Rabanal Che Leon, Maria Fernanda.Pdf (1.930Mb)

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

COMUNICACIÓN Y

Sistemática del género Dicrodon (Reptilia: Teiidae) basada en análisis de secuencia de ADN mitocondrial

TESISINFORMÁTICA

PARA OPTARDE EL TÍTULO DE:

BIÓLOGO

AUTOR: SISTEMAS DEBach. Maria Fernanda Rabanal Che Leon

ASESOR:

Dr. Luis Enrique Pollack Velásquez DIRECCION

TRUJILLO – PERÚ 2015

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dr. Orlando Moisés Gonzáles Nieves Rector

Dr. Rubén César Vera Véliz COMUNICACIÓN Y Vicerrector Académico

Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas Vicerrector de Investigación INFORMÁTICA

DE Dr. José Mostacero León Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas

SISTEMAS Dr. William Zelada Estraver DESecretario de la Facultad de Ciencias Biológicas

Dr. Freddy Peláez Peláez Director de la Escuela Académico Profesional de Ciencias Biológicas DIRECCION

PRESENTACIÓN

Señores miembros del Jurado:

En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de

Grados y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y elevado criterio el presente COMUNICACIÓN trabajo de tesis titulado: Sistemática del género DicrodonY (Reptilia: Teiidae)

basada en análisis de secuencia de ADN mitocondrial, con el cual cumplo con

uno de los requisitos indispensables para obtener el Título Profesional de Biólogo.

Espero que vuestro criterio idóneo sepa comprender algunas omisiones

involuntarias, en tal sentido me someto aINFORMÁTICA su dictamen. DE

Trujillo, 16 de marzo del 2015

SISTEMAS DE

Bach. Maria Fernanda Rabanal DIRECCION Che Leon

iii

DEL ASESOR

Dr. Luis Enrique Pollack Velásquez, suscribe que la presente tesis ha sido

ejecutada de acuerdo a lo establecido en el proyecto respectivo y con las debidas

orientaciones brindadas al tesista.

Con respecto al informe, éste ha sido revisado y acoge las observaciones y COMUNICACIÓN sugerencias pertinentes, ajustándose a las características metodológicasY y formales

de un informe científico.

INFORMÁTICA DE

Dr. Luis Enrique Pollack Velásquez Asesor

SISTEMAS

DIRECCION

DEL JURADO DICTAMINADOR

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Dictaminador de la

presente tesis, declaran que ésta reúne los requisitos formales y fundamentales,

siendo aprobada por unanimidad.

COMUNICACIÓN Y

Dr. William Zelada Estraver Presidente

INFORMÁTICA

Dr. César Medina Tafur Secretario SISTEMAS

DIRECCION Dr. Luis Pollack Velásquez Vocal

DEDICATORIA

A mis padres y hermano por la paciencia y el apoyo brindado

COMUNICACIÓN Y

A mis profesoresINFORMÁTICA y amigos por las enseñanzasDE y los buenos momentos

SISTEMAS

A mi compañero

por estar siempre a mi lado DIRECCION

AGRADECIMIENTO

Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a las siguientes personas, que con su apoyo permitieron que este trabajo se lleve a cabo:

Dr. Luis Pollack Velásquez COMUNICACIÓN Blgo. Carlos Quijano Jara Y

Dr. Jano Núñez Zapata

Dra. Zulita Prieto Lara

Dra. Fátima Zavala de la Cruz, Blga. Ruth Castillo, Blga. Linda Sánchez y Bach. INFORMÁTICA Mónica Arqueros, equipo del Laboratorio de Genética DEy Biología Molecular

Blgo. Juan Carlos Chávez Arribasplata

Bach. Guianfranco Mazzei Coria

Sr.SISTEMAS Carlos Lunavictoria Huamán DE y a mi familia por el interés y apoyo no solo moral, sino también económico.

DIRECCION

vii

FRASE

COMUNICACIÓN “La ciencia trabaja en la frontera entre el conocimientoY y la ignorancia. No tenemos miedo de admitir lo que no sabemos, no existe vergüenza en ello. La única vergüenza está en fingir que tenemos todas las respuestas.”

- Neil deGrasse Tyson

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS

DIRECCION

viii

ÍNDICE

RESUMEN ...... x

ABSTRACT ...... xi

I. INTRODUCCIÓN ...... 1 COMUNICACIÓN II. MATERIAL Y MÉTODOS ...... Y 10

III. RESULTADOS ...... 17

IV. DISCUSIÓN...... 22

V. CONCLUSIONES ...... INFORMÁTICA 25 DE VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 26

ANEXOS ...... 33

SISTEMAS

DIRECCION

RESUMEN

Dicrodon (Duméril & Bibron, 1839)es uno de los géneros de lagartijas más

representativos de los bosques secos de la costa noroeste del Perú y su sistemática,

como la de muchos otros reptiles, se sustenta en la descripción de caracteres

morfológicos, lo cual ha conducido a diversos errores a través del tiempo. Con el COMUNICACIÓN objetivo de evaluar aspectos de la sistemática del géneroY Dicrodon, fueron analizados 842 pares de bases (328 pb de citocromo b y 514pb de citocromo

oxidasa I) para individuos de Dicrodon guttulatum (Duméril & Bibron, 1839),

Dicrodon holmbergi (Schmidt, 1957) y Dicrodon heterolepis (Tschudi, 1845)

provenientes de diferentes áreas costeras y bosques de algarrobo del departamento INFORMÁTICA de La Libertad. Los tres métodos usados, Máxima Parsimonia, Máxima DE Verosimilitud e Inferencia Bayesiana, produjeron árboles con topologías idénticas

en los cuales puede observarse que los individuos de D. guttulatum, D. holmbergi

y D. heterolepis pertenecen a linajes distintos; sin embargo, los linajes de D.

guttulatum y D. holmbergiSISTEMAS se encuentran más cercanamente emparentados entre sí

que con los individuosDE del grupo heterolepis.

DIRECCION

ABSTRACT

Dicrodon (Duméril & Bibron, 1839 is one of the most representative genera of

lizards from dry forests on the Peru northwest coast and their systematic, like

many other reptiles, is based on morfological descriptions, which has led to many

errors over time. In order to assess aspects of the systematic of Dicrodon, 842 bp COMUNICACIÓN (328 pb cytochrome b y 514pb de cytochrome oxidase I) Y were analyzed from Dicrodon guttulatum (Duméril & Bibron, 1839), Dicrodon holmbergi (Schmidt,

1957) y Dicrodon heterolepis (Tschudi, 1845) from different coastal areas and dry

forests of La Libertad region. The three methods used here, Maximun Parsimony,

Maximun Likelihood and Bayesian Inference, produced trees with identical INFORMÁTICA topologies which show that D. guttulatum, D. heterolepis and D. holmbergi DE belong to different lineages. However, D. guttulatum and D. holmbergi are more

closely related to each other than from heterolepis group.

