Institut für Biologie

Biofilmbildung bei Pflanzen-assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium und molekulargenetisch-physiologische Charakterisierung eines neuen Marchantia-Isolats (Mtb. sp. JT1)

Inaugural‐Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

vorgelegt im Fachbereich Naturwissenschaften

der Universität Kassel

von Dipl.‐Biol. Stefan Schauer

Dekan: Prof. Dr. F. Herberg

Gutachter: 1. Prof. Dr. U. Kutschera

2. Prof. Dr. H. Follmann

eingereicht: 12. Januar 2009 Datum der Disputation: 6. Februar 2009

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis...... 2 Abkürzungsverzeichnis...... 7 1 Einleitung...... 10 1.1 Biofilme ...... 10 1.1.1 Vorteile von Biofilmen ...... 11 1.1.2 Matrixkomponenten bakterieller Biofilme...... 11 1.1.3 Biofilme auf Pflanzenoberflächen ...... 12 1.2 Die Gattung Methylobacterium...... 13 1.2.1 Assoziation mit Pflanzen...... 13 1.2.2 Taxonomie ...... 15 1.2.3 Identifikation...... 17 1.3 Bakterielle Speziesdefinitionen...... 17 1.4 Fragestellung und Ziele der Arbeit...... 19 2 Material und Methoden...... 21 2.1 Verbrauchsmaterial ...... 21 2.1.1 Chemikalien...... 21 2.1.2 Enzyme...... 22 2.1.3 Oligonucleotide...... 22 2.1.4 Größenmarker für DNA ...... 22 2.1.5 Fertigchemikalien (Kits)...... 23 2.1.6 Sonstige Verbrauchsmaterialien...... 23 2.2 Software ...... 23 2.3 Geräte ...... 24 2.4 Mikroorganismen ...... 25 2.5 Statistische Auswertung ...... 27 2.5.1 Mittelwert ...... 27 2.5.2 Standardabweichung ...... 27 2.5.3 Standardfehler...... 27 2.6 Sterilisation von Lösungen und Materialien ...... 27 2.6.1 Sterilfiltration ...... 27 2.6.2 Dampfsterilisation ...... 27 2.6.3 Heißluftsterilisation...... 27 2.7 Nährmedien...... 28 2.7.1 Minimalmedien...... 28 2.7.1.1 ATCC Kulturmedium 784 (AMS‐Medium)...... 28 2.7.1.2 Methylobacterium Medium (DSMZ Medium 125)...... 29 2.7.1.3 Medium nach Choi et al. (1989) ...... 29 2.7.1.4 Medium 3 / Medium 4 (Bourque et al. 1995)...... 30 2.7.2 Komplexmedien...... 31 2.7.2.1 Glycerol‐Pepton‐Medium (GP‐Medium)...... 31 2.7.2.2 R2A‐Medium (DSMZ Medium 830) ...... 31 2.7.2.3 Nutrient‐Agar (DSMZ Medium 1)...... 32

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2.8 Mikroskopische Methoden...... 32 2.8.1 Phasenkontrast‐ und Fluoreszenzmikroskopie...... 32 2.8.1.1 Lektinfärbung...... 32 2.8.1.2 Calcofluor White‐Färbung ...... 33 2.8.2 Rasterelektronenmikroskopie...... 34 2.9 Mikrobiologische Methoden ...... 35 2.9.1 Photometrische Bestimmung der Trübung ...... 35 2.9.2 Herstellung einer Zellsuspension...... 35 2.9.3 Herstellung von Dauerkulturen (Kryokonservierung)...... 36 2.9.4 Zellzahlbestimmung mit einer Zählkammer nach Thoma...... 36 2.9.5 Kultivierung der Bakterien in Flüssigkultur ...... 36 2.9.6 Kultivierung der Bakterien auf Festmedium...... 37 2.9.7 Bestimmung der Koloniemorphologie auf Festmedium ...... 37 2.9.8 Bestimmung der Zelldimensionen...... 37 2.9.9 Gram‐Färbung...... 38 2.9.10 Sudan‐Schwarz Färbung (PHB‐Nachweis)...... 38 2.9.11 Kohlenstoffverwertung...... 39 2.9.12 Test auf assimilatorische Nitratreduktion ...... 39 2.9.13 Bestimmung von Temperatur‐Optima...... 40 2.9.14 Bestimmung der Salztoleranz...... 40 2.9.15 Oxidase‐Test...... 40 2.9.16 Katalase‐Test ...... 41 2.9.17 Differenzierung der Bakterienstämme mittels Teststreifen ...... 41 2.9.17.1 Streifen‐Test (API 20 NE) ...... 41 2.9.17.2 Stoffwechsel‐Test (API 50 CH) ...... 42 2.9.18 CFW‐Platten ...... 43 2.9.19 Flagellenfärbung nach Heimbrook et al. (1989)...... 43 2.9.20 Carotinoidextraktion und in vivo Spektrum ...... 44 2.9.21 Motilitätstest...... 44 2.10 Molekularbiologische Methoden...... 45 2.10.1 DNA‐Isolation...... 45 2.10.1.1 Quick & Dirty‐Methode...... 46 2.10.1.2 DNA‐Isolation mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit...... 46 2.10.1.3 Phenol‐Chloroform‐Extraktion...... 47 2.10.1.4 DNA‐Isolation nach Pitcher et al. (1989)...... 48 2.10.1.5 CTAB‐Methode ...... 48 2.10.1.6 DNA‐Isolation mit Anionenaustauschersäulen...... 49 2.10.2 Spektrophotometrische Analyse genomischer DNA ...... 50 2.10.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA...... 51 2.10.4 Vergleichende DNA‐Sequenzanalyse ...... 52 2.10.4.1 In vitro‐Amplifikation von DNA mittels PCR ...... 53 2.10.4.1.1 Präamplifikation des 16S rRNA‐Gens...... 54 2.10.4.1.2 Präamplifikation des partiellen mxaF‐Gens...... 54 2.10.4.2 Aufreinigung von PCR‐ und Sequenzier‐Produkten...... 55

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2.10.4.3 Sequenzierung der PCR‐Fragmente ...... 55 2.10.4.3.1 Primäranalyse der Sequenzierergebnisse ...... 57 2.10.4.3.2 Editierung der Sequenzierergebnisse...... 58 2.10.4.3.3 Überprüfen der Sequenzen ...... 58 2.10.4.4 Molekularphylogenetische Analyse ...... 59 2.10.4.4.1 Wahl der Außengruppe...... 59 2.10.4.4.2 Alignierung der Sequenzen ...... 59 2.10.4.4.3 Rekonstruktion von Stammbäumen...... 60 2.10.4.4.3.1 Distanzbasierte Methoden ...... 60 2.10.4.4.3.2 Charakterbasierte Methoden ...... 61 2.10.4.4.3.2.1 Bayessche Analyse ...... 61 2.10.4.4.3.2.2 Maximum‐Likelihood‐Verfahren...... 62 2.10.4.4.4 Wahl des Substitutionsmodells ...... 62 2.10.4.4.5 Abschätzen des Stichprobenfehlers mittels Bootstrapping.... 63 2.10.4.4.6 Paarweiser Sequenzvergleich ...... 64 3 Ergebnisse...... 65 3.1 Vorbemerkung ...... 65 3.2 Zusammensetzung der verwendeten Minimalmedien...... 65 3.3 Bestimmung der Zellzahl einer Suspension mit OD600 = 0,1 ...... 65 3.4 Vergleich verschiedener mutmaßlicher Mtb. mesophilicum Isolate...... 68 3.4.1 Biofilmbildung auf Standard‐Agarnährböden...... 68 3.4.2 Zeitliche Entwicklung der Koloniemorphologie ...... 68 3.4.3 Biofilmbildung auf modifizierten Nährmedien...... 72 3.4.3.1 Modifikation der Ca2+‐Konzentration...... 72 3.4.3.2 Modifikation der Fe2+‐Konzentration...... 72 3.4.3.3 Modifikation der Mn2+‐Konzentration...... 73 3.4.3.4 Modifikation der Stickstoffkonzentration...... 73 3.4.3.5 Modifikation des C:N:P‐Verhältnisses ...... 74 3.4.4 Wachstum mit Pantothenat...... 75 3.4.5 Analysen im Rasterelektronenmikroskop (SEM) ...... 76 3.4.5.1 Koloniemorphologie des Isolats Mtb. sp. 5a.1.13...... 76 3.4.5.2 Wachstum von Mtb. mesophilicum DSM 1708T mit Pantothenat .... 79 3.5 Biofilmbildung des Isolats JT1 und nahe verwandter Arten ...... 80 3.5.1 Biofilmbildung auf Festmedium ...... 80 3.5.1.1 Standardnährböden...... 80 3.5.1.2 Modifikation des C:N:P‐Verhältnisses ...... 83 3.5.1.3 CFW‐Platten ...... 86 3.5.1.4 Rasterelektronenmikroskopie kompletter Kolonien ...... 89 3.5.2 Biofilmbildung in Flüssigkultur ...... 91 3.5.2.1 Aggregatbildung in Schüttel‐Flüssigkultur...... 93 3.5.2.1.1 Aggregatbildung in R2A‐Flüssigkultur ...... 93 3.5.2.1.2 Aggregatbildung des Isolats JT1 in Flüssigkultur ...... 94 3.5.2.2 Lektinfärbung...... 96 3.5.2.3 CFW‐Färbung...... 97

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3.5.2.4 Analyse von Biofilmen mit dem Rasterelektronenmikroskop...... 98 3.6 Vergleichende DNA‐Sequenzanalysen ...... 102 3.6.1 Vergleichende DNA‐Sequenzanalyse der 16S rDNA ...... 102 3.6.1.1 Auswahl der Typstammsequenzen ...... 104 3.6.1.2 Wahl des Substitutionsmodells ...... 105 3.6.1.3 Phylogenetische Rekonstruktion (16S rDNA)...... 106 3.6.2 Vergleichende DNA‐Sequenzanalyse des partiellen mxaF‐Gens .... 111 3.6.2.1 Auswahl geeigneter Vergleichssequenzen ...... 112 3.6.2.2 Wahl des Substitutionsmodells ...... 113 3.6.2.3 Phylogenetische Rekonstruktion (mxaF‐Gen) ...... 113 3.7 Charakterisierung des Isolat JT1 ...... 118 3.7.1 Gram‐Färbung...... 118 3.7.2 PHB‐Nachweis ...... 118 3.7.3 Bestimmung der Zelldimensionen...... 118 3.7.4 Absorptionsspektren...... 120 3.7.5 Wachstum bei unterschiedlichen pH‐Werten ...... 121 3.7.6 Salztoleranz ...... 122 3.7.6.1 Salztoleranz auf Festmedium...... 122 3.7.6.2 Salztoleranz in Flüssigmedium ...... 123 3.7.7 Kohlenstoffverwertung...... 124 3.7.8 Motilität...... 125 3.7.8.1 Motilität auf halbfestem Nähragar...... 125 3.7.8.2 Motilität in flüssigem R2A‐Medium...... 126 3.7.9 Temperaturbereich ...... 126 3.7.10 Oxidase‐Test...... 127 3.7.11 Katalase‐Test ...... 127 3.7.12 Nitratreduktion...... 127 3.7.13 Teststreifen‐Analyse (API 20 NE) ...... 128 3.7.14 Teststreifen‐Analyse (API 50 CH) ...... 129 3.7.15 Vergleich der Zelloberflächen im Rasterelektronenmikroskop...... 129 3.8 Aufreinigung genomischer DNA...... 132 3.9 DNA‐DNA‐Hybridisierung...... 136 4 Diskussion ...... 138 4.1 Methodische Aspekte...... 138 4.1.1 Anzucht der Bakterien ...... 138 4.1.2 DNA‐Isolation...... 139 4.1.3 Phylogenetische Analyse...... 144 4.2 Molekulare Systematik der Gattung Methylobacterium ...... 145 4.2.1 Vergleichende Sequenzanalyse des 16S rRNA‐Gens ...... 145 4.2.2 Vergleichende Sequenzanalyse des mxaF‐Gen...... 151 4.2.3 Zusammenfassung ...... 156 4.3 Biofilmbildung ...... 157 4.3.1 Matrixkomponenten der Biofilme...... 157 4.3.2 Einfluss des Mediums auf die Biofilmbildung...... 161

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4.3.3 Vergleichende Analyse verschiedener mutmaßlicher Mtb. mesophilicum Isolate ...... 163 4.3.4 Zusammenfassung ...... 166 4.4 Charakterisierung des Marchantia‐Isolats Mtb. sp. JT1 ...... 167 4.4.1 Phänotypische Charakterisierung...... 167 4.4.2 Analyse der Nucleinsäuren...... 169 4.4.3 Carotinoide ...... 173 4.4.4 Zusammenfassung ...... 174 4.4.5 Beschreibung von Mtb. fimbriae sp. nov. und Mtb. funariae sp. nov.176 5 Zusammenfassung ...... 177 Literatur ...... 181 Anhang...... 195 Danksagung...... 205 Erklärung ...... 206

6 Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius Δ delta, Differenz λ lambda μg Mikrogramm (10‐6 Gramm) μl Mikroliter (10‐6 Liter) μm Mikrometer (10‐6 Meter) μM Mikromolar (10‐6 Molar) A Adenin Abb. Abbildung Abk. Abkürzung AS Aminosäure(n) Bchl Bacteriochlorophyll Bez. Bezeichnung BLAST engl. Basic Local Alignment Search Tool, Programmpaket der NCBI bp Basenpaare BSC engl. Biological Species Concept, biologisches Artkonzept c Konzentration C Cytosin C Kohlenstoff C:N:P Molares Verhältnis der drei Elemente Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor zueinander ca. lat. circa, ungefähr, nahe bei CFU engl. Colony Forming Unit(s), Koloniebildende Einheit(en) CFW Calcofluor White Con A Concanavalin A CRW engl. Comparative RNA Website and Project CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid d lat. dies, Tag DBA Dolichos biflorus‐Agglutinin DDBJ engl. DNA Data Bank of Japan, DNA‐Datenbank von Japan (Mishima, Japan) ddH2O doppelt destilliertes Wasser ddNTPs Didesoxyribonucleosidtriphosphate DNA Desoxyribonucleinsäure dNTPs Desoxyribonucleosidtriphosphate dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat dGTP Desoxyguanosintriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat dITP Desoxyinosintriphosphat dUTP Desoxyuridintriphosphat DOI engl. digital object identifier; info:doi/… dsDNA doppelsträngige DNA DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig) EC engl. Enzyme Commission (Enzymnomenklatur) EDTA Ethylendiamin‐tetraessigsäure EMBL engl. European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg) engl. englisch EPS Extrazelluläre polymere Substanzen EST engl. Expressed Sequence Tag, EST‐Datenbank der NCBI et al. lat. et alii, und andere etc. lat. et cetera, und so weiter

7 Abkürzungsverzeichnis

EtOH Ethanol f. d. für die FITC Fluoresceinisothiocyanat g Gramm G Guanin GalNAc N‐Acetylgalactosamin GID GenBank‐ID, eindeutige Zugriffsnummer bei der GenBank GlcNAc N‐Acetylglucosamin GPID Genomprojekt‐ID, eindeutige Zugriffsnummer bei der GenBank GSS engl. Genome Survey Sequences, GSS‐Datenbank der NCBI GTR engl. General Time‐Reversible, Substitutionsmodell h lat. hora, Stunde HTGS engl. High Throughput Genomic Sequences, HTGS‐Datenbank der NCBI IUPAC engl. International Union of Pure and Applied Chemistry JC Substitutionsmodell von Jukes und Cantor (1969) K2P Kimura‐2‐Parameter (Kimura 1980) kbp Kilo‐Basenpaare (103 bp) l Liter (0,001 m3) lat. latein LPS Lipopolysaccharid/e Lsg. Lösung M Molarität [mol/L] Mbp Mega‐Basenpaare (106 bp) MCMC engl. Markov Chain Monte Carlo MeOH Methanol mg Milligramm (10‐3 Gramm) min lat. pars minuta prima, Minuten ml Milliliter (10‐3 Liter) ML engl. Maximum Likelihood mm Millimeter (10‐3 Meter) mM Millimolar (10‐3 Molar) MP engl. Maximum Parsimony Mtb. Abk. Methylobacterium (nach: Subcommittee on the Taxonomy of Phototrophic Bacteria) MW Mittelwert N Stickstoff NCBI engl. National Center for Biotechnology Information (Bethesa, MD, U.S.A.) NCPPB engl. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (Sand Hutton, York, UK) nd nicht durchgeführt Neu5Ac N‐Acetyl‐neuraminsäure NJ engl. Neighbor‐Joining nm Nanometer (10‐9 Meter) OD600 optische Dichte (Absorption) bei einer Wellenlänge von 600 nm P Phosphat p. a. lat. pro analysi, für analytische Zwecke PAT Nucleotid‐Sequenzen der ‘Patent division of GenBank’ PC engl. Personal Computer, Einzelplatzrechner PCR engl. Polymerase Chain Reaction, Polymerase‐Kettenreaktion PDB engl. Brookhaven Protein Database pH lat. pondus Hydrogenii, Maß für Oxoniumionenkonzentration PHB Polyhydroxybutyrat PIS engl. Parsimony Informative Sites, Parsimony‐informative Merkmale pM Pikomolar (10‐12 Molar) PMMA Polymethylmethacrylat 8 Abkürzungsverzeichnis

PNA Peanut‐Agglutinin Pos. Position PPFMs pink‐pigmentierte, fakultativ methylotrophe Bakterien PQQ Pyrrolochinolinchinon PS Polystyrol RCA120 Ricinus communis‐Agglutinin RefSeq Datenbank des NCBI ‚Reference Sequence’ Projekts Rkt. Reaktion RNA Ribonucleinsäure rpm engl. rounds per minute, Umdrehungen pro Minute Rps. Abk. Rhodopseudomonas RT Raumtemperatur s lat. pars minuta secunda, Sekunden s. o. siehe oben SBA Sojabohnen‐Agglutinin SEM engl. Scanning Electron Microscope, Rasterelektronenmikroskop sp. lat. species, Art spp. lat. species pluralis, umfasst die Arten einer Gattung Stdf. Standardfehler ssRNA einzelsträngige RNA STS engl. Sequence Tagged Site, STS‐Datenbank der GenBank, EMBL und DDBJ Sequenzen T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TE Tris‐EDTA Tm Schmelztemperatur Tris Tris(hydroxymethyl)‐aminomethan U engl. units, Einheit für Enzymaktivität U Uracil UEA Ulex europaeus‐Agglutinin ÜN über Nacht UV Ultraviolett v. a. vor allem v/v Volumen/Volumen Vol. Volumen w engl. weak, schwach w/v engl. weight/volume, Masse/Volumen WGA Weizenkeim (engl. wheat germ)‐Agglutinin WGS engl. whole genome shotgun, Datenbank für Sequenzen aus WGS‐Projekten z. B. zum Beispiel

9 Einleitung

1 Einleitung Echte Bakterien (Eubacteria) stellen – neben den Archaebakterien (Archaea) – als einzellige Organismen die am einfachsten organisierten Lebensformen dar. Trotz ihrer vergleichsweise geringen morphologischen Komplexität sind Prokaryoten jedoch die am weitesten verbreiteten Lebewesen und können an fast allen Orten gefunden werden, wo organische Substrate und Wasser verfügbar sind. Nach Hochrechnungen stellen Prokaryoten (Bacteria, Archaea, Cyanobacteria) wahr‐ scheinlich weit mehr als die Hälfte der protoplastischen Biomasse auf unserem Planeten dar (Whitman et al. 1998) und erfüllen daher eine zentrale Rolle im Ökosystem der Erde. Antoni van Leeuwenhoek (1632‐1723) konnte 1675 mit Hilfe seiner selbst entwickelten Mikroskope als Erster Bakterien beobachten und begründete mit seiner Beschreibung von Bazillen, Kokken und Spirillen das Gebiet der Bakteriologie, aus der später die Mikrobiologie hervorgegangen ist (Wissenschaft von den pro‐ und eukaryotischen Mikroben). Ein weiterer wichtiger Schritt in der mikrobiellen Forschung war die Etablierung von Kulturtechniken zur Erstellung von Reinkulturen durch Robert Koch (1843‐1910) Ende des 19ten Jahrhunderts. Während diese Pioniere der Mikrobiologie noch von einem Einzel‐Leben ihrer Studienobjekte ausgegangen sind, wissen wir heute, dass die meisten Bakterien überzelluläre Strukturen ausbilden. Diese Zellaggregate werden als Biofilme bezeichnet.

1.1 Biofilme Mikrobielle Biofilme bestehen aus Mikroorganismenpopulationen, die sich an Grenzflächen (üblicherweise fest‐flüssig) ansammeln, aneinander und/oder an eine Oberfläche gebunden vorliegen und typischerweise von einer Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) umgeben sind, die von den Zellen im Biofilm exkretiert wurden (Morris und Monier 2003, Hall‐Stoodley et al. 2004). Aggregate aus mehreren Zellen, die nicht an eine Oberfläche gebunden vorliegen, werden als Flocken bezeichnet und zeigen oft dieselben Eigenschaften (Hall‐ Stoodley et al. 2004). Die als Biofilm organisierten Zellen weisen dabei eine andere phänotypische Ausprägung sowie ein unterschiedliches Wachstumsverhalten als frei lebende (planktonische) Bakterien auf (O’Toole et al. 2000). Die Biofilmbildung kann durch viele unterschiedliche Faktoren wie z. B. Nähr‐ stoffmangel (James et al. 1995, Gerstel und Römling 2001) oder Signalmoleküle (Quorum Sensing) (Eberl 1999, De Kievit et al. 2001, Penalver et al. 2006) induziert werden und läuft als regulierte Abfolge mehrerer Entwicklungsschritte ab (Stoodley et al. 2002, Sauer et al. 2002, Reisner et al. 2003). Auf eine schwache oder transienten Assoziation mit einer Oberfläche folgt die feste Adhäsion der Bakterien, die oft mit der Produktion von EPS einhergeht. Durch Vermehrung und Rekrutierung planktonischer Zellen entstehen Mikrokolonien, die durch die Produktion einer extrazellulären Matrix zu Biofilmen heranreifen. Die Form des Biofilms wird dabei vor allem durch die Umweltbedingungen bestimmt

10 Einleitung

(Nährstoffe, Flussrate, Scherkräfte, etc.). Als letzter Schritt in der Entwicklung von Biofilmen gilt die Ablösung von Zellen oder Teilen des Biofilms, wodurch eine transiente Beweglichkeit wieder hergestellt wird und die Organismen neue Lebensräume besiedeln können (Hall‐Stoodley et al. 2004). Biofilme konnten in ca. 3,25 Mrd. Jahre alten fossilen Versteinerungen gefunden werden (Rasmusen 2000) und stellen die bevorzugte Lebensform der Bakterien und Archaea dar (Costerton et al. 1995, Flemming und Wingender 2001, Hall‐ Stoodley et al. 2004). Da vermutlich 99 % aller Bakterien in Biofilmen leben und auch die phylogenetisch ältesten prokaryotischen Linien bereits die Fähigkeit zur Biofilmbildung besitzen (Reysenbach et al. 2000, Jahnke et al. 2001), wird angenommen dass diese Eigenschaft bereits sehr früh entstanden ist und ein integrales Charakteristikum des prokaryotischen Lebens darstellt.

1.1.1 Vorteile von Biofilmen Das Leben in Biofilmen bringt einige wesentliche Vorteile für die Bakterien mit sich. So besitzt die EPS‐haltige Biofilmmatrix eine enorme Wasserrückhalte‐ funktion, und kann die Bakterien vor Austrocknung schützen (Monier und Lindow 2003). In der gelartigen EPS‐Matrix kommt es auch zu einer Anreicherung von Nährstoffen, was besonders für oligotrophe Organismen von Bedeutung ist (Baty et al. 2000). Zusätzlich wird ein Schutz der Bakterien vor UV‐Strahlung und Antibiotika durch die Ausbildung der EPS diskutiert. Die Bakterien schaffen sich so ihr eigenes Mikrohabitat (Watnick und Kolter 2000, Morris und Monier 2003). Durch die räumliche Akkumulation der Bakterienzellen wird zudem die Wahr‐ scheinlichkeit von horizontalem Gentransfer erhöht, und die Bildung synergistischer Bakteriengemeinschaften ermöglicht (Morris und Monier 2003). Diese komplexen Lebensgemeinschaften aus Mikroorganismen zeigen dabei sogar Fähigkeiten wie Sozialverhalten oder Altruismus, Kompetenzen die bisher ausschließlich mehrzelligen Organismen zugeschrieben wurden (Crespi 2001, Kreft 2004).

1.1.2 Matrixkomponenten bakterieller Biofilme Als Matrixkomponenten bakterieller Biofilme spielen vor allem Exopoly‐ saccharide, Lipopolysaccharide (LPS), Proteine, Glycoproteine und Lipoproteine eine wichtige Rolle (Flemming et al. 2007). Zusätzlich konnte extrazelluläre DNA (e‐DNA) als strukturelle Komponente in einigen Biofilmen identifiziert werden (Palmgren und Nielson 1996, Whitchurch et al. 2002, Barken et al. 2008). An der Adhäsion der Zellen sind dabei verschiedene proteinöse und/oder zucker‐ haltige Strukturen beteiligt wie z. B. Flagellen (Pringent‐Combaret et al. 1999, Vatanyoopaisarn et al. 2000, Trémoulet et al. 2002), Pili (Pratt und Kolter 1998, Barken et al. 2008), Curli‐Fimbrien (Olsén et al. 1989, Römling et al. 1998), Cellulosefasern (Matthysse et al. 1981, Takeda et al. 2004), Alginat (Zielinski et al. 1992, Hentzer et al. 2001) oder Colansäure (Solano et al. 2002).

11 Einleitung

1.1.3 Biofilme auf Pflanzenoberflächen Es ist allgemein bekannt, dass alle Pflanzenorgane (Spross, Blätter und Wurzel) mit einer Bakterienflora besiedelt sind (Romantschuk 1992, Morris und Monier 2003, Danhorn und Fuqua 2007, Kutschera 2002, 2007, Schauer und Kutschera, 2008). Einige Bakterien können auch in Pflanzengewebe eindringen und dort Biofilme ausbilden. Dies spielt z. B. bei der Ausbildung der Symbiose zwischen Stickstoff‐fixierenden Knöllchenbakterien der Gattung Rhizobium und ihren Wirtspflanzen eine wichtige Rolle (Smith et al. 1987). Auch bei der Infektion von Pflanzenzellen durch Agrobacterium tumefaciens werden extrazelluläre Matrix‐ komponenten von den Mikroben produziert um sich fest an die Oberflächen zu fixieren (Matthysse 1983). Einige Pflanzen‐assoziierte, biofilmbildende Mikro‐ organismen wie Pseudomonas fluorescens können Pflanzen gegen pathogene Pilze schützen (Haas et al. 2000) oder die Assoziation mit Arbuskulären Mykorrhiza‐ pilzen steigern (Bianciotto et al. 2001). Die Anheftung von Bakterien an Pflanzenoberflächen beginnt auch hier mit der Anlagerung der Bakterien an die Pflanzenoberfläche. Je nach Bakterienart können dabei mehr oder weniger spezifische Mechanismen zum Einsatz kommen. Durch die Produktion extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS) können die Bakterien fest an die Oberfläche binden und, durch Vermehrung und Rekrutierung planktonischer Zellen, Mikrokolonien und Biofilme ausbilden (Elvers und Lappin‐ Scott 2000, Danhorn und Fuqua 2007). Die Verteilung der Bakterien auf Pflanzen ist meist sehr heterogen und abhängig von den verfügbaren Nährstoffen und weiteren Faktoren, durch welche die deutlich strukturierte Pflanzenoberfläche (Mechaber et al. 1996) in unter‐ schiedliche Mikrohabitate unterteilt wird. So konnten Monier und Lindow (2004) vor allem an Blattadern und Trichomen bakterielle Biofilme nachweisen. Die Besiedelung der Pflanzen mit Mikroorganismen ist jedoch ein dynamischer Prozess der durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst werden kann (Hirano und Upper 1986, Kinkel 1997). Neben der Verfügbarkeit von Wasser und Nährstoffen als auch der Oberflächenbeschaffenheit sind der bakterielle Zu‐ und Abgang sowie die Wachstums‐ und Überlebensraten der Mikroben entscheidend für die Populationsdichten (Kinkel 1997).

12 Einleitung

1.2 Die Gattung Methylobacterium Bei Bakterien der Gattung Methylobacterium handelt es sich um Gram‐negative, aerobe, stäbchenförmige Bakterien, die ubiquitär anzutreffen sind und daher in einer Vielzahl von Habitaten aufgefunden werden. So konnten Vertreter der Gattung von Pflanzenoberflächen, aus der Luft und aus aquatischen Umgebungen (Meerwasser, Seewasser, Leitungswasser), aber auch von tierischen Quellen (Regenwürmer, Termiten, Menschen) isoliert werden (siehe auch Tabelle 1.2). Dennoch scheint eine enge Beziehung zu Pflanzen zu bestehen (Holland 1997, Trotsenko et al. 2001, Kutschera 2007). Methylobakterien sind in der Lage das von Pflanzen abgegebene Methanol (Nemecek‐Marshall et al. 1995, Hüve et al. 2007) als alleinige Energie‐ und Kohlenstoffquelle zu nutzen und spielen deshalb auch eine Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. In methylotrophen Bakterien wird die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd durch das Enzym Methanol‐Dehydrogenase (EC 1.1.99.8) katalysiert (Anthony und Zatman 1964, Wolf und Hanson 1978, Machlin und Hanson 1988, Anthony und Williams 2003). Als Coenzym wird dabei Pyrrolochinolinchinon (PQQ) zu PQQH2 reduziert (Salisbury et al. 1979), das bei der Re‐Oxidation in zwei nachfolgenden sequentiellen Reaktionen je ein Elektron auf den primären Elektronenakzeptor Cytochrom cL übergibt. Das tetramere Holoenzym (α2β2) besteht aus zwei α‐Untereinheiten (66 kDa) mit je einem Molekül PQQ als prosthetische Gruppe sowie einem Ca2+‐Ion im aktiven Zentrum, um die sich die kleineren β‐Untereinheiten (6 kDa) falten (Blake et al. 1994, Afolabi et al. 2001, Zheng et al. 2001). In Mtb. extorquens AM1 werden für die Oxidation von Methanol zu Formaldehyd durch das Methanol‐Dehydrogenase System insgesamt 25 Gene benötigt, die in fünf Genclustern (mxa, mxb, pqqABC/DE, ppqFG und mxc) organisiert sind (Zhang und Lidstrom 2003). Das mit 14 Genen größte Gencluster (mxaFJGIRSACKLDEHB) wird als Operon in eine einzelne mRNA transkribiert und steht unter Kontrolle eines Methanol‐induzierbaren Promotors (Zhang und Lidstrom 2003). Die Gene mxaF und mxaI codieren dabei für die α‐ bzw. β‐Untereinheit der Methanol‐Dehydrogenase (Nunn und Lidstrom 1986a, b, Nunn et al. 1989); das Gen mxaG codiert das strukturelle Polypeptid des Elektronenakzeptors Cytochrom cL. Die Anordnung der Gene mxaFJGIR ist dabei selbst zwischen den entfernt verwandten methylotrophen Bakterien der α‐ und γ‐ Proteobacteria konserviert (Waechter‐Brulla et al. 1993).

1.2.1 Assoziation mit Pflanzen Besonderes Interesse gilt der Assoziation von Bakterien der Gattung Methylobacterium mit Pflanzen. PPFMs wurden bereits von mehr als 100 Pflanzenspezies isoliert und sind wahrscheinlich ubiquitär als Epiphyten auf Pflanzen aller Taxa anzutreffen (Holland 1997, Corpe und Rheem 1989). Vereinzelt wurden auch bereits engere Assoziationen beschrieben. So identifizierten Idris et al. (2004) mehrere endophytisch lebende Mtb.‐Stämme im Gösing‐Täschelkraut. Pirtillä und Kollegen (2000) konnten Bakterien der Gattung

13 Einleitung als Endophyten in der Waldkiefer (Pinus sylvestris L.) nachweisen. Einige Vertreter wie Mtb. nodulans sind in der Lage, Wurzelknöllchen bei Leguminosen auszubilden und Luftstickstoff zu fixieren (Sy et al. 2001, Jaftha et al. 2002). Viele Mtb.‐Stämme bilden das Enzym 1‐Aminocyclopropan‐1‐carbonsäure (ACC)‐ Deaminase (EC 3.5.99.7) (Idris et al. 2004, Madhaiyan et al. 2006). Dieses Enzym senkt die endogene Ethylenproduktion der Pflanzen durch die Deamination von ACC, dem direkten Vorläufermolekül von Ethylen (einem gasförmigen „Stress‐ hormon“ in Pflanzen). Hornschuh et al. (2002, 2006) konnten zeigen, dass bei Ko‐kultivierung von Funaria hygrometrica mit Methylobakterien eine Erhöhung der Knospenbildung sowie eine Beschleunigung der Gesamtentwicklung des Laubmooses auftraten. Die Autoren wiesen nach, dass dieser positive Effekt der Methylobakterien auf die Produktion des Phytohormons Auxin zurückgeführt werden kann, dass von den Bakterien synthetisiert wird (Ivanova et al. 2001). Jedoch wurde der Biosyntheseweg von Auxin in Methylobakterien bis zum heutigen Zeitpunkt nicht geklärt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Methylobakterien Cytokinine und Vitamine synthetisieren und an ihre Umgebung abgeben (Ivanova et al. 2000, Koenig et al. 2002). Cytokinine sind eine Gruppe von Phytohormonen mit multipler Wirkung auf Wachstum und Entwicklung von Pflanzen, wie die Stimulation der Cytokinese in den Meristemen des Kormus. Durch die Produktion des Enzyms Urease (EC 3.5.1.5) sind die Bakterien auch am Stickstoff‐Metabolismus ihrer Wirtspflanzen beteiligt (Holland und Polacco 1992). Als Nahrungsquelle verwerten die Spezies der Gattung Methylobacterium das von den Pflanzen über die Stomata abgegebene Methanol, welches hauptsächlich bei der Hydrolyse von Pektin (Polygalacturonsäuremethylester) entsteht (Nemecek‐ Marshall et al. 1995, Hüve et al. 2007). Dieser Prozess findet vor allem bei Wachstum und Differenzierung sowie beim Alterungsprozess und der Seneszenz von Pflanzengeweben statt. Die höchste Methanolemission kann bei jungen, schnell wachsenden Blättern beobachtet werden; mit zunehmendem Alter der Blätter nimmt die Methanolemission kontinuierlich ab (Nemecek‐Marshall et al. 1995, Hüve et al. 2007). Dies spiegelt sich auch in der Populationsdichte der PPFMs wider, die auf aktiv wachsenden und meristematischen Geweben am höchsten ausfällt (Holland und Polacco 1992, Holland 1997). Da fast alle bisher untersuchten Pflanzen von PPFMs besiedelt sind und eine Reihe von Pflanzen‐Bakterien‐Interaktionen belegt wurden, wird eine evolutionär sehr alte Beziehung (Coevolution) vermutet (Trotsenko et al. 2001, Kutschera 2007). Durch die Produktion von Phytohormonen und Vitaminen bringen Vertreter der Gattung Methylobacterium dem pflanzlichen Wirtsorganismus einen Selektionsvorteil und können daher als Phytosymbionten (Hornschuh et al. 2002, 2006, Kutschera 2007) oder ‚Plant‐growth promoting bacteria’ (PGPB) (Bashan und Holguin 1998) bezeichnet werden.

14 Einleitung

1.2.2 Taxonomie Die Gattung Methylobacterium wurde 1976 von Patt und Kollegen eingeführt, um ein Methan‐oxidierendes Bakterium taxonomisch einzuordnen, welches sich in seinen Eigenschaften wesentlich von allen anderen, bisher bekannten methylo‐ trophen Bakterien unterschied. Alle bis dahin beschriebenen Methanverwerter waren obligat methylotroph; der von Patt und Kollegen isolierte Stamm konnte jedoch auch komplexere Kohlenstoffquellen wie Zucker und organische Säuren verwerten (Patt et al. 1974). Als Artname wurde daher Methylobacterium organophilum gewählt, um die Präferenz des Isolats für komplexe Kohlenstoff‐ quellen hervorzuheben (Patt et al. 1976). Die pink‐pigmentierten, fakultativ methylotrophen (Bakterien‐)Zellen des Isolats verloren jedoch im Laufe der Zeit die Fähigkeit Methan zu oxidieren (Green und Bousfield 1983, Dedysh et al. 2004). Deshalb wurde eine Berichtigung der Gattungsbeschreibung vorgeschlagen, um auch nicht Methan‐verwertende, pink‐ pigmentierte, fakultativ methylotrophe Bakterien (PPFMs) in die Gattung Methylobacterium mit einordnen zu können, von denen sich Mtb. organophilum nun phänotypisch nicht mehr unterschied (Green und Bousfield 1983). In der Arbeit wurden dabei auch drei neue Methylobacterium‐Spezies beschrieben, die zuvor in der Gattung Pseudomonas geführt wurden: Mtb. rhodinum, Mtb. radiotolerans und Mtb. mesophilicum (Green und Bousfield 1983). Derzeit umfasst die Gattung Methylobacterium 34 fakultativ methylotrophe Spezies (siehe Tabelle 1.2), die – bis auf Mtb. nodulans (Jourand et al. 2004) und Mtb. jeotgali (Aslam et al. 2007) – durch Carotinoide rosa/rot pigmentiert sind. In Tabelle 1.1 wurde die taxonomische Einordnung der Gattung Methylobacterium nach den Regeln der ‚Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea’ (TOBA) (Garrity et al. 2007) aufgeführt. In Tabelle 1.2 wurden alle, zum Zeitpunkt der Abgabe der Arbeit, valide beschriebenen Spezies der Gattung Methylobacterium zusammen‐ gefasst.

Tabelle 1.1: Taxonomische Einordnung der Gattung Methylobacterium nach TOBA, Release 7.7 (Garrity et al. 2007).

Taxonomischer Rang Einordnung Domäne (Superkingdom) Bacteria Stamm (Phylum) Proteobacteria Klasse (Class) Alphaproteobacteria Ordnung (Order) Rhizobiales Familie (Family) Methylobacteriaceae Gattung (Genus) Methylobacterium

15 Einleitung

Tabelle 1.2: Liste aller valide publizierten Spezies der Gattung Mtb. mit Referenzen.

Spezies Typstamm Referenz Isolationsquelle Mtb. adhaesivum AR27 Gallego et al. 2006 Leitungswasser Mtb. aerolatum 5413S‐11 Weon et al. 2008 Luft Mtb. aminovorans TH‐15 Urakami et al. 1993 Erde Mtb. aquaticum GR16 Gallego et al. 2005a Leitungswasser Mtb. brachiatum B0021 Kato et al. 2008 Wasser (Lebensmittelfabrik) Mtb. chloromethanicuma CM4 McDonald et al. 2001 Erde (petrochemische Fabrik) Mtb. dichloromethanicumb DM4 Doronina et al. 2000 Belebtschlamm Mtb. extorquens TK 0001 Urakami und Komagata 1984, Erde Bousfield und Green 1985 Mtb. fujisawaense 0‐31 Green et al. 1988 Region um Fujisawa, Japan Mtb. gregans 002‐074 Kato et al. 2008 Wasser (Lebensmittelfabrik) Mtb. hispanicum GP34 Gallego et al. 2005a Leitungswasser Mtb. iners 5317S‐33 Weon et al. 2008 Luft Mtb. isbiliense AR24 Gallego et al. 2005c Leitungswasser Mtb. jeotgali S2R03‐9 Aslam et al. 2007 Jeotgal (fermentierte Meeresfrüchte) Mtb. komagatae 002‐079 Kato et al. 2008 Wasser (Lebensmittelfabrik) Mtb. lusitanumc RXM Doronina et al. 2002 Abwasserstation Mtb. mesophilicum A47 Austin und Goodfellow 1979 Phyllosphäre von Lolium perenne Green und Bousfield 1983 Mtb. nodulans ORS2060 Jourand et al. 2004 Endophyt von Crotalaria podocarpa Mtb. organophilum XX Patt et al. 1976 See‐Sediment Mtb. oryzae CBMB20 Madhaiyan et al. 2007a Reisstängel (Oryza sativae) Mtb. persicinum 002‐165 Kato et al. 2008 Wasser (Lebensmittelfabrik) Mtb. phyllospherae CBMB27 Madhaiyan et al. 2009 Reis‐Phyllosphäre (Oryza sativae ʹDoug‐Jinʹ) Mtb. platani PMB02 Kang et al. 2007 Phyllosphäre von Platanus orientalis Mtb. podarium FM4 Anesti et al. 2004 Fuß (Homo sapiens) Mtb. populi BJ001 Van Aken et al. 2004 Endophyt von Populus deltoidesxnigra DN34 Mtb. radiotolerans 0‐1 Ito und Iizuka 1971, 4 Jahre eingelagerter Reis (Oryza sativae) Green und Bousfield 1983 Mtb. rhodesianum strain 1 Green et al. 1988 Fermenter mit Formaldehyd Mtb. rhodinum B6 Heumann 1962, Rhizosphäre von Erlen (Alnus sp.) Green und Bousfield 1983 Mtb. salsuginis MR Wang et al. 2007 Meerwasser Mtb. suomiense F20 Doronina et al. 2002 Waldboden Mtb. tardum RB677 Kato et al. 2008 Wasser (Lebensmittelfabrik) Mtb. thiocyanatum ALL/SCN‐P Wood et al. 1998 Rhizosphäre von Allium aflatunense Mtb. variabile GR3 Gallego et al. 2005b Trinkwasser Mtb. zatmanii strain 135 Green et al. 1988 Fermenter mit Formaldehyd a nach Kato et al. (2005, 2008) ist Mtb. chloromethanicum (McDonald et al. 2001) ein späteres heterotypisches Synonym für Mtb. extorquens (Urakami und Komagata 1984, Bousfield und Green 1985). b nach Kato et al. (2005, 2008) ist Mtb. dichloromethanicum (Doronina et al. 2000) ein späteres heterotypisches Synonym für Mtb. extorquens (Urakami und Komagata 1984, Bousfield und Green 1985). c nach Kato et al. (2005, 2008) ist Mtb. lusitanum (Doronina et al. 2002) ein späteres heterotypisches Synonym für Mtb. rhodesianum (Green et al. 1988).

Zusätzlich zu den oben aufgeführten Arten wurde von Idris et al. (2006) die Spezies Mtb. goesingense sp. nov. vorgeschlagen, um das Isolat iEII3 taxonomisch einzuordnen, dass als Endophyt im Gösing‐Täschelkraut (Thlaspi goesingense) isoliert wurde. Jedoch wurde die Speziesbeschreibung nicht offiziell im IJSEM (International Journal of Systematic and Environmental Microbiology) publiziert und ist daher nicht validiert.

16 Einleitung

1.2.3 Identifikation Vertreter der Gattung Methylobacterium sind stäbchenförmige Einheiten (0,8‐1,0 × 1,0‐8,0 μm) und liegen als Einzelzellen oder Aggregate (Rosetten/Cluster bzw. Flocken) vor (Patt et al. 1974, Green und Bousfield 1982, Kutschera et al. 2007). Die Zellen sind vor allem in der stationären Wachstumsphase oft verzweigt oder pleomorph (Kouno und Ozaki 1975). Alle Stämme der Gattung besitzen ein einzelnes polares, subpolares oder laterales Flagellum und sind dadurch beweglich (Green 2006). Die Zellen gehören zur Gruppe der Gram‐negativen Bakterien, obwohl bei einigen Stämmen die Gram‐Reaktion variabel ausfallen kann (Green und Bousfield 1982, Green 2006). Oft können große Einschlüsse aus wasserunlöslichem Poly‐β‐hydroxybutyrat (PHB) in den Bakterien beobachtet werden (Green und Bousfield 1982), die als Nährstoffreserve angelegt werden. PHB gehört zur Klasse der Polyhydroxyalkanoate (PHAs), die sich zum Teil als Ersatz für synthetische Kunststoffe eignen. Viele PHAs werden daher als nachwachsende Rohstoffe bereits kommerziell vertrieben. Teilweise liegen in den Zellen auch Volutin‐Granula vor (Green und Bousfield 1982), die aus Poly‐ phosphaten bestehen und den Bakterien als Energiespeicher dienen. Alle Stämme sind strikt aerob und Katalase‐ sowie Oxidase‐positiv (Green 2006). Vertreter der Gattung Mtb. können neben C1‐Verbindungen meist auch eine große Anzahl komplexer Kohlenstoffverbindungen verwerten (Kouno und Ozaki 1975, Green und Bousfield 1982, Urakami et al. 1993, Hiraishi et al. 1995). Die Identifikation der Spezies innerhalb der Gattung basierte lange Zeit hauptsächlich auf dem Verwertungsmuster der Kohlenstoffquellen. Aufgrund der großen Zahl an Speziesbeschreibungen seit dem Jahr 1999 und der geringen stoffwechsel‐ physiologischen Variabilität, kann aber über dieses System jedoch keine verlässliche Aussage mehr getroffen werden.

1.3 Bakterielle Speziesdefinitionen Arten (Spezies) bilden die Grundlage der biologischen Taxonomie und dienen als Einheit zur Beschreibung von Biodiversität und Evolution (Kämpfer und Rosselló‐ Mora 2004). Bei Bakterien ist der Artbegriff jedoch umstritten (Stanier und van Niel 1962, Woese 1987, Brenner et al. 2001, Roselló‐Mora und Amann 2001, Kutschera 2004, de Queiroz 2005, Staley 2006, Cohan und Perry 2007). Ein Zitat des Evolutionsbiologen Ernst Mayr (1904‐2005) in einem Interview mit der Netzeitung (2003) lautet sogar:„Bakterien haben keine Arten.“1 Nach Mayrs Definition des biologischen Artkonzepts (BSC, biological species concept) sind Spezies Gruppen von sich miteinander kreuzenden natürlichen Populationen, die von anderen Gruppen reproduktiv isoliert sind (Mayr, 1996). Da Prokaryoten sich jedoch nicht zweigeschlechtlich (sexuell) reproduzieren und praktisch keine Rekombinationsschranken aufweisen, lässt sich dieses Konzept nicht auf Bakterien übertragen.

1 http://www.netzeitung.de/wissenschaft/243542.html (veröffentlicht am 17.06.2003). 17 Einleitung

Auch ein morphologisches Artkonzept ist aufgrund der geringen phänotypischen Unterscheidungsmerkmale bei Bakterien nur sehr begrenzt anwendbar und diente deshalb nur in den Anfangszeiten der mikrobiellen Forschung im ausgehenden 18ten Jahrhundert als Maßstab. Der dänische Naturforscher Otto Friedrich Müller (1730‐1784) versuchte als erster eine Systematik für Mikroorganismen zu erstellen und schuf dabei die Gattungen Monas und Vibrio (in seinem Werk ‚Vermium terrestrium et fluviatilium seu animalium infusorium, helminthicorum, et testaceorum non marinorum succincta historia’, 1771). Sein System wurde im frühen 19ten Jahrhundert von Christian Gottfried Ehrenberg (1795‐1876) um die helikalen Bakterien erweitert. Einige der damals eingeführten Speziesbezeichnungen werden auch heute noch verwendet. Mit der Entwicklung neuer Mikroskope und Färbemethoden wurden auch die Taxonomie und das Spezieskonzept angepasst. So wurden im Laufe der Zeit bei der Bestimmung bakterieller Arten schließlich auch physiologische und bio‐ chemische Merkmale (Aufbau der Zellwand, Stoffwechsel, optimale Wachstums‐ temperatur, Enzymaktivitäten etc.) herangezogen. In der modernen Biologie treten vor allem molekulare Marker (16S rDNA, housekeeping genes, DNA‐DNA‐ Hybridisierung, Gesamtgenomvergleiche) in den Vordergrund. Nach der heute gültigen Definition von Rosselló‐Mora und Amann (2001) ist eine bakterielle Spezies eine Kategorie, die eine (vorzugsweise) genomisch kohärente Gruppe individueller Isolate/Stämme beschreibt, welche eine hohe Überein‐ stimmung hinsichtlich (vieler) unabhängiger Merkmale aufweisen, die unter hoch standardisierten Bedingungen vergleichend getestet wurden. Dieser phylophenetische oder polythetische Artbegriff, der heute benutzt wird, gilt als pragmatisch, brauchbar, allgemeingültig und erfolgreich bei seiner Anwendung in Identifikationsverfahren (Kämpfer und Rosselló‐Mora 2004). Dabei stellen zum heutigen Zeitpunkt DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien und die Bestimmung des G+C‐Gehaltes die anerkannten Standards zur Spezies‐ abgrenzung dar (Wayne et al. 1987, Rosselló‐Mora und Amann 2001, Stackebrandt et al. 2002). In Analogie zur binären Nomenklatur von Carl von Linné (1707‐1778) wurden Bakterienspezies mit einem Gattungs‐ und Artnamen versehen (z. B. Blutegel Hirudo medicinalis, analog Darmbakterium Escherichia coli). Diese Übertragung der Taxonomie eukaryotischer Makro‐ auf prokaryotische Mikroorganismen ist jedoch aus einer Reihe von Gründen problematisch (Kutschera 2004). Die Frage nach einem universellen Spezieskonzept, welches auf alle Lebewesen angewendet werden kann, ist ein kontrovers diskutiertes Problem, das sowohl die Wissenschaftstheorie als auch Biologen aller Fachrichtungen beschäftigt.

