Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
Vanessa Mancebo Campos
TESIS DOCTORAL Ciudad Real, 2020
Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos
ESTUDIO DEL PROCESO DE OXIDACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. EFECTO INDIVIDUAL Y COMBINADO DE LOS ANTIOXIDANTES NATURALES
Memoria de investigación presentada por Vanessa Mancebo Campos para aspirar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de Alimentos
Ciudad Real, 1 de Septiembre de 2020
VºBº VºBº
Fdo. María Desamparados Salvador Moya Fdo. Giuseppe Fregapane Quadri Catedrática de Universidad del Catedrático de Universidad del Departamento de Química Analítica y Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Tecnología de Alimentos de la Castilla-La Mancha Universidad de Castilla-La Mancha
El doctorando:
Fdo. Vanessa Mancebo Campos
D. Gregorio Castañeda Peñalvo, Profesor Titular de Universidad y Secretario del Departamento de Química Analítica y Tecnología de Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha.
CERTIFICA
Que el presente trabajo de investigación titulado ESTUDIO DEL PROCESO DE OXIDACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. EFECTO INDIVIDUAL Y COMBINADO DE LOS ANTIOXIDANTES NATURALES constituye la Memoria que presenta Dª Vanessa Mancebo Campos para aspirar al Grado de Doctor en Ciencia y Tecnología de Alimentos y ha sido realizado bajo la dirección de los Catedráticos de Universidad Dra. Dª Mª Desamparados Salvador Moya y Dr. D. Giuseppe Fregapane Quadri.
Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Ciudad Real a 30 de Septiembre de dos mil veinte.
Vº Bº
Fdo. Dña. Rosa del Carmen Rodríguez Martín-Doimeadios Directora del Departamento
Fdo. D. Gregorio Castañeda Peñalvo Secretario del Departamento
ID. DOCUMENTO LsKDIxCiCM Página: 1 / 1 FIRMADO POR FECHA FIRMA ID. FIRMA CASTAÑEDA PEÑALVO GREGORIO 30-09-2020 13:58:46 1601467127620 RODRIGUEZ MARTIN - DOIMEADIOS ROSA DEL CARMEN 30-09-2020 14:13:19 1601468001979
LsKDIxCiCM
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AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han contribuido en este trabajo de Tesis Doctoral, y en particular:
A mis Directores de Tesis, Giuseppe Fregapane y Amparo Salvador, por haberme dado la oportunidad de pertenecer a su grupo de investigación, por su paciencia en todos estos años, y por el ánimo, confianza y apoyo que me han mostrado en este y otros ámbitos de mi vida profesional.
A mis compañeros del GAO. En primer lugar a Sergio Gómez Alonso, que me enseñó y guió en mis primeros pasos como investigadora, y que muchos años después, además de amigo, sigue siendo para mi un referente como profesional. A Aurora, Sergio, Antonio, Rosi y Marina, por los buenos momentos compartidos dentro y fuera del laboratorio, que siempre recordaré con mucho cariño.
A los todos los compañeros de Cesena, en la Universitá di Bologna, especialmente a Lorenzo Cerretani, por permitirme formar parte de su grupo de investigación y dejarme aprender y aportar con total confianza. Gracias a todos los que hicieron de mi estancia un feliz periodo que nunca olvidaré.
A todos los amigos y conocidos que personal o profesionalmente me han hecho llegar su apoyo y han compartido conmigo su conocimiento. Sin duda, todo suma para enfrentar y conseguir cualquier logro.
A mis padres, Antonio y Manoli, por su sacrificio para darme una buena educación y su apoyo incondicional en todas las elecciones que he hecho en mi vida. A mi hermanoRoberto y mi cuñada Esther, por su ánimo y alegría que ayudan siempre a ver las cosas con más luz. Os va a parecer mentira estar leyendo, por fin, mi tesis....
A mi marido, Rubén, por apoyarme siempre en todas mis decisiones, por su paciencia y ánimo en los momentos peores, y por compensar mis altibajos con humor. Sin tí, esta tesis y otras muchas cosas no hubieran sido posibles. Gracias.
Y cómo no, a mis hijos, Adrián y Ariadna. No estaban ni en proyecto cuando comenzó todo esto y ahora son mi mejor proyecto. Que este esfuerzo sea un ejemplo para vosotros y ojalá esteis orgullosos. Gracias por comprender el tiempo que os he robado y darme a cambio abrazos y sonrisas, no puede haber mayor muestra de amor.
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Resumen
La vida útil de los productos alimenticios está fuertemente relacionada con la calidad sensorial y la estabilidad microbiológica y química. En el caso del aceite de oliva virgen es un producto muy inhóspito para los microorganismos, por lo que no sufre degradación microbiológica. Sin embargo, es altamente susceptible a la oxidación, siendo ésta la principal causa de disminución de su extraordinaria calidad como aceite vegetal. La oxidación de lípidos es un proceso que ocurre bastante lentamente a la temperatura de extracción o almacenamiento habitual del aceite de oliva virgen (temperatura ambiente), por lo que tradicionalmente se han empleado métodos acelerados (ASLT, Accelerated Shelf Life Tests) para evaluar la estabilidad oxidativa del aceite en los cuales se incrementa la temperatura para llevar al producto a su máxima oxidación en un período de tiempo relativamente corto. Sin embargo, lo más difícil es correlacionar el valor de la estabilidad oxidativa obtenida en condiciones aceleradas con la vida útil o estabilidad del producto alimenticio en términos de período de almacenamiento máximo en las condiciones habituales de conservación. El trabajo que dio lugar al capítulo 3.1 de esta Tesis Doctoral (“Cinética de oxidación de triacilgliceroles de aceite de oliva bajo ensayos acelerados de vida útil (25-75ºC)”) se orientó a estudiar el efecto de la temperatura en la matriz de triacilgliceroles de aceite de oliva, en ausencia de compuestos pro y antioxidantes, y se relacionó el incremento de la temperatura con algunos de los índices de oxidación primaria y secundaria.
El siguiente paso fue el estudio de la oxidación del aceite de oliva virgen en condiciones normales de almacenamiento (capítulo 3.2 “Evolución de los compuestos mayoritarios y minoritarios e índices de oxidación en el aceite de oliva virgen durante 21 meses de almacenamiento a temperatura ambiente”) para evaluar el papel que desempeñan los compuestos minoritarios del aceite de oliva en este proceso de oxidación. Hasta el momento del planteamiento de dicho estudio, los trabajos encontrados en bibliografía en los que se utilizaran condiciones de temperatura similares a temperatura ambiente contribuyeron a un mejor entendimiento del proceso de autooxidación, sin embargo, no resultaban concluyentes en relación con la vida útil de este producto debido al estudio de sólo un determinado aspecto de la calidad del aceite de oliva o bien a que el poco tiempo de ensayo no era suficiente para obtener resultados concluyentes dada la gran estabilidad del aceite de oliva. En este trabajo se estudiaron los cambios producidos en los ácidos grasos y compuestos minoritarios (compuestos fenólicos, pigmentos y -tocoferol) y se establecieron y evaluaron distintos parámetros relacionados con la estabilidad oxidativa a temperatura ambiente (las velocidades de aumento de índices de oxidación primaria y secundaria, el tiempo en alcanzar los límites de los parámetros de calidad normalizados). Los resultados obtenidos se tomaron como valores experimentales de estabilidad o vida útil a temperatura ambiente. En bibliografía se ha reflejado ampliamente que existe una buena correlación entre la estabilidad oxidativa del aceite de oliva virgen determinada mediante pruebas de oxidación acelerada (AOM o Rancimat), y su contenido inicial de antioxidantes naturales, especialmente compuestos fenólicos (polifenoles totales, o-difenoles o formas oleosídicas de hidroxitirosol). Sin embargo, ningún método acelerado de estabilidad oxidativa se ha reconocido hasta el momento como un parámetro legal debido a la insatisfactoria relación entre los resultados de estos ensayos acelerados y la vida útil real de dichos productos alimenticios. El interés por III
Resumen estudiar más a fondo la oxidación de varios aceites de oliva virgen, con diferentes contenidos de antioxidantes naturales, bajo las condiciones aceleradas que utilizan el aparato Rancimat llevó al siguiente capítulo del plan de trabajo experimental: “Estudio comparativo del comportamiento del aceite de oliva virgen bajo condiciones de oxidación acelerada de Rancimat y almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente”. Los resultados reflejan la evolución de los productos de oxidación primaria y secundaria y el efecto del contenido antioxidante en el curso de la oxidación en las condiciones dadas, definiendo las limitaciones del método Rancimat y similares para determinar la estabilidad y predecir la vida útil de aceites de oliva virgen. Estos resultados y los consultados en bibliografía en relación a ASLT, llevaron a realizar el siguiente trabajo: desarrollar un estudio de la evolución de la oxidación a diferentes temperaturas (40, 50 y 60ºC) de los aceites de oliva virgen investigados que, en paralelo a las pruebas de estabilidad en condiciones ambientales, permitieran desarrollar un modelo de predicción de vida útil (capítulo 3.4 “Estudio cinético para el desarrollo de un test acelerado de estabilidad oxidativa para estimar la vida útil potencial del aceite de oliva virgen”). Gracias a este trabajo el comportamiento cinético de autooxidación de los principales índices de oxidación (PV, K232 y K270) y el sustrato oxidable (ácidos grasos insaturados (UFA)) se detalló por primera vez. Se seleccionó K232 como el mejor índice de oxidación normalizado para la estimación potencial de la vida útil del aceite de oliva virgen, definido como TRUL (Tiempo para alcanzar el límite superior legal de K232), a una temperatura moderada (≤60 ºC): TRUL = a Tb. Los compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen son los responsables de su estabilidad oxidativa, así como su composición de ácidos grasos, elevada en monoinsaturados frente a poliinsaturados. Esta proporción de ácidos grasos es bastante similar en los aceites independientemente de la variedad de aceituna y de los métodos de extracción, sin embargo, sí pueden existir grandes diferencias en el tipo y concentración de compuestos fenólicos y - tocoferol. Las muestras de aceite de oliva virgen estudiadas hasta el momento presentaban importantes diferencias, pero no se había podido relacionar de forma directa ni el tipo ni la concentración de compuestos minoritarios con la estabilidad oxidativa a las temperaturas estudiadas. Por ello, el siguiente trabajo experimental se enfocó a dilucidar el efecto individual y combinado de estos compuestos minoritarios en el aceite de oliva virgen, bien como antioxidantes o prooxidantes, entre 25 y 40 ºC y con los métodos Rancimat y DPPH (capítulo 3.6 “Capacidad antioxidante individual y combinada de compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen evaluados a temperatura moderada en comparación a ensayos acelerados y de capacidad antiradicálica”).
Puesto que el aceite de oliva virgen extra es apreciado y consumido por su valor nutricional debido al aporte de antioxidantes naturales, la vida útil también debe estar relacionada con la persistencia de estos compuestos durante el almacenamiento. Dado que la reacción de oxidación tiene un impacto negativo en fenoles, tocoferoles, pigmentos y otros componentes del aceite de oliva con atributos sensoriales y de salud, parece significativo contemplar la desaparición de estos compuestos durante el almacenamiento para el establecimiento adecuado de la vida útil comercial de AOVE. De ahí los trabajos realizados descritos en los capítulos 3.5 y 3.7: “Estabilidad del aceite de oliva virgen y comportamiento de sus antioxidantes naturales bajo condiciones de almacenamiento acelerado a temperatura media” y “Estudio cinético para el desarrollo de un test acelerado de estabilidad oxidativa para estimar la
IV Resumen vida útil potencial del aceite de oliva virgen: influencia de la composición y estado de oxidación inicial”. Los resultados muestran la contribución de los antioxidantes a la velocidad de oxidación de lípidos del aceite de oliva virgen, y describen las cinéticas de degradación de los compuestos fenólicos y -tocoferol, tanto en condiciones de disponibilidad de oxígeno (botellas abiertas) como limitación del mismo (botellas cerradas). La regresión lineal multivariante (MLR) se utilizó para obtener ecuaciones modelo y tratar de predecir la vida útil a partir de la composición inicial y de la evolución de la oxidación en las condiciones aceleradas investigadas.
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Summary
Shelf life of food products is strongly related to sensory quality and microbiological stability. In the case of virgin olive oil, it is a very inhospitable product for microorganisms, so it does not undergo microbiological degradation. However, it is highly susceptible to oxidation, this being the main cause of the decrease of its extraordinary quality as vegetable oil. Lipid oxidation is a process that occurs fairly slowly at the usual extraction or storage temperature of virgin olive oil (room temperature), so Accelerated Shelf Life Tests (ASLT) have traditionally been used to assess oil oxidative stability, in which the temperature is increased to bring the product to its maximum oxidation in a relatively short period of time. However, the most difficult thing is to correlate the value of the oxidative stability obtained under accelerated conditions with the shelf life or stability of the food product in terms of maximum storage period under the usual conditions. The work that gave rise to chapter 3.1 of this Doctoral Thesis (“Oxidation kinetic in olive oil triacylglycerols under accelerated shelf life testing (25-75ºC)”) was aimed at studying the effect of temperature on the matrix of triacylglycerols olive oil, in the absence of pro and antioxidant compounds, and the increase in temperature was related to some of the primary and secondary oxidation indexes. The next step was the study of virgin olive oil oxidation under normal storage conditions (chapter 3.2 " Evolution of major and minor components and oxidation indices of virgin olive oil during 21 months storage at room temperature") to evaluate the role that olive oil minor compounds play in this oxidation process. Until the time of this study, the works found in bibliography using similar temperature conditions at room temperature contributed to a better understanding of the autoxidation process, however, they were not conclusive regarding shelf life of this product, due to the study of only a certain aspect of the quality of olive oil, or because the short time of testing was not enough to obtain conclusive results given the great stability of olive oil. In this work, changes produced in fatty acids and minor compounds (phenolic compounds, pigments and -tocopherol) were studied and different parameters related to oxidative stability at room temperature (rates of increase of primary and secondary oxidation indexes, and the time to reach the limits of the standardized quality parameters) were established and evaluated.. The obtained results were taken as experimental values of stability or shelf life at room temperature.
In literature it has been widely reflected that there is a good correlation between the oxidative stability of virgin olive oil determined by accelerated oxidation tests (AOM or Rancimat), and its initial content of natural antioxidants, especially phenolic compounds (total polyphenols, o-diphenols or oleosidic forms of hydroxytyrosol). However, none accelerated oxidative stability method has so far been recognized as a legal parameter due to the unsatisfactory relationship between the results of these accelerated tests and the actual shelf life of such food products. The interest in further studying the oxidation of various virgin olive oils, with different natural antioxidant contents, under the accelerated conditions that use the Rancimat apparatus led to the following work, described in Chapter 3.3: “Comparative study of virgin olive oil behaviour under Rancimat accelerated oxidation conditions and long-term room temperature storage". The results reflect the evolution of primary and secondary oxidation products and the effect of the antioxidant content in the course of oxidation under the given VIII
Summary conditions, defining the limitations of the Rancimat method and analogous to determine the stability and predict the shelf life of virgin olive oil. These results and those consulted in the bibliography in relation to ASLT, led to the following work: the study of the evolution of oxidation in the investigated virgin olive oils at different temperatures (40, 50 and 60ºC) that, in parallel to stability tests under environmental conditions, allow developing a shelf life prediction model (chapter 3.4 " Kinetic study for the development of an accelerated oxidative stability test to estimate virgin olive oil potential shelf life"). Thanks to this work, the auto-oxidation kinetic behaviour of the main oxidation indexes (PV, K232 and K270) and the oxidizable substrate (unsaturated fatty acids (UFA)) was detailed for the first time. K232 was selected as the best normalized oxidation index for the potential estimation of virgin olive oil shelf life, defined as TRUL (Time to reach the upper legal limit of K232), at a moderate temperature (≤60 ºC): TRUL = a Tb.
Minor compounds in virgin olive oil are responsible for its oxidative stability, as well as its fatty acid composition, elevated in monounsaturated versus polyunsaturated. This proportion of fatty acids is quite similar in oils regardless of the variety of olive and the extraction methods, however, there may be great differences in the type and concentration of phenolic compounds and -tocopherol. The samples of virgin olive oil studied so far showed important differences, but neither the type nor the concentration of minor compounds could be directly related to the oxidative stability at the temperatures studied. For this reason, the following work focused on elucidating the individual and combined effect of these minor compounds in virgin olive oil, either as antioxidants or pro-oxidants, between 25 and 40 ºC and with the Rancimat and DPPH methods (Chapter 3.6 “Antioxidant capacity of individual and combined virgin olive oil minor compounds evaluated at mild temperature as compared to accelerated and antiradical assays"). Since extra virgin olive oil is appreciated and consumed for its nutritional value due to the contribution of natural antioxidants, shelf life must also be related to the persistence of these compounds during storage. Given that the oxidation reaction has a negative effect on phenols, tocopherols, pigments and other components of olive oil with sensory and health attributes, it seems significant to contemplate the disappearance of these compounds during storage for the proper establishment of commercial shelf life from EVOO. Hence, the work described in chapters 3.5 and 3.7: " Stability of virgin olive oil and behaviour of its natural antioxidants under medium temperature accelerated storage conditions" and " Kinetic study for the development of an accelerated oxidative stability test to estimate virgin olive oil potential shelf life: influence of composition and initial oxidation state”. The results show the contribution of antioxidants to the lipid oxidation rate of virgin olive oil, and describe the degradation kinetics of phenolic compounds and -tocopherol, both in conditions of oxygen availability (open bottles) and limitation of the same (closed bottles). Multivariate linear regression (MLR) was used to obtain model equations and try to predict shelf life from the initial composition and the evolution of oxidation under the investigated accelerated conditions.
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Justificación
El interés del consumidor por el aceite de oliva virgen (VOO) existe desde la antigüedad en los países mediterráneos y desde hace décadas este apreciado producto se está introduciendo con éxito como un alimento de alto valor añadido en países tradicionalmente no productores como Estados Unidos y Japón donde el consumo de VOO está en constante crecimiento (lideran el crecimiento con un 12% para EEUU y un 30% para Japón). Para mantener el prestigio internacional del aceite de oliva virgen extra, su calidad necesita ser mantenida y asegurada a lo largo de su vida útil comercial. El aseguramiento de la calidad y la determinación de la vida útil del aceite de oliva virgen es, por lo tanto, una cuestión de gran importancia para los productores y comercializadores. En los productos de larga duración, como es el caso, se recurre habitualmente a métodos acelerados para estimar su estabilidad en un corto periodo de tiempo de ensayo. Los métodos acelerados habitualmente utilizados en el caso del aceite de oliva recurren a temperaturas altas y/o gran exposición al oxígeno (Rancimat, Método del oxígeno activo (AOM), Índice de estabilidad oxidativa (OSI)) para incrementar la velocidad de oxidación de los lípidos, principal causa de depreciación de sus características organolépticas y de su categoría comercial. Pero al tratar de extrapolar los resultados de los ensayos acelerados de vida útil (ASLT) a altas temperaturas se obtuvo una predicción insuficiente o excesiva de la vida útil real, posiblemente porque el proceso de autooxidación tiene lugar bajo condiciones drásticas, muy diferentes a las que ocurren en condiciones normales de almacenamiento. Esa razón es la que ha llevado a desarrollar los trabajos planteados en esta Tesis Doctoral, desarrollar un ASLT a temperaturas suaves (inferiores a 60 ºC) en paralelo a las pruebas de vida útil en condiciones ambientales. Para conocer cuál es la temperatura más adecuada para realizar dicho ASLT, primero hay que conocer con el máximo detalle cómo se desarrollan los procesos de oxidación de la matriz lipídica, y de los compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen (fenoles, pigmentos, tocoferol) a la temperatura habitual de conservación.
En bibliografía se describen distintos estudios de oxidación de diversos aceites y grasas comestibles, pero, puesto que el grado de insaturación y la proporción de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados es determinante para la velocidad y mecanismos de la reacción de oxidación, resulta primordial obtener resultados concretos con una matriz de triacilgliceroles característicos del aceite de oliva. Del mismo modo, es fundamental conocer la evolución y comportamiento durante la oxidación de los compuestos del aceite de oliva virgen que se consideran antioxidantes, así como los que pueden influir en las características organolépticas del producto (compuestos fenólicos, pigmentos y tocoferoles). Ya que estos se encuentran en concentraciones bastante diferentes en los distintos aceites y que su capacidad antioxidante depende en gran medida de su concentración y de la presencia de otros compuestos minoritarios, resulta de gran valor estudiar su evolución durante la oxidación de forma individual, de forma combinada, en diferentes concentraciones y, cómo no, en muestras de aceite de oliva virgen suficientemente diferentes como para ser representativas de la complejidad de composiciones minoritarias que acontecen en la realidad. Existen estudios en bibliografía, pero la gran mayoría de ellos están
XIII Justificación orientados a obtener una comparación absoluta de la capacidad antioxidante (DPPH, RSC) o la estabilidad oxidativa (IP Rancimat, OSI) de las muestras en su conjunto, y los que tratan con cada uno de los compuestos en concentraciones determinadas, no estudian su transformación en el proceso de oxidación ni su efecto en la matriz lipídica conforme cambia su estado oxidativo tanto a temperatura ambiente como a temperaturas suaves de conservación. La temperatura elegida para el ASLT que se pretende desarrollar tiene que procurar que estos procesos de oxidación que ocurren a temperatura ambiente, se produzcan a una velocidad más rápida, pero conservando los mismos mecanismos de reacción. Si estos mecanismos son muy diferentes, no es probable pensar que sea factible realizar una extrapolación de los resultados obtenidos. Dado que hasta el momento los estudios encontrados de otros autores empleaban temperaturas elevadas de oxidación (alrededor de 100 ºC), y que ya se conocía la falta de correlación entre sus resultados y la estabilidad a temperatura ambiente, en los trabajos que han dado lugar a esta Tesis Doctoral se han empleado temperaturas entre 25 y 75 ºC, aunque también se ha investigado la oxidación a temperaturas alrededor de 100 ºC con el fin de argumentar experimentalmente los motivos de esta falta de correlación.
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Objetivos
El objetivo general de esta Tesis Doctoral es estudiar los cambios que se producen en la matriz lipídica durante el proceso de autoxidación en función de distintas condiciones de temperatura y disponibilidad de oxígeno, así como el papel que desempeñan los compuestos minoritarios del aceite de oliva en este proceso de oxidación, evaluando su efecto de forma individual y combinada. Al mismo tiempo, se ha pretendido desarrollar un ensayo de estabilidad acelerado (ASLT, accelerated shel-life test) que permita establecer la vida útil del aceite de oliva virgen basándose en la determinación de parámetros de calidad normalizados. Este objetivo principal se ha perseguido a través del desarrollo de distintos trabajos experimentales, cuyos objetivos específicos se describen a continuación:
Objetivo 1. Estudio de la estabilidad de la matriz lipídica y de los componentes minoritarios del aceite de oliva frente al proceso de autoxidación 1.a- Conocer el comportamiento de la matriz lipídica, en ausencia de compuestos pro y antioxidantes, estudiando la evolución de los índices de calidad, parámetros de oxidación y evolución del sustrato lipídico durante el proceso de autoxidación a diferentes temperaturas. Se ha evitado el contacto con la luz para impedir la interferencia de la fotooxidación lipídica 1.b- Conocer el comportamiento del aceite de oliva virgen, tanto de su matriz lipídica como de los compuestos minoritarios con propiedades pro y antioxidantes, estudiando la evolución de los índices de calidad, parámetros de oxidación y composición durante el proceso de autoxidación en condiciones térmicas de almacenamiento normal (25 ºC), y en condiciones aceleradas: las utilizadas normalmente en el método Rancimat (100 ºC, 10 L/h de flujo de aire) y a una temperatura media (40-60 ºC)
Objetivo 2. Estudio de la capacidad antioxidante individual y combinada de los antioxidantes naturalmente presentes en el aceite de oliva virgen 2.a- Evaluar el efecto pro o antioxidante de los principales compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen a diferentes temperaturas (entre 25 y 60 ºC) y en presencia y ausencia de oxígeno 2.b- Evaluar este mismo efecto cuando se encuentran combinados en el aceite en distintas concentraciones
2.c- Comparar los resultados obtenidos con los análisis de capacidad antiradicálica y estabilidad oxidativa mediante métodos tradicionales: DPPH y Rancimat
Objetivo 3. Estudio cinético para el desarrollo de un test de estabilidad acelerado a temperatura suave (40-60 ºC) que permita determinar la vida útil potencial del aceite de oliva virgen 3.a- Establecer las cinéticas de oxidación del aceite de oliva virgen utilizando distintos parámetros de oxidación primaria y secundaria, tanto en condiciones aceleradas (40-60 ºC) como a temperatura ambiente (25 ºC) XVII
Objetivos
3.b- Establecer la cinética de oxidación en las condiciones de Rancimat utilizando distintos parámetros de oxidación primaria y secundaria 3.c- Establecer si existe una correlación entre la cinética de oxidación y/o estabilidad oxidativa Rancimat con los valores de vida útil obtenidos previamente a temperatura ambiente 3.d- Establecer las bases del desarrollo de un ensayo acelerado de estabilidad (ASLT) a temperatura suave (40-60 ºC) que permita determinar la vida útil del aceite de oliva en condiciones normales de almacenamiento 3.e- Verificar la relación entre velocidad y temperatura de oxidación de acuerdo a la ecuación de Arrhenius (ln k = ln A + Ea/RT)
3.f- Determinar la vida útil real (shelf life) del aceite de oliva virgen a partir de la cuantificación de los distintos parámetros de calidad normalizados 3.g- Desarrollar un método de estabilidad acelerado a temperatura inferior a 60 ºC que permita determinar la vida útil del aceite de oliva con una buena correlación con los resultados reales
Objetivo 4. Estudio de la influencia en la estimación de la vida útil de la composición y el estado de oxidación inicial del aceite de oliva virgen
4.a- Estudiar la influencia de la composición lipídica y del contenido de compuestos minoritarios, así como del estado de oxidación inicial, en la velocidad y desarrollo de la autoxidación a temperatura ambiente
4.b- Establecer una relación entre la composición inicial del aceite de oliva virgen y su vida útil que permita complementar el ensayo de estabilidad acelerado basado en parámetros de oxidación
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Índiice de tablas y fiiguras
ÍNDICE de TABLAS y FIGURAS
TABLAS
Tabla 1.1. Proporción de mono-hidroperóxidos formados por autooxidación y fotooxidación de los ácidos grasos insaturados
Tabla 1.2. Productos de oxidación secundaria de los ésteres metílicos de los ácidos grasos generados por autoxidación
Tabla 1.3. Ventajas y desventajas de los materiales de envasado de aceite de oliva
Tabla 1.4. Clasificación de los métodos para determinar la actividad antioxidante en función del mecanismo de reacción
Tabla 1.5. Algunos métodos utilizados para determinar la estabilidad oxidativa
Tabla 1.6. Características cualitativas y límites legales de referencia para la calidad virgen extra
Table 2.1. Initial composition and quality indices of olive oil samples
Tabla 2.2. Rango de concentraciones de los antioxidantes en el AOV y cantidades propuestas para su adición al AOP
Tabla 2.3. Nombre de las muestras y concentración de antioxidantes adicionados
Tabla 2.4. Gradiente de disolventes empleado durante la separación cromatográfica de los fenoles del aceite de oliva virgen
Tabla 2.5. Factores de respuesta* respecto al ácido siríngico de los principales fenoles presentes en el aceite de oliva virgen
Table 3.1. Values of the oxidation rate constants (k) and of the regression coefficient (R2) for PV and K270 at the experimental temperatures
Table 3.2. Time required reaching the upper limits for PV, K232 and K270, and the rancidity threshold
Table 3.3. Slope and correlation coefficient of the linear regression of quality indices and time required to reach the upper legal limits for EVOO during storage
Table 3.4. Decrease in fatty acid content (%) during the 21-month storage period
Table 3.5. Changes in VOO phenolic compound contents (mmol/kg) during storage
Table 3.6. Initial Composition and Quality Indices of Olive Oil Samples for Rancimat study
Table 3.7. VOO Stability under Experimental Oxidation Conditions Expressed as Rancimat Induction Period and as the Time Taken To Reach the Legal Limits of Some Quality Indices
XXI Índiice de tablas y fiiguras
Table 3.8. Ratios of Some Oxidation Parameters under Rancimat Conditions and Room Temperature Storage
Table 3.9. Oxidation rate constants (k) for PV, K232 and K270 at the experimental temperatures studied
Table 3.10. Time required reaching the EVOO category upper limit (TRUL, weeks) for PV, K232 and K270
Table 3.11. Comparison between the experimental and predicted TRUL for K232 (weeks) by means of the proposed method based on a potential equation (TRUL = aTb)
Table 3.12. Initial composition and quality indices of the Tunisian virgin olive oil varieties studied.
Table 3.13. Initial oxidation rate and induction period (IP)
Table 3.14. Initial degradation rate of hydroxytyrosol and tyrosol derivatives during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB)
Table 3.15. Initial characteristics of Purified Olive Oil (POO) used in the study
Table 3.16. Oxidation rate constants (k for K232) found during storage in Purified Olive Oil spiked with different individual and combined compounds (hydroxytyrosol, tyrosol, -tocopherol and oleuropein aglycone)
Table 3.17. Oxidative stability (IPa and TRULb) and antiradical (RSCc) activities found during storage in POO spiked with individual and combined compounds (hydroxytyrosol, tyrosol, - tocopherol and oleuropein aglycone)
Table 3.18. Kinetic parameters of complex phenols fitted to a pseudo first-order reaction: Ln(Ct/C0) = kt, where C0 is the initial concentration and Ct the residual concentration at time t
Table 3.19. Kinetic parameters of simple phenols and α-tocopherol fitted to a pseudo zero-order reaction: Ct = C0 + kt
Table 3.20. Linear Arrhenius kinetics of simple phenols and -tocopherol fitted to a pseudo zero- order reaction: k=A∙e -Ea/RT
Table 3.21. Linear Arrhenius kinetics of complex phenols fitted to a pseudo first-order reaction: k=A∙e -Ea/RT
Table 3.22. Variables used to indicate the extent or progress of oxidation
Table 3.23. Components, loadings and scores of the first Principal Component Analysis (PCA1)
Table 3.24. Components, loadings and scores of the first Principal Component Analysis (PCA2)
Table 3.25. Proposed predictive models
XXII Índiice de tablas y fiiguras
FIGURAS
Figura 1.1. Etapas del mecanismo de autooxidación
Figura 1.2. Esquema de la oxidación lipídica
Figura 1.3. – escisión homolítica de monohidroperóxidos
Figura 1.4. Rutas Tipo I y Tipo II de un fotosensibilizador en estado excitado
Figura 2.1. Reacción de la p-anisidina con un 2-alquenal para dar compuestos que absorben a 350 nm
Figura 2.2. Cromatograma de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, ácido palmítico (C16:0); 2, ácido palmitoleico (C16:1); 3, ácido margárico (C17:0);
4, ácido margaroleico (C17:1); 5, ácido esteárico (C18:0); 6, ácido oleico (C18:1); 7, ácido linoleico
(C18:2); 8, ácido linolénico (C18:3); 9, ácido araquídico (C20:0); 10, ácido gadoleico (C20:1); 11, ácido behénico (C22:2)
Figura 2.3. Cromatograma de los compuestos volátiles del espacio de cabeza de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, hexanal; 2, t-2-hexenal; 3, heptanal; 4, t-2-heptenal; 5, octanal; 6, t-2- octenal; 7, nonanal; 8, t-2-decenal ; 9, t,t-2,4-decadienal
Figura 2.4. Cromatograma de los compuestos fenólicos de un aceite de oliva virgen Cornicabra 1, 3,4-DHPEA (hidroxitirosol); 2, p-HPEA (tirosol); 3, ácido vanílico; P.I., ácido siríngico; 4, vainillina; 5, ácido p-cumárico; 6, 3,4-DHPEA-AC; 7, ácido ferúlico; 8, 3,4-DHPEA-EDA; 9, p-HPEA- AC; 10, p-HPEA-EDA; 11, pinorresinol; 12, 1-acetoxipinorresinol+ácido t-cinámico; 13, luteolina; 14, 3,4-DHPEA-EA; 15, apigenina; 16, p-HPEA-EA; 17, TR 42,1; 18, TR 43,3; 19, TR 44,3
Figura 2.5. Cromatograma obtenido en la determinación del contenido en α- tocoferol de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra
Figura 2.6. Cromatograma de los compuestos polares de un aceite de oliva virgen. 1, polímeros de triacilgliceroles (PTG); 2, dímeros de triacilgliceroles (DTG); 3, triacilgliceroles oxidados (TGox); 4, diacilgliceroles (DG); 5, ácidos grasos libres (AG); PI, patrón interno (monooleína)
Figura 2.7. Registro obtenido en la determinación de la estabilidad oxidativa “Rancimat” de tres muestras
Figure 3.1. Kinetic behaviour of UFA content and Peroxide Value during storage at 25 ºC. , PV; , UFA
Figure 3.2. Effect of temperature on oxidation rate constants. , PV; , K270
Figure 3.3. Effect of temperature on the time taken to reach the limit values for PV, K232 and K270, and the rancid threshold. , PV; ▲, K232; , K270; , rancid threshold
XXIII Índiice de tablas y fiiguras
Figure 3.4. Correlation between the time taken to reach the IP for the formation of t,t-2,4- decadienal and the rancid threshold at different temperatures (25–75 ºC)
Figure 3.5. Residual VOO complex phenol contents (%) after 21 months of storage at 25 °C. 3,4-DHPEA-EDA + 3,4-DHPEA-EA), ; (p-HPEA-EDA + p-HPEA-EA),
Figure 3.6. Decrease of a-tocopherol content during storage. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII
Figure 3.7. Evolution of peroxide value under Rancimat conditions (100 °C and air flow of 10 L/h). Samples: , A; , B; ▲, C; , D; х, E; ○, POO. Average PV trend at 25 °C (—) and Rancimat conductivity record (– ∙ –) are illustrated
Figure 3.8. Correlation between VOO shelf life and Rancimat oxidative stability: , samples from the present study; ○, samples from a previous study. Figure 3.9. Behaviour of o-diphenols versus the evolution of PV and UFAs during oxidation in Rancimat. Samples: , A; , ○ B; ▲, ∆ C; , D; х, x E. Solid symbols represent o-diphenols and PV; open symbols represent total UFAs Figure 3.10. Behaviour of phenolic compounds and -tocopherol under Rancimat conditions and at room temperature: hydroxytyrosol; hydroxytyrosol + secoiridoids of hydroxytyrosol (o- diphenols); , tyrosol; , tyrosol + secoiridoids of tyrosol; , -tocopherol Figure 3.11. Evolution of oxidation indices (PV, K232 and K270) and PUFA at 25, 40, 50 and 60 ºC during storage. Samples: I , ; V, , ; error bars show confidence limits, expressed as ± 2 SD. Figure 3.12. Arrhenius plot: Effect of temperature on oxidation rate constants. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII Figure 3.13. Correlation between TRUL and temperature for K232 (TRUL = aTb). Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII
Figure 3.14. Evolution of peroxide value (PV) and K270 during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB)
Figure 3.15. Evolution of free acidity during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) Figure 3.16. Behaviour of -tocopherol during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB)
Figure 3.17. Behaviour of hydroxytyrosol and tyrosol secoiridoid derivatives during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB)
Figure 3.18. Behaviour of hydroxytyrosol and tyrosol during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB)
Figure 3.19. Progress of oxidation during storage in open bottles measured by the evolution of peroxide value (PV) and K232 in Purified Olive Oil spiked with different individual compounds
XXIV Índiice de tablas y fiiguras
(hydroxytyrosol, tyrosol and -tocopherol). H, hydroxytyrosol; T, tyrosol; T, a-tocopherol; POO, Purified Olive Oil. Example of sample labelling: H025, 0.25 mmol/kg of hydroxytyrosol Figure 3.20. Oil stability (measured as TRUL^ and Rancimat IP) reached using different antioxidants (hydroxytyrosol, tyrosol, -tocopherol and oleuropein aglycone) concentrations during storage. , H, hydroxytyrosol; ▲, T, tyrosol; , OA, oleuropein aglycon; ж T, a- tocopherol. ^TRUL, Time to Reach legal Upper Limit for K232
Figure 3.21. Oil stability (measured as TRUL^ and Rancimat IP) reached using different concentrations of mixtures of phenolics (hydroxytyrosol or tyrosol) with -tocopherol (T) during storage. , H, hydroxytyrosol; ▲, T, tyrosol; T, -tocopherol. ^TRUL, Time to Reach legal Upper Limit for K232
Figure 3.22. Time to reach the upper limit (TRUL) for K232 in POO samples with added antioxidants. OB, open bottles; HS, closed bottles with head-space; N2, closed bottles with nitrogen
Figure 3.23. Initial phenolic profile and α-tocopherol content of VOO samples
Figure 3.24. Decrease of hydroxytyrosol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII
Figure 3.25. Decrease of o-diphenol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII
Figure 3.26. Decrease of α-tocopherol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII
Figure 3.27. Real and calculated values from predictive equations. •, tK232_25; ж, tPV20_25;▲; kSECHTYR_25; ○; koDIPH_25
XXV bbrreevviiaattuurraass
ttiilliizzaaddaass
Abreviiaturas
ABREVIATURAS UTILIZADAS
3,4- 3,4-dihidroxifenil etanol 3,4-Dihydroxyphenyl etanol DHPEA (hidroxitirosol) (Hydroxytyrosol )
3,4- Ácido 3,4 dihidroxifeniletanol- Dialdehydic and Aldehydic forms DHPEA-EDA elenólico, y of elenolic acid linked to hydroxytyrosol 3,4- 3,4-dihidroxifeniletanol DHPEA-EA A Factor preexponencial de la ecuación Pre-exponential factor de Arrhenius AA Actividad antioxidante Antioxidant activity AAPH Diclorhidrato de 2,2′-azobis (2-amidino- 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) propano) dihydrochloride ABTS Ácido 2,2′-azinobis- 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6- (3-etilbensotiazolina) -6-sulfónico sulfonic acid AOM Método del oxígeno activo Active Oxygen Method ASLT Estudio acelerado de vida útil Accelerated Shelf Life Test BHA Butilhidroxianisol Butylhydroxyanisole BHT Butilhidroxitolueno Butylhydroxytoluene CB Botellas cerradas Closed bottles
C0 Concentración a tiempo de reacción cero Concentration at zero reaction time COI Consejo Oleícola Internacional International Olive Council
Ct Concentración a tiempo de reacción = t Concentration at reaction time = t CUPRAC Poder antioxidante reductor cúprico Cupric reducing antioxidant power DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Ea Energía de activación Activation energy EVOO Aceite de oliva virgen extra Extra virgin olive oil FA Ácidos grasos Fatty acids FRAP Poder antioxidante reductor férrico ferric reducing antioxidant power Htyr Hidroxitirosol Hydroxytyrosol (3,4-Dihydroxyphenyl etanol) IP Periodo de inducción Induction period k Constante de velocidad de reacción koDIPH Velocidad de disminución de o- Rate of decrease of o-diphenols difenoles (hidroxitirosol y derivados) (hydroxytyrosol and derivatives) kSECHTYR Velocidad de disminución de los Rate of decrease of the secoiridoid derivados secoiridoideos del derivatives of hydroxytyrosol hidroxitirosol MUFAs Ácidos grasos monoinsaturados Monounsaturated fatty acids OA Oleuropeína aglicona Oleuropein aglycon
OB Botellas abiertas Open bottles
XXIX
Abreviiaturas
ORAC Capacidad de absorbancia de radicales Oxygen radical absorbance capacity de oxígeno OS Estabilidad oxidativa Oxidative stability OS Rancimat Estabilidad oxidativa Rancimat Oxidative stability Rancimat OSI Índice de estabilidad oxidativa Oxidative stability index oxTGs Triacilgliceroles oxidados Oxidized triacylglycerols PE Polietileno Polyethylene PET Polietileno tereftalato Polyethylene terephthalate p-HPEA p-hidroxifenil etanol (Tirosol) p-hydroxyphenyl ethanol (Tyrosol) 2-(4- hydroxyphenyl)etanol p-HPEA-EDA Formas dialdehídicas y aldehídicas de dialdehydic and aldehydic forms of p-HPEA-EA ácido elenólico ligado al tirosol elenolic acid linked to tyrosol POO Aceite de oliva purificado Purified olive oil PP Polipropileno Polypropilene PS Poliestireno Polystyrene PUFAs Ácidos grasos poliinsaturados Polyunsaturated fatty acids PV Índice de peróxidos Peroxide value PVC Cloruro de polivinilo Polivinil cloride R Constante de los gases Gas constant ROS Especies reactivas de oxígeno Reactive oxygen species SEC HTYR Secoiridoideos del hidroxitirosol Hydroxytyrosol secoiridoids SEC TYR Secoiridoideos del tirosol Tyrosol secoiridoids t Tiempo Time T Temperatura Temperature TBHQ Terbutil dihidroquinona Terbutyl dihydroquinone TEAC Capacidad antioxidante equivalente a Trolox equivalent antioxidant capacity Trolox tK232: Tiempo necesario a 25ºC para alcanzar Time required at 25ºC to reach the upper el límite legal superior para K232 en legal limit for K232 in extra virgin olive aceites de oliva virgen extra (2,50) oils (2.50) tK270 Tiempo necesario a 25ºC para alcanzar Time required at 25ºC to reach the upper el límite legal superior para K270 en legal limit for K270 in extra virgin olive aceites de oliva virgen extra (0.22) oils (0.22) tPV20 Tiempo necesario a 25ºC para alcanzar Time required at 25ºC to reach the upper el límite legal superior para el valor de legal limit for the value of peroxides in peróxidos en aceites de oliva virgen extra virgin olive oils (20 meq / kg) extra (20 meq/kg) TOH -tocoferol -tocopherol TRAP Potencial antioxidante total para Total radical-trapping antioxidant atrapar radicales potential Tyr Tirosol Tyrosol (2-(4-hydroxyphenyl)etanol) UFAs Ácidos grasos insaturados Unsaturated fatty acids VOO Aceite de oliva virgen Virgin olive oil
XXX
nnddiiccee
Índiice
ÍNDICE GENERAL
1. Introducción general 1 1.1. Autooxidación del aceite de oliva 4 Factores que influyen en el proceso de autooxidación 10 1.2. Papel de los antioxidantes presentes en el aceite de oliva 15 Antioxidantes del aceite de oliva virgen 16 Estudios de la actividad antioxidante 17 1.3. Estudios de estabilidad oxidativa y determinación de la vida útil del aceite de 26 oliva Estabilidad mediante métodos acelerados de oxidación 26 Estabilidad oxidativa en condiciones reales de almacenamiento 28 Predicción o estimación de la vida útil 29 2. Metodología 35 2.1. Muestras de aceite de oliva 37 2.2. Ensayos de estabilidad 40 2.3. Reactivos y síntesis de compuestos 43 2.4. Métodos analíticos 44 2.5. Análisis estadístico y tratamiento de datos experimentales 58 3. Experimental results 61 3.1. Oxidation kinetic in olive oil triacylglycerols under accelerated shelf life 63 testing (25-75ºC) 3.1.1. Primary oxidation products 63 3.1.2. Secondary oxidation products 65 3.1.3. Shelf-life prediction 66 3.2. Evolution of major and minor components and oxidation indices of virgin 69 olive oil during 21 months storage at room temperature 3.2.1. Evolution of legal quality indices 70 3.2.2. Changes in fatty acid composition 72 3.2.3. Changes in phenolic compounds and other minor Components 73
3.3. Comparative study of virgin olive oil behaviour under Rancimat 76 accelerated oxidation conditions and long-term room temperature storage 3.3.1. Evolution of the oxidation process 77 3.3.2. Behaviour of Natural Antioxidants 81
3.4. Kinetic study for the development of an accelerated oxidative stability test 83 to estimate virgin olive oil potential shelf life 3.4.1. Kinetic behaviour of oxidation indices 83 3.4.2. Behaviour of the oxidizing substrate (UFA) 87 Índiice
3.4.3. Effect of temperature on stability 87 3.4.4. Prediction equation for the accelerated stability test 88 3.5. Stability of virgin olive oil and behaviour of its natural antioxidants 91 under medium temperature accelerated storage conditions 3.5.1. VOO varieties initial characteristics in this study 91 3.5.2. VOO stability during storage 93 3.5.3. Behaviour of natural antioxidants 95 3.6. Antioxidant capacity of individual and combined virgin olive oil minor 100 compounds evaluated at mild temperature (25 and 40 ºC) as compared to accelerated and antiradical assays 3.6.1. Antioxidant capacity of individual compounds 101 3.6.2. Effect of combined compounds 106 3.6.3. Open versus closed bottles 108 3.7. Kinetic study for the development of an accelerated oxidative stability 110 test to estimate virgin olive oil potential shelf life: influence of composition and initial oxidation state 3.7.1. Initial antioxidant composition of samples 110 3.7.2. Kinetic behaviour of phenolic compounds and pigments 111 3.7.3. Feasibility of the Arrhenius equation 117 3.7.4. Shelf life of VOO related to its initial composition 118 4. Discusión de resultados 127 5. Conclusiones/Conclusions 149/157 6. Publicaciones científicas 165 7. Bibliografía 169
nnttrroodduucccciióónn eenneerraall
1. Introducciión general
El ACEITE DE OLIVA, uno de los productos básicos de la alimentación en la antigüedad (Mariner, S., 1980; Melena, J.L., 1980; Pascual Guasch, R., 1980), sigue siendo el aceite vegetal comestible más consumido en los países de la cuenca Mediterránea. Su aroma y sabor característicos y sus excelentes propiedades nutricionales justifican el creciente interés que existe entorno a la cultura del aceite de oliva, haciendo que, en las últimas décadas, este producto haya conquistado también a países tradicionalmente no productores como Estados Unidos, Japón y China, donde el consumo está en constante crecimiento. En Estados Unidos, el consumo se ha triplicado en los últimos 25 años, siendo el tercer país consumidor en 2017, después de Italia y España (COI, 2019 a,b). De los 3.2 millones de toneladas producidas a nivel mundial en la campaña 2017/18, los países de la Unión Europea produjeron en torno a 2.2 millones. El resto provino de países del resto del mundo, cuya producción aumentó un 20% respecto a la campaña anterior (COI, 2019 c,d). España es líder en exportación ya que tiene un papel dominante con un 35 % de la exportación mundial, por lo que este cultivo supone una importante fuente de ingresos (COI, 2019 e,f). La imagen y el prestigio de que actualmente goza el aceite de oliva virgen en el mercado nacional e internacional exigen una mejora constante en su calidad y un exquisito cuidado en el mantenimiento de la misma. Se puede sin duda afirmar que es la calidad más que el precio, junto a una adecuada información del consumidor, la principal garantía para la supervivencia y desarrollo del sector olivarero. Los beneficios nutricionales y terapéuticos asociados al consumo de aceite de oliva avalados por numerosos estudios científicos (Pintó et al., 2019; Alkhatib et al., 2018; Rubio et al., 2012; Pitozzi et al., 2012; Cicerali et al., 2010; Perona et al., 2007; Beauchamp et al., 2005), junto al hecho de que la Dieta Mediterránea fuera declarada Patrimonio Inmaterial de la Humanidad en 2010 por la UNESCO, son los que han impulsado la demanda del creciente segmento de población mundial que está atento a la calidad de su comida. Si atendemos a la reglamentación actual (EC No. 1308/2013 y modificaciones), dentro de los aceites de oliva que se pueden comercializar se considera que “el ACEITE DE OLIVA VIRGEN es el aceite obtenido del fruto del olivo (Olea europea L.) exclusivamente por medios mecánicos u otros procedimientos físicos aplicados en condiciones que excluyan toda alteración del producto, y que no se ha sometido a ningún otro tratamiento que no sea su lavado, decantación, centrifugado o filtración, excluidos los aceites obtenidos con el uso de disolventes o de coadyuvantes de acción química o bioquímica, por un procedimiento de reesterificación o como resultado de cualquier mezcla con aceites de otros tipos”. El aceite de oliva virgen que se obtiene de esta forma se convierte, por lo tanto, en el zumo natural de la aceituna, un producto único que es directamente apto para el consumo humano, lo que diferencia al aceite de oliva virgen del resto de los aceites vegetales comestibles, que, en su gran mayoría, deben someterse obligatoriamente a un proceso de refinado previo a su consumo, lo que provoca la desaparición de compuestos estrechamente relacionados con las características organolépticas, propiedades nutricionales y estabilidad oxidativa. El aceite de oliva, especialmente el aceite de oliva virgen, presenta una elevada estabilidad frente a la oxidación, lo que se debe fundamentalmente a dos aspectos: por un lado
3 1. Introducciión general a su composición en ácidos grasos, concretamente al elevado porcentaje de ácidos grasos monoinsaturados que contiene, especialmente de ácido oleico (Kiritsakis, 1990), y por otro, a la presencia de antioxidantes naturales como el α-tocoferol y los compuestos fenólicos (Vázquez- Roncero et al. 1975; Gutiérrez, et al., 1977; Blekas et al., 1995; Tsimidou, 1998; Gómez-Alonso et al., 2002). A pesar de esto el aceite de oliva virgen sigue siendo susceptible a la oxidación, la cual puede producirse durante el procesado de la aceituna o a lo largo del almacenamiento del aceite en la propia almazara, en los comercios o en el hogar del consumidor (Frankel, 2010, 2014; Parenti et al., 2007; Pristouri et al., 2010). Los procesos de oxidación causan diversas alteraciones tanto en la matriz lipídica como en los compuestos minoritarios que componen el aceite de oliva, las cuales se evidencian desde el punto de vista sensorial en una disminución de los atributos frutado, amargo y picante y un aumento del defecto rancio (Morales et al., 2013). Desde un punto de vista físico-químico se origina un aumento de los índices de oxidación normalizados (acidez, índice de peróxidos, absorbancia en el ultravioleta) (Fadda et al., 2012) y además se da una pérdida gradual de compuestos minoritarios con propiedades saludables y nutricionales, como fenoles, tocoferoles y pigmentos (Kotsiou et al., 2016; Gertz et al., 2006, Lavelli et a., 2006). Atendiendo a estos parámetros el grado de oxidación puede determinar la categoría comercial de un aceite de oliva (EC nº 2568/91 y modificaciones; COI, 2019g) antes de su envasado y, una vez introducido en la red comercial, condicionar la aceptación por parte de los consumidores por la depreciación tanto de sus características organolépticas como de propiedades saludables y nutricionales. En la velocidad y mecanismo de la oxidación del aceite de oliva intervienen factores intrínsecos como el grado de insaturación de los ácidos grasos y la concentración de compuestos minoritarios con capacidad antioxidante (Conte et al., 2019), y también factores extrínsecos como la cantidad de oxígeno en contacto con la matriz, la temperatura, la presencia de metales o la exposición a la luz (Pristouri et al., 2010). En este trabajo de investigación destinado a la obtención del título de doctor se ha afrontado el estudio de las transformaciones que sufren tanto la matriz lipídica como los compuestos minoritarios del aceite de oliva como consecuencia de la oxidación, así como la influencia de la temperatura, exposición al oxígeno y contenido y tipo de antioxidantes en la velocidad de oxidación. Por otro lado, se han investigado métodos acelerados que posibiliten la determinación de la vida útil del aceite de oliva virgen dado el gran interés y complejidad que origina esta cuestión entre los implicados en el tejido comercial de este producto.
1.1. AUTOOXIDACIÓN DEL ACEITE DE OLIVA
La oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados es una de las reacciones fundamentales de la química de los lípidos y ha sido objeto de investigación desde hace más de 100 años. Ya en 1890 Ritsert habló de la rancidez como un cambio oxidativo que requería únicamente la presencia de oxígeno y que podía ser acelerado por la luz.
4 1. Introducciión general
El interés en el estudio de este tipo de reacciones se acentuó en los años 60 ante la hipótesis y posteriores evidencias de que muchos de los radicales libres y otras especies reactivas procedentes de reacciones de oxidación pasaban a formar parte de distintas reacciones bioquímicas en el organismo, siendo así potencialmente dañinos para los tejidos y causantes de enfermedades diversas (Cornwell et al., 1979; Yla-Herttuala et al., 1989; Esterbauer et al., 1992; Kratz et al., 2002). El proceso de oxidación lipídica transcurre mediante una serie de reacciones consecutivas o encadenadas, de carácter autocatalítico, entre los ácidos grasos insaturados y el oxígeno en las que intervienen radicales libres. El mecanismo general de la oxidación lipídica tiene 3 etapas: iniciación (1), en la que se forman los radicales libres; propagación (2-3), las reacciones en cadena entre los radicales libres, y terminación (4-5-6), la formación de productos no radicales (Ingold, 1969; Kanner et al., 1987; Kubow, 1992; Frankel et al., 1998) (Figura 1.1).