SISTEMAS

DIRECCION

I. INTRODUCCIÓN

El género Dicrodon (Duméril & Bibron, 1839) comprende tres especies de

lagartijas de tamaño mediano que habitan única y exclusivamente las zonas áridas

y costeras del sur de Ecuador y norte de Perú (Schmidt, 1957; Peters & Donoso-

Barros, 1970; Harvey et al, 2012). Esta franja costera de 100 a 150 km de ancho,

ubicada entre los paralelos 03°56’-13°11’ de Latitud Sur y 75°09’-81°21’ de COMUNICACIÓN Longitud Oeste, corresponde al Bosque Seco EcuatorialY y abarca los

departamentos de Tumbes, Piura, Lambayeque y La Libertad. En ella, el género

Dicrodon se encuentra limitado al hábitat del Bosque Seco de Sabana que posee

vegetación típica como son algunas cactáceas (Cereus y Armatocereus), árboles

de Acacia macracantha “espino”, Capparis scabrida “zapote”, Parkinsonia INFORMÁTICA praecox y P. aculeata “palo verde” entre otros, además de los densos bosques DE secos estacionales de Prosopis sp. “algarrobo” (algarrobales) (Venegas, 2005;

Pollack, 2009; 2010).

D. guttulatum y D.SISTEMAS holmbergi son lagartijas herbívoras diurnas que cavan sus madrigueras enDE la arena alrededor de los árboles de algarrobo, cuyos foliolos, inflorescencias y frutos tiernos constituyen su principal alimento, aunque también

se alimentan de los frutos de Scutia spicata “peal” y pétalos de las flores de

Encelia canescens. En contraste con D. holmbergi que muestra una fuerte

DIRECCIONtendencia a ser especialista, D. guttulatum se comporta como generalista,

demostrando capacidad para adaptarse fácilmente a zonas con ausencia de

algarrobos, alimentándose de foliolos de A. macracantha y frutos de E. canescens,

S. spicata y C. crotonoides; esto le otorga una mayor ventaja de supervivencia

frente a D. holmbergi y lo convierte en pieza clave para el mantenimiento del

ecosistema del bosque seco al tratarse de un importante diseminador de semillas.

A pesar de ello, ambos son omnívoros en estado juvenil. Por el contrario, D.

heterolepis se comporta como omnívoro durante toda su vida y su dieta incluye

pequeños insectos además de las plantas antes mencionadas (Holmberg, 1957;

Schmidt, 1957; Pollack et al, 2007; Pollack, 2009; Hardeman, 2010). Estos

saurios presentan una marcada fluctuación poblacional entreCOMUNICACIÓN los meses de Y invierno, cuando son muy escasos, y los de verano, cuando se los puede encontrar

en gran cantidad aprovechando los días calurosos para salir de sus madrigueras en

busca de alimento (Pollack, 2009).

En la región liberteña, D. guttulatum y D. holmbergi son conocidos comúnmente INFORMÁTICA como “cañanes” y han desempeñado un papel importante en la economía y DE cosmovisión de los pobladores locales desde tiempos pre-incaicos, tal como lo

evidencian sus representaciones en la iconografía y la cerámica Mochica (Anexos

1 y 2). Además, restos óseos de estas lagartijas encontrados en fogones

prehispánicos indicanSISTEMAS que constituían una importante fuente de alimento para los

antiguos peruanos,DE por lo cual eran atrapadas utilizando trampas tradicionales

hechas de carrizo llamadas “tambor” o “chinchorro”; esta experiencia se ha

transmitido a través de las generaciones y es una costumbre que aún perdura en

los poblados de San Pedro de Lloc, Virú y Chao (Anexo 3) donde son preparadas DIRECCION en “seviche”, sopas, guisos o tortillas, y son muy apreciadas por su delicioso

sabor, sus cualidades nutritivas y sus presuntos poderes afrodisíacos. Estas

virtudes son atribuidas a la carne del cañán, probablemente, por la creencia de que

los frutos de algarrobo poseen extraordinarios poderes alimenticios y curativos.

Además, al ser estos frutos su única fuente de alimento, son considerados como

animales “limpios” por los pobladores (Holmberg, 1957; Pollack, 2009; 2010).

La característica principal de este género es la forma de los dientes posteriores, los

cuales son compresos transversalmente, presentando una corona ancha y bipartida COMUNICACIÓN con la ranura orientada longitudinalmente a las mandíbulas Y (Duméril & Bibron, 1839; Burt & Burt, 1933; Peters & Donoso-Barros, 1970; Harvey et al, 2012).

Este rasgo es compartido sólo con los miembros del género Teius Merrem, 1820;

sin embargo, Dicrodon se diferencia de estos por carecer de una cuenca apical en

su hemipene, tener las escamas frontoparietales fusionadas y, especialmente, por INFORMÁTICA poseer el quinto dedo del pie con cuatro falanges, en contraste con Teius, cuyo DE quinto dedo del pie es vestigial (Harvey et al, 2012).

La especie tipo del género es Dicrodon guttulatum (Duméril & Bibron, 1839),

nombrado así por las gotitas (gouttelettes, en francés) o lunares blanquecinos o SISTEMAS amarillentos que llenan su espalda y flancos. Previamente, esta especie fue DE descrita como Cnemidophorus lentiginosus (Garman, 1892), Ameiva leucostigma

(Boulenger, 1899) y Dicrodon barbouri (Noble, 1924); no obstante, todas estas

descripciones coinciden en indicar la presencia de cuatro supraoculares, el

DIRECCIONprimero y parte del segundo en contacto con el frontal y los restantes bordeados

en ambos lados por escamas granulares; de escamas dorsales granulares diminutas

y de tamaño uniforme desde el occipucio hasta la base de la cola, y de dos hileras

de escamas antebraquiales agrandadas.

Por su parte, Dicrodon heterolepis fue descrito inicialmente como Cnemidophorus

heterolepis (Tschudi, 1845) y luego como Dicrodon calliscelis (Cope, 1876).