18 Einleitung

1.4 Fragestellung und Ziele der Arbeit In vorhergehenden Arbeiten wurde beobachtet, dass einige Bakterienstämme der Gattung Methylobacterium durch eine Matrix aus unbekanntem Material fest an die Oberflächen ihrer Wirtspflanzen gebunden sind (Hornschuh et al. 2002). Es ließ sich aber nicht feststellen, ob diese Matrix bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs ist. Auch bilden viele Stämme in Flüssigkulturen große Zellaggregate. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollten daher die Mechanismen der Biofilmbildung sowie der daran beteiligten Substanzen bei Vertretern der Gattung Methylobacterium spp. untersucht werden, um die Interaktionen zwischen Bakterien und Pflanzen besser zu verstehen. Dabei sollen die Bedingungen ermittelt werden, durch welche die EPS‐Produktion induziert wird. Grundlage der Arbeit stellten verschiedene Mtb. spp. Freilandisolate dar, die auf Standard‐Agarnährböden teilweise charakteristische Koloniemorphologien aus‐ bildeten. Besonders auffällig war dabei die Morphologie des Freilandisolats Mtb. sp. 5a.1.13, welches als putatives Mtb. mesophilicum‐Isolat identifiziert wurde (Schauer 2004). Daher sollten verschiedene Mtb. mesophilicum‐Isolate sowie der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T im Hinblick auf ihre Biofilmbildung untersucht werden. Die vorliegende Arbeit baut auf einer Diplomarbeit auf (Schauer 2004), in der bereits die ersten Hinweise auf eine Biofilmproduktion durch die Bakterien gesammelt werden konnten. Dort wurde bereits vermutet, dass bei unter‐ schiedlichen Isolaten wahrscheinlich verschiedenartige Mechanismen für die Biofilmbildung verantwortlich sind. Daher sollte ein phylogenetisch möglichst großer Bereich der Gattung Methylobacterium untersucht werden. Die allgemeinen mikrobiellen Arbeiten umfassten dabei physiologische Unter‐ suchung zu Wachstum und Verhalten der Isolate, Studien zum Einfluss von Nährsalzen und Kohlenstoffquelle auf die Biofilmbildung sowie die Analyse der Biofilmbildung auf Festmedium (Koloniemorphologie). Zusätzlich wurden mikroskopische Verfahren wie Rasterelektronenmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der EPS‐Produktion eingesetzt. Die Rasterkraftmikroskopie erlaubt dabei die Darstellung sehr kleiner Strukturen im Nanometerbereich, wobei die Proben jedoch entwässert werden müssen, und so die native Struktur der Matrix möglicherweise nicht erhalten bleibt. Durch Phasenkontrastmikroskopie und die Verwendung fluoreszenzmarkierter Lektine und anderer Farbstoffe können in vitro Untersuchungen zur EPS‐ Produktion durchgeführt werden, ohne dabei das wässrige Milieu zu verlassen. Durch die Kombination dieser beiden Techniken sollen so die Mechanismen untersucht werden, die zur Biofilmbildung führen; durch die Beobachtung des Wachstums und des Verhaltens der Isolate in Reinkulturen sollen die Bedingungen gefunden werden, bei denen eine maximale bzw. minimale EPS‐ Produktion auftritt.

19 Einleitung

Ein zweites Ziel dieser Arbeit bestand darin, von Moospflanzen (Marchantia polymorpha, Funaria hygrometrica) isolierte Methylobacterium‐Stämme, die bisher nicht klassifiziert werden konnten, zu charakterisieren. Das Hauptinteresse galt dabei dem Lebermoos‐Isolat Mtb. sp. JT1, das von J. Thomas (2003) isoliert wurde und durch die Bildung großer Zell‐Aggregate auffiel (Thomas 2003, Schauer 2004, Kutschera et al. 2007). Auf rasterelektronenmikroskopischen Bildern zeigte der Stamm eine auffällige Strukturierung der Zelloberfläche, die bisher bei keinem anderen Bakterium (der Gattung) beobachtet werden konnte. Auch der Stamm Mtb. sp. F3.2, der 2002 von der Oberfläche eines Funaria hygrometrica Phylloids isoliert wurde (Hornschuh et al. 2002), zeigte in einigen Flüssig‐Nährmedien eine deutliche Aggregatbildung und besaß eine auffällig gestaltete Zelloberfläche. Die taxonomischen Studien wurden in Zusammenarbeit mit dem Institut für Angewandte Mikrobiologie der Justus‐Liebig‐Universität Giessen (Leitung: Prof. P Kämpfer) durchgeführt, wobei molekularphylogenetische und stoffwechsel‐ physiologische Methoden eingesetzt wurden (DNA‐Analysen; Bestimmung der Kohlenhydrat‐Verwertungsparameter unter spezifischen in vitro Kulturbedin‐ gungen). Ergänzend wurden Studien zur Bewegungsphysiologie der Mikroben durchgeführt, da die Motilität der Methylobakterien ein Taxon‐spezifisches Merkmal zu sein scheint.

20 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Verbrauchsmaterial Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit verwendeten Chemikalien und Geräte sind in den folgenden Kapiteln zusammengefasst.

2.1.1 Chemikalien Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, in analysenreiner Qualität (p. a.) von Merck (Darmstadt) bezogen.

Bezeichnung Hersteller / Bezugsquelle Agar, extra pure Merck, Darmstadt Agarose NEEO Ultra Quality Roth, Karlsruhe Ammoniumsulfat, f. d. Biochemie Merck, Darmstadt L‐Arabinose, f. d. Mikrobiologie Merck, Darmstadt Calcium‐D(+)‐Pantothenat, f. d. Biochemie Roth, Karlsruhe Caseinhydrolysat (säurehydrolysiert), f. d. Biochemie Roth, Karlsruhe Calcofluor White M2R Sigma, St. Louis, U.S.A. Dinatriumtartrat‐Dihydrat, p. a. Roth, Karlsruhe DNA‐Auftragspuffer Roth, Karlsruhe dNTPs (Desoxyribonucleosidtriphosphate), 100 mM Eppendorf, Hamburg EDTA (Titriplex III), p. a. Serva, Heidelberg Eisen(II)‐sulfat‐Heptahydrat, p. a. Serva, Heidelberg Ethidiumbromid‐Lsg., 1 % (w/v) Roth, Karlsruhe Fleischextrakt (Difco Beef Extract) Difco Laboratories, Detroit, U.S.A. L‐Glutamin, f. d. Biochemie Merck, Darmstadt L‐Glutaminsäure, f. d. Biochemie Merck, Darmstadt Glutardialdehyd (25%), f. d. Elektronenmikroskopie Merck, Darmstadt Guanidinthiocyanat, f. d. Biochemie Roth, Karlsruhe Hefeextrakt, f. d. Bakteriologie Roth, Karlsruhe Hepes (2‐(4‐(2‐Hydroxyethyl)‐1‐piperazinyl)‐ethansulfonsäure) Boehringer, Mannheim Kaliumnitrat, p. a. Fluka, Buchs, Schweiz Kristallviolett, f. d. Mikroskopie Merck, Darmstadt LiChrosolv® Wasser, f. d. Chromatographie Merck, Darmstadt Methanol (99%), p. a. Merck, Darmstadt Pepton aus Sojabohnenmehl, enzym. hydrolysiert, f. d. Mikrobiologie Fluka, Buchs, Schweiz Roti®‐Phenol, zur DNA‐Isolierung Roth, Karlsruhe Proteose‐Pepton Fluka, Buchs, Schweiz Sudan‐Schwarz B Sigma, St. Louis, U.S.A. Tannin, p. a. Fluka, Buchs, Schweiz Triton X‐100 Sigma, St. Louis, U.S.A. Triton X‐114 Sigma, St. Louis, U.S.A. Tris‐Base (Trizma® base), f. d. Biotechnologie Sigma‐Aldrich, Steinheim Trypton/Pepton aus Casein (pankreatisch) Roth, Karlsruhe D(+)‐Xylose, f. d. Biochemie Merck, Darmstadt

21 Material und Methoden

2.1.2 Enzyme Zur Isolation genomischer DNA und anderer molekularbiologischer Methoden wurden folgende Enzyme verwendet.

Bezeichnung Hersteller / Bezugsquelle Cellulase (pract.) aus Aspergillus niger Serva, Heidelberg Cellulase‚ Onozuka R10’ aus Trichoderma viride Serva, Heidelberg Lysozym (aus Hühnereiweiß), ~ 20 000 U/mg Roth, Karlsruhe Proteinase K (aus Pilzen), ≥30 mAnson U/mg Roth, Karlsruhe Ribonuklease A (aus Rinderpankreas), 90 U/mg Roth, Karlsruhe Taq‐Polymerase Qiagen, Hilden 10x PCR‐Puffer Qiagen, Hilden

2.1.3 Oligonucleotide Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Oligonucleotid‐Primer verwendet.

Bez. Ziel‐Gen (Pos.)a Sequenz (5’‐3’) Längeb Tm c Referenz 5’‐GGA GAG TTA GAT FGPS6 16S rDNA (6‐27) 22 60,3 Sy et al. 2001 CTT GGC TCA G‐3 5’‐AAG GAG GGG ATC FGPS1509 16S rDNA (1522‐1541) 20 63,5 Sy et al. 2001 CAG CCG CA‐3’ 5’‐GAT CGG CCC GCG 2F 16S rDNA (227‐247) 21 60,4 Nishio et al. 1997 TCT GAT TAG‐3’ 5’‐GGC TTA TCA CCG 3R 16S rDNA (1153‐1173) 21 57,3 Nishio et al. 1997 GCA GTC TCC‐3’ 5’‐GCG GCA CCA ACT moxF f1003 mxaF (2086‐2106) 21 66,7 McDonald et al. 1995 GGG GCT GGT‐3’ 5’‐GGG CAG CAT GAA moxF r1561 mxaF (2623‐2642) 20 62,4 McDonald et al. 1995 GGG CTC CC‐3’ a Die Positionsangaben beziehen sich bei der 16S rDNA auf die korrespondierenden Nucleotid‐ positionen bei E. coli, bei mxaF beziehen sich die Positionsangaben auf die Referenzsequenz von Mtb. extorquens AM1 (M31108.1). b Angabe in Nucleotidbasen. c Schmelzpunkt nach Breslauer et al. (1986) in °C; berechnet mit der Computer‐Software AnnHyb 4.913 (50 mM Salz; 250 pM DNA).

2.1.4 Größenmarker für DNA Als Größenstandard für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA wurden folgende DNA‐Leitern verwendet. Die fett gedruckten Fragmente wurden zur leichteren Orientierung vom Hersteller in doppelter Menge beigemischt.

Bezeichnung Größe der Fragmente in Basenpaaren (bp) Bezugsquelle 100 bp DNA‐Leiter, equalized 1000, 900, 800, 700, 600, 500 (2x), 400, 300, 200, 150, 100 Roth, Karlsruhe 100 bp DNA‐Leiter, extended 5000, 4000, 3000, 2500, 1500, 2000, 1000,900, 800, 700, Roth, Karlsruhe 600, 500 (2x), 400, 300, 200, 150, 100 λ HindIII Marker 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125 Roth, Karlsruhe

22 Material und Methoden

2.1.5 Fertigchemikalien (Kits) Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden folgende Fertigchemikaliensets (Kits) verwendet.

Bezeichnung Hersteller Accustain™ Gram‐Färbung Sigma Diagnostics, Deisenhofen API 20 NE mit API AUX Medium bioMérieux, Nürtingen API 50 CH mit API CHE/B‐Medium bioMérieux, Nürtingen DNeasy® Blood & Tissue Kit Qiagen, Hilden Fluorescein Lectin Kit I Vector Laboratories, Inc., Burlingame, U.S.A. Genomic‐tip 100/G Qiagen, Hilden QIAquick® PCR Purification Kit Qiagen, Hilden ABI PRISM BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.

2.1.6 Sonstige Verbrauchsmaterialien

Bezeichnung Hersteller / Bezugsquelle Einmalküvetten, Plastibrand® (PMMA) Roth, Karlsruhe Einwegspritzen (20 ml) B. Braun, Melsungen Objektträger Roth, Karlsruhe Parafilm™ National Can™, U.S.A. Petrischalen (PS, 92x16 mm) Sarstedt, Nürnbrecht Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg SEM‐Probenhalter (0,5’’ Aluminium Specismen Stubs) Agar Scientific Ltd., Cambridge, GB Ted Pella, Inc., Redding, CA, U.S.A. Reaktionsgefäße (1,5, 2,0, 15,0 und 50,0 ml) Sarstedt, Nürnbrecht Sterilfilter (Porengröße 0,20 μm) VWR, Darmstadt

2.2 Software Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zur Dokumentation und Auswertung der Ergebnisse folgende Software auf unterschiedlichen PC‐Systemen (Microsoft WindowsXP) verwendet:

Software Hersteller / Referenz Microsoft Office Microsoft Corporation, Redmond, U.S.A. Photoshop CS Adobe Systems Incorporated, San Jose, U.S.A. ProgRes® CapturePro 2.6 Jenoptik, Jena BioDocAnalyze Biometra, Göttingen AnnHyb 4.913 Olivier Friard BioEdit Version 7.0.9.0 Hall (1999) ClustalW Version 1.4 Thompson et al. (2004) MrMTgui 1.01 Paulo Nuin Modeltest Version 3.7 Posada und Crandall (1998) MrModeltest 2.3 Nylander (2004) MEGA Version 4.0.1 Tamura et al. (2007) MrBayes Version 3.1.2 Ronquist und Huelsenbeck (2003) PAUP* 4b10 Swofford (2003)

23 Material und Methoden

2.3 Geräte Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden folgende Geräte verwendet.

Bezeichnung Hersteller / Bezugsquelle ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A. Analysewaage Typ 2004 MP Sartorius, Göttingen Analysewaage Typ LC 621P Sartorius, Göttingen Brutschrank Typ B 5042E Heraeus, Hanau Digitalkamera Power‐Shot G2 Canon, Tokio, Japan + Conversion Lens Adapter LA‐DC58 Canon, Tokio, Japan + LM Digital‐Adapter DA37LT Micro Tech Lab, Graz, Österreich + Bandpassfilter BP595 Biometra, Göttingen Elektrophoreseapparatur Institutswerkstatt Heizplatte Ikamag REF‐GS Ika Labortechnik, Staufen Hitzesterilisator Heraeus, Hanau Kühlzentrifuge Typ ZK380 Hermle Labortechnik, Wehingen + Hochleistungs‐Winkelrotor (Nr. 220.78 V01) Hermle Labortechnik, Wehingen Kreisschüttler Typ KS501digital Ika Labortechnik, Staufen Kritischer‐Punkt‐Trockner Balzer Union, Lichtenstein Netzgerät für Gelelektrophorese, Modell 200/2.0 Bio‐Rad, Hercules, CA, U.S.A. pH‐Meter pH Level 1 WTW, Weilheim +pH Elektrode blue line pH 0‐14 Schott, Mainz Photomikroskop III Zeiss, Oberkochen + Fluoreszenz‐Auflichtkondensor / Schieber III RS Zeiss, Oberkochen + Digitalkamera DP10 (bis 2007) Olympus, Hannover + Digitalkamera ProgRes® C3 (ab 2007) Jenoptik, Jena Pipetten (2‐20 μl, 20‐200 μl, 200‐1000μl) Rainin, Oakland, CA, U.S.A. Quarzglasküvetten aus SUPRASIL® Hellma, Mühlheim Rasterelektronenmikroskop Hitachi S‐4000 Hitachi, Tokio, Japan Schüttler KS‐15 Control mit Inkubationshaube TH 15 Edmund Bühler, Hechingen Spektralphotometer Uvikon 931 Kontron Instruments, Mailand, Italien Sputter‐Coater Balzer Union, Lichtenstein Stereomikroskop Stemi DV4 Zeiss, Oberkochen Sterilbank Typ CF400B Ceag Schirp Reinraumtechnik, Selm‐Bork Sterilbank Typ C 1083220 Ceag Schirp Reinraumtechnik, Selm‐Bork Thermocycler T‐Gradient 96 Biometra, Göttingen Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg Tischzentrifuge, Typ 1000 Bachofer, Reutlingen Uvikon 931, UV‐VIS Zweistrahl‐Photometer Kontron Instruments, Mailand, Italien UV‐Transilluminator TI 2 Biometra, Göttingen Varioklav Dampfsterilisator H+P Labortechnik, Oberschleißheim Vortex‐Mischer Typ Reax 2000 Heidolph Instruments, Schwabach Wasserbad Typ 1002 Gesellschaft für Labortechnik (GFL), Burgwedel Weißlicht‐Illuminator Degasa, Heidelberg Zählkammer nach Thoma Hecht‐Assistent, Sondheim

24 Material und Methoden

2.4 Mikroorganismen Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienisolate wurden im Rahmen mehrerer, in der Abteilung Pflanzenphysiologie der Universität Kassel angefertigten, Diplomarbeiten isoliert (siehe Tabelle 2.1). Neben den Isolaten Mtb. sp. JT1 (Thomas 2003, Schauer 2004, Kutschera et al. 2007) und Mtb. sp. F3.2 (Hornschuh et al. 2002) wurden im Hinblick auf die Biofilmbildung vor allem das putative Mtb. mesophilicum‐Isolat 5a.1.13 sowie das putative Mtb. extorquens Isolat 1c.1 unter‐ sucht, da diese Isolat phylogenetisch relativ weit von den Moos‐Isolaten entfernt stehen und sich als starker Biofilmproduzenten herausstellten (Schauer 2004).

Der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T wurde von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) erstanden. Die Typstämme Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. radiotolerans DSM 1819T, Mtb. rhodinum DSM 2163T und Mtb. zatmanii DSM 5688T wurden freundlicherweise von der Abteilung Mikrobiologie (Universität Kassel) zur Verfügung gestellt, Mtb. goesingense iEII3 von Frau Dr. Angela Sessitsch (Austrian Research Center, Seibersdorf, Österreich) und Mtb. jeotgali S2R03‐9T von Herrn Zubair Aslam (Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Südkorea).

Zusätzlich wurde für einige Experimente der virulente Wildtyp‐Stamm Agrobacterium tumefaciens B6 verwendet, der von Dr. R. Beiderbeck (Botanisches Institut, Universität Heidelberg) zur Verfügung gestellt und von Kutschera et al. (2000) bereits charakterisiert wurde.

25 Material und Methoden

nur

(1997)

jedoch

al.

et

Referenzen. 2007

Nishio

al.

und

et

2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008 2008

nach

2006

Spezieszuordnung –ort

/

2001 Kutschera Kikutt

Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera Kutschera

bezeichnet. Methode

2006

sp. 2004, 2004, und und und und und und und und und und und und und

eindeutige

Kikutt Mtb. Hornschuh

eine 2002 2002 2002

basierten ‐ Isolationsquelle Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer

al. al. al.

als

Da

2001, et et et 2001,

PCR

2003, 2003, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, 2004, bp).

sowie

Arbeit der

800

der mit

Schönweiß Schauer Referenz Schauer Hornschuh Hornschuh Hornschuh Hornschuh Thomas Thomas Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer Schauer (ca.

Isolate

Verlauf

die

bestimmt

(Blüte) (Thallus) (Thallus) (Phylloid) (Phylloid) (Phylloid) (Phylloid) (Blüte) (Blüte) (Blüte) (Blüte) Spezieszuordnung

weiteren

rDNA

wurden

im

16S

putativer

Phyllosphäre Testa Rhizosphäre Isolationsort Phyllosphäre Phyllosphäre Phyllosphäre Phyllosphäre Phyllosphäre Phyllosphäre Phyllosphäre Rhizosphäre Rhizosphäre Phyllosphäre Rhizosphäre Phyllosphäre Rhizosphäre Rhizosphäre Phyllosphäre Rhizosphäre Rhizosphäre Arbeit der

mit Isolate

die

dieser

Isolate

‐ In Sequenz

werden polymorpha polymorpha

annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus annuus

(2004). hygrometrica hygrometrica hygrometrica hygrometrica

Freiland

partielle kann

die

Helianthus Isolationsquelle Funaria Funaria Funaria Funaria Marchantia Marchantia Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Helianthus Schauer

erfolgen

b

a wurde

b

nach

Hornschuh.

Methylobacterium M. Spezies

Isolate b b b

sp. mesophilicum mesophilicum mesophilicum sp. sp. sp. extorquens sp. sp. mesophilicum extorquens sp. sp. extorquens extorquens extorquens extorquens mesophilicum mesophilicum

Experimente

einige

putative Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mitteilung Für

verwendete

Spezieszuordnung

2.1:

Isolat JT1 JT2 1a.16 5b.1.1 5b.2.20 F3.1 F3.2 T1 F2.1 1c.14 Fu5 5b.1.5 1b.3 5a.1.5 5b.1.5 1c.1 5a.1.8 5b.2.1 5a.1.13 1c.5 aufwändige

persönliche putative Tabelle

identifiziert. a b durch

26 Material und Methoden

2.5 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem PC‐Programm Microsoft Excel.

2.5.1 Mittelwert Die Berechnung des arithmetischen Mittelwerts (xˉ ) einer Stichprobenzahl (n) erfolgte nach der Formel 1 n x = ∑ x n i=1

2.5.2 Standardabweichung Die Berechnung der Standardabweichung (s) einer Stichprobenmenge (n) mit dem Mittelwert (xˉ ) erfolgte nach der Formel n 2 ∑(xi − x) s = i=1 n −1

2.5.3 Standardfehler

Zur Abschätzung des Messfehlers wurde der Standardfehler des Mittelwerts (Sxˉ ) ermittelt. Dieser stellt den mittleren Fehler des Mittelwertes dar und berechnet sich als Quotient der Standardabweichung (s) und der Wurzel der Stichprobenzahl (n). s S = x n

2.6 Sterilisation von Lösungen und Materialien

2.6.1 Sterilfiltration Wässrige Lösungen mit hitzeempfindlichen Substanzen (wie Proteine, Vitamine, Aminosäuren, Zucker) sowie leichtflüchtige Flüssigkeiten (Ethanol, Methanol etc.) wurden durch Filtration mit Sterilfiltern (Porenweite 0,20 μm, VWR, Darmstadt) entkeimt.

2.6.2 Dampfsterilisation Wässrige Lösungen mit nicht hitzeempfindlichen Substanzen und Geräte (wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße etc.) wurden mit einem Varioklav Dampf‐ sterilisator der Firma H+P Labortechnik (Oberschleißheim) in feuchter Hitze bei 121 °C und 2 bar für 20 min sterilisiert.

2.6.3 Heißluftsterilisation Glaswaren sowie Geräte aus Metall wurden bei trockener Hitze von 180 °C für mindestens sechs Stunden in einem Hitzesterilisator der Firma Heraeus (Hanau) sterilisiert.

27 Material und Methoden

2.7 Nährmedien Zur Kultivierung und Charakterisierung der Methylobacterium‐Stämme wurden im Laufe der Arbeit verschiedene Nährmedien verwendet. Dabei wurden sowohl Minimalmedien, mit Methanol und/oder anderen Substraten, als auch Komplexmedien verwendet. Bei Bedarf wurde den Medien vor dem Auto‐ klavieren 1,5 % (w/v) Agar zugesetzt um feste Nährböden zu erhalten.

2.7.1 Minimalmedien Um zu verhindern, dass sich während des Autoklavierens der Minimalmedien schwerlösliche Salze bilden, wurden die Magnesiumsulfat‐, Calciumchlorid‐ und Eisensulfat‐Stammlösungen getrennt autoklaviert und den Medium erst nach abkühlen auf etwa 50 °C steril zugegeben. Zur Herstellung der Medien wurden etwa ¾ des Endvolumens mit doppelt destilliertem Wasser vorgelegt. Die restlichen Lösungen wurden nacheinander zugegeben und anschließend autoklaviert. Bei Bedarf wurde den Medien vor dem Autoklavieren 1,5 % Agar (w/v) zugesetzt. Als Kohlenstoffquelle diente meist Methanol, jedoch wurden auch alternative Kohlenstoffquellen verwendet. Methanol und andere hitzelabile Substanzen wurden sterilfiltriert (siehe Kapitel 2.6.1) und erst zugegeben nachdem das Medium auf etwa 50 °C abgekühlt war.

MgSO4‐Lsg. (1,0M) CaCl2‐Lsg. ( 200 mM) FeSO4‐Lsg (10 g/L = 36 mM) MgSO4 ∙ 7 H2O 24,65 g CaCl2 2,22 g FeSO4 ∙ 7 H2O 1,00 g ddH2O ad 100 ml ddH2O ad 100 ml ddH2O ad 100 ml

2.7.1.1 ATCC Kulturmedium 784 (AMS-Medium) Dieses selektive Minimalmedium eignet sich zur Anreicherung und Kultivierung methylotropher Bakterien. Das Kaliumphosphat‐gepufferte Medium enthält Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle, sowie alle notwendigen Spurenelemente (AMS = Ammonium‐Mineralsalz).

Lösung Volumen Salzlösung (10x) pH 6,8 100 ml Spurenelemente‐Lsg. (1000x) 1,00 ml MgSO4‐Lsg. (1,0 M)* 4,06 ml CaCl2‐Lsg. (200 mM)* 6,8 ml FeSO4‐Lsg. (10 g/L)* 400 μl Methanol (p. a.)* 5,0 ml ddH2O ad 1000 ml * erst nach dem Autoklavieren steril zugegeben

(Zusammensetzung der Salz‐ und Spurenelemente‐Lösung: siehe nächste Seite.)

28 Material und Methoden

Spurenelemente‐Lsg. (1000x) Salzlösung (10x) pH 6,8 Komponente Masse/Volumen Komponente Masse/Volumen MnCl2 ∙ 4 H2O 30 mg ZnSO4 ∙ 7 H2O 100 mg K2HPO4 7,0 g CuCl2 ∙ 2 H2O 10 mg KH2PO4 5,4 g NiCl2 ∙ 6 H2O 20 mg NH4Cl 5,0 g Na2MoO4 H2O 60 mg ddH2O ad 1000 ml CoCl2 ∙ 6 H2O 200 mg H3BO3 300 mg ddH2O ad 1000 ml

2.7.1.2 Methylobacterium Medium (DSMZ Medium 125) Dieses Natriumphosphat‐gepufferte Minimalmedium mit Kaliumnitrat als Stickstoffquelle wird von der DSMZ zur Kultivierung von Mtb. organophilum und Mtb. radiotolerans empfohlen. Da in diesem Medium die Salze deutlich geringer als beim AMS‐Medium konzentriert sind, traten bei diesem Medium keine Probleme mit schwerlöslichen Salzen auf. Das Medium wurde sowohl als Flüssig‐ als auch als Festmedium zur Kultivierung der Methylobacterium‐Stämme verwendet.

Lösung Volumen Medium 125‐Salzlösung (10x) pH 6,8 100 ml Medium 125‐Spurenelemente (10000x) 100 μl MgSO4‐Lsg. (1,0 M)* 810 μl CaCl2‐Lsg. (200 mM)* 680 μl FeSO4‐Lsg. (10 g/L)* 100 μl Methanol (p. a.)* 5,0 ml ddH2O ad 1000 ml * erst nach dem Autoklavieren steril zugeben

Medium 125‐Spurenelemente (10000x) Medium 125‐Salzlösung (10x) pH 6,8 Komponente Masse/Volumen Komponente Masse/Volumen CuSO4 ∙ 5 H2O 5 mg H3BO3 10 mg KNO3 10,0 g MnSO4 ∙ H2O 7 mg Na2HPO4 ∙ 2 H2O 2,9 g ZnSO4 ∙ 7 H2O 70 mg NaH2PO4 ∙ 1 H2O 0,8 g Na2MoO4 ∙ 2 H2O 17 mg ddH2O ad 1000 ml ddH2O ad 100 ml

2.7.1.3 Medium nach Choi et al. (1989) Das von Choi und Kollegen (1989) entwickelte Medium wurde im Hinblick auf das Wachstum und Poly‐β‐Hydroxybutyrat‐Produktion von Mtb. organophilum mit Methanol als Kohlenstoffquelle optimiert. Als Stickstoffquelle dient bei diesem Medium Ammoniumsulfat.

(Zusammensetzung siehe folgende Seite.)

29 Material und Methoden

Lösung Volumen Choi‐Salzlösung (10x) pH 6,8 100 ml Choi‐Spurenelemente (1000x) 1,0 ml MgSO4‐Lsg. (1,0 M)* 1,83 ml CaCl2‐Lsg. (200 mM)* 112 μl FeSO4‐Lsg. (10 g/L)* 130 μl Methanol (p. a.)* 10,0 ml ddH2O ad 1000 ml * erst nach dem Autoklavieren steril zugeben

Choi‐Spurenelemente (1000x) Choi‐Salzlösung (10x) pH 6,8 Komponente Masse/Volumen Komponente Masse/Volumen CuSO4 ∙ 5 H2O 4 mg H3BO3 3 mg (NH4)SO4 10,0 g MnSO4 ∙ H2O 10 mg Na2HPO4 ∙ 2 H2O 26,7 g ZnSO4 ∙ 7 H2O 13 mg KH2PO4 13,1 g Na2MoO4 ∙ 2 H2O 4 mg ddH2O ad 1000 ml CoCl2 ∙ 6 H2O 4 mg ddH2O ad 100 ml

2.7.1.4 Medium 3 / Medium 4 (Bourque et al. 1995) Bourque und Kollegen (1995) entwickelten auf Grundlage des Mediums von Choi et al. (1989) die Medien 3 und 4 um die Biomasse‐ und PHB‐Produktion von Mtb. extorquens zu maximieren. Gegenüber dem Medium von Choi et al. (1989) enthalten Medium 3 und Medium 4 etwas mehr Ammoniumsulfat und deutlich höhere Konzentrationen an Calciumchlorid, Eisensulfat sowie der restlichen Spurenelemente.

Volumen für Lösung Medium 3 Medium 4 M3‐Salzlösung (10x) pH 6,8 100 ml 100 ml M3‐Spurenelemente (1000x) 1,0 ml 3,0 ml MgSO4‐Lsg. (1,0 M)* 1,83 ml 5,4 ml CaCl2‐Lsg. (200 mM)* 680 μl 2,0 ml FeSO4‐Lsg. (10 g/L)* 2,0 ml 6,0 ml Methanol (p. a.)* 10,0 ml 10,0 ml ddH2O ad 1000 ml ad 1000 ml * erst nach dem Autoklavieren steril zugeben

M3‐Spurenelemente (1000x) M3‐Salzlösung (10x) pH 6,8 Komponente Masse/Volumen Komponente Masse/Volumen CuSO4 ∙ 5 H2O 80 mg H3BO3 60 mg (NH4)SO4 10,0 g MnSO4 ∙ H2O 490 mg Na2HPO4 ∙ 2 H2O 26,7 g ZnSO4 ∙ 7 H2O 260 mg KH2PO4 13,1 g Na2MoO4 ∙ 2 H2O 80 mg ddH2O ad 1000 ml CoCl2 ∙ 6 H2O 80 mg ddH2O ad 100 ml

30 Material und Methoden

2.7.2 Komplexmedien Komplexmedien enthalten Extrakte oder verdautes Protein aus biologischem Material, z. B. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Milchpulver, tryptisch oder peptisch verdautes Fleischprotein (Trypton bzw. Pepton), Malzextrakt oder peptisch verdautes Sojabohnenprotein. Die Zusammensetzung dieser Extrakte ist nie genau definiert. Als zusätzliche C‐Quelle werden häufig noch Zucker zugesetzt.

2.7.2.1 Glycerol-Pepton-Medium (GP-Medium) Dieses Pepton‐reiche Komplexmedium nach Green und Bousfield (1982) wurde zur Kultivierung sowie zur Kryokonservierung (siehe Kapitel 2.9.3) der Isolate verwendet. Zur Herstellung des Mediums wurden die benötigten Inhaltsstoffe zusammen in einem entsprechenden Volumen gelöst. Vor dem Autoklavieren des Mediums wurde der pH‐Wert auf 7,0 eingestellt.

Komponente Masse/Volumen Pepton (aus Sojabohnenmehl) 10,0 g Glycerol 10,0 ml ddH2O ad 1000 ml

2.7.2.2 R2A-Medium (DSMZ Medium 830) Dieses Vollmedium wurde zur Bestimmung der Zellzahl heterotropher Mikroorganismen in Trinkwasserproben entwickelt (Reasoner und Geldreich 1985) und im Rahmen der vorliegenden Arbeit zur Kultivierung und Charakterisierung der Methylobacterium‐Stämme verwendet. Zusätzlich wurde das Medium zur Sterilitätskontrolle eingesetzt, da aufgrund der Zusammensetzung des Mediums eine Vielzahl von Mikroorganismen gute Wachstumsbedingungen vorfinden. Das Medium enthält neben Pepton, Caseinhydrolysat und Hefeextrakt, Glukose, lösliche Stärke sowie Brenztraubensäure, die als potentielle Kohlenstoffquellen für Mikroorganismen dienen können. Zur Herstellung des Mediums wurden die benötigten Inhaltsstoffe zusammen in einem entsprechenden Volumen gelöst. Vor dem Autoklavieren wurde der pH‐ Wert mit kristallinem K2HPO4 bzw. KH2PO4 auf 7,2 eingestellt.

Komponente Masse/Volumen Hefeextrakt 0,5 g Proteose‐Pepton 0,5 g Caseinhydrolysat (säurehydrolysiert) 0,5 g Glukose 0,5 g Lösliche Stärke 0,5 g Natrium‐Pyruvat 0,3 g K2HPO4 0,3 g MgSO4 ∙ 7 H2O 0,05 g ddH2O ad 1000 ml

31 Material und Methoden

2.7.2.3 Nutrient-Agar (DSMZ Medium 1) Dieses Pepton‐reiche Vollmedium wurde als Festmedium mit 1,5 % Agar (w/v) zur Charakterisierung der Methylobacterium‐Stämme verwendet. Da alle Isolate auf Nutrient‐Agar (NA) gutes Wachstum zeigten, wurden die Stämme in flüssigem NA kultiviert, wenn große Zellzahlen erforderlich waren.

Komponente Masse/Volumen Pepton (aus Sojabohnenmehl) 5,0 g Fleischextrakt (Beef‐Extract) 3,0 g ddH2O ad 1000 ml

2.8 Mikroskopische Methoden Zur Analyse der Biofilmbildung bei Bakterien der Gattung Methylobacterium kamen im Rahmen der vorliegenden Arbeit verschiedene mikroskopische Techniken zum Einsatz.

2.8.1 Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie Alle Untersuchungen wurden an einem Photomikroskop III (Carl Zeiss, Oberkochen) durchgeführt. Zur besseren Darstellung der Bakterien wurde mit Phasenkontrast gearbeitet. Die Phasenkontrastmikroskopie ist eine Standard‐ technik und soll daher nicht weiter vorgestellt werden. Bei der Fluoreszenzmikroskopie werden fluoreszierende Moleküle (Fluoro‐ chrome) verwendet, die Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und daraufhin längerwelliges Licht emittieren. Intensität und Farbe des Lichts sind dabei charakteristische Eigenschaften des verwendeten Fluorochroms. Die gefärbten Präparate wurden mit Hilfe eines Auflicht‐Fluoreszenzmikroskops (Photomikroskop III mit Fluoreszenz‐Auflichtkondensor (Typ: III RS), Carl Zeiss Oberkochen) ausgewertet. Die zur Anregung und Detektion verwendeten Filterkombinationen wurden in folgender Tabelle dargestellt. Als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung diente ein 100 W Quecksilber‐Kurzbogenlampe (HBO® 100 W/2, Osram, München).

Position Pos. I Pos. III Erregerfilter BP 360/15 BP 475/20 Strahlenteiler FT 430 FT 500 Sperrfilter LP 420 LP 520 Fluorochrom CFW FITC

2.8.1.1 Lektinfärbung Lektine sind Proteine oder Glykoproteine, die spezifische Kohlenhydratstrukturen binden und dadurch in der Lage sind, spezifisch mit Zellen und Zellmembranen zu interagieren und biochemische Reaktionen auszulösen. Sie zeigen selbst jedoch keine enzymatische Aktivität. Lektine besitzen mindestens zwei Zuckerbindungs‐ domänen und können dadurch tierische und pflanzliche Zellen agglutinieren. Der

32 Material und Methoden

Name Lektin leitet sich vom lateinischen Ausdruck legere (für wählen) ab, und beruht auf der Blutgruppenspezifität einzelner Lektine. Lektine sind ubiquitär und wurden sowohl aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen isoliert. Isolierte und gereinigte Lektine stellen äußerst nützliche biochemische Werkzeuge dar, da sie sich aufgrund ihrer Spezifität für ausgewählte Kohlenhydrate u. a. zur affinitätschromatographischen Reinigung von Glykokonjugaten sowie zur Analyse ihres Glykosylierungsmusters, der Identifizierung und Isolierung von Zellen und der immuncyto‐ und histochemischen Analyse eignen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der ‚Fluorescein Lectin Kit I’ (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, U.S.A.) verwendet, der sieben Fluorescein‐ konjugierte Lektine enthält (siehe Tabelle 5.2, Anhang), um die Exopolysaccharid‐ strukturen der Biofilme zu färben. Die Lektinkonjugate wurden in einer Konzentration von 2 mg/ml geliefert und mit dem vom Hersteller empfohlenen Puffer (siehe folgende Tabelle) auf eine 10x konzentrierte Arbeitslösung (100 μg/ml) verdünnt.

Konz. Komponente 0,15 M NaCl 10 mM HEPES, pH 7,5 0,1 mM Ca2+ (0,01 mM) (Mn2+, nur im Puffer für Con A)

Zur Durchführung der Färbung wurden 2‐10 ml Flüssigkultur für 5 min bei 7000 rpm in einer Tischzentrifuge (Bachofer, Reutlingen) abzentrifugiert und das Pellet in Puffer gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Bakterienpellet in Puffer suspendiert und so weit verdünnt, dass noch eine schwache Trübung der Suspension zu erkennen war. Jeweils 180 μl der Zell‐ suspension wurden anschließend mit 20 μl Lektin‐Arbeitslösung (c = 100 μg/ml) zusammenpipettiert und für 20 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 2‐3 μl der Probe auf einen sauberen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt und direkt im Fluoreszenzmikroskop (Filterstellung III) ausgewertet. Auf einen Waschschritt nach der Inkubation mit den Lektinen konnte verzichtet werden, da die Hintergrundstrahlung der ungebundenen Lektine in der Lösung zu vernachlässigen war und die Ergebnisse dadurch nicht negativ beeinflusst wurden.

2.8.1.2 Calcofluor White-Färbung Calcofluor White M2R (CFW) ist ein optischer Aufheller, der spezifisch an β‐(1,4) und β‐(1,3) verknüpfte Polysaccharide (Hexopyranosen) bindet und bei Anregung mit UV‐Licht stark fluoresziert (Darken 1961). Der Fluorophor zeigt u. a. eine hohe Affinität zu Chitin, Cellulose, Succinoglycan und anderen Polysacchariden, wobei Wasserstoffbrücken zwischen Hydroxylgruppen und/oder Stickstofffunktionen von CFW‐Molekülen und freien Hydroxylgruppen von Polysacchariden gebildet werden (Maeda und Ishida 1967, Rattee und Breuer 1974).

33 Material und Methoden

Zur Färbung lebender Biofilme mit CFW wurden 2‐10 ml Flüssigkultur für 5 min bei 7000 rpm abzentrifugiert und das Pellet in sterilem ddH2O gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Bakterienpellet in ddH2O suspendiert und so weit verdünnt, dass noch eine schwache Trübung der Suspension zu erkennen war. Jeweils 180 μl der Zellsuspension wurden anschließend mit 20 μl CFW‐ Stammlösung (0,1 % CFW in ddH2O) zusammenpipettiert und für 20 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 2‐3 μl der Probe auf einen sauberen Objektträger gegeben, mit einem Deckglas abgedeckt und direkt im Fluoreszenz‐ mikroskop (Filterstellung I) ausgewertet. Auf einen Waschschritt nach der Inkubation konnte verzichtet werden, da die Hintergrundstrahlung des ungebundenen CFW in der Lösung zu vernachlässigen war und die Ergebnisse dadurch nicht negativ beeinflusst wurden.

2.8.2 Rasterelektronenmikroskopie Bei der Rasterelektronenmikroskopie (REM, engl. scanning electron microscopy, SEM) werden die Oberflächen der Proben mit einem Elektronenstrahl zeilenweise abgetastet/abgerastert. Biologische Proben bestehen jedoch aus beweglichen Molekülen (v. a. Wasser, Proteine und Lipide) und müssen daher zuvor fixiert, getrocknet und mit einer Elektronen‐reflektierenden Schicht bedampft werden. Bei der Fixierung werden die Proteine der Probe durch das bivalente Glutar‐ dialdehyd zuerst kovalent quervernetzt, indem die beiden reaktiven Aldehyd‐ gruppen mit je einer terminalen Aminogruppe verknüpft werden. Dadurch können postmortale Strukturveränderungen der Probe möglichst gering gehalten werden. Nach der Fixierung folgt die Trocknung der Probe, die wiederum in mehreren Teilschritten abläuft. Dabei muss das Wasser der Probe zuerst stufenweise durch Alkohol substituiert werden, da dieser bei der Kritischen Punkt‐Trocknung in flüssigem CO2 nicht gefriert. Bei der anschließenden Kritischen‐Punkt‐Trocknung wird zuerst der Alkohol schrittweise vollständig durch flüssiges CO2 ersetzt. Das flüssige CO2 wird anschließend unter kontrollierten Druck‐ und Temperatur‐ bedingungen oberhalb des kritischen Punkts verdampft, so dass die Bildung von Gasbläschen ausbleibt und die Zellform erhalten wird. Im Rahmen der Arbeit wurden auf Agarmedien gewachsene Kolonien oder Zellen aus Flüssigkulturen verwendet, um die Zelloberflächen und die an der Biofilm‐ bildung beteiligten Strukturen zu untersuchen. Dazu wurden Aliquots von Flüssigkulturen auf runde Deckgläser (9 mm) pipettiert und für mind. 1 h (oder ÜN) in einer feuchten Kammer inkubiert, um die Zellen zu sedimentieren und an die Glasoberfläche binden zu lassen. Auf festem Nähragar gewachsene Kolonien wurden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten, so dass die Kolonie möglichst unbeschädigt auf einem Reststück Agarmedium verblieb. Die Proben wurden dann in Petrischalen überführt und für mindestens zwei Stunden bei RT in sterilfiltriertem 15 mM Phosphatpuffer pH 7 mit 2 % Glutar‐ dialdehyd fixiert. Anschließend wurden die Präparate mindestens zweimal mit

34 Material und Methoden frischem Puffer gewaschen, um überschüssiges Glutardialdehyd vollständig zu entfernen. Danach wurden die Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe (30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, abs. für jeweils 10 min) entwässert und bis zur Kritischen‐Punkt‐Trocknung bei 4 °C in absolutem Ethanol (p. a.) gelagert. Das Ethanol wurde in einer Kritischen‐Punkt‐Trocknungsmaschine (Balzer Union, Lichtenstein) durch flüssiges CO2 substituiert, und das CO2 anschließend unter kontrollierten Temperatur‐ und Druckbedingungen oberhalb des kritischen Punktes verdampft. Die getrockneten Proben wurden mit Hilfe eines elektrisch leitfähigem, doppel‐ seitigem Klebepunkts auf SEM‐Probenhaltern (Agar Scientific, Cambridge, U.S.A.) befestigt. Anschließend wurden die Proben in einem Beschichtungsgerät (Balzers Union, Lichtenstein) mit einer dünnen Platinschicht bedampft und konnten dann im Rasterelektronenmikroskop (Hitachi S‐4000, Japan) untersucht und doku‐ mentiert werden.

2.9 Mikrobiologische Methoden

2.9.1 Photometrische Bestimmung der Trübung Zur Abschätzung der Zellzahl sowie zur Kontrolle des Wachstums der Bakterien in Flüssigkulturen wurde die Trübung der Suspensionen photometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) in einem Zweistrahl‐Photometer (Uvikon 931, Kontron Instruments, Italien) vermessen. Dazu wurden die Proben in Einmal‐ küvetten mit sterilem Wasser so weit verdünnt, dass die Absorption Werte von unter 1,0 aufwies. Als Referenzprobe diente steriles Nährmedium, welches entsprechend zu den Proben mit Wasser verdünnt wurde. Vor jedem Mess‐ vorgang wurden die Bakteriensuspensionen in den Küvetten gut durchmischt. Jede Probe wurde dreimal vermessen und daraus der Mittelwert gebildet, der anschließend noch mit dem Verdünnungsfaktor der jeweiligen Proben multipliziert wurde, um den Trübungswert der Kulturen zu berechnen.

2.9.2 Herstellung einer Zellsuspension Zur Herstellung einer Zellsuspension wurden etwa 2‐3 gut gewachsene Einzelkolonien von frisch bebrüteten Agarplatten (6‐7 d Inkubation bei 28 °C) mittels einer sterilen Impföse in einem 2,0 ml Reaktionsgefäß mit 300 μl ddH2O gut suspendiert, indem das Zellmaterial zuerst an der trockenen Gefäßwand verteilt und anschließend mit etwas Flüssigkeit suspendiert wurde. Durch 10‐15 sekündiges vortexen sollte sichergestellt werden, dass die Zellen zum größten Teil einzeln vorlagen. Konnten die Kolonien nicht vollständig homo‐ genisiert werden, wurde die Suspension nach dem vortexen für etwa 1 min ruhig stehen gelassen, um die größten Bakterienaggregate zu sedimentieren und nur mit dem Überstand weiterzuarbeiten. Zur Abschätzung der Zellzahl wurden 100 μl der Suspension mit 900 μl ddH2O vermischt und bei einer Wellenlänge von 600 nm photometrisch vermessen (siehe

35 Material und Methoden

Kapitel 2.9.1). Nach der Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor erhält, man so die optische Dichte (OD) der Suspension. Eine Absorption von 0,1 entspricht dabei etwa 1x108 Zellen pro ml. Für einige Versuche wurde anschließend die Zellzahl der Suspensionen mit Hilfe einer Zählkammer nach Thoma ausgezählt (siehe Kapitel 2.9.4). Für die Zählung wurden die Proben mit sterilem ddH2O auf eine OD600 von 0,01 eingestellt (entspricht etwa 1x107 Zellen pro ml).

2.9.3 Herstellung von Dauerkulturen (Kryokonservierung) Zur dauerhaften Lagerung wurden frische Agarkolonien mit einer sterilen Impföse in einem 2,0 ml Reaktionsgefäßen mit Schraubdeckel (Sarstedt, Nürnbrecht) gut verteilt und in 1,5 ml flüssigem GP‐Medium (siehe Kapitel 2.7.2.1) mit 20 % Glycerol (v/v) gut suspendiert und sofort auf Eis gekühlt. Die Dauerlagerung erfolgte bei ‐20 °C im Gefrierschrank. In regelmäßigen Abständen wurden Aliquots der Dauerkulturen entnommen und auf ihre Keimfähigkeit überprüft.

2.9.4 Zellzahlbestimmung mit einer Zählkammer nach Thoma Für einige Experimente wurde die Bakterienkonzentration durch direktes auszählen der Partikel mit einer Zählkammer nach Thoma (0,1 mm Tiefe, 0,0025 mm2, Hecht‐Assistent, Sondheim) bestimmt. Die Proben wurden unmittelbar vor der Auszählung für 30‐60 Sekunden auf einem Vortex‐Mischer bei maximaler Leistung gemischt, um eine gleichmäßige Verteilung der Bakterien in der Suspension zu gewährleisten. Mit einer Pipette wurden 10 μl der Proben zwischen das Deckglas und den Mittelsteg pipettiert, wobei sich die Bakteriensuspension aufgrund von Kapillarkräften gleichmäßig unter dem Deckglas verteilte. Nachdem die Zellen sich etwas abgesetzt hatten, konnte mit der Zählung begonnen werden. Es wurden jeweils zehn B‐Quadrate (untere und obere Reihe sowie Diagonale von links oben nach rechts unten) ausgezählt, um den Mittelwert für ein C‐Feld zu bestimmen. Um die statistische Aussage nicht zu verfälschen, wurden bei der Zählung Zellen, die auf den oberen und linken Begrenzungsstrichen der B‐Felder lagen nicht berücksichtigt, dafür jedoch jene die auf den unteren und rechten Begrenzungslinien lagen. Bei Bakterienaggregaten aus bis zu 50 Zellen wurde die Zahl der Bakterien in den Clustern geschätzt, falls ein direktes Auszählen nicht möglich war. Proben, die größere Aggregate aufwiesen, konnten mit dieser Methode nicht mehr gezählt werden. Die Zelldichte der Proben wurde jeweils in zwei unabhängigen Messungen bestimmt, wobei für die Berechnung der Zellzahl pro Milliliter der Mittelwert aller ausgezählten C‐Felder mit dem Kammerfaktor multipliziert wurde.

2.9.5 Kultivierung der Bakterien in Flüssigkultur Standardmäßig wurden die Bakterienzellen in 100 ml Erlenmeyer‐Glaskolben, die in der Institutswerkstatt mit drei Seitenschikanen ausgestattet wurden, kultiviert. Die Kulturkolben wurden mit maximal 20 ml Medium befüllt und mit ~1x106

36 Material und Methoden

Bakterien/ml (bzw. 1/100 Vol. Bakteriensuspension mit einer OD600 von 0,1) beimpft. Die Kolben wurden mit Alukappen steril verschlossen und bei Raum‐ temperatur (25 ± 2 °C) auf einem Kreisschüttler (IKA‐Labortechnik, Staufen) bei 150 rpm inkubiert.

2.9.6 Kultivierung der Bakterien auf Festmedium Die Kultivierung der Mikroorganismen auf Festmedium erfolgte in Petrischalen (90 mm Durchmesser, 14 mm Höhe, Sarstedt, Nürnbrecht) mit etwa 25 ml Medium pro Schale. Zur Verfestigung der Medien wurde vor dem Autoklavieren 1,5 % (w/v) Agar zugegeben. Zur Bestimmung der Motilität auf halbfestem Nähragar (siehe Kapitel 2.9.21) wurden nur 0,2 % (w/v) Agar zugesetzt.

