UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular

TESE DE DOUTORADO

CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE MARCADORES DArT COM BASE EM MAPEAMENTO GENÉTICO E FÍSICO E DETECÇÃO DE QTLs EM

CÉSAR DANIEL PETROLI

BRASILIA – DF

Abril, 2013

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Biologia Celular

CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE MARCADORES DArT COM BASE EM MAPEAMENTO GENÉTICO E FÍSICO E DETECÇÃO DE

QTLs EM Eucalyptus

Orientador: Dr. Dario Grattapaglia

Tese apresentada ao Departamento de Biologia Celular do Instituto de Biologia, da Universidade de Brasília, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas, Área de Concentração: Biologia Molecular

BRASILIA – DF

Abril, 2013

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TERMO DE APROVAÇÃO

Tese apresentada ao Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, como requisito parcial para obtenção de grau de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Molecular.

Tese defendida e aprovada em 26/04/2013 por:

Dr. Dario Grattapaglia - Orientador Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Dr. Marcio Elias Ferreira Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Dr. Georgios Joannis Pappas Júnior Universidade de Brasília

Dr. Márcio de Carvalho Moretzsohn Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

Dr. Alan Carvalho Andrade Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

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A meus grandes amores

Caro e nossa princesa Isabella

DEDICO

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AGRADECIMENTOS

A realização dessa tese somente foi possível pelo apoio recebido de diversas pessoas e instituições, mas gostaria de agradecer de maneira especial:

À Universidade de Brasília (UnB), e especialmente ao programa de pós-graduação em Biologia Molecular, representados por todos os professores e funcionários, pela oportunidade de realização deste curso.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel superior (CAPES) pelo apoio financeiro que tornou possível a realização desse trabalho.

À EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, pela infra-estrutura de trabalho.

A todas as empresas florestais e Instituições que facilitaram as amostras e os recursos necessários para a realização deste trabalho.

Devo muito à orientação do Dr. Dario Grattapaglia, com quem estabeleci uma relação profissional e pessoal, a qual desejo seja duradoura após a finalização deste trabalho. É em pessoas como ele que eu me espelho e busco inspiração para o meu próprio desenvolvimento profissional e pessoal.

Ao Dr. Andrzej Kilian, director da empresa Diversity Arrays Technology, por ter acreditado no projeto e aberto as portas do DArT para recebernos com muito carinho em Canberra, Australia. Pelos grandes conhecimentos transmitidos que são os pilares para o meu futuro profissional.

Aos membros da banca de avaliação desta tese, o Dr. Marcio Elias Ferreira, Dr. Georgios J. Pappas Júnior, Dr. Marcio de Carvalho Moretzsohn e o Dr. Alan Carvalho Andrade, pelos comentários, sugestões e questionamentos que foram essenciais para a melhoria e o estabelecimento do formato final.

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Aos pesquisadores e técnicos do Laboratorio de Genética Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnología, Marcão, Marcio, Vânia, Glaucia, Zilneide, Lorena, Peter e muito especialmente a minha grande amiga e conselheira Marília.

Aos amigos que tive o prazer de conhecer no Laboratorio de Genética Vegetal, Bruna (e Daniel), Thaisa, Marília (Georgios e meu príncipe Nicolas), Dione (Andrê e Ian), Ediene e Rodrigo, Tati (Bruno e Arthur), Natália, Mariana, Marco (Bia e Teo), Tulio (e Cecilia) e Pedro pela amizade de tantos anos. A muitos de vocês considero irmãos do coração que a vida me presenteu e tenho certeza que nem a distância ou o tempo vai destruir essa amizade tão linda e verdadeira.

Aos meus amigos do laboratório DarT na Austrália, Colleen, Michael, Kasia, Grzegorz, Jason, Ling, Eric, Damian, Puthick, Vanessa, Cina, Cleare, Frank, Gosia, Hang e Adriane, por todo o apoio e carinho durante minha estadia em Canberra, onde passei dois anos maravilhosos da minha vida, cehio de experiências inesquecíveis.

Aos meus irmãos brasileiros Eduardo, Genny, Arnon, Vinicius, Leo, Gabriel, William e Reinaldo, você sempre estarão presentes.

A meus pais, Elena e Cacho, os principais responsáveis por minha educação e formação como pessoa. Sou eternamente agradecida pelos ensinamentos, apoio incondicional e incentivo para meu crescimento pessoal e profissional. Tudo o que eu sou eu devo a vocês.

Ao meu irmão David e sua esposa Sonia pelo apoio, carinho e principalmente por ter me presenteado com duas crianças maravilhosas: Sofia e Tisiano, amos muito vocês!

Ao meu irmão Gastón, pelo carinho e alegria de sempre. Apesar da juventude você é um exemplo para mim.

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À família que me acolheu como mais um filho: Juan, Norma, Adrian, Sole, Vale, Flor e Vicky, tios e primos, pelo carinho e apoio recebido sempre.

À Carol, meu grande amor e companheira de vida, pelo seu apoio, amizade, compreensão e amor incondicional. Este trabalho é compartilhado 100%. Obrigado por ser a melhor esposa do mundo e por ter cumprido meu grande sonho de formar juntos, uma família maravilhosa.

E finalmente a pessoa que conseguiu mudar completamente o sentido da minha vida, nossa princessa Isabella. Nunca imaginei que meu coração tinha tanto amor para dar. Cada dia com um simples sorriso você me faz o papai mais feliz do mundo. Te amo filha! Também para a pessoa que está chegando, você iluminara nossas vidas tanto como a sua irmazihna.

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ÍNDICE Resumo 1

Abstract 2

1. INTRODUÇÃO 4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5

2.1. O gênero Eucalyptus 5

2.2. Atualidade e impacto econômico do Eucalyptus no Brasil 6

2.3. Mapeamento genético 8

2.4. Analise de QTLs (Quantitative Trait Loci) 10

2.5. Melhoramento genético de Eucalyptus 11

2.6. Desenvolvimento de marcadores moleculares em Eucalyptus 13

2.7. Estudos de genética de populações e evolução em Eucalyptus 15

2.8. Desenvolvimento de mapas genéticos em Eucalyptus 15

2.9. Identificação de QTLs em Eucalyptus 17

2.10. Marcadores DArT (Diversity Arrays Technology) 20

3. CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE MARCADORES DArT 24 BASEADA NA ANÁLISE DE MAPEAMENTO POR LIGAÇÃO E FÍSICO NO GENOMA DE Eucalyptus

3.1. INTRODUÇÃO 24

3.2. OBJETIVOS 28

3.3. MATERIAL E MÉTODOS 29

3.3.1. Material vegetal 29

3.3.2. Genotipagem de microssatélites 29

3.3.3. Genotipagem de marcadores DArT (Diversity Arrays Technology) 29

3.3.4. Construção do mapa genético 31

3.3.5. Análise comparativa entre o mapa de ligação e a montagem de sequência 32 do genoma.

3.3.6. Análise comparativa entre o mapa de ligação e a montagem da sequência 32 do genoma

3.4. RESULTADOS 34

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3.4.1. Genotipagem dos marcadores DarT 34

3.4.2. Mapeamento de ligação 36

3.4.3. Distâncias de recombinação e física no genoma de Eucalyptus 43

3.4.4. Análises de redundância das sequências das sondas DArT 47

3.4.5. Alinhamento das sondas DArT no genoma de Eucalyptus 49

3.4.6. Cobertura do espaço gênico de Eucalyptus pelos marcadores DArT 50

3.5. DISCUSSÃO 54

3.5.1. Eficiência da genotipagem de marcadores DArT para análise genética em 55 Eucalyptus

3.5.2. Estimativas de redundância das sondas DarT 57

3.5.3. O mapa genético framework permite estimativas mais confiáveis da 58 relação kpb/cM no genoma de Eucalyptus

3.5.4. O alinhamento do mapa genético à sequência física sugere uma 61 característica pan-genômica do microarranjo DArT e a completude da montagem do genoma de Eucalyptus

3.5.5. O microarranjo DArT oferece uma cobertura uniforme do genoma e 62 amostra preferencialmente regiões ricas em genes

3.6. CONCLUSÃO 63

4. CAPÍTULO 2: MAPEAMENTO DE QTLs PARA CARACTERÍSTICAS DE 65 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA E ANÁLISE DO CONTEUDO GÊNICO NOS INTERVALOS GENÔMICOS CORRESPONDENTES

4.1. INTRODUÇÃO 65

4.2. OBJETIVOS 68

4.3. MATERIAL E MÉTODOS 69

4.3.1. Material vegetal 69

4.3.2. Construção dos mapas e detecção de QTLs 69

4.4. RESULTADOS 70

4.4.1. Correlação entre as características fenotípicas 70

4.4.2. Mapas genéticos e detecção de QTLs (Quantitative Trait Loci) 71

4.4.3. Detecção de QTLs para densidade básica da madeira 75

4.4.4. Detecção de QTLs para crescimento em altura 78

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4.4.5. Detecção de QTLs para diâmetro à altura do peito 81

4.4.6. Detecção de QTLs para rendimento depurado de celulose 83

4.4.7. Detecção de QTLs para teor de lignina total da madeira 86

4.4.8. Detecção de QTLs para a relação Siringil/Guaiacil 91

4.4.9. Detecção de QTLs para densidade da madeira medida pela profundidade 94 de penetração do Pilodyn.

4.4.10. Co-localização de QTLs para diferentes características 97

4.4.11. Conteúdo de genes nos intervalos de QTLs 103

4.5. DISCUSSÃO 105

4.5.1. Análise comparativa com QTLs detectados em outros estudos de 105 Eucalyptus

4.5.2. Estimativas das proporções da variação explicadas pelos QTLs 109

4.5.3. Co-localização entre QTLs mapeados para diferentes características 111

4.5.4. De QTLs para genes e seu uso no melhoramento 112

4.6. CONCLUSÃO 114

5. BIBLIOGRAFIA 115

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Procedimento de desenvolvimento de marcadores DArT. 23

Figura 2. Interpretação de dados calculado pelo programa DArTSoft mostrando a 24 diferença de intensidade entre genótipos.

Figura 3. Distribuição do número e porcentagens de marcadores DArT que 36 passaram o limiar de filtragem adotado para reprodutibilidade (≥95%), qualidade (Q≥65%) e call rate (≥75%).

Figura 4. Mapa de ligação framework DArT/microssatélites para Eucalyptus. 38

Figura 5. Alinhamento do mapa full (barras amarelas) com o mapa framework 41 (Fmwk) (barras verdes) para os 11 pseudo-cromossomos do Eucalyptus mostrando as conexões entre os mesmos locos em ambos os mapas.

Figura 6. Distribuição de frequência das distâncias de recombinação de Kosambi 42 entre marcadores consecutivos ao longo das duas versões do mapa de

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ligação.

Figura 7. Alinhamento do mapa framework com o genoma de referência de 46 Eucalyptus grandis.

Figura 8. Correspondência posicional entre marcadores DArT e modelos gênicos 52 preditos no genoma de Eucalyptus grandis.

Figura 9. Correlações entre o número de sondas DArT, marcadores DArT 53 mapeados e modelos gênicos no genoma de Eucalyptus

Figura 10. Distribuição do número e porcentagens de marcadores DArT de 54 acordo com intervalos crescentes de distância física entre o marcador DArT e o modelo gênico mais próximo no genoma de Eucalyptus.

Figura 11. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer apresentando os 77 QTLs para densidade básica da madeira mapeados por intervalo composto nos grupo de ligação 6 (A), 8 (B) e 10 (C) no genoma do parental materno G38.

Figura 12. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer apresentando os 81 três QTLs para crescimento em altura mapeados por intervalo composto nos grupos de ligação (GL) 1 (A), 2 (B) e 6 (C) no genoma do parental materno G38.

Figura 13. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os 82 QTLs para diâmetro à altura do peito (DAP) mapeados por intervalo composto nos grupos de ligação 7 (A) e 10 (B) no genoma do parental U15.

Figura 14. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os 85 QTLs para rendimento depurado de celulose mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 4 (A) e 5 (B).

Figura 15. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os 90 QTLs para teor de lignina total mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A), 3 (B), 4 (C), 5 (D) e 8 (E).

Figura 16. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os 94 QTLs para relação Siringil/Guaiacil da madeira mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A), 5 (B) e 8 (C).

Figura 17. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os 97 QTLs para penetração do Pilodyn na madeira mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A) e 2 (B).

Figura 18. Localização dos QTLs, para todas as características analisadas, nos 102

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diferentes grupos de ligação (GL) de ambos parentais (E. grandis e E. urophylla).

Figura 19. Representação do número de genes candidatos detectado na mesma 105 região do QTL de maior efeito para teor de Lignina Total mapeado no grupo de ligação 3.

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Estatísticas dos mapas consenso de DArT/microssatélites de E. grandis x E. 39 urophylla.

Tabela 2. Lista dos 45 marcadores DArT mapeados nos 11 grupos de ligação e 46 posicionados em pequenos scaffolds não ancorados na atual montagem do genoma de Eucalyptus grandis (versão 1.0 no Phytozome 6.0).

Tabela 3. Resultados da análise de redundância das 6.918 sequências das sondas DArT 48 sob quatro grupos diferentes de parâmetros de montagem, desde o mais rigoroso (A1) ao mais permissivo (A4).

Tabela 4. Estatísticas descritivas das características fenotípicas avaliadas na população 71 de mapeamento de 171 irmãos-completos.

Tabela 5. Sumário das informações dos QTLs detectados por Intervalo Composto pela 73 estratégia de pseudo-cruzamento teste.

Tabela 6. Correlação de Pearson entre características de crescimento e qualidade da 74 madeira. DAP: diâmetro à altura do peito, CA: crescimento em altura, LT: lignina total, S/G: relação Siringil/Guaiacil, RDC: rendimento depurado de celulose, DB: densidade básica, PP: penetração de pilodyn.

Tabela 7. Número de QTLs detectados para cada característica e genitor e o número de 104 modelos gênicos preditos observados nos intervalos genômicos correspondentes na versão atual do genoma de referência de Eucalyptus.

ANEXOS

ANEXO I. Cópia de artigo publicado:

Petroli CD, Sansaloni CP, Carling J, Steane DA, Vaillancourt RE, Myburg AA, Bonfim da Silva O, Pappas GJ, Kilian A, Grattapaglia D (2012) Genomic Characterization of DArT Markers Based on High-Density Linkage Analysis and Physical Mapping to the Eucalyptus Genome. PLoS ONE 7(9): e44684

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ANEXO II. Cópia de artigo publicado:

Hudson CJ, Freeman JS, Kullan ARK, Petroli CD, Sansaloni CP, Kilian A, Detering F, Grattapaglia D, Potts BM, Myburg AA, Vaillancourt RE (2012) A reference linkage map for Eucalyptus. BMC Genomics 13:240.

ANEXO III. Cópia de resumo expandido publicado:

Sansaloni CP, Petroli CD, Pappas GJ, Bonfim da Silva O, Grattapaglia D (2011) How many genes might underlie QTLs for growth and wood quality traits in Eucalyptus? BMC Proceedings 5(Suppl 7):P37.

ANEXO IV. Cópia de resumo expandido publicado:

García M, Villalba P, Acuña C, Oberschelp J, Harrand L, Surenciski M, Martínez M, Petroli CD, Sansaloni C, Faria D, Grattapaglia D, Poltri S. (2011) A genetic linkage map for a full sib population of Eucalyptus grandis using SSR, DArT, CG-SSR and EST-SSR markers. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 7):P26

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RESUMO

Diversity Arrays Technology (DArT) fornece um sistema robusto, de alto rendimento e baixo custo para a identificação de milhares de polimorfismos na sequência do DNA de indivíduos. Apesar da extensa utilização desta plataforma de genotipagem para diversas espécies de plantas, pouco se conhece sobre os atributos dos marcadores DArT do ponto de vista do conteúdo das sequências e sua distribuição em genomas de plantas. Neste trabalho foram investigadas as propriedades genômicas das 7.680 sondas do microarranjo DArT desenvolvido para Eucalyptus, por meio do seu sequenciamento e mapeamento genético e físico no genoma de referência de Eucalyptus grandis. Em seguida, o mapa genético construído foi utilizado para o mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci) para sete características quantitativas de crescimento e qualidade da madeira em Eucalyptus. Finalmente, para cada QTL identificado foi realizada uma análise preliminar do número de genes anotados na sequência do genoma de Eucalyptus incluídos no intervalo genômico correspondente. Um mapa consenso com 2.274 marcadores DArT ancorado a 210 microssatélites com uma média de distância entre marcadores consecutivos na ordem de sub-centimorgan e um mapa genético framework com 1.029 marcadores ordenados com maior suporte estatístico foram construídos. Ambos exibiram uma extensa colinearidade com a sequência do genoma quando mapeados fisicamente. O número de sequências únicas observadas para as sondas DArT foi consistente com o número de sequências DArT alinhadas em uma posição única no genoma de Euaclyptus. Com uma cobertura do 97% do genoma físico, estes marcadores demonstraram uma ampla e uniforme distribuição ao longo do genoma. Apenas 1,4 Mpb dos 85,4 Mpb das sequências de scaffolds ainda não ancorados no atual genoma de Eucalyptus foi capturado por 45 marcadores DArT geneticamente mapeados mas fisicamente não alinhados nos 11 pseudo-cromossomos de Eucalyptus, fornecendo evidência sobre a qualidade e a completude da montagem atual do genoma de Eucalyptus. A maioria das 89 sondas do microarranjo DArT que não mapearam fisicamente no genoma correspondem a sequências provavelmente ausentes em E. grandis, o que sugere um caráter pan- genômico do microarranjo DArT de Eucalyptus. Uma sobreposição significativa foi encontrada entre o posicionamento dos marcadores DArT e o espaço gênico, com 69%

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das sondas DArT mapeando dentro de modelos gênicos preditos. Uma correlação significativa foi identificada entre o número de modelos gênicos preditos e o número total de sondas DArT encontradas em todo o genoma (índice de Spearman ρ = 0,682, ρ = 3,79e-18). O mapeamento de QTLs detectou 35 QTLs para as características avaliadas, sendo que vários deles sugestivos de sintenia em nível cromossômico com QTLs detectados em estudos anteriores. Um total de 8.036 modelos gênicos preditos foi observado nos intervalos genômicos compreendidos pelos marcadores flanqueantes aos 18 QTLs mapeados no parental materno e 6.678 nos intervalos dos 17 QTLs identificados no parental paterno. Centenas desses genes poderiam ser sugeridos tentativamente como genes candidatos para as características fenotípicas avaliadas, cuja validação demandaria um esforço considerável. Em conclusão, as propriedades genômicas dos marcadores DArT levantadas neste estudo são particularmente interessantes para os investigadores que trabalham com culturas as quais já contam com microarranjos DArT mas para as quais não existe ainda um genoma de referência que permita uma caracterização detalhada. Estas propriedades são potencialmente úteis para a realização de estudos filogenéticos, de genética de populações e predição de fenótipos via seleção genômica, explorando a proximidade destes marcadores a genes.

ABSTRACT Diversity Arrays Technology (DArT) provides a robust, high throughput, cost- effective method to query thousands of sequence polymorphisms in a single assay. Despite the extensive use of this genotyping platform for numerous species, little is known regarding the sequence attributes and genome-wide distribution of DArT markers. We investigated the genomic properties of the 7,680 DArT marker probes of a Eucalyptus array, by sequencing them, constructing a high density linkage map and carrying out detailed physical mapping analyses to the Eucalyptus grandis reference genome sequence. The genetic map was used for QTL (Quantitative trait loci) mapping for seven complex growth and wood quality traits in Eucalyptus. Finally, for each QTL we preliminarily assessed the number of annotated gene models in the Eucalyptus genome found in its corresponding genomic interval delimited by flanking markers. A

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consensus linkage map with 2,274 DArT markers anchored to 210 microsatellites and a framework map, with 1,029 markers ordered with high support, displayed extensive collinearity with the genome sequence. Only 1.4 Mbp of the 75 Mbp of still unplaced scaffold sequence was captured by 45 linkage mapped but physically unaligned markers to the 11 Eucalyptus pseudochromosomes, providing compelling evidence for the quality and completeness of the current Eucalyptus genome assembly. A highly significant correspondence was found between the locations of DArT markers and predicted gene models, while most of the 89 DArT probes unaligned to the genome correspond to sequences likely absent in E. grandis, consistent with the pan-genomic feature of this multi-Eucalyptus species DArT array. DArT markers preferentially target the gene space and display a largely homogeneous distribution across the genome, thereby providing superb coverage for mapping and genome-wide applications in breeding and diversity studies. QTL mapping detected 35 QTLs, several of them syntenic to QTLs in previous studies. A total of 8,036 annotated gene models were found within the genomic interval comprised by the 18 QTLs detected in the maternal parent and 6,678 in the 17 QTLs identified in the paternal parent. Hundreds of such predicted genes could be tentatively suggested as candidates involved in trait variation, whose testing and validation would require a gigantic effort. In conclusion, the comprehensive linkage-to-physical mapping analyses reported herein, provide novel data regarding the genomic attributes of DArT markers in plant genomes in general and for Eucalyptus in particular. These results should be valuable to other species for which DArT arrays are available but not yet reference genomes. Based on the genomic characterization of the DArT probe sequences reported, phylogenies, population genetic surveys and phenotype prediction by genomic selection can now be further explored according to the gene proximity or gene content of particular markers sets.

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1. INTRODUÇÃO

O mapeamento genético permite a identificação de locos que controlam características quantitativas, chamados QTLs (Quantitative Trait Loci). A informação destes locos tem sido utilizada no melhoramento assistido de algumas espécies, bem como em estudos de sintenia, mapeamento comparativo e clonagem posicional de genes (Carneiro and Vieira 2002; Jones, Ougham et al. 2009). Em espécies de Eucalyptus, apesar do grande número de QTLs publicados para características complexas, existem limitações experimentais que dificultam a estimativa precisa da quantidade, posicionamento e magnitude dos efeitos destes locos e consequentemente sua utilização na prática do melhoramento. Entre essas limitações, tem destaque o tamanho pequeno das progênies empregadas, o que tende a superestimar a magnitude dos efeitos, o número reduzido de cruzamentos e ambientes utilizados nos experimentos e as limitações inerentes ao tipo de marcador molecular e, métodos estatísticos de detecção de QTLs (Grattapaglia, Plomion et al. 2009).

Métodos de genotipagem utilizados no mapeamento genético devem ser capazes de gerar milhares de marcadores cobrindo todo o genoma de uma forma rápida, robusta e de baixo custo. Novas tecnologias de sequenciamento e genotipagem vem sendo desenvolvidas para espécies de Eucalyptus (Novaes, Drost et al. 2008; Külheim, Yeoh et al. 2009; Grattapaglia, Silva-Junior et al. 2011; Neves, Mamani et al. 2011). Entretanto estas metodologias ainda tem um custo relativamente alto o que dificulta seu uso para a genotipagem em larga escala de grandes números de amostras. Alto rendimento, cobertura genômica alta transferibilidade de marcadores entre espécies são aspectos chave para aplicações na genética de Eucalyptus. Neste sentido, a tecnologia de genotipagem DArT (Diversity Arrays Technology) oferece marcadores moleculares com estas características (Jaccoud, Peng et al. 2001; Wenzl, Carling et al. 2004). DArT permite a identificação em paralelo de centenas a milhares de marcadores polimórficos em um experimento simples (Akbari, Wenzl et al. 2006) a custos por “data point” menores que os atuais custos de genotipagem via SNPs para um número

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similar de marcadores informativos. Esta tecnologia tem demonstrado ser eficiente para a montagem de mapas genéticos densos, assim como a identificação de QTL’s, a partir dos quais foram identificadas regiões cromossômicas ou genes associados à expressão de características quantitativas e qualitativas em plantas cultivadas como trigo, sorgo centeio e aveia, entre outras (Crossa, Burgueno et al. 2007; Pozniak, Knox et al. 2007; Lillemo, Asalf et al. 2008; Bariana, Bansal et al. 2010; Sadeque and Turner 2010; Zhang, Dong et al. 2011).

Um microarranjo de alta densidade com 7.680 marcadores DArT foi desenvolvido recentemente (Sansaloni, Petroli et al. 2010) e utilizado com sucesso para estudos filogenéticos (Steane, Nicolle et al. 2011), de mapeamento (Hudson, Freeman et al. 2012) e seleção genômica (Resende, Resende et al. 2012). Neste trabalho é apresentada uma caracterização detalhada dos 7.680 marcadores DArT que compõem este arranjo em relação a sua composição de sequência, distribuição no genoma e vizinhança a modelos gênicos preditos. Um mapa genético de alta densidade com estes marcadores foi construido permitindo assim estabelecer uma relação entre distância de recombinação e distância física em todo o genoma. Em seguida este mapa genético foi utilizado para o mapeamento de QTLs para sete características de crescimento e qualidade da madeira e uma análise preliminar realizada de genes preditos no genoma localizados nos intervalos genômicos compreendidos pelos QTLs.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. O gênero Eucalyptus

Eucalyptus L’Hérit. é um gênero que compreende mais de 700 espécies, sendo de vital importância para a indústria florestal no mundo (Brooker 2000; Poke, Vaillancourt et al. 2005). Este gênero pertence à família , sendo Symphyomyrtus seu principal subgênero, o qual está constituído por mais de 300 espécies. Dentre essas, E.grandis, E. globulus, E. urophylla, E. camaldulensis, E. saligna e E. tereticornis, são as mais utilizadas para fins comerciais (Eldridge, Davidson et al. 1994). Originário da

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Austrália e regiões próximas, esta árvore foi introduzida no Brasil na segunda metade do Século XIX (Firmino-Winckler, Wilcken et al. 2009).

A importância econômica decorre do seu rápido crescimento, da sua capacidade produtiva, da sua adaptabilidade em diversos ambientes e facilidade de manejo por plantio direto e rebrota. Porem, a diversidade de espécies deste gênero é o que torna possível atender à demanda de grande parte dos segmentos que utilizam produtos florestais (Potts 2004).

Com relação à produção de celulose, entre as espécies silviculturalmente adaptadas às condições edafoclimáticas do Brasil, destacam-se Eucalyptus grandis, E. saligna, E. globulus e híbridos de E. grandis x E. urophylla (Ferreira and Santos 1997; Vencovsky and Ramalho 2000; Gonçalves, Rezende et al. 2001). Eucalyptus dunnii pode ser considerada uma opção adequada para a produção de celulose. A madeira apresenta maior densidade básica, menor conteúdo de lignina e maior conteúdo de pentosanas com relação a E. saligna e E. grandis, permitindo desta maneira, menor consumo de madeira e reagentes durante a cocção da polpa (Ferreira, Gonzaga et al. 1997). Contudo, é importante a introgressão de alelos de outras espécies visando ampliar a base genética e também possibilitar o melhoramento para diferentes caracteres. Este é o caso de E. camaldulensis, com maior densidade de madeira e maior resistência à seca, hibridizada com clones elite interespecíficos, resultando em ganhos de volume e qualidade de madeira (Bison, Ramalho et al. 2009). A espécie E. nitens é reconhecida por ser altamente resistente a geadas e, embora suscetível à ferrugem, exibe ampla variabilidade quanto à resistência entre procedências. Isto permite a seleção de genótipos resistentes superiores, e pode ser recomendada para incorporação em programas de hibridização visando a produção de clones superiores.

2.2. Atualidade e impacto econômico do Eucalyptus no Brasil

A cultura do Eucalyptus é de grande importância econômica, ambiental e social para o Brasil. Segundo a Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF 2012), atualmente existem aproximadamente 4,9 milhões de hectares

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plantados com Eucalyptus no território nacional, com destaque para as regiões sudeste (54%), nordeste (16%) e centro-oeste (12%), sendo Minas Gerais (28,8%) e São Paulo (21%) os estados com maior superfície plantada. Esta área continua em expansão em todo o Brasil, com o intuito de suprir a demanda de madeira para produção de celulose e carvão vegetal para a indústria siderúrgica, além de outros derivados da madeira como materiais para a construção, móveis, papelão, óleos, e outros (Mora and Garcia 2000).

A utilização de florestas plantadas minimiza a pressão extrativista sobre as espécies autóctones, contribuindo assim diretamente para a conservação ambiental e de espécies nativas. Isto e a necessidade imperiosa de abastecer de madeira, tanto o mercado interno como o externo, são apontados como os fatores principais que levaram à busca de espécies de rápido crescimento e ao desenvolvimento de tecnologias apropriadas para responder às inquietudes das indústrias.

No ano 2011, as exportações brasileiras de produtos de florestas plantadas atingiram US$ 8,0 bilhões, isto significa 3,1% do total de produtos exportados pelo Brasil, um crescimento de 5,3% quando comparado com o ano 2010. A celulose é o produto de maior impacto na economia florestal, somente no ano 2011, foram exportados aproximadamente US$ 5,0 bilhões, apresentando um crescimento de 5,0% em relação ao ano anterior. O Instituto Brasileiro de Planejamento Tributário (IBPT), estimou que a contribuição tributária do setor florestal foi de R$ 7,6 bilhões no ano 2011, representando 0,51% do total arrecadado no país. Atualmente, o setor de florestas gera 4,7 milhões de empregos, incluindo empregos diretos (640,4 mil), indiretos (1,45 milhões) e empregos resultantes do efeito‑renda (2,60 milhões), o que demonstra a importância deste mercado como um grande suporte na criação de fontes de trabalho no Brasil (http://www.abraflor.org.br). Todos estes dados evidenciam a importância do Eucalyptus para a economia do país. Por tanto, existe uma necessidade clara de criar novos recursos e estratégias para atingir a máxima competitividade possível dentro do mercado mundial.

Produtividades florestais crescentes e refinamentos na qualidade dos produtos de madeira por meio de melhoramento genético tornar-se-ão cada vez mais estratégicos

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para a indústria florestal, independentemente do uso final da madeira ser para energia, fibra, celulose ou produtos estruturais de madeira sólida. Ferramentas moleculares baseadas na identificação de polimorfismos no DNA, envolvidos no controle genético de fenótipos de interesse, prometem fornecer novas oportunidades para a seleção de características de crescimento, adaptabilidade a novas condições climáticas e propriedades da madeira de árvores cultivadas (Grattapaglia, Plomion et al. 2009).

2.3. Mapeamento genético

No ano 1910 e através de cruzamentos controlados de moscas (Drosophila melanogaster), Thomas Hunt Morgan e colaboradores observaram proporções fenotípicas não coincidentes com as propostas pela segunda lei de Mendel de “segregação independente dos genes”. Sugeriu assim a presença de alguns genes agrupados num mesmo cromossomo, e a ocorrência ocasional de permutações nas quais existiria uma troca de segmentos cromossômicos entre homólogos. Segundo Morgan, essas variações nas proporções de segregantes, de algum modo, refletiam a distância linear entre dois genes em um mapa genético. Três anos depois, A.H. Sturtevant, interpretando dados oriundos da segregação de genes ligados, sugeriu o uso da porcentagem de recombinantes como indicador quantitativo da distância linear entre dois genes na construção de mapas genéticos (Coelho and Silva 2005).

Os mapas genéticos podem ser definidos como uma sequência de elementos genéticos ordenados de acordo com seus padrões de segregação. Os mapas mostravam que a posição dos genes correspondia à sua ordem linear nos cromossomos. Assim, o conceito de localização dos genes em uma ordem linear passou a ser incorporado à “Teoria Cromossômica da Herança”, a qual foi criada no começo do século XX por W. S. Sutton e T. Boveri (Gardner and Snustad 1986). A transmissão, dos parentais para a progênie, dos marcadores moleculares que estão ligados no mesmo cromossomo é que determina a ordem dos marcadores ao longo do cromossomo. Em geral, quanto mais próximos os marcadores, menor será a possibilidade de ocorrer uma recombinação, logo, esses marcadores segregarão

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juntos; ou quanto mais distantes estiverem os marcadores, maior a chance de ocorrer um crossing-over (Paterson 1996). A prova definitiva da associação entre mapas de ligação e cromossomos veio em 1931 com os estudos realizados por Creighton e McClintock em cromossomos de milho, demonstrando que o crossing-over é resultado de troca entre segmentos cromossômicos (Creighton and McClintock 1931).

Os primeiros mapas genéticos em plantas foram construídos com base em marcadores morfológicos e citológicos, principalmente, nas culturas de milho, tomate e ervilha. Características de herança discreta, cujas classes são facilmente distinguíveis, como nanismo, deficiência de clorofila, cor das pétalas e morfologia foliar foram usadas como marcadores fenotípicos. Entretanto, a disponibilidade de marcadores morfológicos é restrita.

Com o surgimento de marcadores isoenzimáticos, na década de 60, foi possível a construção de mapas para várias espécies. Sem embargo, o número de marcadores dificilmente passava de 30, o que não permitia uma ampla cobertura genômica. O surgimento de marcadores moleculares de DNA, na década de 80, permitiu a saturação de mapas já existentes e, até mesmo, a construção de mapas para espécies de plantas e animais para os quais os estudos de herança eram restritos (Carneiro and Vieira 2002; Coelho and Silva 2005; Pereira and Pereira 2006). Também, se tornaram possíveis a identificação, localização e medição da magnitude do efeito de genes envolvidos no controle de características monogênicas ou quantitativas (Ferreira and Grattapaglia 1998). O número de indivíduos genotipados estabelece o nível máximo de resolução que pode ser alcançado com um número ilimitado de marcadores no mapa genético. Assim frequências de recombinação abaixo de 10% apenas podem ser obtidas pela avaliação de mais de dez gametas passíveis de recombinação e, portanto, informativos (Coelho 2000).

A construção de mapas genéticos baseia-se na existência de desequilíbrio de ligação (DL), que é definido como desvios das frequências haplotípicas observadas, em relação às frequências esperadas sob a hipótese de independência dos locos considerados (Coelho and Silva 2002). Fatores como migração e seleção podem ser responsáveis pela segregação conjunta de segmentos genômicos, causando o DL em

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consequência. Por isso, para a construção de mapas genéticos é necessário o desenvolvimento de populações de mapeamento. Nesse caso, o desequilíbrio de ligação é provocado, basicamente, pela ligação física entre os locos. Os indivíduos utilizados na formação dessas populações devem ser contrastantes para as características de interesse, além de possuírem uma distância genética suficiente para a identificação de marcadores polimórficos, possibilitando a construção do mapa. O tamanho das populações de mapeamento em plantas varia, de maneira geral, entre 50 e 250 indivíduos, mas populações maiores são necessárias para mapeamento de alta resolução (Mohan, Nair et al. 1997; Collard, Jahufer et al. 2005). Diferentes tipos de populações podem ser utilizados para a construção de mapas, sendo as mais comuns as obtidas por retrocruzamentos, populações F2, Linhagens Puras Recombinantes (RILs – “Recombinant Inbred Lines”), linhagens duplo-haploides e, no caso de espécies de fecundação cruzada, cruzamentos entre indivíduos heterozigotos (Ferreira and Grattapaglia 1998; Coelho 2000; Collard, Jahufer et al. 2005).

O uso de mapeamento para estudos comparativos ou de sintenia colabora com o entendimento sobre a evolução dos genomas. Mapas genéticos são úteis para comparar as estruturas genômicas das diferentes espécies, observando a homologia dos genes, conservação da distância e a ordem de ligação nos cromossomos; também como um meio de obtenção de mapa único de referência (Carneiro and Vieira 2002).

2.4. Análise de QTLs (Quantitative Trait Loci)

Com o desenvolvimento das teorias de genética quantitativa (Fisher 1918), reconheceu-se que os caracteres complexos ou quantitativos são controlados pelos mesmos fatores hereditários descritos por Mendel. Vários desses fatores, cada um contribuindo com uma pequena parcela, estão envolvidos na expressão do caráter. Apesar da dificuldade de identificar os locos responsáveis pelas características quantitativas, foi Karl Sax (Sax 1923), quem encontrou uma associação direta entre o tamanho das sementes (característica complexa) e sua coloração (característica monogênica) em populações F2 de feijão. Este tipo de associação entre marcadores morfológicos e locos que controlam caracteres quantitativos foi reportado para vários

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caracteres, mas as análises dependiam, exclusivamente, da suficiente quantidade de marcadores morfológicos que permita uma razoável cobertura do genoma.

Com o advento das diversas classes de marcadores moleculares, tornou-se possível a busca de regiões do genoma responsáveis por parte da variabilidade fenotípica em qualquer espécie de interesse (Tanksley 1993). O cálculo das frequências de recombinação e o ordenamento dos marcadores possibilitou a obtenção de estimativas mais acuradas da localização e do efeito dos QTLs em estratégias de mapeamento por intervalo (Lander and Botstein 1989; Haley and Knott 1992). Neste método estatístico, a informação dos genótipos de ambos os marcadores que flanqueiam um intervalo são tomadas simultaneamente. A análise estatística progrediu com a proposição do mapeamento por intervalo composto (Jansen 1993; Zeng 1993; Zeng 1994), em que marcadores sabidamente relacionados aos QTLs são incluídos como variáveis independentes no modelo de regressão múltipla, diminuindo a variância residual e, com isso, aumentando o poder do teste.

Estas análises permitem, em princípio, obter estimativas do número mínimo de locos envolvidos no controle dos caracteres, o posicionamento ou localização desses locos dentro do genoma, a quantificação das suas contribuições para a variação fenotípica e a avaliação dos seus efeitos em diferentes ambientes e genótipos. Entretanto, apesar de dezenas ou mesmo centenas de QTLs terem sido detectados em diversos estudos, a informação gerada não tem sido imediatamente útil para a seleção assistida no melhoramento de Eucalyptus. As razões para isso incluem a proporção limitada da variação explicada pelos QTLs e a magnitude superestimada dos seus efeitos, além do comportamento imprevisível da interação entre QTLs e diferentes background genéticos, diferentes locais e diferentes idades (Grattapaglia, Ribeiro et al. 2004; Grattapaglia and Kirst 2008; Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Grattapaglia and Resende 2011).

2.5. Melhoramento genético de Eucalyptus

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O melhoramento genético das espécies sobre as quais a indústria florestal vem centrando seus esforços nas últimas décadas, o qual tem colaborado de uma maneira considerável para o aumento da produtividade e qualidade dos produtos florestais. Várias são as características que o melhoramento florestal pretende atingir, entre elas, incremento no crescimento e na produtividade, alterações das propriedades químicas e físicas da madeira, resistência a doenças, tolerância a estresse abiótico, melhoria da capacidade fotossintética, dos caracteres fisiológicos, uso em biorremediação, produção de compostos farmacêuticos e alterações na arquitetura da árvore. Com esse fim, são utilizadas diversas estratégias de melhoramento florestal, tanto por meio do uso de técnicas clássicas, e, mais recentemente, com o uso da biotecnologia.

A possibilidade de prever ganhos é considerada uma das maiores contribuições para o melhoramento. Os materiais genéticos utilizados no setor florestal apresentam, de modo geral, grande variabilidade genética (Paula, Pires et al. 2002). Isto é de grande importância se consideramos que é nessa variabilidade genética que temos a base para tentar prever ganhos que possam melhorar a produtividade no setor. Com este objetivo é que são realizados diferentes programas de seleção de indivíduos superiores, no intuito de melhorar a produção de matéria prima para as diferentes indústrias. Porém, a seleção individual com altas intensidades é uma estratégia arriscada num programa de melhoramento genético, a redução no tamanho efetivo da população pode levar à endogamia e perda de vigor (Oda, Menck et al. 1989). Por este motivo, é de fundamental interesse utilizar métodos elaborados de melhoramento e critérios de seleção. De forma geral, um bom programa de melhoramento genético deve permitir a manutenção da variabilidade em longo prazo, tão grande quanto possível, sacrificando minimamente os resultados de curto prazo (Matheson 1990).

As espécies perenes possuem características que comprometem o sucesso de programas de melhoramento genético que dependam de técnicas clássicas. Existe uma série de obstáculos que dificultam a implementação de programas de melhoramento em espécies florestais (Strauss, Lande et al. 1992). Fatores como sobreposição de gerações, dificuldades de controle nos processos de polinização e fecundação, e complexidade na análise fenotípica dos descendentes. O grande período necessário para atingir o ciclo reprodutivo, a reprodução sexuada e assexuada, a expressão de

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caracteres ao longo de várias idades, a necessidade de grandes áreas de plantio, dentre outros, também dificultam a execução de técnicas clássicas de melhoramento (Tzfira, Zuker et al. 1998; Resende 2001). A depressão endogâmica é também um fator importantíssimo, que torna impraticável a criação de linhagens endogâmicas. Além dos problemas técnico-práticos, é necessário considerar as questões de caráter financeiro. Em programas de melhoramento florestal, independentemente da espécie, os cruzamentos controlados são geralmente caros, consomem tempo e exigem pessoal treinado e área para a realização dos mesmos.

No Brasil, o melhoramento genético do Eucalyptus alcançou enorme sucesso e contribuiu para o expressivo aumento da produtividade de celulose e carvão. Entretanto, para se continuar obtendo resultados adicionais no melhoramento genético é preciso utilizar novas estratégias (Gonçalves, Rezende et al. 2001). A biotecnologia pode ser utilizada para obtenção de ganhos em produtividade, qualidade e sustentabilidade. Tais técnicas passarão, cada vez mais, a integrar as rotinas dos programas de melhoramento, acelerando o alcance de resultados (Golle, Reiniger et al. 2009). Entre as várias ferramentas da biotecnologia, metodologias de marcadores moleculares têm sido desenvolvidas para a análise da diversidade genética.

2.6. Desenvolvimento de marcadores moleculares em Eucalyptus

Um marcador genético representa a variação num sítio particular do genoma, o qual é herdado de maneira Mendeliana, é fácil de identificar e pode ser acompanhado através das gerações. Existem três tipos de marcadores que podem ser empregados: morfológicos (fenotípicos), bioquímicos (proteínas e isoenzimas) e moleculares (baseados no DNA). A decisão sobre qual sistema de marcadores é o mais apropriado para ser usado depende da espécie, do objetivo do trabalho e dos recursos disponíveis. Marcadores genéticos vêm sendo utilizados em Eucalyptus desde os anos 80, quando isoenzimas permitiram realizar os primeiros estudos de sistemas de cruzamento em pomares de sementes e produzir as primeiras versões de mapas genéticos de coníferas (Moran and Bell 1983), além de investigações sobre relacionamentos filogenéticos entre espécies próximas em angiospermas (Burgess and Bell 1983). Desde então, a

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análise genética de Eucalyptus progrediu, essencialmente, em razão do desenvolvimento de novas técnicas moleculares, principalmente, pela característica que os marcadores moleculares apresentam de não sofrerem influência ambiental, ao contrário de marcadores morfológicos e citológicos.

Marcadores moleculares foram utilizados para responder questões evolutivas, descrever a estrutura genética de populações naturais e otimizar o gerenciamento e o avanço de populações de melhoramento de espécies de Eucalyptus. No final dos anos 80 e início dos anos 90, começou-se a utilizar marcadores moleculares gerados com base em fragmentos genômicos produzidos a partir do corte com enzimas de restrição denominados RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Devey, Jermstad et al. 1991; Steane, West et al. 1992; Sale, Potts et al. 1993; Byrne, Murrell et al. 1995). Estes foram seguidos por métodos que utilizam a amplificação de fragmentos de DNA via PCR (Polymerase Chain Reaction). Surgiram assim os marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), produzidos pela amplificação aleatória de fragmentos polimórficos de DNA (Carlson, Tulsieram et al. 1991; Grattapaglia, Wilcox et al. 1991; Grattapaglia and Sederoff 1994; Nesbitt, B.M. Potts et al. 1995), os AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) amplificando seletivamente um subgrupo de fragmentos genômicos gerados com enzimas de restrição (Vos, Hogers et al. 1995; Gaiotto, Bramucci et al. 1997; Marques, Araújo et al. 1998) e os microssatélites (Condit and Hubbell 1991; Byrne, Marquezgarcia et al. 1996; Brondani, Brondani et al. 1998), que são marcadores caracterizados pela amplificação de fragmentos de DNA de um a sete pares de bases repetidos em tandem e que frequentemente se encontram de forma abundante através do genoma de plantas.

No começo do século XXI, o grande destaque no estudo da diversidade genética em espécies florestais foi para o uso de polimorfismos de nucleotídeos únicos ou SNP (Single Nucleotide Polymorphism), vindos da análise de sequência (Brown, Gill et al. 2004; Gonzalez-Martinez, Ersoz et al. 2006; Novaes, Drost et al. 2008; Grattapaglia, Silva-Junior et al. 2011). Recentemente, a avaliação de polimorfismos de sequência, incluindo SNPs e indels tem sido feita em Eucalyptus através do método DArT (Diversity Arrays Technology) (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Esta técnica é baseada na

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hibridização de representações genômicas de complexidade reduzida dispostas em microarranjos (Jaccoud, Peng et al. 2001).

2.7. Estudos de genética de populações e evolução em Eucalyptus

Um variado número de marcadores moleculares vem sendo utilizado para responder diversas questões evolutivas em diferentes níveis taxonômicos no gênero Eucalyptus. Uma revisão recente detalhou as várias aplicações (Grattapaglia, Vaillancourt et al. 2012). Investigações foram conduzidas sobre o relacionamento entre subgêneros (Steane, Nicolle et al. 2002; Whittock 2003) ou espécies (Nesbitt, B.M. Potts et al. 1995; Butcher, Otero et al. 2002; Elliott and Byrne 2004; McKinnon, Vaillancourt et al. 2008), em estudos filogeográficos (Jackson, Steane et al. 1999; Byrne and Hines 2004) e para a descrição da estrutura genética de populações naturais (Steane, Conod et al. 2006; Butcher, McDonald et al. 2009). Marcadores RAPD e microssatélites foram utilizados para discriminar genótipos individuais (Keil and Griffin 1994; Rocha, Abad et al. 2002), estes últimos têm sido também empregados em testes de parentesco (Kirst, Cordeiro et al. 2005; Jones, Shepherd et al. 2008). Análises de variabilidade genética em pomares de sementes foram realizadas através de informações obtidas com a combinação de marcadores AFLP e microssatélites (Marcucci Poltri, Zelener et al. 2003). Métodos de sequenciamento de DNA utilizados para genotipagem de SNPs têm auxiliado na identificação do relacionamento filogenético existente entre E. nitens e E. globulus (Külheim, Yeoh et al. 2009) e, recentemente, marcadores DArT foram utilizados para diferenciar espécies, identificar híbridos interespecíficos e resolver disjunções biogeográficas entre espécies (Steane, Nicolle et al. 2011). Este último trabalho foi realizado com 94 espécies e os resultados revelaram um poder de resolução muito elevado.

2.8. Desenvolvimento de mapas genéticos em Eucalyptus

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Mapas de ligação são ferramentas úteis para os melhoristas que desejam incluir o uso de marcadores moleculares em programas de melhoramento (Staub, Serquen et al. 1996). Mapas genéticos foram desenvolvidos para diversas espécies florestais com o objetivo de localizar QTLs e prover as potenciais bases para a Seleção Assistida por Marcadores (Marker Associated Selected - MAS), em Pinus (Groover, Devey et al. 1994), Populus (Bradshaw and Stettler 1995) e Eucalyptus (Grattapaglia and Sederoff 1994; Byrne, Murrell et al. 1997).

A principal estratégia utilizada para produzir os primeiros mapas de ligação em Eucalyptus foi a de pseudo-cruzamento teste (Grattapaglia and Sederoff 1994), onde os marcadores segregantes são analisados separadamente para cada parental. Este método inclui o cruzamento de indivíduos heterozigotos e a geração de híbridos que, frequentemente, demonstram uma combinação das características favoráveis das espécies parentais. Dentro do subgênero, a hibridização tem mostrado ser um fenômeno relativamente comum entre espécies, embora isto não ocorra entre subgêneros distintos (Griffin, Burgess et al. 1988).

Os primeiros mapas de Eucalyptus foram construídos com centenas de marcadores dominantes, como RAPD (Grattapaglia and Sederoff 1994; Verhaegen and Plomion 1996; Bundock, Hayden et al. 2000) e AFLP (Marques, Araújo et al. 1998; Remington, Whetten et al. 1999). Marcadores mais informativos e transferíveis entre as diferentes espécies foram utilizados em seguida. Assim, os RFLP e microssatélites foram utilizados no desenvolvimento de mapas genéticos, com densidade equivalente porém maior conteúdo informativo e transferibilidade entre pedigrees (Byrne, Murrell et al. 1995; Bundock, Hayden et al. 2000; Gion, Rech et al. 2000; Brondani, Brondani et al. 2002; Thamarus, Groom et al. 2002; Brondani, Williams et al. 2006). Mais recentemente, um painel de marcadores SNPs combinado com microssatélites foi utilizado na construção de um mapa genético consenso incluindo dois pedigrees não relacionados (Lima, Silva- Junior et al. 2011) e mapas genéticos com alguns milhares de marcadores DArT foram construídos (Hudson, Kullan et al. 2011; Hudson, Freeman et al. 2012), incluindo mapas derivados da presente tese (Petroli, Sansaloni et al. 2012).

