Sociedad Española De Virología

VIROLOGÍA Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología

XI CONGRESO SOCIEDAD ESPAÑOLA DE VIROLOGÍA NACIONAL D VIROLOGÍA GRANADA 201 1

Volumen 14 Número 1/2011 EXTRAORDINARIO

XI CONGRESO NACIONAL D VIROLOGÍA GRANADA 2011 COMITÉ EDITORIAL COMITÉ CIENTÍFICO

Comité Organizador Junta Directiva de la SEV Jose María Navarro Tomas Pumarola Presidente: Presidente: Alfredo Berzal Diego Arroyo Alfredo Berzal Herranz Esteban Domingo Solans Enrique Moriones Raul Ortiz de Lejarazu Secretario: Vicepresidente: Mercedes Pérez Francisco Martín José María Navarro Marí Ricardo Flores Pedauyé Cecilio López Ramón Alemany Vocales: Secretario: Juan Antonio García Antonio Villaverde Jordi Gómez Castilla Antonio Talavera Díaz Purificación Fortes Jordi Gómez Carles Suñé Negre Vicesecretario: Jesús Navas Margarita del Val Mercedes Pérez Ruiz Fernando de Ory Manchón Ramón Soriguer Carles Suñé Javier Rodríguez Granger Tesorero: Juan Carlos Saiz José Antonio Darós Enrique Moriones Josep Quer Sivila Amelia Nieto Juan María Torres Isabel Mª Cuadrado Vocales: Eduardo Bejarano Rafael Fernandez Alfonso Ruiz Bravo Juan Carlos Alonso Navarro José María Casasnovas Xavi Bosch Juan Carlos Saiz Rafael Blasco Lozano José Maria Almendral Santiago Elena Alberto Bosch Navarro Vicente Pallás Susanna C. Manrubia Ana María Doménech Gómez Ana Angulo Jordi Reina Rafael Fernández Muñoz Joseph Quer Julián de la Torre Juan García Costa Luis Enjuanes David Navarro Esperanza Gómez-Lucía y Duato Francisco Sobrino Mª Ángeles Muñoz Fernández Ricardo Flores Amelia Nieto Martín Antonio Mas Pilar Pérez Breña Encarnación Martínez Fernando Rodríguez González Juana Díez Javier Romero Cano Carlos Briones Luis Valenciano Clavel Fernando García Nuria Verdaguer Mauricio García Fernando Rodríguez Juan Emilio Echevarría Albert Bosch Concepción Gimeno Gloria Trallero Mariano Cambra

Virología. Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología Volumen 14 - Número 01/2011 - Extraordinario XI CONGRESO NACIONAL D VIROLOGÍA GRANADA 2011 ÍNDICE ÍNDICE

Comité Editorial Sesión Plenaria (V): Comité Organizador Interacción virus-huesped (II) Junta Directiva SEV Comité Científico Sesión paralela VII: rEPlicación vírica (II) Índice Sesión paralela VIII: Conferencias Evolución viral Conferencia Inaugural Conferencia Extraordinaria Sesión paralela IX: Conferencia de Clausura mECanismos de patogenia y persistencia vírica Sesión Plenaria (I) Sesión paralela X: Patrocinado por FIPSE: rESPuesta inmune y vacunas (II) Estrategias moleculares y celulares en la lucha contra el Sesión paralela XI: hIV Virus en terapia y cáncer Sesión Plenaria (II): Sesión paralela XII: Pequeños RNAs, expresión y silenciamiento génico morfogénesis y estructura del virión Sesión Plenaria (III): Sesión Plenaria (VI): Interacción virus-huésped (I) Sesión conjunta con la Sociedad Española de Sesión paralela I: mICrobiología (SEM): rEPlicación vírica (I) mEtagenómica ambiental y clínica Sesión paralela II: POSTERS Interacción virus-huésped (III) Información SEV Sesión paralela III: Próximo número Revista SEV Epidemiología y control de infecciones víricas máster en Virología Sesión paralela IV: rESPUESTA INMUNE Y VACUNAS (I) Sesión paralela V: Señales víricas. Dominios genómicos Sesión paralela VI: aCtualización en técnicas de diagnóstico virológico Sesión Plenaria (IV): Brotes, emergencia y seguridad vírica

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Virología. Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología Volumen 14 - Número 01/2011 - Extraordinario XI CONGRESO NACIONAL D VIROLOGÍA GRANADA 2011 CONFERENCIAS

CONFERENCIA INAUGURAL por primera vea hace unos quince años, abrió las puertas al diseño de nuevas vacunas ate- El virus respiratorio sincitial nuadas bien definidas, algunas de las cuales 25 años después se encuentran en fases avanzadas de ensayos clínicos. Así mismo, el estudio de la entrada del Dr. José Antonio Melero virus en la célula y de los mecanismos de re- Centro Nacional de Microbiología, Instituto plicación y transcripción del genoma viral han de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid dado a la luz moléculas prometedoras que es- tán siendo desarrolladas en varios laboratorios, Hace aproximadamente 25 años decidimos entre ellos el nuestro. afrontar en nuestro laboratorio el desafío de trabajar con el virus respiratorio sincitial (VRS), Por último, uno de los aspectos más caracterís- uno de los patógenos virales más relevantes y ticos de la infección por el VRS es la respuesta del que desconocíamos gran parte de los as- inmune/inflamatoria, cuya modulación resulta pectos básicos de su ciclo infectivo. Desde en- imprescindible para evitar los efectos inmuno- tonces se ha avanzado sustancialmente en el patológicos adversos evidenciados en el pa- conocimiento de la biología molecular del VRS, sado. El estudio de la interacción virus-célula sin que por ello hayamos podido mejorar aún y de la respuesta del organismo a la infección significativamente la prevención o la terapia de por VRS también está aportando resultados las infecciones causadas por este virus. Un re- prometedores que, sin duda, terminarán con- ciente metanálisis a nivel mundial estimaba que tribuyendo a nuevas líneas de defensa frente las infecciones graves por RSV afectan a 20- al virus. 40 millones de niños menores de 5 años, con alrededor de 3-4 millones que requieren hospi- En definitiva, lo que pensábamos hace 25 años talización y un número de fallecidos de 60-170 sobre el VRS ha resultado bastante más com- mil/año. El 99% de estas muertes ocurren en plejo de lo, quizá ingenuamente, habíamos países en vías de desarrollo. A pesar de estas previsto. Pero la tarea a la que nos hemos de- cifras, todavía hoy no se dispone de ningún an- dicado estos años también nos ha aportado al- tiviral específico para el tratamiento de las in- gunas satisfacciones y sin duda hoy estamos fecciones por este virus, ni hay ninguna vacuna mejor posicionados para abordar los retos que para prevenirlas. El único producto comerciali- quedan para controlar más eficazmente una de zado es un anticuerpo monoclonal que usado las infecciones más graves y prevalentes que profilácticamente reduce en un 50% el número siguen afectando al ser humano. de hospitalizaciones por RSV en niños con alto riesgo de tener una enfermedad grave. Sin embargo, el elevadísimo coste de este tratamiento impide el uso generalizado del mismo. CONFERENCIA EXTRAORDINARIA Aun con estos precedentes, pensamos que la Flaviviral host factors: an investigación sigue siendo la única manera de RNA-centric view avanzar en el conocimiento del VRS y que tarde o temprano terminará aportando compuestos Katell Bidet (1), Brandt Levitt (2), Alex Ward químicos o biológicos que servirán para la pro- (1) Caroline LeSommer (2), Sharon Jamison filaxis o la terapia de las infecciones por VRS. (2), and Mariano A. Garcia-Blanco (1),(2) En este sentido, el rescate de virus a partir de Program in Emerging Infectious Diseases, copias de cDNA del genoma viral, conseguido Duke-NUS Graduate Medical School,

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Singapore (1), Center for RNA Biology, ha mantenido activo el interés de la comunidad Departments of Molecular Genetics científica tratando de descifrar las heterodoxas and Microbiology, and Medicine, Duke propiedades de este nuevo agente patógeno. University, Durham, NC USA (2) Recientemente la hipótesis ha sido demostra- Dengue and yellow fever viruses (DENV and da. La prueba definitiva ha requerido del desa- YFV) require an extensive number of factors, rrollo de la replicación de priones en un tubo yet only a limited number have been identified. de ensayo mediante la técnica de PMCA (del To discover these factors we have employed inglés: Protein Misfolding Cyclic Amplification), two complementary strategies: viral RNA-affinity un método que permite que el agente infeccio- chromatography/proteomics, and identification so pueda ser amplificado a expensas de una host proteins required for efficient viral propa- proteína que, de forma endógena, se encuen- gation using RNA interference-based functional tra fundamentalmente en el sistema nervioso genome-scale screens. We will present data central. Inicialmente la proteína susceptible de on two types of host factors discovered using ser convertida se añadía a partir de extractos these two strategies: a family of 3’-5’ exonu- cerebrales, un sustrato compuesto por otras cleases and stress granule components. muchas proteínas, ácidos nucleídos, lípidos, etc…, que dejaron inconclusa la demostración de la hipótesis. Recientemente la prueba defi- CONFERENCIA DE CLAUSURA nitiva ha venido de la mano de un estudio similar en la que se utilizaron únicamente proteí- Priones. Dualidad entre una nas recombinantes generándose, por primera irreductible simplicidad y vez, priones infecciosos recombinantes. Estos una compleja estructura estudios están siendo ampliamente reproduci-

(1), (2) dos por otros grupos de investigación borrando Joaquín Castilla cualquier duda sobre la certeza de la hipótesis CIC bioGUNE, Parque Tecnológico de de “sólo proteína”. Sin embargo, si bien pode- (1) Bizkaia, Ed. 800, 48160 Derio, Bizkaia. mos ahora decir abiertamente que los priones IKERBASQUE, Basque Foundation for pueden estar compuestos únicamente por pro- Science, 48011 Bilbao, Bizkaia. (2) teínas, auto-replicarse y ser infecciosos, estos patógenos con una irreductible simplicidad es- El termino prión fue acuñado por Stanley Prusi- conden misterios aún difíciles de resolver. ner para definir un nuevo agente biológico que basaba su comportamiento infeccioso en su capacidad de auto-replicación. Si bien esta ca- racterística la comparten muchos otros agentes infecciosos, la peculiaridad de este nuevo pató- geno residía en que estaba compuesto por una sola proteína. Esta “herejía” biológica denominada como la hipótesis de “sólo proteína” atribuía a una única proteína la capacidad de mostrar una gran diversidad de estructuras diferentes con propiedades patógenas perfectamente di- ferenciables a partir de una única secuencia de aminoácidos. Durante décadas esta hipótesis

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Patrocinado por FIPSE Estrategias moleculares y celulares en la lucha contra el HIV

Moderadores: Dr. Carles Suñé Dr. Miguel Angel Martínez

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Insight into HIV-1 drug resistance Aptamers are oligonucleotides identified mechanisms through virus evolution through a combinatorial process known as SE- LEX (Systematic Evolution of Ligands by EXpo- Ben Berkhout nantial enrichment). They exhibit both high affi- Laboratory of Experimental Virology, nity and specificity for a pre-determined target University of Amsterdam, the Netherlands of interest. They can be raised against a wide range of molecules -even living cells- including In our HIV-AIDS research line, we study the regulatory molecules or marker proteins of ma- molecular mode of action of several novel an- jor diseases. tiviral approaches. This includes the use of a gene therapy based on the mechanism of RNA We raised aptamers to regulatory RNA structu- interference (RNAi) and the design of novel an- res of HIV-1 or HCV. They display both an ex- tiviral peptides that target the cell entry process. quisite specificity of recognition and a remarka- In particular, we always try to select multiple bly high affinity of binding. Such aptamers can lineages of drug-resistant HIV-1 variants that modulate the expression of the gene under the escape from therapy to obtain an evolutionary control of the targeted signal thus allowing se- perspective of the initial process of virus inhi- lective tuning of a pre-selected gene. Similarly bition and the subsequent viral escape routes. aptamers were raised against viral proteins, For RNAi-mediated inhibition, we demonstrate which display characteristics similar to that of diverse escape routes when a single inhibitor antibodies. They can specifically inhibit an en- is used. In these cases, HIV-1 either mutates zyme or signal the presence of the target pro- the sequence or the structure of the targeted tein. RNA. Several approaches designed to prevent viral escape will be presented, but the simple We developped an automated platform that use of multiple RNAi inhibitors seems to provi- speeds up the selection of aptamers and de- de the most durable therapeutic effect. Three signed a high throughput screening method for generations of antiviral peptides that bind to their identification. The selected aptamers can the gp41 subunit of the HIV-1 Envelope protein be secondarily modified, thus exhibiting impro- have been developed by Roche-Trimeris. Mas- ved properties (nuclease resistance) that make sive virus evolution experiments revealed over- them of interest for use in biological systems. lapping, but distinct escape mechanisms that They can be easily labeled or grafted on a sur- provide molecular details on the peptide-gp41 face for specific detection. interaction. This insight also led to the genera- Aptamer-based tools are of interest as new tion of novel anti-escape peptides that warrant further development. drugs or for the design of probes and sensors. These aspects will be discussed for application to viral diseases. Aptamers: new ligands for therapeutic and diagnostic developments RNA interference as a tool to (1) Jean-Jacques Toulmé , Eric Dausse explore the HIV-1 robustness (1) and Carmelo Di Primo (1) ARNA Laboratory, European Institute of Miguel Angel Martínez Chemistry and Biology, Inserm, University Fundació irsiCaixa, Hospital Universitari of Bordeaux, Bordeaux, France (1) Germans Trias i Pujol, 08916 Badalona, Spain

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High mutation rate and quasispecies dynamics Aplicaciones de dendrímeros of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) de estructura carbosilano en are intimately related to both viral disease and el tratamiento y prevención antiviral treatment strategies. Short interfering de la infección por el VIH RNAs (siRNAs) targeting viral genes can effi- Louir Chonco (1), Rafael Gomez (2), Maria ciently inhibit HIV-1 replication. RNA interferen- Bryszewska (3), Marek Maly (4), Jean- ce (RNAi) has opened new possibilities for the Pierre Majoral (5), F. Javier de la Mata (2), development of novel therapies against viral María Ángeles Muñoz-Fernández (1) infection. Nevertheless, the exquisite sequence Laboratorio InmunoBiología Molecular. Hosital specificity of RNAi is countered by the potential Geenral Universitario Gregorio Marañón, for viral escape, particularly with a highly muta- Madrid, Spain and CIBER-BBN, Spain (1), ble target like HIV-1. We show here that RNAi is Inorganic Chemistry, Universidad Alcalá de a valuable tool for probing the sequence space Henares Madrid, Spain and CIBER-BBN, (2) available for HIV-1 evolution. The evolutionary Spain , Department of General Biophysics, University of Lodz (3), Faculty of Science, J. capacity of HIV-1 was tested by putting a strong E. Purkinje University, Czech Republic (4), selective pressure on highly conserved sequen- Laboratoire de Chimie de la Coordination. ces within the HIV-1 genome. We assayed the Directeur de Recherches, France (5) antiviral efficacy of several siRNAs directed La pandemia del VIH/SIDA es la mayor amena- against HIV-1 essential regions. Serial viral za a la salud mundial con la que probablemen- transfers in U87-CD4 cells were carried out with te nos enfrentemos en nuestra generación. En the former siRNAs. This procedure was iterated 2010, el número de personas que vivían con el for a number of cycles until a virus breakthrough VIH continuó aumentando hasta alcanzar una cifra superiores a los 33 millones. El incremen- was detected. After several serial culture pas- to constante en la población de personas que sages, depending of the siRNA used, resistant vive con el VIH refleja los efectos combinados virus, with single point mutation in the targeted de las tasas persistentemente altas de nuevas region, emerged on the culture supernatant of infecciones y los efectos beneficiosos de la te- the tested siRNAs. Importantly, the addition of rapia antirretroviral. Las innovaciones en nano- tecnología están teniendo un relevante impacto a second generation siRNA that matched the en la investigación del VIH/SIDA. En el trata- escape mutation restored viral inhibition and miento de la enfermedad, se están adaptando delayed the development of escape variants. sistemas de liberación basados en nanopartí- Passages performed with both siRNAs preven- culas para modular la liberación de fármacos ted the emergence of the primary escape mu- o ácido nucleico, reducir la toxicidad asociada a fármacos, proteger a fármacos del metabo- tant and forced the virus to new escape routes. lismo celular y dirigirlo hasta células, tejidos This study demonstrates that second genera- o compartimentos específicos. Además, en la tion siRNAs can be an appropriate strategy to prevención de la infección por el VIH no se ha anticipate and prevent viral escape from RNAi obtenido hasta la fecha una vacuna segura y and to search for new RNAi escape routes.The efectiva, por lo que se están llevando a cabo protocol designed here can be a useful tool to otras aproximaciones para prevenir la transmi- sión del VIH. De las nuevas infecciones que se explore the sequence space available for HIV-1 producen, un 95 % se concentra en África y en evolution. Asia y un 80 % del total de personas-VIH viven

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en estos continentes. Desde hace varios años Modificaciones en la expresión génica asistimos a la progresiva feminización de la debido a la expresión intracelular de pandemia y cerca de la mitad de los individuos- la proteína Tat del VIH-1. Importancia VIH son mujeres, que han adquirido el virus del segundo exón de Tat. principalmente por transmisión heterosexual. En este contexto, los microbicidas representan M.R. López-Huertas (1), M. Sanchez del Cojo un capítulo fundamental de una respuesta inte- (1), S. Callejas (2), D. Abia (3), E. Mateos (1), gral al VIH/SIDA. El objetivo de los microbicidas A. Dopazo (2), M. Coiras (1) y José Alcamí* es reducir de manera significativa la infección Unidad de Inmunopatología del SIDA. por VIH durante las relaciones sexuales y para Centro Nacional de Microbiología, Instituto ello un microbicida deberá ser seguro y eficaz, de Salud Carlos III, Madrid (1), Unidad de además de accesible a todas aquellas perso- Genómica, Centro Nacional de Investigaciones nas que lo necesiten. Se están investigando Cardiovasculares, Madrid (2), BUnidad de microbicidas vaginales y rectales, focalizando Bioinformática. Centro de Biología Molecular la acción antiviral en diferentes regiones del Severo Ochoa, CSIC-UAM, Madrid (3) VIH. Lo que diferencia los microbicidas vaginales de todas las otras herramientas de pre- Antecedentes. La proteína Tat del VIH-1 es un vención en desarrollo es que están pensados regulador esencial de la replicación viral me- para responder a las necesidades específicas diante su acción como elongador del ARN y la de las mujeres. Estamos estudiando dendríme- cooperación con distintos factores del complejo ros aniónicos carbosilanos y sulfonatos como de iniciación de la transcripción. A pesar de que microbicidas con capacidad para prevenir la esta function requiere únicamente la isoforma infección por VIH inactivando directamente al de Tat generada a partir del primer exón (Tat1- virus o unido a células actuando en diferentes 72), todas las variantes circulantes del VIH-1 dianas del ciclo. Un valor añadido es que estas expresan la proteína Tat generada a partir de moléculas pueden proteger frente a procesos los dos exones del VIH-1 (Tat1-101). Por otra parte, como proteína que interacción con facto- inflamatorias que están implicados en facili- res de transcripción se ha descrito la activación tar la transmisión del VIH. Estos dendrímeros por Tat de distintos genes celulares pero no se han mostrado alto rango de biocompatibilidad ha realizado un análisis sistemático de la modi- en líneas celulares epiteliales, células monon- ficación de funciones celulares provocadas por cleares de sangre perifércia, monocitos y cé- la proteína Tat del VIH-1. lulas dendríticas. Además, inhiben la infección de VIH-1, VIH-2 y SIV en células vaginales y Objetivo. Estudiar las modificaciones en la ex- cultivos primarios y el proceso de activación o presión génica provocadas por la expresión in- inflamación. Estudios de toxicidad pre-clínicos tracelular de distintas isoformas de la proteína realizados en ratones y conejos hembras han Tat (Tat1-72 y Tat1-101) y analizar el impacto demostrado que no tienen efecto inflamatorio funcional de las mismas. y que no produce cambios adversos en tejidos Material y métodos. Se generaron líneas celu- cervicales. La utilización de dendrímeros como lares Jurkat con expresion estable e inducible microbicidas con el valor añadido de ser anti- (Tet-off) de las dos isoformas de Tat. El trans- inflamatorios podría ser un punto de inflexión criptoma y expresión de microRNAs fueron en la prevención de la infección por el VIH. Por analizados mediante micro-arrays (Agilent Te- otra parte, dendrímeros catiónicos podrían ser chnologies). Los datos depurados fueron ana- utilizados en terapia génica frente al VIH y en lizados mediante q-value utilizando el software inmunoterapia. SAM (Significance Analysis of Microarrays).

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Se consideraron significativos aquellos valores que superaron un cutoff del 5% del q-value. El análisis funcional fue realizado mediante el programa Ingenuity Pathway Analysis. Se realizó un modelo in sílico de docking de ambas pro- teínas utilizando un espectro NMR de 1jfw en el complejo TAR/P-TEFb utilizando el programa using Modeller 9v4. Resultados La expresión intracelular de la pro- teína Tat modificó de manera extensa la expre- sión génica: 1079 genes fueron desregulados en las células Tat1-101 y 274 en las Tat1-72, Un total de 111 genes vieron alterada su ex- presión en ambas líneas celulares. Algunas de las modificaciones fenotípicas más importantes observadas fueron: 1) La actividad transcripcional dependiente de NF-kB, Sp1 y NF-AT au- mentó en las células Tat 1-101 mientras que en las células Tat 1-72 la expresión fue moderada. 2) Funciones relacionadas con el citoesqueleto celular (quimiotaxis, polarización, polimeriza- ción de actina) se vió profundamente alterada en las Jurkat Tat1-101 pero no en las células Tat1-72. 3) La expresión de Tat 1-101 provo- có una resistencia aumentada a la apoptosis inducida por CD95. 4) La expresión de receptores de superficie característicos de linfocitos T como CD4, CD2, CD1 se vio alterada por Tat1-101 pero no por Tat1-72. 5) Los patrones de expresión de miRNA fueron diferentes entre ambos tipos celulares. Conclusión. La expresión intracelular de la proteína Tat del VIH-1 produce cambios en la expresión génica de la célula que favorecen la persistencia y replicación viral. La isoforma de Tat generada a partir de ambos exones (Tat 1-101) provocó mayores alteraciones en la ex- presión génica celular. La función del segundo exón de Tat y su selección en el curso de la infección natural puede tener relación con las modificaciones intracelulares inducidas por la proteína completa.

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Pequeños RNAs, expresión y silenciamiento génico

Moderadores: Dr. Juan Antonio García Dra. Purificación Fortes

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Arm Race Between Plant And Viruses ving a more profound effect on host gene expression, then previously predicted. József Burgyán (1), (2) Istituto di Virologia Vegetaly, CNR, Torino, Italy (1), Agricultural Biotechnology CO/01 Center, Gödöllö, Hungary (2) El factor de splicing rico en prolina y glutamina (SFPQ/PSF) es esencial para RNA silencing in plants exists as a defence me- la transcripción del virus de la gripe chanism against viruses. Plant viruses are in- ducers as well as target of RNA silencing based Landeras-Bueno S.*, Jorba N., antiviral defence. The silencing of RNA relies Pérez-Cidoncha M., Ortín J. on host- or virus-derived 21-24 nucleotide-long Departamento de Biología Molecular. small RNA (sRNA) molecules, which are the key Centro Nacional de Biotecnología mediators of RNA silencing-related pathways (CSIC), Darwin 3, Madrid y CIBER de in plants and other eukaryotic organisms. Vi- Enfermedades Respiratorias (ISCIII) (1) ral RNAs activate the antiviral RNA silencing generating viral (v) siRNAs, which guide RNA- La RNA polimerasa de los virus de la gripe induced silencing effector complex (RISC) to consiste en un complejo heterotrimérico y es cleave viral genome. However, we have obser- responsable de la transcripción y de la replica- ved that AGO1 the catalitic component of anti- ción viral, que tienen lugar en el núcleo de una viral RISC strictly selects for AGO1 competent célula infectada. En nuestro laboratorio se llevó viral siRNAs, which rapresent only aproximately a cabo un análisis proteómico de la polimerasa 1% of total vsiRNAs. We have also shown, that expresada en células humanas y se identifica- viruses are able to harness antiviral silencing ron una serie de proteínas celulares asociadas. for virus benefit controlling their own parasi- En este estudio se ha caracterizado el papel te subviral molecules such as satellite RNAs. de una de estas proteínas asociadas, llamada Moreover, we have also discovered that these SFPQ/PSF, durante la infección viral. El silen- vsiRNAs guide plant RISC to controll host gene ciamiento de SFPQ/PSF usando dos siRNAs expression. independientes redujo el título viral entre 2 y 5 unidades logarítmicas en infecciones a baja Plant viruses are very efficient pathogens, multiplicidad, mientras que la multiplicación de which are able to infect and invade distinct virus de otras familias como VSV y Adenovirus plant species. They often cause severe symp- apenas se vió afectada. El silenciamiento de toms and damage, which suggests an efficient SFPQ/PSF dio lugar a una reducción y a un re- counter defensive strategy against the antiviral traso en la expresión génica del virus. Ensayos silencing response. In fact most viruses evol- de inmunofluorescencia mostraron una fuerte ved viral silencing suppressors (VSRs), which correlación entre el nivel de SFPQ/PSF y la underlines the antiviral nature of RNA silencing acumulación de NP. Análisis del RNA viral en and reveals a pathogen counter-defensive stra- células silenciadas mostraron que la acumula- tegy with the active suppression of host survei- ción de cRNA, mRNA y vRNA se redujo más de llance. These VSRs often compromise not only 5 veces mientras que el splicing de los mRNAs the antiviral response but they have significant virales no se vió afectado. Además, la acumula- impact on the endogenous silencing pathways. ción de transcritos primarios en células infecta- Recently we and others have shown that VSRs das y tratadas con cicloheximida se redujo en 3 can inhibit RNA silencing in multiply ways ha- veces en ausencia de SFPQ/PSF, implicando a

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este factor en la transcripción primaria del virus viral Tat, afectando a la elongación de la trans- de la gripe. El efecto de SFPQ/PSF en la repli- cripción (1). Además de regular la transcripción, cación y en la transcripción secundaria del virus TCERG1 modula el splicing alternativo de pre- se estudió en un sistema de mini-replicón. Los mRNAs incluyendo al del VIH-1 (póster de M. resultados mostraron que, mientras que la acu- Montes y col.), por lo que se ha postulado que mulación de mRNA viral se redujo en 5 veces, este factor ejerce funciones de “acoplamiento” los niveles de vRNA, y por tanto de replicación, entre las distintas maquinarias que regulan la se incrementaron en 2 veces. Esta es la pri- expresión génica. De acuerdo con este modelo, mera descripción de un factor celular esencial la localización de TCERG1 en el núcleo celular para la transcripción del virus de la gripe y abre es similar a la del resto de factores que intervie- la posibilidad de desarrollar nuevos antivirales nen en el metabolismo del RNA, concentrándo- que bloqueen el primer paso en la expresión se en la periferia de los speckles nucleares (2), génica del virus. estructuras altamente enriquecidas en factores de splicing. En este estudio demostramos la PALABRAS CLAVE: Virus de la gripe, presencia de TCERG1 en el sitio de transcrip- Factores celulares, SFPQ/PSF ción activa del HIV-1 en célula viva y a tiempo real. Para ello hemos hecho uso de proteínas CO/02 fluorescentes y vectores reporteros marcados con sitios de unión para la proteína de la cápsi- Una visión “a tiempo real” del de viral del fago MS2, que permiten localizar de reclutamiento del factor de manera exacta los RNAs virales recién sinteti- elongación TCERG1 al sitio activo de zados (3). Hemos identificado que en la mayoría transcripción del VIH-1 en célula viva de los casos el sitio de transcripción del VIH-1 se sitúa muy próximo a los speckles nuclea- Sánchez Hernández N.* (1), Boireau res, apoyando una vez más el acoplamiento S. (2), Schmidt U. (2), Sánchez- entre los procesos de transcripción y splicing. Álvarez M. (1), Hernández-Munain En este congreso presentaremos también ex- C. (3), Bertrand E. (2), Suñé C. (1) perimentos de FRAP (Fluorescence Recovery Dpto. Biologia Molecular IPBLN-CSIC After Photobleaching) con microscopia fluores- Armilla Granada (1), Inst. de Génétique cente convencional y microscopia confocal que Moléculaire de Montpellier IGMM-CNRS describen las propiedades dinámicas del reclu- Francia (2), Dpto. Inmunología y Biología tamiento de TCERG1 hacia estos lugares así Celular IPBLN-CSIC Armilla Granada (3) como su papel en la dinámica transcripcional del VIH-1. Nuestros resultados aportan nuevos El factor TCERG1 (del inglés transcription e interesantes datos acerca de la regulación elongation regulator 1, también denominado transcripcional del VIH-1, nivel al que la biogé- CA150) se purificó inicialmente de extractos nesis del virus es mayoritariamente regulada en nucleares de células HeLa como un cofactor los sitios de transcripción activa (4). 1. Suñé, C., transcripcional que regula la activación génica Hayashi, T., Liu, Y., Lane, W. S., Young, R. A., del VIH-1. Extractos nucleares de células HeLa and Garcia-Blanco, M. A. (1997) Mol Cell Biol desprovistos de TCERG1 ven bloqueada su ca- 17, 6029-6039 2. Sánchez-Alvarez, M., Golds- pacidad de activar los genes virales por Tat y la trohm, A. C., Garcia-Blanco, M. A., and Suñé, sobre-expresión transitoria de TCERG1 reduce C. (2006) Mol Cell Biol 26, 4998-5014 3. Maiuri, la actividad del promotor del VIH-1, tanto en P., Knezevich A., Bertrand E., and Marcello, A. presencia como en ausencia del trans-activador (2010) Methods 53, 62-67 4. Boireau, S., Maiu-

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ri, P., Basyuk, E., de la Mata, M., Knezevich, la especie tipo de la familia Pospiviroidaecon A.,Pradet-Balade, B., Bäcker, V., Kornblihtt, A., replicación nuclear) se agroinfiltraron con plás- Marcello, A., and Bertrand E. (2007) The Jour- midos (amablemente proporcionados por el nal of cell Biology 179, 291-304. Dr. J.C. Carrington) que expresan las AGO1, PALABRAS CLAVE: TCERG1, FRAP, Sitio AGO2 y AGO7 de Arabidopsis etiquetadas con activo de transcripcion del HIV-1 un epitopo de la hemaglutinina. La inmunopre- cipitación de extractos proteicos de los halos agroinfiltrados y su examen mediante análisis CO/03 Western and Northern con sondas específicas mostró que: i) el nivel de expresión de las tres Las proteínas argonauta AGO1 proteínas fue similar, ii) AGO1 y AGO2, pero no y AGO2 de Arabidopsis se unen AGO7, captaron específicamente cantidades específicamente a los pequeños RNAs similares de los PSTVd-sRNAs de 21 y 22 nt, y derivados de un viroide nuclear iii) AGO7 captó específicamente el miRNA 390 por el que tiene gran afinidad, confirmando así Minoia S* (1), Navarro B (2), Di la fiabilidad del sistema experimental emplea- Serio F (2), Flores R (1) do. Además de extender estos estudios a otros Instituto de Biología Molecular y Celular de miembros de la familia AGO, queremos también Plantas (UPV-CSIC), Valencia (1), Istituto di Vi- examinar si la agroexpresión de AGO1 y AGO2 rologia Vegetale (CNR), Bari, Italia (2) afecta al nivel del RNA genómico de PSTVd, así como emplear secuenciación masiva para La identificación y caracterización en plantas diseccionar las propiedades estructurales de infectadas por viroides nucleares y cloroplás- los PSTVd-sRNAs unidos a proteínas AGO. El ticos de pequeños RNAs viroidales (viroid-de- hallazgo de que AGO2 capta vd-sRNAs con efi- rived small RNAs, vd-sRNAs), similares a los ciencia similar a la de AGO1 es llamativo, por- micro RNAs (miRNAs) y a los pequeños RNAs que recientemente se ha descrito para AGO2 interferentes (small interfering RNAs, siRNAs), un papel en la defensa antiviral. es un firme indicio de la implicación del silenciamiento mediado por RNA en la defensa de PALABRAS CLAVE: viroides, silenciamiento sus huéspedes frente a estos agentes subvira- mediado por RNA, pequeños RNAs les. Sin embargo, la cuestión de si los viroides, como los virus de RNA, son dianas no sólo de CO/04 las RNasas Dicer-like (DCL) que generan los vd- sRNAs sino también del complejo RISC (RNA- Durabilidad de la resistencia al induced silencing complex), es controvertida. potyvirus del mosaico del nabo El componente esencial de las diferentes iso- mediada por un microRNA artificial formas de RISC es uno de los múltiples miembros (hasta diez en Arabidopsis) de la familia Martínez F.* (1), Lafforgue G. (1), Sardanyés Argonauta (AGO), que son cebados y guiados J. (1), De la Iglesia F. (1), Solé R. V. (2), Chua por pequeños RNAs (small RNAs, sRNAs) de N. H. (3), Elena S. F. (1), Darós J. A. (1) origen endógeno o viral. Para investigar si las Instituto de Biología Molecular y Celular de proteínas AGO también captan a los vd-sRNAs Plantas (Consejo Superior de Investigaciones y, en tal caso, qué miembros de esta familia Científicas - Universidad Politécnica de actúan así, hojas de Nicotiana benthamiana in- Valencia), Valencia (1), Instituto de Biología fectada por el viroide del tubérculo fusiforme de Evolutiva (Universitat Pompeu Fabra la patata (Potato spindle tuber viroid, PSTVd, - Consejo Superior de Investigaciones

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Científicas), Barcelona (2), Rockefeller rango estrecho de frecuencia siendo el haplo- University, Nueva York, EE.UU. (3) tipo silvestre el predominante. Sin embargo, cuando se produce la rotura de la resisten- Plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas cia, un haplotipo mutante pasa a representar que expresan un microRNA artificial (amiRNA) el 60.5% de la población mientras el silvestre complementario a una diana de 21 nt en el se reduce al 1.1%. El promedio de diversidad cistrón HC-Pro (amiR159HC-Pro) del virus del por nucleótido es similar a lo largo de los pases mosaico del nabo (TuMV, familia Potyviridae) evolutivos. Los resultados de la ultrasecuen- muestran resistencia a las infecciones por este ciación sugieren que los pases evolutivos no virus. Sin embargo, el grado de resistencia es aumentan la diversidad genética de las pobla- variable en líneas transgénicas de A. thaliana ciones virales sino que desde el primer pase se independientes. Así, mientras la línea 12-4 es establece un equilibrio mutación-selección. El totalmente resistente al TuMV, la línea 10-4 haplotipo silvestre se mantiene en la población solo lo es parcialmente. El análisis del nivel de después de la rotura seguramente por comple- expresión del amiR159HC-Pro en estas líneas mentación. Finalmente, también se estudió el transgénicas mostró que su distinto compor- efecto que la presencia de una segunda es- tamiento se debe al nivel de acumulación del pecie viral tiene sobre la resistencia al TuMV amiRNA en cada una de ellas, siendo menor mediada por el amiRNA. Mientras algunas esen la línea 10-4, parcialmente resistente. Se pecies de virus no interfieren en la resistencia, realizaron experimentos de evolución del TuMV otras como el caulimovirus del mosaico de la mediante pases seriados de 25 linajes indepen- coliflor, el bromovirus del mosaico del pepino dientes del virus en A. thaliana silvestres y en o el phycodnavirus del cascabeleo del tabaco transgénicas 10-4 parcialmente resistentes, y ayudan al TuMV a superar la resistencia. se analizó la capacidad de romper la resistencia de las poblaciones evolucionadas del virus PALABRAS CLAVE: microRNA artificial, en la línea 12-4. Todos los linajes del TuMV resistencia, rotura resistencia acabaron rompiendo la resistencia mediada por el amiR159HC-Pro en las plantas 12-4. La apa- CO/05 rición de linajes capaces de romper la resistencia fue mucho más rápida en los virus evolucio- Expresión de microRNAs artificiales: nados en la línea parcialmente resistente 10-4 una estrategia antiviral en la que en los evolucionados en A. thaliana silves- biotecnología de plantas tres. En las poblaciones virales que rompieron la resistencia se secuenció la región alrededor Zhao M., García J.A., Simón-Mateo C.* de la diana del amiRNA y, en todos los casos, se identificaron una o varias mutaciones en la Departamento de Genética Molecular de Plan- tas, Centro Nacional de Biotecnología (CNB- diana. Uno de los linajes evolucionados en A. (1) thaliana silvestres se caracterizó por ultrase- CSIC), Cantoblanco, 28049 Madrid. cuenciación. Se detectó la presencia de haplo- Los microRNAs (miRNAs) y otros RNAs de tipos mutantes potencialmente rompedores de pequeño tamaño (siRNAs) son componentes la resistencia desde el inicio de la evolución. El claves en varios procesos de regulación génica análisis de las frecuencias de los 57 haplotipos en animales y plantas. En la actualidad estos más abundantes en las poblaciones a lo largo siRNAs se están utilizando para desarrollar he- de la evolución mostró una dinámica temporal rramientas muy útiles en la investigación bioló- cambiante donde los haplotipos fluctúan en un gica y para diversas aplicaciones en medicina y

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agricultura. Dada la similitud funcional de miR- - García, J.A. y Simón-Mateo, C. (2006) Nat. NAs y siRNAs como elementos reguladores, se Biotech. 24: 1358-1359. ha propuesto que los miRNAs pueden desem- peñar también un papel en la defensa antivi- - Niu, Q.-W, Lin, S.-S., Reyes, J.L., Chen, K.-C., ral, aunque este papel no ha sido demostrado Wu, H.-W., Yeh, S.-D. y Chua, N.-H. (2006) Nat. aún en plantas. Independientemente de que Biotech. 24: 1420-1428. los miRNAs endógenos de plantas jueguen un - Qu, J., Ye, J., y Fang, R. (2007) J. Virol. 81: papel antiviral, sí que son buenos candidatos 6690-9. para ser utilizados en biotecnología para pro- - Simón-Mateo, C. y García, J.A. (2006) J. Virol. teger frente a infecciones virales. En nuestro 80: 2429-2436. grupo hemos demostrado que los miRNAs en- dógenos son capaces de procesar genomas de PALABRAS CLAVE: miRNA artificial, virus de plantas en los que se han introducido Resistencia antiviral secuencias diana reconocidas por los miRNAs (Simón-Mateo y García 2006). Este resultado CO/06 predice que la expresión en plantas transgéni- cas de miRNAs artificiales (amiRNAs) especí- Increased in vivo inhibition of HBV ficos de virus podría conferir resistencia frente expression by combining RNA a infecciones virales.Esta predicción ha sido interference and U1 inhibition comprobada experimentalmente y se han ob- (1) (2) tenido plantas transgénicas resistentes a varios Blazquez L , Gonzalez-Rojas J , Abad (2) (2) (2) (2) virus de plantas (Niu et al., 2006; García, J.A. A , Razquin N , Abad X , Fortes P* y Simón-Mateo, C. 2006; Duang et al., 2008; (1) (2) Qu et al., 2007). La resistencia que se consigue CIMA, Pamplona , I con la expresión de amiRNAs lleva asociados nhibition of gene expression can be successfu- menos efectos secundarios y riesgos medioam- lly achieved with RNA interference (RNAi). bientales potenciales que la expresión transgé- However, caution should be taken when RNAi nica de largos fragmentos de secuencias vira- inhibitors are used therapeutically, as they may les. Sin embargo, para saber cómo diseñar un induce dose-dependent unwanted effects. The- amiRNA efectivo y conocer cómo de genera- refore, efficient new methods to block gene lizable y duradera es esta estrategia antiviral, expression with low doses of inhibitors are re- es necesario un estudio más detallado. Con quired. U1 small nuclear RNA –snRNA- interfe- objeto de conseguir resistencia frente a Plum rence (U1i) allows inhibition of gene expression pox virus (PPV) estamos diseñando diferentes by U1 inhibitors (U1in), U1 snRNA molecules tipos de amiRNAs para expresarlos en distintos modified to target a pre-mRNA and inhibit its tipos de precursores de amiRNAs. Con estas polyadenylation. In tissue culture, we have construcciones se evaluará la acumulación del shown that the combination of RNAi and U1i amiRNA maduro y de su banda complementa- results in stronger inhibition of reporter or endo- ria, su actividad frente a sensores y, finalmen- genous genes than that obtained using either of te, su capacidad de conferir resistencia en N. the techniques alone. We have now used these benthamiana y en Prunus, el huésped natural techniques to inhibit HBV expression in mice. de PPV. We show for the first time that U1i inhibits gene expression in animal models. Interestingly, the - Duang, C.G., Wang, C.H., Fang, R.X., y Guo, inhibition obtained with U1i in mouse liver is H.-S. (2008) J. Virol. 82: 11084-95.

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stronger than in tissue culture. Furthermore, combining U1i and RNAi results in synergistic inhibitions also in mice. Toxicological studies indicate that expression of U1i inhibitors is safe. Therefore, we believe that the combination of RNAi and U1i will be a safe option to block HBV and other infectious agents in vivo.

PALABRAS CLAVE: HBV, RNAi, U1 snRNP

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Interacción virus-huésped (I)

Moderadores: Dr. Jordi Gómez Dr. Enrique Moriones

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Treatment failure and resistance Yanguez E (1), García-Culebras A (2), Llompart with direct acting antiviral drugs C (1), Eduardo-Correia B (2), Knobeloch KP (3) (1) (1) (2) against hepatitis C virus , Nieto A , Esteban M , Guerra S* Dpto. de Biología Celular y Molecular, Jean-Michel Pawlotsky, MD, PhD Centro Nacional de Biotecnología CSIC, National Reference Center for Viral Hepatitis Madrid (1), Dpto de Medicina Preventiva B, C and Delta, Department of Virology Salud Publica y Microbiología, Universidad and INSERM U955, Hôpital Henri Mondor, Autónoma de Madrid (2), Instituto de Université Paris-Est, Créteil, France Patología de la Universidad de Friburgo (3) Current treatment of chronic hepatitis C virus infection is based on the combination of pegyla- El gen 15 inducido por interferón (IFN) (ISG15) ted interferon- and ribavirin. The recent develo- codifica una proteína que lleva a cabo una mo- pment of direct-acting antiviral molecules active dificación postraduccional llamada ISGilación. on hepatitis C virus, together with in vitro and in Ratones carentes de ISG15 presentan una vivo studies showing that these drugs may lead susceptibilidad incrementada a la infección por el virus Sindbis (VS), el virus Herpes (VH) y el to the selection of resistant viruses if administe- virus de la gripe (FLU) y aunque en menor me- red alone, has raised concerns that resistance dida con el virus Vaccinia (VV). Estos datos su- may undermine therapy based on direct acting gieren que ISG15 desempeña un papel antiviral antivirals. A new standard-of-care treatment will importante en el hospedador y, por ello, algu- soon be available for both treatment-naïve and nos virus han evolucionado para contrarrestar -experienced patients infected with hepatitis C su actividad, como el virus Influenza B cuya virus genotype 1, based on a triple combination proteína NS1B es capaz de bloquear la unión of pegylated interferon-, ribavirin and a protea- de ISG15, de origen humano, a sus ligandos. se inhibitor, either telaprevir or boceprevir. With Aunque en los últimos años son muchos los this therapy, most failures to eradicate infection avances que se han hecho en la identificación in treatment-adherent patients are due to an inde los mecanismos de acción de ISG15, en re- adequate response to pegylated interferon- and lación a su función antiviral, aún se desconoce ribavirin, in the context of a low genetic barrier el por qué de esta susceptibilidad incrementa- to resistance of first-generation protease inhi- da a la infección, por estos virus en ausencia bitors. The lecture will review patterns of resis- de ISG15. En ese sentido hemos realizado un tance to hepatitis C virus direct acting antiviral estudio analizando la infección tanto con VV drugs in development, the mechanisms un- como con FLU de células primarias aisladas de derlying treatment failure when these drugs are ratones WT e ISG15KO. La ausencia de ISG15 combined with pegylated interferon- and ribavi- no afecta al comportamiento de la infección de rin, the consequences of treatment failure, and fibroblastos por ambos virus, ya que la produc- possible means of optimizing therapies using ción de proteínas virales ocurre por igual en el direct acting antivirals in the future. curso de la infección por VV y FLU. Sin embargo, al infectar macrofágos peritoneales aislados de los ratones WT o ISG15KO, hemos CO/07 observado que la infección de los macrófagos Papel de la proteína de defensa ISG15KO cursa más lenta respecto a los WT. Además, la muerte celular observada tras las ISG15 inducida por interferon infección de los macrófagos WT, es mayor que en las infecciones virales la provocada en los macrófagos KO. Teniendo

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en cuenta que una de las principales funciones viral C2 protein interacts with the plant CSN5, de los macrófagos para el desencadenamiento and its expression in transgenic plants compro- de la respuesta inmune es la de fagocitar a los mises the activity of this complex over CUL1. compuestos extraños, hemos estudiado la ca- Several responses regulated by the CUL1-ba- pacidad fagocítica de los macrofagos WT versus sed SCF ubiquitin E3 ligases (including plant los ISG15-KO. Para los estudios de fagocitosis responses to jasmonates, auxins, gibberellins, hemos empleado esferas de latex fluorescentes ethylene and ABA) are altered in these plants. con las que hemos realizado microscopía time- Impairment of SCF function is confirmed by sta- lapse para observar la fagocitosis de las mis- bilization of YFP-GAI, substrate of the SCFSLY1. mas. Nuestros resultados muestran una clara Transcriptomic analysis of these transgenic reducción de la capacidad fagocítica por parte plants highlights the response to jasmonates as de los macrófagos ISG15-KO, lo que puede ser the main SCF-dependent process affected by la causa de la baja infectividad de los mismos. C2.Exogenous jasmonate treatment of Arabi- El estudio de la respuesta antiviral mediada por dopsis plants disrupts geminivirus infection, su- ISG15 y de los mecanismos de escape de los ggesting that the suppression of the response virus, es crucial para el desarrollo de nuevas to this hormone might be an important requisite terapias contra patógenos humanos. to accomplish the infection. Our findings suggest that C2 affects the activity of SCFs, most PALABRAS CLAVE: interferon, virus, likely through interference with the CSN. Taking respuesta innata into consideration that SCFs are key regulators of many cellular processes, the capability of vi- CO/08 ruses to selectively interfere with or hijack the activity of these complexes might mean a novel Geminiviruses subvert ubiquitination and powerful strategy in viral infections. and inhibit jasmonate signalling by altering CSN-mediated de-rubylation PALABRAS CLAVE: Signalosome, CSN5, of SCF E3 ligase complexes Ubiquitination Lozano-Durán R (1), Rosas-Diaz T (1), Gusmaroli G (2), Perez-Luna A (1), CO/09 (2) (1) Deng XW , Bejarano ER* Modulación de la apoptosis y la Departamento de Genetica, Facultad de señalización pro-inflamatoria por la (1) Ciencias, Universidad de Malaga , De- proteína N1 del Virus de la Vacuna partment of Molecular, Cellular and De- velopmental Biology, Yale University (2) Maluquer de Motes Carlos* (1), Cooray (1) (1) Viruses have to create a suitable cell environ- Samantha , McGourty Keiran , Graham Stephen C (2), Ren Hongwei (1), Bahar ment and elude defence mechanisms, which (2) (2) most likely involves interactions with the host Mohammad W , Stuart David I , Grimes (2) (1) proteins and subsequent interference with or Jonathan M , Smith Geoffrey L usurpation of the cell machinery. Here we des- Imperial College London (1), Division of cribe a novel strategy used by plant DNA viru- Structural Biology, Wellcome Trust Centre for ses (Geminiviruses) to redirect ubiquitination by Human Genetics, University of Oxford (2) interfering with the activity of the CSN (COP9 signalosome) complex. We show that gemini- La proteina N1 del Virus de la Vacuna (VACV) es un factor de virulencia intracelular que per-

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tenece a una familia de proteinas virales, se- feccion atenuada similar a la obtenida con la mejantes a la familia Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) cepa de VACV carente de N1. Estos resultados de proteinas celulares, cuyos miembros inhiben demuestran que en dichos modelos in vivo la apoptosis o la activacion de factores de trans- actividad anti-apoptotica de N1 no contribuye cripción pro-inflamatorios como el factor regu- a la virulencia, y destacan la importancia de la lador de interferon 3 (IRF-3) y el factor nuclear señalización pro-inflamatoria en la respuesta kappa B (NF-kB). De forma excepcional, N1 inmune contra las infecciones virales. inhibe tanto la activacion de NF-kB como apoptosis. Para entender como N1 ejerce estas fun- PALABRAS CLAVE: Virus de la Vacuna, ciones en la celula, se introdujeron mutaciones apoptosis, factor nuclear kappa B en la region hidrofobica de la proteina, similar a la identificada en las proteinas celulares de la CO/10 familia Bcl-2, y en la region que media su dimerizacion. Mutagenesis en la region hidrofobica Gemin5 es una nueva diana de suprimio unicamente la actividad anti-apoptoti- la proteasa Lb de FMDV ca de N1. Para descartar posibles reorganiza- ciones inesperadas de la proteina a causa de Piñeiro del Rio D*, Ramajo las mutaciones introducidas, dichas proteinas Alonso J, Martinez Salas E mutantes fueron cristalizadas. Las estructuras Dinamica y Fucion del Genoma, cristalograficas obtenidas fueron identicas a la CBM-SO, Madrid (1) de la proteina silvestre excepto en el lugar de David Piñeiro, Jorge Ramajo y Encarna Mar- la mutacion, indicando claramente que la actividad anti-apoptotica de N1 esta regulada por tinez-Salas. Centro de Biología Molecular Se- el surco hidrofobito presente en la superficie de vero Ochoa, CSIC-UAM. c/ Nicolás Cabrera 1, la proteina. Por el contrario, mutagénesis en la Cantoblanco, 28049, Madrid. region de dimerizacion suprimio unicamente la actividad anti-NF-kB. Analisis bioquimicos de- El RNA de los Picornavirus a diferencia de los mostraron que esta mutacion previene la dime- mRNAs celulares cuya traducción es depen- rizacion de N1 que ese expresa como mono- diente de cap (7met-GTP) utiliza un elemento mero. de entrada interna al ribosoma (IRES). Los IRES reclutan la maquinaria de iniciación de Una vez identificadas las mutaciones en N1 la traducción y la posicionan en un sitio interno que suprimen específicamente una de las dos del mRNA cercano al AUG iniciador. En este funciones descritas, alelos de N1 que presenta- proceso está implicada la estructura del IRES ban dichas mutaciones fueron introducidos en y requiere la participación de factores que ac- una cepa de VACV carente de la N1 parental túan en trans (ITAF). A tiempos tempranos de para determinar la contribución relativa de cada la infección con FMDV se produce una inhibi- una de las actividades a la virulencia viral. Tan- ción de la traducción de los mRNAs de la célula to en un modelo murino de infeccion intranasal hospedadora. La proteasa Líder (Lb) de FMDV como intradermal, la inoculación con un VACV es la causante de la parada traduccional a esos que expresaba una N1 sin actividad anti-apop- tiempos proteolizando factores de iniciación de totica genero una virulencia similar a la obte- la traducción (eIFs) (eIF4G, eIF3a, eIF3b) y de nida con la cepa silvestre de VACV, mientras proteínas implicadas en la traducción (PABP que la inoculación con un VACV que expresaba (poly(A)-binding protein), PTB (polypyrimidine una N1 sin actividad anti-NF-kB indujo una in- tract binding protein)). Gemin5 es una proteína

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citoplasmática de unión a RNA de 170 kDa per- Instituto de Biología Molecular y Celular teneciente a la familia de las geminas. Contiene de Plantas (CSIC-UPV). Universidad en su extremo amino terminal 13 dominios WD Politécnica de Valencia. Avenida de y en su extremo carboxilo terminal un dominio los Naranjos s/n. 46022 Valencia (1) coiled-coil. Gemin5 forma parte del complejo Within the last few years, a large body of evi- SMN implicado en la formación de las snRNPs, dence has revealed that many viruses require a parte indispensable en la maquinaria de spli- nuclear step to fulfil their life-cycles. The largest cing. Por otro lado, se ha descrito que Gemin5 subnuclear structure is the nucleolus which, in es capaz de interaccionar con eIF4E y con la addition to be the site where the rRNA synthe- estructura cap de los mRNAS. Nuestro grupo sis and ribosome assembly occurs, also partici- ha descrito la capacidad de interacción de Ge- pates in other aspects of RNA processing and min5 con el IRES de FMDV actuando como un diverse important cellular processes. Moreover, regulador negativo de la traducción. En este there have been recently reported that some trabajo describimos que Gemin5 es proteoliza- animal and plant viruses, both nucleus- and da específicamente por FMDV. La proteasa Lb cytoplasm-replicating viruses, have evolved de FMDV es responsable de la proteólisis de strategies to interfere or alternatively to divert Gemin5 generando dos productos, p85 y p57. to its own benefit cellularnucleolar functionsei- A través de una búsqueda en la secuencia de la ther sequestering nucleolar proteins or targe- proteína Gemin5 encontramos varias secuen- ting viral proteins to the nucleolus.Viral proteins cias candidatas a ser puntos de corte recono- trafficking to and from the nucleolus interact cidos por Lb. Mediante análisis mutacional de- with host factors and these interactions, direct or indirectly, are required in different steps of finimos la secuencia KKRKAR (841-846) como the viral infection such as viral attachment and el corazón de la diana de reconocimiento de Lb entry to the cell, intracellular trafficking, trans- dando lugar al fragmento de proteolización p85, lation, replication or virus assembly (Taliansky siendo los residuos RK fundamentales para la et al., 2010 Advances in Virus Research 77, proteolisis. Mediante ensayos de co-traducción 119-158). en reticulocitos de conejo (RRL) usando el tránscrito bicistrónico CAT-IRES FMDV-lucife- Alfalfa mosaic virus (AMV) has a very broad rasa junto con los transcritos que codifican p85 dicotyledonous host range infecting over 600 o p57 determinamos que dichos péptidos man- plant species being mainly transmitted by seed, pollen and aphids. The AMV genome consists tienen la capacidad de regular negativamente in three plus single-stranded RNAs. RNAs 1 la traducción. and 2 encode the replicase proteins P1 and P2, PALABRAS CLAVE: Picornavirus, Proteinas respectively, whereas RNA 3 encodes the mode unión a RNA, Regulación traduccional vement protein and the coat protein (CP). CP is translated from a subgenomic RNA 4. AMV and viruses of the Ilarviruses genus show the CO/11 phenomenon termed “genome activation”,e.g. Alfalfa mosaic virus coat protein these viruses require binding of a few molecules of coat protein (CP) to the 3- end non-trans- localizes at the nucleolus and this lated region (3-NTR) of the viral RNAs to initiate nucleolar step is required to promote infection. Besides, the CP of AMV and probably accurate virus accumulation in plants of most Ilarviruses plays multiple roles in the viral life cycle, including virion assembly, infectivi- APARICIO F.*, HERRANZ M.C., ty, translation and cell-to-cell and systemic mo- SANCHEZ-NAVARRO J.A., PALLAS V.

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vement (Bol, 2005 Annu Rev Phytopathol 43, El virus de la gastroenteritis porcina transmisi- 39-62). This multifunctional role suggests that ble (TGEV), contiene tres genes accesorios: 3a, this viral protein will interact, recruit and divert 3b y 7. El gen 7 sólo está presente en los miem- different host factors/sub-cellular structures re- bros del género alfa 1 de coronavirus, y codifica quired in the diverse steps of the viral cycle. una proteína hidrofóbica de 78 amino ácidos. However, most of these roles are not well, if Para estudiar la función del gen 7, se generó not completely, understood. We are interested un virus TGEV recombinante que no expresaba in the identification and characterization of me- este gen (rTGEV-delta7). Tanto el virus mutante como el virus parental (rTGEV-wt) mostraron chanisms and host factors that AMV CP could la misma cinética de crecimiento y de acumu- be diverting to fulfil viral requirement. lación de RNA viral durante la infección en cultivos celulares. Sin embargo, las células infec- In this work, we report, by confocal microscopy, tadas con el virus rTGEV-delta7 mostraron un that the AMV CP is transported and accumula- mayor efecto citopático debido a un aumento tes in the nucleus and the nucleolus of infected en la apoptosis mediada por caspasas. El análi- cells. In addition, mutational analysis of the N- sis de la síntesis macromolecular mostró que la terminal part of the protein allowed us to define infección del virus rTGEV-delta7 bloqueó la ma- a small basic domain which acts as nucleolar quinaria de la traducción celular e incrementó la signal. Besides, we have found that the accu- degradación del RNA celular en comparación mulation of the AMV CP in the nucleolus is re- con la infección del virus rTGEV-wt. En las cé- quired to reach wild type replication, cell-to-cell lulas infectadas con rTGEV-delta7 se observó and systemic movement levels. Our results indi- un incremento de los niveles de fosforilación del cate that CP nucleolar accumulation was inde- factor eIF2alfa y de la actividad nucleasa. Este pendent of fibrillarin, a pivotal nucleolar protein resultado sugirió que la eliminación del gen 7 with roles in some plant viral infections, since causaba un aumento en la respuesta antiviral no direct interaction was observed with this pro- activada por RNA de doble cadena (dsRNA). tein. A possible role for the nucleolar step of the Mediante programas bioinformáticos se identi- AMV CP will be discussed. ficó en la proteína 7 una secuencia conservada que podría mediar su unión a la subunidad PALABRAS CLAVE: Nucleolus, Alfalfa catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1c), un mosaic virus, virus replication factor esencial en la regulación de la respuesta antiviral. Se postuló que la proteína 7 de TGEV CO/12 podría contrarrestar las defensas antivirales del huésped mediante su asociación a la proteína El gen 7 de coronavirus contrarresta PP1c. Reforzando esta propuesta, en ensayos las defensas del huésped y de coinmunoprecipitación se demostró la inte- modula la virulencia del virus racción de la proteína 7 nativa con la proteína PP1, pero no de la proteína 7 que carecía del Cruz JLG* (1), Sola I (1), Becares M (1), Alberca dominio de unión a la proteína PP1c. Además, B (2), Plana J (2), Enjuanes L (1), Zúñiga S (1) se comprobó el requerimiento de la interacción Centro Nacional de Biotecnología (CNB- entre la proteína 7 y la proteína PP1, durante CSIC). Departamento de Biología Molecular la infección, para la defosforilación del factor y Celular. Darwin 3. Campus Universidad eIF2alfa y la inhibición de la degradación del RNA celular. La inoculación de lechones con Autónoma de Madrid. Cantoblanco. Madrid los virus rTGEV-delta7 y rTGEV-wt mostró que (1), Pfizer Animal Health. Girona (2)

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el virus rTGEV-delta7 presentaba una cinética de crecimiento y patología más aceleradas que el virus parental. Los resultados obtenidos indicaron que el gen 7 contrarresta las defensas del huésped, extendiendo la persistencia del virus TGEV, y facilitando su diseminación. Por lo tanto, la adquisición del gen 7 por el genoma del TGEV probablemente confiere una ventaja selectiva para el virus. PALABRAS CLAVE: coronavirus, respuesta antiviral, PP1

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Brotes, emergencia y seguridad vírica

Moderadores: Dr. Juan Carlos Saiz Dr. Ramón Soriguer Escofer

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Emergencia viral y cambio ambiental CO/61 Gustavo Palacios, PhD Nuevas técnicas de eliminación Center for Infection and Immunity, MSPH, de virus en alimentos Columbia University, New York, NY Bosch Navarro A*, Beguiristain Celayeta N, Fuentes Pardo C, Pintó Solé RM La continua vulnerabilidad de grandes pobla- Virus Entéricos, Departamento de ciones contra las enfermedades infecciosas ha Microbiología e Instituto de Nutrición sido ilustrada recientemente con la aparición y Seguridad Alimentaria, Universidad de graves epidemias y por la emergencia de de Barcelona, Barcelona (1) nuevos patógenos. Dicha vulnerabilidad está La seguridad vírica de los alimentos requiere en algunos casos, relacionada con cambios controlar y eliminar los potenciales patógenos favorecidos por el hombre tanto en ambientes víricos de transmisión alimentaria. El objetivo naturales como en ambientes construidos por de este trabajo ha sido estudiar la sensibilidad él mismo. de virus relevantes en seguridad alimentaria frente a dos tratamientos tecnológicos, uno de La reciente epidemia de SARS , los casos hu- ellos emergente en el mundo alimentario como manos de infección por l virus de la influenza es el uso de luz pulsada y otro ya estableci- aviar H5N1, y la pandemia de influenza H1N1 do pero apenas utilizado como es la radiación nos demuestran que las actuales facilidades ionizante mediante electrones acelerados. En de comunicación aérea y terrestre pueden ex- este estudio se ha determinado el efecto de poner potencialmente a miles de personas a inactivación de estas tecnologías emergentes una enfermedad “intratable” producida por un sobre virus entéricos en muestras de jamón cocido. Para ello se han escogido los virus más agente infeccioso. Hay múltiples ejemplos de relevantes de transmisión alimentaria: los no- factores que han contribuido a epidemias de rovirus genogrupo I y II (NoV GGI, NoV GGII) enfermedades infecciosas. Entre ellos, pode- que son los agentes más frecuentes de brotes mos mencionar a la facilidad para desplazarse, de gastroenteritis de origen alimentario y su el incremento de la población y sus desplaza- modelo propagable in vitro, el norovirus murino mientos , la polución, las actividades agrícolas, tipo I (MNV-1), así como el virus de la hepatitis los cambios de estructuras socioeconómicas, y A (HAV), causante de la enfermedad de ma- los conflictos internacionales. yor gravedad dentro de las más frecuentes de transmisión por alimentos. En esta presentación, discutiremos dos ejemplos de los efectos de cambios ambientales Se han desarrollado y evaluado métodos de sobre las enfermedades infecciosas en el con- elución de virus a partir de matrices cárnicas texto del descubrimiento de nuevos patógenos. y se han utilizado métodos moleculares de RT- Para ello analizaremos en profundidad dos mo- PCR a tiempo real para la detección de NoV humanos y el HAV, aunque dichos métodos delos, un modelo animal agudo ejemplificado no reflejan la infectividad de los mismos. Para por la aparición de la enfermedad inflamatoria ello, se ha intentado refinar estas técnicas mo- en músculo esquelético y cardiaco (“HSMI” se- leculares con tratamientos previos con RNasas gún su acrónimo en inglés) y un modelo huma- y a la vez complementar estos estudios con el no crónico tal como la diabetes mellitus. uso de los virus modelo, el MNV-1 y una cepa

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HM175 43c del HAV, permitiendo, de esta ma- El 13 de octubre de 2009 España declaró un nera, evaluar mediante pruebas de infectividad foco de Influenza Aviar (IA) de Alta Patoge- su supervivencia frente a los tratamientos en- nicidad H7N7 en una explotación de gallinas sayados. ponedoras (308.640 aves) en la provincia de Los mejores resultados de recuperación del vi- Guadalajara. La explotación afectada consta rus de la matriz alimentaria se obtuvieron con de 4 naves contiguas para aves de puesta y una agitación intensa y utilizando PBS + SDS otra nave separada destinada a cría. El 9 de como eluyente dando resultados superiores al octubre de 2009 se constató un aumento de la 5% de recuperación, lo cual es un porcenta- mortalidad en las naves 1 y 2, con una morta- je muy correcto para este tipo de matriz. Tras lidad inicial del 50% y 4% respectivamente. El aplicar dosis crecientes de 0 a 16 KGy sobre 11 de octubre de 2009, el Laboratorio Central muestras de jamón cocido se puede comprobar de Veterinaria (Algete) confirmó mediante PCR que conforme aumentamos la dosis de irradia- y secuenciación, a partir de muestras de hiso- ción aumenta la caída del título infeccioso del pos cloacales obtenidos el 9 de octubre, que virus; sin embargo aplicando la dosis máxima se trataba de un virus influenza A, subtipo H7, legalmente permitida de 10 KGy, sólo se con- de alta patogenicidad (IAAP). Posteriormente, sigue inactivar entre 2.04-2.15 log en el caso se aisló el virus en huevos embrionados, iden- 10 tificándose como un H7N7 mediante inhibición del HAV y entre 2.44-2.60 log10 para el MNV-1. Dosis elevadas de hasta 16 KGy de irradiación de hemaglutinación e inhibición de la neurami- aumentan la inactivación de los virus HAV y nidasa; confirmándose por secuenciación una MNV-1, siendo este último donde se alcanzan cepa IAAP. Las actuaciones llevadas a cabo de sacrificio, limpieza y desinfección, se acom- hasta 4 log10 de inactivación (3.28-3.44 y 3.89- 4.17, respectivamente). Respecto al uso de pañaron de numerosos muestreos de control, luz pulsada, se han aplicado dosis crecientes tanto de animales como de instalaciones, en desde 0.34 a 20 J/cm2. Dosis de 10 y 20 J/cm2 las distintas naves de la explotación afectada. producen inactivaciones de alrededor de 2 y 4 Como resultado de estos análisis se detectó, en las naves 3 y 4, un virus de Influenza Aviar log10, respectivamente, tanto para el HAV como el MNV-1. de Baja Patogenicidad (IABP) H7, distinto del ya mencionado de alta patogenicidad. En la PALABRAS CLAVE: Seguridad alimentaria, nave 4 todos los resultados positivos por PCR Norovirus, Hepatitis A resultaron ser un virus IABP H7, mientras que en la nave 3 coexistían ambas cepas, tanto la CO/62 de baja como la de alta patogenicidad. La co- existencia en la misma explotación de virus Caracterización molecular de la H7 IAAP y IABP es una información de gran hemaglutinina y la neuraminidasa interés epidemiológico, avalando la teoría del del virus causante del primer origen de virus de alta patogenicidad a partir brote de influenza aviar de alta de mutaciones de la cepa de baja patogenicidad, tras la introducción de éste en las na- patogenicidad-H7N7- en gallinas ves 3 y 4 de la explotación. Para avanzar en ponedoras en España la caracterización molecular del virus causan- Tena-Tomás C*, Buitrago D, Rocha te de este brote, se determinó la secuencia A, Sánchez A, Vigo M, Agüero M nucleotídica completa de los genes de la He- maglutinina y de la Neuraminidasa de la cepa Laboratorio Central de Veterinaria, IAAP H7N7 aislada en el foco. Las secuencias Algete, España (1)

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obtenidas no mostraron homología del 100% se ve reflejado en los numerosos estudios con con ninguna otra conocida, siendo, en el caso aves y aislados norteamericanos; por el contra- de la Hemaglutinina, la cepa A/goose/Czech rio son muchos menos los estudios realizados Republic/1848/2009(H7N9), causante del foco con aislados virales y aves silvestres euro-me- de IA en la República Checa, 2009, la más diterráneos. La alta patogenicidad de los aisla- cercana filogenéticamente, con una homología dos americanos en cuervos americanos ha sido del 97%, y , en el caso de la neuraminidasa, la asociada a una mutación puntual: la sustitución cepa A/mute swan/Hungary/5973/2007(H7N7), de treonina (Thr) por prolina (Pro) en la posición con un 96% de homología. Asimismo se deter- 249 de la proteína NS3, siendo hasta la fecha minó la secuencia de la hemaglutinina de todos el único determinante de patogenicidad descri- los virus IA subtipo H7 aislados en España en to para el virus West Nile. Este determinante el período 2004-2010, realizándose un estudio de alta virulencia está presente en los aislados filogenético con todos los aislados europeos IA mediterráneos más recientes. Resultados obte- subtipo H7 de los últimos 10 años. nidos en nuestro laboratorio indican que la presencia de prolina en la posición 249 de la NS3 PALABRAS CLAVE: Influenza Aviar Alta por sí sola no resulta en un aumento de patoge- Patogenicidad (IAAP), H7, secuenciación, nicidad. El gorrión común (Passer domesticus) filogenia es un modelo experimental idóneo ya que es un hospedador competente para el virus West CO/63 Nile, es abundante en todo el área mediterrá- nea, comparte hábitat con el hombre y ha sido Análisis experimental de la infección utilizado extensamente en estudios experimen- por distintas cepas del Virus West tales de infección con cepas norteamericanas Nile (Nilo Occidental) en el gorrión del virus. Los objetivos del presente estudio común (Passer domesticus) fueron: 1) reproducir el modelo experimental de infección por virus West Nile desarrollado del Amo J.* (1), Llorente F. (1), Figuerola en Norteamérica, basado en el uso del gorrión J. (2), Soriguer R. (2), Moreno A. (3), común, empleando ejemplares capturados en Cordioli P. (3), Jiménez M.A. (1) España; 2) utilizar este modelo para comparar Centro de Investigación en Sanidad Animal el curso de la infección producida por distintas del Instituto Nacional de Investigación y cepas euro-mediterráneas y la cepa Norteame- Tecnología Agraria y Alimentaria (CISA- ricana de referencia; 3) evaluar la relevancia de INIA),Valdeolmos (Madrid), España (1), la presencia de prolina en la posición 249 de Estación Biológica de Doñana- CSIC, la proteína NS3 en términos de patogenicidad Sevilla, España (2), Istituto Zooprofillattico para el gorrión común. Para ello, se inocularon Sperimentale Della Lombardia e deel’Emilia grupos de 8 gorriones con diferentes aislados Romagna (IZSLER), Brescia, Italia (3) del virus West Nile obtenidos en España (Sp07, Pro), Italia (It08, Pro e It09, Thr) y Norteamérica El virus West Nile es el Flavivirus más exten- (NY99, Pro). Como resultado, todos los gorrio- dido del planeta, causando una enfermedad nes inoculados desarrollaron viremias detecta- reemergente en Europa con un aumento notables, mostrando diferencias significativas entre ble de casos en humanos, équidos y aves en la cepa americana y las mediterráneas. No se los últimos años. Desde la epidemia de 1999 observaron diferencias significativas en los por- en Norteamérica, el interés por conocer el de- centajes de mortalidad causados por las distin- sarrollo de la enfermedad en sus principales tas cepas. Conclusiones: Este estudio confirma reservorios, las aves, ha ido en aumento. Esto

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que el gorrión común es un buen modelo para podrían ser las mismas en las que se ha detec- el estudio de la infección por virus West Nile. tado el virus Toscana (VTOS). También en es- Además, apunta a que la infección causada por tas zonas se ha encontrado presencia de otro las cepas euro-mediterráneas difiere con res- flebovirus: el virus Arbia (VARB). pecto a la cepa de referencia norteamericana, y El análisis de la secuencia completa de VGR ha sugiere que la mutación Pro en la posición 249 permitido caracterizarle genéticamente como de la proteína NS3 no es factor suficiente para un miembro del complejo de Nápoles al que el aumento de la virulencia. Es necesario aco- pertenece también el mencionado VTOS y otros meter nuevos estudios que ayuden a descubrir virus como Massilia (VMAS), recientemente otros factores asociados con la patogenicidad descrito en Francia (Charrel et al, Vector Borne de este virus Zoonotic Dis. 2009; 9:519-30). VGR es idéntico a VMAS en dos (L y S) de los tres segmentos PALABRAS CLAVE: virus West Nile, que conforman su genoma. Sólo se diferencian patogénesis, proteína NS3 en el fragmento M que codifica la glicoproteína de la envuelta. La diferencia genética en este CO/64 fragmento hace pensar que no es debido a la acumulación de mutaciones puntuales sino, Caracterización antigénica y más bien, a un evento de reordenamiento ge- genética de los virus Granada y nético por intercambio de segmentos. Diversas Arbia circulantes en España pruebas antigénicas han permitido corrobo- rar que VGR pertenece al serogrupo Nápoles Sánchez-Seco MP* (1), Palacios G (2), donde se encuentran virus patógenos para el Travassos da Rosa A (3), Busquets N hombre como VTOS y el virus Nápoles, consti- (4), Tesh RB (3), Aranda C (5), Collao X tuyendo una especie diferenciada. Además, se (6), Pérez-Ruiz M (7), Sanbonmatsu S (7), han encontrado anticuerpos neutralizantes de Navarro JM (7), de Ory F (1), Cardeñosa N VGR en la población de las áreas de Granada y (8), Molina R (9), Lipkin IW (2), Tenorio A (1) Barcelona indicando que es un virus capaz de Virología, Centro Nacional de infectar al hombre. Su potencial patogénico, sin microbiología,(ISCIII), Madrid (1), Columbia embargo, aún no se conoce. Por el contrario la University, Nueva York, USA (2), University búsqueda de VARB, que pertenece al comple- of Texas medical Branch, Galveston, USA jo de Salehabad, en sueros de población sana (3), Centre de Recerca en Sanitat Animal, de la provincia de Barcelona no ha dado resul- Barcelona (4), Servicio de Control de Mosquitos, tados positivos tal como se esperaba ya que Barcelona (5), Universidad de Valparaíso, Chile este virus sólo se ha detectado previamente en (6), Servicio Microbiología, Hospital Virgen flebotomos en Italia y Albania y nunca se ha ende las Nieves, Granada (7), Generalitat de contrado en animales o en el hombre (Verani et Cataluña, Barcelona (8), Parasitología, Centro al, Parassitologia. 1991; 33 Suppl:513-8; Papa Nacional de microbiología,(ISCIII), Madrid (9) et al, ClMI, 5 NOV 2010, DOI: 10.1111/j.1469- 0691.2010.03371.x). El virus Granada (VGR) es un flebovirus recientemente descrito (Collao et al, Am J Trop Med La distribución de estos virus en nuestro país Hyg. 2010; 83:760-5) que circula en flebotomos parece ser amplia ya que han sido encontrados de, al menos, Granada y Barcelona, estando en las únicas regiones donde se ha realizado la probablemente presente en otras zonas del búsqueda en el vector. Además en un pequeño país donde se halle distribuido su vector y que estudio realizado en Ibiza se encontraron fle-

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botomos en los que se pudo amplificar una re- ciélagos. Así, la vigilancia de reservorios natu- gión del gen L de un flebovirus similar a VMAS rales de posibles CoV zoonóticos es necesaria y VGR lo que es compatible con la presencia de no sólo para esclarecer la ecología de estos cualquiera de ellos en esta zona. virus, sino también para permitir una detección PALABRAS CLAVE: flebovirus, arbovirus, temprana de virus que podrían suponer una caractarización nuevos virus amenaza para la salud pública. Para determinar la presencia y distribución de posibles CoV zoonóticos en murciélagos Ibéricos, se captu- CO/65 raron 576 individuos de 26 especies diferentes en 13 localizaciones distintas de España entre Detección de Alpha y Beta 2004-2007. Se recogieron 390 muestras orofa- coronavirus en múltiples especies ríngeas entre 2004 y 2007 y 216 muestras de de murciélagos ibéricos heces en 2007. Se ha diseñado una pan-CoV Falcón A.* (1), Vázquez-Morón S. (2), PCR anidada en una zona conservada del ge- Casas I. (2), Aznar C. (2), Ruiz G. (2), Pozo noma que corresponde al gen de la polimerasa F. (2), Juste J. (3), Ibáñez C. (3), Garin I viral (RdRp). Se ha determinado la presencia (4), Ahiartza J. (4), Echevarría J.E. (2) de CoV en 26 de las 30 especies de murciéla- go conocidas en la península Ibérica, y se han Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, encontrado 14 muestras de 9 especies dife- Madrid.Centro Nacional de Microbiología, (1) rentes positivas para RNA de CoV. El análisis Instituto de Salud Carlos III, Madrid. , filogenético de estos datos muestra una gran Centro Nacional de Microbiología, Instituto (2) diversidad y distribución de alpha y betacorona- de Salud Carlos III, Madrid. , Estación virus, así como la existencia de seis grupos filo- Biológica de Doñana, CSIC, Sevilla, (3) genéticos diferentes para los CoV encontrados Andalucía. , Departamento de Zoología y en España. Algunos de los virus detectados se Biología Celular Animal, Universidad del País (4) asocian a grupos ya descritos en otros países Vasco (UPV/EHU) Leioa, País Vasco. europeos o en China. Además, uno de los virus En Noviembre de 2002 apareció en China el encontrados se ha detectado en la especie res- Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS), tringida únicamente a la península Ibérica y el extendiéndose rápidamente y llegando a afec- norte de África, Eptesicus isabellinus. Los CoV tar a 8.096 personas en 29 países y causando detectados en Hypsugo savii y Eptesicus isa- 774 muertes. En marzo de 2003 se identificó un bellinus pertenecen a los betacoronavirus pero nuevo coronavirus (SARS-CoV) como el agente no se agrupan con los virus conocidos, aunque causal de la enfermedad. Los CoV de murciéla- no tiene entidad suficiente como para formar un go parecen ser los precursores de SARS-CoV y nuevo grupo. Este dato podría sugerir que es- otros CoV que cruzaron la barrera interespecie tos dos virus son cabeza de serie de otros dos desde reservorios animales a la población hu- nuevos grupos. Muy interesantemente, se ha mana. Desde la aparición del SARS-CoV, dada observado la aparición de un nuevo grupo de la elevada mortalidad asociada al mismo, se ha alphacoronavirus no descrito hasta ahora, en el incrementado el interés de la salud humana y que se incluyen los cinco virus detectados en animal por los CoV. La relevancia y posible re- individuos de la especie Nyctalus leisleri, uno emergencia del virus pándémico SARS-CoV y detectado en Myotis myotis y uno detectado en otros virus emergentes de origen zoonótico ha Pipistrellus kuhlii. activado los sistemas de vigilancia de patóge- PALABRAS CLAVE: Coronavirus , nos en animales salvajes, incluyendo los mur- Murciélago, Virus emergentes

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CO/66 campo o de animales infectados o vacunados experimentalmente. Hasta el momento no se Identificación de epítopos en la conoce la función de estos anticuerpos, pu- proteína N del Virus de la Fiebre del diendo estar involucrados en mecanismos de Valle del Rift (RVFV) mediante el evasión viral frente a la respuesta inmune del empleo de anticuerpos monoclonales huésped. y una librería de fagos En este trabajo, hemos desarrollado anticuer- Lorenzo Alguacil G*, López Gil E, pos monoclonales (AcMo) frente a la proteína Hevia E, Boshra H, Brun Torres A N y los hemos utilizado para caracterizar las CISA-INIA, Valdeolmos (1) regiones inmunodominantes presentes en ésta mediante el empleo de una librería de fagos El virus de la fiebre del Valle del Rift es un ar- que expresan péptidos de 12 aminoácidos. Los bovirus perteneciente a la familia Bunyaviridae. resultados preliminares obtenidos indican que Se transmite por la picadura de mosquitos y todos ellos mapean en una región comprendi- desencadena una grave enfermedad tanto en da entre los aa 60-80 de la proteína viral. Ade- animales como en el hombre. La distribución más, estos AcMo fueron capaces de detectar geográfica del virus se ha extendido en los úl- un fragmento recombinante de la proteína N timos años, incluyendo la mayoría de países expresado en baculovirus que incluye esta re- del continente africano, Madagascar y desde gión cuando fueron empleados en ensayos de el año 2001, la Península Arábiga. En los últi- western blotting confirmando así los datos ob- mos años se han producido brotes con mayor tenidos previamente en la librería de fagos. frecuencia en los que ha aumentado el nº de casos humanos y la gravedad de éstos. Este Así pues, el epítopo identificado en este trabajo factor unido a otros como: la diversidad de mos- constituye una herramienta útil para el diseño quitos presentes en otros continentes (Europa de nuevos métodos de diagnóstico más especí- y América) que pueden actuar como vectores ficos, sencillos y económicos frente a RVFV. competentes y de especies animales susceptibles, el aumento del tráfico de ganado entre PALABRAS CLAVE: zoonosis, epítopo, países y la influencia del cambio climático, con- inmunodominante firman el potencial de este virus para emerger e introducirse en otros países. Por todo ello, es necesario el desarrollo de nuevos métodos de prevención y detección más sensibles y rápidos frente a esta enfermedad.

Los sistemas de diagnóstico serológico están basados en la detección de anticuerpos frente a la proteína N del virus mediante ensayos de ELISA. Se trata de la proteína más abundante del virión, asociándose con el RNA del virus formando ribonucleoproteínas. Además, es una proteína de expresión temprana, altamente in- munogénica, pudiéndose detectar altos títulos de anticuerpos específicos anti-N en sueros de

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Interacción virus-huésped (II)

Moderadores Dr. Cecilio López Galíndez Dr. Eduardo Bejarano

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Microbe-host interactions trol. Likewise, when cellular immune responses in persistent infection decrease due to HIV infection, the likelihood to develop active tuberculosis (TB) is markedly (1), (2) Andreas Meyerhans increased. In transplant patients who are per- Department of Virology, University of manently immunosuppressed by medication (1) the Saarland, Homburg, Germany to avoid transplant rejection, control of CMV is ICREA Infection Biology Group, Department of associated with the level of virus-specific CD4 Experimental and Health Sciences, University T cells. Pompeu Fabra, Barcelona Biomedical Research Park, 08003 Barcelona, Spain (2) In this presentation, previous work of our group on the quantification of antigen-specific T cell Many infectious agents establish a persistent responses and their relationship to pathogen infection in humans. Examples that are of parti- control will be summarized. Then I will shift from cular clinical importance are the human immunodeficiency virus (HIV), the hepatitis C virus this static view to a dynamic view of infections (HCV), herpes viruses like the cytomegalovirus and present the progress of present work that (CMV) and the bacterium Mycobacterium tu- aims to define dynamic quality criteria for lym- berculosis (MTB). In all these cases, innate and phocyte responses using novel analysis tools of adaptive immune responses are usually insuffi- CFSE histograms. cient to eliminate the invading microorganism Selected articles during primary infection. This inability of elimi- nation then results in a dynamic balance within HT Banks et al. Estimation of Cell Proliferation the host between microbe expansion and mi- Dynamics Using CFSE Data. Bull Math Biol. 73, crobe-specific adaptive immune responses that 116-150 (2011). may be stably maintained for years without the need for medical interventions. However a slight M Sester et al. Challenges and perspectives for shift in favour of the microbe will rapidly distort improved management of HIV/TB coinfection. this dynamic balance and lead to overt disease. Eur. Respir. J. 36, 1242-1247 (2010) This is well documented by a large number of experimental observations from several groups. C Geldmacher et al. Rapid depletion of Myco- For instance, in the animal model of HIV infec- bacterium tuberculosis-specific T helper 1 cell tion, depletion of CD8 T lymphocytes in rhesus responses during HIV-1 infection. J. Infect. Dis. macaques that are persistently infected with the 198, 1590-1598 (2008). simian immunodeficiency virus (SIV), leads to an increase in virus load. HIV viremia is inver- C Geldmacher et al. CD8 T cell recognition of sely correlated with CD4 T cell proliferative res- multiple epitopes within specific Gag regions is ponses and the number of epitopes in the viral associated with maintenance of a low steady- gag gene recognised by MHC class I-restricted state viremia in HIV-1 seropositive patients. J. CD8 T cells. Multi-clonal, HIV envelope-specific Virol. 81, 2440-2448 (2007). B cells producing broadly neutralizing IgG antibodies were detected in patients with low to T Breinig et al. Antigen-specific T cell respons- intermediate viral loads suggesting a beneficial contribution by the humoral immune response. es: determination of their frequencies, homing In HCV infection, both virus-specific CD4 and properties, and effector functions in human CD8 T cells are required for efficient viral con- whole blood. Methods 38, 77-83 (2006).

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CO/67 lular via GAGs siendo los clusters de residuos básicos presentes en el primer dominio inmu- La proteína secretada de unión a noglobulina los responsables de dicha interac- interferón del virus vaccinia se une a ción. Además, la mutación de los motivos de la superficie celular a través de GAGs interacción con GAGs no afecta a la capacidad de unir y bloquear IFN. El análisis de las pro- (1) (2) (1) Montanuy I* , Alejo A , Alcamí A teínas de unión a IFN codificadas por el virus Centro de Biología Molecular Severo de la viruela, el virus monkeypox y el virus ec- Ochoa (CSIC-UAM), Madrid (1), Centro de tromelia ha demostrado que existe una conser- Investigación en Sanidad Animal, Instituto vación funcional de los sitios de unión a GAGs Nacional de Investigación y Tecnología en poxvirus altamente virulentos en diferentes Agraria y Alimentaria, Valdeolmos, Madrid (2) especies animales.

El sistema de defensa mediado por interferón PALABRAS CLAVE: inmunoevasión, poxvirus (IFN) es uno de los principales efectores de la respuesta inmunológica innata. Para sobrevivir, la mayoría de los virus contrarrestan este me- CO/68 canismo de defensa neutralizando la señaliza- Characterization of the O-GlcNAc ción mediada por IFN a diferentes niveles. Los modification of the coat protein of poxvirus expresan proteínas intracelulares así the potyvirus Plum pox virus and como proteínas secretadas que bloquean esta ruta. La proteína soluble de unión a IFN de tipo its relevance for the viral infection I codificada por los poxvirus se ha descrito pre- Pérez José de Jesús * (1), Juárez Silvia (2), viamente como un factor de virulencia in vivo. Ciordia Sergio (2), García Juan Antonio (1) Esta proteína inmunomoduladora, llamada B18 Genética Molecular de plantas, Centro en el virus vaccinia (VACV), es una glicopro- Nacional de Biotecnología, Madrid teína que pertenece a la superfamilia de las (1), Proteómica, Centro Nacional inmunoglobulinas y de secuencia no relacio- de Biotecnología, Madrid (2) nada con los receptores celulares de IFN de tipo I. La proteína es secretada por las células The addition of O-Linked N-acetylglucosamine infectadas e interacciona con IFN en solución. (O-GlcNAc) residues is a post-translational mo- Además, B18 es capaz de unirse a la superfi- dification of proteins widely distributed in eukar- cie de las células y bloquear la acción del IFN yotic cells. O-GlcNAcylation, like phosphoryla- impidiendo el establecimiento de un estado an- tion, is a dynamic modification occurring in tiviral en células adyacentes no infectadas. Sin nucleus and cytoplasm, which has been studied embargo, el mecanismo por el cual B18 se une mainly in mammals, and a large number of O- a la superficie celular no se conoce. Mediante GlcNAc modification sites have been mapped experimentos de resonancia del plasmón de in proteins from these organisms. In plants, tar- superficie en un biosensor BIAcore con glico- gets of O-GlcNAcylation are largely uncharac- saminoglicanos (GAGs) y ensayos de unión a terized. We have previously shown that the O- células que expresan o no GAGs en su super- linked N-acetylglucosamine transferase (OGT) ficie hemos determinado que la proteína B18 SEC is responsible for the modification of the interacciona con GAGs. También describimos capsid protein (CP) of Plum pox virus (PPV) in que la región amino-terminal de la proteína es Arabidopsis thaliana, and PPV infection was la responsable de la unión a la superficie ce- impaired in OGT-deficient (sec-) Arabidopsis.

