Sujet Etude Des Différentes Biotechniques D'extraction

N° d’ordre : 07/2016-M/GP

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene

Faculté de Génie Mécanique et de Génie des Procédés

MEMOIRE Présenté pour l’obtention du diplôme de Magister En : GENIE DES PROCEDES Spécialité : Technologie Pharmaceutique Par : Haciane Yamina Sujet

Etude des différentes biotechniques d’extraction des molécules à partir de fractions volatiles et polyphénoliques issues des matrices végétales

Soutenu publiquement le 29/06/2016 devant le jury proposé de :

M K.Daoud Professeur à l’USTHB Président M F.Benkaci-Ali Professeur à l’USTHB Directeur de mémoire Mme H.Moghrani Maitre de conférence/A à l’USTHB Examinatrice M N.Nasrellah Maitre de conférence/A à l’USTHB Examinateur M R.Yafssah Docteur chercheur à CRNA Invité REMERCIEMENTS

Je remercie Dieu de m’avoir prêté vie, santé et volonté pour achever ce travail. Je remercie vivement mon promoteur Mr F.BENKACI-ALI, de m’avoir confié ce sujet, et de l’aide précieuse qu’il m’a toujours apportée. Qu’il trouve ici l’expression de ma sincère reconnaissance. Mes sincères remerciements accompagnés de vive reconnaissance vont au personnel du Laboratoire d’Analyse Organique Fonctionnelle de l’Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene, du Centre de Recherche Nucléaire d’Alger (CRNA) implanté à Tilimly, de l’Institut Pasteur et d’HURBAL. Qu’ils trouvent ici le témoignage de ma profonde gratitude pour avoir mis à notre disposition les différents appareils de leur laboratoire. Je remercie plus particulièrement Mr YEFSAH RABAH (CRNA), Mr KEZZAL SALIM (IPA),MmeKHADIDJA(IPA),Mr RACHID (IPA),Mme HAKEM KARIMA ,Mme OUTOUDERT HAKIMA , Mme ZOHRA LABCHERIE , Mme TAMACHE ZINA, Mr KASDI BOUALEM, Mme LATIFA KHETTOU , Mme NASSIMA DOUKHANDJI , Mme CHEMANI MALIKA , Mr KAMEL FERRAH , Mme SAIDA FERRAH , Mme ANIA BABOU , Mr MOUHAMED OUTOUDERT, Mme SOUAD LAZAZI , Mme HAMIDA BENSAFIA , Mme BENNASSER AICHA , Mme TCHOUK F/ZOHRA , Mme NABI MALIKA , Mme BOUGUERNINE SAFIA, Mme FARIDA , Mme RAJA MECAOUI(LAOF) et Mme ZAHIA (LAOF). Mes remerciements les plus sincères à Mr MEZIANE SAID et Mme KRIMICHE IMENE pour l’aide qu’ils m’ont apportée. Je remercie vivement les membres du jury : Mr K. DAOUD, Mr N. NESRALLAH, Mme H. MOGHRANI et R.YEFSAH qui nous ont fait l’honneur d’examiner ce travail. Je remercie mes parents de m’avoir élevée, instruite, pour tous leurs sacrifices ….les mots s’épuisent sans doute, mais vous comprendrez que tout un univers de paroles ne pourrait suffire pour vous dire merci, et à tous ceux qui ont contribué de prés ou de loin à ma réussite MERCI.

DEDICACES

Je dédie humblement ce travail A mes chers parents Mr SAID et Mme NOURA A mon époux NAFAA MEZIANE et ma fille FARAH A ma sœur SABRINA et son époux BILAL et leurs enfants ABD EL HADI et NIHAD A mon frère ABD EL AZIZ et ma sœur SALMA Ames grands parents Mr HASSAN et Mme WARDIA A mes beaux parents Mr SAID et Mme KHEIRA A mon beau frère MAJID et sa femme IMENE et leurs enfants SAID et YACINE A ma belle sœur YOUNA et son époux BOUMEDIENE et leur fis ILYES A mon beau frère TAHAR A toute la famille HACIANE et MEZIANE A tous mes amis sans exception A tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin pour élaborer ce travail LISTE DES ABREVIATIONS

HE : huile essentielle Qte : quantité P. cubéba :Piper cubéba HC : hydrodistillation classique HD-MO : hydrodistillation assistée par micro-onde HD-MO -SV: hydrodistillation assistée par micro-onde sous vide HS-SPME: Head Solide Phase Micro-Extraction t : temps tf : temps finale s : seconde min : minute h :heure P : pression l:litre g :gramme BC : broyage cryogénique BS : broyage simple R : rendement W :watt γ :gamma kGy :kilo gry GC : Chromatographie en phase gazeuse GC/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse KI : Indice de rétention calculé selon Van Den Dool ref : Référence DO :Densité optique CMI : concentration minimale inhibitrice ADN : L'acide désoxyribonucléique ARN : L'acide ribonucléique

Glossaire

• les antalgiques, qui ont pour rôle de diminuer la douleur, et les analgésiques, qui suppriment la sensibilité à la douleur. • La dysenterie est une maladie infectieuse du côlon chez l’humain, qui peut être grave, aiguë ou chronique. • L'entérite est l'inflammation de l'intestin grêle. Chez l'homme elle prend la forme d'une gastro-entérite lorsqu'elle est liée à une gastrite. Chez les anatidés elle prend le nom de peste du canard. • Dans la génétique , la génotoxicité décrit la propriété des agents chimiques que les dommages de l'information génétique dans une cellule provoquant des mutations , ce qui peut conduire à un cancer • La glutathion peroxydase (GPx) est une sélénoprotéine ayant fonction d'enzyme, formée de quatre sous-unités contenant chacune un atome de sélénium incorporé dans une molécule de sélénocystéine (dans laquelle le soufre du groupement thiol de la cystéine est remplacé par le sélénium). La glutathion peroxydase est présente dans les liquides extracellulaires et dans les cellules au niveau du cytosol et des mitochondries. Elle assure la transformation des hydroperoxydes organiques, lipidiques notamment, de type ROOH en ROH • La blennorragie ou gonorrhée(aussi appelée familièrement chaude-pisse, chaude- lance, castapiane ou chtouille) est une infection sexuellement transmissible. C'est une infection des organes génito-urinaires, due au gonocoque (Neisseria gonorrhoeae) découvert par Albert Neisser en 1879 dans un pus d’urétrite aiguë et isolé en 1885 par Bumm. Elle fait partie des gonococcies. • Athérosclérose (aussi connu comme la maladie ou ASVD vasculaire artériosclérose) est une forme spécifique de l' artériosclérose dans laquelle une artère -wall épaississe à la suite de l' invasion et de l' accumulation de globules blancs (leucocytes) (cellule de mousse) et la prolifération de l' intima-muscle lisse la création d' une plaque de fibro cellulaire. • Leishmania est un genre de protistes proche des trypanosomes. C'est un parasite des mammifères transmis par la piqure de phlébotomes et responsable d'une maladie, la leishmaniose. Certaines leishmanioses touchent d'autres mammifères que l'homme, et en particulier les canidés, par exemple la leishmaniose canine (en) chez le chien, notamment en Europe autour de la Méditerranée. • En biologie, un mutagène (du latin, littéralement origine de changement) est un agent qui change le génome (en général l'ADN) d'un organisme et élève ainsi le nombre de mutations génétiques au-dessus du taux naturel d'arrière-plan. Les mutagènes sont en général des composés chimiques ou des radiations. Les mutations, en dehors de celles qui affectent les cellules reproductives, ne sont pas inoffensives. Si elles n'induisent pas toutes des cancers, c'est la première étape nécessaire vers la cancérisation. • Les superoxyde dismutases (SOD), sont des métalloprotéines possédant une activité enzymatique: la catalyse de la dismutation du superoxyde en dioxygène et peroxyde d'hydrogène. Pour cette raison, cette enzyme est une partie importante du système de défense contre les radicaux libres. Elle est présente dans presque tous les organismes aérobies. Une des rarissimes exceptions est Lactobacillus plantarum et les Lactobacillus apparentés, qui n'en possèdent pas et utilisent un mécanisme de défense différent. • La syphilis (connue familièrement sous le nom de vérole ou encore de grande vérole par opposition à la variole ou petite vérole) est une infection sexuellement transmissible contagieuse, due à la bactérie tréponème pâle. Elle se manifeste par un chancre initial et par des atteintes viscérales et nerveuses tardives, certaines manifestations survenant plusieurs années après la contamination. L'évolution de la maladie se fait donc en stades successifs, classiquement trois, aujourd'hui différenciée entre stade précoce et tardif. • Les tanins sont des substances naturelles phénoliques qui peuvent précipiter les protéines à partir de leurs solutions aqueuses. Ce sont des métabolites secondaires des plantes supérieures que l'on trouve dans pratiquement toutes les parties des végétaux (écorces, racines, feuilles, fruits, etc.) où ils jouent le rôle d'armes chimiques défensives contre certains parasites. Sur le plan chimique, ils sont constitués soit de polyol (glucose le plus souvent), ou de catéchine ou de triterpénoïde auquel sont attachés des unités galloyles (ou leurs dérivés) soit d'oligomères ou polymères de flavanols. • IC50 : La concentration inhibitrice médiane (CI50) est une mesure de l'efficacité d'un composé donné pour inhiber une fonction biologique ou biochimique spécifique. Souvent, le composé en question est un éventuel médicament. Cette mesure quantitative indique quelle quantité d'un médicament ou d'une autre substance (inhibiteur) est nécessaire pour inhiber à moitié un processus biologique donné (ou un élément d'un processus, par exemple une enzyme, un paramètre cellulaire, un récepteur cellulaire ou un microorganisme. En d'autres termes, c'est la demi (50 %) concentration inhibitrice (CI) d'une substance (CI à 50 %, ou CI50). Elle est couramment utilisée en tant que mesure de l'efficacité d'un médicament antagoniste en recherche pharmacologique. Selon la FDA, la CI50 représente la concentration d'un médicament qui est requise pour une inhibition à 50 % in vitro. Elle est comparable à la CE50 pour les médicaments agonistes. La CE50 représente aussi la concentration plasmatique nécessaire pour obtenir 50 % d'un effet maximal in vivo. • En chimie, l’adsorption, à ne pas confondre avec l’absorption, est un phénomène de surface par lequel des atomes ou des molécules de gaz ou de liquides (adsorbats) se fixent sur une surface solide (adsorbant) selon divers processus plus ou moins intenses comme les interactions de Van der Waals ou les interactions dipolaires. Un atome adsorbé est un adatome. Ce phénomène a une très grande importance dans l’évolution de nombreuses réactions chimiques. • L’absorption est un phénomène ou processus physique et chimique dans lequel des atomes, molécules ou ions pénètrent dans une phase gazeuse, liquide ou solide. Ce phénomène est différent de l’adsorption où les molécules adsorbées restent à la surface. Les molécules absorbées, quant à elles, entrent à l'intérieur de la phase (en profondeur dans le volume). L’absorption est donc la rétention d’une substance par une autre. L’adsorption et l'absorption peuvent être regroupées sous le terme sorption. • L’hydroxytoluène butylé ou BHT est un additif alimentaire. Il s’agit du 2,6-di-tert- butyl-4-méthylphénol ou 2,6-bis(1,1-diméthyléthyl)-4-méthylphénol. Il s'agit d'un puissant antioxydant synthétique. Son utilisation est controversée et il semble que trop peu d'études aient été menées à son sujet.

Il résiste aux fortes températures qui peuvent être atteintes lors de la fabrication du produit, contrairement à certains antioxydants comme la vitamine E. Il est utilisé dans l'industrie agroalimentaire et cosmétique. Il serait métabolisé en cas d'ingestion et soupçonné d'être allergène et cancérigène. Il est noté E321 par l’Union européenne. Il se présente sous la forme d'une poudre ou de cristaux incolores à jaune pâle

• L’hydroxyanisole butylé ou BHA est un mélange de 2-tertiobutyl-4-hydroxyanisole (2-BHA) et de 3-tertiobutyl-4-hydroxyanisole (3-BHA) : Le BHA est un additif alimentaire. C’est peut-être l’antioxydant synthétique le plus utilisé dans l’industrie alimentaire. Très efficace pour éviter l'oxydation des graisses et huiles, surtout celles d'origine animale, il est cependant suspecté d'être cancérigène. Il est noté E320 par l’Union européenne et se présente généralement sous la forme d’une cire blanche ou jaunâtre. Il peut provoquer des réactions cutanées locales, ou des irritations des muqueuses • Bacillus subtilis est une bactérie catalase-positive que l'on trouve habituellement dans le sol, mais c'est surtout une espèce ubiquitaire(Qualifie un être vivant dont l’aire de répartition est très étendue). Sa capacité à croître rapidement, à atteindre de hautes densités cellulaires et à sécréter un grand nombre de molécules en a fait un outil suscitant l’intérêt des industries agroalimentaires et sanitaires pour ses enzymes et les industries pharmaceutiques et cosmétologiques pour ses molécules à large spectre d’activités biologiques, notamment les antibiotiques. Bacillus subtilis est capable de produire des molécules peptidiques que ne sont pas issues du dogme central de la biologie moléculaire qui est la synthèse peptidique non ribosomale NRPS. L'industrie agroalimentaire, pharmaceutique et biochimique, s'intéresse aussi à Bacillus subtilis. Elle est, en effet, source d'enzymes industrielles telles les amylases, utilisées dans l'industrie du pain, ou encore des protéases et cellulases, dans l'industrie des détergents. La variété natto de B. subtilis sert au Japon à fabriquer le natto, un plat traditionnel à base de soja fermenté. Sa capacité à produire des antibiotiques, comme la bacitracine en fait un organisme d'intérêt également pour l'industrie pharmaceutique. • Chironomus riparius (mouche arlequin) est une espèce d'insectes diptères de la famille des Chironomidae, commune en Amérique du Nord et en Europe. C'est une mouche non piqueuse qui ressemble à un moustique. L'espèce, décrite en 1804 par l'entomologiste allemand, Johann Wilhelm Meigen, a été largement utilisée comme organisme modèle pour l'analyse de la structure du génome des insectes, ainsi que dans des essais toxicologiques et dans des études génétiques de développement fonctionnel. Les adultes, ainsi que leurs formes larvaires, sont impliqués comme vecteurs de maladies, mais contribuent aussi de façon importante à la chaîne alimentaire dans les écosystèmes aquatiques d'eau douce.

• kGy (Métrologie) (Physique) Symbole du kilogray, unité de mesure de dose absorbée du Système international (SI), valant 103 grays. • Le becquerel (Bq) est défini comme le nombre de désintégrations radioactives par seconde au sein d'une certaine quantité de matière. Elle a été nommée ainsi en hommage à Henri Becquerel.

L'ancienne unité de radioactivité était le curie (Ci); la relation entre les deux unités est la suivante : 1 Ci = 37×109 Bq = 37 GBq, on a donc

1 Bq = 27×10-12 Ci = 27 pCi.

• SPE : L'extraction en phase solide (solid-phase extraction, ou SPE) est une méthode de préparation de l'échantillon au cours de laquelle des composés en solution ou en suspension dans une phase liquide sont séparés des autres éléments du mélange par adsorption sélective sur une phase solide en fonction de leurs propriétés physico- chimiques. Ce procédé utilise une phase stationnaire composé d'un adsorbant ou d'un polymère à empreinte moléculaire. Cette méthode est utilisée en chimie analytique pour concentrer et purifier des molécules d’intérêts contenues dans un échantillon avant analyse. Elle permet aussi de conserver l'échantillon en limitant la dégradation des molécules d'intérêts et dans certain cas de changer le solvant dans lequel se trouve les analytes. L'extraction en phase solide peut être utilisée pour préparer de nombreux types d'échantillons avant analyse tel que l'urine, le sang, des boissons...

Principe

La SPE utilise l'affinité des solutés dissous ou en suspension dans un liquide (la phase mobile) pour un solide poreux à travers lequel l'échantillon est passé (la phase stationnaire). Selon le cas, soit les impuretés sont retenues par la phase stationnaire, ce qui purifie l'analyte d'intérêt dans la phase mobile, soit l'analyte est retenu sur la phase stationnaire, les impuretés sont éliminées avec la phase mobile. Dans ce dernier cas, une étape supplémentaire est requise : l'élution de l'analyte, qui doit être désorbé de la phase stationnaire par un solvant approprié.

La phase stationnaire peut être, par exemple: du charbon actif pour extraire des composés peu polaires des phases aqueuses ; du gel de silice pour extraire des composés polaires des phases organiques peu polaires.

• L'extraction liquide-liquide est un procédé de séparation en génie chimique, consistant en une extraction par transfert entre deux phases liquides.

Aussi, contrairement à l'opération de distillation, le produit extrait ne change pas de phase : un mélange binaire dont on veut effectuer la séparation est mis en contact avec un troisième liquide non miscible appelé solvant et retenu pour sa capacité à extraire préférentiellement l'un des éléments du mélange. Après l'opération, on récupère deux phases séparées par décantation : l'extrait formé du solvant enrichi en soluté, et le raffinat, soit le mélange appauvri en soluté.

Cette opération, ordinaire dans l'industrie chimique, permet de séparer des produits ayant des températures d'ébullition très voisines (donc une distillation trop délicate) mais ayant des propriétés physico-chimiques différentes. Au laboratoire, c'est aussi une technique de purification très employée : dans une ampoule à décanter, les deux liquides séparent les solutés en fonction de leur solubilité dans chaque solvant. • Un mélange azéotrope ou azéotropique (a privatif, du grec zêin bouillir et tropos action de tourner) est un mélange liquide qui bout à température fixe en gardant une composition fixe. Un mélange azéotropique est un mélange qui présente, pour une composition particulière, une phase vapeur ayant la même composition que la phase liquide avec laquelle elle est en équilibre.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………………. 1 Chapitre I. Etude bibliographique

I.1. LES HUILES ESSENTIELLES ……………………………………………………….. 3 I.1.1. Historique…………………………………………………………………….…………. 3 I.1.2. Définition…………………………………………………………………………...... 3 I.1.3. Etat naturel……………………………………………………………………………….. 4 I.1.4. Propriétés physique……………………………………………………………………….. 4 I.1.5.Principales propriétés pharmacologiques……………………………………………….... 5 I.1.6. Composition chimique………………………………………………………………… 5 I.1.7. Utilisation ………………………………………………………………………………. 7 I.1.8. Les huiles essentielles de qualité……………………………………………………….. 7 I.2. MÉTHODE ET EQUIPEMENT D’EXTRACTION …………………………………… 8 I.2.1.Enfleurage et Macération ………………………………………………………..……… 8 I.2.2.Extraction par entrainement à la vapeur d’eau (VAP)…………………………….…… 8 I.2.3. Hydrodistillation (HD) …………………………………………………………..…….. 9 I.2.4.Hydrodiffusion …………………………………………………………………………… 11 I.2.5.L’expression à froid……………………………………………………………..………. 11 I.2.6.Extractions assistés par micro onde ……………………………………………..……… 11 I.2.7.Vapodistillation assistée par micro-onde (VAPMO) ………………………………….. 13 I.2.8. Hydrodistillation assistée par micro onde (HDMO) ………………………………….. 14 I.2.9.Hydrodistillation assistée par micro-ondes sous vide pulsé ou (VMHD) (Vaccum Microwave HydroDistillation)……………………………………………………………….. 15 I.2.10. Extraction par solvant assisté par micro onde ESAM………………………..………. 15 I.2.11.Extraction assisté par ultrasons ………………………………………………………. 16 I.2.12.Extraction par du CO2 supercritique ………………………………………..……….. 17 I.2.13.Broyage cryogénique ………………………………………………………………….. 18 I.2.14. Extraction verte ………………………………………………………………………. 19 I.3. LES PLANTES ETUDIEES……………………………………………………………… 21 I. 3.1 Piper cubéba ……………………………………………………………………………. 21 I.3.2. Description botanique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam)…………… 27 I.3.3. Description botanique Pteridium aquilinum…………………………………………… 30 I.3.4 Leucanthemum vulgare (Marguerite commune)……………………………………….. 31 I.4. CONSERVATION PAR IRRADIATION………………………………………...... 33 I.4.1. Types des rayonnements ionisants utilisés par l’industrie alimentaire……….……… 33 I.4.2. Avantages de l’ionisation……………………………………………………………… 34 I.4.3. Interaction rayonnement ionisant- matière…………………………………...... …….. 35 I.4.4.Radiorésistance des microorganismes…………………………………………………. 40 I.4.5. La texture des tissus vivants……………………………………………………...... 40 I.5. TECHNIQUE DE HEADSPACE MICRO-EXTRACTION EN PHASE SOLIDE (HS-SPME)...... 41 I.5.1. Description de la technique SPME…………………………………………….……….. 41 I.5.2. Types d’extraction ………………………………………………………………………. 41 Chapitre II. Extraction des huiles essentielles et les extraits de Piper cubéba

II.1. MATERIEL ET METHODE …………………………………………………..……. 46 II.2. EXTRACTION DES HUILES ESSENTIELLES……………………………………… 49 II.2.1. Essences décantées ……………………………………………………………………. 49 II.2.2. Aspect énergique des techniques étudiées……………………………………………. 50 II.2.3. Impact environnemental des techniques étudiées, quantité de CO2 émise dans l’atmosphère…………………………………………………………………………..……….. 51 II.2.4. Analyse par chromatographie gazeuse et chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC et GC-MS et Conditions opératoires…………………………… 53 II.3. EXTRACTION ET ANALYSE DE L’EXTRAIT VEGETAL DE PIPER CUBEBA.. 65 II.3.1. Conditions opératoires de l’extraction des extraits végétaux…………………………… 65 II.3.2. Dosage des polyphenols et flavonoïdes………………………………………….……… 67 II.3.3. Tests, in vitro, de l’activité anti-oxydante des extraits de Piper cubéba en fonction du solvant d’extraction utilisé…………………………………………………………………… 69 II.3.4. Etude de l’activité antimicrobienne des extraits de Piper cubéba en fonction du solvant d’extraction utilisé………………………………………………………………………………. 73

Chapitre III. Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.1.ÉTUDE DE LA CINÉTIQUE D’EXTRACTION QUANTITATIVE DU CUBÉBA... 80 III.1.1 Méthodes d’extraction et conditions de travail ……………………………………… 80 III.1.2. Cinétique du rendement cumulé d’extraction d’huile essentielle du P. cubéba par HD- MO et HD-MO-SV……………………………………………………………………………. 82 III.1.3. Cinétique du rendement différentielle d’extraction d’huile essentielle du Piper Cubéba par HDMO et HDMO-SV……………………………………………………………. 84 III.1.4. Aspect énergique …………………………………………………………..……. 87 III.1.5. Impact environnemental sur la quantité de CO2 émise dans l’atmosphère………… 89 III.2.ETUDE COMPARATIVE DE LA CINETIQUE D’EXTRACTION (HD-MO ET HD-MO-SV) PAR ANALYSE GC ET GC/MS EN QUANTITE DIFFERENTIELLE… 90 III.2.1. Analyse par GC-MS et Conditions opératoires …………………………….…….. 90 III.2.2. Etude de la cinétique d’extraction des principales classes chimiques (pourcentages différentiels)…………………………………………………………………. 107 III 2.3. Cinétique d’extraction des composés chimiques en quantités cumulées…………… 113 III.3. ETUDE COMPARATIVE ENTRE L’HUILE ESSENTIELLE EXTRAITE PAR HDMO ET HDMO-SV A tf (TEMPS FINALE)…………………………………………..... 120 III.4.TAUX DES EPOXYDES ET D’HYDRATATION DANS L’HUILE ESSENTIELLE DES GRAINES DE PIPER CUBEBA…………………………………… 122

Chapitre IV. Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

IV.1. Les conditions d’irradiation……………………………………………………………. 124 VI .2.Variation du rendement des huiles essentielles extraites par HD-MO en fonction de la dose des rayons gamma ………………………………………………………...... 127 VI.3.L’effet de l’irradiation sur les différentes classes chimiques …………………………. 128 VI .4.Teneur en phénols totaux………………………………………………………………. 138 VI .5 .Teneur en flavonoïdes………………………………………..…………………………. 139 VI .6.Etude de l’effet antioxydant de l’extrait éthanolique de Piper cubéba en fonction des doses gamma……………………………………………………………………………..... 140 VI .7. Etude de l’effet antibactérien …………………..……………………………………... 144

Chapitre V. Head Space-SPME

V.1. Analyse par GC/MS des graines de Piper cubéba extraites par HS-SPME (Solide Phase Micro-Extraction)…………………………..……………………………………….. 147 V.1.1. L’effet de diamètre des particules sur la composition chimique des huiles essentielles extraites par HS-SPME……………………………………………………………………….. 148 V.2. Etude de la composition chimique de certaines plantes par la technique in situ collect par de l’azote liquide avec HS-SPME-GC-MS …………………………………… 153

C ONCLUSION GENERALE………………………………………………………………. 169

Référence bibliographique. Annexe (A) Les protocoles expérimentaux Annexe (B) Les chromatogrammes obtenus

Liste des figures

Figures se trouvant dans les chapitres

Figure. I.1. Glande simple, entièrement Chargée D’huile et en forme de dôme……………...4 Figure. I.2. Les poiles épidermique d’une fleur ………………………………………………4 Figure. I. 3. Exemple de quelques monoterpènes …………………………………………….5 Figure. I.4. Exemples de quelques sesquiterpènes……………………………………………6 Figure. I.5. Exemples de composés aromatiques……………………………………………...6 Figure. I. 6. Schéma du montage vapo-hydrodistillation……………………………………...9 Figure. I.7.schéma du Montage d'hydrodistillation (Clevenger)………………………….…10 Figure. I.8 : schéma du montage d’hydrodiffusion…………………………………………..11 Figure. I.9. Frissonnement des dipôles soumis à une irradiation micro-ondes……………...13 Figure. I.10. Schéma du montage VAP-MO…………………………………………………14 Figure. I.11. schéma du montage HDMO……………………………………………………14 Figure. I.12. schéma du montage VMHD……………………………………………………15 Figure. I.13. schéma du montage ESAM…………………………………………………….16 Figure. I.14. Dispositif de l’évaporateur rotatif ……………………………………………16 Figure. I.15 .Montage d’extraction par ultrasons…………………………………………….17 Figure. I.16. Montage d’extraction par le CO2 supercritique………………………………..18 Figure I.17. Baies séchées de cubèbe …………………………………………………..…21 Figure I.18. Les fruits de l’arbre de cubèbe……………………………………………….…21 Figure I.19. Aspect morphologique de cubèbe………………………………………………21 Figure I.20 .La structure chimique de la molécule de Cubebin [98]……………………...…24 Figue I.21. Zone d'inhibition antifongique contre C. albicans représentée par l'extrait acétonique de P. cubébadéterminée par diffusion sur gélose par la méthode des puits [123]..28 Figue I.22. CMI montrée par l'extrait cétonique de P. CUBÉBAcontre C. albicans (2i) et S .aureus (2ii) déterminée par la méthode de diffusion de puits sur gélose à l’aide d’une série de dilution des extraits: 50 mg / ml (a), 25 mg / ml (b), 12,5 mg / ml (c) 6,25 mg / ml (d) de 3,125 mg / ml (e) et 1,56 mg / ml (F) [123]………………………………………………..…28 Figure I.5.CMI de P.cubébade l’activité antibactérienne envers Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae par la méthode de diffusion sur la gélose [123]…………………………………………………………………..28 Figure I.23. La belle envahissante Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam)………....…30 Figure I .24. Pteridium aquilinum……………………………………………………………31

Figure I .25.Leucanthemum vulgare………………………………………………………..32 Figure I. 26. Radiolyse de l’eau [70]…………………………………………………….…36 Figure I. 27. Effet de l’irradiation sur l’ADN [65]…………………………………………39 Figure I.28. Dispositif SPME………………………………………………………………42

Figure I.29. Schéma de principe de la Micro-extraction sur phase solide [64]…………….42 Figure II.1. L’échantillon étudié Piper cubéba L (Piperaceae)……………………………46 Figure II.2. Dispositif d’extraction par HD………………………………………………..47 Figure II.3. Dispositif d’extraction par HD-MO……………………………………………48 Figure II.4. Variation des rendements de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO (BS) etHD-MO (BC)……………………………………………………………….49 Figure II.5. Variation de l’énergie consommée en fonction de la technique utilisée (HD, HD-MO-BS et HD-MO-BC)……………………………………………………50

Figure II.6. Variation de la quantité de CO2 émise par HD, HD-MO-BS et HD-MO-BC vers l’atmosphère………………………………………………………………………………….52 Figure II.7. Programmation de température de GC et GC/MS………………………………55 Figure II.8. Teneurs des différentes familles chimiques selon la technique utilisée……...…62 Figure II.9. Histogramme des fonctions chimiques extraites par HDMO (BC) et HDMO (BS)………………………………………………………………………………………...…63 Figure II.10. Variation des pourcentages des composés issus des réactions d’oxydation et d’hydratation de l’HE des graines de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO(BS) et HD-MO (BC) ……………………………………………………………………………………….…64 Figure. II.11. Dispositif d’extraction sous solvant assistée par micro-onde…………..…66 Figure. II.12. Dispositif de l’évaporateur rotatif (Rotavapeur)………………………….…66 Figure. II.13. Variation de la quantité de polyphénols dans les extraits de Piper cubéba en fonction du type de solvants………………………………………………………………..…67 Figure. II.14. La quantité de flavonoïdes dans les extraits de Piper cubéba par différents solvants……………………………………………………………………..…68 Figure II.15. Forme libre et réduite de DPPH ……………………………………………69 Figure .II.16. Décoloration de la solution du DPPH du violet en jaune en fonction de la concentration……………………………………………………………………………….....69 Figure II.17. Activité anti-radicalaire du BHT……………………………………...………71 Figure II.18. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique………………………….…..71 Figure. II.19. Activité anti-radicalaire de l’extrait chloroformique…………………………72

Figure. II.20. Activité anti-radicalaire de l’extrait méthanolique…………………………...72 Figure II.21. Activité anti-radicalaire de l’extrait cétonique………………………………..73 Figure II.22. Les zones d’inhibition représentent l’activité antifongique contre Candida albicans des huiles essentielles de P. cubéba dilué dans le DMSO et extraites par deux méthodes HC et HDMO, déterminée par diffusion sur gélose par la méthode des puits…….77 Figure II.23. Les zones d’inhibition représentent l’activité antibactérienne contre V.cholerique des huiles essentielles de P. cubéba, dilué dans le DMSO et extraites par deux méthodes HC et HDMO, déterminée par diffusion sur gélose par la méthoded des puits…….78 Figue II.24. CMI montrée par l'extrait éthanolique de P. CUBÉBA contre Enterococcus feacalis déterminé par la méthode de diffusion de puits sur gélose à l’aide d’une série de dilution des extraits: 22 mg / ml (SM), 11 mg / ml (1), 5,5 mg / ml (2) 2,75 mg / ml (3) de 1,37 mg / ml (4) , 0,68 mg / ml (5) ,0,34 mg / ml (6) et 0,17 mg / ml (7)…………………...79 Figure III.1. Dispositif d’extraction par l’hydrodistillation assistée par micro-onde (HD- MO)…………………………………………………………………………………………...81 Figure III.2. Dispositif d’extraction par HD-MO-SV……………………………………….81 Figure III.3. Variation du rendement cumulé de l’huile essentielle des graines de Piper cubéba en fonction du temps …………………………………………………………….…84 Figure III.4. Variation du rendement différentiel de l’huile essentielle des graines de Piper cubéba en fonction du temps ……………………………………………………………….85 Figure III.5. Variation de la vitesse d'extraction en fonction du temps de HD-MO et HD-MO –SV……………………………………………………………………………..…87 Figure III.6. Les énergies consommées en fonction du temps…………………………….88

Figure III.7. Les quantités de CO2 émises dans l’atmosphère……………………………...89 Figure III.9. Chromatogramme en courant ionique à t=5 mn de HE de Piper cubéba extraite par HD-MO -SV sur une colonne capillaire HP5-MS………………………………….92 Figure III.10. Spectre GC/MS à courant ionique de Méthyle eugénol à t= 2mn ………….93 Figure III.11. Spectre GC/MS à courant ionique de l’eugénol…………………………….93 Figure III.12. Variation du % en alcools et éthers en fonction du temps (HD-MO)……..108 Figure III.13. Variation du % en hydrocarbures monoterpéniques et sesquiterpéniques en fonction du temps (HD-MO)……………………………………………………………..109 Figure III.14.Variation du % en cétones, aldéhydes et esters en fonction du temps (HD-MO) ………………………………………………………………………………………………109 Figure III.15.Variation du % en alcools et éthers en fonction du temps (HD-MO-SV)…111

Figure III.16.Variation du % en monoterpènes et sesquiterpènes en fonction du temps (HD- MO-SV)……………………………………………………………………………………..111 Figure III.17. Variation du % en cétones, aldéhydes et ester en fonction du temps (HD-MO- SV)…………………………………………………………………………………………..112 Figure III.18. Rendement cumulés des principaux composés identifiés l’anéthole (E) et l’eugénol en fonction du temps (HD-MO)……………………………..…114 Figure III.19. Rendements cumulés des principaux composés identifiés Cinéole, Méthyle Eugénol et Myrcène en fonction du temps (HD-MO)………………………………………114 Figure III.20-a. Rendement cumulés des principaux composés identifiés en fonction du temps par HD-MO-SV (Méthyle eugénol et eugénol)………………………………………116 Figure III.20-b. Rendement cumulés des principaux composés identifiés en fonction du temps par HD-MO-SV (1,8 Cinéole, myrcène et anéthole)…………………………………116 Figure III.21. Variation des rendements cumulés des classes chimiques sesquiterpène, cétones, esters, aldéhydes et alcools en fonction du temps (HD-MO)…………………...…118 Figure III.22. Rendement cumulés des fonctions chimiques ethers et monoterpènes en fonction du temps (HD-MO)………………………………………………………………..118 Figure III.23. Rendements cumulés des classes chimiques monoterpènes, esters et éthers en fonction du temps (HDMO-SV)…………………………………………………………….119 Figure III.24. Rendements cumulés des classes chimiques sesquiterpènes, alcools, cétones et aldéhydes en fonction du temps (HDMO-SV)……………………………………………120 Figure III.25. Variation des pourcentages des fonctions chimiques extraites par HDMO et

HDMO-SV à tf (temps final ou temps total d’extraction)……………………………..…121 Figure III.26. Variation des pourcentages des principaux composés extraits par HDMO et

HDMO-SV à tf (temps final ou temps total d’extraction)……………………………..…121 Figure III.27. Variation des taux des époxydes et d’hydratation dans l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO –SV en fonction du temps…………………122 Figure III.28. Variation des pourcentages des composés d’oxydation et d’hydratation dans l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO en fonction du temps ……………….………………………………………………………………………………123 Figure III.29. Variation des pourcentages des composés d’oxydation et d’hydratation dans l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO et HD-MO-SV à tf…123

Figure IV. 1. Schéma de l’irradiateur pilote de CRNA………………………………….…125

Figure VI. 2. Variation du % des rendements des HE de Piper cubéba obtenus par HD-MO en fonction de la dose d’irradiation γ………………………………………………………127

Figure IV.3. Variation de pourcentage du chavicol et méthyle chavicol dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation……………………135

Figure IV. 4. Variation de pourcentage d’eugénol et méthyle eugénol dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation……………………………135

Figure IV. 5. L’effet des rayons gamma sur les composés méthylés (méthyle eugénol et méthyle chavicol )…………………………………………………………………………136

Figure IV. 6. Variation de pourcentage des esters, des aldéhydes et des cétones dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation………………….…13

Figure IV.7. Variation de la teneur en phénols dans l’extrait éthanolique en fonction de la dose d’irradiation de Piper cubéba…………………………………………………………..138

Figure.IV.8. Variation de la teneur en flavonoïdes dans l’extrait éthanolique en fonction de la dose d’irradiation de Piper cubéba…………………………………………………………..140

Figure IV.9. La variation d’ IC 50 (mg/l) en fonction de la dose d’irradiation…………….141

Figure IV.10. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (0,1kGy)…………………142

Figure IV.11. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (1 kGy)…………………..142

Figure IV.12. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (2 kGy)…………………143

Figure IV.13. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (5 kGy)…………………..143

Figure IV.14. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (10 kGy)…………………144

Figure V.1. Les surfaces occupées par les fonctions chimiques des particules de Piper cubéba FDC et MDC analysées par GC/MS-HS-SPME…………………………………………….149 Figure V.2. Les surfaces occupées par les principaux composés des particules de Piper cubéba FDC et MDC analysées par GC/MS-HS-SPME……………………………………149 Figure V .3. Les % des Composés chimiques isolés dans la Impatiens glandulifera par HS- SPME In situ et classique……………………………………………………………………153 Figure V .4. Les % des Composés chimiques isolés dans Leucanthemum vulgare par HS- SPME In situ et classique……………………………………………………………………154 Figure V .5. Les % des Composés chimiques isolés dans Pteridium aquilinum par HS- SPME In situ et classique…………………………………………………………………...155

Figures se trouvant dans l’annexe A

Figure.A.1. Image microscopique de candida Albicans ATCC 10231 Figure.A.2. Image microscopique de Salmonella Typhimirium Figure.A.3. Image microscopique Escherichia coli (ATCC ® 25922) Figure.A.4. Boite de pétrie après dépôt d’échantillon

Figures se trouvant dans l’annexe B

Figure B.1. Chromatogramme en courant ionique à t=2mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.2. Chromatogramme en courant ionique à t=5mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.3. Chromatogramme en courant ionique à t=11mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.4. Chromatogramme en courant ionique à t=20mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.5. Chromatogramme en courant ionique à t=33mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.6. Chromatogramme en courant ionique à t=48mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.7. Chromatogramme en courant ionique à t=5 mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.8. Chromatogramme en courant ionique à t=12mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.9. Chromatogramme en courant ionique à t=20 mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.10. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.11. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD- MO (BS) sur une colonne capillaire HP5-MS

Figure B.12. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD- MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.13. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba témoin (0kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.14. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (0,1 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.15. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (1 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.16. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (2 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.17. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (5 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.18. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (10 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Figure B.19. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (MDC) extraite par HS-SPME sur une colonne capillaire PDMS Figure B.20. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (FDC) extraite par HS-SPME sur une colonne capillaire PDMS Figure B.21. Spectre GC/MS à courant ionique de 2- Oxime-, methoxy-phenyl-_ Figure B.22. Spectre GC/MS à courant ionique de 2- Oxime-, methoxy-phenyl-_(selon la référence nist) Figure B.23. Spectre GC/MS à courant ionique de Biphenol A (BPA) Figure B.24. Spectre GC/MS à courant ionique de Biphenol A (BPA) (selon la référence nist) Figure B.25. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone Figure B.26. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone (selon la référence nist) Figure B.27. Spectre GC/MS à courant ionique de Morpholine, 4-octadecyl

Figure B.28. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone (selon la référence nist) Figure B.29. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Impatiens glandulifera extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS Figure B.30. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Impatiens glandulifera extraite par la technique HS-SPME-GC-MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS Figure B.31. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Pteridium aquilinum extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS Figure B.32. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Pteridium aquilinum extraite par la technique HS-SPME-GC-MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS Figure B.33. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Leucanthemum vulgare extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS Figure B.34. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Leucanthemum vulgare extraite par la technique HS-SPME-GC-MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS

Chapitre I Partie bibliographique

LISTE DES TABLEAUX

Tableaux se trouvant dans les chapitres

Tableau I.1. Les composés majoritaires de l’huile essentielle de Piper cubéba [87] ….....…… 22 Tableau I.2. Les composés photochimiques de Piper cubéba [86]………………………..…… 23 Tableau I.3. Activité antibactérienne de différents extraits de la graine de Piper cubéba[108]…………………………………………………………………………………..... 26 Tableau I.4. Activité antibactérienne des extraits de Piper cubébaméthanoliques, ethanoliques, cétoniques et chloroformiques (22mg/ml) mis dans les puits perforés sur les milieux de culture ( MH et SAB ) après 18-24 d’incubation à 37°C [123]…………………….. 27 Tableau. I. 6. Doses ionisantes et effets biologiques [42]…………………………………..... 34 Tableau.I. 8. Dose de réduction décimale pour certains microorganismes [42]………….….. 40 Tableau I.9. Présentation des caractéristiques et des principales applications des fibres SPME Commercialisées [63]………………………………………………………………………..... 44 Tableau II.1. Pourcentages des différents composés isolés à partir de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO (BS) et HD-MO (BC)……………………………….. 57 Tableau II.1. Pourcentages des différents composés isolés à partir de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO (BS) et HD-MO (BC)……………………………… 57