2.9.7 Bestimmung der Koloniemorphologie auf Festmedium Zur Bestimmung der Koloniemorphologie (Biofilmbildung an der Grenzfläche fest/gasförmig) wurden Aliquots definierter Zellsuspensionen auf verschiedenen Agar‐Nährböden ausplattiert. Die Zelldichte der Impflösung wurde dabei entweder über eine Messung der OD600 oder eine Zellzahlbestimmung mittels Thoma‐Zählkammer bestimmt. Da der Durchmesser und die Morphologie der Kolonie stark von der Kolonie‐ dichte in ihrer Umgebung abhängig sind, wurde die Zahl der Bakterien so gewählt, dass 20‐100 Kolonien auf den Agarplatten wuchsen. Typischerweise wurden hierfür 50 μl einer Bakteriensuspension mit 1x103 Bakterien pro ml (erwartete CFU pro Platte: 50), bzw. 10‐50 μl (je nach Stamm/Isolat) einer 10‐4 verdünnten Suspension mit einer OD600 von 0,1, ausplattiert. Die Agarplatten wurden nach der Inokulation mit der Agaroberfläche nach unten in einem Brut‐ schrank bei 28 °C und Dunkelheit bebrütet. Die Morphologie der Kolonien wurde mit einem Stereomikroskop (Typ Stemi DV 4, Zeiss, Oberkochen) über einen Zeitraum von bis zu 21 Tagen analysiert und mit Hilfe einer adaptierten Kamera (Power Shot G2, Canon) dokumentiert. Dabei wurde darauf geachtet möglichst repräsentative Kolonien auszuwählen, die mindestens zwei Zentimeter Abstand zu benachbarten Kolonien besaßen.

2.9.8 Bestimmung der Zelldimensionen Zur Bestimmung der Zellgrößen wurden die Bakterienstämme für 48 h bei RT und 150 rpm in 10 ml R2A‐Flüssigmedium angezogen. Dadurch sollte gewährleistet werden, dass sich die Mehrzahl der Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden, da Methylobacterium‐Stämme in stationären Kulturen oft zur Ausbildung pleomorpher oder sehr großer Zellen neigen. Aliquots der Kultursuspensionen wurden mit einer 40x Objektivvergrößerung im Phasenkontrast mikroskopiert (Photomikroskop III, Carl Zeiss, Oberkochen) und fotografisch dokumentiert (ProgRes® C3, Jenoptik, Jena). Die Vermessung der Zellen erfolgte mit der Software ProgRes® CapturePro 2.6 (Jenoptik, Jena). Für jeden Stamm wurden dabei mindestens 150 zufällig ausgewählte Zellen in zwei unabhängigen Ansätzen vermessen.

37 Material und Methoden

Aus den gewonnen Daten wurde der Mittelwert (MW) sowie der Standardfehler vom Mittelwert bestimmt, wobei vor der Berechnung die Extremwerte jeder Messreihe (Maximalwert und Minimalwert) aus der Analyse ausgeschlossen wurden. Da die Zellen einer gewissen biologischen Variabilität unterliegen, wurden die Messwerte in 10 Klassen eingeteilt. Um die Variabilität der Zellgrößen darzu‐ stellen, wurde anschließend das Intervall bestimmt, in dem sich mindestens 85 % der Zellen aufhielten.

2.9.9 Gram-Färbung Die histologische Färbung nach Gram (1884) wurde mit der ACCUSTAIN™ Gram Färbung (Sigma Diagnostics, Deisenhofen) durchgeführt. Das Prinzip der Färbung besteht aus drei Stufen (färben‐entfärben‐gegenfärben) und beruht auf den Unterschieden im Aufbau der Zellwand Gram‐positiver und Gram‐negativer Bakterien. Im ersten Schritt werden die Mikroorganismen mit Kristallviolett gefärbt und mit Jodlösung behandelt, wodurch größere Farbstoffkomplexe gebildet werden. Im zweiten Schritt werden die Mikroorganismen durch Entfärben mit Alkohol differenziert. Grampositive Zellen halten den Farbstoff/Iod‐ Komplex in den Zwischenräumen ihrer mehrschichtigen Mureinhülle zurück und bleiben blau. Gram‐negative Zellen, die nur eine dünne Mureinhülle besitzen, der zusätzlich eine zweite Lipid‐Membran aufgelagert ist, werden durch den Alkohol entfärbt. Im dritten Schritt werden die Gram‐negativen Zellen mit Safranin O‐ Lösung gegengefärbt. Gram‐positive Bakterien stellen sich so gefärbt blau/lila dar; Gram‐negative Zellen erscheinen rot. Im Rahmen der Arbeit wurden für die Gram‐Färbung Zellen aus exponentiell wachsenden Minimalmedium‐Flüssigkulturen mit 5 mM Succinat als Kohlen‐ stoffquelle verwendet. 2 ml der Kultur wurden abzentrifugiert und einmal mit ddH2O gewaschen. Eine volle Impföse des Bakterienpellets wurde anschließend auf einem sauberen Objektträger ausgestrichen und hitzefixiert. Die Ausstriche wurden für 1 min mit Kristallviolett‐Lösung (2,3 % Kristallviolett, 0,1 % Ammoniumoxalat, 20 % Ethylalkohol) überschichtet. Nach dem Spülen der Objektträger mit ddH2O wurde das Zellmaterial für 1 min mit Jodlösung nach Gram (0,33 % Jod, 0,66 % Kaliumjodid) überschichtet und wieder gut mit ddH2O gespült. Anschließend wurde für etwa 10 s mit Entfärbelösung (75 % Isopropyl‐ alkohol, 25 % Aceton) gespült (bis sich keine Farbwolken mehr ablösten). Nach Spülen der Objektträger mit ddH2O wurde das Zellmaterial für 1 min mit Safranin O‐Lösung (0,6 % Safranin, 20 % Ethylalkohol) überschichtet. Nach gründlichem Spülen mit ddH2O wurden die Objektträger luftgetrocknet und im Licht‐ mikroskop untersucht.

2.9.10 Sudan-Schwarz Färbung (PHB-Nachweis) Der Nachweis intrazellulärer Lipide erfolgte durch die Färbung hitzefixierter Zellen mit Sudan‐Schwarz B nach Burdon (1946). Für die Färbelösung wurden

38 Material und Methoden

0,03 g Sudan‐Schwarz B in 7,5 ml 95 % Ethanol gelöst und mit ddH2O auf 10 ml aufgefüllt. Im Rahmen der Arbeit wurden Zellen aus stationären Minimalmedium‐ Flüssigkulturen mit 5 mM Succinat als Kohlenstoffquelle auf PHB‐Einlagerungen untersucht. 2 ml stationäre Kultur wurden abzentrifugiert und einmal mit ddH2O gewaschen. Eine volle Impföse des Bakterienpellet wurde anschließend auf einem sauberen Objektträger ausgestrichen und hitzefixiert. Die Ausstriche wurden für 10 min mit Färbelösung überschichtet, mit Filterpapier getrocknet und mit einigen Tropfen Xylol geklärt. Daraufhin wurden die Bakterien für 1 min mit Safranin O‐ Lösung (siehe Kapitel 2.9.9) gegengefärbt. Nach gründlichem Spülen mit ddH2O und Lufttrocknen wurden die Objektträger mit dem gefärbten Zellmaterial mit einem 100x Ölimmersionsobjektiv im Lichtmikroskop ausgewertet.

2.9.11 Kohlenstoffverwertung Die Kohlenstoffassimilation einiger Mtb.‐Isolate und Typstämme wurde – neben der Teststreifen‐Analysen (siehe Kapitel 2.9.17) – auch in 20 ml Flüssigkulturen mit Medium nach Choi et al. (1989) geprüft. Die Substrate wurden dem autoklavierten Medium sterilfiltriert zugegeben. Um falsch negative Ergebnisse auszuschließen, wurden die Medien mit etwa 1x106 Bakterien pro ml beimpft und für mindestens 14 d bebrütet. Als Negativkontrolle wurde Medium ohne Kohlen‐ stoffquelle verwendet, das mit der gleichen Bakterienmenge beimpft wurde.

2.9.12 Test auf assimilatorische Nitratreduktion Die Nitratreduktion des Isolats Mtb. sp. JT1 und einiger naher verwandter Stämme wurde in Medium 125 (siehe Kapitel 2.7.1.2) mit 5 mM Succinat als alleiniger Kohlenstoff‐ und Kaliumnitrat als einziger Stickstoffquelle überprüft. Der Nachweis der Nitratreduktion erfolgte mit den Nit1 und Nit2‐Reagenzien des API 20 NE Teststreifen (bioMeriéux, Nürtingen). Dazu wurden etwa 200 μl einer 7 d bebrüteten Kultur in ein steriles 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt, mit je einem Tropfen Nit1 (enthält Sulfanilsäure und Essigsäure) und Nit2‐Reagenz (enthält N,N‐Dimethyl‐1‐Naphtylamin und Essigsäure) gemischt und nach Herstellerangaben ausgewertet. Wurde von den Bakterien Nitrat zu Nitrit reduziert, so bildet dieses mit der Sulfanilsäure unter sauren Bedingungen ein Diazoniumsalz, das mit Naphtylamin weiter zu einem roten Azofarbstoff reagiert. Blieb die Reaktion negativ (farblos) wurde etwas Zinkpulver zugefügt, um zu prüfen ob sich noch Nitrat in der Lösung befand, das in saurer Lösung durch das Zinkpulver zu Nitrit reduziert wird. Ist auch diese Reaktion negativ (keine Farbreaktion), wurde das Nitrat über Nitrit vollständig zu Stickstoff reduziert (Denitrifikation). Jedoch können einige Bakterien Nitrit zu Ammonium‐Ionen reduzieren (Ammonifikation), was ebenfalls zu einer negativen Nachweisreaktion führt. Als Negativkontrolle diente steriles Nährmedium, dass unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurde.

39 Material und Methoden

2.9.13 Bestimmung von Temperatur-Optima Um den Temperaturbereich zu ermitteln, in dem die Bakterien Wachstum zeigen, wurde 20 ml R2A‐Flüssigmedium mit 1x106 Bakterien/ml beimpft und unter kontrollierten Temperaturbedingungen auf einem Schüttler ‚KS‐15 Control’ mit Inkubationshaube TH 15 (Edmund Bühler, Hechingen) inkubiert. Der getestete Wachstumsbereich lag zwischen 4 und 37 °C (4/10/RT/32/35/37 °C). Die Versuche unterhalb der Raumtemperatur wurden in einem Kühlkabinett (4 °C) durch‐ geführt. Als Kontrollen dienten Kulturen, die bei RT inkubiert wurden.

2.9.14 Bestimmung der Salztoleranz Zur Bestimmung der Salztoleranz der Bakterienstämme wurden sowohl Versuche auf Festmedium, als auch in Flüssigkultur durchgeführt. Zur Bestimmung der Salztoleranz auf Festmedium wurden R2A‐Agarplatten mit unterschiedlichen NaCl‐Konzentrationen hergestellt. Die benötigte Menge an Salz wurde den Medien vor dem Autoklavieren zugefügt. Die Agarplatten wurden nach dem Aushärten und Trocknen mit 10 μl einer Bakteriensuspension einer OD600 von 1 beimpft und bei 28 °C in Dunkelheit inkubiert. Die Auswertung der Platten erfolgte nach 14 d. Zur Ermittlung der Salztoleranz in Flüssigkultur wurden 20 ml R2A‐Flüssig‐ medium mit Zusatz von 0,0‐4,0 % NaCl verwendet, die mit ~1x106 Zellen pro ml beimpft und bei RT und 150 rpm inkubiert wurden. Dabei wurden folgende NaCl‐ Konzentrationen getestet: 0,0 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, 3,0 %, 4,0 %.

2.9.15 Oxidase-Test Der Nachweis des intrazellulären Atmungsenzyms Cytochrom‐c Oxidase (EC 1.9.3.1) erfolgte mit Hilfe des ‚Oxidase Reagent’ der Firma bioMérieux (Nürtingen). Die Zusammensetzung des Reagenz basiert auf dem von Kovacs beschriebenen Oxidase‐Reagenz (Kovacs 1956). In Anwesenheit von Luftsauerstoff und Cytochrom‐c wird das Reagenz (N,N,N,N‐Tetramethyl‐1,4‐phenylendiamin) durch das Enzym Cytochrom‐c Oxidase oxidiert und es entsteht eine violett gefärbte Substanz (Indophenol). Für die Testdurchführung wurden Zellen aus exponentiell wachsenden NA‐ Flüssigkulturen verwendet. 2 ml Kultursuspension wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß für 3 min bei 13000 rpm abzentrifugiert und das Pellet einmal mit sterilem ddH2O gewaschen. Anschließend wurde ein Tropfen des ‚Oxidase Reagent’ auf das Pellet getropft und mit einer Impföse verrieben. Eine positive Reaktion wurde durch eine violett‐ bis purpurfarbene Färbung innerhalb von 10 bis 30 s angezeigt. Ein negatives Ergebnis wird durch fehlende oder verzögert auftretende Färbung angezeigt.

40 Material und Methoden

2.9.16 Katalase-Test Das Enzym Katalase katalysiert die Umsetzung von Wasserstoffperoxid zu Sauerstoff und Wasser. Katalasen verringern so den oxidativen Stress und finden sich in fast allen aerob lebenden Mikroorganismen. Der Katalase‐Nachweis erfolgte mit Hilfe der ‚ID Color Katalase’ (bioMeriéux, Nürtingen). Das Reagenz enthält neben einer 3 %igen Wasserstoffperoxidlösung, ein Dickungsmittel und einen blauen Farbstoff (Evans Blau), die das Ablesen der Reaktion erleichtern. Katalase‐positive Mikroorganismen können durch auf‐ steigende Sauerstoffblasen nachgewiesen werden. Der Test wurde nach Herstellerangaben mit auf Agarmedien gewachsenen Kolonien durchgeführt, die mit einer Impföse in einem Tropfen ‚ID Color Katalase’ auf einem sauberen Objektträger verrieben wurden.

2.9.17 Differenzierung der Bakterienstämme mittels Teststreifen Die folgenden biochemischen und physiologischen Analysen wurden mit Hilfe von Teststreifen der Firma bioMeriéux (Nürtingen) durchgeführt. Dabei werden Mikroröhrchen mit dehydrierten Substraten mit einer Keimsuspension beimpft, welche die Substrate löst. Stoffwechselprodukte, die während der Inkubation entstehen, bewirken Farbumschläge, die entweder direkt oder nach der Zugabe von Reagenzien entstehen. Die Röhrchen für Assimilationstests werden mit einem Minimalmedium beimpft; ein Wachstum (Trübung des Mediums) kann nur dann beobachtet werden, wenn die Bakterien das entsprechende Substrat verwerten.

2.9.17.1 Streifen-Test (API 20 NE) API 20 NE (bioMeriéux, Nürtingen) ist ein standardisiertes System mit 8 konventionellen Reaktionen und 12 Assimilationsreaktionen zur Identifizierung gramnegativer Stäbchen, die nicht zur Familie der Enterobacteriaceae gehören. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die API 20 NE Streifen benutzt um die stoffwechselphysiologischen Eigenschaften einiger ausgewählter Mtb.‐Isolate zu bestimmen. In Tabelle 2.2 sind die dabei getesteten Reaktionen/Enzyme zusammengefasst. Die Durchführung des Tests erfolgte nach den Herstellerangaben mit folgenden Modifikationen:

• Zur Vorbereitung des Inokulums wurden anstatt Kolonien Zellen aus exponentiell wachsenden Flüssigkulturen verwendet, die nach Zentrifugation und einem Waschschritt statt in physiologischer Kochsalzlösung in sterilem ddH2O suspendiert wurden.

• Die Bakteriensuspension wurde auf eine OD600 von 0,5 eingestellt (laut Herstellerangabe sollte die Trübung einem McFarland Standard von 0,5 entsprechen). • Das API AUX Medium wurde mit 500 μl Keimsuspension beimpft (statt mit 200 μl). • Die Tests der ersten beiden Mikroröhrchen (Nitratreduktion und Indolbildung) wurden laut den Herstellerangaben nach 24 h ± 2 h Inkubation bei 28 °C ausgewertet. Die restlichen Spontan‐ und Assimilationsreaktionen wurden über einen Zeitraum von 14 d bei 28 °C inkubiert und ausgewertet.

41 Material und Methoden

Diese Modifikationen waren notwendig, da manche Methylobacterium‐Stämme bei NaCl‐Konzentrationen um 1,0 % bereits kein Wachstum mehr zeigen. Das Suspendieren der Bakterien in ddH2O hatte in Vorversuchen keine negativen Effekte auf das Wachstum der Bakterien gezeigt. Da die Vertreter der Gattung Methylobacterium sehr langsam wachsen, wurde die Inokulationsmenge gegenüber den Herstellerangaben für die konventionellen Tests verfünffacht, bzw. für die Assimilationsreaktionen etwa verzehnfacht, da mit geringeren Bakterien‐ konzentrationen oft falsch‐negative Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle 2.2: Zusammenstellung des API 20 NE Teststreifens mit Kurzbezeichnung und aktiven Bestandteilen (mit Mengenangaben) der Tests. Zusätzlich ist die jeweilige Reaktion bzw. das entsprechende Enzym aufgeführt. Tabelle nach: Gebrauchsanweisung API 20 NE (REF 20 050, 07615J, Feb. 2006).

Test Aktive Bestandteile Menge Reaktionen/Enzyme (mg/Vert.) NO3 Kaliumnitrat 0,136 Nitratreduktion zu Nitrit / Stickstoff TRP L‐Tryptophan 0,2 Indolbildung GLU D‐Glukose 1,92 Fermentation (Glukose) ADH L‐Arginin 1,92 Arginindihydrolase URE Harnstoff 0,76 Urease ESC Aesculin 0,56 Hydrolyse (β‐Glukosidase) Eisencitrat 0,072 GEL Gelatine (bovin) 0,6 Hydrolyse (Protease) PNPG 4‐nitrophenyl‐βD‐galactopyranosid 0,22 β‐Galactosidase GLU D‐Glukose 1,56 Assimilation (D‐Glukose) ARA L‐Arabinose 1,4 Assimilation (L‐Arabinose) MNE D‐Mannose 1,4 Assimilation (D‐Mannose) MAN D‐Mannit 1,36 Assimilation (D‐Mannit) NAG N‐Acetylglucosamin 1,28 Assimilation (N‐Acetylglucosamin) MAL D‐Maltose 1,4 Assimilation (D‐Maltose) GNT Kaliumgluconat 1,84 Assimilation (Kaliumgluconat) CAP Caprinsäure 0,76 Assimilation (Caprinsäure) ADI Adipinsäure 1,12 Assimilation (Adipinsäure) MLT Apfelsäure 1,56 Assimilation (Apfelsäure) CIT Trinatriumcitrat 2,28 Assimilation (Trinatriumcitrat) PAC Phenylacetat 0,8 Assimilation (Phenylacetat)

2.9.17.2 Stoffwechsel-Test (API 50 CH) API 50 CH (bioMeriéux, Nürtingen) ist ein standardisiertes System mit 50 biochemischen Reaktionen zur Prüfung des Kohlenhydratstoffwechsels von Mikroorganismen (Zusammensetzung des Tests siehe Ergebnisse, Tabelle 5.1). Zusammen mit dem Medium CHB/E kann das System zur Identifizierung von Bacillus und verwandten Gattungen sowie Enterobacteriaceae und Vibrionaceae verwendet werden. Während der Inkubation kann durch einen zugesetzten Indikator im Nährmedium zwischen Fermentation und Oxidation der jeweiligen Substrate unterschieden werden. Eine Assimilation des Substrats wird durch Wachstum der Keime angezeigt.

42 Material und Methoden

Die Durchführung des Tests erfolgte nach den Angaben des Herstellers mit folgenden Modifikationen:

• Anstatt Kolonien wurden Zellen aus exponentiell wachsenden Flüssigkulturen zur Vorbereitung des Inokulums verwendet.

• Die Bakteriensuspension wurde auf eine OD600 von 1,0 eingestellt (laut Herstellerangabe sollte die Trübung einem McFarland Standard von 4,0 entsprechen). • Das Medium CHB/E wurde mit 2,0 ml Keimsuspension beimpft (statt mit 1 ml). • Die Tests wurden über einen Zeitraum von 14 d bei 28 °C inkubiert und ausgewertet.

Weil die Vertreter der Gattung Methylobacterium sehr langsam wachsen, wurde die Inokulationsmenge gegenüber den Herstellerangaben etwa verfünffacht, da mit geringeren Bakterienkonzentrationen oft falsch‐negative Ergebnisse erhalten wurden (s. o.).

2.9.18 CFW-Platten Um die Exopolysaccharidproduktion auf unterschiedlichen Nährmedien zu testen, wurde den Festmedien (1,5% Agar) vor dem Autoklavieren 200 μg/ml Calcofluor White M2R zugegeben. Die Platten wurden anschließend mit unterschiedlichen Bakterienmengen beimpft (1 bis 103 CFU), um zu überprüfen, ob die Bildung abhängig von der Bakteriendichte ist.

2.9.19 Flagellenfärbung nach Heimbrook et al. (1989) Die Flagellenfärbung nach Heimbrook et al. (1989) basiert auf der Kombination der ‚wet‐mount’‐Färbetechnik nach Mayfield und Innis (1977) sowie der klassischen Färbemethode nach Ryu (1937), wie sie von Kodaka et al. (1982) verwendet wurde. Die Färbelösung nach Ryu (1937) besteht aus zwei Komponenten (siehe folgende Seite) die im Verhältnis 10:1 (Lösung I:Lösung II) gemischt werden. Nach Filtrieren des groben Präzipitats wurde die Lösung in einer mit Alufolie umwickelten 20 ml Einwegspritze (B. Braun, Melsungen) mit aufgesetzter Kanüle und zwischengeschalteten Sterilfilter (Porengröße 0,2 μm) bei Raumtemperatur gelagert. Im Gegensatz zur Färbevorschrift von Heimbrook et al. (1989) – bei der die beweglichen Zellen von über Nacht bebrüteten Agarkolonien stammten – wurden in der vorliegenden Arbeit ca. 10 μl einer exponentiell wachsenden Flüssigkultur auf einen sauberen Objektträger getropft, mit einem Deckglas abgedeckt und auf bewegliche Zellen untersucht. Konnten dabei ausreichend bewegliche Zellen beobachtet werden (>50%), wurde der Objektträger für 5‐10 min zur Seite gelegt, damit die Zellen sich an die Glasoberflächen anheften konnten. Anschließend wurden 2‐3 Tropfen der Färbelösung nach Ryu (1937) an den Rand des Deckglases pipettiert, die durch Kapillarkräfte unter das Deckglas gesaugt wird und sich dort mit der Zellsuspension vermischt. Die Zellen wurden nach 5‐15 min Inkubation der Färbelösung (RT) bei 100x Objektivvergrößerung auf Flagellen untersucht.

43 Material und Methoden

Lösung I (Beizmittel) Lösung II (Färbelösung) Menge/Vol. Stoff/Lösung Menge/Vol. Stoff/Lösung 10 ml 5 % Phenol (in H2O) 1,2 g Kristallviolett 2 g Tannin 10 ml 95 % Ethanol 10 ml gesättigte, wässrige Kalialaun‐Lösung

2.9.20 Carotinoidextraktion und in vivo Spektrum Die meisten Spezies und Isolate der Gattung Methylobacterium bilden wasserunlösliche Pigmente (Carotinoide), die den Zellen ihre charakteristische rote Farbe verleihen. Die Farbe der Zellsuspension sowie ein in vivo Licht‐ Absorptions‐Spektrum können dabei Hinweise auf den Typ und die chemische Struktur der Pigmente geben. Zur Extraktion der Carotinoide wurde sowohl Zellmaterial aus stationären Flüssigkulturen als auch von Agarkolonien verwendet. Dabei wurden etwa 1x1010, mit ddH2O gewaschenen und pelletierten Bakterien in einem 2,0 ml Reaktionsgefäß mit 400 μl ddH2O gut suspendiert. Anschließend wurden 1,6 ml Methanol zupipettiert (Endkonzentration Methanol: 80 %) und die Suspension für mindestens 1 h auf einem Vortex‐Mischer geschüttelt. Nach Abtrennen der Bakterien und unlöslichen Bestandteile bei 14000 rpm (Tischzentrifuge) wurden die methanolischen Carotinoidextrakte in einem Uvikon 931‐Zweistrahl‐ photometer (Kontron Instruments, Italien) gegen 80 % Methanol als Referenz in einem Wellenlängenbereich von 300‐900 nm spektrometrisch vermessen. Für die Aufnahme des in vivo Absorptions‐Spektrums der Zellen des Isolats Mtb. sp. JT1 wurden Zellen aus Flüssigkulturen verwendet. Etwa 1x109 Zellen wurden geerntet und mit zweimal mit ddH2O gewaschen. Anschließend wurden die Bakterien in 2,0 ml sterilfiltrierter 60 %iger Saccharoselösung suspendiert und wie oben vermessen.

2.9.21 Motilitätstest Zur Prüfung der Beweglichkeit in halbfestem Nähragar wurde 1/10 konzentriertes R2A‐Medium mit 0,2 % (w/v) Agar verwendet (nach Weon et al. 2008), der durch den geringen Agargehalt eine ungehinderte Ausbreitung der Bakterien im Medium erlaubt, Konvektionsströmungen jedoch verhindert. Zur Durchführung des Tests wurden je 10 μl Bakteriensuspension mit einer OD600 von 0,1 (entspricht etwa 2,5x105 Zellen) aufgetropft und die Platten bei 28 °C für 7 d in Dunkelheit inkubiert. Für die Herstellung der Zellsuspension wurden Kolonien frisch bewachsener R2A‐Nähragarplatten verwendet, die in ddH2O suspendiert und photometrisch vermessen wurden (siehe oben).

44 Material und Methoden

2.10 Molekularbiologische Methoden

2.10.1 DNA-Isolation Prokaryoten besitzen im Gegensatz zu tierischen und pflanzlichen Zellen ein relativ kleines Genom, welches häufig aus nur einem zirkulärem Chromosom besteht. Zusätzlich können weitere zirkuläre oder lineare Chromsomen sowie Plasmide unterschiedlicher Größe und Kopienzahl gefunden werden. Das kleinste bisher bekannte bakterielle Genom besitzt der Endosymbiont Carsonella ruddii mit nur 160 kbp und 213 Genen (Nakabachi et al. 2006); das größte bisher sequenzierte mikrobielle Genom besitzt das Myxobacterium Sorangium cellulosum mit mehr als 13 Mbp und fast 10000 Genen (Schneiker et al. 2007)2. Die bisher veröffentlichten Genomdaten der Gattung Methylobacterium wurden in Tabelle 2.3 zusammen‐ gefasst. Tabelle 2.3: Komplett sequenzierte Genome von Vertretern der Gattung Mtb. spp. GPID: Genome‐Project ID. Daten nach 2.

Genom‐ G+C‐ Chromosomen GPID Stamm / Isolat Plasmide (Gene) größe Gehalt (Gene) 19527 Mtb. chloromethanicum CM4T 6,18 Mbp 68,1 % 1 (5464) 2 (351, 39) 18637 Mtb. extorquens PA1 5,47 Mbp 68,2 % 1 (4956) ‐ 19559 Mtb. populi BJ001T 5,85 Mbp 69,4 % 1 (5492) 2 (27, 27) 8 (536, 52, 46, 42, 18817 Mtb. radiotolerans JCM 2831T 6,92 Mbp 71,0 % 1 (5839) 37, 25, 22, 27) 18809 Mtb. sp. 4‐46 7,78 Mbp 71,5 % 1 (7047) 2 (77, 21)

Um hochmolekulare chromosomale DNA für weiterführende molekular‐ biologische Experimente zu gewinnen, müssen die Zellen zuerst aufgeschlossen werden. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen (thermisch, mechanisch, enzymatisch, Zusatz von Detergenzien) und richtet sich danach, welche Zellen (bzw. Gewebe) verwendet werden (Bakterien, Hefen, Pilze, Pflanzen, Tiere). Um den Abbau der freigesetzten Nucleinsäuren zu verhindern, müssen dabei die in der Lösung vorhandenen Nukleasen inaktiviert werden. Dies geschieht meist durch die Zugabe von EDTA und einer Behandlung der Probe mit Proteinase K. Anschließend wird die DNA von Zelltrümmern und Proteinen gereinigt und unter Hochsalzbedingungen mit Alkohol gefällt. Um verbliebene Chemikalien‐ und Salzreste zu entfernen wird die DNA in 70% Ethanol gewaschen und anschließend in TE‐Puffer oder Wasser gelöst. Moderne Fertigchemikalien‐Sätze (‚Kits’) zur Isolation von Nucleinsäuren kommen ohne die gesundheitsgefährdenden Chemikalien Phenol und Chloroform aus. Die Protokolle sind schnell und einfach durchzuführen, so dass innerhalb kurzer Zeit hochreine Nucleinsäurelösungen erhalten werden können. Die meisten Kits beruhen darauf, dass DNA in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen spezifisch an Silikate (Glasmilch bzw. Silikat‐Membranen in Spin‐Säulen) binden. Nach dem Waschen mit speziellen Puffern kann die DNA problemlos mit Puffer

2 nach http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi (Stand am 01.01.2009). 45 Material und Methoden oder Wasser eluiert und weiterverwendet werden. Die Konzentration und Qualität der so gewonnenen genomischen DNA lässt sich anschließend über eine photometrische Analyse und/oder Agarose‐Gelelektrophorese bestimmen. Zur Extraktion chromosomaler DNA wurden Zellen aus exponentiell wachsenden Flüssigkulturen verwendet. Dabei kamen – je nach Verwendungszweck und benötigter Reinheit der DNA – verschiedene Präparationsmethoden zum Einsatz.

2.10.1.1 Quick & Dirty-Methode Für anspruchslose PCR‐Experimente wurde die DNA wie von Nishio et al. (1997) beschrieben isoliert. Dazu wurde eine Bakteriensuspension mit einer OD600 von 1,0 hergestellt und nach Nishio et al. (1997) behandelt.

2.10.1.2 DNA-Isolation mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit Zur Extraktion bakterieller, chromosomaler DNA für die Sequenzierung des 16S rRNA‐Gens und des partiellen mxaF‐Gens wurde der DNeasy® Blood & Tissue Kit der Firma Qiagen (Hilden) verwendet. Dabei wurden die Proben nach dem Protokoll für Gram‐positive Bakterien aufbereitet. Nach Herstellerangaben können so bis zu 60 μg hochreiner DNA erhalten werden. Zur Zell‐Ernte wurden 2‐10 ml einer gut angewachsenen Flüssigkultur (maximal 2 x 109 Zellen) für 10 min bei 7500 rpm pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die Bakterien einmal mit ddH2O gewaschen um Reste des Nährmediums zu entfernen. Das Pellet wurde anschließend in 180 μl enzymatischem Lysepuffer (siehe unten) suspendiert und für min. 30 min bei 37 °C in einem ‚Thermomixer compact’ (Eppendorf, Hamburg) inkubiert. Anschließend wurden 25 μl Proteinase K‐Stammlösung sowie 200 μl Puffer AL (Qiagen, Hilden) zugegeben und die Suspension durch Vortexen gemischt. Die Proben wurden dann bis zur voll‐ ständigen Lyse (1‐3 h oder ÜN) bei 55 °C inkubiert. Nach Zugabe von 200 μl Ethanol (p. a.) und gutem Mischen der Probe wurde das Lysat auf eine DNeasy® Mini Spin Säule aufgebracht, welche in einen 2 ml Auffangbehälter eingesetzt wurde. Durch einminütiges Zentrifugieren bei 8000 rpm wurde die DNA auf der Säule gebunden. Der Auffangbehälter mit Durchfluss wurde verworfen, die DNeasy® Mini Spin Säule wurde in einen frischen 2 ml Auffangbehälter eingesetzt und 500 μl Puffer AW1 auf die Säule pipettiert. Nach einminütiger Zentrifugation bei 8000 rpm wurde der Auffang‐ behälter mit Durchfluss verworfen, die DNeasy® Mini Spin Säule in einen frischen 2 ml Auffangbehälter eingesetzt und 500 μl Puffer AW2 zupipettiert. Anschließend wurde für 3 min bei 14000 rpm zentrifugiert, der Durchfluss verworfen und nochmals für 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert (Trocknung der Membran). Zur Elution der DNA wurden die DNeasy® Mini Spin Säulen in sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße eingesetzt, 100 μl Puffer AE (vorgewärmt auf 65 °C) direkt auf die Membran pipettiert, 1 min inkubiert und 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Um die Ausbeute zu steigern, wurde eine zweite Elution mit 100 μl Puffer AE in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß durchgeführt.

46 Material und Methoden

Typischerweise konnten etwa 20‐30 μg DNA aus 2x109 Zellen isoliert werden. In 200 μl Elutionsvolumen ergaben sich so Konzentrationen von etwa 0,1 μg pro μl.

Enzymatischer Lysepuffer: Fertig‐Puffer 20 mM Tris‐Cl pH 8 Puffer AL Qiagen (Hilden) 2 mM Natrium‐EDTA Puffer AW1 Qiagen (Hilden) 1,2 % Triton®X‐100 Puffer AW2 Qiagen (Hilden) 20 mg/ml Lysozym (frisch zugesetzt) Puffer AE Qiagen (Hilden)

Proteinase K‐Stammlösung: Proteinase K (Roth, Karlsruhe) 20 mg/ml in ddH2O

2.10.1.3 Phenol-Chloroform-Extraktion Bei der klassischen Phenol‐Chloroform‐Extraktion von Nucleinsäuren werden die Proteine nach der Zell‐Lyse mit Phenol denaturiert und anschließend mit Chloroform abgetrennt. Dabei sammeln sich alle hydrophoben Bestandteile des Lysats (Membranlipide, hydrophobe Polypeptidsequenzen etc.) in den organischen Lösungsmitteln (Phenol/Chloroform) an. Hydrophile Reste der denaturierten Proteine interagieren jedoch auch mit der wässrigen Phase, wodurch sich nach Zentrifugation eine Interphase mit denaturierten Proteinen zwischen der unteren organischen Phase (Phenol/Chloroform) und der oberen wässrigen Phase mit den hydrophilen Bestandteilen der Lösung (DNA, Salze, Zucker etc.) bildet. Da Phenol in geringem Maße wasserlöslich ist, sollte der wässrige Überstand nochmals mit 1 Vol. Chloroform ausgeschüttelt werden. Anschließend kann die gereinigte DNA mit geeigneten Salzen und Alkoholen ausgefällt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mit der Phenol‐Chloroform‐Methode sowohl DNA aus frischem Zellmaterial als auch aus bereits vorliegenden DNA‐ Präparationen durchgeführt. Dazu wurde die Methode entsprechend skaliert. Zur Extraktion von DNA aus frischem Zellmaterial wurden ca. 5x1010 Zellen in 7,0 ml Puffer B1 (siehe Kapitel 2.10.1.6) suspendiert und mit 160 μl Lysozy‐ mlösung (50 mg/ml) und 14 μl DNase‐freier RNase A‐Lösung (100 mg/ml) für mindestens 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Proteinase K‐Lösung (20 mg/ml) zugegeben und die Suspension nach kurzem Vortexen für 1 h bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Daraufhin wurden die Proteine durch die Zugabe von 1 Vol. Phenol‐Chloroform‐Isoamylalkohol (25:24:1) denaturiert und durch 10 minütiges zentrifugieren bei 6000 g abgetrennt. Die obere wässrige Phase wurde mit Hilfe einer sterilen 20 ml Glaspipette in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und mit 1 Vol. Chloroform/Isoamylalkohol ausgeschüttelt um Phenolreste aus der Lösung zu entfernen. Nach erneuter Zentrifugation wurde die wässrige Phase in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, die DNA mit 0,6 Vol eiskaltem 2‐Propanol gefällt und durch eine Zentrifugation bei 5000 g und 4 °C für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 1,5 ml 70 %igem Ethanol in ein steriles 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt und zweimal mit

47 Material und Methoden

70 %igen Ethanol gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde für ca. 10 min an der Luft getrocknet, in 200 μl sterilfiltriertem LiChrosolv®‐H2O aufgenommen und für mindestens 2 h bei 50 °C unter gelegentlichem leichten Mischen gelöst.

2.10.1.4 DNA-Isolation nach Pitcher et al. (1989) Mit der Methode nach Pitcher et al. (1989) kann ohne die Verwendung des gesundheitsgefährdenden Phenols hochmolekulare DNA aus Gram‐negativen und Gram‐positiven Bakterien extrahiert werden. Dabei werden nach der Lyse der Zellen mit Guanidinthiocyanat (GTC) nur noch drei weitere Reagenzien und ein Hochgeschwindigkeits‐Zentrifugationsschritt benötigt, wodurch die Methode sehr schnell durchgeführt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode von Pitcher et al. (1989) leicht modifiziert. Zur Extraktion chromosomaler DNA wurden ca. 5x1010 Zellen in 7,0 ml Puffer B1 (siehe Kapitel 2.10.1.6) suspendiert und mit 160 μl Lysozymlösung (50 mg/ml) und 14 μl DNase‐freier RNase A‐Lösung (100 mg/ml) für mindestens 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Proteinase K‐Lösung (20 mg/ml) zugegeben und die Suspension nach kurzem Vortexen für mind. 1 h bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Die Zell‐Lyse erfolgte für 10‐30 min mit 5 Vol. GTC‐Lysepuffer. Die Lysate wurden anschließend auf Eis gekühlt und 15 ml kalte 7,5 M Ammoniumacetat‐ Lösung zugegeben. Nach einer Inkubation von 10 min wurden 0,6 Vol. Chloroform‐Isopropanol‐Lösung (24:1) zugegeben und gründlich gemischt. Zur Phasentrennung wurden die Extrakte anschließend bei 6000 g und 4 °C zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde mit Hilfe einer sterilen 20 ml Glaspipette in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, die DNA mit 0,54 Vol eiskaltem 2‐Propanol gefällt und durch eine Zentrifugation bei 5000 g und 4 °C für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 1,5 ml 70 %igem Ethanol in ein steriles 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt und zweimal mit 70 %igen Ethanol gewaschen. Das resultierende Pellet wurde für ca. 10 min an der Luft getrocknet und in 200 μl sterilfiltriertem LiChrosolv®‐H2O aufgenommen und für 2 h bei 50 °C unter gelegentlichem leichten Mischen gelöst.

2.10.1.5 CTAB-Methode Die Extraktion mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) wurde verwendet um möglichst reine, hochmolekulare DNA zu isolieren (modifiziert nach Murray und Thompson 1980). Der Vorteil dieser Methode liegt darin begründet, dass dabei neben den Proteinen auch viele Polysaccharide abgetrennt werden, durch die nachfolgende Applikationen (wie Restriktionsverdaue und Hybridisierungen) negativ beeinflusst werden könnten. (Murray und Thompson 1980, Stackebrandt und Ebers 2006) Für die Extraktion wurden ca. 5x1010 Zellen in 7,0 ml Puffer B1 (siehe Kapitel 2.10.1.6) suspendiert und mit 160 μl Lysozymlösung (50 mg/ml) und 14 μl DNase‐ freier RNase A‐Lösung (100 mg/ml) für mindestens 30 min bei 37 °C im Wasser‐ bad inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Proteinase K‐Lösung (20 mg/ml)

48 Material und Methoden zugegeben und die Suspension nach kurzem Vortexen für mind. 1 h bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Nach Zugabe von 1 Vol. CTAB‐Puffer (2x) wurde die Suspension gut gemischt und für weitere 30 min bei 50 °C inkubiert. Durch Zugabe von 1 Vol. Chlorform/Isoamylalkohol (24:1) und Zentrifugation (7500 rpm, RT) konnten dann Zellwandbestandteile, denaturierte Proteine und viele Polysaccharide extrahiert werden. Die obere wässrige Phase wurde mit einer sterilen 20 ml Glaspipette in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und nochmals mit 1/10 Vol. 10 % CTAB, 0,7 M NaCl versetzt. Nach Chlorform/Isoamylalkohol‐ Extraktion (siehe oben) wurde die DNA durch Zugabe von 0,6 Vol. Isopropanol gefällt und durch Zentrifugation bei 7000 rpm und 4 °C für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 1,5 ml 70 %igem Ethanol in ein steriles 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt und zweimal mit 70 %igen Ethanol gewaschen. Das resultierende Pellet wurde für ca. 10 min an der Luft getrocknet und in 200 μl sterilfiltriertem LiChrosolv®‐H2O aufgenommen und für mindestens 2 h bei 50 °C unter gelegentlichem leichten Mischen gelöst.

CTAB‐Extraktionspuffer (2x) 2 % (w/v) CTAB 100 mM Tris‐Cl, pH 8,0 1,4 M NaCl

2.10.1.6 DNA-Isolation mit Anionenaustauschersäulen Bei der DNA‐Aufreinigung mit Genomic‐tip 100/G Anionenaustauschersäulen (Qiagen, Hilden) können laut Herstellerangaben bis zu 100 μg chromosomaler DNA direkt aus kultivierten Zellen, Blut oder anderen Geweben isoliert werden. Die Durchführung beruht dabei auf einem optimierten Puffersystem zur Lyse der Zellen, gefolgt von der Bindung der genomischen DNA an das Anionenaustauschermaterial (Silicapartikel mit positiv geladenen DEAE‐Gruppen auf der Oberfläche) unter entsprechenden Niedrigsalz‐ und pH‐Bedingungen. RNA, Proteine, Farbstoffe und niedrigmolekulare Verunreinigungen werden durch einen Waschvorgang (mit einem Puffer mittlerer Salzkonzentration) entfernt. Die genomische DNA wird anschließend mit einem Hochsalzpuffer eluiert und durch eine Isopropanol‐Präzipitation entsalzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden sowohl bereits bestehende DNA‐ Präparationen als auch DNA aus frischem Material mit dem Genomic‐tip 100/G System (Qiagen, Hilden) gereinigt. Um DNA aus frischem Material zu gewinnen wurden 2,2x107 Zellen in 3,5 ml Puffer B1 mit 7 μl RNase A‐Lösung (100 mg/ml) sowie 80 μl Lysozymlösung (50 mg/ml) suspendiert und für mindestens 1 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurden 200 μl Proteinase K‐Lösung (20 mg/ml) zugegeben und die Suspension nach kurzem Vortexen für mind. 1 h bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Daraufhin wurden 1,2 ml Puffer B2 zugegeben, die Suspension durch kurzes Vortexen gemischt und bis zur vollständigen Lyse der Zellen (mind. 30 min) bei 50 °C im Wasserbad inkubiert. Konnte kein vollständig klares Lysat

49 Material und Methoden erhalten werden, wurden die groben Bestandteile der Suspension durch eine Zentrifugation bei 7500 rpm sedimentiert, und nur der Überstand auf die Genomic‐tip Säulen aufgetragen, um ein Verstopfen zu verhindern. Zum Äquilibrieren der Säulen wurden diese mit 4 ml Puffer QBT gespült. Das Bakterienlysat wurde dann vollständig auf die Säule aufgebracht und gebunden. Nach dreimaligem Waschen der Säule mit je 7,5 ml Puffer QC wurde die DNA mit 5 ml 50 °C warmen Puffer QF in ein sauberes 50 ml Reaktionsgefäß eluiert, durch die Zugabe von 3,5 ml (0,7 Vol.) Isopropanol präzipitiert und durch Zentrifugation bei 7000 rpm und 4 °C für 15 min sedimentiert. Das erhaltene Pellet wurde mit 1,5 ml 70 %igem Ethanol in ein steriles 2,0 ml Reaktionsgefäß überführt und zweimal mit 2,0 ml 70 %igen Ethanol gewaschen. Das resultierende Pellet wurde für ca. 10 min an der Luft getrocknet und in 200 μl sterilfiltriertem LiChrosolv®‐ H2O aufgenommen und für mindestens 2 h bei 50 °C unter gelegentlichem leichten Mischen gelöst. Vorgereinigte DNA‐Präparationen (Gesamtvolumen < 500 μl) wurden mit Puffer QBT auf 5,0 ml aufgefüllt und auf die äquilibrierten Säulen aufgebracht. Die Säulen wurden hierbei nur zweimal mit Puffer QC gewaschen.

Puffer B1 (Bakterieller Lysis‐Puffer) Puffer QBT (Äquilibrations‐Puffer) 50 mM Tris‐Cl, pH 8,0 750 mM NaCl 50 mM EDTA, pH 8,0 50 mM MOPS, pH 7,0 0,5 % Tween®‐20 15 % Isopropanol 0,5 % Triton X‐100 0,15% Triton X‐100

Puffer B2 (Bakterieller Lysis‐Puffer) Puffer QC (Wasch‐Puffer) 3 M Guanidin‐HCl 1,0 M NaCl 0,5 % Tween®‐20 50 mM MOPS, pH 7,0 15 % Isopropanol

Puffer QF (Elutions‐Puffer) 1,25 M NaCl 50 mM Tris‐Cl, pH 8,5 15 % Isopropanol

2.10.2 Spektrophotometrische Analyse genomischer DNA Um die Konzentration und Qualität der DNA‐Präparationen zu überprüfen, wurden die DNA‐Lösungen spektrophotometrisch vermessen. Die Grundlage dieser Methode basiert auf dem Lambert‐Beerschen‐Gesetz E = c ⋅ε ⋅ d wobei die Extinktion (E) einer Lösung das Produkt der Konzentration der Probe (c), des stoffspezifischen Extinktionskoeffizienten (ε), und der durchstrahlten Schichtdicke der Probe (d) darstellt. Die gebräuchlichen Extinktionskoeffizienten für dsDNA betragen 0,020 (μg/ml)‐1 cm‐1 bei 260 nm und 0,010 (μg/ml)‐1 cm‐1 bei 280 nm. Für den Proteingehalt werden Extinktionskoeffizienten von 0,00057 (μg/ml)‐1 cm‐1 bei 260 nm und 0,0010 (μg/ml)‐1 cm‐1 bei 280 nm verwendet um die Konzentration zu berechnen. Reine dsDNA‐Lösungen sollten daher theoretisch ein A260:A280‐ 50 Material und Methoden

Verhältnis von 2,0 besitzen, während reine Proteinlösungen ein Verhältnis von 0,57 zeigen sollten. Aus dem Verhältnis der OD260 und der OD280 erhält man so eine Aussage über Proteinkontaminationen des DNA‐Extraktes, bzw. DNA‐Kontaminationen von Proteinextrakten (Warburg und Christian 1942). Für eine verbesserte Reproduzierbarkeit sollten die Messungen in 1‐3 mM Na2HPO4‐Puffer mit pH 8,5 durchgeführt werden (Wilfinger et al. 1997). Der Messbereich sollte dabei zwischen 0,1 und 1,0 liegen. Zur Messung wurden die DNA‐Präparationen mindestens im Verhältnis 1:25 mit 2 mM Na2HPO4‐Puffer pH 8,5 verdünnt. Die Lösungen wurden mit gepaarten Präzisions‐Küvetten aus Quarzglas SUPRASIL® mit einer Schichtdicke von 10,00 mm und einer Zentrums‐ höhe von 15 mm (Hellma, Mülheim) in einem Uvikon 931 Zweistrahl‐Photometer (Kontron Instruments, Italien) gegen reinen Puffer im Wellenlängenbereich von 200‐340 nm mit einer Bandpasseinstellung von 0,5 nm vermessen. Vor der ersten Messung wurde das Gerät für mind. 10 min angestellt – um eine gleichmäßige Intensität der Lichtquelle zu gewährleisten – und ein Nullabgleich des Gerätes durchgeführt. Nach jeder vierten Messung wurde die Eichung des Photometers überprüft und gegebenenfalls neu durchgeführt. Die Nucleinsäurekonzentration errechnet sich aus der Absorption bei 260 nm, der verwendeten Verdünnung und einem spezifischen Multiplikationsfaktor (dsDNA: 50 μg/ml, ssRNA: 40 μg/ml).

2.10.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA Im Rahmen dieser Arbeit wurden PCR‐Fragmente und Präparationen genomischer DNA mittels Agarose‐Gelelektrophorese aufgetrennt. Bei diesem Verfahren dient Agarose als Matrix, in der die DNA‐Moleküle in einem elektrischen Feld aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen im Desoxyribose‐Phosphat‐Rückgrat zur Anode wandern. Die Wanderungs‐ geschwindigkeit wird dabei durch verschiedene Faktoren, wie die Molekülgröße, die Konformation der DNA, die Agarosekonzentration und die angelegte Gleichspannung beeinflusst. Die Laufstrecke linearer, doppelsträngiger DNA‐ Fragmente bis zu einer Größe von etwa 3 kb in einem Agarosegel ist dabei umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus ihres Molekulargewichts. Durch die Verwendung einer DNA‐Leiter mit Fragmenten definierter Größe lässt sich nach der Auftrennung der Proben die Größe der separierten Fragmente abschätzen. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA wurde in Horizontalgelkammern mit einem Gelvolumen von 20 ml (Gelgröße: 5,3 x 7,5 cm) oder 40 ml (Gelgröße: 12,3 x 15,0 cm) durchgeführt. Für das Gel wurden, je nach Größe der Fragmente, 0,8‐2,0% Agarose (w/v) mit 1x konz. TAE‐Puffer aufgekocht, bis die Agarose gelöst war. Nach dem Abkühlen der Lösung auf ca. 60 °C wurde mit Hilfe eines vorbereiteten Gelschlittens und eines Kamms, ein luftblasenfreies Gel mit Taschen gegossen. Nach dem Erstarren der Agarose wurde das Gel in eine Elektrophorese‐ kammer gelegt, die anschließend mit 1x konz. TAE‐Puffer gefüllt wurde, so dass

51 Material und Methoden das Gel knapp mit Puffer bedeckt war. Nach Entfernen des Kamms konnten die mit Probenpuffer vermischten DNA‐Lösungen in die Taschen pipettiert werden. Als Längenstandard für den Bereich von 100‐1000 bp wurde eine 100 bp DNA‐ Leiter ‚equalized’ (Carl Roth, Karlsruhe) verwendet, bei der die DNA‐Menge pro Bande so eingestellt wurde, dass die Intensität der Banden vergleichbar ist. Zur leichteren Orientierung wurde das 500 bp Fragment vom Hersteller in doppelter Menge beigemischt. Auf ein typisches Gel wurden 2,5 μl DNA‐Leiter mit einer Konzentration von 0,05 μg/μl aufgetragen, wodurch sich eine Gesamt‐DNA‐ Menge von 125 ng pro Spur ergibt. Als Längenstandard für größere PCR‐ Fragmente diente eine 100 bp DNA‐Leiter ‚extended’ (Carl Roth, Karlsruhe), die ebenfalls in einer Konzentration von 0,05 μg/μl verwendet wurde. Für genomische DNA‐Präparationen wurde ein Größenmarker mit HindIII verdauter λ‐DNA (c = 0,05 μg/μl) verwendet (Carl Roth, Karlsruhe) Bei der elektrophoretischen Auftrennung von PCR‐Produkten wurden 2‐8 μl PCR‐ Produkt mit 6x konz. Probenpuffer gemischt und in die Geltaschen pipettiert. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte bei 3‐5 V/cm Elektrodenabstand und variabler Stromstärke. Zum Anfärben der DNA‐Banden wurden die Agarosegele für 10‐30 min in Ethidiumbromid‐Lösung (c = 0,05 μg/ml) gefärbt. Dabei interkaliert der im UV‐ Bereich fluoreszierende Farbstoff in die DNA‐Moleküle. Anschließend wurde das Gel für 5‐20 min gewässert, um überschüssiges Ethidiumbromid aus dem Gel zu entfernen und so den Kontrast zu erhöhen. Die Detektion der Banden erfolgte mittels eines UV‐Transilluminators der Firma Biometra (Göttingen). Die Ergebnisse wurden mit einer Digitalkamera (Canon) mit einem aufgesetzten Bandpassfilter (BP595, Biometra) und der PC‐Software BioDoc Analyse (Biometra, Göttingen) dokumentiert.

