ALLYSON SANTOS DE SOUZA

PROSPECÇÃO DA BIODIVERSIDADE CRÍPTICA E PADRÕES BIOGEOGRÁFICOS EM PEIXES DO LITORAL E ILHAS OCEÂNICAS DO ATLÂNTICO OCIDENTAL

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução, com ênfase em Padrões e Processos Evolutivos.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

Natal/RN 2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB

Souza, Allyson Santos de. Prospecção da biodiversidade críptica e padrões biogeográficos em peixes do litoral e ilhas oceânicas do Atlântico Ocidental / Allyson Santos de Souza. - Natal, 2017. 108 f.: il.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.

1. Pomacentridae - Tese. 2. Carangidae - Tese. 3. Taxonomia - Tese. 4. Delimitação de espécies - Tese. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 567

ALLYSON SANTOS DE SOUZA

PROSPECÇÃO DA BIODIVERSIDADE CRÍPTICA E PADRÕES BIOGEOGRÁFICOS EM PEIXES DO LITORAL E ILHAS OCEÂNICAS DO ATLÂNTICO OCIDENTAL

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução, com ênfase em Padrões e Processos Evolutivos.

Aprovado em: 30 de março de 2017.

Comissão Examinadora:

Dr. José Garcia Júnior – IFRN

Dr. Paulo Augusto de Lima Filho – IFRN

Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha – UFRN

Dr. Sérgio Maia Queiroz Lima - UFRN

AGRADECIMENTOS

Primeiramente gostaria de dizer que esta conquista só foi possível devido a ajuda de muitos, encarnados e desencarnados. Agradeço primeiramente aos meus pais, Azuílo de Souza e Rosália Santos, por nunca medirem esforços para fornecer-me boa educação, desde quando os teares ainda eram manuais e de madeira; À Ana Paula Santos de Medeiros pelo apoio e incentivo ao doutorado, além da paciência, companheirismo e cumplicidade; Ao professor Wagner Franco Molina pela orientação, confiança, paciência, serenidade e aprendizado, científico e moral; Aos amigos do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, incluindo Antônio Jales Moraes Vasconcelos, que foi quem me introduziu no laboratório, em 2003, e na genética de peixes; Aos meus ex-professores do Externato Tico e Teco, Colégio Diocesano Seridoense e Centro Educacional José Augusto; À Universidade Federal do Rio Grande do Norte; À Marinha do Brasil/SECIRM; Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade; À Reserva Biológica do Atol das Rocas; Ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis; À Academia Brasileira de Ciências; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq);

Muito obrigado.

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL ...... 12 Padrões da biodiversidade atlântica brasileira...... 12 Estruturas geográficas e geomorfológicas da costa brasileira...... 14 Análises genéticas e morfométricas na detecção da biodiversidade...... 17 OBJETIVO GERAL ...... 19 Objetivos específicos 19 MATERIAL E MÉTODOS ...... 20 Análises moleculares...... 20 Análises morfométricas...... 21 REFERÊNCIAS ...... 23

CAPÍTULO 1 A reappraisal of Stegastes species occurring in the South Atlantic using morphological and molecular data ...... 30 ABSTRACT...... 31 INTRODUCTION...... 32 MATERIAL AND METHODS…...... 33 Specimen collection...... 33 Counts, traditional and geometric multivariate morphometry………………...37 DNA extraction, PCR amplification and DNA sequencing………………...... 37 Analysis of sequences………………...………………...………………...…… 39 RESULTS………………...………………...………………...………………...… 39 Quantification of Fin Rays and Lateral-line Scales………………...…………. 39 Principal Component Analysis………………...………………...……………… 40 Geometric morphometric analysis………………...………………...…………. 43 Genetic variation………………...………………...………………...…………… 44 Comparative genetic analyses………………...………………...……………… 45 DISCUSSION………………...………………...………………...………………. 49 CONCLUSION………………...………………...………………...……………... 52 REFERENCES………………...………………...………………...…………….. 53 Supplementary material Table 1………………...………………...…………… 60

CAPÍTULO 2 Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas ...... 61 RESUMO………………...………………...………………...…………………… 62 INTRODUÇÃO………………...………………...………………...…………….. 63 MATERIAL E MÉTODOS………………...………………...………………...…. 64 Coleta dos espécimes………………...………………...………………...…….. 64 Análises moleculares………………...………………...………………...……… 64 RESULTADOS………………...………………...………………...…………….. 68 Sequências 16S e COI………………...………………...……………………… 68 Sequências da Região Hipervariável 1 (RHV1) ………………...……………. 68 DISCUSSÃO………………...………………...…………………………………. 77 REFERÊNCIAS………………...………………...………………………………. 81 Material suplementar...... ………………...…………… 85

CAPÍTULO 3 Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto, Caranx lugubris Poey 1860 em áreas do Atlântico Ocidental ...... 89 RESUMO………………...………………...………………………...…………… 90 INTRODUÇÃO………………...………………...………………………...……... 91 MATERIAL E MÉTODOS………………...………………...…………………… 92 Coleta dos espécimes………………...………………...……………………….. 92 Análises moleculares………………...………………...………………………... 93 RESULTADOS………………...………………...………………………...…….. 95 DISCUSSÃO………………...………………...………………………...……….. 96 REFERÊNCIAS………………...………………...………………………...…... 101 Material suplementar………………...………………...………………………. 106

CONCLUSÕES GERAIS ...... 107

LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1. Atlântico Sul ...... 15

CAPÍTULO 1

Figura 1. Map showing the geographic distributions of Stegastes variabilis and S. fuscus (red), S. rocasensis (blue), S. sanctipauli (green) and S. trindadensis (yellow)...... 34

Figura 2. Specimens of A Stegastes variabilis Castelnau 1855, B S. fuscus Cuvier 1830, C S. sanctipauli Lubbock and Edwards 1981, D S. rocasensis Emery 1972, E S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, F S. pictus Castelnau 1855..... 35

Figura 3. Dispersion diagram of individual scores in the Principal Components Analysis of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. variabilis (violet squares with an asterisk), and S. trindadensis (green circles) ...... 43

Figura 4. Analysis of the canonical variables of body shape data of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. trindadensis (green circles) and S. variabilis (violet squares with an asterisk) ...... 44

Figura 5. Neighbor-joining tree derived from COI sequences of Stegastes ...... 47

Figura 6. Maximum likelihood tree based on the combination of 16S, COI, CytB, rag1 and rhod (2,580 pb) sequences of Stegastes...... 48

CAPÍTULO 2

Figura 1. Locais de coleta de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas ...... 67

Figura 2. Rede de haplótipos de Abudefduf saxatilis baseado em sequências da RHV1 ...... 71

Figura 3. Árvore de maximum likelihood baseado em sequências RHV1 de Abudefduf saxatilis ...... 72

Figura 4. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências 16S de Abudefduf ...... 73

Figura 5. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências COI de Abudefduf ...... 73

Figura 6. Estruturação genético populacional de Abudefduf saxatilis ao longo da costa leste da América do Sul e ilhas oceânicas brasileiras ...... 76

CAPÍTULO 3

Figura 1. Áreas de coleta dos espécimes de Caranx lugubris ...... 92

Figura 2. Morfótipos I (a) e II (b) de Caranx lugubris (sensu Jacobina et al., 2014), coletados no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo ...... 93

Figura 3. Rede de haplótipos baseadas em sequências parciais da Região Hipervariável 1 (DNAmt) de Caranx lugubris...... 96

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1. Stegastes specimens analyzed and GenBank accession numbers of mitochondrial and nuclear sequences used in phylogenetic estimates ...... 36

Tabela 2. Primers used to amplify sequences of mitochondrial and nuclear genes of Stegastes species ...... 38

Tabela 3. Frequency distribution of counts for 7 species of Stegastes from the Western Atlantic ...... 41

Tabela 4. Variable loadings from sheared principal components analysis for morphometric characters of Stegastes species ...... 42

Tabela 5. Mean pairwise distances (p-distance) (lower diagonal) and mean number of intraspecific (in parentheses) and interspecific (upper diagonal) nucleotide differences with their respective standard errors based on partial sequences of 16S, COI, CytB, rag1 and rhodopsin genes (2,580 bp) ...... 46

Supplementary material Table 1. Genetic divergence (Kimura-2-parameter) among Stegastes species (lower diagonal) with their respective standard errors (upper diagonal) based on partial sequences of COI (658 bps) ...... 60

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Pontos de coleta e número amostral de Abudefduf saxatilis ao longo da costa oeste da América do Sul ...... 66

Tabela 2. Índices de diversidade genética e neutralidade em Abudefduf saxatilis baseado em RHV1 ...... 70

Tabela 3. Estimativas de FST entre diferentes populações geográficas de Abudefduf saxatilis baseadas em RHV1 ...... 74

Tabela 4. Análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) baseado na RHV1 de Abudefduf saxatilis ...... 75

Tabela suplementar 1. Distribuição dos haplótipos encontrados nas sequências Região Hipervariável 1 de Abudefduf saxatilis...... 85

CAPÍTULO 3

Tabela 1. Diversidade genética de Caranx lugubris ...... 100

Tabela suplementar 1. Distribuição de haplótipos em Caranx lugubris ...... 106

RESUMO

O extenso litoral brasileiro é multipartido em diferentes ecossistemas, compostos por estuários, manguezais, sistemas recifais, ilhas costeiras e oceânicas. Estes ambientes possuem uma ictiofauna bastante diversificada composta por 1.297 espécies, das quais aproximadamente 25% representam espécies endêmicas. Esses níveis de biodiversidade podem ser incertos, devido a ocorrência de espécies crípticas e politípicas e pela ausência de estudos populacionais, sobretudo em espécies recifais. Neste sentido, foram analisados aspectos populacionais, taxonômicos e filogenéticos de espécies das famílias Pomacentridae (Perciformes) e Carangidae (Carangiformes), distribuídos ao longo da costa e ilhas oceânicas brasileiras. As análises moleculares e morfométricas realizadas em S. variabilis, S. fuscus, S. rocasensis, S. sanctipauli e S. fuscus trindadensis indicaram sinonímia entre S. rocasensis e S. sanctipauli, e entre S. fuscus e S. fuscus trindadensis. Além disso, revelaram a presença de uma possível espécie críptica que tem sido confundida com S. variabilis. As análises populacionais em Abudefduf saxatilis no Atlântico Ocidental, incluindo as ilhas oceânicas, revelam um quadro de panmixia desde a Venezuela até o sudeste do Brasil, enquanto que as populações insulares possuem diferentes níveis de estruturação genética, sobretudo a da Ilha de Trindade. As análises genéticas na espécie politípica Caranx lugubris indicaram uma grande população panmítica no Atlântico Ocidental, lançando novos dados sobre a origem dos morfótipos que ocorrem no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo. Os dados obtidos aprofundam o conhecimento da fauna íctica insular do Atlântico e servem de subsídios para o manejo e conservação de espécies dessas importantes e particulares regiões oceânicas.

Palavras-chave: Pomacentridae, Carangidae, taxonomia, delimitação de espécies

ABSTRACT

The extensive Brazilian coast is multi-party in different ecosystems, composed by estuaries, mangroves, reef systems, oceanic and coastal islands. These environments detain a largely diversified ichthyofauna composed by 1,297 species, in which 25% represents endemic species. These levels of biodiversity can be uncertain, because of the occurrence of cryptic and polytypic species and the absence of population studies, especially in reef species. In this sense, population, taxonomical and phylogenetical aspects were analyzed form species of the Pomacentridae (Perciformes) and Carangidae (Carangiformes) families, along the coast and oceanic islands of Brazil. The molecular and morphometric analyzes were performed in S. variabilis, S. fuscus, S. rocasensis, S. sanctipauli and S. fuscus trindadensis indicated synonym among S. rocasensis and S. sanctipauli, and between S. fuscus and S. fuscus trindadensis. Besides that, revealed the presence of a possible cryptic species which has been confused with S. variabilis. The population analyzes in Abudefduf saxatilis at the Western Atlantic, including the oceanic islands, reveals a status of panmixia from Venezuela to the Southeast of Brazil, while the island populations have different levels of genetic structuration, specially the population of the Trindade island. The genetic analyzes in the polytypic species Caranx lugubris indicated a large panmitic population in the Western Atlantic, revealing new data about the origins of the morphotypes that occurs in the surroundings of the Saint Paul Rocks archipelago. The data obtained expands the knowledge over the insular ichthyic fauna of the Atlantic and serves as subsidy to the conservation and management of species of these particular and important oceanic regions.

Keywords: Pomacentridae, Carangidae, taxonomy, species delimitation

INTRODUÇÃO GERAL

Padrões da biodiversidade atlântica brasileira

O extenso litoral do Brasil é composto por diferentes ecossistemas costeiros, o que acaba por favorecer a ocorrência de uma diversificada ictiofauna. No entanto, os valores de biodiversidade podem ser dúbios devido a ocorrência de espécies crípticas e politípicas em diversos grupos. O uso de marcadores moleculares e morfométricos podem contribuir na detecção da biodiversidade críptica, fornecendo subsídios para seu manejo e conservação. A ictiofauna brasileira é composta por aproximadamente 1.298 espécies, das quais 456 pertencem à Ordem Perciformes e 45 à Carangiformes (Menezes et al., 2003; Nelson et al., 2016). Incluindo os arquipélagos de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Fernando de Noronha (FN), o Atol das Rocas (AR) e Ilha de Trindade (IT), esta ictiofauna é composta por aproximadamente 25% de espécies endêmicas. Quando apenas a zona costeira é considerada, o nível de endemismo cai para 10,5%. Dentre estes ambientes insulares brasileiros, o Arquipélago de São Pedro e São Paulo possui a maior taxa de endemismos (9,3%) (Floeter et al., 2008). No entanto, o real número de táxons, principalmente endêmicos, é incerto devido ao limitado conhecimento sobre aspectos genéticos de espécies e populações, sobretudo as insulares, e devido ao registro crescente de espécies crípticas e/ou politípicas. No Brasil, a ocorrência de diversidade críptica e espécies politípicas envolvendo espécies das Ordens Perciformes (Luiz-Júnior, 2003; Rangel et al., 2004; Lima et al., 2005; Mendes, 2007; Rangel & Mendes, 2009; Lima-Filho et al., 2012, 2016; Souza et al., 2015) e Carangiformes (Jacobina et al., 2014; Duarte et al., 2017) vêm sendo documentadas, sobretudo nas regiões insulares. Dentre os Perciformes, a família Pomacentridae se destaca por constituir um dos grupos marinhos mais representativos (Wainwright & Bellwood, 2002) e diversificados grupos nos ambientes recifais, com 406 espécies (Eschmeyer & Fong, 2017). A definição taxonômica de diversas espécies de Pomacentridae se mostra complicada devido à ocorrência de complexos de espécies e marcantes variações nos padrões de coloração entre indivíduos e entre áreas de distribuição de uma

12 mesma espécie (Greenfield & Woods, 1974; Allen, 1991; Planes & Doherty, 1997; Novelli et al., 2000; Souza et al., 2011). Nas ilhas oceânicas brasileiras ocorrem três espécies endêmicas de Pomacentridae, que são Stegastes rocasensis, no Atol das Rocas e Arquipélago de Fernando de Noronha, S. sanctipauli, no Arquipélago de São Pedro e São Paulo, e S. fuscus trindadensis, na Ilha de Trindade. Apesar de serem consideradas espécies válidas, seus status taxonômicos estão estabelecidos apenas com base em análises morfológicas tradicionais. Análises com marcadores moleculares do tipo RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) realizadas em S. pictus, S. variabilis, S. fuscus, S. rocasensis e S. sanctipauli não encontraram distinção genética entre as espécies insulares (Dias-Júnior & Molina, 2008). A utilização de outros marcadores moleculares é necessária para a avaliação do status taxonômico destas formas, sobretudo pela ocorrência de vários complexos de espécies nesta família (Greenfield & Woods, 1974). Uma das espécies mais abundantes da família Pomacentridae, Abudefduf saxatilis, conhecida como Sargentinho, constitui o único representante do gênero na costa e ilhas oceânicas brasileiras. Sua ocorrência vai desde Indo-Pacífico até o Atlântico tropical e é uma das espécies mais comuns nos ambientes recifais brasileiros (Gasparini & Floeter, 2001; Feitoza et al., 2003; Menezes, 2003, 2011; Vaske et al., 2005). Mesmo assim, pouco se sabe sobre sua estrutura populacional na costa oeste do Atlântico. No intuito de se obter informações acerca da sua estrutura populacional, análises morfológicas multivariadas em diferentes populações costeiras e insulares de A. saxatilis revelaram uma marcante plasticidade fenotípica interpopulacional e uma variação clinal, no sentido norte-sul do Atlântico, envolvendo diferentes elementos seriais (Molina et al., 2006). Variações populacionais através de marcadores moleculares RAPD, em espécimes coletados na costa dos estados da Bahia e Rio Grande do Norte, além do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, sugerem a existência de significativo isolamento populacional da população desta região insular (Rodrigues & Molina, 2007). Esses dados corroboram com as divergências morfológicas populacionais entre essas regiões (Molina et al., 2006). No Caribe, análises morfométricas indicaram variações morfológicas sobretudo relacionadas à natação e alimentação, enquanto as análises genéticas sugeriram um quadro de panmixia ao longo de 1.800 km da costa mexicana Atlântica (Piñeros

