MASARYKOVA UNIVERZITA Pøírodovìdecká fakulta Ústav experimentální biologie

Diplomová práce

Brno 2019 Marie Krátká Pøírodovìdecká fakulta Ústav experimentální biologie

Adaptivní evoluce genu CenH3 u rostlin s holocentrickými chromozómy Diplomová práce Marie Krátká

Vedoucí práce: Mgr. František Zedek, Ph.D. Brno 2019 Bibliograficky´za´znam

Autor: Bc. Marie Kra´tka´ Prˇı´rodoveˇdecka´fakulta, Masarykova univerzita U´ stav experimenta´lnı´biologie

Na´zev pra´ce: Adaptivnı´evoluce genu CenH3 u rostlin s holocentricky´mi chro- mozo´my Studijnı´program: Experimenta´lnı´biologie

Studijnı´obor: Molekula´rnı´biologie a genetika

Vedoucı´pra´ce: Mgr. Frantisˇek Zedek, Ph.D.

Akademicky´rok: 2018/2019

Pocˇet stran: 54

Klı´cˇova´slova: CenH3; CENP-A; holocentricke´ chromozomy; adaptivnı´ evo- luce, centromericky´tah; asymetricka´meio´za; CENP-C; Cypera- ceae; kodon-substitucˇnı´modely; MEME; aBSREL Bibliographic Entry

Author: Bc. Marie Kra´tka´ Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Adaptive evolution of the CenH3 gene in plants with holocent- ric chromosomes Degree Programme: Experimental biology

Field of Study: Molecular biology and genetics

Supervisor: Mgr. Frantisˇek Zedek, Ph.D.

Academic Year: 2018/2019

Number of Pages: 54

Keywords: CenH3; CENP-A; holocentric chromosomes; centromeric drive; asymmetric meiosis; CENP-C; adaptive evolution Cyperaceae; codon-substitution models; MEME; aBSREL Abstrakt

U organismu˚ s monocentricky´m usporˇa´da´nı´m chromozomu˚ probı´ha´ centromericky´ tah, evolucˇnı´proces iniciovany´expanzı´centromericky´ch repetic, ktere´jsou tak na sebe schopny nava´zat veˇtsˇı´mnozˇstvı´kinetochorovy´ch proteinu˚a pote´by´t dı´ky asymetrii deˇ- licı´ho vrˇete´nka prˇisamicˇı´meio´ze preferencˇneˇsegregova´ny do vajı´cˇka. V reakci na tyto sobecke´centromery docha´zı´k adaptivnı´evoluci kinetochorove´ho proteinu CenH3, ktery´ doka´zˇe zabra´nit tahu sobecky´ch centromer obnovenı´m jejich rovnocennosti. Alternativnı´m zpu˚sobem obrany mohou by´t holocentricke´chromozomy, ktere´majı´v meio´ze kinetochor sestaven pode´l cele´de´lky chromozomu, cozˇmu˚zˇe znemozˇnit rozsˇı´rˇeny´m repetitivnı´m sek- vencı´m zı´skat selekcˇnı´vy´hodu a iniciovat centromericky´tah. V takove´m prˇı´padeˇproto nedocha´zı´k adaptivnı´evoluci CenH3. Tato pra´ce popisuje evoluci genu CenH3 v 34 dru- zı´ch rostlin z holocentricke´cˇeledi Cyperaceae. Selekcˇnı´analy´zou byla nalezena pozitivnı´ selekce CenH3 srovnatelna´s monocentricky´mi organismy s asymetrickou samicˇı´meio´zou, z cˇehozˇvyply´va´, zˇe usporˇa´da´nı´kinetochoru˚beˇhem meio´zy v te´to cˇeledi nebra´nı´centrome- ricke´mu tahu. To by se dalo vysveˇtlit mozˇny´m polycentricky´m usporˇa´da´nı´m kinetochoru beˇhem meio´zy, ktere´vsˇak zatı´m bylo pozorova´no pouze v druhu Rhynchospora pubera. Abstract

In organisms with monocentric chromosome morphology, an evolutionary process called centromere drive takes place. This process is initiated by centromeric repeats ex- pansion, which leads to the recruitment of excess kinetochore proteins. This allows the expanded centromere to be preferentially segregated to the egg during asymmetric female meiosis. In response to the selfish centromeres, kinetochore protein CenH3 adaptively evol- ves. The evolution of CenH3 can avert the centromere drive by restoring the centromere parity. Alternative protection from the centromere drive can be provided by holocentric chromosomes, which have their kinetochore assembled along an entire chromosome du- ring meiosis. This can prevent expanded centromeres from acquiring selective advantage and initiating the centromere drive. In such a case, no adaptive evolution of CenH3 occurs. This thesis describes the evolution of the CenH3 gene in 34 species from the Cyperaceae family. Positive selection of CenH3 comparable with monocentric organisms with asym- metric female meiosis was found using selection analysis, which suggests that the structure of kinetochores in the Cyperaceae family doesn’t prevent the centromere drive. This could be explained by the possible polycentric structure of the kinetochore in this family during meiosis which has so far been observed only in Rhynchospora pubera species.

Podeˇkova´nı´

Na tomto mı´steˇbych chteˇla podeˇkovat vedoucı´mu sve´diplomove´pra´ce Mgr. Frantisˇku Zedkovi, Ph.D. za odborne´vedenı´a rady, ktere´jsem od neˇj obdrzˇela beˇhem vypracova´va´nı´ sve´pra´ce, doc. RNDr. Petrovi Buresˇovi, Ph.D. a Mgr. Pavlovi Vesele´mu, Ph.D. za urcˇenı´ a sbeˇr vzorku˚a Ing. Jakubovi Sˇmerdovi, Ph.D. a KaterˇineˇLojdove´za pomoc v laboratorˇi. Da´le bych chteˇla podeˇkovat organizaci MetaCentrum za poskytnutı´vy´pocˇetnı´ch zdroju˚.

Prohla´sˇenı´

Prohlasˇuji, zˇe jsem svoji diplomovou pra´ci vypracovala samostatneˇs vyuzˇitı´m infor- macˇnı´ch zdroju˚, ktere´jsou v pra´ci citova´ny.

Brno 10. kveˇtna 2019 ...... Marie Kra´tka´ Obsah

Kapitola 1. U´ vod...... 10 1.1 CenH3...... 10 1.2 Centromericky´tah...... 10 1.3 Adaptivnı´evoluce CenH3...... 12 1.3.1 Zˇ ivocˇichove´...... 12 1.3.2 Rostliny...... 12 1.3.3 Evoluce dalsˇı´ch kinetochorovy´ch proteinu˚...... 13 1.3.4 Evoluce CenH3 v organizmech se symetrickou meio´zou...... 13 1.3.5 Vliv usporˇa´da´nı´centromery na evoluci CenH3...... 13 1.4 Holocentricke´chromozomy...... 14 1.4.1 Monocentricke´, metapolycentricke´, holocentricke´...... 14 1.4.2 Centromericke´sekvence...... 16 1.4.3 Centromericky´tah...... 17 1.5 Metody studia adaptivnı´evoluce...... 17

Cı´l diplomove´pra´ce...... 19

Kapitola 2. Materia´l a metody...... 20 2.1 Izolace RNA a DNA, prˇı´prava cDNA...... 20 2.2 Amplifikace genu CenH3 ...... 20 2.2.1 Na´vrh primeru˚a PCR...... 20 2.2.2 Agaro´zova´elektrofore´za...... 22 2.2.3 Optimalizace PCR...... 22 2.3 Sekvenace a u´prava sekvencı´...... 22 2.4 Kodonovy´alignment a konstrukce fylogeneticke´ho stromu...... 22 2.5 Selekcˇnı´analy´za...... 23

Kapitola 3. Vy´sledky...... 24

Kapitola 4. Diskuze...... 29 4.1 Zı´skane´sekvence a fylogeneticky´strom...... 29 4.2 Adaptivnı´evoluce CenH3 ...... 29 4.3 Centromericky´tah...... 30 4.4 Symetrie meio´zy...... 30

–– 4.5 Adaptivnı´role holocentricky´ch chromozomu˚...... 31

Souhrn...... 33

Summary...... 34

Seznam pouzˇite´literatury...... 35

Prˇı´lohy...... 41 Tabulka P1: Seznam zı´skany´ch sekvencı´...... 41 Soubor P1: Skript pro maskova´nı´alignmentu...... 42 Soubor P2: Maskovany´alignment zı´skany´ch sekvencı´...... 43 Soubor P3: Fylogeneticky´strom zı´skany´ch sekvencı´...... 52 Kapitola 1

U´ vod

1.1 CenH3

Protein CenH3 (centromericka´varianta H3, u obratlovcu˚oznacˇovana´jako CENP-A) tvorˇı´ jaky´si ”za´kladnı´ka´men kinetochoru”. CenH3 je varianta histonu H3, ktera´se nacha´zı´ pouze v oblastech centromery (prˇedstavujejaky´si marker funkcˇnı´centromery) a narozdı´l od klasicke´ho H3 umozˇnˇuje vazbu dalsˇı´ch kinetochorovy´ch proteinu˚a sestavenı´kineto- choru v centromericke´oblasti (Van Hooser et al., 2001; Heun et al., 2006). Strukturneˇ je CenH3 velmi podobny´histonu H3 (obzvla´sˇt’v oblasti HFD - histone fold dome´ny na C-konci), lisˇı´se hlavneˇna N-konci, ktery´zajisˇt’uje interakci s DNA a dalsˇı´mi proteiny (naprˇ.kinetochorovy´mi) (Chen et al., 2000; Malik et al., 2002), a loop 1 oblastı´uvnitrˇ HFD, ktera´je typicky v CenH3 o neˇkolik nukleotidu˚delsˇı´nezˇv H3 a je zodpoveˇdna´za specifickou interakci s centromerickou DNA (Malik a Henikoff, 2003). CenH3 je take´specificky´tı´m, zˇe se v pru˚beˇhu evoluce oproti sve´mu kanonicke´mu proteˇjsˇku H3 velmi rychle vyvı´jı´, a to obzvla´sˇteˇv regionech zodpoveˇdny´ch za vazbu DNA. Takova´to rychla´evoluce proteinu naprosto nezbytne´ho pro spra´vny´pru˚beˇh buneˇcˇne´ho deˇlenı´je velmi nezvykla´, cozˇvede k u´vaze, zˇe adaptivnı´evoluce CenH3 je podmı´neˇna rychlou evolucı´ centromericky´ch sekvencı´ (Malik a Henikoff, 2003). Podle hypote´zy centromericke´ho tahu se CenH3 vyvı´jı´v reakci na negativnı´du˚sledky rozsˇı´rˇenı´sobecke´ centromery a tı´m se sta´va´u´cˇastnı´kem evolucˇnı´ch za´vodu˚ve zbrojenı´.

1.2 Centromericky´tah

Podle Mendelovy´ch za´konu˚deˇdicˇnosti je soubor alel v gameta´ch du˚sledkem na´hodne´ho procesu segregace. Tato na´hodnost zajisˇt’uje, zˇe se konkre´tnı´alela vyskytuje v 1/2 vy- tvorˇeny´ch gamet. Meioticky´tah je proces, ktery´tuto rovnova´hu alel v gameta´ch porusˇuje (Sandler a Novitski, 1957). Prˇiasymetricke´samicˇı´meio´ze, ktera´je typicka´pro veˇtsˇinu zˇi- vocˇichu˚a vysˇsˇı´ch rostlin (Gorelick et al., 2016), vznika´ze cˇtyrˇmeioticky´ch produktu˚pouze jedna funkcˇnı´gameta (vajı´cˇko). Sobecke´geneticke´elementy, ktere´umı´vyuzˇı´t buneˇcˇne´ mechanismy k tomu, aby se preferencˇneˇsegregovaly do jedine´vznikajı´cı´samicˇı´gamety, tak zvysˇujı´svou sˇanci uplatneˇnı´v dalsˇı´generaci (Obr. 1.1). Jako sobecke´elementy mohou pu˚sobit naprˇı´klad zmnozˇene´centromericke´satelitnı´repetice, ktere´na sebe va´zˇı´nepomeˇrneˇ vı´ce jednotek CenH3, cozˇumozˇnˇuje sestavova´nı´kinetochoru na sˇirsˇı´oblasti chromozomu,

– 10 – Kapitola 1. U´vod 11

symetrická centromerický tah (samčí) meióza nemůže probíhat

asymetrická centromerický tah (samičí) meióza může probíhat

Obra´zek 1.1: Prˇiasymetricke´meio´ze docha´zı´k preferencˇnı´segregaci silne´centromery (cˇerveneˇ) do oocytu (prˇevzatoz Chma´tal et al. (2017), upraveno)

rozšíření adaptace centromerickése kinetochorových kvence proteinů

rovnocenné výhoda silnější rovnocenné centromery centromery centromery

Obra´zek 1.2: Centromericky´tah zacˇı´na´rozsˇı´rˇenı´m centromericke´sekvence, ktere´jı´umozˇnı´prefe- rencˇnı´segregaci do samicˇı´gamety. Ve druhe´m kroku docha´zı´k adaptivnı´evoluci kinetochorovy´ch proteinu˚(naprˇ.CenH3), ktere´obnovı´rovnova´hu centromer takzˇe vytva´rˇı´”silneˇjsˇı´”centromeru (Iwata-Otsubo et al., 2017). V neˇktery´ch populacı´ch docha´zı´k prˇednostnı´interakci silne´centromery s mikrotubuly vajecˇne´ho po´lu deˇlı´cı´se bunˇky, cozˇvede k jejı´prˇednostnı´segregaci do vajı´cˇka (Chma´tal et al., 2014). Centromericky´tah (Obr. 1.2) tedy umozˇnˇuje rozsˇı´rˇenı´sobecke´ho elementu v populaci, cozˇvsˇak s sebou nese negativnı´du˚sledky, naprˇı´klad zachova´nı´sˇkodlive´alely, ktera´by se nacha´zela ve vazbeˇse sobeckou centromerou (a ktera´by jinak byla vyrˇazenaprˇiroze- ny´m vy´beˇrem) (Malik a Henikoff, 2009; Fishman a Kelly, 2015), nebo sˇpatne´pa´rova´nı´ nerovnocenny´ch heterozygotnı´ch centromer v pru˚beˇhu samcˇı´meio´zy, zpu˚sobujı´cı´nondis- junkci a vznik aneuploidnı´ch gamet (Daniel, 2002) nebo dokonce apopto´zu za´rodecˇny´ch buneˇk (Eaker et al., 2001). U organismu˚s heterogameticky´m samicˇı´m pohlavı´m (naprˇ. pta´ci, neˇkterˇı´plazi a moty´li) by preferencˇnı´uplatneˇnı´jednoho z pohlavnı´ch chromozomu˚ v gameta´ch mohlo vyvola´vat vychy´lenı´pomeˇru pohlavı´(Rutkowska a Badyaev, 2007). Pra´veˇtyto sˇkodlive´u´cˇinky centromericke´ho tahu mohou by´t kompenzova´ny mutacemi prˇi- lehly´ch centromericky´ch proteinu˚(naprˇ.CenH3). Adaptivnı´mutace, ktere´doka´zˇı´zmeˇnit dynamiku interakce mezi centromerickou DNA a CenH3 tak, aby obnovily rovnocennost kinetochoru na beˇzˇne´a silneˇjsˇı´centromerˇe(Obr. 1.2), by proto prˇedstavovalyselekcˇnı´ vy´hodu a byly pozitivneˇselektova´ny a fixova´ny (Henikoff et al., 2001). Kapitola 1. U´vod 12