TAE‐Puffer (50x) Tris‐Base 242 g Essigsäure 57,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 100 ml ddH2O ad 1000 ml

2.10.4 Vergleichende DNA-Sequenzanalyse Bestimmte zelluläre Makromoleküle, wie z. B. Proteine und Nucleinsäuren, stellen gute Maßstäbe der phylogenetischen (evolutionären) Veränderung dar. Der phylogenetische Abstand zwischen zwei Arten kann dabei durch die Sequenz‐ unterschiede homologer Makromoleküle bestimmt werden, da die Zahl der Unterschiede in einem Molekül proportional der Zahl stabil in der DNA fixierter Mutationsänderungen ist, welche das Molekül seit der Abspaltung von einem gemeinsamen Vorfahren erfahren hat (Zuckerkandel und Pauling 1962). Bei der vergleichenden DNA‐Sequenzanalyse werden homologe DNA‐Bereiche mehrerer Individuen sequenziert und diese anschließend miteinander verglichen.

52 Material und Methoden

Dadurch können molekularsystematische Untersuchungen durchgeführt und phylogenetische Verwandtschaftsbeziehungen abgeleitet werden. Das Vorgehen gliedert sich dabei in folgende Punkte:

• Sequenzen ermitteln (Input) • Sequenzen homologisieren (multiples Sequenzalignment erstellen) • Wahl der Rekonstruktions‐/Analyse‐Methode • (Wahl des Algorithmus) • Baumerstellung • Ergebnisüberprüfung/Validierung (Output)

Um eine ausreichende Menge an Template‐Molekülen für die Sequenzierung zu erhalten und gleichzeitig die Komplexität der Probe (genomische DNA vs. PCR‐ Produkt) zu verringern, wurde in einem ersten Schritt das zu untersuchende Gen durch eine PCR präamplifiziert. Das aufgereinigte PCR‐Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese überprüft und anschließend bidirektional sequenziert.

2.10.4.1 In vitro-Amplifikation von DNA mittels PCR Die in vitro‐Amplifikation von DNA erfolgte mittels Polymerase‐Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) (Mullis et al. 1986, Saiki et al. 1988). Alle Reaktionen wurden in einem Thermocycler ‚T‐Gradient’ der Firma Biometra (Göttingen) durchgeführt. Da dieses Gerät, zur Vermeidung von Verdunstungs‐ verlusten, einen beheizbaren Deckel besitzt, konnte auf das Überschichten der PCR‐Ansätze mit Mineralöl verzichtet werden. Eine typische PCR wurde wie in Tabelle 2.4 dargestellt angesetzt. Um eine unspezifische Amplifikation zu vermeiden wurden die PCR‐Reaktionen in einem gekühlten Ständer angesetzt und erst in den Thermocycler gestellt, sobald dieser die initiale Denaturierungstemperatur erreicht hatte.

Tabelle 2.4: Typische Zusammensetzung einer PCR zur Amplifikation genomischer DNA.

Volumen Endkonz. Stammlösung LiChrosolv®‐Wasser (Merck, Darmstadt) 30,9 μl PCR‐Puffer (Qiagen, Hilden) 4,0 μl 1 x 10 x dNTPs (Eppendorf, Hamburg) 0,8 μl 0,2 mM 10 mM Strang‐Primer 1,6 μl 0,4 μM 10 μM Gegenstrang‐Primer 1,6 μl 0,4 μM 10 μM Ziel‐DNA (1:100 in TE) 1,0 μl ~5 ng/Rkt. ~5 ng/μl Taq‐Polymerase (Qiagen, Hilden) 0,1 μl 0,5 U/Rkt. 5 U/μl Gesamt 40,0 μl

53 Material und Methoden

2.10.4.1.1 Präamplifikation des 16S rRNA-Gens Ribosomale RNAs (rRNAs) sind hervorragend dafür geeignet, phylogenetische Beziehungen zwischen lebenden Organismen festzustellen, da sie universell vorhanden und funktional stabil sind (Ribosomen gibt es in Eukaryoten, Protocyten, Mitochondrien und Chloroplasten). Dieser Typ von RNA stellt den Hauptbestandteil der Ribosomen dar und gliedert sich in drei Molekülklassen. In Prokaryoten besitzen die Moleküle ein relatives Molekulargewicht3 von 5 S, 16 S und 23 S. Als ideales Molekül für phylogenetische Studien stellte sich dabei die 16S rRNA (Länge ca. 1500 Nucleotide) heraus, da sie experimentell einfacher zu handhaben ist als 23S rRNA (ca. 2900 Nucleotide). Die 5S rRNA (ca. 120 Nucleotide) kann aufgrund der geringen Größe und des daraus resultierenden geringen Informationsgehalts nur begrenzt für phylogenetische Studien ver‐ wendet werden. Die beiden großen prokaryotischen rRNAs enthalten zahlreiche konservierte Regionen, die nützlich sind, um die richtige Ausrichtung der Sequenz bei der Homologisierung zu bestimmen. In anderen Regionen verfügen diese rRNAs jedoch über ausreichend Sequenzvariabilität, um als ausgezeichnete phylogenetische Chronometer zu dienen. Die Präamplifikation des fast vollständigen 16S rRNA‐Gens wurde in einer PCR mit den universellen eubacteriellen Primern FGPS6 und FGPS1509 (Sy et al. 2001) durchgeführt. In der folgenden Tabelle wurde das Temperaturprofil der Reaktion zusammengefasst.

Tabelle 2.5: PCR‐Programm zur Amplifikation des 16S rRNA‐Gens.

Zyklen Bezeichnung Dauer Temperatur 1x Initiale Denaturierung 5 min 94 °C Denaturierung 30 s 94 °C 30x Primer‐Hybridisierung 30 s 60 °C Primerelongation 1 min 72 °C 1x Finale Elongation 5 min 72 °C 1x Pause ∞ 4 °C

2.10.4.1.2 Präamplifikation des partiellen mxaF-Gens Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte durch den Vergleich der partiellen mxaF‐Sequenzen zusätzliche Informationen zur Phylogenie der Gattung Methylobacterium erhalten werden. Die Präamplifikation eines 558 bp langen Fragments der mxaF‐Gensequenz erfolgte durch PCR mit dem Primerpaar moxF f1003 / moxF r1561 (McDonald et al. 1995). In Tabelle 2.6 (folgende Seite) wurde das verwendete Temperaturprofil der Reaktionen dargestellt.

3. Das Molekulargewicht der ribosomalen RNA‐Moleküle wird in Svedberg Einheiten (S) angegeben (durch Ultrazentrifugation ermittelte Sedimentationskonstanten). 54 Material und Methoden

Tabelle 2.6: PCR‐Programm zur Amplifikation des partiellen mxaF‐Gens.

Zyklen Bezeichnung Dauer Temperatur 1x Initiale Denaturierung 5 min 94 °C Denaturierung 30 s 94 °C 30x Primer‐Hybridisierung 30 s 60 °C Primerelongation 30 s 72 °C 1x Finale Elongation 5 min 72 °C 1x Pause ∞ 4 °C

2.10.4.2 Aufreinigung von PCR- und Sequenzier-Produkten Um die PCR‐Amplifikate und Sequenzierreaktionen von überschüssigen Nukleotiden, unerwünschten Reaktionsprodukten, Salzen und Enzymen zu reinigen, wurde der QIAquick® PCR‐Purification Kit (Qiagen, Hilden) verwendet. Dabei wurde nach den Anweisungen des Herstellers verfahren. Mit dieser Methode können bis zu 10 μg DNA mit Fragmentlängen von 100‐10000 bp aufgereinigt werden (Herstellerangabe). Die PCR‐Fragmente wurden durch einminütige Inkubation der Membran mit 20 μl auf 65 °C vorgewärmtem LiChrosolv®‐Wasser und anschließender ein‐ minütiger Zentrifugation in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß eluiert. Zum Überprüfen der Aufreinigung wurden 1 μl Eluat sowie 5 μl einer 1:100 Verdünnung (2 μl Eluat + 198 μl TE‐Puffer, pH 8) mit 6x konzentriertem Proben‐ auftragspuffer gemischt und zur Überprüfung auf einem TAE‐Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.

2.10.4.3 Sequenzierung der PCR-Fragmente Die heute am häufigsten verwendeten Sequenziermethoden beruhen auf der so genannten Kettenabbruchmethode, die von Sanger et al. (1977) entwickelt wurde. Bei dieser Methode dient die zu sequenzierende DNA als Matrize für die enzymatische Synthese neuer DNA ab einer definierten Primerbindungsstelle. Für die Reaktion wird ein Gemisch aus 2’‐Desoxynucleotiden (dNTPs) und 2’,3’‐Didesoxynucleotiden (ddNTPs) verwendet. Die Konzentration der Nucleotide muss dabei so abgestimmt werden, dass gewährleistet wird, dass an jeder Position der wachsenden Kette ein ddNTP anstatt eines dNTPs eingebaut werden kann. Durch den Einbau eines ddNTPs wird die Kettenverlängerung blockiert, was zu einer Population unterschiedlich langer Fragmente führt, die anschließend über ihre Größe auf einem hochauflösendem Gel aufgetrennt werden können. Die Identitäten der Abbruchnucleotide können dabei entweder durch die Verwen‐ dung von vier verschiedenen Reaktionen mit einem ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) je Reaktion, oder in einer kombinierten Reaktion mit spezifisch markierten ddNTPs bestimmt werden. Um die DNA‐Fragmente aus der Sequenzier‐Reaktion detektieren zu können, muss bei der DNA‐Neusynthese eine Markierung eingebaut werden, die anschließend in geringsten Mengen nachweisbar ist. Diese Markierung kann dabei

55 Material und Methoden an der 5’‐Position des Oligonucleotid‐Primer, in den Desoxynucleotiden, die zur Kettenverlängerung dienen oder den Abbruchnucleotiden eingebaut sein. Als Markierungsmethode kann bei der manuellen Sequenzierung neben der Radioisotop‐Markierung alternativ ein chemoluminiszentes Detektionssystem verwendet werden. Bei der automatisierten Sequenzierung werden Fluoreszenz‐ farbstoffe verwendet, um die DNA‐Banden bei der Elektrophorese zu detektieren. Werden dabei vier verschiedene Farben für die vier Abbruchnucleotide verwendet, kann die Reaktion in einem Gefäß stattfinden und auf einer einzigen Gelspur (bzw. Kapillare) aufgetrennt werden. Die Sensitivität der Farbstoffe konnte durch die Entwicklung der so genannten Energie‐Transfer Farbstoffe (Ju et al. 1995) weiter erhöht werden. Applied Biosystems vertreibt diese Farbstoffe als BigDyes™, die sowohl als Primer‐ oder als Terminator‐Konjugat erhältlich sind. BigDyes™ beinhalten einen Fluorescein Energie‐Donor‐Farbstoff, der direkt an einen Dichlorrhodamin Energie‐Akzeptor‐Farbstoff gebunden ist. Beide Farbstoffe bilden ein Energietransfer‐System, welches eine signifikant höhere Sensitivität aufweist, als ein einzelner Farbstoff. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Sequenzierungen mit einem ‚ABI PRISM BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit’ (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) und der so genannten ‚Cycle sequencing’‐Methode (nach Murray 1989) durchgeführt, bei der in mehreren aufeinander folgenden Zyklen – bestehend aus Denaturierung, Annealing und Extension – ein Extensionsprodukt linear amplifiziert wird. Im Gegensatz zu einer normalen PCR wird dabei nur ein Primer eingesetzt. Ein typischer Reaktionsansatz wurde in folgender Tabelle zusammengefasst:

Tabelle 2.7: Typischer Reaktionsansatz einer Sequenzier‐Reaktion.

Volumen Endkonz. Stammlösung LiChrosolv®‐Wasser (Merck, Darmstadt) 3,0 μl Primer 4,0 μl 1,0 μM 10 μM gereinigtes PCR‐Produkt 5,0 μl ~5 ng/Rkt. ~5 ng/μl Sequenzier‐Puffer 4,0 μl 1 x 5 x (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) Ready‐Reaction‐Mixa 4,0 μl 1x 5x (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) Gesamt 20,0 μl a darin enthalten sind die markierten ddNTPs, dNTPs (dATP, dCTP, dITP, dUTP), AmpliTaq DNA Polymerase FS, Magnesiumchlorid und Puffer.

Als Primer wurden die zur Präamplifikation verwendeten Oligonucleotide benutzt. Für die Sequenzierung der 16S rDNA wurden zusätzlich die Primer 2F und 3R (Nishio et al. 1997) eingesetzt. Die Reaktionen wurden in einem gekühlten Reaktionsgefäßständer angesetzt und in einem ‚T‐Gradient’‐Thermocycler (Biometra, Göttingen) inkubiert. Für die Reaktionen wurde folgendes Temperatur‐ profil (siehe Tabelle 2.8, nächste Seite) verwendet:

56 Material und Methoden

Tabelle 2.8: Typisches Reaktionsprofil einer Sequenzier‐Reaktion

Zyklen Bezeichnung Dauer Temperatur Denaturierung 10 s 94 °C 33x Primer‐Hybridisierung 10 s 58 °C Primerelongation 3 min 60 °C 1x Pause ∞ 4 °C

Die Produkte konnten nach einem Reinigungsschritt (siehe Kapitel 2.10.4.2) aufgetrennt und analysiert werden. Die Auftrennung und Detektion der Produkte erfolgte mit einem ‚ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer’ (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) der mit einer 47 cm langen (Abstand zum Detektor: 30 cm), mit POP6‐Polymer befüllten Kapillare (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) ausgestattet war. Dabei wurden üblicherweise folgende Parameter verwendet:

Tabelle 2.9: Typischerweise verwendete Parameter für die kapillarelektrophoretische Auftrennung von Sequenzier‐Produkten.

Parameter Einstellung Elektrophoresedauer (Run time) 45 min Elektrophorese‐Spannung (Electrophoresis Voltage) 15,0 kV Elektrophorese‐Temperatur (Electrophoresis Temperature) 50 °C Injektionsdauer (Injection Time) 200 s Injektionsspannung (Injection Voltage) 2,0 kV

Die Datenerfassung und erfolgte auf einem WindowsXP PC mit der ABI PRISM 310 Collection‐Software Version 3.1.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.). Nach der Elektrophorese erstellte die Software für jede Probe eine Datei mit den erfassten Rohdaten. Um diese Daten weiter analysieren zu können, mussten diese durch eine Primäranalyse in die korrespondierenden Nukleotide übersetzt werden (siehe Kapitel 2.10.4.3.1). Einige Sequenzierungen wurden von der Firma Seqlab GmbH (Göttingen) durchgeführt. Dazu wurden 6 μl aufgereinigtes PCR‐Produkt (c ≈ 20‐50 ng/μl) mit 1 μl Primer (c = 20 μM) gemischt und verschickt. Als Ergebnis erhielt man dabei die bereits primäranalysierten Daten als vierfarbiges Sequenzchromatogramm.

2.10.4.3.1 Primäranalyse der Sequenzierergebnisse Die Primäranalyse der erhaltenen Sequenz‐Rohdaten wurden mit der Sequencing Analysis Software v5.2 mit KB™ Basecaller Version 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.) durchgeführt. Dazu wurden dem Programm einige Parameter vorgegeben, woraufhin ein Algorithmus der Software die Rohdaten der aufgenommen Farbdaten‐Bilder in die entsprechenden Nucleotidbasen übersetzte und ein vierfarbiges Sequenzchromatogramm erstellte. Jeder Peak repräsentiert dabei ein DNA‐Fragment mit definierter Größe und einem definiertem Abbruch‐ nucleotid, woraus die Basenabfolge der Fragmente ermittelt werden kann. Allen identifizierten Basen wurde von dem Programm ein Wert zugeordnet, der die

57 Material und Methoden

Qualität der Daten angibt. Dieser Wert ist umso höher, je besser das Signal von der Software erkannt und von den restlichen Signalen abgegrenzt werden kann.

2.10.4.3.2 Editierung der Sequenzierergebnisse Nach der Primäranalyse der Daten konnten die dabei erstellten Dateien mit BioEdit Version 7.0.9.0 (Hall 1999) editiert werden. Ein manuelles Editieren der Sequenzen war meist unumgänglich, da die Primäranalyse‐Software nicht alle Signale korrekt auswerten konnte. Die Basensequenz der Rückreaktion wurde zuerst revers komplementiert. Die so erhaltene Sequenz sowie die Sequenz der Hinreaktion wurden anschließend mittels der in BioEdit integrierten Software ClustalW (Version 1.4), bei den vorgegebenen Standardeinstellungen, gegeneinander aligniert. Dadurch konnten auftretende, Sequenzunterschiede der beiden Reaktionen schnell ausfindig gemacht werden. Die fraglichen Basen wurden anschließend sorgfältig manuell editiert. Dabei wurde diejenige Base in die Konsensussequenz aufgenommen, welche den höheren Qualitätswert zeigte. An uneindeutigen Positionen wurden mehrdeutige Abkürzungen verwendet (nach den Konventionen der IUPAC). Nach dem Entfernen der Primersequenzen wurden die ermittelten Konsensus‐ Sequenzen im FASTA Format gespeichert und konnten anschließend weiter analysiert werden.

2.10.4.3.3 Überprüfen der Sequenzen Ein Abgleich der ermittelten Sequenzdaten erfolgte mittels einer BLAST‐Abfrage (Altschul et al. 1990). Dabei wurde das BLASTN Programm (Version 2.2.18+, Altschul et al. 1997) verwendet um in der „nicht redundanten“ Nucleotid‐ datenbank4 nach ähnlichen Nucleotid‐Sequenzen zu suchen (Option: nr/nt). Dadurch sollten die Ergebnisse verifiziert und gleichzeitig ähnliche Sequenzen für die phylogenetische Analyse gesammelt werden. Als Resultat der Suchanfrage erhält man eine graphische Darstellung der ver‐ wendeten Konsensus‐Sequenz und den ähnlichsten Sequenzen der abgefragten Datenbanken. Die Farbe der Balken gibt dabei den Grad der Ähnlichkeit an. Weiter unten werden unter anderem die nach Ähnlichkeit sortierten Sequenzen mit den zugehörigen Genbank‐Nummern, Speziesnamen sowie Kurzbe‐ schreibungen der Gene aufgelistet. Eine gute Übereinstimmung der ermittelten Sequenz mit den ähnlichsten Sequenzen in den Datenbanken bedeutet in der Regel eine enge Verwandtschaft. Wenn die ähnlichste Datenbanksequenz von keinem Typstamm stammte, wurde zusätzlich die Ähnlichkeit mit dem nächsten in der Datenbank vorhandenen Typstamm bestimmt.

4 Alle GenBank und RefSeq Nucleotidsequenzen, EMBL‐, DDBJ‐, PDB‐Sequenzen (ohne HTGS0,1,2, EST, GSS, STS, PAT, WGS). Nicht mehr ʺnon‐redundantʺ. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blastcgihelp.shtml#nucleotide_databases). 58 Material und Methoden

2.10.4.4 Molekularphylogenetische Analyse Bei der molekularphylogenetischen Analyse werden homologe Nucleotid‐ oder Aminosäure‐Sequenzen miteinander verglichen um die evolutionären Verwandt‐ schaftsbeziehungen zu ermitteln und diese in einem Stammbaum graphisch darzustellen. Diese Methoden wurden in meiner Diplomarbeit (Schauer 2004) dargestellt und sollen hier nur kurz rekapituliert werden.

2.10.4.4.1 Wahl der Außengruppe Als Außengruppe (outgroup) wird in der Kladistik ein Taxon bezeichnet, das sich von einer Gruppe anderer Taxa abspaltete, bevor diese untereinander divergierten. Da die Merkmalsausprägung in der Außengruppe gegenüber der Innengruppe als ursprünglich angesehen wird, kann durch die Definition einer Außengruppe die Polarität der Merkmalsveränderungen beurteilt werden. Die meisten Methoden ermitteln aber nicht den phylogenetisch ältesten Ast (outgroup), sondern nur die jeweiligen Verwandtschaftsverhältnisse untereinander. Durch die zusätzliche phylogenetische Information der Außengruppe können die berechneten Bäume gewurzelt, und die Richtung der Evolution rekonstruiert werden. Jedoch können die Topologie und Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb des Stammbaums von der Wahl der Außengruppe abhängen. Die Außengruppe sollte einerseits phylogenetisch relativ nah verwandt zur Innengruppe stehen, andererseits keine zu schnelle Sequenzinformation durchlaufen haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde als Außengruppe für die phylo‐ genetischen Analysen Rhodopseudomonas palustris gewählt. Dieser Stamm wurde vom DOE Joint Genome Institute bereits vollständig sequenziert (GPID: 15750). Das Genom besteht aus 5,51 Mbp (GC‐Gehalt: 65,0%), die 4886 Proteine sowie 73 strukturellen RNAs codieren. Rhodopseudomonas palustris gehört – wie die Gattung Methylobacterium – zu den α‐Proteobacteria und besitzt neben (mehreren) rRNA‐Operons mit identischen 16S rRNA‐Genen auch eine Sequenz mit hoher Sequenzähnlichkeit (> 80%) zu den mxaF‐Sequenzen von Methylobacterium.

2.10.4.4.2 Alignierung der Sequenzen Um die Sequenzen miteinander zu vergleichen, müssen die konservierten und variablen Bereiche der Sequenzen homologisiert (aligniert) werden, um die Änderungen in der Basenabfolge erkennen zu können. Die Divergenz der Sequenzen kann dabei durch verschiedene Ereignisse entstehen: • Die Basen der alignierten Sequenzen stimmen überein: Keine Veränderung seit der Abspaltung von einem gemeinsamen Vorfahren. Evtl. kann diese Situation aber auch durch die Rückmutation einer Substitution entstehen. • Die Basen stimmen nicht überein: Durch eine Substitution wurde eine Base ein‐ bzw. mehrfach ausgetauscht. • Eine oder mehrere Basen sind nur in einer Sequenz vorhanden: Wird durch eine Insertion oder Deletion hervorgerufen. • Durch Inversion (rotieren eines DNA‐Segments aus zwei oder mehr Basen um 180°) kann die Basenabfolge geändert werden.

59 Material und Methoden

Zur Alignierung der Sequenzen wurden die Sequenzen mit Hilfe mathematischer Modelle verglichen und so zueinander ausgerichtet, dass, bei der geringsten Zahl an Fehlpaarungen, möglichst wenige Lücken eingefügt werden mussten. Dazu wurde die in BioEdit 7.0.9.0 (Hall 1999) integrierte PC‐Software ClustalW Version 1.4 (Thompson et al. 1994) verwendet. Das Programm vergleicht zunächst alle Sequenzen paarweise miteinander und erstellt daraus paarweise Alignments und eine Ähnlichkeitsmatrix. Aufgrund der Ähnlichkeiten wird dann ein Dendro‐ gramm – eine Art vorläufiger Stammbaum – der Sequenzen errechnet. Anhand dieses Baums aligniert die Software als erstes die zwei ähnlichsten Sequenzen und arbeitet sich zu den unähnlicheren vor, bis der gesamte Datensatz homologisiert ist. Um ein optimales Alignment zu erzielen werden in ClustalX Insertionen, Deletionen und Substitutionen mit so genannten Strafpunkten (engl. gap penalties) für die Eröffnung (engl. gap opening) und Verlängerung (engl. gap extension) von Lücken belegt. Das Programm findet dann die Lösung, die mit den wenigsten Strafpunkten zu erreichen ist. Die Alignierung der DNA‐Sequenzen wurde mit den vorgegebenen Standardparametern durchgeführt. Da sich im Alignment der 16S rDNA‐Sequenzen einige Unstimmigkeiten (Lücken und Insertionen) fanden, wurden die Sequenzen mit der Software BioEdit 7.0.9.0 (Hall 1999) behutsam manuell editiert. Als Anhaltspunkt diente dabei die Sekundärstruktur der 16S rDNA von Mtb. sp. BF15 (Z23160, siehe Abbildung 5.1, Anhang) die aus der Datenbank der ‚Comparative RNA Website and Project’ (CRW) (Cannone et al. 2002) entnommen wurde. Nach der Alignierung wurden die Datensätze am 5’‐ und 3’‐Ende auf die Länge der kürzesten verfügbaren Sequenzen gekürzt. Die so erhaltenen homologisierten Datensätze bildeten die Grundlage der phylogenetischen Rekonstruktion.

2.10.4.4.3 Rekonstruktion von Stammbäumen Die phylogenetischen Analysen wurden mit verschiedenen Programmen durchgeführt. Dabei wurden sowohl Distanzmethoden wie auch Charakter‐ basierte Methoden eingesetzt, um die verwandtschaftlichen Beziehungen innerhalb der Gattung Methylobacterium herauszustellen.

2.10.4.4.3.1 Distanzbasierte Methoden Distanzbasierte Methoden basieren auf der Idee, dass sich bei bekannten Abständen zwischen allen terminalen Taxa eines Datensatzes die evolutionäre Geschichte dieser Sequenzen rekonstruieren lässt. Grundlage hierfür bildet die von Emile Zuckerkandel und Linus Pauling Anfang der 60er Jahre aufgestellte ‚Molecular Clock Theory’, nach der die Zahl zulässiger Mutationen in den Genen pro Zeiteinheit ungefähr konstant ist (Zuckerkandel und Pauling 1962). Distanzmethoden berechnen die genetische Distanz zwischen den alignierten Sequenzen des Datensatzes für alle möglichen Sequenzpaare. Die Zahl der beobachteten Unterschiede, dividiert durch die Gesamtzahl alignierter Positionen, wird dabei als beobachtete Distanz (auch: sichtbare Distanz oder p‐Distanz) definiert. Die Distanzwerte können dabei mit Hilfe eines Substitutionsmodells

60 Material und Methoden korrigiert werden. Bei der Berechnung des Baumes spielen die Sequenzen selbst keine Rolle, da zur Rekonstruktion ausschließlich die Distanzwerte verwendet werden. Die bekannteste und heutzutage meistgenutzte Distanzbasierte Methode ist das Neighbor‐Joining‐Verfahren (NJ) (Saitou und Nei 1987). Dabei werden die Bäume gesucht, in denen die Summe der Astlängen minimiert wird. Im Gegensatz zum UPGMA‐Verfahren (engl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), bei dem die zwei Taxa als benachbart angesehen werden, deren Abstand minimal ist, werden beim NJ‐Verfahren Distanzen gebildet, die die mittlere Distanz zu allen anderen Taxa mit einbeziehen. Hier werden also die Cluster jeweils miteinander verbunden, die sowohl voneinander gering als auch weit von den anderen ent‐ fernt sind. Mit der NJ‐Methode erhält man ungewurzelte Stammbäume, da die Taxa unterschiedliche Evolutionsraten aufweisen dürfen. Jedoch kann das erhaltene Phänogramm mit Hilfe einer Außengruppe nachträglich gewurzelt werden.

2.10.4.4.3.2 Charakterbasierte Methoden Zur Rekonstruktion phylogenetischer Stammbäume aus Sequenzdaten biologischer Makromoleküle haben sich unter den Merkmalsbasierten Methoden verschiedene Ansätze etabliert. Bei der Bayesschen Analyse wird die Wahrscheinlichkeit eines Baumes auf der Grundlage des vorliegenden Datensatzes berechnet (Huelsenbeck et al. 2001). Mit Maximum‐Likelihood‐Verfahren (ML) wird dagegen auf der Grundlage eines bestimmten Modells der Merkmalsevolution errechnet, wie wahrscheinlich das Zustandekommen einer bestimmten Baumstruktur ist.

2.10.4.4.3.2.1 Bayessche Analyse Bei der Bayesschen Analyse werden die A‐posteriori‐Wahrscheinlichkeiten aus Zufallsstichproben phylogenetischer Bäume berechnet, die proportional zu ihrer Wahrscheinlichkeit in der Stichprobe vertreten sind. Die dabei verwendete statistische Methode wird als „Markov Chain Monte Carlo“ (MCMC) bezeichnet. Ausgehend von einem Zufallsbaum verändert das Computerprogramm bei jedem Schritt der Markov‐Kette einen Parameter der Phylogenie. Verbessert sich dabei die Wahrscheinlichkeit, nimmt das Programm den neuen Baum an, verschlechtert sie sich, wird die Veränderung nur mit einer geringen Wahrscheinlichkeit akzeptiert. Auf diese Weise bewegt sich das Programm durch den Wahrscheinlichkeitsraum aller möglichen Phylogenien, wobei es Bäume proportional zu ihrer Wahrscheinlichkeit sammelt. Die ersten Bäume, die das Programm berechnet, liegen wahrscheinlich weit von den Regionen hoher Wahrscheinlichkeit entfernt. Deshalb verwirft man bei Bayesschen Analysen die ersten 10000 bis 100000 Schritte als so genannte ‚Burn‐in’ Phase. Um die Chance zu erhöhen, dass die Analyse im optimalen Bereich der Wahrscheinlichkeit konvergiert, lässt man meist mehrere Markov‐Ketten gleichzeitig laufen. Die Bayessche Methode hat gegenüber anderen Verfahren

61 Material und Methoden entscheidende Vorteile und ist deshalb sehr populär geworden. So ist die Methode extrem schnell, obwohl hunderttausende oder Millionen von Bäumen berechnet werden. Zur Rekonstruktion der Verwandtschaftsverhältnisse wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das Programm MrBayes Version 3.1.2 (Huelsenbeck und Ronquist 2001, Ronquist und Huelsenbeck 2003) benutzt. Dabei wurde das mit dem Programm MrModeltest 2.3 (Nylander 2004) ermittelte Substitutionsmodell verwendet.

2.10.4.4.3.2.2 Maximum-Likelihood-Verfahren Maximum‐Likelihood‐Verfahren (ML) werden benutzt, um unbekannte Parameter zu schätzen, von denen eine bestimmte Wahrscheinlichkeitsfunktion für einen stochastischen Prozess abhängt. Dabei wird im Allgemeinen ein bestimmtes Modell der Merkmalsevolution vorausgesetzt (Baumtopologie, Astlängen, Substitutionsparameter) und auf dieser Grundlage errechnet, wie wahrscheinlich das Zustandekommen dieser Baumstruktur ist. Mit dem ML‐Verfahren wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der eine Sequenz in eine andere umgewandelt wird, wobei gilt: Je größer der Wahrscheinlichkeitswert, mit der eine Sequenz in die andere umgewandelt wird, umso näher sind diese miteinander verwandt (Felsenstein 1973, 1988). Die Hypothese, welche die höchste Wahrscheinlichkeit aufweist, wird für die plausibelste gehalten. Die ML‐Analysen wurden mit dem Programm PAUP* Version 4b.10 (Swofford 2003) durchgeführt. Dabei wurden die mit dem Programm Modeltest Version 3.7 (Posada und Crandall 1998) ermittelten Parameter verwendet. Auf eine Bootstrap‐Analyse wurde verzichtet, da das ML‐Verfahren rechen‐ intensiv ist und sehr viel Zeit in Anspruch nimmt. Die Berechnung eines einzelnen Datensatzes benötigt dabei oft mehr als 24 h.

2.10.4.4.4 Wahl des Substitutionsmodells Da der Evolutionsprozess ein hochkomplexer, noch nicht in seiner Vollständigkeit verstandener Vorgang ist, müssen die Betrachtungen, die in die Rekonstruktion mit einfließen, immer eine Vereinfachung der Wirklichkeit sein. Dabei bedient man sich sog. Evolutions‐ bzw. Substitutionsmodelle, welche Evolution als einen zufälligen Prozess ansehen, bei dem mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit Nucleotide der DNA durch andere ausgetauscht werden. Je komplizierter ein Modell ist, desto genauer spiegelt es normalerweise die Wirklichkeit wider, aber desto größer ist auch die Gefahr, dass die Annahmen des Modells in der Wirklichkeit nicht zutreffen. Distanzbasierte Verfahren sowie die Bayessche Analyse und die ML‐Methode bieten die Möglichkeit, sich aufgrund eines statistischen Kriteriums zwischen verschiedenen Substitutionsmodellen zu entscheiden, durch welche eine Gewichtung der Substitutionsereignisse vorgenommen wird.

62 Material und Methoden

Beim einfachsten Substitutionsmodell (Jukes und Cantor 1969) wird angenommen, dass die Substitutionsraten zwischen allen vier Nucleotiden die gleichen Wahrscheinlichkeiten besitzen. In der Wirklichkeit unterscheiden sich in der Regel jedoch die Transitions‐ und Transversionsraten, was im Kimura 2‐Parameter Modell (Kimura 1980) berücksichtigt wird. Zusätzlich treten die Nucleotide meist in unterschiedlichen Verhältnissen auf, wodurch die Substitutionsraten zusätzlich beeinflusst werden können. So wird im HKY‐Modell – neben unterschiedlichen Transitions‐ / Transversionsraten – eine variable Basenhäufigkeit vorausgesetzt (Hasegawa et al. 1985). Im GTR‐Modell (engl. general time reversibel) geht man von einer variablen Basenhäufigkeit sowie von unterschiedlichen Raten für alle Arten von Substitutionen aus. Bei all diesen Modellen wird jedoch angenommen, dass die Substitutionsrate für alle Merkmale die gleichen sind. Jedoch besitzen Sequenzen meist Bereiche, die sehr konserviert sind, während in anderen Bereichen Substitutionen häufiger auftreten. Diese Variationen können mit Hilfe zusätzlicher Modelle modelliert werden. Die am häufigsten verwendeten Verfahren sind dabei die Gamma‐ Verteilung, bei der eine Variation der Substitutionshäufigkeiten zwischen ver‐ schiedenen Regionen angenommen wird (Gu und Zhang 1997), und der Modellierung des Anteil invariabler Merkmale im Gesamt‐Alignment. Die Wahl des Substitutionsmodells für die Analysen wurde durch einen ‚Likelihood ratio’‐Test begründet (Huelsenbeck und Crandall 1997, Huelsenbeck und Rannala 1997, Posada und Crandall 1998). Dieser Test stellt eine Möglichkeit der objektiven Beurteilung zur Auswahl eines Substitutionsmodells dar. Anhand der Test‐ ergebnisse kann so beurteilt werden, ob die Anwendung zusätzlicher Parameter zu einer besseren Anpassung der Topologie an den vorliegenden Datensatz führt. Ergibt sich keine signifikante Verbesserung, so sollte das weniger komplexe Modell als Grundlage für die Stammbaumerstellung dienen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden für die Bestimmung der Substitutionsmodelle die Programme Modeltest Version 3.7 (Posada und Crandall 1998) und MrModeltest 2.3 (Nylander 2004) mit der graphischen Benutzer‐ oberfläche MrMTgui 1.0.1 verwendet. Gleichzeitig wurden dabei auch die Basen‐ frequenzen und weitere Parameter für die Rekonstruktion der Verwandtschafts‐ verhältnisse ermittelt.

2.10.4.4.5 Abschätzen des Stichprobenfehlers mittels Bootstrapping Um die Zuverlässigkeit der rekonstruierten Stammbäume zu bewerten, wurde das Bootstrappingverfahren angewandt (Felsenstein 1985). Dabei werden aus dem vorliegenden Datensatz eine große Anzahl modifizierter Datensätze erzeugt. Für jedes dieser so genannten Pseudoreplikate wird anschließend unter dem gleichen Analyseverfahren der sparsamste Baum ermittelt. Dieser Prozess wird einige 100‐ bis mehrere 1000‐mal wiederholt und man erhält so eine große Zahl so genannter Bootstrap‐Bäume. Schließlich wird für jede Gruppierung von Taxa ausgezählt, wie häufig sie in den dabei ermittelten Bäumen vorkommt. Dabei ist die Annahme, dass eine Gruppierung eine monophyletische Gruppe darstellt, umso besser

63 Material und Methoden gestützt, je häufiger sie in den ermittelten Bäumen auftritt. Diese Häufigkeit wird in der Regel als Prozentwert angegeben und als Bootstrapwert bezeichnet. Per Übereinkunft wird davon ausgegangen, dass ein Bootstrapwert von 75‐80% eine gute Stütze für die Monophylie einer Gruppe darstellt. Jedoch erlaubt ein Bootstrapwert keine allgemeinen Aussagen über eine Monophyliewahrschein‐ lichkeit, sondern stellt nur einen Test für die Güte der Ergebnisse im Hinblick auf das vorliegende Datenmaterial und das gewählte Rekonstruktionsverfahren dar. Die mit dem Bootstrap‐Verfahren (oder ähnlichen Methoden) ermittelten Bäume können anschließend in einem Konsensusbaum zusammengefasst werden. Bei der Bildung eines Strikt‐Konsensusbaums werden nur Verzweigungen angezeigt, die in allen Bäumen gefunden werden können. Verzweigungen, die variieren, werden dabei nicht aufgelöst. Bei Konsensusbäumen nach dem Mehrheitsprinzip (majority rule) werden alle Verzweigungen miteinbezogen, die in der Mehrheit der berechneten Replikate erscheinen. Der Mehrheits‐Wert kann durch den Benutzer festgelegt werden, üblicherweise wird jedoch ein 50% Mehrheits‐Konsensusbaum berechnet.

2.10.4.4.6 Paarweiser Sequenzvergleich Die im Anhang dargestellten, paarweisen Sequenzdivergenzen (p‐Distanzen) wurden mit dem Programm MEGA 4.0.1 (Tamura et al. 2007) berechnet. Dabei wurden alle Merkmale im Alignment aus der Analyse ausgeschlossen, in denen eine Sequenz des Alignments eine Lücke zeigte (Option Complete Deletion). Daher fallen die Werte etwas geringer aus, als wenn man die einzelnen Sequenzen direkt paarweise miteinander vergleicht (Option Pairwise Deletion).

64 Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Vorbemerkung Während der Kultivierungsversuche mit dem Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T und dem Isolat Mtb. sp. 5a.1.13 – die beide deutlich strukturierte Kolonien auf GP‐Agar hervorbrachten (siehe Abbildung 3.2 und Abbildung 3.10) – konnten Klone isoliert werden, die diese charakteristische Koloniemorphologie nicht mehr ausbildeten. Die Kolonien der Klone wuchsen auf GP‐Agar nahezu halbrund und glattrandig. Sie besaßen – im Gegensatz zu den Wildtyp‐Kolonien – eine relativ glatte Oberfläche und konnten wesentlich besser von der Agaroberfläche abgenommen und suspendiert werden als die Wildtyp‐Stämme. Weitere Untersuchungen (siehe Ergebnisse dieser Arbeit) zeigten, dass dies auf eine verringerte Produktion exopolymerer Substanzen durch die Bakterien zurückgeführt werden kann. Die Klone wurden im weiteren Verlauf der Arbeit daher als Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ und Mtb. sp. 5a.1.13EPS‐ bezeichnet. Wurden die Kolonien weiter überimpft blieb dieser Phänotyp bei Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ stabil erhalten. Der Biofilm‐negative Klon Mtb. sp. 5a.1.13EPS‐ revertierte zum Teil wieder zum Ursprungsphänotypen, jedoch zeigte die Mehr‐ zahl der Klone von Mtb. sp. 5a.1.13EPS‐ auch nach öfterem Überimpfen die Biofilm‐ negative Kolonieform. Die Identität der Klone wurde durch Sequenzierung der 16S rDNA‐ und des mxaF‐Gens (nur bei Mtb. adhaesivum) überprüft und bestätigt.

3.2 Zusammensetzung der verwendeten Minimalmedien Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Bakterien auf unterschiedlichen Minimal‐Nähragarböden kultiviert um die Biofilmbildung auf festen Substraten zu untersuchen. Dabei zeigten sich bei manchen Stämmen auffallende Unter‐ schiede in der Morphologie der Kolonien, je nachdem welches Medium benutzt wurde. Um die Zusammensetzung der Medien besser vergleichen zu können, wurden die Molaritäten der verwendeten Chemikalien berechnet und in Tabelle 3.1 (nächste Seite) zusammengefasst.

3.3 Bestimmung der Zellzahl einer Suspension mit OD600 = 0,1 Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten mussten des Öfteren Bakterien‐ suspensionen mit einer definierten Anzahl an Zellen erstellt werden. Daher wurde bei den ersten Versuchsreihen parallel zur direkten Auszählung der Bakterien mit einer Zählkammer nach Thoma die Absorption der Suspensionen bei 600 nm bestimmt. Damit konnte bei späteren Versuchen die Lebend‐Zellzahl durch eine Messung der OD600 abgeschätzt, und auf die direkte Zählung verzichtet werden. Dies war vor allem bei großen Ansätzen mit > 10 Isolaten eine große Zeitersparnis und funktionierte zuverlässig solange frisches Zellmaterial verwendet wurde. Als Inokulum dienten Kolonien von R2A‐Agar die 7‐10 d bei 28 °C bebrütet wurden.

65 Ergebnisse

Tabelle 3.1: Vergleich der Zusammensetzungen der verwendeten Minimalmedien. Fett hervorgehoben wurden jeweils die höchsten Konzentrationen. Unterstrichen: niedrigste Konzentrationen.

Methylobacterium‐ ATCC Medium 784 Medium nach Medium 3 Medium 4

Medium (DSM125) (AMS) Choi et al. (1989) (Bourque et al. 1995) (Bourque et al. 1995) Methanola 123,28 mM 123,28 mM 123,28 mM 246,55 mM 246,55 mM KNO3 9,89 mM ‐ ‐ ‐ ‐ NH4Cl ‐ 9,35 mM ‐ ‐ ‐ (NH4)2SO4 ‐ ‐ 7,57 mM 11,35 mM 11,35 mM KH2PO4 ‐ 3,97 mM 9,59 mM 9,59 mM 9,59 mM K2HPO4 ‐ 4,02 mM ‐ ‐ ‐ NaH2PO4 0,58 mM ‐ ‐ ‐ ‐ Na2HPO4 1,62 mM ‐ 15,00 mM 15,00 mM 15,00 mM CaCl2 0,14 mM 1,36 mM 0,02 mM 0,14 mM 0,14 mM MgSO4 0,81 mM 4,06 mM 1,83 mM 1,83 mM 1,83 mM FeSO4 3,60 μM 14,39 μM 4,68 μM 71,94 μM 71,94 μM MnCl2 ‐ 0,15 μM ‐ ‐ ‐ MnSO4 0,04 μM ‐ 0,59 μM 28,99 μM 86,97 μM ZnSO4 0,24 μM 0,35 μM 0,45 μM 9,04 μM 27,13 μM CuCl2 ‐ 0,06 μM ‐ ‐ ‐ CuSO4 0,02 μM ‐ 0,16 μM 3,20 μM 9,61 μM NiCl2 ‐ 0,08 μM ‐ ‐ ‐ Na2MoO4 0,07 μM 0,25 μM 0,17 μM 3,31 μM 9,92 μM CoCl2 ‐ 0,84 μM 0,17 μM 3,36 μM 10,09 μM H3BO3 0,16 μM 4,85 μM 0,49 μM 9,70 μM 29,11 μM a angegeben wurde die vorgeschlagene Menge an Methanol. Nach Bourque et al. (1995) wurden Medium 3 und Medium 4 mit einer initialen Methanolkonzentration von 1,0 % (v/v) für Agarnährboden (siehe Wert in Tabelle) und 0,5 % (v/v) für Flüssigkultivierungen (vgl. Medium nach Choi et al. 1989) verwendet.

In Tabelle 3.2 sind die ermittelten Lebend‐Zellzahlen unterschiedlicher Mtb.‐ Isolate und Typstämme auf verschiedenen Festmedien zusammengefasst. Die Medien reichen dabei von einem Minimalmedium mit Methanol als Kohlenstoff‐ quelle über drei unterschiedliche Komplexmedien, die sich vor allem in der Konzentration der verfügbaren Nährstoffe unterscheiden. Außer dem Stamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T – der kein Wachstum auf GP‐ Agar zeigte – bildeten alle Stämme auf den unterschiedlichen Nährmedien eine relativ konstante Menge an Kolonien aus (siehe Tabelle 3.2 und Abbildung 3.1). Pro ml Bakteriensuspension einer OD600 von 0,1 konnten durchschnittlich etwa 2,5∙107 CFU auf Agarmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol sowie auf R2A‐Agar erhalten werden. Auf Nutrient‐Agar zeigten viele Stämme mit durchschnittlich 2,6∙107 Kolonien die größte Zahl an Kolonien. Die geringste Anzahl an Kolonien bildeten die Methylobacterium‐Stämme durchschnittlich auf GP‐Medium nach Green und Bousfield (1982). Neben Mtb. mesophilicum DSM 1708T, der auf diesem Medium kein Wachstum zeigte, wurde das Auskeimen des Stamms Mtb. adhaesivum (Wildtyp und EPS‐negativ‐Klon) deutlich verringert. Auch die Isolate F3.2, F2.1 und 5a.1.5 bildeten auf GP‐Medium weniger Kolonien als auf den anderen getesteten Agarnährböden. Die meisten Kolonien konnten bei Mtb. jeotgali S2R03‐9T beobachtet werden (durchschnittlich 4,1∙107 CFU/ml); die wenigsten Kolonien keimten beim Stamm Mtb. goesingense iEII3 aus (durchschnittlich 1,5∙107 CFU/ml).

66 Ergebnisse

Tabelle 3.2: Lebend‐Zellzahlen (in CFU/ml ± Standardfehler vom Mittelwert) einer Bakterienlösung mit OD600=0,1 auf unterschiedlichen Festmedien (n≥4). Abkürzungen: Stdf., Standardfehler vom Mittelwert.

Medium nach R2A‐Agar Nutrient‐Agar GP‐Agar Choi et al. (Reasoner und Stamm / Isolat (DSMZ (Green und (1998) mit 1% Geldreich, Medium 1) Bousfield, 1982) MeOH (v/v) 1985) Mtb. sp. JT1 1,7∙107±0,5∙107 1,9∙107±0,4∙107 2,4∙107±0,7∙107 1,8∙107±0,5∙107 Mtb. sp. 5b.2.20 1,8∙107±0,4∙107 1,9∙107±0,3∙107 1,9∙107±0,5∙107 2,0∙107±0,3∙107 Mtb. sp. 1b.3 1,7∙107±0,3∙107 1,8∙107±0,3∙107 1,6∙107±0,4∙107 1,5∙107±0,3∙107 Mtb. sp. F3.2 2,2∙107±0,6∙107 2,4∙107±0,6∙107 2,7∙107±0,9∙107 1,7∙107±0,4∙107 Mtb. sp. F2.1 1,8∙107±0,3∙107 1,9∙107±0,3∙107 2,1∙107±0,6∙107 1,6∙107±0,4∙107 Mtb. sp. 5a.1.5 1,9∙107±0,4∙107 2,4∙107±0,4∙107 2,2∙107±0,6∙107 1,4∙107±0,5∙107 Mtb. sp. 1c.1 3,2∙107±0,3∙107 3,6∙107±0,4∙107 3,4∙107±0,6∙107 3,0∙107±0,3∙107 Mtb. adhaesivum DSM 17169T 2,0∙107±0,3∙107 2,5∙107±0,4∙107 2,8∙107±1,1∙107 0,9∙107±0,2∙107 Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ 2,5∙107±0,7∙107 2,5∙107±0,5∙107 2,1∙107±1,0∙107 0,8∙107±0,3∙107 Mtb. fujisawaense DSM 5686T 3,8∙107±0,5∙107 3,4∙107±0,4∙107 3,3∙107±0,9∙107 3,2∙107±0,4∙107 Mtb. goesingense iEII3 1,6∙107±0,5∙107 1,5∙107±0,3∙107 1,5∙107±0,5∙107 1,4∙107±0,3∙107 Mtb. jeotgali S2R03‐9T 3,9∙107±0,7∙107 4,6∙107±0,8∙107 4,1∙107±0,1∙107 3,7∙107±0,6∙107 Mtb. mesophilicum DSM 1708T 2,5∙107±0,4∙107 3,1∙107±0,6∙107 2,4∙107±0,5∙107 kein Wachstum Mtb. radiotolerans DSM 1819T 4,0∙107±0,8∙107 3,3∙107±0,6∙107 3,2∙107±0,9∙107 3,3∙107±0,7∙107 Gesamtmittelwert ± Stdf. 2,5∙107±0,2∙107 2,6∙107±0,2∙107 2,6∙107±0,2∙107 1,9∙107±0,3∙107

Abbildung 3.1: Graphische Darstellung der Lebend‐Zellzahlen pro ml (CFU/ml) von

Bakteriensuspensionen einer OD600 von 0,1 auf unterschiedlichen Agarnährböden. Symbole: , Medium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol; , R2A‐Agar nach Reasoner und Geldreich (1985); , Nutrient‐Agar; , GP‐Agar nach Green und Bousfield (1982). Zuordnung der Stämme / Isolate: 1, Mtb. sp. JT1; 2, Mtb. sp. 5b.2.20; 3, Mtb. sp. 1b.3; 4, Mtb. sp. F3.2; 5, Mtb. sp. F2.1; 6, Mtb. sp. 5a.1.5; 7, Mtb. sp. 1c.1; 8, Mtb. adhaesivum DSM 17169T; 9, Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐; 10, Mtb. fujisawaense DSM 5686T; 11, Mtb. goesingense iEII3; 12, Mtb. jeotgali S2R03‐9T; 13, Mtb. mesophilicum DSM 1708T; 14, Mtb. radiotolerans DSM 1819T.

