INPA Programa De Pós-Graduação Em Biologia Tropical E Recursos Naturais Programa De Genética, Conservação E Biologia Evolutiva/INPA – PPG-Gcbev

MINISTÉRIO DA CIÊNCIA E TECNOLOGIA - MCT INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA Programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais Programa de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA – PPG-GCBEv

DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA PESCADA, Plagioscion squamosissimus (HECKEL, 1840) NA CALHA DO RIO AMAZONAS

ELIZABETE SIMÃO GALLETTI

Manaus - Amazonas Julho, 2009

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ELIZABETE SIMÃO GALLETTI

DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA PESCADA, Plagioscion squamosissimus (HECKEL, 1840) NA CALHA DO RIO AMAZONAS

Orientador: AYLTON SATURNINO TEIXEIRA Co-orientadora: IZENI PIRES FARIAS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Manaus - Amazonas Julho, 2009

FICHA CATALOGRÁFICA

G167 Galetti, Elizabete Simão Distribuição da variabilidade genética da pescada, Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840) na calha do Rio Amazonas / Elizabete Simão Galetti.‐‐‐ Manaus : [s.n.], 2009. xiv, 67f. : il. color.

Dissertação(mestrado)‐‐ INPA, Manaus, 2009 Orientador : Aylton Saturnino Teixeira Co‐orientador : Izeni Pires Farias Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1.Plagioscion squamosissimus. 2. Genética de população. 3. Pescada ‐ Bacias hidrográficas – Amazônia. I. Título.

CDD 19. ed. 597.580415

Sinopse:

Estudou-se a distribuição da variabilidade genética da pescada, Plagioscion squamosissimus em cinco localidades da

calha principal do rio Amazonas. Níveis de diversidade genética e estruturação genético-populacional foram avaliados.

Palavras-chave: Plagioscion squamosissimus, Genética de População, Região controle, Bacia Amazônica.

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À minha mãe Verônica

Ao meu irmão Vitor

Ao meu amor Ricardo iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus, que não permitiu que eu me desviasse do caminho, me dando forças nas horas mais difíceis, após cada queda. Me ajudando a compreender o porquê de cada acontecimento e de cada pessoa, boas e ruins, colocada em meu caminho.

À minha mãe, para a qual o agradecimento não consigo expressar em palavras. Tudo o que ela representou durante esta fase de minha vida... Como tem sido a vida toda... Pelo AMOR INCONDICIONAL.

Ao meu maninho querido, que comprava as minhas dores a cada lágrima que alguém arrancava dos meus olhos (como tem sido a vida toda) a fim de evitar meu sofrimento nas horas difíceis. E por ser sempre meu fã número um, apesar das minhas limitações.

À minha vó, por tantas orações.

Ao meu pai, por estar sempre na torcida para que o sucesso bata a minha porta por meio das minhas conquistas.

À Doutora Izeni Pires Farias, por ter me recebido em seu laboratório com tanto carinho logo no primeiro dia. E pelas contribuições como co-orientadora, não permitindo que alguma monstruosidade pudesse passar aos meus olhos durante minhas escritas.

Ao Doutor Aylton Saturnino Teixeira, pela gentileza com que sempre me tratou durantes todos estes meses, mesmo em situações adversas ao bom humor. E pelas contribuições como orientador, dispensando horas preciosas do seu tempo investindo no meu “saber” e acreditando em mim.

Aos mestres desta fase, pelas grandes influências na minha formação. Que muito mais que aulas, foram exemplos de profissional que quero (e devo) e que não quero ser.

Ao Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT)/Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), e à Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela infra- estrutura e apoio cedidos, para a realização desta dissertação.

Ao Curso de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEV/INPA), pela oportunidade do aprendizado profissional e pessoal.

À CAPES pela bolsa de estudo concedida, tornando possível a realização do curso de Mestrado.

Ao CNPq/CT-Amazônia/N⁰ 554057/2006-9, sob coordenação da Dra. Izeni Pires Farias, projeto de financiamento que tornou possível a realização deste estudo.

Aos colegas de turma, Arlison, Rodrigo, Leila, Suzana, Fabíola e Alessandra, que de alguma forma contribuíram para a minha formação.

À Alessandra pelo carinho e por toda ajuda concedida na secretaria do GCBEv.

Aos amigos e companheiros profissionais do LEGAL (Laboratório de Evolução e Genética Animal) que sempre me instruíram desde os processos técnicos mais simples, e partilharam discussões complexas com paciência, dedicação e interesse. Em especial, à Valéria, Concy e Natasha, que estiveram ao meu lado, me orientando e partilhando as fases mais difíceis desse trabalho. A essas pessoas mais que “legais”, o meu muito obrigada!!!

Aos companheiros e amigos de república, durante os anos que vivi aqui em função desse mestrado, Cristina, Nathalia, Mírian, Daiane, Letícia, Mário e Herbert, que colaboraram para que eu pudesse estudar em casa. Isso foi muito importante!!!

À Suzana e Letícia, por serem minhas irmãs.

E a todas as pessoas que torceram por mim, e que em nenhum momento acreditaram no meu fracasso. Amigos daqui de Manaus, e de minha terrinha Dourados, que ficaram na torcida sempre.

E ao meu amor, Ricardo que cuidou de mim durante minhas estafas e angústias, foi meu enfermeiro, cozinheiro, companheiro, pessoa insubstituível na minha vida, que nunca me deixou abater. Eu te amo muito!!!

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“Nunca se sabe até onde vai a influência de um mestre” (autor desconhecido)

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RESUMO

A pescada Plagioscion squamosissimus, é um scianídeo de água doce restrito à América do Sul, com ampla distribuição no território brasileiro, originário da bacia amazônica e introduzido nas regiões nordeste e sudeste. Esta espécie apresenta importância para a economia pesqueira da região amazônica, por ser um pescado considerado nobre e de grande valor comercial. No entanto, não há ainda para a pescada, um projeto de manejo de seus estoques pesqueiros, que permita sua conservação. Os estudos genético-populacionais aplicados a espécies de peixes de importância comercial têm gerado importantes dados para uma delimitação mais adequada dos estoques pesqueiros. O conhecimento da distribuição da diversidade genética da pescada branca no canal principal do rio Amazonas pode ser uma importante contribuição para um manejo apropriado da espécie e consequentemente de sua conservação. Cinco localidades do rio Amazonas foram amostradas, com um total de 81 indivíduos coletados. O DNA genômico foi extraído de nadadeiras via CTAB 2%, e a região controle do DNA mitocondrial foi amplificada e sequenciada no sequenciador automático ABI 3130 XL. Os 727 pares de bases obtidos foram alinhados e editados no programa BioEdit v. 5.0.6 e evidenciaram a existência de 54 haplótipos. Resultados provenientes do programa Arlequin 3.1 tambem sugerem altos níveis de diversidade genética para a pescada, verificados pelo elevado índice da média de diversidade gênica (Ĥ=0.9778), e diversidade nucleotídica (π=0.016300). Tais resultados indicam ausência de sobrepesca nas populações de pescada, especialmente, no nível da região controle do DNA mitocondrial. Nos resultados de AMOVA, de toda variabilidade genética observada, 93,68% foi verificada dentro das localidades, e apenas 6,32% encontra-se entre as localidade amostradas. O valor de ΦST (0,06319), apesar de baixo, indica alguma diferenciação entre as localidades (P=0,00673). A ausência de diferenciação entre as localidades foi inferida pela falta de valores significantes das comparações par-a-par de ΦST após a correção de Bonferroni. Estes resultados mostraram que a única comparação significante foi entre Tabatinga – Soure as quais são as localidades dos extremos de distribuição da presente análise. Tais resultados evidenciam que a pescada provavelmente forma uma única população na calha do rio Amazonas em pelo menos uma faixa de aproximadamente 2300Km de distância. A diferenciação genética para essas localidades pode ser o resultado de isolamento por distância, entretanto, pelo teste de Mantel, não observou-se nenhuma correlação entre distância genética e distância geográfica. Uma expansão populacional foi observada entre os pontos extremos da distribuição amostral.

ABSTRACT

The South American silver croaker Plagioscion squamosissimus, is a sciaenid restricted to freshwaters of South America. It has a wide distribution within the Brazilian territory, originally found in the Amazonian basin and introduced in northeast and southeast of Brazil. This species is important for the fishing economy of the Amazonian area, being considered a noble fish species and being of great commercial value. However, there is still no fisheries management project that would allow its conservation. Applied genetic-population studies to species of fish of commercial importance have been generating data of extreme importance for a more appropriate delimitation of fishery stocks. Knowing the distribution of genetic diversity of populations of South American silver croaker in the main channel of the river Amazon, one can obtain data that contribute to the appropriate management of this species in this area, and, consequently, its conservation. Five localities of the Amazon River were sampled, with a total of 81 individuals collected. The genomic DNA was extracted from fins using 2% CTAB, and the control region of the mitochondrial DNA was amplified and sequenced on the ABI 3130 XL automatic sequencer. A total of 727 base pairs (bp) were aligned and edited in the program BioEdit v. 5.0.6. resulting in 54 haplotypes. Results generated in the program Arlequin v. 3.1 also showed the existence high levels of genetic diversity for this specie as seen in elevated value of average genic diversity (Ĥ=0.9778), and in the high values of the average nucleotide diversity (π=0.016300). These results suggest absence of overexploitation of the South American silver croaker populations, specially at the mitochondrial DNA control region. The results of AMOVA indicate that 93,68% of the total genetic variance was observed within sampling localities, and only 6,32% explains between-locality variance. The ΦST value of 0,06319 indicates low but significant (P=0,00673) differentiation among localities. The absence of differentiation between localities was inferred based on the lack of significant pair- wise ΦST values after Bonferroni correction. These results showed that the only significant comparison was between Tabatinga – Soure which are the two extreme- most localities in our analysis. These results imply that P. squamosissimus most likely forms a single population in the main channel of the Amazon River along a distance of at least 2300 km. Genetic differentiation of the two extreme localities may be the result of isolation-by-distance, however, we did not observe significant correlation between genetic and geographic distances. Population expansion was observed among the most distant points of the sample distribution.

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO 01 I. 1. Considerações gerais sobre a bacia amazônica e sua ictiofauna 01 I. 2. O gênero Plagioscion Gill 1861 02 I. 3. A espécie Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840) 05 I. 3. a. Aspectos biológicos 06 I. 3. b. Recursos alimentares 07 I. 3. c. Reprodução 08 I. 3. d. Recurso pesqueiro e importância comercial na região amazônica 10 I. 4. O DNA mitocondrial e estudos moleculares em peixes 11 I. 5. Justificativa 17 II. OBJETIVOS 19 II. 1. Objetivo geral 19 II. 2. Objetivos específicos 19 III. HIPÓTESES TESTADAS 20 IV. MATERIAL E MÉTODOS 21 IV. 1. Coletas e material biológico 21 IV. 2. Procedimentos laboratoriais 22 IV. 2. a. Extração do DNA 22 IV. 2. b. Amplificação do fragmento de mtDNA (região D-loop) 23 IV. 2. c. Purificação do produto amplificado da PCR 24 IV. 2. d. Reação de sequenciamento 25 IV. 2. e. Precipitação do produto de reação de sequência 26 IV. 3. Análises genéticas computacionais 26 IV. 3. a. Alinhamento e edição das sequências 26 IV. 3. b. Análise dos haplótipos e polimorfismo de DNA 26 IV. 3. c. Teste de Neutralidade 27 IV. 3. d. Análise de Variância Molecular e Estimativa do Índice de

Fixação (ФST) 27 IV. 3. e. Teste de Mantel 28 V. RESULTADOS 29

VI. DISCUSSÃO 34 VI. 1. Caracterização genética das populações de pescada 34 VI. 2. Estrutura populacional 37 VI. 3. Considerações finais 41 VII. BIBLIOGRAFIA 43

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Componentes da reação de PCR 23 Tabela 2 – Lista dos primers utilizados para amplificação 24 Tabela 3 – Componentes da reação de sequenciamento 25 Tabela 4 – Primer utilizado para reação de sequenciamento 25 Tabela 5 – Distribuição dos 54 haplótipos de P. squamosissimus em função das localidades 29 Tabela 6 – Parâmetros genéticos para Plagioscion squamosissimus 31

Tabela 7 – Valores de ΦST das comparações par-a-par entre as localidades 32 Tabela 8 – Valores de Nm das comparações par-a-par entre as localidades 32

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Distribuição de Plasgioscion spp. 04 Figura 2 – Distribuição de P. montei 05 Figura 3 – Distribuição de P. auratus 05 Figura 4 – Distribuição de P. ternetzi e P. magdalenae 05 Figura 5 – Distribuição de P. squamosissimus 05 Figura 6 – Plagioscion squamosissimus 07 Figura 7 – Mapa esquemático do genoma mitocondrial completo de Arapaima gigas, no qual estão evidenciados os genes e a região controle (CR) 13 Figura 8 – Mapa dos pontos de coleta 21 Figura 9 – Gel de extração do DNA genômico 22 Figura 10 – Gel do produto de PCR da região controle do mtDNA (D-loop) 24 Figura 11 – Árvore Neighbour-Joining sem raiz apresentando o relacionamento de 54 haplótipos de P. squamosissimus 33