Ambos trabajos destacan el característico patrón desigual de las escamas del

cuerpo (rasgo al que se debe su nombre), empezando por escamas granulares lisas

y adyacentes en el cuello, espalda superior y lados del cuerpo, las mismas que COMUNICACIÓN aumentan gradualmente de tamaño a medida que desciendenY por la espalda hasta convertirse en grandes escamas quilladas, colocadas de forma imbricada sobre la

parte posterior de la espalda y la base de la cola. En 1891, Steindachner se basó en

estas características para realizar una redescripción de heterolepis, refiriéndose a

él como Cnemidophorus. Además describió tres especies nuevas: C. centropyx, C. INFORMÁTICA peruanus y C. tumbezanus, aunque reconoció que éstas no presentaban los rasgos DE y distribuciones característicos de Cnemidophorus, y expresó su creencia de que

podrían pertenecer ya sea a los géneros Dicrodon o Verticaria. Un estudio

posterior de las descripciones originales realizado por Charles E. Burt y May

Danheim Burt en SISTEMAS 1933 señaló que las tres nuevas formas de Steindachner

representaban aDE una única, heterolepis. Además, la observación de una fuerte

compresión transversal de los dientes en esos individuos sirvió para referir esta

especie desde el género Cnemidophorus (donde fue colocado por Tschudi en

1845) al género Dicrodon. En este mismo trabajo se muestra que Dicrodon DIRECCION calliscelis no difiere de Dicrodon heterolepis.

En 1957, Schmidt realizó una descripción de las lagartijas colectadas por el Dr.

Allan Holmberg en el Valle de Chao, departamento de La Libertad, y, a pesar de

que rápidamente identificó que pertenecían a Dicrodon, tras una observación más

detallada encontró que diferían de las dos especies previamente descritas.

Dicrodon holmbergi, bautizada así en honor a su colector, se distingue

visiblemente de D. heterolepis por poseer pequeñas escamas granulares en la parte

posterior de la espalda, y de D. guttulatum por el anillo de pequeñas escamas que

rodean completamente los supraoculares, impidiendo que el supraocularCOMUNICACIÓN anterior Y entre en contacto con la escama frontal. Aún presentando estas diferencias, el

autor no descarta la posibilidad de que D. guttulatum y D. holmbergi puedan

tratarse de formas alopátricas de una misma especie (Schmidt, 1957).

Teniendo en cuenta estas descripciones del patrón de distribución de escamas, INFORMÁTICA además de la coloración del cuerpo y las medidas corporales, aún no se ha DE obtenido una respuesta clara sobre la sistemática del género Dicrodon, así

tenemos que en la década de los setenta se elaboró un manual de campo donde se

mencionan tres especies: D. heterolepis, D. guttulatum y D. holmbergi (Peters &

Donoso-Barros, 1970).SISTEMAS Sin embargo, en un reciente y minucioso estudio

morfológico realizadoDE por Harvey et al, (2012), donde se propone una nueva

taxonomía de la familia Teiidae en base a la descripción de 137 caracteres, se

menciona que el género Dicrodon está conformado por D. heterolepis, D.

guttulatum guttulatum y D. guttulatum holmbergi. DIRECCION

Aunque por muchos años el estudio de la sistemática de los reptiles se basó

principalmente la descripción de caracteres morfológicos, su uso presenta

dificultad para obtener un número suficiente de caracteres válidos en el análisis

filogenético (Carranza, 2002). En cambio, los caracteres moleculares

proporcionan numerosos caracteres informativos que pueden ser seleccionados y

definidos de una manera relativamente objetiva; además, estos marcadores

trabajan directamente con la base genética de la variación y son universales

(Rentaría, 2007). Por estas razones, además del desarrollo deCOMUNICACIÓN la Técnica de la Y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction), los

avances en el diseño y síntesis de cebadores o primers universales y en las

técnicas de secuenciación de ADN, y la mejora de los programas informáticos, la

biología molecular es cada vez más empleada para complementar los estudios

morfológicos y resolver no sólo problemasINFORMÁTICA de sistemática y filogenia, sino

también para dilucidar problemas DE biogeográficos y ecológicos (Carranza et al,

2000; Carranza & Arnold, 2006; 2012; Arnold et al, 2008; 2009). Así tenemos

que estudios citogenéticos realizados en la famiia Teiidae han revelado que

Dicrodon guttulatumSISTEMAS posee 56 cromosomas (Gorman, 1970; Pollack, 2009) y Dicrodon holmbergiDE un numero de 46 cromosomas (Pollack, 2009).

Los marcadores moleculares adecuados se eligen en base al tipo de datos que se

necesitan para el estudio, al tipo de herencia y su tasa de evolución. En

herpetología, los análisis de microsatélites y minisatélites son utilizados para DIRECCION estudios sobre la estructura de las poblaciones naturales, de determinación de

parentesco, selección sexual, comportamiento reproductor y ecología de las

poblaciones; mientras que las secuencias de ADN se emplean para inferir

relaciones filogenéticas en todos los niveles taxonómicos (Carranza, 2002). El

ADN mitocondrial es una molécula en forma de doble hélice circular que, en

vertebrados, tiene una tamaño aproximado de 16.000 pares de bases y no presenta

intrones. Codifica para dos RNAs ribosómicos (12S rRNA y 16S rRNA), más de

20 RNAs de transferencia (tRNAs) y para diversas proteínas implicadas en el

transporte de electrones (citocromo b, citocromo oxidasa I, etc.).COMUNICACIÓN Es uno de los Y marcadores moleculares más utilizados en sistemática debido a su elevada tasa de

evolución en vertebrados y su herencia uniparental a través de la línea materna,

por esto último es haploide y las diferencias encontradas se deben únicamente a

fenómenos de mutación y no a recombinación. Además, las mitocondrias casi

siempre presentan exactamente la mismaINFORMÁTICA secuencia en todos los tejidos y pueden

ser encontradas en grandes cantidadesDE en el citoplasma, esto permite obtener el

ADN necesario para el análisis a partir de pequeñas cantidades de tejido

(Carranza, 2002; Rentaría, 2007).