13 et al., 2015). Diante da extensão da distribuição espacial desta espécie, a utilização de outros marcadores genéticos poderá ser mais útil para um melhor esclarecimento sobre a estrutura populacional na costa e ilhas oceânicas do Brasil. Já a Ordem Carangiformes é constituída por seis famílias, Nematistiidae, Coryphaenidae, Rachycentridae, Echeneidae, Menidae e Carangidae (Nelson et al., 2016), e contêm 161 espécies (Eschmeyer & Fong, 2017), muitas delas representando importantes recursos para a indústria pesqueira e aquacultura comercial (Jory et al., 1985; Olson & Galvan-Magana, 2002; Smith-Vaniz, 2002; Laidley et. al., 2004; Smith-Vaniz & Carpenter, 2007; McMaster & Gopakumar, 2016). Entre as espécies pelágicas, a família Carangidae é representada no litoral brasileiro por 35 espécies, dentre elas Caranx lugubris (Menezes, 2003). Esta espécie possui distribuição circuntropical, incluindo o Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Brasil). Neste arquipélago, foi descrita a ocorrência de dois padrões morfológicos (morfótipos I e II) de C. lugubris, caracterizados principalmente quanto ao forma do corpo e dos olhos e indícios de diversificação citogenética (Jacobina et al., 2014). As causas da ocorrência destes morfótipos, apesar dos esforços, ainda são inconclusivas. Alguns fatores podem estar relacionados à sua origem, tais como como isolamento populacional e adaptação ambiental, invasões interoceânicas de diferentes linhagens de C. lugubris ou hibridação. Apesar de esparsos estudos, a ocorrência esporádica de híbridos naturais (Murakami et al., 2007; Santos et al., 2011), complexos de espécies (Smith-Vaniz & Carpenter, 2007), e indícios de ocorrência de espécies crípticas (Duarte et al., 2017) envolvendo espécies do gênero Caranx foram documentadas e podem estar implicadas na origem dos conspícuos padrões morfológicos desta espécie. Desta forma, análises complementares utilizando outros marcadores genéticos poderiam contribuir para a identificação da causalidade dos morfótipos no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, assim como revelar a estrutura populacional de C. lugubris no Atlântico Sul.

Estruturas geográficas e geomorfológicas da costa brasileira

O Brasil possui o mais extenso litoral inter e subtropical do mundo, estendendo-se por aproximadamente 8.000 quilômetros (km) de costa (Ab’Saber,

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2003; Simões & Hazin, 2005) e cobrindo aproximadamente 38 graus de amplitude latitudinal (Mattox et al., 2014). Toda essa extensão abrange diferentes ecossistemas, tais como estuários, manguezais, lagoas costeiras, litorais arenosos e rochosos, sistemas recifais, ilhas costeiras e oceânicas. O Brasil possui um domínio oceânico com mais de 3,5 milhões de km² (Carvalho, 2005; Serafim, 2007), o que corresponde a cerca de 41% da área territorial terrestre. A extensão da sua plataforma continental varia de oito quilômetros, na altura do litoral da Bahia, a 370 quilômetros, na região da foz do rio Amazonas. A quebra entre a plataforma e o talude continental ocorre entre 75 e 80 metros de profundidade (MMA, 2010) (Figura 1). Quatro ilhas e/ou arquipélagos oceânicos fazem parte do território nacional e são consideradas Unidades de Conservação, sendo elas, o Atol das Rocas (03°51'S, 33°48'O), arquipélagos de Fernando de Noronha (03°51'S, 32°25'O) e São Pedro e São Paulo (0°55'N, 29°20'O), e Ilha de Trindade (20o30’S, 29o19’O) (Figura 1). O Atol das Rocas possui aproximadamente 7,5 km2 e constitui o único atol presente no Atlântico Sul (Kikuchi, 2002; Almeida, 2006), distante aproximadamente 233 quilômetros da costa do Rio Grande do Norte.

Figura 1. Atlântico Sul. IM - Ilha Margarita (Venezuela); ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo; AR - Atol das Rocas; FN - Arquipélago de Fernando de Noronha; IT - Ilha de Trindade; Tracejado - Áreas sob estudo; Imagem modificada de GEBCO World Map 2014. Disponível em: http://www.gebco.net.

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Ao leste do Atol das Rocas, distante 156 km, está localizado o arquipélago de Fernando de Noronha e sua área total é de aproximadamente 16,4 km2. Fernando de Noronha encontra-se a uma distância de 360 km da costa do Rio Grande do Norte e, junto com Atol das Rocas, faz parte da chamada Cadeia de Fernando de Noronha. Esta cadeia é formada por pelo menos cinco montes submarinos que se estendem no sentido Leste-Oeste e dos quais apenas o Atol das Rocas e Fernando de Noronha encontram-se atualmente emersos (Mabesoone & Coutinho, 1970; Almeida, 2006). O arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP) está localizado a 1.000 km da costa brasileira e a 630 km a oeste de Fernando de Noronha. ASPSP possui área total de aproximadamente 17.000 m2 e é composto por seis ilhas maiores, quatro menores e vários rochedos emersos (Almeida, 2006; Viana et al., 2009). As ilhas Trindade e Martin Vaz são as ilhas oceânicas mais isoladas em relação ao continente sul-americano. Trindade possui um território de 13,5 km² e encontra-se a aproximadamente 1.170 km da costa brasileira. Já Martin Vaz mede cerca de 800 m de comprimento, 500 de largura e 175 de altura, localiza-se a 47 km a leste da Ilha de Trindade. Entre a costa brasileira e estas duas ilhas há nove montes submarinos que, juntos, estão orientados no sentido leste-oeste e compõe a chamada Cadeia Vitória-Trindade (Almeida, 2006). Apesar da aparente ausência de barreiras físicas que interfiram na interligação da ictiofauna ao longo de todas essas localidades, algumas espécies exibem diferentes amplitudes de distribuição geográfica. Enquanto que algumas espécies de Carangidae, como C. lugubris, distribuem-se circuntropicalmente (Menezes et al., 2003), outras limitam-se ao Atlântico tropical e partes do Indo- Pacífico, como A. saxatilis (Menezes et al., 2003). Já espécies do gênero Stegastes, possuem distribuição restrita ao pequeno Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Lubbock & Edwards, 1981) Percebe-se que, apesar dos ambientes marinhos não apresentarem barreiras que interrompam totalmente a dispersão e o fluxo entre populações, fatores biológicos e físicos que podem interferir na conectividade e nos padrões de distribuição das espécies. Fatores biológicos, como duração do período pelágico larval e o potencial migratório das espécies, e físicos, como o desague de água doce e sedimentos de grandes rios, e a intensidade e temperatura das correntes oceânicas, podem modelar a biogeografia de diferentes regiões (Floeter et al., 2008;

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Rodrigues et al., 2014; Souza et al., 2015). Dentre os fatores físicos, o imenso desague de água doce e sedimentos do rio Amazonas têm sido apontado como uma importante barreira biogeográfica e provável responsável pela maior parte do endemismo encontrado nos ambientes costeiros brasileiros (Rocha, 2003). Além deste, a ação das correntes oceânicas é outro fator importante na distribuição biogeográfica. Uma das principais correntes no Atlântico Ocidental é a corrente Sul Equatorial, que flui no sentido leste-oeste, passando por Fernando de Noronha, Atol das Rocas, e alcançando a costa nordeste do Brasil, onde bifurca-se, formando a Corrente do Brasil (sentido nordeste-sudeste do Brasil) e a Corrente Norte do Brasil. A Corrente Norte do Brasil continua fluindo no sentido leste-oeste/noroeste, passando pela costa norte brasileira e alcançando a Venezuela. Ao passar pela foz do rio Amazonas, a força da corrente acaba direcionando o desague do Amazonas para o noroeste, na direção da Guiana Francesa, onde o sedimento vai decantando ao longo de uma extensa área (Castro & Miranda, 1998; Rocha, 2003; Lumpkin & Garzoli, 2005). No extremo sul do Brasil, a Corrente das Malvinas tem sido apontada como responsável pela estruturação populacional de algumas espécies (Santos et al., 2006; Rodrigues et al., 2014). Apesar do conhecimento de vários fatores que influenciam na distribuição geográfica da ictiofauna brasileira a causalidade de muitos padrões biogeográficos continua largamente desconhecidos para um grande número de espécies.

Análises genéticas e morfométricas na detecção da biodiversidade

A utilização de marcadores moleculares de DNA e análises morfométricas vêm contribuindo de forma contundente na resolução de incertezas taxonômicas, delineamentos populacionais e identificação de espécies crípticas e politípicas em diversos grupos de peixes marinhos, incluindo espécies da família Pomacentridae e Carangidae (Murakami et al., 2007; Schultz et al., 2007; Lima-Filho et al., 2012, 2016; Jacobina et al., 2014; Martinez-Takeshita et al., 2015; Souza et al., 2015; Duarte et al., 2017). No Brasil, incertezas taxonômicas não resolvidas devido à grande sobreposição de caracteres merísticos, sobretudo em grupos que possuem complexo de espécies como os Pomacentridae (Greenfield & Woods, 1974), puderam ser melhor esclarecidas através de marcadores moleculares (Dias-Júnior e

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Molina, 2008). O uso combinado de diferentes abordagens auxilia no entendimento do processo evolutivo. Em algumas espécies marinhas, como Bathygobius soporator, análises citogenéticas populacionais e morfológicas tanto variações cromossômicas, como intensa plasticidade fenotípica, associada a condições ecológicas particulares (Lima-Filho et al., 2012). Algumas vezes diferentes abordagens evolutivas se mostram complementares em evidenciar diferenciações populacionais. Em Abudefduf saxatilis diferenças populacionais morfológicas foram evidenciadas em populações de diferentes regiões costeiras e ilhas oceânicas brasileiras por análises morfométricas e marcadores moleculares (Molina et al., 2006; Rodrigues & Molina, 2007). Em outros casos, apesar da ocorrência de conspícuos padrões diferenciais de coloração, análises genéticas revelaram ausência de distinção genética entre diferentes colomorfos de Cephalopholis fulva, bem como um quadro de panmixia no litoral brasileiro, incluindo as ilhas oceânicas (Souza et al., 2015). Mais recentemente, a identificação taxonômica clássica e morfometria multivariada não conseguiram distinguir uma possível espécie críptica dentre os espécimes de Caranx crysos coletados na costa do Rio de Janeiro (Brasil), embora sua existência tenha se tornado evidente a partir das análises genéticas (Duarte et al., 2017). Além deste caso, análises moleculares também vêm complementando análises morfométricas em outras espécies do gênero Caranx, inclusive na identificação de híbridos no Havaí, Oceano Pacífico (Murakami et al., 2007; Santos et al., 2011). Diante do exposto, percebe-se que a utilização de marcadores moleculares e morfométricos têm se mostrado uma poderosa ferramenta no estudo da ictiofauna marinha. Além disso, os estudos acima descritos refletem o quão resolutivo podem ser esses marcadores na exploração da biodiversidade de diferentes grupos, incluindo os representantes das famílias abrangidas pelo presente estudo, Pomacentridae e Carangidae.

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OBJETIVO GERAL

O presente trabalho tem como objetivo a análise da diversidade inter e intraespecífica de algumas espécies recifais das famílias Pomacentridae e Carangidae provenientes de regiões costeiras e insulares (Arquipélagos de Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, Atol das Rocas e Ilha de Trindade) do Atlântico Ocidental e região meso-Atlântica, por meio de análises moleculares e morfométricas.

Objetivos específicos

• Avaliar o status taxonômico de espécies do gênero de Stegastes que ocorrem na costa e ilhas oceânicas brasileiras através de morfometria tradicional, morfometria geométrica multivariada e sequenciamento parcial dos genes 16S, Citocromo c oxidase subunidade I, Citocromo B (DNAmt), Rodopsina e rag1 (DNAn);

• Analisar as relações filogenéticas e validação taxonômica das espécies insulares, S. rocasensis, S. sanctipauli e S. trindadensis, e costeiras, S. variabilis e S. fuscus;

• Analisar a estrutura populacional da espécie Abudefduf saxatilis no Atlântico ocidental e suas ilhas oceânicas, através do sequenciamento da Região hipervariável 1 da Região Controle (DNAmt);

• Analisar a estrutura populacional da espécie Caranx lugubris de diferentes regiões oceânicas e da costa brasileira através de sequências parciais dos genes Rodopsina (DNAn), 16S, Citocromo B, Citocromo c oxidase subunidade I, e Região Hipervariável 1 da Região Controle (DNAmt), contribuindo para a análise da ocorrência simpátrica e sintópica de diferentes morfótipos de C. lugubris no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo.

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MATERIAL E MÉTODOS

Coleta dos espécimes

Os espécimes foram coletados com a utilização de anzóis e tarrafas em diversas localidades ao longo do Atlântico ocidental, desde Ilha Margarita, na Venezuela, até o sudeste do Brasil, incluindo as regiões insulares do Atol das Rocas, arquipélagos de Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, e Ilha de Trindade. Amostras biológicas (tecido muscular ou de nadadeira) foram retiradas, acondicionadas em microtubos (2,0 ml) contendo álcool etílico (100%) e armazenadas à -20°C para posterior análise em laboratório.

Análises moleculares

O DNA foi extraído de acordo com o protocolo preconizado por Sambrook et al. (1989) ou Miller et al. (1988). Para as análises utilizamos genes e regiões do DNA mitocondrial (Região Hipervariável 1 da Região Controle, 16S ribossomal RNA, Citocromo c oxidase subunidade I e Citocromo B, e nucleares (Nuclear recombination-activating gene 1 e Rodopsina), as quais foram amplificadas por meio de reações em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com as enzimas exonuclease I (3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) (0,66 U/reação) (GE Healthcare), no termociclador, submetendo o mix à ciclos de 30 minutos em 37ºC e 15 minutos em 80ºC conforme indicação do fabricante. As amostras foram sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda através do sequenciador automático ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software BioEdit (Hall, 1999) e alinhadas de forma múltipla e automática através do MUSCLE (Edgar, 2004) por meio do software MEGA 7 (Kumar et al., 2016). A saturação entre as transições e transversões nas sequências foram verificadas pelo software DAMBE (Xia & Xie, 2001). O software jModelTest 2.1.4 (Darriba et al., 2012) foi utilizado para selecionar o melhor modelo evolutivo para as sequências baseado em Akaike information criterion.

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Árvores de haplótipos foram geradas através do software Network 4.5 utilizando o método median joining (Bandelt et al., 1999). As relações filogenéticas e filogeográficas foram avaliadas através do software MEGA 7 (Kumar et al., 2016) pelos métodos de neighbor-joining e maximum likelihood. A significância dos agrupamentos foi estimada utilizando 1.000 réplicas de bootstrap. Os níveis de diversidade genética, testes de neutralidade, através das estatísticas Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989), estruturação populacional através da estimativa de FST (Wright, 1978), análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992), e Teste de Mantel (Mantel, 1967) foram obtidas através do Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).

Análises morfométricas

Indivíduos sem injúrias foram utilizados nas análises morfométricas. Contagens merísticas dos raios ramificados das nadadeiras dorsal, peitoral, anal e das escamas da linha lateral foram obtidas. A morfometria tradicional, a partir da mensuração de distâncias lineares, permitiu a investigação de variações entre os espécimes, comparadas através da Análise dos Componentes Principais (ACP) (Morrison, 1976), utilizando o software SHEAR (MacLeod, 1990). Foram realizadas dezesseis medições utilizando um paquímetro digital: comprimento padrão, comprimento da cabeça, comprimento do focinho ou distância pré-orbital, diâmetro ocular, altura máxima do corpo, comprimento pré-dorsal, tamanho do último espinho da nadadeira-dorsal, comprimento do maior raio dorsal, comprimento da base da nadadeira anal, comprimento do espinho da segunda nadadeira anal, comprimento do raio anal mais longo, comprimento da nadadeira peitoral, comprimento da nadadeira pélvica, comprimento da nadadeira caudal, profundidade do pedúnculo caudal e largura interorbital. Para explorar a variação de forma corporal no morfo-espaço foram utilizadas análises através de morfometria geométrica. Os exemplares foram fotografados em visão lateral esquerda com uma câmera digital Sony H10 de 8.1 megapixels, sob distância e posição padronizadas. Nove landmarks foram digitalizados através do software tpsDig v2.16 (Rohlf, 2010a) e as imagens ordenadas em um único arquivo com o formato TPS através do software tpsUtil (Rohlf, 2010b). Em seguida, foi

21 realizada a superposição Procrustes (Dryden & Mardia, 1998), Análise de Variância Multivariada (MANOVA) e Análise de Variáveis Canônicas (CVA). A partir da variável canônica de maior influência na variação morfológica, foram obtidos grides de deformação para identificar, com maior clareza, as variações vetoriais existentes entre as espécies.