1.3 Adaptivnı´evoluce CenH3

1.3.1 Zˇ ivocˇichove´ Selekce pu˚sobı´cı´na centromericke´proteiny byla poprve´zdokumentova´na v rodu Droso- phila, kde Malik a Henikoff(2001) nalezli pozitivnı´selekci pu˚sobı´cı´na cely´gen centro- mericke´varianty H3 (v rodu Drosophila oznacˇovany´jako Cid), i na jeho jednotlive´oblasti (N-konec a HFD). Prˇipodrobneˇjsˇı´analy´ze (Malik et al., 2002) bylo v HFD mozˇne´rozlisˇit konzervovane´oblasti, ktere´odpovı´dajı´oblastem interakce mezi histony, a meˇnı´cı´se oblast (loop 1), ktera´interaguje s DNA. N-konec je velmi polymorfnı´, na´padna´je zejme´na vari- abilita v jeho de´lce zpu˚sobena´prˇı´tomnostı´oligopeptidovy´ch repetitivnı´ch motivu˚, z nichzˇ neˇktere´prˇipomı´najı´motivy va´zajı´cı´maly´zˇla´bek DNA. Vysoce variabilnı´N-konec vsˇak obsahuje take´urcˇite´konzervovane´bloky, ktere´by mohly by´t zodpoveˇdne´za interakci s dalsˇı´mi kinetochorovy´mi proteiny nebo sousednı´mi CenH3. Malik a Henikoff(2001) da´le zaznamenali absenci polymorfismu˚v blı´zkosti pozic s adaptivnı´mutacı´, cozˇnaznacˇuje neda´vnou fixaci adaptivnı´ch zmeˇn dı´ky silne´pozitivnı´selekci (selective sweep). Beck a Llopart(2015) identifikovali adaptivnı´evoluci i u dalsˇı´ch komponent kinetochoru v rodu Drosophila a potvrdili pozitivnı´selekci pu˚sobı´cı´na N-konec Cid ve vsˇech sledovany´ch linı´ch a na C-konec v neˇktery´ch liniı´ch. Zedek a Buresˇ(2012) nalezli rezidua podle´hajı´cı´adaptivnı´evoluci na N-konci a v loop 1 oblasti CenH3 ortologu (HCP-3) take´u ha´d’a´tka Caenorhabditis briggsae. Tato adaptivnı´zmeˇna HCP-3 by mohla souviset s expanzı´repetitivnı´ch sekvencı´pozorovanou u tohoto druhu. Pozitivnı´ selekce CENP-A byla nalezena i v rˇa´du prima´tu˚ (Schueler et al., 2010). Autorˇiza´rovenˇpoukazujı´na skutecˇnost, zˇe neˇktere´z pozitivneˇselektovany´ch reziduı´na N- konci CENP-A mohou hra´t roli prˇiposttranslacˇnı´ch modifikacı´ch. V promotorove´oblasti CENP-A navı´c objevili cˇaste´ inzerce transpozonu˚, cozˇ by mohlo naznacˇovat odlisˇnou regulaci genove´exprese v ru˚zny´ch druzı´ch prima´tu˚.

1.3.2 Rostliny Dalsˇı´cˇeledı´, ve ktere´byla evoluce CenH3 zkouma´na, je Brassicaceae. Talbert et al. (2002) nalezli pozitivnı´selekci v ortolognı´m genu CenH3 z Arabidopsis thaliana a A. arenosa pojmenovane´m HTR12. Cooper a Henikoff(2004) popsali podrobneˇjsˇı´strukturu loop 1. Kromeˇpozic, ktere´se adaptivneˇvyvı´jı´, obsahuje loop 1 take´neˇktere´pozice pod silnou purifikujı´cı´selekcı´, ukazujı´cı´na mozˇnou strukturnı´funkci neˇktery´ch reziduı´v loop 1. popsali take´adaptivneˇse vyvı´jejı´cı´pozice v HFD mimo loop 1, tato rezidua se nacha´zı´na povrchu proteinu poblı´zˇdvousˇroubovice DNA. Neumann et al. (2015) sledovali evoluci sekvence CenH3 uvnitrˇtribu Fabeae (cˇeled’ Fabaceae). Tato skupina je pozoruhodna´tı´m, zˇe u jejı´ho spolecˇne´ho prˇedkadosˇlo k dupli- kaci genu CenH3. V neˇktery´ch rodech (Vicia a Lens) dosˇlo ke ztra´teˇnebo umlcˇenı´jedne´z variant, avsˇak u rodu˚ Pisum a Lathyrus byly obeˇvarianty zachova´ny a podı´lejı´se na se- stavova´nı´kinetochoru. U kopie CenH3 zachovane´ve vsˇech druzı´ch Fabeae bylo nalezeno neˇkolik pozic podle´hajı´cı´ch adaptivnı´evoluci uvnitrˇHFD, kdezˇto u kopie specificke´pro rody Pisum a Lathyrus nebyly nalezeny zˇa´dne´. Epizodicka´pozitivnı´selekce CenH3 vsˇak nebyla potvrzena v zˇa´dne´fylogeneticke´linii a oba geny se jako celek vyvı´jejı´pod vlivem Kapitola 1. U´vod 13 negativnı´selekce. Rody lisˇı´cı´se pocˇtem funkcˇnı´ch kopiı´ CenH3 se lisˇı´take´morfologiı´ centromer, zatı´mco rody s jednou kopiı´si zachovaly monocentrickou strukturu, u rodu˚se dveˇma kopiemi dosˇlo k vy´voji takzvany´ch metapolycentricky´ch chromozomu˚(kapitola 1.4.1). Pozitivnı´selekce byla nalezena take´v neˇktery´ch liniı´ch CenH3 u diploidnı´ch a allo- tetraploidnı´ch druhu˚rodu Oryza (Poaceae) (Hirsch et al., 2009) a na neˇktery´ch kodonovy´ch pozicı´ch v N-konci CenH3 v rodu Mimulus (Phrymaceae) (Finseth et al., 2015).

1.3.3 Evoluce dalsˇı´ch kinetochorovy´ch proteinu˚ Talbert et al. (2004) pouka´zali na to, zˇe v liniı´ch, kde nenı´zjisˇteˇna adaptivnı´evoluce CenH3 mu˚zˇe pozitivnı´selekce pu˚sobit na dalsˇı´komponenty kinetochoru, ktere´jsou v kontaktu s DNA (jako naprˇı´klad CENP-C). Adaptivnı´evoluci CENP-C v rˇa´du prima´tu˚potvrdili Schueler et al. (2010).

1.3.4 Evoluce CenH3 v organizmech se symetrickou meio´zou Vztah mezi adaptivnı´evolucı´CenH3 a centromericky´m tahem da´le objasnili Zedek a Bu- resˇ(2016b), kterˇı´porovna´vali frekvenci vy´skytu pozitivnı´selekce CenH3 ve skupina´ch, ktere´majı´symetrickou samcˇı´i samicˇı´meio´zu (naprˇ.mechy, kapradiny, neˇktere´houby) se skupinami s asymetrickou samicˇı´meio´zu. Pozitivneˇselektovane´linie byly s vysˇsˇı´frek- vencı´pozorova´ny ve skupina´ch s asymetrickou meio´zou. Skupiny s asymetrickou meio´zou take´obsahovaly vı´ce pozitivneˇselektovany´ch pozic a vysˇsˇı´pru˚meˇrny´podı´l nesynonym- nı´ch mutacı´. Vsˇechna tato zjisˇteˇnı´ukazujı´na cˇasteˇjsˇı´vy´skyt adaptivnı´evoluce CenH3 v eukaryoticky´ch liniı´ch s asymetrickou samicˇı´meio´zou. To je v souladu s hypote´zou centromericke´ho tahu, protozˇe asymetricka´meio´za je nezbytny´m prˇedpokladempro cen- tromericky´tah (Obr. 1.1) a tedy i navazujı´cı´adaptivnı´evoluci CenH3. Absence pozitivnı´ selekce v rˇı´sˇi hub je oveˇrˇenai dalsˇı´mi analy´zami (Baker a Rogers, 2006; Talbert et al., 2004). Talbert et al. (2004) spekulujı´, zˇe je absence pozitivnı´evoluce CenH3 a CENP-C (v rodu Saccharomyces nazvane´jako Cse4p a Mif2p) mu˚zˇe by´t zpu˚sobena take´nezvyklou strukturou jejich centromer. Bodove´centromery neˇktery´ch kvasinek jsou totizˇslozˇeny ze specificky´ch konzervovany´ch sekvencı´, na ktere´naseda´pouze jediny´nukleozom obsahu- jı´cı´Cse4p (Henikoff a Henikoff, 2012).

1.3.5 Vliv usporˇa´da´nı´centromery na evoluci CenH3 Je tedy zjevne´, zˇe adaptivnı´evoluce CenH3 probı´ha´v mnoha taxonech. Podstata tohoto pro- cesu zrˇejmeˇtkvı´v geneticke´m konfliktu s rychle se vyvı´jejı´cı´mi sobecky´mi centromerami. Existujı´vsˇak okolnosti, ktere´by potencia´lneˇmohly znemozˇnit sobecky´m centromericky´m repeticı´m zı´ska´nı´evolucˇnı´vy´hody. CenH3 v holocentricky´ch rostlina´ch rodu Luzula ne- nese zˇa´dne´zna´mky pozitivnı´selekce (Zedek a Buresˇ, 2016a). Absence pozitivnı´selekce pu˚sobı´cı´na CenH3 v teˇchto rostlina´ch by se dala vysveˇtlit nezvykly´m usporˇa´da´nı´m jejich centromer. Kapitola 1. U´vod 14

A B C

Obra´zek 1.3: Sche´ma typu˚usporˇa´da´nı´centromery (cˇerveneˇzna´zorneˇn kinetochor): A) monocen- tricke´, B) metapolycentricke´, C) holocentricke´

1.4 Holocentricke´chromozomy

1.4.1 Monocentricke´, metapolycentricke´, holocentricke´ Oblast funkcˇnı´centromery je urcˇena prˇı´tomnostı´nukleozomu˚obsahujı´cı´ch CenH3, ktere´ jsou nezbytne´pro sestavenı´kinetochoru (vy´jimkou jsou naprˇı´klad neˇktere´skupiny hmyzu, ve ktery´ch CenH3 chybı´(Drinnenberg et al., 2014)) a na´sledne´nava´za´nı´deˇlı´cı´ho vrˇe- te´nka. Centromericky´ heterochromatin je take´ charakteristicky´ prˇı´tomnostı´ neˇktery´ch posttranslacˇnı´ch modifikacı´, jako naprˇı´klad H2AThr120ph, ktera´se vyskytuje specificky v heterochromatinu funkcˇnı´ch rostlinny´ch centromer a podı´lı´se na regulaci koheze chro- matid prˇibuneˇcˇne´m deˇlenı´(Demidov et al., 2014). V oblasti centromery se take´cˇasto nacha´zı´jedinecˇna´sekvence DNA, ktera´se svou transkripcı´podı´lı´na depozici CenH3 nukleozomu˚do centromericke´ho chromatinu (Que´net a Dalal, 2014) a na´sledneˇnapoma´ha´ stabilizaci jejich vazby (Zhang et al., 2013). Sekvence centromericke´DNA je vsˇak vysoce specificka´pro blı´zce prˇı´buzne´druhy a podle´ha´rychle´divergentnı´evoluci (Henikoff et al., 2001). Podle pocˇtu a rozmı´steˇnı´centromericky´ch oblastı´je mozˇne´urcˇit trˇitypy usporˇa´da´nı´ chromozomu˚(Obr. 1.3). Monocentricke´chromozomy, prˇı´tomne´u veˇtsˇiny eukaryot, se vyznacˇujı´jedinou centro- merickou oblastı´nacha´zejı´cı´se v mı´steˇprima´rnı´konstrikce chromozomu. Centromericka´ sekvence je typicky tvorˇenasatelitnı´mi tandemovy´mi repeticemi nebo odvozena z retro- transposonu˚, celkova´de´lka te´to sekvence mu˚zˇe dosahovat azˇneˇkolik megaba´zı´. Metapolycentricke´chromozomy mohou prˇedstavovatprˇechodny´stav mezi mono- a holocentricky´mi chromozomy (Neumann et al., 2012). V tomto prˇı´padeˇse uvnitrˇrozsˇı´rˇene´ prima´rnı´konstrikce nacha´zı´3-5 diskre´tnı´ch oblastı´centromery va´zajı´cı´ch CenH3. Tento typ centromery byl nalezen u dvou rodu˚z cˇeledi Fabaceae (Neumann et al., 2015). Re- petitivnı´ sekvence tvorˇı´cı´ metapolycentrickou centromeru jsou neobycˇejneˇ rozmanite´. Neumann et al. (2012) identifikovali 13 ru˚zny´ch typu˚satelitnı´ch sekvencı´a jeden typ retrotranspozonove´ho elementu tvorˇı´cı´centromerickou sekvenci DNA Pisum sativum, u monocentricky´ch druhu˚je centromera tvorˇenanejcˇasteˇji pouze jednı´m nebo dveˇma typy satelitu (doplnˇkove´materia´ly v Melters et al. (2013)) Holocentricke´chromozomy majı´takzvanou difuznı´centromeru, ktera´se vyskytuje v mnoha oblastech pode´l cele´de´lky chromozomu. Prˇipozorova´nı´kondenzovany´ch chromo- Kapitola 1. U´vod 15