En el año 2014 seSISTEMAS publicó el Decreto Supremo N°004-2014-MINAGRI que

incluye a las especiesDE Dicrodon holmbergi y Dicrodon heterolepis en la lista de

especies legalmente protegidas y las clasifica como vulnerable (VU) y casi

amenazada (NT), respectivamente. Además, prohíbe su caza, captura, tenencia,

comercio, transporte o exportación con fines comerciales, prioriza la investigación DIRECCION en estas especies orientada a su sistemática, biogeografía, ecología, genética,

conservación y enfermedades, y autoriza su colecta científica cuando la

investigación contribuye al conocimiento científico y conservación. Por otro lado,

podría considerarse que Dicrodon guttulatum no se encuentra amenazado debido a

su amplia distribución geográfica, que incluye algunas de las Áreas Naturales

Protegidas por el Estado, como la Reserva de Biosfera del Noroeste, el Santuario

Histórico Bosque de Pómac, el Área de Conservación Regional Bosque Huacrupe

– La Calera y el Área de Conservación Privada Bosque Natural El Cañoncillo

(Pollack, 2009). COMUNICACIÓN Y Pese a estas medidas, las tres especies de lagartijas se encuentran afectadas por la

fragmentación y el deterioro de su hábitat debido, principalmente, a las

actividades antrópicas como la expansión urbana y la ampliación de la frontera

agrícola con fines de introducir cultivos de interés agroexportador como caña de INFORMÁTICA azúcar, espárrago, algodón, entre otros; aun cuando existen pequeñas DE agrupaciones de algarrobos, estas se encuentran amenazadas por la tala

indiscriminada para la extracción de leña y carbón. Otra situación alarmante es la

fuerte presión de caza a la que son sometidos los cañanes, en especial D.

holmbergi, ya que actualmenteSISTEMAS no sólo son atrapados con las tradicionales trampas

de carrizo, sinoDE que también son capturados mediante el uso de hondas y a través

de la destrucción de sus madrigueras con pala y/o agua, e incluso el empleo de

armas de fuego; estas prácticas son perjudiciales ya que no discriminan tamaño ni

sexo y ocasionan el deterioro del hábitat (Pollack, 2009; 2010). DIRECCION

Frente a esta situación, los estudios para el esclarecimiento de la sistemática son

de suma importancia en el planteamiento de estrategias de conservación

adecuadas, ya que permiten identificar el número de especies y seleccionar

especies y áreas que son prioritarias para ser conservadas. Además, la correcta

delimitación de una especie permite estudiar sus poblaciones y estimar su

variabilidad genética, lo que proporciona información acerca del tamaño del área

que debe conservarse para evitar la reducción del flujo génico. Por esta razón, en

el presente trabajo se utilizaron 842 pares de bases (328 pb de COMUNICACIÓNcitocromo b y 514 Y pb de citocromo oxidasa I) de D. heterolepis, D. guttulatum y D. holmbergi con la

finalidad de evaluar aspectos de la sistemática del género Dicrodon.

INFORMÁTICA

SISTEMAS

DIRECCION

II. MATERIAL Y MÉTODOS

Un total de seis ejemplares del género Dicrodon fueron utilizados en este estudio:

dos Dicrodon heterolepis (Tschudi, 1845), dos Dicrodon guttulatum (Duméril &

Bibron, 1839) y dos Dicrodon holmbergi (Schmidt, 1957). Estos especímenes

fueron colectados en diferentes áreas costeras de la región La Libertad e

identificados usando claves taxonómicas y descripciones morfológicas (Anexo 4) COMUNICACIÓN (Peters & Donoso-Barros, 1970; Harvey et al., 2012). DuranteY la ejecución del

trabajo, fueron sacrificados y almacenados a -70°C; posteriormente fueron

depositados en la colección de Herpetología del Centro de Estudios de Ornitología

y Biodiversidad (CORBIDI).

Como grupo externo se emplearon secuenciasINFORMÁTICA parciales de los genes Citb de

Ameivula abaetensis (Reis Dias, RochaDE & Vrcibradic, 2002), A. ocellifera (Spix,

1825), Aspidoscelis ceralbensis (Van Denburgh & Slevin, 1921), A. deppei

(Wiegmann, 1834), A. guttata (Wiegmann, 1834), A. hyperythra (Cope, 1864), A.

tigris (Baird & Girard,SISTEMAS 1852), A. velox (Springer, 1928), Cnemidophorus ruatanus (Barbour, 1928),DE C. vanzoi (Baskin & Williams, 1966), Kentropyx calcarata (Spix, 1825), K. striata (Daudin, 1802) y Tupinambis quadrilineatus (Manzani &

Abe, 1997), y COI de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758) y Aspidoscelis maxima

(Cope, 1864), todos pertenecientes a la familia Teiidae, disponibles en el banco de

DIRECCIONsecuencias del NCBI. Además se incluyeron ambas secuencias de un Microlophus

peruvianus (Lesson, 1826) (Reptilia: Tropiduridae) obtenidas en el presente

estudio. La información detallada de cada espécimen se encuentra en la Tabla 1.

Tabla 1. Detalles del material y secuencias utilizados en el presente estudio.

Números de accesión Taxones Localidad Referencias Citb COI Ameiva ameiva Guyana - AF206560 (Fu, 2000) (Rosario & Ameivula abaetensis Brazil KF957509 - Santos, No publicado) Mato Grosso, Barra (Whiting et al, Ameivula ocellifera AY217839 - do Garcas (Brazil) 2003) (Radtkey et al, Aspidoscelis ceralbensis - AF006293 - 1997) (Radtkey et al, Aspidoscelis deppei - AF006303 - 1997) (Radtkey et al, Aspidoscelis guttata - AF006302 - COMUNICACIÓN1997) El Arco (Radtkey et al, Aspidoscelis hyperythra AF006291 Y - (México) 1997) Baja California Aspidoscelis maxima - AF206559 (Fu, 2000) (México) Isla Santa Catalina (Radtkey et al, Aspidoscelis tigris AF006270 - (México) 1997) (Noonan et al, Aspidoscelis velox - EU116504 - 2013) (McCranie & Cnemidophorus ruatanus Honduras KF667275 - INFORMÁTICA Hedges, 2013) Maria Major Island (Funk & Fa, Cnemidophorus vanzoi DQ168988 - Saint LuciaDE 2006) San Pedro de Lloc En este En este CORBIDI Dicrodon guttulatum1 (Pacasmayo) estudio estudio 15361 San Pedro de Lloc En este En este CORBIDI Dicrodon guttulatum2 (Pacasmayo) estudio estudio 15362 Mocan (Casa En este En este CORBIDI Dicrodon heterolepis1 SISTEMASGrande, Ascope) estudio estudio 15357 Mocan (Casa En este En este CORBIDI Dicrodon heterolepis2 DE Grande, Ascope) estudio estudio 15358 En este En este CORBIDI Dicrodon holmbergi1 Chao (Virú) estudio estudio 15359 En este En este CORBIDI Dicrodon holmbergi2 Chao (Virú) estudio estudio 15360 (Avila-Pires et Kentropyx calcarata Brazil JQ639738 - al, 2012) DIRECCION Amapa, Mazagao (Avila-Pires et Kentropyx striata JQ639672 - Brazil al, 2012) Goias, Niquelandia (Whiting et al, Tupinambis quadrilineatus AY217838 - (Brazil) 2003) En este En este CORBIDI Microlophus peruvianus Cerro Negro (Virú) estudio estudio 15356 11