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Site-directed mutagenesis and Mass Spectro- CO/69 metry analyses identified several putative O- GlcNAcylation sites in the first 65 aa of PPV CP. Interacción del virus vaccinia CP O-GlcNAcylation appeared to be completely con el hospedador: papel de abolished in a PPV multiple mutant (PPV CP7- la fosfatasa dual DUSP1 T/A) in which threonines T19, T24, T41, T50, Cáceres A* (1), Caelles C (2), Esteban M (3) T53, T54 and T58 were replaced by alanines. Biologia Molecular y Celular, Centro The O-GlcNAcylation-deficient PPV mutant in- Nacional de Biotecnología, Madrid (1), fected Nicotiana clevelandii, Nicotiana bentha- Señalización Celular, IRB, Barcelona miana, and Prunus persica without apparent (2), Biología Molecular y Celular, Centro (3) defects. In contrast, this mutant infected poorly Nacional de Biotecnología, Madrid A. thaliana Col-0. The host-specific relevance of La fosfatasa dual DUSP1, perteneciente a la O-GlcNAcylation of PPV CP is further suppor- cascada de señalización de las MAP quinasas, ted by the result of mixed infections in different ha sido identificada mediante análisis por mi- plants. Whereas PPV wild type and CP7T/A croarrays y validada por RT-PCR, como uno de could coexist in N. clevelandii, P. persica and los factores celulares que se induce selectiva- A. thaliana sec-, wild type PPV outcompeted mente en respuesta a la infección por el virus va- the mutant virus in wild type A. thaliana Col-0. ccinia estirpe salvaje VACV-WR y los mutantes atenuados MVA y NYVAC. DUSP1 defosforila Experiments of incubation in vitro of extracts of específicamente residuos presentes en MAP infected plants suggest that O-GlcNAcylation quinasas y desempeña una labor esencial tanto could be affecting the stability of PPV virions in en la respuesta inmune innata como adaptati- a host specific way. We observed that the CP of va en el hospedador ante diversos patógenos. PPV CP7T/A is much more unstable than that En nuestro estudio hemos utilizado fibroblastos of wild type PPV in extracts of A. thaliana Col-0, embrionarios de ratón (MEFs) knock-out (KO) whereas the stability of both CPs is quite simi- para DUSP1 y ratones KO con el objetivo de lar in extracts of N. clevelandii. The stabilities of evaluar el papel que desempeña la fosfatasa durante la infección por el virus vaccinia. En cé- wild type and CP7T/A CPs were quite similar in lulas en cultivo se ha observado que la ausen- extracts of A. thaliana sec-, suggesting that the cia de DUSP1 está relacionada con una menor instability of the CP7T/A CP is the result of the replicación de VACV-WR y con un cambio en O-GlcNAcylation deficiency rather than of the el patrón de fosforilación de las MAP quinasas amino acid substitutions. All these results are durante la infección. En el modelo murino, la in agreement with a fine-tuning effect of CP O- inoculación por vía intranasal con el virus va- GlcNAcylation on PPV infection, facilitating its ccinia produce una mayor pérdida de peso y una mayor mortandad en los ratones DUSP1 adaptation to different hosts and environmental KO. Asimismo, hemos observado un aumento conditions. en la secreción de citoquinas pro-inflamatorias en los ratones DUSP1 KO a tiempos tempra- PALABRAS CLAVE: O-Linked nos post-infección y un cambio en la respuesta N-acetylglucosamine (O-GlcNAc), O-linked inmune adaptativa generada por el virus. Estos N-acetylglucosamine transferase (OGT), Plum resultados sugieren que DUSP1 participa en la pox virus (PPV) modulación de la cascada de señalización de

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las MAP quinasas, como mecanismo de defen- sis proteica. Los resultados obtenidos median- sa innata antiviral frente a poxvirus. te la utilización de vectores inducibles del virus vacunal demuestran que la coexpresión de la PALABRAS CLAVE: DUSP1, Vaccinia proteína VP3 contrarresta la actividad proapop- tótica de VP2 previniendo la fosforilación de CO/70 eIF2alfa y manteniendo una tasa de síntesis La proteína VP3 del virus de la proteica similar a la observada en cultivos in- bursitis infecciosa modula la fectados con el vector parental. Esta actividad respuesta antiviral a través de su es independiente de su interacción con VP2. La dominio de unión al dsRNA capacidad de unión a dsRNA y su efecto sobre la fosforilación de eIF2alfa sugieren una posible Busnadiego I*, Maestre A.M., Ro- homología funcional de VP3 con otras proteí- dríguez D, Rodríguez J.F. nas de origen viral responsables del control de Departamento de Biología Molecular y la respuesta antiviral innata celular como los Celular, Centro Nacional de Biotecnolo- polipéptidos NS1 o E3L codificados por el virus gía, CSIC, Darwin 3, 28049 Madrid. (1) de la gripe y el virus vacunal, respectivamente. Para analizar esta posibilidad hemos utilizado El virus de la bursitis infecciosa (IBDV), un im- un virus vacunal recombinante que carece del portante patógeno aviar perteneciente a la fa- gen E3L (VVDE3L) y que presenta un rango milia Birnaviridae, carece de envuelta y posee de hospedador muy restringido con respecto al un genoma dsRNA bisegmentado que codifi- del virus parental. Los resultados obtenidos deca cinco proteínas (VP1-5), encerrado en una muestran que la expresión de la proteína VP3 única cápsida icosaédrica. La proteína VP3 rescata de forma eficaz la capacidad del virus (28-kDa), es un polipéptido dimérico estructu- E3L para replicar en diferentes líneas celulares. ral, muy conservado entre los birnavirus, que Finalmente, mediante la introducción de muta- carece de homólogos estructurales conocidos. ciones basadas en la estructura cristalográfica Esta proteína juega un papel central en el pro- de la proteína, hemos determinado de forma ceso de ensamblaje viral actuando a diversos precisa la topología del dominio de unión a ds- niveles: (i) como proteína de andamiaje durante RNA. Está formado por cuatro residuos elec- la morfogénesis de la cápsida; (ii) dirigiendo la tropositivos expuestos en la superficie del dí- encapsidación/activación de la RNA polimera- mero. Una versión mutante de VP3 incapaz de sa viral (VP1); y (iii) recubriendo los segmen- unir dsRNA también carece de la capacidad de tos de dsRNA genómicos para dar lugar a los contrarrestar la respuesta pro-apoptótica de la complejos ribonucleoproteícos que ocupan el proteína VP2 y de reemplazar funcionalmente interior de la partícula viral. Resultados previos al E3L del virus vacunal. Los resultados obte- del laboratorio mostraron que la proteína de la nidos abren una nueva vía para la caracteriza- cápsida (VP2), es un potente inductor de apop- ción de la interacción de IBDV y otros birnavirus tosis. En el presente trabajo, hemos determina- con el sistema inmune de sus huéspedes así do que la actividad pro-apoptótica de VP2 está como para la caracterización del papel funcio- directamente asociada a la fosforilación de la nal de VP3. subunidad alfa del factor eIF2 (eIF2alfa) que desencadena una potente inhibición de la sínte- PALABRAS CLAVE: IBDV, VP3, apoptosis

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CO/71 terium tumefaciens. No acumulación viral ni expresión de síntomas en las plantas inocula- Resistencia a la infección sistémica das. Se ha estudiado en detalle la resistencia a por el begomovirus tomato TYLCV-IL en el caso de la entrada EELM-889 yellow leaf curl virus en el tomate y se ha demostrado un control genético relati- silvestre Solanum habrochaites vamente sencillo, con la implicación de dos loci asociada a la proteína viral C4 independientes, uno dominante y otro recesi- vo. Además, se ha comprobado que estos loci Tomás D.M. (1), Cañizares C. (1), Abad J. (2), difieren con el del gen de resistencia más fre- (1) (1) Fernández-Muñoz R. , Moriones E.* cuentemente utilizado para el control de TYLCD Instituto de Hortofruticultura Subtropical y en los cultivares comerciales de tomate, el gen Mediterránea La Mayora, Consejo Superior Ty-1, por lo que sería posible la combinación de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA- de las resistencias para un control más efectivo CSIC), Estación Experimental La Mayora, de la enfermedad. Además, la resistencia se ha 29750 Algarrobo-Costa, Málaga, Spain (1), Zeta mostrado efectiva frente a todas las diferentes Vegetable Seeds, El Ejido, Almería, Spain. (2) especies/cepas causantes de TYLCD detectadas en el Mediterráneo, no observándose sín- La enfermedad del rizado amarillo del tomate tomas en ningún caso aunque sí acumulación (TYLCD) es una enfermedad emergente en los viral sistémica en las plantas agroinoculadas cultivos de tomate de zonas cálidas del mun- con alguna de ellas. Mediante el uso de quime- do, en los que causa pérdidas cuantiosas. La ras virales y mutantes de expresión construidos dispersión de la enfermedad se asocia con la en base a los dos tipos virales que difieren en emergencia del insecto vector, la mosca blan- su capacidad de ocasionar infección sistémica ca (Hemiptera, Aleyrodidae) Bemisia tabaci y (las cepas IL y Mld de TYLCV), se ha demos- se conoce la implicación de al menos diez es- trado la implicación de la proteína multifuncio- pecies/cepas virales del género Begomovirus nal C4 de la cepa Mld en la capacidad del virus (familia Geminiviridae), siendo la más frecuen- para acumularse en tejidos no inoculados. Se te la cepa IL del virus del rizado amarillo del discutirán los posibles mecanismos implicados tomate (tomato yellow leaf curl virus, TYLCV- en la resistencia. IL). El control de TYLCD a través de los méto- dos tradicionales de manejo de cultivo es muy PALABRAS CLAVE: tomato yellow leaf curl complicado y el uso de resistencia genética en disease, resistencia, tomate el huésped es la estrategia más deseable. Sin embargo, hay un panel muy limitado de fuentes de resistencia para su control, y aun más limita- CO/72 do el número de ellas con posibilidad de utiliza- La proteína celular hCLE se empaqueta ción comercial. Por ello, en este trabajo, se ha en los viriones del virus de la gripe y realizado un amplio escrutinio de especies silvestres relacionadas con tomate y se han loca- es necesaria para la replicación viral lizado dos entradas de Solanum habrochaites, Rodriguez A*, de Lucas S, Pérez-González EELM-388 and EELM-889, con un buen nivel A, Pérez-Cidoncha M, Ortin J, Nieto A de resistencia a TYLCV tanto en condiciones Centro Nacional de Biotecnología naturales como en condiciones experimentales (CSIC), Cantoblanco, Madrid, España y inoculando las plantas con el vector natural o Ciber de Enfermedades Respiratorias, con un clon infectivo por medio de Agrobac- Mallorca, Illes Balears, España. (1)

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La polimerasa del virus de la gripe es un tríme- para la replicación del virus de la gripe y repre- ro compuesto por las subunidades PB1, PB2 y senta uno de los pocos ejemplos de factores de PA. La polimerasa viral, junto con la nucleopro- transcripción celular empaquetados dentro de teína y el RNA viral forman las ribonucleoproteí- los viriones de virus con genoma RNA. nas (RNPs) que llevan a cabo los procesos de PALABRAS CLAVE: Virus de la gripe, transcripción y replicación del RNA viral. Para Interacción virus-célula, Replicación viral llevar a cabo estos procesos la polimerasa viral interacciona con distintos factores celulares implicados en la transcripción celular, entre ellos con la propia RNA polimerasa (RNAP II). En el laboratorio hemos descrito que la proteína celular hCLE se asocia tanto a la subunidad PA de la polimerasa del virus de la gripe como a la RNAP II, modulando positivamente la actividad de esta polimerasa celular.Con el objetivo de determinar la relevancia fisiológica de estás interacciones hemos estudiado el papel de hCLE en la infección por el virus de la gripe. Median- te experimentos de co-inmunoprecipitación de proteínas hemos determinado que hCLE, ade- más de interaccionar con la subunidad PA, se asocia al complejo de la polimerasa viral y por microscopía confocal observamos que hCLE y las RNPs virales colocalizan tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula infectada. Utilizando técnicas de silenciamiento génico, observamos que la actividad de las RNPs virales reconstituidas en células con hCLE silen- ciada disminuye aproximadamente un 50%. En estas condiciones se observa una reducción de 10 veces en los títulos virales, así como en la producción de partículas virales que disminuye entre 50 y 70%, lo que podría indicar que los viriones producidos en las células con hCLE silenciadas son menos infectivos. Además observamos que la acumulación de la proteína hCLE aumenta durante la infección por el virus de la gripe. Finalmente, mediante estudios bio- químicos de partículas virales purificadas e in- munoelectro microscopía de células infectadas determinamos que hCLE se encuentra presente en los viriones del virus de la gripe liberados de células infectadas, fuertemente asociada a las RNPs virales. Conjuntamente, estos datos indican que hCLE es una proteína celular relevante

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Sesión conjunta con la Sociedad Española de Microbiología (SEM) Metagenómica ambiental y clínica

Moderadores: Dr. Albert Bosch Dr. Ricardo Guerrero

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Estudio metagenómico de viral en un lago de la Antártida y la identificación la comunidad de virus en de nuevos virus ssDNA de pequeño tamaño re- lagos de la Antártida presentan el primer paso para entender mejor el papel que los virus juegan en estos ecosis- Antonio Alcami y Alberto López Bueno temas extremos y determinar si estos virus han Alberto López-Bueno (1), Javier Tamames evolucionado en el continente antártico de for- (2), David Velázquez (3), Andrés Moya (2), ma independiente durante millones de años. Antonio Quesada (3) and Antonio Alcamí (1). Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (Consejo Superior de Investigaciones Human microbiome: our other genome Científicas-Universidad Autónoma de Madrid), Campus de Cantoblanco, Madrid Chaysavanh Manichanh (1); Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Institut de Recerca Hospital Universitari Biología Evolutiva, Universidad de Valencia, Vall d’Hebron, Barcelona Valencia (2); Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, Madrid (3) The human microbiome is the collective genome of all microorganisms living at the multiple La Antártida es un continente que ha estado sites of the human body (skin, nasal cavity, oral aislado durante millones de años y representa cavity, gastrointestinal tract and vagina). The- uno de los últimos ecosistemas prístinos de la se microorganisms are estimated to outnumber Tierra. Estudios recientes demuestran que los human somatic and germ cells by a factor of virus son las entidades biológicas más abun- ten. Human and their commensal microorga- dantes del planeta y controlan las comunida- nisms have evolved together over the last two des microbianas. Sin embargo, la naturaleza million years and have become dependent on genética de los virus en ecosistemas antárticos one another. Interaction between humans and era desconocida. Hemos realizado un estudio these bacteria is essential to many aspects of metagenómico de la comunidad de virus del normal ‘mammalian’ physiology, ranging from lago Limnopolar, en la Península Byers (Isla metabolic activity to immune homeostasis. Livingston, Antártida), una región de importan- Ecological or genetic changes that disturb this te valor ecológico con lagos que permanecen mutualism can result in disease. Nowadays, still cubiertos de hielo durante la mayor parte del very little is known about these microbial popu- año, están poco influídos por animales y tienen lations since most of their bacteria are not cul- muy bajos niveles de nutrientes. El metageno- tivable. Moreover, these populations are extrema viral (viroma) del lago Limnopolar ha mos- mely diverse and display an individual-specific trado una sorprendente diversidad de genomas composition. virales con una estimación de cerca de 10.000 especies distribuídas en el mayor número de Several international efforts had been launched familias virales encontradas hasta la fecha en in recent years to enable a comprehensive char- ambientes acuáticos naturales. La transición acterization of the human microbiome by using de un lago cubierto de hielo en primavera a un metagenomic approaches and high-throughput lago abierto en verano da lugar a cambios no- sequencing technology. The initial results have tables en la comunidad viral, que pasa de estar provided tremendous information regarding not compuesta mayoritariamente por virus ssDNA only compositional but also functional insight pequeños a estar dominada por virus dsDNA into this complex microbial ecosystem. A first grandes. La descripción de una gran diversidad catalogue of 3.3 million non-redundant micro-

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bial genes, 150-fold more genes than in the las industrias farmacéuticas, biomédicas, de human genome, has been reported by the Eu- eliminación de contaminantes, nuevas vías de ropean consortium, MetaHIT (Qin et al, Nature generar energía y otras. La validación de estos 2010). The description of 178 genomes from abordajes se ha centrado en la búsqueda de microbes that live in or on the human body had nuevas oxigenasas, que gracias a su enantio- also been reported by the Human Microbiome y regioselectividad permiten la síntesis de una Project (HMP), an American initiative (Science, amplia gama de nuevos productos químicos de 2010). Recently, MetaHIT has discovered that interés industrial. “El Metagenoma Ibérico” ha fecal metagenomes of humans could be classi- desarrollado nuevos vectores de expresión de fied within 3 large clusters or enterotypes (Na- amplio espectro de huesped así como nuevos ture, in press). hospedadores. Su combinación racional permite optimizar los procesos de rastreo de nuevas funciones. Se han aislado más de 100 nuevas proteínas, para algunas de las cuales se han Biodiversidad microbiana funcional desvelado sus propiedades cinéticas y su es- Juan-Luis Ramos. Coordinador del Proyecto tructura 3D. Las librerías y los microorganismos Consolider Ingenio Ref: CSD2007-00005 aislados se han depositado en una Colección de Cultivos asociada al proyecto. CSIC-EEZ, C/Profesor Albareda 1, 18008 Granada, España

El metagenoma microbiano determina el con- El reto del descubrimiento de junto de reacciones enzimáticas que tienen nuevos productos naturales lugar en la Biosfera en nuestro planeta. El pro- en la era de las ómicas yecto “El Metagenoma Ibérico” explora la diversidad microbiana y su metagenoma en suelos Olga Genilloud y sedimentos mareales de la Península Ibérica, Fundación MEDINA, Centro de Excelencia tanto en nichos prístinos como contaminados, en Investigación de Medicamentos usando nuevas aproximaciones experimen- Innovadores en Andalucía, P.T. tales y metodológicas. Mediante técnicas de Ciencias de la Salud, Granada microencapsulación de alta eficiencia hemos La búsqueda de nuevas moléculas con activi- separado células individuales y comunidades dad biológica a partir de compuestos de origen funcionales mínimas y las cultivamos hasta microbiano ha sido durante décadas una de formar microcolonias. En algunos sitios ana- las actividades más prolíficas para el descu- lizados se han encontrado que más del 25% brimiento de nuevos fármacos. Los productos de las secuencias del ARN 16S no se han de- naturales han sido un referente por su diversi- positado antes en bases de datos. Así mismo dad química así como también por la variedad se ha extraído ADN de estos sitios y se han de dianas farmacológicas sobre las que actúan construido más de 120 librerías metagenómi- y especificidad sobre las mismas, producto de cas, algunas de las cuales cuentan con más de un largo proceso de evolución conjunta de los 100 MB en secuencia. Este conjunto de geno- sistemas biológicos. Hoy en día supone todo tecas se utilizan para explorar la biodiversidad un reto seguir apostando por este tipo de molé- microbiana y mediante pruebas funcionales culas como punto de partida para el descubri- (tamizado molecular, selección, minado de miento de nuevos fármacos, teniendo en cuen- actividades sobre moléculas singulares) para ta la cada vez mayor dificultad de identificar explorar e identificar enzimas de interés para

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nuevas estructuras mediante aproximaciones tradicionales. No obstante la cada vez mayor disponibilidad de información de secuencias de genomas completos, y sobre la expresión y regulación de sus sistemas biosintéticos, han demostrado el carácter críptico de una gran mayoría de estos sistemas en condiciones de laboratorio, y las evidencias cada vez mayores de la existencia de otros niveles de regulación, o procesos de señalización intercelular propias del entorno natural entre otros. Todo ello ha conducido a replantear abordajes alternativos para el acceso a la expresión de esta diversidad química a través de la diversidad microbiana y de su metagenoma. La Fundación MEDINA tiene como objetivo continuar contribuyendo al descubrimiento de nuevas moléculas de origen microbiano con aplicación terapéutica, y para ello ha implemen- tado diferentes aproximaciones con las cuales responder a los actuales retos. Se discutirán diferentes enfoques que se están utilizando para acceder a la diversidad biosintética de la comunidad microbiana en el mediomabiente, desde la explotación de su metagenoma al aislamien- to y enriquecimiento in situ de microorganismos anteriormente asumidos como no cultivables, pasando por la diversas modalidades de expre- sión de su metabolismo que permitan acceder a novedosas familias de compuestos con valor biotecnológico.

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Replicación vírica (I)

Moderadores: Dr. Antonio Mas Dr. Santiago Elena

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CO/13 1. Rainsford, E. W., D. Harouaka, and G. W. Wertz. 2010. Importance of Hydrogen Bond La proteina N del Virus Respiratorio Contacts between the N Protein and RNA Ge- Sincitial Humano (VRSH) modula, nome of Vesicular Stomatitis Virus in Encapsi- a traves de su fosforilacion, la dation and RNA Synthesis. J. Virol. 84:1741- transcripción y replicacion viral 1751. 2. Rajiv G.Tawar, S. D. C. v. P. F. V. l. D.-P. n. C. K. M. H. B. G. B. D. B. J. F. E. F. Asenjo A. (1), Calvo E. (2), Cuesta I. (1), Vivo (1) (1) (1) R. 2010. Crystal Structure of a Nucleocapsid- A. , Fermín Y , Villanueva N* like Nucleoprotein-RNA complex of Respiratory CNM.ISCIII.Madrid (1), CNIC.ISCIII.Madrid (2) Syncytial Virus. Science 326:1279-1283. 3. La proteína N del VRSH puede modular la Walter, C. T., D. F. Bento, A. G. Alonso, and transcripción y replicación viral através de fos- J. N. Barr. 2011. Amino acid changes within forilaciones de vida media muy corta que mo- the Bunyamwera virus nucleocapsid protein dificarían residuos de tirosina (Y) . De las 16 differentially affect the mRNA transcription and Y que tiene la proteína N ( 391 aminoácidos) RNA replication activities of assembled ribonu- al menos la Y23 se puede detectar fosforilada cleoprotein templates. J Gen Virol 92:80-84. en partículas virales extracelulares purificadas, producidas durante la infección de células PALABRAS CLAVE: VRSH, proteína N, HEp-2 con VRSH. Esta Y y las más cercanas fosforilación, sintesis de RNA viral a ella ( Y38,Y69 eY88) pertenecientes al brazo (Y23) y dominio N-terminal (el resto) de la CO/14 proteína N, definidos en la estructura tridimensional de la misma (2), han sido sustituidas por La lucha por el espacio: extinción viral fenilalanina (F) o acido aspártico (D), median- debida a la competencia por células te mutagénesis dirigida. Las correspondientes Cuesta J. A. (1), Aguirre J. (2), Capitán proteínas variantes de sustitución así obteni- J. A.* (3), Manrubia S. C. (2) das simulan proteína N constitutivamente de- Dept. de Matemáticas, Universidad Carlos fosforilada o fosforilada, respectivamente en el III de Madrid, Leganés, Madrid (1), Centro de residuo de Y sustituido. Se ha determinado la Astrobiología, INTA-CSIC, Madrid (2), Dept. capacidad de dichas proteínas variantes para de Enginyeria Informàtica i Matemàtiques, formar nucleocápsidas, interaccionar con la Universitat Rovira i Virgili, Tarragona (3) proteína P y para que las correspondientes nucleocapsidas lleven acabo la transcripción y En esta contribución introducimos y analizamos replicación de distintos minigenomas basados un modelo espacial de propagación de infec- en el VRSH. Los resultados obtenidos sugieren ciones virales. La replicación a altas tasas de que, como ya se ha descrito en el virus de la mutación y la producción de un gran número de estomatitis vesicular (1) o en el de la buyanvera réplicas son estrategias evolutivas usuales en (3) , también la proteína N del VRSH modula virus, que les permiten una rápida adaptación la transcripción y replicación viral aunque en a ambientes variables. Esto fuerza a las célu- este caso lo hace através de su fosforilación. las susceptibles de infección a desarrollar me- En nuestro conocimiento es la primera vez que canismos de lucha contra el virus. Es de vital se describe la fosforilación en residuos de Y de importancia entender los mecanismos que pro- la proteína N de un virus perteneciente a la fa- ducen la extinción de poblaciones virales para milia de los Paramyxovirus y la función de dicha desarrollar terapias y protocolos efectivos que fosforilación . anulen la propagación. La aproximación teórica

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más sencilla al fenómeno de la extinción viral struggle for space: Viral extinction through com- proviene de la teoría de cuasiespecies molecu- petition for cells. Phys. Rev. Lett. 106, 028104. lares (Eigen, 1971), según la cual la mutación a ritmos altos puede provocar la extinción del PALABRAS CLAVE: Propagación de fenotipo mejor adaptado. Sin embargo, la evi- infecciones, Cuasiespecies virales, Defensas dencia experimental acumulada desde enton- del hospedador ces ha dado lugar a modelos más realistas (Ei- gen, 2002; Wahl and Krakauer, 2000). Nuestro CO/15 modelo de infección viral (Cuesta et al., 2011) se basa en un nuevo mecanismo de extinción Importancia de las citidina- debido a la competición intraespecífica para desaminasas como agente infectar células susceptibles. El modelo descri- mutagénico en virus de plantas be la dinámica de un conjunto fenotípicamente Cuevas J.M.* (1), Grande-Pérez A. (2), Martín heterogéneo de virus sujeto a mutaciones be- S. (1), de la Iglesia F. (1), Elena S.F. (1) neficiosas, deletéreas y letales. Además, los hospedadores son capaces de desarrollar de- Instituto de Biología Molecular y Celular fensas contra la infección. Cuando el número de Plantas, Consejo Superior de de células accesibles es ilimitado, la población Investigaciones Científicas-UPV, Campus viral puede crecer indefinidamente para com- UPV CPI 8E, Ingeniero Fausto Elio s/n, batir un posible aumento de la resistencia celu- 46022 València, España (1), Área de lar y así evitar la extinción. Por el contrario, este Genética, Universidad de Málaga, Campus mecanismo coevolutivo desaparece cuando la de Teatinos, 29071 Málaga, España (2) geometría donde tiene lugar la propagación se Las desaminasas de la familia génica APOBEC hace explícita en el modelo. En este caso, la ejercen un papel antiviral inespecífico de diana ventaja que el virus puede obtener queda li- en mamíferos. En este trabajo, pretendemos mitada por la accesibilidad a células vecinas, examinar el posible efecto antiviral de las citi- y la extinción sobreviene cuando las defensas dina-desaminasas en plantas. En Arabidopsis celulares aumentan por encima de un umbral. thaliana existe una familia génica de citidina- Nuestros resultados pueden ser relevantes desaminasas (CDA) formada por 9 miembros, para entender la propagación de infecciones si bien el gen CDA1 presenta un nivel de expre- en cosechas o tejidos que limiten la movilidad sión muy superior al resto de los genes CDA. viral, como las hojas de plantas. Este modelo Además, como modelo experimental emplea- es, por tanto, relevante en cuanto a las implica- remos el pararetrovirus del mosaico de la coli- ciones que diferentes geometrías de propaga- flor (Cauliflower mosaic virus, CaMV) mediante ción tienen en el diseño de terapias de control dos estrategias distintas: a) experimentos de efectivas. Eigen M. (1971). Self-organization expresión transitoria de las CDAs en plantas of matter and evolution of biological macromo- de Nicotiana bigelovii infectadas con CaMV; lecules. Naturwissenschaften 58, 465-523. Ei- b) infecciones de A. thaliana transgénicas que gen M. (2002). Error catastrophe and antiviral no expresan CDAs con CaMV. En la primera strategy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13374- aproximación, el análisis del espectro mutacio- 13376. Wahl L. M., and Krakauer D. C. (2000). nal nos ha permitido observar un incremento en Models of experimental evolution: The role of la carga mutacional en aquellas plantas donde genetic change and selective necessity. Gene- se sobreexpresó el gen CDA1 en comparación tics 156, 1437-1448. Cuesta J. A., Aguirre J., con sus respectivos controles. Asimismo, tam- Capitán J. A., and Manrubia S. C. (2011). The bién se observó un incremento, pero en menor

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proporción, en las plantas donde se sobreex- Este proceso está controlado por las secuen- presaron los genes CDA2 y CDA9. Respecto cias reguladoras de la transcripción (TRSs), a la segunda aproximación, utilizamos plantas que preceden a cada gen (TRS-B) y también transgénicas en las que la actividad de todos localizadas en el extremo 3’ del líder (TRS-L). los miembros de la familia CDA es suprimida Las TRS incluyen una secuencia central con- mediante RNAi. Tras la inoculación con CaMV, servada (CS), flanqueada por secuencias va- se procesaron las plantas y se cuantificó el ni- riables. En el CoV de la gastroenteritis porci- vel de acumulación viral en las plantas trans- na transmisible (TGEV) existe un mecanismo génicas en comparación con el de las plantas general que regula los niveles de expresión de silvestres. De este análisis, no se observaron los sgmRNAs, basado en la variación en ener- diferencias significativas en la acumulación vi- gía libre durante la formación del dúplex entre ral. Como conclusión, los resultados de la pri- la TRS-L y las secuencias complementarias a mera aproximación nos muestras que las CDAs las TRS-Bs en el RNA naciente (cTRS-Bs). La presentan una cierta actividad mutagénica aná- transcripción del sgmRNA del gen N también loga a la descrita para sus ortólogos de ma- está específicamente controlada por un motivo míferos, pero su efecto antiviral no parece ser regulador de la transcripción (TRM). Este inclu- tan marcado como para afectar claramente a ye la interacción entre dos secuencias comple- la viabilidad de la población viral, en base a los mentarias de RNA: el elemento proximal (pE) y resultados de nuestra segunda aproximación. el distal (dE), localizadas a 9 y 448 nt, respectivamente, precediendo la CS del gen N (CS-N). PALABRAS CLAVE: desaminasa, virus de Se ha mostrado una correlación positiva entre planta, mutagénesis inducida por hospedador los niveles de sgmRNA N y la extensión de la complementariedad entre los elementos pE y CO/16 dE. Asimismo, la disminución de la distancia entre las secuencias pE y dE aumentó los nive- Motivos de RNA proximales y distales les del sgmRNA N. Se ha identificado un nuevo al gen N regulan la transcripción de componente esencial para la activación trans- su RNA mensajero en coronavirus cripcional del gen N, el dominio activo (AD), que consta de una secuencia de 173 nt que Mateos Gómez P.A.*, Moreno J.L., flanquea al elemento dE por el extremo 5’. La Zuñiga S., Enjuanes L., Sola I. relocalización del motivo AD justo delante de la Departamento de Biología Molecular y Celular. CS-N, en ausencia de los elementos pE y dE, Centro Nacional de Biotecnología (CNB- mantuvo la activación transcripcional del gen N, CSIC). Darwin 3, Campus de la Universidad aunque a niveles inferiores a los obtenidos con Autónoma de Madrid. 28049 Madrid (1) el motivo TRM completo. La función del motivo AD depende de su secuencia primaria y secun- La transcripción en coronavirus (CoV) incluye daria. En el laboratorio se ha propuesto un mo- un proceso de síntesis de RNA discontinuo a delo de trabajo según el cual la interacción a partir del genoma de polaridad positiva, gene- larga distancia entre los elementos pE y dE re- rando RNAs subgenómicos de polaridad nega- localizaría al motivo AD en las proximidades de tiva (sgRNA). Estos sgRNAs sirven como mol- la CS-N, donde obstaculizaría el progreso del de para generar los correspondientes RNAs complejo de transcripción durante la síntesis de de polaridad positiva, que tienen fusionada la los RNA de polaridad negativa. Ello aumentaría secuencia líder 5’ terminal del genoma al extre- la frecuencia del cambio de molde de la cade- mo 5’ de cada mRNA subgenómico (sgmRNA). na negativa de RNA naciente a la TRS-L. La

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secuencia del TRM se ha reducido al mínimo, de ácido siálico en la superficie celular. Por el alcanzando una actividad cuatro veces supe- contrario, la proteína de fusión del virus respi- rior a la del TRM original. Este TRM optimizado ratorio sincitial (F_RSV) puede producir fusión aumentó la expresión de otros genes en posi- de membranas en ausencia de la glicoproteína ciones diferentes del genoma viral. En el con- viral de unión al receptor (G). La proteína de texto del virus completo, el TRM optimizado in- crementó la expresión del gen 3a cinco veces, fusión F_RSV es única entre los paramixovirus, lo que es relevante para el diseño de vectores ya que posee dos sitios de corte multibásicos, virales basados en genomas de CoV. separados por una región de 27 aminoácidos (pep27). Previamente, se han construido una PALABRAS CLAVE: Transcripción, Coronavirus, Nucleocapsida serie de mutantes quiméricos de F_SeV en los que se han insertado uno o los dos sitios de CO/17 corte de F_RSV y diversas regiones del pep27 (Rawling y col., 2008). La inserción de los dos Virus Sendai recombinantes sitios de corte de F_RSV en F_SeV promovió un que expresan una proteína de aumento de la fusión de células transfectadas y fusión (F) con dos sitios de una reducción en la dependencia de la proteína corte por furina reproducen las de unión HN para la formación de sincitios. A características únicas de fusión la vista de los resultados obtenidos en células e infección del virus respiratorio transfectadas, se procedió al rescate de virus sincitial en cultivos celulares Sendai recombinantes (rSeV), que expresan Rawling J* (1), Cano O (1), Garcin D proteínas F mutantes que tienen uno o los dos (2), Kolakofsky D (2), Melero JA (1) sitios de corte de F_RSV. Todos los rSeV con Centro Nacional de Microbiología y CIBER de sitios de corte mutados tuvieron una estabilidad Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud térmica reducida, y los mutantes con el doble Carlos III, Madrid, Spain. (1), Dept. of Microbio- sitio de procesamiento mostraron un fenotipo logy and Molecular Medicine, University of Ge- hiperfusogénico en células infectadas. Ade- (2) neva Medical School, Geneva, Switzerland. más, los mutantes rSeV con dos sitios de corte Los paramixovirus requieren para su entrada mostraron menor dependencia de la interac- en la célula diana la fusión entre las membra- ción de HN con ácido siálico para la infección, nas de la célula y el virus. La infección por imitando así la capacidad específica de RSV paramixovirus también produce la fusión de para fusionar e infectar células en ausencia de células entre sí, dando lugar a células grandes la proteína de unión al receptor. Por lo tanto, multinucleadas (sincitios). Ambos tipos de fu- estos resultados sugieren que la presencia de sión son mediados por la proteína viral de fu- sión (F), que para su activación requiere que se dos sitios de corte mutlibásicos representa una produzca un procesamiento proteolítico en un estrategia para regular la activación de una pro- sitio de corte de carácter básico. Al igual que teína de fusión de paramixovirus en ausencia la mayoría de los paramixovirus, la fusión me- de la proteína de unión al receptor. diada por la proteína de fusión del virus Sendai (F_SeV) requiere coexpresión de la proteína de PALABRAS CLAVE: fusión de membranas , unión al receptor (HN), que se une a residuos paramixovirus, virus respiratorio sincitial

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CO/18 (IFM) como en el sobrenadante de las mismas (ELISA), lo que indica la producción y secreción Estudio de la replicación in vitro de un de partículas virales. Seis semanas después de genoma del virus de la hepatitis C de la transfección y después de varios pases de genotipo 1b clonado de un paciente las células, se secuenció todo el genoma del vi- sometido a trasplante hepático rus BHCV1, encontrándose una única mutación adaptativa en la proteína de la envuelta E2. Adi- Koutsoudakis G*, Pérez del Pulgar S, cionalmente, se creó un virus quimérico inter- Coto-Llerena M, González P, Dragun J, genotípico entre los aislados BHCV1 y JFH1. Mensa L, Crespo G, Navasa M, Forns X Se transfectaron células Huh7.5 células con el Servicio de Hepatología, Hospital Clínic, ARN de este virus y después de varios pases, IDIBAPS, CIBERehd, Barcelona (1) el virus quimérico se adaptó, aumentando su título y acumulando varias mutaciones adapta- Introducción y objetivo: El virus de la hepatitis tivas, sobre todo en la región de las glicoproteí- C (VHC) replica muy poco en cultivo celular. nas de la envuelta viral. Conclusión: Los sueros Solamente el clon JFH1 de genotipo 2a repli- de pacientes infectados por el VHC se pueden ca in vitro a niveles suficientes para el estudio utilizar para inocular células Huh7.5 en cultivo completo del ciclo vital del virus. El objetivo de y para investigar de la replicación del virus in este estudio fue la clonación y la caracteriza- vitro. La construcción de virus recombinantes ción de la replicación in vitro de un nuevo ais- a partir de sueros de pacientes con hepatitis C lado del VHC de genotipo 1b procedente de un podría ser útil para disponer de nuevos geno- paciente sometido a trasplante hepático. Para mas virales capaces de replicar in vitro, abrien- ello, escogimos un suero de ese paciente con do así nuevas perspectivas en el desarrollo de una carga viral excepcionalmente alta: > 9 Log sistemas de cultivo celular del VHC. UI/mL. Métodos: La replicación del virus natural en células Huh7.5 inoculadas directamente PALABRAS CLAVE: Virus de la hepatitis C, con el suero del paciente fue analizada por replicación, cultivo celular inmunofluorescencia (IFM) de las proteínas del VHC y por PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR). Además se procedió a la clonación CO/19 de la secuencia consenso del genoma viral, el Oligomerización y función de ARN cual se denominó Barcelona Hepatitis C virus 1 (BHCV1). Para el estudio de la replicación polimerasas de diferentes genotipos se construyeron replicones subgenómicos que del virus de la hepatitis C contenían el gen marcador de la luciferasa. Re- Clemente-Casares *P (1), López-Jiménez AJ (1), sultados: Cuatro días después de la inoculación Bellón-Echeverría I (1), Encinar JA (2), Martínez- de las células Huh7.5 con el suero del pacien- Alfaro E (3), Pérez-Flores R (4), Mas A (1) te, detectamos ARN y las proteínas del VHC. Tanto el genoma completo como los replicones Laboratorio de Virología Molecular, Centro subgenómicos replicaron a niveles bajos y de Regional de Investigaciones Biomédicas, (1) forma transitoria después de la transfección de Albacete , Instituto de Biología Molecular y las células Huh7.5 con ARN transcrito in vitro. Celular, Universidad Miguel Hernández, Elche (2) Sin embargo, aproximadamente 3 semanas , Unidad de Enfermedades Infecciosas, después de la transfección, se detectó proteí- Hospital General Universitario de Albacete, (3) na de la cápside del VHC tanto en las células Albacete , Servicio de Digestivo, Hospital General Universitario de Albacete, Albacete (4)

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El virus de la hepatitis C es un virus ARN de ciente de Hill para cada una de ellas mostró va- cadena positiva que replica su genoma en com- lores que seguían la tendencia observada para plejos replicativos asociados a micro-vesículas la oligomerización. La polimerasa de genotipo derivadas del retículo endoplasmático. La ARN 5, para la que no se pudo calcular un valor polimerasa dependiente de ARN viral (proteína de coeficiente de Hill por no adaptarse a una NS5B) es una proteína clave en ese complejo curva sigmoidal, fue la proteína que presentó y se ha convertido en diana para el desarrollo el menor grado de oligomerización. Con todos de nuevos compuestos antivirales. NS5B forma estos datos y otros previamente publicados por oligómeros consigo misma y mutaciones que otros grupos se han realizado simulaciones de rompen esas interacciones son letales para su docking in silico que nos han permitido inferir la actividad enzimática. Esta interrupción del pro- geometría de interacción de NS5B y proponer ceso de oligomerización podría usarse como las alfa-helices F y T como elementos implica- estrategia antiviral para combatir el virus. Para dos en dicha interacción. poder estudiar la oligomerización de NS5B hemos desarrollado un método in vitro con PALABRAS CLAVE: polimerasa VHC, proteínas recombinantes que permite analizar oligomerización, cooperatividad interacciones NS5B-NS5B por Förster-resonance-energy-transfer (FRET). Mediante este CO/20 método se ha analizado el efecto de diferentes factores en la oligomerización de NS5Bdelta21 Influencia de los cambios de de genotipo 1 y se ha observado que las inte- aminoácido K65R, V75I Y R78A en la racciones más importantes son electrostáticas fidelidad de copia y termostabilidad por su dependencia de fuerza iónica. Tanto el de la retrotranscriptasa NaCl como el KCl producen cambios en el estado de oligomerización de NS5B dependien- del VIH-1 de grupo O do de su concentración. La combinaciones de Barrioluengo V *, Álvarez M, Bar- diferentes mutantes puntuales de oligomeriza- bieri D, Menéndez-Arias L ción mostró valores de FRET entre 0 y 100%. Centro de Biología Molecular Seve- Asimismo cuando se realizaron estudios de ro Ochoa (CSIC/UAM), Campus de oligomerización de NS5B en presencia de un Cantoblanco, 28049 Madrid (1) inhibidor no-nucleósido (NNI), el PF-254027, se observó una reducción significativa de la se- Las retrotranscriptasas (RTs) son ADN poli- ñal de FRET, sugiriendo una nueva conexión merasas capaces de utilizar como molde tan- entre oligomerización de NS5B y la unión de to ARN como ADN. Las RTs presentan una NNI. Con el objetivo de analizar la implicación elevada tasa de error [alrededor de 10(-4)], lo del proceso de oligomerización en la actividad que explicaría en parte la enorme variabilidad enzimática de NS5B se obtuvieron polimerasas genética observada en el virus de la inmuno- derivadas de diferentes genotipos (genotipos deficiencia humana tipo 1 (VIH-1). A pesar de 1 a 5). La caracterización de la actividad de ello, las variantes de la RT del virus Moloney novo de estas polimerasas mostró una mayor de la leucemia de ratón (MLV) y del virus de la actividad para el enzima de genotipo 1, proba- mieloblastosis de aves (AMV) se usan de for- blemente por la presencia de una isoleucina en ma generalizada en tecnología de ADN recom- posición 405. Por otro lado, el grado de coo- binante, para la síntesis de ADN copia a partir peratividad de la actividad de síntesis de ARN de ARN mensajero. Aunque la RT del VIH-1 determinado mediante la obtención del coefi- parece ser más activa que las RTs de onco-

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rretrovirus a 50-60ºC, su fidelidad de copia es del VIH, tanto en presencia como en ausencia alrededor de 10-15 veces inferior a la descrita de presión farmacológica. para las RTs de MLV y AMV. Los aislados del VIH-1 se han clasificado en cuatro grupos filo- PALABRAS CLAVE: VIH, retrotranscriptasa, genéticos, denominados M, O, N y P. Aunque fidelidad la RT ‘wild-type’ (WT) del VIH-1 grupo O es 2,5 veces más fiel que la de grupo M - subtipo B CO/21 (Álvarez et al. J. Mol. Biol. 2009; 392: 872-884), su fidelidad es inferior a la de la RT del MLV. Implicaciones de SUMO en la El objetivo de este estudio es incrementar la fi- replicación de rotavirus delidad de la RT del VIH-1 grupo O mediante Campagna M * (1), Arnoldi F (2), Marcos-Villar la introducción de cambios de aminoácido que L (1), González-Santamaria J (1), Gallego P (1), producen aumentos importantes de fidelidad en González D (1), Burrone OR (2), Rivas C (1) RTs de grupo M - subtipo B. Para ello se estudiaron los efectos de los cambios K65R, R78A Departamento de Biología Molecular y y K65R/V75I sobre la fidelidad de la RT, utili- Celular, Centro Nacional de Biotecnología zando ensayos enzimáticos de incorporación (CNB), CSIC, Madrid (1), International de nucleótidos y ensayos genéticos basados Centre for Genetic Engineering and en la expresión del gen lacZ codificado en el Biotechnology (ICGEB), Trieste, Italia (2) fago M13mp2. Los ensayos genéticos demostraron que K65R, R78A y K65R/V75I producían Los rotavirus son causantes de enfermedad un aumento de fidelidad de >9 veces respecto diarreica y deshidratación en niños pequeños a la enzima WT, dando lugar a RTs con tasas siendo responsable de 20 de cada 100 muertes de error inferiores a las de la RT del MLV. To- por diarrea en los menores de cinco años. Los das las variantes analizadas presentaron una rotavirus son virus no envueltos con un genoma menor tendencia a producir inserciones y de- de ARN de doble cadena segmentado. La par- leciones que la RT del MLV. El cambio R78A tícula infectiva está constituida por tres capas produce un efecto desestabilizador sobre la proteicas que contienen en su interior los 11 RT, tanto en presencia como en ausencia de segmentos del genoma viral, la RNA polime- V75I. Sin embargo, a temperaturas superiores rasa viral RNA dependiente VP1 y el enzima a 52ºC, los mutantes K65R y K65R/V75I rete- responsable de la adicción al extremo 5’ del nían niveles de actividad polimerasa similares a RNA de la estructura denominada caperuza, los de la enzima WT del VIH-1 grupo O, y eran VP3. Este complejo está rodeado por la proteí- más eficientes que las RTs WT del VIH-1 (gru- na VP2 y en su conjunto constituye el núcleo po M - subtipo B) y del MLV. En comparación del virus. Este núcleo está a su vez rodeado de con la RT WT de grupo O, los mutantes K65R, una segunda capa constituida por la proteína K65R/V75I y R78A presentaron menor eficacia VP6 y de una tercera exterior constituida por de incorporación de nucleótidos incorrectos así las proteínas VP7 y VP4. Una vez que el virus como de extensión de extremos desaparea- entra en la célula, tiene lugar en el citoplasma dos. Es importante destacar que K65R y V75I la formación de unas estructuras llamadas vi- son mutaciones implicadas en resistencia a roplasmas en donde ocurren las fases tempra- fármacos antirretrovirales. Aunque su papel en nas de la replicación viral y la formación de las la fidelidad de copia de la RT parece claro, no partículas virales con doble capa. Además de hay datos sobre su influencia en la evolución las proteínas estructurales VP1, VP2, VP3 y VP6, en los viroplasmas se encuentran las dos

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proteínas no estructurales NSP2 y NSP5. Se Esteban R*, Fujimura T han propuesto varios papeles para NSP2 en Instituto de Biología Funcional y Genómica la replicación viral entre los que se encuentra CSIC/Univ. de Salamanca, Salamanca (1) ser el motor molecular de la replicación viral. El papel de NSP5 es menos conocido. NSP5 se La levadura S. cerevisiae lleva frecuentemente modifica post-traduccionalmente por O-glicosi- el virus L-A perteneciente a la familia Totiviri- lación y por una extensa fosforilación, pero el dae. L-A (con un genoma de dsRNA de 4.6 kb) papel de estas modificaciones en las funciones es el virus helper de un RNA satélite responde NSP5 es poco comprendido. NSP5 interac- sable de la actividad ‘killer’ de levaduras. L-A ciona con la polimerasa VP1 y con NSP2 y es codifica para dos ORFs, Gag y Pol. Los virio- esencial para la formación de los viroplasmas y nes purificados de L-A tienen actividad trans- para la replicación viral. Además, NSP5 forma criptasa que sintetiza in vitro transcritos de L-A estructuras parecidas a los viroplasmas, llama- de forma conservativa. El extremo 5’ de dichos das VLS, cuando se expresa junto a NSP2 o transcritos ha sido objeto de estudio en el pa- VP2 en células no infectadas. En concreto se sado con resultados no concluyentes, atribu- ha demostrado que NSP5 es la proteína esen- yéndosele un extremo 5’ trifosfato o difosfato. cial para el reclutamiento de VP1, VP2, VP6 y Trabajos recientes en nuestro grupo indican NSP2 a las VLS y se supone que ejerce un pa- que L-A es muy sensible a la exonucleasa Xr- pel similar durante la infección viral. Un tipo de n1p, que por sobre-expresión lo elimina de las modificación post-traduccional que regula la in- células. Xrn1p requiere extremos 5’ monofos- teracción entre proteínas tanto celulares como fato. Por todo ello decidimos estudiar la com- virales es la sumoilación. Consiste en la adición posición de los extremos 5’ de L-A. Nuestros con unión covalente del polipéptido SUMO a las resultados indican que los viriones de L-A pue- lisinas situadas en secuencias consenso pre- den utilizar in vitro diferentes nucleótidos inicia- sentes en las proteínas diana. Esta modifica- dores, GTP, GDP o GMP, además del análogo ción regula varios procesos como la estabilidad de cap m7GpppG. En los tres primeros casos, de la proteína, su localización o sus funciones. con independencia del nucleótido incorporado La interacción de proteínas a través de SUMO el extremo 5’ es difosfato. Esto supone que L-A puede ocurrir gracias a la interacción no cova- tiene una maquinaria enzimática muy elabora- lente con una secuencia consenso llamada SIM da para asegurarse de que el extremo 5’ tenga (Sumo Interacting Motif), presente en algúnas esa composición; En el caso de GMP, el fosfato proteínas sumoiladas. En este trabajo demos- en beta del extremo 5’ del RNA sintetizado pro- tramos que NSP5, al igual que el resto de las cede del fosfato en gamma del ATP presente componentes del viroplasma, se sumoila y dis- en la reacción (1). El tipo de extremo 5’ puede cutiremos el papel de SUMO en la formación de ser importante para la estabilidad del transcrito VLS, viroplasmas y replicación viral. o para facilitar su traducción. Nuestra hipótesis es que este grupo difosfato podría actuar como PALABRAS CLAVE: rotavirus, SUMO, NSP5 aceptor de grupos cap. La proteína Gag de los viriones tiene actividad de ‘decapping’ y roba CO/22 grupos cap a mensajeros celulares uniéndolos de una manera covalente (2). Si el extremo 5’ Los transcritos del virus L-A de difosfato realmente sirve de aceptor de estos S cerevisiae tienen un extremo grupos cap el virión realizaría una transferen- 5’ difosfato Importancia en cia de caps celulares a sus propios RNAs. Se el ciclo de vida del virus discutirán datos preliminares que apuntan a la

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transferencia de grupos cap al transcrito naciente. (1) Fujimura, T., Esteban, R. (2010) J. Biol. Chem. 285: 22911-2298. (2) Blanc, A., Ribas, J.C., Wickner, R.B., So- nenberg, N. (1994). Mol. Cell. Biol. 14: 2664- 2674 PALABRAS CLAVE: Transcripción, Extremo 5’, Cap

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Interacción virus-huésped (III)

Moderadores: Dra. Amelia Nieto Dr. José Maria Casasnovas

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CO/23 PALABRAS CLAVE: Caspases, Vaccinia Virus, Virus-host Caspases in virus-infected cells contribute to recognition CO/24 by CD8+ T lymphocytes López D (1), García-Calvo M (2), Desorganización nuclear a tiempos Smith GL (3), Del Val M* (4) tempranos tras la infección in vitro con el virus de la peste porcina africana Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid (1), Merck Research Ballester M* (1), Gallardo C (2), Salas M.L Laboratories, Rahway, NJ, USA (2), Imperial (3), Rodríguez J.M (4), Rodriguez F (1) College London, United Kingdom (3), Centro Centre de Recerca en Sanitat Animal de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC- (CRESA), UAB-IRTA, Bellaterra, Barcelona UAM), y Centro Nacional de Microbiología, (1), Centro de Investigación en Sanidad Instituto de Salud Carlos III, Madrid (4) Animal, INIA, Valdeolmos, Madrid (2), Centro CD8+ cytotoxic T lymphocytes recognize inde Biología Molecular Severo Ochoa fected cells in which MHC class I molecules (CSIC-UAM), Universidad Autónoma de Madrid, Cantoblanco, Madrid (3), Centro present pathogen-derived peptides that have Nacional de Microbiología, Instituto de been processed mainly by proteasomes. Many Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid (4) infections induce a set of proteases, the caspases involved in apoptosis or inflammation. In this study, we report that processing and pre- El Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA), es un virus ADN de doble cadena de gran ta- sentation of a short vaccinia virus-encoded Ag maño, que provoca una de las enfermedades can take place also by a nonproteasomal pa- porcinas más devastadoras, causando verda- thway, which was blocked in infected cells with deros estragos económicos en los países afec- chemical inhibitors of caspases. By cleaving at tados. Tradicionalmente, el VPPA se ha consi- noncanonical sites, at least two caspases gene- derado un virus exclusivamente citoplasmático rated antigenic peptides recognized by T lym- al generar enzimas suficientes para permitir su phocytes. The sites and the peptidic products transcripción y replicación. No obstante, dife- were partially overlapping but different to those rentes estudios han evidenciado la presencia used and produced by proteasomes in vitro. de una fase temprana de replicación nuclear, Antigenic natural peptides produced in infected produciéndose fragmentos de ADN de peque- cells by either pathway were quantitatively and ño tamaño que acaban en el citoplasma de las qualitatively similar. Finally, coexpression of the células infectadas, zonas conocidas como fac- natural vaccinia virus protein B13, which is an torías víricas donde tiene lugar la replicación inhibitor of caspases and apoptosis, impaired citoplasmática y el ensamblaje de las nuevas Ag presentation by the caspase pathway in in- partículas víricas. Con el fin de estudiar el posi- fected cells. These data support the hypothe- ble mecanismo por el cual el ADN del virus en- sis that numerous cellular proteolytic systems, tra o abandona el núcleo de la célula infectada, including those induced during infection, such y profundizar en las modificaciones producidas as caspases involved in apoptosis or in inflam- por el virus en el núcleo de la célula huésped mation, contribute to the repertoire of presented a tiempos tempranos post-infección, hemos lle- peptides, thereby facilitating immunosurveillan- vado a cabo experimentos de immuno-FISH en ce. 3D y análisis de expresión de diferentes proteí-

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nas nucleares, en células Vero no infectadas ta anti-viral. Sin embargo, el gran genoma de o infectadas con el virus BAD71V a diferentes los poxvirus, ha permitido a esta familia viral tiempos post-infección. Los resultados obteni- desarrollar distintas estrategias eficaces en el dos muestran que la lamina A/C, una proteína bloqueo de la actividad inmunológica de estas multifuncional que mantiene la integridad de la citoquinas. Los receptores virales de TNF (vT- envoltura nuclear, se desorganiza a tiempos NFR) son proteínas solubles capaces de unir y tempranos post-infección, coincidiendo con el bloquear algunos miembros de los TNFSFLs. lugar donde se localiza el ADN viral. Así mismo, Dentro de los poxvirus, se han descrito cuatro éste y otros marcadores nucleares cambiaron genes distintos de vTNFRs, y se han denomi- de localización a tiempos tardíos post-infec- nado CrmB, CrmC, CrmD y CrmE. A pesar de ción, encontrándose en el citoplasma de las su similitud estructural con la región extracelular células infectadas. Estos resultados sugieren de los receptores celulares de TNF, hemos en- un posible mecanismo por el cual el ADN del contrado diferencias en las afinidades y espe- virus accedería y/o abandonaría el núcleo de la cificidades de unión a distintos TNF entre estos célula huésped. Por otra parte, el efecto de la vTNFRs. CrmB y CrmD, a diferencia de CrmE infección en el núcleo celular provocó una re- y CrmC, son capaces de unir y bloquear no distribución de proteínas nucleares a tiempos sólo el TNFα, sino también LTα y LTβ. Por otra tempranos post-infección: lamina A/C, ARN parte, mientras que CrmC y CrmD presentan polimerasa II, SC-35 (marcador de los splicing mejor afinidad por los ligandos murinos, CrmE speckles donde tiene lugar la maduración de y CrmB están más especializados en interferir los ARNm celulares) y B-23 (proteína nucleo- con los ligandos humanos. Para esclarecer las lar). Estos resultados, junto a la redistribución, bases moleculares de la interacción vTNFR- defosforilación y posterior degradación de la ligando, hemos desarrollado una amplia gama ARN polimerasa II, apuntan un nuevo mecanis- de mutantes en el CrmD del virus ectromelia, mo por el cual el VPPA sería capaz de producir agente causal de mousepox, modelo de ratón la inhibición de la transcripción de los ARNm y ampliamente utilizado para estudiar la viruela la síntesis de proteínas celulares, previamente humana. Así, hemos identificado algunos de descrita durante la infección con el VPPA. los residuos clave para la afinidad y especificidad de la intercción CrmD-ligando. Estos re- PALABRAS CLAVE: Organización nuclear, sultados sugieren que existen diferencias en RNA polimerasa II, lamina A/C las bases estructurales que rigen la interacción de los distintos vTNFR-ligando, y además nos CO/25 pueden ayudar a explicar la posible asocia- ción entre el distinto rango de hospedador y Diferencias en la actividad ANTI-TNF de los vTNFRs codificados de cada poxvirus. El los vTNFRs codificados por poxvirus TNF de membrana (tmTNF), además de ser un precursor de la forma soluble del TNF, juega Pontejo SM* (1), Ruiz-Argüello B (2), Alcami A (1) un importante papel en la respuesta inmunoló- Centro de Biología Molecular Severo gica ante las infecciones y algunos trastornos Ochoa, Madrid (1), Instituto Nacional inflamatorios. Esta forma del TNF tiene además de Investigación Animal, Madrid (2) una doble actividad funcionando tanto de ligando como de receptor e induciendo señales en la La superfamilia de ligandos del TNF (TNFSFLs) célula que expresa TNF en membrana. Hemos engloba un conjunto de citoquinas proinflama- visto que algunos de los vTNFRs son capaces torias con importantes funciones en la respues- también de unirse al tmTNF modulando así la

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actividad dual de esta citoquina. Estos estudios no induce redistribución de PI4P y que estos permitirán comprender y mejorar el mecanismo lípidos no se asocian al complejo de replicación de acción de las drogas anti-TNF utilizadas en viral. Además, la replicación del VNO no resultó la clínica, así como comprender el papel e im- inhibida por el tratamiento con el inhibidor de portancia de los vTNFRs en la patogénesis de fosfatifilinositol-4-quinasas PIK93, al contrario los poxvirus. de lo observado en el caso de la infección con el Coxsackievirus B5. Resultados similares se ob- PALABRAS CLAVE: vTNFRs, TNF, CrmD tuvieron cuando se analizó la infección de otro flavivirus: el virus Usutu, excepto que, mientras las células infectadas con VNO no mostraron CO/26 evidencias de la inducción de una respuesta El ensamblaje del complejo autofágica, las infectadas con virus Usutu si lo de replicación del virus del hicieron. Estos resultados constituyen un ejem- Nilo Occidental en el retículo plo de los diferentes requerimientos celulares para el ensamblaje de los complejos de replica- endoplasmático es independiente ción de los virus ARN, incluso para miembros de fosfatidilinositol-4-fosfato y no de un mismo género. Estas características úni- induce una respuesta autofágica cas de la replicación del VNO podrían ser de Martín-Acebes MA*, Jimenez de Oya N, interés para el diseño de terapias antivirales Blazquez AB, Escribano-Romero E, Saiz JC específicas frente al virus. Departamento de Biotecnología, PALABRAS CLAVE: virus Nilo Occidental, INIA, Madrid (1) flavivirus, replicación El virus del Nilo Occidental (VNO) es un flavivirus neurotrópico transmitido por mosquitos CO/27 cuyos hospedadores principal son las aves, aunque también puede infectar humanos y Determinantes de secuencia que equinos entre otros mamíferos. De la misma controlan el paso por las etapas manera que para otros virus ARN, la replica- tempranas de la ruta de secreción ción del VNO se asocia a reordenaciones de de una proteína de movimiento membranas intracelulares. En este estudio se viral asociada a membrana han analizado las reordenaciones de membra- Serra-Soriano M, Pallás V, Navarro JA* nas intracelulares derivadas de la infección con una cepa del VNO altamente neurovirulenta. El Virología Molecular y Evolutiva de complejo de replicación viral se localizó en el Plantas, IBMCP, Valencia (1) retículo endoplasmático, y la observación mediante microscopía electrónica reveló las alte- La interacción de las proteínas de movimiento raciones de membranas características de la (MPs) virales con el sistema de endomembra- infección por flavivirus. Basándose en los resul- nas celular es un fenómeno decisivo que ocu- tados obtenidos para otros virus ARN, reciente- rre durante el proceso patogénico y, en muchos mente se ha propuesto el requerimiento común casos, depende de la presencia de dominios de un microambiente lipídico enriquecido en hidrofóbicos. p7B es una de las dos MPs impli- fosfatidilinisitol-4-fosfato (PI4P) para la replica- cadas en el movimiento célula a célula del virus ción de los virus ARN. Sin embargo, nuestros de las manchas necróticas del melón (MNSV). resultados indican que la infección con el VNO Esta proteína inicia su camino hacia el plasmo-

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desmo (Pd) insertándose en la membrana del PALABRAS CLAVE: Proteína de movimiento, retículo endoplasmático (RE) para después ser Transporte intracelular, Movimiento viral exportada al aparato de Golgi (AG) en un proceso dependiente de la formación de vesículas CO/28 COPII en los ERES (Endoplasmic Reticulum Exit Sites). Desde el AG la MP alcanzaría el Expresión del receptor de la manosa Pd en un proceso desconocido aún y que abre según la génesis de lesiones en tejidos nuevas perspectivas de estudio. La asociación afectados por virus VISNA/MAEDI de esta proteína a la membrana del RE de la célula vegetal es consecuencia de la inserción Crespo H* (1), Glaria I (1), Jáuregui P (1), completa en la bicapa lipídica de su único domi- de Andrés X (1), Pérez M.M (2), Luján L (2), nio hidrofóbico (TMD). Además, esta MP adop- Polledo L (3), García-Marín J.F. (3), Amorena ta una orientación en membrana de tipo II lo B (1), de Andrés D.F. (1), Reina R (1) que implica que la región amino terminal (Nt) Instituto de Agrobiotecnología, UPNA- queda expuesta al citoplasma mientras que la CSIC-Gobierno de Navarra, Pamplona. región carboxilo terminal (Ct) se sitúa en el lu- (1), Facultad de Veterinaria, Universidad men del RE. Una hidrofobicidad adecuada así de Zaragoza,Zaragoza (2), Facultad de como el mantenimiento de la estructura secun- Veterinaria, Universidad de León,León (3) daria típica en alfa-hélice del TMD son factores El receptor de la manosa (MR) se considera un críticos que controlan la inserción en membra- nexo entre la inmunidad innata y la adquirida, na, el transporte intracelular de la MP y, en con- ya que está implicado en procesos de endocito- secuencia, el movimiento viral. Sin embargo, el sis, fagocitosis, presentación y procesamiento TMD por si solo es incapaz de mediar la salida de antígeno, señalización intercelular y produc- de una proteína heteróloga del RE por lo que ción de citokinas pro- y anti-inflamatorias. El los dominios amino y/o carboxilo terminal de- MR es una proteína transmembrana capaz de ben desempeñar también un papel relevante reconocer residuos manosilados presentes en en el paso de p7B por las etapas tempranas la superficie de muchos patógenos, inclusive de la ruta de secreción. En este trabajo hemos los virus. Recientemente se ha identificado y demostrado que la eliminación tanto del do- secuenciado el gen ovino del MR y estudiado su minio Nt como del Ct impide el transporte de implicación en la entrada del virus visna/maedi p7B al AG. Sin embargo, la MP se distribuye (VVM) en las células, al parecer mediante su homogéneamente por todo el RE en ausencia interacción con los residuos manosilados pre- del dominio Ct mientras que en ausencia del sentes en la glicoproteína de la envoltura vírica dominio Nt, p7B se localiza probablemente en gp135. El VVM es un lentivirus que infecta a las subdominios del RE. Mediante experimentos especies ovina y caprina provocando, tras un de mutagénesis dirigida hemos caracterizado período asintomático variable, cuadros clínicos un único residuo básico localizado en el domi- como encefalitis, neumonía intersticial, artritis nio Ct y una región de 5-6 residuos del dominio y/o mamitis, que conducen inevitablemente a Nt, no relacionada con las señales típicas de la muerte del animal. El objetivo de este estu- transporte al AG, como los motivos de secuen- dio fue analizar la expresión diferencial del MR cia implicados en el proceso de salida del RE en los diversos tejidos diana del virus (pulmón, de p7B. Por último, hemos estudiado la impli- mama, articulación, encéfalo, médula y/o plexo cación de estos elementos de secuencia en el coroideo), en ovinos con infecciones naturales movimiento célula a célula del MNSV. por VVM. Se analizaron distintos tejidos de ani-

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De forma natural, el virus de la tristeza de los males infectados por VVM, clasificados según cítricos (CTV) sólo infecta el floema de algunas la sintomatología clínica principal observada especies de la familia Rutaceae, principalmen- mediante examen anatomopatológico: neu- te de los géneros Citrus y Fortunella. Sin em- monía intersticial, encefalitis o artritis. Como bargo, la agroinfiltración de Nicotiana bentha- control se incluyeron muestras de animales se- miana con un clon de cDNA del aislado T36 da ropositivos asintomáticos (sin lesiones) y sero- lugar a una infección sistémica, que no ocurre negativos. El análisis de la expresión del MR se cuando se agroinfiltra con un clon equivalente realizó mediante PCR en tiempo real, utilizando del aislado T318A, pese a que éste se replica la β-actina como control endógeno de la expre- bien en células de N. benthamiana. Otros ais- sión. Los resultados obtenidos indican que, en lados de CTV (p.e. T385) ni siquiera se repli- todos los animales con afección clínica estu- can en células de esta especie. Para ver si la diados, los niveles de expresión del MR están proteína mayoritaria de la cápsida (p25), que incrementados en aquellos tejidos que presen- además se comporta en N. benthamiana como tan el mayor grado de lesión, variando el tejido un supresor intercelular del silenciamiento me- con máxima expresión (nervioso, pulmonar, diado por RNA, pudiera estar implicada en esta articular), según los signos clínicos principales interacción variable, la fusión p25-GFP (proteí- del animal (neurológico, pulmonar y articular, na fluorescente verde) se expresó transitoria- respectivamente). Además, resultados preli- mente en N. benthamiana por agroinfiltración. minares indican una relación directa entre la El análisis mediante microscopía confocal mos- expresión del MR y la carga proviral detectada tró que la p25 de los aislados T36 y T385 se en dichos tejidos. En conjunto, estos resultados localiza principalmente en el núcleo, mientras revelan que el receptor endocítico MR puede que la de T318A se detecta en la membrana jugar un papel importante en la patogénesis por nuclear y citoplasmática, pero no en el núcleo. el VVM y que este receptor podría considerarse Para identificar las posibles señales de locali- un buen indicador de lesiones a nivel histológi- zación nuclear se construyeron seis proteínas co y de manifestaciones clínicas en infecciones quiméricas intercambiando tres regiones de por dicho virus. p25 de los genotipos T36 y T318A. Las pautas PALABRAS CLAVE: receptor de la manosa, de distribución celular de estas quimeras sugie- virus visna/maedi, patogénesis ren que el fragmento aminoacídico 1-31 está implicado en la localización nuclear de p25 de CO/29 T36 y T385, y extranuclear de T318A. Sin embargo, la deleción de este fragmento en la p25 La localización subcelular de de los tres genotipos no cambió su localización la proteína de la cápsida p25 subcelular, lo que sugiere que la señal de lo- difiere entre aislados del virus calización podría ser bipartita. Muchos aislados de la tristeza de los cítricos de CTV, incluyendo T36, tienen una valina en la posición 31 de p25, mientras que los aisla- Navarro-López J (1), Ruiz-Ruiz S (2), dos más virulentos como T318A tienen una Flores R (2), Moreno P (1), Ambrós S* (1) leucina. Sorprendentemente, un único cambio Centro Protección Vegetal y Biotecnología, Leu31Val en la p25 de T318A dio lugar a que Instituto Valenciano de Investigaciones ésta se localizase en el núcleo, mientras que el Agrarias (IVIA), Moncada (Valencia) (1), cambio complementario Val31Leu en la p25 de Instituto de Biología Molecular y Celular de T36 eliminó su localización nuclear. Este resul- Plantas (IBMCP), CPI-UPV, Valencia (2) tado indica que la Leu31 está implicada en la

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localización extranuclear de la p25 de T318A procesos, la morfogénesis viral y el reconoci- (al menos en N. benthamiana), si bien se des- miento virus-hospedador están recibiendo una conoce si esta diferencia con el genotipo T36 atención cada vez mayor como dianas para el podría afectar la distinta capacidad de ambos desarrollo de nuevos agentes antivirales. El ob- genotipos para infectar sistémicamente esta jetivo de nuestro estudio ha sido analizar expe- especie. Por otra parte, la expresión de p25 de rimentalmente si la aglomeración macromole- T36, T318A y T385 en N. benthamiana como cular puede influir en la inhibición por agentes un RNA subgenómico del virus X de la patata antivirales del autoensamblaje de la cápsida y no dio lugar en ningún caso a un aumento en del reconocimiento virus-receptor celular. Para la intensidad de los síntomas, al contrario de lo ello, se utilizaron dos sistemas virales simpli- que sucede con otro supresor del silenciamien- ficados, y diversos compuestos peptídicos to codificado por CTV. como agentes antivirales experimentales. En el primer modelo se evaluó la inhibición del au- PALABRAS CLAVE: Interacción virus- toensamblaje in vitro de la cápsida madura del huésped, localización subcelular, virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1). agroinfiltración Para ello, se utilizaron dos inhibidores de ensamblaje, el dominio C-terminal aislado de la CO/30 proteína de la cápsida CA y un péptido peque- ño (CAI) que se une a CA. Los resultados mos- La aglomeración macromolecular traron que, en condiciones de aglomeración reduce la acción de compuestos macromolecular similares a las fisiológicas, la inhibidores del ensamblaje de virus capacidad de estos compuestos de inhibir el y del reconocimiento virus-célula ensamblaje in vitro de la cápsida de HIV-1 se reduce sustancialmente con respecto a las con- Rincón Forero V* (1), Bocanegra Rojo diciones habitualmente utilizadas en ensayos R (1), Rodríguez Huete A (1), Rivas Ca- in vitro, es decir en ausencia de aglomeración ballero G (2), García Mateu M (1) molecular. En el segundo modelo evaluamos la Centro de Biología Molecular ´Severo inhibición del reconocimiento entre células hos- Ochoa´ (CSIC-Universidad Autónoma de pedadoras y el virus de la fiebre aftosa (FMDV), Madrid), Madrid (1), Centro de Investiga- para ello, utilizamos como inhibidor experimen- ciones Biológicas (CSIC), Madrid (2) tal un péptido pequeño que contiene el motivo RGD y que es capaz de bloquear la interacción Los fluidos biológicos contienen una elevada entre FMDV y receptores en la membrana ce- concentración total de macromoléculas, lo que lular. De nuevo, los resultados mostraron que, que conlleva a la exclusión de volumen de una en condiciones de aglomeración macromole- molécula por otra. Estudios teóricos y experi- cular, se reduce significativamente la actividad mentales han demostrado que este fenómeno, inhibitoria del péptido sobre el reconocimiento denominado aglomeración macromolecular, virus-célula y la infectividad (aunque en este aumenta en diferente medida la actividad quí- caso el efecto fue dependiente de la relación mica de moléculas de diferente forma y tamaño receptor celular:partícula vírica). Los resulta- y puede tener efectos importantes en el reco- dos obtenidos con los dos modelos analizados nocimiento molecular. Sin embargo, la influen- están esencialmente de acuerdo con prediccio- cia de la aglomeración macromolecular en los nes derivadas de la teoría de aglomeración ma- eventos de reconocimiento que involucran par- cromolecular. Además, indican que la actividad tículas virales, y su inhibición por compuestos inhibitoria de diferentes fármacos antivirales de antivirales no había sido explorada. Entre estos

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pequeño tamaño observada en ensayos in vitro completo y a un número mayor de secuencias o ex vivo puede ser sustancialmente atenuada nucelotídicas. Para ello y dada la antigüedad de in vivo, debido a las condiciones de aglomera- las secuencias, seleccionamos de la base de ción macromolecular presentes en los fluidos datos de Los Alamos (LANL) secuencias de pa- extra- e intracelulares en el organismo. cientes infectados al comienzo de la epidemia: PALABRAS CLAVE: Aglomeración 68 norteamericanas (anteriores a 1991) y 32 macromolecular, Agentes antivirales europeas (anteriores a 1996). Ante la ausencia de secuencias españolas antigüas analizamos el virus de 44 LTNPs españoles infectados en- CO/31 tre 1980-1995 así como 11 virus españoles de Identificación y caracterización de un 1989 (sin seguimiento). Por último se incluye- grupo de virus ancestrales deletereos ron 25 secuencias obtenidas de controladores en pacientes españoles no progresores de élite publicadas. El alineamiento final constó de 184 secuencias de 2502 nucleótidos que Casado Herrero C (1), Pernas Escario M fueron analizadas filogenéticamente mediante (1), Sandonís Martín V (1), Alvaro Cifuen- inferencia bayesiana y por máxima verosimili- tes T (1), Fuentes R (1), Martínez-Prats L tud. También se analizaron factores genéticos (2), Delgado R (2), del Romero J (3), Ro- del huésped relacionados con el control de la dríguez C (3), López-Galíndez C* (1) infección (haplotipos HLA y otros polimorfismos Servicio de Virología Molecular, Centro genéticos). El análisis filogenético confirmó Nacional de MIcrobiología, Instituto de la existencia de un grupo de virus con un úni- Salud Carlos III, Madrid (1), Laboratorio co origen en estos pacientes no progresores. de Microbiología. Hospital 12 de Octu- Todos los pacientes incluidos en el grupo fue- bre. IMSALUD. Madrid (2), Centro Sani- ron usuarios de drogas en los 80 y todos vi- tario Sandoval. IMSALUD. Madrid (3) vieron en Madrid. El ACMR obtenido para este grupo de virus se encuentra muy próximo al La progresión clínica de la infección por el VIH-1 ACMR de la epidemia del subtipo B, indicando es variable, aunque la mayoría de los pacien- la ausencia de evolución de estos virus pese tes desarrolla la enfermedad a los 10 años sin al tiempo transcurrido desde la primoinfección. tratamiento antirretroviral, existe una pequeña Estos datos sugieren que los pacientes se ha- proporción de individuos (pacientes no progre- bían infectado con un virus deletéreo, respon- sores o LTNPs) que no muestran síntomas clíni- sable de la falta de evolución clínica. Para con- cos tras 10 años de infección. El análisis filoge- firmar esta hipótesis, la secuencia del gen env nético de las secuencias virales en el gen de la de dos de los pacientes se clonó y los virus ob- envuelta (env) en pacientes LTNPs españoles, tenidos tras transfección fueron utilizados para incluyendo controladores de élite, evidenció la infectar células mononucleares de sangre pe- existencia de un grupo de virus que mostraban riférica. Estos experimentos revelaron una ca- mínimas diferencias genéticas entre sí(<2%) y pacidad replicativa extremadamente reducida ramas en el árbol filogenético extremadamente de estos virus y en ensayos de fusogenicidad cortas al ancestro común mas reciente (ACMR) demostraron también una capacidad fusogé- del subtipo B. Este grupo de virus incluía se- nica muy limitada. Este estudio ha identificado cuencias obtenidas de 5 individuos controlado- la existencia de un grupo de pacientes VIH no res de la infección y con más de 20 años de progresores infectados por un mismo virus con infección. Para clarificar la historia filogenética características deletéreas. de estos virus, ampliamos el estudio al gen env

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PALABRAS CLAVE: VIH-1, Evolución, CARD de ser ubiquitinado, de unirse a TRIM25 Patogenicidad y de unirse a MAVS. Los resultados apoyan un modelo donde la fosforilación de la serina 8 de CO/32 RIG-I actuaría como interruptor negativo de la señalización de la activación para prevenir la El papel de la fosforilación de la serina producción de IFN-β. 8 de RIG-I en la regulación del IFN-beta PALABRAS CLAVE: RIG-I, interferon, Nistal Villan E* (1), Ulrike Gack M (2), Gonzalez receptor de reconocimiento de patogenos Aseguinolaza G (1), Wang R (3), Aggarwal AK (4), Jung JU (2), García-Sastre A (5) Terapia Genica y Hepatitis virales, CIMA, Pamplona (1), Department of Microbiology and Molecular Genetics and Tumor Virology Division, New England Primate Research Center, Harvard Medical School, Southborough, Massachusetts, USA (2), Department of Genetics and Genomic Sciences, Mount Sinai School of Medicine, One Gustave L. Levy Place, New York, USA (3), Department of Structural & Chemical Biology, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA (4), Department of Microbiology, Mount Sinai School of Medicine, New York, USA (5) RIG-I es una proteína implicada en el reconocimiento de las infecciones víricas y acti- vación de la respuesta antiviral en las células de animales cordados. Los mecanismos que regulan la activación de RIG-I no están bien caracterizados. En la presente comunicación describimos la identificación y la función de la fosforilación de RIG-I en el amino acido de la serina 8. Las mutaciones de la serina 8 de RIG-I a aminoácidos fosfomiméticos dio lugar a un defecto significativo en la activación de la inducción del interferón-β(IFN-β). RIG-I se une a TRIM25, una ligasa del ubiquitina E3 que es capaz de ubiquitinar el dominio CARD de RIG-I. La ubiquitinatión del dominio CARD es necesaria para que RIG-I se una a la proteína MAVS, situada en la superficie de la mitocondria y elemento esencial en la via de activacion del IFN-β. Mutaciones de la serina 8 a aspartato y al glutamato afectan a la capacidad del dominio

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Epidemiología y control de infecciones víricas

Moderadores: Dr. Juan E. Echevarría Dr. Jordi Reina Prieto

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CO/33 PALABRAS CLAVE: Transmisión no vectorial, Poblacion fundadora Factores que determinan la eficacia de la transmisión por contacto CO/34 del virus del mosaico del tabaco (Tobacco Mosaic Virus, TMV) Vigilancia del dengue importado y detección de genotipos y linajes Sacristán S, Ramos E, Díaz M, del virus en países endémicos Fraile A, García-Arenal F* asociados a severidad de la Centro de Biotecnologia y Genómica de infección y potencial epidémico Plantas UPM-INIA, Campus de Montegancedo, 29223 Pozuelo de Alarcón, Madrid (1) Franco *L (1), Mamani E (2), Molero F (1), Saenz E (3), Viquez M (3), Van Esbroeck M (4), Cnops La transmisión horizontal de los virus en las L (4), Salas R (5), Hernández L (1), Tenorio A (1) poblaciones de sus huéspedes determina su Laboratorio de Arbovirus y virus importados, epidemiología y su éxito evolutivo. De ahí el Centro Nacional de Microbiología,Madrid (1), interés de conocer los factores que determi- Laboratorio de Virología,Instituto Nacional nan la eficacia de la transmisión. En el caso de Salud, Lima, Perú (2), Laboratorio de de los virus de plantas, la transmisión vectorial Referencia en Virología,Centro Costarricense ha recibido mucha más atención que la trans- de Investigación y Enseñanza en Nutrición misión por contacto, que es el mecanismo de y Salud (INCIENSA) ,San José, Costa Rica transmisión de virus que causan importantes (3), Instituto de Medicina Tropical de Antwerp, epidemias, englobados en géneros como los Antwerp, Bélgica (4), Centro Panamericano de Tobamovirus, Potexvirus u Hordeivirus. Hemos Fiebre Aftosa, OPS/OMS, Brasilia, Brasil (5) analizado los factores que determinan la efica- El dengue es la enfermedad trasmitida por ar- cia de la transmisión del virus del mosaico del trópodos más prevalente a nivel mundial. En tabaco (TMV). Igual que para otros mecanismos España y en el resto de Europa es la arboviro- de transmisión, la eficacia de la transmisión de sis más frecuentemente importada. El espectro TMV depende de la oportunidad de contacto clínico de la infección varía desde casos asin- entre plantas infectadas y sanas. Como en el tomáticos, pasando por enfermedad febril auto- caso de la transmisión vectorial, la transmisión limitada, que puede desencadenar en enferme- por contacto da lugar a cuellos de botella im- dad severa como dengue hemorrágico (DH) y portantes y a poblaciones fundadoras peque- síndrome de shock por dengue (SSD). Los virus ñas. Sin embargo, la transmisión por contacto dengue (DENV) circulan en ciclos endémicos/ se diferencia de los otros tipos de transmisión epidémicos en humanos y en ciclos selváticos/ estudiados en que su eficacia no se correlacio- enzoóticos predominantemente en primates no humanos. Se conocen 4 serotipos, DENV 1, na positivamente con la carga viral en la hoja 2, 3 y 4. Dentro de cada uno de los 4 seroti- fuente de inóculo. Otros factores, relacionados pos están descritas variantes genéticas que se con la edad de la hoja o la forma en que fue in- denominan genotipos. La comparación de los fectada, tienen un papel principal en la eficacia diferentes genotipos virales con la información de la transmisión. Se ha analizado si la eficacia epidemiológica ha permitido la asociación entre de transmisión se puede relacionar con la efica- una alta tasa de trasmisión y una mayor inci- cia de colonización sistémica y/o con la carga dencia de enfermedad severa (DH, SSD), con viral en el conjunto de los tejidos infectados.

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algunos grupos virales específicos. Así mismo, CO/35 el análisis filogenético de los genotipos virales evidencia una gran diversidad viral representa- Plan para la Erradicación de la da por diferentes linajes. En el presente trabajo Poliomielitis (PEP) en España: presentamos los resultados de la vigilancia de Sistema de vigilancia de poliovirus genotipos del dengue importado a España des- y otros enterovirus (1998-2010) de 2008 a 2010 y la detección de circulación de diferentes linajes en Latinoamérica y África Cabrerizo M* (1), de Miguel T (1), Bustillo asociados a severidad de presentación de la I (1), Avellón A (1), Trallero G (1), y Red enfermedad y/o mayor potencial epidémico. El de laboratorios primarios de vigilancia hallazgo de diferentes genotipos y linajes intro- de parálisis flácida aguda (2) ducidos en zonas mediterráneas con presencia Laboratorio de Enterovirus, del mosquito trasmisor en Europa, el Ae. albo- CNM, ISCIII, Madrid (1), (2) pictus ,representa un riesgo para el inicio de ciclos de trasmisión autóctona en España, ya Introducción. España consiguió el certificado que se han detectado en este estudio variantes de `libre de polio´ en 2002 pero, debido a su genéticas posiblemente similares al del virus situación geográfica y a la inmigración, el ries- DENV que ha sido capaz de trasmitirse en la go de importación de casos de poliovirus (PV) Costa Azul de Francia en el verano de 2010. tipo salvaje o derivados de vacuna (PVDV) es Por otro lado, en el oeste de África, por primera alto. Objetivo. Para `mantener un estado libre vez se ha asociado un caso de DH con DENV-2 de polio´ y evitar la reintroducción del virus, de genotipo selvático. Además, se ha confirma- en España se desarrolla desde 1998 un PEP do la expansión del genotipo III de DENV-3, nacional que incluye mantener un sistema de en sitios previamente ausente. Mientras, en vigilancia de parálisis flácida aguda (PFA) en Latinoamérica y el Caribe se evidenció la am- menores de 15 años. Este sistema se comple- plia circulación de DENV-1 genotipo América- menta con el estudio de enterovirus (EV) no- África, linaje América, descrito como de gran polio en otras patologías (especialmente me- potencial epidémico. Finalmente la detección ningitis aséptica y cuadros respiratorios), todo precoz de un linaje de DENV-2 diferente a los lo cual permite detectar rápida y eficazmente que previamente circulaban en Perú, asociado cualquier caso compatible con poliomielitis para a severidad de la infección hizo posible la alerta descartar o confirmar la presencia de PV. Mé- temprana y la movilización efectiva de recursos todos. El sistema está formado por una Red para frenar la expansión de este virus. La vigi- de 9 Laboratorios coordinada por el Laboratorio lancia del dengue importado y la retroalimen- de Enterovirus del CNM, certificado por la OMS tación a los países endémicos propiciada por como Laboratorio Nacional de Poliovirus (LNP). este tipo de estudios permite no solo el cono- Dicho laboratorio se encarga de la confirmación cimiento de los diferentes genotipos y linajes y caracterización intratípica de todos los PV de DENV que circulan a nivel global si no que aislados, incluidos los PVDV, obtenidos por los también pueden contribuir al incremento de la laboratorios de la red y por otros no pertene- movilización de recursos y la intensificación de cientes. Utiliza métodos de inmunofluorescen- acciones de control en estos países; pudiendo repercutir en Europa en la disminución de ca- cia y seroneutralización en cultivos celulares y sos importados. técnicas moleculares de PCR y análisis de secuencia. Además, realiza el tipado de otros EV PALABRAS CLAVE: dengue, genotipos, detectados tanto en casos de PFA como con importado otros síndromes. Resultados. Desde 1998, la

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red de laboratorios ha analizado una media de Valencia (1), Departamento de Microbiología, 8600 muestras clínicas al año, detectándose Hospital Vall d´Hebrón, Barcelona (2) EV en un 8% de ellas. Los EV de casos clí- nicamente relevantes o compatibles con infec- INTRODUCCIÓN: Los rotavirus constituyen ción por poliovirus son enviados al LNP donde la principal etiología de gastroenteritis agu- son caracterizados. Respecto a los PV, durante da (GEA) en niños y en una gran variedad de todo el periodo se han aislado un total de 242, animales en todos los países del mundo. Aten- todos anteriores a 2005 (en 2004 se cambió diendo a los genes que codifican las proteínas la vacuna oral por la inactivada) y todos fue- VP7 y VP4, estos virus se clasifican en genoti- ron caracterizados como vacunales, excepto pos G (VP7) y P (VP4). Los genotipos G1-G4 7 que resultaron ser PVDV-2 y que provenían y G9 son los más frecuentemente detectados de un caso importado de poliomielitis y de sus en los países desarrollados. OBJETIVOS: Ca- contactos familiares. Se trataba de un paciente racterizar los genotipos G y P de rotavirus de- con una inmunodeficiencia primaria, vacunado tectados en niños con GEA en Valencia y Ca- en su país de origen con vacuna oral que le taluña durante 7 periodos anuales desde 2003 produjo durante el 2005 un cuadro de PFA. Las a 2010. MATERIAL Y MÉTODOS: Se han ana- altas coberturas de inmunización y las medidas lizado 1.544 muestras de heces de niños con adoptadas impidieron que se produjese un bro- GEA por rotavirus mediante enzimoinmunoa- te. Este caso fue detectado gracias a los siste- nálisis (ELISA) o inmunocromatografía, perte- mas de vigilancia establecidos y, hasta el mo- necientes a 7 temporadas desde julio de 2003 mento, es el único de estas características que a junio de 2010, procedentes de hospitales de se ha notificado en España. Conclusiones. la Comunidad Valenciana y Cataluña. Se rea- La vigilancia de PV y otros EV es fundamental lizó la extracción del ARN viral de las heces y para la detección precoz y la caracterización de se determinaron los genotipos G y P mediante los casos de polio importados que puedan pro- transcripción inversa y PCR semi-anidada múl- ducirse en nuestro país. La OMS recomienda tiple con cebadores tipo-específicos de cada continuar dicha vigilancia activa no sólo hasta genotipo. RESULTADOS: Se caracterizaron que se consiga la erradicación sino después, los genotipos G y P de 1.482 cepas de rotavi- durante la etapa de post-certificación. rus (96%) correspondientes a otros tantos pacientes. El genotipo G1P[8] fue el predominan- PALABRAS CLAVE: poliovirus, vigilancia, te durante el periodo de estudio, y se encontró erradicación en 811 pacientes (52,5%). El segundo genotipo más frecuentemente detectado fue G9P[8] en CO/36 345 pacientes (22,3%). Otros genotipos menos frecuentes han sido G2P[4] con 126 cepas Vigilancia epidemiológica de (8,2%), G4P[8] con 49 cepas (3,2%) y G3P[8] rotavirus y emergencia de genotipos con 42 cepas (2,7%). Se observó la presencia poco comunes en la Comunidad de infección mixta en 74 muestras (4,8%). Se Valenciana y Cataluña de 2003 a 2010 han detectado cepas con genotipos poco frecuentes en nuestra área geográfica, como el Fernández Jiménez M* (1), Téllez Castillo genotipo G8P[6] en 13 cepas (0,8%), G8P[14] CJ (1), Carmona Vicente N (1), Bartolomé en 1 cepa (0,1%) y G6P[14] en una muestra Comas R (2), Buesa Gómez J (1) (0,1%). CONCLUSIONES: En conjunto, G1P[8] Departamento de Microbiología, Facultad ha sido el genotipo predominante durante el pe- de Medicina, Universidad de Valencia, riodo de estudio. G9P[8] se detectó por primera

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vez en nuestra área geográfica en el periodo su secuenciación y posterior análisis utilizando 2003-04 y ha constituido el genotipo predomi- los programas Seqman, MAFFT y Bioedit. La nante en los años posteriores. Se han encon- reconstrucción filogenética fue realizada con el trado cepas de los genotipos G6P[14], G8P[6] paquete MEGA5. Se utilizó el algoritmo BLAST, y G8P[14], todos ellos poco comunes y de posi- para buscar secuencias del GenBank simila- ble origen zoonótico o importados. res a las de nuestro estudio. Resultados: De las 397 muestras, 204 (51,4%) correspondie- PALABRAS CLAVE: rotavirus, genotipo, ron a HRV-A, 39 (9,8%) HRV-B, 154 (38,8%) epidemiología HRV-C. Dentro de los HRV-A, detectamos 52 de los 75 serotipos descritos (69,3%), además CO/37 de tres grupos que no se asociaron con los serotipos hasta ahora descritos, uno formado Análisis de la variabilidad por 16 secuencias, que se agruparon con otras de los rinovirus humanos procedentes de Edimburgo, China, Jordania, que infectan a niños Corea y Japón, el segundo por 6 que se rela-

(1) (1) cionaron con otras de Japón, Estados Unidos, Cuevas MT* , Ledesma J , Pozo China e Italia. Finalmente una única secuencia F (1), Calvo C (2), García-García ML (2), agrupó con muestras de Estados Unidos, Italia, Molinero M (1), Reyes N (1), Casas I (1) Alemania, Jordania y Reino Unido Respecto a Laboratorio de Gripe y Virus los HRV-B, detectamos 13 de los 25 serotipos Respiratorios. CNM. ISCIII. Madrid (1), definidos (52%), además de 3 nuevos grupos, Departamento de Pediatría. Hospital el primero formado por 6 secuencias que agru- (2) Severo Ochoa. Leganes. Madrid paron con otras de Italia, Finlandia y Australia; el segundo constituido por 2 secuencias, simi- Introducción: Clásicamente, los rinovirus hu- lares a muestras de Nepal e Italia, y por último, manos (HRV) han sido los responsables del un tercer grupo formado por 1 secuencia se- catarro común. Actualmente se les asocia con mejante a otra de California. Dentro de HRV-C, otitis media, neumonía y exacerbaciones asmá- detectamos 27 de los 33 tipos ya aceptados ticas. Genética y antigénicamente se han defi- (81,8%) y 15 de los 28 propuestos recientemen- nido dos especies: HRV-A, formado por 75 serotipos y HRV-B, compuesto por 25 serotipos. te (53,6%). Tres secuencias no agruparon con En 2009, se ha aceptado una tercera especie, ninguna de estas referencias, pero si lo hicieron HRV-C, que no se aísla en cultivos celulares y con otros rinovirus procedentes de Escocia, Ja- en dónde se han aceptado 33 tipos y se han pón, Tailandia y China. Conclusiones: Se ha propuesto 28 más. Objetivo: Realizar el estu- detectado una gran diversidad de rinovirus que dio filogenético de rinovirus en pacientes pediá- han circulado en Madrid durante el periodo de tricos, para conocer los genotipos que circulan tiempo estudiado en pacientes pediátricos. Glo- en nuestro país y su variabilidad. Pacientes. balmente detectamos 107 de los 161 serotipos/ Material y Métodos. Se incluyeron 397 mues- tipos descritos de las tres especies A, B y C tras de aspirados nasofaríngeos procedentes (66,5%). Definimos 7 nuevos grupos formados de 374 niños atendidos en el Hospital Severo por 35 secuencias, que a su vez agrupaban con Ochoa de Leganés, entre 2003 y 2010. Tras la altos valores de bootstrap con otras proceden- extracción del ARN viral, se amplificó median- tes de otros paises. Este estudio confirma que te RT-PCR en la región correspondiente a las los rinovirus son un grupo heterogéneo, del que proteínas de superficie VP4/VP2. Se procedió a aún quedan grupos por definir.