S. cereale (M) L. elegans (H) R. pubera (H) C. elegans (H) mitóza meióza

Obra´zek 1.4: Usporˇa´da´nı´centromery v mito´ze a meio´ze se u neˇktery´ch holocentriku˚lisˇı´. Vyobrazen karyotyp monocentricke´ho Secale cereale (prˇevzatoz Schubert et al. (2014)) a holocentricky´ch Luzula elegans (difuznı´centromera prˇiobou typech buneˇcˇne´ho deˇlenı´(Heckmann et al., 2014; Demidov et al., 2014)), Rhynchospora pubera (prˇimeio´ze je centromera tvorˇenashluky (Marques et al., 2016)) a chromozom Caenorhabditis elegans (kinetochor (zeleneˇ) prˇimeio´ze ”objı´ma´”jeden konec chromozomu (cˇerveneˇ) (Howe et al., 2001; Dumont et al., 2010)) zomu˚ve sveˇtelne´m mikroskopu nenı´zrˇetelna´prima´rnı´konstrikce a oblasti centromery, na ktery´ch docha´zı´k sestavenı´kinetochoru a nava´za´nı´deˇlicı´ho vrˇete´nka typicky tvorˇı´ souvisly´pa´s (Obr. 1.3,1.4). Toto odlisˇne´usporˇa´da´nı´s sebou prˇina´sˇı´take´mnoho rozdı´lu˚ v pru˚beˇhu buneˇcˇne´ho deˇlenı´. V holocentricky´ch rostlina´ch rodu Luzula byla zdokumen- tova´na takzvana´invertovana´meio´za, prˇiktere´docha´zı´beˇhem I. meioticke´ho deˇlenı´k rozdeˇlenı´sestersky´ch chromatid a prˇiII. meioticke´m deˇlenı´jsou rozdeˇleny nesesterske´ chromatidy (Heckmann et al., 2014). Ne vsˇechny organismy si vsˇak zachova´vajı´holocent- ricke´usporˇa´da´nı´chromozomu˚beˇhem mito´zy i meio´zy (Obr. 1.4). U hlı´stic Caenorhabditis a Parascaris v pru˚beˇhu meio´zy nenı´centromera difuznı´, ale lokalizova´na na jednom z chro- mozoma´lnı´ch koncu˚(Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Navı´c se prˇiI. meioticke´m deˇlenı´ rozcha´zı´nesesterske´chromatidy - tak, jak je zvykem u monocentriku˚(Maddox et al., 2004). Urcˇitou odlisˇnost v meio´ze mu˚zˇeme pozorovat i u rostliny Rhynchospora pubera z cˇeledi Cyperaceae, kde se sice ”klasicka´”difuznı´holocentromera vyskytuje v pru˚beˇhu mito´zy, ale beˇhem meio´zy vytva´rˇı´jake´si oddeˇlene´centromericke´shluky (Marques et al., 2016). U dalsˇı´ch rostlin z cˇeledi Cyperaceae zatı´m nebylo usporˇa´da´nı´kinetochoru beˇhem meio´zy studova´no (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Holocentrismus vznikl a zanikl neˇkolikra´t v rozlicˇny´ch eukaryoticky´ch taxonech (Obr. 1.5), fylogeneticke´modely odhadujı´, zˇe celkem dosˇlo k 13 azˇ19 takovy´m vzniku˚m (Melters et al., 2012; Escudero et al., 2016). Jenom v ra´mci krytosemenny´ch pravdeˇpodobneˇdosˇlo azˇk 6 neza´visly´m prˇechodu˚m z monocentricke´ho na holocentricke´ usporˇa´da´nı´(Escudero et al., 2016). Odhaduje se, zˇe prˇiblizˇneˇ1,5 % (5 500) druhu˚krytose- menny´ch rostlin (veˇtsˇina z nich z cˇeledi Cyperaceae) ma´holocentricke´usporˇa´da´nı´(Buresˇ et al., 2013). Holocentricky´typ centromer byl potvrzen v cˇeledı´ch Juncaceae (sı´tinovite´) a Cyperaceae (sˇa´chorovite´) z rˇa´du Poales (lipnicotvare´) a v rodu Chionographis z rˇa´du Liliales (liliotvare´), z vysˇsˇı´ch dvoudeˇlozˇny´ch rostlin take´v rodu Drosera (rosnatka) a Cuscuta (kokotice) (Buresˇ et al., 2013). Vzhledem k polyfyleticke´mu pu˚vodu holocent- ricky´ch chromozomu˚nenı´jasne´, nakolik jsou si na molekula´rnı´u´rovni vza´jemneˇpodobne´ Kapitola 1. U´vod 16

Ecdysozoa Viridiplantae vyšší dvouděložné Odonata Drosera Zoraptera + Dermaptera jednoděložné Cuscuta Hexapoda Hemiptera Psocodea Magnoliopsida cyperidní klad Trichoptera + Lepidoptera Chionographis

Remipedia + Copepoda + Brachiopoda Myristica zbytek Crustacea Trithuria Myriapoda nahosemenné

roztoči kapradiny + plavuně Arachnida Dysderoidea mechy + játrovky + hlevíky

Buthidae Zygnematophyceae

zbytek Chelicerata Chlorophyceae + Charophyceae + Coleochaetophyceae

? Onychophora Glaucophyta + Rhodophyta Tardigrada Nematoda Monocentrické nebo neurčené chromozomy Priapulida + Kinorhyncha + Lophotrochozoa Holocentrické chromozomy

Obra´zek 1.5: Zjednodusˇeny´fylogeneticky´strom vy´skytu holocentricky´ch chromozomu˚(prˇevzato ze Zedek a Buresˇ(2018)). Holocentricke´chromozomy se vyskytujı´v neˇkolika rˇa´dech hmyzu, stonozˇka´ch a mnohonozˇka´ch, neˇktery´ch roztocˇı´ch, pavoucı´ch, sˇtı´rech a hlı´sticı´ch. Holocentricke´ rostliny zahrnujı´prˇedevsˇı´m dvoudeˇlozˇne´rody rosnatek a kokotic, jednodeˇlozˇne´cyperidnı´rostliny (sı´tinovite´a sˇa´chorovite´) a spa´jive´rˇasy v ru˚zny´ch liniı´ch. Funkce a struktura holocentricky´ch chromozomu˚byla nejpodrobneˇji prostudova´na u C. elegans, z rostlin potom u rodu Luzula cˇeledi Juncaceae.

1.4.2 Centromericke´sekvence Homogennı´repetitivnı´sekvence specificke´pro oblast centromery jsou vsˇak beˇzˇny´m jevem pouze u monocentricky´ch (a metapolycentricky´ch) chromozomu˚(Plohl et al., 2014). V prˇı´padeˇholocentricky´ch chromozomu˚je kinetochor kolokalizujı´cı´s jedinecˇnou repetitivnı´ sekvencı´spı´sˇe vy´jimkou. Zˇ a´dne´z repetitivnı´ch sekvencı´ C. elegans nemajı´vysokou afinitu k CenH3, na za´kladeˇrozvrzˇenı´repetitivnı´ch sekvencı´se lze domnı´vat, zˇe jedinecˇnou cent- romerickou DNA neobsahujı´ani rostliny rodu Luzula (Heckmann et al., 2013), Eleocharis (Cyperaceae) (de Souza et al., 2018) a moty´l Bombyx mori (d’Alencon et al., 2010). Vy´- jimkou jsou neˇktere´druhy rodu Rhynchospora, kde byly nalezeny satelitnı´repetice Tyba tvorˇı´cı´centromeru (Marques et al., 2015). Tyto 3 azˇ16 kb dlouhe´oblasti kolokalizujı´s CenH3 a beˇhem kondenzace chromozomu tvorˇı´dra´zˇku (prˇimito´ze) nebo diskre´tnı´cen- tromericke´shluky (prˇimeio´ze) pode´l cele´de´lky chromozomu (Obr. 1.4, Marques et al. (2016)). Satelitnı´ sekvence tvorˇı´cı´ centromeru vsˇak nebyla nalezena ve vsˇech druzı´ch Rhynchospora (Ribeiro et al., 2017) a Tyba sekvence netvorˇı´centromerickou sekvenci ani v dalsˇı´ch rodech Cyperaceae, zu˚sta´va´proto ota´zkou, zda i neˇktere´dalsˇı´holocentricke´ druhy cˇi rody z cˇeledi Cyperaceae mohou obsahovat repetitivnı´centromericke´sekvence, Kapitola 1. U´vod 17 nebo zda je Rhynchospora opravdu vy´jimkou.

1.4.3 Centromericky´tah Vzhledem k tomu, zˇe v holocentricky´ch organismech nehraje centromericka´DNA tak za´- sadnı´roli jako u monocentriku˚, da´se usuzovat, zˇe prˇı´padne´rozsˇı´rˇenı´satelitnı´ch sekvencı´ v podstateˇneovlivnı´lokalizaci CenH3. Pokud by tomu tak skutecˇneˇbylo, centromericky´ tah by v holocentricky´ch organismech nemohl probı´hat, protozˇe rozsˇı´rˇenı´satelitnı´ch sek- vencı´by nevyu´stilo v rozsˇı´rˇenı´kinetochoru a preferencˇnı´segregaci do samicˇı´ch gamet (Talbert et al., 2009; Malik a Henikoff, 2009). Neprˇı´tomnost centromericke´ho tahu by tak zpu˚sobila me´neˇcˇastou pozitivnı´selekcı´CenH3. Tento prˇedpokladje naplneˇn u rodu Luzula, kde nebyly nalezeny zˇa´dne´stopy pozitivnı´selekce CenH3 (Zedek a Buresˇ, 2016a). Holocentricke´chromozomy by tak mohly vznikat jako preventivnı´obrana prˇedakumulacı´ satelitnı´ch sekvencı´v du˚sledku centromericke´ho tahu (Talbert et al., 2009; Malik a Heni- koff, 2009; Zedek a Buresˇ, 2016a). Tomu by nasveˇdcˇovala skutecˇnost, zˇe se holocentricke´ chromozomy vyskytujı´pouze v organismech s asymetrickou meio´zou (Zedek a Buresˇ, 2016a).

1.5 Metody studia adaptivnı´evoluce

Zmeˇny aminokyselinove´sekvence vznikajı´nesynonymnı´mutacı´(N) sekvence genu (mu- tovany´kodon ko´duje jinou aminokyselinu), na tyto mutace pote´na u´rovni proteinu pu˚sobı´ selekcˇnı´tlak, ktery´zpu˚sobı´fixaci nebo eliminaci alely podle toho, zda je prˇı´nosna´nebo sˇkodliva´. Pozitivnı´selekce tak fixuje ty alely, ktere´organismu prˇina´sˇı´adaptivnı´vy´hodu. Dalsˇı´typ mutacı´, synonymnı´mutace (S), nemajı´vliv na aminokyselinovou sekvenci pro- teinu, protozˇe mutovany´triplet ko´duje stejnou aminokyselinu, na tyto alely proto selekce typicky nepu˚sobı´. Selekcˇnı´ tlak na urcˇity´ protein je mozˇne´ sledovat pomocı´ pomeˇru frekvence nesy- nonymnı´ch a synonymnı´ch mutacı´(ω = dN/dS) (ktery´lze odhadnout ze sekvencı´genu ru˚zny´ch druhu˚a jejich fylogeneticke´ho stromu). Pokud na gen nepu˚sobı´zˇa´dny´selekcˇnı´tlak (vyvı´jı´se neutra´lneˇ), je tento pomeˇr prˇiblizˇneˇroven 1. Pozitivnı´selekce zvy´sˇı´frekvenci nesynonymnı´ch mutacı´a tedy i ω, ktera´v tomto prˇı´padeˇdosahuje hodnot > 1. Negativnı´ selekce bude nesynonymnı´mutace odstranˇovat a ω proto bude < 1. Pozitivnı´selekce vsˇak nepu˚sobı´na dN ve vsˇech fylogeneticky´ch veˇtvı´ch a na vsˇech kodonovy´ch pozicı´ch sekvence. Veˇtsˇinou na protein pu˚sobı´negativnı´selekce a pozitivnı´ selekcˇnı´tlak se vyskytuje pouze epizodicky (naprˇı´klad kdyzˇse CenH3 adaptivneˇvyvı´jı´, aby obnovilo rovnova´hu centromer), takzˇe celkova´ ω (naprˇı´cˇpozicemi a liniemi) te´meˇrˇ nikdy neprˇesa´hne 1. Identifikovat tyto epizody adaptivnı´evoluce je mozˇne´pomocı´ko- don-substitucˇnı´ch modelu˚, ktere´umozˇnˇujı´rozdeˇlit kodony do neˇkolika trˇı´d reprezentujı´ch pozice vyvı´jı´jejı´cı´se neutra´lneˇ(ω = 1), pod negativnı´selekcı´(ω < 1) nebo pod pozitivnı´ selekcı´(ω > 1). Pokud dosˇlo v dane´m genu k epizodeˇpozitivnı´selekce, bude model ob- sahujı´cı´trˇı´du pozic pod pozitivnı´selekcı´pravdeˇpodobneˇjsˇı´nezˇmodely pocˇı´tajı´cı´pouze s trˇı´dami neutra´lnı´evoluce a negativnı´selekce (Kosiol a Anisimova, 2012). aBSREL (Adaptive Branch-Site Random Effects Model) umozˇnˇuje prˇirˇaditkazˇde´jed- notlive´linii (veˇtvi fylogeneticke´ho stromu) azˇ3 hodnoty ω a rozdeˇlit kodony do 3 trˇı´d Kapitola 1. U´vod 18 a urcˇit, ve ktery´ch liniı´ch je model obsahujı´cı´trˇı´du pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚vy´- znamneˇpravdeˇpodobneˇjsˇı´nezˇ”nulovy´model”(nepovolujı´cı´trˇı´du pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚) a ve ktery´ch tedy pravdeˇpodobneˇdosˇlo k epizodicke´pozitivnı´selekci (Smith et al., 2015). MEME (Mixed Effect Models of Evolution) umozˇnˇuje kazˇde´pozici kodonu prˇirˇadit vlastnı´hodnotu ω, tato hodnota mu˚zˇe lisˇit v jednotlivy´ch linı´ch. Tento model proto do- ka´zˇe identifikovat pozice pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚i v prˇı´padeˇepizodicke´selekce (selekce pouze v neˇktery´ch linı´ch) (Murrell et al., 2012). Cı´l diplomove´pra´ce

Prˇedchozı´m studiem evoluce genu CenH3 v holocentricky´ch organismech bylo zjisˇteˇno, zˇe v rostlina´ch rodu Luzula se tento gen nevyvı´jı´pod pu˚sobenı´m pozitivnı´selekce, cozˇ je v kontrastu k poznatku˚m zı´skany´m z dalsˇı´ch eukaryoticky´ch taxonu˚. Tento jev lze vysveˇtlit holocenricky´m usporˇa´da´nı´m jejich chromozomu˚, ktere´ by mohlo zabranˇovat centromericke´mu tahu. Tato vlastnost by poskytla organismu˚m adaptivnı´vy´hodu a mohla tak by´t jednı´m z du˚vodu˚, procˇholocentricke´chromozomy v pru˚beˇhu evoluce vznikaly opakovaneˇ. Pokud by holocentricke´ chromozomy opravdu zabranˇovaly centromericke´mu tahu, bylo by mozˇne´ocˇeka´vat neprˇı´tomnost pozitivnı´selekce pu˚sobı´cı´na CenH3 i u dalsˇı´ch skupin holocentricky´ch organismu˚. Cˇeled’Cyperaceae (sˇa´chorovite´) je dı´ky sve´velikosti a prˇı´buznosti k rodu Luzula jasny´m kandida´tem na oveˇrˇenı´tohoto prˇedpokladu. Cı´lem te´to diplomove´pra´ce je charakterizovat selekcˇnı´tlaky pu˚sobı´cı´na gen CenH3 v rostlina´ch cˇeledi Cyperaceae a ten porovnat s evolucı´genu v dalsˇı´ch monocentricky´ch a holocentricky´ch skupina´ch. Zı´skane´poznatky prˇispeˇjı´k objasneˇnı´vlivu centromericke´ho tahu na holocentricke´organismy a k zodpoveˇzenı´ota´zky, zda se holocentricke´chromozomy mohly vyvinout jako obrana proti sobecky´m centromera´m.