Figura 1.1. Etapas del mecanismo de autooxidación (Fuente: Chaiyasit et al., 2007)
El mecanismo de autooxidación ha sido ampliamente estudiado en las últimas décadas en distintas matrices lipídicas. Los resultados de gran parte de estos estudios se han recopilado en diferentes trabajos bibliográficos muy conocidos como los de E.N. Frankel (1991, 1998, 2014), Nawar (1996) o Min et al. (2002). Para explicar de forma apropiada el mecanismo de una reacción es necesario, por un lado, realizar un estudio cinético de la velocidad de reacción y por otro, conocer los productos de dicha reacción. Varios autores se han centrado en dilucidar el comportamiento cinético de este tipo de reacciones. Brimberg (1993a) utilizó los datos experimentales de trabajos anteriores y encontró una ecuación empírica de velocidad capaz de explicar los resultados obtenidos en ensayos de oxidación de sustratos con dobles enlaces no-conjugados en distintas condiciones de temperatura:
dx/dt = k [O2] (1-x/n) f(t) ; F(x)= K f(t) + a
5 1. Introducciión general
En esta ecuación, x es el número de moles de O2 consumidos por mol de sustrato en el tiempo t, [O2] es la concentración de O2 en el sustrato, (1-x/n) es la cantidad de sustrato sin reaccionar en el tiempo t, y n es el número de moléculas de O2 que pueden reaccionar con una molécula de sustrato. Las funciones F(x) y f(t) cambian independientemente y asumen diferentes formas dependiendo del estado de oxidación: iniciación, propagación o terminación. De la misma forma realizó un estudio cinético utilizando como matrices lipídicas metil oleato, oleil alcohol y ácido oléico (Brimberg, 1993b), encontrando como principal diferencia en la autooxidación del metil linoleato y metil oleato que la descomposición de los hidroperóxidos del segundo es mucho más rápida en relación con su velocidad de formación. Algunos años después, Brimberg y Kamal-Eldin ampliaron estos estudios utilizando ésteres metílicos del ácido linoleico con dobles enlaces conjugados (2003a) y otras matrices como ácido linoleico y metil linoleato con prooxidantes y antioxidantes añadidos (2003b). Como resultado global evidenciaron la aplicabilidad en todos los casos de la misma ecuación cinética básica a cada uno de los estados de autooxidación, aún cuando existe el efecto de catalizadores metálicos y/o inhibidores. Por otro lado, hallaron que los productos de oxidación primaria son monohidroperóxidos si el sustrato no contiene dobles enlaces conjugados y oligohidroperóxidos en el caso de tratarse de dienos conjugados. Neff et al. (1990) y Frankel et al. (1990) realizaron estudios de oxidación con trilinoleina y trilinolenina como matrices y observaron que, contrariamente a los hidroperóxidos del metil linoleato y metil linolenato, los cuales forman dímeros durante la oxidación, no se forman dímeros a partir de la oxidación de trilinoleina y trilinolenina en las mismas condiciones. Por otro lado, los monohidroperóxidos de la trilinoleina sufren una posterior oxidación más drástica dando lugar a bis- y tris- hidroperóxidos. Estos y otros trabajos similares demostraron que la oxidación de los triacilgliceroles es mucho más compleja y no podía ser estudiada utilizando como modelo los ésteres sencillos de los ácidos grasos. Miyashita et al. (1990), mediante estudios de autooxidación ya con triacilgliceroles sintéticos, compuestos por ácido linoleico y linolénico en posiciones 1,2- y 1,3- de la molécula, demostraron que la velocidad de oxidación aumenta con el grado de instauración del triacilglicerol. Por otro lado, en los triacilgliceroles mixtos, compuestos por ácido linoleico (L) y ácido linolénico (Ln), la posición de éstos en la molécula también condiciona la velocidad de oxidación. Tomando como ejemplo estos sustratos, la velocidad de oxidación decrece en el orden LnLnL > LnLLn > LLnL > LLLn, lo que se explica por la interacción entre dos radicales linolenoilo contiguos o un radical linoleilo y un linolenilo adyacentes, que parece aumentar la susceptibilidad a la oxidación de la molécula. Los hidroperóxidos formados a partir de los ácidos grasos insaturados (LOOH) son los productos primarios de la oxidación lipídica. La susceptibilidad de los ácidos grasos de los triacilgliceroles a la autooxidación dependerá de la disponibilidad de los hidrógenos en posición alílica y, por tanto, de su facilidad para formar radicales peroxilo (LOO)ֹ (Frankel, 1998). La sustracción del átomo de hidrógeno se produce en el carbono adyacente al doble enlace ya que requiere menor energía (Min et al., 2002). Cuando hay más de una posición alílica se formarán isómeros y su número dependerá tanto del ácido graso de partida como del tipo de oxidación al
6 1. Introducciión general que se vea sometido. Los principales hidroperóxidos que se pueden formar por autooxidación a partir de los ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico se muestran en la Tabla 1.1.
Tabla 1.1. Proporción de mono-hidroperóxidos formados por autooxidación y fotooxidación de los ácidos grasos insaturados (Fuente: Kanavouras et al., 2006b)
Ácido graso Posición Proporción (%) Grupo OOH Doble enlace Autooxidación Fotooxidación C8 C9 27 C9 C10 23 50 Ácido oleico C10 C8 23 50 C11 C9 27 C8 C9, C12 1.5 C9 C10, C12 46.5 31 Ácido C10 C8, C12 0.5 18 linoleico C11 C9, C13 49.5 18 C13 C9, C11 1.5 33 C14 C9, C12 C9 C10, C12, C15 37 23 C10 C8, C12, C15 13 Ácido C12 C9, C13, C15 8 12 linolénico C13 C9, C11, C15 10 14 C15 C9, C12, C16 13 C16 C9, C12, C14 45 25
Distintos estudios empíricos permitieron comprobar que, cuando el nivel de oxidación aumenta, los hidroperóxidos se descomponen y originan, mediante rutas complejas, una gran diversidad de compuestos secundarios de oxidación: alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, hidrocarburos, monómeros oxidados, dímeros y polímeros oxidables, trímeros, epóxidos, dímeros no polares y polímeros. La velocidad de formación y el tipo de radicales peroxilo generados varía en función del grado de insaturación de los ácidos grasos, por tanto, los productos de descomposición de los hidroperóxidos dependerán principalmente de la composición en ácidos grasos de los triacilgliceroles de la matriz oxidada (Frankel, 1987). Tanto los mecanismos de descomposición como los productos secundarios formados dependen también enormemente de las condiciones de oxidación empleadas. La ruptura homolítica de los hidroperóxidos (LOOH) entre sus dos moléculas de oxígeno es la ruta más común de descomposición de hidroperóxidos (Min et al., 2002). Esta reacción genera un radical alcoxilo (LO•) y un radical hidroxilo (•OH). El radical alcoxilo (LO•), que es más energético que el alquilo (L•) o el peroxilo(LOO•), puede formar parte reacciones de β- escisión (Figura 1.2) que son de gran importancia para la calidad de los alimentos porque causa
7 1. Introducciión general que los ácidos grasos se descompongan en sustancias volátiles de bajo peso molecular que causan rancidez (Frankel, 1985).
Figura 1.2. Esquema de la oxidación lipídica (Fuente: Chaiyasit et al., 2007)
El radical alquilo (L•) puede formar ya sea un hidrocarburo mediante la abstracción de un átomo de hidrógeno, o un alcohol mediante la reacción con un radical hidroxilo (•OH). De forma similar, el radical olefínico puede reaccionar ya sea con un radical hidrógeno (•H) para formar una olefina, o con un radical hidroxilo (•OH) para producir 1-enoles que tautomerizan a aldehídos saturados. La formación de aldehídos de cadena más corta ocurre por la reacción de radicales alquilo con oxígeno para producir hidroperóxidos primarios, que posteriormente se descomponen hacia aldehídos, vía radical alcoxilo, o se escinden para producir formaldehído y un radical alquilo con un átomo de carbono menos (Figura 1.3) (Frankel, 2014). En la Tabla 1.2 se nombran los productos de oxidación secundaria de los ésteres metílicos de los ácidos grasos generados por autoxidación.
8 1. Introducciión general
Figura 1.3. – escisión homolítica de monohidroperóxidos (Fuente: Frankel, 2014)
Tabla 1.2. Productos de oxidación secundaria de los ésteres metílicos de los ácidos grasos generados por autoxidación. Fuente: Frankel (1985)
Clase Ácido oleico Ácido linoleico Ácido linolénico Aldehídos Octanal Pentanal Propanal Nonanal Hexanal Butanal 2-Decenal 2-Octenal 2-Butenal Decanal 2-Nonenal 2-Pentenal 2,4-Decadienal 2-Hexenal 3,6-Nonadienal Decatrienal Ác. Carboxílicos Heptanoato de metilo Heptanoato de metilo Heptanoato de metilo Octanoato de metilo Octanoato de metilo Octanoato de metilo 8-oxooctanoato de metilo 8-oxooctanoato de Nonanoato de metilo metilo 9-oxononanoato de metilo 9-oxononanoato de 9-oxononanoato de metilo metilo 10-oxodecanoato de metilo 10-oxodecanoato de 10-oxodecanoato de 10-oxo-8-decenoato de metilo metilo metilo 11-oxo-9-undecenoato de metilo Alcoholes 1-Heptanol 1-Pentanol 1-Octen-3-ol Hidrocarburos Heptano Pentano Etano Octano Pentano
9 1. Introducciión general
Han sido esenciales, para el conocimiento empírico del proceso de autooxidación del aceite de oliva, trabajos como el de Gómez-Alonso et al. (2004a y 2004b), realizados con una matriz de triacilgliceroles procedentes de aceite de oliva, en ausencia de compuestos pro- y antioxidantes para evitar efectos adyacentes, que describen la transformación en la composición de los triacilgliceroles, así como la evolución de los compuestos formados durante la oxidación. La realización de estos ensayos en un rango de temperatura entre 25 y 75 ºC, permitió, a partir de la velocidad de formación y descomposición de los hidroperóxidos, conocer los parámetros cinéticos y termodinámicos de la reacción de autoxidación de la matriz lipídica del aceite de oliva. El siguiente paso en el estudio del proceso de autoxidación del aceite de oliva parece obvio que sea la experimentación con éste producto en sí. La interpretación de los resultados obtenidos de forma empírica resulta un arduo trabajo debido a que deber considerarse la influencia que los compuestos minoritarios, como antioxidantes, catalizadores y los propios productos de reacción, ejercen en la velocidad y los mecanismos de autooxidación, ya que pueden entrar a formar parte de la cadena de reacción en cualquiera de sus etapas. Además, existen numerosos factores externos que aceleran el mecanismo de autoxidación: la temperatura, exposición a la luz, presencia de trazas de metales, presencia de ácidos grasos libres y la humedad (Pokorny, J. 1987). Estos factores también han sido investigados en numerosos estudios con el fin de conocer su efecto en los mecanismos de los procesos físicos y/o químicos causantes de la pérdida de calidad del aceite.
Factores que influyen en el proceso de autooxidación La velocidad de autoxidación aumenta exponencialmente con la temperatura ya que también la energía de activación depende fuertemente de la temperatura. Además, el oxígeno que pueda estar en contacto con el aceite se solubiliza más fácilmente en la matriz lipídica cuanto mayor es la temperatura, facilitando así la oxidación. La reducción de la presión parcial del oxígeno en contacto con la matriz lipídica reduce la velocidad de oxidación. Es por ello que desde hace más de dos décadas el aceite se almacena en las almazaras en tanques cerrados, con la adición en algunos casos de un gas inerte (nitrógeno o argón), incluso en las botellas para venta y consumo, ya que se ha comprobado que la baja disponibilidad de oxígeno condiciona la reducción de la oxidación del aceite (Di Giovacchino et al., 2002; Pristouri et al., 2010). La luz es un factor difícil de evitar durante los procesos de elaboración del aceite y sobre todo durante su exposición comercial y el tiempo que transcurre hasta su consumo. La oxidación de oxígeno singlete (fotooxidación) iniciada por la clorofila tiene un papel importante en el inicio de la oxidación del aceite de oliva. La interacción de la luz con el oxígeno triplete es la principal fuente de formación de oxígeno singlete en los alimentos. Los pigmentos de los alimentos actúan como fotosensibilizadores, a medida que absorben la energía de la luz, el fotosensibilizador pasa a estado excitado singlete (1Sens). El sensibilizador puede pasar a estado triplete excitado (3Sens) por absorción de luz, e iniciar la oxidación fotosensibilizada mediante dos vías (Figura 1.4): la de tipo I se caracteriza por la
10 1. Introducciión general transferencia de un átomo de hidrógeno o de un electrón entre un sensibilizador excitado en estado triplete y un sustrato lipídico, lo que resulta en la producción de radicales libres o iones radicálicos libres, que pueden reaccionar con el oxígeno para producir hidroperóxidos. En la vía de tipo II, el sensibilizador excitado en estado triplete reacciona con oxígeno triplete a través de un mecanismo de aniquilación triplete-triplete para formar sensibilizador singlete y oxígeno singlete, que puede reaccionar a su vez con ácidos grasos insaturados y dar hidroperóxidos. La clorofila es el principal fotosensibilizador del aceite de oliva y sigue este tipo II de reacción. La velocidad de la reacción de tipo II depende principalmente de la solubilidad y concentración de oxígeno presente en el alimento (Kanavouras et al., 2006b).
hv 1Sens 1Sens* 3Sens*
Tipo I Tipo II
3 1% 99% + O2 + RH 3 1 + O2 O2 + RH
SenH + R˙ ˙O-1 + 1Sen ROOH + 1Sen
O2 ROOH +Sens Figura 1.4. Rutas Tipo I y Tipo II de un fotosensibilizador en estado excitado (elaboración propia a partir de Kanavouras et al., 2006b; y Frankel, 2014)
Los hidroperóxidos conjugados y no conjugados que se forman son diferentes de los formados por el mecanismo de autoxidación. Ninguno de estos dos tipos de reacciones, formadoras de radicales libres, son inhibidas por compuestos antioxidantes captadores de radicales libres (Frankel, 2014) Muchos investigadores han estudiado las diferencias en los procesos de auto y fotooxidación, sometiendo a las mismas muestras a oxidación en presencia y en ausencia de iluminación. Este es el caso de los trabajos de Gutiérrez-Rosales et al. (1988), De Leonardis et al. (1998), Okogeri et al. (2002), Caponio et al. (2005) y Vacca et al. (2005) que coinciden en afirmar que la oxidación avanza más rápidamente cuando el aceite se expone a la luz. Reuniendo las conclusiones generales de estos estudios se puede decir que la fotoxidación se caracteriza por provocar un aumento mayor de la absorbancia a 270 nm, lo que indica una rápida descomposición de los hidroperóxidos y mayor formación de trienos que de dienos conjugados. Además, se produce una rápida decoloración del aceite como consecuencia de la degradación de las clorofilas. Es característica también la desaparición del α-tocoferol sin que vaya acompañada de cambios en el sustrato lipídico, debido a que actúa como captador de oxígeno en estado singulete. La reducción es menor en el caso de fenoles, escualeno, carotenoides y esteroles. Por otro lado, la autooxidación se caracteriza por un mayor aumento de los peróxidos
11 1. Introducciión general y dienos conjugados, lo que indica cambios inminentes en el sustrato lipídico. Estos cambios van acompañados de una reducción de los fenoles, carotenoides y también de α-tocoferol. Los resultados comentados coinciden con los obtenidos por Psomiadou et al. (2002a y 2002b). Sin embargo, Rastrelli et al. (2002), afirma que, según su experimentación, el efecto de la fotooxidación sobre la vitamina E es despreciable, viéndose ésta más afectada por la exposición al aire que a la luz, al igual que el escualeno, los fenoles y los esteroles. La recomendación general por tanto es que, para preservar las cualidades positivas y la calidad el aceite de oliva es necesario utilizar contenedores opacos durante su manejo en la almazara y botellas oscuras para su comercialización y consumo. De estos ensayos, realizados en diferentes condiciones de iluminación, exposición al aire y temperatura, se puede deducir como conclusión general que el efecto negativo combinado de la exposición del aceite de oliva al aire y a la luz es mayor que cuando ambos actúan separadamente. También se ha estudiado el avance de la oxidación del aceite de oliva en relación con el envase y el material de envasado. El contenedor en la almazara y el envase comercial pueden influir directamente en la calidad del aceite de oliva, protegiendo al producto del oxígeno y de la luz. Los materiales usados para este fin han sido diversos: el metal (aluminio y hojalata), el vidrio, el acero inoxidable (a nivel industrial) y más recientemente el plástico. Además del polietileno tereftalato (PET), el cartón recubierto de polietileno de baja densidad (LDPE) o recubierto de aluminio en lámina (briks o bolsas bag-in-box) se utilizan hoy para el envasado de aceites vegetales, incluido el aceite de oliva. En los últimos 20 años ha existido un elevado interés científico en el material de envasado del aceite de oliva y su impacto sobre la vida útil. Gutiérrez-Rosales et al. (1988) utilizó botellas de polietileno (PET), polipropileno (PP), cloruro de polivinilo (PVC) y vidrio oscuro llenas, prácticamente sin espacio de cabeza. En las botellas de PET y PP, permeables al oxígeno, los peróxidos aumentaron con el tiempo de almacenamiento, mientras que en las de PVC y vidrio (impermeables) los peróxidos disminuyeron, ya que el O2 disponible era exclusivamente el disuelto en el aceite y el existente en el espacio de cabeza. La acidez aumentó ligeramente en todos los envases, pero lo hizo algo más en el de vidrio. Los descensos de tocoferol y estabilidad fueron más acusados en las botellas permeables al aire. Kaya et al. (1993) comparó polietileno (PET), vidrio transparente y vidrio oscuro, y comprobó que la estabilidad, determinada por el aumento de peróxidos, era mayor en el aceite de oliva almacenado en vidrio oscuro, ya que no permite el paso del oxígeno ni de la luz. Procida et al. (1999) realizó sus ensayos con envases metálicos y botellas de vidrio verde y transparente. Los peróxidos aumentaron más en las botellas transparentes, así como el índice de Totox. La reducción de los compuestos fenólicos fue menor en los envases metálicos, al igual que los tocoferoles. Por otro lado, Coutelieris et al. (2006), utilizando como muestra aceite de oliva virgen extra envasados en vidrio, PET y PVC, comprobó que la cantidad de hexanal producido durante la conservación bajo luz es mayor, por tanto, la luz tiene una influencia significativa en la
12 1. Introducciión general evolución del hexanal, mientras que la disponibilidad de oxígeno a través de los envases es menos influyente, especialmente a bajas temperaturas. Pristouri et al. (2010) experimentó con diversos materiales de envasado: vidrio transparente, PET transparente, PET transparente con un filtro de la luz ultravioleta, PET transparente recubierto con una película de aluminio y polipropileno (PP) transparente. Tras monitorizar los parámetros de oxidación y el color durante 12 meses a 35 ºC concluyó que el PP y el PE no eran los más aconsejables debido a su elevada permeabilidad al oxígeno. El filtro de UV en el material PET no mantuvo sustancialmente en el tiempo la calidad del VOO. Los materiales de baja permeabilidad al oxígeno como el PET protegen el producto pero no más allá de los tres meses si hay exposición a la luz. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Méndez y Falqué (2007). Por lo tanto, el mejor material para el envasado del VOO fue el vidrio oscurecido seguido del PET. Cecchi et al. (2010) estudiaron el comportamiento de botellas de PET que contenían en su estructura un compuesto captador de oxígeno. Después de 13 meses de experimentación concluyeron que este compuesto barrera en la matriz del plástico era capaz de preservar mejor la calidad y los atributos del EVOO, ya que el menor flujo de oxígeno que atravesaba el PET con barrera mantuvo los niveles de oxidación primaria y secundaria por debajo de los obtenidos con botellas de PET convencional. Estudios que exponen resultados a favor del tipo de envasado en brik o latas recubiertas son, por ejemplo, los de Méndez y Falqué (2007), a pesar de ser actualmente los envases más usados. Ambos envases ralentizan la degradación del aceite de oliva porque protegen de la luz y del oxígeno, pero además el envase en brik conserva mucho mejor las características iniciales del producto. Las conclusiones de Samaniego-Sánchez et al. (2012) reflejaron una disminución de la calidad del aceite en todos los tipos de envases en el siguiente orden: PET > botellas de vidrio > Tetra-Brik® En la Tabla 1.3 se resumen las ventajas y desventajas de los materiales empleados para el envasado del aceite de oliva virgen. El gobierno de España prevé la aprobación a finales del año 2020 del Real Decreto por el que se aprueba la norma de calidad de los aceites de oliva y de orujo de oliva (MAPA, 2020). Uno de los objetivos (artículo 8) es prohibir el uso de envases de plástico para embotellar el aceite de oliva virgen extra de origen español, para reducir el impacto ecológico y de este modo dar un valor añadido este producto. Actualmente, la mayoría de envasadoras utilizan el plástico para sus embotellados por su ligereza, bajo coste y resistencia. Este decreto impactaría de forma directa y supondría un problema sobre todo para envases de gran tamaño en los cuales el plástico es el material más utilizado. Sustituir este material por lata o vidrio supondría un aumento de coste y peso. Fuera de esta normativa se quedarían tan solo dos tipos de envases: las botellas de 5 L envasadas directamente en almazara o cooperativa, y las monodosis, ya que el uso de plásticos para monodosis destinadas a bares y restaurantes, seguiría permitido.
13 1. Introducciión general
Tabla 1.3. Ventajas y desventajas de los materiales de envasado de aceite de oliva (Adaptada de Wang et al., 2014)
Material Ventajas Desventajas - Pesado y frágil Vidrio oscurecido -Ampliamente utilizado en alimentos y - Solo útil para pequeños y (ámbar o verde) bebidas, mejor que el plástico y envases medianos embotellados. claros - Más caro que los envases de - Posibilidad de distintos formatos: plástico translúcido o completamente opaco. - Protege de la luz y del oxígeno - Fácil de esterilizar - Reutilizable y reciclable, eco-friendly - Ampliamente utilizado en alimentos y - Pesado y frágil. Vidrio bebidas - Solo útil para pequeños y transparente - Protege del oxígeno. medianos embotellados. - Estudios revelan que los envases que - Más caro que los envases de permiten ver la coloración del aceite, son plástico más atractivos para el consumidor. - No protege de la luz, lo que acelera - Reutilizable y reciclable, eco-friendly la oxidación - Asociado con un producto “Premium” - Poco estudiado Aluminio - Pueden alearse con elementos - Los iones tóxicos de aluminio metálicos para lograr unas adecuadas pueden migrar al producto y producir propiedades mecánicas alteraciones si no está esmaltado - Protege de la luz y oxígeno - Más caro que otros materiales - Mejor usar con un esmalte de grado - No permite ver el color del alimentario (materiales poliméricos) producto - Ligeros y compactos - Reciclable y eco-friendly - Protege de la luz y oxígeno - Precio elevado. Latas de hojalata - Medianamente buena resistencia - Envases reutilizados pueden dar mecánica lugar a la corrosión del metal y emisión - Usadas en retail (0.5 L- 5 L) de componentes que aceleren la - Adecuadas para litografiar oxidación del aceite, reduciendo su - Ligeros y compactos. vida útil en el siguiente envasado - Reciclable y eco-friendly - Menor estabilidad del aceite que en PET o vidrio - No permite ver el color del producto - Alta protección frente a - Precio elevado para su uso Acero inoxidable microorganismos, humedad, luz y oxígeno comercial - Muy extendida en la industria para su - Pesado conservación y transporte - Alta resistencia a la corrosión - Reutilizable y reciclable, eco-friendly - Muy extendido su uso en alimentos y - No recomendable su reutilización PET (polietileno bebidas por la emisión de componentes tereftalato) - Mejor que el PVC y el PE para aceite de tóxicos en los siguientes usos oliva - El trasparente deja pasar la luz y - Ligero, resistente y barato aceleran la oxidación del aceite - Pueden añadirse a su composición - Es poroso por lo que permite la elementos para absorber los rayos UV penetración de humedad y gases (oscurece el plástico) y captadores de
oxígeno para alargar la vida útil del VOO - Reciclable y eco-friendly - El transparente permite ver el color del aceite
14 1. Introducciión general
Tabla 1.3. Ventajas y desventajas de los materiales de envasado de aceite de oliva (cont.) (Adaptada de Wang et al., 2014)
Material Ventajas Desventajas - Popular en muchos países: Grecia, - Monómeros de cloruro de vinilo PVC (polivinil cloride- Italia y Francia (VCM), ftalato de dioctilo (DOR), y cloruro de polivinilo) - Buena protección frente al oxígeno adipato de dioctilo (DOA) pueden - Moderada resistencia mecánica migrar al aceite durante su - Adaptable a todos los tipos de cierre almacenamiento, por lo que no puede - Ligero y barato usarse sin un recubrimiento - Reciclable y eco-friendly (normalmente PVCD) - No protege de la luz - Las botellas de PVC son un contaminante en el reciclado de las botellas de PET, por lo que su reciclaje no está claro - Ha sido sustituido por PET - Buena resistencia mecánica - No son adecuados para el PP (polipropileno) - Ligero y barato envasado por su elevada PS (poliestireno) - Reciclable y eco-friendly permeabilidad al oxígeno - El PS es el que menor estabilidad PE (polietileno) da al aceite de todos los plásticos - Mayor protección frente al oxígeno - Uso poco extendido Cartón revestido y la luz que el vidrio y el plástico, - No reutilizable (Brik) prolonga de forma eficiente la vida útil y - No permite ver el producto, lo que mantiene los antioxidantes se percibe negativamente por el - Escasa posibilidad de rotura durante consumidor en transporte - Adecuado para litografiar - Ligero y barato - Reciclable y eco-friendly - Similares al cartón revestido, - Similares al cartón revestido Bag-in-box aunque aún más duradero - Aún poco estudiado, el plástico - Su uso se está extendiendo utilizado puede tener influencia en la especialmente en EEUU vida útil del aceite - Ligero y barato
1.2. PAPEL DE LOS ANTIOXIDANTES PRESENTES EN ACEITE DE OLIVA
El papel de los compuestos antioxidantes como inhibidores de la autooxidación lipídica ha sido también uno de los aspectos más ampliamente estudiados. La prevención de la oxidación en alimentos es de gran importancia, por un lado, desde un punto de vista nutricional, ya que los radicales libres y otros compuestos de oxidación son susceptibles de provocar el deterioro de tejidos y causar así enfermedades como aterosclerosis o cáncer (Simic et al., 1980) y, por otro lado, desde el punto de vista económico, ya que la aparición de off-flavors debidos a la oxidación (Grosch et al., 1981; Frankel, 1982, 1987; Dobarganes et al., 1986; Kochhar, 1993; Ben- Hassine et al., 2013 ) devalúa la calidad del producto. Centrándonos en este último aspecto, el de la protección del producto, existen numerosos trabajos en los cuales se evalúa la capacidad de estabilización ante la autooxidación que poseen determinados compuestos. Desde hace décadas, se estudia la posibilidad de
15 1. Introducciión general aumentar la estabilidad de los aceites vegetales adicionando antioxidantes procedentes de fuentes naturales como especias, hierbas, semillas, vegetales, etc. Los aceites vegetales con baja estabilidad oxidativa parecen ser los que fueron objeto de estudio en primer lugar. Así, por ejemplo, Dutton et al. (1948) observó un aumento de la estabilidad del aceite de soja al adicionar sorbitol, manitol, xilitol, glicerol o ácido cítrico, ya que actúan como agentes quelantes de los metales que aparecen en el aceite como consecuencia del proceso de refinado. Otros de los primeros trabajos de este tipo se realizaron con aceite de maíz (Cort, 1974) y aceite de semilla de algodón (Sifuentes Villanueva et al., 1974). Kiritsakis et al. (1983) fue uno de los primeros en estudiar los efectos de la adición de antioxidantes sintéticos al aceite de oliva virgen y comprobó que, en las condiciones de su experimentación (50, 65 y 100 ºC), todos los antioxidantes utilizados (BHA, BHT, TBHQ y propil galato) mejoraban la estabilidad de este aceite. Sin embargo, el aceite de oliva, sobretodo el de calidad virgen extra, contiene de forma natural una concentración relevante de compuestos antioxidantes. Además, la reglamentación comunitaria relativa a los aceites de oliva virgen no permite el uso de aditivos, por lo que la adición de antioxidantes para mejorar la estabilidad de algunos aceites vegetales no existe en el caso del aceite de oliva virgen.
Antioxidantes del aceite de oliva virgen El aceite de oliva virgen extra contiene de forma natural una concentración relevante de moléculas potencialmente antioxidantes, como los tocoferoles, el β-caroteno y los compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos más importantes que se han identificado en aceite de oliva virgen se pueden dividir en diferentes grupos: ácidos fenólicos, alcoholes fenólicos, secoiridoideos, lignanos y flavonas. Los que se encuentran en mayor cantidad son, generalmente, los secoiridoideos, seguidos por los tocoferoles, lignanos, β-caroteno, alcoholes fenólicos y luteolina (Bendini et al., 2007; Brenes et al., 2000). Los secoiridoideos del EVOO derivan principalmente de la oleuropeína, la demetiloleuropeína, y el ligustrósido, mediante hidrólisis enzimática, realizada por la beta-glucosidasa, del fruto del olivo (Angelino et al., 2011). Sus concentraciones dependen del cultivar, la etapa de maduración y los métodos de cosecha y procesamiento (Gómez Rico et al., 2006, 2007, 2008, 2009; Inarejos-García et al., 2010). El 3,4- DHPEA-EDA, derivado de la oleuropeína, es responsable del sabor amargo, mientras que el p- HPEA-EDA, derivado del ligustrósido, es responsable del sabor picante, por lo que estos sabores son características positivas del EVOO en relación con los beneficios para la salud. En cantidades menores se encuentran los fenoles sencillos: hidroxitirosol, tirosol, tirosol acetato, ácidos vanílico, p-cumárico y ferúlico, vainillina, los flavonoides apigenina y luteolina, y los lignanos pinorresinol y acetopinorresinol (Montedoro et al., 1993; Brenes et al., 2000; Owen et al., 2000; Mateos et al., 2001). Estos compuestos fenólicos se consideran los principales antioxidantes del aceite de oliva. Actúan como antioxidantes primarios evitando la propagación de las reacciones oxidativas mediante la donación de un radical hidrógeno a los radicales peroxilo que se forman
16 1. Introducciión general durante la fase de iniciación de la oxidación lipídica, con la consecuente formación de radicales fenoxilo, los cuales son estables por resonancia y relativamente no reactivos frente a los ácidos grasos y el oxígeno, por lo que no son capaces de iniciar o propagar reacciones de oxidación. La eficacia de los compuestos fenólicos como sustancias antioxidantes depende de la estabilidad por resonancia de los radicales fenoxilo a los que dan lugar, que se encuentra condicionada por la presencia de sustituyentes donadores de electrones en el anillo aromático y por el tamaño de los mismos (Scott, 1965). La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos depende de la concentración y de su estructura química. En general, los efectos más positivos en el aceite de oliva virgen se observan con las estructuras 3,4-dihidroxi y 3,4,5-trihidroxi, ligadas a un anillo aromático que confiere a la molécula una mayor deslocalización del protón, facilitando la capacidad captadora de radicales libres (Torres de Pinedo et al., 2007). Otra característica estructural que puede incrementar la capacidad antioxidante el grupo hidroxilo primario sobre la cadena alquílica, como en el caso del tirosol (p-HPEA) y del hidroxitirosol (3,4-DHPEA) (Torres de Pinedo et al., 2007). El aceite de oliva también contiene compuestos fenólicos lipofílicos (tocoferoles). El isómero -tocoferol representa más del 90% del total. Los tocoferoles pueden actuar como antioxidantes por dos mecanismos primarios, uno en el cual donan su átomo de hidrógeno fenólico a un radical libre lipídico, y otro en el cual se incluye la unión o captación de oxígeno en estado singlete (Kiritsakis, 1998). Parece ser que los compuestos fenólicos tienen más efectividad para inhibir la autooxidación del aceite de oliva en el estado inicial, mientras que el -tocoferol se hace más efectivo cuando los productos primarios de oxidación (hidroperóxidos) alcanzan una cierta concentración (Blekas et al., 1995). El color del aceite de oliva es la consecuencia de la combinación del verde proporcionado por las clorofilas, y el naranja-ocre de los carotenos, lo cual diferencia al VOO de otros aceites vegetales. Los carotenos son potentes protectores frente a la fotooxidación, actuando como captadores de oxígeno en estado singlete, mientras que las clorofilas y sus derivados tienen actividad prooxidante debido a su capacidad para formar compuestos en estado electrónico excitado a partir de la luz (Bradley et al., 1992). De entre los esteroles, el D-5-avenasterol es efectivo como antioxidante, mientras que el estigmasterol y colesterol son ineficaces para reducir la oxidación térmica de una matriz de triacilgliceroles de similar composición al VOO (Gordon et al., 1983).
Estudios de la actividad antioxidante En general podemos definir la actividad o capacidad antioxidante como la capacidad de un compuesto para suprimir, retrasar o prevenir procesos de oxidación, causados principalmente por especies reactivas de oxígeno (ROS). Sin embargo, los términos "actividad antioxidante" (AA) y "capacidad antioxidante" tienen diferentes significados: la actividad antioxidante se ocupa de la cinética de una reacción
17 1. Introducciión general entre un antioxidante y el prooxidante o radical al que reduce o elimina, mientras que la capacidad antioxidante mide la eficiencia de conversión termodinámica de un medio oxidante tras la reacción con un antioxidante (Lewoyehu et al., 2019). Según Huang, Ou y Prior (2005), los antioxidantes han sido tradicionalmente divididos en dos clases: antioxidantes primarios o chain-breaking, y antioxidantes secundarios o preventivos. En los mecanismos de ruptura de cadena, los pasos de iniciación (al reaccionar con un lípido radical) o propagación (al reaccionar con radicales alcoxilo o peroxilo) son inhibidos.
L˙ + AH LH + A˙ LO˙ + AH LOH + A˙ LOO˙ + AH LOOH + A˙
Por otro lado, los antioxidantes secundarios (preventivos) son moléculas que retrasan la velocidad de la oxidación, por ejemplo, quelantes de iones de metales de transición pueden inhibir las reacciones de tipo Fenton que producen radicales hidroxilo:
+2 +3 - Fe + H2O2 Fe + ˙OH + OH
La actividad antioxidante se puede medir indirectamente en función de sus efectos. La mayoría de los métodos se basan en el uso de diversos sistemas generadores de radicales que se ponen en contacto con la muestra para la cual se analiza la capacidad antioxidante. Los métodos para determinar la capacidad antioxidante se dividen en dos grupos principales (Wright et al., 2001): - ensayos basados en la reacción de transferencia de un solo electrón (SET, single electron transfer), monitoreada a través de un cambio de color a medida que se reduce el oxidante, y - ensayos basados en una transferencia de átomos de hidrógeno (HAT, hydrogen atom transfer), donde el antioxidante y el sustrato compiten por los radicales peroxilo libres En la Tabla 1.4 se describen las características de los mismos, y se enumeran los más relevantes. Otros métodos no incluidos en estos dos grupos son el método de la inhibición de la reacción de oscilación de Briggs-Rauscher (Cervellati et al., 2002b), los métodos de quimioluminiscencia (Ashida et al., 1991), y métodos de electroquimioluminiscencia (Chmura et al., 1994).
18 1. Introducciión general
Tabla 1.4. Clasificación de los métodos para determinar la actividad antioxidante en función del mecanismo de reacción
SET, single electron transfer HAT, hydrogen atom transfer
Se evalúa la capacidad de los posibles Se evalúa la capacidad de un antioxidante antioxidantes de transferir un electrón y para eliminar los radicales libres mediante la reducir ciertos compuestos, incluidos los donación de protones. El radical aromático carbonilos, metales y radicales. formado es estable por resonancia. ROO˙ + AH/ArOH ROOH + A˙ /ArO˙ La acción antioxidante se simula en un medio Un reactivo fluorescente y los antioxidantes de potencial redox adecuado, es decir, los reaccionan con ROO•, y la AA se determina a antioxidantes reaccionan con un medio partir de la cinética de la competencia fluorescente o coloreado (agente oxidante) midiendo la curva de disminución de en lugar de con radicales peroxilo. Los fluorescencia del medio en ausencia y ensayos espectrofotométricos basados en ET presencia de antioxidantes, integrando el área miden la capacidad de un antioxidante para bajo estas curvas y encontrando la diferencia reducir a un oxidante, que cambia de color entre ellos Prior et at. (2005). cuando se reduce. El grado de variación de color (ya sea un aumento o disminución de la absorbancia del medio a una longitud de onda dada) se correlaciona con la concentración de antioxidantes en la muestra. Métodos: Métodos: - TEAC (Trolox equivalent antioxidant - Decoloración de la crocina utilizando capacity) o ABTS (2,2’-azinobis(3- AAPH (diclorhidrato de 2,2′-azobis (2- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) amidino-propano) - ferric reducing antioxidant power (FRAP) - total radical-trapping antioxidant potential (TRAP) - cupric reducing antioxidant power (CUPRAC) - oxygen radical absorbance capacity (ORAC) - 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging capacity assay - método del -caroteno linoleato Benzie y Strain, 1996, Brand-Williams et al., Alho & Leinonen, 1999; Huang et al., 2005; Ou, 1995, Huang et al., 2005, Re et al., 1999 et al., 2002; Prior et al., 2005
Método del ABTS (Ácido 2,2′-azinobis- (3-etilbensotiazolina) -6-sulfónico (ABTS)) o TEAC. Este método fue utilizado por primera vez por Miller and Rice-Evans en 1993 y adaptado por Re et al. (1999) para determinar la capacidad antioxidante de compuestos fenólicos, carotenoides y de plasma. La técnica mejorada para la generación del radical ABTS˙+ implica la producción directa del cromóforo ABTS˙+ azul / verde a través de la reacción entre ABTS y persulfato de
19 1. Introducciión general potasio. Muestra máximos de absorción a longitudes de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm, así como el máximo más comúnmente utilizado a 415 nm. La adición de antioxidantes al radical catiónico preformado lo reduce en un grado y en un tiempo que depende de la actividad antioxidante, la concentración del antioxidante y la duración de la reacción. Así, el alcance de la decoloración como porcentaje de inhibición del catión radicálico ABTS˙+ se determina en función de la concentración y tiempo y calculado en relación con la reactividad de Trolox como patrón (TEAC, Trolox equivalent antioxidant capacity), en las mismas condiciones. El método es aplicable al estudio de ambos, antioxidantes solubles en agua y antioxidantes liposolubles, compuestos puros y extractos de alimentos. Método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power). Se presentó en 1996 por Benzie and Strain como un método novedoso, derivado de la capacidad reductora férrica de los componentes del plasma (Ferric Reducing Ability of Plasma), para determinar el “poder antioxidante”. Es un método colorimétrico basado en la reducción de un complejo férrico de tripiridiltriazina (Fe+3-TPTZ) a su forma ferrosa (Fe+2), a pH bajo (3.6). Durante esta reducción la disolución se torna de un color azul con un máximo de absorbancia a 593 nm. En este método el Fe+3 está en exceso y la velocidad de reacción hacia Fe+2-TPTZ, y por tanto al desarrollo del color azul, viene limitada por la capacidad reductora de la muestra que se pretende evaluar (antioxidante). La capacidad antioxidante de la muestra se determina mediante una curva de calibración, utilizando Trolox como compuesto de referencia. Los resultados se expresan generalmente en mol de Trolox Equivalente (TE) por gramo de aceite. Método CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity). Hay poca información publicada sobre este método. El método está basado en la reducción de Cu (II) a Cu (I) por reductores (antioxidantes) presentes en una muestra. Un reactivo cromogénico, la batocuproína (2,9- dimetil-4,7-difenil-1,10-fenantrolina), forma un complejo 2:1 con Cu (I), que tiene una absorbancia máxima a 490 nm (Schilt, A, 1966). Método DPPH (2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH)). Su uso fue propuesto por Brand- Williams et al., (1995) para evaluar la AA de compuestos fenólicos. Estos últimos se dejan reaccionar con un radical estable, (DPPH˙) en una solución de metanol. La reducción de DPPH˙ se sigue monitoreando la disminución de la absorbancia en una característica longitud de onda durante la reacción. En su forma radical, DPPH˙ absorbe a 515 nm, pero al reducirse con un antioxidante o una especie radical, la absorción desaparece progresivamente hasta alcanzar una fase estacionaria. De la representación gráfica del % de DPPH˙ remanente en la fase estacionaria, frente a los moles de antioxidante/mol de DPPH˙, se obtiene el valor EC50 (Efficient Concentration) que es la cantidad de antioxidante necesario para reducir la cantidad de DPPH˙ en un 50%. Otra forma de expresarlo es mediante el valor 1/EC50 = ARP (anti-radical power) de manera que cuanto mayor es el ARP más eficiente es el antioxidante. Otros autores utilizan una curva de calibrado con Trolox para expresar los resultados como μmol de TE. Método de la decoloración de la crocina (Crocin bleaching assay). Este método mide la capacidad de inhibición de los antioxidantes para proteger el blanqueo de la crocina, un derivado carotenoide natural, por el generador de radicales libres AAPH (Bors et al., 1984). Experimentalmente, la reacción se lleva a cabo en un tampón fosfato (pH 7.0) que contiene 10 μM de crocina y cierta cantidad del antioxidante. A continuación, se añade el iniciador radical AAPH (0.5 M) para inicial la reacción. El progreso de la reacción se monitoriza mediante un
20 1. Introducciión general espectrómetro UV-vis a una longitud de onda de 443 nm, la absorción máxima de crocina. La velocidad de blanqueo se vuelve lineal 1 minuto después de la adición de AAPH y se monitoriza durante 10 minutos. Las velocidades iniciales de blanqueo de crocina se obtienen de las curvas cinéticas en presencia (V) o ausencia (V0) de antioxidantes. La relación entre V y V0 obedeció a la ecuación:
V0/V = 1 + (ka/kc) x [AH]/[C] donde ka es la constante de velocidad para la reacción de antioxidantes con ROO˙, kc es la constante de velocidad para la reacción entre ROO˙ y crocina, [C] es la concentración de crocina, y [AH] es la concentración de antioxidante. Una gráfica de [AH]/[C] versus V0/V debería dar una gráfica lineal con una pendiente de ka/kc, que indica la capacidad relativa de eliminación de radicales peroxilo. Este método tiene aplicaciones muy limitadas en muestras de alimentos hasta el momento. La crocina absorbe a una longitud de onda bastante corta (450 nm), y muchos pigmentos alimenticios, como los carotenoides, absorben luz a la misma longitud de onda. Finalmente, la crocina es una mezcla de pigmentos naturales extraídos del azafrán y está sujeta a una variabilidad de lote a lote, lo que limita su aplicación industrial en un procedimiento cuantitativo. Método TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) El método TRAP utiliza R- ficoeritrina (R-PE) como sustrato fluorescente. El progreso de la reacción de R-PE con AAPH se monitoriza fluorimétricamente a una longitud de onda de excitación de 495 nm y de emisión de 575 nm. La AA se expresa como equivalentes de Trolox (X) por la ecuación:
CTrolox/TTrolox = X/Tplasma
donde CTrolox es la concentración de Trolox, TTrolox es la fase lag (tiempo) de la curva cinética de R-PE en presencia de Trolox, X es la capacidad antioxidante del plasma y Tplasma es la fase lag (tiempo) de la curva cinética en presencia de plasma. X se multiplica por 2.0 (el factor estequiométrico de Trolox) y por el factor de dilución de la muestra para dar el valor de TRAP
(μmol / L). Para obtener el TTrolox de la curva cinética de la muestra, se añade Trolox a la mezcla de reacción cuando la fluorescencia de R-PE es del 50% del valor inicial. La reacción se sigue hasta que la velocidad de disminución de fluorescencia llega a un nivel justo antes de la adición de Trolox. La fase “lag” se calcula extrapolando las curvas de oxidación máxima de R-PE antes y después de la adición de Trolox (Huang et al., 2005). Método ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Ninfali et al., (2001) desarrollaron este método para su uso en aceites vegetales adaptándolo de Cao et al. (1993). Mide la eficiencia de los antioxidantes para reducir los radicales peroxilo generados en la mezcla de reacción a partir del diclorhidrato de 2,2′-azobis (2-amidino-propano) (AAPH), en comparación con el análogo hidrófilo de la vitamina E, llamado Trolox. Una vez que se inica la reacción con la adición del AAPH a la muestra, se mide la fluorescencia cada 5 min a la emisión de 565 nm y excitación de 540 nm hasta fluorescencia cero. Se usó -ficoeritrina (B-PE) como detector de actividad radical. Cuando la muestra agota su capacidad de atrapar radicales peroxilo, B-PE se convierte en el objetivo de los radicales y pierde rápidamente su fluorescencia. El área bajo la curva de disminución de la fluorescencia es
21 1. Introducciión general proporcional a la capacidad antioxidante de la muestra. Se realiza también una curva con Trolox. El valor ORAC se refiere al área de protección neta bajo la curva de B-PE en presencia del extracto fenólico de aceite o Trolox, menos el blanco. La capacidad de absorber radicales peroxilo de la muestra se determina como μmol de Trolox equivalente (TE) por gramo de aceite. Este método se ha utilizado, por ejemplo, por Antonini et al. (2015) para clasificar varios EVOO en cuatro categorías de calidad en función de las unidades ORAC (μmol de Trolox equivalente/g): 1–4, EVOO de baja calidad; 4–8, intermedio; 8-12, alto; > 12, de alta calidad. Los valores ORAC están directamente correlacionados con el contenido fenólico (Ninfali et al., 2002). Método del -caroteno-linoleato. El método fue creado por Marco (1968) y simplificado por Miller (1971). Se han realizado muchas modificaciones posteriores para simplificar la operativa o mejorar la reproducibilidad transfiriendo el procedimiento a una microplaca. El proceso se desarrolla en una emulsión acuosa de ácido linoleico y β-caroteno, que se decolora cuando es destruido por los radicales generados por la oxidación espontánea del ácido graso, promovido por inducción térmica, normalmente a 50 ° C. La cuantificación se basa la velocidad con la que decae la absorbancia del β-caroteno (a 470 nm) en presencia de concentraciones crecientes del antioxidante. La medición de la absorbancia se realiza periódicamente hasta que el color del caroteno desaparece en los tubos control. Una mezcla preparada sin β-caroteno se usa como blanco. La AA se evalúa usando la siguiente fórmula:
AA = 100 [1 (A0 – At) / (A°0 - A°t)]
donde A0 y A°0 son los valores de absorbancia medidos en el momento cero de la incubación para la muestra (antioxidante) y el control, respectivamente, y At y A°t son la absorbancia medida en la muestra de prueba y el control, respectivamente, después de la incubación durante t minutos. Aunque este método es ampliamente utilizado, ha sido criticado por diferentes razones: por su sensibilidad a variables como temperatura, pH, efectos solventes, oxígeno disuelto y la posibilidad de interacciones con otros compuestos en muestras complejas. Este proceso se adaptó por Samaniego Sánchez et al. (2007) a muestras de AOVE siguiendo el método de Gorinstein et al. (2003). Métodos de quimioluminiscencia. La quimioluminiscencia se puede definir como la emisión de radiación ultravioleta, visible o infrarroja de una molécula o átomo como resultado de la transición de un estado excitado electrónicamente, que se ha producido como consecuencia de una reacción química. Hay muchas reacciones químicas inorgánicas y orgánicas que son conocidas por producir luz. Una reacción típica sería: A + B C * + DC * C + Luz, donde (*) indica un estado excitado La quimioluminiscencia (CL) ofrece la posibilidad de desarrollar métodos para medir la capacidad de los compuestos antioxidantes presentes en los alimentos para extinguir los radicales libres mediante la donación de hidrógeno (Prior et al., 2005 ) En tales mecanismos, las mediciones de AA se basan cinéticas competitivas, donde los antioxidantes compiten con el luminol por los radicales libres, lo que resulta en una disminución de la emisión de luz en comparación con la intensidad de CL obtenida en ausencia de los antioxidantes: la muestra inhibe la emisión de luz inducida por el radical en proporción a su contenido de antioxidantes.
22 1. Introducciión general
Como agentes luminiscentes se usan habitualmente luminol (5-amino-2,3-dihydrophthalazine- 1,4-dione) o lucigenina (bis-N-methylacridinium nitrate). Para iniciar la reacción de formación de +2 radicales libres se usan generalmente el reactivo Fenton (Fe /H2O2) o el AAPH. La AA se determina midiendo la inhibición de la emisión de un blanco y se expresa como EC50, que representa la concentración de antioxidante necesario para disminuir en un 50% la emisión del blanco. Las reacciones quimioluminiscentes (CL), gracias a ventajas tales como su alta sensibilidad y selectividad, amplio rango lineal, simplicidad y el uso de instrumentación económica para monitorizar la emisión de luz, tienen un potencial analítico considerable en una gran variedad de aplicaciones, y siempre que un ensayo de CL se consigue automatizar se logran mejores resultados en términos de reproducibilidad de los datos, número de muestras analizadas y facilidad de empleo (Girotti et al., 2004). Método de la inhibición de la reacción de oscilación de Briggs-Rauscher (BR). La singular reacción en la que se basa este método fue expuesta y explicada por primera vez por T. S. Briggs y W. C. Rauscher en 1973. El sistema oscilante consiste en la yodización y oxidación de un sustrato orgánico (generalmente el ácido malónico o sus derivados) por yodato ácido en presencia de Mn(II) como catalizador. R. Cervellati y K. Höner han adaptado y usado ampliamente este método con éxito para determinar la AA de numerosos compuestos y alimentos porque es fácil, económico y rápido frente a otros métodos. Además, permite determinar también la actividad prooxidante, sinérgica o antagonista de mezclas de compuestos. Bajo las condiciones apropiadas, el sistema BR muestra una variación periódica de la concentración de productos intermedios y catalizadores. Los principales intermedios para los cuales las concentraciones oscilan en la reacción BR son: ion yoduro, yodo, las especies de oxi-yodo HOI, HIO2 y IO2˙ y el radical hidroperoxilo HOO˙ (Cervellati et al., 2000; Cervellati et al., 2001). Cuando los antioxidantes captadores de radicales libres se añaden a una mezcla BR oscilante activa, hay un cese inmediato de las oscilaciones, pero después de un tiempo se reanuda el comportamiento oscilatorio. Cuanto mayor es la concentración y actividad del antioxidante, mayor es el tiempo de inhibición (tinhib), es decir, el tiempo transcurrido entre el cese y la reanudación de las oscilaciones. En presencia de un indicador de almidón, las oscilaciones son "visibles": la mezcla cambia periódicamente de color en la secuencia incoloro-amarillo- azul-incoloro ... etc. Se han empleado multitud de métodos utilizando diferentes enfoques para la estimación de la actividad antioxidante (AA) (Antolovich et al. 2002; Sánchez-Moreno, 2002; Roginsky y Lissi 2005). Todos los mencionados antes con más o menos variaciones, se han aplicado a los aceites comestibles, pero, en la mayoría de los casos, se utilizan los extractos hidrófilos de los aceites, que no superan el 1 % del peso total. Sin embargo, para determinar la AA real de un aceite es indispensable evaluar las AA de sus compuestos hidrófilos y lipófilos. Se ha comprobado que la contribución a la AA total de un aceite de los correspondientes extractos acuosos y orgánicos es diferente para los aceites de oliva en comparación con los aceites de semillas. Los extractos acuosos de aceites de semillas muestran AA insignificante, mientras que sus extractos lipófilos contribuyen más del 90% a la AA total de aceite. Por lo tanto, la actividad antioxidante de los aceites de semillas debe medirse en muestras de aceite no tratado y no en extractos acuosos, de lo contrario se subestima el verdadero contenido antioxidante de los aceites de semilla (Christodouleas et al. 2011).
23 1. Introducciión general
Se han utilizado técnicas de quimioluminiscencia para el seguimiento de los radicales libres producidos en los procesos de oxidación y también para la estimación de la AA en extractos acuosos de aceites (Minioti y Georgiou, 2008; Papadopoulos et al. 2003; Navas y Jiménez 2007). Dada la complejidad de los procesos de oxidación, no existe un método único que refleje completamente el perfil antioxidante de una muestra y, por lo tanto, los datos recopilados por los investigadores son difíciles de comparar e interpretar (Frankel et al., 2000). Además, muchos factores pueden afectar la actividad de los antioxidantes ya que algunos antioxidantes retrasan la oxidación de lípidos en ciertas condiciones, pero promueven la oxidación de lípidos en otras condiciones (Huang et al., 1994). Lo óptimo sería medir la actividad de cada uno de los componentes de una muestra, pero es difícil determinar el tipo, el número y la concentración de antioxidantes y, por lo tanto, los métodos descritos miden la actividad general de todos los antioxidantes (conocidos o desconocidos) en la muestra. Lo recomendado por ciertos grupos de investigación (Hengst, et al., 2009; Huang et al., 2005), es el uso de más de un ensayo para determinar la AA de extractos de alimentos o compuestos individuales, ya que los diferentes métodos pueden producir resultados muy divergentes en función de los mecanismos de reacción, el efecto de los solventes de extracción en los compuestos, etc. Se deben utilizar varios métodos, basados en diferentes mecanismos. Así, por ejemplo, Tabart et al. (2009) utilizaron 4 métodos diferentes para evaluar la AA de compuestos fenólicos estándar y zumos de frutas: ABTS-TEAC, DPPH, ORAC, hemolisis. También Müller et al. (2011) utilizaron 4 métodos diferentes para evaluar la AA de carotenoides individuales y otros antioxidantes en aceites y zumos en función de su mecanismo de reacción: FRAP (actividad para reducir los iones férricos), TEAC (actividad para reducir los cationes radicálicos sintéticos), DPPH (actividad para barrer radicales libres) y LPSC (actividad para barrer radicales peroxilo). En ambos trabajos se propuso expresar ll resultado de la AA como una media ponderada de los resultados obtenidos en los diferentes ensayos. En el caso de Müller et al. para los métodos FRAP, TEAC, DPPH y LPSC, el factor de ponderación se calculó dividiendo la actividad antioxidante de un compuesto determinado utilizando un determinado método por la actividad media determinada para todo el conjunto de compuestos (''all'') en el mismo método. La siguiente ecuación describe como ejemplo el cálculo promedio ponderado para licopeno (LYC):
Al estudiar los resultados de AA en distintos alimentos, observaron que, por un lado, el ensayo LPSC dio valores de AA altos para los zumos ricos en carotenoides y bajos en vitamina E (tomate, zanahoria). Por otro lado, los ensayos basados en los mecanismos redox (TEAC, FRAP) así como el ensayo de barrido de la DPPH mostraron valores 10 veces menores. Sin embargo, el grupo de aceites ricos en vitamina E (girasol, oliva, nuez y especialmente aceite de pescado) dieron valores de DPPH mucho más altos que los zumos.