67 Ergebnisse

3.4 Vergleich verschiedener mutmaßlicher Mtb. mesophilicum Isolate Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden fünf verschiedene putative Mtb. mesophilicum Isolate ausgewählt (siehe Tabelle 3.3), die im Hinblick auf ihre Biofilmbildung untersucht werden sollten. Die Spezies‐Zuordnung der Stämme erfolgte dabei durch das PCR‐basierte Nachweisverfahren von Nishio et al. (1997) und einen Vergleich der partiellen 16S rDNA‐Sequenzen. Tabelle 3.3: Auflistung der putativen Methylobacterium mesophilicum‐Isolate mit Referenzen.

Isolat / Stamm Referenz Mtb. mesophilicum DSM 1708T Austin und Goodfellow 1979, Green und Bousfield 1983 Mtb. sp. JT2 Thomas 2003, Schauer 2004, Kikutt 2006 Mtb. sp. Fu5 Hornschuh 2001, Kikutt 2006 Mtb. sp. 5a.1.13 Schauer 2004, Schauer und Kutscher 2008 Mtb. sp. 1c.5 Schauer 2004, Schauer und Kutscher 2008

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden vor allem die Isolate 1c.5 und 5a.1.13 untersucht. Die Stämme JT2 und Fu5 wurden in einer assoziierten Diplomarbeit von Kikutt (2006) näher charakterisiert. Als Vergleichsorganismus für die Versuche diente der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T.

3.4.1 Biofilmbildung auf Standard-Agarnährböden Das Rhizosphärenisolat Mtb. sp. 5a.1.13 bildete auf GP‐Agar und AMS‐Agar mit 1,0 % Methanol als Kohlenstoffquelle charakteristisch strukturierte Kolonien aus, die stark an der Agaroberfläche hafteten und nur sehr schwer suspendiert werden konnten. Auf Medium 3‐ und Medium 4‐Agar (mit 1% Methanol) bildete der Stamm runde, relativ glatte Kolonien, die sich leichter suspendieren ließen. Im Gegensatz dazu bildete der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T auf allen Minimalmedien stets runde, glatte Kolonien aus, die leicht zu suspendieren waren. Auf GP‐Agar wuchs der Typstamm nur bei Inokulation mit einer hohen Zellzahl und zeigte dabei eine andere Morphologie als das Rhizosphärenisolat Mtb. sp. 5a.1.13 (siehe Abbildung 3.2, nächste Seite). Die Isolate 1c.5 (Schauer 2004) und Fu5 (Hornschuh 2001) zeigten auf den Standard‐Agarnährböden dieselbe Morphologie wie der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T (nicht dargestellt).

3.4.2 Zeitliche Entwicklung der Koloniemorphologie Um einen Überblick über die Entwicklung der Koloniemorphologie zu erhalten, wurden repräsentative Einzelkolonien über einen Zeitraum von 21 d fotografisch dokumentiert, wobei die ersten Kolonien nach 4‐5 d Bebrütung bei 28 °C sichtbar wurden. Alle Kolonien waren undurchsichtig und aufgrund der gebildeten Carotinoide rot pigmentiert. In Abbildung 3.3 wurde die Entwicklung der Kolonien von Mtb. mesophilicum DSM 1708T und den beiden Sonnenblumen‐Isolaten 5a.1.13 und 1c.5 von Tag 7 bis Tag 14 dargestellt.

68 Ergebnisse

Abbildung 3.2: Koloniemorphologie des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T und des putativen Mtb. mesophilicum Isolats 5a.1.13 auf unterschiedlichen Standard‐Agarnährböden nach 14 d Inkubation bei 28 °C. Nährmedien: GP‐Agar, Glycerol‐Pepton‐Festmedium nach Green und Bousfield (1982) mit 1,5 % Agar; Medium 4‐Agar (1,0 % MeOH), Medium 4‐Festmedium (nach Bourque et al. 1995) mit 1,5 % Agar und 1,0 % Methanol; AMS‐Agar (1,0 % MeOH), AMS‐ Festmedium mit 1,5 % Agar und 1,0 % (v/v) Methanol. Messbalken: 1 mm.

Der Typstamm der Spezies Mtb. mesophilicum bildete auf Minimalmedium mit Methanol als alleiniger Kohlenstoff‐ und Energiequelle runde, ganzrandige, knopf‐ bis leicht kegelförmige Kolonien mit glänzender, glatter Oberfläche, die nach 14 d Inkubation bei 28 °C einen Durchmesser von 2‐3 mm besaßen. Auf GP‐Agar bildete der Typstamm runde, ganzrandige Kolonien aus, die flach wuchsen und eine matte Oberfläche besaßen. Die Oberfläche der Kolonien des Typstamms auf GP‐Agar zeigte am Anfang ihrer Entwicklung meist eine leichte, gewellte Strukturierung der Oberfläche (siehe Abbildung 3.3, Reihe 1c). Im Laufe der Kolonieentwicklung schwächte sich die Strukturierung meist noch etwas ab, so dass fast glatte Kolonien erhalten wurden (Abbildung 3.2). Jedoch konnten in unabhängigen Versuchen leichte Unterschiede beobachtet werden. Diese Unter‐ schiede können evtl. auf einen unterschiedlichen initialen Wassergehalt der Agar‐ platten bzw. eine geringfügig andere Zusammensetzung zurückgeführt werden. Das Rhizosphärenisolat 5a.1.13 zeigte auf den in Abbildung 3.3 dargestellten Agarnährmedien jeweils eine unterschiedliche Koloniemorphologie. Auf AMS‐Agar bildete der Stamm kraterförmige Kolonien, die nach zwei Wochen etwa 1 mm Durchmesser besaßen. Die Kolonien konnten nach 4‐5 Tagen mit unbewaffnetem Auge erkannt werden und hatten zu diesem Zeitpunkt noch eine halbkugelige Form. Nach etwa 6‐8 Tagen konnten bereits erste Einbuchtungen in der Mitte der Kolonien beobachtet werden, die im Laufe der Entwicklung immer deutlicher hervortraten. Im Zentrum der Kolonien blieb nur ein relativ dünner

69 Ergebnisse

Bakterienfilm zurück, während sich am Rand der Kolonie ein Wulst/Ring auftürmte (siehe Abbildung 3.3, Reihe 2a). Nach 14 d hatten die Kolonien einen Durchmesser von etwa 2 mm. Auf Medium 4‐Agar bildete das Isolat 5a.1.13 runde, ganzrandige, erhabene Kolonien mit einer relativ glatten Oberfläche aus. Die Kolonien hatten nach zwei Wochen einen Durchmesser von etwa 3 mm und zeigten auf diesem Medium und Medium 3‐Agar keine besonderen Auffälligkeiten. Sie konnten – im Gegensatz zu Kolonien von einem der beiden anderen Nährmedien – relativ gut suspendiert werden. Die wohl interessanteste Morphologie zeigte der Stamm auf GP‐Agar (siehe Abbildung 3.3, Reihe 2c). Die Zellen bildeten dabei eine dreidimensionale, faltige Struktur aus, die an einen Medusen‐Kopf erinnerte (siehe Abbildung 3.7). Die Kolonien hatten ein konvexes Profil, einen unregelmäßigen Rand und einen Durchmesser von etwa 3 mm nach 14 d Inkubation bei 28 °C. Sie konnten nach 4‐5 Tagen Inkubation bei 28 °C mit unbewaffnetem Auge erkannt werden und zeigten zuerst eine nahezu halbkugelige Form. Wie auf AMS‐Agar konnte zunächst eine kleine Einbuchtung in der Koloniemitte erkannt werden (Tag 6‐7). Jedoch bildeten sich im Laufe der Entwicklung strangförmige Strukturen aus, die eine dreidimensionale, faltige Koloniemorphologie entstehen ließen. Das Isolat 1c.5 zeigte eine mit dem Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T vergleichbare Entwicklung der Koloniemorphologie auf allen getesteten Nähr‐ böden. Auf den beiden Minimalmedien (AMS‐ und Medium 4‐Agar) bildete das Isolat runde, nahezu konvexe, ganzrandige Kolonien mit glatter, glänzender Ober‐ fläche (siehe Abbildung 3.3, Reihe 3a und b) die nach 14 d Inkubation bei 28 °C einen Durchmesser von etwa 2‐3 mm besaßen. Auch auf GP‐Agar zeigte das Isolat 1c.5 eine mit dem Typstamm vergleichbare Kolonieentwicklung, wobei nach 14 d Inkubation runde, ganzrandige, leicht erhabene Kolonien mit einer leicht gewellten, matten Oberfläche vorlagen (siehe Abbildung 3.3, Reihe 3c). Zusätzlich wurde für den Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T sowie die Isolate 5a.1.13 und 1c.5 täglich die Fläche einzelner Kolonien vermessen, um den Zeitpunkt zu bestimmen, ab dem die Kolonie nur noch wenig wächst. In Abbildung 3.4 wurden die ermittelten Daten für den Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T graphisch dargestellt. Als Ausgangswert wurde die Fläche 5 d alter Kolonien ermittelt und die Flächenzunahme (in %) zum darauf folgenden Tag berechnet. Dabei zeigte sich, dass die Koloniefläche vor allem bis zum 9ten Tag nach Beimpfung der Platten deutlich an Fläche zunahm. Jedoch lag der Flächenzuwachs der Kolonien zwischen Tag 9 und 14 je nach Medium immer noch zwischen 20‐50 % gegenüber dem Vortag (Medium 4‐ und GP‐Agar). Ab dem 14ten Tag lag der Flächenzuwachs der Kolonien gegenüber dem Vortag unter 20 %. Auch die Morphologie der Kolonien änderte sich nach 14 d Inkubation nicht mehr grundlegend. Daher wurden die meisten Experimente nach spätestens 14 d Inkubation ausgewertet.

70 Ergebnisse

Abbildung 3.3: Zeitliche Entwicklung der Koloniemorphologie verschiedener putativer Mtb. mesophilicum Stämme auf unterschiedlichen Nährböden. Messbalken: 1 mm. Reihe 1a, Mtb. mesophilicum DSM 1708T auf AMS‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 1b, Mtb. mesophilicum DSM 1708T auf Medium 4‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 1c, Mtb. mesophilicum DSM 1708T auf GP‐Agar; 2a, Mtb. sp. 5a.1.13 auf AMS‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 2b, Mtb. sp. 5a.1.13 auf Medium 4‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 2c, Mtb. sp. 5a.1.13 auf GP‐Agar; 3a, Mtb. sp. 1c.5 auf AMS‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 3b, Mtb. sp. 1c.5 auf Medium 4‐Agar mit 1,0 % Methanol (v/v); 3c, Mtb. sp. 1c.5 auf GP‐Agar.

71 Ergebnisse

Abbildung 3.4: Zeitliche Abhängigkeit der Flächenzunahme (ΔA) einzelner Kolonien von Mtb. mesophilicum DSM 1708T auf Standard‐Nähragarmedien gegenüber dem Vortag in Prozent (n=4). Die Isolate 1c.5 und 5a.1.13 zeigten eine ähnliche zeitliche Abhängigkeit der Kolonieentwicklung und wurden daher nicht dargestellt.

3.4.3 Biofilmbildung auf modifizierten Nährmedien Da das Rhizosphärenisolat Mtb. sp. 5a.1.13 auf den definierten Minimalmedien AMS und Medium 4 (nach Bourque et al. 1995) verschiedenartige Kolonie‐ morphologien hervorbrachte, sollte(n) die Komponente(n) des Nährmediums ermittelt werden, durch welche diese Unterschiede verursacht werden.

3.4.3.1 Modifikation der Ca2+-Konzentration Bei einem Vergleich der Nährmedien‐Zusammensetzungen (siehe Kapitel 3.1) fiel zuerst die hohe Calciumkonzentration von AMS auf, wobei Medium 4 (nach Bourque et al. 1995) nur etwa 1/10 dieser Menge enthält. Zusätzlich wurde vermutet, dass Calcium als zweiwertiges Ion eine Rolle bei der Ausprägung und Verknüpfung der Biofilmmatrix spielen könnte. Jedoch brachte eine Erniedrigung der Calcium‐Konzentration in AMS‐Medium auf 0,14 mM, bzw. eine Erhöhung der Konzentration in Medium 4 (nach Bourque et al. 1995) auf 1,36 mM keine signifikante Änderung der Koloniemorphologie mit sich.

3.4.3.2 Modifikation der Fe2+-Konzentration Die Konzentration an verfügbarem Eisen spielt bei der Biofilmbildung und Anheftung einiger Bakterien eine wichtige Rolle (Banin et al. 2005, Baldassarri et al. 2001, Scharfman et al. 1996, Moreira et al. 2003). Da Medium 4 (nach Bourque et al. 1995) etwa fünfmal soviel Eisensulfat enthält wie AMS‐Medium wurde auch die Konzentration dieser Komponente wechselseitig ausgetauscht.

72 Ergebnisse

Dennoch konnte kein signifikanter Einfluss auf die Struktur der Kolonien festgestellt werden. Kolonien die auf eisenhaltigem Medium kultiviert wurden, zeigten jedoch eine deutlichere Pigmentierung als Kolonien auf Medium mit verringertem Eisengehalt.

3.4.3.3 Modifikation der Mn2+-Konzentration Auch das Spurenelement Mangan wird in AMS‐Medium und Medium 4 in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. AMS‐Medium enthält etwa 0,15 μM Manganchlorid, während in Medium 4 etwa 87 μM Mangansulfat enthalten sind. Dies entspricht einem Konzentrationsunterschied mit einem Faktor von etwa 580. Jedoch konnte auch hier durch das wechselseitige Austauschen der Konzentrationen keine signifikante Änderung der Koloniemorphologie beobachtet werden.

3.4.3.4 Modifikation der Stickstoffkonzentration Wurden die Salzlösungen der beiden Medien AMS und Medium 3 (Zusammen‐ setzung und Herstellung siehe Kapitel 2.7.1.1 und 2.7.1.4) ausgetauscht, konnte auch ein Wechseln der Koloniemorphologie des Isolats Mtb. sp. 5a.1.13 beobachtet werden. Da die Salzlösungen nur Stickstoff‐ und Phosphatquelle enthalten wurde in den folgenden Versuchen die Stickstoffkonzentration im Nähragar variiert. Für diese Experimente wurde als Basis das Medium nach Choi et al. (1989) verwendet, da aufgrund der hohen Calciumkonzentration in AMS‐Medium sowie der hohen Eisenkonzentration in Medium 4 (Bourque et al. 1995) oft schwerlösliche Salz‐ ausfällungen auftraten. Da diese beiden Nährelemente jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Morphologie der Kolonien hatten (siehe oben) und Medium 3 (Bourque et al. 1995) auf dem Medium von Choi et al. (1989) basiert, brachte diese Umstellung keine experimentellen Probleme mit sich. Für die Versuche wurden Stickstoffkonzentrationen von 1 mM (NH4)2SO4 bis zu 50 mM (NH4)2SO4 getestet. Zusätzlich wurden auch einige Konzentrationen mit Nitrat (KNO3) getestet um den Einfluss der Stickstoffquelle auf die Koloniemorphologie zu untersuchen. Dabei zeigte sich, dass die Oberflächen‐Struktur der Kolonien des Isolats Mtb. sp. 5a.1.13 deutlich von der verfügbaren Menge an Stickstoff abhängig ist. Auf den Medien mit 1 mM Ammoniumsulfat bildete der Stamm strukturierte, krater‐ förmige Kolonien aus. Wurde die Konzentration an verfügbaren Stickstoff erhöht, so bildeten sich kompaktere, nahezu halbkugelige Kolonien, die auch leichter zu suspendieren waren, als Kolonien von stickstoffarmen Medium. Der Übergang der Morphologie fand dabei nicht sprunghaft statt, sondern es konnte ein gradueller Übergang beobachtet werden (siehe Abbildung 3.5). Ab einer Konzentration von etwa 10 mM Ammoniumsulfat und mehr wuchsen dabei nahezu halbkonvexe Kolonien heran. Auf die Koloniemorphologie des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T hatte die Variation der Stickstoffkonzentration nur geringen Einfluss. Der Stamm bildete auf allen getesteten Ammoniumsulfat‐ (0,5 mM, 1 mM, 10 mM, 20 mM,

73 Ergebnisse

25 mM, 50 mM) und Kaliumnitratkonzentrationen (10 mM) halbkonvexe, ganzrandige Kolonien mit glatter und glänzender Oberfläche. Lediglich die Größe der Kolonien nahm mit steigender Stickstoffkonzentration ab. Dies kann wahrscheinlich auf eine Hemmung der Wachstumsrate zurückgeführt werden. So konnten Bourque et al. (1995) und Oh et al. (1996) bei einer Ammoniumionen‐ Konzentration von etwa 90 mM eine Halbierung der maximalen Wachstumsraten von Mtb. extorquens ATCC 55366 bzw. Mtb. organophilum NCIMB 11278T nachweisen. Die Art der Stickstoffquelle (Ammonium vs. Nitrat) zeigte bei beiden Stämmen keinen signifikanten Einfluss auf die Morphologie der Kolonien.

Abbildung 3.5: Einfluss der Stickstoffkonzentration in Nährmedium nach Choi et al. (1989), mit 1,0 % Methanol als Kohlenstoffquelle, auf die Koloniemorphologie vom Mtb. sp. 5a.1.13. Die Agar‐ medien wurden für 14 d bei 28 °C inkubiert (n>3). Abgebildet wurden repräsentative Kolonien eines Einzelversuchs. Messbalken: 1 mm.

3.4.3.5 Modifikation des C:N:P-Verhältnisses Nach den Ergebnissen zum Einfluss der Stickstoffverfügbarkeit auf die Koloniemorphologie der putativen Mtb. mesophilicum‐Isolate wurde abschließend in einem Einzelversuch zusätzlich zur Stickstoffkonzentration, die Konzentration an Phosphat‐ und Kohlenstoffquelle variiert. Dabei wurden folgende Kombinationen getestet:

Tabelle 3.4: getestete Variationen des C:N:P‐Verhältnis. Alle nicht variierenden Medienzusätze wurden wie im Medium nach Choi et al. (1989) verwendet.

Methanol (NH4)2SO4 KH2PO4 / Na2HPO4 C:N:P‐Verhältnis 0,1 % (ca. 25 mM) 1 mM 1 mM 25:2:1 1,0 % (ca. 250 mM) 1 mM 1 mM 250:2:1 1,0 % (ca. 250 mM) 10 mM 1 mM 250:20:1 1,0 % (ca. 250 mM) 25 mM 1 mM 250:50:1 0,1 % (ca. 25 mM) 1 mM 10 mM 25:2:10 1,0 % (ca. 250 mM) 1 mM 10 mM 250:2:10 1,0 % (ca. 250 mM) 10 mM 10 mM 250:20:10 1,0 % (ca. 250 mM) 25 mM 10 mM 250:50:10 0,1 % (ca. 25 mM) 1 mM 25 mM 25:2:25 1,0 % (ca. 250 mM) 1 mM 25 mM 250:2:25 1,0 % (ca. 250 mM) 10 mM 25 mM 250:20:25 1,0 % (ca. 250 mM) 25 mM 25 mM 250:50:25

74 Ergebnisse

Der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T bildete auf allen angebotenen Nährmedien runde, erhabene bis leicht konvex‐kegelförmige, ganzrandige Kolonien mit glatter, glänzender Oberfläche. Teilweise konnte ein kleiner zentraler Höcker beobachtet werden (siehe Abbildung 3.6A, 10 mM (NH4)2SO4 mit 10 mM / 25 mM Phosphat). Bei niedrigem Phosphatangebot zeigten die Kolonien ein leicht kegelförmiges Profil, während die Kolonien bei höheren Phosphatkonzentrationen eher ein erhabenes Profil aufwiesen. Die Kolonien hatten nach 14 d Inkubation einen Durchmesser von etwa 2‐3 mm, wobei eine niedrige Konzentration an Methanol (0,1 %) die Ausbreitung der Kolonien eher zu begünstigen schien. Das Isolat 5a.1.13 zeigte auf allen Nährböden mit 1 mM (NH4)2SO4 eine kraterförmige Koloniemorphologie, wobei die angebotene Menge an Kohlenstoff oder Phosphat nur eine geringfügige Rolle bei der Entwicklung der Kolonie‐ morphologie zu spielen scheint (siehe Abbildung 3.6B, Reihen 1 und 2). Jedoch bildete das Isolat auf Nährböden mit > 10 mM (NH4)2SO4, 1,0 % Methanol und 1 mM Phosphat runde, konvexe Kolonien mit einem leicht gewellten Rand und einer matten, rauen Oberfläche hervor. Mit der gleichen Menge an Kohlenstoff und Stickstoff, jedoch mit 10 mM Phosphat im Medium bildeten die Zellen des Stamms wieder kraterförmige Kolonien, die jedoch deutlich kompakter ausfielen, als auf den Agarnährböden mit nur 1 mM Ammoniumsulfat. Bei einer Phosphat‐ konzentration von 25 mM bildeten sich wieder kompaktere Kolonien, die jedoch im Gegensatz zu den Kolonien auf 1 mM Phosphat eine relativ glatte, glänzende Oberfläche besaßen. Zusätzlich zeigten sich „Reste“ der Kraterform in Gestalt einer kleinen, zentralen Einbuchtung (siehe Abbildung 3.6B, Reihe 1 und 2).

Abbildung 3.6: Einfluss des C:N:P‐Verhältnis auf die Koloniemorphologie des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T (A) und das Rhizosphärenisolat Mtb. sp. 5a.1.13 (B). Die Agarnährböden wurden für 14 d bei 28 °C inkubiert. Messbalken: 1 mm.

3.4.4 Wachstum mit Pantothenat Nach Urakami et al. (1984) stimuliert Calcium‐D‐Pantothenat das Wachstum der Spezies Mtb. mesophilicum, Mtb. radiotolerans und Mtb. fujisawaense. Pantothensäure (Vitamin B5) gehört zur Gruppe der B‐Vitamine und ist als Bestandteil von Coenzym A an vielen Reaktionen im Stoffwechsel beteiligt; dazu gehören beispielsweise der Auf‐ und Abbau von Kohlenhydraten. 75 Ergebnisse

Daher wurde das Wachstum des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T und der putativen Mtb. mesophilicum‐Isolate 1c.5 und 5a.1.13 auf Agar‐Festmedium (Medium 4 nach Bourque et al. 1995) sowie in Flüssigkultur (AMS‐Medium und Medium nach Choi et al. 1989) getestet. Die Versuche wurden mit einer Konzentration von 0,1 mM Ca‐Pantothenat im Medium durchgeführt. Nach Urakami et al. (1984) wird das Wachstum der betreffenden Stämme bereits durch 1,0 mg/l (~ 2 μM) maximal stimuliert, während bei 0,1 mg Pantothenat pro Liter nur eine geringe Wirkung erkannt werden kann. Bei den Versuchen auf Festmedium zeigte sich keinerlei Effekt auf das Wachstum oder die Morphologie der Stämme durch die Zugabe von Pantothenat. Bei der Kultivierung in flüssigem Minimalmedium mit 1,0 % Methanol als Kohlenstoffquelle zeigte sich jedoch eine deutliche Stimulation des Wachstums von Mtb. mesophilicum DSM 1708T sowie der Isolate 1c.5 und Fu5 durch Pantothen‐ säure. Zusätzlich bildeten die Stämme in Flüssigkultur mit Pantothenat stern‐ förmige Aggregate aus, während die Zellen ohne Vitaminzusatz vor allem einzeln vorlagen (siehe Abbildung 3.9). Auf das Wachstum der Isolate 5a.1.13 und JT2 hatte die Zugabe von Pantothenat keinen Einfluss. Der Stamm zeigte sowohl ohne als auch mit Ca‐Pantothenat ein relativ langsames Wachstum, das durch die Bildung eines Biofilms (Schüttelrand) an der Phasengrenze flüssig‐gasförmig gekennzeichnet war. Auch ohne Pantothenat bildete das Isolat viele Aggregate aus, die im Laufe der Kultivierung an Größe zunahmen und aus mehreren tausend Zellen bestehen konnten.

3.4.5 Analysen im Rasterelektronenmikroskop (SEM) Zur Strukturanalyse der Agarkolonien sowie der Zelloberflächen und Biofilm‐ matrix wurden rasterelektronenmikroskopische Studien mit dem Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T und dem Isolat 5a.1.13 durchgeführt.

3.4.5.1 Koloniemorphologie des Isolats Mtb. sp. 5a.1.13 Um die außergewöhnliche Morphologie des Isolats 5a.1.13 auf Agarnährböden zu analysieren wurden neben lichtmikroskopischen Bildern auch rasterelektronen‐ mikroskopische Aufnahmen fixierter Kolonien erstellt. In Abbildung 3.7 wurde eine repräsentative Kolonie des Isolats 5a.1.13 auf GP‐ Agar dargestellt. In der oberen Reihe wurde die Kolonie in vivo dargestellt. Durch die Verwendung von Durchlicht ließen sich die Strukturen der Kolonie deutlich besser darstellen (Abbildung 3.7B) als mit Auflichtbeleuchtung (Abbildung 3.7A). Abbildung 3.7C‐F zeigt die gleiche Kolonie nach Fixierung, Trocknung und Beschichtung im Rasterelektronenmikroskop. Die Kolonie wurde dabei nach der Trocknung auf einer Seite mechanisch zerstört um einen Einblick in das Innere der Kolonie zu ermöglichen (siehe Abbildung 3.7C). Abbildung 3.7D zeigt eine Detailaufnahme der Kolonieoberfläche. Dabei wird deutlich, dass die einzelnen Stränge voneinander abgetrennt vorliegen und nur an der Unterseite ein direkter Kontakt zur Gesamtkolonie besteht. In Abbildung 3.7E und F wurde die Kontakt‐ fläche zwischen zwei nebeneinanderliegenden Strängen dargestellt. Daraus wird

76 Ergebnisse ersichtlich, dass die einzelnen Stränge durch eine dünne Schicht nach außen begrenzt werden. Dieser Überzug bedeckte die Oberfläche der Bakterien‐Stränge fast komplett. An den Stellen an denen die Hülle etwas unterbrochen war, bildeten sich dünne Filamente aus derselben Substanz, aus der auch die Schleimschicht bestand. Die dünnsten Filamente besaßen einen Durchmesser von etwa 40 nm; die dickeren bis etwa 130 nm. Einige Zellen des Isolats zeigten warzenförmige Aufwüchse auf ihrer Oberfläche, die einen Durchmesser von 50‐130 nm aufwiesen. Auf einzelnen Zellen konnten bis zu 25 solcher Aufwüchse gezählt werden. In Abbildung 3.8 wurden die beiden Morphotypen des Isolats 5a.1.13 auf modifiziertem Medium nach Choi et al. (1989) mit 1 mM Ammoniumsulfat und 1,0 % Methanol dargestellt. Bei der linken, großen Kolonie handelt es sich um eine spontane Morphotyp‐Transition des ursprünglichen, kraterförmigen Morpho‐ typen, der auf der rechten Seite der Abbildung zu sehen ist (siehe Abbildung 3.8A und B). Die Zellen der Wildtyp‐Kolonie waren dabei in einem Netzwerk extra‐ zellulärer Fibrillen eingebettet (siehe Abbildung 3.8D). Der Durchmesser der Fibrillen lag etwa zwischen 30 und 100 nm. Auf der Oberfläche der – mehr oder weniger ungeordnet vorliegenden Zellen – konnten kleine warzenförmige Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 60‐130 nm beobachtet werden. Diese Aufwüchse verteilten sich scheinbar unregelmäßig auf der Bakterienoberfläche, jedoch konnten häufiger größere Anhäufungen dieser Appendices an den Zell‐ polen beobachtet werden. Die Zellen der spontanen Morphotyp‐Transition lagen scheinbar dichter gepackt in der entsprechenden Kolonie vor (siehe Abbildung 3.8C). Zwischen den Bakterien konnten wenige, relativ dünne und kurze, filamentöse Strukturen beobachtet werden, die einen Durchmesser von etwa 50‐90 nm aufwiesen. Im Gegensatz zum Wildtyp konnten keine Strukturen auf der Zelloberfläche beobachtet werden. Dennoch lagerten sich die Zellen bevorzugt über ihren Zellpole zusammen, wodurch sternförmige Aggregate entstanden.

77 Ergebnisse

Abbildung 3.7: Mikroskopische Studie einer repräsentativen Kolonie des Isolats Mtb. sp. 5a.1.13 auf GP‐Agar nach 14 d Inkubation bei 28 °C. A: Kolonie im Auflicht. B: Durchlichtbeleuchtete Kolonie zur Darstellung der Strukturen (Mess‐ balken bei A und B: 1 mm). C bis F: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der oben dar‐ gestellten Kolonie. Zur leichteren Orientierung wurden die Bereiche, die im folgenden Bild detaillierter dargestellt werden, mit einem schwarzen Rahmen markiert. Beschreibung siehe Text.

78 Ergebnisse

Abbildung 3.8: Mikroskopische Studie des Wildtyps des Isolats 5a.1.13 und einer spontanen

Morphotyp‐Transition auf modifiziertem Nähragar nach Choi et al. (1989) mit 1 mM (NH4)2SO4 und 1,0 % Methanol nach 14 d Inkubation bei 28 °C. A und B: Kolonien im Auflicht (A) und Durchlicht (B). Die rechte Kolonie stellt den Wildtyp mit der charakteristischen Kraterform dar). Links ist der abgeleitete Phänotyp des Isolats ausgekeimt. Messbalken: 1 mm. C: Detailansicht der Zellen des abgeleiteten Morphotyp (Beschreibung siehe Text). D: Detailansicht der Zellen des ursprünglichen Morphotyp (Beschreibung siehe Text).

3.4.5.2 Wachstum von Mtb. mesophilicum DSM 1708T mit Pantothenat In Abbildung 3.9 wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T, nach 6 d Wachstum in Flüssigmedium mit 1,0 % Methanol dargestellt. Abbildung 3.9A zeigt die Zellen nach Wachstum in Medium ohne Pantothenat‐ zugabe. Dabei lagen die Zellen vor allem einzeln oder in Gruppen aus 2‐3 Zellen zusammen. Wurde dem Nährmedium 0,1 mM Ca‐Pantothenat zugesetzt, war ein Großteil der Zellen in Aggregaten aus 20‐50 Zellen organisiert (Abbildung 3.9B). Die Zellen waren dabei polar angeordnet und über dünne Schleimfäden mit einem Durchmesser von etwa 20‐100 nm miteinander verbunden, die bevorzugt an den Enden der Bakterienzellen synthetisiert wurden. Über diese Fäden konnten die Bakterien zugleich an die Glasoberfläche des Deckglases binden. Auch ohne Pantothenat bildeten die Bakterien diese Fäden aus, jedoch in einem weitaus geringeren Umfang.

79 Ergebnisse

Auf den Zellen des Typstamms konnten – wie beim Isolat 5a.1.13 – vereinzelt kleine warzenförmige Aufwüchse mit einem Durchmesser von etwa 50‐100 nm beobachtet werden.

Abbildung 3.9: Raterelektronenmikroskopische Aufnahmen des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T aus 6 d alten Flüssig‐Schüttelkulturen (150 rpm) mit Medium 125 (1,0 % Methanol). Ohne Zugabe von Pantothenat lagen die Zellen vor allem einzeln oder paarweise vor (A). Wurde dem Medium 0,1 mM Ca‐Pantothenat zugesetzt, organisierte sich die Mehrzahl der Zellen in Aggregaten (B).

3.5 Biofilmbildung des Isolats JT1 und nahe verwandter Arten Die Biofilmbildung und das Wachstum des Isolats Mtb. sp. JT1 sowie einiger anderer ausgewählter Isolate wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit sowohl auf unterschiedlichen Agarnährböden als auch in Flüssigkultur untersucht und mit nahe verwandten Typstämmen verglichen.

3.5.1 Biofilmbildung auf Festmedium Die Biofilmbildung an der Phasengrenze fest‐gasförmig wurde auf Nährmedium‐ Platten untersucht, die standardmäßig mit 1,5 % Agar verfestigt wurden.

3.5.1.1 Standardnährböden Für die Versuche wurden Aliquots definierter Bakteriensuspensionen auf den Nährböden ausplattiert. So sollte gewährleistet werden, dass Einzelkolonien auskeimen die auf eine einzige Vorläuferzelle zurückgeführt werden können und sich gegenseitig nicht zu stark in ihrem Wachstum beeinflussen. Dabei konnten fast alle Stämme auf den angebotenen Nährböden auskeimen und Kolonien hervorbringen (siehe Abbildung 3.10 und Tabelle 3.2). Einzig der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T zeigte auf GP‐Medium nach Green und Bousfield (1982) kein Wachstum. Jedoch konnte der Stamm auf Nutrient‐Agar kultiviert werden, der etwas weniger Pepton enthält. Auch auf 0,5x konzen‐ triertem GP‐Agarnährboden zeigte der Stamm normales Wachstum. Wurde der Stamm mittels Dreistrich auf GP‐Platten überimpft, so keimten meist nur an den Stellen der Platte Kolonien aus, die mit sehr vielen Bakterien beimpft wurden.

80 Ergebnisse

Auch viele andere Mtb. spp. bildeten auf GP‐Agar kleinere Kolonien als auf Nutrient‐Agar. Bis auf den unpigmentierten Typstamm Mtb. jeotgali S2R03‐9T, der undurch‐ sichtige, beige‐weiß gefärbte Kolonien bildete, zeigten alle Stämme die für PPFMs charakteristische Pigmentierung, die je nach Stamm und Kultivierungs‐ bedingungen (Medium, Kultivierungsdauer, Sauerstoffverfügbarkeit, Belichtung etc.) von blass‐rosa bis tief‐rot reichte. Die Größe der Kolonien nach 14 d Inkubation bei 28 °C lag zwischen 1 und 3 mm. Der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T zeigte auf allen Nährmedien eine auffällig strukturierte Koloniemorphologie (siehe Abbildung 3.10, Reihe 1), die an die Morphologie des Stamms 5a.1.13 erinnerte (vgl. dazu Kapitel 3.4). Der Typstamm brachte auf allen Nährmedien mehr oder weniger strukturierte Kolonien hervor, wobei sich das Profil der Kolonien jedoch deutlich unter‐ schiedlich gestaltete. Auf GP‐Agar bildete der Stamm runde, konvexe Kolonien mit unregelmäßigem Rand und einer gefurchten, matten Oberfläche, die nach zwei Wochen Inkubation einen Durchmesser von etwa 2 mm besaßen. Auf Nutrient‐Agar, R2A‐Agar und Nähragar nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol bildete der Stamm runde, konvex‐kraterförmige Kolonien mit unregel‐ mäßigem Rand und einer strukturierten, matten Oberfläche. Die Kolonien erreichten dabei nach 14 d einen Durchmesser von etwa 1‐2 mm. Der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ zeigte im Gegensatz zum Typstamm auf allen Nährmedien kreisrunde, konvex‐erhabene, ganzrandige Kolonien mit glatter und glänzender Oberfläche (vgl. Abbildung 3.11B). Die Kolonien ließen sich wesentlich leichter von der Agaroberfläche abnehmen und suspendieren als Kolonien des Typstamms. Der Stamm Mtb. goesingense iEII3 bildete auf Medium nach Choi et al. (1989) mit Methanol als Kohlenstoffquelle nur sehr kleine, runde, konvexe, ganzrandige Kolonien mit einem Durchmesser von ca. 1 mm und glatter, glänzender Ober‐ fläche nach 14 d Inkubation bei 28 °C. Auf den Komplex‐Agarmedien R2A und GP wuchsen runde, erhabene bis konvexe, ganzrandige Kolonien mit meist glatter, glänzender Oberfläche. Teilweise bildete der Stamm leicht angedeutete, kreis‐ förmige Strukturen auf der Oberfläche der Kolonien (siehe Abbildung 3.10, 2B und C). Auf Nutrient‐Agar zeigte der Stamm eine strukturierte, relativ matte Oberfläche und ein mehr oder weniger deutlich ausgeprägtes kraterförmigen Profil. Mtb. jeotgali S2R03‐9T zeigte auf allen angebotenen Nährmedien ein rundes, erhabenes bis konvexes, ganzrandiges Koloniewachstum mit glatter, glänzender Oberfläche (siehe Abbildung 3.10, Reihe 4). Die Kolonien auf GP‐Agar und Minimalmedium mit 1,0 % Methanol erreichten dabei nach zwei Wochen Wachstum bei 28 °C einen Durchmesser von ca. 1 mm, auf R2A‐ und Nutrient‐ Agar wurden die Kolonien etwas größer (2‐3 mm) Die Typstämme Mtb. fujisawaense DSM 5686T (Abbildung 3.10, Reihe 3), Mtb. radiotolerans DSM 1819T (Abbildung 3.10, Reihe 6) und Mtb. mesophilicum DSM 1708T (Abbildung 3.10, Reihe 5) brachten auf den Nährmedien runde, erhabene bis

81 Ergebnisse konvexe, ganzrandige Kolonien mit glatter glänzender Oberfläche hervor. Jedoch keimte Mtb. mesophilicum DSM 1708T nicht auf GP‐Medium aus. Bei einigen Versuchen zeigten die Kolonien des Stamms Mtb. radiotolerans DSM 1819T auf R2A‐Agar eine leicht strukturierte Oberfläche (siehe Abbildung 3.10, 6B) und einen leicht erhöhten, glatten Wulst am äußeren Kolonierand. Das Lebermoos‐Isolat Mtb. sp. JT1 (Abbildung 3.10, Reihe 7) sowie das Isolat 5b.2.20 (Abbildung 3.10, Reihe 8), bildeten auf den getesteten Nährmedien eine identische Morphologie aus. Die Kolonien hatten eine runde Form mit ganzen Rändern und erhabenen Profil, wobei in der Koloniemitte oft eine leichter Höcker zu erkennen war. Die Oberfläche der Kolonien war stets glatt und glänzend. Der Durchmesser der Kolonien nach 14 Tagen Inkubation bei 28 °C lag auf allen Medien bei etwa 3 mm. Das Isolat 1b.3 (Abbildung 3.10, Reihe 9) – das nach Analyse der 16S rDNA sehr nahe mit den Isolaten JT1 und 5b.2.20 verwandt ist – zeigte auf den Nährmedien einen anderen Phänotyp. Auf Agarmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol bildete der Stamm runde, erhabene Kolonien mit ganzen Rändern und einer deutlich strukturierten, matten Oberfläche. Auf R2A‐Agar bildete der Stamm flach erhabene, Kolonien mit ganzem Rand und glatter, glänzender Oberfläche. Auf GP‐ und Nutrient‐Agar zeigte der Stamm runde, erhabene Kolonien mit einem leicht unregelmäßigem Rand und einer matt‐glänzenden Oberfläche, die meist etwas rau ausfiel. Über alle Versuchsdurchgänge gesehen zeigte der Stamm eine Koloniemorphologie, die an die Kolonie‐Phänotypen der Isolate F3.2, F2.1 und 5b.1.5 erinnerte. Die Isolate F3.2 (Abbildung 3.10, Reihe 10), F2.1 (Abbildung 3.10, Reihe 11) und 5a.1.5 (Abbildung 3.10, Reihe 12) zeigten eine einander sehr ähnliche Morphologie auf den unterschiedlichen Nährmedien. Auf R2A‐ und Nutrient‐Agar bildeten die Isolate runde, leicht kegelförmig‐erhabene, ganzrandige Kolonien mit glatter und glänzender Oberfläche. Auf GP‐Medium hatten die Kolonien auch eine runde Form und ein erhabenes Profil mit ganzen Rändern, jedoch war die Oberfläche der Kolonien matt‐glänzend und meist leicht angeraut. Alle drei Stämme brachten auf Agarmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol runde Kolonien mit einem kegelförmig‐erhabenen Profil, einem leicht unregelmäßigem Rand und einer matten, rauen Oberfläche hervor (siehe Abbildung 3.10, Reihe 10 und 12, Spalte A). Die in Abbildung 3.10 dargestellte Koloniemorphologie des Stamms F2.1 auf Nähragar nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol ist eher untypisch, zeigt jedoch in welchen Variationsbreiten die Ausbildung der Koloniemorphologie schwankte. Die Kolonien dieser drei Isolate hatten nach 14 Tagen Inkubation bei 28 °C einen Durchmesser von etwa 2‐3 mm, wobei auf GP‐Medium die größten Kolonien erhalten wurden. Am einfachsten ließen sich die Kolonien von R2A‐ und Nutrient‐Agar suspendieren; Kolonien von Agarnährböden nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol konnten nach längerer Inkubationsdauer (> 7 d) nicht vollständig suspendiert werden.

82 Ergebnisse

Abbildung 3.10: Koloniemorphologie von Methylobacterium‐Typstämmen und –Isolaten nach 14 d Inkubation bei 28 °C. Abgebildet wurde ein repräsentativer Versuchsansatz (n=5). Durch Variationen in der Koloniemorphologie zwischen verschiedenen Versuchsdurchgängen kann es vorkommen, dass einzelne Kolonien nicht exakt mit der durchschnittlichen Ausprägung übereinstimmen (Details siehe Text). Messbalken: 1 mm. Spalten: A, Medium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol; B, R2A‐Agar nach Reasoner und Geldreich (1985); C, Nutrient‐Agar; D, GP‐Agar nach Green und Bousfield (1982). Reihen: 1, Mtb. adhaesivum DSM 17169T; 2, Mtb. goesingense iEII3; 3, Mtb. fujisawaense DSM 5686T; 4, Mtb. jeotgali S2R03‐9T; 5, Mtb. mesophilicum DSM 1708T; 6, Mtb. radiotolerans DSM 1819T; 7, Mtb. sp. JT1; 8, Mtb. sp. 5b.2.20; 9, Mtb. sp. 1b.3; 10, Mtb. sp. F3.2; 11, Mtb. sp. F2.1; 12, Mtb. sp. 5a.1.5.

3.5.1.2 Modifikation des C:N:P-Verhältnisses Analog zu den Versuchen zur Kolonieentwicklung auf modifizierten Nährmedien mit den putativen Mtb. mesophilicum‐Isolaten (siehe Kapitel 3.4.3), sollte der Einfluss des C:N:P‐Verhältnis auf die Morphologie einiger ausgesuchter Typ‐ stämme und Isolate ermittelt werden. Als Versuchsobjekte wurden dabei Mtb. adhaesivum DSM 17169T, der daraus hervorgegangene Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐, das Marchantia‐Isolat Mtb. sp. JT1 sowie das putative Mtb. extorquens Isolat 1c.1 verwendet. Der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T wurde getestet, da er auf ver‐ schiedenen Nährmedien eine auffällig strukturierte, mit dem putativen Mtb. mesophilicum Isolat 5a.1.13 vergleichbare Koloniemorphologie hervorbrachte. Zum Vergleich wurde auch der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ untersucht, der diese charakteristische Kolonieform nicht mehr ausbildete. Zusätzlich wurde das Isolat 1c.1 getestet, welches wahrscheinlich der Spezies Mtb. extorquens zugeordnet

83 Ergebnisse werden kann und daher phylogenetisch relativ weit von den Stämmen Mtb. mesophilicum DSM 1708T, Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. sp. JT1 entfernt ist. Dennoch zeigte das Isolat 1c.1 auf GP‐Agar eine ähnliche Koloniemorphologie wie Mtb. adhaesivum DSM 17169T und das Isolat 5a.1.13. Der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T brachte auf den modifizierten Agarnährböden unterschiedliche Koloniemorphologien (Abbildung 3.11A) hervor. Wie das Isolat 5a.1.13 (vgl. Abbildung 3.6B) bildete auch Mtb. adhaesivum DSM 17169T auf Agarplatten mit 1 mM Phosphat, 1,0 % Methanol und 25 mM Ammoniumsulfat runde, glattrandige, konvexe Kolonien mit glatter Oberfläche, die im Gegensatz zu 5a.1.13 jedoch glänzend erschien. Auf allen anderen C:N:P‐ Verhältnissen bildete der Stamm eine mehr oder weniger deutlich strukturierte Oberfläche aus. Anders als Isolat 5a.1.13 bildete Mtb. adhaesivum DSM 17169T auf den Nährböden mit niedrigem Phosphat‐ und Stickstoffanteil keine krater‐ förmigen Kolonien, sondern runde, kegelförmige Kolonien mit unregelmäßigem Rand und rauer, matter Oberfläche. Eine kraterförmige Morphologie konnte bei Mtb. adhaesivum DSM 17169T bei hohen Phosphatkonzentrationen und gleichzeitig geringem Stickstoff‐Angebot (2 mM N:25 mM P) beobachtet werden. Jedoch fiel die Morphologie deutlich anders aus als beim Isolat 5a.1.13, denn die glänzenden Kolonien mit einer faltigen Oberfläche zeigten im Profil eine deutliche Kegelform mit einem kleinen kreisförmigen Wulst im Zentrum der Kolonie. So erinnerten die unregelmäßig geformten Kolonien des Typstamms eher an einen Vulkankrater, während die Kolonien des Stamms 5a.1.13 auf den entsprechenden Nährböden an einen Einschlag‐ oder Explosionskrater erinnerten. Bei mittleren Phosphat‐ konzentrationen (10 mM) und 1 mM Ammoniumsulfat bildete der Stamm Koloniemorphologie, die sowohl Merkmale der auf mit weniger (1 mM) bzw. mehr Phosphat (25 mM) gewachsenen Kolonien besaßen und somit eine Übergangsform darstellen. Dabei bildeten die runden, kegelförmigen Kolonien mit unregelmäßigem Rand eine deutlich gröber strukturierte, Oberfläche als die Kolonien mit weniger Phosphat‐Angebot. Mit 1,0 % Methanol im Nährboden zeigten sich auch bereits kleine, zentrale Wülste, wie sie auch mit N:P‐ Verhältnissen von 2 mM N:25 mM P gebildet wurden. Dieser zentrale Wulst konnte auch bei den Kolonien beobachtet werden, die mit 1 mM Phosphat und 20 mM Stickstoff wuchsen. Jedoch zeigte der äußere Bereich der Kolonie dabei eine ähnliche Struktur wie die Kolonien, die mit der gleichen Menge an Phosphat, aber nur 2 mM Stickstoff wuchsen. Auf allen anderen nicht näher beschriebenen C:N:P‐Platten bildete der Stamm Zwischenformen der oben beschriebenen Phäno‐ typen aus. Dabei war vor allem auffällig, das der Stamm bei der höchsten Stickstoffkonzentration von 50 mM und 10 mM Phosphat die größten Kolonien hervorbrachte. Die Menge an verfügbarer Kohlenstoffquelle zeigte bei diesem Stamm nur geringfügige Auswirkungen auf die Morphologie der Kolonien. Im Vergleich zum Typstamm bildete der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ auf allen angebotenen C:N:P‐Verhältnissen runde, erhabene und ganzrandige Kolonien (siehe Abbildung 3.11B). Die Oberfläche der Kolonien, die mit 1 mM Ammoniumsulfat angezogen wurden, besaßen eine matte Oberfläche, die etwas

84 Ergebnisse angeraut erschien; Kolonien die auf Nährmedium mit 10 mM oder mehr Ammoniumsulfat wuchsen, zeigten hingegen eine glatte und glänzende Ober‐ fläche. Interessanterweise zeigte der Klon auf den unterschiedlichen Nährböden die gleichen Größenverhältnisse wie der Typstamm, wobei auch hier die Kolonien mit 20 mM Stickstoff auffällig klein blieben. Das Marchantia‐Isolat Mtb. sp. JT1 bildete auf allen angebotenen Nährböden runde, ganzrandige Kolonien (siehe Abbildung 3.11C). Auch bei diesem Stamm konnten Veränderungen der Koloniemorphologie beobachtet werden, die jedoch nicht so drastisch ausfielen wie bei Mtb. adhaesivum DSM 17169T oder dem Isolat 5a.1.13. Mit 1 mM Phosphat im Nähragar bildete der Stamm erhabene Kolonien mit einer leichten zentralen Erhebung und glatter, glänzender Oberfläche. Bei 10 mM und 25 mM Phosphat im Medium wurde die Oberfläche matter und besaß eine leichte Strukturierung, die an die Grübchen erinnerte. Auch das Profil der Kolonie nahm mit ansteigender Phosphat‐Konzentration – zumindest bei einer niedrigen Stickstoffkonzentration – eine eher kegelförmige Form an. Auf den Platten mit 10 mM Phosphat und 50 mM Stickstoff bildete sich im Zentrum der Kolonien eine leicht strukturierte Fläche, die von einem Ring mit einer relativ glatten Oberfläche umgeben wurde. Die Größe der Kolonien des Isolats JT1 war bei Phosphatkonzentrationen von 10 und 25 mM relativ konstant und nicht oder nur geringfügig von der angebotenen Kohlenstoff‐ und Stickstoffkonzentration abhängig und lag nach 14 Tagen Wachstum bei etwa 4 mm. Hatte das Isolat nur 1 mM Phosphat zur Verfügung, blieben die Durchmesser der Kolonien bei etwa 2‐3 mm. Die Koloniemorphologie des putativen Mtb. extorquens Isolat 1c.1 (siehe Abbildung 3.11D) zeigte auf den modifizierten C:N:P‐Agarplatten eine ähnliche Abhängigkeit wie das Isolat JT1. Auch hier besaßen die Kolonien auf den Medien mit der geringsten Phosphatkonzentration den kleinsten Durchmesser und zeigten eine (zum größten Teil) glatte, matt‐glänzende Oberfläche, während bei höheren Phosphatkonzentrationen eine deutliche Strukturierung der Kolonieoberfläche ausgebildet wurde. Auch bei 1 mM Phosphat und 20 / 50 mM Stickstoff im Medium konnten bereits strukturierte Bereich im Zentrum der Kolonien beobachtet werden, die jedoch noch von einem Ring mit glatter Oberfläche umgeben waren. Auf allen Nährmedien bildete der Stamm nahezu runde, flache, Kolonien mit einer matt‐glänzenden, strukturierten Oberfläche. Auch bei diesem Stamm zeigte sich auf den Agarplatten mit 25 mM Phosphat und 50 mM Stickstoff ein außergewöhnlicher Koloniephänotyp; im Gegensatz zu den beiden Mtb. adhaesivum Stämmen (vgl. Abbildung 3.6A und B), Mtb. mesophilicum DSM 1708T (vgl. Abbildung 3.6A) und dem Isolat 5a.1.13 (vgl. Abbildung 3.6B) bildete das Isolat 1c.1 nur relativ kleine Kolonien auf diesem Medium.