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Capítulo 1

A reappraisal of Stegastes species occurring in the South Atlantic using morphological and molecular data

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ABSTRACT The taxonomic status of Pomacentridae species can be difficult to determine, due to the high diversity, and in some cases, poorly understood characters, such as color patterns. Although Stegastes rocasensis, endemic to the Rocas atoll and Fernando de Noronha archipelago, and S. sanctipauli, endemic to the São Pedro and São Paulo archipelago, differ in color pattern, they exhibit similar morphological characters and largely overlapping counts of fin rays and lateral-line scales. Another nominal insular species, S. trindadensis, has recently been synonymized with S. fuscus but retained as a valid subspecies by some authors. Counts and morphometric analyses and mitochondrial DNA (COI, 16S rRNA, CytB) and nuclear DNA (rag1 and Rhodopsin) comparisons of three insular species (S. rocasensis, S. sanctipauli and S. trindadensis) and three other South Atlantic species (S. fuscus, S. variabilis and S. pictus) were carried out in the present study. Analyses of the principal components obtained by traditional multivariate morphometry indicate that the species in general have similar body morphology. Molecular analyses revealed conspicuous similarity between S. rocasensis and S. sanctipauli and between S. trindadensis and S. fuscus and a clear divergence between S. variabilis from Northeast Brazil and S. variabilis from the Caribbean region. Our data suggest that S. sanctipauli is a synonym of S. rocasensis, support the synonymy of S. trindadensis with S. fuscus, and reveal the presence of a likely cryptic species in the Caribbean that has been confused historically with S. variabilis.

Keywords: Pomacentridae, damselfish, species delimitation, taxonomy, insular species

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INTRODUCTION

Genetic analyses have revealed a large number of cryptic species in different groups of fish (e.g., [1, 2]). The term “cryptic” species, although the definition is not unanimous, generally refers to two or more distinct species that are nominally classified as one due to the difficult-to-distinguish morphologies [3]. Morphological variations with no genetic differences have been explained as phenotypic plasticity, recent isolation, incomplete limits between species, or the product of selection [4]. On the other hand, so-called polytypic species, in which genetically similar individuals of one species display conspicuously different coloration or morphology, occur more frequently [4, 5]. Inconsistencies between color patterns with morphology and genetic markers are relatively common and have been reported for a number of fish families including Pomacentridae [6-8]. This family, whose members are known as damselfishes, is one of the most represented marine groups in reef environments [9]. Indeed, damselfishes are a diverse group, with 399 species [10], whose taxonomic definition is complicated by the occurrence of species complexes and marked variations in coloration patterns among individuals and geographic areas [11-14]. The western Atlantic contains Pomacentridae representatives of the genera Abudefduf (1 sp.), Microspathodon (1 sp.), Chromis (5 spp.), and Stegastes (7 spp.) [13, 15-19]. Some Stegastes species are considered endemic of insular environments of the South Atlantic, such as S. rocasensis Emery 1972, in the Rocas Atoll (RA) and Fernando de Noronha Archipelago (FNA), and S. sanctipauli Lubbock and Edwards 1981, exclusive to St. Paul’s Rocks. The first two oceanic formations are part of an alignment of submarine volcanoes that make up the Fernando de Noronha Chain [20, 21]. More southward, in the Trindade and Martim Vaz Archipelago (TI), located in the easternmost part of the submarine mountain chain called Vitoria-Trindade and Martim Vaz, 1,167 km off the coast of Espírito Santo State, southeastern Brazil, S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, was described and considered endemic to TI [20, 21]. Extensively overlapping morphometric characters in Stegastes (including the synonyms Brachypomacentrus Bleeker and Eupomacentrus Bleeker), a morphologically conservative group [22], in addition to cytogenetic [23] and dominant marker similarities [24], reveal uncertainty regarding the taxonomic status and

32 phylogenetic relationships of S. rocasensis, S. sanctipauli and S. trindadensis, and the last was recognized as a synonym of S. fuscus Cuvier 1830 by Gasparini and Floater [16], Carter and Kaufman [25] and Pinheiro et al. [26]. Based only on morphological criteria, S. rocasensis and S. sanctipauli have been considered similar to each other and to S. variabilis Castelnau 1855 [22, 27]. Although scarce biological information is available [14, 28, 29], there is some genetic data or information on its evolutionary history [23, 30, 31]. In order to clarify the taxonomic status and relationships of these three insular species and test the current hypotheses of ancestrality [22, 27], counts comparisons of serial elements, traditional and geometric multivariate morphometric analyses, and analyses of mitochondrial (16S ribosomal RNA – 16S, Cytochrome oxidase subunit 1 – COI, and Cytochrome B – CytB) and nuclear gene sequences (Nuclear recombination-activating gene 1 - rag1 and Rhodopsin - rhod) were performed.

MATERIAL AND METHODS

Specimen collection

Individuals of Stegastes fuscus (MZUEL 8958, 22 specimens, 43.9-65.0 mm SL; coast of Rio Grande do Norte state (RN) – 5o16’S, 35o22’W); S. rocasensis (MZUEL 8956, 9, 36.6-66.5 mm SL; Rocas atoll (RA) - 3o51’S, 33o49’W); S. rocasensis (MZUEL 8960, 18, 42.7-78.2 mm SL; Fernando de Noronha archipelago (FNA) - 3o50’S, 32o24’W); S. sanctipauli (MZUEL 8959, 18, 58.3-80.1 mm SL; São Pedro and São Paulo archipelago (SPSPA) - 3°50'S, 32°24'W); S. trindadensis (MZUEL 13908, 12; Trindade island (TI) - 20o30’S - 29o19’W) and S. variabilis (MZUEL 8957, 18, 33.3-57.2 mm SL; coast of Rio Grande do Norte state (RN) - 5o16’S - 35o22’W) were analyzed (Fig. 1 and 2). Fragments of muscle tissue or fins were removed and stocked in microtubes (1.5 ml) with absolute ethanol and stored at -20°C. Voucher specimens were fixed in 10% formaldehyde, preserved in 70% ethanol and deposited in the Museu de Zoologia from Universidade Estadual de Londrina (MZUEL - Table 1).

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Fig. 1 Map showing the geographic distributions of Stegastes variabilis and S. fuscus (red), S. rocasensis (blue), S. sanctipauli (green) and S. trindadensis (yellow). FNA - Fernando de Noronha archipelago; RA - Rocas atoll; SPSPA - São Pedro e São Paulo archipelago; TI - Trindade island.

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Fig. 2 Specimens of A. Stegastes variabilis Castelnau 1855, B. S. fuscus Cuvier 1830, C S. sanctipauli Lubbock and Edwards 1981, D. S. rocasensis Emery 1972, E. S. trindadensis Gasparini, Moura and Sazima 1999, F. S. pictus Castelnau 1855. Figures indicated by lower case letters correspond to the juveniles of the respective species. Bars 1 cm

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Table 1. Stegastes specimens analyzed and GenBank accession numbers of mitochondrial and nuclear sequences used in phylogenetic estimates Taxonomic Collection n Deposited GenBank access number** identification sites vouchers* 16S COI CytB rag1 rhod S. pictus RA 3 MZUEL 08955 KM077255-57 KM077183-85 KM077201-03 KM077219-21 KM077237-39 S. variabilis RN 3 MZUEL 08957 KM077258-60 KM077186-88 KM077204-06 KM077222-24 KM077240-42 S. fuscus RN 3 MZUEL 08958 KM077261-63 KM077189-91 KM077207-09 KM077225-27 KM077243-45 S. rocasensis RA 3 MZUEL 08956 KM077264-66 KM077192-94 KM077210-12 KM077228-30 KM077246-48 S. rocasensis FNA 3 MZUEL 08960 KM077267-69 KM077195-97 KM077213-15 KM077231-33 KM077249-51 S. sanctipauli SPSPA 3 MZUEL 08959 KM077270-72 KM077198-200 KM077216-18 KM077234-36 KM077252-54 S. trindadensis TI 3 MZUEL 13908 KX066003-05 KX066006-08 KX066009-11 KX066012-14 KX066015-17 Macrodon - 1 - AY253541 JQ365417 AY253604 KP722921 KP723010 ancylodon*** Haemulon - 1 - JQ740958 JQ741187 JQ741415 KF141251 EF095619 aurolineatum*** * Museu de Zoologia from Universidade Estadual de Londrina (MZUEL); ** Sequences obtained in this study. RA Rocas atoll; RN Rio Grande do Norte state; FNA Fernando de Noronha archipelago; SPSPA São Pedro and São Paulo archipelago; TI Trindade island; *** Sequences from GenBank

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Counts, traditional and geometric multivariate morphometry

Injury-free adults of the species identified as Stegastes fuscus (n=31); S. variabilis (n=18), S. rocasensis (n=5; RA); S. rocasensis (n=18; FNA); S. sanctipauli (n=17); and S. trindadensis (n=26) were used in morphometric analyses. Counts of branched rays in dorsal, pectoral and anal fins and lateral-line scales were obtained for all the specimens. Multivariate morphometry based on measuring linear distances made it possible to investigate variations among species of Stegastes, compared by Principal Component Analysis (PCA) [32], using SHEAR software [33]. Sixteen measurements were taken with a digital caliper: standard length, head length, snout length, orbit diameter, greatest body depth, predorsal length, length of last dorsal-fin spine, length of longest dorsal ray, anal-fin base length, length of second anal-fin spine, length of longest anal ray, pectoral-fin length, pelvic-fin length, caudal-fin length, caudal-peduncle depth, and interorbital width. Geometric morphometrics analyses were used to explore the variation in body shape in morphospace. Left side view photographs of the specimens were taken with an 8.1 megapixel Sony H10 camera, at a standard distance and position. Nine landmarks were digitized: 1. distal extremity of the premaxillary bone; 2. origin of dorsal fin; 3. end of dorsal fin; 4. origin of the anal fin; 5. end of the anal fin; 6. origin of the ventral fin; 7. insertion of pectoral fin; 8. posterior and 9. anterior orbit using tpsDig v2.16 software [34] and the images were ordered into a single TPS format with tpsUtil software [35]. Next, Procrustes superimposition [36], Multivariate Analysis of Variance (MANOVA) and Canonical Variables Analysis (CVA) were carried out. Deformation grids were obtained from the canonical variables that most influenced morphological variation, in order to more clearly identify vector variations between species.

DNA extraction, PCR amplification and DNA sequencing

Molecular analyses involved extracting DNA from three individuals of Stegastes fuscus, S. variabilis, S. pictus, S. sanctipauli, and S. trindadensis and six of S. rocasensis (three from Rocas atoll and three from Fernando de Noronha archipelago).

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Total DNA was extracted from muscle tissue according to proteinase K/phenol-chloroform protocols [37] Fragments of three mitochondrial genes (16S, COI, and CytB) and two nuclear genes (rag1 and rhod) from each individual were amplified using the polymerase chain reaction method (PCR). The PCRs were prepared to a final volume of 25 μl containing: 1.0 μl of total DNA (50 ng/μl), 3.0 U of

Taq polymerase, 1.0 μl of 50 mM MgCl2, 1.0 μl of 10× buffer, 1.0 μl of 10 mM dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), 1.0 μl of each primer (10 μM), and ultrapure water to complete the final volume of the reaction. The thermal profiles for PCR were as follows: 95oC for 5 min, followed by 35 cycles at 95oC for 30 s, annealing temperature for 45 s (Table 2), and 72oC for 45 s, with final elongation at 72oC for 7 min. The PCR products (5 μl) were purified with exonuclease I enzymes (3.3 U/reaction) and shrimp alkaline phosphatase (0.66 U/reaction) (GE Healthcare), in a thermal cycler, submitting the mix to a 30-min cycle at 37oC and 15 min at 80oC. The samples were sequenced in ACTGene Análises Moleculares Ltda. through the ABI- PRISM 3500 Genetic Analyzer automatic DNA sequencer (Applied Biosystems).

Table 2. Primers used to amplify sequences of mitochondrial and nuclear genes of Stegastes species. Gene primers Tm oC References 16S L1987 (5’- GCC TCG CCT GTT TAC CAA AAA C - 3’) 52 [65] H2609 (5’- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T - 3’) COI COI-FishF2 (5’- TCG ACT AAT CAT AAA GAT ATC GGC 50 [66] AC - 3’) COI-FishR2 (5’- ACT TCA GGG TGA CCG AAG AAT CAG AA - 3’; CytB FishcytB-F (5' - ACC ACC GTT GTT ATT CAA CTA CAA 52 [67] GAA C– 3’) CytBI-5R (5' – GGT CTT TGT AGG AGA AGT ATG GGT GGA A– 3’) rhod Rod-F2w (5' – AGC AAC TTC CGC TTC GGT GAG AA – [67] 3’) 60 Rod-R4n (5' – GGA ACT GCT TGT TCA TGC AGA TGT AGA T – 3’) rag1 RAG1-F3 (5’-GCC TCA GAA AAC ATG GTG CT -3’) [68] 50 RAG1-R3 (5’- CCA CAC AGG TTT CAT CTG GA -3’) Tm Melting Temperatures

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Analysis of sequences

The electroferograms obtained were verified using BioEdit software [38]. The sequences of each gene were aligned using MUSCLE [39] in the MEGA 6 software package [40]. The sequences of mitochondrial (16S, COI and CytB) and nuclear genes (rag1 and rhodopsin) from each individual were concatenated, forming a single nucleotide sequence. Sites with gaps were excluded from all genetic analyses. Sequences of the COI gene of 22 additional Stegastes species or populations were obtained from BOLD (www.boldsystem.org) and used for the comparative analyses. The mean genetic divergence rates (Kimura-2-parameter model) and the neighbor-joining tree were obtained with the MEGA 6 software [40]. The relationships among insular species (S. sanctipauli, S. rocasensis and S. trindadensis) were determined by the Maximum Likelihood Method using MEGA 6 software [40]. The best evolutionary method for the sequences was determined by jModelTest2 software [41] using the Akaike information criterion. Macrodon ancylodon (Sciaenidae) and Haemulon aurolineatum (Haemulidae) were used as outgroups. These families are outgroup candidates because they, along with the Pomacentridae, are members of order Perciformes [42, 10]. The number of polymorphic sites along the sequences was estimated using DnaSP 5 software [43], while mean genetic divergence rates (p-distances) and the mean number of intra and interspecific nucleotide differences were estimated by MEGA 6 software [40].

RESULTS

Quantification of Fin Rays and Lateral-line Scales

Frequency distributions of counts of fin rays and lateral-line scales are presented in Table 3. There is great similarity among species, except for S. pictus, which modally exhibits fewer pectoral-fin rays than the other species. Numerical differences were observed between counts taken in populations of S. variabilis from Brazil and those described for Caribbean region [44]. Counts do not discriminate among S. fuscus, S. variabilis, S. rocasensis and S. sanctipauli.

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Principal Component Analysis (PCA)

The first principal component retained 88.6% of data variance, whereas in the second and third axes (sPC2 and sPC3), it was 2.6% and 2.1%, respectively (Table 4). The first PC is positively related to all measurements and was interpreted as being related to size, while the second and third, with positive and negative values, respectively, represent the shape. The individual scores for the species revealed partial overlapping among them in these components (Fig. 3). However, in the second axis, S. variabilis was completely separated from S. rocasensis, S. trindadensis and S. sanctipauli, but with greater similarity to S. fuscus, whereas S. fuscus presented intermediate scores between these species. The individuals identified as S. sanctipauli and S. rocasensis are not separated morphometrically along sPC2 and sPC3. In the third axis S. trindadensis is separated from S. rocasensis (Fig. 3). The samples identified as S. rocasensis from Fernando de Noronha archipelago and S. rocasensis from Rocas atoll are not separated in any of the axes, nor is the sample of S. sanctipauli. The variables that discriminate S. fuscus and S. variabilis from S. rocasensis, S. trindadensis and S. sanctipauli by the second PC are caudal peduncle depth, interorbital width and body depth (positive loadings, Table 4). By contrast, the variables with the highest values in S. rocasensis, S. trindadensis and S. sanctipauli are length of the longest anal ray, length of the second anal spine, snout length, and length of the longest dorsal ray (negative loadings in Table 4). Stegastes trindadensis differs from both populations of S. rocasensis by having a longer pelvic fin, last dorsal spine, anal-fin base, and longest dorsal ray (positive loadings, Table 4), and shorter snout, smaller orbit diameter, and shorter head (negative values, Table 4).