24 1. Introducciión general
Dentro de un mismo grupo de alimentos, como el aceite de oliva virgen, también se han utilizado varios métodos en paralelo para determinar la AA. Por ejemplo, Fanali et al. (2018) utilizaron DPPH, ORAC, FRAP y TEAC para evaluar la AA de la fracción fenólica total de aceites de oliva virgen, y sus resultados indicaron que a medida que la concentración total de compuestos fenólicos aumenta la AA medida por todos los métodos basados en diferentes mecanismos de reacción, aumenta independientemente del origen de la muestra. Los resultados mostraron una correlación positiva y significativa (R2 > 0.6) entre la concentración de oleuropeína aglicona y ligustrósido aglicona y la AA determinada por los cuatro ensayos. La aplicación de la quimioluminiscencia fue propuesta de forma preliminar para la evaluación de la AA total, del aceite de sin transformar, en una serie de aceites de oliva virgen extra (Christodouleas et al. 2009) y finalmente se ha propuesto como efectiva esta técnica tras ser validada por separado tanto en el extracto hidrófilo como el lipófilo (Christodouleas et al. 2011). También Pulgarín et al. (2010) mejoraron un método FIA-CL (Flow injection analysis chemiluminiscence) para la estimación de actividad antioxidante de aceites no tratados (girasol refinado, soja, maíz, oliva virgen y sésamo) simplemente diluidos en n-hexano. Se inyectaron en soluciones acuosas, creando microemulsiones que producían un significativo aumento en la emisión de luz. En las condiciones utilizadas, los valores EC50 de los aceites de maíz, girasol, oliva, soja y sésamo fueron comparables con los obtenidos por el método DPPH. En 2010, Cecchi et al. utilizaron por primera vez la reacción de oscilación de Briggs- Rauscher para evaluar la actividad antioxidante de un alimento no soluble en agua, muestras de aceite de oliva virgen. Determinaron la AA total del aceite sin modificar, lo cual es importante porque se tienen en cuenta los efectos sinérgicos de los antioxidantes en la propia matriz. En 2015, Condelli et al. propusieron un método para estimar la actividad antioxidante del aceite de oliva virgen, expresada como EC50, a partir del parámetro químico K225, relacionado con el amargor del aceite. La capacidad predictiva del modelo fue validada al comparar la actividad antioxidante estimada con la medida de AA en un conjunto de muestras de aceite desconocidas. Los resultados indicaron que la AA del aceite de oliva virgen podría predecirse satisfactoriamente utilizando el K225 según la siguiente ecuación: AA (EC50) = -111.12 K225 +62.1 En varias ocasiones se ha demostrado que el compuesto fenólico forma dialdehídica del ácido elenólico unido a hidroxitirosol (ácido 3,4 dihidroxifeniletanol-elenólico: 3,4-DHPEA-EDA), y un isómero de oleuropeína aglicona (3,4-dihidroxifeniletanol: 3,4-DHPEA-EA) son los principales responsables de la actividad antioxidante del aceite y estos compuestos también están relacionados al sabor amargo del aceite (Del Carlo et al., 2004; Favati et al., 2013; Gambacorta et al., 2012; Loizzo et al., 2012). En la bibliografía se muestra en numerosas ocasiones una correlación lineal entre el valor EC50 (métodod DPPH) y la concentración de polifenoles (Gargouri et al., 2013; Malencic et al., 2008; Mariod et al., 2009). Sin embargo, no se ha encontrado correlación entre el los polifenoles totales y la actividad antioxidante determinada con el método -caroteno-linoleato (Mariod et al., 2009; Milella et al., 2014; Condelli et al., 2015). Esto significa que los diferentes métodos pueden dar resultados diferentes debido a los diferentes mecanismos de reacción y
25 1. Introducciión general diferentes solventes y pH involucrados. Además, las diferencias pueden ser más evidentes cuando se evalúa la actividad antioxidante de una matriz compleja, como el aceite de oliva. A la hora de determinar la AA de un alimento, tanto para preservarse a sí mismo, como para producir efectos positivos en el organismo, es indispensable utilizar varios métodos basados en diferentes principios mecánicos en función del mecanismo antioxidante que se pretende evaluar, algunos serán más efectivos a la hora de reducir los iones férricos, otros serán más activos para atrapar radicales tipo ABTS, u otros para atrapar radicales peroxilo.
1.3. ESTUDIOS DE ESTABILIDAD OXIDATIVA Y DETERMINACIÓN DE LA VIDA ÚTIL DEL ACEITE DE OLIVA
Estabilidad mediante métodos acelerados de oxidación La estabilidad oxidativa (OS) del aceite de oliva en condiciones normales puede ser de hasta más de 18 meses, por lo tanto, generalmente se emplean métodos acelerados de oxidación para determinar el período de inducción en un período de tiempo relativamente corto (Frankel, 2014). En los métodos acelerados más comúnmente empleados se utilizan altas temperaturas y/o flujos de aire. En este tipo de ensayos se determina el tiempo para alcanzar un punto de inflexión en la velocidad de oxidación (periodo de inducción, IP), que establece el límite entre las fases de oxidación primaria y las fases de oxidación secundaria. El IP se determina utilizando distintos criterios en función del método empleado y de las determinaciones analíticas realizadas. Los métodos más conocidos y comúnmente usados, como son el método Rancimat (Di Lecce et al., 2009; Esquivel et al., 2009; Mateos et al., 2006; Platero-López & García-Mesa, 2007), AOM (active oxygen method) (Laubli et al., 1986; Gutiérrez, 1989; Kaya et al., 1993) y OSI (oxidative stability index) (Carrasco-Pancorbo et al., 2007; Ceci & Carelli, 2010; Cercaci et al., 2007; Gómez-Caravaca et al., 2007; Márquez-Ruiz et al., 2008) emplean temperaturas alrededor de los 100-120 ºC y flujos de aire de entre 10 y 20 L/h (Baldioli et al., 1996; Aparicio et al., 1999; Koski et al., 2002; Mateos et al., 2003, 2005; Abaza et al., 2005). El punto final de la oxidación, llamado periodo de inducción (IP) se alcanza cuando se produce un cambio brusco en la velocidad de aumento de la conductividad eléctrica, causada por el incremento de los compuestos volátiles producidos en las fases más avanzadas de la oxidación. En el caso del AOM, el cambio en la velocidad de aumento del índice de peróxidos es considerado como punto final del ensayo. Los métodos anteriores se utilizan con éxito para evaluar la estabilidad durante la fritura, porque es el único proceso en el que el aceite se somete a calentamiento continuamente durante mucho tiempo o en el que el aceite se calienta de forma discontinua, pero no han dado buen resultado con la estabilidad oxidativa o vida útil a temperatura ambiente (Kaya et al., 1993; Velasco et al., 2002; Frankel, 2014). La elevada temperatura y la concentración de oxígeno diluido en la matriz lipídica influyen en los cambios en las energías de activación y el mecanismo de las reacciones de oxidación. La velocidad de oxidación lipídica es independiente de la presión
26 1. Introducciión general parcial de O2 a temperatura ambiente, pero no lo es a elevadas temperaturas debido a que la disminución de la solubilidad del O2 causa que la concentración de O2 llegue a ser un factor limitante en el aumento del grado de oxidación. Las reacciones de polimerización y ciclación de los ácidos grasos poliinsaturados, que ocurren principalmente a temperaturas elevadas no son significativas a temperature ambiente (Frankel, 2010). De ahí que se hayan desarrollado también estudios de estabilidad acelerados a diversas temperaturas por debajo de 85 ºC, aunque lo aconsejable es como máximo a 60 ºC (Frankel, 1993). En estos ensayos acelerados se miden diferentes parámetros indicadores del grado de oxidación (índice de peróxidos, K232, K270, índice de p-anisidina, ácidos grasos libres, volátiles de oxidación, compuestos polares, etc) o la evolución de los compuestos iniciales del aceite de oliva (triglicéridos, tocoferoles, compuestos fenólicos, pigmentos, índice de amargor, etc). La relación con la oxidación de estos parámetros indicadores, así como la forma de cuantificarlos, están descritas en el capítulo 2 “Metodología”. Las técnicas analíticas más convencionales, a modo de resumen, se reflejan en la Tabla 1.5.
Tabla 1.5. Algunos métodos utilizados para determinar la estabilidad oxidativa (elaboración propia a partir de Alonso-Salces et al., 2011)
Técnica analítica Referencias Carrasco-Pancorbo et al., 2007; Di Lecce et al., 2009; Índice de peróxidos (PV) Márquez-Ruiz et al., 2008 Dienos conjugados Deiana et al., 2002 Trienos conjugados Hrncirik & Fritsche, 2005 Índices de absorción en el UV K232 y Antolin et al., 2000; Cañizares-Macías et al. 2004; K270 Márquez-Ruiz et al., 2008; Platero-López et al., 2007 Coni et al. 2004; García Mesa et al. 1993; Gennaro et Análisis termogravimétricos al. 1998; Santos et al. 2002
Análisis de calorimetría diferencial de Vecchio et al., 2009 barrido (DSC) Cromatografía en columna y 13C NMR Hidalgo et al., 2002 Cromatografía líquida de alta resolución Baccouri et al., 2008; Gallina-Toschi et al., 2005; (HPLC) Tena et al., 2009 HPLC con espectrometría UV o Carrasco-Pancorbo et al.,2007 espectrometría de masas Carrasco-Pancorbo et al., 2007; Gallina-Toschi et al., Electroforesis capilar 2005 Cromatografía de gases (GC) Gallina-Toschi et al., 2005; Henna et al., 2009 Método asistido por ultrasonido Platero-López et al., 2007 Método asistido por microondas Cañizares-Macías et al., 2004 Resonancia paramagnética de electrones Papadimitriou et al., 2006
27 1. Introducciión general
Estabilidad oxidativa en condiciones reales de almacenamiento La estabilidad oxidativa del aceite de oliva a temperatura ambiente es de gran interés para conocer su vida útil. Debido a que el VOO es relativamente estable a la oxidación por su composición química particular (una proporción baja de ácidos grasos poliinsaturados y una cantidad significativa de componentes con propiedades antioxidantes), tradicionalmente ha habido poco control de su estabilidad en condiciones normales de almacenamiento. El método ideal para medir los cambios en el VOO durante el almacenamiento sería una prueba en la que el aceite se almacene en condiciones realistas y los cambios se evalúen periódicamente a lo largo del tiempo. La mayoría de los métodos antes mencionados aplicados a condiciones reales de almacenamiento requieren mucho tiempo de ensayo y acaban resultando caros. Por ello, en los últimos años los métodos clásicos para determinar la estabilidad oxidativa se han ido complementando y comparando con técnicas instrumentales novedosas que presentan ventajas: son no selectivas, requieren muy poco o ningún pretratamiento de la muestra, usan pequeñas cantidades de reactivos o solventes orgánicos, los análisis suelen tardar pocos minutos por cada muestra, y tienen alta reproducibilidad y repetitividad. Se han desarrollado las técnicas analíticas de huella digital (fingerprintings techniques) para su aplicación en el seguimiento de la oxidación y posterior predicción o estimación de la estabilidad oxidativa en distintas condiciones. Estas técnicas analíticas de huella digital son la resonancia magnética nuclear (NMR) (Guillen & Ruiz, 2001, 2006), la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Guillen & Cabo, 2000; Henna et al., 2009), la espectroscopía de fluorescencia (Guimet et al., 2005; Tena et al., 2009), análisis de la huella genética (DNA fingerprinting) (Spaniolas et al., 2008), la nariz electrónica (Lerma-García et al., 2009), y el Oxitest (Kamvissis et al., 2008; Mora et al., 2009). Por ejemplo, en un estudio de Alonso-Salces et al. (2011), usaron la espectroscopía 1H-NMR para evaluar la estabilidad oxidativa de varios aceites de oliva conservados a temperature ambiente protegidos de la luz durante más de 3 años. Los espectros se tomaron periódicamente durante todo el tiempo de ensayo, se estudió su evolución y se analizaron mediante componentes principales (PCA). En este caso, bajo dichas condiciones de almacenamiento ideal, ninguna de las señales presentes en los espectros originales a tiempo cero desaparecieron o experimentaron disminuciones o aumentos significativos durante el periodo de estudio. Solo pequeños cambios o la aparición de algunas señales de baja intensidad indicaron cierta degradación hidrolítica y oxidativa después de un año. Otro ejemplo es el uso de modelos multivariantes del infrarrojo visible y cercano (vis/NIRS), en modo de transmitancia, que se han utilizado para estimar la estabilidad oxidativa del VOO. También se han desarrollado modelos predictivos para la determinación de ácidos grasos libres (FFA), índice de peróxidos (PV) y dienos conjugados (K232), parámetros que son importantes indicadores del deterioro de la calidad de los aceites de oliva (Cayuela-Sánchez et al., 2013). El dispositivo potenciométrico multisensor lengua electrónica (E-tongue) junto con el análisis discriminante lineal acoplado al algoritmo simulado de selección de variables (LDA-SA),
28 1. Introducciión general mostró un potencial satisfactorio para clasificar aceites de oliva virgen almacenados en diferentes condiciones de luz/oscuridad y tiempo. De hecho, se demostró que el dispositivo podría monitorizar con éxito el tiempo de almacenamiento de los aceites de oliva en botellas de vidrio y, por lo tanto, podría usarse para evaluar su frescura en las condiciones habituales de exposición a la luz comercial (ya sea en la oscuridad o expuesta a la luz natural/ artificial) durante el primer año de almacenamiento. El funcionamiento altamente satisfactorio del procedimiento propuesto se demostró también utilizando datos externos con fines de validación, concluyendo que es bastante superior en comparación con el uso de datos fisicoquímicos o sensoriales (Rodrigues et al., 2017).
Predicción o estimación de la vida útil Específicamente, la vida útil del aceite de oliva virgen extra podría definirse como el período de tiempo en condiciones normales de almacenamiento dentro del cual los parámetros de calidad están dentro de los límites aceptados para esta categoría comercial y no se desarrollan sabores extraños o defectos (Guillaume et al., 2016). Un estudio de vida útil se puede dividir en tres pasos fundamentales. El primer paso implica la identificación del evento químico, físico o biológico más crítico que conduce al agotamiento de la calidad del producto, seguido de la definición del límite de aceptabilidad relevante. En el siguiente paso, los cambios de los indicadores de calidad seleccionados se monitorizan en función del tiempo en las condiciones de almacenamiento que imitan las previsibles (pruebas de vida útil en tiempo real) o en condiciones ambientales capaces de acelerar el deterioro (prueba acelerada de vida útil — ASLT). Por último, los datos deben ajustarse a un modelo matemático para obtener una estimación o predicción de la vida útil, (Calligaris et al., 2015). Entre todos los factores ambientales potencialmente aplicables para acelerar reacciones oxidativas, la temperatura es sin duda el más utilizado. Esto no solo se debe al hecho de que la temperatura es uno de los factores más críticos que afectan la cinética de reacción de los alimentos, sino también a la disponibilidad de una relación matemática entre la temperatura y la velocidad de reacción, que es la conocida ecuación de Arrhenius: k = A ∙exp(- Ea/ RT) donde k es la constante de velocidad de reacción; R es la constante universal de los gases (8,31 J K-1 mol -1), T es la temperatura absoluta (K, grados Kelvin); Ea es la energía de activación aparente (J mol-1) y A es el llamado factor preexponencial (o factor de frecuencia). Se ha demostrado que esta ecuación es válida empíricamente para estimar la velocidad de una amplia gama de cambios químicos, físicos y sensoriales complejos que ocurren en los alimentos (Labuza et al., 1985). Se ha explicado anteriormente que es necesario proteger al aceite contra su principal causa de deterioro, la oxidación de los lípidos, que puede tener muchos efectos deletéreos sobre su calidad. Según el Reglamento de la Unión Europea (EC) 2568/91, así como la norma comercial del Consejo Oleícola Internacional (COI, 2019g), el aceite extraído de las aceitunas por métodos
29 1. Introducciión general mecánicos debe cumplir con una serie de índices de calidad para ser clasificado en la categoría de virgen extra. De hecho, el cumplimiento de estos parámetros debe garantizarse durante toda la vida útil del producto para evitar el riesgo de degradación del producto a la categoría de aceite virgen o inferiores. En la Tabla 1.6. se resumen los parámetros de calidad y sus límites legales. Tabla 1.6. Características cualitativas y límites legales de referencia para la calidad virgen extra Parámetros de de calidad Límites establecidos por EC nº 2568/91 y COI Índice de peróxidos (PV) (meqO2/kg) ≤ 20.0 K232 2.50 K270 0.22 Ésteres etílicos de los ácidos grasos (FAEEs) ≤ 30 (campañas posteriores a 2016) Acidez (%) ≤ 0,8 Ceras (mg/kg) C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9 si el % total de C16:0 es ≤ 14 % Monopalmitato de 2-glicerilo (%) ≤ 1,0 si el % total de C16:0 es > 14 % Estigmastadienos (mg/kg) (1) ≤ 0,05 Ácidos grasos mayoritarios (%) Ácido palmítico C16:0 7.50–20.00 Ácido esteárico C18:0 0.50–5.00 Ácido oleico C18:1 ∆9cis 55.00–83.00 (suma de ambos) Ácido oleico C18:1 ∆11cis Ácido linoleico C18:2 ∆9cis,12cis 2.50–21.00 Ácido linolénico C18:3 ∆9cis,12cis,15cis 1.00
En la devaluación de calidad del aceite de oliva virgen extra debida a la oxidación está incluida la formación de características sensoriales desagradables, la reducción drástica del bouquet y las notas gustativas, así como la reducción de los antioxidantes naturales. La concentración y el umbral de olor de los compuestos volátiles son cruciales. Varios investigadores (Solinas et al., 1987; Angerosa, 2000, 2002; Kotsiou et al., 2015) han informado que, durante la oxidación, la reducción drástica de los aldehídos, alcoholes y ésteres C6 de la vía lipo-oxigenasa y el aumento de los aldehídos saturados e insaturados (C5-C11) producto de la oxidación química, incluido el hexanal, reducen la percepción de los atributos positivos y las notas sensoriales agradables, lo que conlleva a la aparición de aromas y sabores desagradables en el VOO reconocidos en su conjunto como el defecto rancio. Además, los compuestos fenólicos, particularmente los secoiridoideos, disminuyen durante el almacenamiento del EVOO, lo que conlleva una disminución del amargor y la intensidad picante, atributos positivos que son característicos de un aceite de oliva fresco y que están directamente relacionados con el contenido de fenoles en el aceite. La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) declaró la admisibilidad de la siguiente declaración de propiedades saludables para el EVOO “el consumo de aceite de oliva rico en polifenoles (hidroxitirosol, 5 mg/día) contribuye a la protección del daño oxidativo de los lípidos en sangre”. Su uso conlleva dos condiciones: primero, el aceite de oliva debe contener al menos 5 mg de hidroxitirosol y sus derivados en 20 g, y en segundo lugar, la declaración debe ir
30 1. Introducciión general acompañada de una indicación de que se pueden obtener beneficios para la salud consumiendo 20 g de aceite al día (European Regulation (EC) No. 432/2012). Si esta declaración de propiedades saludables se hace de forma voluntaria en el etiquetado, la conservación de esta característica composicional es un factor más a tener en cuenta para la determinación de la vida útil del aceite de oliva. Con todo esto se pretende hacer énfasis en que son muchos los aspectos a tener en cuenta en la calidad percibida por el consumidor, además de la variabilidad de las características iniciales que pueden tener diferentes aceites de la misma calidad, lo que complica considerablemente el desarrollo de un método predictivo de la vida útil de este producto. A pesar de los numerosos estudios sobre la oxidación de los EVOO en la literatura, hasta el momento de inicio de esta Tesis Doctoral, han sido pocos los que han proporcionado modelos valiosos para la predicción de la vida útil de los EVOO envasados. En el 2000, Pagliarini et al., siguieron los cambios producidos durante el almacenamiento y distribución de 36 muestras de VOO monitorizando 21 parámetros diferentes y mediante análisis sensorial. Mediante análisis lineal multivariante, los parámetros más significativos fueron K232, Rancimat IP, clorofilas, carotenos, -tocoferol, hidroxitirosol y tirosol. El único legislado con un límite para la categoría virgen extra fue el K232, por lo que establecieron 3 modelos predictivos del tiempo para alcanzar el límite de 2.10, el primero a partir del IP, el segundo con la concentración de hidroxitirosol y el tercero con la de tirosol. Sin embargo, estos modelos solo tendrían aplicabilidad cuando el aceite es conservado en condiciones ideales, sin que se produzcan cambios apreciables debidos a la oxidación. Gutiérrez y Fernández (2002) siguieron los límites de calidad establecidos en el Reglamento EC 2568/91 durante la oxidación de dos aceites de dos variedades a 2 y 30 ºC, en oscuridad y bajo la luz, así como la evolución de la OS, esteroles, perfil de ácidos grasos, pigmentos, polifenoles y -tocoferol. El único índice que aumentó de forma significativa que el K270 bajo condiciones de iluminación, y se estableció una excelente correlación entre la OS inicial y el tiempo en alcanzar el límite de K270 = 2.5. El tiempo de ensayo fue de solo 6 meses, muy inferior al que habitualmente se establece como vida útil del EVOO. Zanoni et al. (2005) divulgaron por primera vez un modelo fenomenológico para predecir la estabilidad del VOO basado en índices de composición inicial combinados. Estableció un modelo matemático para predecir la degradación del EVOO en función de la combinación del valor inicial de acidez, contenido de ácido oleico y sabor amargo. La actividad antioxidante y el contenido de compuestos polares minoritarios mostraron un impacto insignificante en la degradación del EVOO en este estudio y fueron excluidos del modelo propuesto. En este sentido, una limitación importante de este modelo es que se basó en índices constantes sin tener en cuenta los cambios de composición en condiciones de almacenamiento. En los estudios de Coutelieris et al. (2006) y Kanavouras et al. (2006a), se determinó experimentalmente la identidad y cantidad de hexanal producido por la oxidación del aceite de oliva virgen extra almacenado en luz y oscuridad, a diferentes temperaturas y en diferentes materiales de envasado. Estableciendo el límite de detección sensorial del hexanal y el tiempo en alcanzar o no alcanzar ese límite, definieron el parámetro Psafe como la probabilidad de alcanzar el final de la vida útil durante un tiempo determinado en unas condiciones
31 1. Introducciión general determinadas de conservación. Introdujeron un modelo matemático predictivo para describir el transporte masivo (de oxígeno y hexanal) desde y hacia la fase oleosa a través de varios materiales de envasado, también a varias temperaturas (5-40 ºC) y condiciones de luz/oscuridad. Se demostró que el modelo propuesto, respaldado matemáticamente, es muy apropiado y satisfactorio para explicar la potencial evolución químico-física de la oxidación del aceite de oliva. Aparicio-Ruiz et al. (2012) utilizaron un modelo matemático predictivo (Know-How, modelo de utilidad, MIT_TO-0022272) para estimar el porcentaje de pirofeofitinas (PPP) en los EVOO almacenados a 10 y 16 ºC, en la oscuridad y con falta de oxígeno. Este modelo predictivo puede usarse para estimar la tendencia de los porcentajes de pirofeofina a en un marco de tiempo-temperatura dado y, por tanto, estimar cuándo el aceite perderá su frescura pero solo en base a este parámetro, no teniendo en cuenta por ejemplo los límites de los parámetros de calidad legislados, y no considerando tampoco el efecto que la luz podría tener sobre las clorofilas. En 2013, Farhoosh et al., trataron de correlacionar los valores OSI a 100 y 130ºC con los parámetros de oxidación obtenidos durante el almacenamiento a 50 ºC, con el fin de establecer un método acelerado de predicción de vida útil. El periodo de inducción (cambio en la velocidad) del índice de peróxidos (IPPV) y de los dienos conjugados (IPCD) se consideraron como los parámetros más adecuados para medir la OS a 50 ºC. Consiguieron una ecuación empírica para relacionar la estabilidad a 50 ºC con el OSI, de manera que podría determinarse con este único test acelerado. A partir de ahí, con un valor de Q10 = 2.1, estimaron la vida útil a 25 ºC. La limitación a este método es que solo se usaron dos muestras para establecer la ecuación empírica. Guillaume y col. (2016) utilizaron cuatro parámetros de calidad, tiempo de inducción, diacilgliceroles (DAG), factor de ácido graso libre (factor FFA) y porcentaje de PPP, para identificar una fecha de caducidad óptima (BBD, best before date) utilizando el valor más bajo obtenido de tres ecuaciones, relacionadas con el tiempo de inducción, DAG y FFA, respectivamente. Se demostró que los DAG y las PPP son predecibles y cambian linealmente con el tiempo, mientras que FFA proporciona un valor para la calidad inicial del aceite y no cambia significativamente en condiciones de almacenamiento adecuadas. Este modelo es preciso para EVOO envasado y almacenado en condiciones ideales. Ya se han mencionado los trabajos de Rodrigues et al. (2017) y Cayuela et al. (2013) para estimar la estabilidad del VOO mediante la lengua electrónica y mediante el espectro en el IR visible y cercano. El enfoque quimiométrico de la combinación de la medición mediante la lengua electrónica, la medición de parámetros físico-químicos mediante espectroscopía, y el análisis estadístico integral podría determinar con éxito la frescura de las muestras de EVOO durante las condiciones normales de almacenamiento comercial (almacenadas en la oscuridad o expuestas a la luz) y proporcionar una predicción precisa de la vida útil. No obstante, es importante y necesario contar con al menos ocho panelistas capacitados para proporcionar datos sensoriales, ya que la falta de datos sensoriales podría influir significativamente en los resultados del análisis estadístico.
32 1. Introducciión general
Conte et al. (2020) propusieron un ASLT a temperaturas entre 25 y 60 ºC, utilizando aceites de oliva envasados con reducido espacio de cabeza (baja disponibilidad de oxígeno). Su conclusión fue que ni los productos de oxidación primaria ni el contenido de antioxidantes pueden considerarse buenos indicadores de vida útil. Según su estudio y teniendo en cuenta la normativa de la UE, el mejor índice que permite predecir la vida útil del EVOO resultó ser el K270 (valor límite 0.22). Expuso también la utilización del porcentaje de pirofeofitina a (%PPa, valor límite 17%) como indicador de frescura. Los cambios de la pirofeofitina a fueron mucho más sensibles a los cambios de temperatura que los índices de oxidación secundarios. Esto significa que utilizando alguno de estos índices y conociendo su dependencia con la temperatura, sería posible realizar una prueba acelerada a 60 º C para estimar la vida útil del EVOO a temperatura ambiente. Durante los últimos años se han utilizado también herramientas matemáticas como la red neuronal artificial (ANN). Es un algoritmo matemático con la capacidad de relacionar los parámetros de entrada y salida, mejorando a través de la iteración sin requerir un conocimiento previo de las relaciones entre las variables del proceso (Cevoli et al., 2011). Hoy en día, existe un interés creciente en la aplicación de las redes neuronales como algoritmos de resolución de problemas para realizar mapeo, regresión, modelado, agrupamiento, clasificación y análisis de datos multivariados. La flexibilidad de la red neuronal permite tratar con problemas altamente no lineales y con cualquier tipo de datos. Las redes neuronales artificiales también se han aplicado en el control de calidad de muchos productos alimenticios con aceite de oliva (Cajka et al., 2010; Torrecilla et al., 2013). Por ejemplo, el trabajo de Silva et al. (2015) tenía como objetivo evaluar la influencia del material de envasado (latas de hojalata, botellas de PET transparentes y de color ámbar) y las condiciones de exposición a la luz (bajo la luz y en la oscuridad) sobre la estabilidad de las características fisicoquímicas del aceite de oliva virgen extra utilizando redes neuronales artificiales como técnica discriminativa y de clasificación. El análisis de sensibilidad mostró que el índice de peróxidos, el contenido de ácidos grasos libres, los parámetros de color L/ C/h/, el contenido de tocoferol y de clorofila fueron los atributos fisicoquímicos con mayor poder discriminativo. También mostró la ``robustez'' del modelo que indica qué análisis fisicoquímicos podrían usarse para resolver problemas de agrupamiento, reconocimiento de patrones, clasificación y adulteración relacionados con la producción de aceite de oliva virgen extra. Las investigaciones de Kanavouras y Coutelieris (2017) y sus recopilaciones bibliográficas derivaron en 2017, en una propuesta metodológica en la que, primeramente, estructuran todos los conocimientos obtenidos respecto a la oxidación del aceite de oliva en todos los entornos posibles, en una matriz de “categoría x nivel” (4 x 3). Dentro de esa matriz, cada columna o nivel representa una consideración de oxidación específica. En general, el movimiento progresivo del Nivel 1 al Nivel 3 es paralelo al incremento de la complejidad de la descripción del fenómeno. Las cuatro categorías (columnas) son los componentes del fenómeno, considerando que generalmente podrían simplificarse en materia, energía, relaciones de transformación, y productos. Todos estos conceptos holísticos que describirían el fenómeno de la oxidación lipídica en cualquier entorno deben ser contemplados para rellenar la matriz de la forma más completa posible, que será la única manera de obtener predicciones los más exactas posibles. Todas las celdas de la matriz que no puedan rellenarse con los conocimientos empíricos
33 1. Introducciión general realizados hasta un momento dado, deberían ser motivo de impulso de estudios experimentales para obtener esta información. Es fundamental, cómo no, traducir los conceptos y conocimientos a lenguaje matemático (dimensiones, sistemas, ecuaciones,…), para lo cual Kanavouras y Coutelieris (2017) establecen una serie de reglas. La transición a través de las tres columnas sigue la regla simple del incremento de dimensiones: pasando de la descripción unidimensional (columna 1) a un espacio multidimensional pero de dimensión finita (columna 2), y finalmente, a un espacio vectorial de dimensión infinita (columna 3). Asimismo, el tratamiento matemático siguió la misma tendencia: de una sola ecuación (columna 1) a un sistema de ecuaciones (columna 2), mientras que el Nivel 3 requiere diferentes manipulaciones matemáticas específicas (procedimiento asintótico, integraciones generalizadas, etc.) para satisfacer las transiciones. Con la aplicación de esta metodología, que puede ser alimentada por toda la comunidad científica, se pretende con bastante confianza poder alcanzar un grado de predicción de la estabilidad o vida útil del aceite de oliva a partir de ecuaciones matemáticas.
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22.. MMeettooddoollooggííaa
2. Metodologíía
2.1. MUESTRAS DE ACEITE DE OLIVA
Las siete muestras de aceite de oliva virgen utilizadas para realizar prácticamente todos los ensayos de almacenamiento pueden clasificarse en dos grupos según el modo en el que fueron obtenidas: - Muestras I y II elaboradas mediante el sistema de extracción Abencor a partir de aceitunas sanas de la variedad Cornicabra cultivadas en olivares de las provincias de Ciudad Real y Toledo y recogidas mediante la técnica del ordeño - Muestras III - VII elaboradas, mediante el empleo de sistemas industriales, en almazaras de las provincias de Ciudad Real y Toledo a partir de aceitunas de la variedad Cornicabra Dado el objeto de los ensayos planteados, las muestras de aceite de oliva y el sistema de extracción se seleccionaron para que éstas presentasen deferencias en su composición inicial, principalmente en tocoferoles y compuestos fenólicos. Esta composición se describe en la Tabla 2.1. Como era de esperar, existen diferencias estadísticamente significativas entre las muestras en los contenidos de antioxidantes, con concentraciones iniciales que variaron de 0.33 a 0.55 mmol/kg para el -tocoferol y de 1.08 a 3.88 mmol/kg para los fenoles totales. En consecuencia, la estabilidad oxidativa determinada mediante el método Rancimat, también difiere considerablemente entre las muestras, ya que aquellas con mayores concentraciones de compuestos fenólicos, especialmente o-difenoles, presentan una mayor estabilidad oxidativa. Todas las muestras cumplían los requisitos de la Unión Europea para la categoría virgen extra en cuanto a los valores de acidez libre, índice de peróxidos, K232 y K270, con la excepción de la muestra VII cuyo valor de acidez libre (0,84%) es ligeramente superior al límite establecido de 0,80% (EC 1989/2003). Los índices que se refieren a productos de oxidación primarios o secundarios están muy por debajo de los valores límite superiores legales para aceite de oliva virgen extra (PV <20 meq/kg; K232 <2.50 y K270 <0.22), lo que indica un estado de oxidación inicial bajo, como se deseaba. Las matrices lipídicas son muy similares porque todas las muestras provenían de aceitunas de una sola variedad cultivadas en la misma área (cultivar Cornicabra en Castilla-La Mancha). La composición de ácidos grasos, con un alto porcentaje de ácido oleico y bajos contenidos de ácido linoleico y linolénico, es la característica de la variedad Cornicabra (Aranda et al., 2004). Sin embargo, hay algunas diferencias estadísticamente significativas en los contenidos de ácidos grasos insaturados de las muestras, especialmente en el ácido linoleico (C18: 2). Los contenidos de clorofila y pigmentos carotenoides varían en un amplio rango, probablemente porque las aceitunas se encontraban en diferentes etapas de madurez. Todas las muestras, una vez recogidas en el laboratorio, fueron previamente filtradas con sulfato sódico anhidro y se almacenaron en botellas de vidrio color topacio, perfectamente tapadas y sin espacio de cabeza, en una nevera a 8 ºC hasta el inicio del ensayo.
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2. Metodologíía
Table 2.1. Composición inicial e índices de calidad de las muestras de aceite de oliva virgen
Muestras de aceite de oliva virgen I II III IV V VI VII POO Acidez libre (%) 0.41 ± 0.02d 0.21 ± 0.01b 0.14 ± 0.01a 0.20 ± 0.01b 0.50 ± 0.01e 0.34 ± 0.01c 0.84 ± 0.01f ND PV (meq O2/kg) 5.47 ± 0.04d 5.49 ± 0.17d 3.06 ± 0.07b 3.68 ± 0.10c 2.87 ± 0.05a 6.52 ± 0.14f 5.80 ± 0.08e 0.00 ± 0.01 K232 1.93 ± 0.05d 1.87 ± 0.06d 1.73 ± 0.02c 1.61 ± 0.01a,b 1.56 ± 0.01a 1.67 ± 0.04b,c 1.72 ± 0.01c 0.91 ± 0.01 K270 0.16 ± 0.01d 0.16 ± 0.01d 0.13 ± 0.01b,c 0.12 ± 0.01b 0.10 ± 0.01a 0.12 ± 0.01b 0.14 ± 0.01c 0.02 ± 0.01 Índice anisidina 25.3 ± 0.93f 23.2 ± 0.96e 20.6 ± 0.51d 11.6 ± 0.01c 9.29 ± 0.26a,b 9.42 ± 0.07b 8.06 ± 0.12a 0.09 ± 0.01 C18:1 (%) 79.0 ± 0.04a 81.5 ± 0.01g 81.0 ± 0.01f 79.4 ± 0.03b 80.9 ± 0.01e 80.1 ± 0.01c 80.8 ± 0.01d 80.2 ± 0.02 C18:2 (%) 5.09 ± 0.01d 3.61 ± 0.01a 3.87 ± 0.01b 5.29 ± 0.01e 5.32 ± 0.01f 4.94 ± 0.01c 5.31 ± 0.01e,f 4.80 ± 0.01 C18:3 (%) 0.71 ± 0.01e 0.59 ± 0.01c 0.65 ± 0.01d 0.58 ± 0.01b 0.58 ± 0.01b 0.54 ± 0.01a 0.57 ± 0.01b 0.50 ± 0.01 ClorofilasA 11.4 ± 0.12e 43.0 ± 0.12g 19.6 ± 0.05f 3.83 ± 0.09c 2.20 ± 0.06a 6.79 ± 0.20d 2.58 ± 0.02b NA CarotenoidesA 6.32 ± 0.02e 15.3 ± 0.01g 12.9 ± 0.01f 4.12 ± 0.01c 2.71 ± 0.01a 4.49 ± 0.02d 3.09 ± 0.02b NA o-DifenolesB 2.05 ± 0.01b 2.16 ± 0.31b 2.46 ± 0.13b 0.70 ± 0.05a 0.71 ± 0.03a 0.58 ± 0.02a 0.51 ± 0.01a NA Fenoles totalesB* 3.70 ± 0.15c 3.88 ± 0.26c 3.88 ± 0.22c 1.41 ± 0.07b 1.38 ± 0.03b 1.35 ± 0.05b 1.08 ± 0.03a NA o-difenoles/ Fenoles totales* 0.55 0.03d 0.56 0.11d 0.63 0.06e 0.51 0.07c 0.51 0.03c 0.43 0.03a 0.47 0.02b NA Secoiridoideos de Htyr/ Htyr libre 11.53 0.11d 21.14 0.12e 12.23 0.10d 31.00 0.18f 10.46 0.12c 1.21 0.03a 5.95 0.08b NA
Fenoles complejos/ Fenoles 11.99 0.11 c 18.43 0.13d 11.55 0.15c 25.30 0.19e 11.42 0.12c 0.69 0.02a 6.02 0.09b NA simples -TocoferolB 0.55 ± 0.01e 0.44 ± 0.01c 0.53 ± 0.01e 0.38 ± 0.01b 0.45 ± 0.01d 0.33 ± 0.01a 0.36 ± 0.01b NA b a a c e d f -Tocoferol/o-difenoles 0.27 0.05 0.20 0.03 0.22 0.02 0.54 0.05 0.63 0.04 0.57 0.04 0.71 0.03 NA OS (h) 133.2 ± 2.5d 158.0 ± 0.4e 138.7 ± 7.2d 80.6 ± 0.8b,c 82.2 ± 0.8c 69.9 ± 2.5a 75.7 ± 1.1b 4.0 ± 0.1 PV, índice de peróxidos (peroxide value); OS, estabilidad oxidativa (oxidative stability); POO: aceite de oliva purificado (purified olive oil), ND: no determinado; NA: no aplica Valores medios con letras diferentes en la misma línea son estadísticamente diferentes (p < 0.05). A Expresado como mg/kg. B Expresado como mmol/kg, * Suma de hidroxitirosol, tirosol y sus derivados secoiridoideos
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2. Metodologíía
El método de extracción utilizando el sistema Abencor reproduce a escala de laboratorio el procedimiento industrial habitual siguiendo las fases de molienda, batido, centrifugación y decantación (Martínez et al., 1975). El equipo consta de tres elementos que son un molino de martillos, una termobatidora y una centrífuga de pastas, además de una serie de elementos auxiliares. El molino de martillos está construido de acero inoxidable y gira a una velocidad de 3000 rpm. La termobatidora consta de un baño de agua en su parte inferior, cuya temperatura está regulada mediante un termostato, y en la parte superior un sistema de paletas de acero inoxidable que gira a 50 rpm. y que permite el batido simultáneo de hasta ocho muestras de pasta de aceituna. La centrífuga de pastas es de tipo “cesta”, está construida de acero inoxidable y gira a 3500 rpm. Los elementos auxiliares de los que consta el equipo son una balanza para pesar la pasta de aceituna, un cronómetro para controlar el tiempo de batido de la pasta y probetas graduadas de 500 ml para la decantación del aceite. El procedimiento experimental que se utiliza para la obtención del aceite de oliva virgen mediante este sistema consiste en molturar las aceitunas, una vez limpias, lavadas y secas, en el molino de martillos, homogeneizar la pasta obtenida y proceder al batido de la misma en cazos de acero inoxidable, en cada uno de los cuales se ponen 700 g de pasta, durante 20 minutos a 30 ºC. A continuación, se añaden 100 ml de agua caliente y se continúa batiendo 10 minutos más. En el caso de pastas difíciles se puede añadir microtalco natural (MTN) en una cantidad adecuada (1,5-2 %) para romper la emulsión que pudiera formarse. Terminado el batido, se somete la pasta a centrifugación y se recoge el mosto oleoso en una probeta graduada. Con el fin de recuperar la máxima cantidad de aceite del retenido en la pasta, se añade una pequeña cantidad de agua y se centrifuga de nuevo, recogiendo el líquido separado en una probeta. Una vez separado de las aguas de vegetación el aceite se lleva a un recipiente adecuado y se filtra sobre sulfato sódico anhidro a través de papel “jarabe”. El aceite filtrado se recoge en una botella de vidrio de color topacio y se almacena sin espacio de cabeza en nevera a 4 ºC hasta el momento de su utilización. También se utilizó una muestra de aceite de oliva purificado (POO), libre de antioxidantes, pro-oxidantes y metales, como muestra control y como matriz lipídica para adicionar antioxidantes. Para elaborar este POO, se utilizó la cromatografía de absorción en columna (Khan et al., 1999) utilizando el método de Yanishlieva et al. (1995). Se llenó una columna de vidrio (40 cm x 2.5 cm d.i) con 70 gramos de alúmina (tipo 507c, neutra, Fluka, Buchs, Suiza), previamente activada durante 4 horas a 180 ºC, y se suspendió en n-hexano. Se diluyeron 100 gramos de aceite de oliva virgen convencional de la variedad Cornicabra en 1000 mL de n- hexano destilado y se pasó esta dilución a través de la columna de alúmina. Tanto la columna como el matraz colector estuvieron protegidos de la luz en todo momento para prevenir la oxidación inducida por la luz. Finalmente, el n-hexano se separó del aceite mediante destilación a vacío con una corriente de nitrógeno. Las características composicionales de este aceite de oliva purificado (POO) se detallan en la Tabla 2.1.
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2. Metodologíía
2.2. ENSAYOS DE ESTABILIDAD
CON ACEITE DE OLIVA VIRGEN
Almacenamiento en estufa a temperatura controlada. De cada una de las siete muestras de aceite de oliva se dispusieron alícuotas de 40 ml en botellas de vidrio color topacio de 125 ml de capacidad (d.i. = 4,2 cm, superficie expuesta al aire 13.85 cm2). De cada alícuota se dispusieron dos duplicados, “a” y “b”, para reducir la posibilidad de error debido al envase. Estas botellas se almacenaron abiertas y en oscuridad en una cámara climática a 25 0,1 ºC. A intervalos de tiempo previamente establecidos se tomaron una botella “a” y una “b” de cada aceite y se realizaron los correspondientes análisis, todos por duplicado. El mismo procedimiento se realizó a temperaturas de 40 ºC, 50 ºC y 60 ºC. Los tiempos de almacenamiento fueron 93 semanas a 25 ºC, 41 semanas a 40 ºC, 34 semanas a 50 ºC, y 19 semanas a 60 ºC. En la siguiente imagen se esquematiza el procedimiento de almacenamiento en cámaras a distintas temperaturas:
Oxidación acelerada en el equipo Rancimat. En primer lugar, se determinó la estabilidad oxidativa Rancimat a 100 ºC (10 L/h de flujo de aire) de cada una de las siete muestras de aceite de oliva virgen (VOO), así como de una muestra de aceite de oliva purificado (POO), calculando el periodo de inducción (en horas) de cada muestra. Después, 14 g de cada VOO (por duplicado) y 21 g del POO se distribuyeron en 4 y 6 tubos de vidrio, respectivamente (3.5 g/tubo), y se sometieron a oxidación en las condiciones mencionadas durante periodos de tiempo
40
2. Metodologíía correspondientes en cada caso al 20, 40, 60, 80 y 100% del periodo de inducción obtenido al inicio. Tras este tiempo las muestras se guardaron en frascos cerrados en refrigeración para su análisis inmediato. Las alícuotas de aceite usadas para determinar el periodo de inducción también fueron analizadas, correspondiendo a un tiempo de oxidación equivalente al 110-120% del periodo de inducción. Antes de someterlas a oxidación, a cada muestra se añadieron 2 mL de una solución de metil heptadecanoato en heptano (10 mg/mL) como estándar interno para permitir una cuantificación absoluta de los ácidos grasos (Dobarganes et al., 1988; UNE-EN 14103).
CON ACEITE DE OLIVA PURIFICADO Y ANTIOXIDANTES AÑADIDOS Para estudiar el efecto antioxidante individual y sinérgico de diferentes compuestos presentes habitualmente en el aceite de oliva virgen, se adicionaron diferentes concentraciones de estos compuestos al POO. Se prepararon diferentes concentraciones de hidroxitirosol (H), tirosol (T), oleuropeina aglicona (mezcla de forma aldehídica y dialdehídica) (1:1; OA) y - tocoferol (-T) y se añadieron las correspondientes alícuotas en metanol (para H, T y OA) o hexano (para -T) a una cantidad determinada de POO. El disolvente se eliminó mediante una corriente de nitrógeno. Las concentraciones finales en el POO se decidieron en función de la cantidad habitual de estos compuestos en el VOO. La Tabla 2.2 muestra estos valores y las concentraciones propuestas. Tabla 2.2. Rango de concentraciones de los antioxidantes en el VOO y cantidades propuestas para su adición al POO Compuesto Mín- Máx Concentraciones propuestas para adicionar al POO (mmol/kg) H (3,4-DHPEA) 0.03 - 0.26 0.05 – 0.10 - 0.25 – 0.50 mmol/kg T (p-HPEA) 0.04 - 0.54 0.05 – 0.10 - 0.25 – 0.50 mmol/kg OA (DOA + AOA) 0.32 - 2.27 0.10 – 0.50 – 1.0 – 2.0 mmol/kg α-TOH 0.30 - 0.55 0.10 – 0.20 – 0.50 – 1.0 mmol/kg
Así, se elaboraron 36 muestras diferentes de POO conteniendo una concentración determinada de uno o dos de estos compuestos mencionados. En la Tabla 2.3. se describe la nomenclatura de las muestras y las concentraciones de antioxidantes correspondientes. Duplicados de cada una de estas 36 muestras se almacenaron en oscuridad a dos temperaturas, 25 ºC y 40 ºC, en tres condiciones diferentes de almacenamiento: (i) en botellas abiertas de vidrio color topacio (OB) (i.d.: 4.2 cm; superficie expuesta al aire: 13.85 cm2); (ii) en botellas cerradas con un 10% de espacio de cabeza (HS)
(iii) en botellas cerradas con atmósfera de N2 (N2).
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2. Metodologíía
Tabla 2.3. Nombre de las muestras y concentración de antioxidantes adicionados
Nombre Concentración Nombre Concentración de Nombre Concentración de antioxidante/s de antioxidante/s (mmol/kg) antioxidante/s (mmol/kg) (mmol/kg) POO 0 T1 1.0 de T H025 + 0.25 de H + T050 0.50 de T H005 0.05 de H OA010 0.10 de OA H025 + T1 0.25 de H + 1 de T H010 0.10 de H OA020 0.20 de OA H050 + 0.50 de H + T020 0.20 de T H025 0.25 de H OA050 0.50 de OA H050 + 0.50 de H + T050 0.50 de T H050 0.50 de H OA1 1.0 de OA H050 + T1 0.50 de H + 1 de T T005 0.05 de T H005 + 0.05 de H + 0.20 de T010 + 0.10 de T + T020 T T020 0.20 de T T010 0.10 de T H005 + 0.05 de H + 0.50 de T010 + 0.10 de T + T050 T T050 0.50 de T T025 0.25 de T H005 + T1 0.05 de H + 1 de T T025 + 0.25 de T + T020 0.20 de T T050 0.50 de T H010 + 0.10 de H + 0.20 de T025 + 0.25 de T + T020 T T050 0.50 de T T010 0.10 de T H010 + 0.10 de H + 0.50 de H010 + OA1 0.10 de H + 1 T050 T de OA T020 0.20 de T H010 + T1 0.10 de H + 1 de T H025 + 0.25 de H + OA050 0.50 de OA T050 0.50 de T H025 + 0.25 de H + 0.20 de H050 + 0.50 de H + T020 T OA050 0.50 de OA
A continuación, se esquematiza el procedimiento de almacenamiento en cámaras a distintas temperaturas:
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2. Metodologíía
A lo largo de 50 semanas de almacenamiento, se tomaron muestras periódicamente para seguir el proceso de las reacciones de oxidación.
2.3. REACTIVOS Y SÍNTESIS DE COMPUESTOS
REACTIVOS Todos los reactivos empleados como diluyentes o solventes fueron de calidad analítica de grado HPLC o grado para espectroscopía, suministrados por Merck (Darmstadt, Alemania). Otros compuestos utilizados fueron: - Tirosol (2-(4-hydroxyphenyl)ethanol), -tocoferol (from vegetable oil, Type V), - glucosidasa (from almonds, BioChemika, lyophilised, powder, P6 units/mg), ácido siríngico, heptadecanoato de metilo, DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) y Trolox (6-hydroxy- 2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), suministrados todos por Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA) - Hidroxitirosol (3,4-Dihydroxyphenyl ethanol) y Oleuropeína glucósido, suministrados por Extrasynthèse (Lyon-Nord, Genay, France)
SÍNTESIS DE OLEUROPEÍNA AGLICONA (OA) Uno de los compuestos fenólicos mayoritarios en el aceite de oliva, al que se le han atribuido propiedades antioxidantes, es la forma aglicona de la oleuropeína (OA), ó 3,4-DHPE-EA (3,4- dihydroxyphenyl ethanol- elenolic acid). Su presencia en el aceite se debe a la hidrólisis de la oleuropeína de la aceituna de forma natural por la enzima -glucosidasa. Con el fin de estudiar su efecto antioxidante, y al ser un compuesto no disponible comercialmente, fue sintetizado en el laboratorio siguiendo el método propuesto por Limiroli et al. (1995). Para ello se añade β- glucosidasa de almendra (Fluka, ref. 49290, 7.55 U/mg, 250 mg) a una solución de oleuropeína (Extrasynthèse, ref. 0204, 500 mg) (130 mg) en tampón acetato (0.05 mol/L, pH 5.2, 10 ml) hasta una concentración final de 1 mg/ml. Se incuba a 32 ºC entre 3 y 4 horas con agitación suave y constante. Posteriormente se centrifuga a 12000 g durante 10 minutos y se extrae con cloroformo:metanol (2:1) agitando durante 1 minuto. Se centrifuga de nuevo a 3500 g durante 5 minutos. La fracción orgánica se evapora bajo corriente de nitrógeno y después se disuelve en cloroformo, acetona o agua para su caracterización en NMR. 1H NMR: Señales de oleuropeína: 1.55 (10-H), 5.73 (1-H), 6.02 (8-H), 7.48 (3-H) Señales de OA: 1.86 y 1.88 ppm (dd, J 7.17 Hz) y 8.92 y 8.95 ppm (dd, J 1.76 Hz)
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2. Metodologíía
2.4. MÉTODOS ANALÍTICOS
GRADO DE ACIDEZ El grado de acidez de un aceite, o acidez libre, es el contenido en ácidos grasos libres presentes, expresados en tanto por ciento en peso de ácido oleico, el mayoritario del aceite de oliva. La determinación se realiza mediante valoración de la muestra, previamente disuelta en éter etílico-etanol 96º (1:1 v/v), con una disolución etanólica de potasa de concentración exactamente conocida (0,1 ó 0,5 N) utilizando fenolftaleína como indicador (EEC 2568/91). El grado de acidez o acidez libre del aceite de oliva se calcula a partir de la siguiente expresión: 282 V N Grado de acidez = 10 P donde V es el volumen de disolución de KOH gastado en la valoración (ml), N es la normalidad exacta de la disolución de KOH y P es el peso de la muestra de aceite (g).
ÍNDICE DE PERÓXIDOS El índice de peróxidos es el método químico más común para determinar el grado de deterioro oxidativo de las grasas y aceites. Los resultados se expresan como miliequivalentes de oxígeno activo por kilogramo de aceite que producen la oxidación del yoduro a yodo en unas condiciones determinadas (EEC 2568/91). En la reacción, que tiene lugar en medio ácido, se libera un mol de yodo por cada mol de oxígeno peroxídico. El yodo liberado se valora con una disolución de tiosulfato sódico utilizando almidón como indicador. Para llevar a cabo esta determinación, en primer lugar, se desaloja el aire del interior de un matraz Erlenmeyer de 250 ml y cuello esmerilado mediante una corriente de gas inerte (N2,
CO2 o Ar) y se tapa con un tapón de vidrio. A continuación, se pesan entre 1,2 y 2 g de aceite, en función del índice de peróxidos esperado, se añaden 10 ml de cloroformo para disolver la muestra, 15 ml de ácido acético glacial para proporcionar medio ácido y 1 ml de una disolución saturada de yoduro potásico. Se cierra el matraz, se agita durante 1 minuto, levantando al final el tapón para que salgan los vapores, y se deja reaccionar durante 5 minutos en oscuridad. Transcurrido este tiempo la reacción se detiene añadiendo 75 ml de agua destilada y agitando vigorosamente para que el yodo liberado pase a la fase acuosa. Finalmente, se ponen unas gotas de una disolución de almidón como indicador y se valora el yodo liberado con una disolución de tiosulfato sódico 0,002 N si se presupone un índice de peróxidos inferior a 12 meq/kg ó 0,01 N si es superior, agitando con fuerza hasta que el color del medio vire de violeta a blanco sucio.
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2. Metodologíía
Paralelamente se debe realizar una prueba en blanco, sin aceite, para conocer el estado de los reactivos y la limpieza del material empleado. Si en este ensayo se gastan más de 0,5 ml de disolución de tiosulfato 0,01 N puede deberse a que los reactivos estén contaminados o a que el material no esté perfectamente limpio. El índice de peróxidos (PV) del aceite se calcula a partir de la expresión:
(V - V0) $ N $ 1000 PV = P
donde V es el volumen de disolución de tiosulfato empleado en la valoración (ml), V0 es el volumen de la misma disolución utilizado en el ensayo en blanco (ml), N es la normalidad exacta de la disolución de tiosulfato sódico empleada y P es el peso de la muestra (g).
ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA (K232 y K270) La medida de absorción en el UV de una disolución de aceite en ciclohexano permite detectar su estado de deterioro oxidativo y las modificaciones inducidas por los procesos tecnológicos. Durante la autooxidación de los ácidos grasos poliinsaturados se forman hidroperóxidos que en su estructura contienen dobles enlaces conjugados los cuales absorben radiación en torno a una longitud de onda de 232 nm. Estos compuestos evolucionan con el tiempo dando lugar a otros como las diacetonas o, en el caso de los hidroperóxidos de ácidos grasos con tres o más dobles enlaces, a sistemas con tres dobles enlaces conjugados. Estos productos secundarios, procedentes de la degradación de los hidroperóxidos, tienen la característica de absorber radiación UV entorno a los 270 nm. La medida se realiza en una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico a las longitudes de onda antes señaladas. En este trabajo los coeficientes de extinción de la muestra disuelta en ciclohexano se han determinado según el Reglamento de la Unión Europea (EEC 2568/91), utilizando un espectrofotómetro Agilent 8453.
El coeficiente de extinción a una longitud de onda λ (Kλ) se calcula a partir de la expresión:
E K C e
donde Eλ es la extinción medida en el espectrofotómetro a dicha longitud de onda, C es la concentración de la disolución de aceite (g/100 ml) y e es el paso óptico de la cubeta (cm).
Los valores de extinción (Eλ) deben estar comprendidos en el intervalo que va desde 0,1 a 0,8 en el caso contrario es necesario repetir la medida utilizando soluciones más concentradas o más diluidas, según el caso.
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2. Metodologíía
ÍNDICE DE p-ANISIDINA La p-anisidina es un compuesto que reacciona con los aldehídos, tanto volátiles como no volátiles, para dar productos que absorben radiación en torno a 350 nm (Figura 2.1), considerándose por lo tanto un indicador de la presencia de productos de oxidación secundarios.
R NH N C 2 H H R C + H O + 2 O
OMe OMe p-anisidina 2-alquenal
Figura 2.1. Reacción de la p-anisidina con un 2-alquenal para dar compuestos que absorben a 350 nm
El índice de p-anisidina se define como cien veces la densidad óptica medida a 350 nm en una cubeta de 1 cm de paso óptico de una solución que contiene 1,00 g de aceite en 100 ml de una mezcla de disolvente (isooctano) y reactivo preparado de acuerdo con el método oficial de la A.O.C.S (Cd 18-90). El procedimiento consiste en pesar entre 0,5 y 4,0 g de aceite en un matraz aforado de 25 ml y disolver con isooctano y medir la absorbancia a 350 nm de dicha disolución usando isooctano como blanco y una cubeta de 1 cm de paso óptico (Aa). A continuación, se toman 5 ml de la disolución de aceite y se llevan a un tubo de ensayo donde se hacen reaccionar con 1 ml de reactivo de p-anisidina durante 10 minutos. Finalmente, se mide la absorbancia a 350 nm del producto de la reacción en la misma cubeta y usando como blanco una mezcla en idéntica proporción del disolvente y del reactivo de p-anisidina (Ad). El índice de p-anisidina se calcula como:
25 (1,2 Ad Aa) IAn = P donde Aa es la absorbancia de la disolución de aceite antes de la reacción, Ad es la absorbancia después de la reacción y P es el peso de la muestra de aceite (g). La medida del índice de p-anisidina se usa en algunas ocasiones junto con el índice de peróxidos para describir la extensión total de la oxidación en una grasa o aceite (Holm, 1972). Esta medida del grado de oxidación conocida como índice de Totox se calcula como la suma del índice de p-anisidina más dos veces el índice de peróxidos, por lo que es un parámetro totalmente empírico, ya que corresponde a la suma de parámetros con diferentes unidades.