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I. INTRODUÇÃO

I.1. Considerações gerais sobre a bacia amazônica e sua ictiofauna

A bacia amazônica é formada por um contingente de rios, lagos e igarapés, destacando-se o majestoso rio Amazonas, o maior rio tropical do mundo, tanto em vazão como em área. Em termos de extensão, o rio Amazonas possui 6.518 km, só sendo ultrapassado pelo rio Nilo com 6.671 km, e sua largura varia entre 1.8 km (em Óbidos) até 20 km (Sioli, 1984; Santos & Ferreira, 1999), fora do estuário – podendo aumentar consideravelmente durante as grandes cheias. Uma importante característica desta bacia consiste em uma alta pluviosidade que é distribuída desigualmente ao longo do ano nas diferentes sub-regiões, fazendo com que existam épocas de secas (chamadas de verão) e chuvosas (chamadas de inverno), sendo que os afluentes da margem direita (como os rios: Madeira, Tapajós e Xingu) não seguem a mesma dinâmica de chuvas que os afluentes da margem esquerda (como o rio Negro) (Santos & Ferreira, 1999). A formação do sistema fluvial amazônico foi moldada por profundas transformações que consistiram no surgimento da cadeia andina, na interação dos escudos cristalinos das Guianas e do Brasil e no envolvimento de uma planície sedimentar situada na região central. Dentre elas, a mais notável transformação geológica ocorreu quando os Andes emergiram formando uma importante barreira com o oceano Pacífico, fazendo com que a comunicação existente entre o sistema de rios da região amazônica e o oceano Pacífico fosse interrompida e um novo mecanismo de drenagem foi estabelecido passando do sentido leste-oeste para oeste-leste, desembocando no Atlântico (Lundberg et al., 1998). A história geológica da Amazônia resulta na formação do maior sistema de rios do planeta, entrelaçado por um incontável número de grandes e pequenos rios, que drenam 7.050.000 km2 de terra, caracterizados pela heterogeneidade de águas claras pretas e brancas, e variação nos valores de pH (Sioli, 1984). Esta heterogeneidade de ambientes mantém uma ictiofauna de água doce com peixes bem adaptados ao ecossistema amazônico, espécies de variados tamanhos, formas e estratégias de vida, constituindo-se em ambientes propícios ao

1 desenvolvimento de estoques pesqueiros abundantes, que são explorados desde os tempos pré-coloniais (Soares et al., 2007). Reis et al. (2003) apresentam uma lista de catalogação de quase 4.500 espécies de peixes de água doce neotropical. Eles ainda apontam para um grande número de epécies (1.550) que ainda esperam decrição científica. No entanto, o número de espécies da bacia amazônica ainda é incerto, sendo comum a descrição de novas espécies, mesmo sendo algumas delas já exploradas pela pesca comercial, com diversos grupos ainda carecendo de uma revisão mais atualizada (Barthem & Fabré, 2003). Lovejoy et al., (2006) consideram, nesta bacia, a possível influência de incursões marinhas do Mioceno e conexões na evolução da fauna de peixes da Amazônia, e a possibilidade dessas incursões terem iniciado a transição evolutiva de ambientes marinhos para ambientes de água doce, como ocorreu para as espécies continentais de scianídeos da América do Sul. Os peixes da família Sciaenidae são primariamente marinhos, no entanto algumas espécies fazem parte da ictiofauna de água doce neotropical. Nesta família estão incluídos 78 gêneros e 287 espécies que habitam a costa, estuários e águas doces de regiões tropicais e temperadas. Seis gêneros são restritos a água doce, mas também podem ocorrer em estuários, onde Pachyurus La Cepède, Pachypops Gill, Plagioscion Gill, e Petilipinnis Casatti, são peixes de água doce endêmicos da América do Sul, e conhecidos no Brasil como pescadas. Com as várias revisões no nível de espécie para estes scianídeos, 20 espécies são reconhecidas na América do Sul (Casatti, 2003), sendo cinco delas do gênero Plagioscion (Casatti, 2005).

I. 2. O gênero Plagioscion Gill 1861

As espécies de água doce da família Sciaenidae, possuem, provavelmente, duas linhagens de origem marinha, que seriam Plagioscion e Pachyurus/Pachypops/Petilipinnis. Uma possível, e mais provável, porta de entrada para ancestrais marinhos de peixes no alto Amazonas, teria sido o Caribe ou o Pacífico (ou ambas), e ainda, para Plagioscion, até mesmo a boca do Paraná teria servido de entrada na América do Sul no processo de transição para água doce. Como estas hipóteses se baseiam em estudos de relacionamento dessas espécies 2 com espécies irmãs marinhas, a situação de Plagioscion ainda não é bem definida, pois sua colocação nos relacionamentos filogenéticos ainda não é muito clara (Lovejoy, 2006) De acordo com Casatti (2003) o gênero Plagioscion compreende sete espécies de peixes de água doce da região neotropical sulamericana, no entanto, apenas cinco espécies são consideradas como válidas, pois Plagioscion heterolepis (Bleeker) e P. microps Steindachner estão atualmente incluídas nos gêneros Johnius (Sasaki, 1992) e Nebris, respectivamente. As cinco espécies consideradas válidas (baseadas em características merísticas e morfométricas) são Plagioscion squamosissimus (Heckel 1840), P. auratus (Castelnau 1855), P. magdalenae (Steindachner 1878), P. ternetzi Boulenger 1895, e P. montei Soares & Casatti 2000. Tais espécies não são geralmente fáceis de separar apenas por caracteres merísticos ou coloração. De acordo com Casatti (2005), ainda existem oito nomes sinônimos para estas mesmas espécies: Johnius crouvina Castelnau (sin. de P. squamisissimus), Johnius amazonicus Castelnau (sin. de P. squamosissimus), Corvina monacantha Cope (sin. de P. auratus), Pseudosciaena surinamensis Bleeker (sin. de P. squamosissimus), P. auratus iquitensis Nakashima (sin. de P. squamosissimus), P. squamosissimus iquitensis Nakashima (sin. de P. squamosissimus), P. macdonaghi Daneri (sin. de P. ternetzi), e P. casattii Aguilera & Aguilera (sin. de P. squamosissimus). Com isso, Casatti (2005) providenciou uma chave de identificação para as espécies de Plagioscion baseada em dados morfométricos, com o intuito de tentar resolver a situação da taxonomia pouco definida do gênero, atualmente incluído na subfamília Cynoscioninae. Além das espécies viventes citadas (todas de água doce), duas novas espécies (fósseis) foram descritas por Aguilera & Aguilera (2003) baseadas em mensurações que comparam o comprimento total do peixe com o tamanho do otólito. Elas são P. marinus e P. urumacoensis, na costa norte da América do Sul e no Peru e Bolívia (Setas, Figura – 1). Os peixes do gênero Plagioscion estão originalmente distribuídos nas bacias dos rios Magdalena, Amazonas, Orinoco, Essequibo, na parte baixa da bacia do rio Paraná e rios das Guianas (Casatti, 2003). Membros do gênero também têm sido introduzidos nas bacias do rio São Francisco e alto rio Paraná e em reservatórios artificiais do nordeste do Brasil (Casatti, 2005) (Figura – 1).

Figura 1 – Distribuição de Plasgioscion spp (setas – espécies fósseis). De acordo com Aguilera & Aguilera, 2003.

As Figuras 2, 3, 4 e 5 mostram os mapas de distribuição das cinco espécies de Plagioscion sp. (Casatti, 2005), onde é possível observar a ampla distribuição de P. squamosissimus em relação às outras espécies congêneres, abrangendo bem mais que a bacia amazônica, onde é natural. Essa espécie é amplamente distribuída nas bacias do Orinoco, Amazonas e Parnaíba, introduzida em reservatórios do nordeste do Brasil durante os anos de 1970, e na bacia do Paraná por volta de 1950, desenvolvendo rapidamente hábito lêntico. Atualmente, está entre as espécies dominantes do reservatório de Itaipú (Benedito-Cecilio & Agostinho, 2000).

Figura 2* – Distribuição de P. montei Figura 3* – Distribuição de P. auratus

Figura 4*- Distribuição de P. ternetzi Figura 5*- Distribuição de e P. magdalenae P. squamosissimus

(*) De acordo com Casatti, 2005.

I.3. A espécie Plagioscion squamosissimus (Heckel 1840)

Plagioscion squamosissimus faz parte do Reino Animalia, Phylum Chordata, Classe Actinopterygii, Ordem Perciformes e da Familia Scianidae. Foi descrito pela primeira vez por Heckel (1840) com o nome de Sciaena squamosissima com amostras do rio Negro e rio Branco, e recebeu a nomenclatura atual por Jordan &

Eigenmann (1889) em trabalho de revisão. Após a descrição por Heckel, a espécie já foi estudada por vários autores, e mesmo depois de ter sido enquadrada no gênero Plagioscion recebeu outros nomes para a espécie em diferentes trabalhos; no entanto, P. squamosissimus até hoje permanece (Casatti, 2005). No rio Amazonas, todas as espécies do gênero Plagioscion são denominadas “pescadas”, embora possam receber nomes diferentes, conforme a espécie e/ou região do Brasil (Annibal, 1983). Os quatro nomes populares mais conhecidos são: pescada branca (nome pelo qual é conhecida em quase toda sua distribuição); corvina (Bacia do Paraná e nordeste brasileiro); pescada-do-Piauí (nordeste brasileiro); e South American silver croaker (como é conhecida fora da América) (Parente & Batista, 2005; Pinheiro & Frédou, 2004; Santos et al, 2003).

I.3.a. Aspectos biológicos

Em uma descrição da pescada (P. squamosissimus) feita por Wallace entre 1850 e 1852 em coleta realizada no rio Uaupés, a espécie apresenta colorido grafite metálico, com alguns reflexos violeta no dorso, branco prateado no abdômen, cabeça prateada e escura com reflexos metálicos no topo, nadadeiras brancas e escuras. Uma mancha preta sobre e abaixo da base da nadadeira peitoral, escamas delicadas quase cobrindo a caudal e a base da nadadeira dorsal, primeiro raio da nadadeira anal um espinho – opérculo externo pontiagudo com uma margem larga de pele. Cabeça e opérculo inteiramente cobertos por escamas. Maxila superior ligeiramente prolongada, dentes em uma única fileira em cada maxila pontiagudos, aciculares, distantes, com vários dentes diminutos entre eles, em cima e embaixo na faringe, língua grande livre. Narinas, dois pares próximos aos olhos. Primeiro raio da ventral um espinho livre adpresso. Linha lateral ondulada, elevada, desenhando um contorno até a extremidade da cauda. Escamas ligeiramente elípticas, dispostas em fileiras diagonais, horizontalmente, um tanto maiores embaixo do que acima da linha lateral. Duas pedras opalinas são encontradas na cabeça destes peixes abaixo do cérebro. Come peixes [predominantemente], produz um grunhido alto no fundo d’água. (Ragazzo, 2002).

Há internamente, nos machos, uma musculatura timpânica que produz sons semelhantes a roncos. Esse tecido compõe-se de duas camadas de musculatura elástica que provocam a estridulação por contração e extensão muscular. Tendo sido notado também que as placas faringeanas denteadas produzem sons de efeito diferenciado ou composto ao dos músculos timpânicos, sendo esta uma função sonora, tanto nos machos quanto nas fêmeas (Annibal, 1983). O adulto da espécie pode chegar a mais de 25 cm de comprimento e 0,35 Kg. Os comprimentos e pesos máximos observados são de 59 cm e 5,45 Kg para as fêmeas, e 55,5 cm e 3,73 Kg para os machos. Na maior parte dos espécimes analisados, as fêmeas alcançam tamanhos e pesos mais elevados que os dos machos (Loubens, 2003), o que também foi observado por Annibal (1983) para as pescadas da Amazônia Central. Normalmente, as pescadas podem ser capturadas em áreas relativamente profundas nos lagos de várzea, e há também maior atividade da espécie durante o período noturno (Annibal, 1983).

Figura 6 – Plagioscion squamosissimus. (foto: Daniela Leroy)

I.3.b. Recursos alimentares

Esta espécie é um predador de topo, e o peixe é o principal componente de sua dieta (Loubens, 2003). Em regiões onde é invasora, pode tornar-se ameaça para a comunidade nativa, como para a espécie endêmica da Bacia do Paraná P. 7 ternetzi, onde pescadores locais têm notificado declínio na abundância desta espécie e das espécies-presas (Torres, 2006). Bennemann, et al. (2006), estudando a dinâmica trófica de P. squamosissimus, observaram que a composição dos recursos alimentares consumidos, puderam ser agrupados em seis categorias: peixes, camarão, Odonata, Ephemeroptera, outros grupos de insetos e diversos (constituída de restos de vegetais, detritos e organismos que foram raramente encontrados). Mesmo os alimentos principais dessa espécie sendo peixes, com a redução na sua disponibilidade ela se torna oportunista, substituindo-os por outro alimento que esteja abundante, no caso deste estudo, o recurso que substituiu os itens da categoria peixes foi o camarão, que aumentou em número, atingindo os maiores valores em composição percentual, que pôde estar sendo mais consumido pela corvina após a redução da abundância das espécies de peixes-presa.