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2.9. Identificação de QTLs em Eucalyptus

O mapeamento de QTLs em Eucalyptus tem encontrado, invariavelmente, locos de maior efeito para todas as características consideradas, apesar da precisão experimental limitada, a falta de um pré-desenho dos pedigrees que maximize a segregação fenotípica, e as populações de mapeamento limitadas. O sucesso na detecção de QTLs de maior efeito pode ser explicado pela natureza selvagem e a ampla heterogeneidade genética apresentada pelo gênero (Grattapaglia and Kirst 2008). QTLs para características juvenis, como a altura das plântulas, área foliar e tolerância de mudas a geadas foram mapeados em E. nitens (Byrne, Murrell et al. 1997; Byrne, Murrell et al. 1997). Também têm sido revelados QTLs que regulam elementos relacionados com habilidade de propagação vegetativa em E. tereticornis e E. globulus (Marques, Vasques-Kool et al. 1999), assim como em híbridos E. grandis x E. urophylla (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1995) e E. tereticornis x E. globulus (Marques, Carocha et al. 2005). Foram identificados QTLs para florescimento precoce em híbridos E. urophylla x E. grandis e em E. globulus (Missiaggia 2005; Bundock, Potts et al. 2008). QTLs para resistência a insetos foram mapeados numa população híbrida (Shepherd, Chaparro et al. 1999), e para a produção de óleos essenciais e terpenos em uma população composta unicamente por indivíduos E. nitens (Henery, Moran et al. 2007). QTLs de efeito maior para resistência a ferrugem provocado por Puccinia psidii foram mapeados e validados em diversos pedigrees de E. grandis (Junghans, Alfenas et al. 2003; Mamani, Bueno et al. 2010; Alves, Rosado et al. 2011) e dois QTLs de resistência a Mycosphaerella em E. globulus, (Freeman, O’Reilly-Wapstra et al. 2008), evidenciando um controle possivelmente mais simples da resistência a estas doenças provocadas por fungos em Eucalyptus.

QTLs para características de crescimento e qualidade da madeira foram mapeados em diversos trabalhos em diferentes espécies de Eucalyptus. Os primeiros QTLs foram publicados para crescimento em volume e densidade básica da madeira em E. grandis (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1996) e E. grandis x E. urophylla (Verhaegen, Plomion et al. 1997). Em seguida QTLs foram descritos para E. globulus (Moran, Thamarus et al. 2002; Thamarus, Groom et al. 2004; Freeman, Whittock et al. 2009) e E. nitens(Thumma, Baltunis et al. 2010). QTLs e genes candidatos para caracteres de

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propriedade da madeira foram mapeados em grupos de ligação (GL) equivalentes. Isto foi observado inclusive em espécies diferentes, com número diferente de QTLs, mas em muitas oportunidades, conservando a posição (Bundock, Potts et al. 2008; Freeman, Whittock et al. 2009; Thumma, Baltunis et al. 2010; Gion, Carouche et al. 2011). O agrupamento de QTLs para diferentes características na mesma posição pode refletir as altas correlações fenotípicas observadas entre as características sugerindo a existência de genes pleiotrópicos. Por exemplo, a concentração de celulose foi positivamente correlacionada com o rendimento de polpa e negativamente com extrativos, da mesma forma como a produção de boa qualidade da polpa está ligada a altos níveis de celulose e baixos de extrativos e lignina (Thumma, Baltunis et al. 2010). Existe também uma relação positiva entre o ângulo da microfibrila e a concentração de lignina (Gindl and Teischinger 2002; Hori, Suzuki et al. 2003; Gindl, Gupta et al. 2004; Thumma, Baltunis et al. 2010), fato acompanhado por um agrupamento dos QTLs que determinam estes caracteres. Em 2005 um estudo de genética de associação demonstrou a existência de polimorfismos (25 SNPs) em um gene envolvido na via de biossíntese da lignina (CCR - Cinnamoyl CoA reductase) afetando o desenvolvimento de microfibrilas em uma população de E. nitens (Thumma, Nolan et al. 2005). Cinco anos depois, o mesmo gene foi co-localizado também com um QTL que determina o ângulo da microfibrila no grupo de ligação 10 numa população da mesma espécie (Thumma, Baltunis et al. 2010).

Comparações diretas do número e dos efeitos de QTLs entre diferentes estudos são complicados, pois diferentes estudos utilizam diferentes desenhos experimentais, marcadores e técnicas de análise (Freeman, Whittock et al. 2009). Mesmo utilizando marcadores altamente transferíveis entre espécies, devido aos poucos marcadores em comum entre os mapas de ligação publicados para Eucalyptus, na maioria dos casos, a resolução é insuficiente para determinar a homologia de QTLs entre diferentes estudos além do nível de grupo de ligação. Diferenças na posição do QTL e do gene candidato, poderiam sugerir a existência de genes ainda não mapeados e com efeitos significativos sobre a característica. Estudos de QTLs são limitados pelo fato de tipicamente envolverem apenas uma ou poucas famílias segregantes e um número restrito de marcadores. Como resultado, somente um pequeno número de QTLs pode

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ser detectado, e, além disso, seus efeitos são fortemente superestimados devido ao conhecido efeito "Beavis" (Beavis 1998; Xu 2003).

A análise de QTLs em Eucalyptus tem sido conduzida com base em pedigrees simples utilizando mapas de ligação. Um dos principais obstáculos para o uso de dados de QTLs no melhoramento é a falta de representação de multiplos “backgrounds” genéticos. Um número crescente de experimentos de mapeamento de QTLs em Eucalyptus vem sendo publicado utilizando múltiplas famílias. Invariavelmente tem sido encontrada uma ampla interação entre QTLs em diferentes backgrounds genéticos com alguns QTLs mais estáveis, ou seja, detectados em diversas famílias, e outros mais específicos (Thamarus, Groom et al. 2004; Freeman, Potts et al. 2013). Embora existam QTLs sintenicos e colineares entre diferentes pedigrees de Eucalyptus, a especificidade de muitos deles para famílias e sítios específicos reforça a importância de considerar que os efeitos próprios da configuração genética e do sítio poderiam complicar a aplicação de seleção assistida por marcadores.

QTLs mais estáveis em diferentes “backgrounds” genéticos e em uma variedade de ambientes poderão, entretanto, ser os principais alvos de técnicas de mapeamento de alta resolução e potencial clonagem posicional mediante o uso do genoma de Eucalyptus grandis, recentemente sequenciado (http://www.phytozome.net/cgi- bin/gbrowse/Eucalyptus/). Para isso, entretanto, é necessária uma redução considerável do tamanho dos intervalos de recombinação associados aos QTLs para regiões relativamente pequenas do genoma da ordem de apenas algumas centenas de milhares de pares de bases. Com este objetivo, deverão ser desenvolvidos mapas de ligação de altíssima densidade com milhares de marcadores genotipados em progênies segregantes de milhares de indivíduos, de forma a amostrar um grande número de eventos de recombinação. Além disso, a fenotipagem desses indivíduos deverá ter alta precisão de forma a permitir uma categorização clara nas diferentes classes fenotípicas. Esta abordagem tem sido possível para QTLs de alta penetrância, em geral mapeados para características de alta herdabilidade em espécies modelo como Arabidopsis ou em culturas altamente domesticadas como arroz, trigo e tomate para as quais são disponíveis populações de linhagens puras recombinantes e/ou linhagens quase isogênicas (Sugimoto, Takeuchi et al. 2010; Bailey, Cevik et al. 2011). Em

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Eucalyptus, entretanto, estas condições não foram satisfeitas, o que torna a clonagem posicional de QTLs um desafio técnico enorme.

2.10. Marcadores DArT (Diversity Arrays Technology)

Apesar de todos os desenvolvimentos recentes, existe uma necessidade de tecnologias que permitam genotipar polimorfismos de sequência em paralelo e em larga escala, ou seja, grandes números de amostras a custos muito reduzidos por genótipo e com elevada robustez analítica. No caso de plantas cultivadas, tecnologias que consolidem todos estes atributos teriam diversas aplicações imediatas e permitiriam a efetiva integração de tecnologias genômicas em procedimentos operacionais de melhoramento genético, estudos de diversidade e distância genética, introgressão de alta precisão de segmentos genômicos, mapeamento genético de alta resolução e genética de associação.

A metodologia DArT (Diversity Arrays Technology) foi desenvolvida para atender várias das limitações de outros métodos. Descrita dez anos atrás (Jaccoud, Peng et al. 2001), apresenta uma série de vantagens que complementam com eficiência as metodologias de análise de polimorfismo ora em utilização, tais como microssatélites, AFLP e SNP. A metodologia DArT envolve tres etapas: 1) Construção de uma biblioteca (representação genômica), a qual reune o DNA genômico total de um grupo de diversos indivíduos que representem o germoplasma de interesse. Este DNA é submetido a um processo de redução da complexidade por meio de corte com enzimas de restrição, as quais reconhecem e cortam preferencialmente em regiões hipometiladas do DNA. As representações genômicas obtidas a partir do pool de DNA são clonadas, criando bibliotecas de insertos individuais, os quais são imobilizados sobre um microarranjo geralmente denominado de "descoberta", pois tem por objetivo permitir a seleção de fragmentos que revelem polimorfismo de sequência. 2) Genotipagem das amostras, na qual o DNA das amostras individuais de estudo ou targets e suas replicas (30%) é cortado com a mesma combinaçao de enzimas de restrição, com o objetivo de gerar a mesma redução de complexidade utilizada anteriormente para o desenvolvimento das bibliotecas, posteriormente os fragmentos

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obtidos são amplificados via PCR. As replicadas são geradas para poder estabelecer o nível de reprodutibilidade do experimento por meio da homologia dos dados. Os fragmentos são marcados com fluorescência, hibridizados sobre o arranjo de descoberta e submetidos num processo de lavagem para, finalmente, serem escaneados para a detecção dos sinais fluorescentes (Figura 1). 3) Análise de dados, os fragmentos polimórficos detectados mostram sinais de hibridização variáveis entre diferentes indivíduos. Quando a relação de sinal target/referência é similar em todos os slides, os fragmentos são considerados monomórficos, enquanto que se dois clusters (alelos) são distinguidos e a variância da intensidade relativa entre eles é de pelo menos 80% da variância total, os clones são considerados polimórficos e genotipados de forma binaria como “0” ou “1”. A capacidade do software de posicionar o sinal em um dos clusters (0 ou 1) é medida pela qualidade do marcador (Q) (Figura 1). Quando a diferencia da intensidade do sinal não é suficiente para poder posicionar os clones dentro de um dos dois cluster, estes são considerados como dados faltantes. A porcentagem de genótipos que são chamados de “0” ou “1” para cada clone em todos os targets é representado pelo parâmetro Call Rate (Sansaloni et al., 2010). Estas etapas da técnica estão padronizadas, embora possam precisar de pequenas modificações dependendo da espécie alvo.

O método baseia-se na hibridização de DNA com sondas relativamente longas (300-500 pb) derivadas de regiões de baixo número de cópias. A metodologia DArT, normalmente, fornece sinal consistente mesmo entre espécies relacionadas, um recurso especialmente valioso em Eucalyptus. Os clones de DNA que compõem o arranjo podem ser sequenciados e as sequências compartilhadas e usadas como marcadores âncoras robustos para mapeamentos de QTL comparativos ou para explorar o genoma referência em projetos de clonagem posicional. DArT fornece uma plataforma de genotipagem padronizada de alto rendimento através de milhares de marcadores, milhares de amostras podem ser facilmente testadas em paralelo.

A tecnologia DArT vem sendo amplamente utilizada nos últimos anos em mais de 60 espécies de plantas, incluindo espécies florestais como Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al. 2010) e Pinus (Alves-Freitas, Kilian et al. 2010). Devido aos diferentes aperfeiçoamentos na robustez e reprodutibilidade, esta técnica tem se revelado

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altamente interessante para diversas aplicações, desde a análise de variabilidade genética em populações, mapeamento genético de alta densidade e em apoio a projetos de montagem de genomas. Entretanto, a maior vantagem desta classe de marcadores é a rapidez de genotipagem e o custo reduzido por genótipo (data point), o que torna esta tecnologia útil para a efetiva aplicação em procedimentos operacionais de seleção assistida por marcadores.

O primeiro microarranjo de genotipagem DArT para Eucalyptus com 7.680 marcadores foi desenvolvido, demonstrando seu potencial para a análise da diversidade e estudos de mapeamento de ligação em espécies do gênero (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Recentemente, o microarranjo DArT para Eucalyptus tem demonstrado ser muito útil na diferenciação de espécies, identificação de híbridos interespecíficos e resolução de disjunções biogeográficas entre espécies (Steane, Nicolle et al. 2011). Este mesmo microarranjo já foi utilizado na construção de alguns mapas genéticos, demonstrando um alto grau de sintenia e colinearidade entre populações de Eucalyptus (Hudson, Kullan et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012).

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Figura 1: Procedimento de desenvolvimento de marcadores DArT. Na primeira etapa é construída a biblioteca genômica posteriormente impressa no microarranjo. Na segunda etapa, a progênie de uma população segregante ou indivíduos para estudos de diversidade são genotipados por meio da hibridação da representação genômica (i.e. amostra tecnicamente denominada “target” na metodologia DArT) sobre os slides (i.e. microarranjo). Software específico identifica clones polimórficos que são marcados como presente (1) ou ausente (0) na representação genômica.

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1.5 polimórfico 1 Aceito 0.5 1

) 0 0 Rejeito -0.5 Probabilidade de cada clone referência 0 1 0 1

da -1 individual Q = 95% pertencer a um

sinal cluster

1 monomórfico

do do target/ Aplicação de 0.5 parâmetros sinal ( de qualidade 0 log para filtrar -0.5 clones

-1 Q = 50% -1.5 -1.5 -0.5 0.5 1.5 log (target/ref.)

Figura 2. Interpretação de dados calculado pelo programa DArTSoft mostrando a diferença de intensidade entre genótipos. À esquerda, os gráficos mostram o log (sinal do taget/sinal da referência), quanto maior é a diferença de intensidade entre clusters (Q=95%), maior é o polimorfismo dos marcadores. Se a intensidade é homogênea (Q<50%), os marcadores são monomórficos. À direita está exemplificada a diferença de intensidades entre amostras representadas como ausência (0) e presença (1).

3. CAPÍTULO 1

CARACTERIZAÇÃO GENÔMICA DE MARCADORES DArT BASEADA NA ANÁLISE DE MAPEAMENTO GENÉTICO E FÍSICO NO GENOMA DE Eucalyptus

3.1. INTRODUÇÃO

Tecnologias de marcadores de DNA para genotipagem de alto desempenho e custos acessíveis, tornaram-se indispensáveis na caixa de ferramentas do geneticista

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de plantas. Uma grande variedade de métodos para detectar polimorfismos de sequência de DNA entre plantas individuais foi desenvolvida e usada amplamente nos últimos 25 anos. Apesar da hibridação baseada em DNA ter inaugurado esta jornada com marcadores RFLP (Tanksley, Young et al. 1989), os métodos baseados em PCR (Williams, Kubelik et al. 1990; Vos, Hogers et al. 1995) foram os responsáveis pela remoção das barreiras que impediam o acesso à análise genômica de plantas para um grande número de espécies, incluindo culturas órfãs e muitas espécies florestais. A maioria dos métodos de marcadores moleculares baseados em PCR, no entanto, possuem baixo desempenho, e, por conseguinte, são muito demorados e economicamente de alto custo, para aplicações que requerem a genotipagem de milhares de amostras, para centenas de marcadores dentro de orçamentos modestos. Apesar de plataformas de SNP terem sido desenvolvidas para um número crescente de espécies vegetais (Ganal, Altmann et al. 2009), elas ainda permanecem em grande parte limitadas para as principais culturas e, seus custos por amostra, são inacessíveis para a maioria dos programas de melhoramento e de conservação de germoplasma de plantas.

Diversity Arrays Technology (DArT), foi descrito há mais de uma década (Jaccoud, Peng et al. 2001) e tem experimentado um interesse crescente nos últimos anos como um método robusto, de alta transferibilidade, capaz de detectar milhares de polimorfismos de presença/ausência que cobrem todo o genoma em um único experimento e a custos muito reduzidos. Embora exista uma propriedade intelectual, esta técnica é livremente licenciada sob um modelo “open-source” (Kilian 2009), uma condição que tem estimulado o desenvolvimento de microarranjos de genotipagem para mais de 60 organismos, incluindo muitas culturas menos privilegiadas (Wenzl, Carling et al. 2004; Xia, Peng et al. 2005; James, Schneider et al. 2008; Mantovani, Maccaferri et al. 2008; Bolibok-Bragoszewska, Heller-Uszynska et al. 2009; Tinker, Kilian et al. 2009; Hippolyte, Bakry et al. 2010; Bartos, Sandve et al. 2011; Howard, Whittock et al. 2011; Milczarski, Bolibok-Bragoszewska et al. 2011; Reddy, Rong et al. 2011; Supriya, Senthilvel et al. 2011; Yang, Saxena et al. 2011; Belaj, Dominguez-Garcia et al. 2012; Van Schalkwyk, Wenzl et al. 2012). DArT envolve o isolamento e clonagem de um conjunto aleatório de fragmentos de DNA produzidos a partir da redução de

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complexidade genômica de uma, ou um conjunto de amostras de DNA, de vários acessos de germoplasma, de modo que uma coleção representativa de sequências genômicas variáveis de uma ou mais espécies-alvo é capturada. Vários milhares destes clones de DNA são dispostos sobre uma lâmina de vidro e hibridizados com o produto de PCR de uma amostra submetida ao mesmo processo de redução da complexidade genômica que a biblioteca de clones. Sendo um método baseado na hibridação DNA- DNA e utilizando sondas relativamente longas (300-500 pb), DArT fornece um sinal alto e consistente, mesmo para espécies relacionadas (Steane, Nicolle et al. 2011).

Apesar da ampla utilização desta plataforma de genotipagem para muitas espécies de plantas, pouco se sabe sobre os atributos das sondas genômicas do microarranjo DArT que geram os vários milhares de marcadores genotipados. Com exceção de um estudo em aveia, e as recentes pesquisas em pequena escala de algumas centenas de sequências das sondas DArT em tomate (Van Schalkwyk, Wenzl et al. 2012) e maçã (Schouten, Weg et al. 2012), microarranjos DArT completos ainda não foram examinados em nível de sequência para uma melhor compreensão da redundância, cobertura do genoma e conteúdo gênico. Além disso, não há informação disponível sobre a distribuição de marcadores DArT ao longo do genoma, principalmente pela ausência de um genoma de referência disponível para a maioria das espécies para as quais esta tecnologia tem sido utilizada.

Recentemente foi desenvolvido um microarranjo de genotipagem DArT de alta densidade com 7.680 sondas selecionadas a partir de uma ampla representação de 64 espécies de Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Uma característica particularmente notável desta ferramenta de genotipagem baseada em hibridização tem sido a sua transferibilidade entre as diferentes espécies do gênero, um atributo dificilmente oferecido por microssatélites ou SNPs (Grattapaglia, Silva-Junior et al. 2011). DArT tem proporcionado uma plataforma padronizada de genotipagem de alto desempenho, em que milhares de marcadores podem ser facilmente testados em paralelo para milhares de amostras em todas as espécies de Eucalyptus. Este microarranjo DArT tem demonstrado um excelente desempenho para complexas análises filogenéticas e de diversidade (Steane, Nicolle et al. 2011), seleção genômica (Resende, Resende et al. 2012) e mapeamento genético (Sansaloni, Petroli et al. 2010;

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Hudson, Kullan et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012). Uma descrição detalhada sobre o conteúdo de sequência e a distribuição no genoma das sondas de DNA que compõem este microarranjo DArT deverá incrementar o seu valor para estudos comparativos de mapeamento de QTLs, navegar a partir dos mapas de ligação para o genoma de referência, em projetos de clonagem posicional e para extrair informação genômica adicional a partir de marcadores informativos identificados em estudos filogenéticos, de genética populacional e seleção genômica.

Mapas genéticos têm sido ferramentas fundamentais para a análise da herança de características qualitativas e quantitativas, para o mapeamento comparativo, para montagem de genomas inteiros e para aplicações de melhoramento molecular, incluindo análises de germoplasma, seleção assistida por marcadores e clonagem baseada em mapa (Jones, Ougham et al. 2009). Mapas de ligação genética para espécies de Eucalyptus foram relatados a partir de diferentes pedigrees, tanto intra como interespecíficos, utilizando diferentes tecnologias de marcadores moleculares (Grattapaglia and Kirst 2008; Grattapaglia, Vaillancourt et al. 2012). Um bom número de mapas de ligação genética tem sido produzido em Eucalyptus com tecnologias de marcadores dominantes RAPD e AFLP (Grattapaglia and Sederoff 1994; Verhaegen and Plomion 1996; Marques, Araújo et al. 1998; Bundock, Hayden et al. 2000; Myburg, Griffin et al. 2003; Freeman, Potts et al. 2006), microssatélites (Brondani, Brondani et al. 2002; Brondani, Williams et al. 2006) e SNPs (Lima, Silva-Junior et al. 2011), enquanto RFLPs (Byrne, Murrell et al. 1995; Thamarus, Groom et al. 2002) e um recente microarranjo de genotipagem SFP (Single Feature Polymorphisms) (Neves, Mamani et al. 2011) permitiram posicionar centenas de genes em mapas existentes. Apesar de todos esses avanços, essas tecnologias de marcadores moleculares não foram eficientes em fornecer uma ferramenta amplamente aplicável que possa ser usada para ligar os genótipos aos fenótipos de uma forma extensa, que inclua o mapeamento comparativo, a descoberta de genes e que auxiliasse aos programas de melhoramento. Recentemente, marcadores DArT têm fornecido um mapeamento de ampla cobertura e alta densidade, necessário para caminhar nessa direção (Hudson, Kullan et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012), embora não se tenha realizado uma caracterização mais profunda de seu conteúdo genômico.

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Neste estudo, investigamos as propriedades genômicas das 7.680 sondas DArT que integram o microarranjo de Eucalyptus por meio de seu sequenciamento, construindo um mapa de ligação de alta densidade e realizando uma análise detalhada do mapeamento físico destes marcadores utilizando-se a sequência do genoma referência de Eucalyptus grandis (www.phytozome.net). Neste capítulo, estávamos particularmente interessados em verificar o desempenho dos marcadores DArT para mapeamento de ligação em uma família interespecífica de Eucalyptus. Também caracterizamos a composição de sequência das sondas do microarranjo DarT, para avaliar a sua distribuição física em termos de cobertura global do genoma e distância em relação aos modelos gênicos preditos. Por último, examinamos a consistência entre o ordenamento de locos físico versus o baseado em recombinação.

3.2. OBJETIVOS

1) Construir um mapa genético para um população de referência Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla e verificar o desempenho dos marcadores DArT para mapeamento de ligação;

2) Caracterizar a composição de sequência das sondas do microarranjo DArT em relação à redundância e o seu possível conteúdo gênico;

3) Avaliar a distribuição física dos marcadores, em termos de cobertura do genoma e distância em relação a modelos gênicos preditos;

4) Alinhar o mapa genético aos pseudocromossomos correspondentes para examinar a consistência entre o ordenamento dos locos em termos físicos versus genético com base em recombinação;

5) Fornecer estimativas para cada cromossomo, e para o genoma como um todo, da relação entre distância física e distância de recombinação no genoma de Eucalyptus.

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3.3. MATERIAL E MÉTODOS

3.3.1. Material Vegetal

Uma população de mapeamento F1 de 177 indivíduos foi derivada de um cruzamento interespecífico entre duas árvores elite, E. grandis (clone G38) e E. urophylla (clone U15). Ambas as espécies são amplamente plantadas nos trópicos e pertencem ao mesmo subgênero Symphyomyrtus. Esta população de mapeamento, chamada GxU-IP foi selecionada como um pedigree de referência para fins de mapeamento no projeto Genolyptus (Grattapaglia 2004), imortalizada por propagação via mini-estaquia e plantada em ensaio repetido em cinco locais em Julho de 2003 em blocos casualizados com parcelas de árvore única e cinco repetições por local. O DNA foi extraído de ambos os pais e todos os indivíduos F1, utilizando-se 150mg de tecido foliar armazenado a -20C como descrito anteriormente (Grattapaglia and Sederoff 1994). As amostras de DNA resultantes foram de qualidade consistente e adequada para genotipagem via DArT e microssatélites.

3.3.2. Genotipagem de microssatélites

Uma triagem de 300 marcadores microssatélites EMBRA (Brondani, Williams et al. 2006; Faria, Mamani et al. 2010; Faria, Mamani et al. 2011) foi utilizada na identificação de polimorfismos entre os parentais, com uma análise adicional de seis indivíduos da progênie F1 para verificar a segregação, resultando na seleção de 222 microssatélites informativos. A genotipagem dos microssatélites foi realizada em sistemas multiplex, com detecção de multi-fluorescência em um sequenciador automático ABI 3100XL, como descrito anteriormente (Brondani and Grattapaglia 2001; Faria, Mamani et al. 2011).

3.3.3. Genotipagem de marcadores DArT (Diversity Arrays Technology)

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Uma descrição detalhada do método usado para preparar o arranjo de alta densidade DarT, para Eucalyptus, foi descrita recentemente (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Resumidamente, foram construídas 18 bibliotecas de representações genômicas, com um total de 23.808 sondas de DNA provenientes de 64 espécies diferentes de Eucalyptus, utilizando-se o método de redução da complexidade genômica PstI/TaqI, as quais foram testadas em um painel de 96 indivíduos. Um conjunto de 7.680 sondas que revelaram polimorfismos robustos foi selecionado e usado para construir o microarranjo de genotipagem operacional DArT. Este procedimento foi otimizado por meio de: (1) amostragem de uma grande coleção de variantes de sequência para aumentar a recuperação de clones polimórficos, e (2) transferibilidade interespecífica dos marcadores registrados. Com o mesmo método de redução de complexidade genômica utilizado na construção da biblioteca, representações genômicas dos parentais e dos 177 indivíduos F1 da população de mapeamento foram geradas para produzir “targets”, os quais posteriormente foram hibridizados no microarranjo. Um grupo de amostras foi marcado com fluorescência Cy-3 (verde) e outro grupo com Cy-5 (vermelho), para assim otimizar o rendimento de cada lâmina, já que podem ser hibridizadas duas amostras com diferentes cores na mesma lâmina.

Após a hibridação, as lâminas do microarranjo foram lavadas e escaneadas, usando um equipamento TECAN LS300 confocal a laser, com uma resolução de 20 mm por pixel com aquisição sequencial de três imagens para cada lâmina. O sinal emitido a partir do sitio de clonagem do vetor poli-linker, marcado com fluorescência FAM, proporcionou um valor de referência para a quantidade de fragmentos de DNA amplificados e, presentes em cada “spot” do microarranjo. As imagens resultantes foram analisadas usando DArTSoft versão 7.44, um software desenvolvido por Diversity Arrays Technology Pty. Ltd. para a extração de dados das imagens do microarranjo, a detecção de polimorfismos e a definição do marcador. O valor relativo de intensidade de hibridação foi então calculado para todos os “spots” aceitos como log[target/referência], ou seja, log[sinal de Cy-3 / sinal de FAM] para os targets marcados com Cy-3, e log[sinal de Cy-5 / sinal de FAM] para os targets marcados com Cy-5. Posteriormente, DArTSoft comparou os valores de intensidade relativa obtidos

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para cada um dos clones. Se a relação target/referência entre dois clusters possuía uma variância de intensidades relativas, de pelo menos 80% da variância total, os clones eram considerados polimórficos e genotipados de forma binaria como “1” ou “0”. Targets com valores de intensidade relativa que não puderam ser atribuídos a um ou outro cluster (0 ou 1) foram registados como dados perdidos. Métodos padrão de descoberta de marcadores foram implementados através de uma combinação de parâmetros extraídos automaticamente, a partir dos dados do arranjo usando DArTsoft. Os parâmetros utilizados neste estudo foram: (1) reprodutibilidade ≥ 95%, como medida pela concordância do chamado genótipo entre repetições da técnica (targets replicados e processados para um mínimo de 30% das amostras de DNA genotipadas); (2) qualidade do marcador Q ≥ 65, o qual representa a variância entre clusters como uma porcentagem da variância total na distribuição do sinal de fluorescência entre as amostras testadas; e (3) Call Rate do marcador ≥ 75% (porcentagem de targets que puderam ser registrados como '0' ou '1').

3.3.4. Construção do mapa genético

Um mapa de ligação genética único e integrado foi construído utilizando ambos os dados de marcadores, seja os codominantes microssatélites e os dominantes DArT, usando JoinMap v3.0 (Van Ooijen and Voorrips 2001). Marcadores microssatélites segregaram a partir de cada um dos parentais individualmente em uma configuração 1:1, ou em uma proporção 1:2:1 em configuração F2 de fase de ligação desconhecida, com ambos os parentais igualmente heterozigotos para o mesmo genótipo, ou ainda em configuração totalmente informativa 1:1:1:1 com três ou quatro alelos diferentes no total, segregando a partir dos dois parentais. Marcadores dominantes DArT, por outro lado, segregaram em uma configuração de pseudo-cruzamento teste 1:1, a partir de cada um dos parentais individualmente, ou em razão 3:1 quando ambos os parentais eram heterozigotos. Para ambos os dados, microssatélites e DArT, os marcadores que mostraram Call Rate ≥ 75% e apresentaram uma das proporções de segregação esperadas com α ≤ 0,01 foram usados para a análise de ligação. O agrupamento e ordenamento dos marcadores foram estabelecidos inicialmente pela

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aplicação do algoritmo de máxima verossimilhança, usando JoinMap, com população tipo CP; agrupamento a LOD > 15; fração de recombinação ≤ 0,4, com valor de Ripple = 1; jump in goodness-of-fit threshold = 5 (correspondendo à diferença normalizada de Qui-quadrado antes e após a adição de um loco); utilizando a função de mapeamento Kosambi. O ordenamento dos marcadores com JoinMap foi realizado por anelamento simulado, excluindo aqueles marcadores que contribuíam para uma ordem instável nas duas primeiras tentativas de ordenamento para produzir um mapa framework, com um suporte estatístico para ordenamento de alta verossimilhança. Marcadores segregantes adicionais foram então incorporados ao mapa de ligação com menor rigor em uma terceira e última tentativa do JoinMap, para proporcionar uma posição de mapa a um maior número possível de marcadores DArT segregantes.

3.3.5. Análise comparativa entre o mapa de ligação e a montagem da sequência do genoma

Foi realizada uma avaliação genômica da consistência na ordem dos marcadores, estimada no mapa de ligação framework com a posição física dos marcadores no genoma, alinhando estes sobre os 11 scaffolds correspondentes aos 11 pseudo- cromossomos da atual versão do genoma de referência de Eucalyptus (versão 1.0 disponível em Phytozome 6.0, http://www.phytozome.net/Eucalyptus.php), produzido a partir da árvore autofecundada BRASUZ1 (Brasil Suzano S1). Este alinhamento foi também utilizado para proporcionar estimativas para cada cromossomo específico e do genoma completo, com base na correspondência entre distância física e fração de recombinação no genoma de Eucalyptus, bem como uma estimativa da eficiência da cobertura genômica fornecida pelo mapa framework.

3.3.6. Caracterização genômica dos marcadores DArT

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Os clones de E. coli contendo as 7.680 sondas DArT de Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al. 2010) foram rearranjados em vinte placas de 384 poços e submetidos a sequenciamento Sanger, bidirecional, no laboratório de genômica da Universidade de Purdue (www.genomics.purdue.edu). Após a filtragem de qualidade e a clivagem das regiões do vetor e sitios PstI, as sequências obtidas foram depositadas no GenBank (números de acesso HR865291-HR872186). A redundância das sondas DArT em nível de sequência foi analisada através do software Geneious Pro 5.1.7 (Drummond, Ashton et al. 2011), usando um mínimo de sobreposição de 50 pb, para uma sequência ser agrupada dentro de um contig e uma identidade de sobreposição de 98% (a “identidade de sobreposição” é a porcentagem mínima de bases que deve ser idêntica dentro da região de sobreposição, para a sequência ser agrupada). Os números de sondas DArT únicas e redundantes foram avaliados através da aplicação de quatro diferentes parâmetros de agrupamento, desde o mais rigoroso (A1) ao mais permissivo (A4). Estes parâmetros foram: (a) tamanho da palavra (word length), ou seja, o número mínimo de bases consecutivas que deveriam coincidir perfeitamente a fim de encontrar uma correspondência entre duas sequências; (b) número máximo de bases únicas incompatíveis permitidas por read como uma porcentagem do tamanho da sobreposição entre dois reads; (c) número máximo de bases ambíguas permitidas nas palavras coincidentes; (d) o número máximo de gaps que podem estar inseridos dentro de cada read como uma porcentagem do tamanho da sobreposição entre dois reads; (e) tamanho máximo de cada gap que pode estar inserido dentro dos reads.

Após o pré-processamento para remover os contaminantes, artefatos de sequenciamento e sequências de baixa qualidade, todas as sondas DArT para as quais foram obtidas sequências foram mapeadas sobre o genoma referência de Eucalyptus grandis (versão 1.0 disponível em Phytozome 6.0). O mapeamento foi realizado utilizando o software BWA-SW (versão 0.5.8) a partir da ferramenta de alinhamento Burrows-Wheeler (Li and Durbin 2010) para produzir um arquivo BAM (Li, Handsaker et al. 2009). O limiar para um hit da sequência da sonda ser retido foi definido para um valor fixo (T = 70). Foram considerados até dois hits como sendo um “mapeamento de sucesso” e utilizados os valores sub-ótimos de cada um dos hits para classificar a “confiabilidade do mapeamento” e a “taxa esperada de erro do mapeamento'' para os

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resultados. Finalmente, para examinar as características genômicas dos marcadores DArT em relação aos modelos gênicos preditos na versão 1.0 do genoma de Eucalyptus grandis, todos os marcadores pertencentes ao arranjo DarT, incluindo aqueles agrupados e ordenados no mapa genético, foram mapeados fisicamente no genoma de referência. Posteriormente os 11 pseudo-cromossomos foram divididos em intervalos de 5Mbp para realizar uma análise detalhada da localização dos marcadores DArT em relação com os modelos gênicos preditos. Uma correlação de Spearman entre o número de marcadores DArT e o número de modelos gênicos anotados em cada intervalo foi estimado para cada pseudo-cromossomo. Além disso, foi avaliada a distância física em pares de bases a partir de cada sonda DArT sequenciada, com o modelo gênico predito mais próximo, para fornecer uma visão genômica ampla da cobertura do espaço gênico no genoma de Eucalyptus propiciada pelo arranjo DArT.

3.4. RESULTADOS

3.4.1. Genotipagem dos marcadores DArT

A distribuição dos marcadores nos diferentes níveis de reprodutibilidade tendeu para as classes de maior qualidade. Por exemplo, a partir dos 3.933 marcadores que tinham reprodutibilidade ≥ 95%, 70% apresentaram reprodutibilidade igual ou maior do que 99%. Para os 4.884 marcadores que passaram a o valor limiar de qualidade, 61% tinham Q ≥ 70, enquanto que dos 5.415 marcadores com um Call Rate ≥ 75%, 36% apresentaram um Call Rate ≥ 90% (Figura 2). Enquanto os parâmetros de reprodutibilidade e Q são medidas que diretamente avaliam a qualidade da genotipagem, o Call Rate reflete essencialmente a porcentagem tolerada de dados perdidos. Um Call Rate menos rigoroso de marcadores com valores ≥ 75% foi adotado para maximizar o número de marcadores posicionados no mapa de ligação, uma vez que tal limiar produziria ainda dados de marcadores com boa qualidade para ~128 gametas recombinantes informativos que permitem uma análise satisfatória da ligação e ordenamento dos marcadores durante a construção do mapa. As 7.680 sondas do microarranjo de Eucalyptus resultaram em 3.191 marcadores que simultaneamente

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passaram todos os parâmetros de filtragem de qualidade de marcador além do filtro de Call Rate (Figura 2).

A partir dos 3.191 marcadores testados para observação do comportamento mendeliano, apenas 215 não se encaixaram em qualquer uma das proporções, 1:1 ou 3:1, e foram excluídos das análises posteriores. Assim, os 2.976 marcadores DArT que mostraram comportamento mendeliano foram utilizados na análise de ligação, e destes, 1.777 segregaram numa configuração 1:1 de pseudo-cruzamento e 1.199 numa razão de 3:1, ou seja, foram locos heterozigotos segregando simultaneamente a partir de ambos os parentais. Em relação ao conjunto de dados de microssatélites, 166 locos foram totalmente informativos com três ou quatro alelos segregando em quatro classes genotípicas distintas proporcionando locos âncora para a construção de um mapa de ligação integrado. Quarenta e dois microssatélites segregaram a partir de um dos parentais apenas, 25 a partir de E. grandis e 17 de E. urophylla, enquanto 14 segregaram em uma configuração F2 1:2:1 de fase desconhecida.

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1164; 24% > 90 1902; 39% 80 - 89

70 - 79

65 - 69

757; 15%

1061; 22% Reprodutibilidade Qualidade (Q)

Call rate

Figura 3. Distribuição do número e porcentagens de marcadores DArT que passaram o limiar de filtragem adotado para reprodutibilidade (≥95%), qualidade (Q≥65%) e call rate (≥75%). Um diagrama de Venn consolida a informação mostrando todas as classificações possíveis dos marcadores DArT de acordo com os três critérios adotados. Somente marcadores que satisfizeram simultaneamente a todos os três critérios foram usados para o mapeamento de ligação.

3.4.2. Mapeamento de ligação

Um conjunto de 3.198 marcadores (2.976 DArTs e 222 microssatélites) foi sujeito a uma análise de mapeamento. A análise de agrupamento a LOD>15,0 resultou em 2.980 marcadores reunidos em 11 grupos de ligação numerados como estabelecido anteriormente (Grattapaglia and Sederoff 1994; Brondani, Williams et al. 2006) e

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avaliados pela presença de marcadores microssatélites âncoras. O mapa de ligação construído com suporte de alta verossimilhança para o ordenamento dos marcadores após a segunda rodada de JoinMap é apresentado como um “Mapa Framework” (Figura 3). O mapa de ligação obtido após a terceira rodada de ordenamento é chamado a seguir de “Mapa full” ou mapa completo, e é apresentado como uma maneira de fornecer uma posição preliminar de todos os marcadores informativos para a subsequente caracterização genômica (Tabela 1 e Figura 4). O mapa framework, construído seguindo a segunda rodada do JoinMap resultou em 1.029 marcadores posicionados com alta verossimilhança, 861 DArTs e 168 microssatélites. Quando um ordenamento menos rigoroso foi permitido, um total de 2.484 marcadores foi mapeado (2.274 DArTs e 210 microssatélites). Os 496 marcadores remanescentes não puderam ser posicionados, mesmo utilizando um critério mais permissivo, possivelmente como resultado da redundância de marcadores DArT no nível de sequência (ver abaixo) ou devido a uma ligação muito próxima, de modo que não puderam ser amostrados recombinantes suficientes para resolver o ordenamento relativo ao longo do mapa.

Uma proporção maior de microssatélites (80%) foi posicionada no mapa framework do que de marcadores DArT (45%), provavelmente devido ao maior conteúdo informativo dos microssatélites multialélicos que fornecem um maior poder para categorizar haplótipos recombinantes contra haplótipos parentais e, assim, determinar a ordem dos marcadores. No entanto, o tamanho final do mapa framework foi apenas 9,5% menor do que o mapa full, 1.176,7cM e 1.303,9 cM respectivamente (Tabela 1 e Figura 4). As ordens dos marcadores de ambos os mapas (framework e full) foram geralmente consistentes, apesar de que alguns conjuntos de marcadores invertidos puderam ser observados, principalmente nos grupos de ligação (GL) GL1, GL2, GL7 e GL9. Além disso, embora a expectativa fosse de que todos os marcadores do mapa framework estivessem contidos no mapa full este não foi sempre o caso. O mapa framework continha 99 marcadores que foram excluídos quando um limiar de ordenamento mais permissivo foi utilizado para a construção do segundo mapa. Estes se concentraram nos grupos GL2 (42 marcadores), GL3 (26 marcadores), GL1 (19 marcadores) e GL11 (8 marcadores) (Figura 4).

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LG 1 LG 2 LG 3 LG 4 LG 5 LG 6 LG 7 LG 8 LG 9 LG 10 LG 11

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eP t -567179 eP t -642875 eP t -599678 EMBRA1 0 6 eP t -643831 eP t -566933 eP t -599317 EMBRA6 9 5 EMBRA1 6 5 6 eP t -641995 eP t -642868 eP t -637201 eP t -639226 EMBRA1 0 5 EMBRA1 3 6 2 eP t -503609 eP t -568592 105 eP t -504192 EMBRA1 8 4 5 eP t -503656 EMB R A1 4 7 0 eP t -566984 eP t -574421 EMBRA6 4 6 EMBRA3 eP t -564685 eP t -568616 eP t -571092 EMBRA2 8 6 eP t -571262 eP t -599633 eP t -564650 eP t -563241 EMBRA1 7 5 eP t -565513 eP t -640303 eP t -639244 eP t -566154 EMBRA1 2 5 eP t -640043 eP t -563876 110 eP t -640651 eP t -599614 eP t -565909 EMBRA5 3 eP t -568788 eP t -575625 eP t -599290 eP t -574824 eP t -564880 eP t -638623 eP t -571936 eP t -565887 eP t -569095 eP t -638925 eP t -571166 eP t -571665 eP t -642912 eP t -504234 eP t -599578 eP t -563350 EMBRA9 3 4 eP t -571850 eP t -643884 eP t -567938 eP t -571195 eP t -503764 eP t -504697 EMBRA1 0 7 1 eP t -573624 eP t -640871 115 EMBRA7 0 5 eP t -599895 eP t -640477 eP t -570889 eP t -572230 eP t -572469 eP t -572752 eP t -570043 eP t -636624 eP t -570269 eP t -504436 eP t -573530 eP t -639725 EMBRA9 2 8 eP t -600416 eP t -571164 eP t -574401 eP t -566673 eP t -567735 EMBRA1829 eP t -505124 eP t -640185 eP t -574150 eP t -567794 120 eP t -504454 eP t -571131 eP t -640231 eP t -566138 eP t -563830 eP t -575230 eP t -568382 eP t -642570 eP t -569856 eP t -642855 eP t -640416 eP t -639594 eP t -570633 eP t -573120 eP t -564874 eP t -575571 eP t -503679 eP t -502974 eP t -567203 eP t -643149 eP t -599942 eP t -564407 eP t -572895 EMBRA3 9 125 eP t -571022 eP t -503588 eP t -639199 eP t -574476 eP t -600664 eP t -564111 eP t -637995 EMBRA1 2 4 4 eP t -643298 eP t -564561 eP t -563807 eP t -504913 eP t -638369 eP t -636465 eP t -640084 EMBRA1 9 6 6 eP t -568366 eP t -571553 eP t -643992 130 eP t -638607 eP t -639025 eP t -503273 EMBRA7 4 7 eP t -643040 eP t -636681 eP t -504553 eP t -564452 eP t -564455 eP t -569732 EMBRA8 0 eP t -567448 eP t -568818 eP t -642836 eP t -565647 eP t -637084 eP t -570192 EMBRA1 1 4 2 eP t -575309 eP t -637844 eP t -573883 eP t -568916 eP t -571629 EMBRA8 3 6 eP t -575337 eP t -571831 eP t -642666 eP t -569222 eP t -567274 Eg 2 4 eP t -569117 eP t -567323 eP t -640825 eP t -575564 eP t -565089 eP t -575587 EMBRA6 8 1 eP t -568640 eP t -642040 eP t -638904 eP t -565432 eP t -644128 eP t -599991 eP t -644317 eP t -568630 eP t -570733 eP t -640029 eP t -565132 eP t -504991 eP t -575727 eP t -636614 eP t -567811 eP t -571507 eP t -564413 eP t -643956 eP t -573165 Es157 eP t -600085 eP t -575728 eP t -566877 EMBRA1 0 3 9 eP t -503513 eP t -565848 eP t -640937 EMBRA3 4 5 eP t -574039 eP t -566027 eP t -562898 EMBRA1 3 5 EMBRA6 9 6 eP t -644213 eP t -599485 eP t -571616 EMBRA1 3 6 4 eP t -644359 eP t -599960 eP t -599530 eP t -641971 eP t -641866 eP t -504847 eP t -568950 eP t -563311 eP t -569237 eP t -599266 eP t -503908 eP t -641207 eP t -575752 eP t -639589 eP t -503715 eP t -564011 eP t -599683 eP t -564253 Eg 9 6 eP t -562969 eP t -641178 eP t -574273 eP t -573250 EMBRA1 4 9 4 eP t -572635 EMBRA1 1 3 9 eP t -640659

Figura 4. Mapa de ligação framework DArT/microssatélites para Eucalyptus. O mapa inclui 1.029 marcadores posicionados com alto suporte de verossimilhança para o ordenamento de locos, envolvendo 861 DArTs (em preto) e 168 microssatélites (em vermelho) com uma escala em centiMorgan à esquerda.

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Tabela 1. Estatísticas dos mapas consenso de DArT/microssatélites para a população segregante de E. grandis x E. urophylla.

Grupo de Ligação/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Total Média Desvio padrão Pseudo-cromossomo Mapa Fulla N Total de Marcadores 207 244 270 106 189 271 224 275 220 263 215 2.848 225,8 49,34 N de Marcadores DarT 191 219 256 93 166 231 210 262 204 246 196 2.274 206,7 47,68 N de Microssatélites 16 25 14 13 23 40 14 13 16 17 19 210 19,1 7,98 Tamanho Total (cM) 167,8 129 102,4 86,6 130,7 116,5 117,3 118,6 118,3 117,4 99,5 1.303,9 118,5 20,8 Distância Média entre Marcadores (cM) 0,8 0,5 0,4 0,8 0,7 0,4 0,5 0,4 0,5 0,4 0,5 0,5 Mapa Frameworkb N Total de Marcadores 80 131 128 57 74 104 75 107 78 92 103 1.029 93,5 23,4 N de Marcadores DarT 72 112 115 44 54 72 64 95 64 82 87 864 78,3 22,6 N de Microssatélites 8 19 13 13 20 32 11 12 14 10 16 168 15,3 6,6 Tamanho Total (cM) 114,0 122,1 124,6 76,1 100,3 121,6 130,5 116,2 92,5 87,4 91,5 1.176,8 107 18,1 Distância Média entre Marcadores (cM) 1,4 0,9 1,0 1,3 1,4 1,2 1,7 1,1 1,2 1,0 0,9 1,1 - 0,3 Mapa Framework no Genomac N Total de Marcadores Framework 62 98 102 52 68 88 68 94 66 82 89 869 79 16,5 Distância Física Coberta (Mpb) 40,7 63,8 79,7 41,1 73,8 50,3 51,9 68,4 38,4 38,6 40,8 587,5 - - Proporção de kpb/cM 357,3 522,1 639,2 539,9 736,1 413,7 548,4 588,9 415,1 441,4 445,4 - 513,4 112,7 a Mapa Full: todos os marcadores mapeados com um suporte probabilístico permissivo para ordenamento. b Mapa Framework: marcadores ordenados com o maior suporte estatístico. c Mapa Framework no genoma: marcadores do mapa Framework foram posicionados na sequência do genoma de Eucalyptus grandis para fornecer uma correspondência entre distância física e fração de recombinação para cada pseudo-cromossomo e ao nível do genoma total.