Tableau II.3. Activité anti-radicalaire des extraits de Piper cubéba (IC50)…………………… 70 Tableau II.4. Activité antibactérienne des extraits de Piper cubéba des extraits méthanoliques, ethanoliques, cétoniques et chloroformiques (22mg/ml), et les huiles essentielles ( avec des dilutions 1/10) incorporés dans les puits perforés sur les milieux de culture de MH et SAB après 18-24 d’incubation à 37°C …………………………………….. 76 Tableau II.5. La CMI des extraits méthanoliques, éthanoliques, cétoniques et chloroformiques de Piper cubéba, incorporés dans le milieu de culture de MH et SAB après 18-24 d’incubation à 37° par la méthode de diffusion …………………………………….…… 76 Tableau III. 1. Conditions opératoires des différentes techniques d’extraction utilisées……… 80 Tableau III .2 . Variation du rendement en fonction de la durée d’extraction par la technique HD-MO………………………………………………………………….……………………. 82 Tableau III .3 . Variation du rendement en fonction de la durée d’extraction HD-MO- SV………………………………………………………………………………………….……. 83 Tableau III. 4. Les Vitesses instantanées en fonction du temps par HD MO sous Vide………. 85 Tableau III. 5. Les Vitesses instantanées en fonction du temps par HD MO……………...... 85 Tableau III.6. Analyse qualitative et semi-quantitative des essences obtenues à différents temps d’extraction assistée par microondes (t1-t6)………………………………………… 94 Tableau III. 7. Les composés chimiques identifiés uniquement dans l’huile essentielle de Piper Cubéba extraite par HD-MO –SV……………………………………………………….. 102 Tableau III. 8. Composition chimique de l’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO- SV……………………………………………………………………………………………… 103 Tableau III. 9. Variation du % des familles chimiques en fonction de la durée d’extraction par HD- MO………………………………………………………..……………………..…… 108 Tableau III.10. Variation du % des familles chimiques en fonction de la duré d’extraction par (HD-MO-SV)……………………………………………………………………………..……. 110 Tableau III.11. Rendement différentielle des principaux composés identifiés (HD-MO)...... 113 Tableau III. 12. Rendement cumulés des principaux composés identifiés (HD-MO)……….. 113 Tableau III.13. Rendements différentiels des principaux composés identifiés (HD-MO- SV)…………………………………………………………………………………………….. 115 Tableau III.14. Rendement cumulés des principaux composés identifiés (HD-MO-SV)……... 115 Tableau III. 15. Rendement cumulés des fonctions chimiques (HD-MO)……………..…….. 117 Tableau III.16. Rendement cumulés des fonctions chimiques………………………………. 119 Tableau IV.1. Le débit de dose et la durée d’exposition aux rayons ɣ cubéba………………………………………………………………………………………. 125 Tableau IV. 2. La composition chimique de l’huile essentielle de Piper cubéba en fonction de différentes doses d’irradiation ………………………………………………………..…….. 129 Tableau IV.3. Variation de pourcentage des monoterpènes et des sesquiterpènes dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation……………………….. 134 Tableau IV. 4. Variation de pourcentage des alcools et des éthers dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation…………………………………………… 134 Tableau. IV. 5. Variation de l’activité antibactérienne des extraits éthanoliques (22g/l) issus des graines de Piper cubéba irradiées (avec les doses 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10kGy), mis dans des puits perforés dans le milieu de culture (MH et SAB) après 18-24 h d’incubation à 37°, en fonction de la dose d’irradiation……………………………………………………………….. 146 Tableau IV. 6. Variation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles (dilution 1/10) issus des graines de Piper cubéba irradiées (avec les doses 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10kGy), mis dans des puits perforés dans le milieu de culture (MH et SAB) après 18-24 h d’incubation à 37°, en fonction de la dose d’irradiation ………………………………………………………………. 146 Tableau V .1 . Composition chimique de la graine de Piper cubéba en fonction de diamètre des particules analysée par GC/MS-HS-SPME………………………………………………… 150 Tableau V .2 . Variation de % des composés chimiques des graines de Piper cubéba en fonction de la dimension des particules………………………………………………….…….. 152 Tableau V .3 . Composition chimique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) analysée par GC/MS-HS-SPME in situ-collecte……………………………………………….. 157 Tableau V.4. Origine des différentes classes chimiques extraites de l’ Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) par HS-SPME in situ-collecte……………………………………..…….. 159 Tableau V .5. Composition chimique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) analysée par GC/MS-HS-SPME classique……………………………………………………… 162 Tableau V.6. Origine des différentes fonctions chimiques extraites de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) par HS-SPME classique………………………………...... 163 Tableau V .7 . Composition chimique de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) analysée par GC/MS-HS-SPME In situ collecte………………………………………………. 164 Tableau V .8 . Composition chimique de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) analysée par GC/MS-HS-SPME classique…………………………………………………….. 165 Tableau V.9. Origine des différentes fonctions chimiques extraites de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) par HS-SPME classique………………………………...…….. 166 Tableau V .10 . Composition chimique de la Pteridium aquilinum analysée par GC/MS-HS- SPME in situ collecte…………………………………………………………………………… 167 Tableau V .11 . Composition chimique de la Pteridium aquilinum analysée par GC/MS-HS- SPME classique………………………………………………………………………...... ……. 168 Tableaux figurant dans les annexes Tableau.A.1.la plage de concentration choisie pour l’étude de l’effet antibactérien

INTRODUCTION GENERALE Introduction

La conception des biotechniques d’extraction vertes et durables de produits naturels, est actuellement un sujet de recherche dans la zone multidisciplinaire de la chimie appliquée, la biologie et la technologie. L'extraction verte est basée sur la découverte et la conception de procédés d'extraction qui permettra de réduire la consommation d'énergie, et permet l'utilisation de solvants alternatifs et produits naturels renouvelables, et d'assurer un environnement sûr et extrait de haute qualité / produit [29]. Les huiles essentielles, composées de molécules volatiles, peuvent généralement être extraites par entraînement à la vapeur, méthode qui n’a connu que très peu d’évolution jusqu’à nos jours. Il existe cependant des technologies plus performantes et moins onéreuses, parmi lesquelles figurent deux biotechniques d’extraction, consistant en l’hydrodistillation assistée par micro-onde sous vide et la Micro Extraction en Phase Solide (headspace-SPME), que nous avons adopté dans cette étude. Ce travail a pour objectif, d’une part de comparer entre les trois techniques hydrodistillation classique (HD), hydrodistillation assistée par micro onde (HDMO) et Hydrodistillation assistée par micro onde sous vide (HDMO-SV) pour l’extraction des huiles essentielles de Piper cubéba (épice d’origine indienne), et d’autre part, d’étudier l’effet d’ionisation par rayon γ sur la composition chimique de cette épice. En parallèle, nous avons sélectionné 4 matières premières pour tester l’application de la technologie d’extraction Head Space SPME: Piper cubéba, Impatiens glandulifera, Pteridium aquilinum et Leucanthemum vulgare : ces matières premières ont l’avantage d’être peu chères, disponibles et ayant des rendements en huiles essentielles relativement élevés et plus facilement manipulables. Le présent mémoire est structuré autour de cinq axes de travail qui sont : . La présentation, dans une première partie, d’une synthèse bibliographique recensant les huiles essentielles et leurs techniques d’extraction, de données générales sur les plantes étudiées ainsi que sur la conservation des aliments par irradiation et sur la SPME ; . la réalisation, dans une deuxième partie, de deux études comparatives : la première concerne la confrontation entre deux méthodes d’extraction conventionnelle (hydrodistillation classique et hydrodistillation assistée par micro-ondes)et entre deux modes de broyage portant sur le rendement et la composition chimique de l’huile essentielle (volatile) extraite des graines de Piper cubéba, par l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse et de la Introduction

chromatographie gazeuse couplée au spectromètre de masse(GC et GC/MS) ;la deuxièmes porte sur l’influence de différents solvants sur les extraits de la plante étudiée vis- à –vis del’activité antibactérienne et le taux des polyphénols et flavonoïdes des extraits de Piper cubéba ; . la réalisation, en troisième partie, d’une étude quantitative (rendement global) et analytique (par GC et GC/MS) des deux cinétiques d’extraction d’huile essentielle de Piper cubéba par HDMO et HDMO-SV, en vue de sélectionner la technique la plus économique tout en gardant la qualité du volatile ; . l’étude, en quatrième partie, de l’effet d’ionisation par rayon γ sur la composition chimique des huiles essentielles (par GC et GC/MS) et sur l’activité antibactérienne, le taux des polyphénols et flavonoïdesdes extraits de Piper cubéba ; . Enfin, l’étude, dans une dernière partie, de l’effet de diamètre des particules sur le profil aromatique du volatile de Piper cubéba extrait par headspace- SPME, ainsi que de l’effet de l’azote liquide (-196°C) in situ-collecte couplée à la headspace-GC-MS-SPME sur la composition chimique des huiles essentielles des trois fleurs : glandulifera, Pteridium aquilinum et Leucanthemum vulgare. Une conclusion générale clôture le présent mémoire, tout en ouvrant des perspectives quant aux résultats obtenus au cours des expérimentations effectuées aux différentes étapes de ce travail.

CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I Etude bibliographique

I.1. LES HUILES ESSENTIELLES

I.1.1. Historique

Les premières preuves de fabrication et d’utilisation des huiles essentielles datent de l’an 3000 avant J.C. Les huiles essentielles semblent donc avoir accompagné la civilisation humaine depuis ses premières genèses. Les égyptiens puis les grecs et les romains ont employé diverses matières premières végétales ainsi que les produits qui en découlent, notamment les huiles essentielles. Ces utilisations concernaient différents domaines : parfumerie, médecine, rites religieux, coutumes païennes, alimentation, etc. L’étape byzantine de la civilisation a permis l’instauration des bases de la distillation avec l’ère arabe de la civilisation, l’huile essentielle devient un des principaux produits et de commercialisation internationale. Ainsi, vers l’an mille, Avicenne, médecin et scientifique persan, a défini précisément le procédé d’entraînement à la vapeur. L’Iran et la Syrie deviennent les principaux centres de production de divers types d’extraits aromatiques. Par la suite, les huiles essentielles ont bénéficié des avancées scientifiques, au niveau des techniques d’obtention et de l’analyse de leur composition chimique. Parallèlement, leur utilisation a aussi tiré profit de l’avènement de l’aromathérapie. René-Maurice GATTEFOSSE a crée, en 1928, le terme de l’aromathérapie et il a mené de nombreux travaux concernant les huiles essentielles, notamment leurs propriétés ; ces résultats seront à l’origine de nombreuses autres recherches [1].

I.1.2. DÉFINITION

Les huiles essentielles sont des mélanges complexés de substances odorantes et volatiles contenus dans les végétaux, c’est l’extrait naturel qui résulte de la distillation à la vapeur d’eau des plantes ou des graines aromatiques [2]. L’huile essentielle est le produit obtenu à partir d’une matière première d’origine végétale, soit par entraînement à la vapeur, soit par des procédés mécaniques à partir de l’épicarpe frais de certains agrumes, soit par distillation. L’huile essentielle est ensuite séparée de la phase aqueuse par des procédés physiques [3].

Chapitre I Etude bibliographique

I.1.3. État naturel

Dans le règne végétal, les huiles essentielles n’existent quasiment que chez les végétaux supérieurs. Elles sont produites dans le cytoplasme des cellules sécrétrices et s’accumulent en général dans des cellules glandulaires spécialisées (Figure. I.1), situées en surface de la cellule et recouvertes d’une cuticule (Figure. I.2). Elles peuvent être stockées dans divers organes : fleurs, feuilles, écorces, bois, racines, rhizomes, fruits ou graines [4].

Figure. I.1. Glande simple, entièrement Figure. I.2. Les poiles épidermique sur Chargée d’huile et en forme de dôme une fleur (800x)

I.1.4. Propriétés physiques Les huiles essentielles sont généralement : - liquides à la température ordinaire ; - volatiles et entrainable à la vapeur d’eau ; - incolores ou jaune pale lorsqu’elles viennent d’être préparées ; - Leurs densités inferieure à 1 ; - peu solubles dans l’eau mais lui communiquent leurs odeur ; - soluble dans la plupart des solvants organiques ; - sensibles a l’oxydation et donc de conservation limitée. - hydrophobes et lipophiles (interactives avec les graisse et les organes riches en graisses).

De ces propriétés découlent les principales précautions à prendre pour les conserver, dans des flacons de petite taille bien bouchés, colorés ou en aluminium et a basse température [2].

Chapitre I Etude bibliographique

I.1.5.Principales propriétés pharmacologiques

Les huiles essentielles sont toute : - Antiseptiques (antimicrobiennes et anti-infectieuses) ; - Désintoxicantes ; - Revitalisantes (supports d’énergie vitale et régulatrices du système nerveux et des glandes hormonales) [5].

I.1.6. Composition chimique

La composition des huiles essentielles est déterminée par la chromatographie gazeuse (GC) et spectrométrie de masse (SM), elles sont constituées principalement de deux groupes de composés odorants distincts selon la voie métabolique empruntée ou utilisée. Il s’agit des : les terpènes (mono et sesquiterpènes), les composés aromatiques et des composés d’origines diverses (carbures, acides, alcools…) [6].

• Les monoterpènes

Les monoterpènes sont les plus simples constituants des terpènes dont la majorité est rencontrée dans les huiles essentielles (90%) [7] .Ils comportent deux unités isoprène (C5H8), selon le mode de couplage « tête-queue ». Ils peuvent être acycliques, monocycliques ou bicycliques. A ces terpènes se rattachent un certain nombre de produits naturels à fonctions chimiques spéciales.

Figure. I. 3. Exemple de quelques monoterpènes

Chapitre I Etude bibliographique

• Les sesquiterpènes Ce sont des dérivés d’hydrocarbures en C15H22 (assemblage de trois unités isoprènes). Il s’agit de la classe la plus diversifiée des terpènes qui se divisent en plusieurs catégories structurelles, acycliques, monocycliques, bicycliques, tricycliques, polycycliques. Ils se trouvent sous forme d’hydrocarbures ou sous forme d’hydrocarbures oxygénés comme les alcools, les cétones, les aldéhydes, les acides et les lactones dans la nature [6].

Figure. I.4. Exemples de quelques sesquiterpènes

• Les composés aromatiques Une autre classe de composés volatils fréquemment rencontrés est celle des composés aromatiques dérivés du phénylpropane (Figure. 5) [6] .Cette classe comporte des composés odorants bien connus comme la vanilline, l'eugénol, l'anéthole, l'estragole et bien d'autres. Ils sont davantage fréquents dans les huiles essentielles d'Apiaceae (persil, anis, fenouil, etc.) et sont caractéristiques de celles du clou de girofle, de la vanille, de la cannelle, du basilic, de l'estragon, etc.

Figure. I.5. Exemples de composés aromatiques

Chapitre I Etude bibliographique

I.1.7. Utilisation

Les huiles essentielles possèdent de nombreuses activités biologiques. En phytothérapie, elles sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques contre les maladies infectieuses d’origine bactérienne, par exemple contre les bactéries endocanalaires [8] ou au niveau de la microflore vaginale [9] et d’origine fongique contre les dermatophytes [10]. Cependant, elles possèdent également des propriétés cytotoxiques [11] qui les rapprochent donc des antiseptiques et désinfectants en tant qu’agents antimicrobiens à large spectre. Dans les domaines phytosanitaires et agroalimentaires, les huiles essentielles ou leurs composés actifs pourraient également être employés comme agents de protection contre les champignons phytopathogènes [12] et les microorganismes envahissant les denrées alimentaires [13]. Les huiles essentielles jouent un rôle écologique dans les interactions végétales, végétale- animales et pourraient même constituer des supports de communication par des transferts de messages biologiques sélectifs [14]. En effet, elles contribuent à l'équilibre des écosystèmes, attirent les abeilles et des insectes responsables de la pollinisation, protègent les végétaux contre les herbivores et les rongeurs, possèdent des propriétés antifongiques, antibactériennes, allopathiques dans les régions arides et peuvent servir de solvants bioactifs des composés lipophiles [15], [16]. Traditionnellement, les huiles essentielles sont présentes dans le processus de fabrication de nombreux produits finis destinés aux consommateurs. Ainsi, elles sont utilisées dans l’agroalimentaire (gâteaux, biscuits, soupe, sauce, chewing gum, chocolats, bonbons…) pour aromatiser la nourriture. Elles sont également utilisées dans l’industrie de la parfumerie, de la cosmétique et de la savonnerie. On les utilise aussi dans la fabrication des adhésifs (colle, scotch …), et celle de la nourriture pour animaux, dans l’industrie automobile, dans la préparation des sprays insecticides. L'homéopathie et l'aromathérapie sont des exemples courants d'usage d'huiles essentielles en médecine douce, et leur popularité s'est accrue d'une façon considérable ces dernières années [17].

I.1.8. Les huiles essentielles de qualité

Les meilleures garanties que l’on puisse obtenir sont, d’une part, la certitude qu’il s’agit d’huiles essentielles pures et naturelles, d’autre part, qu’elles sont issues de plantes cultivées en agriculture biologique. Les huiles essentielles devront être authentiquement pures et naturelles, ni décolorées, ni peroxydées, ni déterpénées, ni rectifiées, ni concentrées, elles ne

Chapitre I Etude bibliographique doivent pas non plus être coupées par quelque produit naturel ou chimique que se soit et ne doivent contenir ni conservateur, ni colorant, ni aucun autres additif. Sur l’emballage, doivent Figure. Iurer un certain nombre d’information : ♦ La désignation botanique (nom latin) de la plante : genre, espèce, variété. ♦ Le pays de production exact : Madagascar, Australie… ♦ La partie de la plante utilisée pour extraire l’huile essentielle : fleurs, feuilles, zeste… ♦ Le procédé d’extraction : entrainement à la vapeur d’eau, expression à froid… ♦ Les principes actifs majeurs qui définissent l’identité biochimique de l’huile essentielle et son chémotype [18].

I.2. Méthode et équipement d’extraction

Les huiles essentielles sont obtenues avec des rendements très faibles (de l’ordre de 1%) ce qui en fait des substances fragiles, rares, et précieuses. Ainsi les différentes techniques d’extraction des huiles essentielles ou extraits aromatiques doivent tenir compte de ces caractéristiques et apporter des performances quantitatives satisfaisantes. Une forte demande toujours plus exigeante basée sur différents phénomènes physiques : la distillation, l’extraction ou la séparation, ces techniques d’extraction seront présentées selon le principe sur lequel elles sont basées et classées en deux catégories distinctes selon le produit final obtenu : une huile essentielle ou un extrait aromatique.

I.2.1.Enfleurage et Macération

Cette technique la plus couteuse et peu employée aujourd’hui. On l’emploie pour des fleurs sensibles, ne supportant pas un chauffage trop élevé, comme le jasmin, la violette et la rose. Les fleurs sont mises à macérer dans des graisses ou des huiles et chauffées (bain- marie ou soleil) et étalées sur des châssis en bois pendant plusieurs jours. Une fois gorgés de parfum. Les corps gras sont filtrés à l’aide d’un tissu de lin ou d’un coton. Les huiles sont ensuite lavées à l’alcool pur. Filtrées et évaporées [19].

I.2.2.Extraction par entrainement à la vapeur d’eau (VAP)

L’entrainement à la vapeur constitue la technique la plus utilisée et la plus aisée à mettre en œuvre pour la production d’huiles essentielles. Le chauffage permet, dans une première étape de former de la vapeur d’eau qui détruit la structure des cellules végétales, libère les molécules contenues et entraîne les plus volatiles en les séparant du substrat cellulosique.

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Le courant de vapeur ainsi crée permet l’entrainement d’un mélange hétérogène d’eau et de molécules organiques. Il s’agit plus précisément de la formation d’un azéotrope entre l’eau et chacun des constituants du mélange. Ainsi, des substances possédant des points d’ébullition assez élevés peuvent être extraites. La vapeur, chargée de l'essence de la matière première distillée, se condense dans le serpentin de l'alambic avant d'être récupérée dans un essencier. Les parties insolubles dans l'eau de condensation sont décantées et en raison de sa plus faible densité, l’huile essentielle se place au dessus de la phase aqueuse. La phase aqueuse contenant les composés hydrosolubles est appelée eau de distillation (ou hydrolat).

Figure. I.6. Schéma du montage vapo-hydrodistillation

I.2.3. Hydrodistillation (HD) L’hydrodistillation proprement dite, est la méthode normée pour l’extraction d’une huile essentielle [3,20]. Le principe de l’hydrodistillation correspond à une distillation hétérogène. Le procédé consiste à immerger la matière première végétale dans un bain d’eau. L’ensemble est ensuite porté à ébullition généralement à pression atmosphérique. La chaleur permet l’éclatement et la libération des molécules odorantes contenues dans les cellules végétales. Ces molécules aromatiques forment avec la vapeur d’eau, un mélange azéotropique. Sachant que la température d’ébullition d’un mélange est atteinte lorsque la somme des tensions de vapeur de chacun des constituants est égale à la pression d’évaporation, elle est donc inférieure à chacun des points d’ébullition des substances pures. Ainsi le mélange azéotropique « eau + huile essentielle » distille à une température égale 100°C à pression atmosphérique alors que les températures d’ébullition des composés aromatiques sont pour la

Chapitre I Etude bibliographique plupart très élevées. Il est ensuite refroidi et condensé dans un essencier ou vase florentin. Une fois condensées, eau et molécules aromatiques du fait de leurs différences de densité, se séparent en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle. La distillation peut s’effectuer avec ou sans recyclage de la phase aqueuse obtenue lors de la décantation. Le principe de recyclage est communément appelé cohobage. En laboratoire le système équipé d’une cohobe qui est généralement utilisé pour l’extraction des huiles essentielles en accord avec la Pharmacopée Européenne est le Clevenger [21]. La durée d’une hydrodistillation peut considérablement varier, pouvant atteindre plusieurs heures selon le matériel utilisé et la matière végétale à traiter. La durée de la distillation influe non seulement sur le rendement mais également sur la composition de l’extrait [22].

Figure. I.7.schéma du Montage d'hydrodistillation (Clevenger)

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I.2.4.Hydrodiffusion

L’hydrodiffusion est une variante de l’entraînement à la vapeur (Figure.I.8). Cette technique relativement récente et particulière. Elle exploite ainsi l’action osmotique de la vapeur d’eau. Elle consiste à faire passer, du haut vers le bas et à pression réduite, la vapeur d'eau à travers de la matrice végétale.

Figure. I.8. Schéma du montage d’hydrodiffusion

I.2.5.L’expression à froid

Le procédé d'extraction par expression à froid est assurément le plus simple mais aussi le plus limité. Il est réservé à l’extraction des composés volatils dans les péricarpes des hespéridés ou encore d’agrumes qui ont une très grande importance pour l’industrie des parfums et des cosmétiques. Il s’agit d’un traitement mécanique qui consiste à déchirer les péricarpes riches en cellules sécrétrices. L’essence libérée est recueillie par un courant d’eau et reçoit tout le produit habituel de l’entraînement à la vapeur d’eau, d’où la dénomination d’huile essentielle [23].

I.2.6.Extractions assistés par micro onde

En 1986, Ganzler et al, furent les premiers à présenter une technique d’extraction par solvant assistée par micro-ondes en vue d’une analyse chromatographique. Cette technique permettait de réduire les temps d’extraction et donc les dépenses en énergie par rapport à une méthode conventionnelle. En 1990, Paré et al, ont déposé un premier brevet européen, sur

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«l’extraction de produits naturels assistée par micro-ondes ». Ils proposaient d’irradier le matériel végétal en présence d’un solvant transparent aux micro-ondes de type hexane.

 Les micro-ondes Les rayonnements micro-ondes sont des ondes électromagnétiques qui se propagent dans le vide à la vitesse de la lumière. Elles sont caractérisées par une fréquence comprise entre 300MHz et 30GHz, c’est-à-dire par une longueur d’onde comprise entre 1m et 1cm. Sur le spectre électromagnétique, elles sont situées entre les radiofréquences et les infrarouges [24].  Le chauffage micro-ondes

Le transfert de chaleur sous chauffage micro-ondes est complètement inversé par rapport au chauffage conventionnel. Le transfert de chaleur classique se transmet de l'extérieur vers l’intérieur du récipient. Sous chauffage micro-ondes, le volume traité devient lui même source de chaleur. On parle de dégagement de la chaleur de l’intérieur vers l'extérieur du récipient. La paroi externe du réacteur est plus froide que le milieu du réacteur dans le cas du chauffage micro-ondes, et inversement pour le cas du chauffage conventionnel par double enveloppe, plaque chauffante et flamme. C’est un mode de chauffage instantané en volume et non en surface. Les phénomènes thermiques de conduction et de convection ne jouent plus qu’un rôle secondaire d'équilibrage de la température. Des surchauffes locales peuvent également se produire.

 Les interactions ondes - matière

Le mécanisme du chauffage diélectrique repose sur le fait que les molécules polaires ont des extrémités négatives et positives : ce sont des dipôles. En l’absence de champ électrique, les dipôles d’un milieu diélectrique se trouvent orientés au hasard sous l’effet de l’agitation thermique du milieu. Sous l'effet d'un champ électrique continu, les molécules tendent à s'orienter dans la direction du champ électrique. Plus le champ électrique est intense, moins l'agitation thermique. Lorsque toutes les molécules sont orientées, il apparaît un moment dipolaire global induit. Sous l'effet d'un champ électrique alternatif de fréquence, les dipôles s'orientent dans la direction du champ sur une demi alternance, se désorientent lorsque le champ s'annule et se réorientent dans l'autre sens pendant la seconde demi alternance : c'est la rotation dipolaire. L’énergie électrique est convertie en énergie cinétique par la rotation des dipôles.

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L'énergie cinétique est transformée partiellement en chaleur : l'alignement des dipôles par rapport au champ électrique est contrarié par les forces d'interactions entre molécules (les forces de liaison par pont hydrogène et les forces de liaisons de Van der Waals). Ces forces peuvent être assimilées à des forces de frottement internes qui existent dans les contacts solide-solide. Elles s'opposent ainsi à la libre rotation des molécules. De la friction produite, naît le dégagement de chaleur. La dissipation d'énergie par le produit peut être maximale si la fréquence du champ électrique est égale à la fréquence de relaxation. Le phénomène de relaxation correspond à l'apparition d'un déphasage entre l'oscillation du champ électrique et celui des dipôles. Les fréquences micro-ondes étant imposées, l'échauffement d'un produit avec une efficacité maximale est exceptionnel. Dans ce cas, une grande partie des molécules soumises à l’action du champ micro-ondes ne tourne pas avec le changement alternatif du champ mais frissonne comme le montre la figure.9.

Figure. I.9. Frissonnement des dipôles soumis à une irradiation micro-ondes

I.2.7.Vapodistillation assistée par micro-onde (VAPMO)

La Vapodistillation est l’une des méthodes de choix pour l’obtention des huiles essentielles. A la différence de l’hydrodistillation, cette technique ne met pas en contact direct l’eau et la matière végétale à traiter. De la vapeur d’eau fournie par une chaudière traverse la matière végétale située au dessus d’une grille. Durant le passage de la vapeur à travers le matériel, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ». Le mélange est ensuite véhiculé vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et une phase organique : l’huile essentielle. L’absence de contact direct

Chapitre I Etude bibliographique entre l’eau et la matière végétale, puis entre l’eau et les molécules aromatiques évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de l’huile [25].

Figure. I.10. Schéma du montage VAP-MO

I.2.8. Hydrodistillation assistée par micro onde (HDMO)

Le procédé d’hydrodistillation par micro-ondes est basé entièrement sur le principe de l’hydrodistillation classique. Le matériel végétal est donc placé en présence d’une quantité d’eau suffisante dans un ballon disposé dans l’enceinte du four à micro-ondes. Le système de réfrigération ainsi que la partie prévue pour la récupération des essences sont situés à l’extérieur du four. Les avantages cités sont la rapidité et la similitude de la composition de l’huile par rapport à une hydrodistillation classique.

Figure. I.11. schéma du montage HDMO

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I.2.9.Hydrodistillation assistée par micro-ondes sous vide pulsé ou (VMHD) (Vaccum Microwave HydroDistillation)

Cette technique d’extraction, dont l’origine est l’hydrodistillation classique, est basée sur l’utilisation conjointe des micro-ondes et d’un vide pulsé. D’après les concepteurs du VMHD l’extraction serait dix fois plus rapide que l’hydrodistillation pour un rendement équivalent et un extrait de composition identique. Les composés responsables des notes « crues » les plus thermosensibles semblent être conservées après une extraction par VMHD contrairement à une hydrodistillation classique.

Figure. I.12. schéma du montage VMHD

I.2.10. Extraction par solvant assisté par micro onde ESAM Cette technique d’extraction a été développée au cours des dernières décennies à des fins analytiques [26]. Le procédé consiste à irradier par micro-ondes de la matière végétale broyée en présence d’un solvant absorbant fortement les micro-ondes (le méthanol) pour l’extraction de composés polaires ou bien en présence d’un solvant n’absorbant pas les microondes (hexane) pour l’extraction de composés apolaires. Cette méthode est la plus utilisée. Si sa rapidité de mise en œuvre en fait une technique de choix pour l’extraction et plus particulièrement pour l’extraction de composés aromatiques d’origine végétale. Après le chauffage pendant 30minute environ on obtient un mélange qui contient le solvant en suite on

Chapitre I Etude bibliographique fait bouillir le mélange obtenu, dans le but d’éliminer le solvant à l’aide d’un rota vapeur. Ceci est possible car sa température d’ébullition est inférieure à celle de l’huile essentielle. On obtient ainsi une essence concrète qui est pate fortement odorante contient des cires et des corps gras.

Figure. I.13. schéma du montage ESAM Figure. I.14. Dispositif de l’évaporateur rotatif I.2.11.Extraction assisté par ultrasons Les ultrasons sont des vibrations acoustiques de fréquence trop élevée pour produire une sensation auditive. Un ultrason correspond à une fréquence supérieure à 20 000 Hz ; il est, par rapport aux sons audibles, ce que les radiations ultraviolettes sont aux radiations visibles du spectre [27].

 Les propriétés des ultrasons

Dans le domaine chimique, les ultrasons améliorent les propriétés catalytiques de certains corps, font cesser les états d'équilibre instable, provoquent la division des macromolécules d'amidon et de gélatine (par dépolymérisation elles se transforment en molécules plus petites). En biologie, sous l'action de ces ondes on observe la désagrégation de noyaux cellulaires, l'éclatement des hématies et l'arrêt des fermentations. L'exploitation de ce domaine peut conduire à d'importantes applications en médecine [27].

 L’hydrodistillation assistée par ultrasons Il s’agit dans ce cas précis d’un traitement « pré » ou « post » opératoire. En effet, les micros cavitations générées par les ultrasons, désorganisent la structure des parois végétales, notamment les zones cristallines cellulosiques.

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Les ultrasons favorisent la diffusion et peuvent modifier l’ordre de distillation des constituants des huiles essentielles. Dans certains cas, les rendements en huile essentielle sont augmentés et les cinétiques accélérées. L’utilisation des ultrasons pendant l’hydrodistillation est vaine. Une unité d’hydrodistillation équipée d’une fontaine d’ultrasons peut produire plus vite des points d’ébullition, mais ne dégonflent pas les bulles. Par conséquent, les ultrasons ne sont pas une bonne option pour les procédés par ébullition. Cependant, l’extraction assistée par les ultrasons est une technique de choix pour les solvants de faible point d’ébullition, à des températures d’extraction inférieures au point d’ébullition [28].

Figure. I.15 .Montage d’extraction par ultrasons

I.2.12.Extraction par du CO2 supercritique

La technique est fondée sur la solubilité des constituants dans le dioxyde de carbone à L’état supercritique. Grâce à cette propriété, le dioxyde de carbone permet l’extraction dans le domaine liquide (supercritique) et la séparation dans le domaine gazeux. Le dioxyde de carbone est liquéfié par refroidissement et comprimé à la pression d’extraction choisie. Il est ensuite injecté dans l’extracteur contenant le matériel végétal, puis le liquide se détend pour se

Chapitre I Etude bibliographique convertir à l’état gazeux pour être conduit vers un séparateur où il sera séparé en extrait et en solvant (Figure. I.16).

Figure. I.16. Montage d’extraction par le CO2 supercritique

I.2.13.Broyage cryogénique

Ce procédé consiste à pulvériser la partie active de la plante sèche en la broyant à froid sous azote liquide à –196°C. Ce gaz neutre, constituant de l’air que nous respirons, est injecté sur les plantes sèches ou humide pour les rendre plus cassantes et pour éviter toute élévation de température pendant le broyage. Il faut savoir qu’au cours d’un broyage classique, la température produite par frottement peut atteindre +70°C, et ainsi détruire les principes actifs, les composants volatils et les constituants sensibles à la chaleur en conséquence une qualité inférieure du produit broyé conduisant à une réduction de l’arome du produit. Parmi les avantages de broyage cryogénique on peut citer : - permet de conserver l’intégralité des produits actifs de la plante, il préserve au maximum des constituants de la plante, et donc ses propriétés. En effet sans broyage à froid, les plantes s'échauffent, et certaines molécules peuvent se dénaturer et les arômes s'évaporer ; -permet un broyage très fin, rigidifiées par le froid, les plantes deviennent plus friables : il est donc plus facile de les couper très finement, ce qui donne une poudre fluide et homogène ; - améliorer la productivité en facilitant le broyage.

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I.2.14. Extraction verte

La conception de méthodes d'extraction vertes et durables de produits naturels est actuellement un sujet de recherche dans la zone chaude multidisciplinaire de la chimie appliquée, la biologie et la technologie. Les tendances récentes dans l'extraction techniques ont surtout porté sur la recherche de solutions qui minimisent l'utilisation de solvants. Ceci, bien sûr, doivent être atteints tout en permettant l'intensification des procédés et une production rentable de haute extraits de qualité

[29].  Définition de l'extraction Vert Une définition générale de la chimie verte, c'est l'invention, la conception et l'application de produits chimiques et des procédés pour réduire ou d'éliminer l'utilisation et la production de substances dangereuses. En ce qui concerne l'extraction de produits naturels verte, cette définition peut être modifiée comme suit: " L'extraction verte est basée sur la découverte et la conception de procédés d'extraction qui permettra de réduire la consommation d'énergie, et permet l'utilisation de solvants alternatifs et produits naturels renouvelables, et d'assurer un environnement sûr et Extrait de haute qualité / produit " [29].

Trois solutions principales ont été identifiées pour concevoir et démontrer l'extraction verte au laboratoire à l'échelle industrielle et à l'approche d'une consommation optimale des matières premières, des solvants et énergie: - l'amélioration et l'optimisation des processus existants ; - en utilisant l'équipement non dédié ; - l'innovation dans les processus et les procédures, mais aussi dans la découverte d'autres solvants [29].

 Les principes de l'extraction Vert

La liste des «six principes d'extraction des produits naturels verte» devrait être considérée pour l'industrie et les scientifiques comme une direction pour mettre en place un label innovant et vert, charte et standard, et comme un reflet d'innover non seulement dans le processus, mais dans tous les aspects de l'extraction solide-liquide: Principe 1: L'innovation par la sélection de variétés et de l'utilisation des ressources végétales renouvelables [30].

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Principe 2: L'utilisation de solvants alternatifs et principalement de l'eau ou des agro-solvants [31]. Principe 3: Réduire la consommation d'énergie par récupération d'énergie et l'utilisation de technologies innovantes [31]. Principe 4: La production de coproduits au lieu de déchets, y compris la bio-raffinage et agro- industrie. Principe 5: Réduire opérations unitaires et favorisent les processus de sécurité, robuste et contrôlé [32]. Principe 6: Viser un extrait non dénaturé et biodégradable, sans contaminants [32]. Les principes ont été identifiés et décrits non comme des règles, mais plutôt comme des exemples novateurs à suivre, découvert par des scientifiques et appliqués avec succès par l'industrie.

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I.3. LES PLANTES ETUDIEES

I. 3.1 Piper cubéba

• Description Botanique

Le cubèbe L. (Piperaceae), nom botanique Piper cubéba de la famille (Piperaceae), est une épice originaire d'Inde. Il porte aussi le nom de cubèche, embèbe, poivre à queue, poivre de Java ou encore poivre du Kissi, on peut le trouver à Java, Sumarta, Bornéo du sud et d'autres îles de l'océan Indien [85].

C’est une plante vivace, avec une tige grimpante, branches rondes, épaisses, couleur de cendre et l’enracinement au niveau des articulations, les feuilles sont de quatre à six pouces et demi de longueur et deux pouces de largeurs ovales, oblongues, acuminées et très lisses [86].

Ces fleurs sont disposées aux pointes et à l’extrémité des branches. Son fruit, une baie plutôt plus longue que celle de poivre noir (figure I.17) [86].

Figure I.17. Baies séchées de cubèbe Figure I.18. Les fruits de l’arbre de cubèbe

Figure I.19. Aspect morphologique de cubèbe

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Les baies séchées de l'arbre de cubèbe sont largement utilisées comme agent aromatisant dans des boissons et des cigarettes et comme assaisonnement alimentaire en Europe [88]. Le cubèbe s'accorde très bien avec les plats de légumes.

• Composition chimique du Cubèbe  Huile essentielle

La composition chimique de l'huile essentielle de fruits mûrs (R=11,8%) et les feuilles (R=0,9%) de Piper cubébaL. fils. (Piperaceae) a été étudiée par GC et GC / MS [87]. Les résultats concernant les composés majoritaires sont regroupés dans le tableau I.1.

Tableau I.1. Les composés majoritaires de l’huile essentielle de Piper cubéba[87]

les principaux pourcentage Référence composants

Sabinène 9,1%

β-élémène 9,4%

l'huile de baies β-caryophyllène 3,1% [87]

l'épi-cubébol 4,3%

cubébol 5,6%

trans-sabinène 8,2% hydrate

l'huile des feuilles β-caryophyllène 5,0% [87]

l'épi-cubébol 4,2%

γ-cadinène 16,6%

cubébol 4,8%

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Pas de grandes différences qualitatives ont été constatées dans la composition entre l'huile de baies et huile de feuilles, bien que les baies contiennent une quantité considérable traces (<0,05%) qui ont été pas trouvé dans les feuilles. La principale différence était de nature quantitative [87].

D’après les travaux de Bortaso et al, ont trouvé que les baies de Piper cubéba contiennent jusqu'à 10% d’huile essentielle, composée de monoterpènes (sabinene 50%, carène, α-thujène, le 1,4-cinéol et de 1,8-cinéole) et sesquiterpènes (copaène, β-cubébène α- et δ-cadinene, caryophyllène, germacrene, cubébol)[122].

 Huile fixe • Les composés photochimiques

D’après les travaux de Gayatri Nahak et RK Sahu sur les composés photochimiques (tableau 1), ont prouvé la présence de grandes quantités de glycosides, alcaloïdes, des tanins, des composés phénoliques et d’autres composés de métabolites secondaires ont été détectés dans l’extrait éthanolique de Piper cubéba[86].

(Sies et Stahl, 1995 ; PIETTA ,2000) [91] ont montré que le système de vie est protégé par les enzymes de cette plante tels que le superoxyde dismutase, glutathion peroxydase et de la catalase et certain antioxydant endogène tels que α-tocophérol, l’acide ascorbique, - carotène et l’acide urique, puisque les antioxydants endogènes agissent en tant que système 𝛽𝛽de défense intracellulaire en protégeant les cellules (les dégâts des radicaux libres).

Tableau I.2. Les composés photochimiques de Piper cubéba [86]

Alcaloïde Glycoside Terpenoïde Stéroïde Flavonoïde Tanin Anthraquinone

P.cubéba + + -- + + + +

(+) présence et (-) absence

• La teneur totale en phénolique et IC 50

Les composés phénoliques typiques qui possèdent l’activité antioxydante sont principalement les acides phénoliques et flavonoïdes [92].

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L’extrait éthanolique de Piper cubébaa indiqué une forte teneur en composé phénolique 123,1±0,05 (μg/g). Les résultats sont exprimés en tant que équivalents de catéchol (pg/mg). Une forte activité antioxydante de l’extrait éthanolique est de 77,61±0,02% avec IC50 de 10,54±0,12μg/mg [86], on a obtenu IC50 de 11,3 ± 0,3 (μg/ml) avec l’extrait méthanolique[109].

Les huiles fixes de Piper cubébariches en composés phénoliques notamment acide phénolique, les flavonoïdes, quinines, coumarines,lignanes, stilbènes et tanins qui augmentent l’effet antioxydant de la plante [102,103]. Ces composés antioxydants jouent un rôle très important dans l’activité antibactérienne, antiviral, anticancéreuse [106], antitumorale, anti- mutagénique [107], anti-inflammatoire et anti-atherosclerotic [104–105].

