Romero Castillo Marianella Dolores Análisis de los ácidos kaurénicos de varias especies de coespeletia y ruilopezia Universidad de Los Andes-Facultad de Farmacia y Bioanálisis-Postgrado en Química de Medicamentos. 2000. p. 106 Venezuela Disponible en: http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33592&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=26870&col=5

¿Cómo citar? UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD, DE FARMACIA POSTGRADO EN, QUIMICA DE MEDICAMENTOS MERIDA-VENEZUELA

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. sERJIULA \ e rdero1 \ 'l'uliO Febres -~·--· ' Por: Farm o Marianella Do Romero Castillo Septiembre, 2000

DIGITAliZADO http://tesis. u/a. ve ESTA TESIS FUE REALIZADA EN EL LABORATORIO DE PRODUCTOS NATURALES DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES DE LA FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES. TUTORIADA POR EL DOCTOR ALFREDO USUBILLAGA. AGRADEaMIENTOS

A la DIVINA PRESENCIA DE DIOS, por ser mi fuente creadora y brindarme su amor divino y por haberme enviado a sus guías espirituales y guardianes silenciosos quienes me guían y me acompañan y me permiten compartir con mis hermanos de grupo, a todos ellos gracias.

A mi querida familia por su apoyo en todo momento.

Al Doctor ALFREDO USUBILLAGA, por su apoyo y valiosa colaboración en el aporte de sus conocimientos y sus generosos consejos y amistad.

Agradezco al CONICIT, por el otorgamiento al profesor ALFREDO

USUBILLAGA, el proyecto SI-97000048 que permitió la compra del equipo GC/MS modelo HP 5973 con el cual se realizó el trabajo.

A mis queridas compañeras de post grado, ROSA, YOLIMAR, REBECA Y

DAYSIS, por brindarme su amistad sincera.

A la profesora NANCY KHOURY, por su cotutoria.

Al profesor LUIS ROJAS, por su colaboración.

Al Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia. Universidad de los Andes. RESUMEN

El presente trabajo describe el aislamiento e identificación de los ácidos kaurénicos que contienen las hojas de Coespeletia moritziana, Coespeletia spicata, Coespeletia thyrsiformis, Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia lindenii Ruilopezia marcesens, plantas endémicas de los Estados Mérida y Táchira, conocidos popularmente como frailejones. Las hojas secas y molidas de cada una de estas plantas se extrajeron con una mezcla de n-hexano-éter dietílico (3:1), se aisló la fracción ácida mediante agitación del extracto etéreo con una solución de NaOH 0.1 N. Una alícuota de la fracción ácida se metiló con diazometano y los ésteres metílicos se inyectaron en un cromatógrafo de gases provisto de un detector de masas (HP MSD 5973). Se utilizó una columna capilar de 5% de fenil-metil-polisiloxano (HP-5) de 30m de largo, 0.2 mm de diámetro interno y 0.25 ¡.tm de espesor de película. Los ésteres metílicos de los ácidos se identificaron mediante comparación de sus espectros de masas con los espectros de sustancias patrón existentes en el laboratorio, o preparadas mediante síntesis. En las tres especies de Coespeletia estudiadas el ácido kaurénico es el componente más abundante, sin embargo en las tres está presente el ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico. Otro ácido particularmente abundante es el ácido 15-a-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (H) (10.8% en la C. thyrsiformis) y el ácido 15- a-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (I) (20.2% en la C. spicata). Es importante anotar que en la C. moritziana recolectada en el páramo de Piñango en Septiembre contiene 28.7 'Yo H, en tanto que aquella cosechada en el páramo de la Culata en Diciembre contiene 30.1 % de I. En las cuatro especies de Ruilopezia estudiadas igualmente se encuentra el ácido kaurénico como componente mayoritario y también está presente el ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico. Sin embargo en la R. floccosa el ácido kaurénico (50.9%) no está tan contaminado por el ácido diénico (9.0'Yo) y por consiguiente, esta especie es particularmente valiosa como fuente natural de ácido kaurénico. La R. marcesens contiene ácido 15-a-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (15.9%) y el ácido 15- a-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico es relativamente abundante en la R. atropurpurea (18.2%) y en la R. floccosa (25.2%), en cambio en la R. /indenii el ácido (-)-kaur-9(11)- 16-dien-19-oico es el segundo más abundante (28.6%). ABSTRACT

This work describes the isolation and identification of kaurenic acids present in the leaves of Coespeletia moritziana, Coespeletia spicata, Coespeletia thyrsiformes, Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia floccosa, Ruilopezia lindenii and Ruilopezia marcesens, endemic plants of the páramos from Mérida and Táchira States, popularly known as frailejón. Dry and ground leaves were extracted with an n-hexano:diethyl ether mixture (3:1), the acid fraction was obtained by shaking the ethereal extract with a 0.1 N NaOH solution. An aliquot of the acid fraction was methylated with diazomethane and the methyl esters were inyected in a gas chomatograph fitted with a 5% phenyl-methyl polysiloxane capillary column (30 m x 0.2 mm id x 0.25 ¡..tm film) was used. The methyl esters were identified by genuine samples available in the laboratory or obtained by synthesis. Kaurenic acid was the main contituent in all species studied, but (-)-kaur-9(11).16-dien-19-oic acid was also present. Another substance particulraly abundant is 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (H) (10.8% in C. thyrsiformiS) and 15-a.-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (I) (20.2% in C. spicata). It is worth noting that C. moritziana isolated at Piñango in Septiembre contains 28.7% of H while C. moritziana at La Culata in December contains 30.1% of I. The four species of Ruilopezia al so contain kaurenic a cid as the main contituent and (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oic acid is al so present in all of them. Nevertheless (-)­ kaur-9(11)-16-dien-19-oic acid is not no abundant (9.0%) in R. floccosa which contains 50.9% kaurenic acid, therefore this species is valuable as a source of kaurenic acid. R. marcesens contains 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oic acid (15.9%) and 15-a.­ isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oic acid is relativaly abundant in R. atropurpurea(18.2%) and R. floccosa (25.2%), on the other hand (-)-kaur 9(11)-16-dien-19-oic acid is the second most important component in R. lindenii(28.6%). CONTENIDO

Pag I.- INTRODUCCIÓN ...... 1 IT.- ANTECEDENTES ...... 9 CLASIFICACIÓN DE LOS DITERPENOS ...... 10 - DITERPENOS LINEALES ...... 10 - DITERPENOS BidCLICOS ...... 10 - DITERPENOS TRidCLICOS ...... 11 - DITERPENOS TETRAdCLICOS ...... 12 - DITERPENOS MACROdCLICOS Y SUS DERIVADOS DE CICLIZACIÓN ...... 13 BIOSINTESIS DE DITERPENOS ...... 16 DITERPENOS AISLADOS DE LAS HELIANTHEAE ...... 19 m.- OBJETIVOS ...... 21 IV.- RESULTADOS...... 23 RECOLECCIÓN...... 24 EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS...... 24 V.- PARTE EXPERIMENTAL ...... 34 RECOLECCIÓN ...... 35 EXTRACCIÓN ...... 35 PREPARACIÓN DE LA NITROSO METIL UREA ...... 36 METILACIÓN DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS ...... 36 OBTENCIÓN DEL ÁCIDO 15-0-VALEROXI-(-)- KA UR-16-EN-19-0ICO ...... 3 7 OBTENCIÓN DEL ÁCIDO 15-0.ISOVALEROXI-(-)- KA UR-16-EN-19-0ICO ...... 3 7 OBTENCIÓN DEL ÁCIDO 15-0.BUTIROXI-(-)- KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 38 ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO DE GASES/MASAS...... 39 , 13 , ANALISIS DE RMN C DE LOS DERIVADOS KAURENICOS ...... 40 ANÁLISIS DE ESPECTROS EN DOS DIMENSIONES...... 40 VI.- DISCUSIÓN...... 41 VII.- CONCLUSIONES...... 49 vm.- BIBLIOGRAFIA ...... 51 IX.- ANEXOS ...... 59 CONTENIDO DE TABLAS

Pag TABLA l. ESTRUCTURA Y ORIGEN DE ALGUNOS KAURENOS ...... 8 TABLA 2. ÁCIDOS Y OTROS KAURENOS AISLADOS DE LAS HELIANTHEAE ...... 20 TABLA 3. SITIOS DE RECOLECCIÓN Y PARAMETROS DEL MATERIAL EXTRAIDO ...... 26 TABLA 4. ÉSTERES MATÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS Y OTROS COMPUESTOS AISLADOS DE LA FRACCIÓN ÁCIDA DE LA Coespeletia moritziana, Coespeletia spicata y Coespeletia thyrsiformis, DETERMINADOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS...... 30 TABLA 5. ÉSTERES MATÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS Y OTROS COMPUESTOS AISLADOS DE LA FRACCIÓN ÁCIDA DE LA Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia floccosa, Ruilopezia lindenii y Ruilopezia marcesens, DETERMINADOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS ...... 31 TABLA 6. ESTRUCTURA DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS KAURÉNICOS Y OTROS COMPUESTOS AISLADOS DE LA FRACCIÓN ÁCIDA DE LAS ESPECIES DE Coespeletias y Ruilopezias ESTUDIADAS ...... 32 TABLA 7. RMN C13 DE LOS DERIVADOS KAURÉNICOS ...... 48

¡¡ CONTENIDO DE ESQUEMAS

Pag ESQUEMA 1. PROCESO DE EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS ...... 27 ESQUEMA 2. PREPARACIÓN DE LA NITROSO METIL UREA ...... 28 ESQUEMA 3. METILACIÓN DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS ...... 29

CONTENIDO DE FIGURAS

Pag FIGURA l. ESTRUCTURA DE ALGUNOS KAURÉNOS AISLADOS DE LAS RESINAS DE DIFERENTES ESPECIES DE FRAILEJÓN ...... 6 FIGURA 2. CLASIFICACIÓN DE LOS DITERPENOS ...... 14 FIGURA 3. BIOSINTESIS DE DITERPENOS ...... 18 FIGURA 4. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Coespeletia moritziana ...... 60 FIGURA 5. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Coespeletia spicata ...... 61 FIGURA 6. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Coespeletia thyrsiformis ...... 62 FIGURA 7. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Ruilopezia atropurpurea ...... 63 FIGURA 8. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Ruilopezia floccosa...... 64

¡¡¡ Pag FIGURA 9. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Ruílopezia /indenii...... 65 FIGURA 10. CROMATOGRAMA DE IONES TOTALES (TIC) DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS DE LA Ruílopezía marcesens...... 66 FIGURA 11. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO (-)-KAUR-9(11)-16-DIEN-19-0ICO ...... 67 FIGURA 12. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO (-)-KAUR-15-EN-19-0ICO ...... 68 FIGURA 13. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER MElÍLICO DEL ÁCIDO (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 69 FIGURA 14. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER MElÍLICO DEL ÁCIDO 15-a.-OH-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 70 FIGURA 15. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a.-ACETOXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 71 FIGURA 16. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a.-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO ...... 72 FIGURA 17. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a.-SENECIOXI-(-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO ...... 73 FIGURA 18. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a.-ISOVALEROXI-(-)-KA UR- 16-EN-19-0ICO ...... 74 FIGURA 19. ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 75 FIGURA 20. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER MElÍLICO DEL ÁCIDO (-)-KAUR-9(11)-16-EN-19-0ICO ...... 76 FIGURA 21. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER MElÍLICO DEL ÁCIDO ISOKAURÉNICO ...... n FIGURA 22. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO KAURÉNICO ...... 78