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LG1 full LG1 fmwk LG2 full LG2 fmwk LG3 full LG3 fmwk LG4 full LG4 fmwk LG5 full LG5 fmwk LG6 full LG6 fmwk LG7 full LG7 fmwk LG8 full LG8 fmwk LG9 full LG9 fmwk LG10 full LG10 fmwk LG11 full LG11 fmwk

ePt-636954 EMBRA1139 ePt-569380 ePt-600181 ePt-504554 ePt-504836 ePt-567747 EMBRA704 ePt-643745 ePt-567607 ePt-571769 ePt-571303 ePt-637073 EMBRA1624 ePt-565031 ePt-600321 EMBRA1643 ePt-570724 ePt-641390 ePt-563044 EMBRA949 ePt-568931 ePt-564380 ePt-571279 ePt-567634 ePt-571036 ePt-564395 ePt-503229 ePt-600594 ePt-567398 ePt-574273 ePt-640419 ePt-641578 ePt-503352 ePt-641946 ePt-503489 ePt-564765 ePt-569023 ePt-569220 ePt-640592 ePt-572557 ePt-572954 ePt-574102 ePt-566351 ePt-565718 ePt-573666 ePt-568875 ePt-574798 ePt-599999 ePt-567502 ePt-640721 ePt-567510 ePt-599222 ePt-642089 ePt-639589 ePt-574476 EMBRA1474 ePt-641837 ePt-504847 ePt-641564 ePt-563006 ePt-572568 ePt-566370 ePt-643583 ePt-569878 ePt-599649 ePt-574586 ePt-567348 ePt-563311 ePt-639585 ePt-568627 ePt-565085 ePt-568679 ePt-571456 ePt-504913 ePt-569441 ePt-572210 ePt-600658 ePt-636665 ePt-572676 ePt-637594 ePt-574912 ePt-638739 ePt-563148 ePt-643149 ePt-642931 ePt-638940 ePt-569253 ePt-574361 ePt-566138 ePt-565900 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ePt-565816 ePt-564111 ePt-567735 ePt-639607 ePt-572981 ePt-574129 ePt-565213 ePt-641802 ePt-564086 ePt-572086 ePt-569245 ePt-636465 ePt-640231 ePt-567637 ePt-562936 ePt-569966 ePt-568037 EMBRA917 ePt-504868 ePt-572242 EMBRA242 ePt-639025 ePt-640416 ePt-599632 ePt-504354 ePt-574663 ePt-504928 ePt-639336 ePt-644058 ePt-600739 EMBRA120 ePt-564455 ePt-564880 ePt-643890 ePt-573408 ePt-571395 ePt-573801 EMBRA922 ePt-572938 ePt-574425 EMBRA41 ePt-637084 ePt-573624 ePt-644344 ePt-563266 ePt-563003 ePt-571738 ePt-641100 ePt-567899 ePt-638597 ePt-570163 ePt-636624 ePt-572964 ePt-564389 ePt-562922 ePt-637309 ePt-566759 ePt-573464 ePt-564975 ePt-575230 ePt-503736 ePt-568053 ePt-643225 ePt-570066 ePt-637579 ePt-640764 EMBRA669 ePt-571182 ePt-573120 ePt-504000 ePt-644288 ePt-503847 ePt-570830 ePt-642915 ePt-504908 EMBRA87 ePt-637023 ePt-643047 ePt-563807 ePt-572886 ePt-638939 ePt-600466 ePt-504032 ePt-565164 EMBRA21 ePt-568150 ePt-564450 ePt-643992 ePt-573467 ePt-599880 ePt-566154 ePt-574889 ePt-570771 ePt-600729 ePt-573052 ePt-564956 ePt-504553 ePt-570733 ePt-636919 ePt-642912 ePt-639639 ePt-565743 EMBRA383 ePt-566679 ePt-565532 ePt-568436 ePt-575708 ePt-575638 ePt-565902 ePt-638047 ePt-562810 EMBRA165 ePt-642984 ePt-565994 ePt-573059 ePt-644097 ePt-569786 ePt-638845 ePt-566788 ePt-565984 ePt-563308 ePt-569222 ePt-642666 ePt-599982 ePt-564379 ePt-569856 ePt-567046 ePt-503098 ePt-572591 ePt-640825 ePt-575630 ePt-565432 EMBRA1928 ePt-571022 ePt-599676 ePt-570990 ePt-599641 ePt-568916 ePt-573883 ePt-564413 EMBRA2014 ePt-643298 ePt-640307 ePt-566792 ePt-564298 ePt-642040 ePt-643488 ePt-600085 EMBRA1492 ePt-569525 ePt-644293 ePt-574278 ePt-504678 ePt-644317 EMBRA347 ePt-575727 EMBRA357 ePt-636614 ePt-599344 ePt-643232 ePt-567923 ePt-504991 ePt-642836 ePt-640141 ePt-572765 ePt-643956 ePt-640620 ePt-641496 ePt-505054 ePt-575749 ePt-638904 ePt-562796 EMBRA1369 ePt-642207 ePt-566121 ePt-562821 ePt-566305 ePt-564451 ePt-599425 ePt-575587 ePt-564582 ePt-570106 ePt-567177 ePt-636819 ePt-567274 ePt-644128 ePt-641607 ePt-637643 ePt-572142 ePt-571507 ePt-641108 ePt-599683 ePt-565046 ePt-565078 ePt-573310 ePt-643841 ePt-575728 ePt-639682 ePt-565316 EMBRA1081 ePt-572084 ePt-644213 ePt-641503 ePt-642974 EMBRA1039 ePt-569607 ePt-575752 ePt-563379 ePt-574220 ePt-568843 ePt-503513 ePt-565615 ePt-572689 ePt-575145 ePt-569599 ePt-571631 ePt-640029 ePt-569670 ePt-570988 ePt-639197 ePt-564985 ePt-564892 ePt-573880 ePt-569572 ePt-641577 ePt-640468 ePt-571466 ePt-564336 ePt-570364 ePt-567408 ePt-568474 ePt-564346 ePt-575612 EMBRA33 ePt-640519 ePt-570104 ePt-566441 ePt-565107 ePt-639810 ePt-574655 ePt-599738 ePt-564313 ePt-563112 ePt-568058 ePt-574173 ePt-644188 ePt-503613 ePt-642188 EMBRA82 ePt-636787 ePt-574671 ePt-565128 ePt-599458 ePt-565633 ePt-639925 ePt-566230 ePt-640434 ePt-566484 ePt-567719 ePt-567169 ePt-568046 ePt-504220 ePt-639246 ePt-599655 ePt-637248 ePt-569798 ePt-638280 ePt-599324 ePt-600131 EMBRA189 ePt-641656 ePt-600517 ePt-565669 ePt-502892 ePt-642738 ePt-638008 ePt-600718 ePt-571616 ePt-600714 EMBRA1364 EMBRA696 40 ePt-643917

Figura 5. Alinhamento do mapa full (barras amarelas) com o mapa framework (Fmwk) (barras verdes) para os 11 pseudo-cromossomos do Eucalyptus mostrando as conexões entre os mesmos locos em ambos os mapas. O mapa full inclui um total de 2.484 marcadores, 2.274 DArTs e 210 microssatélites enquanto que o mapa framework possui 1.029 marcadores posicionados com alta verossimilhança para a ordem dos locos, sendo 861 DArTs e 168 microssatélites. Marcadores DArT em preto e microssatélites em vermelho; na esquerda encontra-se a escala em centiMorgan.

O mapa full de marcadores DArT continha em média 226 marcadores por GL posicionados a uma distância média entre marcadores consecutivos de 0,5 cM, enquanto que o mapa framework tinha em média 93,5 marcadores por GL e uma distância média entre marcadores de 1,1 cM (Tabela 1). A distribuição de distâncias de mapa entre marcadores consecutivos no mapa framework foi significativamente diferente daquela no mapa full (p = 0,021 em teste não paramétrico de Komolgorov- Smirnov) (Figura 5). Este resultado demonstra que (i) o mapa framework espalha marcadores com alto suporte estatístico para proporcionar um ordenamento robusto de locos e (ii) reduz a proporção de distâncias curtas entre marcadores (< 1 cM) em relação ao mapa full (87% no mapa full e 65% no mapa framework).

Uma análise da origem dos 861 marcadores DArT mapeados no mapa framework mostrou que 197 (23%) que segregaram em uma proporção 1:1 tinham origem a partir do genitor E. urophylla e 298 (35%) a partir do genitor E. grandis, enquanto que 366 (42%) eram heterozigotos em ambos os pais, segregando 3:1. Proporções muito semelhantes foram observadas quando todos os 2.274 marcadores DArT foram examinados. Estes resultados sugerem uma maior heterozigosidade no genitor E. grandis do que no genitor E. urophylla. A partir das 7.680 sondas do microarranjo, 2.274 (isto é, aproximadamente 30%), foram por fim mapeados nesta família segregante. No entanto, se os 3.191 marcadores DArT que passaram os filtros de qualidade de genotipagem para este experimento fossem considerados, 71% dos marcadores poderiam ser mapeados. Embora a proporção de marcadores que pode ser mapeada dependa em grande parte da heterozigosidade de sequência dos 41

parentais e da sua divergência genética, este resultado corrobora o excelente desempenho do microarranjo DArT para fins de mapeamento de ligação em Eucalyptus.

> 10.0 9.0 - 10.0 8.0 - 9.0 Mapa Full 7.0 - 8.0 Mapa Framework 6.0 - 7.0 5.0 - 6.0 4.0 - 5.0 3.0 - 4.0 2.8 - 3.0 2.6 - 2.8 2.4 - 2.6 2.2 - 2.4 2.0 - 2.2 1.8 - 2.0 1.6 - 1.8 1.4 -1.6 1.2 - 1.4 1.0 - 1.2 0.8 - 1.0 0.6 - 0.8 Distância entre marcadores consecutivos (cM) marcadoresconsecutivos entre Distância 0.4 - 0.6 0.2 - 0.4 0 - 0.2 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 % Distâncias entre marcadores consecutivos

Figura 6. Distribuição de frequência das distâncias de recombinação de Kosambi entre marcadores consecutivos ao longo das duas versões do mapa de ligação. A distribuição de distâncias de mapa no mapa framework foi significativamente diferente daquela do mapa full (p = 0,021 de um teste não paramétrico de Komolgorov- Smirnov), confirmando o fato de que o mapa framework espalha os marcadores retidos com elevado suporte de ordenamento e reduz a proporção de distâncias entre marcadores menores do que um centiMorgan, de um total de 87% no mapa full para 65% no mapa framework.

42

3.4.3. Distâncias de recombinação e física no genoma de Eucalyptus

O alinhamento do mapa de ligação framework com a sequência do genoma de Eucalyptus indicou que a ordem relativa dos marcadores mapeados concorda amplamente com suas posições físicas (Figura 6). Apenas alguns marcadores esparsos ou pequenos blocos de marcadores (por exemplo, nos GL1 e GL4) mostraram uma ordem localmente inconsistente com a estimada na sequência do genoma. Após a inspeção ainda mais aprofundada dos dados de segregação dos poucos marcadores que mostraram discrepância entre suas posições físicas e aquelas obtidas com base em recombinação, constatou-se que vários deles estavam no limite em termos de parâmetros de qualidade e de Call Rate, o que poderia explicar as inconsistências observadas. A partir dos 1.029 marcadores mapeados no framework, 869 puderam ser posicionados sobre a sequência do genoma, enquanto que para os 160 remanescentes não foi obtida sequência ou mapearam em algum dos 4.941 scaffolds menores adicionais não ancorados na montagem atual do genoma de Eucalyptus. Os 869 marcadores mapeados genética e fisicamente cobriram um total de 587,5 Mpb da sequência (Tabela 1), proporcionando assim uma cobertura de 97% dos 605,8Mbp atualmente montados nos 11 scaffolds principais do genoma de Eucalyptus. As estimativas pseudo-cromossomo-específicas sobre a relação entre distância física em kpb e a fração de recombinação em cM variou entre 357,3 kpb/cM para o pseudo- cromossomo 1 e 736,1 kpb/cM para o pseudo-cromossomo 5, com uma média de 513,4 kpb/cM para o genoma todo (Tabela 1). Quando o mapa full foi alinhado com a sequência do genoma (dados não mostrados), dos 2.274 marcadores DArT segregantes e geneticamente mapeados, 1.986 alinharam nos 11 pseudo-cromossomos, enquanto que 45 marcadores mapearam em 31 scaffolds não ancorados e para 243 marcadores DArT não foi obtida sequência ou não mapearam na atual vesão do genoma. Com base nos marcadores DArT mapeados, os 31 scaffolds não ancorados, adicionando 1,4 Mpb de sequências, puderam ser alocados aos 11 pseudo-cromossomos (Tabela 2).

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LG1 fmwk Chr. 1 LG2 fmwk Chr. 2 LG3 fmwk Chr. 3 LG4 fmwk Chr. 4 LG5 fmwk Chr. 5 LG6 fmwk Chr. 6

ePt-503716 ePt-637146 ePt-503532 ePt-503692 ePt-564556 ePt-573782 EMBRA1643 ePt-571642 ePt-571642 ePt-567586 EMBRA1624 ePt-570721 ePt-503616 ePt-504928 ePt-572689 ePt-567634 ePt-503616 ePt-503692 EMBRA189 ePt-504928 EMBRA1474 ePt-572007 ePt-572007 ePt-572689 ePt-564582 EMBRA187 ePt-575243 ePt-637146 ePt-636787 ePt-644293 ePt-568290 ePt-639441 ePt-639441 ePt-564313 ePt-640307 EMBRA2055 ePt-574374 ePt-575243 ePt-569670 ePt-639639 ePt-503679 ePt-564805 ePt-574374 ePt-565046 ePt-564313 ePt-504697 ePt-569562 EMBRA373 ePt-564582 ePt-573801 ePt-643040 ePt-565684 ePt-572571 EMBRA110 ePt-599344 ePt-637579 ePt-565145 ePt-564805 ePt-575150 ePt-503732 ePt-640620 ePt-571738 ePt-567634 ePt-569707 ePt-569562 ePt-600523 ePt-563498 ePt-642207 ePt-642915 EMBRA1624 ePt-570201 ePt-572571 ePt-637022 ePt-568161 ePt-599676 EMBRA189 EMBRA1643 ePt-504814 ePt-568161 ePt-504723 ePt-641662 ePt-567046 ePt-642207 EMBRA949 ePt-573606 ePt-568853 ePt-503732 ePt-599344 ePt-641494 ePt-637966 ePt-566788 ePt-570286 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LG7 fmwk Chr. 7 LG8 fmwk Chr. 8 LG9 fmwk Chr. 9 LG10 fmwk Chr. 10 LG11 fmwk Chr. 11

EMBRA681 EMBRA80 ePt-575763 ePt-574671 ePt-505048 ePt-567719 ePt-638531 EMBRA669 ePt-573184 ePt-637643 ePt-599674 ePt-642854 ePt-642974 EMBRA87 ePt-599875 ePt-504908 EMBRA165 ePt-642339 ePt-504398 ePt-562810 EMBRA21 ePt-571551 ePt-639995 ePt-565743 EMBRA669 ePt-636518 ePt-504093 ePt-570771 ePt-503948 EMBRA165 ePt-568366 ePt-567719 ePt-565164 EMBRA87 ePt-566264 ePt-644498 ePt-567997 ePt-569117 ePt-574671 EMBRA33 ePt-505048 ePt-641837 EMBRA357 ePt-573981 ePt-570544 EMBRA33 ePt-565316 ePt-575763 EMBRA42 ePt-565085 ePt-567303 ePt-600505 ePt-570755 ePt-641496 ePt-566121 ePt-638531 EMBRA98 ePt-572362 ePt-641063 ePt-638109 ePt-572241 ePt-575145 ePt-570106 ePt-636518 ePt-642848 ePt-639258 ePt-571185 ePt-567694 ePt-643322 ePt-637643 ePt-570988 ePt-642339 EMBRA751 ePt-562895 ePt-504329 ePt-644370 ePt-565085 ePt-642974 ePt-565078 ePt-571551 ePt-637299 ePt-567492 ePt-504330 ePt-570443 ePt-641837 ePt-562810 ePt-574220 ePt-575706 ePt-599681 ePt-643631 ePt-503904 ePt-503948 ePt-599919 ePt-565743 ePt-566792 ePt-504087 ePt-569278 ePt-599251 ePt-636919 EMBRA2014 ePt-563368 ePt-567492 ePt-565164 ePt-570990 ePt-564895 ePt-642907 ePt-641193 ePt-644498 ePt-566290 ePt-503985 ePt-567610 ePt-504908 ePt-574278 ePt-599674 ePt-573469 ePt-599919 ePt-572221 ePt-642346 ePt-503968 ePt-643631 ePt-570771 EMBRA10 ePt-599825 ePt-504215 ePt-567610 ePt-575638 ePt-644065 ePt-573751 ePt-566264 ePt-570988 ePt-568223 ePt-567997 ePt-563807 ePt-599875 ePt-574679 ePt-564900 ePt-504138 ePt-572362 ePt-570364 ePt-503715 ePt-573981 ePt-636633 ePt-639995 ePt-641063 ePt-504192 ePt-570269 ePt-562895 ePt-569572 ePt-566788 ePt-600505 ePt-504791 ePt-642854 ePt-572981 EMBRA1492 ePt-503395 ePt-639258 ePt-574220 ePt-565806 ePt-567694 ePt-504162 ePt-504398 ePt-504330 ePt-571017 ePt-564821 ePt-565436 ePt-565078 EMBRA40 ePt-638109 ePt-565115 ePt-573184 ePt-571185 EMBRA1928 ePt-570295 ePt-638004 ePt-570106 EMBRA1428 ePt-600257 ePt-572663 ePt-570544 ePt-503904 EMBRA941 ePt-571408 EMBRA47 ePt-566121 ePt-575378 EMBRA1870 ePt-644162 ePt-570755 ePt-504329 ePt-639625 ePt-573753 ePt-504515 ePt-565316 ePt-568195 ePt-570443 ePt-504751 ePt-572241 ePt-567303 ePt-575674 ePt-572218 ePt-636787 ePt-570990 EMBRA61 ePt-644370 ePt-638818 ePt-643322 EMBRA357 ePt-575752 ePt-504015 EMBRA1364 ePt-503098 ePt-570361 ePt-563368 ePt-562769 ePt-504093 EMBRA2014 EMBRA1977 ePt-503502 0 ePt-642848 EMBRA48 ePt-566792 EMBRA153 ePt-503968 ePt-564986 ePt-565436 ePt-571017 ePt-568154 ePt-636915 ePt-567101 ePt-574278 ePt-562786 ePt-503985 ePt-569587 ePt-638004 EMBRA1492 EMBRA629 ePt-642585 ePt-502901 ePt-564238 ePt-573149 ePt-504015 ePt-572761 EMBRA47 ePt-564900 ePt-563305 ePt-572443 5 ePt-639354 EMBRA10 ePt-504799 ePt-573751 ePt-574754 ePt-575608 ePt-562892 ePt-504893 ePt-639432 ePt-571096 ePt-643870 EMBRA40 ePt-565922 ePt-504138 ePt-643020 ePt-504515 EMBRA1928 ePt-642464 ePt-643509 ePt-573537 ePt-503461 EMBRA1428 ePt-638297 ePt-641324 10 ePt-570894 EMBRA157 ePt-642346 ePt-568194 EMBRA269 ePt-565029 ePt-563183 ePt-568195 ePt-641057 ePt-571408 ePt-572871 ePt-599438 ePt-644065 EMBRA1851 ePt-643793 ePt-565916 ePt-567436 ePt-569067 EMBRA1470 ePt-573753 ePt-641649 EMBRA48 ePt-566290 ePt-637637 ePt-504803 15 ePt-503387 EMBRA157 ePt-568223 ePt-573717 ePt-503395 ePt-568630 ePt-643368 ePt-563442 ePt-599701 ePt-504232 ePt-563434 ePt-568745 EMBRA61 ePt-574325 ePt-570295 ePt-564376 ePt-639688 EMBRA941 ePt-567901 ePt-571618 ePt-569999 ePt-642862 ePt-565806 ePt-640132 ePt-564821 Eg91 ePt-502901 EMBRA629 ePt-599692 ePt-562887 20 ePt-643020 ePt-643368 ePt-575378 ePt-573789 ePt-574487 ePt-568150 ePt-503461 Es140 ePt-638325 ePt-566694 ePt-572761 ePt-639688 ePt-570361 ePt-641881 ePt-572218 ePt-571096 ePt-569274 EMBRA1977 ePt-566551 ePt-569843 ePt-572871 ePt-639165 ePt-574202 ePt-642841 ePt-599455 25 ePt-504454 ePt-642970 EMBRA1851 ePt-566263 ePt-574268 ePt-569587 ePt-642712 ePt-503229 EMBRA731 EMBRA269 ePt-642210 ePt-569316 ePt-568154 ePt-503608 ePt-639727 ePt-570894 ePt-564966 EMBRA153 ePt-563297 ePt-643793 ePt-644137 ePt-639354 ePt-504893 ePt-567900 ePt-639729 ePt-574754 ePt-638466 ePt-562786 ePt-644096 EMBRA1319 30 EMBRA121 ePt-643870 ePt-642464 ePt-600455 ePt-575107 ePt-641649 ePt-643098 EMBRA38 ePt-637253 ePt-572443 EMBRA7 ePt-563183 ePt-637637 ePt-503303 ePt-505072 ePt-564986 ePt-573478 EMBRA731 ePt-640899 ePt-639432 EMBRA145 ePt-567436 ePt-575674 EMBRA954 ePt-571991 35 ePt-562769 ePt-504851 ePt-642841 ePt-565896 ePt-639905 ePt-505054 ePt-642460 ePt-639625 ePt-504817 ePt-644195 ePt-504791 ePt-573230 ePt-566988 ePt-566787 ePt-575107 EMBRA623 ePt-566586 ePt-568194 ePt-640089 EMBRA1319 ePt-644137 ePt-502872 ePt-573789 ePt-600305 ePt-503502 EMBRA69 ePt-568745 ePt-563305 ePt-640418 ePt-503908 40 ePt-564376 ePt-564991 ePt-641881 ePt-637856 ePt-636915 EMBRA128 ePt-642862 ePt-599701 ePt-641573 ePt-643936 ePt-504751 ePt-571207 ePt-570411 ePt-571934 ePt-642585 ePt-575564 ePt-639165 ePt-566263 ePt-503007 ePt-565711 ePt-638818 ePt-638562 ePt-504799 ePt-570411 ePt-504803 45 ePt-569192 ePt-642712 ePt-504817 ePt-569337 ePt-575016 ePt-642307 ePt-567549 ePt-565922 ePt-503990 ePt-505072 EMBRA1761 ePt-564966 ePt-572030 ePt-569383 ePt-568866 ePt-572663 ePt-568180 ePt-573149 ePt-574202 ePt-571991 ePt-565426 ePt-573478 ePt-566551 ePt-599498 ePt-639963 50 ePt-504162 ePt-599873 ePt-638297 ePt-638929 ePt-644195 ePt-575025 ePt-638466 ePt-567900 ePt-572668 ePt-563220 ePt-565115 EMBRA203 ePt-641057 ePt-644043 ePt-641558 ePt-643898 ePt-567101 ePt-600455 EMBRA310 ePt-570513 ePt-644162 ePt-564519 ePt-571934 ePt-567179 ePt-565711 ePt-637564 ePt-643098 ePt-503303 ePt-568788 ePt-565082 55 ePt-642907 ePt-642748 ePt-637253 ePt-644030 ePt-504232 ePt-641995 ePt-504851 ePt-503608 ePt-571166 ePt-600411 ePt-600473 ePt-573374 ePt-640899 ePt-564530 ePt-569843 ePt-503656 ePt-573230 ePt-567901 ePt-640303 ePt-567300 ePt-573469 EMBRA1427 ePt-503990 ePt-600635 ePt-566694 60 ePt-571262 ePt-567549 ePt-638325 ePt-566933 ePt-575083 ePt-504215 ePt-643850 ePt-644096 ePt-568901 ePt-574268 ePt-599578 ePt-568180 ePt-599692 ePt-563028 ePt-563081 ePt-636633 ePt-570436 ePt-563297 ePt-572949 ePt-639729 ePt-567203 ePt-599873 ePt-640089 ePt-564685 ePt-503013 ePt-569278 ePt-641899 ePt-573717 ePt-571477 ePt-639727 65 ePt-639199 ePt-502872 ePt-641573 ePt-573738 ePt-599317 ePt-599681 ePt-568411 ePt-640132 ePt-642641 ePt-562887 ePt-642677 ePt-564991 ePt-503007 ePt-573786 ePt-573796 ePt-566562 ePt-641482 ePt-574325 ePt-643032 ePt-643936 ePt-567735 ePt-571207 ePt-569337 ePt-643612 ePt-574065 70 ePt-569246 EMBRA668 ePt-565896 ePt-566917 ePt-571618 ePt-640416 ePt-638562 ePt-569383 ePt-504837 ePt-568592 ePt-637299 ePt-570733 ePt-574801 ePt-563876 ePt-575049 ePt-640231 ePt-570436 ePt-640418 ePt-571195 ePt-568616 EMBRA98 ePt-600085 ePt-600305 ePt-643149 ePt-575702 ePt-573624 ePt-637181 ePt-599498 ePt-600416 ePt-571665 75 EMBRA751 ePt-503513 ePt-637856 ePt-574476 ePt-565082 ePt-564880 ePt-641899 EMBRA954 ePt-572230 ePt-575625 EMBRA42 ePt-572779 ePt-566787 ePt-643707 ePt-600411 ePt-638904 ePt-640208 ePt-563028 EMBRA204 ePt-639244 EMBRA145 EMBRA3 ePt-638929 ePt-643271 ePt-575016 80 ePt-642666 ePt-564519 EMBRA204 EMBRA210 ePt-503764 EMBRA7 EMBRA1362 ePt-644043 ePt-566138 ePt-563220 ePt-642836 ePt-573374 EMBRA1578 EMBRA39 Eg91 ePt-565513 ePt-571477 ePt-638623 ePt-568866 ePt-573883 ePt-572645 EMBRA210 ePt-571164 85 EMBRA121 ePt-643831 ePt-572949 ePt-599633 ePt-643509 ePt-504553 ePt-642748 EMBRA310 ePt-567794 EMBRA623 EMBRA53 ePt-566917 ePt-504913 ePt-639963 ePt-643992 ePt-641685 ePt-573738 ePt-642570 EMBRA69 ePt-638925 ePt-568901 EMBRA1829 ePt-570513 ePt-599364 ePt-572668 EMBRA1244 90 EMBRA128 ePt-570889 ePt-600635 ePt-639594 ePt-642210 ePt-643850 ePt-573786 ePt-572469 EMBRA1761 ePt-567938 ePt-644030 ePt-640871 ePt-503013 ePt-567002 ePt-643612 EMBRA747 ePt-569192 EMBRA928 ePt-643032 ePt-563350 ePt-563081 95 ePt-568411 ePt-638596 EMBRA836 ePt-565426 ePt-565089 ePt-642641 ePt-575083 EMBRA1427 ePt-599981 ePt-575571 ePt-575025 ePt-571629 ePt-564530 ePt-567300 EMBRA203 ePt-502973 EMBRA1142 ePt-637564 ePt-637995 ePt-572882 ePt-573796 100 EMBRA668 ePt-504837 Eg24 ePt-643898 ePt-568382 ePt-574065 ePt-643831 ePt-566933 ePt-567179 ePt-641995 ePt-503273 ePt-599317 EMBRA1362 ePt-503609 ePt-642868 105 ePt-503656 ePt-564874 ePt-568592 EMBRA3 ePt-564685 EMBRA1470 ePt-571262 ePt-640084 ePt-568616 ePt-565513 ePt-640303 ePt-599633 ePt-640043 ePt-572895 ePt-639244 EMBRA53 ePt-568788 ePt-563876 110 ePt-564880 ePt-570192 ePt-575625 ePt-638925 ePt-571166 ePt-638623 ePt-599578 ePt-574039 ePt-571665 ePt-567938 ePt-571195 ePt-563350 ePt-573624 EMBRA696 ePt-503764 115 ePt-570889 ePt-572230 ePt-640871 ePt-636624 ePt-565432 ePt-572469 EMBRA928 ePt-600416 ePt-570269 ePt-567735 ePt-569237 EMBRA1829 ePt-571164 ePt-574150 ePt-567794 120 ePt-640231 ePt-568382 ePt-568950 ePt-566138 ePt-640416 ePt-639594 ePt-642570 ePt-564874 ePt-575571 ePt-567203 ePt-572895 ePt-643149 125 ePt-639199 ePt-574476 EMBRA39 ePt-637995 EMBRA1244 ePt-563807 ePt-640084 ePt-504913 ePt-643992 EMBRA1966 130 ePt-503273 ePt-504553 EMBRA747 ePt-569732 EMBRA80 ePt-642836 ePt-570192 ePt-573883 EMBRA1142 ePt-571629 EMBRA836 ePt-642666 ePt-567274 ePt-575564 Eg24 ePt-565089 EMBRA681 ePt-638904 ePt-565432 ePt-568630 ePt-570733 ePt-575727 ePt-564413 ePt-600085 ePt-503513 ePt-574039 EMBRA696 EMBRA1364 45

Figura 7. Alinhamento do mapa framework com o genoma de referência de Eucalyptus. Correspondência do posicionamento dos marcadores DArT e microssatélites no mapa de ligação framework (barras verdes) e nos 11 scaffolds peudo-cromossômicos de Eucalyptus grandis (barras brancas). A escala à esquerda corresponde simultâneamente às distâncias em centiMorgan para o mapa de ligação e em Mpb para as sequências nos pseudo-cromossômos.

Tabela 2. Lista dos 45 marcadores DArT mapeados nos 11 grupos de ligação e posicionados em pequenos scaffolds não ancorados na atual montagem do genoma de Eucalyptus grandis (versão 1.0 no Phytozome 6.0). Estes marcadores DArT mapeados geneticamente permitiram a alocação de 31 pequenos scaffolds (1.4 Mpb de sequência total) aos 11 pseudo-cromossomos principais.

Marcadores Posições de Grupos de Ligação/ Tamanho de N˚ do Tamanho DArT mapa dos Pseudo-cromossomo sequências DArT Sacffold do marcadores (cM) não Scaffold ancorado (pb) ePt-571990 39.98 7 342 24 625.428 ePt-599305 45.43 3 226 50 200.725 ePt-639198 60.54 2 688 118 109.742 ePt-569673 36.45 2 326 134 73.68 ePt-574447 77.42 2 497 134 ePt-641713 36.62 2 305 134 ePt-568315 30.79 7 317 207 54.558 ePt-503680 85.13 8 310 207 ePt-572981 92.18 9 337 460 27.208 ePt-599970 69.7 6 452 491 26.388 ePt-641657 69.7 6 453 491 ePt-641907 69.7 6 452 491 ePt-642658 69.7 6 453 491 ePt-503696 47.35 6 465 499 25.365 ePt-641193 26.65 8 304 556 23.569 ePt-571092 93.5 2 295 578 23.216 ePt-565718 7 6 610 686 22.065 ePt-641578 6.55 6 438 686 ePt-503229 11.76 10 241 746 18.491

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ePt-570410 34.11 9 522 847 16.12 ePt-642696 42.73 9 536 847 ePt-643222 44.55 11 554 949 14.791 ePt-599337 148.04 1 377 958 16.434 ePt-643196 148.46 1 376 958 ePt-567002 64.73 8 445 1033 ePt-640230 44.41 3 292 1165 12.751 ePt-572676 35.65 10 382 1221 12.304 ePt-575708 98.48 8 549 1340 11.269 ePt-644097 98.48 8 558 1340 ePt-599556 56.67 2 546 1519 10.167 ePt-599364 63.45 8 245 1533 9.961 ePt-570223 30.13 3 399 1585 10.093 ePt-640659 122.09 2 342 1685 9.193 ePt-504097 31.65 8 601 1742 8.856 ePt-565887 51.24 5 580 1843 8.383 ePt-599614 50.38 5 578 1843 ePt-643170 51.28 5 578 1843 ePt-570110 81.04 9 229 1891 8.187 ePt-568521 59.84 2 381 1915 8.269 ePt-564907 29.1 9 356 2966 7.743 ePt-573755 34.37 3 383 3233 4.288 ePt-599351 34.43 3 384 3233 ePt-568568 85.77 5 383 3329 4.17 ePt-572802 47.53 3 263 4064 3.562 ePt-573923 47.51 3 263 4064

3.4.4. Análises de redundância das sequências das sondas DArT

Foram obtidas sequências Sanger para 6.918 das 7.680 sondas DArT (90%), com um tamanho médio de 534 pb. Sob os parâmetros mais rigorosos de montagem (ver Material e Métodos), de um total de 6.918 sequências, 3.709 agruparam em clusters multi-sequência com duas ou mais sequências por cluster. Estas foram agrupadas dentro de 1.374 clusters únicos de sequências não redundantes, enquanto que 3.209 tiveram uma única sequência representada, ou seja, singletons exclusivos. No total, as

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6.918 sondas para as quais foram obtidas sequências representaram efetivamente 4.583 locos únicos, ou seja, uma estimativa da taxa de redundância de 33,75%. Sob parâmetros de montagem mais liberais, o número de locos únicos foi reduzido para um total de 3.864, proporcionando uma estimativa da taxa de sequências redundantes de 44,14% (Tabela 3). Se uma taxa equivalente de redundância é assumida para as 762 sondas DArT para as quais não puderam ser obtidas sequências, as 7.680 sondas no arranjo DArT amostrariam efetivamente entre 4.289 e 5.087 locos únicos no genoma de Eucalyptus. Todas as 6.918 sequências foram submetidas ao GenBank e 6.896 foram finalmente aceitas e depositadas (22 foram cortadas por terem tamanhos menores do que o mínimo aceito pelo NCBI), recebendo números de acesso HR865291-HR872186, com identificadores de clones correspondentes à nomenclatura convencionada dos marcadores DArT usada neste trabalho. Estes clones foram apresentados contra o banco de dados completo do NCBI EST, dos quais 3.703 (53,6%) retornaram com hits BLASTn positivos.

Tabela 3. Resultados da análise de redundância das 6.918 sequências das sondas DArT sob quatro grupos diferentes de parâmetros de montagem, desde o mais rigoroso (A1) ao mais permissivo (A4) (ver Material e Métodos para detalhes).

Parâmetro A1 A2 A3 A4 Comprimento da palavra (word length) 18 14 12 10 Index do compr. da palavra 13 12 11 10 Mismatches 10% 15% 20% 20% Ambiguidades por leitura 4 4 16 16 % máximo de gaps por leitura 10% 15% 20% 20% Tamanho do gap 1bp 2bp 5bp 5bp Resultados da análise de redundância N de singletons exclusivosa 3.209 2.607 2.381 2.276 N de sequências redundantesb 3.709 4.311 4.537 4.642 N de sequências únicas não redundantesc 1.374 1.537 1.587 1.588 Total de sequências selecionadasd 4.583 4.144 3.968 3.864 Taxa estimada de sequências redundantes 33,75% 40,0% 42,64% 44,14% aSequências únicas sem correspondência com nenhuma outra leitura.

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bSequências que agruparam dentro de clusters multi-sequência com mais de duas sequências por cluster. cSequências únicas provenientes de clusters redundantes. dSoma de singletons (exclusivos) sem correspondência e sequências não redundantes.

3.4.5. Alinhamento das sondas DArT no genoma de Eucalyptus

A partir das 6.896 sondas DArT para as quais sequências de qualidade foram obtidas, 6.631 (96%) puderam ser alinhadas com sucesso sobre a sequência do genoma de Eucalyptus grandis (versão 1.0 em Phytozome 6.0), enquanto 265 não puderam ser mapeadas usando parâmetros de elevado rigor. Assim, das sondas mapeadas 6.390 foram alinhadas nos 11 principais pseudo-cromossomos e as 241 remanescentes se posicionaram nos 4.941 pequenos scaffolds adicionais não ancorados. Quando estes resultados de mapeamento foram utilizados para avaliar a qualidade dos parâmetros de alinhamento de sequências adotados (ver Material e Métodos) uma taxa de erro de mapeamento de 0,002 foi estimada mediante a observação de 12 sequências não mapeadas em 6.631, isto é, uma confiabilidade  99.8%. Curiosamente, este número corresponde precisamente com a média de reprodutibilidade estimada por DArTsoft seguindo os valores limiares padrão utilizados para a seleção de marcadores. Usanso-se o valor padrão (default) de BWA (T = 37) como o limiar para o hit da sequência ser retido, 166 das 265 sondas não mapeadas puderam ser alinhadas adicionalmente com os 11 pseudo-cromossomos principais, sendo que 91 destas 166 sondas também foram mapeadas no mapa de ligação full. Além disso, das 89 sondas que permaneceram fisicamente não mapeadas no genoma de E. grandis, 36 foram mapeadas com sucesso também no mapa de ligação.

Adicionalmente, foi realizado um exame mais aprofundado do alinhamento das 6.631 sondas DArT no genoma montado de Eucalyptus, incluindo todos os 4.952 scaffolds pequenos. Um total de 4.189 sondas foi alinhado com alta confiança em uma simples e única posição do genoma, assim como o seu mapeamento produziu um simples hit sem sub-alinhamentos. Para 2.252 das 2.442 sondas remanescentes, um segundo sub-alinhamento foi retido, o qual sobrepôs o mesmo loco que o do primeiro melhor alinhamento. Portanto, no total, 6.441 sondas DArT das 6.631 avaliadas (97,1%) foram consideradas como alinhadas para um único loco no genoma. Para as

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190 sondas nas quais um segundo hit foi reportado por BWA, realizamos uma análise usando ferramentas quiméricas de detecção fornecidas pelos softwares de montagem de fragmentos CD HIT (Li and Godzik 2006) e EULER DNA (Pevzner, Tang et al. 2001), os quais foram executados com parâmetros pré-definidos, resultando na ausência de reads quiméricos. Para 135 sondas, o sub-alinhamento retido foi localizado em uma posição diferente no mesmo scaffold, e em 95 destes casos, a distância entre alinhamentos foi menor do que 1 kb, o que sugere uma duplicação contígua em tandem. Para 40 sondas DArT as distâncias entre o alinhamento do primeiro e o segundo hit eram maiores do que 1 kb, com 13 deles maiores do que 10 kb. Finalmente, apenas 55 sondas foram alinhadas para posições em diferentes pseudo- cromossomos. Em 37 destes casos, ambos os locos foram encontrados nos 11 pseudo- cromossomos principais e em 18 casos um dos locos foi encontrado em um scaffold não ancorado. A frequência de sondas DArT multiloco em cromossomos diferentes observada em Eucalyptus (55 em 6.631, ou seja, 0,83%) é consistente com a frequência de 1,4% observada em um estudo de mapeamento de ligacão em cevada (Wenzl, Li et al. 2006).

3.4.6. Cobertura do espaço gênico de Eucalyptus pelos marcadores DArT

Para caracterizar o espaço gênico de Eucalyptus coberto pelo microarranjo DArT, foram consideradas apenas as sondas alinhadas nos 11 pseudo-cromossomos anotados. Estas totalizaram 6.390 sondas, as quais alinharam em um total de 6.571 posições, uma vez que 181 sondas também alinharam em uma segunda posição, de acordo com o limiar de BWA adotado. A distribuição das 6.571 sondas DArT alinhadas e dos 1.986 marcadores DArT mapeados geneticamente, foi plotada em conjunto com a distribuição dos 41.204 modelos gênicos preditos no genoma do Eucalyptus (versão 1.0). O genoma foi particionado em 122 intervalos de 5 Mpb cada, os quais, em média, correspondem a ~10 cM de distância no intervalo de mapa, assumindo um total de 1.200 cM de distância de recombinação (Figura 7). O histograma indica que o microarranjo DArT proporciona uma cobertura consideravelmente homogênea de marcadores ao longo do genoma e sugere uma relação constante entre o número de

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modelos gênicos e o número de marcadores DArT. Esta relação foi evidenciada através de uma correlação de Spearman relativamente forte e altamente significativa entre o número de modelos gênicos preditos e o número total de sondas DArT encontradas em cada intervalo do genoma (ρ = 0,682, ρ = 3,79e-18), e do mesmo modo, com o número de marcadores DArT mapeados (ρ = 0,467, ρ = 5,19e-8) (Figura 8). Estes resultados indicam que o microarranjo DArT tende a fornecer marcadores segregantes em essencialmente todos os intervalos genômicos de 5 Mpb com o número de marcadores DArT aumentando com o número de genes dentro do intervalo. Em média, cada intervalo contém 16±9,0 marcadores geneticamente mapeados, 53 ±21,6 sondas DArT e 334 ±100,9 modelos gênicos preditos. Apenas quatro intervalos tinham menos de 20 sondas DArT mapeadas e somente 11 dos 122 intervalos tinham menos de 5 marcadores mapeados geneticamente. Além disso, pouco menos de 70% das sequências DArT foram mapeadas a zero pb a partir do modelo gênico predito mais próximo, e menos de 10% localizadas a uma distância maior do que 10 kpb dos modelos gênicos preditos (Figura 9).

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Figura 8. Correspondência posicional entre marcadores DArT e modelos gênicos preditos no genoma de Eucalyptus grandis. Os 11 pseudo-cromossomos do genoma de Eucalyptus grandis (Versão 1.0 no Phytozome 6.0), foram divididos em 122 intervalos de 5 Mpb. Para cada intervalo foram plotados o número de sondas DArT (barras azuis), o número de marcadores DArT mapeados geneticamente (barras vermelhas) e o número de modelos gênicos preditos (barras verdes).

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A

B

Figura 9. Correlações entre o número de sondas DArT, marcadores DArT mapeados e modelos gênicos no genoma de Eucalyptus. Correlações de Spearman (ρ) foram estimadas entre: (A) o número de sondas DArT e o número de modelos gênicos, e (B) o

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número de marcadores DArT mapeados e o número de modelos gênicos, para intervalos genômicos de 5 Mpb.

276 171 354 4% 3% 5% 724 11%

490 8%

4556 69%

0 kpb ≤ 1 kpb ≤ 5 kpb ≤ 10 kpb ≤ 20 kpb ≥ 20 kpb

Figura 10. Distribuição do número e porcentagens de marcadores DArT de acordo com intervalos crescentes de distância física entre o marcador DArT e o modelo gênico mais próximo no genoma do Eucalyptus.

3.5. DISCUSSÃO

Este estudo fornece dados inéditos e detalhados sobre os atributos genômicos dos marcadores DArT no genoma de uma planta. Após o desenvolvimento de um microarranjo DArT de alto desempenho para Eucalyptus (Sansaloni, Petroli et al. 2010) examinamos as propriedades genômicas das sondas DArT que integram este microarranjo por meio do seu sequenciamento, a construção de um mapa de ligação de alta densidade e a comparação física com a sequência genômica de Eucalyptus grandis BRASUZ1 recentemente disponibilizada. Demonstramos que as sondas DArT têm preferencialmente o espaço gênico como alvo e exibem uma distribuição uniforme no genoma todo, proporcionando uma excelente cobertura genômica para aplicações em estudos de melhoramento e diversidade. Tais propriedades gerais de marcadores DArT não tinham sido ainda descritas, apesar dos vários estudos já

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publicados com base na aplicação destes marcadores em um grande número de espécies de plantas.

3.5.1. Eficiência da genotipagem de marcadores DArT para análise genética em Eucalyptus

Um conjunto de parâmetros relativamente rigorosos de filtragem foi aplicado às intensidades de sinal obtidas a partir das 7.680 sondas DArT no microarranjo de Eucalyptus. Um total de 3.191 marcadores (41,5%) passou todos os limiares de qualidade do marcador e de call rate (Figura 2), uma proporção consistente com as estimativas iniciais relatadas durante a validação do microarranjo (Sansaloni, Petroli et al. 2010) e estudos de mapeamento recentes com pedigrees interespecíficos similares (Hudson, Kullan et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012). Além da filtragem pela qualidade do marcador, foi aplicada uma triagem estrita para examinar o comportamento mendeliano esperado. Uma distorção da segregação foi relatada em alguns estudos anteriores de mapeamento em Eucalyptus, embora, na maioria das vezes, em uma proporção não diferente da esperada pelo simples acaso (Grattapaglia and Sederoff 1994; Brondani, Williams et al. 2006). Isto se tornou um tema de interesse como uma forma de avaliar as interações heteroespecíficas nos híbridos F1 que afetam as taxas de introgressão entre espécies distantes (Myburg, Vogl et al. 2004). Neste pedigree particular, no entanto, assim como no primeiro estudo de mapa de ligação em Eucalyptus (Grattapaglia and Sederoff 1994), não seria de se esperar distorção de segregação, uma vez que a segregação do marcador foi observada a partir de cada uma das espécies puras parentais e não nos gametas derivados de um híbrido F1 onde uma distorção poderia ser esperada. Assim, apenas 215 marcadores (6,7%) foram excluídos devido a desvios de segregação esperados, uma proporção próxima dos 5% esperados pelo acaso. Além do erro de amostragem, estes marcadores distorcidos podem incluir casos de locos duplicados, tal como as 55 sondas DArT alinhadas com alta confiabilidade em posições de pseudo-cromossomos diferentes, e as 13 sondas alinhadas a distâncias maiores do que 10 kpb. Em ambos os casos, estas ocorrências podem dar origem a uma mistura dos sinais de hibridação e taxas de

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segregação distorcidas. Os 97% de cobertura do genoma físico total fornecido pelo mapa de ligação construído neste estudo indica que a manutenção de marcadores distorcidos na análise de ligação poderia não melhorar a cobertura, mas, em vez disso, poderia complicar o ordenamento do marcador se as distorções derivadas de dados perdidos em excesso ou de erros de genotipagem fossem incluídas (Hackett and Broadfoot 2003).

Dentre os 2.976 marcadores DArT incluídos na análise de ligação, 2.274 foram por fim mapeados e ordenados no mapa consenso full e 864 na versão framework (Tabela 1). A proporção de marcadores DArT mapeados está dentro do número previsto de marcadores úteis para o mapeamento, entre 1.818 e 2.553, tal como foi inicialmente relatado quando o microarranjo DArT para Eucalyptus foi desenvolvido (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Este número também é comparável aos 2.229 marcadores DArT mapeados no mapa consenso de duas famílias de retrocruzamento relacionadas E. grandis x E. urophylla (Kullan, van Dyk et al. 2012) e para os 1.845 ESTs baseados em marcadores Single Feature Polymorphism (SFP) relatado anteriormente para o mesmo pedigree utilizado neste estudo (Neves, Mamani et al. 2011). A proporção de marcadores informativos em tais pedigrees interespecíficos de mapeamento foi consideravelmente maior do que o número observado em pedigrees intraespecíficos. Hudson et al. (Hudson, Kullan et al. 2011) puderam mapear somente 1.060 marcadores DArT em uma família F2 derivada de dois indivíduos F1 da mesma procedência e apenas 569 em um cruzamento da mesma origem em E. globulus. A divergência genética entre as espécies e os níveis correspondentes de heterozigosidade diferencial de sequência nos locos DArT determinam, em grande parte, a proporção de marcadores informativos capturados. A plataforma de genotipagem DArT tem proporcionado uma ordem de magnitude maior no número de marcadores para o mapeamento em Eucalyptus do que as tecnologias anteriores, como RAPD, AFLP e microssatélites (Grattapaglia and Kirst 2008). A natureza não domesticada do Eucalyptus resultou em um maior número de marcadores mapeados do que a maioria dos mapas de ligação construídos com microarranjos DArT extensivamente otimizados tais como aqueles para trigo, aveia, (Tinker, Kilian et al. 2009), sorgo (Mace, Rami et al. 2009), e cevada (Wenzl, Li et al. 2006).

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Recentemente, entre 3.100 e 3.500 marcadores polimórficos DArT de alta qualidade foram detectados em populações de melhoramento compostas de várias centenas de indivíduos de E. grandis e E. urophylla, no contexto de experimentos de seleção genômica (Resende, Resende et al. 2012). Como esperado, quando comparado com uma média de 2.200 a 2.300 marcadores capturados e mapeados em pedigrees biparentais, o microarranjo DArT fornece entre 40 e 50% de marcadores a mais quando em nível de população. Se proporções semelhantes são mantidas, pode-se antecipar que, em populações de melhoramento de E. globulus, o microarranjo DArT irá proporcionar entre 750 e 1.500 marcadores informativos, dependendo da variabilidade geral da população e da procedência.

3.5.2. Estimativas de redundância das sondas DArT

Estimativas reportadas da redundância de marcadores DArT obtidas comparando o padrão de segregação em população de mapeamento ou estimando as distâncias de Hamming entre os marcadores, têm variado de 38% em cevada (Wenzl, Li et al. 2006), a 43% em Arabidopsis (Wittenberg, Lee et al. 2005). Depois de sequenciar todos as sondas do microarranjo DArT para Eucalyptus, foi calculada uma redundância com base na comparação direta de sequências entre 33,75 e 44,14% (Tabela 3). Isto é consistente com a taxa de redundância de 46% para milhares de sondas DArT sequenciadas a partir do microarranjo de genotipagem para aveia (Tinker, Kilian et al. 2009). Sob o mesmo protocolo de redução da complexidade genômica, a redundância irá variar de acordo com a estrutura do genoma específico da espécie-alvo, a diversidade das amostras utilizadas para construir representações genômicas e, em grande parte, com o critério de triagem das sondas e o número final de sondas selecionadas. Quanto mais sondsa são analisadsa, uma maior redundância irá resultar. A redundância pelo sequenciamento de apenas algumas centenas de sondas DArT, previamente selecionadas para o polimorfismo, foi estimada em 15% para um microarranjo de maçã, apesar de que uma redundância potencial de 50% foi reconhecida para todos os clones do microarranjo sequenciado (Schouten, Weg et al. 2012). Considerando que uma distribuição física e de mapeamento genético

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razoavelmente uniforme das sondas DArT foi alcançada através do genoma de Eucalyptus (Figuras 6 e 7), um certo nível de redundância das sondas no microarranjo DArT pode ser uma característica desejável. As sondas DArT de Eucalyptus variam em tamanho (534 ±215 pb) e, embora compartilhem porções de sequência de DNA, terão capacidade variável para detectar polimorfismos de sequência entre indivíduos e populações, proporcionando assim uma melhora no potencial e na flexibilidade de genotipagem no genoma completo.

Um aspecto interessante da análise de redundância de sequência das sondas DArT surgiu, entretanto, quando se comparou o alinhamento destas com o genoma de referência. Entre 3.864 e 4.583 sequências únicas foram observadas para as sondas DArT (Tabela 3), uma estimativa consistente com as 4.189 sondas DArT alinhadas com confiabilidade em uma posição única dentro do genoma. No entanto, o alinhamento gerado pelo programa BWA para o genoma revelou que 2.252 sondas adicionais mapearam em posições exclusivas, de modo que, no total, 6.441 locos únicos não redundantes no genoma foram obtidos através do microarranjo DArT indicando que a redundância real é muito menor do que aquela estimada pela simples comparação de sequências. Esta é a primeira vez que uma análise deste tipo foi efetuada numa espécie para a qual um microarranjo DArT e um genoma de referência estão disponíveis. Esta avaliação comprova que as estimativas de redundância baseadas em uma simples montagem de sequências de sondas DArT tendem a ser altamente conservadoras e que os marcadores DArT de Eucalyptus tem, na verdade muito baixa redundância quando avaliados em termos de posições únicas no genoma.

3.5.3. O mapa genético framework permite estimativas mais confiáveis da relação kpb/cM no genoma de Eucalyptus

Duas versões do mapa de ligação foram construídas neste estudo, cada uma com objetivos específicos. Um mapa framework foi construído como a "hipótese" que melhor explicou os dados de segregação observados, para fornecer informações mais precisas referentes ao ordenamento dos marcadores (Keats, Sherman et al. 1991; Vision, Brown et al. 2000) e para ser usado na estimativa da relação entre a distância 58

física e a fração de recombinação (Figura 3). Por outro lado, o mapa full, que incluía todos os marcadores DArT segregantes, foi construído para proporcionar uma posição preliminar para todos os marcadores DArT possíveis e, assim, permitir uma avaliação mais extensiva da cobertura do genoma e da distribuição de marcadores DArT relativa aos genes. Além disso, através da inclusão de um maior número de marcadores (mesmo com ordenamento mais permissivo), este mapa ofereceu uma melhor probabilidade de alocação dos scaffolds não ancorados aos pseudo-cromossomos do atual genoma referência de Eucalyptus. O ordenamento dos marcadores de ambos os mapas, framework e full, foi geralmente comparável e os tamanhos totais dos mapas foram também próximos (Figura 4 e Tabela 1). No entanto, conjuntos de marcadores invertidos foram observados entre estas duas versões do mapa, bem como marcadores que não mapearam quando se passou de um mapa para o outro e vice versa. Estes resultados fundamentam o fato bem conhecido de que a resolução da ordem do marcador não é uma questão trivial ainda mais quando um grande número de marcadores é mapeado com um tamanho de progênie limitado (Cheema and Dicks 2009). Esta observação também suporta o fato de que inversões semelhantes e não colinearidades relatadas em estudos anteriores de mapeamento comparativos entre espécies de Eucalyptus (Hudson, Kullan et al. 2011) são, em geral, reflexos de ordenamentos inconsistentes de marcadores devido a várias fontes de erro experimental (Hackett and Broadfoot 2003) e raramente podem ser tomadas como evidências de qualquer ocorrência biológica relevante, a menos que dados de validação independente estejam disponíveis. Com a disponibilidade de um genoma de referência para Eucalyptus, aliada a tecnologias de sequenciamento de alto rendimento e procedimentos de montagem poderosos, tais validações podem agora tornar-se possíveis.