– 19 – Kapitola 2

Materia´l a metody

2.1 Izolace RNA a DNA, prˇı´prava cDNA

Pro izolaci genu CenH3 byly vybra´ny rostliny z divoky´ch populacı´druhu˚naprˇı´cˇcˇeledı´ Cyperaceae (Tab. P1). Sebrane´rostliny byly uchova´ny v chladu a neprodleneˇpouzˇity k izolaci DNA nebo RNA, prˇı´padneˇbyly kultivova´ny ve sklenı´ku pro pozdeˇjsˇı´izolaci. Pro izolaci byly pouzˇity ba´ze mlady´ch listu˚. RNA byla izolova´na pomocı´kitu QIAGEN R RNeasy R Plant Mini Kit podle pokynu˚vy´robce (pouzˇit byl RLT pufr prˇı´davkem β-mer- kaptoetanolu) a jejı´orientacˇnı´koncentrace zmeˇrˇenapomocı´spektrofotometru Biochrom Libra S22. Pote´byla ze vzorku reverznı´transkripcı´pomocı´kitu QIAGEN R QuantiTect R Reverse Transcription Kit prˇipravenacDNA podle pokynu˚vy´robce. Genomova´DNA byla izolova´na ze vzorku˚, z nichzˇse nepodarˇilozı´skat amplifikovatelnou RNA. DNA byla izo- lova´na pomocı´kitu MACHEREY-NAGEL Nucleospin R Plant II podle pokynu˚vy´robce s u´pravami. Lyzovany´rostlinny´materia´l byl po 5 min inkubaci prˇi0 ◦C centrifugova´n 2 min prˇi14 000 g a supernatant byl na´sledneˇodebra´n do filtracˇnı´(ru˚zˇove´) kolonky. Kolonky byly ve vsˇech krocı´ch centrifugova´ny pouze prˇi4 000 RPM. Po druhe´m promytı´vazebne´ roztokem PW2 byla kolonka znovu centrifugova´na 2 min za u´cˇelem vysusˇenı´membra´ny.

2.2 Amplifikace genu CenH3

2.2.1 Na´vrh primeru˚a PCR Primery pro amplifikaci CenH3 byly navrzˇeny na za´kladeˇjizˇzna´my´ch sekvencı´ CenH3 cˇeledi Cypereceae zı´skany´ch z databa´zı´(Tab. P1). Bylo navrzˇeno neˇkolik sekvencı´forward a reverse primeru˚lisˇı´cı´ch se mı´stem naseda´nı´a prˇı´tomnostı´degenerovany´ch ba´zı´(Tab. 2.1 a Tab. 2.2), cˇı´mzˇbylo docı´leno naseda´nı´primeru˚i na sekvence CenH3 teˇch druhu˚, ktere´ se od zna´my´ch sekvencı´do jiste´mı´ry lisˇı´. Mı´sta naseda´nı´primeru˚byla vybra´na tak, aby vy´sledny´produkt pokry´val prakticky celou protein-ko´dujı´cı´cˇa´st genu CenH3. Sekvence byly amplifikova´ny Taq Purple polymera´zou za reakcˇnı´ch podmı´nek uvedeny´ch v Tab. 2.3 v termocycleru BIOER GenePro za pouzˇitı´programu rozepsane´ho v Tab. 2.4.

– 20 – Kapitola 2. Materia´l a metody 21

Tabulka 2.1: Sekvence primeru˚

na´zev smeˇr sekvence CYP-FOR1 forward ATGRCSAGAACSAAGCACTT CYP-FOR2 forward ATGRCNAGAACSAAGCACTT CYP-FOR3 forward GCNAGAACSAAGCACTTCT CYP-REV1 reverse CCACAWTCGACGRCCACTAAT CYP-REV2 reverse TCGACGRCCACTAATRCGCCT

Tabulka 2.2: Primerove´kombinace

na´zev forward primer reverse primer teplota naseda´nı´[◦C] A CYP-FOR1 CYP-REV1 54 B CYP-FOR1 CYP-REV2 56 C CYP-FOR2 CYP-REV1 54 D CYP-FOR2 CYP-REV2 56 E CYP-FOR3 CYP-REV1 54 F CYP-FOR3 CYP-REV2 56

Tabulka 2.3: Slozˇenı´reakcˇnı´smeˇsi prˇiamplifikaci v celkove´m objemu 50 µl

reakcˇnı´slozˇka mnozˇstvı´[µl] ddH2O 36,5 Taq Buffer complete 5 dNTP mix (10 mM) 0,5 primery (25 µM) 0,5 Purple Taq (1U/µL) 2,5 templa´tova´DNA/cDNA 5

Tabulka 2.4: Program PCR prˇiamplifikaci z cDNA

krok cˇas teplota [◦C] 1 Pocˇa´tecˇnı´denaturace 3 min 95 2c Denaturace 30 s 95 3c Naseda´nı´primeru˚ 1 min podle primeru˚ 4c Extenze 30 s* 72 kroky 2-4 byly opakova´ny 35× * prˇiamplifikaci z DNA trvala extenze 45 s Kapitola 2. Materia´l a metody 22

Tabulka 2.5: Fina´lnı´koncentrace slozˇek v 1× TBE pufru

slozˇka koncentrace [mM] Tris ba´ze 89 H3BO3 89 EDTA 1 dH2O -

2.2.2 Agaro´zova´elektrofore´za Produkty amplifikace byly analyzova´ny pomocı´agaro´zove´gelove´elektrofore´zy. Z agaro´zy (PCR agarose, Top-Bio) a 1× TBE pufru (Tab. 2.5) byl prˇipraven1% gel, do ktere´ho byla vmı´cha´na fluorescencˇnı´barva (GoodView Nucleic acid stain, SBS Genentech Co.). Elektrofore´za byla provedena ve vaneˇs TBE pufrem prˇinapeˇtı´6,5 V/cm po dobu 30 min. Gel byl pote´nasnı´ma´n pod UV sveˇtlem.

2.2.3 Optimalizace PCR V prˇı´padeˇ, zˇe produktem amplifikace nebyl jeden prouzˇek o ocˇeka´vane´de´lce, byly testo- va´ny variace reakcˇnı´ch podmı´nek, a to koncetrace horˇecˇnaty´ch iontu˚(1,5-4 mM) a teploty naseda´nı´primeru˚(50,8-56 ◦C). V prˇı´padeˇ, zˇe meˇl prouzˇek produktu PCR spra´vnou veli- kost, ale byl velmi slaby´, byla provedena reamplifikace. Prˇireamplifikaci byl jako templa´t pouzˇit 100×, 1000× nebo 10000× zrˇedeˇny´produkt PCR (podle koncentrace produktu) a pu˚vodnı´kombinace primeru˚.

2.3 Sekvenace a u´prava sekvencı´

Sekvenace amplifikovany´ch genu˚byla provedena Sangerovy´m sekvenova´nı´m firmou Ma- crogen. Zı´skane´sekvence byly upraveny za pomoci na´stroju˚MEGA X (Kumar et al., 2018) a Chromas Lite 2.6.6. (Technelysium Pty Ltd) tak, aby byly do dalsˇı´analy´zy zahrnuty pouze exonove´sekvence dobre´kvality a nedocha´zelo ke vzniku falesˇny´ch polymorfismu˚.

2.4 Kodonovy´ alignment a konstrukce fylogeneticke´ho stromu

Na´sledneˇbyl pouzˇit software BAli-Phy 3.4.1 (Redelings a Suchard, 2005), ktery´vyuzˇı´va´ Bayesovskou statistiku pro soubeˇzˇnou tvorbu kodonove´ho alignmentu a fylogeneticke´ho stromu. Bylo spusˇteˇno 5 neza´visly´ch rˇetezcu˚se 100 000 iteracemi, jejichzˇsjednocenı´m byl zı´ska´n fina´lnı´alignment a strom. Pro vy´pocˇet byl pouzˇit substitucˇnı´model GY94 a indel model RS07, prvnı´ch 10 % (10 000) iteracı´z kazˇde´ho rˇeteˇzce nebylo zahrnuto do vlastnı´ho vy´pocˇtu (takzvany´burn-in, Redelings a Suchard(2005)). Kromeˇ samotne´ho kodonove´ho alignmentu byly vypocˇı´ta´ny i spolehlivostnı´ sko´re spra´vnosti alignmentu jednotlivy´ch pozic, kodony se spolehlivostnı´m sko´re nizˇsˇı´m nezˇ 80 % byly pomocı´R skriptu (Soubor P1) zamaskova´ny jako ”???”, stejneˇtak jako mezery Kapitola 2. Materia´l a metody 23 sousedı´cı´s teˇmito nespolehlivy´mi pozicemi. Zamaskova´ny byly take´chybeˇjı´cı´zacˇa´tky a konce neu´plny´ch sekvencı´. U fylogeneticke´ho stromu byla vypocˇı´ta´na spolehlivost jednotlivy´ch veˇtvı´. Do dalsˇı´ analy´zy byl pouzˇit 50% konsenzua´lnı´strom (nody s nı´zkou podporou jsou kolabova´ny do polytomie).

2.5 Selekcˇnı´analy´za

Analy´za byla provedena pomocı´kodonoveˇ-subtitucˇnı´ch modelu˚dostupny´ch na serveru Datamonkey 2.0 (Weaver et al., 2018). Pro identifikaci konkre´tnı´ch fylogeneticky´ch liniı´, v nichzˇprobı´ha´pozitivnı´selekce CenH3, byl pouzˇit aBSREL (strucˇny´princip metody v kap. 1.5, Smith et al. (2015)), pro identifikaci konkre´tnı´ch kodonovy´ch pozic alignmentu, v nichzˇprobeˇhla epizodicka´selekce a vy´pocˇet celkove´ ω byl pouzˇit MEME (strucˇny´princip metody v kap. 1.5, Murrell et al. (2012)). De´lka stromu (odvozena´z pocˇtu nukleotidovy´ch substitucı´na kodon) byla vypocˇı´ta´na pomocı´PAML 4.7 (Yang, 2007). Vy´sledky z cˇeledi Cyperaceae byly porovna´ny s dalsˇı´mi taxony. Sekvence pouzˇite´pro toto srovna´nı´byly zı´ska´ny z doplnˇkovy´ch materia´lu˚ Zedek a Buresˇ(2012), Zedek a Buresˇ(2016a) a Zedek a Buresˇ(2016b). Kapitola 3

Vy´sledky

Bylo zı´ska´no celkem 34 sekvencı´genu CenH3 z rodu Cyperaceae, z nichzˇbylo 6 drˇı´ve publikova´no v databa´zı´ch (GeneBank a onePK) a 28 noveˇsekvenova´no (seznam vzorku˚ uveden v tabulce P1). Kodonovy´ alignment pouzˇity´ pro selekcˇnı´ analy´zy je uveden v prˇı´loze S. P2. Pomocı´selekcˇnı´analy´zy metodou MEME bylo v genu nalezeno 10 pozic (kodonu˚), ktere´ se na hladineˇ vy´znamnosti p < 0,05 v minulosti vyvı´jely pod pozitivnı´ selekcı´ (Obr. 3.1). Pocˇet pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚na de´lku fylogeneticke´ho stromu byl tedy 1,808. Pozitivneˇselektovane´kodony se nacha´zı´prˇeva´zˇneˇna N-konci proteinu (6 kodonu˚ prˇi p < 0,05), v HFD se nacha´zı´4 pozitivneˇselektovane´kodony, z toho 1 v oblasti loop 1.

loop 1 N-konec HFD Obra´zek 3.1: Rozlozˇenı´pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚v proteinu CenH3. Cˇerveneˇjsou oznacˇeny pozitivneˇselektovane´kodony na hladineˇvy´znamnosti p < 0,05

Pomocı´aBSREL bylo identifikova´no 6 liniı´, kde je gen CenH3 pozitivneˇselektova´n na hladineˇvy´znamnosti p < 0,05 (Obr. 3.2), avsˇak po Holm-Bonferroniho korekci na mnohona´sobne´testova´nı´nebyla zˇa´dna´z teˇchto liniı´na hladineˇ 0,05 statisticky vy´znamna´. Podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´prˇedkorekcı´na mnohona´sobne´testova´nı´byl 7,8 %. Porovna´nı´ frekvence pozitivnı´ selekce v Cyperaceae s dalsˇı´mi taxony (Tab. 3.1, Obr. 3.3) ukazuje, zˇe oproti organismu˚m se symetrickou samicˇı´ meio´zou a holocent- ricke´mu rodu Luzula zde probı´ha´pozitivnı´selekce s vysˇsˇı´frekvencı´. Pozitivnı´selekce je zde srovnatelna´s monocentricky´mi skupinami s asymetrickou meio´zou, v prˇı´padeˇpocˇtu nalezeny´ch kodonu˚je dokonce nejvysˇsˇı´. Celkova´ ω (Obr. 3.4) v cˇeledi Cyperaceae je 0,496, cozˇje vysˇsˇı´nezˇu symetricky´ch i asymetricky´ch organismu˚, ale srovnatelne´s holocentricky´m rodem Luzula.

– 24 – Kapitola 3. Vy´sledky 25

Carex acutiformis

Carex hartmanii

Carex nigra 0.05 Carex hirta p > 0,05 Carex rostrata p < 0,05 Carex panicea

Carex pilosa

Carex flacca

Carex pilulifera

Carex digitata

Carex caryophyllea

Carex humilis

Carex alba

Carex muricata agg

Carex echinata

Carex canescens

Carex leporina

Carex bohemica

Carex elongata

Carex remota

Eriophorum angustifolium

Scirpus sylvaticus

Eriophorum vaginatum

Eleocharis vivipara

Eleocharis acicularis

Eleocharis dulcis

Cyperus papyrus

Cyperus alternifolius

Cyperus textilis

Cyperus fuscus

Isolepis prolifera

Rhynchospora pubera

Lepidosperma gibsonii

Mapania palustris Obra´zek 3.2: Fylogeneticky´strom zı´skany´ch sekvencı´genu CenH3, cˇerveneˇjsou oznacˇeny linie podle´hajı´cı´pozitivnı´selekci (p < 0,05) bez korekce na mnohona´sobne´testova´nı´ Kapitola 3. Vy´sledky 26

Tabulka 3.1: Podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´a kodonu˚v cˇeledi Cyperaceae a dalsˇı´ch skupina´ch

veˇtve (bez skupina typ1 pocˇet sekvencı´ de´lka stromu ω2 veˇtve (s korekcı´)4 kodony5 korekce)3 Aspergillus M/S 18 8,725 0,066 0 0 0 Colletotrichum M/S 7 1,096 0,041 0 0 0 kapradiny M/S 8 7,587 0,086 0 0 0 Lycopodiophyta M/S 5 6,045 0,024 0 0 0 mechy M/S 10 2,242 0,105 0 0 1,338 Penicillium M/S 11 5,814 0,056 0,105 0 0 Plasmodium M/S 7 3,247 0,043 0 0 0 Saccharomyces M*/S 9 6,921 0,065 0 0 0,144 Trichoderma M/S 6 1,750 0,042 0,111 0 0,571 Asteraceae M/A 7 1,698 0,186 0,091 0 1,178 Brassicaceae M/A 20 3,179 0,429 0,053 0 1,573 Drosophila M/A 16 4,065 0,303 0,103 0,069 1,230 Fabaceae M/A 18 4,464 0,302 0,091 0,030 0,448 kostnate´ryby M/A 11 4,856 0,126 0,053 0 0,412 Poaceae M/A 20 3,965 0,276 0,054 0 1,513 prima´ti M/A 14 1,116 0,404 0,160 0 0,896 Tetrahymena M/A 13 8,465 0,036 0,043 0,043 0,118 Caenorhabditis H/A 8 7,074 0,187 0,154 0 0,283 Luzula H/A 18 1,278 0,514 0 0 0 Cyperaceae H/A 34 5,531 0,496 0,078 0 1,808 1typ centromery (monocentricka´(M), holocentricka´(H))/typ samicˇı´meio´zy (asymetricka´(A), symetricka´ (S)) *kvasinky majı´regiona´lnı´nebo bodovou monocentrickou centromeru 2pru˚meˇrna´ ω vsˇech kodonu˚ve vsˇech liniı´ch 3podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´ze vsˇech veˇtvı´alignmentu na hladineˇ p < 0,05 bez korekce na mno- hona´sobne´testova´nı´ 4podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´ze vsˇech veˇtvı´alignmentu na hladineˇ p < 0,05 po korekci na mnoho- na´sobne´testova´nı´ 5pocˇet pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚na de´lku stromu Kapitola 3. Vy´sledky 27