I.3.c. Reprodução

A tendência de proporção entre os sexos da pescada do Lago do Rei – AM foi verificada por Annibal (1983), que encontrou a proporção próxima de 1 para 1 entre os sexos, com capturas relativas crescentes de fêmeas em torno dos meses de novembro e junho. Loubens (2003) estudando a população de P. squamosissimus de Trindade – rio Mamoré – calculou que aproximadamente 50% da população de adultos (maduros sexualmente) contribuem na reprodução. Esse autor identificou quatro fases de maturação sexual para as fêmeas e três para os machos, e comprimento médio total na primeira maturação de 24 cm para as fêmeas e 21 cm para os machos, com tamanhos mínimos observados de 19cm para fêmeas e 18,2 cm para os machos. No entanto, Santos et al. (2003), analisando os aspectos reprodutivos da espécie em um açude do Ceará, verificou que a espécie não apresenta dimorfismo sexual aparente, nem mesmo no período reprodutivo, apresenta cinco fases de maturação para fêmeas e três para machos, com comprimento médio na primeira maturação de 24,7 e 24,2 cm para fêmeas e machos, respectivamente. A época de reprodução é caracterizada por picos de desova em fevereiro e junho, embora se reproduza o ano todo. 8

A dificuldade de detectar dimorfismo sexual na espécie também foi verificada por Viana et al. (2006) em estudo de comparação de métodos de análise de variação morfométrica, no qual observaram que o método de morfometria geométrica foi ligeiramente mais eficiente para verificar dimorfismo sexual, não identificado no método tradicional. A reprodução da pescada também foi alvo de estudos em ambientes que sofreram modificações drásticas provocadas pelo homem. Agostinho (2000), aplicando uma metodologia que lhe permitiu estimar o tamanho da primeira maturação sexual em peixes, verificou que as fêmeas de P. squamisissimus do reservatório de Itaipú apresentaram comprimento de 17,8 ±1,63 cm. No mesmo reservatório, Carnelós & Benedito-Cecilio (2002), com amostras da espécie dos anos 80, observaram que o tamanho da primeira maturação de machos foi de 16,2 cm e de fêmeas foi de 17,8 cm. Esse tamanho aumentou durante o período de estudo, chegando a 22,5 cm para ambos os sexos quando toda a população participou efetivamente do processo reprodutivo, mostrando estratégia reprodutiva adaptativa que garante o sucesso da espécie. Com período de reprodução da primavera ao outono, e picos na primavera e verão. A análise dos estágios de maturidade efetivada sobre as fêmeas da espécie por Annibal (1983), de espécimes do Lago do Rei no Amazonas, demonstraram um período amplo de desova, que aliado à observação de diferentes graus de semi- desova, induz a caracterizar a desova como parcelada. Ele também verificou que a época de maior intensidade reprodutiva se deu no período de vazante-seca (entre agosto e outubro), quando inicia fortemente o processo, que se estende até o período de inicio da enchente (entre dezembro e fevereiro). Larvas de P. squamosissimus dos rios Paranapanema, Paraná, Ivinhema e Baía foram analisadas por Baumgartner et al. (2003), que verificaram maiores densidades médias de dezembro/93 a fevereiro/94, relacionadas à elevada temperatura e nível da água, com tamanhos (maiores freqüências) na classe de 4,0 mm de comprimento. A emissão sonora tem evidentemente uma função importante na atividade reprodutiva, havendo nítido aumento da incidência e abundância desta nos meses próximos ao início da reprodução (agosto e setembro), apesar de ser verificado

9 durante todos os meses do ano, podendo estar relacionado também com agregação, desagregação e movimentos dos cardumes (Annibal, 1983).

I.3.d. Recurso pesqueiro e importância comercial na região amazônica

Nos anos de 2001 e 2002, Pinheiro & Frédou (2004), numa análise dos principais recursos pesqueiros desembarcados no Estado do Pará, de embarcações que trabalham com a Piramutaba Brachyplatystoma vaillantii como peixe alvo, observaram que o grupo dos scianídeos apresentou-se entre as oito famílias de peixes mais diversificadas em espécies (cinco espécies), e que na Baía do Marajó, uma importante área do estuário amazônico, apareceu entre as duas famílias mais diversificadas (sete espécies). Em especial, P. squamosissimus apresentou uma porcentagem de 0,68 (estuários) e 0,51 (água doce) da pesca total nesta região, ficando entre as espécies dominantes da fauna acompanhante da piramutaba e da dourada Brachyplatystoma rousseauxii. A pescada é um peixe que pode ser capturado com rede ou anzol, e faz parte das três principais espécies que comandam a atividade pesqueira do reservatório da UHE-Tucuruí no rio Tocantins. Foi o principal pescado desembarcado em Marabá- PA no período de 1992 a 1999, e o terceiro em Tucuruí, onde, juntamente com o tucunaré, é mais valorizado no mercado, tendo rendido milhões para a economia pesqueira neste período para a região. É uma das espécies consideradas mais nobres, preferida pelos pescadores, seus familiares e população urbana do entorno do reservatório (Camargo & Petrere-Jr., 2004). Na Amazônia boliviana, a espécie não tem muito histórico de exploração por causa das técnicas normalmente usadas na atividade pesqueira da região. No entanto, nas últimas décadas ela tem se tornado alvo pelo método de pesca fácil, ser um peixe sem espinhos (fácil de descarnar), e muito apreciado. A única dificuldade técnica para se investir na produção é o acondicionamento, pois a carne é frágil (Loubens, 2003). Com relação ao comércio em Manaus, dados sobre o pescado da década de 90 foram analisados por Parente & Batista (2005) e mostraram que a pescada (Plagioscion spp.), no ano de 1995, apresentou-se entre os peixes de maior valor comercial (preço no varejo), depois do tambaquí (Colossoma macropomum) e do 10 pirarucu (Arapaima gigas), e igualado ao do tucunaré (Cichla spp.), considerado um pescado nobre e preferido pela população de maior poder aquisitivo. Genericamente, em diversas partes do mundo se tenta fazer a avaliação dos estoques pesqueiros (unidades básicas de recursos pesqueiros), objetivando orientar principalmente a administração e a legislação da pesca. As investigações têm como objetivo determinar: qual, quanto, onde, como e quando utilizar de maneira sustentável os recursos naturais existentes (Annibal, 1983). Diante deste importante recurso pesqueiro da região amazônica, uma política de manejo se faz necessária para a conservação dos estoques. E para isso, estudos populacionais são indispensáveis na identificação de diferentes estoques pesqueiros. Um exemplo de estudo populacional para a espécie foi o de Worthmann (1979), que utilizou o desenvolvimento do otólito da pescada (P. squamosissimus) de diferentes lagos e rios da Amazônia Central (lago Janauacá, rio Jari, rio Negro e rio Branco) para diferenciar unidades populacionais desta espécie. Foram determinadas diferenças significativas entre os locais, concluindo-se que as populações podem ser diferenciadas pela velocidade de crescimento individual. Estudos baseados no conhecimento da biologia, dinâmica e estrutura das populações, ajudam a estabelecer critérios para a exploração das unidades de manejo de estoques pesqueiros, bem como vários estudos populacionais, que, nos últimos anos, por meio da análise do mtDNA (e outros marcadores moleculares), contribuem com dados indispensáveis para o devido manejo de diversas espécies.

I.4. O DNA mitocondrial e estudos moleculares em peixes

A molécula de DNA presente na mitocôndria dos animais é pequena, de aproximadamente 16.500 ± 500 pb (os vertebrados são os que geralmente apresentam os menores tamanhos), e constituída de uma dupla fita de DNA complementar, disposta de maneira circular (Avise et al., 1984; Meyer, 1993; Ballard & Whitlock, 2004) (Figura 7). Existem múltiplas cópias de DNA dentro da mitocôndria. Dependendo do tipo de célula, milhares de genomas mitocondriais são encontrados por célula (Meyer, 1993). Coletivamente, as mitocôndrias, podem ocupar até 25% do volume do

11 citoplasma, e seu genoma corresponder a aproximadamente 1/10.000 do menor genoma nuclear animal (Ballard & Whitlock, 2004). Dos 37 genes codificados pelo mtDNA, dois codificam para RNAs ribosomais, 22 codificam para RNAs transportadores e 13 codificam para subunidades da cadeia de transporte de elétrons, onde carboidratos e gorduras são oxidados gerando gás carbônico, água e ATP (Meyer, 1993; Ballard & Whitlock, 2004). Também há subprodutos tóxicos da fosforilação oxidativa (superóxido, peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos ogânicos) que podem danificar o DNA, lipídeos e proteínas (Ballard & Whitlock, 2004), além da ineficiência dos mecanismos de reparo da replicação (Wilson, et al., 1985), contribuindo para que a taxa de mutação do mtDNA seja de cinco a dez vezes maior que os genes codificantes do genoma nuclear (Ballard & Whitlock, 2004; Brown et al., 1982), o que resulta em evolução muito mais rápida que em cópias únicas de DNA nuclear (Brown et al., 1979) e alta variabilidade (Meyer, 1993). Além de grandes variações intraespecíficas que são freqüentes devido a duplicações em tandem que envolvem a região controle. Em peixes, diferenças intraespecíficas podem ser tão grandes quanto diferentes entre as espécies (Meyer, 1993). O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido extensivamente usado nas últimas três décadas como ferramenta para estudos de evolução e passado demográfico de populações e espécies. Esta ferramenta mostrou-se inestimável para os campos novos de ecologia molecular e filogeografia (Ballard & Whitlock, 2004). A região controle um marcador mitocondrial muito utilizado, localizada entre as regiões responsáveis pela codificação do RNAt da prolina e do RNAt da fenilalanina (Lee et al., 1995). Apresenta variações no tamanho nas diferentes espécies de peixes estudas, como por exemplo, no pirarucu Arapaima gigas, esta região foi seqüenciada e se apresentou relativamente pequena, com 787 pb (Hrbek & Farias, 2008), ou do tambaqui Colossoma macropomum para o qual, a mesma região, chegou a apresentar 1176 pb (Santos et al., 2007). Esta região controle do DNA mitocondrial consiste em uma região não codificante do genoma. Por não ter função de expressão gênica, esta região tanto em vertebrados quanto em invertebrados está sobre baixa influência de mecanismos evolutivos e, por isso, apresenta um alto grau de variabilidade gênica em níveis

12 interespecíficos (Meyer, 1994). Por esse motivo, a variabilidade intraespecífica tem sido freqüentemente acessada a partir de estudos com essa região. Por apresentar acúmulo de substituições nucleotídicas a região controle fornece algumas das melhores informações para estudar níveis de fluxo gênico entre as populações, inclusive as de peixes (Brown et al., 1993).

Figura 7 – Mapa esquemático do genoma mitocondrial completo de Arapaima gigas, no qual estão evidenciados a região controle (azul) os genes que codificam para RNAs ribosomais (amarelo), para RNAs transportadores (cinza) e para subunidades da cadeia de transporte de elétrons (branco). Modificado de Hrbek e Farias (2008).

Em revisão das aplicações moleculares nos estudos de populações de peixes, Ferguson et al (1995) mostraram que a utilização do mtDNA vem ocorrendo desde o fim da década de 70, antes mesmo do uso do DNA nuclear (nDNA). Essas informações de acesso direto à molécula de DNA só foram conseguidas pelo desenvolvimento da técnica de amplificação do DNA usando a reação em cadeia da polimerase (PCR). Essa técnica abriu um “leque” de possibilidades [utilizando-se vários tipos de marcadores, como RAPD, RFLP, AFLP, minissatélites, microssatélites, e sequencias de genes nucleares e mitocondriais], tornando possível, por exemplo, examinar mudanças genéticas em populações de peixes de até cem anos atrás, ou mais, usando material arquivado em coleções de laboratórios de peixes e espécimes de museus. Desde então, significativas contribuições têm

13 sido feitas, especialmente no que tange o manejo adequado de várias espécies de água doce. Por suas características especiais, o mtDNA tem sido aplicado como um marcador genético ideal à pesquisa de população e biologia evolutiva de peixes, onde as pesquisas sobre este marcador progridem em sua estrutura e características, sequenciamento do genoma completo, estrutura da região controle e polimorfismos (Guo et al., 2004). Um exemplo desses trabalhos foi o apresentado por Hrbek & Farias (2008) sobre o sequenciamento do genoma completo do Pirarucu (Arapaima gigas), um importante recurso pesqueiro para a economia da região amazônica, com sugestão até de uma possível heteroplasmia do mtDNA da espécie. Geralmente, um único tipo de DNA mitocondrial é encontrado nos organismos. No entanto, há relatos de heteroplasmia, a presença de mais de um tipo de mtDNA no indivíduo, que tem sido encontrado na maioria dos principais grupos de organismos, incluindo várias espécies de peixes (Meyer, 1993). Vários trabalhos têm sido realizados no grupo dos peixes utilizando tal marcador, com o objetivo de responder a várias questões. Formiga-Aquino (2004) em estudo populacional da piramutaba Brachyplatystoma vaillantii no sistema estuário Amazonas-Solimões com o uso da análise da região controle (D-loop), de 100 indivíduos, identificou 92 haplótiplos, dentre eles, 87 singletons, caracterizando uma única população que migra sazonalmente na Amazônia, não havendo correlação entre a distância genética e a distância geográfica. Num estudo de genética de populações com o pirarucu Arapaima gigas por Hrbek et al. (2005) utilizando seqüências de DNA mitocondrial de 120 indivíduos com amostras de sete localidades da calha principal da bacia amazônica, foi observada maior diversidade haplotípica nas áreas distantes dos grandes centros urbanos da Amazônia. Também foi evidenciado baixo nível de diferenciação populacional, suportando uma contínua conectividade entre as populações na calha principal, formando uma grande população panmítica. Uma espécie que apresentou ampla variabilidade na bacia do rio Negro (com análise da região controle do mtDNA) foi Hypopygus lepturus, em trabalho de Schmitt (2005). Estes peixes elétricos foram coletados em vários tributários entre São Gabriel da Cachoeira e Barcelos, no Estado do Amazonas, tendo sido