IV Pag FIGURA 23. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-HIDROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 79 FIGURA 24. POSIBLE FORMACIÓN DE LOS FRAGMENTOS m/z 123 y m/z 109 A PARTIR DEL FRAGMENTO m/z 274 EN EL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-KIDROXI-(-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO ...... 80 FIGURA 25. FORMACIÓN DE LOS FRAGMENTOS m/z 317 y m/z 257 EN EL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-KIDROXI-{-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO ...... 81 FIGURA 26. ESQUEMA GENERAL DE LOS ÉSTERES METÍLICOS DE LOS ÁCIDOS 15-a-HIDROXI KAURÉNICOS Y SUS DERIVADOS...... 82 FIGURA 27. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 83 FIGURA 28. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-SENECIOXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 84 FIGURA 29. ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-ISOVALEROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO ...... 85 FIGURA 30. RMN 13C DEL ÁCIDO (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO...... 86 FIGURA 31. RMN 13C DEL ÁCIDO (-)-KAUR-9(11)-16-DIEN- 19-0ICO...... 86 FIGURA 32. RMN 13 C DEL ÉSTER MElÍLICO ÁCIDO 15-a-OH­ (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO...... 87 FIGURA 33. RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-a-ACETOXI-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 88 FIGURA 34. RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-BUTIROXI-{-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 89 FIGURA 35. RMN 13C DEL ÁCIDO 15-a-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 90 FIGURA 36. RMN 13C DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 91

V FIGURA 37. RMN 1H DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 92 FIGURA 38. RMN COSY DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 93 FIGURA 39. RMN HMQC DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 94 FIGURA 40. RMN HMBC DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO...... 95

Vi

La familia de las Asteraceae (Compuestas) es una de las que posee mayor número de especies presentando alrededor de unas 22000 que producen gran variedad de metabolitos secundarios entre los cuales se destacan los terpenos. Estos compuestos se consideran derivados del isopreno y se clasifican de acuerdo a su peso molecular en monoterpenos, que poseen 10 átomos de carbonos o dos unidades de isopreno, sesquiterpenos (15 átomos de carbonos), diterpenos (20 átomos de carbonos) y triterpenos (30 átomos de carbonos). Los monoterpenos y sesquiterpenos son compuestos volátiles, obtenidos de las hojas y flores por destilación simple, siendo los componentes principales de los aceites esenciales. Numerosas esencias obtenidas de plantas son usadas como saborizantes de alimentos, en perfumería y con fines

1 medicinales • Los terpenos mantienen un lugar especial en la química orgánica, por su abundancia y la facilidad con que se les puede obtener. La mayor parte de los compuestos terpenoides se encuentran libres en los tejidos de las plantas o en combinación con otras sustancias, pero muchos de ellos se encuentran como glicósidos,

1 ésteres de ácidos orgánicos y en algunos casos en combinación con proteínas • Los diterpenos son compuestos químicamente heterogéneos, constituidos por 20 átomos de carbono equivalentes a cuatro unidades de isopreno, son metabolitos secundarios de origen vegetal, aunque algunos se obtienen de fuentes marinas. Muchos diterpenos poseen actividad biológica, principalmente los que son producidos por plantas pertenecientes a las familias Ericaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae y Asteraceae. Más de 1200 diterpenos han sido identificados de aproximadamente 550 géneros de las Asteraceae. Probablemente el único diterpeno universalmente distribuido es el fitol [1] (Figura 2) compuesto de origen acíclico, el

1 cual está presente como éster adherido a la molécula de clorofila • Entre los diterpenos más estudiados se encuentra el taxol, compuesto nitrogenado aislado inicialmente de Taxus brevifolia Nutt y posteriormente de varias

2 especies de Taxaceae , con una alta actividad contra el melanoma B16 y el cáncer

2 3 mamario , así como también contra la leucemia • • Un representante característico de la flora de los páramos venezolanos es el frailejón , planta cuya resina contiene diterpenos, especialmente ácidos kaurénicos. Los frailejones se agruparon inicialmente en el género Espeletia, hasta 1976. Este nombre fue creado por Humboldt y Bonpland en 1808 con tres especies del área de

4 Bogotá y en honor al Virrey Espelet • En 1814 Humboldt publicó bajo el nombre de Trixis neriifolia a un árbol resinífero colectado en la Silla de Caracas. Posteriormente esta especie fue transferida por Schutz al género Espeletia en 1856. Weddell dividió el género Espeletia en dos grupos, árboles con dos especies y hierbas con nueve. Standley5 en 1915, describió 17 especies, siendo el primero en mencionar el característico crecimiento en forma de roseta de muchas especies de frailejón. Un estudio muy completo del género fue realizado en 1935 por Smith y Koch 6 quienes describieron la morfología, anatomía floral y palinología. Este estudio incluye 30 especies distribuidas en Colombia y Venezuela, extendiéndose hasta el Norte de Ecuador. Cuatrecasas 7 creó en 1976 la subtribu Espeletiinae, subdividida en siete géneros: Carramboa, Coespeletia, Espeletia, Espeletiopsis, Libanothamus, Ruilopezia y Tamania. Estas especies pertenecen a la familia Asteraceae y tribu Heliantheae. En total se han descrito para Venezuela 85 especies, agrupadas en los siete géneros antes mencionados. Los primeros estudios sobre la química del frailejón se deben a Piozzi y

8 colaboradores , quienes descubrieron en 1968 el ácido grandiflorólico [A] (Figura 1)

9 aislado de Espeletia grandiflora, una especie colombiana. Brieskorn y Pohlmann , aislaron por primera vez de la resina de la Espeletia schutzii, especie venezolana, el ácido (-)-Kaur-9(11)-16-dien-19-oico [B]. asi como el ácido 15-a-acetoxi-(-)-Kaur-16- en-19- oico [C] y el ácido grandiflórolico.

10 11 En la Universidad de Jos Andes • se han realizado estudios sobre diferentes especies de frailejón, lo que ha conducido al aislamiento de nuevos diterpenos, tales

3 como el aldehído(-)-Kaur-15-en-19-al [D] y el ácido-16-a.-hidroxi-(-)-9(11)- en-19-oico

[E]. Hasta el momento se han descrito más de 140 especies de frailejón y solamente se han estudiado fitoquímicamente unos 18. Bohlmann ha publicado estudios sobre los componentes de algunas especies, realizados sobre material obtenido del

12 13 Herbario del Instituto Smithosian • · A principios de siglo se realizaron estudios sobre la composición de resinas ácidas, exudados de varias plantas superiores, que presentan un alto contenido de ácidos diterpénicos; entre ellos se encuentra un grupo muy importante que pertenece a los diterpenos tetracíclicos, los ent-kauranos 3 (tabla 1). Un representante de este grupo es el ácido (-)-kaur- 9(11)16-dien-19-oico [B], ha sido utilizado como punto de partida para la síntesis de nuevos diterpenos; algunos de ellos poseen esqueletos diferentes obtenidos mediante reordenamiento, con miras a la obtención de

14 15 sustancias con actividad biológica • • Se ha demostrado que algunos ácidos diterpénicos de la serie del kaureno tienen propiedades citotóxicas contra el melanoma B16F1 en ratones, como el ácido-15-a.-hidroxi-kaurénico [A] y el ácido kaur- 16-en-19-oico [F], el cual además, inhibe el crecimiento de Staphy!ococcus aureus y

16 17 Candida a/bicans • • En vista de que el ácido kaurénico presenta baja solubilidad en agua, lo que dificulta la evaluación de experimentos in vivo, se decidió obtener derivados más polares sin afectar su doble enlace ni el grupo carboxilo que aparentemente juega un papel muy indispensable en su actividad biológica. Se pensó que los derivados más idoneos para mejorar la solubilidad y no afectar negativamente la actividad biológica del ácido kaurénico serían azúcares, por lo que se intentó la síntesis de ésteres del

ácido kaurénico con diferentes azúcares, lo que aumentaría su solubilidad y al mismo tiempo permitiría que el derivado azucarado actuase posiblemente como un

18 profármaco •

4 En este trabajo se describe el análisis e identificación de los ácidos diterpénicos tipo kaureno presentes en la resina de Coespeletia moritziana, Coespe/etia spicata, Coespe/etia thyrsiformis, Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia floccosa, Ruilopezia lindenii y Ruilopezia marcesens. Conjuntamente se realizó un estudio de los aceites esenciales en las mismas especies, reportandose la existencia del aldehído kaurénico (-)-kaur-16-en-19-al 19, además de encontrarse un alto contenido de limoneno en dos de las especies, lo cual le confiere un potencial uso en la

19 preparación de expectorantes •

5 FIGURA 1

ESTRUCTURAS DE ALGUNOS KAURENOS AISLADOS DE LAS RESINAS

DE DIFERENTES ESPECIES DE FRAILEJÓN.

12 17

5 6 4''••cooH 19 Ácido 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico Ácido-(-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico [A] [B]

'• ,, .. ,, o'c-CH3 'COOH 11 , o Acido 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en-19-oico kaur-15-en-19-al [C] [D]

Ácido 16-a.-OH-( -)-kaur-9(11)-en-19-oico Ácido ( -)-kaur-16-dien-19-oico [E] Ácido kaurénico [F]

6 , CONTINU ACION FIGURA l ....

HOH C'''' 2 ·····cooH kaur-16-en-19-ol Ácido (-)-kaur-15-en-19-oico [G] [H]

CH20H

·····cooH Ácido(-)-kaur-15-en-17-oxo-19-oico kaur.16-eno-18-ol [!] [J]

·····cooH ·····coH Ácido 15-a-OH-(-)-kaur-9(11)-dien-19-oico kaur-16-a-OH-19-al [K] [L]

·····cooH Ácido kauránico [M]

7 TABLA 1 ESTRUCTURA Y ORIGEN DE ALGUNOS KAURENOS

ESQUELETO COMPUESTO ESTRUCTURA ORIGEN REF

Baccharís mínutiflora 20 (-)-kaur-16- C. morítzíana ent-kaurano 12 oxo-18-acetoxi E. schultzzí 21 Fspeletíopsís glandulosa 12

ent­ ácido-(-)-kaur- kaurano ,17- 16-oxo-17-nor- Helíanthus radula 22 nor- 19-oico

C. lutescens 13 ent- kaur-16-en-4- C. morítziana kaurano ,18- beta-hidroxi- 12 Libanothamnus nor- 18-nor 23 HO tamanus

ent­ kaur-16-en-4- C.marcana 13 kaurano,19- alfa-hidroxi- Libanothamnus 23 nor- 19-nor tamanus

ent-kaurano,9- Wederegiolido, Wedelia 24 lO-seco 15-alfa-hidroxi

8 9 CLASIFICACION DE LOS t>ITERPENOS.

