SIMILARIDADE CARIOTÍPICA ENTRE Barycholos Ternetzi E CINCO ESPÉCIES DO GÊNERO Eleutherodactylus DO SUDESTE DO BRASIL (ANURA, LEPTODACTYLIDAE, ELEUTHERODACTYLINAE)
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” i INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas Biologia Celular e Molecular SIMILARIDADE CARIOTÍPICA ENTRE Barycholos ternetzi E CINCO ESPÉCIES DO GÊNERO Eleutherodactylus DO SUDESTE DO BRASIL (ANURA, LEPTODACTYLIDAE, ELEUTHERODACTYLINAE) João Reinaldo da Cruz de Campos Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular) Fevereiro 2006 ii SIMILARIDADE CARIOTÍPICA ENTRE Barycholos ternetzi E CINCO ESPÉCIES DO GÊNERO Eleutherodactylus DO SUDESTE DO BRASIL (ANURA, LEPTODACTYLIDAE, ELEUTHERODACTYLINAE) João Reinaldo da Cruz de Campos Orientadora: Sanae Kasahara Co-orientador: Fernando Ananias Dissertação de Mestrado apresentada ao In stituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita F ilho”, Campus de Rio Claro, para a obtenção do título de Mestre em Ciências B iológicas (Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular) Rio Claro Estado de São Paulo – Brasil 2006 iii 597.8 Campos, João Reinaldo da Cruz de C198s Similaridade cariotípica entre Barycholos ternetzi e cinco espécies do gênero Eleutherodactylus do Sudeste do Brasil (Anura, Leptodactylidae, Eleutherodactylinae) / João Reinaldo da Cruz de Campos. -- Rio Claro, [86p], 2006. f. : il. figs., gráfs., tabs. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista Instituto de Biociências Orientador: Sanae Kasahara Co-orientador: Fernando Ananias 1. Anuro. 2. Cromossomo. 3. Citogenética. 4. Coloração diferencial. 5. Anfíbios. I. título iv Nunca, jamais desanimeis, embora venham ventos contrários Santa Paulina v Dedico este trabalho aos meus pais João (in memorian) e Cida, que mesmo sem entender o que fiz me apoiaram incondicionalmente, sempre vi Agradeço especialmente à Dra. Sanae Kasahara pela excelente orientação, amizade e exemplo de profissionalismo e competência; e ao amigo André Bombeiro pelo convívio e companheirismo durante quase toda a realização deste trabalho vii AGRADECIMENTOS Ao amigo e co-orientador Dr. Fernando Ananias, que sempre me apoiou e acreditou em mim; À Dra. Ana Paula Zampieri Silva, uma das grandes responsáveis pela minha vinda a Rio Claro; Ao Dr. Célio F. B. Haddad pelas coletas e identificação dos anuros, e pelas discussões sobre a sistemática e taxonomia dos grupos em estudo; A todos que fazem ou fizeram parte do nosso grupo de pesquisa, principalmente ao Thiago, Gal, Simone, Eduardo e João; embora alguns tenham optado por rumos diferentes estarão sempre em meus pensamentos; Aos funcionários do Instituto de Biociências de Rio Claro, especialmente Lucila, Neuza, Mônika e Gerson pela amizade e pelas conversas divertidas durante os “lanchinhos”; À Cristiane Miléo, não só pelo apoio nas questões de informática, mas principalmente pela pessoa maravilhosa que é; Aos professores e amigos do Departamento de Biologia, em especial às Dras. Doralice, Carmem, Maria Isabel, Ana Maria e, particularmente à Dra. Patrícia pelo auxílio na técnica de FISH; Aos grandes amigos Rogilene, Dani e Fred, pessoas fantásticas que merecem todo o meu carinho; A todos os amigos e colegas de laboratório, especialmente ao Márcio, Marielle, Janaína, Isabela, Thaís, Márcia, Tatiana, Renata, Juliana, Douglas, Zé Augusto, Rosângela e Sandra, muito obrigado pela simpatia de sempre e pelos inúmeros momentos de descontração; Aos amigos do 4º CBI de 2005, Jaqueline, Xyne, Marcela, Priscila Hayashi, Cíntia (e Oz), Nádia, Gustavo, Luiz, Rubén, Mônica, entre outros, obrigado pela companhia de sempre no RU e pelos divertidos encontros culinários feitos em casa; Aos amigos e professores da Universidade Braz Cubas de Mogi das Cruzes, que sempre me apoiaram e torceram por mim, especialmente ao Kleber, Adriana, Cátia, Juliana, Regina, Edson, Viviane e Ziva Maria; viii Ao Flamarion e Elisete, que muito carinhosamente me acolheram e me fizeram parte de sua família; À chefia do Departamento de Biologia de Rio Claro pela facilidade no uso das instalações do IB; Aos funcionários da Biblioteca, principalmente à Moema, pelo auxílio nos COMUTs; Ao Dr. Vladimir Pavam Margarido e ao Dr. Luis Antonio Carlos Bertollo do laboratório de Genética e Evolução de Peixes da UFSCar, pela facilidade na realização da técnica de FISH; Ao Programa de Capacitação de Pessoal (CAPES) pelo apoio financeiro concedido e pela bolsa de Mestrado; Ao Programa de Caracterização, Conservação e Uso Sustentável da Biodiversidade do Estado de São Paulo (BIOTA-FAPESP), pelo auxílio financeiro ao trabalho; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela ajuda financeira ao grupo de pesquisa; A todos os meus familiares, especialmente aos meus pais, por todo o apoio, incentivo e compreensão durante a minha ausência; E, finalmente, a Deus, por permitir que tantas pessoas maravilhosas façam parte da minha vida. ix Sumário página I. RESUMO.................................................................................................... 