Extracción, amplificación y secuenciación del ADN mitocondrial

Los procesos de extracción y amplificación de las secuencias de ADN

mitocondrial se llevaron a cabo en el Laboratorio de Genética y Biología

Molecular de la Universidad Nacional de Trujillo. La extracción del ADN total, se

obtuvo realizando algunas modificaciones al método descrito por Carranza et al.

(1999). Para ello, se extrajeron aproximadamente 10mg de tejido muscular de la

cola (Anexo 5), los cuales fueron picados finamente y transferidos a tubos de COMUNICACIÓN microcentrífuga de 2ml con 800µl de solución de digestiónY (100mM Tris-HCl pH8; 100mM NaCl; 10mM EDTA pH8; 0,5% SDS y 0,75 mg/ml de proteinasa

K). Las muestras se incubaron a 55°C por un lapso de 60 minutos, durante los

cuales fueron agitadas regularmente en un vortex (Anexo 6). La purificación se

realizó por extracción con fenol/cloroformo (Sambrook & Russell, 2001) INFORMÁTICA añadiendo 800µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1v/v) y DE mezclando bien el contenido de cada tubo en un vortex. Las fases orgánica y

acuosa fueron separadas por centrifugación a 14500rpm por 10 minutos a

temperatura ambiente (Anexo 7); posteriormente, la fase acuosa superior se

transfirió a un tubo deSISTEMAS microcentrífuga limpio, teniendo cuidado de no acarrear las

proteinas de laDE interfase. Para precipitar el ADN, se añadieron 800µl de

isopropanol y se mezcló muy suavemente por inversión, observando la formación

del flóculo. Las muestras se dejaron reposar a -20°C por 2 o 3 días y luego se

centrifugaron a 14500rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. El isopropanol DIRECCION fue removido cuidadosamente y el precipitado (Anexo 8) fue enjuagado con 800µl

de etanol 70%. La pastilla de ADN se recuperó centrifugando a 14500rpm por 10

minutos y, después de remover cuidadosamente el etanol, se dejó secar durante 20

minutos a 30°C en un concentrador. El precipitado se disolvió en 50µl de buffer

TE (pH 8.0) y se almacenó a -20°C. La concentración del ADN obtenido a partir

cada muestra se midió en un espectrofotómetro UV-Visible Thermo Scientific

Genesys 10 Bio (Anexo 9); aquellas muestras que presentaban una elevada

concentración fueron diluidas agregando buffer TE con el fin de homogenizar los

valores de concentración de ADN en los diferentes tubosCOMUNICACIÓN (Anexo 10). La Y visualización de los fragmentos de ADN extraídos se realizó por electroforesis en

gel de agarosa al 1% con una solución amortiguadora de TAE 1X. El volumen

final de carga fue de 10µl, este consistió en una mezcla de 8µl de ADN y 2µl de

Azul de Bromofenol. Las bandas de ADN fueron observadas en un

fotodocumentador de imágenes BIO-RADINFORMÁTICA Molecular Imager® ChemiDoc XRS +

System (Anexo 11). DE

Los fragmentos de los genes mitocondriales codificantes de rápida evolución

citocromo b (Citb) y citocromo oxidasa I (COI) fueron amplificados mediante la

técnica de la ReacciónSISTEMAS en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Anexo 12) en 25µl de DE Master Mix (H2O bidestilada; 1X Buffer de reacción; 2mM MgCl2; 200µM de

cada dNTP; 0,4µM cebador directo; 0,4µM cebador inverso; 2U FastStart Taq

DNA Polymerase y ~250ng de ADN). Los cebadores usados tanto en la

amplificación como en la secuenciación de ambos fragmentos mitocondriales son DIRECCION listados en el Anexo 13. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes:

desnaturalización inicial a 95°C por 4 minutos seguida por 35 ciclos de

desnaturalización a 94°C por 30 segundos, alineamiento a 45°C (para COI) y

55°C (para Citb) por 45 segundos y extensión a 72°C por un minuto, finalmente

una extensión final a 72°C por 10 minutos. Las reacciones de PCR para ambos

genes se llevaron a cabo en un termociclador Applied Biosystems Veriti de 96

pocillos para tubos de 0,2ml. La concentración del ADN amplificado en cada

producto de PCR se midió en un espectrofotómetro UV-Visible Thermo Scientific

Genesys 10 Bio (Anexo 14). Todas las reacciones de PCR se verificaronCOMUNICACIÓN mediante Y electroforesis en gel de agarosa al 2% con una solución amortiguadora de TAE

1X. El volumen final de carga fue de 6µl que consistió en una mezcla de 4µl de

producto de PCR y 2µl de Azul de Bromofenol. Las bandas de ADN fueron

observadas en un fotodocumentador de imágenes BIO-RAD Molecular Imager®

ChemiDoc XRS + System (Anexo 15INFORMÁTICA). Los fragmentos de ADN amplificado

fueron derivados a Laboratorios BIOLINKS,DE en Lima, para su purificación y

secuenciación. Los resultados fueron remitidos por correo electrónico en formato

AB1.

Análisis filogenéticoSISTEMAS DE Las secuencias parciales de ADN obtenidas fueron editadas manualmente bajo

criterios conservadores como la observación del cromatograma y el recorte de los

extremos de bajo nivel de calidad en la lectura. Para completar el fragmento se

DIRECCIONutilizó la reversa complementaria de la cadena inversa. Posteriormente, las

secuencias se alinearon manualmente en la base de datos del NCBI (National

Center for Biotechnology Information) confirmando que las secuencias

correspondían a fragmentos de los genes mitocondriales citocromo b y citocromo

oxidasa I para indivuos de la familia Teiidae.