Cyperaceae

Brassicaceae

1.5

Poaceae mechy Drosophila

Asteraceae 1.0

primáti

Trichoderma

0.5

Saccharomyces Fabaceae kostnaté ryby Caenorhabditis Aspergillus

na délku stromu ů na délku po č et pozitivn ě selektovaných kodon Tetrahymena kapradiny Penicillium Colletotrichum 0.0 Luzula Plasmodium Lycopodiophyta

0.00 0.05 0.10 0.15 podíl pozitivně selektovaných větví

monocentrické druhy se symetrickou samičí meiózou monocentrické druhy s asymetrickou samičí meiózou holocentrické druhy s asymetrickou samičí meiózou

Obra´zek 3.3: Zobrazenı´podı´lu˚pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´a pocˇtu˚pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚ na de´lku stromu CenH3 v cˇeledi Cyperaceae a dalsˇı´ch skupina´ch. Boxploty vyjadrˇujı´ rozlozˇenı´hodnot na obou osa´ch, prˇerusˇovana´cˇa´ra oznacˇuje hodnotu v cˇeledi Cyperaceae Kapitola 3. Vy´sledky 28

0.6

Luzula

Cyperaceae

0.4 celková ω Caenorhabditis 0.2

0.0

symetrická asymetrická holocentrické typ meiózy/chromozomů Obra´zek 3.4: Celkova´omega genu CenH3 ve trˇechholocentricky´ch skupina´ch (cˇervene´body) v porovna´nı´s organismy s asymetrickou a symetrickou samicˇı´meio´zou Kapitola 4

Diskuze

4.1 Zı´skane´sekvence a fylogeneticky´strom

V neˇktery´ch skupina´ch rostlin se vyskytujı´paralognı´varianty nebo pseudogeny CenH3 vznikle´duplikacı´genu nebo polyploidizacı´. Ve veˇtsˇineˇrostlin docha´zı´k umlcˇenı´nebo ztra´teˇjedne´z kopiı´, ale naprˇı´klad rody Luzula, Pisum nebo Mimulus obsahujı´druhy, kde je vı´ce variant CenH3 zachova´no a podı´lı´se na sestavova´nı´kinetochoru (Zambrano-Mila et al., 2019). V cˇeledi Cyperaceae zatı´m nebyly takove´to varianty popsa´ny v literaturˇeani nalezeny v te´to pra´ci, to vsˇak neznamena´, zˇe se zde nemohou vyskytovat (jejich sekvence se mu˚zˇe lisˇit natolik, zˇe nebyly amplifikova´ny pouzˇity´mi primery). V prˇı´padeˇ, zˇe by zı´skane´ sekvence CenH3 ve skutecˇnosti byly nerozpoznany´mi paralognı´mi variantami nebo pseudogeny, nebyly by vy´sledky selekcˇnı´analy´zy spolehlive´. Tomu, zˇe byly zı´ska´ny pouze ortolognı´sekvence CenH3 nasveˇdcˇuje skutecˇnost, zˇe fy- logeneticky´strom zı´skany´ch sekvencı´(S. P3) odpovı´da´druhove´mu stromu Cyperaceae zı´skane´mu na za´kladeˇ7 jaderny´ch a chloroplastovy´ch markeru˚(Buresˇet al., nepubliko- vane´). Vzhledem k tomu, zˇe zı´skane´sekvence neobsahujı´stop kodony, se lze domnı´vat, zˇe nedosˇlo ani k amplifikaci nefunkcˇnı´ch pseudogenu˚. Mu˚zˇeme proto usoudit, zˇe byly zı´ska´ny funkcˇnı´ortolognı´sekvence CenH3, ktere´jsou vhodne´pro selekcˇnı´analy´zu.

4.2 Adaptivnı´evoluce CenH3

Z porovna´nı´v ra´mci monocentricky´ch organismu˚je zrˇejme´, zˇe prˇijejich opeˇtovne´analy´ze pro tuto pra´ci byl stejneˇ jako v Zedek a Buresˇ(2016b) nalezen veˇtsˇı´ pocˇet pozitivneˇ selektovany´ch kodonu˚na de´lku stromu, podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´a celkova´ ω ve skupina´ch s asymetrickou meio´zou nezˇve skupina´ch se symetrickou meio´zou (Obr. 3.3, Obr. 3.4). Podı´l pozitivneˇselektovany´ch veˇtvı´a pocˇet pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚zjisˇteˇny´ v cˇeledi Cyperaceae je podobny´ jako u mononcentricky´ch organismu˚ s asymetrickou meio´zou (Obr. 3.3) a celkova´ ω je dokonce vysˇsˇı´nezˇu monocentriku˚(Obr. 3.4). Z teˇchto vy´sledku˚mu˚zˇeme usoudit, zˇe na CenH3 v Cyperaceae pu˚sobı´podobna´pozitivnı´selekce jako v monocentricky´ch organismech s asymetrickou meio´zou. Pozitivneˇselektovane´kodony se navı´c nacha´zı´hlavneˇna N-konci CenH3 a v N-kon- cove´cˇa´sti HFD, cozˇodpovı´da´rozlozˇenı´pozitivneˇselektovany´ch kodonu˚u Brassicaceae

– 29 – Kapitola 4. Diskuze 30

(Cooper a Henikoff, 2004) a dalsˇı´ch monocentricky´ch skupina´ch (kap. 1.3). Skutecˇnost, zˇe pozitivnı´selekce pu˚sobı´na homolognı´oblasti genu v obou skupina´ch napovı´da´tomu, zˇe se CenH3 v Cyperaceae vyvı´jı´podobneˇjako v monocentricky´ch asymetricky´ch skupina´ch. Zajı´mave´je srovna´nı´hodnoty celkove´ ω mezi skupinami s holocentricky´mi chromo- zomy. Zatı´mco v druhu Caenorhabditis je ω podobna´jako u monocentricky´ch asymetriku˚, rod Luzula a cˇeled’Cyperaceae ma´hodnotu ω vy´razneˇvysˇsˇı´. V rodu Luzula se navı´c vysoka´ hodnota neda´vysveˇtlit pozitivnı´selekcı´, protozˇe zde nebyly identifikova´ny zˇa´dne´pozi- tivneˇselektovane´veˇtve ani kodony. Zedek a Buresˇ(2016a) spekulujı´, zˇe vysoka´celkova´ ω v rodu Luzula mu˚zˇe by´t zpu˚sobena relaxovanou selekcı´ CenH3.

4.3 Centromericky´tah

Podobnost evoluce CenH3 v Cyperaceae v porovna´nı´ s monocentriky s asymetrickou meio´zou a jejı´odlisˇnost v porovna´nı´s monocentriky se symetrickou meio´zou (Obr. 3.3) napovı´da´, zˇe v Cyperaceae probı´ha´ centromericky´ tah. Tento vy´sledek je v rozporu s prˇedpokladem,zˇe holocentricke´usporˇa´da´nı´v Cyperaceae bra´nı´centromericke´mu tahu. K vysveˇtlenı´ tohoto vy´sledku je nutne´ vzı´t v potaz, zˇe usporˇa´da´nı´ chromozomu˚ v holocentricı´ch mu˚zˇe by´t odlisˇne´beˇhem mito´zy a meio´zy (Obr. 1.4, kap. 1.4.1). Jediny´ druh z cˇeledi Cyperaceae, u ktere´ho bylo zatı´m pozorova´no usporˇa´da´nı´kinetochoru beˇhem meio´zy, je Rhynchospora pubera (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Meioticky´kinetochor zde nenı´ sestavova´n v jedne´ linii pode´l cele´ de´lky chromozomu, ale polycentricky v oddeˇleny´ch shlucı´ch (Marques et al. (2016), Obr. 1.4). Sestavova´nı´kinetochoru v neˇkolika druzı´ch rodu Rhynchospora je navı´c va´za´no na specificke´centromericke´sekvence, satelity Tyba (Marques et al., 2015). Expanze teˇchto repetic by potencia´lneˇmohla zpu˚sobit zveˇtsˇenı´ kinetochorovy´ch shluku˚. Takove´to usporˇa´da´nı´ by tedy potencia´lneˇ narozdı´l od difuznı´ centromery pode´l cele´de´lky chromozomu mohlo umozˇnˇovat centromericky´tah. Podobna´ situace nasta´va´ i u rodu Caenorhabditis, kde je usporˇa´da´nı´ meioticky´ch chromozomu˚te´meˇrˇmonocentricke´(Marques a Pedrosa-Harand, 2016). V te´to skupineˇ byla takte´zˇ nalezena pozitivnı´ selekce CenH3 (Zedek a Buresˇ, 2012). Naopak v rodu Luzula, kde byl v meio´ze pozorova´n difuznı´kinetochor pode´l cele´de´lky chromozomu (Heckmann et al., 2014), nebyla nalezena zˇa´dna´pozitivnı´selekce genu CenH3 (Zedek a Buresˇ(2016a), Obr. 3.3). Z pozorova´nı´meio´zy jedine´ho druhu cˇeledi Cyperaceae vsˇak nenı´mozˇne´posoudit, zda je polycentricke´usporˇa´da´nı´kinetochoru v meio´ze charakteristicke´pro vy´znamnou cˇa´st cˇeledi. K objasneˇnı´, zda se tento mechanismus skutecˇneˇmu˚zˇe uplatnˇovat, by bylo nutne´pozorovat meioticke´usporˇa´da´nı´kinetochoru v ru˚zny´ch rodech Cyperaceae.

4.4 Symetrie meio´zy

Centromericky´ tah mu˚zˇe probı´hat v takove´m typu meio´zy, kdy pouze jeden ze dvou homolognı´ch chromozomu˚da´va´vzniknout gameteˇ. U veˇtsˇiny krytosemenny´ch rostlin je typicky´syste´m, kdy samicˇı´meio´za probı´ha´asymetricky a pouze jeden ze cˇtyrˇmeioticky´ch produktu˚mu˚zˇe vytva´rˇatmegasporu (monosporie) a samcˇı´meio´za probı´ha´symetricky a docha´zı´k vy´voji mikrospor ze vsˇech cˇtyrˇechmeioticky´ch produktu˚(tetrasporie) (Gorelick Kapitola 4. Diskuze 31 et al., 2016; Lersten, 2008). V takove´m prˇı´padeˇse tedy mu˚zˇe centromericky´tah uplatnˇovat pouze prˇimegasporogenezi. Centromericky´tah v cˇeledi Cyperaceae vsˇak mu˚zˇe zrˇejmeˇprobı´hat i beˇhem mikrospo- rogeneze, protozˇe zde docha´zı´k za´niku 3 meioticky´ch produktu˚(monosporii) nejen prˇi vzniku vajı´cˇka, ale take´prˇivzniku pylu (Furness a Rudall, 2011). Samcˇı´ asymetricka´ meio´za by potencia´lneˇmohla zveˇtsˇit vy´hodu silny´ch centromer a zintenzivnit tak centro- mericky´tah. Je vsˇak nejasne´, zda by takove´posı´lenı´centromericke´ho tahu vedlo k intenzivneˇjsˇı´po- zitivnı´selekci CenH3. Nerovnocennost centromer beˇhem symetricke´samcˇı´meio´zy totizˇ zpu˚sobuje vznik aneuploidnı´ch gamet (Daniel(2002), kap. 1.2) a pokud tedy nevznikajı´ tyto negativnı´du˚sledky centromericke´ho tahu, da´se prˇedpokla´dat, zˇe se snı´zˇı´intenzita pozitivnı´selekce CenH3 (Elde et al., 2011). V souladu s tı´mto prˇedpokladem Elde et al. (2011) v rodu prvoku˚s vy´hradneˇasymetrickou meio´zou Tetrahymena nenalezli zˇa´dne´ stopy pozitivnı´selekce v tomto genu. Zedek a Buresˇ(2016b) vsˇak prˇipozˇitı´citliveˇjsˇı´ch kodon-substitucˇnı´ch modelu˚ pozitivnı´ selekci identifikovali, ta vsˇak byla slabsˇı´ nezˇ u skupin s kombinacı´asymetricke´a symetricke´meio´zy (Obr. 3.3). Podle vy´sledku˚v rodu Tetrahymena se zda´, zˇe negativnı´du˚sledky centromericke´ho tahu neza´visle´na symetricke´ samcˇı´meio´ze jsou dostatecˇne´pro vznik selekcˇnı´ho tlaku na CenH3, ale adaptivnı´evoluce CenH3 je me´neˇintenzivnı´. Naopak v cˇeledi Cyperaceae se zda´, zˇe zde pozitivnı´selekce pu˚sobı´dokonce intezivneˇji (alesponˇco se ty´cˇe pocˇtu kodonovy´ch pozice a celkove´ ω) nezˇu skupin s kombinacı´obou typu˚meio´zy. Intenzita selekce vsˇak v prˇı´padeˇCyperaceae mu˚zˇe by´t ovlivneˇna take´nezvykly´m usporˇa´da´nı´m chromozomu˚, takzˇe nelze rozhodnout, zda je intenzivneˇjsˇı´pozitivnı´selekce du˚sledkem asymetricke´samcˇı´meio´zy. Vliv samcˇı´ monosporie na intenzitu pozitivnı´selekce CenH3 by bylo vhodne´studovat v cˇeledi Erica- ceae, dvoudeˇlozˇny´ch rostlina´ch s monocentricky´mi chromozomy, ktera´obsahuje druhy se symetrickou i asymetrickou samcˇı´meio´zou (Furness a Rudall, 2011). Ani monosporicka´tvorba za´rodecˇne´ho vaku nenı´univerza´lnı´pro vsˇechny krytose- menne´. V neˇkolika neza´visly´ch skupina´ch jednodeˇlozˇny´ch i dvoudeˇlozˇny´ch zde dosˇlo k vy´voji bisporicke´ho (naprˇ. Allium (Amaryllidaceae)) nebo tetrasporicke´ho (naprˇ. Pepe- romia (Piperaceae), Drusa (Apiaceae), Fritillaria (Liliaceae) za´rodecˇne´ho vaku (Lersten, 2008). Pokud docha´zı´ke vzniku tetrasporicke´ho za´rodecˇne´ho vaku, zˇa´dny´z meioticky´ch produktu˚nezanika´a vsˇechny majı´sˇanci, zˇe dajı´vzniknout vajı´cˇku. Pokud by se vajı´cˇko vyvinulo na´hodneˇz jednoho z teˇchto produktu˚, nemeˇl by zde tedy probı´hat centrome- ricky´tah. Skupiny obsahujı´cı´blı´zce prˇı´buzne´druhy s monosporickou a tetrasporickou megasporogenezı´by tak byly zajı´mavy´mi modely pro studium centromericke´ho tahu.