85 Ergebnisse

Abbildung 3.11: Einfluss des C:N:P‐Verhältnis auf die Koloniemorphologie des Typstamms Mtb. adhaesivum DSM 17169T (A), des Klons Mtb. adhaesivum DSM 19169EPS‐ (B), Mtb. sp. JT1 (C) und Mtb. extorquens 1c.1 (D). Die Agarnährböden wurden 14 d bei 28 °C inkubiert. Kolonien, die auf‐ grund ihrer Größe nicht komplett dargestellt werden konnten, wurden so abgebildet, dass sowohl das Zentrum als auch ein Teil des Randes zu erkennen sind. Messbalken: 1 mm.

3.5.1.3 CFW-Platten Um die Exopolysaccharidproduktion einiger Methylobacterium‐Isolate zu untersuchen wurden verschiedene Agar‐Standardmedien mit 200 μg CFW pro ml Nährmedium benutzt. Zusätzlich wurden auch Platten mit nur 50 μg CFW pro ml Medium verwendet, um zu testen, ob durch CFW das Wachstum und Auskeimen der Stämme beeinflusst wird. Zur Kontrolle der Zellzahl wurden parallel dazu Agarnährböden ohne CFW‐Zusatz hergestellt und beimpft. Dabei zeigten sich keinerlei negative Auswirkungen auf die Zahl der Koloniebildenden Einheiten, wenn 200 μg/ml zugesetzt wurden. Jedoch konnte aufgrund der höheren Farbstoffkonzentration eine stärkere Fluoreszenz beobachtet werden. Daher wurden die Agarplatten standardmäßig mit 200 μg CFW pro ml Medium hergestellt. Nach Haigler et al. (2001) kann CFW jedoch den Aufbau von Cellulose‐Microfibrillen in vivo beeinflussen. Jedoch zeigten die Kolonien keinen veränderten Morphotyp zur Kontrolle (Medium ohne CFW). Um den Einfluss der Zellzahl auf die Bildung CFW‐bindender Substanzen zu untersuchen wurden zwei unterschiedlich konzentrierte Bakteriensuspensionen vorbereitet (1x103 und 1x105 Zellen pro ml), von denen jeweils 20 μl auf die

86 Ergebnisse

Nährböden aufgetropft wurden. So keimten auf einer Fläche von etwa 4 mm2 etwa 10–20 Einzelkolonien bzw. eine flächige Kolonie aus. Zusätzlich wurden etwa 100 μl des geringer konzentrierten Inokulums mit einem Drigalskispatel plattiert. Die Auswertung der Platten erfolgte nach 7 Tagen Inkubation bei 28 °C im Brutschrank durch Bestrahlung mit UV‐Licht einer Wellenlänge von 366 nm. In Abbildung 3.12 wurden einige Isolate eines repräsentativen Versuchsansatzes abgebildet. Jedoch zeigten sich bei den Reproduktionen der Versuche Schwankungen in der Intensität der Fluoreszenz. Dies war zum einen durch Abweichungen in der Wachstumsgeschwindigkeit (Biomasseproduktion) der Stämme gegeben, andererseits konnten nie exakt dieselbe Menge an Bakterien aufgetropft werden. Da die Zelldichte bei einigen Stämmen anscheinend ein wichtiger Faktor bei der Induktion der Biofilmbildung ist, variierten die Ergebnisse zum Teil. Daher kann es vorkommen, dass die gemittelten Ergebnisse aus mindestens drei Einzelversuchen in Tabelle 3.5 nicht mit Abbildung 3.12 übereinstimmen. Bei allen getesteten Stämmen konnte die Bildung CFW‐bindender Substanzen nachgewiesen werden. Die deutlichsten Fluoreszenz‐Signale wurden dabei meist bei den Kolonien gefunden, die auf GP‐Medium wuchsen. Auch mit R2A‐Medium bildeten viele Stämme CFW‐bindendes Material. Auf Medium 4‐Agar mit Methanol als alleiniger Kohlenstoffquelle gewachsene Kolonien zeigten generell nur eine sehr schwache Fluoreszenz, wohingegen auf den Methanol‐haltigen Minimalmedien AMS sowie Medium nach Choi et al. (1989) einige Stämme eine deutliche Menge CFW‐bindender Substanzen produzierten. Wie bereits erwähnt zeigte sich ein deutlicher Einfluss der Anfangszelldichte auf die Bildung CFW‐bindender Substanzen durch die Bakterien. Dabei können jedoch keine generellen Rückschlüsse gezogen werden. So konnte bei Einzel‐ kolonien der Isolate Mtb. goesingense iEII3 und Mtb. sp.1c14 auf AMS‐Agar keine CFW‐Akkumulation nachgewiesen werden, während bei hohen Anfangs‐ zelldichten eine deutliche Fluoreszenz der Kolonien beobachtet werden konnte. Beim putativen Mtb. mesophilicum‐Isolat 5a.1.13 hingegen konnte nur in Einzel‐ kolonien eine deutliche Fluoreszenz nachgewiesen werden. Bei hohen Anfangs‐ zelldichten erschienen die Kolonien unter UV‐Licht schwarz. Dies war auch bei Einzelkolonien der Fall, wenn diese nicht genügend Abstand zu Nachbarkolonien hatten oder die Koloniedichte pro Fläche zu hoch ausfiel. Das putative Mtb. extorquens Isolat 1c.1 zeigte auf nahezu allen getesteten Medien die stärkste Fluoreszenz nach UV‐Anregung der Kolonien (siehe Tabelle 3.5 und Abbildung 3.12 Spalte 13). Dies spricht dafür, dass dieser Stamm die meisten CFW‐bindenden Exopolysaccharide synthetisiert. Das Isolat T1, das wahr‐ scheinlich ebenfalls der Spezies Mtb. extorquens zugeordnet werden kann, zeigte ein fast identisches Verhalten (siehe Tabelle 3.5 und Abbildung 3.12 Spalte 14). Jedoch fiel die Fluoreszenz der Kolonien nach UV‐Anregung bei vergleichbarem Wachstum meist etwas schwächer aus. Auf Medium 4‐Agar mit 1,0 % Methanol konnten beim Isolat T1 – im Gegensatz zu 1c.1 – kein fluoreszieren der Kolonien nach UV‐Anregung beobachtet werden.

87 Ergebnisse

Der Stamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T zeigte auf allen getesteten Nährmedien eine starke Akkumulation von CFW in den Kolonien (siehe Tabelle 3.5 und Abbildung 3.12 Spalte 1). Beim Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ konnte im Vergleich dazu auf den angebotenen Medien mit CFW‐Zusatz keine bzw. eine deutlich verringerte Fluoreszenz beobachtet werden, was auf eine verringerte Produktion CFW‐bindenden Materials hinweist (siehe Tabelle 3.5 und Abbildung 3.12 Spalte 2). Der Stamm Mtb. goesingense iEII3 bildete – bei Beimpfung mit wenigen Bakterien – auf vielen Medien nur sehr kleine Kolonien aus, die kein CFW akkumulierten. Jedoch brachte das Isolat bei einer hohen Anfangszelldichte auf AMS‐Medium mit CFW Kolonien hervor, die nach Bestrahlung mit UV‐Licht fluoreszierten. Auf GP‐ Medium zeigte der Stamm gutes Wachstum, jedoch konnte keine Fluoreszenz der Kolonien beobachtet werden. Die Kolonien erschienen bei Bestrahlung schwarz (siehe Abbildung 3.12: Spalte 3, Reihe 6).

Tabelle 3.5: Fluoreszenz‐Intensität einiger Methylobacterium spp. Kolonien auf Festmedium mit 1,5% Agar und 200 μg CFW pro ml Nährmedium nach 7 d Inkubation und Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 366 nm (n≥3). Die Bakterienmenge wurde dabei auf etwa 10 Bakterien pro Impf‐Punkt eingestellt. Werte in eckigen Klammern geben abweichende Ergebnisse bei Beimpfung mit etwa 1000 Bakterien pro Impf‐Punkt an. Symbole: ++, starke Fluoreszenz; +, deutliche Fluoreszenz; R, Fluoreszenz nur am Rand der Kolonie; 0, keine Fluoreszenz (Kolonie „verschwindet“ im Hintergrund); ‐, Kolonie absorbiert UV‐Licht (Kolonie erscheint dunkel bei UV‐ Bestrahlung); k.W., kein Wachstum.

Stamm / Isolat AMS‐Agara Choi‐Agarb Medium 4‐Agarc R2A‐Agar GP‐Agar Mtb. adhaesivum DSM 17169T + + + + + Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ 0 [+] ‐ R [‐] ‐ ‐ Mtb. goesingense iEII3 ‐ [+] 0 0 R ‐ Mtb. fujisawaense DSM 5686T R ‐ ‐ ‐ 0 [+] Mtb. jeotgali S2R03‐9T + + 0 + + Mtb. mesophilicum DSM 1708T + 0 0 0 k.W. [‐] Mtb. radiotolerans DSM1819T R ‐ 0 R [‐] R [+] Mtb. zatmanii DSM 5688T 0 [R] ‐ ‐ ‐ ‐ Mtb. sp. JT1 R [+] ‐ ‐ ‐ + Mtb. sp. 5b.2.20 R [+] ‐ ‐ ‐ + Mtb. sp. 1b.3 ++ + 0 [+] 0 [+] + Mtb. sp. F3.2 R [+] + [++] 0 [+] ‐ [+] + Mtb. sp. F2.1 R [+] + [++] + 0[+] + Mtb. sp. 5a.1.5 R + [++] 0 [+] ‐ ‐ [+] Mtb. sp. 1c.14 ‐ [+] ‐ ‐ ‐ ‐ Mtb. sp. 5a.1.13 + [R] ‐ ‐ + [R] + [‐] Mtb. sp. 1c.1 + ++ + ++ ++ Mtb. sp. T1 + ++ 0 ++ + a AMS‐Festmedium mit 1,5 % Agar und 200 μg CFW pro ml Medium. Als Kohlenstoffquelle wurde 1,0 % Methanol (v/v) verwendet. b Festmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,5 % Agar und 200 μg CFW pro ml Medium. Als Kohlenstoffquelle wurde 1,0 % Methanol (v/v) verwendet. c Medium 4‐Agar nach Bourque et al. (1995) mit 1,5 % Agar und 200 μg CFW pro ml Medium. Als Kohlenstoffquelle wurde 1,0 % Methanol (v/v) verwendet.

88 Ergebnisse

Die beiden Isolate JT1 und 5b.2.20 bildeten auf den getesteten Medien meist eine vergleichbare Menge an CFW‐bindenden Material; auch zwischen den Isolaten F3.2, F2.1 und 5a.1.5 konnten nur geringe Unterschiede beobachtet werden. Das Isolat 1b.3 zeigte meist eine etwas stärkere Fluoreszenz als F3.2. Die getesteten Typstämme (Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Methylobacterium mesophilicum DSM 1708T, Methylobacterium radiotolerans DSM 1819T und Methylobacterium zatmanii DSM 5688T) bildeten auf allen Medien relativ wenig CFW‐bindendes Material. Lediglich bei Mtb. jeotgali S2R03‐9T konnte bei den meisten Nährmedien eine deutliche Akkumulation von CFW in den Kolonien beobachtet werden.

Abbildung 3.12: Kolonien verschiedener Mtb. spp. auf Nähragar mit CFW‐Zusatz. In der oberen Reihe wurde jeweils eine Auflichtfotographie der Kolonien dargestellt, die darunter liegende Reihe zeigt die gleichen Kolonien bei UV‐Auflichtbeleuchtung (Wellenlänge: 366 nm). Messbalken: 1 mm. Beschreibung siehe Text. Zuordnung der Stämme/Isolate: 1, Mtb. adhaesivum DSM 17169T; 2, Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐, 3, Mtb. goesingense iEII3; 4, Mtb. fujisawaense DSM 5686T, 5, Mtb. jeotgali S2R03‐9T; 6, Mtb. mesophilicum DSM 1708T; 7, Mtb. radiotolerans DSM1819T; 8, Mtb. sp. JT1; 9, Mtb. sp. 1b.3; 10, Mtb. sp. F3.2; 11, Mtb. sp. F2.1; 12, Mtb. sp. 5a.1.13; 13, Mtb. sp. 1c.1; 14, Mtb. sp. T1

3.5.1.4 Rasterelektronenmikroskopie kompletter Kolonien Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden von einigen ausgewählten Stämmen rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen kompletter Kolonien erstellt. Da einige Stämme auf Agarmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol strukturierte und schwer suspendierbare Kolonien hervorbrachten, wurde dieses Medium als Grundlage verwendet. Bei der Fixierung der Kolonien in wässriger Glutardialdehyd‐Lösung lösten sich jedoch viele Kolonien auf (Mtb. sp. JT1, Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Methylobacterium jeotgali S2R03‐9T, Mtb. mesophilicum DSM 1708T, Mtb. radiotolerans DSM 1819T), so dass nur Einzelzellen bzw. Bruchstücke der Kolonie fixiert werden konnten. Einige Kolonien konnten jedoch vollständig in ihrer Struktur erhalten bleiben. Diese wurden in Abbildung 3.13 dargestellt.

89 Ergebnisse

Die beiden Stämme F3.2 und F2.1 (siehe Abbildung 3.13, Spalte 2 und 3) bildeten beide einen ähnlich geformten Koloniehabitus aus, wobei das Isolat F2.1 generell strukturiertere Kolonien hervorbrachte als F3.2 (vgl. Kapitel 3.5.1.1). Die Kolonien beider Stämme besaßen eine zentral gelegene, runde Struktur, die von einem konzentrischen Ring umgeben war. Von dort aus verliefen sternförmige Stränge nach außen, die sich dabei zum Teil aufgabelten oder ihr Wachstum einstellten. Jedoch konnte auf der Strecke vom Zentrum der Kolonie nach außen keine Vereinigung von zwei getrennten Strängen beobachtet werden. Bei genauerer Untersuchung der Kolonieoberfläche zeigte sich, dass die Bakterien beider Stämme in eine netzartige Matrix aus extrazellulärem, fibrillärem Material eingebettet vorlagen. Diese Fibrillen hatten eine Länge von bis zu mehreren μm und einen Durchmesser von etwa 10‐50 nm, wobei sich die dickeren Stränge aus mehreren dünneren Einzelfilamenten zusammensetzten. Auf der gesamten Oberfläche der beiden Bakterienisolate F3.2 und 2.1 befanden sich kleine, meist kreis‐ oder reiskörnförmigen Fimbrien mit einem Durchmesser von etwa 20‐40 nm. Die Zellen des Isolats F3.2 besaßen teilweise über 100 dieser kleinen, im rasterelektronenmikroskopischen Bild hell erscheinenden, fast punktförmigen Fimbrien auf jeder Zelle, während die Zellen des Stamm F2.1 fast ebenso viele beulenförmige Auswüchse zeigten, die mit einem Durchmesser von 20‐50 μm etwas größer erschienen als die Fimbrien und sich im rasterelektronen‐ mikroskopischen Bild farblich kaum von der Zelloberfläche abhoben. Diese beulenförmigen Zellaufwüchse waren zahlenmäßig etwa so häufig auf den Zellen des Stamms F2.1 zu erkennen, wie die Fimbrien bei Isolat F3.2. Bei einigen Präparationen konnten allerdings sowohl Fimbrien wie auch beulenartige Strukturen auf einer Zelle gefunden werden. Beide Strukturen bestehen wahrscheinlich aus demselben Material und zeigen aus unbekannten Gründen eine unterschiedliche Ausprägung. Dieses Phänomen konnte auch beim Marchantia‐Isolat JT1 beobachtet werden. Der Stamm Mtb. goesingense iEII3 bildete auf Agarmedium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % Methanol als Kohlenstoffquelle sehr kleine, kompakte Kolonien (siehe Abbildung 3.13, Spalte 3). Bei der rasterelektronenmikroskopischen Analyse der Kolonien zeigte sich, dass die gesamte Kolonie fast durchgängig mit einer Hülle aus extrazellulärem Material bedeckt war. Dieser Überzug mit einer Dicke von etwa 30‐60 nm war an einigen Stellen unterbrochen, so dass die darunter liegenden Zellen erkannt werden konnten (siehe Abbildung 3.13, Spalte 3 untere Reihe). Auch auf den Zellen des Stamms Mtb. goesingense iEII3 konnten kleine Aufwüchse mit einem Durchmesser von etwa 30‐80 nm und einer Länge von bis zu 130 nm beobachtet werden. Jedoch traten diese Strukturen in deutlich geringerer Zahl auf als bei F3.2 und F2.1. Der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T und der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ bildeten wie der Stamm Mtb. goesingense iEII3 nur sehr kleine Kolonien auf dem angebotenen Nährmedium mit 1,0 % Methanol (Abbildung 3.13, Spalten 4 und 5). Wie bei den Isolaten F3.2 und F2.1 waren die Zellen in ein Netzwerk aus extrazellulären Fibrillen eingebettet. Jedoch konnten beim Typstamm deutlich

90 Ergebnisse mehr EPS beobachtet werden, die sich zum Teil zusammenlagerten und so flächige Strukturen ausbildeten (siehe Abbildung 3.13, Spalte 4, untere Reihe). Die Filamente beider Klone hatten üblicherweise einen Durchmesser von etwa 20‐90 nm. Auf der Zelloberfläche beider Klone konnten – wie bei den anderen Stämmen – kleine Fimbrien mit einem Durchmesser von etwa 20‐80 nm beobachtet werden. Dabei besaß der Typstamm deutlich mehr dieser Zell‐ appendices, die vor allem an den Polen der Zellen ausgebildet wurden und offensichtlich die Entstehungsorte der extrazellulären Fibrillen darstellten. Die Zellen des Typstamms blieben deutlich kürzer als die des Klons, was im Widerspruch zu den Messungen der Dimensionen steht (vgl. Kapitel 3.7.3). Allerdings wurden die Bakterien dabei auf einem anderen Medium angezogen, und befanden sich in einer anderen Wachstums‐ und Entwicklungsphase.

Abbildung 3.13: Mikroskopischer Vergleich der Koloniemorphologie verschiedener Methylobacterium‐Stämme auf Festmedium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol. Die Stämme wurden für 21 d bei 28 °C bebrütet. Obere Reihe: Für einen Größenvergleich wurden die Kolonien bei gleicher Vergrößerung durch ein Binokular fotografiert (Messbalken = 1 mm). Mittlere Reihe: Übersicht über die Kolonie (SEM). Untere Reihe: Detailaufnahmen der Kolonieoberflächen.

3.5.2 Biofilmbildung in Flüssigkultur Die Biofilmbildung ausgewählter Methylobacterium‐Stämme wurde in unbewegten Flüssigkulturen (Standkulturen) mit Medium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % Methanol untersucht. Da viele Stämme nur sehr langsam wachsen wurden die Kulturen für mindestens 3 Wochen bei RT inkubiert. In Tabelle 3.6 wurden einige Eigenschaften der Biofilme aufgeführt. Alle untersuchten Stämme bildeten in unbewegten Standkulturen – nach anfangs vornehmlich planktonischem Wachstum im Medium – Biofilme an der Grenzfläche flüssig‐gasförmig aus. Im Laufe der Biofilmbildung sammelten sich die Bakterien dabei meist an der Mediumoberfläche an; z.T. bildete sich auch ein

91 Ergebnisse

Bakterienfilm am Boden des Kulturgefäßes. Bei Kulturen mit wenig Nährmedium (d. h. einem niedrigem Flüssigkeitsstand) bildete sich teilweise kein Biofilm an der Mediumoberfläche, sondern nur am Boden. Am Ende des Versuchszeitraums von drei Wochen lag meist nur noch ein kleiner Anteil an Zellen planktonisch vor, was sich in einer geringen Trübung der Suspensionen bemerkbar machte. Der Großteil der Zellen hatte sich in Biofilmen an der Flüssigkeitsoberfläche (und am Boden des Kulturgefäßes) organisiert. Der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T und der Stamm 1c.5 zeigten sehr ähnliche Biofilme, mit einer dünnen Kahmhaut (< 1 mm Dicke), die sich durch Schütteln der Kultur leicht fast komplett auflösen ließ. Auch der Stamm JT2 bildete ähnliche Bofilme, zeigte aber durch ein langsameres Wachstum meist erst nach 14 Tagen Inkubation erste Anzeichen einer Kahmhautbildung. Auch das Isolat JT1 bildete auf dem angebotenen Nährmedium erst nach etwa 10‐14 Tagen dünne Biofilme, die sich durch Schütteln der Kultur in mikroskopisch kleine Aggregate suspendieren ließen. Im Gegensatz dazu bildete das phylo‐ genetisch eng verwandte Isolat 5b.2.20 schon nach 7 Tagen eine Kahmhaut, die nach drei Wochen mehrere mm dick war und durch Schütteln nur in Bruchstücke unterschiedlicher Größe zerteilen ließ. Auch konnte bei diesem Stamm eine gute Anheftung der Zellen an das Kulturgefäß beobachtet werden, was sich dadurch äußerte, das nach Schütteln der Kultur ein Bakterienring an der Glasoberfläche zurückblieb, wo sich die Grenzfläche flüssig‐gasförmig befand. Die drei putativen Mtb. extorquens‐Isolate 1c.1, 5a.1.8 und 5b.2.1 bildeten sehr ähnliche Biofilme aus, die –wie bei Isolat 5b.2.20 – bereits nach einer Woche erste Ansätze einer Kahmhaut zeigten und nach drei Wochen Inkubation mehrere mm dick werden konnten. Auch diese Biofilme konnten durch Schütteln der Kulturen nicht wieder vollständig suspendiert, sondern nur in Bruchstücke unter‐ schiedlicher Größe zerteilt werden. Auch bei diesen drei Isolaten verblieb ein Bakterienring an der Oberfläche des Kulturkolbens zurück, woraus eine gute Adhäsion der Zellen an Glasoberflächen abgeleitet werden kann.

Tabelle 3.6: Eigenschaften der Biofilme verschiedener Methylobacterium‐Isolate nach 21 d Wachstum bei Raumtemperatur in Medium nach Choi et al. mit 1,0 % Methanol. n ≥ 3.

Beginn der Film‐ Dicke des Stabilität Anheftung an Stamm / Isolat bildung nach etwa Films des Filmsa Kulturgefäß (Glas) Mtb. mesophilicum DSM 1708T 10 d dünn 0 keine Anheftung Mtb. sp. 1c.5 10 d dünn 0 keine Anheftung Mtb. sp. JT2 14 d sehr dünn ‐ keine Anheftung Mtb. sp. JT1 10 d dünn 0 wenig Anheftung Mtb. sp. 5b.2.20 7 d sehr dick + gute Anheftung Mtb. sp.1c.1 7 d dick + gute Anheftung Mtb. sp. 5a.1.8 7 d sehr dick + gute Anheftung Mtb. sp. 5b.2.1 7 d sehr dick + gute Anheftung a Die Stabilität des Biofilms wurde durch Schütteln der Kultur bestimmt (+, stabil, Biofilm lässt sich durch schütteln nur in sehr grobe Bruchstücke zerteilen; 0, Biofilm zerfällt leicht in kleine Bruchstücke und lässt sich größtenteils in mikroskopisch kleine Aggregate suspendieren; ‐, fragiler Biofilm, der sich vollständig in mikroskopisch kleine Aggregate suspendieren lässt).

92 Ergebnisse

3.5.2.1 Aggregatbildung in Schüttel-Flüssigkultur Die Aggregatbildung der einzelnen Stämme in bewegten Flüssigkulturen (150 rpm) fiel je nach verwendetem Nährmedium und Wachstumsphase der Kulturen unterschiedlich aus. In Komplexmedien konnten jedoch generell mehr Aggregate beobachtet werden als in Minimalmedium mit Methanol als alleiniger Kohlenstoffquelle. Das Auftreten und die Größe von Aggregaten nahm mit der Kulturdauer zu, wodurch sich bei einigen Stämmen (z. B. Mtb. sp. F3.2, Mtb. sp. 1c.1 oder Mtb. adhaesivum DSM 17169T) makroskopisch erkennbare Flocken in der Kultur bildeten, die sich aus mehreren Tausend Einzelzellen zusammensetzten. Dies ging manchmal so weit, dass fast keine Einzelzellen mehr in der Suspension verblieben. Einige Stämme die stark zur Bildung von Aggregaten neigten, bildeten einen dicken Schüttelring an der Grenzphase (fest‐)flüssig‐gasförmig des Kultur‐ gefäßes. Besonders ausgeprägt war dies bei den Stämmen Mtb. sp. 1c1 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T zu beobachten. In der frühen exponentiellen Phase lagen die Zellen aller Stämme größtenteils einzeln vor. Aufgrund der Teilungsaktivität der Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase konnten bei allen Stämmen auch vereinzelt Zellpaare beobachtet werden. Jedoch wurden bei vielen Stämmen nach 24 h Inkubation auch kleinere Aggregate aus 5‐50 Zellen beobachtet. Je nach Isolat/Stamm waren diese Aggregate dabei mehr oder weniger strukturiert angeordnet. Mit fortschreitender Kulturdauer nahm die Anzahl und Größe der Aggregate kontinuierlich zu. Alle untersuchten Methylobacterium spp. bildeten in der stationären Wachstumsphase Aggregate.

3.5.2.1.1 Aggregatbildung in R2A-Flüssigkultur Da viele Vergleichsstudien zur Aggregatbildung in flüssigem R2A‐Medium durchgeführt wurden (Gallego et al. 2005a,b,c, 2006, Aslam et al. 2007, Weon et al. 2008) und alle Stämme Wachstum auf diesem Medium zeigen, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ebenfalls R2A‐Medium (nach Reasoner und Geldreich 1985) verwendet. In Tabelle 3.7 wurden die Charakteristika exponentiell wachsender Schüttel‐Flüssigkulturen einiger Mtb. spp. zusammengefasst: Tabelle 3.7: Charakteristika von Zellen verschiedener Mtb. spp. aus exponentiell wachsenden R2A‐Flüssigkulturen (150 rpm, RT). Symbole: ++, große Aggregate (>50 Einzelzellen); +, vorhanden; R, selten (engl. rare). n ≥ 3.

Einzel‐ Aggregate / Stamm/Isolat Paare Motilität zellen Rosetten Mtb. adhaesivum DSM 17169T + R ++ + Mtb. goesingense iEII3 + R + + Mtb. jeotgali S2R03‐9T + R + + Mtb. fujisawaense DSM 5686T + R + + Mtb. mesophilicum DSM 1708T + R + + Mtb. radiotolerans DSM 1819T + R + + Mtb. sp. JT1 + R + + Mtb. sp. 1b.3 + R + + Mtb. sp. F3.2 + R ++ + Mtb. sp. F2.1 + R + +

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Bei der Untersuchung zeigte sich, dass alle Stämme/Isolate in der exponentiellen Wachstumsphase vor allem als (bewegliche) Einzelzellen vorlagen. Aufgrund der hohen Teilungsaktivität in dieser Wachstumsphase konnten bei allen Stämmen auch vereinzelt Zellpaare beobachtet werden, die sich wahrscheinlich gerade geteilt, aber noch nicht komplett abgeschnürt hatten. Alle Stämme zeigten bereits nach 24 Stunden Wachstum Zellaggregate, wobei sich die Stämme in Häufigkeit und Größe der Aggregate unterschieden. Mit zunehmender Kulturdauer nahm die Größe und Häufigkeit der Aggregate zu, wobei einige Stämme (Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. sp. F3.2) nach 7 Tagen Inkubation fast voll‐ ständig in Aggregaten vorlagen, während bei anderen Stämmen der Großteil der Zellen einzeln vorlag. Mit zunehmender Kulturdauer nahm die Beweglichkeit der Zellen deutlich ab. Bei Erreichen der stationären Phase lagen meist bereits keine beweglichen Zellen mehr vor.

3.5.2.1.2 Aggregatbildung des Isolats JT1 in Flüssigkultur Um die Aggregatbildung des Isolats JT1 näher zu charakterisieren wurde dieser in Flüssigmedium nach Choi et al. (1989) kultiviert. Bei der physiologischen Charakterisierung des Stamms zeigte sich, dass die Zellen des Stamms mit Fructose als einziger Kohlenstoff‐ und Energiequelle vor allem einzeln (planktonisch) vorliegen. Wird der Stamm dagegen mit Methanol als einziger Kohlenstoff‐ und Energiequelle inkubiert, bilden sich im Laufe der Kultivierung Aggregate aus mehreren hundert Zellen. In der stationären Phase des Wachstums sind dann nur noch vereinzelt einzelne Zellen zu erkennen. Die auffällige Aggregatbildung des Isolats JT1 in Methanol‐haltigem Minimal‐ medium wurde bereits von Kutschera et al. (2007) beschrieben. Allerdings wurde in der Veröffentlichung nicht auf die zeitliche Abhängigkeit der Aggregatbildung eingegangen und als Vergleichsorganismus wurde der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T verwendet, der ohne Pantothenat‐Zusatz im Medium nur sehr wenige Aggregate bildet (vgl. Kapitel 3.4.4). Um die zeitliche Abhängigkeit der Aggregatbildung zu untersuchen, wurde das Isolat JT1 daher parallel mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen angezogen und über einen Zeitraum von 14 d beobachtet. Dabei wurde sowohl der Anteil der planktonischen Zellen als auch die mittlere Aggregatgröße bestimmt. Zur Kontrolle des Wachstums wurde die Zellzahl pro ml Nährmedium und die optische Dichte der Kulturen bei 600 nm bestimmt. Das Isolat JT1 zeigte mit beiden Kohlenstoffquellen Wachstum, wobei die Generationszeit mit 1,0 % Methanol etwas kürzer ausfiel und diese nach etwa 4‐5 Tagen die stationäre Phase erreichten (siehe Abbildung 3.14A). Die Zellzahl lag dabei bei etwa 3x108 Zellen pro ml. Mit Fructose als Substrat wurde diese Zellzahl erst nach etwa 8 d Inkubation erreicht, welche jedoch im weiteren Verlauf noch weiter zunahm und sich bei etwa 6x108 Zellen pro ml einpendelte. Die in Fructose gewachsenen Zellen waren dabei bedeutend kürzer als die in Methanol ange‐ zogenen Vergleichszellen.

94 Ergebnisse

Dies spiegelte sich auch in der Messung der optischen Dichten der Suspensionen bei 600 nm wider (siehe Abbildung 3.14C), bei der die Methanol‐Kulturen ab fünf Tagen Kulturdauer keine signifikante Steigerung der Absorption mehr zeigten, während bei den Fructose‐Kulturen ein stetiger Anstieg der OD600 über den gesamten Versuchszeitraum zu beobachten war. Zusätzlich zur Zellgröße beeinflussen wahrscheinlich jedoch auch die Zahl und Größe der Aggregate in der Suspension die Messungen. In den Kulturen mit 1,0 % Methanol konnten bereits nach 24 h Inkubation etwa 50 % aller Zellen in Rosetten/Aggregaten beobachtet werden (siehe Abbildung 3.14B), die im Durch‐ schnitt aus etwa vier Zellen bestanden (siehe Abbildung 3.14D). Bei den Fructose‐ Kulturen betrug die Zellzahl pro Aggregat im Durchschnitt zwar auch etwa vier Zellen pro Aggregat, jedoch lagen hier nur etwa 10 % aller Zellen in Aggregaten vor. Dieses Verhältnis änderte sich – bei den mit Fructose wachsenden Zellen – im Verlauf der Kultivierung nur geringfügig (siehe Abbildung 3.14 B und D), während bei den Methanol‐Kulturen ab dem vierten Tag über 80 % der Zellen in Aggregaten vorlagen, die eine durchschnittliche Zahl von >17 Zellen enthielten. Die Aggregate konnten jedoch aus mehreren hunderten Zellen zusammengesetzt sein, wodurch sich ein hoher Standardfehler vom Mittelwert ergab (siehe Abbildung 3.14D).

Abbildung 3.14: Wachstum und Aggregatbildung des Stamms Mtb. sp. JT1 in Flüssig‐ Schüttelkulturen mit Medium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % Methanol ( ) oder 0,5 % Fructose ( ) als einziger Kohlenstoffquelle. n = 5 (aus zwei voneinander unabhängigen Ansätzen). Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts. A: Entwicklung der Zellzahl pro ml Nährmedium. B: Anteil der planktonischen Zellen in Prozent. C: Entwicklung der optischen Dichte der Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm. D: Mittlere Zellzahl pro Aggregat.

95 Ergebnisse

3.5.2.2 Lektinfärbung Die Färbung lebender Biofilme mit fluoreszenzmarkierten Lektinen wurde sowohl mit Material von festen Nährböden als auch mit Zellen aus Flüssigkulturen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Lektine vor allem an große Zellaggregate binden. Nur die Zellen der beiden putativen Mtb. extorquens Isolate 1c.1 und T1 wurden durch das Con A‐Konjugat direkt angefärbt. Bei fast allen Biofilmen konnte eine diffus verteilte Fluoreszenz mit Con A‐FITC über den gesamten Biofilm beobachtet werden. Teilweise konnten sich intensiver gefärbte Regionen in den Biofilmen beobachten lassen, die strangförmig, meist in den zentralen Regionen des Biofilms lagen und die Struktur des Aggregats bestimmten. Die Zusammensetzung dieser Matrixkomponenten scheint jedoch je nach angebotener Nahrungsquelle und –verfügbarkeit zu variieren. So zeigten Biofilme, die in Minimalmedium mit Methanol als Kohlenstoffquelle gewachsen waren, andere Charakteristika und Lektin‐Bindungspartner als Biofilme aus Komplex‐ medien. Da sehr viele Stämme in GP‐Medium (nach Green und Bousfield 1982) gut wachsen und große Zellaggregate (Biofilme) ausbilden, wurden die Untersuchungen standardmäßig in diesem Medium durchgeführt. Um eine maximale Matrixproduktion und Biofilmbildung zu erreichen, wurden die Kulturen in der stationären Phase untersucht. In der Tabelle 3.8 wurden die dabei ermittelten Daten zusammengefasst. Dabei zeigte sich, dass generell nur die Lektine Con A, WGA und RCA120 an die Biofilme der Bakterien binden konnten. Die Lektine DBA, PNA, SBA und UEA I zeigten keine Spezifität zu den Bestandteilen der Biofilme oder Bakterienoberflächen.

Tabelle 3.8: Bindung der fluoreszenzmarkierten Lektine an lebende Biofilme aus stationären GP‐Flüssigkulturen. Symbole: +++ sehr starke Fluoreszenz im Biofilm, auch Einzelzellen gefärbt; ++, starke Fluoreszenz im Biofilm; +, Fluoreszenz im Biofilm; ‐, keine Fluoreszenz. Abkürzungen: Con A, Concanavalin A; DBA, Dolichos biflorus‐Agglutinin; PNA, Peanut‐Agglutinin; RCA120, Ricinus communis‐Agglutinin; SBA, Sojabohnen‐Agglutinin; UEA I, Ulex europaeus‐Agglutinin; WGA, Weizenkeim‐Agglutinin.

Stamm / Isolat Con A DBA PNA RCA120 SBA UEA I WGA Mtb. fujisawaense DSM 5686T + ‐ ‐ + ‐ ‐ ++ Mtb. mesophilicum DSM 1708T + ‐ ‐ + ‐ ‐ ++ Mtb. radiotolerans DSM 1819T + ‐ ‐ + ‐ ‐ + Mtb. sp. 1c.5 + ‐ ‐ + ‐ ‐ + Mtb. sp. 5a.1.13 + ‐ ‐ + ‐ ‐ ++ Mtb. sp. JT1 + ‐ ‐ + ‐ ‐ + Mtb. sp. 5b.2.20 + ‐ ‐ + ‐ ‐ ++ Mtb. sp.1c.1 +++ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Mtb. sp. 5a.1.8a ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + Mtb. sp. 5b.2.1a ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + Mtb. sp. T1 +++ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Agrobacterium tumefaciens B6 ++ ‐ ‐ + ‐ ‐ + a Die Stämme zeigten nur ein schlechtes Wachstum in GP‐Medium und bildeten nur wenige Aggregate/Biofilme.

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Die deutlichsten Fluoreszenz‐Signale konnten bei Biofilmen der beiden putativen Mtb. extorquens Isolate 1c.1 und T1 bei Inkubation mit dem FITC‐gekoppelten Lektin Con A nachgewiesen werden. Dabei wurde jedoch nicht nur die EPS‐ Matrix angefärbt, sondern auch die gesamte Außenmembran der Bakterien. Bei allen anderen positiv getesteten Isolaten und Typstämmen (siehe Tabelle 3.8) konnte eine mehr oder weniger diffuse Fluoreszenz zwischen den verbundenen Einzelzellen im Biofilm beobachtet werden. Mit dem Lektin WGA wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Bei allen positiv getesteten Stämmen (siehe Tabelle 3.8) konnte eine mehr oder weniger definierte Fluoreszenz in Biofilmen nachgewiesen werden. Einzelzellen wurden mit dem Lektin nicht angefärbt. Bei einigen Biofilmen konnte eine deutlich begrenzte Fluoreszenz in den zentralen Bereichen des Biofilms ausgemacht werden (vgl. Abbildung 3.15). Die gefärbten Strukturen bildeten dabei das „Gerüst“ der Aggregate, durch das die Form des Biofilms bestimmt wurde. Mit dem Lektin RCA120 konnten diffuse Fluoreszenzsignale bei einigen Biofilmen beobachtet werden (siehe Tabelle 3.8). Auch bei diesem Lektin wurden nur extrazelluläre Strukturen gefärbt, die für den Zusammenhalt des Biofilms sorgen.

Abbildung 3.15: Biofilm/Aggregat des Isolats JT1 im Phasenkontrast (linkes Bild). In der Mitte ist das Aggregat nach Doppelfärbung mit CFW (blau) sowie FITC‐WGA (grün) und UV‐Anregung dargestellt. Rechts wurden beide Bilder übereinander gelegt. Die Zellen wurden in Minimal‐ medium mit 1,0 % Methanol für 7 d bei RT angezogen. Messbalken: 10 μm.

3.5.2.3 CFW-Färbung Analog zur Lektinfärbung (s. o.) wurden die Zellen und Biofilme mit Calcofluor White (CFW) gefärbt, einem Fluoreszenz‐Aufheller, der an Cellulose und ähnliche Substanzen bindet (siehe auch Kapitel 3.5.1.3). In Tabelle 3.9 wurden die dabei ermittelten Ergebnisse aufgeführt. Mit Ausnahme der Isolate 5a.1.8 und 5b.2.1 – die in GP‐Medium nur schlecht wachsen und wenig Biofilme und Flocken bildeten – konnte eine Bindung des Fluorochroms an die extrazelluläre Matrix aller Biofilme nachgewiesen werden. Auch hier wurde oft nur ein zentraler Bereich der Biofilme gefärbt (vgl. Abbildung 3.15). Bei größeren Aggregate (> 100 Zellen) konnte meist eine diffuse Fluoreszenz über den gesamten Biofilm beobachtet werden, wobei einige (meist zentral gelegene) Bereiche stärker fluoreszierten.

97 Ergebnisse

Tabelle 3.9: Bindung von CFW an lebende Biofilme aus stationären GP‐Flüssigkulturen.Symbole: +, Bindung an Biofilme; ‐, keine Bindung an die Biofilme.

Stamm / Isolat CFW Mtb. fujisawaense DSM 5686T + Mtb. mesophilicum DSM 1708T + Mtb. radiotolerans DSM 1819T + Mtb. sp. 1c.5 + Mtb. sp. 5a.1.13 + Mtb. sp. JT1 + Mtb. sp. 5b.2.20 + Mtb. sp.1c.1 + Mtb. sp. 5a.1.8a ‐ Mtb. sp. 5b.2.1a ‐ Mtb. sp. T1 + Agrobacterium tumefaciens B6 + a Die Stämme zeigten nur ein schlechtes Wachstum in GP‐ Medium und bildeten nur wenige Aggregate/Biofilme.

3.5.2.4 Analyse von Biofilmen mit dem Rasterelektronenmikroskop Um die Mechanismen der Biofilmbildung und der daran beteiligten Strukturen zu untersuchen wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Biofilmen angefertigt, die in Flüssigkulturen gewachsen waren. Dabei wurden mit dem putativen Mtb. extorquens Isolat 1c.1 und dem Marchantia‐Isolat Mtb. sp. JT1 zwei Stämme ausgewählt, die phylogenetisch relativ weit voneinander entfernt liegen und deutliche Unterschiede in der Biofilmbildung aufwiesen. Das Isolat Mtb. sp. JT1 bildete in unbewegten Standkulturen einen fragilen Biofilm an der Grenzfläche flüssig‐gasförmig aus, der durch schütteln der Kulturen einfach in mikroskopisch kleine Aggregate aufgelöst werden konnte. Die Ober‐ fläche des Biofilmes zeigte meist eine leichte wellenförmige Struktur, die auch im Rasterelektronenmikroskop beobachtet werden konnte (Abbildung 3.16A). Bei näherer Betrachtung des Biofilms zeigte sich, dass die Bakterien sich zu stern‐ oder rosettenförmigen Aggregaten zusammenfanden, die wiederum in schlauch‐ förmigen Strukturen organisiert waren (Abbildung 3.16B). Die Oberfläche der Zellen war mit zahlreichen fimbrienartigen Fortsätzen besetzt, die einen Durch‐ messer von etwa 25‐40 nm und eine Länge von bis zu 300 nm aufwiesen (Abbildung 3.16C und D) und der Verknüpfung der Einzelzellen sowie der Adhäsion an Oberflächen dienten. Zusätzlich konnten auch relativ wenige extra‐ zelluläre Fibrillen (~ 30‐40 nm Durchmesser, mehrere μm Länge) beobachtet werden. Wurde das Isolat JT1 in Schüttelkulturen angezogen, fielen die Fimbrien meist kürzer aus (vgl. Abbildung 3.17). Dafür konnten auf den Zelloberflächen häufig warzen‐ oder beulenförmige Aufwüchse beobachtet werden. Diese Beulen scheinen dabei Reste der Fimbrien darzustellen, da die Zahl, Lokalisation und Größe ungefähr übereinstimmen.

98 Ergebnisse

Abbildung 3.16: Biofilm des Isolats Mtb. sp. JT1 einer Standkultur mit Medium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % (v/v) Methanol. A: Übersichtsaufnahme über den Biofilm. B: Detailansicht des Biofilms. C: Detailaufnahme von der Oberseite des Biofilms. D: Detailaufnahme der Oberfläche von Einzelzellen mit Fimbrien.

Abbildung 3.17: Biofilm des Isolats Mtb. sp. JT1 einer Schüttelkultur mit GP‐Medium. A: Übersicht. B: Detailansicht.

99 Ergebnisse

Das Isolat 1c.1 stellte sich im Laufe der Arbeit als einer der stärksten Biofilmbildner heraus. Die Kahmhaut des Stamms konnte nach drei Wochen Kultivierung nicht durch einfaches Schütteln zerstört werden, sondern zerfiel bei mechanischer Belastung in makroskopische Aggregate. Im rasterelektronen‐ mikroskopischen Übersichtsbild zeigten sich furchenartige Einkerbungen im Biofilm (siehe Abbildung 3.18A und B). Jedoch konnte nicht geklärt werden, ob diese Spalten auch in vivo vorliegen oder ob dies ein Artefakt bei der Trocknung der Proben darstellte. Die Oberfläche der Zellen war im Gegensatz zu Isolat JT1 glatt; jedoch schienen die zahlreichen Fibrillen – welche eine netzartige Matrix bildeten – direkt an der Außenmembran der Bakterien synthetisiert zu werden. Die Fibrillen hatten typischerweise einen Durchmesser von etwa 20‐40 nm und eine Länge von bis zu mehreren μm. Die Matrix wurde vor allem auf der Oberseite des Biofilms nachgewiesen (Abbildung 3.18C), während die dem Nährmedium zugewandte Seite deutlich weniger Fasern beinhaltete (Abbildung 3.18D).

Abbildung 3.18: Biofilm des Isolats Mtb. sp. 1c.1 einer Standkultur mit Medium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % (v/v) Methanol. A: Übersichtsaufnahme über den Biofilm. Die Spalten stellen wahrscheinlich Präparationsartefakte dar. B: Detailansicht einer Bruchstelle in der Matrix. C: Detailaufnahme von der Oberseite des Biofilms (Luft). D: Detailaufnahme von der Unterseite des Biofilms (flüssiges Nährmedium).

100 Ergebnisse

In Schüttelkulturen bildete der Stamm 1c.1 ebenfalls viel extrazelluläres Material, welches sich im rasterelektronischen Bild als Fibrillen mit einem Durchmesser von 20‐50 nm darstellte. Durch die Zusammenlagerung vieler Einzelfibrillen entstand dabei ein dichtes Netz in dem die Bakterien eingebettet waren (siehe Abbildung 3.19).

Abbildung 3.19: Biofilm des Isolats Mtb. sp. 1c.1 aus einer Schüttelkultur mit GP‐Medium. A: Übersicht. B: Detailansicht.

Auch der Stamm Agrobacterium tumefaciens B6 bildete Fibrillen, die einen vergleichbaren Durchmesser (25‐50 nm) besaßen und die Zellen netzartig ver‐ knüpften (siehe Abbildung 3.20). Für diese Spezies konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um Cellulose‐Fibrillen handelt (Matthysse et al. 1981).

Abbildung 3.20: Biofilm des Stamms Agrobacterium tumefaciens B6 aus einer GP‐Schüttelkultur. A: Übersicht. B: Detailansicht.

101 Ergebnisse

3.6 Vergleichende DNA-Sequenzanalysen In Tabelle 3.10 wurden einige Charakteristika der den vergleichenden DNA‐ Sequenzanalysen zugrunde liegenden Datensätze zusammengefasst. Für die Analyse der 16S rDNA konnten die Sequenzen aller Typstämme gesammelt werden Der Datensatz bestand letztendlich aus 17 eigens ermittelten Sequenzen (siehe Tabelle 3.11) und 36 Typstamm‐Sequenzen die der NCBI‐ GenBank entnommen wurden. Damit waren alle bisher beschriebenen Spezies der Gattung Methylobacterium in die Analyse mit einbezogen. Der Datensatz der partiellen mxaF‐Sequenzen setzte sich aus 10 Sequenzen, die im Verlauf der vorliegenden Arbeit ermittelt wurden (siehe Tabelle 3.14), sowie 19 Sequenzen aus den Datenbanken der NCBI‐GenBank zusammen. Jedoch konnten nicht alle Spezies der Gattung in die Analyse mit einbezogen werden, da für einige Spezies noch keine Sequenzdaten vorlagen.

Tabelle 3.10: Charakteristika der für die vergleichenden DNA‐Sequenzanalysen verwendeten Datensätze.

Länge (bp)a Charakteristika des Datensatzes Anzahl des der konservierte variable einzigartige Datensatz PISb an Taxa Alignments Sequenzen Merkmale Merkmale Merkmale 16S rDNA 53 1311 1297‐1302 1090 210 62 148 mxaF 29 517 517 347 170 68 102 a die Länge des Gesamt‐Alignments und die Länge der Nucleotidsequenzen variiert aufgrund von eingefügten Lücken (gaps) im Alignment. b PIS: ‚Parsimony Informative Sites’

3.6.1 Vergleichende DNA-Sequenzanalyse der 16S rDNA Bei allen getesteten Methylobacterium‐Isolaten konnte mittels PCR ein etwa 1500 bp langes DNA‐Fragment amplifiziert werden. Die ermittelten Sequenzen der Isolate zeigten bei der BLAST‐Suche die größte Ähnlichkeit zu Vertretern der Gattung Methylobacterium (siehe Tabelle 3.11). Die Sequenzen wurden nach Editierung an die GenBank übermittelt und unter den Zugriffsnummern FJ157960‐FJ157976 archiviert (siehe Tabelle 3.11). Nach Homologisierung der ermittelten Sequenzen mit den Sequenzen der Typ‐ stämme aus der GenBank (siehe Tabelle 3.12) wurde ein 1311 Merkmale umfassendes Alignment mit 53 Taxa erhalten (siehe Tabelle 3.10).

102 Ergebnisse

in

das und

war

War

Längen

2542 2388 2435 2509 2439 2439 2354 2315 2423 2540 2574 Max score Analyse

der

dargestellt.

lesbareren

a a a die (GID)

(AB175636.1) (AB175633.1) (AB175633.1)

(AB302928.1) (AB302928.1) (AB302928.1) (AB302928.1) (AB302928.1)

T T T T T T T T 1708 9399 9399 wurden

17169 17169 17169 17169 17169 (AY364020.2) (AY364020.2) (AY364020.2)

Typstammsequenz

DSM

Datenbankabgleichs DSM DSM DSM DSM DSM iEII3 iEII3 iEII3 ‐

NCIMB NCIMB

echte

Typstammsequenz

BLAST

adhaesivum adhaesivum adhaesivum goesingense adhaesivum adhaesivum extorquens goesingense goesingense mesophilicum extorquens nächste

(GID).Zusätzlich

des

Mtb. Ähnlichster Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Die

bits)

dar.

(in

’ 2572 2520 2551 2538 2500 2538 Max score 2446 2562 2480 2531 2538 2554 2576 2484 2560 2513 2545

score Spezies

Zugriffsnummern ‐ Max ‚ ermittelt.

(EF188430.1) (EF188430.1) (EF188430.1)

GenBank

(AM697295.1)

beschriebene 243 243 243

erzieltem mit

(AM697295) clone clone clone

und valide

(AB298399.1)

BF0001C136 (AB175636.1) (AB175636.1) (AB175636.1) (AB175633.1) (AB175633.1) (AB175633.1)

Typstammsequenz

T T T T T T 48)

keine

Sequenzen

‐ (AB252207.1) 1708 1708 1708 9399 9399 9399

BF0001C136 isolate

(=NEU (CP000908.1) Klammern)

(GID)

Arbeit

proteobacterium proteobacterium proteobacterium DSM DSM DSM

rDNA ähnlichste (AM237344.1)

RB603B (in NCIMB PA1 TA5 NCIMB NCIMB

der (DQ322592.1)

die Isolat 16S (AM910541.1)

16.b bacterium alpha alpha bacterium alpha

‐ F50 Enf3 OS

sp. extorquens sp. brachiatum mesophilicum extorquens extorquens mesophilicum sp. mesophilicum extorquens extorquens Abgabe

(AB302928.1).