Para comprobar que los ejemplares de Dicrodon estudiados pertenecen a un grupo

monofilético, se empleó el método de Máxima Verosimilitud (ML) para analizar

de forma independiente las secuencias de ambos genes, incluyendo como grupo

externo secuencias disponibles en el NCBI de otras especies de lagartijas COMUNICACIÓN pertenecientes a la familia Teiidae. El soporte estadístico deY los nodos de estos árboles filogenéticos fue evaluado usando el método Bootstrap con 1000

repeticiones.

Las secuencias de ADN fueron alineadas empleando Clustal X 2.0 (Larkin et al.,

2007) con los parámetros por defecto (gapINFORMÁTICA opening = 15; gap extension = 6.66). En ambos casos, todas las secuenciasDE tuvieron la misma longitud y, por lo tanto, ningún gap fue introducido (Anexos 16 y 17). Se utilizó BioEdit v7.2.5 (Hall,

1999) para concatenar las secuencias de ADN, dando origen a una super matriz

compuesta por 6 secuencias de 842 pares de bases (328 pb de citocromo b y SISTEMAS 514pb de citocromo oxidasa I). jModelTest 2.1.7 (Darriba et al., 2012; Guindon & DE Gascuel, 2003) fue usado para seleccionar los modelos evolutivos más apropiados

para cada conjunto de datos bajo el Criterio de Información Bayesiano (BIC);

estos fueron el modelo HKY+I para cada gen independiente (Citb y COI) y el

DIRECCIONmodelo GTR+I para ambos genes concatenados (Citb + COI).

Los métodos de Máxima Parsimonia (MP), Máxima Verosimilitud (ML) e

Inferencia Bayesiana (IB) fueron empleados para el análisis filogenético de los

dos fragmentos de genes separados y de la matriz combinada. Tanto el análisis de

MP como el de ML se llevaron a cabo usando MEGA 6 (Tamura et al., 2013). En

el análisis de MP se utilizó el algoritmo de Max-mini Branch-&-bound y, en el

caso del análisis de ML, se realizó una búsqueda heurística empleando el método

de Nearest-Neighbor-Interchange (NNI), haciendo el árbol inicial mediante el

algoritmo de NJ/BioNJ. El análisis de IB se realizó en MrBayesCOMUNICACIÓN 3.2 (Ronquist et Y al., 2012) usando cuatro cadenas de un algoritmo de Cadena de Markov-Monte

Carlo con valores predeterminados. Todos los análisis empezaron con árboles

generados al azar y se hicieron correr para 2.0x106 generaciones en dos

ejecuciones diferentes con muestreos a intervalos de 200 que produjeron 10 000

árboles. Los primeros 2000 árboles fueronINFORMÁTICA descartados, y un árbol consenso fue

generado por la regla de la mayoríaDE (majority rule) a partir de los árboles

restantes. La frecuencia de cualquier clado particular entre los árboles

individuales que contribuyen al árbol consenso representa la probabilidad

posterior de ese cladoSISTEMAS (Ronquist et al., 2012); sólo aquellos valores iguales o por encima del 95%DE fueron considerados para indicar el apoyo suficiente (Wilcox et al., 2002). El soporte estadístico de los nodos de los árboles filogenéticos

obtenidos en los análisis de MP y ML fue evaluado usando el método Bootstrap

con 1000 repeticiones; en el caso del análisis de IB, el soporte estadístico de los DIRECCION nodos fue proporcionado por las probabilidades posteriores.

III. RESULTADOS

Los árboles obtenidos por el método de ML aplicado a las secuencias de genes

Citb y COI de forma independiente coincidieron en agrupar a los individuos

estudiados en una misma rama con un ancestro común, con respecto a las otras

especies de la familia Teiidae incluidas, corroborando la monofilia del género

Dicrodon (Figuras 1 y 2). Esto obtuvo un buen apoyo de los valores de bootstrap COMUNICACIÓN en ambos casos, aunque en el análisis de Citb posee un mejorY respaldo.

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION

Figura 1. Relaciones de los individuos del género Dicrodon con respecto a otras especies de la familia Teiidae basadas en el análisis de 328 pb del gen citocromo b. Microlophus peruvianus fue usado como grupo externo. Las cifras cercanas a los nodos son el valor de bootstrap de ML con 1000 repeticiones.

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA Figura 2. Relaciones de los individuos del género Dicrodon con respecto a otras especies de la familia Teiidae basadas en el análisis de 514 pb del gen citocromo oxidasa I. Microlophus peruvianus fue usado comoDE grupo externo. Las cifras cercanas a los nodos son el valor de bootstrap de ML con 1000 repeticiones.

Las secuencias parciales del gen mitocondrial citocromo b para especimenes de la

misma especie mostraronSISTEMAS una similitud del 99% (327/328) para ambos individuos

de D. heterolepisDE, y una identidad del 100% (328/328) para las especies D.

guttulatum y D. holmbergi; la secuencia de D. heterolepis se correspondió en un

93% con las secuencias de D. guttulatum (306/328) y D. holmbergi (305/328),

mientras que el grado de correspondencia entre estas últimas fue de 98% DIRECCION (321/328) (Anexo 16). Con respecto a citocromo oxidasa I, la similitud de las

secuencias entre individuos de la misma especie fue de un 99% tanto para D. 18

heterolepis (513/514) como para D. guttulatum (512/514); la secuencia de D.

heterolepis se correspondió en un 94% (484/514) con la de D. guttulatum y un

95% (487/514) con la de D. holmbergi, a la vez que las secuencias de estas

últimas se correspondieron en un 98% (505/514) (Anexo 17). Por otro lado, de los

842 pares de bases del conjunto de datos combinado (328 pb de citocromo b y 514

pb de citocromo oxidasa I), 194 fueron variables y 55, parsimoniamente

informativos.

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

Figura 3. Relaciones de los individuos del género Dicrodon basadas en 328 pb del gen mitocondrial citocromo b. Microlophus peruvianus fue usado como grupo externo. Tanto DIRECCIONel análisis de Máxima Parsimonia (MP), como los de Máxima Verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB) arrojaron topologías idénticas. Las cifras cercanas a los nodos son: valor de bootstrap de MP / valor de bootstrap de ML / valor de probabilidad posterior Bayesiana (sólo los valores iguales o superiores a 0.95 se indican con un asterisco “*”). 19

Los tres métodos empleados, Máxima Parsimonia, Máxima Verosimilitud e

Inferencia Bayesiana, realizaron estimaciones muy similares de las relaciones

entre los especímenes incluidos en el estudio y produjeron árboles con topologías

idénticas con algunas diferencias en los índices de bootstrap, tanto en los análisis

realizados a los genes citocromo b y citocromo oxidasa I por separado como en el

realizado a la matriz de los datos concatenados (Figuras 3, 4 y 5).