4.5 Adaptivnı´role holocentricky´ch chromozomu˚

Ze zı´skany´ch vy´sledku˚vyply´va´, zˇe holocentricke´chromozomy v cˇeledi Cyperaceae prav- deˇpodobneˇnebra´nı´centromericke´mu tahu. Je proto nepravdeˇpodobne´, zˇe holocentricke´ chromozomy vznikly u spolecˇne´ho prˇedkaCyperaceae a Juncaceae (cˇeled’obsahujı´cı´rod Luzula) pra´veˇza u´cˇelem potlacˇenı´centromericke´ho tahu. Vzhledem k tomu, zˇe vsˇechny ne- za´visle vznikle´linie holocentricky´mi chromozomy majı´velice podobnou strukturu beˇhem mito´zy, ale beˇhem meio´zy se lisˇı´(Marques a Pedrosa-Harand, 2016), se zda´, zˇe hlavnı´ evolucˇnı´vy´hoda holocentricky´ch chromozomu˚se uplatnˇuje pra´veˇbeˇhem mito´zy. Takovou Kapitola 4. Diskuze 32 vy´hodou by mohla by´t tolerance vu˚cˇi fragmentaci chromozmu˚(Zedek a Buresˇ, 2018). Kinetochory sestavene´po cele´de´lce chromozomu naopak mu˚zˇou beˇhem meio´zy prˇi- na´sˇet proble´my s orientacı´chromozomu˚, cozˇvyzˇaduje dodatecˇnou u´pravu struktury pro spra´vnou segregaci v meio´ze (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Vznikajı´proto ru˚zne´ strategie pro vyrovna´nı´se s teˇmito proble´my. Je mozˇne´, zˇe pokud neˇktere´z teˇchto strategiı´ umozˇnı´zachova´nı´kinetochoru po cele´de´lce chromozomu (jako v rodu Luzula), mohou za´rovenˇzcela nebo cˇa´stecˇneˇbra´nit centromericke´mu tahu. Bylo by zajı´mave´zjistit, zda existujı´i dalsˇı´skupiny, u nichzˇv meio´ze neza´visle vzniklo usporˇa´da´nı´kinetochoru bra´- nı´cı´centromericke´mu tahu, trˇebav rodech Drosera, Cuscuta nebo Chionographis. Tato adaptace bra´nı´cı´centromericke´mu tahu ale nejspı´sˇe nenı´prima´rnı´m du˚vodem vzniku ho- locentricky´ch chromozomu˚. Souhrn

Centromericky´tah je evolucˇnı´proces, ktery´je iniciova´n expanzı´centromericky´ch repe- tic. Tato rozsˇı´rˇena´centromera je na´sledneˇschopna´na sebe nava´zat vı´ce kinetochorovy´ch proteinu˚, cozˇprˇiasymetricke´samicˇı´meio´ze zpu˚sobı´preferencˇnı´segregaci silne´centro- mery do vajı´cˇka. Takova´to sobecka´centromera tak zı´ska´va´vy´znamnou evolucˇnı´vy´hodu. Centromericky´tah vsˇak take´zpu˚sobuje negativnı´du˚sledky s vlivem hlavneˇna fertilitu organismu. Negativnı´u´cˇinky centromericke´ho tahu jsou u monocentricky´ch organismu˚ kompenzova´ny adaptivnı´evolucı´kinetochorovy´ch proteinu˚(jako naprˇı´klad CenH3), ktere´ doka´zˇı´pozmeˇnit svoji interakci s centromerickou DNA a obnovit rovnova´hu centromer. Dalsˇı´m zpu˚sobem obrany proti centromericke´mu tahu by mohly by´t holocentricke´ chromozomy, ktere´sestavujı´kinetochor pode´l cele´de´lky chromozomu a v nichzˇpoloha centromery typicky nenı´spjata se specificky´m typem repetitivnı´ch sekvencı´. Expanze re- petitivnı´ch sekvencı´v holocentricky´ch chromozomech proto pravdeˇpodobneˇnezpu˚sobı´ rozsˇı´rˇenı´kinetochoru, ktere´je nezbytne´pro zı´ska´nı´evolucˇnı´vy´hody a iniciaci centrome- ricke´ho tahu. Pokud tedy v holocentricky´ch organismech neprobı´ha´centromericky´tah, nebude do- cha´zet k na´sledne´adaptivnı´evoluci CenH3. Tomu odpovı´da´evoluce CenH3 v rodu Luzula, kde nebyly nalezeny zˇa´dne´stopy pozitivnı´selekce. V te´to pra´ci byla studova´na evoluce CenH3 v cˇeledi Cyperaceae za u´cˇelem zjisˇteˇnı´, zda i v te´to cˇeledi bra´nı´holocentricke´usporˇa´da´nı´chromozomu˚centromericke´mu tahu. Pomocı´kodon-substitucˇnı´ch modelu˚bylo nalezeno podobne´mnozˇstvı´pozitivneˇselekto- vany´ch fylogeneticky´ch veˇtvı´a kodonu˚jako u monocentricky´ch organismu˚s asymetrickou meio´zou. Selektovane´kodony v Cyperaceae se navı´c nacha´zı´ve stejny´ch dome´na´ch jako u teˇchto monocentricky´ch skupin. Z toho vyply´va´, zˇe v cˇeledi Cyperaceae stejneˇjako u teˇchto skupin pravdeˇpodobneˇprobı´ha´centromericky´tah. Je mozˇne´, zˇe narozdı´l od rodu Luzula (ve ktere´m je kinetochor sestavova´n po cele´ de´lce chromozomu beˇhem mito´zy i meio´zy) v cˇeledi Cyperaceae docha´zı´k sestavova´nı´ kinetochoru v jedne´linii pode´l cele´de´lky chromozomu pouze beˇhem mito´zy, ale beˇhem meio´zy ma´kinetochor podobu oddeˇleny´ch shluku˚, ktere´by potencia´lneˇprˇiexpanzi repetic mohly va´zat veˇtsˇı´mnozˇstvı´kinetochorovy´ch proteinu˚a umozˇnˇovat tak centromericky´tah. Zda´se, zˇe holocentricke´chromozomy nevznikly prima´rneˇjako obrana proti centro- mericke´mu tahu, protozˇe u mnoha holocentricky´ch skupin (mezi ktere´mu˚zˇe patrˇiti cˇeled’ Cyperaceae) nedocha´zı´v meio´ze k sestavova´nı´kinetochoru pode´l cele´ho chromozomu kvu˚li proble´mu˚m s orientacı´chromozomu˚prˇisegregaci. Pokud by dosˇlo k u´praveˇusporˇa´- da´nı´kinetochoru, ktere´by umozˇnilo spra´vnou segregaci v meio´ze a za´rovenˇzachovalo sestavenı´kinetochoru pode´l cele´de´lky chromozomu, mohlo by ke znemozˇneˇnı´centrome- ricke´ho tahu dojı´t.

– 33 – Summary

The centromere drive is an evolutionary process initiated by the expansion of centromere repeats. This enlarged centromere is then capable of recruiting excess kinetochore proteins. This can cause preferential segregation of the stronger centromere into the egg during asy- mmetric female meiosis, providing the selfish centromere with a substantial evolutionary advantage. On the other hand, the centromere drive also causes deleterious consequences particularly affecting the organism’s fertility. These deleterious effects are in monocentric organisms neutralized by adaptive evolution of kinetochore proteins (like CenH3), which can alter its interaction with the centromeric DNA a restore centromere parity. Another form of protection from the centromere drive could be the holocentric chro- mosomes, which have their kinetochore assembled along the entire chromosome length and in which the centromere position isn’t generally tied to a specific type of repetitive sequences. Therefore the expansion of repeats in holocentric chromosomes isn’t likely to cause kinetochore expansion. This denies the evolutionary advantage of the selfish centromere and prevents the initiation of centromere drive. Given that the holocentric chromosomes don’t need to suppress the centromere drive, the adaptive evolution of CenH3 won’t occur. This is the case in the Luzula genus, where no signs of positive selection acting on CenH3 were found. In this thesis, the evolution of CenH3 in the Cyperaceae family was studied to determine if the holocentric structure of chromosomes in this family prevents the centromere drive. Using codon-substitution models, a similar quantity of positively selected branches and codons was found in the Cyperaceae family as in monocentric organisms with asymmetric meiosis. Also, the selected codons in Cyperaceae were allocated to the same domains as in these monocentric groups. For these reasons we can infer that the centromere drive takes place in Cyperaceae, similarly to monocentric groups with asymmetric meiosis. It is possible that in contrast to the Luzula genus (where the kinetochore is assembled along the entire chromosome in both mitosis and meiosis), in the Cyperaceae family the kinetochore is assembled in continuous line only in mitosis but during meiosis the kinetochore could form discrete clusters instead. These clusters could potentially recruit excess kinetochore proteins in response to expanded repeats and facilitate the centromere drive. It seems that the holocentric chromosomes didn’t primarily originate in order to prevent the centromere drive, since in many holocentric taxa (possibly including Cyperaceae) the kinetochore doesn’t cover the entire chromosome length because of problems with proper chromosome segregation during meiosis. If there was a situation which allows the correct meiotic segregation and also kinetochore assembly along the entire chromosome, this arrangement could also prevent the centromere drive.

– 34 – Seznam pouzˇite´literatury

Baker, R. E. a Rogers, K. (2006). Phylogenetic analysis of fungal centromere h3 proteins. Genetics, 174(3):1481–1492.

Beck, E. A. a Llopart, A. (2015). Widespread positive selection drives differentiation of centromeric proteins in the drosophila melanogaster subgroup. Scientific reports, 5:17197.

Buresˇ, P., Zedek, F., a Markova´, M. (2013). Holocentric chromosomes. In Plant Genome Diversity Volume 2, pages 187–208. Springer.

Chen, Y., Baker, R. E., Keith, K. C., Harris, K., Stoler, S., a Fitzgerald-Hayes, M. (2000). The n terminus of the centromere h3-like protein cse4p performs an essen- tial function distinct from that of the histone fold domain. Molecular and cellular biology, 20(18):7037–7048.

Chma´tal, L., Gabriel, S. I., Mitsainas, G. P., Martı´nez-Vargas, J., Ventura, J., Searle, J. B., Schultz, R. M., a Lampson, M. A. (2014). Centromere strength provides the cell biological basis for meiotic drive and karyotype evolution in mice. Current Biology, 24(19):2295–2300.

Chma´tal, L., Schultz, R. M., Black, B. E., a Lampson, M. A. (2017). Cell biology of cheating—transmission of centromeres and other selfish elements through asymmetric meiosis. In Centromeres and Kinetochores, pages 377–396. Springer.

Cooper, J. L. a Henikoff, S. (2004). Adaptive evolution of the histone fold domain in centromeric histones. Molecular biology and evolution, 21(9):1712–1718. d’Alencon, E., Sezutsu, H., Legeai, F., Permal, E., Bernard-Samain, S., Gimenez, S., Gagneur, C., Cousserans, F., Shimomura, M., Brun-Barale, A., et al. (2010). Extensive synteny conservation of holocentric chromosomes in lepidoptera despite high rates of local genome rearrangements. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(17):7680–7685.

Daniel, A. (2002). Distortion of female meiotic segregation and reduced male fertility in human robertsonian translocations: Consistent with the centromere model of co-evolving centromere dna/centromeric histone (cenp-a). American journal of medical genetics, 111(4):450–452.

– 35 – Seznam pouzˇite´literatury 36 de Souza, T. B., Chaluvadi, S. R., Johnen, L., Marques, A., Gonza´lez-Elizondo, M. S., Bennetzen, J. L., a Vanzela, A. L. (2018). Analysis of retrotransposon abundance, diversity and distribution in holocentric eleocharis (cyperaceae) genomes. Annals of botany, 122(2):279–290.

Demidov, D., Schubert, V., Kumke, K., Weiss, O., Karimi-Ashtiyani, R., Buttlar, J., Heckmann, S., Wanner, G., Dong, Q., Han, F., et al. (2014). Anti-phosphorylated his- tone h2athr120: a universal microscopic marker for centromeric chromatin of mono-and holocentric plant species. Cytogenetic and genome research, 143(1-3):150–156.

Drinnenberg, I. A., Henikoff, S., Malik, H. S., et al. (2014). Recurrent loss of cenh3 is associated with independent transitions to holocentricity in insects. Elife, 3:e03676.

Dumont, J., Oegema, K., a Desai, A. (2010). A kinetochore-independent mechanism drives anaphase chromosome separation during acentrosomal meiosis. Nature cell biology, 12(9):894.

Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., a Handel, M. A. (2001). Evidence for meiotic spindle chec- kpoint from analysis of spermatocytes from robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science, 114(16):2953–2965.

Elde, N. C., Roach, K. C., Yao, M.-C., a Malik, H. S. (2011). Absence of positive selection on centromeric histones in tetrahymena suggests unsuppressed centromere- drive in lineages lacking male meiosis. Journal of molecular evolution, 72(5-6):510– 520.

Escudero, M., Ma´rquez-Corro, J. I., a Hipp, A. L. (2016). The phylogenetic origins and evolutionary history of holocentric chromosomes. Systematic Botany, 41(3):580–585.

Finseth, F. R., Dong, Y., Saunders, A., a Fishman, L. (2015). Duplication and adaptive evolution of a key centromeric protein in mimulus, a genus with female meiotic drive. Molecular biology and evolution, 32(10):2694–2706.

Fishman, L. a Kelly, J. K. (2015). Centromere-associated meiotic drive and female fitness variation in mimulus. Evolution, 69(5):1208–1218.

Furness, C. A. a Rudall, P. J. (2011). Selective microspore abortion correlated with aneuploidy: an indication of meiotic drive. Sexual plant reproduction, 24(1):1–8.

Gorelick, R., Carpinone, J., a Derraugh, L. J. (2016). No universal differences between female and male eukaryotes: anisogamy and asymmetrical female meiosis. Biological Journal of the Linnean Society, 120(1):1–21.

Heckmann, S., Jankowska, M., Schubert, V., Kumke, K., Ma, W., a Houben, A. (2014). Alternative meiotic chromatid segregation in the holocentric plant luzula elegans. Nature communications, 5:4979.

Heckmann, S., Macas, J., Kumke, K., Fuchs, J., Schubert, V., Ma, L., Novak, P., Neumann, P., Taudien, S., Platzer, M., et al. (2013). The holocentric species l uzula elegans shows Seznam pouzˇite´literatury 37

interplay between centromere and large-scale genome organization. The Plant Journal, 73(4):555–565.

Henikoff, S., Ahmad, K., a Malik, H. S. (2001). The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving dna. Science, 293(5532):1098–1102.

Henikoff, S. a Henikoff, J. G. (2012). “point” centromeres of saccharomyces harbor single centromere-specific nucleosomes. Genetics, 190(4):1575–1577.