Los diterpenos se pueden clasificar como: 1) lineales, 2) bicíclicos: labdanos y clerodanos, 3) tricíclicos: pimaranos, abietanos y diterpenos relacionados, 4) tetracíclicos: kauranos, beyeranos, atisanos y giberalinas 5) macrocíclicos y productos de sus delaciones 16 (Figura 2).

t>ITERPENOS LINEALES.

El más diverso grupo de diterpenos lineales son derivados del geranilnerol y abarca a derivados lactónicos, oxepanes y lactononas. Han sido encontrados en generos como Acanthosperu, Ichthyothere, Melampodium y otros géneros pertenecientes a las Heliantheae. Por cientos de años un té preparado de las hojas de Montanoa tomentosa, ha

25 sido usado medicinalmente como antifertilizante • A su vez, el extracto de esta

26 planta posee efectos en la inducción del aborto y de la menstruación , apareciendo el Zoapatanol [2], como el mayor componente responsable de la actividad, aparte de otros diterpenos como el oxepano y sus precursores, que fueron aislados de estas especies.

, t>ITERPENOS BICICLICOS.

Entre la serie de los labdanos se encuentra un número importante de diterpenos distribuidos en varias especies, las cuales poseen ciertas actividades biológicas. Compuestos como el sclareol [3] y el 13-epi-sclareol pertenecientes a la

10 serie de los labdanos-normales, han sido aislados de la resina de Nícotíana glutinosa, miembro de la Solanaceae, presentando una actividad inhibitorio en el crecimiento

27 radical de varias colonias de hongos • De esta misma serie de labdanos-normales se encuentran los Grindelanos, aislados de especies pertenecientes a los géneros Grinde/ía, Chrysothamnus, Solidago y Haplopappus de las compuestas, con una actividad antialimenticia contra el

28 escarabajo colorado de la papa • Otras sustancias, como la lactona accuminolida [4], obtenida de la Neouvaría acumínatíssíma ( Annonaceae ) muestra actividad citotóxica contra ciertos tipos de

29 30 células cancerígenas del cuerpo humano • • La actividad antimutagénica ha sido asociada con la presencia del ácido poliáltico en extractos de una planta medicinal asiática, conocida como "Mankeishi"

30 obtenida de Vitex rotundifloría perteneciente a la familia Verbenaceae • En la serie del clerodano se encuentran los compuestos neoclerodanos aislados de las especies de Scutellaria, de la familia Labiatae, el scutaltisin obtenido de la S.

31 32 altísima y el scutalbin obtenido de la S. albida • , presentando actividades antifungicas y antialimenticias. De la planta medicinal Tínospora cordífolía (Menispermaceae) se han aislado

33 34 una serie de clerodanos, [la cordiosida y la tinosponona] • , usados ampliamente en la medicina ayurvédica tradicional.

, DITERPENOS TRICICLICOS.

El ácido abiético [5] es el mayor constituyente de las resinas comerciales preparadas a partir de las oleorresinas de las coníferas, así como también los ácidos pimáricos, sapiético, neobiético e isopimárico, los cuales se isomerizan fácilmente al

35 ácido abiético • El anillo C de estas estructuras es frecuentemente aromático o

11 altamente insaturado, entre ellas se destacan un grupo de quinonas de las cuales la taxodona [6] y taxodiona [7] aisladas de las semillas de Taxodíum dístíehíum

35 36 (Cuppressale), son fuertes inhibidoras del crecimiento de tumores • • Otras quinonas diterpénicas fueron obtenidas del Plectranthus heteroensis y

37 38 de Salvia regla ambas pertenecientes a la familia Labietae • , presentando actividad antibacterial y antiviral. También en los grupos de totarol, abietano y pimarano se ha demostrado actividad hipocolesterolémica en ratas, encontrándose que la inhibición de la absorción intestinal del colesterol estaba involucrada en el

39 mecanismo de acción del totarol y del ácido abiético •

, DITERPENOS TETRACICliCOS.

La mayorla de los diterpenos tetracíclicos contienen como base estructural el (-)- kaureno; de este grupo se han descrito importantes actividades biológicas como es el caso de un diterpenoide presente en la especie Síderítís, el linearol,

3 40 ampliamente distribuido y activo en ratones como antiinflamatorio Y • El ácido kaur-16-en-19-oico y el ácido trachyloban-19-oico, obtenidos de

16 41 Helíanthus annus (Asteraceae) poseen actividad antialimenticia Y • El glicósido steviósido, aislado de la planta paraguaya "Coa - eche", Stevia rebaudiana, es 200

35 veces más dulce que el azúcar • En la serie de los beyaranos, se encuentra el ácido scopadulcico [8] de Scoparia

42 3 dulcís (Scrophulariaceae), que posee actividad antitumoral .4 • Finalmente las giberillinas son un grupo de sustancias ampliamente usadas como promotoras del crecimiento de las plantas.

12 , DITERPENOS MACROCICUCOS Y SUS DERIVADOS DE CICUZACION.

Hay un grupo de compuestos macrocíclicos como el cembreno [9], que se forma al ciclar cabeza-cola del GGPF. Este hidrocarburo inicialmente aislado de varios vegetales superiores principalmente pinos, ha sido el primero de su serie en ser caracterizado. Varios de sus derivados se han encontrado en corales y otras fuentes marinas como, en el caso del butenólido eunicina en Eunicea mammosa. Los grupos furánicos y las faetonas son frecuentes en estos diterpenos macrocíclicos y uno de ellos lo constituye la jatrophona, sustancia inhibidora de tumores aislada de Jatropha gossypiifolia, vulgarmente llamada " Tua-Tua ", es una planta a la cual se le atribuyen varias propiedades curativas. Por otra parte, tenemos la jatrophatriona, aislada de Jatropha macrorhiza, que si bien no presenta un grupo faetona insaturada, posee actividad antitumoral, probablemente proveniente del sistema dienona que posee. Una serie de ésteres propionil y butanoil, los cuales poseen moderada actividad

44 anti-HIV, han sido obtenidos de Ephorbia. Myrsinite • Otros compuestos macrocíclicos son los derivados del taxano, [10] de los cuales se han aislado .unos 25 compuestos, son altamente oxigenados y se presentan totalmente hidroxilados o como derivados de ésteres de diversos ácidos. Son responsables del envenenamiento del ganado y se aíslan del género Taxus; algunos con un anillo oxetánico en su estructura, tienen propiedades citotóxicas, como la beccatina-IIT. las Euforbiaceas son ricas en forboles, otros derivados macrocíclicos con el

35 esqueleto del casbeno [11], altamente tóxicos y co-carcinogénicos •

13 FIGURA 2 , CLASIFICACION DE LOS DITERPENOS

1.- UNEALES

OH

CH20H

Fitol [1] Zoaparnnol [2]

2.- BICICUCOS

o

sclareol [3] accuminolida [4]

14 , CONTINUACION FIGURA 2 ....

3.- TRICÍCLICOS

H0 C''··· 2 Ácido abiético [5] o taxodona [6] taxodiona [7]

4.- TETRACÍCLICOS o

OBz Ácido scopadulcico [8]

5.- MACROCÍCLICOS

casbeno [11] cembreno [9] taxano [10]

15 BIOSINTESIS DE DITERPENOS.

Los diterpenos forman un conjunto de compuestos, procedentes del

35 45 metabolismo del geranilgeranilpirofosfato (GGPF). La ciclación • comienza generalmente con el ataque electrofílico sobre el doble enlace 14-15 y la especie atacante es siempre un protón. Es por ello que muchas de estas estructuras no están oxigenadas en C-3 del esqueleto (antiguo C-14 del GGPF) (figura 3). Contrario a los triterpenos, cuya ciclación es un proceso concertado que se inicia con la formación de un epóxido, razón por la cual la mayoría de esas moléculas son oxigenadas en C-3 y además preservan la configuración absoluta "esteroidal" en la fusión de los anillos, en los diterpenos se encuentran ambas antípodas naturales aún en la misma planta. En la Figura 2 se ilustra la formación de los esqueletos principales, sin especificar la estereoquímica, provenientes de la ciclación inicial del tipo "triterpenoidal" la cual es seguida por la formación de estructuras más complejas de 3, 4 y 5 anillos. Está ciclación da lugar a un sistema de tipo decalina (cis o trans}, el cation evoluciona hacia un intermediario importante, el pirofosfato de labdadienilo. Este después de la solvólisis del grupo pirofosfato, origina un carbocatión alílico que puede sufrir el ataque del metileno exo y llegar así, por una serie de combinaciones diversas a los diferentes esqueletos policíclicos diterpénicos conocidos.

La saturación de los cationes da lugar a compuestos bicíclicos y sus derivados heterocíclicos con un mayor número de anillos. La formación del sistema tricíclico de catión labdanilo, procede con retención de la relación anti-trans del hidrógeno en C-9 y el metilo en C-10. Dependiendo de la estereoquímica de C-13 se originan dos estereoisómeros : a) derivados del ácido pimárico donde el metilo C-13 tiene orientación alfa y b) derivados del ácido isopimárico cuyo metilo C-13 tiene orientación beta. El catión tricíclico puede sufrir reordenamiento de hidrógenos y metilos para formar nuevos esqueletos como

16 abietano, cassano, rimurano, totarano y el nucleo de 17 átomos de carbono: podocarpano, entre los más recurrentes. Si el doble enlace de C-15 satura el catión pimarilo en C-8 se obtiene un nuevo intermediario que originará esqueletos de beyarano (conocidos también como stachano e hibano) y a partir de éste se forman aquellos de las series kaurano, trachylobano y atisano.

A partir del esqueleto kaurano, dos clases de compuestos se forman por contracción del anillo A ( grayanotoxinas) y del anillo B (gibberilinas). La unión de los anillos A y B sigue siendo trans como en el precursor(-) kaureno, el cual debe sufrir la migración del enlace C-5, C-10 a C-1, el resto del esqueleto es idéntico al del precursor. También dentro de este grupo se localizan los alcaloides tipo garrya con esqueleto del kaurano, y los del tipo acónito con esqueletos de 20 carbonos o tipo aconano con 19 carbonos.