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Table 3. Frequency distribution of counts for 7 species of Stegastes from the Western Atlantic Dorsal rays Species N 12 13 14 15 16 17 Variation Mean S. sanctipauli* 21 - - 1 20 - - 14-15 14.9 S. sanctipauli 11 - - 1 10 - - 14-15 14.9 S. rocasensis* 36 - 1 3 31 1 - 13-16 14.9 S. rocasensis (RA) 9 - - 2 6 1 - 14-16 14.8 S. fuscus 18 - - 2 15 1 - 15-16 14.9 S. variabilis* 57 - - 3 23 29 2 14-17 15.5 S. variabilis 10 - - 4 6 - - 14-15 14.6 S. pictus 13 - - - 7 6 - 15-16 15.5 S. trindadensis* 23 ------14-17 - S. trindadensis 12 - - - - - 12 17 17 Anal rays Species N 11 12 13 14 15 16 Variation Mean S. sanctipauli* 21 - - 21 - - - 13 13.0 S. sanctipauli 11 - - 9 2 - - 13-14 13.2 S. rocasensis* 36 - - 36 - - - 13 13.0 S. rocasensis (RA) 9 - - 7 2 - - 13-14 13.2 S. fuscus 18 - 3 9 6 - - 12-14 13.2 S. variabilis* 57 - 1 20 32 4 - 12-15 13.7 S. variabilis 10 - 3 7 - - - 12-13 12.7 S. pictus 13 - 1 4 7 1 - 12-15 13.6 S. trindadensis* 23 ------13-15 - S. trindadensis 12 - - 1 7 4 - 13-15 14.2 Pectoral rays Species N 17 18 19 20 21 22 Variation Mean S. sanctipauli* 21 - - 2 18 1 - 19-21 19.9 S. sanctipauli 11 - - 1 10 - - 19-20 19.9 S. rocasensis* 36 - - 2 31 3 - 19-21 20.0 S. rocasensis (RA) 9 - - 1 8 - - 19-20 19.9 S. fuscus 18 - - 2 8 8 - 19-21 20.3 S. variabilis* 57 - 1 16 38 2 - 18-21 19.7 S. variabilis 10 - - 1 7 2 - 19-21 20.1 S. pictus 13 1 11 1 - - - 17-19 18.0 S. trindadensis* ------19-21 - S. trindadensis 12 - 1 11 - - - 18-19 18.9 Lateral line-scales Species N 16 17 18 19 20 21 Variation Mean S. sanctipauli* 12 - - - 2 19 - 19-20 19.8 S. sanctipauli 11 - - - - 11 - 20 20.0 S. rocasensis* 36 - - 2 4 29 1 18-21 19.8 S. rocasensis (RA) 9 - - - 2 7 - 19-20 19.8 S. fuscus 18 - - - - 15 3 20-21 20.2 S. variabilis* 57 - - 2 28 27 - 18-20 19.4 S. variabilis 10 - - - 1 9 - 19-20 19.9 S. pictus 13 - - - 1 12 - 19-20 19.9 S. trindadensis* 23 ------19-21 - S. trindadensis 12 - - - 1 10 1 19-21 20.0 Literature data for S. variabilis and S. pictus [44], S. rocasensis [22], S. sanctipauli [27] and S. trindadensis [17] are highlighted with an asterisk; RA Rocas Atoll.

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Table 4. Variable loadings from sheared principal components analysis for morphometric characters of Stegastes species Principal component PC1 sPC2 sPC3 Percentage of variance 88.63 2.640 2.118 Variables Standard length 0.258112 -0.001448 -0.210450 Head length 0.241320 0.047276 -0.232662 Snout length 0.303126 -0.296250 -0.552961 Orbit diameter 0.200732 -0.020172 -0.235335 Greatest body depth 0.255074 0.319120 -0.100978 Predorsal length 0.246296 0.030081 -0.044675 Length of last dorsal spine 0.240925 0.016873 0.384464 Length of longest dorsal ray 0.276920 -0.264052 0.202150 Anal fin base length 0.237181 0.094722 0.219734 Length of second anal spine 0.245731 -0.383452 0.149272 Length of longest anal ray 0.261460 -0.477297 0.144833 Pectoral fin length 0.241844 0.114243 0.014072 Pelvic fin length 0.201796 0.123833 0.466247 Caudal fin length 0.271083 -0.167673 -0.092469 Caudal peduncle depth 0.241178 0.406146 0.017068 Interorbital width 0.258160 0.360734 -0.140756

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Fig. 3 Dispersion diagram of individual scores in the Principal Components Analysis of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. variabilis (violet squares with an asterisk), and S. trindadensis (green circles), in the space defined by sPC2 and sPC3.

Geometric morphometric analysis

Canonical variables 1 and 2 contributed more to the shape variation among samples of Stegastes (Procrustes MANOVA: SS = 0.086; df = 70; F = 11.93; p = <0.001; Pillai’s trace = 2.37; Pillai’s trace p = <0.001), accounting for 83.7% (CV1 = 57.3; CV2 = 26.4; p <0.001). The individual scores of the species demonstrate a marked overlap in the morphospace of S. fuscus and S. variabilis along the two axes. Stegastes sanctipauli individuals overlapped with those of S. rocasensis (RA; FNA) (Fig. 4). Stegastes rocasensis individuals of RA and FNA were more discriminated between each other than with the sample of SPSPA. The deformation grids obtained from CV2 show morphological distinctions between S. fuscus and S. variabilis relative to landmarks 1-3 and 6-9, which are related to the position of the fins (anal, 43 dorsal, pelvic and pectoral), mouth and eyes (Fig. 4a). The warped outlines generated from CV1 data demonstrate the morphological diversification of S. rocasensis and S. sanctipauli in relation to the position of landmarks 2-7 (Fig. 4b), which correspond primarily to variations in anterior and posterior body height. Body variations between S. fuscus and S. trindadensis show differences in pectoral- and anal-fin position, as well as body length and height (Fig. 4c).

Fig. 4 Analysis of the canonical variables of body shape data of Stegastes fuscus (blue diamonds), S. rocasensis (Fernando de Noronha archipelago, pink squares), S. rocasensis (Rocas atoll, yellow triangles), S. sanctipauli (X), S. trindadensis (green circles) and S. variabilis (violet squares with an asterisk), between the CV1 and CV2 axes (CV1=57.3% and CV2=26.4%). The deformation grids illustrate the variation in body shape of a Stegastes fuscus and S. variabilis, b S. rocasensis and S. sanctipauli, and c S. fuscus and S. trindadensis on CV1.

Genetic variation

For genetic diversity analyses 90 nucleotide sequences were generated, 18 for each of the five molecular markers analyzed. The access numbers of sequences in GenBank are listed in Table 1. After the alignments the sequences resulted in 540

44 base pairs (bp) of gene 16S, 668 bp of CytB, 633 bp of COI, 290 bp of rag1 and 449 bp of rhodopsin. The concatenation of five fragments resulted in consensus sequences of 2,580 bp, which were used in genetic comparisons. Stegastes sanctipauli (SPSPA) and S. rocasensis (FNA/RA) specimens shared identical haplotypes for all the genes, except for one specimen of S. rocasensis from the FNA, which exhibited a mutation (ts G  A) in the CytB gene. Stegastes variabilis showed more genetic differences in relation to S. rocasensis, S. sanctipauli and S. trindadensis than to the coastal species S. fuscus. The mean number of intraspecific nucleotide differences ranged from 0 to 2 (Table 5). The nucleotide diversity of concatenated sequences was extremely low in S. rocasensis from FNA and RA, and absent in S. sanctipauli and S. rocasensis from RA (0 ± 0.0). The highest mean nucleotide differences in the species under study was found between S. pictus and S. variabilis (228 ± 13).

Comparative genetic analyses

A neighbor-joining analysis of the COI sequences with 27 species/populations shows that the genetic distance among species ranges from 0.000  0.000 to 0.207  0.021 (Supplementary Material - Table 1). Genetic distance values of 0.000  0.000 were observed between Stegastes rocasensis from literature and present study, between S. rocasensis and S. sanctipauli, and between S. pictus from literature and present study. A genetic distance of 0.001  0.001 was observed between S. trindadensis and a sample of S. fuscus analyzed in the present study. Between S. variabilis and a sample of S. fuscus analyzed in the present study a genetic distance of 0.040  0.008 was observed. The relationship among samples is showed in the Fig. 5. Maximum likelihood using the concatenated sequences of 16S, COI, CytB, rag1 and rhod genes produced resolved clusters with high bootstrap values that clarify the relationships among Atlantic species of Stegastes (Fig. 6). In both analyses (COI and concatenated sequences) the data clearly demonstrate a clade formed by S. rocasensis (RA and FNA) and S. sanctipauli, whose individuals are genetically the same, as well as almost complete genetic similarity between S. fuscus and S. trindadensis. Stegastes variabilis and S. pictus show a low genetic similarity with insular forms.

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Table 5. Mean pairwise distances (p-distance) (lower diagonal) and mean number of intraspecific (in parentheses) and interspecific (upper diagonal) nucleotide differences with their respective standard errors based on partial sequences of 16S, COI, CytB, rag1 and rhodopsin genes (2,580 bp). Species 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. (0.6 ± 0.6) (2 ± 1.1) (1.3 ± 0.9) (0 ± 0.0) (0.6 ± 0.6) (0.0 ± 0.0) (0.0 ± 0.0) 1. S. pictus - 213±13 206±12 204±12 204±12 204±12 206±12 2. S. variabilis 0.087±0.005 - 202±13 214±13 214±13 214±13 201±13 3. S. fuscus 0.084±0.004 0.083±0.005 - 88±8.0 89±8.0 88±8.0 3.6±1.8 4. S. rocasensis RA 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 - 0.3±0.3 0.0±0.0 87±8.0 5. S. rocasensis FNA 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 0.000±0.000 - 0.3±0.3 87±8.0 6. S. sanctipauli 0.084±0.005 0.088±0.005 0.036±0.004 0.000±0.000 0.000±0.000 - 87±8.0 7. S. trindadensis 0.084±0.004 0.088±0.005 0.001±0.004 0.035±0.003 0.035±0.003 0.035±0.003 - Analysis based on 1000 bootstrap replications; Gaps were considered a pairwise deletion; RA Rocas atoll, FNA Fernando de Noronha archipelago.

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Fig. 5 Neighbor-joining tree derived from COI sequences of Stegastes. Analysis based on the Kimura-2-parameter evolutionary model with 1000 bootstrap replicates (only values higher than 70 shown); SPSPA São Pedro and São Paulo archipelago, RA Rocas atoll, FNA Fernando de Noronha archipelago, TI Trindade island.; Numbers below branches indicate bootstrap percentages; Numbers before species names refer to BOLD sequences; The COI sequences obtained in this study are highlighted. 47

Fig. 6 Maximum likelihood tree based on the combination of 16S, COI, CytB, rag1 and rhod (2,580 pb) sequences of Stegastes. Analysis based on the GTR+G evolutionary model with 1000 bootstrap replicates. Highlighted are the close relationships between the insular species S. rocasensis and S. sanctipauli and between S. fuscus and S. trindadensis. SPSPA São Pedro and São Paulo archipelago; RA Rocas atoll; FNA Fernando de Noronha archipelago; TI Trindade island. Numbers below branches indicate maximum likelihood bootstrap percentages.

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DISCUSSION

Morphological approaches, associated with mitochondrial- and nuclear-gene analyses between continental and insular species of Stegastes in the western Atlantic displayed putative incongruities with respect to the taxonomic status attributed to the insular species S. rocasensis, S. sanctipauli, and S. trindadensis. Classification of Stegastes species is particularly dependent on color patterns, given that they exhibit conservative morphology [12]. Indeed, discrimination of some species through the exclusive use of phenotypic criteria has been problematic [45], since it reveals limited or ambiguous morphological characters or those with significant plasticity. Furthermore, phenotypic variations are not always effective phylogenetic characters, given that they may reflect adaptations to different ecological regimes to which the species are subjected in their distribution area [46]. Aspects of coloration have masked the marked morphological similarities between Stegastes rocasensis and S. sanctipauli as observed in the present study. The juveniles and adults of the former are notably bicolored (blue dorsally and yellow ventrally), exhibiting dark lines on the side of the body in large individuals. Stegastes sanctipauli exhibits bright yellow to dark green or yellowish-brown coloration in adults, whereas juveniles have yellow heads and bodies, darkening slightly on the dorsal portion. Dark lines are observed on the flanks below the lateral line. The presence of a body with yellow color patterns is also shared with S. variabilis. On the other hand, juvenile Stegastes fuscus exhibits bright-blue coloration on the dorsum, becoming lighter ventrally, and adults are largely brown. Stegastes trindadensis displays similar coloration to that of the continental species S. fuscus, from which it is distinguished in the juvenile phase by the yellow coloration of the beginning of the dorsal fin [14]. In the Fernando de Noronha archipelago, Rocas atoll and São Pedro and São Paulo archipelago, the abundance of S. rocasensis and S. sanctipauli individuals is directly related to the structural composition of the environment and diversity of the substrate cover [47]. In this respect, these insular regions can mobilize phenotypic responses adaptive to different selective pressures, both in terms of body shape and coloration of individuals from each region. Abnormal body coloration has been described in individual species of Stegastes [48], including four of those analyzed here: S. fuscus, S. variabilis, S. rocasensis and S. pictus [14, 15 ,50]. These

49 variations can be due to non-genetic factors [14], or even, in this or other genera, intrapopulational characteristics, without being necessarily supported, however, by very high levels of genetic differentiation [51]. Menezes and Figueiredo [52] underscored the greater similarity in coloration and morphological characters between S. fuscus, S. rocasensis and S. sanctipauli, compared to other species of Stegastes on the Brazilian coast. Indeed, the modal values of counts in the three species are largely concordant, with marked overlapping of minimum and maximum values. However, this did not occur with S. pictus, which show a lower value for pectoral rays (18). Analyses of the principal components obtained by traditional multivariate morphometry indicated that the species in general have similar body morphology. In relation to insular forms, S. rocasensis from RA and FNA exhibit overlapping morphological aspects. These two populations of S. rocasensis demonstrated markedly similar morphology to that of S. sanctipauli, and accurate ordering on the sPC2 and sPC3 axes. In fact, both species display morphological patterns more similar to each other than to the other species of Stegastes analyzed. On the other hand, the continental species S. variabilis exhibits only partial discrimination of insular individuals, which could suggest the effect of different environmental pressures. Although morphological diversification occurs between Stegastes species, they share conservative body patterns. Similarly to multivariate analyses, geometric morphometry analyses also show significant morphological similarity between S. rocasensis (FNA) and S. sanctipauli. Curiously, subtle body differences were more common between S. rocasensis individuals from RA and FNA, than with S. sanctipauli. This may be caused by distinct environmental factors, causing a disruptive selection of morphotypes adapted to local conditions. Indeed, as a response to environmental characteristics, many fish species demonstrate considerable phenotypic plasticity that increases their aptitude to a determinate environment [53]. When compared to other insular ecosystems, the low habitat diversity of Rocas atoll [54] may have driven the morphological changes observed in the population of S. rocasensis from RA due to the different ecological resources in the systems [46, 55,56]. Variations in body shape between the species of Stegastes analyzed were significant in terms of the positions of the dorsal and anal fins, and body height.