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PALABRAS CLAVE: HRVA, HRVB, HRVC, aspectos, a su alta resistencia a los sistemas nuevos serotipos/tipos, pacientes pediátricos de desinfección o al costoso control a nivel de laboratorio. En este trabajo, planteamos estan- darizar un método de recuperación de partí- CO/38 culas víricas a partir de muestras de agua de Detección y genotipado de virus abasto, provenientes de la red de distribución entéricos en aguas de abasto del del área metropolitana de la isla de Tenerife. área metropolitana de Tenerife Así como, estudiar la diversidad genotípica de Adenovirus humano, Enterovirus y Rotavirus Coronado Álvarez N.M.* (1), Teigell Pérez humano, circulantes en el área metropolitana. N. (1), Expósito Rodríguez M. (2), González Para ello, se analizó el agua potable de la tota- Martín C. (1), Matute Cruz P. (3), Martín lidad de los puntos de la red de distribución de Delgado M. (4), Valladares Hernández B. (1) los municipios de S/C de Tenerife y La Laguna Instituto Universitario de Enfermedades (32 y 18 respectivamente). Cada punto fue ana- Tropicales y Salud Pública de Canarias. lizado por duplicado (n=100) en dos períodos Universidad de La Laguna. La Laguna (1), Área de lluvia diferentes, comprendidos entre marzo de Genética. Departamento de Parasitología, de 2007 y noviembre de 2008. La recuperación Ecología y Genética. Universidad de de partículas víricas se realizó mediante filtra- La Laguna. La Laguna (2), Servicio de ción de 1000 litros de agua potable a través de Epidemiología. Dirección General de Salud cartuchos de carga positiva. Con la finalidad de Pública. Servicio Canario de Salud. Consejería detectar el genoma viral, se realizaron ampli- de Sanidad del Gobierno Autónomo de ficaciones de regiones específicas para cada Canarias. Santa Cruz de Tenerife (3), Servicio virus, mediante variaciones de la técnica PCR. de Sanidad Ambiental. Dirección General de El genotipado se llevó a cabo mediante la se- Salud Pública. Servicio Canario de la Salud. cuenciación de los amplicones obtenidos con el Consejería de Sanidad del Gobierno Autónomo tamaño esperado. Los resultados revelaron un de Canarias. Santa Cruz de Tenerife (4) 15% de muestras positivas para al menos uno de los virus entéricos en estudio, detectando Los programas de vigilancia y control sanitario 17 genomas virales, de los cuales 6 pertene- de los abastecimientos de agua de consumo cieron a Adenovirus humano, 7 a Enterovirus y humano de la Comunidad Autónoma Canaria, 4 a Rotavirus humano. Tras analizar los resul- han mejorado la calidad del agua suministrada tados en función del municipio cabe destacar la por la red pública, disminuyendo la incidencia diferencia de población viral entre ambos, ob- de enfermedades de origen hídrico. No obs- servando la ausencia de Enterovirus en S/C de tante, durante determinadas épocas del año Tenerife y de Adenovirus humano en La Lagu- (otoño e invierno), se produce una alta inciden- na. El análisis de las secuencias mostró como cia de problemas gastrointestinales de posible serotipos predominantes a Adenovirus humano etiología viral. La presentación epidémica, el 2, Echovirus 30 y Rotavirus humano G1. Con patrón epidemiológico y la temporalidad de los este estudio confirmamos la presencia de virus mismos, avalan el origen hídrico, hipótesis que entéricos en muestras de agua potable del área no puede ser refutada con los análisis de con- metropolitana de la isla de Tenerife, genotipán- trol de calidad realizados habitualmente. Des- dose la población viral circulante. Este trabajo de el punto de vista de salud pública, los virus entéricos de transmisión hídrica son el grupo ha sido cofinanciado por la Dirección General de patógenos más críticos, debido, entre otros de Salud Pública del Gobierno de Canarias y

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por la Fundación Canaria de Investigación y detección de la mutación se realizó por RT- Salud (P.I. 82/07). PCR, obteniéndose un producto de 197 pares de bases en el caso en que no se presentara PALABRAS CLAVE: Detección molecular, la mutación o de 165 en caso de deleción. Los Agua de abasto, Enterovirus resultados se comprobaron mediante secuen- ciación. RESULTADOS: Se detectó la asocia- CO/39 ción preferente entre ciertas mutaciones en receptores de citoquinas en pacientes infectados Implicaciones de receptores de por el virus A(H1N1)2009, resultando 3 (6,4%) citoquinas en gripe A(H1N1) 2009 heterocigóticos y 1 (2,2%) homocigótico. Los Cuevas MT* (1), Ledesma J (1), Pozo F (1), cuatro casos se dieron en mujeres (p<0.05) de Falcón AM (2), Rodríguez A (2), Calderón A (1), Extremadura, Galicia y dos de Castilla-La Man- Moreno S (1), Nieto A (2), Casas I (1), SGVE (3) cha. El primero fue un caso leve y los otros dos fueron casos graves de neumonía. Además se Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios, estudió la correlación entre la caracterización (1) CNM, ISCIII, Madrid , Departamento génica, la severidad de la infección y la asocia- de Biología Molecular y Celular, ción con otros factores agravantes. CONCLU- (2) CNB. UAM, Madrid , Sistema de SIONES: Existe una asociación cuantificable (3) Vigilancia de la Gripe en España entre receptores de citoquinas y la infección por gripe A pandémica. Los resultados obteni- INTRODUCCIÓN: Algunos receptores de cidos indican que para determinar la implicación toquinas tienen un papel relevante en deter- de receptores de citoquinas y la infección por minadas enfermedades. Así en el caso de la gripe pandémica se requiere la caracterización infección por VIH dos tipos diferentes de recep- tanto de las propiedades virales como las del tores de citoquinas, tienen un papel relevante hospedador. ya que son necesarios para la entrada del virus en la célula. En otros casos se ha relacionado PALABRAS CLAVE: receptores de la presencia de determinadas mutaciones en citoquinas, gripe A(H1N1)2009 estos receptores con un peor pronóstico de la enfermedad, como en el caso de la infección por el virus West Nile. OBJETIVO: El objetivo del presente trabajo es determinar la implica- ción de receptores de citoquinas en pacientes infectados por el virus de la gripe A(H1N1) pan- démica y su posible relación con otros factores virales asociados con severidad. PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio incluyó 57 pacientes, 52 con diagnóstico de A(H1N1)2009 y 5 como grupo control (no diagnosticados de gripe pandémica). De ellos 30 eran hombres y 27 mujeres. En cuanto al diagnóstico: siete de ellos fueron casos leves, 3 presentaron asma, 1 distress respiratorio, 40 neumonía y 4 sufrieron fallo multiorgánico. Se desconoce la clínica de dos casos. Tres pacientes fallecieron. La

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Respuesta inmune y vacunas (I)

Moderadores: Dr. Ramón Alemany Dra. Margarita del Val

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CO/40 de larga duración. Además, se ha demostrado que madres preñadas inmunizadas transmiten Transmisión vertical de la inmunidad la inmunidad específica a sus crías, tanto por adquirida por ratonas inmunizadas vía intrauterina como por la lactancia. Estos re- con proteínas recombinantes sultados indican que ambos inmunógenos son de la cápsida viral (ORF2) del buenos candidatos vacunales. virus de la hepatitis E (VHE) PALABRAS CLAVE: Virus de la hepatitis E, Jiménez de Oya N., Alonso-Padilla vacunas, respuesta inmunológica J., Blázquez AB., Escribano-Romero E.*, Escribano J.M., Sáiz J.C. CO/41 Departamento de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Producción de VHH protectivos Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra. Coruña frente a rotavirus del grupo A en Km. 7.5. 28040 Madrid, Spain (1) sistemas alternativos de expresión El virus de la hepatitis E (VHE, familia Hepevi- Gómez-Sebastian S* (1), Núñez MC ridae) es un virus no envuelto con un genoma (1), Garaicoechea L (2), Alvarado C (1), de ARN de polaridad positiva que codifica tres Romero L (1), Lasa R (1), Wigdorovitz A marcos de lectura abierta, siendo el ORF2 el (2), Parreño V (2), M.Escribano J (3) que codifica la proteína de la cápsida viral, la (1) más inmunogénica. El virus se transmite por ALGENEX, Madrid , Instituto de (2) vía entérica y se asocia a la aparición de gran- Virología, INTA, Buenos Aires , (3) des epidemias de hepatitis aguda en regiones Biotecnología, INIA, Madrid endémicas tropicales y subtropicales donde las Los Rotavirus (RV) producen diarreas severas condiciones higiénicas y de salubridad del agua en niños menores de 5 años, llegando a provo- potable no son adecuadas. En regiones no encar más de 600.000 muertes al año, fundamen- démicas se presenta en forma de brotes espo- talmente en los países en desarrollo, y millones rádicos que podrían tener un origen zoonótico. de hospitalizaciones en el primer mundo. Los La tasa de mortalidad de la enfermedad se es- RV presentan una gran variabilidad genética, tima en el 1-2%, aunque en mujeres embaraza- existiendo 7 grupos (del A al G), siendo el gru- das puede alcanzar hasta el 30%. Actualmente po A el mas frecuente. Los RV del grupo A se no existen terapias específicas ni vacunas co- subclasifican en serotipos G y P según la va- merciales disponibles. riación genética de las proteínas de la envol- En este trabajo presentamos la producción de tura externa VP7 y VP4. Hasta el momento se anticuerpos específicos frente al VHE en rato- han descrito 33 G genotipos y 35 P genotipos. nas Swiss inmunizadas con dos construcciones A diferencia de la elevada variabilidad de las recombinantes de la proteína ORF2 del VHE, proteínas de la envoltura externa, la proteína la proteína completa y una forma truncada en VP6 esta muy conservada (90 % de homolo- los primeros 111 aminoácidos. Las ratonas se gía de secuencia de aminoácidos) y es muy inmunizaron con diferentes dosis de ambas inmunogénica, siendo esta proteína la emplea- proteínas recombinantes parcialmente purificada para el diagnóstico de RV del grupo A. Las das de larvas de insecto (T. ni) infectadas con vacunas disponibles para niños estan basadas baculovirus recombinantes. Ambos inmunóge- en el uso de virus vivo atenuado y las vacunas nos indujeron títulos elevados de anticuerpos veterinarias de virus inactivado. En ambos ca-

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sos se formulan inmunogenos polivalentes que de 12 millones de personas con una estimación solo contemplan los genotipos mas importantes anual de 1,5 millones de nuevas infecciones. de cada especie por lo que no son de amplio En vista de la toxicidad e ineficacia que tienen espectro, viéndose comprometida su universa- las drogas para controlar la infección, se con- lidad. La generación de vacunas frente a RV sidera que se debe desarrollar una vacuna ca- grupo A dirigidas a proteínas más conservadas paz de conferir inmunidad permanente contra entre los diferentes serotipos, como por ejem- el parásito. plo la proteína VP6, supondría una gran ventaja en este aspecto. Sin embargo los anticuerpos Nuestro grupo ha desarrollado una vacuna convencionales dirigidos contra esta proteína frente a leishmaniosis cutánea y visceral ba- no son capaces de neutralizar la infeccion. Los sada en el virus vaccinia atenuado MVA que llamados nanobodies o VHH, anticuerpos de expresa la proteína LACK de leishmania. El camélido, de estructura más sencilla y de me- virus MVA se generó tras más de 500 pases nor tamaño si son capaces de interactuar con la seriados en fibroblastos embrionarios de pollo, proteína VP6 e inducir una neutralización viral durante los cuales perdió alrededor del 15% de de amplio espectro y la protección de ratones su genoma y con él la capacidad de replicar lactantes frente la diarrea por rotavirus. En el en células humanas y de la mayoría de mamí- presente trabajo se describe la expresión de feros. Aunque el virus MVA presenta una alta VHHs dirigidos frente a la proteína VP6 en el inmunogenicidad, diversos estudios sugieren sistema IBES® basado en el uso de insectos biofactoría. La funcionalidad y universalidad de que la respuesta frente a antígenos heterólo- estas moléculas frente a RV del grupo A se ha gos se podría incrementar mediante el uso de demostrado en ensayos in vitro e in vivo en un virus con capacidad replicativa. modelo murino. Los resultados obtenidos de- En el presente trabajo se caracterizan nuevas muestran que estas moléculas pueden prevenir cepas mutantes del virus vaccinia generadas o reducir los síntomas de diarrea en animales tras pases seriados de la estirpe WR en células infectados. de mamífero. Debido a la estrategia seguida en PALABRAS CLAVE: VHH o nanobodies, su generación no han perdido su capacidad de Rotavirus (RV) replicar en mamíferos, aunque la replicación está limitada debido, entre otros factores, a la CO/42 alteración de proteínas implicadas en morfogé- nesis. Caracterización de nuevos mutantes Se ha estudiado tanto su seguridad como la replicativos del virus vaccinia respuesta inmunológica inducida por mutantes como candidatos vacunales que expresan la proteína LACK, demostrándo- frente a la leishmaniasis se que son vectores seguros y que presentan Sánchez-Sampedro L.*, Gómez una alta inmunogenicidad. Además, con la se- C.E., Esteban M. cuenciación de los genomas completos de los virus estudiados se abre una nueva vía para el Biología Molecular y Celular, Centro Nacional de Biotecnología, Madrid (1) estudio del impacto de distintas mutaciones y deleciones en el genoma del virus vaccinia. La leishmaniasis es una enfermedad parasita- PALABRAS CLAVE: leishmaniasis, virus ria de distribución mundial, que afecta a más vaccinia

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CO/43 el desarrollo de estas células a DCs maduras. Asimismo las DCs maduras no expresan CD80, Interferón tipo I (IFN-I) limita CD86 ni MHC-II y por lo tanto, el virus es capaz la capacidad del virus de la de interferir en su capacidad de presentación lengua azul (VLA) de infectar de antígeno y migración hacia órganos linfoi- precursores hematopoyéticos des secundarios. Las poblaciones de DCs en y células dendríticas in vivo bazo también muestran alteraciones. Todos estos hallazgos sugieren que las células hema- Rodriguez-Calvo T *, Rojas JM, Sevilla N topoyéticas pueden tener un papel importante Centro de Investigación en Sanidad en la eliminación de la infección a través de la Animal (CISA-INIA), Madrid, España. (1) producción de IFN-I ya que la falta del mecanismo de retroalimentación positivo a través del Los interferones que se engloban dentro del receptor IFNAR, aumenta la susceptibilidad de tipo I (IFN-I) son elementos esenciales en el de- estas células a la infección. sarrollo de la respuesta inmune innata y limitan PALABRAS CLAVE: Virus de la lengua azul, la diseminación de muchos virus, retrasando Células dendríticas, Interferón tipo I o evitando la aparición de la enfermedad que causan. El virus de la lengua azul (VLA) pertenece al género Orbivirus y a la familia Reoviri- CO/44 dae y tiene una gran importancia económica. Es un virus sin envoltura que posee ARN de TAP-independent CD8+ T lymphocyte doble cadena como genoma y que causa una responses against vaccinia virus enfermedad de tipo hemorrágico, afectando a MHC class I ligands suffice to rumiantes. La sintomatología es más evidente provide antiviral protection en ciertas razas de oveja. El VLA se transmite Lázaro S* (1), Iborra S (1), Ramos mayoritariamente por la picadura de mosquitos M (1), López D (1), Del Val M (2) de tipo Culicoides, que actúan como vectores para los hospedadores mamíferos. Este virus Centro Nacional de Microbiología, Instituto se caracteriza también por inducir la produc- de Salud Carlos III, Madrid. (1), Centro de ción de gran cantidad de IFN-alpha, ya que las Biología Molecular Severo Ochoa, (CSIC- células infectadas producen IFN-I en respuesta UAM), y Centro Nacional de Microbiología, a la presencia de ARN de doble cadena a nivel Instituto de Salud Carlos III, Madrid. (2) intracelular. La producción de IFN-I es depen- CD8+ T lymphocytes screen peptides displa- diente de un mecanismo de retroalimentación yed at the plasma membrane by MHC class I positivo en el que está implicado el receptor de molecules. Most of these peptides result from IFN-I (IFNAR). Hemos desarrollado un modelo cytosolic proteolysis and are transported into de ratón (Calvo-Pinilla et al. PLoS One 2009 the endoplasmic reticulum by TAP transporters, 4(4):e5171) en el que ratones deficientes para where they meet nascent MHC class I molecu- el receptor de IFN-I (IFNAR(-/-)) son altamente les. TAP-independent antigen processing pa- susceptibles a la infección por el VLA. En este thways have been described, but the extent to trabajo describimos la capacidad del VLA de which they contribute to CD8+ T-cell responses infectar progenitores hematopoyéticos y célu- to viruses is still unclear. In this report, we show las dendríticas (DCs) in vitro e in vivo. El VLA that CD8+ T lymphocytes from VACV-infected infecta las células progenitoras de la médula TAP1-deficient mice recognized vaccinia virus ósea de los ratones IFNAR(-/-), interfiriendo en (VACV) antigens presented by TAP-deficient

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infected dendritic cells to the same extent as (CNB-CSIC). Darwin 3. Campus Universidad by wild type infected cells. About 13% of the Autónoma de Madrid.. 28049 Madrid. (2) wild type response was directed against viral epitopes presented by MHC class I molecules El mutante defectivo de SARS-CoV que carece independently of TAP. Analysis of 30 individual de la proteína de la envuelta E (SARS-CoV- VACV epitopes revealed up to 12 epitopes that deltaE) está atenuado in vivo (DeDiego et al. could be processed independently of TAP, and 2007 and DeDiego et al. 2008). Para identificar CD8+ T-lymphocyte lines mono-specific for los mecanismos que median la atenuación del most of these were established from TAP1-de- virus SARS-CoV-deltaE, se comparó la expre- ficient animals. Half of these peptides derived sión génica en células infectadas con los virus from membrane viral proteins. Interestingly, the SARS-CoV-deltaE y SARS-CoV parental, que other half derived from cytosolic viral proteins, expresa la proteína E. Se demonstró que la ex- and yet gained access to vesicular or secretory presión de genes de respuesta a estrés aumen- antigen presentation pathways in the absence taba en la infección en ausencia de la proteína of TAP. Finally, CD8+ T lymphocytes primed by E. Además genes implicados en transcripción, two of these peptides were sufficient to provide metabolismo, immunoregulación, apoptosis y protection against viral infection in TAP-deficient ciclo celular y diferenciación variaban su expre- mice. These findings underline the remarkable sión significativamente en células infectadas contribution of TAP-independent antigen pro- con el virus SARS-CoV-deltaE en relación a cessing pathways to CD8+ T-cell priming and las células infectadas con el virus parental, lo protection from infection with VACV, a virus cual indicó que la proteína E afecta la expre- successfully used to eradicate smallpox and sión de estos genes. Interesantemente, la apor- currently considered as a vaccine vector. tación de la proteína E en trans disminuyó la expresión de los genes de estrés observada en SL and SI contributed equally to this work. las células infectadas con el virus SARS-CoV- deltaE y redujo el estrés producido por otros PALABRAS CLAVE: MHC class I epitopes, virus respiratorios y por drogas que inducen es- vaccinia virus, TAP trés por diferentes mecanismos. La proteína E de SARS-CoV redujo la respuesta a proteínas CO/45 incorrectamente plegadas inducida durante la infección viral y limitó la apoptosis celular. In- La proteína de la envuelta (E) teresantemente, la expresión de las citoquinas del coronavirus del síndrome proinflamatorias CCL2 y CXCL2 se redujo en respiratorio agudo y grave (SARS- las células infectadas con el virus SARS-CoV- CoV) regula las respuestas de deltaE. Estos datos están de acuerdo con la re- estrés celular y la inflamación ducción de la inflamación observada en los pul- mones de hamsters, ratones transgénicos que DeDiego M. L. (1), Jimenez-Guardeño J. expresan el receptor de SARS-CoV y ratones M. * (1), Nieto-Torres J. L. (1), Regla-Nava convencionales infectados con el virus SARS- J. A. (1), Oliveros J. C. (2), Enjuanes L. (1) CoV-deltaE. En concreto, en ratones convencio- Departamento de Biología Molecular y Celular nales infectados con el virus SARS-CoV-deltaE Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). se observó una disminución de neutrófilos en Darwin 3. Campus Universidad Autónoma las zonas de inflamación pulmonar, que son un de Madrid.. 28049 Madrid (1), Unidad de marcador de inflamación aguda. La reducción Genómica. Centro Nacional de Biotecnología de la inflamación en ausencia de la proteína E

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probablemente contribuyó a la atenuacion ob- Sevilla. Spain. CIBER de Enfermedades servada para los mutantes SARS-CoV-deltaE. Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). (4), El efecto de la proteína E de SARS-CoV en la Unidad de Hepatología, Hospital Universitario disminución de las respuestas a estrés y apop- de la Princesa, Madrid. Spain. CIBER de tosis y en el aumento en la inflamación podría Enfermedades Hepáticas y Digestivas estar mediado por proteínas celulares que se (CIBERehd) (5), Unidad de Hepatología, unen a la proteína E y que se están estudian- Hospital General de Valencia. Spain (6), Unidad do. El virus SARS-CoV-deltaE atenuado indujo de Pediatría, Hospital Universitario San Cecilio protección frente al desafío con cepas patóge- Granada. Spain. CIBER de Enfermedades nicas homólogas y heterólogas de SARS-CoV Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) (7) en hamsters y ratones transgénicos y conven- ANTECEDENTES Y OBJETIVOS: Los factores cionales. En conjunto, estos datos indican que virales son considerados los mejores predicto- la proteína E de SARS-CoV es un factor de res de respuesta al tratamiento con Interferón virulencia y que el virus atenuado SARS-CoV- pegilado (IFNpeg) y Ribavirina (RBV) en pa- deltaE es un candidato muy prometedor para cientes con Hepatitis Crónica C (HCC). Sin em- proteger frente al virus SARS-CoV. bargo, en la actualidad se sabe que los factores PALABRAS CLAVE: SARS-CoV, virulencia, genéticos del hospedador juegan un papel muy proteína de la envuelta importante. El objetivo es analizar la relación que existe entre los factores inmunogenéticos del paciente con HCC, HLA e IL28B, con la res- CO/46 puesta al tratamiento combinado, y su relación Importancia de los factores genéticos con los factores virales. del hospedador, HLA e IL28B, METODOS: 428 pacientes naive con HCC fue- como predictores de respuesta al ron incluidos en este estudio de cohortes res- interferón pegilado y ribavirina en tropectivo multicéntrico. Los pacientes fueron pacientes con hepatitis crónica C tratados con IFNpeg/RBV durante 48 semanas en el genotipo-1 (n=378, 88%), y durante 24 Muñoz de Rueda P* (1), López-Nevot semanas en genotipo no-1 (n=50, 12%). Se ge- MA (2), Sáenz-López P (2), Casado J (3), notiparon los alelos HLA de clase I, HLA-A*, -B* Martín-Casares A (2), Palomares P (3), y –C*, y los de clase II, HLA-DRB1* y DQB1*, Quiles R (1), Gila A (1), Romero-Gómez así como los polimorfismos rs12979860 de la M (4), Pavón EJ (3), Muñoz-Gámez JA (3), IL28B. Carazo A (3), Sanz-Cameno P (5), Moreno- Otero R (5), Diago M (6), Palacios A (1), RESULTADOS: El genotipo CC de IL28B Ruiz-Extremera A (7), Salmerón J (1) (aOR=4.3, 95%IC: 2.6-7), presencia de HLA- Unidad de Aparato Digestivo, Hospital DQB1*0301 (aOR=2.08, 95%IC:1.2-3.5), edad Universitario San Cecilio, Granada. Spain. ≤40 años (aOR=2.4, 95%IC:1.5-3.8), genotipo CIBER de Enfermedades Hepáticas y viral (aOR=3.2, 95%IC:1.4-7.2) y la carga viral Digestivas (CIBERehd) (1), Servicio de basal ≤600.000UI/ml (aOR=2.2, 95%IC:1.4- Inmunología, Hospital Universitario Virgen 3.6) fueron independientemente asociados con de las Nieves, Granada. Spain (2), Unidad la respuesta virológica sostenida (RVS) en el de Aparato Digestivo, Hospital Universitario análisis de regresión logística multivariante. Al eliminar del modelo multivariante la variable San Cecilio, Granada. Spain (3), Unidad de IL28B el área bajo la curva (AUC) disminuyó Hepatología, Hospital Ntra. Sra. de Valme,

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significativamente (0.76 vs 0.69; P=0.03). La curva ROC realizada del modelo multivariante con los factores virales fue menor que la realizada con los factores inmunogenéticos (0.67 vs 0.72, respectively; P=0.04). Los alelos HLA- DQB1*0301 y -A*0201 se asociaron con el genotipo CC de IL28B y con la RVS (P<0.0001, en ambos casos). Los pacientes genotipo CC de IL28B con RVS, presentaron menor carga viral basal (P=0.016) y menor ALT basal (P=0.02) que los no-RVS; mientras que los pacientes genotipo CT/TT de IL28B fueron mas jóvenes (P<0.0001), con menor GGT basal (P=0.006), menor carga viral (P<0.0001) y con mayor pro- porción de genotipo viral no-1 (P<0.0001) que los que no presentaron RVS. CONCLUSIONES: Los genotipos HLA- DQB1*0301 y CC de la IL28B, son factores independientemente asociados con la RVS. Existe un sinergismo entre los alelos HLA- DQB1*0301 y HLA-A*0201 y el genotipo CC de IL28B, que incrementa la proporción de RVS. La IL28B es el mejor factor predictivo de respuesta al tratamiento combinado en pacientes con HCC. PALABRAS CLAVE: Hepatitis crónica C, HLA, IL28B

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Mecanismos de patogenia y persistencia vírica

Moderadores: Dr. José María Almendral Dr. Vicente Pallás

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CO/93 requisitos de la inserción en horquilla asociada con este síndrome son más complejos de Disección molecular del determinante lo que incialmente se pensaba. Teniendo en patogénico de un viroide cloroplástico cuenta que la secuenciación masiva de genote- y papel potencial en patogénesis del cas de pequeños RNAs de hojas sanas y afec- silenciamiento mediado por RNA tadas por PC ha desvelado diferencias en la acumulación de algunos micro RNAs y peque- Navarro B* (1), Gisel A (2), Rodio ME (1), ños RNAs interferentes del huésped (efectores Delgado S (3), Flores R (3), Di Serio F (1) característicos del silenciamiento mediado por Istituto di Virologia Vegetale (CNR), Bari, Italia RNA), la implicación de este mecanismo en la (1), Istituto di Tecnologie Biomediche (CNR), patogenicidad del PLMVd aparece como una Bari, Italia (2), Instituto de Biología Molecular y alternativa factible. Celular de Plantas (UPV-CSIC), Valencia (3) PALABRAS CLAVE: viroides, silenciamiento La enfermedad denominada calico del melo- mediado por RNA, pequeños RNAs cotonero (peach calico, PC), que se manifies- ta como una clorosis extrema (albinismo) en CO/94 hojas, tallos y frutos, es inducida por variantes de secuencia atípicas del viroide del mosaico Caracterizacion de una linea celular latente del melocotonero (Peach latent mosaic persistentemente infectada con el viroid, PLMVd, de la familia Avsunviroidae con Aquabirnavirus IPNV con resistencia a replicación cloroplástica), que difieren de las superinfeccion con virus heterologos variantes latentes y de aquéllas que inducen mosaico por tener una inserción caracterís- Agulló E, García P, Martínez A, Chico V, tica de 12-13 nt en una posición definida del Ortega-Villaizán MM, Estepa A, Perez L* RNA genómico. El determinante patogénico Instituto de Biología Molecular asociado al PC se ha cartografiado en esta in- y Celular (IBMC), Universidad serción específica, que adopta una conforma- Miguel Hernández, Elche (1) ción en horquilla. En estudios previos hemos demostrado que un tetrabucle apical UUUU es La existencia de peces asintomáticos portado- estrictamente necesario para preservar las pro- res de virus es una amenaza constante para la piedades patogénicas asociadas a este deter- acuicultura. El establecimiento de infecciones minante molecular. En el trabajo presente he- persistentes en cultivo celular (in vitro) nos pro- mos diseccionado las propiedades funcionales porciona modelos para el estudio y la identifica- de este elemento estructural mediante mutagé- ción de los factores implicados. Con anteriori- nesis dirigida, inoculación y observación de los dad se han descrito cultivos de líneas celulares síntomas expresados, y caracterización de las de salmón y trucha (familia salmónidos) persis- progenies que se acumulan en tejidos verdes tentemente infectados con el virus de la necro- y albinos de melocotoneros de semilla GF-305 sis pancreática infecciosa (IPNV). Aquí se des- inoculados con las variantes mutadas. Nues- cribe la infección persistente de líneas celulares de ciprínidos con IPNV. Estos cultivos pueden tros datos muestran que no sólo el tetrabucle mantenerse a temperatura subóptima para apical UUUU de la inserción en horquilla, sino replicación del virus durante meses. Durante también su tallo y particularmente su composi- este tiempo las células pueden subcultivarse ción nucleotídica, desempeñan un papel clave sin perder la producción de virus. Un aspecto en la inducción del PC, indicando así que los

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interesante de estas células persistentemente CoV), se generó y caracterizó una colección infectadas es que muestran mayor resistencia de cinco anticuerpos monoclonales y un suero a superinfección con virus homólogos y heteró- policlonal específicos para los extremos car- logos que la línea celular de la que proceden. boxilo y amino de la proteína, respectivamente. La resistencia requiere la continua replicación Usando estos anticuerpos, la proteína E se de- de IPNV en el cultivo celular, que se mantiene tectó en el compartimento intermedio (ERGIC) a un nivel bajo: los datos indican que el número en células transfectadas con un plásmido que de células en el cultivo que expresan antígenos codificaba la proteína E y en células infectadas virales es inferior al 1%. En peces teleósteos se con SARS-CoV. No se encontró evidencia de ha descrito la producción de proteínas de tipo la acumulación de la proteína E en la superficie interferón en suero, en respuesta a infecciones virales. Entre los mecanismos conocidos de ac- celular, utilizando tres técnicas complementa- ción antiviral inducidos por interferón, la vía de rias: inmunofluorescencia, inmunomicroscopía expresión de las proteínas Mx es uno de los electrónica y marcaje y purificación de proteí- más potentes. El análisis de la expresión del nas de la superficie celular. La determinación gen Mx en las células persistentemente infecta- de la actividad canal iónico en la membrana das apunta a que podría haber relación entre el plasmática de células que expresaban la pro- nivel de expresión de Mx y resistencia. teína E mediante whole-cell patch clamp, indicó que la proteína E no se estaba comportando PALABRAS CLAVE: acuicultura, birnavirus, como un canal iónico activado por voltaje en persistencia la membrana plasmática, reforzando que esta proteína no se acumula en la superficie celular. CO/95 La topología de la proteína E en membranas intracelulares se estudió mediante la permeabi- Localización subcelular, topología y lización diferencial de las membranas plasmá- actividad canal iónico de la proteína de tica e intracelulares utilizando detergentes y la la envuelta del coronavirus causante del detección de los extremos amino- y carboxilo- síndrome respiratorio agudo y severo terminal en ensayos de inmunofluorescencia. Nieto-Torres J.L.* (1), DeDiego M.L. (1), Jiménez- Se ha propuesto un modelo topológico en el Guardeño J. M. (1), Regla-Nava J. A. (1), Verdiá- que la proteína E de SARS-CoV expone su Báguena C. (2), Aguilella V. M. (2), Enjuanes L. (1) extremo amino terminal hacia el lumen de las Departmento de Biología Molecular y membranas intracelulares y el extremo carboxi- Celular, Centro Nacional de Biotecnología lo hacia el citoplasma celular. La deleción del (CNB-CSIC), Madrid (1), Departamento de gen E del SARS-CoV genera virus con fenotipo Física, Universitat Jaume I, Castellón (2) atenuado. Para estudiar si existe una relación entre virulencia y actividad canal iónico de la La proteína de la envuelta (E) de coronavirus proteína E, se han identificado dos mutaciones (CoV) es una proteína transmembrana de pe- (N15A, V25F) que inactivaron la actividad ca- queño tamaño que participa en procesos de nal iónico de péptidos sintéticos derivados de la ensamblaje, morfogénesis y tráfico intracelular de los viriones y presenta actividad canal ióni- proteína en bicapas lipídicas artificiales. Dichas co. Para estudiar la distribución subcelular y la mutaciones se están insertando en un clon viral topología de la proteína E del CoV causante del infectivo para evaluar su efecto en la atenua- síndrome respiratorio agudo y severo (SARS- ción del virus.

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PALABRAS CLAVE: Proteína de la envuelta vios. Sin embargo, una proporción de los casos de SARS-CoV, Localización subcelular, Activi- graves y muertes se ha dado en pacientes jóve- dad canal iónico nes y aparentemente sanos. Esta observación podría sugerir que dentro de la diversidad de CO/96 virus pandémicos que circulan en humanos, algunas cepas podrían tener una virulencia más Estudio de la patogenicidad de alta de lo normal. Para analizar esta posibili- virus de la gripe H1N1 pandémica dad, aislamos virus procedentes de pacientes aislados de pacientes con fallecidos, de casos graves o leves, pero que no tuviesen patologías previas conocidas. Es- diferente grado de enfermedad tos virus se han aislado y crecido en cultivo ce- Falcón A.* (1), Rodriguez A. (1), Martínez- lular y se han analizado in vitro e in vivo para Orellana P. (2), Martorell J. (3), Casas I. (4), determinar si poseen marcadores de virulencia Pozo F. (4), Guerra S. (5), García-Migura L. (2), especiales. Con este propósito, por un lado se Martínez J. (2), Majó N. (2), García-Barreno ha determinado la secuencia completa de sus B. (4), Ortín J. (1), Melero J.A. (4), Pérez- genomas mediante ultrasecuenciación y estas Breña P. (4), Montoya M. (2), Nieto A. (1) se han comparado entre ellas y con la cepa pandémica de referencia A/California/04/2009 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC. (H1N1). Por otro lado, se ha determinado la Campus de la Universidad Autónoma, (1) replicación viral en ensayos de único y múlti- Cantoblanco, Madrid , Centre de Recerca ple ciclo, y se han determinado los niveles de en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, expresión de diferentes citoquinas pro y anti- Campus de la Universitat Autònoma inflamatorias en células epiteliales de pulmón (2) de Barcelona, Bellaterra, Barcelona. , humano. Además, se ha analizado su virulen- Departament de Medicina i Cirurgia Animals, cia y tropismo en modelos animales de ratón y Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), hurón inoculados vía intranasal ó intratraqueal, Bellaterra, Barcelona. (3), Centro Nacional respectivamente determinándose los síntomas de Microbiología, ISCIII, Majadahonda, clínicos, temperatura y supervivencia, así como Madrid. (4), Dpto de Medicina Preventiva, la replicación viral en diferentes órganos de los Salud Pública y Microbiología, Universidad animales inoculados. También se ha realizado Autónoma de Madrid, Madrid (5) un estudio histopatológico de diversos tejidos El nuevo virus de la gripe H1N1 pandémico ha de las vías respiratorias y otros órganos de los afectado principalmente a adolescentes y adul- animales inoculados con los distintos aislados tos jóvenes sin haberse declarado apenas ca- virales. Tras el análisis de las secuencias, se sos en los mayores de 60 años. Aunque este han encontrado mutaciones puntuales compar- tidas entre los diferentes aislados y mutaciones nuevo virus ha resultado ser menos patogénico puntuales específicas de aislado en algunos de lo esperado, desde abril de 2009 ha infec- de los segmentos genómicos. Los ensayos tado a millones de personas y ha producido de replicación han mostrado diferencias prin- más de 18400 muertes en todo el mundo hasta cipalmente en el inicio del ciclo de replicación agosto de 2010. En Europa se han declarado viral de algunos de los aislados. Además, en 4878 casos hasta marzo de 2010, y en Espa- ratones se han detectado diferentes niveles de ña se han declarado 271 muertes relaciona- carga viral en diversos órganos de los ratones das con el virus H1N1 pandémico hasta junio inoculados, y se han observado distintas lesio- de 2010. Muchos de los casos graves se han nes histopatológicas. En hurón, se han obser- dado en pacientes con factores de riesgo pre-

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vado diferencias tanto en la progresión de los de detección estimado en el orden de 100 UI/ signos clínicos como en la replicación viral en el ml. En un estudio preliminar de validación del aparato respiratorio de los animales infectados método, se han amplificado y secuenciado 40 con los diferentes aislados. cepas de VHB procedentes de portadores cró- PALABRAS CLAVE: Gripe pándemica H1N1, nicos seleccionados por el único criterio de pre- Patogenicidad, Histopatología modelo animal sentar viremia detectable mediante el método de amplificación utilizado rutinariamente en el laboratorio para la detección del virus [Avelón CO/97 et al., J Med Virol 2006; 74:24-36]. El análisis de las secuencias, aún en curso, ha permitido Desarrollo y aplicación de un ya detectar algunos de los cambios que se han método para la amplificación y la asociado a una mayor incidencia de presenta- caracterización molecular de la región ción de hepatocarcinoma. X del genoma del virus de la hepatitis B PALABRAS CLAVE: HBxAg, Proteína X VHB, Sevillano Mantas A.M. *, Avellón Genotipo A, B, C, D, E y F del VHB A, Fogeda M, Echevarría J.M. Unidad de Hepatitis, Área de Virología. CO/98 Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda, Madrid (1) Influencia del polimorfismo rs12979860 en el gen IL28B en la respuesta al La proteína X (HBxAg) del virus de la hepatitis tratamiento antiviral contra la hepatitis B (VHB) es un transactivador de trascripción que puede jugar un papel en la transformación C después del trasplante hepático de los hepatocitos. Algunos estudios sugieren Coto-Llerena M*, Pérez del Pulgar S, que las mutaciones en el gen X del VHB favore- Crespo G, Carrión JA, Martínez SM, cerían el desarrollo del hepatocarcinoma. Con Sánchez-Tapias JM, Navasa M, Forns X el objetivo de facilitar el estudio de la variabili- Servicio de Hepatología, Hospital Clínic, dad de dicho gen, se ha diseñado y optimizado IDIBAPS, CIBERehd, Barcelona (1) un sistema de amplificación que permita realizar esos estudios por secuenciación directa del Introducción y objetivo: La cirrosis hepática producto amplificado. Dicho producto posee causada por la infección por el virus de la he- una longitud de 465 pares de nucleótidos, y su patitis C (VHC) es una de las principales indica- traducción a aminoácidos predice la secuencia ciones de trasplante hepático (TH) en el mun- del HBxAg entre las posiciones 488 y 642 de la do. Recientemente, varios polimorfismos (SNP, proteína. El diseño de los iniciadores se realizó Single Nucleotide Polymorphism) en el gen de tomando en consideración 46 secuencias de la interleucina 28B (IL28B) se han asociado con acceso público correspondientes a 8 genotipos la respuesta al tratamiento antiviral con inter- diferentes del VHB. Tras la optimización de la ferón pegilado (pegIFN) y ribavirina en pacien- reacción de amplificación, se comprobó su um- tes con hepatitis crónica C. Concretamente, el bral de detección estudiando muestras con ADN genotipo rs12979860 CC constituye un factor viral cuantificado en UI/ml mediante hibridación predictivo independiente de la respuesta a la con amplificación de señal (branched-DNA) y terapia antiviral. Por este motivo, el objetivo genotipo conocido, incluyendo los genotipos de nuestro estudio fue investigar la influencia A, B, C, D, E y F. Los mejores resultados se del polimorfismo rs12979860 del gen IL28B en obtuvieron para el genotipo E, con un umbral

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receptores de TH y sus respectivos donantes, el patrón de respuesta al tratamiento antiviral, en la respuesta al tratamiento antiviral después especialmente en los receptores con genotipo del TH. Métodos: Se incluyeron 128 pacientes favorable de IL28B. infectados por el VHC de genotipo 1b, que fueron sometidos a TH. Todos los pacientes reci- PALABRAS CLAVE: Virus de la hepatitis C, bieron tratamiento antiviral basado en pegIFN IL28B, respuesta virológica y ribavirina después del TH. El ADN genómico de donantes y receptores se extrajo de células CO/99 mononucleares de sangre periférica (PBMC). En el caso de no disponer de PBMC, el ADN Estudio de factores virales y del genómico se extrajo de muestras hepáticas huésped determinantes en la parafinadas obtenidas del explante (receptor) y evolución de la infección por VHC del injerto (donante) en el momento del TH. El hacia cronicidad o curación mediante genotipo del SNP rs12979860 (CC, CT o TT) se secuenciación masiva 454/Roche determinó por PCR a tiempo real utilizando son- (1) (1) das Taqman. Resultados: La distribución de los Cubero León *M. , Garcia-Cehic D. , (1) (2) genotipos de IL28B fue diferente ente donan- Esteban Mur J.I. , Rodriguez-Frias F. , (3) tes y receptores, siendo mayor la prevalencia Ortega Serrano I. , Domingo Solans E. (4) (5) del genotipo favorable rs12979860 CC en los , Sauleda Oliveras S. , Bes Majó M. (5) (3) (1) donantes que en los receptores (50% vs.19%, , Sanchez Pla A. , Esteban Mur R. , (1) (1) p<0.001). La respuesta a la terapia antiviral Guàrdia Massó J. , Quer Sivila J. después del TH fue significativamente más ele- Laboratori Malalties Hepàtiques-Medicina vada en los receptores con genotipo CC com- Interna. Vall d’Hebron Institut de Recerca parado con los genotipos CT/TT (59% vs. 25% (VHIR)-HUVH.UAB. Barcelona. CIBERehd p=0.002). En cuanto al genotipo del donante, (1), Departamento de Bioquímica. Hospital la respuesta al tratamiento antiviral fue mayor Universitari Vall d’Hebron (HUVH).Barcelona. en los pacientes que recibieron hígados de do- CIBERehd (2), Unidad de Estadística y nantes CC frente a los que recibieron injertos Bioinformática (UEB).Vall d’Hebron Institut de de donantes CT/TT, aunque las diferencias no Recerca (VHIR)-UAB. Barcelona (3), Centro fueron estadísticamente significativas (41% vs. de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC- 29%, p=0.179). Al analizar de forma combinada Universidad Autónoma de Madrid.CIBERehd los genotipos de IL28B de donantes y recep- (4), Banc de Sang i Teixits.Hospital Universitari tores, obtuvimos un dato muy interesante: la Vall d’Hebron (HUVH).Barcelona.CIBERehd (5) respuesta virológica sostenida después del TH La evolución de la infección por el virus de la fue significativamente mayor en los pacientes hepatitis C (VHC) hacia cronicidad o curación con genotipo CC que recibieron hígados de do- depende tanto de factores virales (heterogenei- nantes CC (83%), en comparación con el resto dad, composición de la población, etc) como de de combinaciones de genotipos de IL28B en factores del huésped (HLA, polimorfismos ge- donantes y receptores (27%, p< 0.001). Con- néticos en IL-28B, etc.). El objetivo de este tra- clusión: Nuestro resultados demuestran que bajo ha sido estudiar mediante secuenciación el genotipo de IL28B del receptor juega papel masiva (GS-FLX) la complejidad y composición principal en la respuesta al tratamiento de la de la quasiespecies en dos pacientes que han hepatitis C recurrente. Sin embargo, el trasplan- compartido inóculo viral pero con diferente te de hígados procedentes de donantes con el evolución de la infección y relacionarlo con po- genotipo CC de IL28B influye positivamente en limorfismos en la región IL-28B, HLA II y res-

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puesta inmune CD4 contra diferentes epítopos CO/100 de NS3. Métodos: Se pirosecuenció la proteína NS3 (proteasa-helicasa), a partir de 7 ampli- El virus herpes simplex de tipo 1 cones solapados de 400 nts cada uno, a partir induce la acumulación del péptido de suero del paciente A (con infección crónica) beta-amiloide en vesículas autofágicas que transmitió el VHC por vía sexual a su pareja Santana Martínez S., Recuero Vicente M., (B), que resolvió la infección espontáneamen- Sastre Merlín I., Valdivieso Amate F., Bullido te. Se obtuvieron un total de 519745 secuen- Gomez-Heras M. J., Aldudo Soto J.* cias de 350-400 nucleótidos. La población viral del paciente crónico presentó una mayor com- Departamento de Biología Molecular, Centro plejidad (Entropía de Shannon: 0,2-0,5) que la de Biología Molecular ‘Severo Ochoa’ (1) población viral de la paciente B (0,05-0,1). La (C.S.I.C.-U.A.M)/CIBERNED, Madrid frecuencia de mutación de nucleótidos (sliding- windows analysis -DNAsp5-) fue significativa- El virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) es mente mayor en la región proteasa del paciente un virus neurotrópico que ha sido implicado crónico A, mientras que a nivel de aminoácidos, en la patogénesis de algunas enfermedades no hubo diferencias significativas. El perfil de neurológicas, incluyendo la encefalitis cerebral respuesta inmune CD4 específica (ELISPOT) severa. En los últimos años se han acumulado en aislados de sangre periférica frente a pools un número creciente de evidencias que vincu- de péptidos sintéticos, mostró que las regiones lan la infección con HSV-1 del sistema nervioso 1327-1417 y 1527-1642 es donde se concen- central con la enfermedad de Alzheimer (EA). Además, HSV-1 es capaz de modular la auto- tró la respuesta inmune diferencial, coincidien- fagia, un proceso esencial que interviene en do con una mayor frecuencia de mutación a la degradación de proteínas a través del com- nivel de aminoácidos en el paciente crónico. partimento lisosomal. Alteraciones del proceso Ambos pacientes presentaron HLA de clase aurofágico podrían intervenir en la formación II asociados a curación espontánea, paciente de depósitos de agregados de proteínas abe- A: DRB1*1501 y la paciente B: DRB1*1101 y rrantes característicos de los cerebros afecta- DQB1*0301. Respecto a los polimorfismos en dos por enfermedades neurodegenerativas. la región IL-28B, la paciente B presentó homo- Utilizando un modelo basado en la línea celular cigosis CC en el SNP 12979860 y TT en el SNP de neuroblastoma humano SK-N-MC que ex- 8099917, ambos asociados a curación espon- presa establemente la proteína precursora del tánea, mientras que el paciente crónico fue he- péptido beta-amiloide (APP), se ha analizado terocigoto en ambos polimorfismos (CT y GT el efecto de la infección con HSV-1 sobre el respectivamente). La variabilidad en epítopos procesamiento de APP y los niveles del pép- concretos de la helicasa del VHC, el genotipo tido beta-amiloide, así como sobre el proceso de IL28, además de la homogeneización de la de autofagia. Este análisis ha mostrado que quasiespecies que se produce durante la fase HSV-1 induce un fuerte incremento de la lipi- aguda de la infección, sobre todo después de dación de LC3, el principal marcador del pro- sufrir un cuello de botella, puede haber condu- ceso autofágico, disparando la acumulación de cido a que la paciente B haya sido capaz de vesículas autofágicas en etapas tardías de la eliminar el virus y conseguir una curación es- infección. Además, en las células infectadas no pontánea. se produce la ejecución del proceso autofági- co como consecuencia de un fallo en la fusión PALABRAS CLAVE: secuenciación masiva, de las vesículas autofágicas con los lisosomas. complejidad quasispecies, polimorfismos

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Por otra parte, HSV-1 induce un aumento de rus son altamente dependientes de la maqui- los niveles del péptido beta-amiloide intracelu- naria traduccional celular para llevar a cabo la lar a la par que una intensa disminución de los síntesis de sus proteínas. Durante la infección niveles del péptido beta-amiloide extracelular. por VPPA se produce una fuerte inhibición de El defecto en la degradación autofágica en cé- la síntesis de proteínas celulares, mientras que lulas infectadas unido a la inhibición de la se- las proteínas virales son eficientemente sinteti- creción del péptido beta-amiloide y al aumento zadas. En el presente trabajo se ha analizado de la actividad gamma-secretasa inducidos por el efecto de la infección de VPPA en el estado la infección, podría tener como consecuencia la y localización de los principales componentes acumulación intracelular del péptido beta-ami- de la maquinaria traduccional celular, así como loide en compartimentos autofágicos. También de los ARN mensajeros celulares y virales. Los hemos demostrado que, en nuestros modelos Resultados obtenidos se resumen a continua- celulares de infección, la autofagia no es el ción: proceso implicado en la generación del péptido beta-amiloide y evidencias preliminares apun- - A pesar de la activación de caspasa-3 pro- tan a la vía secretora constitutiva como respon- ducida con la infección de VPPA, los niveles sable de la producción del péptido. Todos estos del factor de iniciación eIF4G permanecen resultados sugieren que HSV-1 ejerce un com- constantes. Durante la infección por VPPA no plejo control sobre el procesamiento de APP y solo se mantiene la integridad de este factor, la autofagia y podría contribuir a la acumulación si no que además se produce una redistribu- del péptido beta-amiloide característica de los ción del mismo a los sitios de replicación viral, cerebros de pacientes con la EA. conocidos como factorías virales. - Asimismo, PALABRAS CLAVE: HSV-1, amiloide, otros componentes del complejo de iniciación alzheimer de la traducción, como eIF4E, eEF2, eIF2alfa y eIF3b, así como los ribosomas, se concentran CO/101 en la periferia de las factorías virales. - El tratamiento de las células infectadas por VPPA con Distribución y utilización de Ara C previene la redistribución de los factores los factores de iniciación de la eIF4G y eIF4E alrededor de la factoría viral, lo traducción celular por el virus de que sugiere que para que se produzca dicha la peste porcina africana (VPPA) redistribución es necesaria la síntesis de proteí- nas virales tardías, la formación de las factorías Quintas A* (1), Castelló A (2), G.Sánchez virales, o ambos procesos. - A tiempos tardíos E (1), Nogal M (1), Barroso S (1), de la infección se observa una disminución de Carrasco L (3), Revilla Y (1) los ARNm polyadenilados en el citoplasma, Biología Celular e Inmunología, CBMSO mientras que los ARNm virales (p72 y A224L) CSIC-UAM, Madrid (1), EMBL, Heidelberg, se localizan en los alrededores de las factorías Germany (2), Dinámica y Función del virales, en el entorno donde ribosomas, mito- Genoma, CBMSO CSIC-UAM, Madrid (3) condrias y factores de iniciación se acumulan. Estos datos sugieren focalización de la traduc- El Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA) ción viral en el entorno donde el virus replica y es un virus DNA de gran tamaño que ha desa- realiza su morfogénesis. rrollado una gran variedad de estrategias para evadir los mecanismos de defensa de la célula En resumen, el reclutamiento de la maquinaria huésped. Como parásitos intracelulares, los vi- traduccional en las factorías virales, así como

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la degradación de los ARNm polyadenilados, muestras y el cumplimiento de la normativa éti- forman parte del mecanismo por el cual el virus ca y legal existente. inhibe la síntesis de proteínas celulares, facilitando la síntesis de sus propias proteínas y la Actualmente, este biobanco recibe muestras de producción viral. 37 hospitales de toda España y dispone de más de 134.000 viales de distintos tipos de mues- PALABRAS CLAVE: VPPA, eIF4G, eIF4E, tras, procedentes de cerca de 6.000 pacientes. factorías virales A día de hoy casi 3.000 de estas muestras participan en 24 proyectos de investigación nacio- CO/102 nales e internacionales. El BioBanco VIH, una Esta infraestructura representa una apuesta no- herramienta para el avance del vedosa porque, aparte de su obvia contribución conocimiento en VIH/SIDA a la investigación, pretende fomentar la coope- ración entre grupos, creando redes especializa- García Merino I*, Gómez Rico C, das en el estudio y el tratamiento del VIH. García Torre A, Gallego de la Fuente J, de las Cuevas Moreno N, Jiménez PALABRAS CLAVE: Biobanco, Muestras, VIH Fuentes J.L., Muñoz Fernández M.A. BioBanco VIH, Plataforma de Laboratorio, Laboratorio de Inmunobiología Molecular, Hospital General Universitario Gregorio Marañón, Madrid, Spain; Unidad Asociada de Retrovirologia Humana, HGUG-CSIC (1) Una limitación importante en el estudio de cualquier enfermedad suele ser la escasa disponibilidad de material biológico procedente de pacientes. Para salvar esta carencia se han constituido estructuras dirigidas al almacena- miento de muestras biológicas. Una de estas estructuras son los biobancos. El BioBanco VIH se crea en el año 2004 con el objetivo de contribuir al avance del conocimiento científico en la infección por el VIH. Para lograr su objetivo lleva a cabo la recepción, el procesamiento, la criopreservación y la cesión con fines investigadores de muestras biológicas de pacientes VIH, integrados en seis cohortes con características definidas. Todos los procesos realizados en el BioBan- co están sometidos a un estricto sistema de gestión de calidad, basado en el Norma ISO 9001:2008, que garantiza la calidad de las

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Señales víricas. Dominios genómicos

Moderadores: Dra. Encarnación Martínez Dra. Juana Diez

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CO/47 res. Nuestros resultados avalan la existencia de una interacción funcional a larga distancia Caracterización funcional de entre el dominio IIId y el dominio 5BSL3.2 del la interacción RNA-RNA entre RNA genómico viral. Esta unión desempeña un los extremos del genoma del papel fundamental en la regulación de la activi- virus de la hepatitis C dad traduccional del IRES de VHC. Romero López C*, Berzal Herranz A PALABRAS CLAVE: VHC, IRES, Interacción Instituto de Parasitología y Biomedicina RNA-RNA López-Neyra, CSIC. Armilla, Granada (1) En el RNA genómico del virus de la hepatitis CO/48 C (VHC) existen numerosos elementos funcionales de estructura secundaria conservada Identificación de secuencias del que resultan indispensables para la síntesis de coronavirus de la gastroenteritis la poliproteína viral. La región IRES (internal porcina transmisible necesarias ribosome entry site), situada en el extremo 5’ para la encapsidación del RNA de VHC, reúne una serie de dominios responsables del reclutamiento de la maquina- Palacio L.*, Capiscol C., Enjuanes L., Sola I. ria traduccional. Tanto el proceso de inicio de Departamento de Biología Molecular y traducción del genoma del VHC como la pos- Celular. Centro Nacional de Biotecnología terior etapa de elongación están potenciados (CNB-CSIC). Campus Universidad Autónoma. por la región 3’ no traducible (3’UTR), capaz de Cantoblanco. Darwin, 3. 28049 Madrid (1) capturar factores proteicos celulares que interaccionan simultáneamente con ambos extre- La encapsidación de genomas de virus RNA mos del RNA viral para generar una estructu- es dependiente del reconocimiento de secuen- ra circular. En el laboratorio hemos descrito la cias específicas encis que adoptan estructuras existencia de una interacción a larga distancia secundarias definidas. El estudio de señales directa y específica entre los extremos 5’ y 3’ en cis del genoma del virus de la gastroente- del genoma del VHC que contribuiría al fenó- ritis porcina transmisible (TGEV) mostró que meno de circularización. La unión se establece minigenomas del virus que incluyen los 2144 entre dominios esenciales para el ciclo viral: nt del extremo 5’ del virus junto con los 494 nt el dominio IIId del IRES y el dominio 5BSL3.2 del extremo 3’ contienen las secuencias ne- situado en el extremo 3’ de la secuencia codi- cesarias para su encapsidación eficiente. Los ficante de la polimerasa del virus. Esta interac- 2144 nt del extremo 5’ del virus se dividieron ción repercute directamente en la eficiencia de en 8 fragmentos solapantes que se expresaron la actividad traduccional IRES-dependiente de individualmente como RNAs mensajeros sub- manera específica. Nuestros datos demuestran genómicos (sgmRNAs). Para ello cada uno de que el dominio 5BSL3.2 inhibe la función del estos fragmentos se clonó sustituyendo al gen IRES de VHC, incluso en presencia de la región 3a/b del genoma viral. El análisis de las eficien- 3’UTR. Este efecto es dependiente del tiempo y cias de encapsidación de los sgmRNAs porta- del contexto molecular en el que se encuentre dores de cada uno de los fragmentos mostró el dominio 5BSL3.2. La unión de este motivo al que la secuencia más pequeña suficiente para dominio IIId bloquea la formación de complejos la encapsidación eficiente del sgmRNA incluía 80S traduccionalmente activos e interfiere con los primeros 598 nt del extremo 5’ del genoma el reclutamiento de factores proteicos celula- viral. La predicción de la estructura secundaria

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de este fragmento permitió definir cinco domi- res del ciclo viral. El sitio de entrada interna del nios estructurales formados por varias estruc- ribosoma (IRES) dirige el inicio de la traducción turas en horquilla. El primero de ellos contiene por un mecanismo independiente de cap. Los la secuencia leader, presente en todos los sg- IRES de piconavirus tienen que compaginar la mRNAs generados por el virus, y una horqui- adquisición de un estructura especifica con su lla (stem-loop) ampliamente conservada entre interacción con ITAFs y eIFs para ser reconoci- diferentes grupos de Coronavirus que sólo se dos por la maquinaria traduccional. El IRES del forma en el extremo 5’ del genoma viral. La mo- virus de la fiebre aftosa (FMDV) está organiza- dificación de la estructura secundaria de este do en 5 dominios estructurales. Los dominios stem-loop, mediante la introducción de muta- distales son responsables de la interacción con ciones puntuales o la delección de los nucleóti- proteínas; por el contrario, un número muy re- dos apicales de la horquilla, redujo la eficiencia ducido de factores interaccionan con el dominio de encapsidación a niveles similares al control central, el dominio 3. El dominio 3 posee el mo- negativo. Por tanto, se puede concluir que este tivo conservado GNRA en su zona apical. Este motivo de RNA es necesario para la encapsida- dominio es el único con capacidad para interac- ción del genoma de TGEV. Para evaluar si este cionar consigo mismo y complementar en trans motivo es además suficiente para la encapsi- IRES defectivos, lo que lo convierte en un can- dación del genoma, cada uno de los dominios didato para promover interacciones intra e in- estructurales 2 a 5, o bien todos ellos conjun- termoleculares. Los motivos GNRA contribuyen tamente, se delecionaron de la secuencia ori- al plegamiento del RNA mediante interacciones ginal, observándose que los sgmRNAs corres- específicas con su receptor. El motivo GNRA pondientes no se encapsidaron eficientemente. del IRES de FMDV adopta una estructura de Dado que en esta región del genoma viral se bucle de 4 nucleótidos y es responsable de la localizan también señales en cis implicadas en organización de los lazos adyacentes. Trabajos replicación, es necesario discernir si la encap- previos en nuestro laboratorio demostraron que sidación del genoma viral es dependiente de la una mutación puntual en este motivo produce replicación. una reorganización estructural del dominio 3 PALABRAS CLAVE: Coronavirus, junto con una disminución de la actividad IRES Encapsidación, Motivos RNA de 100 veces delimitando la presencia del receptor del motivo GNRA en el dominio 3. En este estudio se ha realizado la búsqueda del CO/49 receptor del motivo GNRA mediante diversos Estudio funcional y estructural del abordajes; El análisis de variabilidad genética de aislados naturales determinó como invarian- tallo apical del IRES de FMDV te una región de 3 pares de bases G:C presen- Fernández N* (1), Fernández-Miragall tes en el tallo apical. La mutagénesis dirigida O (1), Ramajo J (1), García-Sacristán A de esa región mostró una disminución de la (2), Briones C (2), Martinez-Salas E (1) actividad IRES, poniendo de manifiesto la importancia de los nucleótidos que componen el Centro de Biología Molecular Severo tallo apical. El análisis de reactividad SHAPE y Ochoa, CSIC-UAM, Madrid. (1), Centro de de accesibilidad a oligonucleótidos antisentido Astrobiología, CSIC-INTA, Madrid (2) impresos en microarrays reveló una reorga- El genoma de los picornavirus contiene regio- nización estructural del dominio 3 que afecta nes no codificantes altamente estructuradas en principalmente al brazo que incluye el motivo las que se localizan varios elementos regulado- GNRA y a la región mutada. Estos resultados

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están en concordancia con la disminución de dad estructural y una arquitectura modular que la interacción de los transcritos del dominio 3 es determinante para su función biológica. Así, con el brazo del motivo GNRA observada en para entender los mecanismos que regulan la ensayos de retardo en gel. En función de los traducción de proteínas virales dependiente de resultados obtenidos proponemos que el domi- IRES resulta necesario determinar la organiza- nio central del IRES de FMDV adquiere una es- ción estructural del IRES en condiciones nati- tructura esencial para la actividad, estabilizada vas. En nuestro laboratorio hemos desarrollado por contactos terciarios en los que intervienen una metodología de análisis estructural de los el motivo GNRA y el tallo apical del dominio 3. elementos estructurales/funcionales presentes en el extremo 5´ UTR de RNAs genómicos vi- PALABRAS CLAVE: Picornavirus, IRES, rales basada en el estudio de su accesibilidad Reactividad SHAPE a oligonucleótidos complementarios impresos en microarrays. Los microarrays para el estu- CO/50 dio estructural del RNA viral contienen baterías de oligonucleótidos específicos, complementa- Caracterización estructural de rios a secuencias contiguas o solapantes que dominios funcionales de RNAs cubren por completo el extremo 5ÚTR de di- genómicos virales mediante ferentes virus. El RNA genómico viral se mar- microarrays de DNA ca fluorescentemente con procedimientos que no alteran su estructura, y posteriormente se García-Sacristán Ana* (1), Fernández Noemí hibrida al microarray en condiciones nativas. (2), Díaz-Gonzalez Raquel (3), Fernández- Una vez optimizadas las diferentes variables Algar María (4), Gómez Jordi (3), Martínez- experimentales que intervienen en el proce- Salas Encarna (2), Briones Carlos (1) so, los resultados obtenidos nos han permiti- Dpto. Evolución Molecular, Centro de do determinar la accesibilidad diferencial de Astrobiología (INTA-CSIC), Torrejón de Ardoz, los diferentes dominios estructurales del IRES Madrid. Centro de Investigación Biomédica del virus de la hepatitis C (HCV) [Martell et al. en Red de Enfermedades Hepáticas y Nucleic Acids Res. (2004), García-Sacristán et Digestivas (CIBERehd). (1), Dpto. Dinámica al., en preparación] y del virus de la fiebre afto- y función del genoma. Centro de Biología sa (FMDV) [Fernández et al. Virology (2011)] Molecular Severo Ochoa (CSIC). Universidad mostrando una buena correlación con los datos Autónoma de Madrid. Cantoblanco. Madrid derivados de otras técnicas estructurales. Ade- (2), Dpto. de Biología Molecular, Instituto más, esta tecnología nos ha permitido estudiar de Parasitología y Biomedicina López- la estructura del dominio 5ÚTR en otros RNA Neyra, Armilla, Granada (3), Dpto. Evolución virales muy estructurados pero que carecen de Molecular, Centro de Astrobiología (INTA- elementos IRES, como es el caso del virus del CSIC), Torrejón de Ardoz, Madrid (4) Nilo Occidental (WNV) [Díaz-González et al., en preparación]. La alta sensibilidad y especi- La traducción del RNA genómico de todos los ficidad de la tecnología de microarrays resulta miembros de la familia Picornaviridae, así como prometedora para la descripción de estructu- de algunos representantes de los Flaviviridae, ras terciarias en el 5’UTR de los RNAs virales, comienza por la interacción del ribosoma con para el estudio de las interacciones RNA-RNA el internal ribosome entry site (IRES), un ele- de larga distancia entre los dominios 5ÚTR y mento estructural localizado en el extremo 5´ 3ÚTR de HCV y otros virus, y para la caracte- no codificante (5´ UTR) del RNA viral. Los ele- rización de interacciones RNA-proteína con re- mentos IRES presentan una elevada compleji-

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levancia funcional. Adicionalmente, al tratarse aftosa (FMDV) como PAMPs, se ha analizado de una tecnología de alto rendimiento, los mi- la capacidad de los principales elementos es- croarrays de estructura nos permiten analizar tructurados en las 5´ y 3´NCRs, fragmento S, muestras clínicas de HCV de los genotipos 1b IRES (‘internal ribosome entry site’) y 3´NCR de y 2a, en busca de una posible correlación entre FMDV, para estimular la respuesta inmune in- la estructura del IRES y la respuesta del virus a nata antiviral mediante transfección en células tratamientos antivirales. porcinas cultivadas.

PALABRAS CLAVE: Internal Ribosome Entry Como resultado, se pudo detectar un incremen- Site (IRES), Microarrays de DNA, Estructura/ to significativo de los niveles de expresión del función RNA mRNA de IFN beta en las células transfectadas con los distintos elementos. Las cinéticas CO/51 de inducción entre los distintos elementos de RNA fueron comparadas a lo largo del tiempo. Elementos estructurados presentes Adicionalmente, se detectó la presencia de ac- en las regiones no codificantes del tividad antiviral en los correspondientes sobre- RNA de FMDV como estimuladores de nadantes de transfección, existiendo correla- la respuesta inmune innata in vitro ción en cada caso con los niveles de inducción detectados. Rodriguez Pulido M* (1), Borrego Rivero B (2), Sobrino Castelló F (1), Saiz Zalabardo M (1) La identificación de estos dominios altamente Centro de Biología Molecular Severo Ochoa estructurados en las NCRs de FMDV como (CSIC-UAM), Cantoblanco, 28049 Madrid (1), activadores de la respuesta inmune innata en CISA-INIA, Valdeolmos, 28130 Madrid (2) cultivo celular, sugiere su ensayo y potencial aplicación in vivo como estimuladores de la El interferon tipo I (IFN) ejerce un papel fun- respuesta innata y en estrategias antivirales damental en la inmunidad innata antiviral en dirigidas al control de enfermedades causadas respuesta a la invasión de un patógeno. El por patógenos sensibles a IFN. reconocimiento de moléculas exógenas como PALABRAS CLAVE: regiones no codificantes, ‘patrones moleculares asociados a patógenos’ FMDV, Respuesta innata (PAMPs) por distintos sensores virales presentes en la célula inicia la activación de esta respuesta inmune innata que culmina con la se- CO/52 creción de IFN alfa/beta con actividad antiviral, Identificación de elementos de antiproliferativa e inmunoestimuladora. estructura tipo tRNA dentro de la La generación de RNA de doble cadena (ds- población de mRNAs hepáticos RNA) en la célula infectada en forma de frag- humanos: ejemplo del mRNA IFNA5 mentos genómicos, intermediarios replicativos Díaz-Toledano R.*, Gómez J. o estructuras secundarias, es detectada por IPBLN-CSIC Avda. del Conocimiento, sensores virales citoplásmicos que identifican (1) el dsRNA como PAMP. Para analizar el posible s/n.18100 Armilla (Granada), CIBERehd reconocimiento de elementos altamente estruc- Elementos de RNA miméticos son aquellos turados presentes en las regiones no codifican- cuya estructura ha evolucionado para interac- tes (NCRs) del genoma del virus de la fiebre cionar con una proteína o un complejo macro-

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molecular que normalmente se une a un RNA principales puntos de corte se encuentran en distinto. Usando el mismo lugar de unión el las posiciones A376/A378 y A489/A491 lo que RNA mimético involucra a la proteína o com- correspondería a dos estructuras tipo tRNA plejo en un proceso biológico diferente al usual. muy próximas dentro de la región codificante. El mimetismo de RNA fue descrito por primera La presencia de elementos estructurales comu- vez hace más de 40 años entre el tRNA celular nes entre el RNA del virus de la hepatitis C y un y la región 3’ de los virus de plantas. En es- gen de defensa antiviral abre nuevas vías de tos se observó que el extremo 3’ del RNA viral exploración para la persistencia viral. era capaz de incorporar un aminoácido espe- cífico en presencia de la aminoacil tRNA sin- PALABRAS CLAVE: tRNA like, Interferón tetasa correspondiente. Más tarde se vio que alfa, HCV esta misma estructura podía ser sustrato de otras enzimas implicadas en el metabolismo CO/53 del tRNA como la RNAsa P (el enzima que procesa el precursor del tRNA), o la enzima que La proteína p23 del virus de la añade -CCA, etc. Empleando la enzima RNAsa tristeza de los cítricos: determinantes P se han identificado estructuras tipo tRNA en de su localización nucleolar e la región IRES del RNA de HCV y otros RNAs influencia de los mismos sobre virales: pestivirus, picornavirus y dicistrovirus. la supresión del silenciamiento El objetivo de este trabajo es averiguar, si el mediado por RNA y la patogénesis mRNA poli(A) hepático comparte característi- cas estructurales con los RNAs virales, que les Ruiz-Ruiz S* (1), Sánchez-Navarro J (1), Navarro permiten ser reconocidas por la RNAsa P. Me- L (2), Moreno P (2), Peña L (2), Flores R (1) diante ensayos de competición in vitro hemos Instituto de Biología Molecular y Celular comprobado que la población de mRNAs hepá- de Plantas (UPV-CSIC), Valencia (1), ticos es capaz de competir sobre la reacción de Instituto Valenciano de Investigaciones procesamiento de la RNasa P humana sobre Agrarias, Moncada, Valencia (2) un sustrato natural marcado, en la misma pro- porción que la observada para el pretRNAtyr. Para contrarrestar la defensa antiviral de sus Usando tecnología de microarrays identifica- húespedes, el RNA genómico (19.3 kb) del vi- mos mRNAs portadores potenciales de estruc- rus de la tristeza de los cítricos (Citrus tristeza turas tipo tRNA. Hemos confirmado la relación virus, CTV), género Closterovirus, codifica tres de mimetismo para 3 transcritos subclonados proteínas que son supresores del silenciamien- correspondientes a los genes: histona H2AFJ, to mediado por RNA (RNA silencing suppres- proteína ribosomal RPS9 y para el RNA del sors, RSS) en Nicotiana spp. Una de ellas (p23, interferón IFNA5. Para ello se emplearon en- una proteína de unión a RNA de 209 aminoáci- sayos de inhibición competitiva reversa y expe- dos con un dedo de Zn flanqueado por motivos rimentos de digestión in vitro. Se seleccionó el básicos), además de actuar como RSS, contro- RNA del interferón alfa subtipo 5 para corrobo- la la acumulación asimétrica de los RNAs (+) y rar mediante pruebas bioquímicas más riguro- (-) de CTV y es un determinante de patogenici- sas que los cortes observados en los experi- dad en varias especies de cítricos (incluyendo mentos de digestión in vitro eran consecuencia naranjo amargo y pomelo) en los que induce del procesamiento de la RNasa P. Esto incluye un síndrome de amarilleamiento (seedlings la identificación de la química de extremos 5´P yellows). Con el fin de profundizar en el cono- y 3´OH para los productos de digestión. Los cimiento de esta proteína, la fusion p23-GFP

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(green fluorescent protein) se agroexpresó en N. benthamiana. El examen mediante micros- copía láser confocal reveló su acumulación en el nucleolo y cuerpos de Cajal, así como en plasmodesmos, siendo estos resultados confirmados por colocalización de p23 con diferentes proteínas marcadoras. Por lo tanto, p23 es la primera proteína descrita de un closterovirus con localización nucleolar. Para diseccionar la correspondiente señal (nucleolar localization signal, NoLS), que típicamente está asociada con motivos básicos, se ensayaron seis versiones truncadas de p23: la deleción del fragmen- to aminoacídico 158-209 no alteró el patrón de localización, que sin embargo se perdió al de- lecionar los fragmentos 125-209, 100-209, 50- 66, 67-86 ó 50-86. Así pues, las regiones 50- 86 y 100-158 (ambas con motivos básicos y la primera con el dedo de Zn) contienen la NoLS (bipartita). Además, la actividad RSS de p23 (analizada por su co-agroexpresión con GFP en la línea transgénica de N. bentamiana 16c que expresa constitutivamente GFP) se perdió no sólo con las deleciones que anulan su loca- lización nucleolar, sino tambien con la deleción 158-209, indicando que dicha actividad implica a la mayoría de las regiones de p23. Por últi- mo, la capacidad de p23 de inducir necrosis al expresarla en N. benthamiana como un RNA subgenómico del virus X de la patata (Potato virus X), únicamente la retuvo el mutante de de- leción 158-209, mostrando que el dedo Zn y los motivos básicos flanqueantes forman parte del determinante de patogénesis de p23.

PALABRAS CLAVE: virus de RNA, localización subcelular, silenciamiento mediado por RNA

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Actualización en técnicas de diagnóstico virológico

Moderadores: Dr. Diego Arroyo Dra. Concepción Gimeno

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CO/54 co procedente de las muestras respiratorias era analizado por duplicado con ambas metodolo- Comparación del Test Luminex xTAG® gías. En el caso de discrepancia en el resulta- RVP FAST con métodos nested- do obtenido, la muestra se procesaba de nue- PCR multiplex en el diagnóstico vo. Adicionalmente, se han comparado ambos etiológico de infección respiratoria métodos analizando, por un lado, un panel de en pacientes pediátricos 20 muestras correspondientes a los dos programas de control de calidad externo de la OMS Pozo F* (1), Reyes N (1), Calvo C (2), García- realizados durante 2010 para la detección mo- García ML (2), Cruz N (1), Molinero M (1), lecular de virus de la gripe, y por otro lado, ana- Ledesma J (1), Cuevas MT (1), Casas I (1) lizando diluciones seriadas de cultivos de los Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios. adenovirus más frecuentemente asociados con CNM, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), infección respiratoria. RESULTADOS. Del total Majadahonda, Madrid (1), Servicio de Pediatría (2) de muestras estudiadas, en 106 (87%) se pudo del Hospital Severo Ochoa, Leganés, Madrid detectar alguno de los virus respiratorios diana INTRODUCCIÓN. Las infecciones respiratorias mediante xTAG® RVP FAST y en 98 (80%) uti- agudas constituyen la enfermedad infecciosa lizando el conjunto de nested-PCR. De manera más frecuente en el ser humano. La mayoría de independiente, xTAG® RVP FAST detectó un estas infecciones sólo afectan al tracto respira- mayor número de rinovirus y coronavirus, pero torio superior, pero en niños menores de dos mostró deficiencias en la detección de virus años es particularmente habitual la afectación parainfluenza y adenovirus. La secuenciación de vías bajas, siendo causa frecuente de hos- del producto de amplificación generado por los pitalización. Los agentes etiológicos que con ADV utilizando el método de PCR convencional mayor frecuencia se asocian con la infección demuestra que los adenovirus discrepantes no respiratoria en los niños son de origen vírico, se asocian específicamente a ningún genoti- habiéndose identificado hasta ahora más de doscientos virus respiratorios distintos. Una ca- po. La detección del resto de virus no mostró racterística general de las infecciones respira- ninguna discrepancia reseñable entre ambas torias es que un mismo virus puede ocasionar técnicas. CONCLUSION. xTAG® RVP FAST cuadros clínicos diferentes. Con el objetivo de un test rápido y reproducible en el diagnóstico continuar mejorando el diagnóstico diferencial etiológico de la infección respiratoria de origen y completar el número de virus implicados en la vírico, no obstante la sensibilidad de detección patología respiratoria, se ha realizado un estu- de adenovirus y virus parainfluenza es más dio de evaluación de un método comercial que baja que la que ofrecen métodos de PCR con- utiliza una nueva aproximación técnica (tecno- vencionales. logía Luminex de detección de ácidos nucleicos mediante el empleo de microarrays de ADN en PALABRAS CLAVE: INFECCIÓN fase líquida) en comparación con los métodos RESPIRATORIA, PCR, LUMINEX de PCR convencional desarrollados en nuestro laboratorio. MATERIALES Y MÉTODOS. Se CO/55 han analizado prospectivamente 124 muestras Caracterización etiológica mediante de aspirado nasofaríngeo procedentes de ni- ños menores de 5 años hospitalizados a causa detección molecular y serología de de una patología respiratoria entre noviembre pacientes con gripe al inicio de la 2009 y marzo 2010. El extracto de ácido nuclei- pandemia por el virus A (H1N1)2009

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Casas I* (1), Gonzalez-Esguevillas M ponente vacunal H3N2 A/Brisbane/10/2007 y (2), Perez-Grajera I (3), de la Fuente J (3), se ha ensayado en 26 de los casos. Se han Pozo F (2), Ledesma J (1), de Ory F (3) considerado positivos los casos con serocon- Laboratorio de Gripe y Virus Respiratorios versión (SC) o con presencia de títulos ≥1/40 CNM, ISCIII (1), Laboratorio de Gripe para ambas técnicas en alguna de las muestras y Virus Respiratorios CNM, ISCIII (2), de suero. Laboratorio de Serología CNM, ISCIII (3) RESULTADOS: De los 27 casos analizados INTRODUCCIÓN: Desde la aparición en abril mediante RT-PCR, 19 fueron positivos al nuevo 2009 del nuevo A(H1N1)2009, se han adapta- virus (70,4%), 7 negativos y 1 inhibido no siendo métodos de diagnóstico y caracterización do posible la amplificación del control interno. de los virus gripales a este nuevo virus. Si la toma de la muestra se ha realizado en momen- Mediante Nt-ELISA, en 20/27 casos (74%) se tos tardíos de la enfermedad o si el paciente detectó respuesta serológica frente al virus ha recibido tratamiento antiviral, los resultados pandémico definiéndose 19 SC que incluían 4 de RT-PCR en muestras respiratorias pueden casos en donde la RT-PCR fue negativa. Entre ser negativos. El diagnóstico serológico com- los 7 negativos, 4 fueron positivos en RT-PCR. plementa el conocimiento de la infección y de Mediante IHA, en 18/26 casos (69,2%) se de- la cobertura vacunal. tectó respuesta positiva al nuevo virus definién- dose 13 SC. En comparación con la RT-PCR, OBJETIVO: Valorar las aproximaciones diag- la sensibilidad de Nt-ELISA y IHA con un cut-off nósticas directas e indirectas para la caracteri- de ≥1/40 es del 79% y del 73,6% respectiva- zación etiológica específica de casos de infec- mente. ción por el virus de la gripe A(H1N1)2009 en el inicio de la pandemia. Los resultados han sido positivos frente a A/ Brisbane/59/2007 en 15 de los 27 casos me- METODOLOGÍA: diante Nt-ELISA y en 11 de los 26 casos mediante IHA, indicando una respuesta heteróloga 1. Muestras y Pacientes: entre abril a diciembre frente a este antígeno o una seroprevalencia de 2009, se recibieron 27 casos con cuadro gripal anticuerpos procedentes de la vacuna anual. de los que se dispuso de muestra respiratoria, y 63 sueros pareados en fase aguda (27) y con- CONCLUSIONES: La IHA con cut-off ≥1/40 valeciente (36). mostró mayor concordancia con la Nt-ELISA y con la RT-PCR que la IHA con cut-off ≥1/20 2. Detección directa molecular: RT-PCR con- para el diagnóstico de las infecciones por el vi- vencional y RT-PCR en tiempo real en las rus pandémico. En serología, se requiere una muestras respiratorias. validación de los cut-offs para adaptar los ensayos de IHA a los virus con una nueva hema- 3. Métodos serológicos: se ha estandarizado un glutinina. La Nt-ELISA resultó ser superior que nuevo ensayo de neutralización revelada con la IHA en la detección del nuevo virus. El patrón ELISA (Nt-ELISA) utilizando las cepas pandé- de anticuerpos observado mediante Nt-ELISA mica A/California/07/2009 y vacunal estacional frente al virus pandémico y frente al vacunal ha A/Brisbane/59/2007 y se ha aplicado en todas sido diferente. las muestras de suero. Se ha adaptado el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IHA) PALABRAS CLAVE: Gripe A(H1N1)2009, frente a ambos virus, se incluyendo el com- Serologia, Caracterización etiologica

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CO/56 está disponible. La detección de antígeno viral mediante la técnica del ELISA es una buena al- Diferenciación de los coronavirus ternativa para el diagnóstico de estas infeccio- humanos NL63 y 229E, mediante nes. Debido a la baja homología de secuencia la utilización de un nuevo DAS- ELISA basado en anticuerpos en la nucleoproteina (N) de los distintos coro- monoclonales específicos navirus, así como su alta inmunogenicidad, dicha proteína supone un buen marcador para el (1) (2) Sastre Antoraz P* , Dijkman R , diagnóstico de infecciones por CoVs. En este Camuñas Talavera A (1), Ruiz Gonzalez T (1), F. Jebbink M (2), Van Der Hoek L (2), trabajo, describimos la producción y caracte- Vela Olmo C (1), Rueda Perez P (1) rización de anticuerpos monoclonales (AcMs) Ingenasa, Madrid (1), Medical dirigidos frente a la proteína N de HCoV-NL63 Microbiology, Cinima, Amsterdam (2) y HCoV-229E, así como la puesta a punto de un DAS-ELISA (double antibody sandwich Los Coronavirus (CoVs) pertenecen a la familia Coronaviridae. Son virus con envuelta, cuyo enzyme-linked immunosorbent assay) capaz material genético es RNA de cadena sencilla y de detectar y diferenciar las dos especies de polaridad positiva. Existen 5 especies de CoVs virus. Para ello, la proteína N de HCoV-NL63 humanos (HCoV), todos asociados a infeccio- y HCoV-229E fue expresada en bacterias y nes respiratorias que pueden producir desde usada como antígeno para la inmunización un resfriado común a un síndrome respiratorio agudo severo (SARS). HCoV-229E y HCoV- de ratones y consiguiente obtención de MAbs NL63 son dos de las cinco especies humanas específicos. Como resultado de las inmuniza- que circulan por todo el mundo; pertenecen al ciones, se obtuvieron tres AcMs específicos grupo de los Alphacoronavirus y son los más a HCoV-NL63, uno específico a HCoV-229E próximos a nivel filogenético. En la mayoría de y cuatro que reconocían ambos virus. Después los casos, las infecciones por estos virus no producen síntomas clínicos severos, aunque de su caracterización, se seleccionaron tres en niños de corta edad, ancianos y personas AcMs para el desarrollo del DAS-ELISA dife- inmunodeprimidas pueden conducir a enferme- rencial. El ensayo fue capaz de detectar hasta dades respiratorias graves, requiriendo incluso 3 ng/ml de proteína N recombinante y virus de hospitalización. A pesar de que los síntomas cultivo hasta un título de 50 TCID50/ml. No se provocados por ambos virus son similares, detectó reactividad cruzada con otros coronavi- HCoV-NL63 puede desencadenar lesiones más severas incluyendo bronquiolitis y pneumonía. rus humanos, ni con un coronavirus de origen Por lo tanto, la diferenciación entre estos dos animal perteneciente al mismo grupo (TGEV). virus es importante. La detección de antígeno Podemos concluir que el nuevo ensayo DAS- viral es crítica para un diagnóstico rápido de la ELISA es específico y, por lo tanto, puede ser infección seguida de un tratamiento adecuado. considerado una potencial herramienta para la Actualmente la principal técnica utilizada para el diagnostico de CoVs es la RT-PCR. Sin em- detección y diferenciación de infecciones cau- bargo, este método presenta algunos incon- sadas por HCoV-NL63 y HCoV-229E. venientes como la inestabilidad del RNA viral, así como la necesidad de un equipo sofisticado PALABRAS CLAVE: HCoV-NL63, HCoV- para el desarrollo del ensayo, que no siempre 229E, DAS-ELISA DIFERENCIAL

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CO/57 usando una parcela de vivero experimental de 658 plantas de Citrus macrophylla. Las plantas Detección fiable de Citrus tristeza se analizaron por ambas técnicas y las plantas virus (CTV) mediante RT-PCR con resultado diagnóstico discrepante fueron a tiempo real utilizando dianas analizadas de nuevo mediante ambas técnicas inmovilizadas en membranas y además por pruebas biológicas de inocula-

(1) (2) ción por injerto de lima mejicana. Se tomó como Vidal Izquierdo E. , Yokomi R.K. , Moreno verdadera positiva aquella planta con reacción Lozano A. (3), Bertolini E. (1), Martínez (1) (1) positiva al menos por dos de las tres técnicas Manjavacas M.C. , Cambra Álvarez M.* empleadas. De esta forma, se calculó para la Virología e Inmunología. Protección Vegetal técnica Inmunoimpresión-ELISA una sensibili- y Biotecnología. IVIA. Moncada (Valencia) dad de 80,15%, una especificidad de 99,63% (1), USDA, Agricultural Research Service, y unas razones de verosimilitud positiva y ne- Parlier, CA, EEUU (2), Departamento de gativa de 216,42 y 0,20, respectivamente. Para Protección Vegetal. Instituto de Ciencias ‘Tissue-print’ RT-PCR a tiempo real se estimó (3) Agrarias. ICA-CSIC, Madrid una sensibilidad de 98,20%, una especificidad La tristeza es la enfermedad viral más impor- de 85,19% y unas razones de verosimilitud posi- tante que afecta a los cítricos por la gravedad tiva y negativa de 6,63 y 0,02, respectivamente. de su impacto (más de 100 millones de árboles La combinación de las técnicas Inmunoimpre- muertos en todo el mundo). Su agente causal sión-ELISA y ‘Tissue-print’ RT-PCR a tiempo es Citrus tristeza virus (CTV), género Closte- real, puede sustituir al análisis convencional en rovirus, familia Closteroviridae. Su principal lima mejicana, con el consiguiente ahorro eco- modo de dispersión a larga distancia es el uso nómico y rapidez diagnóstica. Ambos métodos de material vegetal infectado y a corta distan- resultan muy apropiados para realizar rutinaria- cia su transmisión por diversas especies de mente numerosas muestras de forma sencilla, pulgones de forma semi-persistente. El control precisa y a bajo coste. de la enfermedad se basa en la utilización de plantas libres de CTV e injertadas sobre patro- PALABRAS CLAVE: Parámetros de nes resistentes o que induzcan tolerancia a la diagnóstico, Métodos directos enfermedad. Para ello, y para programas de erradicación de aislados agresivos, se preci- CO/58 san métodos de detección precisos y fiables, capaces de ser usados en gran escala. Se ha Un ensayo FRET para el comparado la validada técnica serológica de cribado de inhibidores de la Inmunoimpresión-ELISA (que usa los anticuer- proteasa NS3/4A del VHC pos monoclonales específicos de CTV 3DF1 y 3CA5) con la técnica molecular ‘Tissue-print’ Sabariegos Jareño R* (1), Aparicio Prats E (2), RT-PCR a tiempo real. En ambos sistemas no Martínez de la Sierra MA (2), Llopis Borrás J (1) es necesario efectuar extractos ni purificar áci- Centro Regional de Investigaciones dos nucleicos. Para ello, se analizaron 1.395 Biomédicas, Facultad de Medicina, UCLM, muestras procedentes de árboles adultos y Albacete (1), Fundació irsiCaixa, Hospital plantas de vivero. La concordancia entre las Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona (2) técnicas fue substancial con un índice kappa de Cohen de 0,77 ± 0,03. Los parámetros de Tras el descubrimiento del virus de la hepatitis diagnóstico de ambas técnicas se estimaron C (VHC), la proteasa viral NS3/4A se postuló

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rápidamente como una posible diana farmaco- este caso una EC50 de 145 nM (entre 5 y 20 lógica, ya que es esencial para el ciclo de vida veces mayor que para genotipo 1b). En el caso del virus. Actualmente para el cribado de inhibi- de proteasas de genotipo 3 su baja actividad dores se dispone de varios replicones (genoti- catalítica nos ha impedido determinar la EC50 po 1b, 1a y diversas quimeras), un virus capaz con fiabilidad estadística, no obstante, ésta se de replicar en cultivo (genotipo 2) y diversos halla en el rango micromolar. También hemos métodos in vitro para medir la eficiencia cata- validado el ensayo para medir la sensibilidad lítica de las proteasas. Recientemente, hemos a la droga de mutantes de resistencia que han desarrollado un biosensor basado en transfe- sido descritos previamente (R155K y D168A). rencia de energía resonante de fluorescencia En conclusión, hemos desarrollado un sistema (FRET) que permite estimar la actividad de de cribado in vitro que permite de una manera NS3/4A en células vivas. El ensayo es sensi- rápida y sencilla la caracterización tanto de la ble, cuantitativo y capaz de caracterizar la acti- eficiencia catalítica del enzima como su perfil vidad de distintas variantes de proteasa (Saba- de resistencia frente a inhibidores específicos. riegos et al; AAC (2009), 53(2): 728-734). En este estudio hemos adaptado el ensayo a un PALABRAS CLAVE: NS3/4A, Inhibidores, formato de placa de 96 pocillos para posibili- Resistencias tar el cribado de fármacos, y lo hemos validado utilizando un fármaco de probada eficacia CO/59 (compuesto 25a de Liverton et al; JACS (2008), 130(14):4607-9). Hemos tenido en cuenta dos Presencia de adenovirus en muestras factores que afectarán sin duda la eficacia de de leones marinos enfermos de futuras terapias frente a la proteasa: la variabi- LÓceanografic. Diseño y optimización lidad intrínseca del genoma viral y la aparición de una PCR en tiempo real para de mutaciones de resistencia. Se cotransfecta- el diagnóstico de adenovirus en ron células He-La con plásmidos de expresión leones marinos (Otaria flavescens) del sensor fluorescente y de distintas variantes de la proteasa. Tras 4h 30 min se adicionaron Rocha A* (1), Tena-Tomás C (1), Buitrago distintas diluciones del inhibidor. A las 24h D (1), Ruano MJ (1), Villalba R (2), García se obtuvieron los espectros de emisión (460- Párraga D (2), Vigo M (1), Agüero M (1) 550nm, con excitación a 430 nm). En ausencia Laboratorio Central de Veterinaria, de proteasa, se observa la emisión del aceptor, Algete, España (1), L´Oceanographic, la cual disminuye en presencia de proteasa. Valencia, España (2) Así, el ratio entre la emisión del aceptor (citrina) y la emisión del donante (cian) da una medida En el año 2010 varios leones marinos (Otaria fla- de la actividad de NS3/4A. Utilizando este for- vescens) del parque acuario L´Oceanographic mato, hemos medido la sensibilidad de distin- (Valencia) presentaron síntomas clínicos de tas proteasas a este fármaco. Un conjunto de enfermedad, llegando a producirse la muerte 7 secuencias consenso obtenidas de pacientes de dos de ellos. Muestras de estos dos anima- de genotipo 1b mostraron valores de EC50 en les llegaron al Laboratorio Central de Veterina- el rango 6.55-31.26 nM. También en este rango ria (LCV) para determinar qué patógeno había de inhibición se situó la proteasa derivada del producido la muerte de estos animales. Tras replicón 1b del VHC (EC50 3.8 nM). Se ensa- realizarse una serie de pruebas bacteriológi- yó también el fármaco frente a una proteasa cas y virológicas, en el LCV se determinó que estándar de genotipo 2 (J6), alcanzándose en las muertes podían estar relacionadas con la

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presencia de un adenovirus. Resultados equi- y disminuyendo considerablemente el riesgo de valentes fueron obtenidos en el laboratorio del contaminación en relación al método de PCR Dr. Thjis Kuiken (Erasmus MC, Rotterdam, The convencional. La técnica desarrollada se ha Netherlands) donde también habían sido envia- empleado en el seguimiento de los animales das muestras de estos ejemplares (comunica- (sanos y enfermos) sometidos a cuarentena en ción personal). Los adenovirus (Adenoviridae) el parque L´Oceanografic, resultando de gran son una familia de virus que infectan tanto hu- ayuda en la resolución del problema sanitario manos como animales. Aunque nunca han sido planteado. aislados, se conocen infecciones de este virus en leones marinos y otros mamíferos acuáticos PALABRAS CLAVE: adenovirus, leones que pueden llegar a provocar la muerte del ani- marinos, PCR en tiempo real mal. La detección del adenovirus en las muestras de leones marinos recibidas en el LCV se CO/60 realizó empleando una técnica de PCR para adenovirus humano, descrita por Allard et al., Utilidad de las técnicas de 2001, que amplifica un fragmento de 300 pb de amplificación genómica la región del genoma codificante de la proteína tradicionales en el diagnóstico hexon 10. Posteriormente, se obtuvo la secuen- de los virus respiratorios, en un cia del fragmento amplificado (Otaria flavescens hospital de Valparaíso, Chile adenovirus Spain/2010, Nº acceso Genbank: HM776944), confirmándose que correspondía a Collao X* (1), Noguera M (1), Báez X (1), un adenovirus, si bien dicha secuencia no coin- Peña C (1), Torres M (2), Vergara R (3) cidía al 100% con la de ningún otro adenovirus Virología, Escuela de Medicina ,Universidad previamente descrito. Las muestras positivas de Valparaíso, Chile (1), Laboratorio, se inocularon en células VERO y VERO E6 sin Hospital carlos Van Buren, Valparaíso, que en ningún caso fuera posible el aislamien- Chile (2), Pediatría, Hospital Carlos to del adenovirus tras completarse tres pases Van Buren de Valparaíso, Chile (3) ciegos sucesivos. Basándose en la secuencia Las infecciones respiratorias virales constitu- obtenida, se diseño una pareja de primers y yen una importante causa de morbilidad en el una sonda Taqman, con la ayuda del programa mundo, especialmente en población infantil, Primer Express 2.0 (Applied Biosystems), con siendo los virus respiratorio sincicial (VRS), el objetivo de desarrollar una PCR en tiempo influenza (VI), parainfluenza (PI) y adenovirus real específica para este adenovirus, que per- (ADV) los más comunes. En la última década, mitiera diagnosticar la presencia del genoma gracias a las técnicas de amplificación genómi- viral en muestras clínicas de forma rápida y con ca, se han detectado nuevos virus respiratorios alta sensibilidad. Tras la optimización del nue- tales como: metapneumovirus (hMPV), boca- vo método de PCR desarrollado, se realizaron virus (hBoV) y las variantes del virus influen- ensayos de sensibilidad en comparación con la za. Como en la mayoría de Sudamérica, Chile PCR convencional empleada en el diagnóstico es fuertemente afectado por las infecciones inicial. Los resultados obtenidos mostraron que respiratorias en época invernal, colapsando los la técnica de PCR en tiempo real es una herra- servicios de atención médica debido principal- mienta adecuada para diagnosticar la presen- mente al aumento de casos ocurridos. En este cia de este adenovirus en muestras clínicas de caso, el papel del laboratorio es esencial en la animales enfermos, permitiendo mayor rapidez entrega de un diagnóstico certero y rápido para y automatización en la obtención de resultados, un óptimo manejo clínico del paciente. En el

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Hospital Carlos Buren de Valparaíso se reali- para la detección de los virus respiratorios es- za la detección de virus respiratorios comunes: tudiados. VRS, VI, VPI y ADV mediante inmunofluorescencia, no existiendo herramientas diagnósti- PALABRAS CLAVE: Virología, Diagnóstico, cas para la detección de virus como hMPV y Respiratorios hBoV, desconociendo el rol que cumplen en las infecciones respiratorias. Esto nos motivó a estudiar la etiología viral de las infecciones respiratorias en muestras diagnosticadas como negativas por IF en dicho hospital. Se utilizaron métodos de amplificación genómica desarrollados en el laboratorio de Gripe y Virus Respi- ratorios del Centro Nacional de Microbiología (CNM), ISCIII de España, y el objetivo principal fue conocer la etiología viral de las infecciones respiratorias en muestras diagnosticadas como negativas por IF en dicho hospital. Se recolectaron 700 muestras de aspirado nasofaringeo, durante agosto 2009 y enero 2010, negativas por IF para VI, VRS, ADV y VPI. Un total de 182 muestras (26%) fueron analizadas. Se extrajo el material genético y posteriormente se realizaron 3 reacciones de amplificación genómica descritas previamente (Coiras y Cols., 2003; López Huertas y Cols. 2005; y Pozo y cols., 2007) para la detección de un panel de virus respiratorios (VRS A y B, VI A,B,C , ADV, hMPV y hBoV). Se detectaron 65 muestras con resultado positivo (35,7%) de las cuales 33 (18,1% de 182) correspondió a hMPV ,12 (6.6%) hBoV y 12 (6.6.%) ADV. Se destaca el aporte de la técnica utilizada, ya que evidenció la importancia de hMPV como agente responsable de infecciones respiratorias en nuestra zona. En relación a hBoV, es el primer hallazgo de este virus en la región, y finalmente, la detección de un panel de virus respiratorios en una única reacción de amplificación encontró un 45% de falsos negativos de la IF para ADV. Este estudio permite acercarnos a la realidad epidemio- lógica de los virus respiratorios en nuestra ciudad y en el país, impulsando nuevos estudios (clínicos, epidemiológicos y moleculares), con herramientas diagnósticas, útiles y accesibles

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Replicación vírica (II)

Moderadores: Dr. Ricardo Flores Pedauyé Dr. Francisco Sobrino

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CO/73 viral se analizó inicialmente mediante Western- blot. Una proteína de aproximadamente 105 Encapsidación de proteínas kDa, que se correspondía con la RdRp, se de la replicasa viral en detectó en virus purificados. Para confirmar viriones de coronavirus la incorporación de la RdRp en las partículas virales, el virus purificado se analizó mediante Nogales A*, Márquez-Jurado S, microscopía confocal. La RdRp se detectó en Galán C, Enjuanes L, Almazán F viriones permeabilizados con Triton X-100 pero Departamento de Biología Molecular y Celular, no en viriones sin permeabilizar, de forma simi- Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), lar a la nucleoproteína que fue utilizada como Darwin 3, Campus Universidad Autónoma control positivo. Finalmente, se demostró que (1) de Madrid, Cantoblanco, Madrid 28049 la RdRp se incorporaba en los viriones purificados de TGEV mediante inmunomicroscopía Los coronavirus (CoV) son virus RNA de cade- electrónica. Además, se detectaron otros com- na sencilla y polaridad positiva que se carac- ponentes de la replicasa viral, tales como la nsp terizan por tener el genoma de mayor longitud 2 y nsp 3, sugiriendo que los CoV incorporan en (unas 30 kb) conocido entre los virus RNA. La la partícula viral el complejo de replicación, el replicación y la transcripción de CoV son pro- cual podría actuar como un motor de iniciación cesos complejos que tienen lugar en vesículas de la replicación del genoma viral durante las citoplasmáticas de doble membrana (DMVs). primeras etapas del ciclo infectivo de CoV. Ambos procesos son llevados a cabo por el complejo de replicación-transcripción codifica- PALABRAS CLAVE: Coronavirus, do en el gen de la replicasa, junto con la par- Replicación, RdRp ticipación de proteínas celulares. Una proteína clave en la sínteis de RNA viral es la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp). Un aná- CO/74 lisis proteómico de partículas virales altamente Picornavirus IRES accessibility to 2´O- purificadas del coronavirus de la gastroenteritis methyl antisense oligoribonucleotides: porcina transmisible (TGEV) sugirió la posible implications in the inhibition incorporación de la RdRp en los viriones. Para estudiar la presencia de la RdRp en la partícula of viral gene expression viral, se generó una colección de anticuerpos Fajardo Mallari T J *, Rosas M F, monoclonales (mAbs) específicos para la RdRp Sobrino F, Martinez-Salas E del TGEV. El análisis mediante Pepscan de los Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, epítopos reconocidos por los mAbs identificó CSIC, Univesidad Autonoma de Madrid, cuatro epítopos lineales localizados en una (1) región de 62 aminoácidos en el dominio N-ter- Nicolas Cabrera 1, 28049, Madrid minal de la RdRp, sugiriendo que esta región Picornavirus protein synthesis is controlled podría ser inmunodominante. Utilizando estos by the Internal Ribosome Entry Site (IRES), mAbs se demostró que la RdRp colocalizaba por microscopía confocal con otros componen- a cis-acting element that recruits translation tes de la replicasa viral (nsp 2, nsp 3 y nsp 8) machinery without the need for m7GpppN cap en vesículas perinucleares. Estas vesículas se on the mRNA. Viral protein synthesis in Foot- identificaron por microscopía electrónica como and-mouth disease virus (FMDV), a prototype DMVs. La presencia de la RdRp en la partícula of the genus Apthovirus starts from two AUGs, AUG1 and AUG 2, as soon as the viral particle

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enters the cell cytoplasm. Factors necessary for the development of new methods of comba- for protein translation activity recognize IRES ting this recurrent animal infection. domains (D1-D5). RNA probing and Selective 2´Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Exten- PALABRAS CLAVE: Picornavirus, Internal sion (SHAPE) reactivity showed that the central Ribosome Entry Site, 2´O-Methyl Antisense domain is a self-folding region that contains the Oligoribonucleotides conserved GNRA and RAAA motif organized in loops. Differences in the RNA organization of CO/75 the IRES have been observed by in-vivo foo- tprint assays relative to the RNA probing obser- Implicación de la proteína vhs ved in-vitro, indicating conformational changes del virus herpes simplex tipo 1 in the RNA structure that may be important for en la inhibición de la replicación IRES activity. del virus de la pseudorrabia por coinfección de ambos virus We have used an in-vitro and in-vivo translation assay to explore the accessibility of the FMDV Lerma L*, Guerra S, Martín B, Tabarés E IRES structure to 32 overlapping sequences Departamento de Medicina Preventiva, Salud of 2´O-methyl antisense oligoribonucleotides Pública y Microbiología, Facultad de Medicina, (ASO) to analyze the capacity of the ASO to in- Universidad Autónoma de Madrid, Madrid (1) hibit viral gene expression. RNA transcripts of the form CAT-IRES-Luciferase and the whole Los virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) y el vRNA genome were pre-annealed with ASO virus de la pseudorrabia (PRV) pertenecen a complementary to different IRES region. ASO la subfamilia Alphaherpesvirinae de la familia complementary to luciferase AUG, vRNA AUG1 Herpesviridae, orden Herpesvirales. Ambos and AUG2 regions and a scrambled sequence virus son capaces de infectar un similar y am- were used for control purposes. plio espectro de células dado que comparten Results from in-vitro translation of bicistronic los mismos receptores, aunque, por razones RNA shows that the inhibitory regions are loca- desconocidas, los primates en general y el ted in the D3 and D4, while the inhibitory ASOin hombre en particular son refractarios a la infec- vRNA were mostly located in the apical region ción por PRV. Estudios de complementación of the D3, D5 and AUG1. The D3 region of the entre proteínas homólogas de ambos virus han IRES exhibit different results in in-vitro and mostrado que ciertas funciones de ciertas pro- in-vivo, particularly in the apical region where teínas pueden ser reemplazadas entre ambos GNRA and RAAA motifs are located. These virus. Las proteínas inmediatamente tempra- could be a result of RNA-RNA or RNA-protein nas IE180 de PRV e ICP4 de HSV-1, muestran interactions changes in the IRES in solution or alto nivel de similaridad en su secuencia protei- inside the cell. ca implicando analogías funcionales entre ellas y algunas, como la capacidad de autoregula- As expected, the luciferase AUG ASO was in- ción, pueden intercambiarse entre sus virus. hibitory. However, vRNA AUG1 and AUG2 pre- En nuestro laboratorio al tratar de complemen- sent different results. AUG2 is inhibitory only in- tar mutantes defectivos de HSV-1 en ICP4 por vivo and the AUG1 inhibitory at both conditions. coinfección con PRV comprobamos que HSV-1 These results demonstrated the accessibility inhibe la infección de PRV, mientras PRV no lo of the IRES and its capacity to inhibit the viral hace con la infección de HSV-1. Los viriones de gene expression. This could also pave the way HSV-1 contienen en el tegumento la proteína

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activadora de la transcripción VP16 (codifica- hojas de tomate. Se detectó una actividad de da por el gen UL48) y la proteína de “shut-off” ligación capaz de circularizar el RNA sustrato (vhs) (codificada por el gen (UL41), que interac- en las fracciones que eluyen de la columna a cionan entre ellas permitiendo la transición de concentraciones de KCl en torno a 0.5 M. Esta los genes en el ciclo replicativo. actividad es específica de los extremos ensa- En el presente trabajo, se han construído mu- yados (5’-P, 3’-OH) y por lo tanto diferente de la tantes de HSV-1 con deleciones en la proteína única RNA ligasa conocida en plantas: la tRNA vhs (HSV41GF) que no inhiben la replicación ligasa, que reconoce extremos 5’-OH y 2’,3’- de PRV por coinfección de ambos virus, a di- fosfodiéster cíclico (2’,3’>P). La nueva activi- ferencia del virus parental y mutantes en ICP4 dad de tomate es sensible a desnaturalización que sí lo hacen, indicando que la proteína vhs térmica y degradación proteolítica, requiere de HSV-1 puede estar implicada en la inhibi- Mg2+ y ATP, y muestra especificidad de sus- ción de la infección de PRV. trato, ligando exclusivamente el PSTVd lineal abierto en el sitio de procesamiento fisiológico. PALABRAS CLAVE: HSV-1, PRV, vhs Utilizando como sustrato de la reacción [alfa- 32P]ATP se detectó una proteína adenilada de CO/76 90 kDa con un comportamiento cromatográfi- co coincidente con la actividad RNA ligasa. El Actividades RNA ligasa implicadas análisis por espectrometría de masas permitió en la replicación de los viroides identificar que la actividad que circulariza el nucleares y cloroplásticos RNA viroidal reside en la DNA ligasa 1 de tomate. El cDNA correspondiente se clonó y expresó Nohales M. A.*, Flores R., Darós J. A. en Escherichia coli. La proteína resultante se Instituto de Biología Molecular y Celular purificó y, mediante ensayos in vitro, se confir- de Plantas (Consejo Superior de mó su capacidad de circularizar eficientemente Investigaciones Científicas - Universidad el PSTVd lineal abierto en el sitio de procesa- Politécnica de Valencia), Valencia (1) miento fisiológico. Los viroides son pequeños RNAs circulares Respecto de los viroides cloroplásticos (familia de cadena sencilla (246-401 nt) patógenos de Avsunviroidae), se ha identificado una isoforma plantas. No codifican proteínas propias, por lo de la tRNA ligasa con un péptido de tránsito al que su replicación depende de su interacción cloroplasto. La tRNA ligasa reconoce especí- con factores del huésped. La replicación ocurre ficamente extremos de RNA 5’-OH y 2’,3’>P, a través de un mecanismo de círculo rodante que son los que produce el autocorte mediado de RNA con tres etapas: transcripción RNA- por las ribozimas de cabeza de martillo carac- RNA que origina RNAs oligoméricos, corte terísticas de los Avsunviroidae. El cDNA de la de estos oligómeros a monómeros lineales, tRNA ligasa de berenjena, incluyendo el pépti- y circularización. Para identificar factores ce- do de tránsito al cloroplasto, se clonó y expresó lulares implicados en la ligación de los RNAs en E. coli. Los ensayos de ligación in vitro con monoméricos lineales de los viroides nucleares la proteína purificada, empleando como sustra- (familia Pospiviroidae), se ensayó la ligación to el RNA del viroide latente de la berenjena in vitro del RNA monomérico lineal del viroide (ELVd), mostraron que esta enzima, en una del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd), reacción dependiente de Mg2+ y ATP, circu- abierto por la posición G95-G96 y con extremos lariza eficientemente el ELVd lineal cuando se 5’-fosfomonoéster (5’-P) y 3’-hidroxilo (3’-OH), encuentra abierto exclusivamente por el sitio de en presencia de fracciones de proteínas de procesamiento fisiológico.