17 FIGURA 3

BIOSINTESIS DE DITERPENOS

OH

OPP OPP

GGPP ion labdonilo monool 12 ¡ 17 1~

16

b

beyaranos pimaranos R 1=Jl Me, R z=a H) cassanos rimuranos (R 1=a H. R z=Jl Me) 12 13

14

1~ --- podooarpanos abietanos ~ .... 17 16 12

toraranos kauranos trachylobanos

20 11

17 7 grayanos gibbanos

18 DITERPENOS AISLADOS DE LAS HELIANTHEAE

Todas las especies hasta ahora estudiadas, pertenecientes al género Espeletia, correspondientes a la tribu Heliantheae, contienen diterpenos tetracíclicos del tipo kaurano (Figura 1). En base a Jos resultados fitoquímicos, se ha tratado de buscar una

6 correlación de éstos con la posible filogenia de Espeletía según Smith y Koch , trabajo publicado en 1935. Sin embargo, los datos químicos que se han obtenido hasta el presente y que se obtendrán de las especies cuya investigación se ha iniciado, podrían ser utilizados más adelante en la elaboración de un cuadro filogenético más completo.

la clasificación de Smith y Koch comprende cinco grupos, a los cuales se le han añadido otras especies que encajan por sus características morfológicas y anatómicas y por contener los mismos componentes. En la tabla 2, se representan Jos componentes aislados de estas especies, de donde se puede inferir que todas ellas

46 están íntimamente relacionadas •

19 TABLA 2

, ACIDOS Y OTROS KAURENOS AISLADOS DE LAS

HELIANTHEAE

COMPUESTO ESPECIE REF Acido-(-)-kaur-16-en-19-oico [F] Coespeletia moritziana 11,12 Espeletia tenore 16 Espeletia semiglobulata 11 Espeletia grandiflora 16 y 47 Acido-15-alfa-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19- Espeletia schultzzi 16 y 47 oico [A] Espeletía tímotensis 16 y47 Espeletia weddellii 16 y47 Espeletía semíglobulata 11 Espeletía grandíflora 16 y 48 Acido-(-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico [B] Espeletia schultzzí 16 y 48 Espeletia hartwegíana 16 y 48 Espeletia timotensis 16 y__ 48 Acido-15-alfa-acetoxi-(-)-kaur-16-en-19-oico Espeletia schultzzi 16 [C] Espeletia grandiflora 16 y 49 Espeletiopsis kaur-16-eno-19-ol [G] guacharaca 16 y 49 Ruilopezia margarita 16 y 49

kaur-15-eno-19-al [D] Espeletia tenore 10 y 16 Espeletia wedde//ii 10 y 16 Acido-(-)-kaur-15-en-19-oico [H] Coespeletia moritziana 16 y 50 Espe/etia tenore 16 y_ 50 Acido-16-alfa-hidroxi-(-)-9(11)-en-19-oico [E] Coespe/etia marcana 16 kaur-16-eno-18-ol [I] Espe/etia tenore 16 y 50 Acido-(-)-15-en-17-al-19-oico [J] Espeletíopsís 51 guacharaca Acido-(-)-15-alfa-hidroxi-(-)-kaur-16-dien-19- Espeletia schultzzí 16 y 21 oico [K] kaur-16-alfa-hidroxi-19-al [L] Ruilopezía margarita 16 y_ 49

20 21 1 . - Aislar la fracción ácida de cada uno de los extractos de las especies estudiadas: - 3 especies del género Coespeletia.

- 4 especies del género Ruilopezia.

2.- Identificar los ácidos que producen cada una de las especies.

3.- Determinar la concentración relativa de cada uno de los ácidos.

22 1 ' \

1 1 '

23 , RECOLECCION

Las especies estudiadas fueron recolectadas en diferentes páramos de los estados Mérida y Táchira, tomándose en cuenta la época de floración (tabla 3). Las muestras fueron autenticadas en los Herbarios de las Facultades de Farmacia y Forestal, para ello se contó con la colaboración de los Profesores Benito Briceño de la

Facultad de Ciencias, Gilberto Morillo de la Facultad de Ciencias Forestales y Pablo Meléndez de la Facultad de Farmacia.

, , EXTRACCION Y ANALISIS

De las partes aéreas de cada una de las especies estudiadas se tomaron de 500 a 600 g y se colocaron en una estufa a 50 °C. El material botánico seco se molió obteniéndose de 65 a 270 g de material seco, que se extrajo en un sohxlet, con una mezcla de n-hexano-éter etílico (3:1). Para aislar la fraccion ácida cada uno de estos extractos se agitó con una solución O,lN de NaOH, procedimiento que transforma los ácidos en sus respectivas sales sódicas que son solubles en agua. A continuación la fase acuosa se llevó a pH 3.0 por adición de HCI 1.0 N y se agitó con hexano-éter etílico para recuperar los ácidos libres (esquema 1).

Finalmente se metiló una parte de la fracción ácida con diazometano en solución etérea para transformar los ácidos en sus respectivos ésteres metílicos, sustancias más volátiles y adecuadas para realizar el análisis mediante cromatografía

52 53 de gases-masas - (esquema 2 y 3). Se prefiere utilizar ácidos metílicos porque tienen un comportamiento cromatográfico mejor que los ácidos libres que no eluyen en forma simétrica, además los ácidos como tales se quedan retenidos por un largo tiempo dentro de la columna, lo que origina la formación de picos anchos y dificulta así la lectura de los cromatogramas.

24 Aunque se han descrito métodos para el ánalisis de ácidos kaurénicos mediante

54 cromatografía líquida , se prefirió el análisis mediante cromatografía de gases ya que se dispone de un sistema GC/MS. Uno de los primeros trabajos que describe el

55 análisis de ésteres metílicos de ácidos diterpénicos se debe a Foster y Zinkel • Otros autores han utilizado análisis cromatográfico de derivados sililados de ácido kaurénico y compuestos similares sobre columnas capilares de 5'Yo fenil metil

56 silicona , columna que ya había sido utilizada para el análisis del esqueleto del

57 kaureno y otros hidrocarburos diterpénicos • En este trabajo se prefirió utilizar los ésteres metílicos en lugar de derivados sililados, puesto que ensayos previos con columnas capilares 5% fenil, 95'Yo metil polisiloxano han demostrado ser las más apropiadas para el análisis de los ésteres metílicos del ácido kaurénico y sus

58 derivados • Los ésteres metílicos de los ácidos kaurénicos (tabla 4, 5 Y 6) se identificaron por comparación de sus espectros de masas con los espectros de ácidos kaurénicos metilados patrones existentes en el Instituto de Investigaciones. En algunos casos, fue preciso obtener el ácido patrón haciendo reaccionar el ácido del origen natural (15-n-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico) con diferentes anhídridos, podemos mencionar al ácido 15-n-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (I) sustancia que estaba presente en varias de las resinas que fueron sometidas al estudio de sus espectros de masas, y a fin de confirmar esta suposición se sintetizó el producto y se corrió una muestra en el equipo de GC/MS, comprobandose dicha afirmación. Las estructuras de algunos de los ácidos kaurénicos obtenidos inicialmente, fueron corroboradas con estudios de RMN 13C cuyos desplazamientos químicos se muestran en la tabla 7 (Figuras 30-36). En algunos casos como en el ácido 15-ceto­ kaur-16-en-19-oico, fue necesario realizar espectros bidimensionales de RMN-COSY, HMQC y HMBC (Figuras 38-40).

25 TABLA 3 , SITIOS DE RECOLECCION Y PARAMETROS DEL MATERIAL

EXTRAIDO

ESPEOE ZONA DE No DE CANTIDAD EXTRACTO PESO Y% DE LA

RECOLECOÓN VOUCHER EXTRA! DA OBTENIDO FRACOÓN ÁODA

(PÁRAMOS) (peso seco) (gramos)

Piñango (2-9-98) A.U03 85g 0,20g 0,020 9 (10,0 'Yo) C. moritziana La Culata (9-12-99) A.U 12 270g 11,2 9 3,74 9 (33,3 %)

Las Cruces (22-11-98) R.A01 500g 67,0g 3,00 9 (4,47 'Yo) C. splcata La Culata (10-12-99) A.U 14 210g 14,8 9 5,13 9 (34,66 'Yo)

El Batallón (6-11-98) R.A03 210g 8,50g 1,70 g (20,0 'Yo) C. thyrslformls El Batallón (22-6-99) R.A 03.1 118g 5,22 g 2.27g (43,48 'Yo)

El Batallón (6-11-98) R.A02 145 g 12,0 9 2,6 9 (21,66 'Yo) R. atropurpurea El Batallón (22-6-99) R.A05 120g 6,64g 2,2 g (33,28 %)

R. floccosa El AguiJa (25-5-99) R.A04 152 g 18,0 9 7,29 g (40,5 'Yo) R. linden// San José (10-8-99) A.U06 230g 17,1g 10,0 9 (58,53 'Yo)

La Negra (14-12-98) A.U05 65 g 3,56 g 0,9 g ((25,28 'Yo)

R. marcesens La Negra (22-6-99) A.U 16 85g 7,42g 2,14 g (28,84 'Yo)

La Negra (27-1-2000) R.A07 90g 11,2 g 2,28 g (20,35 'Yo)

26 ESQUEMA 1

PROCESO DE EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE LOS ÁCIDOS , KAURENICOS

MATERIAL SECO Y MOLIDO

n-hexano-éter 3:1 L--Ex_TR_A_cCI_ó_N_ .....I-- (Soxhlet)

EXTRACTO 1 AGREGAR SOLUCIÓN DE NaOH AL 5'Yo (agitar)

+ FRACCIÓN ÁCIDA FRACCIÓN• NEUTRA (ACUOSA) hexano-éter 1) añadir HCL diluido hasta pH 3.0 ~· 2} aqitar con hexano-éter

FRACCIÓN ACUOSA FRACCIÓN ORGÁNICA (impurezas) (contiene los ácidos kaurénicos)

27 ESQUEMA 2

PREPARACIÓN DE LA NITROSO METIL UREA

59 g Acetamida disueltos en 28 mi de Br2 1 Se añade gota a gota 40 g de NaOH en 160 mi de H20

1 se calienta

49 g de Acetilmetilurea se mezclan con 50 mi de HCL

1 se diluyen con 50 mi de H20 O helada Se añade bajo agitación 38 g de NaN02 en 45 mi de H20 helada

1 baño de hielo (1 hora)

Sólido se filtra al vacío y se lava con agua helada l Producto (se seca al aire)

28 ESQUEMA 3 METILACIÓN DE LOS ÁCIDOS KAURÉNICOS

10 g de nitroso metil urea se cubren con 150 mi de EtzO

¡ se enfría con baño de hielo

Se le añade una solución de KOH en agua (50%p/v)

Mezcla (se calienta sobre agua tibia)

la mezcla de Diazometano-EtzO destila y se recoge en un balón sobre EtzO

l se enfría en baño de hielo la solución diazometano-EtzO se agrega a los ácidos kaurénicos disueltos en EtzO

29 TABLA 4

, , , , ESTERES METIUCOS DE lOS ACIDOS KAURENICOS Y OTROS COMPUESTOS AISLADOS DE lA FRACCION ÁCIDA DE lA Coespeletia moritziana, Coespeletía spicata y Coespeletia thyrsiformis, DETERMINADOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

Coespeletio Coespeletio CtH!spelt!tia Coespeletio moritziono morltziono spicoto Thyrsiformis IDENTIFICAaON No Pi ñango La Culata PM Area % Area % (Ésteres metílicos) 2-9-98 9-12-99 La Culata El Batallón Area % Area % (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico 1 18.3 6.1 12.2 16.4 314 (A) (-)-kaur-15-en-19-oico 2 0.2 316 -- - (B) (-)-kaur-16-en-19-oico 3 32.3 45.5 42.0 47.5 316 (C) (-)-kaur-16-en-19-ol 4 0.3 288 - - - (D) 5 0.1 330 No identificado 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico 6 0.9 8.43 6.4 14.1 332 (E) 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en- 7 2.0 1.2 374 -- 19-oico (F) 15-a.-isobutiroxi-(-)-kaur-16- 8 2.1 402 - - - en-19-oico (G) 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en- 9 28-.7 7.1 0.7 10.8 414 19-oico (H) 15-a-isovaleroxi-(-)-kaur-16- 10 0.9 30.1 20.2 11.3 416 en-19-oico (I)

N° =Sustancia en orden de e lución.