• Les lignanes et les alcaloïdes

Les graines de Piper cubéba sont riches en lignanes et alcaloïdes tels que cubébine, hinokinine, yateine et isoyateine [98], Cubebin un excellant antioxydant[101] qui donne à la graine de différentes activités biologiques anti-inflammatoires, analgésiques [99], antibactériennes [100].

Figure I.20 .La structure chimique de la molécule de Cubebin [98]

• Effet biologique et utilisation

Le cubèbe a plusieurs effets biologiques ; il a était prescrit pour traiter la gonorrhée, la dysenterie, la syphilis, la douleur abdominale, entérite et l'asthme et il a également un effet inhibiteur sur la protéase du virus de l’hépatite C [89,97]. Plusieurs études ont montré l’effet anti-inflammatoire et analgésique de l’extrait de méthanol à partir du fruit de Piper

Chapitre I Etude bibliographique cubéba[90,93], anti-type IV allergique [90], anti-leishmanial [94], genotoxic [95], anti- proliférative [96]. En Inde, le cubèbe est inclu dans divers remèdes, Charaka et Sushruta prescrivent une pate de cubèbe comme un bain de bouche , pour les maladies bucco dentaires, la perte de la voix, la mauvaise haleine, la fièvre et la toux .Dans la médecine chinoise, le cubèbe est utilisé pour sa propriété de réchauffement. Dans la médecine tibétaine, le cubèbe (kakola en tébétain) est cosidéré comme une drogue [86]. Les arabes utilisent le cubebe (Kababa en arabe) dans la préparation de ras-el-hanout, mélange d'épices très utilisé dans la cuisine du Maghreb, où on lui prête des vertus aphrodisiaques. • L’effet antibactérien de Piper cubéba Khan M et Siddiqui Mu ont fait une étude sur l’ activité antibactérienne et antifongique de Piper cubéba par différents solvants, en utilisant la méthode de diffusion des disques sur les géloses (gélose nutritive pour les bactéries de gram + ; gélose Macconkey pour la bactérie de gram – et Potato dextrose pour levure et moisissure).Une fois ces géloses disposées sur les boites de pétrie et refroidie, ils sont ensemencés par les bactéries suivantes :Gram+ tel que Staphylococcus Albus, Bacillus megaterium, Gram – tels que Salmonella Typhi, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia colis et fongique tel que Aspergillus niger. Les disques imbibés par les différents extraits sont placés délicatement sur les géloses ensemensées incubées à 37 °C pendant 24h, les résultats sont récapitulés dans le tableau ci- dessous[108].

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Tableau I.3. Activité antibactérienne de différents extraits de la graine de Piper cubéba[108]. solvant E.coli B.megaterium S.albus S.typhi P.aeruginosa A.niger

Carbone + + + - + * tetrachloride

Benzène + + + + + +

Chloroforme + - + + + ++

Ethyle + - + + + - acétate

Acétone + - + + + +

Ethanol ++ + + + + ++

Eau distillée + + + + - -

Diamètre du disque=4mm, Diamètre de la zone d’inhibition en (mm) indiqué par les signes +, ++, - et *. Où ++ = 10-14mm, + =5-9mm, - = pas d’inhibition *= pas tester.

Nous remarquons d’après les résultats ci-dessus que les extraits éthanoliques et benzoïques sont mieux appropriés du fait qu’il ya une sensibilité envers toutes les bactéries testées.

Kamal Rai Aneja et al, ont signalé que Streptococcus mutans ,Candida albicans, Staphylococcus aureus et Saccharomyces cerevisiae sont des bactéries et levure responsable de plusieurs infections dans la cavité buccale, pour cette raison là, ils ont testé l’effet antibactérien de 5 extraits de piper cubébapréparés par différents solvants, puis ils l’ont comparé par celui des antibiotiques et ils ont trouvé que l’extrait cétonique a indiqué une grande activité antibactérienne contre S.aureus avec une zone d'inhibition de 18,96 mm suivie par l’extrait méthanolique (17,65 mm) et extraits éthanoliques(17,32 mm) (tableau 1). S. aureus a survécu jusqu'à 12,5 mg / ml et une CMI de 25 mg / ml (tableau 2La figure 2 ii). Les zones d'inhibition produites par les 3 solvants contre S. mutans ont varié de 13 à 12,64 mm, et ce microorganisme a survécu jusqu'à 25 mg / ml (CMI = 50 mg /ml).les extraits de la phase aqueuse (chaudes et froides) n'a pas montré une activité contre les levures et les bactéries testées (tableau 1).

Chapitre I Etude bibliographique

Piper cubéba peut être utilisé pour traiter les espèces fongiques buccales, en particulier C. albicans, le fait qu’on a enregistré une zone d’inhibition plus grande que les antibiotiques (Ciprofloxacin et Ampholericin-B), souvent utilisés pour traiter ces agents pathogènes. Cependant, l'isolement des composés purs et de leurs analyses toxicologiques. L’investigation clinique chez l'animal doit être faite avant que celle chez l’homme [123].

Tableau I.4. Activité antibactérienne des extraits de Piper cubébaméthanoliques, ethanoliques, cétoniques et chloroformiques (22mg/ml) mis dans les puits perforés sur les milieux de culture ( MH et SAB ) après 18-24 d’incubation à 37°C [123].

Solvant utilisé Diamètre de la zone d’inhibition (mm) Streptococcus Staphylococcus Candida Saccharomyces mutans aureus albicans cerevisiae Acétone 12,64±0,57 18 ,96±1 15,31±0,57 14±0 Méthanol 12,31±0,57 17,65±0,57 12,31±0,57 12,94±1 Ethanol 13±00 17,32±0,57 11,94±1 13,95±1 Solution - - - - aqueuse chaude Soution aqueuse - - - - froide Ciprofloxacin 27,32±0,57 34,66±0,57 ND ND Ampholericin-B ND ND 13±0 11,94±1 20%DMSO - - - (-) :pas d’activité, ND : pas tester, le diamètre des puits=8mm.

Figue I.21. Zone d'inhibition antifongique contre C. albicans représentée par l'extrait acétonique de P. cubébadéterminée par diffusion sur gélose par la méthode des puits [123].

Chapitre I Etude bibliographique

Figue I.22. CMI montrée par l'extrait cétonique de P. CUBÉBAcontre C. albicans (2i) et S .aureus (2ii) déterminée par la méthode de diffusion de puits sur gélose à l’aide d’une série de dilution des extraits: 50 mg / ml (a), 25 mg / ml (b), 12,5 mg / ml (c) 6,25 mg / ml (d) de 3,125 mg / ml (e) et 1,56 mg / ml (F) [123]

Figure I.5.CMI de P.cubébade l’activité antibactérienne envers Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans et Saccharomyces cerevisiae par la méthode de diffusion sur la gélose [123]

Solvant utilisé La concentration minimale inhibitrice (CMI) mg/ml Streptococcus Staphylococcus Candida Saccharomyces mutans aureus albicans cerevisiae Acétone 50 25 12,5 12,5 Methanol 50 25 25 12,5 Ethanol 50 25 25 12,5

Chapitre I Etude bibliographique

I.3.2. Description botanique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam)

Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam), la belle envahissante ou la Balsamine géante. Plantae, Spermatophytes, Angiospermes, Dicotylédones, Ericales, Balsaminaceae

Synonymes :

Impatiens glanduligera Lindley ; Impatiens roylei Walpers ; Balsamina roylei (Walpers) Ser. Plante herbacée annuelle de 0.5 à 2 m de hauteur. Les tiges sont rougeâtres, multi ramifiées, dressées, creuses et sans poils avec de larges nœuds enflés et se terminent par des racines allant jusqu’à 1015 cm de profondeur. Ses feuilles sont glabres, simples, de forme oblongue, ovale à elliptique, nettement dentées et disposées de façon opposée. Les fleurs zygomorphes sont regroupées en inflorescences en forme de grappe lâche contenant de 2 à 14 fleurs odorantes. Elles sont de couleur rose à rouge ou pourpre, et se terminent vers le bas par un éperon droit et court. Les fruits appelés capsules sont longs de 1,5 à 3 cm à déhiscence élastique et contiennent entre 4 et 16 graines [110].

Distribution en France

La plante est présente sur une grande partie du territoire national, dans les zones océaniques et de montagnes, mais aussi en bordure de cours d’eau en région méditerranéenne [110].

Distribution en Europe

La plante est largement répandue en Europe du Nord (GrandeBretagne, Finlande, Suède, Norvège, Danemark) et en Europe de l’Ouest (Allemagne, Suisse, République Tchèque), de l’Est (Pologne, Hongrie, Roumanie, Russie) et du Sud (Espagne) [110].

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Figure I.23. La belle envahissante Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam)

I.3.3. Description botanique Pteridium aquilinum

Pteridium aquilinum est une plante cosmopolite qui envahit les terrains dégradés des jachères et des cultures pérennes du sud de la Côte d’Ivoire. Quoique nuisible aux cultures, elle ne doit pas être éradiquée à cause de ses nombreuses utilisations par l’homme. Elle sert en effet dans la médecine traditionnelle pour traiter des maladies comme le rhumatisme, l’aménorrhée, la fontanelle, etc. Cette plante peut être aussi utilisée dans divers autres domaines: l’alimentation humaine, la literie [111]. Pteridium aquilinum - Fougère aigle

Famille : (Dennstaedtiaceae)

Synonyme : Pteris aquilina

Origine : Régions tempérées et subtropicales

Le genre PTERIDIUM : 1 seule espèce.

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Descriptif de l'espèce P. AQUILINUM Vivace caduque. Rhizome profond, horizontal, traçant, poilu, d'où s'élèvent tard en saison de très grandes frondes coriaces, 0,60-1,50 de haut, généralement triangulaires et 2-3 fois divisées. Pétiole long, robuste, noirâtre vers sa partie inférieure, vert dans sa partie aérienne. Lorsqu'on tranche la partie inférieure du pétiole, on voit au microscope le dessin approximatif d'un aigle à 2 têtes formé par les vaisseaux ligneux, ce qui a valu son nom vernaculaire ; dans d'autres versions, ce nom est dû à la forme des jeunes frondes qui se déploient au printemps, sous l'aspect de "serres d'aigle" couvertes de poils gris. Bord des pinnules un peu réfléchi, se repliant pour protéger les sporanges [113].

Figure I .24. Pteridium aquilinum

I.3.4 Leucanthemum vulgare (Marguerite commune)

• Synonymes : Grande pâquerette, lecanthème commun, grande marguerite • Famille : Famille de la marguerite – Asteraceae (Compositae) • Hauteur : 20–70 cm • Fleur : Nombreux fleurons radiés blancs ligulés et fleurons tubulaires bisexués en disque jaunes regroupés en capitules, 3–6 cm de diamètre. Ligule de fleurons s’ouvrant rapidement. Pointe munie de trois dents peu marquées. Corolle de fleurons à cinq lobes. Calice absent ou rudimentaire. Cinq étamines, anthères regroupées en tube autour du style. Pistil constitué de deux carpelles soudés, style solitaire, stigmate

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bilobé. Capitule enveloppé par trois verticilles de bractées involucrées. Capitule solitaire, à l’extrémité de la tige et des ramifications. • Feuilles : Alternes, généralement munies de poils épars des deux côtés. Feuilles inférieures à long pétiole, limbe obovale, muni d’un bord à longues dents. Feuilles supérieures sessiles ou à pétiole court, limbe étroitement elliptique ou lancéolé à oblancéolé, muni de bords à grandes dents. • Fruit : Cypsèle cylindrique, d’environ 3 mm long, à 10 cannelures, parfois couronnée d’un anneau membraneux en forme de couronne. • Habitat : Prairies, bords de routes, champs, pelouses, lisières de forêts. • Période de floraison : Juin–septembre.

La marguerite commune est une plante vivace, parfois bisannuelle, autrefois fréquente dans les prairies sèches, mais aujourd’hui plus souvent présente sous forme de mauvaise herbe ou de plante ornementale. Elle peut même pousser dans les pelouses, où elle n’atteint jamais la maturité à cause des tontes régulières.

La marguerite commune peut parfois être confondue avec la camomille inodore (Tripleurospermum inodorum). Toutefois, cette dernière possède des feuilles en lacets finement lobées. La marguerite commune est l’emblème de la Finlande centrale [112].

Figure I .25.Leucanthemum vulgare

Chapitre I Etude bibliographique

I.4. CONSERVATION PAR IRRADIATION

Selon une étude scientifique américaine, des chercheurs ont identifié 14 éclosions de maladies déclarées et attribuées à la consommation d'épices contaminées par des pathogènes au cours de la période 1973-2010. Les pays signalant des éclosions sont le Canada, le Danemark, l'Angleterre et du Pays de Galles, France, Allemagne, Nouvelle-Zélande, la Norvège, la Serbie et les Etats-Unis. Ensemble ; les foyers détectés dans ces pays ont porté sur 1946 cas de maladies chez l’homme, dont 128 cas d’hospitalisation et deux décès. Les sous-espèces Salmonella enterica et Bacillus spp ont été identifiées comme l'agent causal des épidémies [50].

La contamination des épices est due aux conditions de leur manipulation dans des champs sans aucune sécurité hygiénique, de leur transport et de leur conditionnement anarchique, ce qui favorise la croissance bactérienne et la prolifération des insectes et d’autres animaux nuisibles : tout cela à pour conséquence la dégradation de la qualité de ces épices créant un vrai problème économique et de santé publique qui inquiète les autorités de contrôle.

La décontamination et la désinsectisation des aliments par l’irradiation gamma est un excellent traitement phytosanitaire, l’avantage de ce procédé résidant dans le non recours aux désinfectants ou aux conservateurs chimiques et à la possibilité de son application après l’emballage, ce qui réduit le risque de recontamination. Actuellement cette technique est très répandue dans l’industrie agroalimentaire et pharmaceutique dans les pays développés (USA, France...) [51].

I.4.1. Types des rayonnements ionisants utilisés par l’industrie alimentaire

Ioniser c’est soumettre les denrées alimentaires à l’action des radiations fondamentales pour les assainir ou les stériliser, et augmenter leur durée de conservation [65]. On peut utiliser trois types de radiations [42]:  Rayons gamma émis par du cobalt 60, très pénétrants (énergie 1Mev) ;  Electrons accélérés de moins de 10 Mev (e-, contrairement aux rayons gamma et rayons X qui sont des photons);  Rayons X d’énergie inférieure à 5 Mev. Ces rayons éjectent des électrons des atomes, sans toucher au noyau atomique, ce qui lèse

Chapitre I Etude bibliographique l’ADN (effet direct recherché) [66]. Ils génèrent aussi des produits de radiolyse, surtout dans l’eau ou en présence d’oxygène (on traite donc à sec, congelé ou sous vide). Les rayons gamma : sont très différents des électrons par leur origine, leurs sources, leur utilisation. Mais le processus d’interaction avec le produit traité, bien que différent de celui des électrons, aboutit également à une ionisation des atomes touchés, donc à un transfert d’énergie à la masse irradiée [42]. Les rayonnements gamma sont émis par des noyaux radioactifs. Pour ioniser les denrées alimentaires, on utilise principalement le cobalt 60 et le césium 137 comme sources de rayonnements, les deux étant des radio isotopes [42].

I.4.2. Avantages de l’ionisation

Trois avantages de l’ionisation pour assainir ou stériliser : 1. Traitement à froid : respecte les produits fragiles mieux que le chauffage ; 2. Traitement des produits déjà conditionnés : pas de récontamination bactérienne ; 3. Pas de résidus : produits de radiolyse sont instables (contrairement aux conservateurs). Pour les aliments, 10 kGy est la dose moyenne autorisée par (FAO/IAEA/WHO) [67, 68 et 69] (tableau1).

Tableau. I. 6. Doses ionisantes et effets biologiques [42]

Dose (Kgr) Effet Nommé 0.1 Inhibe la germination - 1 Retarde la maturation - 1 Tue les insectes, les parasites radurisation 5 pasteurise radicidation >5 stérilise radappertisation

Radappertisation : application de la dose de radiations ionisantes suffisantes pour détruire le nombre ou l’activité des organismes vivants, de façon à ce qu’ils ne soient détectables qu’en très petit nombre. En absence de reconstitution, aucune altération par les microorganismes ne doit pouvoir être détectée.

Radicidation : application de doses suffisantes pour que le nombre de microorganismes non sporulés, pathogènes soit réduit de façon à ce qu’aucun ne puisse être détectée par une méthode standard. 34

Chapitre I Etude bibliographique

Radurisation : application de doses n’altérant pas le produit, provoquant une diminution substantielle du nombre de microorganismes pouvant gâter le produit [42].

I.4.3. Interaction rayonnement ionisant- matière

Lorsqu’un rayonnement pénètre dans la matière, il se produit des interactions caractérisées par des échanges d’énergies entre le rayonnement et les atomes du milieu. L’étude des interactions des rayonnements avec la matière met en évidence deux situations fondamentalement différentes [42]. a) Rayonnement directement ionisant Le faisceau est constitué de particules chargées ou d’ions lourds ; la matière étant constituée d’électrons négatifs et de noyaux positifs, les particules chargées seront électrostatiquement attirées ou repoussées par le milieu ; il s’agit donc d’un caractère d’interaction obligatoire. On dit que les particules sont directement ionisantes [42]. b) Rayonnement indirectement ionisant Le faisceau est constitué de particules non chargées, neutrons ou photons Le rayonnement n’a plus de caractère d’interaction obligatoire, c’est le hasard des rencontres entre les particules et les éléments du milieu qui caractérise ce deuxième cas; on dit que l’on a un caractère d’interaction stochratique. Par opposition aux particules chargées, les neutrons ou les photons sont des particules indirectement ionisantes parce que le dépôt d’énergie dans la matière se fait par l’intermédiaire des particules secondaires, protons ou électrons, mis en mouvement à la suite des interactions primaires [42].

 La radiolyse de l’eau

L’eau représentant plus de 70% de la masse des organismes vivants, la radiolyse de l’eau a une importance particulière dans les phénomènes d’irradiation indirecte (figure3). Les radiations ionisantes interagissent avec l’eau par des phénomènes soit d’ionisation (1), soit d’excitation électronique (2) suivant leur énergie. Les espèces générées par la radiolyse de l’eau ne sont pas stables et vont donc se transformer en espèces plus stables.

Chapitre I Etude bibliographique

Figure I. 26. Radiolyse de l’eau [70]

Les molécules d’eau ionisées se dissocient, engendrant une molécule d’eau cationique et un électron. L’eau cationique est un acide fort qui perd rapidement un proton au profit de l’eau environnante, formant un radical OH (3). Les électrons arrachés possèdent quant à eux une énergie cinétique initiale suffisante pour parcourir de grandes distances. Ils perdent progressivement cette énergie par collision jusqu’à être suffisamment ralentis pour être « - piégés » par les molécules d’eau et deviennent des électrons hydratés eaq (4). Les molécules d’eau excitées par un rayonnement ionisant (2) peuvent soit perdre leur énergie d’excitation (chaleur et vibration) et retomber ainsi à leur état d’énergie fondamental, soit se dissocier et donner deux radicaux .OH et H. (5). Les radicaux produits par ionisation et excitation peuvent se recombiner, une grande partie étant reconvertie en eau, ou diffuser dans la solution.  Les protéines Les radicaux réagissent avec les acides aminés, les peptides et les protéines par abstraction d’hydrogène, transfert d’électron ou addition.

Les dommages oxydatifs induits sur les protéines par les radicaux libres peuvent conduire à des modifications structurales (dimérisations par pontage intra- ou inter-protéines,

Chapitre I Etude bibliographique agrégations, fragmentations, réarrangements ou modification des acides aminés) et fonctionnelles (perte d'activité enzymatique ou altération du processus de protéolyse).

Le radical hydroxyle, groupement électrophile, oxyde préférentiellement les sites à forte densité électronique et ce radical va attaquer soit le squelette peptidique, soit les chaînes latérales. Compte tenu de la diversité des chaînes latérales des acides aminés, de nombreux radicaux peuvent donc être formés suite à l’attaque radicalaire.

Goshe et al. (2000) [72] ont montré que la probabilité de réaction du radical hydroxyle était plus grande avec les chaînes latérales qu’avec le Cα, parce que les liaisons C-H des chaînes latérales sont plus accessibles au solvant, et donc aux radicaux, que la liaison Cα-H.

 Les enzymes Les enzymes ne sont pas inactivées par radiation qu’à des doses généralement élevées rarement utilisées dans le traitement des denrées alimentaires. C’est pourquoi on associe souvent à l’irradiation un traitement par la chaleur afin d’inactiver les enzymes susceptibles d’altérer le produit au cours du stockage.

Suivant les cas la dose de l’irradiation peut engendrer :

• L’activation de l’enzyme et ce par la destruction des inhibiteurs enzymatiques, la formation des activateurs qui sont les peroxydes suite à l’irradiation des lipides, la formation des radicaux libres très réactifs tels que .OH et .H et un gain en énergie par la cellule. • La désactivation de l’enzyme par inhibition partielle ou totale du fait de l’apparition des cassures au niveau des acides aminés des chaînes latérales, des cassures des liaisons responsables de la conformation secondaire et tertiaire des protéines (cassure des liaisons responsables de la conformation du site catalytique et la destruction de la structure tridimensionnelle, suite à des doses supérieures choses qui entraînent la rupture des liaisons disulfure et hydrogènes nécessaires à l’activité enzymatique [71] La résistance des enzymes aux rayonnements ionisants diffère d’une classe à une autre selon les intervalles des doses tolérées. On distingue dans le tableau 2 la radiorésistance des enzymes (tableau 2).

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Tableau. I. 7. Classification de quelques enzymes selon leur radiorésistance [71]

Radiorésistance Dose tolérée Exemple d’enzyme faible <50Gy amylases phosphatases acides moyenne 1kGy - 8kGy invertase forte >8kGy peroxydases, des catalases, des Polyphénols oxydases, des oxydoréductases

 Les lipides

L’effet sur les molécules lipidiques est plus significatif. En présence d’oxygène, on a accélération d’auto-oxydation des lipides qui provoque la formation de hydroperoxydes qui se transforment à leur tour à des substances carbonyles. Divers produits de radiolyse de l’eau peuvent réagir avec les lipides insaturés, ces réactions aboutissent à la formation d’hyperoxyacides gras [42].

 Les polysaccharides

Les polysaccharides peuvent être hydrolysés au niveau de la liaison osidique ce qui conduit à une solubilisation partielle des pectines et des celluloses avec l’apparition des sucres réducteurs. En effet en rompant les molécules d'amidon les rayonnements favorisent l'apparition des molécules de glucoses [42].

 Les Vitamines

La radiosensibilité des vitamines est très variable, elle dépend de la nature de la vitamine mais aussi de la composition chimique du milieu notamment la présence de l’eau, d’oxygène et d’acide gras insaturé. La radiosensibilité d’une vitamine diminue si le milieu est acide, et/ou elle est protégée dans l’aliment. Elle augmente avec la présence de l’oxygène et de l’eau. Les vitamines sensibles sont la thiamine, la vitamine K, la vitamine E, la vitamine B1, la vitamine B11 et les vitamines radio résistantes sont la niacine, la Vitamine D, la pyridoxine, et la riboflavine [42].

 Les microorganismes

Les effets biologiques des rayonnements ionisants sont recherchés dans les traitements

Chapitre I Etude bibliographique appliqués aux produits agroalimentaires. Il s’agit d’empêcher le développement des êtres vivants indésirables qui accompagnent ces produits, ou encore de modifier diverses activités biologiques au sein des aliments eux-mêmes.

 Conséquence biologique Les rayonnements ionisants entraînent surtout des modifications chimiques de l'ADN et de l’ARN: il s'agit de ruptures de chaînes ou liaisons hydrogène, de formations entre hélices, ou plus grave, de ponts entre bases successives d’un même brin [73] (figure 4). Les modifications peuvent avoir comme conséquences un blocage de la duplication de l’ADN, lorsqu’il n’existe pas de système de réparation pour ce type de liaison et un arrêt de la synthèse de protéines lorsque l’ARN messager rencontre un codon radiomodifié pour lequel il n’existe pas d’ARN de transfert correspondant [66]. A cela s'ajoute une oxydation détruisant la structure lipoprotéique de la membrane. Ces perturbations entraînent une inhibition de la croissance, voire la mort des cellules. Les micro-organismes en phase de multiplication sont d'ailleurs les plus vulnérables car la croissance entraîne un effet fortement amplificateur des altérations de l'ADN [73].

Figure I. 27. Effet de l’irradiation sur l’ADN [65] 39

Chapitre I Etude bibliographique

I.4.4.Radiorésistance des microorganismes

Si les effets des rayonnements ionisants sont communs à tous les micro-organismes, leur radiosensibilité diffère selon leur position taxonomique. Cette différence de radiosensibilité peut être évaluée à partir des valeurs de D10 (c'est-à- dire de la dose absorbée provoquant la destruction de 90% de la population initiale) qui sont définies pour chaque genre et espèce [66]. La radiosensibilité augmente avec la taille, et le degré d'organisation de la cellule. Pour un type d'organisation cellulaire, elle croit avec la quantité d'acides nucléiques contenue dans la cellule, c’est ainsi qu’on classe par échelle croissante : les virus ; les bactéries ; les eucaryotes; les pluricellulaires (tableau3).

Tableau.I. 8. Dose de réduction décimale pour certains microorganismes [42]

Microorganisme Dose en kGy Clostridium botulinum 1.5-2.5 Clostridium perfringens 1.3-3.5 Escherichia Coli K12 0.13 Lactobacilles Homo fermentaires 2.2 Hétéro fermentaires 0.8 Moisissures Sp. penicillium 0.4 Sp. cladosporum 1.3 Levures 0.1 Virus Fièvre aphteuse 0.48 Polio 1.4

I.4. 5. La texture des tissus vivants Le prétraitement par les rayonnements gamma modifie et endommage la structure des tissus. En effet, ils augmentent la perméabilité des cellules végétales, ce qui en résulte une amélioration du taux de transfert lors de l’extraction solide-liquide [73, 43, 44, 45, 77, 46]. Cependant, l’irradiation peut toucher à la texture. Ces changements sont dus à des endommagements des tissus intérieures, diminution de la pression de turgescence et l’hydrolyse des composés structuraux des parois cellulaires comme la pectine [79,80, 81, 82, 83].

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I.5. TECHNIQUE DE HEADSPACE MICRO-EXTRACTION EN PHASE SOLIDE (HS-SPME)

La qualité des analyses des composés organiques présents à l’état de traces repose sur la spécificité et l’efficacité des étapes d’extraction et de purification ainsi que sur la sensibilité des méthodes chromatographiques. Ces principes doivent servir de base pour entreprendre des analyses de composés volatils, d’arômes, de pesticides ou de tout autre contaminant chimique. La préparation des échantillons liquide, a recourt le plus souvent aux techniques d’extraction liquide-liquide ou de purification sur phase solide (SPE). Ces méthodes restent très coûteuses en temps et en argent, requièrent des quantités importantes de solvants et sont souvent délicates à mettre en œuvre. La Micro Extraction en Phase Solide (SPME) est une technique de concentration ne nécessitant pas de solvant et où la préparation de l’échantillon est très souvent limitée à son prélèvement. Elle repose sur la partition des composés d’intérêt entre la matrice de l’échantillon et une phase polymérique spécifique supportée par une fibre en silice. Introduite au début des années 1990 par Pawliszin, cette technique permet le traitement d’échantillons de toutes natures (solide, liquide, gazeux) et trouve des applications très nombreuses dans des domaines aussi variés que l’environnement, la pharmacie ou l’agroalimentaire. Enfin, la technique SPME peut être utilisée aussi bien en chromatographie gazeuse que liquide [62].

I.5.1. Description de la technique SPME

• Présentation

La SPME est une technique de préconcentration de l’échantillon sur phase polymérique dite phase solide ne nécessitant ni préparation de l’échantillon, ni extraction par solvants contrairement aux méthodes analytiques conventionnelles. Elle regroupe les étapes de prélèvement, de traitement de l’échantillon et permet de plus un transfert direct des analytes vers la chromatographie via une désorption thermique. Ce dernier point constitue d’ailleurs un avantage car il minimise ainsi les pertes et les erreurs liées habituellement aux processus d’échantillonnage en plusieurs étapes.

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Figure I.28. Dispositif SPME

Figure I.29. Schéma de principe de la Micro-extraction sur phase solide [64]

Chapitre I Etude bibliographique

Initialement développée pour l’analyses de composés organiques à l’état de traces dans l’eau (composés organiques volatils, hydrocarbures aromatiques polycycliques, pesticides, surfactants, organométalliques, organochlorés, amines…), la technique de prélèvement par SPME a été ensuite adaptée à l’analyse d’autres matrices telles que les sols, les matériaux biologiques et plus récemment l’air. Depuis son introduction au début des années 1990, le champ d’application de la SPME s’est considérablement élargi et a conquit avec succès des domaines aussi diverses que l’agro-alimentaire, la médecine, la pharmacie et l’environnement. La SPME est constituée d’une fibre en silice fondue dont une partie est insérée et maintenue dans un micro-tube en acier inoxydable. L’autre partie de la fibre est recouverte d’une phase polymérique, comme le montre le schéma de la figure (I.28 et 29), avec laquelle est effectuée l’extraction des analytes. Introduit dans une aiguille inox, le micro tube fonctionne alors comme un piston et permet ainsi au polymère soit d’être exposé à la matrice pour l’extraction ou d’être protégé lors du stockage par exemple. L’ensemble est supporté par une seringue modifiée permettant une utilisation plus aisée [63]. Une fois concentrés sur la fibre SPME, les composés chimiques peuvent être désorbés thermiquement dans l’injecteur d’un chromatographe en phase gazeuse, ou par rinçage par un solvant spécifique dans le cas d’un couplage avec un chromatographe en phase liquide [62].

• Les paramètres importants

L’efficacité de la technique SPME dépend principalement de la quantité d’analytes qu’il est possible de concentrer sur la fibre. La répartition des composés à analyser entre la matrice de l’échantillon, l’espace de tête et la fibre est fonction de plusieurs paramètres physicochimiques, dont les plus importants sont [62]:

-La température; - Le pH; - La force ionique; - L’agitation; - La nature de la phase polymérique appliquée sur la fibre. Plusieurs types de fibre existent selon la nature de la phase polymérique. Chaque phase présente une spécificité pour une classe de composés donnés. Le tableau I.1 regroupe les fibres SPME les plus couramment utilisées.

Chapitre I Etude bibliographique

Tableau I.9. Présentation des caractéristiques et des principales applications des fibres SPME Commercialisées [63]

Nature des composés Revêtement Epaisseur extraits Température Matériels (μm) Masse molaire Polarité Maximale compatibles (g.mol-1) d'utilisation 100 60-275 - 280 PDMS 30 80-500 - 280 GC/HPLC 7 125-600 -/+ 340 65 50-300 ++ GC PDMS/DVB 270 60 50-300 ++ HPLC PA 85 60-300 +++ 320 GC/HPLC CAR/PDMS 75 30-225 - 320 GC CW/DVB 65 40-275 ++ 260 GC CW/TPR 50 +++ HPLC DVB/CAR/PDMS 50/30 40-275 + 270 GC -: apolaire, +: peu polaire, ++: polaire, +++: très polaire

(PDMS : Polydiméthylsiloxane ; DVB : Divenylbenzène CAR: Carboxen CW: Carbowax PA: Polyacrylate TPR: Template resin)

I.5.2. Types d’extraction Les revêtements PDMS et PA sont des polymères non poreux et hydrophobes. Le PDMS est un solide amorphe apparenté à un liquide visqueux tandis que le PA est un solide cristallin qui, aux températures de désorption utilisées, devient liquide. Pour ces polymères, les analytes sont extraits par absorption. Pour les autres supports c'est-à-dire ceux comportant des mélanges de phases, il s’agit d’une extraction par adsorption. Les deux adsorbants utilisés sont le DVB et le CAR, matériaux poreux avec une grande surface spécifique (environ 750 m².g-1), qui sont mélangés au PDMS ou au CW pour adhérer à la silice fondue. Ainsi, le choix d’une fibre aura, en rapport à son mode de sorption, une influence directe sur le protocole de prélèvement [63].

Chapitre I Etude bibliographique

La fibre est plongée dans la solution à analyser (on parle d'immersion de la fibre) ou dans l'espace de tête au-dessus de la solution (on parle d'extraction head space). Les analytes vont être progressivement absorbés par la phase stationnaire.

Après un temps suffisant appelé temps d'équilibration, il s'établit un équilibre de partage entre la phase solide constituée par la fibre et la phase gazeuse ou liquide.

La fibre est ensuite rétractée dans l'aiguille, retirée de l'échantillon.

Conclusion

La micro-extraction sur phase solide permet de réaliser des extractions quantitatives, cette méthode offre donc une relative souplesse pour l’échantillonnage et la quantification de composés organiques. Le mode de sorption associé à la nature de la fibre influence toutefois le protocole d'échantillonnage. On note également que l'humidité et la température ont ou peuvent avoir, selon la nature de la fibre, une influence significative sur la quantité de composés extraits. De ce fait, il faut donc apporter aux conditions d'échantillonnages une importance particulière.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

L’objectif de ce travail est d’extraire des huiles essentielles (volatiles) et des huiles fixes de Piper cubéba avec un meilleur aspect énergétique, qualitatif et quantitatif. Dans ce contexte, nous comparons l’influence des deux méthodes d’extraction (HD et HD-MO) et du mode de broyage (broyage simple et cryogénique) sur le rendement et la composition chimique de l’huile essentielle extraite à partir des graines de P.cubéba.

En parallèle, nous comparons l’influence des différents solvants sur le taux de flavonoïdes, taux de polyphénols, l’effet antioxydant et l’effet antibactérien des extraits de ces graines.

II.1. MATERIELS ET METHODES

x Echantillonnage Le support végétal de notre étude est constitué des graines de Piper cubéba. Le cubèbe L. (Piperaceae), nom botanique Piper cubéba de la famille (Piperaceae), est une épice originaire d'Inde. Les échantillons de Piper cubéba ont été achetés au niveau de marché communale de la commune de Saoula wilaya d’Alger.

Figure II.1. L’échantillon étudié Piper cubéba L (Piperaceae)

x Condition opératoire de l’extraction des huiles essentielles Une partie des graines de P.cubéba a été broyée à l’aide d’un broyeur électrique pendant 30 s (broyage simple) et l’autre partie des graines, on l’a broyée avec de l’Azote liquide (- 196°C) et avec le même broyeur (broyage cryogénique) et passées à l’extraction par les deux techniques HD et HD-MO. 46

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x Hydrodistillation HD Masse =200 g Volume d’eau=1l Puissance de chauffage=400 W Temps d’extraction =2 h 30 mn

Figure II.2. Dispositif d’extraction par HD

x Hydrodistillation assistée par micro-ondes HD-MO avec broyage simple(BS) ou cryogénique (BC). Masse =100 g Volume d’eau=250 ml Puissance de chauffage=801 W Temps d’extraction = 30 mn

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Figure II.3. Dispositif d’extraction par HD-MO

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II.2. EXTRACTION DES HUILES ESSENTIELLES II.2.1. Essences décantées Les essences des graines de Piper cubéba obtenues sont de couleur jaune foncée avec une très forte odeur persistante.

D’après la figure II.4, les rendements atteints varient entre 0,81%, 1,03% et 0,82% par HD(BS), HD-MO (BS) et HD-MO(BC) respectivement. Ces rendements sont inférieurs à ceux enregistrés dans la bibliographie (R(%) = 11,8%) [87]. En effet, cette différence peut être essentiellement due aux conditions géographiques dont se trouvent chacune des plantes.

Avec la technique HD-MO, nous constatons que l’introduction du cryobroyage (HD- MO-BS) a conduit à un rendement relativement inférieur (0,82%) que celui obtenu avec le broyage classique (HD-MO-BS) (1.03%). Cette diminution est probablement liée aux faibles diamètres des particules produites à basse température, provoquant le phénomène de colmatage et réduisant le contact solide –liquide et le transfert de matière du soluté à partir des sites endogènes (pores et micro-pores) de la matrice végétale (la graine broyée).

Les rendements

1,03

0,81 0,82

HD HD-MO (BS) HD-MO (BC)

Figure II.4. Variation des rendements de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO (BS) etHD-MO (BC)

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II.2.2. Aspect énergique des techniques étudiées

L’énergie d’extraction est l’énergie fournie par un gramme de matière végétale pour extraire son huile essentielle, elle est exprimée en kWh.

Nous avons calculé l’énergie consommée par les formules ci-après [78] :

= 3600 1000 ܹ ܧ ுா݉ כ כ :W : le travail en (watts*s), avec P : la puissance de l’appareil en (watts) ݐכൌܹܲ t : le temps de chauffage en (s) m HE : la masse de l’huile essentielle en (g)

kWh/g d'HE 0,9 0.819 0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3 0,184 0,2 0.146

0,1

0 HD HD-MO-BS HD-MO-BC

Figure II.5. Variation de l’énergie consommée en fonction de la technique utilisée (HD, HD-MO-BS et HD-MO-BC)

À partir de la figure (II.5), on remarque que la technique HD est la plus consommatrice d’énergie comparée au procédé utilisant les micro-ondes. L’accélération du processus de chauffage (HD-MO) par l’introduction des ondes électromagnétiques des micro-ondes de l’intérieur de la matrice végétale vers l’extérieur, réduit considérablement la durée d’extraction des essences.

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Or, nous constatons que l’utilisation de l’azote liquide dans le broyage a fait légèrement augmenter l’énergie consommée par g d’huile essentielle extraite à cause de la diminution du rendement obtenu.

Le principal objectif du broyage cryogénique est surtout d’isoler une huile essentielle chimiquement non dégradée par les effets thermiques et hydrolytiques du processus d’extraction, le fait que lors du broyage, en maintenant la masse végétale à très basse température.

Comme moyen efficace au problème de colmatage, il est nécessaire de mettre au point un système d’agitation ou de turbulence dans le système solvant-matière végétale broyée afin de mettre en suspension les particules solides et d’augmenter la surface de contact eau-particules végétales.

II.2.3. Impact environnemental des techniques étudiées, quantité de CO2 émise dans l’atmosphère

La quantité de CO2 émise dans l’atmosphère des deux méthodes d’extractions HD-MO et HD est calculée selon la formule suivante [78] :

Masse CO2 dégagée = Energie consommé (KWh/g HE) * 800g

La technique HD (Figure II.6) dégage une quantité de CO2 plus importante (655,2g de CO2 par g d’huile essentielle) que la HD-MO (116,8 g) et HD-MO-BC (147,2 g). Cette quantité élevée est aggravée par la lenteur de la technique (temps de chauffage élevé).

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700 655,2

E 600 H ' d

a 500 p

e é g

a 400 g é d

O 300 C

e d

t 200 i

t 147,2 n 116,8 a u

Q 100

0 HD HD-MO-BS HD-MO-BC

Figure II.6. Variation de la quantité de CO2 émise par HD, HD-MO-BS et HD-MO-BC vers l’atmosphère

Notre étude a montré le grand avantage de l’extraction par micro-ondes :

x Réduction considérable non seulement de l’énergie consommée mais aussi du temps alloué à l’extraction des essences ;

x Réduction de la quantité de CO2 rejetée dans l’environnement ; x Simplicité de réalisation de la technique et reproductibilité des résultats.

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II.2.4. Analyse par chromatographie gazeuse et chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse GC et GC-MS et Conditions opératoires

Le but de notre travail est de contribuer à l’étude qualitative et semi-quantitative des huiles essentielles (volatiles) de Piper cubéba extraites par les trois méthodes citées auparavant. L’influence du cryobroyage a été aussi déterminée en utilisant des analyses chromatographiques et le couplage GC-MS.

¾ Généralité

La séparation des composés s’effectue en général par CPG notamment pour les composes volatils. La méthode couramment utilisée pour l’identification des huiles essentielles est le couplage CPG/SM. Il permet de connaître, dans la grande majorité des cas, la masse moléculaire d’un composé et d’obtenir des informations structurales relatives à une molécule à partir de sa fragmentation. Chaque constituant est caractérisé par son indice de Kovats [40]. Les indices de Kovats sont les temps de rétention relatifs des substances analysées par rapport à celles des alcanes. La formule ci-dessous décrit le calcul des indices de Kovats à partir des temps de rétentions des composés cibles et ceux des alcanes utilisant les indices de Van Den Dool:

= 100( ) + 100 ( ) ݐோூ െݐோ௡ ܭܫ ݊ KI : indice de Kovats d'un composé inconnuݐோ ௡ାଵ ିݐோ௭ n = nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui sort avant le composé inconnu tR : temps de rétention i = molécule inconnue n = nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui sort avant le composé inconnu n+1= nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui a été élué après le composé inconnu.