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2. Metodologíía
PIGMENTOS CLOROFÍLICOS Y CAROTENOIDES Los pigmentos clorofílicos y los carotenoides se han determinado según el método propuesto por Mínguez-Mosquera et al. (1990) empleando un espectrofotómetro Agilent 8453 con una cubeta de 1 cm de paso óptico. El procedimiento analítico consiste en pesar con exactitud 7,50 ± 0,01 g de muestra de aceite en un matraz aforado de 25 ml, enrasar con ciclohexano y homogeneizar perfectamente el contenido. A continuación, se mide la absorbancia de la disolución en el espectrofotómetro a 670 nm para determinar el contenido en clorofilas y a 472 nm para los pigmentos carotenoides, utilizando ciclohexano como blanco. El contenido de pigmentos se expresa en mg/kg a partir de las siguientes expresiones:
A 2500 Clorofilas = 670 6,13 P
A 125 Carotenoides = 472 P
siendo A670 y A472 la absorbancia medida a 670 y 472 nm respectivamente y P el peso de la muestra (g).
COMPOSICIÓN EN ÁCIDOS GRASOS La composición en ácidos grasos del aceite de oliva se expresa como porcentaje de área de sus ésteres metílicos. El procedimiento consiste en realizar la hidrólisis de los triglicéridos y la transesterificación de los ácidos grasos obtenidos para dar lugar a los ésteres metílicos correspondientes. Posteriormente se procede a la separación de los ésteres metílicos formados por cromatografía de gases en columna capilar. El protocolo seguido para la formación de los ésteres metílicos en frío es una modificación del método A.O.C.S. Ch 1-91 correspondiente al Reglamento Europeo EU 796/2002. El procedimiento empleado consiste en pesar 0,5 g de muestra de aceite en un vial con tapón de rosca de 5 ml de capacidad al que se añaden 3 ml de hexano para su completa disolución. A continuación, se añaden 0,5 ml de KOH en metanol 2 N, se agita enérgicamente durante 1 minuto y se deja reposar hasta la perfecta separación de las fases. La disolución sobrenadante que contiene los ésteres metílicos de los ácidos grasos ya está lista para ser inyectada en el cromatógrafo de gases. Este método sólo es válido cuando en la muestra de aceite hay una cantidad de ácidos grasos libres inferior al 3,3 %. En la determinación se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent serie 6890 equipado con inyector automático (Agilent 7683) y detector de ionización de llama (FID). La columna capilar empleada en la separación (Sugelabor, Madrid) está recubierta interiormente de una película de 0,25 m de espesor de la fase SGL-1000 (polietilenglicol acidificado), con una longitud de 50 m y un diámetro interno de 0,25 mm. Como gas portador se emplea helio con un flujo de 1 ml/min, el
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2. Metodologíía volumen de inyección de muestra es de 1 l y la relación de split es 50:1. Durante el análisis la temperatura del inyector y el detector es de 250 ºC y el horno se mantiene a 210 ºC.
El contenido de cada uno de los ésteres metílicos de los ácidos grasos (AGi) se expresa como porcentaje del total, calculándose de acuerdo a la siguiente expresión:
Ai AGi = 100 AT en la que Ai es el área de pico correspondiente al éster metílico del ácido graso “i” y AT es el área total correspondiente a la suma de todos los ésteres metílicos. En la Figura 2.2 se muestra, a modo de ejemplo, un cromatograma de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra. En los casos en los que se desearon conocer los cambios producidos en el contenido del aceite en ácidos grasos insaturado debido a la oxidación, se recurrió al cálculo de la relación entre el área del ácido graso insaturado en cuestión y el área del ácido palmítico, ya que éste al ser saturado prácticamente no se altera (Dobarganes et al. 1988). Los porcentajes de los ácidos grasos insaturados que aún no se han oxidado (AGi no oxidado) se calculan como:
(Ai / AC16:0 )0 AGi no oxidado = 100 (Ai / AC16:0 )t
donde (Ai/AC16:0) es el cociente entre el área del ácido graso insaturado en cuestión “i” y el área del ácido palmítico a tiempo cero “0” y después de la oxidación “t”.
pA 1 6 160 7
140
120
100 5 80
60 2 40 8 9 20 10 3 4 11
0 14 16 min 2 4 8 10 12 Figura 2.2. Cromatograma de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, ácido palmítico (C16:0); 2, ácido palmitoleico (C16:1); 3, ácido margárico
(C17:0); 4, ácido margaroleico (C17:1); 5, ácido esteárico (C18:0); 6, ácido oleico (C18:1); 7, ácido linoleico (C18:2); 8, ácido linolénico (C18:3); 9, ácido araquídico (C20:0); 10, ácido gadoleico (C20:1); 11,
ácido behénico (C22:2) 48
2. Metodologíía
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES La descomposición de los hidroperóxidos formados a partir de los ácidos grasos insaturados da lugar a la aparición de una serie de compuestos volátiles que inciden negativamente en la calidad sensorial del aceite de oliva virgen. A continuación, se describe el método analítico empleado para determinar el contenido en aldehídos volátiles del aceite, el cual se basa en la combinación de la micro-extracción en fase sólida (SPME) y la cromatografía de gases, de acuerdo al procedimiento descrito por Jelen et al. (2000). La extracción de los compuestos volátiles del espacio de cabeza del aceite de oliva se realiza de acuerdo a la secuencia que a continuación se detalla. Se toman 3 g de la muestra de aceite a analizar y se ponen en un vial de 10 ml de capacidad, la muestra se mantiene a 28 ºC durante una hora para que se alcance el equilibrio en el espacio de cabeza. A continuación, se perfora el liner de teflón que cubre el vial con la aguja de micro-extracción en fase sólida y durante 20 minutos se expone la fibra de material absorbente, en este caso una combinación de divinilbenceno/carboxeno/dimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) (Supelco Inc., Bellefonte, PA). Finalmente, la fibra se retrae dentro de la aguja, ésta se extrae del vial, se lleva directamente al portal de inyección del cromatógrafo, y se resorbe durante 5 minutos. Para la separación cromatográfica de los compuestos se emplea un aparato Agilent 6890 equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna capilar HP-5 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane) de dimensiones 30 m x 0,32 mm x 0,25 µm (Agilent, USA). La temperatura del inyector y el detector durante el análisis es de 240 y 300 ºC, respectivamente y el gas portador utilizado es helio (2 ml/min). La separación de los compuestos se logra gracias a la aplicación del siguiente gradiente de temperatura: 35 ºC durante 5 minutos, aumento hasta 100 ºC a 4 ºC/min y hasta 220 ºC a razón de 15 ºC/min. Los compuestos volátiles se identificaron por comparación de sus tiempos de retención con los de las correspondientes sustancias patrón. Como compuestos de referencia se usaron hexanal suministrado por Sigma Chemical Co.; heptanal, octanal, nonanal, t- 2-hexenal, t-2-heptenal, t-2-octenal y t,t-2,4-decadienal proporcionados por Aldrich Chemie y t-2- decenal de Fluka Chemie. Los resultados del análisis se expresan como unidades arbitrarias de área de cada uno de los compuestos estudiados. En la Figura 2.3 se muestra un cromatograma típico de los compuestos volátiles del espacio de cabeza de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra.
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2. Metodologíía
pA 8 12 1
10
8 2
7 6 5 4 9 3 6 4
2 0 5 10 15 20 25 min Figura 2.3. Cromatograma de los compuestos volátiles del espacio de cabeza de un aceite de oliva virgen Cornicabra. 1, hexanal; 2, t-2-hexenal; 3, heptanal; 4, t-2-heptenal; 5, octanal; 6, t- 2-octenal; 7, nonanal; 8, t-2-decenal ; 9, t,t-2,4-decadienal
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS Se ha realizado de acuerdo con el protocolo propuesto por Mateos et al. (2001). En primer lugar, se extrae la fracción fenólica del aceite y para ello se recurre a la extracción en fase sólida
(SPE). Para el posterior análisis cromatográfico se emplea una columna C18, empleando como sistema de detección la absorción en el ultravioleta, característica común a todos los compuestos fenólicos. Como sistema de cuantificación se ha elegido el método del patrón interno, en este caso de ácido siríngico (Sigma Chemical Co.). Para la obtención del extracto fenólico se toman 2,5 g de muestra, se añaden 250 l de una disolución (15 ppm) de patrón interno en metanol y se lleva a un evaporador rotativo a vacío (Büchi R-114) con el fin de eliminar el disolvente. Posteriormente, el aceite se disuelve en 6 ml de hexano y se hace pasar por una columna de extracción en fase sólida, con un volumen de 3 ml y un relleno de 0,5 g de fase Diol (Supelco), que previamente ha sido acondicionada con 6 ml de metanol y 6 ml de hexano. A continuación, la columna SPE se lava con 6 ml de hexano y 4 ml de hexano-acetato de etilo 85:15 (v/v) para eliminar los posibles restos de grasa y otros compuestos ligeramente polares que pudieran contaminar el extracto. La elución del extracto fenólico se realiza por paso a través de la columna de tres volúmenes de 5 ml de metanol que se recogen en un solo matraz. A continuación, el extracto fenólico se lleva a sequedad en el evaporador rotativo a vacío a una temperatura no superior a 35 ºC. Una vez concentrado hasta sequedad, el residuo se redisuelve en 250 l de metanol-agua 50:50 (v/v). Para realizar la separación de los compuestos fenólicos se utiliza un equipo HPLC de la serie 1100 de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) con detector ultravioleta-visible de
50
2. Metodologíía diodos (DAD). La columna empleada en la separación es una Spherisorb S3 ODS2 (Waters) o bien una Zorbax SB-C18, ambas con tamaño de partícula de 5 m y dimensiones 250 x 4,6 mm. La temperatura a la que se realiza la separación es de 30 ºC, y el volumen de inyección es de 20 l. La separación de los fenoles se logra mediante elución en gradiente con una mezcla de agua-ácido acético 95:5 (v/v), metanol y acetonitrilo, cuyo esquema se recoge en la Tabla 2.4. Los cromatogramas se adquieren a las longitudes de onda de 240, 280 y 335 nm, pero para la cuantificación se utilizan solamente los datos obtenidos a 280 nm, mientras que el resto se usan con fines cualitativos. Para la cuantificación, de modo general, se recurre al empleo del patrón interno, en este caso ácido siríngico, y por tanto la concentración de los compuestos (Ci) se expresa en miligramos de ácido siríngico por kilogramo de aceite, calculándose de acuerdo con la siguiente expresión:
CPI Ai Ci API
donde CPI es la concentración del patrón interno en el aceite (mg/kg) y Ai y API son las áreas del compuesto fenólico de interés y el patrón interno respectivamente. En algunos casos concretos, para la cuantificación de los fenoles se recurre al empleo de los factores de respuesta corregidos a partir de los datos publicados por Mateos et al. (2001) (Tabla 2.5) de acuerdo a la siguiente expresión:
C C F F i R donde CF es la concentración de compuesto fenólico en cuestión (mg/kg), Ci es la concentración de dicho compuesto fenólico expresada como miligramos de ácido siríngico por kilogramo de aceite y FR es el factor de respuesta.
Tabla 2.4. Gradiente de disolventes empleado durante la separación cromatográfica de los fenoles del aceite de oliva virgen
Tiempo (min) Agua-Ácido acético % Metanol % Acetonitrilo % Flujo (ml) 0 95,0 2,5 2,5 1,0 50 34,0 33,0 33,0 1,0 52 0,0 100,0 0,0 1,0 65 0,0 100,0 0,0 1,0 68 95,0 2,5 2,5 0,6 72 95,0 2,5 2,5 1,0
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2. Metodologíía
Tabla 2.5. Factores de respuesta* respecto al ácido siríngico de los principales fenoles presentes en el aceite de oliva virgen
Compuesto Tiempo de retención (min) Factor de respuesta (FR) Hidroxitirosol 6,2 3,947 Tirosol 9,3 5,065 Ácido vanílico 12,2 1,259 Vainillina 15,6 0,770 Ácido p-cumárico 17,7 0,648 3,4-DHPEA-AC 18,3 4,814 Ácido ferúlico 19,5 3,311 3,4-DHPEA-EDA 23,9 7,961 p-HPEA-AC 26,9 6,678 p-HPEA-EDA 29,2 11,260 Pinorresinol 30,3 1,240 1- acetoxipinorresinol 30,6 3,568 Ácido t-cinámico 30,6 0,348 3,4-DHPEA-EA 34,1 9,696 p-HPEA-EA 39,2 12,959 *Calculados a partir de los factores de respuesta respecto al ácido p-hidroxifenilacético publicados por Mateos et al. (2001)
En la Figura 2.4 se muestra un cromatograma típico de los compuestos fenólicos que se pueden encontrar en un aceite de oliva virgen.
ANÁLISIS CUALITATIVO DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS El espectro de masas de los compuestos fenólicos adicionados al aceite de oliva purificado se obtuvo tras colectar las correspondientes fracciones (picos 1, 2, 8, 10, 14 y 16) del eluyente del HPLC en metanol/agua y mediante su inyección directa en una fuente de electrospray (ESI) en modo negativo. El nitrógeno se usó como gas nebulizador con un flujo de 14 (unidades arbitrarias). La temperatura y el voltaje del capilar fueron 250 ºC y 4.50 kV, respectivamente. Todos los datos se recogieron en modo de ionización negativo. Los experimentos de fragmentación se produjeron usando helio como gas de colisión, con una energía de colisión de entre el 30 y el 40 %.
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Material y Métodos
mAU
14 600
500 8
400
1 10 300 16
200 2 12 100 P.I. 11 13 17 15 18 19 3 4 5 6 7 9 0 5 15 20 25 30 35 40 45 min
Figura 2.4. Cromatograma de los compuestos fenólicos de un aceite de oliva virgen Cornicabra 1, 3,4-DHPEA (hidroxitirosol); 2, p-HPEA (tirosol); 3, ácido vanílico; P.I., ácido siríngico; 4, vainillina; 5, ácido p-cumárico; 6, 3,4-DHPEA-AC; 7, ácido ferúlico; 8, 3,4-DHPEA- EDA; 9, p-HPEA-AC; 10, p-HPEA-EDA; 11, pinorresinol; 12, 1-acetoxipinorresinol+ácido t-cinámico; 13, luteolina; 14, 3,4-DHPEA-EA; 15, apigenina; 16, p-HPEA-EA; 17, TR 42,1; 18, TR 43,3; 19, TR 44,3
DETERMINACIÓN DE α-TOCOFEROL POR HPLC El α- tocoferol, tocoferol mayoritario del aceite de oliva virgen, se ha determinado por cromatografía líquida de alta eficacia, según el método de la A.O.C.S. (Ce 8-89). El procedimiento analítico consiste en pesar 200 mg de aceite en un matraz aforado de 10 ml, disolverlos en hexano para HPLC e inyectar en el cromatógrafo. La cuantificación se realiza por interpolación del área del pico del α- tocoferol en una recta de calibrado obtenida en las mismas condiciones experimentales, a partir de disoluciones patrón de α- tocoferol en hexano preparadas inmediatamente antes de su uso, de concentraciones exactamente conocidas que cubren el rango entre 1 y 8 mg/l. El equipo empleado para la separación y cuantificación del α- tocoferol ha sido un cromatógrafo de líquidos Agilent de la serie 1100 acoplado a un detector de fluorescencia Thermo Finnigan modelo FL3000 y la columna utilizada (250 x 4,6 mm) es de relleno Lichrosorb Si-60 de 5 m (Sugerlabor). La fase móvil que se emplea en la separación es una mezcla de n- hexano-isopropanol 98,5:1,5 (v/v) con un flujo de 1 ml/min, y un volumen de inyección de 20 l. Para la detección del α- tocoferol mediante fluorescencia se emplea una longitud de onda de excitación de 290 nm y una longitud de onda de emisión de 330 nm (Figura 2.5).
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2. Metodologíía
mAU
225
200 α-tocoferol 175
150
125
100
75
50
1 2 3 4 5 6 7 8 min
Figura 2.5. Cromatograma obtenido en la determinación del contenido en α- tocoferol de un aceite de oliva virgen de la variedad Cornicabra
La concentración de α- tocoferol en el aceite de oliva Cα-T (mg/kg) se calcula a partir de la siguiente expresión:
C D V C T P donde CD es la concentración de α- tocoferol en la disolución de aceite calculada a partir de la recta de calibrado (mg/l), V es el volumen del matraz donde se prepara la disolución de aceite (ml) y P es el peso de aceite empleado (g).
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS POLARES POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO (HPSEC) La separación por cromatografía de exclusión por tamaño de los compuestos polares formados durante la degradación oxidativa de los triacilgliceroles es una técnica que permite evaluar por separado los diferentes grupos de sustancias que se incluyen dentro de los compuestos polares y que difieren en peso molecular. Esta técnica analítica posibilita la separación de la fracción polar en triacilgliceroles oxidados (TGox), diacilgliceroles (DG), ácidos grasos libres (AG) y dímeros y polímeros de triacilgliceroles oxidados (DTG y PTG). El método que a continuación se describe se basa en el propuesto por Márquez-Ruiz et al. (1996). En un matraz aforado de 5 ml se pesan aproximadamente 250 mg con precisión 0,001 g de la muestra a analizar y se añaden 500 l de una disolución de monooleína (Sigma Chemical Co.) utilizada como patrón interno en éter isopropílico con una concentración de 10 mg/ml; el matraz se enrasa con hexano. Para proceder a la extracción de los compuestos polares de la matriz lipídica se toman 2 ml de muestra y se llevan a una columna de SPE con 1 g de sílice (Supelco), que ha sido previamente acondicionada por el paso de 10 ml de hexano- éter etílico 87:13 (v/v). A continuación, y con el fin de eliminar los triacilgliceroles no alterados,
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Material y Métodos se lava la columna con 15 ml de hexano que se desechan. Los compuestos polares se eluyen con 15 ml de hexano- éter etílico 87:13 (v/v), se recogen en un matraz adecuado y se llevan a evaporar hasta sequedad a un evaporador rotativo a vacío (Büchi R-114). Finalmente, el residuo que queda en el matraz se redisuelve en 500 l de tetrahidrofurano (THF) y ya está preparado para la separación cromatográfica. Para la separación y la detección de los compuestos polares de alteración se emplea un cromatógrafo de líquidos Agilent de la serie 1100 equipado con dos columnas PL-Gel (300 x 7,5 mm) con un tamaño de poro de 100 y 500 Ǻ, respectivamente, conectadas en serie (Agilent) y un detector de índice de refracción. La fase móvil empleada es tetrahidrofurano con un flujo de 1 ml/min y un volumen de inyección de 20 l. En la Figura 2.6 se puede observar el cromatograma de los compuestos polares de un aceite de oliva virgen Cornicabra.
Los resultados se expresan como porcentaje en peso de cada una de las fracciones (Ci) respecto al aceite de acuerdo a la siguiente fórmula:
donde Ai y API son el área de la fracción considerada y del patrón interno respectivamente y Ca y CPI son la concentración de aceite y patrón interno en la disolución que se somete a análisis respectivamente (mg/ml).
nRIU 3 30000
4 25000
20000
15000
P.I. 10000
5000 2 5 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 min
Figura 2.6. Cromatograma de los compuestos polares de un aceite de oliva virgen. 1, polímeros de triacilgliceroles (PTG); 2, dímeros de triacilgliceroles (DTG); 3, triacilgliceroles oxidados (TGox); 4, diacilgliceroles (DG); 5, ácidos grasos libres (AG); PI, patrón interno (monooleína)
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2. Metodologíía
DETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD OXIDATIVA POR EL MÉTODO RANCIMAT Para la realización del ensayo de estabilidad oxidativa se ha empleado un equipo Rancimat 679 (Metrohm) en el cual la oxidación tiene lugar con saturación de oxígeno y a temperatura elevada. La determinación de la estabilidad oxidativa, que se mide en horas, se calcula como el periodo que tardan en producirse compuestos volátiles polares como consecuencia del inicio de la oxidación secundaria de las grasas y se denomina periodo de inducción. La medida proporcionada por este equipo se basa en la detección conductimétrica de los productos de descomposición de los hidroperóxidos, principalmente ácidos orgánicos de cadena corta. El aparato consta de un bloque calefactor, que permite establecer temperaturas de oxidación comprendidas entre 50 y 220 ºC, con capacidad para seis tubos de reacción en los que se coloca el aceite. Para acelerar el proceso de oxidación se hace pasar por el aceite un flujo de aire. Este aire, a la vez que proporciona el oxígeno necesario para la oxidación, arrastra los compuestos volátiles formados durante el proceso y los conduce a un frasco borboteador que contiene agua y una célula que mide constantemente la conductividad del agua. Cuando se inicia la descomposición de los hidroperóxidos, es decir, las reacciones de oxidación secundaria, se desprenden una serie de compuestos volátiles, principalmente ácido fórmico, que son retenidos en el agua desionizada dando lugar a un aumento de la conductividad. El punto de inflexión de la curva de conductividad, denominada curva de oxidación, define el periodo de inducción del proceso de oxidación de la muestra. Dicho punto es la intersección de la línea base con la tangente a la curva trazada cuando se produce un brusco aumento de conductividad (Figura 2.7).
Figura 2.7. Registro obtenido en la determinación de la estabilidad oxidativa “Rancimat” de tres muestras
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Material y Métodos
El procedimiento analítico empleado consiste en pesar 3,5 g de aceite en el tubo de reacción, introducirlo en el bloque de calentamiento, previamente calentado a la temperatura de trabajo, conectar la toma de aire al aparato y la salida de aire a los frascos donde se encuentran alojadas las correspondientes células de medida de la conductividad. Las condiciones de trabajo empleadas para el aceite de oliva virgen son una temperatura de 100 ºC y un caudal de aire de 10 l/h, según el método propuesto por Gutiérrez (1989).
DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIRADICÁLICA: MÉTODO DPPH La capacidad de atrapar radicales libres (Radical Scanvenging Capacity, RCS) se midió mediante la técnica espectrofotométrica propuesta por Brand-Williams et al. (1995), en la cual mide la desaparición del radical libre DPPH. La aplicación de este método para medir la capacidad antiradicálica (RCS) de las fracciones lipídica, hidrófila y total del VOO por Espín et al. (2000), fue la seguida en este caso. Para la extracción de la fracción polar (hidrófila), se hizo pasar el aceite disuelto en n- hexano, a través de una columna SPE (solid phase extraction) de fase diol, y posteriormente se eluyó la fase polar con metanol. La fracción apolar (lipófila) se obtuvo lavando la muestra de aceite con metanol, agitando vigorosamente, seguido de centrifugación para eliminar los componentes hidrófilos. La parte lipófila se redisolvió en acetato de etilo. La fracción total se obtuvo disolviendo directamente el aceite en acetato de etilo. De cada extracto se prepararon diferentes diluciones. Del extracto metanólico o del extracto en acetato de etilo se tomaron 100 l y se añadieron a 2.9 mL de solución de DPPH (6∙105 M). en metanol, para la fracción hidrófila, y en acetato de etilo para la fracción lipófila y la fracción total. Se midió la disminución de la absorbancia a 515 nm, cada minuto hasta alcanzar una medición estable (aproximadamente a los 60 minutos). Los resultados se expresan como equivalentes de Trolox/kg de aceite, a partir de una recta de calibrado en la que se midió la absorbancia a 515 nm de diferentes concentraciones de este antioxidante reaccionando con la solución de DPPH. En el caso de la fracción total, la eficacia antiradicálica relativa (Relative Antiradical Eficiency, RARE) se calculó de la siguiente forma:
para neutralizar el efecto de la actividad antiradicálica que otros compuestos, como los pigmentos, también poseen.
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2. Metodologíía
2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y TRATAMIENTO DE DATOS EXPERIMENTALES
Todos los análisis y tratamientos estadísticos de resultados que aparecen a lo largo de esta memoria han sido realizados aplicando los programa informáticos Microsoft Office Excell 2007 for Windows (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, EE.UU), SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) y GraphPad Prism 4.02 para Windows (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).
ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA Este tratamiento se ha empleado para presentar los datos experimentales resumidos en tablas, a través de parámetros estadísticos como son: media; desviación típica; mínimo; percentiles 10, 25, mediana, 75 y 90 y máximo, que representan la dispersión de los valores observados.
ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL SIMPLE Y MÚLTIPLE Y REGRESIÓN POLINÓMICA Este análisis tiene como objetivo el cálculo de la relación de dependencia entre una variable dependiente y otra en la regresión simple, u otras independientes en la regresión múltiple, mediante un modelo matemático que define la forma de la dependencia entre las variables, y/o predice el valor de la variable dependiente en función de los valores de la/s otra/s. Cuando se parte de muchas variables independientes es necesario seleccionar solo las más relevantes, ya que el modelo de regresión, además de realista, debe ser sencillo. Una de las metodologías que permite realizar esta selección de variables es la regresión múltiple por pasos sucesivos, y en ella la selección de variables se realiza por etapas, escogiendo en da una de ellas la variable que más contribuye al aumento del coeficiente de regresión y desechando las menos relevantes y significativas.
ANÁLISIS DE LA VARIANZA El análisis de la varianza estudia los efectos de uno o más factores sobre la variación de los valores medios dentro de uno o más grupos de datos, determinando si existen o no diferencias estadísticamente significativas entre los mismos. El nivel de la significación estadística se establece a partir del valor de F que proporciona este análisis. Para determinar entre qué grupos existen diferencias significativas se ha empleado el método ANOVA utilizando el test de Duncan. El valor de las medias se consideró significativamente diferente con p <0.05.
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Material y Métodos
RELACIÓN VELOCIDAD-TEMPERATURA POR MEDIO DE LA ECUACIÓN DE ARRHENIUS Algunos de los estudios realizados han permitido establecer una relación directa entre las velocidades de reacción (oxidación) y la temperatura por medio de la ecuación de Arrhenius:
Ln k = Ln A – Ea/RT [1] donde k es la constante de velocidad, R es la constante de los gases (8.31 J/K/mol), T es la temperatura absoluta (K), Ea es la energía de activación (J/mol) y A es el factor pre- exponencial. No siempre la relación entre k y T es lineal, sino que existe un determinado nivel de curvatura. En estos casos puede aplicarse la ecuación de Arrhenius modificada (IUPAC 1997, Herberguer et al., 1987): K = ATn e –Ea/RT [2] donde A, n y Ea son parámetros determinados utilizando ajustes no-lineales (0 cT –cT k = k0 e ó s = s0 e [4] Log k = Log k0 + cT ó Log s = Log s0 - cT [5] Considerando la anterior definición del factor Q10 y la ecuación de Arrhenius, la energía de activación de una reacción que implica el deterioro en la calidad de un producto puede relacionarse mediante la expresión: Ea 10 Ln Q 10 c 10 R T(T 10) Por lo tanto, a partir de la representación gráfica de Log k o Log s vs. T puede calcularse la constante “c” y así en factor Q10. Siguiendo la ecuación de Arrhenius, el factor Q10 puede expresarse también como: k( T 10) Ea 10 59 Q10 exp k R TT 10 T 2. Metodologíía y, de la misma forma, el factor QT para cualquiera que sea en cambio de temperatura aplicado sería:: k (T T ) Ea T QT exp k R TT T T 10 T 10 Multiplicando el término exponencial por 10 T 10 se obtiene: k TT10 (T T ) Ea 10 TT 10 10TT QT exp Q10 k R TT 10 10T T T Considerando que la temperatura en condiciones normales de estudio es siempre cercana a 300 K entonces T 10 1 T T k T (T T ) y así: Q Q 10 T k 10 T 60 33.. EExxppeerriimmeennttaall RReessuullttss 3. Experiimental results 3.1. OXIDATION KINETIC IN OLIVE OIL TRIACYLGLYCEROLS UNDER ACCELERATED SHELF LIFE TESTING (25-75ºC) A kinetic study of the autoxidation reaction in olive oil triacylglycerols stored in darkness at different temperatures (25, 40, 50, 60 and 75 ºC), in absence of pro- and antioxidant compounds to avoid confounding effects, is described. After the induction period (IP) the decrease in the oxidizing substrate and the formation of primary oxidation products followed a pseudo-zero-order kinetic, and the calculated activation energy (Ea) from the Arrhenius equation for the formation of hydroperoxides was 32.1 kJ mol-1. The formation of secondary oxidation products followed a pseudo-first-order kinetic whose rate reaction constant also increased exponentially with temperature. The first oxidation index to exceed the upper limit in the EU regulations was peroxide value (PV), followed by K232 and K270. The time required reaching these limits and the rancidity threshold showed a potential dependence on temperature, and therefore with accelerated storage at 75 ºC, purified olive oil (POO) shelf- life in ambient conditions (25 ºC) can be predicted. Finally, there was a good linear relationship between the time required to reach the rancidity threshold and the IP of the formation of the 2,4-decadienal, and hence this instrumental determination could be useful to measure sensory recognition of the rancid defect in POO. The POO presented very low levels of both primary (fatty acid hydroperoxides, measured as peroxide value; K232, and oxidized triacylglycerols) and secondary (fatty acid hydroperoxides decomposition products, detected as K270; anisidine value; and dimers and polymers of triacylglycerols) oxidation products. In terms of fatty acids, the POO employed presented high oleic acid content (80.2%) and low polyunsaturated fatty acid content (5.3%), as previously reported in more details (Gómez-Alonso et al., 2004a). 3.1.1. Primary oxidation products The kinetic behaviour of the oxidizing substrate, the unsaturated fatty acids (UFAs), and of the primary products of the autoxidation reaction, the fatty acids (FA) hydroperoxides measured as peroxide value (PV) are depicted in Figure 3.1. This figure plots the data obtained at 25 ºC; however, the same behaviour was observed at all of the experimental temperatures (25, 40, 50, 60 and 75 ºC). The kinetic of the oxidation process corresponded to an autocatalytic reaction [1], in which the degradation rate of the UFAs and the formation rate of the FA hydroperoxides, very low at the beginning of the storage, increased very rapidly in the IP. After the IP, the behaviour of the autoxidation reaction was apparently pseudo-zero-order, where the rate of the reaction does not depend on the concentration of the oxidizing substrate: C = C0 + k t [1] where C0 and C are respectively the concentration of hydroperoxides in the fresh POO and after time t (h) of storage and k (mol l-1 s-1) is the rate constant of the reaction. 63 3. Experiimental results Under the experimental conditions, the factor limiting the oxidation reaction is the diffusion of atmospheric oxygen into the oily phase (Yanishlieva-Maslarova, 2001). Figure 3.1. Kinetic behaviour of UFA content and Peroxide Value during storage at 25 ºC., PV; , UFA. A previous work by this research group showed that the behaviour during the autoxidation reaction of conjugated dienes (K232) and of oxidized triacylglycerols (oxTGs) was very similar to that observed for PV (Gómez-Alonso et al., 2004a). The kinetic behaviour of these indices of the primary oxidation products is therefore presumably also of pseudo zero-order. Values of the oxidation rate constants k and of the regression coefficients for PV and K270 at the temperatures studied are reported in Table 3.1. The value of k for PV increased with the temperature from 1.10 10-8 mol l-1 s-1 at 25 ºC up to 7.52 10-8 mol l-1 s-1 at 75 ºC, which confirmed that this factor considerably influences the rate of the autoxidation reaction. The regression coefficient (r2) for PV was always higher than 0.985 for all the temperatures studied and showed a good linear relationship with storage time, as observed in Figure 3.1 at 25 ºC. 64 3. Experiimental results Table 3.1. Values of the oxidation rate constants (k) and of the regression coefficient (r2) for PV and K270 at the experimental temperatures. T (ºC) Peroxide value K270 k [10-8 mol l-1 s-1] r2 k [10-7 mol l-1 s-1] r2 25 1.10 ± 0.06 0.988 2.93 ± 0.21 0.957 40 2.47 ± 0.07 0.992 8.02 ± 0.38 0.978 50 3.22 ± 0.13 0.985 13.20 ± 0.77 0.964 60 4.38 ± 0.09 0.995 19.44 ± 1.07 0.968 75 7.52 ± 0.15 0.996 34.74 ± 1.96 0.972 T, temperature; k, oxidation rate constants; r2, regression coefficients The plot of the natural logarithm (Ln) of the PV rate constant versus the inverse of the temperature (1/T) showed a good linear relationship (r2 = 0.990), as depicted in Figure 3.2. This kinetic behaviour thus followed the Arrhenius equation: Ln k = Ln A+Ea/RT, where A (mol l-1 s-1) is a constant known as the pre-exponential factor, Ea (kJ mol-1) is the activation energy, R (kJ K-1 mol-1) is the gas constant and T (K) is the absolute temperature. The values of Ea and A for the formation reaction of the primary oxidation products as calculated from the experimental data were 32.1 kJ mol-1 and 3.22 10-8 mol l-1 s-1 respectively. 3.1.2. Secondary oxidation products The K270 index was chosen to study the kinetic behaviour of the secondary oxidation products. In fact, as shown in a previous work, the behaviour of this oxidation parameter is very similar to that of the formation of dimers and polymers of triacylglycerides (DTGs + PTGs), and therefore the conclusions of the analysis of K270 kinetic behaviour (i.e. the order of the reaction and the compliance of the Arrhenius equation) can also be applied to the other oxidation index (Gómez-Alonso et al., 2004a). The kinetic of the formation of secondary oxidation products followed a pseudo-first- order reaction (r2 > 0.957): Ln(C/C0) = k t [2] Values of k (s-1) and r2 for the increase of absorbance at 270 nm during storage at the different temperatures studied are reported in Table 3.1. The rate constant for K270 increased rapidly with temperature, ranging from 2.93 10-7 s-1 at 25 ºC up to 34.74 10-7 s-1 at 75 ºC. The behaviour of the rate constant of the secondary oxidation products with temperature also followed an Arrhenius equation (r2 = 0.991), as observed in Figure 3.2. 65 3. Experiimental results Figure 3.2. Effect of temperature on oxidation rate constants, PV; , K270. 3.1.3. Shelf-life prediction From a practical point of view, it is far more useful to be able to predict shelf-life in normal storage conditions, which in virgin olive oil is determined by the time it takes to reach the upper limits of the EU quality indices (Velasco et al., 2002) using an accelerated shelf-life testing (ASLT) method (Kaya et al, 1993; Coppin et al., 2001), than to determine the effect of temperature on kinetic behaviour. Table 3.2 shows the storage time required by the POO warmed at different temperatures to exceed the upper limits established by EU Regulation (EC 796/2002) in the case of extra virgin olive oil: for PV (20 meq/kg), K232 (2.50) and K270 (0.200). The Table also shows the time taken to reach the recognition threshold of the rancid defect in POO, as measured by a trained virgin olive oil sensory panel. The first oxidation index to exceed the legal upper limit was PV, followed by K232 and K270. The behaviour of the rancidity threshold was closer to that of K232, particularly at lower temperatures. 66 3. Experiimental results Table 3.2. Time required reaching the upper limits for PV, K232 and K270, and the rancidity threshold. T (ºC) Time (h) PV = 20 meq/kg K232 = 2.50 K270 = 0.200 Rancid threshold 25 114±612 1301±8 2473±27 1506±65 40 24±61 302±2 913±25 339±16 50 112±1 169±1 557±2 246±9 60 63±1 107±3 317±4 198±9 75 36±1 50±1 161±4 100±5 T, temperature; PV, peroxide value The observed relationship between the temperature and the time required to reach the upper legal limits followed a potential equation, and not an exponential one as suggested by other authors for olive oil (Kaya et al., 1993): t = a Tb [3] where t is the time (h) taken to reach the upper limit at temperature T (ºC), and a and b are respectively the regression constant and the coefficient. Consequently, the plot of the natural logarithm of the time required (t) versus the logarithm of the temperature (T) gave a linear relationship, as depicted in Figure 3.3: Lnt =Lna +b LnT [4] The data plotted in Figure 3.3 suggest that accelerated storage at 75 ºC can predict POO shelf life at room temperature (25 ºC) in darkness. Moreover, while PV, K232 and K270 behaviours are almost parallel, the time required to reach the rancidity threshold was closer to that for PV and K232 at lower temperature. This means that the time required reaching the upper limits for PV and K232 is more affected by the temperature than the rancidity threshold. Moreover, at RT the times taken to reach the upper values for PV, K232 and the rancidity threshold are similar, and therefore the limits established by the EU for PV or K232 may be a useful index of the sensory stability of POO. Of course, this must be evaluated in virgin olive oil. It is important to note that equations [1] to [4] are not intended to define the chemical mechanisms of the reactions that actually take place during autoxidation as proposed by other authors (Brimberg, 1993a y 1993b; Brimberg et al., 2003b). They are simple empirical equations that could be used to predict with reasonable accuracy the concentration of relevant oxidized components, and hence the time required to reach a given value in an oxidation or quality index under normal storage conditions (shelf life), from the results of an ASLT. 67 3. Experiimental results Figure 3.3. Effect of temperature on the time taken to reach the limit values for PV, K232 and K270, and the rancid threshold. , PV; ▲, K232; , K270; , rancid threshold. A previous work by this research group suggested that the time required to reach the rancidity threshold was apparently related with the IP of the formation reaction of t,t-2,4- decadienal (Gómez-Alonso et al., 2004). Based on the results for the range of temperatures studied (25–75 ºC), it can now be shown that there was in fact a high linear correlation (R2 = 0.999) between these two parameters, as reported in Figure 3.4. This instrumental determination may therefore be useful for measuring sensory recognition of the rancid defect, at least in POO. The value of the slope of the linear regression (0.97) was close to 1, and therefore the time required to reach the rancidity threshold is approximately equal to the IP for formation of t,t-2,4-decadienal. 68 3. Experiimental results Figure 3.4. Correlation between the time taken to reach the IP for the formation of t,t-2,4- decadienal and the rancid threshold at different temperatures (25–75 ºC). 3.2. EVOLUTION OF MAJOR AND MINOR COMPONENTS AND OXIDATION INDICES OF VIRGIN OLIVE OIL DURING 21 MONTHS STORAGE AT ROOM TEMPERATURE This research reports the evolution of major and minor components and oxidation indices of seven samples of virgin olive oil (VOO) which differ in their initial contents of natural antioxidants, during 21 months of storage at room temperature and in darkness. As expected, statistically significant differences in the antioxidant contents were observed, with initial concentrations ranging from 0.33 to 0.55 mmol/kg for -tocopherol and from 1.08 to 3.88 mmol/kg for total phenols. The quality indices PV, K232 and K270 increased linearly during the storage time studied (21 months), which should make it possible to predict the shelf- life of a VOO sample by extrapolation from the results obtained during a relatively short period of storage (i.e. several weeks). K232 was the first parameter that exceeded the established upper limit for extra VOO and therefore seems to be the most relevant index for analysis and monitoring to determine the commercial category of the olive oil. The reduction of total phenolic compounds ranged from 43% to 73%, and it was remarkable that the decrease was higher in samples whose initial phenol contents were greater. Hydroxytyrosol increased linearly in most samples, whereas its complex forms decreased considerably, with the exception of two in which the hydroxytyrosol content decreased continuously or diminished after an initial 69 3. Experiimental results increase. This fact was probably due to the low initial concentration of hydroxytyrosol secoiridoid forms: i.e. 0.32 mmol/kg for the sum of 3,4-DHPEA-EDA and 3,4-DHPEA-EA in one of these samples as compared to between 0.65 and 2.06 mmol/kg in the others. Finally, there was a slight and apparently linear fall in the α-tocopherol content of all samples, with a reduction ranging from 0.054 mmol/kg (12%) to 0.127 mmol/kg (23%), although there may be a short lag phase at the beginning of the assay. 3.2.1. Evolution of legal quality indices Samples were those described in chapter 2.1 (in Metodología). Table 2.1 shows the values of the legal quality indices and the composition of each sample of virgin olive oil (VOO) at the beginning of the assay. The quality indices, PV, K232 and K270, increased linearly during the storage time studied (21 months), as shown by the regression coefficients presented in Table 3.3. It should therefore be possible to extrapolate from this observation to predict the shelf-life of a VOO sample from results recorded over a relatively short period of storage (i.e. a matter of weeks). Table 3.3. Slope and correlation coefficient of the linear regression of quality indices and time required to reach the upper legal limits for EVOO during storage Sample PV K232 K270 Slope R2 Timea Slope R2 Timea Slope · 10-3 R2 Timea I 0.146 0.981 103b 0.0173 0.979 33 1.580 0.952 35 II 0.086 0.976 167 b 0.0064 0.948 103 b 0.702 0.940 86 III 0.156 0.982 103 b 0.0149 0.987 54 1.330 0.978 66 IV 0.155 0.969 96 b 0.0183 0.965 53 1.070 0.952 95 b V 0.133 0.976 122 b 0.0153 0.986 63 1.210 0.985 99 b VI 0.123 0.965 100 b 0.0136 0.982 56 0.864 0.958 114 b VII 0.094 0.951 141 b 0.0123 0.973 62 1.000 0.951 84 POO – – 6.8 – – 7.7 – – 15.3 a Time (weeks) to reach the maximum values of quality parameter for extra virgin olive oil (EEC 2596/1991 and later amendments): PV, 20 meq/kg; K232, 2.50; K272, 0.22. b Times (weeks) calculated by extrapolation. In all samples, the peroxide value was lower than 6.6 meq/kg at the beginning of the assay (Table 2.1). In none of the oils did it exceed the upper limit (20 meq/kg) established by European Regulation for extra virgin olive oil (EVOO) during the 21-month storage period studied, and therefore the time required to reach the legal limit was extrapolated. This result showed the significant effect of minor VOO compounds on oxidative stability since, 70 3. Experiimental results as shown in Table 3.3, the time required to reach the same limit in purified olive oil (POO) was less than seven weeks. However, these results contrast with the findings of Okogeri et al. (2002) in that, according to their assays, VOO samples (of Lianolia variety, with low initial PV and relatively high antioxidant levels, stored in closed bottles, darkness, room temperature and only 3% of head-space) reached the upper limit for PV in less than eight months. In order to determine whether the oxidation rate during storage was related to the initial oxidation level of the oil, the correlation between the rate of increase of PV and its initial value in the oil samples was examined. The results showed that there was no statistically significant correlation between these two parameters (R2 = 0.357, p = 0.156). Moreover, the evolution of PV during storage showed no obvious correlation with the initial Rancimat oxidative stability of these oils (p = 0.905) or, as also reported by Cinquanta et al. (2001), with their phenolic compound (p = 0.422) or α-tocopherol (p = 0.303) contents. For example, samples III and IV, which had similar initial values for PV but very different phenolic compound contents (Table 2.1), exhibited very similar oxidation rates. The behaviour observed for K232 index was very similar to that found for PV in that it followed a pseudo-zero-order kinetic and there was no simple correlation between the evolution of this index and the initial K232 values, Rancimat oxidative stability, or natural antioxidant content. As expected, the rate of increase of these two indices, K232 and PV, correlated directly (R2 = 0.764; p 0.05). However, unlike PV, K232 was the first index to exceed the upper limit of 2.50, established by the EU Regulations for EVOO, in all samples except for sample II; this meant that it would fail to qualify for the maximum oil category in a period of time ranging from 33 to 63 weeks. During the storage time, most oils also exceeded the upper limit for edible oil, K232 2.60. Consequently, K232 seems to be the most useful index for analysis and monitoring to determine the commercial category of olive oil. These results also show how important VOO minor compounds are in retarding the increase of K232 index, given that it took less than 8 weeks of storage to reach the limit value of 2.50 in POO. With respect to the K270 index, a secondary oxidation product marker, samples I and III, both with high oxidative stability and phenolic compound contents, presented the highest slope over the storage time. Sample II, with a very similar initial oxidation status and phenolic content presented the lowest rate of increase for K270. One possible explanation of the different behaviour observed is that the linolenic acid content of the samples was significantly higher in oils I and III (Table 2.1). In fact, as we know, linolenic acid is the most susceptible VOO fatty acid to autoxidation (Cosgrove et al., 1987) and its hydroperoxides undergo rapid decomposition, yielding compounds some of which absorb UV radiation at 270 nm. A multiple linear regression analysis of the data suggested that the rate of increase of K270 could be explained by taking into account initial concentrations of α-tocopherol and chlorophyll pigments in the oils (r2 = 0.997; p < 0.001) as variables, in addition to the linolenic acid content. The positive correlation observed between -tocopherol content and the increased rate of K270 could be explained by its pro-oxidant activity in the first steps of autoxidation (Blekas et al., 1995), whereas the negative regression found between 71 3. Experiimental results chlorophyll pigments in the oil and the rate of increase of K270 would appear to indicate that the antioxidant effect of this pigment group is slight when the autoxidation reaction occurs in darkness (Endo et al., 1984; Psomiadou et al., 2002). It is also noteworthy that K270 was not the first VOO quality index to exceed the legal limit during storage, contrary to what was reported by Gutiérrez and Fernández (2002). Moreover, in the cited work, a good linear regression (r = 0.982) was established between the initial Rancimat oxidative stability of the oils and the time required to reach the upper limit value for K270, a correlation that was not observed in the present work. 3.2.2. Changes in fatty acid composition Few changes were observed in the unsaturated fatty acid composition during the 21- month storage period. This was due to the levels of antioxidant compounds and the mild storage conditions employed in this research, which reduced the oxidation in the oils. After 93 weeks of storage, there were no detectable changes in oleic acid, the main unsaturated fatty acid of VOO. The changes observed in the polyunsaturated fatty acids (PUFA), linoleic and linolenic, in each VOO sample, are shown in Table 3.4. As expected, linolenic acid decreased more, the reductions ranging between 2.1% and 3.8% for linoleic acid and between 5.8% and 10.0% for linolenic acid. In all the VOO samples studied, the observed reduction was 2.5–2.8 times greater in linolenic acid than in linoleic acid. This rate is higher than was observed during autoxidation of POO (1.76; Gómez-Alonso et al., 2004b) under the same oxidation conditions (PV between 10 and 20 meq/kg), which may suggest that natural VOO antioxidants protect linoleic more than linolenic acid. This could be explained by the fact that the activity of antioxidants differs, depending on the oxidizing substrate (Yanishlieva-Maslarova, 2001). Table 3.4. Decrease in fatty acid content (%) during the 21-month storage period Sample I II III IV V VI VII C18:2a 3.3 ± 0.4 2.1 ± 0.3 3.5 ± 0.4 3.8 ± 0.5 2.9 ± 0.3 3.3 ± 0.3 3.0 ± 0.2 C18:3a 8.5 ± 0.9 5.8 ± 0.4 9.6 ± 0.6 10.0 ± 1.0 8.2 ± 0.8 8.7 ± 0.9 7.7 ± 0.8 Totalb 0.23 ± 0.03 0.11 ± 0.01 0.20 ± 0.02 0.26±0.03 0.20±0.02 0.21±0.02 0.20±0.02 a With respect to initial fatty acid content. b With respect to initial total fatty acid content. At the end of the assay, oxidation of total fatty acids was as high as 0.20% in all samples, except in VOO II where the loss was only 0.11% and the increases of PV, K232 and K270 were also smaller. Analysis of the correlation between the loss of PUFA and the increase of indices measuring oxidation products showed that K232 had the highest statistically significant determination coefficient (R2 = 0.924, p < 0.001). In view of these results, it seems possible that the best analytical index to measure the degree to which VOO polyunsaturated fatty acids are affected by oxidation when stored in darkness and at room temperature (25 °C) is UV absorbance at 232 nm. 72 3. Experiimental results Finally, once again, no significant correlation was observed between changes in fatty acid composition and natural antioxidant content or Rancimat oxidative stability. This fact tends to confirm the previous results with PV, K232 and K270 indices. 3.2.3. Changes in phenolic compounds and other minor components Table 3.5 shows VOO content in the main phenolic compounds at the beginning, in the middle and at the end of the assay. The sum of hydroxytyrosol, tyrosol and their secoiridoid derivatives during storage at 25 °C decreased considerably in all samples, but the rate of decrease was clearly different between one sample and another. The downward trend observed in the phenol content appeared roughly to follow a pseudo-first-order kinetic (0.848 R2 0.966). This is consistent with polyphenol contents as measured by colorimetric methods (Gutiérrez & Fernandez, 2002). The total per cent reduction ranged from 43% and 73% for samples VI and III, respectively. It should be noted that this decrease was greater in samples with higher initial phenol contents. Hydroxytyrosol and tyrosol concentrations increased linearly in practically all samples, confirming that their secoiridoid derivatives undergo partial non-oxidative hydrolysis (Brenes et al., 2001). Only two samples differed in this respect: sample VI, whose hydroxytyrosol content decreased continuously, and sample VII, which increased initially but eventually presented a downward trend. This was probably due to the low initial concentration of hydroxytyrosol complex forms, i.e. 0.32 mmol/kg for the sum of 3,4-DHPEA-EDA and 3,4- DHPEA-EA in sample VI as compared to 0.65–2.06 in VOO samples I–V. The evolution of tyrosol content was very similar to that of hydroxytyrosol, with the same exceptions to the overall upward trend. Table 3.5 also shows that concentration of hydroxytyrosol and tyrosol complex forms in VOO decreased considerably over the storage time. As Figure 3.5 shows, the decrease of hydroxytyrosol secoiridoid derivatives was greater than that of tyrosol complex forms, in all cases. However, the differences are smaller than was expected considering that tyrosol and its secoiridoid derivatives lack antioxidant activity (Baldioli et al., 1996; Mateos et al., 2003). This fact therefore suggests that phenolic compounds are not very stable, even in mild storage conditions, which is an important aspect and merits more thorough investigation. 