50

These ecomorphological divergences suggest adaptations related to the swimming process, with direct implications on habitat use [57], biotic interactions [58] and foraging [59]. On the other hand, morphological changes in position and mouth size could reflect different degrees of food specialization, especially in relation to the type and potential size of the prey [60]. The phenotypic plasticity identified in populations of S. rocasensis from RA, FNA and SPSPA indicate an intense environmental effect on the local adaptive patterns of each population. Indeed, in the damselfish Abudefduf saxatilis, counts and multivariate morphometry analyses between different populations, revealed clinal variation between northeastern/RA-SPSPA regions and the southern coast of Brazil, in addition to marked morphological differences between the populations of Rocas atoll, Fernando de Noronha archipelago and São Pedro and São Paulo archipelago [61]. This condition has been identified in other Atlantic species, such as the frillfin goby (Bathygobius soporator), which exhibits significant morphological variations between contiguous populations along the Brazilian coast, the action of ecological factors being the likely mobilizers of morphological diversification [46]. In groups with marked phenotypic plasticity, such as Pomacentridae, genetic analyses are particularly revealing regarding population structuring [51], or defining the biological status of groups whose morphological characteristics have not been resolved. Analyses of 16S, COI, CytB, rag1 and rhod gene sequences, widely used in phylogenetic evaluation, enabled the assessment of taxonomic status and the level of genetic divergence between the insular forms S. rocasensis, S. sanctipauli and S. trindadensis in relation to other congeneric species. In this respect, despite the various sequences used, S. rocasensis and S. sanctipauli showed no genetic divergence between them, suggesting that they represent a single species. Similarly, a very low genetic divergence was identified between S. fuscus and S. trindadensis (0.1%). Our genetic data support the synonymy of S. trindadensis with S. fuscus and do not support subspecific division within that species. Analyses with the COI sequences of Stegastes species confirm that samples of S. rocasensis (our data and also data from the literature) and S. sanctipauli are genetically identical. The genetic distance between our samples of S. trindadensis and S. fuscus also show that they are almost identical. A single record in the BOLD database identified as S. fuscus does not match our sequences of S. fuscus but matches sequences of S. diencaeus and appears to be a misidentification. A

51 comparison between our data for S. pictus and the BOLD data shows no difference between them. On the other hand, a comparison of our COI data of samples of S. variabilis from northeast Brazil with sequences of S. variabilis from the Caribbean area showed a genetic distance between them of d= 0.040  0.008. Barcoding studies with fishes showed that the genetic distance (based on the Kimura-2- parameter model) between species usually is around 2% [62]; thus, the present data on S. variabilis suggest the possible occurrence of a cryptic species. Although counts of more Brazilian specimens of S. variabilis are needed, Table 3 indicates that there may be modal differences in some counts between Brazilian and Caribbean populations. Stegastes sanctipauli was described as endemic to SPSPA, an insular region approximately 600 km from FNA and 700 km from RA, an occurrence site of S. rocasensis. The occurrence of S. rocasensis in the remote SPSPA [63] can indicate color polymorphisms or evidence of sporadic recruitment between these two areas. Nevertheless, it demonstrates a more geographically or morphologically diffuse situation than was previously believed. Thus, the evidence that S. rocasensis and S. sanctipauli are the same species suggests the occurrence of color polymorphism maintained by different selective pressures between these insular regions. Recent evidence of phylogeographic patterns in the Brown Chromis (Chromis multilineata) demonstrates gene flow, involving FNA and SPSPA [51]. Despite the suggestion of greater isolation in the SPSPA population, also identified for S. sanctipauli [24], the population of this species exhibits moderate genetic structuring between the insular regions and other coastal populations. Our morphological and genetic data show that the physical distance between the sites of S. rocasensis and S. sanctipauli apparently do not preclude gene flow between these occurrence areas.

CONCLUSION

It cannot be ruled out that S. rocasensis, S. sanctipauli and S. fuscus from Trindade Island (S. trindadensis) may represent species in statu nascendi [64], where reproductive isolation remains incomplete, but the absence of genetic differentiation and distinct morphological characters between S. rocasensis and S. sanctipauli and between S. trindadensis and S. fuscus is strong evidence for the recognition of two

52 vs. four species. On the other hand, the differentiation observed between Brazilian and Caribbean S. variabilis is strong evidence of a putative new species.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank the National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq - Proc. 141234/2009-1; 309879/2013-2; 442664/2015-0) for financial support, and for the research scholarship awarded to ASS and RXS, and Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade for the specimen collection license (#19135-5).

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Supplementary material Table 1. Genetic divergence (Kimura-2-parameter) among Stegastes species (lower diagonal) with their respective standard errors (upper diagonal) based on partial sequences of COI (658 bps).

Species 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

1 Stegastes_adustus 0,017 0,016 0,013 0,009 0,017 0,014 0,009 0,014 0,017 0,017 0,018 0,016 0,016 0,017 0,018 0,017 0,016 0,014 0,018 0,013 0,013 0,014 0,014 0,016 0,012 0,012

2 Stegastes_albifasciatus 0,158 0,017 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,018 0,016 0,008 0,015 0,012 0,018 0,018 0,016 0,018 0,018 0,016 0,015 0,017 0,016 0,017 0,017 0,019 0,019 0,020

3 Stegastes_arcifrons 0,132 0,152 0,014 0,016 0,018 0,014 0,016 0,012 0,017 0,017 0,018 0,019 0,015 0,017 0,017 0,016 0,015 0,014 0,018 0,012 0,012 0,012 0,012 0,013 0,016 0,015

4 Stegastes_beebei 0,105 0,170 0,111 0,013 0,016 0,012 0,013 0,014 0,017 0,019 0,018 0,018 0,015 0,017 0,019 0,017 0,016 0,014 0,017 0,012 0,013 0,014 0,014 0,015 0,015 0,014

5 Stegastes_diencaeus 0,057 0,175 0,134 0,103 0,018 0,013 0,000 0,015 0,016 0,018 0,018 0,017 0,015 0,017 0,019 0,017 0,016 0,015 0,018 0,014 0,014 0,015 0,015 0,016 0,010 0,011

6 Stegastes_faciolatus 0,157 0,148 0,162 0,148 0,172 0,019 0,018 0,018 0,018 0,016 0,020 0,017 0,018 0,019 0,016 0,021 0,020 0,016 0,019 0,018 0,017 0,018 0,018 0,020 0,019 0,019

7 Stegastes_flavilatus 0,106 0,177 0,118 0,091 0,094 0,188 0,013 0,015 0,017 0,018 0,018 0,018 0,016 0,016 0,020 0,016 0,015 0,015 0,018 0,014 0,015 0,016 0,016 0,017 0,013 0,014

8 Stegastes_fuscus 0,057 0,175 0,134 0,102 0,000 0,172 0,093 0,015 0,016 0,018 0,018 0,016 0,015 0,017 0,018 0,017 0,016 0,015 0,018 0,014 0,014 0,015 0,015 0,016 0,010 0,011

9 Stegastes_fuscus_PP 0,116 0,157 0,080 0,103 0,114 0,160 0,127 0,114 0,017 0,017 0,018 0,017 0,014 0,019 0,017 0,016 0,016 0,011 0,016 0,009 0,009 0,009 0,009 0,001 0,014 0,014

10 Stegastes_leucostictus 0,153 0,159 0,157 0,151 0,151 0,167 0,149 0,151 0,149 0,017 0,016 0,017 0,016 0,016 0,017 0,017 0,017 0,016 0,017 0,015 0,017 0,018 0,018 0,017 0,017 0,016

11 Stegastes_limbatus 0,162 0,045 0,155 0,176 0,181 0,149 0,186 0,180 0,156 0,171 0,015 0,012 0,018 0,020 0,017 0,019 0,018 0,017 0,015 0,017 0,016 0,016 0,016 0,018 0,019 0,019

12 Stegastes_lividus 0,175 0,128 0,175 0,159 0,173 0,185 0,172 0,172 0,160 0,164 0,128 0,015 0,017 0,017 0,019 0,019 0,018 0,016 0,004 0,017 0,017 0,018 0,018 0,018 0,019 0,020

13 Stegastes_nigricans 0,153 0,084 0,172 0,177 0,166 0,160 0,184 0,163 0,158 0,173 0,079 0,126 0,018 0,018 0,017 0,019 0,018 0,016 0,014 0,017 0,016 0,017 0,017 0,018 0,018 0,019

14 Stegastes_otophorus 0,137 0,178 0,122 0,123 0,128 0,173 0,136 0,128 0,113 0,133 0,176 0,168 0,171 0,018 0,018 0,018 0,017 0,014 0,017 0,014 0,014 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015

15 Stegastes_partitus 0,157 0,182 0,152 0,167 0,164 0,187 0,149 0,163 0,173 0,158 0,197 0,166 0,183 0,172 0,018 0,012 0,011 0,016 0,017 0,016 0,017 0,018 0,018 0,020 0,019 0,019

16 Stegastes_pelicieri 0,169 0,146 0,151 0,168 0,178 0,134 0,194 0,177 0,142 0,171 0,150 0,169 0,155 0,173 0,173 0,020 0,018 0,018 0,018 0,018 0,017 0,018 0,018 0,018 0,021 0,021

17 Stegastes_pictus_PP 0,148 0,180 0,136 0,150 0,155 0,207 0,138 0,155 0,144 0,161 0,184 0,174 0,185 0,160 0,078 0,185 0,000 0,017 0,019 0,015 0,016 0,016 0,016 0,016 0,017 0,017

18 Stegastes_pictus 0,141 0,176 0,133 0,141 0,148 0,197 0,130 0,148 0,144 0,155 0,177 0,170 0,176 0,154 0,074 0,176 0,000 0,016 0,018 0,014 0,015 0,016 0,016 0,016 0,016 0,017

19 Stegastes_planifrons 0,118 0,151 0,100 0,111 0,126 0,146 0,131 0,126 0,064 0,146 0,167 0,154 0,159 0,123 0,154 0,155 0,151 0,144 0,016 0,011 0,010 0,010 0,010 0,012 0,015 0,016

20 Stegastes_punctatus 0,177 0,117 0,163 0,156 0,170 0,172 0,166 0,170 0,144 0,169 0,122 0,011 0,121 0,161 0,168 0,166 0,180 0,175 0,151 0,016 0,016 0,017 0,017 0,018 0,019 0,019

21 Stegastes_rectifraenum 0,106 0,151 0,079 0,092 0,107 0,154 0,113 0,107 0,051 0,136 0,152 0,160 0,169 0,115 0,142 0,151 0,131 0,127 0,070 0,151 0,008 0,008 0,008 0,010 0,015 0,015

22 Stegastes_rocasensis 0,116 0,147 0,075 0,105 0,120 0,144 0,128 0,120 0,051 0,153 0,146 0,162 0,154 0,118 0,152 0,141 0,139 0,132 0,060 0,151 0,043 0,000 0,000 0,010 0,016 0,017

23 Stegastes_rocasensis_PP 0,120 0,148 0,076 0,109 0,123 0,149 0,134 0,123 0,051 0,156 0,150 0,164 0,160 0,120 0,160 0,146 0,139 0,139 0,064 0,152 0,044 0,000 0,000 0,010 0,017 0,017

24 Stegastes_sanctipauli_PP 0,120 0,148 0,076 0,109 0,123 0,149 0,134 0,123 0,051 0,156 0,150 0,164 0,160 0,120 0,160 0,146 0,139 0,139 0,064 0,152 0,044 0,000 0,000 0,010 0,017 0,017

25 Stegastes_trindadensis 0,123 0,167 0,085 0,109 0,118 0,165 0,127 0,118 0,001 0,141 0,160 0,157 0,161 0,111 0,174 0,139 0,140 0,140 0,069 0,149 0,052 0,049 0,049 0,049 0,015 0,015

26 Stegastes_variabilis 0,085 0,188 0,130 0,120 0,063 0,174 0,105 0,063 0,112 0,167 0,191 0,187 0,180 0,135 0,169 0,201 0,148 0,143 0,132 0,181 0,124 0,132 0,136 0,136 0,113 0,008

27 Stegastes_variailis_PP 0,088 0,200 0,132 0,119 0,071 0,173 0,107 0,071 0,118 0,149 0,192 0,191 0,187 0,137 0,165 0,191 0,155 0,155 0,145 0,183 0,130 0,140 0,140 0,140 0,123 0,040 PP present paper.

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Capítulo 2

Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas

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Estrutura genética multipopulacional de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas

RESUMO Abudefduf saxatilis constitui uma espécie anfi-Atlântica, distribuindo-se desde o Caribe a toda a costa brasileira e ilhas oceânicas do Arquipélago de São Pedro e São Paulo, Arquipélago de Fernando de Noronha, Atol das Rocas e Ilha de Trindade. Estudos prévios em A. saxatilis sugerem a existência de diferenciação genética e morfológica entre populações costeiras e ilhas meso-Atlânticas. Aqui foram analisadas, através de sequências da Região Hipervariável 1 do DNAmt, a estrutura populacional de A. saxatilis em 12 diferentes regiões geográficas do Atlântico Ocidental, abrangendo da Venezuela ao sudeste do Brasil e ilhas oceânicas Fernando de Noronha, São Pedro e São Paulo, Trindade e Atol das Rocas. Nossos resultados sugerem a existência de estruturação genética em quatro grupos genéticos. O primeiro é constituído por todas as populações costeiras, outro pelos indivíduos de Fernando de Noronha e Atol das Rocas, um grupo conspícuo formado pelos indivíduos de São Pedro e São Paulo, e o último, altamente estruturado, formado pela população da Ilha de Trindade. Apesar do alto potencial dispersivo desta espécie, um elevado padrão de autorecrutamento parece estar envolvido na manutenção de perfis genéticos particulares nas ilhas oceânicas brasileiras.

Palavras-chave: Pomacentridae, marcadores moleculares, fluxo gênico, Sergeant-major

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INTRODUÇÃO

Os representantes da família Pomacentridae estão entre os grupos mais comuns nos ambientes recifais (Allen & Adrim, 1992; Nelson, 2016). No Atlântico Ocidental algumas espécies apresentam uma ampla distribuição geográfica, como Chromis multilineata, Microspathodon chrysurus e Abudefduf saxatilis (Menezes & Figueiredo, 1985; Robins et al., 1986; Carpenter & Niem, 2001;). Esta última espécie é o único representante do gênero Abudefduf no Atlântico Sul, e exibe uma das mais amplas distribuições dentre todos os pomacentrídeos. Abudefduf saxatilis pode ser encontrada em ambos os lados do Atlântico, ocupando desde a latitude 43ºN até 35ºS (Carpenter & Niem, 2001). No Atlântico Ocidental distribui-se do litoral do Canadá até o Uruguai Scott & Scott, 1988; (Carpenter & Niem, 2001). No litoral brasileiro ocupa toda a costa, incluindo as ilhas oceânicas do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR) e Ilha de Trindade (IT) (Gasparini & Floeter, 2001; Vaske et al., 2005; Macieira et al., 2015). Estudos sobre a estrutura populacional de A. saxatilis ao longo da costa da América do Sul são escassos. Análises filogeográficas das populações de A. saxatilis da costa oeste do Atlântico, através de sequências Citocromo B (CytB) e Citocromo c oxidase subunidade I (COI) indicam pelo menos duas linhagens filogenéticas, indicando divergências entre as populações costeiras (Belize, Panamá, Venezuela e Brasil) da localizada na Ilha de Ascensão (Bermingham et al., 1997). No Atlântico Sul o uso de marcadores do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic Dna) em duas populações do litoral nordeste do Brasil e ASPSP identificou uma maior similaridade genética entre as populações costeiras (Rio Grande do Norte e Bahia) em relação à população insular do ASPSP (Rodrigues & Molina, 2007). A variação morfológica das populações da espécie, incluindo áreas do nordeste e sudeste do Brasil (estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia, Rio de Janeiro e Santa Catarina), e ilhas oceânicas brasileiras (Atol das Rocas e Arquipélago de São Pedro e São Paulo) por meio de morfometria multivariada indicaram uma marcante plasticidade fenotípica interpopulacional e uma clina envolvendo diferentes elementos seriais no sentido norte sul do Atlântico (Molina et al., 2006). Recentemente, análises morfométricas e genéticas em populações de A. saxatilis ao longo de 1.800 km da costa mexicana, utilizando microssatélites e sequências mitocondriais (Citocromo B e Região Controle), evidenciou variações

63 morfológicas interregionais, apesar da ocorrência de um padrão de panmixia de populações de A. saxatilis (Piñeros et al., 2015). A fim de analisar a variação genética da espécie no Atlântico Ocidental, foram analisados indivíduos de Abudefduf saxatilis de 12 regiões geográficas, que abrangiam desde o litoral da Venezuela (11ºN), ao norte, ao litoral do Estado de São Paulo, Brasil (23ºS), ao sul, incluindo quatro ilhas oceânicas brasileiras, totalizando cerca de seis mil e quinhentos quilômetros de linha de costa.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta dos espécimes

Foram obtidas amostras biológicas (tecido muscular ou de nadadeiras) de 265 exemplares de Abudefduf saxatilis (Figura 1), os quais foram capturados com o auxílio de tarrafa (rede de pesca). A área de amostragem abrangeu desde a Ilha Margarita (IM), na Venezuela, até o sudeste do Brasil. Na costa brasileira os espécimes foram coletados no litoral dos Estados do Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ) e São Paulo (SP), adicionalmente exemplares foram coletados no Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP) e Ilha de Trindade (IT) (Tabela 1, Figura 1). As coletas foram realizadas no período de 2010 a 2015 e os pontos de coleta mais extremos cobriram mais de 6.500 km de distância. Os espécimes foram taxonomicamente identificados de acordo com Carpenter & Niem (2001). As amostras de tecidos foram acondicionados em microtubos de 2,0 ml contendo álcool etílico (100%) e estocadas em temperatura de -20°C.