La chromatographie gazeuse est une technique très répandue extrêmement sensible, la séparation sur la colonne se faisant sur des composés qui doivent être à l’état gazeux. L’analyse des composés solides ou liquides impose de les porter à l’état de vapeur par chauffage. L’appareil utilisé est de type Hewlett Packard 6890, équipé d’un détecteur à ionisation de flamme (FID). La colonne utilisée est une colonne apolaire HP5-MS (Hewlett Packard) 5% diphényle 95% diméthylpolysiloxane).

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x Longueur : 60 m. x Diamètre interne: 0,32 mm. x Épaisseur de la phase : 0,25 ȝm.

Les conditions chromatographiques sont données ci-dessous :

* Le gaz vecteur est l’Helium, son débit est de l’ordre de 0,3 ml/min.

* La température de four a été programmée au début à 60°C pendant 8 min puis montée jusqu’à 250°C à raison de 4°C/min et reste constante durant 20 min.

* La température de l’injecteur est de 300°C.

* La température de détecteur est de 220°C.

* Le volume injecté est de 0,1ȝl pure.

Le chromatogramme a été couplé à un ordinateur équipé d’un logiciel HP Chemstation permettant de calculer les pourcentages des différents constituants de ces huiles volatils.

À partir de l’équation ci-dessus; l’identification des constituants a été effectuée par comparaison des indices de rétentions par ceux de la gamme d’alcane C8 – C28 et les spectres de masse ions-fragments caractéristiques obtenus à ceux cité en littérature [41] et donnés par les banques de librairies spectrales (Nist 2002 et Wiley 2007).

¾ Analyse par GC-MS et Conditions opératoires

Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse à la spectrométrie de masse GC-MS est une technique d’analyse qui possède plusieurs atouts : le chromatogramme en phase gazeuse permet de séparer les constituants d’un mélange. Le spectromètre de masse associé permet d’obtenir le spectre de masse de chacun des constituants et bien souvent de les identifier. La chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse possèdent des limites de sensibilité voisines. Leur association permet de disposer d’un outil analytique très performant. L’identification de produits est réalisable pour des quantités de l’ordre du nano gramme, la détection par fragmentométrie est possible jusqu’au picogramme. Il réclame peu d’échantillon, la quantité injectée est de l’ordre du microlitre. Il est rapide, le temps d’acquisition du spectre est identique à celui de l’analyse chromatographique.

La même essence est injectée dans un chromatographe couplé à un spectromètre de masse GC-MS de type HP6890, à impact électronique avec une énergie d’ionisation de 70 eV.

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Les conditions opératoires de la colonne, d’injection et de programmation de température étant identiques à celles de la chromatographie gazeuse. Le débit du gaz vecteur (hélium) est de 0.5 ml/mn. La température de l’interface du spectromètre de masse est fixée à 280 °C, le temps du solvant delay est de 4 min. L’huile extraite est injectée en GC-MS pour établir une analyse qualitative et semi-quantitative. L’identification des constituants a été effectuée par comparaison des indices de rétention et des spectres de masse obtenus et avec ceux cités en littérature [41] et donnés par les banques de librairie spectrale (Wiley7, Nist 2002).

On a travaillé avec la programmation suivante :

Figure II.7. Programmation de température de GC et GC/MS

Le tableau 1 dresse l’analyse qualitative et semi-quantitative des essences extraites par différentes méthodes, ce qui a permis d’obtenir les chromatogrammes présentés dans l’annexe B (figure B.1 jusqu’à B.3)

D’après l’étude GC-GC/MS (tableau II.1) nous avons isolé 106 composés avec HD, 115 composés avec HD-MO-(BS) et 109 composés avec HD-MO-(BC).

Les deux composés chimiques eugénol (18,27%, 25,89% et 27,08%) et méthyle eugénol (47,72%, 45,92% et 49,55%) contribuent un fort pourcentage de la composition chimique de l’huile avec les techniques d’extraction HD, HD-MO (BS) et HDMO(BC) respectivement, ces deux composés sont extraits avec des quantités plus importantes avec les techniques HD-MO (BC) sachant que l’eugénol et le méthyle eugénol possèdent des activités antioxydantes et antibactérienes puissantes [118].

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D’autres constituants aussi importants sont détectés, citons l’exemple du myrcène, ce composé est obtenu à des taux aussi importants 10,23%. dans l’huile extraite par HD-MO (BS) contre 7,85% dans l’huile extraite par HD et du cinéole , qui est extrait à un taux plus élevé par la technique de HD-MO-BS (3,16%).Ces deux composés ayant une grande activité antioxydante prouvée [119]. Par ailleurs, le tableau II.2, nous a permis de dénombrer 24 constituants identifiés uniquement dans les huiles extraites par HD-MO (BS) tels que Myrac aldéhyde, Chavibétol acétate, Davanone , Turmerone , Eudesmol <5-epi-7-epi-Į->, Cubenol <1-epi- >, Cubenol <1-epi->, Eremoligenol, Khusinol, et plusieurs autres composés. De même, dans ߚ les huiles extraites par hydrodistillation, nous avons décelé 15 constituants chimiques que nous ne retrouvons pas dans l’huile essentielle extraite par HD-MO, on peut citer : le Furfural <5-méthyl->, Phénol, Menth-2-en-1-ol , Furfural <5-méthyl->, Bornéol, Acétophenone<ȡ-méthyl->, Cymen-9-ol <ȡ->, Caryophyllene <(Z)->, Gurjunène < > et Germacrène D…etc. Ces composés représentent globalement des alcools, des cétones, des ߚ éthers et des esters. Les facteurs essentiels responsables de ces comportements peuvent être divers, on peut citer : le transfert de masse qui diffère d’une technique à une autre, en effet dans le cas de l’hydrodistillation, la chaleur est fournie du milieu extérieur vers l’intérieur de la charge végétale ce qui entraîne d’abord une diffusion de l’eau au sein des particules, puis l’extraction par l’eau chauffée du soluté et enfin l’entraînement de l’huile essentielle sous l’effet des vapeurs d’eau. Dans le cas des micro-ondes, la chaleur provient directement de l’intérieur des particules végétales sous l’effet de l’absorption de l’énergie des radiations par l’eau du milieu provenant soit, de l’humectage ou des glandes vasculaires de la plante [115]. Sa restitution sous forme de chaleur provoque ainsi la migration des composés contenus dans la charge végétale par la vaporisation de l’eau en contact des cites endogènes et exogènes de la matrice, qui souvent subissent des destructions de leur micro-structure causées par la formation des bulles de gaz [116,117]. Les micro-ondes interagissent sélectivement avec les molécules d’eau et permettent une augmentation rapide de la température d’ébullition qui entraîne un transfert de matière accéléré d’où une durée d’extraction très réduite [114].

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Tableau II.1. Pourcentages des différents composés isolés à partir de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO (BS) et HD-MO (BC) HD HD-MO (BS) HD-MO (BC) KI réf Composés Area% KI Area% KI Area% KI 930 Thujene <Į> 0,03 931 0,05 931 0,02 931 939 Pinene <Į> 0,10 941 0,12 941 0,07 941 942 Phenol 0,01 943 943 943 960 Benzaldehyde 0,01 962 0,01 962 0,01 962 964 Furfural <5-methyl-> 0,01 966 966 966 975 Sabinene 0,10 976 0,19 976 0,11 976 979 Pinene <ȕ> 0,13 981 0,15 981 0,09 981 990 Myrcene 7,85 991 10,23 991 6,71 991 1002 Phellandrène<Į> 0,13 1003 0,03 1003 0,02 1003 1002 Carene < -2-> 0,15 1005 0,01 1005 0,01 1005 1017 Terpinène <Į> 0,13 1018 0,16 1018 0,09 1018 1024 Cymene ߜ 0,39 1025 0,21 1025 0,18 1025 1029 Limonene 0,69 1030 0,62 1030 0,39 1030 1031 Cineole 2,13 1033 3,16 1033 2,75 1033 1037 Ocimene <(Z)- ȕ -> 0,06 1037 0,07 1037 0,05 1037 1050 Ocimene <(E)- ȕ -> 0,96 1052 0,98 1052 0,69 1052 1054 Prenyl isobutyrate 0,01 1055 0,01 1055 0,01 1055 1059 Terpinène <Ȗ-> 0,19 1061 0,22 1061 0,15 1061 1088 Mentha-2,4(8)-diene 0,41 1089 0,28 1089 0,21 1089 1089 Guaiacol 0,04 1091 0,02 1091 0,02 1091 1092 Epoxymyrcene <6,7-> 0,02 1093 0,02 1093 0,02 1093 1096 Linalool 0,89 1097 0,76 1097 0,78 1097 1103 Perillene 0,01 1104 0,01 1104 0,01 1104 1107 Phenyl éthyl alcool 0,01 1108 0,01 1108 0,01 1108 1110 Menthatriene <1,3,8-ȡ-> 0,03 1112 0,02 1112 0,03 1112 1120 Sabina ketone 0,04 1122 0,03 1122 0,03 1122 1121 Menth-2-en-1-ol 0,02 1123 1123 1123 1138 Thujanol 0,04 1139 0,02 1139 0,02 1139 1142 Epoxy-ocimene<(E)-> 0,02 1144 0,01 1144 0,01 1144 1157 Nonen-1-ol <(3Z)-> 0,01 1158 1158 1158 1159 Pinene oxyde < -> 0,01 1161 0,01 1161 0,01 1161 1166 Terpineol< -> 0,02 1167 0,01 1167 0,01 1167 1169 Nonanol ߚ 0,01 1170 1170 1170 1169 Borneol ߜ 0,01 1172 1172 1172 1173 Ethylbenzoate 0,01 1175 0,01 1175 0,01 1175 1177 Terpinen-4-ol 1,02 1179 0,69 1179 0,72 1179 1182 Acetophenone <ȡ-methyl-> 0,01 1184 1184 1184 1182 Cymen-8-ol <ȡ-> 0,08 1185 0,03 1185 0,03 1185 1188 TerpineoI <Į> 1,51 1189 0,84 1189 0,90 1189 1191 Methyl salicylate 0,10 1192 0,12 1192 0,11 1192 57

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

1191 Phenol<2-allyl-> 0,02 1193 1193 1193 1194 Decenal<(4Z)-> 0,01 1195 0,01 1195 0,01 1195 1196 Methyl chavicol 1,16 1197 0,99 1197 0,98 1197 1199 Decenal<(7Z)-> 0,01 1201 1201 1201 1205 Cymen-9-ol <ȡ-> 0,01 1207 1207 1207 1208 Piperitol 0,03 1210 0,02 1210 0,02 1210 1213 Octanol acetate 0,03 1215 0,01 1215 0,01 1215 Sabinene hydrate acetate (Ac vs, 1221 IPP) 0,06 1223 0,05 1223 0,05 1223 1241 Cumin aldehyde 0,18 1243 0,14 1243 0,15 1243 1243 Carvone 0,13 1245 0,05 1245 0,06 1245 1250 Anis aldehyde <ȡ-> 0,01 1252 0,01 1252 0,01 1252 1250 Chavicol 0,21 1252 0,46 1252 0,44 1252 1263 Carvone oxyde 0,02 1265 0,01 1265 0,01 1265 1267 Geranial 0,04 1269 0,05 1269 0,05 1269 1270 Cinnamaldehyde <(E)-> 0,01 1272 0,01 1272 0,01 1272 1284 Anethole <(E)-> 0,26 1284 0,36 1284 0,17 1284 1285 Terpinen-7-al <Į-> 0,02 1287 0,02 1287 0,02 1287 1287 Safrole 1288 0,01 1288 0,01 1288 1291 Terpinen-7-al <Ȗ-> 0,02 1291 0,02 1291 0,02 1291 1293 Decadienal <(2E,4Z)-> 0,05 1295 0,03 1295 0,03 1295 1298 Pinocarvyl acetate 0,01 1299 0,01 1299 0,01 1299 1299 Carvacrol 0,02 1201 0,02 1201 0,02 1201 1316 Decadienal<(2E,4E)-> 0,11 1318 0,05 1318 0,04 1318 1338 Elemene < -> 0,07 1339 0,03 1339 0,03 1339 1359 Eugenol 18,27 1361 25,89 1361 27,08 1361 1375 Ylangene <ߜĮ> 0,33 1377 0,13 1377 0,14 1377 1381 Geranyl acétate 0,18 1383 0,06 1383 0,07 1383 1382 Thujic acid 1384 0,02 1384 1384 1390 Elemène< > 0,71 1392 0,47 1392 0,57 1392 1403 Méthyle eugénol 47,72 1407 45,92 1407 49,55 1407 1407 Isoeugénolߚ <(Z)-> 0,02 1410 0,03 1410 0,02 1410 1408 Caryophyllène <(Z)-> 8,02 1410 1410 1410 1429 Dictamnol 1431 0,02 1431 0,02 1431 1431 Thujopsene 1433 0,03 1433 0,01 1433 1432 Copaène< -> 0,05 1434 0,04 1434 0,04 1434 1433 Gurjunène < -> 0,04 1433 1433 1433 1442 Farnesène ߚ<(Z)- -> 0,01 1444 0,02 1444 0,01 1444 1454 Humulene<Įߚ> 1,50 1456 0,89 1456 1,10 1456 1460 Aromadendèreneߚ 0,08 1462 0,05 1462 0,05 1462 1463 Cadina-1(6),4-diene 0,03 1465 0,02 1465 0,02 1465 1466 Ishwarane 0,01 1466 0,01 1466 0,02 1466 1466 Caryophyllène <9-epi-(E)-> 0,10 1468 0,10 1468 0,12 1468 1467 Ethyl cinnamate <(E)-> 1469 0,01 1469 1469 1472 Dauca-5,8-diène 0,07 1473 1473 1473

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

1476 Cadina-1(6),4-diène 0,39 1478 0,29 1478 0,37 1478 1482 Widdra-2,404 )-diène 0,39 1484 0,31 1484 0,33 1484 1485 Germacrene D 0,03 1486 1486 1486 1490 Selinene < -> 0,47 1492 0,36 1492 0,44 1492 1492 Methyl isoellgenol <(E)-> 0,06 1493 0,12 1493 0,14 1493 1500 Muuroleneߚ <Į> 0,05 1502 1502 1502 1500 Isodaucène 0,16 1503 0,22 1503 0,29 1503 1502 Patchoulène <Ȗ-> 0,03 1504 0,01 1504 0,02 1504 1505 Farnesene <(E,E)-Į-> 0,07 1507 0,07 1507 0,08 1507 1512 Amorphène< -> 0,04 1514 0,04 1514 0,04 1514 1520 Myrac aldéhyde 1522 0,01 1522 0,01 1522 1522 Selinene <7-epi-ߜ Į-> 0,01 1524 0,01 1524 0,01 1524 1523 Cadinene< -> 0,26 1523 0,13 1523 0,15 1523 1525 Chavibetol acétate 1527 0,07 1527 0,03 1527 1534 Cadina-1,4-dieneߜ 0,01 1535 0,01 1535 0,01 1535 1538 Cadinene<Į> 0,01 1539 0,01 1539 0,01 1539 1545 Calacorene <Į> 0,01 1547 0,01 1547 1547 1549 Elemol 0,04 1550 0,05 1550 0,06 1550 1557 Elemicin 0,03 1559 0,10 1559 0,11 1559 1566 Davanone 1568 0,01 1568 0,01 1568 1578 Spathulénol 0,02 1579 0,05 1579 0,05 1579 1583 Caryophylleneߚ oxyde 0,60 1585 0,99 1585 1,07 1585 1583 Neryl isovalerate 0,01 1586 0,03 1586 0,03 1586 1587 Thujopsan-2-a-ol 0,01 1589 0,02 1589 0,02 1589 1595 Turmerone 1597 0,02 1597 0,01 1597 1607 Eudesmol <5-epi-7-epi-Į-> 1609 0,07 1609 0,01 1609 1608 Humulene epoxyde II 0,06 1610 0,16 1610 0,17 1610 1620 Helifolen-12-al D 1622 0,01 1622 0,01 1622 1628 Cubénol <1-epi-> 1630 0,02 1630 0,02 1630 1631 Eremoligenol 1633 0,03 1633 0,03 1633 1640 Caryophylla-4(12),8(13)-dien-5Į-ol 1642 0,06 1642 0,06 1642 1642 Muurolol 0.01 1644 0,05 1644 0,06 1644 1646 Muurolol <Į-> (=Torreyol) 1647 0,03 1647 0,03 1647 1648 Agarospirol 0.03 1650 0,27 1650 0,30 1650 1653 Himachalol 1655 0,02 1655 0,02 1655 1669 Turmérone 1671 0,42 1671 0,02 1671 1669 Caryophyllène <14-hydroxy-9-epi-(E)-> 1669 0,11 1669 0,09 1669 1678 Foeniculin 1678 0,02 1678 0,01 1678 1680 Khusinol 1680 0,02 1680 0,02 1680 ri=1582 Curlone 0,03 1710 1713 Cédroxyde 1713 0,04 1713 0,03 1713 ri=1567 2-Propenal, 3-(3,4-dimethoxyphenyl)- 0,05 1560 0,04 1560 0,03 1560 1961 Géranyl linalool<(Z,Z)-> 0,03 1962 0,21 1962 0,23 1962 1987 Géranyl linalool <(E,Z)-> 1989 0,07 1989 0,07 1989

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Tableau II .2. Pourcentages des différents composés isolés à partir de l’huile essentielle de Piper cubéba extraite uniquement par HD ou uniquement par HD-MO (BS) Méthode d’extraction HD HD-MO KI réf Composés Area KI Area KI 942 Phenol 0,01 945 964 Furfural <5-methyl-> 0,01 965 1121 Menth-2-en-1-ol 0,02 1123 1157 Nonen-1-ol <(3Z)-> 0,01 1159 1169 Nonanol 0,01 1161 1169 Bornéol 0,01 1170 1182 Acétophénone<ȡ-méthyle-> 0,01 1183 1191 Phenol<2-allyl-> 0,02 1193 1199 Decenal <(7Z)-> 0,01 1202 1205 Cymen-9-ol <ȡ-> 0,01 1208 1382 Thujic acid 0,02 1382 1287 Safrole 0,01 1289 1408 Caryophyllène <(Z)-> 8,02 1410 1429 Dictamnol 0,02 1430 1431 Thujopsène 0,03 1433 1433 Gurjunène 0,04 1433 1467 Ethyl Cinnamate <(E)-> 0,01 1468 1472 Dauca-5,8-diene 0,07 1472 1485 GermacreneD 0,03 1486 1500 Muurolene<Į> 0,05 1501 1520 Myrac aldéhyde 0,01 1522 1525 Chavibetol acetate 0,07 1524 1566 Davanone B 0,01 1564 1595 Turmérone 0,02 1598 1607 Eudesmol <5-epi-7-epi-Į-> 0,07 1607 1620 Helifolen-12-al D 0,01 1622 1628 Cubénol <1-epi-> 0,02 1629 1631 Eremoligenol 0,03 1632 1640 Caryophylla-4(12),8(13)-dien-5Į-ol 0,06 1642 1646 Muurolol <Į-> (=Torreyol) 0,03 1647 1653 Himachalol 0,02 1653 1669 Turmérone 0,42 1670 1669 Caryophyllene <14-hydroxy-9-epi-(E)-> 0,11 1671 1678 Foeniculin 0,02 1679 1680 Khusinol 0,02 1683 1707 Curlone 0,03 1706 1713 Cedroxyde 0,03 1712 1713 Cedroxyde 0,01 1714 1987 Géranyl linalool <(E,Z)-> 0,07 1988

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Nous avons regroupé la majorité des composés identifiés sous forme de classes chimiques (Figure 8), afin de comparer globalement les deux techniques appliquées. Les hydrocarbures monoterpéniques constituent une fraction importante au sein de l’huile extraite par micro-onde HD-MO (BS) (13%). Ces derniers d’ailleurs, entraînent une quantité légèrement élevée que hydrodistillation (11,34%). Globalement, l’extraction des hydrocarbures sesquiterpéniques est nettement favorisée par l’hydrodistillation (12,94%) que par les micro-ondes (3,23 %). La figure 8 montre clairement, la capacité de micro-onde d’extraire des quantités plus importantes en composés à fonction alcool (29,19%) que l’ hydrodistillation (24%). L’eugénol constitue le composé majoritaire. On peut supposer que ce comportement revient essentiellement à la polarité et à la constante diélectrique élevées de ces derniers qui absorbent les radiations émises et les restituent sous forme de chaleur, ce qui favorise d’une part leur diffusion des cites de localisation vers le milieu extracellulaire et d’autre part leur entraînement par les vapeurs d’eau. Le pourcentage en composés à fonction cétone sont isolées à faible quantité avec une teneur n’excédant pas les 0,56% et 0.21% par les techniques HD-MO et HD respectivement. La Turmerone constitue le composé majoritaire de la fraction cétonique avec un pourcentage de 0,42% (Tableau II.1), ce composé est considéré comme un principe actif anticancéreux, anti-inflammatoire et antioxydant; on le trouve avec un pourcentage très élevé (61%) dans l’huile essentielle de Curcuma longa. L [120]. Le pourcentage en éther constitue un facteur de qualité d’une huile essentielle. On remarque qu’avec les micro-ondes on isole une plus grande quantité (51,90%) par rapport à l’hydrodistillation (50,66%), le méthyle eugénol constitue le grand pourcentage de cette fonction. Le % en aldéhydes constitue également un facteur de qualité essentielle de la volatile, ainsi au regard de nos résultats (Figure 8), on remarque globalement que les micro- ondes n’ont pas tendance à extraire une quantité plus importante d’aldéhydes (0,40%) comparée à l’hydrodistillation (0,53%). Les esters sont extraits par les deux techniques d’extraction, mais généralement à des teneurs ne dépassant guère les 0,39 %. Cependant, les résultats trouvés ne nous permettent pas de généraliser sur toutes les extractions assistées par micro-ondes. En effet, les conditions de travail telles que la pression, la puissance appliquée, la durée d’extraction, la nature de la matrice, la granulométrie et la

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba conception de l’appareil utilisé sont des facteurs qui régissent tout le mécanisme d’extraction et orientent l’aspect qualitatif et quantitatif des huiles essentielles obtenues.

60,00%

51,90% 50,66% 50,00%

40,00%

29,1930% 30,00% HD 24% HD-MO

20,00%

13% 12,94% 11,34% 10,00%

3,23% 0,36% 0,40% 0,39% 0,53% 0,21% 0,56% 0,00% monoterpènesesquiterpène alcool ether ester aldehyde cétone

Figure II.8. Teneurs des différentes familles chimiques selon la technique utilisée

D’après la figure II.9, nous constatons que le broyage cryogénique nous a permis d’isoler une quantité plus importante en éther (54,71%), l’alcool (30,55%) et sesquiterpènes (3,83%) par rapport au broyage simple l’éther (51,90%), l’alcool (29,19%) et sesquiterpène (3,23%). Ceci confirme que le broyage cryogénique permet de mieux extraire les composés les plus actifs.

Toutefois, le broyage simple nous a permis d’isoler mieux les cétones 0,56%, les aldéhydes 0,40%, les esters 0,36% et les monoterpènes 13%.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

60,00% 54,71% 51,90% 50,00%

40,00%

30,55% 29,1930% 30,00% HDMO (BC) 20,00% HDMO(BS) 13% 8,82% 10,00% 3,83% 0,56% 3,23% 0,40% 0,31% 0,36% 0,37% 0,13% 0,00%

Figure II.9. Histogramme des fonctions chimiques extraites par HDMO (BC) et HDMO (BS)

Taux des époxydes et d’hydratation dans l’HE des graines de Piper cubéba D’après la figure 10, on remarque que les réactions d’oxydation et d’hydratation sont moins importantes dans l’HE extraite par HD classique que dans celle extraite par HD-MO (BS) et HD-MO (BC). L’analyse de ces huiles essentielles par GC/GC-MS, nous a permis de recenser 8 reactions d’oxydation qui ont dû au contacte de certains composés chimiques avec l’aire tels que Myrcène, Ocimène (E), Pinène ,Carvone (cis), caryophylléne, humulène, cédrène et qui ont donné Epoxymyrcene <6.7->, Epoxy-ocimene<(E)->, ߚ Pinene oxyde < ->, Carvone oxyde , Caryophyllene oxyde, Humulene epoxyde II et Cédroxyde respectivement. Ainsi que 4 réaction d’hydratation qui ont dû ߚ au contact des composés chimiques avec l’eau comme Sabina kétone, sabinène

acétate, turmérone (ar) et caryophllène qui ont donné Sabina ketone , Sabinene hydrate acetate (Ac vs. IPP) ,Turmerone et Caryophyllène <14-hydroxy-9-epi-(E)-> respectivement.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Par conséquent, l’HE extraite par HD est plus stable (elle est de bonne qualité) que celle extraite par HD-MO.

1,6 1,35 1,4 1,28 1,2

1 0,78 0,8 oxyde 0,6 hydro

0,4 0,21 0,18 0,2 0,10

0 HD HD-MO (BS) HD-MO (BC)

Figure II.10. Variation des pourcentages des composés issus des réactions d’oxydation et d’hydratation de l’HE des graines de Piper cubéba extraite par HD, HD-MO(BS) et HD-MO (BC)

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II.3. EXTRACTION ET ANALYSE DE L’EXTRAIT VEGETAL DE PIPER CUBEBA

Nous avons fixé les objectifs suivants : ¾ Extraction de l’extrait végétal (huile fixe) des graines de Piper Cubéba à l’aide de plusieurs solvants ; ¾ Evaluation du pouvoir piégeur (scavenger) des différents extraits, vis-à-vis d’un radical libre relativement stable (DPPH), dosage de polyphénol et flavonoïdes et effet antibactérien.

II.3.1. Conditions opératoires de l’extraction des extraits végétaux

L’extraction a été réalisée à l’aide d’un dispositif représenté dans la figure II.10 dont les conditions opératoires sont les mêmes pour tous les solvants utilisés.

Masse = 60 g Puissance = 300 W Broyage simple à l’aide d’un broyeur électrique pendant 30s Volume de solvant = 200 ml Temps d’extraction =30 mn

¾ Les solvants utilisés selon l’ordre de polarité décroissante -Méthanol -Ethanol -Acétone -Chloroforme

Le solvant résiduel, après extraction, a été éliminé après avoir soumis l’échantillon dans un évaporateur rotatif (Figure. II.11) contenant un bain-marie d’eau distillée tiède (40°C), à une vitesse de 60 tour/mn, on obtient ainsi des extraits solides.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Figure. II.11. Dispositif d’extraction sous solvant assistée par micro-onde

Figure. II.12. Dispositif de l’évaporateur rotatif (Rotavapeur)

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II.3.2. Dosage des polyphenols et flavonoïdes

Le dosage des polyphenols et des flavonoïdes a été réalisé selon le protocole décrit en annexe (A.2 et A.3).

Une nette différence des pourcentages des polyphenols (figure. II.12) et des flavonoïdes (figure. II.13) dans l’huile fixe végétale a été observée (figure II.10), selon le type de solvant utilisé. Ces pourcentages varient selon un ordre croissant avec l’éthanol, le méthanol, l’acétone et le chloroforme. Cette différence est due à la solubilité des molécules extraites vis à vis du solvant utilisé ainsi que leur polarité. En effet, l’alcool extrait les composés polaires alors que l’acétone isole moins de composés polaires comparé à l’éthanol et le méthanol. Le chloroforme solubilise les larges variétés des familles chimiques de faible polarité. Nous constatons que la graine de Piper Cubéba est riche en polyphénols et flavonoïdes apolaires et peu polaires.

)

0,500 g / g m ( s l 0,419 o

n 0,402 e

0,400 h p y l o p

n e

r 0,288 0,300 u e n e

T 0,234

0,200

0,100

0,000 ethanol meth acetone cloroforme

Figure. II.13. Variation de la quantité de polyphénols dans les extraits de Piper cubéba en fonction du type de solvants

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

0,250 )

g 0,226 / g m (

s e d 0,200 i o n o v a l f

n e

r u

0,150 e n e T

0,100

0,069

0,050 0,041

0,020

0,000 meth ethanol acetone chloroform

Figure. II.14. La quantité de flavonoïdes dans les extraits de Piper cubéba par différents solvants

II.3.3. Tests, in vitro, de l’activité anti-oxydante des extraits de Piper cubéba en fonction du solvant d’extraction utilisé

x Effet scavenger du radical DPPH

Pour étudier l’activité anti-radicalaire des différents extraits, nous avons opté pour la méthode qui utilise le DPPH (diphényl picryl-hydrayl) comme un radical libre relativement stable selon des travaux antérieurs (Annex A.1). Dans ce test les antioxydants réduisent et décolorent le DPPH, ayant une couleur violette, en un composé jaune (figure II.16).

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Figure II.15. Forme libre et réduite de DPPH

L’ampleur de la réaction dépendra de la capacité des antioxydants de donner l’hydrogène (figure II.15). Le profile d’activité anti-radicalaire obtenu (Figure II.16, 17, 18, 19 et 20) révèle que les extraits ainsi que le butyl-hydroxy toluène (BHT) pris comme référence sont des anti-radicalaires (tableau II.3).

Figure .II.16. Décoloration de la solution du DPPH du violet en jaune en fonction de la concentration

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Tableau II.3. Activité anti-radicalaire des extraits de Piper cubéba (IC50)

Extrait IC50 (mg /l)* BHT 10,14 Extrait méthanolique 4,54 Extrait éthanolique 6,85 Extrait cétonique 23,58 Extrait chloroformique 29,19

*Les valeurs représentent la moyenne de trois essais

À des fins comparatives, un antioxydant (le BHT) standard est utilisé. Il a indiqué une activité anti-radicalaire importante avec un IC50 de l’ordre de 10,14 mg/l.

Parmi les quatre extraits de Piper cubéba, l’extrait méthanolique représente l’extrait le plus actif avec un IC50 de l’ordre de 4,54 mg /l suivi par l’extrait éthanolique avec un IC50 de 6,85 mg/l. Ces extraits sont dotés d’une activité antioxydante différente à celle trouvée dans la bibliographie (IC50 de 10,54 ȝg/mg et de 11,3 ȝg/ml avec l’extrait éthanolique [86] et méthanolique respectivement [109]). Par contre, l’activité anti-radicalaire la plus faible a été enregistrée par l’extrait chloroformique et cétonique (IC50= 29,19 mg/l et 23,58 mg/l respectivement). Cette activité décroit avec la décroissance de la polarité de ces solvants. Par conséquent, nous constatons que les polyphénoles et les flavonoïdes les plus polaires représentent une forte activité antioxydante.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

80 BHT 70 )

% 60 (

e r i

a 50 l a c i

d 40

a y = 4,602x + 3,332 r i t R² = 0,992

n 30 a é t

i 20 v i t c

A 10

0 0 5 10 15 20

Figure II.17. Activité anti-radicalaire du BHT

extrait ethanolique 100,00

80,00 %

e r i a l a

c 60,00 i d a

r y = 16,14ln(x) + 18,96 i t

n R² = 0,960 a 40,00 é t i v i t c A 20,00

0,00 0 20 40 60 80 100 Concentration mg/l

Figure II.18. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique

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80,00 Extrait chloroformique

60,00 %

e r i a l a c i y = 16,21ln(x) - 0,235 d a

r R² = 0,939

i 40,00 t n a

é t i v i t c A 20,00

0,00 0 20 40 60 80 100 Concentration mg/l Figure. II.19. Activité anti-radicalaire de l’extrait chloroformique

Extrait methanolique

100,00

90,00 %

e 80,00 r i a l

a 0,196

c y = 39,75x i 70,00 d

a R² = 0,970 r i t n a

60,00 é t i v i t

c 50,00 A

40,00

30,00 0 20 40 60 80 100

Concentration mg/l Figure. II.20. Activité anti-radicalaire de l’extrait méthanolique

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

100 Extrait cétonique %

e r i 80 a l a c i d a r i t

n 60 a

é t i v i 0,394 t y = 14,79x c A 40 R² = 0,951

0 0 20 40 60 80 100

Concentration mg/l Figure II.21. Activité anti-radicalaire de l’extrait cétonique

II.3.4. Etude de l’activité antimicrobienne des extraits de Piper cubéba en fonction du solvant d’extraction utilisé Ces expériences ont été réalisées à l’institut pasteur (IPA) situé à Dely-ibrahim Cheraga, laboratoire contrôle de qualité, sur des souches de références (annexe A.4). Souches microbiennes utilisée :

Candida Albicans ATCC 10231 Salmonella Typhimirium ref IPA S.aureus ATCC 25923 Enterococcus feacalis ATCC29212 V.cholerique ref IPA E.colis ATCC 25922 P aeruginosa ATCC27853

On a essayé de suivre le comportement de quelques bactéries envers des extraits méthanolique, ethanolique, cétonique et chloroformique de concentration 22 g/l, en utilisant le

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

DMSO comme solvant, et en mesurant les zones inhibitrices cas par cas, selon la méthode des puits (annexe A.4).

Dans le tableau 4 ci-dessous figure les résultats relatifs aux propriétés antimicrobiennes des extraits éthanoliques, méthanoliques, chloroformique et cétoniques, et celles des huiles essentielles de P. cubéba, les valeurs de CMI de ces extraits contre les agents pathogènes sont présentées dans le tableau 5.

Il apparait à travers de ces données que :

- l’activité antimicrobienne des extraits de Piper cubéba varie en fonction des différents solvants et le témoin (DMSO pur) ne produit aucun effet inhibiteur ;

-pour l’extrait chloroformique, il n’existe qu’une seule activité antibactérienne contre la bactérie à gram + (staphéloccocus auréus) et une autre activité antifongique (Candida albicans); par contre, aucun effet inhibiteur n’a été enregistré contre les bactéries à gram- ;

- s’agissant de l’extrait cétonique, un effet antibactérien a été révélé contre les bactéries à gram (–), à l’exception de E.coli où il n’a été enregistré aucun effet inhibiteur.

Une lecture plus précise des données (voir le tableau 4) montre que l’huile essentielle de P. cubéba, extraite par HDMO, est considérée comme la plus efficace contre Candida albicans, avec une zone d’inhibition de 23 mm (figure 21), suivie par l’huile extraite par HC (22 mm).

Concernant la levure (C albicans), il est constaté qu’elle a survécu jusqu'à la concentration de 5,5 mg / ml dans l'extrait chloroformique avec une CMI de 11 mg / ml et une zone inhibition de 15mm suivie par l'extrait éthanolique et méthanolique avec la même CMI.

Pour la bactérie (Vibrions cholériques) il est relevé qu’elle a survécu jusqu’à la concentration 0,34mg/ml avec une CMI =1,37 mg/ml dans l’extrait méthanolique ; la plus grande zone d'inhibition de cette bactérie a été marquée par l’huile essentielle extraite par hydrodistillation classique (30mm) suivie par l’huile extraite par HDMO (23mm).

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Les résultats obtenus concernant les activités antifongique et antibactérienne pourrait s’expliquer par le fait que l’huile essentielle de Piper cubéba contient une forte quantité d’eugénol (18,27-25,89%) et de méthyl eugénol (47,72-45,92%) eux-mêmes possédant des propriétés activités antibactérienne et antifongique[118].

Par contre, la zone d’inhibition de P aeruginosa, E.coli et Enterococcus feacalis, est plus large dans les extraits que dans les huiles essentielles, notamment l’extrait méthanolique, dont les diamètres sont respectivement de 19mm, 15,5mm et 12,5mm, avec la même (CMI =1.37mg/ml). Ces résultats pourrait s’expliquer par le fait que les extraits de Piper cubéba sont riches en lignanes et en alcaloïdes tels que cubebin, hinokinin, yatein and isoyatein[98] qui ont renforcé cette activité antibactérienne[100].

Par ailleurs, les bactéries S.aureus et S.Typhimirium ont des zones d’inhibition proches dans les extraits et les huiles essentielles de Piper cubéba avec la même CMI dans l’extrait méthanolique (1,37mg/ml).

Ces résultats permettent d’émettre l’hypothèse de la possibilité d’utiliser les huiles essentielles de Piper cubéba comme des antibiotiques naturels qui semblent réagir très efficacement contre les levures C Albicans qui provoquent les infections buccales et contre les vibrions cholériques responsables du choléra ; comme on peut les associer dans les formulations des solutions de bain de bouche, de dentifrices et de différents désinfectants...

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Tableau II.4. Activité antibactérienne des extraits de Piper cubéba des extraits méthanoliques, ethanoliques, cétoniques et chloroformiques (22mg/ml), et les huiles essentielles ( avec des dilutions 1/10) incorporés dans les puits perforés sur les milieux de culture de MH et SAB après 18-24 d’incubation à 37°C

Les huiles fixes Les huiles essentielles les solvants utilisés Methanol Ethanol Acetone Chloroforme HC HDMO Diamètre d'inhibition (mm) Les bactéries gram (+) S.aureus 15 12 0 10 16 13 Les bactéries gram (-) S.Typhimirium 13 11 12 0 12 14 Enterococcus feacalis 12,5 11 10,5 0 10 11 V.cholerique 15 12 12 0 30 23 E.colis 15,5 12 0 0 9 12 P aeruginosa 19 11 8,5 0 7 7 Levure C.Albicans 9 10 0 15 22 23 DMSO pure 0 0 0 0 0 0 Tableau II.5. La CMI des extraits méthanoliques, éthanoliques, cétoniques et chloroformiques de Piper cubéba, incorporés dans le milieu de culture de MH et SAB après 18-24 d’incubation à 37° par la méthode de diffusion

Méthanol Ethanol Chloroforme Acétone Les souches CMI (mg/ml) Les bactéries gram (+) S.aureus 1,37 5,5 22 Les bactéries gram (-) S.Typhimirium 1,37 2,75 5,5 Enterococcus feacalis 1,37 2,75 2,75 V.cholerique 1,37 2,75 5,5 E.colis 1,37 2,75 P aeruginosa 1,37 2,75 5,5 Levure C.Albicans 11 11 11

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Figure II.22. Les zones d’inhibition représentent l’activité antifongique contre Candida albicans des huiles essentielles de P. cubéba dilué dans le DMSO et extraites par deux méthodes HC et HDMO, déterminée par diffusion sur gélose par la méthode des puits

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

b d

Figure II.23. Les zones d’inhibition représentent l’activité antibactérienne contre V.cholerique des huiles essentielles de P. cubéba, dilué dans le DMSO et extraites par deux méthodes HC et HDMO, déterminée par diffusion sur gélose par la méthode des puits

a :le puits correspond à la dilution 1/10de huile essentielle extraite par HDMO.

b:le puits correspond à la dilution 1/100 de huile essentielle extraite par HDMO.

d : le puits correspond à la dilution 1/10de huile essentielle extraite par HC.

c : le puits correspond à la dilution 1/100 de huile essentielle extraite par HC.

Chapitre II Extraction des huiles essentielles et des extraits de Piper cubéba

Figue II.24. CMI montrée par l'extrait éthanolique de P. CUBÉBA contre Enterococcus feacalis déterminé par la méthode de diffusion de puits sur gélose à l’aide d’une série de dilution des extraits: 22 mg / ml (SM), 11 mg / ml (1), 5,5 mg / ml (2) 2,75 mg / ml (3) de 1,37 mg / ml (4) , 0,68 mg / ml (5) ,0,34 mg / ml (6) et 0,17 mg / ml (7)

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

La cinétique d’extraction assistée par micro-ondes simple et sous vide de l’huile essentielle de Piper cubéba sera détaillée dans cette partie, l’objectif de cette étude est d’une part, de suivre les deux cinétique d’extraction quantitative (rendement en fonction du temps) et de déterminer le temps utile pour le déroulement des deux processus et d’autre part, de suivre analytiquement (par GC et GC/MS) chaque point décrivant l’allure de la courbe des deux cinétiques d’extraction R (%) = f(temps), ce qui permettra parallèlement, d’observer les deux profils de variation des principaux composés et des différentes familles chimiques de l’essence de Piper cubéba en fonction de la durée d’extraction et vérifier si une extraction assistée par micro-ondes menu d’une pompe à vide conduit à une même essence qu’une extraction assistée par micro-ondes simple. Pour ce faire, un seul échantillon de graines fera l’objet de nos investigations; notre choix s’est porté sur Piper cubéba originaire d’inde , pour plusieurs raisons jugées utiles telles que le rendement obtenu pour faciliter la collecte aux différents temps et la disponibilité de la matière végétale comme un produit largement commercialisé en Algérie.

III.1.ÉTUDE DE LA CINÉTIQUE D’EXTRACTION QUANTITATIVE DU CUBÉBA

III.1.1 Méthodes d’extraction et conditions de travail

Notre travail consiste à étudier la variation du rendement quantitatif différentiel et cumulé en fonction du temps, ainsi que de suivre le profil de variation des courbes de vitesse et d’accélération des différentes étapes d’extraction. Les montages réalisés sont mentionnés dans les figures (III .1 et 2) et les conditions opératoires au tableau III. 1.

Tableau III. 1. Conditions opératoires des différentes techniques d’extraction utilisées

Techniques Plantes Poids de Puissances Temps de Temps Rendement(%) Solvant d’extraction l’échantillon (W) chauffage totale utilisé (g) d’extraction HD-MO Cubéba 200 (BS) 800 10 min 66 min 0,707 H2O 32s (1l) HD-MO SV Cubéba 200 (BS) 600 05 min 30 min 0,635 H2O (P = 80 25s (1l) mbar)

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Figure III.1. Dispositif d’extraction par l’hydrodistillation assistée par micro-onde (HD-MO)

Figure III.2. Dispositif d’extraction par HD-MO-SV

• La pompe utilisée Marque allemande vaccuubrand (Membran-vakuumpumpe) N° :2578701 Max : 1,9m3/h 80mbar 230V 50/60Hz 1,1 A

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.1.2. Cinétique du rendement cumulé d’extraction d’huile essentielle du P. cubéba par HD- MO et HD-MO-SV

D’après les résultats des tableaux 2 et 3, on a enregistré un rendement total de 0,707%, en huile essentielle extraite par HD-MO qui est légèrement élevé par rapport à celui obtenu par HD-MO -SV (R= 0,636%). Les essences des graines de Piper cubéba obtenues, pour les deux techniques, sont de couleur jaune foncé avec une très forte odeur persistante.

Pour la technique HD-MO, les premières gouttes de l’huile essentielles extraites ont été récupérées au bout de 10 mn 32s et la durée totale de cette cinétique d’extraction est de 66 mn avec un débit relativement faible de 0,06 ml/s alors que la technique HD-MO-SV (à basse pression p = 80 m bars) le temps pour récupérer la première goutte d’huile essentielle était de 5 min 25s et pour une durée totale 30 mn avec un débit résulté de 0,139 ml/s.

Les rendements différentiels les plus élevés par la technique HD-MO sont obtenus en 33 min (R=0,458%) tandis que ceux de la technique HD-MO-SV sont obtenus au bout de 20 mn seulement (R= 0,373%) .

Tableau III .2 . Variation du rendement en fonction de la durée d’extraction par la technique HD-MO

Temps Temps Quantité Quantité Rendement Rendement Enérgie CO2 émis total Différentiel extraite extraite différentiel cumulé kWh/g dans écoulé (mn) différentielle cumulée (%) (%) d’HE l’atmosphère (mn) (g) (g) 0 0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 2 2 0,030 0,030 0,015 0,015 0,889 711,111 5 3 0,024 0,054 0,012 0,027 1,235 987,654 11 6 0,231 0,285 0,116 0,143 0,515 411,696 20 9 0,133 0,418 0,067 0,209 0,638 510,367 33 13 0,915 1,333 0,458 0,667 0,330 264,066 48 15 0,081 1,414 0,041 0,707 0,453 362,093 66 18 0,000 1,414 0,000 0,707 0,622 497,878

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Tableau III .3 . Variation du rendement en fonction de la durée d’extraction HD-MO-SV

Temps Temps Quantié Quantité Rendement Rendement Enérgie co2 émis total Différentiel extraite extraite différentiel cumulé kWh/g dans écoulé (mn) différentielle cumulée (%) (%) d’HE l'atmosphère (mn) (g) (g) 0 0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 5 5 0,273 0,273 0,137 0,137 0,303 299,781 12 7 0,252 0,525 0,126 0,263 0,378 374,126 20 8 0,746 1,271 0,373 0,636 0,260 257,561 30 10 0,000 1,271 0,000 0,636 0,390 386,342

La figure 3 montre les deux profils de variation du rendement cumulé d’extraction HD- MO et HD-MO-SV qui sont similaires en fonction du temps. Globalement, on observe trois phases pour les deux techniques HD-MO et HD-MO-SV, la première étape (1) est représentée par une branche curviligne OA et OA’ respectivement qui caractérise les premières quantités extraites, situées généralement à la surface superficielle des particules végétales (sites exogènes) représentant près de 50 % du rendement total, obtenu en 20 min pour HD-MO classique et 12 mn pour HD-MO-SV. Cette partie est suivie d’une droite croissante AB et A’B’ respectivement tendant vers un premier palier (étape (2)), représentant la partie de l’huile essentielle diffusant de l’intérieur des particules solides (sites intra-particulaires endogènes) vers le milieu extérieur, entraînée par l’eau des cellules végétales et l’eau d’humectage, représentant près de 50 % de l’essence restante extraite en 48 mn pour HD-MO classique et 20 min pour HD-MO-SV. La troisième étape (3) correspond à un palier horizontal BC et B’C’ respectivement qui marque la fin de l’extraction (épuisement de la charge végétale).

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

0,800 B C 0,700 B' C' 0,600

0,500

0,400 HD-MO SOUS VIDE HD-MO 0,300 A'

Rendement ajouté(%) Rendement 0,200 A 0,100

0,000 O 0 10 20 30 40 50 60 70 Durée d'extraction (mn)

Figure III.3. Variation du rendement cumulé de l’huile essentielle des graines de Piper cubéba en fonction du temps

III.1.3. Cinétique du rendement différentielle d’extraction d’huile essentielle du Piper Cubéba par HDMO et HDMO-SV

La figure III.4 relative à la variation du pourcentage en rendement différentiel en fonction du temps des deux méthodes utilisées, montre deux profiles de courbes similaires de la cinétique par HD-MO et HD-MO-SV avec des temps d’extraction différents. En effet, la technique HD-MO-SV s’effectue en un temps relativement plus court (20 mn) comparé à l’autre technique (48 mn). Les deux courbes (HD-MO et MD-MO-SV) présentent trois phases distinctes avec deux maximums B et E, B’ et E’ respectivement, durant le processus d’extraction. La première phase correspond à la curviligne OA et OA’ respectivement et la seconde phase correspond à la branche AB et A’B’ respectivement (figure III.4). De ce fait, on constate que les deux points A et A’ au temps 20 mn et 12 mn respectivement, correspondent approximativement au début de la diffusion intraparticulaire des sites endogènes. La phase 3 pour les deux techniques (représentée par BC et B’C’ respectivement dans la figure III.4) correspond à l’étape d’épuisement avec une vitesse d’extraction qui tend progressivement vers une valeur nulle.

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

0,500 B HD-MO

HD-MO SOUS VIDE B' 0,400

0,300

0,200

E' A'

Rendement différentiels Rendement différentiels (%) 0,100 E A

C' C 0,000 O 0 10 20 30 40 50 60 70 Durée d'extraction écoulée (min)

Figure III.4. Variation du rendement différentiel de l’huile essentielle des graines de Piper cubéba en fonction du temps

A partir de la figure 3, nous avons déduit les vitesses instantanées pendant toute la durée d’extraction pour les deux techniques (tableau 4 et 5).

Tableau III. 4. Les Vitesses instantanées en fonction du temps par HD MO sous Vide

Temps (mn) 0 5 12 20 30 Vitesse (%/mn) 0 0 ,026 0,023 0,0168 0

Tableau III. 5. Les Vitesses instantanées en fonction du temps par HD MO

Temps (mn) 0 2 5 11 20 33 48 66 Vitesse (%/mn) 0 0,005 0,010 0,016 0,009 0,018 0,002 0

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

La figure 5 représente un cas spécifique de l’extraction par micro-ondes doté par une pompe à vide (HD-MO-SV) totalement différent de celui rencontré dans les extractions par micro –ondes (HD-MO) dont les deux mécanismes sont régis par la loi d’Angeledis et coll. [30,31] impliquant trois phases : la dissolution au voisinage du solide, la diffusion intraparticulaire et la diffusion dans les pores capillaires [32].

Dans notre cas (figure III.5), on observe trois zones pour les deux techniques. Le mécanisme proposé est le suivant : pour la cinétique assistée par HD- MO, la première phase (0-20 mn) avec une branche curviligne (OO’) à vitesse légèrement croissante, traduit l’extraction de l’essence située au voisinage immédiat du solide (dépôt exogène), suivie par une hyperbole O’M montrant une décroissance rapide de la vitesse d’extraction indiquant la fin de la première étape, tandis que pour la technique HD-MO-SV, durant la première phase correspond à l’intervalle de temps (0-5mn) et on observe une droite OM’ avec une forte croissance de la vitesse d’extraction atteignant une valeur supéreiure à celle atteinte par la HD-MO. La deuxième étape (2) (HD-MO : 20-48 mn, HD-MO-SV : 5-20 mn) est contrôlée par la diffusion de l’huile à l’intérieur des pores (diffusion intraparticulaire). Pendant cette phase, la vitesse de pénétration de l’eau dans les pores est plus importante que la vitesse de diffusion du soluté et la quantité extraite dépend de cette dernière.

La 3ème étape (HD-MO : 48-66 mn, HD-MO-SV : 20-30 mn) est le stade de l’épuisement, durant ce temps.

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

0,03 M' HD MO sous vide 0,025 HD MO

0,02 O' 0,015

0,01

Vitesse d'extraction (%/mn) d'extraction Vitesse M 0,005

0 O 0 10 20 30 40 50 60 70 Temps d'extraction écoulé (mn) Figure III.5. Variation de la vitesse d'extraction en fonction du temps de HD-MO et

HD-MO –SV

Aux environs du point (M) pourrait exister une phase intermédiaire où coexistent les deux phénomènes des étapes 1 et 2 qui est bien apparue dans la cinétique HD-MO classique, l’extraction de l’essence située à la surface superficielle des graines broyées et la diffusion intraparticulaire [33]. Des travaux assez récents, utilisant l’extraction assistée par micro-ondes ont étudié la cinétique d’extraction en 30 mn avec une puissance de 500 Watts [34] et qui ont obtenu une allure de courbe d’extraction (rendement en fonction du temps) qui n’a pas mis en évidence la première branche linéaire OA(figure 1) correspondant à l’extraction des cites exogènes, et d’après les deux cinétiques qu’on a effectuées , on constate que la quasi-totalité de l’ essence extraite des graines de Piper cubéba soit située dans les cites endogènes de la charge végétale. D’où le profil cinétique pourrait dépendre fortement de la nature et de la charge végétale traitée [35, 36, 37].

III.1.4. Aspect énergique Le calcul de l’énergie consommée par gramme d’extrait constitue un indice énergétique permettant de juger l’efficacité d’une technique d’extraction de point de vue de la consommation d’énergie.

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

On a calculé l’énergie consommée par les formules ci-après[78] :

= 3600 1000 𝑊𝑊 𝐸𝐸 W : le travail en (watts*s), avec: = . ∗ ∗ 𝑚𝑚𝐻𝐻𝐻𝐻

Pour "P" sous Vide = (P+P pompe) 𝑊𝑊avec P𝑃𝑃 pompe∗ 𝑡𝑡 =V*I =230*1,1=253watts V : f.e.m (V) I : intensité de courant électrique (A) P : la puissance de l’appareil en (watts) t : le temps de chauffage en (s) m HE : la masse de l’huile essentielle en (g)

1,600

1,200 E (kWh) HDMO

E kWh

0,800 E(kWh)

0,400

0,000 0 10 20 30 40 50 60 70 t (mn) Figure III.6. Les énergies consommées en fonction du temps

D’après les deux courbes des énergies d’extractions (figure 6), on remarque que la HD- MO est plus consommatrice d’énergie comparée à la HD-MO-SV. Ces profiles de courbe correspondent à la quantité d’huile essentielle différentielle extraite et aux temps investis. Dans l’ensemble, on constate que les quantités isolées durant la première étape d’extraction par HD-MO sont les plus consommatrices d’énergie.

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.1.5. Impact environnemental sur la quantité de CO2 émise dans l’atmosphère

La quantité de CO2 émise dans l’atmosphère des deux méthodes d’extractions HD-MO et HD-MO-SV est calculée selon la formule suivante :

Masse CO2 dégagée = Energie consommé (KWh/g HE) * 800g

[78]

D’après la figure (7), on remarque que la technique HD-MO dégage une quantité de CO2 plus importante que celle dégagée par HD-MO-SV, de début jusqu’à la fin du processus d’extraction.

1000,000

HD MO

HD MO sous vide

500,000 CO2 émis dans l'atmosphère dans émis CO2

0,000 0 10 20 30 40 50 60 70 Durée d'extraction

Figure III.7. Les quantités de CO2 émises dans l’atmosphère

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.2.ETUDE COMPARATIVE DE LA CINETIQUE D’EXTRACTION (HD-MO ET HD-MO-SV) PAR ANALYSE GC ET GC/MS EN QUANTITE DIFFERENTIELLE

III.2.1. Analyse par GC-MS et Conditions opératoires

Pour chaque point des deux courbes (la figure 4), une quantité d’essence a été récupérée pour être analysée par GC et GC/MS. Pour ces dernières, toutes les conditions opératoires ont été maintenues identiques aux conditions citées dans le chapitre II. Les tableaux 23 et 24 dressent l’analyse qualitative et semi-quantitative des essences extraites aux différents temps, ce qui a permis d’obtenir les chromatogrammes (Figures III-8 et 9) et le reste est présenté dans l’annexe B (figure B.4 jusqu’à B.12) L’extraction des huiles essentielles du Piper cubéba par HD MO suivit par GC- GC/MS nous a permis d’identifier 194 composés des différentes familles chimiques, les composés identifiés sont mentionnés dans le tableau ci- dessous (Tableau 6). D’après l’étude GC-GC/MS, les deux produits méthyle eugénol (Figure III-10) et eugénol (Figure III-11) contribuent à un fort pourcentage de la composition chimique de l’huile. Durant l’extraction, le pourcentage de méthyle eugénol reste constant, aux alentours de 50%, alors que le % d’eugénol augmente avec le temps, il atteint une valeur maximale de 69,29% à t2. Pour les composés Myrcène et Cinéole <1,8> se trouvent à un pourcentage important au début de l’extraction puis diminuent avec le temps. Les chromatogrammes obtenus montrent une quantité importante de composés à masse moléculaire élevée sortant généralement après la 6e minute. Au dessous de cette valeur peu de pics sortent des chromatogrammes, il s’en suit une quantité très faible en composés légers.

On constate qu’au temps t6= 18 mn aucune trace d’essence décantée ou hydrosoluble n’a été décelée. En effet, la phase aqueuse de collection à été traitée par de l’éther éthylique afin de récupérer les quelques traces d’essence susceptibles d’être solubilisées, mais ça n’a rien donné par l’analyse chromatographique.

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Abundance 5

1-Myrcène 2-Cinéole <1,8-> 3-Anéthole <(E) ->

4-Eugénol

5-Méthyl eugénol

6-Caryophyllène <(Z) ->

1 3 6 2

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure III.8. Chromatogramme en courant ionique à t=5mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Abundance

6 7 1-Myrcène

2-Cinéole <1,8->

3-Linalool

4-Terpinèn-4-ol

5-Terpinéol<ɣ -> 6-Eugénol

7-Méthyl eugénol

5 8-Humulène <α->

9-Selinène < >

8 10-Caryophyllène𝛽𝛽 oxyde

3 4 10 9

1 2

10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Time-->

Figure III.9. Chromatogramme en courant ionique à t=5 mn de HE de Piper cubéba extraite par HD-MO -SV sur une colonne capillaire HP5-MS 92

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Figure III.10. Spectre GC/MS à courant ionique de Méthyle eugénol à t= 2mn

Figure III.11. Spectre GC/MS à courant ionique de l’eugénol

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Tableau III.6. Analyse qualitative et semi-quantitative des essences obtenues à différents temps d’extraction assistée par microondes (t1-t6) 2mn 5mn 11mn 20mn 33mn 48mn

composés KI réf KI Area% KI Area% KI Area% KI Area% KI Area% KI Area%

1 Thujène <α> 930 930 0,06

2 Pinène <α> 939 939 0,37 940 0,52 940 0,07 939 0,04 0,07 939 938 0,68

3 Citronellène< -> 950 950 0,01 949 0,01 949 0,01

4 Benzaldéhyde 960 960 0,01 𝛽𝛽 5 Sabinene 975 975 0,20

6 Pinène < > 979 978 0,37 978 0,41 978 0,12 978 0,07 0,11 979 980 0,95

7 Hepten-2-one <6-Methyl-5-> 985 985 0,01 𝛽𝛽 8 Myrcène 990 989 13,80 988 5,72 990 0,17 990 0,07 3,79 990 990 1,03

9 Linalool oxyde 993 992 0,02 992 0,03

10 Carène < -2-> 1002 1002 0,08

11 Phéllandrène <α-> 1002 1001 0,01 1002 0,01 𝛿𝛿 12 Mentha-1(7),8-diene <ρ-> 1004 1004 0,01

13 Sylvestrène 1007 0,03 1008 1007 0,01

14 IsoamyI isobutyrate 1009 1009 0,01

15 Terpinène <α-> 1017 1017 0,13 1017 0,02 1017 0,01 0,08 1017 1017 0,03

16 Cymène <ρ-> 1024 1022 0,65 1022 0,35 1023 0,12 1024 0,06 0,23 1024 1024 0,24

17 Limonene 1025 1025 0,99 1025 0,52

18 Phellandrène < -> 1029 1027 0,16 1027 0,10 1028 0,85

19 Cinéole <1,8-> 1031 1031 6,63 1031 2,23 1031 0,39 1031 0,22 1,47 1031 1031 2,00 𝛽𝛽 20 Ocimène <(Z)- -> 1037 1037 0,04 1040 0,01 0,03 1037 1040 0,02

21 Ocimène <(E)- -> 1050 1049 0,51 1049 0,06 1051 0,02 1050 0,01 0,38 1050 1051 0,16 𝛽𝛽 22 Terpinène 1059 1059 0,11 1059 0,02 1059 0,01 0,10 1059 1059 0,04 𝛽𝛽 23 Sabinene hydrate (lPP vs, OH) 1070 1068 0,01

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

24 Vertocitral C 1080 1080 0,01

25 Fenchone 1086 1084 0,01 1085 0,01 1086 0,06

26 Linalool oxyde (furanoid) 1086 1088 0,01

27 Mentha-2,4(8)-diène <ρ-> 1088 1090 0,16 1090 0,01 0,14 1088

28 Cymenène <ρ-> 1091 1093 0,01 1093 0,03

29 Epoxymyrcene <6,7-> 1092 1092 0,01

30 Linalool 1096 1098 0,93 1098 0,32 1098 0,75 0,32 1096 1098 1,24

31 Pinene oxyde<α-> 1099 1100 0,08

32 Thujone 1102 1100 0,04

33 Isopentyl isovalérate 1103 1103 0,08 1103 0,03

34 Methyl butyl isovalerate <2-> 1104 1104 0,01 1104 0,01 1106 0,09

35 Menthatriène <1,3,8-ρ-> 1110 1110 0,01

36 Thujone 1114 1113 0,01 1112 0,01

37 Thujone 1114 1113 0,01

38 Sabina ketone 1120 1118 0,08

39 Menth-2-en-1-ol 1121 1121 0,01 1121 0,01

40 Campholenal<α-> 1126 1126 0,01

41 Chrysanthénone 1127 1127 0,01 1127 0,01

42 2-Cyclohexen-1-ol, 1-methyl-4-(1- 1130 1130 0,02 methylethyl)-, trans- 43 Terpineol <1 -> 1133 1134 0,01

44 Nopinone 1140 1142 0,01

45 Cumin aldéhyde 1241 1243 0,07

46 Sabinol (trans for OH vs, IPP) 1142 1144 0,01

47 Geijerene 1143 1145 0,01

48 Isocitral 1144 1147 0,01 1147 0,01

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

49 Camphor 1146 1148 0,06 1148 0,04 1148 0,04

50 Menthone 1152 1152 0,01

51 Nonadienal <(2E,6Z)-> 1154 1154 0,01

52 Nonen-1-ol <(3Z)-> 1157 1156 0,01

53 Sabina kétone 1159 1159 0,01

54 Pinocarvone 1164 1163 0,03 1163 0,02 1163 0,04

55 Terpineol< -> 1166 1164 0,02 1166 0,02

56 Ethylbenzoate 1173 1173 0,01 1173 0,02 𝛿𝛿 57 Terpinen-4-ol 1177 0,42 1177

58 Terpinen-4-ol 1177 1177 0,75 1177 0,31 1176 0,86 1175 0,12 1175 3,79

59 Acetophenone<ρ-methyl-> 1182 1182 0,01

60 Cymen-8-ol <ρ-> 1182 1182 0,06 1184 0,01 1184 0,06

61 Cryptone 1185 1183 0,04 1183 0,03

62 TerpineoI <α> 1188 1186 0,92 1186 0,58

63 Methyl salicylate 1191 1191 0,04 0,03 1198

64 Methyl chavicol 1196 1194 1,27 1194 0,88 1198 1,48 1196 0,45 0,66 1195 1096 0,03

65 Terpineol<γ-> 1199 1199 1,73 0,76 1199 1199 1,98

66 Dihydro carvone 1200 1202 0,02 1201 0,02

67 Décanal 1201 1201 0,02

68 Octanol acetate 1213 1213 0,02 1214 0,02

69 Nonadienol <(2E,4E)-> 1219 1220 0,02

70 Sabinène hydrate acétate (Ac vs, 1221 1219 0,01 IPP) 71 Pulégol 1229 1229 0,02

72 Ascaridole 1237 1236 0,06 1235 0,04

73 Cumin aldéhyde 1241 1241 0,07 1241 0,19 0,06 1241 1241 0,18

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

74 Carvone 1243 1243 0,07 1242 0,41 1241 0,18 0,67 1243 1242 0,26

75 Anis aldehyde <ρ-> 1250 1248 0,03 1252 0,16 1251 0,07 0,05 1250 1251 0,12

76 Chavicol 1250 1250 0,02 1250 0,25 1250 0,38 0,08 1250 1250 0,27

77 Phenylethylacetate<2-> 1258 1257 0,02 1256 0,01

78 Géranial 1267 1269 0,02

79 Néryl formate 1282 1282 0,20 1280 0,07 1280 0,11

80 Anéthole <(E)-> 1284 1284 4,44 1284 2,37 1286 5,09 1286 1,98 2,49 1284 1285 5,07

81 Terpinen-7-al <α-> 1285 1285 0,01 1285 0,02

82 Terpinen-7-al <γ-> 1291 1289 0,06 1291 0,01 1289 0,03

83 Décadienal <(2E,4Z)-> 1293 1292 0,23 1293 0,10 0,04 1293 1292 0,06

84 Géranyl formate 1298 1300 0,02

85 Acétophenone <3'-methoxy-> 1298 1298 0,01

86 Carvacrol 1299 1301 0,07 1300 0,04 1300 0,05

87 Guaiacol <ρ-vinyl-> 1309 1309 0,01

88 Decadienal<(2E,4E)-> 1316 1314 0,15 1314 0,28 0,10 1316 1314 0,05

89 Methylo-anisate 1337 1337 0,01

90 Terpinyl acetate <α-> 1349 1347 0,04 1347 0,02 1347 0,02

91 Eugénol 1359 1354 8,49 1359 12,00 1360 25,11 1360 19,44 18,91 1359 1360 18,85

92 Ylangène <α-> 1372 1368 0,09 1370 0,05 1372 0,14 0,13 1375 1372 0,16

93 Damascenone <(E)- -> 1384 1384 0,13 1384 0,08 1384 0,09

94 Elemène< -> 1390 1386 0,37 1390 0,24 1390 0,68 1389 0,70 0,57 1390 1389 0,60 𝛽𝛽 95 Jasmone<( Z)-> 1392 1392 0,03 1392 0,07 1392 0,02 𝛽𝛽 96 Longipinène < -> 1400 1399 0,01

97 Methyl eugénol 1403 1403 52,51 1403 69,29 1403 51,02 1403 55,01 62,29 1403 1403 53,99 𝛽𝛽 98 Caryophyllène <(Z)-> 1408 1409 3,89 1409 3,15

99 Mefranal 1425 1425 0,02

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

100 Copaene< -> 1432 1432 0,05 1432 0,03

101 Guaiene <α-> 1439 1439 0,03 1439 0,02 𝛽𝛽 102 Aromadendrene 1441 1441 0,02 1441 0,02

103 Himachalene <α-> 1451 1450 0,02

104 Methyl isoeugellol <(Z)-> 1453 1453 0,03

105 Humulène<α> 1454 1443 0,57 1454 0,39 1452 1,20 0,80 1454 1452 0,95

106 Prenyl limonène 1459 1457 1,07

107 Aromadendrane 1462 1462 0,06 1459 0,08 1458 0,05

108 Cadina-1(6),4-diène 1463 1461 0,01

109 Muurola-4(14),5-diène 1466 1466 0,02

110 Caryophyllene <9-epi-(E)-> 1466 1467 0,06

111 Ethyl cinnamate <(E)-> 1467 1465 0,01 1466 0,01

112 Aristolochene <4,5-di-epi-> 1473 1473 0,02 1473 0,01

113 Acoradiène <10-epi- -> 1475 1475 0,12 1475 0,08

114 Cadina-1(6),4-diene 1476 1476 0,12 𝛽𝛽 115 Chamigrène < -> 1477 1477 0,07 1477 0,11 0,12 1477 1477 0,06

116 Gurjunène <γ-> 1477 1477 0,11 1475 0,12 0,41 1477 1475 0,08 𝛽𝛽 117 Muurolène <γ-> 1479 1479 0,18 1479 0,27

118 Curcumene 1480 0,05 1480

119 GermacreneD 1485 1483 0,37

120 Aristolochène 1488 1488 0,35 1488 0,53 0,30 1488 1488 0,30

121 Selinène < > 1490 1492 0,54 1492 0,34

122 Methyl isoeugénol <(E)-> 1492 1492 0,03 1490 0,33 1491 0,49 0,38 1492 1492 0,19 𝛽𝛽 123 Cadina-1,4-diène 1495 1495 0,02

124 Viridiflorène 1496 1494 0,23 1496 0,11 1496 0,40

125 Isodaucène 1500 1502 0,14 1502 0,13

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

126 Farnesène <(E,E)-α-> 1505 1505 0,12

127 Premnaspirodiène 1506 1504 0,01

128 Bisabolène<( Z)-α-> 1507 1507 0,12 0,10 1507 1507 0,05

129 Germacrène A 1509 1509 0,23

130 Amorphene< -> 1512 1512 0,09 1511 0,03

131 Cadinène<γ-> 1513 1515 0,06 1515 0,35 𝛽𝛽 132 Curcumène< -> 1515 1516 0,06

133 Myrac aldéhyde 1520 1520 0,03 1520 0,04 1520 0,01 𝛽𝛽 134 Selinene <7-epi-α-> 1522 1522 0,02 1520 0,02 1522 0,01

135 Cadinène < -> 1523 1524 0,21 0,17 1523 1521 0,14

136 Chavibetol acétate 1525 1525 0,02 1527 0,02 1526 0,01 𝛿𝛿 137 Cuprenène <γ-> 1533 1533 0,02 1533 0,02 1533 0,01

138 Cadinène <α-> 1538 1539 0,02 1535 0,03 1535 0,01

139 Calacorène <α-> 1545 1543 0,02 1538 0,06 1540 0,01

140 Italicène epoxyde 1548 1544 0,01

141 Elemicin 1557 1559 0,16 1557 0,26 0,16 1557 1557 0,07

142 Silphiperfol-5-en-3-ol A 1559 1567 0,02 1553 0,01

143 Nérolidol<(E)-> 1563 1564 0,04 1564 0,01

144 Calacoène < -> 1565 1563 0,01 1560 0,02

145 lonol acétate <(E)-α-isomethyl-> 1569 1569 0,03 𝛽𝛽 146 Caryophyllényl alcohol 1572 1573 0,03 1570 0,07 1570 0,02

147 Cedrène époxyde<α-> 1575

148 Prenopsan-8-ol 1577 1577 0,04

149 Spathulénol 1578 0,08 1578 1578 0,01

150 Caryophyllene oxyde 1583 1583 0,61 1583 0,36 1583 2,28 1583 3,79 1,72 1583 1583 1,61

151 Allo-hédycaryol 1589 1589 0,02

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

152 Diethyl phthalate (plastizer 1590 1592 0,03 contaminant!) 153 Salvial-4(14)-en-1-one 1594 1592 0,04 1592 0,07 1594 0,02

154 Fokienol 1596 1598 0,01

155 Rosifoliol 1600 1602 0,03

156 Humulène epoxyde II 1608 1608 0,37 1606 0,78 1605 0,22

157 Bisaboladien-4-ol <2,(7Z)-> 1619 1619 0,18 1619 0,48 1619 0,12

158 Junénol 1619 1620 0,01 1619 0,03

159 Silphiperfol-6-en-5-one 1625 0,10 1625

160 Citronellyl pentanoate 1625 1625 0,05 1626 0,16 1626 0,02

161 Isolongifolanone 1626 1624 0,01 1624 0,03

162 Eremoligénol 1631 1631 0,06 1632 0,55 0,11 1631 1631 0,05

163 Hinesol 1641 0,33 1641

164 Cubénol 1646 1644 0,15

165 Muurolol <α-> (=Torreyol) 1646 1647 0,09

166 Khusilal 1648 0,08 1648

167 AgarospiroI 1648 1648 0,03

168 Valérianol 1658 1658 0,10

169 Selin-11-en-4-α-ol 1659 1659 0,30 1659 1,20 1659 0,18

170 Lyral 1666 1666 0,42

171 Caryophyllène <14-hydroxy-(Z)-> 1667 0,17 1667

172 Caryophyllène <14-hydroxy-9-epi-(E)- 1669 1671 0,06 > 173 Turmérone 1669 1669 0,06 1669 0,95

174 Salicylic acid, héxyl ester 1675 1675 0,03 1675 0,37

175 Cédranol<5-neo-> 1685 1685 0,07

100

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

176 Gérmacra-4(15),5,10(14)-trien-1-α-ol 1686 1686 0,05

177 Mayurone 1710 1709 0,13 1709 0,48

178 Cinnamaldehyde <4-hydroxy-3- 1729 1729 0,05 methoxy-> 179 Isobicyclogermacrenal 1734 1734 0,45

180 Farnesol <(2E,6E)-> 1743 1743 0,04 1743 0,13

181 Costol<γ-> 1746 1747 0,11

182 Bisabolone <6S,7R)-> 1749 1747 0,15

183 Lancéol<(Z)-> 1761 1761 0,10

184 Costol < -> 1767 1765 0,07 1765 0,18 0,07 1767

185 Atlantone <(E)-α-> 1778 1776 0,12 𝛽𝛽 186 Cinnamaldéhyde, 3,4-dimethoxy- ri=1567 1780 0,16 1779 0,41 1779 0,13

187 Isovalencenol <(E)-> 1793 1787 0,05

188 LongifoloIacétate 1820 1820 0,02 1820 0,06

189 Pseudoisoeugenyl 2-methylbutyrate 1842 1843 0,02 1843 0,07 1843 0,08 <(E)-> 190 Farnésyl acétone <(5Z,9E)-> 1889 1890 0,03 1890 0,10 1890 0,02

191 Farnésyl acétone<(5E,9E)-> 1913 1913 0,07 1913 0,01

192 n-Hexadecanoic acid 1957 1957 0,24

193 Géranyl linalool<(Z,Z)-> 1 961 1961 0,03 1961 0,26 1961 1,27 0,27 1961 1961 0,21

194 Géranyllinalool <(Z,E)-> 1 998 1998 0,09 1998 0,50 0,08 1987 1998 0,07

101

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Globalement, la technique HD-MO-SV isole un nombre plus faible de constituant (131 composés), comparé à la technique HD-MO (tableaux 6 et 8 respectivement), ce qui laisse penser qu’un nombre plus élevé de composés implique d’éventuelles formations d’artéfacts, issus des réactions de dégradations, causées par la haute température (plus de 100°C). Bien que la technique HD-MO-SV opère à basse pression (80 mbar), permet de diminuer significativement cette température à 50°C. Contrairement à la technique HD-MO, dans HD-MO-SV, la plupart des composés chimiques sont isolés dès le premier point t1= 5mn et cela probablement dû à la vitesse d’extraction relativement importante, entrainant le maximum de composés. Au total, 15 composés chimiques ont été identifiés uniquement dans l’huile essentielle extraite par HD-MO -SV (Tableau7) dont quelques constituants sont isolés uniquement dans des temps précis tels que Linalool (1,78%) à t1, Shisofuran (1,81%) à t2 et Farnesène <(E,E)-α-> ( 0,19%) à t3. .

Tableau III. 7. Les composés chimiques identifiés uniquement dans l’huile essentielle de Piper Cubéba extraite par HD-MO –SV

KI réf Composés 1 1100 Isopentyl2-methyl butanoate 2 1100 Methyl butyl-2-methyl butyrate <2-> 3 1159 Isopulégol 4 1169 Lavandulol 5 1198 Shisofuran 6 1205 Verbenone 7 1232 Fenchyl acetate 8 1388 Duprezianene <11-> 9 1456 Patchoulène <α-> 10 1459 Sesquisabinène 11 1551 Silphiperfol-5-en-3-one R 12 1577 Santalénone 13 1675 Santalol <(Z)-α-> 14 1595 Turmérone

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Tableau III. 8. Composition chimique de l’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV

t1= 5mn t2=12mn t3= 20mn N° KI réf Composés Area KI Area KI Area KI 1 939 Pinène <α> 0,10 939 0,06 940 0,07 940 2 950 Citronellene< -> 0,03 950 0,01 951 3 979 Pinène < > 𝛽𝛽 0,12 979 0,10 980 0,03 980 4 990 Mycène 0,30 990 5,43 991 0,17 991 𝛽𝛽 5 1002 Phéllandrène <α-> 0,01 1002 0,02 1003 6 1008 Sylvestrène 0,01 1008 0,01 1009 0,01 1009 7 1009 IsoamyI isobutyrate 0,01 1009 0,01 1010 8 1017 Terpinène <α-> 0,03 1017 0,07 1018 0,02 1018 9 1024 Cymène <ρ-> 0,12 1024 0,17 1025 0,10 1025 10 1029 Phellandrène < -> 0,15 1029 0,43 1030 0,16 1030 11 1031 Cinéole <1,8-> 0,44 1031 1,85 1032 0,36 1032 𝛽𝛽 12 1037 Ocimène <(Z)- -> 0,01 1037 0,04 1038 0,01 1038 13 1050 Ocimène <(E)- -> 0,03 1050 0,61 1051 0,02 1051 𝛽𝛽 14 1059 Terpinène <γ-> 0,02 1059 0,11 1060 0,02 1060 𝛽𝛽 15 1070 Sabinène hydrate (lPP vs, OH) 0,03 1070 16 1086 Linalool oxyde (furanoid) 0,01 1086 17 1086 Fenchone 0,03 1086 0,19 1087 0,04 1087 18 1091 Cymenène <ρ-> 0,01 1091 0,01 1092 19 1092 Epoxymyrcène <6,7-> 0,05 1092 0,01 1093 20 1096 Linalool 1,78 1096 21 1098 Sabinène hydrate (lPP vs, OH) 0,04 1098 1,07 1099 0,32 1099 22 1099 Pinène oxyde<α-> 0,06 1099 0,04 1100 0,04 1100 23 1100 Isopentyl 2-methyl butanoate 0,01 1101 24 1100 Methyl butyl-2-methyl butyrate <2-> 0,01 1101 25 1102 Thujone 0,01 1103 26 1104 Methyl butyl isovalerate <2-> 0,02 1106 27 1110 Menthatriène <1,3,8-ρ-> 0,01 1129 0,01 1111 28 1114 Thujone 0,01 1113 1115 29 1120 Sabina ketone 0,11 1118 0,08 1121 0,02 1121 30 1126 Campholénal<α-> 0,01 1126 31 1133 Terpinéol <1-> 1134 0,01 1134 32 1140 Nopinone 0,01 1134 33 1144 Isocitral 0,06 1144 0,01 1145 0,02 1145 34 1146 Camphor 0,05 1140 0,07 1147 35 1152 Menthone 0,01 1152 0,01 1153 36 1157 Nonen-1-ol <(3Z)-> 0,01 1156 0,01 1158

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

37 1159 Isopulegol 0,01 1160 38 1164 Pinocarvone 0,02 1164 0,02 1165 39 1166 Terpineol< -> 0,01 1166 0,01 1167 0,02 1167 40 1169 Lavandulol 0,02 1167 𝛽𝛽 41 1173 Ethylbenzoate 0,03 1170 0,02 1174 0,01 1174 42 1177 Terpinèn-4-ol 5,10 1176 0,82 1178 0,37 1178 43 1182 Acétophenone<ρ-méthyl-> 0,01 1182 44 1182 Cymèn-8-ol <ρ-> 0,05 1185 0,02 1183 7,90 1183 45 1185 Cryptone 0,02 1184 0,01 1186 0,04 1186 46 1191 Methyl salicylate 0,25 1192 0,91 1192 47 1192 Dihydro carvone 0,01 1203 48 1196 Methyl chavicol 0,03 1206 0,02 1197 49 1198 Shisofuran 1,81 1199 50 1199 Terpinèol<γ-> 1,87 1190 0,93 1200 51 1200 Dihydro carvone 0,02 1202 0,01 1201 52 1205 Verbenone 0,01 1206 53 1213 Octanol acétate 0,04 1214 0,02 1214 0,01 1214 54 1216 Carvéol 0,05 1210 0,02 1217 55 1219 Nonadienol <(2E,4E)-> 0,03 1218 0,02 1220 0,01 1220 Sabinène hydrate acetate (Ac vs, 56 1221 IPP) 0,02 1222 0,02 1222 57 1232 Fenchyl acetate 0,09 1233 58 1241 Cumin aldéhyde 0,37 1237 0,29 1242 0,25 1242 59 1243 Carvone 0,95 1242 0,49 1244 1,08 1244 60 1250 Anis aldehyde <ρ-> 0,06 1251 0,03 1251 0,06 1251 61 1250 Chavicol 0,67 1258 0,64 1251 0,68 1251 62 1282 Néryl formate 0,13 1270 0,10 1283 0,18 1283 63 1284 Anéthol <(E)-> 1,01 1283 2,19 1285 1,60 1285 64 1285 Terpinèn-7-al <α-> 0,05 1280 0,02 1286 65 1291 Terpinèn-7-al 0,04 1287 0,03 1292 0,03 1292 66 1293 Décadienal <(2E,4Z)-> 0,01 1294 0,01 1294 67 1298 Acétophénone <3'-methoxy-> 0,02 1299 68 1298 Géranyl formate 0,02 1299 69 1299 Carvacrol 0,06 1302 0,05 1300 0,07 1300 70 1316 Decadiénal<(2E,4E)-> 0,02 1314 1317 0,01 1317 71 1349 Terpinyl acétate <α-> 0,11 1347 0,09 1350 0,07 1350 72 1359 Eugénol 28,21 1366 29,34 1360 31,03 1360 73 1375 Linalool isohutanoate 0,03 1383 0,02 1376 74 1384 Damascénone <(E)- -> 0,11 1385 0,09 1385 0,11 1385 75 1388 Duprezianène <11-> 0,02 1389 𝛽𝛽

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

76 1390 Elemène< -> 1,03 1390 0,65 1391 0,42 1391 77 1392 Jasmone<( Z)-> 0,03 1399 0,03 1393 𝛽𝛽 78 1403 Méthyl eugénol 39,39 1418 41,65 1404 39,61 1404 79 1425 Méfranal 0,02 1424 80 1432 Copaène< -> 0,06 1427 0,05 1433 81 1439 Guaiène <α-> 0,04 1436 0,03 1440 𝛽𝛽 82 1441 Aromadendrène 0,02 1445 0,02 1442 83 1451 Himachalène <α-> 0,01 1452 84 1454 Humulène <α-> 1,90 1452 1,36 1455 0,93 1455 85 1456 Patchoulène <α-> 0,01 1447 0,01 1457 86 1459 Sesquisabinène 0,08 1460 87 1462 Aromadendrane 0,08 1458 0,06 1463 88 1463 Cadina-1(6),4-diene 0,03 1461 0,02 1464 89 1467 Ethyl cinnamate <(E)-> 0,02 1464 0,01 1468 0,03 1468 90 1473 Aristolochene <4,5-di-epi-> 0,03 1467 0,02 1474 0,03 1474 91 1477 Chamigrène < -> 0,26 1473 0,13 1478 92 1477 Gurjunène <γ-> 0,08 1478 0,10 1478 𝛽𝛽 93 1479 Muurolène <γ-> 0,56 1479 0,42 1480 0,38 1480 94 1488 Aristolochène 0,73 1483 0,52 1489 1,15 1489 95 1490 Selinène < > 0,90 1492 0,67 1491 0,57 1491 96 1492 Méthyl isoeugénol <(E)-> 0,12 1497 0,10 1493 0,15 1493 𝛽𝛽 97 1500 Isodaucène 0,40 1502 0,29 1501 0,33 1501 98 1505 Farnesène <(E,E)-α-> 0,19 1506 99 1506 Premnaspirodiene 0,02 1504 0,01 1507 100 1507 Bisabolène<( Z)-α-> 0,10 1507 0,09 1508 101 1512 Amorphène< -> 0,14 1511 0,07 1513 102 1520 Myrac aldehyde 0,01 1517 0,01 1521 0,04 1521 𝛽𝛽 103 1522 Selinène <7-epi-α-> 0,02 1514 0,02 1523 0,09 1523 104 1523 Cadinène < -> 0,25 1521 0,18 1524 0,37 1524 105 1525 Chavibetol acétate 0,02 1526 𝛽𝛽 106 1533 Cuprenène <γ-> 0,01 1530 0,01 1534 0,02 1534 107 1538 Cadinène <α-> 0,01 1535 0,01 1539 0,02 1539 108 1545 Calacorène <α-> 0,01 1540 0,01 1546 0,01 1546 109 1551 SilphiperfoI-5-en-3-one 0,01 1553 0,01 1552 0,01 1552 110 1557 Elemicin 0,03 1557 0,04 1558 0,09 1558 𝛽𝛽 111 1563 Nerolidol<(E)-> 0,01 1564 0,01 1564 0,03 1564 112 1567 Caryophyllène oxyde 0,04 1549 0,03 1568 0,06 1568 113 1572 Caryophyllènyl alcohol 0,01 1569 0,01 1573 0,02 1573 114 1577 Santalénone 0,04 1578 115 1578 Spathulénol 0,02 1587 0,01 1579 0,02 1579

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

116 1583 Caryophyllène oxyde 1,42 1580 0,85 1584 1,45 1584 117 1594 Salvial-4(l4)-en-1-one 0,02 1590 0,01 1595 118 1595 Turmérone 0,01 1596 0,03 1596 119 1596 Fokiénol 0,04 1597 0,01 1597 120 1608 Humulène epoxyde II 0,19 1605 0,13 1609 0,24 1609 121 1619 Bisaboladien-4-ol <2,(7Z)-> 0,09 1595 0,07 1620 0,10 1620 122 1625 Citronéllyl pentanoate 0,03 1626 0,01 1626 0,03 1626 123 1659 Selin-11-en-4-α-ol 0,12 1654 0,13 1660 0,26 1660 124 1631 Eremoligénol 0,04 1631 0,03 1632 125 1675 Santalol <(Z)-α-> 0,06 1676 126 ri=1567 Cinnamaldehyde, 3,4-dimethoxy- 0,11 1779 0,06 1779 0,09 1779 127 1842 Pseudoisoeugenyl 2-methylbutyrate <(E)-> 0,01 1843 0,01 1843 0,02 1843 128 1889 Farnésyl acétone <(5Z,9E)-> 0,03 1897 0,02 1890 0,03 1890 129 1913 Farnésyl acétone<(5E,9E)-> 0,01 1918 0,01 1914 0,01 1914 130 1 961 Géranyl linalool<(Z,Z)-> 0,13 1952 0,13 1962 0,20 1962 131 1987 Géranyl linalool <(E,Z)-> 0,04 1986 0,04 1988 0,06 1988

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.2.2. Etude de la cinétique d’extraction des principales classes chimiques (pourcentages différentiels)

 Extraction par HD-MO

La figure 12 relative aux fonctions chimiques montre l’écrasante majorité des éthers, constitués essentiellement de méthyle eugénol, avec des pourcentages varient entre 60,86% à 75,14 % durant toutes les étapes d’extraction donc on constate que la répartition de ces fonctions chimiques est homogène dans les cites exogènes et endogènes de la graine de Piper cubéba. Ainsi que les alcools (11,13% à 29,26 %), constitués essentiellement de l’eugénol, sont extraits avec un pourcentage élevé durant la deuxième étape d’extraction des cites endogènes.

Les familles des hydrocarbures monoterpéniques et les sesquiterpéniques (figure 13) donnent des allures de courbes non linéaires. Ces dernières montrent que les plus grands % de ces classes chimiques sont collectés aux temps 2 mn et 20 mn l’étape de l’extraction des essences situé dans les sites exogènes facilement accédés.

Quant aux autres classes chimiques (figure 14), les cétones et aldéhydes, on observe des allures de courbe non linéaires aussi avec des formes similaires. Ces dernières indiquent que les plus grands % (3,49 et 1,36% respectivement) de ces classes sont collectés aux temps 20 mn qui représente le point (M) où pourrait exister une phase intermédiaire où coexistent les deux phénomènes des étapes 1 et 2 (extraction à partir des cites endogènes et exogènes au même temps).

Les esters sont présents au sein de toutes les fractions à des % différents. Une partie de ces composés (obtenus au début d’extraction) ne sont pas issus d’une réaction d’estérification vu le temps relativement court pour l’activation de la réaction par contre ceux obtenus à la fin du processus pourrait éventuellement provenir d’une réaction d’estérification des acides gras libres [38,39].

Généralement, il faut être méticuleux dans la détermination du temps d’extraction optimal et il ne suffit pas de se contenter des courbes cinétiques quantitatives (rendement global) mais une étude cinétique qualitative et semi-quantitative (GC et GC-MS) doit être effectuée afin de connaître le temps opportun pour limiter le temps d’extraction.

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

Tableau III. 9. Variation du % des familles chimiques en fonction de la durée d’extraction par HD-MO t t (mn) Mono- Sesqui- Alcools Cétones Aldéhydes Ethers Esters (mn) différentiel terpénes terpénes % % % % % total % %

2 2 17,48 5,51 11,13 0,07 0,11 65,49 0,04 5 1 7,57 4,02 13,22 0,00 0,00 75,14 0,00 11 3 2,02 3,86 29,69 0,94 1,04 60,86 0,45 20 3 0,41 4,59 25,07 3,49 1,36 63,02 0,25 33 4 4,95 2,65 21,59 0,85 0,99 68,51 0,03 48 2 4,03 3,30 26,98 0,59 0,66 63,25 0,35

80,00%

60,00%

40,00% Alcools % ether

20,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60

Figure III.12. Variation du % en alcools et éthers en fonction du temps (HD-MO)

108

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

20,00% Hydrocarbures monoterpéniques % 16,00% Hydrocarbures sesquiterpéniques % 12,00%

8,00%

4,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60

Figure III.13. Variation du % en hydrocarbures monoterpéniques et sesquiterpéniques en fonction du temps (HD-MO)

4,00%

3,00%

2,00% Cétones % Aldéhydes % Esters %

1,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60

Figure III.14.Variation du % en cétones, aldéhydes et esters en fonction du temps (HD-MO)

109

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

 Extraction par HD-MO-SV

Durant l’extraction par la technique HD-MO-SV, on a enregistré une forte variation de pourcentage en classes chimiques entre le premier et les deux derniers points (Figures III-15, 16 et 17) où on a remarqué une légère diminution des hydrocarbures sesquiterpéniques, des aldéhydes, des cétones et des alcools, et une augmentation non négligeable en hydrocarbures monoterpéniques, des éthers et des esters. Cette forte variation est favorisée par la nature du processus d’extraction dominé par l’isolement des composés situés directement sur les sites exogènes facilement accédés. Le pourcentage de ces composés chimiques demeure constant entre les deux derniers points (Figures III-15, 16 et 17) ce qui implique que le processus fait extraire l’huile située dans les cites endogènes et celle restée dans les cites exogènes au même temps.

Tableau III.10. Variation du % des familles chimiques en fonction de la duré d’extraction par (HD-MO-SV)

t (mn) t(mn) Mono- Sesqui- différentiel total terpènes terpènes Alcools Cétones Aldéhydes Ethers Esters ‘(cumulé) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 5 5 0,98 6,59 38,22 1,42 0,64 41,29 0,39 7 12 7,23 4,72 33,33 0,70 0,45 48,69 0,51 8 20 7,23 4,72 33,31 0,70 0,45 48,69 0,53

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Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

50,00%

40,00% Alcools % ether

30,00% 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Figure III.15.Variation du % en alcools et éthers en fonction du temps (HD-MO-SV)

10,00%

8,00%

6,00%

4,00% Hydrocarbures monoterpéniques % Hydrocarbures 2,00% sesquiterpéniques %

0,00% 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Figure III.16.Variation du % en monoterpènes et sesquiterpènes en fonction du temps (HD- MO-SV)

111

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

1,60% Cétones % Aldéhydes % Esters % 1,20%

0,80%

0,40%

0,00% 4 9 14 19 24

Figure III.17. Variation du % en cétones, aldéhydes et ester en fonction du temps (HD-MO- SV)

112

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III 2.3. Cinétique d’extraction des composés chimiques en quantités cumulées

 Principaux composés identifiés  Extraction HD-MO

Le tracé des rendements globaux (masses cumulées) des principaux composés identifiés sont illustrés sur les figures 18 et 19. Nous constatons que pour le Méthyl eugénol et l’Anéthole, le profil des courbes cinétiques suit un profile quasi linéaire et quasi constant durant toutes les étapes d’extraction, ce qui confirme la répartition homogène de ces composés dans les cites exogènes et endogènes. Par ailleurs, le Myrcène et le Cinéole<1,8-> suivent un profile linéaire avec une pente décroissante, durant la 1 ère étape de l’extraction des cites exogènes (2 et 11min), suivie par un palier constant dans la deuxième étape d’extraction des cites endogènes alors que pour l’eugénol, durant la 1 ère étape, suit un profile linéaire croissant suivi par un palier constant avec des pourcentages élevés. Ce qui confirme que les cites endogènes des graines de Piper cubéba sont riches en eugénol. De même, la vitesse d’extraction (pente) est liée directement à la polarité et à la constante diélectrique des constituants de l’essence puisque nous constatons que certains composés de forte polarité tel que l’eugénol sont extraits à une vitesse d’extraction plus élevée que l’Anéthole et le Myrcène dont la polarité est plus faible.

Tableau III.11.: Rendement différentielle des principaux composés identifiés (HD-MO)

temps(mn) 2 5 11 20 33 48 Myrcène (%) 13,80 5,72 0,17 0,07 3,79 1,03 Cinéole <1,8-> (%) 6,63 2,23 0,39 0,22 1,47 2,00 Anéthole <(E)-> (%) 4,44 2,37 5,09 1,98 2,49 5,07 Eugénol (%) 8,49 12,00 25,11 19,44 18,91 18,85 Méthyl eugénol (%) 52,51 69,29 51,02 55,01 62,29 53,99 Tableau III. 12. Rendement cumulés des principaux composés identifiés (HD-MO)

temps (mn) 2 5 11 20 33 48 Myrcène (%) 13,80 10,21 2,07 1,44 3,05 2,94 Cineole <1,8->(%) 6,63 4,68 1,20 0,89 1,29 1,33 Anéthole <(E)->(%) 4,44 3,52 4,79 3,90 2,93 3,05 Eugénol(%) 8,49 10,05 22,26 21,36 19,68 19,63 Méthyl eugénol(%) 52,51 59,97 52,72 53,45 59,52 59,20

113

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

40,00% Eugenol Anethole <(E)->

30,00%

20,00% quantité extraite (%) extraite quantité 10,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60 temps (mn)

Figure III.18. Rendement cumulés des principaux composés identifiés l’anéthole (E) et l’eugénol en fonction du temps (HD-MO)

70,00%

60,00%

50,00%

40,00% Cineole <1,8-> Methyl eugenol 30,00% Myrcene quantité extraite (%) extraite quantité 20,00%

10,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60 temps(mn) Figure III.19. Rendements cumulés des principaux composés identifiés cinéole, méthyle eugénol et myrcène en fonction du temps (HD-MO).

114

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

 Extraction HD-MO-SV Pour l’Eugénol, le Méthyle Eugénol et l’Anéthole, nous constatons que la vitesse d’extraction (pente) par HDMO-SV (figure III-20-a et b) est quasiment constante. Cependant pour le Myrcène et le 1,8 Cinéole, un profile parabolique est observé (figure III-20-b) ce qui implique un comportement différent de chaque composé vis-à-vis de cette technique utilisée. En effet, plusieurs paramètres (Pression, Débit, Température….) rentrent en jeu pour diriger ces vitesses d’extraction. .

Tableau III.13. Rendements différentiels des principaux composés identifiés (HD-MO-SV)

temps (mn) 5 12 20 Méthyl eugénol (%) 39,39 41,65 39,61 Eugénol (%) 28,21 29,34 31,03 Myrcène (%) 0,30 5,43 0,17 Anéthole <(E) -> (%) 1,01 2,19 1,60 Cinéole <1,8-> (%) 0,44 1,85 0,36

Tableau III.14. Rendement cumulés des principaux composés identifiés (HD-MO-SV)

temps (mn) 5 12 20 Méthyl eugénol (%) 39,39 40,47 39,97 Eugénol (%) 28,21 28,75 30,09 Myrcène (%) 0,30 2,76 1,24 Anéthole <(E) -> (%) 1,01 1,58 1,59 Cinéole <1,8-> (%) 0,44 1,12 0,67

115

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

43,00%

41,00%

39,00%

37,00% Methyl eugenol 35,00% Eugenol 33,00%

quantité extraite (%) extraite quantité 31,00%

29,00%

27,00%

25,00% 0 5 10 15 20 25 temps (mn) Figure III.20-a. Rendement cumulés des principaux composés identifiés en fonction du temps par HD-MO-SV (Méthyle eugénol et eugénol)

5,00%

Anethole <(E)-> Cineole <1,8-> Myrcene quantité extraite (%) extraite quantité

0,00% 0 5 10 15 20 25 temps (mn) Figure III.20-b. Rendement cumulés des principaux composés identifiés en fonction du temps par HD-MO-SV (1,8 Cinéole, myrcène et anéthole)

116

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

 Les classes chimiques  Extraction par HD-MO

Il est à constater qu’une même allure de courbe (figures 21 et 22) est observée dans le cas des classes chimiques similaire au cas précédent (principaux composés identifiés). En effet, toutes les familles chimiques évoluent avec le temps suivant un profile de courbe quasi linéaire dans l’intervalle de temps 2-48 mn avec des pentes différentes, à l’exception de la courbe des Alcools, qui présente durant la 1ère phase, une vitesse d’extraction qui augmente en fonction du temps puis elle diminue légèrement durant la 2ème phase. De même, on observe une diminution de la vitesse d’extractions des éthers et des monoterpènes en fonction du temps en parallèle avec l’augmentation de la vitesse d’extraction des alcools, des cétones, des esters, des aldéhydes et sesquiterpènes.

En effet, le début de l’extraction des essences, situées dans les cites exogènes, est contrôlé par la dissolution de ses composés chimiques dans le solvant alors que la fin de l’extraction est régie par un autre phénomène qui est le transfert de matière dans les sites intraparticulaires, ce qui donne une idée sur la répartition des fonctions chimiques : pour les hydrocarbures monoterpéniques et sesquiterpéniques semblent être localisés dans les sites exogènes, et les alcools, les cétones, les esters et les aldéhydes dans les sites endogènes tandis que les éthers sont réparties d’une façon homogène dans ces sites.

Tableau III. 15. Rendement cumulés des fonctions chimiques (HD-MO) t (mn) 2 5 11 20 33 48 Monoterpénes% 17,48 13,07 4,11 2,93 4,32 4,30 sesquiterpéne % 5,51 4,85 4,04 4,22 3,14 3,15 Alcools % 11,13 12,06 26,35 25,94 22,95 23,19 Cétones % 0,07 0,04 0,77 1,63 1,10 1,07 Aldéhydes % 0,11 0,06 0,86 1,02 1,00 0,98 Ethers% 65,49 69,78 62,55 62,70 66,69 66,49 Esters % 0,04 0,02 0,37 0,33 0,13 0,14

117

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

30,00%

25,00%

20,00%

Alcools % 15,00% sesquiterpéne % Cétones % Esters % quantité extraite % extraite quantité 10,00% Aldéhydes %

5,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60 temps (mn)

Figure III.21. Variation des rendements cumulés des classes chimiques Sesquiterpène, cétones, esters, aldéhydes et alcools en fonction du temps (HD-MO)

80,00%

70,00%

60,00%

50,00% ether 40,00% monoterpénes % 30,00% quantité extraite % extraite quantité 20,00%

10,00%

0,00% 0 10 20 30 40 50 60 temps (mn)

Figure III.22. Rendement cumulés des fonctions chimiques Ethers et monoterpènes en fonction du temps (HD-MO)

118

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

 Extraction par HD MO-SV

La vitesse d’extraction des classes chimiques isolées par la technique HD-MO-SV est presque constante (Figures III.23 et 24), vue la linéarité des courbe obtenues (vitesse en fonction du temps), ce qui confirme que l’extraction par HD-MO-SV de tous les composés chimiques des sites exogènes et endogènes se fait au même temps et de même vitesse.

Tableau III.16. Rendement cumulés des fonctions chimiques

t (mn) 5 12 20 Classes chimiques Hydrocarbures Monoterpéniques % 0,98 3,98 5,88 Hydrocarbures sesquiterpéniques % 6,59 5,69 5,12 Alcools % 38,22 35,87 34,37 Cétones % 1,42 1,07 0,85 Aldéhydes % 0,64 0,55 0,49 Ethers% 41,29 44,84 47,10 Esters % 0,39 0,45 0,50

50,00%

40,00%

30,00% quantité extraite % extraite quantité monoterpénes % Esters % 20,00% ether

10,00%

0,00% 0 5 10 15 20 25 temps (mn)

Figure III.23. Rendements cumulés des classes chimiques monoterpènes, esters et éthers en fonction du temps (HDMO-SV)

119

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

50,00%

40,00%

30,00% sesquiterpéne %

Alcools % 20,00%

quantité extraite % extraite quantité Cétones %

Aldéhydes % 10,00%

0,00% 0 5 10 15 20 25 temps (mn)

Figure III.24. Rendements cumulés des classes chimiques Sesquiterpènes, alcools, cétones et aldéhydes en fonction du temps (HDMO-SV)

III.3. ETUDE COMPARATIVE ENTRE L’HUILE ESSENTIELLE EXTRAITE PAR

HDMO ET HDMO-SV A tf (TEMPS FINALE)

En consultant les pourcentages cumulés obtenus au temps final (tf), correspondant au temps total d’extraction, une quantité importante de monoterpènes représentés par le Myrcène, de sesquiterpènes, d’alcools (eugénol), de cétones et d’aldéhydes ont été isolée avec la technique HD-MO comparée à la HD-MO-SV (Figure III.25 et 26). En parallèle, on a enregistré un pourcentage en esters et en éthers (notamment le méthyle eugénol et Cinéol <1,8>) qui est plus élevé dans HD-MO-SV que dans HD-MO.

Ceci peut être expliqué que la durée d’extraction a un effet non négligeable sur la composition chimique. En effet le t HDMO=48mn est plus grand que t HDMO SV=20mn, cette prolongation a conduit aux réactions d’hydratation de méthyle eugénol d’où l’augmentation de l’eugénol .

D’où, on peut conclure que la technique HD-MO-SV permet d’éviter mieux les réactions thermiques et hydrolytiques.

120

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

50 hdmo 45 hdmosv

0 monoterpénes sesquiterpéne Alcools Cétones Aldéhydes ether Esters

Figure III.25. Variation des pourcentages des fonctions chimiques extraites par HDMO et

HDMO-SV à tf (temps final ou temps total d’extraction)

45 hdmo 40 hdmosv 35

0 Myrcene (%) Cineole <1.8->(%) Anethole <(E)->(%) Eugenol(%) Methyl eugenol(%)

Figure III.26. Variation des pourcentages des principaux composés extraits par HDMO et

HDMO-SV à tf (temps final ou temps total d’extraction)

121

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

III.4. TAUX DES EPOXYDES ET D’HYDRATATION DANS L’HUILE ESSENTIELLE DES GRAINES DE PIPER CUBEBA

D’après la figure 29, on confirme que le taux des époxydes et d’hydratation est plus important dans l’HE extraite par HD-MO (12,60%, 1,97% respectivement à tf) que dans celle extraite par HD-MO-SV (4,9%, 1,92% respectivement à tf ). L’analyse de ces huiles essentielles par GC/GC-MS (tableau 8 et 6), nous a donné la variation des taux des époxydes et d’hydratation en fonction du temps (figure 27 et 28 ) où on a constaté que le taux des époxyde est très élevé (5,02%) dans l’HE extraite par HD-MO après 20 min d’extraction alors qu’il est très faible dans l’HE extraite par HD-MO-SV et il reste constant au alentours (1,12 et 1,9%) de même pour le taux d’hydratation (1,72% après 33min d’extraction par HD-MO et 1,22% après 12 min d’extraction par HD-MO-SV) .

On conclue que l’étude de la cinétique d’extraction par HD-MO -SV est plus facile et plus pratique, du fait de la diminution importante du temps de chauffage et d’énergie consommée ce qui implique une réduction significative des réactions de dégradation de type hydrolytique et oxydative.

2 1,88 1,9 1,8 1,6 1,4 1,22 1,2 1,12

1 oxide 0,8 hydro 0,6 0,4 0,4 0,3 0,2 0 5min 12min 20min

Figure III.27. Variation des taux des époxydes et d’hydratation dans l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO –SV en fonction du temps

122

Chapitre III Cinétique d’extraction assistée par HD-MO et HD-MO-SV

6 5,02 5

2,84 3 oxide 1,72 2,05 hydro 2 1,72

1 0,61 0,36 0 0 0,14 0 0,11 0 2mn 5mn 11mn 20mn 33mn 48mn

Figure III.28. Variation des pourcentages des composés d’oxydation et d’hydratation dans l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO en fonction du temps

14 12,60 12

8 oxide 6 4,9 hydro 4 1,92 1,97 2

0 HD-MO-SV HD-MO

Figure III.29. Variation des pourcentages des composés d’oxydation et d’hydratation dans

l’huile essentielle des graines de Piper cubéba extraite par HD-MO et HD-MO-SV à tf

123

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Le but de cette étude est de déterminer l’effet de l’irradiation gamma sur le rendement en huile essentielle, l’effet antioxydant, l’effet antibactérien, la teneur en phénols et en flavonoïdes des graines de Piper cubéba. Les échantillons de Piper cubéba sont conditionnés dans des sachets alimentaires stériles de 300g et traités à différentes doses d’irradiation (0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10 kGy) par une source de cobalt 60. Le traitement des graines de Piper cubéba est fait à l’unité d’irradiateur de recherche du Centre de Recherche Nucléaire d’Alger (CRNA) implanté au boulevard Frans Fanon en face l’hôtel Ourassi, durant la période du 01 Avril au 08 Avril 2014 et les extractions des huiles essentielles et les huiles fixes ont été faites durant le mois de mai 2014.

IV.1. Les conditions d’irradiation

• Source de rayonnement

Irradiateur pilote :

Au cours de ce travail, une source de rayonnement Gamma de 60Co est utilisée. L’irradiateur pilote du Centre de Recherche Nucléaire d’Alger (CRNA) est composé de trois 60 sources cylindriques de Co de type COP4 fabriquées par ORIS (France). Elle sont disposées verticalement dans un porte-source en acier inoxydable.

Les sources de dimenssion 384mm de hauteur et de 26,6mm de diamétre ainsi disposées forment une hauteur active de 1152mm. Pour des raisons pratiques une cale de 85mm a été déposée sous la source du bas.

En position d’irradiation, la partie inférieure de cette source se trouve à 350mm au- dessus de la platine. L’activité iniale au 08.10.2002 date d’installation de la source, était de 13,32.1014Bq soit 35990 Ci. L’activité de la source était de 7612,83 Ci au mois d’avril 2014.(FigureVI.1.)

Débit de dose à la distance de 30 cm de la source et une hauteur de 90 cm est de 5.2 Gy/mn.

124

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Tableau IV.1. Le débit de dose et la durée d’exposition aux rayons ɣ des graines de piper cubéba

Dose (kGy) Débit de dose (Gy/mn) Durée d’exposition 0,1 5,2 19mn 1 5,2 3h 2 5,2 6h 24 mn 5 5,2 16h 10 5,2 32h

La durée d’irradiation est calculée à partir de la formule suivante : Dose (kGy)= I(Gy/mn)* temps

Figure IV. 1. Schéma de l’irradiateur pilote de CRNA

125

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

 Condition opératoire de l’extraction des huiles essentielles Masse =100g Volume d’eau=250 ml Puissance de chauffage=801W Temps d’extraction =30mn Les graines sont broyées dans une presse à café avec du l’Azote liquide (broyage cryogénique) durant 30 secondes et passées à l’extraction par HD-MO (Hydrodistillation assistée par micro-onde).  Condition opératoire de l’extraction des extraits éthanoliques Masse=60g Puissance=374W Broyage cryogénique Volume de solvant (éthanol) = 200ml Temps d’extraction =30mn

126

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

VI .2.Variation du rendement des huiles essentielles extraites par HD-MO en fonction de la dose des rayons gamma

Dans cette partie, on a étudié la variation des rendements des huiles essentielles récupérées par l’ hydrodistillation assistée par micro-onde en fonction des doses des rayons gamma. Les résultats des rendements sont illustrés sur la figure ci-dessous :

Les rendements 1,02

0,82 0,82 0,83 0,82 0,84

0,0 0,1 1,0 2,0 5,0 10,0

igure VI. 2. Variation du % des rendements des HE de Piper cubéba obtenus par HD-MO en fonction de la dose d’irradiation γ

Suite à l’application des différentes doses d’irradiation, on constate une légère augmentation de rendements en huile essentielle pour les échantillons traités par rapport au témoin non irradié. Avec la dose 0,1 kGy, on a obtenu un rendement très important à raison de 1,02%. Plusieurs recherches ont traité les effets de l’irradiation sur le rendement d’extraction, en effet, l'ionisation des fruits augmente de manière significative le rendement en jus de raisin et de fraises sans en affecter sa qualité [42]. Les travaux de Wang et Chao réalisés en 2002 et 2003 ont montré que l’irradiation augmente la perméabilité des cellules végétales ce qui entraîne une augmentation du transfert de masse [43, 44, 45, 46]. Les études de Nayak et al en 2006 ont prouvé que l’irradiation améliore l’extraction solide-liquide [47], alors que d’autres recherches ont prouvé qu’ils peuvent paraitre comme négatif tels que les travaux de Hang et Mau en 2007 qui ont montré que l’irradiation n’aucun effet sur le rendement en huile de Antrodia camphorata mycelia traitée par les doses 2,5 ; 5 et 10 kGy [48].

127

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

VI .3. L’effet de l’irradiation sur les différentes classes chimiques

Pour chaque HE des graines de Piper cubéba irradiées, une quantité d’essence a été récupérée pour être analysée par GC et GC/MS. Pour ces dernières, toutes les conditions opératoires on été maintenues identiques aux conditions citées dans le chapitre II. Le tableau 2 dresse l’analyse qualitative et semi-quantitative des essences des graines de Piper cubéba irradiées par différentes doses, ce qui a permis d’obtenir les chromatogrammes présentés en annexe B (figure.B.13 jusqu’à 17). L’extraction des huiles essentielles de Piper cubéba par HD MO suivit par GC- GC/MS nous a permis d’identifier 109 composés des différentes familles chimiques, les composés identifiés sont mentionnés dans le tableau ci- dessous (Tableau 2).

128

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Tableau IV. 2. La composition chimique de l’huile essentielle de Piper cubéba en fonction de différentes doses d’irradiation

Dose (kGy) 0 0,1 1 2 5 10 KI réf Composés Area% KI Area% KI Area% KI Area% KI Area% KI Area% KI 1 930 Thujène <α> 0,02 931 0,08 929 0,04 931 0,03 931 0,08 931 0,07 931 2 939 Pinène <α> 0,07 940 0,17 938 0,11 940 0,08 940 0,17 940 0,16 940 3 960 Benzaldéhyde 0,01 961 0,01 959 0,01 961 0,01 961 0,01 961 0,01 961 4 975 Sabinène 0,11 976 0,26 974 0,14 976 0,13 976 0,24 976 0,23 976 5 979 Pinène < > 0,09 980 0,2 978 0,14 980 0,12 980 0,21 980 0,19 980 6 990 Myrcène 6,71 991 11,56 989 8,85 991 8,59 991 12,27 991 11,18 991 𝛽𝛽 7 1002 Phellandrène<α> 0,02 1003 0,09 1001 0,06 1003 0,07 1003 0,08 1003 0,08 1003 8 1002 Carène < -2-> 0,01 1003 0,05 1001 0,05 1003 0,05 1003 0,04 1003 0,06 1003 9 1017 Terpinène <α> 0,09 1018 0,18 1016 0,14 1018 0,13 1018 0,18 1018 0,17 1018 𝛿𝛿 10 1024 Cymène <ρ-> 0,18 1025 0,33 1023 0,24 1025 0,27 1025 0,34 1025 0,27 1025 11 1029 Limonène 0,39 1030 0,71 1028 0,57 1030 0,57 1030 0,76 1030 0,68 1030 12 1031 Cinéole <1,8-> 2,75 1032 3,71 1030 3,17 1032 3,08 1032 3,99 1032 3,66 1032 13 1037 Ocimène <(Z)- -> 0,05 1038 0,08 1036 0,06 1038 0,06 1038 0,08 1038 0,07 1038 14 1050 Ocimène <(E)- -> 0,69 1051 1,15 1049 0,97 1051 0,94 1051 1,15 1051 1,04 1051 𝛽𝛽 15 1059 Terpinène < -> 0,15 1060 0,25 1058 0,21 1060 0,2 1060 0,24 1060 0,24 1060 𝛽𝛽 16 1088 Mentha-2,4(8)-diène <ρ-> 0,21 1089 0,32 1087 0,28 1089 0,28 1089 0,32 1089 0,31 1089 𝛿𝛿 22 1089 Guaiacol 0,02 1090 0,01 1088 0,01 1090 0,01 1090 0,01 1090 0,01 1090 17 1092 Epoxymyrcène <6,7-> 0,02 1093 0,03 1091 0,02 1093 0,02 1093 0,03 1093 0,02 1093 18 1096 Linalool 0,78 1097 0,78 1095 0,75 1097 0,73 1097 0,78 1097 0,75 1097 19 1103 Perillène 0,01 1104 0,01 1102 0,01 1104 0,01 1104 0,01 1104 0,01 1104 23 1107 Phenyl ethyl alcohol 0,01 1108 0,01 1106 0,01 1108 0,01 1108 0,01 1108 129

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

20 1110 Menthatriène 0,02 1111 0,02 1109 0,02 1111 0,01 1111 0,02 1111 0,01 1111 25 1110 Menthatriène <1,3,8-ρ-> 0,01 1111 0,01 1109 0,01 1111 0,01 1111 0,01 1111 0,01 1111 24 1120 Sabina ketone 0,03 1121 0,03 1119 0,03 1121 0,03 1121 0,03 1121 0,03 1121 26 1138 Thujanol 0,02 1139 0,02 1137 0,02 1139 0,02 1139 0,02 1139 0,02 1139 27 1142 Epoxy-ocimène<(E)-> 0,01 1143 0,02 1141 0,01 1143 0,01 1143 0,02 1143 0,01 1143 28 1159 Pinene oxyde < -> 0,01 1160 0,01 1158 0,01 1160 0,01 1160 0,01 1160 0,01 1160 29 1166 Terpinéol< -> 0,01 1167 0,01 1165 0,01 1167 0,01 1167 0,01 1167 0,02 1167 𝛽𝛽 30 1173 Ethylbenzoate 0,01 1174 0,01 1172 0,01 1174 0,01 1174 0,01 1174 0,01 1174 𝛿𝛿 31 1177 Terpinen-4-ol 0,72 1178 0,73 1176 0,74 1178 0,72 1178 0,77 1178 0,73 1178 32 1182 Cymen-8-ol <ρ-> 0,03 1183 0,04 1181 0,03 1183 0,04 1183 0,04 1183 0,04 1183 33 1188 TerpineoI <α> 0,9 1189 0,92 1187 0,98 1189 0,91 1189 0,9 1189 0,96 1189 34 1191 Méthyl salicylate 0,11 1192 0,08 1190 0,09 1192 0,08 1192 0,07 1192 0,08 1192 35 1194 Decenal<(4Z)-> 0,01 1195 0,01 1193 0,01 1195 0,01 1195 0,01 1195 0,01 1195 36 1196 Méthyl chavicol 0,98 1197 0,83 1195 0,81 1197 0,76 1197 0,8 1197 0,79 1197 37 1208 Pipéritol 0,02 1207 0,02 1207 0,02 1207 0,02 1207 0,02 1207 0,02 1209 38 1213 Octanol acetate 0,01 1212 0,01 1212 0,01 1212 0,01 1214 0,01 1214 0,01 1214 Sabinene hydrate acétate 39 1221 (Ac vs, IPP) 0,05 1220 0,04 1220 0,05 1220 0,05 1222 0,04 1222 0,04 1222 40 1241 Cumin aldéhyde 0,15 1240 0,11 1240 0,1 1240 0,09 1242 0,09 1242 0,1 1242 41 1243 Carvone 0,06 1242 0,05 1242 0,04 1242 0,05 1244 0,04 1244 0,04 1244 42 1250 Anis aldehyde <ρ-> 0,01 1249 0,01 1249 0,01 1249 0,01 1251 43 1250 Chavicol 0,44 1249 0,69 1249 0,88 1249 0,75 1251 0,58 1253 0,72 1251 44 1270 Cinnamaldéhyde <(E)-> 0,01 1269 0,01 1269 0,01 1271 0,01 1266 0,01 1271 46 1263 Carvone oxyde 0,01 1262 0,01 1262 0,01 1262 0,01 1264 0,01 1271 0,01 1264 45 1267 Geranial 0,05 1266 0,03 1266 0,02 1266 0,04 1268 0,03 1268 0,03 1268 48 1284 Anéthole <(E)-> 0,17 1283 0,22 1283 0,21 1283 0,28 1285 0,16 1281 0,1 1285 47 1285 Terpinen-7-al <α-> 0,02 1284 0,01 1284 0,01 1284 0,01 1286 0,01 1278 0,01 1286 130

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

49 1287 Safrole 0,01 1286 0,01 1286 0,01 1286 0,01 1288 0,01 1283 0,01 1288 50 1291 Terpinen-7-al 0,02 1290 0,01 1290 0,01 1292 51 1293 Decadienal <(2E,4Z)-> 0,03 1292 0,03 1292 0,02 1292 0,03 1290 0,02 1290 0,01 1294 52 1299 Carvacrol 0,02 1298 0,02 1298 0,02 1298 0,02 1298 0,02 1298 0,02 1300 53 1316 Decadiénal<(2E,4E)-> 0,04 1315 0,05 1315 0,06 1315 0,05 1312 0,05 1312 0,03 1317 54 1338 Elemene < -> 0,03 1337 0,03 1337 0,04 1337 0,03 1337 0,03 1337 0,03 1339 55 1359 Eugénol 27,08 1358 29,06 1358 31,4 1358 31,09 1360 26,45 1361 29,09 1360 𝛿𝛿 56 1375 Ylangene <α> 0,14 1374 0,13 1374 0,14 1374 0,15 1372 0,13 1371 0,14 1376 57 1381 Géranyl acétate 0,07 1380 0,06 1380 0,06 1380 0,07 1382 0,07 1382 0,06 1382 58 1390 Elemene< -> 0,57 1389 0,4 1389 0,44 1389 0,43 1388 0,44 1388 0,51 1391 60 1403 Methyl eugénol 49,55 1402 38,94 1402 40,31 1402 40,69 1405 39,01 1405 37,76 1404 𝛽𝛽 59 1407 Isoeugénol <(Z)-> 0,02 1406 0,02 1406 0,01 1406 0,04 1405 0,02 1405 0,03 1408 61 1429 Dictamnol 0,02 1428 0,02 1428 0,01 1428 0,02 1429 3,85 1430 0,02 1430 63 1431 Thujopsene 0,01 1430 0,02 1430 0,02 1430 0,03 1433 0,02 1433 0,02 1432 62 1432 Copaéne< -> 0,04 1431 0,03 1431 0,02 1431 0,03 1430 0,03 1430 0,03 1433 64 1442 Farnesene <(Z)- -> 0,01 1441 0,02 1441 0,01 1441 0,01 1442 0,01 1444 0,02 1443 𝛽𝛽 65 1454 Humulène<α> 1,1 1453 0,83 1453 0,96 1453 0,93 1451 0,89 1451 1,04 1455 𝛽𝛽 66 1460 Aromadendrene 0,05 1459 0,04 1459 0,04 1459 0,04 1461 0,04 1458 0,05 1461 67 1463 Cadina-1(6),4-diène 0,02 1462 0,01 1462 0,01 1462 0,02 1461 0,01 1463 0,01 1464 69 1466 Ishwarane 0,02 1465 0,01 1465 0,01 1465 0,01 1465 0,01 1465 0,02 1467 70 1466 Caryophyllene <9-epi-(E)-> 0,12 1465 0,09 1465 0,1 1465 0,11 1471 0,1 1471 0,12 1467 68 1467 Ethyl Cinnamate <(E)-> 0,01 1466 0,01 0,01 1460 0,02 1468 71 1476 Cadina-1(6),4-diène drans-> 0,37 1475 0,25 1475 0,28 1475 0,29 1477 0,25 1476 0,3 1477 72 1482 Widdra-2,4(14 )-diène 0,33 1481 0,29 1481 0,34 1481 0,33 1481 0,31 1481 0,38 1483 73 1490 Selinène < -> 0,44 1489 0,37 1489 0,44 1489 0,42 1490 0,39 1490 0,48 1491 74 1492 Methyl isoeugénol <(E)-> 0,14 1491 0,13 1491 0,13 1491 0,15 1494 0,12 1494 0,02 1493 𝛽𝛽 75 1500 Isodaucene 0,29 1499 0,17 1499 0,19 1499 0,17 1499 0,18 1499 0,22 1501 131

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

76 1502 Patchoulène <γ-> 0,02 1501 0,01 1501 0,01 1501 0,01 1502 0,01 1502 0,02 1503 77 1505 Farnesene <(E,E)-α-> 0,08 1504 0,05 1504 0,06 1504 0,06 1505 0,05 1505 0,07 1506 78 1512 Amorphène< -> 0,04 1511 0,03 1511 0,04 1511 0,04 1509 0,03 1509 0,04 1513 80 1520 Myrac aldehyde 0,01 1519 0,01 1519 0,01 1519 0,01 1519 0,01 1519 0,01 1521 𝛿𝛿 79 1522 Selinène <7-epi-α-> 0,01 1521 0,01 1521 0,01 1521 0,01 1520 0,01 1520 0,01 1523 81 1523 Cadinene< -> 0,15 1522 0,12 1522 0,14 1522 0,14 1519 0,12 1521 0,15 1524 82 1525 Chavibetol acetate 0,03 1524 0,05 1524 0,03 1524 0,02 1524 0,02 1524 0,01 1526 𝛿𝛿 83 1534 Cadina-1,4-diene 0,01 1533 0,01 1533 0,01 1533 0,01 1533 0,01 1535 84 1538 Cadineène<α> 0,01 1537 0,02 1537 0,01 1537 0,02 1537 0,01 1537 0,01 1539 85 1545 Calacorène <α> 0,01 1544 0,01 1544 0,01 1544 0,01 1544 0,01 1546 86 1549 Elemol 0,06 1548 0,05 1548 0,04 1548 0,05 1547 0,04 1547 0,04 1550 87 1557 Elemicin 0,11 1556 0,08 1556 0,01 1556 0,09 1557 0,07 1557 0,07 1558 88 1566 Davanone 0,01 1565 0,01 1565 0,01 1565 0,01 1564 89 1578 Spathulenol 0,05 1577 0,05 1577 0,05 1577 0,05 1577 0,04 1578 0,04 1579 𝛽𝛽 90 1583 Caryophyllène oxyde 1,07 1582 1,01 1582 1,08 1582 1,05 1583 1,02 1582 0,91 1584 92 1583 Neryl isovalerate 0,03 1582 0,03 1582 0,03 1582 0,03 1583 0,03 1583 0,03 1584 91 1587 Thujopsan-2-a-ol 0,02 1586 0,01 1586 0,01 1586 0,01 1588 0,01 1588 0,01 1588 93 1595 Turmérone 0,01 1594 0,02 1594 0,02 1594 0,02 1599 0,02 1596 0,02 1596 95 1607 Eudesmol <5-epi-7-epi-α-> 0,01 1606 0,06 1606 0,07 1606 0,06 1607 0,07 1607 0,07 1608 94 1608 Humulene epoxyde Il 0,17 1607 0,17 1607 0,18 1607 0,17 1608 0,17 1607 0,15 1609 96 1628 Cubénol <1-epi-> 0,02 1627 0,02 1627 0,02 1627 0,02 1628 0,02 1628 0,02 1629 97 1631 Eremoligenol 0,03 1630 0,03 1630 0,03 1630 0,03 1630 0,02 1630 0,03 1632 98 1640 Caryophylla-4(12),8(13)-dien-5α-ol 0,06 1639 0,05 1639 0,06 1639 0,05 1639 0,04 1639 0,05 1641 99 1642 Muurolol 0,06 1641 0,05 1641 0,05 1641 0,05 1640 0,04 1640 0,05 1643 100 1646 Muurolol <α-> (=Torreyol) 0,03 1645 0,02 1645 0,02 1645 0,02 1645 0,02 1645 0,02 1647 101 1653 Himachalol 0,02 1652 0,01 1652 0,02 1652 0,02 1652 0,01 1652 0,02 1654

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Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

102 1648 AgarospiroI 0,3 1647 0,24 1647 0,3 1647 0,25 1650 0,23 1650 0,27 1649 103 1669 Turmérone 0,02 1668 0,09 1668 0,02 1668 0,02 1668 0,02 1668 0,05 1670 Caryophyllene <14-hydroxy-9-epi-(E)- 104 1669 > 0,09 1668 0,1 1668 0,1 1668 0,09 1668 0,08 1668 0,09 1670 105 1678 Foeniculin 0,01 1677 0,01 1677 0,01 1677 0,01 1676 0,01 1676 0,01 1679 106 1680 Khusinol 0,02 1679 0,01 1679 0,02 1679 0,02 1680 0,01 1680 0,01 1681 107 1713 Cédroxyde 0,03 1712 0,02 1712 0,03 1712 0,02 1713 0,02 1712 0,02 1714 108 1961 Géranyl linalool<(Z,Z)-> 0,23 1960 0,18 1960 0,25 1960 0,22 1960 0,17 1960 0,23 1962 109 1987 Géranyl linalool <(E,Z)-> 0,07 1986 0,05 1986 0,08 1986 0,07 1984 0,05 1984 0,07 1988

133

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

. Les monoterpènes et les sesquiterpènes Les hydrocarbures monoterpéniques et sesquiterpéniques varient en fonction de la dose d’irradiation. En effet, l'ionisation de Piper cubéba augmente de manière significative la quantité en monoterpènes (plus de 7,35% ) par rapport au témoin. Pour les sesequiterpenes, on a enregistré une diminution de 0,89% par rapport au témoin non irradié notamment : la diminution du pourcentage de l’Isaudocène, l’Elemène < -> et l’humulène <α> par contre on constate une légère augmentation de certains sesquiterpène𝛽𝛽 tel que le Widdra-2,4(14 )-diene et le Selinene < ->.

Ces résultats confirment les travaux d’Antonelli𝛽𝛽 et al en 1998 qui ont étudié l’effet de l’irradiattion sur l’huile essentielle d’Ocinum basilicum et qui ont montré une augmentation du pourcentage des monoterpènes et diminution des sesquiterpènes [47].

Tableau IV.3. Variation de pourcentage des monoterpènes et des sesquiterpènes dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation

Dose (kGy) 0 0,1 1 2 5 10 monoterpène 8,82% 15,44% 11,88% 11,52% 16,17% 14,76% sesquiterpène 3,83% 2,94% 3,31% 3,28% 3,07% 3,67%

. Les alcools et les éthers D’après les résultats du tableau IV. 4, on remarque une grande augmentation d’alcools (plus de 4,87%) et une importante diminution d’éthers (-11,48%) par rapport au témoin non irradié.

Tableau IV. 4. Variation de pourcentage des alcools et des éthers dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation Dose (kGy) 0 0,1 1 2 5 10 Alcool 31,14% 33,29% 36,01% 35,40% 34,34% 33,44% Ethers 55,01% 45,18% 45,98% 46,32% 45,43% 43,53%

134

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

1,20% Chavicol Methyl chavicol

1,00%

0,80% %

0,60%

0,40%

0,20%

0,00% 0 0,1 1 2 5 10 dose (kGy) Figure IV.3. Variation de pourcentage du chavicol et méthyle chavicol dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation

Eugenol Methyl eugenol 60,00%

50,00%

40,00%

% 30,00%

20,00%

10,00%

0,00% 0 0,1 1 2 5 10 Dose (kGy)

Figure IV. 4. Variation de pourcentage d’eugénol et méthyle eugénol dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation

135

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Pour les échantillons ionisés par les rayons γ, on remarque une importante augmentation de l’eugénol (+4,32%) et de chavicol (+0,44) par rapport au témoin non irradié (Tableau IV. 2) et une diminution significative de leurs composés methylés (méthyl eugénol et méthyl chavicol) par rapport au témoin. Ceci peut être expliqué qu’il y ait une réaction de substitution (H.) par des coupures de liaison (O-R’) par ces irradiations, ou bien une inhibition de l’activité de l’enzyme O-méthyltransférase [121] ait lieu.

O-méthyltransférase rayons γ R-OH R-O-R’ . Réaction de substitution (H )

Figure IV. 5. L’effet des rayons gamma sur les composés méthylés (méthyle eugénol et méthyle chavicol )

. Les esters, les aldéhydes et les cétones D’après la Figure IV. 6, on remarque une diminution non négligeable des esters et des aldéhydes. Pour l’échantillon traité par 0,1 kGy, on a enregistré une augmentation significative de la cétone représentée par le niveau élevé de la turmérone (Tableau IV. 2).

136

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

0,4 Ester (%) 0,37 Aldéhyde (%) 0,35

0,31 Cétone(%) 0,3 0,290,29 0,29 0,27 0,26 0,26 0,26 0,26 0,25 0,25 0,24

0,2 0,2

0,15 0,14 0,13 0,13 0,13 0,12

0,1

0,05

0 0 0,1 1 2 5 10

Figure IV. 6. Variation de pourcentage des esters, des aldéhydes et des cétones dans les huiles essentielles de Piper cubéba en fonction de la dose d’ionisation

137

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

On a essayé de suivre les paramètres de qualité des différents échantillons des huiles essentielles issues de Piper cubéba traitées et non traitées tels que le dosage des phénols, des flavonoïdes et l’effet antioxydant afin de voir l’effet de l’irradiation gamma de Piper cubéba sur la qualité d’huile essentielle.

VI .4. Teneur en phénols totaux Le dosage colorimétrique avec le Folin ciocalteu’s a permis de suivre la teneur en polyphénols en mg/g d’extrait de Piper cubéba après de différentes doses d’irradiation (figure IV.6), et cela par rapport à une gamme d’étalon de DO (Densité optique) en fonction de la concentration en acide gallique selon la méthode décrite en annexe (A.3).

1,600

1,316 1,223 1,200

0,800

0,372 Teneur en phénols (mg /g) 0,400 0,234 0,241 0,269

0,000 0 0,1 1 2 5 10

Dose d'irradiation (kGy)

Figure IV.7. Variation de la teneur en phénols dans l’extrait éthanolique en fonction de la dose d’irradiation de Piper cubéba

Les résultats montrent que les taux en composés phénoliques varient nettement en fonction de la dose d’irradiation. En effet, on assiste à une augmentation de la teneur en phénols en fonction de la dose d’irradiation de 0 jusqu’à 5 kGy. Une teneur maximale de phénols dans l’huile de 1,316 mg/g d’extrait a été obtenue suite à l’irradiation de Piper

138

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Cubéba avec la dose de 2 kGy et ce qui correspond à une multiplication par un facteur de 5,62 par rapport au témoin. Au cours de notre recherche bibliographique nous n’avons pas trouvé de travaux similaires, toutefois plusieurs recherches ont traité les effets de l’irradiation sur la teneur en phénols sur d’autres plantes médicinales. En effet, Khattak et al. ont observé une augmentation en phénols proportionnelle à l’augmentation de la dose d’irradiation ( de 2 à 16 kGy) de la Nigella staiva [51], Harisson et al. (2007) ont trouvé une quantité plus importante dans les amandes avec 4 kGy par rapport au témoin [52]. Adamo et al. (2004) ont enregistré une augmentation de la quantité phénolique avec les dose 1 et 2,5 kGy et ils ont proposé que les radiations γ sont capables de casser les ponts chimiques de polyphénols, ce qui facilite la libération et la solubilité de phénols de faible masse moléculaire [53]. Hang et Mau (2006) ont enregistré une augmentation de tocophérols avec une diminution de tanin dans l’extrait méthanolique de Agaricus blazei irradié par rapport au produit non irradié [54] .

VI .5 . Teneur en flavonoïdes

On remarque que les taux en flavonoïdes (calculés selon la méthode décrite en annexe A.2) varient selon la dose d’irradiation (Figure.IV.7). En effet, on assiste à une augmentation de la teneur en flavonoïdes en fonction de la dose d’irradiation de 0 jusqu’à 5 kGy. Une teneur maximale de 0,229 mg/g de flavonoïde dans l’huile a été obtenue suite à l’irradiation de Piper Cubéba avec une dose de 2 kGy et ce qui correspond à une multiplication par un facteur de 5,58 par rapport au témoin, et cela peut être expliquée par l’augmentation de transfert de masse de ces flavonoides avec l’augmentation de la dose de rayonnement qui lèse la paroi pectocellulosique des cellules sécrétrices et améliore sa perméabilité. En réalité, durant notre recherche bibliographique, nous n’avons pas trouvé des travaux qui étudient l’effet des rayons gamma sur la teneur en flavonoïdes de Piper cubéba même sur d’autres plantes.

139

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

0,250 0,229

0,200

0,150

0,119 0,116

0,100 teneur en flavonoides (mg/g) en teneur flavonoides

0,048 0,051 0,050 0,041

0,000 0 0,1 1 2 5 10 Dose d'irradiation (kGy) Figure.IV.8. Variation de la teneur en flavonoïdes dans l’extrait éthanolique en fonction de la dose d’irradiation de Piper cubéba

VI .6.Etude de l’effet antioxydant de l’extrait éthanolique de Piper cubéba en fonction des doses gamma

Les valeurs IC50 de ces extraits ont été calculées selon la méthode décrite en annexe A.1, les résultats obtenus sont montrés dans la figure IV.9, 10, 11, 12, 13 et 14.

On remarque une diminution significative de la valeur d’IC50 des extraits éthanoliques issus des graines de piper cubéba, irradiées par les doses 1, 2 et 5 kGy par rapport au témoin, la valeur la plus faible d’IC50 indique une forte activité antioxydante et cela due probablement aux fortes teneurs de phénols et de flavonoïdes dans ces extraits.

Donc l’activité de piégeage de DPPH est plus grande dans les extraits irradiés notamment à la dose 1 et 2 kGy par rapport aux extraits non irradiés.

En revanche, malgré que l’extrait éthanolique irradié par la dose 10 kGy contient une quantité importante de phénol et de flavonoïde, sa capacité de piégeage de DPPH est très faible avec IC50 très élevé (11,14mg/l) par rapport au témoin (6,84mg/l), cela peut être due à la dégradation de ces composés chimiques par l’irradiation.

140

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Plusieurs recherches ont entamé l’effet des rayons gamma sur l’antioxydant de d’autres plantes. Khattak et al, (2008) ont indiqué que l’irradiation gamma améliore l’effet antioxydant de l’extrait méthanolique et cétonique de Nigella staiva[51], ce qui confirme nos résultats obtenus.

Alors que les travaux d’Ahn et al. (2005) ont prouvé une diminution de l’activité de piégeage du radicale libre DPPH de chinese cabbage irradié [55] et Mishra et al (2006) ont constaté que l’activité de piégeage de DPPH du thé irradié ( par 1, 2, 5, 10 kGy) ne change pas par rapport au thé non irradié [56].

On conclue que chaque plante réagit différemment vis-à-vis de l’irradiation aux gammas, selon sa composition chimique et d’autres caractéristiques physico-chimiques, ce qui laisse la recherche dans cette allure très vaste.

12 11,14

8 IC 50 mg/l 6,84 6,8

6 5,56

4,02 4,08 4

0 0 0,1 1 2 5 10 Dose d'irradiation (kGy) Figure IV.9. La variation d’ IC 50 (mg/l) en fonction de la dose d’irradiation

141

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Activité de piégeage du radical libre DPPH d'extrait éthanolique (0.1kGy)

100 90 80 70 y = 16.7 ln(x) + 17.98 60 R² = 0.954 50 40 30 Pouvoire de de Pouvoire piégeage (%) 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (mg/l)

Figure IV.10. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (0,1kGy)

Activité de piégeage du radical libre DPPH d'extrait éthanolique 1 kGy

110 100 90 80 70 60 y = 15,54ln(x) + 28,37 50 R² = 0,927 40

Pouvoire de piégeage (%) 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (mg/l)

Figure IV.11. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (1 kGy)

142

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Activité de piégeage du radical libre DPPH d'extrait éthanolique 2 kGy 110

100

70 y = 15.79 ln(x) + 27.76 60 R² = 0.941 50

Pouvoire de de Pouvoire piégeage (%) 30

0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (mg/l)

Figure IV.12. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (2 kGy)

Activité de piégeage du radical libre DPPH d'extrait éthanolique 5kGy 110 100 90 80 70 y = 17,16ln(x) + 20,53 60 R² = 0,920 50 40 30 Pouvoire de de Pouvoire piégeage (%) 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (mg/l)

Figure IV.13. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (5 kGy)

143

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Activité de piégeage du radical libre DPPH d'extrait éthanolique 10 kGy

110 100 90 80 70 60 y = 19,42ln(x) + 3,179 50 R² = 0,906 40

Pouvoire de de Pouvoire piégeage (%) 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 120

Concentration (mg/l)

Figure IV.14. Activité anti-radicalaire de l’extrait éthanolique (10 kGy)

VI .7. Etude de l’effet antibactérien

On a essayé de suivre le comportement de quelques bactéries envers les extraits de concentration 22 mg/ml et les huiles essentielles avec une dilution de (1/10) issus des graines de Piper cubéba ionisées (0 ; 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10kGy), en utilisant le DMSO comme solvant, et en mesurant les zones inhibitrices cas par cas, selon la méthode des puits décrite en annexe A.4.

Dans les tableaux 5 et 6 ci-dessous figurent les résultats relatifs aux propriétés antimicrobiennes des extraits éthanoliques (22mg/ml) et celles des huiles essentielles (dilution 1/10) issus des graines de P. cubéba irradiées par rayon ɣ avec les doses 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 kGy.

Il apparait à travers de ces données que :

• la zone d’inhibition des extraits et celle des huiles essentielles des graines de Piper cubéba (Tableau. IV. 5 et 6) varient en fonction de la dose d’irradiation et le témoin (DMSO pur) ne produit aucun effet inhibiteur ; 144

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

• la zone d’inhibition de V. cholerique est plus grande dans les extraits et dans les huiles essentielles issus des graines irradiées notamment avec la dose 5 kGy (+7mm par rapport au témoin(0kGy)) et avec la dose 0,1kGy (+ 10 mm par rapport au témoin (0kGy)) respectivement. • le diamètre de la zone d’inhibition de S.aureus est plus large dans les extraits et les huiles essentielles issus des graines de Piper cubéba irradiées, il atteint son maximum avec la dose 10 kGy (+5 mm par rapport au témoin) ; • les huiles essentielles issues des graines irradiées sont plus actives contre Candida Albicans par rapport aux extraits, particulièrement avec la dose 0,1 kGy (31mm) ; • S.Typhimirium, et P aeruginosa sont inhibées par les extraits issus des graines irradiés avec un diamètre maximal de 15 et 16 mm respectivement contre 11mm diamètre de témoin(0kGy) et cela avec la dose 1 kGy de même pour Enterococcus feacalis et E.colis (+ 4 mm avec la dose 2 kGy et + 3 mm avec la dose 2 et 10 kGy respectivement par rapport au témoin ( 0 kGy)) alors que dans les huiles essentielles issues des graines irradiées, les bactéries en question sont inhibées avec des diamètres maximaux avec la dose 0,1 kGy (+1, +2, +5 et +5,5 mm par rapport au témoin (0kGy), respectivement). En général, on remarque que les extraits et les huiles issus des graines irradiées sont plus actifs dans l’intervalle 0,1-5 kGy contre les bactéries et la levure. Cette augmentation de l’activité antibactérienne des échantillons irradiés est probablement due à une augmentation importante des phénols et flavonoïdes isolés dans l’extrait et en eugénols dans l’huile essentielle de Piper cubéba ionisée.

145

Chapitre IV Etude des graines de Piper cubéba irradiées par rayon γ

Tableau. IV. 5. Variation de l’activité antibactérienne des extraits éthanoliques (22g/l) issus des graines de Piper cubéba irradiées (avec les doses 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10kGy), mis dans des puits perforés dans le milieu de culture (MH et SAB) après 18-24 h d’incubation à 37°, en fonction de la dose d’irradiation

Dose d'irradiation (kGy) 0 0,1 1 2 5 10 Les souches de référence le diamètre de la zone d’inhibition (mm) Les bactéries gram (+)

S.aureus 12 10 14 13 12 17 Les bactéries gram (-)

S.Typhimirium 11 12 15 13.5 13 11 Enterococcus feacalis 11 13 12 15 14 13 V.cholerique 12 14 16 12.5 19 16 E.colis 12 10 13 15 11 15 P aeruginosa 11 12 16 9 9 10 Levure

C.Albicans 10 8 10 8 8 10 DMSO pure 0 0 0 0 0 0 Tableau IV. 6. Variation de l’activité antibactérienne des huiles essentielles (dilution 1/10) issus des graines de Piper cubéba irradiées (avec les doses 0,1 ; 1 ; 2 ; 5 et 10kGy), mis dans des puits perforés dans le milieu de culture (MH et SAB) après 18-24 h d’incubation à 37°, en fonction de la dose d’irradiation

Dose d'irradiation (kGy) 0 (témoin) 0,1 1 2 5 10 Les souches de référence le diamètre de la zone d’inhibition (mm) Les bactéries gram (+) S.aureus 13 16 12 14 13 18 Les bactéries gram (-) S.Typhimirium 14 15 14 14 12 14 Enterococcus feacalis 11 13 11 13 11 12 V.cholerique 23 33 18 30 20 30 E.colis 12 17 10 11 11 13 P aeruginosa 7 12,5 12 7 10 7 Levure C.Albicans 23 31 21 22 21 25 DMSO pure 0 0 0 0 0 0

146

Chapitre V Head Space-SPME Chapitre V Head Space-SPME

Dans ce chapitre, nous allons étudier l’effet de diamètre des particules sur le profil aromatique du volatile de Piper cubéba extrait par headspace-SPME, ainsi que de l’effet de l’azote liquide (-196°C) in situ-collecte couplée à la headspace-GC-MS-SPME sur la composition chimique des huiles essentielles des trois fleurs : glandulifera, Pteridium aquilinum et Leucanthemum vulgare.

V.1. Analyse par GC/MS des graines de Piper cubéba extraites par HS-SPME (Solide Phase Micro-Extraction)

Les expériences de HS-SPME sur les graines de Piper cubéba ont été réalisées au laboratoire de spectrométrie de masse de Liège ULG. Les spectres GC-MS obtenus ont été exploités par le logiciel X-Calibur à notre niveau pour réaliser cette partie. Le GC-MS utilisé est de type Polaris, les chromatogrammes obtenus sont présentés dans l’annexe B (figure 19 et 20).

Le broyage de la plante végétale a été réalisé selon deux types de broyage différents :

Moyennement divisé (MDC)  Broyage cryogénique

Finement divisé (FDC)

Conditions opératoires :

-Masse de l’échantillon : 0,02g

-Température d’absorption : 40°C

-Diamètre de particules : MDC : 250 μm, FDC : 80 μm

-Type de broyage des particules végétales : cryogénique avec de l’azote liquide à -196°C

-Durée de contact fibre-volatile : 10 mn

-Durée de désorption dans l’injecteur du GC-MS : 5 mn

-Fibres utilisées : PDMS (Polydiméthyl siloxane)

-Programmation de la température identique à celle du chapitre II.

147

Chapitre V Head Space-SPME

V.1.1. L’effet de diamètre des particules sur la composition chimique des huiles essentielles extraites par HS-SPME

Au total, prés de 76 composés ont été isolés et identifiés (Figure V-35 et tableau 12) par HS-SPME -GC et GC/MS dont 53composés ont été identifiés par FDC et 69 composés par MDC.

On a enregistré une augmentation considérable du pourcentage en hydrocarbures monoterpèniques avec le broyage cryogénique moyennement divisé notamment le Mycène de 4,59% (FDC) à 15,74 %(MDC), Ocimen (Z)- de 2,67% (FDC) à 8,92% (MDC), Ocimen

(E)- de 1,67 %(FDC) à 3,37% (MDC) et Sabinène𝛽𝛽 de 0,15%(FDC) à 1,28%(MDC). Alors que 𝛽𝛽le taux de l’éther est plus prononcé en utilisant le broyage finement divisé particulièrement le méthyle eugénol de 45,77 %(MDC) à 61%(FDC) et l’anéthol de 0,76(MDC) à 16,9% (FDC). Certains composés sont isolés uniquement dans les particules de Piper cubéba (MDC) comme Fenchene <α>, Camphène Carène < -2-> , Epoxy-ocimene<(E)-> , Isopulégol

>, Pinene oxyde < ->, Cyclocitral < > , Thymol,𝛿𝛿 méthyl ether et Phenol <2-(1E)-propényl- > ou uniquement dans𝛽𝛽 celles de FDC tels𝛽𝛽 que Nojigiku acetate, Anisaldehyde <ρ->, Anethole <(Z) -> et Méthyl isoellgenol <(E) ->.

Ceci peut être expliqué que dans HS-SPME des graines de Piper cubéba MDC, la fibre PDMS est occupée et saturée par les monterpènes, situés dans les cellules sécrétrices exogènes facilement accédées tandis que pour celle des particules FDC, elle est saturée par les composés oxygénés parce que ce mode de broyage (FDC) a éclaté les cellules sécrétrices endogènes riches en composés oxygénés d’où l’augmentation de la surface de contacte (aiguille de la SPME et les composés oxygénés).

Nous constatons que la granulométrie joue un rôle très important dans le profile qualitatif et quantitatif de la volatile. En effet, les éthers sont mieux extraits quand les particules sont FDC contrairement aux Hydrocarbures monoterpéniques, alcools et aldéhydes sont mieux extraits quand les particules sont MDC.

D’où l’importance de certains paramètres physiques tels que le diamètre qui sont liés directement au phénomène de transfert et d’autres phénomènes complexes.

148

Chapitre V Head Space-SPME

4E+09

3,5E+09

3E+09

2,5E+09

2E+09

1,5E+09 FDC MDC 1E+09

50000000

Figure V.1. Les surfaces occupées par les fonctions chimiques des particules de Piper cubéba FDC et MDC analysées par GC/MS-HS-SPME

3E+09

2,5E+09

2E+09

1,5E+09 FDC 1E+09 MDC

50000000

Figure V.2. Les surfaces occupées par les principaux composés des particules de Piper cubéba FDC et MDC analysées par GC/MS-HS-SPME

149

Chapitre V Head Space-SPME

Tableau V .1 . Composition chimique de la graine de Piper cubéba en fonction de diamètre des particules analysée par GC/MS-HS-SPME finement Moyennement divisés Divisés (cryobroyage) (cryobroyage) Composés chimiques KI réf KI %Area KI %Area Thujène <α> 930 930 0,03 930 0,12 Pinène <α> 939 938 0,08 938 0,45 Fenchene <α> 952 952 0,01 Camphène 954 955 0,01 Sabinène 975 976 0,15 977 1,28 Pinène < > 979 982 0,1 982 0,44 Myrcene 990 992 4,59 994 15,74 𝛽𝛽 Carène < -2-> 1002 999 0,04 Phellandrène<α> 1002 1003 0,01 1002 0,03 𝛿𝛿 Carène < -3-> 1011 1009 0,05 1010 0,12 Terpinène <α> 1017 1020 0,05 1021 0,14 𝛿𝛿 Cymène 1026 1029 0,21 1029 0,36 Ocimène <(Z)- -> 1037 1037 2,67 1037 8,92 Ocimène <(E)- -> 1050 1050 1,67 1050 3,37 𝛽𝛽 Terpinene < -> 1059 1062 0,27 1062 0,41 𝛽𝛽 Mentha-3,8-diène <ρ-> 1072 1074 0,01 1075 0,06 𝛿𝛿 Terpinolène 1088 1088 0,15 1088 0,43 Cymenène <ρ-> 1091 1094 0,01 1094 0,07 Sabina ketone 1120 1122 0,3 1124 0,69 2,6-Dimethyl-1,3,5,7-octatetraene, E,E- 1134 1134 0,05 1132 0,24 Epoxy-ocimene<(E)-> 1142 1142 0,03 Isopulégol 1148 1147 0,02 Pinene oxyde < -> 1159 1159 0,01 Viridène 1167 1133 0,01 1166 0,02 𝛽𝛽 Ethylbenzoate 1173 1175 0,02 1175 0,03 Terpinen-4-ol 1177 1179 0,3 1179 0,37 Cymen-8-ol 1179 1182 0,01 1181 0,02 Méthyl chavicol 1196 1200 1,12 1999 3,19 Cyclocitral < > 1219 1220 0,01 Thymol, méthyl ether 1235 1232 0,01 𝛽𝛽 Nojigiku acetate 1241 1238 0,01 Cumin aldéhyde 1241 1243 0,03 1242 0,03 Anisaldehyde <ρ-> 1242 1263 0,22 Isogeijerène C 1249 1250 0,02 Anethole <(Z)-> 1252 1254 0,03 Phenol <2-(1E)-propényl-> 1267 1268 0,08 Perilla aldéhyde 1271 1271 0,03

150

Chapitre V Head Space-SPME

Anethole <(E)-> 1284 1286 16,9 1288 0,79 Thymol 1290 1292 0,02 Carvacrol 1299 1301 0,03 Trimethyl benzaldéhyde <2,3,4-> 1314 1316 0,05 Patchenol <(Z)-> 1318 1320 0,01 Cubebène <α> 1348 1350 0,02 Eugénol 1359 1358 2,75 1357 1,61 Longicyclène 1374 1375 0,03 1374 0,07 Patchoulène < -> 1381 1381 0,46 1380 0,7 Sesquithlljene<7-epi-> 1391 1393 0,59 1393 0,87 𝛽𝛽 Methyl eugénol 1403 1405 61 1404 45,77 Duprezianène < > 1422 1419 3,21 1424 5,66 Gurjunène < > 1433 1435 0,05 𝛽𝛽 Bergamotène <α-trans-> 1434 1436 0,19 𝛽𝛽 Myltayl-4(12)-ene 1447 1448 0,01 Methyl isoeugénol <(Z)-> 1453 1455 0,01 Caryophyllene <9-epi-(E)-> 1466 1465 0,69 1465 0,87 Acoradiene <10-epi- -> 1475 1474 0,01 Amorpha-4,7(11)-diene 1481 1481 0,06 1481 0,08 𝛽𝛽 Selinène < > 1490 1490 0,32 1489 0,67 Méthyl isoellgenol <(E)-> 1492 1494 0,15 𝛽𝛽 Pseudowiddrene 1498 1498 0,17 Premnaspirodiene 1506 1505 0,16 1505 0,46 Amorphane < -> 1512 1512 0,02 1513 0,01 Cadinène < -> 1523 1525 0,1 1525 0,2 𝛿𝛿 Calamenène 1529 1530 0,02 𝛿𝛿 Selina-3,7(11)-diène 1546 1547 0,01 Elemicin 1557 1551 0,12 1551 0,08 caryophillene oxyde 1567 1563 0,03 1563 0,02 Bornyl angelate 1565 1566 0,21 Spathulenol 1578 1589 0,01 1579 0,03 Salvial-4(14)-en-1-one 1594 1596 0,01 Khusimone 1604 1606 0,27 1607 0,49 Humulene epoxyde II 1608 1609 0,03 1610 0,06 Caryophylla-4(12),8(l3)-dien-5 -ol 1640 1642 0,02 1642 0,01 Methyl jasmonate <(Z)-> 1649 1651 0,01 𝛽𝛽 Caryophyllene <14-hydroxy-9-epi-(E)-> 1669 1670 0,02 1671 0,03 Foeniculin 1678 1685 0,57 1680 0,02 Amorpha-4,9-dien-14-al 1704 1706 0,01

151

Chapitre V Head Space-SPME

Tableau V .2 . Variation de % des composés chimiques des graines de Piper cubéba en fonction de la dimension des particules moyennement finement divisés divisés dp=250μm dp=85μm Monoterpène 32,0 10,05 Sesquiterpène 9,32 5,88 Cétones 1,19 0,57 Alcools 2,22 3,11 Aldéhyde 0,13 0,25 Ethers 49,94 79,36 Esters 0,04 0,03 Total 94,84 99,25

V.2. Etude de la composition chimique de certaines plantes par la technique in situ collect par de l’azote liquide avec HS-SPME-GC-MS

Les expériences HS-SPME, sur des fleurs récoltées au niveau du parc de Sart Tilman dans la ville de liège en Belgique, ont été réalisées et analysées au laboratoire de spectrométrie de masse de Liège ULG. Les spectres GC-MS obtenus, ont été exploités par le logiciel X-Calibur à notre niveau. Le GC-MS utilisé est de type Polaris.

152

Chapitre V Head Space-SPME

59,23 60 INSITUT

CLASSIQUE 50 46,37

30 28,32

9,66 10

0,18 1,29 0 composé naturel dégagé composé naturel de la composé industriel par les bactérie plante

Figure V .3. Les % des Composés chimiques isolés dans la Impatiens glandulifera par HS-SPME In situ et classique

153

Chapitre V Head Space-SPME

61,88 INSITUT CLASSIQUE 60

42,68

40 38

10 4,19 2,1 0 0 composé naturel dégagé par composé naturel de la composé industriel les bactérie plante

Figure V .4. Les % des Composés chimiques isolés dans Leucanthemum vulgare par HS-SPME In situ et classique

154

Chapitre V Head Space-SPME

30 27 25,6 25

INSITUT

20 CLASSIQUE

10,9 10

1,78 1,07 0 0 composé naturel dégagé par composé naturel de la plante composé industriel les bactérie

Figure V .5 . Les % des Composés chimiques isolés dans Pteridium aquilinum par HS-SPME In situ et classique

D’après les figures (4, 5 et 6), on remarque que l’extraction par HS-SPME-GC-MS de Impatiens glandulifera, Leucanthemum vulgare et Pteridium aquilinum et par deux méthodes (classique et in situ (cryogénique-collecte)) a permis d’identifier 3 catégories des composés chimiques tels que : • des composés hétérocycliques naturels volatils dégagés par des bactéries de sol (B.subtilis) comme Morpholine, 4-octadecyl- et Dibutyl phthalate (DBP) [58], ou par la levure Candida albicans comme phényle éthyle alcool (alcool phénéthylique) [61], de plus on a isolé le 2,4,6-Tri-t-butylbenzenethiol considéré comme métabolite primaire de Chironomus riparius (insecte)[59]. Ces composés ont été isolés avec un grand pourcentage uniquement avec HS- SPME classique alors qu’avec la technique HS-SPME in situ (cryogénique-

155

Chapitre V Head Space-SPME

collecte) n’ont été pas identifiés puisque l’activité de ces microorganismes a été inhibée par l’azote liquide (-196°C) durant l’extraction (10min) ; • des composés de biosynthèses de la plante : la technique in situ cryogénique- collecte, nous a permit d’identifier plus de ces composés naturels ce qui en résulte que cette technique protège les composés fragiles et volatils de la plante notamment ceux de l’Impatiens glandulifera (9,66% de composés de biosynthèsepar insitu collecte et 1,29% par la méthode classique) et la Leucanthemum vulgare (61,88% de composés de biosynthèse par insitu collecte et 2,1%par la méthode classique) ; • des composés chimiques de gaz rejetés par les industries, de toute sorte, ont été isolés tels que le Biphénol A (BPA) un composant chimique entrant dans la fabrication de bouteilles et de nombreux emballages, DEP, BHT, des insecticides [Anthracene, 9-(1-methylethyl)-] et des fongicides [Tributyl phosphate(TBP)].

D’après ces études, nous constatons que la technique HS-SPME a une capacité limitée où les composés volatils rentrent en compétition pour arriver à la fibre PDMS et elle a une tendance d’extraire des composés chimiques de masse moléculaire très élevée.

156

Tableau V .3 . Composition chimique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) analysée par GC/MS-HS-SPME in situ-collecte

N° Apex %Ar RT ea KI KI Composés identifiés Formule chimique 1 6,29 0,05 852 855 Hexenal « (2E) ->* C6H10O 2 11 0,43 949 Acetic acid, N'-[3-(1-hydroxy-1-phenylethyl)phenyl]hydrazide C16H18N2O2 3 24,65 0,06 1260 1256 Piperitone epoxyde (epoxyde vs, IPP)* C10H16 O2 4 26,07 0,21 1298 1298 Octenol propanoate «5Z)->* C11 H20 O2 5 29,33 0,84 1393 ri=1385 Pyrrolidine, 1-[2-(dimethylamino)-1,1-dimethylethoxy]-2,2-dimethyl- C12H26N2O 6 29,9 0,04 1410 1409 Citronellyl oxy-acetaldehyde* C12H22O2 7 31,08 0,06 1448 1459-1558 Butylated Hydroxytoluene C15H24O 8 31,45 0,03 1459 1456-1507 o-Hydroxybiphenyl C12 H10 O 9 31,68 0,02 1467 1469 Ethyl- (2E,4Z),decadienoate* C12H20O2 10 34,06 0,13 1544 1566 Dodecanoic acid* C12H24O2 11 34,68 0,23 1565 1590 Diethyl phthalate (plastizer contaminant!)** C12H14O4 12 35,57 0,12 1595 1591 Apofarnesol <(E)-dihydro->* C14 H26 O 13 36,09 0,1 1613 1627 Benzophenone* C13 H10 O 14 36,34 3,6 1622 ri=1695 3-Quinolinecarboxylic acid Decanoic acid, decyl ester C10H7NO2 15 36,61 0,28 1631 1612-1690 Tributyl phosphate** C12H27O4P 16 37,59 2,42 1666 1652 Isoamyl geranate * C 15 H26 02 17 38,13 0,07 1685 1668 Phloroacetophenone <2,4-dimethylether->* C10H12O4 18 38,28 0,01 1690 1678 Apiole* C12H14O4 19 38,71 0,5 1706 ri=1879 Oxirane-2-carboxylic acid, 3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-, methyl ester C13H16O6 20 38,98 0,14 1716 1771 (Adamantyl-1)benzene C16H20 21 39,12 0,1 1721 1760/1771 Benzyl benzoate*/(Adamantyl-1)benzene C14H12O2/C16H20

Benzyl benzoate*/(Adamantyl-1)benzene/Acetosyringone C14H12O2/C16H20/C 22 39,45 0,07 1733 1760/1771/1740 10H12O4

157

23 39,9 0,16 1750 1740 Acetosyringone C10H12O4 24 40,09 0,36 1757 1760 Nocrac M 17 C16H26O 25 40,51 0,06 1772 1760 Benzyl benzoate* C14H12O2 26 40,95 0,25 1789 ri=1783 Isosalsoline C11 H15 O2 27 41,14 0,06 1796 ri=1797 Benzenesulfonamide, N-butyl- C10H15NO2S 28 42,86 0,54 1862 1813 Cryptomeridiol* C15H28O2 29 43,56 9,14 1889 ri=1940 1-(2-Thiazolyl)biuret C5H6N4O2S 30 43,78 0,94 1898 ri=1901 Dendroban-12-one, 10-hydroxy- C16H25NO3 31 44,21 27,25 1915 ri=1633 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone C14H20O2 32 44,44 0,13 1924 1922 Totarene* C20 H32 33 44,68 0,4 1934 1938/ri=1901 Cembrene*/ Dendroban-12-one, 10-hydroxy- C20H32/C16H25NO3 34 45,33 2,11 1960 1897-1960 Dibutyl phthalate (DBP) C16H22O4 35 45,75 3,01 1977 1938/ri=1901 Cembrene*/ Dendroban-12-one, 10-hydroxy- C20 H32/C16H25NO3 36 45,99 0,18 1987 ri=1980 2,4,6-Tri-t-butylbenzenethiol C18H30S 37 46,71 0,41 2017 ri=2030 Anthracène, 9-(1-methylethyl)- C17H16 38 47,06 0,09 2031 ri=2030 Ethanone, 1-(1,2,3,5,6,7-hexahydro-1,1,5,5-tetramethyl-s-indacen-4-yl)- C18H24O 39 48,64 5,22 2099 ri=2083 N-[[2-Morpholinoethyl]]maleamic acid C10H16N2O4 40 49,59 0,36 2141 2184 Sandaracopimarinal* C20H30O 41 50,76 1,63 2192 2181 Biphénol A (BPA)** C15 H16 O2 42 51,06 0,19 2206 2209 Octadecanol acetate* C20H40O2 43 52,37 0,22 2267 2214 Retene* C18H18 44 53,26 5,74 2326 ri=2324 [1,2,4]Triazolo[4,3-a]azepine-3-thione, 2-morpholin-4-ylmethyl-2,5,6,7,8,9-hexahydro- C12H20N4OS 45 57,74 1,04 2702 ri=2511 Morpholine, 4-octadecyl-** C22H45NO 46 58,24 0,3 2718 ri=2704 1,2-Benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester C24H38O4 ND : signifie ‘non determiné’ / : signifie ‘et ‘

158

Tableau V.4. Origine des différentes classes chimiques extraites de l’ Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) par HS-SPME in situ-collecte

Composés chimiques Fonctions chimiques et utilisation Hexenal «(2E)-> aldéhyde Piperitone époxyde (epoxyde vs. IPP) cétone Octenol propanoate «5Z)-> ester Pyrrolidine, 1-[2- (dimethylamino)-1,1- dimethylethoxy]-2,2- dimethyl- composé chimique industrielle Citronellyl oxy- acetaldehyde aldehyd Butylated Hydroxytoluene BHT additif /antioxydant utilisé dans l'industrie (contaminant) o-Hydroxybiphenyl disinfectant, fungicide, germicide, synthetic intermediate Ethyl- (2E.4Z).decadienoate ester Dodecanoic acid acide Diethyl phthalate (plastizer contaminant!) DEP contaminant industriel Apofarnesol <(E)- dihydro-> Alcool Benzophenone cétone 3-Quinolinecarboxylic acid Decanoic acid, decyl ester herbicide [57]

159

Tributyl phosphate TBP herbicide /fongicide Isoamyl geranate Ester Phloroacetophenone <2,4-dimethylether-> cétone Apiole Ether Oxirane-2-carboxylic acid, 3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-, methyl ester composé chimique à utilisation pharmaceutique (Adamantyl-1)benzene composé chimique aromatique Benzyl benzoate/(Adamantyl- 1)benzene ester/composé aromatique Benzyl benzoate/(Adamantyl- 1)benzene/Acetosyringo ne ester/composé industrielle aromatique/ une phénolique( composé naturelle de la plante) Acetosyringone une phénolique( composé naturelle de la plante) Nocrac M 17 stabilisant pour polyoléfine Benzyl benzoate ester Isosalsoline Alcaloides naturelles dans les plantes Benzenesulfonamide, N-butyl- un plastifiant Cryptomeridiol Alcool ce composé apparaît lors de la phase de concentration et de cristallisation lors de la production industrielle de l'urée 1-(2-Thiazolyl)biuret comme engrais Dendroban-12-one, 10- hydroxy- Alkaloide naturel 2,5-di-tert-Butyl-1,4- un antioxydant utilisé pour étudier l'élimination de taux des micropolluants dans les pluies

160

benzoquinone Totarene diterpenes Cembrene/ Dendroban- 12-one, 10-hydroxy- Alkaloide naturel hétérocyclique .composé organique volatil dégagé par les bactéries de sol Dibutyl phthalate (DBP) ( B.Subtilis) [58] Cembrene/ Dendroban- 12-one, 10-hydroxy- Alkaloide naturel 2,4,6-Tri-t- butylbenzenethiol parmis les métabolites primaires de Chironomus riparius (insecte) [59] Anthracene, 9-(1- methylethyl)- insecticide Sandaracopimarinal Aldéhyde un composant chimique, le bisphénol A, entrant dans la fabrication de bouteilles et de nombreux emballages de produits alimentaires (les biberons, la vaisselle, les récipients destinés au four à micro-ondes, les cannettes et les Biphenol A (BPA) boîtes de conserve, les revêtements époxy-phénoliques des conteneurs d'eau potable et des cuves à vin) Octadecanol acetate ester Rétène est dérivé de la dégradation de diterpénoïdes spécifiques biologiquement Retene produites par les conifères Morpholine, 4- octadecyl- hétérocyclique .composé organique volatils dégagé par les B.Subtilis[58] 1,2- Benzenedicarboxylic acid, diisooctyl ester plastifiant