14 observado que os haplótipos encontrados estão agrupados em clados, com tamanha diferença entre eles (7% em média), cujos indivíduos podem estar formando um complexo de espécies. Um estudo genético populacional com a pescada-gó (Macrodon ancylodon), um scianideo marinho, utilizando análises do mtDNA e morfométricas, foi feito na costa do Atlântico sul, no qual as diferenças genéticas inferem a presença de duas espécies diferentes (conceito filogenético) para os dois grupos separados por 23 mutações, além de fornecer informações de migração e estimativa de expansão populacional para os grupos (Santos et al., 2006). Ribeiro (2006) verificou populações geneticamente estruturadas, com análise de genes mitocondriais, de espécies de arraias-de-água-doce do gênero Potamotrygon da bacia amazônica, com baixo poder de dispersão e isolamento por distância. A metodologia usada por esse autor, chamada “DNA barcoding” (seqüências do gene COI), baseada nos níveis de diferenciação encontrados nas seqüências dos haplótipos, também foi testada para a família Potamotrygonidae, que foi válida para alguns casos, com exceções de algumas espécies, que necessitam de outros padrões acessórios. Batista & Alves-Gomes (2006), em estudo populacional da dourada (Brachyplatystoma rousseauxii), também sugerem uma única população migradora no eixo Estuário-Amazonas-Solimões, por meio de análise da região controle do mtDNA de amostras de três localidades (Tabatinga, Manaus e Belém). Esses autores verificaram que a espécie não é formada de populações geneticamente diferentes ao longo da calha, mas exibe uma variabilidade genética mais alta na região estuária (Belém) em comparação com a região mais próxima da cabeceira (Tabatinga), o que é característico do padrão de migração da espécie, que passa a maior parte da vida, crescendo e se alimentando ao longo da calha, e voltam aos tributários para se reproduzir. Santos et al. (2007) estimaram a variabilidade genética do tambaqui (Colossoma macropomum) ao longo do rio Solimões-Amazonas, com a análise da região controle do mtDNA, e não encontrou populações diferenciadas, mas elevado fluxo gênico entre as amostras populacionais estudadas, observado no grande número de valores infinito de Nm.

Schneider (2007) estudou a variabilidade genética (ATPase 8/6) do peixe borboleta Carnegiella strigata, em várias localidades nas bacias de três rios de água preta da Amazônia central (Negro, Uatumã e Urubú) e verificou diferença significativa entre os pontos amostrados (populações estruturadas) com baixos índices de fluxo gênico entre a maioria das localidades, e ainda, a evidência de duas unidades evolutivas para a espécie, dada a elevada distância genética entre elas (10,80 a 11,50%). Haplótipos da região controle do mtDNA também foram usados por Farias & Hrbek (2008) na análise populacional de peixes discos (Symphysodon spp.) para determinar as diferenças entre os grupos de diferentes fenótipos destes peixes, revelando alta variação genética (87,54%), que corroboraram com as variações nas freqüências alélicas para o gene nuclear RAG1 (mais baixas, porém significativas). O mtDNA também é utilizado em estudos de filogenia molecular, como no dos Clupeiformes, no qual resolveu melhor clados intermediários dentro das cinco famílias analisadas, que o marcador nuclear utilizado na mesma análise (Li & Ortí, 2007). Para os Gymnotiformes, que, juntamente com dados de eletrofisiologia, foram mais informativos no nível de famílias, do que os dados morfológicos (Alves-Gomes et al., 1995). E muito úteis para o grupo dos ciclídeos, ajudando não só a compreender os processos evolutivos, mas contribuindo com a sistemática do grupo (Farias et al., 1999; 2000; 2001; Willis et al., 2007). Com relação a estudos moleculares com a espécie P. squamosissimus, pode- se dizer que são, ainda, insuficientes para se traçar um perfil genético da mesma. Torres (2006) analisou RFLPs para o gene citocromo b de mtDNA em Plagioscion, testando a técnica como marcador de espécies invasoras, mas não encontrou diferenciação molecular para o nível específico entre a suposta amostra de P. ternetzi (rio Paraná – Foz do Iguaçu) e a de P. squamosissimus (rio Negro – Manaus). Um estudo populacional para P. squamosissimus na calha do rio Amazonas utilizando polimorfismo de transferrina identificou subpopulações geneticamente distintas para quatro localidades, mostrando a evidência de distinção populacional para a espécie na região da Amazônia Central (Teixeira et al., 2002), bem como estudos citogenéticos baseados no heteromorfismo da região do organizador nucleolar (NOR), em amostras coletadas no rio Tefé, Lago Catalão e rio Pitinga

(Feldberg et al., 1999). Tal heteromorfismo está associado à caracterização de estoques intraespecíficos ou populações em alguns grupos de peixes, que no caso, foi o primeiro estudo a apresentar esta situação em Perciformes neotropicais.

I.5. Justificativa

A pesca [predatória] pode afetar a composição ou mesmo a variabilidade de uma espécie, podendo atuar tanto sobre uma espécie alvo, como sobre as espécies acompanhantes. Assim, para as espécies de valor comercial, e de outras removidas como subproduto da captura, a pesca é um dos fatores principais de mortalidade de animais adultos, muitas vezes comprometendo o recrutamento dos estoques (Hilsdorf et al., 2006). O potencial que uma espécie possui de se adaptar às constantes modificações ambientais depende, em grande parte, do nível de diversidade genética encontrada na mesma, de modo que a variabilidade genética dentro e entre populações pode ser um componente decisivo para a sobrevivência de uma espécie a médio e longo prazo (Frankham et al., 2002). Com o crescimento e importância, cada vez mais evidente, dos estudos de genética pesqueira, espera-se que seus dados alcancem os programas de manejo e contribuam para a delimitação dos estoques pesqueiros de captura. Conhecer a estruturação genética de um conjunto de indivíduos que se distribuem naturalmente no meio ambiente é importante para sabermos se os mesmos compõem uma única população ou mais de uma. Para isso, é necessário saber se há populações geneticamente estruturadas ou não. Populações geneticamente estruturadas compõem estoques segundo o “conceito genético de estoques” de Ovenden (1990), que se trata de uma unidade reprodutivamente isolada e geneticamente diferente de outros estoques. Tal análise foi realizada no presente estudo em populações de P. squamosissimus, na calha principal do rio Amazonas. Conhecida como pescada, é uma espécie amplamente distribuída nos rios brasileiros, mas que se originou na bacia amazônica (Casatti, 2003, 2005), a qual possui relevante importância na economia pesqueira (Camargo e Petrere-Jr., 2004; Parente & Batista, 2005), requerendo um melhor direcionamento das políticas de manejo aplicadas a esta 17 espécie. O que pode ser feito com a contribuição de estudos de análise genético- populacional. Já foi detectada a evidência de populações geneticamente distintas desses animais na calha do rio Amazonas com análise do polimorfismo da transferrina (Teixeira et al., 2002), e em diferentes rios da bacia amazônica com análises morfométricas (Worthmann, 1979) e citogenéticas (Feldberg et al., 1999). Este estudo propôs a utilização de um marcador molecular bastante variável, o sequenciamento da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial, bastante usado para estudos da estruturação genética em populações naturais (Hrbek et al.,2005; Batista & Alves-Gomes, 2006; Santos et al., 2007; etc.), como ferramenta para avaliar como a variabilidade genética da pescada se distribui na calha principal do rio Amazonas. Os dados gerados neste estudo vêm a contribuir para uma melhor elucidação a respeito da estruturação genético-populacional para esta espécie na calha deste rio, e assim gerar subsídios para o desenvolvimento de projetos de conservação e manejo, que associado a outros estudos (dinâmica e estrutura das populações, história natural e outros) podem delimitar melhor os estoques sob captura. Estes dados auxiliam na administração e legislação da pesca, pois levam à geração de critérios de exploração (manejo) das unidades de estoques que visam uma conservação a longo prazo dos recursos naturais pesqueiros.

II. OBJETIVOS

II.1 Objetivo geral

• Caracterizar geneticamente as populações da pescada branca Plagioscion squamosissimus da calha principal do rio Amazonas pela estimativa dos níveis de diversidade genética e fluxo gênico, visando gerar informações para futuros planos de conservação e gerenciamento pesqueiro deste importante recurso para a região amazônica

II.2 Objetivos específicos

1. Caracterizar a variabilidade genética inter e intrapopulacional 2. Detectar se a espécie apresenta estrutura genética populacional 3. Se houver diferenciação genética entre as populações, verificar se está relacionada com a distribuição geográfica

III. HIPÓTESES TESTADAS

1. H0 – Plagioscion squamosissimus apresenta níveis de variabilidade genética homogêneos ao longo da calha principal do rio Amazonas

2. H0 – As populações de P. squamosissimus não apresentam estruturação genética nos pontos amostrados

3. H0 – Não existe relação entre a distância genética e a distância geográfica nas populações estudadas

IV. MATERIAL E MÉTODOS

IV.1 Coletas e material biológico.

Foram utilizadas entre 12 e 22 amostras de tecido (nadadeira ou tecido muscular) de espécimes coletadas durante a pesca artesanal (a maioria por pescadores da região) de cada uma das cinco regiões distribuídas ao longo da calha principal do rio Amazonas. Uma amostra de tecido de cada peixe foi retirada e fixada em etanol 95% em tubo de eppendof, e etiquetados conforme coletor, localidade e data de coleta. Para representar a população da calha principal do Rio Amazonas, as seguintes regiões foram escolhidas como pontos de coleta (mapa figura 8) com os respectivos números de indivíduos sequenciados (entre parênteses): Tabatinga (14), Lago Tefé (12), Lago Janauacá (entorno Manaus) (13), Soure – Rio Paracatú (Ilha de Marajó) (22), e Macapá (20).

Figura 8 – Mapa dos pontos de coleta.

IV.2. Procedimentos laboratoriais

IV.2.a. Extração do DNA.

Com uso de pinça e bisturi estéril, uma amostra de tecido foi extraída e após retirado todo o excesso de álcool, colocada em tudo de eppendorf (2 ml) para a extração do DNA. Para tal, foi utilizado tampão CTAB 2% (NaCl, EDTA 0,5 M, Tris HCl 1 M, PVP polivinil) (Doyle & Doyle, 1987), com algumas modificações, e proteinase K a 1%, levados a “banho-maria” a 60 ⁰C overnight, ou até que o material estivesse completamente dissolvido, para o rompimento das células. RNAase foi utilizada para impedir que moléculas de RNA interferissem nos processos de amplificação e sequenciamento. Foram feitas lavagens com clorofórmio para a remoção dos restos celulares e separação dos ácidos nucléicos. Para a precipitação do DNA, foram utilizadas lavagens com isopropanol e álcool etílico a 70%. Com a visualização do pellet, o DNA foi colocado para secar a temperatura ambiente e ressuspendido com água deionizada autoclavada (miliq). Para verificação do material extraído, 2 µl do corante Bromofenol misturado a 2 µl do DNA total foram aplicados em gel de agarose a 1% e levado a cuba de eletroforese horizontal com tampão Tris-Borato-EDTA 1X onde a corrida do material foi feita a 70 V iniciais, passados para 90 V. Posteriormente, o gel de agarose foi corado com brometo de etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL) e levado a um transluminador de luz UV Image Master (Pharmacia Biotech) para visualização do DNA (Figura 9).

Figura 9 – Gel de extração do DNA genômico.

IV.2.b. Amplificação do fragmento de mtDNA (região D-loop)

A região controle do mtDNA (D-loop) foi amplificada por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Saiki et al., 1988), técnica que permite a obtenção de um grande número de cópias de um fragmento de interesse a partir do DNA genômico extraído do tecido. Para que a reação acontecesse, foi utilizado, para cada amostra, os seguintes reagentes (Tabela 1): 1,2 µl de tampão de reação 10 X (Tris-KCl 200 mM pH 8,5);

1,5 µl de MgCl2 (25 mM); 1,5 µl de dNTP (10 mM); 1,2 µl do primer 1 (PsDLF1 – forward – não publicado/desenvolvido neste trabalho) (2 µM); 1,2 µl do primer 2 (12SR4 – reverse – Hrbek & Farias, 2008) (2 µM), 0,4 µl de DNA polimerase (Taq) (2,5u/ µl), 1,0 µl de DNA e 7,0 µl de água miliq, totalizando um volume final de 15,0 µl.

Tabela 1 – Componentes da reação de PCR. Reagentes Concentração Volumes (µl) Tampão 10X 1,2 MgCl 25 mM 1,5 dNTP 10 mM 1,5 Primer1 2 µM 1,2 Primer2 2 µM 1,2 DNA polimerase 2,5 u/µL 0,4 DNA (amostra) -- 1,0 Água miliq -- 7,0 TOTAL 15,0

Cada conjunto de reação foi colocado em tubo de 0,2 µl e levado a um termociclador Eppendorf onde se processou a reação de amplificação que se deu conforme os passos descritos abaixo: • Desnaturação inicial a 93°C por 1 minuto (uma única vez); 35 ciclos de: • Desnaturação a 93 °C por 40 segundos; • Anelamento a 50 °C por 40 segundos; • Extensão a 72 °C por 1,5 minuto; • Extensão final a 72 °C por 5 minutos (uma única vez). 23

Tabela 2 – Lista dos primers utilizados para amplificação.

Primers Sequência Referência “D-loop” PsDLF1 (forward ) 5’-CGGTCTTGTAAACCGGATGT-3’ Não publicado* 12Sr4 (reverse) 5'-TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTT-3' Hrbek & Farias 2008 * Primer desenvolvido neste trabalho.

