INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA

ANA PAULA COSTA DE CARVALHO

Manaus, Amazonas

Junho 2014 i

Ana Paula Costa de Carvalho

CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA

Orientador: Ph.D. Tomas Hrbek

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção de título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus, Amazonas Junho 2014

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C331c Carvalho, Ana Paula Costa de Código de barras de DNA como ferramenta para o estudo da biodiversidade de peixes da família Cichlidae na bacia Amazônica / Ana Paula Costa de Carvalho. --- Manaus: [s.n.], 2014. xii, 86 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2014. Orientador: Tomas Hrbek. Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

1. DNA Barcoding. 2. Conservação. 3. Ictiofauna. 4. Neotropical. I.Título CDD 597.58

Sinopse:

Estudou-se a metodologia do código de barras de DNA (gene

COI) para identificar e delimitar a ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. O código de barras de DNA conseguiu discriminar a maioria das espécies analisadas e sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies.

Palavras-chave: Citocromo oxidase I, espécies crípticas, identificação.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus pela minha existência, pela dádiva de viver e por abençoar sempre o meu caminho.

Aos meus Familiares, principalmente aos meus Avós (Raimundo Ferreira da Costa e Maria Mendes da Costa) e aos meus Pais (Domingos Marques de Carvalho e Euzemar Costa de Carvalho) que moram no meu coração, pelo afeto e carinho, pelos conselhos que me ajudaram a vencer na estrada da vida e pelo incentivo na minha determinação, devo tudo isso à vocês.

Ao Francisco Martins de Castro, meu esposo, pelo companheirismo, amor, carinho, dedicação, apoio e compreensão nas fases difíceis da minha vida e pela vitória conquistada.

Ao Professor Dr. Tomas Hrbek pela orientação, confiança e ajuda durante a execução deste trabalho.

A Profª. Dra. Izeni Pires Farias pelo apoio e ensinamentos durante o desenvolvimento da minha dissertação.

Agradeço o Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA pela oportunidade de mestrado. Os Professores do programa que se dedicaram em repassar conhecimentos essenciais ao meu aprendizado e para a minha formação profissional durante as disciplinas. E também a secretária Alessandra, sempre disposta a atender nossas solicitações.

A Universidade de Federal do Amazonas (UFAM) pelo espaço utilizado do Laboratório de Genética (LEGAL) para execução das análises do meu mestrado.

A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos e pelo financiamento deste projeto de pesquisa juntamente com a CNPq e FAPEAM.

Aos colegas (José, Valéria, Deyla, Natasha, Sarah, Gabi, Mário, Adriano, Júlia, Olavo, Concy, Elciomar, Fabrício, Fabinho e Emanuel) do Laboratório de Evolução e Genética

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Animal (LEGAL)/UFAM que voluntariamente me ajudaram a realizar este trabalho. Obrigada pela colaboração, incentivo e atenção!

Aos pesquisadores e amigos do INPA e do LEGAL pela receptividade e colaboração em realizar as coletas e identificar as amostras.

Enfim, agradeço a todos, que de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho.

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"Há homens que lutam um dia e são bons. Há outros que lutam um ano e são melhores. Há os que lutam muitos anos e são muito bons. Porém, há os que lutam toda a vida. Esses são os imprescindíveis."

Bertolt Brecht.

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RESUMO

Os ciclídeos neotropicais constituem um grupo variado, no qual compreendem cerca de 60 gêneros e pelo menos 1300 espécies são reconhecidas. São distribuídas na América Central e do Sul, Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, litoral do sul da Índia. A diversidade encontrada na família Cichlidae abrange os mais diferentes aspectos morfológicos e ecológicos, que facilitam na adaptação dos peixes desta família. Além disso, evidências com base nos dados moleculares mostraram que a maior parte da diversificação da ictiofauna Neotropical ocorreu recentemente. Estas características tornam difícil a compreensão da taxonomia e identificação dessa fauna, tornando um grande desafio para as ferramentas moleculares. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo testar a eficácia da metodologia do código de barras de DNA (gene COI) para identificar e delimitar a ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. Para esta finalidade, foram analisadas 59 espécies de peixes na bacia Amazônica, sendo amostrado por até cinco espécimes, identificadas a priori morfologicamente, e obtidas 147 sequências de código de barras de DNA. Foram combinados os dados morfológicos com os moleculares, onde apenas nove espécies apresentaram concordância em ambos os métodos de identificação. Das 45 espécies analisadas, 40 (88,8%) foram corretamente identificadas pelas sequências de códigos de barras. Os principais valores de divergência genética intraespecífica e interespecífica pelo K2P nos agrupamentos moleculares foram 0% e 55%. E verificou-se sete espécies crípticas (15,5%), sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (11,2%) mostraram ausência de monofilia recíproca. Este estudo é o primeiro analisar um grande número de espécies de peixes de água doce da região Neotropical, incluindo um grande número de espécies estreitamente relacionadas. Os resultados confirmaram a eficácia do código de barras para sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies, que passaram recentemente por um processo de irradiação, além de discriminar a maioria das espécies analisadas. Os resultados também revelaram divergências genéticas sugestivas de isolamento reprodutivo e especiação críptica em sete espécies. Enfim, os resultados obtidos contribuirão significamente para o projeto Internacional do Código de Barras da Vida, e para a campanha -BOL fornecendo as sequências de código de barras para uso na identificação dessas espécies por especialistas e não-especialistas, e permitindo-lhes estar disponível para uso em outras aplicações.

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ABSTRACT

The Neotropical are a diverse group, which comprises about 60 genera and at least 1300 are recognized. They are distributed in Central and , Texas, West Indies, Africa, Madagascar, Syria, Israel, Iran, Sri Lanka, southern coast of India. The diversity found in the family covers the most different morphological and ecological aspects that facilitate the adaptation of this fish family. In addition, evidence based on molecular data showed that most of the diversification of the Neotropical fish fauna occurred recently. These features make it difficult to understand the and identification of this fauna, becoming a major challenge for molecular tools. In this context, this study aimed to test the effectiveness of DNA barcode methodology (COI gene) to identify and delineate the diverse ictiofauna of freshwater cichlids in the Neotropics. For this purpose, 59 species of Amazon basin fish were analyzed, being sampled by up to five specimens, morphologically identified beforehand, and 147 DNA barcode sequences obtained. Morphological data were combined with the molecular where only nine species showed agreement in both methods of identification. Of the 45 species analyzed, 40 (88.8%) were correctly identified by the barcode sequencing. The main values of intraspecific and interspecific genetic divergence by K2P in molecular clusters were 0% and 55%. Seven cryptic species (15.5%) as well as seven complexes of species (15.5%) were verified and approximately five species (11.2%) showed absence of mutual monophyly. This study is the first to analyze a large number of freshwater fish species in South America, including a large number of closely related species. The results confirmed the effectiveness of barcode to signal cryptic species and species complexes, which have recently undergone a process of irradiation, in addition to discriminate most species analyzed. The results also revealed genetic differences suggesting reproductive isolation and cryptic speciation in seven species. Finally, the results will contribute significantly for the Life Barcode International Project, and for the FISH-BOL campaign providing sequences of barcodes on the identification of these species by specialists and non-specialists, as well as allowing them to be available for use in other applications.

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SUMÁRIO

Pág. RESUMO……………………………………………………………………….. vi

ABSTRACT..…………………………………………………………………… vii

1. INTRODUÇÃO GERAL……………………………………………………. 13 1.1 Biologia e Ecologia dos Ciclídeos...... 13 1.2 História Biogeográfica dos Ciclídeos...... 18

1.3 Código de Barras de DNA...... 19

CAPÍTULO I...... 23 Artigo I...... 24 2. CONSIDERAÇÕES GERAIS...... 47 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 47

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LISTA DE TABELAS

Pág. Tabela 1. Nomes das espécies, baseadas nas identificações morfológicas, que 59 foram analisadas no presente estudo. Tabela 2. Nome e referências das seqüências dos primers usados na 67 amplificação e seqüenciamento. Tabela 3. Número de espécies que foram identificadas pelo banco de dados online BOLD (Barcode of life) e NCBI (National Center Biotechnology 71 Information). Tabela 4. Valores médios das divergências intraespecífica e interespecífica do gene COI (divergência mínima, média, máxima e desvio padrão) das 147 71 sequências obtidas pelo método de Kimura-2-parâmetros. Tabela 5. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) entre os 72 genêros de Ciclídeos amazônicos representados por mais que uma espécie. Tabela 6. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos classificados morfologicamente e representados por mais de um 72 espécime. Tabela 7. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos classificados molecularmente e representados por mais de um 74 espécime. Tabela 8. Número de linhagens biológicas encontradas para cada espécie de 75 ciclídeos na Bacia Amazônica. Tabela 9. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos delimitados molecularmente pelo modelo Generalized Mixed Yule 77 Coalescent (GMYC). Tabela 10. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos classificados morfologicamente. 82

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LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Representação da morfologia externa de um Ciclídeo. 14 Figura 2. Placas dentígeras faringianas em Cichlasoma minckleyi e Crenicichla chicha. 14 Figura 3. Mapa do genoma mitocondrial de Arapaima gigas representando os principais 18 genes. O citocromo c oxidase é mostrada em vermelho. Figura 4. Esquema do barcoding gap. Em vermelho mostra a distribuição da variação 20 intraespecífica e em amarelo a variação interespecífica.

Capítulo I.

Figura 1. Localidades onde foram realizadas as amostragens das espécies de ciclídeos realizados na bacia hidrográfica da Amazônia. Os números correspondem aos locais 28 de amostragem: 1 – Rio Araguaia; 2 – Rio Xingu; 3 – Rio Tapajós; 4 – Rio Purus; 5 – Rio Jatapu; 6 – Rio Negro. Figura 2. Árvore com as espécies delimitadas pelo modelo GMYC, construídas a 68 partir de 147 sequências de código de barras de DNA.

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1. INTRODUÇÃO GERAL

1.1 Biologia e Ecologia dos Ciclídeos

Os primeiros estudos com a família Cichlidae foram realizados por Heckel em 1840, e posteriormente por Jardine em 1843. Em 1904, Pellegrin conseguiu revisar todos os gêneros e espécies da família conhecidas por ele com base em diagnósticos morfológicos. Entre 1905 a 1906 Regan fez uma série de revisões taxonômicas nas espécies e gêneros da família, o que melhorou significativamente as classificações dos táxons Neotropicais (Kullander, 2003). Porém, a primeira revisão filogenética para o grupo dos ciclídeos neotropicais foi feita apenas em 1976 por Cichocki (Kullander, 2003). Mais recentemente, revisões taxonômicas com base em dados morfológicos e moleculares foram feitos por Kullander (1998), Farias et al. (1999), Farias et al. (2000), Sparks e Smith (2004), Kocher (2004), López-Fernandez et al. (2005), Smith et al. (2008), López-Fernández et al. (2010), Hulsey et al. (2010), Hulsey et al. (2011) e McMahan et al. (2013) proporcionando hipóteses filogenéticas com base na morfologia e dados moleculares respectivamente. Os peixes ciclídeos são conhecidos pela sua rápida especiação simpátrica e radiação adaptativa - processos biológicos - nos quais permitiram a colonização dos lagos africano (Malawi, Victoria e Tanganyika) e das regiões neotropicais (Genner et al., 2007; López- Fernández et al. 2013; Hilary e López-Fernández, 2013). Somente nesses lagos, nos últimos milhões de anos, surgiram mais de 1.000 espécies de peixes de água doce (Allender et al., 2003). Dessa forma, os ciclídeos formam um dos grupos mais diversos de peixes de água doce do mundo, com aproximadamente 1900 espécies descritas (Kullander, 1998, 2003). A diversidade encontrada neste grupo abrange os mais diferentes aspectos que variam desde as características morfológicas e ecológicas, que facilitam na adaptação dos peixes desta família (Kullander, 2003). Os ciclídeos neotropicais também constituem um grupo variado, no qual compreendem cerca de 60 gêneros e estima-se que mais de 1300 espécies são reconhecidas (López-Fernandez et al., 2010, Kullander, 2003). Apresentam 7-24 espinhos na nadadeira dorsal e 2-12 na nadadeira anal, uma única narina em cada lado da cabeça e corpo comprimido lateralmente. A linha lateral é geralmente dividida em uma porção anterior- superior terminando abaixo da extremidade da base da nadadeira dorsal, e uma porção posterior-inferior correndo ao longo do meio do pedúnculo caudal (Figura 1) (Kullander,

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2003; Froese e Pauly, 2012).

Figura 1. Representação da morfologia externa de um Ciclídeo. Fonte: Fishbase.

As maxilas são geralmente móveis e apresentam protrusão (Froese e Pauly, 2012; Sampaio e Guolart, 2011). Há uma variação considerável na forma da placa dentária associada à dieta especializada. Também possuem placas dentígeras faringianas (Varela et al., 2012) (Figura 2) utilizadas na mastigação que sustentam a monofilia do grupo (Kullander, 2003). Esse complexo maxilar da faringe que se localiza atrás da cavidade bucal é funcionalmente dissociado das maxilas, e apresenta grande diversificação de formas e funções entre as espécies desta família (Meyer 1993 apud Sampaio e Goulart, 2011).

Figura 2. Placas dentígeras faringianas em Cichlasoma minckleyi (A e B) e Crenicichla chicha (C). Fonte: Figura adaptada deDe Trapani, um modo 2003 geral, in: Sampaio os ciclídeos e Goulart possuem 2012; Varela cuidado et al., 2012. parental (incubação oral ou depósito de ovos em superfícies) e o seu comprimento do corpo varia de 25-30 mm para as espécies dos gêneros Apistogramma e Taeniacara a aproximadamente um metro em Cichla temensis (Kullander, 2003). A família também é caracterizada por diversos padrões de cores entre as espécies do mesmo gênero, que são explicados pela atuação da seleção divergente ou disruptiva nas suas colorações, nos quais permitiram formar uma ampla variação no grupo de ciclídeos (Allender

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et al., 2003). Essas colorações auxiliam na escolha do parceiro, onde os machos, geralmente têm cores mais evidentes do que as fêmeas (Dalton et al., 2010). Os ciclídeos apresentam diferenças de diversificação entre os clados de espécies “fenotipicamente crípticas” e radiações que muitas vezes contêm espécies “geneticamente crípticas” (Hulsey, 2009; Perazzo, 2010; Martins-Santos et al., 2014). Esses complexos de espécies muitas das vezes, dificultam na delimitação das espécies de um grupo, pois em alguns grupos distintos aparentam pouca ou nenhuma diferença fenotípica, enquanto que em outros casos, apresentam grandes diferenças fenotípicas que facilitam na delimitação das diferentes linhagens (Hulsey, 2009). Até a década de 90, estimava-se que cerca de 160 táxons não tinham sido descritos na América do Sul (Kullander, 1998, 2003). Porém, recentemente diversas espécies de ciclídeos foram descritas morfologicamente, na bacia amazônica, entre elas: Apistogramma angayuara e Apistogramma salpinction no rio Trombetas (Kullander e Ferreira, 2005); sveni e G. neambi na drenagem do rio Tocantins (Lucinda et al., 2010); Dicrossus foirni e Dicrossus warzeli nos rios Tapajós e rio Negro (Römer et al., 2010); Krobia xinguensis no rio Xingu (Kullander, 2012) e Crenicichla chicha no rio Tapajós (Varella et al., 2012). Em outras localidades do Brasil, também já foram descritas novas espécies de ciclídeos: Laetacara araguaiae na cidade de Rio Verde no estado de Goiás (Ottoni e Costa, 2009); Australoheros perdi no Vale do Rio Doce no sudeste do Brasil (Ottoni et al., 2011); Australoheros tavaresi, Australoheros mattosi e Australoheros montanus nas bacias dos rios São Francisco, Paraná e Paraíba do Sul, sudeste do Brasil (Ottoni, 2012); Laetacara flamannellus no estado do Amapá (Ottoni et al., 2012). Quanto à distribuição da família, podem ser encontrados na América Central e do Sul, Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, e no litoral do sul da Índia (Kullander, 2003; Froese e Pauly, 2012). Na América do Sul, habitam locais lênticos dentro de rios e córregos, e algumas espécies dos gêneros Crenicichla, Teleocichla e são considerados reofílicos (Kullander, 2003). Na América do Sul, o sistema fluvial amazônico passou por grandes transformações geológicas, destacando-se a mudança no sentido da drenagem dos rios de leste-oeste para oeste-leste (Lundberg et al., 1998; Albert et al., 2006). Ocorreu a formação do Lago Pebas (15-10 Ma) que ocupou a Amazônia Ocidental, no qual foi separada da Amazônia Central e Leste pelo Arco Purus, promovendo possivelmente a diversificação alopátrica. Com o surgimento da cordilheira andina venezuelana e depois o surgimento do arco Uapes (12 Ma) ocorreu o rompimento do Arco Purus, possibilitando a reconexão entre a Amazônia Ocidental

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e a Amazônia Central e Leste, permitindo uma colonização recíproca de faunas endêmicas nessas bacias. Além desses eventos geomorfológicos, as incursões marinhas também influenciaram na diversificação e colonização de vertebrados na Amazônia (Lovejoy et al., 2006; Lundberg, 1998; Farias e Hrbek, 2008). A bacia amazônica é composta por três estruturas geológicas diferentes: (i) a Cordilheira dos Andes, à Oeste; os (ii) Escudos Cristalinos, da Guiana ao Norte e do Brasil ao Sul; e (iii) a planície sedimentar (Ruffino, 2004). Os rios são classificados de acordo com suas condições físico-químicas, no qual se diferencia nas cores de águas brancas, claras e pretas (Sioli, 1950). Os rios de águas brancas possuem suas nascentes na região andina e os tributários são os afluentes da margem direita, como os rios Juruá, Purus e Madeira e na margem esquerda, o rio Içá e Japurá. Os de águas claras, são transparentes e esverdeadas devido as baixas quantidades de sedimentos e de sólidos dissolvidos, entre eles estão os rios Tapajós, Xingu, Trombetas, Branco, Nhamudá, Tocantins, Araguaia e Paru se originam nas encostas dos escudos das Guianas e do Brasil. A bacia sedimentar Amazônica possui cerca de 2 milhões de km2 e possui sedimentos dos Escudos Cristalinos e dos Andes que se depositaram no vale Amazônico, durante o Terciário e Quaternário. Ela drena águas escuras do rio Negro, Jutaí, Tefé e Coari (Junk et al., 2011; Junk et al., 2012; Ruffino, 2004). Apesar dos diferentes processos geológicos e climáticos terem influenciados na distribuição e diversificação dos ciclídeos amazônicos, estimativas a cerca da biodiversidade do grupo ainda são incertas e muitas espécies necessitam ser identificadas e descritas (Farias et al., 2001). Até o momento, a maioria das espécies foi identificada por meio de análises morfológicas utilizando chaves de identificações (www.barcoding.si.edu), porém, caracteres morfológicos podem não ser eficientes para diagnosticar as espécies de ciclídeos (Colatreli et al., 2012). Pois, existem evidências de compartilhamento de haplótipos entre os diferentes grupos fenotípicos e espécies (Farias e Hrbek, 2008; Colatreli et al., 2012; Willis et al., 2007; Willis et al., 2012). Os ciclídeos além de apresentarem rápido tempo de geração e idade reprodutiva, possuem alta diversidade e adaptação, ampla distribuição, ocorrência de espécies crípticas, podendo levar a subestimação de suas espécies. Também sofrem com a influência das variações sazonais e fatores geológicos, no aspecto biológico, ecológico e genético do grupo, o que pode afetar as suas populações (Crampton, 2008). Portanto, torna-se importante entender a organização, distribuição e diferenciação genética das espécies deste grupo de peixes numa determinada bacia hidrográfica, como a bacia Amazônica, de modo, que posteriormente possam ser definidas melhores estratégias conservacionistas (Frankham et al.,

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2008).

1.2 História Biogeográfica dos Ciclídeos

Os fósseis mais antigos dessa família datam do Eoceno na América do Sul e do Oligoceno da África (Murray, 2001). Assim, acredita-se que surgiram ainda no Cretáceo e sua a filogenia molecular e morfológica demonstra que os ciclídeos são monofiléticos (Stiassny, 1991; Farias et al., 1999; Chakrabarty 2004; Sparks e Smith, 2004, 2005). Existem duas abordagens a cerca da distribuição disjunta dos ciclídeos nos continentes, uma está relacionada com a dispersão que ocorreu pela transposição de uma barreira geográfica, que colaborou na exploração de novas áreas e no processo de especiação. Esta hipótese pode ser mais provável, devido à evidência do registro fóssil, estimativas de divergência do relógio molecular e a tolerância ao sal de alguns ciclídeos (Murray, 2001; Vences et al 2001; Briggs 2003). De acordo com Murray (2001), com a fragmentação da Gondwanna (entre 135 a 65 milhões de anos), dois grupos teriam se formado distintamente: os ciclídeos africanos (Velho Mundo) e os ciclídeos sulamericanos. A linhagem africana migrou para a América do Sul e depois se espalhou facilmente para a América Central e Norte (Murray, 2001). Segundo esse mesmo autor, existem muitos exemplos de espécies de ciclídeos que toleram a salinidade o qual não seria uma barreira à dispersão desses ciclídeos no passado, e, portanto, a distribuição desse grupo não é estritamente Gondwana. E a outra abordagem se atribui ao evento vicariante que separou as populações por uma fragmentação (separação do supercontinente da Gondwana), determinando assim, a distribuição da fauna de ciclídeos (Farias et al., 2000; Chakrabarty, 2004; Sparks e Smith, 2005). Segundo essa hipótese, os estudos realizados com filogenia dos ciclídeos mostram coerências com a hipótese da fragmentação da Gondwana. Como por exemplo, Farias et al. (1999), mostraram que os ciclídeos de Madagascar e Indianos formavam linhagens basais, além de serem grupo irmãos com os clados africanos e neotropicais, cuja relação coincide com a separação do continente Madagáscar e Indiano. Os ciclídeos neotropicais e africanos divergiram posteriormente após a abertura do Oceano Atlântico Sul. Já Spark e Smith (2004), verificaram que o ancestral comum sofreu divisão, formando dois clados: o Etroplinae no continente Madagáscar-Índia, e o clado Ptychochrominae formado Madagáscar e África + América do Sul. O grupo formado por Madagáscar e Índia (Etroplinae) foi separado no

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Cretáceo, dessa forma, baseado nessas relações e nas evidências geológicas de peixes ciclídeos, eles argumentaram que a atual distribuição de Cichlidae é congruente com vicariância Gondwana (Spark e Smith, 2004).

1.3 Código de Barras de DNA

Atualmente existem limitações em estudos taxonômicos que são baseados apenas em análises morfológicas, sendo assim, a inclusão de dados moleculares torna-se oportuno e necessário para discriminar e identificar os táxons (Moritz e Cicero, 2004), como por exemplo, os ciclídeos (Ribeiro, 2007). Em 2003, pesquisadores da Universidade de Guelph, em Ontário, Canadá, propuseram um "código de barras de DNA", que poderia auxiliar no processo de identificação e delimitação das espécies (Savolainen et al., 2005). Esse código de barras se baseia num pequeno fragmento padronizado, com apenas 648 pares de bases, do genoma mitocondrial (DNAmt), o citocromo c oxidase subunidade I (COI) (figura 3) (Hebert et al., 2003a; Hebert et al., 2003b; Stoeckle, 2003).

Figura 3. Mapa do genoma mitocondrial de Arapaima gigas representando os principais genes. O citocromo c oxidase é mostrada em vermelho (Hrbek e Farias, 2008).

A escolha pelo DNAmt para distinguir as espécies visou pelas suas maiores diferenças nas sequências dos ácidos nucléicos entre as espécies e pela abundância de cópias em relação ao DNA nuclear, tornando-o bastante informativo e fácil de ser recuperado a partir de amostras pequenas ou parcialmente degradas (Stoeckle e Hebert, 2008). Ele é compartilhado entre táxons variados, possui elevadas substituições neutras na terceira posição do nucleotídeo

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e não contêm íntrons, os quais podem dificultar a amplificação usando a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Stoeckle, 2003; Hebert et al., 2003a). O código de barras de DNA é caracterizado pela presença de primers universais de uma região específica que flanqueiam regiões das sequências conservadas; codifica parte da enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial e gera sinais filogenéticos (Hebert et al., 2003b; Hebert e Gregory, 2005). Entre os fatores que determinam a efetividade deste sistema taxonômico estão: baixa divergência intraespecífica, estruturação populacional e o tamanho efetivo populacional (Meyer e Paulay, 2005; Ortiz, 2010). A variação intraespecífica consiste nas diferenças genéticas comuns entre indivíduos da mesma espécie. A divergência interespecífica são as diferenças que se acumulam entre as espécies (Hartl, 2008). A sobreposição entre as distâncias genéticas entre espécies estreitamente relacionadas (divergência interespecífica) e maior variação intraespecífica originam espécies geneticamente polifiléticas e parafiléticas, dificultando a delimitação dos organismos pelo marcador COI (Meyer e Paulay, 2005; Tofolli et al., 2008). Assim, as variações intraespecíficas devem ser sempre menores que as divergências interespecíficas para que as espécies sejam reconhecidas através deste método (Figura 4) (Hebert 2003b; Stoeckle, 2003; Ortiz, 2010). Dessa forma, a variação intraespecífica é inversamente proporcional ao tamanho do barcoding gap. E a estrutura populacional também pode afetar o barcoding gap na medida em que ele irá afetar a variação intraespecífica (Ortiz, 2010). Por isso, é importante a amostragem para melhor desempenho do código de barras, uma vez que o número amostral e dos pontos de coletas forem insuficientes, pode-se interferir nos resultados e acabar subestimando as variações intraespecíficas e superestimar as divergências interespecíficas e facilitar na visualização do barcoding gap (Meyer e Paulay, 2005; Ortiz, 2010). Assim, o barcoding gap é uma diferença clara entre as distâncias genéticas interespecíficas e intraespecíficas que facilita a delimitação dos táxons. O critério consiste em que a distância genética interespecífica deve ser 10 vezes maior do que a distância intraespecífica (Hebert et al., 2004b; Wiemers e Fiedler, 2007). Em casos de alta variação intraespecífica o barcoding gap torna-se ausente (Ortiz, 2010). Para Barret e Hebert (2005) é fundamental determinar esses intervalos de variação intra e interespecífica entre os diferentes grupos taxonômicos. Outro critério importante para a existência do barcoding gap é o tamanho efetivo populacional (Ne). Pois, em casos que existam Ne grande necessita-se de mais tempo para a separação total e diferenciação entre as populações, além de aumentar a probabilidade de se

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encontrar alta variação intraespecífica, e consequentemente, a não visualização do barcoding gap (Ortiz, 2010; Toffoli et al., 2008).

A

B Distância Genética

Figura 4. EsquemaA do barcoding gap. Em vermelho mostra a distribuição da variação intraespecífica e em amarelo a variação interespecífica. (A) Para efetividade do DNA Barcoding, com distribuições discretas e sem sobreposição. (B) Uma versão alternativa do mundo com significativa sobreposição e sem gap (Fonte: Meyer e Paulay, 2005).

Desde o início da descoberta e utilização do código de barras de DNA em diversas pesquisas, essa metodologia vem sofrendo algumas críticas. Os críticos argumentam algumas falhas nesse novo método molecular, entre elas, o uso de distâncias genéticas para a construção de árvores e utilizar árvores a partir de um único gene para inferir filogenias (DeSalle et al. 2005); divergência genética interespecífica para delimitar as espécies (Moritz e Cicero 2004; Wiemers e Fiedler 2007); além do baixo desempenho numa amostragem insuficiente (Meyer e Paulay, 2005). Outros autores afirmam que um pequeno segmento do DNA mitocondrial como uma única fonte de dados, não pode representar o genoma completo para estudo da biodiversidade e substituir a taxonomia clássica (Dunn, 2003; Lipscomb et al., 2003; Mallet e Willmott, 2003; Will e Rubinoff, 2004; Ebach e Holdrege, 2005; Will et al., 2005). Porém, os defensores afirmam que o código de barras de DNA está cada vez mais refinado e a caminho de tornar-se uma ferramenta essencial para identificação e delimitação das espécies (Hajibabaei et al. 2006; Kress e Erickson 2008; Janzen et al., 2009). A abordagem permite delimitar grupos geneticamente distintos, principalmente espécies crípticas (Hebert et al. 2004a), de forma rápida e precisa (Hebert e Gregory, 2005; Gómez et al., 2007), que são espécies indistinguíveis morfologicamente que vivem em localidades

21

diferentes, porém não se intercruzam (Futuyma, 2002). E também os complexos de espécies que são morfologicamente semelhantes e vivem numa mesma área, mas não se intercruzam. Para Rach et al. (2008), a utilização dos códigos de barras de DNA baseado em presença ou ausência de substituições de nucleotídeos distintos, mostrou-se ser uma ferramenta eficaz para a identificação, discriminação e delimitação dos grupos em qualquer nível taxonômico. Essa nova ferramenta já foi utilizada em diversos trabalhos com grupos de invertebrados e vertebrados, tais como: insetos (Hebert et al., 2004a; Hajibabaei et al., 2006; Rach et al., 2008; Janzen et al., 2009; Silva-Brandão et al., 2009; Dincã et al., 2011; Park et al., 2011; Webb et al., 2012); anelídeos (Oceguera-Figueroa et al., 2010); aves (Hebert et al., 2004b); morcegos (Clare et al., 2011) e principalmente para o grupo dos peixes (Ward et al., 2005, 2009; Frederico et al. 2012; Chakrabarty, 2006). Pereira et al. (2011a) observaram que a espécie de Piabina argentea é formada por mais de uma unidade biológica. Colatreli et al. (2012), verificaram a existência de cinco espécies hipotéticas para o ciclídeo do gênero Astronotus. Pereira et al. (2011b) utilizaram o código de barras de DNA em peixes de água doce da bacia Paraíba do Sul no estado de São Paulo e conseguiram discriminar todas as 58 espécies analisadas, entre elas a espécie Geophagus proximus. León-Romero et al. (2012) utilizaram o código de barras de DNA no grupo de espécies Herichthys bartoni para testar a monofilia e eficência desta ferramenta para discriminar as espécies. Nwani et al. (2011) aplicaram o código de barras em 38 gêneros de famílias diferentes em peixes de água doce na Nigéria e verificaram que o COI conseguiu separar a maioria das espécies de ciclídeos, com exceção para as espécies Oreochromis niloticus e Sarothrodon boulengeri que houve compartilhamento de haplótipos. As ferramentas moleculares vêm contribuindo cada vez mais para a identificação das espécies crípticas e a utilização das sequências das diversas pesquisas conservacionistas com o código de barras de DNA, são atualmente, inseridas no banco de dados de código de barras da vida (BOLD, www.barcodinglife.org), juntamente com uma imagem e informação de garantia para cada espécime voucher (Hajibabaei et al., 2006). O Banco de Dados do Código de Barras da Vida (em BOLD) consiste numa plataforma de informática que auxilia na aquisição, armazenamento, análise e publicação de códigos de barras de DNA (Ratnasingham e Hebert, 2007). A análise dos dados, do projeto código de barras da vida é realizada pelo CBOL (Consórcio para o Código de Barras da Vida), que é uma colaboração internacional de 170 organizações com membros de 50 países. O objetivo é estabelecer uma biblioteca pública de

22

sequências de DNA ligadas aos espécimes nomeados (www.barcoding.si.edu). Existe uma necessidade de estabelecer e fazer cumprir as normas dos dados e para isso, a CBOL iniciou diálogo com os grandes repositórios genômicos, como por exemplo, National Center for Biotechnology Information – NCBI. Esse sistema estabelece orientações formais que devem ser cumpridas para os registros obter a designação de código de barras de DNA. Este trabalho constitui-se então num aporte importante para consolidação da base de dados no projeto universal Barcode da Vida, não só para a delimitação e identificação de espécies no nível mundial, mas, também para o conhecimento do estado local da nossa subestimada biodiversidade de ciclídeos no Amazonas, aspecto que limita a execução de políticas protecionistas para as espécies, especialmente os peixes, fonte importante de renda e alimento.

2. OBJETIVO

2.1. Objetivo geral:

Analisar a diversidade dos peixes da família Cichlidae oriundos de oito rios da bacia Amazônica por meio do gene mitocondrial CO1.

2.2. Objetivos específicos:

- Gerar códigos de barras de DNA para as espécies de peixes da família Cichlidae amostradas em seis rios amazônicos (Rio Negro, Purus, Jatapu, Tapajós, Xingu e Araguaia/Tocantins);

- Verificar a hipótese da ferramenta de código de barras de DNA para delimitar e identificar espécies de ciclídeos;

- Identificar presença de espécies crípticas e complexos de espécies nos ciclídeos;

- Observar casos de não monofilia nas espécies de ciclídeos amostrados.

23

CAPÍTULO I1

1 Manuscrito formatado de acordo com as normas da revista Mitochondrial DNA. Manuscrito a ser submetido.

24

1 Código de barras de DNA para identificar espécies de ciclídeos da bacia Amazônica,

2 Brasil.

3 ANA PAULA C. CARVALHO 1, JOSÉ G. MARTÍNEZ 1, IZENI P. FARIAS 1 & TOMAS

4 HRBEK 1

5 1 Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade

6 Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM,

7 Brasil. 2

8 Resumo

9 Nesse estudo foram analisadas 45 espécies de peixes de água doce da família Cichlidae em

10 seis localidades da bacia Amazônica, Brasil, por meio do código de barras de DNA. As

11 delimitações moleculares apresentaram distâncias genéticas médias interespecíficas que

12 variaram de 0%-55% e distância média intraespecífica com variação de 0%-1%. Dentre os

13 táxons analisados molecularmente foi possível identificar sete espécies crípticas (15,5%) e

14 sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (11,2%) mostraram

15 ausência de monofilia recíproca. Os dados demonstram que a taxonomia dos ciclídeos

16 Amazônicos ainda não está totalmente resolvida, sendo necessária a inclusão da taxonomia

17 integrativa para a resolução dos complexos de espécies aqui encontrados.

18

19 Palavras-chave: taxonomia, peixes de água doce, mtDNA, Cichlidae.

20

Correspondência: A. P. C de Carvalho, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia,

Universidade Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000, 69077-000, Manaus, AM,

Brasil. Tel: +55 92 981057917. E-mail: [email protected]

25

21 Introdução

22 A família Cichlidae é composta por aproximadamente 1900 espécies (Kullander,

23 2003), com variadas características morfológicas e ecológicas que permitem a fácil adaptação

24 nos mais diferentes hábitats (Kullander 2003; Genner et al. 2007). Os grupos desta família

25 podem ser encontrados desde a América Central e Sul até o litoral sul da Índia (Kullander

26 2003; Froese e Pauly 2012).

27 Cerca de 60 gêneros e pelo menos 600 espécies são encontradas na região Neotropical

28 (López-Fernandez et al. 2010). Destas, 257 espécies são encontradas na bacia Amazônica

29 (Thompson 2010), com ampla distribuição contemplando toda a calha principal do rio

30 Amazonas e em seus afluentes (Kullander 2003).

31 As espécies dessa família sofrem pressão de pesca significativa em decorrência de sua

32 importância econômica (Chao 2001; Fernandez Acosta et al. 2008), que coloca em risco as

33 suas populações. Porém poucos estudos têm sido realizados para descrever diversas espécies

34 na Amazônia (Lewinsohn e Prado 2005).

35 Dessa forma, a alta diversidade morfológica e genética, favorece a presença espécies

36 crípticas e complexo de espécies, tornando a taxonomia instável e proporcionando diversas

37 mudanças na nomenclatura e na indefinição entre as espécies (Hulsey 2009; Amado et al.

38 2011; Anseeuw et al. 2012; Colatreli et al. 2012, Mejía et al. 2015). Além dessa grande

39 riqueza, o compartilhamento de haplótipos entre os diferentes grupos fenotípicos das espécies

40 (Willis et al. 2007; Farias e Hrbek 2008; Colatreli et al. 2012; Willis et al. 2012a) e a pouca

41 amostragem em diversas localidades dos diferentes rios amazônicos, acabam subestimando o

42 número evidente de espécies existentes (Kullander 1998). Isto faz com que se torne difícil à

43 aplicação de práticas conservacionistas das suas populações (Crampton 2008). Vários estudos

44 filogeográficos têm sido realizados para distinguir espécies crípticas e elucidar os casos de

45 polimorfismos intraespecíficos em ciclídeos (Willis et al. 2012a; 2012b; Musilová et al.

26

46 2008). Desta maneira, trabalhos adicionais são necessários com o fim de determinar não só

47 novas metodologias para o reconhecimento das espécies, como também a sua aplicabilidade e

48 eficiência na delimitação de espécies de ciclídeos como base para a sua conservação e

49 manejo.

50 Considerando as limitações da taxonomia tradicional para a delimitação de espécies,

51 torna-se necessário a inclusão de dados do código de barras de DNA para detectar as unidades

52 geneticamente distintas e facilitar na descoberta de novas espécies (Ward et al. 2009; Mejía et

53 al. 2015), especialmente em ambientes cada vez mais vulneráveis à pressão antrópica na bacia

54 Amazônica.

55 O código de barras tem surgido com sucesso na aplicação em várias espécies de peixes

56 ao redor do mundo (Ward et al. 2005; Ward et al. 2009), permitindo criar grandes bases de

57 dados como FISH-BOL (Campanha do Código de Barras da Vida para Peixes)

58 (http://www.fishbol.org), envolvendo dados de referência para sequências de DNA para

59 espécies do grupo (Becker et al. 2011; Léon-Romero et al. 2012, Bhattacharya et al. 2015).

60 Aliado a isso, esse novo método de identificação (COI) tem facilitado no controle (Steinke et

61 al. 2009) e regulamentação de práticas conservacionistas de peixes da bacia amazônica

62 (Ardura et al. 2010; Aquilino et al. 2011).

63 Uma região padronizada e curta com apenas 648 pares de base do gene mitocondrial,

64 citocromo oxidase I (COI), denominado código de barras de DNA, é utilizada atualmente para

65 delimitações rápidas e precisas de espécies de animais (Hebert et al. 2003a; Hebert et al.

66 2004; Hebert e Gregory 2005; Stoeckle e Hebert 2008).

67 Essa metodologia se baseia em dois principais pressupostos que mostram a eficácia do

68 código de barras de DNA: i) monofilia recíproca das espécies (Meyer e Paulay 2005) e ii) as

69 diferenças genéticas intraespecíficas que são sempre menores do que as diferenças genéticas

70 entre as espécies (divergência intraespecífica 10x maior do que a divergência interespecífica)

27

71 (Hebert et al 2003b; Stoeckle 2003).

72 Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo, gerar códigos de barras de DNA

73 para as espécies e verificar a hipótese que ferramenta molecular (COI) pode discriminar e

74 delimitar as espécies de ciclídeos na bacia Amazônica.

75

76 Material e métodos

77 Amostragem

78 Foram obtidas 147 sequências do código de barras de DNA (COI) de 16 gêneros, 45

79 espécies da família Cichlidae (Tabela 1) de seis rios da bacia amazônica (Figura 1), com

80 amostragem de até cinco espécimes por espécies. Os espécimes foram coletados por meio da

81 licença do IBAMA n° 11325-1.

82 Para cada exemplar amostrado, coletou-se uma pequena amostra de tecido do

83 pedúnculo caudal ou da nadadeira peitoral esquerda. Os tecidos foram armazenados em etanol

84 a 95% até o processamento em laboratório e os vouchers foram preservados em formaldeído a

85 10% e conservados em etanol a 70%.

86 Todos os tecidos foram depositados na Coleção de Tecidos de Genética

87 Animal/CTGA–ICB/UFAM (CGEN) do Laboratório de Evolução e Genética Animal,

88 Universidade Federal do Amazonas (LEGAL/UFAM) e os vouchers foram depositados na

89 coleção de peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).

28

90

91 Figura 1. Localidades das amostragens das espécies de ciclídeos da bacia Amazônica. Os

92 números correspondem aos locais de amostragem: 1 – rio Araguaia; 2 – rio Xingu; 3 – rio

93 Tapajós; 4 – rio Purus; 5 – rio Jatapu; 6 – rio Negro.

94

95 Extração, PCR e Sequenciamento

96 O DNA foi isolado por meio do método fenol-clorofórmio (Sambrook e Russel, 2001).

97 Uma região parcial do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade 1 (COI) foi

98 amplificado via reação em cadeia da polimerase (PCR) com um volume final de 15 μL

99 contendo: 6,8 μL de H2O ultrapura; 1,5 μL de MgCl2 (25 mM); 1,5 μL de dNTPs (10 mM);

100 1,5 μL de tampão 10x (100mM Tris-HCl, 500mM KCl); 1,2 μL de cada primer (2 μM)

101 (Tabela 2); 0,3 μL de Taq DNA Polymerase (1 U/μL) e 1 μL de DNA (concentração variando

102 de 30 a 60 ng) em termociclador Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems).

103 As condições da PCR consistiram em 35 ciclos de desnaturação a 93°C por 10

29

104 segundos, anelamento a 50°C por 35 segundos e extensão a 68°C por 1 minuto e 30 segundos.

105 A amplificação foi verificada em gel de agarose 1%, acrescido de gel red (Biotium) e

106 marcador (GeneRuler 1kb DNA Ladder).

107 Os produtos de PCR foram purificados com o kit ExoSap de acordo com as

108 recomendações do fabricante e submetido as reações de sequenciamento foi utilizado o Kit

109 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Standart Version 3.1 (Applied Biosystems, Inc), para

110 um volume final de 10 µL por amostra, composta por: 4,4 µL de água ultrapura; 1,3 µL de

111 tampão de sequenciamento 5X; 2,0 µL primers forward (M13F -21) (2 μM) e/ou reverse

112 (M13R -27) (2 μM) (Tabela 2); 0,3 µL de BigDye Terminator v 3.1 (Applied Biosystems,

113 Foster City, CA, USA) e 2 µL de DNA purificado.

114 Os produtos resultantes dessa reação foram precipitados com etanol (100% e 70%) e

115 EDTA (125mM), em seguida ressuspendidas com 10 µL Hi-Di formamida e submetidas ao

116 sequenciador automático ABI 3130xl (Applied Biosystems Inc.).

117

118 Análises dos dados

119 As sequências foram editadas, alinhadas e traduzidas no programa Geneious v. 5.4

120 (Drummond et al. 2011). Posteriormente foram submetidas ao programa BLAST (Altschul et

121 al. 1997) para confirmação e comparação da região sequenciada com os dados disponíveis no

122 National Center for Biotechnology Information (Genbank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e

123 do Barcoding of Life Database (BOLD) (Ratnasingham e Hebert 2007).

124 A delimitação das espécies foi realizada pelo modelo Generalized Mixed Yule

125 Coalescent (GMYC) (Fujisawa e Barraclough 2013), no programa estatístico R versão 3.0.2

126 (R Development Core Team 2013). As espécies delimitadas pelo GMYC e as espécies

127 identificadas morfologicamente foram obtidos valores de distâncias médias intraespecíficas e

128 interespecíficas e distância par-a-par pelo método de Kimura-2-parâmetros no programa

30

129 MEGA 5.05 (Tamura et al. 2011).

130

131 Resultados

132 Foram obtidas sequências do código de barras de DNA (COI) de 16 gêneros e 45

133 espécies da família Cichlidae. Sendo que Crenicichla foi o gênero que apresentou maior

134 número de espécies (11) e os gêneros Acarichthys, Acaronia, Biotodoma, Caquetaia, Heros,

135 Laetacara, Mesonauta e Symphysodon apresentaram menores números de espécies (1)

136 analisadas (Tabela 5).

137 Foram encontradas sequências de COI no Genbank e BOLD para apenas 13 espécies,

138 sendo elas: Apistogramma agassizi, Geophagus argyrostictus, Geophagus altifrons, Heros

139 efasciatus, Symphysodon aequafasciatus, Acaronia nassa, Cichla piquiti, Acarichthys

140 heckelii, Retroculus lapidifer, Retroculus xinguensis, lilith, Teleocichla sp.,

141 Crenicichla percna (Tabela 3).

142 Cerca de 40 espécies apresentaram monofilia, com exceção de duas espécies do gênero

143 Teleocichla (T. preta e T. cf. gephyrogramma) do rio Xingu e três espécies de Crenicichla (C.

144 jegui, C. lugubris e C. aff. strigata) do rio Araguaia, que apresentaram parafilia (Figura 2).

145 As divergências genéticas interespecíficas variaram de 0% a 17%, com média de 7%

146 entre os gêneros representados por mais de uma espécie (Tabela 5). As divergências genéticas

147 médias intraespecíficas para as espécies identificadas morfologicamente variaram de 0% a

148 8%, com média de 2%. De acordo com as identificações morfológicas, foram identificadas 45

149 espécies, sendo que 24 espécies (53,3%) apresentaram distâncias médias intraespecíficas ≤

150 2% e 7 espécies (15,5%) tanto da mesma localidade quanto de locais diferentes foram

151 encontrados valores de divergências genéticas médias intraespecíficas >2% e separados em

152 clados pela árvore GMYC (Tabela 6 e Figura 2).

153 Para os indivíduos amostrados dentro das mesmas localidades, tem-se o exemplo da

31

154 espécie Teleocichla cinderela, amostradas nos pedrais de São Miguel e São Bento,

155 localizados no rio Araguaia, apresentaram distância média intraespecífica de 6% e pelas

156 análises GMYC apresentaram-se em diferentes clados. A espécie Geophagus argyrostictus da

157 localidade Xingu, também apresentaram distância média intraespecífica >2% e foram

158 separados em dois clados pelas análises moleculares.

159 E as espécies Apistogramma agassizi (3%), Acaronia nassa (3%), Crenicichla regani

160 (3%), Geophagus altifrons (7%) e Geophagus sp. (3%), amostrados de diferentes localidades

161 (Purus, Jatapu, Tapajós, Xingu) e com tipos de águas diferentes (branca, preta e clara),

162 também apresentaram valores de divergências genéticas médias intraespecíficas maiores que

163 2% e foram delimitados em clados de acordo com a respectiva localidade pelo modelo

164 GMYC (Figura 2).

165 Observou-se que algumas espécies identificadas pela taxonomia morfológica como

166 espécies diferentes, apresentaram valores de distâncias par-a-par menores que 2%. Como por

167 exemplo, as espécies de Cichla temensis do rio Jatapu e Cichla melaniae do rio Xingu;

168 Crenicichla lugubris, C. jegui, C. strigata do rio Araguaia; Teleocichla cf. gephyrogramma e

169 T. n sp. preta do rio Xingu, identificadas morfologicamente como duas ou mais espécies e

170 delimitadas pelo GMYC também como espécies diferentes (Figura 2), porém a distância

171 interespecífica foi de 0-2% para as duas delimitações (Tabela 9 e 10). Em outras situações o

172 modelo GMYC delimitou algumas espécies com maior número de linhagens (Tabela 8 e 9) do

173 que identificadas morfologicamente (Tabela 10), porém os valores de divergências

174 interespecíficos foram < 2%.

175 Comparando as duas ferramentas (taxonomia tradicional e molecular) neste estudo

176 para delimitar as espécies de ciclídeos, apenas nove espécies apresentaram congruência pelas

177 técnicas utilizadas na delimitação, havendo, portanto, concordância entre elas.

178 As divergências médias intra (0%) e interespecíficas (32%) foram encontradas para as

32

179 espécies identificadas molecularmente (Tabela 4), apresentando um gap cerca de 30 vezes

180 maior entre espécies do que dentro das espécies.

181 Foram identificadas de 1 a 4 linhagens biológicas entre as 45 espécies analisadas neste

182 estudo, sendo as espécies Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus e Crenicichla regani

183 com maiores números de linhagens (4) (Tabela 8).

184

185 Discussão

186 A ictiofauna Amazônica é bastante diversa e por isso é importante conhecer essa

187 riqueza, para que seja realizado o monitoramento dos peixes comercializados que sofrem

188 riscos de extinção. Para isso é necessário práticas conservacionistas que visem uma gestão nos

189 recursos pesqueiros da região. E a técnica do código de barras de DNA pode ser utilizada para

190 identificar com precisão as espécies ameaçadas comercialmente e na descrição das espécies

191 subestimadas (Benzaquem et al. 2015; Kress et al. 2015).

192 Os ciclídeos apresentam ampla distribuição geográfica e uma grande diversidade de

193 espécies que se adaptam rapidamente em diferentes habitats, onde muitas delas ainda não

194 foram descritas (Reis et al. 2003). Além disso, o compartilhamento de haplótipos entre os

195 diferentes grupos fenotípicos das espécies (Willis et al. 2007; Farias e Hrbek 2008; Colatreli

196 et al. 2012; Willis et al. 2012a) e os complexos de espécies podem levar a subestimação dessa

197 diversidade (Albert et al. 2006; Kullander et al. 2003; Farias e Hrbek 2008). A utilização

198 somente da morfometria tradicional e contagens merísticas não é possível separar algumas

199 espécies de ciclídeos, devido aos altos níveis de sobreposição entre caracteres taxonômicos

200 (McMahan et al. 2011; Soria-Barreto et al. 2011; Mejía et al. 2015).

201 Nas análises moleculares foi possível identificar 14 espécies a mais em relação às

202 identificações morfológicas. O que corrobora com o estudo de Winterbottom et al. (2014) que

33

203 identificaram 42 espécies a mais através do código de barras de DNA em peixes do gênero

204 Trimma.

205 Os valores de distâncias para as espécies identificadas morfologicamente que

206 apresentaram valores intraespecíficos > 2% também foram delimitados em diferentes clados,

207 indicando possíveis novas espécies, tais como Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus,

208 Acaronia nassa, Crenicichla regani, Geophaugs altifrons, Geophagus sp., Teleocichla

209 cinderela (Tabela 6 e Figura 2).

210 Para essas mesmas espécies juntamente com Mesonauta festivus, e com exceção da

211 espécie Teleocichla cinderela, provenientes de localidades diferentes (Purus, Jatapu, Tapajós

212 e Xingu) e com tipos de água diferentes (branca, preta e clara) foram delimitados em

213 diferentes clados pelo modelo GMYC (Figura 2), formando mais de uma linhagem biológica.

214 Segundo Hulsey (2009) os complexos de espécies muitas das vezes, dificultam na delimitação

215 das espécies de um grupo, pois em alguns grupos distintos aparentam pouca ou nenhuma

216 diferença fenotípica. Pereira et al. (2011a; 2011b) e Pazian et al. (2012) identificaram

217 complexos de espécies de Piabina argentea (Characidae) em águas doce neotropicais. Mejía

218 et al. (2015) utilizaram o código de barras de DNA no complexo de espécies de ciclídeos

219 Herichthys bartoni e verificaram a existência de três grupos genéticos composto por seis

220 espécies.

221 Neste estudo as espécies Apistogramma agassizi, Aequidens pallidus, Geophagus

222 argyrostictus, Cichla melaniae, Crenicichla n sp. preta e Teleocichla cinderela da mesma

223 localidade (Jatapu, Xingu e Araguaia) foram delimitados em mais de um clado (Figura 2). A

224 presença de espécies crípticas pode subestimar o número evidente de espécies existentes em

225 uma mesma localidade (Colatreli et al. 2012, Kadarusman et al. 2012). Winterbottom et al.

226 (2014) utilizaram a ferramenta molecular do código de barras de DNA e descobriram uma

227 grande diversidade oculta de peixes do Canadá. Enquanto que na região Amazônica,

34

228 Benzaquem et al. (2015) verificaram a diversidade críptica em Nannostomus (Lebiasinidae).

229 Na Amazônia, a alta diversidade críptica dentro de áreas alagadas que não apresentam

230 barreiras, proporcionam a divergência da população e o processo de especiação (Crampton

231 2008; Piggoti et al. 2011), propiciando grandes desafios para o reconhecimento das espécies

232 pelas ferramentas moleculares.

233 A bacia Amazônica é um mosaico com diferentes tipos de água conectados pelo rio

234 Amazonas. As condições hidrográficas (variáveis físicas e químicas) podem agir como

235 barreiras para o fluxo gênico para a dispersão de peixes atuando como forças seletivas que

236 propiciam a especiação alopátrica (Lovejoy e Araújo 2000; Toffoli et al. 2008; Ducan e

237 Fernandes 2010).

238 Foram observadas as distâncias médias interespecíficas, nas análises moleculares <

239 2% entre espécies diferentes, sinalizando compartilhamento de haplótipos. Os resultados

240 apontaram que duas espécies dos gêneros Teleocichla (Teleocichla preta e Teleocichla cf.

241 gephyrogramma) e três espécies de Crenicichla (Crenicichla jegui, Crenicichla lugubris e

242 Crenicichla lugubris) apresentaram parafilia. Para Meyer e Paulay (2005) as espécies

243 parafiléticas são aspectos limitantes para a ferramenta molecular discriminar as espécies.

244 Resultados semelhantes de parafilia foram encontrados por Musilová et al. (2008) para os

245 gêneros de ciclídeos Aequidens e Cichlasoma e por Toffoli et al. (2008) nas espécies de

246 arraias de água doce.

247 Quando o processo de coalescência não é suficiente para separar as espécies, ocorrem

248 às sobreposições da variação intraespecífica com a interespecífica originando espécies

249 parafiléticas, causadas pela retenção do polimorfismo ancestral ou introgressão após o

250 processo de hibridação (Hickerson et al. 2010; Avise 2004; Moritz e Cícero 2004). Esses

251 fatores podem explicar o compartilhamento de haplótipos entre as espécies de Teleocichla e

252 Crenicichla, observados neste trabalho, como também pode ter havido erro no processo de

35

253 identificação baseados em caracteres morfológicos para estas espécies.

254 Hubert et al. (2012) observaram compartilhamento de haplótipos em 8% das 190

255 espécies de peixes canadenses, suspeitando-se de que as espécies não poderiam ser separadas

256 devido à radiação recente e hibridação, ou até mesmo alguns pares de espécies com

257 sobreposição de haplótipos seriam talvez uma única espécie.

258 Para Ward et al. (2009) e Pereira et al. (2013) a radiação recente na ictiofauna

259 neotropical para diversas espécies de peixes e a hibridação podem interferir no uso correto do

260 código de barras de DNA. A delimitação das espécies de alguns gêneros da família Cichlidae

261 também tem sido problemática, devido ao compartilhamento de haplótipos de DNA

262 mitocondrial entre as espécies (Farias e Hrbek 2008; Willis et al. 2012a; Willis et al. 2012b).

263 A metodologia do código de barras de DNA é simples, cujas seqüências são obtidas a

264 partir de vários indivíduos. Os indivíduos semelhantes e relacionados são agrupados e existe

265 uma variação genética dentro e entre as espécies, no qual as distâncias genéticas entre as

266 espécies são maiores do que dentro das espécies (Damasphatra e Mallet 2006). O modelo de

267 distância Kimura-2-Parâmetros (K2P) é utilizado no nível de espécie e é o melhor modelo

268 utilizado, quando as distâncias intraespecíficas são baixas (Miyaki et al. 2001).

269 Hebert et al. 2004, propôs um limiar de 2% para delimitar as espécies através do

270 código de barras de DNA, este limite baseia-se na distribuição de valores de distância

271 genética (K2P) intra e inter-específicos. De acordo com Hebert et al. (2003), Johns e Avise

272 (1998) as divergências intraespecíficas raramente são maiores que 2%, e as divergências

273 interespecíficas para a maioria dos vertebrados são superiores a 2%. Assim, para as espécies

274 com distâncias menores que 2% podem consideradas a mesma espécie, e acima de 2%

275 consideradas como espécies diferentes. Mesmo assim, o limiar proposto por Hebert et al.

276 2004 deve ser cuidadosamente analisado para cada grupo (Ward et al. 2009).

277 O valor de 2% foi o mais utilizado para delimitar as espécies de peixes por alguns

36

278 pesquisadores (Pereira et al. 2013; Hubert et al. 2008; Ward et al. 2009; Carvalho et al. 2011),

279 portanto, para algumas espécies de ciclídeos esse limiar não foi tão eficiente, como por

280 exemplo, para as espécies de Cichla temensis do rio Jatapu e Cichla melaniae do rio Xingu

281 identificadas morfologicamente como duas espécies e delimitadas pelo GMYC também como

282 espécies diferentes, porém a distância interespecífica foi de 2%. Em outras situações o modelo

283 GMYC delimitou alguns gêneros com maior número de espécies do que identificadas

284 morfologicamente, porém os valores de divergências interespecíficos foram < 2%. Isso

285 significa que para as análises que abrange uma grande diversidade de espécies, a utilização de

286 um limiar padrão para todas elas não seja muito adequado.

287 A maioria das espécies (88,8%), foi discriminada pela ferramenta do código de barras

288 de DNA, apresentando divergência média (K2P) intraespecífica de 0% e interespecífica de

289 32%, estabelecendo um gap cerca de 30 vezes entre a variação intra e interespecífica.

290 Resultados semelhantes foram encontrados por Hubert et al. (2012) que verificaram em

291 espécies de peixes de água doce da fauna canadense uma divergência média de 27 vezes

292 maior entre as espécies do que dentro de cada espécie, com estimativas de distância (K2P)

293 média de 0,3% entre as espécies e 8,3% entre os gêneros. Ward et al. (2005) encontraram

294 0,39% e 9,93%, respectivamente para espécies de peixes australianos. Ward et al. (2009)

295 estudaram espécies de peixes marinhos e de água doce, encontraram distância média

296 intraespecífica para as 294 espécies no valor de 0,35%, enquanto que a média interespecífica

297 foi 8,11%.

298 Como a monofilia recíproca é um critério para a efetividade do código de barras de

299 DNA (Meyer e Paulay, 2005), as espécies que formaram clados reciprocamente monofiléticos

300 puderam ser identificadas utilizando esta ferramenta, no qual se pôde verificar a sua eficiência

301 em quase 90% das espécies utilizadas neste estudo. Peixes de água doce e salgada têm sido

302 facilmente identificados usando o código de barras, com 60-98% das espécies exibindo clados

37

303 monofiléticos (Hubert et al. 2008; Steinke et al. 2009; Mccusker et al. 2012; Young et al.

304 2013; Paz et al. 2014)

305 De acordo com Hebert et al. (2002) o código de barras de DNA atribui corretamente

306 até mesmo os táxons poucos amostrados aos seus respectivos filo ou ordem, e também

307 demonstra as atribuições a nível de espécie. Atualmente, com a aplicação dessa ferramenta em

308 diversos trabalhos, construiu-se uma biblioteca para o armazenamento dos resultados dos

309 códigos de barras para facilitar no conhecimento da biodiversidade (Savolainen et al. 2005;

310 Hebert et al. 2010), esse banco de dados, denominado Sistema de Dados do Código de Barras

311 da Vida (BOLD) auxilia na aquisição, armazenamento, análise e publicação de códigos de

312 barras de DNA (Ratnasingham e Hebert 2007).

313 Do total (59) de espécies identificadas pela ferramenta molecular, apenas 28,8%

314 apresentaram sequências de código de barras de DNA depositadas no banco de dados do

315 BOLD e Genbank (Tabela 3), o que significa que existem poucas sequências do código de

316 barras de DNA de ciclídeos depositadas nesses bancos de dados, podendo está relacionado

317 com a falta de estudos moleculares com as espécies de peixes da Amazônia.

318 Comparando os resultados morfológicos e moleculares, observou-se que apenas nove

319 espécies foram identificadas corretamente por ambas as metodologias. Baldwin et al. (2011)

320 combinaram dados moleculares de COI e morfológicos para analisar espécimes de Starksia no

321 Atlântico ocidental e verificaram que existe incongruência entre as duas ferramentas de

322 identificação, porém as linhagens genéticas são reconhecidos como espécies se forem

323 suportado pela morfologia. Ping et al. (2015) utilizaram as ferramentas morfológicas e

324 moleculares (COI) e observaram duas linhagens separadas de Nemipterus japonicus, isolados

325 geograficamente no sul da China.

326

327

38

328 Conclusão

329 Esse estudo foi o primeiro a examinar um grande número de gêneros (15)

330 representados por diversas espécies de ciclídeos em seis rios da bacia Amazônica.

331 Pôde-se verificar a eficiência da técnica do código de barras de DNA em discriminar

332 aproximadamente 90% das espécies analisadas, revelando uma diversidade oculta relacionada

333 à presença de complexo de espécies e espécies crípticas. A descoberta das diferentes espécies

334 crípticas é possível conhecer as principais espécies de ciclídeos que podem estar sendo

335 comercializados sem ao menos serem descritas, além de auxiliar novas pesquisas

336 morfológicas, verificando as diferenças sutis que as espécies apresentam.

337 A obtenção dos códigos de barras de DNA para as espécies da família Cichlidae

338 proporcionará contribuições importante sobre a ictiofauna Amazônica, para os bancos de

339 dados do BOLD e na Campanha FISH-BOL.

340

341 Agradecimentos

342 Esta pesquisa faz parte do projeto da rede SISBIOTA/Rede BIOPHAM (Sistema

343 Nacional de Pesquisa em Biodiversidade/Rede de pesquisa para ampliação do conhecimento

344 sobre a biodiversidade de vertebrados da Amazônia brasileira com aplicações sobre seu uso e

345 conservação) com apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do

346 Amazonas (FAPEAM) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

347 (CNPq), sob a coordenação de I. P. Farias. A permissão para realizar o trabalho de campo e

348 para a coleta de amostras de tecido foi concedida pelo IBAMA (Licença nº 11325-1).

349 Agradecemos os especialistas Ph. D. Lúcia Helena Rapp Py-Daniel e D. Jansen Alfredo

350 Sampaio Zuanon, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia e os demais colaboradores

351 que auxiliaram no processo de coleta e identificações morfológicas. Aos colegas de

352 Laboratório de Genética Animal da Universidade Federal do Amazonas (UFAM) que

39

353 ajudaram nas análises laboratoriais e nas correções do manuscrito. Este artigo constitui uma

354 parte da Dissertação de Mestrado do Programa de Genética, Conservação e Biologia

355 Evolutiva do INPA / UFAM.

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550

551

552

553

47

554 CONSIDERAÇÕES FINAIS

555

556 Os fatores ecológicos e históricos que ocorreram na bacia Amazônica proporcionaram

557 a especiação, onde atualmente ainda não é possível saber a verdadeira diversidade de peixes

558 existentes nos rios amazônicos por causa espécies crípticos.

559 As espécies crípticas de ciclídeos foram descobertas nesta pesquisa pelo código de

560 barras de DNA, no qual estavam sendo negligenciadas, porque não era possível separá-las

561 baseadas apenas em caracteres morfológicos.

562 Algumas espécies da família Cichlidae não são monofiléticas e apresentam taxonomia

563 mal resolvida. E o compartilhamento de haplótipos para algumas espécies está relacionado

564 aos processos de irradiação recente que ocasionam a retenção do polimorfismo ancestral ou

565 introgressão após o processo de hibridação. Essas características dificultam na eficácia do

566 código de barras de DNA na identificação e delimitação das espécies de maneira precisa.

567 As sequências obtidas, a partir do código de barras de DNA de várias espécies de

568 ciclídeos, irão contribuir positivamente no banco de dados do BOLD e FISH-BOL, auxiliando

569 na identificação dessas espécies por pesquisadores e não-especialistas em todo o mundo.

570

571 Referências Bibliográficas

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880

59

881 ANEXO A 882 883 Tabela 1. Nomes das 148 espécies, baseadas nas identificações morfológicas, que foram analisadas no presente estudo.

ID Número ID Número Espécie Localidade CTGA do Voucher Aequidens michaeli Arara, banco direito do Iriri, Rio Iriri, Xingu CTGA_1754 30954 Aequidens michaeli Cachoeira do Jericoá, Xingu CTGA_11191 Aequidens pallidus Pedral, borda da ressaca, Jatapu CTGA_100496 37196 Aequidens pallidus Igarapé do Santo Amaro, margem direita do rio Jatapu CTGA_100513 37166 Aequidens pallidus Igarapé do Santo Amaro, margem direita do rio Jatapu CTGA_100514 37166 Aequidens pallidus Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100240 37105 Aequidens pallidus Igarapé extra, próx. igarapé Central, Trilha central (Aiuanã), Rio Negro CTGA_105155 42363 Aequidens pallidus Igarapé extra, próx. igarapé Central, Trilha central (Aiuanã), Rio Negro CTGA_105156 42363 Aequidens cf. eape Igarapé Barreirinha, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104548 41457 Apistogramma sp. Rio Iriri, com 4 horas baixo boca do Rio Novo, Xingu CTGA_2031 31132 Apistogramma aff. Staecki Igarape 2, km 4 da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio

Jatapu Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103206 42054

Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103207 42054 Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103208 42054

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Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103209 42054 Apistogramma agassizi Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103210 42054 Apistogramma agassizi Igarapé Barreirinha, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104507 41464 Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100264 37404 Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100265 37404 Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã Apistogramma agassizi Igarape do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu. CTGA_100539 37293 Apistogramma agassizi Igarape 2 acima do Tabocal, margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100608 39064 Apistogramma agassizi Margem direita a montante da Vila de Sao Jose do Jabote CTGA_100581 39049 Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100263 37404 Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100266 37404 Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã Apistogramma agassizi Igarape 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100256 37404 Jatapu, bacia do baixo rio Uatumã Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100550 37116 Apisotgramma pertensis Igarape do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100538 37301 Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100551 37116 Apisotgramma pertensis Igarapé 2, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100552 37116 Apisotgramma pertensis Igarapé do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100527 37293

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Apisotgramma pertensis Igarapé do Monte Negro (Ig. 3 margem direita), afluente do rio Jatapu CTGA_100526 37293 Apistogramma gr. Brevis Igarapé do Espinho, Trilha esquerda CTGA_105145 38866 Apistogramma gr. Brevis Igarapé do Espinho, Trilha esquerda CTGA_105147 38866 Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103261 42055 Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103262 42055 Apistogramma pulchra Igarapé dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103259 42055 Apistogramma pulchra Igarapé dos caetanos, Ipixuna, rio Purus CTGA_103591 42096 Apistogramma pulchra Igarapé dos caetanos, Ipixuna, rio Purus CTGA_103594 42096 Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100690 37322

Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100706 37322 Acarichthys heckelii Pedral próximo ao lago da Velha, rio Jatapu CTGA_100689 37322 Acarichthys heckelii Igarapé Cotó, comunidade de Cametá CTGA_104304 41369 Acaronia nassa Igarapés dos Mutuns, Ipixuna, rio Purus CTGA_103246 42053 Acaronia nassa Igarapé Barreirinha, rio Tapajós CTGA_104553 Biotodoma cupido Flona Ipixuna, rio Ipixuna, boca do lago Gaivota, rio Purus CTGA_104096 42244 Caquetaia spectabilis Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11394 Caquetaia spectabilis Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11435 Crenicichla n. sp. Laranja Ilha do Curapé, rio Iriri, Xingu CTGA_1844 30780 Crenicichla n. sp. Laranja Praia rochosa no banco esquerdo, rio Iriri, Xingu CTGA_1788 30902 Crenicichla n. sp. Laranja Praia rochosa no banco esquerdo, rio Iriri, Xingu CTGA_1802 30902 Crenicichla n. sp. Laranja Ilha do Curapé, rio Iriri, Xingu CTGA_1843 30780

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Crenicichla percna Barinha, cachoeiras no meio do canal, rio Iriri, Xingu CTGA_1889 30929 Crenicichla aff. Inpa Boca do rio Novo, Xingu CTGA_1958 31034 Crenicichla sp.1 Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2852 Crencichla jegui Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2853 Crenicichla lugubris Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2862 Crenicichla lugubris Vila de Sta. Izabel, rio Araguaia, Pará CTGA_2863 Crenicichla astroblepa Pedral São Miguel, rio Araguaia CTGA_2970 Crenicichla astroblepa Pedral São Miguel, rio Araguaia CTGA_3069 Crenicichla astroblepa Pedral Rebojo, rio Araguaia CTGA_3417 Crenicichla astroblepa Araguatins, Tocantins CTGA_3093 Crenicichla aff strigata Pedral Rebojo, rio Araguaia CTGA_3409 Crenicichla n. sp. Preta Rio Xingu (área 03) CTGA_11096 Crenicichla n. sp. Preta Rio Xingu (área 03) CTGA_11097 Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Jericoá, rio Xingu CTGA_11189 Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Jericoá, rio Xingu CTGA_11197 Crenicichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, rio Xingu CTGA_2100 31003 Crenicichla n. sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11136 Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11137 Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11138 Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (área 04) CTGA_11139 Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11233

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Crenicichla sp. Xingu Rio Xingu (Corredeira a jusante da Cachoeira de Belo Monte) CTGA_11425 Crenicichla regani Igarapé 4, 300m da trilha da esquerda, Lago da Velha, margem direita do rio CTGA_100258 37401 Jatapu Crenicichla regani Rio Jatapu. Braço do Igarapé 2 CTGA_100350 Crenicichla regani Flona Ipixuna, rio Ipixuna, comunidade Mutum, tonco CTGA_104101 41923 Crenicichla regani Flona Ipixuna, rio Ipixuna, comunidade Mutum, tonco CTGA_104100 41923 Crenicichla regani Igarapé no acesso para as trilhas da comunidade de Cametá CTGA_104256 Crenicichla regani Igarapé Jutuarana CTGA_104806 41321 Crenicichla regani Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11391 Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11230 Cichla melaniae Rio Xingu (Corredeira a jusante da Cachoeira de Belo Monte) CTGA_11430 Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11231 Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11232 Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11228 Cichla melaniae Rio Iriri, Xingu CTGA_11058 Cichla melaniae Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11229 Cichla mirianae pitanga Rio Xingu (jusante de Belo Monte) CTGA_11433 Cichla mirianae pitanga Rio Xingu (jusante de Belo Monte) CTGA_11434 Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100336 37155 Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100334 37155 Cichla temensis Igarapé 3, na margem esquerda do rio Jatapu CTGA_100335 37155

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Cichla piquiti Pedral Remanso dos Botos CTGA_3060 Geophagus altifrons Pedral Cachoeira do Zé dos gatos CTGA_2744 Geophagus altifrons Flona Ipixuna, rio Ipixuna, boca do lago Gaivota, Purus CTGA_104036 42247 Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11350 Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11240 Geophagus argyrostictus Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11351 Geophagus argyrostictus Rio Bacajá, Xingu CTGA_11312 Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11059 Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11060 Geophagus argyrostictus Rio Iriri, Xingu CTGA_11061 Geophagus sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1651 30852 Geophagus sp. Praia em frente a comunidade de Cametá, Tapajós CTGA_104694 41518 Geophagus sp. Praia em frente a comunidade de Cametá, Tapajós CTGA_104696 41518 Geophagus sp. Praia em frente à com. Itapuama, Tapajós CTGA_104996 41526 Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104573 41272 Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104574 41272 Geophagus proximus Em frente à comunidade Cametá, Tapajós CTGA_104576 41272 Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11397 Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11398 Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11399 Heros efasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11400

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Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100685 37323 Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100692 37323 Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100704 37323 Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100705 37323 Heros efasciatus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100716 37323 Laetacara araguaiae Praia em frente à comunidade Cametá, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104891 41146 Mesonauta festivus Igarapé Barreirinha, Tapajós CTGA_104529 Mesonauta festivus Igarapé Anduru, margem esquerda do rio Tapajós CTGA_104595 41254 Mesonauta festivus Pedral próximo ao lago da Velha CTGA_100732 37324 Mesonauta festivus Ressaca do Jatapu CTGA_100680 37241 Mesonauta festivus Ressaca do Jatapu CTGA_100681 37241 Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3178 Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3179 Retroculus lapidifer Araguatins,Tocantins CTGA_3180 Retroculus xinguensis Barinha, cachoeiras no meio do canal, Rio Iriri, Xingu CTGA_1903 30948 Retroculus xinguensis Rio Xingu (Praia do caju) CTGA_11235 Satanoperca jurupari Araguatins,Tocantins CTGA_3174 Satnoperca sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1700 30887 Satnoperca sp. Boca do Irirí, Rio Iriri na confluência com Rio Xingu CTGA_1703 30887 Satanoperca lilith Ressaca do Jatapu CTGA_100670 37267 Satanoperca lilith Ressaca do Jatapu CTGA_100418 37211

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Satanoperca lilith Pedral, borda da ressaca Jatapu CTGA_100485 37437 Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11437 Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11439 Symphysodon aequafasciatus Rio Xingu (Santo Antônio) CTGA_11440 Teleocichla sp. Pedral Remanso dos Botos CTGA_3000 Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2064 31019 Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2102 31019 Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2103 31019 Teleocichla n. sp. Preta Cachoeira do Espelho, Rio Xingu CTGA_2104 31019 Teleocichla cf. gephyrogramma Rio Xingu (Cachoeira do Jericoá) CTGA_11190 Teleocichla cinderela Pedral São Miguel, Araguaia CTGA_2975 Teleocichla cinderela Pedral São Miguel, Araguaia CTGA_2976 Teleocichla cinderela Pedral Rebojo, Araguaia CTGA_3094 884 885 886 887 888 889 890 891 892

67

893 Tabela 2. Nome e referências das sequencias dos primers usados na amplificação e sequenciamento no presente estudo. 894

Gene Primer Primer sequence 5’ - 3’ Referências

VF2 5’gtaaaacgacggccagtCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC3’ FishF2 5’gtaaaacgacggccagtCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC3’ CO1 Ivanova et al., 2007 FishR2 5’caggaaacagctatgacTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA3’ VR1d 5’caggaaacagctatgacCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA3’ M13F (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT CO1 Messing, 1983 M13R (-27) CAGGAAACAGCTATGAC 895 896 897 898 899 900 901 902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912

68

913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923 924 925 926 927 928 929 930 931 932 933 934 935 936 937 938 939 940 941 942 943 944 945 946 947 948 949 950 951 952 953 954 955 956 957 958 959

69

960 961 962 963 964 965 966 967 968 969 970 971 972 973 974 975 976 977 978 979 980 981 982 983 984 985 986 987 988 989 990 991 992 993 994 995 996 997 998 999 1000 1001 1002 1003 1004 1005 1006 1007 1008 1009

70

1010 1011 1012 1013 1014 1015 1016 1017 1018 1019 1020 1021 1022 1023 1024 1025 1026 1027 1028 1029 1030 1031 1032 1033 1034 Figura 2. Árvore com as espécies delimitadas pelo modelo GMYC, construídas a partir de 1035 147 sequências de código de barras de DNA. 1036 1037 1038 1039 1040 1041 1042 1043 1044 1045 1046 1047 1048 1049 1050 1051 1052 1053 1054 1055 1056 1057 1058

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1059 Tabela 3. Número de espécies que foram identificadas pelo banco de dados online 1060 BOLD (Barcode of life) e NCBI (National Center Biotechnology Information). 1061 Número de Família Espécies BOLD NCBI1062 espécimes 7 Cichlidae Apistogramma agassizi 14 1063 Cichlidae Geophagus argyrostictus 7 7 Cichlidae Geophagus altifrons 2 1 1064 Cichlidae Heros efasciatus 9 9 Cichlidae Symphysodon aequafasciatus 3 3 1065 Cichlidae Acaronia nassa 2 2 1066 Cichlidae Cichla piquiti 1 1 Cichlidae Acarichthys heckelii 4 41067 Cichlidae Retroculus lapidifer 3 3 Cichlidae Retroculus xinguensis 2 2 1068 Cichlidae Satanoperca lilith 3 3 1069 Cichlidae Teleocichla sp. 1 1 Cichlidae Crenicichla percna 1 11070 TOTAL 13 52 38 8 1071

1072

1073

1074

1075 Tabela 4. Valores médios das divergências intraespecífica e interespecífica do gene COI

1076 (divergência mínima, média e máxima) das 147 sequências obtidas pelo método de Kimura-2-

1077 parâmetros.

Dados Moleculares N Div. mínima Div. média Div. máx.

Intraespecífica 147 0,0 0,0 0,01

Interespecífica 147 0,0 0,32 0,55

1078

1079 1080 1081 1082 1083

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1084 Tabela 5. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) entre os genêros de Ciclídeos 1085 amazônicos representados por mais que uma espécie.

% média da Número de Gênero distância gêneros intraespecífica

Aequidens 3 11% Apistogramma 6 17% Acarichthys 1 0% Acaronia 1 3% Biotodoma 1 N/A Caquetaia 1 0% Crenicichla 11 17% Cichla 4 3% Geophagus 4 6% Heros 1 0% Laetacara 1 N/A Mesonauta 1 1% Retroculus 2 5% Satanoperca 3 15% Symphysodon 1 0% Teleocichla 4 13% 1086 1087 1088 1089 1090 1091 Tabela 6. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos 1092 classificados morfologicamente e representados por mais de um espécime.

Número de % média da Espécie espécimens distância analisadas intraespecífica Aequidens michaeli 2 0% Aequidens pallidus 6 8% Aequidens cf. eape 1 N/A Apistogramma sp. 1 N/A Apistogramma aff. staecki 1 N/A Apistogramma agassizi 14 3% Apisotgramma pertensis 6 0% Apistogramma gr. brevis 2 1%

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Apistogramma pulchra 5 0% Acarichthys heckelii 4 0% Acaronia nassa 2 3% Biotodoma cupido 1 N/A Caquetaia spectabilis 2 0% Crenicichla n. sp. laranja 4 0,2% Crenicichla percna 1 N/A Crenicichla aff. inpa 1 N/A Crenicichla sp.1 1 N/A Crencichla jegui 1 N/A Crenicichla lugubris 2 0% Crenicichla astroblepa 4 0% Crenicichla aff strigata 1 N/A Crenicichla n. sp. preta 5 1% Crenicichla sp. xingu 6 0,2% Crenicichla regani 7 3% Cichla melaniae 7 1% Cichla mirianae pitanga 2 0% Cichla temensis 3 0% Cichla piquiti 1 N/A Geophagus altifrons 2 7% Geophagus argyrostictus 7 0,3% Geophagus sp. 4 3% Geophagus proximus 3 0,5% Heros efasciatus 9 0% Laetacara araguaiae 1 N/A Mesonauta festivus 5 1% Retroculus lapidifer 3 0,2% Retroculus xinguensis 2 0% Satanoperca jurupari 1 N/A Satnoperca sp. 2 0% Satanoperca lilith 3 0,2% Symphysodon aequafasciatus 3 0,2% Teleocichla sp. 1 N/A Teleocichla n. sp. preta 4 0,1% Teleocichla cf. gephyrogramma 1 N/A Teleocichla cinderela 3 6% 1093 1094 1095 1096 1097 1098 1099 1100

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1101 Tabela 7. Porcentagem média da distância intraespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos 1102 classificados molecularmente e representados por mais de um espécime. 1103 Número de % média da Espécie espécimens distância analisadas intraespecífica

Aequidens michaeli 2 0% Aequidens pallidus_JAT3 1 N/A Aequidens pallidus_JAT1 2 0% Aequidens pallidus_JAT2 1 N/A Aequidens pallidus_RN 2 0% Aequidens cf. eape 1 N/A Apistogramma sp. 1 N/A Apistogramma aff staecki 1 N/A Apistogramma agassizi_JAT1 3 0% Apistogramma agassizi_JAT2 5 0.3% Apistogramma agassizi_PUR 5 0.3% Apistogramma agassizi_TAP 1 N/A Apistogramma pertensis_JAT 6 0% Apistogramma gr brevis_RN 2 0.5% Apistogramma pulchra_PUR 5 0% Acarichthys heckelli_JAT_TAP 4 0% Acaronia nassa_PUR 1 N/A Acaronia nassa_TAP 1 N/A Biotodoma cupido 1 N/A Caquetaia spectabilis 2 0% Crenicichla n. sp. laranja 4 0.2% Crenicichla percna 1 N/A Crenicichla aff. Inpa 1 N/A Crenicichla sp1 1 N/A Crenicichla lugubris 4 0% Crenicichla astroblepa 4 0% Crenicichla n sp preta 5 1% Crenicichla sp xingu_XIN 6 0% Crenicichla regani_XIN 1 N/A Crenicichla regani_JAT 2 0% Crenicichla regani_PUR 2 0.3% Crenicichla regani_TAP 2 0.3% Cichla melaniae_XIN2 3 0% Cichla melaniae_XIN1 4 0% Cichla mirianae pitanga 2 0% Cichla temensis 3 0%

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Cichla piquiti 1 N/A Geophagus altifrons_ARA 1 N/A Geophagus altifrons_PUR 1 N/A Geophagus argyrostictus_XIN2 4 0% Geophagus argyrostictus_XIN1 3 0% Geophagus sp_TAP 3 0.5% Geophagus sp_XIN 1 N/A Geophagus proximus_TAP 2 0.5% Heros efasciatus_XIN_JAT 9 0% Laetacara araguaiae_TAP 1 N/A Mesonauta festivus_TAP 2 0.3% Mesonauta festivus_JAT 3 0.4% Retroculus lapidifer 3 0.2% Retroculus xinguensis 2 0% Satanoperca jurupari 1 N/A Satanoperca sp. 2 0% Satanoperca lilith 3 0.2% Symphysodon aequafasciatus 3 0.2% Teleocichla sp. 1 N/A Teleocichla n. sp. preta 5 0.3% Teleocichla cinderela_ARA1 1 N/A Teleocichla cinderela_ARA2 1 N/A Teleocichla cinderela_ARA3 1 N/A 1104 1105 1106 1107 Tabela 8. Número de linhagens biológicas encontradas para cada espécie de ciclídeos na Bacia 1108 Amazônica. 1109 Família Espécies Número de linhagens Cichlidae Apistogramma agassizi 4 Cichlidae Apistogramma sp. 1 Cichlidae Apistogramma pertensis 1 Cichlidae Apistogramma pulchra 1 Cichlidae Apistogramma gr. brevis 1 Cichlidae Apistogramma aff. staecki 1 Cichlidae Biotodoma cupido 1 Cichlidae Geophagus argyrostictus 2 Cichlidae Geophagus altifrons 2 Cichlidae Geophagus proximus 1 Cichlidae Geophagus sp. 2 Cichlidae Caquetaia spectabilis 1 Cichlidae Heros efasciatus 1

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Cichlidae Symphysodon aequafasciatus 1 Cichlidae Mesonauta festivus 2 Cichlidae Laetacara araguaiae 1 Cichlidae Acaronia nassa 2 Cichlidae Cichla melaniae 2 Cichlidae Cichla piquiti 1 Cichlidae Cichla temensis 1 Cichlidae Cichla mirianae pitanga 1 Cichlidae Acarichthys heckelii 1 Cichlidae Aequidens cf. epae 1 Cichlidae Aequidens pallidus 4 Cichlidae Aequidens michaeli 1 Cichlidae Retroculus lapidifer 1 Cichlidae Retroculus xinguensis 1 Cichlidae Satanoperca jurupari 1 Cichlidae Satanoperca sp. 1 Cichlidae Satanoperca lilith 1 Cichlidae Teleocichla cf. gephyrogramma 1 Cichlidae Teleocichla n. sp. preta - Cichlidae Teleocichla sp. 1 Cichlidae Teleocichla cinderela 3 Cichlidae Crenicichla regani 4 Cichlidae Crenicichla aff. inpa 1 Cichlidae Crenicichla percna 1 Cichlidae Crenicichla sp. preta 2 Cichlidae Crenicichla sp. xingu 1 Cichlidae Crenicichla jegui 1 Cichlidae Crenicichla lugubris - Cichlidae Crenicichla strigata - Cichlidae Crenicichla n. sp. laranja 1 Cichlidae Crenicichla astroblepa 1 Cichlidae Crenicichla sp. 1 1 TOTAL 45 60 1110 1111 1112 1113 1114 1115 1116 1117 1118 1119

77

1120 Tabela 9. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos delimitados molecularmente pelo modelo Generalized Mixed 1121 Yule Coalescent (GMYC). 1122

_brevis_RN

Aeq_michaeli_XIN Aeq_pallidus_JAT3 Aeq_pallidus_JAT1 Aeq_pallidus_JAT2 Aeq_pallidus_RN Aeq_cf_eape_TAP Ap_sp_XIN Ap_aff_staecki_JAT Ap_agassizi_JAT1 Ap_agassizi_JAT2 Ap_agassizi_PUR Ap_agassizi_TAP Ap_pertensis_JAT Ap_gr Ap_pulchra_PUR Aca_heckelli_JAT_TAP Ac_nassa_PUR Ac_nassa_TAP Bio_cupido_PUR Caq_spectabilis_XIN Cr_n_sp_laranja_XIN Cr_percna_XIN Cr_aff_inpa_XIN Cr_sp1_ARA Cr_lugubris_ARA

Aeq_michaeli_XIN Aeq_pallidus_JAT3 0.15

Aeq_pallidus_JAT1 0.10 0.12

Aeq_pallidus_JAT2 0.16 0.01 0.11

Aeq_pallidus_RN 0.15 0.06 0.11 0.07

Aeq_cf_eape_TAP 0.15 0.20 0.14 0.20 0.16 Ap_sp_XIN 0.34 0.32 0.35 0.32 0.30 0.37

Ap_aff_staecki_JAT 0.39 0.36 0.39 0.37 0.37 0.36 0.22

Ap_agassizi_JAT1 0.37 0.40 0.38 0.41 0.39 0.37 0.26 0.19

Ap_agassizi_JAT2 0.36 0.39 0.37 0.40 0.38 0.38 0.26 0.19 0.00

Ap_agassizi_PUR 0.34 0.35 0.36 0.37 0.33 0.33 0.25 0.21 0.06 0.06 Ap_agassizi_TAP 0.36 0.36 0.36 0.37 0.35 0.37 0.27 0.19 0.04 0.04 0.03

Ap_pertensis_JAT 0.36 0.39 0.40 0.41 0.38 0.39 0.24 0.20 0.22 0.23 0.24 0.22 Ap_gr_brevis_RN 0.37 0.34 0.35 0.35 0.35 0.37 0.29 0.20 0.24 0.24 0.21 0.21 0.25

Ap_pulchra_PUR 0.37 0.41 0.39 0.41 0.39 0.39 0.27 0.19 0.25 0.25 0.27 0.27 0.17 0.27

Aca_heckelli_JAT_TAP 0.24 0.29 0.25 0.27 0.27 0.24 0.31 0.31 0.31 0.32 0.36 0.35 0.32 0.35 0.35

Ac_nassa_PUR 0.22 0.24 0.21 0.24 0.23 0.23 0.34 0.37 0.37 0.38 0.36 0.36 0.44 0.44 0.46 0.27

Ac_nassa_TAP 0.21 0.24 0.22 0.24 0.21 0.22 0.33 0.34 0.35 0.36 0.35 0.35 0.42 0.43 0.42 0.24 0.03 Bio_cupido_PUR 0.35 0.37 0.37 0.39 0.38 0.37 0.36 0.42 0.37 0.38 0.39 0.37 0.44 0.43 0.41 0.41 0.39 0.40

Caq_spectabilis_XIN 0.26 0.26 0.28 0.26 0.24 0.26 0.35 0.36 0.36 0.37 0.35 0.37 0.38 0.38 0.41 0.19 0.21 0.18 0.42

Cr_n_sp_laranja_XIN 0.24 0.31 0.32 0.32 0.31 0.35 0.38 0.40 0.41 0.40 0.41 0.43 0.45 0.44 0.44 0.28 0.30 0.29 0.37 0.31

Cr_percna_XIN 0.26 0.32 0.32 0.32 0.31 0.33 0.37 0.34 0.41 0.41 0.42 0.42 0.42 0.40 0.42 0.31 0.31 0.31 0.34 0.34 0.08

78

Cr_aff_inpa_XIN 0.30 0.37 0.32 0.36 0.38 0.34 0.41 0.45 0.43 0.42 0.43 0.43 0.47 0.46 0.47 0.27 0.33 0.31 0.36 0.36 0.16 0.20

Cr_sp1_ARA 0.35 0.40 0.37 0.42 0.42 0.32 0.37 0.41 0.38 0.39 0.37 0.38 0.42 0.37 0.48 0.27 0.30 0.31 0.38 0.34 0.24 0.25 0.23

Cr_lugubris_ARA 0.29 0.33 0.38 0.35 0.29 0.34 0.36 0.39 0.41 0.42 0.41 0.40 0.45 0.41 0.45 0.31 0.28 0.27 0.37 0.33 0.11 0.10 0.20 0.23

Cr_astroblepa_ARA 0.38 0.40 0.39 0.41 0.41 0.33 0.37 0.37 0.35 0.36 0.34 0.35 0.41 0.36 0.47 0.30 0.29 0.28 0.35 0.32 0.26 0.26 0.26 0.08 0.22 Cr_n_sp_preta_XIN 0.29 0.36 0.34 0.36 0.34 0.37 0.37 0.38 0.38 0.38 0.43 0.41 0.42 0.43 0.42 0.30 0.26 0.26 0.36 0.29 0.08 0.07 0.16 0.27 0.12

a_XIN

Aeq_michaeli_XIN Aeq_pallidus_JAT3 Aeq_pallidus_JAT1 Aeq_pallidus_JAT2 Aeq_pallidus_RN Aeq_cf_eape_TAP Ap_sp_XIN Ap_aff_staecki_JAT Ap_agassizi_JAT1 Ap_agassizi_JAT2 Ap_agassizi_PUR Ap_agassizi_TAP Ap_pertensis_JAT Ap_gr_brevis_RN Ap_pulchra_PUR Aca_heckelli_JAT_TAP Ac_nassa_PUR Ac_nassa_TAP Bio_cupido_PUR Caq_spectabilis_XIN Cr_n_sp_laranj Cr_percna_XIN Cr_aff_inpa_XIN Cr_sp1_ARA Cr_lugubris_ARA Cr_sp_xingu_XIN 0.26 0.34 0.32 0.34 0.32 0.35 0.36 0.38 0.37 0.37 0.41 0.41 0.42 0.44 0.43 0.29 0.25 0.24 0.35 0.31 0.07 0.08 0.16 0.27 0.11 Cr_regani_XIN 0.35 0.38 0.40 0.39 0.40 0.31 0.50 0.42 0.40 0.39 0.40 0.40 0.51 0.47 0.44 0.33 0.35 0.32 0.35 0.35 0.23 0.23 0.24 0.28 0.28 Cr_regani_JAT 0.33 0.37 0.40 0.37 0.36 0.31 0.46 0.41 0.38 0.38 0.40 0.40 0.47 0.42 0.43 0.33 0.32 0.29 0.34 0.32 0.19 0.23 0.25 0.27 0.25 Cr_regani_PUR 0.33 0.36 0.40 0.36 0.35 0.32 0.47 0.39 0.38 0.37 0.41 0.39 0.46 0.42 0.41 0.33 0.32 0.29 0.33 0.32 0.20 0.22 0.24 0.28 0.23 Cr_regani_TAP 0.34 0.38 0.40 0.38 0.39 0.31 0.50 0.41 0.40 0.39 0.41 0.40 0.50 0.47 0.44 0.31 0.34 0.31 0.36 0.35 0.22 0.23 0.23 0.27 0.27 Ci_melaniae_XIN2 0.23 0.24 0.25 0.24 0.22 0.26 0.30 0.35 0.34 0.35 0.36 0.35 0.37 0.41 0.35 0.23 0.25 0.23 0.35 0.24 0.31 0.30 0.36 0.33 0.33 Ci_melaniae_XIN1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.24 0.27 0.34 0.34 0.38 0.37 0.40 0.39 0.39 0.41 0.37 0.24 0.24 0.24 0.37 0.23 0.31 0.29 0.36 0.34 0.33 Ci_mirianae_pitanga_XIN 0.23 0.26 0.22 0.25 0.21 0.21 0.33 0.38 0.38 0.39 0.36 0.37 0.38 0.42 0.41 0.25 0.21 0.20 0.32 0.25 0.33 0.31 0.36 0.29 0.35 Ci_temensis_JAT 0.21 0.24 0.24 0.24 0.22 0.26 0.31 0.36 0.33 0.33 0.34 0.33 0.37 0.40 0.37 0.23 0.24 0.24 0.37 0.22 0.30 0.29 0.35 0.32 0.31 Ci_piquiti_ARA 0.23 0.24 0.24 0.24 0.22 0.29 0.30 0.36 0.32 0.33 0.34 0.33 0.36 0.39 0.35 0.25 0.25 0.25 0.36 0.24 0.30 0.31 0.38 0.34 0.32 Geo_altifrons_ARA 0.23 0.29 0.29 0.30 0.31 0.32 0.31 0.45 0.39 0.39 0.36 0.39 0.33 0.38 0.35 0.29 0.28 0.28 0.37 0.31 0.28 0.28 0.29 0.38 0.35 Geo_altifrons_PUR 0.27 0.30 0.32 0.30 0.31 0.37 0.31 0.46 0.39 0.39 0.36 0.37 0.34 0.38 0.35 0.27 0.32 0.32 0.35 0.32 0.30 0.31 0.31 0.38 0.34 Geo_argyrostictus_XIN2 0.22 0.29 0.29 0.29 0.29 0.28 0.34 0.39 0.34 0.35 0.34 0.34 0.33 0.36 0.38 0.25 0.28 0.28 0.35 0.32 0.28 0.29 0.30 0.38 0.33 Geo_argyrostictus_XIN1 0.22 0.29 0.27 0.29 0.29 0.26 0.36 0.41 0.36 0.36 0.34 0.34 0.33 0.37 0.38 0.25 0.28 0.29 0.35 0.32 0.30 0.30 0.31 0.38 0.34 Geo_sp_TAP 0.22 0.29 0.29 0.30 0.30 0.32 0.31 0.46 0.40 0.41 0.38 0.40 0.35 0.39 0.37 0.28 0.30 0.30 0.36 0.30 0.26 0.26 0.28 0.38 0.34 Geo_sp_XIN 0.24 0.32 0.31 0.33 0.32 0.34 0.30 0.43 0.38 0.39 0.37 0.39 0.33 0.36 0.36 0.23 0.29 0.29 0.35 0.28 0.29 0.29 0.31 0.37 0.37 Geo_proximus_TAP 0.24 0.29 0.30 0.29 0.29 0.34 0.29 0.44 0.38 0.39 0.36 0.37 0.33 0.38 0.35 0.24 0.30 0.30 0.38 0.29 0.27 0.29 0.30 0.33 0.32 He_efasciatus_XIN_JAT 0.23 0.22 0.21 0.23 0.22 0.22 0.39 0.34 0.37 0.37 0.36 0.36 0.37 0.36 0.40 0.25 0.23 0.23 0.43 0.19 0.36 0.31 0.37 0.36 0.36 Lae_araguaiae_TAP 0.21 0.23 0.24 0.24 0.24 0.22 0.37 0.37 0.43 0.43 0.39 0.41 0.40 0.40 0.46 0.25 0.17 0.19 0.37 0.25 0.31 0.31 0.28 0.30 0.29 Mes_festivus_TAP 0.25 0.23 0.25 0.23 0.22 0.25 0.37 0.41 0.42 0.41 0.37 0.41 0.49 0.37 0.50 0.30 0.25 0.24 0.42 0.20 0.31 0.30 0.38 0.33 0.32

79

Mes_festivus_JAT 0.23 0.23 0.23 0.23 0.21 0.25 0.35 0.40 0.39 0.39 0.36 0.39 0.46 0.38 0.47 0.29 0.22 0.22 0.39 0.19 0.30 0.30 0.38 0.31 0.31 Ret_lapidifer_ARA 0.28 0.26 0.27 0.26 0.25 0.30 0.32 0.41 0.35 0.36 0.37 0.40 0.38 0.38 0.41 0.29 0.23 0.22 0.38 0.23 0.34 0.36 0.35 0.38 0.35 Ret_xinguensis_XIN 0.28 0.31 0.27 0.31 0.27 0.32 0.35 0.40 0.36 0.37 0.37 0.40 0.41 0.41 0.46 0.29 0.24 0.23 0.42 0.23 0.35 0.38 0.35 0.41 0.40 Sat_jurupari_ARA 0.23 0.28 0.27 0.27 0.26 0.30 0.37 0.33 0.38 0.37 0.37 0.36 0.44 0.34 0.40 0.27 0.25 0.24 0.41 0.23 0.32 0.33 0.35 0.36 0.33 Sat_sp_XIN 0.26 0.27 0.27 0.27 0.28 0.31 0.32 0.34 0.37 0.36 0.36 0.35 0.42 0.30 0.38 0.27 0.28 0.26 0.40 0.23 0.32 0.31 0.35 0.34 0.35 Sat_lilith_JAT 0.26 0.28 0.30 0.29 0.30 0.24 0.33 0.39 0.38 0.39 0.36 0.40 0.42 0.36 0.41 0.26 0.24 0.22 0.40 0.25 0.32 0.32 0.34 0.32 0.31 Sym_aequafasciatus_XIN 0.25 0.21 0.21 0.23 0.23 0.26 0.37 0.40 0.40 0.41 0.36 0.38 0.40 0.41 0.46 0.29 0.22 0.25 0.42 0.22 0.31 0.33 0.33 0.36 0.37 Te_sp_ARA 0.29 0.30 0.34 0.31 0.33 0.38 0.40 0.44 0.42 0.41 0.38 0.40 0.44 0.44 0.43 0.37 0.34 0.33 0.40 0.39 0.23 0.26 0.25 0.36 0.29 Te_n_sp_preta_XIN 0.29 0.28 0.34 0.30 0.29 0.34 0.36 0.38 0.40 0.39 0.37 0.40 0.41 0.39 0.43 0.33 0.30 0.29 0.39 0.33 0.26 0.26 0.23 0.31 0.27 Te_cinderela_ARA1 0.38 0.40 0.43 0.42 0.42 0.43 0.53 0.48 0.51 0.50 0.49 0.49 0.53 0.49 0.55 0.41 0.39 0.37 0.43 0.39 0.30 0.31 0.34 0.38 0.34 Te_cinderela_ARA2 0.39 0.39 0.44 0.42 0.41 0.43 0.53 0.47 0.54 0.53 0.52 0.52 0.51 0.50 0.53 0.44 0.40 0.38 0.44 0.42 0.31 0.30 0.34 0.39 0.35 Te_cinderela_ARA3 0.34 0.36 0.38 0.38 0.38 0.38 0.48 0.44 0.49 0.49 0.46 0.46 0.48 0.46 0.49 0.39 0.35 0.33 0.40 0.38 0.28 0.27 0.29 0.35 0.30

ns_PUR

Geo_sp_XIN

Geo_sp_TAP

Cr_regani_XIN Cr_regani_JAT

Ci_piquiti_ARA

Cr_regani_TAP

Cr_regani_PUR

Ci_temensis_JAT

Cr_sp_xingu_XIN Mes_festivus_JAT

Mes_festivus_TAP

Ret_lapidifer_ARA

Ci_melaniae_XIN2 Ci_melaniae_XIN1

Geo_altifrons_ARA

Geo_altifro

Cr_astroblepa_ARA Geo_proximus_TAP Ret_xinguensis_XIN

Cr_n_sp_preta_XIN

Lae_araguaiae_TAP

He_efasciatus_XIN_JAT

Geo_argyrostictus_XIN2 Geo_argyrostictus_XIN1

Ci_mirianae_pitanga_XIN

Cr_n_sp_preta_XIN 0.28 Cr_sp_xingu_XIN 0.27 0.05 Cr_regani_XIN 0.31 0.23 0.26 Cr_regani_JAT 0.30 0.22 0.25 0.04 Cr_regani_PUR 0.30 0.21 0.24 0.04 0.01 Cr_regani_TAP 0.30 0.23 0.25 0.01 0.04 0.04 Ci_melaniae_XIN2 0.33 0.33 0.32 0.33 0.33 0.35 0.32 Ci_melaniae_XIN1 0.32 0.32 0.32 0.33 0.33 0.35 0.32 0.02 Ci_mirianae_pitanga_XIN 0.27 0.35 0.34 0.35 0.33 0.36 0.34 0.06 0.07 Ci_temensis_JAT 0.32 0.32 0.31 0.35 0.33 0.35 0.33 0.02 0.03 0.07 Ci_piquiti_ARA 0.32 0.33 0.31 0.35 0.35 0.36 0.33 0.02 0.04 0.07 0.03 Geo_altifrons_ARA 0.38 0.30 0.29 0.34 0.35 0.35 0.35 0.29 0.29 0.29 0.27 0.29 Geo_altifrons_PUR 0.40 0.32 0.31 0.33 0.33 0.33 0.34 0.28 0.30 0.29 0.28 0.27 0.07 Geo_argyrostictus_XIN2 0.37 0.29 0.27 0.30 0.30 0.32 0.31 0.27 0.27 0.26 0.25 0.26 0.10 0.09

80

Geo_argyrostictus_XIN1 0.37 0.31 0.28 0.30 0.32 0.33 0.31 0.27 0.27 0.25 0.25 0.26 0.10 0.10 0.01 Geo_sp_TAP 0.39 0.28 0.27 0.32 0.33 0.33 0.33 0.29 0.29 0.28 0.28 0.29 0.02 0.06 0.09 0.09 Geo_sp_XIN 0.39 0.29 0.28 0.34 0.34 0.33 0.35 0.29 0.29 0.27 0.27 0.27 0.06 0.04 0.10 0.10 0.05 Geo_proximus_TAP 0.35 0.30 0.28 0.31 0.33 0.33 0.32 0.26 0.28 0.26 0.25 0.25 0.06 0.03 0.10 0.10 0.05 0.04 He_efasciatus_XIN_JAT 0.35 0.34 0.36 0.35 0.33 0.33 0.34 0.24 0.23 0.24 0.23 0.26 0.33 0.32 0.32 0.32 0.32 0.29 0.29 Lae_araguaiae_TAP 0.31 0.30 0.31 0.33 0.30 0.31 0.31 0.24 0.24 0.22 0.24 0.25 0.31 0.32 0.31 0.33 0.32 0.31 0.32 0.20 Mes_festivus_TAP 0.34 0.32 0.32 0.41 0.37 0.38 0.40 0.22 0.22 0.23 0.23 0.24 0.34 0.34 0.32 0.34 0.33 0.32 0.32 0.22 0.25 Mes_festivus_JAT 0.33 0.30 0.29 0.39 0.35 0.36 0.38 0.21 0.20 0.21 0.21 0.22 0.33 0.32 0.31 0.32 0.32 0.30 0.31 0.22 0.24 0.02 Ret_lapidifer_ARA 0.35 0.33 0.32 0.39 0.37 0.37 0.38 0.24 0.27 0.23 0.24 0.24 0.25 0.27 0.28 0.28 0.26 0.24 0.26 0.28 0.28 0.32 0.30 Ret_xinguensis_XIN 0.41 0.34 0.33 0.45 0.41 0.41 0.42 0.29 0.29 0.27 0.27 0.27 0.28 0.30 0.30 0.31 0.29 0.26 0.30 0.28 0.28 0.31 0.29 0.09 Sat_jurupari_ARA 0.32 0.31 0.31 0.35 0.37 0.36 0.34 0.24 0.25 0.25 0.23 0.24 0.31 0.32 0.30 0.32 0.31 0.33 0.31 0.28 0.27 0.28 0.25 0.29 0.30 Sat_sp_XIN 0.33 0.31 0.32 0.35 0.35 0.36 0.36 0.23 0.24 0.26 0.23 0.22 0.31 0.29 0.30 0.31 0.30 0.29 0.29 0.29 0.26 0.28 0.26 0.32 0.32 Sat_lilith_JAT 0.31 0.32 0.31 0.35 0.34 0.36 0.34 0.24 0.25 0.21 0.25 0.24 0.30 0.27 0.29 0.30 0.30 0.29 0.28 0.30 0.25 0.27 0.26 0.22 0.29 Sym_aequafasciatus_XIN 0.37 0.34 0.30 0.44 0.39 0.42 0.42 0.24 0.25 0.21 0.22 0.23 0.30 0.27 0.29 0.29 0.28 0.27 0.25 0.17 0.24 0.21 0.18 0.31 0.33 Te_sp_ARA 0.37 0.24 0.22 0.31 0.30 0.29 0.28 0.32 0.33 0.35 0.31 0.30 0.33 0.35 0.35 0.36 0.34 0.36 0.35 0.39 0.34 0.31 0.29 0.39 0.39 Te_n_sp_preta_XIN 0.34 0.25 0.24 0.31 0.29 0.29 0.30 0.30 0.32 0.30 0.30 0.30 0.37 0.37 0.36 0.38 0.37 0.36 0.35 0.32 0.30 0.33 0.32 0.35 0.37 Te_cinderela_ARA1 0.35 0.31 0.31 0.32 0.30 0.31 0.30 0.33 0.35 0.33 0.33 0.34 0.43 0.47 0.40 0.40 0.42 0.43 0.43 0.38 0.36 0.37 0.36 0.41 0.42 Te_cinderela_ARA2 0.36 0.31 0.31 0.31 0.29 0.29 0.29 0.34 0.35 0.33 0.34 0.35 0.43 0.46 0.42 0.42 0.43 0.44 0.43 0.40 0.35 0.39 0.38 0.40 0.44 Te_cinderela_ARA3 0.31 0.27 0.28 0.27 0.25 0.26 0.25 0.30 0.31 0.30 0.29 0.31 0.38 0.41 0.37 0.37 0.38 0.38 0.38 0.34 0.31 0.35 0.33 0.36 0.38

IN

Sat_sp_XIN

Sat_lilith_JAT

Sat_jurupari_ARA

Te_sp_ARA

Te_n_sp_preta_X Te_cinderela_ARA1 Te_cinderela_ARA2 Te_cinderela_ARA3

Sym_aequafasciatus_XIN Sat_jurupari_ARA Sat_sp_XIN 0.04 Sat_lilith_JAT 0.24 0.23 Sym_aequafasciatus_XIN 0.28 0.26 0.26 Te_sp_ARA 0.34 0.38 0.32 0.37 Te_n_sp_preta_XIN 0.32 0.33 0.33 0.34 0.15

81

Te_cinderela_ARA1 0.40 0.40 0.33 0.44 0.16 0.22 Te_cinderela_ARA2 0.43 0.43 0.34 0.43 0.16 0.24 0.05 Te_cinderela_ARA3 0.38 0.38 0.31 0.39 0.12 0.21 0.08 0.05 1123 1124 1125 1126 1127 1128 1129 1130 1131 1132 1133 1134 1135 1136 1137 1138 1139 1140 1141 1142 1143 1144 1145 1146 1147 1148 1149 1150 1151

82

1152 1153 Tabela 10. Distância média da distância interespecífica (K2P) para as espécies de ciclídeos classificados morfologicamente.

Ap_sp.

Cr_sp1

Cr_jegui

r_sp_xingu

Ac_nassa

Ci_piquiti

Cr_regani

Cr_percna

Bio_cupido

Ap_pulchra

Ap_agassizi

Cr_aff_inpa Cr_lugubris Ci_temensis

Ci_melaniae

Aeq_cf_eape Aca_heckelli C

Ap_pertensis

Aeq_pallidus

Ap_gr_brevis

Aeq_michaeli

Geo_altifrons

Cr_astroblepa

Ap_aff_staecki

Cr_n_sp_preta

Cr_aff_strigata

Caq_spectabilis

Cr_n_sp_laranja

Ci_mirianae_pitanga

Aeq_michaeli 0.1 Aeq_pallidus 0.2 0.2 Aeq_cf_eape 0.3 0.3 0.4 Ap_sp. 0.4 0.4 0.4 0.2 Ap_aff_staecki 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 Ap_agassizi 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 Ap_pertensis 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 Ap_gr_brevis 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3 Ap_pulchra 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 Aca_heckelli 0.2 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 Ac_nassa 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Bio_cupido 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4 Caq_spectabilis 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 Cr_n_sp_laranja 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 Cr_percna 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.5 0.5 0.3 0.3 0.4 0.4 0.2 0.2 Cr_aff_inpa 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 Cr_sp1 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2 Cr_jegui 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2 0.0 Cr_lugubris 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 0.2 Cr_astroblepa 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.2 0.0 0.0 0.2 Cr_aff_strigata 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.3 0.1 0.1 0.3 0.1 Cr_n_sp_preta 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.3 0.1 0.1 0.2 0.3 0.1 0.1 0.3 0.1 0.1 Cr_sp_xingu

83

0.3 0.4 0.3 0.5 0.4 0.4 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 Cr_regani 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Ci_melaniae 0.2 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.3 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 Ci_mirianae_pitanga Ci_temensis 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.02 0.1 Ci_piquiti 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.03 0.1 0.03 Geo_altifrons 0.2 0.3 0.3 0.3 0.5 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Geo_argysrostictus 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 Geo_sp 0.2 0.3 0.3 0.3 0.5 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.04 Geo_proximus 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.2 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.04 He_efasciatus 0.2 0.2 0.2 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 Lae_araguaiae 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.2 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 Mes_festivus 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.5 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 Ret_lapidifer 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 Ret_xinguensis 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Sat_jurupari 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 Sat_sp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 Sat_lilith 0.3 0.3 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 Sym_aequafasciatus 0.2 0.2 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.5 0.3 0.2 0.4 0.2 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 Te_sp 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.2 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Te_n_sp_preta 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 Te_cf_gephyrogramma 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 Te_cinderela 0.4 0.4 0.4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4

.

Te_sp

Sat_sp

_cinderela

Geo_sp

Sat_lilith

Sat_jurupari

Mes_festivus

Ret_lapidifer Te

He_efasciatus

Geo_proximus

Te_n_sp_preta

Ret_xinguensis

Lae_araguaiae

Geo_argysrostictus

Sym_aequafasciatus

Te_cf_gephyrogramma

Geo_argysrostictus Geo_sp. 0.1 Geo_proximus 0.1 0.05

84

He_efasciatus 0.3 0.3 0.3 Lae_araguaiae 0.3 0.3 0.3 0.2 Mes_festivus 0.3 0.3 0.3 0.2 0.2 Ret_lapidifer 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Ret_xinguensis 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 Sat_jurupari 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Sat_sp 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.03 Sat_lilith 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 Sym_aequafasciatus 0.3 0.3 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 Te_sp 0.4 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.3 0.4 Te_n_sp_preta 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 Te_cf_gephyrogramma 0.4 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.2 0.0 Te_cinderela 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.3 0.4 0.1 0.2 0.2 1154