161

Tableau V .5. Composition chimique de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) analysée par GC/MS-HS-SPME classique

Apex Formule RT %Area KI KI réf Composés identifiés chimique 1 5,6 0,42 836 ri=849 Ethanethioamide** C2H5NS 2 5,77 3,73 840 ri=1671 Bicyclo[2,2,1]heptan-2-one, 7-[3-(t-butyldimethylsilyloxy)propyl]-** C16H30O2Si 3 6,12 6,61 848 ri=1690 Benzoic acid, 2,4,6-trichloro-** C7H3Cl3O2 4 7,47 0,49 879 ri=1301 Oxime-, methoxy-phenyl-_** C8H9NO2 5 10,04 45,88 931 ri=1301 Oxime-, methoxy-phenyl-_** C8H9NO2 6 11,15 4,27 952 ri=1899 Ethanone, 1,2-diphenyl-, oxime** C14H13NO 7 11,66 4,43 962 ri=1900 Ethanone, 1,2-diphenyl-, oxime** C14H13NO 8 18,12 2,86 1096 ri=1578 Benzaldéhyde, 2,5-bis[(trimethylsilyl)oxy]-** C13H22O3Si2 9 18,24 4,83 1099 ri=1578 Benzaldéhyde, 2,5-bis[(trimethylsilyl)oxy]-** C13H22O3Si2 10 22,48 0,14 1202 1198 Shisofuran* C10H12O 11 25,84 0,88 1292 1314 Trimethyl benzaldéhyde <2,3,4->* C10H12O 12 37,06 0,21 1647 ri=1695 3-Quinolinecarboxylic acid C10H7NO2 13 41,14 0,13 1796 ri=1797 Benzenesulfonamide, N-butyl- (NBBS) C10H15NO2S 14 42,26 0,27 1839 1842 Pseudoisocugenyl 2-méthylbutyrate «(E)->* C15 H20 O3 15 43,58 0,23 1890 ri=1887 Nimorazole C9H14N4O3 16 48,64 0,6 2099 ri=2075 N-[[2-Morpholino]ethyl]succinamic acid C10H18N2O4

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Tableau V.6. Origine des différentes fonctions chimiques extraites de l’Impatiens glandulifera (Himalayan Balsam) par HS-SPME classique

Composés chimiques Fonctions chimiques et utilisations cancérigène sert à analyser quantitativement des les Ethanethioamide composés inorganiques cocataliseur rentre dans plusieurs réactions chimiques dans Benzoic acid, 2,4,6-trichloro- l'industrie pharmaceutique et autre OXIME .composé organique volatil dégagé par les bactéries Oxime-, methoxy-phenyl-_ de sol B.Subtilis [58] Shisofuran éther Trimethyl benzaldéhyde <2,3,4-> aldéhyde 3-Quinolinecarboxylic acid agent antibactérien [60] Benzenesulfonamide, N-butyl- (NBBS) plastifiant Pseudoisocugenyl 2-methylbutyrate «(E)-> ester Nimorazole molécule anti-infection et anticancéreuse

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Tableau V .7 . Composition chimique de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) analysée par GC/MS-HS-SPME In situ collecte

Apex N° RT %Area KI KI réf Composés identifiés Formule chimique 1 5,55 0,17 835 849 Ethanethioamide C2H5NS 2 5,71 1,87 839 849 Ethanethioamide C2H5NS 3 5,95 1,8 844 849 Ethanethioamide C2H5NS 4 7,63 2,56 882 912 / 884 acetylfuran(2-) * / et 7-Oxabicyclo[2,2,1]hept-5-en-2-one C6H6O2/C6H6O2 5 9,01 0,29 911 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 6 27,15 0,62 1329 1328 Silphiperfol-5-ene* C15 H24 7 27,43 0,28 1337 1336 Presilphiperfol-7-ene * C 15 H24 8 27,96 0,19 1353 1348 Silphiperfol-5-ene <7-epi->* C15 H24 9 28,12 0,74 1358 1359 Eugénol* C10 H12 O2 10 28,7 0,75 1375 1364 Anisaldehyde * C10 H14 O3 11 30,42 0,07 1427 1422 Duprezianene * C15 H24 12 30,53 0,08 1430 1422 Duprezianène * C15 H25 13 31,25 11,67 1453 1451 Spirolepechinene* C15 H24 14 31,96 1,92 1475 1496 Coumarin <3-methyl->* C10 H8 O2 15 32,45 0,78 1491 1493 Guaiène * CI5 H24 16 32,89 0,34 1505 1502 Cuprenene <α->* C15 H24 17 33,28 2,36 1518 1518 Nootkatene* C15 H22 18 33,57 1,47 1528 1522/1533 Calamenene /Hydroxy citronellal * C15H22/C14 H30 O3 19 33,98 37,71 1542 1554 Coumarin <6-methyl->* C10 H8 02 20 35,6 0,34 1596 1554 Coumarin <6-methyl->* C10H8 02 21 48,64 0,06 2099 2108 Propanamide, N-(4-methyl-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-3-morpholino- C10H16N4O3

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Tableau V .8 . Composition chimique de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) analysée par GC/MS-HS-SPME classique

Apex Formule RT %Area KI KI réf Composés identifiés chimique 1 5,26 0,09 829 849 Ethanethioamide** C2H5NS 2 5,5 0,74 834 849 Ethanethioamide** C2H5NS 3 5,61 4,22 837 ri=602 Acetamide, 2-fluoro-** C2H4FNO 4 5,92 4,33 844 849 Ethanethioamide** C2H5NS 6 7,8 10,21 886 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 7 8,22 0,08 896 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 8 8,64 5,67 904 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 9 8,88 13,56 909 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 10 9,38 1,06 918 885 2-Cyclohexen-1-one** C6H8O 11 9,54 0,15 922 ri=1301 Oxime-, methoxy-phenyl-_** C8H9NO2 12 9,64 0,43 923 ri=1301 Oxime-, methoxy-phenyl-_** C8H9NO2 13 10,15 37,22 933 ri=1301 Oxime-, methoxy-phenyl-_** C8H9NO2 14 13,67 0,37 1000 1008 3-Ethyl-3-heptanol C9 H20 O 15 13,95 0,41 1006 1008 3-Ethyl-3-heptanol C9 H20 O 16 16,07 0,12 1052 1044 Formic acid phenylmethyl ester C8H8O2 17 18,97 0,6 1116 1120 Phényl éthyl alcohol C8H10O 18 19,23 1,19 1123 1120 Phényl éthyl alcohol C8H10O 19 23,39 1,06 1226 1237 Cyclobutadiene, 1,2,3,4-tetrakis-(trimethylsilyl)- C16H36Si4 20 31,24 0,1 1453 1451 Spirolepechinène* C15 H24 21 32,13 0,08 1481 ri=1475 1-Butyl(dimethyl)silyloxy-2-phenyléthane C14H24OSi 22 33,97 0,09 1541 1554 Coumarin <6-méthyl->* C10 HS O2 23 37,07 0,22 1648 ri=1695 3-Quinolinecarboxylic acid C10H7NO2 24 41,14 0,06 1796 ri=1797 Benzenesulfonamide, N-butyl- C10H15NO2S 25 43,58 0,09 1890 ri=1896 1,3-Oxazinane, 3-(2-bromo-2,2-dinitroethyl)- C6H10BrN3O5 26 48,63 0,43 2098 2108 Propanamide, N-(4-methyl-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-3-morpholino- C10H16N4O3 165

Tableau V.9. Origine des différentes fonctions chimiques extraites de Leucanthemum vulgare (Marguerite commune) par HS-SPME classique

Composés chimiques identifiés Fonctions chimiques et utilisations Ethanethioamide cancérigène sert à une analyse quantitative des composés inorganiques Fluoroacétamide est un composé organique, c’est un poison métabolique qui perturbe le cycle Acétamide, 2-fluoro- de l'acide citrique et a été utilisé en tant que rodenticide. 2-Cyclohexen-1-one composé organique très utilisé dans l'industrie pharmaceutique et de parfumerie Oxime-, methoxy-phenyl-_ OXIME .composé organique volatils dégagés par les bactérie de sol B.Subtilis[58] Formic acid phenylmethyl ester ester donne un arome et odeur au fleur se trouve dans les huiles essentielles Alcool phénéthylique se trouve dans l'extrait de rose, oeillet, la jacinthe, le pin d'Alep, de fleur d'oranger, d'ylang-ylang, géranium, de néroli, et champaca. Il est également un autoantibiotic Phényl ethyl alcohol produite par le champignon Candida albicans [61] Spirolepechinene sesquiterpène Coumarin <6-methyl-> cétone 3-Quinolinecarboxylic acid agent antibactérien[60] Benzenesulfonamide, N-butyl- plastifiant 1,3-Oxazinane, 3-(2-bromo-2,2- dinitroethyl)- herbicde

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Tableau V .10 . Composition chimique de la Pteridium aquilinum analysée par GC/MS-HS-SPME in situ collecte

Apex RT %Area KI KI réf Composés identifiés Formule chimique 1 6,32 11,82 853 847 2-Hexyn-1-ol** C6H10O 2 11,02 3,52 950 ri =1899 Ethanone, 1,2-diphényl-, oxime** C14H13NO 3 11,59 0,17 894 ri =1899 Ethanone, 1,2-diphényl-, oxime C14H13NO 4 11,73 0,19 895 ri =1899 Ethanone, 1,2-diphényl-, oxime C14H13NO 5 12,83 8,7 984 1000 Cyclotetrasiloxane, octamethyl- C8H24O4Si4 6 20,91 0,21 1163 1164 Chrysanthenol * C10 H16 O 7 26,05 0,06 1297 1295 Menthyl acétate* C 12 H22 O2 8 27,76 0,06 1347 1327 Mentha-l,4-dien-7-ol * C10 H 16 O 9 30,22 0,09 1421 1419 Caryophyllène<(E)-> C15 H24(adams) 10 32,13 0,11 1481 1426 Cymene <2,5-dimethoxy-p->* C12 H18 O2 11 33,03 0,08 1510 1497 Methyl p-tert-butylphenyl acetate* C13 H18 O2 12 33,63 0,13 1530 1529 Calamenène * CI5 H22 13 37,06 0,11 1647 ri=1695 3-Quinolinecarboxylic acid C10H7NO2 14 38,62 0,04 1702 1757 Eremophilone <8-hydroxy-dihydro->* C15 H24 02 15 39,12 0,17 1721 1716 1H-Indene, 2,3-dihydro-1,1,3-trimethyl-3-phenyl- C18H20 16 40,93 0,11 1788 1713 Calamenène <5-hydroxy-cis->* C15 H22 O 17 41,13 0,24 1795 ri=1797 Benzenesulfonamide, N-butyl- C10H15NO2S 18 42,26 0,12 1839 ri=1864 Benzene, 1,1'-(3,3-dimethyl-1-butenylidene)bis-** C18H20 19 43,25 0,18 1877 1880 Laurenen C20 H32 20 43,58 0,12 1890 ri=1887 Nimorazole C9H14N4O3 21 48,62 0,44 2098 ri=2083 N-[[2-Morpholinoethyl]]maleamic acid C10H16N2O4

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Tableau V .11 . Composition chimique de la Pteridium aquilinum analysée par GC/MS-HS-SPME classique

Apex RT %Area KI KI réf Composés Formule chimique 1 5,82 6,07 841 849 Ethanethioamide** C2H5NS 2 6,24 1,49 851 ri=602 Acetamide, 2-fluoro- C2H4FNO 3 9,76 1,81 926 ri=1301 Oxime-, méthoxy-phenyl-_ C8H9NO2 4 9,93 0,21 929 ri=1301 Oxime-, méthoxy-phényl-_ C8H9NO2 5 10,18 25,01 934 ri=1301 Oxime-, méthoxy-phenyl-_ C8H9NO2 6 11,64 1,76 962 Ethanone, 1,2-diphenyl-, oxime** C14H13NO 7 15,28 0,54 1035 1007 Hexenoic acid «(2E)->* C6 H10 O2 8 16,78 0,08 1067 1065 Isobutyl acetoacétate* C8 H14 O3 9 25,59 0,88 1285 1279 Nonanal* C11 H24 O2 10 27,33 1,8 1335 RI=1387 Benzene, [(tetramethylcyclopropylidene)methyl]- C14 H18 11 32,13 0,09 1481 1426 Cymene <2,5-dimethoxy-p->* C12 H18 O2 12 37,06 0,52 1647 ri=1695 3-Quinolinecarboxylic acid C10H7NO2 13 41,13 0,07 1795 ri=1797 Benzenesulfonamide, N-butyl- C10H15NO2S 14 42,27 0,05 1839 1842 Pseudoisoeugenyl 2-methylbutyrate «(E)->* C15H20O3 15 43,25 0,05 1877 1880 Laurenène* C20 H32 16 43,58 0,24 1890 ri=1887 Nimorazole C9H14N4O3 17 45,91 0,09 1983 1986 Amorpha-4,7(11)-dien-8-one <2-α-acetoxy->* C17H24O3 18 48,63 0,44 2098 ri=2083 N-[[2-Morpholinoethyl]] maleamic acid C10H16N2O4

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CONCLUSION GENERALE

Conclusion générale

L’étude comparative de l’huile de Piper cubéba extraite par deux méthodes différentes (HD et HD-MO) et avec deux modes de broyage (simple et cryogénique), a révélé que la technique HD-MO (BS et BC) permet : - d’obtenir un rendement global en volatile légèrement élevée (1,03%, 0,82 % respectivement) par rapport à l’hydrodistillation classique avec une réduction considérable de l’énergie consommée et de la quantité de CO2 rejetée dans l’environnement (82,17% et 77,53 % respectivement); - un gain de temps dans l’extraction des essences (30min au lieu 2h 30min) ; Néanmoins, elle a mis en évidence la présence d’un taux très élevé des composés issus des réactions d’oxydation et d’hydratation par rapport à l’hydrodistillation classique, influant négativement sur la qualité de l’huile essentielle.

Grâce à la chromatographie en phase gazeuse et à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, il a été rendu possible de caractériser chacune des essences relatives à chaque technique, et de donner une analyse semi-quantitative de leurs constituants, en particulier les principaux composés antioxydants et antibactériens, représentés essentiellement par l’eugénol et le méthyle eugénol ; la technique d’extraction par HD-MO-BC a donné des résultats assez différents de HD-MO-BS : elle est plus avantageuse puisqu’elle a fourni des essences plus riches en composés volatils les plus actifs ce qui, manifestement, influe favorablement sur la qualité des essences.

En parallèle, une étude sur les extraits des graines de piper cubéba a été menée où nous avons constaté qu’elle est riche en polyphenols, en flavonoïdes et en antioxydants, notamment l’extrait méthanolique qui représente l’extrait le plus actif avec un IC50 de l’ordre de 4,54 mg

/l suivi par l’extrait éthanolique avec un IC50 de 6,85 mg/l.

À l’issue de ces résultats, on peut proposer de remplacer des antioxydants synthétiques couramment utilisés dans l’industrie des corps gras et dont les coûts ne sont pas onéreux, tels que le BHT et le BHA, par les extraits éthanoliques de Piper cubéba, étant donné que ce solvant utilisé lors de l’expérimentation (l’éthanol) est naturel et ne représente aucun risque pour la santé.

Les résultats de l’effet antibactérien permettent d’émettre l’hypothèse de la possibilité d’utiliser les huiles essentielles de Piper cubéba comme des antibiotiques naturels qui semblent réagir très efficacement contre les levures C Albicans qui provoquent les infections buccales et contre les vibrions cholériques responsables du choléra ; comme on peut les

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Conclusion générale associer dans les formulations des solutions de bain de bouche, de dentifrices et de différents désinfectants...il reste naturellement à développer une recherche plus approfondie pour confirmer ces résultats dans le domaine toxicologique.

Par ailleurs, nous avons déterminé deux profils cinétiques d’extraction et proposé un mécanisme propre aux micro-ondes (sous vide) différent de celui des techniques HD-MO conventionnelles. Le suivi analytique par GC et GC/MS de la composition chimique des essences extraites décrivant les deux profils cinétiques d’extraction, montre que le méthyle eugénol se répartit d’une manière homogène dans les sites exogènes et endogènes des graines de Piper cubéba alors que l’eugénol se répartit aléatoirement, avec un fort pourcentage dans les sites endogènes. Cette dernière constatation confirme que l’extraction par la technique HD-MO se fait par étapes successives allant des sites exogènes puis vers les sites endogènes, contrairement au processus HD-MO-SV dont les étapes d’extraction sont simultanées.

Le même suivi analytique montre une nette augmentation du pourcentage des composés issus des réactions d’oxydation et d’hydratation dans l’huile essentielle de Piper cubéba extraite par HD-MO, par rapport à celle extraite par HD-MO-SV : en effet, l’étude de la cinétique d’extraction par HD-MO -SV est plus facile et plus pratique avec la diminution importante du temps de chauffage et d’énergie consommée, ce qui implique une réduction significative des réactions de dégradation de type hydrolytique, oxydative ou thermique, et une récupération d’une huile essentielle ‘’proche’’ de l’huile de biosynthèse.

Une autre partie de ce travail a été consacrée à l’étude de l’effet des radiations gamma sur l’huile et l’extrait de la graine de Piper cubeba vis-à-vis : • de la composition chimique : nous concluons que les composés méthylés de l’huile essentielle de la graine de Piper cubéba ne sont pas radio résistants, notamment le méthyle eugénol qui se convertit facilement en eugénol suite à l’irradiation ɣ ; nous avons constaté une augmentation du pourcentage des mono terpènes et une diminution des sesquiterpènes ce qui confirme les travaux d’Antonelli et al en 1998. • de l’activité de piégeage du radical libre DPPH : nous remarquons une augmentation significative de l’activité de piégeage du radical libre DPPH d’extraits éthanoliques, particulièrement les extraits irradiés par les doses 1, 2 et 5 kGy par rapport au témoin, cela étant du aux fortes teneurs de phénols et de flavonoïdes, à ces mêmes doses d’irradiation. cette étude nous a ainsi permis de

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Conclusion générale

constater une corrélation positive entre l’augmentation des phénols, des flavonoïdes et l’activité de piégeage du radical libre DPPH.

Un travail complémentaire important reste à effectuer sur l’effet de l’irradiation sur les huiles essentielles et les extraits de la graine de Piper cubéba consistant, par d’autres expérimentations itératives : - à vérifier la reproductibilité des résultats relatifs aux extractions et à l’analyse qualitative et semi-quantitative, afin d’affiner nos comparaisons ; -et à déterminer l’efficacité des radiations sur la stérilité de l’épice P.cubéba, pour mieux cibler la dose optimale d’irradiation.

D’autres nouvelles biotechniques d’extraction, telle que HS-SPME, ont été effectuées sur Piper cubéba , montrant l’importance de l’effet de la granulométrie sur les profils qualitatif et semi-quantitatif de la composition chimique de P.cubéba : en effet il a été constaté qu’avec les graines finement divisées, une grande quantité de composés actifs tels que les éthers (notamment le méthyle eugénol et Anéthol )et les alcools (eugénol) ont été isolées, tandis qu’avec les graines moyennement divisées le pourcentage des monoterpènes (Ocimen (Z)- ,

Ocimen (E)- , et Myrcène) est le plus important. 𝛽𝛽 𝛽𝛽 Enfin, cette nouvelle technologie nous permis également de valoriser l’effet de l’azote liquide (in situ) couplée à la HS-SPME-GC-MS sur la composition chimique des huiles essentielles de d’autres matrices végétales telles que la fleur Impatiens glandulifera, Leucanthemum vulgare et Pteridium aquilinum :en effet il s’est avéré très efficace, puisqu’une quantité plus importante de composés de biosynthèse de ces fleurs par rapport aux témoins, a été isolée dans le même temps nous a renseigné sur l’état environnemental de ces plantes.

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ANNEXE A

Annexe A

A.1. l’effet antioxydant IC50

Préparation de la solution DPPH Brièvement, La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100 ml d’éthanol.

Préparation de la solution d’extrait

Les échantillons ont été préparés par dissolution dans l’éthanol absolu. Pour tous les extraits, on prépare des solutions dans d’éthanol à raison de 1mg/ml. Ces solutions dites solutions mères, subirent ensuite des dilutions pour en avoir différentes concentrations.

L’essai au DPPH Dans des tubes secs et stériles, on introduit 25 μl des solutions d’extraits à 975 μl de DPPH, le mélange est laissé à l’obscurité pendant 30 mn et la décoloration par rapport au contrôle négatif contenant uniquement la solution de DPPH est mesurée à 517 nm.

Expression des résultats L’activité anti-oxydante « AA % » est estimée selon l’équation ci-dessous :

AA% = [(Abs517 contrôle - Abs échantillon517) / Abs 517contrôle] x 100

Les résultats ont été exprimés par la moyenne de trois mesures.

Les valeurs IC50 moyennes ont été calculées par régressions linéaires des 3 essais séparés ou l’abscisse est représentée par la concentration des composés testés et l’ordonnée par l’activité antioxydante en pourcentage.

Le radical DPPH est un radical libre organique stable, avec une bande maximum d'absorption entre 515-528 nm.

Annexe A

A.2. Dosage des flavonoïdes Réactifs :

7 2 g de Chlorure d’aluminium (AlCl3 ) dans 100 mL d’eau

Mode opératoire : 8 1 mL d’AlCl3 + 1 mL de l’échantillon 9 Lire l’absorbance à 420 nm après 1 heure d’incubation 10 Standard : Quercetine

11 Témoin : Solution de AlCl3 + solvant (dans lequel se trouve l’échantillon).

(*si les solutions ne sont pas transparentes on centrifuge)

Les résultats ont été exprimés par la moyenne de trois mesures

A.3. Phénols totaux

Réactifs :

1 Réactif de Folin-Ciocalteu

1 ml du réactif de Folin à diluer à 10 ml avec de l’eau distillée

- Carbonate de Sodium (Na2CO3)

Solution à 75 g/L de carbonate de sodium

Mode opératoire : 1 1.25 ml du réactif de Folin solution diluée 2 0.25 ml de l’échantillon 3 Après 3 minutes de réaction, ajouter 1 ml de solution de carbonate de sodium 4 Laisser les solutions 30 minutes à l’abri de la lumière et lire l’absorbance à 765 nm (*si les solutions ne sont pas transparentes on centrifuge) 5 Témoin : (pour régler le zéro) Effectuer l’essai à blanc sans ajouter l’échantillon (c'est- à-dire le remplacer avec le solvant éthanol) c’est è dire prendre1.25 ml du réactif de Folin solution diluée + 0.25 ml éthanol 6 Standard : Acide gallique dans de l’eau distillée ou le solvant dans lequel se trouve l’échantillon. Les résultats ont été exprimés par la moyenne de trois mesures

Annexe A

A.4. Effet antibactérien

Souches microbiennes utilisée :

Candida Albicans Salmonella Typhimirium Escherichia coli

Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Vibrio cholerae Pseudomonas aeruginosa

[email protected] ou [email protected] Adresse

Candida albicans est une levure non capsulée, non pigmentée, et aérobie, forme ainsi des colonies blanches crémeuses [124]. Elle provoque des infections fongiques (candidiase ou candidose) essentiellement au niveau des muqueuses digestive et gynécologique. Les candidoses sont une cause importante de mortalité chez les patients immunodéprimés comme les patients atteints du sida [125] ;

Figure.A.1. Image microscopique de candida Albicans ATCC 10231

Salmonella Typhimirium ref IPA

Les salmonelles (Salmonella) forment un genre de protéobactéries appartenant à la famille des entérobactéries. Elles mesurent 0,7 à 1,5 μm de diamètre, pour 2 à 5 μm de longueur avec un flagelle. Annexe A

Elles provoquent des maladies telles que la fièvre typhoïde, la fièvre paratyphoïde et la toxi- infection alimentair[126, 74] ;

Figure.A.2. Image microscopique de Salmonella Typhimirium

E.colis ATCC 25922

Il s’agit de coliformes thermo tolérants qui produisent de l’indole à partir du trypthophane à 44 °C. ce sont donc également des bacilles à gram négatifs, aérobies facultatifs, non sporulés, capable de se multiplier en présence de sels bilières [74].

Elle se transmet à l’homme principalement par des aliments contaminés on observe dans les symptômes de l’infection à ECEH des crampes abdominales et des diarrhées qui, dans certains cas, évoluent vers des diarrhées sanglantes (colite hémorragique). Il peut également y avoir de la fièvre et des vomissements [126] ;

Annexe A

Figure.A.3. Image microscopique Escherichia coli (ATCC ® 25922)

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Le staphylocoque doré (Staphylococcus aureus) est l'espèce la plus pathogène du genre Staphylococcus. Elle est responsable d'intoxications alimentaires, d'infections localisées suppurées et dans certains cas extrêmes, d'infections potentiellement mortelles (patient immunodéprimé, prothèses cardiaques). S. aureus se présente comme une coque en amas (grappes de raisin), gram positif et catalase positif. Sa teneur en caroténoïdes lui confère une couleur dorée à l'origine de son nom [75] ;

Enterococcus faecalis

E. faecalis se présente comme un microorganisme non-mobile, anaérobie facultatif, il fermente le glucose sans production de gaz. C'est une des rares bactéries lactiques à posséder une catalase, active seulement lorsque la bactérie peut acquérir de l'hème [76] ;

Vibrio cholerae

La bactérie Vibrio cholerae (vibrion cholérique ou bacille virgule en français) est une bactérie gram négatif, en forme de bâtonnet incurvé, mobile et responsable du choléra chez l'homme, une maladie épidémique contagieuse[74] ;

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa, autrement connu sous le nom de bacille pyocyanique, bacille du pus bleu , gram-négatives du genre Pseudomonas. C’est l'une des bactéries les plus de difficiles à traiter cliniquement. Le taux de mortalité atteint 50% chez les patients (de les immunodéprimés) [84] ;

Mode opératoire

La méthode est qualitative. Elle consiste à mettre en présence les extraits végétaux dont on veut démontrer un éventuel pouvoir antibactérien et/ou antifongique, avec les germes à tester selon la méthode décrite par Rai Aneja et al [123]. a. Préparation des boites de Pétrie Annexe A

Les deux milieux de culture, la Mueller Hinton(MH) (pour les bactéries) et Sabouraud (pour la levure) sont fondus dans un bain-marie à 95°C. Ensuite on verse aseptiquement 50ml du milieu dans des boites de Pétrie de 9cm de diamètre. On laisse refroidir et solidifier le milieu de culture dans des boites de Pétri sur la paillasse. b. Préparation de l’inoculum La préparation de l’inoculum se fait à partir d’une jeune culture de 18 heures pour les bactéries et 48 heures pour les levures. Des suspensions troubles ont été réalisées en prélevant 3 à 5 colonies bien distinctes, dans 5ml d’eau physiologique stériles, puis nous agitons au vortex. c. Ensemencement A l’aide d’un écouvillon, on prélève une quantité de la suspension de levure ou de bactéries repiquées dans l’eau physiologique, on ensemence sur toute la surface du milieu de culture. d. Dépôt d’échantillons . Les huiles fixes Dans les huit puits, perforés dans le milieu froid et solide à l’aide d’un tube en inox (Diamètre= 6mm) stérilisé et flambé, on dépose 50μl d’extrait obtenu, dilué dans DMSO à différente concentration (Figure.A.4).

Tableau.A.1.la plage de concentration choisie pour l’étude de l’effet antibactérien

N° SM 1 2 3 4 5 6 7 Concentration 22 11 5,5 2,75 1,375 0,6875 0,3437 0,1718 (mg/ml) SM : solution mère

. Les huiles essentielles On a dilué 50 μl dans 500 μl de DMSO (dilution 1/10) et à partir de cette dilution on a préparé la dilution (1/100), on dépose 50μl des deux dilutions dans les puits de même façon que les extraits. On a déposé 50 μl DMSO pure considéré comme le contrôle négatif.

Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) CMI est définie comme étant la concentration la plus faible d'un composé / extrait / médicament qui inhibe complètement la croissance du micro-organisme dans 24 h35. La CMI Annexe A des extraits ont été déterminées par la méthode de diffusion de puits de gélose modifiée. Une dilution en série double de chaque extrait a été préparé une solution mère à partir de 0,11g de chaque extrait dilué dans 5 ml de DMSO, 1 ml de la solution mère est suivi par une dilution dans de 1ml de DMSO pour atteindre une diminution de plage de concentration de 22 mg / ml à 0 ,1718 mg / ml. Un volume de 50 μl de chaque dilution a été introduit dans les puits dans les boites de pétries déjà ensemencées. Toutes les boites d'essai ont été mises en incubation en aérobiose à 37 ° C pendant 24 heures et a observé pour les zones d'inhibition. La plus faible concentration de chaque extrait montrant une zone claire de d'inhibition (> 6 mm), considéré comme la CMI [123].

Figure.A.4. Boite de pétrie après dépôt d’échantillon

ANNEXE B

Abundance 5 1-Myrcène 2-Cineole <1,8-> 3-Anethole <(E)-> 4-Eugenol 5-Methyl eugenol 6-Caryophyllene

2 4

3 6

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.1. Chromatogramme en courant ionique à t=2mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance 5 1-Myrcène

2-Cineole <1,8-> 3-Anethole <(E)-> 4-Eugenol 5-Methyl eugenol 6-Caryophyllene <(Z)->

1 3 6 2

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.2. Chromatogramme en courant ionique à t=5mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance 1-Myrcene 2-Cineole 3-Linalool 4-Terpinen-4-ol 9 5-Terpineol<ɣ -> 8 6-Methyl chavicol 7-Anethole <(E)-> 8-Eugenol 9-Methyl eugenol 7 10-Prenyl limonene 11-Caryophyllene oxide

12-Humulene epoxide Il

11 6

10 5 3 2 4 12 13 1

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.3. Chromatogramme en courant ionique à t=11mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire

HP5-MS

Abundance

1-Anethole <(E)-> 3 2-Eugenol 3-Methyl eugenol 4-Humulene <α-> 5-Caryophyllene oxide 6-Humulene epoxide II 7-Geranyl linalool«(Z,Z)-> 2

1 7

6 4

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.4. Chromatogramme en courant ionique à t=20mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance 1-Myrcene 2-Cineole <1,8-> 8 3-Terpinen-4-ol 4-TerpineoI <α>

5-Methyl chavicol 6-Anethole <(E)-> 7 7-Eugenol 8-Methyl eugénol 9-Humulène α 10-Caryophyllène oxide

2 3 4 5 9

10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 Time-->

Figure B.5. Chromatogramme en courant ionique à t=33mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

11 1- Pinène <α> 2- Pinène 3- Mycène 4- Cinéole <1,8->

10 5- Linalool 6- Terpinen-4-ol 7- Terpineol<ɣ -> 8- Terpinen-4-ol 9- Anethole <(E)-> 10- Eugenol 11- Methyl eugenol 12- Humulene <α->

9 13- Caryophyllene oxide

4 13 7

1 2 3 5 12 6

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.6. Chromatogramme en courant ionique à t=48mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

6 7 1-Mycène 2-Cinéole <1,8-> 3-Linalool 4-Terpinèn-4-ol 5-Terpinéol<ɣ -> 6-Eugénol 7-Methyl eugénol 8-Humulène <α-> 9-Selinène < > 10-Caryophyllène oxide 𝛽𝛽

3 4 10 9

2 1

Time--> 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Figure B.7. Chromatogramme en courant ionique à t=5 mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

1-Myrcène 7 6 2-Cineole <1,8-> 3-Sabinene hydrate

(lPP vs. OH) 4-Shisofuran 5-Anethole <(E)-> 6-Eugenol 7-Methyl eugenol 8-Humulene <α-> 9-Caryophyllene oxide 1

4 8 2 9 3

Time--> 10.00 20.00 30.00

Figure B.8. Chromatogramme en courant ionique à t=12mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance 1-Cymen-8-ol <ρ-> 2-Carvone 4 5 3-Anéthole <(E)-> 4-Eugénol 1 5-Méthyl eugénol

6-Humulene <α-> 7-Aristolochene 8-Caryophyllene oxide 9-Ar-tumerone

3 8

6 7 2

10.00 20.00 30.00 Time-->

Figure B.9. Chromatogramme en courant ionique à t=20 mn d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO-SV sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance 9

1-Myrcène 2-Cinéole <1,8-> 3-Ocimène <(E)-B-> 4-Linalool 5-Terpinèn-4-ol 8 6-TerpineoI <α> 7-Methyl chavicol 8-Eugénol 9-Méthyl eugénol 10 10-Caryophyllene < (Z) -> 11-Humulene<α> 1 12-Caryophyllene oxide

2 6 11

3 4 12 5 7

10.00 20.00 30.00 Time--> Figure B.10. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

1-Myrcène 2-Cinéole <1,8-> 9 3-Ocimene <(E)-B-> 4-Linalool 8 5-Terpinen-4-ol 6-TerpineoI <α> 7-Methyl chavicol 8-Eugenol 9-Methyl eugenol 10-Humulene<α> 11-Caryophyllene oxide 1 12-Turmerone

6 11 3 10 4 5 7 12

10.00 20.00 30.00 40.00 Time--> Figure B.11. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO (BS) sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

1-Myrcène 9 2-Cinéole <1,8-> 3-Ocimene <(E)-B-> 4-Linalool

8 5-Terpinen-4-ol 6-TerpineoI <α> 7-Methyl chavicol 8-Eugenol 9-Methyl eugenol

10-Humulene<α> 11-Caryophyllene oxide 1

6 10 4 11 3 5 7

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.12. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Piper Cubéba extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

1-Myrcène 9 2-Cinéole <1,8-> 3-Ocimene <(E)-B-> 4-Linalool

8 5-Terpinen-4-ol 6-TerpineoI <α> 7-Methyl chavicol 8-Eugenol 9-Methyl eugenol

10-Humulene<α> 11-Caryophyllene oxide 1

6 10 4 11 3 5 7

10.00 20.00 30.00 40.00 Time--> Figure B.13. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba témoin (0kGy) extraite par HD-MO(BC) sur

une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.14. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (0,1 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS Abundance

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.15. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (1 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

10.00 20.00 30.00 40.00 Time-->

Figure B.16. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (2 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS

Figure B.17. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (5 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS

Abundance

Time--> 10.00 20.00 30.00 40.00

Figure B.18. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (10 kGy) extraite par HD-MO(BC) sur une colonne capillaire HP5-MS

RT: : 100 1-Myrcène 7 95 2- Ocimene <(Z)- -> 3-Ocimene <(E)- -> 90 4-Methyl chavicol𝛽𝛽

85 5- Anethole <(E)-𝛽𝛽> 80 6- Eugenol 75 7-Methyl eugenol 70 8-Duprezianene < >

65 𝛽𝛽 60 55

50 1

40 35 2 8 30

25 3 4 20

15 6 5

0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Time (min)

Figure B.19. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (MDC) extraite par HS-SPME sur une

colonne capillaire PDMS

100 7 95

90 85

65 5 60

55 50 45 8 40

35 30 1 2 6 25

20 3 4 15 10

0 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Time (min)

Figure B.20. Chromatogramme en courant ionique d’HE des graines de Piper Cubéba irradiées (FDC) extraite par HS-SPME sur une colonne capillaire PDMS

133 100

OH N 151

42 73 55 68 31 81 105 91 121 0 30 50 70 90 110 130 150 (mainlib) Oxime-, methoxy-phenyl-_ 112 Figure B.21. Spectre GC/MS à courant ionique de 2- Oxime-, methoxy- Figure B.22. Spectre GC/MS à courant ionique de 2- phenyl-_ Oxime-, methoxy-phenyl-_(selon la référence nist)

213 100

HO OH

228 119

65 99 135 39 77 165 197 27 51 181 0 20 50 80 110 140 170 200 230 (mainlib) Phenol, 4,4'-(1-methylethylidene)bis-

Figure B.23. Spectre GC/MS à courant ionique de Biphenol A (BPA) Figure B.24. Spectre GC/MS à courant ionique de Biphenol A (BPA) (selon la référence nist)

205 100 205.2 100 220 95

90 O 85 177 80

75 163 70

60 55 O 50 50

45 177.3 40 135 35 220.1 67 30 149

25 57 91 43 121

20 192.3 77 107 15 91.4 135.3 163.4 178.4 10 77.3 107.3 149.4 221.1 191 79.3 131.3 145 173.4 179.3 5 55.1 67.3 123.3 89.3 0 0 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 10 40 70 100 130 160 190 220 m/z (replib) 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone

Figure B.25. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert-Butyl- Figure B.26. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert-Butyl-1,4- 1,4 -benzoquinone benzoquinone (selon la référence nist)

# : 100 100 100.1 100

60 O

55 N 50 50

15 70.2

10 101.1 72.3 87.2 43 5 86.2 71.2 3 88.3 98.4 87 73.2 77.2 93. 95. 69 140 170 282 310 338 0 0 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100102 104 106 20 70 120 170 220 270 320 m/z (mainlib) Morpholine, 4-octadecyl-

Figure B.27. Spectre GC/MS à courant ionique de Figure B.28. Spectre GC/MS à courant ionique de 2,5-di-tert- Morpholine, 4-octadecyl Butyl-1,4-benzoquinone (selon la référence nist)

100 2 95 90 1-Benzoic acid, 2,4,6-trichloro- 85 2- Oxime-, methoxy-phenyl-_ 80

10 1

0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 Time (min)

Figure B.29. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Impatiens glandulifera extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS

: : 100 3

95 1- 3-Quinolinecarboxylic acid Decanoic acid, decyl ester -

90 2- Isoamyl géranate

85 3- 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone 80 4- Cembrene et Dendroban-12-one, 10-hydroxy- 75 5- Biphenol A (BPA) 70 6- Morpholine, 4-octadecyl- 65

60 55

35 30 6 4 25 1 20 2 5

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.30. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Impatiens glandulifera extraite par la technique HS-SPME-GC-MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS

60.53 100 ?

70 2-Hexyn-1-ol

65 60 ? 55 6.32 Ethanone, 1,2-diphenyl-, oxime 56.27 50

35 Cyclotetrasiloxane, octamethyl-

30 12.61 56.42 25 12.83 5.74 55.98 63.31 20 52.61 53.31 11.02 18.10 19.60 56.84 15 50.49 25.82 47.42 10 31.32 44.05 23.40 7.23 36.16 40.34 43.25 5 13.73 28.61 33.63 45.60

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.31. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Pteridium aquilinum extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS

: 10.18 : 100 Oxime-, methoxy-phenyl-_ 95 - 90 85 ? 80

75 17.25

65 60 55

45 Acetamide,

40 2-fluoro- 35

25 6.24 20 18.28 15 27.33

10 9.77 11.08 56.27 13.06 23.44 19.49 37.06 52.60 56.42 5 6.48 13.46 28.59 48.63 20.24 33.14 38.01 43.58 59.21 63.61 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.32. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Pteridium aquilinum extraite par la technique HS-SPME-GC-MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS

60.53 100 ?

70 2-Hexyn-1-ol

65 60 ? 55 6.32 Ethanone, 1,2-diphenyl-, oxime 56.27 50

35 Cyclotetrasiloxane, octamethyl-

30 12.61 56.42 25 12.83 5.74 55.98 63.31 20 52.61 53.31 11.02 18.10 19.60 56.84 15 50.49 25.82 47.42 10 31.32 44.05 7.23 23.40 40.34 43.25 5 13.73 28.61 33.63 36.16 45.60

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.31. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Pteridium aquilinum extraite par la technique HS-SPME-GC-MS sur une colonne capillaire PDMS

10.15 100 5.61

95 Acetamide, 2-fluoro- 90 85

75 70 Oxime-, methoxy-phenyl-_ 65 60 55

25 8.88 20 8.52

10 17.25 18.28 11.14 13.19 19.23 56.27 5 23.39 48.63 52.61 25.85 28.57 33.14 37.07 37.98 43.58 56.85 63.61 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.33. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Leucanthemum vulgare extraite par la technique HS-SPME-GC- MS sur une colonne capillaire PDMS

33.98 NL: 100 7.42E6 95 Coumarin <6-methyl-> TIC MS 131021- 90 094

65 60

55 Spirolepechinene 50

35 31.25

10 18.07 56.27 5 5.71 7.63 11.03 58.79 13.02 19.48 23.44 27.15 52.60 17.35 28.70 35.60 36.16 43.25 48.12 50.48 60.27 63.65 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Time (min)

Figure B.34. Chromatogramme en courant ionique d’HE de Leucanthemum vulgare extraite par la technique HS-SPME-GC- MS in situ collect (par de l’azote liquide) sur une colonne capillaire PDMS