PM =Peso molecular de los ésteres metilícos de los ácidos kaurénicos.

30 TABLA 5 , , , , ESTERES METIUCOS DE ACIDOS KAURENICOS AISLADOS DE LA FRACCION ÁCIDA DE LA Ruilopezia atropurpurea, Ruilopezia f/ocossa, Ruilopezia lindenii y Ruilopezia marcesens, DETERMINADOS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS.

Ruilopezia Ruilopezia Ruilopezia Ruilopezia atropurpurea flocossa lindenii marcesens IDENTIFICAaÓN No PM , Area % Area % Area % Area % (Esteres metílicos) El Batallón El Agulla San José La Negra (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico 1 14.3 9.0 28.6 9.6 314 (A) (-)-kaur-16-en-19-oico 2 47.9 50.9 47.9 44.3 316 (C) 3 6.5 318 No identificado 4 3.8 330 No identificado 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico 5 5.4 9.5 10.9 5.8 332 (E) 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en 19-oico 6 1.0 374 - - - (F) 15-a.-isobutiroxi-(-)-kaur-16-en-19- 7 2.3 402 - -- oico (G) 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19- 8 3.8 1.1 5.5 15.9 414 oico (H)

15-a.-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19- 9 18.2 25.2 416 - - oico (I)

N° =Sustancia en orden de elución.

PM = Peso molecular de los ésteres metilícos de los ácidos kaurénicos.

31 TABLA 6 , , , , ESTRUCTURA DE LOS ESTERES METILICOS DE AaDOS KAURENICOS Y OTROS COMPUESTOS AISLADOS DE LA FRACCIÓN ÁCIDA DE LAS ESPECIES DE COESPELETIAS Y RUILOPEZIAS ESTUDIADAS.

COMPUESTO ESTRUCTURA

Éster metílico del ácido

(-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico 2 (A) 3

Éster metílico de ácido (-)-kaur-15-en-19-oico (Ácido isokaurénico) (B) ., .,, •cooc~

Éster metílico del ácido (-)-kaur-16-en-19-oico (Ácido kaurénico) (C) .,

'••coocH3

Kaurenol (-)-kaur-16-en-19-ol (D)

Éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (E) ··-~cooc~

32 CONTINUACION TABLA 6 ...

COMPUESTO ESTRUCTURA

12

Éster metílico del ácido 2 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (F) 3

Éster metílico del ácido 15-0 -isobutiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (G)

Éster metílico del ácido 15-O -senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (H)

Éster metílico del ácido 15-0-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (I)

33 34 RECOLECCIÓN

Para la realización de este estudio se recolectó de cada especie de 1 a 3 gra~os de hojas en los páramos de Piñango, La Culata, Las Cruces, La Negra, El

1 Batallón, El Aguila y San José, en los Estados Táchira y Mérida, a una altitud

1 comprendida entre los 3000 a 3800 mts. Las respectivas muestras botánicas testigo (Voucher) se encuentran depositadas en el Herbario de la Facultad de Farmacia.

, EXTRACCION (ESQUEMA 1). 1

El material seco y molido (hojas 65 a 270 g), se sometió a una extracción con 1500 mi de hexano-éter en proporción 3:1 en un extractor Soxhlet durante 48 horas. l

1 ' El extracto así obtenido se le midió su volumen total y se tomó una alicuota que se concentró a presión reducida en una rotavapor, esto permitió calcular el peso total de sólidos en el material extraído. Para la obtención de la fracción ácida se tomó el concentrado del extracto y se agit6 en un embudo de decantación con una solución al 5% de hidróxido de sodio para formar las sales de los ácidos, que pasan a la fase acuosa, mientras que en la fase

1 orgánica permanecen las sustancias neutras como ceras, aldehídos y alcoholes ditefpénicos. La fase acuosa se trató posteriormente con HCI 1.0 N y se llevó a pH 3 para hidrolizar las sales y liberar los ácidos. Se agitó inmediatamente con hexano-éter

1 3:1 para recuperar los ácidos libres.

1 Finalmente la fracción ácida se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para su posterior análisis (esquema 1).

35 PREPARACION DE LA NITROSO METIL UREA (Esquema 2)

La nitroso metil urea se prepara por la nitrosación de la metilurea, se han descrito varios métodos, pero se utilizó el método de la acetilmetilurea para ello se tomó 59 g de acetamida que se disolvió en 28 mi de Br2 y luego se agregó gota a gota 40 g de NaOH disueltos en 160 mi de HzO. Esta mezcla se calentó hasta ebullición y se hirvió por tres minutos. El producto resultante se dejó en reposo 1 hora en baño de hielo para obtener su cristalización, se filtró y el filtrado se lavó con agua helada. Luego se mezcla 40 g de acetilmetilurea con 50 mi de HCI y se calentó en baño de vapor hasta disolución total del sólido. La solución resultante se diluyé con 50 mi de agua helada y se le añadió una solución fría de 42 g de NaNOz en 50 mi de agua. La mezcla se colocó en baño de hielo durante 5 a 10 minutos, el sólido formado se filtró al vacío y se lavó con poca agua helada. El producto resultante se secó al aire y se pesó.

, , , METILACION DE LOS ACIDOS KAURENICOS (Esquema 3).

Una vez obtenida la nitrosometilurea se montó un equipo para obtener diazometano, se colocó en un balón de 250 mi, 5g de nitrosometilurea cubriendólos con 150 mi de éter. Se enfrió el balón con agua helada y se añadió una solución fria de 15 g de KOH en 15 mi de HzO. El balón es ajustado a un condensador que condensa el éter que arrastra el diazometano el cual es atrapado en un balón sumergido en baño de hielo. Para dar comienzo a la reacción se calentó la mezcla con agua tibia. El proceso empieza liberando nitrógeno, y finaliza cuando el éter se torna incoloro y llega a la tercera parte del volumen inicialmente utilizado. Para frenar la reacción se enfría el balón con agua helada. Para llevar a cabo la metilación, el ácido disuelto en éter etílico o cloroformo se mezcla con un volumen suficiente de solución de diazometano en éter.

36 Se deja reaccionar a temperatura ambiente y cuando ha desaparecido el color rosado se lleva la solución a sequedad y se pesa el éster metílico obtenido.

, , OBTENCION DEL ACIDO 15-0-VALEROXI-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO.

Para la obtención del ácido 15-0-valeroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico se hizo reaccionar 200 mg del ácido 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico con 2 mi de anhídrido valérico equivalente a 1,88 g y 2ml de piridina por espacio de 2 días a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se añadió agua helada para hidrolizar el exceso de anhídrido. Esta mezcla se retomó con cloroformo y se lavó con agua varias veces, la fase clorofórmica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó varias veces con tolueno para eliminar la piridina. El producto resultante se dejó por varios días para que cristalizara, no dando resultado , obteniéndose un líquido aceitoso. Este producto se metiló, haciendolo reaccionar con una solución de diazometano disuelto en éter dietílico y se analizó por GC/MS, obteniéndose un espectro de masas de un producto que eluye a 10.11 min y muestra un ion molecular a m/z=416.

, , OBTENCION DEL ACIDO 15-0-ISOVALEROXI-(-)-KAUR-16- EN-19-0ICO (I).

Este ácido se obtuvo en forma similar al anterior, donde se hizó reaccionar 200 mg del ácido 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico con 2 mi de anhídrido isovalérico equivalente a 1,86 g y 2ml de piridina por espacio de 2 días, luego se añadió agua helada para hidrolizar el exceso de anhídrido. Esta mezcla se retomó con cloroformo y se lavó con agua varias veces, la fase clorofórmica se secó sobre sulfato de sodio y

37 se llevó hasta sequedad tratándola con tolueno varias veces para eliminar la piridina. El producto resultante igualmente fué un líquido aceitoso, que se metiló y se analizó mediante GC/MS, dando igualmente un pico que muestra el ion molecular a m/z=416 (Figura 18).

, , , OBTENCION DEL ACIDO 15-0-BUTIROXI-(-)-KAUR-16-EN- 19-0ICO.

Para la obtención de este ácido, igualmente se hizo reaccionar 200 mg del ácido 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico con 2 mi de anhidrido butírico equivalente a 1,93 g y 2ml de piridina por espacio de 2 días, luego se añadió agua helada para hidrolizar el exceso de anhidrido. Esta mezcla se retomó con cloroformo y se lavó con agua varias veces, la fase cloroformica se secó sobre sulfato de sodio y se llevó hasta sequedad tratándola con tolueno varias veces para eliminar la piridina. El producto resultante igualmente fué un líquido aceitoso, que se metilo y se analizó por GC/MS, dando un pico que muestra un ion molecular a m/z=402.

, , , OBTENCION DEL ACIDO 15-0-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR-16- EN-19-0ICO (G).

Este ácido se obtuvo en forma similar a los ácidos anteriores, haciendo reaccionar 200 mg del ácido 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico con 2 mi de anhidrido isobutírico equivalente a 1,91 g y 2ml de piridina por espacio de 2 días, luego se añadió agua helada para hidrolizar el exceso de anhidrido. Esta mezcla se retomó con cloroformo y se lavó con agua varias veces, la fase clorofórmica se secó sobre sulfato de sodio y se llevó hasta sequedad tratándola con tolueno varias veces para eliminar la piridina. Este producto igualmente se presentó como un líquido aceitoso,

38 que se analizó también por GC/MS, observándose un pico que muestra un ion molecular a m/z=402 (Figura 16).

, , OBTENCION t>EL ACit>O 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-

19-0ICO.

Para la obtención de este ácido se tomaron 100 mg del ácido 15-a.-OH-(-)-kaur- 16-en-19-oico y se disolvieron en acetona, luego se colocó en baño de hielo a 5 oc con agitación añadiénd~le gota a gota el reactivo de Kiliani. La solución toma al principio una coloración verde y por último una ligera coloración rosada que señala el final de la reacción. Para eliminar el exceso de oxidante se le adicionó metano!. El producto resultante (1,49 g) se colocó en una columna y se bajó con una mezcla de hexano­ acetato de etilo al 5% en fr•acciones de lit, estas se analizarán por TLC, obteniéndose como resultado el producto oxidado el cual presentó un punto de fusión de 70° debido a la presencia de impurezas. Este ácido se metiló para ser analizado por GC/MS, obteniéndose un espectro de masas que presenta un ion molecular a m/z=344 (Figura 19). Sin embargo, el peso molecular de este ácido es 330, pero este caso se detallará más adelante en la discusión.