Análises moleculares

O DNA total foi extraído de acordo com Sambrook et al. (1989). Para as análises populacionais, a Região Hipervariável 1 (RHV1) da Região Controle do DNA mitocondrial foi amplificado utilizando os primers “A” e “E” descritos por Lee et al. (1995). Os primers L1987 e H2609 (Palumbi et al., 1991), e FishF2 e FishR2 (Ward et al., 2005) foram utilizados para amplificar os genes RNAr 16S (16S) e Citocromo c

64 oxidase subunidade 1 (COI), respectivamente. Sequências 16S e COI, previamente depositadas no GenBank foram utilizadas nas comparação com as amostras de A. saxatilis utilizados no presente trabalho. Para as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram utilizadas as condições de Souza et al. (2015). Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com as enzimas exonuclease I (3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (0,66 U/reação) (GE Healthcare), no termociclador, submetendo as misturas a ciclos de 30 min em 37ºC e 15 min em 80ºC. As amostras foram sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda através do sequenciador automático de DNA ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software BioEdit (Hall, 1999) e alinhadas de forma múltipla e automática através do MUSCLE (Edgar, 2004) por meio do software MEGA7 (Kumar et al., 2016). Sítios onde gaps foram inseridos automaticamente foram considerados nas análises. A saturação entre as transições e transversões nas sequências foram verificadas pelo software DAMBE (Xia & Xie, 2001). O software jModelTest 2.1.4 (Darriba et al., 2012) foi utilizado para selecionar o melhor modelo evolutivo paras as sequências baseado em Akaike information criterion. As redes de haplótipos foram geradas através do software Network 4.5 utilizando o método median joining (Bandelt et al., 1999). As relações genéticas entre as amostras foram avaliadas através do método de maximum likelihood utilizando o software MEGA7 (Kumar et al., 2016). A significâncias dos agrupamentos em todas as árvores geradas foram estimadas utilizando analises de bootstrap baseadas em 1.000 réplicas. Os níveis de diversidade genética, testes de neutralidade, através das estatísticas de Fs (Fu, 1997) e D (Tajima, 1989), estruturação populacional através da estimativa de FST (Wright, 1978), análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992), e o teste de Mantel (Mantel, 1967), foram estimados através do software Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010).

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Tabela 1. Pontos de coleta e número amostral de Abudefduf saxatilis ao longo da costa oeste da América do Sul. Coordenadas Localidades geográficas Abreviatura N geográficas Ilha Margarita (Venezuela) IM 10º57’N, 64º00’O 29 Ceará (Brasil) CE 03º42’S, 38º30’O 22 Rio Grande do Norte (Brasil) RN 05º16’S, 35º22’O 20 Arquipélago de Fernando de Noronha (Brasil) AFN 03º50’S, 32º24’O 21 Atol das Rocas (Brasil) AR 03º51’S, 33º49’O 21 Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Brasil) ASPSP 00º55’N, 29º20’O 26 Pernambuco (Brasil) PE 08º00’S, 34º50’O 23 Bahia (Brasil) BA 13º00’S, 38º29’O 23 Espírito Santo (Brasil) ES 20º20’S, 40º14’O 13 Rio de Janeiro (Brasil) RJ 22º45’S, 41º52’O 18 São Paulo (Brasil) SP 23º27’S, 45º03’O 24 Ilha de Trindade (Brasil) IT 20º30’S, 29º19’O 25 Total 265 N – Número amostral.

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Figura 1. Locais de coleta de Abudefduf saxatilis no oeste do Atlântico Sul e ilhas oceânicas. Venezuela: Ilha Margarita (IM); Brasil: Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT). Tracejado – Delimitação da área sob estudo; Em detalhe um exemplar da espécie Abudefduf saxatilis.

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RESULTADOS

Sequências 16S e COI

O alinhamento automático resultou em sequências consenso de 478 pares de bases (pb) para o gene 16S e 657 pb para o gene COI. Para as análises de maximum likelihood foram utilizados os modelos de substituição nucleotídica GTR+I e GTR+G para as sequências 16S e COI, respectivamente.

Sequências da Região Hipervariável 1 (RHV1)

Foram coletados 265 espécimes de Abudefduf saxatilis oriundos de doze localidades distribuídas no Atlântico Ocidental. A análise das sequências RHV1 revelou apenas 165 haplótipos distintos (Números de acesso dos haplótipos no Genbank: KX812544 - KX812708). Os fragmentos sequenciados possuem 415 pb, nos quais foram encontrados 180 substituições, sendo 34 transversões e 146 transições. O gráfico das transições/transversões versus distância genética não indicou a presença de saturação nas sequências (dado não mostrado). O modelo GTR+G foi selecionado como melhor modelo de substituição nucleotídica para as sequências RHV1. O conteúdo de bases A/T foi claramente maior (63,06%) que G/C (G=22,32%, C=14,61%, T=35.60% e A=27,46%). As diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) variaram entre 0,886 e 1, e entre 0,018 e 0,094, respectivamente. A distribuição de cada haplótipo nas populações pode ser verificado na tabela suplementar 1 (Tabela S1). Os indivíduos coletados em IT foram os que exibiram os menores índices (Tabela 2). A rede de haplótipos mostrou que quase todos os haplótipos de maior frequência são compartilhados entre várias localidades geográficas. No entanto, dos 9 haplótipos exclusivos encontrados na Ilha de Trindade, 8 uniram-se a um indivíduo exclusivo do RJ e formaram um agrupamento distinto que sugere significativo isolamento populacional (Figura 2). Os índices de neutralidade Tajima’s D e Fu’s Fs foram negativos para todas as populações, sendo significativos para a maioria (Tabela 2). A árvore de maximum likelihood (ML) baseada em sequências RHV1 se mostrou politômica envolvendo a maioria dos indivíduos analisados. Os agrupamentos com valores de bootstrap maiores que 80 exibiram indivíduos de

68 diferentes regiões geográficas. Entretanto, um ramo com elevado suporte agrupou os 24 indivíduos coletados na IT e um indivíduo coletado no RJ demonstrando um claro sinal de diferenciação populacional (Figura 3).

Dentre as 12 localidades geográficas analisadas, os valores FST sugeriram a existência de pelo menos quatro populações com estruturações genéticas que variaram de pequena à muito grande. As localidades costeiras integram uma grande população panmítica, incluindo a população da Ilha Margarita (Venezuela), enquanto que as quatro regiões insulares sugerem três populações com diferentes graus de isolamento genético. A primeira, formada AFN e AR, outra pelos indivíduos do ASPSP, e uma última última por indivíduos da IT. Excepcionalmente, IT foi a localidade que apresentou os maiores valores de FST, variando entre 0,36 a 0,68, caracterizando uma grande diferenciação genética (Tabela 3). Apesar da elevada divergência genética a análise das sequências 16S e COI demonstraram que os espécimes analisados possuem inteira identidade com outras amostras de A. saxatilis previamente depositadas no Genbank. Além disso, como pode ser observado nas árvores de maximum likelihood (Figuras 4 e 5), todos os espécimes de A. saxatilis agrupam-se entre si formando ramos suportados por valores de boostrap de 99 para ambos os genes.

Os teste de AMOVA corroboram os valores de FST (Tabela 3) quanto a existência de quatro grupos genéticos de A. saxatilis na costa da América do Sul (costa, AFN/AR, ASPSP e IT). Estes grupos divergem entre si por uma diferença de 20,17%. Nesta conformação de quatro grupos, a diferença média entre as populações dentro dos grupos foi de apenas 1,87% (Tabela 4). A representação da estruturação genética encontrada em A. saxatilis ao longo da costa leste do Atlântico está representada na Figura 6. Considerando as 12 regiões geográficas amostradas, o teste de Mantel não encontrou correlação entre as distâncias genética e geográfica (p = 0,172). Entretanto, quando a população da ilha Margarita (Venezuela) é retirada da análise, esta associação passa a ser significativa (p = 0,039).

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Tabela 2. Índices de diversidade genética e neutralidade em Abudefduf saxatilis baseado em RHV1. Localidades n H h ± sd π ± sd Tajima’s D Fu’s Fs geográficas IM (Venezuela) 29 26 0,992 ± 0,011 0,094 ± 0,048 -1,7449* -9,6230* CE 22 22 1,000 ± 0,013 0,042 ± 0,023 -2,0143* -18,9883* RN 20 20 1,000 ± 0,015 0,036 ± 0,020 -1,8133* -17,8188* AFN 21 18 0,981 ± 0,022 0,058 ± 0,031 -0,9659 -6,7198* AR 21 17 0,966 ± 0,030 0,070 ± 0,037 -0,6820 -4,0104 ASPSP 26 13 0,920 ± 0,030 0,021 ± 0,012 -1,7756* -4,2852* PE 23 21 0,988 ± 0,018 0,054 ± 0,029 -1,2492 -11,3235* BA 23 21 0,992 ± 0,015 0,061 ± 0,032 -0,7858 -10,0965* ES 13 10 0,961 ± 0,041 0,038 ± 0,021 -1,5852* -2,3121 RJ 18 16 0,980 ± 0,028 0,053 ± 0,029 -1,6910* -6,3465* ES 24 21 0,989 ± 0,015 0,044 ± 0,024 -1,7751* -12,0738* IT 25 9 0,886 ± 0,030 0,018 ± 0,011 -1,6727* -1,1223 Todas 265 162 0,990 ± 0,001 0,057 ± 0,029 -1,956* -24,1607* n = Número de indivíduos; H = Número de haplótipos; h = Diversidade haplotípica; π = Diversidade nucleotídica; sd = Desvio padrão. Venezuela: Ilha Margarita (IM); Brasil: Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); *p ≤ 0.05.

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Figura 2. Rede de haplótipos de Abudefduf saxatilis baseado em sequências da RHV1. O tamanho dos círculos é proporcional à frequência do haplótipo, e as cores indicam as localidades onde o haplótipo é encontrado. Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).

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Figura 3. Árvore de maximum likelihood baseado em sequências RHV1 de Abudefduf saxatilis. Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); Grupo externo = Chromis multilineata (GenBank: KM211600-KM211603). Outros haplótipos = Haplótipos que não formaram qualquer agrupamento e exibiram-se na forma de ramos politômicos. Apenas ramos com valores de bootstrap maiores que 80 são exibidos.

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Figura 4. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências 16S de Abudefduf. Números acima dos ramos correspondem às porcentagens de bootstrap. Números antes dos nomes referem-se aos números de acesso do Genbank. Negrito = Sequências geradas no presente estudo.

Figura 5. Árvore de maximum likelihood baseada em sequências COI de Abudefduf. Números acima dos ramos correspondem às porcentagens de bootstrap. Números antes dos nomes referem-se aos códigos de acesso do Genbank. Negrito = Sequências geradas no presente estudo.

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Tabela 3. Estimativas de FST entre diferentes populações geográficas de Abudefduf saxatilis baseadas em RHV1. Locais 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 1. IM - 2. CE 0,02 - 3. RN 0,04 0,00 - 4. AFN 0,04 0,11 0,11 - 5. AR 0,01 0,07 0,11 0,01 - 6. ASPSP 0,06 0,03 0,04 0,17 0,14 - 7. PE 0,00 -0,00 0,01 0,05 0,04 0,06 - 8. BA 0,01 0,03 0,10 0,07 0,03 0,13 0,02 - 9. ES 0,01 -0,03 -0,01 0,10 0,06 0,05 -0,00 0,04 - 10. RJ 0,00 -0,01 0,01 0,08 0,04 0,05 -0,00 0,02 -0,02 - 11. SP 0,01 -0,01 0,00 0,11 0,07 0,06 -0,00 0,04 -0,01 -0,01 - 12. IT 0,36 0,55 0,60 0,49 0,43 0,68 0,50 0,46 0,60 0,50 0,53 Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT); Negrito - p ≤ 0,05.

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Tabela 4. Análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) baseado na RHV1 de Abudefduf saxatilis. Porcentagem Estatística Valor Comparações Fonte de variação de variação ɸ p (IM, CE, RN, AFN, AR, ASPSP, Entre as populações 14,92 ɸst = 0,149 0,000 PE, BA, ES, RJ, SP, IT) Within populations 85,08 - - ((IT) x (IM, CE, RN, AFN, AR, Entre grupos 38,64 ɸct = 0,386 0,099 ASPSP, PE, BA, ES, RJ, SP)) Entre as populações 3,01 ɸsc = 0,049 0,000 dentro dos grupos Dentro das 58,35 ɸst = 0,416 0,000 populações ((IT) x (AFN, AR, ASPSP) x (IM, Entre grupos 18,74 ɸct = 0,187 0,010 CE, RN, PE, BA, ES, RJ, SP)) Entre as populações 3,34 ɸsc = 0,041 0,000 dentro dos grupos Dentro das 77,92 ɸst = 0,220 0,000 populações ((IT) x (AFN, AR) x (ASPSP) x Entre grupos 20,17 ɸct = 0,201 0,002 (IM, CE, RN, PE, BA, ES, RJ, SP)) Entre as populações 1,87 ɸsc = 0,023 0,000 dentro dos grupos Dentro das 77,96 ɸst = 0,220 0,000 populações Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).

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Figura 6. Estruturação genético populacional de Abudefduf saxatilis ao longo da costa leste da América do Sul e ilhas oceânicas brasileiras. Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).

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DISCUSSÃO

A espécies A. saxatilis no Atlântico Ocidental exibe um diversificado padrão de estruturação genética, até então não identificado em outras regiões do Atlântico. A Região Hipervariável 1 das populações de Abudefduf saxatilis apresentaram altos índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, cujos menores valores estavam presentes entre os indivíduos da Ilha de Trindade e Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Tabela 2). Possivelmente isto decorra do grau de isolamento geográfico destas populações. Este isolamento é confirmado pelos altos índices FST de Wright (Wright, 1978), sobretudo para a população de insular de Trindade. A. saxatilis forma pelo menos quatro populações na costa da América do Sul: uma formada pelas regiões geográficas costeiras (IM+CE+RN+PE+BA+ES+RJ+SP), uma por AR+AFN e outra por ASPSP, estas isoladas por pequena/moderada diferenciação genética; e uma última população formada por IT, a qual apresentou alto grau de isolamento genético destacado por todas as análises. De fato, valores de FST semelhantes aos encontrados em A. saxatilis de AFN e AR já foram documentados para outras espécies que habitam estas ilhas, como Chromis multilineata e Cephalopholis fulva (Cunha et al., 2014; Souza et al., 2015), o que reforça a ideia de que o isolamento genético daquelas populações, apesar de pequeno, é significativo. A rede de haplótipos demonstrou uma alta diversidade haplotípica de A. saxatilis, o compartilhamento de haplótipos mais frequentes entre várias regiões geográficas e a existência de alta frequência de haplótipos únicos. O único agrupamento perceptível na rede de haplótipos envolveu oito haplótipos da IT, dos dez encontrados para esta população, e um haplótipo oriundo do RJ (Figure 2). O isolamento da população de IT também ficou evidente na árvore de maximum likelihood (Figura 3), o qual foi suportado por alto valor de bootstrap. Nesta análise, a maioria dos haplótipos formaram ramos politômicos individuais não informativos e, devido a isso, foram agrupados no ramo “outros haplótipos” para uma melhor representação da árvore. Os demais agrupamentos formados suportados por valores de bootstrap acima de 80 não indicaram nenhuma estruturação populacional, pois são compostos por haplótipos oriundos de diferentes regiões geográficas. A análise de AMOVA sugere a existência de pelos menos quatro grupos genéticos: ((IT) x (AFN, AR) x (ASPSP) x (IM, CE, RN, PE, BA, ES, RJ, SP)). A

77 porcentagem de variação entre estes grupos é de 20,17% (ɸct = 0,201, p = 0,002) e de apenas 1,87% Entre as populações dentro dos grupos (ɸsc = 0,023, p = 0,022) (Tabela 4). A ausência de estruturação entre as populações da ilha Margarita e da costa brasileira, apesar de estarem “separadas” por pelo menos 3.400 km de distância podem constituir um reflexo de um elevado fluxo gênico no passado, ou a manutenção estocástica de fluxo gênico no presente Neste caso, a barreira física promovida pelo desague de água doce e sedimentos do Rio Amazonas pode não desempenhar um papel importante no isolamento das populações brasileiras e caribenha de A. saxatilis. Na condição atual de elevação do nível do oceano Atlântico, a pluma de água doce desaguada pelo Rio Amazonas estende-se sobre a água salgada até cerca de 500 km mar adentro e até uma profundidade de 30 metros. No entanto, regiões entre 50 e 70 metros de profundidade possuem pouca sedimentação e salinidade normal, permitindo sua colonização por esponjas e peixes recifais (Collette & Rutzler, 1977; Rocha et al., 2000; Rocha, 2003). A apesar de A. saxatilis ainda não ter sido registrado habitando essas áreas, é possível que ela o faça, já que há registros de ocorrência de A. saxatilis a 50 metros de profundidade (Rocha & Myers, 2015). Desta forma, estas esponjas poderiam servir de habitat disponível à ampliação da área de ocupação de A. saxatilis e, por um processo de “stepping stones” (Kimura, 1953) por entre as esponjas, conectando as populações ao norte e ao sul do Rio Amazonas, homogeneizando-as. Além disso, indivíduos juvenis e adultos de A. saxatilis já foram registrados sob algas e objetos à deriva (Castro et al., 2002), o que, dependendo da frequência de ocorrência e da força das correntes oceânicas, pode contribuir no aumento do fluxo gênico entre diferentes regiões geográficas. O isolamento pela distância entre as regiões costeiras e destas com as insulares é corroborado pelo teste de Mantel. No entanto, isso ocorre apenas quando a população de Ilha Margarita (Venezuela) é removida da análise. A homogeneidade populacional pode ser influenciada pela ação das correntes oceânicas, as quais poderiam carrear larvas de A. saxatilis durante seu período pelágico, o qual pode chegar a 55 dias (Shulman & Bermingham, 1995). Uma das principais correntes no Atlântico Ocidental é a Corrente Sul Equatorial (CSE), que flui no sentido leste-oeste, passando pelo AFN, AR e alcançando a costa nordeste do Brasil, onde bifurca-se, formando a Corrente do Brasil (sentido