73 3. Experiimental results Table 3.5. Changes in VOO phenolic compound contents (mmol/kg) during storage Storage Sample time (weeks) I II III IV V VI VII 0 0.16 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.14 ± 0.02 0.03 ± 0.01 0.06 ± 0.01 0.27 ± 0.01 0.07 ± 0.01 3,4-DHPEA 45 0.20 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.13 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.25 ± 0.01 0.12 ± 0.01 HTYR 93 0.21 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0.16 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.19 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0 0.12 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.04 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.65 ± 0.01 0.09 ± 0.01 p-HPEA 45 0.16 ± 0.01 0.09 ± 0.01 0.09 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.57 ± 0.02 0.14 ± 0.01 TYR 93 0.19 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.13 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.48 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0 1.48 ± 0.07 1.60 ± 0.16 0.89 ± 0.04 0.30 ± 0.04 0.34 ± 0.01 0.05 ± 0.01 0.19 ± 0.01 3,4-DHPEA-EDA 45 0.86 ± 0.07 0.90 ± 0.01 0.31 ± 0.02 0.17 ± 0.02 0.18 ± 0.02 0.02 ± 0.01 0.14 ± 0.01 93 0.67 ± 0.06 0.63 ± 0.06 0.21 ± 0.02 0.10 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.01 ± 0.01 0.09 ± 0.01 0 0.40 ± 0.01 0.46 ± 0.05 1.38 ± 0.06 0.53 ± 0.02 0.31 ± 0.01 0.27 ± 0.01 0.24 ± 0.01 SEC HTYRSEC 3,4-DHPEA-EA 45 0.21 ± 0.01 0.23 ± 0.01 0.54 ± 0.03 0.23 ± 0.02 0.14 ± 0.01 0.12 ± 0.01 0.15 ± 0.01 93 0.12 ± 0.01 0.19 ± 0.01 0.34 ± 0.02 0.13 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0 1.29 ± 0.05 1.36 ± 0.11 0.73 ± 0.03 0.47 ± 0.01 0.45 ± 0.01 0.06 ± 0.02 0.32 ± 0.01 p-HPEA-EDA 45 0.81 ± 0.09 0.77 ± 0.01 0.30 ± 0.04 0.36 ± 0.04 0.26 ± 0.03 0.04 ± 0.01 0.29 ± 0.03 93 0.73 ± 0.06 0.59 ± 0.06 0.24 ± 0.03 0.24 ± 0.02 0.21 ± 0.03 0.03 ± 0.01 0.21 ± 0.02 0 0.24 ± 0.01 0.26 ± 0.03 0.58 ± 0.05 0.33 ± 0.01 0.23 ± 0.01 0.17 ± 0.01 0.20 ± 0.01 SEC TYR p-HPEA-EA 45 0.13 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0.30 ± 0.03 0.23 ± 0.02 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.14 ± 0.01 93 0.09 ± 0.01 0.14 ± 0.01 0.23 ± 0.03 0.15 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.09 ± 0.01 0 3.70 ± 0.00 3.88 ± 0.56 3.88 ± 0.22 1.41 ± 0.07 1.38 ± 0.03 1.35 ± 0.05 1.08 ± 0.03 Total phenols* 45 2.36 ± 0.18 2.24 ± 0.03 1.66 ± 0.14 1.12 ± 0.11 0.88 ± 0.06 1.10 ± 0.04 0.97 ± 0.06 93 2.01 ± 0.16 1.74 ± 0.14 1.31 ± 0.11 0.79 ± 0.05 0.70 ± 0.05 0.88 ± 0.02 0.73 ± 0.04 * Sum of hydroxytyrosol, tyrosol and their secoiridoid derivatives 74 3. Experiimental results Figure 3.5. Residual VOO complex phenol contents (%) after 21 months of storage at 25 °C. (3,4-DHPEA-EDA + 3,4-DHPEA-EA) , (p-HPEA-EDA + p-HPEA-EA) As depicted in Figure 3.6, -tocopherol content fell slightly and apparently linearly in all samples, although there may have been a short lag phase at the beginning of the assay. At the end of the storage period, the total reduction in the α-tocopherol content varied between 0.054 mmol/kg (12%) in sample II and 0.127 mmol/kg (23%) in sample I. These reductions were much smaller than the 50% observed by Okogeri and Tasioula-Margari (2002) during 12 months storage of virgin olive oil in bottles with only 3% headspace at room temperature and in darkness. On the other hand, the total reduction of α-tocopherol was smaller than that of the o-diphenols, which, according to references in the literature (Blekas et al., 1995), may indicate that the latter had a greater antioxidant effect, especially in the early stages of oxidation. Figure 3.6. Decrease of -tocopherol content during storage. , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII 75 3. Experiimental results The chlorophyll pigments of virgin olive oil have been reported to act as prooxidants under light (Rahmani et al., 1998) and as antioxidants in darkness (Psomiadou et al., 2002). With the spectrophotometric method used in the present research, only a slight decrease in the chlorophyll content could be detected, irrespective of the initial concentration in virgin olive oils. The concentrations of carotenoid pigments, to which some authors ascribe some prooxidant activity in darkness (Lee et al., 1992), also decreased slightly with time. The reduction was more pronounced and very similar in samples II and III, that is the ones with higher initial carotenoid contents. However, these pigments are unlikely to be of importance, given the dissimilarity in the course of the autoxidation process. 3.3. COMPARATIVE STUDY OF VIRGIN OLIVE OIL BEHAVIOR UNDER RANCIMAT ACCELERATED OXIDATION CONDITIONS AND LONG-TERM ROOM TEMPERATURE STORAGE The results reported in this part of the study highlight the differences in the olive oil oxidation process under Rancimat accelerated conditions with respect to long-term storage at room temperature and clearly shows the lack of correlation between shelf life and the Rancimat induction period. A better correlation, although not yet satisfactory, was found when the same oxidation end-point was used in both assays. The parameter K270, a marker of secondary oxidation products, was the first index to reach the established upper legal limit under Rancimat conditions, whereas at 25 ºC it was an index of primary oxidation products (K232). Furthermore, the ratio of oxidation rate at Rancimat conditions to oxidation rate at 25 ºC was more than double for secondary oxidation products compared with primary ones. Notable differences were also observed in degradation rates of the different unsaturated fatty acids and in rates of formation of polar oxidation compounds. Moreover, under the Rancimat conditions antioxidants such as o-diphenols and -tocopherol rapidly depleted, and when they had practically disappeared, there was a sharp increase in oxidation indices, such as peroxide value, and in oxidation products. At 25 ºC, on the other hand, the depletion was much lower. Although original samples were the same that in the previous study, virgin olive oils of Cornicabra variety, five instead of seven were used in the current study and they presented slightly different quality indices due to the time effect, so Table 3.6 shows the compositional values and initial oxidation levels of these samples. Data relating to the characteristics of the purified olive oil (POO) sample used in this study are also shown. 76 3. Experiimental results Table 3.6. Initial Composition and Quality Indices of Olive Oil Samples for Rancimat study Virgin Olive Oil Samplesa A B C D E POOb a b b b b PV (meq O2/kg) 6.0±0.1 8.5±0.4 8.6±0.3 8.0±0.1 8.5±0.1 ND K232 1.89±0.03 b 2.02±0.01 c 1.86±0.05 ab 2.02±0.01 c 1.80±0.01 a 0.91±0.01 K270 0.15±0.01 c 0.17±0.01 d 0.13±0.01 b 0.13±0.01 b 0.11±0.01 a 0.02±0.01 C18:1c 823.2±0.6 d 799.5±2.0 c 794.5±0.5 b 791.2±1.8 a 795.9±0.1 b 839.1±0.0 C18:2c 36.68±0.03 a 38.52±0.11 b 52.71±0.04 d 53.23±0.11 e 49.08±0.01 c 53.24±0.01 C18:3c 5.82±0.07 b 6.28±0.02 c 5.81±0.01 b 5.50±0.01 a 5.39±0.07 a 5.51±0.01 C18:1/C18:2 22.45±0.04 e 20.75±0.01 d 15.08±0.02 b 14.86±0.01 a 16.22±0.01 c 16.70±0.01 α-tocopherold 0.46±0.01 c 0.56±0.02 d 0.42±0.01 b 0.41±0.01 b 0.34±0.01 a ND o-diphenolsd 1.48±0.05 d 1.21±0.03 c 0.54±0.01 b 0.56±0.01 b 0.42±0.03 a ND total phenolsd 2.64±0.09 d 1.99±0.0629 c 1.10±0.01 ab 1.13±0.01 b 1.00±0.03 a ND o-diphenols/ 0.56±0.01 c 0.61±0.01 d 0.49±0.01 b 0.48±0.01 b 0.41±0.01 a ND total phenols complex/ 9.36±0.39 d 6.99±0.16 c 7.38±0.12 c 3.14±0.03 b 0.57±0.17 a ND simple phenol Rancimat (h) 140.3±3.3 d 118.7±1.7 c 65.7±1.0 a 72.2±1.9 b 65.1±2.0 a 4.0±0.1 a Mean values with different letters in the same row are statistically different (p 0.05). b POO, purified olive oil; ND, not detected. c Expressed as g/kg of methyl heptadecanoate. d Expressed as mmol/kg. 3.3.1. Evolution of the oxidation process The evolution of the PV in the VOO and POO samples in the course of oxidation under Rancimat conditions (100 ºC and 10 L/h air flow) is depicted in Figure 3.7. PV and K232 (data not shown for the latter) both appeared to be suitable indices for monitoring the progress of oxidation and for determining the IP in VOOs under Rancimat conditions rising linearly until the Rancimat assay end-point, when a sudden increment was observed (Figure 3.7). In all VOOs, in line with previous findings by our group and other authors (Gómez Alonso et al., 2007; Gutiérrez et al., 2002b), the PV increased linearly up to about 80– 90% of the IP following a pseudo-zero-order kinetic (R2 > 0.964). In contrast, the PV increase for POO was considerably greater from the very first (Gómez Alonso et al., 2004), fitting a second- grade polynomial equation (R2 =0.999). Under these accelerated oxidation conditions both primary and secondary oxidation indices K232, K270, and p-anisidine value followed a similar trend (data not shown). The average PV trend observed at 25 ºC for the same VOO samples (Gómez Alonso et al., 2007) is also shown in Figure 3.7 as a straight line ascending to the established end-point (20 meq of O2/kg, the maximum value established for the extra virgin category) in 96–167 weeks (Table 3.7). However, as expected, under Rancimat conditions VOO samples reached this PV in just 28–56 h, which is about 40–60% of the IP, in accordance with reports by other authors (Gutiérrez et al., 2002b). 77 3. Experiimental results Under the Rancimat conditions the UV characteristic K270, a marker of secondary oxidation products, was the first oxidation index to reach the legal limit established for the extra virgin olive oil category (EC 1989/2003), whereas at 25 ºC it was K232, an index of primary oxidation products (Table 3.7). This means that under these accelerated conditions (100 ºC and 10 L/h air flow) oxidation was very fast and hydroperoxides decomposed to secondary oxidation products much more quickly than at 25 ºC. In fact, the ratio of the oxidation rates measured under the Rancimat and at 25 ºC conditions was more than double in the case of the secondary oxidation products (445 to 798, measured by the parameter K270) than for primary products (124 to 285, measured by the K232), as depicted in Table 3.7. Figure 3.7. Evolution of peroxide value under Rancimat conditions (100 °C and air flow of 10 L/h). Samples: , A; , B; ▲, C; , D; х, E; ○, POO. Average PV trend at 25 °C (—) and Rancimat conductivity record (– · –) are illustrated Table 3.7. VOO Stability under Experimental Oxidation Conditions Expressed as Rancimat Induction Period and as the Time Taken To Reach the Legal Limits of Some Quality Indices Rancimat conditions 25 °C PV =20 meq/kg Sample IP (h) K232=2.5 (h) K270=0.22 (h) PV=20 meq/kg (h) K232=2.5 (h) K270=0.22 (h) (h and IP%) A 140.3 55.7 39.7 62.3 22.9 167a 103 a 86 B 118.7 49.8 41.9 44.7 15.7 103 a 54 66 C 65.7 32.7 49.7 28.9 20.4 96 a 53 95 a D 72.2 44.2 61.2 26.4 24.4 122 a 63 99 a E 65.1 27.9 42.8 31.3 24.8 100 a 56 114 a POO 4.0 1.2 29.8 1.8 3.8 6.8 7.7 13.3 a Times calculated by extrapolation. As Figure 3.8 clearly shows, no correlation was found between the stability at room temperature, measured as the time taken by the first oxidation index to reach the legal upper limit (K232 as previously mentioned) and Rancimat oxidative stability (R2= 5 × 10-6) in seven 78 3. Experiimental results comprehensively studied VOOs, five samples from the present study and two more from our previous work (Gómez Alonso et al., 2007). A similar plot was obtained using the time taken to reach PV = 20 as the end-point of the assay (R2=0.15). This means that the Rancimat test cannot be used to predict the real shelf life of VOOs, probably because of the different oxidation mechanisms that take place under these diverse conditions. A better correlation, although not yet satisfactory (R2= 0.55, p= 0.01), was found between stability at 25 ºC and under the Rancimat conditions, using the time required to reach PV=20 as end-point in both cases (Table 3.7). It could be helpful to investigate this matter further to see whether the Rancimat assay could be modified to provide more relevant information regarding the stability and shelf life of VOO under normal storage conditions. Figure 3.8. Correlation between VOO shelf life and Rancimat oxidative stability: , samples from the present study; ○, samples from a previous study. During oxidation under the Rancimat conditions, triacylglycerol unsaturated fatty acids (UFA: oleic, linoleic, and linolenic) remained virtually constant throughout the induction period while protected by antioxidant o-diphenols and suddenly decreased when the latter had practically disappeared, as Figure 3.9 clearly shows. The ratio between fatty acid losses under the Rancimat conditions and at 25 ºC was higher in the case of linoleic acid (4.1–5.3), followed by linolenic (2.3–4.1) and oleic (1.1–4.5) acids; this shows that the effect of the Rancimat conditions on oxidizability was greater in the case of the di-unsaturated fatty acid, although sample B presented similar rates for all three fatty acids (Table 3.8). One possible explanation is that the highest linolenic acid content in this sample produced more linolenyl peroxyl radicals at 100 ºC, which also accelerate the oxidation of oleic and linoleic acids (Frankel, 1998). No significant differences were observed in the ratio between the percentages of loss of C18:2 and C18:1 with respect to C18:3/C18:2 at 25 ºC, indicating that the presence of an additional double bond produces a proportional change in oxidizability. The same did not apply under the Rancimat conditions, when the ratio of percent loss of C18:2/C18:1 was generally higher, and the ratio of loss of C18:3/C18:2 was even lower than at 25 ºC. These ratios indicate that temperature and oxygen influenced the stability of linoleic acid more than the other unsaturated fatty acids. 79 3. Experiimental results Figure 3.9. Behaviour of o-diphenols versus the evolution of PV and UFAs during oxidation in Rancimat. Samples: , A; , ○ B; ▲, ∆ C; , D; х, x E. Solid symbols represent o-diphenols and PV; open symbols represent total UFAs Table 3.8. Ratios of Some Oxidation Parameters under Rancimat Conditions and Room Temperature Storage Oxidation Reduction (% loss) in unsaturated fatty acid Oxidized polar compounds rate a (%) Rancimat/ Rancimat/ 25 ºC 25 ºC Rancimat Rancimat/ 25 ºC 25 ºC conditions sample K232 K270 C18:1 C18:2 C18:3 C18:2/ C18:3/ C18:2/ C18:3/ oxTGs DTGs DGs FFA C18:1 C18:2 C18:1 C18:2 + PTGs A 285 704 1.5 4.5 2.5 2.80 2.68 8.34 1.50 3.57 3.76 1.15 0.66 B 124 445 4.5 4.8 4.1 2.21 2.78 2.37 2.37 1.45 4.91 0.91 0.62 C 204 656 1.1 4.1 3.2 2.15 2.17 7.86 1.68 2.01 2.75 0.88 0.72 D 201 505 1.5 5.3 2.7 3.11 2.58 11.22 1.31 1.09 1.87 0.83 0.41 E 272 798 2.8 4.3 2.3 3.83 2.55 5.82 1.34 1.27 2.14 0.66 0.57 a oxTGs, oxidized triacylglycerol monomers; DTGs + PTGs, dimeric and polymerized TGs; DGs, diacylglycerol monomers; FFAs, free fatty acids. Differences concerning the formation of polar oxidation compounds were also evaluated. The formation of these compounds drastically increased close to the Rancimat IP, causing a large analytical error in their quantification. At about 80% of the IP, the sum of dimers and polymers of TGs (DTGs + PTGs), formed mainly at high temperatures as a consequence of thermal oxidation, rose by between 1.9 and 4.9 times more than with oxidation at 25 ºC, and the oxidized triacylglycerol monomers (oxTGs) increased by between 1.1 and 3.6 times (Table 3.8). In contrast, diacylglycerols and free fatty acid contents were lower 80 3. Experiimental results than under oxidation at room temperature (0.66–1.15 for diacylglycerols and 0.41–0.72 for free fatty acids) due to further oxidation, thermal decomposition, and side reactions (polymerization and cleavage) that become significant at 100 ºC (Frankel, 1998). 3.3.2. Behaviour of Natural Antioxidants o-diphenols are the most active antioxidants in VOOs (Baldioli et al., 1996; Gutfinger, 1981; Gómez Alonso et al., 2002), which was one of the main criteria used in selecting the samples employed in this study, along with the ratios between the concentrations of the different types of phenolic compounds. Hence, samples C–E, with similar total phenol, o-diphenol, and - tocopherol contents, differed considerably in their complex/simple phenols ratio. Moreover, samples A and B possessed the highest antioxidant content; at the same time, however, the former possessed the highest total phenol and o-diphenol contents and complex/simple phenols ratio, whereas the latter had the highest α-tocopherol content and o-diphenols/total phenols ratio (Table 3.6). Under the Rancimat conditions, o-diphenols rapidly became depleted from the outset. Once they had practically disappeared, the oxidation indices, such as the peroxide value, and the oxidation products, increased sharply (Figure 3.9). The o-diphenols were considerably depleted in all samples: depletion of their initial content reached 90% before 80% of the IP; on the other hand, the depletion of tyrosol and its derivatives was less pronounced (70–86%). In contrast, the o-diphenol loss was much smaller in the same samples at 25 ºC (Gómez Alonso et al., 2007), ranging between 54 and 71%, whereas that of tyrosol and derivatives was between 33 and 58% (Figure 3.10). Under both oxidation conditions, the behaviour of hydroxytyrosol and its secoiridoid derivatives (o-diphenols) appeared to follow a pseudo-first-order kinetics: Ln 2 2 C = kt + Ln C0; 0.89 R 0.96 at 25 ºC and 0.97 R 0.99 under the Rancimat conditions. Taking into account the known lack of antioxidant activity of tyrosol and its derivatives (Baldioli et al., 1996, Mateos et al., 2003), their elevated loss at 100 ºC was presumably caused by thermoxidative degradation, which may of course also have occurred in the other phenolic compounds. With respect to simple phenols, as an example in the case of sample A, Figure 3.10 shows that hydroxytyrosol and tirosol remained practically constant at 25 ºC, probably due to a rate of hydrolysis of secoiridoid derivatives (Brenes et al., 2001), releasing simple phenols, similar to the rate of their oxidation. In contrast, under Rancimat conditions decomposition appeared to occur at a higher rate than formation from complex secoiridoids; moreover, the complex phenols also decompose more quickly, which means there is a smaller pool able to give simple phenols. As a result, concentrations of simple phenols fell from the beginning. Under the Rancimat conditions -tocopherol also decreased rapidly and almost linearly from the very first, being reduced about 99% of its initial content at 80% of the IP (Figure 3.10). The decrease of this compound was much less pronounced at 25 ºC, at which depletion was no higher than 30% in any sample. As Figure 3.10 shows, in the case of sample A, this compound remained nearly constant during more than 40 weeks of storage at 25 ºC; under the Rancimat conditions, however, -tocopherol content dropped from the very first. The rapid decrease 81 3. Experiimental results observed under the Rancimat conditions could be due mainly to the very high susceptibility of this molecule to oxidation to -tocopherolquinones at high temperatures (Verleyen et al., 2001), which diminishes the protection of unsaturated fatty acids against oxidation. Figure 3.10. Behaviour of phenolic compounds and -tocopherol under Rancimat conditions and at room temperature: hydroxytyrosol; hydroxytyrosol + secoiridoids of hydroxytyrosol (o-diphenols); , tyrosol; , tyrosol + secoiridoids of tyrosol; , -tocopherol. The synergistic effect of o-diphenols and -tocopherol studied by some authors is dependent on the relative concentration of both antioxidants and the oxidation level of the lipid matrix (Blekas et al., 1995). Moreover, according to the results of this study it would be strongly related to the oxidation conditions used because it is considerably different at ambient and accelerated conditions. Therefore, the antioxidant capacity determined under accelerated 82 3. Experiimental results oxidation conditions (Mateos et al., 2005; Baldioli et al., 1996; Mateos et al., 2003) could probably not be ascribed as well at room temperature. On the basis of the existing literature and the results reported in this study, which highlight how the oxidation process under Rancimat accelerated conditions (similar to AOM and OSI) differs from oxidative stability at room temperature, it is confirmed that no correlation exists between the stability under normal storage conditions and the Rancimat induction period (Figure 3.8). Therefore, although these rapid assays are very useful in measuring a relative oxidative stability index for virgin olive oils and other edible oils, moreover providing a good correlation with concentrations of phenolic compounds as we know, they cannot be used to extrapolate the shelf life of these food products because this correlation has not been confirmed at room temperature (Cinquanta et al., 2001; Gómez Alonso et al., 2007). 3.4. KINETIC STUDY FOR THE DEVELOPMENT OF AN ACCELERATED OXIDATIVE STABILITY TEST TO ESTIMATE VIRGIN OLIVE OIL POTENTIAL SHELF LIFE This study proposes an accelerated test performed at mild temperature (40–60 ºC) to measure oxidative stability and estimate the potential shelf life of extra-virgin olive oil (EVOO). The kinetic behaviour of normalized oxidation indices (PV, K232 and K270) and the oxidizing substrate [unsaturated fatty acids (UFA)] during storage of different virgin olive oil samples in darkness and at different temperatures (25–60 ºC) is reported for the first time. PV and K232 followed an apparent pseudo zero-order kinetics (R2 ≥ 0.951) at all the experimental temperatures in all samples, whereas the evolution of K270 apparently better fitted a pseudo first-order kinetics (R2 ≥ 0.926). The temperature-dependent kinetics of the oxidation indices and the UFA were well described by the linear Arrhenius equation between 25 and 60 ºC (0.960 R2 0.999, p < 0.05). The best correlation between loss of PUFA and increase of oxidation product indices was K232 (0.581 R2 0.924). The time required to reach the upper limits for PV, K232 and K270 established for the EVOO category in the current EU legislation correlated well with temperature using a potential equation, making it possible to set up an accelerated stability test at temperatures below 60 ºC to estimate the potential shelf life under normal storage temperature conditions. 3.4.1. Kinetic behaviour of oxidation indices Initial composition and quality indices are reported in Table 2.1. The oxidation indices PV, K232 and K270 increased constantly during the 21-month storage period at 25 ºC, as reported elsewhere (Gómez Alonso et al., 2007), whereas at 40, 50 and 60 ºC a stationary phase was observed after a few weeks of storage, as depicted in Figure 3.11 a–c. During the early storage, before reaching the plateau, PV and K232 followed an apparent pseudo zero-order kinetics (R2 > 0.951) at all temperatures and for all samples studied. These results are in agreement with those reported by Calligaris et al. (2006) in the same temperature range. 83 3. Experiimental results It is worth noting that the behaviour of the PV was very similar in all samples, regardless of differences in initial antioxidant content, except at the highest temperature, 60 ºC. In this case, the stationary phase was reached later in samples with higher initial antioxidant content (I–III); however, samples IV–VII presented a short stationary phase followed by a sharp rise in PV (Figure 3.11a for samples I and V). For K232 the evolution at 60 ºC presented the same apparent differences between samples as in the case of the PV behaviour; however, both the short stationary phase and the later increase in samples IV–VII were less evident (Fig. 3.11b). The plot of K270 value versus time did not result in a straight line as in the case of PV and K232. At 40, 50 and 60 ºC the rate of increase in the first weeks of storage was slower; also, this lag-phase was shorter as temperature increased, since it is likely that the time required reaching the activation energy of the hydroperoxide decomposition reaction decreases as temperature increases. After the rising period, a stationary phase was observed at 40 and 50 ºC but not at 60 ºC (Figure 3.11c). Thus, the evolution of this index of secondary oxidation products seemed to correlate better with a pseudo first-order kinetics (R2 >0.926), especially at 40–50 ºC. The calculated oxidation rate constants (k) are reported in Table 3.9. The lowest values at all temperatures were recorded in sample II for PV (0.085–1.37 at 25 and 60 ºC, respectively), K232 (0.0058–0.151) and K270 (0.0039–0.134), and the highest were those of sample IV for PV (0.16–3.12) and K232 (0.0183–0.326) and sample V for K270 (0.0081–0.189). The determination coefficients (R2) ranged between 0.926 and 0.999 (p <0.05), indicating that the fits were suitable. European Regulation (EC 2568/91 and following amendments) has set maximum values for PV, K232 and K270 for VOO to qualify for the extra-virgin category at 20 meq/kg, 2.5 and 0.22, respectively. The experimental or extrapolated time required to reach the upper limit (TRUL), which represents the storage time needed to lose the maximum VOO commercial category due to oxidation, is reported in Table 3.10. The upper limit value for PV was not reached by any sample at 25 ºC, nor by samples II and VII at 40 ºC, sample VII at 50 ºC or sample II at 60 ºC. In all cases, stabilization occurred below or slightly above this limit (Figure 3.11 a–c). The fact that this limiting value for peroxides was not reached after 21 months of storage in open bottles at 25 ºC or even under more drastic conditions (40, 50 and 60 ºC) could mean that it is not a good reference value to assess the quality of olive oil, especially when it has been stored for a certain period of time. It is well known that peroxides decompose at advanced oxidation stages (Frankel, 1998); so while the PV decreases, oxidation and hence quality depreciation carries on. Unlike PV, the upper K232 limit value for EVOO was reached in practically all samples, over 21 months of storage at 25 ºC (Gómez Alonso et al., 2007), and earlier as storage temperature increased (Table 3.10). Curiously, K232 and PV tended to stabilize at a similar value in each sample at 40, 50 and even 60 ºC (Fig. 3.11 a–c). All samples reached the EU upper K270 limit value for EVOO (0.22) during the experimental period, with the exception of samples V and VI at 25 ºC (Table 3.10). 84 3. Experiimental results Figure 3.11. Evolution of oxidation indices (PV, K232 and K270) and PUFA at 25, 40, 50 and 60 ºC during storage. Samples: I , ; V, , ; error bars show confidence limits, expressed as ± 2 SD. 85 3. Experiimental results Table 3.9. Oxidation rate constants (k) for PV, K232 and K270 at the experimental temperatures studied Samples T (ºC) I II III IV V VI VII PVa (x 10–1) 25 1.49±0.06 0.85±0.04 1.54±0.07 1.60±0.06 1.39±0.04 1.23±0.06 1.01±0.04 40 5.48±0.20 3.65±0.40 7.13±0.70 8.27±0.80 6.04±0.60 4.29±0.40 4.08±0.30 50 10.1±0.8 9.18±0.4 15.6±0.7 13.9±1.3 10.0±1.3 8.94±0.4 8.30±0.9 60 22.0±0.2 13.7±1.5 28.5±2.0 31.2±0.8 23.0±0.4 17.9±0.1 14.6±1.6 K232b (x 10–2) 25 1.68±0.09 0.582±0.08 1.46±0.06 1.83±0.096 1.53±0.05 1.36±0.05 1.23±0.06 40 7.44±0.29 4.21±0.53 7.14±0.56 9.30±0.85 8.54±0.60 6.45±0.34 7.69±0.50 50 14.0±0.54 9.95±0.54 16.3±1.28 20.2±1.38 18.8±1.16 12.4±0.32 14.3±0.62 60 30.3±3.32 15.1±0.551 21.2±3.23 32.6±0.904 30.6±2.97 22.5±1.02 31.3±3.03 K270c (x 10–3) 25 6.77±0.44 3.87±0.23 6.84±0.41 6.10±0.33 8.06±0.41 5.65±0.39 5.56±0.52 40 41.9±1.42 37.1±1.54 45.7±2.36 46.0±2.29 53.5±2.79 43.4±2.47 40.1±3.51 50 87.9±3.20 81.9±5.83 82.4±7.92 119± 9.75 121±7.87 79.9±6.50 86.0±3.66 60 161±22 134±9.6 137±16 170±10 189±24 169±3.3 164±9.0 a Pseudo zero-order kinetics: C = C0 + kt; k in meq/kg/week; C0 in weeks. b Pseudo zero-order kinetics: C = C0 + kt; k in mmol/kg/week; C0 in weeks. c Pseudo first-order kinetics: Ln C = Ln C0 + kt; k in week–1; C0 in weeks. Table 3.10. Time required reaching the EVOO category upper limit (TRUL, weeks) for PV, K232 and K270 Samples T (ºC) I II III IV V VI VII PV = 20 meq/kg – 0.992 R2 1.000 ** 25 97.5* 170.3* 110.0* 102.0* 123.2* 109.6* 140.6* 40 25.3 37.0* 22.5 16.4 26.1 29.0 33.6* 50 12.3 14.8 10.3 8.4 12.7 12.9 15.2* 60 5.6 8.4* 5.4 3.8 5.8 6.2 8.4 K232 = 2.5 – 0.995 R2 1.000** 25 34.0 108.7* 52.8 48.7 61.7 61.1 63.7 40 6.2 15.8 10.0 8.0 10.0 11.9 9.4 50 2.4 6.5 4.7 3.5 3.4 5.8 4.5 60 1.3 4.0 2.6 2.2 2.2 3.2 2.1 K270 = 0.22 – 0.987 R2 0.997** 25 37.1 74.7 66.7 90.1 97.4* 103.9* 78.1 40 7.8 14.7 14.3 16.9 20.5 21.6 15.4 50 2.2 4.7 5.5 5.4 6.3 8.6 5.4 60 1.1 2.5 2.1 3.1 3.4 4.1 2.8 * The upper limit value was not reached during the experimental period ** TRUL vs. T; TRUL = aTb 86 3. Experiimental results 3.4.2. Behaviour of the oxidizing substrate (UFA) The evolution of the oxidizing substrate, mainly the polyunsaturated fatty acids (PUFA), is depicted in Figure 3.11 d together with the kinetic behaviour of primary and secondary oxidation products. The unsaturation grade of fatty acids and the storage temperature were decisive factors accounting for the different oxidation rates observed. Thus, while the oleic (C18:1) acid content remained practically constant during the experimental period at all temperatures studied, linoleic (C18:2) and linolenic (C18:3) acids decreased almost linearly and at a rate increasing with temperature, presenting a lag phase during the first weeks at 25 ºC and a deceleration during the final stages at 40 and 50 ºC. No significant differences were observed in UFA oxidation rates between samples with respect to their initial antioxidant contents; however, at 60 ºC the plateau was reached later in samples with higher antioxidant content (I–III) and the decrease was faster in samples IV–VII. As an example, see samples I and V in Figure 3.11 d. This is consistent with the observed evolution of PV and K232 noted earlier. The ratios of unoxidized fatty acids C18:1/C18:2, C18:1/C18:3 and C18:2/C18:3 increased slightly with time (data not shown), since the more unsaturated a fatty acid is, the more oxidizable it is. This behaviour was similar in all samples at 25, 40, 50 and 60 ºC, except in samples IV–VII at 60 ºC in which these ratios were considerably higher by the end of the storage period. The best correlation between loss of PUFA and increase of oxidation indices measuring oxidation products was recorded for K232, not only at 25 ºC (Gómez Alonso et al., 2007) but also at 40, 50 and 60 ºC (0.581 R2 0.924). 3.4.3. Effect of temperature on stability It is very relevant to determine the relationship between storage temperature and VOO oxidation rate since (i) oxidative stability may in principle be defined in terms of a rate constant (k) defining lipid matrix degradation or oxidation product formation, and (ii) temperature (T) is one of the most important factors affecting oxidation in accelerated shelf life testing (ASLT). Regression analyses employing the Ln k vs. 1/T equation are depicted in Figure 3.12. These indicate that the temperature dependence of oxidation indices and UFA rates were well described by the linear Arrhenius model between 25 and 60 ºC (0.960 R2 0.999, p < 0.05). The apparent activation energy (Ea) calculated from primary oxidation indices and UFA data was comparable for all samples; mean values were 64.8 ± 2.8 kJ/mol for PV, 69.6 ± 4.9 kJ/mol for K232 and 67.6 ± 5.4 kJ/mol for PUFA. The similarity of these values supports the assumption that degradation of PUFA leads to peroxide and conjugated diene formation. A higher activation energy (mean 77.1 ± 4.4 kJ/mol) was calculated for the secondary oxidation index K270. As regards oxidizing substrates, the variation between samples was higher in the case of oleic acid (76.3 ± 22.9 kJ/mol). The experimental values obtained in this study were consistent with earlier data that report Ea values for lipid oxidation from 24 to 240 kJ/mol (Frankel, 1998; 1993; Tan et al., 2001). It is worth noting that the activation energy for the formation of primary and secondary oxidation products in the EVOO used was twice the activation energy for PV and 87 3. Experiimental results K270 determined in purified olive oil (32.1 and 42.2 kJ/mol, respectively) according to data reported in an earlier paper (Gómez Alonso et al., 2004). The action of antioxidants as peroxyl radical scavengers delays the propagation phase of lipid oxidation, so that more energy would be needed for the formation and decomposition of hydroperoxides. Figure 3.12. Arrhenius plot: Effect of temperature on oxidation rate constants. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII Another way to express the dependence of the reaction rate on temperature is to employ the Q10 factor. According to equation [5] (point 2.5 in “Metodología”), the Log k vs. T plots resulted in straight lines (0.948 R2 0.998, p <0.05) for the indices PV, K232 and K270 (data not shown). 3.4.4. Prediction equation for the accelerated stability test Although VOO may be consumed even years after production without risk to health, its prized sensory and nutritional properties are significantly affected by oxidation, and that is the main cause of quality depreciation. Thus, from commercial and economic standpoints it should be most useful to be able to predict VOO stability or shelf life by means of an accelerated test that can be performed at a mild temperature. VOO stability or shelf life may be defined and based on the TRUL established in the EU regulation for the EVOO category. The experimental or extrapolated TRUL values for PV, K232 88 3. Experiimental results and K270 from this study are reported in Table 3.10; they correlate satisfactorily with temperature (T, ºC) using a potential equation, TRUL = aTb (Table 3.10), as depicted in Figure 3.13 in the case of K232. Figure 3.13. Correlation between TRUL and temperature for K232 (TRUL = aTb). Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII To estimate the potential shelf life by means of an accelerated test at temperatures below 60 ºC, we suggest that K232 is the best normalized index for oxidation monitoring in that (i) it is a good marker of primary oxidation products, (ii) it is the first normalized index to remain within the EU limits at all the temperatures studied (Table 3.10), (iii) it presents high linearity in the early stages of oxidation, making it possible to calculate a rate of oxidation from which the shelf life can be estimated, (iv) it presents the best correlation with loss of UFA, and finally (v) it is simple to determine, the procedure is highly repeatable and reproducible, and it presents no problems of interference with other natural compounds in olive oil (such as phenolic compounds which absorb at 280 nm and can interfere with the parameter K270). On the basis of the experimental results observed in this study, we therefore conclude that it is feasible to perform an accelerated stability test at a temperature below 60 ºC to estimate the shelf life under normal storage temperature conditions. Table 3.11 shows that the predicted TRUL for K232 with the proposed method, by using a mean value for factor “b”, is 89 3. Experiimental results reasonably similar to the experimental TRUL in the VOO samples studied (determination coefficients and confidence intervals are shown in Table 3.11). Table 3.11. Comparison between the experimental and predicted TRUL for K232 (weeks) by means of the proposed method based on a potential equation (TRUL = aTb) Samples Experimental TRUL Predicted TRUL Experimental TRUL Confidence interval at: at 25 ºC at 25 ºC * 40 ºC R2 = 0.896 I 6.2 35.4 34.0 31.9–39.2 II 15.8 90.6 108.7 81.7–100.5 III 10.0 57.7 52.8 52.0–64.0 IV 8.0 45.8 48.7 41.3–50.8 V 10.0 57.3 61.7 51.7–63.5 VI 11.9 68.2 61.1 61.5–75.6 VII 9.4 54.2 63.7 48.9–60.1 * 50 ºC R2 = 0.689 I 2.4 31.1 34.0 26.7–36.2 II 6.5 86.0 108.7 73.8–100.1 III 4.7 61.6 52.8 52.9–71.7 IV 3.5 45.7 48.7 39.2–53.2 V 3.4 45.2 61.7 38.8–52.6 VI 5.7 75.4 61.1 64.7–87.8 VII 4.5 59.9 63.7 51.4–69.8 * 60 ºC R2 = 0.768 I 1.3 32.7 34.0 27.0–39.6 II 4.0 104.6 108.7 86.2–126.8 III 2.6 67.6 52.8 55.7–81.9 IV 2.2 56.2 48.7 46.3–68.1 V 2.2 55.8 61.7 46.1–67.7 VI 3.2 82.4 61.1 68.0–99.9 VII 2.1 54.3 63.7 44.8–65.8 “b” mean value for K232 = –3.72 ± 0.22 * Correlation between predicted and experimental TRUL according to the proposed model Q10 factors obtained from experimental TRUL values were similar for all samples, as shown by their mean values: 2.10 ± 0.2 for PV, 2.07 ± 0.4 for K232 and 2.51 ± 0.6 for K270. This means that an increase of 10 ºC in the experimental temperature reduces the time taken by the test by more than half. Finally, based on the reported kinetics results, a study on VOO real storage conditions with limited oxygen availability (reduced headspace) may now be carried out to confirm the general applicability of the proposed stability test. In addition to the development of this accelerated method for VOO stability and potential shelf life estimation, in view of the role of 90 3. Experiimental results major and minor VOO components in the oxidation process, this group made further research into the relationship between the stability of VOO and its initial composition. 3.5. STABILITY OF TUNICIAN VIRGIN OLIVE OIL VARIETIES AND BEHAVIOUR OF ITS NATURAL ANTIOXIDANTS UNDER MEDIUM TEMPERATURE ACCELERATED STORAGE CONDITIONS The aim of the present study was to advance in understanding virgin olive oil stability, in particular the behaviour of its natural antioxidants during long-term storage. The changes undergone by tocopherols and complex and simple phenolic compounds and their antioxidant activity were studied under medium temperature (50 ºC) accelerated oxidation conditions over a storage period of 8 months. Different oxygen availability (open and closed bottles, OB and CB) and four different monovarietal Tunisian virgin olive oils (VOO; Chemlali, Chétoui, El Hor and Oueslati) which vary in their fatty acid profile and content of natural antioxidants were employed. Oueslati VOO showed the lowest initial oxidation rate (4.6 PV/week) and as a consequence the highest induction period (IP; 16 days) as compared to the other VOOs studied (initial rate from 7.7 to 12.1 PV/week and IP from 9 to 12 days for El Hor and Chemlali, respectively, in both cases). In all cases, the complete depletion of -tocopherol corresponded with the observed induction period. Since the oxidation rate in the varieties studied is not sufficiently different to explain the great differences in the initial degradation rate observed in the phenolic compounds (mainly between Chétoui VOO, 163 μmol kg -1 week -1, as compared to the other VOO oils, e.g. 6.1 and 2.5 μmol kg -1 week -1, respectively, in Chemlali and El Hor VOOs), a concentration dependent degradation rate of complex phenols is suggested. 3.5.1. VOO varieties initial characteristics in this study The monovarietal VOOs obtained from the olive varieties studied in this assay, Chemlali, Chétoui, El Hor and Oueslati, represent the most common olive cultivars grown throughout Tunisia and especially in the north and the centre of the country. The values of the quality parameters were below the upper limits established by the EC Regulations in all the samples employed in this study as reported in Table 3.12. All samples were comparable in terms of quality indices and their initial oxidative status (e.g. free acidity between 0.25% and 0.50%; peroxide values between 7.8 and 15.2 meq/kg), but they varied considerably in terms of their initial composition in fatty acid and amounts of minor components with antioxidant activity. The fatty acid profile of olive oil as is well known is one of the main responsible factors for the high oxidative stability of virgin olive oil. It is one of the characteristics predominantly determined by the genotype and is under a lower influence from environmental factors especially the monounsaturated-to-polyunsaturated ratio (Velasco et al., 2002). Table 3.12 gives the ranges for the main fatty acids in the studied VOO varieties in which statistically significant differences were observed (oleic acid from 59% in Chemlali to 74% in Oueslati; linoleate from 9.7% in El Hor to 16.8% in Chemlali; linolenate from 0.62% in Ouslati to 0.70% in Chétoui and El Hor). The reported results were in accordance with previously published data on these varieties (Ben Temine et al., 2004; Krichène et al., 2007). 91 3. Experiimental results Table 3.12. Initial composition and quality indices of the Tunisian virgin olive oil varieties studied Virgin Olive Oil Samples Chemlali Chétoui El Hor ▲ Oueslati Free acidity (% C18:1) 0.48 ± 0.02c 0.25 ± 0.01a 0.30 ± 0.01b 0.50 ± 0.01c PV (meq O2/kg) 13.2 ± 0.3c 7.8 ± 0.3a 9.5 ± 0.5b 15.2 ± 0.3d K232 2.24 ± 0.05b 2.39 ± 0.02c 2.19 ± 0.01b 2.06 ± 0.02a K270 0.10 ± 0.01a 0.18 ± 0.01c 0.12 ± 0.01ab 0.13 ± 0.00b C16:0 (%) 18.3 ± 0.5c 10.0 ± 0.1a 14.42 ± 0.14b 10.42 ± 0.31ª C18:1 (%) 59.1 ± 0.4a 69.0 ± 0.1b 69.7 ± 0.2b 73.9 ± 0.1c C18:2 (%) 16.8 ± 0.2d 15.1 ± 0.1c 9.7 ± 0.1a 11.0 ± 0.1b C18:3 (%) 0.67 ± 0.01b 0.70 ± 0.01b 0.70 ± 0.01b 0.62 ± 0.01a b d c a -Tocopherol (mg/kg) 238.2 ± 2.9 378.5 ± 11.7 316.6 ± 3.3 160.0 ± 0.7 a c b a Total polar phenols (µmol/kg) 176 ± 2 1263 ± 55 356 ± 38 196 ± 4 Hydroxytyrosol secoiridoid derivatives 61.63 ± 0.88a 771.07 ± 16.84c 58.94 ± 2.62a 80.97 ± 1.17b (µmol /kg) c d b a Hydroxytyrosol (µmol /kg) 5.06 ± 0.02 10.49 ± 0.12 1.55 ± 0.07 1.28 ± 0.01 Tyrosol secoiridoid derivatives 74.20 ± 2.03a 393.84 ± 13.73c 257.59 ± 11.53b 67.41 ± 2.32a (µmol/kg) b a a b Tyrosol (µmol /kg) 15.92 ± 0.83 11.71 ± 0.41 11.23 ± 0.13 15.64 ± 0.42 a b a a o-Diphenols (µmol/kg)* 66.69 ± 0.90 781.56 ± 29.25 60 .50 ± 5.74 82.25 ± 0.80 a c b d Oxidative stability (h)** 21.3 ± 0.10 41.9 ± 0.1 33.6 ± 0.2 43.5 ± 0.4 a c a b DPPH (µmol Trolox/kg) 659 ± 6 1803 ± 79 625 ± 64 1242 ± 38 Means ± SD, significant differences in the same row are showed by different letters (p < 0.05) * Expressed as the sum of hydroxytyrosol and its derivatives. ** Expressed as Rancimat IP at 100 ºC and 10 l/h air flow. Because of the purpose of this study, these monovarietal Tunisian virgin olive oils were selected on the basis on known differences in their natural antioxidant contents. As expected statistically significant differences between VOO varieties were observed as reported in Table 3.12. The -tocopherol content in the VOOs studied varied from 160 mg/kg in Oueslati to 378 mg/kg in the Chétoui variety. The initial concentration of the total polar phenolic compounds ranged widely from 176 µmol ·kg-1 in Chemlali oil to 1263 µmol ·kg-1 was observed in Chétoui oil (771 µmol ·kg-1), whereas a much lower and similar concentration was observed for the other three varieties studied (59, 62 and 81 µmol ·kg-1 in El Hor, Chemlali and Oueslati respectively). Tyrosol derivatives contents were similar in Oueslati and Chemlali oils (67 and 74 µmol ·kg-1) and much higher in El Hor and Chétoui (258 and 394 µmol ·kg-1between 11–12 µmol ·kg-1 (Chétoui and El Hor) and 16 µmol ·kg-1 92 3. Experiimental results (Chemlali and Oueslati). For hydroxytyrosol, Chétoui contained the highest amount (11 µmol ·kg1), while Oueslati and El Hor presented the lowest amount (1.3 and 1.6 µmol·kg-1, respectively). On the basis of the fatty acid and antioxidant composition, a relevant difference in the oxidative stability of the studied monovarietal VOO was expected. In fact, the Rancimat induction period (IP) varied considerably between samples: Chemlali oil was the least stable with an IP mean value of 21.3 h while Chétoui and Oueslati oils were the most stable with 41.9 and 43.5 h, respectively (Table 3.12). A similar trend, although with some differences, was observed for the antioxidant capacity measured by the DPPH assays, ranging from 625 and 659 µmol trolox·kg-1 for El Hor and Chemlali oils, to 1242 µmol trolox·kg-1 for Oueslati and 1803 µmol trolox·kg-1 for Chétoui. 3.5.2. VOO stability during storage The evolution of the oxidation indices and changes in the major and minor composition of the four monovarietal VOOs studied over a storage period of 8 months under medium temperature (50 ºC) accelerated oxidation conditions in closed (CB) and open (OB) bottles was monitored and analysed. Figure 3.14 reports the progress of the oxidation process in the monovarietal VOOs studied. As is well known, PV (or K232) and K270, the former (PV and K232) expressing the hydroperoxide content, and the latter the formation of secondary oxidation products, are suitable indices for monitoring the progress of oxidation (Frankel, 2005). As expected, in the case of CB samples a much lower oxidation rate was observed; both the PV (Figure 3.14 a) and K270 (Figure 3.14 b) slowly and almost linearly increased during the 33 week storage assay, and a definite faster increase in PV was observed only towards the end of the storage period. On the contrary, in the case of OB samples, in the absence of oxygen limitation, a strong and extended oxidation was observed throughout the storage period with a PV higher than 200 meq/kg at the end of the assay. Typical behaviour in the formation of primary oxidation products was also observed which, as known, is characterised by an induction period and an exponential increase. The evolution of PV was similar in all the VOO samples studied with the exception of Oueslati oil which showed a significantly lower progress of oxidation. A similar behaviour was also observed for K232 (data not shown). On the basis on the evolution of PV (Figure 3.14 a) the initial oxidation rate and the induction period (IP) were estimated (Table 3.13). Oueslati VOO indeed showed the lowest initial oxidation rate (4.6 PV/week) and as a consequence the highest IP (16 days), as compared to the other VOOs studied (initial rate from 7.7 to 12.1 PV/week and IP from 9 to 12 days for El Hor and Chemlali, respectively). This behaviour was also confirmed by the evolution of the secondary oxidation products (K270, Figure 3.14 b) as well as by the lowest decomposition rate of the oxidising substrate, the unsaturated fatty acids (UFA; from 0.13 g/100 g/w), in the Oueslati oil, as reported in Table 3.13. 93 3. Experiimental results Figure 3.14. Evolution of peroxide value (PV) and K270 during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) Oueslati virgin olive oil is characterised by the lowest α-tocopherol content (160 mg/kg, as compared to the range in the VOO varieties studied of 160 up to 378 mg/kg), low total phenol and o-diphenol contents (196 and 83 µmol ·kg-1, respectively, as compared to 176–1263 and 61– 782 µmol ·kg-1 in the samples analysed), highest C18:1 (74%, as compared to the range 59–74% observed) and low C18:2 contents (11%, as compared to 10–17%). Its favourable fatty acid composition, within the VOO varieties studied, is not very different from that of El Hor, which moreover possesses double the amount of α-tocopherol. Therefore this does not apparently explain the significant higher stability observed in this variety. Moreover, Chetoui, with the highest initial oxidation rate (12.1 PV/week), is nevertheless the variety with the highest content 94 3. Experiimental results of both α-tocopherol (378 mg/kg) and o-diphenols (782 µmol ·kg-1), and therefore the effect of the natural antioxidants present in VOO is not still clear. On the basis of these facts and also on the preliminary results of this research group, the significantly lower oxidation rate observed in the case of the Oueslati VOO may be due to a certain pro-oxidant effect exerted by the α- tocopherol at the beginning of the oxidation process. Indeed, a satisfactory direct correlation (R2= 0.991) is obtained between the contents of α-tocopherol and C18:2 (independent variables) and the initial oxidation rate observed. Table 3.13. Initial oxidation rate and induction period (IP) Chemlali Chétoui El Hor ▲ Oueslati OB (open bottles) PV/week 8.6 12.1 7.7 4.6 IP (day) 9 12 9 16 UFA/week (g/100 g/w) 0.22 0.23 0.38 0.13 CB (closed bottles) PV/week 1.27 0.71 1.14 0.35 IP (day) n.a. n.a. n.a. n.a. n.a., not applicable. UFA, unsaturated fatty acid. As a consequence of the accelerated eight month storage period described, the free acidity of both the OB and CB-stored VOO samples increased slowly and linearly at the beginning of the oxidation process and for up to 9–12 weeks at a similar rate (between 0.015% and 0.020% per week) as depicted in Figure 3.15. After this period a much faster increase in free acidity was observed in the OB samples, once again at a similar rate (0.16% per week on average) with the exception of the Oueslati VOO (0.012% per week), which therefore possessed the lowest value of free acidity at the end of the storage period (1.55% after 33 weeks). Contrary to this, all the CB VOO samples followed the same linear trend observed at the beginning of the storage up to the end of the assay (33 weeks) with final free acidity values of between 1.10% and 1.20%. 3.5.3. Behaviour of natural antioxidants The different oxidation rates observed in the monovarietal VOO samples studied should be the result of the combined effects of their fatty acid profile and the action of pro- and/or antioxidant minor compounds present in the oils. As the oils lose their antioxidant capacity during the accelerated oxidation assay, it may be expected that the endogenous antioxidative system is being progressively depleted. To better understand the role of these minor components in the VOO oxidative stability changes in their com-position were monitored during the progress of oxidation. 95 3. Experiimental results Figure 3.15. Evolution of free acidity during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) Figure 3.16. Behaviour of -tocopherol during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) -Tocopherol is by far the predominant tocopherol isomer present in virgin olive oil, which is moreover the biologically most active. For both open and closed bottling conditions a certain loss of -tocopherol was observed during storage suggesting that it is being used to protect the oil against oxidation. However, as expected, the degradation rate was very different 96 3. Experiimental results for the two conditions studied, since its content was lost much more quickly in oils stored in OB than in CB (Figure 3.16). In fact, in OB samples a rapid decrease in the amount of α-tocopherol until its complete disappearance at 9–12 weeks was observed at a similar rate in all samples with the exception of the Oueslati VOO, which showed, as previously reported, the lowest oxidation rate (Figure 3.14 and Table 3.13) within the studied varieties. In all cases, including the last one, the complete depletion of α-tocopherol corresponded with the IP observed in the PV curve (Figure 3.14 and Table 3.13), clearly showing the apparent relationship between the observed effect – the disappearance of α-tocopherol – and the cause – the progress of oxidation, measured as PV increase – and therefore its antioxidant role. On the other hand, as previously reported, an apparent direct relationship was observed between the initial α-tocopherol content and the initial oxidation rate observed in the VOOs studied, showing a probable pro-oxidant effect of this compound, although this statement requires further detailed investigation. In samples stored in CB a similar behaviour was observed in all cases. After an initial decrease during the first weeks of storage, the degradation rate of α-tocopherol slowed and a plateau was almost reached. In all cases, a similar amount of α-tocopherol was lost in the olive oils during the eight-month storage period (between 90 and 110 mg/kg). As is already known, the polar phenolic fraction of VOO consists of a heterogeneous mixture of compounds that varies in terms of chemical and sensory properties and impact on the stability of VOO (Servili et al., 2002). As shown in Figure 3.17 the content of both oleuropein-derived aglycons (aldehydic and dialdehydic forms of elenolic acid linked to hydroxytyrosol) and ligstroside-derived aglycons (aldehydic and dialdehydic forms of elenolic acid linked to tyrosol) were rapidly reduced under the medium temperature (50 ºC) accelerated storage conditions of the assay. Since, the oxidation rate observed in the VOO varieties studied is not sufficiently different (Table 3.13) to be able to explain the great difference in the initial degradation rate obtained in the study (Table 3.14), mainly between Chétoui VOO (163 μmol kg -1 week -1) as compared to the other VOO oils (e.g. 6.1 and 2.5 μmol kg -1 week -1, respectively, in Chemlali and El Hor VOOs), a concentration dependent degradation rate of secoiridoid phenols is there-fore suggested. Moreover, a great degradation is also observed in the case of tyrosol derivatives (Figure 3.17 b), which, as is well known, do not possess any antioxidant activity (Papadopoulos et al., 1991), and even in the CB stored samples in which the oxidation rate is much lower (Table 3.13). Therefore, the decrease observed in the VOO complex phenols must be largely due to a lack of stability of these secoiridoid compounds and be only partially related to the antioxidant role of some of them. A certain direct linear correlation between the initial concentration of the secoiridoid families and the observed initial degradation rate (Table 3.14) was observed in both cases for OB and CB samples (R2 0.98; slopes 0.22 per week and 0.07 per week, respectively). This aspect, related to the stability of complex phenolic compounds in VOO, is of great relevance from the antioxidant and nutritional point of view and it is currently under further investigation by this research group. 97 3. Experiimental results Figure 3.17. Behaviour of hydroxytyrosol and tyrosol secoiridoid derivatives during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) The initial degradation rate observed in the secoiridoid compounds is quite significant, even in the CB samples as previously mentioned although nevertheless 2–4 times lower than in OB (Table 3.14). As a consequence, the residual amount of the complex phenolic compounds after the eight month accelerated storage at 50 ºC is significantly higher than in OB samples, in particular when the initial concentration of oleuropein or ligstroside-derivated compounds is high (Chétoui: 91 µmol ·kg-1 of residual hydroxytyrosol derivatives and 114 µmol ·kg-1 of residual tyrosol derivatives, and El Hor: 30 and 70 µmol ·kg-1, respectively; Figure 3.17 and Table 3.14). 