, , ANALISIS CROMATOGRAFICO DE GASES/MASAS

Para la separación e identificación de los ácidos kaurénicos fue necesario metilar una alícuota de las fracciones ácidas obtenidas de cada una de las especies estudiadas. Cada muestra se analizó por comatografía de gases acoplada a un detector de masas, utilizando un sistema HP-5973 (Hewlett Packard). Se empleó una columna capilar 5% fenil, 95io metilpolisiloxano de 30 m de longitud y 0,2 mm de diámetro interno, con un espesor de película de 0,25 Jlln. Como gas portador se utilizó helio a

39 una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Para la identificación de los componentes se contó con la base de datos Wiley (6ta Edición). Se inyectó 1.0 J.LI de solución que contenía alrededor de 10 mg de muestra. Se usó un reparto de 100:1, es decir que del microlitro inyectado solamente 0,01 J.LI penetró en la columna. Se utilizó una temperatura inicial de 250 °C que se mantuvo durante 5 min, luego se aplicó un calentamiento a razón de 5 o/m in hasta una temperatura final de 300 oc que se mantuvo durante 5 min. En total el programa tenia una duración de 20 min que era suficiente para analizar todas las muestras ya que el derivado más pesado eluía en un tiempo máximo de 12 min. La temperatura de la interfase cromatografo­ espectrómetro se mantuvo en 280 °C; la temperatura de la cámara de ionización a 230 °C y el cuadrupolo a 150 °C. El análisis se realizó a 70 eV, a una velocidad de 2.2 espectros/segundo sobre un rango de masas de 10 a 550 amu.

ANÁLISIS DE RMN 13C DE LOS DERIVADOS KAURÉNICOS.

Los espectros de RMN se realizaron en un espectrometro Bruker Avance 400 MHz de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Los Andes. Las muestras se prepararon disolviendo 10 a 30 mg de producto en 0.5 mL de solventes deuterados (CDCL3, C5D5N)

, ANALISIS DE ESPECTROS EN DOS DIMENSIONES.

La adquisición de espectros en dos dimensiones se realizó para obtener correlaciones de tipo 1H-1H (COSY) y otros espectros bidimensionales como HMQC Y HMBC como en el caso del ácido 15-ceto-kaur-16-en-19-oico.

40 41 En la tabla 3 se presentan los datos de la recolección de los frailejones estudiados, especificando el lugar y fecha de recolección. Es importante acotar que es preciso recolectar los frailejones cuando están en flor porque de otra manera se dificulta la identificación botánica. El análisis de los cromatogramas de cada uno de los frailejones estudiados representados en las figuras (4-10) el estudio comparativo de los datos contenidos en las tablas 4 y 5 permitió establecer que la composición química entre las especies estudiadas varía muy poco. En algunos casos como en la Coespeletia thyrsiformes y Ruilopezia floccosa se lograron identificar el lOO% de los compuestos, pertenecientes todos a derivados kaurénicos. En otros frailejones este porcentaje varió como en el caso de la C. spicata con un (84.7%) debido a la presencia de ceras y otros compuestos. Además, en esta especie se encuentra presente el kaurenol (D) alcohol diterpénico que suele pasar a la fracción neutra porque es muy abundante, esto tal vez se deba a que no hubo una buena separación de estas dos fracciones al realizar la extracción. El ácido kaurénico es el componente más abundante en todas las especies estudiadas. Es interesante destacar que la R. floccosa es una buena candidata para obtener ácido kaurenico ya que se encuentra en un 50.9%, además de ser una de las especies que contiene poco ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico (A), lo que es una ventaja, ya que separar el ácido kaurénico de este ácido es muy difícil, debido a que tienen el mismo comportamiento sobre columna de silica gel. Se logró establecer diferencias en cuanto a porcentajes en una misma especie, como es el caso de C. moritziana, que en su primera recolección en el páramo de Piñango demostró un contenido de ácido 15-0-senecioxi-(-)-kaur-16-en 19-oico (H) del 28,7 'Yo y en una segunda recolección en el páramo La Culata un 7,1%. Por otra parte el ácido 15-0-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (I) que estaba presente en la C. moritziana recolectada la primera vez mostró un 0,9% y en la segunda recolección un contenido del 30,1%. Probablemente se trata de dos razas químicas diferentes, en

42 donde puede influir la zona de recolección, realizada una en el páramo de Piñango y otra en el páramo de la Culata. También es posible que la diferencia observada se deba a la diferente época del año en que fueron colectadas, la de Piñango en septiembre y la de la Culata en diciembre. Para elucidar este punto se sugiere recolectar la especie de Piñango en diciembre y la de la Culata en septiembre. Existen en la literatura algunos trabajos que discuten el espectro de masas de diterpenoides tipo kaureno y kaurano. Garcia Jiménez y Reed 59 han estudiado el espectro de masas del kaureno y del kaurano, aunque no del ácido kaurénico, utilizando marcaje con C-13. No llegaron a conclusiones que permitieran establecer un patrón de fragmentación. No se han encontrado trabajos que discutan específicamente el espectro de masas del ácido kaurénico. En la (Figura 13) se observa el espectro de masas del éster metílico del ácido kaurénico (C) y en la figura 22 se presenta un probable patrón de fragmentación para explicar la formación de los fragmentos más importantes en el espectro de masas. El ion molecular (M+ m/z 316) es relativamente abundante (~60%). Se observa el ion m/z 301 que se atribuye a pérdida del metilo C-18. El fragmento más abundante es m/z =257 que se origina probablemente por pérdida del grupo COOCH3 (M+-59). Se propone que el ion m/z 301 da origen por pérdida del grupo COOCHJ y de un protón, al fragmento m/z 241 es el segundo en abundancia (80-85 %). El esquema de fragmentación del espectro de masas del éster metílico del ácido (-)-kaur-15-en-19-oico (B) (Figuras 12 y 21) sigue el mismo patrón de fragmentación del éster metílico del ácido kaurénico con la diferencia de que se observa que el fragmento m/z=273 es uno de los más abundante. Este fragmento se forma a partir del ion m/z=301 por pérdida de 28 unidades de masa M+-C2H4. Kalinovsky y asociados han estudiado en detalle el espectro de masas del ácido 16-hidroxi-(-)-kauran-19-oico 60 y de algunos kaurenolidos 61 pero estos compuestos no tienen importancia en el caso del frailejón. De mayor utilidad para el presente estudio de los ésteres metílicos de los ácidos de las especies Coespeletia y Ruilopezia

43 son los fragmentos que se derivan del espectro de masas propuestos para el éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico 62 (E) (Figura 14). Los esquemas representados en las (Figuras 23, 24 y 25) describen de una manera racional la posible fragmentación del éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur- 16-en-19-oico. En la (Figura 23) partiendo de ion molecular m/z=332 se observa la pérdida de 58 unidades de masa por saturación del doble enlace con transferencia de protones que propicia la formación del grupo cetona y el rompimiento del enlace entre el C-8 y C-15 y luego la del enlace C-13 y C-16 dando origen al ion m/z=274. También se observa que a partir del ion molecular m/z=332 hay pérdida de una molécula de

H20 que da origen al ion M+-H20 (m/z=314) que producirá el fragmento m/z=255 por pérdida del grupo COOCH3. En la figura 24 se propone la posible ruta de formación de los fragmentos m/z = 123 y m/z = 109. En la figura 25 se presenta la formación de los picos m/z = 317 por pérdida de un metilo a partir del ion molecular del éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico y la formación del pico m/z = 257, dos de los picos más importantes. El espectro de masas del éster metílico del ácido 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en- 19-oico (F) (Figura 15) con ion molecular m/z=374, sigue el mismo patrón de fragmentación que el éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico con la diferencia de la pérdida del grupo acetoxi de 42 unidades de masa que da origen al fragmento m/z=332. En la Figura 11 se observa el espectro de masas del éster metílico del ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico y en la Figura 20 se presenta el posible patrón de fragmentación donde se explica la formación de los fragmentos más importantes del espectro de masas. Partiendo del ion molecular M+ m/z=314 se observa la pérdida del grupo COOCH3 (M+ -59) dando origen al fragmento m/z=255 que a su vez por pérdida del ion M+ -CH4 produce el fragmento m/z=239 que es el más abundante. En la Figura 26 se presenta el posible patrón de fragmentación general de los espectros de masas del ésteres metílicos de los ácidos 15- O, derivados kaurénicos

44 que presentan un mismo patrón, partiendo del ion molecular (M+ m/z 332) formado por la pérdida del grupo 15-0 y seguido por la pérdida del ion (M+ -HzO) lo que origina el fragmento m/z 314, a partir de este ion se produce el fragmento m/z 255, uno de los fragmentos más abundantes por pérdida del grupo COOCH3. La tensión del anillo (d) del éster metílico del ácido 15-a.-hidroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico hace que se produzca su ruptura con pérdida de 58 unidades de masa, originando al fragmento m/z=274. De esta manera a partir del ion m/z 274 es posible la formación del fragmento m/z=109. En la Figura 28 se describe la posible formación del pico m/z 83 que es el ion más abundante {pico base) en el espectro de masas del éster metílico del ácido 15-a.­ senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (Figura 17) originado por pérdida del grupo senecioxi, debido a una ruptura a. en la cadena lateral, lo que da origen al ion m/z = 332, en caso de que este fragmento conserve la carga positiva. En la Figura 29 se muestra la formación del fragmento m/z 85 que es el más importante en el espectro de masas del éster metílico del ácido 15-a.-isovaleroxi-(-)­ kaur-16-en 19-oico (Figura 18). Dicho fragmento se forma por ruptura a. del enlace que une al carbonilo del ácido isovaleroxi al kureno. Tanto el espectro de masas como el esquema de fragmentación del éster metílico del ácido 15-a.-isovaleroxi como el del 15-a.-valeroxi son iguales ya que no se observan diferencias cuantitativas ni cualitativas. De manera similar en la Figura 27 se muestra la formación del fragmento m/z 71 que es el más importante del espectro de masas del éster metílico del ácido 15-a.­ isobutiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (Figura 16). Este fragmento se forma por ruptura a. del enlace que une al carbonilo del ácido isobutiroxi al kaureno. De igual manera no se observan diferencias entre el espectro de masas del éster metílico del ácido 15-a.­ isobutiroxi y el15-a.-butiroxi por lo tanto el esquema de fragmentación es el mismo. En el caso del ácido 15-ceto-(-)-kaur-16-en-19-oico (CzoHze03), el éster metílico de esta sustancia debería dar un ion molecular a m/z 330 (Cz1H3o03) pero se observa un ion molecular a m/z 344 (Figura 19). Se hizo un estudio completo de resonancia