T zusätzlich ermittelte

der

Uncultured Ähnlichstes Uncultured Mtb. Uncultured Mtb. Mtb. Uncultured Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Uncultured Mtb. Mtb. Mtb. Mtb.

17169

Zugriffsnummern ‐ bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp wurde Arbeit

DSM

der Zeitpunkt 1427 Länge 1430 1386 1365 1407 1366 1421 1427 1408 1428 1411 1428 1399 1419 1414 1386 1407

GenBank zum

Typstamm,

mit Rahmen

adhaesivum stellt

FJ157965 FJ157961 GID FJ157973 FJ157976 FJ157966 FJ157974 FJ157975 FJ157960 FJ157967 FJ157971 FJ157962 FJ157963 FJ157972 FJ157964 FJ157968 FJ157969 FJ157970

kein Im

Mtb.

Isolate

3.11:

Isolat

5a.1.5 1a.16 1b.3 F2.1 1c.1 5a.1.8 F3.1 F3.2 JT1 1c.5 5b.2.20 1.c14 5b.1.1 5b.1.4 5a.1.13 5b.1.5 5b2.1

Fällen goesingense

sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp.

Tabelle Mtb.

ähnlichste ähnlichsten Mtb. Isolat Mtb. Mtb. a Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. diesen

103 Ergebnisse

3.6.1.1 Auswahl der Typstammsequenzen Für die phylogenetische Analyse wurden Vergleichs‐Sequenzen der Typstämme aus der NCBI‐GenBank bezogen (siehe Tabelle 3.12). Üblicherweise wurde die Sequenz verwendet, die mit der Speziesbeschreibung veröffentlicht wurde, jedoch wurden auch aktuelleren Daten mit einbezogen. Dabei wurden teilweise Differenzen festgestellt (siehe dazu auch Kato et al. 2005). In diesen Fällen wurden alle verfügbaren Sequenzen kritisch evaluiert, da für jede Spezies nur die Sequenz des Typstamms mit in die Analyse einbezogen wurde. Als Anhaltspunkt für die Auswahl diente dabei vor allem die publizierte 16S rRNA‐Sekundärstruktur (siehe Abbildung 5.1, Cannone et al. 2002) sowie der Vergleich mit den homologen Sequenzen. Oft konnten so Sequenzierfehler erkannt werden und die am wahrscheinlichsten zutreffende Nukleotid‐Sequenz gewählt werden.

Insbesonders traf dies auf folgende Stämme (GID und zugehörige Referenz in Klammern) zu:

• Mtb. chloromethanicum CM4T (AF198624, McDonald et al. 2001)5,

• Mtb. dichloromethanicum DM4T (AF198624, Doronina et al. 2000)5,

• Mtb. extorquens TK0001T (M95656, Bratina et al. 1992),

• Mtb. lusitanum RXMT (AY009403, Doronina et al. 2002)5,

• Mtb. organophilum XXT (D32226, Hiraishi et al. 1995),

• Mtb. rhodesianum 1T (D32228, Hiraishi et al. 1995),

• Mtb. rhodinum B6T (D32229, Hiraishi et al. 1995),

• Mtb. suomiense F20T (AY009404, Doronina et al. 2002),

• Mtb. thiocyanatum ALL/SCN‐PT (U58018, Wood et al. 1998) und

• Mtb. zatmanii 135T (D32230, Hiraishi et al. 1995).

Für diese Arten wurden die von Kato und Kollegen (2005, 2008) ermittelten Sequenzen verwendet, da diese eine gute Qualität besitzen (fast vollständige Sequenzen mit wenigen mehrdeutigen Positionen).

5 Diskussion siehe Kato et al. 2005 104 Ergebnisse

Tabelle 3.12: für die phylogenetische Analyse der Evolution des 16S rRNA‐Gens verwendete Typstamm‐Sequenzen mit GenBank‐Zugriffsnummern (GID) und Referenzen.

Stamm GID Referenz Mtb. adhaesivum AR27T AM040156.1 Gallego et al. 2006 Mtb. aerolatum 5413S‐11T EF174498.1 Weon et al. 2008 Mtb. aminovorans JCM 8240T AB175629.1 Kato et al. 2005 Mtb. aquaticum GR16T AJ635303.1 Gallego et al. 2005a Mtb. brachiatum B0021T AB175649.1 Kato et al. 2008 Mtb. chloromethanicum NCIMB 13688T AB175630.1 Kato et al. 2005 Mtb. dichloromethanicum DSM 6343T AB175631.1 Kato et al. 2005 Mtb. extorquens IAM 12631T AB175632.1 Kato et al. 2005 Mtb. fujisawaense DSM 5686T AB175634.1 Kato et al. 2005 Mtb. goesingense iEII3 AY364020.2 Idris et al. 2006 Mtb. gregans 002‐074T AB252200.1 Kato et al. 2008 Mtb. hispanicum GP34T AJ635304.1 Gallego et al. 2005a Mtb. iners 5317S‐33T EF174497.1 Weon et al. 2008 Mtb. isbiliense AR24T AJ888239.1 Gallego et al. 2005c Mtb. jeotgali S2R03‐9T DQ471331.1 Aslam et al. 2007 Mtb. komagatae 002‐079T AB252201.1 Kato et al. 2008 Mtb. lusitanum NCIMB 13779T AB175635.1 Kato et al. 2008 Mtb. mesophilicum DSM 1708T AB175636.1 Kato et al. 2005 Mtb. nodulans ORS 2060T AF220763.1 Sy et al. 2001 Mtb. organophilum JCM 2833T AB175639.1 Kato et al. 2005 Mtb. oryzae CBMB20T AY683045.1 Madhaiyan et al. 2007a Mtb. persicinum 002‐165T AB252202.1 Kato et al. 2008 Mtb. phyllosphaerae CBMB27T EF126746.2 Madhaiyan et al. 2009 Mtb. platani PMB02T EF426729.1 Kang et al. 2007 Mtb. podarium FM4T AF514774.1 Anesti et al. 2004 Mtb. populi BJ001T AY251818.2 Van Aken et al. 2004 Mtb. radiotolerans DSM 1819T AB175640.1 Kato et al. 2005 Mtb. rhodesianum DSM 5687T AB175642.1 Kato et al. 2005 Mtb. rhodinum DSM 2163T AB175644.1 Kato et al. 2005 Mtb. salsuginis MRT EF015478.1 Wang et al. 2007 Mtb. suomiense NCIMB 13778T AB175645.1 Kato et al. 2005 Mtb. tardum RB677T AB252208.1 Kato et al. 2008 Mtb. thiocyanatum DSM 11490T AB175646.1 Kato et al. 2005 Mtb. variabile GR3T AJ851087.1 Gallego et al. 2005c Mtb. zatmanii DSM 5688T AB175647.1 Kato et al. 2005

3.6.1.2 Wahl des Substitutionsmodells Bei der Ermittlung des am besten zutreffenden Substitutionsmodells mit Modeltest (Posada und Crandall 1998) konnte das GTR‐Modell unter Einbezug eines Anteils an invariablen Merkmalen und Modellierung einer Gamma‐ Verteilung (GTR+I+G) die Daten am besten erklären. Die ermittelten Parameter (siehe Tabelle 3.13, folgende Seite) wurden (soweit möglich) für die weitere molekularphylogenetische Analyse verwendet.

105 Ergebnisse

Tabelle 3.13: Mit Modeltest ermittelte Parameter für die phylogenetische Analyse des 16S rRNA‐Gens.

Parameter Wert Basenfrequenzen freqA 0,2357 freqC 0,2365 freqG 0,3225 freqT 0,2053 Austauschraten R(a) [A‐C] 0,5084 R(b) [A‐G] 3,2679 R(c) [A‐T] 2,.5033 R(d) [C‐G] 1,3346 R(e) [C‐T] 5,4110 R(f) [G‐T] = 1,0000 Unterschiedliche Merkmals‐Variationsraten Anteil invariabler Merkmale (ncat=4) 0,7776 Variable Merkmale Formfaktor der Gammaverteilung 0,6588

3.6.1.3 Phylogenetische Rekonstruktion (16S rDNA) Bei der Rekonstruktion der Verwandtschaftsverhältnisse auf Grundlage der 16S rDNA‐Sequenzen von 53 Taxa konnten bestimmte Gruppierungen (bezeichnet mit A bis G) mit allen verwendeten Rekonstruktionsverfahren erhalten werden. Dies beruht zum Teil darauf, dass sich einige Sequenzpaare in keinem einzigen Merkmal unterscheiden ließen (siehe auch Tabelle 5.3: Abschätzung der evolutionären Sequenz‐Divergenzen), jedoch konnten auch Einheiten zusammen‐ gefasst werden, die eine relativ hohe genetische Divergenz aufweisen jedoch in allen errechneten Bäumen gemeinsam gefunden wurden. Vier Sonnenblumen‐Isolate (5a.1.8, 5b.1.4, 5b.1.5 und 5b.2.1) besitzen Sequenzen, die identisch mit denen der Typstämme Mtb. extorquens NCIMB 9399T und Mtb. dichloromethanicum DSM 6343T sind und daher nicht voneinander differenziert werden konnten. Auch Mtb. sp. 1c.1 und Mtb. chloromethanicum NCIMB 13688T, unterschieden sich nur in jeweils einer einzigen Basen von den eben genannten Sequenzen. Zusammen mit Mtb. zatmanii DSM 5688T bildeten die o. g. Isolate immer ein monophyletisches Cluster (nachfolgend mit A bezeichnet). Auch die Isolate Mtb. mesophilicum DSM 1708T, 1c.5 und 5b.1.1 besaßen identische Sequenzen und bildeten zusammen mit 5a.1.13 und Mtb. brachiatum B0021T immer eine Einheit, die, zusammen mit dem Isolat Mtb. sp. 1a.16, bei allen Analysen als monophyletisches Cluster auftrat (D). 5a.1.13 unterschied sich nur in einem Merkmal von Mtb. mesophilicum DSM 1708T, Mtb. brachiatum B0021T in zwei. Die Sequenz des Isolats 1a.16 unterschied sich in 10 Basen von der des Typstamms Mtb. mesophilicum DSM 1708T und 13 von Mtb. brachiatum B0021T, wobei sich 8 dieser Substitutionen in der V6‐Region6 (nach Neefs et al. 1990) finden.

6 Position der Substitution bezogen auf E. coli: 1007‐1022. 106 Ergebnisse

Eine weitere Gruppe genetisch ähnlicher Isolate (G) setzte sich aus den Isolaten JT1, 5b.2.20, 1b.3 sowie F3.2, F3.1, F2.1 und 5a.1.5 zusammen, wobei JT1 und 5b.2.20 sowie F3.2, F3.1, F2.1 und 5a.1.5 jeweils identische Sequenzen besitzen. Das Isolat 1b.3 zeigt eine geringere genetische Distanz zu den Isolaten JT1 und 5b.2.20 als zur Gruppe um F3.2 und bildete in allen Analysen eine monophyletische Einheit mit JT1 und 5b.2.20. Diese Einheit konnte bei allen Rekonstruktions‐ verfahren von der Gruppe um das Isolat F3.2 deutlich abgegrenzt werden. Das Isolat 1c.14 zeigte die geringste genetische Distanz zum Stamm Mtb. goesingense iEII3 und bildete mit ihm eine mono‐ oder paraphyletische Einheit (H), die zusammen mit Mtb. adhaesivum AR27T und Mtb. iners 3517S‐33T meist nahe der Wurzel des Baums platziert wurde. Zusätzlich wurden weitere monophyletische Gruppierungen in allen Analysen wieder gefunden, die ausschließlich Typstammsequenzen umfassten und daher im Folgenden nur kurz angesprochen werden sollen. Mtb. populi BJ001T und Mtb. thiocyanatum DSM 11490T bildeten immer eine Schwestergruppe zu Mtb. rhodesianum DSM 5687T/Mtb. lusitanum NCIMB 13779T und Mtb. podarium FM4T. Zusammen bildeten diese fünf Stämme in allen Analysen eine monophyletische Schwestergruppe (B) zu Cluster A. Die größte genetische Divergenz konnte in dem mit (C) bezeichneten Sequenz‐ cluster beobachtet werden, welches sich aus den beiden Gruppen Mtb. aquaticum GR16T und Mtb. platani PMB02T sowie Mtb. isbiliense AR24T und Mtb. nodulans ORS2060T zusammensetzte. Zusätzlich befand sich Mtb. variabile GR3T in dieser Einheit, wobei die Stellung des Stamms innerhalb dieser Gruppe je nach verwendeten Analyseverfahren variierte. Die mit E bezeichnete Gruppe, bestehend aus Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. oryzae CBMB20T und Mtb. phyllosphaerae CBMB27T sowie Mtb. radiotolerans DSM 1819T, Mtb. tardum RB677T, Mtb. hispanicum GP34T und Mtb. gregans 002‐074T, stellte sich meist als Schwestergruppe zu Cluster D dar. In der mit F bezeichneten Gruppe konnten stets die Sequenzen der Spezies Mtb. aerolatum 5413S‐11T und Mtb. persicinum 002‐165T gefunden werden, die eine Schwestergruppe zu Mtb. komagatae 002‐079T bildeten.

Bei Betrachtung der erstellten Stammbäume ließen sich diese Gruppen in drei große, Subcluster einteilen. Die Gruppen G und H sowie Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. iners 5317S‐33T und Methylobacterium jeotgali S2R03‐9T konnten allerdings keinem dieser Subcluster eindeutig zugeordnet werden und bildeten meist eine basale, paraphyletische Einheit. Das monophyletische Subcluster 1 umfasst die Gruppen A‐C und wird durch die Stämme Mtb. aminovorans JCM 8240T, Mtb. suomiense NCIMB 13778T, Mtb. salsuginis MRT, Mtb. rhodinum DSM 2163T sowie Mtb. organophilum JCM 2833T ergänzt. Subcluster 2 beinhaltet die Gruppen D‐F. In Abbildung 3.21 wurde das Phänogramm einer Neighbor‐Joining‐Analyse dargestellt. Die paarweisen Distanzen wurden dabei anhand des GTR‐Modells mit Gammaverteilung unter Einbeziehung des Anteils invariabler Merkmale geschätzt

107 Ergebnisse

(GTR+I+G). Zum Vergleich dazu wurde im Anhang (Abbildung 5.2) ein NJ‐ Stammbaum dargestellt, der mit dem (relativ einfachen) Substitutionsmodell von Jukes und Cantor (1969) berechnet wurde. In beiden Bäumen ließen sich dabei fast identische Gruppierungen und Verzweigungen beobachten. Jedoch bildete Gruppe G um Mtb. sp. JT1 in der Analyse mit dem einfacheren Substitutionsalgorithmus eine basale Schwester‐ gruppe zu den Gruppen D, E und F im Subcluster 2. Auch die Stämme Mtb. adhaesivum AR27T, Mtb. iners 5317S‐33T sowie Methylobacterium goesingense iEII3 und das Isolat 1c.14 wurden bei der Rekonstruktion mit einfachen Algorithmen (p‐Distanz und JC) nicht als paraphyletische Gruppe an der Wurzel des Baumes platziert, sondern bildeten eine Schwestergruppe zu Subcluster 1 (Anm.: Der Ast dieser Verzweigung besaß eine negative Astlänge, die verfahrensbedingt auftreten kann, für die Darstellung des Baums wurde der Betrag der Astlänge eingezeichnet). Beide Varianten konnten jedoch nicht durch ausreichend hohe Bootstrapwerte gestützt werden. In allen NJ‐Analysen konnte die gesamte Gruppe A mit dem Speziescluster um Mtb. extorquens sowie Mtb. zatmanii als Monophylum gefunden werden, wobei nur die Verzweigung von Mtb. extorquens, Mtb. chloromethanicum, Mtb. dichloromethanicum und der Eigenisolate durch einen Bootstrapwert von 71 % (JC) bzw. 70 % (GTR+I+G) mäßig belegt wurde. In allen NJ‐Analysen bildete Gruppe B eine Schwestergruppe zu A. Jedoch konnten weder für diese Verzweigung, noch für die internen Knoten der Gruppe B ausreichend hohe Bootstrapwerte erhalten werden. In Subcluster 1 zeigte nur die Abzweigung der Gruppe C einen Bootstrapwert der diese auch statistisch unterstützt (JC: 95 %; GTR+I+G: 97 %). Auch innerhalb dieser Gruppe besaßen die Knoten Bootstrap‐ werte von < 90 % und konnten so ausreichend belegt werden. Die Stämme Mtb. salsuginis, Mtb. aminovorans, Mtb. suomiense und Mtb. rhodinum fanden sich bei den NJ‐Analysen zwischen den Abzweigungen der Gruppen A, B und C in unter‐ schiedlicher Reihen‐ und Verzweigungsfolge. Jedoch konnte für keine interne Verzweigung ein Bootstrapwert von > 65 % berechnet werden. Mtb. organophilum wurde mit in allen Distanz‐Analysen mit einer niedrigen Bootstrap‐Unterstützung von etwa 70 % basal von Gruppe C platziert und bildete so ein Schwestertaxon zu den Gruppen A, B und C sowie den dazwischen verstreuten Sequenzen. In Subluster 2 fanden sich in allen Distanzanalysen die Gruppen D, E und F, wobei das Sequenzpaar der Stämme Mtb. gregans und Mtb. hispanicum (E2) eine paraphyletische Einheit mit den Stämmen um Mtb. fujisawaense (E1) bildete. Mit einer guten Bootstrap‐Unterstützung von 89 % (JC) bzw. 87 % (GTR+I+G) konnte hingegen die Gruppe D in allen Analysen als monophyletische Schwestergruppe von E1 herausgestellt werden. Auch die internen Verzweigungen in Gruppe D konnten mit einem hohen Bootstrapwert belegt werden. Die Verzweigung von Gruppe F konnte zwar bei allen Distanzanalysen beobachtet werden, jedoch bietet der niedrige Bootstrapwert von ca. 60 % nur eine mäßige statistische Unterstützung.

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Abbildung 3.21: Evolutionäre Beziehung von 53 Taxa basierend auf einer NJ‐Analyse der 16S rDNA‐Sequenzen unter Annahme des GTR+I+G‐Modells. Abgebildet wurde der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 1,17. Bootstrapwerte über 50 % sind auf den Ästen angegeben (basierend auf 10000 Replikaten). Gestrichelte Linien deuten negative Astlängen an. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Länge des Messbalkens entspricht 0,01 Substitutionen pro Merkmal. In Abbildung 3.22 wurde ein 50 % Mehrheitskonsensusbaum einer Bayesschen Analyse abgebildet. Für die Berechnung wurde das GTR+I+G‐Substitutionsmodell vorgegeben, welches sich bei einer Analyse der Daten mit MrModeltest (Nylander 2004) als geeignetes Verfahren herausstellte. Die Analyse beruht auf vier simultanen MCMC‐Berechnungen mit jeweils vier Ketten und 1025000 Generationen, wobei jeder 100te Baum gespeichert wurde. Da die vier simultanen Berechnungen erst nach etwa 800000 Generationen eine ausreichende Konvergenz zueinander aufwiesen wurden nur die letzten 250000 Generationen jeder Berechnung analysiert. Der dargestellte Konsensusbaum in Abbildung 3.22 basiert daher auf insgesamt 10000 Bäumen. Zusätzlich wurde eine Analyse mit 5 Mio. Generationen, aber nur zwei simultanen MCMC‐Berechnungen mit jeweils vier Ketten durchgeführt, um die Konvergenz der einzelnen Berechnungen zu verbessern. Dabei wurden nur die letzten 1,5 Mio. Generationen ausgewertet. Allerdings unterschieden sich die Baumtopologien beider Berechnungen nicht (Daten nicht gezeigt). Lediglich die posterioren Kladenwahrscheinlichkeiten zeigten geringfügige Unterschiede.

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Abbildung 3.22: Evolutionäre Beziehung von 53 Taxa basierend auf einer Bayesschen‐Analyse der 16S rDNA‐Sequenzen unter Annahme des GTR+I+G‐Modells. Abgebildet wurde ein 50 % Mehrheits‐Konsensus‐Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 2,88. Über den Ästen wurden die posterioren Kladenwahrscheinlichkeiten (clade probabilities) angegeben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Länge des Messbalkens entspricht 0,01 Substitutionen pro Merkmal. Die Topologie der Dendrogramme war fast identisch mit der in der NJ‐Analyse (GTR+I+G) ermittelten. Daher werden im Folgenden nur die Unterschiede in den Baumverzweigungen aufgeführt. Die über den Ästen angegebenen posterioren Kladenwahrscheinlichkeiten sind – ähnlich wie Bootstrapwerte – ein Maß dafür, wie oft die Verzweigungen in den gesammelten Bäumen gefunden wurden. Sie können jedoch nicht direkt mit Bootstrapwerten verglichen werden. An der Wurzel konnten auch hier die Arten Mtb. iners, Mtb. adhaesivum, Mtb. goesingense und Mtb. sp. 1c.14 als paraphyletische Gruppe gefunden werden, die die Basis des Baums bildeten, wobei die Kladenwahrscheinlichkeiten diese Verzweigungen nur mäßig stützten. Im Gegensatz zur NJ‐Analyse wurde Mtb. iners dabei direkt an der Basis des Baums platziert. Die Taxa der Gruppe G konnten im Konsensusbaum nicht aufgelöst werden und bildeten so, zusammen mit Mtb. sp. 1b.3, eine polytome Einheit. Mtb. jeotgali wurde bei der Bayesschen Analyse direkt vor den Knoten gesetzt, der Subcluster 1 und 2 voneinander trennte. In Subcluster 2 stellten sich die Gruppen D und F wie in der NJ‐Analyse dar. Dabei konnten meist hohe posteriore Wahrscheinlichkeiten berechnet werden, die diese Topologie unterstützen. Lediglich die Aufspaltung der Gruppen D und E wurde nur in 63 % der Bäume gefunden. Die Arten Mtb. fujisawaense, Mtb. oryzae und Mtb. phyllosphaerae konnten nicht eindeutig voneinander abgegrenzt werden und wurden daher zu einer trichotomen Einheit zusammengefasst. Diese bildeten eine Schwestergruppe zu dem monophyletischem Cluster aus Mtb. radiotolerans, Mtb. tardum, Mtb. gregans und Mtb. hispanicum, wobei hohe Wahrscheinlichkeiten von > 80 % für diesen Knoten erhalten wurden. Basal dieser Gruppe zweigte

110 Ergebnisse

Gruppe F ab, die das Subcluster 2 komplettierte. Die Abzweigung und Topologie dieser Gruppe konnte in allen berechneten Bäumen wieder gefunden werden. Die Verzweigung zwischen den zwei Subclustern wurde dabei mit einer posterioren Kladenwahrscheinlichkeit von 76 % nur mäßig gestützt. Das Subcluster 1 wurde auch in der Bayesschen Analyse von Mtb. organophilum basal abgegrenzt. Darauf folgte die mit einer hohen Kladenwahrscheinlichkeit abgesicherte Verzweigung der monophyletischen Gruppe C um Mtb. variabile und Mtb. isbiliense. Anschließend folgten die Verzweigungen der Spezies Mtb. rhodinum, Mtb. salsuginis, Mtb. suomiense, wobei sich jeweils nur ein Taxon abspaltete. Bis auf die Verzweigung von Mtb. rhodinum konnten diese Knoten in allen analysierten Bäumen gefunden werden. Anschließend spaltete sich Gruppe B ab. Auch diese Verzweigung konnte in allen Bäumen gefunden werden. Die interne Topologie der Gruppe B konnte jedoch statistisch nur mäßig gestützt werden. Das monophyletische Cluster 1 mit Mtb. zatmanii und der Gruppe um Mtb. mesophilicum und Mtb. brachiatum komplettierte das Subcluster 1. Die Verzweigung dieser Gruppe wurde durch einen hohen Wahrscheinlichkeitswert unterstützt.

3.6.2 Vergleichende DNA-Sequenzanalyse des partiellen mxaF-Gens Bei allen getesteten Methylobacterium‐Isolaten konnte mit der Primerkombination moxF f1003 / moxF r1561 ein ca. 560 bp langes Fragment amplifiziert werden. Für vier Freilandisolate und sechs Typstämme wurden die PCR‐Fragmente mit den Primern moxF f1003 und moxF r1561 bidirektional sequenziert. Nach dem Entfernen der Primersequenzen verblieb eine Nucleotidsequenz von 516 bp Länge. Um das Leseraster (open reading frame) des mxaF‐Gens beizubehalten wurde ein Thymin des Primers moxF f1003 am 5’‐Ende der Sequenz beibehalten, wodurch 517 bp (bzw. 172 AS) ausgewertet werden konnten. Die Sequenzen wurden an die GenBank übermittelt und unter den Zugriffsnummern FJ157950‐ FJ157959 archiviert (siehe Tabelle 3.14). Tabelle 3.14: Im Rahmen der Arbeit ermittelte, partielle mxaF‐Sequenzen mit GenBank‐ Zugriffsnummern (GID). Zusätzlich wurden die ähnlichsten Isolate des BLAST‐Datenbank‐ abgleichs mit GenBank‐Zugriffsnummern (in Klammern) und der erzielten ‚Max ident’ (in Prozent) dargestellt. Auf die Angabe des nächsten Typstammes wurde verzichtet, da nicht für alle Typstämme Sequenzen in der Datenbank vorliegen.

Stamm / Isolat GID Ähnlichstes Isolat (GID) Max ident Mtb. adhaesivum DSM 17169T FJ157950 Mtb. sp. CBMB5 (EF562491.1) 97 % Mtb. fujisawaense DSM 5686T FJ157951 Mtb. oryzae CBMB20T (EF562478.1) 100 % Mtb. jeotgali S2R03‐9T FJ157952 Mtb. jeotgali strain S2R03‐9 (EF031552.1) 99 % Mtb. mesophilicum DSM 1708T FJ157953 Mtb. oryzae CBMB20T (EF562478.1) 95 % Mtb. radiotolerans DSM 1819T FJ157954 Mtb. radiotolerans JCM 2831T (CP001001.1) 100 % Mtb. goesingense iEII3 FJ157955 Mtb. sp. CBMB5 (EF562491.1) 92 % Mtb. sp. JT1 FJ157956 Uncultured methylotrophic bacterium 94 % clone D1RTMAX460 (DQ260414.1) Mtb. sp. 5b.2.20 FJ157957 Uncultured methylotrophic bacterium 94 % clone D1RTMAX460 (DQ260414.1) Mtb. sp. F3.2 FJ157958 Mtb. sp. CBMB5 (EF562491.1) 95% Mtb. sp. F2.1 FJ157959 Mtb. sp. CBMB5 (EF562491.1) 95%

111 Ergebnisse

3.6.2.1 Auswahl geeigneter Vergleichssequenzen Zum Überprüfen der Reproduzierbarkeit der Methode wurden zwei Stämme sequenziert, für die bereits Daten in der NCBI GenBank hinterlegt wurden. Zum einen wurde die partielle Sequenz für Mtb. radiotolerans DSM 1819T ermittelt (FJ157954) und mit dem entsprechenden GenBank‐Eintrag des Genomprojekts von Mtb. radiotolerans JCM 2831T (CP001001.1 Region 4457490..4456974) verglichen. Der Typstamm wurde vom DOE Joint Genome Institute7 bereits vollständig sequenziert und besitzt ein Chromosom mit 6,1 Mbp sowie 8 Plasmide mit Größen von 0,02 bis 0,59 Mbp. Der paarweise Sequenzvergleichs zeigte dabei eine 100 %ige Identität beider Sequenzen (siehe Tabelle 3.14). Weiterhin wurde die partielle mxaF‐Sequenz für Mtb. jeotgali S2R03‐9T ermittelt, da bei Alignments mit dem GenBank‐Eintrag der Speziesbeschreibung von Aslam et al. (2007) mit anderen mxaF‐Sequenzen drei Insertionen auftraten, die das Lese‐ raster des Gens verschieben. Daher sollte geklärt werden ob, es sich dabei um echte Insertionsereignisse oder um Sequenzierfehler handelt. Der paarweise Sequenzvergleich der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Sequenz (FJ157952.1) und der von Aslam et al. (2007) publizierten (EF031552.1) bestätigte die Vermutung, dass die Referenzsequenz fehlerhaft übermittelt wurde und drei Basen zuviel enthält. Bei der Homologisierung beider Sequenzen zeigten sich die oben erwähnten Lücken, wodurch davon ausgegangen werden kann, dass es sich nicht um echte Insertionsereignisse handelt. Bei den Berechnungen wurde daher nur die eigens ermittelte Sequenz (FJ157952.1) verwendet.

Tabelle 3.15: für die phylogenetische Analyse des mxaF‐Gens verwendete Typstamm‐Sequenzen mit GenBank‐Zugriffsnummern (GID) und Referenzen.

Stamm GID Referenz Mtb. aquaticum DSM 16371T EF562464.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. chloromethanicum CM 4T ABEX01000002.1 ctg 73 Region 108414..108930 Mtb. dichloromethanicum DSM 6343T AJ878068.1 Dedysh et al. (unpublished) Mtb. extorquens DSM 1337T EF562466.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. hispanicum DSM 16372T EF562468.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. lusitanum KCTC 12964T EF562469.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. nodulans ORS 2060T AF220764.1 Sy et al. 2001 Mtb. organophilum ATCC 27886T M22629.1 Machlin und Hanson, 1988 Mtb. oryzae CBMB20T EF562478.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. phyllosphaerae CBMB27T EF562496.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. podarium FM4T AY468366.1 Anesti et al. 2004 Mtb. populi BJ001T CP001029 Region 4944195..4946075 Mtb. rhodesianum DSM 5687T EF562473.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. rhodinum ATTC 14821T U70527.1 McDonald und Murrell, 1997 Mtb. salsuginis MRT EF030550.1 Wang et al. 2007 Mtb. suomiense KCTC 12963T EF562474.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. thiocyanatum DSM 11490T EF562475.1 Madhaiyan et al. (unpublished) Mtb. zatmanii DSM 5688T EF031553.1 Aslam et al. 2007

7 http://genome.jgi‐psf.org/finished_microbes/metra/metra.info.html 112 Ergebnisse

Für die molekular‐phylogenetische Analyse des partiellen mxaF‐Gens wurde zusätzlich in den Datenbanken der NCBI nach homologen Sequenzen bei Typstämmen der Gattung Methylobacterium gesucht. In Tabelle 3.15 wurden die GenBank‐Zugriffsnummern der bereits veröffentlichten Typstammsequenzen zusammengefasst, die in die Analyse miteinbezogen wurden.

3.6.2.2 Wahl des Substitutionsmodells Bei der Ermittlung des am besten zutreffenden Substitutionsmodells mit den Programmen Modeltest (Posada und Crandall 1998) und MrModeltest (Nylander 2004) konnte das GTR‐Modell unter Einbezug des Anteils an invariablen Merkmalen und Modellierung einer Gamma‐Verteilung (GTR+I+G) die Daten am besten erklären. Die ermittelten Parameter (siehe Tabelle 3.16) wurden soweit möglich für die weitere molekularphylogenetische Analyse verwendet. Tabelle 3.16: Mit Modeltest ermittelte Parameter für die phylogenetische Analyse des partiellen mxaF‐Gens.

Parameter Wert Basenfrequenzen freqA 0,2293 freqC 0,3482 freqG 0,2787 freqT 0,1438 Austauschraten R(a) [A‐C] 0,8748 R(b) [A‐G] 2,3256 R(c) [A‐T] 2,8245 R(d) [C‐G] 5,9234 R(e) [C‐T] 9,5873 R(f) [G‐T] = 1,0000 Unterschiedliche Merkmals‐Variationsraten Anteil invariabler Merkmale (ncat=4) 0,4269 Variable Merkmale Formfaktor der Gammaverteilung 0,6288

3.6.2.3 Phylogenetische Rekonstruktion (mxaF-Gen) Auch bei der phylogenetischen Analyse der partiellen mxaF‐Gensequenzen konnten bestimmte Gruppen in allen Baumtopologien wieder gefunden werden. Diese wurden mit den Buchstaben a bis f abgekürzt und sollen im Folgenden besprochen werden. In Cluster a fanden sich stets die Sequenzen der Arten Mtb. extorquens, Mtb. rhodinum, Mtb. chloromethanicum und Mtb. dichloromethanicum – die zusammen eine monophyletische Einheit bildeten – sowie Mtb. podarium, welche immer basal dieser Gruppe abzweigte. Gruppe b bestand aus Mtb. rhodesianum und Mtb. lusitanum. Diese Arten besitzen vollständig identische (Teil‐)Sequenzen und konnten daher nicht differenziert werden. Mtb. populi und Mtb. thiocyanatum wurden zur Gruppe c zusammengefasst. In Gruppe d wurden 5 Spezies eingeordnet, wobei Mtb. fujisawaense, Mtb. phyllosphaerae und Mtb. oryzae identische Sequenzen besaßen und dadurch nicht unterschieden werden konnten. Zusätzlich fanden sich in dieser Einheit immer auch die Stämme Mtb. mesophilicum

113 Ergebnisse und Mtb. radiotolerans. In Gruppe e wurden die Stämme JT1 und 5b.2.20 sowie F3.2 und F2.1 zusammengefasst. Wie bei den 16S rDNA‐Sequenzen konnten auch hier keine Unterschiede zwischen JT1 und 5b.2.20 bzw. F3.2 und F2.1 beobachtet werden, jedoch besaßen die beiden Stammpärchen eine genetische Divergenz von 3,7 % (siehe auch Tabelle 5.4 im Anhang) und konnten so in den Analysen gut voneinander abgegrenzt werden. In Gruppe f fanden sich stets die beiden Stämme Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum, die trotz einer hohen genetischen mxaF‐ Sequenzdivergenz von 7,9 % immer als Schwestertaxa auftraten. Diese Gruppen konnten wiederum zu größeren monophyletischen Einheiten zusammengefasst werden, die im Folgenden mit Subcluster 1 bis 3 bezeichnet wurden. Subcluster 1 bestand aus den Gruppen a, b und c sowie den Spezies Mtb. zatmanii, Mtb. suomiense und Mtb. salsuginis. In Subcluster 2 fand sich Gruppe d wie auch die Arten Mtb. hispanicum und Mtb. jeotgali. Die Gruppen e und f bildeten zusammen mit Mtb. adhaesivum und Mtb. goesingense Subcluster 3. In Abbildung 3.23 wurde ein NJ‐Phänogramm abgebildet, bei dem die paarweisen genetischen Distanzen mit dem GTR+I+G‐Algorithmus geschätzt wurden. Zum Vergleich dazu wurde in Abbildung 5.4 (Anhang) ein NJ‐Baum dargestellt, bei dem das Substitutionsmodell von Jukes und Cantor (JC) verwendet wurde. Zusätzlich wurden Analysen mit unkorrigierten Distanzdaten (p‐Dist.) und dem Kimura‐2‐Parameter‐Modell (K2P) durchgeführt (nicht dargestellt). In allen Fällen konnte dabei Gruppe a als terminale Einheit gefunden werden, wobei die basale Verzweigung der Art Mtb. podarium nur durch einen niedrigen Bootstrapwert von 35 % (JC) bzw. 66 % (GTR+I+G) gekennzeichnet war. Auf diese Gruppe folgten bei Analysen mit einfachen Substitutionsmodellen (p‐Dist., JC, K2P) die Abzweigungen der Spezies Mtb. rhodesianum/Mtb. lusitanum sowie Mtb. zatmanii. Diese Verzweigungen konnten jedoch in weniger als 50 % aller Bootstrap‐Replikate gefunden werden. Bei Verwendung des GTR+I+G‐ Algorithmus wurden die Spezies Mtb. salsuginis, Mtb. suomiense und Mtb. zatmanii in einer paraphyletischen, polytomen Gruppe zusammengefasst. Basal davon fand sich das Sequenzpaar der Spezies Mtb. rhodesianum und Mtb. lusitanum (Gruppe b) wieder. Jedoch konnte die Abtrennung der beiden letztgenannten Gruppen auch bei Analyse mit dem GTR+I+G‐Verfahren nicht durch die Bootstrap‐Analyse belegt werden. Basal wurde das monophyletische Subcluster 1 durch das Speziespaar Mtb. populi und Mtb. thiocyanatum (Gruppe d) abgeschlossen, wobei die Verzweigung durch einen Bootstrapwert von 67 % nur schwach gestützt wurde. Bei Verwendung einfacher Substitutionsmodelle fand sich Gruppe d in einer Polytomie mit Mtb. salsuginis und Mtb. suomiense wieder. Das Subcluster 1 wurde dabei durch die Spezies Mtb. organophilum abgeschlossen. Für die dichotome Verzweigung konnte dabei eine relativ hohe Bootstrap‐Unterstützung von etwa 80 % erhalten werden. Unter Verwendung des GTR+I+G‐Substitutions‐ modells wurde Mtb. organophilum direkt an der Wurzel des Baums platziert und konnte so keinem Subcluster zugeordnet werden. Jedoch war die evolutive Distanz der Sequenz zu Subcluster 1 wesentlich geringer als zu jedem anderen.

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Abbildung 3.23: Evolutionäre Verwandtschaft von 29 Taxa auf Grundlage der partiellen mxaF‐ Gensequenzen. Die evolutionäre Abfolge wurde mit der Neighbor‐Joining‐Methode ermittelt (Saitou und Nei 1987). Die evolutionären Distanzen wurden mit dem GTR+I+G‐Modell berechnet. Der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 0,75 wurde dargestellt. Auf den Ästen wurden Bootstrapwerte > 50 % eingezeichnet (basierend auf 10000 Replikaten). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Messbalken: 0,01 Substitutionen pro Merkmal. Die beiden Gruppen e und f wurden mit allen getesteten Substitutionsmodellen in das monophyletischen Subcluster 3 eingeordnet. Zwischen diesen beiden Gruppen fanden sich die Sequenzen der Stämme Mtb. adhaesivum und Mtb. goesingense wieder, wobei die Topologie dieser beiden Stämme je nach verwendetem Substitutionsverfahren geringfügig variierte. So bildeten sie unter Verwendung des GTR+I+G‐Modells eine monophyletische Schwestergruppe zu f, während sie bei den einfacheren Substitutionsmodellen als paraphyletische Gruppe vor dem Sequenzcluster d platziert wurden. Für beide Varianten konnten jedoch nur geringe Bootstrapwerte berechnet werden. Auch die Abtrennung dieses Subclusters konnte mit einem Wert von 50‐53 % nicht zuverlässig abgesichert werden. Die Stellung der Taxa in Subcluster 2 variierte je nach Komplexität des verwendeten Substitutionsmodells. Einfache Modelle (p‐Dist., JC, K2P) stellten Subcluster 2 als eine monophyletische Schwestergruppe zu Subcluster 1 dar, wobei ein mäßiger Bootstrapwert von 72 % diese Verzweigung unterstützte. Bei Verwendung der unkorrigierten p‐Distanzen fiel der Bootstrapwert mit 78 % etwas höher aus. Wurde das GTR+I+G‐Modell zur Rekonstruktion der Verwandt‐ schaftsverhältnisse verwendet, bildeten hingegen Subcluster 2 und Subcluster 3 monophyletische Schwestergruppen. Jedoch konnte diese Anordnung in weniger als 50 % der Bootstrapreplikate gefunden werden. Subcluster 2 bestand bei allen Analysen aus den Sequenzen der Gruppe d sowie den Arten Mtb. hispanicum und Mtb. jeotgali. Die Wahl des Substitutionsverfahrens hatte in diesem Subcluster nur einen geringen Einfluss auf die errechnete interne Topologie. Dabei wurden 115 Ergebnisse lediglich die Positionen der Spezies Mtb. mesophilicum und Mtb. radiotolerans getauscht, die sich zwischen den basal gelegenen Spezies Mtb. jeotgali und Mtb. hispanicum sowie den genetisch identischen Sequenzen von Mtb. fujisawaense, Mtb. oryzae und Mtb. phyllosphaerae einordneten. Das Verzweigungsmuster blieb dabei jedoch bestehen. Neben den Distanzanalysen wurden auch für dieses Genfragment die Charakterbasierten Verfahren Maximum Likelihood (ML) und eine Bayessche Analyse verwendet um die Phylogenie zu rekonstruieren. In Abbildung 3.24 wurde ein 50 % Mehrheitskonsensusbaum einer Bayesschen Analyse abgebildet. Für die Berechnung wurde dem Programm das GTR+I+G‐Substitutionsmodell vorgegeben, welches sich bei einer Analyse der Daten mit MrModeltest (Nylander 2004) als das am besten geeignete Verfahren herausstellte. Die Analyse beruht auf vier simultanen MCMC‐Berechnungen mit jeweils vier Ketten und 2050000 Generationen, wobei jeder 100te Baum gespeichert wurde. Da die vier simultanen Berechnungen erst nach etwa 1500000 Generationen eine ausreichende Konvergenz aufwiesen wurden nur die letzten 250000 Generationen der Berechnungen analysiert. Dabei konnten wieder 3 Subcluster beobachtet werden, die in ihrer Zusammensetzung und Topologie der NJ‐Analysen mit einfachen Substitutions‐ modellen glichen. Subcluster 1 bildete dabei eine monphyletische Schwester‐ gruppe zu Subcluster 2. Subcluster 1 und 2 bildeten zusammen eine mono‐ phyletische Gruppe, die dem ebenfalls monophyletischen Subcluster 3 gegenüberstanden. In Gruppe a bildeten Mtb. extorquens und Mtb. rhodinum – im Gegensatz zu den NJ‐Kladogrammen – keine direkten Schwestergruppen sondern eine para‐ phyletische Einheit, von der aus sich die Taxa Mtb. chloromethanicum und Mtb. dichloromethanicum weiter abzweigten. Jedoch konnten die zwei terminalen Knoten der Gruppe keine hohen Kladenwahrscheinlichkeiten aufweisen. Jedoch wurden die eben genannten Spezies mit der basal davon abzweigende Art Mtb. rhodinum in allen analysierten Bäumen gefunden. Die Abzweigung der Spezies Mtb. podarium, die die basale Begrenzung der Gruppe a darstellte, wurde ebenfalls in einer Vielzahl errechneter Bäume wieder gefunden (88 %), wodurch die genetische Ähnlichkeit der darin gesammelten Arten unterstützt wird. Bei der Bayesschen Analyse konnte bei den weiter basal liegenden Stämmen keine eindeutige Topologie ausreichend belegt werden, wodurch die Gruppen b und c, sowie die Spezies Mtb. salsuginis, Mtb. suomiense, Mtb. zatmanii und die Verzweigung zu Gruppe a eine Polytomie im Stammbaum bildeten. Die Verzweigung von Mtb. organophilum wurde bei der Bayesschen Analyse der Daten direkt vor Subcluster 1 gesetzt. Diese Topologie konnte jedoch nur in 63 % aller Bäume gefunden werden. Auch Subcluster 2 unterschied sich nur geringfügig von den NJ‐Bäumen. Jedoch konnte die Spezies Mtb. hispanicum in weniger als 50 % der berechneten Bäume innerhalb des Subclusters gefunden werden, woraus eine polytome Verzweigung resultierte. Der Knoten an dem sich der Stamm Mtb. jeotgali und Gruppe d

116 Ergebnisse aufspalteten bildete daher die Basis der weiteren Topologie des Subclusters. Mit einer Kladenwahrscheinlichkeit von 71 % wurde dieser Knoten jedoch nur mäßig unterstützt. Auch innerhalb der Gruppe d konnte kein eindeutiges Verzweigungs‐ muster ermittelt werden. Lediglich die Zusammengehörigkeit der Gruppe wurde durch einen posteriore Wahrscheinlichkeitswert von 100 % sehr gut gestützt. Das komplette Subcluster 3 wurde mit einer Kladenwahrscheinlichkeit von nur 56 % gefunden, jedoch besaßen die Gruppen e und f mit 80 und 98 % selbst gut abgesicherte Knoten. Bei der Rekonstruktion der Verwandtschaftsverhältnisse mit der Maximum Likelihood‐Methode (ML) konnten die Subcluster 1 bis 3 mit vergleichbaren Topologien wieder gefunden werden (Abbildung 5.5). Für die Analyse wurden die mit Modeltest ermittelten Parameter als Vorgaben verwendet. Hierbei wurden jedoch die Spezies der Gruppe b, Mtb. lusitanum und Mtb. rhodesianum, direkt an der Wurzel des Baums platziert und zeigten so den geringsten evolutionären Abstand zur Außengruppe. Auch die Reihenfolge der weiter intern liegenden Knoten und Taxa war im Vergleich zu den NJ‐Phylogrammen und der Bayesschen Analyse „umgedreht“. Subcluster 1 und 2 konnten im ML‐Baum nur als para‐ phyletische Einheiten gruppiert werden. Das terminal gelegene, monophyletische Subcluster 3 besaß im ML‐Baum exakt die gleiche Topologie wie in den NJ‐ Analysen mit einem einfachen Substitutionsmodell.

Abbildung 3.24: Evolutionäre Beziehung von 29 Taxa basierend auf einer Bayesschen‐Analyse der partiellen mxaF‐Sequenzen unter Annahme des GTR+I+G‐Modells. Abgebildet wurde ein 50 % Mehrheits‐Consensus‐Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 1,52. Über den Ästen wurden die Kladenwahrscheinlichkeiten (clade probabilities) angegeben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Länge des Messbalkens entspricht 0,01 Substitutionen pro Merkmal.

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3.7 Charakterisierung des Isolat JT1

3.7.1 Gram-Färbung Für die Gram‐Färbung des Stamms Mtb. sp. JT1 wurden Zellen aus exponentiell wachsenden, 48 h alten Minimalmedium‐Flüssigkulturen mit 5 mM Succinat verwendet. Nach Fixieren und Färben der Zellen wurden die Bakterien mit einem 40x Objektiv im Lichtmikroskop betrachtet. Die Zellen stellten sich dabei als Gram‐ negative Stäbchen dar (siehe Abbildung 3.25A).

3.7.2 PHB-Nachweis Die Färbung der Zellen mit Sudan‐Schwarz B zum Nachweis intrazellulärer Lipid‐ Einschlüsse wurde mit Bakterien aus stationären Minimalmedium‐Flüssig‐ kulturen mit 5 mM Succinat als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Dabei konnten in den meisten Zellen polar angeordnete, schwarz gefärbte Strukturen erkannt werden (siehe Abbildung 3.25B), was auf die Einlagerung von PHB schließen lässt.

Abbildung 3.25: Zellen des Isolats Mtb. sp. JT1 im Lichtmikroskop. A: Nach Gram gefärbte Zellen. B: Sudan‐Schwarz B gefärbte Zellen aus einer stationären Minimalmedium‐Flüssigkultur zum Nachweis sudanophiler Einschlüsse. Messbalken: 10 μm.

3.7.3 Bestimmung der Zelldimensionen Zur Bestimmung der Zelldimensionen der Stämme/Isolate wurden diese in flüssigem R2A‐Medium kultiviert, da dieses Medium auch in vielen aktuellen Speziesbeschreibungen verwendet wurde und daher Vergleichsdaten zur Verfügung standen. Bei der Kultivierung der Zellen zeigte sich, dass die durchschnittliche Zell‐Länge mit fortschreitender Kulturdauer zum Teil sehr deutlich über der durch‐ schnittlichen Länge in der exponentiellen Wachstumsphase lag. Dabei konnten Zellen mit einer Länge von bis zu 8 μm beobachtet werden.

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Um eine möglichst gute Vergleichbarkeit zu erreichen sollten die Zellgrößen deshalb in der exponentiellen Wachstumsphase bestimmt werden (Imhoff und Caumette 2004). Daher wurden die Zellen der R2A‐Flüssigkulturen nach 24 Stunden Inkubation bei RT und 150 rpm im Phasenkontrast mit einem 40x Objektiv fotografisch dokumentiert und mit der zur Kamera gehörenden, geeichten Bildverarbeitungs‐ software vermessen. Stämme/Isolate, die nach 24 Stunden Inkubation kein ausreichendes Wachstum zeigten, wurden nach 48 Stunden vermessen. Da die Zellen einer natürlichen Variation unterliegen, wurden die ermittelten Daten aus mindestens drei unabhängigen Experimenten gepoolt und in zehn gleich breite Klassen eingeteilt. Dabei zeigte sich eine annähernde Normal‐ verteilung der untersuchten Parameter. Anschließend wurde der Bereich bestimmt, in dem sich mindestens 85% der Zellen befanden. In Tabelle 3.17 wurden die entsprechenden, diesen Bereich einschließenden, Klassengrenzen dargestellt. Zusätzlich wurde der Mittelwert aller Messwerte bestimmt und in der Tabelle aufgeführt. Der Standardfehler lag dabei unter 0,05 μm und wurde daher nicht aufgeführt. Die mittlere Zellbreite der Stämme betrug zwischen 1,0 μm für Mtb. jeotgali S2R03‐9T und 1,3 μm für Methylobacterium goesingense iEII3, wobei sich die Bereiche der beiden Stämme, in die sich 85 % der Zellen einordnen ließen, jedoch überlappten. Auch bei der Zelllänge unterschieden sich die untersuchten Isolate nicht wesentlich. So besaßen die Zellen des Stamms mit den durchschnittlich längsten Zellen (Mtb. fujisawaense DSM 5686T) eine mittlere Länge von 2,9 μm, während der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ Zellen mit einer mittleren Länge von nur 1,6 μm aufwies. Jedoch überlappten sich auch hier die Bereiche, in denen 85 % der Zellen zu finden waren.

Tabelle 3.17: Zellgrößen von Mtb. spp. in exponentiell wachsenden R2A‐ Schüttelkulturen. Die Zellen wurden in 20 ml Medium bei RT und 150 rpm für 24 (oder 48) h inkubiert. Für die Dimensionen wurde jeweils der Bereich angegeben, in den sich mindestens 85 % der Zellen einordnen ließen (siehe Text). In runden Klammern wurde der berechnete Mittelwert aller Einzelmessungen dargestellt. n: Anzahl der Einzelmesswerte aus mindestens drei unabhängigen Experimenten.