Uma simples inspeção visual dos mapas, framework e full, alinhados (Figura 4) e a diferença significativa encontrada entre as distribuições das distâncias de mapa entre marcadores consecutivos nas duas versões de mapa (p = 0,021) (Figura 5), sustentam a conclusão de que a construção do mapa framework remove, em grande parte, conjuntos altamente clusterizados de marcadores DArT, deixando um mapa esparso com uma cobertura genômica equivalente e suporte estatístico melhorado para o

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ordenamento relativo. Além disso, quando o mapa de ligação de microssatélites e DArTs foi comparado com um mapa constituído unicamente pelo marcador co- dominante, a distância de recombinação total não foi alterada (dados não apresentados). Este resultado adicional sugere que, enquanto os microssatélites fornecem uma cobertura adequada do genoma, os marcadores DArT efetivamente cobrem o genoma em regiões não amostrados anteriormente, proporcionando assim a densidade necessária para mapeamento de alta resolução e estudos genômicos mais detalhados. O mapa framework deveria, portanto, ser tomado como o mapa mais confiável quando se trata de análise comparativa com o genoma de referência ou estudos com base em mapas (tais como procurar a co-localização de genes com potenciais QTLs de grande efeito).

O alinhamento e mapeamento físico de 869 marcadores framework, DArTs e microssatélites, nos 11 scaffolds principais da sequência genômica de Eucalyptus permitiu uma estimativa da relação entre distância física e fração de recombinação em cada pseudo-cromossomo e para todo o genoma. Esta estimativa variou consideravelmente (357-736 Kpb/cM), com uma média genômica de 513 kpb/cM (Tabela 1). Interessante observar que esta estimativa coincide com as estimativas preliminares de 395-559 kpb/cM relatadas com base nos primeiros mapas de ligação disponíveis (Grattapaglia and Sederoff 1994) e as primeiras estimativas do tamanho do genoma de Eucalyptus (Grattapaglia and Bradshaw 1994). Desta vez, contudo, utilizando a sequência do genoma no qual os marcadores framework foram mapeados fisicamente, uma estimativa melhorada foi possível. Usando uma abordagem diferente, baseada exclusivamente em um conjunto selecionado de 153 pares de marcadores flanqueadores mapeados em aproximadamente 1 cM de distância, uma estimativa de 633 kpb/cM foi proposta (Kullan, van Dyk et al. 2012). Além do potencial viés introduzido pelos pares de marcadores especificamente selecionados e, como consequência, impedindo a variação intrínseca entre distância de recombinação e distância física ao longo do genoma, esta estimativa foi baseada em marcadores ordenados com uma probabilidade permissiva. Consideramos, portanto, as estimativas apresentadas neste trabalho, tanto em nível pseudo-cromossômico como de média genômica as melhores aproximações para Eucalyptus até o momento (Tabela 1),

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apesar de reconhecer que a taxa de recombinação ao longo do genoma pode variar em ordens de magnitude (Rafalski and Morgante 2004).

3.5.4. O alinhamento do mapa genético à sequência física sugere uma característica pan-genômica do microarranjo DArT e a completude da montagem do genoma de Eucalyptus

A consistência entre a ordem dos marcadores DArT framework mapeados e sua ordem física na sequência do genoma demonstra a qualidade da montagem dos scaffolds do genoma atual de Eucalyptus (Figura 6). Enquanto o mapa de ligação relatado por Kullan et al. (Kullan, van Dyk et al. 2012) foi utilizado de forma eficaz para assistir no ordenamento de scaffolds durante a montagem do genoma (J. Schmutz, comunicação pessoal) o mapa de ligação aqui apresentado não foi, e, portanto, constitui uma validação independente do atual genoma de Eucalyptus. Além disso, do ponto de vista de completude do genoma, apenas 45 marcadores dos 2.274 mapeados não puderam ser alinhados nos 11 scaffolds principais. Por outro lado, apenas 89 sondas permaneceram fisicamente não mapeadas no genoma. Embora estes marcadores não mapeados possam corresponder a seções faltantes da montagem do genoma, também podem corresponder a sequências que não existem no genoma de E. grandis, lembrando que as 7.680 sondas do microarranjo foram desenvolvidas a partir de 18 representações genômicas envolvendo 64 espécies diferentes de Eucalyptus com uma ampla diversidade filogenética. Uma análise minuciosa da fonte original dessas 89 sondas DArT não mapeadas revelou que 65 delas vieram de bibliotecas de representação genômicas construídas com DNA de espécies diferentes de E. grandis, enquanto que 24 sondas eram provenientes desta espécie (Sansaloni, Petroli et al. 2010). No entanto, foi observado um número significativamente maior de sondas DArT com origem diferente de E. grandis, não mapeadas no genoma, do que o que seria esperado pelo simples acaso (Pearson Qui-quadrado 5,03; valor de p = 0,0249). Este resultado, em conjunto com o excelente desempenho do microarranjo em investigações filogenéticas do gênero (Steane, Nicolle et al. 2011), sugere um atributo pan-genômico único deste microarranjo DArT para Eucalyptus. Enquanto a maioria das

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sondas corresponde ao componente núcleo ("core") que envolve características genômicas comuns entre indivíduos e espécies de Eucalyptus, algumas sondas podem ser derivadas a partir do “genoma dispensável” composto de elementos de sequências de DNA parcialmente compartilhadas e/ou não compartilhadas entre as espécies (Morgante, De Paoli et al. 2007; Cao, K. Schneeberger et al. 2011).

A completude da montagem atual do genoma também foi sustentada pela observação de que, dos 85,4 Mpb de sequência não ancorada dos 4.941 scaffolds pequenos, apenas 1,4 Mpb foram capturados por 45 marcadores mapeados em 31 scaffolds e a maioria foi localizada em posições intermediárias ao longo dos grupos de ligação e não nos extremos (Tabela 2). Se a montagem do genoma fosse incompleta, seria de se esperar a captura de uma proporção consideravelmente maior de scaffolds e sequências não ancoradas. De fato, durante a montagem do genoma de Populus, Drost et al. (Drost, Novaes et al. 2009), valendo-se de um mapa de densidade média com 608 marcadores, foram capazes de ancorar 116 sequências scaffolds em posições genéticas únicas dentro dos grupos de ligação, o que estendeu o genoma em aproximadamente 35,7 Mpb de sequência dos 75 Mpb ainda não ancorados até aquele momento. Estes resultados, junto com o fato de que 86% dos 4.941 scaffolds não ancorados do genoma de Eucalyptus são menores do que 20 kpb, sugerem que a grande maioria dos scaffolds não ancorados corresponde a fragmentos de haplótipos alternativos de pseudo-cromossomos já montados, possivelmente derivados de regiões de elevada heterozigosidade no genoma do Eucalyptus e não a porções faltantes na montagem do genoma.

3.5.5. O microarranjo DArT oferece cobertura uniforme do genoma e amostra preferencialmente regiões ricas em genes

Os resultados a partir da análise de BLAST das sequências de sondas DArT no genoma de Eucalyptus (Figura 7) corroboram estudos anteriores em outras espécies vegetais relatando que marcadores DArT obtidos com base na endonuclease PstI estão predominantemente localizados em regiões do genoma de baixa cópia e ricas em genes (Akbari, Wenzl et al. 2006; Wenzl, Li et al. 2006; Tinker, Kilian et al. 2009). No 62

entanto, a possibilidade de mapear as sondas DArT em um genoma de referência anotado além de uma análise BLAST simples contra ESTs, revelou uma relação significativa entre o número de marcadores DArT e os modelos gênicos preditos (Figura 8), com uma pequena proporção de sondas DArT localizadas a mais de 10 kpb do gene mais próximo (Figura 9). Este resultado é significativo, pois pode ajudar a explicar o excelente nível de resolução que o microarranjo DArT tem proporcionado para estudos de genética populacional e melhoramento em uma ampla representação de espécies de Eucalyptus (Steane, Nicolle et al. 2011; Resende, Resende et al. 2012). Baseadas na caracterização genômica das sondas DArT relatadas neste estudo, pesquisas sobre filogenia ou genética de populações com base nestes marcadores podem agora ser realizadas explorando a proximidade dos marcadores a genes ou o conteúdo gênico de conjuntos específicos de marcadores. Como alternativa, os marcadores DArT provenientes de genes específicos podem ser selecionados a priori para reconstruções filogenéticas diferenciais. Além disso, a combinação entre a cobertura genômica fornecida e a associação predominante com o espaço gênico pode também ter contribuído para o bom desempenho do microarranjo DArT no fornecimento de marcadores para modelos preditivos precisos em estudos recentes de seleção genômica (SG) (Resende, Resende et al. 2012). Torna-se possível agora correlacionar os atributos genômicos dos marcadores DArT com suas contribuições específicas para a capacidade preditiva de modelos de SG ou para a resolução de filogenias específicas e, portanto, apontar para marcadores específicos ou segmentos genômicos de particular interesse em estudos posteriores.

3.6. CONCLUSÃO

Os resultados deste trabalho, seguindo os estudos genéticos em Eucalyptus recentemente publicados e baseados em marcadores DArT (Hudson, Kullan et al. 2011; Steane, Nicolle et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012; Resende, Resende et al. 2012), destacam o valor desta plataforma de genotipagem para pesquisas genéticas, melhoramento e evolução do genoma em espécies deste gênero. Dada a uniformidade dos métodos utilizados no desenvolvimento de microarranjos DArT, as propriedades

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genômicas dos marcadores descritos neste estudo são possivelmente comuns à maioria, se não todos, os genomas de angiospermas. A tecnologia DArT tem evoluído atualmente aproveitando o sequenciamento de alto desempenho de reads curtos (Sansaloni, Petroli et al. 2011). Ao combinar o método estabelecido de redução de complexidade do genoma, também adotado pelos protocolos recentemente descritos de genotipagem por sequenciamento (Genotyping-by-Sequencing - GbS) (Elshire, Glaubitz et al. 2011; Poland, Brown et al. 2012), um salto considerável tem ocorrido na capacidade de detecção de polimorfismos. No entanto, os atributos genômicos gerais de marcadores obtidos via GbS, assim como a cobertura do genoma e a ocorrência preferencial em regiões ricas em genes, deverão ser essencialmente os mesmos que os descritos no presente estudo. GbS, entretanto, fornece a vantagem potencial adicional de que um número muito maior de marcadores com base em counts de sequência digitais em vez do sinal analógico do microarranjo é obtido, além da possibilidade de genotipar marcadores co-dominantes SNPs. Este avanço poderá incentivar uma diminuição nos atuais custos de genotipagem em grande escala para plantas, além do que as plataformas de DArT e SNP têm feito nos últimos anos. Porém, a infraestrutura de informática necessária para manejar, armazenar e analisar os arquivos enormes de sequência gerados por GbS para milhares de amostras não será imediatamente disponível na esfera da maior parte dos programas de recursos genéticos e melhoramento de plantas. A genotipagem baseada no microarranjo DArT com seus protocolos de processamento e análise padronizados deverão, portanto, continuar a ser uma ferramenta útil para uma série de aplicações na análise genética de plantas, especialmente aquelas que não necessariamente requerem uma genotipagem de muito alta densidade.

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4. CAPÍTULO 2

MAPEAMENTO DE QTLs PARA CARACTERÍSTICAS DE IMPORTÂNCIA ECONÔMICA E ANÁLISE DO CONTEUDO GÊNICO NOS INTERVALOS GENÔMICOS CORRESPONDENTES

4.1. INTRODUÇÃO

O mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci) é uma abordagem não enviesada na qual a variação fenotípica observada é analisada frente à segregação de marcadores discretos, os quais revelam a localização de regiões genômicas que afetam a característica fenotípica mensurada. O princípio do mapeamento de QTLs é associar estatisticamente as regiões genômicas responsáveis pelo controle genético da característica com a segregação de marcadores moleculares (Jones, Ougham et al. 2009). A precisão da localização de QTLs é limitada pela informação, em particular o número de recombinantes, que é obtido a partir da observação dos genótipos dos marcadores. Estes recombinantes observados podem ser limitados pelo tamanho reduzido da amostragem e a falta de dados genotípicos (Mackay 2001; Doerge 2002). As estimativas dos efeitos de QTLs são geralmente confusas por causa da distância entre o marcador e o QTL. Este problema é minimizado quando é utilizado um mapa de alta densidade, e o QTL é localizado em intervalos mais estreitos entre marcadores adjacentes ligados (Thoday 1961; Lander and Botstein 1989). Porém, apesar dos avanços nas plataformas de genotipagem, os de QTLs detectados têm capturado proporções limitadas da variação genética. O desenvolvimento de marcadores moleculares transferíveis e o aumento do uso de pedigrees múltiplos para mapeamento de QTLs permitirão realizar análises comparativas de QTLs detectados em estudos independentes, fornecendo assim, dados de validação. A informação do posicionamento do QTL, juntamente com a disponibilidade de sequências genômicas anotadas, abre a perspectiva de identificar genes candidatos ao QTL para características complexas (Price 2006).

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Em Eucalyptus, vários estudos têm identificado QTLs de maior efeito responsáveis pelo controle de características quantitativas de importância econômica. Esses locos controladores estão envolvidos no desenvolvimento de componentes de produtividade (crescimento volumétrico e forma), qualidade da madeira (densidade básica, teor de lignina, rendimento em celulose), resistência a estresses abióticos (tolerância ao frio e à seca) e resistência a patógenos, principalmente fungos (Junghans, Alfenas et al. 2003; Freeman, O’Reilly-Wapstra et al. 2008; Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Mamani, Bueno et al. 2010; Gion, Carouche et al. 2011). Entretanto, apesar de QTLs de maior efeito terem sido mapeados, a informação gerada tem sido pouco útil para a seleção assistida por marcadores (SAM). As principais razões pelas quais estes locos não têm auxiliado de maneira eficaz os programas de melhoramento florestal foram amplamente discutidas (Grattapaglia and Kirst 2008; Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Grattapaglia and Resende 2011). Dentre esses motivos, podemos considerar a detecção limitada de variação alélica, uma vez que apenas a variação alélica dos parentais da população é amostrada; um efeito dos QTLs superestimado devido ao pequeno tamanho das populações utilizadas; e o comportamento imprevisível da interação entre alelos favoráveis aos QTLs em diferentes backgrounds genéticos, diferentes locais e idades das populações envolvidas (Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Grattapaglia and Resende 2011). Outro fator limitante na identificação e utilização efetiva de QTLs é a restrita resolução e cobertura genômica fornecida pelos marcadores moleculares. Estudos de QTL identificam regiões genômicas amplas que incluem várias centenas de genes ou elementos reguladores e, por isso, representam apenas um passo muito preliminar na identificação dos polimorfismos causantes (Grattapaglia and Kirst 2008).

Embora muitas tecnologias de marcadores moleculares tenham sido desenvolvidas com grande sucesso para Eucalyptus nas últimas décadas (Grattapaglia and Sederoff 1994; Gaiotto, Bramucci et al. 1997; Brondani, Brondani et al. 1998; Brondani, Williams et al. 2006; Grattapaglia, Silva-Junior et al. 2011; Neves, Mamani et al. 2011), todas elas apresentam limitações. Por exemplo, no caso de microssatélites, a descoberta e validação de um grande número de marcadores que cobrem o genoma inteiro é lenta porque envolve várias etapas. microssatélites e SNPs, têm um custo alto por basear-se

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em informação de sequência, embora esta tenha se tornado bem mais accessível hoje. O desenvolvimento de técnicas robustas que permitam a genotipagem de milhares de marcadores em milhares de amostras em um simples experimento resolveria grande parte das limitações mencionadas. Assim, para aplicações que demandam uma análise ampla do genoma, a tecnologia ideal deve oferecer não somente milhares de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma, mas também estes devem ser obtidos preferencialmente em um experimento único, simples e de baixo custo. Neste sentido, a metodologia DArT (Diversity Arrays Technology) foi desenvolvida para atender várias das limitações expostas por outros métodos. Descrita no ano 2001 (Jaccoud, Peng et al. 2001), esta tecnologia de genotipagem apresenta uma série de vantagens que complementam com eficiência as metodologias de análise de polimorfismo atualmente utilizadas, tais como microssatélites, AFLP e SNP. A metodologia DArT normalmente fornece sinal consistente mesmo entre espécies relacionadas, um recurso especialmente valioso em Eucalyptus. Os clones de DNA que compõem o arranjo podem ser sequenciados e as sequências compartilhadas e usadas como marcadores âncoras robustos para mapeamentos de QTL comparativos ou para explorar o genoma referência em projetos de clonagem posicional. Esta tecnologia tem mostrado resultados extremamente positivos em estudos que variam desde a obtenção de perfis genéticos para a identificação individual até a análise de diversidade (Wenzl, Carling et al. 2004; White, Law et al. 2008; Steane, Nicolle et al. 2011; Zhang, Liu et al. 2011; He and Bjørnstad 2012). Além disso, possibilita a construção rápida de mapas de ligação de alta densidade (Wenzl, Li et al. 2006; Hippolyte, Bakry et al. 2010; Milczarski, Bolibok-Bragoszewska et al. 2011; Oliver, Jellen et al. 2011; Thudi, Bohra et al. 2011), mapeamento físico, em projetos que envolvem sequenciamento dos marcadores (Paux, Sourdille et al. 2008; Rodríguez-Suárez, Giménez et al. 2012), seleção assistida por marcadores (McCartney, Stonehouse et al. 2011) e seleção genômica ampla (Crossa, Campos et al. 2010; Grattapaglia, Sansaloni et al. 2010; Resende, Resende et al. 2012). Especificamente no que refere à identificação de QTLs, este marcador dominante tem demonstrado eficiência na captura de locos ou regiões genômicas controladoras da expressão de algumas características em cevada e trigo (Bedo, Wenzl et al. 2008; Huynh, Wallwork et al. 2008; Sadeque and Turner 2010; Zhang, Dong et al. 2011).

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Como grandes pedigrees tornaram-se disponíveis e o mapeamento de alta resolução com tecnologias tais como SNPs, DArTs e Genotipagem por Sequenciamento se tornaram rotina em árvores, a informação posicional de QTLs poderia ser uma alternativa às atuais abordagens que dependem de genes candidatos tentativos para estudos de associação genética. Entre as várias características para as quais QTLs foram mapeados em espécies florestais aquelas que apresentaram maior herdabilidade, tais como composição química da madeira, são mais propensos a envolver genes candidatos de maior efeito, embora recentes estudos de associação mostrem que mesmo tais genes explicam uma proporção muito pequena da variação (Wegrzyn, Eckert et al. 2010).

Neste segundo capítulo foi utilizado um mapa genético construído com mais de 2.000 marcadores DArT e microssatélites para realizar um experimento de mapeamento de QTLs. Com base nos QTLs detectados, foi realizada uma avaliação do número de genes anotados na sequência do genoma de referência de Eucalyptus que estariam incluídos no intervalo genômico correspondente a cada QTL identificado.

4.2. OBJETIVOS

1) Construção de um mapa genético com alto suporte estatístico para ordenamento de marcadores para cada genitor da família IP (E. grandis x E. urophylla).

2) Mapeamento de QTL’s (Quantitative Trait Loci) para características de crescimento e qualidade da madeira, utilizando o mapa genético construído e os dados fenotípicos disponíveis.

3) Análise da co-localização de QTLs com genes anotados no genoma referência de Eucalyptus.

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4.3. MATERIAL E MÉTODOS

4.3.1. Material vegetal

Um total de 177 indivíduos F1 derivados do cruzamento E. grandis x E. urophylla, assim como os seus parentais foram genotipados com o microarranjo DArT para Eucalyptus como descrito recentemente (Sansaloni, Petroli et al. 2010). Esta população de mapeamento é a mesma família IP utilizada na análise do capítulo anterior, porém, o mapeamento de QTLs foi realizado a partir de 171 indivíduos pertencentes à progênie F1 desta população. Os seis indivíduos faltantes da população original genotipada não foram incluídos na avaliação devido à ausência de mensurações fenotípicas. As medições fenotípicas de sete características foram utilizadas na análise: Crescimento em Altura (CA); Diâmetro à Altura do Peito (DAP); Densidade Básica da madeira (DB); Rendimento Depurado da Celulose (RDC); Lignina Total (LT); Relação Siringil/Guaiacil (S/G) e Penetração do Pilodyn (PP), uma medida indireta de densidade da madeira. Estes dados foram levantados ao longo do projeto Genolyptus envolvendo equipes de campo e de laboratórios de diversas instituições e fornecidos para este estudo. Notadamente os dados laboratoriais de qualidade da madeira foram levantados pela equipe do Laboratório de Celulose e Papel da Universidade Federal de Viçosa e os dados de crescimento em campo pela equipe de melhoramento da Fibria S.A. no experimento montado em Guaíba, RS aos 3 anos de idade.

4.3.2. Construção dos mapas e detecção de QTLs

Marcadores DArT foram combinados com microssatélites e um novo mapa de ligação foi construído para cada parental da família IP usando o software JoinMap v3.0 (Van Ooijen and Voorrips 2001). Ambos os mapas parentais foram montados com os mesmos critérios e valores limiares para cada parâmetro usados pelo software na produção do primeiro mapa (ver capítulo 1). Um mapeamento de QTLs para cada característica foi conduzido nos mapas parentais de maneira individual através do

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método de mapeamento por Marca Simples, Intervalo Simples e Intervalo Composto, recursos disponíveis no software para Windows QTL Cartographer versão 2.5 (Wang, Basten et al. 2007). Para cada característica foi adotado um nível de significância de 5% com base em um teste envolvendo 1.000 permutações de acordo com o procedimento descrito por Churchill e Doege (1994) (Churchill and Doerge 1994) e implementado no QTL Cartographer. Isto permitiu determinar o LOD mínimo para detectar significância nas análises.

O mapeamento de intervalos utiliza um par de marcadores como unidade de análise ao invés de um marcador somente (Lander and Botstein 1989). O mapeamento por Intervalo Simples (IS) delimita um intervalo entre dois marcadores onde o programa realiza as análises na busca de um QTL. Valores de LOD são gerados dentro do intervalo a cada 1 cM e comparados com o LOD obtido por meio de permutações. No mapeamento por Intervalo Composto (IC), além do intervalo considerado na análise, são considerados também os outros QTLs presentes, ou seja, a correlação não é independente da existência de outros QTLs. Na análise de IC a escolha de cofatores, marcadores supostamente ligados a QTLs a serem incluídos como variáveis independentes no modelo de regressão múltipla, foi feita através de uma regressão step-wise (método “forward”). O número de cofatores variou para cada característica, de acordo com a recomendação de Zeng (1994) (Zeng 1994) de se testar múltiplos modelos para encontrar aquele que possui o melhor balanço entre os erros tipo I e II. Para todas as características foram feitas análises utilizando 5 e 8 cofatores através do modelo 6 do QTL Cartographer. Com isso, escolheu-se, para cada característica, o modelo cujo valor de cofator proporcionou o maior número de QTLs com maiores significâncias estatísticas (maiores valores de LOD).

4.4. RESULTADOS

4.4.1. Correlação entre as características fenotípicas

A partir dos dados coletados no campo para as características de crescimento e os dados de qualidade da madeira gerados no laboratório, foram estimados os valores

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genéticos (VG) de cada uma das características. A análise estatística foi realizada por meio de um modelo misto no qual foram considerados os seguintes fatores: (1) super bloco – efeito aleatório; (2) blocos dentro de superblocos – efeito aleatório; (Brown, Kadel et al. 2001), falhas nas linhas, colunas e diagonais – todas efeitos aleatórios; (4) famílias – efeito fixo; (5) genótipos dentro de famílias – efeito aleatório. Seis dos indivíduos amostrados na genotipagem não foram fenotipados para as características avaliadas neste estudo. Na tabela 4 são apresentadas as estatísticas descritivas para as características fenotípicas avaliadas nos 171 irmãos-completos da família. As estatísticas descritivas contêm os valores máximos e mínimos, média, variância, desvio padrão e coeficiente de variação.

Tabela 4. Estatísticas descritivas das características fenotípicas avaliadas na população de mapeamento de 171 irmãos-completos.

Caraterísticas Máximo Mínimo Média Variância Desvio Coeficiente padrão de variação

DB (Kg/m3) 469,5 429,0 448,3 70,3 8,4 0,018

Altura (m) 12,2 8,1 10,4 0,6 0,8 0,075

DAP (cm) 12,3 7,2 9,9 1,0 1,0 0,010

RDC (%) 56,6 50,9 53,4 0,7 0,8 0,015

LT (%) 27,2 22,9 25,4 0,5 0,7 0,027

S/G 2,9 2,0 2,4 0,0 0,2 0,065

Pilodyn (mm) 23,8 18,7 21,1 1,0 1,0 0,048

DB - densidade básica da madeira; DAP – diâmetro à altura do peito; RDC – rendimento depurado de celulose; LT – teor de lignina total; S/G – relação siringil/guaiacil; Pilodyn – penetração do Pilodyn.

4.4.2. Mapas genéticos e detecção de QTL (Quantitative Traits Loci)

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A detecção de QTLs foi realizada usando um mapa de ligação genética framework construído para cada parental com alto suporte de verossimilhança (LOD > 3.0) para ordenamento dos marcadores dentro dos grupos de ligação. O mapa materno (E. grandis) teve um total de 825 marcadores (684 DArTs + 141 microssatélites) mapeados, cobrindo 1.993,63 cM do genoma. Já o mapa paterno (E. urophylla) constituiu-se de 511 marcadores (410 DArTs + 101 microssatélites), com um tamanho total de recombinação de 1.381,92 cM, ambos os mapas formados por 11 grupos de ligação consistente com o número de cromossomos da espécie e numerados de acordo com o mapa de referência (Brondani, Williams et al. 2006).

Conforme esperado, a densidade de marcadores do mapa construído para análise de QTLs cobriu boa parte do genoma. O fato de haver 314 (62%) marcadores segregando no parental G38 a mais em relação ao U15 é um indicativo de uma maior heterozigosidade no genitor E. grandis. Isso por sua vez resultou em maior cobertura genômica no mapa genético de G38 (1.993,63 cM) em relação a U15 (1.381,92cM), devido ao maior número de locos segregantes. Porém, isto aparentemente não teve reflexo no número de QTLs detectados no mapa de cada genitor (18 para G38 e 17 para U15), o que poderia ser explicado pela distribuição uniforme dos marcadores nos mapas individuais.

Nesta população segregante, 18 QTLs foram detectados em E. grandis, enquanto que um conjunto de 17 QTLs foi identificado em E. urophylla associados às características de crescimento e qualidade da madeira avaliadas via mapeamento por intervalo composto (IC) (Tabela 5). Detectou-se pelo menos um QTL em cada grupo de ligação (GL), com exceção do GL11 no qual não foram identificados QTLs em nenhum dos mapas parentais. Sobre o GL8 foram localizados sete QTLs, um deles para Crescimento em Altura, dois para Densidade Básica, dois locos associados à Lignina Total e outros dois para a relação Siringil/Guaiacil, quatro deles pertencentes ao mapa materno e três ao paterno, sendo, portanto o grupo de ligação com o maior número de QTLs posicionados. Para todas as sete características avaliadas, pelo menos um QTL foi detectado. Especificamente Lignina Total foi a característica para a qual foi detectado o maior número de QTLs, oito em total, cinco de origem materna e três de origem paterna.

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Tabela 5. Sumário das informações dos QTLs detectados por Intervalo Composto pela estratégia de pseudo-cruzamento teste. Estão discriminados os genitores, os grupos de ligação e a posição dentro do grupo onde os locos foram detectados, bem como seus valores de LOD e estimativa da porcentagem da variação fenotípica explicada pelos QTLs.

Característica Genitor Grupo de Posição (cM) LOD Variação ligação explicada (%)

CA G38 1; 2; 6 76; 59; 21 3,4; 3,6; 3,8 6.7; 8.2; 7.3

U15 7; 8; 10 104; 123; 42 3,7; 3,7; 5,3 6,7; 6,9; 10,4

LT G38 1; 3; 4; 5; 8 2; 126; 77; 3,4; 3,8; 3,4; 5,5; 8,6; 5,5; 68; 143 6,5; 4 10; 6

U15 3; 4; 8 39; 51; 189 3,9; 3,9; 3,1 7,7; 7,9; 5,8

S/G G38 1; 5; 8 1; 31; 15 4,1; 4,2; 3,8 8,1; 8,1; 7,1

U15 8; 9 69; 61 3,5; 4,5 11,6; 27,8

RDC G38 4; 5 73; 69 4,7; 6,2 9,3; 22,4

U15 1; 4; 9 131; 53; 0.2 3.4; 4,2; 3 5,9; 8,5; 6

DB G38 6; 8; 10 98; 0.01; 26 6,1; 5,1; 5,6 10,9; 10,3; 11,3

U15 8 73 4,5 9,3

DAP U15 7; 10 104; 42 3,3; 3,9 6; 7,5

PP G38 1; 2 105; 133,36 3,4 18,0; 21,22

U15 1; 2; 10 68; 117; 42 3,2 19,65; 15,44; 18,94

As características analisadas aqui são: Crescimento em Altura (CA); Teor de Lignina Total (LT); relação Siringil/Guaiacil (S/G); Rendimento Depurado de Celulose (RDC); Densidade Básica (DB); Diâmetro à Altura do Peito (DAP) e Penetração do Pilodyn (PP). Os parentais estão representados pelo nome da amostra, sendo G38 é o genitor materno (E. grandis) e U15, o genitor paterno (E. urophylla).

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Foram encontradas correlações fenotípicas significativas (p < 0,01) entre Diâmetro à Altura do Peito e outras duas características, uma correlação altamente positiva com

o Crescimento em Altura (rxy = 0,78) e uma menor com o teor de Lignina Total (rxy = 0,25). Por sua vez a Lignina Total também está correlacionada positivamente com

Crescimento em Altura (rxy = 0,20), porém a correlação foi negativa com a relação

Siringil/Guaiacil (rxy = -0,59), densidade básica (rxy = -0,37) e com o Rendimento

Depurado de Celulose (rxy = -0,85), sendo esta a maior correlação encontrada. Outra correlação positiva esperada ocorreu entre Siringil/Guaiacil e o Rendimento Depurado

de Celulose (rxy = 0,40) e também com a Densidade Básica (rxy = 0,51). Finalmente e com um alto grau de significância, a capacidade de penetração do Pilodyn foi correlacionada com outras três características de crescimento: correlação positiva com

o diâmetro à altura do peito (rxy = 0,59) e o Crescimento em Altura (rxy = 0,32); e

correlação negativa com a densidade básica (rxy = -0,29) (Tabela 6).

Tabela 6. Correlação de Pearson entre caraterísticas de crescimento e qualidade da madeira. DAP: diâmetro à altura do peito, CA: Crescimento em Altura, LT: lignina total, S/G: relação Siringil/guaiacil, RDC: rendimento depurado de celulose, DB: densidade básica, PP: penetração de pilodyn.

DAP CA LT S/G RDC DB PP

DAP 1

CA 0.7806** 1

LT 0.2533** 0.2034** 1

S/G -0,1157 a -0,0711 a -0.5872** 1

RDC -0,1064 a -0,0722 a -0.8482** 0.4012** 1

DB -0.2068** -0,1456 a -0.3757** 0.5152** 0.1697* 1

PP 0.585** 0.3248** 0.0478 -0,0262 0,0752 -0.2943** 1

*P<0.05; **P<0.01; a não significativo.

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A seguir serão descritos os QTLs identificados pela estratégia de mapeamento por intervalo composto (IC) para cada uma das sete características avaliadas na família de irmãos completos de E. grandis x E. urophylla analisada neste estudo. Estimativas da proporção de variação fenotípica explicada por cada QTL foram também realizadas com uma análise de intervalo de mapa usando o software Cartographer v2.5 (Wang, Basten et al. 2007).

4.4.3. Detecção de QTLs para densidade básica da madeira

A densidade básica é uma medida relacionada com o crescimento secundário da madeira, e também indica a qualidade que esta possui e consequentemente é uma característica de grande interesse econômico para o setor florestal. Quanto maior a densidade menor é a porosidade da madeira e, portanto, maior tende a ser o seu conteúdo de celulose. Porém, a lignina também contribui para a densidade da madeira e, portanto, nem sempre uma madeira mais densa reflete uma matéria-prima de qualidade superior para a indústria de celulose. A média obtida pela população segregante avaliada para densidade básica da madeira foi de 448,3 Kg/m3, com desvio padrão de 8,4 Kg/m3.

Quatro QTLs foram detectados como altamente significativos para Densidade Básica da madeira em três grupos de ligação (Figura 10). Três dos QTLs significativamente associados à característica foram identificados no mapa materno (E. grandis), nos grupos de ligação GL6, GL8 e GL10. No mapa paterno (E. urophylla), um único QTL foi detectado, no GL8. Para o mapa materno determinou-se que os QTLs mapeados explicavam 10,9% (GL6), 10,3% (GL8) e 11,33% (GL10) da variação fenotípica, enquanto que o QTL correspondente ao mapa paterno explicou 9,3% (GL8) da variação em densidade básica da madeira.

75

A

B

76

C

D

Figura 11. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer apresentando os QTLs para densidade básica da madeira mapeados por intervalo composto nos grupos de ligação 6 (A), 8 (B) e 10 (C) no genoma do parental materno G38. Em D é mostrado o QTL detectado no grupo de ligação 8 no parental U15. Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,5.

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4.4.4. Detecção de QTLs para crescimento em altura

A característica Crescimento em Altura determina em grande parte o crescimento volumétrico final das árvores. Na população segregante do presente trabalho, aos três anos de idade as árvores tiveram altura média de 10,4 m, com desvio padrão de 0,8 m.

Para esta característica foram detectados seis QTLs através do mapeamento por Intervalo Composto (Figura 11), metade deles no genoma materno e a outra metade no genoma paterno. Os locos identificados em E. grandis localizaram-se no GL1, GL2 e GL6, e explicaram 6,7%, 8,2% e 7,3% da variação da Altura, respectivamente. Os três QTLs identificados no genoma de E. urophylla foram localizados nos grupos GL7, GL8 e GL10, explicando 6,7%, 6,9% e 10,4% da variação fenotípica desta carasterística, respectivamente.

A

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B

C

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D

E

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F

Figura 12. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer apresentando os três QTLs para altura da árvore mapeados por intervalo composto nos grupos de ligação (GL) 1 (A), 2 (B) e 6 (C) no genoma do parental materno G38. No parental U15 foram detectados outros três QTLs nos GL 7 (D), 8 (E) é 10 (F). Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,3 para G38 e 3,1 para U15.

4.4.5. Detecção de QTLs para diâmetro à altura do peito

Esta característica também participa diretamente da determinação do crescimento volumétrico das árvores. Quanto maior o diâmetro das árvores, maior tende a ser o volume final de madeira. Na população segregante do presente trabalho, as árvores tiveram um DAP médio de 9,9 cm, com desvio padrão de 1,0 cm.

Foram detectados dois QTLs (Figura 12), este foram localizados no GL7 e no GL10 apenas no genoma paterno (E. urophylla). O QTL identificado no GL7 explicou 6,0% da variação no DAP dentro desta população, enquanto que o loco situado no GL10, explicou 7,5%.

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A

B

Figura 13. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os QTLs para diâmetro das árvores à altura do peito (DAP) mapeados por intervalo composto nos grupo de ligação 7 (A) e 10 (B) no genoma do parental U15. Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,1.

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4.4.6. Detecção de QTLs para rendimento depurado de celulose

O rendimento depurado medido percentualmente refere-se à proporção de celulose gerada no final da polpação em relação à quantidade inicial de madeira utilizada no inicio do processo em relação peso/peso. Esse é um dos atributos mais importantes para a indústria de celulose, pois é uma medida que consolida diversos componentes físicos e químicos da madeira que, juntos, impactam o rendimento final de produção de celulose. Na população segregante do presente trabalho, o rendimento da polpa de celulose médio foi de 53,4% com um desvio padrão de 0,8%.

Para esta importante característica foram identificados dois QTLs (Figura 13), localizados nos grupos GL4 e GL5 no do genoma de E. grandis. Estes QTLs explicaram respectivamente 9,3% e 22,4% da variação fenotípica da característica dentro da população segregante. No genoma de E. urophylla foram três os QTLs localizados nos grupos GL1, GL4 e GL9. O QTL pertencente ao GL1 explicou 5,9% da variação em relação ao rendimento de celulose, enquanto que o QTL mapeado no GL4 explicou 8,5% , e o do GL9, 6,0% da variação de dita característica.

A

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B

C

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D

E

Figura 14. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os QTLs para rendimento depurado de celulose mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 4 (A) e 5 (B). No genoma do parental U15 foram detectados QTLs nos GL 1 (C), 4 (D) e 9 (E). Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,2 para G38 e 3,0 para U15.

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4.4.7. Detecção de QTLs para teor de lignina total da madeira

A lignina é, depois da celulose, o constituinte mais abundante da madeira. Para a produção de polpa celulósica, é necessária a desagregação das microfibras de celulose. A lignina pode ser um agente permanente de ligação entre as células e necessita ser eliminada no processo de polpação, exigindo uma grande quantidade de energia e reagentes nocivos ao ambiente para sua solubilização. Além disso, a lignina também dificulta as operações de branqueamento da polpa celulósica. Porém, é importante destacar que lignina extraída durante a polpação é utilizada como energia para realimentar o processo. Tudo isso faz do teor de lignina da madeira um dos atributos mais importantes na definição da qualidade da madeira para a indústria de celulose. Na população segregante do presente trabalho, o teor de lignina total médio foi de 25,4%, com um desvio padrão de 0,7%.

Para esta característica foram detectados oito QTLs (Figura 14), cinco dos quais estavam presentes no mapa do genitor E. grandis e três no mapa do genitor E. urophylla. Os QTLs maternos foram identificados nos grupos de ligação GL1, GL3, GL4, GL5 e GL8, cada um explicando respectivamente 5,5%, 8,6%, 5,5%, 10,0% e 6,0% da variação de lignina total. Os QTLs do genoma paterno localizaram-se nos grupos de ligação GL3, GL 4 e GL8, cada um deles foi estimado como responsável por 7,7%, 7,9% e 5,8%, da variação fenotípica da característica, respectivamente.

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A

B

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C

D

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E

F

89

G

H

Figura 15. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os QTLs para teor de lignina total mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A), 3 (B), 4 (C), 5 (D) e 8 (E). No genoma do parental U15 foram detectados QTLs nos GL 3 (F), 4 (G) e 8 (H). Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,3 para G38 e 3,0 para U15.

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4.4.8. Detecção de QTLs para a relação Siringil/Guaiacil

O siringil e guaiacil são dois monolignois, ou seja, alcoóis componentes da lignina. A relação entre esses dois alcoóis é fundamental para determinar a reatividade da lignina. O siringil, por não possuir o carbono C5 disponível para reação, faz com que as estruturas de lignina siringil sejam menos condensadas e, consequentemente, mais favoráveis ao ataque pelo álcali. Assim, quanto maior a relação siringil/guaiacil maior é a reatividade da lignina e, portanto, mais fácil será a sua extração no processo de polpação (Gomide, Colodette et al. 2005). Pela importância da lignina no fornecimento de energia para alimentar o processo de polpação, o grande alvo das pesquisas nas áreas de melhoramento e biologia molecular tem sido o aumento na relação siringil/guaiacil e não a redução do teor de lignina total da madeira. Na população segregante do presente trabalho, a relação siringil/guaiacil média foi de 2,4 com desvio padrão de 0,2.

Foram detectados cinco QTLs para a característica relação siringil/guaiacil nesta população interespecífica (Figura 15). A partir do mapa materno foram identificados três QTLs nos grupos de ligação GL1, GL5 e GL8, enquanto os outros dois QTLs eram de origem paterna e estavam posicionados nos grupos GL8 e GL9. Os locos que pertenciam ao mapa E. grandis explicaram 8,1%, 8,1% e 7,1% da variação fenotípica desta característica. No mapa de E. urophylla determinou-se que os QTL explicavam 11,6% (GL8) e 27,8% (GL9) da variação fenotípica para a relação entre este dois alcoóis.

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A

]

B

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C

D

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E

Figura 16. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os QTLs para relação Siringil/Guaiacil da madeira mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A), 5 (B) e 8 (C). No genoma do parental U15 foram detectados QTLs nos GL 8 (D), 9 (E). Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,4 para G38 e 3,2 para U15.

4.4.9. Detecção de QTLs para densidade da madeira medida pela profundidade de penetração do Pilodyn.

Esta densidade foi medida através da penetração na madeira de um elemento metálico do equipamento Pilodyn. A penetração da haste desse instrumento é utilizada como uma medida indireta da densidade básica da madeira. Quanto maior a penetração dessa haste na madeira, menor é a densidade. Na população segregante do presente trabalho, a profundidade média de penetração do Pilodyn foi de 21,1 mm, com desvio padrão de 1,0 mm.

Foram detectados cinco QTLs (Figura 16), dois deles a partir do genoma do genitor E. grandis e três a partir do genitor E. urophylla. Os locos pertencentes ao mapa

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materno foram detectados nos grupos GL1 e GL2, estes dois QTLs explicavam, respectivamente, 18,0% e 21,22% da variação nos valores da característica medida. Aqueles locos identificados no mapa paterno foram mapeados nos grupos GL1, GL2 e GL10, respondendo respectivamente por 19,7%, 15,4% e 18,9% da variação fenotípica em densidade medida pela penetração do Pilodyn.

A

B

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C

D

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E

Figura 17. Gráficos gerados pelo programa QTL Cartographer demonstrando os QTLs para penetração do Pilodyn na madeira mapeados por intervalo composto no parental G38 nos grupos de ligação 1 (A) e 2 (B). No genoma do parental U15 foram detectados QTLs nos GL 1 (D), 2 (E) e 10 (E). Eixo Y: valor de LOD; Eixo X: intervalo entre os marcadores do grupo de ligação. O valor de LOD definido pelo teste de permutação com 5% de significância foi de 3,4 para G38 e 3,2 para U15.

4.4.10. Co-localização dos QTLs para diferentes características

Para todas as sete características fenotípicas analisadas foi detectado pelo menos um QTL pelo método de intervalo composto (IC). Na figura 17 pode ser observada a disposição de todos os QTLs identificados em ambos os mapas parentais, assim como a co-localização, com coberturas diferentes, destes locos nos respectivos grupos de ligação. No mapa de E. grandis (G38), três QTLs para teor de Lignina Total foram mapeados nas mesmas posições que um QTL para a relação S/G no GL1 e QTLs para Rendimento Depurado de Celulose (RDC) nos GL4 e GL5. No mesmo mapa parental, outro loco associado à relação S/G foi co-localizado com um QTL relacionado com a Densidade Básica da madeira (GL8). No mapa paterno E. urophylla (U15), o QTL para

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RDC no GL4 foi co-localizado com um QTL associado ao teor de Lignina Total, coincidindo com o resultado do mapa materno. Mesmo evento se observou entre os QTLs para relação S/G e Densidade Básica da madeira. Outro QTL para S/G co-localizou com QTL para RDC no GL9. Por outro lado, os dois QTLs que influenciam o Diâmetro à Altura do Peito foram co-localizados com dois dos três QTLs associados ao Crescimento em Altura (GL7 e GL10). No GL10, observaram-se, uma tripla sobreposição entre QTLs (Diâmetro à Altura do Peito – Crescimento em Altura – Penetração de Pilodyn).