Do produto final da reação (PCR) foi retirado 2 µl, adicionado a 2 µl de azul de Bromofenol, aplicado em gel de agarose 1%, e após corrida em cuba de eletroforese, corado com Brometo de Etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL) e levado ao transluminador de luz UV para visualização e verificação do tamanho do fragmento amplificado comparado ao marcador DNA lambda (1000pb) (Figura 10).

1200pb

Figura 10 – Gel do produto de PCR da região controle do mtDNA (D-loop).

IV.2.c. Purificação do produto amplificado da PCR

A purificação do DNA foi feita via EXO-SAP (exonuclease e fosfatase alcalina), que em temperatura ideal de ação dessas enzimas (com o uso do termociclador) eliminaram da reação amplificada resíduos de baixo peso molecular tais como sais, primers e dNTPs. Para cada 10 µl do produto da PCR foi utilizado 0,27 µl de EXO (10 u/µl); 0,40 µl de SAP (1 u/µl) e 2,33 µl de água deionizada autoclavada.

IV.2.d. Reação de sequenciamento

A reação de sequenciamento foi feita em uma placa específica (para eletroinjeção no sequenciador automático), para um volume final, por amostra, de 10 µl, contendo: DNA amplificado e purificado; primer interno (PsDLF2 – forward – não publicado/desenvolvido neste trabalho); Big Dye – um mix contendo DNA polimerase, dNTPs e dideoxinucleotídeos (que possuem a fluorescência a ser captada no sequenciador automático); tampão do Big Dye; e água autoclavada deionizada.

Tabela 3 – Componentes da reação de sequenciamento. Reagentes Volumes (µl) Tampão 2,5 Primer 2,0 Água miliq 2,2 Big Dye 0,3 Produto da PCR purificado 3,0 TOTAL 10,0

Em seguida, as amostras foram submetidas ao termociclador Eppendorf com ciclos programados para desnaturação das fitas complementares; anelamento dos primers e extensão da região a ser sequenciada: 35 ciclos de: • Desnaturação a 96 °C por 10 segundos; • Anelamento a 50 °C por 15 segundos; • Extensão a 60 °C por 4 minutos.

Tabela 4 – Primer utilizado para reação de sequenciamento.

Primers Sequência Referência “D-loop” PsDLF2 (forward ) 5’-GTAAAGCGGATGTCGGAGGT -3’ Não publicado* * Primer desenvolvido neste trabalho.

IV.2.e. Precipitação do produto de reação de sequência

Após a reação de seqüenciamento, as amostras de DNA resultantes serão precipitadas. Para isso foi utilizado 2,5µl de EDTA (125 mM); 27,5 µl de etanol (100%), e 30 µl de etanol (70%). Seguindo protocolo de centrifugação e temperaturas adequadas. A ressuspensão das amostras foi feita com 10 µl de Hi-Di Formaldeído. Em seguida, a placa contendo o DNA foi submetida a eletroinjeção no sequenciador automático ABI 3130XL (Applied Biosystems), de acordo com a metodologia padrão do fabricante.

IV.3. Análises genéticas computacionais

IV.3.a. Alinhamento e edição das seqüências

As seqüências da região controle (D-loop) foram conferidas e editadas no programa BioEdit Version 5.0.6. (Hall, 1999). O alinhamento das sequências foi feito com o auxílio da ferramenta ClustalW (Thompson et al., 1996). Após a edição manual das seqüências, aos sítios que apresentaram deleções ou inserções (indels) foram acrescentados gaps com a finalidade de manter a homologia entre os sítios. Todas as seqüências obtidas e utilizadas nas análises correspondem à região controle (D-loop) parcial do DNA mitocondrial, com 727pb, obtidos no sequenciamento com um único primer.

IV.3.b. Análise dos haplótipos e polimorfismo de DNA

O nível de variação genética intra-específico foi medido por meio do número de haplótipos observados em cada localidade amostrada, dos índices de diversidade gênica (Ĥ) – probabilidade de duas seqüências tomadas ao acaso em uma população serem diferentes entre si – e diversidade nucleotídica (π) – média das diferenças nucleotídicas em cada sítio entre duas seqüências tomadas da população

26 ao acaso – calculados pelo método de Nei (1987), e número de sítios segregantes (polimórficos), definidos como número de sítios nucleotídicos que diferem entre as sequências alinhadas. Análises evolutivas moleculares e filogenéticas foram conduzidas com o uso do Mega versão 4 (Tamura et al., 2007), no qual dados de sequência nucleotídica foram importados para a construção de uma árvore de haplótipos usando o método de “agrupamento de vizinhos” – Neighbour-Joining (NJ).

IV. 3. c. Teste de Neutralidade

Os testes D de Tajima (Tajima, 1989) e Fs de Fu (Fu, 1997), usando o programa Arlequim 3.1 (Excoffier et al., 2005), foram aplicados neste estudo para avaliar se as mutações encontradas na região controle do mtDNA da pescada são neutras ou sofrem influência de seleção, ou seja, se esta região gênica está em desequilíbrio de mutação-deriva genética. Por se tratar de uma região não codificadora, que, portanto, não sofre pressão de seleção, a detecção de desvios significantes do equilíbrio genético pressupõe uma recente expansão populacional ou bottleneck. O teste D de Tajima é baseado na relação entre o número de sítios segregantes e a média das diferenças par-a-par, enquanto o teste Fs de Fu é baseado na probabilidade de observar um dado número de alelos em uma amostra de determinado tamanho, condicionado ao número médio observado das diferenças par-a-par. Numa comparação entre os testes, em geral, a estatística Fs de Fu é mais sensível em detectar eventos demográficos que a estatística D de Tajima.

IV.3.d. Análise de Variância Molecular e Estimativa do Índice de Fixação (ФST)

Com o intuito de averiguar a existência de população diferenciada (estruturação genética) foi utilizada a Análise de Variância Molecular (AMOVA) implementada no programa Arlequim 3.1 (Excoffier et al., 2005), pela qual é possível determinar a variabilidade genética inter e intrapopulacional, utilizando a freqüência dos haplótipos encontrados nas diferentes regiões amostradas, buscando os níveis de divergência evolutiva entre os haplótipos, e estimando os níveis de diferenciação entre populações. 27

A estimativa do índice de fixação (ФST) foi obtida pela razão entre os componentes variantes, para revelar a existência ou não de diferenciação entre as populações de pescada. Foram obtidas comparações populacionais par-a-par para estes valores.

O índice ФST, obtido na Análise de Variância Molecular (AMOVA), para verificar a variância entre subpopulações, é análogo ao índice FST de Wright (1978) – que verifica a existência de estruturação gênica nas populações naturais a partir da variância das frequências gênicas entre localidades diferentes. A variância analisada na obtenção do índice ФST, é obtida a partir do número de mutações entre os haplótipos. Uma das vantagens dessa análise é que pode ser usada com um número grande de tipos de marcadores moleculares (ao contrário do FST e do GST, que se aplicam mais a dados de marcadores co-dominantes), no entanto, a interpretação é semelhante (Solé-Cava, 2001) Adicionalmente foi estimado o nível de fluxo gênico Nm (número de migrantes por geração), inferidos a partir das comparações par-a-par dos valores obtidos de

ФST, sob o modelo de migração de ilhas para haplótipos ФST = 1/Nm+1, por meio da AMOVA. A AMOVA testa a significância dos índices e da diversidade genética por meio de 1000 permutações não paramétricas dos haplótipos entre as populações. A correção de Bonferroni (Rice, 1989) foi aplicada para análises que envolveram múltiplas comparações.

IV.3.e. Teste de Mantel

O teste de Mantel, realizado no programa Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005), por se tratar de um método estatístico que testa a significância da relação entre duas matrizes de similaridade, foi utilizado para estimar a significância da relação entre a distância genética (valores de ΦST) e a distância geográfica (com base na distância em quilômetros pelo leito do rio) ajustando o nível de confiança para testes de permutações (1000 replicações).

V. RESULTADOS

Das amostras populacionais de Plagioscion squamosissimus (Tabatinga, Tefé, Janauacá, Macapá e Soure), foram obtidas 81 sequências parciais da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial, compostas por um total de 727pb cada. Foram verificadas as seguintes composições de bases nucleotídicas: Citosina 21.01%, Timina 31.18%, Adenina 32.77%, e Guanina 15.04%. Entre os 727pb, 71 sítios foram polimórficos, e suas mutações corresponderam a dois sítios com inserções e 69 com substituições, sendo elas 65 transições (substituição de uma pirimidina por outra pirimidina, ou de uma purina por outra purina) e cinco transversões (substituição de uma purina por uma pirimidina, e vice- versa). De todos os 81 indivíduos analisados, obtidos das cinco populações amostrais, foram encontrados 54 haplótipos, sendo que, destes, 43 foram singletons (haplótipos únicos). O H7 foi, não somente o haplótipo mais frequente (nove Indivíduos), mas também o haplótipo com maior distribuição geográfica (três das cinco localidades) (Tabela 5).

Tabela 5 – Distribuição dos 54 haplótipos de P. squamosissimus em função das localidades. Haplótipos Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Total H1 3 1 - - - 4 H2 1 - - - - 1 H3 1 - - - - 1 H4 1 - - - - 1 H5 1 - - - - 1 H6 1 - - - - 1 H7 1 4 4 - - 9 H8 1 - - - - 1 H9 1 - - - - 1 H10 1 - - - - 1 H11 1 - - - - 1 H12 1 - - - - 1 H13 - 1 - - - 1 H14 - 2 2 - - 4 H15 - 1 - - - 1 H16 - 1 - - - 1 H17 - 1 - - - 1 H18 - 1 - - - 1 H19 - - 1 - - 1 29

H20 - - 1 - - 1 H21 - - 1 - - 1 H22 - - 1 - - 1 H23 - - 1 - - 1 H24 - - 1 - 1 2 H25 - - 1 - - 1 H26 - - - 1 - 1 H27 - - - 4 2 6 H28 - - - 3 - 3 H29 - - - 2 - 2 H30 - - - 1 1 2 H31 - - - 1 - 1 H32 - - - 1 - 1 H33 - - - 1 - 1 H34 - - - 1 - 1 H35 - - - 1 - 1 H36 - - - 2 - 2 H37 - - - 1 - 1 H38 - - - 1 - 1 H39 - - - - 2 2 H40 - - - - 1 1 H41 - - - - 1 1 H42 - - - - 1 1 H43 - - - - 1 1 H44 - - - - 1 1 H45 - - - - 2 2 H46 - - - - 1 1 H47 - - - - 1 1 H48 - - - - 1 1 H49 - - - - 1 1 H50 - - - - 1 1 H51 - - - - 1 1 H52 - - - - 1 1 H53 - - - - 1 1 H54 - - - - 1 1 Total 14 12 13 20 22 81

Os níveis de variação genética intra-específicos para a pescada foram estimados com base nos parâmetros genéticos e na análise de polimorfismo de DNA. Quando as populações foram agrupadas, a diversidade gênica (Ĥ) total estimada foi de 0.9778, e a diversidade nucleotídica (π) 0.016300. Já, quando as populações foram analisadas isoladamente, a diversidade gênica (Ĥ) variou de

0.8930 em Tefé a 0.9870 em Soure, e a diversidade nucleotídica (π) de 0.009657 em Tabatinga a 0.020609 em Soure, que podem ser vistos na Tabela 6. Com relação aos testes de neutralidade, o teste D de Tajima e o Fs de Fu não obtiveram os mesmos resultados (P<0,05). O teste D de Tajima não foi significativo para nenhuma localidade, porém o teste Fs de Fu (mais sensível) foi significativo para as localidades de Tabatinga e Soure. Quando as localidades foram agrupadas, os resultados apresentaram a mesma situação, na qual Fs de Fu também foi significativo (Tabela 6). Valores negativos e significantes para os testes de neutralidade geralmente são observados em populações que sofreram rápida expansão demográfica e são interpretados como crescimento populacional.

Tabela 6 – Parâmetros genéticos para Plagioscion squamosissimus. População Número Número de Sítios Diversidade Diversidade D de Fs de amostral haplótipos polimórficos gênica nucleotídica Tajima Fu Tabatinga 14 12 29 0.9670±0.0437 0.009657±0.005419 -0.94012 -3.98737* Tefé 12 8 34 0.8939±0.0777 0.012046±0.006736 -0.92504 0.39878 Janauacá 13 9 38 0.9103±0.0683 0.011762±0.006539 -1.28035 -0.25774 Macapá 20 13 45 0.9421±0.0340 0.018092±0.009494 0.09917 -0.00758 Soure 22 19 46 0.9870±0.0175 0.020609±0.010693 0.67935 -4.50358* TOTAL 81 54 71 0.9778±0.0079 0.016300±0.008259 -0.61763 - 24.34593* (*) = P<0,05

Nos dados de AMOVA, de toda variabilidade genética observada, 93,68% foi verificada dentro das localidades, e apenas 6,32% encontra-se entre as localidade

amostradas. O valor de ΦST (0.06319), apesar de baixo, indica alguma diferenciação entre as populações (P=0,00673) em um nível de significância de 0,05. As Tabelas 7 e 8 apresentam a diferenciação genética representada pelos

valores de comparações par-a-par de ΦST (FST de Wright) e Nm (número de migrantes por geração), respectivamente, obtidos para as amostras populacionais referentes às cinco localidades analisadas.