78 nordeste/sudeste do Brasil) e a Corrente Norte do Brasil (CNB). A CNB continua fluindo no sentido leste-oeste, passando pela costa norte brasileira e alcançando a Venezuela, já com o nome de Corrente das Guianas (CG) (Castro & Miranda, 1998; Lumpkin & Garzoli, 2005). No entanto, efeitos de autorecrutamento de larvas parecem favorecer a diferenciação populacional nas regiões insulares brasileiras (Molina et al. 2006; Cunha et al., 2014). De fato, apesar das características da CSE e da pequena distância entre o AFN/AR e o litoral favorecerem a panmixia, no entanto, significativa estruturação genética se mostra presente entre estas regiões (Tabela 3). O isolamento geográfico das ilhas oceânicas, atrelado à fatores biológicos e ao autorecrutamento larval, este último já atribuído anteriormente aos A. saxatilis do AR e ASPSP (Molina et al., 2006; Rodrigues & Molina, 2007), parecem ser responsáveis pela modelagem genética das populações insulares analisadas. Os padrões de estruturação populacionais de A. saxatilis do Golfo do México e mar do Caribe, analisadas através de Citocromo B, Região Controle (DNAmt) e microssatélites encontraram um padrão de panmixia em populações distribuídas ao longo de 1.800 km na costa Atlântica mexicana (Piñeros et al., 2015). Esta homogeneidade genética entre as regiões costeiras de distribuição da espécie é similar ao observado para as regiões costeiras do litoral do Brasil. Isto retrata a manutenção de fluxo gênico entre localidades circunvizinhas desta espécie, e destaca o caráter particular das estruturações populacionais encontradas nas regiões insulares do Brasil, sobretudo Trindade. Apesar da forte diferenciação populacional apontada para a Ilha de Trindade, as sequências 16S e COI confirmam a identidade genética dos espécimes daquela região com A. saxatilis. A Ilha de Trindade, assim como Atol das Rocas e Fernando de Noronha estão indiretamente conectados à costa brasileira através de montes oceânicos submarinos atualmente submersos. Junto com pelo menos cinco montes submarinos, Atol das Rocas e Fernando de Noronha fazem parte da Cadeia de Fernando de Noronha, a qual se estende no sentido leste-oeste (Mabesoone & Coutinho, 1970; Almeida, 2006). Já a Ilha de Trindade, junto com a ilha de Martim Vaz e mais cinco montes submarinos, faz parte de outra cadeia chamada Cadeia Vitória-Trindade, também orientada no sentido leste-oeste (ver Macieira et al., 2015). Estes montes submarinos podem ter desempenhado um papel importante na manutenção do fluxo gênico entre as populações costeiras e insulares,

79 principalmente ao longo das regressões marinhas durante o Pleistoceno (Bernat et al., 1983; Hearty, 1998; Barreto et al., 2002). Com a diminuição dos níveis dos oceanos, muitos destes montes submarinos tornaram-se habitáveis, o que pode ter favorecido o processo de stepping stones nessas regiões. No entanto, isto parece não ter ocorrido com A. saxatilis, ou apenas não foi detectado através das sequências da Região Hipervariável 1, pois todas as ilhas apresentaram significativos níveis de diferenciação populacional, sobretudo a Ilha de Trindade. Os altos níveis de diferenciação populacional encontrados na Ilha de Trindade são inéditos e nunca antes registrados em peixes recifais da costa brasileira. Este registro reitera a necessidade de preservação destas áreas estratégicas para a manutenção da biodiverdidade e reforça a ideia de que o conhecimento prévio da variabilidade genética a nível populacional é fundamental para a conservação dos recursos genéticos naturais e da biodiversidade.

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REFERÊNCIAS

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Tabela suplementar 1. Distribuição dos haplótipos encontrados nas sequências Região Hipervariável 1 de Abudefduf saxatilis.

Haplótipos IM CE RN AFN AR ASPSP PE BA ES RJ SP IT TOTAL 1 1 1 1 1 1 1 6 2 1 1 3 1 1 4 2 1 1 3 1 3 2 13 5 2 2 6 1 1 7 2 1 3 8 1 1 9 1 1 10 1 1 11 2 1 3 12 1 1 13 1 1 3 4 1 10 14 1 1 15 1 1 1 3 16 1 1 17 1 1 18 1 1 1 2 19 1 1 20 1 1 21 1 1 1 3 2 8 22 1 1 23 1 1 24 1 1 25 1 1 26 1 1 27 1 1 28 1 1 29 1 1 30 1 1 31 1 1 1 1 4 32 1 1 33 1 1 34 1 1 35 1 1 36 1 1 37 1 1 2 38 1 1 2 39 1 1 40 1 1 2 41 1 1 2 42 1 1 43 1 1 44 1 1 45 1 1 46 1 1 85

47 1 1 48 1 1 49 1 1 50 1 1 51 1 1 52 1 1 53 1 1 1 3 54 1 1 2 55 1 1 56 1 1 57 1 1 58 1 1 59 2 2 60 1 1 61 1 1 62 1 1 63 1 1 64 1 1 65 1 1 66 1 1 67 1 1 68 1 1 69 1 1 70 1 1 71 1 1 72 1 1 73 1 2 3 74 1 1 75 1 1 76 1 1 77 1 1 78 1 1 79 1 1 80 1 1 81 1 1 82 1 1 83 1 1 84 1 5 1 1 2 1 2 13 85 1 1 86 1 1 87 1 1 88 1 1 89 2 2 90 1 1 91 1 1 92 2 2 93 5 5 94 2 2 95 1 1 2

86

96 1 1 97 1 1 98 1 1 99 1 1 100 1 1 2 101 1 1 102 1 1 103 1 1 2 104 1 1 105 1 1 106 1 1 107 1 1 108 1 1 109 1 1 110 1 1 111 1 1 112 1 1 113 1 1 2 114 1 1 2 115 2 2 116 1 1 117 1 1 118 1 1 119 1 1 2 120 2 2 121 1 1 122 1 1 123 1 1 124 1 1 125 1 1 126 1 1 127 1 1 128 1 1 129 1 1 130 1 1 131 2 2 132 1 1 133 1 1 134 1 1 135 1 1 136 1 1 137 1 1 138 1 1 139 1 1 140 1 1 141 1 1 142 1 1 143 1 1 144 1 1

87

145 1 1 146 1 1 147 1 1 148 2 2 149 1 1 150 1 1 151 1 1 152 1 1 153 1 1 154 1 1 155 1 1 156 1 1 157 2 2 158 4 4 159 5 5 160 1 1 161 5 5 162 4 4 163 2 2 164 1 1 165 1 1 Ilha Margarita (IM), Ceará (CE), Rio Grande do Norte (RN), Arquipélago de Fernando de Noronha (AFN), Atol das Rocas (AR), Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), Pernambuco (PE), Bahia (BA), Espírito Santo (ES), Rio de Janeiro (RJ), São Paulo (SP), Ilha de Trindade (IT).

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Capítulo 3

Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto, Caranx lugubris Poey 1860 em áreas do Atlântico Ocidental

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Estruturação populacional panmítica do xaréu-preto, Caranx lugubris Poey 1860 em áreas do Atlântico Ocidental

RESUMO Carangidae constitui um grupo diversificado cujos representantes podem se distribuir por amplos espaços oceânicos. Uma dessas espécies, Caranx lugubris destaca-se por apresentar distribuição circuntropical, que no Atlântico inclui a costa e ilhas oceânicas brasileiras. No arquipélago de São Pedro e São Paulo indivíduos de C. lugubris foram previamente categorizados em morfótipos I e II em relação a variações cromossômicas e morfológicas. A origem destes morfótipos e a estrutura populacional da espécie em território brasileiro são desconhecidos. Aqui, indivíduos de C. lugubris de três localidades do Atlântico, Arquipélago de São Pedro e São Paulo (morfótipos I e II), costa do estado do Rio Grande do Norte e Ilha de Trindade tiveram suas sequências parciais do gene nuclear Rodopsina, mitocondriais 16S, Citocromo B, Citocromo c oxidase subunidade I, e Região Hipervariável 1 da Região Controle do DNA mitocondrial analisadas. Indivíduos do Arquipélago de São Pedro e São Paulo têm altos índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, sugerindo que esta região possa desempenhar importante papel na manutenção da variabilidade genética da espécie. A ausência de divergências genéticas entre os morfótipos I e II, e de estruturação populacional entre as três regiões geográficas analisadas, revelam um quadro de panmixia. Apesar de descartadas algumas hipóteses, as análises genéticas foram inconclusivas quanto a origem dos morfótipos. Para isso, a utilização de outros marcadores moleculares, e a análise de amostras de outras regiões oceânicas poderão contribuir para esclarecer sua ocorrência.

Palavras-chave: Carangidae, Black jack, morfótipos, panmixia, fluxo gênico

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INTRODUÇÃO

A família Carangidae é formada por 148 espécies (Eschmeyer & Fong, 2017), distribuídas em 30 gêneros (Nelson et al., 2016). Essencialmente pelágicos, algumas espécies apresentam extensa distribuição geográfica, variando desde pan- Atlântica até circunglobal (Gasparini & Floeter, 2001; Feitoza et al., 2003; Swart et al., 2016), podendo ser encontradas em todos os oceanos (Smith-Vaniz, 2002; Nelson et al., 2016). Apesar de intensivamente exploradas na pesca tradicional e comercial (Smith-Vaniz, 2002), seus padrões de estruturação populacional, sobretudo das espécies do gênero Caranx, são muito esparsas. Este é um dos gêneros mais diversificados na família (Nelson et al., 2016), no qual estão incluídas espécies com extensa distribuição geográfica, o que favorece a sobreposição de formas filogeneticamente próximas, com ocorrência esporádica de híbridos naturais (Murakami et al., 2007; Santos et al., 2011) e complexos de espécies (Smith-Vaniz & Carpenter, 2007). Caranx lugubris Poey 1860, Black Jack, uma espécie de grande porte que apresenta distribuição circuntropical (Oceanos Atlântico, Índico e Pacífico), incluindo a costa e ilhas oceânicas brasileiras, tais como Ilha de Trindade e Arquipélago de São Pedro e São Paulo (Feitoza et al., 2003; Gasparini & Floeter, 2001; Garcia- Júnior et al., 2015). No arquipélago de São Pedro e São Paulo, indivíduos de C. lugubris apresentam dois padrões morfológicos caracterizados principalmente quanto ao formato do corpo e tamanho dos olhos (morfótipos I e II), e indícios de diversificação citogenética (Jacobina et al., 2014). O morfótipo I é caracterizado por um corpo mais robusto, no plano dorso-ventral e olhos menores, enquanto que o morfótipo II tem o corpo mais esguio e olhos maiores. Os morfótipos apresentam características citogenéticas similares, exceto quanto ao número de sítios DNAr 5S. Enquanto o morfótipo I apresentava marcações em dois pares de cromossomos, no morfótipo II estes sítios estavam localizados em três pares de cromossomos (Jacobina et al., 2014). As variações citogenômicas em poucos indivíduos e a caracterização morfológica dos dois morfótipos ensejam análises complementares sobre a ocorrência de perfis genéticos diferenciados entre os morfótipos. O presente trabalho tem por objetivo analisar a estrutura genética de Caranx lugubris em diferentes regiões oceânicas e da costa brasileira através de sequências parciais do gene nuclear Rodopsina (Rhod), dos genes mitocondriais 16S e

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Citocromo B (CytB), Citocromo c oxidase subunidade I (COI), e Região Hipervariável 1 (RHV1) da Região Controle, contribuindo para a análise da ocorrência simpátrica e sintópica de diferentes morfótipos de C. lugubris no entorno do ASPSP.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta dos espécimes

Amostras de tecido de espécimes de C. lugubris foram coletados em três regiões geográficas do Atlântico Ocidental e regiões insulares meso-Atlânticas (Figura 1) entre os anos de 2013 e 2014. De um total de 34 amostras, 20 foram de indivíduos do Arquipélago de São Pedro e São Paulo (ASPSP), sendo 10 do morfótipo I e 10 do morfótipo II (Figura 2), 8 espécimes da Ilha de Trindade (IT) e 6 espécimes da costa do estado do Rio Grande do Norte (RN), litoral nordeste do Brasil (Figura 1). Após a coleta, fragmentos hepáticos e de nadadeiras foram acondicionados em microtubos (2,0 ml) com álcool etílico (100%) e armazenados em temperatura de -20°C. Os espécimes foram taxonômicamente identificados de acordo com Smith-Vaniz (2002).

Figura 1. Áreas de coleta dos espécimes de Caranx lugubris. ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo, RN - Rio Grande do Norte, IT - Ilha de Trindade; Tracejado - Representação da estrutura populacional encontrada. 92

Figura 2. Morfótipos I (a) e II (b) de Caranx lugubris (sensu Jacobina et al., 2014), coletados no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo.

Análises moleculares

O DNA total foi extraído de acordo com o protocolo (modificado) de extração salina proposto por Miller et al. (1988). Fragmentos de Rhod, COI, 16S, CytB e RHV1 foram amplificados através do método de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) de acordo com Souza et al. (2015). Os primers e as temperaturas de anelamento utilizados nas PCRs foram os seguintes: Rodopsina – Primers Rod-F2w e Rod-R4n, 60ºC (Jiménez et al., 2007), Citocromo c oxidase subunidade I – Primers

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FishF2 e FishR2, 50ºC (Ward et al., 2005), 16S - Primers L1987 e H2609, 52ºC (Palumbi et al., 1991), Citocromo B – Primers FishcytB-F e CytBI-5R, 52ºC (Jiménez et al., 2007) e Região Hipervariável 1 – Primers A e E, 52ºC (Lee et al., 1995). Os produtos de PCR (5 μl) foram purificados com as enzimas exonuclease I (3,3 U/reação) e fosfatase alcalina de camarão (SAP) (0,66 U/reação) (GE Healthcare), no termociclador, submetendo o mix à ciclos de 30 minutos em 37ºC e 15 minutos em 80ºC. As amostras foram sequenciadas pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda através do sequenciador automático ABI-PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Os eletroferogramas obtidos foram conferidos com o auxílio do software BioEdit (Hall, 1999) e as sequências de cada gene foram separadamente alinhadas de forma múltipla e automática através do MUSCLE (Edgar, 2004) por meio do software MEGA6 (Tamura et al., 2013). As sequências 16S e COI geradas foram submetidas à ferramenta Nucleotide BLAST (Disponível em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), pertencente ao NCBI (National Center for Biotechnology Information), a fim de estimar a similaridade genética com sequências previamente depositadas no Genbank (Disponível em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). As sequências COI foram submetidas ao Identification System (Disponível em http://www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine) para também estimar a similaridade com sequências previamente depositadas no BOLD (The Barcode of Life Data System; Ratnasingham & Hebert, 2007). A rede de haplótipos foi implementada utilizando o método median joining através do software Network 4.5 (Bandelt et al., 1999). Os níveis de diversidade genética, testes de neutralidade, através das estatísticas Fs (Fu, 1997) e D (Tajima,

1989), e a estruturação populacional, através da estimativa de FST (Wright, 1978) foram analisados através do software Arlequin 3.5 (Excoffier & Lischer, 2010). Árvores baseadas no método de verossimilhança foram geradas através do software MEGA6 (Tamura et al., 2013) a fim de evidenciar o relacionamento entre os morfótipos I e II, e entre as diferentes regiões geográficas amostradas. Em todas as análises os sítios com gaps, inserções e deleções foram considerados.