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

Figura 4. Relaciones de los individuos del género Dicrodon basadas en 514 pb del gen mitocondrial citocromo oxidasa I. Microlophus peruvianus fue usado como grupo externo. Tanto el análisis de Máxima Parsimonia (MP), como los de Máxima Verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB) arrojaron topologías idénticas. Las cifras cercanas a los nodos son: valor de bootstrap de MP / valor de bootstrap de ML / valor de DIRECCIONprobabilidad posterior Bayesiana (sólo los valores iguales o superiores a 0.95 se indican con un asterisco “*”).

Estos árboles mostraron que el género Dicrodon está conformado por dos grupos:

(1) un grupo basal con un fuerte respaldo en el que se encuentra D. heterolepis y

(2) un clado formado por D. guttulatum y D. holmbergi que está bien soportado en

los análisis de COI y Citb+COI, pero su apoyo es débil en Citb. De acuerdo a

esto, los linajes de D. guttulatum y D. holmbergi se encuentran más cercanamente

emparentados entre sí que con los individuos del grupo heterolepis, con respecto a

los cuales se pudo observarse una notoria división.

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

Figura 5. Relaciones de los individuos del género Dicrodon basadas en 328 pb de citocromo b y 514pb de citocromo oxidasa I. Microlophus peruvianus fue usado como DIRECCIONgrupo externo. Tanto el análisis de Máxima Parsimonia (MP), como los de Máxima Verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB) arrojaron topologías idénticas. Las cifras cercanas a los nodos son: valor de bootstrap de MP / valor de bootstrap de ML / valor de probabilidad posterior Bayesiana (sólo los valores iguales o superiores a 0.95 se indican con un asterisco “*”). 21

IV. DISCUSIÓN

La monofilia del género Dicrodon fue fuertemente respaldada en los árboles

obtenidos por el método de Máxima Verosimilitud; sin embargo, las relaciones

observadas entre las otras especies de la familia Teiidae deben tomarse con

cautela ya que los géneros Ameiva y Cnemidophorus son probablemente grupos

paráfileticos y, por lo tanto, las relaciones filogenéticas pueden variar de acuerdo COMUNICACIÓN a la elección de los taxones (Gimenes et al, 2007). El análisisY de los genes Citb y

COI por separado y del conjunto de datos combinado resultaron en la siguiente

configuración: ((D. guttulatum, D. holmbergi), D. heterolepis), confirmando la

relación cercana de los linajes de D. guttulatum y D. holmbergi con respecto a las

del grupo heterolepis, cuya divergencia, considerada válida en este estudio, INFORMÁTICA corroboraría que estas últimas representan a una especie separada, tal como se ha DE señalado en evaluaciones morfológicas previas (Tschudi, 1845; Burt & Burt,

1933; Schmidt, 1957; Peters & Donoso-Barros, 1970; Harvey et al, 2012).

En cuanto a D. guttulatumSISTEMAS y D. holmbergi, a diferencia del estudio molecular realizado por PollackDE (2009) donde se emplearon las secuencias de los genes 12S rARN y tARN-Val y que no arrojó diferencias entre ambos grupos, los resultados

del análisis filogenético indican que pertenecen a linajes diferentes. Estas

diferencias en los resultados pueden deberse a la variabilidad genética superior

DIRECCIONque presentan los genes codificantes Citb y COI (con respecto a los genes

ribosomales, por ejemplo) que los hace mucho más informativos en estudios de

sistemática taxonómicos bajos (Carranza, 2002).

Esta separación genética podría explicar las sutiles diferencias en la disposición

de las escamas granulares que rodean a los supraoculares, la cual es usualmente

utilizada con fines de diagnóstico. Según esto, en D. guttulatum el anillo de

escamas no rodea completamente a los supraoculares, encontrándose el primer

supraocular siempre en contacto con la escama frontal; por el contrario, en D.

holmbergi los supraoculares se encuentran completamente circundados por estas

escamas granulares y, aun cuando el anillo puede encontrarse estrechamente

interrumpido en la parte anterior, siempre separa la escama COMUNICACIÓN frontal del primer Y supraocular (Schmidt, 1957; Peters & Donoso-Barros, 1970). Con respecto a lo

anterior, estudios realizados por José Cei (2003, 2007) indican que los patrones de

distribución de las escamas supraoculares son características morfológicas

constantes que presentan variación entre los diferentes grupos taxonómicos y que,

por lo tanto, pueden ser empleados conINFORMÁTICA fines de diagnóstico. Otra característica

morfológica importante, aunque DE menos empleada, para diferenciar a ambos

grupos es la presencia de cuatro hileras de escamas antebraquiales en D.

holmbergi (Schmidt, 1957) en vez de las dos hileras que se aprecian en D.

guttulatum (DumérilSISTEMAS & Bibron, 1839; Garman, 1892; Boulenger, 1899; Noble, 1924; Schmidt,DE 1957).

Basado en los resultados obtenidos en el presente estudio (Figuras 3, 4 y 5), en las

diferencias morfológicas descritas en trabajos anteriores (Duméril & Bibron,

1839; Garman, 1892; Boulenger, 1899; Noble, 1924; Schmidt, 1957) y en los DIRECCION trabajos de cariotipo realizados por Gorman (1970) y Pollack (2009), que revelan

diferencias en la morfología de los cromosomas y establecen un número diploide

de 46 cromosomas para D. holmbergi y 56 cromosomas para D. guttulatum, se

propone que D. guttulatum y D. holmbergi representan a dos especies distintas; a

pesar de ello, más muestras de ADN de Citb y COI, así como de otros marcadores

mitocondriales y nucleares, además de adicionales estudios morfológicos,

ecológicos y biogeográficos son requeridos antes que los problemas de

nomenclatura entre estos grupos puedan ser completamente resueltos.

COMUNICACIÓN No obstante, teniendo en cuenta que D. guttulatum es una especieY endémica del Bosque Seco Ecuatorial de Perú y Ecuador (Venegas, 2005), que D. holmbergi se

encuentra restringido sólo a los valles de Virú y Chao (Schmidt, 1957; Pollack,

2009) y que no hay evidencias que ambos tipos de lagartijas habiten una misma

área geográfica, es posible afirmar que el aparente grado de divergencia genética, INFORMÁTICA morfológica y cariotípica se debe a que ambos linajes han estado separados por un DE largo tiempo y cuyas diferencias pueden haberse originado por vicarianza.