Tabela 7 – Valores de ΦST das comparações par-a-par entre as localidades. População Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Tabatinga ---- Tefé 0.12077* ---- Janauacá 0.13895* -0.05223 ---- Macapá 0.06018 0.01234 0.01952 ---- Soure 0.16287** 0.06461 0.07562* 0.01465 ----

(*) Significância dos valores de ΦST (P<0,05).

(**) Significância dos valores de ΦST (P<0,005) após correções de Bonferroni para múltiplas comparações.

Tabela 8 – Valores de Nm das comparações par-a-par entre as localidades. População Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Tabatinga ---- Tefé 3.64011 ---- Janauacá 3.09830 ∞ ---- Macapá 7.80807 40.01669 25.11238 ---- Soure 2.57001 7.23886 6.11204 33.61981 ----

Dentre as dez comparações par-a-par para os testes de ΦST dos dados de AMOVA, quatro delas apresentaram valores significativos antes da correção de Bonferroni (P<0,05), (Tabela 7). No entanto, após as correções de Bonferroni (P<0,005), somente uma das comparações (Soure e Tabatinga) apresentou valor significativo para o ΦST (P=0,00455). Desta forma, considerando a diferenciação genética encontrada entre as localidades dos extremos da distribuição, a hipótese de isolamento por distância foi testada, mas não se constatou um valor significativo para o coeficiente de correlação do teste de Mantel (r=0,534878, P>0,05), revelando que não existe nenhuma correlação entre a divergência genética observada (ΦST) entre Soure e Tabatinga e a distância geográfica (Km) para as populações de pescada analisadas. A análise que usou o método de Neighbor Joining apresentou uma topologia evidenciando uma distribuição aleatória dos haplótipos de diferentes localidades geográficas sem a formação de grupos de haplótipos específicos por localidade (Figura 11) – considerada como uma das evidências de ausência de estrutura genético-populacional.

Figura 11 – Árvore Neighbour-Joining sem raiz apresentando o relacionamento de 54 haplótipos de P. squamosissimus. A origem geográfica dos haplótipos é definida na legenda de cores.

VI. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, diferentes técnicas moleculares, usando DNA nuclear ou mitocondrial (mtDNA), polimorfismo de proteína e isoenzimas, têm fornecido novas informações a respeito da variabilidade genética de populações naturais de várias espécies, permitindo o delineamento de unidades de manejo e avaliação de unidades de conservação (Ferguson et al., 1995). Os estudos das estruturas populacionais permeados por técnicas moleculares é parte de extrema importância da genética da conservação e tem sido útil tanto no estudo de populações exploradas comercialmente – que podem se apresentar abundantes, mas com riscos populacionais devido à superexploração – quanto para auxiliar estudos de espécies ameaçadas de extinção (Frankham et al., 2002). Os peixes são um exemplo de animais selvagens consumidos por nossa espécie em grande escala por meio da exploração direta de populações naturais, diferente da exploração de plantas e animais domésticos. E é graças a esse fator que a “genética pesqueira” tem ganhado espaço e força nos estudos genético- populacionais (Solé-Cava, 2001).

VI.1. Caracterização genética das populações de pescada

Os polimorfismos genéticos são usados na investigação de relacionamentos genéticos entre subpopulações em uma espécie. Estas análises de estudos genéticos populacionais em animais frequentemente têm sido focadas no DNA da mitocôndria. Este é informativo sobre ascendências, pois na maioria das espécies animais, é quase sempre de herança materna e raramente sofre recombinação. E tem sido usado como marcador para estudos de subestrutura ou recente história populacional (Hartl & Clark, 2007). Os resultados da análise da região controle (D-loop) de P. squamosissimus evidenciaram altos níveis de diversidade genética, verificados no elevado índice da média de diversidade gênica (Ĥ=0.9778), e nos altos valores da média de diversidade nucleotídica (π=0.016300) para as populações analisadas. Altos níveis de diversidade genética na região controle de peixes da Amazônia, já foram

34 detectados por outros autores. Um exemplo disso é o estudo da variabilidade genética do Tambaqui (Colossoma macropomum) feito por Santos et al. (2007), que revelaram índices de diversidade gênica elevados (Ĥ=0.999), e o mesmo se deu para a diversidade nucleotídica (π=0.012). Outro exemplo de peixe amazônico, cujos níveis de diversidade genética também foram avaliados é a dourada Brachyplatystoma rousseauxii, para o qual Batista & Alves-Gomes (2006), também utilizando a região controle do mtDNA, detectaram índices de diversidade gênica que variaram de 0.886 a 1.000 e diversidade nucleotídica variando de 0.0064 a 0.0095. Os autores observaram uma maior diversidade genética na região do baixo rio Amazonas, com valores decrescendo no sentido leste/oeste na calha deste rio, fato este associado possivelmente ao retorno direcionado dos indivíduos aos seus tributários de origem para se reproduzirem. Estudos recentes sobre a caracterização genética de populações de peixes migradores do rio Amazonas (e alguns tributários) foram realizados para Prochilodus nigricans (Machado, 2009) e Semaprochilodus insignis (Passos, 2009) com a região controle do mtDNA, para os quais os autores também evidenciam altos níveis de diversidade gênica (Ĥ=0.9114) e (Ĥ=0.9606), respectivamente. Não há publicado até o momento, dados de diversidade genética de P. squamosisimus, ou mesmo para outras espécies do gênero Plagioscion, utilizando- se marcadores moleculares de DNA (mitocondriais ou nucleares). No entanto, alguns trabalhos vêm sendo realizados caracterizando geneticamente espécies marinhas da família Scianidae (Lankford-Jr et al., 1999; Santos et al., 2003; Vinson et al., 2004; Santos et al., 2006; Alves-Costa et al., 2008; Rodrigues et al., 2008). Embora a maioria dos scianídeos façam parte de um ambiente muito diferente do ambiente de P. squamosissimus, estão fortemente relacionados, ao comparar-se esta espéice à maioria dos peixes de água doce neotropicais, que possuem uma associação relativamente antiga com ambientes de água doce, como os Characiformes e Siluriformes (Lovejoy et al., 2006). Um exemplo de estudo genético-populacional com scianídeos foi o trabalho de Santos et al (2006) que caracterizaram populações da pescada-gó Macrodon ancylodon na costa leste da América do Sul, onde profundas divergências genéticas sem diferenças morfológicas foram detectadas, resultando em dois grupos

35 significativamente diferentes. Estes indivíduos apresentaram uma alta diversidade gênica (Ĥ=0.906), que dentro das populações variou de moderada (Ĥ=0.515) a alta (Ĥ=0.909), no entanto, a diversidade nucleotídica (π) variou apenas de 0.0010 a 0.0030, refletindo desse modo uma alta similaridade de sequências dentro das populações de ambos os grupos. A diversidade genética de Cynoscion acoupa da costa norte do Brasil, um scianídeo marinho muito explorado, foi caracterizada por diversidade gênica variando de moderada a alta (Ĥ=0.892), e diversidade nucleotídica muito baixa (π=0.00288). Níveis baixos em comparação a outras espécies também exploradas já estudadas com a região controle (D-loop). Nenhum sítio variável foi observado com três ou mais variantes, indicando que a maior variabilidade do D-loop em C. acoupa é relativamente recente (Rodrigues et al., 2008). Todas estas espécies citadas são exploradas e de significativa importância comercial. No entanto, quando altos níveis de diversidade genética são encontrados, como no caso da pescada, fica evidente a ausência de um afunilamento populacional que possa ser verificado no nível de diversidade genética. Este fato pode estar relacionado ao tamanho efetivo dessas populações, pois quanto maior o tamanho efetivo populacional, menor será o efeito da deriva genética sobre estas. Porém, isso não elimina o efeito da pesca predatória (dado o fato de que ainda não existe, para a pescada, um plano de manejo para as populações naturais), significa apenas, que este efeito ainda não atingiu a diversidade genética da espécie nestas localidades. O teste D de Tajima não revelou valor significativo para nenhuma das localidades aqui analisadas, e o teste Fs de Fu não foi significativo para a maioria delas, exceto para Tabatinga e Soure (Tabela 6), que compõem as localidades dos extremos da distribuição analisadas no presente trabalho. Estas análises estatísticas, que testam a hipótese de mutação neutra, indicam que as amostras populacionais de pescada se encontram em equilíbrio genético (mutação-deriva) no que diz respeito ao mtDNA, ou seja, aparentemente não estão sob o efeito de pressão seletiva. Para as localidades onde o teste Fs de Fu apresentou valores significativos, são descartados os efeitos de seleção, uma vez que a região controle do mtDNA (D-loop) não se trata de uma região gênica codificadora de proteína, e, portanto, não sofre efeito de pressão seletiva. Esta diferença entre os resultados dos

36 dois testes é observada pelo fato do Fs de Fu ser um teste mais sensível, e representa para estas localidades, que estão no extremo da distribuição amostrada, uma expansão no seu tamanho populacional pela qual estas populações passaram ou estão passando.

VI.2. Estrutura populacional

Grande parte das populações é agrupada dentro de pequenas subpopulações nas quais formam unidades locais intercruzantes. Tal agrupamento é chamado de estrutura populacional ou subdivisão populacional, e é quase universal entre os organismos. Quando existe subdivisão populacional, existe, quase inevitavelmente, alguma diferenciação genética entre as subpopulações (Hartl & Clark, 2007). Ao se analisar a variação genética de Plagioscion squamosissimus no presente estudo, os resultados da análise de variância molecular (AMOVA) mostraram que a maior porcentagem de variação genética ocorreu dentro das populações (93,68%).

Os 6,32% de variação encontrada entre as localidades (ΦST=0.06319, P<0,05) é refletida nos valores de ΦST encontrados para as comparações par-a-par (Tabela 7), que segundo a AMOVA apresentou diferenciação significativa para quatro, das dez comparações antes da correção de Bonferroni (P<0,05). No entanto, ao se aplicar as correções de Bonferroni, apenas uma diferenciação significativa (P<0,005) foi detectada entre Tabatinga e Soure (os extremos da distribuição amostral) com valor

ΦST=0.16287, que Segundo Wright (1978) é indicativo de moderada diferenciação. Para este estudo, a hipótese de isolamento por distância não foi confirmada dada a falta de correlação entre as distâncias genéticas (valores de ΦST) e geográficas (distância em Km seguindo o percurso do rio) evidenciada pelo teste de Mantel (r=0,534878, P>0,05). Ainda assim é possível que este isolamento esteja ocorrendo, pois o valor significativo de ΦST ocorre entre as localidades mais distantes. Uma amostragem mais completa da calha do rio Amazonas, incluindo também seus tributários, associado a um marcador molecular mais sensível (microssatélites) poderiam elucidar melhor esta situação encontrada. Divergências entre dados de marcadores foram observadas em estudo genético- populacional do pirarucu. Hrbek et al. (2005) usando genes mitocondriais ND1 e ATP6 e 8 para estudar a estrutura genética populacional do pirarucu Arapaima gigas

(Schinz, 1822) na bacia Amazônica não observaram estrutura populacional e concluíram que o pirarucu provavelmente forma uma grande população panmítica. No entanto, Hrbek et al. (2007), combinando dados de genes mitocondriais com dados de marcadores microssatélites, também detectaram, para o pirarucu, um intenso fluxo gênico entre as localidades, porém verificaram o efeito de isolamento por distância, que só pôde ser observado nos dados de microssatélites, com fluxos gênicos significantemente restritos a distâncias maiores que 2.500 Km. Apesar da pouca diferenciação apresentada para a pescada entre os extremos de distribuição, todos os valores de Nm observados nas comparações par-a-par entre as localidades são maiores que 1.0, evidenciando conexões entre todas as localidades amostradas. Esses valores de Nm, que variaram de 2.57001 (entre Tabatinga e Soure) a infinito (entre Tefé e Janauacá), evidenciam um alto índice de fluxo gênico entre as pescadas das 5 localidades amostradas representando a população da calha principal do rio Amazonas. Altos índices de fluxo gênico estão sempre associados a uma ausência de estruturação populacional. Essa situação é comum de ser observada em peixes migradores, e tem sido relatada para outras espécies estudadas no rio Amazonas. Como no caso do estudo genético populacional do tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) com a análise da região controle do mtDNA, para o qual Santos et al. (2007) identificaram uma única população panmítica ocorrendo na calha principal do rio Amazonas verificada pelos altos índices de fluxo gênico representado por valores altíssimos para o número de migrantes por geração (Nm=infinito) para a grande maioria das comparações. A ausência de estruturação populacional para peixes da bacia amazônica também foi verificada no estudo de variabilidade genética da dourada Brachyplatystoma rousseauxii (Castelnau, 1855) e da piramutaba Brachyplatystoma vaillantii (Valenciennes, 1840), dois grandes bagres migradores da bacia Amazônica. Batista et al. (2005), utilizando a região controle (D-loop), para caracterizar a variabilidade genética inter e intraespecífica desses peixes, encontraram altos níveis de polimorfismo genético em todas as localidades amostradas ao longo do canal principal do rio Amazonas. E apesar das diferenças de diversidade genética observada nas duas espécies, os altos níveis de fluxo gênico entre as localidades,