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G38-1 G38-2 G38-3 G38-4 U15-1 U15-2 U15-3U15 - 2 U15-4 U15-7 G38-1 G38-2 0.0 G38U15-1G38-3ePt-572240 - 2 U15-2 G38-4 U15-3 U15-4 U15-7 9.8 ePt-641565 13.0 ePt-574111 0.0 ePt-572240 ePt-569565 14.7 0.0 ePt-575721 9.8 ePt-641565 ePt-569253 15.4 1.4 ePt-641216 13.0 ePt-574111 ePt-641261 16.819.0 ePt-642222 14.7 ePt-575721 21.2 ePt-503235 0.0 ePt-569565 22.5 ePt-565390 0.0 15.4ePt-504928ePt-641216 24.8 ePt-564654 0.0 ePt-644188 1.4 ePt-569253 24.7 ePt-504760 0.5 16.8ePt-569798ePt-642222 28.3 ePt-599612 ePt-574889 ePt-639639 19.0 ePt-641261 26.1 ePt-575337 2.5 22.5ePt-566484ePt-5653903.2 0.0 ePt-504928 38.2 ePt-568757 ePt-504032 21.2 ePt-503235 31.1 ePt-572740 3.7 24.7ePt-636787ePt-5047604.2 ePt-568037 0.5 ePt-569798 60.6 ePt-573042ePt-644188 24.8 ePt-564654 40.8 0.0ePt-573142 4.1 26.1ePt-564313ePt-575337 ePt-504240 ePt-5992382.5 ePt-566484 73.9 ePt-570523ePt-574889 ePt-639639 28.3 ePt-599612 43.5 embra058 31.1ePt-565107ePt-5727405.0ePt-564336ePt-575444 3.7 ePt-636787 78.83.2 ePt-505067ePt-504032 4.2 38.2 ePt-568757 44.6 embra068 40.8ePt-575612ePt-573142ePt-573880ePt-567907 ePt-5757694.1 ePt-564313 103.5 eg096ePt-568037 5.9 60.6 ePt-573042 54.9 4.2ePt-566007 4.3 43.5ePt-569670embra058 ePt-642886 ePt-565107 ePt-564336 107.4 embra1810ePt-504240 ePt-599238 4.2 G38 - 1 73.9 ePt-570523U15 - 1 56.2 5.0ePt-564663 44.6ePt-641503embra0686.6ePt-639682ePt-565213 ePt-575612 ePt-573880 0.0 ePt-572142 108.9 embra648ePt-575444 4.4 78.8 ePt-505067 57.1 ePt-504109 54.9ePt-565046ePt-566007 ePt-571738 ePt-6375794.3 ePt-569670 5.3 ePt-572591 111.4 ePt-563003ePt-567907 ePt-575769 6.8 103.5 eg096 61.6 5.9ePt-569562 56.2ePt-599344ePt-564663ePt-642207ePt-637309 ePt-573801 ePt-641503 ePt-639682 6.4 ePt-571996 112.0 ePt-562922ePt-642886 7.0 4.4 107.4 embra1810 61.7 ePt-564805 57.1ePt-640620ePt-5041097.0 ePt-642915 ePt-565046 7.4 ePt-642984 113.26.6 ePt-600466ePt-565213 0.0 ePt-572142 108.9 embra648 61.8 ePt-572571 7.1 61.6ePt-599676ePt-56956219.8ePt-567046ePt-599719 ePt-599344 ePt-642207 9.1 ePt-572242 ePt-643754ePt-566429ePt-571738ePt-638845ePt-637579 7.0 5.3 ePt-572591 111.4 0.0ePt-563003ePt-565025 62.3114.66.8 7.2 61.7ePt-566788ePt-564805 ePt-574932 ePt-641758 ePt-640620 10.9 ePt-571182 ePt-642027ePt-637309ePt-565902ePt-573801 24.0 6.4 ePt-571996 112.0 1.7ePt-562922ePt-573410 65.4 ePt-503732 11.4 61.8ePt-574680ePt-572571 ePt-599559 7.1 ePt-599676 ePt-5670460.0 ePt-599651 16.1 ePt-638597 116.67.0 ePt-569525ePt-642915 7.4 ePt-642984 113.2 13.1ePt-600466ePt-642731 65.8 ePt-600458 12.9 62.3ePt-599848ePt-64375431.4 ePt-638583 7.2 ePt-566788 2.2 embra213 17.5 ePt-570448 122.419.80.0 ePt-565025embra201ePt-599719 9.1 ePt-572242 19.2ePt-566429ePt-567557ePt-638845 65.9 ePt-563498 20.3 65.4ePt-570173ePt-50373234.0 ePt-643521 11.4 ePt-574680 4.7 embra179 114.6 20.3 ePt-570932 125.91.7 ePt-573410embra027ePt-574932 ePt-641758 10.9 ePt-571182 30.9ePt-642027ePt-574533ePt-565902 66.0 24.0ePt-568161 20.5 65.8ePt-599773ePt-60045834.5 ePt-642943 12.9 ePt-599848 10.2 ePt-636922 ePt-642939 26.1 ePt-572976 128.913.1 ePt-642731ePt-600083ePt-599559 0.0 ePt-599651 16.1 ePt-638597 116.6 31.2ePt-569525ePt-573052 66.6 ePt-504595 20.6 65.9ePt-641822ePt-56349838.9 ePt-638546 ePt-63696920.3 ePt-570173 10.7 ePt-637670 ePt-638706 33.4 ePt-569501 129.219.231.4 ePt-567557ePt-564786ePt-638583 2.2 embra213 17.5 ePt-570448 122.4 39.6embra201ePt-571540 66.9 ePt-599598 66.0ePt-562970ePt-56816140.8ePt-638730ePt-600457 20.5 ePt-599773 ePt-573124 ePt-599408 61.7 ePt-568150 129.830.934.0 ePt-574533ePt-565163ePt-643521 20.7 4.7 embra179 0.0 embra078 13.9 20.3 ePt-570932 125.9 44.0embra027ePt-565684 71.1 ePt-567864 66.6ePt-572329ePt-50459541.6 embra122 20.6 ePt-641822 ePt-638013 65.8 ePt-600019 132.331.234.5 ePt-573052ePt-600397ePt-642943 10.2 ePt-636922 ePt-6429390.8 embra1122 26.1 ePt-572976 128.9 46.9ePt-600083ePt-641705 71.5 ePt-563204 26.4 66.9ePt-566054ePt-59959842.6 embra361 ePt-562970 ePt-63873021.2 eg128 ePt-565892 ePt-640846 137.439.638.9 ePt-571540embra333ePt-638546 ePt-636969 10.7 ePt-637670 ePt-63870620.76.8 ePt-643630 33.4 ePt-569501 129.2 50.3ePt-56478666.4 ePt-575598 72.9 ePt-637076 ePt-570424 27.6 71.1ePt-571509ePt-567864 embra350 ePt-572329 24.0 ePt-5992830.0 embra078 ePt-575150 138.544.0 ePt-565684ePt-599556ePt-600457 43.9 ePt-573124 ePt-59940810.0 ePt-503766 ePt-568150 129.8 ePt-565163ePt-642989 73.5 40.8ePt-574930 28.8 71.5ePt-575039ePt-56320413.9 26.4 ePt-566054 40.1 embra19440.8 embra1122 61.7 56.6 140.546.9 ePt-641705ePt-563425 45.6 ePt-640230ePt-638013 ePt-636515 132.3 ePt-600397ePt-503701 ePt-504723 73.7 41.6ePt-573117embra122 30.9 72.9ePt-565437ePt-637076 ePt-570424 27.610.6 ePt-571509 42.5 embra645 6.8 ePt-643630 65.8 ePt-600019 71.0 ePt-564452 ePt-565647 50.3 ePt-575598ePt-566607 47.1 21.2ePt-643596eg128 LT ePt-637966 141.842.6ePt-563231embra361 11.3 ePt-638422 ePt-503766 ePt-565892 ePt-640846 S/G 137.4 embra333ePt-638607 ePt-563830 74.3 31.2 73.5ePt-504319ePt-57493048.7 ePt-636978 28.8 ePt-575039 44.3 embra33210.0 ePt-637022 ePt-636685 143.556.6 ePt-642989ePt-571180embra350 24.0 ePt-599283 ePt-568117 ePt-641184 ePt-568676 66.4 ePt-575150 138.5 ePt-59955671.1 ePt-599942 ePt-504436 74.6 43.9ePt-569673 34.8 73.7ePt-569064ePt-573117 30.9 ePt-565437 47.6 embra150710.60.0 ePt-636515 62.1 145.9 ePt-564452embra072 ePt-565647 49.9 40.1eg098embra1944 ePt-642508 ePt-570649 140.5 ePt-56342574.4 ePt-599639 45.6ePt-504602ePt-640230ePt-641713 34.9 74.3ePt-568368ePt-563231ePt-639473 31.211.4 ePt-504319 53.9 ePt-57373711.3 ePt-638422 ePt-503701 ePt-504723 ePt-600664 ePt-638369 74.7148.2 ePt-638607ePt-566850ePt-563830 51.7 42.5embra286embra645 71.0 ePt-56660774.9 ePt-571015 ePt-643108 47.1ePt-571763ePt-643596ePt-503249 35.0 74.6ePt-599385ePt-569673 ePt-569064ePt-600106 ePt-563377 ePt-64017513.9 ePt-568117ePt-574475ePt-641184 0.0 ePt-568676 LT ePt-637966 141.8 ePt-505124 ePt-570633 ePt-599942 ePt-504436 61.0 embra1007 34.8 54.0 S/G 76.5 ePt-569944 149.762.148.7ePt-503994embra063ePt-636978 44.3 embra332 ePt-600655 ePt-563643 ePt-642508 ePt-570649 71.1 ePt-637022 ePt-636685 143.5 70.0ePt-571180embra219 74.8 38.8 ePt-637889ePt-50460262.2 ePt-641713ePt-642546 34.9 ePt-568368 ePt-63947355.0 embra00411.4 77.7 embra147 150.949.9 ePt-600664ePt-570024eg098 ePt-638369 74.7 47.6 embra1507 11.9 ePt-639668 ePt-641290 31.6 ePt-575564 74.4 ePt-599639 145.9 78.9embra072embra934 74.9 ePt-503604 45.5 embra361ePt-571763 ePt-503249embra1071 35.0 ePt-599385 58.2 embra078 ePt-600106 ePt-563377 13.9 ePt-574475 CA 64.2 83.3 embra006 152.951.7 ePt-505124embra110embra286 ePt-570633 53.9 ePt-573737 ePt-562875 ePt-570286 31.9 ePt-568630 74.9 ePt-571015 ePt-643108 148.2 84.0ePt-566850embra012 75.1 ePt-642609 46.2 74.8embra239ePt-503994 ePt-570223 ePt-50450638.8 ePt-637889 61.2 ePt-639711 ePt-600655 ePt-563643 ePt-571510 153.470.0 embra219embra898 66.0 54.0 ePt-640175 ePt-637551 52.3 ePt-573624 31.6 ePt-575564 86.0 75.2 61.0ePt-570809embra1007 LT 46.9 embra122ePt-503604 12.0 11.9 ePt-639668 ePt-641290 76.5 ePt-569944 149.7 87.5embra063embra632 78.9 embra934 74.9 66.9 ePt-569297 45.5 embra361 LT 63.3 embra186 ePt-574390 ePt-571262 CA 59.2 86.5 ePt-642723 ePt-570597 155.262.2ePt-570657embra043ePt-642546 55.0 embra004 18.0 ePt-599702RDC ePt-562875 ePt-570286 31.9 ePt-568630 77.7 embra147 150.9 95.3ePt-570024embra070 75.5 47.8 75.1embra350ePt-64260967.0 ePt-504274 ePt-57514646.2 embra239 ePt-567897 ePt-574589 90.9 embra2000 156.084.0 embra012embra915embra1071 58.2 embra078 21.5 ePt-504594 65.8 61.6 ePt-503656 52.3 ePt-573624 CA 64.2ePt-573566 ePt-637551 76.8 ePt-570275 LT 12.0 83.3 embra006 152.9 100.6embra110embra180 87.5 embra632 49.5 75.2 ePt-57080967.2 ePt-570043 LT 46.9 embra122 ePt-643706 RDC 61.7 ePt-641995 92.0 embra1627 76.9156.866.0ePt-570261embra172ePt-570223 ePt-504506 51.0 ePt-638285ePt-57065761.2 ePt-639711 45.2 eg128 18.0 ePt-599702 59.2 ePt-574390 ePt-571262 86.0 ePt-571510 153.4 101.9embra898ePt-636576 95.3 embra070 75.5 ePt-567660 ePt-64111647.8 embra350 69.4 ePt-56715971.2 ePt-637768 98.7 embra070 77.0159.466.9ePt-504852embra126ePt-569297 ePt-64006867.5LT 63.3 embra186 46.2 ePt-563144 21.5 ePt-504594 61.6 ePt-503656

CA 51.5 155.2 embra043 76.8 RDC ePt-573566 ePt-570275 ePt-570753 86.5 ePt-642723 ePt-570597 107.5 ePt-566342 ePt-504519 100.6 embra180 ePt-570139ePt-567897ePt-565405ePt-57458949.5 69.5 LT 79.9 embra1761 101.5 embra180 161.067.0ePt-573877embra1332ePt-504274 ePt-575146 56.3 ePt-573339 RDC eg128 61.7 ePt-641995 embra2000 PP 156.0 embra915ePt-570414 77.2 51.7 76.9ePt-571501ePt-57026165.8 51.0 ePt-638285 70.1 ePt-60052745.2 90.9 110.1 101.9171.1 ePt-636576ePt-565990 ePt-563419 68.6 ePt-567122ePt-643706 embra213 87.4 embra128 71.2 ePt-637768 156.8 embra172103.4 embra219 77.3 67.2ePt-640566ePt-570043 51.8 77.0ePt-641628ePt-504852 51.557.4 ePt-640068 72.7 ePt-57283646.2 ePt-563144 92.0 embra1627 110.5 ePt-566798 107.5171.2 ePt-566342ePt-600542ePt-504519 68.7 69.4ePt-566700ePt-567159 96.2 embra069 embra1761 105.3 ePt-570119 78.7 ePt-574308ePt-567660ePt-599330ePt-641116 ePt-637352LT ePt-573877ePt-504317 ePt-568516 ePt-637683 56.3 ePt-573339 79.9 embra070 159.4 embra126ePt-640361 ePt-641659 PP 77.2 51.7 ePt-571501 74.1 ePt-571498 98.7 110.6 110.1181.867.5 ePt-570414ePt-574374 73.1 69.5ePt-568818ePt-570753 ePt-636880 ePt-567331 100.1 embra623 87.4 embra128 PP 106.0 embra1639 PP ePt-564993ePt-570139ePt-639677ePt-565405 63.6 embra213 101.5 embra180 161.0 118.0embra1332embra1627 77.3ePt-503957ePt-64056673.2ePt-642125ePt-636681 51.8 ePt-641628 76.1 ePt-57200957.4 107.1 ePt-572431 110.5182.168.6 ePt-566798ePt-575243ePt-567122ePt-639441 52.2 70.1 ePt-600527 ePt-641762 104.1 embra121 96.2 embra069 103.4 embra219 171.1 121.3ePt-565990ePt-566960ePt-563419 ePt-643189 ePt-599398 78.7ePt-503899ePt-574308ePt-600313ePt-599330ePt-567323 ePt-637352 ePt-50431777.7 ePt-641273 ePt-568516 ePt-637683 79.3110.6183.4 ePt-640361ePt-572763ePt-641659 75.6 72.7 ePt-572836 ePt-574628 CA 104.8 eg091 100.1 embra623 171.2 ePt-600542107.9 ePt-642875 68.7ePt-567410ePt-566700ePt-573651 ePt-639851ePt-564993 ePt-639677 68.5 ePt-503957 ePt-64212579.0 ePt-57431663.6 ePt-636880 ePt-567331 105.3 ePt-570119 122.3 ePt-575761 LT 118.0 embra1627 77.0 ePt-564561 ePt-571936 185.2 ePt-504011 74.1 ePt-571498 52.268.6 ePt-503189 DAP 106.8 embra007 104.1 embra121 181.8 ePt-574374110.0 ePt-567357 73.1ePt-644056ePt-568818 52.3 ePt-503042ePt-643189 ePt-599398 ePt-503899 ePt-60031379.6 ePt-574877 ePt-641762 PP 106.0 embra1639 PP 122.5 121.3 ePt-566960 77.2 ePt-571553 embra042

114.8 CA 110.9 embra934 187.073.2ePt-643265ePt-575224ePt-636681ePt-599401 52.7 79.3ePt-574914ePt-567410ePt-56672776.1ePt-573651ePt-572009 75.9 ePt-566804 68.5 ePt-574628 104.8 eg091 107.1 ePt-572431 182.1 122.6ePt-575243ePt-574232ePt-639441 122.3 ePt-575761 79.9 ePt-566877 ePt-639851 117.1 embra751 PP ePt-599549 ePt-641273 112.6 ePt-571603 81.5190.275.6ePt-639229ePt-567323ePt-569480 ePt-569753 77.7 68.6 ePt-503189 DAP 106.8 embra007 107.9 ePt-642875 183.4 122.7ePt-572763ePt-574026 122.5 ePt-567357 52.8 ePt-64405680.3 ePt-640937 52.3 ePt-503042 113.2 ePt-643939 192.577.0ePt-642226ePt-569193ePt-564561ePt-573099 79.0 ePt-574316 75.9118.3 ePt-566804embra098 114.8 embra042 110.0 ePt-571936 185.2 128.5ePt-504011ePt-640491 ePt-574232 53.0 ePt-573637ePt-64326586.0 ePt-599401ePt-504847 52.7 ePt-574914 ePt-566727 RD 122.6193.1 ePt-637146 79.6 ePt-574877 117.1 embra751 114.3 embra632 81.6 77.2ePt-567853ePt-571553 PP ePt-640819 110.9 embra934 187.0 ePt-575224ePt-599667 ePt-638457 122.7 ePt-574026 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ePt-568679 148.3 ePt-636614 252.4 ePt-600658 148.7 ePt-643956 259.4 ePt-642561 263.3 ePt-641623

99

G38-1 G38-2 G38-3 G38-4

0.0 ePt-569565 1.4 ePt-569253 19.0 ePt-641261 21.2 ePt-503235 24.8 ePt-564654 0.0 ePt-644188 28.3 ePt-599612 ePt-574889 ePt-639639 3.2 ePt-504032 G38-1 G38-2 38.2 ePt-568757G38-3 G38-4 60.6 ePt-573042 4.2 ePt-568037 ePt-504240 ePt-599238 73.9 ePt-570523 5.0 U15-1 78.8 ePt-505067 U15-2 U15-3ePt-575444 U15-4 U15-7 ePt-567907 ePt-575769 103.5 eg096 5.9 107.4 embra18100.0 ePt-572240 ePt-642886 6.6 ePt-565213 0.0 ePt-572142 108.9 embra648 9.8 ePt-641565 0.0 ePt-569565 G38 - 3 ePt-571738 ePt-637579 5.3 ePt-572591 111.4 ePt-56300313.0 ePt-574111 1.4 ePt-569253 6.8 ePt-637309 ePt-573801 G38 - 4 6.4 ePt-571996 112.0 ePt-56292214.7 ePt-575721 U15 - 3 19.0 ePt-641261 7.0 ePt-642915 7.4 ePt-642984 113.2 ePt-60046615.4 ePt-641216 21.2 ePt-503235 19.8 ePt-599719 9.1 ePt-572242 ePt-56642916.8ePt-638845ePt-642222 24.8 ePt-564654 114.6 0.0 ePt-644188 ePt-574932 ePt-641758 10.9 ePt-571182 ePt-64202722.5ePt-565902ePt-565390 24.0 0.0 ePt-504928 28.3 ePt-599612 ePt-574889 ePt-639639 ePt-599559 0.0 ePt-599651 16.1 ePt-638597 116.6 ePt-5695253.224.7 ePt-504032ePt-504760 0.5 ePt-569798 38.2 ePt-568757 31.4 ePt-638583 2.2 embra213 17.5 ePt-570448 122.4 embra20126.1 ePt-568037ePt-575337 2.5 ePt-566484 60.6 ePt-573042 4.2 34.0 ePt-643521 4.7 embra179 20.3 ePt-570932 125.9 embra02731.1 ePt-504240ePt-572740ePt-599238 3.7 ePt-636787 73.9 ePt-570523 34.5 ePt-642943 10.2 ePt-636922 ePt-642939 26.1 ePt-572976 128.9 ePt-6000835.040.8 ePt-575444ePt-573142 4.1 ePt-564313 78.8 ePt-505067 38.9 ePt-638546 ePt-636969 10.7 ePt-637670 ePt-638706 33.4 ePt-569501 129.2 ePt-56478643.5 ePt-567907embra058ePt-575769 ePt-565107 ePt-564336 103.5 eg096 40.8 4.2ePt-600457 ePt-573124 ePt-599408 61.7 ePt-568150 129.8 ePt-5651635.944.6 ePt-642886embra068 ePt-575612 ePt-573880 13.9 107.4 embra1810 41.6 embra122 ePt-638013 65.8 ePt-600019 132.3 ePt-60039754.9 ePt-566007 4.3 ePt-569670 108.9 embra648 6.6 ePt-565213 embra361 21.2 eg128 0.0 ePt-572142 ePt-565892 ePt-640846 137.4 embra33356.2 ePt-564663 42.6 ePt-641503 ePt-639682 111.4 ePt-563003 ePt-571738 ePt-637579 4.4embra350 24.0 ePt-599283 5.3 ePt-572591 66.4 ePt-575150 138.5 ePt-5995566.857.1 ePt-504109 43.9 ePt-565046 ePt-562922 ePt-637309 ePt-573801 40.1 embra1944 6.4 ePt-571996 112.0 140.5 ePt-56342561.6 ePt-569562 45.6 ePt-640230ePt-599344 ePt-642207 ePt-503701 ePt-504723 7.0 ePt-642915 42.5 embra645 7.4 ePt-642984 71.0113.2 ePt-600466 ePt-56660761.7 ePt-564805 47.1 7.0ePt-643596 LT ePt-637966 141.8 ePt-599719 ePt-640620

S/G 19.8 9.1 ePt-572242 ePt-566429 ePt-638845 48.7 ePt-636978 44.3 embra332 71.1114.6 ePt-637022 ePt-636685 143.5 ePt-57118061.8 ePt-574932ePt-572571ePt-641758 7.1 ePt-599676 ePt-567046 10.9 ePt-571182 ePt-642027 ePt-565902 24.0 49.9 eg098 47.6 embra1507 74.4 ePt-599639 U15-1 145.9 embra07262.3 ePt-599559ePt-643754U15-2 7.2 ePt-566788U15-30.0 ePt-599651 U15-4 U15-7 16.1 ePt-638597 116.6 ePt-5695250.0 ePt-565025 51.7 embra286 53.9 ePt-573737 74.9 ePt-571015 ePt-643108ePt-573410 148.2 ePt-56685031.465.4 ePt-638583ePt-503732 11.4 ePt-5746802.2 embra213 17.5 ePt-570448 122.4 embra2011.7 0.0 ePt-572240 61.0 embra1007 54.0 ePt-640175 76.5 ePt-569944 149.7 embra06365.8 ePt-643521ePt-600458 12.9 ePt-5998484.7 embra179 ePt-570932 125.9 embra02713.1 ePt-642731 34.0 62.2 ePt-642546 55.0 embra004 20.3 77.7 embra147 150.9 ePt-57002465.9 9.8ePt-563498ePt-641565 20.3 ePt-57017310.2 ePt-636922 ePt-642939 128.9 ePt-60008319.2 ePt-567557 34.5 ePt-642943 embra1071 58.2 embra078 26.1 ePt-572976 CA 13.0 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ePt-641705 43.9 ePt-567660 ePt-641116 69.4 ePt-567159 98.7 embra070 159.4 embra12672.9 24.7ePt-637076ePt-504760ePt-570424 27.6 0.5ePt-57150940.1ePt-569798embra1944 6.8 ePt-643630 140.5 ePt-56342550.3 ePt-575598 45.6 ePt-640230 67.5 ePt-570139 ePt-565405 69.5 ePt-570753 ePt-503701 ePt-504723 embra180 161.0 embra133273.5 26.1ePt-574930ePt-575337 28.8 2.5ePt-575039ePt-566484embra645 10.0 ePt-503766 71.0 101.5 ePt-56660756.6 ePt-642989 47.1 ePt-643596 42.5 70.1 ePt-600527 LT ePt-637966 141.8 31.1 ePt-572740 68.6 ePt-5671223.7 ePt-636787 10.6 ePt-636515 S/G embra219 171.1 ePt-56599073.7ePt-563419ePt-573117 30.9 ePt-565437 embra332 103.4 ePt-571180 ePt-564452 ePt-565647 48.7 ePt-636978 44.3 72.7 ePt-572836 71.1 ePt-637022 ePt-636685 143.5 171.2 ePt-60054274.3 40.8ePt-563231ePt-573142 68.7 ePt-5667004.1 ePt-564313 11.3 ePt-638422 105.3 ePt-570119 LT 31.2 ePt-50431947.6 embra1507 145.9 embra072 ePt-638607 ePt-563830 49.9 eg098 74.1 ePt-571498 74.4 ePt-599639 181.8 ePt-57437474.6 43.5ePt-569673embra058 73.1 34.8ePt-568818ePt-569064ePt-565107ePt-573737ePt-564336 ePt-568117 ePt-641184 0.0 ePt-568676 PP 106.0 embra163962.1 ePt-599942PP ePt-504436 51.7 embra286 4.2 53.9 74.9 ePt-571015 ePt-643108 148.2 ePt-566850 44.6 embra068 73.2 ePt-636681 ePt-575612 ePt-573880 11.4 76.1ePt-642508ePt-572009ePt-570649 107.1 ePt-572431 ePt-600664 ePt-638369182.1 ePt-57524361.0 ePt-639441embra1007ePt-504602 ePt-641713 34.9 ePt-56836854.0 ePt-639473ePt-640175 76.5 ePt-569944 149.7 embra063 74.7 54.9 ePt-566007 75.6 ePt-567323 ePt-569670 77.7ePt-600106ePt-641273ePt-563377 107.9 ePt-642875 ePt-505124 ePt-570633183.4 ePt-57276362.2 ePt-642546ePt-571763 ePt-503249 35.0 4.3ePt-59938555.0 embra004 13.9 ePt-574475 77.7 embra147 150.9 ePt-570024 56.2 ePt-564663 77.0 ePt-564561 79.0 ePt-574316 110.0 ePt-571936 185.2 ePt-50401174.8 embra1071ePt-503994 38.8 ePt-63788958.2ePt-641503embra078ePt-639682 ePt-600655 ePt-563643 CA 152.9 embra11070.0 embra219 64.2 ePt-5715534.4 79.6 ePt-574877 31.6 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100

G38 - 6 G38-5 G38-6 G38-8 G38-10 U15-1 U15-2 G38-5U15-3 G38-6U15-4 U15-7 G38-8 G38-10 0.0 ePt-504554 ePt-571769 0.0 ePt-572240 0.00.6 ePt-504554 embra1643 9.8 ePt-641565 0.62.0 ePt-571769 embra1624 13.0 ePt-574111 2.02.7 embra1643 ePt-564765 14.7 ePt-575721 2.76.2 embra1624 ePt-641578 15.4 ePt-641216 6.26.3 ePt-564765 ePt-565718 ePt-572557 16.8 ePt-642222 6.36.5 ePt-641578 ePt-565390 7.0 ePt-599999 ePt-599222 0.0 ePt-573015 22.5 0.0 ePt-504928 6.5 ePt-565718 ePt-572557 0.0 ePt-640592 ePt-504760 ePt-568627 ePt-599649 9.6 ePt-572688 24.7 0.5 ePt-569798 7.08.6 ePt-599999 ePt-599222 0.0 ePt-573015 8.3 ePt-503229 ePt-575337 ePt-569441 ePt-637594 10.5 ePt-562979 0.0 ePt-640592 26.1 2.5 ePt-566484 ePt-568627 ePt-599649 9.6 ePt-572688 14.6 ePt-571279 ePt-572740 8.69.1 ePt-565900 ePt-642931 11.5 ePt-565031 8.3 ePt-503229 31.1 3.7 ePt-636787 ePt-569441 ePt-637594 10.5 ePt-562979 22.9 ePt-567510 ePt-573142 10.3 ePt-566077 ePt-573401 12.6 ePt-563135 14.6 ePt-571279 40.8 4.1 ePt-564313 9.1 ePt-565900 ePt-642931 11.5 ePt-565031 26.5 ePt-641564 embra058 G38 - 5 10.9 ePt-600400 ePt-573324 15.3 ePt-574039 22.9 ePt-567510 43.5 ePt-565107 ePt-564336 10.3 ePt-566077 ePt-573401 12.6 ePt-563135 43.8 ePt-504913 embra068 4.2 13.4 embra187 17.9 ePt-504669 26.5 ePt-641564 44.6 ePt-575612 ePt-573880 10.9 ePt-600400 ePt-573324 15.3 ePt-574039 53.9 ePt-503489 ePt-566007 0.0 embra009 16.4 embra844 20.1 ePt-565089 43.8 ePt-504913 54.9 4.3 ePt-569670 13.4 embra187 17.9 ePt-504669 55.5 ePt-566351 ePt-564663 13.8 ePt-599895 ePt-571850 17.2 ePt-643213 20.3 ePt-571629 53.9 ePt-503489 56.2 0.0 embra009ePt-641503 ePt-639682 16.4 embra844 20.1 ePt-565089 74.9 ePt-573316 ePt-504109 16.0 4.4ePt-565887 17.6 ePt-641098 22.6 ePt-573666 55.5 ePt-566351 57.1 13.8 ePt-599895ePt-565046ePt-571850 17.2 ePt-643213 20.3 ePt-571629 80.0 ePt-572676 ePt-569562 16.1 ePt-643170 18.0 ePt-566092 ePt-568290 23.0 ePt-643745 74.9 ePt-573316 61.6 16.0 ePt-565887ePt-599344 ePt-642207 17.6 ePt-641098 22.6 ePt-573666 87.7 embra155 ePt-564805 16.2 7.0ePt-599614 19.5 ePt-636757 23.9 ePt-567502 80.0 ePt-572676 61.7 16.1 ePt-643170ePt-640620 18.0 ePt-566092 ePt-568290 23.0 ePt-643745 90.6 embra127 ePt-572571 19.1 ePt-573743 19.8 ePt-599342 25.9 ePt-504836 87.7 embra155 61.8 16.2 7.1ePt-599614ePt-599676 ePt-567046 19.5 ePt-636757 23.9 ePt-567502 92.5 ePt-570269 ePt-643754 21.7 ePt-571931 ePt-640650 20.5 ePt-640201 28.2 ePt-599957 90.6 embra127 0.0 ePt-565025 62.3 19.1 7.2ePt-573743ePt-566788 19.8 ePt-599342 25.9 ePt-504836 92.7 ePt-640871 ePt-563350 ePt-503732 22.8 ePt-599214 ePt-573606 ePt-641494 29.8 ePt-642089 92.5 ePt-570269 1.7 ePt-573410 65.4 21.7 11.4ePt-571931ePt-574680ePt-640650 20.520.6 ePt-640201 28.2 ePt-599957 94.3 ePt-637034 65.8 ePt-600458 23.3 12.9ePt-599678ePt-599848 ePt-573606ePt-637523 ePt-641494 31.4 ePt-640464 92.7 ePt-640871 ePt-563350 13.1 ePt-642731 22.8 ePt-599214 20.6 ePt-565145 29.8 ePt-642089 ePt-503413 ePt-502845 65.9 ePt-563498 24.6 20.3embra005ePt-570173 20.7 ePt-637523 32.9 ePt-569023 94.3 ePt-637034 19.2 ePt-567557 23.3 ePt-599678 20.8 ePt-504814 31.4 ePt-640464 94.9 ePt-638780 ePt-640660 66.0 ePt-568161 25.6 20.5embra168ePt-599773 20.7 ePt-565145 36.2 ePt-574586 ePt-503413 ePt-502845 30.9 ePt-574533 24.6 embra005 21.0 ePt-570201 32.9 ePt-569023 ePt-641360 ePt-644337 66.6 ePt-504595 27.4 20.6ePt-574584ePt-641822ePt-639226 20.8 ePt-504814 38.8 ePt-573548 94.9 ePt-638780 ePt-640660 31.2 ePt-573052 25.6 embra168 21.1 ePt-569707 36.2 ePt-574586 95.1 ePt-644430 66.9 ePt-599598 28.0 embra037ePt-562970 ePt-638730 21.0 ePt-570201 48.5 ePt-567596 ePt-641360 ePt-644337 39.6 ePt-571540 27.4 20.7ePt-574584 ePt-639226 23.6 embra813 38.8 ePt-573548 96.8 ePt-574725 71.1 ePt-567864 29.7 ePt-565033ePt-572329 21.1 0.0 ePt-569707embra078 53.0 ePt-642738 95.1 ePt-644430 44.0 ePt-565684 28.0 embra037 25.2 ePt-641851 48.5 ePt-567596 97.1 ePt-572516 71.5 ePt-563204 32.0 26.4embra202ePt-566054 23.6 0.8 embra813embra1122 53.6 ePt-600718 96.8 ePt-574725 46.9 ePt-641705 29.7 ePt-565033 28.5 embra094 53.0 ePt-642738 97.5 ePt-573783 72.9 ePt-637076 ePt-570424 33.8 27.6embra214ePt-571509 25.2 6.8 ePt-641851ePt-643630 U15 - 7 54.2 ePt-600131 97.1 ePt-572516 50.3 ePt-575598 32.0 embra202 30.5 embra627 53.6 ePt-600718 99.5 embra022 73.5 ePt-574930 34.6 28.8ePt-640261ePt-575039 28.510.0 embra094ePt-503766 54.3 ePt-565669 97.5 ePt-573783 56.6 ePt-642989 33.8 embra214 31.9 embra1690 54.2 ePt-600131 101.1 ePt-564530 73.7 ePt-573117 36.0 30.9embra045ePt-565437 30.510.6 embra627ePt-636515 60.5 embra696 99.5 embra022 ePt-564452 ePt-565647 34.6 ePt-640261 embra196 54.3 ePt-565669 ePt-642641 ePt-643032 74.3 ePt-563231 36.7 31.2embra209ePt-504319 32.811.3 embra1690ePt-638422 62.8 ePt-504153 101.1 ePt-564530

31.9 RD ePt-638607 ePt-563830 36.0 embra045 37.9 ePt-568253 60.5 embra696 101.3 ePt-566917 ePt-644030 74.6 ePt-569673 40.3 34.8ePt-564952ePt-569064 32.8 embra196ePt-568117 ePt-641184 0.0 ePt-56867665.9 ePt-567274 ePt-642641 ePt-643032 62.1 ePt-599942 ePt-504436 36.7 embra209 S/G 62.8 ePt-504153 ePt-600635 ePt-568901

38.8 ePt-504039ePt-642508 ePt-570649 RD ePt-504602 ePt-641713 40.6 34.9ePt-574954ePt-568368 ePt-639473 CA 37.911.4 ePt-568253 68.7 ePt-565432 101.3 ePt-566917 ePt-644030 ePt-600664 ePt-638369 74.7 40.3 ePt-564952 eg062 65.9 ePt-567274 DB 101.4 ePt-572949 ePt-571477 ePt-571763 ePt-503249 43.4 embra746 39.3 ePt-600106 ePt-563377 S/G 71.0 embra082 ePt-600635 ePt-568901 S/G 35.0 ePt-599385 38.8 ePt-504039 13.9 ePt-574475 ePt-505124 ePt-570633 40.6 ePt-574954 CA 68.7 ePt-565432 102.0 ePt-572882 ePt-503994 44.5 ePt-599828 ePt-565983ePt-600655ePt-569127ePt-563643 74.7 ePt-569732 DB 101.4 ePt-572949 ePt-571477 70.0 embra219 74.8 43.4 38.8embra746ePt-637889 39.340.4 eg062 71.0 embra082 103.6 ePt-644043 S/G 44.9 ePt-644442 11.9 ePt-638101ePt-639668ePt-503517ePt-641290 31.6 ePt-57556475.4 ePt-570192 102.0 ePt-572882 78.9 embra934 74.9 ePt-503604 44.5 45.5ePt-599828embra361 ePt-565983 ePt-569127 74.7 ePt-569732 ePt-638929 45.1 ePt-570209 40.440.7 ePt-640562ePt-562875 ePt-570286 31.9 ePt-56863076.9 ePt-575022 104.1 ePt-644043 84.0 embra012 75.1 ePt-642609 44.9 46.2ePt-644442embra239 ePt-638101 ePt-503517 75.4 ePt-570192 103.6 embra979 42.7 en016ePt-637551 52.3 ePt-573624 ePt-564180 107.1 ePt-503990 46.9LT 12.0 79.0 ePt-638929 embra632 75.2 ePt-570809 45.1 46.9ePt-570209embra122 40.7 ePt-640562 76.9 ePt-575022 104.1 87.5 LT ePt-503873 59.2 ePt-574390 ePt-571262 107.9 embra943 RDC 44.6 75.5 ePt-570657 49.4 47.8ePt-567737embra350ePt-565836 42.718.0 en016ePt-599702 80.2 ePt-564050 107.1 ePt-503990 95.3 embra070 46.9 embra979 44.7 ePt-568084 61.6 ePt-50365679.0 ePt-564180 109.3 ePt-571934 76.8 ePt-573566 LT 51.9 ePt-639942ePt-570275 21.5 ePt-504594 82.1 embra928 107.9 embra943 49.5 LT ePt-503873 100.6 embra180 RDC 49.4 ePt-567737 ePt-565836 44.6 80.2 ePt-564050 109.8 ePt-570411 RDC ePt-571328 61.7 ePt-641995 76.9 ePt-570261 56.7 51.0ePt-599482ePt-638285 44.945.2 ePt-568084eg128 86.5 ePt-503875 109.3 ePt-571934

DB 44.7 101.9 ePt-636576 51.9 ePt-639942 ePt-574876 71.2 ePt-63776882.1 embra928 110.9 embra1470 77.0 ePt-504852 56.9 51.5ePt-563387ePt-640068 45.246.2 ePt-571328ePt-563144 88.6 ePt-503680 109.8 ePt-570411 107.5 ePt-566342 ePt-504519 56.7 ePt-599482 44.9 79.9 embra176186.5 ePt-503875 112.8 ePt-566988 ePt-573877 57.0 ePt-574498 DB 45.456.3 ePt-503672ePt-573339 90.5 embra003 110.9 embra1470 PP 77.2 51.7 ePt-571501 45.2 ePt-574876 110.1 ePt-570414 56.9 ePt-563387 45.9 ePt-504312 87.4 embra12888.6 ePt-503680 116.2 embra038 77.3 ePt-640566 51.8ePt-643712ePt-641628ePt-564364 45.457.4 ePt-503672embra213 91.8 embra053 112.8 ePt-566988 110.5 ePt-566798 57.058.2 ePt-574498 46.5 ePt-600050 96.2 embra06990.5 embra003 116.9 embra731 78.7 ePt-574308 ePt-599330 ePt-571004ePt-637352ePt-640790ePt-504317 45.9 ePt-504312ePt-568516 ePt-637683 94.1 embra1362 116.2 embra038 110.6 ePt-640361 ePt-641659 ePt-643712 ePt-564364 47.6 ePt-502997 100.1 embra62391.8 embra053 120.0 ePt-644396 ePt-564993 ePt-639677 58.258.8 ePt-573307ePt-503957 ePt-642125 46.563.6 ePt-600050ePt-636880 ePt-567331 99.6 embra668 116.9 embra731 118.0 embra1627 52.2ePt-571004 ePt-640790 48.3 ePt-599900 104.1 embra12194.1 embra1362 120.6 ePt-637919 ePt-643189 ePt-599398 60.0 ePt-572815ePt-503899 ePt-600313 47.6 ePt-502997ePt-641762 103.3 ePt-636848 120.0 ePt-644396 121.3 ePt-566960 58.8 ePt-573307 LT 99.6 embra668 ePt-566963 CA 121.8 79.3 ePt-567410 ePt-573651 60.2 ePt-566975 49.068.5 ePt-637258ePt-574628 104.8 eg091105.4 embra203 120.6 ePt-637919 122.3 ePt-575761 60.0 ePt-572815ePt-639851 48.3 ePt-599900 103.3 ePt-636848 123.2 ePt-562786

DAP 106.8 embra007

50.7 ePt-503696 LT ePt-644056 60.5 52.3ePt-599635ePt-503042 49.068.6 ePt-637258ePt-503189 110.1 ePt-641685 121.8 ePt-566963 122.5 ePt-567357 60.2 ePt-566975 ePt-599643 114.8 embra042105.4 embra203 124.0 embra153 ePt-643265 ePt-599401 64.3 52.7ePt-568568ePt-574914 ePt-566727 52.675.9 ePt-503696ePt-566804 110.4 ePt-640208 123.2 ePt-562786 122.6 ePt-574232 60.5 ePt-599635 50.7 117.1 embra751110.1 ePt-641685 125.9 ePt-568851 PP 81.5 ePt-639229 ePt-569480 68.7 ePt-575685 55.7 ePt-575311 ePt-570436 ePt-637181 124.0 embra153 122.7 ePt-574026 64.3 52.8ePt-568568ePt-569753 52.6 ePt-599643 110.4111.2 ePt-640208 128.2 ePt-566859 ePt-642226 ePt-573099 73.2 embra143 55.9 ePt-599853 118.3 embra098 ePt-641899 125.9 ePt-568851 128.5 ePt-640491 68.7 53.0ePt-575685ePt-573637 55.7 ePt-575311 ePt-570436 ePt-637181 128.5 ePt-574427 RD 59.6 ePt-563633 81.6 ePt-567853 83.3 53.1ePt-572286ePt-640819 55.9 ePt-599853 111.2112.2 ePt-599873 128.2 ePt-566859 ePt-599667 ePt-638457 73.2 embra143 ePt-503564 ePt-504083 ePt-641899 128.6 ePt-504802 131.5 82.6 ePt-636833 84.5 53.2embra1345ePt-571974 59.6 ePt-563633 112.3 ePt-567549 ePt-568180 128.5 ePt-574427 ePt-566146 ePt-566200 83.3 ePt-572286 ePt-573875 ePt-637490 112.2 ePt-599873 131.1 ePt-575378 82.7 ePt-643365 89.0 53.6ePt-567769ePt-567960 59.9 ePt-503564 ePt-504083 115.0 ePt-504851 128.6 ePt-504802 ePt-638215 ePt-636507 84.5 embra1345 ePt-639502 112.3 ePt-567549 ePt-568180 132.7 embra1428 84.9 ePt-567796 95.7 53.8embra120ePt-564595 59.9 ePt-573875 ePt-637490 118.1 ePt-564966 131.1 ePt-575378 ePt-562913 ePt-640386 89.0 ePt-567769 ePt-563189 115.0 ePt-504851 133.7 ePt-565806 87.3 ePt-570185 98.9 54.8ePt-568389ePt-572474 60.2 ePt-639502 120.4 ePt-639354 ePt-643870 132.7 embra1428 133.2 ePt-643505 ePt-644117 95.7 embra120 60.6 ePt-599499 ePt-643950 118.1 ePt-564966 134.8 embra061 88.4 embra915 54.9ePt-571913ePt-567194ePt-639138 60.2 ePt-563189 120.7 ePt-563183 ePt-567436 133.7 ePt-565806 ePt-575615 ePt-568160 101.998.9 ePt-568389 60.8 ePt-563016 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embra1081 174.1 ePt-566594 202.0 ePt-571810 116.4 ePt-637861 98.2 ePt-573310 199.2 ePt-574281 102.0 embra345 206.0 ePt-563279 119.1 ePt-569681 98.9 embra1081 202.0 ePt-571810 103.9 embra290 210.1 ePt-570795 121.6 embra027 102.0 embra345 206.0 ePt-563279 104.8 embra1793 226.7 ePt-642599 124.0 embra201 103.9 embra290 210.1 ePt-570795 106.2 embra135 228.2 ePt-568340 129.4 ePt-574129 104.8 embra1793 226.7 ePt-642599 173.4 ePt-563359 133.9 embra648 106.2 embra135 228.2 ePt-568340 180.3 ePt-564450 135.2 embra1810 173.4 ePt-563359 138.8 ePt-570066 180.3 ePt-564450 139.0 ePt-570830 148.3 ePt-636614 148.7 ePt-643956

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U15-8 U15-9 U15-10

U15-8 U15-9 U15-10

G38-5 G38-6 G38-8 G38-10 G38-5 G38-6 G38-8 G38-10 0.0 ePt-5045540.0 ePt-599609 0.6 ePt-5717693.7 ePt-599243 0.0 ePt-504554 2.0 embra164314.8 ePt-643616 0.6 ePt-571769 2.7 embra162418.7 ePt-641576 2.0 embra1643 G38 - 10 6.2 ePt-56476549.8 ePt-643917 2.7 embra1624 G38 - 8 6.3 ePt-64157852.6 ePt-600714 U15 - 9 6.2 ePt-564765 6.5 ePt-565718 ePt-572557ePt-637248 ePt-568046 6.3 ePt-641578 60.3 7.0 ePt-599999 ePt-599222ePt-640434 6.5 ePt-565718 ePt-572557 0.0 ePt-573015 ePt-56862760.4ePt-599649ePt-599458 0.0 ePt-640592 7.0 ePt-599999 ePt-599222 9.6 ePt-572688 0.0 ePt-573015 8.6 ePt-569441 ePt-637594ePt-570104 ePt-640468 0.0 ePt-573089 8.3 ePt-503229 ePt-568627 ePt-599649 0.0 ePt-64059263.9 10.5 ePt-562979 9.6 ePt-572688 ePt-565900 ePt-642931ePt-568474 1.8 ePt-643877 14.6 ePt-571279 8.6 ePt-569441 ePt-637594 9.1 8.3 ePt-503229 11.5 ePt-565031 10.5 ePt-562979 10.3 ePt-56607770.6ePt-573401ePt-599982 ePt-637344 ePt-600147 22.9 ePt-567510 9.1 ePt-565900 ePt-642931 14.6 ePt-571279U15 - 8 12.62.2 ePt-563135 11.5 ePt-565031 10.9 ePt-60040070.9ePt-573324ePt-575708 ePt-644097 ePt-599278 ePt-565827 26.5 ePt-6415640.0 embra1470 10.3 ePt-566077 ePt-573401 22.9 ePt-567510 15.3 ePt-574039 12.6 ePt-563135 13.4 embra187 ePt-573467 ePt-572886 6.9 embra310 43.8 ePt-50491315.6 embra038 10.9 ePt-600400 ePt-573324 26.5 ePt-64156471.4 17.9 ePt-504669 15.3 ePt-574039 16.4 embra844 ePt-644288 8.3 embra210 53.9 ePt-50348918.9 embra731 13.4 embra187 0.0 embra009 43.8 ePt-504913 20.1 ePt-565089 17.9 ePt-504669 17.2 ePt-64321373.2 ePt-568053 9.9 embra204 55.5 ePt-56635136.3 embra061 16.4 embra844 13.8 ePt-599895 ePt-571850 53.9 0.0ePt-503489ePt-599609 20.3 ePt-571629 0.0 embra009 20.1 ePt-565089 17.6 ePt-64109876.3 ePt-503359 10.2 embra1578 74.9 ePt-57331639.2 embra1428 17.2 ePt-643213 16.0 ePt-565887 55.5 3.7ePt-566351ePt-599243 22.6 ePt-573666 13.8 ePt-599895 ePt-571850 20.3 ePt-571629 18.0 ePt-56609276.7ePt-568290ePt-569134 ePt-636656 16.2 embra954 80.0 ePt-57267640.7 ePt-599500 17.6 ePt-641098 16.1 ePt-643170 74.9 14.8ePt-573316ePt-643616 23.0 ePt-643745 16.0 ePt-565887 22.6 ePt-573666 19.5 ePt-636757 ePt-644093 ePt-569640 28.3 embra1851 87.7 embra15542.6 ePt-566625 18.0 ePt-566092 ePt-568290 16.2 ePt-599614 80.0 18.7ePt-57267676.8 ePt-641576 23.9 ePt-567502 16.1 ePt-643170 23.0 ePt-643745 19.8 ePt-599342 ePt-639501 29.9 embra1977 90.6 embra12743.5 embra040 19.5 ePt-636757 19.1 ePt-573743 87.7 49.8embra155ePt-643917 25.9 ePt-504836 16.2 ePt-599614 23.9 ePt-567502 ePt-64020177.4 ePt-642840 31.8 es140 92.5 ePt-570269 ePt-572453 21.7 ePt-571931 ePt-640650 20.5 90.6 embra127 28.2 ePt-599957 PP 44.7 19.8 ePt-599342 U15-8 52.6U15-9ePt-600714 U15-10 CA 19.1 ePt-573743 25.9 ePt-504836 34.1 embra629 92.7 DAP ePt-640871 ePt-563350 22.8 ePt-599214 92.5ePt-573606ePt-57026981.2ePt-641494ePt-637248embra928ePt-568046 29.8 ePt-642089 48.1 embra010 21.7 ePt-571931 ePt-640650 20.5 ePt-640201 28.2 ePt-599957 20.6 RDC 52.5 embra1928 94.3 ePt-637034 23.3 ePt-599678 92.7ePt-63752360.3ePt-64087187.2 embra003ePt-563350 31.4 ePt-640464 51.6 ePt-574476 22.8 ePt-599214 ePt-573606 ePt-641494 29.8 ePt-642089 ePt-640434 58.3 embra1492 ePt-503413 ePt-502845

S/G embra053 20.6 24.6 embra005 20.7 94.3ePt-565145ePt-63703488.7 S/G 32.9 ePt-569023 57.6 embra033 23.3 ePt-599678 ePt-637523 31.4 ePt-640464 60.4 ePt-599458 62.6 embra357 ePt-638780 ePt-640660 25.6 embra168 20.8 ePt-504814ePt-50341391.9 ePt-568919ePt-502845 0.036.2 ePt-573089ePt-574586 94.9 63.0 ePt-642974 24.6 embra005 20.7 ePt-565145 32.9 ePt-569023 ePt-570104 ePt-640468 ePt-574584 ePt-639226 21.0 ePt-57020163.992.1 ePt-503506 64.2 ePt-643877ePt-573548embra2014 ePt-64136065.4 ePt-644337ePt-563112 20.8 ePt-504814 27.4 DB 94.9 ePt-638780ePt-568474ePt-640660 1.838.8 25.6 embra168 36.2 ePt-574586 21.1 ePt-569707 ePt-640126 ePt-641101 68.6 ePt-504329 ePt-503904 95.1 ePt-644430 21.0 ePt-570201 28.0 embra037 70.6ePt-641360ePt-599982ePt-644337 48.5 ePt-637344ePt-567596ePt-600147 27.4 ePt-574584 ePt-639226 38.8 ePt-573548 23.6 embra813 ePt-643832 ePt-643897 2.268.7 ePt-504330 96.8 ePt-574725 21.1 ePt-569707 29.7 ePt-565033 95.1 70.9ePt-64443092.2 ePt-575708 ePt-644097 53.0 ePt-599278ePt-642738ePt-565827 0.0 embra1470 28.0 embra037 48.5 ePt-567596 25.2 ePt-641851 ePt-572670 ePt-568780 71.0 ePt-574052 97.1 ePt-572516 23.6 embra813 32.0 embra202 96.8 ePt-574725ePt-573467 ePt-572886 6.953.6 embra310ePt-600718 15.6 embra038 29.7 ePt-565033 53.0 ePt-642738 28.5 embra09471.4 ePt-643831 ePt-571393 86.8 ePt-636919 97.5 ePt-573783 25.2 ePt-641851 33.8 embra214 97.1 ePt-572516ePt-644288 8.354.2 embra210ePt-600131 18.9 embra731 32.0 embra202 53.6 ePt-600718 30.5 embra627 ePt-637500 ePt-600487 96.0 ePt-563056 99.5 embra022 28.5 embra094 34.6 ePt-640261 97.5 73.2ePt-57378392.8 ePt-568053 9.954.3 embra204ePt-565669 36.3 embra061 33.8 embra214 54.2 ePt-600131 31.9 embra1690 ePt-504434 104.1 ePt-572668 101.1 ePt-564530 30.5 embra627 36.0 embra045 99.5 76.3embra022ePt-503359 10.260.5 embra1578embra696 39.2 embra1428 34.6 ePt-640261 54.3 ePt-565669 embra196101.8 ePt-503575 109.8 ePt-572777 ePt-642641118.4 ePt-643032ePt-570076 36.7 embra209 32.8 101.1 CA 76.7ePt-564530ePt-569134 ePt-636656 16.262.8 embra954ePt-504153 40.7 ePt-599500 31.9 embra1690 RD 36.0 embra045 60.5 embra696 37.9 ePt-568253 ePt-638276 ePt-636824 118.0 ePt-600416 101.3 ePt-566917 ePt-644030 32.8 embra196 40.3 ePt-564952 ePt-642641101.9 ePt-644093ePt-643032ePt-569640 28.365.9 embra1851ePt-567274 42.6 ePt-566625 36.7 embra209 62.8 ePt-504153 76.8 ePt-503998 S/G 120.7 ePt-566290 ePt-600635130.3 ePt-568901ePt-574332 RD 38.8 ePt-504039 embra1977 ePt-568253 40.6 ePt-574954 CA 101.3 ePt-566917ePt-639501ePt-644030 29.968.7 ePt-565432 43.5 embra040 37.9 DB 40.3 ePt-564952 65.9 ePt-567274 39.3 eg062 102.4 ePt-639731 121.7 ePt-572230 101.4 ePt-572949 ePt-571477 43.4S/G embra746 ePt-600635 ePt-568901 31.871.0 es140embra082

S/G 77.4 ePt-642840 ePt-572453 38.8 ePt-504039 PP 44.7

40.6 ePt-574954 CA 68.7 ePt-565432 ePt-565983104.1ePt-569127ePt-641982 122.5 ePt-644065 CA 102.0 ePt-572882 DAP 44.5 ePt-599828 DB 101.4 ePt-572949 ePt-571477 34.174.7 embra629ePt-569732 43.4 embra746 39.3 eg062 71.0 embra082 40.4 81.2 embra928 123.1 ePt-642346 103.6 48.1ePt-644043embra010 S/G 44.9 ePt-644442 102.0ePt-638101ePt-572882104.7ePt-503517ePt-572940 ePt-566046 RDC 52.575.4 embra1928ePt-570192 44.5 ePt-599828 ePt-565983 ePt-569127 74.7 ePt-569732 87.2 embra003 125.3 ePt-562892 104.1 51.6ePt-638929ePt-574476 40.4 45.1 ePt-570209 40.7 103.6ePt-640562ePt-644043107.7 ePt-567002 58.376.9 embra1492ePt-575022 S/G embra053 44.9 ePt-644442 ePt-638101 ePt-503517 75.4 ePt-570192 88.7 S/G ePt-564900 57.6 embra033 embra979 42.7 en016 108.7 ePt-599364 62.6126.1 embra357ePt-564180 107.1 ePt-503990 ePt-570209 40.7 ePt-640562 46.9 ePt-575022 104.1 91.9ePt-638929ePt-568919 79.0 63.0 ePt-642974 45.1 LT 76.9 ePt-503873109.0 ePt-573374 137.8 ePt-572387 107.9 embra943 RDC 44.6 42.7 en016 49.4 ePt-567737 ePt-565836 107.1 92.1ePt-503990ePt-503506 64.280.2 embra2014ePt-564050 65.4 ePt-563112 46.9 embra979 79.0 ePt-564180 DB ePt-6399420.0 ePt-599609 44.7 ePt-568084 ePt-502872 ePt-571207 149.8 ePt-504329embra928ePt-566348ePt-503904 109.3 ePt-571934 LT ePt-503873 51.9 107.9 embra943110.2 ePt-640126 ePt-641101 68.682.1 RDC ePt-567737 ePt-565836 44.6 ePt-564050 49.4 ePt-59948280.23.7 ePt-599243 44.9 ePt-571328 ePt-564991 151.3 ePt-504330ePt-503875ePt-562962 109.8 ePt-570411 56.7 109.3 LT ePt-571934ePt-643832 ePt-643897 68.786.5