45 magnética nuclear uni y bidimencional (Figuras 36-40) para determinar la estructura de esta sustancia obtenida mediante oxidación con reactivo de Kiliani del ácido 15-a.­ OH-(-)-kaur-16-19-oico y se llegó a la conclusión de que la estructura es la que se representa en la Figura 19. Se encontró en la bibliografía estudios realizados sobre el desplazamiento de un ion hidruro entre los carbonos C-15 y C-16 63·64. Esto permite visualizar la posibilidad de que algo parecido ocurra en el ácido 15-ceto-(-)-kaur-16- en-19-oico, por consiguiente se considera que se produce una reacción en la cámara de ionización que da como resultado la adición de un grupo CH2 sobre el anillo (d) que posee la cetona, conduciendo al aumento de 14 unidades de masa (330+14=344). Es interesante acotar que en el espectro de la mezcla de ácidos metilados de varios frailejones se observó la presencia de un compuesto con peso molecular m/z 344, que no se menciona en las tablas por ser minoritario. En la tabla 7 se presentan los desplazamientos químicos de C-13 de los ácidos (-)-kaur-9(11)-16-en-19-oico (1 ), ácido kaurénico (2), éster metílico del ácido 15-a.­ OH-kaur-16-en-19-oico (3), ácido 15-a.-acetoxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (4), ácido 15-a.­ butiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (5), ácido 15-a.-isobutiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (6), ácido 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico (7) y el ácido 15-ceto-(-)-kaur-16-en-19- oico (8), representados en las Figuras 30-36. Las diferencias observadas entre el espectro C-13 del ácido (-)-kaur-9(11)-16- en-19-oico y el ácido kaurénico se deben principalmente a diferencias en la configuración causadas por la introducción del doble del ácido (-)-kaur-9(11)16-en-19- oico. En el caso de los kaurenos que están hidroxilados en C-15 la presencia del sustituyente produce un importante desplazamiento de la señal del carbono C-9 cuando el sustituyente es "beta" ya que hay una interacción 1,3 diaxial con el protón 9- pH 61. El éster metílico del ácido 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico aislado de varias especies de frailejón, muestra el carbono C-9 a 53.2 ppm (en CHCI3) en tanto que se ha reportado un valor de 54.0 ppm (en C5H5N) para el derivado 15-a.-OH y 46.0 ppm

46 65 para el derivado 15-p-OH • Existe también interacción del sustituyente sobre C-7 pero en este caso se observa que el sustituyente 15-a produce desplazamiento de la señal C-7 hacia campo más alto (35,2) ya que los dos protones de este grupo metilénico están sometidos a compresión estérica.

47 TABLA 7 RMN 13C DE LOS DERIVADOS KAURÉNICOS.

1 2 3 4 5 6 7 8 C-1 41.0 40.7 40.7 40.5 40.5 40.5 40.6 39.8 C-2 20.3 19.0 19.0 18.9 18.9 19.0 19.1 18.8 C-3 38.2 37.7 36.1 37.1 37.2 34.7 37.7 37.6 C-4 44.7 43.7 43.7 43.6 43.6 43.7 43.7 43.7 C-5 46.6 57.0 56.9 56.5 56.5 56.5 56.7 51.6 C-6 18.4 21.8 21.0 20.7 20.7 20.8 20.8 20.0 C-7 29.9 41.2 35.2 37.6 37.6 37.6 37.3 33.6 C-8 42.3 44.2 47.6 47.4 47.3 47.4 47.1 52.5 C-9 155.9 53.9 53.2 52.8 52.8 52.9 53.1 56.0 C-10 39.0 39.6 39.5 39.8 39.7 39.8 39.9 40.3 C-11 115.1 18.4 18.2 18.3 18.6 18.4 18.4 18.4 C-12 37.9 33.1 32.5 32.6 32.5 32.6 32.6 32.7 C-13 41.2 43.8 42.3 42.4 42.4 42.5 42.7 38.1 C-14 45.0 39.7 36.1 34.6 36.5 37.3 34.9 36.5 C-15 50.3 48.9 82.5 83.0 82.6 82.4 81.9 211.0 C-16 158.5 155.9 160.0 155.3 155.4 155.5 155.7 149.5 C-17 105.9 103.0 108.3 109.9 109.8 109.7 109.6 114.5 C-18 28.3 28.9 28.7 28.8 28.8 28.8 28.8 28.9 C-19 184.7 184.7 178.1 184.2 184.0 204.4 184.2 184.0 C-20 23.6 15.6 15.6 15.3 15.7 15.8 15.8 15.5 OCH3 - - 51.1 -- --- CH3CO -- - 171.1 ---- CH..3CO -- - 21.2 - - -- C-1' -- -- 173.6 177.1 166.5 - C-2' - - -- 34.7 34.3 156.1 - C-3' - - -- 18.6 19.0 116.5 - C-4' -- -- 13.7 19.1 27.2 - C-5' ------20.2 -

1: Ácido (-)-kaur-9(11)-16-en-19-oico, 2: Ácido (-)-kaur-16-en-19-oico, 3: Éster metílico del ácido 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico, 4: Ácido 15-a-acetoxi-16-en-19-oico, 5: Ácido 15-a-butiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico, 6: Ácido 15-a-isobutiroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico, 7: Ácido 15-a-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico, 8: Ácido 15-ceto-(-)-kaur-16-en-19-oico.

48 49 1.- El ácido (-)-kaur-16-en-19-oico es el ácido diterpénico mayoritario en todas las especies estudiadas: C. moritziana, C. spicata, C. thyrsiformis, R. atropurpurea, R. floccosa, R. lindenii y R. marcesens. 2.- El ácido (-)-kaur-9(11)-16-dien-19-oico es el segundo más abundante en la C. thyrsiformis(16.4%) y en la R. lindenii(28.6%). 3.- El ácido 15-a.-senecioxi-(-)-kaur-16-en-19-oico es el segundo en abundancia en la C. morítzíana de Pi ñango (28. 7o¡o) y en la R. marcesens (15. 9% ). 4.- El ácido 15-a.-isovaleroxi-(-)-kaur-16-en-19-oico es el segundo más abundante en la C. morítziana de la Culata (30.1%), C. spícata (20.2o¡o), R. atropurpurea (18.2%) y R. floccosa (25.2%). 5.- El ácido 15-a.-OH-(-)-kaur-16-en-19-oico es relativamente abundante (5.4-14.1%) en todas las especien estudiadas excepto en la C. moritziana de Piñango (0.9%). 6.- Estudios de RMN indican que en los ácidos hidroxilados en C-15 la orientación de la cadena es alfa. 7.- Todas las especies estudiadas y muy en especial la R. floccosa (50.9%) pueden ser una fuente importante de ácido kaurénico. 8.- En la resina de los frailejones estudiados se detectó algunos ácidos minoritarios cuya estructura no se ha podido establecer.

50 ' \ .

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58 59 FIGURA 4 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Coespeletío morítzíono TIC: 1.7e+07 .e 13

2 ·1.~? 1.- (-)-kaur-9(11)-16-dlen-19-olco

2.- (-)-kaur-16-en-19-olco 1.5e+07 3.- 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-olco

1.<4e+07 4.- 15-a-lsovaleroxl-(-)-kaur-16-en-19-olco ' 5.- 15-a-senecloxl-(-)-kaur-16-en-19-olco 1.3e+07

1.2e+07

1.1e+07

1e+07

9000000 4

10.13 6000000

7000000

6000000

5000000

4000000 1 3 3.47 ' 3000000 6.30 5 11.37 2000000

1000000 .. 3~1 .. ~{6f'i61 )...... ·- ·- -- 19.00 tnme-> .C.I 5.00 6.b< 7.00 8.00 9.00 10.00 .. 1.~.00 12.00 13.00 14.00__ _15.0Q_j!?~~ 17.Q<.l _ _1~ •.~-. 60 FIGURA 5 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Coespeletia spicata tn;: .e 12 2.3e-+07 2 2.2e-+07 1.- (-)-kour-9(11)-16-dien-19-oico

2.1e-+()7 2.- (-)-kour-16-en-19-oico

2e+07 3.- 1!5-a-OH-(-)-kour-16-en-19-olco

1.Ge-+07 4.- 15-.a-iSOYGicroxi-(-)-kour-16-en-19-olco

1Jie-t07

1.7e-+()7

1.&tt07

1.58-+()7

1Ae-+07

1.3e-*07

1.2e-t07

1.1e-+()7

1e+07 4 1 10.10 QOOOOO() 3.-46

8000000

7000000

6000000

5000000 ..aooooo 3 6.28 3000000

2000000

1000000 4.98 174 ,, f5t~ ~73 7t1 11.34 .. l. A ·-- - - trine->" .c.bó 15.00 6.tl( 7.00 e.oo 9.bó 10.00 11!00 12;00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00

61 FIGURA 6 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Coespeletio thyrsiformis

1350000 .e 11

1300000 2 1.- (-)-kour-9(11)-16-dlen-19-olco

1250000 2.- (-)-kaur-16-en-19-olco

1200000 3.- 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-olco

1150000 4.- 15-a-lsovaleroxl-(-)-kaur-16-en-19-olco

1100000 5.- 15-a·senecloxl-(-)-kaur-16-en-19-olco ,

1050000

1000000

950000

900000

850000

800000

750000

700000 1 650000 3.47 600000

550000

500000

450000

400000 3 6.30 350000 5 4 1 11.37 300000 10.05 250000

200000

10.00 11.00 12.00 13;00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 62 FIGURA 7 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Ruílopezío otropurpureo

111..~ 410

4200000 2 ! 1.- (-)-kour-9(11)-16-di~n-19-olco 4000000 2.- (- )-kour-16-~n-19-olco

3600000 3.- 1!5-a-OH-(-)-kaur-16-~n-19-olco

3600000 4.- 1!5-a-Jsovol~roxl-(- )-kaur-16-en-19-oico . < . 5.- 1!5-a-s~n~cloxl-(- )-kaur-16-~n-19-olco 3400000 1

1 3200000

3000000

2800000

2600000

2.(00000

2200000

2000000 1 1800000 3.46 1600000

1400000 4 1200000 . 10.08

1000000

800000 3 600000 6.28 6.59 5 400000 .74 11.35

1\. A 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00------1.(.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 63 FIGURA 8 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Ruílopezío floccoso

11~: ~ .... ~:r .e 14 1.- (-)-kaur-9(11)-16-dlen-19-olco 2.6e+07 2· 2.5e+07 2.- (-)-kaur-16-cn-19-olco

2.4e+07 3.- 1!~-a-OH-(- )-kaur-16-cn-19-olco

2.3e+07 4.- 15-a-lsovaleroxl-(-)-kaur-16-cn-19-olco

2.2e+07

2.1e+07

2e+07

1.9e+07

1.8e+07

1.7e+07

1.6e+07

1.5e+07 4 1.4e+07 10.12 1.3e+07

1.2e+07 1 1.1e+07 3.46 ' 1e+07

9000000

6000000

7000000 3 6000000 6.29 .