38 apresentados por ambas as espécies, sugerem a existência de uma grande população panmítica. Ao se comparar os dados apresentados neste estudo, a respeito da estruturação genética populacional da pescada, aos de outras espécies de scianídeos, nos deparamos com alguns diferenciais, pois os trabalhos publicados nesta área têm abrangido apenas espécies marinhas para este grupo. A estruturação genética encontrada em organismos marinhos é mediada por processos diferentes dos que ocorrem em ambientes de água doce. No mar, há uma ausência de barreiras geográficas que isolem as populações, e para peixes com capacidade de migrar livremente, outros fatores (que ainda não são muito bem explicados) atuam no processo de diversificação. Como pôde ser observado nas populações de pescada- gó Macrodon ancylodon na costa do Atlântico da América do Sul, por Santos et al. (2006), que verificaram uma separação da espécie em dois grupos (denominados pelos autores de “Tropical” e “Subtropical”) suportada pela AMOVA, com 93.09% de toda a variação sendo dividida entre os dois grupos (sugerindo que M. ancylodon tenha sofrido um processo de especiação), e ainda, foram detectadas estruturações genéticas dentro de cada um dos grupos. Os autores associaram as diferenciações genéticas, que ocorreram nesta espécie, a uma adaptação a regimes térmicos locais e à ação das correntes marítimas como barreira ao fluxo gênico. Em espécies de peixes de água doce, os fatores que atuam como barreira ao fluxo gênico influenciando processos de estruturação e/ou diversificação são variados e têm sido relatados em resultados de alguns estudos genéticos, como o descrito por Farias & Hrbek (2008) que caracterizaram geneticamente espécies do gênero dos acarás-dicos (Symphysodon spp.) da bacia Amazônica, para os quais, fragmentação passada, isolamento por distância (limite na dispersão), preferências pelas diferenças químicas da água são citados como processos que ajudam a explicar a diferenciação representada nos clados. A estruturação genética encontrada por Sanches & Galetti-Jr (2007) em populações de Piraputanga Brycon hilarii, um caraciforme que ocorre na Bacia do Paraguai, teve um fator comportamental associado a esse processo de diferenciação na sub-bacia do rio Miranda. Os autores relatam que a estruturação populacional foi mais evidente entre os peixes coletados no período não-reprodutivo, que representa a época de menor deslocamento desses peixes, mostrando que eles

39 se organizam em unidades reprodutivas geneticamente diferenciadas, e apesar de serem peixes migradores, fogem à regra de formar grandes populações panmíticas em um dado sistema hidrográfico. Estruturação genética populacional em P. squamosissimus foi descrita por Teixeira et al. (2002) por meio da análise do polimorfismo da proteína transferrina para quatro localidades da calha principal do rio Amazonas. Três sub-populações geneticamente distintas foram identificadas (Careiro/Iranduba, Coari e Tefé) com altas frequências de determinados alelos (Tf2, Tf4 e Tf3, respectivamente). Os autores associaram essas diferenciações a um possível isolamento entre elas no passado. Apesar de ter sido descrito baixo coeficiente de seleção para a transferrina (Monostory et al., 1984), alguma pressão seletiva exercida pelo ambiente, que, esteja interferindo na expressão da proteína transferrina, poderia funcionar como uma hipótese para explicar a incongruência dos dados de Teixeira et al. (2002) em comparação aos resultados do presente estudo – no qual nenhuma estruturação (ou muito pouca, considerando-se os dois extremos de distribuição) foi verificada ao nível de um marcador bastante variável e que está totalmente (ou quase) isento da pressão de seleção do ambiente. Há também outros relatos de estudos morfométricos (Worthmann, 1979) e citogenéticos (Feldberg et al., 1999) que sugerem diferenciação populacional para P. squamosissimus em rios da Amazônia central. Entretanto, nenhum desses resultados corroboram os resultados observados no presente trabalho, o de ausência de diferenciação genética entre as localidades com mais de 2.300Km de distância como entre Soure e Tefé. A ausência de populações geneticamente estruturadas na calha principal do rio Amazonas tem sido verificada para um número crescente de espécies de peixes – dourada Brachyplatystoma rousseauxii e piramutaba Brachyplatystoma vaillantii (Batista et al., 2005); pirarucu Arapaima gigas (Hrbek et al., 2005; Hrbek et al., 2007); tambaqui Colossoma macropomum (Santos et al., 2007); e recentemente curimatã Prochilodus nigricans (Machado, 2009) e jaraqui Semaprochilodus insignis (Passos, 2009). Grande parte desses autores relacionam essa ausência de estruturação genética ao sistema de várzea na Amazônia, que em épocas de cheia produzem conexões que facilitam o fluxo gênico entre os peixes de diferentes localidades. Mas não se descarta a necessidade de mais estudos com uma

40 amostragem mais completa (tanto em localidades amostradas, quanto em número de amostras de cada localidade) e utilização de outros marcadores, podendo assim, elucidar melhor esta questão para a pescada.

VI.3. Considerações finais.

Espécies de peixes, frequentemente, são divididas em populações mais ou menos isoladas reprodutivamente, ou seja, estoques, na terminologia de manejo de peixes. Estoques individuais frequentemente diferem consideravelmente em suas características biológicas, e, respondendo independentemente à exploração, requerem manejos independentes (Ferguson et al., 1995). A biologia pesqueira considera as unidades de estoques como uma unidade de manejo, e as descrições genéticas produzem dados para comparar e medir a divergência genética de diferentes estoques e ajudar a determinar a variedade de estoques conhecidos (Jamieson, 1973). As implicações das análises genético-populacionais para estudos de conservação são muito importantes. Se uma espécie ameaçada, que ocupa uma determinada área, se apresenta estruturada, então a estratégia de conservação deve procurar preservar a diversidade da espécie naquela área, pois já podem existir adaptações locais que se perderiam no caso de a população ser misturada com outras. Se a população da espécie é homogênea, ao longo de toda a área de ocorrência, então é viável concentrar a proteção da espécie em apenas uma área para a recolonização das outras quando necessário (Haig, 1998). Em se tratando de espécies de peixes de importância comercial, a preocupação de conservação visa não somente a detecção de uma possível ameaça de extinção, mas, primordialmente, a manutenção de uma exploração sustentável. Nos dias atuais, as técnicas utilizadas como manejo de diversas espécies de peixes exploradas comercialmente têm se baseado na proibição da pesca em épocas de defeso, delimitação de tamanho do pescado e das técnicas utilizadas para a pesca, entre outros. Hilsdorf et al. (2006) ressaltam que os aspectos da genética no manejo de estoques capturados pela pesca comercial raramente está na pauta de discussões dos programas de manejo dos estoques pesqueiros. No entanto, estudos que visam estratégia de conservação de peixes baseados em

41 dados genéticos (ou tendo esses dados como ferramenta adicional) já é uma realidade discutida (Fabré & Barthem, 2005; Hilsdorf et al., 2006; Hrbek et al., 2007) e tendem a fazer parte desses programas de manejo pesqueiro, haja visto a importante contribuição desses estudos para que cheguemos, ao menos, próximo de uma política de pesca verdadeiramente sustentável. O presente estudo avaliou a variabilidade genética da pescada P. squamosissimus, na calha principal do rio Amazonas ao nível do marcador mitocondrial (D-loop) e evidenciou que: - Com exceção da pequena diferenciação populacional observada entre as localidades dos extremos da distribuição das localidades analisadas, não há delimitação de populações geneticamente estruturadas entre as cinco localidades amostradas na calha principal do rio Amazonas. No entanto, uma expansão populacional foi observada entre os pontos mais distantes da distribuição amostral; - Os resultados de diversidade genética baseados na análise da região controle do DNA mitocondrial mostram que a pesca predatória ainda não atingiu essas populações; - Apesar de não ter sido detectado estatisticamente um isolamento por distância, o mesmo não deve ser descartado, dada a diferenciação genética encontrada entre os indivíduos dos pontos amostrais mais distantes (Soure e Tabatinga). Por fim, os dados deste estudo revelam que na ausência de populações geneticamente estruturadas, não há uma área delimitada em específico, do ponto de vista da informação genética dessas populações. Neste caso, as estratégias de conservação para a pescada (P. squamosissimus) no rio Amazonas não devem ser traçadas diferenciadamente.

VII. BIBLIOGRAFIA

Agostinho, C. S. 2000. Use of Otoliths to Estimate Size at Sexual Maturity in Fish. Braz. Arch. Biol. Technol. 43 (4).

Aguilera, O. & Aguilera, D. R. de. 2003. Two new otolith-based Scianidae species of the genus Plagioscion from South American neogene marine sediments. J. Paleont., 77(6), pp. 1133–1138.

Alves-Costa, F. A.; Martins, C.; Matos, F. D. C.; Foresti, F.; Oliveira, C. & Wasko, A. P. 2008. 5S rDNA characterization in twelve Sciaenidae fish species (Teleostei, Perciformes): Depicting gene diversity and molecular markers. Genetics and Molecular Biology. 31,1 (suppl), 303-307.

Alves-Gomes, J. A.; Ortí, G.; Haygood, M.; Heiligenberg, W. & Meyer, A. 1995. Phylogenetic Analysis of the South American Electric Fishes (Order Gymnotiformes) and the Evolution of Their Electrogenic System: A Synthesis Based on Morphology, Eletrophysiology, and Mitochondrial Sequence Data. Mol. Biol. Evol. 12(2): 298-318.

Annibal, S. R. P. 1983. Avaliação bio-ecológica e pesqueira das “pescadas” (Plagioscion squamosissimus HECKEL, 1840 e Plagioscion montei SOARES, 1978) no “Sistema Lago do Rei”- Ilha do Careiro - AM - Brasil. Master thesis, PPG-BTRN, INPA, Manaus, AM, Brazil.

Avise, J. C.; Niegel, J.E.; Arnold, J. 1984. Demographic influences on mitochondrial DNA lineage survivorship in animal populations. Jour. Mol. Evol., 20: 99-105.

Ballard, W. O.; Whitlock, M. C. 2004. The incomplete natural history of mitochondria. Mol. Eco., 13: 729-744.

Barthem, R. B. & Fabré, N. N. 2003. Biologia e Diversidade dos Recursos Pesqueiros da Amazônia. In: A Pesca e os Recursos Pesqueiros na Amazônia Brasileira, ed. ML Ruffino. pp. 11-55. Manaus: ProVárzea-IBAMA.

Batista, J. S. & Alves-Gomes, J. A. 2006. Phylogeography of Brachyplatystoma rousseauxii (Siluriformes – Pimelodidae) in the Amazon Basin offers preliminary evidence for the first case of “homing” for an Amazonian migratory catfish. Genetics and Molecular Research 5 (4): 723-740.

Batista, J. S.; Formiga-Aquino, K.; Farias, I. P. & Alves-Gomes, J. A. 2005. Variabilidade genética da dourada e da piramutaba na bacia Amazônica. In: O Manejo da Pesca dos Grandes Bagres Migradores: Piramutaba e Dourada no Eixo Solimões-Amazonas .Fabré, N. N. & Barthem, R. B., eds, pp. 15–19. Manaus: Edicões ProVárzea/Ibama.

Baumgartner, M. S. T.; Nakatani, K.; Baumgartner, G. & Makrakis, M. C. 2003. Spatial and temporal distribution of “Curvina” larvae (Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840) and its relationship to some environmental variables in the upper Paraná rivers floodplain, Brazil. Braz. J. Biol., 63(3): 381- 391.

Benedito-Cecilio, E. & Agostinho, A. A. 2000. Distribution, abundance and use of different environments by dominant ichthyofauna in the influence área of the Itaipu reservoir. Acta Scientiarum, Maringá, 22 (2): 429-437.

Bennemann, S. T.; Capra, L. G.; Galves, W. & Shibatta, O. A. 2006. Dinâmica trófica de Plagioscion squamosissimus (Perciformes, Scianidae) em trechos de influência da represa Capivara (rios Paranapanema e Tibagi) Iheringia, Sér. Zool., Porto Alegre, 96(1):115-119.

Brown, W. M., George Jr., M. & Wilson, A. C. 1979. Rapid evolution of mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76: 1967-1971.

Brown, W. M.; Pranger & E. M.; Wang, A. 1982. Mitochondrial DNA sequences of primates: Tempo and mode of evolution. Jour. Mol. Evol., 18: 225-239.

Brown, J. R.; Beckenbach, A. T. & Smith, M. J. 1993. Intraespecific DNA sequence variation of the mitochondrial control region of white sturgeon (Acipenser transmontanus). Mol. Bio. Evol., 10 (2): 326-341.

Camargo, S. A. F. de & Petrere-Jr., M. 2004. Análise de risco aplicada ao manejo precaucionário das pescarias artesanais na região do Reservatório da UHE- Tucuruí (Pará, Brasil).

Carnelós, R. C. & Benedito-Cecilio, E. 2002. Reproductive Strategies of Plagioscion squamosissimus Heckel, 1840 (Osteichthyes Scianidae) in the Itaipu Reservoir, Brazil. Brazilian Archives of Biology and Technology. 45 (3): 317-324.

Casatti, L. 2003. Family Sciaenidae (Drums or croakers). In: R.E. Reis, S. O. Kullander & C. J. Ferraris Jr. (orgs.), Check list of the freshwater of South and Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre, pp. 599–602.

Casatti, L. 2005. Revision of the South American freshwater genus Plagioscion (Teleostei, Perciformes, Scianidae). Zootaxa, 1080: 39-64.

Castro, A. L. F.; Stewart, B. S.; Wilson, S. G.; Hueter, R. E.; Meekan, M. G.; Motta, P. J.; Bowen, B. W. & Karl, S. A. 2007. Population genetic structure of Earth’s largest fish, the whale shark (Rhincodon typus). Molecular Ecology, 16: 5183- 5192.

Doyle, J. J. & Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. Bot. Soc. Amer. 19: 11-15.