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PALABRAS CLAVE: viroides, RNA ligasa, diferentes, siendo el crecimiento geométrico en DNA ligasa gran medida más mutagénico que el mecanismo stamping machine. Pese a su importancia, CO/77 hay poca información disponible acerca del modo de replicación escogido por los diferen- Dinámica de la acumulación tes virus, como es el caso de los virus de RNA intracelular de un virus de RNA de de simple hebra (+) de plantas. Una de las pe- plantas: replicación geométrica culiaridades de estos virus es su marcada asi- versus stamping machine metría entre los RNAs de ambas polaridades, Martínez F.*, Sardanyés J., acumulándose preferentemente el RNA (+). Elena S. F., Darós J. A. En este trabajo se ha determinado la cinética de acumulación intracelular de las cadenas (+) Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (Consejo Superior de y (-) en un proceso de infección de protoplas- Investigaciones Científicas - Universidad tos por parte de un virus de RNA de plantas Politécnica de Valencia), Valencia (1) (el virus del mosaico del nabo, TuMV, familia Potyviridae), para inferir la contribución que el Los virus de RNA poseen una capacidad de rá- crecimiento geométrico y mecanismo stamping pida evolución que les permite prosperar en el machine tienen en su replicación. Para ello, se ambiente hostil de la célula huésped, escapan- llevaron a cabo experimentos de transfección do de sus mecanismos de defensa y dotándo- de protoplastos de Nicotiana benthamiana con les de propiedades como la emergencia viral, un clon de cDNA del TuMV que permitieron ini- adaptación a nuevos huéspedes o virulencia. ciar infecciones sincrónicas. Mediante RT-PCR Estas cualidades se explican dado el gran ta- cuantitativa especifica de hebra (RT-ssqPCR) maño de las poblaciones virales y las elevadas se determinó la acumulación de los RNAs vira- tasas de mutación que estos presentan. La les (+) y (-) a lo largo del proceso de infección. frecuencia con que se generan virus mutantes Los datos experimentales permitieron ajustar después de un proceso infeccioso no solo de- un modelo matemático de ecuaciones diferen- pende de la tasa de error de la replicasa viral, ciales que describe la dinámica de acumulación sino también de la dinámica de síntesis de los de cada cadena viral y contempla la asimetría RNAs virales (+) y (-) durante su replicación. de producción entre las cadenas (+) y (-). El análisis de los parámetros del modelo mostró Dos modelos teóricos contrapuestos que des- que cuando el TuMV se replica en protoplastos criben la replicación de un virus de RNA son el utiliza una estrategia de amplificación mixta con crecimiento geométrico, donde las cadenas de el 93% de sus genomas procedentes de un me- RNA (+) y (-) sirven como molde para la sínte- canismo stamping machine y un 7% de creci- sis de cadenas complementarias con la misma miento geométrico. Esta estrategia combinada eficiencia, y el mecanismo stamping machine, podría aportar al virus robustez mutacional y, al donde las cadenas de la polaridad (-) son utili- mismo tiempo, rapidez y eficacia para colonizar zadas reiteradamente como molde para sinteti- el huésped. zar múltiples copias de la hebra complementa- ria (+). Las frecuencias de mutación resultantes PALABRAS CLAVE: replicación RNA, carga de ambos mecanismos son completamente mutacional, stamping machine

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CO/78 virales purificadas, lo que indica que en el citoplasma se encuentran RNPs no encapsidadas. RNPs como maquinaria de Estos datos, al igual que los resultados descri- transcripción y replicación genómica tos recientemente para el virus de la necrosis en virus dsRNA, Birnavirus pancreática infecciosa (IPNV), otro miembro de la familia Birnaviridae, apoyan la hipótesis en Dalton RM*, Rodríguez JF la que la cápsida de los birnavirus no funciona Biologia Molecular, Centro Nacional como core transcripcional sino que las RNPs de Biotecnología, Madrid (1) actúan como maquinaria de transcripción y re- plicación genómica independiente de la cápsi- El Virus de la Bursitis Infecciosa (IBDV) es el da viral. Es notable apreciar que esta hipótesis miembro mejor caracterizado de la familia Bir- aportaría a los Birnavirus una mayor similitud naviridae, que agrupa virus icosaédricos des- funcional con algunos virus de RNA de cadena nudos con genoma bisegmentado de RNA de sencilla y polaridad positiva, pertenecientes a doble cadena (dsRNA). La partícula viral posee las familias Noda- y Tetraviridae, que con otras una única cápsida de simetría T=13 forma- familias de virus dsRNA. da por 260 trímeros del polipéptido VP2. Esta cápsida encierra complejos ribonucleoprotei- PALABRAS CLAVE: IBDV, virus dsRNA, cos (RNPs) formados por el genoma dsRNA RNPs asociado a la proteína VP3 y unido covalentemente a la forma VPg de la RNA polimerasa CO/79 dependiente de RNA (VP1). La presencia de RNPs encerradas en una única cápsida en el Complejos de replicación y IBDV representa una acusada divergencia es- transcripción del torovirus equino tructural y funcional con respecto al resto de BEV: localización intracelular y origen los virus icosaédricos dsRNA prototípicos con de las membranas implicadas dos o mas cápsidas concéntricas y cuyos genomas están permanentemente encerrados Ávila G* (1), Rejas M.T (2), Jiménez dentro de la cápsida interna o core transcrip- M (1), Rodríguez D (1) cional. Esta estructura juega un papel crítico Departamento de biología celular y molecular, en la ocultación del genoma viral frente a los Centro Nacional de Biotecnología (CNB- sensores celulares de dsRNA, a la vez que CSIC), Madrid (1), Servicio de Microscopía provee la maquinaria enzimática para sintetizar electrónica, Centro de Biología Molecular el dsRNA y mRNAs virales. Experimentos de ‘Severo Ochoa’ (CSIC-UAM), Madrid (2) inmunofluorescencia en células infectadas con IBDV muestran que a tiempos tempranos del Los torovirus son virus RNA de cadena senci- ciclo viral no se observa co-localización de la lla y polaridad positiva, pertenecientes al orden proteína de cápsida VP2 con la proteína VP3 y Nidovirales, que causan infecciones entéricas el dsRNA (RNPs), sugiriendo que la cápsida de en distintas especies de animales domésticos IBDV se desensambla durante el proceso de in- y en humanos. La mayoría de los virus RNA de ternalización, liberando al citoplasma las RNPs. cadena positiva utilizan vesículas citoplasmá- Por otro lado, el análisis mediante gradientes ticas de doble membrana (DMVs) para anclar de glicerol de extractos de células infectadas sus complejos de replicación y transcripción. con IBDV muestra la presencia de fracciones En estudios de microscopía electrónica obser- que contienen RNA genómico con mayor gra- vamos la presencia de DMVs en células infec- do de sensibilidad a RNAsas que las partículas tadas con el torovirus equino BEV. Mediante

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inmunomarcado de criosecciones con un anti- LC3, marcadora de esta ruta, colocaliza con las cuerpo anti-dsRNA pudimos detectar este in- proteínas implicadas en replicación y transcrip- termediario de la replicación viral en el interior ción. Actualmente se está llevando a cabo un de las DMVs. Por otro lado, se ha estudiado estudio más exhaustivo utilizando activadores la localización intracelular de los complejos de e inhibidores de la ruta autofágica para obtener replicación/transcripción mediante microsco- datos más concluyentes sobre el posible uso pia confocal. Para ello, se han utilizado sueros de la misma en la formación de los complejos generados en nuestro laboratorio que recono- de replicación/transcripción de BEV. cen las proteínas virales proteasa y helicasa, que son clave en el proceso de replicación y PALABRAS CLAVE: Torovirus, Complejos de transcripción viral. A tiempos tempranos post- replicación/transcripción, Vesículas infección los complejos están localizados de forma dispersa, formando puntos discretos CO/80 en la célula que se van acumulando cerca del núcleo conforme avanza la infección. El RNA Cellular decapping activators viral de nueva síntesis, marcado con bromouri- promote HCV propagation dina, y detectado con un anticuerpo específi- Scheller N*, Peréz Vilaró G, co, presenta un patrón de distribución similar Caballé Ibáñez A, Díez J al de estas proteínas a lo largo de la infección. Sin embargo, cuando analizamos por la misma Department of Experimental and técnica la colocalización con el dsRNA obser- Health Sciences, Universitat Pompeu vamos únicamente una colocalización par- Fabra, 08003 Barcelona (1) cial. Por otra parte, para determinar el origen Growing evidence is uncovering a complex inde las vesículas se han llevado a cabo estudios terplay between cellular mRNA decay proteins de colocalización entre proteínas marcadoras and the replication of positive-strand RNA viru- de orgánulos celulares y las proteínas implica- ses. In eukaryots a major pathway of mRNA de- das en replicación y transcripción. La primera cay is the 5´-3´deadenylation dependent decay aproximación fue estudiar la implicación de la pathway in which after deadenylation, the Dcp1/ ruta exocítica dado que por resultados previos Dcp2 enzyme and the Xrn1 decap and degrade del laboratorio sabemos que el virus utiliza el the mRNA, respectively. All factors from this pa- ERGIC para el ensamblaje de la partícula viral. thway localize in P-bodies, dynamic cytoplas- Los estudios de colocalización indican que este mic foci harbouring the RNA decay machinery compartimento celular no está implicado en la and mRNAs that are silenced by a plethora of formación de las vesículas asociadas con BEV, distinct mechanisms. Recently we showed that ni tampoco otros componentes de esta ruta. HCV RNA translation and replication depend on Además nos permiten concluir que los comple- Rck/p54, LSm1 and PatL1, three decapping ac- jos de replicación están físicamente separados tivators from the 5´-3´deadenylation dependent del sitio de ensamblaje viral. Tampoco la ruta decay pathway, while the decapping enzyme endocítica ni las mitocondrias parecen tener re- Dcp2 and the exonuclease Xrn1 are not nee- lación con las DMVs. En otros sistemas virales ded, suggesting that it is not the decapping step se ha descrito la utilización de componentes itself what is needed but the proteins acting de la ruta autofágica para la formación de los upstream of it. However, the precise molecular complejos de replicación/trascripción. Mediante features involved and whether P-body formation microscopía confocal hemos podido comprobar itself has a role in HCV biology remain elusive. que a tiempos tardíos de la infección la proteína As a first step to address this, we transiently

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depleted in human hepatocyte cell lines Hedls/ virus y Valovirus). Los norovirus son la principal Ge-1, Rap55 and Edc3, the other decapping causa de gastroenteritis a nivel mundial en hu- activators of the 5´-3´deadenylation dependent manos. El virus de la enfermedad hemorrágica decay pathway, and tested the effect on HCV del conejo (RHDV), del género Lagovirus, es un translation and replication, and on the produc- virus emergente que provoca la muerte de los tion of infectious virus. Interestingly, we found animales infectados en 24-48 horas, y ha diez- that Hedls/Ge-1 and Edc3 were indeed also re- mado severamente las poblaciones de conejos quired for HCV propagation, while Rap55 was domésticas y silvestres en todo el mundo. Entre not. Since Rap55 is required for P-body forma- los vesivirus cabe destacar el calicivirus felino tion, our data indicate that formation of these (FCV), que provoca infecciones respiratorias structures is not crucial for HCV propagation. en gatos, y el virus del exantema vesicular por- Edc3 and Rap55 proteins are conserved from cino (VESV), que circuló por los EE.UU en la yeast to humans. Remarkably, by using a sys- primera mitad del siglo XX causando una pato- tem that allows the replication of the plant posi- logía en cerdos muy similar a la fiebre aftosa. tive-strand RNA Brome mosaic virus in yeast, Los estudios epidemiológicos demostraron que we showed that as for Lsm1, PatL1 and Rck/ el virus VESV se originó a partir del virus del p54, translation of Brome mosaic virus RNA león marino de San Miguel (SMSV), mediante depends on Edc3 while Rap55 had no effect. un salto de hospedador, debido a la alimenta- The functional conservation in the use of deca- ción del ganado porcino con desechos crudos pping activators by positive-strand RNA viruses de origen marino. of different kingdoms underlines the robustness of this viral strategy to promote their translation La mayoría de los calicivirus no crece en cul- and replication. tivos celulares, lo que dificulta el estudio de muchos aspectos de la biología de estos virus. PALABRAS CLAVE: HCV, P-bodies, RNA Una excepción a esta regla la constituyen los decay virus encuadrados en el género Vesivirus, que se propagan eficientemente en líneas de cultivos celulares. Así, el virus FCV crece en célu- CO/81 las de riñón de gato, pero no líneas celulares Dos cambios puntuales de aminoácido procedentes de otras especies de mamífero. en la proteína de la cápsida Mediante pases sucesivos en cultivos celulares del calicivirus felino confieren hemos obtenido 4 variantes virales de FCV ca- expansión del tropismo celular paces de replicar en distintas líneas derivadas de riñón de mono. La comparación de las se- Bárcena J*, Angulo I, Almanza H, cuencias de estos virus con la del virus parental Morales M, Blanco E, Mena I reveló un reducido número de mutaciones que Centro de Investigación en Sanidad Animal podrían estar implicadas en la ampliación de (CISA-INIA). Valdeolmos. 28130 Madrid (1) tropismo celular observada. Dichas mutaciones se localizan en la fase de lectura ORF2, que co- Los calicivirus son una familia de virus RNA de difica una proteína que se procesa, dando lugar polaridad positiva que incluye importantes pató- a la proteína LC (leader capsid) y a la única pro- genos para animales y humanos. Actualmente, teína de la cápsida viral, VP1. Utilizando gené- la familia se divide en cinco géneros: Norovirus, tica reversa hemos introducido distintas combi- Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus y Nebovirus, y naciones de estas mutaciones en el genoma del hay otros dos géneros más propuestos (Reco- virus parental y hemos analizado la capacidad

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de los virus quiméricos obtenidos para infectar hepatocelular, por lo que la infeccion cronica líneas celulares de mono. Nuestros resultados por este virus constituye la primera causa de indican que el fenotipo de tropismo ampliado transplante de higado en el mundo. No exis- requiere de al menos 2 cambios de aminoáci- te vacuna frente al virus y la terapia actual es do en la proteína VP1. Dichos cambios se lo- inespecífica, parcialmente eficaz y esta asocia- calizan en regiones de la proteína importantes da a notables efectos secundarios. Por lo tanto, para la unión virus-célula o implicadas en la es necesario el desarrollo de compuestos anti- neutralización por anticuerpos.Además, me- virales frente al virus. En este sentido, hemos diante ensayos de competición, hemos definido desarrollado un sistema de rastreo (screening) una mutación puntual en la proteína LC, que no de compuestos potencialmente activos frente es estrictamente necesaria para la infección de al virus de la hepatitis C sirviéndonos de un células de mono, pero aumenta considerable- modelo de infección para este virus en cultivo mente la eficacia biológica del virus, específi- celular. El sistema se basa en la cuantificación camente en las células no felinas. Finalmente, calorimétrica de la propagación del virus en distintas evidencias experimentales sugieren cultivo en presencia de diversos compuestos que el evento implicado para la restricción del en un formato de 96 pocillos. Se trata de un FCV para infectar células no felinas se sitúa en sistema no sesgado que identifica compuestos un evento temprano, después de la unión virus- que alteran cualquier aspecto de la infección célula pero antes de la traducción y replicación independientemente de que la diana sea ce- del genoma. lular o viral. Empleando esta herramienta inte- rrogamos librerías de compuestos generados PALABRAS CLAVE: calicivirus felino FCV, mediante química “click”, una forma de síntesis tropismo, cápsida viral química modular y altamente predecible que permite generar rápidamente un gran numero CO/82 de derivados de una estructura química identificada como antiviral. El screening de una co- Compuestos antivirales frente al virus lección de 1200 compuestos permitió identificar de la hepatitis C derivados de trans- una nueva familia de compuestos antivirales, estilbeno bloquean la replicación del no tóxicos con actividad a concentraciones por RNA viral al comienzo de la infección debajo de 5 µM. Gracias a la rápida síntesis de

(1) (2) cientos de compuestos derivados, se pudieron Gastaminza P.* , Pitram S. , Dreux determinar las características químicas nece- M. (3), Krasnova L. (2), Dong J. (2), Fokin (2) (2) (3) sarias para la actividad antiviral. De este modo, V. , Sharpless B. , Chisari F. se pudo generar un compuesto derivado no Departamento de Biologia Celular tóxico, con actividad por debajo de 50 nM y con y Molecular, CNB-CSIC, Madrid (1), un índice terapéutico muy superior. El estudio Department of Chemistry, The Scripps de su modo de acción indica que los compues- Research Institute, La Jolla (2), Department tos mencionados anteriormente interfieren con of Immunology and Microbial Science, The los primeros ciclos de síntesis de ARN viral al Scripps Research Institute, La Jolla (3) principio de la infección pero carecen de efecto Más de 170 millones de personas en el mundo una vez los complejos de replicación han sido se encuentran infectadas crónicamente por el formados. Análisis del perfil genético de mu- virus de la hepatitis C. La mayoría de los pa- tantes resistentes indican que la proteína no cientes crónicos presentan fibrosis que progre- estructural NS5A constituye la diana molecular sa a cirrosis y en muchos casos a carcinoma de estos compuestos. En resumen, se presen-

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taran la estructura y el modo de acción de una nueva familia de compuestos con actividad antiviral frente a HCV. PALABRAS CLAVE: hepatitis C, antivirales, replicacion

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Evolución viral

Moderadores: Dr. Carlos Briones Dr. Fernando García Arenal

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CO/83 probability in C. annuum. Under a number of different conditions, we consistently found a low A single virion can cause frequency (< 2%) of primary infection foci with systemic infection: a test of the both genotypes present, indicating that most foci independent action hypothesis had resulted from infection by a single virion. In model with a plant RNA virus a few rare cases, we found that one of the genotypes was present only in the inoculated leaf, Zwart MP*, Daròs JA, Elena SF but not in the systemically infected tissues. In Instituto de Biología Molecular y Celular these cases, the other genotype had surroun- de Plantas, CSIC-UPV, València (1) ded infected tissues in the inoculated leaf and Effective population size Ne is a central concept cut off access to vascular tissue. Although we in viral evolution, determining the prevalence of have hereby identified a mechanism of depen- multiple-genotype infections and the strength of dence that operates during co-infection, the fre- genetic drift. Effective population size has been quency of these events was so low that they did estimated by laboratory experiments for many not affect model predictions. Overall, our results different plant viruses, resulting in a range of es- show that the IAH model can predict the outco- timates. Do these different estimates, however, me of TEV inoculation. Given that effective po- result from meaningful biological differences pulation size is simply the product of dose and between plant viruses? Moreover, how do we the infection probability in the IAH framework, expect effective population size to change with our results provide good evidence that effective variables such as dose and host susceptibility? population size is dose dependent for TEV. This To address these questions, we performed an has two important ramifications: (1) variation in experimental test of the Independent Action estimates of effective population sizes for plant Hypothesis (IAH) model of infection using To- viruses may simply be due to variation in dose, bacco etch potyvirus (TEV) and two host plants and (2) the minimum number of virions causing species, Nicotiana tabacum and Capsicum systemic infection is one. annuum. The independent action hypothesis PALABRAS CLAVE: Infection model, states that each virion has a fixed probability of Independent action hypothesis, Tobacco etch infecting the host, and that the action of each potyvirus virion is independent of the presence of other virions. We developed IAH as a simple proba- CO/84 bilistic model that predicts (1) dose response, (2) the number of foci of primary infection in the Virulencia y coevolución planta-virus inoculated leaf, and (3) the frequency of mixed- en poblaciones de Arabidopsis thaliana genotype infections in systemic infection. To ex- perimentally test the model, we generated two Montes N* (1), Pagán I (1), Fraile A (1), TEV ´genotypes´, which are identical except for Alonso-Blanco C (2), García-Arenal F (1) the fluorescent marker – eGFP or mCherry – Centro de Biotecnologia y Genómica de incorporated. We inoculated three-week-old Plantas UPM-INIA, Campus de Montegancedo, plants with a 1:1 mixture of purified virions, and 29223 Pozuelo de Alarcón, Madrid (1), Centro measured dose response, primary infection foci Nacional de Biotecnología. CSIC, Campus and mixed-genotype systemic infections. The Universidad Autónoma, Cantoblanco, Madrid (2) data were not significantly different from model predictions for both N.tabacum and C. annuum, Aunque se acepta que los virus de plantas although there was a 50-fold lower infection perjudican a sus huéspedes y que hay coevo-

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lución planta-virus, la evidencia proviene sólo to, para analizar si la infección por CMV es un de agroecosistemas, en los que la población factor en la evolución de arabidopsis se eligió viral responde a la manipulación humana de la otro enfoque. En 12 poblaciones silvestres que población del huésped. Para analizar la coevo- representan la distribución de arabidopsis en lución planta-virus se requiere un patosistema la Península Ibérica se determinó la estructu- silvestre, y para ello hemos elegido a Arabidop- ra genética respecto a caracteres relevantes sis thaliana, modelo para la genética molecular para la interacción (resistencia y tolerancia) y de plantas (y cada vez más para su ecología) y para marcadores neutrales. La comparación de los virus que la infectan en la naturaleza. Con ambas estructuras mostró que eran significati- este sistema nos preguntamos si la incidencia vamente distintas, e indica que hay selección viral es importante en las poblaciones silves- para defensa frente a CMV. Estos resultados tres de arabidopsis y si se dan las condiciones son compatibles con una hipótesis de coevolu- necesarias para la coevolucion: a) el resultado cion, y son los primeros, que conozcamos, en de la interacción planta-virus depende de sus los que se demuestra un papel de los virus en genotipos, b) hay variación genética en los ca- la evolución de las plantas racteres que determinan la interacción, c) hay PALABRAS CLAVE: Evolucion de la efectos recíprocos de estos caracteres en la virulencia, Coevolucion planta-virus eficacia biológica de huésped y virus. Se ha estudiado la infección por virus en seis poblaciones silvestres de arabidopsis situadas en un CO/85 transecto N-S de 300 km en la meseta central, visitándolas periódicamente para caracterizar Experimental multihost evolution su demografía y la incidencia de cinco virus con of Tobacco etch virus distinta historia vital: Cucumber mosaic virus, Bedhomme S* (1), Lafforgue G (1), Elena SF (2) CMV; Cauliflower mosaic virus, CaMV; Turnip IBMCP, Valencia (1), IBMCP, Valencia y crinkle virus, TCV; Turnip mosaic virus, TuMV, (2) y Turnip yellow mosaic virus, TYMV. La inci- Santa Fe Institute, Santa Fe, USA dencia varía según virus y año, pero no según In the context of extension of the host range, población, y puede alcanzar valores elevados a virus can recurrently be submitted to the se- de hasta 0,70. Además, la incidencia es máxi- lection pressures of a new host or to the se- ma en estados tempranos del desarrollo de las lection pressures of various alternating hosts, plantas, al final del invierno. Ambos datos son depending on the ecological conditions. We compatibles con un efecto negativo de la infec- were interested in understanding the different ción viral en la eficacia de arabidopsis. Experi- strategies of adaptation that can result from the- mentos en condiciones controladas indican que se two ecological situations. la virulencia en el virus predominante, CMV, y las defensas de resistencia y tolerancia en la We used experimental evolution as an appro- planta, dependen de los genotipos de virus y ach and started from an infective clone of the plantas que interaccionan, y que hay variación Tobacco etch virus (TEV) and derived experi- heredable en los caracteres implicados. Sin mental lines, transferred either on the same embargo, virulencia y defensas también depen- host at each transfer (specialist lines) or on al- den de factores ecológicos como la densidad ternative host (generalist lines). We used four de la población del huésped, lo que dificulta la different hosts and derived ten replicates of extrapolación de los resultados de los experi- the four specialist evolutionary histories and of mentos a las condiciones de campo. Por tan- three generalist evolutionary histories.

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We then used a complete crossed design to de la familia Bromoviridae. Su genoma está evaluate the infectivity and the virulence on constituido por tres RNAs de polaridad positi- the four hosts of all evolved virus lineages. We va. Los RNAs monocistrónicos 1 y 2 codifican were able to find the signature of antagonistic las proteínas P1 y P2 del complejo de la RNA pleiotropy and of local adaptation of the evolved polimerasa, respectivamente. El RNA 3 contie- lineages but our data did not show the general ne dos pautas de lecturas abierta que codifican disadvantage of generalist strategies predicted la proteína de movimiento (MP) y la proteína by theoretical models. The acquisition of the de cubierta (CP), la cual es expresada a tra- consensus sequences of the 70 evolved line- vés de un RNA subgenómico o RNA 4. Análisis ages allowed us to analyse the host specifici- previos pusieron de manifiesto que el gen de la ty and the history-specificity of the mutations MP de AMV es funcionalmente intercambiable accumulated and to relate the genotype to the para el transporte a corta y larga distancia por phenotype of each lineage. el correspondiente gen de virus pertenecientes PALABRAS CLAVE: Experimental evolution, a ocho géneros virales de la familia 30K (Sán- Tobacco etch virus, Host switch chez-Navarro y col., 2006; Virology 341: 66-73; Sánchez-Navarro y col., 2010; J. Virology 84: CO/86 4109-4112). Sin embargo, el intercambio de la MP de AMV por la MP del virus del mosaico del Una región 5’ no traducible bromo (BMV) en la que se han eliminado los evolucionada del RNA 3 del virus 48 residuos de amino ácido del extremo C-ter- del mosaico de la alfalfa facilita minal, generó un RNA 3 quimera (MPBMV255/ el transporte a corta y larga CP) defectivo para el transporte a larga distan- distancia de un virus quimera cia (Sánchez-Navarro y col., 2001; MPMI 14: 1051-1062). En el presente trabajo hemos rea- Fajardo T. V. M. (1), Peiró A. (2), Pallás lizado experimentos de evolución viral dirigidos V. (2), Sánchez-Navarro J. A.* (2) a caracterizar determinantes de secuencia del Embrapa Uva e Vinho, Rua Livramento RNA 3 quimera MPBMV255/CP críticos para el 515. Bento Gonçalves –RS- Brasil CEP: transporte sistémico. Los resultados obtenidos 95.700-000. (1), Instituto de Biología han puesto de manifiesto que modificaciones Molecular y Celular de Plantas (CSIC- del extremo 5’ no traducible (5’UTR) son sufi- UPV). Campus UPV, CPI 8E. C/ Ingeniero cientes para facilitar el transporte a corta y larga Fausto Elio s/n, 46022 Valencia (2) distancia, tanto con virus quimera que poseen la MP de BMV como de diferentes MPs de la fa- El transporte de los virus de plantas es un pro- milia 30K. En este escenario, hemos analizado ceso esencial del patógeno que puede signifi- la posible implicación del 5’UTR modificado en car la diferencia entre una infección sistémica, procesos de replicación y/o traducción local o subliminar (una única célula). Una vez iniciada la infección, los virus de plantas nece- PALABRAS CLAVE: Transporte viral, sitan invadir las células adyacentes (transporte evolución viral, proteína de movimiento 30k a corta distancia), para alcanzar las partes distales del huésped a través del sistema vascular o transporte a larga distancia. CO/87 El virus del mosaico de la Alfalfa (AMV) es el Caracterización de la resistencia a miembro tipo del género Alfamovirus dentro 5-azacitidina en el bacteriófago Qbeta

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Lázaro E*, Arribas M, Cabanillas L para el virus salvaje. La determinación de la secuencia consenso de las poblaciones adap- Departamento de Evolución Molecular, Centro tadas muestra la fijación de una mutación no de Astrobiología (INTA-CSIC), Madrid (1) sinónima en la proteína readthrough del virus, La replicación de los virus RNA tiene lugar con la cual aparentemente no está implicada en re- tasas de error muy elevadas, lo cual conduce a plicación. A pases posteriores aparecen otras la generación de poblaciones con un elevado mutaciones en la replicasa viral que, a pesar grado de heterogeneidad genética que facilita de tener valor selectivo en presencia de AZC, la adaptación a nuevas presiones selectivas. permanecen como polimorfismos durante un Sin embargo, la replicación a alta tasa de error número elevado de generaciones. también tiene consecuencias negativas que se PALABRAS CLAVE: mutagénesis, manifiestan en la reducida tolerancia de los vi- adaptación, resistencia rus RNA al incremento en la acumulación de mutaciones. Las frecuentes extinciones obser- CO/88 vadas en virus RNA que replican en presencia de mutágenos sugieren que en estos virus la Tempo and mode of inhibitor-mutagen selección natural ha escogido potenciar la ca- antiviral therapies: a multidisciplinary pacidad adaptativa a costa de utilizar tasas de approach error que están en el límite compatible con la Iranzo J. (1), Perales C. (2), Domingo viabilidad de la población. La nueva estrategia E. (2), Manrubia S. C.* (1) antiviral conocida como mutagénesis letal está basada en esta hipótesis y propone el trata- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) (1), Centro miento de las enfermedades causadas por vi- de Biología Molecular ‘Severo Ochoa’ (2) rus RNA mediante el incremento artificial de la tasa de error, principalmente a través del uso The continuous emergence of drug-resistant de análogos mutagénicos de nucleósidos. viruses is a major obstacle for the successful treatment of viral infections, thus representing a En los últimos años se han identificado varios persistent spur to the search for new therapeutic mutantes resistentes a mutágenos, lo cual de- strategies. Among them, research on multi-drug muestra que durante la evolución a alta tasa de treatments is currently at the forefront of phar- error también se pueden fijar mutaciones be- maceutical, clinical, and computational inves- neficiosas que permiten la adaptación a condi- tigation. Still, there are many unknowns in the ciones de mutagénesis incrementada. En este way different drugs interact among themselves estudio hemos analizado el comportamiento and with the pathogen they aim at controlling. evolutivo de una población del bacteriófago Here, we discuss combination therapies invol- Qbeta que se replica durante un elevado nú- ving two dissimilar drugs: the mutagen ribavirin, mero de generaciones en presencia de 5-aza- and an inhibitor of the viral replication, guani- citidina (AZC), un análogo mutagénico de la dine. These drugs were used in vitro to analy- citidina. Hemos obtenido una población viral se the performance of their sequential versus que presenta menor capacidad para acumular simultaneous administration in the control of mutaciones en presencia de AZC que las po- infections by foot-and-mouth disease virus. blaciones del virus que han evolucionado en However, a systematic analysis of viral respon- ausencia de mutágeno. Esta población también se to drug doses, essential before undertaking es capaz de evitar la extinción cuando se trans- in vivo trials, demands an unaffordable amount mite con AZC en condiciones que son letales of time and resources. Hence, we have used a

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theoretical approach to design an in silico model Centro de Biología Molecular ‘Severo representing the dynamical response of the viral Ochoa’ (CSIC-UAM), Campus de population to the two drugs. In agreement with Cantoblanco, 28049 Madrid. (1) the theoretical predictions, in vitro experiments Estudios previos documentaron la selección de confirm in particular cases that the suitability un mutante del virus de la fiebre aftosa (VFA) of simultaneous or sequential administration con una triple sustitución en su polimerasa depends on the administered doses. Further, (3Dpol): P44S, P169S, M296I (mutante SSI) the model predicts the dynamic response of the que confiere resistencia al análogo mutagéni- viral population for any dose combination and, co de nucleósido ribavirina (R). La única alte- in particular, determines the amount of inhibitor ración estructural significativa detectada en la and mutagen required to minimise the probabi- polimerasa SSI en comparación con la del virus lity of appearance of resistant mutants. It turns estándar fue una reorganización de los aminoá- out that the intrinsic characteristics of the virus cidos M16 a K18 de la zona amino (N)-terminal play a key role to determine the appropriate- de la enzima y reorientación de nucleótidos del ness of a sequential or a simultaneous therapy. molde de RNA que podrían alterar el reconoci- Knowledge of several model parameters is ob- miento de R-trifosfato (RTP) (Agudo et al. PLoS tainable by means of few, simple experiments, Pathogens 6(8), e1001072, 2010). En la zona such that the model and its predictions could be N-terminal de la polimerasa se ha identificado extended to other viral systems. una señal de localización nuclear (NLS) a pesar de que el VFA tiene un ciclo de replicación res- REFERENCES tringido al citoplasma. La NLS tiene la secuencia MRKTKLAPT y comprende los aminoácidos 16 [1] Perales C, Agudo R, Tejero H, Manrubia a 24. Virus con las sustituciones K18E y K20E SC, Domingo E (2009) Potential Benefits of Se- no muestran efecto citopático y revierten tras 1 quential Inhibitor-Mutagen Treatments of RNA y 2 pases post-transfección en células BHK-21. Virus Infections. PLoS Path. 5:e1000658. La polimerasa de los virus mutantes, contra- riamente a la del virus estándar, muestra una [2] Iranzo J, Perales C, Domingo E, Manru- localización mayoritariamente citoplasmática, bia SC (2011) Tempo and mode of inhibitor- sugiriendo que las sustituciones K18E y K20E afectan el transporte al núcleo. Las polimerasas mutagen antiviral therapies: a multidisciplinary con K18E y K20E (denominadas 3Dpol-E18 y approach. Preprint 3Dpol-E20) han sido expresadas en E. coli, purificadas y su actividad enzimática comparada PALABRAS CLAVE: mathematical model , in con la de 3Dpol estándar. 3Dpol-E18 y 3Dpol- vitro viral evolution, sequential therapy E20 muestran una disminución de unas 15 veces en su capacidad de unir un RNA iniciador- CO/89 molde, aunque las enzimas mantienen una actividad de polimerización que es ligeramente Señal de localización nuclear inferior en el caso de 3Dpol-E18 y la mitad en implicada en reconocimiento de el caso de 3Dpol-E20. Al comparar la cinética nucleótidos: multifuncionalidad de de incorporación de nucleótidos estándar y de un dominio de una polimerasa vírica RTP, se ha observado que, sorprendentemente, con algunos iniciadores-molde 3Dpol-E18 y de la Higuera I.*, Caridi F., Sánchez- 3Dpol-E20 muestran una mayor incorporación Aparicio M.T., Domingo E., Sobrino F. de RTP al RNA producto que la 3Dpol están-

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dar. Este resultado abre nuevas posibilidades de extinguir las poblaciones del VIH-1 cuando para entender las interacciones que favorecen se propaga tanto en presencia como en au- el reconocimiento de RTP por enzimas víricos, sencia de otras drogas antirretrovirales como confirma el importante papel de la zona N-ter- es el análogo de nucleósido AZT. El objetivo minal de 3Dpol de VFA en catálisis, e implica a una NLS en una función de reconocimiento principal de este trabajo es la identificación del de nucleótidos. El carácter multifuncional de la agente mutagénico más eficaz dentro de una zona N-terminal de 3Dpol ha sido confirmado librería de análogos de nucleósidos. Es decir, por la observación de un defecto de migración aquel que produzca un mayor incremento en la al núcleo de la 3Dpol mutante SSI. El hecho tasa de mutación del VIH-1 y la menor toxicidad de que la resistencia a R de SSI haya nece- celular. Para medir la capacidad mutagénica de sitado alterar una función aparentemente independiente como es la de localización nuclear, estos los compuestos mutagénicos, hemos uti- sugiere que acciones antivirales que combinan lizado y adaptado un nuevo sistema de cribado mutagénesis e inhibición podrían conducir a la de agentes, el sistema de HIG (HSA IRES GFP) extinción del virus por los defectos multifuncio- (Dapp MJ et al, J Virol, 2009, 83(22):11950-8). nales que sufrirían los posibles mutantes de Esta metodología permite establecer de ma- resistencia. nera rápida y eficaz las IC50 de los distintos PALABRAS CLAVE: Señal de Localización agentes mutagénicos a evaluar. Posteriormen- Nuclear, Ribavirina, Mutagénesis Letal te, hemos realizado pases seriados del virus VIH-1 en presencia de los agentes evaluados CO/90 como activos para determinar si pueden llevar la población viral a extinción o bien ésta se Mutagénesis letal del virus de la puede adaptar y surgir un resistente. De esta inmunodeficiencia humana de tipo 1 manera, hemos podido establecer que tan- Martrus Zapater G*, Capel Malo to la 5-azacitidina (5-AZC), como la 5-aza-2- E, Nevot Banus M, Clotet Sala C, ’deoxicitidina son capaces de ejercer un claro Martínez de la Sierra MA efecto antiviral a bajas concentraciones (50µM Laboratorio de Retrovirología, y 200nM respectivamente). Pases seriados de Fundació Irsicaixa, Hospital Germans sobrenadante de cultivos de células MT4 infec- (1) Trias i Pujol, Badalona tadas con VIH-1 con 5-AZC llevan la población La mutagénesis letal es una estrategia antiviral viral a extinción en cinco pases seriados (equi- con la que se ha demostrado que ciertos agen- valente a 25 días de cultivo). La secuenciación tes mutagénicos, análogos de nucleósidos, son de la poblaciones virales previas a la extinción capaces de hacer entrar los virus en catástrofe muestran un incremento en el número de muta- de error al aumentar su tasa de mutación. Ello ciones G->C, mutación característica generada conlleva que los virus pierdan su infectividad y por la 5-AZC. Estos resultados demuestran que disminuya su replicación efectiva. En trabajos la 5-AZC puede llevar a la población viral a su previos de nuestro laboratorio, se demostró en extinción. el sistema de pases seriados de cultivos de cé- lulas MT4 infectadas con VIH-1, la capacidad PALABRAS CLAVE: mutagénesis letal, del mutágeno 5-hidroxideoxicitidina (5-OH-dC) VIH-1, análogo de nucleósido

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CO/91 vamente con el aumento de la heterogeneidad de las cuasiespecies virales pero no estaba Pérdidas de eficacia biológica asociado a un camino evolutivo concreto, sino significativas pueden ocurrir en que cada virus fijaba mutaciones en distintas el VIH-1 durante pases seriados regiones del genoma. Aunque el comporta- en gran tamaño poblacional miento individual de los diferentes virus era he- Lorenzo Redondo *R., López Galíndez C. terogéneo, la gran mayoría(9 de 12) presenta- Servicio de Virología Molecular. ba aumentos de eficacia considerables tras los Centro Nacional de Microbiología 30 pases. Sorprendentemente, dos de los virus (CNM). Instituto de Salud Carlos III. que presentaban mayores eficacias en pase 21 Majadahonda, Madrid 28220, Spain (1) sufrieron caídas significativas en pase 31, llegando incluso en uno de los casos a presentar El virus de la inmunodeficiencia humana de valores menores que en el pase inicial. Dichos tipo 1(VIH-1) debido a su alta tasa de mutación virus en pase 21, tenían las mayores eficacias, y elevada producción de progenie, presenta una distribución en cuasiespecies, en la que la los títulos virales más altos, alta actividad RT, nube de mutantes se comporta como unidad pero a su vez tenían las heterogeneidades más de selección. Así, el objeto de la evolución es bajas. Por el contrario, en el pase final la mayo- la cuasiespecie en su conjunto y no un varian- ría de estas características se habían perdido, te individual. Para conocer las consecuencias aunque, a pesar de su baja eficacia, estos virus que esta distribución en cuasiespecie tiene en presentaban gran efecto citopático. A pesar de la infección viral, se llevan a cabo estudios in lo establecido para los estudios in vitro, la rela- vitro aplicando cambios en el tamaño poblacio- ción virus-célula en cultivos celulares no es fija, nal del virus en pases seriados. Estos cambios poblacionales moldean la composición de las sino que se constituye un ambiente cambiante cuasiespecies virales. En este trabajo se han en el que existe una selección positiva constan- llevado a cabo 30 pases in vitro en gran tama- te en el virus y se observan diferentes patrones ño poblacional para recuperación de la eficacia de evolución. En este contexto, virus con ex- biológica en virus que habían sufrido previa- cesiva especialización y limitada heterogenei- mente, tras pases placa a placa, fuertes caídas dad en un momento dado, como en los virus de eficacia. Una vez realizados, se analizaron en pase 21, pueden sufrir posteriores caídas de los virus obtenidos en los pases 11, 21 y 31 de eficacia por su falta de capacidad adaptativa. recuperación. Se calculó la eficacia de los virus en ensayos de competición, se obtuvieron las PALABRAS CLAVE: Evolución, Eficacia, In secuencias consenso de los genomas comple- Vitro tos y se analizaron las cuasiespecies de cada virus en 4 regiones genómicas. Así mismo, se midieron diferentes características fenotípicas CO/92 como el título, la producción de proteína p24, la actividad retrotranscriptasa(RT) y las carac- Múltiples mecanismos modelan la terísticas citopáticas. Tras estos análisis se ob- evolución de los papilomavirus: la servó un aumento continuo y muy significativo relación borrosa entre genotipo viral de la eficacia global de los virus a lo largo de y manifestaciones fenotípicas de las los pases. Este aumento correlacionaba positi- infecciones por papilomavirus

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Bravo I.G.*, Alemany L., Bosch procedentes de 38 países, e identificado me- F.X., de Sanjosé S. diante genotipado y/o secuenciación los PVs Infección y Cáncer. Instituto Catalán presentes en las muestras. Los tipos más co- de Oncología. Barcelona (1) munes fueron HPV16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, y 58 con una contribución relativa de 8196 de Uno de cada cinco casos de cáncer en hu- 8977 casos positivos (91%, 95%CI 90-92%). manos está relacionado con la infección por Los PVs ligados a cáncer cervical pertenecen diferentes agentes, y los papillomavirus (PVs) fundamentalmente a las especies 5, 6, 7, 9 y representan más del 30% de esta carga. La 11 de los Alpha-PVs. Sin embargo, estos PVs investigación sobre la biología de los PVs se de “alto riesgo” no son monofiléticos. Asimis- basa históricamente en una serie de hipótesis mo, otros virus que son clasificados como de pobremente contrastadas, tales como la espe- “bajo riesgo” (p.ej. HPV6) se encuentran en cificidad de hospedador y de tropismo tisular, o lesiones malignas con más frecuencia que al- la coevolución entre PVs y sus hospedadores. gunos miembros de especies de “alto riesgo”, Presentamos aquí un ejemplo de la potencia de tales como HPV66, 69, 70 u 82. la combinación de las aproximaciones epide- miológicas y evolutivas para la comprensión de Concluímos que existe una conexión entre las la biología viral y de la conexión entre genotipo clasificaciones evolutivas y epidemiológicas en viral y fenotipo y manifestaciones clínicas de la los PVS. Sin embargo los desacuerdos entre infección. las mismas evidencian en realidad que nuestro conocimiento acerca de la evolución de los Por un lado, hemos construido filogenias ro- genotipos es más profundo que nuestra com- bustas tanto de los PVs como de sus hospe- prensión de las vías que conectan genotipos dadores y analizado la convergencia entre determinados con fenotipos complejos, tales ambas reconstrucciones mediante una batería como el cáncer. de pruebas que incluye comparaciones topoló- gicas y de congruencia de longitud de ramas. PALABRAS CLAVE: coevolución virus- Podemos estimar que la codivergencia virus- hospedador, conexión genotipo-fenotipo, hospedador puede dar cuenta del 30% de los conexión epidemiología-evolución eventos evolutivos necesarios para conciliar ambas historias evolutivas. El escenario evolutivo que mejor describe la evolución de estos virus es el de una radiación de los PVs previa a la radiación de los mamíferos placentarios, que generó un número limitado de linajes, que posteriormente co-evolucionaron de manera independiente con sus hospedadores. Adicional- mente, otros eventos tales como la duplicación dentro de un linaje y/o la pérdida selectiva en determinados linajes, la recombinación, el salto de hospedador, y la colonización de nuevos nichos han desempeñado un papel fundamental en la evolución de los PVs.

Por otro lado hemos analizado más de 10,500 muestras de casos de cáncer cervical invasivo

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Respuesta inmune y vacunas (II)

Moderadores: Dra. Margarita del Val Dr. Enrique Villar

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CO/103 Los resultados obtenidos in vitro e in vivo muestran que las flagelinas de Marinobacter F Caracterización funcional de las y FR tienen una capacidad adyuvante similar flagelinas deMarinobacter algicola y su (vías SC e IN) a la de la flagelina deSalmonella aplicación terapéutica en combinación FljB. Con ambas flagelinas obtenemos niveles con la flagelina deSalmonella similares de IL8 secretada por células Caco-2, Gomez-Casado E* y también de anticuerpos IgG en ratón frente a Departamento de Biotecnología, Instituto un epitopo modelo que sirvió como inmunógeno Nacional de Investigación y Tecnología en fusión a las flagelinas. El estudio in vitro de Agraria y Alimentaria (INIA). Autovía secreción de IL8 por células Caco-2 mostró que A6, Km 7.5, 28040-Madrid, Spain. (1) los anticuerpos anti-FljB presentes en el suero de ratones HPI con FljB neutralizan la flagelina La flagelina es ligando del receptor TLR5 que se expresa constitutivamente en la superficie de Salmonella FljB, pero no las flagelinas de de células endoteliales, osteoblastos y célu- Marinobacter que siguen siendo funcionales a las presentadoras de antígeno. La interacción concentraciones tan bajas como 50 ng. El estu- TLR5-flagelina conlleva la activación NF-kB dio de neutralización in vivo se realizó en ratón que induce la expresión de múltiples factores midiendo el nivel en suero de CCL20 como me- contribuyendo a la protección y regeneración diador temprano de respuesta inmune. Grupos tisular, incluyendo inhibidores de la apoptosis, de ratones HPI con FljB, se inocularon con FljB secuestradores de especies reactivas de oxí- y con FR, observándose que la flagelina FljB se geno, y citocinas que aumentan la respuesta neutralizó por completo y no indujo la produc- inmune humoral y celular. La activación de NF- kB mediante la flagelina es uno de los mecanis- ción de CCL20, mientras que la flagelina FR no mos por los cuales se inhibe la vía proapoptóti- se neutralizó con los anticuerpos anti-FljB indu- ca de p53, uno de los principales determinantes ciendo la activación de TLR5 y la producción de la radiosensibilidad. de CCL20. La flagelina de Salmonella typhimurium se ha Todos los resultados obtenidos indican que las utilizado de forma generalizada como modelo flagelinas de Marinobacter tienen una capaci- de adyuvante para diversas vacunas, trata- dad adyuvante similar a la flagelina de Salmo- miento de tumores, y como protector frente a agentes biológicos, químicos y radiológicos. nella. Estos hallazgos permiten usar las flageli- Sin embargo, la flagelina es inmunogénica y su nas de Marinobacter en hiperinmunizados con uso continuado, y la infección previa por Sal- Salmonella y viceversa. Se establece un mejor monella generan anticuerpos anti-flagelina de uso dosis/respuesta aplicando secuencialmen- Salmonella que neutralizan la funcionalidad te ambas flagelinas como adyuvantes para va- de posteriores dosis de esta flagelina. En este cunas, tratar tumores y radioterapia, pero evi- trabajo hemos caracterizado: 1) la capacidad tando el riesgo de sufrir un shock por el efecto adyuvante in vitro e in vivo de las flagelinas de proinflamatorio. Marinobacter algicola (F y FR) respecto a la de Salmonella typhimurium (FljB); y 2) la funciona- PALABRAS CLAVE: Flagelina, lidad cruzada de las flagelinas deMarinobacter Neutralización, TLR5, CCL20, Marinobacter y Salmonella en individuos hiperinmunizados (HPI) con cada una de las flagelinas. algicola, Salmonella, Vacunas, NF-kB

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CO/104 IFNAR (-/-), aunque no era capaz de proteger a los ratones inmunizados frente al virus he- La inmunización combinada con terólogo BTV-8. En busca de una estrategia y vectores DNA Y MVA que ex- composición vacunal que indujera protección presan las proteínas VP2, VP7 y cruzada frente a distintos serotipos de BTV se NS1 de BTV-4 confiere protec- evaluó la combinación de vectores vacunales ción multiserotipo frente a BTV DNA/rMVA que expresan las proteínas VP2, VP7 y NS1. La proteína NS1 es una de las más Calvo Pinilla E* (1), Navasa N (2), conservadas entre serotipos, además de ser la Anguita J (2), Ortego J (1) mayor inductora de CTLs. Los ratones inmuni- Centro de Investigación en Sanidad zados con esta vacuna mostraron una fuerte Animal, CISA-INIA, Madrid (1), University inducción de respuesta celular frente a las pro- of Massachusetts, Amherst (2) teínas VP2, VP7 y NS1, así como una fuerte inducción de anticuerpos neutralizantes frente El virus de la lengua azul (BTV), pertenece a BTV-4. Los ratones vacunados quedaron pro- al género Orbivirus, dentro de la familia Reo- tegidos totalmente frente al desafío con el se- viridae, y su genoma está compuesto por 10 rotipo homólogo BTV-4 y al heterólogo BTV-8. segmentos de RNA de doble cadena. Hasta Además, mostraron un alto grado de protección la fecha se ha documentado la existencia de heteróloga, del 85%, frente a BTV-1. Estos re- 25 serotipos de este virus. La gran diversidad sultados confirman el potencial de esta la vacu- genética de BTV es consecuencia tanto de mu- na combinada DNA/rMVA-VP2/VP7/NS1 como taciones puntuales en su genoma como de la vacuna multiserotipo de BTV. reorganización de los segmentos génicos indi- PALABRAS CLAVE: Lengua azul, Vacuna, viduales. La escasa reactividad cruzada entre Multiserotipo los diferentes serotipos de BTV dificulta la ge- neración de una vacuna que sea efectiva frente CO/105 a desafíos heterólogos. Las vacunas inactiva- das que se utilizan hoy en día son específicas Inmunogenicidad y protección de serotipo. Sin embargo, algunos trabajos con inducida por vacunas de ADN y MVA vacunas recombinantes experimentales han frente a la infección del virus de la descrito que la combinación de algunos inmu- fiebre del Valle del Rift en ratones nógenos de BTV induce una cierta protección cruzada frente otros serotipos.El objetivo de López Gil E.* (1), Lorenzo Alguacil G. (1), nuestro trabajo es la generación de vacunas Hevia E. (1), Gilbert S. (2), Brun Torres A. (1) recombinantes y estrategias de vacunación, CISA-INIA, Valdeolmos (1), Jenner combinando diferentes antígenos de BTV, para Institute, University Of Oxford (2) analizar la respuesta inmune protectora frente a desafíos homólogos y heterólogos de BTV La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoono- en el modelo animal de infección de BTV basis que afecta principalmente a rumiantes, tanto sado en ratones IFNAR (-/-). Resultados pre- domésticos como salvajes. El virus de la fiebre vios mostraron que la vacunación combinada del Valle del Rift (VFVR) se transmite mediante basada en DNA desnudo y el vector viral MVA, la picadura de insectos, aerosoles y fluidos cor- que expresan las proteínas VP2, VP5 y VP7 porales, causando abortos en animales gestan- de BTV-4, era capaz de inducir una protección tes y una elevada tasa de mortalidad en anima- total frente a un desafío homólogo en ratones les jóvenes. La infección en el hombre puede

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ser asintomática, o producir síntomas leves que incrementó la protección parcial inducida con en el 1-2% de los casos evoluciona a hepatitis, dos dosis de pCMV-N, aunque los signos clí- encefalitis, retinitis y fiebre hemorrágica. nicos en los animales persistieron durante más tiempo. Por último, los animales inmunizados Las vacunas que se han desarrollado hasta con una única dosis de MVA-N no se prote- ahora para el control de la enfermedad están gieron tras el desafío, presentando títulos de basadas en la atenuación e inactivación del viremia superiores al resto de animales inmu- virus, pero presentan efectos adversos y falta nizados. de efectividad. Por ello, se están desarrollando vacunas de nueva generación basadas en Los resultados obtenidos confirman que la va- inmunización con ADN, partículas similares a cuna MVA recombinante expresando las glico- virus (VLPs), proteínas recombinantes y varios proteínas del virus podría ser considerada en vectores virales, con el fin de obtener vacunas un futuro una candidata vacunal frente al VFVR, más seguras, y eficaces. ya que reúne una serie de ventajas como eficacia, seguridad, viabilidad y su posible uso en el En este trabajo se han empleado dos vectores hombre. vacunales: plásmidos ADN (pCMV) y el virus vaccinia atenuado de la cepa Ankara (MVA), PALABRAS CLAVE: VACUNA, MVA, expresando tanto las glicoproteínas virales Gn/ PROTECCIÓN Gc como la nucleoproteína N del VFVR. Se evaluó la respuesta inmune humoral y la pro- CO/106 tección inducida por dichos vectores mediante estrategias de vacunación homólogas (ADN o N-ras is critical for antiviral memory MVA) y heterólogas (ADN+MVA), en ensayos but dispensable for effector de protección frente a un aislado virulento del CD8+ T-cell development VFVR en ratones BALB/c. Iborra S (1), Ramos M (1), Lázaro S (1), (1) (2) (1) En los sueros de animales inmunizados con Aguilar F , Santos E , López D , (3) (4) vacunas que expresaban las glicoproteínas vi- Fernández-Malavé E , Del Val M* rales se detectó invariablemente la presencia Centro Nacional de Microbiología, Instituto de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, los de Salud Carlos III, Madrid (1), Centro de anticuerpos generados frente a la nucleoproteí- Investigación del Cáncer (CSIC-USAL), na viral no fueron capaces de neutralizar la in- Salamanca (2), Inmunología, Facultad fección in vitro. de Medicina, Universidad Complutense, Madrid. (3), Centro de Biología Molecular Los resultados obtenidos tras el desafío con Severo Ochoa (CSIC-UAM) y Centro el VFVR mostraron un 100% de protección en Nacional de Microbiología, Instituto aquellos animales vacunados con una única de Salud Carlos III, Madrid (4) dosis de MVA-Gn/Gc, sin detectarse viremia ni signos clínicos en este grupo. Por otra parte, Signals emanating from the TCR that distincti- la inmunización con dos dosis homólogas del vely determine effector versus memory CD8+ T- plásmido pCMV-Gn/Gc confirió el mismo grado lymphocyte differentiation are poorly understo- de protección (71%) que el obtenido con un ré- od. By using mice deficient for the small GTPase gimen heterólogo pCMV-Gn/Gc + MVA-Gn/Gc, N-ras, we show here that N-ras-deficient CD8+ disminuyéndose la morbilidad con este último. T lymphocytes were activated and expanded Por otro lado, el empleo de pCMV-N + MVA-N normally during a primary antiviral response.

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In contrast, generation of fully functional and expresión heteróloga se ha demostrado que protective antiviral memory CD8+ T cells was la proteína de la cápsida de los calicivirus es severely compromised by the N-ras deficiency. capaz de autoemsamblarse formando cápsidas The defect in memory generation correlated vacías (VLPs), que son estructural, antigéni- with impaired TCR-mediated induction of the ca e inmunogénicamente indistinguibles a los memory-associated transcription factor eomes- virus nativos. Dichas VLPs constituyen valio- odermin. Inhibition of mTOR with rapamycin sas herramientas para estudios estructurales, mostly rescued both defects, although early im- como reactivos de diagnóstico, o para el desa- pairment of eomesodermin induction was insen- rrollo de vacunas frente a los virus de los que sitive to rapamycin and correlated instead with proceden. altered activation of the PI3K/AKT pathway in El virus de la enfermedad hemorrágica del co- the absence of N-ras. Thus, our study identifies nejo (RHDV) es el prototipo del género Lagovi- N-ras as a key regulator of signalling pathways rus. Se trata de un virus emergente descrito ini- downstream of the TCR that critically converge cialmente en China en 1984. Se transmite por in mTOR for the differentiation of protective an- vía aerogena y provoca la muerte de los ani- tiviral memory CD8+ T lymphocytes. males infectados en 24-48 horas. Actualmente PALABRAS CLAVE: vaccinia virus, T tiene distribución mundial, ha causado graves lymphocyte, protection pérdidas en explotaciones de conejos domés- ticos y diezmado severamente las poblaciones CO/107 de conejos silvestres. Existen vacunas comerciales basadas en virus inactivado que se em- Generación de cápsidas vacías plean para proteger a los conejos domésticos. (VLPs) quiméricas de calicivirus La cápsida del virus RHDV está formada por que inducen una potente respuesta 180 copias (90 dímeros) de la proteína estruc- humoral neutralizante frente a tual, VP60. Las VLPs derivadas del virus RHDV epítopos heterólogos insertados son muy inmunogénicas y confieren protección frente a un desafío letal con el virus. Moreno N* (1), Gómez Y (1), Castón J.R. (2), Mena I (1), Blanco E (1), Bárcena J (1) Nuestro grupo ha desarrollado un sistema de producción de VLPs derivadas del virus RHDV Centro de Investigación en Sanidad Animal basado en la expresión de la proteína VP60 en (CISA-INIA). Valdeolmos. 28130 Madrid (1), el sistema de baculovirus. El objetivo de esta Dept. de estructura de macromoléculas, línea de trabajo es el desarrollo de dichas VLPs Centro Nacional de Biotecnología/ como vector para la presentación multimérica CSIC, Cantoblanco, 28049 Madrid (2) de epítopos inmunogénicos heterólogos, deri- La familia Caliciviridae comprende virus sin vados de patógenos de interés en sanidad ani- envuelta con una cápsida proteica de simetría mal. En trabajos anteriores hemos demostrado icosaédrica y RNA monocatenario de polaridad que VLPs quiméricas de RHDV con un epítopo positiva de 7,4 -8,3 Kb. La mayoría de los ca- T-citotóxico heterólogo insertado en el extremo licivirus no crece en cultivos celulares, lo que N-terminal, son capaces de inducir una potente dificulta el estudio de muchos aspectos de su respuesta celular protectiva específica frente al biología.Una característica particular de los ca- epítopo foráneo insertado [Virology 387 303- licivirus es que la cápsida está formada por una 312 (2009)]. El objetivo del presente estudio única proteína estructural, algo poco frecuente fue evaluar el potencial de las VLPs de RHDV en los virus animales. Utilizando sistemas de para inducir una respuesta inmune eficiente

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frente a epítopos B heterólogos. Para este fin Desde su erradicación en España a mediados se generaron VLPs quiméricas de RHDV en de los noventa, la Peste Porcina Africana (PPA) las que se insertó un epítopo B neutralizante, ha estado confinada al África Subsahariana y procedente de la cápsida del calicivirus felino Cerdeña, donde el virus responsable (VPPA) se (FCV), en cuatro sitios de inserción distintos, mantiene endémico en un ciclo silvático entre con diferentes grados de exposición en la su- cerdos domésticos y sus reservorios naturales perficie de la cápsida. Las VLPs quiméricas (cerdos salvajes y garrapatas del género Or- se inocularon en grupos de ratones C57BL/6 y nithodoros). 40 años después de su aparición se analizó la respuesta humoral inducida. Los en la península ibérica, la historia se ha vuelto resultados obtenidos indican que las VLPs de a repetir con los brotes de PPA declarados en RHDV son capaces de inducir altos niveles de Georgia en 2007, hoy extendidos a países limí- anticuerpos neutralizantes frente al epítopo B trofes, incluyendo Rusia. Desafortunadamente, heterólogo, cuando éste se incorpora en deter- no existe tratamiento ni vacuna eficaz frente minadas localizaciones accessibles a la super- al VPPA, por lo que su control se basa en el ficie en las VLPs. Esto sugiere que las VLPs de diagnóstico precoz y sacrificio de los animales RHDV podrían ser útiles para el desarrollo de infectados, medida inaplicable en los países nuevas estrategias vacunales. pobres que la sufren de manera endémica. Así pues, urge disponer de una vacuna que ayude PALABRAS CLAVE: Calicivirus RHDV, VLPs a controlar esta enfermedad. quiméricas, epítopos B neutralizantes En la última edición del congreso de la SEV, presentamos los resultados obtenidos tras la CO/108 inmunización con un plásmido (pCMV-UbsHA- Nuevos avances en el desarrollo PQ), codificando tres antígenos virales (de los de vacunas ADN frente al virus más de 150), fusionados a ubiquitina, con el de la peste porcina africana objetivo de potenciar la presentación antigéni- ca en Clase I y la respuesta T-CD8+ inducida. Lacasta A. (1), Ballester M. (1), Argilaguet Desde entonces, hemos podido demostrar que J.M. (1), Mora M. (1), Monteagudo P.L. (1), la protección conferida por pCMV-UbsHAPQ Reche P. (2), Rodríguez J.M. (3), Salas correlacionaba totalmente con la inducción de M.L. (3), Accensi F.* (4), Rodríguez F. (1) una respuesta T-CD8+ específica, en ausencia Centre de Recerca en Sanitat Animal de anticuerpos. A partir de PBMCs de los su- (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat pervivientes, se pudieron identificar 2 epítopos Autonoma de Barcelona, 08193 Bellaterra, T-CD8+ inmunodominantes (9aa) contenidos Barcelona, Spain (1), Departamento de en la hemaglutinina viral, con un claro poten- Microbiología I, Universidad Complutense cial protectivo. Para identificar nuevas dianas de Madrid, 28040 MADRID, Spain (2), vacunales, se ha generado una librería genó- Centro de Biología Molecular Severo Ochoa mica del VPPA codificando pequeños fragmen- (CBMSO), Madrid (3), Centre de Recerca tos al azar del mismo, fusionados a ubiquitina. en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Experimentos de inmunización con los más de Campus de la Universitat Autonoma de 4000 clones de que consta nuestra genoteca Barcelona, 08193 Bellaterra, Barcelona, (600μg en total, conteniendo <0,3μg de cada Spain . Departament de Sanitat i Anatomia plásmido individual), demostraron su potencial Animals, Universitat Autònoma de Barcelona, protectivo. El 60% de los animales vacunados 08193 Bellaterra, Barcelona, Spain (4) (3 de cada 5 cerdos en dos experimentos inde-

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pendientes), sobrevivieron al desafío infección La gripe estacional causa cada año enormes letal con VPPA, en ausencia de anticuerpos pérdidas económicas en el mundo. Este hecho, y observándose una proliferación masiva de junto con la aparición de nuevos virus influen- células T-CD8+ en los supervivientes. Hasta za de alta patogenicidad y transmisibilidad, ha ahora, se han podido identificar 7 clones indi- despertado un creciente interés en el desarrollo viduales en la zona central del genoma, que, de nuevas estrategias vacunales que permitan utilizados en experimentos de co-inmunización mejorar las actualmente en uso. Uno de los junto con pCMV-UbsHAPQ (dosis de 600μg en mayores inconvenientes de las vacunas actua- total, conteniendo 75μg de cada uno de los 8 les frente a influenza es el estrecho rango de plásmidos contenidos en la vacuna), incremen- protección que confieren, siendo eficaces úni- taron la supervivencia de los animales hasta un camente frente a virus relacionados con la cepa 50% (en comparación con el 33% de protección vacunal; factor limitante para un virus con tanta obtenido con pCMV-UbsHAPQ). capacidad de variabilidad. En nuestro grupo, hemos pretendido abordar este problema dise- Nuestros resultados demuestran que la inmuni- ñando una vacuna formada por péptidos de la zación con ADN puede resultar una herramienta hemaglutinina del virus que teóricamente cum- ideal tanto para caracterizar nuevos antígenos plieran los siguientes requisitos: ser altamente con potencial vacunal, como para identificar los conservados dentro de cada una de las cepas mecanismos implicados en protección. Sin des- objeto del estudio (H1 y H5 en nuestro caso), deñar la relevancia que los anticuerpos neutra- altamente inmunogénicos y topológicamente próximos al sitio de unión del virus con la cé- lizantes pueden tener, una vacuna del futuro lula, como para que los anticuerpos generados frente al VPPA debería ser capaz de inducir in vivo tras la inmunización fueran capaces de una potente respuesta celular, incluyendo una bloquear la misma. Mediante una predicción respuesta T-citotóxica. computacional se sintetizó un péptido para la H1 y 3 péptidos para la H5 (de 34-35 aminoáci- PALABRAS CLAVE: Peste Porcina Africana, dos de longitud) que cumplían estos requisitos vacuna DNA, respuesta inmune teóricos, para a continuación utilizarlos in vivo en experimentos de inmunización en cerdos. CO/109 La vacunación de cerdos convencionales con tres dosis de una mezcla de péptidos provocó, Reconocimiento del virus de la no sólo una elevada respuesta de anticuer- influenza H1N1 tras la inmunización pos específica detectada por ELISA, sino que en cerdo con péptidos sintéticos además indujo una potente respuesta inmune celular. Tras la infección intranasal con el virus Vergara-Alert J* (1), Ballester M (1), pH1N1, A/Catalonia/63/2009, y a pesar de que Argilaguet J.M (2), Busquets N (1), Rivas R los anticuerpos inducidos mostraron una débil (1), Veljkovic V (3), Rodríguez F (1), Darji A (1) capacidad para inhibir la hemaglutinación y Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), para neutralizar el virus, el 50% de los cerdos UAB-IRTA, Bellaterra, Barcelona, Spain (1), vacunados (2 de 4) mostraron una reducción Departament de Ciències Experimentals del virus en lavado broncoalveolar, detectable i de la Salut (CEXS), Universitat Pompeu a día 6 post-infección. Con el objetivo de de- Fabra (UPF), Barcelona, Spain (2), Center mostrar la respuesta específica frente al virus pH1N1 por parte de los animales vacunados, for Multidisciplinary Research, Institute of se puso a punto una técnica específica de in- Nuclear Sciences VINCA, Belgrade, Serbia (3)

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munofluorescencia. Los resultados obtenidos confirman que la vacuna es capaz de producir anticuerpos que reconocen al virus pH1N1, complementando así, los resultados obtenidos anteriormente por ELISA. El hecho de que, tan- to las células T como los anticuerpos inducidos por la vacuna fueran capaces de reconocer al virus pH1N1 aislado de un paciente en el Hos- pital Clínic de Barcelona, con una secuencia di- vergente en 3 aminoácidos en lo que se refiere al péptido H1 utilizado para la vacunación, abre nuevas expectativas de futuro en cuanto al desarrollo de vacunas capaces de proteger frente a más de un virus diferente. PALABRAS CLAVE: virus influenza, péptidos sintéticos, inmunofluorescencia

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Virus en terapia y cáncer

Moderadores: Dr. Rafael Fernández Dr. Francisco Martín

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CO/110 transducción de la señal inductora de muerte celular por apoptosis. Se infectaron células tu- Modificación de la capacidad morales en cultivo con rNDV-B1/FAS. Nuestro apoptótica del virus de la enfermedad resultados indican que la sobreexpresión de de Newcastle y caracterización fas, durante la replicación del virus en la célula del recombinante rNDV-B1/ FAS hospedadora y la consiguiente sobreproducción del receptor humano FAS, altera el programa Cuadrado-Castaño S*, Villar E natural de inducción de la apoptosis inducida Departamento de Bioquímica y por la cepa B1. El estudio de esta modificación Biología Molecular, Universidad de los patrones apoptóticos y los efectos del de Salamanca, Salamanca (1) rNDV-B1/FAS sobre distintas líneas tumorales humanas, serán necesarios para valorar el El Virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV) posible potencial de este recombinante como perteneciente a la familia Paramyxoviridae, po- agente oncolítico. Proyecto financiado por el see una única copia de RNA monocatenario de FIS (PI08/1813) a E.V., cofinanciado por los polaridad negativa, rodeada de una membrana fondos FEDER de la EU. S.C.C. es PIF contra- externa en la que están insertas las proteínas tado de la Universidad de Salamanca, financia- de reconocimiento del receptor (HN) y de fusión do por La Junta de Castilla y León. de membranas (F). Se sabe que el NDV induce la muerte de células tumorales (y no de las PALABRAS CLAVE: NDV, Apoptosis, normales) mediante la inducción de la “vía in- Oncolisis trínseca” de la apoptosis. No obstante, los mecanismos moleculares de su citotoxicidad, de CO/111 la susceptibilidad celular a la replicación oncolí- tica del NDV y de las rutas de señalización im- Análisis del ciclo vital del parvovirus plicadas, son aún poco comprendidos. Desde diminuto del ratón (MVM) en células hace tiempo se sabe que el uso del NDV como de glioblastomas humanos agente oncolítico con cepas que están circulando en la naturaleza, ofrece una efectividad muy Gil-Ranedo J*, Moreno O, limitada. Debido a ello se ha propuesto la ne- Izquierdo M, Almendral J.M. cesidad de utilizar cepas modificadas mediante Centro de Biología Molecular Severo ingeniería genética. La aplicación de técnicas Ochoa (CSIC-UAM), Departamento de genética inversa para virus RNA-, nos ha de Biología Molecular, Universidad permitido insertar genes foráneos en el geno- Autónoma de Madrid (UAM) (1) ma del NDV de la cepa lentogénica Hitchner-B1 y, posteriormente, rescatar virus recombiantes Hemos investigado las etapas del ciclo vital con capacidad infectiva que expresan las co- de dos cepas del parvovirus diminuto del ra- rrespondientes proteínas foráneas durante su tón (MVMi y MVMp) en líneas establecidas de ciclo de in fección. Uno de estos recombinantes glioblastoma humano (U87 y U373) para fun- que hemos desarrollado es rNDV-B1/FAS, en damentar, desde los parámetros moleculares cuyo genoma se ha insertado una copia de la que rigen esta interacción virus-hospedador, su ORF del gen humano fas. El receptor FAS, per- posible aplicación oncolítica futura. Se encon- teneciente a la familia de los TNFR´s (Tumor traron los siguientes mecanismos implicados Necrosis Factor Receptor ), es un componente en estas interacciones: (I) Síntesis del genoma. clave de la denominada “vía extrínseca” en la En U87, aunque la cepa MVMi produjo niveles

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elevados de mensajeros y de proteínas no-es- Molecular, Centro Nacional de tructurales (NS1) y estructurales (VP1, VP2), el Investigaciones Oncológicas, Madrid (2) virus fue incapaz de replicar su ADN a niveles detectables, por lo que no se observó madura- PTEN es un supresor de tumores que se en- ción de partículas infecciosas; (ii) Modificación cuentra frecuentemente alterado en cáncer. postraduccional. Durante la maduración de la Esta fosfatasa es una proteína multifuncional cápsida, las subunidades (VP) se ensamblan que está implicada en el control de la prolifera- en trímeros que se fosforilan por la kinasa Raf-1 ción celular, el control de la estabilidad cromo- de la ruta MAPK. Esta fosforilación es esencial sómica, la migración celular, la autorenovación para la translocación nuclear de los trímeros. de las células madres y la senescencia celu- Los niveles de actividad de Raf-1 en gliomas lar. Se ha observado que muchas proteínas U373 y U87 fue consistente con el grado de importantes para el control de la proliferación fosforilación de las VPs y con la acumulación celular son también claves en la modulación de nuclear de las cápsidas; (iii) Salida de la célula. la replicación viral. Además, se ha demostrado En U373 la cepa MVMi expresa sus proteínas que algunas proteínas supresoras de tumores y replica el genoma, pero el virus se propaga son reguladas por el sistema del interferón, deficientemente en los cultivos debido a un pro- uno de los principales mecanismos de defensa blema en la salida al medio desde las células contra las infecciones virales. Para analizar el infectadas. Esta restricción pudo ser superada papel de PTEN en la replicación viral, emplea- por el gen NS de la cepa MVMp, y parece im- mos fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) plicar la interacción NS2/CRM1, que facilita la aislados de ratones heterocigotos para PTEN salida del virus a través del poro nuclear. Es- (PTEN+/-), salvajes (PTEN WT) y con una cotos resultados ilustran la estrecha dependencia pia extra de PTEN (Super PTEN, PTEN SP). del ciclo vital del MVM con la transformación Tras la infección de estas células con distin- celular que opera en los glioblastomas. La retos virus, observamos que la replicación de gulación por factores celulares implicados en los mismos se veía afectada negativamente cáncer, como Raf-1, apoya nuestrso esfuerzos de menera dependiente a las dosis de PTEN en caracterizar el potencial oncolítico de estos presente en las células. Además, el análisis de virus. los MEFs reveló que la infección viral inducía la modificación post-traduccional del supresor de PALABRAS CLAVE: Parvovirus, Viroterapia tumores que iba acompañada de una translo- oncolítica, Glioma cación de la proteína a los cuerpos nucleares de PML (PML-NBs). En este trabajo se muestra cómo se regulan ambos procesos y cómo una CO/112 alteración de los mismos puede afectar a la re- Actividad antiviral de la proteína plicación viral. supresora de tumores PTEN PALABRAS CLAVE: Actividad antiviral, González Santamaría J* (1), Ortega A (2), Supresores de tumores, PTEN Campagna M (1), Marcos-Villar L (1), González (1) (1) (2) (1) D , Gallego P , Serrano M , Rivas C CO/113 Departamento de Biología Molecular y Celular, Centro Nacional de Biotecnología, Efecto de la acetilación de p53 CSIC, Madrid (1), Programa de Oncología en la respuesta antiviral

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González D.* (1), Muñoz-Fontela C. (2), de p53 como la inducción de apoptosis en res- Marcos-Villar L. (1), González-Santamaría puesta a la infección viral. Nuestros resultados J. (1), Campagna M. (1), Gallego P. indican que la acetilación de 53 es necesaria (1), Aaronson S. (2), Rivas C. (1) para que la proteína ejerza su actividad anti- Dep. de Biología Molecular y Celular, Centro viral. Nacional de Biotecnología (CSIC), Madrid PALABRAS CLAVE: p53, acetilación, virus (1), Dep. of Oncological Sciences, Mount Sinai School of Medicine, , New York. (2) CO/114 El supresor de tumores p53 se conoce como ‘el guardián del genoma’ debido a su capacidad Modelo in vivo de análisis de neoplasia de prevenir la transformación celular a través cervical humana basado en la de la inducción del arresto del ciclo celular y la expresión del oncogén E7 del virus del apoptosis. Estudios recientes indican que p53 papiloma humano tipo 16 (VPH 16) es, además, una diana transcripcional del inter- (1) (1) ferón de tipo I (IFN) y se activa en respuesta Buitrago Pérez A , Dueñas M , Lloveras B (2) (3) (4) (4) a la infección viral. De esta forma, p53 contri- , Holguín A , Duarte B , Larcher F , del (3) (1) (1) buye a la apoptosis inducida por determinados Rio M , Paramio JM , García Escudero R* agentes virales, reduciendo la capacidad repli- Unidad de Oncología Molecular, División de cativa de los mismos. Además p53 contribuye Biomedicina Epitelial, CIEMAT, Madrid, España a la acción antiviral a través de la activación (1), IDIBELL, Instituto Catalán de Oncología, transcripcional de genes inducidos por el inter- L´Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Hospital ferón como IRF9, IRF5, ISG15 y TLR3. El papel del Mar, Barcelona, España (2), Unidad de p53 en el control de la infección por virus de Medicina Regenerativa, División de depende al menos en cierta medida de su ca- Biomedicina Epitelial, CIEMAT, Madrid, España pacidad de activar la apoptosis a través de la (3), Unidad de Modelización de Enfermedades transactivación de genes tales como PUMA y Cutáneas, División de Biomedicina Noxa y para ello es necesaria la fosforilación de Epitelial, CIEMAT, Madrid, España (4) p53. Otras modificaciones post-traduccionales de p53 tales como la sumoilación o acetilación El virus del papiloma humano (VPH) es el agen- parecen, además, contribuir a la activación de te causal de cáncer de cérvix humano y está p53 en respuesta a ciertos estímulos pero el asociado con carcinoma escamoso cutáneo. papel que la acetilación de p53 ejerce sobre la La oncogénesis viral es debida a las activida- actividad antiviral de este supresor aún no se des moleculares de algunos genes tempranos ha esclarecido. como el oncogén E7, capaz de inactivar la familia de proteínas del retinoblastoma. Aunque Nuestros resultados muestran que la infección la vacuna profiláctica que existe previene la viral induce la acetilación de p53 y por ello, en aparición de nuevas infecciones de los tipos de este trabajo nos hemos centrado en estudiar el VPH más frecuentes (como VPH 16 y 18), exis- papel de dicha modificación post-traduccional te la necesidad de desarrollar nuevas terapias en la actividad antiviral de p53. Para abordarlo dirigidas y nuevos modelos de análisis de las se han utilizado líneas celulares que no expre- mismas. Con este objetivo, hemos desarrollado san p53, que expresan establemente p53 sal- un modelo in vivo de análisis de VPH basado vaje o que expresan una forma mutada de p53 en la expresión del oncogén E7 en queratinoci- incapaz de ser acetilado, y hemos analizado tos primarios humanos y reconstitución de piel tanto la activación de dianas transcripcionales que es injertada en ratones inmunodeprimidos.