Más estudios son requeridos para evaluar el estado actual de las poblaciones de

estos tres taxones, especialmente de D. holmbergi y D. heterolepis que son SISTEMAS especies legalmente protegidas por Decreto Supremo N°004-2014-MINAGRI y DE cuya distribución esta limitada al territorio nacional, para profundizar el

conocimiento sobre estas especies y que puedan ofrecer buenas alternativas para

su consevación y la del bosque seco. DIRECCION

V. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en el presente trabajo con respecto a los grupos

Dicrodon heterolepis, Dicrodon guttulatum y Dicrodon holmbergi permiten

concluir que:

- Los tres taxones estudiados están incluidos en un mismo grupo

monofilético, el género Dicrodon. COMUNICACIÓN Y - Los individuos de D. guttulatum, D. holmbergi y D. heterolepis

pertenecen a linajes distintos.

- Los ejemplares de D. heterolepis divergen de D. guttulatum y D.

holmbergi tanto genética como morfológicamente, corroborando que se INFORMÁTICA trata de una especie separada. DE - D. guttulatum y D. holmbergi presentan diferencias genéticas,

morfológicas y cariotípicas que indican que representan a dos especies

distintas pero cercanamente emparentadas; sin embargo, se necesitan de

estudios complementariosSISTEMAS para que su taxonomía esté totalmente

esclarecida.DE

DIRECCION

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION

COMUNICACIÓN Y

ANEXOS

INFORMÁTICA

SISTEMAS

DIRECCION

Anexo 1. Representación del “cañan” en la iconografía Mochica (Lavallée, 1970).

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

Anexo 2. Cerámico de la cultura Mochica con representación de lagartijas (cañanes) (Museo Larco, 2010)

SISTEMAS DE

DIRECCION

Anexo 3. Trampa de carrizo para la captura tradicional de cañanes (A) Holmberg, 1957 (B) Pollack, 2009. 34

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

Anexo 4. Principales características morfológicas de las especies del género Dicrodon. DIRECCIONEscamas dorsales de (A) Dicrodon heterolepis, (B) Dicrodon guttulatum y (C) Dicrodon holmbergi. Escamas supraoculares de (D) Dicrodon guttulatum y (E) Dicrodon holmbergi.

COMUNICACIÓN Y

Anexo 5. Extracción de muestras de tejido muscular de la cola.

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION Anexo 6. (A) Incubación de las muestras a 55°C. (B) Apariencia de la muestra después de la digestión; el tejido ya no es visible y el buffer toma una apariencia lechosa.

COMUNICACIÓN Y

Anexo 7. Separación de fases orgánica y acuosa durante purificación con fenol/cloroformo.

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION

Anexo 8. ADN precipitado con isopropanol.

Anexo 9. Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría.

COMUNICACIÓN Anexo 10. Estimaciones de la concentración de ADN en cada muestraY obtenidas mediante espectrofotometría. El * indica las muestras que fueron amplificadas y secuenciadas.

Muestra Concentración Concentración Nombre Repetición inicial (µg/ml) final (µg/ml) A 12.35 2.083 Microlophus peruvianus B* 10.65 2.083 C INFORMÁTICA2.050 2.050 A DE 3.500 2.083 Dicrodon heterolepis1 B 4.100 2.083 C* 5.100 2.083 A 1.200 1.200 Dicrodon heterolepis2 B* 1.800 1.800 SISTEMAS C 1.800 1.800 DE A 2.100 2.100 Dicrodon guttulatum1 B 2.900 2.083 C* 2.950 2.083 A* 2.550 2.083 Dicrodon guttulatum2 B 1.500 1.500 DIRECCION C 1.250 1.250 A 2.100 2.100 Dicrodon holmbergi B* 2.450 2.083 C 2.800 2.083

COMUNICACIÓN Y Anexo 11. Visualización de los fragmentos de ADN extraídos en gel de agarosa. El * indica las muestras que fueron amplificadas y secuenciadas.

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION

Anexo 12. Técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa. (A) Preparación del Master Mix. (B) Termociclador Applied Biosystems Veriti de 96 pocillos para tubos de 0,2ml.

Anexo 13. Lista de los cebadores usados para amplificar y secuenciar los genes mitocondriales. Los códigos de ambigüedad son R=A/G, W=A/T y Y=C/T.

Gen Cebador Secuencia (5’-3’) Referencia

Cyt b1 CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA (Kocher et al., Citb 1989) Cyt b2 CCC TCA GAA TGA TAT TTG TCC TCA

COI-a CCT GCA GGA GGA GGA GAY CC COI (Palumbi, 1996) COI-b CCA GAG ATT AGA GGG AAT CAG TG

COMUNICACIÓN Y

Anexo 14. Estimaciones de la concentración de ADN amplificado en cada producto de PCR obtenidas mediante espectrofotometría.

Concentración en Gen Muestra (ng/µl) Microlophus peruvianus 7.650 INFORMÁTICA Dicrodon heterolepis1 8.400 DE Dicrodon heterolepis2 8.150 Citb Dicrodon guttulatum1 8.250

Dicrodon guttulatum2 9.500 SISTEMAS Dicrodon holmbergi 9.150 DE Microlophus peruvianus 9.000

Dicrodon heterolepis1 9.250

Dicrodon heterolepis2 8.700 COI DIRECCION Dicrodon guttulatum1 11.30

Dicrodon guttulatum2 11.30

Dicrodon holmbergi 11.65

COMUNICACIÓN Y Anexo 15. Visualización de los fragmentos de ADN amplificados en gel de agarosa. En ambos casos, los carriles 1= marcador de peso molecular, 2= control negativo, 3= Microlophus peruvianus, 4= Dicrodon heterolepis1, 5= Dicrodon heterolepis2, 6= Dicrodon guttulatum1, 7= Dicrodon guttulatum2 y 8= Dicrodon holmbergi.

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE

DIRECCION

. b

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS

DE del parciales gen citocromo mitocondrial de ineamiento secuencias las múltiple Al

. 6 1

Anexo

DIRECCION

COMUNICACIÓN Y

INFORMÁTICA DE

SISTEMAS DE ineamiento múltiple de las secuencias parciales del gen mitocondrial citocromo oxidasa I. del oxidasa parciales gen citocromo mitocondrial de ineamiento secuencias las múltiple Al

. 7 1

Anexo DIRECCION