44.7 ePt-568084 DB 51.9 ePt-639942 82.114.8 embra928ePt-643616 ePt-57487692.2122.8 ePt-574037 ePt-567895 110.9 embra1470 ePt-571328 56.9 ePt-563387 45.2 109.8 ePt-570411ePt-572670 ePt-568780 71.088.6 ePt-574052ePt-503680 56.7 ePt-599482 44.9 86.518.7 ePt-503875ePt-641576 ePt-503970 ePt-502901 112.8 ePt-566988 DB 45.4 ePt-503672122.9 45.2 ePt-574876 57.0 ePt-574498 110.9 embra1470ePt-643831 ePt-571393 86.890.5 ePt-636919embra003 56.9 ePt-563387 88.649.8 ePt-503680ePt-643917 45.9 ePt-504312123.0 ePt-503461 116.2 embra038 45.4 ePt-503672 ePt-643712 ePt-564364 112.8 ePt-566988ePt-637500 ePt-600487 96.091.8 ePt-563056embra053 57.0 ePt-574498 58.2 90.552.6 embra003ePt-600714 46.5 ePt-60005092.8123.8 ePt-642677 116.9 embra731 ePt-504312 ePt-571004 ePt-640790 116.2 embra038ePt-504434 104.194.1 ePt-572668embra1362 ePt-643712 ePt-564364 45.9 91.8 embra053ePt-637248 ePt-568046 ePt-562919 120.0 ePt-644396 58.2 58.8 ePt-57330760.3 47.6 116.9ePt-502997101.8embra731133.8 ePt-503575 109.899.6 ePt-572777embra668 118.4 ePt-570076 46.5 ePt-600050 CA ePt-571004 ePt-640790 94.1 embra1362ePt-640434 48.3 ePt-599900142.2 ePt-504624 120.6 ePt-637919 ePt-502997 60.0 ePt-572815 120.0 ePt-644396ePt-638276 ePt-636824 118.0103.3 ePt-600416ePt-636848

47.6 LT 58.8 ePt-573307 99.660.4 embra668ePt-599458 49.0 ePt-637258101.9148.7 ePt-573980 121.8 ePt-566963 48.3 ePt-599900 60.2 ePt-566975 120.6 ePt-637919ePt-503998 120.7105.4U15ePt-566290embra203 - 10 130.3 ePt-574332 60.0 ePt-572815 103.3 ePt-636848ePt-570104 ePt-640468 ePt-5036960.0153.9 ePt-573089ePt-637895 123.2 ePt-562786 60.5 LT ePt-599635 50.7 121.8 ePt-566963ePt-639731 121.7110.1 ePt-572230ePt-641685 60.2 ePt-566975 49.0 ePt-637258 105.463.9 embra203ePt-568474 102.41.8 ePt-643877 124.0 embra153 64.3 ePt-568568 52.6 123.2ePt-599643ePt-562786156.8 ePt-641982ePt-639891 122.5110.4 ePt-644065ePt-640208 60.5 ePt-599635 50.7 ePt-503696 110.1 ePt-641685ePt-599982 104.1 ePt-637344 ePt-600147 125.9 ePt-568851 68.7 ePt-57568570.6 55.7 124.0ePt-5753112.2embra153159.2 ePt-572917 123.1 ePt-642346ePt-570436 ePt-637181 64.3 ePt-568568 52.6 ePt-599643 110.4 ePt-640208 104.7 ePt-599278ePt-572940ePt-565827ePt-566046 111.2 128.2 ePt-566859 73.2 embra14370.9 ePt-575708 ePt-644097 55.9 ePt-599853ePt-568851161.3 ePt-570646 125.3 0.0ePt-562892ePt-641899embra1470 68.7 ePt-575685 55.7 ePt-575311 ePt-570436 ePt-637181 125.9 107.76.9 embra310ePt-567002 ePt-574427 83.3 ePt-572286 ePt-573467 ePt-572886 59.6 ePt-563633167.5 ePt-566264 126.1112.215.6ePt-564900ePt-599873embra038 128.5 embra143 55.9 ePt-599853 111.271.4 ePt-641899 128.2 108.78.3ePt-566859embra210ePt-599364 73.2 ePt-644288 ePt-503564171.7ePt-504083ePt-642652 18.9ePt-572387embra731 128.6 ePt-504802 59.6 ePt-563633 84.5 embra1345 128.5 109.0ePt-574427embra204ePt-573374 137.8112.3 ePt-567549 ePt-568180 83.3 ePt-572286 112.273.2 ePt-599873ePt-568053 59.9 ePt-5738759.9190.5ePt-637490ePt-642586 36.3 embra061 131.1 ePt-575378 ePt-503564 ePt-504083 89.0 ePt-567769 128.6 ePt-504802ePt-502872 ePt-571207 149.8115.0 ePt-566348ePt-504851 84.5 embra1345 112.376.3 ePt-567549ePt-503359ePt-568180 ePt-639502110.210.2193.0 embra1578ePt-572673 39.2 embra1428 132.7 embra1428 59.9 ePt-573875 ePt-637490 95.7 embra120 131.1 ePt-575378ePt-564991 151.3118.1 ePt-562962ePt-564966 89.0 ePt-567769 115.076.7 ePt-504851ePt-569134 ePt-636656 LT 16.2 embra954 40.7 ePt-599500 133.7 ePt-565806 98.9 ePt-568389 60.2 132.7ePt-563189122.8embra1428ePt-574037 ePt-567895 120.4 ePt-639354 ePt-643870 95.7 embra120 ePt-639502 118.1 ePt-564966ePt-644093 ePt-569640 28.3 embra1851 42.6 ePt-566625 134.8 embra061 ePt-57191376.8 ePt-639138 60.6 133.7ePt-599499122.9ePt-565806ePt-643950ePt-503970 ePt-502901 120.7 ePt-563183 ePt-567436 98.9 ePt-568389 60.2 ePt-563189 101.9 120.4 ePt-639354ePt-639501ePt-643870 29.9 embra1977 43.5 embra040 136.1 ePt-568223 ePt-640370 ePt-600525 60.8 134.8ePt-563016123.0embra061ePt-503461 122.2 embra157 ePt-571913 ePt-639138 60.6 ePt-599499 ePt-643950 120.777.4 ePt-563183ePt-642840ePt-567436 31.8 es140 ePt-572453 136.2 ePt-599220 ePt-565816 ePt-599236 62.7 embra051 PP 44.7 embra048 101.9 104.5 136.1 123.8ePt-568223ePt-642677 CA 123.7 ePt-640370 ePt-600525 60.8 ePt-563016 122.2 embra157embra928 34.1 embra629 DAP 136.3 ePt-569601 106.1 ePt-57207681.2 68.3 136.2embra938ePt-599220 124.848.1 ePt-643368embra010 104.5 ePt-565816 ePt-599236 62.7 embra051 123.7 embra048 RDC 133.852.5 embra1928ePt-562919 137.7 ePt-641492 ePt-567151 109.9 ePt-56924587.2 embra003 70.5 ePt-566135ePt-569601 125.951.6 ePt-599438ePt-574476 106.1 ePt-572076 68.3 embra938 124.8 ePt-643368 136.3 142.258.3 embra1492ePt-504624 ePt-643056 S/G embra053 138.1 88.7 71.7 ePt-570164S/G 57.6 embra033 70.5 ePt-566135 149.6 ePt-573995 137.7 148.7ePt-641492embra357ePt-573980ePt-567151 129.2 ePt-503596 109.9 ePt-569245 125.991.9 ePt-599438ePt-568919 72.8 embra10662.6 63.0 ePt-642974 140.1 embra010 ePt-570164 153.3 ePt-567625 138.1 153.9ePt-643056ePt-637895 136.1 ePt-575608 149.6 ePt-573995 71.7 129.292.1 ePt-503596ePt-503506 embra10564.2 embra2014 65.4 ePt-563112 141.4 embra040 DB 155.8 ePt-640700 76.4 140.1 embra010ePt-639891 137.8 embra047 153.3 ePt-567625 72.8 embra106 136.1 ePt-575608ePt-640126 ePt-641101 156.868.6 ePt-504329 ePt-503904 144.7 ePt-639336 167.1 ePt-572638 78.2 141.4ePt-572312embra040ePt-572917 143.8 ePt-565436 155.8 ePt-640700 76.4 embra105 137.8 embra047ePt-643832 ePt-643897 159.268.7 ePt-504330 146.1 ePt-566759 ePt-640764 169.7 ePt-640988 78.9 144.7ePt-637828ePt-639336ePt-570646 ePt-570755 ePt-572241 167.1 ePt-572638 78.2 ePt-572312 143.892.2 ePt-565436ePt-572670 ePt-568780 161.371.0 ePt-574052 145.6 147.4 ePt-641100 174.1 ePt-638674 87.7 146.1ePt-640477ePt-566759ePt-566264ePt-640764 ePt-643322 ePt-570544 169.7 ePt-640988 78.9 ePt-637828 ePt-570755ePt-643831ePt-572241ePt-571393 167.586.8 ePt-636919 149.4 embra033 145.6 91.4 147.4ePt-570163ePt-641100ePt-642652 ePt-573184 ePt-504398 174.1 ePt-638674 87.7 ePt-640477 ePt-643322ePt-637500ePt-570544ePt-600487 171.796.0 ePt-563056 150.3 ePt-574220 93.0 149.4ePt-575230embra033ePt-573120ePt-642586 150.7 ePt-599875 ePt-639995 91.4 ePt-570163 92.8 ePt-573184ePt-504434ePt-504398 104.1190.5 ePt-572668 153.7 ePt-503673 150.3ePt-568916193.0ePt-574220ePt-569222ePt-572673 ePt-642854 93.0 ePt-575230 ePt-573120 150.7101.8 ePt-599875ePt-503575ePt-639995 95.3 109.8 ePt-572777 118.4 ePt-570076 154.6 ePt-643232 CA 153.7ePt-640825ePt-503673 153.0 ePt-641193 ePt-568916 ePt-569222 ePt-642854ePt-638276 ePt-636824 118.0 ePt-600416 155.9 ePt-574739 95.3 154.6ePt-642040ePt-643232ePt-644317 155.1 ePt-600741 ePt-640825 153.0101.9 ePt-641193ePt-503998 95.7 120.7 ePt-566290 130.3 ePt-574332 156.9 embra922 155.9ePt-504991ePt-574739 161.8 ePt-641837 ePt-642040 ePt-644317 155.1 ePt-600741ePt-639731 121.7 ePt-572230 158.9 ePt-640436 95.7 102.4 97.4 156.9ePt-571507embra922 174.1 ePt-566594 ePt-504991 161.8 ePt-641837ePt-641982 122.5 ePt-644065 199.2 ePt-574281 104.1 98.2 158.9ePt-573310ePt-640436 97.4 ePt-571507 174.1 ePt-566594ePt-572940 ePt-566046 123.1 ePt-642346 202.0 ePt-571810 104.7 98.9 199.2embra1081ePt-574281 98.2 ePt-573310 ePt-567002 125.3 ePt-562892 206.0 ePt-563279 107.7 102.0 202.0embra345ePt-571810 98.9 embra1081 ePt-599364 126.1 ePt-564900 210.1 ePt-570795 108.7 103.9 206.0embra290ePt-563279 102.0 embra345 ePt-573374 137.8 ePt-572387 226.7 ePt-642599 109.0 104.8 210.1embra1793ePt-570795 103.9 embra290 ePt-502872 ePt-571207 149.8 ePt-566348 228.2 ePt-568340 106.2 226.7embra135ePt-642599 104.8 embra1793 110.2 ePt-564991 151.3 ePt-562962

LT 173.4 ePt-563359 106.2 embra135 228.2 ePt-568340 122.8 ePt-574037 ePt-567895 180.3 ePt-564450 173.4 ePt-563359 DB: densidade básica122.9 ePt-503970 ePt-502901CA: crescimento de altura LT: lignina total RDC: rendimento 180.3 ePt-564450 123.0 ePt-503461 123.8 ePt-642677 PP: penetração do133.8 pilodynePt-562919 DAP: diâmetro à altura do peito S/G: relação siringil/guaiacil de celulose 142.2 ePt-504624 148.7 ePt-573980 153.9 ePt-637895 156.8 ePt-639891 159.2 ePt-572917 161.3 ePt-570646 167.5 ePt-566264 Figura 18. Localização171.7 ePt-642652 dos QTLs para todas as características estudadas nos diferentes 190.5 ePt-642586 193.0 ePt-572673 grupos de ligação (GL) de ambos os parentais (E. grandis e E. urophylla). As características analisadas foram: Densidade Básica da madeira (DB); Penetração do Pilodyn (PP); Crescimento em altura (CA); Diâmetro à Altura do Peito (DAP); Lignina Total (LT); relação Siringil/Guaiacil (S/G) e Rendimento Depurado de Celulose (RDC). Apenas os GL onde foram mapeados QTLs são apresentados. As barras representam as regiões onde o valor de LOD ultrapassou o limiar definido pelo teste de permutação com um nível de significância de 5%. Os marcadores DArTs estão representados pela cor preta e os marcadores microssatélites estão designados com a cor vermelha.

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4.4.11. Conteúdo de genes nos intervalos de QTLs

As sequências de marcadores DArT e microssatélites flanqueando os intervalos nos quais os QTLs foram mapeados, foram usadas para extrair os genes anotados na atual versão do genoma referência de Eucalyptus (http://www.phytozome.net/). No total 8.036 modelos gênicos anotados foram encontrados dentro dos amplos intervalos genômicos compreendidos por todos os 18 QTLs de origem materna (E. grandis), com uma média de 446,4 genes por QTL. Para os 17 QTLs identificados no mapa paterno (E. urophylla), 6.678 genes foram encontrados, com uma média de 692,8 genes por QTL (Tabela 7). Na maioria dos intervalos genômicos analisados, os QTLs de origem paterna (U15) co-localizaram com um número maior de modelos gênicos anotados do que aqueles de origem materna (G38). Um total de 3.294 genes previamente identificados no genoma de referência encontraram-se co-localizados com o grupo de três QTLs maternos identificados para Densidade Básica. Este é o maior número de genes localizados na mesma região genômica entre todos os QTLs descobertos nesta análise. Por outro lado, nos dois QTLs de origem paterna para a característica Diâmetro à Altura do Peito, foram identificados apenas 228 genes no genoma referência de Eucalyptus. A característica com maior número de QTLs identificados neste estudo foi Lignina Total. Os cinco QTLs de origem materna e os três QTLs provenientes do genitor paterno encontraram-se co-localizados com uma quantidade similar de genes (Tabela 7).

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Tabela 7. Número de QTLs detectados para cada característica e genitor e o número de modelos gênicos preditos observados nos intervalos genômicos correspondentes na versão atual do genoma de referência de E. grandis.

Característica Parental # de QTLs # total de genes G38 3 914 CA U15 3 1.599 G38 5 1.698 LT U15 3 1.749 G38 3 719 S/G U15 2 499 G38 2 790 RDC U15 3 496 G38 3 3.294 DB U15 1 505 G38 2 890 PP U15 3 1.602 DAP* U15 2 228 Genitores: G38, materno (E. grandis) e U15, paterno (E. urophylla). Número (#) de genes dentro do mesmo intervalo genômico e anotados previamente no genoma de Eucalyptus. Características avaliadas: Crescimento da Altura (CA); Lignina Total (LT); relação Siringil/Guaiacil (S/G); Rendimento Depurado de Celulose (RDC); Densidade Básica (DB); Penetração do Pylodin (PP) e Diâmetro à Altura do Peito (DAP). * Não foram identificados QTLs para DAP no genoma materno (G38 – E. grandis).

A seguir, a Figura 18 representa o número de genes observados no pseudo- cromossomo 3 do genoma de referência contidos no intervalo de um dos cinco QTLs para Lignina Total em E. grandis. Na distância de 11 Mpb coberta pelo intervalo de confiança do QTL detectado envolvendo 9 marcadores DArT e 4 microssatélites, encontram-se distribuídos 895 modelos gênicos preditos. Uma vez reduzido esse espaço genômico a 100 kpb, o número de genes dessa região diminuiu para nove.

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190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ePt-566757 ePt-638572 ePt-639142 ePt-643522 ePt-638450 ePt-639141 ePt-639903 ePt-574816 ePt-565486 ePt-568160 ePt-575615 ePt-644117 ePt-643505 ePt-640386 ePt-562913 ePt-636507 ePt-638215 ePt-566200 ePt-566146 ePt-638457 ePt-599667 ePt-640491 ePt-574026 ePt-574232 ePt-567357 ePt-575761 ePt-566960 ePt-641659 ePt-640361 ePt-566798 ePt-570414 ePt-504519 ePt-566342 ePt-636576 ePt-570633 ePt-505124 ePt-638369 ePt-600664 ePt-504436 ePt-599942 ePt-563830 ePt-638607 ePt-565647 ePt-564452 ePt-642989 ePt-575598 ePt-641705 ePt-565684 ePt-571540 ePt-573052 ePt-574533 ePt-567557 ePt-642731 ePt-573410 ePt-565025 embra1627 embra011 embra180 embra070 embra632 embra012 embra934 embra219 LOD>3

U15-1 %PULP ePt-574273 ePt-503826 ePt-641707 ePt-637542 ePt-641600 ePt-571831 ePt-639908 ePt-565741 ePt-599544 ePt-570738 ePt-565291 ePt-564718 ePt-565133 ePt-571011 ePt-568329 ePt-567194 ePt-572474 ePt-564595 ePt-567960 ePt-571974 ePt-640819 ePt-573637 ePt-569753 ePt-566727 ePt-574914 ePt-503042 ePt-639851 ePt-600313 ePt-503899 ePt-642125 ePt-503957 ePt-504317 ePt-637352 ePt-641628 ePt-571501 ePt-640068 ePt-638285 ePt-570275 ePt-637889 ePt-599385 ePt-639473 ePt-568368 ePt-569064 ePt-504319 ePt-565437 ePt-575039 ePt-571509 ePt-566054 ePt-572329 ePt-638730 ePt-562970 ePt-641822 ePt-599773 ePt-570173 ePt-599848 ePt-574680 ePt-566788 ePt-567046 ePt-599676 ePt-640620 ePt-642207 ePt-599344 ePt-565046 ePt-639682 ePt-641503 ePt-569670 ePt-573880 ePt-575612 ePt-564336 ePt-565107 ePt-564313 ePt-636787 ePt-566484 ePt-569798 ePt-504928 embra125 embra350 embra122 embra239 embra361 GL 3 U15-3

TL Scaffold 3 80 Mbp ePt-566804 ePt-503189 ePt-574628 ePt-641762 ePt-567331 ePt-636880 ePt-637683 ePt-568516 ePt-573339 ePt-563144 ePt-504594 ePt-599702 ePt-637551 ePt-570286 ePt-562875 ePt-641290 ePt-639668 ePt-563643 ePt-600655 ePt-563377 ePt-600106 ePt-570649 ePt-642508 ePt-641184 ePt-568117 ePt-638422 ePt-636515 ePt-503766 ePt-643630 embra1122 embra213 embra078 eg128

U15-4 QTL Lignina total 11 Mbp = 895 genes

TL 9 DArTs + 4 SSR %PULP 100 Kbp ePt-637768 ePt-641995 ePt-503656 ePt-571262 ePt-574390 ePt-573624 ePt-568630 ePt-575564 ePt-574475 ePt-568676 embra1761 embra098 embra751 embra042 embra007 embra121 embra623 embra069 embra128 100 Kbp = 9 genes eg091

U15-7

CBH HG ePt-572673 ePt-642586 ePt-642652 ePt-566264 ePt-570646 ePt-572917 ePt-639891 ePt-637895 ePt-573980 ePt-504624 ePt-562919 ePt-642677 ePt-503461 ePt-502901 ePt-503970 ePt-567895 ePt-574037 ePt-564991 ePt-571207 ePt-502872 ePt-573374 ePt-599364 ePt-567002 ePt-566046 ePt-572940 ePt-641982 ePt-639731 ePt-503998 ePt-636824 ePt-638276 ePt-503575 ePt-504434 ePt-600487 ePt-637500 ePt-571393 ePt-643831 ePt-568780 ePt-572670 ePt-643897 ePt-643832 ePt-641101 ePt-640126 ePt-503506 ePt-568919 ePt-642840 ePt-639501 ePt-569640 ePt-644093 ePt-636656 ePt-569134 ePt-503359 ePt-568053 ePt-644288 ePt-572886 ePt-573467 ePt-644097 ePt-575708 ePt-599982 ePt-568474 ePt-640468 ePt-570104 ePt-599458 ePt-640434 ePt-568046 ePt-637248 ePt-600714 ePt-643917 ePt-641576 ePt-643616 ePt-599243 ePt-599609 embra053 embra003 embra928

U15-8

TL HG

S/G WSG Figura 19. Representação do número de modelos gênicos preditos no genoma ePt-562962 ePt-566348 ePt-572387 ePt-564900 ePt-562892 ePt-642346 ePt-644065 ePt-572230 ePt-566290 ePt-600416 ePt-572777 ePt-572668 ePt-563056 ePt-636919 ePt-574052 ePt-504330 ePt-503904 ePt-504329 ePt-565827 ePt-599278 ePt-600147 ePt-637344 ePt-643877 ePt-573089 embra2014 embra1492 embra1928 embra1977 embra1851 embra1578 embra357 embra629 embra954 embra204 embra210 embra310 referência de Eucalyptus detectados na es140 mesma região do QTL de maior efeito para

U15-9

teor de Lignina Total mapeado no grupoS/G de ligação 3. %PULP ePt-574332 ePt-570076 ePt-563112 ePt-642974 ePt-574476 ePt-572453 ePt-566625 ePt-599500 embra1428 embra1470 embra033 embra010 embra040 embra061 embra731 embra038 U15-10

4.5. DISCUSSÃO

CBH HG 4.5.1. Análise comparativa com QTLs detectados em outros estudos em Eucalyptus

Diversos estudos de mapeamento comparativo demonstraram que os genomas das espécies de Eucalyptus comercialmente utilizadas, pertencentes ao subgênero Symphyomyrtus são sintênicos e colineares (Marques, Brondani et al. 2002; Brondani, Williams et al. 2006; Freeman, Potts et al. 2006; Hudson, Kullan et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012). Isto sugere que o posicionamento de QTLs, uma vez detectados, podem ser comparados entre espécies do gênero, embora não necessariamente sua magnitude e direção do efeito na característica alvo. Para realizar um mapeamento

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comparativo de QTLs entre espécies diferentes, é necessário utilizar marcadores comuns entre mapas de ligação diferentes (Thumma, Baltunis et al. 2010). Porém, até hoje poucas são as análises de QTLs realizadas com a utilização de marcadores DArT no gênero Eucalyptus (Kullan, van Dyk et al. 2012; Freeman, Potts et al. 2013), e mesmo com microssatélites, em geral apenas algumas dezenas de marcadores comuns têm sido utilizadas. Isto evidentemente dificulta esta avaliação comparativa, permitindo apenas fazer comparações tentativas em nível de grupo de ligação, e apenas ocasionalmente de forma mais precisa em nível de mesmos intervalos genômicos ou flanqueados pelos mesmos marcadores. As análises comparativas abaixo descritas são, portanto, em sua maioria, realizadas apenas em nível de cromossomo e devem ser consideradas apenas sugestivas de homologia.

Um total de 35 QTLs foi encontrado para as sete características de crescimento e qualidade da madeira avaliadas (Tabela 5). Para todas as características, mais de um QTL foi detectado, cada um explicando uma proporção relativamente pequena, e provavelmente superestimada (veja a seguir), da variação. Este resultado corrobora o controle poligênico destas características conforme destacado em outro estudo recentes (Gion, Carouche et al. 2011). Uma arquitetura poligênica evidentemente também dificulta a comparação de QTLs entre diferentes estudos, tendo em vista que os efeitos são pequenos e distribuidos por todo o genoma.

A localização dos QTLs descritos para Densidade Básica da madeira coincide parcialmente com QTLs mapeados em estudos anteriores em Eucalyptus. Alguns QTLs têm demonstrado coincidência com análises que envolveram espécies como E. globulus (Freeman, Whittock et al. 2009), E. nitens (Thumma, Baltunis et al. 2010), E. grandis e E. urophylla (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1996; Verhaegen, Plomion et al. 1997; Rocha, Barros et al. 2007; Gion, Carouche et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012). Nosso estudo revelou também um total de 5 QTLs para a penetração do pilodyn, os quais foram sintênicos com outros trabalhos em populações de E. grandis e E. urophylla (Verhaegen, Plomion et al. 1997; Gion, Carouche et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012).

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Em ambos os mapas foram identificados QTLs associados ao Rendimento Depurado de Celulose no GL4. Este resultado condiz com o posicionamento, em nível cromossômico, de um QTL que foi detectado para o mesmo caráter em E. globulus (Moran, Thamarus et al. 2002; Thamarus, Groom et al. 2004) e E. nitens (Thumma, Baltunis et al. 2010). Entretanto, esta coincidência não foi observada para os demais QTLs detectados para esta característica nos outros grupos de ligação (GL1, GL5 e GL9). Também no GL4 de ambos os parentais, foram localizados QTLs responsáveis pela variação no teor de Lignina Total, consistente com o fato destas duas características estarem associadas, embora de forma inversa. QTLs associados ao teor de lignina foram também descritos anteriormente no GL4 em E. nitens (Thumma, Baltunis et al. 2010). Curiosamente, em E. grandis nosso estudo identificou o mesmo número de QTLs para a relação S/G que o trabalho publicado recentemente para o mesmo tipo de cruzamento interespecífico (Gion, Carouche et al. 2011), um deles mapeado também no GL1, enquanto os outros dois em cromossomos distintos.

Geralmente, as características de crescimento possuem uma herdabilidade menor do que as características de qualidade da madeira (Raymond 2002; Hamilton and Potts 2008), consequência, entende-se, do maior número de genes envolvidos no controle e do maior efeito ambiental sobre estas características (Raymond and Apiolaza 2004; Freeman, Potts et al. 2011). Para as características de crescimento avaliadas foram descritos no total 8 QTLs, três de origem materna (E. grandis) e outros cinco de origem paterna (E. urophylla). Especificamente para Diâmetro à Altura do Peito, foi localizado um par de QTLs unicamente a partir do parental E. urophylla. Um QTL foi posicionado no GL7,assim como no estudo realizado no primeiro mapeamento de QTLs para o gênero Eucalyptus, embora aquele QTL tenha sido identificado em E. grandis (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1996). O segundo QTL foi mapeado no GL10, este coincide na sua localização cromossômica com outra análise feita também em E. urophylla (Kullan, van Dyk et al. 2012) e em E. globulus (Bundock, Potts et al. 2008; Freeman, Whittock et al. 2009). Não foram observadas coincidências de QTLs com outros estudos (Verhaegen, Plomion et al. 1997; Kirst, Myburg et al. 2004; Gion, Carouche et al. 2011). Por outro lado, dois dos três QTLs para o Crescimento em Altura foram mapeados nos GL1 e GL2 em E. grandis, e estes foram sintênicos aos obtidos

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para a mesma espécie (Gion, Carouche et al. 2011). O posicionamento no GL10 do QTL identificado a partir de E. urophylla e que controla a mesma característica foi coincidente na sua localização cromossômica com outra análise realizada em E. globulus (Bundock, Potts et al. 2008). O fato dos QTLs para este segundo caráter de crescimento terem sido encontrados em cinco dos 11 grupos de ligação (GL2, GL6, GL7, GL8 e GL10) (Tabela 5, Figura 17), sugere que provavelmente várias regiões genômicas estejam envolvidas no controle do crescimento, consistente com resultados recentes de experimentos com maior poder de detecção em uma abordagem de seleção genômica (Resende, Resende et al. 2012).

A análise tentativa de mapeamento comparativo, em grande parte em nível de grupo de ligação, indica que mais de 45% dos QTLs detectados nesta análise foram também detectados de forma independente em outros experimentos de mapeamento de QTLs envolvendo famílias não relacionadas das mesmas espécies ou de espécies diferentes. Estes resultados sugerem que algum nível de coincidência de QTLs pode ser esperado embora testes estatísticos sejam necessários para avaliar esta hipótese contra a alternativa de uma coincidência devida ao simples acaso. Esta análise se torna, entretanto, impossível de ser realizada tendo em vista a baixa precisão do posicionamento dos QTLs pela falta de marcadores comuns aos vários experimentos de mapeamento.

Talvez a melhor análise comparativa de QTL detectados entre diferentes populações de uma espécie florestal foi recentemente realizada envolvendo duas populações geneticamente não relacionadas de Eucalyptus com 738 e 920 indivíduos, respectivamente, no âmbito de um experimento de seleção genômica (SG) (Resende, Resende et al. 2012). Essas populações, pertencentes a duas empresas distintas e compostas por indivíduos pertencentes a algumas dezenas de famílias, foram avaliadas para quatro características fenotípicas, crescimento em altura, diâmetro, densidade básica e rendimento em celulose e genotipadas com a mesma plataforma DArT utilizada neste estudo, para cerca de 2500 marcadores, sendo cerca de 1600 em comum entre as duas populações. Os resultados demonstraram uma coincidência altamente significativa no que diz respeito ao posicionamento genômico das centenas de marcadores associados a QTLs, todos de muito pequeno efeito. Cerca de 50% dos

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QTLs apresentaram-se conservados em sua localização delimitada em bins genômicos de 500 kpb. Entretanto, a magnitude e direção dos efeitos (positivo ou negativo no caráter) dos QTLs variaram amplamente entre as duas populações, fazendo com que modelos de SG tivessem baixa acurácia preditiva entre as populações. Este resultado foi consistente com as expectativas teóricas de existência de variabilidade na fase de ligação entre alelos aos marcadores e alelos aos QTLs, ou seja, na estrutura do desequilíbrio de ligação. Além disso, as duas populações foram avaliadas em ambientes distintos, o que introduziu um efeito confundido da interação QTL com ambiente, contribuindo para as diferenças na magnitude e direção dos efeitos. A conclusão daquela análise indica que embora boa parte dos locos que controlam características complexas possa ser conservada entre populações quanto ao posicionamento genômico, os alelos e seus efeitos dificilmente o serão em função da heterogeneidade genética da espécie, impossibilitando a transferência de informação entre populações para fins práticos de seleção assistida (Resende, Resende et al. 2012). A inconsistência de QTLs entre diferentes estudos evidentemente dificulta a utilização da informação de QTLs para seleção em programas de melhoramento. Além disso, os dados mostram ainda que algumas dezenas ou centenas de locos estão envolvidos no controle da variação de características complexas como crescimento, de forma que a abordagem de localizar e tentar introgredir alelos favoráveis a múltiplos QTLs tem aplicabilidade prática muito limitada para não dizer nula (Bernardo 2008; Grattapaglia, Plomion et al. 2009).

4.5.2. Estimativas das proporções da variação explicada pelos QTLs

Da mesma forma que em todos os estudos de mapeamento anteriormente publicados para Eucalyptus, neste estudo, também, estimativas das proporções da variação explicada por todos os QTLs fornecidas pelo QTL Cartographer foram elevadas, variando de 5,5% para LT até incríveis 27,8% para S/G (Tabela 5). O QTL de maior efeito mapeado no parental E. urophylla controlaria assim quase 28% da variação fenotípica na relação Siringil/Guaiacil. Um loco com esta característica seria potencialmente muito interessante, uma vez que um aumento na relação S/G facilita a

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extração da lignina no processo de polpação. Da mesma forma, um dos QTLs detectados a partir do parental E. grandis para Rendimento Depurado de Celulose explicaria 22,5% da variação fenotípica. Uma baixa concentração de lignina total e uma elevada relação Siringil/Guaiacil estão ligadas a uma maior eficiência na extração química de polpa de celulose, portanto são propriedades interessantes para seleção. QTLs de grande efeito também seriam aqueles detectados para a penetração do Pilodyn explicando entre 18,0% e 21,2% no genitor materno e 15,4% e 19,6% no genitor paterno (Tabela 5). Em E. urophylla, foi detectado um QTL de grande efeito responsável por estimados 25,4% da variação na capacidade de penetração do Pilodyn (Gion, Carouche et al. 2011). QTLs para Densidade Básica explicaram individualmente até 11,3% da variação fenotípica em E. urophylla (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1996; Kullan, van Dyk et al. 2012) e até mesmo 29,4% em uma população hibrida E. grandis x E. urophylla (Rocha, Barros et al. 2007). Já para as características de crescimento, os 8 QTLs detectados explicariam individualmente proporções menores da variação, entre 6% e pouco mais de 10%, ou seja, cerca da metade do que QTLs para características de qualidade da madeira. Estes resultados coincidem com outros estudos em Eucalyptus, nos quais QTLs explicaram <10% da variação (Grattapaglia, Bertolucci et al. 1996; Freeman, Whittock et al. 2009; Thumma, Baltunis et al. 2010; Gion, Carouche et al. 2011; Kullan, van Dyk et al. 2012).

Infelizmente, entretanto, todos os estudos de mapeamento de QTLs em Eucalyptus publicados até o momento, inclusive este do presente estudo, sofrem do bem conhecido "efeito Beavis", em seguimento ao famoso experimento de simulação publicado por William Beavis para avaliar a eficiência do mapeamento de intervalo para detectar e estimar o efeito de poligenes (Beavis 1998). Aquele estudo demonstrou que quando uma progênie segregante de apenas 100 indivíduos é utilizada, o poder de detecção de QTLs de menor efeito é de apenas 3%. Além disso, a magnitude do efeito dos poucos QTLs que ultrapassam com sucesso o limite de detecção é superestimado em cinco ou até dez vezes, a depender da herdabilidade do caráter. Além disso, o efeito Beavis também causa um viés importante ao subestimar o número total de QTLs controlando a característica, justamente pelo fato do experimento não conseguir detectar QTLs de efeitos médios e pequenos.

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O estudo de Beavis, baseado em simulações, foi mais tarde validado com um desenvolvimento estatístico teórico mostrando que este efeito decorre fundamentalmente do fato de que os QTLs detectados são amostrados de uma distribuição truncada ao se aplicar um limite crítico para a declaração do QTL (Xu 2003). Em seguida, um amplo estudo experimental em milho mapeando QTLs com 990 linhagens F5 em 19 ambientes demonstrou que os 18 QTLs detectados para produtividade explicaram somente 42% da variância genética e mesmo estes estavam superestimados. Ao realizar validação cruzada com subconjuntos de indivíduos, somente 30% da variação pôde ser explicada. O problema da superestimativa dos efeitos se tornou exacerbado ao reduzir o tamanho da população de mapeamento para menos de 200 indivíduos. Estes resultados sugerem que o mapeamento de QTLs para características complexas (ex. produtividade, crescimento volumétrico), características estas possivelmente controladas por muitos genes de pequeno efeito (modelo infinitesimal), dificilmente, ou provavelmente nunca produzem resultados confiáveis do ponto de vista da variância fenotípica ou genética explicada, ao utilizar progênies de tamanho limitado de apenas poucas centenas de indivíduos. Os resultados apresentados na Tabela 5 deste estudo devem, portanto, ser considerados sob esta ótica. Métodos que buscam corrigir retrospectivamente essas estimativas para valores mais próximos da realidade tem sido propostos (Sun, Dimitromanolakis et al. 2011) e poderão ser utilizados nos nossos dados futuramente.

4.5.3. Co-localização entre QTLs mapeados para diferentes características

Vários dos caracteres estudados apresentaram correlações fenotípicas significativas (Tabela 6) e vários QTLs para diferentes características foram co- localizados no mesmo intervalo em ambos os mapas parentais. Dos 35 QTLs, 19 apresentaram algum tipo de sobreposição, em geral entre dois QTLs ou mesmo três em alguns casos (Figura 17). As três propriedades químicas da madeira avaliadas (LT, S/G e RDC) tiveram a maior quantidade de QTLs co-localizados, o que é esperado, tendo em vista que o teor de lignina e a relação dos tipos de lignina S/G são naturalmente correlacionados e ambos impactam diretamente o rendimento em

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celulose. As correlações fenotípicas entre estas três características foram elevadas, entre LT e RDC (rxy = -0,85; P<0,01), entre LT e S/G (rxy = -0,58; P<0,01) e entre S/G e

RDC (rxy = 0,40; P<0,01), consistente com as estimativas disponíveis para E. globulus (Stackpole, Vaillancourt et al. 2011). Kullan et al. (Kullan, van Dyk et al. 2012) reportaram a co-localização entre QTLs para características de crescimento e qualidade da madeira, fato este que não foi observado neste estudo, com exceção da co-localização no GL 10 para densidade, crescimento em altura e diâmetro. A correlação fenotípica entre estas três características foi de baixa a moderada, mas como era de se esperar, a correlação entre Crescimento em Altura e Diâmetro à Altura do Peito foi positiva e elevada (rxy = 0,78).

A co-localização de QTLs para características correlacionadas fornece evidência experimental adicional da validade dos QTLs detectados do ponto de vista de posicionamento no genoma. Esta observação pode ser devida a QTLs pleiotrópicos, ou seja, um mesmo QTL controlando diferentes características, ou à ligação física de diferentes genes que controlam as diferentes características e a resolução do mapeamento não permite separar os efeitos individuais. A hipótese mais parsimoniosa neste caso, entretanto, parece ser a de QTLs pleiotrópicos, considerando a detecção de várias co-localizações para as mesmas duas características e as elevadas correlações fenotípicas. Esta mesma conclusão foi também proposta no estudo semelhante ao nosso, recentemente publicado para uma população de mapeamento de E. grandis x E. urophylla (Gion, Carouche et al. 2011).

4.5.4. De QTLs para genes e seu uso no melhoramento

A abordagem de mapeamento e co-localização entre QTLs e genes expressos tem sido utilizada historicamente em estudos de espécies florestais como uma maneira de sugerir possíveis candidatos ou por vezes de tentar validar genes candidatos de forma indireta. Isto foi publicado para Pinus taeda (Brown, Bassoni et al. 2003), Pinus pinaster (Pot, Rodrigues et al. 2006) e Picea glauca (Pelgas, Bousquet et al. 2011) por exemplo, casos nos quais não existem genomas de referência e provavelmente continuarão sem contar com este recurso por algum tempo, apesar de esforços recentes terem sido

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iniciados neste sentido (Neale and Kremer 2011). Em Eucalyptus, os primeiros relatos de co-localização tentativa de genes e QTLs foram em E. globulus com base em sondas de RFLP derivadas de cDNA para genes que codificam para enzimas da via de lignificação (Thamarus, Groom et al. 2004). Esta mesma abordagem foi utilizada para QTLs para ângulo da microfibra em E. nitens (Thumma, Baltunis et al. 2010). Recentemente esta abordagem foi novamente utilizada para sugerir conexão entre QTLs e o gene ccr que codifica para uma importante enzima da via de lignificação e tem sido proposto como um forte gene candidato para o controle do teor de lignina (Gion, Carouche et al. 2011), apesar das evidências serem somente indiretas.

Com a disponibilização da sequência de referência do genoma de E. grandis, a análise de QTL ganhou mais relevância ainda e tem sido proposta como uma abordagem chave para a identificação posicional de genes candidatos responsáveis pela variação nas características quantitativas de qualidade da madeira (Freeman, Potts et al. 2011). Partindo da premissa de que esta co-localização não é um evento aleatório, a co-localização entre QTLs e genes, poderia apontar para diversos genes, com funções conhecidas ou desconhecidas (Gion, Carouche et al. 2011). Os estudos de QTLs, entretanto, pelas limitações inerentes aos experimentos, tipicamente têm resultado em QTLs que cobrem amplas regiões genômicas envolvendo vários centiMorgans. Considerando que, em média, 1 cM corresponde entre 350 e 550 kpb, cada QTL provavelmente compreenderá algumas centenas de genes ou elementos reguladores cis. Por isso, diferentemente do que às vezes é proposto, o mapeamento de QTL, embora uma abordagem útil e não enviesada de conectar fenótipo ao genoma, representa apenas um passo inicial, de muito baixa resolução, rumo à identificação do(s) gene(s) ou sequências genômicas relevantes.

A avaliação realizada neste estudo demonstrou exatamente isso. O experimento de mapeamento de QTL realizado com uma progênie de 171 indivíduos representa um tamanho bastante comum em estudos deste tipo. A densidade de marcadores utilizada, entretanto, foi consideravelmente maior do que a que normalmente se usa. Além disso, o genoma de Eucalyptus além de ter um tamanho de moderado a pequeno para plantas em geral, conta com uma sequência de referência de altíssima qualidade, gerada por sequenciamento Sanger. Mesmo assim, ao proceder com esta abordagem,

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alardeada como sendo de grande utilidade por alguns, centenas de modelos gênicos são observados, vários dos quais poderiam ser provisoriamente sugeridos como responsáveis pelo QTL. A validação de alguma proposta de gene candidato dependeria de experimentos adicionais complexos de validação. Isto, entretanto, seria um grande desafio em espécies florestais geneticamente heterogêneas, para as quais não existem populações de linhagens puras recombinantes ou linhagens quase isogênicas e os fenótipos são quantitativos. Além disso, mesmo se um ou mais genes forem identificados com sucesso, estes certamente explicarão apenas uma pequena proporção da variação fenotípica total na característica o que, do ponto de vista prático do melhoramento, será pouco útil.

4.6. CONCLUSÃO

Neste estudo foram identificados vários QTLs que controlam proporções aparentemente elevadas da variação fenotípica para um conjunto de características economicamente importantes em Eucalyptus. Estas estimativas são, entretanto, superestimadas pelas limitações inerentes ao experimento. Uma análise comparativa entre o nosso estudo e outros estudos de mapeamento de QTLs em espécies de Eucalyptus permitiu sugerir a sintenia de parte dos QTLs detectados, embora apenas em nível de cromossomo, sem resolução suficiente para efetivamente declarar homologias robustas. Uma avaliação da co-localização de QTLs com genes anotados no genoma de Eucalyptus demonstrou que centenas de genes poderiam ser tentativamente sugeridos como candidatos ao controle da variação nas características alvo do estudo, cuja validação experimental envolveria um esforço enorme e muito provavelmente inútil do ponto de vista prático, pois estes genes explicariam muito pouco da variação genética total.

Apesar do grande volume de informação de mapeamento de QTLs em Eucalyptus, não existe demonstração da utilização efetiva de QTLs no melhoramento operacional de espécies do gênero e em espécies florestais em geral. O mesmo vale para resultados de experimentos de genética de associação que, da mesma forma, resultam em algumas poucas associações, cujos efeitos, também superestimados (Sun, 114

Dimitromanolakis et al. 2011), explicam uma porção muito pequena da variação genética (Thumma, Nolan et al. 2005; Thumma, Matheson et al. 2009; Wegrzyn, Eckert et al. 2010). Várias são as razões para isso, já amplamente discutidas para o caso de espécies florestais (Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Grattapaglia and Resende 2011),

É tácito entre melhoristas que características complexas são produto da interação coletiva de múltiplos genes dinâmicos ao longo do tempo e no espaço, e cujos efeitos são modificados por influências ambientais, principalmente em espécies perenes. Este ponto de vista tem sido cada vez mais corroborado por evidências experimentais nos mais diversos organismos. Em vista das dificuldades mencionadas e a falta de evidências ao longo dos últimos 25 anos que justifiquem o grande esforço que envolve a detecção de QTLs, é necessario capitalizar a utilização de outros métodos que possam correlacionar genótipos e fenótipos de uma maneria mais global, simples e rápida. Neste sentido, a seleção genômica ampla (Genome Wide Selection - GWS) (Meuwissen, Hayes et al. 2001) tem surgido como uma alternativa prática para capturar, simultaneamente, a maior parte da variação para múltiplos caracteres quantitativos. Esta abordagem preditiva dispensa a necessidade de mapear e localizar QTLs ou genes, mas foca exclusivamente nos aspectos de eficiência operacional e ganho genético. Recentemente tem sido proposta para espécies florestais (Grattapaglia, Plomion et al. 2009; Grattapaglia and Resende 2011; Iwata, Hayashi et al. 2011; Denis and Bouvet 2012) e seu potencial demonstrado em experimentos em Eucalyptus (Resende, Resende et al. 2012) e Pinus (Resende, Munoz et al. 2012). Estes resultados indicam que a seleção genômica ampla deverá ser tema de intensa pesquisa com grande potencial de aplicação nos próximos anos.

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Genomic Characterization of DArT Markers Based on High-Density Linkage Analysis and Physical Mapping to the Eucalyptus Genome

Ce´sar D. Petroli1,2, Carolina P. Sansaloni1,2, Jason Carling3, Dorothy A. Steane4,5, Rene´ E. Vaillancourt4, Alexander A. Myburg6, Orzenil Bonfim da Silva Jr.1, Georgios Joannis Pappas Jr.1, Andrzej Kilian3, Dario Grattapaglia1,2,7* 1 Plant Genetics Laboratory, EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology, Brasilia, Brazil, 2 Department of Cell Biology, Universidade de Brasilia, Brası´lia – DF, Brazil, 3 Diversity Arrays Technology Pty Ltd., Yarralumla, Australia, 4 School of Plant Science and CRC for Forestry, University of Tasmania, Hobart, Tasmania, Australia, 5 Faculty of Science, Health, Education and Engineering - ML12, University of the Sunshine Coast, Maroochydore DC, Queensland, Australia, 6 Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria, Pretoria, South Africa, 7 Genomic Sciences Program - Universidade Cato´lica de Brası´lia, Brası´lia – DF, Brazil

Abstract Diversity Arrays Technology (DArT) provides a robust, high throughput, cost-effective method to query thousands of sequence polymorphisms in a single assay. Despite the extensive use of this genotyping platform for numerous plant species, little is known regarding the sequence attributes and genome-wide distribution of DArT markers. We investigated the genomic properties of the 7,680 DArT marker probes of a Eucalyptus array, by sequencing them, constructing a high density linkage map and carrying out detailed physical mapping analyses to the Eucalyptus grandis reference genome. A consensus linkage map with 2,274 DArT markers anchored to 210 microsatellites and a framework map, with improved support for ordering, displayed extensive collinearity with the genome sequence. Only 1.4 Mbp of the 75 Mbp of still unplaced scaffold sequence was captured by 45 linkage mapped but physically unaligned markers to the 11 main Eucalyptus pseudochromosomes, providing compelling evidence for the quality and completeness of the current Eucalyptus genome assembly. A highly significant correspondence was found between the locations of DArT markers and predicted gene models, while most of the 89 DArT probes unaligned to the genome correspond to sequences likely absent in E. grandis, consistent with the pan-genomic feature of this multi-Eucalyptus species DArT array. These comprehensive linkage-to-physical mapping analyses provide novel data regarding the genomic attributes of DArT markers in plant genomes in general and for Eucalyptus in particular. DArT markers preferentially target the gene space and display a largely homogeneous distribution across the genome, thereby providing superb coverage for mapping and genome-wide applications in breeding and diversity studies. Data reported on these ubiquitous properties of DArT markers will be particularly valuable to researchers working on less-studied crop species who already count on DArT genotyping arrays but for which no reference genome is yet available to allow such detailed characterization.

Citation: Petroli CD, Sansaloni CP, Carling J, Steane DA, Vaillancourt RE, et al. (2012) Genomic Characterization of DArT Markers Based on High-Density Linkage Analysis and Physical Mapping to the Eucalyptus Genome. PLoS ONE 7(9): e44684. doi:10.1371/journal.pone.0044684 Editor: Tongming Yin, Nanjing Forestry University, China Received June 1, 2012; Accepted August 6, 2012; Published September 11, 2012 Copyright: ß 2012 Petroli et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: The project was supported by the Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Project Grants 559245/2008-4 and 560831/2008-0) and PRONEX FAP-DF Project Grant "NEXTREE" 193.000.570/2009 to DG. This study was carried out as part of Cesar Petroli’s doctoral thesis at the University of Brasilia. CPS and CDP had doctoral fellowships from CAPES (Brazilian Ministry of Education) and DG a productivity research fellowship from CNPq. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors acknowledge the help and technical support from many employees of Diversity Arrays Technology Pty. Ltd. Two of the authors on this manuscript, namely Andrzej Kilian and Jason Carling, are employees of Diversity Arrays Technology Pty Ltd, which offers genome profiling service using the microarray whose genomic characterization is described in this report. This fact, however, has not interfered whatsoever with the full, objective, transparent and unbiased presentation of the research results described in the manuscript nor alters the authors’ adherence to all the PLoS ONE policies on sharing data and materials. * E-mail: [email protected]

Introduction Most PCR-based molecular marker methods, however, are low throughput and mobility-based, and therefore too time consuming DNA marker technologies for high throughput genome-wide and costly for applications that require genotyping thousands of genotyping at affordable costs have become indispensable in the samples for thousands of markers within modest budgets. plant geneticist’s toolbox. A large array of methods to detect DNA Although large SNP arrays have been developed for an increasing sequence polymorphisms among individual plants have been number of plant species [4], they still remain largely limited to the developed and used widely in the last twenty five years. Although major crops and their costs per sample are unaffordable for most DNA based hybridization inaugurated this journey with RFLP plant breeding and germplasm conservation programs. markers [1], PCR-based methods [2,3] were responsible for Diversity Arrays Technology (DArT) was described over a removing the barrier to entry in plant genomic analysis for a large decade ago [5] and has experienced increasing interest in recent number of species, including orphan crops and many forest trees.