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La expresión de E7 en los trasplantes de piel que posee actividad antitumoral per se, tanto se mantiene durante el período analizado de 3 por sus propiedades citostáticas como por su a 6 meses, permitiendo la aparición de lesio- capacidad para potenciar la respuesta inmune nes que se asemejan histopatológicamente a frente al tumor. Para este trabajo, generamos neoplasia cervical intraepitelial (NIC) humana, un vector de SFV que expresaba interferón- especialmente en el caso del oncogén del VPH alfa murino (SFV-IFN). A pesar de la actividad 16. Además, se analizó la expresión de cono- antiviral inherente al IFN-alfa, el vector SFV- cidos biomarcadores de la enfermedad huma- IFN pudo producirse a altos títulos en células na mediante inmunodetección (MCM7 y p16) y BHK-21. SFV-IFN fue capaz de infectar células PCR cuantitativa de genes y ARN micro, que TC-1, una línea tumoral de ratón que expresa confirmó que los trasplantes comparten las ca- las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma racterísticas moleculares de lesiones premalig- humano, produciendo altas cantidades de IFN- nas y malignas asociadas a VPH de alto riesgo. alfa, tanto in vitro como in vivo. La inyección En conclusión, describimos un modelo in vivo intratumoral de SFV-IFN en tumores TC-1 sub- que puede ser usado para análisis básico o cutáneos fue capaz de inducir una respuesta preclínico de terapias antitumorales asociadas citotóxica específica frente al antígeno E7, que al VPH. fue acompañada de una alteración en el núme- ro de células inmunosupresoras presentes en PALABRAS CLAVE: virus del papiloma el tumor. Como consecuencia directa de estos humano, oncogén E7 efectos, el tratamiento con SFV-IFN produjo la eliminación de un 58% de tumores TC-1 cuan- CO/115 do se trataron tras 21 días de su implantación. Los ratones tratados con este vector mostraron Un vector del virus del Bosque una elevada supervivencia con muy baja toxi- de Semliki (SFV) que expresa cidad. Los datos presentados en este trabajo interferón-alfa induce potentes sugieren que SFV-IFN podría representar una respuestas antitumorales en un nueva y potente herramienta para tratar tumo- modelo murino de cáncer cervical res establecidos en pacientes. Quetglas JI, Fioravanti J, Ardaiz N, PALABRAS CLAVE: Alfavirus, terapia génica, Medina-Echeverz J, Baraibar J, Prieto carcinoma cervical J, Berraondo P, Smerdou C* División de Terapia Génica y Hepatología, CO/116 Facultad de Medicina, Centro para la Investigación Médica Aplicada (CIMA), La coadministración de vectores del Universidad de Navarra, Avenida de virus del Bosque de Semliki (SFV) Pío XII 55, 31008 Pamplona. (1) que expresan interleuquina-12 con SFV silvestre (SFVwt) aumenta el Los vectores basados en el virus del Bosque efecto antitumoral en un modelo de de Semliki (SFV) representan una herramienta adenocarcinoma de colon murino prometedora para la terapia génica del cáncer. Esto es debido tanto a sus elevados niveles de Ruiz-Guillén M*, Bezunartea J, expresión de proteínas recombinantes como a Quetglas J.I., Prieto J, Smerdou C su capacidad de inducir apoptosis en las célu- División de Terapia Génica y Hepatología, las que infectan. El IFN-alfa es una molécula Facultad de Medicina, Centro de Investigación

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Médica Aplicada (CIMA), Universidad de aumento de la expresión de luciferasa en el tu- Navarra, Av. Pio XII 55, 31008 Pamplona. (1) mor en todos los casos, sugiriendo que SFVwt puede también movilizar vectores de SFV in Los vectores de SFV se basan en un RNA viral autorreplicativo que contiene la secuencia vivo. Finalmente se evaluó si la movilización de de la replicasa, y en el que las secuencias de SFV-IL-12 con SFVwt podría aumentar el efec- los genes estructurales han sido sustituidas to antitumoral del vector en tumores subcutá- por un gen heterólogo. Para empaquetar estos neos MC38. Los tumores fueron tratados con vectores se cotransfectan células con el RNA 2x10e7pv de SFV-IL-12 sólo o en combinación vector junto con RNAs helper que aportan las con 10e5pv de SFVwt. El grupo de ratones tra- proteínas estructurales del virus en trans. Las tados con la terapia combinada mostró un 60% partículas virales obtenidas de esta forma sólo (n=25) de remisiones tumorales completas empaquetan el RNA vector, por lo que son ca- mientras que en el grupo tratado sólo con SFV- paces de infectar células pero no se propagan IL-12 se observó un 33% (n=24) de remisiones ya que carecen de los genes que aportan las proteínas estructurales. completas. Esta mejora significativa del efecto antitumoral obtenida con la combinación puede En trabajos previos demostramos que un vector ser debida a una mayor expresión de IL-12, así de SFV que expresa la interleuquina-12 (SFV- como a la inducción de apoptosis en un mayor IL-12), tenía un potente efecto antitumoral en número de células tumorales. Esta estrategia diferentes modelos de tumores implantados en puede constituir una nueva aproximación para roedores. Sin embargo, la capacidad antitumoral de dicho vector en tumores espontáneos de mejorar el efecto antitumoral de vectores de mayor tamaño fue más limitada, lo que puede SFV. ser debido a que la expresión de IL-12 se pro- PALABRAS CLAVE: Alfavirus, Terapia duce de forma transitoria y sólo en las células Génica, Cáncer infectadas inicialmente. Pensamos que el efec- to antitumoral de los vectores de SFV podría mejorarse si el vector se propagase en el tumor. Una estrategia sencilla para movilizar vectores de SFV es la coinfección de células con dichos vectores y virus SFVwt, que aportaría en trans las proteínas estructurales virales. Para probar esta hipótesis en primer lugar se estudió la movilización de vectores in vitro, mediante la coinfección de células BHK con SFV-LacZ y SFVwt a diferentes MOIs. En todos los casos se produjeron partículas virales (pv) de SFV-LacZ eficientemente, alcanzando títulos de 10e8pv/ ml. A continuación se evaluó la capacidad de movilización de vectores de SFV in vivo, en tumores de adenocarcinoma de colon murino MC38 implantados subcutáneamente en ratones singénicos. La coadministración de 10e8pv de un vector que expresa luciferasa (SFV-Luc) con diferentes dosis de SFVwt resultó en un

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Morfogénesis y estructura del virión

Moderadores: Dra. Nuria Verdaguer Dr. Mauricio García Mateu

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CO/117 We established the mechanism that allows VP60 to switch among quasi-equivalent confor- Structural polymorphism of a T=3 capsid protein is increased by insertion mational states. In contrast to results with other of epitopes at the molecular switch caliciviruses, the VP60 molecular switch that controls its structural polymorphism (to acqui- and leads to larger T=4 capsids re the three conformations required for a T=3 Castón J.R.* (1), Luque D. (1), González capsid) is contained in the NTA region, which J.M. (1), Gómez-Blanco J. (1), Chichón J. faces the inner surface of the capsid shell. (1), Mena I. (2), Angulo I. (2), Bárcena J. (2) Mutants lacking the first 29 N-terminal amino Department of Structure of Macromolecules, acid residues lost the ability to acquire different Centro Nacional de Biotecnología/CSIC, conformations and assemble mostly into a T=1 Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain (1), capsid (Virology 322:118, 2004). Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Valdeolmos, 28130 Madrid (2) RHDV VLP structure has been solved to 7.0 Å resolution by three-dimensional cryo-electron Rabbit Hemorrhagic Disease virus (RHDV) is microscopy. These studies allowed definition the causative agent of a highly infectious disea- of the backbone structure of VP60 protein fo- se of domestic and wild rabbits. RHDV is the llowing flexible docking analysis of homologous prototype strain of the genus Lagovirus within models. Our quasi-atomic model was valida- the family Caliciviridae, a group of nonenvelo- ted by insertion of foreign epitopes at theN- or ped, icosahedral viruses. Because a cell cultu- C-terminal regions, as well as in predictable re able to support authentic RHDV has not been internal loops facing the outermost surface of found, much of our understanding of these vi- protruding domain. These structural studies ruses, including their structure, has depended constituted the framework for use of RHDV on self-assembled recombinant RHDV empty capsids as a delivery system for B and T cell VLP. epitopes. The hypervariable region (5’HVR) of

FCV capsid protein (5’HVRFCV), which localizes Caliciviruses are composed of 180 copies of a at the outermost tip on its protruding domain, single capsid protein (CP). Atomic resolution contains a neutralizing epitope. The inserted structures of VLP of Norwalk virus (Science 5’HVRFCV epitope has the sequence GSGN- 286: 287, 1999), and native San Miguel sea lion DITTANQYDAADIIRN. Double insertion of this virus (SMSV) (PNAS 103: 8048, 2006) and fe- epitope at the VP60 N-terminal end leads to line calicivirus (FCV) virions (J. Virol. 84: 5550, larger T=4 capsids, increasing the capacity for 2010) indicate that the virion consists of 90 di- structural polymorphism of a CP. Previous ma- mers of the CP arranged with a T=3 symmetry. nipulations to decipher the molecular basis of Each monomer contains three structural do- the inherent structural polymorphism of a capsid mains—an N-terminal arm (NTA), the shell (S), protein always led to loss of structural plasticity, and a protruding domain (P). The P domain is and we are exploring this unprecedented disco- highly flexible (J. Viro.l 84: 5836, 2010), which very at finer structural and molecular levels. facilitates virus-host receptor interactions at the PALABRAS CLAVE: structural polymorphism, outermost surface (J. Virol. 82: 8051, 2008). capsid protein, RHDV

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CO/118 ilustra la dificultad de manipular genéticamente la cápsida de parvovirus, pero tambien permite Inserción de péptidos heterólogos definir las etapas que estos virus siguen para en la cápsida del Parvovirus madurar o para alcanzar el núcleo al comienzo diminuto del ratón (MVM): efectos de la infección. sobre ensamblaje y ciclo viral PALABRAS CLAVE: Ensamblaje, Estructura, Capsida Almendral del Rio JM*, Sánchez-Martínez C, Grueso E, Blanco N, Fernandez M, Elizalde M, de Miguel F, Sanchez J, Kourani O, Villarejo A CO/119 Centro de Biología Molecular (1) Análisis estructural de un intermediario Severo Ochoa (CSIC-UAM) de desencapsidación del virus del Las dos proteínas estructurales (VP1, VP2) del resfriado (human rhinovirus 2) parvovirus diminuto del ratón (MVM), se en- Garriga D.* (1), Pickl-Hertz A. (2), Luque D. (3), samblan en el núcleo para formar una cápsida Castón J.R. (3), Blaas D. (2), Verdaguer N. (4) icosaédrica (T=1) de alta estabilidad. Es sabido Departamento de Biología Molecular y que esta cápsida no tolera fácilmente manipu- Celular, Centro Nacional de Biotecnología laciones genéticas, debido a su elevado grado (CNB-CSIC), Madrid (1), Institute of Medical de ordenamiento estructural, a excepción del Biochemistry, University of Vienna, Vienna extremo n-terminal de VP2 (denominado 2Nt), Biocenter (VBC), Viena (2), Departamento un dominio desordenado que es procesado en de Estructura de Macromoléculas, Centro el endosoma durante la entrada de la partícula. Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Hemos insertados péptidos heterólogos, que Madrid (3), Institut de Biologia Molecular mimetizan dominios del factor VEGF, en el 2Nt de Barcelona (IBMB-CSIC), Parc y en la espícula (eje 3x) de la cápsida de un ge- Científic de Barcelona, Barcelona (4) noma infeccioso del MVM, para investigar funciones de la cápsida en el ciclo viral, así como Para poder llevar a cabo la infección de la cé- las posibilidades de manipular el tropismo de lula huésped, los picornavirus como el HRV2 este virus. La inserción del péptido denominado (human rhinovirus, serotipo 2) necesitan que el V1 (de 6 mer) en el 2Nt permitió un correcto genoma viral salga de la cápside y se libere en ensamblaje de la cápsida en el núcleo y la for- el citoplasma celular. mación de viriones con genoma viral empaque- tado. Sin embargo, estos viriones quiméricos En trabajos anteriores se ha descrito que la fueron incapaces de re-iniciar la infección, pro- desencapsidación del ARN de este virus tiene bablemente porque el procesamiento endoso- lugar en el endosoma y que requiere de unos mal de VP2 es inhibido por V1. Por el contrario, cambios conformacionales en la cápside viral la espícula (3x) parece ser menos tolerante a la que son completamente dependientes de la ba- inserción de péptidos, ya que generalmente no jada del pH (hasta alrededor de 5.5). se observa formación de cápsidas en cantidades significativas. Estamos actualmente esca- Estos cambios conformacionales dan lugar a lando la producción de viriones quiméricos ma- unas formas vacías de la cápside viral, que ya nipulados en la espícula, para intentar obtener no contienen el ARN viral y que sedimentan a cantidades suficientes que permitan analizar 80S (en lugar de los 160S de la cápside nati- sus propiedades biológicas. Esta investigación va).

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En este estudio hemos podido determinar, me- Castellanos, M.* (1), Pérez, R. (1), Carrasco, diante cristalografía de rayos X, la estructura C. (2), Hernando, M. (2), Gómez-Herrero, (2) (2) (1) tridimensional de estas cápsides 80S a 3.0Å de J. , de Pablo, P.J. , Mateu, M.G. resolución. Esta es la primera vez que se obtie- Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, ne la estructura a resolución atómica de un in- (CSIC-UAM), Madrid (1), Departamento termediario de desensamblaje de un rhinovirus, de Física de la Materia Condensada, lo que nos permite estudiar los cambios que se Universidad Autónoma de Madrid, Madrid. (2) dan en la cápside cuando pierde el ARN. *MC y RP contribuyeron por igual a este tra- Comparando la estructura de la cápside vacía bajo. con la de la cápside nativa se observa que, Hemos investigado una posible relación entre en términos generales, durante el proceso de propiedades mecánicas de un virus y su fun- desencapsidación del HRV2 la cápside se ha cionamiento biológico, utilizando el virus dimi- expandido (tiene unos 10Å más de diámetro) y, nuto del ratón (MVM) como modelo. Nuestros en consecuencia, tiene menor grosor. También resultados previos utilizando diversas técnicas, se observan cambios considerables en los ejes incluyendo microscopía de fuerzas atómicas quinarios, donde el canal existente se ensan- (AFM), demostraron que la presencia de inte- cha por uno de sus extremos, y en los ejes bi- racciones no covalentes entre la cápsida de narios, donde aparecen unos agujeros de unos MVM y el DNA vírico contenido en su interior 13Å de ancho que podrían tener implicaciones refuerza térmica y mecánicamente el virión directas en la salida del ARN viral. (Reguera et al (2005) JBC 280,17969; Carras- co et al (2006) PNAS 103, 13706; Carrasco Un análisis detallado de la estructura de la cáp- et al (2008) PNAS 105, 4150). Estas interac- side vacía revela que los movimientos de los ciones aumentan la rigidez mecánica global a protómeros que dan lugar a esta nueva disposi- través del reforzamiento de diversas regiones ción son fruto de un movimiento que sufren las del virión, pero no cerca de los poros presen- subunitades de VP1, consecuencia, a su vez, tes en la cápsida. En otro estudio demostramos de un colapso de la cavidad del bolsillo (pocket) que residuos de la cápsida situados en la base de dentro el barril ß. Este colapso en VP1 está de estos poros son necesarios para permitir un ligado a la liberación del ácido graso que ocupa cambio conformacional asociado con la traslo- este espacio en la cápside nativa (el pocket fac- cación de segmentos peptídicos a través de los tor), cosa que explicaría el efecto antirhinoviral poros, y necesario para que el virión sea infec- de los compuestos que se unen a este bolsillo. cioso (Reguera et al (2004), PNAS 101, 2724). En base a los resultados mencionados, formu- PALABRAS CLAVE: Rhinovirus, Cápside, lamos la hipótesis de que los residuos situados Desencapsidación en la base de los poros de la cápsida de MVM son necesarios para conferir una suficiente flexibilidad mecánica local que permita los cam- CO/120 bios conformacionales detectados, y por tanto la infectividad del virus. Esta hipótesis predice La inhibición de cambios que mutaciones de los residuos situados en la conformacionales necesarios para base de los poros, pero no de otros residuos de la infectividad de un virión está la cápsida, no sólo impedirán el cambio confor- asociada con la disminución de la macional y la infección, sino que también harán elasticidad local de la cápsida la cápsida mecánicamente más rígida, al me-

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nos en la región de los poros. En el presente Biología Molecular, Instituto de Parasitología y estudio hemos demostrado experimentalmente Biomedicina López-Neyra, Armilla, Granada (4) esta hipótesis mediante AFM. En ninguna de las cápsidas con mutaciones situadas fuera de Una de las etapas más importantes en el ini- la base de los poros se observó un incremento cio del ciclo replicativo viral es la traducción de en la rigidez mecánica en la región de los po- su RNA genómico. En el caso del virus de la ros con respecto a la cápsida no mutada. Por Hepatitis C (HCV) y de otros miembros de las el contrario, en todas y cada una de las cápsi- familias Flaviviridae y Picornaviridae, el inicio das con mutaciones en la base de los poros se de la traducción está regulado por una región observó un incremento significativo en la rigi- altamente estructurada, localizada en el extre- dez mecánica de esa región. Estos resultados mo 5´ no codificante (5´UTR) de su RNA genó- apoyan fuertemente la hipótesis de que la base mico, denominado sitio de entrada interna del de los poros en la cápsida de MVM presenta ribosoma o internal ribosome entry site (IRES). una estructura lo suficientemente flexible desde La estructura del IRES de HCV es muy com- el punto de vista mecánico como para permitir pleja y su correcto plegamiento es indispensa- que ocurran cambios conformacionales locales ble para el comienzo de la traducción de las necesarios para la infectividad. En nuestro co- proteínas virales. Durante los últimos años se nocimiento, estos resultados aportan la primera ha estudiado la estructura del elemento IRES evidencia directa de una implicación biológica de HCV completo, o bien de algunos de sus de la elasticidad mecánica de un virus, y sugie- dominios por separado, empleando técnicas ren vías para la manipulación racional de la ri- como el análisis de covariación de secuencias, gidez/flexibilidad mecánica de partículas víricas la modificación química o enzimática seguida con fines nanobiotecnológicos. de transcripción reversa, la resonancia mag- nética nuclear (RMN), la difracción de rayos X PALABRAS CLAVE: elasticidad, propiedades o la microscopía electrónica. Recientemente, mecánicas, cambios conformacionales en nuestro laboratorio hemos puesto a punto una herramienta de análisis estructural de alta CO/121 resolución como es la Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para el estudio de la topología Visualización del elemento IRES del IRES de HCV en condiciones nativas. El mi- del virus de la Hepatitis C mediante croscopio de AFM es un instrumento mecánico- Microscopía de Fuerza Atómica óptico que consiste en una punta muy afilada acoplada a una micropalanca flexible, sobre García-Sacristán Ana* (1), López-Camacho cuya parte posterior incide un haz láser que se Elena (2), Moreno Miguel (3), Gómez Jordi (4), refleja hasta un fotodetector. La optimización Martín-Gago Jose Ángel (2), Briones Carlos (1) de la técnica de AFM nos ha permitido anali- Dpto. Evolución Molecular, Centro de zar la topografía de moléculas individuales de Astrobiología (INTA-CSIC), Torrejón de Ardoz, RNA en condiciones nativas adsorbidas sobre Madrid. Centro de Investigación Biomédica en una superficie plana, con una resolución verti- Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas cal de 0,5 nm y lateral de hasta 4 nm. Hemos (CIBERehd). (1), Dpto. Instrumentación. aplicado esta técnica para el estudio del plega- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC), miento del elemento IRES de HCV, analizando Torrejón de Ardoz, Madrid (2), Dpto. Evolución la longitud y grado de estructuración del IRES Molecular, Centro de Astrobiología (INTA- en presencia de concentraciones crecientes CSIC), Torrejón de Ardoz, Madrid (3), Dpto. de de ión magnesio. El estudio realizado aporta

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nuevos datos sobre la estructura tridimensional los mismos principios fundamentales se pue- que debe adoptar el IRES de HCV en el interior den extender a situaciones más complejas que de la célula para unirse al ribosoma y comenzar incluyan estos aspectos. la traducción independiente de cap. Los resultados obtenidos revelan la utilidad de la técnica Nuestro análisis permite evaluar el papel que de AFM para la visualización y análisis de la juegan la concentración de proteínas y su in- estructura de elementos funcionales presentes teracción en la formación de las cápsidas. En en RNAs genómicos virales. particular, veremos cómo estos dos parámetros PALABRAS CLAVE: Internal Ribosome Entry controlan las condiciones en las cuales el auto- Site (IRES), Microscopía de Fuerza Atómica ensamblaje es factible, determinando el tama- (AFM), estructura RNA genómico ño del núcleo crítico y el tiempo de formación de las estructuras. El modelo explica también CO/122 los rasgos más característicos de la cinética del auto-ensamblaje vírico in vitro, tales como Principios físicos del auto- la fuerte dependencia en la concentración, la ensamblaje de los virus existencia de un lapso de tiempo antes del ini- Luque Santolaria A.*, Reguera López D. cio de la formación de cápsidas, la cinética sig- Departamento de Física Fundamental, moidal o el fenómeno de histéresis. (1) Universidad de Barcelona, Barcelona Este estudio puede ser de gran utilidad, por Una etapa fundamental en la replicación de un ejemplo, para guiar la exploración de la concen- virus es la formación de su cápsida. Mayormen- tración de proteínas y el resto de condiciones te, las cápsidas víricas se auto-ensamblan me- que facilitan el auto-ensamblaje vírico en expe- diante un proceso espontáneo que no requiere rimentos in vitro. También establece un marco energía química en forma de ATP. Así, muchos donde interpretar los efectos termodinámicos virus se pueden reconstituir in vitro a partir de y cinéticos de los cambios en las condiciones sus componentes esenciales (proteínas del de ensamblaje observadas in vivo. Además, la cápside y material genético), y, en condiciones comprensión de los mecanismos físicos que re- adecuadas, es posible formar la cápsida inclu- gulan la formación de los virus, puede constituir so en ausencia del material genético. Todo ello un primer paso para el desarrollo de estrategias sugiere que el auto-ensamblaje vírico es un antivirales de amplio espectro enfocadas a in- proceso termodinámico espontáneo que debe terferir con el proceso de auto-ensamblaje. obedecer principios físicos generales. Referencias: [1] R. Zandi, P. van der Schoot, D. Reguera, W. Kegel, and H. Reiss, ‘Classical En esta contribución, presentamos un estudio nucleation theory of virus capsids’, Biophys. J. teórico que caracteriza el auto-ensamblaje de 90, 1939-1948 (2006). [2] A. Luque, D. Regue- las cápsidas virales desde un punto de vista ra, A. Morozov, J. Rudnick, and R. Bruinsma, termodinámico y cinético. La investigación se ‘The assembly of spherical shells: Line energy, centra en el caso más sencillo de formación de implosion and closure catastrophe’ (preprint). cápsidas esféricas vacías in vitro, en ausencia de material genético y de agentes tipo chapero- PALABRAS CLAVE: cápsida, auto- nas o proteínas de ‘scaffolding’. Sin embargo, ensamblaje, cinética

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CO/123 preparaciones de virus purificado suficientes para estudios morfológicos por criomicrosco- Análisis morfológico de partículas pia electrónica (crioEM) en muestras vitrifica- infecciosas del virus de la hepatitis das. Dicho análisis ha revelado la existencia C por criomicroscopía electrónica de poblaciones de partículas pleomórficas y de tamaño heterogéneo. Las partículas fueron cla- (1) (2) Gastaminza P.* , Dryden K. , Boyd B. sificadas en distintas poblaciones en función de (3) (2) (4) (3) , Yeager M. , Wood M. , Chisari F. la presencia de una estructura semejante a una Biologia Celular y Molecular, CNB-CSIC bicapa lipídica. Las poblaciones predominantes Madrid (1), Physiology and Biological están constituidas por partículas de alrededor Physics, University of Virginia,. Charlotesville de 65 nm de diámetro con una posible envuelta (2), Immunology and Microbial Science, y partículas de 45 nm que carecen de dicha es- The Scripps Research Institute, La Jolla tructura. Las muestras analizadas fueron frac- (3), Core Microscopy Lab, The Scripps cionadas empleando gradientes isopícnicos de Research Institute, La Jolla (4) sacarosa con la intención de estudiar poblaciones de virus con diferentes densidades y, por Aproximadamente un 3% de la población mun- lo tanto, diferentes ratios infectividad:genoma. dial se encuentra crónicamente infectada por el Dicho analisis permitió observar que las partí- virus de la hepatitis C (HCV). Este virus circula culas de 65 nm rodeadas por una bicapa lipí- en la sangre de pacientes infectados en forma dica son predominantes en las fracciones con de partículas con una característica pero he- mayor infectividad especifica y con una den- terogénea baja densidad, entre 1.006 y 1.2g/ sidad alrededor de 1.1 g/ml, mientras que las ml. Estudios previos en chimpancés sugieren partículas desnudas de 45 nm prevalecen en que las partículas de menor densidad son mas fracciones donde la infectividad especifica es infecciosas que las de densidades más altas. menor en fracciones correspondientes a 1.13- En concreto, se estableció que las partículas 1.15 g/ml. Este estudio constituye una primera de alrededor de 1.1g/ml presentan un ratio aproximación al estudio estructural de partícu- infectividad:genoma óptima. Hemos verificado las infecciosas de HCV producidas en cultivo que las propiedades biofísicas de las partícu- celular. las producidas en cultivo celular conservan las propiedades biofísicas de las observadas en PALABRAS CLAVE: hepatitis C, crioEM, pacientes. Sin embargo, a pesar de poder pro- virion ducir virus en cultivo celular, los títulos virales son bajos (104 ffu/ml) siendo prácticamente im- posible realizar estudios bioquímicos y estructurales. Mediante pases seriados en células de hepatoma humano (Huh-7.5.1), hemos obtenido una variante de la cepa JFH-1 del virus de la hepatitis C que replica muy eficazmente en cultivo. Además, hemos aislado un clon celular hiperpermisivo a la infección derivado de Huh- 7.5.1 (Huh-7.5.1 clon 2 ). Infectando dicho clon con la variante de HCV adaptada hemos incrementado los títulos virales en dos ordenes de magnitud. Este proceso y un cuidadoso proceso de concentración y purificación permite obtener

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CP/124 RESULTADOS: Los factores predictivos de RVS fueron: edad≤40 años (P=0.016), ba- Estudio de la IL6 y la IL10 durante el jas concentraciones de IL6 basal (P=0.025) tratamiento combinado en pacientes y el polimorfismo CC de la IL28B (P=0.011). con Hepatitis Cronica C (HCC) Los factores independientes de RVS (re- genotipo 1 y su relacion con la IL28B y gresión logística) fueron: edad≤40 años la respuesta virológica sostenida (RVS) (ORa=3.7, IC95%=1.5-8.9, P=0.004), IL6 basal (ORa=0.527, IC95%=0.288-0.965, Pavón EJ* (1), Muñoz de Rueda P (2), López- P=0.038), GGT (ORa=0.990, IC95%=0.982- Nevot MA (3), Gila A (2), Casado J (1), León 0.999, P=0.028) y el polimorfismo CC de la J (2), Sanjuán L (1), Quintero D (2), Mundi JL IL28B (ORa=2.7, IC95%=1.0-7.2, P=0.044). (2), Ruiz-Extremera A (4), Salmerón J (2) En los 138 pacientes, la IL6 mostró cambios Unidad de Aparato Digestivo, Hospital transitorios durante el tratamiento volviendo a Universitario San Cecilio, Granada. Spain. los valores basales un mes finalizado el mis- (1) , Unidad de Aparato Digestivo, Hospital mo. Los valores de IL10 a la semana 52 fue- Universitario San Cecilio, Granada. Spain. ron inferiores a los basales. A la semana 12, CIBER de Enfermedades Hepáticas y (2) la IL10 aumentó (P=0.007) y la IL6 disminuyó Digestivas (CIBERehd). , Servicio de (P=0,004); al estratificar por respuesta, la IL6 Inmunología, Hospital Universitario Virgen (3) presentó una disminución 6 veces mayor en los de las Nieves, Granada. Spain , Unidad de no-RVS que en los RVS (P=0.042), mientras Pediatría, Hospital Universitario San Cecilio que no se observaron diferencias estadísticas Granada. Spain. CIBER de Enfermedades en la IL10. Además no se encontró relación Hepáticas y Digestivas (CIBERehd). (4) entre ambas citoquinas con los polimorfismos ANTECEDENTES: Las citoquinas juegan un de la IL28B en este periodo. Un mes después papel importante en la regulación de la respues- del tratamiento, la IL10 disminuyó más en los ta inmune, pero la función que desempeñan pacientes con RVS (P≤0.001), mientras que durante el tratamiento con Interferon Pegilado en los no-RVS apenas se apreció el cambio. y Rivabirina (IFNpeg/RBV) se desconoce. Los Cuando se estratificó por genotipo de la IL28B niveles inadecuados de producción de citoqui- (CC vs no-CC), la disminución de la IL10 fue nas pueden disminuir la RVS. Recientemente mayor en los CC que en los no-CC (P=0.046). ha sido demostrado que la RVS depende de los En los pacientes con RVS tanto CC como no- polimorfismos de la IL28B. CC observamos una disminución de la IL10 es- tadísticamente significativa (P=0.003, P≤0.001 MÉTODOS: Hemos estudiado los niveles de respectivamente). expresión en suero y los polimorfismos de IL6 e IL10, así como los polimorfismos de la IL28B CONCLUSIÓN: Tanto la IL6, la edad, la GGT y en 138 pacientes con HCC genotipo 1, tratados el polimorfismo CC de la IL28B son factores incon IFNpeg/RBV durante 48 semanas en las dependientes de respuesta en este estudio. El muestras: (1) Basales, (2) 3 meses después de tratamiento combinado produce un descenso iniciar el tratamiento (semana 12) y (3) un mes en la concentración de la IL10, especialmente después de finalizar el tratamiento (semana en los pacientes con RVS tanto del grupo CC 54). 77 pacientes (56%) presentaron una RVS como del no-CC. Por tanto, la IL10, la IL6 y el y 61(44%) no-RVS. El genotipo de la IL28B fue genotipo CC de la IL28 son factores importan- determinado en todos los casos excepto en 4 pacientes: 37(27%) CC y 97(70%) no-CC. tes para conocer la efectividad del tratamiento.

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PALABRAS CLAVE: Hepatitis crónica C, dos muestras de sangre consecutivas. Los ni- Citoquinas, Respuesta virológica sostenida ños infectados fueron clasificados como: (A) ni- ños con viremia transitoria con posterior VHC- RNA-vo y sin seroconversión; (B) niños con CP/125 infección permanente o crónica que mantuvie- Estudio del factor genético IL-28B en ron el VHC RNA- positivo de forma permanente la transmisión vertical del virus de la y con seroconversión. hepatitis C y en la evolución hacia la Resultados: De las 31 madres con polimorfis- cronicidad de los niños infectados mo CC de la IL28B, 19 madres (61%) fueron Ruiz-Extremera A* (1), Muñoz-Gámez JA (2), VHC-RNA+vo mientras que entre las 68 madres Quilez-Perez R (1), Salmerón-Ruiz MA (3), con polimorfismo no-CC, 56(82%) fueron VHC- Muñoz de Rueda P (1), Casado J (2), Carazo RNA+vo (OR=2,95; 95%CI: 1.1-7,7; P<0.026). A (2), Gila A (1), Martín A (2), Pavón EJ (2), León Los niños nacidos de madres VHC-RNA-vo y (1) (4) (1) J , Sanjuán-Nuñez L , Salmerón J anticuerpos VHC+vo no presentaron transmi- Hospital Universitario San Cecilio, CIBER sión vertical. 22 de los 128 (17%) niños nacidos de Enfermedades Hepáticas y Digestivas de madres VHC-RNA+vo adquirieron la infec- (1), Hospital Universitario San Cecilio, ción pero solo 8 (6%) fueron infectados crónica- Granada (2), Hospital Materno Infantil mente. La tasa de transmisión vertical fue más La Paz, Madrid (3), Departamento de elevada en los hijos de madres con alta carga Medicina, Universidad de Granada (4) viral (>600.000 UI/mL; OR=9; 95%CI: 1.1-88; Introducción: La transmisión vertical del virus P<0.05). El polimorfismo de la IL28B de las de la hepatitis C es la principal ruta de infección madres y de los niños no se asoció con un in- por VHC en niños, pero los factores de riesgo crementado riesgo de transmisión vertical. Sin involucrados en la transmisión vertical del VHC embargo, en el aclaramiento viral espontáneo permanecen sin determinar. del VHC en los niños verticalmente infectados, el genotipo CC de la IL28B del niño así como el Objetivos: Este estudio pretende analizar el genotipo viral no-1 se asociaron con el aclara- papel de la IL28B en la transmisión vertical del miento viral. La regresión logística multivariante VHC así como en el aclaramiento espontáneo mostró que la única variable asociada de forma del virus en niños verticalmente infectados. independiente con el aclaramiento espontáneo fue el polimorfismo CC de la IL28B en los niños Pacientes y Métodos: Entre 1991 y 2009, 133 infectados verticalmente con VHC genotipo 1 madres han sido incluidas en el estudio. De es- (OR=17;95%CI:1.2-250;P<0.05). Conclusio- tas, 100 madres fueron VHC-RNA+vo y tuvie- nes: la carga viral alta de la madre es el único ron 128 niños, y 33 madres fueron VHC-RNA- factor de riesgo asociado a transmisión vertical vo/VHC anticuerpos+vo, con 43 niños. Los del VHC. El polimorfismo de la IL28B no juega recién nacidos fueron seguidos al nacimiento y ningún papel en transmisión vertical, sin em- a los 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 y 24 meses y anual- bargo, el genotipo CC de la IL28B del niño está mente a los 3, 4, 5 y 6 años analizando el ARN- asociado independientemente con aclaramien- VHC y en los positivos se determinó el genoti- to espontáneo del VHC en niños infectados con po viral. IL28B (single nucleotide polymorphism genotipo 1. rs12979860) fue determinado en las madres y en sus hijos. Se asumió transmisión vertical PALABRAS CLAVE: VHC, IL28B, cuando los niños presentaron VHC-RNA+vo en Transmisión Vertical

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CP/126 an absorbing regime, suggests a smooth (i.e., second-order), absorbing-state phase transi- Studying viral RNA intracellular tion. Finally, we also provide the equilibria and accumulation under differential stability properties for a simpler model only in- replication modes A dynamical corporating the asymmetry in replication tied to systems approach differential replication modes. Sardanyés J.*, Martínez F., PALABRAS CLAVE: Complex Systems, Daròs J. A., Elena S. F. Nonlinear dynamics, RNA virus Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP), Consejo CP/127 Superior de Investigaciones Científicas (CSIC-UPV), València (1) Productive CD4-dependent HIV-1 fusion, entry and infection dynamically We study simple nonlinear mathematical mo- studied by total internal reflection dels describing the time dynamics of viral RNA fluorescence microscopy in living cells strands considering differential replication modes. The models allow us to study the dynamics Barroso-Gonzalez J.* (1), Garcia- of genomic and antigenomic strands for (+) Exposito L. (1), de Armas-Rillo L. (1), ssRNA viruses, considering different replication Puigdomènech I. (2), Machado J.D. (1), strategies ranging from purely geometric repli- Blanco J. (1), Valenzuela-Fernandez A. (1) cation (GR) to the so-called stamping machine Laboratorio de inmunología Celular y Viral, replication (SMR). In GR both (+)- and (-)-sen- Laboratorio de Neurosecreción, Unidad e se strands are used as templates for further re- Farmacología, Departamento de Medicina plication while for SMR one or few (-) strands Física y Farmacología, Facultad de Medicina, are replicated to produce the whole progeny of Instituto de Tecnologías Biomédicas (ITB), (+) strands. We first analyze a two-dimensio- Universidad de La Laguna (ULL), Campus de nal dynamical system of differential equations Ofra s/n, Tenerife 38071, Spain. (1), Fundació successfully used to quantitatively reproduce IrsiCaixa-HIVACAT, Institut de Recerca experimental results reporting the accumula- en Ciènces de la Salut Germans Trias i tion kinetics of RNA strands for Turnip mosaic Pujol(IGTP), Hospital Germans Trias i Pujol, potyvirus (TuMV). For such a model, we cha- Universitat Autònoma de Barcelona, Badalona racterize the equilibrium points of the system 08916, Barcelona, Catalonia, Spain. (2) also identifying a non-degenerate transcritical bifurcation involving the extinction of both (+) Total Internal Reflection Fluorescence Micros- and (-) strands depending on three key para- copy (TIRFM) can dynamically study, at the plasma membrane, the fate of internalization or meters: degradation rates (δ), replication rates (r) and the contribution of both mechanisms to export of different cargos or cell-surface mole- replication ( ). We show that the bifurcation as- cules. In this work, we aimed to apply the TIR- α FM technology to the study of HIV-1 fusion and sociated with α generically takes place when the replication mode gets closer to the SMR entry process, determining the function of Arf6- mode, thus suggesting that GR may involve mediated membrane dynamics on HIV-1 early an increase in viral stability and persistence in infection. TIRFM studies of the CD4-dependent dynamical terms. This transcritical bifurcation, HIV-1 uptake process were performed by using which involves the switching from an active to fluorescent HIV-1-Gag-EGFP viral particles in

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permissive TZMbl (CD4+/CXCR4+/CCR5+) Farmacología, Departamento de Medicina cells, transiently expressing the fluorescent Física y Farmacología, Facultad de Medicina, CD4-DsRed molecule together with one of the Instituto de Tecnologías Biomédicas (ITB), different Arf6-HA construct and the PH-ECFP Universidad de La Laguna (ULL), Campus de probe. We first observed that TZMbl cell over- Ofra s/n, Tenerife 38071, Spain (1), Fundació expressing the Arf6-Q67L and Arf6-T44N cons- irsiCaixa-HIVACAT, Institut de Recerca en tructs presented accumulation of PIP2-asso- Ciències de la Salut Germans Trias i Pujol ciated structures on plasma membrane where (IGTP), Hospital Germans Trias i Pujol, these mutants distributed. Indeed, we observed Universitat Autònoma de Barcelona, Badalona that wt-Arf6-, Arf6-Q67L- and Arf6-T44N-ECFP 08916, Barcelona, Catalonia, Spain. (2) constructs did not co-localize with cell-surface As the initial barrier to viral entry, the plasma CD4-DsRed, and that HIV-1 binding to CD4 membrane along with membrane trafficking did not promote co-distribution of virus-bound machinery and cytoskeleton are of fundamental or free CD4 with Arf6 constructs. Arf6 mutants importance in the viral cycle. However, little is did not affect the formation or the trafficking of known about the contribution of plasma mem- clathrin-coated structures (CCS). Our results brane dynamics during early HIV-1 infection. indicated that alteration of Arf6-mediated PIP2- Considering that Arf6 regulates cellular invasion membrane dynamics at regions of HIV-1/CD4 via several microorganisms by coordinating interaction, by over-expressing Arf6-Q67L-HA membrane trafficking, our aim was to study the or Arf6-T44-HA mutant or Arf6 knock-down, function of Arf6-mediated membrane dynamics prevented productive CD4-dependent HIV-1 on HIV-1 entry and infection of T lymphocytes. uptake and infection (BlaM-Vpr virions), without We observed that an alteration of the Arf6-GTP/ affecting the first HIV-1/CD4 interaction. There- GDP cycle, by GDP-bound or GTP-bound in- fore, we propose that TIRFM is a powerful and active mutants or by specific Arf6 silencing, in- appropriate technology to study early HIV-1 inhibited HIV-1-envelope-induced membrane fu- fection events, which require Arf6-coordinated sion, entry and infection of T lymphocytes and plasma membrane dynamics to promote viral permissive cells, regardless of viral tropism. fusion and entry, in a clathrin independent man- Furthermore, cell-to-cell HIV-1 transmission of ner. primary human CD4+ T lymphocytes was inhibited by Arf6 knock-down. Arf6 silencing or its PALABRAS CLAVE: TIRFM, HIV-1, mutants did not affect fusion, entry and infec- Membrane traffic tion of VSV-G pseudotyped viruses or ligand- induced CXCR4 or CCR5 endocytosis, both CP/128 clathrin-dependent processes. Finally, we use non-replicative, X4- or R5-tropic HIV-1 viral par- HIV-1 requires ARF6-mediated ticles containing BLaM-Vpr to study early viral membrane dynamics to efficiently fusion entry in Arf6 Knockdown CD4+ T lym- enter and infect T lymphocytes phocytes. Our results show that specific Arf6 silencing significantly inhibited viral fusion and García-Expósito L.* (1), Barroso-González entry, regardless of viral tropism, without affect J. (1), Puigdomènech I. (2), de Armas entry of VSV-G pseudotyped virus. Therefore, Rillo L. (1), Machado J.D. (1), Blanco we propose that efficient early HIV-1 infection of J. (1), Valenzuela-Fernández A. (1) CD4+ T lymphocytes requires Arf6-coordinated Laboratorio de Inmunología Celular y Viral, plasma membrane dynamics that promotes vi- Laboratorio de Neurosecreción, Unidad de ral fusion and entry.

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PALABRAS CLAVE: Arf6, HIV-1 das entre los años 2006-2007. Cuando se ana- lizó la conservación de estas 139 secuencias, se observó que el promedio de la conservación CP/129 descendió de una manera significativa entre las Evolución de la proteasa del secuencias aisladas entre 1993-94 (98%, nt; virus de la inmunodeficiencia 96.5%, aa) y las aisladas con posterioridad al humana tipo 1 (VIH-1) a lo año 2005 (96%, nt; 95%, aa) (p< 0.0001, nt; p< largo de 14 años: ¿Atenuación 0.0001, aa). En segundo lugar, analizamos la de su capacidad replicativa o CR de los virus de los tres grupos (1993-1994: incremento de su robustez? n=6; 2006-2007: n=6; Resistentes a IPs: n=8). Para ello, analizamos por un lado la CR de los Capel E.*, Martrus G., Parera M., diferentes virus salvajes respecto al virus an- Clotet B., Martínez M.A. cestral de subtipo B. Los virus de 1993-1994 Laboratorio de Retrovirología, mostraron tener una mejor CR que los de 2006- Fundació Irsicaixa, Hospital Germans 2007, y éstos a su vez mostraron una mejor CR Trias i Pujol, Badalona. (1) que los resistentes a IPs. Sin embargo, la di- La aparición de mutaciones de resistencia a ferencia observada no resultó ser significativa. inhibidores de la proteasa (IP) del Virus de la Por otro lado analizamos el cambio de la CR Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (VIH-1) li- de estos tres grupos tras ser sometidos a hi- mita los beneficios de la terapia antirretroviral. permutagénesis in vitro respecto a sus homó- Estas mutaciones en la proteasa viral no sólo logos salvajes. En los tres casos la CR se vio reducen la unión de los IPs a la proteasa sino significativamente disminuida, siendo los virus que también menguan la capacidad replicativa resistentes a IPs los que más vieron afectada (CR) del virus. Sin embargo, se sabe muy poco su CR. acerca del efecto de mutaciones en la proteasa del VIH-1 sobre la CR del virus. En un estudio Estos resultados sugieren que los virus some- previo en nuestro laboratorio (Fernández et al. tidos a presión selectiva con el uso de IPs se JVI 2007 81, 2485) se observó la existencia de muestran más vulnerables a la aparición de una correlación positiva entre la conservación nuevas mutaciones. Mientras que los virus de de una secuencia, respecto a la secuencia an- pacientes naïve se muestran más robustos cestral de subtipo B, y su eficacia biológica in vitro (r2 = 0.07531, p = 0.0006). pese a la divergencia genética. La acumulación de mutaciones deletéreas puede tener implica- Para conocer cómo afecta la diversificación ge- ciones en la adaptación del VIH-1 a su hospe- nética a la CR del virus, hemos analizado tres dador. grupos de secuencias de la proteasa viral, dos PALABRAS CLAVE: Capacidad replicativa, de los cuales compuestos por pacientes naïve Hipermutagénesis, Evolución (no tratados) infectados en dos periodos separados de 14 años aproximadamente y uno compuesto por pacientes tratados con uno o CP/130 más IPs. En primer lugar, hemos analizado la Epidemiología de los casos de divergencia genética en 139 secuencias de la proteasa viral de nuestra unidad clínica, 89 ob- hepatitis A en la Comunidad Autónoma tenidas entre los años 1993-1994 y 50 obteni- de las Islas Baleares, 2000-2010

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Reina J* (1), Déniz C (1), Salvá F (1), Galmés los pacientes positivos habían sido previamen- A (2), Nicolau A (2), Gimenez J (2) te vacunados frente a la hepatitis A. Se esta- Unidad de Virologia. Hospital Universitario blecieron medidas higiénicas y preventivas y se Son Espases. Palma de Mallorca (1), Servicio realizó la vacunación específica en las perso- de Epidemiologia. CAIB.Baleares (2) nas del entorno epidemiológico. Objetivo: Estudiar las características Conclusiones: La incidencia de hepatitis A en epidemiológicas de los casos de nuestra comunidad está dentro del rango co- hepatitis A detectados en el período municado. Se han observado amplias oscila- 2000-2010 en la Comunidad Balear. ciones en diferentes años (asociados a brotes), detectándose un incremento en el último año. Material y Metodos: A lo largo del estudio se Parece que en nuestra área geográfica la he- han estudiado aquellos pacientes con clínica patitis A presenta unas ondas epidémicas con compatible de padecer una hepatitis aguda (ic- picos cada 4 años. teria, fatiga, transaminasas elevadas..). A cada PALABRAS CLAVE: Hepatitis A, paciente se le realizó la determinación seroló- Epidemiología, Características gica frente a la hepatitis A a través del estudio de la presencia de una IgM específica (Liaison, HAV-IgM, DiaSorin, Italia), siguiendo las ins- CP/131 trucciones estrictas del fabricante. También se Brote de sarampión causado descartaron la hepatitis B y C y otras etiológias responsables de afectación hepática mediante por el genotipo D4 en población técnicas serológicas y moleculares. Además se de Palma de Mallorca realizó una encuesta epidemiológica para co- Reina J* (1), Déniz C (1), Gimenez nocer los datos clínicos y epidemiológicos mí- J (2), Mosquera M (3) nimos de los pacientes positivos y reconocer el entorno social de los casos. Unidad de Virologia. Hospital Universitario Son Espases. Palma de Mallorca (1), Servicio de Epidemiologia. CAIB.Baleares (2), Centro Resultados: A lo largo del período de estudio se Nacional de Microbiologia. Madrid (3) han diagnosticado 188 casos de hepatitis A, os- cilando el número de casos en cada año desde un mínimo de 4 casos en 2003 hasta un máxi- Objetivo: Estudiar las características clínicas y mo de 50 casos en 2000. En 2010 se detectó epidemiológicas de un brote autóctono de sa- un brote escolar que afectó a 16 personas (7 rampión ocurrido en la Comunidad Balear. niños, 2 cuidadores y 7 familiares). La tasa de Material y Metodos: Durante el mes de abril se incidencia ha oscilado entre 0.4 a 5.9/100.000 comunicaron 9 pacientes con sospecha clínica con un índice epidémico acumulado a 2009 de de primoinfección por el virus del sarampión. 2.11. En los últimos dos años parece que se A todas ellas se les tomaron muestras de san- ha producido un estancamiento de la tasa de gre para estudio serológico (Enzygnost/anti- incidencia anual en 1.4-1.7 casos/100.000. El Measles IgM, Siemens) y frotis faríngeo y orina 73.4% de los casos eran hombres y el 26.6% para aislamiento viral. Las muestras tras su mujeres. Por edades los pacientes <15 años proceso de homogeneización fueron sembra- representaron el 10.1%, entre 15-24 años el das en shell-vials de la línea celular Vero (Vir- 15.4%, entre 25-34 años el 36.7% y los >35 cell, Granada). Tras el proceso de incubación años el 37.7%. La edad media de los casos ha fueron reveladas con un anticuerpo monoclo- sido de 34 años (rango 6-59 años). Ninguno de nal específico mediante una técnica de inmu-

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nofluorescencia indirecta. Se realizó el estudio PALABRAS CLAVE: Sarampión, Genotipo clínico, epidemiológico y revisión del calendario D4, Epidemiología vacunal. Se analizaron los nexos epidemiológi- cos entre los casos y el posible origen del caso primario. Se recomenaron medidas higiénicas CP/132 y epidemiológicas y la vacunación o revacuna- Brotes de la enfermedad mano-pie- ción de los casos dudosos. boca causados por el Coxsackievirus Resultados: De los 9 casos sospechosos sólo A16 en población pediátrica pudieron ser confirmados 6 de ellos (66%). La Reina J* (1), Déniz C (1), Gimenez confirmación se realizó en 4 casos (66%) por J (2), Trallero G (3) presentar una IgM específica frente al virus del Unidad de Virologia. Hospital Universitario sarampión y en 2 casos (33%) por el intenso Son Espases. Palma de Mallorca (1), Servicio vínculo epidemiológico. Las edades de los pa- de Epidemiologia. CAIB.Baleares (2), Centro cientes confirmados oscilaban entre los 10 me- Nacional de Microbiologia. Madrid (3) ses y los 30 años, aunque 5 de ellos (83%) eran menores de 21 meses (lactantes). En cuanto Objetivo: Estudiar las características clínicas al género, 4 de los casos (66%) eran mujeres y epidemiológicas de los niños afectados en y 2 (33%) hombres. En 5 casos los pacientes unos brotes de la enfermedad mano-pie-boca carecían de vacunación trivalente previa y en ocurridos durante los meses de junio-julio 2009 un solo caso (la mujer de 30 años) existía el en la Isla de Mallorca antecedente histórico de una dosis vacunal previa. En 2 casos (33%) se precisó del ingre- Material y Metodos: A lo largo de los meses so hospitalario, debido fundamentalmente a de junio y julio se describieron pequeños bro- la corta edad de los pacientes, aunque no se tes (4-5 casos) de niños con una sintomato- presentaron ningún tipo de complicaciones clí- logía que clínicamente era compatible con la nicas en los pacientes. Los estudios epidemio- enfermedad designada como mano-pie-boca. lógicos demostraron que el caso índice era de Se realizaron los estudios epidemiológicos y un mujer extranjera sin contactos previos con se tomaron muestras de algunos de ellos. Las personas sospechosas de infección por el virus principales muestras estudiadas fueron los fro- del sarampión. El brote duró unos 20 días y se tis faríngeos y las heces. Todas las muestras limitó tras la puesta en marcha de las medidas fueron inoculadas por la técnica de shell-vial en epidemiológicas y de control correspondientes. las líneas celulares corrrespondientes (MRC-5 Todas las muestras fueron negativas en el ais- y Vero) (Vircell, Granada) para el aislamiento de lamiento por cultivo celular. Los estudios gené- enterovirus. Las monocapas fueron reveladas ticos demostraron que el virus del sarampión mediante una técnica de inmunofluorescencia aislado en las muestras correspondía al geno- indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal tipo D4. específico para estos virus (clon 5-D8/1, Dako Conclusiones: El sarampión es una infección Diagnostica, Barcelona). Todas las muestras viral sometida a vigilancia epidemiológica ac- fueron enviadas al CNM para la realización de tiva. La detección e identificación rápida y es- la RT-PCR de confirmación y caracterización. pecífica de los casos sospechosos evita la di- Resultados: El cultivo de las muestras fue ne- seminación de los casos primarios. El genotipo gativo en todas ellas. De las muestras remiti- detectado es el que actualmente predomina en das al CNM se pudo detectar la presencia del el territorio nacional.

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Coxsakievirus A 16 en 3 frotis faríngeos y unas CP/133 heces. El número de casos comunicado fue de 23, aunque muy probablemente el número total Evaluación preliminar de un método de casos fuera mucho mayor, debido a la dis- comercial para la detección antigénica persión y a la beningnidad de la sintomatología. rápida y específica del virus gripal Las principales manifestaciones clínicas fueron A (H1N1) 2009 pandémico fiebre y aparición de lesiones vesículo-ampo- llosas en la zona orofaríngea, manos, plantas Reina J*, Déniz C, Prades C de los pies y zona del pañal. Las lesiones se Unidad de Virologia. Hospital Universitario ulceraban con facilidad debido al roce. El pe- Son Espases. Palma de Mallorca (1) ríodo de incubación se estableció en unos 4.5 Objetivo: Evaluar la sensibilidad de un método días en los casos en los que se conocía el an- inmunocromatográfico específico para la detec- tecedente del contacto previo con otro caso. ción antigénica rápida de la gripe A pandémica Referente al género, 13 pacientes eran niños frente a un método genérico en muestras posi- (56.5%) y 10 niñas (43.5%). Las edades oscila- tivas por RT-PCR. ban entre los 21 meses y los 6 años, mostrando un amplio espectro que varió en cada uno de Material y Metodos: Durante la pandemia de los brotes. Se establecieron recomendaciones gripe A de 2009 se seleccionaron 30 muestras higiénicas y de salud pública en todos los casos pediatricas (aspirados nasofaríngeos) con- notificados y sus contactos. Los brotes se auto- secutivas positivas frente al virus influenza A limitaron en el tiempo y al cabo de 12 días de su (H1N1) pandémico por una técnica comercial inicio no se comunicaron casos posteriores. En de amplificación genómica RT-PCR (Applied ningún caso la infección vírica presentó compli- Biosystems, USA). Estas muestras fueron en- caciones o dejó secuelas neurológicas. sayadas de forma simultánea frente a un méto- do comercial inmunocromatográfico específico Conclusiones: Durante la época estival son fre- frente al virus gripal pandémico (Influenza Ag cuentes los brotes infecciosos causados por los A/B/A(H1N1)-pandemic rapid test, SD Stan- diferentes enterovirus. La enfermedad mano- dard Disagnostics, Gyenggi-do, South Korea) y pie-boca se presenta como pequeños brotes otro genérico frenta al virus influenza A (Direc- asociados a un caso índice y aunque puede tigen EZ FluA+B; Becton & Dickinson, USA) si- estar causado por diferentes enterovirus, el guiendo en ambos casos las recomendaciones Coxsackievirus A16 es una de las principales estrictas del fabricante. El método específico etiologías. La vigilancia epidemiológica y la presenta 2 bandas de reactividad, una genérica toma de muestras en estas situaciones permite para el virus influenza A (nucleoproteína, NP) y el establecimiento definitivo de la etiología viral otra específica para el virus influenza A pandé- de estos procesos pediátricos. mico (H1N1) 2009 (hemaglutinina, HA). El mé- PALABRAS CLAVE: Enfermedad Mano-Pie- todo genérico sólo detecta la nucleoproteína. Boca, Coxsackievirus A16, Pediatría Resultados: La técnica antigénica específica dio como positivas al virus gripal pandémico y al virus influenza A (de forma simultánea) 9 muestras (30%), 4 sólo fueron positivas frente al virus influenza A y negativas frente al virus pandémico (13%) y 17 fueron consideradas como negativas frente a ambos virus (57%);

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por lo tanto en 13 muestras (43%) el resultado tes con sintomatología compatible (síndrome de la detección antigénica fue como mínimo de febril, leucopenia) y con orina negativa a CMV muestra positiva frente al virus influenza A. La al nacer y durante los primeros 10 días tras el técnica antigénica genérica dio como positivas nacimiento y posterior positividad a esta edad. frente al virus influenza A 14 muestras (46.6%) Las muestras de orina y leche se sembraron y 16 como negativas (53.4%) frente al mismo. en viales de la línea MRC-5 (Vircell, Granada) Las 14 muestras positivas detectadas por esta y fueron revelados a las 24 y 48 horas con un última técnica eran las mismas que las detec- anticuerpo monoclonal específico anti-p24 (). tadas por el método específico más una dada La amplificación genómica de las diferentes previamente como negativa por el método es- muestras (leche y sangre) se realizó mediante pecífico. una PCR múltiple comercial (Real, Durviz, Va- lencia) siguiendo las instrucciones del fabrican- Conclusiones: El método comercial de detec- te. Para la prueba de la antigenemia se utilizó ción antigénica específico ha mostrado muy sangre completa (EDTA) y su positividad se de- baja sensibilidad frente al virus gripal pandémi- tectó mediante un anticuepo monoclonal anti- co (HA) y una sensibilidad parecida al genérico pp65. No se realizaron estudios serológicos a en la positividad frente a la nucleoproteína. A los niños ni a las madres. pesar de ello, su gran ventaja es su especificidad de modo que su positividad determina Resultados: Se han estudiado 28 niños con la presencia del virus gripal pandémico en la sospecha de infección postnatal por CMV y muestra en un tiempo de reacción inferior a los lactancia materna. De ellos 12 (42.8%) tuvieron 30 minutos. alguna transfusión sanguínea y 16 (57.2%) no la precisaron. En los pacientes trasfundidos la PALABRAS CLAVE: Detección antigénica, sospecha del origen de la infección por CMV Gripe A (H1N1) pandémica, Evaluación era de la sangre o de la leche materna. De técnica ellos en 9 (75%) la leche fue positiva por PCR, no pudiéndose analizar la sangre en ningún CP/134 caso. En los 3 (25%) restantes se consideró a la sangre como el origen de la primoinfección. Diagnóstico de la primoinfección De los pacientes no trasfundidos, en 9 (56.2%) postnatal por citomegalovirus la leche materna fue positiva por PCR. De los (CMV) trasmitida por lactancia 28 pacientes estudiados en 18 (64.2%) se con- materna en pacientes de riesgo sideró que la leche materna era el origen de la infección por CMV, en 3 (10.7%) podía ha- Reina J* (1), Balliu P (2), Déniz C (1), Prades C (1) ber sido la sangre trasfundida y en 7 (25%) no Unidad de Virologia. Hospital Universitario pudo establecerse el posible origen. De las 28 Son Espases. Palma de Mallorca (1), leches sembradas sólo en 4 (14.2%) se pudo Servicio de Pediatria. Hospital Universitario aislar el CMV, coincidiendo con su positividad Son Espases. Palma de Mallorca (2) previa por PCR. Todos los 28 pacientes presentaron cultivo positivo de orina a CMV con un Objetivo: Estudiar el papel de la lactancia ma- tiempo medio desde el nacimiento de unos 20 terna en las infecciones postnatales por CMV días. La PCR de sangre y la antigenemia sólo en pacientes prematuros de riesgo fue positiva en 3 (10.7%) pacientes. Debido a sus condiciones de prematuridad ninguno de Material y Metodos: Se ha considerado como los pacientes había salido del hospital desde infección postnatal o perinatal aquellos pacien-

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su nacimiento. Se pudieron analizar 10 (35.7%) trabajo, se estudió el rol del CRE como posi- muestras de orina de las madres lactantes y ble diana terapéutica. Para ello se utilizó un sólo en 4 (40%) de ellas se aisló el CMV. método de selección molecular in vitro contra un fragmento del genoma viral que contenía el Conclusiones: La leche materna constituye CRE, se seleccionaron aptámeros, moléculas uno de los principales factores de riesgo en la capaces de unirse eficientemente y específica- adquisición de la primloinfección por CMV. La mente a otros dominios. Los aptámeros selec- PCR permite realizar un diagnóstico rápido y específico de este tipo de infección y descartar cionados se ordenaron en grupos que se unían el origen transfusional de la misma. a distintas regiones del CRE y se eligieron candidatos que representaban a cada grupo para PALABRAS CLAVE: Citomegalovirus, PCR, estudiar su capacidad de interferir con el ciclo Lactancia viral así como intentar dilucidar su mecanismo de acción. Estudios de transfección de células CP/135 portadoras de replicones del HCV con los ap- támeros demostraron que el aptámero P9-8, Caracterización del dominio genómico cuya región de unión se sitúa próxima al codón CRE, del virus de la hepatitis C stop de la polimerasa NS5B es capaz de inhibir como potencial diana terapeútica un 70% la replicación viral. Otros que se unen a diferentes regiones en el CRE inhiben entre un Marton S.M.*, Berzal-Herranz A. 30 y un 40 % la replicación viral. Los ensayos Instituto de Parasitología y Biomedicina de competición in vitro de la unión de la polime- López Neyra, Granada (1) rasa NS5B al CRE muestran que los aptámeros cuya diana es el bucle apical del CRE, que es El virus de la hepatitis C, HCV, es un virus de la región de interacción con la RNA polimera- RNA que infecta a más de 170 millones de per- sa, causan una disminución de entre un 80 y sonas (3% de la población mundial), causando un 85 % de la unión de la NS5B al CRE. Su- infección persistente en humanos lo que con- giriendo que el efecto inhibidor observado en lleva al desarrollo de la hepatitis C crónica, ci- células, pueda deberse a una competencia por rrosis y carcinoma hepatocelular. Actualmente el sitio de unión de la RNA polimerasa al CRE. no existen tratamientos antivirales específicos Los aptámeros cuyas dianas mapean en otras y efectivos para la infección con HCV. En el ge- regiones del CRE no muestra un efecto sobre noma del HCV se han identificado elementos la unión de la proteína. estructurales muy conservados, en estructura y secuencia. Esta gran conservación se corres- PALABRAS CLAVE: virus de la hepatitis C, ponde con una función biológica esencial en el CRE, aptámeros ciclo replicativo y/o infectivo del virus. Tal es el caso del cis-acting replication element, CRE, CP/136 que es un dominio de tres tallos lazos (5BSL3.1, 5BSL3.2 y 5BSL3.3) que forma una estructura Cócteles de péptidos diseñados cruciforme y durante la replicación del genoma racionalmente para bloquear del virus actúa como elemento regulador en cis interacciones entre subunidades de de la actividad de la polimerasa viral. El CRE se sitúa en el extremo 3’ del genoma viral, en la cápsida madura de HIV-1 inhiben la región codificante para la RNA polimerasa el ensamblaje de la cápsida in vitro dependiente de RNA, NS5B. En el presente y la infección por el virus ex vivo

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Bocanegra R. (1), Nevot M. (2), Domenech condiciones de aglomeración molecular simi- R. (3), López-Pérez I. (1), Rodríguez-Huete lares a las de los fluidos biológicos. Cócteles A.* (1), Cavasotto C. N. (4), Martínez M. compuestos por mezclas de estos péptidos y el A. (2), Neira J. L. (5), Mateu M. G. (1) péptido CAI (un inhibidor de la polimerización Centro de Biología Molecular Severo de CA previamente descrito) consiguieron abo- Ochoa (CSIC-UAM), Madrid (1), Fundación lir completamente el ensamblaje de la cápsida IrsiCaixa, Hospital Germans, Trias i Pujol, de HIV-1, incluso utilizando dosis relativamente Barcelona (2), Centro de Biología Molecular bajas de cada péptido, que por separado tie- y Celular, Universidad Miguel Hernández, nen un efecto muy pequeño. Hemos utilizado Elche, Alicante (3), The University of Texas un péptido heterólogo como transportador para Health Science Center at Houston, School introducir los péptidos anteriores en el interior of Health Information Science, Texas, USA de células susceptibles de infección por HIV-1. (4), Centro de Biología Molecular y Celular, Usándolos por separado CAC1, CAC1M, H8 y Universidad Miguel Hernández, Elche, CAI no fueron capaces de inhibir apreciable- Alicante; Instituto de Biocomputación y Física mente la producción de HIV-1 en células en de los Sistemas Complejos, Zaragoza (5) cultivo. Sin embargo, mezclas de estos mismos péptidos inhibieron sustancialmente la produc- Las interfases que participan en la polimeriza- ción y la infección por HIV-1. Los péptidos dise- ción de la proteína de la cápsida CA del virus ñados pueden servir para el desarrollo de cade la inmunodeficiencia humana (HIV-1) cons- bezas de serie de nuevos agentes anti-HIV. De tituyen nuevas dianas para el desarrollo de in- modo más general, este estudio proporciona hibidores interfásicos del ensamblaje de la cáp- una prueba de principio sobre la capacidad de sida madura de HIV-1. Una de estas dianas es diseñar racionalmente inhibidores interfásicos la interfase de dimerización de CA, formada en del ensamblaje de cápsidas víricas, y revela el gran medida por la hélice 9, que se localiza en valor del uso de combinaciones de dichos inhi- el dominio C-terminal (CTD) de CA. Previamen- bidores para impedir el ensamblaje y la infec- te habíamos diseñado un péptido, CAC1, que ción por HIV-1. representa la secuencia de la hélice 9 en CTD, PALABRAS CLAVE: HIV-1, cápsida, y demostrado que CAC1 es capaz de unirse a antivirales CTD con una afinidad relativamente elevada. En este estudio hemos mapeado el sitio de unión de CAC1, que presenta un importante CP/137 solapamiento con la interfase de dimerización Uso de larvas de insecto como de CA. Además hemos modificado racional- plataforma para la producción mente CAC1 para aumentar su solubilidad y su afinidad de unión a CTD, y diseñado racio- de vacunas contra influenza nalmente otros cuatro péptidos que reproducen Gómez-Casado E* (1), Gómez-Sebastián las secuencias de otros segmentos helicoidales S (2), Núñez C (2), Lasa-Covarrubias R (2), de CA que también forman parte de las interfa- Martínez-Pulgarín S (1), Escribano J.M. (1) ses entre subunidades de la cápsida madura. Departamento de Biotecnología, Instituto Hemos encontrado que los péptidos CAC1 y Nacional de Investigación y Tecnología su variante racional CAC1M, así como H8 (que Agraria y Alimentaria (INIA). Autovía A6, Km representa la secuencia de la hélice 8 en CTD) 7.5, 28040-Madrid, España (1), Alternative son capaces de inhibir eficazmente el ensam- Gene Expression S.L. (ALGENEX). Centro blaje in vitro de la cápsida de HIV-1, incluso en empresarial. Parque Científico y Tecnológico

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de la Universidad Politécnica de Madrid. Pérez Brocal V* (1), Moya A (2) Campus de Montegancedo. 28223- Unidad Mixta de Investigación en Genómica y (2) Pozuelo de Alarcón-Madrid, España Salud del Centro Superior de Investigación en El aumento de la capacidad de producción es Salud Pública (CSISP) - Instituto Cavanilles una de las prioridades más importantes para de Biodiversidad y Biología Evolutiva (ICBiBE) (1) las vacunas contra la gripe estacional y pandé- de la Universidad de Valencia, Valencia , mica. En el presente estudio, hemos utilizado Unidad Mixta de Investigación en Genómica y un sistema combinado de infección baculovi- Salud del Centro Superior de Investigación en rus-larvas de insecto como biofactorías para Salud Pública (CSISP) - Instituto Cavanilles mejorar la producción de la hemaglutinina (HA) de Biodiversidad y Biología Evolutiva (ICBiBE) (2) del virus influenza A/PR/8/34 (H1N1). Las lar- de la Universidad de Valencia, Valencia vas de insecto producen 4 veces más proteína El reciente desarrollo de nuevas tecnologías HA que los cultivos de células de insecto, por para la secuenciación masiva ha permitido el unidad de biomasa. Una sola larva infectada despegue de los estudios metagenómicos y de Trichoplusia ni fue capaz de producir hasta por lo tanto del análisis simultáneo de múltiples 113 microgramos de HA recombinante, soluble genomas procedentes de un número creciente y fácil de purificar, necesitándose 1,2xe8 cé- de muestras ambientales. Esta masiva obten- lulas de insecto Sf21 infectadas con el mismo ción de datos está llevando, entre otras cosas, baculovirus para obtener una cantidad similar a un enorme avance de nuestro conocimiento de HA. Además, el uso del péptido de retención del microbioma del intestino humano. Sin em- en retículo endoplasmático KDEL fusionado bargo, el mayor esfuerzo hasta la fecha ha ido a la HA incrementó al doble la producción de dirigido al estudio de las comunidades bacteria- esta proteína. La HA derivada de la larva fue nas y su implicación en la salud humana. Por el inmunogénicamente funcional en ratones vacu- contrario, el estudio de las comunidades virales nados, induciendo anticuerpos inhibidores de la en general, y de bacteriófagos en particular, ha hemaglutinación y una respuesta inmune pro- experimentado un desarrollo mucho menor. Sin tectiva frente a un desafío letal con 4xLD50 del embargo, para que el estudio de las comuni- virus A/PR/8/34. La productividad, escalabilidad dades microbianas del intestino humano sea y rentabilidad de estas pequeñas biofactorías completo, se hace necesario el estudio de la basadas en las larvas de insectos abre nuevas diversidad y estructura del virioma. Esto resulta posibilidades como estrategia para la produc- fundamental para entender los efectos del virio- ción de vacunas de subunidades recombinan- ma sobre la salud y el bienestar, así como sus tes contra la gripe estacional y pandémica, en posibles implicaciones en enfermedades y/o sustitución a las tecnologías de fermentación o síndromes intestinales crónicos, como la en- aquellas que utilizan huevos embrionados. fermedad inflamatoria intestinal o el síndrome PALABRAS CLAVE: Influenza, del intestino irritable. Para lograr estos objeti- Hemaglutinina, Vacunas vos, se hace necesario desarrollar una meto- dología experimental adecuada que permita la CP/138 determinación del virioma fecal humano. Dis- poner de un protocolo experimental adecuado Aproximación a la metodología para el aislamiento, extracción, amplificación experimental y bioinformática y secuenciación de genomas virales resulta para el estudio del virioma a partir tan importante como el desarrollo y aplicación de muestras fecales humanas de herramientas para el posterior análisis bio-

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informático y estadístico de dichas muestras. utilizando como ligando los primeros 500 nt de Por ello, hemos revisado y puesto a punto un los extremos 5’ y 3’ del genoma del CoV de la compendio de técnicas basadas en métodos gastroenteritis porcina transmisible (TGEV). Se rutinarios de laboratorio que nos permitan de aislaron 9 proteínas que se unieron preferen- un modo rápido y sencillo el estudio tanto de virus de ADN como de ARN procedentes de cialmente al extremo 3’ del genoma. Entre es- muestras fecales. En este trabajo, compara- tas proteínas se incluían varios miembros de la mos los resultados obtenidos a partir de varias familia de las hnRNPs (A1, A2B1, A0, U y Q), muestras tomadas de individuos controles sala proteína de unión a poli-A (PABP), el coac- nos y evaluamos los efectos que parámetros tivador de transcripción p100, la glutamil-prolil tales como la longitud de las lecturas obteni- tRNA sintetasa (EPRS) y la arginil tRNA sinte- das mediante pirosecuenciación en plataforma 454, así como diferentes métodosVirioma de tasa (ArgRS). El papel de estas proteínas en la ensamblaje de secuencias o la importancia de replicación viral se analizó mediante ensayos las herramientas de búsqueda y las bases de de silenciamiento génico con siRNAs, obser- datos tienen sobre los resultados obtenidos. vándose que al menos las proteínas hnRNP Q, PALABRAS CLAVE: virioma, heces, PABP, EPRS y ArgRS estaban implicadas en pirosecuenciación la síntesis de RNA viral. Con el fin de identificar el dominio RNA del extremo 3’ del genoma CP/139 que interacciona con estas proteínas, se reali- zó un mapeo mediante cromatografía de afini- Mapeo de dominios RNA del dad a RNA utilizando como ligando fragmen- genoma de coronavirus que interaccionan con proteínas celulares tos de RNA solapantes del extremo 3’. En una implicadas en replicación primera etapa se confirmó la unión específica de la PABP al poli-A viral y se delimitó el do- Márquez-Jurado S.*, Galán C., Nogales minio de interacción para las proteínas EPRS, A., Enjuanes L., Almazán F. ArgRS y hnRNP Q en un fragmento de 131 nt Departamento de Biología Molecular y Celular, localizado a 303 nt del extremo 3’ del genoma. Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Partiendo de este fragmento se demostró que Darwin 3, Campus Universidad Autónoma de Madrid, Cantoblanco, Madrid 28049. (1) tanto la EPRS como la ArgRS interaccionaban específicamente con una secuencia de 32 nt. Los coronavirus (CoV) son virus RNA de cadena El análisis detallado de esta secuencia mostró sencilla y polaridad positiva. El RNA genómico una elevada homología en secuencia y estruc- es infeccioso y se traduce al inicio de la infec- tura secundaria con un inhibidor de la traduc- ción dando lugar a la replicasa viral, que junto ción descrito en mRNAs de genes implicados con proteínas celulares, media los procesos de en inflamación. En CoV esta secuencia de RNA replicación y transcripción viral. Ambos proce- podría estar implicada en la inhibición de la tra- sos requieren el reconocimiento específico de ducción del genoma viral y promover el cambio señales en cis localizadas en los extremos del de traducción a replicación. genoma. Con el fin de identificar proteínas celulares implicadas en la síntesis de RNA de CoV PALABRAS CLAVE: Coronavirus, se realizó una cromatografía de afinidad a RNA Replicación, Interacción virus-huesped

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CP/140 papel de la proteasa celular furina en la infec- ción y transducción por AAV. La furina es una La proteasa furina juega un papel endoproteasa de la familia PC que cortas en importante en la infección de diferentes sitios polibásicos consenso (R-X-R/K-R) y es serotipos de virus adeno asociado esencial para la producción de factores solu- Suárez L * (1), Pañeda A (1), Zabaleta V (1), bles como citoquinas, factores de crecimiento, Nistal E (1), Olagüe C (1), Buning H (2), Aldabe maduración de proteínas virales y procesos de (3) (4) (1) R , Prieto J , González-Aseguinolaza G invasión tumoral. Para analizar el papel de la Laboratorio de Terapia Génica de furina en la infección por AAV hemos utilizado Hepatitis Viral, División de Terapia Génica una linea tumoral carente de furina funcional y Hepatología, Centro de Investigación (LOVO) y la misma línea transfectada de for- Médica Aplicada (CIMA), Pamplona, ma estable con un plásmido que expresa furina Navarra, España. (1), Centro de Medicina (LOVO-Fur). En primer lugar hemos comproba- Molecular, Universidad de Colonia, Alemania. (2), Laboratorio de Inmunología Clínica, do que la furina es necesaria para que las cé- División de Terapia Génica y Hepatología, lulas sean eficientemente transducidas por los Centro de Investigación Médica Aplicada AAVs pertenecientes a los serotipos 1, 2, 5, 6 (CIMA), Pamplona, Navarra, España. (3), y 8. La expresión del transgén era o muy baja División de Terapia Génica y Hepatología, o nula en las células LOVO mientras la mayo- Centro de Investigación Médica Aplicada ría de las células expresan el transgén en las (4) (CIMA), Pamplona, Navarra, España. células LOVO-fur. Actualmente estamos anali- La terapia génica basada en vectores virales zando en que paso de la infección del virus es hoy en día se prevé como una poderosa he- necesaria la acción de esta proteasa. En primer rramienta para el tratamiento de enfermedades lugar hemos comprobado que la furina no actúa tanto hereditarias como adquiridas para las directamente sobre la cápside viral ya que tras cuales hasta el momento no se tiene cura. Los incubación del virus con furina recombinante virus adeno asociados (AAV) dentro del con- no vemos productos de degradación de la cáp- junto de vectores virales empleados en terapia side y los virus no recuperan la capacidad de génica representan una atractiva alternativa al uso de otros vectores virales. Los AAV son vi- transducción de las células LOVO. En segundo rus no patogénicos y se ha comprobado que lugar la furina no es necesaria para la entrada son capaces de translucir distintos tejidos y del virus ya que podemos detectar DNA viral expresar el transgén durante largos periodos en el interior tanto de LOVO como de LOVO de tiempo. Para su entrada en la célula cada fur. Además, experimentos de microscopia de serotipo utiliza receptores diferentes lo cual fluorescencia realizados con AAVs en los cua- implica que presenten una biodistribución di- les la cápside esta covalentemente marcada ferente tras su administración in vivo. Sin em- con GFP muestra al virus en el interior de las bargo existen distintos tipos celulares difíciles células LOVO. Por lo tanto nuestros resultados de transducir debido principalmente a que el indican que bien la furina o una proteína rela- tráfico del virus a nivel subcelular es muy poco eficiente. A pesar de los trabajos realizados por cionada con está juega un papel importante en diferentes grupos todavía no se conoce total- el transporte del virus al núcleo. mente todos los factores implicados en este PALABRAS CLAVE: Virus adeno asociados, proceso. En este trabajo hemos analizado el Furina

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CP/141 Las implicaciones de la sustitución T70I en la estructura de la glicoproteína E y en su función Aislamiento y caracterización serán discutidas. de un mutante del virus del Nilo Occidental con resistencia a la PALABRAS CLAVE: virus Nilo Occidental, inactivación por pH ácido endosomas, glicoproteína Martín-Acebes MA*, Saiz J-C CP/142 Departamento de Biotecnología, INIA (1) Efecto antiviral del ácido El virus del Nilo Occidental (VNO) es un flavivi- valproico frente a la infección rus transmitido por mosquitos responsable de por virus con envoltura epidemias de meningitis, encefalitis y parálisis flácida tanto en aves, como en équidos y huma- Vázquez-Calvo A (1), Saiz J-C (2), nos. El VNO entra en las células mediante en- Sobrino F (1), Martín-Acebes MA* (2) docitosis. El pH ácido dentro de los endosomas Centro de Biología Molecuar ‘Severo desencadena rápidos cambios conformaciona- Ochoa’, Madrid (1), Departamento de les en la glicoproteína E de la envoltura viral Biotecnología, INIA, Madrid (2) que dan lugar a la fusión de ésta con la membrana endosomal. Los cambios conformaciona- El ácido valproico (VPA) es un ácido graso de les de la glicoproteína E pueden ser inducidos cadena corta de uso común para el tratamiento mediante la exposición a pH ácido en ausencia de trastornos neurológicos humanos. Puesto de membranas diana, originando la pérdida de que el VPA interfiere con el metabolismo de infectividad de las partículas virales. Siguiendo los lípidos celulares, se analizó su efecto so- un abordaje genético para estudiar este proce- bre la infección en cultivos celulares de virus so, se aisló un mutante de VNO con mayor re- pertenecientes a siete familias relevantes para sistencia frente a la inactivación por pH ácido. la salud humana y animal, incluyendo ocho vi- El análisis de su genoma completo.reveló que rus con envoltura lipídica y cuatro sin envoltura. un único cambio de aminoácido (T70I) en la gli- EL VPA inhibió drásticamente la multiplicación coproteína E era el responsable del incremento de los virus con envoltura, incluyendo agentes en la resistencia a pH ácido. Este cambió iba zoonóticos como el virus de la coriomeningitis ligado a un incremento en la sensibilidad de linfocitaria y el virus del Nilo Occidental (VNO), la infección a la subida del pH endosomal me- sin afectar a los virus sin envoltura analizados. diada por agentes químicos, sugiriendo que el EL VPA redujo la infección del virus de la esto- mutante requiere un pH más ácido dentro de matitis vesicular sin producir un bloqueo signifi- los endosomas celulares para su fusión. No cativo de la síntesis de ARN o proteínas virales. se observaron alteraciones en la cinética de la Sin embargo, en el caso de VNO, el VPA inhi- infección viral, tamaño de la placa, o tasas de bió tanto la síntesis de ARN como de proteínas mortalidad inducida en ratones inoculados con virales, lo que indica que este fármaco podría el mutante. Sin embargo, mediante ensayos de inhibir diferentes etapas de la infección por competición se observó una reducción en la virus con envoltura. De esta manera, el VPA eficacia biológica del mutante bajo condiciones puede contribuir a entender pasos cruciales en estándar de cultivo. Estos resultados aportan la maduración viral y al desarrollo de futuras es- nuevas evidencias de la flexibilidad adaptativa trategias contra las infecciones asociadas a los frente a factores ambientales, la variación del virus con envoltura. pH en este caso, de las poblaciones del VNO.

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PALABRAS CLAVE: antiviral, virus con al PTV-6; 9.7% al PTV-4; 4.8% al PTV-5; 4.8% envoltura, membranas formaban un nuevo cluster denominado PTV- 12; 3.2% a los cluster PTV-1, PTV-7 y PTV-11 CP/143 (respectivamente), y 1.6% al PTV-8. Los genotipos 3, 9 y 10 no estaban representados en las Caracterización molecular muestras aisladas. Para verificar la clasifica- de Teschovirus aislados en ción filogenética por VP1 del nuevo cluster, se España: descripción de un secuenció el genoma completo de un represen- posible nuevo genotipo tante de dicho grupo (CC25) obteniendo una secuencia de 6904nt (125 nt -7019 nt respecto Cano-Gómez C* (1), Buitrago M.D (2), García- a la cepa F65 (GenBank NC_003985)). Con la Casado M.A (1), Fernández-Pinero J (1), región correspondiente a la poliproteína (P1) se Agüero M (2), Jiménez- Clavero M.A (1) construyó un alineamiento incluyendo las se- Centro de Investigación en Sanidad Animal cuencias disponibles publicadas en GenBank, (CISA)-INIA, Valdeolmos, Spain (1), Laboratorio se calculó el modelo de sustitución nucleotídico Central de Veterinaria, Algete, Spain. (2) y se construyeron árboles filogenéticos usando varios métodos estadísticos. Al mismo tiempo En un estudio previo (1), 206 aislados virales, se estudio la similitud de CC25 con los 11 ge- procedentes de una colección de muestras fenotipos de referencia para PTV y con las se- cales recogidas durante el programa de sero- cuencias disponibles del subgrupo III (PTV 2, vigilancia de la enfermedad vesicular porcina 4, 6 y 8) en el cual se incluía el nuevo posible (SVD), fueron sometidos a análisis moleculares clado. Para esclarecer si este nuevo genoti- dirigidos usando un grupo de PCR específicas po identifica un nuevo serotipo de teschovirus, para conocer la prevalencia de los virus entéri- serán necesarios estudios serológicos detalla- cos porcinos en España. Los resultados indica- dos que tengan en cuenta el alto nivel de reac- ban una alta prevalencia de virus pertenecien- ción cruzada existente entre ellos. Este estudio tes a la Familia Picornaviridae (57.8%): géneros demuestra la alta prevalencia y diversidad ge- teschovirus (84%) y sapelovirus (16%). Las nética de los teschovirus en España y revela muestras fueron negativas para miembros del la existencia de un posible nuevo genotipo que género enterovirus (Enterovirus-B y virus de la hemos denominado putativamente PTV-12. enfermedad vesicular porcina). Para la carac- terización de los virus del género teschovirus 1.-Buitrago D, Cano-Gómez C, Agüero M, et se desarrollaron herramientas moleculares que al.: 2010, A survey of porcine picornaviruses tenían por diana la amplificación de la proteí- and adenoviruses in fecal samples in Spain. na VP1 completa. Posteriores análisis de ho- J Vet Diagn Invest. 22:763-766. mología fueron llevados a cabo a través de las secuencias consenso obtenidas y fueron cons- PALABRAS CLAVE: teschovirus porcinos, truidos árboles filogenéticos usando el método picornavirus, análisis filogenético estadístico de máxima verosimilitud, aplicando un modelo de sustitución nucleotídico y un test CP/144 de filogenia seleccionado en función de un alineamiento previo. Los datos de dicho análisis Análisis de la relevancia funcional indicaban los siguientes resultados: 50% de las del factor celular Nxp2 en el ciclo muestras pertenecían al cluster PTV-2; 19.4% de infección del virus de la gripe

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Ver, L. S.*, Jorba, N., Ortín, J. de la polimerasa del virus de la gripe. Nuestros Departamento de Biología Molecular y Celular, resultados indican que entre estos, Nxp2 po- Centro Nacional de Biotecnología, Madrid (1) dría ser relevante para la infección con el virus de la gripe. Dado que Nxp2 tiene dominios de Los virus de la gripe tipo A, incluidos en la fami- unión a RNA, a matriz nuclear y a otras proteí- lia Orthomyxoviridae, son virus RNA de cadenas y podría ejercer un papel como adaptador na negativa y genoma segmentado. Los ocho entre la RNP viral y la matriz nuclear. Se están fragmentos en los que está dividido su genoma llevando a cabo experimentos para determinar codifican para doce proteínas virales. La poli- el posible rol de Nxp2 durante la infección por merasa del virus está formada por tres de es- el virus de la gripe. tas proteínas: PA, PB1 y PB2. Este complejo es responsable de la transcripción y replicación PALABRAS CLAVE: Influenza, factores del genoma viral (vRNPs) a lo largo del ciclo celulares, Nxp2 infectivo del virus. Dado que el virus de la gripe transcribe y replica su RNA genómico en el CP/145 núcleo de las células infectadas, la polimerasa viral debe ser transportada al núcleo para Caracterización de las distribuciones cumplir su función. El virus de la gripe es un de fitness en poblaciones del agente patógeno altamente variable que oca- bacteriófago Qbeta que han siona infecciones respiratorias en humanos en evolucionado a diferente tasa de error forma de epidemias anuales y pandemias oca- sionales. La identificación y caracterización de Cabanillas L*, Arribas M, Lázaro E los actores celulares involucrados, es de suma Departamento de Evolución Molecular, Centro importancia para mejorar nuestra capacidad de de Astrobiología (INTA-CSIC), Madrid (1) respuesta a futuras epidemias o pandemias de Los virus que tienen RNA como material ge- este virus. En el laboratorio hemos identificado nético se replican con tasas de error muy ele- proteínas celulares que interaccionan con la vadas, lo cual les confiere una gran capacidad polimerasa viral por análisis de espectrometría para adaptarse a los cambios en las presiones de masas de complejos polimerasa-proteínas selectivas en periodos cortos de tiempo. Sin intracelulares purificados con la etiqueta TAP. embargo, el hecho de que la mayoría de las Entre estas proteínas se encuentra la proteí- mutaciones que se producen tienen efectos na de matriz nuclear, Nxp2. En cinéticas de negativos en el fitness hace que los virus RNA infección viral la proteína Nxp2 co-localiza con sean especialmente susceptibles a incrementos las RNPs virales a tiempos tempranos de in- adicionales en la tasa de error. Se ha demos- fección. Para analizar la relevancia de Nxp2 trado que la evolución de los virus RNA a tasa durante la infección viral, se infectaron con el de error incrementada conduce a la generación virus de la gripe células en las que este factor de poblaciones compuestas por individuos de había sido silenciado con siRNAs. Los títulos menor fitness, lo cual puede provocar su extin- obtenidos y la acumulación de proteínas virales ción. Estos hallazgos han inspirado una nueva se compararon con los obtenidos en células sin terapia antiviral conocida como mutagénesis silenciar, observando una disminución de me- letal que está basada en el tratamiento de las dio logaritmo en el rendimiento viral y una me- enfermedades virales mediante el uso de mutá- nor acumulación de algunas proteínas virales genos. Un hecho que debe ser tenido en cuenta en las células silenciadas. En resumen, hemos a la hora de aplicar la mutagénesis letal es que identificado varios factores presentes en célu- el efecto de muchas mutaciones es contingen- las humanas que interaccionan con el complejo

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te, dependiendo del fitness del individuo en el PALABRAS CLAVE: mutagénesis, fitness, que se producen y del ambiente en el que la re- adaptación plicación tiene lugar. Por tanto, es posible que muchas mutaciones con efecto deletéreo puedan ser beneficiosas y tener valor selectivo en CP/146 circunstancias de cambio ambiental. También Cuantificación de la infección se desconoce cual es la capacidad adaptativa primaria en un sistema de los virus aislados de poblaciones mutage- experimental virus-planta nizadas. Todo esto debe ser investigado para evaluar los riesgos de que la mayor diversidad Hillung J.*, de la Iglesia F., genética generada durante un tratamiento mu- Cuevas J.M., Elena S.F. tagénico favorezca la adaptación a las nuevas Instituto de Biología Molecular y presiones selectivas con las que se tenga que Celular de Plantas, Consejo Superior enfrentar el virus. de Investigaciones Científicas-UPV, En este trabajo se han determinado los valores Campus UPV CPI 8E, Ingeniero Fausto (1) de fitness de un conjunto de virus individuales Elio s/n, 46022 València, España aislados de dos poblaciones del bacteriófago Qbeta, una que ha evolucionado a tasa de error Los virus de ARN son comúnmente empleados incrementada por la presencia del agente mu- como modelos de evolución en distintos sis- tagénico 5-azacitidina (AZC) y otra que ha evo- temas experimentales, tales como los cultivos lucionado a la tasa de error estándar del virus celulares eucariotas, modelos bacterianos y (población control). En ambos casos el fitness organismos superiores (plantas, ratones, etc). se determinó a dos temperaturas diferentes, Un aspecto importante en este tipo de estudios 37º C y 30º C, que representan condiciones es la determinación de la cantidad de virus que de replicación óptimas y subóptimas respecti- inicia efectivamente la infección, ya que de este vamente. Los resultados obtenidos muestran valor depende la variabilidad genética presente que en condiciones óptimas los virus aislados en la población de partida, y por ende, presen- de la población control tienen valores de fitness ta una influencia determinante en la potencial significativamente más altos que los aislados acción de cuellos de botella poblacionales. En de la población mutagenizada. Sin embargo, este trabajo, estudiamos la relación entre la en condiciones subóptimas los valores de fit- cantidad de partículas virales que se añade en ness no difieren significativamente en ambas el proceso mecánico de inoculación y el nú- poblaciones, lo cual indica que las mutacio- mero efectivo que inicia la infección. Para ello, nes deletéreas generadas como consecuencia utilizamos un virus de ARN de cadena sencilla del aumento de la tasa de error tienen efectos y polaridad positiva, el del mosaico del nabo menores en condiciones de cambio ambiental. (TuMV) y Arabidopsis thaliana como planta También se ha estudiado la capacidad de los modelo. En nuestro laboratorio, disponemos de virus aislados de ambas poblaciones para ga- un plásmido que contiene el genoma completo nar fitness a 37º C y a 30º C, observándose de TuMV, donde se ha insertado el gen que co- que después de 10 pases los virus aislados de difica la proteína fluorescente verde (GFP), lo ambas poblaciones alcanzan valores simila- que permite observar el proceso de infección res. Este resultado sugiere que las mutaciones en las hojas inoculadas y a nivel sistémico. acumuladas durante el tratamiento con AZC no En primer lugar, a partir de un stock de este han disminuido de forma significativa la capaci- virus modificado, se estimó la cantidad de virus dad adaptativa del virus. mediante RT-PCR cuantitativa (RT-qPCR). A

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continuación, se hizo un total de 6 diluciones mensajero no procesado del segmento 8. Esta seriadas (factor de dilución 1:2) de este stock, proteína puede unir diferentes tipos de RNA e y se inocularon 5 plantas (3 hojas/planta) de A. interacciona con múltiples proteínas virales y thaliana para cada una de estas diluciones. 72 celulares, siendo un factor de regulación clave horas después de la inoculación, se observó las durante la infección. Entre otras funciones, la hojas inoculadas en una lupa de fluorescencia proteína NS1 bloquea la respuesta antiviral con objeto de contar el número de focos infec- mediada por interferón a diferentes niveles. ciosos. Nuestros resultados muestran que no existe una relación lineal entre la cantidad de Para estudiar el papel de la proteína NS1 en partículas virales utilizadas en la inoculación y la inhibición de esta respuesta nos propusimos las que inician de manera efectiva la infección, generar y caracterizar una colección de mutan- donde se aprecia un marcado comportamiento tes virales que tengan afectado el bloqueo de la estocástico. De especial relevancia es el he- misma. Para ello se han han generado diferen- cho de que apenas unas decenas de partículas tes poblaciones del virus mediante pases con- virales son las que inician la infección, varios secutivos de un virus silvestre sobre células en órdenes de magnitud por debajo de la cantidad las que el sistema de interferón se encuentra utilizada en la inoculación. En conclusión, este afectado. Cabe esperar que, al haber eliminado bajo nivel de infección en condiciones experi- la presión selectiva, se acumulen mutaciones mentales hace prever un papel relevante de los en el segmento NS. Como control se han lleva- cuellos de botella durante la transmisión mecá- do a cabo pases consecutivos del virus en las nica. células paternas. Los pases se han realizado en seis tandas independientes con la intención PALABRAS CLAVE: virus de planta, infección de aumentar así la diversidad de mutantes que primaria puedan surgir, ya que la aparición de mutaciones se debe a un proceso aleatorio. De esta CP/147 forma se han obtenido una serie de poblaciones virales cuyas características sugieren que Generación de una colección pueden ser mutantes en el bloqueo de la res- de mutantes del virus de la puesta interferón. gripe potencialmente afectados en el bloqueo de la respuesta Se ha realizado un screening de las diferentes mediada por interferón poblaciones generadas. Para ello se usaron células que expresan la proteína GFP bajo el Pérez-Cidoncha, M* (1), Oliveros, (2) (1) promotor de INF-β. Aquellos virus afectados en J.C. , Ortín, J. el bloqueo de la respuesta interferón deberían Centro Nacional de Biotecnología (CSIC). inducir la expresión de GFP. De esta forma se Madrid y CIBER de Enfermedades seleccionaron un total de 140 clones virales Respiratorias (ISCIII) (1), Centro Nacional que crecen de forma normal pero inducen la de Biotecnología (CSIC). Madrid (2) expresión de GFP. En la actualidad se están El virus de la gripe pertenece a la familia Or- usando diferentes técnicas con la intención de thomyxoviridae y se caracteriza por tener en- identificar aquellos virus con un fenotipo más vuelta lipídica y un genoma formado por 8 seg- acentuado. Se pretende caracterizar los mutan- mentos de RNA de cadena sencilla y polaridad tes seleccionados para entender así los meca- negativa, que codifican 11 proteínas. La proteí- nismos moleculares subyacentes en cada uno na no estructural NS1 es generada a partir del de ellos, así como entender mejor los diferentes

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papeles de la proteína NS1 en el bloqueo de valentemente al menos por un puente disulfu- la respuesta a interferón Además de estudiar ro. En estudios anteriores se había visto que clones virales individuales se estudiaron las cé- péptidos que incluían el sitio de corte II de la lulas positivas para GFP en su conjunto. A par- proteína F eran capaces de interaccionar con tir de éstas se obtuvieron poblaciones virales proteoglicanos, sugiriendo que la interacción altamente enriquecidas en virus mutantes. En de la proteína F con estos compuestos estaba la actualidad se está analizando la secuencia mediada por interacciones electrostáticas entre de estas poblaciones mediante secuenciación esos residuos básicos y las cargas negativas masiva para obtener así un mapa del genoma de los glicosaminoglicanos. Con el fin de confir- donde se representen aquellas regiones poten- mar estos resultados en la proteína, se han rea- cialmente implicadas en el bloqueo de la res- lizado estudios de unión a la superficie celular puesta a interferón. de una forma soluble de la proteína F (FTM-), con distintos grados de procesamiento proteolí- PALABRAS CLAVE: Influenza, NS1, tico o mutantes de la FTM- en los que los sitios Interferón de corte I y/o II se habían cambiado. Los resultados obtenidos indican que efectivamente CP/148 el sitio de corte II de la proteína FTM- tiene un papel esencial en la unión de esta proteína a Relevancia de los sitios de corte los proteoglicanos de la superficie celular. Ade- proteolítico de la proteína de fusión más, se ha observado que esta propiedad de del virus respiratorio sincitial (VRS) interaccionar con glicosaminoglicanos se pue- para su unión a proteoglicanos de transferir a una proteína FTM- del virus Sen- de la superficie celular dai (VSe), injertando en esta proteína el motivo de doble corte proteolítico de la proteína F del Trento A.*, Rawling J., García Barreno VRS. Asimismo, virus Sendai recombinantes B., Cano O., Melero J. A. en los que la proteína F ha sido modificada Unidad de Biología Viral. Centro para incorporar el doble procesamiento pro- Nacional de Microbiología y CIBER de teolítico de la proteína F del VRS son capaces Enfermedades Respiratorias, Instituto de unirse a proteoglicanos e infectar células de Salud Carlos III, Madrid (1) independientemente, al menos en parte, de la unión de la proteína HN del VSe a ácido siálico. El virus respiratorio sincitial (VRS) es capaz de Todo esto sugiere que la regulación del proce- replicar en cultivos celulares en ausencia de la samiento proteolítico de la proteína F del VRS proteína de unión al receptor (G). Es decir, la puede ser un mecanismo que permita la inte- proteína de fusión (F), además de promover la racción de esta proteína con proteoglicanos de fusión de las membranas del virus y de la célu- la superficie celular y suplantar así a la proteína la, es capaz de suplir la carencia de la proteína de unión. Ese mecanismo puede estar también G para unir el virus a la superficie celular. Se relacionado con la regulación de la activación ha descrito que esta interacción está mediada de la proteína F del VRS para iniciar el proceso por proteoglicanos. La proteína F del VRS se de fusión de membranas. sintetiza como un precursor inactivo (F0) que posteriormente se procesa proteolíticamente PALABRAS CLAVE: Virus Respiratorio en dos sitios multibásicos RARR-109 (sitio I) Sincitial, Proteína de fusión, unión a y KKRKRR-136 (sitio II) para dar lugar a las proteoglicanos cadenas F1 y F2 que se mantienen unidas co-