5000000

4000000

3000000 7.43 2000000 6Jl 8.74 1000000 :~ r 3~{(.1 ·.. -12Á32 . 1i31 ~- ~ ~¡eyo5.7 tf9 J ~36 OÁ37 . ---· ·- -- ·~nme-> 4.00 5.00 6.X 7.b 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14~00 15.00 16.00 17:00 18.00 19.00 64 FIGURA 9 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Ruilopezia lindenii

lll;: ..= "'~.u 4 16 1.6e-t07 1 1.- (-)-kour-9(11)-16-dien-19-olco 1.55e+07 3.49 2 1.5e+07 2.- (-)-kour-16-en-19-olco U5e+07 3.- 1!5-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-olco Ue+07 4.- 1!5-a-senecloxl-(-)-kaur-16-en-19-olco 1.35e+07 1.3e+07 1.25e+07 1.28+07 1.15e+07 1.1e+07 1.05e+07 1e+07 9500000 9000000 8500000 8000000 7500000 7000000 6500000 6000000 5500000 5000000 3 4500000 6.32 4000000 3500000 3000000 . 2500000 4 2000000 11.39 1500000 1000000 500000 js.81 7Á62 -" 10,:61 ,.._ -" . ~· j,.. ~tr .A .. .A lnme-> 4.>Ó 5.00 6.0C 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 65 FIGURA 10 , CROMATOGRAMA, DE IONES, TOTALES (TIC), DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ACIDOS KAURENICOS DE LA Ruilopezia marcesens m;: ""01 9500000 z 1.- (-)-kaur-9(11)-16-dlen-19-olco 9000000 2.- (-)-kaur-16-en-19-olco

8500000 3.- 15-a-OH-(-)-kaur-16-en-19-olco

4.- 15-a-senecloxi-(-)-kaur-16-en-19-oico 8000000

7500000

7000000

6500000

6000000

5500000

5000000

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3500000 1 1 4' 3000000 3.38 11.15

2500000 .C.99

2000000 3 1500000 6.73 1000000 11.00

500000 .. ij89 • _...... - J.. liAf ~~~ A-.-- - " ~ .c.bó 5.00 6.00 7.00 8.bó 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00

66 FIGURA 11 . , , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METIUCO DEL ACIDO (-)-KAUR-9(11)-16-DIEN-19-0ICO (A)

1.COOOOO

1300000 299 1200000 1100000 1000000

llOOOOO eooooo 700000 600000 '

~ 255 31-4 ..aoooo 300000 e1 1-41 183 200000 117 211 1COOOO

0\ ...... ,¡ FIGURA 12 ESPECTRO DE MASAS Da ÉSl ER METÍLico Da ÁCIDO (-)-KAUR-le-EN-19-0ICO (B)

750000 700000 316 650000 600000 550000 251 5000001 1 106 ~ 187 .(50000 241 400000 207 3500001 11 ~ 119 300000 273 301 250000 159 2000001 79 131 147 150000 223 1000001 55 67 41

0\ 00 FIGURA 13 , , , - ESPECTRO DE MASAS DEL ES f ER METIUCO DEL ACIDO (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (C)

1300000

1200000 241 1100000 ..•• COOCH:! 1000000 213 SIOOOOO eooooo 318

700000

eooooo 01 121 301 ·~ 1 213 .cooooo ' r~ 300000 187 1 11 11 ~1111 t. 1~ ;" 1 198 200000 t 55 41• 1 100000 o ·-> 1 ...... :,.._ 0'1 \0 ·FIGURA, 14 , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METIUCO DEL ACIOO 15-a-OH-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (E)

eooooo

700000 ·······oH ··.,COOCH:, 600000 121 29G

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18Sa . 314 332

1~ 173 Q 200000 214 !4"1 1 .;..... 100000

.....¡ o .FIGURA, 15 , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METIUCO DEL ACIDO 15-a-ACETOXI-(-)-KAUR-16~EN-19-0ICO (F)

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--...J FIGURA, 16 , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METIUCO DEL ACIDO 15-a-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (G)

·-

255

350000 :

300000 ····o, % A e-o( 71 o~ % , 250000

200000 332 Q 121 1~ D1 . 211 100000 1<47

~ 185 50000 .c02

360 .c2SI.CS1 477 ~ 555 898

...... ¡ N FISURA 17 . , , . , ESPECTRO DE MASAS Da ES 1ER METILICO DEL ACIDO 15-a-SENECIOXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (H)

3000000

2400000 /CHa ····o 9-c, 'c-e CHa # 1 O H 1800000 1600000 1.COOOOO 1200000 ~ 1 255 800000

eooooo 332 121 .COOOOOI 55 .., 211 . 1-47 .c51 m S03 m 553 eoo trz1 m

...... _¡ r...,¡ FIGURA 18 . , , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METILICO DEL ACIDO 15-a-ISOVALEROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (I)

,~

32000 30000

2:55 ... /CH:s ·=¡ 1 1. ~ ''0....._ /CH, 2-COOO -1'C-CH;z CH;, o . =) 1 85 18000 16000

828

...... ,¡ ~ FIGURA 19 . , , , ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METIUCO DEL ACIDO 15-CETO- (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

550000

500000

-450000

400000 ...•• , COOC1-i:, 350000 285

300000 123 .1 250000 91 1 200000 163•

150000 251 147 41 . 67 1, 1 ~1 j 1 100000 82

.....,¡ VI FIGURA 20 ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL , , , ESTER METIUCO DEL ACIDO KAUR-(-)-9(11)-16-DIEN- 19-0ICO (FIGURA 11)

+ + +

m/z= 314 miz= 314 m/z= 314

!-coocH3

+ +

m/z=239 m/z=255

76 FIGURA 21 ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER , , , METIUCO DEL ACIDO ISOKAURENICO (FIGURA 12)

+ +

m/z=241 m/z=257

f-COOCH, a f-coocH,

12 + + c .... H 'H -CH3 - b

mlz=316

m/z=301

m/z=273

77 FIGURA 22 ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER , , , MEnUCO DEL ACIDO KAURENICO (FIGURA 13)

+ + +

-%... ____.a

rrlz = 316 rrlz =301

b ¡-CXXXl-b-H

+ + +

rrlz = 241 rrlz = 257 rrlz =273

78 FIGURA 23

ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ÉSTER METÍUCO DEL , ACIDO 15-a-HIDROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (FIGURA 14)

+ +

miz= 332

+ +

miz = 314 1 miz= 332 ,- COOCH3

+ +

o

miz = 255

+ +

+

miz= 274 miz = 58

79 FIGURA 24 POSIBLE FORMACIÓN DE LOS FRAGMENTOS m/z 123 Y m/z 109 A PARTIR DEL , , FRAGMENTO m/z 274 EN EL ESPECTRO DE MASAS DEL ESTER METILICO DEL ÁCIDO 15-a-HIDROXI-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO (FIGURA 14).

+ +

a a miz= 274 miz= 274

1-CoocH,

+ +

! l + +

H

+

e b miz miz= 123 miz = 109 = 106

80 FIGURA 25 FORMAaÓN DE LOS FRAGMENTOS m/z 317 Y m/z 257 EN EL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER METÍLICO DEL ÁaDO 15-a-HIDROXI-(-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO (FIGURA 14).

+.

miz= 332

+

H

cooc~ miz= 317

+.

m/z = 257

81 FIGURA 26 , , ESQUEMA GENERAL DE LOS ESTERES METILICOS DE LOS ÁCIDOS 15-HIDROXI KAURÉNICOS Y SUS DERIVADOS.

(E,F,H,I,J)

+ +

miz= 332 m/z = 332 m/z = 314

\ !-COOCH, + +

mlz=274 miz= 255

!-COOCH, +

miz= 109

82 FIGURA 27 ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER , , METIUCO DEL ACIDO 15-a-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR-16-EN-

19-0ICO (FIGURA 16)

12 +.

miz= 402 1 \ +. +.

miz= 71

miz= 332

83 FIGURA 28 ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER , , METIUCO DEL ACIDO 15-a.-SENECIOXI-(-)-KAUR-16-EN-

19-0ICO (FIGURA 17)

12 +

miz= 414 1 \ + +

miz= 83

miz= 332

84 FIGURA 29

ESQUEMA DE FRAGMENTACIÓN DEL ESPECTRO DE MASAS DEL ÉSTER , , METIUCO DEL ACIDO 15-a-ISOVALEROXI-(-)-KAUR-16-EN-

19-0ICO (FIGURA 18)

12 +.

miz= 416 1 \ + +

miz= 85

miz= 332

85 FIGURA 30- RMN 13 C DEL ÁCIDO (-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

;:: 1 •• 1 ~~l~laii"IW~R~~~~alla•-• ~~ !Í ! 1i !!! ! ~~~Q8i·~·~~d-·RRR·Q~sss~ 1 1 1 1 \ 1 1 u L\ 11 ~l~/ '\ \\Jk/

... •• ... .. 101 • • .. ..

FIGURA 31 - RMN 13 C DEL ÁCIDO (-)-KAUR-9(11)-16-DIEN-19-0ICO

'

.. ''co OH

l -h 1 SS 50 45 40 35 lO 25 20 ppol

-

UO 170 UO 150 140. llO 120 110 lOO 'O 10 70 CO SO 40 30 20 PP1

86 FIGURA 32- RMN 13 C DEL ÉSTER ME1ÍLICO DEL ÁCIDO 15-a-OH-(-)­ KAUR-16-EN-19-0ICO

87 FIGURA 33 - RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-a- ACETOXI-{-)­ KAUR-16-EN-19-0ICO

~~~8~~~~~~~~~~~~8~;~~!~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ l....._~ l L l L l l l ~l...... _l...,_l,.\ "-' '11 -.....;:; =f=i~~ ""'¡)

ppo 160 loiO 120 100 80 60 20

88 FIGURA 34 - RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-BUTIROXI-KAUR-16-EN-19-0ICO

~ 1

89 FIGURA 35- RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-a-ISOBUTIROXI-(-)-KAUR- 16-EN-19-0ICO

~ 1

90 FIGURA 36- RMN 13 C DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

~.. i

J. J. '" PPI 160 140 120 100 80 150 ~o 20

91 FIGURA 37- RMN 1 H DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

/

ppt

92 FIGURA 38- RMN COSY DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

~ ~~~Q ~ O'-',..,.. o• 1~. ~e ·--- . (i~---0.-.r ~~~~ ~rp; .,.o ~ ----- ·----· ---·- ll)ii·~ ~---'- ,... ~ ot!>¿) ~ .. M. .'(J oov ( p·; O -e ~ mo D o o D u l~ ...,.~ ol!>p 00 o ( • ji o o V o •9,f o o o

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93 FIGURA 39- RMN HMQC DEL ÁCIDO 15-CETO-(-)-KAUR-16-EN-19-0ICO

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94 FIGURA 40- RMN HMBC DEL ÁCIDO 15-CETO-(-}-KAUR-16-EN-19-0ICO

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