Heun, P., Erhardt, S., Blower, M. D., Weiss, S., Skora, A. D., a Karpen, G. H. (2006). Mislocalization of the drosophila centromere-specific histone cid promotes formation of functional ectopic kinetochores. Developmental cell, 10(3):303–315.

Hirsch, C. D., Wu, Y., Yan, H., a Jiang, J. (2009). Lineage-specific adaptive evolution of the centromeric protein cenh3 in diploid and allotetraploid oryza species. Molecular biology and evolution, 26(12):2877–2885.

Howe, M., McDonald, K. L., Albertson, D. G., a Meyer, B. J. (2001). Him-10 is required for kinetochore structure and function on caenorhabditis elegans holocentric chromosomes. The Journal of cell biology, 153(6):1227–1238.

Iwata-Otsubo, A., Dawicki-McKenna, J. M., Akera, T., Falk, S. J., Chma´tal, L., Yang, K., Sullivan, B. A., Schultz, R. M., Lampson, M. A., a Black, B. E. (2017). Expanded satellite repeats amplify a discrete cenp-a nucleosome assembly site on chromosomes that drive in female meiosis. Current Biology, 27(15):2365–2373.

Kosiol, C. a Anisimova, M. (2012). Selection on the protein-coding genome. In Evolutio- nary Genomics, pages 113–140. Springer.

Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., a Tamura, K. (2018). Mega x: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular biology and evolution, 35(6):1547–1549.

Lersten, N. R. (2008). Flowering plant embryology: with emphasis on economic species. John Wiley & Sons.

Maddox, P. S., Oegema, K., Desai, A., a Cheeseman, I. M. (2004). ”holo”er than thou: Chromosome segregation and kinetochore function in c. elegans. Chromosome Re- search, 12(6):641–653.

Malik, H. S. a Henikoff, S. (2001). Adaptive evolution of cid, a centromere-specific histone in drosophila. Genetics, 157(3):1293–1298.

Malik, H. S. a Henikoff, S. (2003). Phylogenomics of the nucleosome. Nature structural & molecular biology, 10(11):882.

Malik, H. S. a Henikoff, S. (2009). Major evolutionary transitions in centromere comple- xity. Cell, 138(6):1067–1082. Seznam pouzˇite´literatury 38

Malik, H. S., Vermaak, D., a Henikoff, S. (2002). Recurrent evolution of dna-binding motifs in the drosophila centromeric histone. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(3):1449–1454.

Marques, A. a Pedrosa-Harand, A. (2016). Holocentromere identity: from the typical mitotic linear structure to the great plasticity of meiotic holocentromeres. Chromosoma, 125(4):669–681.

Marques, A., Ribeiro, T., Neumann, P., Macas, J., Nova´k, P., Schubert, V., Pellino, M., Fuchs, J., Ma, W., Kuhlmann, M., et al. (2015). Holocentromeres in rhynchospora are associated with genome-wide centromere-specific repeat arrays interspersed among euchromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(44):13633–13638.

Marques, A., Schubert, V., Houben, A., a Pedrosa-Harand, A. (2016). Restructuring of holocentric centromeres during meiosis in the plant rhynchospora pubera. Genetics, 204(2):555–568.

Melters, D. P., Bradnam, K. R., Young, H. A., Telis, N., May, M. R., Ruby, J. G., Sebra, R., Peluso, P., Eid, J., Rank, D., et al. (2013). Comparative analysis of tandem repeats from hundreds of species reveals unique insights into centromere evolution. Genome biology, 14(1):R10.

Melters, D. P., Paliulis, L. V., Korf, I. F., a Chan, S. W. (2012). Holocentric chromoso- mes: convergent evolution, meiotic adaptations, and genomic analysis. Chromosome Research, 20(5):579–593.

Murrell, B., Wertheim, J. O., Moola, S., Weighill, T., Scheffler, K., a Pond, S. L. K. (2012). Detecting individual sites subject to episodic diversifying selection. PLoS genetics, 8(7):e1002764.

Neumann, P., Navra´tilova´, A., Schroeder-Reiter, E., Koblı´zˇkova´, A., Steinbauerova, V., Chocholova, E., Nova´k, P., Wanner, G., a Macas, J. (2012). Stretching the rules: mono- centric chromosomes with multiple centromere domains. PLoS genetics, 8(6):e1002777.

Neumann, P., Pavlı´kova´, Z., Koblı´zˇkova´, A., Fukova´, I., Jedlicˇkova´, V.,Nova´k, P., a Macas, J. (2015). Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of cenh3 gene in fabeae species. Molecular biology and evolution, 32(7):1862–1879.

Plohl, M., Mesˇtrovic,´ N., a Mravinac, B. (2014). Centromere identity from the dna point of view. Chromosoma, 123(4):313–325.

Que´net, D. a Dalal, Y. (2014). A long non-coding rna is required for targeting centromeric protein a to the human centromere. Elife, 3:e26016.

Redelings, B. D. a Suchard, M. A. (2005). Joint bayesian estimation of alignment and phylogeny. Systematic biology, 54(3):401–418. Seznam pouzˇite´literatury 39

Ribeiro, T., Marques, A., Nova´k, P., Schubert, V., Vanzela, A. L., Macas, J., Houben, A., a Pedrosa-Harand, A. (2017). Centromeric and non-centromeric satellite dna organisation differs in holocentric rhynchospora species. Chromosoma, 126(2):325–335.

Rutkowska, J. a Badyaev, A. V. (2007). Meiotic drive and sex determination: molecular and cytological mechanisms of sex ratio adjustment in birds. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 363(1497):1675–1686.

Sandler, L. a Novitski, E. (1957). Meiotic drive as an evolutionary force. The American Naturalist, 91(857):105–110.

Schubert, V., Lermontova, I., a Schubert, I. (2014). Loading of the centromeric histone h3 variant during meiosis–how does it differ from mitosis? Chromosoma, 123(5):491–497.

Schueler, M. G., Swanson, W., Thomas, P. J., Program, N. C. S., a Green, E. D. (2010). Adaptive evolution of foundation kinetochore proteins in primates. Molecular biology and evolution, 27(7):1585–1597.

Smith, M. D., Wertheim, J. O., Weaver, S., Murrell, B., Scheffler, K., a Kosakovsky Pond, S. L. (2015). Less is more: an adaptive branch-site random effects model for effi- cient detection of episodic diversifying selection. Molecular biology and evolution, 32(5):1342–1353.

Talbert, P.B., Bayes, J. J., a Henikoff, S. (2009). Evolution of centromeres and kinetochores: A two-part fugue. In The Kinetochore:, pages 1–37. Springer.

Talbert, P. B., Bryson, T. D., a Henikoff, S. (2004). Adaptive evolution of centromere proteins in plants and animals. Journal of biology, 3(4):18.

Talbert, P. B., Masuelli, R., Tyagi, A. P., Comai, L., a Henikoff, S. (2002). Centromeric localization and adaptive evolution of an arabidopsis histone h3 variant. The Plant Cell, 14(5):1053–1066.

Van Hooser, A. A., Ouspenski, I. I., Gregson, H. C., Starr, D. A., Yen, T. J., Goldberg, M. L., Yokomori, K., Earnshaw, W. C., Sullivan, K. F., a Brinkley, B. R. (2001). Specification of kinetochore-forming chromatin by the histone h3 variant cenp-a. Journal of Cell Science, 114(19):3529–3542.

Weaver, S., Shank, S. D., Spielman, S. J., Li, M., Muse, S. V., a Kosakovsky Pond, S. L. (2018). Datamonkey 2.0: a modern web application for characterizing selective and other evolutionary processes. Molecular biology and evolution, 35(3):773–777.

Yang, Z. (2007). Paml 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood. Molecular biology and evolution, 24(8):1586–1591.

Zambrano-Mila, M. S., Aldaz-Villao, M. J., a Casas-Mollano, J. A. (2019). Canonical histones and their variants in plants: Evolution and functions. In Epigenetics in Plants of Agronomic Importance: Fundamentals and Applications, pages 185–222. Springer. Seznam pouzˇite´literatury 40

Zedek, F. a Buresˇ, P.(2012). Evidence for centromere drive in the holocentric chromosomes of caenorhabditis. PLoS One, 7(1):e30496.

Zedek, F. a Buresˇ, P. (2016a). Absence of positive selection on cenh3 in luzula sug- gests that holokinetic chromosomes may suppress centromere drive. Annals of botany, 118(7):1347–1352.

Zedek, F. a Buresˇ, P. (2016b). Cenh3 evolution reflects meiotic symmetry as predicted by the centromere drive model. Scientific reports, 6:33308.

Zedek, F. a Buresˇ, P. (2018). Holocentric chromosomes: from tolerance to fragmentation to colonization of the land. Annals of botany, 121(1):9–16.

Zhang, T., Talbert, P. B., Zhang, W., Wu, Y., Yang, Z., Henikoff, J. G., Henikoff, S., a Jiang, J. (2013). The cento satellite confers translational and rotational phasing on cenh3 nucleosomes in rice centromeres. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(50):E4875–E4883. Prˇı´lohy

Tabulka P1: Seznam zı´skany´ch sekvencı´

druh datum izolace identifikacˇnı´cˇı´slo pu˚vod primery Eleocharis ovata 26.02.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B,D,E,F Eleocharis vivipara DRR031129 databa´ze NCBI Eleocharis acicularis 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Eleocharis dulcis SRR1523109 databa´ze NCBI Isolepis prolifera 10.11.2017 sbı´rka u´stavu A,B Cyperus textilis 26.02.2018 sbı´rka u´stavu A,B Cyperus papyrus PWSG2039705 databa´ze oneKP Cyperus fuscus 26.02.2018 sbı´rka u´stavu A,B Cyperus alternifolius 19.09.2017 sbı´rka u´stavu A,B,C,D,F Carex hirta 10.07.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy A,B Carex rostrata 09.05.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex pilosa 10.11.2017 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy A,B Carex panicea 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex acutiformis 19.09.2017 sbı´rka u´stavu A,B,C,D,E,F Carex nigra 10.07.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex alba 19.04.2018 sbı´rka P. Vesele´ho A,B Carex flacca 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex digitata 10.11.2017 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy A,B Carex humilis 09.05.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy A,B Carex caryophyllea 19.04.2018 P. Vesely´, Brneˇnska´prˇehrada A,B Carex pilulifera 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex hartmanii 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Rhynchospora pubera KR029618,KR029619 databa´ze NCBI Lepidosperma gibsonii XPAF2052339 databa´ze oneKP Mapania palustris WBIB2063480 databa´ze oneKP Eriophorum angustifolium 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Eriophorum vaginatum 10.07.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Scirpus sylvaticus 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex remota 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex leporina 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex canescens 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex bohemica 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex elongata 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Carex muricata 19.04.2018 P. Vesely´, Brneˇnska´prˇehrada A,B Carex echinata 01.06.2018 P. Buresˇ, Zˇ d’a´rske´vrchy B Soubor P1: Skript pro maskova´nı´alignmentu (.R) 1 #cílem skriptu je 2 # zamaskovat pozice alignmentu se spolehlivostním skóre ni¾¹ím ne¾ prahová hodnota 3 # zamaskovat mezery na okrajích neúplných sekvencí 4 # zamaskovat mezery obsahující zamaskované pozice 5 6 source("http://bioconductor.org/biocLite.R") 7 biocLite("Biostrings") 8 install.packages("seqinr") 9 10 ############NASTAVITPRAHOVOUHODNOTU############ 11 treshold <- 0.8 12 #######NASTAVITCESTUKEVSTUPNÍMSOUBORÙM####### 13 alignment_dir <- "Results/P1-max.fasta" 14 probabilities_dir <- "Results/P1-max-AU.prob" 15 16 17 library(Biostrings) 18 library(seqinr) 19 20 # naèíst vstupní soubory 21 alignment <- readDNAMultipleAlignment(alignment_dir) 22 prob <- t(read.table(probabilities_dir, header=TRUE, row.names = NULL)) 23 24 # upravit vstupní soubory 25 prob2 <- prob[-nrow(prob),] 26 alignment2 <- as.matrix(alignment) 27 28 # zamaskovat nespolehlivé pozice 29 positions <- prob2<=treshold 30 31 masked<-alignment2 32 masked[positions==TRUE]<-"?" 33 34 # vytvoøit funkci na maskování mezer 35 replace.gaps <- function(x) { 36 # od zaèátku 37 if (x[1]=="-") { 38 x [1] <-"?" 39 } 40 for (i in 1:(length(x)-1)) { 41 if (x[i]=="?") { 42 if (x[i+1]=="-") { 43 x[i+1]<-"?" 44 } 45 } 46 } 47 # od konce 48 if (x[length(x)]=="-") { 49 x[length(x)]<-"?" 50 } 51 for (i in length(x):2) { 52 if (x[i]=="?") { 53 if (x[i-1]=="-") { 54 x[i-1]<-"?" 55 } 56 } 57 } 58 return (x) 59 } 60 61 # zamaskovat mezery 62 processed <- apply(masked,1,replace.gaps) 63 processed2 <- t(processed) 64 65 # vytvoøitFASTA soubors upraveným alignmentem 66 outputprocessed <- split(processed2, 1:nrow(processed2)) 67 write.fasta(outputprocessed,names=row.names(processed2), 68 file.out=paste("processed_",treshold,".fas",sep=""))

Soubor P2: Maskovany´alignment zı´skany´ch sekvencı´(.fas) >Rhynchospora_pubera TTCTCGGTT?????????GGAAAA------AAGGCTGTCTCACGC---ACCAAAGCTCGT GGTGGAGAGAGTAGCGTTCTTGTTCAGCCAGATGGATCTGAT------AAC---CAA GGTGACTTGAATGGCACTCCTATG------AGCCAAAAT??????CCAAAC ACTCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGAAAGAGTGCCCGGGCCCCGCCAACT CCTAGCTTGAAAGGAAGTTCCGAT?????????????????????AAGAGA---AAG??? AAG---CATCGGTATAGGCCTGGTACCGTTGCATTGAGAAAAATACGTAAATTTCAGAAA ACGACCCATTTGTTAATACCAGCTGCTCCTTTTTCCAGATTGGCGAGGGAGGTTACAGAG TTATTCAACAAAGATATG---CGATGGACTCCTGCAGGTCTTCTTGCCCTTCATGAGGCA GCAGAATATTATTTAGTTGATCTCTTTGAGGATGCCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGTGCGACAGTTAGGGATAAGGATATACAGTTGGCAAGGCGC

>Lepidosperma_gibsonii AGTTCGAAG?????????GGGACGAAA---AGAGCCGCCTCACAC---TTCAACGATCGT GCTAAAGGGAGCAGT---TCCGGTCAGCCTGATGAACCTGAT------AACCCACAA CTTGATGTCAATGGCGAACCTACT------AGCCAATAT??????CATCGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGGTCGCAACCCTAGCCGGGTTCCTCCAAAT CCTAGACTA---GGGAGTGGAGATGATCGAAGCCAGCAG?????????AGA---AAG??? AAG---CACCGGTATCGACCTGGTACTGTCGCCTTGCGGGAAATCCGCAAGTTTCAAAAA TCTACCAAACTATTAATACCGAATGCTGCGTTCTTCAGATTGACAAGGGAGGTATCATCG CACTACAGCAAAGATGTTACTAGATGGACACCTGGAGCTCTTCTTGGCCTTCAAGAGGCA GCAGAATACTACATAGTAGAGCTGTTAGAGGACGCCAACCAGATGGCGATCCATGCCAAG CGTGTAACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGTTAGGCGT >Mapania_palustris TTCTCCATC?????????GCAAGGGCT---AAA------TCCAAAGCTGGT GTCGGAGGGAGCAGC---TCTGCTTTGCGAGATGGATCTAGT------ATTCAACAA GGTGATGTCAGTGGCACCGCCACC------AGTCAAAAT??????CTGAGG ATCCTC?????????????????????ACGGCCCGCAAGACTAGCCGGCCCCCTCAAACT CCTAGACTTCAAGGGAGCAGAAATGATGAAAGCCAGCAA??????GAGACA---AGG??? AAGTCTCATCGATACCGGCCTGGTACCGTTGCTTTGCGGGAAATCCGCAAGTTTCAAAAA AGTACCCACTTGTTAATACCGCTTGCTGCTTTTGCCAGATTGGCAAGGGAGATCACAGAG CTTGTCTCGAAAGATGTAAATCGGTGGACACCTGGAGCTCTTATGGCCCTTCAAGAGGCG GCAGAGTACTACATTGTAGATTTGTTAGAGGATGCCAACCTATGTGCCTTGCATGCAAAG CGAGTGACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC

>Eleocharis_dulcis ???TCGAGC---AGATCAGGA---AAG---AAGGTC???GCACGCCGCTCCATGGCTACT GCTGGAGGGACCAGCTCCTCTACCCAGCCCCACGAAACTGATGCTTTACAGAACCAACAA GGCGATATCAATGATGCTTCTACA------CACCAAGTG??????CCGAGG ACCACA???CAA????????????AACACTGCTAGAAAGAGTTCCAGGCCCCCTTCCGCT CCTACCCTGAAAGGA---GGTGGTGATGCAACCCAGAAA??????CAGACT---AAG??? AAG---CATCGGTTTCGGCCTGGTACTGTTGCATTGCGCGAAATACGCAAATTTCAAAAA AGTACCCTTCTGTTAATACCGGGCCTTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAA TTCTGGAATCCAAAAATAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTGATTGCTATCCAGGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGAACTGTTAGAAGATGCAAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGCATAACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTG?????????