1 II. ABSTRACT................................................................................................ 3 III. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 5 IV. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................... 9 1. Considerações sobre os gêneros Barycholos e Eleutherodactylus...... 9 2. Citogenética do gênero Eleutherodactylus........................................... 16 V. OBJETIVOS.............................................................................................. 26 VI. MATERIAL................................................................................................ 28 VII. MÉTODOS E TÉCNICAS........................................................................ 34 1. Obtenção das preparações cromossômicas a partir de medula óssea, fígado, baço e testículo, segundo BALDISSERA Jr et al. (1993), com modificações.......................................................................................... 34 2. Obtenção das preparações cromossômicas a partir de intestino e testículo, segundo SCHMID (1978), com modificações................................ 35 3. Preparação de lâminas........................................................................ 36 4. Coloração convencional com Giemsa................................................. 36 5. Marcação de regiões organizadoras de nucléolo pelo nitrato de prata (Ag-RONs), segundo HOWELL e BLACK (1980), com modificações.................................................................................................. 37 6. Coloração da heterocromatina (banda C), segundo SUMNER (1972), com modificações.............................................................................. 37 7. Coloração por fluorocromos GC e AT específicos, segundo SCHWEIZER (1980) e CHRISTIAN et al. (1998), com modificações................................................................................................. 38 8. Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr, segundo GALETTI Jr e MARTINS (1999), com modificações...................................... 39 9. Análises cromossômicas..................................................................... 40 VIII. RESULTADOS....................................................................................... 42 IX. DISCUSSÃO............................................................................................ 63 X CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................... 73 XI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 76 1 I. RESUMO Estudos citogenéticos comparativos foram realizados em seis espécies de Eleutherodactylinae, da região Sudeste do Brasil: Barycholos ternetzi, Eleutherodactylus binotatus, E. juipoca, Eleutherodactylus sp., E. guentheri e E. parvus. Foram feitas análises, em alguns casos pela primeira vez, com coloração pelo Giemsa, Ag-RON, banda C, coloração por CMA3 e DAPI e hibridação in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr. Todas as espécies apresentaram 2n=22 e grande similaridade nos cariótipos com coloração convencional, apesar da variação dos pares 8, 10 e 11 que são telocêntricos em algumas espécies e submetacêntricos em outras. Barycholos ternetzi e Eleutherodactylus binotatus com NF=38 têm esses três pares telocêntricos e os demais cromossomos, metacêntricos ou submetacêntricos; E. juipoca e Eleutherodactylus sp. com NF=40 mostraram apenas os pares 8 e 11 telocêntricos; e E. guentheri e E. parvus com NF=44 apresentaram os pares 8, 10 e 11 com dois braços cromossômicos, assim como os demais elementos do cariótipo. Diferentemente do observado nas espécies de Eleutherodactylus com Ag-RONs em apenas um par de cromossomos, isto é, no par 1 em E. binotatus, no par 11 em E. juipoca e Eleutherodactylus sp. e no par 6 em E. guentheri e E. parvus, B. ternetzi mostrou sítios Ag-positivos nos cromossomos dos pares 1, 4, 5, 9 e 11, com apenas 1 a 3 marcações por metáfase em cada indivíduo. Contudo, o par principal com Ag-RON na espécie parece ser o 11, como em E. juipoca e Eleutherodactylus sp. O sítio da RON foi 2 comprovado pela técnica de FISH em E. binotatus e em um dos exemplares de B. ternetzi que mostrou marcação de Ag-RON do tipo 9p 11p11p. As espécies mostraram padrão centromérico de banda C, mas bandas intersticiais ou teloméricas