PLOS ONE | www.plosone.org 1 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers years as a robust, high throughput, cost-effective genome-wide phenotypes in a broader and more sustainable way that includes method to assay thousands of presence/absence polymorphisms in comparative mapping, gene discovery and genome assisted a single assay. Although proprietary, this technique is licensed breeding. Recently, DArT markers have provided the coverage freely under an open-source model [6], a condition that has and high-density mapping required to move in that direction stimulated the development of genotyping arrays for more than 60 [29,30], although they are still lacking a deeper characterization of organisms including many less privileged crops their genomic content. [7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]. DArT involves the In this study we investigated the genomic properties of the 7,680 isolation and cloning of a random set of DNA fragments from a DArT marker probes that populate the Eucalyptus array by complexity-reduced DNA sample assembled by pooling several sequencing them, constructing a high density linkage map and germplasm accessions so that a representative collection of carrying out detailed physical mapping analyses using the recently variable genomic sequences of one or more target species is released Eucalyptus grandis reference genome sequence (www. captured. Several thousand of these DNA clones are arrayed on a phytozome.net). We were specifically interested in: (1) verifying glass slide and interrogated with a similarly complexity-reduced, DArT marker performance for linkage mapping, i.e. level of PCR-amplified genomic sample. Being a DNA-DNA hybridiza- polymorphism, locus ordering and genome coverage; (2) charac- tion-based method using relatively long probes (,300–500 bp), terizing the sequence composition of the DArT array probes DArT provides high and consistent signal to noise ratio even regarding sequence redundancy and gene content; (3) assessing the across related taxa [22]. physical distribution of the DArT marker probes in terms of In spite of the extensive use of this genotyping platform for overall genome coverage and distance from predicted gene many plant species, very little is known regarding the genomic models; (4) aligning the linkage map to the corresponding attributes of the DArT array probes that generate the several pseudochromosome scaffolds to assess the consistency of physical- thousand markers genotyped. With the exception of a study in oats versus recombination-based locus ordering; and (5) providing [23], and recent small scale surveys of a few hundred DArT probe pseudochromosome level and genome wide estimates of the sequences in tomato [16] and apple [24], to the best of our relationship between physical and recombination distances. knowledge complete DArT arrays have not yet been examined at the sequence level for redundancy, genome coverage and gene Materials and Methods content. Additionally, no information is available about the distribution of DArT markers across a genome, mainly because Plant Material no reference assembly has yet been available for most species A mapping population of 177 F1 individuals was derived from where this technology has been used. an inter-specific cross between two highly heterozygous elite trees, A high density DArT genotyping microarray with 7,680 E. grandis (clone G38) and E. urophylla (clone U15). Both species are selected probes from a wide representation of 64 Eucalyptus species widely planted in the tropics and belong to the same subgenus, was recently developed [25]. The genus Eucalyptus includes over Symphyomyrtus. This mapping pedigree, named GxU-IP was 700 species some of which are the most widely planted hardwood selected as a reference pedigree for mapping purposes in the trees worldwide [26]. A particularly outstanding feature of this Genolyptus project [43], immortalized by mini-cutting propaga- hybridization-based genotyping tool has been its genus-wide tion and planted in a replicated trial in five locations in July 2003 transferability across species, an attribute hardly offered by in randomized blocks with single tree plot with five replicates per microsatellites or SNPs [27]. DArT has provided a standardized location. Genomic DNA was extracted from both parents and all high-throughput genotyping platform, whereby thousands of F1 individuals using 150 mg of leaf tissue stored at –20uC as markers can be readily assayed in parallel for thousands of described previously [34]; the resulting DNA samples were of samples across Eucalyptus species. This DArT array has demon- consistent quality and suitable for DArT and microsatellite strated excellent performance for complex phylogenetic and genotyping. diversity analyses [22], genomic selection [28] and linkage mapping [25,29,30]. A detailed understanding regarding the Microsatellite Genotyping sequence content and genome-wide distribution of the DNA Screening of 300 EMBRA microsatellite markers [44,45,46] for probes that compose this DArT array should greatly expand its polymorphism between the two parents with the additional value for comparative QTL mapping studies, to navigate from analysis of six F1 progeny individuals to verify segregation, linkage maps to the reference sequence in positional cloning resulted in the selection of 222 informative microsatellites. projects and to extract additional genomic information from Microsatellite genotyping was carried out in multiplexed systems uniquely informative markers identified in phylogenetic, popula- with multi-fluorescence detection in an ABI 3100XL as described tion genetics and Genomic Selection studies. earlier [45,47]. Genetic linkage maps have been pivotal tools for examining the inheritance of qualitative and quantitative traits, for comparative DArT Genotyping mapping, whole genome assembly and for molecular breeding A detailed account of the methods used to prepare the high applications, including germplasm analyses, marker-assisted selec- density Eucalyptus DArT array was reported earlier [25]. Briefly, 18 tion and map-based cloning [31]. Linkage maps for species of reduced representation PstI/TaqI genomic libraries involving a Eucalyptus have been reported for several pedigrees, both intra- and total of 64 different Eucalyptus species were built and 23,808 DNA inter-specific, using different molecular marker technologies probes were screened in a panel of 96 individuals. A set of 7,680 [32,33]. Extensive linkage mapping data of anonymous markers probes that revealed robust polymorphisms was selected and used has been accumulated with dominant RAPD and AFLP technol- to construct the operational DArT genotyping array. This ogies [34,35,36,37,38,39], while RFLPs [40,41] and a recent procedure optimized (1) sampling of a large collection of sequence Single Feature Polymorphisms (SFP) genotyping array [42] have variants to increase recovery of polymorphic clones; and (2) inter- allowed positioning hundreds of genes on existing maps. In spite of specific transferability of the scored markers. Genomic represen- all these advances, these marker technologies have not provided a tations of the two parents and 177 F1 individuals of the mapping widely applicable tool that can be used to link genotypes to population were generated with the same complexity reduction

PLOS ONE | www.plosone.org 2 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers method used to prepare the library to generate ‘targets’ for pedigree with the physical position of the markers in the currently hybridizing to the arrays. After hybridization, microarray slides assembled genome sequence was carried out by aligning the were washed and scanned using a TECAN LS300 confocal laser higher confidence framework linkage map to the 11 main scaffolds microarray scanner at a resolution of 20 mm per pixel with of the current assembly of the E. grandis genome sequence (version sequential acquisition of 3 images for each microarray slide. The 1.0 available in Phytozome 6.0) produced for the one-generation signal from the FAM-labeled vector polylinker provided a selfed tree ’BRASUZ1’ (Brazil Suzano S1). This alignment was reference value for quantity of amplified DNA fragment present also used to provide pseudochromosome-specific and genome- in each ‘spot’ of the microarray. The resulting images were wide estimates of the correspondence between physical distance analyzed using DArTSoft version 7.44, a program created by and recombination fraction in the Eucalyptus genome, as well as an Diversity Arrays Technology Pty. Ltd. for microarray image data estimate of the effective genome coverage provided by the extraction, polymorphism detection, and marker scoring. A framework map. relative hybridization intensity value was then calculated for all accepted spots as log [Cy-3 signal/FAM signal] for the targets Genomic Characterization of DArT Marker Probes labelled with Cy-3, and log [Cy-5 signal/FAM signal] for targets E. coli clones containing the 7,680 Eucalyptus DArT probes [25] labelled with Cy-5. DArTSoft then compared the relative intensity were re-arrayed in twenty 384-deep-well-plates and submitted for values obtained for each clone across all slides/targets to detect the bi-directional Sanger sequencing to the genomics facility of Purdue presence of clusters of higher and lower values corresponding to University (www.genomics.purdue.edu). Following quality trim- marker scores of ‘1’ and ‘0’ respectively. Targets with relative ming and clipping of vector regions and PstI sites, sequences intensity values that could not be assigned to either of the clusters obtained were deposited in GenBank (accession numbers were recorded as missing data. Standard methods of marker HR865291-HR872186). Redundancy of DArT probes at the discovery were deployed using a combination of parameters sequence level was investigated using Geneious Pro 5.1.7 [49] automatically extracted from the array data using DArTsoft. The using a minimum sequence overlap of 50 bp for a sequence to be following parameters were used: (1) reproducibility $95% as assembled into a contig and an overlap identity of 98% (the measured by the concordance of the genotype call between ‘‘overlap identity’’ is the minimum percentage of bases that must technical replicates (replicated targets processed for a minimum of be identical in the region of overlap in order for a sequence to be 30% of the DNA samples genotyped); (2) marker quality Q $65, assembled). The numbers of unique and redundant DArT probes which measures between-cluster variance as a percentage of total were then assessed by applying four different sets of sequence variance in fluorescent signal distribution among tested samples; assembly parameters, from a most stringent assembly (A1) to the and (3) marker call rate $75% (percentage of targets able to be most liberal one (A4). These parameters were: (a) word length, i.e. scored as ‘0’ or ‘1’). the minimum number of consecutive bases that must match perfectly in order to find a match between two sequences; (b) Genetic Map Construction maximum number or single base mismatches allowed per reads as A single integrated genetic linkage map was constructed using a percentage of the size of the overlap between two reads; (c) both the co-dominant microsatellite data and the dominant DArT maximum number of base ambiguities allowed in word matches; marker data using JoinMap v3.0 [48]. Microsatellite markers (d) maximum number of gaps that may be inserted into each read segregated either from each single parent in a 1:1 ratio, from both as a percentage of the size of the overlap between two reads; (e) parents in a 1:2:1 ratio following a phase-unknown F2 configu- maximum size of each gap that may be inserted into reads. ration with both parents equally heterozygous for the same After preprocessing to remove contaminants, sequencing genotype, or in a fully informative 1:1:1:1 ratio with three or four artifacts and low quality sequences, all DArT probes for which different alleles segregating from the two parents. Dominant DArT sequences were obtained were mapped to the assembled Eucalyptus markers, on the other hand, segregated either in a 1:1 pseudo- grandis reference genome (version 1.0 available in Phytozome 6.0). testcross configuration from each single parent or in a 3:1 ratio Mapping was carried out using the BWA-SW (version 0.5.8) when both parents where heterozygous. For both the microsatellite component from the Burrows-Wheeler Alignment tool [50] to and DArT data, markers that showed $75% call rate and fitted produce a BAM [51] file. As the BWA tool can detect chimerical one of the expected segregation ratios at a$0.01 were used for reads reporting two or more hits, parameters were set up such that linkage analysis. The grouping and ordering of the markers were non-optimal mapping was avoided. The threshold for a probe established initially by applying the maximum likelihood algorithm sequence hit to be retained was set to a fixed value (T = 70), of JoinMap with population type CP; grouping at LOD.15; corresponding to twice the median value of the numeric recombination fraction #0.4; ripple value = 1; jump in goodness- distribution obtained from the formula 5.56log (L). This formula of-fit threshold (the normalized difference in goodness-of-fit chi- was applied to each one of the DArT probe sequences with length square before and after adding a locus) equal to 5 under a L, accounting for the fact that this formula is used by BWA as a Kosambi mapping function. Marker ordering with JoinMap was coefficient for threshold adjustments. As a consequence, BWA did carried out by simulated annealing, excluding markers that not search for suboptimal hits with a score lower than the contributed to unstable marker orders in the first two ordering alignment score minus T. The BWA options for the alignment rounds to yield a higher likelihood support framework map. score calculation including the score of a match (a), mismatch Additional segregating markers were then fitted to the linkage penalty (b), gap open penalty (q), and gap extension penalty (r) maps at lower stringency by the third and final round of JoinMap were left at their default settings (a = 1; b = 3; q = 5; r = 2). As an to provide map position for a larger number of segregating DArT additional evaluation of the quality of the mapping procedure, markers. sequence alignment information was extracted from the BAM file using an in-house Perl script designed to report all queried Comparative Analysis between the Linkage Map and the sequence hits and sub-optimal alignment scores. We considered up Assembled Genome Sequence to two hits to be a ‘‘successful mapping’’ and used the sub-optimal A genome-wide assessment of the consistency of the marker scores for each one of the hits to classify the ‘‘mapping reliability’’ order estimated in the linkage map derived from this particular and ‘‘expected mapping error rate’’ of the procedure. Finally, to

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Figure 1. Framework DArT/microsatellite linkage map for Eucalyptus. The map includes 1,029 markers positioned with high confidence for locus order, involving 861 DArT (in black) and 168 microsatellites (in red) with a centiMorgan scale on the left. doi:10.1371/journal.pone.0044684.g001 inspect the genomic features of the DArT markers relative to markers positioned with higher confidence, 861 DArT and 168 predicted gene models in version 1.0 of the Eucalyptus grandis microsatellites. When a more liberal marker ordering was allowed, genome, the 11 scaffolds were partitioned into 5 Mbp bins. A a total of 2,484 markers were mapped (2,274 DArT markers and Spearman rank correlation between the number of DArT markers 210 microsatellites). The remaining 496 markers could not be and number of gene models annotated in each bin was estimated mapped, even using a relaxed stringency, possibly as a result of for each pseudochromosome scaffold. Additionally the physical redundancy of DArT markers at the sequence level (see below) or distance in base pairs from each sequenced DArT probe to the due to very close linkage so that not enough recombinants could closest gene model was estimated to provide a genome-wide be sampled to resolve relative ordering along the map. picture of the gene-space coverage of the Eucalyptus genome A much larger proportion of segregating microsatellites (80%) provided by the DArT array. could be fitted in the Framework map than DArT markers (45%), most likely due to the higher information content of the fully Results segregating multiallelic microsatellites that provide higher power to categorize recombinant versus parental haplotypes and thus DArT Marker Genotyping determine order. However, the final size of the Framework map The distribution of markers across the different levels of was only 9.5% smaller than the Full map (1,176.7 versus reproducibility was skewed towards the highest quality classes. 1,303.9 cM) (Table 1 and Figure S2). Marker orders of the For example, out of the 3,933 markers that had reproducibility Framework map and the Full map were generally consistent, $95%, 70% of them had reproducibility equal to or greater than although some inverted sets of markers were observed, mainly on 99%. For the 4,884 markers that passed the threshold quality linkage groups 1, 2, 7 and 9. Furthermore, although the score, 61% had Q $70, while out of the 5,415 markers with a call expectation was that all framework markers would be contained rate $75%, 36% had a call rate $90% (Figure S1). While in the Full map this was not always the case. The Framework map reproducibility and Q score are measures that directly appraise the contained 99 markers that were excluded when a relaxed ordering quality of the genotyping, the call rate essentially reflects the threshold was allowed upon Full map construction. They were percent missing data tolerated. A relatively less stringent marker concentrated on linkage groups 2 (42 markers), 3 (26 markers), 1 call rate of $75% was adopted to maximize the number of (19 markers) and 11 (8 markers) (Figure S2). markers positioned on the linkage map, since such a threshold The Full map of DArT markers contained on average 226 would still yield good quality marker data for ,128 informative markers per linkage group positioned at a sub-centiMorgan recombinant gametes that allow satisfactory marker linkage and average inter-marker distance of 0.5 while the Framework map ordering analyses during map construction. The 7,680 probe had on average 93.5 markers per linkage group and yielded a Eucalyptus microarray yielded a total of 3,191 markers that 1.1 cM average inter-marker distance (Table 1). The distribution simultaneously passed all marker quality and call rate filtering of map distances between consecutive markers in the Framework parameters (Figure S1). map was significantly different from the one in the Full map Out of 3,191 markers tested for Mendelian behavior only 215 (p = 0.021 in a non-parametric Komolgorov-Smirnov test) (Figure did not fit either a 1:1 or a 3:1 ratio and were excluded from S3). This result demonstrates that (i) a Framework map spreads out further analyses. Out of the 2,976 DArT markers that showed well-supported markers to provide robust locus ordering and (ii) Mendelian behavior and were used in the linkage analysis, 1,777 reduces the proportion of short inter-marker distances (,1 cM) segregated in a 1:1 pseudo-testcross configuration and 1,199 in a relative to a Full map (87% in the Full map and 65% in the 3:1 fashion, i.e. were heterozygous loci segregating simultaneously Framework map). from the two parents. Regarding the microsatellite dataset, 166 A tally of the origin of the 861 DArT markers mapped on the loci were fully informative with three or four alleles segregating in Framework map showed that 197 (23%) markers segregated 1:1 four distinct genotypic classes providing valuable anchor loci for from E. urophylla, 298 (35%) from E. grandis, while 366 (42%) were the construction of an integrated linkage map. Forty-two heterozygous in both parents segregating 3:1. Very similar microsatellites segregated from one of the parents only, 25 from proportions were observed when all 2,274 DArT markers were E. grandis and 17 from E. urophylla, while 14 segregated in a 1:2:1 examined. These results suggest a higher sequence heterozygosity F2 phase-unknown configuration. in the E. grandis parent than in the E. urophylla parent. Out of the 7,680 marker probes in the array, 2,274 (i.e. approximately 30%), Linkage Mapping were ultimately mapped in this single segregating family. A dataset with 3,198 markers (2,976 DArT and 222 microsat- However, if the 3,191 DArT markers that passed the genotyping ellites) was subjected to a mapping analysis. Grouping analysis at quality filters for this experiment were considered, 71% of the LOD.15.0 resulted in 2,980 markers grouped in 11 bona fide markers could be mapped. Although the proportion of markers groups (numbered as established earlier [44]) and assessed by the that can be mapped depends largely on the sequence heterozy- presence of anchoring microsatellite markers. The linkage map gosity of the parents and their genetic divergence, this result built with higher likelihood support for marker order following the corroborates the outstanding performance of the DArT array for second round of JoinMap is presented as a ‘‘Framework map’’ linkage mapping purposes in Eucalyptus. (Figure 1). The linkage map obtained after the third round of ordering is hereafter called the ‘‘Full map’’ and is presented as a Recombination and Physical Distances in the Eucalyptus way to provide a preliminary position from which all the Genome informative markers fed into the subsequent genomic character- The alignment of the Framework linkage map to the Eucalyptus ization analysis (Table 1 and Figure S2). The Framework map, genome sequence indicates that the relative order of linkage built following the second round of JoinMap, resulted in 1,029 mapped markers by and large agrees with their relative physical

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Table 1. Mapping statistics of the DArT/microsatellite consensus maps of Eucalyptus grandis x E. urophylla.

Linkage Group/ Pseudochromosome 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Total Mean St.dev.

Full mapa Total # markers 207 244 270 106 189 271 224 275 220 263 215 2,484 225.8 49.34 # DArT markers 191 219 256 93 166 231 210 262 204 246 196 2,274 206.7 47.68 # Microsatellites 16 25 14 13 23 40 14 13 16 17 19 210 19.1 7.98 Total size (cM) 167.8 129 102.4 86.6 130.7 116.5 117.3 118.6 118.3 117.4 99.5 1,303.9 118.5 20.8 Average inter-marker distance 0.8 0.5 0.4 0.8 0.7 0.4 0.5 0.4 0.5 0.4 0.5 0.5 – – Framework Mapb Total # markers 80 131 128 57 74 104 75 107 78 92 103 1,029 93.5 23.4 # DArT markers 72 112 115 44 54 72 64 95 64 82 87 864 78.3 22.6 # Microsatellites 8 19 13 13 20 32 11 12 14 10 16 168 15.3 6.6 Total size in cM 114.0 122.1 124.6 76.1 100.3 121.6 130.5 116.2 92.5 87.4 91.5 1,176.8 107 18.1 Average inter-marker distance 1.4 0.9 1.0 1.3 1.4 1.2 1.7 1.1 1.2 1.0 0.9 1.1 - 0.3 Framework to genome mapc Total # framework markers 62 98 102 52 68 88 68 94 66 82 89 869 79 16.5 Physical dist. covered (Mbp) 40.7 63.8 79.7 41.1 73.8 50.3 51.9 68.4 38.4 38.6 40.8 587.5 – – Ratio kbp/centiMorgan 357.3 522.1 639.2 539.9 736.1 413.7 548.4 588.9 415.1 441.4 445.4 – 513.4 112.7

aFull map: all markers mapped at relaxed support for order. bFramework map: markers ordered with higher statistical support. cFramework to genome map: framework markers were positioned onto the assembled Eucalyptus grandis genome sequence to provide a correspondence between physical distance and recombination fraction for each pseudochromosome and at the genome-wide level. doi:10.1371/journal.pone.0044684.t001 positions (Figure 2). Typically only a few sparse markers or small redundant sequences, while 3,209 sequences were unique, blocks of markers (e.g. LG1 and LG4) show a locally inconsistent unmatched singletons. In total, the 6,918 probes for which order with the one estimated in the genome sequence. Upon sequences were obtained represented effectively 4,583 unique loci, further inspection of the segregation data of the few scattered i.e. a low bound estimate of the rate of redundancy of 33.75%. markers showing discrepancy between their physical- and recom- Under more liberal assembly parameters, the total number of bination-based positions, several of them were borderline in terms unique loci was reduced to a total of 3,864, providing a high-end of marker quality and call rate parameters, which could possibly estimate of the rate of sequence redundancy at 44.14% (Table 2). explain the observed inconsistencies. Out of the 1,029 framework- If an equivalent rate of redundancy is assumed for the 762 DArT mapped markers, 869 could be positioned on the genome probes for which no sequences could be obtained, the 7,680 sequence while the remaining 160 either had no sequence probes in the DArT array effectively sample between 4,289 and available for mapping or mapped to the 4,941 smaller additional 5,087 unique loci in the Eucalyptus genome. All 6,918 sequences unanchored scaffolds of the current Eucalyptus genome assembly. were submitted to GenBank and 6,896 were eventually accepted The 869 linkage- and physically-mapped markers covered a total and deposited (22 were trimmed to sizes smaller than acceptable of 587.5 Mbp of sequence (Table 1) thereby providing 97% by the NCBI), receiving accession numbers HR865291- coverage of the 605.8 Mbp currently assembled in the 11 main HR872186, with clone identifiers corresponding to the DArT scaffolds of the Eucalyptus genome. Pseudochromosome-specific marker naming convention used in this report. Searched against estimates of the relationship between physical distance in kbp and the complete NCBI EST database, 3,703 (53.6%) returned with recombination fraction in cM varied between 357.3 for pseudo- positive BLASTn hits (Table S2). chromosome 1 and 736.1 for pseudochromosome 5, with a genome-wide average of 513.4 kbp/cM (Table 1). When the full DArT Marker Probe Alignment to the Eucalyptus Genome linkage map was aligned to the genome sequence (data not shown), Out of the 6,896 DArT probes for which quality sequences were out of the 2,274 genetically mapped segregating DArT markers, 1,986 aligned to the 11 pseudochromosomes, while 45 markers obtained, 6,631 (96%) could be successfully aligned to the mapped to 31 unanchored scaffolds and 243 DArT markers had assembly of the Eucalyptus grandis genome sequence (version 1.0 no sequence available or did not map to the current assembly. in Phytozome 6.0) while 265 DArT probes could not be mapped Based on the linkage-mapped DArT markers, the 31 unanchored using high stringency parameters. Of the mapped probes, 6,390 of scaffolds, adding up 1.4 Mbp of sequence, could be assigned to the them aligned to the 11 main pseudochromosomes and 241 to the 11 main pseudochromosomes (Table S1). additional 4,941 small unanchored scaffolds. When these mapping DArT probe sequence redundancy analysis. Sequences results were used to assess the quality of the sequence alignment were obtained for 6,918 of the 7,680 DArT probes (90%), with parameters adopted (see Material and Methods) a mapping error average size of 534 bp. Under the most stringent assembly rate of 0.002 was estimated by observing 12 unsuccessfully parameters (see Material & Methods), out of the 6,918 sequences, mapped sequences in 6,631, i.e. a reliability $99.8%. Interest- 3,709 fell into multi-sequence clusters with two or more sequences ingly, this number matches precisely the average scoring per cluster. These were merged into 1,374 unique clusters of non- reproducibility estimated by DArTsoft following the standard

PLOS ONE | www.plosone.org 6 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers

Figure 2. Alignment of the Framework map to the Eucalyptus grandis reference genome. Correspondence of the DArT and microsatellite marker positions on the Framework linkage map (green bars) with their location on the 11 Eucalyptus grandis pseudochromosome scaffolds (white bars). The scale on the left corresponds simultaneously to centiMorgan distances for the linkage map and to Mbp of sequence for the pseudochromosome scaffolds. doi:10.1371/journal.pone.0044684.g002 marker selection thresholds used. When the threshold for a probe observed in Eucalyptus (55 in 6,631, i.e. 0.83%) is consistent with sequence hit to be retained was set down to the BWA default level the 1.4% frequency observed in a linkage mapping study in barley (T = 37), 166 of the 265 unmapped probes could be additionally [54]. aligned to the 11 main pseudochromosomes and 91 of these 166 probes were also linkage-mapped onto the Full map. Additionally, DArT Marker Coverage of the Eucalyptus Gene-space out of the 89 probes that remained physically unmapped to the E. To characterize the Eucalyptus gene-space covered by the DArT grandis genome assembly, 36 were successfully linkage-mapped as array, we considered only the probes that were aligned to the 11 well. annotated pseudochromosomes. These totaled 6,390 probes which A further examination of the alignment of the 6,631 DArT aligned to a total of 6,571 positions, given that 181 probes also probes to the Eucalyptus genome assembly, including all 4,952 aligned to a second position according to the BWA threshold scaffolds, was carried out. A total of 4,189 probes were confidently adopted. The distribution of both the 6,571 DArT probes aligned to a single and unique position in the genome as their positions and the 1,986 genetically mapped DArT markers, were mapping produced a single hit with no subalignment score. For plotted together with the distribution of the 41,204 predicted gene 2,252 of the 2,442 remaining probes, a second subalignment was models in the Eucalyptus genome (version 1.0) partitioned into 122 retained which overlapped the same locus as the one of the first bins of 5 Mbp each, which on average correspond to ,10 cM best alignment. Therefore in total 6,441 DArT probes out of the map distance bins, assuming a ,1200 cM total recombination 6,631 evaluated (97.1%) were considered to be aligned to a single distance (Figure 3). The histogram indicates that the DArT locus in the genome. For the 190 probes in which a second hit was microarray provides a homogeneous genome-wide coverage of reported by BWA, we carried out an analysis using chimeric tools markers and suggests a monotonic relationship between the detection provided by the CD-HIT [52] and EULER DNA [53] number of gene models and the number of DArT markers. In fact fragment assembly softwares with default parameters, resulting in a relatively strong and highly significant Spearman rank correla- no detectable chimeric reads. For 135 probes, the retained tion was found between the number of predicted gene models and subalignment was located in a different position on the same the total number of DArT markers found in a genome bin scaffold, and in 95 of these cases the distance between alignments (r = 0.682; p = 3.79e-18), and likewise with the number of mapped was smaller than 1 kb, suggesting a contiguous tandem duplica- DArT markers (r = 0.467; p = 5.19e-8) (Figure 4). These results tion. For 40 DArT probes the distances between the first and show that the DArT array tends to provide segregating markers in second hit alignments were larger than 1 kb, with 13 of them essentially all 5 Mbp genomic bins with the number of DArT larger than 10 kb. Finally, only 55 probes were aligned to positions markers scaling with the number of genes in the bin. On average on different pseudochromosomes. In 37 of these cases both loci each bin contains 1669.0 genetically mapped markers, 53621.6 were found in the 11 main pseudochromosomes and in 18 cases DArT marker probes and 3346100.9 predicted gene models. one of the loci was found in an unanchored scaffold. The Only four bins had fewer than 20 DArT marker probes mapping frequency of multilocus DArT probes in different chromosomes to them and only 11 out of the 122 bins had fewer than 5

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PLOS ONE | www.plosone.org 8 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers

Figure 3. Genome-wide correspondence of DArT markers and predicted gene models in the Eucalyptus grandis genome. The 11 pseudochromosomes of the Eucalyptus grandis genome (Version 1.0 in Phytozome 6.0), were partitioned into 122 bins of 5 Mbp. For each bin the numbers of DArT marker probe positions (blue bars), the number of genetically mapped DArT markers (red bars) and the number of predicted gene models (green bars) were plotted. doi:10.1371/journal.pone.0044684.g003 genetically mapped markers. In addition, almost 70% of the DArT [25] we have now examined the genomic properties of the DArT marker sequences were mapped at zero bp from the closest marker probes that populate this array by sequencing them, predicted gene model and less than 10% were located further than constructing a high density linkage map and carrying out physical 10 kbp from predicted gene models (Figure 5). comparisons to the recently released Eucalyptus grandis BRASUZ1 annotated genome sequence. We have shown that DArT marker Discussion probes preferentially target the gene space and display a uniform distribution across the genome, providing excellent coverage for This study provides unprecedented data regarding the detailed genome-wide applications in breeding and diversity studies. Such genomic attributes of DArT markers in a plant genome. Following ubiquitous DArT marker properties had not been described the development of a high performance Eucalyptus DArT array

Figure 4. Correlations between DArT markers probes, mapped DArT markers and gene models. Spearman Rank correlations were estimated between: (A) the number of DArT marker probes and the number of gene models; and (B) the number of mapped DArT markers and the number of gene models, for every 5 Mbp genome bin. doi:10.1371/journal.pone.0044684.g004

PLOS ONE | www.plosone.org 9 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers

number of useful markers for mapping, between 1,818 and 2,553, as originally reported when the Eucalyptus DArT array was developed [25]. This number is also comparable to the 2,229 DArT markers mapped in the consensus map of two related backcross families of E. grandis x E. urophylla [30] and to the 1,845 EST-based Single Feature Polymorphism markers map reported earlier for the same pedigree used in this study [42]. The proportion of informative markers in such interspecific mapping pedigrees has been considerably higher than the number observed in intraspecific pedigrees. Hudson et al. [29] could only map 1,060 DArT markers in an outcrossed F2 family derived from two inter- provenance F1 individuals and only 569 in an inter-provenance cross of E. globulus. Genetic divergence between species and corresponding levels of differential sequence heterozygosity at the DArT loci determine in large part the proportion of informative markers ultimately captured. The DArT genotyping platform has provided an order of magnitude larger number of markers for Figure 5. Distribution of the physical distance between DArT mapping in Eucalyptus than previous technologies such as RAPD, markers and gene models in the Eucalyptus genome. Distribution AFLP and microsatellites [32]. The undomesticated nature of of the proportions of the 6,571 DArT marker probe positions according Eucalyptus resulted in a larger number of markers mapped than to distance classes in kbp from the closest predicted gene model in the most DArT-based linkage maps built with extensively optimized Eucalyptus grandis genome (version 1.0). DArT arrays such as those for wheat, oats [23], sorghum [57], and doi:10.1371/journal.pone.0044684.g005 barley [54]. Recently, between 3,100 and 3,500 high quality polymorphic previously in spite of several DArT marker-based applied studies DArT markers were scored in breeding populations composed of published to date for a large number of plant species. several hundred individuals of E. grandis and E. urophylla in the context of Genomic Selection experiments [28]. As expected, DArT Marker Genotyping Efficiency for Genetic Analysis when compared to an average of 2,200 to 2,300 markers captured in Eucalyptus and mapped in biparental pedigrees, the DArT array provides A set of relatively strict filtering parameters was applied to the between 40 and 50% more markers at the population level. If signal intensities obtained from the 7,680 probes in the Eucalyptus similar proportions are kept, one can anticipate that in E. globulus microarray. A total of 3,191 markers (41.5%) passed all marker breeding populations, the DArT array will provide between 750 quality and call rate thresholds (Figure S1), a proportion consistent and 1,500 informative markers depending on the general with the original estimates reported during array validation [25] variability of the population and provenance composition. and recent mapping studies in similar interspecific pedigrees [29,30]. Besides marker quality filtering, a strict screening for Probe Redundancy is a useful Property of the DArT Array adherence to Mendelian expectations was applied. Segregation Reported estimates of DArT marker redundancy obtained by distortion has been reported in some previous Eucalyptus mapping comparing the segregation pattern in mapping population or studies although, most of the time, at a rate no different from the estimating Hamming distances between markers have varied from one expected by chance alone [34,44]. This became a topic of 38% in barley [54], to 43% in Arabidopsis [58]. After sequencing all interest as a way to assess heterospecific interactions in the F1 DArT probes on the array, a redundancy of between 33.75 and hybrid affecting introgression rates between distant species [55]. In 44.14% was estimated (Table 2). This is consistent with the 46% this particular pedigree, however, just as in the first linkage map redundancy rate reported for several thousand sequenced DArT study in Eucalyptus [34], no segregation distortion would be probes from an oat genotyping array [23]. Under the same genome expected in principle, since marker segregation was observed from complexity reduction protocol, redundancy will vary with the each pure species parent and not in the gametes derived from a F1 particular genome structure of the target species, the diversity of hybrid where distortion could be expected. Accordingly, only 215 samples used to build genomic representations and, largely, with markers (6.7%) were excluded due to departures from expected the probe screening criteria and the final number of selected segregation ratios, a proportion close to the 5% expected by probes. As more probes are surveyed, a higher redundancy will chance alone. Besides sampling error, these distorted markers result. Redundancy from sequencing only a few hundred DArT could include cases of duplicated loci such as the 55 DArT probes probes, previously selected for polymorphism, was estimated at shown to confidently align to positions on different pseudochro- 15% in an apple array, although a potential redundancy of 50% mosomes, and the 13 probes aligning at distances greater than was acknowledged had all clones on the array been sequenced [24]. 10 kbp, which in both cases would give rise to mixed hybridization Considering that a fairly uniform physical and mapping distribu- signals and distorted segregation ratios. The 97% genome-wide tion of the DArT probes was achieved across the Eucalyptus genome physical coverage provided by the linkage map built in this study (Figures 2 and 3), a certain level of probe redundancy in the DArT indicates that keeping distorted markers in the linkage analysis array is actually a desirable feature. Eucalyptus DArT probes vary in would not improve coverage but, rather, could complicate marker size (5346215 bp) and, although sharing portions of DNA ordering if distortions derived from excessive missing data or sequence, will have variable abilities to detect sequence polymor- mistyping were included [56]. phism across individuals and populations, thereby providing Out of the 2,976 DArT markers included in the linkage analysis improved power and flexibility for genome-wide genotyping. 2,274 were eventually mapped and ordered in the full consensus An interesting aspect of the DArT probe sequence redundancy map and 1,029 in the framework version (Table 1). The emerged when comparing the alignment of DArT probes to the proportion of DArT markers mapped is well within the predicted reference genome. Between 3,864 and 4,583 unique sequences

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Table 2. Results of redundancy analysis of the 6,918 DArT of marker order is not a trivial issue and more so when a large marker probe sequences under four different sets of assembly number of markers are mapped with a limited progeny size [61]. parameters from the most stringent (A1) to the most relaxed This observation also supports the fact that similar apparent (A4) (see Material and Methods for details). inversions and non-colinearities reported in previous comparative linkage mapping studies across sexually compatible Eucalyptus species [29] are, by and large, ordering inconsistencies due to Parameter A1 A2 A3 A4 various sources of experimental error [56] and rarely should be taken as evidence of any relevant biological genomic occurrence Word length 18 14 12 10 unless independent validation data is available. With the Index Word length 13 12 11 10 availability of a reference genome for Eucalyptus, coupled to high Mismatches 10% 15% 20% 20% throughput sequencing technologies and powerful assembly Ambiguities per read 4 4 16 16 procedures, such validations might now become possible. A simple visual inspection of the aligned Full and Framework Maximum % gaps per read 10% 15% 20% 20% maps (Figure S2) and the significant difference found between the Gap size 1bp 2bp 5bp 5bp distributions of map distances between consecutive markers in the Results of redundancy analysis two map versions (p = 0.021) (Figure S3), support the conclusion # Unmatched singletona 3,209 2,607 2,381 2,276 that framework map building largely removes highly clustered sets # Redundant sequencesb 3,709 4,311 4,537 4,642 of DArT markers, leaving a sparser map with essentially equivalent genome coverage and improved statistical support for # Unique non-redundant 1,374 1,537 1,587 1,588 sequencesc relative ordering. Moreover, when the linkage map of microsat- ellites and DArTs was compared with a microsatellite-only map, Total selected sequencesd 4,583 4,144 3,968 3,864 the total recombination distance did not change (data not shown). Estimated rate of sequence 33.75% 40.0% 42.64% 44.14% This additional result suggests that, while the microsatellites do redundancy provide adequate genome coverage, the DArT markers effectively aUnique sequences not matching any of the other reads. cover the genome in previously unsampled genomic regions, bSequences that fall into multi-sequence clusters with more than two thereby providing the necessary marker density for high-resolution sequences per cluster. mapping and genome-wide studies. The Framework map should cUnique sequences drawn from the redundant clusters. dSum of unmatched singleton and non-redundant sequences. therefore be taken as the most reliable map when it comes to doi:10.1371/journal.pone.0044684.t002 comparative analysis with the reference genome or map-based efforts (such as looking for the co-localization of genes with were observed for the DArT probes (Table 2), an estimate potentially large effect QTLs). consistent with the 4,189 DArT probes confidently aligned to a The alignment and physical mapping of 869 framework unique position in the genome. Nevertheless the BWA alignment mapped DArT and microsatellite markers to the 11 main scaffolds to the genome assembly revealed that 2,252 additional probes of the Eucalyptus genome sequence allowed an estimation of the mapped to exclusive positions so that, in total, 6,441 loci in the relationship between physical distance and recombination fraction genome were sampled by the DArT array. This is the first time in each pseudochromosome and for the whole genome. This such an analysis has been carried out for a species for which a estimate varied considerably (357 to 736 kbp/cM) with a genome- DArT array and a reference genome are available. It shows that wide average of 513 kbp/cM (Table 1). Interestingly, this estimate is not far from the coarse estimates of 395–559 kbp/cM reported redundancy estimates based on a simple assembly of DArT probe early on, based on the first available linkage maps [34] and the first sequences tend to be conservative. estimates of Eucalyptus genome size [62]. This time, however, by using the assembled genome sequence to which framework Framework Linkage Mapping Allows Reliable Estimates markers were mapped physically, an improved estimate was of the kbp/cM Ratio in the Eucalyptus Genome possible. Kullan et al. [30] using a different approach, based Two versions of a linkage map were built in this study, each one exclusively on a selected set of 153 pairs of flanking markers with specific objectives. A Framework map was built as the mapped at approximately 1 cM distance, estimated 633 kbp/cM. "hypothesis" that best explained the segregation data observed, to Besides the potential bias introduced by specifically selecting pairs provide more accurate information regarding marker order of markers and, as a consequence, precluding the intrinsic [59,60] and to be used for the estimation of the relationship variation in recombination versus physical distance along the between physical distance and recombination fraction (Figure 1). genome, that estimate was based on markers ordered at a relaxed On the other hand, the Full map, that included all segregating likelihood. We therefore consider the estimates presented in this DArT markers, was built to provide a preliminary position for all work, both at the pseudochromosome level and whole-genome possible DArT markers and thus allow a more extensive average to be better approximations for Eucalyptus (Table 1), assessment of the genome coverage and distribution of DArT although we acknowledge that recombination rates are expected to markers relative to genes. Additionally, by including the largest vary by orders of magnitude across a genome [63]. number of markers (even if at a relaxed order), this map offered a better probability of assigning unanchored scaffolds to the Linkage to Physical Mapping Suggests a Pan-genomic assembled pseudochromosomes of the current Eucalyptus reference Feature of the DArT Array and Completeness of the genome sequence. Marker order of the Framework map and the Eucalyptus Genome Assembly Full map were generally comparable and total map sizes were also The overall consistency between the order of framework close (Figure S2 and Table 1). However, inverted sets of markers mapped DArT markers and their physical order in the genome were observed between these map versions as well as markers that sequence substantiate the quality of scaffold assembly in the dropped out when going from one map to the other and vice versa. current Eucalyptus genome sequence (Figure 2). While the linkage These results substantiate the well-known fact that the resolution map reported by Kullan et al. [30] was used effectively to assist

PLOS ONE | www.plosone.org 11 September 2012 | Volume 7 | Issue 9 | e44684 Genomic Characterization of DArT Markers scaffold ordering during genome assembly (J. Schmutz pers. study, phylogenies or population genetic surveys based on DArT comm.) the linkage map presented herein was not, and thus markers can now be further explored according to the gene constitutes an independent validation of the current Eucalyptus proximity or gene content of particular markers sets. Alternatively, genome. Furthermore, from the completeness standpoint, only 45 DArT markers from specific genes or selectively neutral regions markers out of 2,274 linkage mapped ones could not be aligned to can be selected a priori for targeted phylogenetic reconstructions. the 11 main scaffolds. Conversely, only 89 probes remained Moreover, the combination between genome-wide coverage and physically unmapped to the genome sequence. Although these predominant association to the gene-space could also account for unmapped markers could imply missing sections in the genome the good performance of the DArT array in providing markers for assembly, they could also correspond to sequences that do not exist accurate genome-wide predictive models in recent Genomic in the E. grandis genome, recalling that the 7,680 probes on the Selection (GS) studies [28]. It might now be possible to correlate array were developed from 18 genomic representations involving the genomic attributes of the DArT markers to their specific 64 different Eucalyptus species with a broad phylogenetic diversity. contributions to the predictive ability of GS models or to the A scrutiny of the original source of these 89 unmapped DArT resolution of specific phylogenies and hence look for specific probes revealed that 65 of them came from genomic representa- markers or genomic segments of particular interest in subsequent tion libraries built with DNA from species other than E. grandis, studies. while 24 came from E. grandis [25]. Nevertheless we observed significantly more non-E. grandis DArT probes not mapping to the Conclusion genome than what would be expected due to chance alone The results of this work, following the recently published DArT- (Pearson Chi-square 5.03; p value = 0.0249). This result, together based genetic studies in Eucalyptus [22,28,29,30], further highlight with the excellent performance demonstrated for diverse phylo- the value of this genotyping platform for genetics, breeding and genetic investigations in the genus [22], suggests a distinctive pan- evolutionary genome-wide surveys in species of this genus. Given genomic attribute of this Eucalyptus DArT array. While most the commonality of the methods used in developing DArT arrays, probes correspond to core genomic features common to all the genomic properties of the markers described in this study are individuals and Eucalyptus species, a few probes may be derived likely ubiquitous to most if not all angiosperm plant genomes. The from the ‘‘dispensable genome’’ composed of partially shared and/ DArT technology has now evolved by taking advantage of high- or non-shared DNA sequence elements among species [64,65]. throughput short read sequencing [68]. By combining its long time Completeness of the current assembly was also supported by the established genome complexity reduction method, also adopted by observation that, out of 85.4 Mbp of unanchored sequence in recently described genotyping-by-sequencing (GbS) protocols 4,941 small scaffolds, only 1.4 Mbp across 31 scaffolds was [69,70], a considerable leap in genome-wide polymorphism captured by 45 mapped markers and all, but a couple, were detection has taken place. Nevertheless, the general genomic located in intermediate positions along the linkage groups and not attributes of the GbS-derived markers as far as genome coverage at the extremes (Table S1). Were the genome assembly and preferential targeting of gene-rich regions should remain incomplete, one would expect to capture a considerably larger essentially the same as those described in this study, although a proportion of unanchored scaffolds and sequence. In fact, during much larger number of markers based on digital sequence counts the poplar genome assembly, Drost et al. [66], using a medium- rather than analog microarray signal are obtained, in addition to density 608 marker map, were able to anchor 116 sequence the scoring of co-dominant SNP markers. This advance might scaffolds to unique genetic positions in linkage groups, thereby push down current costs of large scale high-throughput plant adding to the genome some 35.7 Mbp of sequence out of the genotyping even further than the DArT and SNP platforms did in 75 Mbp still unanchored at the time. These results, together with the last few years. However, the necessary informatics infra- the fact that 86% of the 4,941 unanchored Eucalyptus genome structure required to handle, store and analyze the huge sequence scaffolds are less than 20 kbp in length, strongly suggest that the files generated by GbS for several thousand samples will not be vast majority of unanchored scaffolds correspond to fragments of immediately available in the realm of most plant genetic resources alternative haplotypes of already assembled pseudochromosomes, and breeding operations. Microarray-based DArT genotyping possibly derived from regions of high heterozygosity in the with its standardized processing and analysis protocols shall Eucalyptus genome and not to missing portions of the genome. therefore continue to be a useful tool for a number of applications in plant genetic analysis, particularly those that not necessarily The Eucalyptus DArT Array Provides Uniform Genome- require very high density genome-wide genotyping. wide Coverage While Preferentially Targeting Gene-rich Regions Supporting Information Results from BLAST hits and genome-wide analysis of the Figure S1 Distributions of the number and percentages Eucalyptus DArT probe sequences (Table S2 and Figure 3) of DArT markers that passed the filtering thresholds corroborated previous studies in other plant species reporting that adopted for reproducibility ($95%), quality score (Q PstI-based DArT markers are predominantly located in low-copy, $65) and call rate ($75%). A Venn diagram consolidates the gene-rich regions of the genome [23,54,67]. However, the information showing all possible classifications of the DArT opportunity to map the DArT probes to a fully annotated markers according to the three filtering criteria adopted. Only reference genome beyond a simple BLAST analysis against ESTs, markers that satisfied simultaneously all three criteria were used revealed a highly significant relationship between the numbers of for linkage mapping. DArT markers and predicted gene models (Figure 4) with a small (PDF) proportion of DArT probes located more than 10 kbp from the closest gene (Figure 5). This result is significant as it might help Figure S2 Alignment of the Full map (yellow bars) to the explain the unprecedented level of resolution that the DArT array Framework (Fmwk) map (green bars) for the eleven has provided for population genetic and breeding studies across Eucalyptus pseudochromosomes built using JoinMap the full range of Eucalyptus species [22,28]. Based on the genomic 3.0, showing the connections between the same loci on characterization of the DArT probe sequences reported in this both maps. The Full map includes a total of 2,484 markers,

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2,274 DArT and 210 microsatellites while the Framework map the assignment of 31 small scaffolds (1.4 Mbp of total sequence) to has 1,029 markers positioned with higher confidence for locus the 11 main pseudochromosomes. order, 861 DArT and 168 microsatellites. DArT markers in black (PDF) and microsatellites in red; centiMorgan scale on the left. Table S2 BLASTn hits of DArT marker probes (Genbank (PDF) accession numbers HR865291-HR872186) searched against the Figure S3 Frequency distributions of Kosambi recom- complete NCBI EST database (August 12 2010 build); 3,703 bination distances between consecutive markers across (53.6%) returned with positive BLASTn hits (e value ,1e–5). the two linkage map versions. The distribution of map (XLSX) distances in the Framework map was significantly different from the one in the Full map (p = 0.021 of a non-parametric Acknowledgments Komolgorov-Smirnov test), confirming the fact that a Framework map spreads out the retained markers with high support for We acknowledge the help and technical support from many employees of ordering and reduces the proportion of inter-marker distances Diversity Arrays Technology Pty. Ltd. where the genotyping work was smaller than one centiMorgan from a total of 87% in the Full map performed. to 65% in the Framework map. (PDF) Author Contributions Table S1 List of the 45 DArT markers linkage mapped to the Conceived and designed the experiments: DG AK AAM REV DAS. eleven groups but aligning to small unanchored scaffolds of the Performed the experiments: CDP CPS JC. Analyzed the data: CDP CPS current Eucalyptus grandis genome assembly (version 1.0 into DG OBS GJP. Contributed reagents/materials/analysis tools: DG DAS REV AAM. Wrote the paper: DG CDP. Phytozome 6.0). These linkage mapped DArT markers allowed

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RESEARCH ARTICLE Open Access A reference linkage map for Eucalyptus Corey J Hudson1*, Jules S Freeman1,2, Anand RK Kullan3, César D Petroli4, Carolina P Sansaloni4, Andrzej Kilian5, Frank Detering5, Dario Grattapaglia6, Brad M Potts1, Alexander A Myburg3 and René E Vaillancourt1

Abstract Background: Genetic linkage maps are invaluable resources in plant research. They provide a key tool for many genetic applications including: mapping quantitative trait loci (QTL); comparative mapping; identifying unlinked (i.e. independent) DNA markers for fingerprinting, population genetics and phylogenetics; assisting genome sequence assembly; relating physical and recombination distances along the genome and map-based cloning of genes. Eucalypts are the dominant tree species in most Australian ecosystems and of economic importance globally as plantation trees. The genome sequence of E. grandis has recently been released providing unprecedented opportunities for genetic and genomic research in the genus. A robust reference linkage map containing sequence-based molecular markers is needed to capitalise on this resource. Several high density linkage maps have recently been constructed for the main commercial forestry species in the genus (E. grandis, E. urophylla and E. globulus) using sequenced Diversity Arrays Technology (DArT) and microsatellite markers. To provide a single reference linkage map for eucalypts a composite map was produced through the integration of data from seven independent mapping experiments (1950 individuals) using a marker-merging method. Results: The composite map totalled 1107 cM and contained 4101 markers; comprising 3880 DArT, 213 microsatellite and eight candidate genes. Eighty-one DArT markers were mapped to two or more linkage groups, resulting in the 4101 markers being mapped to 4191 map positions. Approximately 13% of DArT markers mapped to identical map positions, thus the composite map contained 3634 unique loci at an average interval of 0.31 cM. Conclusion: The composite map represents the most saturated linkage map yet produced in Eucalyptus. As the majority of DArT markers contained on the map have been sequenced, the map provides a direct link to the E. grandis genome sequence and will serve as an important reference for progressing eucalypt research.