>Eleocharis_acicularis TTCTCGAGC???AGATCCGCCAGGAAA---AAGTCCGCCGCTCGCCGCTCCATGGCTGAT GCTAAAGGGGACAGCTCCTCCGCGCAGCCCAATGAATCTGATGCTTTGCCGAACCAACAA GGCGATGCCAATGATGCCCCTGCA------GATCAAGAG???TAC---AAG ACCCCT???AAG????????????AGCACTGCTAGAAAGAGTTCCAAGCCCCCTACAAGC CGAAACCTGGATGGA---GGTGGTAATGCAAGCCAGAAA??????CAGACC---AAG??? AAG---CATCGGTATCGGCCTGGTACTGTAGCACTGCGGGAAATACGTAAATTTCAAAAA ACAACCCATCTGTTGATACCATCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGTAAAGGAGATAACAGAA TTCTTCAACCCAGACATAACTCGATGGACACCTGGAGCTATGATTGCTCTCCAGGAGGCA GCAGAATACTACCTTGTAGAACTGTTTGAAGATGGCAATCTATGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTGACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGCTAGGCGC

>Eleocharis_vivipara CTCTCGAGC?????????GGCCGGAAA---AAGGTCGCCGCTCGCCGCTCCATGGGTGCT GCTGGAGGGGACAGCTCC---GCTCAGCCCAATGAAACTGAT------AACCAACAA GGCGATGCCAATGATGCCCCTGCA------GATCAAGAG???TAC---AAG ACCCCT???AAG????????????AACACTGCTAGAAAGAGTTCCAGGCCCCCTACTTCC CGAAACCTGGATGGT---GGTGGTAATGCAAGCCAAAAA??????AAGACC---AAG??? AAG---CATCGGTATCGGCCTGGTACCGTAGCACTGCGGGAAATACGGAAATTTCAGAAA ACATCCCATCTGTTGATACCAGCCCTTCCTTTTGCGAGATTGGTAAAGGAGGTAGCAGCA TTCTTCAACCCAGACATAAATCGATGGACTCCCGGAGCTATGATTGCTATCCAGGAGGCA GCAGAATACTACCTTGTAGAACTGTTTGAAGATGCCAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTGACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGCTAGGCGC >Isolepis_prolifera TTCGCGAGC?????????GGAAAGAAG---AAGGTT---GCGCGTCGCTCTATCGGTCCT GTTGGAGTTAGCCGCTCCTCCGCTCAGCCTGACGGAACTGATGCT------AACCAACTA GCTGATGTCAATGGTACTCCTACT------CCGCAA??????CAGAAG ACCCCG?????????????????????ACCGCTAGGAAGAGTACTAGGCCTCCTTTCACT CCTAATTTGAAAGGAAACAATGGTGTTGGAAACACGACA??????CGG------AAG??? AAG---CATCGATATCGGCCTGGTACTGTTGCATTGCGGGAGATCCGCACTTATCAGAAA ACAACCCATTTGTTAATACCGGCCTGTGCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACATCT TTCTTTAACCCGGAGATTAATCGGTATACTCCTGGAGCTCTTATTGCCCTGCAAGAGGCA GCAGAACACTACATTGTAGAACTGTTCGAGGACACCAATCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGTGTCACAATAATGCAAAAGGATGTATACTTGGCTAGGCGC

>Cyperus_fuscus TTCGCGAAC---AGATCAGGGAGGAAGAAAAAGGTTGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA------TCCTCTTCTCAGCCCGACGGAACTGATACT------GACGAACAT ------AAG ACTCCG???AAA????????????AACACTGCTAGAAAGAGCTCCAGGCCTCCTCCCACT CCTAATTTGCAAGGAAACAGCACTGATGCAAGGCAGAAA??????CAGACT---AAG??? AAG---CATCGATATCGGCCTGGTACTGTTGCGCTGCGGGAAATCCGCAAATATCAGAAA ACTGCTTATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAATCCAGAAATAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTTATGGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAACACTACTTGGTAGAACTGTTCGAGGACACCAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCTAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC

>Cyperus_textilis TTCTCGAAC?????????GCGAGGAAG---AAGGCCGCCTCACGCCGCGCTCTCGCTCTT GCTGGA------TCCTCCGCTCAGCCCGACGGAACTGATACT------AATCAGCAT GGTGATGTCACTGGTACTCCTACA------AACAAACAA??????CAGAAG ACTCCG?????????????????????ACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCAAGCCGGCAA??????CAT------AAG??? AAG---CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGGAGTCCTGCAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACTTGGTAGAACTGTTAGAGGACACCAATCTCTGCGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC

>Cyperus_alternifolius TTCTCGAAC---AAATCAGCGAGGAAG---AAGGCCGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA------CCCTCCGCTCAGTCTGACGGAACCGATACT------AATCAGCAT AGTGATGTCACTGGTACTCCTACA------GACAAACAA??????CAGAAG ACTCCG???AAA????????????AACACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCCAGCCGGCAA??????CAT------AAG??? AAG---CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGGAGTCCTGCAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACTTGGTAGAACTGTTAGAGGACACCAATCTCTGCGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC >Cyperus_papyrus TTCTCGAAC???AAATCAGCGAGGAAG---AAGGCCGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA------CCCTCCGCTCAGTCTGACGGAACCGATACT------AATCAGCAT AGTGATGTCACTGGTACTCCTACA------GACAAACAA??????CAGAAG ACTCCG???AAA????????????AACACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCCAGCCGGCAA??????CAT------AAG??? AAG---CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGG????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????

>Eriophorum_angustifolium ???????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????CAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA------AGCCAACAC??????CAGCGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCTACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCCTGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT---AAA??? AAG---CATCGATTCCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGCAGGTTTCAGAAA AGTACCCATCTGTTAATACCGGCCATTGCTATTGCGAGATTGGCAAGGGAGTTAACAGAG TACGTGAACCCAGCTATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTG???????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????

>Scirpus_sylvaticus TTCACGAGC?????????GCTAGGAAA---AAAGCCGTCGCGCGCAGATCCACGGCTCCT GCTGGAGGGAGCAGCTCCTCCGCTCAGCCCGATGTAACTGATGCTTCACAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA------AGCCATCAC??????CACCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCCTGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT---AAA??? AAG---CATCGATTTCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGTAGGTTTCAGAAA AGTACCCATCTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCGAGATTGGCAAGGGAGATGACAGCG GACTATAACCCACATATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGCTTGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC

>Eriophorum_vaginatum TTCACGAGC?????????GCTAGGAAA---AAAGCCGTCGCGCGCAGATCCACGGCTCCT GCTGGAGGGAGCAGCTCCTCCGCTCAGCCCGATGTAACTGATGCTTCACAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA------AGCCAACAC??????CAGCGG ACCCCA?????????????????????ACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCATGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT---AAA??? AAG---CATCGATTTCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGCAGGTTTCAGAAA AGTACCCAACAGTTAATACCGGCCATTGCTTTTGCGAGATTGGCAAGGGAGATAACAATG GACATTAACCCACATATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGCTTGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCGAGGCGC >Carex_muricata_agg TTATCGAGC???AAATCTGCAAGAAAA---AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACGG??????CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGTGGCCATGATGCAAGACCTCAA??????GAGACTATGAAA??? AAG---CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC

>Carex_elongata ???TCGAGC?????????GCAAGGAAA---AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACGG??????CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGTGGCCTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACTATGAAA??? AAG---CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAAAATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCT??????

>Carex_remota ???TCGAGC???AAATCTGCAAGGAAA---AAAGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGGTGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGGCGCTTCTACA------ACCCAACGG??????CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CATCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCT??????

>Carex_echinata ????????????????????????????????????GTAGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACGG------CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTAAACCCAAAAGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC >Carex_canescens TTATCGAGC???AAATCTGCAAGAAAA---AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACGG??????CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAACACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGAGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACCCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC

>Carex_leporina ???????????????????????????????????????GCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTAGA------ACCCAACGG??????CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGTCCCGTCCAACT CCAACACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGAGCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGACCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGAGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC

>Carex_bohemica ???????????????????????????????????????GCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACGG???????????? ????????????????????????AGCACTGCTCGGAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGA?????????GATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? ??????CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGG???????????????????????????????????????

>Carex_alba TTCTCGAGC???ACA---GCA?????????AAAGTCGCGGCTCGCAAATCCACTGCTACT GCTGGAGGGAGCAGCTCCACAGCT------CCACCGCTCAGCTCCACCCAACAG??????CCGCGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGGAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGA?????????CATGTAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTTCCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCCGAATACTACATTGTAGAATTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC >Carex_pilulifera TTCTCGAGC???ACA---GCAAAGAAA---AAAGTCACCGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC??????GCTCAGTCCGATGGAACTGAT------AACAAACGA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACAG???????????? ????????????????????????AGTACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAGTGCACGGA?????????CATGTAAGACATCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACATGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCCTAAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATTCTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACTATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGG???

>Carex_digitata ???????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????CCCGATGGAACTGATGATTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGATGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTAGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGAAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCCTGAATCCAAATGTAAACCGGTGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACTAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATT??????????????????????????????

>Carex_caryophyllea TTCTCGAGC???ACA---GCAAAGAAG---AAAGTCACCGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCACTCAGCCTGATGGAATTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CGATGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAATGAATGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCGA??????GAGACT????????? AAG---CATCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATCACAGAG TTCTTGAACCCAAACGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC

>Carex_humilis TTCTCGAGC???TCA---GCAAGGAAA---AAAGCC??????CGCAGATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ACC???CAG??????CCACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGT??????CATGTAAGA???????????????ACT????????? AAG---CATCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTATTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATAACGGAG TTCTTAAACCCAAACGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC >Carex_flacca TTCTCGAGC???ACA---GCAAAGAAA---AAAGTCACCGCG??????TCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC??????GCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTAAGGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ATCCAACAG??????ACACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCT????????????ACT????????? AAG---CATCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAAATTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCAGTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC

>Carex_panicea TTCTCGAGC???ACA---GCAAGG?????????GTCAAAGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC??????GCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTAAAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTGCA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCAA??????GAGAGT????????? AAG---CGTCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCTAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGG???

>Carex_pilosa TTCTCGAGC???ACA---GCA????????????GTCAAAGCG??????TCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC??????GCTCAGCCCAATGGAACTGATGCTTTAAAGAAC?????? GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAATGGA???????????????AGACCT?????????GAGACT????????? AAA---CGTCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATCACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCTAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC

>Carex_acutiformis TTCTCGAGC---ACA---GCAAGGAAA---AAAGTCAGAGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGTTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCATTGACGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CGACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAGTGAATGGAAGTGGCTATCATGCAAGACATCAA??????GAGACTAAGAAA??? AAG---CGACGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAGA AGTACCAGACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCG GCAGAATATTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATTCAATTGGCTAGACGC >Carex_hartmanii TTCTCGAGC???ACA---GCAAGGAAA---AAAGTCAAAGTGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTGCCACA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGTGGCCGTCATGCAAGACATCAA??????GAGACA---AAA??? AAG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAAATTCAGAGA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTTCTCAACCCAAATGTAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTGGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCT??????

>Carex_nigra ???????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????CAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGGACGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCA?????????????????????ACTGCTCGCAAGAGTACACTATCCCGTCCAACT CCAATAGTGAATGGAAGTGGCCATCATGCAAGACATCAA??????GAGACTAAGAAA??? AAG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAGA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCTATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTG????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????

>Carex_hirta ???????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????CGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGTCCCGTCCCACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGCAAGACATCAA??????GAGACT????????? AAG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCGATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATT??????????????????????????????

>Carex_rostrata TTCTCGAGC???ACA---GCAAGGAAA---AAAGTCAAAGCGCGAAGATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCAATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA------ACCCAACAG??????CCACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATACAAGACATCAA??????GAGACT????????? AGG---CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACTATTATGCAAAGGGATATGCAATTGGCTAGGCGC Soubor P3: Fylogeneticky´strom zı´skany´ch sekvencı´(.nwk) (Carex_acutiformis,Carex_hartmanii,Carex_nigra, (((Carex_flacca,((Carex_alba,(((Eriophorum_angustifolium, (Scirpus_sylvaticus,Eriophorum_vaginatum)), ((Rhynchospora_pubera,(Lepidosperma_gibsonii, Mapania_palustris)),((Isolepis_prolifera,(Cyperus_fuscus, (Cyperus_textilis,(Cyperus_alternifolius,Cyperus_papyrus)))), (Eleocharis_dulcis,(Eleocharis_acicularis, Eleocharis_vivipara))))),(Carex_muricata_agg,((Carex_echinata, (Carex_canescens,(Carex_leporina,Carex_bohemica))), (Carex_elongata,Carex_remota))))),(Carex_pilulifera, (Carex_digitata,(Carex_caryophyllea,Carex_humilis))))), (Carex_panicea,Carex_pilosa)),(Carex_hirta,Carex_rostrata)));