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CP/149 PM. Ambas deleciones mantienen la pauta de lectura de la proteína. La región contigua a la Detección y caracterización de la deleción en el ARN-D1 es rica en T mientras población de haplotipos de ARNs que en el ARN-D2 aparece una repetición de defectivos generados por un aislado la secuencia GAAA. Además, ambas zonas del virus del moteado de la parietaria están altamente estructuradas, lo que podría

(1) explicar el salto de la RNA polimerasa a regio- Martínez Moncayo C , Rubio Miguélez nes distantes de la molécula de ARN dando L (2), Aramburu de Vega J (1), López (3) lugar a estos ARN-Ds. En las plantas donde del Rincón C , Soler Aleixandre S se detectó el ARN-D2, el haplotipo mayoritario (3), Galipienso Torregrosa L* (1) de éste tiene la misma secuencia nucleotídi- Departamento de Patología Vegetal (IRTA), ca que la del ARN parental. Sin embargo, en 08348 Cabrils (Barcelona) (1), Departamento las plantas donde se detectó el ARN-D1 no se de Protección Vegetal y Biotecnología (IVIA), da esta situación y el haplotipo mayoritario del 46113 Moncada (Valencia) (2), Departamento ARN-D1 tiene una secuencia idéntica a un ha- (3) de Biotecnología (COMAV), 46022 Valencia plotipo minoritario (4.4%) del ARN parental. La El virus del moteado de la parietaria (Parietaria identidad nucleotídica entre los haplotipos ma- mottle virus, PMoV), del género Ilarvirus (familia yoritarios del ARN-D1 y parental es del 94%. Bromoviridae), se aisló por primera vez en Italia Que nosotros sepamos, esta sería la primera a partir de plantas de parietaria (Parietaria offi- descripción de ARN-Ds en el género Ilarvirus y cinalis). Posteriormente se detectó en tomate de un ARN-D heterólogo con respecto al ARN (Solanum lycopersicum) y pimiento (Capsicum parental en virus de plantas. annuum), en los que causaba lesiones necróti- PALABRAS CLAVE: ARN defectivo (ARN-D), cas en hoja y fruto, afectando a la producción Haplotipo, PMoV de estos cultivos. El virus se transmite por po- len a través de diversos tipos de insectos y está distribuido en varios países de la cuenca medi- CP/150 terránea: Italia, Grecia, Francia y España. En este trabajo hemos detectado ARNs defectivos Evaluating the distribution of (ARN-Ds) en plantas de Nicotiana benthamiana mutational fitness effects forTobacco inoculadas con el aislado de PMoV de tomate etch potyvirus across host species T-32, procedente de Italia. Adicionalmente, he- Lalic J* (1), Pròsper À (1), Cuevas mos caracterizado la población de haplotipos JM (1), Elena SF (2) de estos ARN-Ds y de los ARNs parentales mediante el análisis de SSCP (single stranded IBMCP, CSIC-UPV, Valencia (1), IBMCP, CSIC- conformation polymorphism) y secuenciación UPV, Valencia, The Santa Fe Institute 1399 de la zona contigua a la delección de 100 clo- Hyde Park Road Santa Fe, NM 87501 USA (2) nes por planta, obtenidos a partir de productos Emergence of new epidemic viruses is demons- de RT-PCR. Mediante hibridación molecular en trated to be a critical issue of public health and Northern blot se detectó en algunas plantas un economic welfare. It is a complex, multilevel ARN defectivo (ARN-D1) que tenía una dele- problem that consists in acquisition of genetic ción de 144 nt en el gen que codifica la proteína variation by mutation or recombination within a de movimiento (PM) viral mientras que en otras virus population in the reservoir host that would plantas se detectó un ARN defectivo (ARN- enable the host-switch. Since mutation is the D2) con una deleción de 264 nt también en la key prerequisite to virus emergence, it is of

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major importance to gain more understanding could be explained by virus-host evolutionary of this topic. Changes at the genomic level that history. High infectivity, but low mean fitness directly affect fitness of an organism are called values for TEV within non-Solanaceae can be mutational fitness effects (MFE). MFE are usua- explained by lack of exploitable resources in- lly categorized as lethal, deleterious, neutral side of the infected atypical host. Low variance and advantageous, depending on their effect on implies stability of performance and signifies a fitness. In reality, this view of MFE is too simpli- greater ability of a virus to cope with the vaga- fied; their effects rather constitute a continuum ries of the environment, i.e. when facing multi- and are conditional to environment. Thus, in ple hosts. the light of evaluating the likelihood of a virus spilling over from its natural host to new ones, PALABRAS CLAVE: RNA virus emergence, we sought to answer the following question: by mutational fitness effects, host range knowing the distribution of MFE in the natural host, can we predict the shape and location of CP/151 the distribution in alternative hosts? Caracterización de los residuos To tackle it, we estimated the fitness effects of de las subunidades PA Y PB2 de 20 single-nucleotide substitution mutants of To- la polimerasa del virus de la gripe bacco etch potyvirus (TEV) across a range of implicados en la patogenicidad host species.Five plant species were TEV natural hosts, belonging to the Solanacea family, viral debida a la degradación de whereas other three were non-native hosts la RNA polimerasa II celular belonging to three other plant families. Viral fit- Llompart C. M.* (1), Rodríguez A. ness is approximated by the Malthusian growth (1), Kochs G. (2), Nieto A. (1) parameter within a host. Departamento de Biología Molecular y We found that fitness of virus genotypes within Celular, Centro Nacional de Biotecnología Solanaceae and non-Solanaceae showed diffe- C.S.I.C., Madrid (1), Department of Virology, rent patterns of distributions parameters. Expo- University of Freiburg, Alemania (2) sure of TEV genotypes to atypical hosts (non- Solanaceae) led to reduction of the mean viral Los virus de la gripe tipo A poseen un geno- fitness, while the variance remained constant. ma segmentado compuesto por ocho cadenas Within Solanaceae, the tail of the distribution is de RNA de cadena sencilla y polaridad negati- drawn out more to the left side, thus comprising more deleterious mutations. Non-Solanacea va, que codifican un total de 11 proteínas. Los had right-skewed distributions, containing a RNAs del virus se encuentran en forma de ribo- proportion of neutral, or possibly even, slightly nucleoproteínas (RNPs), complejos formados beneficial mutations. Overall, majority of mu- por los RNAs monocatenarios, recubiertos por tations were neutral in all the hosts examined, la nucleoproteína (NP) y las tres subunidades while deleterious mutational effects appeared in componentes de la polimerasa viral (PB1, PB2 low frequency (<20%). Lethal mutants were ex- y PA). Estas RNPs son las encargadas de rea- clusively found in two members of Solanaceae lizar los procesos de transcripción y replicación and no beneficial mutational effect was found in del RNA viral en el núcleo de la célula infecta- any of the host. da. A lo largo de la infección se observan tres ti- Observed differences in distributions of mutatio- pos de RNAs virales: los vRNAs genómicos, los nal fitness effects across heterogeneous hosts cRNAs y los mRNAs virales. Para la síntesis de

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los mRNAs virales se utilizan cap-oligonucleóti- CP/152 dos generados por la RNA polimerasa II (RNAP II) celular como iniciadores. La subunidad PB2 Líneas establecidas porcinas para el reconoce el cap de los extremos 5’ de los men- estudio de la infección y la inducción sajeros celulares y, a continuación, la actividad de citoquinas por el virus de la endonucleotídica presente en PA corta estos peste porcina africana (VPPA) RNAs a 10-13 nucleótidos de su extremo 5’ y de León Patricia * (1), Bustos Mª José (1), los utiliza como iniciadores. Martinez Alba (1), Gil Solange (2), Martins Carlos (2), L. Carrascosa Angel (1) Estudios previos del laboratorio mostraron que en el transcurso de la infección ocurre una de- Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Universidad gradación de la RNAP II, con la consecuente in- Autónoma de Madrid, Spain (1), Faculdade hibición de la transcripción celular mediada por de Medicina Veterinária, Universidad dicha polimerasa. Esta degradación es un pro- Técnica de Lisboa, Portugal (2) ceso general que ocurre con cepas virales de distinto origen exceptuando las cepas atenua- La célula blanco natural de la infección del Vi- rus de la peste porcina africana (VPPA) es el das como A/PR/8/34 (PR8). Existe una variante monocito-macrófago de cerdo, si bien muchos hipervirulenta de PR8 (hvPR8) que, a diferencia aislados virales naturales y de laboratorio se de la cepa atenuada (lvPR8), crece muy rápido han podido multiplicar en líneas celulares esen células infectadas, es más virulento en rato- tablecidas de mono (Hurtado et al., 2010), lo nes e induce la proteólisis de la RNAP II celu- que ha supuesto una inestimable ayuda para el lar. Utilizando virus recombinantes de hvPR8 y diagnóstico, titulación, producción y análisis de lvPR8, se determinó que las subunidades PA y estos aislados virales en el laboratorio. Sin em- PB2 de la polimerasa viral están implicadas en bargo, el estudio de la respuesta inmune y, más la degradación de la RNAP II. Los virus hvPR8 concretamente, de la inducción de citoquinas y lvPR8 difieren en las posiciones 193 y 550 en por los distintos aislados virales, requiere el uso la subunidad PA y en las posiciones 105, 456 de células de origen porcino. Como alternativa y 504 en PB2. El objetivo de este trabajo es el al uso de células primarias de cerdo (monocitos y macrófagos) para el estudio de la infección de caracterizar en cada una de estas proteínas viral proponemos el uso de líneas celulares es- los residuos que determinan que una cepa vi- tablecidas porcinas derivadas de macrófagos ral adquiera la capacidad proteolítica. Para ello de cerdo, cuya respuesta a la infección in vitro hemos generado virus recombinantes hvPR8 y por VPPA debe ser un reflejo fidedigno y, sobre lvPR8 conteniendo las correspondientes muta- todo, reproducible y fácilmente exportable, de ciones en las subunidades PA y PB2. Espera- la situación generada por el virus en la infec- mos poder adscribir el fenotipo de degradación ción natural in vivo. Mostraremos un estudio a un residuo particular de estas subunidades o comparativo de la infección por VPPA de líneas bien a una determinada combinación de ellos, celulares como IPAM, WSL y SAM, derivadas además de determinar la patogenicidad de los de macrófagos de cerdo (doméstico o salvaje), virus recombinantes que presenten capacidad analizando su susceptibilidad frente a diversos para inducir la degradación de la RNAP II. aislados del VPPA mediante la evaluación de la transcripción de genes virales, la síntesis de PALABRAS CLAVE: virus de la gripe, proteínas inducidas por la infección, y la pro- patogenicidad, polimerasa viral ducción de virus infectivo (titulada por plaqueo

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en células COS). En relación con la inducción IPBLN, CSIC,Granada (1), Centro de citoquinas porcinas, se comparará la trans- Nacional de Microbiología, Instituto de cripción de una serie de ellas (en paralelo con Salud Carlos III, Madrid (2), Institut für macrófagos alveolares de cerdo como células Virologie, University of Düsseldorf (3) blanco control) seleccionadas por su posible La activación de los genes del VIH-1 por la pro- valor pronóstico en relación con el grado de vi- teína viral Tat requiere de la presencia de facto- rulencia presentado por cada aislado viral: en res celulares específicos. Uno de ellos, el factor este sentido, se analizarán citoquinas como de transcripción TCERG1 (del inglés transcrip- IL-6, IL-12, IL-15, IL-1β, TNF-α, TGF-β, IFN-α e tion elongation regulator 1, también denomina- IFN-β, que han sido descritas como diferencial- do CA150), fue aislado mediante cromatografía mente inducidas en la infección de monocitos de afinidad con Tat. TCERG1 es una proteína porcinos por virus virulentos y atenuados (Gil nuclear cuya secuencia génica contiene nume- et al., 2008). La posible utilización de ensayos rosos dominios de interacción proteína-proteí- in vitro de perfil de citoquinas como alternativa na, algunos de los cuales se han definido en a las infecciones in vivo se evaluará en aisla- factores reguladores de la transcripción y el dos virales obtenidos en el campo y generados procesamiento de los mRNAs. TCERG1 tiene en el laboratorio para incrementar el grado de un efecto funcional específico sobre el promo- atenuación en virus parentales parcialmente vi- tor del VIH-1. Extractos nucleares de células rulentos. HeLa desprovistos de TCERG1 ven bloqueada - Hurtado, C., Bustos, M.J. and Carrascosa, su capacidad de activar los genes virales por A.L., 2010. The use of COS-1 cells for studies Tat y la sobre-expresión de TCERG1 en células of field and laboratory African swine fever virus produce una drástica inhibición en la actividad samples. J Virol Methods 164, 131-4. - Gil, S., del promotor viral, tanto en presencia como en Sepulveda, N., Albina, E., Leitao, A. and Mar- ausencia de Tat (1). La represión del promo- tins, C., 2008. The low-virulent African swine tor del VIH-1 es específica, ya que TCERG1 fever virus (ASFV/NH/P68) induces enhanced no afecta la actividad transcripcional de otros expression and production of relevant regula- promotores virales. La represión mediada por CA150/TCERG1 depende de la caja TATA del tory cytokines (IFN , TNF and IL12p40) on α α promotor del VIH-1 y esta inhibición se pro- porcine macrophages in comparison to the duce por una disminución de la capacidad de highly virulent ASFV/L60. Arch Virol 153, 1845- elongación de los complejos transcripcionales 54. (2). Ambos fenómenos, la dependencia de la PALABRAS CLAVE: virus peste porcina caja TATA y la inhibición de la elongación, se africana, citoquinas, grado de virulencia producen también en la activación de los genes del VIH-1 por la proteína Tat, lo cual indica un paralelismo funcional entre ambos facto- CP/153 res. TCERG1 interviene también en procesos El factor de elongación de la de splicing del mRNA. Nuestro grupo ha des- transcripción TCERG1 regula crito interacciones de TCERG1 con la maquinaria de splicing así como el requerimiento de el splicing alternativo y la este factor en procesos de splicing alternativo replicación del VIH-1 de genes celulares (3,4). En este Congreso, Montes M* (1), Coyras M (2), Montanuy I (1), describiremos el reclutamiento de TCERG1 a López-Huertas M.R (2), Mateos E (2), Asang los complejos de pre-iniciación y elongación C (3), Schaal H (3), Alcamí J (2), Suñé C (1) de la transcripción que regulan el promotor del

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VIH-1, la regulación del splicing alternativo del aim of this second evolution experiment was to virus por TCERG1 de una forma acoplada a la study how defective genomes evolved when transcripción y la importancia de TCERG1 en la complemented by host provided genes. To replicación viral. 1. Suñé, C., Hayashi, T., Liu, this end, the mutational spectrum in the rest of Y., Lane, W. S., Young, R. A., and Garcia-Blan- the genome was determined. How would this co, M. A. (1997) Mol Cell Biol 17, 6029-6039 2. big genomic perturbation affect the regulation Suñé, C., and Garcia-Blanco, M. A. (1999) Mol of expression and accumulation of all other vi- Cell Biol 19, 4719-4728 3. Sánchez-Alvarez, M., Goldstrohm, A. C., Garcia-Blanco, M. A., ral components? Five transgenic plants were and Suñé, C. (2006) Mol Cell Biol 26, 4998- inoculated with RNA from wildtype TEV and 5014 4. Sanchez-Alvarez, M., Montes, M., San- another five with TEV-?NIb. In total, these 10 chez-Hernandez, N., Hernandez-Munain, C., plants constituted the starting point for indepen- and Suñé, C. (2010) J Biol Chem 285, 15220- dent evolution lineages. Every 7 days, viruses 15233 were extracted and mechanically re-inoculated in order to perform batch serial passages. The PALABRAS CLAVE: TCERG1, splicing alternativo, replicación process of evolution ran for 30 passages, and every 10 passages, the genetic composition of the viral populations was characterized. In the CP/154 case of redundancy, no deletions were obser- Evolution of genetic and functional ved in the NIb gene. Furthermore, the spectrum redundancy in an RNA virus of mutation was composed in a large majority of Tromas N*, Prosper A, F. Elena S synonymous mutations. A completely different mutational profile was observed in the case of IBMCP,CSIC,Valencia (1) the complemented defective virus: a majority of The aim of this project is to evaluate the evolu- non-synonymous mutations was obtained. Cri- tion of genetic redundancy in a unique experi- tical TEV genome regions were also mutated as mental system: TEV and transgenic Nicotiana well as some well conserved proteolitic sites of tabacum expressing TEV replicase gene NIb the NIa protein. References: Li, X.H. & Carring- (Nt::NIb; Li & Carrington 1995). During infec- ton, J.C. 1995. Complementation of Tobacco tion of these plants, the NIb copy coded by the TEV genome is redundant with the NIb poly- etch potyvirus mutants by active RNA polyme- merase produced by the transgenic plant and rase expressed in transgenic cells. Proc. Natl. thus should experienced relaxed selection. In Acad. Sci. USA 92, 457-461. this specific case, we examined the impact of PALABRAS CLAVE: Tobacco Etch Virus, this functional redundancy on TEV genome evolution. Our working hypothesis was that the Evolution, Redundancy main factor of viral fitness, in our experimental system, is replication speed and thus selection CP/155 would favor shorter genomes that would replicate faster. Thus, a reduction of TEV genome Translational inhibition of APOBEC3G size should be expected during the evolution antiviral factor by HIV-1 Vif protein of TEV in Nt::NIb. In parallel, genotype TEV- DNIb, that lacks the entire NIb cistron, was Guerrero S.*, Mercenne G., also evolved in the same transgenic host. The Batisse J., Bernacchi S., Richer D., Marquet R., Paillart J-C.

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UPR 9002-CNRS, IBMC, Architecture PALABRAS CLAVE: Vif, APOBEC3G, & Reactivity of RNA, Université TRANSLATIONAL INHIBITION de Strasbourg, France. (1) The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is a small CP/156 basic protein essential for viral fitness and pa- thogenicity. Vif targets the cellular cytosine Caracterización de la respuesta deaminase, APOBEC3G (hA3G), which inhibits inmune antitumoral inducida por replication of HIV-1 by inducing extensive mu- un vector del virus del Bosque de tation (G to A) in (-) strand DNA during reverse Semliki que expresa interleuquina- transcription. Vif inhibits hA3G by inducing its 12 en tumores hepáticos degradation through the ubiquitin-proteasome pathway and by repressing its translation at the Quetglas JI, Ruiz-Guillén M*, Rodriguez- mRNA level. At the moment, very little is known Madoz JR, Bezunartea J, Casales E, about the translational repression of hA3G by Medina-Echeverz J, Hervás-Stubbs S, Vif and the mechanisms involved. Berraondo P, Prieto J, Smerdou C División de Terapia Génica y Hepatología, To address the role of Vif in the translational Facultad de Medicina, Centro para la regulation of hA3G, we first characterized Vif Investigación Médica Aplicada (CIMA), binding sites on the full-length hA3G mRNA Universidad de Navarra, Avenida de and on fragments corresponding to its coding Pío XII 55, 31008 Pamplona. (1) or unstranslated regions (UTR). Vif binding affinity is higher for the 3’-UTR than for the 5’-UTR, En estudios previos se observó que un vector even though this region contains at least one basado en el virus del Bosque de Semliki que high affinity Vif binding site. Several Vif binding expresaba interleuquina-12 (SFV-IL-12) tenía sites were mapped in these regions by enzy- capacidad para erradicar >90% de tumores matic footprinting. Secondly, we analyzed the subcutáneos MC38 de adenocarcinoma de co- effect of Vif on hA3G translation in an in vitro lon de ratón. Sin embargo, cuando los tumores transcription/translation assay and in HEK 293T fueron implantados en el hígado, la administra- cells in presence or absence of proteasome in- ción del vector provocó remisiones tumorales hibitors (MG132 and ALLN). Interestingly, these completas solamente en el 60% de los anima- experiments confirmed that Vif inhibits transla- les. Estos datos indicaban que las respuestas tion of hA3G mRNA and identified the 5’-UTR antitumorales dependen en gran medida del as a major element for this repression. entorno tumoral, siendo menos eficaces en el hígado.Con el fin de mejorar la eficacia del tra- Experiments are in progress to determine with tamiento en este órgano, se decidió caracteri- precision the motifs of the 5’-UTR involved in zar la respuesta inmune antitumoral en estos the translational inhibition of hA3G and clarify animales. Se inocularon ratones C57BL/6 que the impact of this translational repression in the portaban en el hígado tumores MC38 con una viral replication cycle. dosis intratumoral de 10e8 partículas virales de SFV-IL-12 o un volumen equivalente de salino This work is supported by a grant from the (control). A tiempos tempranos (1-4 días) todos French National Agency for Research on AIDS los animales tratados con vector presentaron and Viral Hepatitis (ANRS) to JCP, and by post- niveles séricos elevados de IL-12 e interferón doctoral and doctoral fellowships from ANRS gamma (IFNgamma), e infiltración tumoral de and SIDACTION to JB and SG, respectively. células CD3(+) y CD8(+). Aunque estos datos

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sugirieron la inducción de una respuesta inmune CP/157 antitumoral efectora, no permitieron determinar diferencias entre animales respondedores y no Virus West Nile (Nilo Occidental) respondedores, para lo cual se hicieron experi- circulantes en España e Italia (2007- mentos a tiempos más largos postratamiento. 2010): secuenciación completa y Se estudió la respuesta citotóxica frente a célu- análisis filogenético en comparación las MC38 mediante ensayos de in ‘vivo killing’ con otras variantes euro-mediterráneas y de ELISPOT de IFNgamma. En los animales (1) (1) tratados ambas respuestas fueron elevadas a Llorente F.* , Sotelo E. , Fernández- (1) (2) (3) los 8 días postratamiento, disminuyendo poste- Pinero J. , Vázquez A. , Moreno A. , (2) (3) (4) riormente de forma más pronunciada en anima- Herrero L. , Cordioli P. , Agüero M. , (2) (1) les no respondedores. Mediante citometría de Tenorio A. , Jiménez-Clavero M.A. flujo, y utilizando tetrámeros MHC I específicos Centro de Investigación en Sanidad Animal para un péptido de MC38, se observó que en del Instituto Nacional de Investigación y los animales tratados a 7-10 días postratamien- Tecnología Agraria y Alimentaria (CISA-INIA), to aparecía una población relativamente alta Valdeolmos (Madrid), España (1), Centro de linfocitos T CD8(+) específicos para MC38, Nacional de Microbiología, Instituto de Salud que en su mayor parte adquirieron el fenotipo Carlos III, Majadahonda (Madrid), España CD62L(-), característico de células T efectoras (2), Istituto Zooprofillattico Sperimentale Della de memoria. Esta población apareció antes en Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), animales que respondieron al tratamiento. Se Brescia, Italia (3), Laboratorio Central de (4) realizaron también estudios de infiltrados celu- Veterinaria, Algete (Madrid), España. lares por citometría de flujo en hígado, bazo y tumor, observándose profundos cambios en las El virus West Nile (WNV) es un flavivirus per- distintas poblaciones del sistema inmune entre teneciente al grupo de la Encefalitis Japonesa el grupo de animales tratados y control a día 4 que se mantiene en un ciclo enzoótico entre tras el tratamiento. A día 13, se pudieron apre- aves (reservorio viral) y mosquitos (vector). Es ciar cambios entre los animales que habían el causante de una zoonosis grave en huma- respondido y los que no, entre los que destacó nos (fiebre/encefalitis por WNV) causando tam- un aumento significativo del receptor alfa de bién enfermedad en caballos. En los últimos 15 IL-15 en linfocitos T CD8(+) de animales res- años ha aumentado rápidamente su distribu- ción geográfica. En Europa se han incremen- pondedores. Estudios de depleción mostraron tado en los últimos años el número de brotes que las células T CD8(+) son indispensables y su virulencia, aumentando los casos clínicos para la eficacia del tratamiento mientras las en humanos y caballos, así como la mortalidad células T CD4(+) solo tienen un papel parcial. en aves silvestres. El primer caso descrito en Estos datos indican que aunque el tratamiento España de fiebre/encefalitis por WNV se dio en intratumoral con el vector SFV-IL12 induce una una persona infectada en Extremadura en el potente respuesta de células T CD8(+) especí- año 2004. En muestras de águila imperial reco- ficas contra el tumor, el mantenimiento de una gidas en Castilla-La Mancha entre 2001 y 2005 población de linfocitos efectores de memoria es se demostró la presencia del virus por RT-PCR. importante para conseguir remisiones comple- El primer aislamiento del WNV en España se tas en tumores hepáticos. obtuvo a partir de águilas reales enfermas pro- PALABRAS CLAVE: Alfavirus, Terapia cedentes de Castilla-La Mancha en 2007. En Génica, Cancer 2010 España sufrió la mayor incidencia de en-

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fermedad por WNV producida hasta el momen- CP/158 to, dándose desde agosto hasta diciembre 36 brotes en Andalucia afectando a 44 caballos (9 Nuevo flavivirus en Europa: brote muertes), con 2 casos clínicos detectados en de virus Bagaza en perdices y humanos. En Italia, entre los años 2008 y 2010 faisanes en el sur de España, 2010 ha ocurrido un elevado número de brotes, principalmente en el noreste del país, con 80 ca- Agüero M. (1), Fernández-Pinero J. (2), sos clínicos en caballos y 30 en humanos. Los Buitrago D. (1), Sánchez A. (1), Elizalde objetivos del presente trabajo han sido 1) ob- M. (2), San Miguel E. (1), Villalba R. (1), tener las secuencias nucleotídicas completas Llorente F. (2), Jiménez-Clavero M.A.* (2) de WNV detectados en España e Italia entre Laboratorio Central de Veterinaria, Algete, 2008 y 2010 y 2) estudiar las relaciones filoge- España (1), Centro de Investigación en Sanidad néticas existentes entre ellos y respecto a otros Animal, CISA (INIA), Valdeolmos, España (2) aislados del Mediterraneo occidental, África y Norteamérica. Se han obtenido las secuencias En las últimas dos décadas, varias enferme- nucleotídicas completas de WNV correspon- dades transmitidas por mosquitos, y, en par- dientes a aislados y muestras de campo, com- ticular, aquellas causadas por flavivirus, han prendiendo: muestra de encéfalo de un caballo ocasionado invasiones remarcables de territo- que sucumbió a la enfermedad (Cádiz, 2010), rios más allá de su área de distribución tradi- pool de mosquitos positivos (Huelva, 2008), y cional. El virus West Nile (Nilo Occidental) en cuatro aislados de WNV procedentes de aves los Estados Unidos, el virus Usutu en Europa y silvestres (un arrendajo, dos urracas y una ga- el virus de la encefalitis japonesa en Australia viota) recogidas durante los brotes de Italia de son ejemplos notables de estos “saltos” de fla- 2008 y 2009. Como resultado, el estudio filo- vivirus entre continentes. Describimos aquí un genético realizado con las nuevas secuencias brote de enfermedad en aves silvestres (perdi- completas y las ya disponibles, revela que los ces y faisanes) que se produjo en la provincia virus analizados de la zona del Mediterráneo de Cádiz en septiembre de 2010, causada por occidental desde 1996 constituyen un grupo un flavivirus, el virus Bagaza, que nunca antes monofilético, con dos ramas principales, una había sido detectado en el continente europeo. agrupa la mayoría de las secuencias, incluyen- El virus Bagaza (BAGV) fue aislado por primera do la del caballo afectado de Cádiz (2010) y los vez en la localidad de Bagaza, República Cen- virus italianos de los brotes de 2008 y 2009, troafricana, en 1966, a partir de un pool de mos- y otra que comprende los aislados de águilas quitos Culex sp. Posteriormente, fue aislado de reales de Castilla-La Mancha (2007), la se- mosquitos en diversos países de África Occi- cuencia de mosquito de Huelva (2008) y un ais- dental y en la India, donde las pruebas seroló- lado equino italiano de 1998. Estos resultados gicas indican que este virus podría ser capaz sugieren que desde 1996 en el Mediterráneo de infectar a humanos, aunque su patogenici- occidental ha habido una única introducción del dad en esta especie sigue siendo incierta. En virus, seguida de una evolución en dos varian- septiembre de 2010 un evento de mortalidad tes muy relacionadas pero distinguibles genéti- inusual en perdiz roja (Alectoris rufa) que afec- camente. Representantes de ambas variantes han circulado en España e Italia en diferentes tó también en menor medida a faisán común momentos. (Phasianus colchicus) causó alarma en diversos cotos de caza de la provincia de Cádiz. Los PALABRAS CLAVE: Virus West Nile, signos clínicos observados incluían debilidad, Mediterraneo, filogenia postración, descoordinación motora, pérdida

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de peso y diarrea blanquecina. El brote coinci- Pedrera M.* (1), Pérez de Diego A.C. (2), dió con los primeros casos de fiebre/encefalitis Gómez-Villamandos J.C. (1), Sánchez- por virus West Nile en caballos en España. Se Vizcaíno J.M. (2), Rodríguez-Sánchez B. (2), analizaron muestras de aves afectadas, resul- Pleguezuelos F.J. (1), Sánchez-Cordón P.J. (1) tando negativas a virus West Nile por RT-PCR Dpto. Anatomía y Anatomía Patológica específica para los linajes 1 y 2; sin embargo se Comparadas, Facultad de Veterinaria, obtuvieron fragmentos de amplificación especí- Universidad de Córdoba (1), Dpto. ficos en una RT-PCR genérica para flavivirus, Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, lo que indicaba que un flavivirus no WNV podía Universidad Complutense de Madrid (2) ser el causante de la mortalidad observada. La secuencia de nucleótidos obtenida a partir del La lengua azul (LA) es una enfermedad infec- fragmento amplificado en esta RT-PCR genéri- ciosa no contagiosa de rumiantes producida ca mostraba una gran similitud con el virus Ba- por un virus RNA del género Orbivirus (familia gaza. Las muestras positivas fueron inoculadas Reoviridae) del que se conocen al menos 25 tanto en cultivos celulares (Vero, BHK) como en serotipos diferentes, entre los que no existe in- huevos de gallina embrionados, confirmándose munidad cruzada. por RT-PCR el aislamiento del virus en ambos sistemas. Se determinó la secuencia nucleotí- El objetivo de este trabajo fue realizar un es- dica completa del virus Bagaza causante del tudio comparativo de clínica, lesiones, viremia brote, a partir de muestras de tejidos infectados y respuesta de anticuerpos en ovejas Merinas de una de las perdices que sucumbieron a la inoculadas con los serotipos 1 y 8 del virus de enfermedad. Se construyó el árbol filogenético la LA. con la secuencia completa del BAGV de este brote y otras 32 secuencias completas abar- Se emplearon 19 ovejas negativas al vLA y a cando una amplia gama de flavivirus, entre anticuerpos. 16 ovejas (8 por grupo) fueron ellos dos representantes del BAGV disponibles inoculadas por vía subcutánea frente a los seen GenBank. El análisis filogenético mostró rotipos 1 (cepa BTV-1/AGL2006/01) y 8 (cepa una estrecha relación con los virus Bagaza de BTV-8/BEL2006/01). Los animales fueron ob- la República Centroafricana y la India (94,1% y jeto de un seguimiento clínico diario y toma de el 92,8% de identidad, respectivamente). Como la temperatura rectal. Se tomaron muestras de conclusión, el virus Bagaza, un flavivirus hasta sangre entre los 2 y 15 días post inoculación ahora nunca encontrado en Europa, ha sido de- (dpi) para determinar la aparición de viremia y tectado y aislado, por vez primera en España, la respuesta de anticuerpos. Los animales fue- afectando letalmente a aves silvestres. ron sacrificados en grupos de 2 a los 3, 6, 12 y 15 dpi. Durante la necropsia se llevó a cabo PALABRAS CLAVE: Virus Bagaza, flavivirus, una evaluación macroscópica de las lesiones. perdiz Pese a que la presencia del virus en sangre se confirmó mediante RT-PCR desde los 3 dpi CP/159 para ambos serotipos, el número de animales Estudio comparativo de las formas virémicos fue mayor frente al serotipo 8. Sin clínicas y de la respuesta inmune en embargo, el periodo de viremia fue más prolon- gado en los animales inoculados con el seroti- ovejas inoculadas con los serotipos po 1, presentando también mayores niveles de 1 y 8 del virus de la lengua azul expresión del virus.

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La cinética de anticuerpos inducida por ambos Romero-Palomo *F (1), Sánchez-Cordón serotipos presentó diferencias, siendo más pre- P.J. (1), Pedrera M. (1), Risalde M.A. (1), coz en el caso de los animales inoculados con Molina V. (1), Sánchez-Vizcaíno J.M. el serotipo 8, alcanzándose además en este (2), Gómez-Villamandos J.C. (1) grupo niveles más elevados en fechas más Dpto. de Anatomía y Anatomía Patológica tempranas. Comparadas, Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba (1), Dpto. de Los animales inoculados con el serotipo 1 mos- Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. traron una clara hipertermia desde fechas más Universidad Complutense de Madrid (2) tempranas (4 dpi) que los inoculados con el serotipo 8, alcanzando temperaturas más eleva- La Peste Porcina Africana (PPA) es una enfer- das (41.53ºC) que se mantuvieron durante un medad hemorrágica producida por un virus de la mayor periodo de tiempo. Además, los sínto- familia Asfarviridae, que afecta exclusivamente mas clínicos fueron más intensos y más prolon- a animales de la familia Suidae, que constituye gados frente al serotipo 1, observándose una un grave peligro para la ganadería porcina de forma subclínica de enfermedad que pasaría la UE. Según su virulencia, los aislados del vi- casi desapercibida en el caso de los animales rus pueden ser de alta, de moderada o de baja inoculados con el serotipo 8. virulencia, desarrollando distintas formas clíni- cas, siendo las agudas y subagudas las que se Ambos serotipos dieron lugar a la aparición producen con mayor frecuencia y las que dan de lesiones macroscópicas similares en las una sintomatología más intensa, con lesiones mismas fechas, que fueron menos frecuentes hemorrágicas generalizadas. El objetivo de en los animales inoculados con el serotipo 8, este trabajo fue caracterizar la lesiones histo- destacando la presencia de lesiones de tipo patológicas y la distribución de antígeno vírico vascular (edema y hemorragias) ligeramente en tejidos de cerdos inoculados con el aislado mas intensas en los animales inoculados con Kenya/05 del virus de la peste porcina africana el serotipo 1. (vPPA), cuyos mecanismos patogénicos per- En conclusión, nuestros resultados ponen de manecen sin aclarar. Para ello se inocularon manifiesto la existencia de unos mecanismos 10 animales cruzados de raza blanca por vía patogénicos similares para ambos serotipos, intranasal con 10 Unidades Hemoadsorbentes así como una menor capacidad patógena del del aislado Kenya/05, mientras que 2 animales serotipo 8 con respecto al serotipo 1. fueron utilizados como controles no inoculados. Los animales murieron en el transcurso de la (Proyecto financiado por el MICINN AGL2009- enfermedad o fueron sacrificados a los 36 días 13174-C02-01) post-inoculación (dpi). Durante este periodo se tomaron muestras de sangre a fin de determi- PALABRAS CLAVE: Lengua azul, Serotipo 1 nar la presencia del virus mediante PCR. Tras y 8, Oveja la muerte o sacrificio de los animales, se llevó a cabo una valoración de las lesiones macros- CP/160 cópicas y la toma de muestras de tejidos que fueron procesadas de forma rutinaria para su Estudio histopatológico y distribución estudio histopatológico y para la detección de de antígeno en tejidos de cerdos antígeno vírico mediante técnicas inmunohisto- inoculados con el aislado Kenya/05 químicas (AcMo Vp73, Ingenasa, Madrid). Cin- del virus de la peste porcina africana co animales murieron entre los 12 y 21 dpi,

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mostrando lesiones características de la PPA Centro de Biología Molecular Severo (esplenomegalia hiperémica, linfadenitis he- Ochoa, Madrid (1), Centro Nacional morrágica, petequias y equimosis en serosas y de Biotecnología, Madrid (2) mucosas de distintos órganos). Los 5 animales La proteína no estructural 3A del virus de la restantes se recuperaron clínicamente y tras fiebre aftosa (VFA) está formada por 153 ami- su sacrificio a los 36 dpi no se observaron le- noácidos dentro de los cuales se encuentra una siones macroscópicas destacables. Todos los región de 28 residuos hidrofóbicos que se pre- cerdos (excepto uno) permanecieron virémicos dice constituyen un dominio transmembrana. hasta su muerte o sacrificio. Los animales re- Basándose en datos estructurales de Poliovi- cuperados presentaron un menor número de rus, se predice que el extremo N-terminal de la lesiones histopatológicas que los animales que proteína 3A de aftosa presenta dos regiones de murieron en el transcurso de la enfermedad, los alfa-hélices que forman una horquilla en su for- cuales mostraron lesiones de mayor intensidad ma monomérica y que podrían mediar la forma- características de la PPA. Destacó la presen- ción de homodímeros mediante interacciones cia de hiperemia y hemorragias de forma ge- hidrofóbicas de los residuos mas expuestos. El neralizada, depleción en órganos linfoides extremo C-terminal de ésta proteína es el mas junto a imágenes de picnosis, fragmentación y largo dentro de la familia Picornaviridae. En el macrófagos de cuerpo tingible características presente trabajo se ha caracterizado la unión de la proteína 3A a fracciones de membranas de apoptosis, así como infiltrados inflamato- en lisados de células Vero transfectadas transi- rios mononucleares. En cuanto a la detección toriamente, mediante tratamientos bioquímicos inmunohistoquímica del virus, la presencia de y separación por centrifugación de fracciones células infectadas (principalmente macrófagos) solubles e insolubles, viendo que se compor- en los tejidos de los animales que murieron fue ta como una proteína periférica de membrana. muy elevada, siendo escasa en los animales También se estudió su posible asociación con que sobrevivieron. Estos resultados ponen de membranas ricas en dominios resistentes a de- manifiesto que el aislado Kenya/05 del vPPA tergentes no iónicos (rafts) mediante ultracen- indujo la aparición tanto de formas subagudas trifugación en gradientes de sacarosa en pre- de la enfermedad como de formas subclínicas sencia de 0,5% Tritón X-100, descartándose que podrían pasar desapercibidas, en las que dicha asociación. Por otra parte, se han sinteti- los animales permanecieron virémicos. Finan- zado péptidos sintéticos del extremo N-terminal ciado por el Proyecto Europeo ASFRISK del VII correspondientes a la secuencia de la proteí- Programa Marco (KBBE 211691) na wild type (wt) y con mutaciones puntuales en aminoácidos que se predice participan en PALABRAS CLAVE: peste porcina africana, la dimerización. Analizando éstos péptidos en histopatología, inmunohistoquímica electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, nativas, wes- CP/161 tern blots con anticuerpos frente al extremo amino generados en el laboratorio y tinción con Caracterización de la proteína 3A coomasie, se ha evidenciado la formación de del VFA: su unión a membranas dímeros y multímeros en el wt mientras que en y su capacidad de dimerizar los mutantes no se visualizan posibles dímeros ni multímeros. Estos resultados sugieren que el González Magaldi M* (1), extremo amino de 3A dimeriza y multimeriza y Kremer L (2), Sobrino F (1) que las posiciones 38 y 41 son fundamentales

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para dichas interacciones. Se está utilizando y mostraron un patrón anómalo de síntesis de una técnica de detección de interacciones de proteínas virales en ensayos de traducción in proteínas mediante el uso de anticuerpos pri- vitro. En este trabajo se describe que la inser- marios conjugados a pequeñas sondas de ADN ción de una única glicina en la posición 151 que al encontrarse lo suficientemente cerca permite recuperar virus infeccioso. De esta ma- permiten su amplificación y posterior detección nera, a diferencia de lo observado con la doble fluorescente del producto amplificado. Con ésta inserción y la inserción en el residuo 5, el RNA técnica se ha confirmado mediante microscopía mutante (3A151?G) obtenido produjo virus inde fluorescencia la presencia de homodímeros fecciosos en células BHK-21, aunque su infecti- en células transfectadas con la proteína com- vidad específica se vio disminuida con respecto pleta así como en células infectadas. al wt en dos órdenes de magnitud. Así mismo, la cinética de producción viral del mutante en PALABRAS CLAVE: proteína 3A, dímeros, cultivos celulares estuvo retrasada respecto a membranas la del virus wt. Sin embargo, la mutación introducida no permitió el progreso de la infección CP/162 en ratones lactantes, estimado como letalidad. El análisis de las proteínas virales producidas La introducción de una inserción en en células BHK-21 mostró que para el mutan- el extremo carboxilo terminal de la te 3A151?G el procesamiento de 3ABBB rinde proteína 3A del virus de la fiebre aftosa mayoritariamente 3AB como producto final, ob- permite recuperar virus infectivo servándose solo trazas de 3A, mientras que en el caso del virus wt es 3A el principal produc- Vieira Prado Y. A.* (1), Sobrino to final detectado. La inserción introducida se Castelló F. (2), Rosas Kuz M. F. (1) mantuvo tras cinco pases seriados. Los títulos Departamento de Virología y Microbiología, virales, los niveles de RNAv (medidos por RT- Centro de Biologia Molecular ‘Severo Ochoa’, PCR Real Time) y las imágenes obtenidas por Madrid (1), Departamento de Virología y inmunofluorescencia, apoyan también que esta Microbiología, Centro de Biologia Molecular inserción genera virus viables aunque con una ‘Severo Ochoa’, MadridDepartamento de menor capacidad de multiplicación. Estos da- Biología Molecular, Centro de Biologia tos sugieren que el mantenimiento estricto de la Molecular ‘Severo Ochoa’, Madrid (2) secuencia del extremo carboxilo terminal de 3A El procesamiento efectuado por las proteasas no es esencial para la multiplicación del VFA en virales de la única poliproteína del virus de la cultivos celulares. fiebre aftosa (VFA), generada por la traducción PALABRAS CLAVE: Aftosa, Proteínas no del RNA viral, es dependiente de la secuencia estructurales, Mutantes de aminoácidos flanqueantes a los puntos de proteolisis. La proteína no estructural 3A (de CP/163 153 aminoácidos) es esencial para la viabilidad del VFA. Como parte de las estrategias Propiedades biológicas del seguidas para su caracterización funcional se virus de la pseudorrabia (PRV- produjeron plásmidos que permitían obtener BT90) cuya replicación es RNA viral que codificaba proteínas 3A con in- inducible con tetraciclina serciones de glicina en los residuos aminoací- dicos 5 y 151 o con una única inserción en el Lerma L* (1), Gadea I (2), Varela L (1), residuo 5. Estos RNAs no fueron infecciosos Muñoz AL (1), Martín B (1), Tabarés E (1)

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Departamento de Medicina Preventiva, CP/164 Salud Pública y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid, Interacción del receptor de estrógenos Madrid (1), Servicio de Microbiología Médica, (ESRα) con la ARN-polimerasa del Fundación Jiménez Díaz, Madrid (2) VHC analizada mediante FRET El virus de la pseudorrabia (PRV) pertenece Ruiz-López E* (1), Hillung J (2), a la familia Herpesviridae dentro del orden de Bellón-Etxeverría I (3), Mas A (3) los Herpesvirales. Los herpesvirus presen- Centro Regional de Investigaciones tan un ciclo replicativo que puede dividirse en Biomédicas (CRIB)Universidad de Castilla tres fases inmediatamente temprana (IE o α), la Mancha (UCLM) C/ Almansa 14 02006 Albacete, SPAIN (1), Centro Regional temprana (E o β) y tardía (L o γ), las cuales están reguladas en cascada temporalmente. El de Investigaciones Biomédicas (CRIB) número de genes IE depende de cada virus y Universidad de Castilla la Mancha (UCLM) C/ Almansa 14 02006 Albacete, SPAIN codifican proteínas que son factores transcrip- (2), Centro Regional de Investigaciones cionales que inducen la expresión de los genes Biomédicas (CRIB) Universidad de E y L., por lo que controlan el ciclo replicativo Castilla la Mancha (UCLM) C/ Almansa de estos virus. PRV sólo tiene un gen IE, pre- 14 02006 Albacete, SPAIN (3) sente en dos copias en el genoma, que codifica para la proteína IE180. En el presente trabajo, El Virus de la Hepatitis C (VHC) infecta a más se han estudiado las propiedades biológicas de 200 millones de personas en el mundo y es del virus recombinante PRV-BT90, en el que el el principal causante de carcinoma hepatocelu- promotor del gen IE180 ha sido reemplazado lar. Es un virus ARN de cadena positiva que replica su genoma en complejos replicativos (CR) por el promotor inducible por tetraciclina (Ptet), asociados a micro-vesículas derivadas del re- por lo que todo el ciclo replicativo es regulado tículo endoplasmático. La proteína viral encar- por tetraciclina o doxiciclina. La producción de gada de la replicación del genoma es NS5B, la virus en células Hela Tet-Off (con presencia del ARN polimerasa dependiente de ARN. Varias transactivador tTA) fue similar al virus parental son las proteínas celulares que se han relacio- vBecker2, sin embargo la producción de virus nado con la replicación del VHC, entre ellas el en células Vero fue al menos 100 veces inferior receptor de estrógenos α (ESRα), cuyo domi- a la del virus parental. La formación de placas nio C coprecipita con NS5B. Se ha descrito que en células Hela Tet-Off fue inhibida por la pre- ESRα potencia la presencia de NS5B en los sencia de doxiciclina. La expresión de la pro- CR, actuando como regulador de la replicación teína IE180 bajo control del promotor Ptet trae viral. Dos mutantes del dominio C, en los que se reemplazó la secuencia salvaje IRK (resi- consigo la pérdida de la virulencia en ratones duos 255-257) y DRR (residuos 258-260) por respecto al virus parental, aumentando la DL50 TGT (mutante 255M) y ANT (mutante 258M) de 178 CTDI50 a más de 106 CTDI50. Dada mostraron una afinidad por NS5B disminuida la baja virulencia, este virus podría ser usado y, en paralelo, una estimulación debilitada de como cooperador para la producción de ampli- la replicación del VHC. El papel jugado por el cones de PRV en gran escala. ESRα en el ciclo viral del VHC lo convierte en potencial diana para nuevos tratamientos anti- PALABRAS CLAVE: PRV, Tetraciclina virales.

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El objetivo del presente trabajo es el análisis CP/165 de la interacción ESRα-NS5B mediante Förs- ter-resonance-energy-transfer (FRET). Para Efecto de la proteína IE180 del ello se fusionaron la polimerasa NS5B Δ21 y virus de la pseudorrabia sobre el dominio C del ESRα con las proteínas fluo- la actividad de los promotores rescentes cyan y citrina. También se obtuvie- tumorales humanos hTERT y CEA ron las proteínas de fusión ESR?(255M)-cyan y ESR?(258M)-citrina correspondientes a los Lerma L*, Torres M, Martín B, Tabarés E mutantes 255M y 258M, respectivamente. Departamento de Medicina Preventiva, Salud Posteriormente se clonaron en un vector de Pública y Microbiología, Facultad de Medicina, expresión bacteriano, pDEST14, se sobre- Universidad Autónoma de Madrid, Madrid (1) expresaron y purificaron a homogeneidad mediante cromatografía de afinidad. La interacción El virus de la pseudorabia (PRV), perteneciente de las diferentes proteínas de fusión se analizó a la familia Herpesviridae, orden Herpesvirales, en ensayos de FRET combinando cantidades ha sido propuesto para uso como vector en equimolares de NS5B-cyan o NS5B-citrina con terapia génica humana y en viroterapia en el las diferentes construcciones del dominio C del tratamiento del cáncer, dado que puede tener ESRα fusionadas a citrina o cyan, respectiva- ventajas sobre herpes simplex tipo 1 (HSV-1) mente. por la ausencia de virulencia, recombinación y seroprevalencia en la población humana. Du- Los resultados obtenidos confirmaron la inte- rante la infección productiva, los genes de los racción de NS5B con el dominio C del receptor virus herpes son expresados en tres fases de estrógenos α. Cuando se comparó la inte- temporalmente ordenados en genes inmediata- racción de NS5B con el dominio C del ESRα mente tempranos (IE) o genes alfa, tempranos salvaje respecto a los mutantes 255M y 258M, (E) o genes beta y tardíos (L) o genes gamma. observamos una menor interacción de éstos Los genes IE son factores transcripcionales con NS5B. Además, esta interacción es depen- que inducen la expresión de los genes E y L. diente de fuerza iónica ya que a mayores con- PRV tiene un sólo gen IE (IE180) mientras que centraciones de NaCl menor es la interacción HSV-1 tiene seis, alfa0, alfa4, alfa22, alfa27, observada mediante FRET. alfa47 y US1.5, siendo alfa4 el que codifica la proteína reguladora más importante (ICP4). En conclusión, en este estudio hemos puesto Las proteínas IE180 e ICP4 muestran alto nivel a punto una metodología basada en FRET que de similaridad en su secuencia proteica impli- permite analizar de manera cuantitativa la inte- cando analogías funcionales entre ellas y algu- racción ESR?-NS5B. Datos previos publicados nas pueden intercambiarse entre sus virus. En por otros grupos de investigación sugieren que este trabajo se analiza el efecto la proteína la interrupción de la interacción ESR?-NS5B IE180 sobre la actividad de los promotores de podría convertirse en una futura vía para com- los genes de la telomerasa humana (hTERT) batir la infección por VHC. Por tanto, mediante y del antígeno carcinoembrionario (CEA). Para esta tecnología podemos confirmar la interac- ello, mediante PCR y a partir de DNA de cé- ción del receptor de estrógenos α con NS5B así lulas HeLa y de amnios humano, se amplifica- como analizar de manera cuantitativa las condi- ron los promotores hTERT y CEA, respectiva- ciones en las que se produce. mente, y se comprobó su actividad mediante la expresión de la proteína IE180 (plásmidos PALABRAS CLAVE: VHC, Polimerasa, pATER180 y pCEA180) y de la expresión de la Receptor de estrógenos

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proteína EGFP usada como marcador (plásmi- los aislados que superan la resistencia Sw-5 dos pZTER-GF y pCEA-GF). La proteína IE180 de tomate han estado restringidos a dos co- (expresada bajo control del promotor induci- marcas de la provincia de Barcelona (alrededor ble por tetraciclina, plásmido pAZT180) inhibe de unos 900 Km2), en donde también se han la expresión del promotor de la telomerasa e encontrado aislados de TSWV incapaces de induce la expresión del promotor del antígeno infectar tomate resistente. El análisis de las se- carcinoembrionario, mientras la ICP4 de HSV-1 cuencias nucleotídicas de estos aislados reveló induce la expresión de ambos promotores. Los una elevada diversidad genética en esta pe- plásmidos pATER180 y pCEA180 serán utiliza- queña área que fue equivalente a la diversidad dos en la obtención de virus oncolíticos. de TSWV en todo el mundo, así como una flujo PALABRAS CLAVE: PRV, hTERT, CEA genético elevado dentro de estas comarcas y limitado con otros países. La caracterización biológica de algunos aislados sugiere que no CP/166 hay correlación entre la capacidad de superar Caracterización molecular y la resistencia Sw-5 de tomate y la capacidad de biológica de aislados españoles del multiplicación del virus en algunos huéspedes, virus del bronceado que superan Datura stramonium, tomate no resistente y pimiento, así como en la transmisión por el trips la resistencia Sw-5 de tomate Frankliniella occidentalis. Debreczeni D.E. (1), Aramburu J. (2), López C. (3), Belliure B. (4), Galipienso PALABRAS CLAVE: emergencia, Tospovirus, L. (2), Soler S. (3), Rubio L.* (1) Bunyaviridae IVIA, 46113 Moncada, Valencia (1), IRTA, 08348 Cabrils, Barcelona (2), COMAV- CP/167 UPV, 46022 Valencia (3), CIBIO-UA, 03690 San Vicente del Raspeig, Alicante (4) Relaciones filogenéticas dentro del género Fabavirus El virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV) causa grandes pér- Rangel E.A.*, Ferriol I., Rubio L. didas económicas en diversos cultivos agríco- IVIA, 46113 Moncada, Valencia (1) las de todo el mundo. El control de la enfermedad es muy difícil dado el gran número de El género Fabavirus, subfamilia Comovirinae, especies vegetales susceptibles al virus que familia Secoviridae está compuesto de cuatro actúan como reservorio, así como su rápida y especies: El virus 1 del marchitamiento del eficiente dispersión por un grupo de insectos haba (Broad bean wilt virus 1, BBWV-1), el vi- denominados trips. En tomate, el mayor éxito rus 2 del marchitamiento del haba (BBWV-2), se consiguió mediante la incorporación del gen el virus del mosaico suave de la ortiga blanca Sw-5 en variedades comerciales de tomate que (Lamium mild mosaic virus, LMMV) y el virus confiere resistencia contra un amplio espectro del mosaico de la gentiana (Gentian mosaic de aislados de TSWV. Sin embargo, en algu- virus, GeMV). La secuencia nucleotídica de nos países han aparecido aislados de TSWV varios aislados de BBWV-1, BBWV-2 y GeMV capaces de superar esta resistencia al cabo de han sido determinadas, pero no se conoce nin- unos años de cultivar variedades de tomate con guna secuencia de LMMV. En este trabajo, se este gen de resistencia. En España esto ocurrió determinó la secuencia nucleotídica del aislado en Barcelona en el año 2002 y desde entonces de LMMV PV-0455 de la colección alemana de

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microorganismos y cultivos celulares DSMZ y días se evaluaron la sintomatología (intensidad se comparó con la secuencia de los otros fa- y número de plantas con síntomas), así como bavirus. Para ello se inferieron las relaciones la infectividad del virus (tasa de infección y acu- filogenéticas de aislados estas cuatro especies mulación viral estimadas mediante RT-PCR en virales usando un método de máxima verisimi- tiempo real). Se observó una reducción en la litud a partir de secuencias aminoacídicas (tra- sintomatología así como en la infectividad del ducidas) usando el modelo de substitución ami- virus que fue proporcional a la intensidad de los noacídica que mejor se ajustaba a los datos. tratamientos. Este análisis mostró cuatro clados principales que correspondían a las especies virales, con- PALABRAS CLAVE: control, resistencia firmando la clasificación taxonómica. La identi- sistémica adquirida dad aminoacídica fue entre 40 y 60% entre las distintas especies y mayor del 80% entre aisla- CP/169 dos de la misma especie viral. Evaluación de vectores virales basados PALABRAS CLAVE: Taxonomía, en el virus del manchado foliar de los Comovirinae, Secoviridae cítricos para silenciar genes en plantas de Nicotiana benthamiana y cítricos CP/168 Agüero J.*, Velázquez K., Navarro L., Inducción de resistencia parcial Moreno P., Vives M.C., Guerri J. en haba contra el virus 1 del Centro de Protección Vegetal y marchitamiento del haba Biotecnología. Instituto Valenciano de Ferriol I.*, Rubio L. Investigaciones Agrarias. Apartado IVIA, 46113 Moncada, Valencia (1) oficial 46113, Moncada, Valencia. (1) El virus 1 del marchitamiento (Broad bean wilt Los vectores virales se han utilizado como una virus 1, BBWV-1) es el miembro tipo del género herramienta eficaz para el estudio de la función Fabavirus dentro de la subfamilia Comovirinae. de genes de plantas mediante genética inversa. Los virus de este género producen daños en Esta estrategia, conocida como silenciamien- un gran número de cultivos hortícolas y orna- to génico inducido por virus (VIGS), presenta mentales, están distribuidos por todo el mundo ventajas importantes sobre otras técnicas em- y se dispersan eficazmente por varias especies pleadas para este fin, como la transformación de pulgón. En este trabajo se ensayaron varios genética, ya que permite estudiar la función de tratamientos con un activador de la resistencia genes en un corto periodo de tiempo y el análi- sistémica adquirida (systemic acquired resistan- sis de genes esenciales para el desarrollo cuyo ce, SAR) en habas cultivadas en el invernadero silenciamiento impediría la regeneración de e inoculadas con BBWV-1. Se probaron cua- plantas durante el proceso de transformación. tro concentraciones del activador y tres tipos Esto es especialmente interesante en el caso de tratamientos que diferían en el momento y de plantas leñosas como los cítricos, que po- frecuencia de la aplicación del producto: a) apli- seen largos periodos juveniles y donde la trans- cación del producto en plántulas de haba y re- formación genética es complicada. Por este petición cada siete días; b) una sola aplicación motivo hemos desarrollado distintos vectores al inocular el virus; y c) una sola aplicación al virales basados en el virus del manchado foliar aparecer los síntomas. Al cabo de diez y veinte de los cítricos (Citrus leaf blotch virus, CLBV)

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para inducir el silenciamiento de genes en el los mRNAs virales, junto con la inhibición de la huésped experimental Nicotiana benthamiana síntesis de proteínas de la célula infectada. Di- y en cítricos, su huésped natural. Estos vecto- versos autores han destacado la contribución res se han empleado para silenciar tanto genes de la proteína viral NS1 en este mecanismo, a endógenos de la planta como el gen gfp intro- través de su interacción funcional con la región ducido experimentalmente en plantas transgé- 5´terminal de los mRNAs virales. Así, se ha nicas. Dos de los vectores desarrollados son identificado un cassette de cuatro nucleótidos muy estables y han inducido el fenotipo del gen en esta región 5ćonservada, que parece ser silenciado en sucesivas brotaciones durante al imprescindible para la activación traduccional menos un año. Se ha observado inducción del mediada por NS1. Con el fin de analizar la con- silenciamiento en distintos tejidos de la planta tribución de cada uno de esos cuatro nucleó- incluidos meristemos, lo que resulta de gran in- tidos y el papel de NS1 en la regulación de la terés para el estudio de genes implicados en el expresión génica del virus de la gripe, hemos desarrollo de órganos. generado una colección de mutantes que presentan todos los cambios posibles en cada una PALABRAS CLAVE: VIGS, CLBV, Cítricos de las cuatro posiciones, tanto de un segmento de síntesis temprana (NS) como tardía (M). Los CP/170 plásmidos generados expresan el gen de la clo- ranfenicol-acetil transferasa (CAT) en sentido Contribución de los extremos 5’UTR antimensajero, flanqueado por extremos muta- de los mRNAs del virus de la gripe dos del vRNA viral. Su expresión está bajo el en la expresión génica viral control de un promotor de la RNA polimerasa I, para evitar la adición del cap y del polyA de los Rodríguez-Rodríguez P*, Yángüez E, Nieto A RNAs generados. De este modo, la síntesis del Biología Molecular y Celular, Centro correspondiente mRNA y de la proteína CAT Nacional de Biotecnología, Madrid (1) es absolutamente dependiente del sistema viral. Un análisis exhaustivo de estos mutantes El genoma del virus de la gripe está compuesto muestra como algunas mutaciones producen por 8 segmentos de RNA (vRNA) de cadena una inhibición drástica de la actividad de la po- sencilla y polaridad negativa. Los extremos de limerasa viral, mientras que otras parecen me- cada uno de ellos están altamente conservados jorarla. También hemos identificado mutantes y poseen complementariedad parcial e inverti- de transporte y/o traducción. Mediante el aná- da, generando una estructura de panhandle lisis de la relación CAT/mRNA citoplamático que conforma el promotor viral y que, mediante diferenciaremos los mutantes de traducción de la unión de la RNA polimerasa viral, participa los de transporte. Además, mediante la compa- en los procesos de transcripción, replicación ración de la actividad CAT en infecciones con y empaquetamiento de viriones. Siguiendo a virus convencionales o que no expresan NS1, esta región promotora, y formando parte de las estudiaremos la implicación de la proteína NS1 UTRs virales, existe una serie de nucleótidos en la regulación de la expresión génica viral. específicos de cada segmento viral. Como con- Experimentos futuros proveerán de datos que secuencia de la transcripción viral se generan permitan comprender el papel de las secuen- los mRNAs del virus, que son estructuralmente cias 5ÚTR adyacentes al promotor viral en la indistinguibles de los mensajeros celulares, ya infección por el virus de la gripe. que presentan una estructura 5ćap y un extremo 3´poliadenilado. Pese a ello, en la célula PALABRAS CLAVE: Influenza, transcripción/ infectada se produce la traducción selectiva de replicación, traducción

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CP/171 plementaria. TYLCV es uno de los virus que producen la enfermedad del rizado amarillo del Rápida evolución de los Begomovirus tomate (TYLCD), que ocasiona daños cuantio- del complejo del rizado amarillo del sos en los principales países productores de tomate en sus huéspedes naturales zonas cálidas y templadas, incluyendo la Cuen- Sánchez-Campos S* (1), Domínguez- ca Mediterránea. Esta enfermedad está causa- Huerta G (1), Tomás DM (1), Navas-Castillo da por un complejo de geminivirus transmitidos J (1), Grande-Pérez A (2), Moriones E (1) por la mosca blanca Bemisia tabaci. Su gama Estación Experimental La Mayora, de huéspedes está restringida fundamental- Instituto de Hortofruticultura Subtropical mente a especies de la familia Solanaceae y Mediterránea La Mayora (IHSM-UMA- como el tomate o el pimiento, aunque se han CSIC), Algarrobo-Costa, Málaga (1), Área de detectado también en judía y cucurbitáceas. En Genética, Universidad de Málaga, Instituto de España, se ha descrito la presencia de cuatro Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea begomovirus asociados con TYLCD además de (2) La Mayora (IHSM-UMA-CSIC), Málaga TYLCV, tomato yellow leaf curl Sardinia virus Los geminivirus (familia Geminiviridae) son vi- (TYLCSV), tomato yellow leaf curl Málaga virus rus de DNA que poseen genomas circulares de (TYLCMalV) y tomato yellow leaf curl Axarquia cadena sencilla (ssDNA) con polaridad positiva virus (TYLCAxV), estos dos últimos surgidos que se replican en el núcleo de la célula median- por recombinación de los anteriores. En este te el mecanismo de círculo rodante, presentan trabajo hemos estudiado la capacidad de evo- altas tasas de mutación y frecuentes procesos lución de los geminivirus TYLCSV, TYLCV y de recombinación y una estructura genética en TYLCMalV en diversos huéspedes naturales sus poblaciones de tipo cuasiespecie. La gene- [tomate susceptible (ty1/ty1), tomate resistente ración de poblaciones altamente variables les (Ty1/ty1), judía y Solanum nigrum] en los que permite evolucionar y adaptarse al ambiente en difieren en su adaptación. Para ello, se han in- el que se encuentren causando nuevas enfer- fectado plantas con el clon infectivo correspon- medades o superando las resistencias genéti- diente y se han analizado muestras a los 15, 30 cas. Por ello, es fundamental conocer los facto- y 45 días postinoculación. Los genomas vira- res que determinan su evolución para el diseño les presentes en la población progenie se han de estrategias de control más duraderas. En el amplificado empleando la técnica del círculo caso de los virus de plantas, una de las estra- rodante (RCA), clonado y se han secuenciado tegias más usadas es el empleo de cultivares dos regiones genómicas comprendiendo ORFs con resistencia genética. Sin embargo, dada la de las proteínas CP y Rep así como la región naturaleza dinámica de las poblaciones virales, intergénica. Los resultados muestran espectros pueden surgir mutantes que superen dichas de mutantes con una alta complejidad y hete- resistencias. El begomovirus (género Begomo- rogeneidad y diversidad genéticas característi- virus) del rizado amarillo del tomate (TYLCV) cos de virus con estructura en cuasiespecies; es un geminivirus con genoma monopartito de se observan diferencias entre los huéspedes ~2,7 kb que codifica la proteína de la cápsida analizados. CP y V2 mientras que las proteínas Rep, TrAP, REn y C4 son codificadas por la cadena com- PALABRAS CLAVE: Evolución, tomato yellow leaf curl virus , tomate

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CP/172 experimental con 4 grupos de ovejas infectadas con 4 aislados diferentes de RVFV. En todos Desarrollo de un ELISA de doble los casos, el ensayo determinó como positi- reconocimiento para la detección vos los sueros de los animales a los 8-9 días de anticuerpos específicos postinfección El análisis ROC de los resulta- del virus del valle del Rift dos obtenidos con 490 ovejas y 94 vacas de Rebollo Polo B (1), Venteo Moreno A* (2), zonas libres de la enfermedad indicó un 99,5% Alison Lubisi B (3), Boshra H (4), Martín- de especificidad. Por último, el ensayo ha sido Folgar R (4), Abad Morejón FX (5), Brun comparado en el centro de referencia de la OIE Torres A (4), Sanz Fernández A (2) para esta enfermedad .El ELISA DR mostró una concordancia del 90% con su ensayo es- INGENASA, Madrid. (1), INGENASA, Madrid. pecífico para la detección de IgMs y del 93,4 % (2), Onderstepoort Veterinary Institute, con otro ensayo comercial para la detección de Sudafrica (3), CISA-INIA, Valdeolmos, anticuerpos anti RVFV. Madrid (4), CRESA, Barcelona (5) PALABRAS CLAVE: RVFV, ELISA DOBLE El virus de la fiebre del valle del Rift (RVFV), RECONOCIMIENTO perteneciente al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, es el causante de una enfermedad emergente que se transmite por nume- CP/173 rosas especies de mosquitos y causa graves epidemias en rumiantes y el hombre en África Pseudopartículas virales del virus y la península Arábiga. Una vacuna efectiva y de la bursitis Infecciosa como un diagnóstico serológico eficaz son objetivos transportadores de antígenos prioritarios para el control de esta enfermedad, Pascual E.* (1), Rodríguez J. F. (2), considerada en EEUU como potencial agente Carrascosa J. L. (1), Castón J. R. (1) bioterrorista. En el presente trabajo se ha desarrollado un ELISA de Doble Reconocimiento Centro Nacional de Biotecnolgía-CSIC, (DR) capaz de detectar anticuerpos específicos Departamento Estructura de Macromoléculas del RVFV. El ELISA DR se basa en el antigena- (1), Centro Nacional de Biotecnolgía-CSIC, do de la placa con la proteína de la nucleocáp- Departamento Biología Molecular y Celular (2) sida viral (N) expresada en E.coli y el uso de la misma proteína conjugada con peroxidasa El virus de la bursitis infecciosa (IBDV) es un como revelador. Es, por tanto, un test apto para virus dsRNA que posee una cápsida icosaé- cualquier especie y tipo de anticuerpo (IgG, drica T=13levo de ~70 nm de diámetro. Esta IgM, IgA, etc.). Para valorar la sensibilidad del cápsida está formada por la proteína VP2 (441 ensayo se analizaron ovejas inmunizadas ex- residuos), que se sintetiza como un precursor perimentalmente con plásmidos de expresión pVP2 (512 residuos). El interruptor molecular que llevaban insertado el gen de la proteína N que controla el polimorfismo estructural de VP2 bajo el promotor del CMV. Posteriormente, to- se localiza en la región C-terminal que es pro- dos los animales recibieron un desafío de virus teolizada una vez que ha cumplido su función. atenuado y se analizaron serológicamente. El El proceso de ensamblaje está mediado por ensayo fue capaz de detectar como positivos interacciones electrostáticas entre el segmen- tanto los animales vacunados como los infec- to C-terminal 443-453 y el extremo C-terminal tados. La sensibilidad analítica se determinó de VP3, la otra proteína mayoritaria que actúa a partir de sueros obtenidos en una infección como ‘scaffolding’. En ausencia de VP3, el en-

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samblaje eficiente de pseudopartículas virales tas cápsidas son desensambladas y reensam- (VLPs) con simetría T=13 requiere la presencia bladas mediante diálisis frente a tampones de de un ‘tag’ de His en el extremo N-terminal de baja fuerza iónica (5 mM Tris–HCl, pH 8.0, and VP2 (proteína His-VP2466), indicando que mi- 5 mM EDTA) y el tampón estandard PES [25 metiza la función de VP3. Las cápsidas vacías mM PIPES pH 6.2, 150 mM NaCl, and 20 mM formadas por la proteína His-VP2466 son ópti- CaCl2], respectivamente. Es la primera vez que mas para la inserción de proteínas heterólogas se demuestra la reversibilidad del ensamblaje porque son muy espaciosas; considerando un de la cápsida de IBDV. radio interno promedio de 26.5 nm, el volumen disponible (dedicado al genoma) es ~77,900 PALABRAS CLAVE: VLPs, IBDV, nm3. Estamos explorando nuevas cápsidas Transportador quiméricas usando como modelo inicial la pro- teína EGFP fusionada al tag de His que se CP/174 localiza hacia el interior de la cápsida. La expression de la proteína EGFP-His-VP2466 en Diagnóstico de parvovirus B19 células de insecto usando un sistema de ba- por detección de IgM y reacción culovirus recombinante es ineficiente para el en cadena de la polimerasa: ensamblaje de VLPs: la mayor parte de la pro- experiencia de seis años teína quimérica permanece soluble. Para me- Mosquera M.M.* (1), Echevarría J.E. (1), jorar el rendimiento de VLPs, hemos coexpre- Minguito T. (2), Hoyas C. (1), de la Fuente sado EGFP-His-VP2466 e His-VP2466 a partir J. (2), González I. (1), de Ory F. (2) de dos baculovirus recombinantes en distintas relaciones, incrementando la incorporación de Unidad de Aislamiento y Detección de Virus. Centro Nacional de Microbiología. la proteína EGFP-His-VP2466 en las VLPs. (1) Análisis estequiométricos basados en geles de Majadahonda (Madrid) , Unidad de Serología. Centro Nacional de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie in- (2) dican que ~200 copias de EGFP-His-VP2466 Microbiología. Majadahonda (Madrid) son incorporadas por partícula viral cuando los La expresión clínica más habitual de la infección baculovirus recombinantes se usan en una rela- por parvovirus B19 (PVB19) en niños es el eri- ción 3 ó 5 (EGFP-His-VP2466):1 (His-VP2466). tema infeccioso, mientras que en adultos este EGFP es incorporada con su estructura nativa virus suele causar más comúnmente artropa- ya que las VLP pueden ser detectadas median- tías que eritema. La afectación articular puede te microscopía de fluorescencia. Estas VLPs prolongarse e incluso hacerse crónica. Asimis- quiméricas serán analizadas estructuralmente mo, el virus da lugar a crisis aplásica transitoria mediante crio-microscopía electrónica tridimen- en pacientes con hemoglobinopatías y aplasia sional para visualizar directamente la densidad crónica de células rojas en inmunodeprimidos. correspondiente a las moléculas de EGFP. La pérdida fetal y la hidropesía se asocian a Estamos comprobando la capacidad inmuno- la infección en el embarazo. Finalmente se ha génica de estas cápsidas inmunizando ratones asociado también a miocarditis, hepatitis, vas- con las cápsidas purificadas o la EGFP solu- culitis, enfermedad renal, enfermedad neuroló- ble. Por otra parte, hemos desarrollado un sis- gica y púrpura trombocitopénica idiopática. El tema in vitro de ensamblaje-desensamblaje de objetivo de este estudio fue valorar la eficacia las cápsidas His-VP2466, ya que estas VLPs del diagnóstico de PVB19 realizado en el Cen- quiméricas son excelentes ‘nanoboxes’ para tro Nacional de Microbiología (CNM) entre los introducir macromoléculas en las células. Es- años 2005 y 2010 mediante dos técnicas diag-

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nósticas. Se analizaron sueros con diferentes PALABRAS CLAVE: Parvovirus B19, cuadros clínicos para IgM por ELISA de captura Serología, Reacción en cadena de la de cadenas pesadas (Parvovirus B19 IgM EIA, polimerasa Biotrin) y RT-PCR anidada. En caso de positividad de cualquiera de las dos técnicas se reali- CP/175 zó la confirmación en una segunda alícuota. Se recibieron 14602 muestras para diagnóstico Un nuevo tospovirus causando de PVB19 durante este periodo. Se analizaron necrosis en tomate y pimiento por las dos aproximaciones (IgM y RT-PCR) en Arequipa, Perú 4513 muestras. Se detectaron 512 (11,35%) Torres Aliaga Roger (1), Larenas muestras positivas por al menos una de las dos Keymer Javiera (2), Fribourg Solis técnicas empleadas: 242 (47,27%) fueron po- Cèsar (3), Romero Cano Javier* (2) sitivas por ambas técnicas, 206 (40,23%) fue- Protección Vegetal, INIA, Madrid. Fitopatología ron positivas solo por RT-PCR y 64 (12,50%) Universidad Nacional Agraria La Molina, solo por detección de IgM. Los años con ma- Lima, Perú (1), Protección Vegetal, INIA, yor número de muestras recibidas en el CNM Madrid (2), Fitopatología, Universidad fueron 2005 y 2006, lo cual se refleja en un Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú (3) mayor porcentaje de positivos en esos mismos años. De las 4513 muestras 3669 tenían datos El Género tospovirus de la familia Bunyaviridae de diagnóstico clínico. Las categorías clínicas afecta severamente la producción de alimentos en las que se sospechó con mayor frecuencia y plantas ornamentales a nivel mundial, son PVB19 como agente causante fueron: artralgias virus altamente distribuidos en regiones tem- (25,75%), exantema (18,17%), infección hema- pladas y subtropicales del mundo y son transmitidos por especies de trips de una manera tológica (12,59%), infección con síndrome febril circulativa. En el Perú han sido reportados el (5,54%) y controles de PVB19 en embarazadas tospovirus del bronceado del tomate (Toma- (2,68%). Se obtuvo un 21,29% de positivos en to spotted wilt virus, TSWV) y recientemente muestras con diagnóstico de artralgias, 23,44% el virus de la mancha amarilla del iris (Iris ye- en casos de exantema, 12,30% en infecciones llow spot virus, IYSV) en cebolla. Diferentes hematológicas, 4,49% en infecciones con sín- muestras de tomate y pimiento con síntomas drome febril y 2,73% en controles de PVB19 de necrosis en hojas y tallos fueron obtenidos en embarazadas. Por otro lado, se recibieron del valle de La Joya, Arequipa, Perú y se ino- un 9,51% de muestras para control de PVB19 cularon en algunos huéspedes diferenciales de sin especificación de diagnóstico obteniéndose tospovirus. Dos aislados uno proveniente de un porcentaje de positividad del 11,72%. Glo- tomate que no infecta pimiento y que ocasio- balmente, el rendimiento de la PCR fue su- na lesiones cloróticas en Vigna uniculata (T2) perior al de IgM (87,50% vs. 59,76%), siendo y otro proveniente de pimiento que infecta pi- la diferencia especialmente importante en los miento y tomate y ocasiona lesiones necróticas casos de enfermedad hematológica (92,06% en V. uniculata (T1) fueron elegidos para su vs. 42,86%). La detección genómica permitió caracterización molecular. Usando los cebadores universales para tospovirus J13 y BR-066 diagnosticar más casos, especialmente en pase amplificó por RT-PCR un fragmento de 700 cientes con enfermedad hematológica. Ambas pb que fueron clonados en pGEM-T y secuen- aproximaciones muestran ser complementarias ciados, de la secuencia obtenida se diseñaron en el diagnóstico de este virus.

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nuevos cebadores ToNSskpni y ToNkpni usa- plantas jóvenes como adultas consiste en la dos en combinación con el cebador universal producción de tumoraciones en el envés de las para tospovirus UHPK obtuvimos la secuencia hojas, que le dan una consistencia rugosa. La completa de la nucleocapsida (N) del fragmento estructura genómica de los Fijivirus consiste de S-RNA de los virus en estudio. Análisis filoge- 10 segmentos de RNA bicatenario lineal, dos nético con el programa Mega 5 nos mostró que de los cuales son bicistronicos. MRDV y virus estos aislados se agrupaban con los tospovirus similares o relacionadas han sido citadas en del continente americano. La proteína deducida Europa Mediterránea, Israel, Argentina y Bra- sil; sin embargo, en muchos de estos países de la nucleocapsida (N) mostraba un alta ho- solamente se ha realizado un diagnóstico de la mología de identidad de los aminoácidos (97%) presencia del virus, mediante sintomatología o de los dos aislados, un (88%) con el virus del extracción de RNAs bicatenarios, como es el rayado necrótico del alstroemeria (Alstroeme- caso de España. En este trabajo hemos reali- nia necrotic streak virus, ANSV) y un (85%) con zado una caracterización molecular del MRDV, el virus de las manchas en anillo del cacahuete purificando los 10 segmentos genómicos y (Groundnut ring spot virus, GRSV), indicando analizándoles en geles de agarosa. Algunos que T1 y T2 representan dos razas del mismo de estos segmentos fueron amplificados me- virus y que al tener menos del 90 % de homo- diante RT-PCR usando cebadores diseñados logía de la secuencia de amino ácidos de la a partir de la secuencia de un aislado italia- nucleocápsida de los tospovirus conocidos, es no del MRDV, que es la única secuencia, de una nueva especie de tospovirus americano, este virus, presente en el GenBank. Los DNAs para el cual se propone el nombre de virus pe- amplificados fueron clonados y secuenciados, ruano necrótico del pimiento (Pepper peruvian analizando su homología y/o variabilidad con necrotic virus, PPNV). el aislado italiano del MRDV. El DNA viral fue igualmente utilizado para desarrollar sondas no radiactivas para la detección del virus en cam- PALABRAS CLAVE: Tospovirus, etiologia, po por hibridaciones moleculares. taxonomía PALABRAS CLAVE: Identificación, CP/176 Secuenciación, variabilidad Caracterización molecular del CP/177 virus del enanismo rugoso del maiz infectando maiz en España Diversidad de genomas defectivos Ortiz Cortés Vilma (1), Romero Cano Javier* (2) en poblaciones naturales del Laboratorio de Sanidad, Dirección Begomovirus (familia Geminiviridae) Técnica de Evaluación de Variedades y Tomato Yellow Leaf Curl virus (1) Laboratorios. INIA, Madrid , Departamento Fiallo-Olivé E* (1), Martínez-Zubiaur Y (2) de Protección Vegetal, INIA, Madrid (2), Moriones E (1), Navas-Castillo J (1) El virus del enanismo rugoso del maíz, (Maize Instituto de Hortofruticultura Subtropical rough dwarf virus, MRDV) pertenece al géne- y Mediterránea La Mayora (IHSM-UMA- ro Fijivirus, grupo II de la familia Reoviridae, CSIC), Consejo Superior de Investigaciones es transmitido bajo condiciones de campo por Científicas, 29750 Algarrobo-Costa, homópteros de la familia Delphacidae, el úni- (1) co vector conocido en Europa es Laodelphax Málaga , Centro Nacional de Sanidad striatellus y el síntoma característico tanto en Agropecuaria (CENSA), San José de Las Lajas, Mayabeque, Cuba (2)

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Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) es uno López Jiménez A.J.* (1), Clemente de los begomovirus (género Begomovirus, fa- Casares P. (2), Bellón Echeverría I. (2), milia Geminiviridae) que mayores daños causa Más López A. (2), Martínez Alfaro E. (3) al cultivo del tomate. Aunque TYLCV tiene su Centro Regional de Investigaciones Biomédica origen en el Viejo Mundo, en las dos últimas (CRIB). Universidad de Castilla- La Mancha. / décadas se ha producido su diseminación a la Unidad de Enfermedades Infecciosas. Hospital mayor parte de las zonas de cultivo del tomate General Universitario de Albacete. (1), Centro en todo el mundo. En América, se detectó su Regional de Investigaciones Biomédica presencia por primera vez a principios de los (CRIB). Universidad de Castilla- La Mancha. años 1990 en la República Dominicana, desde (2), Unidad de Enfermedades Infecciosas. donde se distribuyó rápidamente a otros países Hospital General Universitario de Albacete. (3) del Caribe, Centroamérica y los Estados Uni- dos. En Cuba, TYLCV se detectó por primera La ARN polimerasa dependiente de ARN del vez en 1995, causando cuantiosas pérdidas virus de la Hepatitis C (NS5B) es una enzima económicas en tomate, habiéndose descrito clave en el ciclo de vida del virus. Este enzima asímismo infecciones en pimiento y frijol. En se sitúa en complejos replicativos asociados este trabajo presentamos la caracterización de a micro-vesículas derivadas del retículo endo- una colección de aislados de TYLCV recogidos plasmático, donde genera copias de la cadena en Cuba en los últimos años. Todos ellos per- ARN (+) del genoma viral a través de un inter- tenecen a la cepa “Israel” (TYLCV-IL) de este mediario de cadena ARN (-). En los últimos virus, observándose una gran conservación años, y a través de diferentes técnicas, se ha de la secuencia nucleotídica de su genoma. El incidido en el importancia de la estructura oli- análisis del genoma viral, llevado a cabo tras la gomérica de NS5B en la actividad ARN polime- amplificación por círculo rodante (rolling circle rasa. Los estudios estructurales y bioquímicos amplification, RCA) con DNA polimerasa φ29, señalan una transición entre dos estados con- puso asímismo de manifiesto la presencia de formacionales del enzima durante el proceso de una gran variedad de genomas defectivos. La síntesis. Una conformación cerrada, promotora presencia de moléculas defectivas de origen vi- de la iniciación “de novo” de la síntesis, y una ral ha sido descrita en otros miembros de la fa- conformación abierta que favorece una poste- milia Geminiviridae y su generación puede es- rior elongación, más procesiva, de la cadena de tar asociada con el mecanismo de replicación nueva síntesis. dependiente de recombinación, un proceso El objetivo de este estudio es establecer una alternativo a la replicación por círculo rodante relación entre oligomerización y conformación típica de esta familia. a través del estudio de los diferentes tipos de PALABRAS CLAVE: begomovirus, TYLCV, actividad descritos para NS5B “in vitro”: inicia- genoma defectivo ciación “de novo”, actividad terminal-transferasa, extensión de primer y “template switching”. CP/178 Mediante el uso del molde LE-19, el cual nos permite observar los productos derivados de los Regulación de la actividad de la diferentes tipos de actividad, se ha analizado el ARN polimerasa del virus de la efecto que diferentes factores moduladores del Hepatitis C a través de cambios estado oligomérico provocan sobre cada tipo conformacionales dependientes del de actividad. La titulación de la concentración estado de oligomerización del enzima de proteína muestra una activación alostérica,

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reflejada en una gráfica sigmoidal, solo para la metodologías, pero está limitado por factores actividad “de novo”. La actividad de extensión como la cantidad de información genética que de primer muestra una relación lineal con la se puede introducir en los virus vectores, la cantidad de polimerasa. Del mismo modo, un posibilidad de expresar simultáneamente múl- incremento de la concentración de NaCl, que tiples proteínas o el riesgo de escape de clo- según nuestros datos evita las interacciones nes infecciosos virales al medio ambiente. Para electrostáticas de la estructura oligomérica, hacer frente a estas limitaciones, se ha desa- afecta en mayor medida al proceso de inicia- rrollado un vector viral basado en el virus del ción “de novo” que al de extensión de primer. grabado del tabaco (TEV, familia Potyviridae), Por otro lado se ha estudiado la actividad del en el que se ha reemplazado el cistrón de la mutante de oligomerización (H502A), así como RNA polimerasa viral (NIb) por un casete para de mutantes de conformación abierta (W397A la coexpresión de múltiples proteínas heterólo- y H428A). El resultado de estos análisis confir- gas. Dichas proteínas están flanqueadas por ma un escenario en el cual la interacción oligo- sitios de corte específicos de la proteasa viral mérica de subunidades de la polimerasa NS5B permiten la estabilización de la conformación NIaPro, lo que permite su eficiente liberación cerrada competente para la iniciación “de novo” de la poliproteína viral. Gracias a la deleción de en ausencia de primer. Posteriores experimen- NIb, el vector únicamente se replica y mueve tos se encaminarán a determinar los motivos sistémicamente en plantas donde la actividad estructurales implicados en la formación de la viral NIb es suplementada en trans a través de estructura oligomérica por parte de NS5B, así un transgén o expresada mediante otro vector como determinar los factores implicados en la viral compatible. transición conformacional en relación a este Utilizando este vector se ha logrado la expre- proceso. sión simultánea de tres proteínas fluorescentes reporteras roja, amarilla y azul (mCherry, PALABRAS CLAVE: HCV, NS5B, oligomerización Venus y mTagBFP), etiquetadas respectivamente con los epítopos FLAG, HA y c-Myc. La observación del tejido infectado mediante CP/179 lupa de fluorescencia y microscopio confocal Expresión simultánea de cantidades mostró que las tres proteínas se expresaron si- equimolares de múltiples multáneamente en todo el tejido infectado y en proteínas en plantas a través de la misma localización subcelular (citoplasma y núcleo). Un análisis western demostró que las un vector viral desarmado tres proteínas heterólogas se liberan muy efi- Bedoya L. C.*, Martínez F., cientemente de la poliproteína viral. Se calculó Rubio L., Darós J. A. la acumulación de 8 mg de una de las proteínas Instituto de Biología Molecular y Celular heterólogas coexpresada (mCherry) por kg de de Plantas (Consejo Superior de peso fresco de tejido infectado, 9 días después Investigaciones Científicas - Universidad de la inoculación. El seguimiento de la expre- Politécnica de Valencia), Valencia (1) sión a lo largo del tiempo mostró que el vector expresa eficientemente las proteínas durante El uso de vectores virales para la expresión en dos semanas y que es lo suficientemente esta- plantas de proteínas heterólogas tiene grandes ble para iniciar un segundo ciclo de infección a ventajas en tiempo y coste con respecto a otras partir de tejido infectado.