98 3. Experiimental results Table 3.14. Initial degradation rate of hydroxytyrosol and tyrosol derivatives during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) Chemlali Chétoui El Hor ▲ Oueslati Htyr derivatives (µmol/kg) 61.6 771.1 58.9 81.0 OB (µmol/kg/week) 2.54 163 6.06 n.a. CB (µmol/kg/week) 1.37 51.9 1.16 1.54 Tyr derivatives (µmol/kg) 74.2 393.8 257.6 67.4 OB (µmol/kg/week) 6.06 57.4 50.8 3.0 CB (µmol/kg/week) 3.11 17.5 14.1 1.72 n.a., not applicable Figure 3.18. Behaviour of hydroxytyrosol and tyrosol during storage at 50 ºC in open (OB) and closed bottles (CB) 99 3. Experiimental results The content of the simple phenols hydroxytyrosol (Htyr, o-diphenol) and tyrosol (Tyr, mono-phenol), in all cases increased in the initial stage of storage (Figure 3.18) as a result of phenolic aglycon hydrolysis (Brenes et al., 2001). Nevertheless, the behaviour of hydroxytyrosol in OB stored samples was very different. In fact, after an initial increase a clear decrease was observed probably due to its decomposition acting as an antioxidant. The concentration of the hydroxytyrosol measured in VOO at a particular time would therefore be the sum of its formation from the decomposition of its secoiridoid derivatives (Figure 3.17a and Table 3.14) and its decomposition due to its role as antioxidant (Figure 3.18a). In the case of the Oueslati VOO, in which the observed oxidation rate is the lowest (4.6 PV/week; Table 3.13), the decomposition rate of hydroxytyrosol was also significantly lower than in the case of Chétoui. Moreover, the degradation of hydroxytyrosol was practically not observed in CB samples (Figure 3.18a), in which the oxidation rate is much lower (0.35–1.27 PV/week; Table 3.13) than in OB stored VOOs. This observation may also indicate that, unlike its secoiridoid derivatives, hydroxytyrosol is probably a more stable compound in VOO. Finally, the behaviour of both hydroxytyrosol and tyrosol in CB stored samples during the eight-month assay was very similar; apparently showing once again that the very different behaviour observed between these two compounds in OB samples, where a greater stability of the mono-phenol (tyrosol) can be detected (Figure 3.18), is mainly due to the antioxidant role of hydroxytyrosol. 3.6. ANTIOXIDANT CAPACITY OF INDIVIDUAL AND COMBINED VIRGIN OLIVE OIL MINOR COMPOUNDS EVALUATED AT MILD TEMPERATURE (25 AND 40 ºC) AS COMPARED TO ACCELERATED AND ANTIRADICAL ASSAYS The individual and combined antioxidant and antiradical capacity of the main minor compounds of virgin olive oil (-tocopherol, hydroxytyrosol, tyrosol and oleuropein aglycone) spiked in Purified Olive Oil (POO) as the lipid matrix model is described. The antioxidant activity was assessed under mild temperature conditions (25 and 40 ºC) to mimic the autoxidation process during real storage conditions. These results were compared with accelerated (Rancimat Induction Period) and antiradical (DPPH) tests. The higher concentration of o- diphenols (hydroxytyrosol or oleuropein aglycone) in olive oil led to a lower oxidation rate under the conditions studied, resulting in a strong antioxidant effect. Remarkably -tocopherol acted as a pro-oxidant at 25 and 40 ºC, in particular during the first oxidation stage. In contrast, this compound behaved as an antioxidant under Rancimat and DPPH conditions. The oxidation rate constant as a function of the concentration of spiked compound fit an exponential decay model very well and therefore the progress of the oxidation reaction could be predicted. No synergistic or antagonistic effects were generally observed when combined antioxidant compounds were assayed. 100 3. Experiimental results 3.6.1. Antioxidant capacity of individual compounds Table 3.15 shows the compositional characteristics and oxidation indices of POO used in this study. Table 3.15. Initial characteristics of Purified Olive Oil (POO) used in the study Fatty acid composition (%) C16:0 11.20 ± 0.01 C16:1 0.96 ± 0.01 C17:1 0.23 ± 0.01 C18:0 3.37 ± 0.01 C18:1 75.52 ± 0.02 C18:2 7.17 ± 0.01 C18:3 0.71 ± 0.01 C20:0 0.43 ± 0.01 C20:1 0.29 ± 0.01 C22:0 0.11 ± 0.01 PV (meq O2/kg oil) 4.23 ± 0.12 K232 1.29 ± 0.04 K270 0.061 ± 0.012 Phenolic compounds (mmol/kg) ND -Tocopherol (mmol/kg) ND ND, not detected The evolution of oxidation, measured by the peroxide value (PV) and K232 index, in Purified Olive Oil (POO) spiked with different concentrations of hydroxytyrosol (H; up to 0.50 mmol/kg) and -tocopherol (T; up to 1.0 mmol/kg) is depicted in Figure 3.19. During storage in open bottles at 25 ºC, the increase in the peroxide value (PV) was linear from the beginning and during the 50 weeks of the assay (Figure 3.19 a); thus, the reaction kinetics apparently followed a pseudo-zero order (0.895 R2 0.999). The evolution of the ultra-violet absorption values (K232) during storage at 25 ºC was also roughly linear (Figure 3.19 c) following pseudo-zero order kinetics (0.827 R2 0.990), although at higher T concentrations, a greater initial oxidation rate was observed. The experimental results clearly show that hydroxytyrosol possesses a strong antioxidant effect that increases with its concentration in the POO. On the contrary, a pro-oxidant effect directly proportional to its content was observed in the case of -tocopherol. At a higher storage temperature (40 ºC) a typical two-stage oxidation curve was observed for both oxidation indices (PV and K232) in the case of POO and samples spiked with a lower concentration of H (up to 0.10 mmol/kg) or T (up to 0.25 mmol/kg). Samples with higher hydroxytyrosol (H025 and H050) or -tocopherol (T050 and T1) levels show different behaviours (Figure 3.19b,d). Indeed, a great stabilisation effect was observed in the case of H whereas, on the contrary, a faster increase in PV and K232 was found during the 4–8 first weeks 101 3. Experiimental results of storage in the case of T. During the first weeks of storage at 40 ºC, PV and K232 increased also linearly (0.909 R2 0.999). The addition of increasing amounts of hydroxytyrosol (H; from 0.05 up to 0.50 mmol/kg) greatly reduced the oxidation progress of the oil. For example, the oxidation rate (k) was reduced to half with 0.10 mmol/kg added H (20 μmol kg -1 week -1; H = 0.10 and T = 0 in Table 3.16) as compared to POO (38 μmol kg -1 week -1; T = 0 and H = 0). A similar behaviour was observed after adding oleuropein aglycone (OA), leading to a reduction in the oxidation rate from 38 μmol kg -1 week -1 (POO; T = 0 and H = 0) down to 19 μmol kg -1 week -1 with the addition of 0.2 mmol/kg of OA (OA = 0.2 and H = 0 in Table 3.16). The remarkable protective antioxidant effect of o-diphenols (hydroxytyrosol, H, and its secoiridoid derivatives, oleuropein aglycones, OA) on olive oil (OO) was even more marked at 40 ºC in the advanced oxidation reaction (Figure 3.19b,d), where the second oxidation stage was inhibited at least during the 50 weeks of storage studied in spiked samples with a high H or OA concentration (H ≥ 0.25 or OA ≥ 0.50 mmol/kg). Figure 3.19. Progress of oxidation during storage in open bottles measured by the evolution of peroxide value (PV) and K232 in Purified Olive Oil spiked with different individual compounds (hydroxytyrosol, tyrosol and -tocopherol). H, hydroxytyrosol; T, tyrosol; T, α- tocopherol; POO, Purified Olive Oil. Example of sample labelling: H025, 0.25 mmol/kg of hydroxytyrosol 102 3. Experiimental results On the contrary, the addition of -tocopherol (T) to POO resulted in a pro-oxidant effect as compared to control oil (POO; Figure 3.19): a higher T concentration led to a higher oxidation rate constant measured by PV or K232 at 25 ºC (Figure 3.19 a, c; Table 3.16) and in the first stage at 40 ºC (Figure 3.19 b, d). For example, the oxidation rate (k) doubled with 0.5 mmol/kg added T (73 μmol kg -1 week -1; T = 0.5 and H = 0 in Table 3.16) as compared to POO (38 μmol kg -1 week -1; T = 0 and H = 0). It is worth mentioning that in the advanced oxidation process at 40 ºC, PV and K232 in-creased at an apparently slower rate in samples with a higher T content (Figure 3.19 b, d). This could be explained by the formation of tocopheroxyl radicals that participate in propagating reactions by hydrogen abstraction from lipid hydroperoxides (Kamal-Eldin et al., 1996; Ouchi et al., 2009; Bakir et al., 2013). However, over a certain peroxide accumulation, -tocopherol moieties begin to act as radical quenchers, decreasing the oxidation rate. Table 3.16. Oxidation rate constants (k for K232) found during storage in Purified Olive Oil spiked with different individual and combined compounds (hydroxytyrosol, tyrosol, - tocopherol and oleuropein aglycone) 25 ºC 40 ºC T 0 0.2 0.5 1.0 0 0.2 0.5 1.0 0 38 ± 2 60 ± 3 73 ± 4 80 ± 6 124 ± 4 206 ± 6 266 ± 9 309 ± 12 0.05 25 ± 2 49 ± 3 65 ± 4 76 ± 6 87 ± 4 171 ± 5 241 ± 6 305 ± 27 H 0.10 20 ± 2 43 ± 3 59 ± 4 76 ± 5 71 ± 2 151 ± 3 212 ± 6 281 ± 9 0.25 13 ± 2 31 ± 5 47 ± 7 71 ± 5 53 ± 2 112 ± 3 178 ± 5 258 ± 11 0.50 11 ± 1 37 ± 4 49 ± 3 52 ± 4 39 ± 1 135 ± 3 169 ± 6 189 ± 5 0.10 38 ± 2 58 ± 3 67 ± 5 – 124 ± 4 201 ± 7 267 ± 11 – T 0.25 38 ± 2 74 ± 4 61 ± 5 – 127 ± 3 205 ± 6 264 ± 10 – OA 0 0.1 0.2 0.5 1.0 0.1 0.2 0.5 1.0 0 24 ± 2 19 ± 2 12 ± 2 8 ± 1 84 ± 3 69 ± 2 56 ± 7 38 ± 2 0.10 – – – 9 ± 1 – – – 37 ± 7 H 0.25 – – 10 ± 2 – – – 40 ± 6 – 0.50 – – 10 ± 2 – – – 43 ± 3 – pseudo zero-order kinetic: C = C0 + kt; k in μmol kg -1 week -1; H (hydroxytyrosol), T (tyrosol), T (-tocopherol), OA (oleuropein aglycone) in mmol/kg POO (Purified Olive Oil) oxidation rate: 38 μmol kg -1 week -1 at 25 ºC (T = 0, H or T = 0), 124 μmol kg -1 week -1 at 40 ºC (T = 0, H or T = 0) It is relevant to remark that the value of the oxidation rate constant (k, Table 3.16) as a function of the concentration of the added compound (H, OA and T) fit an exponential decay -x/b 2 model very well [y = y0 + ae ; 0.990 < R < 0.999], and therefore the progress of the oxidation reaction could be simulated and predicted. The “a” parameter in the equation is positive for H and OA and negative in the case of T according to their anti- or pro-oxidant effect as already described. Oxidation rates calculated from K232 values were used in a previous work to determine the Time needed to Reach the Upper EU Limit (TRUL) for the extra virgin olive oil category. As reported in chapter 3.4.4, this parameter was considered the most suitable for monitoring olive 103 3. Experiimental results oil autoxidation since it is the first index to reach EU limits, it shows high linearity in the early stages of oxidation and it presents no problems of interference with other natural compounds in olive oil (such as phenolic compounds, which absorb at 280 nm and can interfere with the measurement of the parameter K270). Increasing amounts of hydroxytyrosol (H) and oleuropein aglycone (OA) produced an increase in the oxidative stability of the oil, measured by both TRUL (25 and 40 ºC; Table 3.17, Figure 3.20 a, b) or Rancimat IP (100 ºC and 10 L/h; Table 3.17, Figure 3.20 c). The accelerated Rancimat Induction Period (IP) was determined since this is one of the most common methods to compare the stabilising effect of different antioxidants in oils and derivatives. The remarkable antioxidant effect of H and OA was apparently not proportional to concentration over 0.25 or 0.50 mmol/kg of the simple phenolic or its complex secoiridoid derivatives since a plateau was apparently reached from this point onward. A similar behaviour was observed for the Rancimat IP (Figure 3.20 c), in agreement with results obtained by Mateos et al. (2003) but in disagreement with the linear increase reported by Servili et al. (1996). Figure 3.20. Oil stability (measured as TRUL^ and Rancimat IP) reached using different antioxidants (hydroxytyrosol, tyrosol, -tocopherol and oleuropein aglycone) concentrations during storage. , H, hydroxytyrosol; ▲, T, tyrosol; , OA, oleuropein aglycon; ж T, - tocopherol. ^TRUL, Time to Reach legal Upper Limit for K232 104 3. Experiimental results The effect of the antioxidant concentration on the improvement in the Rancimat IP was very similar for H and OA: i.e. 29.4 and 27.7 h, respectively, at 0.1 mmol/kg (Table 3.17). However, the analysis of TRUL showed that at 25 and 40 ºC a double concentration of oleuropein aglycone (OA) with respect to hydroxytyrosol (H) is required to reach the same stabilising effect (i.e. 0.1 and 0.2 mmol/kg, respectively, to reach about 60 weeks of stability at 25 ºC; Table 3.17), which means that the simple phenolic is presumably more active as an antioxidant under the mild conditions studied. As already established and reported in the literature, tyrosol did not show antioxidant activity at any concentration studied (Figure 3.20 and Tables 3.16 and 3.17), which is consistent with the lack of antioxidant capacity generally attributed to this phenol (Mateos et al., 2003; Fki et al., 2005). Table 3.17. Oxidative stability (IPa and TRULb) and antiradical (RSCc) activities found during storage in POO spiked with individual and combined compounds (hydroxytyrosol, tyrosol, - tocopherol and oleuropein aglycone) Antiradical Antiradical Oxidative stability Oxidative stability activity (RSCc) activity (RSCc) b b TRUL Polar Total TRUL Polar Total IPa IPa (weeks) fr. fr. (weeks) fr. fr. (h) d (h) d Samples 25 ºC 40 ºC (eq/kg) RARE Samples 25 ºC 40 ºC (eq/kg) RARE POO 15.2 31.7 9.8 15 1.00 Combined Individual H005 26.1 24.3 6.9 87 1.94 H005 23.8 45.2 13.0 58 0.64 H005 29.6 18.1 4.9 71 2.62 H010 29.4 61.2 17.2 136 1.24 H005 33.8 15.8 3.9 63 0.00 H025 42.1 89.6 23.2 246 1.78 H010 28.0 28.1 8.0 156 2.02 H050 54.6 109.2 29.7 550 1.93 H010 32.3 20.1 5.6 108 3.49 T005 15.9 30.8 9.2 16 1.02 H010 35.1 15.1 4.1 65 4.59 T010 15.8 30.9 9.5 16 1.01 H025 37.8 39.4 10.8 376 2.21 T025 15.6 32.4 9.6 14 0.88 H025 36.4 23.2 6.1 338 3.76 T050 15.5 30.9 9.7 16 0.87 H025 35.8 16.3 4.5 228 4.20 αT010 19.7 23.8 6.9 – 1.88 H050 31.5 32.8 8.9 255 2.33 αT020 24.3 20.2 5.9 – 2.39 H050 37.9 24.0 6.9 432 3.79 αT050 29.2 15.6 4.3 – 3.13 H050 43.0 22.3 6.1 623 4.78 – T010 + αT1 32.5 14.4 3.7 3.63 21.3 20.9 6.0 43 1.74 αT020 T010 + OA010 27.7 48.5 13.9 177 1.37 27.0 17.6 4.4 38 3.07 αT050 T025 + OA020 38.5 63.6 17.4 326 2.16 22.2 16.4 5.9 1 2.32 αT020 T025 + OA050 60.5 94.3 20.7 1119 3.13 27.5 18.0 4.2 1 2.29 αT050 OA1 84.8 121.4 25.7 2149 3.46 H010 88.0 122.3 30.5 2376 4.71 H025 64.5 114.8 29.3 1226 3.21 H050 63.2 115.0 27.6 976 3.52 Please refer to the text for more details on oxidation assays and definitions. Examples of sample labelling: T025, 0.25 mmol/kg of tyrosol; H010 + OA1, 0.10 mmol/kg of hydroxytyrosol combined with 1 mmol/kg of oleuropein aglycone. a IP, Rancimat induction period 105 3. Experiimental results b TRUL, time to reach legal upper limit for K232 c RSC, radical scavenging capacity of the polar and total fractions d RARE, relative antiradical efficiency Remarkable behaviour of -tocopherol was observed in this study, since under mild conditions, 25 and 40 ºC, this compound acted as a pro-oxidant, decreasing the stability of the oil expressed as TRUL as its concentration rose (i.e. from 23.8 down to 15.6 weeks increasing its concentration from 0.10 to 0.50 mmol/kg; Table 3.17). On the contrary, under accelerated Rancimat conditions (100 ºC, 10 L/h), T behaved as an antioxidant, for example increasing the induction period (IP) from 19.7 up to 29.2 h from 0.10 to 0.50 mmol/kg (Table 3.17). This fact makes questionable the use of this kind of accelerated method to assess the antioxidant capacity of different compounds, more so if the results are then extrapolated to real storage conditions. The Radical Scavenging Capacity (RSC) was measured by the DPPH test. In the polar fraction (methanolic extract) of the studied oil samples, the RSC showed a linear relationship with the concentration of hydroxytyrosol (from 58 to 551 Trolox eq/kg; R = 0.995) and OA (from 177 to 2149, R = 0.994; Table 3.17). In contrast to the TRUL and IP trends, RSC was linear with concentration over the entire studied range and, furthermore, the antiradical effect of the secoiridoid derivative (OA) was greater than the simple o-diphenol. Once again, tyrosol did not show any significant RSC value. Regarding the antiradical activity of the total fraction (hydrophilic and lipophilic, expressed as Relative Antiradical Efficiency; RARE) it could be observed (Table 3.17) that, in this case, T behaved as an antioxidant in a similar way to H and OA, increasing its capacity with its concentration, in contrast to the pro-oxidant effect observed as measured by TRUL (Table 3.17) or the oxidation rate constant (Table 3.16). 3.6.2. Effect of combined compounds In VOO and edible oils, different natural compounds with anti-oxidant activity are present at the same time and, therefore, it is very important to study the combined effect, whether synergistic or antagonistic. At both studied temperatures (25 and 40 ºC), the addition of -tocopherol to any concentration of hydroxytyrosol or tyrosol considerably diminished the oxidative stability of the oil, expressed as TRUL (Table 3.17 and Figure 3.21) or as the oxidation rate (Table 3.16), as compared to the control oil spiked with the phenolic compound alone. For instance, the addition of 0.2 mmol/kg of T to POO spiked with 0.1 mmol/kg of H greatly reduced its TRUL from 61.2 down to 28.1 weeks (Table 3.17), increasing the initial oxidation rate from 20 up to 43 μmol kg -1 week -1 (Table 3.16). From another point of view, it was observed that the positive effect of the addition of H on T spiked oil was significant only at lower T concentrations (0.20 mmol/kg; Figure 3.21 a, b). From the values of the experimental oxidation rate constants (k) found in this study and reported in Table 3.16, it can be concluded that no synergistic or antagonistic effects were observed when more than one compound was present in the POO. In fact, the sum of the positive effect (reduction in k) due to the addition of a certain concentration of one antioxidant, 106 3. Experiimental results H or OA, and the negative effect (increase in k) produced by the presence of a determined amount of T was close to the oxidation rate observed by spiking POO with a combined concentration of any of the studied compounds (H, OA and T). For example, the experimental oxidation rate measured at 25 ºC in POO spiked with 0.05 mmol/kg of H and 0.2 mmol/kg of T, 49 μmol kg -1 week -1 (Table 3.16), could be calculated by the sum of the antioxidant (H minus POO k values from Table 3.16) and pro-oxidant (T minus POO k values) effects: (H005 minus POO) plus (T02 minus POO) plus POO that is equivalent to H005 (25 μmol kg -1 week -1; Table 3.16) plus T02 (60 μmol kg -1 week -1) minus POO (38 μmol kg -1 week -1) giving a predicted value of 47 μmol kg -1 week -1. Figure 3.21. Oil stability (measured as TRUL^ and Rancimat IP) reached using different concentrations of mixtures of phenolics (hydroxytyrosol or tyrosol) with -tocopherol (T) during storage. , H, hydroxytyrosol; ▲, T, tyrosol; T, -tocopherol. ^TRUL, Time to Reach legal Upper Limit for K232 Oxidation stability, measured as Rancimat IP, once again behaved differently (Figure 3.21 c), since an antagonistic effect between H and T was apparently observed. For example, the IP increased only from 23.8 up to 33.8 h by adding 1 mmol/kg T to 0.05 mmol/kg H (H005 + T1; Table 3.17), whereas the theoretical sum of the individual effects would have been greater (23.8 + 24.3 = 48.1), or even de-creased from 42.1 down to 35.8 h by adding 1 mmol/kg T to 0.25 107 3. Experiimental results mmol/kg H (H025 + T1; Table 3.17). These results are in agreement with those obtained by Mateos et al., (2003). Practically no effect was observed by adding increasing quantities of tyrosol (T) to - tocopherol (T) spiked POO (Figure 3.21); moreover the same T effect, pro-oxidant for TRUL and antioxidant for Rancimat IP, was observed. The addition of the oleuropein aglycone (OA) to hydroxytyrosol (H) increased the stability of POO since the oxidation rate constant diminished; for example, from 20 down to 9 μmol kg -1 week -1 with the addition of 1 mmol/kg of OA to 0.1 mmol/kg of H (H 0.10, OA 1.0) at 25 ºC or from 53 down to 40 μmol kg -1 week -1 with spiking 0.5 mmol/kg of OA over 0.25 mmol/kg of H (H 0.25, OA 0.50) at 40 ºC (Table 3.16), although this effect was less pronounced for peroxide formation at 40 ºC (data not shown). For mixtures of phenolics and -tocopherol, an increasing content of the latter produced a reduction in RSC (Radical Scavenging Capacity), possibly because some phenolic moieties had previously interacted with tocopheroxyl radicals. From the comparison of the RSC results of the total fraction at the same concentration, the Relative Antiradical Efficiency (RARE) decreased in the order -tocopherol ≥ oleuropein aglycone > hydroxytyrosol >> tyrosol (Table 3.17). In all cases, the RARE increased with the total concentration of antioxidants, except for tyrosol, both for singly added compounds as well as for mixtures of them. However, this increase was not linear since it tended to reach a plateau from certain total antioxidant content. No synergism in antiradical efficiency was observed since the sum of the RAREs of samples with singly added antioxidants was always higher than the RARE of samples with mixtures of antioxidants at equivalent concentrations. For example, the RARE of H025 (1.78) plus the RARE of OA050 (3.13) was higher than the RARE of the sample H025 + OA050 (3.21; Table 3.17). 3.6.3. Open versus closed bottles The present study on the antioxidant capacity of VOO minor components and on oil stability was mainly carried out in open bottles (OB) to accelerate autoxidation and therefore to be able to measure differences in the oxidation rate under the natural antioxidant concentrations studied. However, VOO tanks in oil mills and the commercial products are stored in closed containers, with the addition in some cases of an inert gas (nitrogen or argon), since it is established that under these limited oxygen availability conditions the oil oxidation is reduced (Di Giovacchino et al., 2002; Krichène et al., 2010; Pristouri et al., 2010). Therefore, it is relevant and of interest to compare the oil stability behaviour observed in OB and in closed bottles (CB) under head space (HS) or nitrogen (N2) conditions. In closed bottles at 25 ºC, the linear evolution of PV and K232 was fitted to pseudo-zero- order kinetics (0.955 R2 0.999) along the 50 weeks of the storage period studied, both under head space (HS) and nitrogen (N2) conditions. Once again, a pro-oxidant effect of T was found. For instance, POO samples spiked with 0.5 mmol/ kg T showed a faster oxidation rate under closed bottle conditions (64 and 62 μmol kg -1 week -1 for NS and N2 conditions) as compared to POO (22 and 18 μmol kg -1 week -1 for HS and N2, respectively). On the contrary, as expected, the addition of H or OA reduced the initial oxidation rate: 12 μmol kg -1 week -1 for 0.25 108 3. Experiimental results mmol/kg H spiked oils under both HS and N2 storage conditions and 12 μmol kg -1 week -1 for 0.5 mmol/kg OA oils under HS and N2. In all cases, no significant statistical differences were observed between HS and N2 storage conditions. As far as the shelf-life (TRUL) behaviour of the oil under the storage conditions studied is concerned, in the case of POO (control oil), TRUL greatly increased from open bottles (OB), HS and N2 closed bottles conditions: 32 , 55 and 68 weeks, respectively, similarly to results reported by other authors (Di Giovacchino et al., 2002; Krichène et al., 2010; Pristouri et al., 2010). As previously discussed, the addition of phenolic antioxidants (H or OA) greatly stabilised the POO and therefore less (H025) or even no difference (OA050) was observed between the different storage conditions studied: for example, from 90 (OB) to 107 and 104 weeks (HS and N2; no statistically significant difference) for POO spiked with 0.25 mmol/kg of hydroxytyrosol. A shelf life of 90 weeks, approximately 18 months, is indeed the recommended expiry date for virgin olive oil. Once again, the presence of T drastically reduced the stability of the oil and its strong pro-oxidant effect was clearly visible even under HS and N2 conditions (18 mmol/kg on average, with no statistically significant differences between OB, HS and N2). At 40 ºC, the oxidation rate was much higher and no statistically significant differences were observed under the different storage conditions studied (OB, HS and N2), with the exception of the T spiked POO sample, which presented higher TRUL K232 in bottles with N2, probably because the higher temperature increased the formation of tocopheroxyl radicals in the presence of oxygen (Figure 3.22) Figure 3.22. Time to reach the upper limit (TRUL) for K232 in POO samples with added antioxidants. OB, open bottles; HS, closed bottles with head-space; N2, closed bottles with nitrogen 109 3. Experiimental results 3.7. KINETIC STUDY FOR THE DEVELOPMENT OF AN ACCELERATED OXIDATIVE STABILITY TEST TO ESTIMATE VIRGIN OLIVE OIL POTENTIAL SHELF LIFE : INFLUENCE OF COMPOSITION AND INITIAL OXIDATION STATE The development of effective shelf life prediction models is extremely important for the olive oil industry. This research is the continuation of a previous accelerated shelf life testing (ASLT) protocol at mild temperature (40–60 ºC), applied in this case to evaluate the temperature and oxidation effect on minor components (phenols, tocopherol, pigments) to properly complete a shelf life predictive model. The kinetic behaviour of phenolic compounds, -tocopherol and pigments during storage of different virgin olive oil samples in darkness and at different temperatures (25–60 ºC) is reported. The temperature-dependent kinetic of phenolic compounds and -tocopherol were well described by the linear Arrhenius model between 25 and 60 ºC, but regression for tyrosol kinetic presented the worst correlation coefficients. The apparent activation energy (Ea) was calculated and did not show relationship with compositional indicators (MUFA/PUFA, or antioxidant contents). Principal component analysis (PCA) was used to transform the considered compositional and degradation variables into fewer uncorrelated principal components (PC) resulting 4: factor “substrate: fatty acid and antioxidant content, factor “initial oxidation state and conditions”, factor “free simple phenols”, and factor “transformation rates”. In addition, multivariate linear regression (MLR) was used to run modelling equations for shelf life prediction from initial composition and accelerated oxidation progress. 3.7.1. Initial antioxidant composition of samples The seven VOO samples used in this study were those described in chapter 2.1 (in Metodología). Table 2.1 shows the values of the legal quality indices and the composition of each sample of virgin olive oil (VOO) at the beginning of the assay. All the VOO samples met the European Union requirements for the “extra” virgin category (EC 1989/2003). The initial peroxide values, K232 and K270 showed that oxidation level was low and very similar in the seven virgin olive oils studied. Lipid matrices were very similar since all samples came from monovarietal Cornicabra VOO, but with some expected low but statistically significant differences in the unsaturated fatty acid (UFAs) contents, especially in linoleic acid (C18:2). On the contrary, and according to the purpose of this study, there were notable differences in the types and concentrations of natural antioxidants, phenolic compounds and tocopherols. Figure 3.23 depicts in detail the phenolic profile of VOO samples and their content of α- tocopherol. It can be seen that samples II and III had the highest total phenol content (3.88 mmol/kg), followed by sample I (3.70 mmol/kg). However, sample II had higher content of dialdehydic forms of oleuropein and ligstroside aglycons and lower of the aldehydic forms, whereas it occurs inversely in sample III. The lowest total phenol content was that of samples VII (1.08 mmol/kg) and VI (1.35 mmol/kg), however, this latter presented the highest content of free tyrosol (0.54 mmol/kg) and hydroxytyrosol (0.26 mmol/kg) and the lowest one of complex phenols (0.55 mmol/kg). Samples IV and V were very similar with respect to the o-diphenols and total phenol content, however presented very different complex/simple phenol ratio. Sample I 110 3. Experiimental results was that with the highest α-tocopherol content (0.55 mmol/kg) and sample VI that with the lowest one (0.33 mmol/kg). Figure 3.23. Initial phenolic profile and α-tocopherol content of VOO samples 3,4-DHPEA, hydroxytyrosol; p-HPEA, tyrosol; 3,4-DHPEA-EDA, dialdehydic form of oleuropein aglycon; p- HPEA-EDA, dialdehydic form of ligstroside aglycon; 3,4-DHPEA-EA, aldehydic form of oleuropein aglycon; p-HPEA-EA, aldehydic form of ligstroside aglycon; Sum Sec. Htyr, secoiridoid derivatives of hydroxytyrosol (3,4-DHPEA-EDA + 3,4-DHPEA-EA); Sum Sec. Tyr, secoiridoid derivatives of tyrosol (p- HPEA-EDA + p-HPEA-EA); o-diphenols (3,4-DHPEA + 3,4-DHPEA-EDA + 3,4-DHPEA-EA); Total Ph., total phenols (3,4-DHPEA + p-HPEA + 3,4-DHPEA-EDA + p-HPEA-EDA + 3,4-DHPEA-EA + p-HPEA-EA) 3.7.2. Kinetic behaviour of phenolic compounds and pigments Figure 3.24 shows that, as temperature increased differences between samples concerning their phenolic composition became more evident as a consequence of the different rates of hydrolysis of the secoiridoid derivatives, the thermal decomposition and its action as antioxidants. At 40 ºC hydroxytyrosol content increased only in sample II and maintained practically constant in samples III and IV during the whole experimental period. For the rest of samples an initial stage was observed where this simple phenol slightly increased or remained constant, to diminish afterwards at different rates until reach a final stationary phase. At 50 and 60 ºC the rate of decomposition seems to be higher than that of formation, since the content of hydroxytyrosol falls from the very first in all samples. Samples IV, V, VI and VII reached the final stationary state at 50 and 60 ºC when hydroxytyrosol had practically disappeared, however, this was not the case of samples I, II and III which preserved between 20 and 50 % of the initial content at the end of the storage period. 111 3. Experiimental results The faster decrease of hydroxytyrosol at all temperatures was in sample VI, that with lowest ratios Sec. Htyr/ Free Htyr (1.21) and Complex/Simple Phenols (0.69), whereas the slowest rates of hydroxytyrosol were those of samples II and IV, which had the highest ratios Sec. Htyr/ Free Htyr (21.1 and 31) and Complex/Simple Phenols (18.4 and 25.3). One of the lowest rate was also in sample III, which presented the highest o-diphenol content and highest ratio o-diphenols/ total phenols (Table 2.1). In samples I, II and III, it is feasible a reasonable yielding of hydroxytyrosol from complex phenols hydrolysis. Figure 3.24. Decrease of hydroxytyrosol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII The content of tyrosol followed a general slow growing trend at all temperatures studied, meaning that the rate at which this compound decomposed was always lower than that of the hydrolysis of its secoiridoid derivatives. One exception to this trend was sample VII, with the lowest content of tyrosol secoiridoids, in which the hydrolysis of complex was not enough to compensate the tyrosol lost either by thermal decomposition or because of its antioxidant action. The same happened to sample VI from 40 to 60 ºC. A general decrease of hydroxytyrosol secoiridoids (sum of the dialdehydic and aldehydic forms of oleuropein aglycon) and of o-diphenols (also including free hydroxytyrosol) was common to all samples (Figure 3.25). In the final state, the content of these secoiridoids maintained practically invariable or dropped very slowly, coinciding with the stabilization of peroxide values and K232 reported for the same samples in the previous works (chapters 3.4 and 3.5). 112 3. Experiimental results The tendency of tyrosol secoiridoids (sum of the dialdehydic and aldehydic forms of ligstroside aglycon) content was similar to that of hydroxytyrosol derivatives, but the rate of decrease of the former and the percentages of final loses were lower, so stability of the tyrosol secoiridoid compounds appeared to be greater than that of hydroxytyrosol derivatives, according to previous works (chapters 3.3 and 3.6) and according to Krichene et al. (2015). The commented observations confirm that the o-diphenol group comprised in the molecule of hydroxytyrosol and its derivatives makes them more active antioxidants in the used conditions but possibly also more susceptible to oxidation and thermal decomposition than tyrosol secoiridoids as previously reported (chapters 3.3, 3.4, 3.6), as demonstrated by the lower slope of the degradation kinetics, especially at higher storage temperatures (Table 3.18). The analysis of time-concentration data indicated that evolution of hydroxytyrosol and tyrosol fitted to pseudo-zero-order kinetics, whereas the dialdehydic and aldehydic forms of oleuropein and ligstroside aglycons, o-diphenols and total phenols apparently followed pseudo first-order kinetics, in accordance with Lavelli et al. (2006), Gómez-Alonso et al. (2007), Mancebo-Campos et al. (2008) and Krichene et al. (2015). Kinetic parameters are detailed in Tables 3.18 and 3.19. Degradation rate constant (k) values obtained in this study for secoiridois of tyrosol and hydroxytyrosol are around 100 times higher than those obtained for Lavelli et al. (2006) at 40 ºC, since they used closed bottles but were agree with those of Krichene et al. (2015) in open bottles at 25 ºC and 50 ºC in samples with similar initial phenolic content. Figure 3.25. Decrease of o-diphenol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII 113 3. Experiimental results Table 3.18. Kinetic parameters of complex phenols fitted to a pseudo first-order reaction: Ln(Ct/C0) = kt, where C0 is the initial concentration and Ct the residual concentration at time t. 25 ºC 40 ºC 50 ºC 60 ºC -2 2 -2 2 -2 2 -2 2 k /10 Ln C0 *R k /10 Ln C0 *R k /10 Ln C0 *R k /10 Ln C0 *R I - 1.04 ± 0.07 0.666 ± 0.03 0.949 -4.23 ± 0.37 0.335 ± 0.08 0.930 -9.39 ± 0.19 0.273 ± 0.04 0.995 -17.23 ± 0.77 0.176 ± 0.09 0.979 II 0.699 ± 0.04 0.925 0.289 ± 0.06 0.927 0.411 ± 0.03 0.997 0.225 ± 0.10 0.946 -1.12 ± 0.05 -3.01 ± 0.18 -8.43 ± 0.39 -14.03 ± 0.62 III -1.58 ± 0.14 0.799 ± 0.05 0.956 -8.22 ± 0.45 0.452 ± 0.14 0.932 -14.25 ± 0.13 0.293 ± 0.09 0.987 -23.30 ± 0.47 0.0005 ± 0.11 0.975 IV -1.47 ± 0.04 -0.183 ± 0.05 0.935 -8.69 ± 0.32 -0.492 ± 0.13 0.951 -12.35 ± 0.37 -0.807 ± 0.18 0.954 -33.10 ± 0.91 -0.673 ± 0.08 0.994 V -1.67 ± 0.12 -0.202 ± 0.05 0.939 -7.11 ± 0.51 -0.571 ± 0.15 0.894 -10.52 ± 0.45 -0.953 ± 0.15 0.951 -26.45 ± 0.10 -0.959 ± 0.06 0.996 SEC HTYR VI -1.54 ± 0.05 -1.05 ± 0.04 0.953 -6.31 ± 0.17 -1.42 ± 0.10 0.956 -11.25 ± 0.24 -1.53 ± 0.08 0.987 -23.68 ± 0.49 -1.71 ± 0.06 0.994 VII -1.16 ± 0.07 -0.671 ± 0.04 0.941 -5.47 ± 0.20 -1.14 ± 0.11 0.923 -15.00 ± 0.62 -1.10 ± 0.08 0.991 -25.50 ± 0.35 -1.34 ± 0.07 0.995 I -0.86 ± 0.07 0.461 ± 0.06 0.739 -1.73 ± 0.16 0.016 ± 0.08 0.763 -2.43 ± 0.13 -0.052 ± 0.05 0.918 -10.35 ± 0.83 -0.008 ± 0.04 0.977 II -1.03 ± 0.10 0.459 ± 0.07 0.786 -1.53 ± 0.15 0.010 ± 0.06 0.821 -3.28 ± 0.18 0.095 ± 0.04 0.968 -5.94 ± 0.42 -0.076 ± 0.02 0.980 III -1.42 ± 0.04 0.271 ± 0.07 0.883 -3.08 ± 0.14 -0.323 ± 0.13 0.777 -5.04 ± 0.09 -0.327 ± 0.09 0.944 -9.35 ± 0.58 -0.471 ± 0.09 0.922 IV -0.94 ± 0.04 -0.166 ± 0.07 0.753 -2.15 ± 0.11 -0.658 ± 0.11 0.738 -3.13 ± 0.21 -0.781 ± 0.14 0.719 -13.00 ± 0.70 -0.716 ± 0.07 0.964 SEC TYR V -1.24 ± 0.13 -0.190 ± 0.07 0.818 -2.28 ± 0.02 -0.777 ± 0.11 0.749 -2.82 ± 0.33 -0.908 ± 0.10 0.794 -9.55 ± 0.44 -1.02 ± 0.01 0.999 VI -0.94 ± 0.07 -1.36 ± 0.04 0.889 -2.90 ± 0.18 -1.68 ± 0.08 0.907 -4.82 ± 0.24 -1.59 ± 0.04 0.987 -12.98 ± 0.60 -1.84 ± 0.06 0.976 VII -0.63 ± 0.09 -0.541 ± 0.04 0.817 -1.68 ± 0.33 -1.06 ± 0.10 0.675 -3.02 ± 0.22 -1.07 ± 0.08 0.873 -7.30 ± 0.60 -1.21 ± 0.06 0.936 I -0.87 ± 0.05 0.742 ± 0.03 0.941 -3.62 ± 0.29 0.457 ± 0.07 0.923 -8.20 ± 0.53 0.408 ± 0.07 0.987 -14.88 ± 0.57 0.307 ± 0.07 0.988 II -1.00 ± 0.12 0.739 ± 0.04 0.908 -2.51 ± 0.17 0.358 ± 0.06 0.910 -6.77 ± 0.42 0.454 ± 0.06 0.986 -12.28 ± 0.56 0.305 ± 0.08 0.951 III -1.46 ± 0.12 0.841 ± 0.05 0.942 -5.57 ± 0.34 0.427 ± 0.06 0.975 -11.98 ± 0.13 0.388 ± 0.08 0.986 -17.00 ± 1.50 0.062 ± 0.11 0.970 IV -1.29 ± 0.07 -0.163 ± 0.05 0.911 -3.89 ± 0.49 -0.728 ± 0.14 0.842 -11.48 ± 0.15 -0.672 ± 0.13 0.973 -31.98 ± 1.56 -0.498 ± 0.13 0.983 o-DIPH V -1.24 ± 0.09 -0.142 ± 0.05 0.916 -3.71 ± 0.33 -0.553 ± 0.07 0.948 -10.67 ± 0.63 -0.534 ± 0.10 0.984 -25.90 ± 0.78 -0.589 ± 0.07 0.994 VI -0.95 ± 0.04 -0.430 ± 0.02 0.962 -4.92 ± 0.18 -0.601 ± 0.07 0.957 -12.05 ± 0.58 -0.517 ± 0.07 0.994 -25.33 ± 0.25 -0.684 ± 0.10 0.989 VII -0.77 ± 0.05 -0.509 ± 0.03 0.897 -4.83 ± 0.18 -0.685 ± 0.11 0.903 -15.83 ± 0.57 -0.602 ± 0.17 0.966 -26.10 ± 1.15 -0.901 ± 0.07 0.994 I -0.85 ± 0.01 1.35 ± 0.04 0.866 -1.89 ± 0.28 0.938 ± 0.07 0.840 -4.18 ± 0.11 0.924 ± 0.06 0.964 -10.98 ± 0.64 0.928 ± 0.04 0.980 II -0.97 ± 0.01 1.31 ± 0.05 0.845 -1.50 ± 0.25 0.879 ± 0.05 0.844 -4.29 ± 0.23 1.01 ± 0.05 0.974 -8.73 ± 0.44 0.870 ± 0.04 0.972 III -1.39 ± 0.13 1.28 ± 0.05 0.909 -2.81 ± 0.18 0.708 ± 0.13 0.772 -5.35 ± 0.44 0.695 ± 0.12 0.911 -14.75 ± 2.07 0.636 ± 0.11 0.933 IV -1.08 ± 0.10 0.563 ± 0.06 0.804 -2.27 ± 0.23 0.053 ± 0.09 0.789 -4.08 ± 0.09 -0.016 ± 0.13 0.825 -13.03 ± 0.74 0.010 ± 0.08 0.958 TOT PHTOT V -1.15 ± 0.12 0.567 ± 0.06 0.838 -2.41 ± 0.15 0.104 ± 0.06 0.896 -4.29 ± 0.14 0.026 ± 0.08 0.926 -11.53 ± 0.45 -0.098 ± 0.03 0.994 VI -0.66 ± 0.03 0.442 ± 0.03 0.852 -2.08 ± 0.12 0.209 ± 0.06 0.893 -4.55 ± 0.08 0.310 ± 0.02 0.995 -10.93 ± 0.13 0.172 ± 0.03 0.990 VII -0.59 ± 0.05 0.254 ± 0.04 0.738 -2.09 ± 0.08 -0.053 ± 0.07 0.849 -4.78 ± 0.14 -0.103 ± 0.08 0.940 -10.93 ± 0.62 -0.213 ± 0.04 0.985 k, reaction rate (weeks -1); Ln Co, obtained from the intercept for t=0; *P<0.05; SEC HTYR, Hydroxytyrosol secoiridoids; SEC TYR, Tyrosol secoiridoids; o-DIPH, o-diphenols; TOT PH=total phe 3. Experiimental results Table 3.19. Kinetic parameters of simple phenols and -tocopherol fitted to a pseudo zero-order reaction: Ct = C0 + kt 25 ºC 40 ºC 50 ºC 60 ºC -3 2 -3 2 -3 2 -3 2 k /10 C0 *R k /10 C0 *R k /10 C0 *R k /10 C0 *R I 0.502 ± 0.12 0.170 ± 0.005 0.608 -1.47 ± 0.70 0.195 ± 0.01 0.425 -8.97 ± 0.72 0.238 ± 0.007 0.981 -12.57 ± 1.07 0.199 ± 0.006 0.972 II 0.405 ± 0.09 0.099 ± 0.004 0.622 1.32 ± 0.27 0.103 ± 0.006 0.753 -2.73 ± 0.22 0.157 ± 0.003 0.968 -2.97 ± 0.44 0.127 ± 0.004 0.900 III 0.379 ± 0.07 0.118 ± 0.003 0.775 -0.153 ± 0.26 0.140 ± 0.006 0.041 -4.16 ± 0.46 0.153 ± 0.005 0.965 -9.63 ± 0.60 0.171 ± 0.005 0.981 IV 0.437 ± 0.06 0.035 ± 0.002 0.829 -0.479 ± 0.14 0.058 ± 0.003 0.589 -3.07 ± 0.54 0.069 ± 0.005 0.916 -5.39 ± 0.66 0.058 ± 0.004 0.944 HTYR V 0.535 ± 0.08 0.078 ± 0.003 0.781 -1.93 ± 0.28 0.124 ± 0.005 0.887 -6.63 ± 0.63 0.146 ± 0.006 0.974 -10.61 ± 0.66 0.117 ± 0.004 0.985 VI -1.44 ± 0.14 0.315 ± 0.006 0.903 -6.76 ± 0.66 0.281 ± 0.01 0.946 -16.21 ± 1.08 0.308 ± 0.01 0.987 -28.06 ± 2.65 0.268 ± 0.016 0.966 VII 0.413 ± 0.12 0.097 ± 0.005 0.484 -3.80 ± 0.81 0.168 ± 0.01 0.787 -8.51 ± 0.33 0.151 ± 0.003 0.996 -11.33 ± 1.15 0.110 ± 0.007 0.961 I 0.672 ± 0.06 0.1272 ± 0.003 0,907 2.69 ± 0.40 0.131 ± 0.009 0,849 1.80 ± 0.58 0.172 ± 0.01 0,621 5.51 ± 1.01 0.143 ± 0.008 0,857 II 0.251 ± 0.07 0.090 ± 0.003 0,468 2.23 ± 0.31 0.076 ± 0.007 0,864 2.31 ± 0.48 0.112 ± 0.009 0,791 6.51 ± 0.71 0.088 ± 0.006 0,944 III 0.3724± 0.07 0.079 ± 0.003 0,658 2.51 ± 0.58 0.078 ± 0.01 0,754 3.06 ± 0.75 0.119 ± 0.01 0,735 7.02 ± 0.82 0.093 ± 0.007 0,936 TYR IV 0.588 ± 0.04 0.043 ± 0.002 0,949 2.78 ± 0.33 0.051 ± 0.007 0,901 2.62 ± 0.65 0.080 ± 0.01 0,733 8.16 ± 0.49 0.057 ± 0.004 0,983 V 0.514 ± 0.06 0.066 ± 0.003 0,869 1.41 ± 0.25 0.080 ± 0.005 0,802 0.674 ± 0.48 0.116 ± 0.009 0,244 2.31 ± 0.49 0.093 ± 0.005 0,786 VI -1.76 ± 0.43 0.646 ± 0.02 0,567 -8.46 ± 3.62 0.603 ± 0.04 0,577 -11.05 ± 1.28 0.634 ± 0.02 0,938 -20.04 ± 1.83 0.564 ± 0.01 0,968 VII 0.446 ± 0.08 0.107 ± 0.004 0,704 -0.518 ± 0.38 0.165 ± 0.008 0,189 -2.04 ± 0.18 0.163 ± 0.003 0,965 -3.13 ± 0.64 0.144 ± 0.005 0,829 I -1.44 ± 0.06 0.558 ± 0.008 0.936 -7.49 ± 0.62 0.512 ± 0.02 0.974 -25.20 ± 0.27 0.535 ± 0.04 0.973 -54.15 ± 0.37 0.554 ± 0.02 0.986 II -0.74 ± 0.04 0.445 ± 0.007 0.859 -3.80 ± 0.30 0.405 ± 0.01 0.895 -15.20 ± 0.22 0.440 ± 0.03 0.973 -38.05 ± 0.39 0.458 ± 0.02 0.970 III -1.25 ± 0.12 0.546 ± 0.01 0.887 -6.18 ± 0.39 0.493 ± 0.02 0.912 -25.80 ± 0.50 0.559 ± 0.03 0.985 -49.45 ± 0.47 0.566 ± 0.02 0.981 IV -0.99 ± 0.03 0.400 ± 0.01 0.815 -5.80 ± 0.15 0.362 ± 0.01 0.966 -20.83 ± 0.52 0.378 ± 0.003 1.000 -46.40 ± 0.18 0.410 ± 0.01 0.994 TOH V -0.91 ± 0.03 0.466 ± 0.007 0.886 -5.24 ± 0.13 0.412 ± 0.01 0.949 -19.65 ± 1.39 0.431 ± 0.02 0.994 -46.98 ± 1.33 0.454 ± 0.02 0.982 VI -1.01 ± 0.14 0.335 ± 0.007 0.905 -3.47 ± 0.25 0.281 ± 0.006 0.97 -16.25 ± 0.53 0.311 ± 0.02 0.992 -34.58 ± 0.54 0.326 ± 0.01 0.984 VII -0.80 ± 0.04 0.359 ± 0.008 0.819 -3.63 ± 0.14 0.309 ± 0.008 0.949 -16.13 ± 2.11 0.336 ± 0.03 0.970 -36.60 ± 0.53 0.356 ± 0.009 0.995 k. reaction rate (mmol kg-1 weeks -1) Co. obtained from the intercept for t=0 *P<0.05 HTYR, Hydroxytyrosol; TYR, Tyrosol , TOH, -tocopherol 115 3. Experiimental results The content of -tocopherol followed a similar pattern in all samples, falling roughly linearly and faster with temperature (Figure 3.26). At 25 and 40 ºC the rate of reduction seems to be slightly lower at the beginning of storage, even seemed to remained nearly constant during more than forty weeks of storage at 25 ºC, and began to go down when o-diphenols depletion had almost concluded. This is in accordance with that stated in chapter 3.3: - tocopherol showed antioxidant effect at advanced oxidation stages, when free peroxil radicals reach a certain value and are not trapped for phenolic antioxidants. However, at 50 and 60 ºC, α- tocopherol content dropped rapidly from the beginning and stabilized in all samples when the depletion was significant. The total decrease of this compound ranged between 12-28 % at 25 ºC, 26-56 % at 40 ºC, 79-99 % at 50 ºC and 90-100 % at 60 ºC. Some authors have reported the high susceptibility of this molecule to oxidize to α-tocopherolquinones at high temperatures (Verleyen et al., 2001), fact that could explain the faster decrease at 50 and 60 ºC. Tocopherol at temperatures lower than 50 ºC are protected for polar phenols acting as antioxidants in the first oxidation stages. Excluding the final stationary phases at 50 and 60 ºC, the evolution of α-tocopherol was attempted to correlate to a pseudo zero-order reaction (according with Krichene et al., 2015), which kinetic parameters are listed in Table 3.19. Figure 3.26. Decrease of -tocopherol content (normalized graphs) in VOO samples at 25, 40, 50 and 60 ºC. Samples: , I; , II; ▲, III; , IV; , V; , VI; , VII 3. Experiimental results 3.7.3. Feasibility of the Arrhenius equation As expected, an increase in storage temperature increased the degradation of phenolic compounds and α-tocopherol, particularly at 50 and 60 °C. Regression analyses from the Ln k versus 1/T plots indicated that the temperature dependence of phenolic compounds and -tocopherol degradation rates were well described by the linear Arrhenius model between 25 and 60 ºC, but regression for tyrosol kinetic presented the worst correlation coefficients. The apparent activation energy (Ea) was calculated from the slopes of the lines fitted to the Ln k plotted as a function of the inverse of absolute temperature (Tables 3.20 and 3.21). Values of Ea were no significantly different between samples (Table 3.20), thus, similar energy was necessary to initiate the degradation of phenolic compounds and tocopherol despite the initial composition. These Ea values for total phenols degradation were nearly twice those reported for Campanella et al. (2008) (37.4-39.1 kJ/mol), with olive oil forced to oxidation at temperatures higher than 98 ºC. Ea values for -tocopherol were in all samples higher than those of phenolic compounds, showing again the higher stability of this compound in olive oil when phenols are present. The Ea obtained previously for oxidation reactions (65 kJ/mol for primary oxidation products and of about 77 kJ/mol for secondary oxidation products) (chapter 3.4) of the same olive oil samples indicated no marked relationship with oxidative stability or TRUL. Accordingly, neither Ea for antioxidants decay showed relationship with compositional indicators (MUFA/PUFA, or antioxidant contents). This suggests that Ea should not be used as a single parameter to compare the rate of lipid oxidation or the oxidative stability of olive oil or other lipid systems (Farhoosh et al., 2014). The other main kinetic parameter affecting reaction rate is A (pre-exponential or frequency factor), calculated from the intercepts of the lines fitted to the Ln k plotted as a function of the inverse of absolute temperature. Minor changes in Ea leads to major changes in A values. In fact, plots of Ea vs A leads to exponential trend (0.972 R2 0,998). This means a higher contribution for A than for Ea to the rate of lipid oxidation and the rate of antioxidant depletion of the oils studied, according to Uri (1961) and Cho (1997). In fact, there were higher and significant differences in A values between samples for all phenols and -tocopherol (Tables 3.20 and 3.21). Being A an indicator of the frequency of molecules collisions, it could be thinkable a relationship with initial concentration, however no meaningful correlation was found. The obtained values of Ea and k, cannot provide a mechanistic interpretation of any reaction, since oxidation is a complex reaction, but can be used as descriptive tools of the temperature dependence of reaction (Van Boekel, 2008). 117 3. Experiimental results 3.7.4. Shelf life of VOO related to its initial composition Zanoni et al. (2005) reported for the first time a phenomenological model to predict stability of EVOO based on combined initial composition indices. The selected degradation parameters could be predicted by means of acidity, oleic acid and bitter taste, but no further the initial state, since after storage degradation parameters may change as a result of lipid oxidation, and models being based on constant indices, are not able to predict a new degradation extent. Aparicio-Ruiz et al. (2012) used a predictive mathematical model (Know-How, Utility model, MIT_TO-0022272) to estimate percentage of pyropheophytin a (PPP) in VOOs stored at any given temperature in darkness and with lack of oxygen. The predictive model can be used to estimate the trend of PPP in a given time−temperature frame. This method is useful for freshness but not necessary correlated with shelf life, since it depends on other quality parameters. In 2016, Guillaume et al. used four quality parameters, induction time, diacylglycerols (DAGs), free fatty acid factor (FFA factor), and pyropheophytins percentage (PPP), to identify a best before date (BBD, in months) using the lowest value obtained from three equations, related to induction time, DAGs and FFA, respectively. DAGs and PPP were shown to be predictable and change linearly with time whereas FFA provides a value for the initial oil quality and does not change significantly under proper storage conditions. This model is accurate for EVOO packaged and stored at ideal conditions. By means of powerful statistical linear discriminant analysis (LDA) and simulated annealing (SA) variable selection algorithm approach, Rodrigues et al. (2017) tried EVOO shelf life evaluation applying a potentiometric electronic tongue with nonspecific cross-sensitivity lipid membranes to assess the commercial storage conditions including light exposure and storage time. Good results were obtained for evaluation from volatiles produced by oxidation during storage, but not in this study for EVOO shelf life prediction. This research group proposed the TRUL (Time to Reach the Upper legal Limit) parameter, related to K232, as a value for predicting oxidative stability at 25 ºC, from ASLT at temperature lower than 60 ºC (Mancebo-Campos et al., 2008). As a result, the predicted TRUL at 25 ºC was very close to the experimental TRUL at the same temperature when applying the proposed model to accelerated storage temperatures (40, 50 and 60 ºC). From the previously commented results, further investigation was carried out concerning the subjacent relationship between oxidative stability at room temperature or shelf life of virgin olive oil and its initial composition. In relation to phenolic compounds and their relationship with oxidative stability, it has been widely reported the high correlation of this compounds, mainly o-diphenols with higher antioxidant capacity, with induction period measured by Rancimat (Gómez-Alonso et al., 2002). Nevertheless, this correlation is not simple and evident with the rate of oxidation at temperatures bellow 60 ºC and neither with shelf life determined by the oxidation parameters (Gómez-Alonso et al., 2007; Mancebo-Campos et al., 2008). This could be because the content of phenolic compounds in EVOOs exceeds the point to which the concentration of antioxidants is still relevant as oxidation rate is concerned. 118 3. Experiimental results Table 3.20. Linear Arrhenius kinetics of simple phenols and -tocopherol fitted to a pseudo zero-order reaction: k=A·e -Ea/RT HTYR TYR TOH Ea (kJ/mol) A(week-1) *R2 Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 I 81.70 ± 13.84a 9.4E+10 ± 1.9E+02a 0.946 43.34 ± 15.20 a.b 3.0E+04 ± 3.3E+02a 0.803 85.31 ± 5.32a 1.4E+12 ± 7.6b 0.992 II 49.67 ± 8.44 a 2.3E+05 ± 2.5E+01 b 0.945 91.13 ± 37.66b 3.4E+12 ± 1.7E+06b 0.745 93.37 ± 10.67 a 1.6E+13 ± 5.8E+01a 0.975 III 84.56 ± 46.47 a 1.2E+11 ± 4.8E+07 c 0.623 66.52 ± 11.30 a.b 2.1E+08 ± 7.5E+01c 0.945 88.38 ± 9.94 a 3.8E+12 ± 4.4E+01c 0.975 IV 64.17 ± 20.96 a 5.4E+07 ± 2.9E+03 d 0.824 57.02 ± 12.21 a.b 6.4E+06 ± 1.0E+02d 0.916 92.54 ± 6.82 a 1.6E+13 ± 1.3E+01 a 0.989 V 73.28 ± 6.53 a 3.7E+09 ± 1.2E+01 e 0.984 27.42 ± 18.49 a 3.5E+01 ± 1.1E+03a 0.524 92.04 ± 7.76 a 1.3E+13 ± 1.9E+01d 0.986 VI 71.22 ± 4.81 a 4.7E+09 ± 6.2 f 0.991 55.92 ± 8.67 a.b 1.3E+07 ± 2.7E+01e 0.954 85.06 ± 14.89 a 7.0E+11 ± 2.9E+02e 0.942 VII 80.04 ± 14.67 a 5.8E+10 ± 2.7E+02 g 0.937 49.55 ± 14.85 a.b 1.7E+05 ± 2.8E+02a 0.848 92.87 ± 12.12 a 1.3E+13 ± 1.0E+02f 0.967 Same letters indicate no significant differences between samples P<0.05 HTYR, Hydroxytyrosol; TYR, Tyrosol; TOH, -tocopherol Table 3.21. Linear Arrhenius kinetics of complex phenols fitted to a pseudo first-order reaction: k=A·e -Ea/RT O-DIPH TOT PHE SEC HTYR SEC TYR Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 Ea (kJ/mol) A (week-1) *R2 I 66.86 ± 3.41a.b 4.9E+09 ± 3.7a 0.995 58.58 ± 7.77a 1.4E+08 ± 19a 0.966 65.65 ± 3.49a.b 3.6E+09 ± 3.8a 0.994 53.79 ± 14.13a 1.9E+07 ± 220a 0.879 II 59.40 ± 5.59a 2.5E+08 ± 8.4b 0.983 52.03 ± 11.26a 1.1E+07 ± 73b 0.914 60.70 ± 5.99a 4.8E+08 ± 9.8b 0.981 41.26 ± 7.86 a 1.5E+05 ± 20b 0.932 III 58.64 ± 5.89a 3.1E+08 ± 9.4b 0.980 53.34 ± 8.22a 2.7E+07 ± 23c 0.955 61.15 ± 7.08a 1.0E+09 ± 15c 0.974 44.04 ± 3.57 a 7.2E+05 ± 3.9c 0.987 IV 74.62 ± 7.06a.b.c 1.4E+11 ± 15c 0.982 56.10 ± 10.06a 6.1E+07 ± 46d 0.940 68.74 ± 6.25a.b 2.0E+10 ± 11d 0.984 56.85 ± 12.27a 7.6E+07 ± 110d 0.915 V 71.45 ± 6.09a.b.c 3.8E+10 ± 10d 0.986 51.26 ± 7.79a 9.8E+06 ± 19e 0.956 62.04 ± 5.25a 1.4E+09 ± 7.4e 0.986 43.50 ± 12.31a 4.6E+05 ± 110e 0.862 VI 77.01 ± 3.14b.c 3.2E+11 ± 3.3e 0.997 63.41 ± 2.53a 8.4E+08 ± 2.6f 0.997 63.42 ± 1.98a 2.2E+09 ± 2.1f 0.998 59.36 ± 4.65a 2.4E+08 ± 5.9f 0.988 VII 84.23 ± 8.37c 5.2E+12 ± 24f 0.981 67.82 ± 2.38a 4.5E+09 ± 2.5g 0.998 73.87 ± 6.05b 1.1E+11 ± 10g 0.987 55.74 ± 3.85a 3.6E+07 ± 4.3g 0.991 Same letters indicate no significant differences between samples P<0.05 SEC HTYR, Hydroxytyrosol secoiridoids; SEC TYR, Tyrosol secoiridoids; o-DIPH, o-diphenols; TOT PHE=total phenols 3. Experiimental results The high MUFAs/PUFAs ratio, which is typical of olive oil, is one of the main reasons for the higher stability of olive oil with respect to other edible oils (Velasco et al., 2002, Beltrán et al., 2004). In the studied samples, this ratio ranged from 13.5 to 19.4. The higher levels of the ratio should show the greater oxidative stability of the olive oils, but in previous studies, no direct correlation was found with this ratio and the rate of oxidation at temperatures below 60 ºC, neither with shelf life determined by the oxidation parameters (Mancebo-Campos et al., 2008). Variables used to indicate the extent or progress of oxidation were those related to the increase of primary and secondary oxidation products and the decrease of antioxidant compounds or unsaturated fatty acids, and are detailed in Table 3.22 as well as variables regarding the initial lipidic or antioxidant composition. Principal component analysis (PCA) was used to transform the considered variables into fewer uncorrelated principal components (PC). The first PCA (PCA1) was done including the initial physical-chemical characteristics of samples (16 variables, see Table 3.23), at 25, 40, 50 and 60 ºC separately (N=28 samples), and with joined data for the four temperatures (N=112 samples). For N=112, the KMO factor (Kayser- Meyen-Olkin) had a value of 0.773, indicating an acceptable fit of the sample to this analysis. Bartlett test had zero significance, so there was significant correlation between variables. Three factors (principal components) were generated in the PCA, explaining the 79.11% of the variance. Significant eigenvalues were PC1 = 9.035, PC2 = 2.932, PC3= 1.481. Table 3.22. Variables used to indicate the extent or progress of oxidation Related to initial Related to Variables for Variables for Proposed independent state oxidation PCA 1 PCA 2 variables for MLR CAROT ini kIP Temperature kIP CAROT ini CLOROF ini kK232 PV ini kK232 CLOROF ini HTYR ini kK270 K232 ini kK270 TOTAL ini TYR ini kTOTPH K270 ini kTOTPH SECHTYR ini TOTAL PH ini koDIPH OSRancimat koDIPH oDIPH ini SECHTYR ini kSECHTYR UFAs ini kSECHTYR aTOH ini SECTYR ini kSECTYR PUFAs ini kSECTYR UFAs ini oDIPH ini kTOH CAROT ini kTOH PUFAs ini TYR&SEC ini kUFAs CLOROF ini kUFAs MUFAs/PUFAs aTOH ini kPUFAs HTYR ini kPUFAs PV ini UFAs ini tIP20 TYR ini K232 ini PUFAs ini tK23225 TOTAL PH ini K270 ini PV ini tK270022 SECHTYR ini kIP K232 ini SECTYR ini kK232 K270 ini oDIPH ini kK270 OSRancimat TYR&SEC ini kTOTPH aTOH ini koDIPH kSECHTYR kTOH kUFAs kPUFAs tIP20 tK23225 120 3. Experiimental results From the rotated component matrix (Table 3.23), the highest and positive loadings in PC1 were those of initial antioxidants contents (chlorophyll, carotenoids, hydroxytyrosol secoiridoids, tyrosol secoiridoids, o-diphenols, tyrosol+secoiridoids, total phenols) and directly related measures (Rancimat OS). The highest and negative loadings those of UFAs and PUFAs contents (oxidizable substrate). Thus, PC1 could be considered as the factor “substrate: fatty acid and antioxidant content”, and explained the 54.15% of variance. The highest and positive loadings in PC2 were those of temperature, initial PV, K232 and K270. PC2 could be the factor “initial oxidation state and conditions”, and explained the 17.25% of the variance. The highest and positive loadings in PC3 were those of initial hydroxytyrosol and tyrosol contents, so PC3 could be the factor “free simple phenols”, explaining the 8.72% of the variance. Table 3.23. Components, loadings and scores of the first Principal Component Analysis (PCA1) Component matrix a Rotated Component matrix a Components score Coeficient (loadings) (loadings) matrix Component Component Component 2: initial 2: initial oxidation oxidation 3: 1: state and 3: simple 1: state and simple 1 2 3 substrate conditions phenols substrate conditions phenols TEMPERATURE -0.183 0.538 0.627 -0.178 0.822 -0.094 -0.020 0.183 0.423 PVini -0.341 0.720 0.257 -0.295 0.716 0.318 -0.038 0.246 0.173 K232ini 0.152 0.731 0.274 0.195 0.725 0.261 0.017 0.249 0.185 K270ini 0.529 0.539 0.327 0.550 0.610 0.055 0.059 0.184 0.221 CAROTini 0.864 0.052 -0.002 0.863 0.021 -0.055 0.096 0.018 -0.001 CHLOROini 0.778 0.105 0.057 0.778 0.101 -0.055 0.086 0.036 0.038 HTYRini 0.015 0.762 -0.515 0.113 0.229 0.884 0.002 0.260 -0.347 TYRini -0.312 0.691 -0.635 -0.210 0.102 0.961 -0.035 0.236 -0.429 TOTALini 0.968 0.010 -0.148 0.973 -0.110 0.015 0.107 0.003 -0.100 SECHTYRini 0.974 -0.138 -0.040 0.959 -0.149 -0.163 0.108 -0.047 -0.027 SECTYRini 0.933 -0.190 0.069 0.907 -0.115 -0.274 0.103 -0.065 0.046 oDIPHini 0.973 -0.049 -0.102 0.970 -0.124 -0.058 0.108 -0.017 -0.069 TYR+SECini 0.919 0.106 -0.218 0.937 -0.084 0.136 0.102 0.036 -0.147 TOHini 0.726 -0.147 0.283 0.691 0.063 -0.384 0.080 -0.050 0.191 UFAsini -0.686 -0.297 -0.020 -0.706 -0.222 -0.108 -0.076 -0.101 -0.014 PUFAsini -0.832 -0.221 0.047 -0.849 -0.118 -0.093 -0.092 -0.075 0.031 OSRancimat 0.945 -0.005 -0.008 0.940 -0.028 -0.096 0.105 -0.002 -0.006 Extraction method: Rotation method: Varimax. Rotation method: Without Principal Components a The rotation has converged in 5 rotation Analysis iterations Components score PV, peroxide value; CAROT, carotenoids, CLORO, chlorophylls; HTYR, hydroxytyrosol; TYR, tyrosol; SEC HTYR, Hydroxytyrosol secoiridoids; SEC TYR, Tyrosol secoiridoids; o-DIPH, o-diphenols; TOTAL=total phenols; TOH, - tocopherol; UFA, unsaturated fatty acids; PUFA, polyunsaturated fatty acids; OS, Oxidative stability The second PCA (PCA2) was used to reduce variables based on rates of increase or decrease of oxidation indices, fatty acids and antioxidants (10 variables, see Table 3.22), at 25, 40, 50 and 60 ºC separately (N=28 samples), and with joined data for the four temperatures (N=112 121 3. Experiimental results samples). For N=112, the KMO factor had a value of 0.885, indicating a good fit of the sample to this analysis. Bartlett test had zero significance, so there was significant correlation between variables. Applying Kaiser rule (eigenvalues <1) only one factor (principal component) was generated in the PCA, explaining the 87.2% of the variance. Significant eigenvalue was PC1 = 9.594. This factor could mean “transformation rates”. In this case, loadings were negative for temperature and rates of PV, K232, K270, and were positive for rates of antioxidant and PUFAs reduction (Table 3.24). Several attempts of multivariate linear regression (MLR) were done in order to explain/predict the relationship among shelf life, initial composition and/or oxidation progress. For sequential variable selection, a stepwise regression was carried out. Table 3.24. Components, loadings and scores of the first Principal Component Analysis (PCA2) Component matrix a (loadings) Components score matrix Component Component 1 1 TEMPERATURE -0.917 TEMPERATURE -0.096 kPV -0.952 kPV -0.099 kK232 -0.966 kK232 -0.101 kK270 -0.967 kK270 -0.101 kTOTPH2 0.969 kTOTPH2 0.101 koDIPH2 0.960 koDIPH2 0.100 kSECHTYR 0.981 kSECHTYR 0.102 kSECTYR 0.944 kSECTYR 0.098 kTOH 0.953 kTOH 0.099 kUFAs 0.627 kUFAs 0.065 kPUFAs 0.981 kPUFAs 0.102 Extraction method: Principal Components Analysis Rotation method: Varimax. a 1 component extracted Components score PV, peroxide value; SEC HTYR, Hydroxytyrosol secoiridoids; SEC TYR, Tyrosol secoiridoids; o-DIPH, o-diphenols; TOTPH=total phenols; TOH, -tocopherol; UFA, unsaturated fatty acids; PUFA, polyunsaturated fatty acids The parameters suggested as dependent variables were those related to EVOO quality: - tPV20: time needed at 25ºC to reach the upper legal limit for peroxide value in extra virgin olive oils (20 meq/kg) (N =28), - tK232: time needed at 25ºC to reach the upper legal limit for K232 in extra virgin olive oils (2.50 meq/kg) (N =28), - tK270: time needed at 25ºC to reach the upper legal limit for K270 in extra virgin olive oils (0.22 meq/kg) (N =28), Considering also that the health claim “olive oil polyphenols contribute to the protection of blood lipids from oxidative stress” may be used for olive oil that contains at least 5 mg of 122 3. Experiimental results hydroxytyrosol and its derivatives per 20 g of olive oil, another investigated dependent variables were: - koDIPH: rate of o-diphenols (hydroxytyrosol and derivatives) decrease at 25 ºC (N =28) - kSECHTYR: rate of hydroxytyrosol secoiridoid derivatives decrease at 25 ºC (N =28) With this calculation and the known initial content of o-diphenols or hydroxytyrosol secoiridoid derivatives, it could be predicted the time to which the health claim could be maintained. As independent variables there were firstly considered all those related to initial state (12 variables), besides those related to oxidation development at accelerated temperature studied (11 variables x 3 temperatures = 33 variables) (see Table 3.22). An analysis of variance (ANOVA) procedure was used to determine the significance of the model. The results of the MLR model model respond to equation like: y = h0 + b1x1 + b2x2 + b3x3+…….bnxn where y is dependent variable, xn are the independent variables, and bn corresponded to coefficient correlation of xn. A negative bn means a preventive or negative effect of the corresponding variable on y. On the other hand, positive values demonstrate a correspondence with the selected dependent variable. h0 in the final equation correspond to the constant. To select the proper model equations, diagnosis of collinearity, homoedasticity, and normal residues distribution were tested. Sometimes, the software introduced just one independent variable that no significatively increase R2 but suppose to perform an accelerate oxidation test at a different temperature. In this case, this variable was removed from the model in order to simplify the experimental predictive work. Table 3.25 shows the final selected model equations. Table 3.25. Proposed predictive models Dependent Model by MLR R2 variable tPV20_25 -59.62+ 4.97 tK232_40 + 1266.03 koDIPH_40+ 116.66 kPV_40+ 19.47 tPV20_60 0.946 tK232_25 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 0.904 koDIPH_25 -0.008 -0.005 kPV_50 + 0.001PVini – 0.001 t K232_50 0.901 -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104x10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kSECHTYR_25 0.915 kUFAs_50 42.56+17.85 transformation rates -16.57 initial oxidation state and tPV20_25 0.575 conditions -14.20 free simple phenols +8.51 substrate 20.15 +7.19 transformation rates -8.74 initial oxidation state and conditions - tK232_25 0.501 9.53 free simple phenols +5.51 substrate koDIPH_25 -0.095 +0.082 transformation rates + 0.011 substrate 0.937 -0.106+0.087 transformation rates +0.006 substrate +0.004 initial oxidation kSECHTYR_25 0.969 state and conditions 123 3. Experiimental results Despite the fact that the models explained a high percentage of the variance (90.1-90.6%) few independent variables were automatically considered among all available. Thus, modelling equations were tried using the calculated factor for principal components (PC1, substrate: fatty acid and antioxidant content; PC2, initial oxidation state and conditions, PC3, free simple phenols) as independent variables. Resulting selected modelling equations are described in Table 3.25. Although high determination coefficients were obtained for koDIPH_25 and kSECHTYR_25 (0.937 and 0.969, respectively), this equations had some value for explaining the behaviour of the experimental variables, but lower predictive value, due to the complexity for factor experimental calculation. Figure 3.27 shows the correlation between real experimental values and those calculated with model equations. Figure 3.27. Real and calculated values from predictive equations. •, tK232_25; ж, tPV20_25;▲; kSECHTYR_25; ○; koDIPH_25 124 3. Experiimental results On the basis of the experimental results observed in a previous study (Mancebo-Campos et al., 2008), it is feasible to perform an accelerated stability test at a temperature below 60 ºC to estimate shelf-life based on normalize parameters, using TRUL for K232 (tK232_25) and a mean value for factor “b” : tK232_25 = a Tb b, mean value -3.72 ± 0.22 -3.72± 0.22 a = texp/Texp texp = time to reach K232=2.5 at Texp Texp = temperature of the accelerated test (i.e. 40 ºC) T = temperature of ambient storage (i.e. 25 ºC) Focusing on samples initial oxidation conditions and substrate, TRUL for K232 (tK232_25) can also be predicted by means of the following model equation: tK232_25= 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 (R2= 0.904) Also can be estimated when the concentration of hydroxytyrosol derivatives would falloff below 5 mg/20 g of olive oil, by prediction of the rate of degradation of secoiridoids hydroxytyrosol at room temperature from an accelerated storage at 50 ºC, by means of the model equation: kSECHTYR_25= -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104·10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kUFAs_50 (R2= 0.915) 125 iissccuussiióónn ddee eessuullttaaddooss 4. Diiscusiión de resultados En esta parte se presenta la discusión general de los resultados del trabajo de investigación que constituye esta Tesis Doctoral, siguiendo la estructura de los objetivos planteados. 1. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE LA MATRIZ LIPÍDICA Y DE LOS COMPONENTES MINORITARIOS DEL ACEITE DE OLIVA FRENTE AL PROCESO DE AUTOXIDACIÓN 1.1) Evolución de la oxidación de la matriz lipídica entre 25 y 75 ºC (25, 40, 50, 60 y 75 ºC) La oxidación de la matriz lipídica se comporta según una reacción autocatalítica (Frankel, 1998) en la cual la velocidad de degradación de los UFAs y la velocidad de aumento de peróxidos es lenta al inicio de la oxidación, pero se incrementa a partir del periodo de inducción (IP) (Capítulo 3.1, Figura 3.1). También el parámetro K270, así como la concentración de dímeros y polímeros de triacilgliceroles, aumentaron de forma logarítmica con el tiempo. Por otro lado, al igual que en Gómez-Alonso et al. (2004), se verificó una relación lineal, con pendiente muy cercana a la unidad, entre el tiempo de almacenamiento necesario para alcanzar el umbral de detección de rancidez sensorial y el periodo de inducción en la formación del compuesto t,t-2,4-decadienal (Capítulo 3.1, Figura 3.4), por lo que la determinación por cromatografía de gases de este compuesto se consideró de gran utilidad para medir el umbral de rancidez en el POO y en el rango de temperaturas de autoxidación comprendido entre 25 y 75 ºC. 1.2) Evolución de la oxidación del aceite de oliva virgen entre 25 y 60º C (25, 40, 50 y 60 ºC) según los índices de calidad normalizados A cada una de las temperaturas estudiadas, la velocidad de aumento del PV y K232 fue muy similar en todas las muestras independientemente del contenido inicial de antioxidantes, excepto a la temperatura de 60 ºC, en la que las muestras con mayor contenido de antioxidantes tardaron más tiempo en alcanzar la fase estacionaria, y las de menor contenido inicial de antioxidantes sufrieron, a partir de la misma, un aumento considerable de la velocidad de oxidación en lugar de una estabilización (Capítulo 3.4, Figura 3.11 a y b). Las constantes de velocidad de oxidación (k) fueron calculadas para PV, K232 y K270 en base a las cinéticas experimentales obteniendo buenos coeficientes de determinación (0.926 R2 0.999) (Capítulo 3.4, Tabla 3.9). La muestra que presentó menor velocidad de oxidación a todas las temperaturas estudiadas fue la muestra II, una de las de mayor contenido inicial de antioxidantes. Por el contrario, la que se oxidó más rápidamente fue la muestra IV, con un contenido de antioxidantes medio. 129 4. Diiscusiión de resultados 1.3) Factibilidad de los límites de los parámetros de calidad normalizados para revelar el grado de oxidación Al final de las 93 semanas de almacenamiento a 25 ºC, ninguna de las siete muestras había sobrepasado el límite de 20 meq/kg establecido para el índice de peróxidos (EC 1989/2003) para la calidad virgen extra (Capítulo 3.2, Tabla 3.3). Tampoco lo hicieron las muestras II y VII a 40 ºC; ni la VII a 50 ºC ni la II a 60 ºC (Capítulo 3.4, Tabla 3.10). En todos los casos, la fase estacionaria se alcanzó por debajo o ligeramente por encima de dicho límite (Capítulo 3.4, Figura 3.11 a). Esto lleva a pensar que el índice de peróxidos no es un buen parámetro para determinar el estado de oxidación, especialmente cuando se trata de un almacenamiento prolongado. Los hidroperóxidos se descomponen con el avance de la oxidación, por lo que la disminución del índice de peróxidos en el tiempo nos daría una información equivocada sobre el estado del aceite. Por el contrario, el parámetro K232 fue el primero en superar el límite establecido por la Normativa Europea (2.50) en seis de las siete muestras estudiadas a 25 ºC (Capítulo 3.2, Tabla 3.3), y en todos los casos a temperaturas entre 40 y 60 ºC (Capítulo 3.4, Tabla 3.10). Este es uno de los aspectos por los que se considerará el mejor de los tres parámetros normalizados para establecer el final de la vida útil del AOV, además de porque, de los tres índices de oxidación normalizados, presentó el coeficiente de determinación más alto con la disminución de los ácidos grasos poliinsaturados en todas las temperaturas estudiadas (0.581 < R2<0.924). En todos los casos, excepto en las muestras V y VI a 25 ºC, el límite de 0.22 establecido para el parámetro K270 se alcanzó durante el periodo experimental (Capítulo 3.4, Tabla 3.10). Las muestras I y III, ambas con elevado contenido inicial en compuestos fenólicos y OS Rancimat, presentaron una mayor velocidad de aumento de este parámetro. La muestra II, con similar estado de oxidación inicial y contenido fenólico mostró la menor velocidad de aumento del K270. Una posible explicación a este diferente comportamiento se encontró en el hecho de que el contenido en C18:3 de las muestras I y III era significativamente mayor (Capítulo 2, Tabla 2.1). 1.4) El grado de instauración de los ácidos grasos, la concentración de antioxidantes y la temperatura de almacenamiento son factores decisivos que influyen sobre su velocidad de oxidación La concentración de ácido oleico (C18:1) permaneció prácticamente constante durante el periodo experimental en todas las temperaturas y muestras de VOO estudiadas. Sin embargo, el ácido linoleico (C18:2) y el linolénico (C18:3) disminuyeron a mayor velocidad conforme aumentó la temperatura del ensayo, alcanzando una deceleración en las fases finales del ensayo a 40 y 50 ºC (Capítulo 3.4, Figura 3.11 d). A 25 ºC, el C18:3 disminuyó entre 2.5 y 2.8 veces más que el C18:2, en todas las muestras estudiadas (Capítulo 3.2, Tabla 3.4). En el caso del POO a 25 ºC, la proporción de la disminución de ambos ácidos grasos fue menor (1.8) para el mismo grado de oxidación del aceite (índice de peróxidos entre 10 y 20 meq/kg) lo que sugiere que los antioxidantes presentes en el aceite de oliva virgen protegen de forma más efectiva frente a la oxidación al ácido linolénico que al linoleico. 130 4. Diiscusiión de resultados No se observaron diferencias significativas en las velocidades de degradación de UFAs entre muestras con diferente contenido inicial de antioxidantes entre 25 y 50 ºC, sin embargo, a 60 ºC, la fase estacionaria final se alcanzó antes en las muestras con mayor contenido de antioxidantes (I-III) y la disminución fue más rápida en las muestras con menos antioxidantes iniciales (IV-VII) (Capítulo 3.4, Figura 3.11 d), coincidiendo con los resultados comentados para el índice de peróxidos y la K232. La menor protección de los PUFAs por la menor cantidad de antioxidantes es más notable a partir de los 60 ºC. Las relaciones entre ácidos grasos no-oxidados, C18:1/C18:2; C18:1/C18:3 y C18:2/C18:3, aumentaron ligeramente con el tiempo ya que cuanto más insaturado es un ácido graso más susceptible es frente a la oxidación. El comportamiento fue similar en todas las muestras entre 25 y 60 ºC, excepto en las muestras IV-VII a 60 ºC en las cuales estas relaciones fueron considerablemente más altas al final del periodo de almacenamiento, 1.5) Evolución de la oxidación en los compuestos minoritarios del aceite de oliva A medida que aumenta la temperatura, las diferencias entre las muestras con respecto a su composición fenólica se hacen más evidentes como consecuencia de las diferentes velocidades de hidrólisis de los derivados secoiridoideos, la descomposición térmica y su acción como antioxidantes. El aumento lineal de las concentraciones de fenoles sencillos, HTYR y TYR, en prácticamente todas las muestras a 25 ºC, pudo producirse a partir de la hidrólisis no oxidativa de sus derivados secoiridoideos (Brenes et al., 2001). En las muestras VI y VII, con la menor concentración inicial de derivados SEC HTYR (0.32 y 0.43 mmol/kg, respectivamente) y SEC TYR (0.23 y 0.52 mmol/kg, respectivamente), el HTYR y TYR disminuyeron desde el principio (Capítulo 3.2, Tabla 3.5) por la menor incidencia y velocidad de hidrólisis de los fenoles complejos frente a la velocidad de oxidación de los fenoles sencillos. Este hecho se corroboró también porque las muestras de aceite purificado con menos de 0.50 mmol/kg de SEC HTYR añadido se comportaron de la misma forma (Capítulo 3.6). A 40 ºC, el contenido de HTYR aumentó solo en la muestra II, en el resto se mantuvo prácticamente constante o disminuyó a diferentes velocidades hasta alcanzar una fase estacionaria final. A 50 y 60 ºC, la velocidad de descomposición parece ser mayor que la de formación, ya que el contenido de HTYR cayó desde el principio en todas las muestras. Las muestras IV, V, VI y VII alcanzaron el estado estacionario final a 50 y 60 ºC cuando el hidroxitirosol prácticamente había desaparecido, sin embargo, las muestras I, II y III conservaron entre 20 y 50% del contenido inicial al final del período de almacenamiento (Capítulo 3.7, Figura 3.24). La disminución más rápida de HTYR en todas las temperaturas se produjo en la muestra VI, que inicialmente presentaba las relaciones más bajas de Secoiridoideos de hidroxitirosol/Hidroxitirosol libre (SEC HTYR/Free Htyr) (1.21) y Fenoles complejos/simples (0.69), mientras que las velocidades más lentas de caída de hidroxitirosol fueron las de las muestras II y IV, que tuvieron las proporciones más altas de SEC HTYR /Free Htyr (21.1 y 31) y fenoles complejos/simples (18.4 y 25.3). Una de las velocidades más bajas también se presentó en la muestra III, que tenía el mayor contenido inicial de o-difenoles y la relación más alta de o-difenoles/fenoles totales (Capítulo 2, Tabla 2.1). En las muestras I, II y III, 131 4. Diiscusiión de resultados se produjo por tanto una liberación de hidroxitirosol a partir de la hidrólisis de fenoles complejos. El contenido de TYR siguió una tendencia de crecimiento general a todas las temperaturas estudiadas, lo que significa que la velocidad a la que este compuesto se descompuso fue siempre menor que la de la hidrólisis de sus derivados secoiridoideos. Una excepción a esta tendencia fue la muestra VII, en la cual el tirosol se redujo desde el principio. Como se ha comentado tenía el contenido más bajo de SEC TYR por lo que la hidrólisis de sus derivados complejos no fue suficiente para compensar la pérdida de tirosol, ya sea por descomposición térmica o como consecuencia de su acción antioxidante. Lo mismo ocurrió con la muestra VI de 40 a 60 ºC. Análogos resultados se obtuvieron con aceite de oliva de variedades griegas a 50 ºC en botellas abiertas (Capítulo 3.5, Figura 3.18 b). Una disminución general de los SEC HTYR (suma de las formas dialdehídicas y aldehídicas de oleuropeína aglicona) y de o-difenoles (que también incluyen hidroxitirosol libre) fue común en todas las muestras, pero más rápida conforme aumentó la temperatura del estudio (Capítulo 3.2, Tabla 3.5, Figura 3.5) (Capítulo 3.7, Figura 3.25). En el estado final, el contenido de estos secoiridoideos se mantuvo prácticamente invariable o disminuyó muy lentamente, coincidiendo con la estabilización de los valores de PV y el K232 (Capítulo 3.4). Ocurrió de forma similar con otras variedades de aceite de oliva a 50 ºC, con una disminución inicial más rápida en botellas abiertas (OB) que en cerradas (Capítulo 3.5, Figura 3.17 a). La tendencia del contenido de SEC TYR (suma de las formas dialdehídicas y aldehídicas de ligustrósido aglicona) fue similar a la de los derivados de hidroxitirosol, pero la velocidad de disminución de los primeros y los porcentajes de pérdida final fueron menores (Capítulo 3.2, Tabla 3.5, Figura 3.5) (Capítulo 3.5, Figura 3.17 b), por lo que la estabilidad de los compuestos SEC TYR parece ser mayor que la de los SEC HTYR, coincidiendo también con Krichène et al. (2015). Las observaciones comentadas confirman que el grupo o-difenol comprendido en la molécula de hidroxitirosol y sus derivados los hace antioxidantes más activos en las condiciones utilizadas, pero su reducción se debe en gran parte a que son más susceptibles a la oxidación y descomposición térmica que los SEC TYR (Capítulos 3.3, 3.4, 3.5 y 3.6), como lo demuestra la menor pendiente de la cinética de degradación, especialmente a temperaturas de almacenamiento más altas (Capítulo 3.7, Tabla 3.18). Respecto al contenido de -tocoferol, la concentración inicial disminuyó de forma prácticamente lineal después de 21 meses de almacenamiento a 25 ºC (Capítulo 3.2, Figura 3.6) (Capítulo 3.7, Figura 3.26). La disminución entre 40 y 60 ºC fue también lineal pero más rápida con el incremento de temperatura. A 25 y 40 ºC, la tasa de reducción parece ser ligeramente menor al comienzo del almacenamiento, incluso parecía permanecer casi constante durante más de cuarenta semanas de almacenamiento a 25 ºC, y comenzó a disminuir cuando el agotamiento de los o-difenoles casi había concluido. En todas las muestras, esta disminución fue menor que la observada para los o-difenoles, lo que confirma, de acuerdo también con las observaciones de Blekas et al. (1995), que éstos últimos poseen mayor capacidad antioxidante que el -tocoferol especialmente en las primeras etapas de la autoxidación. En las etapas avanzadas de oxidación, el -tocoferol actúa como antioxidante, cuando los radicales peroxilo 132 4. Diiscusiión de resultados libres alcanzan cierto valor y no quedan atrapados por los antioxidantes fenólicos. Sin embargo, a 50 y 60 ºC, el contenido de α-tocoferol disminuyó rápidamente desde el principio y se estabilizó en todas las muestras cuando el agotamiento fue significativo. La disminución total de este compuesto varió entre 12-28% a 25 ºC, 26-56% a 40 ºC, 79-99% a 50 ºC y 90-100% a 60 ºC. Similares resultados se obtuvieron con otras variedades de aceite de oliva almacenadas en botellas abiertas a 50 ºC (Capítulo 3.5, Figura 3.16). Algunos autores han informado de la alta susceptibilidad de esta molécula a oxidarse a α-tocoferolquinonas a altas temperaturas (Verleyen et al., 2001), hecho que podría explicar la disminución más rápida a 50 y 60 ºC. El tocoferol a temperaturas inferiores a 50 ºC está protegido por los compuestos fenólicos que actúan como antioxidantes en las primeras etapas de oxidación. Los pigmentos carotenoides presentan una elevada susceptibilidad a la oxidación (Yasnishlieva et al., 1998) por la presencia de un sistema conjugado de doble enlace y grupos hidroxilo en su molécula, lo cual podría explicar la mayor tasa de reducción con la temperatura que se muestra en el Capítulo 3.7, de acuerdo con Hrncirik, et al. (2005) El efecto de los carotenoides en el aceite de oliva virgen en condiciones de autooxidación podría ser incluso negativo debido a sus productos de oxidación, que posiblemente puedan reaccionar con el sustrato lipídico y acelerar así la oxidación (Subagio et al., 2001). La reducción del contenido de clorofilas fue mucho menor que la de los carotenoides. Según Ceballos et al. (2003) y Hrncirik et al. (2005) su efecto como fotosensibilizadores debería ser inexistente en este estudio ya que los aceites se almacenaron en la oscuridad. Sin embargo, según Endo et al. (1985a, 1985b) sí puede darse una actividad antioxidante de estos compuestos en la oscuridad debido a la posible donación de un radical hidrógeno para romper las reacciones en cadena de radicales libres. La disminución también podría deberse a que en el aceite de oliva los pigmentos de clorofila se degradan para formar pirofeofitinas, esta reacción comienza poco después de que se extrae el aceite. Los pigmentos se descomponen debido a un proceso que implica la descarbometoxilación de clorofila y feofitinas para formar pirofeofitinas (Gertz et al., 2006). 1.6) Evolución de la oxidación de la matriz lipídica y del aceite de oliva virgen en condiciones Rancimat (100 ºC y 10 L/h de flujo de aire) Se observó un incremento de los parámetros de oxidación primaria, PV y K232, (Capítulo 3.3, Figura 1) y ambos parámetros resultaron aparentemente apropiados para monitorizar el avance de la oxidación y determinar también el IP, ya que su aumento fue lineal hasta prácticamente el IP Rancimat, produciéndose un repentino incremento a partir de ese momento. El límite de 20 meq O2/kg establecido para la categoría virgen extra se alcanzó para todas las muestras de VOO entre 28 y 56 horas, lo que corresponde aproximadamente al 40-60% del periodo de inducción (de acuerdo a los resultados de Gutiérrez et al., 2002a). El parámetro K270 fue el primero en alcanzar el límite establecido por la reglamentación en todas las muestras (Capítulo 3.3, Tabla 2), mientras que a 25 ºC lo fue el parámetro K232. Esto significa que, bajo estas condiciones aceleradas, los hidroperóxidos se transforman en compuestos secundarios de oxidación mucho más rápidamente que a 25 ºC. En efecto, la relación entre la velocidad de aumento de la K270 en Rancimat vs. 25 ºC osciló en valores entre 133 4. Diiscusiión de resultados 445 y 798, mientras que esta misma relación para K232 estuvo en el rango de 124 y 285 (Capítulo 3.3, Tabla 3). En todas las muestras de VOO, el PV aumentó linealmente siguiendo una cinética de pseudo orden cero (R2 > 0.964) hasta alcanzar aproximadamente el 80-90% del IP. En lo que respecta a los triacilgliceroles de los ácidos grasos insaturados (oleico, linoleico y linolénico) permanecieron prácticamente constantes a lo largo de todo el periodo de inducción, protegidos por la acción antioxidante de los o-difenoles, sin embargo, su concentración se redujo drásticamente a partir del IP, cuando los o-difenoles prácticamente habían desaparecido (Capítulo 3.3, Figura 3). La relación entre ácidos grasos degradados en condiciones Rancimat y los degradados a 25 ºC fue mayor en todas las muestras para el C18:2 (4.1-5.3), seguido por el C18:3 (2.3–4.1) y finalmente el C18:1 (1.1–4.5). Una excepción fue la muestra B, que presentó valores similares para los tres ácidos grasos (Capítulo 3.3, Tabla 3), posiblemente porque su mayor contenido en C18:3 respecto a las otras muestras hizo que durante la oxidación se produjese una cantidad mayor de radicales linolenilo, que a su vez aceleraron la oxidación a 100 ºC de los ácidos grasos C18:2 y C18:1 (Frankel, 1998). A 25 ºC no se observaron diferencias significativas en la relación porcentaje de degradación de C18:2/C18:1 con el porcentaje de degradación C18:3/C18:2, por lo que la presencia de un doble enlace adicional produce un cambio proporcional en la susceptibilidad a la oxidación a esta temperatura. No ocurrió así bajo condiciones Rancimat, donde la relación porcentaje de degradación de C18:2/C18:1 fue generalmente mayor, y la relación porcentaje de degradación de C18:3/C18:2, fue incluso menor que a 25 ºC. Por lo tanto, se confirma que la alta temperatura y el elevado flujo de aire, influyen de forma más acentuada en el ácido linoleico que en los demás ácidos grasos insaturados. En las condiciones Rancimat, la concentración de o-difenoles disminuyó rápidamente desde el principio y, una vez que prácticamente habían desaparecido (la reducción de su contenido inicial alcanzó el 90% antes del 80% del IP), los índices de oxidación y los productos de oxidación se incrementaron bruscamente (Capítulo 3.3, Figura 3). El agotamiento del TYR y sus derivados fue menos pronunciado (70-86%). En contraste, la pérdida de o-difenoles fue mucho menor en las mismas muestras a 25 ° C (Capítulo 3.2), oscilando entre 54 y 71%, mientras que la de TYR y derivados fue entre 33 y 58% (Capítulo 3.3, Figura 4). En ambas condiciones de oxidación, el comportamiento del HYTR y sus SEC HTYR (o-difenoles) siguió una cinética de pseudo primer orden: Ln C= kt + Ln C0; (0.89 ≤R2≤0.96 a 25 ° C y 0.97≤R2≤0.99 bajo las condiciones Rancimat). Teniendo en cuenta escasa actividad antioxidante del TYR y sus derivados (Baldioli et al., 1996; Mateos et al., 2003), su elevada pérdida a 100 ° C se debió probablemente en su totalidad a la degradación termoxidativa, que por supuesto también puede haber ocurrido en los otros compuestos fenólicos. En las condiciones Rancimat, el -tocoferol disminuyó rápidamente y casi linealmente desde el primer momento, (la reducción de su contenido inicial alcanzó el 99% antes del 80% del IP) (Capítulo 3.3, Figura 4). La disminución de este compuesto fue mucho menor a 25 °C, ya que el agotamiento no fue superior al 30% en ninguna muestra. La rápida disminución observada podría deberse a la oxidación a altas temperaturas hacia -tocoferolquinonas (Verleyen et al., 2001). 134 4. Diiscusiión de resultados El efecto sinérgico de los o-difenoles y el -tocoferol estudiados por algunos autores depende de la concentración relativa de ambos antioxidantes y del nivel de oxidación de la matriz lipídica (Blekas et al., 1995). Además, de acuerdo con los resultados de este estudio, estaría fuertemente relacionado con las condiciones de oxidación utilizadas porque es considerablemente diferente en condiciones ambientales y aceleradas. Por lo tanto, la capacidad antioxidante del -tocoferol determinada por otros autores en condiciones de oxidación acelerada (Baldioli et al., 1996; Mateos et al., 2003, 2005) probablemente no podría atribuírsele también a temperatura ambiente. 2. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE INDIVIDUAL Y COMBINADA DE LOS ANTIOXIDANTES NATURALMENTE PRESENTES EN EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN La gran capacidad estabilizadora de los compuestos minoritarios del aceite de oliva también quedó evidenciada, al comparar el tiempo necesario de cualquiera de las siete muestras estudiadas a 25 ºC para alcanzar los límites normalizados del índice de peróxidos, K232 o K270 (Capítulo 3.2, Tabla 3.3), con las 6.8, 7.7 y 15.3 semanas respectivamente que fueron necesarias para que lo hiciera el POO. A la vista de estos resultados, se intentó confirmar una posible relación entre la velocidad de oxidación, determinada con los parámetros PV y K232, y otros parámetros como la OS Rancimat, el contenido inicial en compuestos fenólicos o -tocoferol, o el estado inicial de oxidación. 2.1) Efecto individual de los compuestos minoritarios en la oxidación de la matriz lipídica En el estudio con POO con diferentes concentraciones de HTYR y -tocoferol, durante el almacenamiento en botellas abiertas a 25 ºC, el aumento en el PV y la K232 fue lineal desde el principio y durante las 50 semanas del ensayo; así, la reacción de oxidación primaria siguió aparentemente una cinética de pseudo orden cero (0.895 ≤R2 ≤0.999). A una temperatura de almacenamiento más alta (40 ºC), se observó una curva de oxidación en dos etapas para ambos índices de oxidación (PV y K232) en el caso de POO (Capítulo 3.6, Figura 3.19). Cantidades crecientes de HTYR y oleuropeína aglicona produjeron un aumento en la estabilidad oxidativa del POO, tanto por el valor de TRUL a 25 ºC y a 40 ºC (Capítulo 3.6, Tabla 3.17, Figura 3.20a, b) como por el valor del IP Rancimat (Tabla 3.17, Figura 3.20 c). La velocidad de oxidación (k) se redujo a la mitad con 0.10 mmol/kg de HTYR agregado al POO (de 38 a 20 μmol kg -1 semana -1) o con 0.2 mmol/kg de oleuropeína aglicona (OA) (de 38 μmol kg -1 semana -1 hasta 19 μmol kg -1 semana -1) (Capítulo 3.6, Tabla 3.16). Sin embargo, solo concentraciones de HTYR ≥ 0.25 mmol/kg u oleuropeína aglicona ≥ 0,50 mmol/kg mostraron efecto antioxidante en estados de oxidación avanzada, reduciendo la velocidad de aumento de PV y K232 (Figura 3.19 b, d). El notable efecto antioxidante de HTYR y oleuropeína aglicona dejó de ser proporcional a la concentración por encima de 0.25 mmol/kg de HTYR o de 0.50 mmol/kg de OA ya que a partir 135 4. Diiscusiión de resultados de estas concentraciones la gráfica (Figura 3.20) muestra una tendencia a estabilizarse. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Mateos et al. (2003) para IP Rancimat pero contraponen el aumento lineal con la concentración reportado por Servili et al. (1996). El efecto de la concentración de antioxidantes sobre la mejora en el IP Rancimat fue muy similar para HTYR y oleuropeína aglicona: 29.4 horas y 27.7 horas, respectivamente, a 0.1 mmol/kg (Capítulo 3.6, Tabla 3.17). Sin embargo, el análisis de TRUL mostró que a 25 y 40 ºC se requiere una concentración doble de oleuropeína aglicona con respecto al HTYR para alcanzar el mismo efecto estabilizador, es decir, 0.1 y 0.2 mmol/kg, respectivamente, para alcanzar aproximadamente 60 semanas de estabilidad a 25 ºC (Tabla 3.17), lo que significa que, en condiciones suaves de oxidación, el compuesto fenólico simple es presumiblemente más activo como antioxidante. Como ya se ha evidenciado en otras partes de la investigación, el TYR no mostró actividad antioxidante a ninguna concentración estudiada (Capítulo 3.6, Figura 3.20, Tablas 3.16 y 3.17), lo que coincide con la falta de capacidad antioxidante generalmente atribuida a este fenol (Mateos et al., 2003; Fki et al., 2005). La adición de -tocoferol resultó en un efecto prooxidante: una mayor concentración de - tocoferol condujo a una mayor velocidad de oxidación en todo el periodo de ensayo a 25 ºC (Capítulo 3.6, Figura 3.19 a,c; Tabla 3.16), y a una menor estabilidad del POO (expresada como TRUL) pasando de 23.8 a 15.6 semanas aumentando su concentración de 0.10 a 0.50 mmol/kg (Tabla 3.17). A 40 ºC actuó como prooxidante durante la fase de oxidación primaria, disminuyendo la estabilidad del aceite a medida que su concentración aumentó de 0.10 a 1 mmol/kg. La velocidad de oxidación primaria (k) se duplicó con 0.5 mmol/kg de -tocoferol agregado al POO (de 38 μmol kg -1 semana -1 a 73 μmol kg -1 semana -1; Tabla 3.16). En la fase de oxidación secundaria, se apreció cierta actividad antioxidante a concentración ≥ 1 mmol/kg (Figura 3.19 b, d). Esto podría explicarse por la formación de radicales tocoferoxilo que participan en la propagación de reacciones por abstracción de hidrógeno de los hidroperóxidos lipídicos (Kamal-Eldin et al., 1996; Ouchi et al., 2009; Bakir et al., 2013). Sin embargo, a partir de una cierta acumulación de peróxido, los restos -tocoferol comienzan a actuar como desactivadores de radicales, disminuyendo la velocidad de oxidación. Por el contrario, en condiciones aceleradas del Rancimat el -tocoferol se comportó siempre como antioxidante, aumentando el IP de 19.7 horas a 29.2 horas para un incremento de concentración de 0.10 a 0.50 mmol/kg. Este resultado hace cuestionable el uso de este tipo de métodos acelerados para evaluar la capacidad antioxidante de diferentes compuestos, más aún si los resultados se pretenden extrapolar a condiciones reales de almacenamiento. La representación gráfica de la constante de velocidad de oxidación (k) en función de la concentración del compuesto agregado (H, OA y T) (Capítulo 3.6, Tabla 3.16) se ajusta muy -x/b 2 bien a un modelo de disminución exponencial y= y0 + ae ; (0.990 ≤R ≤0.999), y por lo tanto el progreso de la reacción de oxidación podría simularse y predecirse. El parámetro “a” en la ecuación es positivo para HTYR y oleuropeína aglicona y negativo en el caso de -tocoferol de acuerdo con su efecto antioxidante o prooxidante como ya se ha descrito. 136 4. Diiscusiión de resultados 2.2) Capacidad antioxidante de los compuestos combinados En los VOO y otros aceites comestibles, los compuestos naturales con actividad antioxidante están presentes al mismo tiempo y, por lo tanto, es muy importante estudiar su efecto combinado, ya sea sinérgico o antagonista. A las dos temperaturas estudiadas (25 y 40 ºC), la adición de -tocoferol a cualquier concentración de HTYR o TYR tuvo un efecto prooxidante, disminuyendo considerablemente la estabilidad oxidativa del POO, expresada como TRUL (Capítulo 3.6, Tabla 3.17 y Figura 3.21) o como velocidad de oxidación (Capítulo 3.6, Tabla 3.16), en comparación con el aceite enriquecido con el compuesto fenólico solo. Por ejemplo, la adición de 0.2 mmol/kg de - tocoferol al POO enriquecido con 0.1 mmol/kg de HTYR redujo considerablemente su TRUL de 61.2 a 28.1 semanas (Tabla 3.17), aumentando la velocidad de oxidación inicial de 20 a 43 μmol kg-1 semana-1 (Tabla 3.16). Por otro lado, se observó el efecto positivo de la adición de HTYR al aceite con -tocoferol, pero fue significativo solo a concentraciones de -tocoferol más bajas (0,20 mmol/kg; Figura 3.21 a, b). A partir de los valores experimentales de las constantes de velocidad de oxidación (k) encontradas en este estudio (Tabla 3.16), se puede concluir que no se observaron efectos sinérgicos o antagonistas cuando se añadió tocoferol junto con hidroxitirosol u oleuropeína. De hecho, la suma del efecto positivo (reducción en k) debido a la adición de una cierta concentración de hidroxitirosol (H) o oleuropeína aglicona (OA), y el efecto negativo (aumento en k) producido por la presencia de una determinada cantidad de -tocoferol, resultó muy próxima a la velocidad de oxidación observada al añadir al POO una concentración combinada de cualquiera de los compuestos estudiados (H o OA y T). Por ejemplo, la velocidad experimental de oxidación medida a 25 ºC en POO enriquecido con 0.05 mmol/kg de HTYR + 0.2 mmol/kg de -tocoferol (49 μmol kg -1 semana -1; Tabla 3.16), podría calcularse de forma muy aproximada mediante la suma del efecto neto del antioxidante sobre la velocidad (k de H0.05 menos k de POO) y del efecto neto prooxidante (k de -T0.2 menos k de POO) más la velocidad de oxidación del propio POO solo (k de POO): (25 μmol kg -1 semana -1– 38 μmol kg -1 semana -1) + (60 μmol kg -1 semana -1– 38 μmol kg -1 semana -1) + 38 μmol kg -1 semana -1= valor pronosticado de 47 μmol kg -1 semana -1 La adición de la oleuropeína aglicona (OA) al hidroxitirosol (H) aumentó la estabilidad de POO ya que la constante de la velocidad de oxidación (k) disminuyó; por ejemplo, de 20 a 9 μmol kg -1 semana -1 con la adición de 1 mmol/kg de OA a 0.1 mmol/kg de H (H 0.10 x OA 1.0) a 25 ºC; o de 53 a 40 μmol kg -1 semana -1 con un aumento de 0.5 mmol/kg de OA sobre 0.25 mmol/kg de H (H 0.25 x OA 0.50) a 40 ºC, pero solo para concentraciones de hidroxitirosol < 0.50 mmol/kg (Tabla 3.16). La estabilidad a la oxidación, medida como IP Rancimat, una vez más se comportó de manera diferente (Capítulo 3.6, Figura 3.21 c), ya que aparentemente se observó un efecto antagonista entre HTYR y -tocoferol. Por ejemplo, el IP aumentó solo de 23.8 a 33.8 h al agregar 1 mmol/kg de -tocoferol al purificado con 0.05 mmol/kg de HTYR (H005 + T1; Tabla 3.17), mientras que la suma teórica de los efectos individuales hubiera sido mayor (23.8 + 24.3 = 48.1). El IP incluso disminuyó de 42.1 a 35.8 h al agregar 1 mmol/kg de -tocoferol al POO con 137 4. Diiscusiión de resultados 0.25 mmol/kg de HTYR (H025 + T1; Tabla 3.17). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Mateos et al. (2003). Prácticamente no se observó ningún efecto al agregar cantidades crecientes de TYR al POO enriquecido con -tocoferol (Figura 3.21). Además, se observó el mismo efecto prooxidante del -tocoferol para el TRUL a 25 y 40 ºC y antioxidante para el IP Rancimat. 2.3) Capacidad antiradicálica de los compuestos individuales La capacidad para atrapar radicales libres (RSC) se midió mediante la prueba DPPH. En la fracción polar (extracto metanólico) de las muestras de aceite estudiadas, la RSC fue lineal con la concentración en todo el rango estudiado, a diferencia de las tendencias del TRUL e IP. Además, el efecto anti radical de la oleuropeína aglicona fue mayor que el del HTYR. Una vez más, el TYR no mostró ningún valor significativo de RSC (Capítulo 3.6, Tabla 3.17). Con respecto a la actividad anti radicálica de la fracción total (hidrofílica y lipofílica, expresada como Eficiencia anti radicálica relativa; RARE), se pudo observar (Tabla 3.17) que, en este caso, el -tocoferol se comportó como un antioxidante de manera similar a HTYR y oleuropeína aglicona, aumentando su capacidad con su concentración, en contraste con el efecto prooxidante observado medido por el TRUL (Tabla 3.17) o la constante de velocidad de oxidación (Tabla 3.16). Para mezclas de compuestos fenólicos y -tocoferol, un contenido creciente de este último produjo una reducción en RSC, posiblemente porque algunos restos fenólicos habían interactuado previamente con radicales tocoferoxilo. A partir de la comparación de los resultados de RSC de la fracción total a la misma concentración, la eficiencia anti radical relativa (RARE) disminuyó en el orden -tocoferol ≥ oleuropeína aglicona> hidroxitirosol >> tirosol (Tabla 3.17). En todos los casos, a excepción del tirosol, el RARE aumentó con la concentración total de antioxidante tanto para compuestos añadidos individualmente como para mezclas de ellos. Sin embargo, este aumento no fue lineal ya que tendió a alcanzar una meseta a partir de cierto contenido total de antioxidantes. No se observó sinergismo en la eficacia anti radicálica ya que la suma de las RARE de las muestras con antioxidantes añadidos por separado fue siempre mayor que la RARE de las muestras con mezclas de antioxidantes en concentraciones equivalentes. Por ejemplo, el RARE de H025 (1.78) más el RARE de OA050 (3.13) fue mayor que el RARE de la muestra H025 + OA050 (3.21; Tabla 3.17). 2.4) Comparación entre resultados con botellas abiertas y con botellas cerradas Tanto en botellas cerradas (HS, N2) como abiertas (OB) a 25 ºC, la evolución lineal del PV y K232 se ajustó a una cinética de pseudo orden cero a lo largo de las 50 semanas del período de almacenamiento estudiado. En el caso del POO, el TRUL aumentó considerablemente en el orden botellas abiertas 138 4. Diiscusiión de resultados muestras de aceite de oliva virgen a 50 ºC (Capítulo 3.5, Tabla 3.13) y por otros autores (Di Giovacchino et al., 2002; Pristouri et al., 2010). La adición de HTYR o de oleuropeína aglicona redujo la velocidad de oxidación inicial en 12 μmol kg -1semana-1, tanto para POO enriquecido con 0.25 mmol/kg de HTYR como para POO con 0.5 mmol/kg de oleuropeína aglicona. No se observaron diferencias estadísticas significativas entre las condiciones de almacenamiento con HS y con N2. En cuanto al valor de TRUL, observó poca (H025) o incluso ninguna diferencia (OA050) entre las diferentes condiciones de almacenamiento estudiadas (Figura 3.22). La adición de -tocoferol redujo drásticamente la estabilidad del POO y su fuerte efecto prooxidante fue claramente visible incluso en condiciones de HS y N2. Las muestras de POO enriquecidas con 0.5 mmol/kg de -tocoferol mostraron una velocidad de oxidación más rápida -1 -1 en botellas cerradas (64 y 62 μmol kg semana para condiciones HS y N2) en comparación con -1 -1 el POO (22 y 18 μmol kg semana para HS y N2, respectivamente). A 40 ºC, la velocidad de oxidación fue mucho más alta y no se observaron diferencias estadísticamente significativas para OB, HS y N2, con la excepción de la muestra de POO con - tocoferol añadido, que presentó mayor TRUL K232 en botellas con N2 (16.2), frente a 7.6 en botellas con HS y 4.3 en botellas abiertas (Figura 3.22), probablemente porque esta temperatura más elevada aumentó la formación de radicales tocoferoxilo en presencia de oxígeno en todas las condiciones. Estos resultados coinciden con los obtenidos con VOOs tunecinos almacenados a 50 ºC, en botellas abiertas (OB) (Capítulo 3.5, Figura 3.16). 3. ESTUDIO CINÉTICO PARA EL DESARROLLO DE UN TEST DE ESTABILIDAD ACELERADO A TEMPERATURA SUAVE (40-60 ºC) QUE PERMITA DETERMINAR LA VIDA ÚTIL POTENCIAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN 3.1) La cinética de oxidación primaria de la matriz lipídica del aceite de oliva entre 25 y 75 ºC es de pseudo orden cero mientras que la de oxidación secundaria es de pseudo primer orden. Del estudio de la evolución del PV en del POO, se dedujo que el mecanismo de formación de hidroperóxidos parece seguir una cinética de pseudo orden cero (C=C0 + kt), en la cual la velocidad de reacción es independiente de la concentración de sustrato oxidable. Este resultado fue el mismo para la evolución del índice K232 y los triacilgliceroles oxidados y también para todas las temperaturas de oxidación estudiadas, por lo que puede concluirse que la oxidación primaria de la matriz lipídica del aceite de oliva sigue una cinética de pseudo orden cero. C0 es el valor del índice correspondiente en el aceite fresco, C es el valor después de un tiempo t (en horas) de almacenamiento, y k es la constante de velocidad de la reacción. El estudio de la evolución del parámetro K270, así como de la concentración de dímeros y polímeros de triacilgliceroles, los cuales aumentaron de forma logarítmica con el tiempo, permitió concluir que la cinética de formación de productos de oxidación secundaria a partir de la matriz lipídica del aceite de oliva es de pseudo primer orden (ln C/C0 =kt). 139 4. Diiscusiión de resultados Los valores de constante de velocidad y coeficientes de regresión para PV y K270 a todas las temperaturas estudiadas se detallan en la Tabla 3.1. 3.2) Las cinéticas de oxidación primaria y de oxidación secundaria del aceite de oliva virgen a 25 ºC es de pseudo orden cero Durante los 21 meses de almacenamiento en oscuridad a temperatura controlada de 25 ºC y en botellas abiertas, los parámetros de oxidación primaria PV y K232 aumentaron de forma lineal (Capítulo 3.2, Tabla 3.3), siguiendo cinéticas de pseudo orden cero (C=C0 + kt), al igual que en el caso del POO. Sin embargo, el parámetro K270 siguió igualmente una tendencia lineal, contrariamente a lo sucedido con el POO cuya cinética era de pseudo primer orden. 3.3) La cinética de oxidación primaria del aceite de oliva virgen entre 40 y 60 ºC es de pseudo orden cero mientras que la de oxidación secundaria es de pseudo primer orden. Las constantes de velocidad de oxidación (k) fueron calculadas para PV, K232 y K270 en base a las cinéticas experimentales obteniendo excelentes coeficientes de determinación (0.926 R2 0.999) (Capítulo 3.4, Tabla 3.9). La muestra que presentó menor velocidad de oxidación a todas las temperaturas estudiadas fue la muestra II, una de las de mayor contenido inicial de antioxidantes. Por el contrario, la que se oxidó más rápidamente fue la muestra IV, con un contenido de antioxidantes medio. A temperaturas de almacenamiento del VOO más elevadas (40, 50 y 60 ºC), los parámetros PV y K232 inicialmente aumentaron también siguiendo cinéticas de pseudo orden cero (de acuerdo con Calligaris et al., 2006). Sin embargo, tras varias semanas se alcanzó una fase estacionaria (Capítulo 3.4, Figura 3.11 a-c) en todas las muestras estudiadas independientemente del contenido en antioxidantes. A 60 ºC, la fase estacionaria se alcanzó más tarde en aquellas con mayor contenido en antioxidantes (I-III) y en las muestras con menor contenido inicial en antioxidantes (IV-VII), la fase estacionaria fue muy corta e inmediatamente seguida por un extraordinario aumento del PV y la K232 (Capítulo 3.4, Figura 3.11 a-b). La muestra que presentó menor velocidad de oxidación a todas las temperaturas estudiadas fue la muestra II, una de las de mayor contenido inicial de antioxidantes. Por el contrario, la que se oxidó más rápidamente fue la muestra IV, con un contenido de antioxidantes medio. Entre 40 y 60 ºC, la velocidad de aumento del parámetro K270 siguió una cinética de pseudo primer orden (ln C/C0 =kt). La fase “lag” inicial resultó más corta conforme aumentó la temperatura de oxidación, probablemente porque el tiempo necesario para alcanzar la energía de activación de la descomposición de los hidroperóxidos disminuye conforme aumenta la temperatura. Después de la fase de aumento, se alcanzó una fase estacionaria a 40 y 50 ºC pero no a 60 ºC (Capítulo 3.4, Figura 3.11 c). Los valores de constante de velocidad y coeficientes de regresión para PV, K232 y K270 a todas las temperaturas estudiadas están detallados en la Tabla 3.9. 140 4. Diiscusiión de resultados 3.4) La velocidad de oxidación primaria y secundaria del aceite de oliva está relacionada con la temperatura mediante la ecuación de Arrhenius. En el estudio de oxidación del POO entre 25 y 75 ºC, se observó que los valores de constante de velocidad (k) calculados para PV y K270 aumentaron con la temperatura (Capítulo 3.1, Tabla 3.1). Concretamente, el paso de 25 a 75 ºC produjo que la k para PV prácticamente se multiplicara por 7, y la k para K270 por 11, mostrando así que este parámetro influye de forma esencial en la velocidad de autoxidación de la matriz lipídica del aceite de oliva. La velocidad de oxidación primaria y secundaria de la matriz lipídica se relacionaron satisfactoriamente con la temperatura mediante la ecuación lineal de Arrhenius (ln k = lnA + Ea/RT) (Capítulo 3.1, Figura 3.2), (A, factor preexponencial; Ea, energía de activación de la reacción; R, constante de los gases; T, temperatura absoluta). De igual manera, los análisis de regresión lineal del logaritmo de k para el incremento de PV, K232, K270 y para la degradación de UFAs frente a la inversa de la temperatura de almacenamiento entre 25 y 60 ºC, corroboraron esta relación de tipo Arrhenius también en el VOO (Capítulo 3.4, Figura 3.12). Los valores de Ea obtenidos para la formación de productos de oxidación primaria (PV) y secundaria (K270) en el VOO (64.8 y 77.1, respectivamente) son prácticamente el doble que los del POO (32.1 y 42.2, respectivamente). Esto soporta la teoría de que los antioxidantes reaccionan capturando radicales libres y retrasando así la fase de propagación de la reacción de oxidación lipídica, por lo que es necesaria más energía para la formación y descomposición de los hidroperóxidos. La similitud entre los valores experimentales de Ea para PV, K232 y PUFAs en VOO, apoyan la teoría de que la degradación de los PUFAs conduce a la formación de peróxidos y dienos conjugados. Estos valores experimentales de Ea están en concordancia con los obtenidos por otros autores (Frankel, 1993; Frankel, 1998; Tan et al., 2001). 