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RESULTADOS

Foram sequenciados e analisados fragmentos de 443 pares de bases (pb) do gene Rhod, 655 pb do COI, 583 pb do 16S, 645 pb do CytB e 423 pb da RHV1, totalizando 2.749 pb. As análises realizadas através do Nucleotide BLAST e BOLD Identification System revelaram que as sequências 16S e COI geradas eram compatíveis exclusivamente com sequências de C. lugubris. Devido a ocorrência de sítios polimórficos entre os indivíduos as estimadas de similaridade genética variaram entre 99 e 100%. As análises populacionais envolvendo as localidades de ASPSP, RN e Trindade foram realizadas a partir de sequências Região Hipervariável 1 (RHV1). Além da RHV1, os morfótipos I e II do ASPSP tiveram as sequências dos genes Rhod, COI, 16S e CytB analisadas, revelando-se bastante conservados para C. lugubris, sobretudo Rhod, o qual exibiu apenas um único haplótipo para todos os espécimes sequenciados (N=20). Os demais genes apresentaram-se também muito conservados com apenas dois haplótipos distintos para 16S e COI, e três para CytB. A Região Hipervariável 1 apresentou uma alta variabilidade haplotípica e nucleotídica (Tabela 1), e foi utilizada para as análises populacionais. Nenhuma das quatro sequências de DNA analisadas exibiu diferenças genéticas entre os morfótipos I dos II encontrados em ASPSP. Nas análises intrapopulacionais envolvendo apenas ASPSP, a rede de haplótipos inferiu que um indivíduo do morfótipo I é o haplótipo mais basal, porém não ficou evidenciado diferenciações genéticas entre indivíduos dos dois morfótipos encontrados no ASPSP (Figura 3a). A rede de haplótipos entre indivíduos do ASPSP, RN e IT, indicou um haplótipo basal compartilhado entre ASPSP e RN. Além disso, não foi identificada estruturação populacional entre as três localidades analisadas (Figura 3b). As redes de haplótipos com formato de estrela e os testes de neutralidade indicaram expansão demográfica (Figura 3; Tabela 1). As árvores de maximum likelihood revelam agrupamentos indistintos dos morfótipos I e II e dos indivíduos do ASPSP, RN e IT (dados não mostrados). Os valores FST não foram significativos entre as três localidades analisadas (ASPSP, RN e IT).

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Figura 3. Rede de haplótipos baseadas em sequências parciais da Região Hipervariável 1 (DNAmt) de Caranx lugubris. ASPSP = Arquipélago de São Pedro e São Paulo; IT = Ilha de Trindade; RN = Rio Grande do Norte; Arcos = Frequência dos haplótipos.

DISCUSSÃO

Apesar da grande importância econômica e ecológica das espécies do gênero Caranx, análises sobre a estrutura genética populacional neste gênero são escassas (e.g. Santos et al., 2011; Duarte et al., 2017), limitando sua aplicação na formulação de políticas públicas de conservação e manejo. A alta variabilidade genética (Tabela 1) e a ocorrência de morfótipos distintos de C. lugubris em partes da sua distribuição (ASPSP), ratificam a necessidade de análises populacionais mais elaboradas. Como explicação para a peculiar ocorrência destes morfótipos foram sugeridas variadas causas, tais como dimorfismo sexual, isolamento populacional e adaptação ambiental, hibridização e invasões interoceânicas de linhagens de C. lugubris a partir do Índico. Uma das possibilidades aventadas, a ocorrência de dimorfismo sexual, foi originalmente descartada, diante da ocorrência de machos e fêmeas com ambos os morfótipos (Jacobina et al., 2014). Estruturação genética regional ou divergência genética poderiam estar associadas à conspícua variação morfológica de C. lugubris no ASPSP. Contudo, as análises realizadas com base em sequências Rhod, COI, 16S, CytB e RHV1 não evidenciaram qualquer diferenciação genética entre os morfótipos I e II, nem entre

96 os indivíduos das regiões costeira do Rio Grande do Norte e oceânicas do ASPSP e Ilha de Trindade, sugerindo um cenário panmítico. Em contraste com a variação morfológica intra-regional presente em parte da distribuição de C. lugubris, análises genéticas em indivíduos de Caranx crysos da costa do estado do Rio de Janeiro (Brasil) sugeriram a existência de uma possível espécie críptica dentre os indivíduos analisados, a qual não foi percebida através da identificação taxonômica clássica e morfometria multivariada dos indivíduos coletados (Duarte et al., 2017). Estas variações fenotípicas e genéticas neste gênero apoiam a complexidade de variação e assincronia destes padrões em espécies de Caranx. A ocorrência de hábitos migradores (Riede, 2004) e presença de ovos e larvas pelágicas (Briggs, 1960) favorecem o atual quadro de panmixia observado entre indivíduos de C. lugubris nas vastas áreas amostradas no Atlântico. Cenários semelhantes de panmixia foram encontrados em outras espécies da família Carangidae, tais como Caranx ignobilis e C. melampygus (Santos et al., 2011), Trachurus trachurus (Comesaña et al., 2008), T. murphyi (Cárdenas et al., 2009), e T. japonicus (Song et al., 2013). A homogeneidade genética apresentada por C. lugubris e outras espécies deste gênero, com amplo potencial dispersivo, sugere a avaliação de diversificação genética utilizando modelos geográficos que envolvam grandes áreas da distribuição. De fato, análises populacionais interoceânicas na espécie Seriola lalandi revelaram a existência de marcada estruturação populacional ao longo dos oceanos Atlântico, Pacífico e Índico (Swart et al., 2016). Apesar da ausência de estruturação populacional em C. lugubris, os elevados índices de diversidade dos indivíduos do arquipélago (Tabela 1) quando comparados com os das demais regiões geográficas analisadas (RN e Trindade) sugerem que o ASPSP pode desempenhar importante papel na manutenção da variabilidade genética da espécie. De fato, o arquipélago de São Pedro e São Paulo localiza-se na latitude 0º55’, pouco acima da linha do Equador, distante 950 km da costa do Brasil e 1800 km da costa africana. Por ser uma região sob forte influência das correntes equatoriais (ver Rocha, 2003), é possível que sua localização favoreça o acúmulo de indivíduos/ovos/larvas oriundas de populações de ambos os lados do Atlântico. As distribuições geográficas de algumas espécies de peixes, como a moreia M. pavonina com ocorrência na costa brasileira e ASPSP, e M. melanotis presente na costa africana e no ASPSP (Feitoza et al., 2003; Wirtz et al., 2013), demonstram

97 sua atuação na manutenção de indivíduos de ambos os lados do Atlântico. Além disso, é possível que o regime de correntes reinantes no Atlântico Sul propicie que caso indivíduos de linhagens oriundas do oceano Índico ultrapassem a barreira da Corrente de Benguela, estes possam ser direcionados a aportar nesta região. Caso seja confirmado, isto poderia ajudar a explicar a maior diversidade haplotípica nesta região insular, haja visto que estudos recentes sugerem que invasões através da África do Sul têm contribuído para a diversidade de peixes do Atlântico (Floeter et al., 2008). Espécies com grande amplitude de distribuição propicia áreas de sobreposição que podem favorecer a ocorrência de hibridizações entre espécies próximas. No gênero Caranx já foram documentados casos de hibridação (Murakami et al., 2007; Santos et al., 2011) e complexo de espécies (Smith-Vaniz & Carpenter 2007), que poderiam ser causas da ocorrência dos morfótipos encontrados no arquipélago de São Pedro e São Paulo. As análises realizadas através do Nucleotide BLAST e Identification System revelaram que as sequências 16S e COI obtidas são compatíveis com espécimes de C. lugubris do arquipélago de São Pedro e São Paulo (Oceano Atlântico), da ilha Moorea (Polinésia Francesa, Pacífico) e dos bancos de Protea (África do Sul, Índico). A ausência de divergência genética demonstra o conservadorismo destas sequências, e aparente ausência de espécies crípticas, apesar da existência de efetivas barreiras biogeográficas ao longo da sua distribuição. Diante da herança matrilinear do DNA mitocondrial, a ocorrência de hibridação interespecífica envolvendo C. lugubris poderia ser detectada com base nas sequências COI e 16S caso a atuação materna fosse provida por outra espécie. De fato, híbridos no gênero Caranx já foram descritos para as ilhas do Havaí (Pacífico) através do sequenciamento de genes mitocondriais. Híbridos de Caranx ignobilis x C. melampygus e C. melampygus x C. sexfasciatus diferenciam-se da espécie C. melampygus em apenas uma mutação no gene COI e uma no gene 16S (Murakami et al., 2007). Uma vez que esta variação nucleotídica está dentro do intervalo de variação encontrado dentre as espécies de peixes para o gene COI (Ward et al., 2005) e no suporte provido pela análise de outros genes mitocondriais, como ATPase 6 e ATPase 8 (Santos et al., 2011), identificou-se C. melampygus como a linhagem materna destes híbridos. Diferentemente do que acontece entre Caranx hippos, C. caninus e C. fischeri (Smith-Vaniz & Carpenter, 2007), até o momento não existem indicações de

98 que C. lugubris constitua um complexo de espécies no Atlântico. Essa condição tem pouco suporte taxonômico, bem como das evidências genéticas aqui apresentadas, embora divergências genéticas interoceânicas mais marcantes não possam ser descartadas. Algumas evidências têm apontado que o isolamento geográfico associado a fatores ambientais intrínsecos do ASPSP podem atuar sobre algumas espécies, favorecendo a fixação de padrões fenotípicos peculiares em peixes de diferentes famílias. Neste sentido, já foram registrados fenótipos cromáticos atípicos para as espécies Holacanthus ciliaris (Pomacanthidae) e Chromis multilineata (Pomacentridae) (Feitoza et al., 2003; Luiz-Júnior, 2003; Cunha et al., 2014), ou variações morfológicas em Abudefduf saxatilis (Pomacentridae) (Molina et al., 2006). Mais recentemente, análises genéticas em espécies do gênero Stegastes revelaram que S. sanctipauli, até então considerada endêmica do ASPSP, constitui na realidade uma sinonímia de S. rocasensis, com distribuição também no arquipélago de Fernando de Noronha e no Atol das Rocas (Souza et al., 2016). As interpretações de dualidade entre essas formas se baseavam exclusivamente no conjunto de variações morfológicas e cromáticas da população de S. rocasensis presente no ASPSP. Estes casos ilustram brevemente os padrões de variação que podem ocorrer em decorrência das condições físicas e ambientais a que estão sujeitas as espécies naquela região insular. As reduzidas dimensões territoriais (ver Motoki et al., 2009) e condições ambientais particulares do ASPSP poderiam intensificar competições inter e intraespecíficas, promovendo adaptações morfológicas relacionadas à natação e alimentação (Bond, 1979; Breda et al., 2005; Piorski et al., 2005; Lima-Filho et al., 2012). Embora pouco provável está hipótese merece uma análise mais detalhada. Os resultados obtidos indicam uma condição de panmixia em C. lugubris nas regiões oceânicas amostradas do Atlântico e sugerem um papel do ASPSP como área estratégica para a manutenção da diversidade genética da espécie. Além disso, aparentemente os morfótipos não decorrem de divergências genéticas, contudo, outros marcadores genéticos e amostras de C. lugubris provenientes de outras regiões oceânicas poderão vir a contribuir para esclarecer sua ocorrência.

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Tabela 1. Diversidade genética de Caranx lugubris.

N h S Hd ± sd π ± sd D FS Genes/ASPSP (Morf. I + II) Rodopsina 20 1 0 0 0 - - 16S 4 2 1 0,500 ± 0,265 0,0008 ± 0,0009 - - Citocromo c oxidade subunidade I 6 2 1 0,333 ± 0,215 0,0005 ± 0,0006 - - Citocromo B 20 3 2 0,194 ± 0,114 0,0003 ± 0,0004 - -

RHV1/Regiões geográficas ASPSP (Morf. I + II) 19 19 56 1,000 ± 0,017 0,110 ± 0,060 -2,307* -14,204* Ilha de Trindade 8 7 13 0,964 ± 0,077 0,070 ± 0,044 -0,554** -2,181** Rio Grande do Norte 6 4 5 0,866 ± 0,129 0,029 ± 0,022 -0,825** -0,624** Todas as populações 33 28 65 0,986 ± 0,012 0,013 ± 0,007 -2,375* -22,603* N - Número de indivíduos; h - Número de haplótipos; S - Número de sítios polimórficos; Hd - Diversidade haplotípica; π - Diversidade nucleotídica; sd - Desvio padrão; D - Estatística Tajima (Tajima, 1989); Fs - Estatística Fu (Fu, 1997); RHV1 - Região Hipervariável 1; ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo; Morf. - Morfótipo; *p = 0; **p > 0,05; A distribuição dos haplótipos e os números de acesso ao Genbank encontram-se na Tabela suplementar 1.

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Tabela suplementar 1. Distribuição de haplótipos em Caranx lugubris. Genes Haplótipos ASPSP RN IT Total Genbank Rodopsina Hap1 20 (10 indivíduos Morf. I, 10 20 submetido indivíduos Morf. II) 16S Hap1 3 (2 indivíduos Morf. I, 1 3 submetido indivíduo Morf. II) Hap2 1 (Morf. I) 1 submetido COI Hap1 5 (3 indivíduos Morf. I, 2 5 submetido indivíduos Morf. II) Hap2 1 (Morf. II) 1 submetido Citocromo B Hap1 18 (9 indivíduos Morf. I, 9 18 submetido indivíduos Morf. II) Hap2 1 (Morf. I) 1 submetido Hap3 1 (Morf. I) 1 submetido RHV1 Hap1 1 (Morf. II) 1 submetido Hap2 1 (Morf. II) 1 submetido Hap3 1 (Morf. II) 1 submetido Hap4 1 (Morf. II) 1 submetido Hap5 1 (Morf. II) 1 submetido Hap6 1 (Morf. II) 1 submetido Hap7 1 (Morf. II) 1 submetido Hap8 1 (Morf. II) 1 submetido Hap9 1 (Morf. II) 1 submetido Hap10 1 (Morf. II) 2 3 submetido Hap11 1 (Morf. I) 1 submetido Hap12 1 (Morf. I) 1 submetido Hap13 1 (Morf. I) 1 submetido Hap14 1 (Morf. I) 1 submetido Hap15 1 (Morf. I) 1 submetido Hap16 1 (Morf. I) 1 submetido Hap17 1 (Morf. I) 1 submetido Hap18 1 (Morf. I) 1 submetido Hap19 1 (Morf. I) 1 submetido Hap20 1 1 submetido Hap21 1 1 submetido Hap22 2 2 submetido Hap23 1 1 submetido Hap24 1 1 submetido Hap25 2 1 3 submetido Hap26 1 1 submetido Hap27 1 1 submetido Hap28 1 1 submetido ASPSP - Arquipélago de São Pedro e São Paulo; RN - Rio Grande do Norte; IT - Ilha de Trindade; COI -Citocromo c oxidase subunidade I; RHV1 - Região Hipervariável 1; Morf. - Morfótipo.

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CONCLUSÕES GERAIS

• Os genes mitocondriais 16S, CytB e COI mostraram-se eficientes como marcadores taxonômicos moleculares para o gênero Stegastes;

• Stegastes sanctipauli e S. rocasensis constituem uma mesma espécie;

• O nível de diferenciação genética entre S. fuscus trindadensis e S. fuscus não é suficiente para manutenção do status de espécie para a população da Ilha de Trindade;

• As variações morfológicas entre Stegastes “sanctipauli” e S. rocasensis, e entre S. fuscus e S. fuscus “trindadensis” estão em parte atreladas a condições ecológicas diferenciadas entre as regiões de ocorrência das populações;

• A diferenciação genética encontrada em diferentes pontos de distribuição de S. variabilis sugere a ocorrência de uma nova espécie no Atlântico;

• As populações costeiras de Abudefduf saxatilis, desde a Venezuela até o sudeste do Brasil, representam uma população panmítica, enquanto que as populações insulares apresentam estruturação genética em diferentes níveis, sobretudo a da Ilha de Trindade;

• A espécie C. lugubris constitui uma população panmítica envolvendo a costa do estado do Rio Grande do Norte, Ilha de Trindade e Arquipélago de São Pedro e São Paulo;

• Os morfótipos I e II exibidos pela espécie Caranx lugubris no entorno do Arquipélago de São Pedro e São Paulo não possuem divergências genéticas para as sequências analisadas;

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• O Arquipélago de São Pedro e São Paulo representa um ambiente estratégico para a manutenção da biodiversidade brasileira;

• A distância do litoral sul-americano e as ilhas é diretamente proporcional ao aumento da divergência genética entre as populações insulares e costeiras;

• Os ambientes insulares brasileiros possuem nível reduzido de fluxo gênico com outras regiões insulares e a costa sul-americana;

• Os resultados obtidos podem ser utilizados como subsídios para o manejo e conservação das espécies e ambientes insulares do Atlântico Ocidental.

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