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Para estudiar la posible utilidad de este vector medio de un vector de expresión de shRNA viral en ingeniería metabólica de plantas, se in- como modelo biológico y analizado el efec- sertó un casete de 2.66 kpb correspondiente a to de CHD6 en proliferación celular mediante los dos factores de transcripción Delila y Ro- curvas de crecimiento y análisis de ciclo celular sea1 de Antirrhinum majus, que se sabe que por citometría de flujo. Además, para identificar interactúan físicamente entre sí y promueven la genes candidatos que estén siendo regula- biosíntesis de antocianinas. La inoculación de dos por CHD6, hemos realizado un análisis de plantas de tabaco que expresan NIb con este transcriptoma de células control y silenciadas vector provocó una fuerte acumulación de an- para CHD6. Por otra parte, dados los datos que tocianinas en el tejido infectado claramente vi- se tienen de interacción entre CHD6 y la subu- sible al volverse las hojas de color rojo. nidad PA de la polimerasa viral, se ha evaluado su asociación con el complejo heterotrimerico PALABRAS CLAVE: vector expresión, de la polimerasa así como con las RNPs vi- potyvirus, ingeniería metabólica rales. Nuestros resultados indican que existe una reducción de alrededor de un 15-20% en CP/180 las curvas de crecimiento de células silenciadas en comparación con las células control. El Caracterizacion de la proteína análisis de ciclo celular revela una acumulación remodeladora de cromatina CHD6 de células silenciadas en fase G0/G1 del ciclo. en la proliferación celular y la Basándonos en el análisis de transcriptoma y replicación del virus de la gripe tras su validación por Real-Time PCR, hemos identificado un número muy limitado de genes Chavez *J. P., Alfonso R., Nieto A. diferencialmente regulados por CHD6, algunos Departamento de Biología Molecular y Celular, de los cuales se asocian con ciclo y prolifera- Centro Nacional de Biotecnología, Madrid (1) ción celular y otros están asociados a diversas patologías neuronales. Por tanto el remodela- La proteína CHD6 descrita recientemente, dor de cromatina CHD6, regula positivamente pertenece a la subfamilia III de la familia de el ciclo celular facilitando la transición de la fase proteínas remodeladoras de cromatina CHD G0/G1 a S, y controla la transcripción de un nú- (Chomodomain-Helix DNA binding). Estudios mero limitado de genes celulares. Por otro lado previos, han mostrado que CHD6 se localiza en hemos caracterizado que CHD6 se asocia con sitios intranucleares de síntesis de mRNAs lo el complejo de la polimerasa del virus asi como que sugiere su participación en la transcripción con las RNPs virales. celular. Por otra parte, y en relación con el virus de la gripe, se ha visto en un ensayo de doble PALABRAS CLAVE: CHD6, cromatina, gripe híbrido en levadura que CHD6 interacciona con la subunidad PA del complejo de la polimerasa viral. Puesto que CHD6 es una proteína asociada a cromatina, de la cual se conoce muy poco acerca de su función endógena, así como la relación que existe entre esta estructura celular y el virus de la gripe, decidimos profundizar en su estudio como factor asociado a la polimerasa viral. Hemos construido líneas celulares HEK293T silenciadas para CHD6 por

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CP/181 trabajo ha mostrado la presencia de un motivo estructural reconocido por la RNasa III de Motivos estructurales en la región 5’ Escherichia coli (Ec-RNasa III) y la RNasa III del RNA genómico del virus del Nilo humana Dicer, así como dos motivos reconoci- Occidental (VNO) comunes a otros dos por el ribozima de la RNasa P de Synecho- miembros de la familia Flaviviridae cistis sp. (Rz6803) y por la RNasa P humana. (1) Se ha demostrado que los cortes son específi- Díaz-González, R* , García-Sacristán, cos identificando la naturaleza química de los A (2), Briones, C (2), Saiz, JC (3), Berzal- (1) (4) nuevos extremos generados tras los distintos Herranz, A , Gómez, J cortes (5’-fosfato y 3’-hidroxilo) y por inhibición Departamento de Biología Molecular, competitiva con sustratos naturales de las nu- Instituto de Parasitología y Biomedicina cleasas. Las posiciones de corte identificadas López-Neyra, Avda del Conocimiento s/n, fueron: C471 - C472 y G505 - U506 para la Ec- 18100 Armilla, Granada (1), Laboratorio de RNasa III; G505 - U506 para la RNasa Dicer Evolución Molecular, Centro de Astrobiología humana; y G517 - A518, U521 - C522, A610 (CSIC-INTA), Carretera de Ajalvir Km. 4, - U611 y U645 - G646 para el Rz6803. Para la 28850 Madrid y Centro de Investigación RNasa P humana las posiciones de corte han Biomédica en Red de Enfermedades sido estimadas a partir de la movilidad electro- Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) (2), forética de las bandas producto, alrededor de Departamento de Biotecnología, Instituto las posiciones 300, 400, 510, 550, 580 y 600. Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA), Mediante ensayos de hibridación a microarrays Ctra Coruña km 7.5, 28040 Madrid (3), de oligonucleótidos complementarios de DNA Departamento de Biología Molecular, Instituto para el estudio estructural del RNA viral, se ha de Parasitología y Biomedicina López- comprobado que los motivos estructurales en- Neyra, Avda del Conocimiento s/n, 18100 contrados para las RNasas P se localizan en Armilla, Granada y Centro de Investigación una región bastante accesible del RNA, mien- Biomédica en Red de Enfermedades tras que el motivo estructural para las RNasas Hepáticas y Digestivas (CIBERehd) (4) III se encuentra en una región menos accesible del genoma del VNO. El estudio de la estructu- El virus del Nilo Occidental (VNO) pertenece ra se ha completado utilizando RNasas espe- al género Flavivirus de la familia Flaviviridae. cíficas de RNA de simple y doble cadena, T1 A diferencia de otros miembros de esta familia y V1 respectivamente, y demuestra que la re- como el virus de la hepatitis C (VHC) y de los gión reconocida por la Ec-RNasa III y Dicer es pestivirus animales relacionados, el RNA del compatible con un tallo largo de RNA en forma VNO presenta una región 5’ no traducible corta de doble cadena, mientras que las posiciones (posiciones 1-96) cuya traducción es depen- reconocidas por el Rz6803 y la RNasa P huma- diente de ‘cap’. El objetivo de este trabajo se na presentan estructuras más complejas en las ha centrado en averiguar si, a pesar de estas que interviene un posible pseudoknot. diferencias, el RNA del VNO contiene, al igual Concluimos que, a pesar de la ausencia de ho- que el VHC y los pestivirus animales, motivos mología de secuencia en el fragmento analiza- estructurales reconocidos por las nucleasas es- do del RNA de VNO y los pestivirus animales pecíficas de estructura secundaria y terciaria, o VHC, los tres géneros de la familia Flavivi- RNasa III y RNasa P respectivamente. ridae presentan una estructura reconocida por Se han ensayado los primeros 702 nucleótidos la RNasa III entre las posiciones 400 y 500. del genoma viral del VNO. El resultado de este Además, comparten motivos de reconocimien-

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to para la RNasa P que se sitúan también en y morbilidad en niños. Una gran proporción de posiciones coincidentes entre los nucleótidos estas diarreas se deben a infecciones virales. 300 y 400. En países desarrollados, la gastroenteritis viral PALABRAS CLAVE: virus del Nilo Occidental, es una de las enfermedades más común en to- RNasa III, RNasa P dos los grupos de edad, siendo NoV la principal causa viral de gastroenteritis vírica en humanos. CP/182 Prevalencia de norovirus en muestras En este trabajo, se analizaron 1202 muestras clínicas de pacientes afectados por clínicas de pacientes afectados por gastroen- gastroenteritis en el noroeste español teritis procedentes del Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña. Las muestras se Manso CF (1), Polo D (1), Fernández recibieron semanalmente durante un periodo MB (2), Bou G (2), Romalde JL* (1) de 6 meses (Julio-Diciembre 2010), tras ser Departamento de Microbiología y sometidas a análisis bacteriológico y detección Parasitología. CIBUS-Fac. Biología. de rotavirus (RV) y adenovirus (AdV) mediante Universidad de Santiago de Compostela. métodos serológicos. La detección de NoV y vi- Santiago de Compostela (1), Servicio de rus de la hepatitis A (HAV) se realizó mediante Microbiología. Complejo Hospitalario RT-PCR en tiempo real con sondas TaqMan. Universitario de A Coruña. A Coruña (2) Tras el análisis bacteriológico y serológico, un Los Norovirus (NoV) son el patógeno más co- 79% de las muestras resultaron ser de etiología mún asociado a gastroenteritis no bacterianas en todo el mundo. El género Norovirus, perte- desconocida. De los casos de gastroenteritis de neciente a la familia Caliciviridae, se divide en origen bacteriano, los agentes con mayor pre- cinco genogrupos que incluyen 29 clusters ge- valencia fueron Salmonella (7,5%) y Campylo- néticos (8 en el genogrupo I [GI], 17 en GII, bacter (9%). RV, AdV y HAV fueron detectados 2 en GIII y 1 en GIV y GV). Los genogrupos en menos del 1% de las muestras. Del 79% de I, II y IV han sido detectados en humanos. La muestras en las que no se había identificado el infección primaria de NoV se produce por in- agente etiológico, se detectó NoV en más de un gestión de comida o agua contaminada con 25%, porcentaje que se mantuvo en práctica- heces, mientras que la infección secundaria se mente todos los grupos de edad. Es importante produce por contacto persona-persona, siendo destacar el hecho de que se han encontrado necesaria una dosis infectiva muy baja. infecciones mixtas bacteria-NoV en un 2,7% de En la mayoría de los casos de gastroenteritis las muestras y coinfecciones de los genogru- el agente etiológico causante de la enfermedad pos I y II de NoV en un 4,25%. no llega a identificarse. En muchos casos, debi- En conclusión, NoV es un agente etiológico do a la corta duración y a la completa recupera- importante de gastroenteritis en el noroeste de ción, el individuo afectado no acude al médico. España, y cuyo papel en la etiología del cua- Por otro lado, los análisis realizados en los hos- dro infeccioso está siendo infravalorado a nivel pitales en casos de gastroenteritis no incluyen hospitalario. análisis virológicos de forma rutinaria. Se ha descrito que en países en desarrollo, la diarrea PALABRAS CLAVE: Norovirus, es una de las principales causas de mortalidad Gastroenteritis vírica, Prevalencia

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CP/183 incluye especies que infectan hongos y plantas como el haba, el arroz, y el pimiento. Los aná- Evidencia de infección por virus con lisis filogenéticos pusieron de manifiesto que genoma de dsRNA pertenecientes el nuevo endornavirus de aguacate está más a varios géneros en aguacate relacionado con Oryza rufipogon endornavirus que con otros miembros de este género. En (1) (2) Villanueva F.* , Sabanadzovic S. , todas las variedades de aguacate infectadas (3) (1) Valverde R.A. , Navas-Castillo J. por PAV se ha detectado además la presencia Departamento de Virología, Instituto de una molécula de dsRNA de 675-682 pb sin de Hortofruticultura Subtropical y identidad nucleotídica con el genoma viral. Éste Mediterránea “La Mayora”, Málaga (1), podría ser el primer dsRNA satélite asociado a Department of Biochemistry, Molecular un endornavirus. Por otra parte, se han clonado Biology, Entomology and Plant Pathology, tres moléculas de dsRNA, también presentes Mississippi State University, Mississippi en la variedad ‘Fuerte’, de aproximadamente State (2), Department of Plant Pathology 3500, 3300 y 2800 pb. Un análisis preliminar de and Crop Physiology, Louisiana State la secuencia de estas moléculas ha puesto de University AgCenter, Baton Rouge (3) manifiesto cierta relación filogenética con virus del género Chrysovirus, integrado exclusiva- La cromatografía mediante celulosa CF-11 es mente por especies que infectan a hongos. un procedimiento sencillo que se ha utilizado con éxito para la purificación y caracteriza- PALABRAS CLAVE: Endornavirus, ción de moléculas de RNA de doble cadena Chrysovirus, Avocado (dsRNA) de origen viral presentes en plantas y hongos. En plantas, estas moléculas suelen CP/184 corresponder a las formas replicativas de virus que poseen un genoma de RNA de cadena Nuevo polimorfismo en el gen sencilla. Por otra parte, existen virus con geno- Mx1 (Myxovirus Resistance 1) ma de dsRNA que infectan algunas especies de cerdos de raza ibérica vegetales. Estos virus, pertenecientes a grupos bien diferenciados, están filogenéticamente re- Chinchilla Rodríguez B*, Martín del Burgo lacionados con virus de hongos y en la natura- MA, Escrig Llavata C, Real Soldevilla G leza parecen transmitirse sólo de forma vertical Biotecnología, INIA Ctra. de La a la progenie. Diversas variedades de aguaca- Coruña Km 7.5, 28040 Madrid (1) te (Persea americana) poseen asociadas mo- El gen Mx1 (Myxovirus resistance 1) forma léculas de dsRNA fácilmente visualizables tras parte del conjunto de genes inducidos por in- cromatografía con celulosa CF-11 y electrofo- terferón alfa y la proteína MX1 está implicada resis, aunque hasta ahora no existía ninguna en la respuesta primaria frente a la infección información sobre su naturaleza. En este traba- por diferentes virus RNA, entre los que se jo presentamos los resultados obtenidos tras la encuentran los virus Influenza A y el virus del clonación y secuenciación de varias de estas Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino moléculas de dsRNA presentes en aguacate (PRRS). Se ha demostrado que determinados var. ‘Fuerte’. Una de ellas, de 13448 pb, corres- polimorfismos en el locus del gen Mx1 murino ponde al genoma de un nuevo miembro del gé- determinan la supervivencia de ratones infecta- nero Endornavirus [denominado tentativamen- dos con virus Influenza. Hasta el momento, se te Persea americana endornavirus (PAV)], que han descrito en la especie porcina tres polimor-

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fismos en el gen Mx1, dos de los cuales dan en esta raza tendría un valor epidemiológico lugar a proteínas MX alteradas en el dominio C- añadido dado que, debido a su sistema de ex- terminal, región donde se localiza la actividad plotación extensivo, son animales expuestos al antiviral de las mismas. La prevalencia de di- contacto permanente con aves potencialmente chos polimorfismos varía según la raza porcina transmisoras de nuevos virus Influenza. y, uno de ellos, consistente en una deleción de PALABRAS CLAVE: Mx1, Influenza, PRRS, 11 pares de bases en el extremo 3´ del gen, da Cerdo Ibérico lugar a una proteína MX1 con menor actividad antiviral frente a Influenza. Hemos identificado un nuevo alelo en cerdos de raza ibérica que se CP/185 caracteriza por la presencia de una deleción de 28 pares de bases en el exón 14 del gen Mx1. Estudio comparativo de los virus Esta deleción produce un cambio en el marco ARN y las vacunas en uso en de lectura del gen que resulta en una proteína las piscifactorías de Europa con 6 sustituciones de aminoácidos y con 20 Gómez Casado E* (1), Encinas aminoácidos más en la región C-terminal con P (1), Estepa A (2), Coll J (1) respecto a la proteína MX1 nativa. Como en el caso de la deleción de 11 pares de bases, este Biotecnología, INIA, Autovía A6, Km 7,5. nuevo polimorfismo afecta al dominio antiviral 28040-Madrid (1), Universidad Miguel de la proteína MX1. A partir de DNA genómico Hernández, IBMC, 03202-Elche (2) es posible, mediante PCR, identificar genética- Los virus ARN producen las enfermedades que mente a los individuos portadores de dicho po- causan los mayores impactos ecológicos y so- limorfismo. Se ha evidenciado que los macrófa- cioeconómicos en la cría de peces en Europa. gos alveolares procedentes de cerdos ibéricos El salmón, la trucha, la dorada, la lubina, el portadores del alelo mutante, muestran una rodaballo y la carpa, sufren necrosis nerviosa menor resistencia frente al virus PRRS, cuando viral producida por betanodavirus (VNNV), la se tratan con interferón alfa, que los proceden- necrosis pancreática infecciosa producida por tes de individuos que portan el alelo normal. aquabirnavirus (IPN), la septicemia hemorrá- Para comprobar el efecto de dicha mutación en gica viral (SHV) y necrosis hematopoyética in- la actividad antiviral frente al virus Influenza, se fecciosa (NHI) producidas por novirhabdovirus, ha clonado el cDNA de los genes Mx1 mutante la viremia primaveral de la carpa producida por y nativo en un vector de expresión para poder rabdovirus (SVCV), enfermedad del páncreas realizar experimentos de infección in vitro en la del salmón y la enfermedad del sueño de la tru- línea celular Vero. cha producidas por alfavirus (SPDV) y la ane- mia infecciosa del salmón producida por isavi- La demostración de la actividad antiviral in vivo rus (ISAV). No existe ningún tratamiento eficaz de la proteína MX1 y/o de otras proteínas impli- que no sea el sacrificio de los peces de las cadas en la respuesta inmune innata del hospe- granjas infectadas, evitando movimientos de dador, así como la identificación de polimorfis- los peces hacia y desde las áreas infectadas y, mos naturales en las poblaciones de animales en algunos casos particulares, la vacunación. susceptibles, permitiría la selección genética En este trabajo, se hace un estudio sobre: 1) de individuos más resistentes a determinadas las características moleculares de los virus infecciones. En el cerdo Ibérico, aparte del im- ARN y las vacunas que se utilizan actualmen- pacto económico en su producción, la dismi- te, 2) el desarrollo de nuevas vacunas de ADN nución de la prevalencia de la infección gripal para algunos virus ARN, 3) el diseño de nuevos

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métodos de vacunación masiva, 4) la transfe- Pública. Servicio Canario de la Salud. rencia de la inmunidad materna, 5) la existen- Consejería de Sanidad del Gobierno Autónomo cia de protección cruzada entre genotipos, 6) de Canarias. Santa Cruz de Tenerife (3), el uso de vacunas ADN más seguras basadas Servicio de Epidemiología. Dirección General en plásmidos de expresión con secuencias de de Salud Pública. Servicio Canario de Salud. un único origen (peces) y, finalmente, 7) la dis- Consejería de Sanidad del Gobierno Autónomo tribución del ADN del plásmido de expresión de Canarias. Santa Cruz de Tenerife (4) después de la vacunación. Por otro lado, para obtener unos niveles de protección similares a La gastroenteritis aguda (GEA) constituye una los producidos por infecciones virales natura- enfermedad que afecta a millones de personas les en los supervivientes, y por infecciones con en todo el mundo. Este cuadro puede ser pro- virus vivos atenuados y/o vacunas basadas ducido por diferentes agentes dentro de los que en virus inactivados con adyuvantes oleosos, se incluyen enterovirus. En Tenerife, se detecta las nuevas formulaciones de vacunas de ADN durante otoño e invierno, una alta incidencia de deberían contener nuevos adyuvantes mole- gastroenteritis de posible etiología viral en la culares como otros componentes virales (ARN población infantil, lo que implica un incremento de doble cadena o proteínas virales). Además, de la demanda de atención sanitaria. Nuestro para ser aprobadas por las autoridades euro- objetivo fue estudiar la diversidad genotípica de peas correspondientes, las vacunas de ADN los virus entéricos (Adenovirus humano, Ente- para peces también requieren del estudio de rovirus y Rotavirus humano) a partir de mues- la persistencia del ADN tras la vacunación, su tras fecales en la población infantil del área me- posible impacto en el medio acuático y la acep- tropolitana de Tenerife. Para ello, se analizaron tación por los consumidores. un total de 108 muestras fecales de pacientes con GEA, cedidas por el Servicio de Urgencias PALABRAS CLAVE: Piscifactorías, Virus Pediátricas del Hospital de día infanto-juvenil ARN, Vacunas de Tenerife. Dichas muestras fueron recogidas durante tres períodos de lluvias invernales CP/186 comprendidos entre diciembre de 2007 y febrero de 2008. Se agruparon en cuatro categorías Detección y genotipado de en función del rango de edad hasta un máximo virus entéricos en niños con de 14 años (en años: <1; 1-5; 5-12; >12) y la gastroenteritis agudas (GEA) del distribución por sexos fue un 51% de niños y un área metropolitana de Tenerife 49% de niñas. Una vez sometidas las muestras fecales a una concentración de las partículas Coronado Álvarez N.M.* (1), Teigell Pérez víricas, se procedió a la detección molecular N. (1), González Martín C. (1), Expósito mediante variaciones de la técnica PCR espe- Rodríguez M. (2), Delgado Martín M. (3), Matute cífica para cada virus. El genotipado se realizó Cruz P. (4), Valladares Hernández B. (1) mediante la secuenciación de los amplicones Instituto Universitario de Enfermedades obtenido con el tamaño esperado. Los resulta- Tropicales y Salud Pública de Canarias. dos revelaron que un 64,8% de las muestras Universidad de La Laguna. La Laguna (1), Área analizadas dieron positivo para al menos uno de Genética. Departamento de Parasitología, de los virus entéricos estudiados, identificándo- Ecología y Genética. Universidad de La se coinfección por dos o más virus patógenos Laguna. La Laguna (2), Servicio de Sanidad en un 32,9% de los pacientes sintomáticos. Tras Ambiental. Dirección General de Salud examinar los resultados en función del sexo y la

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edad, obtuvimos que el 48,7% de los positivos presión interna generada por el empaqueta- correspondían a niñas, mientras que el 51,4% miento del material genético. Por ello, tras el restante, a niños. La mayor prevalencia de in- auto-ensamblaje de la cápsida y antes de ser fección fue encontrada en las categorías menor infectivos, muchos virus sufren un proceso de de 1 año (60,7%; n=28) y de 1 a 5 años (66,1%; maduración que ajusta las propiedades mecá- n=56). Cabe destacar la homogeneidad en nicas de la cubierta vírica y que con frecuencia la distribución de la población viral detectada implica una transición de pandeo o ‘buckling’. en función de los dos parámetros estudiados, En esta transición, la procápside inicialmente edad y sexo. Tras el análisis de las secuencias, cuasi-esférica y con simetría icosaédrica se observamos un predominio de los serotipos 41 transforma en una cáscara poliédrica con caras y 2 para Adenovirus humano; Coxsackievirus- planas triangulares y la forma de un icosaedro. A6, A14 y Echovirus 30 para Enterovirus y para Rotavirus, G1 y P[8]. Este es el primer trabajo En esta contribución presentaremos los resul- en el que se confirma la presencia de virus en- tados de un estudio computacional en el que se téricos en la población infantil con GEA durante analiza el fenómeno de pandeo en cápsidas vi- períodos invernales, genotipándose la pobla- rales cuasi-esféricas [2]. En particular, mediante ción viral circulante en el área metropolitana de un modelo físico sencillo [3], discutiremos cómo la isla de Tenerife. Este trabajo ha sido cofinan- depende la transición de pandeo y la forma final ciado por la Dirección General de Salud Pública (esférica o poliédrica) de la cápside del número del Gobierno de Canarias y por la Fundación de triangulación T, y sobre todo de la clase P Canaria de Investigación y Salud (P.I. 82/07). del virus, en el contexto de la clasificación de PALABRAS CLAVE: Gastroenteritis aguda, Caspar y Klug [4]. Los resultados de nuestro Enterovirus, Detección molecular estudio sugieren que resulta energéticamente favorable adoptar una forma poliédrica al so- meter al virus a una expansión, como ocurre CP/187 en la maduración de algunos virus. Además, la Influencia de la estructura de forma poliédrica resultante es mecánicamente más robusta, tolera expansiones más grandes las cápsidas en el buckling y la y es capaz de soportar presiones internas más maduración de los virus esféricos elevadas, lo cual podría justificar por qué algu- Aznar M.*, Luque A., Reguera D. nos dsDNA virus sufren este tipo de transición. Dpto. Física Fundamental, Universidad La comprensión de las ventajas biofísicas de de Barcelona, Barcelonana (1) sufrir un proceso de maduración y de las propiedades mecánicas de la cápsides podría ser La estructura y las propiedades mecánicas de útil tanto a la hora de dificultar la capacidad in- las cápsidas virales juegan un papel importan- fectiva de estos virus in vivo como a la hora de te tanto en la estabilidad [1] como en diversos un mejor manejo de los virus in vitro de cara a procesos biológicos durante el ciclo vital de los aplicaciones en nanociencia o biomedicina. virus. Desde la replicación de un virus a la in- vasión de un huésped, la cápsida vírica debe [1] C. Carrasco, M. Castellanos, P.J. de Pablo, mantenerse íntegra y estable a través de am- M.G. Mateu, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 105, bientes con condiciones hostiles, por ejemplo 4150-5 (2008). [2] M. Aznar, A. Luque and D. de pH y concentraciones salinas. Además, los Reguera, (preprint). [3] R. Zandi, D. Reguera, virus de ADN de doble cadena (dsDNA) deben Phys. Rev. E. 72, 021917 (2005) [4] D.L.D Cas- de resistir hasta decenas de atmósferas de par and A. Klug, Quant. Biol. 27, 1-24 (1962).

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PALABRAS CLAVE: buckling, simulaciones, mucho más sensible que la obtenida mediante cápsides quasi-esféricas ELISA o RT-PCR convencional y permite la de- tección de diversos aislados virales en árboles de campo de distintas variedades y en cual- CP/188 quier época del año. La máxima acumulación Detección y cuantificación del de virus se observó en hoja y corteza joven, si virus de la psoriasis de los cítricos bien también se detectó en hoja y corteza vieja. mediante RT-PCR en tiempo real La menor acumulación se detectó en el tronco principal y en las raíces. Este nuevo método de Velázquez K. *, Alba L., Guerri J., diagnóstico mejora sustancialmente los actual- Moreno P., Navarro L., Vives M.C. mente disponibles y es una herramienta valiosa Centro de Protección Vegetal y para los programas de saneamiento, cuarente- Biotecnología. Instituto Valenciano de na y certificación que se llevan a cabo en Espa- Investigaciones Agrarias. Valencia. (1) ña y en otros países. La psoriasis de los cítricos es una enfermedad PALABRAS CLAVE: CPsV, qRT-PCR, que produce grandes pérdidas económicas en SybrGreen algunas regiones citrícolas. Está causada por el virus de la psoriasis de los cítricos (Citrus psorosis virus, CPsV), miembro tipo del género CP/189 Ophiovirus, familia Ophioviridae, que tiene un Caracterización de miRNAs afectados genoma formado por tres moléculas de RNA de cadena sencilla y polaridad negativa. CPsV por la infección y predicción de se transmite mediante propagación de material mRNAs potenciales dianas de sRNAs vegetal infectado y en algunos países se ha derivados del viroide en el patosistema observado transmisión natural por algún vector Hop stunt viroid-Cucumis sativus desconocido. El diagnóstico de esta enfermedad se ha efectuado tradicionalmente mediante Martinez G*, Pallás V, Gomez G ensayos de infectividad sobre plantas indicado- Instituto de Biología Molecular y ras de semilla cultivadas en invernadero. Ac- Celular de Plantas. CSIC-UPV. CPI, Av. tualmente, en los programas de saneamiento Fausto Elio s/n, 46022-Valencia (1) y certificación de cítricos se emplea además la técnica TAS-ELISA, que permite una detección Los viroides son los patógenos de plantas con rápida y específica del virus pero presenta una menor complejidad biológica. Su genoma está sensibilidad baja por lo que pueden diagnosti- compuesto por un RNA no codificante, por lo carse falsos negativos. Además, los anticuer- que su ciclo de vida es estrictamente depen- pos empleados no son comerciales y se dis- diente de interacciones con el huésped. In- pone de una cantidad limitada de los mismos. ducen una repuesta patogénica debido a una Para buscar una alternativa a esta técnica he- estrecha interrelación con la planta, probable- mos desarrollado un protocolo de detección del mente relacionada con el silenciamiento de virus mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo RNA. Este modelo de patogénesis sugiere que real con SybrGreen utilizando iniciadores espe- sRNAs derivados del viroide pueden silenciar cíficos del RNA 3. El ensayo permitió detectar en trans mRNAs endógenos y de esta mane- hasta 1000 copias y la respuesta fue lineal en ra inducir síntomas. Alternativamente, estos un rango de siete órdenes de magnitud. Esta síntomas podrían resultar de alteraciones (in- técnica proporciona una detección de CPsV ducidas por el viroide) en los miRNAs de la

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planta. Hasta el momento y quizás debido a de vías reguladoras mediadas por miRNAs que la falta de información genómica de los hués- pueden resultar alteradas durante la infección y pedes (incluyendo la población de miRNAs) y ii) un significativo número de mRNAs del hués- de los sRNAs derivados del viroide, estas in- ped susceptibles de ser silenciados por sRNAs teracciones no han sido aun estudiadas en derivados del viroide. Se necesitan estudios profundidad. Aquí analizamos las relaciones adicionales para comprobar si las interrelacio- entre silenciamiento y patogénesis inducida por nes observadas son funcionales y si tienen o no el Viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) en relación directa con la expresión de síntomas pepino (Cucumis sativus). Primero caracteri- en la planta infectada. zamos en profundidad los sRNAs endógenos de pepino recuperados de plantas infectadas PALABRAS CLAVE: Silenciamiento de y no infectadas, para analizar como el viroide RNA-Patogénesis, miRNAs de Cucurbitaceas, interfería en la biogénesis y funcionalidad de Secuenciación de sRNAs estos ribo-reguladores. Luego y mediante una aproximación bioinformática buscamos en el CP/190 transcriptoma de pepino potenciales dianas de los sRNAs derivados del HSVd que pudieran Evidence for a potential nuclear- ser regulados durante la infección. Nuestros re- dependent step in the traffic to sultados indicaron que el proceso de infección chloroplasts of viroids belonging está asociado con alteraciones en el mapa de to the Avsunviroidae family miRNAs de pepino, principalmente en lo que a eficiencia de procesamiento y niveles de acu- Gomez G*, Pallás V mulación se refiere. Hemos observado que el Instituto de Biología Molecular y HSVd induce aumentos en la acumulación de Celular de Plantas, CSIC-UPV. CPI, Av. al menos 5 miRNAs y que algunas familias de Fausto Elio s/n, 46022-Valencia. (1) miRNA son específicas de planta infectada. Mu- chos de estos miRNAs han sido asociados con Viroids are the smallest non coding RNAs able funciones reguladoras en procesos de repues- to subvert plant cell metabolism to induce pa- ta a estrés tanto biótico como abiótico. Por otra thogenesis in their host. They are classified into parte hemos identificado en el transcriptoma two families: Pospiviroidae, whose replication del huésped mRNAs que podrían ser silencia- takes place in the nucleus, and Avsunviroidae dos durante la infección por sRNAs derivados that are generally considered to replicate into del viroide. Resulta interesante que un por- chloroplasts. The members of the family Avsun- centaje significativo de estas potenciales dia- viroidae are the unique known functional RNAs nas correspondiera a genes relacionados con able to traffic into chloroplasts of the plant cell. procesos de regulación del desarrollo, lo que Consequently, the endogenous RNA-import pa- hace posible que su represión pudiese estar thway used by these pathogenic RNAs to enter relacionada con efectos fenotípicos similares into chloroplast remains yet to be identified. In a síntomas comúnmente asociados con infec- a recent work we demonstrate that a chimeric ciones del HSVd (enanismo, deformación foliar RNA sequence derived from the Eggplant latent y alteraciones en la floración). En resumen, los viroid (a member of the Avsunviroidae family) resultados obtenidos sugieren que la interrela- acting as 5´UTR end was able to mediate the ción entre el proceso de patogénesis inducido specific traffic and accumulation of functional por el viroide y el silenciamiento de RNA podría GFP mRNA from the nucleus into chloroplast. ocurrir en dos escenarios diferentes i) una serie This observation was employed as experimental

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basis to propose the existence of a novel plant gent picture in that in the initial phase of their life signaling mechanism (mediated by non coding cycle the viroids belonging to the Avsunviroidae RNAs) able to regulate the selective import of will be first transported from the cytoplasm into nuclear transcripts into chloroplast. Furthermo- the nucleus to be then specifically delivered re, we speculate that Avsunviroidae members from the nucleus to the chloroplasts, where they may subvert this pathway to mediate their spe- can replicate. cific traffic to this organelle. However, this idea potential pathway must require the existence PALABRAS CLAVE: Intracellular transport of a previous step involving the transport of the regulated by ncRNAs, Avsunviroidae viroid from the cytoplasm to the nucleus. To localization determine if this RNA-import pathway could be used by members of the Avsunviroidae family CP/191 to regulate their specific transit to the chloroplast we analyze the main stages of this route. Pirosecuenciación del genoma de First, we developed a PVX-based in vivo assay 5 aislados del virus ectromelia that uses a chimeric (GFP-intron-ELVd) construct as reporter to determine if this small RNA Mavian C*, López-Bueno A, Alcamí A enters the nucleus. Next, we use an engineered Centro de Biología Molecular Severo reporter containing the same full length ELVd Ochoa (CSIC-UAM), Madrid (1) sequence fussed as 5´UTR end to the GFP cDNA. This construct was used in transient ex- El virus ectromelia, que pertenece a la familia pression assays by agro infiltration, to confirm poxviridae, es el agente causal de mousepox. the selective traffic of canonical ELVd mono- Al igual que el virus de la viruela, el virus ec- meric-sequence from the nucleus into chloro- tromelia presenta un estrecho rango de hospe- plast. At confocal microscopy, we observed that dador y causa una enfermedad severa con un the GFP was expressed in plant-leaves infected alto índice de mortalidad, lo que le convierte en with the intron-bearing and ELVd sequence-em- un modelo de referencia para el estudio de la bedded PVX construct, indicating the functional patogénesis de los poxvirus. La secuenciación expression of the GFP. Since PVX replicates del genoma de distintas cepas relacionadas de exclusively in the cytoplasm, the intron-bearing un virus y el análisis de su capacidad infecciosa messenger RNA will not produce a functional en un modelo animal es la aproximación clásica GFP unless the RNA is targeted, by the ELVd utilizada para definir los determinantes molecu- genomic RNA, to the nucleus where the intron lares de virulencia y patogénesis. Aunque este can be removed, supporting that the nuclear tipo de aproximación se ha empleado habitual- import of the ELVd is possible in the infected mente para virus con genomas pequeños, el cells. We subsequently analyzed if the mono- desarrollo de nuevas técnicas de secuenciación meric ELVd was able to traffic from the nucleus masiva nos está facilitando la secuenciación to the chloroplast. The obtained results indicate del genoma de virus de gran tamaño como los that the GFP arising from the chimeric transcript poxvirus (aproximadamente 200 Kbp). En este (5´UTR-ELVd-GFP) accumulated specifically trabajo se presenta el análisis comparativo del in the chloroplasts of the agro-infiltrated plant genoma de 5 aislados del virus ectromelia ob- cells, indicating that the ELVd genomic RNA tenidos por pirosecuenciación (454-Roche) con is able to mediate the selective traffic of GFP mRNA from the nucleus into chloroplast where una profundidad de lectura que varía entre 13- is translated. These findings supports an emer- 380x. Se discutirá el distinto grado de conser- vación entre los genes implicados en inmuno-

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dulación y aquellos que codifican por proteínas ne del hospedador y jugando un papel funda- estructurales, de replicación y transcripción. Las mental en la patogénesis. Nuestro laboratorio diferencias encontradas varían desde grandes describió la existencia de un nuevo dominio de delecciones ocasionadas por sucesivos pases unión a quimioquinas, denominado SECRET en membranas corioalantoideas hasta mutacio- (del inglés Smallpox virus Encoded Chemoki- nes puntuales que podrían afectar al grado de ne Receptor), presente en varias proteínas de virulencia de estos aislados. poxvirus (Alejo et al., 2006, PNAS 103: 5995). La relevancia del dominio SECRET se refleja PALABRAS CLAVE: poxvirus, ectromelia, en su expresión por un gran número de pox- pirosecuenciación virus, incluyendo ECTV, VARV, MPXV, CPV y el virus vaccinia. Se desconoce el papel del CP/192 dominio SECRET en el ciclo viral, en la inmuno- modulación y en la patogénesis. ECTV codifica Relevancia del dominio SECRET tres proteínas potencialmente secretadas que en la inmunomodulación y contienen el dominio SECRET, bien de manera patología causada por poxvirus independiente (E12 y E184) o fusionada a un Viejo-Borbolla A* (1), Alejo A (2), Rubio D dominio de unión a TNF (CrmD). Para enten- (1), Martínez-Martín N (1), Alcamí A (1) der la función del dominio SECRET in vitro e in vivo hemos estudiado las proteínas E12 y Dept. Virología y Microbiología, Centro de E184 de ECTV. Hemos realizado experimentos Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC- de interacción proteína-proteína, experimen- UAM, Madrid (1), Centro de Investigación tos funcionales e infecciones in vivo con virus en Sanidad Animal, Instituto Nacional recombinantes que no las expresan. Ambas de Investigación y Tecnología Agraria y proteínas son secretadas y unen quimioquinas Alimentaria, Valdeolmos, Madrid (2) con alta afinidad, inhibiendo su función. Mostra- La familia Poxviridae tiene entre sus miembros remos evidencias indicando el mecanismo uti- importantes patógenos humanos y animales. lizado por el dominio SECRET para inhibir las Entre ellos destacan los virus de la viruela quimioquinas y su importancia en la patología. (VARV), monkeypox (MPXV), cowpox (CPXV) Nuestros resultados muestran la relevancia del y ectromelia (ECTV). ECTV causa mousepox dominio SECRET en la virulencia de poxvirus. en ratones, una enfermedad similar a la viruela en humanos. Debido a su peligrosidad, la PALABRAS CLAVE: inmunomodulación, investigación con VARV está muy restringida. patología, quimioquina Para entender el ciclo viral de VARV y su pato- logía asociada es necesario el uso de modelos CP/193 virales alternativos. ECTV constituye uno de los mejores modelos para estudiar la patología Alteración de distintos motivos causada por VARV en particular y las infeccio- estructurales del RNA obtenidos nes virales agudas en general. Las quimioqui- en condiciones mutagénicas nas son proteínas quimioatrayentes que dirigen usando como modelo el RNA el tráfico leucocitario a los sitios de infección 1-570 del virus de la hepatitis C siendo esenciales en la respuesta antiviral. Los poxvirus expresan proteínas que interaccionan Prieto-Vega S.*, Gómez J. con quimioquinas modulando el sistema inmu- Biología Molecular, IPBLN-CSIC , Granada (1)

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Nuestro laboratorio ha identificado cinco mo- distintos factores en las distintas condiciones tivos estructurales del RNA, reconocidos por mutagénicas. factores bioquímicos y biofísicos de forma es- En el caso del reconocimiento de las estructu- téreoespecífica, en los primeros 570 nucleó- ras sensibles al corte con RNAsa III, este dismi- tidos (nt) del RNA del virus de la hepatitis C. nuye aproximadamente un 20%. Sorprenden- Tales motivos estructurales son los siguientes: temente esta pérdida está acompañada de la 1- formación de un enlace cross link mediado aparición de una nueva banda electroforética, por sensibilidad a la luz UV(254 nm); 2- rotura de forma reproducible, que supone en torno al específica del RNA viral mediado por sensibili- 16% aproximadamente, poniendo de manifies- dad a la luz UV(254 nm); 3- motivo sensible a la to la aparición de un nuevo motivo estructural ribonucleasa P humana y procariota; 4 y 5- dos reconocido por la RNAsa III. La sensibilidad a la regiones alternativas e incompatibles, sensibles rotura específica del RNA viral mediado por luz a la RNasa III de E. coli. Los estudios teóricos UV(254nm) disminuye en torno al 6%, mientras de Peter Schuster y su grupo han establecido que la sensibilidad a la formación de un enlace la relación entre el espacio de secuencias y el cross link mediado por luz UV (254nm) decae de estructuras de máxima estabilidad del RNA. casi a la mitad. El punto fundamental es que a una misma estructura del RNA le corresponde un número En conjunto, y a falta de los datos del numero extraordinariamente elevado de secuencias. de mutaciones por molécula en cada una de las Los primeros 570 nts del virus de la hepatitis C condiciones mutagénicas testadas, se puede ofrecen una buena posibilidad de evaluar esta concluir que el efecto de las mutaciones en la relación en una variedad de estructuras locales estructura del RNA es muy dependiente del tipo y conformacionales del RNA. Estos datos puede estructura del RNA. den ayudarnos a identificar la sensibilidad de PALABRAS CLAVE: Estructura-RNA, las estructura del RNA a la catástrofe de error. Mutagénesis, HCV El objetivo de este trabajo es evaluar de forma sistemática, la alteración del patrón estructural CP/194 de cada uno de los ‘motivos estructurales’ antes descritos en poblaciones de RNA transcritas in Cambio conformacional del IRES del vitro en condiciones mutagénicas crecientes. virus de la hepatitis C inducido por el micro-RNA hepático miR-122 Las condiciones mutagénicas se han logrado amplificando la región 1-570 del RNA de HCV Ariza-Mateos A.*, Gómez J. por PCR en presencia de iones Mn++ (5mM), o Departamento de Biología Molecular, Instituto también desbalanceando las concentraciones de Parasitología y Biomedicina ‘López de nucleótidos desde 180microM hasta 1mM. Neyra’ CSIC, Armilla, 18100 Granada. (1) Los factores estereospecíficos empleados para La traducción del mRNA del virus de la hepatitis el reconocimiento de las distintas estructuras C está mediada por un dominio estructural en han sido las enzimas RNAsa III y P, y la luz el RNA que facilita la entrada interna del ribo- UV(254nm). El efecto se ha analizado de for- soma (IRES). Este dominio está flanqueado por ma cinética. Los resultados se han seguido por dos secuencias que anillan entre sí, dejando al electroforesis desnaturalizante, se han cuantificado en fosforimager y se ha representado IRES encerrado en un bucle de RNA. El micro- la curva con la caída de la reactividad para los RNA hepático miR-122 compite eficazmente

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con este anillamiento, provocando un cambio El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) conformacional del RNA o ‘switch’, que libera al es un virus aviar con envoltura lipoproteica y IRES de este bucle. El IRES incluye un motivo RNA monocatenario de polaridad negativa que estructural parecido al tRNA, donde se localiza pertenece a la familia de la Paramixoviridae, el AUG del inicio de la traducción. El objetivo género Avulavirus. Para su entrada en la cé- de este estudio ha sido evaluar, sí cuando se lula diana son necesarias sus dos proteínas de da el ‘switch’ cambia la estructura tipo tRNA en membrana: la hemaglutinina-neuraminidasa, ensayos in vitro. Usando RNasas específicas HN, que reconoce glicoproteínas y glicolípidos, de simple y doble cadena (T1 y V1) no observamos variaciones importantes en la estructura y la proteína de fusión, F. En la mayoría de los secundaria del RNA en la región del motivo tipo Paramixovirus se ha descrito que la fusión de tRNA. Sin embargo, RNasas dependientes de las membranas vírica y celular mediada por la estructuras tipo tRNA que están implicadas en proteína F tiene lugar a pH neutro. Sin embar- el metabolismo del tRNA (RNasa P y RNasa go, nuestro grupo ha propuesto que el proceso Z) sí muestran un cambio en la reactividad del de fusión del NDV con la célula diana puede RNA. La RNasa P (ribozima de RNasa P de activarse a pH ácido. En el presente trabajo he- Synechocystis sp. y RNasa P humana) mues- mos profundizado en este mecanismo de acti- tra una disminución de hasta un 75% en la ac- vación. La infectividad del virus en células HeLa cesibilidad a la estructura tipo tRNA; mientras y ELL-0 tratadas con 3 pulsos de 3 minutos a que la RNasa Z de Escherichia coli incrementa pH 5 aumentó 3 y 1,5 veces respectivamente su accesibilidad ligeramente. Ensayos con un respecto de células incubadas a pH neutro. fragmento truncado del RNA de HCV (1-402) También detectamos un aumento significativo en el que está impedido el ‘switch’ y con una del grado de fusión virus-célula en un ensayo serie de mutantes del miR-122 ayudaron a con- de microscopía de fluorescencia, y mediante el firmar los datos obtenidos con las RNasas P y análisis de sincitios. Asimismo, células trans- Z. Estas variaciones observadas sobre la es- fectadas con las proteínas de la membrana ví- tructura terciaria se interpretan como un cam- rica sometidas a tratamiento a pH ácido a 29ºC bio en la accesibilidad del IRES de HCV en la y 31ºC, dieron lugar a los mismos niveles de región de la estructura tipo tRNA inducido por fusión que células control a 37ºC. Proponemos el miR-122. que el pH ácido disminuye la barrera energética PALABRAS CLAVE: HCV, IRES, miR-122 necesaria para la activación de la proteína de fusión del NDV. CP/195 Trabajo subvencionado por el FIS, cofinancia- Activación de la fusión del virus de la do por fondos FEDER (PI08/1813; a E. V.) y enfermedad de Newcastle a pH ácido la Junta de Castilla y León (SA009A08; a I. M. Sánchez Felipe L*, Villar Ledesma B.). LSF es PDI contratado en la Universidad E, Muñoz Barroso I de Salamanca, financiado por la Junta de Cas- Departamento de Bioquímica y tilla y León. Biología Molecular. Universidad de Salamanca. Salamanca. (1) PALABRAS CLAVE: NDV, Fusión virus-célula

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CP/196 promotor sintético temprano / tardío, se ha generado el recombinante MVA-C-deltaF1L susti- Mejora de la inmunogenicidad frente tuyendo el gen F1L por el gen rsGFP. En este a las proteínas ENV/GAG-POL-NEF trabajo hemos generado y caracterizado dicho del subtipo C de VIH-1 expresadas vector analizando una serie de parámetros desde la cepa atenuada del Virus tanto in vitro (crecimiento viral, estabilidad de Vaccinia MVA mediante la deleción los antígenos de VIH, inducción de apoptosis del gen viral anti-apoptótico F1L y secreción de citoquinas pro-inflamatorias en diferentes líneas celulares murinas y humanas) Perdiguero B.*, Gómez C.E., como in vivo. Estudios sobre la inmunogenici- Nájera J.L., Esteban M. dad de dicho virus recombinante en el modelo Biología Molecular y Celular, Centro murino demuestran que la deleción del gen F1L mejora cuantitativamente la inmunogenicidad Nacional de Biotecnología, Madrid (1) frente a los antígenos de VIH de manera sig- Los Poxvirus constituyen uno de los modelos nificativa tanto en la fase adaptativa como en virales mejor caracterizados y más comúnmen- la fase memoria de la respuesta inmunológica. te utilizados como vectores vacunales. Entre Estas observaciones sugieren que la deleción sus miembros se encuentra la cepa atenuada del gen F1L podría constituir una estrategia vá- del virus vaccinia MVA que proporciona un alto lida para la optimización de MVA como vector nivel de expresión de genes exógenos y seguri- vacunal. dad e inmunogenicidad frente al antígeno hete- PALABRAS CLAVE: MVA, F1L, Apoptosis rólogo. En la actualidad, recombinantes basados en MVA están siendo utilizados en ensayos clínicos en fase I frente al VIH/SIDA y recien- CP/197 temente se ha concluido en España un nuevo ensayo clínico con esta cepa. Sin embargo, Análisis filogenético de los genes VP7 se sigue trabajando en la optimización de este y NSP4 de cepas de rotavirus G9 candidato vacunal. Con este objetivo, en el Téllez Castillo C.J., Fernández Jiménez M. presente trabajo nos propusimos la mejora de *, Carmona Vicente N., Buesa Gómez J. MVA mediante la deleción del gen anti-apoptó- Departamento de Microbiología, Facultad de tico F1L que codifica una proteína de localiza- Medicina, Universidad de Valencia, Valencia (1) ción mitocondrial implicada en la inhibición de la caspasa-9 y de proteínas pro-apoptóticas de Introducción: El genotipo G9 de rotavirus se la familia Bcl-2 (Bak y Bax). La deleción de este describió por primera vez en 1983 en los EEUU, gen fue motivada por observaciones previas en convirtiéndose posteriormente en uno de los las que células dendríticas que han fagocitado genotipos más prevalentes en todo el mundo. células infectadas apoptóticas pueden presen- Las cepas del genotipo G9 se han dividido en 6 tar antígenos virales a las células T citotóxicas linajes y 11 sublinajes filogenéticos. La proteína e inducir una respuesta inmune. En el contexto no estructural 4 (NSP4) interviene en el ciclo del desarrollo de una vacuna, la inducción de replicativo de rotavirus y actúa como una viro- apoptosis podría aumentar la inmunogenicidad porina y como una enterotoxina viral. Se han frente al antígeno. Utilizando como virus paren- descrito 11 genotipos del gen de NSP4. Obje- tal MVA-C, que expresa desde el locus TK las tivo: Caracterizar filogenéticamente los genes proteínas gp120 y Gag-Pol-Nef (GPN) de VIH-1 codificantes de VP7 y de NSP4 en las cepas (subtipo C) bajo el control transcripcional del de rotavirus del genotipo G9P[8] de niños con

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gastroenteritis en Valencia y Castellón de 2005 Instituto de Agrobiotecnología. CSIC- a 2009 y analizar su variabilidad genética. Ma- Universidad Pública de Navarra-Gobierno terial y métodos: Se seleccionaron 60 cepas de Navarra). Pamplona. (1), Facultad de de rotavirus G9P[8] identificadas por RT-PCR Veterinaria. Universidad de Zaragoza. con oligonucleótidos genotipo-específicos y Zaragoza. (2), MRC Centre for Medical secuenciación de los genes de VP7 y NSP4. Molecular Virology, Infection and Immunity, University College London, Las secuencias nucleotídicas fueron analiza- (3) das con el programa BioEdit y comparadas con Windeyer Building, London. UK. secuencias de referencia de GenBank. El aná- Los lentivirus de pequeños rumiantes (LVPR), lisis de las secuencias nucleotídicas se com- que incluyen al virus de la artritis encefalitis pletó con los programas ClustalX, GeneDoc y caprina (VAEC) y el virus Visna/Maedi (VVM), MEGA 4.0. Se estudió el polimorfismo y el ni- infectan a ovinos y caprinos, causando lenta vel de divergencia de las secuencias obtenidas y progresivamente enfermedades de tipo pul- mediante el programa DnaSP. Resultados: Se monar, mamario, articular y/o neurológico. La obtuvieron las secuencias del gen de VP7 y del infección podría ser inhibida por factores de gen de NSP4 en 57 y 59 cepas G9P[8], res- restricción viral expresados por la célula dia- pectivamente. Se encontró un alto grado de na que previenen la progresión del ciclo vital identidad nucleotídica (97%) en las secuencias viral. Uno de los factores de restricción más analizadas de ambos genes. Se construyeron estudiados es TRIM5, del que se han descrito variantes con función antiviral en primates, bo- dendrogramas mediante el método Neighbor- vinos, conejos y liebres. TRIM5 puede inhibir la joining de las secuencias nucleotídicas de VP7 infectividad de retrovirus de distintas especies, y NSP4. El análisis filogenético demostró que de forma natural; por otra parte, en condiciones todas las cepas G9P[8] estudiadas corresponde sobre-expresión, puede inhibir la infección den al linaje IIId, aunque se distribuyen en dos por retrovirus de su propia especie. El primer clusters, y al genotipo NSP4 B (E1). Conclu- objetivo de este estudio fue caracterizar el siones: Las cepas analizadas de rotavirus G9 TRIM5 caprino, y determinar su posición filoge- circulantes en Valencia y Castellón durante el nética. Se observó que los TRIM5 de ovinos y periodo 2005-2009 pertenecen al linaje III y al caprinos presentaban una alta similitud (91%) y sublinaje IIId. Este linaje de G9 circula simul- contenían los dominios típicos de la familia de táneamente en el resto de Europa. Todas las proteínas TRIM5, RBCC y PRY-SPRY que les cepas de rotavirus G9 estudiadas presentan el confieren la capacidad de unión a la cápside genotipo B (E1) de NSP4. vírica. Además, presentaban una alta similitud (91%) con TRIM5 de Bos taurus, indicando una PALABRAS CLAVE: rotavirus, filogenia, estrecha relación filogenética. El segundo ob- genotipos jetivo fue evaluar el posible papel restrictivo de TRIM5 en la infección por VVM. Para ello, se CP/198 clonó TRIM5 ovino a partir de macrófagos de lavado broncoalveolar (MLBA) y de fibroblas- Caracterización de la restricción del tos de piel (FP), obteniéndose 3 secuencias virus VISNA/MAEDI por TRIM5 ovino diferentes de TRIM5 ovino, una de ellas procedente de MLBA y las otras dos de FP. A conti- Jáuregui P* (1), Crespo H (1), Glaria I (1), nuación, se transdujeron con estas secuencias de Andrés X (1), Luján L (2), Towers G (3), fibroblastos murinos de la línea celular MDTF, Amorena B (1), de Andrés D (1), Reina R (1) carentes de TRIM5. Tras infectar con la cepa

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EV1 de VVM estos MDTF transducidos, se injerto en este huésped y se analizó la varia- demostró la existencia de una restricción sig- bilidad genética generada. La secuencia con- nificativa de la infección cuando el TRIM5 que senso de la población viral del primer pase no expresaban procedía de FP pero no de MLBA. mostró cambios con respecto a la secuencia Así, el cambio de 3 aminoácidos (que distinguía del clon, mientras que la del pase 5 mostró al- al TRIM5 de MLBA de los de FP) fue suficien- gunos cambios nucleotídicos que daban lugar te para que TRIM5 ovino procedente de MLBA a 1 (línea CTV-T36-GFP) o 6 (línea CTV-T36) fuera incapaz de restringir VVM. Este trabajo cambios de aminoácido (aa) en posiciones sin identifica un gen de la inmunidad innata con relevancia funcional de la ORF 1a, la mayoría actividad frente a LVPR. Un conocimiento más de los cuales no se observó en pases sucesi- profundo en la inmunidad innata de los ovinos vos. En los linajes del pase 11 se detectaron 14 y caprinos, especialmente en las interacciones sustituciones nucleotídicas en CTV-T36-GFP y virus- hospedador, podría contribuir al desarro- 16 en CTV-T36, aunque la mayoría afectaban llo de nuevos tratamientos o vacunas frente a a posiciones no conservadas en los ORFs 1a estas infecciones. y 1b, p33, p61, p18, p20 y p23. Cinco de estos cambios eran comunes a ambos linajes (3 PALABRAS CLAVE: TRIM5, Lentivirus de en la ORF 1a y 2 en p23) y dos de las sustitu- Pequeños Rumiantes, Inmunidad Innata ciones observadas en el gen p23 de CTV-T36 se hallan en el dominio conservado del dedo CP/199 de Zn, aunque no afectan a ninguno de los aminoácidos clave de esta estructura. El gen Estabilidad genetica del virus marcador gfp parece bastante estable y tras de la tristeza de los cítricos en 11 pases en Nb no detectamos cambios en su pases seriados en la especie no- secuencia consenso. Se observó un aumento huésped Nicotiana benthamiana de acumulación viral (evaluada por RT-PCR cuantitativa) en los 10 primeros pases y un lige- Navarro-López J* (1), Ruiz-Ruiz S ro adelanto en la aparición de los síntomas de (2), Moreno P (1), Ambrós S (1) infección sistémica en Nb. Viriones purificados Centro Protección Vegetal y Biotecnología, de los pases 4, 5 y 11 mantuvieron la misma Instituto Valenciano de Investigaciones infectividad en cítricos que el aislado parental Agrarias (IVIA), Moncada, Valencia. (1), (100%) y no mostraron cambios aparentes en Instituto de Biología Molecular y Celular de la distribución o expresión de síntomas en na- Plantas (IBMCP), CPI-UPV, Valencia (2) ranjo amargo, lima Mexicana, pomelo Duncan, Citrus tristeza virus (CTV), género Closterovi- naranjo dulce Pineapple y Citrus macrophylla, rus, tiene un RNA genómico de ~20 Kb y su en comparación con el aislado T36 nativo. Se único huésped natural son los cítricos. Sin está ensayando si la adaptación de CTV a Nb embargo, se ha conseguido la infección sisté- permite la transmisión mecánica entre plantas mica de Nicotiana benthamiana (Nb), una es- de este huésped. pecie no-huésped, mediante agroinoculación PALABRAS CLAVE: Variabilidad genética, de clones de cDNA del aislado T36, con o sin Adaptación al huésped, Pases seriados el gen marcador gfp (poblaciones CTV-T36- GFP y CTV-T36). Para estudiar si la invasión sistémica de Nb produce adaptación de CTV a este huésped o modifica sus características biológicas, se iniciaron pases seriados por

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CP/200 servir para la detección precoz de enfermedad en estos animales indicando la aparición de un Aplicación de la Termografía Infrarroja proceso febril, y consecuentemente de una po- para la detección de fiebre producida sible infección, aumentando la sensibilidad de en respuesta al virus de la Lengua Azul los planes de vigilancia. Pérez de Diego Camacho A.C.* (1), de las El objetivo de este estudio ha sido evaluar la Heras Sánchez A.I. (1), Sánchez Cordón P.J. TI como herramienta para la detección de fie- (2), Sánchez-Vizcaíno Rodríguez J.M. (1) bre, así como establecer los límites a partir de los cuales un animal se puede considerar fe- Centro VISAVET. Departamento de bril. Para ello, fueron desafiadas un total de 22 Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid (1), ovejas con el virus de la LA, registrándose sus Departamento de Anatomía y Anatomía temperaturas rectales y termográficas de ma- Patológica Comparadas. Facultad de nera estandarizada y en condiciones ambien- Veterinaria. Universidad de Córdoba (2) tales controladas, antes y después del desafío. Se obtuvieron un total de 389 registros rectales La Termografía Infrarroja (TI) es una herramien- y 389 registros termográficos. ta de medición de la temperatura, basada en la capacidad de los cuerpos para emitir y reflejar Se comprobó la correlación de las temperatu- radiación infrarroja, siendo ésta proporcional a ras obtenidas entre ambas técnicas, validando la temperatura superficial de los cuerpos. Esta la TI como técnica para medir la temperatura radiación es recogida por una cámara termo- corporal en ovejas. La diferencia entre las tem- gráfica, que nos permite transformarla en una peraturas rectales adquiridas en ovejas y las imagen en la que la gama de colores se corres- temperaturas por TI es de 1,6682ºC de media ponde con un patrón de temperaturas. superior en las temperaturas rectales. Al utili- Se han descrito diferentes aplicaciones de esta zar dicho valor como factor de corrección, una herramienta tanto en medicina humana como temperatura rectal de 40ºC equivaldría a una en Veterinaria, entre ellas destaca su uso en temperatura de 38,322ºC en TI. Se establece aeropuertos para la detección de fiebre en pa- que valores superiores a 38,322ºC detectados sajeros sospechosos de SARS. Puesto que mediante TI corresponderían con estados febri- la TI es una técnica rápida, no invasiva y con les, obtenido una sensibilidad del 82% y una capacidad para detectar individuos febriles, es especificidad del 90%. considerada unaherramienta muy interesante En conclusión, se ha comprobado que la TI es para su uso en Medicina Preventiva Veterina- una herramienta eficaz en la detección de fie- ria. bre originada por el virus de la LA en ovejas. El uso de la TI puede reducir costes en las campa- La Lengua Azul (LA) es una enfermedad infec- ñas de vigilancia, al detectar precozmente nue- ciosa de los rumiantes producida por un orbivi- vas infecciones y poder así dirigir el muestreo rus, que se transmite a través de vectores del de los animales centinelas analizando aquellos género Culicoides. Uno de los signos clínicos que presenten fiebre. que presentan los animales infectados es la fiebre. En España, se llevan a cabo planes de Proyecto financiado: MICINN AGL2009-13174 vigilancia de esta enfermedad, en los que se -C02-01 analizan hasta 100.000 muestras anuales procedentes de animales centinelas.La TI podría PALABRAS CLAVE: Termografía Infrarroja, Lengua Azul, Fiebre

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CP/201 contraste con estas características convencionales, existe un pequeño grupo de virus que Análisis estructural de la presenta unas características atípicas en el do- polimerasa del tetravirus de Thosea minio de la palma, donde el motivo catalítico C asigna y su relación evolutiva ocupa una posición no canónica. Esto se debe con la familia Birnaviridae a un reordenamiento de los motivos estructurales de la palma, pasando de un orden secuen- Ferrero DS* (1), Rodríguez JF (2), Verdaguer N (3) cial A-B-C-D a un orden permutado C-A-B-D. Biología Molecular y Celular, Centro Na- Los ejemplos conocidos hasta el momento para (1) cional de Biotecnología-CSIC, Madrid , estas polimerasas no canónicas provienen de Biología Molecular y Celular, Centro Na- (2) los miembros de la familia Birnaviridae (geno- cional de Biotecnología, Madrid , Biología ma de RNA doble cadena) y dos miembros de Estructural, Institut de Biologia Molecu- la familia Tetraviridae (genoma de RNA simple lar de Barcelona-CSIC, Barcelona (3) cadena), lo que ha llevado a identificar a estos La comparación de genomas o secuencias de virus como un linaje diferente con respecto al proteínas ha permitido relacionar fácilmente común de todas las polimerasas que pudo di- aquellos virus con una estrecha relación evolu- vergir en un estadio muy temprano de la evo- tiva, pero este abordaje no es eficiente para de- lución de estos enzimas, tal como indican los tectar vínculos entre virus poco relacionados. análisis filogenéticos. En contraste, la creciente cantidad de informa- ción en el campo de la biología estructural per- En este trabajo hemos expresado la RpRd del mite establecer comparaciones morfológicas virus de Thosea Asigna (Tetravirus) y resuelto de proteínas muy conservadas entre distintos su estructura por difracción de rayos X a una organismos que facilitan el trazado de nuevas resolución de 2,1 Å. Esta es la primera estruc- relaciones evolutivas. Las RNA polimerasas tura obtenida de una polimerasa no canónica RNA dependientes (RpRd), son proteínas esen- perteneciente a un virus con genoma de RNA ciales para la replicación de los virus RNA, por de simple cadena. Su similitud con la RpRd del tanto su estructura básica y sus mecanismos virus de la bursitis infecciosa (IBDV) pertene- de catálisis han sido conservados durante la ciente a la familia Birnaviridae, en especial en evolución. La arquitectura de las RpRd, al igual la organización no canónica del dominio de la que las polimerasas en general, recuerda a una palma, confirma que existe una estrecha rela- mano derecha parcialmente cerrada con dife- ción evolutiva entre ambos virus. El ancestro en rentes dominios que representan el pulgar, los común sería el punto de divergencia entre los dedos y la palma. Este último, que contiene el virus de RNA con genoma de simple y doble sitio activo de la enzima, es la región más conservada de todas las polimerasas conocidas y cadena. se considera un vestigio de una polimerasa an- PALABRAS CLAVE: RNA polimerasa, cestral. Dentro de él se han identificado 5 moti- Evolución de virus, Virus de RNA vos estructurales (designados secuencialmente de A a E) que son fundamentales para los dis- CP/202 tintos procesos del funcionamiento enzimático: reconocimiento y unión de los ribonucleótidos Mecanismos de entrada del (motivos A y B), transferencia de grupos fosfato virus respiratorio sincitial (motivos A y C), integridad estructuras (motivo en células de cultivo D), unión del nucleótido iniciador (motivo E). En

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Holguera Báez *J., Villar Ledesma sidad de Salamanca, financiado por la Junta de E., Muñoz Barroso I. Castilla y León. Dpto de Bioquímica y Biología Molecular. PALABRAS CLAVE: RSV, endocitosis, fusión Universidad de Salamanca. Salamanca. (1)

El virus respiratorio sincitial, RSV, es el princi- CP/203 pal agente infeccioso del tracto respiratorio inferior de niños, inmunodeprimidos y ancianos, Implicación de APOBEC3 ovino frente al que aún se desconocen vacunas y en el desarrollo de Visna medicamentos eficaces. Pertenece al género Glaria I* (1), Jáuregui P (1), Crespo H (1), de Pneumovirus, dentro de la familia Paramixovi- Andrés X (1), Polledo L (2), García-Marín JF (2), ridae. Se ha descrito que la entrada del RSV Amorena B (1), de Andrés D (1), Reina R (1) en la célula hospedadora como en la mayoría Instituto de Agrobiotecnología, CSIC-UPNA- de los paramixovirus ocurre por fusión directa Gobierno de Navarra, Pamplona (1), Facultad de las membranas vírica y celular a pH neu- de Veterinaria, Universidad de León, León (2) tro. Sin embargo, ciertos datos (Kolokoltsov et al. 200, J. Virol 81, 7786-7800) apuntan a que Los lentivirus de pequeños rumiantes (LVPR), el silenciamiento génico de la ruta endocítica que incluyen al virus de la artritis encefalitis ca- dependiente de clatrina provoca una disminu- prina (VAEC) y al visna/maedi (VVM), infectan ción de la infección vírica. Además en otro virus al ganado ovino y caprino causando una enfer- relacionado, el metapneumovirus humano, se medad pulmonar (maedi), mamaria, articular ha visto una activación de la fusión a pH áci- y/o encefálica (visna). La replicación de lenti- do (Schowalter et al. 2006, J. Virol 80, 10931- virus es inhibida por las proteínas APOBEC3 41). En el presente trabajo hemos estudiado el (A3) dada su actividad mutagénica citidina des- mecanismo de entrada del RSV, analizando el aminasa. En ovinos se han descrito tres genes, efecto de inhibidores de diferentes procesos de que codifican cuatro proteínas (A3Z1, A3Z2, A3Z3 y A3Z2Z3) con actividad citidina desami- las rutas de endocitosis sobre la unión, fusión nasa in vitro. Muchos lentivirus han desarrolla- e infectividad víricas, y siguiendo la entrada del do un mecanismo para contrarrestar la acción virus mediante microscopía confocal. También de A3. Así, Vif del VVM degrada in vitro A3Z2Z3 hemos analizado el efecto del pH ácido sobre la ovino y de otras especies, pero la capacidad de fusión del RSV con células de cultivo median- A3 ovino para proteger in vivo a los animales te técnicas espectrofluorimétricas, y mediante frente a la infección por LVPR aún se descono- el análisis de sincitios. Nuestros datos apoyan ce. Estudios en otros lentivirus demuestran una que el RSV utiliza mecanismos endocíticos relación inversa entre la expresión de ARNm de para la entrada en la célula hospedadora. El A3 y la viremia en plasma, sugiriendo una acti- aumento en el conocimiento a nivel molecular vidad antiviral de A3. de los procesos de entrada del RSV en particular, y paramixovirus en general, permitirá di- En el presente trabajo se determinó la posible señar en un futuro, de forma racional, nuevos asociación entre el estatus clínico/asintomático medicamentos antivíricos y vacunas. de los ovinos infectados por LVPR y los niveles Trabajo subvencionado por el FIS (PI08/1813; de expresión de las moléculas A3. Se realizó a E. V.) y la Junta de Castilla y León (SA009A08; una cuantificación relativa de la expresión de a I. M. B.). JHB es PDI contratado en la Univer- cada una de las moléculas A3 mediante PCR en tiempo real, usando b-actina como control

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endógeno de expresión. Se comprobó que Pérez Escoda T. (1), Tena Tomás C. (2), Rebollo la expresión de A3Z1 disminuía in vitro en la Polo B. (1), Vigo Martín M. (2), García Miguet J. maduración de monocitos a macrófagos, sin (1), Venteo Moreno A.* (1), Sanz Fernández A. (1) cambios en los niveles de expresión de las INGENASA, Madrid (1), Laboratorio Central otras tres moléculas, por lo que se decidió Veterinario de Sanidad Animal, Madrid (2) utilizar para el estudio células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) no estimuladas. La Peste Equina Africana está causada por el Se analizaron muestras de ovinos con distinto virus del mismo nombre (VPEA) y es transmi- estatus sanitario respecto de la infección por tido por la picadura de mosquitos del género LVPR: seronegativos en contacto con el virus, culicoides. Sus huéspedes son principalmente seropositivos asintomáticos y seropositivos todas las especies de équidos. El virus perte- con manifestación clínica visna. Para todas las nece al género orbivirus y está compuesto por moléculas A3, los animales seropositivos asin- un genoma RNA ds que codifica para 7 proteí- tomáticos mostraron una expresión levemente nas estructurales (VP1-VP7) que forman una menor que los seronegativos. Los animales doble cubierta proteica y para 4 proteínas no afectados clínicamente mostraron una expre- estructurales. La VP7 es la proteína mayoritaria sión significativamente menor que los otros dos del core y posee los determinantes antigénicos grupos, siendo esta diferencia muy pronuncia- de grupo. Es una proteína muy conservada da para las moléculas A3Z3 y A3Z2-Z3, media entre los 9 serotipos de VPEA y tiene un 40% para A3Z2 y muy leve para A3Z1. de homología con otros orbivirus como EHDV y BTV. El presente trabajo muestra el desarro- Los resultados indican una mayor expresión de llo y validación de un inmunoensayo de doble A3 en animales no infectados pero en contacto reconocimiento (ELISA DR) y un test rápido con el virus, que colaboraría en la “neutraliza- basado en la técnica de inmunocromatografía ción” viral. Pero cuando el virus logra establecer (IC) para la detección específica de anticuer- la infección, A3 podría retener a los seropositi- pos de VPEA basado en la proteína VP7 ex- vos en un estadio asintomático, “neutralizando” presada en células de insecto por baculovirus parcialmente al virus. Finalmente, en estadios recombinante. La VP7 se usa tanto para tapizar más avanzados de la infección, el virus supe- el soporte sólido (placa ELISA ó membrana de raría al sistema inmune y los niveles de A3 se nitrocelulosa) como conjugada a peroxidasa reducirían drásticamente, con el consiguiente para ELISA y conjugada a látex para IC. Para desarrollo de manifestaciones clínicas. la validación del ensayo se utilizaron: Sueros de referencia de: 7 cabras y 9 cobayas infec- PALABRAS CLAVE: APOBEC3, Lentivirus de tadas con los 9 serotipos de VPEA, 24 ovejas Pequeños Rumiantes, restricción viral infectadas con los diferentes serotipos de BTV y 8 terneras con los serotipos de EHDV. Sueros CP/204 experimentales de: 8 ovejas infectadas con el serotipo 4 de VPEA, 2 caballos infectados con Desarrollo y validación de el serotipo 4 y 8 de VPEA y terneras infectados inmunoensayos directos de doble con el serotipo 4 y 8 de BTV. Sueros positivos reconocimiento (DR) para la de campo: 116 sueros de caballo de campo positivos a PEA (107 vacunados y 9 infectados detección en suero de anticuerpos durante el brote del año 1990 en España) Sue- específicos de la VP7 del virus ros negativos de campo: 743 sueros de caballo de la peste equina africana de zonas libres de PEA (Argentina, Uruguay y

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España) Los resultados con sueros experimen- 104 copias/ml en plasma se asocian con un mal tales mostraron que los ensayos ELISA DR e pronóstico de la enfermedad. IC detectaron anticuerpos específicos de VPEA a partir del día 7 p.i y además reconocieron Objetivos: Evaluar prospectivamente la replica- todos los serotipos del VPEA. Ninguno de los ción de BK en plasma y orina mediante PCR a ensayos presentó reacción cruzada con anti- tiempo real cuantitativa en pacientes recepto- cuerpos específicos de los distintos serotipos res de trasplante renal. de los orbivirus BTV y EHDV .La especificidad diagnóstica fue del 99% para ambas técnicas Material y métodos: Durante un periodo de un y la sensibilidad del 100%. Los resultados in- año (febrero 2010-enero 2011) se analizaron dican que estas dos aproximaciones diagnósti- prospectivamente un total de 257 muestras cas son herramientas útiles para el control y la (plasma y orina) pertenecientes a pacientes vigilancia de la infección por VPEA, dadas sus con trasplante renal, siguiendo el protocolo es- características cercanas al 100% de especifici- tablecido para estos pacientes. La detección dad y sensibilidad y por su precocidad en la de- del ADN de BKV se realizó mediante la técnica tección de anticuerpos en los primeros estadios de PCR a tiempo real cuantitativa SmartBKV de la enfermedad. (Cepheid, Suecia), con un rango de detección de 300 a 1x108 copias/ml. Previamente, se rea- PALABRAS CLAVE: Virus de la Peste Equina lizó la extracción de los ácidos nucleicos con Africana, ELISA de doble reconocimiento, el sistema automatizado NucliSens easyMag Inmunocromatografía (BioMerieux, Francia).

CP/205 Resultados: Durante un periodo de un año se analizaron 257 muestras (66 muestras de plas- Estudio de infección por poliomavirus ma y 191 muestras de orina) procedentes de 62 BK en pacientes con trasplante renal pacientes con trasplante renal. La edad media de los pacientes fue de 47 años (rango 9-71), Iborra Bendicho M.A.*, Salvador siendo el 57% hombres (36/63). En 41 paciente García C., Moreno Docón A. (66%), la PCR del virus en orina permaneció Unidad de Virología (Servicio de negativa; en 10 pacientes (16%) la orina fue Microbiología). Hospital Universitario positiva, 7 con viruria <107 copias/ml y 10 con Virgen de la Arrixaca. Murcia (1) > 107 copias/ml. En 7 pacientes (11%) el virus fue detectado tanto en orina como en san- Introducción: El poliomavirus BK (BKV) es un virus de pequeño tamaño que permanece la- gre, 2 pacientes con viremia <104 copias/ml y tente principalmente en el riñón tras la infec- 5 pacientes con viremia >104 copias/ml. En 4 ción primaria. Este virus puede reactivarse en pacientes sólo se procedió a la determinación pacientes inmunodeprimidos, preferentemente en plasma con ausencia de viremia. De las 66 en trasplantados renales. Esta reactivación se muestras de plasma analizadas a lo largo del asocia a nefropatía intersticial, estenosis ure- estudio, 41(62%) fueron positivas obteniéndo- tral o cistitis hemorrágica con deterioro de la se en el 73% (30/41) de ellas una viremia su- función renal en un 1-10% de los casos, y alta perior a 104 copias/ml. Se detectó el ADN del tasa de pérdida del injerto. Según las recomen- virus en 48(25%) de las 191 muestras de orina daciones de distintas sociedades científicas de analizadas. En el 52% (25/48) de las muestras trasplante renal, se establece que concentra- de orina positivas se detectó el virus a concen- ciones superiores a 107 copias/ml en orina y traciones elevadas (>107 copias/ml).

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Conclusiones: Las técnicas moleculares ac- la infección in vitro, ya que en células humanas tuales permiten una rápida detección y cuan- HeLa, donde la infección por el mutante VVdel- tificación del BKV, lo que permite realizar un taE3L es abortiva, VVdeltaE3L/NS1 es capaz diagnóstico precoz de nefropatía causada por de replicar y producir títulos virales similares dicho virus, mejorando el pronóstico de la en- obtenidos con el virus wild type. Hemos de- fermedad. mostrado que NS1 expresada en el contexto de VVdeltaE3L es capaz de rescatar la síntesis de PALABRAS CLAVE: Poliomavirus BK, proteínas virales, inhibir la apoptosis y la degra- Transplante renal, PCR a tiempo real dación de RNA, y suprimir la producción de pro- teínas proinflamatorias. En cambio, la proteína CP/206 NS1 no es capaz de recuperar la funcionalidad del virus en la infección in vivo en el modelo de La proteína NS1 del virus de la ratón. Al igual que el mutante VVdeltaE3L, el vi- gripe es capaz de sustituir a la rus VVdeltaE3L/NS1 es incapaz de expandirse proteína E3 del virus vaccinia en sus desde el lugar de inoculación a los órganos de funciones in vitro pero no in vivo los ratones infectados. Estos resultados indican Guerra S* (1), Abaitua F (2), Martínez- que aunque hay similitudes, también hay dife- Sobrino L (3), Esteban M (4), García- rencias en la funcionalidad de E3 y NS1 como Sastre A (5), Rodríguez D (4) inhibidores de la respuesta antiviral mediada por el IFN, que si bien pasan desapercibidas en Dpto de Medicina Preventiva Salud Pública la infección in vitro, se hacen evidentes durante y Microbiología, Universidad Autónoma de la infección in vivo. Madrid (1), Herpesvirus Molecular Biology. Department of Medicine, Section of Virology. PALABRAS CLAVE: interferon, PKR, Imperial College London (2), Department of Vaccinia Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and CP/207 Dentistry, Rochester, New York (3), Dpto. de Biología Celular y Molecular, Centro Estudio de un brote nosocomial por Nacional de Biotecnología CSIC, Madrid (4), rotavirus en un servicio de pediatría Mount Sinai School of Medicine, NYC (5) Jiménez Mayordomo M (1), Tormo Palop N* Las proteínas E3 del virus vaccinia y NS1 del (2), Buesa Gómez J (3), Fernández Jiménez virus de la gripe juegan un papel fundamental M (3), Guna Serrano MR (2), Ocete Mochón en la inhibición de la respuesta inmune inna- MD (2), Navalpotro Rodríguez D (2), Lurbe ta mediada por interferón (IFN). Ambas tienen Ferrer E (4), Gimeno Cardona C (2) dominios de unión a RNA de doble cadena. Te- niendo en cuenta las similitudes y las diferen- Sección de Microbiología, Hospital de cias entre estas proteínas hemos realizado un Manises, Manises (Valencia) (1), Servicio estudio en el que comparamos las actividades de Microbiología, Centro de Diagnóstico de E3 y NS1 en el contexto de la infección por Biomédico, Consorcio Hospital General el virus vaccinia. Para ello hemos generado un Universitario de Valencia, Valencia (2), virus vaccinia recombinante denominado VV- Departamento de Microbiología, Facultad de deltaE3L/NS1, en el que se ha sustituido la pro- Medicina, Universidad de Valencia, Valencia teína E3 por NS1. Nuestro estudio revela que la (3), Servicio de Pediatría, Consorcio Hospital proteína NS1 es capaz de reemplazar a E3 en General Universitario de Valencia, Valencia (4)

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Introducción: Durante el periodo del 14 al 27 de uno había completado la vacunación correcta- enero de 2009, se registró en nuestro hospital mente (Rotarix®) y presentó rotavirus G4[P8]. un incremento del número de muestras fecales Los 8 niños con el mismo genotipo G2P[4] co- positivas por inmunocromatografía (IC) para ro- incidieron en su estancia hospitalaria y fueron tavirus grupo A (ImmunoCardSTAT!Rotavirus, considerados como brote nosocomial. Siete de Meridian), coincidiendo con la aparición de ellos presentaron GEA durante el ingreso de síntomas en el personal sanitario del servicio aparición 6 días de media tras el ingreso (3-10 de pediatría, por lo que realizamos un estudio días). El promedio de tiempo de ingreso del to- genotípico de las cepas detectadas para deter- tal de niños fue de 9,4 días; mientras que en los minar si se trataba de casos relacionados. que cursaron con infección por rotavirus fue de 10,3 días y en los que presentaban rotavirus Material y métodos: Se analizaron 34 mues- G2P[4] fue de 11,75 días. tras de 32 pacientes (edad media: 10 meses (1 mes – 7 años)): 23 estaban hospitalizados en Conclusiones: No se detectó el caso índice pediatría –de éstos, sólo 4 ingresaron por gas- y no hubo una relación directa entre las habi- troenteritis aguda (GEA)- y 9 acudieron a ur- taciones de los pacientes ingresados, pero la gencias pediátricas por GEA, siendo remitidos aparición de síntomas en el personal sanitario a su domicilio. Tras extracción del ARN de una asignado a este servicio durante el mismo pe- suspensión fecal, se realizó una transcripción riodo hace sospechar que la transmisión fue inversa con cebadores aleatorios y amplifica- nosocomial. ción con oligonucleótidos específicos del gen PALABRAS CLAVE: rotavirus, brote de VP6. Para genotipificar las muestras positi- nosocomial, genotipos G y P vas, se realizó para VP7 y VP4 separadamente una PCR semianidada con un cebador común y una mezcla de cebadores específicos de cada CP/208 genotipo G y P, que generan amplímeros de Inhibición de la acción de la tamaños distintos para cada genotipo., analizados mediante electroforesis en gel de agarosa. proteína de defensa ISG15 por la Se revisaron retrospectivamente las historias proteína E3 del Virus Vaccinia de los pacientes positivos para conocer las ca- Eduardo-Correia B (1), García-Culebras racterísticas epidemiológicas del brote. A (1), Versteeg G (2), García-Sastre Resultados: 14 muestras de 14 niños fueron A (2), Tabarés E (1), Guerra S* (1) positivas por PCR, de las cuales 13 lo fueron Dpto de Medicina Preventiva Salud también por IC. De los pacientes no ingresados Pública y Microbiología, Universidad (n=9), 4 fueron positivos por IC y PCR sien- Autónoma de Madrid (1), Mount Sinai do todos rotavirus G1P[8]. De los pacientes School of Medicine, NYC (2) hospitalizados (n=23), 9 fueron positivos por IC y 10 por PCR. En 8 de estos últimos, el genotipo El gen 15 inducido por interferón (IFN) (ISG15) fue G2P[4] y ninguno había sido ingresado por codifica para una proteína que lleva a cabo GEA; dos de ellos fueron negativos para rota- una modificación postraduccional llamada IS- virus por IC y PCR el día del ingreso. Los otros Gilación. El Virus Vaccinia (VV) prototipo de dos positivos, G4P[8] y G1P[8], aparecieron en la familia Poxviridae, es el grupo más comple- niños ingresados por GEA y no se considera- jo de virus DNA que replican en el citoplasma ron infección nosocomial. Se obtuvieron datos de la célula huésped. Recientemente, hemos de vacunación de 10/14 niños infectados y solo demostrado que ISG15 está implicado en la

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replicación de VV regulando la respuesta inmu- Centro Nacional de Microbiología, ne innata tras la infección. E3 es una proteína ISCIII, Majadahonda. (1), Hospital multifuncional con dos dominios claramente di- Universitario Ramón y Cajal, Madrid (2) ferenciados implicada en rango de hospedador El principal tratamiento frente a infecciones y patogénesis que forma parte de la respuesta por citomegalovirus (CMV) es el ganciclovir antagonista de VV frente a la ruta del IFN. El (GCV). La terapia y profilaxis antiviral prolonga- dominio N-terminal está involucrado en la loca- da con GCV se ha asociado a resistencia viral, lización nuclear de la proteína, en la interacción aumentando proporcionalmente al tiempo de con PKR y en la unión a Z-DNA, mientras que tratamiento. Mutaciones en el gen que codifica el dominio C-terminal se relaciona con la unión la proteína quinasa UL97 y en la ADN polime- a ARN de doble cadena. Mediante un ensayo rasa UL54 se han implicado en la resistencia de ISGilación in vitro hemos estudiado el im- de CMV a GCV. El 90% de estas mutaciones pacto de la expresión de diferentes dominios ocurren en UL97 entre los codones 460 y 520, de E3 en la ISGilación de proteínas celulares. implicados en la unión de ATP, y entre el 590 Hemos generado conjugados de ISG15 me- y 607, relacionados con el reconocimiento del diante transfección de plásmidos que expresen sustrato. La mutación más frecuentemente ISG15 y las enzimas E1 (UBE1) y E2 (UbcM8), descrita se encuentra en el codón 460. Se ha necesarias para la reacción de ISGilación. La desarrollado un método de PCR en tiempo real contrasfección del plásmido que expresa E3, que detecta específicamente la presencia o no con los plásmidos descritos anteriormente pro- de esta mutación mediante la utilización de los duce una disminución del proceso ISGilación. cebadores y sondas que se detallan: Cebador Estos experimentos se han llevado a cabo con sentido+: CMV460 5´ TCAATCACCAGTGTCG- el sistema de ISGilación humano y murino y en TGTATGC 3´ Cebador antisentido-: CMV460 5´ AGGGCTCGCTGAGGCTGTA 3´ Sonda 460R: ambos casos hemos determinado que E3 es 5´ VIC-CTTTGACATTACACCCGTG´3´ Son- capaz de interaccionar con ISG15 y modular su da 460S: 5´ FAM-CATTACACCCATGAACGT acción. VV ha desarrollado con su proteína E3 3´ En un estudio preliminar de validación del un mecanismo para contrarrestar la respuesta método, se seleccionaron 50 LCRs de pacien- antiviral mediada por ISG15, el esclarecimien- tes con enfermedad neurológica y resultado to de esta y los mecanismos de escape de los positivo para CMV en el periodo comprendido virus es crucial para el desarrollo de nuevas te- entre 2005 y 2011 por un método descrito pre- rapias contra patógenos humanos. viamente por el laboratorio. Las muestras fueron remitidas al laboratorio de detección viral PALABRAS CLAVE: Interferon, ISG15, E3 del Centro Nacional de Microbiología para el diagnóstico microbiológico de dichos pacien- CP/209 tes. Adicionalmente, se seleccionaron una serie de muestras de LCR y/o plasma de pacientes Desarrollo de un método de con sospecha de resistencia a GCV. Se sospe- detección mediante PCR en tiempo cha resistencia a GCV cuando no hay respues- real de mutaciones en UL97 de ta clínica al tratamiento o respuesta virológica citomegalovirus que confieren con disminución en la antigenemia o carga vi- resistencia a ganciclovir ral. Con el fin de confirmar los resultados obtenidos mediante el nuevo método y caracteri- Tarragó Asensio D.* (1), Mateos M.L. zar ésta y otras mutaciones, se analizaron las (2), Echevarría Mayo J.E. (1) secuencias del gen UL97 de un amplio panel

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de muestras. Se utilizaron dos nuevas parejas Por su estructura y complejidad, estos domi- de cebadores que nos permiten secuenciar dos nios RNA aislados podrían ser reconocidos por fragmentos del gen donde se han descrito que los sensores virales celulares como ‘PAMPs’ se acumulan la mayoría de las mutaciones que (‘Pathogen Associated Molecular Patterns’), confieren resistencia. Los resultados obtenidos y desencadenar una respuesta inmune inna- nos permitirán elaborar una base de datos con ta. Previamente hemos demostrado la capaci- la información detallada de las mutaciones más dad de algunos de estos dominios para inducir frecuentemente asociadas a resistencia a GCV IFN tipo I y actividad antiviral en cultivo celular en nuestro país. Los métodos moleculares apli- (ver Rodríguez-Pulido et al.). En este trabajo cados a la detección de resistencias a GCV son hemos extendido estos estudios a sistemas in una herramienta rápida y eficaz para la deter- vivo. Ratones (adultos y lactantes) fueron ino- minación de la idoneidad del tratamiento. culados con los distintos dominios y se analizó la presencia de IFNa e IFNb en muestras de PALABRAS CLAVE: Resistencia suero recogidas a distintos tiempos tras la ino- a Ganciclovir, PCR en tiempo real, culación. Todos los elementos ensayados re- Citomegalovirus sultaron ser potentes inductores de IFNa, y se observó una buena correlación entre niveles de CP/210 IFN y actividad antiviral en ensayos clásicos de inhibición de infección en cultivo, probando su Inducción de inmunidad innata in relevancia biológica. Teniendo en cuenta que, vivo por regiones no codificantes al igual que muchos otros virus, el VFA es muy del RNA del virus de fiebre aftosa sensible a los IFNs de tipo I, estos resultados revelan el potencial de estos dominios RNA del Borrego Rivero B* (1), Rodriguez Pulido M (2), VFA, moléculas no infectivas y fáciles de pro- Sobrino Castello F (2), Saiz Zalabardo M (2) ducir, para la inducción temprana de un estado (1) CISA-INIA, Valdeolmos, 28130 Madrid , antiviral in vivo, y su posible contribución a un (2) CBMSO Cantoblanco, 28049 Madrid rápido control de la infección viral. La respuesta inmune innata constituye una pri- PALABRAS CLAVE: Inmunidad innata, IFN mera línea de defensa frente a los patógenos tipo I, Virus de fiebre aftosa que se desencadena rápidamente tras la infec- ción, antes de que comience a desarrollarse la respuesta inmune adaptativa. En las célu- CP/211 las infectadas ciertos productos virales, como Caracterización molecular de los los RNAs de doble cadena, son reconocidos virus de la gripe circulantes durante como extraños por los sensores virales, inicián- dose una cascada de señales que conduce a las temporadas 2006-2007, 2007- una rápida respuesta antiviral, con secreción 2008 y 2008-2009 en Catalunya de interferones tipo I (IFNa e IFNb). Además Antón A* (1), Marcos MA (2), Martínez de sus funciones antivirales, estas citoquinas A (3), Torner N (3), Isanta R (2), Tudó G desempeñan un papel inmunomodulador en la (2), de Molina P (1), Pumarola T (1) subsiguiente activación de la respuesta inmune Laboratorio de Microbiología-Sección de adaptativa. Según predicciones estructurales Virología, Barcelona Centre for International los extremos 3’ y 5’ no codificantes del RNA del Health Research (CRESIB, Hospital Clínic- virus de la fiebre aftosa (VFA) se pliegan en va- Universitat de Barcelona), 08036 Barcelona, rios dominios adoptando estructuras estables. España (1), Laboratorio de Microbiología-

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Sección de Virología, Hospital Clínic- por A/Brisbane/59/07, caracterizadas por las Universitat de Barcelona, 08036 Barcelona, substituciones aminoacídicas D35N, T82K, España (2), Departament de Salut, Generalitat Y94H, K140E, V165A, R188K, R208K, W251R, de Catalunya, 08005 Barcelona, España (3) T266N y E273K, comparando con A/New INTRODUCCIÓN: Los virus de la gripe A(VGA) Caledonia/20/99. 3 de las 28 cepas estudiadas y B(VGB) causan epidemias anuales. La vacu- presentaban la mutación H275Y que confie- nación es la forma más eficaz de prevención. re resistencia a oseltamivir. No se detectaron Los fármacos antivirales actualmente aproba- mutaciones en M2. Todas las cepas de VGB dos para el tratamiento y/o profilaxis de la gripe estudiadas pertenecían al linaje Yamagata. La son los inhibidores del canal iónico M2 y los in- mayoría de HAs estaban filogenéticamente re- hibidores de la neuraminidasa (NAIs). Mutacio- lacionadas con B/Florida/4/06, caracterizadas nes en M2 y NA están relacionadas con resis- por las substituciones D196N, G229S y D478E, tencia antiviral. En este trabajo resumimos los comparando con B/Florida/7/04. No se detec- resultados de la caracterización molecular de tan mutaciones en NA. Durante la temporada los virus de la gripe circulantes durante las tem- 2008-2009 la mayor parte de VGA fue H3N2. poradas 2006-2007, 2007-2008 y 2008-2009. Las HAs se agruparon filogenéticamente en el clado caracterizado por las mutaciones S193F, MATERIAL Y MÉTODOS: fueron selecciona- D225N, G50E, K140I y K173Q, comparando das representativamente aislamientos del virus con A/California/7/04. Todas las cepas anali- de la gripe (A y B). Las regiones codificantes zadas presentaban la mutación S31N. En 3 de para el dominio 1 de la HA, NA y M2 fueron las 19 muestras se puedo detectar la mutación estudiadas. D151N en la NA, relacionada con resistencia a NAIs. Todos los VGB pertenecían al linaje Vic- RESULTADOS: Durante la temporada 2006- toria. Las mayoría de HAs estudiadas estaban 2007 la mayor parte de VGA fue H3N2. La relacionadas con B/Brisbane/60/2008, caracte- mayoría de HAs estaban filogenéticamente re- rizadas por los cambios N75K, V146I, N165K y lacionadas con A/Wisconsin/67/2005, caracte- S172P, comparando con B/Malaysia/2506/2004. rizadas por las substituciones S193F y D225N No se detectaron mutaciones en NA. comparando con A/California/7/04; sustituciones adicionales (G50E and K140I) permitían distinguir subgrupos. 13 de las 15 cepas pre- CONCLUSIONES: Estudiando las HAs de los sentaban la mutación S31N en M2 que confiere virus gripales circulantes se pone de manifiesto resistencia a adamantanos. En 1 se detectó la la deriva genética, que justifica la revisión anual mutación D151G en NA relacionada con resis- de la composición de la vacuna. La emergencia tencia a NAIs. Las cepas de VGB pertenecían de virus de la gripe resistentes a los antivirales a los linajes Yamagata y Victoria. Las HAs de son un problema de salud pública. las cepas del linaje Victoria estaban relaciona- PALABRAS CLAVE: Gripe, Resistencia, das con la cepa vacunal B/Malaysia/2506/04, Caracterización aunque con cambios (N165K). Las HAs de las cepas del linaje Yamagata estaban relacionadas con B/Florida/7/04, aunque con cambios CP/212 (D196N y N458D). No se detectaron mutaciones en NA. Durante la temporada 2007-2008 Detección molecular de la mayor parte de VGA fue H1N1. Las HAs calicivirus entéricos porcinos estudiadas pertenecían al clado representado en granjas españolas

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Blanco E* (1), Guerra B (1), Mena I (1), Moreno nuevos ensayos desarrollados mostraron ni- N (1), Simón M (2), Casal J (2), Bárcena J (1) veles adecuados de eficiencia y sensibilidad, CISA-INIA, Valdeolmos. Madrid por lo que se van a validar analizando mues- (1), CRESA, Barcelona (2) tras de heces recogidas en distintas granjas porcinas españolas. En la actualidad se estan Los calicivirus son virus sin envuelta, icosaé- analizando 160 muestras de heces, recogidas dricos, con un genoma constituido por una mo- en 8 granjas diferentes. Las muestras estan lécula de RNA de polaridad positiva de 7,5 kb. distribuidas en 5 grupos en función de la edad: La familia Caliciviridae se divide actualmente i) madres; ii) lechones 1 semana; iii) cerdos 5 en cinco géneros: Norovirus, Sapovirus, Vesi- semanas; iv) cerdos 7 semanas y v) cerdos 20 virus, Lagovirus y Nebovirus, y hay dos géne- semanas. Los resultados preliminares indican ros más propuestos (Recovirus y Valovirus). que la prevalencia de los norovirus y sapovi- Los norovirus y sapovirus son virus entéricos rus, fundamentalmente es elevada en la ca- que infectan al hombre y a diversas especies baña porcina española, en concordancia con de animales domésticos como cerdos, vacas estudios similares realizados recientemente en y perros. Los norovirus son la principal causa otros países. La incidencia de estos virus en de gastroenteritis en humanos a nivel mun- función de la edad parece ser algo diferente. dial, mientras que los sapovirus afectan princi- Mientras que los sapovirus se encuentran fun- palmente a niños menores de cinco años. En damentalmente en animales post-destete (5, 7 cerdos se pueden encontrar calicivirus encua- y 20 semanas), los norovirus son más frecuen- drados en tres géneros: Norovirus, Sapovirus y tes en los lechones de 1 semana y en lechones Valovirus. La estrecha relación genética entre al final del cebo (20 semanas). En conjunto los los norovirus y sapovirus circulantes en hombre resultados presentados en este estudio sugie- y cerdo plantea interrogantes sobre el potencial ren que los ensayos desarrollados constituyen zoonótico de estos virus. Con objeto de evaluar una herramienta de diagnóstico de gran interés la prevalencia de estos virus en la población para el desarrollo de estudios epidemiológicos porcina española, primers capaces de amplifi- sobre los virus entéricos porcinos. car específicamente fragmentos de norovirus, PALABRAS CLAVE: Calicivirus, cerdo, RT- sapovirus y valovirus porcinos, se diseñaron PCR teniendo en cuenta las secuencias disponibles de estos calicivirus en el GenBank. Con dichos CP/213 primers se desarrollaron ensayos de RT-PCR convencional en un solo paso, que permitieron Caracterización de enterovirus identificar de forma específica dichos virus en asociados a brotes de onicomadesis heces porcinas disponibles en nuestro laboratorio. La sensibilidad y el límite de detección Pérez-Vilaró G*, Scheller N, Díez J de dichos ensayos se determinaron utilizando Department of Experimental and RNA estándar generados por transcripción in Health Sciences, Universitat vitro. Utilizando los mismos primers se desarro- Pompeu Fabra, Barcelona (1) lló también un ensayo Real-Time de RT-PCR basado en la utilización de SYBR Green. La Processing Bodies (PB) and Stress Granules especificidad de estas reacciones se determi- (SG) are highly dynamic cytoplasmatic granu- nó secuenciando directamente los amplicones les that are conserved among eukaryotes. PB generados y comparando las secuencias ob- are present under normal growth and contain tenidas a las disponibles en el GenBank. Los translationally repressed mRNAs together with

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the mRNA decay and miRNA machinery. In CP/214 contrast, SG are observed during cell stress and contain mRNAs that are stalled in the process Caracterización de enterovirus of translation initiation in conjuction with transla- asociados a brotes de onicomadesis tion initiation factors and ribosomal subunits. In- Bracho M. A.* (1), Gonzalez-Candelas F. (2), terestingly, some PB and SG components have Valero A (3), Córdoba J. (4), Salazar A (5) been shown to be required for the life cycle of Hepatitis C Virus (HCV), a major human patho- Centro Superior de Investigación en Salud Pública, Valencia (1), Universitat de Valencia, gen. However, it is unknown how the presence Valencia (2), University of Edinburg, Scotland of HCV is affecting the formation and composi- (3), Hospital Universitario La Fe, Valencia (4), tion of these cytoplasmatic granules. To address Centre Salut Pública de València, Valencia (5) this question, we have analyzed the kinetics of PB and SG formation under HCV infection by El síndrome boca mano pie (SBMP) es una using multiple PB and SG markers. Immunos- enfermedad benigna típicamente infantil cau- taining assays demonstrated that at 96 hours sada por enterovirus. Durante el verano y el post-infection disruption of PB was detected otoño de 2008 en Valencia se declararon más and no induction of SG was observed, although de 300 casos de onicomadesis (caída de uñas) HCV is described to induce cell stress. Since asociados a un diagnóstico previo de SBMP. formation of PB and SG granules depend on the Presentamos los resultados caracterización de concentration of their components one possibi- enterovirus obtenidos de casos de onicomade- lity was that the observed effects were due to a sis, con y sin enfermedad previa de SBMP, y de lower expression of PB and SG components. niños sanos expuestos a casos de onicomade- We excluded this possibility since western blot sis recogidos en 9 guarderías de la ciudad. Se analysis showed that the expression levels of tomaron 70 muestras fecales de las cuales 38 multiple PB and SG components were unaffec- fueron positivas para enterovirus. A partir de la ted by the HCV infection. Interestingly, the SG secuencia completa del gen de la cápsida VP1 component TIA-1 co-localized with NS5A sug- se determinó el serotipo de los enterovirus de- gesting that this host factor is recruited to the tectados. Los serotipos predominantes fueron replication sites of HCV. This together with the los coxsackievirus (CV) A10, CVB1 y CVA6, fact that previous results showed that the core aunque tambien se detectaron otros serotipos PB protein Lsm1 directly interact with regulatory en menor grado. El análisis filogenético mostró signals in the HCV 5´and 3´untraslated regions la relación con aislados de todo el mundo, in- strongly suggest that the effect of HCV infection cluidos aquellos aislados procedentes de otros on PB and SG formation is likely mediated by brotes de SBMP o brotes de onicomadesis aso- the viral recruitment of some of their compo- ciados a SBMP ocurridos en España y Finlan- dia durante los años 2008 y 2009. A la luz de nents. Thus, HCV infection modulates the for- los resultados de genotipado y de proximidad mation of PB and SG and utilizes some of their genética entre los correspondientes serotipos components for its replication. These results proponemos que la coinfección de un serotipo expand our knowledge about key HCV-host cell comúnmente asociado a SBMP junto con el interactions and might provide novel cellular serotipo CVB1 causó los brotes descritos de targets for antiviral treatment. onicomadesis-SBMP. En el contexto de la vigilancia epidemiológica de enterovirus, también PALABRAS CLAVE: Hepatitis C Virus, proponemos la secuenciación completa del gen Processing Bodies, Stress Granules

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VP1 para una mejor resolución de las relacio- así como las hnRNPs A0, A1, A2/B1, Q y U in- nes entre aislados. teraccionan preferentemente con el extremo 3’ en ambas líneas celulares, mientras la nucleoli- PALABRAS CLAVE: Enterovirus, na lo hace sólo en el caso de la línea HeLa S3. Onicomadesis, Sindrome boca mano pie Mientras que con mayor afinidad al extremo 5’ identificamos la hnRNP-K en Hela S3 y PCBP-2 CP/215 en HEK 293-T. Para el estudio funcional hemos seleccionado la PABP, silenciando células HEK Identificación de proteínas 293-T y observando el efecto de este silencia- celulares que interaccionan in miento en el título del RaV. Los resultados ob- vitro con los extremos del genoma tenidos parecen indicar una acción negativa de del Vesivirus de conejo (RaV) la PABP en la replicación del RaV. Arrojo Fernández J. *, Dalton K., Parra F. PALABRAS CLAVE: Calicivirus Instituto Universitario de Biotecnología de Asturias.Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Oviedo. c/ CP/216 Fernando Bongera. Edificio Santiago Gascón Características clínicas de la gripe s/n. 33006. Oviedo. Tfno: 985104215. e-mail:[email protected] (1) en una temporada epidémica estacional (2010-2011) vs período Dentro de los calicivirus nos encontramos con pandémico (2009-2010) que pocos virus son capaces de replicarse en cultivos celulares, así como una casi total falta Ocete Mochón MD* (1), Navalpotro de replicones que nos permitan el estudio fun- Rodriguez D (2), Tormo Palop N (2), Guna cional de los resultados obtenidos in vitro. El Serrano MR (3), Gimeno Cardona C (3) género Vesivirus comprende la mayor parte de Microbiología. Centro de Diagnóstico los calicivirus que infectan cultivos celulares, Biomédico. Consorcio Hospital General entre ellos el Vesivirus de conejo (RaV) (Mar- Universitario Valencia. Universidad tín-Alonso et al. 2005) lo que lo convierte en un Católica de Valencia (1), Microbiología. buen modelo para el estudio de la biología mo- Centro de Diagnóstico Biomédico. lecular de la replicación en calicivirus. El RaV Consorcio Hospital General Universitario se replica en el citoplasma dentro de estructu- Valencia. (2), Microbiología. Centro de ras vesiculares pero se desconoce qué proteí- Diagnóstico Biomédico. Consorcio nas regulan los procesos de replicación y tra- Hospital General Universitario Valencia. ducción del genoma viral. A partir de transcritos Universidad de Valencia (3) de diferente longitud del extremo 5´ del genoma del Rav y del mRNA subgenómico, co-terminal Objetivos: Estudiar el comportamiento clíni- con el extremo 3´, se hizo una cromatografía de co de los casos de gripe A en nuestro hospital afinidad a RNA con extractos citoplasmáticos (CHGUV), en dos periodos de actividad gripal. de dos líneas celulares humanas (HEK 293-T Material y métodos Análisis retrospectivo de y HeLa S3). Posteriormente se identificaron por los casos de gripe A en el CHGUV desde julio espectrometría de masas aquellas proteínas de 2010 a febrero de 2011. Los casos de gripe con una unión preferente por los extremos 3´ o A fueron confirmados mediante PCR a tiempo 5´ o por una línea celular respecto a la otra. En- contramos que las riboproteínas PABP y PTBP real a partir de muestras nasofaringeas.