Background their value to genetics research has led to numerous link- Genetic linkage maps are valuable resources which can be age mapping projects being undertaken in plants. Detailed used to provide a framework for many genomic analyses. linkage maps have been produced for all of the world’s Linkage maps can be used to investigate the organisation staple cereal species [12], and in forest trees, linkage maps and evolution of genomes through comparative mapping have been produced for many of the most widely-planted [1-3] and serve as a basis for investigating phenotypic species due to their commercial importance as wood and traits of ecological and economic importance through the fibre crops [1,13,14]. localisation of quantitative trait loci [QTL; 4-6]. Subse- Grattapaglia and Sederoff [15] published the first gen- quently, QTL results may be used to help guide the selec- etic linkage map in the forest tree genus Eucalyptus in tion of candidate genes for association studies or be 1994. Subsequently, many mapping pedigrees have been applied in marker-assisted breeding programmes [7,8]. established for the purpose of linkage map construction Linkage maps can also be used to anchor physical maps and associated QTL analyses. More than 20 eucalypt and assist in the assembly of genome sequences [9-11]. genetic linkage maps have been reported with most The wide application of linkage maps in combination with being produced in the main commercially grown species, or their hybrids, from the Eucalyptus subgenus Symphyo- myrtus. Thus, the majority of linkage mapping projects * Correspondence: [email protected] 1School of Plant Science and CRC for Forestry, University of Tasmania, Private have focussed on E. grandis, E. urophylla and E. globulus Bag 55 Hobart, Tasmania 7001, Australia [reviewed in 16], while a smaller number of maps have Full list of author information is available at the end of the article

© 2012 Hudson et al., licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 2 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

also been produced for E. nitens [17], E. teriticornis effects; 38] and are more useful in some genetic ana- [18,19], E. camaldulensis [20] and for species in the lyses, such as estimating population genetic parameters closely related genus Corymbia [21]. (e.g. inbreeding levels), relative to dominant marker Many early eucalypt linkage maps were constructed types such as DArT. In addition, the DArT marker assay using random amplification of polymorphic DNA can be subject to cross-hybridization from duplicated (RAPD) and amplified fragment length polymorphism loci in the genome, although most such artifacts can be (AFLP) molecular markers [16,22]. However, the an- excluded by preselecting markers exhibiting Mendelian onymous nature of these dominant markers has limited segregation ratios in mapping pedigrees. the transfer of linkage information between studies At present, DArT markers have been used to construct [16,23]. More informative, codominant markers such as linkage maps in seven independent E. globulus and/or isozyme and random fragment length polymorphism E. grandis × E. urophylla hybrid family mapping pedi- (RFLPs) have also been used in eucalypt linkage map- grees [11,32,33]. All of these maps also contain a variable ping, although, their low throughput, low inter-pedigree number of co-dominant microsatellite markers, which polymorphism and labour intensive genotyping require- provide important links to many earlier eucalypt linkage ments have limited their use [16,23]. The more recent maps. In the two largest mapping pedigrees (more than development of highly polymorphic microsatellite mar- 500 individuals each), 1010 [32] and 2229 [33] DArT kers made available a large potential suite of markers markers, were mapped at sub-centiMorgan marker that are transferrable between species and polymorphic densities and collectively more than 4000 DArT and in multiple pedigrees. This enabled linkage group syn- microsatellite markers have been mapped in the seven teny to be established between maps containing com- pedigrees. mon microsatellite markers and the positions and All DArT marker based linkage maps were constructed stability of QTL across multiple species to be examined using the program JoinMap 4.0 [37]. This program is one [e.g. 24-27]. The ability to establish linkage group syn- of the most commonly used linkage mapping programs teny has also enabled moderate-density comparative and appears to be the only software available for building mapping studies [23,28]. linkage maps using the combined segregation data from Recent advances in molecular methods have led to multiple populations [39-41]. However, it is presently not high-throughput genotyping systems being developed feasible to combine the segregation data contained within [e.g. 29,30]. These have made it possible to quickly gen- the seven eucalypt mapping families describe above (col- erate many hundreds of markers in single mapping pedi- lectively 1950 individuals), and successfully order such grees and have helped facilitate the construction of high large numbers of markers within linkage groups (up density linkage maps [12]. Most recently in Eucalyptus, to ~ 500) due to computational limitations (Van Ooijen Diversity Arrays Technology [DArT; 31] has been used pers comm.). To circumvent the limitations of traditional to generate large numbers of molecular markers for gen- segregation-based methods of linkage map construction, etic linkage mapping in several mapping pedigrees alternative marker-merging strategies have been devel- [e.g. 11,32,33]. The eucalypt DArT markers are highly oped. A so-called ‘composite map’ can be produced in transferable across species from subgenus Symphyomyr- which markers from individual component maps are tus [34] and the high-throughput array-based genotyping merged into a single map based on their position relative system provides wide genome coverage [35]. A key bene- to common anchor loci. For example, the ‘neighbours’ fit of the Eucalyptus DArT markers is the public avail- marker-merging approach of Cone et al. [42] and the ability of the sequences of most of the 7680 markers marker-merging method implemented in the PhenoMap contained on the genotyping array [GenBank accession program (GeneFlow Inc. USA) have been used to success- numbers HR865291 - HR872186], thus making it pos- fully construct high density composite maps containing sible to anchor DArT markers directly to the reference several thousand markers in a number of plant species; in- E. grandis genome sequence [v1.0 released January 2011; cluding Sorghum [43], barley [41,44,45] and maize [42,46]. 36]. However, while the DArT technology offers many In this study, a marker-merging method was used to advantages, the DArT markers do suffer some limita- construct a high-density DArT and microsatellite marker tions due to their dominant nature. For example, the in- composite linkage map from seven independently con- complete segregation information provided by those structed maps. Recent comparative mapping analyses DArT markers segregating in a 3:1 ratio (intercross) using 236 to 393 markers shared between three of the results in an exponential increase of marker-ordering maps [see 32] showed that these linkage maps exhibited calculations compared to fully-informative co-dominant high synteny (> 93.4% markers occurring on the same markers [37]. Co-dominant markers also provide more linkage groups) and high colinearity (> 93.7% markers complete information in QTL mapping studies [e.g. having the same order within linkage groups). This indi- allowing estimation of additive and dominant allelic cated that it would be possible to merge markers from Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 3 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

several component maps into a single high quality map maps comprised 11 linkage groups in accordance with featuring robust marker-order together with very high the haploid chromosome number of Eucalyptus [48]. marker density. It is expected that this composite map Before building the composite map, marker names were will facilitate marker and map information exchange and standardised across maps, homologous linkage groups were serve as a valuable reference for species in the subgenus identified using common (anchor) loci and marker co- Symphyomyrtus. linearity between component maps was visually inspected in MapChart [49]. Map data was supplied for both frame- Methods work (1032-marker) and comprehensive (2484-marker) The following terms are used to describe the various maps built in the GU-Emb family [see 11]. Based on the types of linkage maps reported in this paper; (1) sex- level of marker-order agreement between linkage groups averaged map – a consensus of individually constructed from these maps with other component maps, either GU- male and female maps, built in a single family using seg- Emb framework (LG’s1,3,5,7and9)orcomprehensive regation data from both parents, (2) consensus map – a (LG’s2,4,6,8,10and11)linkagegroupswereincludedin consensus of multiple individually constructed male and composite map construction. Five linkage groups from female maps, built in multiple families (e.g. F2 double- three of the smaller E. globulus mapping families (Table 1) pseudo backcross) using segregation data from all of the were found to have substantial regions of non-colinearity families, and (3) composite map – an integrated map of (discordant marker-orders) with other component maps. multiple sex-averaged and/or consensus maps, built Consequently, LG6 and LG10 from the GLOB-F1-1 map, using a marker-merging method. LG4 and LG9 from the GLOB-F1-4 and LG4 from the GLOB-F1-5 map were excluded from composite map Component maps construction. The composite map was built using an E. grandis × The number of markers included for composite map E. urophylla F2 double pseudo-backcross pedigree consen- construction ranged from 498 (GLOB-F1-4) to 2290 sus linkage map [both species from section Latoangulatae; (GU-SA; Table 1). In total, this consisted of 4350 indi- 33] plus one E. grandis × E. urophylla sex-averaged map vidual markers, including: 4089 DArT, 253 microsatel- constructed in a F1 hybrid pedigree [11] and five pure- lites and eight mapped genes. Ninety-six markers (2.2% species E. globulus [section Maidenaria;32]sex-averaged of the total number of markers; termed ‘multicopy’ mar- linkage maps constructed in either outcrossed F2 or F1 fam- kers) were mapped to two or more linkage groups across ilies (hereafter referred to as ‘component’ maps). Compo- component maps. This resulted in the 4350 individual nent map family sizes ranged from 172 (GLOB-F2-1) to markers being mapped to 4457 positions. Of these 4457 547 (GU-SA) and collectively contained 1,950 indivi- positions, 1960 could be considered to be bridging loci, duals (Table 1). The component maps were constructed meaning that these markers had been mapped to syn- by different researchers. All used JoinMap 4.0 [37] with tenic linkage groups in two or more component maps marker-ordering within linkage groups (LGs) estimated and would serve as anchor loci during composite map using the regression algorithm of Stam [47] combined construction. Conversely, 2497 marker positions were with the Kosambi mapping function. All component unique to single component maps.

Table 1 Component map details Linkage mapa Map n cM MMI Markers mapped abbreviation (percentage of unique markers in pedigree) DArT SSR Gene Total b E. grandis × E. urophylla SA double pseudo-backcross F2 GU-SA 547 1107 0.51 2229 (45%) 59 (46%) 2 (100%) 2290 (45%) ce E. grandis × E. urophylla Embrapa F1 GU-Emb 177 1229 0.78 1617 (41%) 193 (77%) 0 1810 (44%) d E. globulus Lighthouse F2 GLOB-LH 503 1151 1.21 1010 (27%) 50 (12%) 0 1060 (27%) d E. globulus FAM1 F1 GLOB-F1-1 184 1033 1.97 571 (14%) 4 (0%) 2 (0%) 577 (14%) d E. globulus FAM4 F1 GLOB-F1-4 184 1137 2.46 488 (10%) 6 (0%) 4 (25%) 498 (10%) d E. globulus FAM5 F1 GLOB-F1-5 183 1055 2.09 600 (22%) 4 (0%) 2 (0%) 606 (21%) d E. globulus FAM1 F2 GLOB-F2-1 172 1258 2.73 660 (18%) 30 (30%) 5 (40%) 695 (18%) Summary of the component maps used to construct the composite map. For each map, progeny size (n), map length (cM; total for all 11 linkage groups), mean marker interval (MMI; average for all 11 linkage groups) and total number of mapped markers (using only those linkage groups included in composite map construction; see Methods) are given. For DArT, microsatellite (SSR) and gene markers mapped on each component map, the percentage of markers unique to that map (i.e. not mapped in any of the six other component maps) are given in parentheses. aCross details and reference; bKullan et al. [33], cPetroli et al. [11] d e and Hudson et al. [32]. Data for the E. grandis × E. urophylla Embrapa F2 component map calculated using a combination of framework and comprehensive linkage groups (see Methods). Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 4 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

Composite map construction Composite map features The composite linkage map was constructed at Diver- Following composite map construction, marker-order sity Arrays Technology (DArT) Pty Ltd (Canberra, correlations between composite and component map Australia) using specially developed R scripts which linkage groups were calculated in SAS 9.2 (SAS Institute, merged component map markers into the composite Cary, USA) using the PROC CORR Spearman function. map based on their relative map positions. The E. To test whether multicopy markers were distributed 2 grandis × E. urophylla SA F2 (GU-SA) linkage map equally across linkage groups, a χ test was used to com- was used as the seed-map (i.e. the ‘fixed backbone’ to pare the observed versus expected number of multicopy which markers from other component maps were marker positions occurring on each linkage group. The added) due to it having the largest progeny size, the expected number of multicopy markers per linkage largest number of both mapped and unique markers group was calculated as; (total number of multicopy (Table 1) and high overall marker colinearity to the marker positions in the composite map/total number of 11 main superscaffolds of the assembled E. grandis DArT marker positions in the composite map) × number genome sequence [33,36]. The procedure for building of DArT marker positions per linkage group for that each composite map linkage group was as follows. linkage group. The BLAST server available at Phytozome Firstly, the number of common markers in each seed- [36] was used to search for DArT marker duplications. map – component map linkage group comparison The bl2seq tool at NCBI [50] was used to examine was identified. Spearman rank marker-order correla- DArT marker sequence similarity/redundancy. All tions were then estimated and a heuristic ‘fit value’ graphical representations of linkage maps were drawn for each comparison was calculated as; Fit value = cor- using MapChart [49]. relation × log (number of common markers); where the second term rewards for the number of common Results markers with a diminishing returns function. Follow- Composite map details ing selection of the component map linkage group A total of 4101 individual markers, comprising 3880 with the highest Fit value, unique markers (i.e. those DArT markers, eight gene-based markers and 213 not mapped on the seed linkage group, or the ‘build- microsatellite markers were included in the composite ing’ composite linkage group in following rounds) map. The composite map totalled 1107 cM which was were added to the seed linkage group (or ‘building’ within the range of component map lengths (1033– composite map linkage group) using linear regression. 1258 cM; Table 1) and contained only eleven marker Here, the slope (m) and intersect (c) calculated from intervals ≥ 3 cM; with a maximum marker interval of fitting the positions of common markers on the seed 5.9 cM. The composite map contained 81 multicopy linkage group (pc) to their positions on the selected DArT markers (2.1% of total DArT markers) which were component map (pi) linkage group (pc = m × pi + c) mapped to 171 map positions. Most multicopy markers was used to calculate the positions of unique compo- occurred on two linkage groups only, however, one mar- nent map markers added to the seed linkage group. ker (ePt-574238) mapped to three linkage groups while Once this first round was completed, the remaining four markers (ePt-503174, ePt-568818, ePt-637610, ePt- component linkage groups were compared to this 637861) mapped to four linkage groups. This resulted in new ‘building’ composite map linkage group and the the 4101 markers being mapped to 4191 positions process was repeated. This continued until all unique (Table 2). Over half (2171 or 53%) of the markers markers had been added from remaining component mapped to these 4191 map positions had been mapped maps which shared at least three common markers in a single component map only (i.e. were not shared with the building composite map linkage group and among multiple component maps). Approximately 13% had a marker-order correlation coefficient ≥ 0.50. This of DArT markers mapped to identical positions in the process was repeated for each linkage group to yield composite map. Therefore, the map contained 3634 the final composite map of 11 linkage groups. Mar- unique map loci with an average interval of 0.31 cM. kers which mapped to the distal ends of composite The number of multicopy DArT marker positions on linkage groups and which had relatively large inter- each linkage group ranged from 5 to 24 and represented marker intervals (≥ 5 cM) and poor support (e.g. 1.9-6.4% of the total number of DArT markers mapped mapped in one component map only) were removed. per linkage group (Table 2). Although LG5 and LG7 The numbering and orientation of linkage groups fol- contained a larger proportion of multicopy DArT mar- lowed the convention established in Brondani et al. ker positions (e.g. LG1 contained only 5 multicopy [23]; this also corresponds to the numbering of pseu- DArT marker positions, or 1.9% of the total number of dochromosome assemblies in the E. grandis genome DArT marker positions; Table 3), the proportion of mul- sequence [36]. ticopy DArT marker positions found on each linkage Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 5 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

Table 2 Composite map summary origins and multicopy DArT marker information is pre- LG cM Markers mapped Average MC sented in Additional file 1. marker DArT DArT SSR Genes Total interval pos.a (cM) Composite – component map colinearity Colinearity between component and composite map 1 93.8 250 12 0 262 0.42 5 linkage groups can be viewed graphically in Figure 1 2 102.1 451 29 0 480 0.24 18 (for the GLOB-LH map) and in Additional file 2 (all 3 105.6 429 18 2 449 0.28 21 component maps). Pair-wise linkage group marker- 4 80.9 219 9 3 231 0.41 12 order correlations were generally high (greater than 5 95.9 366 8 0 374 0.30 24 0.90; Table 3) reflecting the high colinearity shown 6 125.3 408 43 1 452 0.31 15 between common markers (Figure 1 and Additional file 2). However, a small degree of non-colinearity 7 87.7 305 9 1 315 0.33 18 did occur between all component maps and the com- 8 137.3 540 26 0 566 0.28 19 posite map. Eleven component map linkage groups 9 82.9 312 20 0 332 0.29 10 had marker-order correlations of less than 0.90 10 97.8 336 20 1 357 0.30 12 (Table 3), however, these linkage groups were either, 11 97.3 354 19 0 373 0.31 17 (1) identified as having poor marker colinearity with Total 1106.5 3970 213 8 4191 0.31 171b other component maps prior to composite map con- struction and excluded from analysis (five linkage Summary of the composite map: including the number of mapped markers, length and average marker intervals by linkage group (LG). aMC DArT pos. - groups with gray shading in Table 3), or (2) marker- indicates the number of multicopy (MC) DArT marker positions (pos.) occurring order information from these linkage groups was not on each linkage group. bThe 171 multicopy DArT marker positions represent 81 multicopy DArT markers (see Additional file 1). incorporated during composite map construction (correlation value without asterisk; six linkage groups group did not significantly differ from that expected by Table 3) due to markers from these maps being pre- chance across all linkage groups (χ2 = 12.99, P = 0.22, viously added from other linkage groups having bet- df = 10). There was no trend within linkage groups for ter fit values. Thus, these poorly correlated linkage multicopy DArT markers to be clumped in either distal groups did not adversely affect the composite map or central linkage group areas (data not shown). Com- marker-order. For each linkage group, the average posite map marker details, component map(s) marker pair-wise marker-order correlation between the

Table 3 Composite – component map marker-order correlation coefficients Composite map LG Component map a b GLOB-LH GU-Emb GLOB-F2-1 GLOB-F1-1 GLOB-F1-4 GLOB-F1-5 Average Average 1 0.98* 0.56F 0.99* 0.99* 0.98* 0.95* 0.91 0.98 2 0.98* 0.95C* 0.93* 0.95* 0.98* 0.85 0.94 0.96 3 0.91* 0.99F* 0.97* 0.99* 0.97* 0.99* 0.97 0.97 4 0.98* 0.74C 0.96* 0.89 0.79ex 0.19ns,ex 0.76 0.97 5 0.99* 0.92F 0.96* 0.96* 0.99* 0.96* 0.96 0.97 6 0.99* 0.99C* 0.99* 0.63ex 0.99* 0.86 0.91 0.99 7 0.98* 0.65F 0.99* 0.98* 0.96* 0.91* 0.91 0.96 8 0.98* 0.99C* 0.99* 0.66 0.94* 0.99* 0.93 0.98 9 0.99* 0.97F* 0.98* 0.97* 0.65ex 0.97 0.92 0.98 10 0.95* 0.98C* 0.97* 0.35ns,ex 0.92 0.97* 0.86 0.97 11 0.99* 0.99C* 0.99* 0.97* 0.96 0.99* 0.98 0.99 Averagec 0.98 0.88 0.97 0.85 0.92 0.87 Averaged 0.98 0.98 0.97 0.97 0.97 0.96 Marker-order correlations between composite map and component map linkage groups; the GU-SA component map is not shown as this map was used as the seed-map (i.e. provided a fixed-order and all correlations were 1.0). For the GU-Emb component map, superscript letters indicates whether the framework (F) or comprehensive (C) linkage group was used in map construction. Component map linkage groups initially excluded from composite map construction are indicated by ex superscript. An asterisk following the correlation value indicates that marker-order information from the component map was incorporated during construction of the composite map linkage group. Apart from two correlations (indicated by ns superscript) all correlations were significant at α ≤ 0.05. Averages: acalculated using all six component maps, bcalculated using only those linkage groups included in composite map construction (marked with an asterisk), ccalculated using all 11 linkage groups, dcalculated using only those linkage groups included in composite map construction (marked with an asterisk). Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 6 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

134562 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 78910 11 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Figure 1 Marker colinearity between the GLOB-LH component map (left) and composite map (right). Lines between each homologous linkage group pair indicate the positions of common markers. The scale bar is in Kosambi’s centiMorgans. composite map and those component maps included 606 base-pair similarity, e-value: 0.0). For the four in map construction ranged from 0.96 to 0.99 (Aver- unique multicopy markers, three were detected to have ageb column; Table 3). loci duplications within the E. grandis genome sequence. In each case, the positions of duplicated loci detected in DArT marker duplications the E. grandis genome sequence corresponded to the Although not a main focus of this study, evidence for linkage groups to which the marker was mapped. the occurrence of duplicated DArT marker loci within the assembled E. grandis genome sequence [36] was Discussion investigated for the five multicopy markers which had Composite map construction been mapped to three or more linkage groups. Two of Data from seven component maps were integrated into these markers (ePt-637610 and ePt-637861; see Add- a single composite map which represents the highest itional file 1) mapped to the same map position on each density map yet produced in Eucalyptus. A major advan- of four linkage groups (LGs 2, 3, 5 and 8) and were tage of the marker-merger method used in this study found to be redundant markers (i.e. identical sequences) was the substantial time and labour savings made when based on their marker sequence similarity (bl2seq: 583/ compared to the effort required to produce comparable Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 7 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

maps using traditional, segregation-based methods. For which are evolutionary meaningful units compared to base example, Li et al. [40] constructed a 2111 marker com- pair distances. Additionally,itisalsoimportanttounder- posite map from four barley mapping pedigrees and stand the relationship between physical map (i.e. genome) reported that it took ‘several thousand hours’ of comput- and genetic map distances as this can have implications for ing time. In a larger barley study, Wenzl et al. [41] pro- map-based cloning efforts and/or marker-assisted selection. duced a 2935 loci composite map from ten mapping For example, uneven recombination rates across a genome populations using JoinMap 3.0 [51] in combination with [12,55] may result in physically distant markers appearing specially built Perl scripts and reported that the project to be genetically close to each other, or vice versa. In euca- required several months of semi-manual data processing lypts, Kullan et al. [33] recently compared 153 linkage map [41]. In contrast, the composite map produced in this intervals of approximately 1 cM against contigs of the study was built in a single day. E. grandis genome and found that the genetic map to phys- ical distance relationship varied considerably; ranging from Utility of the composite map 100 kb to 2.4 Mbp per 1 cM. Therefore, the composite As sequences are available for the majority of DArT mar- map will be useful to provide further insight into the rela- kers on the map (91%; data not shown), the composite tionship between physical and genetic map distance in map provides a direct link to the E. grandis genome se- addition to identifying hot (or cold) spots of recombination. quence [36]. We have made use of this link to search the A key use of the composite map will be for compari- E. grandis genome sequence for candidate genes asso- son of QTL and candidate gene positions detected ciated with QTL locations and to facilitate the placement across variable genetic backgrounds and/or environ- of candidate genes in the component linkage maps with- ments in different studies. This has previously been lim- out the need for time consuming marker development ited due to a lack of common markers being shared and genotyping. Sequence-based linkage maps have also between maps [23]. For example, Thumma et al. [27] provided useful tools to aid in the assembly of genome detected multiple co-locating growth-related QTL on sequences [e.g. 52,53] and can be particularly beneficial in LG5 in E. nitens but could not accurately compare the taxa (such as eucalypts) which have a relatively small gen- position of this QTL to similar growth-related trait QTL ome size. For example, during the assembly of the detected on this same linkage group in two other studies E. grandis genome sequence, a DArT linkage map was [24,56]. Although most of the markers contained on the valuable in guiding contigs into the 11 main pseudochro- composite map are DArT markers, which to date have mosomes [16]. However, not all contigs could be aligned only been mapped in the pedigrees included in this and approximately 12% of the 693 Mbp E. grandis genome study, the map does contain several hundred microsatel- sequence remains unassembled in more than 4900 small lite markers (213) which will enable synteny and co- unlinked scaffolds [54]. With the composite map contain- linearity to be established with many earlier linkage ing many more DArT markers (1600+) than the linkage maps used for QTL detection; e.g. 13 out of 22 earlier map used to aid genome assembly, the composite map studies have mapped a variable number of microsatel- markers may provide further positional information and lites [16]. This will enable QTL to be aligned against the help to anchor some of the unlinked scaffolds and refine composite map which may provide deeper insight into the current E. grandis genome sequence. the genetic control of phenotypic traits in the genus. For Over half (53%) of the markers placed in the composite example, following the construction of an integrated map originated from a single component map (i.e. were map for melon (Cucumis melo) which used data from not shared among multiple component maps). Therefore, eight independent mapping experiments, it was possible the ability to determine the relative positions of markers to align 370 QTL detected for 62 traits from 18 experi- mapped in different maps has been greatly enhanced ments [57]. Through this alignment, QTL detected in through the integration of this data into a single map. This different studies for economically important traits were has already proven advantageous to our research group, found to co-locate [57]; providing supporting evidence with the composite map being used to quickly identify the to substantiate the biological basis of the observed linkage relationships of microsatellite markers used in marker-trait association [7,8]. population genetic studies. Although now a relatively sim- As in all linkage mapping studies, it is important to con- ple task, it was previously necessary to consult multiple sider both the quality of the map produced and any spe- linkage maps and assess their colinearity to obtain this cific map characteristics. In the alignment of 6480 DArT same information. Furthermore, any marker developed in marker sequences against the E. grandis genome sequence eucalypts which has known sequence, can now potentially [36], Petroli et al. [11] reported that although the majority be found in the eucalypt genome sequence and then of markers (4189) occurred at a single genome position aligned against the reference map in order to estimate its with high support, many marker sequences (2291), albeit distance to other markers in units of recombination (cM); at lower confidence, also exhibited similarity to a second Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 8 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

genome position and that about half of these genome high correlations, most component maps did exhibit some regions contained repeat elements. Furthermore, prelim- marker-order inconsistencies with the composite map. A inary analysis of the E. grandis genome sequence suggests number of (mostly) single marker-order inconsistencies that (as has been observed in some Rosid genomes) a did occur over large distances, but most marker-order dis- whole-genome duplication event has occurred in the agreements occurred among tightly grouped markers in lineage () subsequent to the ancient hexaploidy regions of less than 5 cM. Although it is possible that event shared by all (Myburg et al., unpublished). some of these marker-order differences could be real and Such whole-genome, as well as, segmental duplication represent local chromosomal rearrangements or marker events will affect thousands of marker loci, but most duplications between the different mapping pedigrees would be expected to diverge in sequence with evolution- and/or species, they are more likely to reflect marker- ary time yielding mostly unique marker loci. Thus, the order inaccuracies within any of the component maps or presence of multicopy markers (representing putatively simply be artefacts of the statistical uncertainty associated duplicated loci) in the composite map was not unex- with ordering tightly linked markers [see 58]. While users pected. It is worth noting that in the construction of each of this map should be aware of these limitations and how component map, only those markers which segregated as they may affect marker ordering, overall, the generally a single Mendelian locus were mapped. Therefore, in the high marker-order correlations observed and the exclu- event of a marker duplication being present within a pedi- sion of component map linkage groups having poor mar- gree, only one locus could be polymorphic in order for ker colinearity from initial composite map construction that marker to produce a single loci segregation ratios. (and thus not adversely affecting composite map marker- Consequently, it is likely that only a subset of the dupli- order) suggests that the composite map is of a sufficiently cated loci present within the eucalypt genome have been high quality to facilitate the transfer of genetic information identified in the composite map. Given that the PstI between studies. enzyme used in the complexity reduction step of DArT The composite map will be most useful for studies in- marker development [35] preferentially produces markers volving species from subgenus Symphyomyrtus sections located in hypomethylated, gene rich regions [55], and Latoangulatae and Maidenaria; due to the composite that many DArT markers contain protein coding map being built from linkage maps constructed in spe- sequences [33], it is possible that some of the multicopy cies from these sections. However, due to the high level markers identified may be associated with different gene of genome synteny and colinearity detected between family members and/or be part of larger duplicated species from these relatively distant sections [28,32,34], regions. Further studies are required to examine the full information from the composite map should also be ap- extent and evolution of the duplicated loci. We also plicable to many other commercially important eucalypt expected some marker redundancy (markers with the species in closely related sections (e.g. E. camaldulensis same sequence) among the 3808 composite map DArT from subgenus Symphyomyrtus section Exsertaria). markers; an issue which arises due to the process by which DArT markers are generated, resulting in the same ampli- Future marker integration fied genomic fragment being represented more than once A number of recent studies have focussed on the develop- on the genotyping array [31,35]. Therefore, identical ment of molecular markers for use in eucalypts. In clones (e.g. the same DArT fragment, but with different addition to the DArT genotyping array developed for use DArT marker names) are expected to produce identical in eucalypts [35], the feasibility of high-throughput SNP genotype scores and should map to identical (or near genotyping has been explored [59] and several tens of identical) map positions; as found for the markers ePt- species-transferrable EST-based SSR markers have been 637610 and ePt-637861 identified as identical clones in recently reported [60,61]. Furthermore, DArT genotyping this study. by sequencing (GBS), which combines the complexity The marker-merging method used in this study took ad- reduction method of DArT [31] with next generation se- vantage of the fact that individual component maps were quencing (NGS), and which can potentially deliver up to constructed using high marker-ordering stringency which three-fold as many markers as conventional DArT geno- resulted in linkage maps having robust marker-orders typing [see 62] is becoming a cost-competitive genotyping [32]. The comparison of the composite map marker-order option due to the recent plummeting costs of NGS se- against individual component maps gives an indication of quencing. Therefore, to broaden the use of the composite the quality of the composite map. Marker-order correla- map for comparative analyses and to optimise its’ worth, it tions were mostly excellent with high pair-wise linkage will be necessary to add new markers to the current ver- group marker-order correlations found in most compari- sion of the composite map in the future. Although beyond sons. For example, in 48 out of 66 pair-wise comparisons the scope of this study, it would also be valuable to com- the marker-order correlation exceeded 0.95. Despite these pare the marker order of the composite map to maps built Hudson et al. BMC Genomics 2012, 13:240 Page 9 of 11 http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/240

using the same data with other marker-merging software respectively. AK and FD constructed the composite map. REV and AAM (e.g. BioMercator [63], CarthaGene [64] or MergeMap conceived the study, and along with BMP and JSF, contributed to the design of the study. All authors read and approved the final manuscript. [65]). The R scripts and map marker positions of the com- ponent maps used in this study can be made available upon request. Funding Funding for this project was provided by the Australian Research Council (DP0770506 & DP110101621) as well as the Cooperative Research Centre for Conclusion Forestry (Australia). Construction of the GU-SA map was supported by Sappi, Mondi, the Technology and Human Resources for Industry Program (THRIP), The integration of markers from seven individual genetic the National Research Foundation (NRF) and the Department of Science and linkage pedigrees has resulted in a composite, reference Technology (DST) of South Africa. map for eucalypts with 4101 DArT and microsatellite Author details markers. Although some small marker-order inconsist- 1School of Plant Science and CRC for Forestry, University of Tasmania, Private encies exist between component maps and the compos- Bag 55 Hobart, Tasmania 7001, Australia. 2CRN Research Fellow, Faculty of ite map, there is a relatively high agreement of marker- Science, Health, Education and Engineering, University of the Sunshine Coast, Locked Bag 4, Maroochydore, QLD 4558, Australia. 3Department of Genetics, order between component maps; which indicates that Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria, the composite map represents a good estimation of the Pretoria 0002, South Africa. 4EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology true marker positions in most cases. However, at finer - EPqB Final W5 Norte 70770–917 Brazilia DF and Dep. Cell Biology, Universidade de Brazilia – UnB, Brasilia, DF, Brazil. 5Diversity Arrays scales (sub-cM) marker-orders may differ between com- Technology Pty Ltd, PO Box 7141, Yarralumla, ACT 2600, Australia. 6EMBRAPA ponent and composite maps due to limited statistical Genetic Resources and Biotechnology - Parque Estação Biológica - PqEB - Av. power to order such tightly linked markers. Overall, the W5 Norte (final), Brasília, DF - Brazil - 70770–917, Universidade Catolica de Brasília- SGAN, 916 modulo B, 70790-160DF, Brasilia, Brazil. genome coverage and marker density of the composite map greatly exceeded that achieved in any of the single Received: 23 March 2012 Accepted: 4 June 2012 mapping populations. It is expected that this composite Published: 15 June 2012 map will provide a valuable reference map for the world-wide Eucalyptus research community, facilitate References 1. 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Brown GR, Bassoni DL, Gill GP, Fontana JR, Wheeler NC, Megraw RA, Davis MF, (outside) and the composite map (centre). Horizontal lines on linkage Sewell MM, Tuskan GA, Neale DB: Identification of quantitative trait loci group bars indicate marker positions and lines between linkage groups influencing wood property traits in loblolly pine (Pinus taeda L.). III. QTL indicate the position of common markers. The scale bar shown is in verification and candidate gene mapping. Genetics 2003, 164:1537–1546. Kosambi’s centiMorgans. Component map names (abbreviations; see 8. Wheeler NC, Jermstad KD, Krutovsky K, Aitken SN, Howe GT, Krakowski J, Table 1) are given above each linkage group. Linkage groups excluded Neale DB: Mapping of quantitative trait loci controlling adaptive traits in from composite map construction are indicated in parentheses following coastal Douglas-fir. IV. Cold-hardiness QTL verification and candidate the component map name. An asterisk indicates whether marker-order gene mapping. Molecular Breeding 2005, 15:145–156. information from the component map was incorporated during 9. Semagn K, Bjornstad A, Ndjiondjop MN: Principles, requirements and composite map construction (see Methods). For the GU-Emb component prospects of genetic mapping in plants. African Journal of Biotechnology map, superscript letters indicates whether the framework (f) or 2006, 5:2569–2587. comprehensive (c) linkage group from this pedigree was used in 10. The Potato Genome Sequencing Consortium: Genome sequence and composite map construction. analysis of the tuber crop potato. Nature 2011, 475:189–195. 11. Petroli C, Sansaloni C, Carling J, Mamani E, Steane D, Myburg A, Vaillancourt R, Kilian A, Pappas G, Bonfim da Silva O, Grattapaglia D: Genomic Competing interest characterization, high-density mapping and anchoring of DArT markers to 'The authors declare that they have no competing interests. the reference genome of Eucalyptus. 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doi:10.1186/1471-2164-13-240 Cite this article as: Hudson et al.: A reference linkage map for Eucalyptus. BMC Genomics 2012 13:240.

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Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit Sansaloni et al. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 7):P37 http://www.biomedcentral.com/1753-6561/5/S7/P37

POSTER PRESENTATION Open Access How many genes might underlie QTLs for growth and wood quality traits in Eucalyptus? Carolina Sansaloni1*, César Petroli1, Georgios Pappas2, Orzenil Da Silva2, Dario Grattapaglia3 From IUFRO Tree Biotechnology Conference 2011: From Genomes to Integration and Delivery Arraial d’Ajuda, Bahia, Brazil. 26 June - 2 July 2011

Background derived from an E. grandis x E. urophylla cross. Indivi- QTL mapping is an unbiased approach where the pheno- duals were genotyped with the Eucalyptus DArT micro- type reveals the location of regulatory genes or genomic array described earlier [3]. The DArT marker data were regions affecting the trait of interest. The development of combined with 222 microsatellites and a linkage map transferable molecular markers and the increased use of for each parent was constructed using JoinMap 3.0 [4]. multiple pedigrees for QTL mapping have allowed com- Six traits were measured: height growth (HG), circum- parative analysis of QTLs across independent studies ference at breast height (CBH); wood specific gravity thus providing validation data. Such QTL positional (WSG); cellulose pulp yield (%PULP); Total Lignin (TL); information, together with the availability of annotated syringyl/guaiacyl ratio (S/G). QTL mapping was carried genome sequences, now promises to identify strong can- out using QTL Cartographer [5] on the two parental didate genes for a number of traits [1]. As large pedigrees maps separately at 1 cM intervals. Empirical threshold become available and higher resolution mapping with significance levels for QTL detection were determined SNPs, DArT and genotype-by-sequencing technologies by 1,000 permutations considering a significance level of becomes routine in forest trees, QTL positional informa- 5%. All the segregating DArT and microsatellite markers tion could be an alternative to the current approaches were mapped onto the 11 pseudo-molecules of the that rely on tentative candidate genes for association Eucalyptus grandis draft genome sequence covering genetics studies. Among the several traits for which 609 Mbp. QTLs have been mapped in forest trees those that display higher heritability, such as wood chemical composition, Results are more likely to involve candidate genes of stronger QTL analyses were carried out using framework genetic effect although recent association studies show that even linkage maps with high likelihood support for order. such genes explain very small proportion of the variation The maternal map had 825 markers (684 DArTs + 141 [2]. In this study we used a high-resolution map with SSR) and the paternal map 511 markers (410 DArTs + over 2,000 Diversity Arrays Technology (DArT) markers 101 SSR). A total of 16 QTLs in E. grandis and 14 in E. to carry out an initial assessment of the number of anno- urophylla were detected influencing growth and wood tated gene models in the reference genome sequence of quality traits. High and significant positive phenotypic Eucalyptus that putatively co-locate with QTLs for correlations were found between CBH and HG, TL and growth and wood quality traits. S/G, and S/G and %PULP. In the maternal E. grandis map, five QTLs were identified for TL (Linkage groups Methods (LG) 1, 3, 4, 5 and 8), two QTLs for %PULP (LG 4 and AQTLmappingstudywascarriedoutwithaclonally 5), three for S/G (LG 1, 5 and 8), WSG (LG 6, 8 and replicated segregating population of 171 F1 individuals 10) and HG (LG 1, 2 and 6). In the E. urophylla pater- nal map we detected three QTLs for %PULP (LG 1, 4 and 9), three for HG (LG7, 8 and 10), three for TL * Correspondence: [email protected] (LG3, 4 and 8), two for CBH (LG7 and 10), two for S/G 1EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB Final W5 Norte 70770-917 Brazilia DF and Dep. Cell Biology, Universidade de Brazilia – UnB, (LG 8 and 9), and one for WSG (LG 8). More than two Brazil QTLs were clustered on LG 4, 5 and 8 in E. grandis and Full list of author information is available at the end of the article

© 2011 Sansaloni et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Sansaloni et al. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 7):P37 Page 2 of 2 http://www.biomedcentral.com/1753-6561/5/S7/P37

on LG 4, 8 and 9 in E. urophylla suggesting interesting Technology (DArT) microarray for genome-wide genotyping in genomic regions to look for candidate genes to be tested Eucalyptus. Plant Methods 2010, 6:16. 4. Stam P: Construction of Integrated Genetic-Linkage Maps by Means of a in association mapping. Several of these QTLs were syn- New Computer Package - Joinmap. Plant Journal 1993, 3(5):739-744. tenic to QTLs found in other studies [6,7] providing 5. Wang S, Basten CJ, Zeng Z-B: Windows QTL Cartographer 2.5. North some indirect support for their validity. The sequences Carolina State University, Raleigh, NC: Department of Statistics; 2011. 6. Thumma BR, Southerton SG, Bell JC, Owen JV, Henery ML, Moran GF: of DArT and microsatellite markers bracketing QTLs Quantitative trait locus (QTL) analysis of wood quality traits in. Eucalyptus were used to extract the gene models from the Eucalyp- nitens. Tree Genetics & Genomes 2010, 6(2):305-317. tus reference genome. A total of 7,125 predicted gene 7. Freeman JS, Whittock SP, Potts BM, Vaillancourt RE: QTL influencing growth and wood properties in Eucalyptus globulus. Tree Genetics & models are found across all maternal QTLs, with an Genomes 2009, 5(4):713-722. average of 445 genes per QTL. For the paternal QTLs 8. Grattapaglia D, Kirst M: Eucalyptus applied genomics: from gene 5,076 gene models exist, with an average of 362 genes sequences to breeding tools. New Phytologist 2008, 179(4):911-929. per QTL. doi:10.1186/1753-6561-5-S7-P37 Cite this article as: Sansaloni et al.: How many genes might underlie QTLs for growth and wood quality traits in Eucalyptus? BMC Proceedings Conclusions 2011 5(Suppl 7):P37. As in many other QTL mapping studies in Eucalyptus [6-8] we have identified several QTLs that control a modest proportion of the phenotypic variation for a number of economically important traits. In this first assessment of putative candidate genes co-locating with these QTLs we found thousands of annotated gene models, hundreds of which could be tentatively sug- gested as being involved in trait variation. Notwithstand- ing the low mapping resolution provided by the small progeny, this preliminary study shows that tens or hun- dreds of genes will likely be always found underlying QTLs for such complex traits. Testing and validation of such large numbers of geneswillrequireagigantic effort. Furthermore a large proportion of the phenotypic variation remains unexplained by the few QTLs mapped. It is therefore questionable from the applied stand point how much useful information this approach will effectively provide for the advancement of association genetics and, for that matter, of breeding practice.

Acknowledgments This work was supported by the Brazilian Ministry of Science and Technology through CNPq grant 577047/2008-6 and FAP-DF Grant NEXTREE 193.000.570/2009 and EMBRAPA Macroprogram 2 project grant 02.07.01.004

Author details 1EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB Final W5 Norte 70770-917 Brazilia DF and Dep. Cell Biology, Universidade de Brazilia – UnB, Brazil. 2EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB Final W5 Norte 70770-917 Brazilia DF, Brazil. 3EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology – Estação Parque Biológico, 70770-910, Brazilia, DF and Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília - Brazilia, Brazil. Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: Published: 13 September 2011 • Convenient online submission References • Thorough peer review 1. Price AH: Believe it or not, QTLs are accurate! Trends Plant Sci 2006, 11(5):213-216. • No space constraints or color figure charges 2. Wegrzyn JL, Eckert AJ, Choi M, Lee JM, Stanton BJ, Sykes R, Davis MF, • Immediate publication on acceptance Tsai CJ, Neale DB: Association genetics of traits controlling lignin and cellulose biosynthesis in black cottonwood (Populus trichocarpa, • Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar Salicaceae) secondary xylem. New Phytol 2010, 188(2):515-532. • Research which is freely available for redistribution 3. Sansaloni CP, Petroli CD, Carling J, Hudson CJ, Steane DA, Myburg AA, Grattapaglia D, Vaillancourt RE, Kilian A: A high-density Diversity Arrays Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit García et al. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 7):P26 http://www.biomedcentral.com/1753-6561/5/S7/P26

POSTER PRESENTATION Open Access A genetic linkage map for a Full sib population of Eucalyptus grandis using SSR, DArT, CG-SSR and EST-SSR markers Martín García1*, Pamela Villalba1, Cintia Acuña1, Javier Oberschelp2, Leonel Harrand2, Mauro Surenciski2, María Martínez1, César Petroli3, Carolina Sansaloni3, Danielle Faria3, Dario Grattapaglia3, Susana Marcucci Poltri1 From IUFRO Tree Biotechnology Conference 2011: From Genomes to Integration and Delivery Arraial d’Ajuda, Bahia, Brazil. 26 June - 2 July 2011

Background responses and other functions (Acuña et al., this jour- Eucalypts are the most widely planted hardwood trees in nal). These CG-SSR and EST-SSR were not mapped in the world, occupying globally more than 18 million hec- Eucalyptus previously. tares, as an important source of carbon neutral renew- able energy and raw material for pulp, paper and solid Material and methods wood. Intensive planting programs of Eucalyptus grandis Plant material have been carried out in the Argentinian Mesopotamia. E. grandis x E. grandis (EG-INTA-161 x EG-INTA-152) Linkage maps are useful tools for quantitative trait loci F1 population of 130 full-sib progeny cloned (3 ramets) (QTL) analyses and detection. Several maps for QTL and planted in 2007 in Entre Ríos, Argentina, was analyses of growth and wood quality have been devel- analyzed. oped in this genus [1,2] and most of the E. grandis maps have been carried out in interspecific crosses. Genotyping Improved marker density in genetic maps, high- The parents of the mapping cross were initially screened throughput techniques and transferability across species with: 55 SSR, 12 CG-SSR and 37 EST-SSR markers; are key aspects to increase resolution and speed for a these last two classes of markers derive from a broad variety of genomic applications in Eucalyptus.In this study (for details see Acuña et. al., this journal). Capil- context, an important issue in association studies is the lary electrophoresis and fluorescent detection were car- selection of appropriate mapped candidate genes that ried out on an ABI 3130xlGenetic Analyzer. A DArT co-localize with QTL of interest. Microarray of 7,860 clones was screened for useful As part of the Biotech MERCOSUR project (Marcucci polymorphic markers. et al., this journal), we here report the construction of a genetic linkage map for E. grandis in the context of a Linkage and bioinformatic analysis QTL study of this specie in an effort to understand the All loci were tested for goodness of fit to expected Men- molecular basis for quantitative trait variation in wood delian segregation ratios using Chi-square goodness of quality. This map includes Diversity Arrays Technology fit tests. The assignment of DArT sequence function (DArT) [3], microsatellite (SSR) markers [4], Candidate was performed using the Blast2GO software [http:// Genes-SSR (CG-SSR) for wood quality traits and stress www.blast2go.org/]. A consensus genetic linkage map responses functions and Expressed Sequence Tag-SSR was constructed with JoinMap v3.0 [5]. Linkage para- (EST-SSR) for putative function related to stress meters were set as 10 minimum LOD and 0.4 maximum recombination fractions.

* Correspondence: [email protected] 1Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Instituto de Biotecnología. Results and discussion De Los Reseros y Dr. Nicolás Repetto s/n°, CP 1686, Hurlingham, Buenos In this intraspecific E. grandis population, 78% of the Aires, Argentina Full list of author information is available at the end of the article SSR markers tested could be mapped. Most mapped

©2011Garcíaetal;licenseeBioMedCentralLtd.ThisisanopenaccessarticledistributedunderthetermsoftheCreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. García et al. BMC Proceedings 2011, 5(Suppl 7):P26 Page 2 of 2 http://www.biomedcentral.com/1753-6561/5/S7/P26

SSR loci were fully informative, segregating in approxi- tool for future analysis in locating genes of interest in mate ratios of 1:1:1:1 (either heterozygous in both par- Eucalyptus. ents four alleles in total). Seven SSR loci that followed approximate segregation ratios of 1:1 (heterozygous in Author details only one parent) were EMBRA 47,51,101,179,676, 1Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Instituto de Biotecnología. 1244,2010. De Los Reseros y Dr. Nicolás Repetto s/n°, CP 1686, Hurlingham, Buenos 2 From the DArT Microarray of 7,860 clones, 31% of Aires, Argentina. EEA INTA Concordia. Grupo de Mejoramiento Genético Forestal. Estación Yuquerí s/n, CP 3200, Concordia, Entre Ríos, Argentina. the marker were selected because of their high call rate 3Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - Parque Estação Biológica - (>0.80) and polymorphism between parents. PqEB - Av. W5 Norte (final). Caixa Postal 02372, 70770-970 - Brasília, DF – Alargeproportion(1,503/2,381=63%)oftheDArT Brazil. markers displayed a Mendelian behavior indicating that Published: 13 September 2011 they sample single copy regions and provide markers that can be used for genetic analyses (65% segregating References in 1:1 ratio and 35% in 3:1 ratio). 1. Petroli CD, Sansaloni CP, Kilian A, Steane DA, Myburg AA, Pappas GJ, Faria DA, Vaillancourt RE, Grattapaglia D: A high-density sub-centiMorgan The map was assembled with 1032 markers, including integrated DArT/microsatellite genetic linkage map for species of 976 DArT, 43 SSR loci (2-6 per linkage group), seven Eucalyptus based on 2,980 markers. Resumos do 56° Congresso Brazileiro de EST-SSR and six CG-SSR. The resulting integrated map Genética 2010 [http://web2.sbg.org.br/congress/sbg2008/pdfs2010/GP159- 34030.pdf]. featured the expected 11 major linkage groups, yielding 2. Thumma BR, Southerton SG, Bell JC, Owen JV, Henery ML, Moran GF: a genome coverage of 1358.4 cM, and an average conse- Quantitative trait locus (QTL) analysis of wood quality traits in Eucalyptus cutive intermarker distance of 1.3 cM in accordance to nitens. Tree Genet Genom 2010, 6:305-317. 3. Sansaloni CP, Petroli CD, Carling J, Hudson CJ, Steane DA, Myburg AA, other reports [1,4]. Linkage groups were numbered fol- Grattapaglia D, Vaillancourt RE, Kilian A: A high high-density Diversity lowing the standardized nomenclature for Eucalyptus Arrays Technology (DART) microarray for genome genome-wide proposed by Brondani et al [4]. genotyping in Eucalyptus. Plant Methods 2010, 6:16. 4. Brondani RP, Williams ER, Brondani C, Grattapaglia D: A microsatellite- The six Candidate Genes and seven ESTs include consensus linkage map for species of Eucalyptus and a novel set of 230 enzymes involved in lignin and cell-wall polysaccharide microsatellite markers for the genus. BMC Plant Biology 2006, 6:20. biosynthesis and stress responses genes, while 267 DArT 5. Stam P: Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package: JoinMap. Plant J 1992, 3(5):739-744. (29.7%) were assigned to a gene ontology (GO) cate- gories and 296 loci (32.9%) had significant matches with doi:10.1186/1753-6561-5-S7-P26 Cite this article as: García et al.: A genetic linkage map for a Full sib the nonredundant protein database using BLASTX. population of Eucalyptus grandis using SSR, DArT, CG-SSR and EST-SSR Thus, 25 enzymes in 56 metabolic pathways were repre- markers. BMC Proceedings 2011 5(Suppl 7):P26. sented by at least one sequence with its corresponding EC number. The inclusion of common previously mapped SSR markers in several different eucalypt species within the subgenus Symphyomyrtus (E. globulus, E. camaldulensis, E. dunnii, E. tereticornis,andpredominantlyE. grandis and E. urophylla) allowed comparison of linkage groups among this E. grandis population and other species of the genus. Linkage orders previously reported in E. glo- bulus, E. grandis and E. urophylla were also observed in this intraspecific E. grandis population, supporting the developed map.

Conclusions Submit your next manuscript to BioMed Central In this work, 13 new functional SSR and 976 DArT (296 and take full advantage of: with assigned functions) markers are mapped in an intraspecific E. grandis F1 population. This map will be • Convenient online submission used to locate QTL for wood quality and growth traits • Thorough peer review in the specie. Also, this map can help to identify candi- • No space constraints or color figure charges date genes and regions in the Eucalyptus genome useful • Immediate publication on acceptance for fine scale analysis with association studies that are • Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar being developed by our group (see Cappa et al., this • Research which is freely available for redistribution volume).The putative functional approach combined with the genetic linkage mapping provides an advantage Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit