INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA ANA PAULA COSTA DE CARVALHO Manaus, Amazonas Junho 2014 i Ana Paula Costa de Carvalho CÓDIGO DE BARRAS DE DNA COMO FERRAMENTA PARA O ESTUDO DA BIODIVERSIDADE DE PEIXES DA FAMÍLIA CICHLIDAE NA BACIA AMAZÔNICA Orientador: Ph.D. Tomas Hrbek Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção de título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Manaus, Amazonas Junho 2014 ii C331c Carvalho, Ana Paula Costa de Código de barras de DNA como ferramenta para o estudo da biodiversidade de peixes da família Cichlidae na bacia Amazônica / Ana Paula Costa de Carvalho. --- Manaus: [s.n.], 2014. xii, 86 f. : il. color. Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2014. Orientador: Tomas Hrbek. Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. 1. DNA Barcoding. 2. Conservação. 3. Ictiofauna. 4. Neotropical. I.Título CDD 597.58 Sinopse: Estudou-se a metodologia do código de barras de DNA (gene COI) para identificar e delimitar a ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. O código de barras de DNA conseguiu discriminar a maioria das espécies analisadas e sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies. Palavras-chave: Citocromo oxidase I, espécies crípticas, identificação. iii AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus pela minha existência, pela dádiva de viver e por abençoar sempre o meu caminho. Aos meus Familiares, principalmente aos meus Avós (Raimundo Ferreira da Costa e Maria Mendes da Costa) e aos meus Pais (Domingos Marques de Carvalho e Euzemar Costa de Carvalho) que moram no meu coração, pelo afeto e carinho, pelos conselhos que me ajudaram a vencer na estrada da vida e pelo incentivo na minha determinação, devo tudo isso à vocês. Ao Francisco Martins de Castro, meu esposo, pelo companheirismo, amor, carinho, dedicação, apoio e compreensão nas fases difíceis da minha vida e pela vitória conquistada. Ao Professor Dr. Tomas Hrbek pela orientação, confiança e ajuda durante a execução deste trabalho. A Profª. Dra. Izeni Pires Farias pelo apoio e ensinamentos durante o desenvolvimento da minha dissertação. Agradeço o Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA pela oportunidade de mestrado. Os Professores do programa que se dedicaram em repassar conhecimentos essenciais ao meu aprendizado e para a minha formação profissional durante as disciplinas. E também a secretária Alessandra, sempre disposta a atender nossas solicitações. A Universidade de Federal do Amazonas (UFAM) pelo espaço utilizado do Laboratório de Genética Animal (LEGAL) para execução das análises do meu mestrado. A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos e pelo financiamento deste projeto de pesquisa juntamente com a CNPq e FAPEAM. Aos colegas (José, Valéria, Deyla, Natasha, Sarah, Gabi, Mário, Adriano, Júlia, Olavo, Concy, Elciomar, Fabrício, Fabinho e Emanuel) do Laboratório de Evolução e Genética iv Animal (LEGAL)/UFAM que voluntariamente me ajudaram a realizar este trabalho. Obrigada pela colaboração, incentivo e atenção! Aos pesquisadores e amigos do INPA e do LEGAL pela receptividade e colaboração em realizar as coletas e identificar as amostras. Enfim, agradeço a todos, que de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho. v "Há homens que lutam um dia e são bons. Há outros que lutam um ano e são melhores. Há os que lutam muitos anos e são muito bons. Porém, há os que lutam toda a vida. Esses são os imprescindíveis." Bertolt Brecht. vi RESUMO Os ciclídeos neotropicais constituem um grupo variado, no qual compreendem cerca de 60 gêneros e pelo menos 1300 espécies são reconhecidas. São distribuídas na América Central e do Sul, Texas, Índias Ocidentais, África, Madagascar, Síria, Israel, Irã, Sri Lanka, litoral do sul da Índia. A diversidade encontrada na família Cichlidae abrange os mais diferentes aspectos morfológicos e ecológicos, que facilitam na adaptação dos peixes desta família. Além disso, evidências com base nos dados moleculares mostraram que a maior parte da diversificação da ictiofauna Neotropical ocorreu recentemente. Estas características tornam difícil a compreensão da taxonomia e identificação dessa fauna, tornando um grande desafio para as ferramentas moleculares. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo testar a eficácia da metodologia do código de barras de DNA (gene COI) para identificar e delimitar a ictiofauna diversificada de ciclídeos em água doce da região Neotropical. Para esta finalidade, foram analisadas 59 espécies de peixes na bacia Amazônica, sendo amostrado por até cinco espécimes, identificadas a priori morfologicamente, e obtidas 147 sequências de código de barras de DNA. Foram combinados os dados morfológicos com os moleculares, onde apenas nove espécies apresentaram concordância em ambos os métodos de identificação. Das 45 espécies analisadas, 40 (88,8%) foram corretamente identificadas pelas sequências de códigos de barras. Os principais valores de divergência genética intraespecífica e interespecífica pelo K2P nos agrupamentos moleculares foram 0% e 55%. E verificou-se sete espécies crípticas (15,5%), sete complexos de espécies (15,5%) e aproximadamente cinco espécies (11,2%) mostraram ausência de monofilia recíproca. Este estudo é o primeiro analisar um grande número de espécies de peixes de água doce da região Neotropical, incluindo um grande número de espécies estreitamente relacionadas. Os resultados confirmaram a eficácia do código de barras para sinalizar espécies crípticas e complexos de espécies, que passaram recentemente por um processo de irradiação, além de discriminar a maioria das espécies analisadas. Os resultados também revelaram divergências genéticas sugestivas de isolamento reprodutivo e especiação críptica em sete espécies. Enfim, os resultados obtidos contribuirão significamente para o projeto Internacional do Código de Barras da Vida, e para a campanha FISH-BOL fornecendo as sequências de código de barras para uso na identificação dessas espécies por especialistas e não-especialistas, e permitindo-lhes estar disponível para uso em outras aplicações. vii ABSTRACT The Neotropical cichlids are a diverse group, which comprises about 60 genera and at least 1300 species are recognized. They are distributed in Central and South America, Texas, West Indies, Africa, Madagascar, Syria, Israel, Iran, Sri Lanka, southern coast of India. The diversity found in the Cichlid family covers the most different morphological and ecological aspects that facilitate the adaptation of this fish family. In addition, evidence based on molecular data showed that most of the diversification of the Neotropical fish fauna occurred recently. These features make it difficult to understand the taxonomy and identification of this fauna, becoming a major challenge for molecular tools. In this context, this study aimed to test the effectiveness of DNA barcode methodology (COI gene) to identify and delineate the diverse ictiofauna of freshwater cichlids in the Neotropics. For this purpose, 59 species of Amazon basin fish were analyzed, being sampled by up to five specimens, morphologically identified beforehand, and 147 DNA barcode sequences obtained. Morphological data were combined with the molecular where only nine species showed agreement in both methods of identification. Of the 45 species analyzed, 40 (88.8%) were correctly identified by the barcode sequencing. The main values of intraspecific and interspecific genetic divergence by K2P in molecular clusters were 0% and 55%. Seven cryptic species (15.5%) as well as seven complexes of species (15.5%) were verified and approximately five species (11.2%) showed absence of mutual monophyly. This study is the first to analyze a large number of freshwater fish species in South America, including a large number of closely related species. The results confirmed the effectiveness of barcode to signal cryptic species and species complexes, which have recently undergone a process of irradiation, in addition to discriminate most species analyzed. The results also revealed genetic differences suggesting reproductive isolation and cryptic speciation in seven species. Finally, the results will contribute significantly for the Life Barcode International Project, and for the FISH-BOL campaign providing sequences of barcodes on the identification of these species by specialists and non-specialists, as well as allowing them to be available for use in other applications. viii SUMÁRIO Pág. RESUMO……………………………………………………………………….. vi ABSTRACT..…………………………………………………………………… vii 1. INTRODUÇÃO GERAL……………………………………………………. 13 1.1 Biologia e Ecologia dos Ciclídeos................................................................... 13 1.2 História Biogeográfica dos Ciclídeos.............................................................. 18 1.3 Código de Barras de DNA............................................................................... 19 CAPÍTULO I........................................................................................................ 23 Artigo I................................................................................................................... 24 2. CONSIDERAÇÕES GERAIS.......................................................................