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Resultados Un total de 165 casos confirmados Conclusiones: La media de edad de los pa- de gripe A (35 en la temporada epidémica es- cientes es de 30 años y se confirma la escasa tacional y 165 en el periodo pandémico) fueron incidencia de la infección en individuos mayo- atendidos en el hospital en el periodo de es- res de 65 anos. La principal complicación es tudio, de ellos 77 (46,7%) eran hombres y 88 la neumonía. A pesar de la baja incidencia de (53,3%) mujeres. La media de edad fue de 30,1 Gripe A (H1N1)n en la temporada 2010-2011 la años (rango de edades entre 1 mes y 79 años). presentación clínica fue más grave, un exitus y El grupo de edad mas afectado fue el de 12-40 mayor porcentaje de pacientes ingresados en años con 99 casos (60%), y el menos afecta- UCC (20% vs 5,3%). do el grupo de los mayores de 65 con 5 casos PALABRAS CLAVE: Gripe A, Temporada (3,0%). Todos los pacientes pertenecen a algu- epidémica estacional, Periodo pandémico no de los grupos de riesgo establecidos por el CDC, embarazo (56 casos, 33,9%), asma y/o CP/217 alguna enfermedad pulmonar de base (35 casos, 21,2%), inmunosupresion (7 casos, 4,2%), Evaluación de la capacidad de diabetes mellitas (4 casos, 2,4%), neoplasia (2 protección en corderos de una casos, 1,2%), obesidad (7 casos, 4,2%), car- vacuna basada en un virus diopatía (3 casos, 21,8%). De los 165 pacientes Vaccinia Ankara recombinante con gripe A, 32 (19,4%) sufrieron alguna compli- que codifica las glicoproteínas del cación y un paciente falleció por parada cardio- rrespiratoria antes del ingreso. La complicación virus de la fiebre del Valle del Rift mas frecuente fue la neumonía, que apareció Busquets N (1), López E (2), Abad FX (1), en 17 de los casos (53,1%). Cabe destacar que Lorenzo G (2), Galindo I (1), Rivas R (1), 5 (15,6% de las neumonías) se dieron en ni- Bensaid A (1), Solanes D (1), Rodríguez F (1), ños menores de 7 años. Otras complicaciones Gilbert SC (3), Domingo M (1), Brun A* (2) asociadas fueron: reagudizaciones del asma CReSA, Bellaterra, Barcelona (1), con broncoespasmo en 11(34,4%) pacientes, CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid insuficiencia respiratoria severa en 4 casos (2), Jenner Institute, Oxford (3) (12,5%), shock séptico en 3 casos (9,4%), un caso (3,1%) de descompensación diabética y El virus de la Fiebre de la Valle del Rift (VFVR) otro (3,1%) con pericarditis. Del total de pacien- es un Bunyavirus transmitido mediante la pica- tes estudiados, 44 (26,7%) fueron hospitaliza- dura de mosquitos, ampliamente distribuido en dos en distintos servicios del hospital: Infec- países subsaharianos, Mauritania, Egipto y la ciosas registro 3 ingresos (6,8%), Pediatría 8 Península Arábiga, causando enfermedad en (18,2%), Respiratorio 21(47,7%), Oncología 1 humanos y rumiantes domésticos. Numerosas (2,3%), Medicina Interna 3 (6,8%). Requirieron especies de mosquitos presentes en Europa, hospitalización en la Unidad de Cuidados Críti- entre las que se encuentran Aedes spp, y Culex cos (UCC) 8 casos (4,8%), 1 (12,5%) durante spp., son capaces de transmitir y actuar como la pandemia y 7 (87,5%) en la temporada epi- reservorios del virus. La enfermedad de la fie- démica estacional. La comparación del resto de bre del Valle del Rift (FVR) podría introducirse datos clínicos, edad, sexo, factores de riesgo y en Europa debido, entre otros factores, a cam- complicaciones más frecuentes, entre los dos bios en las condiciones climáticas que favore- periodos no demostró diferencias significati- cieran el desarrollo de poblaciones de vectores vas. competentes. Por todo ello, es deseable mejo-

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rar las vacunas actuales frente a la FVR en las los mecanismos de la respuesta inmunológica especies susceptibles. responsable de la protección parcial obtenida necesitarán ser caracterizados. Este estudio presenta los resultados obtenidos empleando una nueva vacuna candidata basa- PALABRAS CLAVE: fiebre del Valle del Rift, da en un recombinante del virus vaccinia Anka- MVA recombinante, vacunas ra modificado (MVA) que codifica las dos gli- coproteínas estructurales (Gn y Gc) del VFVR CP/218 (rMVA-GnGc). Esta vacuna experimental confi- rió una protección total en ratones desafiados Caracterización de la proteína con una dosis letal del virus. Para evaluar su hemaglutinina-esterasa de eficacia en rumiantes, se inmunizaron corderos dos aislados de campo de mediante una única dosis de rMVA-GnGc por torovirus porcino: diferencias vía subcutánea y 14 días más tarde se desafia- ron con 10e5 TCID50 de la cepa virulenta 56/74 antigénicas y de especificidad del VFVR, tal y como había sido previamente de unión a ácidos sialicos establecido en nuestro laboratorio. Alonso Padilla Julio* (1), Pignatelli Garrigós La eficacia de la vacuna se valoró basándose Jaime (2), Rodríguez Aguirre Dolores (1) en la aparición de signos clínicos, temperatura Biología molecular y celular, Centro corporal, y detección de RNA viral en sangre y Nacional de Biotecnología (CSIC), Madrid secreciones. Pocos signos clínicos se asocia- (1), Neurobiología molecular, celular, y del ron a la FVR tras el desafío, con la excepción de desarrollo, Instituto Cajal (CSIC), Madrid (2) un animal del grupo vacunado con rMVA-GnGc y dos del grupo control, los cuales presentaron Los torovirus (ToV) (familia Coronaviridae,orden apatía y disminución del apetito. Un animal de Nidovirales) son virus ARN de cadena sencilla cada grupo murió a los 5 y 6 días post-inocula- y polaridad positiva, que causan infecciones ción (pi) respectivamente, mostrando la típica entéricas. Se han descrito cuatro especies víri- lesión hepática descrita para la FVR. En los cas específicas de hospedador: torovirus equi- animales del grupo control se registró pirexia no (EqToV o BEV), torovirus bovino (BToV), desde el día 2 pi hasta el día 5 pi, mientras que torovirus porcino (PToV) y torovirus humano los animales del grupo vacunado con rMVA- (HToV). Las partículas virales constan de cua- GnGc mostraron fiebre solamente el día 3 pi. tro proteínas estructurales: la proteína de la El RNA del virus se pudo detectar en sangre en todos los animales del grupo vacunado con nucleocápsida (N), la proteína de membrana rMVA-GnGc a día 3 pi mediante RT-qPCR, y a (M), la proteína de la espícula (S) y la proteí- día 5 pi únicamente en el cordero que murió. na hemaglutinina esterasa (HE). Esta última se En cambio, las ovejas del grupo control presen- caracteriza por estar estructurada en dos domi- taron RNAemia hasta el día 13 pi. Finalmen- nios: un dominio hemaglutinina, con capacidad te, se detectó RNA viral en hisopos nasales y de unir ácidos siálicos, y otro dominio catalítico bucales desde el día 3 hasta el día 7 pi en el con actividad acetil-esterasa. Los ácidos siáli- grupo control mientras que solamente el corde- cos, residuos glucídicos terminales de glico- ro que murió del grupo inmunizado con rMVA- proteínas y glicolípidos, pueden actuar como GnGc excretó virus a día 3 pi. Estos resultados receptores virales y se encuentran distribuidos confirman la capacidad esta vacuna para con- de forma diferencial a lo largo de las mucosas trolar la infección en un modelo ovino aunque de los tractos respiratorio y digestivo.

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Durante un estudio longitudinal sobre PToV en CP/219 España llevado a cabo en cuatro granjas, se observó la presencia de dos cepas distintas del Identificación y caracterización de virus dentro de una misma granja, e incluso en un nuevo tipo de papilomavirus un mismo animal a dos edades diferentes (7 y Arroyo-Andújar JD*, Edo-Bellés 11 semanas). La secuencia del gen HE de las M, Corella-Huebra D, Villena- dos cepas de PToV detectadas en ese animal Gascó N, Bermejo-Ramírez R reveló que dichos aislados de PToV pertene- (1) cen a dos linajes de PToV distintos (Markelo Progenie molecular y P4). Los papilomavirus constituyen un grupo de virus con una destacable heterogeneidad. Hasta El objetivo de este trabajo fue la caracterización el momento se han caracterizado totalmente de las proteínas HE de los dos linajes, determi- más de 120 genotipos (o simplemente ‘tipos’), nando su actividad acetil-esterasa, la especifi- y se han detectado miles de aislados diferentes cidad de unión a ácidos siálicos, así como su que son considerados ‘subtipos’ o ‘variantes’ de antigenicidad. Los genes HE de estos aislados los tipos de referencia. El concepto de ‘tipo’ de se clonaron en el locus HA del genoma del virus papilomavirus es de gran importancia ya que vaccinia para dar lugar a virus recombinantes cada uno posee características biológicas y clí- (rVV). La correcta expresión de las correspon- nicas significativamente diferentes. El criterio dientes proteínas HE se comprobó por Western para la definición de ‘tipo’, ‘subtipo’ y ‘variante’ blot en extractos de células infectadas con los de papilomavirus se ha establecido arbitraria- rVV obtenidos. Mediante un ensayo enzimático mente en base a la similitud de la secuencia de basado en el sustrato colorimétrico pNPA (pa- nucleótidos del ORF L1, el más conservado. Un ranitrofenil acetato) se demostró así mismo que genoma de papilomavirus se define como un las proteínas expresadas poseían actividad nuevo ‘tipo’ si presenta diferencias superiores esterasa, en contraste con el extracto del rVV al 10 % en este ORF (de Villiers et al., 2004). control (rVV-HA-). Se realizaron ensayos de hemaglutinación frente a eritrocitos de distintas En el presente trabajo se ha caracterizado un especies animales, observándose diferencias nuevo aislado de papilomavirus humano. El en cuanto a la especificidad de unión entre las análisis de identidad respecto a todos los papi- dos proteínas HE. Las diferencias de especi- lomavirus descritos hasta el momento muestra ficidad fueron también determinadas mediante una similitud de secuencia del 89 % en el ORF ensayos de competitividad de receptores con L1 respecto al tipo más cercano filogenética- eritrocitos de ratón. mente (el VPH 72). Atendiendo a los criterios actuales, el nuevo aislado debe ser considera- Los resultados obtenidos indican que los dos do un nuevo ‘tipo’ de papilomavirus, probable- linajes de HE son diferentes en cuanto a espe- mente el VPH 150. cificidad de unión por el receptor. Además, estas proteínas presentan diferencias antigénicas PALABRAS CLAVE: papilomavirus, tipo, VPH en el dominio hemaglutinina, de forma que los anticuerpos generados por los animales contra una proteína HE no son capaces de inhibir la hemaglutinación inducida por la otra proteína. PALABRAS CLAVE: Torovirus porcino, Hemaglutinina esterasa, Ácidos siálicos

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CP/220 este modelo de infección, con el objetivo de intentar desentrañar los mecanismos inmuno- Utilización de un virus atenuado como lógicos implicados en protección. Grupos de modelo para estudiar los mecanismos 4 cerdos de 10 semanas de edad se inmuni- inmunológicos y los antígenos virales zaron intramuscularmente con diversas dosis implicados en la protección frente al del virus: 102, 104 y 105 UHA50, para, a con- Virus de la Peste Porcina Africana tinuación, realizar un seguimiento diario de la sintomatología clínica de la PPA, de la replica- Lacasta Marín Anna*, Accensi Alemany ción del virus, así como de la respuesta inmune Francesc, Mora Salvatierra Mercedes, inducida, estudiando tanto la cinética de apari- Ballester Devis Maria, López Monteagudo ción de anticuerpos como de respuesta celular Paula, Blanco Esther, Rodríguez Fernando específica. Finalmente, los animales supervi- CReSA, UAB, Bellaterra (1) vientes fueron re-infectados con una dosis letal del virus homólogo virulento E75L para evaluar Desde su reentrada en el continente Europeo la protección conferida. El virus E75CV1 siguió en el año 2007 a través de Georgia desde el el comportamiento esperado, únicamente a la Este Africano, el campo de la investigación dosis intermedia de 104 UHA50, mostrando los sobre el virus de la Peste Porcina Africana 4 cerdos signos clínicos muy leves de la enfer- (VPPA) ha cobrado un nuevo protagonismo. A pesar de que este virus es el causante de una medad, apenas reflejados en una hipertermia de las enfermedades más importantes del por- temporal, coincidiendo con el pico de viremia cino (la PPA), y de que éste mantuvo en jaque y recuperándose a continuación totalmente. Fi- a la economía de países como el nuestro du- nalmente, estos cuatro animales quedaron to- rante tres décadas, hasta su erradicación de la talmente protegidos frente a la re-infección con península a mediados de los noventa, poco se una dosis letal del virus virulento E75L (también sabe sobre los mecanismos relevantes en pro- de 104 UHA50), coincidiendo con la presencia tección frente al mismo y como consecuencia en los animales, tanto de anticuerpos como directa, no existe una vacuna frente a la enfer- células T específicas. Actualmente, nos encon- medad. A día de hoy los únicos modelos sóli- tramos en el proceso de identificación de los dos de protección frente al VPPA se basan en antígenos virales reconocidos específicamen- la utilización de virus atenuados. Sin embargo, te, prestando una especial atención a la identi- la utilización de este tipo de vacunas está lejos ficación de epítopos CTL del virus con potencial de ser una realidad, en gran medida debido a protectivo (ver exposición oral de Accensi et al). la patogenicidad residual de los virus atenua- Curiosamente, el 50% de los cerdos infectados dos utilizados, dejando en ocasiones animales con la dosis máxima o mínima del virus atenua- portadores inaparentes del virus e incluso revir- do, murieron como consecuencia de la infec- tiendo su virulencia. ción, mostrando sintomatologías compatibles con la infección aguda o con la reactivación En el presente trabajo utilizamos el virus ate- de una infección persistente, respectivamente. nuado E75CV1, obtenido por el Dr. Francisco Durante la presentación se discutirá el poten- Ruiz-Gonzalvo en el INIA tras adaptar el virus cial de los conocimientos adquiridos para la ob- virulento E75 (aislado en España en 1975) a tención futura de una vacuna segura y eficaz células de riñón de mono CV1. Tras 4 pases contra la VPPA. ciegos en este tipo celular, el virus recuperado mostró un fenotipo atenuado in vivo. Más de PALABRAS CLAVE: VPPA, vacuna, tres décadas después, decidimos reproducir inmunologia

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CP/221 CP/222 Modeling viral RNA intracellular Posición 222 de la hemaglutinina de amplification under differential los virus A(H1N1)2009 circulantes en replication modes: a dynamical España desde el inicio de la pandemia systems approach Ledesma J* (1), Pozo F (1), Cuevas MT (1), Sardanyés J*, Martínez F, Calderón A (1), Reyes N (1), Moreno S (1), Cruz Daròs J. A., Elena S. F. N (1), González-Esguevillas M (1), Molinero M (1), López-Valero M (1), Casas I (1), Sistema de Instituto de Biología Molecular y (2) Celular de Plantas (IBMCP), Consejo Vigilancia de la Gripe en España (SVGE) Superior de Investigaciones Científicas Centro Nacional de Gripe-Madrid, (CSIC-UPV), València (1) Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), We study simple nonlinear mathematical mo- Majadahonda, Madrid (1), SVGE (2) dels describing the time dynamics of viral RNA for (+) sense single-stranded RNA viruses un- INTRODUCCIÓN/OBJETIVOS. La entrada der differential replication modes ranging from de los virus de la gripe a las células que in- purely geometric replication (GR) to stamping fectan está mediada por la hemaglutinina que machine replication (SMR). We first analyze a participa en el reconocimiento de residuos de two-dimensional dynamical system of differen- ácido siálico presentes en la membrana celu- tial equations succesfully used to quantitatively lar. La hemaglutinina de los virus humanos y reproduce experimental results reporting the aviares tiene afinidad por el ácido siálico alfa accumulation kinetics of RNA strands for Tur- 2-6-galactosa (SA alfa 2-6-gal) y el ácido siálico nip mosaic potyvirus. For such a model, we alfa 2-3-galactosa (SA alfa 2-3-gal), respectiva- characterize the equilibrium points of the sys- mente. En el tracto respiratorio superior del ser tem also identifying a non-degenerate transcri- humano el SA alfa2-6-gal se expresa mayorita- tical bifurcation involving the extinction of both riamente mientras que en el inferior se expre- strands depending on three keyparamaters: de- san SA alfa 2-6-gal y SA alfa 2-3-gal de igual gradation rates (delta), replicationrates (r) and manera. Se ha descrito que el cambio del ácido the mode of replication (alfa). We show that aspártico por una glicina en la posición 222 de the bifurcation associated with alfa generica- la subunidad HA1 de la hemaglutinina (D222G, lly takes place when the replication mode gets numeración H1) confiere al virus afinidad por closer to the SMR mode, thus suggesting that ambas configuraciones de ácido siálico. Desde GR may involve an increase in viral stability in que por primera vez en noviembre de 2009 en dynamical terms. This transcritical bifurcation, Noruega se describió la aparición de la muta- which involves the switching from an active to ción D222G en virus de la gripe A(H1N1)2009, an absorbing regime, suggests a smooth (i.e., el Centro Nacional de Gripe en Madrid ha vigi- second-order), absorbing-state phase transi- lado las mutaciones que se presentan en esta tion. Finally, we also provide the equilibria and posición los virus recibidos de los laboratorios stability properties for a simpler model only in- del Sistema de Vigilancia de la Gripe en Espa- corporating the asymmetry in replication tied to ña (ReLEG-SVGE). El objetivo de este trabajo differential replication modes. es analizar la presencia de mutaciones en la posición 222 de la hemaglutinina de los virus PALABRAS CLAVE: Complex Systems, de la gripe A(H1N1)2009 desde la aparición Replication mode, RNA virus de este virus en nuestro país y su relación con

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gravedad en la enfermedad. MATERIALES CP/223 Y MÉTODOS. Se amplificó y secuenció la re- gión HA1 en un total de 679 virus de la gripe Identificación del epítopo reconocido A(H1N1)2009 procedentes de muestras respi- por un anticuerpo monoclonal ratorias o aislamientos de células MDCK. De frente a norovirus GII4 (1) ellos, 214 virus fueron detectados en casos Carmona Vicente N.* , Fernández Jiménez (1) (2) (1) graves y 447 en casos leves. Las secuencias M. , Rodríguez Díaz J. , Buesa Gómez J. obtenidas fueron alineadas y analizadas filoge- Departamento de Microbiología, Facultad néticamente mediante el paquete informático de Medicina, Universidad de Valencia, Valencia (1), Departamento de Biotecnología, MEGA 4. El periodo de estudio abarcó desde el Instituto de Agroquímica y Tecnología de 25 de abril de 2009 (primer caso diagnosticado Alimentos, CSIC, Paterna (Valencia) (2) de A(H1N1)2009 en España) hasta marzo de Introducción y Objetivos Los norovirus son la 2011. RESULTADOS. Se detectaron mutacio- principal causa de brotes epidémicos de gas- nes en la posición 222 de la HA1 en 83 virus troenteritis aguda. Los norovirus humanos se A(H1N1)2009 (12,56%). La mutación D222G clasifican en tres genogrupos, GI, GII y GIV. En fue encontrada en 11 virus (1,66%) todos ellos los últimos años se ha descrito la circulación procedentes de casos graves (5,14%, p<0,001), de variantes del genotipo GII.4 produciendo dos de ellos con mala evolución. Nueve de los infecciones muy frecuentes en la población. La virus fueron detectados entre julio de 2009 y proteína VP1 se pliega en dos dominios denominados S y P. El dominio P (“protuberante”) enero de 2010 y el resto en enero de 2011. se divide en dos subdominios, P1 y P2, de los Además, se encontró el cambio de ácido aspár- cuales P2 es el más superficial. Este dominio tico (E) por D en 72 virus (10,89%) procedentes P2 es la región menos conservada del genoma de 38 casos leves y 34 graves (p=0,004), entre de norovirus y desempeña un papel fundamen- julio de 2009 y enero de 2010. CONCLUSIO- tal en la interacción con el receptor celular y en NES: La aparición de mutaciones en la posi- la antigenicidad del virus. Se desconoce el pa- ción 222 de la subunidad HA1 se asocia a ma- pel de los anticuerpos en la protección frente a yor gravedad en la enfermedad, principalmente las infecciones por norovirus. Con el objetivo de identificar posibles epítopos inmunodominan- la mutación D222G, detectada únicamente en tes o de neutralización, nos hemos propuesto casos graves. Aunque en la presente tempora- producir anticuerpos monoclonales (AcMo) da, las mutaciones en esta posición han sido frente a VLPs del genotipo GII.4. Material y detectadas en menor medida, es recomen- métodos Producción de partículas pseudovíri- dable continuar la vigilancia de la circulación cas (VLPs) de norovirus GII.4 variante 2006b de virus con mutaciones en la posición 222 y en células de insecto Sf9 con baculovirus re- principalmente en casos graves. Financiación: combinantes y purificación por ultracentrifuga- ción. Inmunización a ratones BALB/c con las DGEG-1304/08-TS-13-B (Ministerio de Sani- VLPs y desarrollo de hibridomas productores dad y Política Social), PS09/00246 (Fondo de de anticuerpos monoclonales que reconozcan Investigaciones Sanitarias) y MPY-1440/09 por enzimoinmunoanálisis cepas de norovirus (Ministerio de Ciencia e Innovación) GII.4. Clonación, expresión y purificación del dominio P2 de VP1 de norovirus GII.4-2004 en PALABRAS CLAVE: A(H1N1)2009, D222G, Escherichia coli como proteína recombinante, enfermedad grave

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para diseñar ensayos inmunoenzimáticos y CP/224 analizar la reactividad de los anticuerpos monoclonales producidos frente a esta región P2 Efecto de la Tetherina/BST-2 de la cápside de norovirus. Determinación del en la formación de virus epítopo reconocido por el monoclonal mediante vaccinia extracelular la técnica de ‘phage display’ utilizando la libre- Blasco Lozano R, Sánchez-Puig J* ría de fagos Ph.D.-C7C, y secuenciación de los Biotecnología, INIA, Madrid (1) clones seleccionados por el mismo para obtener la secuencia consenso de aminoácidos. Re- La tetherina, también conocida como BST-2, sultados Se han producido anticuerpos mono- es una proteína antiviral inducida por interferón clonales IgG1 frente a las VLPs de norovirus que afecta a la liberación de partículas de HIV genotipo GGII.4 que reconocen norovirus en maduras desde células infectadas. Es bien co- muestras clínicas. Se ha logrado la expresión nocido que la proteína Vpu es un antagonista del dominio P2 de VP1 como proteína recombi- de tetherina, de manera que sólo mutantes de HIV-1 deficientes en Vpu son sensibles al efec- nante en Escherichia coli. El AcMo 4C5C10 fue to de tetherina. Esta proteína también afecta a el que presentó mayor reactividad en ensayos otros virus envueltos como algunos miembros de enzimoinmunoanálisis, tanto frente a VLPs de las familias de Arenavirus, Filovirus y Rab- como frente al dominio P2, y es el que se ha dovirus. La topología poco habitual de esta pro- utilizado para la identificación de su epítopo. teína, junto con la localización en microdomi- Después de tres rondas, se secuenciaron 19 nios de membrana enriquecidos en colesterol clones, obteniéndose una secuencia consenso y su homodimerización son rasgos clave en la de 30 aminoácidos. El AcMo reconoce la VP1 actividad de la tetherina. Es una proteína trans- en ELISA, pero de forma débil en western blot membrana tipo II y se une a la bicapa lipídica donde la proteína está desnaturalizada, sugi- por dos sitios, por el dominio transmembrana riendo que la interacción entre el AcMo y la VP1 N-terminal y por un anclaje de glicofosfatidili- es dependiente de la conformación. Esto se co- nositol (GPI) en el dominio C-terminal. Se ha sugerido que la tetherina bloquea directamente rrobora por la secuencia consenso obtenida, la liberación del virus gracias a su doble anclaje donde se aprecian series de 4-5 aminoácidos en la membrana y que promueve la endocito- lineales y el resto dependientes de la confor- sis de los virus envueltos desde la membrana mación. celular.Hemos investigado un posible papel de la tetherina en los últimos estadios de la morfo- Conclusiones La producción de partículas génesis del virus vaccinia y en la liberación del pseudovíricas (VLPs) y del polipéptido P2 de virus. La producción de virus extracelular no se la cápside de norovirus ha permitido identificar vió afectada por pretratamiento con interferón sitios antigénicos reconocidos por el anticuerpo de células BSC-1 o 293T. Además, la expresión monoclonal. Estos sitios antigénicos, situados transitoria de tetherina antes de la infección no en el dominio P de la VP1, son importantes en afectó a la transmisión célula a célula del virus, la interacción con los receptores celulares y polo que sugiere que o bien la tetherina no es ca- siblemente en la protección frente a la infección paz de inhibir la liberación del virus vaccinia.o por norovirus. bien que el virus dispone de mecanismos para contrarrestar la acción de ésta proteína antivi- PALABRAS CLAVE: Norovirus, Epítopo, ral.Para estudiar la capacidad de la tetherina phage display library para bloquear la transmisión del virus hemos

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construído diversos virus vaccinia recombinan- pe en España (SVGE) integra una red de mé- tes expresando diferentes versiones de la te- dicos centinelas, epidemiólogos y laboratorios therina. La expresión de la tetherina a tiempos cuyo objetivo es detectar la actividad gripal y tardíos en células infectadas por dichos recom- caracterizar los virus de la gripe circulantes. El binantes es capaz de inhibir unas 10 veces la Centro Nacional de Gripe de Madrid, que re- formación de virus extracelular, pero también cibe virus cultivados y/o muestras clínicas de afectó a la producción de virus intracelular. Es- los laboratorios participantes en la red (Re- tos resultados sugieren que la tetherina tiene LEG), caracteriza genéticamente los virus que potencial para ejercer un efecto antiviral, pero circulan en España durante cada temporada que éste efecto no parece específico de la for- epidemiológica. El objetivo de este trabajo es ma extracelular del virus. estudiar los cambios genéticos aparecidos en la hemaglutinina de los virus de la gripe que PALABRAS CLAVE: tetherina, virus vaccinia, han circulado desde el inicio de la temporada antiviral epidemiológica 2010/11, considerada la tercera onda epidémica con este virus. MATERIALES CP/225 Y MÉTODOS. Desde octubre de 2010 hasta marzo de 2011, se ha realizado la amplifica- Vigilancia y caracterización ción y secuenciación de la subunidad HA1 de molecular de los virus de la gripe la hemaglutinina de 95 virus A(H1N1)2009, 15 A y B circulantes en España virus A(H3N2) y 40 virus tipo B. Todas las se- durante la temporada 2010/11 cuencias obtenidas fueron alineadas con otras secuencias referencia tomadas de la base de Ledesma J* (1), Pozo F (1), Cuevas MT datos GISAID y analizadas filogenéticamente (1), Reyes N (1), Calderón A (1), González- mediante el paquete informático MEGA 4. RE- Esguevillas M (1), López-Valero M (1), Moreno S SULTADOS. El análisis filogenético de los virus (1), Cruz N (1), Molinero M (1), Casas I (1), Sistema A(H1N1)2009 mostró que, aunque se relaciona- de Vigilancia de la Gripe en España (SVGE) (2) ban con la cepa vacunal A/California/07/2009, Centro Nacional de Gripe-Madrid, varios virus formaban dos nuevos subgrupos Centro Nacional de Microbiología, genéticos independientes con gran robustez Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), estadística. Uno de ellos se caracterizaba por Majadahonda, Madrid (1), SVGE (2) la presencia de las mutaciones R205K, I216V y V249L. El segundo subgrupo presentaba INTRODUCCIÓN/OBJETIVOS. Los virus de las mutaciones V47I, E172K, K308E y S83P. la gripe presentan una alta tasa de mutación, En lo referente a los virus AH3N2, la mayoría principalmente en las proteínas de la envoltu- agrupaban filogenéticamente con el subgru- ra, hemaglutinina y neuraminidasa. Cambios po A/HongKong/2121/2010, caracterizado por puntuales de aminoácidos en estas proteínas las mutaciones Y94H, T212A, I230V y E280A pueden provocar cambios antigénicos que con- e incluido dentro del grupo A/Perth/16/2009 fieren capacidad a los virus para escapar de la (cepa vacunal). También se identificaron vi- inmunidad adquirida tras la vacunación. Es por rus españoles dentro de este subgrupo que ello que la OMS actualiza anualmente la for- presentaban la mutación S199A. El análisis mulación de la vacuna empleada de acuerdo de los virus de gripe B mostró que todos los a los datos recogidos durante cada temporada virus estaban relacionados con la cepa vacu- epidemiológica de gripe por el Sistema de Vi- nal B/Brisbane/60/2008 mostrando cambios gilancia de la Gripe a nivel mundial (GISN). En de los aminoácidos L58P y P144L. CONCLU- nuestro país, el Sistema de Vigilancia de la Gri-

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SIONES: El análisis realizado de los virus de H275Y en la NA de los virus A(H1N1)2009 ana- la gripe circulantes durante la temporada actual lizados en nuestro laboratorio desde el inicio de 2010/11 en España muestra la existencia de di- la pandemia. MATERIALES Y MÉTODOS. Se ferencias genéticas significativas con respecto realizó la amplificación y secuenciación de a las cepas vacunales identificando grupos ge- un fragmento parcial de la NA de 491 virus néticos en los virus de la gripe A y B. La carac- A(H1N1)2009 procedentes de 477 pacientes terización antigénica de estos virus, valorarán con infección confirmada por este virus desde la implicación de cambios en la antigenicidad abril de 2009 hasta marzo de 2011. De todas de estos nuevos grupos genéticos de los virus las muestras respiratorias analizadas, 185 fue- gripales. Financiación: DGEG-1304/08-TS-13 ron tomadas a partir de 171 pacientes graves y -B (Ministerio de Sanidad y Política Social), el resto de 306 pacientes con enfermedad leve. PS09/00246 (Fondo de Investigaciones Sani- Todas las secuencias obtenidas fueron alinea- tarias) y MPY-1440/09 (Ministerio de Ciencia e das y analizadas filogenéticamente mediante el Innovación) paquete informático MEGA 4 para estudiar la PALABRAS CLAVE: gripe, hemaglutinina, presencia de la mutación H275Y que confiere filogenia resistencia a oseltamivir. RESULTADOS. Se detectó la mutación H275Y en la NA de 5 virus. Todos ellos procedían de muestras respi- CP/226 ratorias de pacientes hospitalizados (2,92%), Mutación H275Y en la neuraminidasa 3 de ellos fueron mujeres y 2 hombres cuya de los virus A(H1N1)2009 circulantes edad media fue 38±14 años. De estos 5 pacientes, 2 presentaron mala evolución. Todos desde el inicio de la pandemia estos pacientes que presentaban factores de Ledesma J* (1), Pozo F (1), Cuevas MT (1), riesgo asociados (inmunodepresión, enferme- Calderón A (1), Moreno S (1), Reyes N (1), Cruz dad respiratoria o renal cónica), fueron tratados N (1), González-Esguevillas M (1), Molinero M previamente con oseltamivir. Tres de los virus (1), López-Valero M (1), Casas I (1), Sistema de resistentes fueron detectados en noviembre de Vigilancia de la Gripe en España (SVGE) (2) 2009, uno en enero de 2010 y el último en febre- Centro Nacional de Gripe-Madrid, ro de 2011. CONCLUSIONES. Se detecta baja Centro Nacional de Microbiología, circulación de virus de la gripe A(H1N1)2009 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), con la mutación H275Y en la NA, lo que indica Majadahonda, Madrid (1), SVGE (2) que el uso del oseltamivir es efectivo en el tratamiento de la infección por este virus. A pesar INTRODUCCIÓN/OBJETIVOS. El virus de la de los virus con la mutación H275Y han sido gripe A(H1N1)2009 fue identificado por primera detectados en pacientes previamente tratados vez en abril de 2009 en México, detectándo- con oseltamivir, es crucial la monitorización de se el primer caso en España el 25 de abril de la aparición de resistencias tanto en pacientes 2009. Aunque el virus es sensible al tratamien- tratados como no tratados con el fin de actuar to con los inhibidores de neuraminidasa (NA), eficazmente ante una posible dispersión de oseltamivir y zanamivir, se han declarado a ni- estos virus en la población general. Financia- vel mundial hasta el momento 383 virus resis- ción: DGEG-1304/08-TS-13-B (Ministerio de tentes a oseltamivir. Todos estos virus presen- Sanidad y Política Social), PS09/00246 (Fondo taron el cambio de una histidina por una tirosina de Investigaciones Sanitarias) y MPY-1440/09 en la posición 275 (H275Y). El objetivo de este (Ministerio de Ciencia e Innovación) trabajo es estudiar la aparición de la mutación

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PALABRAS CLAVE: A(H1N1)2009, insecto Sf9 con baculovirus recombinantes y neuraminidasa, oseltamivir purificación por ultracentrifugación. Clonación del dominio P2 de VP1 de norovirus GII.4-2004, expresión en Escherichia coli como proteína CP/227 recombinante y purificación de la proteína por Seroprevalencia de anticuerpos cromatografía de afinidad; para diseñar ensa- frente a norovirus GII4 en Valencia yos inmunoenzimáticos de ‘binding’ a saliva y monocapas de células Caco-2 y, analizar la se- Carmona Vicente N*, Fernández- roprevalencia de anticuerpos frente a esta re- Jiménez M, Ribes Fernández J.M., gión P2 de la cápside de norovirus. Resultados Téllez Castillo C.J., Buesa Gómez J y conclusiones Se ha logrado la expresión del Departamento de Microbiología, Facultad de dominio P2 de VP1 como proteína recombinan- Medicina, Universidad de Valencia, Valencia (1) te con colas de histidina en Escherichia coli. Este dominio, se ha utilizado para analizar la Introducción y objetivos Los norovirus (NoV) seroprevalencia de anticuerpos frente a norovi- son la causa más frecuente de gastroenteritis rus en 443 muestras de suero de pacientes de aguda de origen vírico, provocando complica- Valencia, utilizando inmunoensayos. El 99,5% ciones frecuentes en pacientes con enferme- de las muestras fueron positivas, confirmando dades de base, inmunocomprometidos y tras- que la infección por norovirus es muy frecuen- plantados. En los últimos años se ha descrito te. Las muestras de suero se dividieron en 10 la circulación de variantes de genotipo GII.4, grupos de edad. Se observó que los niveles de produciendo infecciones muy frecuentes en anticuerpos se incrementan gradual y significa- la población. La diversidad genética ocasiona tivamente con la edad, obteniéndose el máxi- cambios en la antigenicidad de la cápside ví- mo título de anticuerpos a los 41-50 años. Se rica, facilitando, probablemente, la aparición ha analizado la reactividad frente a las VLPs de cepas resistentes a los anticuerpos neutra- producidas, observándose unos valores lige- lizantes. No se ha logrado la replicación de no- ramente superiores a los detectados frente al rovirus humanos en cultivos celulares ni existe dominio P2. Esto confirma que los anticuerpos ningún modelo animal, lo que dificulta de forma séricos reconocen P2 y no reaccionan de ma- importante su estudio. La proteína VP1 se plie- nera inespecífica. Probablemente, no todos los ga en dos dominios principales denominados S pacientes se hayan infectado con la cepa de y P. Este último domino se divide en dos sub- norovirus utilizada en los ensayos, lo que nos dominios, P1 y P2, de los cuales P2 es el más induce a pensar que algunos determinantes superficial, presenta la secuencia menos con- antigénicos de la región P2 han de estar conservada del genoma de norovirus y, por tanto, servados en las diferentes cepas del mismo genotipo GII.4. desempeña un papel fundamental en la interac- ción con el receptor celular y en la antigenicidad PALABRAS CLAVE: norovirus, del virus (Tan y Jiang, 2005). Se han descrito seroprevalencia, anticuerpos dos epítopos en esta región P2, específicos de variantes GII.4 (Allen et al, 2009). Nuestro objetivo ha sido analizar la seroprevalencia de CP/228 anticuerpos frente a VLPs y el dominio P2 de la Prevalencia de parvovirus B19, cápside de norovirus. Material y métodos Pro- virus herpes tipo 2 y varicela en ducción de partículas pseudovíricas (VLPs) de gestantes del área norte de Granada norovirus GII.4 variante 2006b en células de

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Mazuelas Teatino JP* (1), Padilla A PVB19=61,4% (209/340), VHS2=3% (6/197) (2), Sampedro Martínez A (3), Ortega y VVZ=98% (345/352). Por edad, en PVB19 J (3), Sánchez Gómez J (3) destaca el grupo de gestantes >35 años con Servicio de Microbiología. Hospital una prevalencia del 72,7% (8/11); en el caso Rafael Méndez. Lorca (Murcia). (1), del VVZ, a partir de los 31 años la prevalencia Distrito Granada Nordeste. (2), Servicio es del 100% (41/41); por último, en el caso del de Microbiología. Hospital Universitario VHS-2 la prevalencia fue mayor en gestantes Virgen de las Nieves. Granada. (3) mayores de 30 años (7,5%; 3/40), no encon- trándose ningún caso en las más jóvenes (<20 Introducción: Los agentes infecciosos que pue- años). den transmitirse de la madre al niño durante el Conclusiones: Las cifras de prevalencia que embarazo o el período neonatal suponen un hemos obtenido son similares a las de otros importante problema de salud en los recién estudios seroepidemiológicos realizados en nacidos. Los microorganismos incluidos en el población española, destacando la baja preva- control serológico sistemático de la gestante lencia del VHS-2. son: virus de la Rubéola, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, virus de la hepatitis B PALABRAS CLAVE: prevalencia, gestante, y virus de la inmunodeficiencia humana. En virus circunstancias especiales puede plantearse incluir en el estudio otros agentes de transmi- sión vertical como virus varicela-zóster (VVZ), CP/229 virus herpes simple-2 (VHS-2) y parvovirus B19 Epidemiología molecular del virus (PVB19). Nuestro objetivo fue conocer la pre- de la rabia en Ceuta y Melilla valencia de anticuerpos frente a estos agentes dentro del contexto africano en gestantes del área Norte de Granada. Vázquez Morón S* (1), Muñoz Material y métodos: estudio prospectivo de pre- Cervera M (2), Berciano Rodríguez valencia y posterior estratificación por grupos J. M (1), Echevarría Mayo J. E (1) de edad (<20, 20-25, 26-30, 31-35 y >35 años) Aislamiento y Detección de Virus. CNM. en gestantes del área norte de Granada. Mues- Majadahonda (1), Laboratorio de Salud tras: sueros de gestantes, previo consentimien- Pública de Málaga. Málaga. (2) to informado. El número de sueros (una muestra por gestante) en función del agente a investigar INTRODUCCIÓN: La Península Ibérica y las fue: 340 para PVB19, 197 para VHS2 y 352 islas españolas están actualmente libres de ca- para VVZ. Periodo: enero-julio 2010. Ensayos sos de rabia causada por el virus de la rabia serológicos: la detección de IgG anti-PVB19 y clásica (RABV) en mamíferos terrestres. Sin VHS-2 se realizó mediante ensayo de quimio- embargo, de forma periódica se vienen infor- luminiscencia en un autoanalizador Centaur® mando casos de rabia desde las ciudades si- XP (Siemens, Alemania). La detección de an- tuadas en el norte de África, Ceuta y Melilla. Las ticuerpos anti-VVZ se realizó por aglutinación cepas virales implicadas en estos casos han con partículas de látex (VVZ Scan latex, Becton sido estudiadas con el objetivo de establecer Dickinson, USA). las características epidemiológicas de su cir- culación. MÉTODOS: Setenta y ocho muestras Resultados: Los datos de prevalencia global de 1983 hasta la fecha, con resultado positivo obtenidos para cada uno de los agentes fueron: por inmunofluorescencia, se utilizaron para la

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amplificación del ARN viral y secuenciación del llular decapping activators LSm1-7, Pat1p and extremo 5’ variable del gen de la nucleoproteí- Dhh1p, which function in the deadenylation- na. Las secuencias fueron alineadas, utilizan- dependent mRNA decay pathway, are required do el programa Clustal X 1,81, junto con otras for translation and replication of two (+)RNA 161 de diferentes partes del mundo obtenidas a viruses, the plant Brome Mosaic Virus (BMV) partir de bases de datos públicas y analizadas and the human hepatitis C virus (HCV). To fur- por métodos filogenéticos. Por último, el grupo ther explore the role of these cellular proteins de las secuencias de Ceuta y Melilla se anali- in the replication of (+)-stranded RNA viruses, zaron por separado con los mismos métodos, we used the ability of the animal (+)RNA Flock junto con las secuencias disponibles del conti- House virus (FHV) to replicate in yeast. FHV nente africano. RESULTADOS: Todas las se- has a bipartite genome composed of RNAs 1 cuencias de Ceuta y Melilla se agruparon con and 2, which encode the catalytic component of secuencias de Marruecos y Argelia, tanto en el the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) árbol general como en el árbol del continente and the capsid protein precursor, respectively. africano. Por otro lado, se obtuvieron diferentes The RdRp also transcribes from RNA1 a subgrupos para Ceuta y Melilla. CONCLUSIONES: genomic (sg) RNA3 via a long-distance pai- Todas las cepas pertenecen al grupo Africa 1 ring between DSCE and PSCE regions in the junto con las cepas de Marruecos y Algeria, de RNA1. In turn, sgRNA3 plays a central role in acuerdo con la localización geográfica de am- coordinating the synthesis of RNA2 that is im- bas ciudades. El análisis ha permitido observar portant for proper viral encapsidation. Thus, a una circulación de cepas diferentes desde 1983 proper RNA1/sgRNA3 ratio is key for fine tuning regulation of essential steps in FHV. Here we a 1990 en Melilla y desde1991 a1996 en Ceuta. show that such ratio depends on LSm1-7, Pa- En ambas ciudades, se produjo un reemplazo t1p and Dhh1p. The different steps of FHV re- de cepa en esas fechas, entrando otras nuevas plication were assessed in wild-type yeast and que continúan circulando en la actualidad. in deletion mutants lacking LSm1, Pat1 or Dhh1 PALABRAS CLAVE: Rabia, Epidemiología proteins. Deletion of LSm1, Pat1 and Dhh1 proteins dramatically increased sgRNA3 levels by 15-35-fold when compared to the wild-type stra- CP/230 in, while RNA1 genomic accumulation was only affected by a 1 to 4-fold. This difference was ob- The decapping activators LSm1-7, served in both the positive and negative strands Pat1 and Dhh1 are required for and was not caused by differences in RdRp ex- maintaining the proper genomic/ pression or differences in early events such as subgenomic ratio of Flock House RNA1 and sgRNA3 steady-state levels, RNA1 virus, a (+)-stranded RNA virus translation, or recruitment to the replication site.

(1) (1) Since it has been suggested that LSm1-7, Pa- Giménez-Barcons M* , Alves-Rodrigues I , t1p and Dhh1p promote decapping of cellular (2) (2) (1) Van Whynsberghe PM , Alquist P , Díez J RNAs by likely altering RNA structures, one at- Departament de Ciències Experimentals tractive possibility that we are currently evalua- i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, ting is that they maintain proper RNA1/sgRNA3 Barcelona (1), Institute for Molecular Virology, ratio by affecting the DSCE/PSCE sequence University of Wisconsin-Madison (2) structure in RNA1. These results, together with the previously described role of these proteins Viruses depend on host factors for their life on BMV, HCV and the bacteriophage Qbeta, cycle. We have previously shown that the ce-

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emphasize the pivotal roles of LSm1-7, Pat1p amplificaron las distintas ORFs mediante PCR and Dhh1p in controlling crucial steps in the re- utilizando cebadores específicos. Para estudiar plication of (+)-strand RNA viruses. la localización de las proteínas expresadas, las células transfectadas fueron analizadas me- PALABRAS CLAVE: decapping activators, (+)-stranded RNA viruses, replication diante microscopía confocal. La expresión de las proteínas fue también confirmada por Wes- tern blot utilizando un anticuerpo específico CP/231 anti-GFP. Los resultados obtenidos mostraron Estudio de la expresión y que las proteínas ORF1 y ORF3 de TTSuV1 y localización celular de las proteínas TTSuV2 se localizan en el núcleo de las células de Torque teno sus virus transfectadas, concretamente en el nucleolo. Asimismo, se observó la presencia de las pro- Martínez-Guinó L* (1), Ballester M (1), teínas ORF1 de TTSuV1 y la ORF3 de TTSuV2 Segalés J (2), Kekarainen T (1) en el nucleoplasma de las células, formando Centre de Recerca en Sanitat Animal estructuras globulares de distinto tamaño. La (CReSA), UAB-IRTA, 08193 Bellaterra, proteína ORF2 de ambas especies virales se Barcelona, Spain (1), Centre de Recerca encontró distribuida por el citoplasma y el nú- en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, cleo de las células transfectadas pero nunca en Departament de Sanitat i Anatomia Animals, el nucleolo. El análisis mediante Western blot Universitat Autònoma de Barcelona, confirmó la expresión de las proteínas ORF2 08193 Bellaterra, Barcelona, Spain (2) y ORF3 para los dos TTSuVs pero reveló la expresión de una proteína, correspondiente a Torque teno sus virus 1 (TTSuV1) y 2 (TT- SuV2) son las dos especies principales de un la ORF1, de una masa molecular menor a la virus ADN de la familia Anelloviridae, genero esperada. Tras el estudio de transcripción, se Iotatorquevirus, que infecta al cerdo domésti- determinó la generación, mediante una estra- co y al jabalí. A día de hoy existen muy pocas tegia de splicing alternativo, de dos isoformas técnicas laboratoriales para el estudio del virus, distintas para la proteína ORF1 de TTSuV1, basándose su diagnóstico mayoritariamente confirmando los resultados previamente obte- en la técnica de PCR. Con el objetivo de pro- nidos mediante Western blot. Además, se iden- fundizar en la biología de TTSuV, se realizó tificaron tres isoformas distintas para la ORF1 y el análisis de transcripción y expresión de las la ORF3 de TTSuV2. El análisis de localización proteínas virales y se determinó su localización celular de las nuevas isoformas reveló diferen- subcelular. Para ello, se amplificaron las tres tes patrones de localización entre las isoformas open reading frames (ORF) del virus (ORF1, de ORF1 de TTSuV1 y ORF3 de TTSuV2. Los ORF2 y ORF3), a partir de suero de cerdo PCR resultados obtenidos describen por primera vez positivo para ambas especies de TTSuV, y se el patrón de splicing alternativo utilizado por los clonaron en un vector que permite expresar la genes de TTSuV1 y TTSuV2, así como la loca- proteína de interés fusionada al gen de la pro- lización subcelular de las isoformas generadas, teína verde fluorescente (GFP). Una vez obte- permitiendo avanzar en el conocimiento de las nidas, las construcciones fueron transfectadas posibles proteínas virales implicadas durante la en células porcinas de riñón de cerdo (PK-15). infección con TTSuV. Para el análisis de transcripción, se extrajo el ARN total de las células transfectadas con cada PALABRAS CLAVE: Torque teno sus virus, construcción y tras su conversión a cDNA, se Anelloviridae, proteínas virales

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CP/232 origen hospitalario. En 3 de ellos, los resultados fueron negativos por las técnicas empleadas. Brotes de gastroenteritis En 5 de ellos, se obtuvieron resultados positi- aguda (GEA) por norovirus vos por las dos técnicas empleadas y en los otros 3 solo se obtuvieron resultados positivos Rodríguez-Granger J*, Pedrosa I, por medio de la RT-PCR, siendo la detección Sanbonmatsu S, Ceballos R, Pérez- de antígeno negativa. De los ocho brotes, 7 Olmo C, García-Maldonado F, Pérez-Ruiz estuvieron causados por NoV genogrupo II y 1 M, Sampedro A, Navarro Marí JM por NoV genogrupo I. CONCLUSIONES: NoV Servicio de Microbiología. Hospital es una causa frecuente de brotes de GEA en Universitario Virgen de las Nieves, Granada (1) nuestro medio, donde circula predominante- INTRODUCCIÓN: Norovirus es la principal mente el genogrupo II. Los métodos de diag- causa de brotes de gastroenteritis no bacteria- nóstico molecular son más sensibles que las na a nivel mundial. Hasta hace relativamente técnicas de detección de antígeno en el estudio poco tiempo el diagnóstico de estos virus era de brotes de GEA viral. dificultoso, basándose principalmente en la mi- PALABRAS CLAVE: norovirus, brote, croscopía electrónica. La aparición de métodos gastroenteritis moleculares y más recientemente de métodos de detección de antígeno ha facilitado su diag- nóstico. El objetivo de este trabajo es presentar CP/233 la utilidad de la RT-PCR y la detección de an- Estimación de casos de síndrome tígeno en brotes de GEA de origen viral. MA- gripal a partir de datos de Vigilancia TERIAL Y MÉTODOS: El periodo de estudio Epidemiológica (EDO) y laboratorio abarca desde julio 2010 hasta febrero de 2011, durante el cual recibimos muestras de heces durante noviembre 2009 en Castellón de posibles brotes de GEA como Laboratorio Bellido-Blasco JB * (1), Ballester-Rodríguez I de Referencia de Salud Pública en Andalucía (2), Pardo-Serrano F (3), Tirado-Balaguer MD para enfermedades con sospecha de etiología (3), Romeu-García MA (4), Silvestre-Silvestre E vírica. Se estudiaron de manera sistemática la (4), Arnedo-Pena A (4), Meseguer N (4), Herrero- presencia en heces de antígeno de rotavirus Carot C (4), Vargas-Leguás H (5), Caylà JA (5) (RotV) , adenovirus entéricos (AdV) , astrovirus CIBER-ESP. Epidemiología, Centro de (AsV) y norovirus (NoV) por inmunocromatogra- Salud Pública de Castellón (1), CIBER-ESP. fias de Vikia Rota-Adeno (Biomerieux), Astrovi- Epidemiología, Centrro de Salud Pública rus Quick Check (RAL laboratorios), Rida Quick de Castellón (2), Servicio Microbiología. Norovirus(RAL laboratorios). Para el diagnósti- Hospital General de Castellón (3), co molecular se utilizó el kit comercial Seeplex Epidemiología, Centrro de Salud Pública Diarrea-V ACE Detection (Seegene) que se de Castellón (4), Epidemiología. Agència basa en una RT-PCR múltiple para estos mis- e Salut Pública de Barcelona (5) mos virus, y diferencia entre NoV genogrupos I y II. Para cada brote se estudió un mínimo de En el contexto de la declaración de pandemia dos muestras y un máximo de 4. RESULTA- por virus de la gripe A durante 2009 se instau- DOS: Durante este periodo se estudiaron un raron en toda España sistemas de notificación total de 34 muestras de heces pertenecientes epidemiológica basados en datos de laborato- a 11 brotes, 9 de origen extrahospitalario (8 re- rio (LAB) que complementaban el sistema tra- sidencias geriátricas y 1 brote familiar) y 2 de dicional de enfermedades de declaración obli-

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gatoria (EDO). Con el objetivo de estimar los Ruiz G (1), Berciano JM (1), Garin I (4), Aihartza casos reales de síndrome gripal ocurridos en J (4), Perez-Breña P (1), Echevarría JE (2) la población de nuestra área de trabajo (par- Centro Nacional de Microbiologia, Instituto te de Castellón, aprox. 475000 habitantes) se de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, utilizó el método de captura-recaptura a partir Spain. (1), Centro Nacional de Microbiologia, de los datos aportados por los dos sistemas Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, (EDO y LAB) durante las 4 semanas de mayor Madrid, Spain. CIBER Epidemiologia y incidencia (Semana 44 a 47, noviembre). Se ha Salud Publica CIBERESP. Spain (2), Estación realizado la estimación global y también estra- Biológica de Doñana. CSIC, Sevilla. Spain tificando por edad y por semana para valorar la (3), Departamento de Biología Evolutiva, dependencia de los dos sistemas. Universidad del Pais Vasco. Spain (4)

A través de sistema EDO se notificaron 7181 INTRODUCCIÓN: A lo largo de los últimos casos y a través del sistema LAB se identifica- años se ha demostrado que los murciélagos ron 524 casos con sospecha de gripe; de ellos son reservorios de diferentes familias de virus 211 fueron coincidentes en ambos. La estima- y posible fuente de infecciones emergentes en ción global para el periodo estudiado fue de el ser humano. El primer adenovirus (AdV) de 17785 casos (intervalo de confianza 95% de murciélago Bat AdV1-FBV1, fue detectado de 15968-19602). El coeficiente de independencia manera fortuita en Japón. Después de una ex- obtenido en los datos estratificados por edad tensiva búsqueda se describió el segundo ADV y por semana no fue significativo (p=0,621 y de murciélago, Bat AdV2-PPV1, en Alemania a p=0,746, respectivamente) sugiriendo inde- partir de 3 pipistrelos comunes. Durante 2007- pendencia de los sistemas. La estimación por 2008 en China se ha descrito el tercer AdV de estratos fue similar a la global. Estos resulta- murciélago, Bat AdV3-TJM. dos son semejantes a los de otros estudios en Inglaterra y Nueva Zelanda. Indican que la ci- OBJETIVO: Búsqueda de nuevos AdV de mur- fra notificada por el sistema tradicional (EDO), ciélago en diferentes especies de murciélago ha de multiplicarse por un factor de 2,5 para españolas. estimar el número de pacientes con síndrome METODOLOGÍA: Entre los años 2004 a 2008 gripal. Durante el mes del estudio, noviembre, se ha buscado la presencia de AdV en diferen- alrededor del 3,7% e la población de nuestra tes especies de murciélago de nuestro país. Se estuvo clínicamente afectada, asumiendo uan han estudiado 856 murciélagos comprendidos duración media de la enfermedad de 5 días, en 27 diferentes especiescapturados en Anda- eso sifnigica una prevalencia puntual (dia- lucía, Valencia, Alicante, Cataluña, Extrema- ria) de más de 3000 casos en promedio. dura, Asturias, Galicia, País Vasco, Navarra, La Rioja y Menorca. Se han tomado muestras PALABRAS CLAVE: gripe pandémica, orofaríngeas y de heces y se han estudiado epidemiología, captura-recaptura mediante una PCR genérica de Familia dise- ñada en el gen que codifica para la proteína del CP/234 exon. Nuevos grupos de adenovirus en RESULTADOS: Se han detectado AdV de en murciélagos Paleárticos Occidentales 27 murciélagos Nyctalus lasiopterus, N. leisleri, Rhinolophus euryale, R. ferrumequinum, Myotis (1) (2) (3) Casas I* , Vazquez-Moron S , Juste J , myotis, Pipistrellus pygmaeus, e Hypsugo savii. Falcon A (1), Aznar C (2), Ibañez C (3), Pozo F (1),

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13 fueron encontrados en muestras respirato- desarrollo. Instituto Cajal, CSIC, Madrid (2), rias y 14 en heces. Todos los AdV fueron in- Unitat de Epidemiología, CRESA, Barcelona (3) cluidos en el género Mastadenovirus, y se dis- tribuyeron en 4 grupos diferentes. Uno de ellos Los torovirus son patógenos entéricos que procedente de Nyctalus lasiopterus se incluía pueden ocasionar gastroenteritis. Se clasifi- en un grupo junto con el bat AdV-TJM (China), can dentro de la familia Coronaviridae, orden el bat AdV2-PPV1 (Alemania) y los AdV ca- Nidovirales. Existen cuatro especies dentro del ninos, Grupo2 de AdV de murciélago. Un nú- género: torovirus equino (EqToV o BEV), bovi- mero elevado de nuevos AdVs se incluyen en no (BToV), porcino (PToV) y humano (HToV). lo que correspondería al Grupo 3 de AdV de El PToV fue descrito por primera vez en 1998 murciélago que incluiría, 13 AdV de Nyctalus (Kroneman et al., J Virol 72, 3507-3511) en Ho- lasiopterus,4 de N. leisleri, 2 de Hypsugo savii y landa, pero se conoce poco sobre su inciden- 1 de Pipistrellus pipistrellus. De manera similar cia. Estudios serológicos previos sugieren una 2 nuevos AdV procedentes de N. lasiopterus y elevada prevalencia de anticuerpos frente a con secuencia idénticas no se relacionan con PToV en Europa. En España, trabajos previos ninguno de los virus descritos en mamíferon, del laboratorio definieron una seroprevalencia incluyendo los AdV de murciélagos configuran- cercana al 100% en animales mayores de 11 do en Grupo 4. Finalmente, 3 nuevos AdV pro- semanas de edad (Pignatelli et al., 2010. Vet cedentes del genero Rhinolophus, 1 de Myotis Microb 146, 260-268) procedentes de explota- myotis y 1 de Hypsugo savii configurarían en ciones de ciclo cerrado localizadas en el nores- Grupo 5. te del país (Aragón). El objetivo de este trabajo es llevar a cabo un estudio de seroprevalencia CONCLUSIONES: Se ha encontrado una gran frente a PToV a nivel Nacional. Para ello, y variabilidad y frecuencia de nuevos AdV en como parte del proyecto PORCIVIR (Patogenia murciélagos sanos de nuestro país sugiriendo de enfermedades víricas del cerdo) del Progra- que estos nuevos virus y sus hospedadores ma CONSOLIDER se han recolectado mues- deben presentar historias evolutivas comunes. tras de suero de animales procedentes de 100 La variabilidad se refleja en la descripción de 3 granjas repartidas por toda la geografía espa- Grupos nuevos de AdV y la mayor frecuencia ñola. Se recogieron muestras de al menos tres se observa en 2 especies de nóctulos. granjas por provincia muestreada siguiendo PALABRAS CLAVE: Adenovirus, Murcielago, una completa lista de criterios epidemiológicos. Analisis filogenetico Entre estos, la edad de los lechones, el estado sintomatológico dea las explotaciones (presen- CP/235 cia o no de gastroenteritis), tipo de explotación, condiciones higiénicas de las granjas,... Para Estudio de seroprevalencia de este estudio se ha aplicado el mismo sistema torovirus porcino en España de detección serológica tipo ELISA indirecto utilizado anteriormente basado en la proteína Alonso Padilla Julio* (1), Pignatelli Garrigós de la nucleocápsida (N) de PToV como an- Jaime (2), Plazuelo Calvo Susana (1), tígeno (Pignatelli et al., 2009. Virus Res 143, Simon Grifé Meritxell (3), Casal i Fabrega 33-43). Hasta el momento se han estudiado Jordi (3), Rodríguez Aguirre Dolores (1) 51 granjas en las que se han analizado mayo- Biología molecular y celular, Centro ritariamente sueros de madres reproductoras Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid (n = 510) y de lechones de edad superior a 11 (1), Neurobiología molecular, celular y del semanas (n = 460). Los resultados obtenidos

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confirman los descritos previamente con un nú- detectó en España en 1984 en ciruelo japonés mero reducido de granjas, definiendo una se- y albaricoquero y se ha dispersado a casi to- ropositividad cercana al 100% de las muestras das las zonas productoras de frutales de hueso de animales mayores de 11 semanas de edad. donde está presente con mayor o menor preva- Estos resultados muestran una distribución am- lencia. Su principal modo de dispersión a larga plia y muy elevada de la infección por PToV en distancia es el tráfico de material vegetal infec- la cabaña porcina española, independiente de tado. A corta distancia lo transmiten diversas la sintomatología entérica de los animales o de especies de pulgones de forma no persistente. la localización y condición higiénica de las ex- Para estudiar el posible origen de los aislados plotaciones. No se observaron diferencias entre los datos obtenidos en las explotaciones de españoles y su variabilidad, se recolectaron y ciclo cerrado y los registrados al analizar mues- se conservaron liofilizados en colección 77 ais- tras de una serie de explotaciones procedentes lados virales procedentes de diferentes áreas de Extremadura donde los animales se criaron geográficas y hospedadores. La mayoría de a cielo abierto. En éstas, de nuevo la seroposi- ellos del tipo común Dideron (PPV-D) y algu- tividad frente a PToV fue del 100%. nos del tipo agresivo Marcus (PPV-M) de focos PALABRAS CLAVE: torovirus porcino, erradicados o en proceso de erradicación. La seroprevalencia, ELISA variabilidad de los aislados españoles fue comparada con la de 40 aislados procedentes de Rumanía (detección de PPV en 1941) que se CP/236 analizaron de forma similar. Se amplificaron Variabilidad genética de aislados dos secuencias parciales, una del gen de la CP españoles de Plum Pox Virus, y otra de la región P3-6K1 y CI. Aplicando el agente causal de la enfermedad de modelo de sustitución nucleotídica Kimura 2, la Sharka de los frutales de hueso en el caso de aislados PPV-D, la diversidad nucleotídica de la CP fue de 0,0064 y la de la Olmos Castelló A.* (1), Pérez Martínez región P3-6K1 y CI de 0,0034 y de 0,0120 y (2) (3) J.J. , Zagrai I. , Gorris Grancha M.T. 0,0122, respectivamente, para los escasos (1) (4) , Candresse T. , Cambra Álvarez aislados de PPV-M analizados. El análisis filo- (1) (2) M. , García Álvarez J.A. genético de aislados PPV-D españoles mues- Centro de Protección Vegetal y Biotecnología. tra, para ambas regiones, gran homogeneidad IVIA. Moncada (Valencia) (1), Centro y una mínima variabilidad de secuencias que Nacional de Biotecnología (CNB). CSIC. sugiere un origen común y confirma la hipóte- (2) Madrid , Breeding and Virology.Fruit sis de una única o unas pocas introducciones (3) Research Station. Bistrita (Rumanía) , de material infectado y su posterior dispersión. Equipe de Virologie. UMR BFP. INRA. Los aislados tipo PPV-M españoles presentan Villenave d´Ornon (Francia) (4) mayor variabilidad, probablemente debida a La enfermedad de la sharka es la más grave de proceder de distintas introducciones recientes. los frutales de hueso (albaricoquero, ciruelos La variabilidad de los aislados de PPV rumanos y melocotonero) por las pérdidas económicas resultó muy superior, detectándose además de que provoca. Está causada por Plum pox virus los tipos D y M el tipo Rec (recombinante entre (PPV), agente de cuarentena, género Potyvi- D y M). Se han seleccionado tres aislados es- rus, familia Potyviridae, del que se han descrito pañoles tipo D (el único en dispersión natural siete tipos (D, M, EA, C, Rec, W y T). El virus se en España) para su secuenciación completa.

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*Este estudio ha sido financiado por los proyec- Surgió en Europa en 2001 en Austria, asocián- tos: CE-7FP KBBE204429 SharCo y AGL2009- dose a mortalidad aviar durante cinco veranos 07531 del Ministerio de Ciencia e Innovación. consecutivos. En la última década, se ha de- PALABRAS CLAVE: secuenciación, tipos tectado anticuerpos frente al virus en una gran PPV variedad de aves de Europa (Austria, Hungría, Suiza, Reino Unido, España e Italia). USUV CP/237 emergió como un nuevo patógeno importante para el hombre en el verano de 2009, cuando Detección de los virus West se asoció con los trastornos neurológicos en Nile y Usutu en mosquitos Cx. dos pacientes en Italia. Durante el año 2008 y perexiguus en España 2009 se analizaron 3,471 lotes de mosquitos Vázquez A* (1), Ruiz S (2), Herrero L (1), Moreno capturados en humedales de Doñana y ma- J (2), Molero F (1), Magallanes A (2), Sánchez- rismas del Odiel en Huelva. Estos lotes fueron Seco MP (1), Figuerola J (3), Tenorio A (1) analizados mediante una RT-Nested-PCR ge- Laboratorio de Arbovirus y Enfermedades nérica en el gen de la NS5 para flavivirus. Se ha Víricas Importadas. Centro Nacional de detectado WNV en 7 lotes de mosquitos Culex Microbiología. Instituto de Salud Carlos III perexiguus capturados en el 2008 y genoma vi- (1), Servicio de Control de Mosquitos, Di- ral correspondiente a USUV en el 2009 en un putación Provincial de Huelva (2), Consejo lote del mismo vector. El análisis filogenético Superior de Investigaciones Científicas. demostró que el WNV detectado es similar a la (3) Estación Biológica de Doñana. Sevilla cepa descrita en águilas imperiales en España Los virus West Nile (WNV) y Usutu (USUV) son en 2007 y que el genoma viral correspondiente flavivirus en cuyo ciclo biológico las aves ac- a USUV es muy similar al obtenido a partir de túan como hospedadores amplificadores y son Culex pipiens en España en 2006. Se ha conse- transmitidos por mosquitos, siendo el hombre guido el aislamiento en células Vero E6 para el y equinos hospedadores finales. WNV tiene WNV, pero no para el USUV. Estos resultados una distribución mundial y la mayoría de las infecciones en humanos son asintomáticas pu- describen la primera detección en España de diendo llegar a producir encefalitis, meningitis, WNV linaje 1 y USUV en Cx.perexiguus. Esta parálisis flácida e incluso hepatitis fulminantes. información podría ser muy útil para un mejor Desde el año 1996 ha cobrado una gran impor- conocimiento sobre el ciclo biológico de estos tancia sanitaria, y se considera re-emergente virus. Ambos virus están en plena dispersión en Europa y emergente en el continente ame- por Europa, WNV incrementando en los últimos ricano desde 1999, donde causó una gran epi- años el número de brotes y virulencia en hu- demia con miles de infecciones y muertes. En manos y caballos, y en el caso de USUV des- los últimos 30 años en Europa y en la cuenca cribiéndose los primeros casos de enfermedad Mediterránea se han descrito casos de enfermedad en humanos, aves y/o equinos. En Es- en humanos. El conocimiento de la circulación paña en el año 2010, ha producido por primera de estos virus en nuestro país es importante vez un brote en caballos y se han descrito dos para una posible prevención y vigilancia de la infecciones agudas en humanos en Andalucía. enfermedad. USUV se aisló en la República Centroafricana PALABRAS CLAVE: Virus West Nile, Virus en un hombre con fiebre y erupción cutánea. Usutu, España

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CP/238 a pacientes de los cuales 69 correspondían a casos graves que requirieron ingreso en UCI y Estudio de mutaciones en el virus de la 78 eran cuadros leves (pacientes atendidos en gripe H1N1 2009 asociadas a cambios urgencias hospitalarias y pacientes de la Red en la patogenicidad y resistencia Centinela de Gripe en Andalucía). A nivel de a inhibidores de neuraminidasa hemaglutinina, la mutación D222G se obser- vó en 4 casos, 3 de la temporada 2009-2010 Sanbonmatsu S*, Pedrosa I, Ceballos R, Pérez Olmo C, Rodríguez Granger J, Pérez y uno de la presente temporada. Aunque esta Ruiz M, Rivera MA, Béjar L, Navarro Marí JM mutación también ha sido detectada a nivel mundial en pacientes con cuadros leves, en Servicio de Microbiología, Hospital nuestra serie estos 4 casos eran pacientes con Universitario Virgen de las Nieves, Granada (1) enfermedad grave. Además se ha detectado la La mutación H275Y en la neuraminidasa del mutación D222N en otros 3 casos graves, y la virus de la gripe H1N1 (2009) confiere resisten- mutación D222E en 11 casos, de los cuales 3 cia a oseltamivir. Por otra parte, determinadas correspondían a casos graves y 8 a casos le- mutaciones en la hemaglutinina del virus de ves. Aunque las mutaciones D222N y D222E la gripe H1N1 (2009) se han relacionado con no se han relacionado con cambios en el poder cambios en el poder patógeno de éste. Los re- patógeno del virus, la primera sólo se detectó ceptores celulares para los virus gripales son en casos de infección grave. El estudio gené- oligosacáridos glicosilados unidos a un extre- tico de la neuraminidasa reveló dos casos con mo de ácido siálico a través de un enlace alfa- la mutación H275Y (1,9%). En el momento de 2,6 o alfa-2,3. La hemaglutinina viral es la pro- la toma de la muestra, los pacientes ya habían teína responsable de la unión a dicho receptor. recibido tratamiento con oseltamivir, por tanto, La infección humana por los virus de la gripe no se pudo determinar si pudieron desarrollar ocurre en la mayoría de los casos a nivel del resistencia durante el mismo. Eran pacientes tracto respiratorio superior, en el cual existen inmunodeprimidos (enfermos con cánceres he- mayoritariamente receptores con residuos de matológicos) que fallecieron. ácido siálico con unión alfa-2,6. Mientras que los receptores celulares en el tracto respiratorio PALABRAS CLAVE: H1N1 2009, inferior son de tipo alfa-2,3 y en mucha menor hemaglutinina, neuraminidasa cantidad, alfa-2,6. Por estudios con la gripe española causante de la pandemia de 1918, CP/239 se demostró que la mutación D225G en la hemaglutinina aumentaba la afinidad del virus Cumplimiento de los postulados de por los receptores de alfa-2,3. Se ha postula- Koch para un begomovirus (familia do que esta mutación en el actual virus pan- Geminiviridae) que infecta especies démico (aminoácido 222) podría permitir una replicación más eficiente en el tracto respirato- de Ipomoea (familia Convolvulaceae) rio inferior y conferir al virus un mayor poder Orílio AF*, Trenado HP, Márquez-Martín patógeno. Hemos analizado mutaciones a nivel B, Moriones E, Navas-Castillo J de neuraminidasa y hemaglutinina en 101 y 147 cepas del virus H1N1 (2009) aisladas en Instituto de Hortofruticultura Subtropical Andalucía durante las temporadas 2009-2010 y Mediterránea “La Mayora” (IHSM-UMA- y 2010-2011, respectivamente, pertenecientes CSIC), Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 29750 Algarrobo-Costa, Málaga (1)

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La batata (Ipomoea batatas) y especies rela- ‘Promesa’ se observó pérdida de la pigmenta- cionadas como I. indica están frecuentemente ción morada en la zona internervial. En la va- infectados por begomovirus monopartitos (gé- riedad ‘Beauregard’, además, se observó una nero Begomovirus, familia Geminiviridae) [Lo- pérdida significativa de producción de raíces zano et al. (2009) J. Gen. Virol. 90: 2550-2562]. comercializables. Por otra parte, la progenie Los begomovirus que infectan a especies del generada a partir del clon infectivo de SPL- género Ipomoea, o ‘swepovirus’, pertenecen a CLaV ha sido transmisible por Bemisia tabaci un grupo distinto de los begomovirus del Viejo biotipo Q a partir de plantas de I. setosa a I. y Nuevo Mundo, representando uno de los pa- setosa, I. nil, y batata ‘Promesa’. La secuen- sos iniciales en la diversificación de este géne- ciación del genoma completo de la progenie ro de virus. La obtención de clones infectivos viral a partir de una de las plantas de I. setosa de begomovirus es un proceso relativamente infectada mediante transmisión por B. tabaci sencillo que se ha simplificado tras la disponibi- ha confirmado la identidad con el begomovirus lidad de la técnica de amplificación por círculo inicialmente inoculado. Esta es la primera vez rodante (rolling circle amplification, RCA) utili- que se han verificado los postulados de Koch zando DNA polimerasa φ29. Sin embargo, la para una enfermedad de batata causada por un obtención de clones infectivos de las especies swepovirus. de swepovirus no ha tenido éxito hasta la fecha. Por lo tanto, los postulados de Koch no han podido ser verificados para ninguna de las PALABRAS CLAVE: Begomovírus, Ipomoea enfermedades causadas por estos virus. spp., Postulados de Koch

En este trabajo presentamos la obtención de CP/240 un clon infectivo de un aislado desweet pota- to leaf curl Lanzarote virus (SPLCLaV) a partir Cuevavirus, un nuevo género de una planta de batata de un cultivo comercial viral en la familia Filoviridae de la provincia de Málaga. El genoma viral se Negredo A* (1), Palacios G (2), Dopazo H amplificó mediante RCA y tras la digestión par- (3), Vázquez-Morón S (4), González F (5), cial del producto obtenido se generaron formas de la Cruz D (1), Molero F (1), Juste J (6), diméricas en tándem del genoma que se clona- Quetglas J (6), Savji N (2), Wick I (2), Pizarro ron en un vector binario. Se utilizaron cultivos M (7), Hirschberg D (2), Hutchison S (8), de Agrobacterium tumefaciens conteniendo el (2) (4) (1) plásmido recombinante para agroinocular plan- Lipkin I , Echevarría JE , Tenorio A tas de batata (var. ‘Beauregard’ y ‘Promesa’), I. Laboratorio de Arbovirus y Enfermedades nil (var. ‘Scarlett O’Hara’), I. setosa y Nicotiana Víricas Importadas, Centro Nacional de benthamiana. Mediante hibridación molecular y Microbiología, Madrid (1), Center for Infection PCR se confirmó la infección viral en plantas and Immunity, Columbia University, New York de las cuatro especies. Las plantas deI. nil, I. (2), Comparative Genomics Unit, Centro de setosa y N. benthamiana infectadas a partir del Investigación Príncipe Felipe, Valencia (3), clon dimérico mostraron síntomas consistentes Laboratorio de Aislamiento y Detección Viral, en enrollamiento de las hojas, amarilleo y re- Centro Nacional de Microbiología, Madrid (4), ducción de crecimiento. Además, las plantas de Calle Carrión nº 14-3ºH, Posada de Llanera, I. nil mostraron amarilleo de las nerviaduras. En Principado de Asturias (5), Evolutionary batata, las plantas de la variedad ‘Beauregard’ Biology Department, Estación Biológica de presentaron síntomas de rizado de hoja y en Doñana (CSIC) (6), Facultad de Veterinaria,

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Universidad Complutense de Madrid (7), Roche CP/241 Life Sciences, Branford, CT, 06405, USA (8) Diseño y optimización de una RT-PCR Un nuevo virus, denominado virus Lloviu, ha en tiempo real para el diagnóstico sido descubierto en murciélagos de la especie del Flavivirus Bagaza (BAGV) Miniopterus schreibersii en una cueva del norte de la Península Ibérica empleando métodos Buitrago D*, Rocha A, Tena- genéricos de amplificación genómica desarro- Tomás C, Vigo M, Agüero M llados para actividades de diagnóstico e investi- Laboratorio Central de Veterinaria, gación en el Centro Nacional de Microbiología. Algete, España. (1) La secuencia de un fragmento de 186 pb del El virus Bagaza (BAGV) perteneciente a la fa- gen de la polimerasa que amplifica dicho méto- milia Flaviviridae, género Flavivirus, subgénero do mostró una similitud del 75 % con la especie Ntaya, fue aislado por primera vez en Bagaza, Zaire del género Ebolavirus; posteriormente, el República Centro Africana en 1966. Posterior- análisis filogenético realizado con un fragmen- mente se aisló en distintos países de África Oc- to de 2500 pb, que incluye parcialmente el gen cidental y en la India donde los estudios de se- que codifica la nucleoproteína y el gen que co- rología indican que podría ser capaz de infectar difica la polimerasa viral, definió la formación de a humanos, aunque actualmente se desconoce un nuevo clado dentro de la familia Filoviridae. su patogenicidad en esta especie. Reciente- En esta familia viral se incluyen virus que cau- mente el BAGV se ha detectado y aislado por san fiebre hemorrágica en primates, y pueden primera vez en España a partir de muestras de infectar cerdos y murciélagos; se han identifi- perdices rojas (Alectoris rufa) enfermas, espe- cado 6 especies virales, cinco de ellas integran cie endémica de la Península Ibérica, siendo el género Ebolavirus y una especie conforma el también la primera vez que el virus ha apare- género Marburgvirus. La información de la se- cido en el continente Europeo. (Ver descripción cuencia completa del genoma del virus Lloviu del brote en poster: Nuevo flavivirus en Europa: obtenida mediante técnicas de secuenciación brote de virus Bagaza en perdices y faisanes masiva, ha permitido conocer que la organiza- en el sur de España, 2010) Para la detección ción del genoma es similar a la de los filovirus del virus se utilizó una técnica de RT-PCR he- y más próxima a Ebolavirus que a Marburgvi- minested para el género Flavivirus descrita por rus, encontrándose truncado el extremo 5´ del Scaramozzino et al 2001, que amplifica par- genoma. El análisis de distancia genética (p- cialmente la región del genoma que codifica distancia) indica que la secuencia del genoma la proteína no estructural NS5, una de las más del virus Lloviu es aproximadamente igual de conservadas en el género. Los fragmentos de distante a ambos géneros (51 % a Ebolavirus ADN (220pb) obtenidos en este análisis fueron y 56 % a Marburgvirus). Estas características secuenciados bidireccionalmente y las secuen- indican un nuevo género viral dentro de la fa- cias obtenidas mostraron una identidad del 98 milia FilovirIdae, al que hemos denominado % y 95%, respectivamente, con dos aislados Cuevavirus, nombre que deriva del tipo de ac- Bagaza previamente descritos (African strain cidente geográfico donde se localiza la especie DakAr B209, AY632545; Indian strain 96363, de murciélago en la que ha sido encontrado el EU684972), lo que permitió concluir que el fla- virus Lloviu. vivirus detectado correspondía al BAGV. El objetivo del trabajo que se presenta ha sido desa- PALABRAS CLAVE: filovirus, murciélagos, rrollar una RT-PCR en tiempo real, específica emergentes para el virus BAG, que permita diagnosticar la

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presencia de genoma viral en muestras clínicas Sanjosé Aranda L* (1), Glaria Ezquer de forma rápida y con alta sensibilidad. Para I (2), Ramsés Arias R (2), Ballesteros ello se realizó una comparación de las secuen- Benavides N (1), de Andrés Cara D (2), cias NS5 del virus español con la de todos los Amorena Zabalza B (2), Doménech virus Bagaza disponibles en Genbank, em- Gómez A (1), Gómez-Lucía Duato E (1) pleando el programa de alineamiento múltiple Departamento de Sanidad Animal. Facultad Clustal W. Basándose en este alineamiento, de Veterinaria. Universidad Complutense. se diseñó una pareja de primers y una sonda Madrid (1), Instituto de Agrobiotecnología TaqMan-MGB, utilizando el programa Primer (CSIC-UPNA, Pamplona, Navarra) (2) Express 2.0 (Applied Biosystems), en una re- gión conservada entre las diferentes cepas del Maedi/Visna (MV) es una enfermedad cróni- virus BAG y con suficientes cambios respecto a ca producida por un lentivirus, el virus Maedi/ otros flavivirus como para garantizar su espe- Visna (MVV) y que afecta principalmente al cificidad. En la optimización de la RT-PCR en ganado ovino produciendo una sintomatología tiempo real se ensayaron distintas combinacio- respiratoria, nerviosa, mamítica y/o articular, nes de concentración de primers y sonda para dependiendo tanto de factores virales como del conseguir la mejor eficiencia de la reacción. Se hospedador. Aunque la infección persiste de determinó la sensibilidad del método optimiza- por vida, la expresión y eliminación del virus se do y se comparó con la del ensayo RT-PCR he- relaciona con momentos reproductivos como minested empleado en el diagnóstico inicial del el parto o la lactación. Esto lleva a plantear la brote. Asimismo se realizaron ensayos de es- hipótesis de si, como ocurre en otros retrovi- pecificidad, empleando otros virus de la familia rus, las hormonas pueden ser capaces de di- Flaviviridae, con resultados satisfactorios. La rigir la expresión de genes virales a través de técnica desarrollada ha demostrado ser válida su interacción con unos elementos reguladores para la detección del BAGV, tanto en aislados hormonales (HRE) localizados en le región pro- del virus, como en muestras clínicas proceden- motora/reguladora de la replicación, denomi- tes de animales afectados, permitiendo realizar nada LTR, del genoma proviral. Nuestro grupo un diagnóstico sensible del patógeno en menos de investigación ha estudiado previamente el de 4 horas desde la recepción de las muestras efecto de las hormonas esteroideas sobre un en el laboratorio. En combinación con un sis- lentivirus felino, el virus de la inmunodeficien- tema de extracción automatizado este método cia felina (FIV), encontrando que la replicación permitiría realizar un análisis a gran escala de del virus se ve alterada en presencia de estra- la presencia del virus en las posibles poblacio- diol, progesterona y cortisol e identificándose nes animales afectadas, lo que puede resultar varios sitios HRE en la región U3 del LTR. De de gran utilidad ante una hipotética reaparición forma similar, en estudios preliminares sobre el del mismo. efecto del estradiol en cultivos de fibroblastos PALABRAS CLAVE: Flaviviridae, Bagaza, infectados por MVV hemos observado un in- RT-PCR en tiempo real cremento de la apoptosis que podría deberse a que la hormona actúe directamente sobre la replicación de la cepa EV1 de MVV y sea éste CP/242 el causante directo del desencadenamiento de Efecto de las hormonas esteroideas la apoptosis. Además, se han identificado, mediante los programas Bioedit Sequence Align- sobre la actividad transcripcional de la ment Editor y Genomatix (trancription factor región LTR del virus de Maedi/Visna binding sites), varios posibles HRE situados en

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la región LTR del genoma proviral de MVV: la The CoV are a large family of positive-stranded secuencia AAGTCA de reconocimiento a estró- RNA viruses subdivided in three genus α, β genos (subgrupo ER) y la secuencia TGCACT and γ (1). Prototype viruses in each group are de reconocimiento a glucocorticoides/progeste- transmissible gastroenteritis virus (TGEV, α1), rona (GR/PR). Sin embargo, a partir de la se- human coronaviruses (hCoV) 229E and NL63 cuencia no es posible concluir que sean sitios (α2), mouse hepatitis virus (MHV, β1), severe funcionales. Por ese motivo, el objetivo de este acute respiratory syndrome coronavirus (SARS- estudio es evaluar el efecto de varias hormo- CoV, β2), and avian infectious bronchitis virus nas esteroideas sobre la actividad promotora (IBV, γ). The CoV are enveloped viruses with de la región LTR de la cepa EV1 del MVV. Para large surface projections coming out of the viral ello se han construido plásmidos AcGFP, que envelope. The protrusions or peplomers corres- contienen el gen para la GFP (proteína verde pond to the CoV spike (S) glycoprotein, a type fluorescente) y en cuyo MCS (multiple cloning I membrane protein with a single transmembra- site) se ha clonado la región U3-CAP del LTR ne region anchored to the lipid envelope at the donde se encuentran los sitios de regulación de C-terminal moiety. The determinants defining la transcripción (promotores y enhancers). Una the CoV tropism are located in the N-terminal particularidad del vector AcGFP es que carece S1 region of the S protein, which is specialized de promotores propios, por lo que la expresión in recognition of cell surface receptor mole- de la proteína verde fluorescente dependerá de cules for virus entry into host cells. There is a que se active o no la maquinaria de transcrip- significant variability in receptor usage among ción del LTR. De este modo, tras realizar las coronaviruses, which is suggestive of diversity transfecciones en fibroblastos se puede evaluar among the spike proteins. TGEV and hCoV- la actividad transcripcional del LTR a través de 229E use the aminopeptidase N (APN) receptor la medición de la expresión de la proteína GFP from pigs and humans respectively (2,3). The mediante citometría de flujo y estudiar su va- S1 region of the S protein is a major target of riación en función de las diferentes concentra- immune responses. Among the four antigenic ciones y tipos de hormonas. Los resultados de sites defined in the TGEV S protein (4), the main las variaciones en la expresión de la GFP serán neutralization antigenic site A overlaps with the presentados en el póster. determinants responsible of TGEV tropism (5). We have determined the crystal structure PALABRAS CLAVE: maedi, visna, LTR, of an APN binding domain of the TGEV S pro- hormonas esteroideas tein in complex with a neutralizing monoclonal antibody (1AF10) that prevents virus binding to CP/243 the receptor. The TGEV RBD adopts a β-barrel structure similar to that described for the NL63 Structural bases of virus, an alphacoronavirus that do not bind to alphacoronavirus neutralization the APN receptor. The structure shows that ex- by preventing virus binding to posed loops at the tip of the β-barrel, are major the aminopeptidase N receptor epitopes of TGEV neutralizing antibodies. Mo- reover, mutations in those loops showed that Reguera J, Santiago C, Ordoño D, Mudgal they are also engaged in binding of the TGEV G, Enjuanes L, Casasnovas JM* S protein to the APN receptor. Our results show Centro Nacional de Biotecnología, structural conservation among the receptor bin- CSIC, Darwin 3, Campus Universidad ding domains of alphacoronavirus, independent Autónoma, 28049 Madrid, Spain (1) of the receptor molecule they recognize, and

Virología. Publicación Oficial de la Sociedad Española de Virología XI CONGRESO NACIONAL D VIROLOGÍA GRANADA 2011 POSTERS

prove that alphacoronavirus neutralization by the immune system is accomplished by targeting critical receptor binding residues in the CoV S protein. 1. Enjuanes, L., Gorbalenya, A. E., de Groot, R. J., Cowley, J. A., Ziebuhr, J., and Snijder, E. J. (2008) Nidovirales. in Encyclopedia of Virology (Mahy, B. W. J., and Van Regenmortel, M. H. V. eds.), Third Ed., Elsevier, Oxford. pp 419-430

2. Yeager, C. L., Ashmun, R. A., Williams, R. K., Cardellichio, C. B., Shapiro, L. H., Look, A. T., and Holmes, K. V. (1992) Nature 357, 420-422 3. Delmas, B., Gelfi, J., L’Haridon, R., Vogel, L. K., Sjostrom, H., Noren, O., and Laude, H. (1992) Nature 357, 417-420 4. Sánchez, C. M., Jiménez, G., M.D., L., Co- rrea, I., Suñé, C., Bullido, M., Gebauer, F., Smerdou, C., Callebaut, P., Escribano, J. M., and Enjuanes, L. (1990) Virology 174, 410-417

5. Godet, M., Grosclaude, J., Delmas, B., and Laude, H. (1994) J. Virol. 68, 8008-8016 PALABRAS CLAVE: alphacoronavirus, aminopeptidase N receptor, crystal structure

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