3.5) El valor del TRUL (Time to Reach the Upper Limit) del parámetro de oxidación primaria K232 se postula como el indicador mejor relacionado con la vida útil El primer estudio relacionado con la posibilidad de predecir la vida útil del aceite de oliva a partir de ensayos acelerados de estabilidad se realizó a partir de POO, calculando el tiempo de almacenamiento necesario para alcanzar los límites establecidos por la Normativa Europea (EC 796/2002) para los parámetros de oxidación primaria (PV y K232) y secundaria (K270) en la máxima calidad, VIRGEN EXTRA, del aceite de oliva. En lo que respecta a los estudios con VOO, el hecho, ya mencionado anteriormente, de que al final del periodo de almacenamiento a 25-60 ºC prácticamente ninguna de las siete muestras estudiadas sobrepasara el límite de 20 meq/kg establecido para la calidad virgen extra y que, en todos los casos, la fase estacionaria se alcanzase por debajo o ligeramente por encima de dicho límite, nos llevó a concluir que el PV no es un buen valor de referencia para establecer la calidad del aceite de oliva, especialmente cuando éste puede haber sido almacenado durante un periodo de tiempo, ya que en estados más avanzados de oxidación, los hidroperóxidos se 141 4. Diiscusiión de resultados descomponen, disminuyendo el índice de peróxidos aunque la oxidación sigue aumentando y la calidad del aceite reduciéndose. Por el contrario, el hecho de que el parámetro K232 fuese el primero en superar el límite establecido por la Normativa Europea (2.50) en seis de las siete muestras estudiadas a 25 ºC, y en todos los casos a temperaturas entre 40 y 60 ºC (Capítulo 3.4, Tabla 3.10) hizo que este parámetro se revelase como más adecuado para seguir la evolución de la oxidación y ser relacionado con la estabilidad del VOO. Otras razones adicionales para considerar este parámetro como el más apropiado para seguir la evolución de la oxidación del VOO fueron (Capítulo 3.2, Capítulo 3.4): - su mejor correlación con la degradación de ácidos grasos poliinsaturados y aumento de índices de oxidación en todas las temperaturas estudiadas (0.581 R2 0.924) - elevada linealidad en los primeros estadios de la oxidación, lo que permite calcular una velocidad de oxidación para estimar la vida útil en un tiempo breve - el método para su determinación, es sencillo, reproducible, y no presenta interferencias con otros compuestos presentes naturalmente en el aceite de oliva (como los polifenoles que absorben también a 272-280 nm y podrían interferir en la determinación de la K270) El tiempo necesario (experimental o calculado) para alcanzar el límite fijado por la normativa europea para PV, K232 y K270 en la categoría de aceite de oliva virgen extra se ha denominado TRUL (Time to Reach the Upper legal Limit). 3.6) La estabilidad oxidativa Rancimat no presenta correlación con la vida útil a temperatura ambiente Considerando diversos trabajos referenciados en bibliografía, y dados los resultados de este estudio que expone cómo el proceso de oxidación en condiciones aceleradas difiere sustancialmente de lo que sucede a temperatura ambiente, se confirma que no existe correlación entre la estabilidad oxidativa en condiciones normales de almacenamiento (medidas como TRUL para índice de peróxidos o TRUL para K232) y el periodo de inducción obtenido con el método Rancimat (R2 = 0.15 y R2= 5∙10-6) (Capítulo 3.3, Figura 2). Mejor correlación, aunque no excesiva (R2 = 0.55), se obtuvo entre el TRUL para índice de peróxidos a 25 ºC y el TRUL para índice de peróxidos en condiciones Rancimat (Capítulo 3.3, Tabla 2). Esto podría dar pie a una investigación aparte para comprobar si ciertas modificaciones en el método Rancimat, podrían ser relevantes para relacionar más directamente la estabilidad oxidativa con la vida útil a temperatura ambiente. De momento y en las condiciones de uso habitual, aunque este tipo de test acelerados (también AOM u OSI) son útiles para medir la estabilidad oxidativa en términos comparativos entre aceites de oliva u otros aceites vegetales, con una buena correlación entre el periodo de inducción y el contenido en compuestos fenólicos, no es posible extrapolar los resultados a un valor determinado de vida útil, puesto que esta correlación no se ha podido confirmar a temperatura ambiente (Cinquanta et al., 2001). 142 4. Diiscusiión de resultados 3.7) Existe una relación de tipo potencial entre el TRUL y la temperatura de almacenamiento Se consiguió establecer una relación de tipo potencial entre el tiempo (t) en alcanzar el límite de los parámetros de oxidación PV, K232, K270 y rancidez sensorial, y la temperatura (T) de almacenamiento (t=a∙Tb), lo cual, para el POO, permitiría calcular con bastante aproximación el tiempo necesario para alcanzar cualquiera de estos límites a temperatura ambiente (25 ºC) a partir de un ensayo de almacenamiento acelerado en oscuridad, por ejemplo, a 75 ºC (Capítulo 3.1, Figura 3.3). A partir de la representación gráfica lineal de logaritmo de tiempo frente a logaritmo de temperatura, fue posible observar que, a temperatura de 25 ºC, el tiempo en alcanzar los límites normalizados de PV y K232 es similar al necesario para alcanzar el umbral de rancidez, por lo que estos límites normalizados pueden considerarse buenos indicadores de la estabilidad sensorial del POO. Para el EVOO, también se ha evidenciado esta relación de tipo potencial entre el TRUL y la temperatura (TRUL=a∙Tb) en los estudios entre 25 y 60 ºC (Capítulo 3.4, Tabla 3.10). La representación gráfica lineal de logaritmo de TRUL frente a logaritmo de temperatura permite calcular el valor de “b” (pendiente de la recta) (Capítulo 3.4, Figura 3.13). En el caso del parámetro K232, el valor experimental medio de “b” para todas las muestras fue de -3.72 ±0.22. Por lo tanto, es factible realizar un ensayo de estabilidad acelerado a temperatura menor o igual a 60ºC para estimar la vida útil, expresada como TRUL K232, a 25 ºC: tK232_25 = a Tb b, valor medio -3.72 ± 0.22 -3.72 ± 0.22 a = texp / Texp texp = tiempo para alcanzar K232 = 2.5 a la Texp Texp = temperatura del ensayo acelerado (por ejemplo, 40 ºC) T = temperatura de almacenamiento normal (por ejemplo, 25 ºC) En el Capítulo 3.4, Tabla 3.11, se detallan los valores TRUL calculados, siendo muy similares y a los reales y siempre dentro del intervalo de confianza. Esta última ecuación, así como las ecuaciones cinéticas propuestas, son empíricas y no pretenden explicar un mecanismo de reacción, sino que permiten predecir con cierta aproximación la concentración de un parámetro de oxidación determinado y, por tanto, el tiempo necesario para alcanzarlo en condiciones normales de almacenamiento, a partir de un ensayo de estabilidad acelerado. 3.8) Cinéticas de degradación de compuestos fenólicos y -tocoferol Del análisis de los datos de concentración de compuestos fenólicos con el tiempo de almacenamiento se pudo deducir que la evolución del hidroxitirosol y el tirosol se ajustó a la cinética de orden pseudo-cero (Ct = Co + kt), mientras que las formas dialdehídicas y aldehídicas de oleuropeína y de ligustrósido agliconas, o-difenoles y fenoles totales, aparentemente siguieron una cinética de pseudo primer orden (Ln(Ct/C0) = kt), de acuerdo con Lavelli et al. 143 4. Diiscusiión de resultados (2006), Gómez-Alonso et al. (2007), y Krichène et al. (2015) Los parámetros cinéticos se detallan en el Capítulo 3.7 (Tablas 3.18 y 3.19). Los valores de la constante de velocidad de degradación (k) obtenidos en este estudio para los SEC HTYR y SEC TYR son alrededor de 100 veces más altos que los obtenidos por Lavelli et al. (2006) a 40 ºC, ya que usaron botellas cerradas, pero coinciden con las de Krichène et al. (2015) en botellas abiertas a 25 ºC y 50 ºC en muestras con un contenido fenólico inicial similar. Excluyendo las fases estacionarias finales a 50 y 60 ºC, se intentó correlacionar la evolución del α-tocoferol con una reacción de pseudo orden cero (Krichène et al., 2015). 3.9) La velocidad de degradación de los compuestos fenólicos y -tocoferol está relacionada con la temperatura mediante la ecuación de Arrhenius Como se esperaba, un aumento en la temperatura de almacenamiento aumentó la degradación de los compuestos fenólicos y el -tocoferol, particularmente a 50 y 60 ° C. Los análisis de regresión de las gráficas Ln k vs 1/T indicaron que la dependencia de las velocidades de degradación de los compuestos fenólicos y del -tocoferol con la temperatura podía describirse con el modelo lineal de Arrhenius entre 25 y 60 ºC, sin embargo la regresión para la cinética del tirosol presentó los peores coeficientes de determinación (Capítulo 3.7; Tablas 3.20 y 3.21) La energía de activación aparente (Ea) se calculó a partir de las pendientes del ajuste lineal de Ln k representada frente a la inversa de la temperatura absoluta (Tablas 3.20 y 3.21). Los valores de Ea no fueron significativamente diferentes entre las muestras, lo que hace suponer que es necesaria una energía similar para iniciar la degradación de compuestos fenólicos y -tocoferol, independientemente de la composición inicial. Estos valores de Ea para la degradación total de fenoles fueron casi el doble de los reportados por Campanella et al. (2008) (37.4-39.1 kJ/mol), con aceite de oliva sometido a oxidación a temperaturas superiores a 98 ºC. Los valores de Ea para -tocoferol fueron mayores que para los compuestos fenólicos en todas las muestras, revelando nuevamente la mayor estabilidad de este compuesto en el aceite de oliva mientras los fenoles están presentes. El Ea obtenido previamente para las reacciones de oxidación (65 kJ/mol para productos de oxidación primaria y de aproximadamente 77 kJ/mol para productos de oxidación secundaria) (Capítulo 3.4) de las mismas muestras de aceite de oliva no indicaron una marcada relación con la estabilidad oxidativa o TRUL. En consecuencia, tampoco la Ea de la descomposición de los antioxidantes mostró relación con los indicadores de composición inicial (MUFA/PUFA o contenido de antioxidantes). Esto sugiere que la Ea no debe usarse como un parámetro único para comparar la velocidad de oxidación de lípidos o la estabilidad oxidativa del aceite de oliva u otros sistemas lipídicos (Farhoosh et al., 2014). El otro parámetro cinético principal que afecta la velocidad de reacción es A (factor pre- exponencial o de frecuencia), calculado a partir de las intersecciones del ajuste lineal de Ln k representada frente a la inversa de la temperatura absoluta. Los cambios menores en Ea conducen a cambios importantes en los valores de A. De hecho, las gráficas de Ea vs A ajustaron con una tendencia exponencial (0.972 144 4. Diiscusiión de resultados mayores y significativas entre muestras en los valores de A para todos los compuestos fenólicos y -tocoferol (Capítulo 3.7, Tablas 3.20 y 3.21). Siendo A un indicador de la frecuencia de colisiones de moléculas, podría pensarse una relación con la concentración inicial, sin embargo, no se encontró ninguna correlación significativa. Los valores obtenidos de Ea y k, no pueden proporcionar una interpretación mecanicista de ninguna reacción, ya que la oxidación es una reacción compleja, pero pueden usarse como herramientas descriptivas de la dependencia de la reacción con la temperatura (Van Boekel, 2008). 4. ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN Y EL ESTADO DE OXIDACIÓN INICIAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN. INFLUENCIA EN LA ESTIMACIÓN DE SU VIDA ÚTIL Aparte del estudio cinético, en el cual se argumentaron las posibilidades de un ensayo de estabilidad acelerado con un VOO, a temperatura inferior a 60 ºC, para estimar la vida útil del mismo, basado en el valor límite de un parámetro de oxidación normalizado (TRUL K232) (Capítulo 3.4), también se estudió la posibilidad de estimar la vida útil en base a medidas de composición y/o de estado de oxidación inicial del VOO. En cuanto a los compuestos fenólicos y su relación con la estabilidad oxidativa, se ha reportado en numerosas ocasiones y comprobado también en este trabajo de investigación, la alta correlación entre la concentración de estos compuestos en el VOO (principalmente o- difenoles con mayor capacidad antioxidante) y el período de inducción en Rancimat (Gómez- Alonso et al., 2002). Sin embargo, esta correlación no se ha encontrado a temperaturas inferiores a 60 ºC en los trabajos que han dado lugar a esta tesis doctoral, ni con la velocidad de oxidación (calculada para el incremento de PV, K232, K270, o disminución de ácidos grasos) y tampoco con la vida útil o estabilidad oxidativa (determinada por el TRUL de los parámetros de oxidación normalizados) (Capítulo 3.2, Capítulo 3.4, Capítulo 3.5). La posible relación polinómica entre concentración de antioxidante y el TRUL K232 presentada en el estudio con POO al que se añadieron antioxidantes de forma individual o combinada (Capítulo 3.6, Figura 3.20) no se encontró con las muestras de VOO a ninguna de las temperaturas estudiadas. Esto podría deberse, por una parte, a que el contenido de compuestos fenólicos en el VOO excede el punto en el que la concentración de antioxidantes sigue siendo relevante en lo que respecta a la velocidad de oxidación y, por otra parte, a las complejas reacciones de degradación (por oxidación y por unión a radicales peroxilo) y de formación (por hidrólisis de las formas complejas) que sí coexisten cuando la temperatura de almacenamiento es baja (25-60 ºC). La alta relación MUFAs/PUFAs típica del aceite de oliva es una de las principales razones de la mayor estabilidad del aceite de oliva con respecto a otros aceites comestibles (Velasco et al., 2002, Beltrán et al., 2004). En las muestras estudiadas, esta proporción varió de 13.5 a 19.4. Las muestras con los valores más altos de esta relación deberían mostrar la mayor estabilidad oxidativa pero, como se ha mencionado, no se encontró correlación directa entre esta relación y 145 4. Diiscusiión de resultados la velocidad de oxidación a temperaturas inferiores a 60 ºC, ni con la vida útil determinada por los parámetros de oxidación (Capítulo 3.4). Las variables utilizadas para indicar el progreso de la oxidación fueron las relacionadas con el aumento de los productos de oxidación primarios y secundarios, y con la disminución de los compuestos antioxidantes o ácidos grasos insaturados (Capítulo 3.7, Tabla 3.22), así como las variables relacionadas con la composición lipídica o antioxidante inicial. Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para transformar las variables consideradas en menos componentes principales no correlacionados (PC). El primer PCA (PCA1) se realizó incluyendo las características físico-químicas iniciales de las muestras (16 variables, ver Tabla 3.22). Se generaron tres factores (PC1, PC2, PC3) en el PCA1, que explicaban el 79.11% de la varianza. El PC1 explicó el 54,15% de la varianza y se consideró como el factor "sustrato: contenido de ácidos grasos y antioxidantes", ya que las cargas más altas y positivas en PC1 fueron para los contenidos de antioxidantes iniciales (clorofilas, carotenoides, SEC HTYR, SEC TYR, o-difenoles, TYR + secoiridoideos, fenoles totales) y medidas directamente relacionadas (periodo de inducción Rancimat). Las cargas más altas y negativas fueron las de los contenidos de UFAs y PUFAs (sustrato oxidable). El PC2 explicó el 17.25% de la varianza. Las cargas más altas y positivas fueron las de temperatura, PV inicial, K232 y K270 por lo que se consideró el factor "estado de oxidación inicial y condiciones". Las cargas más altas y positivas en PC3 fueron las de los contenidos iniciales de HTYR y TYR, por lo que se consideró el factor "fenoles simples libres", y explicó el 8,72% de la varianza. El segundo PCA (PCA2) se utilizó para reducir las variables relacionadas con las velocidades de aumento o disminución de los índices de oxidación, ácidos grasos y antioxidantes (10 variables, ver Tabla 6). Aplicando la regla de Kaiser (valores propios <1) solo se generó un factor, explicando el 87.2% de la varianza. Este factor (PC1) podría significar "velocidades de transformación". Las cargas fueron negativas para la temperatura y las velocidades de PV, K232, K270, y fueron positivas para las velocidades de reducción de antioxidantes y PUFAs (Capítulo 3.7, Tabla 3.24). Se realizaron varios intentos de regresión lineal multivariante (MLR) para explicar la relación entre la vida útil, la composición inicial y/o el progreso de la oxidación. Para la selección de variables secuenciales, se realizó una regresión por pasos sucesivos. Como variables dependientes se estudiaron tPV20, tK232, tK270, koDIPH y kSECHTYR. Como variables independientes se consideraron todas aquellas relacionadas con el estado inicial (12 variables), además de las relacionadas con el desarrollo de oxidación a la temperatura acelerada estudiada (11 variables x 3 temperaturas = 33 variables) (Capítulo 3.7, Tabla 3.22). A continuación, se detallan las ecuaciones finales de los modelos seleccionados (Capítulo 3.7, Tabla 3.25): tPV20_25 = -59.62+ 4.97 tK232_40 + 1266.03 koDIPH_40+ 116.66 kIP_40+ 19.47 tIP20_60 tK232_25 = 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 koDIPH_25 = -0.008 -0.005 kIP_50 + 0.001PVini – 0.001 t K232_50 146 4. Diiscusiión de resultados kSECHTYR_25 = -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104x10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kUFAs_50 A pesar de que los modelos anteriores conseguían explicar un alto porcentaje de la varianza (90.1-90.6%), se consideraron pocas variables independientes de forma automática entre todas las disponibles. Por ello, se probó a obtener un modelo utilizando el factor calculado para cada uno de los componentes principales obtenidos (PC1, sustrato: contenido de ácidos grasos y antioxidantes; PC2, estado y condiciones de oxidación inicial, PC3, fenoles simples libres) como variables independientes. Las ecuaciones del modelo resultante fueron las siguientes (Capítulo 3.7, Tabla 3.25): tPV20_25 = 42.56+17.85 transformation rates -16.57 initial oxidation state and conditions -14.20 free simple phenols +8.51 substrate tK232_25 = 20.15 +7.19 transformation rates -8.74 initial oxidation state and conditions -9.53 free simple phenols +5.51 substrate koDIPH_25 = -0.095 +0.082 transformation rates + 0.011 substrate kSECHTYR_25 = -0.106+0.087 transformation rates +0.006 substrate +0.004 initial oxidation state and conditions Aunque se obtuvieron coeficientes de determinación altos solo para koDIPH_25 y kSECHTYR_25 (0.937 y 0.969, respectivamente), estas ecuaciones podrían tener algún valor para explicar el comportamiento de las variables experimentales, sin embargo, su valor predictivo es bajo, debido a la complejidad que tendría el cálculo de los factores de forma experimental, ya que implicaría realizar ensayos acelerados a 3 temperaturas y determinar múltiples variables. En conclusión, según las condiciones de oxidación inicial y la composición inicial de un VOO, el TRUL para K232 (tK232_25) se puede predecir mediante la siguiente ecuación modelo: tK232_25 = 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 (R2 = 0.904) También se puede estimar en qué momento la concentración de derivados de hidroxitirosol caería por debajo de 5 mg/20 g de aceite de oliva, mediante la predicción de la velocidad de degradación de los secoiridoideos del hidroxitirosol a temperatura ambiente a partir de un almacenamiento acelerado a 50 ºC, mediante la ecuación modelo: kSECHTYR_25 = -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104 ∙ 10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kUFAs_50 (R2 = 0.915) La Figura 3.27 del Capítulo 3.7 muestra la correlación entre los valores experimentales reales y los calculados con ecuaciones modelo (0.832 ≤ R2 ≤ 0.946). 147 oonncclluussiioonneess 1 5. Conclusiiones 1. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD DE LA MATRIZ LIPÍDICA Y DE LOS COMPONENTES MINORITARIOS DEL ACEITE DE OLIVA FRENTE AL PROCESO DE AUTOXIDACIÓN 1.1) Evolución de la oxidación de la matriz lipídica entre 25 y 75 ºC - Durante la oxidación, la velocidad de degradación de los UFAs y la velocidad de aumento de PV, K270, y concentración de dímeros y polímeros de triacilgliceroles es lenta al inicio, pero se incrementa de forma logarítmica con el tiempo, sobre todo a partir del periodo de inducción - Existe una correlación lineal entre el tiempo de almacenamiento necesario para alcanzar el umbral de detección de rancidez sensorial y el periodo de inducción en la formación del compuesto t,t-2,4-decadienal, por lo que la determinación por cromatografía de gases de este compuesto se consideró de gran utilidad para medir el umbral de rancidez en el POO y en el rango de temperaturas de autoxidación comprendido entre 25 y 75 ºC 1.2) Evolución de la oxidación del aceite de oliva virgen entre 25 y 60º C - El grado de instauración de los ácidos grasos en el VOO, la concentración de antioxidantes y la temperatura de almacenamiento son factores decisivos que influyen sobre su velocidad de oxidación - La concentración del MUFA ácido oleico (C18:1) permaneció prácticamente constante durante el periodo experimental en todas las temperaturas. Sin embargo, los PUFAs ácido linoleico (C18:2) y linolénico (C18:3) disminuyeron a mayor velocidad conforme aumentó la temperatura del ensayo - Los antioxidantes presentes en el aceite de oliva virgen protegen de forma más efectiva frente a la oxidación al ácido linolénico que al linoleico - No se observaron diferencias significativas en las velocidades de degradación de UFAs entre muestras con diferente contenido inicial de antioxidantes entre 25 y 50 ºC, sin embargo, sí a 60 ºC donde la fase estacionaria final se alcanzó antes en las muestras con mayor contenido de antioxidantes y la disminución fue más rápida en las muestras con menos antioxidantes iniciales - La menor protección de los PUFAs por la menor cantidad de antioxidantes es más notable a partir de los 60 ºC 1.3) Evolución de la oxidación en los compuestos minoritarios del aceite de oliva entre 25 y 60 ºC - La diferencia de la acción oxidativa en aceites de oliva virgen con distinta composición fenólica se hace más evidente a medida que aumenta la temperatura, como consecuencia de las diferentes velocidades de hidrólisis de los derivados secoiridoideos, la descomposición térmica y su acción como antioxidantes - En VOOs con menos de 0.50 mmol/kg de derivados secoiridoideos del HTYR, la oxidación a 25 ºC produce una disminución de este fenol simple (HTYR) por la menor incidencia y velocidad de hidrólisis de los fenoles complejos frente a la velocidad de oxidación de los fenoles sencillos 151 5. Conclusiiones - En VOOs con más de 0.50 mmol/kg de derivados secoiridoideos del HTYR la oxidación a 25 ºC produce un incremento de este fenol simple (HTYR) debido a la hidrólisis no oxidativa de los derivados secoiridoideos - A temperaturas más elevadas (40-60 ºC) la velocidad de descomposición del fenol simple parece ser mayor que la de formación, ya que el contenido de HTYR cayó desde el principio en todos los VOOs - La velocidad de desaparición del HTYR (40-60 ºC) parece ser mayor cuanto más baja es la relación SEC HTYR/HTYR y la relación Fenoles complejos/simples - En el caso del TYR, la velocidad de hidrólisis de sus derivados secoiridoideos es siempre mayor que la velocidad de su descomposición, ya que su contenido aumentó con la oxidación a todas las temperaturas. La excepción es cuando el contenido de SEC TYR es de 0.50 mmol/kg o inferior, ya que entonces la hidrólisis de sus derivados complejos no es suficiente para compensar la pérdida de tirosol por descomposición térmica - El contenido de SEC HTYR (suma de las formas dialdehídicas y aldehídicas de oleuropeína aglicona) y de o-difenoles (que también incluyen hidroxitirosol libre) disminuye a mayor velocidad conforme aumenta la temperatura de oxidación, hasta llegar a un punto de estabilización, coincidiendo también con la estabilización de los valores de PV y K232. La velocidad de disminución es mayor cuando el oxígeno no es limitante (en botellas abiertas que en cerradas). El contenido de SEC TYR también se reduce pero a una velocidad menor, por lo que la estabilidad de los compuestos SEC TYR parece ser mayor que la de los SEC HTYR - El grupo o-difenol del hidroxitirosol y sus derivados los hace antioxidantes más activos en las condiciones utilizadas, pero su reducción se debe en gran parte a que son más susceptibles a la oxidación y descomposición térmica que los SEC TYR como lo demuestra la menor pendiente de la cinética de degradación, especialmente a temperaturas más altas - El α-tocoferol a temperaturas inferiores a 50 ºC disminuye más lentamente que los o- difenoles porque está protegido por estos que actúan como antioxidantes en las primeras etapas de oxidación. A 50 y 60 ºC, disminuye rápidamente desde el principio dada la alta susceptibilidad de esta molécula a oxidarse a α-tocoferolquinonas 1.4) Evolución de la oxidación de la matriz lipídica y del aceite de oliva virgen en condiciones Rancimat - Bajo estas condiciones aceleradas, los hidroperóxidos se transforman en compuestos secundarios de oxidación mucho más rápidamente que a 25 ºC - La alta temperatura y el elevado flujo de aire, influyen de forma más acentuada en el ácido linoleico que en los demás ácidos grasos insaturados - En ambas condiciones de oxidación (25 ºC y Rancimat), el comportamiento del HYTR y sus SEC HTYR (o-difenoles) siguió una cinética de pseudo primer orden: Ln C= kt + Ln C0, pero la degradación fue completa antes del IP Rancimat y no así en 93 semanas a 25 ºC - El -tocoferol disminuyó rápidamente y casi linealmente desde el primer momento, (99% de reducción en el IP) posiblemente debido en gran parte a la oxidación a altas temperaturas hacia -tocoferolquinonas. A 25 °C, el agotamiento no fue superior al 30% en ninguna muestra 152 5. Conclusiiones - El efecto sinérgico de los o-difenoles y el -tocoferol estudiados depende de la concentración relativa de ambos antioxidantes y de las condiciones de oxidación utilizadas porque es considerablemente diferente en condiciones ambientales y aceleradas. Por lo tanto, la capacidad antioxidante del -tocoferol determinada en condiciones de oxidación acelerada no puede atribuírsele del mismo modo a temperatura ambiente 2. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE INDIVIDUAL Y COMBINADA DE LOS ANTIOXIDANTES NATURALMENTE PRESENTES EN EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN 2.1) Efecto individual de los compuestos minoritarios en la oxidación de la matriz lipídica - Entre 25 y 40 ºC, cantidades crecientes de HTYR y oleuropeína aglicona producen un aumento en la estabilidad del POO frente a la oxidación, pero solo concentraciones de HTYR ≥ 0.25 mmol/kg u oleuropeína aglicona ≥ 0,50 mmol/kg muestran efecto antioxidante también en estados de oxidación avanzada, reduciendo la velocidad de aumento de PV y K232 - En estas condiciones suaves de oxidación, el HTYR es doblemente activo como antioxidante para la misma concentración de oleuropeína aglicona, sin embargo, el efecto de la misma concentración de ambos sobre la mejora en el IP Rancimat es muy similar - El efecto antioxidante de HTYR y oleuropeína aglicona deja de ser proporcional a concentraciones mayores de 0.25 mmol/kg de HTYR o de 0.50 mmol/kg de OA - El TYR no posee actividad antioxidante ni prooxidante a ninguna concentración en ninguna de las condiciones estudiadas - En condiciones suaves, 25 y 40 ºC, el -tocoferol actúa como prooxidante durante la fase de oxidación primaria del POO, disminuyendo la estabilidad del aceite a medida que su concentración aumenta de 0.10 a 1 mmol/kg, ya sea solo o en presencia de o-difenoles. En la fase de oxidación secundaria, se aprecia cierta actividad antioxidante a concentración ≥ 1 mmol/kg. Por el contrario, en condiciones aceleradas del Rancimat el -tocoferol es siempre antioxidante - Los resultados obtenidos hacen cuestionable el uso de este tipo de métodos acelerados para evaluar la capacidad antioxidante de diferentes compuestos, más aún si los resultados se pretenden extrapolar a condiciones reales de almacenamiento - La representación gráfica de la constante de velocidad de oxidación (k) en función de la concentración del compuesto agregado (H, OA y T) se ajusta muy bien a un modelo de -x/b 2 disminución exponencial y= y0 + ae ; (0.990 ≤R ≤0.999), y por lo tanto el progreso de la reacción de oxidación podría simularse y predecirse 2.2) Capacidad antioxidante de los compuestos combinados - A 25 y 40 ºC, la adición de α-tocoferol a cualquier concentración de HTYR o TYR tuvo un efecto prooxidante, disminuyendo considerablemente la estabilidad oxidativa del POO - No se observaron efectos sinérgicos o antagonistas cuando se añadió α-tocoferol junto con hidroxitirosol u oleuropeína 153 5. Conclusiiones - La adición de oleuropeína aglicona al hidroxitirosol aumentó la estabilidad de POO ya que la constante de la velocidad de oxidación disminuyó, pero solo para concentraciones de hidroxitirosol < 0.50 mmol/kg - En condiciones Rancimat, se observó un efecto antagonista entre HTYR y -tocoferol - No se observó ningún efecto al agregar cantidades crecientes de TYR al POO, ni de forma individual ni combinada con α-tocoferol en ninguna de las condiciones estudiadas 2.3) Capacidad antiradicálica de los compuestos individuales - En la fracción polar de las muestras de aceite estudiadas la RSC fue lineal con la concentración en todo el rango estudiado, a diferencia de las tendencias del TRUL e IP. Además, el efecto anti radical de la oleuropeína aglicona fue mayor que el del HTYR. Una vez más, el TYR no mostró ningún valor significativo de RSC - Con respecto a la actividad anti radicálica de la fracción total (hidrofílica y lipofílica), expresada como RARE, el -tocoferol se comportó como un antioxidante de manera similar a HTYR y oleuropeína aglicona, aumentando su capacidad con su concentración, en contraste con el efecto prooxidante observado medido por el TRUL o la constante de velocidad de oxidación - La RARE disminuyó en el orden -tocoferol ≥ oleuropeína aglicona> hidroxitirosol >> tirosol - No se observó sinergismo en la eficacia anti radicálica con mezclas de estos compuestos 2.4) Comparación entre resultados con botellas abiertas y con botellas cerradas - EL valor de TRUL K232 a 25 ºC en las muestras de POO con HTYR, oleuropeína aglicona o -tocoferol fue muy similar en botellas cerradas, con HS o con N2, e incluso en botellas abiertas, mientras que la diferente disponibilidad de oxígeno sí afectó al TRUL K232 del POO solo (N2>HS>OB) - La adición de -tocoferol redujo drásticamente la estabilidad del POO y su fuerte efecto prooxidante fue claramente visible incluso en condiciones de HS y N2, mientras que HTYR y oleuropeína estabilizaron el aceite en t odas las condiciones de temperatura y disponibilidad de oxígeno - A 40 ºC, la velocidad de oxidación fue mucho más alta y no se observaron diferencias estadísticamente significativas para OB, HS y N2, con la excepción de la muestra de POO con - tocoferol añadido 3. ESTUDIO CINÉTICO PARA EL DESARROLLO DE UN TEST DE ESTABILIDAD ACELERADO A TEMPERATURA SUAVE (40-60 ºC) QUE PERMITA DETERMINAR LA VIDA ÚTIL POTENCIAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN - La cinética de oxidación primaria de la matriz lipídica del aceite de oliva entre 25 y 75 ºC es de pseudo orden cero, (C=C0 + kt), mientras que la de oxidación secundaria es de pseudo primer orden (ln C/C0 =kt) 154 5. Conclusiiones - Las cinéticas de oxidación primaria y de oxidación secundaria del aceite de oliva virgen a 25 ºC es de pseudo orden cero (C=C0 + kt) - La cinética de oxidación primaria del aceite de oliva virgen entre 40 y 60 ºC es de pseudo orden cero (C=C0 + kt) mientras que la de oxidación secundaria es de pseudo primer orden (ln C/C0 =kt) - La velocidad de oxidación primaria y secundaria del aceite de oliva, medidas por el incremento de PV, K232, K270 y para la degradación de UFAs, están relacionada con la temperatura mediante la ecuación de Arrhenius (ln k = lnA + Ea/RT) - El índice de peróxidos (PV) no es un buen parámetro para determinar el estado de oxidación del VOO, especialmente cuando se trata de un almacenamiento prolongado. Los hidroperóxidos se descomponen con el avance de la oxidación, por lo que la cuantificación aislada del índice de peróxidos en el tiempo nos daría una información equivocada sobre el estado del aceite - El valor del TRUL (Time to Reach the Upper Limit) del parámetro de oxidación primaria K232 se postula como el indicador mejor relacionado con la vida útil, por las siguientes razones: fue el primero en superar el límite establecido por la Normativa Europea (2.50) en seis de las siete muestras estudiadas a 25 ºC, y en todos los casos a temperaturas entre 40 y 60 ºC presentó la mejor correlación con la degradación de PUFAs y aumento de índices de oxidación en todas las temperaturas estudiadas tiene una elevada linealidad en los primeros estadios de la oxidación, lo que permite calcular una velocidad de oxidación para estimar la vida útil en un tiempo breve el método para su determinación, es sencillo, reproducible, y no presenta interferencias con otros compuestos presentes naturalmente en el aceite de oliva - No existe correlación entre la estabilidad oxidativa en condiciones normales de almacenamiento (medidas como TRUL para PV o TRUL para K232) y el periodo de inducción obtenido con el método Rancimat - Existe una relación de tipo potencial entre el TRUL y la temperatura de almacenamiento entre 25 y 60 ºC (TRUL=a∙Tb), por lo tanto, es factible realizar un ensayo de estabilidad acelerado a temperatura menor o igual a 60ºC para estimar la vida útil, expresada como TRUL K232, a 25 ºC - La evolución del hidroxitirosol y el tirosol se ajustó a la cinética de orden pseudo-cero (Ct = Co + kt), mientras que las formas dialdehídicas y aldehídicas de oleuropeína y de ligustrósido agliconas, o-difenoles y fenoles totales, aparentemente siguieron una cinética de pseudo primer orden (Ln(Ct/C0) = kt) - La velocidad de degradación de los compuestos fenólicos y -tocoferol está relacionada con la temperatura mediante la ecuación de Arrhenius (ln k = lnA + Ea/RT) - Es necesaria una energía similar para iniciar la degradación de compuestos fenólicos y - tocoferol, independientemente de la composición inicial 155 5. Conclusiiones - Los valores de Ea para -tocoferol fueron mayores que para los compuestos fenólicos en todas las muestras, revelando nuevamente la mayor estabilidad de este compuesto en el aceite de oliva mientras los fenoles están presentes 4. ESTUDIO DE LA INFLUENCIA EN LA ESTIMACIÓN DE LA VIDA ÚTIL DE LA COMPOSICIÓN Y EL ESTADO DE OXIDACIÓN INICIAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN - Con las muestras de VOO no se ha encontrado ninguna correlación directa significativa entre contenido en compuestos fenólicos y/o α-tocoferol y/o la relación MUFAs/PUFAs con la velocidad de oxidación (calculada para el incremento de PV, K232, K270, o disminución de ácidos grasos) y tampoco con la vida útil o estabilidad oxidativa (determinada por el TRUL de los parámetros de oxidación normalizados) - Según las condiciones de oxidación inicial y la composición inicial de un VOO, el TRUL para K232 (tK232_25) se puede predecir mediante la siguiente ecuación modelo: tK232_25 = 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 (R2 = 0.904) También se puede estimar en qué momento la concentración de derivados de hidroxitirosol caería por debajo de 5 mg/20 g de aceite de oliva, mediante la predicción de la velocidad de degradación de los secoiridoideos del hidroxitirosol a temperatura ambiente a partir de un almacenamiento acelerado a 50 ºC, mediante la ecuación modelo: kSECHTYR_25 = -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104 ∙ 10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kUFAs_50 (R2 = 0.915) 156 oonncclluussiioonnss 5. Conclusiions 1. STUDY OF THE STABILITY OF THE LIPID MATRIX AND THE MINOR OLIVE OIL COMPONENTS DURING THE AUTOXIDATION PROCESS 1.1) Evolution of the lipid matrix oxidation between 25 and 75 ºC - During oxidation, the degradation rate of UFAs and the rate of increase of PV, K270, and dimers and polymers of triacylglycerols is slow at the beginning, but increases logarithmically with time, especially from the period induction - There is a linear correlation between the storage time necessary to reach the sensory rancidity detection threshold and the induction period in the formation of the compound t, t- 2,4-decadienal. Thus, the determination by gas chromatography of this compound was considered very useful to measure the rancidity threshold in POO and in the autoxidation temperature range between 25 and 75 ºC 1.2) Evolution of virgin olive oil oxidation of between 25 and 60º C - The degree of unsaturation of fatty acids in VOO, the concentration of antioxidants and the storage temperature are decisive factors that influence its oxidation rate. - The concentration of the MUFA oleic acid (C18:1) remained practically constant during the experimental period at all temperatures. However, the PUFAs linoleic acid (C18:2) and linolenic acid (C18:3) decreased at a higher rate as the test temperature increased. - The antioxidants present in virgin olive oil protect linolenic acid more effectively against oxidation than linoleic acid. - No significant differences were observed in the degradation rates of UFAs among samples with different initial antioxidant content between 25 and 50 ºC, however, there were differences at 60 ºC, where the final stationary phase was reached earlier in the samples with higher antioxidant content and the decline was faster in samples with fewer initial antioxidants. - The lower protection of PUFAs due to the lower amount of antioxidants is more noticeable at temperatures from 60 ºC. 1.3) Evolution of olive oil minor compounds oxidation between 25 and 60 ºC - The difference in oxidative action in virgin olive oils with different phenolic composition becomes more evident as temperature increases, as a consequence of the different hydrolysis rates of the secoiridoid derivatives, thermal decomposition and their action as antioxidants. - In VOOs with less than 0.50 mmol/kg of HTYR secoiridoid derivatives, oxidation at 25 ºC produces a decrease in this simple phenol (HTYR) due to the lower incidence and speed of hydrolysis of complex phenols as compared to the oxidation rate of the simple phenols. - In VOOs with more than 0.50 mmol/kg of HTYR secoiridoid derivatives, oxidation at 25 ºC produces an increase in this simple phenol (HTYR) due to the non-oxidative hydrolysis of the secoiridoid derivatives. - At higher temperatures (40-60 ºC) the decomposition rate of simple phenol appears to be higher than that of formation, since the HTYR content fell from the beginning in all VOOs 159 5. Conclusiiones - The disappearance speed of HTYR (40-60 ºC) seems to be higher the lower the SEC HTYR/HTYR ratio and the complex/simple phenols ratio. - In the case of TYR, the rate of hydrolysis of its secoiridoid derivatives is always greater than the rate of decomposition, since its content increased with oxidation at all temperatures. The exception is when the SEC TYR content is 0.50 mmol/kg or less, since the hydrolysis of its complex derivatives is not enough to compensate for the loss of tyrosol by thermal decomposition. - The content of SEC HTYR (sum of the dialdehyde and aldehyde forms of oleuropein aglycone) and o-diphenols (which also include free hydroxytyrosol) decreases at a higher rate as the oxidation temperature increases, until reaching a stabilization point, also coinciding with the stabilization of the PV and K232 values. The rate of decrease is greater when oxygen is not limiting (in open bottles than in closed ones). The SEC TYR content is also reduced but at a slower rate, so the stability of the SEC TYR compounds appears to be greater than that of the SEC HTYR. - The o-diphenol group of hydroxytyrosol and its derivatives make them more active antioxidants under the conditions used, but their reduction is largely due to the fact that they are more susceptible to oxidation and thermal decomposition than SEC TYRs as evidenced by the lower slope of degradation kinetics, especially at higher temperatures. - -tocopherol decreases more slowly than o-diphenols at temperatures below 50 ° C because it is protected by these, which act as antioxidants in the first stages of oxidation. At 50 and 60 ºC, it decreases rapidly from the beginning given the high susceptibility of this molecule to be oxidized to α-tocopherolquinones. 1.4) Evolution of oxidation in the lipid matrix and virgin olive oil under Rancimat conditions - Under these accelerated conditions, hydroperoxides transform into secondary oxidation compounds much more rapidly than at 25 ° C - High temperature and high airflow have a greater influence on linoleic acid than on other unsaturated fatty acids. - In both oxidation conditions (25 ºC and Rancimat), the behaviour of HYTR and its SEC HTYR (o-diphenols) followed a pseudo first order kinetics: Ln C = kt + Ln C0, but the degradation was complete before IP Rancimat and not so in 93 weeks at 25 ºC. - -tocopherol decreased rapidly and almost linearly from the beginning, (99% reduction in IP) due in large part to high temperature oxidation to -tocopherolquinones. At 25 ° C, depletion was not greater than 30% in any sample. - The synergistic effect of the o-diphenols and -tocopherol studied depends on the relative concentration of both antioxidants and on the oxidation conditions used because it is considerably different under ambient and accelerated conditions. Therefore, the antioxidant capacity of -tocopherol determined under accelerated oxidation conditions cannot be ascribed to it in the same way at room temperature. 160 5. Conclusiiones 2. STUDY OF THE INDIVIDUAL AND COMBINED ANTIOXIDANT CAPACITY OF THE ANTIOXIDANTS NATURALLY PRESENT IN VIRGIN OLIVE OIL 2.1) Individual effect of minor compounds on lipid matrix oxidation - Between 25 and 40 ºC, increasing amounts of HTYR and oleuropein aglycone produce an increase in the stability of POO against oxidation, but only concentrations of HTYR ≥ 0.25 mmol/kg or oleuropein aglycone ≥ 0.50 mmol/kg show antioxidant effect also in advanced oxidation states, reducing the rate of increase of PV and K232. - Under these mild oxidation conditions, HTYR is doubly active as an antioxidant for the same concentration of oleuropein aglycone, however, the effect of the same concentration of both on the improvement in IP Rancimat is very similar. - The antioxidant effect of HTYR and oleuropein aglycone is no longer proportional to concentrations greater than 0.25 mmol kg of HTYR or 0.50 mmol/kg of OA. - TYR does not have antioxidant or pro-oxidant activity at any concentration under any of the conditions studied. - At mild conditions, 25 and 40 ºC, -tocopherol acts as a pro-oxidant during the primary oxidation phase of POO, decreasing the stability of the oil as its concentration increases from 0.10 to 1 mmol/kg, either alone or in the presence of o-diphenols. In the secondary oxidation phase, some antioxidant activity is observed at a concentration ≥ 1 mmol/kg. On the contrary, under accelerated Rancimat conditions, -tocopherol is always an antioxidant. - The obtained results make questionable the use of this type of accelerated methods to evaluate the antioxidant capacity of different compounds, especially if the results are to be extrapolated to real storage conditions. - The graphical representation of the oxidation rate constant (k) as a function of the concentration of the added compound (H, OA and T) fits very well to an exponential decrease -x/b 2 model y = y0 + ae ; (0.990 ≤R ≤0.999), and therefore the progress of the oxidation reaction could be simulated and predicted. 2.2) Antioxidant capacity of the combined compounds - At 25 and 40 ºC, the addition of α-tocopherol at any concentration of HTYR or TYR had a pro-oxidant effect, considerably reducing the oxidative stability of POO. - No synergistic or antagonistic effects were observed when α-tocopherol was added together with hydroxytyrosol or oleuropein. - The addition of oleuropein aglycone to hydroxytyrosol increased the stability of POO since the oxidation rate constant decreased, but only for hydroxytyrosol concentrations <0.50 mmol/kg. - At Rancimat conditions, an antagonistic effect between HTYR and -tocopherol was observed. - No effect was observed when adding increasing amounts of TYR to POO, neither individually nor in combination with α-tocopherol in any of the conditions studied. 161 5. Conclusiiones 2.3) Anti-radical ability of individual compounds - In the polar fraction of the oil samples studied, the RSC was linear with the concentration throughout the range studied, unlike the TRUL and IP trends. Furthermore, the anti-radical effect of oleuropein aglycone was greater than that of HTYR. Again, the TYR did not show any significant RSC value. - Regarding the anti-radical activity of the total fraction (hydrophilic and lipophilic), expressed as RARE, -tocopherol behaved as an antioxidant in a similar way to HTYR and oleuropein aglycone, increasing its capacity with concentration, in contrast to the observed pro- oxidant effect measured by TRUL or oxidation rate constant. - The RARE decreased in the order -tocopherol ≥ oleuropein aglycone> hydroxytyrosol >> tyrosol. - No synergism was observed in anti-radical efficacy with mixtures of these compounds. 2.4) Comparison between results with open and closed bottles - The TRUL K232 value at 25 ºC in the POO samples with HTYR, oleuropein aglycone or α-tocopherol was very similar in closed bottles, with HS or with N2, and even in open bottles, while the different availability of oxygen did affect to TRUL K232 from POO alone (N2> HS> OB). - The addition of -tocopherol drastically reduced the stability of POO and its strong pro-oxidant effect was clearly visible even under HS and N2 conditions, while HTYR and oleuropein stabilized the oil under all conditions of temperature and oxygen availability. - At 40 ºC, the oxidation rate was much higher and statistically significant differences were not observed for OB, HS and N2, with the exception of the POO sample with added - tocopherol. 3. KINETIC STUDY FOR THE DEVELOPMENT OF AN ACCELERATED STABILITY TEST AT MILD TEMPERATURE (40-60 ºC) THAT ALLOWS TO DETERMINE THE POTENTIAL SHELF LIFE OF VIRGIN OLIVE OIL - The kinetics of primary oxidation of the olive oil lipid matrix between 25 and 75 ºC is pseudo-order zero, (C = C0 + kt), while that of secondary oxidation is pseudo-first order (ln C/C0 = kt ). - The kinetics of primary oxidation and secondary oxidation of virgin olive oil at 25 ºC are pseudo-order zero (C = C0 + kt). - The kinetics of primary oxidation of virgin olive oil between 40 and 60 ºC is of pseudo order zero (C = C0 + kt) while that of secondary oxidation is of pseudo first order (ln C/C0 = kt). - The rate of primary and secondary oxidation of olive oil, measured by the increase in PV, K232, K270 and for the degradation of UFAs, are related to temperature through the Arrhenius equation (ln k = lnA + Ea / RT). - The peroxide value (PV) is not a good parameter to determine the oxidation state of VOO, especially when it is a prolonged storage. Hydroperoxides decompose with the progress 162 5. Conclusiiones of oxidation, so the isolated quantification of the peroxide index over time would give us wrong information about the oxidation state of the oil. - The TRUL (Time to Reach the Upper Limit) value of the primary oxidation parameter K232 is postulated as the indicator best related to the shelf life, for the following reasons: was the first to exceed the limit established by the European Regulation (2.50) in six of the seven samples studied at 25 ºC, and in all cases at temperatures between 40 and 60 ºC presented the best correlation with the degradation of PUFAs and increase in oxidation indices at all the temperatures studied has a high linearity in the first oxidation stages, which makes it possible to calculate an oxidation rate to estimate the shelf life in a short time the method for its determination is simple, reproducible, and does not present interferences with other compounds naturally present in olive oil - There is no correlation between oxidative stability under normal storage conditions (measured as TRUL for PV or TRUL for K232) and the induction period obtained with the Rancimat method. - There is a potential relationship between TRUL and storage temperature between 25 and 60 ºC (TRUL = a ∙ Tb), therefore, it is feasible to perform an accelerated stability test at a temperature lower than or equal to 60ºC to estimate the shelf life, expressed as TRUL K232, at 25 ºC. - The evolution of hydroxytyrosol and tyrosol was adjusted to pseudo-zero order kinetics (Ct = Co + kt), while the dialdehyde and aldehyde forms of oleuropein and of ligustroside aglycones, o-diphenols and total phenols, apparently followed a kinetic pseudo first order (Ln (Ct / C0) = kt). - The degradation rate of phenolic compounds and -tocopherol is related to temperature by the Arrhenius equation (ln k = lnA + Ea / RT). - A similar energy is necessary to initiate the degradation of phenolic compounds and α- tocopherol, regardless of the initial composition. - Ea values for -tocopherol were higher than for phenolic compounds in all samples, again revealing the greater stability of this compound in olive oil while phenols are present. 4. STUDY OF THE INFLUENCE OF COMPOSITION AND INITIAL OXIDATION STATE ON THE ESTIMATION OF VIRGIN OLIVE OIL SHELF LIFE - With the studied VOO samples, no significant direct correlation has been found between the content of phenolic compounds and/or α-tocopherol and/or the MUFAs/PUFAs ratio with the oxidation rate (calculated for the increase in PV, K232, K270, or decrease in fatty acids) and neither with the shelf life or oxidative stability (determined by the TRUL of the normalized oxidation parameters). 163 5. Conclusiiones - Depending on the initial oxidation conditions and the initial composition of a VOO, the TRUL for K232 (tK232_25) can be predicted using the following model equation: tK232_25 = 6.23 + 7.63 tK232_40 + 490.05 koDIPH_40 (R2 = 0.904) - It is also possible to estimate when the concentration of hydroxytyrosol derivatives would fall below 5 mg/20 g of olive oil, by predicting the degradation rate of the secoiridoids of hydroxytyrosol at room temperature from an accelerated storage at 50 ºC, using the model equation: kSECHTYR_25 = -0.029 + 0.114 K270ini + 8.104 ∙ 10-5 PUFAsini + 0.111 kTOTPH_50 + 0.004 kUFAs_50 (R2 = 0.915) 164 66.. PPuubblliiccaacciioonneess cciieennttííffiiccaass 6. Publicaciones científicas PUBLICACIONES CIENTÍFICAS EN REVISTAS INTERNACIONALES A LAS QUE HA DADO LUGAR ESTE TRABAJO DE TESIS DOCTORAL Publicaciones principales Artículo I. 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Vanessa Mancebo Campos, Giuseppe Fregapane, Mª Desamparados Salvador. “Kinetic study for the development of an accelerated oxidative stability test to estimate virgin olive oil potential shelf life: influence of composition and initial oxidation state” (2020, En preparación) Otras publicaciones Salvador, M.D., Gómez-Alonso, S., Mancebo-Campos, V., Fregapane, G. “Evolution of volatile compounds and sensory rancidity in purified olive oil during storage under normal and 167 6. Publicaciones científicas accelerated conditions (25-75 ºC)”, in Food Flavor and Chemistry: Explorations into the 21st Century, “Formation of Flavors”, Ed. Royal Society of Chemistry. Pág. 224-230. ISBN 0-85404-653- 4 (2005) Fregapane, G, Mancebo-Campos, V., Gomez-Rico, A., Salvador, M.D. “Natural antioxidants content in virgin olive oil-Influence of agronomical and technological factors, and nutritional importance”, in Innovations in traditional foods. Vol. II. Ed. Elsevier/UPV. Pág. 963-966. 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