Excoffier, L.; Laval, G.; Schneider, S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evol. Bioin. Onl., 1: 47-50.

Fabré, N. N. & Barthem, R. B. 2005. O Manejo da Pesca dos Grandes Bagres Migradores: Piramutaba e Dourada no Eixo Solimões-Amazonas . eds,. Manaus: Edicões ProVárzea/Ibama. 113p.

Farias, I. P.; Ortí, G.; Sampaio, I.; Schneider, H. & Meyer, A. 1999. Mitochondrial DNA phylogeny of the family Cichlidae: Monophyly and fast molecular evolution of the Neotropical assemblage. Journal of Molecular Evolution. 48: 703-711.

Farias, I. P.; Ortí, G. & Meyer, A. 2000. Total evidence: Molecules, morphology, and the phylogenetics of cichlid fishes. Journal of Experimental Zoology (Molecular Development and Evolution). 288: 76-92.

Farias, I. P.; Ortí, G.; Sampaio, I. Schneider, H. & Meyer, A. 2001. The Cytochrome b Gene as a Phylogenetic Marker: The Limits of Resolution for Analyzing Relationships Among Cichlid Fishes. Journal of Molecular Evolution. 53: 89- 103.

Farias, I. P. & Hrbek, T. 2008. Patterns of diversification in discus fishes (Symphysodon spp. Cichlidade) of the Amazon basin. Molecular Phylogenetics and Evolution. 49: 32-43.

Feldberg, E.; Porto, J. I. R.; dos Santos, E. B. P. & Valentin, F. C. S. 1999. Cytogenetic studies of two freshwater scianids of the genus Plagioscion (Perciformes, Scianidae) from the Central Amazon. Genet. Mol. Biol. 22: 351- 356.

Ferguson, A.; Taggart, J. B.; Prodöhl, P. A.; McMeel, O.; Thompson, C.; Stone, C.; McGinnity, P. & Hynes, R. A. 1995. The application of molecular markers to the study and conservation of fish populations, with special reference to Salmo. Journal of Fish Biology. 47 (Supplement A), 103-126.

Formiga-Aquino, K. 2004. Variabilidade genética da piramutaba – Brachyplatystoma vaillantii (Valenciennes, 1840) (Siluriformes: Pimelodidae) no sistema Estuário-

Amazonas-Solimões. Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Manaus, Am. 75p

Frankham, R.; Ballou, J. R. & Briscoe, D. A. 2002. Introducion to Conservation Genetics. Cambridge University Press, Cambridge, England.

Fu, Y-X. 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth, hitchhiking and background selection. Genetics 147, 915-925.

Guo, X. H.; Liu, S. J.; Liu, Q.; Liu, Y. 2004. New progresses on mitochondrial DNA in fish. Yi Chuan Xue Bao., 31(9):983-1000.

Haig, S. M. 1998. Molecular contributions to conservation. Ecology. 79: 413-425.

Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser, 95: 95-98.

Hartl, D. L.; Clark, A. G. 2007. Principles of Population Genetics. Sinauer Associates, Inc. Publisher. Suderland, Massachusetts. 652p.

Hilsdorf. A. W. S.; Resende, E. K. & Marques, D. K. S. 2006. Genética e Conservação de Estoques Pesqueiros de Águas Continentais no Brasil: Situação Atual e Perspectivas. Documentos/Embrapa Pantanal, Corumbá. 43p.

Hrbek, T.; Farias I. P.; Crossa, M.; Sampaio, I.; Porto, J. I. R.; Meyer, A. 2005. Population genetic analysis of Arapaima gigas, one of the largest freshwater fishes of the Amazon basin: implications for its conservation. Animal conservation, 8: 297-308.

Hrbek, T.; Crossa, M. & Farias, I. P. 2007. Conservation strategies for Arapaima gigas (Schinz, 1822) and the Amazonian várzea ecosystem. Braz. J. Biol., 67 (4, suppl.): 909-917.

Hrbek, T.; Farias, I. P. 2008. The complete mitochondrial genome of the pirarucu (Arapaima gigas, Arapaimidae, Osteoglossiformes). Genetics and Molecular Biology. 31, 1 (suppl), 293-302.

Jamieson, A. 1973. Genetic ‘tags’ for marine fish stocks. In: Sea Fisheries Research. Harden Jones. FR (ed) London, Elek Science. p. 91-99.

Lee, W. J.; Conroy, J.; Howell, W. H.; Kocher, T. D. 1995. Structure and evolution of teleost mitochondrial control regions. Jour. Mol. Evol., 41: 54-66.

Li, C. & Ortí, G. 2007. Molecular phylogeny of Clupeiformes (Actinopterygii) inferred from nuclear and mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 44: 386-398.

Lankford-Jr, T. E.; Targett, T. E.; Gaffney, P. M. 1999. Mitochondrial DNA analysis of population structure in the Atlantic croaker, Micropogonias undulatus (Perciformes: Sciaenidae). Fishery Bulletin, 97: 884-890.

Loubens, G. 2003. Biologie de Plagioscion squamosissimus (Teleostei: Sciaenidae) dans le bassin du Mamoré (Amazonie bolivienne). Ichthyological Exploration of Freshwaters, München, 14 (4): 335-352.

Lovejoy, N. R.; Albert, J. S. & Crampton, W. G. R. 2006. Miocene marine incursions and marine/freshwater transitions: Evidence from Neotropical fishes. Journal of South American Earth Sciences. 21: 5-13.

Lundberg, J. G.; Marshall, L. G.; Guerrero, J.; Horton, B.; Malabarba, M. C. S. L.; Wesseling, F. 1998. The stage for neotropical fish diversification: A history of tropical South American Rivers. In: Malabarba, L. R.; Reis, R. E.; Vari, R. P.; Lucena, Z. M.; Lucena, C. A. S. Phylogeny and classification of Neotropical fishes. EDIPUCRS, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. p.30-36.

Machado, V. N. 2009. Análise da variabilidade genética da curimatã Prochilodus nigricans (Agassiz, 1829) na calha do rio Amazonas e seus principais tributários. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em Ciências Pesqueiras nos Trópicos/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 65pp.

Meyer, A. 1993. Evolution of mitochondrial DNA in fishes. In: Molecular Biology Frontiers: Biochemistry and Molecular Biology of Fishes. Vol. 2. P. W. Hochachka & T. P. Mommsen (eds.). Amsterdam, Holland: Elsevier.

Meyer, A. 1994. DNA Technology and phylogeny of fish: Molecular phylogenetic studies of fish. In: Beaumont, A.R. Genetic and evolution of aquatic organisms. Chapman and Hall, London. p.219-249

Monostory Z, Nagy A, Gervai J and Csanyi V (1984). Polymorphism and inheritance of serum esterases and beta-globulins in the paradise fish (Macropodus opercularis; Anabantidae). Anim. Blood Groups Biochem. Genet. 15: 1-11.

Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics Columbia University Press, New York, NY.

Ovenden, J. R. 1990. Mitochondrial DNA and marine stock assessment: a review. Australian Journal of Marine and Freshwater Research. 41 (6) 835-853.

Parente, V. de M. & Batista, V. da S. 2005. A organização do desembarque e o comércio de pescado na década de 1990 em Manaus, Amazonas. Acta Amazônica. 35(3): 375 – 382.

Passos, K. B. 2009. Genética populacional do jaraqui de escama grossa (Semaprochilodus insignis – Prochilodontidae, Characiformes). Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 56pp.

Pinheiro, L. A. & Frédou, F. L. 2004. Caracterização geral da pesca industrial desembarcada no Estado do Pará. Revista Científica da UFPA. Vol. 4.

Ragazzo, M. de T. 2002. Peixes do Rio Negro por Alfred Russel Wallace (1850- 1852). Livro. Organização – texto introdutório e traduções Mônica de Toledo- Piza Ragazzo. Edusp – Editora da Universidade de São Paulo, Imprensa Oficial do Estado, São Paulo. 1ª ed. Pág. 486-487.

Reis R. E.; Kullander S. O. & Ferraris C. J. eds. 2003. Check List of the Freshwater Fishes of South and Central America. Porto Alegre, Brazil: EDIPUCRS. 734 pp.

Ribeiro, D. T. 2006. História evolutiva de espécies do gênero Potamotrygon Garman, 1877 (Potamotrygonidae) na Bacia Amazônica. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 126pp.

Rice, W. R. 1989. Analyzing tables of statistical tests. Evolution 43, 223-225.

Rodrigues, R.; Schneider, H.; Santos, S.; Vallinoto, M; Sain-Paul, U. & Sampaio, I. 2008. Low levels of genetic diversity depicted from mitochondrial DNA sequences in a heavily exploited marine fish (Cynoscion acoupa, Sciaenidae) from the Northern coast of Brazil. Genetics and Molecular Biology. 31,2, 487- 492.

Sanches, A. & Galetti-Jr, P. M. 2007. Genetic evidence of population structuring in the neotropical freshwater fish Brycon hilarii (Valenciennes, 1850). Braz. J. Biol. 67 (4, Suppl.): 889-895.

Santos, G. M.; Ferreira, E. J. G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe- McConnell, R. H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. EDUSP, São Paulo, São Paulo, Brasil. p.345-37.

Santos, S.; Schneider, H.; Sampaio, I. 2003. Genetic differentiation of Macrodon ancylodon (Sciaenidae, Perciformes) populations in Atlantic coastal waters of South America as revealed by mtDNA analysis. Genetics and Molecular Biology. 26, 2, 151-161.

Santos, S. B. A. F.; Silva, A. C. da & Viana, M. S. R. 2003. Aspectos reprodutivos da pescada-do-piauí, Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840), capturada no Açude Pereira de Miranda (Pentecoste - Ceará). Revista Ciência Agronômica, Vol. 34, N⁰.1: x – y.

Santos, S.; Hrbek, T.; Farias, I. P.; Schneider, H. & Sampaio, I. 2006. Population genetic structuring of the king weakfish, Macrodon ancylodon (Scianidae), in Atlantic coastal Waters of South America: deep genetic divergence without morphological change. Molecular Ecology. 15, 4361-4373.

Santos, M. C. F.; M. L. Ruffino & I. P. Farias. 2007. High levels of genetic variability and panmixia of the tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) in the main channel of the Amazon River. Journal of Fish Biology. 71: 33-44.

Saik, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. 1988. Primer directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Scie., 239: 487-491.

Schmitt, R. 2005. Filogeografia de “Hypopygus lepturus” Hoedeman, 1962 (Gymnotiformes: Rhamphycthyidae) ao longo do médio rio Negro, Amazônia. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 156pp.

Schneider, C. H. 2007. Análise da variabilidade genética do peixe ornamental Carnegiella strigata (Characiformes, Gasteropelecidae) de três rios de água preta da Amazônia Central. Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 72pp.

Sioli, H. 1984. The Amazon and its main affluents: Hydrography, morphology of the river courses, and river types. In: The Amazon Limnology and landscape ecology of a mighty tropical river and its basin. Ed. Harald Sioli, p. 263. Springer Verlag, New York, NY.

Soares, M. G. M. 2007. (ed.) Peixes de lagos do Médio rio Solimões. Manaus, EDUA, 176 pp.

Solé-Cava, A. M. 2001. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: Matioli, S. R. (ed.). Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos Editora. p. 172-192.

Tajima, F. 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123, 585-595.

Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599. (Publication PDF at http://www.kumarlab.net/publications)

Teixeira, A. S.; Jamieson, A. & Raposo, J. C. P. 2002. Transferrin polymorphism in Central Amazon populations of pescada, Plagioscion squamosissimus. Genet. Mol. Res. 1 (3): 216-226.

Thompson , J. D.; Higgins, D. G. & Gibson, T. J. 1996. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22, 4673-4680.

Torres, R. A. 2006. Molecular taxonomy of Plagioscion Heckel (Perciformes, Scianidae) and evidence from mtDNA RFLP markers for an invasive species in the Paraná river, Southern Brazil. Revista Brasileira de Zoologia, 23 (4): 1235- 1242.

Viana, A. P.; Frédou, T. & Lucena, F. 2006. Aplicações de técnicas morfométricas no estudo da morfometria de Pescada Branca, Plagioscion squamosissimus, Heckel (1940), Perciformes, Scianidae, desembarcada na Ilha de Mosqueiro- PA. Boletim do Laboratório de Hidrobilogia, 19: 01-012.

Vinson, C.; Gomes, G.; Schneider, H.; Sampaio, I. 2004. Sciaenidae fish of the Caeté River estuary, Northern Brazil: mitochondrial DNA suggests explosive radiation for the Western Atlantic assemblage. Genetics and Molecular Biology. 27,2, 174-180.

Willis, S. C.; Nunes, M. S.; Montaña, C. G.; Farias, I. P. & Lovejoy,N. R. 2007. Systematics, biogeography, and evolution of the Neotropical peacock basses Cichla (Perciformes: Cichlidae). Molecular Phylogenetics and Evolution. 44(1): 291-307.

Wilson, G. M.; Thomas, W. K.; Beckenbach, A. T. 1985. Intra- and interspecific mitochondrial DNA sequences divergence in Salmo: rainbow, steelhead, and cutthroat throuts. Can. J. Zool., 63: 2088-2094.

Worthmann, H. 1979. A relação entre o desenvolvimento do otólito e o crescimento do peixe como auxílio na distinção de populações de pescada (Plagioscion squamosissimus). Acta Amazonica 9: 573-586. Wright, S. 1978. Evolution and the genetics of populations. The University of Chicago Press, London. 580p.

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