Stamm/Isolat Breite in μm Länge in μm n Mtb. sp. JT1 1,0‐1,3 (1,2) 1,9‐3,9 (2,8) 257 Mtb. sp. F3.2 1,0‐1,4 (1,2) 1,7‐3,4 (2,7) 294 Mtb. jeotgali S2R03‐9T 0,8‐1,2 (1,0) 1,8‐3,5 (2,6) 251 Mtb. goesingense iEII3 1,1‐1,5 (1,3) 1,6‐4,0 (2,8) 368 Mtb. fujisawaense DSM 5686T 1,0‐1,6 (1,3) 1,8‐3,8 (2,9) 162 Mtb. adhaesivum DSM 17169T 1,0‐1,4 (1,2) 1,3‐3,2 (2,3) 424 Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ 1,0‐1,4 (1,2) 1,3‐2,2 (1,6) 478 Mtb. mesophilicum DSM 1708T 0,9‐1,3 (1,1) 1,9‐2,9 (2,4) 192 Mtb. radiotolerans DSM 1819T 1,0‐1,4 (1,2) 1,9‐3,4 (2,6) 213

119 Ergebnisse

3.7.4 Absorptionsspektren Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Pigmente folgender Stämme mit 80 % (v/v) Methanol extrahiert: Mtb. sp. JT1, Mtb. sp. 5b.2.20, Mtb. sp. 1b.3, Mtb. sp. F3.2, Mtb. sp. F2.1, Mtb. sp. 5a.1.5, Mtb. sp. 1c.14, Mtb. sp. 1c.1, Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. goesingense iEII3, Mtb. fujisawaense DSM 5686T und Mtb. jeotgali S2R03‐9T. Mit Ausnahme des unpigmentierten Typstamms Mtb. jeotgali S2R03‐9T zeigten alle Stämme ein ähnliches UV/Vis‐Absorptions‐Spektrum, mit einem für Carotinoide charakteristischen, dreigipfeligem Peak zwischen 400 und 600 nm (vgl. Abbildung 3.26A). Die Absorptionsmaxima lagen dabei bei etwa 520, 490 und 465 nm, wobei der Peak mit der kürzesten Wellenlänge nur als Schulter zu erkennen war. Bei allen Stämmen trat auch ein Peak bei ca. 360 nm auf, der interessanterweise bei ethanolischen Pigment‐Extrakten nicht nachgewiesen werden konnte. Zusätzlich war bei allen Stämmen ein kleiner Peak bei ca. 312 nm nachzuweisen. In einigen Kulturen konnte ein Peak bei etwa 770 nm beobachtet werden, der auf das Vorhandensein von Bacteriochlorophyll a schließen lässt (Yurkov und Beatty 1998). Dies war vor allem bei schnell gewachsenen, jungen Kulturen aus NA‐ Flüssigkultivierungen der Fall, jedoch wurde dieser Peak teilweise auch bei Pigmentextraktionen mit Zellen von GP‐Agar oder aus Minimalmedium‐ Flüssigkulturen mit Methanol als Kohlenstoffquelle nachgewiesen. Die für die Induktion der Bacteriochlorophyllsynthese entscheidenden Faktoren wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht weiter untersucht. In Abbildung 3.26B wurde ein in vivo Absorptions‐Spektrum einer Zellsuspension des Isolats Mtb. sp. JT1 in 60 % (w/v) Saccharose dargestellt.

Abbildung 3.26: UV/Vis‐Absorptionsspektren des Isolats Mtb. sp. JT1 (Beschreibung siehe Text). A: methanolische Carotinoidextraktionen; ( ): Zellen aus Medium nach Choi et al. (1989) mit 1,0 % Methanol; ( ): Zellen aus NA‐Flüssigmedium). B: in vivo Absorptions‐Spektrum einer Zellsuspension in 60 % Saccharose.

120 Ergebnisse

3.7.5 Wachstum bei unterschiedlichen pH-Werten Um das Wachstum des Isolats Mtb. sp. JT1 bei unterschiedlichen pH‐Werten zu testen, wurden je 25 ml autoklaviertes und abgekühltes R2A‐Medium mit HCl und NaOH auf pH‐Werte von 4‐10 eingestellt. Jeweils 10 ml wurden anschließend in zwei sterile Kulturgefäße sterilfiltriert. Die Ansätze wurden mit 1x107 Bakterien inokuliert und für 7 d bei RT und 150 rpm inkubiert. Zur Bestimmung des Wachstums wurde jeden Tag ein Aliquot der Kultur photometrisch bei einer Wellenlange von 600 nm vermessen. Zu Beginn der Kultivierung und nach 7 d wurde der pH‐Wert der Kulturen mit pH‐Teststreifen (pH‐Bereich 0‐14, Merck, Darmstadt) bestimmt (siehe Abbildung 3.27). Bei der Bestimmung der pH Toleranz des Stamms Mtb. sp. JT1 in R2A‐ Flüssigmedium zeigte sich, dass die Bakterien den pH‐Wert des nur schwach gepufferten Mediums verändern. Nach 7 Tagen besaßen die meisten Kulturen (initialer pH‐Wert von 6,0‐10,0) einen pH zwischen 8 und 9. Nur die Kulturen, die mit einem anfänglichen pH von 4,0 angesetzt wurden, änderten ihren pH‐Wert kaum. Jedoch konnte in diesen Ansätzen auch kein Wachstum beobachtet werden. Bei den Kulturen mit pH 5,0 zeigte Kultur (a) nach 4‐5 Tagen Wachstum; bei Kultur (b) stellte sich jedoch erst nach 7 Tagen eine Trübung des Mediums ein. Nach 7 Tagen Inkubation zeigte Kultur (a) einen pH‐Wert von etwa 7,0‐7,5; Kultur (b) etwa pH 6,5‐7,0.

Abbildung 3.27: pH‐Teststäbchen (pH Bereich 0‐14, Merck, Darmstadt) der Mtb. sp. JT1‐Kulturen am Beginn des Versuchs (obere Reihe) und nach 7 d Kultivierung (untere Reihe) bei 25 °C und 150 rpm. Beschreibung siehe Text.

121 Ergebnisse

Das beste Wachstum zeigte der Stamm Mtb. sp. JT1 in neutralen Medien (pH 7,0 und 7,2), wobei nach 48 h die maximale Trübung der Kultur erreicht wurde. Bei anfänglichen pH‐Werten von 8,0 und 9,0 wurde das Wachstum etwas verlangsamt, wobei die Kulturen nach 72 h eine maximale Trübung erreichten. Die Kultur mit pH 6,0 (a) erreichte zwar ebenfalls nach 72 h ihre maximale Trübung, jedoch benötigte die zweite Kultur mit pH 6,0 (b) 7d bis zum Erreichen der stationären Phase; ab dem dritten Tag konnte eine Trübung des Mediums beobachtet werden. Beide Kulturen, die mit einem anfänglichen pH‐Wert von 10,0 angesetzt wurden, zeigten nach 5 d eine erkennbare Trübung des Mediums und erreichten nach 7 d die stationäre Phase. Bei der Wiederholung des Versuchs mit pH‐Werten von 6,0, 7,0, 7,2 und 8,0 (jeweils zwei Ansätze) erreichten alle Kulturen nach 48 h ihre maximale Trübung. Daher wurden die weiteren Versuche zur pH‐Toleranz nach drei Tagen Wachs‐ tum ausgewertet, um auszuschließen, dass die Bakterien durch die Änderung des pH‐Werts des Mediums falsch positive Ergebnisse entstehen lassen. Dabei zeigte das Isolat JT1 Wachstum in Medien mit einem initialen pH‐Wert von 6,0‐9,0. Der optimale pH‐Wert lag im neutralen Bereich (pH 7,0‐7,2). Der Stamm F3.2 zeigte kein Wachstum innerhalb der ersten drei Tage in R2A‐ Medium mit pH‐Werten von 4,0 und 5,0. Wachstum konnte in den Kulturen mit pH‐Werten von 6,0‐10,0 beobachtet werden, wobei die Zellen in dem Medium mit pH 10 eine abnormale Zellform aufwiesen.

3.7.6 Salztoleranz

3.7.6.1 Salztoleranz auf Festmedium Die Salztoleranz des Stamms Mtb. sp. JT1 und einiger Methylobacterium‐Isolate wurde auf R2A‐Agarplatten (1,5 % Agar) mit zugesetzten NaCl (0,5 %, 1,0 % und 2,0 %) getestet. Die Agarplatten wurden für 14 d bei 28 °C bebrütet. In Tabelle 3.18 wurden die Ergebnisse von mindestens drei Agarplatten aus zwei unabhängigen Versuchsreihen zusammengefasst.

Tabelle 3.18: Salztoleranz einiger Methylobacterium‐Isolate auf R2A‐Festmedium mit zugesetztem NaCl nach 14 d Inkubation bei 28 °C. Beschreibung siehe Text.

R2A‐Agar R2A‐Agar R2A‐Agar Stamm/Isolat R2A‐Agar (0,5% NaCl) (1,0% NaCl) (2,0% NaCl) Mtb. sp. JT1 + + ‐ ‐ Mtb. mesophilicum DSM 1708T + + + ‐ Mtb. zatmanii DSM 5688T + + + ‐ Mtb. radiotolerans DSM 1819T + + + ‐ Mtb. fujisawaense DSM 5686T + + + ‐ Mtb. sp. 5b.2.20 + + ‐ ‐ Mtb. sp. 1c.1 + + + w Mtb. sp. 5a.1.13 + + + ‐ Mtb. sp. 1c.5 + + + w

122 Ergebnisse

Alle getesteten Stämme zeigten Wachstum auf den Medien mit maximal 0,5 % zugesetztem NaCl. Bei einer Konzentration von 1,0 % NaCl konnten die beiden phylogenetisch eng verwandten Isolate JT1 und 5b.2.20 nicht mehr auskeimen. Auf den Medien mit 2,0 % zugesetztem NaCl zeigten nur noch die beiden Isolate 1c.1 und 1c.5 einen leichten Bakterienfilm, wenn die Platten mit hohen Anfangs‐ zelldichten beimpft wurden. Bei Beimpfung der Nährmedien mit einer geringen Keimdichte konnte auch bei diesen Isolaten kein Wachstum beobachtet werden.

3.7.6.2 Salztoleranz in Flüssigmedium Die Salztoleranz des Isolats Mtb. sp. JT1 wurde zusätzlich in flüssigem R2A‐ Medium mit NaCl‐Zugabe von 0 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,0 %, 3,0 % und 4,0 % getestet. Die Kulturen wurden dabei für 7 d bei 28 °C und 150 rpm in jeweils 10 ml R2A‐ Nährmedium mit der entsprechenden Menge an NaCl inkubiert. Der Stamm zeigte das beste Wachstum in Medium ohne zugesetztes NaCl (siehe Abbildung 3.28). Bereits bei einer NaCl‐Konzentration von 0,5 % wurde das Wachstum um fast 50 % verlangsamt. Bei 2,0 % NaCl im Medium oder mehr zeigte der Stamm kein Wachstum innerhalb von vier Tagen. Jedoch stieg die OD600 der Kultur bis Tag 14 kontinuierlich an und zeigte nach 14 d eine mittlere Absorption von 0,03. Bei 3,0 % oder mehr NaCl im Medium konnte kein Wachstum beobachtet werden.

Abbildung 3.28: Halblogarithmische Wachstumskurve des Stamms Mtb. sp. JT1 in flüssigem R2A‐Medium zur Ermittlung der Salztoleranz. Dargestellt wurden die Wachstumskurven von Kulturen mit 0 %, 0,5 %, 1,0 % und 2,0 % NaCl‐ Zusatz. Fehlerbalken: Standardfehler des Mittelwerts (n≥3).

123 Ergebnisse

Die Salztoleranz des Stamms Mtb. sp. F3.2 wurde im Bereich von 0,0‐2,0 % getestet. Der Stamm zeigte dabei das beste Wachstum in R2A ohne Salzzugabe (maximale Trübung nach 2‐3 d). Bei Zusatz von 1,0 % und 2,0 % wurde das Wachstum des Stamms verlangsamt (maximale Trübung nach 4‐5 d), jedoch zeigte der Stamm auch bei 2,0 % noch deutliches Wachstum. Zusätzlich wurde die Salztoleranz des Stamms Mtb. fujisawaense DSM 5686T im Bereich von 1,0‐2,0 % untersucht. Dieser Stamm zeigte in R2A‐Medium ohne zusätzliches NaCl und im Medium mit 1,0 % NaCl etwa gleich gutes Wachstum. Jedoch konnte kein Wachstum bei Zusatz von 2,0 % NaCl beobachtet werden.

3.7.7 Kohlenstoffverwertung Die Substratverwertung des Stamms Mtb. sp. JT1 sowie einiger phylogenetisch eng verwandter Isolate wurde in Tabelle 3.19 zusammengefasst. Das Isolat JT1 konnte im Gegensatz zu den anderen getesteten Stämmen Tartrat (5 mM) assimilieren und verstoffwechseln. Bei Wachstum mit Citrat (5 mM) zeigten die Isolate JT1 und F3.2 nur schwaches Wachstum, während Mtb. goesingense iEII3 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T eine normale Wachstums‐ geschwindigkeit zeigten. Ansonsten konnten keine Unterschiede in der Kohlen‐ stoffverwertung beobachtet werden. Hierbei sollte noch erwähnt werden, dass Mtb. goesingense iEII3 entgegen der Angaben von Idris et al. (2006) Wachstum mit Glutamat und Citrat zeigte. Der Stamm zeigte kein Wachstum mit L‐Arabinose wie bei Idris et al. (2006) beschrieben. Tabelle 3.19: Substratverwertung einiger Mtb. Isolate/Stämme. Symbole/Abkürzungen: +, Wachstum; w, schwaches Wachstum; ‐, kein Wachstum; nd, nicht durchgeführt.

Substrat (getestete Mtb. goesingense Mtb. adhaesivum Mtb. sp. JT1 Mtb. sp. F3.2 Konzentration) iEII3 DSM 17169T Acetat (5 mM) + nd nd nd L‐Arabinose (5 mM) ‐ nd ‐ nd L‐Aspartat (5 mM) +* +* nd nd Betain (5 mM) ‐ nd nd nd Trinatriumcitrat (5 mM) w w + + Ethanol (0,5 %) + + nd nd Ameisensäure (2 mM) + + nd nd D‐Fructose (0,5 %) + nd nd nd D‐Glukose (5 mM) ‐ nd nd nd L‐Glutamat (5 mM) +* +* +* +* L‐Glutamin (5 mM) + + + + Glycerol (0,5 %) w w nd nd Mannose (0,5 %) ‐ nd nd nd Methanol (0,5 %) + + + + Na‐Succinat (5 mM) + + nd nd Na‐Tartrat (5 mM) + ‐ ‐ ‐ Saccharose (0,5 %) ‐ nd nd nd D‐Xylose (0,5 %) ‐ ‐ ‐ ‐ Casaminosäuren (0,05 %) + + nd nd Hefeextrakt (0,05 %) + + nd nd Proteose‐Pepton (0,05 %) + + nd nd Sojapepton (0,05 %) + + nd nd Nutrient‐Agar / GP‐Agar + / + + / + + / + + / + ‐N‐Quelle + 0,5 % Methanol ‐ ‐ nd nd * diese Substrate können von den Bakterien auch als alleinige Stickstoffquelle verwendet werden.

124 Ergebnisse

3.7.8 Motilität

3.7.8.1 Motilität auf halbfestem Nähragar Zum Prüfen der Motilität wurden einige Stämme auf halbfesten Nähragar aufgetropft und für 7 d bei 28 °C bebrütet. Der halbfeste Nähragar soll den Mikroorganismen eine ungehinderte Ausbreitung im Medium gestatten und gleichzeitig Konvektionsströmungen verhindern, die ein falsch positives Ergebnis vorspiegeln würden. Als Medium wurde für die Versuche 1/10x konzentriertes R2A‐Medium mit 0,2 % Agar (w/v) verwendet (nach Weon et al. 2008). Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Versuchreihen wurden in Tabelle 3.20 zusammengefasst. Die Zellen des Typstamms Mtb. jeotgali S2R03‐9T sowie die drei phylogenetisch eng verwandten Isolate JT1, 5b.2.20 und 1b.3 zeigten keine Ausbreitung im halbfeste Nähragar, sondern bildeten auf der Agaroberfläche Kolonien aus. Alle anderen getesteten Stämme zeigten eine mehr oder weniger starke Ausbreitung im Nährmedium (Ergebnisse nicht dargestellt).

Tabelle 3.20: Motilität einiger Mtb. Typstämme und Isolate auf halbfestem Nähragar (nach Weon et al. 2008). Beschreibung siehe Text.

Stamm/Isolat Motilität Mtb. adhaesivum DSM 17169T + Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ + Mtb. goesingense iEII3 + Mtb. fujisawaense DSM 5686T + Mtb. jeotgali S2R03‐9T ‐ Mtb. mesophilicum DSM 1708T + Mtb. radiotolerans DSM1819T + Mtb. sp. JT1 ‐ Mtb. sp. 5b.2.20 ‐ Mtb. sp. 1b.3 ‐ Mtb. sp. F3.2 + Mtb. sp. F2.1 + Mtb. sp. 5a.1.5 + Mtb. sp. 1c.14 + Mtb. sp. 1c.1 + Mtb. sp. T1 +

Bei den Versuchen zeigte sich eine Auffälligkeit, die hier erwähnt werden soll. Wurden Agarplatten an mehreren Punkten mit Bakterien beimpft, so breiteten sich die Zellen bevorzugt auf die Seite aus, die am weitesten von der nächsten Kolonie entfernt lag. Auch stoppte das Wachstum der Bakterien, bevor sich zwei im Agar wachsende Bakteriengemeinschaften vereinigten. Dadurch verblieb ein heller Bereich im Nähragar, der nicht (oder nur sehr spärlich) mit Bakterien besiedelt war. Dabei war es unerheblich, ob die benachbarten Kolonien Klone einer Ausgangskolonie oder verschiedene Isolate darstellten. Dies deutet darauf hin, dass sich die Bakterienverbände gegenseitig wahrnehmen können und mit einer Hemmung des Wachstums / der Beweglichkeit reagieren. Wahrscheinlich spielen dabei von den Bakterien sezernierte Signalmoleküle (N‐Acyl‐Homoserin‐ 125 Ergebnisse

Laktone) und die entsprechenden Rezeptoren eine wichtige Rolle, wodurch die Bakterien untereinander kommunizieren können. Dieser Prozess wird als Quorum Sensing (QS) bezeichnet (Waters und Bassler 2005). Auch bei Vertretern der Gattung Methylobacterium konnten QS‐Systeme nachgewiesen werden (Nieto Penalver et al. 2006, Penalver et al. 2006, Poonguzhali et al. 2007).

3.7.8.2 Motilität in flüssigem R2A-Medium Zur Prüfung der Motilität des Isolats JT1 und einiger eng verwandter Typstämme und Isolate wurden die Bakterien in 10 ml flüssigem R2A‐Medium bei Raumtemperatur und 150 rpm bebrütet. Bei der Durchführung zeigte sich, dass die Zellen meist nur in einem kurzen Zeitraum am Anfang der Kultivierung beweglich vorlagen. Die Beweglichkeit nahm mit zunehmender Kulturdauer und steigender Bakterienzahl für gewöhnlich deutlich ab. Die meisten beweglichen Zellen konnten – je nach Wachstum der Kultur und des verwendeten Stamms – nach 24 oder 48 h Inkubation beobachtet werden. Alle untersuchten Stämme bildeten in der logarithmischen Wachstumsphase bewegliche Zellen aus (siehe Tabelle 3.7). Bei einigen Stämmen und Isolaten wurde eine Geißelfärbung nach Heimbrook et al. (1989) durchgeführt. Alle getesteten Stämme besaßen dabei ein polares oder subpolares Flagellum.

3.7.9 Temperaturbereich Das Wachstum des Marchantia‐Isolats Mtb. sp. JT1 wurde in R2A‐Schüttelkulturen (150 rpm) im Temperaturbereich von 4 bis 37 °C getestet. Als Referenzorganismen wurden die Typstämme Mtb. mesophilicum DSM 1708T und Mtb. fujisawaense DSM 5686T verwendet. Die Daten (siehe Tabelle 3.21, folgende Seite) zeigen, dass alle getesteten Stämme im Temperaturbereich von 10‐32 °C wachsen konnten. Mtb. fujisawaense DSM 5686T zeigte im Gegensatz zu Mtb. sp. JT1 und Mtb. mesophilicum DSM 1708T noch Wachstum bei 35 und 37 °C. Bei 4 °C konnte bei Mtb. fujisawaense DSM 5686T kein Wachstum innerhalb von 14 d Inkubation beobachtet werden, während die Kulturen der Stämme Mtb. sp. JT1 und Mtb. mesophilicum DSM 1708T nach etwa 10 d eine deutliche Trübung aufwiesen. Die höchste Teilungsrate zeigten die Stämme in einem Temperaturbereich von 25‐30 °C. Selbst trotz der relativ langen Generationszeiten der Vertreter der Gattung Methylobacterium konnten nur sehr geringe Unterschiede in der Wachstumsgeschwindigkeit in diesem Temperaturbereich festgestellt werden. Alle Flüssigkultivierungen der Bakterien wurden daher bei Raumtemperatur durchgeführt.

126 Ergebnisse

Tabelle 3.21: Wachstum von Mtb. sp. JT1 und anderer Stämme bei unterschiedlichen Temperaturen. +, Wachstum; ‐, kein Wachstum; nd, nicht durchgeführt.

Mtb. mesophilicum Mtb. fujisawaense Temperatur Mtb. sp. JT1 DSM 1708T DSM 5686T 4 °C + + ‐ 10 °C + + + RT (25 °C) + + + 28 °C + + + 32 °C + + + 35 °C ‐ ‐ + 37 °C ‐ nd +

3.7.10 Oxidase-Test Der Nachweis des intrazellulären Enzyms Cytochrom‐c Oxidase (EC 1.9.3.1) wurde mit Zellen aus jungen, exponentiell wachsenden NA‐Schüttelkulturen durchgeführt, da bei der Verwendung von auf Nähragar gewachsenen Kolonien sehr häufig falsch negative Ergebnisse erhalten wurden. Auch Zellen aus exponentiell wachsenden R2A‐Flüssigkulturen zeigten meist keine Reaktion. Alle getesteten Stämme zeigten bei Verwendung junger Zellen Cytochrom‐c Oxidaseaktivität (siehe Tabelle 3.22), die durch eine violett‐ bis purpurfarbene Indophenol‐Färbung des behandelten Zellmaterials angezeigt wurde. Tabelle 3.22: Physiologische Charakteristika des Marchantia‐Isolats Mtb. sp. JT1 sowie nahe verwandter Isolate und Typstämme. w, schwache Reaktion (weak); +, positiv; ‐, negativ.

Stamm/Isolat Oxidase Katalase Nitratreduktion Mtb. sp. JT1 w + w Mtb. sp. F3.2 w + w Mtb. jeotgali S2R03‐9T + + w Mtb. goesingense iEII3 w + w Mtb. fujisawaense DSM 5686T + + w Mtb. adhaesivum DSM 17169T + + + Mtb. mesophilicum DSM 1708T + + w Mtb. radiotolerans DSM 1819T + + w

3.7.11 Katalase-Test Das Enzym Katalase wurde nach Herstellerangaben mit Einzelkolonien von frischen (< 7d) R2A‐Agarplatten und der „ID Color Katalase“‐Lösung (bioMeriéux, Nürtingen) nachgewiesen. Alle getesteten Stämme besaßen deutliche Katalase‐Aktivität (siehe Tabelle 3.22), was durch das entstehen von Sauerstoffbläschen angezeigt wurde.

3.7.12 Nitratreduktion Für den Test auf assimilatorische Nitratreduktion wurden die Stämme für 7 Tage in modifiziertem Medium nach Choi et al. (1989) mit 5 mM Succinat als alleiniger Kohlenstoffquelle und Kaliumnitrat als einziger Stickstoffquelle inkubiert. Als Negativkontrolle wurde steriles Medium verwendet, das unter den gleichen Versuchsbedingungen inkubiert wurde.

127 Ergebnisse

Alle getesteten Stämme konnten Nitrat zu Nitrit reduzieren (siehe Tabelle 3.22). Mtb. adhaesivum DSM 17169T zeigte dabei die deutlichste Reaktion.

3.7.13 Teststreifen-Analyse (API 20 NE) Die erste Testreihe wurde mit Mtb. sp. JT1, Mtb. sp. F3.2 und Mtb. fujisawaense DSM 5686T und nach den Angaben des Herstellers beimpft und ausgewertet. Bei allen Stämmen konnte nach 48 Stunden Urease‐Aktivität beobachtet werden, jedoch zeigte kein einziger Assimilations‐Test eine positive Reaktion. Dies wurde darauf zurückgeführt, dass die Vertreter der Gattung Methylobacterium relativ langsam wachsende Organismen sind. Daher wurden die Teststreifen für 14 d bei 28 °C bebrütet. Bei den Stämmen Mtb. sp. JT1 und Mtb. sp. F3.2 konnte jedoch auch trotz verlängerter Inkubationszeit kein Wachstum beobachtet werden. Aus den Tests zur Kohlenstoffverwertung (siehe Kapitel 3.7.7) war jedoch bereits bekannt, dass Mtb. sp. JT1 und Mtb. sp. F3.2 Trinatriumcitrat als Kohlenstoffquelle verwerten können. Die Assimilationstests von Mtb. fujisawaense DSM 5686T hingegen waren mit bereits publizierten Ergebnissen vergleichbar (Kato et al. 2005, Idris et al. 2006, Weon et al. 2008). Da aus vorangegangenen Kultivierungs‐ experimenten bereits bekannt war, dass die Kulturen bei zu geringen Inokulationsmengen und unzureichender Sauerstoffzufuhr kein Wachstum zeigen, wurde die Inokulationsmenge wie in Kapitel 2.9.17 beschrieben erhöht. Dadurch konnten auch bei den Isolaten JT1 und F3.2 positive Assimilations‐ reaktionen beobachtet werden. Die Testergebnisse des Stamms Mtb. fujisawaense DSM 5686T wurden durch die Erhöhung der Inokulationsmenge nicht beeinflusst.

Tabelle 3.23: Ergebnisse der API 20 NE‐Teststreifen. Getestete Stämme siehe Tabelle. Abkürzungen: NO3, Reduktion von Nitrat zu Nitrit / Stickstoff; URE, Urease‐Aktivität; GEL, Gelatinehydrolyse (Protease‐Aktivität); GLU, D‐Glukose‐Assimilation; ARA, L‐Arabinose‐ Assimilation; MNE, D‐Mannose‐Assimilation; GNT, Kaliumgluconat‐Assimilation; ADI, Adipin‐ säure‐Assimilation; MLT, Apfelsäure‐Assimilation; CIT, Trinatriumcitrat‐Assimilation. n: Anzahl der Testdurchläufe; +, positiv (deutliche Reaktion); w, schwach positiv (positive Reaktion bei URE nach mehr als 48 h bzw. schwaches Wachstum bei Assimilationstest); ‐, negativ (keine Reaktion).

Stamm n NO3 URE GEL GLU ARA MNE GNT ADI MLT CIT Mtb. sp. JT1 5 ‐/‐ w ‐ ‐ ‐ ‐ + + + w Mtb. sp. F3.2 5 ‐/‐ w ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + Mtb. sp. 1b.3 3 ‐/‐ w ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ + + ‐ Mtb. adhaesivum 2 w/‐ + ‐ w w w + + + + DSM 17169T Mtb. fujisawaense 4 ‐/‐ + ‐ + + w + + + w DSM 5686T Mtb. jeotgali S2R03‐9T 2 ‐/‐ w w ‐ ‐ ‐ + + + ‐ Mtb. goesingense iRII3 2 ‐/‐ w ‐ ‐ ‐ ‐ + + + + Kein getesteter Stamm zeigte Indolbildung (TRP), Glukosefermentation (GLU), Arginindihydrolase‐Aktivität (ADH), β‐Glucosidase‐Aktivität (ESC) oder β‐Galactosidase‐ Aktivität (PNPG). Kein Stämme konnte D‐Mannit (MAN), N‐Acetylglucosamin (NAG), D‐Maltose (MAL), Caprinsäure (CAP) und Phenylacetat (PAC) als Kohlenstoffquelle nutzen. Diese Reaktionen wurden der Übersichtlichkeit halber nicht aufgeführt.

128 Ergebnisse

In Tabelle 3.23 wurden die Testergebnisse zusammengefasst. Die Auswertung der Tests gestaltete sich dabei teilweise schwierig, da die Bakterien generell nur wenig Biomasse in den Mikroröhrchen bildeten. Da das Ergebnis nur durch das einfache abschätzen der Trübung per Auge bestimmt wird, konnte oft keine eindeutige Aussage getroffen werden. Die Assimilationstests wurden daher nur als Indizien gewertet und nicht in die Charakterisierung der Isolate mit aufgenommen.

3.7.14 Teststreifen-Analyse (API 50 CH) Die API 50 CH Teststreifen wurden mit in Medium CHB/E suspendierten Bakterien der Stämme Mtb. sp. JT1 und Mtb. fujisawaense DSM 5686T für 14 d bei 28 °C bebrütet. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 5.1 (Anhang) zusammengefasst. Jedoch lässt die große Zahl negativer Testergebnisse bei Mtb. sp. JT1 darauf schließen, dass die Sensitivität des Tests nicht ausreichend ist, um die Kohlenstoff‐ verwertung zu bestimmen. So konnte bei den klassischen Kohlenstoff‐ verwertungstests Fructose als Substrat dienen, während hier keine Reaktion beobachtet werden konnte. Daher wurden diese Tests nicht in die Charakterisierung des Stamms mit einbezogen.

3.7.15 Vergleich der Zelloberflächen im Rasterelektronen- mikroskop Für einen rasterelektronenmikroskopischen Vergleich der Zelloberflächen‐ strukturen des Isolats Mtb. sp. JT1 und nahe verwandten Spezies der Gattung Methylobacterium wurden die Stämme für 21 d bei 28 °C auf Agarplatten mit Medium nach Choi et al. (1989) und 1,0 % Methanol als Kohlenstoffquelle inkubiert. Repräsentative Kolonien der Stämme wurden anschließend fotografisch dokumentiert, aus dem Agarnährboden ausgeschnitten und fixiert. Durch den Kontakt mit der wässrigen Fixierlösung lösten sich einige Kolonien in kleinere Bruchstücke auf (Mtb. sp. JT1, Mtb. sp. 1b.3, Mtb. sp. 5b.2.20, Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. jeotgali S2R03‐9T, Mtb. mesophilicum DSM 1708T und Mtb. radiotolerans DSM 1819T). Die Kolonien dieser Stämme wuchsen auf den Nährmedium‐Platten mit glatter und glänzender Oberfläche (siehe Abbildung 3.10) und schleimiger Konsistenz. Andere Kolonien konnten hingegen komplett in ihrer Struktur erhalten werden (Mtb. sp. F3.2, Mtb. sp. F2.1, Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ und Mtb. goesingense iEII3). Die Kolonien dieser Stämme bildeten auf diesem Nähragar fest haftende Kolonien aus, die sich nur schwer suspendieren ließen (siehe auch Kapitel 3.5.1.4). Nach Trocknung und Beschichtung wurden die Zellen bei 15000x Vergrößerung mikroskopiert (siehe Abbildung 3.29). Neben der Analyse der Zelloberfläche wurde je Stamm die Größe von fünf (repräsentativen) Zellen bestimmt, um diese Werte mit den in Kapitel 3.7.3 ermittelten Werten zu vergleichen. Bei der mikroskopischen Analyse der Zellen zeigte sich, dass alle Bakterien‐ stämme extrazelluläre Fibrillen bildeten, über die der Kontakt zu Nachbarzellen und zum Substrat hergestellt wird. Jedoch unterschieden sich die Stämme in Struktur und Menge an gebildeten EPS. Zusätzlich konnten bei allen Stämmen

129 Ergebnisse fimbrienartige Strukturen mit einem Durchmesser von 15‐50 nm (in Ausnahme‐ fällen bis zu 90 nm) auf der Zelloberfläche beobachtet werden. Die Länge und Zahl der Fimbrien war dabei auch wieder abhängig vom untersuchten Stamm/Isolat. Die beiden phylogenetisch eng verwandten Isolate JT1 und 5b.2.20 bildeten auf dem angebotenen Nährmedium fast identische Zellen mit teilweise mehreren 100 Fimbrien auf ihrer Oberfläche aus. Dabei war oft die gesamte Oberfläche mit diesen Appendices ausgestattet. Einige Zellen zeigten Fimbrien‐freie Bereiche, wobei jedoch kein generelles Lokalisationsmuster erkannt werden konnte. Teil‐ weise lagen diese Streifen in der Zellmitte, manchmal aber auch an den Zellpolen. An diesen Stellen konnten statt der Fimbrien oft eine Noppen‐ oder Warzen‐ förmige Strukturen erkannt werden, wobei Anordnung und Anzahl mit den Fimbrien übereinstimmte. Die beiden Isolate bildeten relativ wenige, lange extra‐ zelluläre Fibrillen, jedoch konnten auch hier Stränge mit einem Durchmesser von etwa 20‐30 nm und einer Länge von mehreren μm beobachtet werden. Diese Fibrillen lagerten sich dabei teilweise zu flächigen Strukturen zusammen. Die Zellen besaßen eine Breite von etwa 0,5‐0,7 μm und eine Länge von bis zu 4 μm. Das Isolat Mtb. sp. 1b.3, das ebenfalls in enger phylogenetischer Verwandtschaft mit den Isolaten JT1 und 5b.2.20 steht, zeigte eine ähnlich gestaltete Morphologie. Jedoch waren die Bakterien bedeutend kürzer (1,1‐1,5 μm) und breiter (0,7‐0,8 nm). Die Fimbrien des Stamms 1b.3 fielen etwas dünner und kürzer aus, als die der Isolate JT1 und 5b.2.20. Die Stämme F3.2 und F2.1 bildeten eine sehr ähnliche Zellmorphologie aus. Jedoch besaßen die beiden Laubmoos‐Isolate nur sehr kurze, fast punktförmige Fimbrien mit einem Durchmesser von etwa 20‐50 nm, die auf der gesamten Oberfläche anzutreffen waren. Auch bei diesen beiden Isolaten (v. a. bei F2.1) konnten noppenartige Strukturen auf der Zelloberfläche beobachtet werden, an denen keine Fimbrien anzutreffen waren. Beide Stämme waren bei einer Länge von etwa 1,0‐2,0 μm, 0,6‐0,7 μm breit und bildeten deutlich mehr EPS als die Isolate JT1, 5b.2.20 und 1b.3. Die Fibrillen hatten einen Durchmesser von ca. 20‐45 nm, eine Länge von bis zu mehreren μm und bildeten ein Netzwerk in dem die Zellen fixiert vorlagen. Der Stamm Mtb. goesingense iEII3 bildete auf der Kolonieoberfläche einen (fast) durchgängigen Film aus EPS (siehe Kapitel 3.5.1.4). Im inneren der Kolonie konnten überwiegend glatte Zellen mit einer Breite von ca. 0,5‐0,7 μm und einer Länge von etwa 1,0‐2,0 μm beobachtet werden, die vergleichbar dicke Stränge exopolymerer Substanzen sekretierten. Diese Filamente hatten einen Durchmesser von meist 40‐60 nm und erreichten eine Länge von über 1 μm. Einzelne Filamente konnten sich auch zu flächigen Strukturen zusammenschließen, die große Bereiche der Kolonie komplett bedeckten. Der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T sekretierte augenscheinlich die größte Menge exopolymerer Substanzen. Die Fibrillen bildeten ein dichtes Netzwerk, wobei sich auch hier die Fibrillen zu flächigen Strukturen zusammenlagern konnten. Die Einzelfibrillen hatten meist einen Durchmesser von 20‐30 nm (wobei

130 Ergebnisse jedoch auch dickere Fibrillen von bis zu 90 nm erkannt werden konnten) und eine Länge von teilweise über einem μm besaßen. Die Zellen, die eine fast vollständig glatte Oberfläche hatten, trugen wenige fimbrienartige Zellanhänge, die mit einem Durchmesser von etwa 30‐60 nm relativ groß ausfielen. Die Zellen des Typstamms waren mit einer Breite von etwa 0,65‐0,75 μm und einer Länge von 1,0‐1,3 μm deutlich kürzer als die des Klons Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐, der bei einem vergleichbaren Durchmesser bis zu 3 μm lange Zellen bildete.

Abbildung 3.29: Rasterelektronenmikroskopischer Vergleich des Stamms Mtb. sp. JT1 mit phylogenetisch nahe verwandten Isolaten und Typstämmen. Vergrößerung siehe Messbalken. Erste Reihe (jeweils von links nach rechts): Mtb. sp. JT1, Mtb. sp. 5b.2.20, Mtb. sp. 1b.3; zweite Reihe: Mtb. sp. F3.2, Mtb. sp. F2.1, Mtb. goesingense iEII3; dritte Reihe: Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐, Mtb. jeotgali S2R03‐9T; vierte Reihe: Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. radiotolerans DSM 1819T, Mtb. mesophilicum DSM 1708T.

131 Ergebnisse

Der Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ bildete deutlich weniger EPS als der Typ‐ stamm und besaß auf seiner Zelloberfläche nur wenige punktförmige, fimbrien‐ artige Strukturen mit einem Durchmesser von etwa 30‐80 nm. Die extrazellulären Fibrillen schienen vor allem an den Zellpolen sekretiert zu werden und hatten einen Durchmesser von etwa 20‐90 nm. Mtb. jeotgali S2R03‐9T bildete eine mit dem Klon Mtb. adhaesivum DSM 17169EPS‐ vergleichbare Zellmorphologie und EPS‐Produktion aus. Die etwa 0,4‐0,5 μm breiten und ca. 1‐2 μm langen Zellen bildeten wenige Fibrillen mit einem Durch‐ messer von 20‐40 nm und einer Länge von über einem μm aus und hatten eine glatte Oberfläche mit nur wenigen Aufwüchsen, die einen Durchmesser von bis zu 50 nm besaßen. Der Typstamm Mtb. fujisawaense DSM 5686T zeigte – bei einer Zellbreite von etwa 0,5‐0,6 μm und einer Länge von 1,0‐1,5 μm – eine relativ glatte Oberfläche, die mit wenigen fimbrienartigen Strukturen besetzt war. Die Aufwüchse hatten einen Durchmesser von etwa 20‐40 nm. Der Stamm bildete jedoch relativ viel EPS, die als Fibrillen (Durchmesser von etwa 20‐50 nm) ein dichtes Netzwerk formten. Die Fibrillen schienen auch bei diesem Stamm vor allem an den polaren Enden der Zellen synthetisiert zu werden. Bei Mtb. radiotolerans DSM 1819T konnten nur sehr wenige extrazelluläre Fibrillen nachgewiesen werden. Jedoch erschien es auf den rasterelektronemikroskopischen Aufnahmen so, als ob die Zellen mit einer Schleichschicht bedeckt waren (vgl. Mtb. goesingense iEII3). Auch auf der sonst glatten Oberfläche des Stamms konnten wieder wenige, punktförmige Fimbrien mit einem Durchmesser von etwa 20‐50 nm erkannt werden. Auch der Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T bildete nur relativ wenig extra‐ zelluläres Material. Jedoch konnten auf der sonst glatten Oberfläche einige punkt‐ förmige Auflagerungen mit einem Durchmesser von etwa 15‐40 nm beobachtet werden.

3.8 Aufreinigung genomischer DNA Da bei den DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Experimenten sehr große Abweichungen und Schwankungen auftraten, wurde vermutet, dass dies wahrscheinlich auf Begleitstoffe zurückgeführt werden kann, die bei der Extraktion der chromo‐ somalen DNA nicht ausreichend entfernt wurden (persönliche Mitteilung Prof. P. Kämpfer). Im Rahmen der Arbeit wurden daher verschiedene Methoden getestet, um möglichst reine und hochmolekulare genomische DNA in ausreichender Menge zu gewinnen. Für ein Hybridisierungs‐Experiment wurden 120 μl DNA‐ Lösung mit einer Konzentration von 0,3 μg/μl (36 μg genomische DNA) benötigt. Im Folgenden sollen dabei die wichtigsten Punkte und Erkenntnisse aufgeführt werden. Bei der klassischen Phenol‐Chloroform‐Extraktion von DNA und der von unseren Kooperationspartnern in Gießen verwendeten Methode nach Pitcher et al. (1989) werden Exopolysaccharide bei der Phasentrennung mit organischen Lösungs‐ mitteln wahrscheinlich nicht ausreichend entfernt und bleiben in der wässrigen

132 Ergebnisse

DNA‐Phase gelöst. Durch die Präzipitation mit Alkohol werden dann neben der DNA auch die EPS mit ausgefällt. Bei der Durchführung beider Methoden machte sich dies durch eine sehr dünne Interphase nach dem ersten Extraktionsschritt bemerkbar. Zusätzlich erhielt man am Ende der Extraktion ein relativ großes, schneeweißes Pellet aus DNA und Begleitstoffen. Mit der Methode nach Pitcher et al. (1989) konnte zwar sehr viel DNA extrahiert werden (ca. 1‐2 mg aus 5x1010 Zellen), jedoch enthielten die Extrakte sehr viel niedermolekulare Nucleinsäuren (siehe Abbildung 3.30) und ungünstige A260:A230‐Verhältnisse. Daher wurde mit diesen Methoden gereinigte DNA nicht weiter für die Hybridisierungs‐ Experimente verwendet. Bei der Aufreinigung von DNA mit den Genomic‐tip 100/G‐System (Qiagen, Hilden) konnten bei den Stämmen Mtb. sp. F3.2 und Mtb. goesingense iEII3 gute Ergebnisse mit A260:A230‐Verhältnissen von > 2,0 erzielt werden. Jedoch wurden mit dieser Methode bei den Stämmen Mtb. sp. JT1 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T nur sehr wenig DNA erhalten (siehe Abbildung 3.30), die zusätzlich noch erheblich mit Begleitstoffen kontaminiert war, was sich durch hohe Absorptions‐ werte bei einer Wellenlänge von 230 nm und einem ungünstigen Verhältnis der A260:A230 bemerkbar machte. Durch Deproteinierung mit CTAB (nach Murray und Thompson 1980) wurde eine wesentlich dickere Interphase nach dem ersten Extraktionsschritt und der Phasentrennung mit Chloroform erhalten, was darauf hinweist, das mit dieser Technik mehr störende, polymere Bestandteile entfernt werden können. Beim Stamm Mtb. goesingense iEII3 konnte jedoch keine scharfe Interphase erhalten werden. Daher wurde bei diesem Stamm die wässrige Phase großzügig abgenommen und ein zusätzlicher Extraktionsschritt eingefügt. Bei dem folgenden Extraktionsschritt konnte nur noch eine dünne Interphase beobachtet, weshalb davon ausgegangen werden konnte eine ausreichende Reinigungs‐ wirkung erzielt zu haben. Nach dem Fällen der DNA mit Isopropanol und Waschen mit EtOH wurde ein glasig‐weißes Pellet erhalten, das in LiChrosolv‐ H2O gelöst und spektrometrisch vermessen wurde. Mit der CTAB‐Methode aufgereinigte DNA (siehe Abbildung 3.31) zeichnete sich durch gute A260:A280‐ Werte und relativ hohen Ausbeuten aus, jedoch traten auch bei dieser Technik teilweise niedrige A260:A230‐Verhältnisse auf. Dies betraf vor allem die Stämme Mtb. goesingense iEII3 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T. Daher wurden mit der CTAB‐ Methode gereinigte DNA‐Extrakte nochmals mit dem Genomic‐tip 100/G System (Qiagen, Hilden) aufgereinigt. Dabei traten aber die gleichen Probleme wie bei der Isolation von DNA aus frischem Zellmaterial zutage, d. h. bei den Stämmen Mtb. sp. JT1 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T konnte nur sehr geringe Mengen an DNA isoliert werden (siehe Abbildung 3.30 CTAB‐>GT). Das Genomic‐tip 100/G System (Qiagen, Hilden) wurde auch benutzt, um bereits bestehende DNA‐Isolationen, die mit einem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) gereinigt wurden, nochmals zu extrahieren. Dabei konnte bei allen vier Stämmen gute Ergebnisse erzielt werden (siehe Tabelle 3.25 und Abbildung 3.30).

133 Ergebnisse

Bei Mtb. adhaesivum DSM 17169T wurde nur sehr wenig DNA erhalten, da bereits relativ wenig Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Alle DNA‐Extrakte wurden mit 2 mM Na2HPO4‐Puffer (pH 8,5) mindestens 1:25 verdünnt und zur Quantifizierung und Überprüfung der Reinheit spektralphoto‐ metrisch in einem Wellenlängenbereich von 200‐340 nm vermessen. Aus den ermittelten A260‐Werten wurde die Nucleinsäurekonzentration berechnet und die Lösungen anschließend mit LiChrosolv‐H2O auf eine Konzentration von 0,3 μg/μl eingestellt. Ein Aliquot dieser Lösungen wurden 1:25 mit 2 mM Na2HPO4‐Puffer (pH 8,5) verdünnt und erneut spektrometrisch vermessen (siehe Abbildung 3.32). Als Referenz wurde niedermolekulare Lachs‐DNA (Roth, Karlsruhe) vermessen. Dabei zeigte sich jedoch, dass das Absorptionsmaximum der Nucleinsäure‐ Lösungen aus Mtb.‐Kulturen nicht wie üblich bei 260 nm, sondern bei etwa 256 nm lag. Im Vergleich zur Referenz‐DNA‐Lösung schienen die Spektren dabei generell um etwa 5 nm in den kurzwelligeren Bereich verschoben zu sein. Die Nucleinsäurelösung der Lachs‐DNA zeigte hingegen das erwartete Absorptions‐ maximum bei 260 nm (siehe Abbildung 3.32).

Abbildung 3.30: Vergleich unterschiedlicher

DNA‐Extraktionsmethoden. Von links nach rechts: CTAB‐gereinigte Abbildung 3.31: 0,8 %iges TAE‐Agarosegel DNA, die in einer zweiten Extraktion mit der CTAB‐Aufreinigungen (vgl. auch dem Genomic‐tip 100/G‐System gereinigt Tabelle 3.24 und Abbildung 3.32). wurden (CTAB‐>GT); Proben die nur mit Von links nach rechts: M: DNA‐Leiter λ dem Genomic‐tip 100/G‐System gereinigt HindIII (2,5 μl), 1: Mtb. sp. JT1, 2: Mtb. sp. wurden (GT); Proben die nach der Methode F3.2, 3: Mtb. goesingense iEII3, 4: Mtb. T von Pitcher et al. (1989) aufgereinigt wurden adhaesivum DSM 17169 . Aufgetragen (Pitcher). Das 0,8 %ige TAE‐Agarosegel wurden jeweils 50 ng DNA (5 μl mit 0,01 wurde mit jeweils 5 μl DNA‐Extrakt beladen. μg/μl). Angabe der Fragmentgrößen in bp. M: DNA‐Leiter λ HindIII (2 μl), 1: Mtb. sp. JT1, 2: Mtb. sp. F3.2, 3: Mtb. goesingense iEII3, 4: Mtb. adhaesivum DSM 17169T. Angabe der Fragmentgrößen in bp.

134 Ergebnisse

Abbildung 3.32: UV‐Vis‐Spektren der für die DNA‐DNA‐Hybridisierungen verwendeten DNA‐ Präparationen. Zusätzlich wurde niedermolekulare DNA aus Lachs (Roth, Karlsruhe) spektrometrisch vermessen und als Referenz dargestellt. Min: lokales Absorptionsminimum bei etwa 230 nm, Max: lokales Absorptionsmaximum bei etwa 260 nm. A: CTAB‐gereinigte DNA‐ Präparationen, B: DNA‐Präparationen, die zuerst mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), und anschließend mit dem Genomic‐tip 100/G System (Qiagen) gereinigt wurden.

Tabelle 3.24: Parameter der für die DNA‐DNA‐Hybridisierung‐Experimente verwendeten, mittels CTAB‐Methode gereinigten DNA‐Extrakte. Abkürzungen: Max, lokales Absorptions‐ maximum bei etwa 260 nm; Min, lokales Absorptionsminimum bei etwa 230 nm; Konz, berechnete Nucleinsäurekonzentration.

Mtb. sp. Mtb. sp. Mtb. goesingense Mtb. adhaesivum Lachs‐DNA Parameter JT1 F3.2 iEII3 DSM 17169T niedermolekular A260:A230 2,12 2,16 1,81 1,51 1,94 A260:A270 1,26 1,26 1,24 1,25 1,13 A260:A280 1,93 1,94 1,85 1,81 1,83 Max 256,0 nm 256,5 nm 256,0 nm 255,5 nm 260,5 nm Min 228,5 nm 228,5 nm 228,5 nm 229,5 nm 230,5 nm Konz. 0,31 μg/μl 0,28 μg/μl 0,29 μg/μl 0,29 μg/μl 0,31 μg/μl

Tabelle 3.25: Parameter der DNA‐Extrakte, die zuerst mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) und in einer zweiten Runde mit dem Genomic‐tip 100/G gereinigt wurden. Abkürzungen: Max, lokales Absorptionsmaximum bei etwa 260 nm; Min,: lokales Absorptions‐ minimum bei etwa 230 nm; Konz, berechnete Nucleinsäurekonzentration.

Mtb. sp. Mtb. sp. Mtb. goesingense Mtb. adhaesivum Lachs‐DNA Parameter JT1 F3.2 iEII3 DSM 17169T niedermolekular A260:A230 2,13 1,96 2,10 1,80 1,94 A260:A270 1,25 1,23 1,25 1,22 1,13 A260:A280 1,93 1,83 1,91 1,80 1,83 Max 256,5 nm 256,5 nm 256,5 nm 255,5 nm 260,5 nm Min 228,5 nm 228,5 nm 228,0 nm 228,5 nm 230,5 nm Konz. 0,31 μg/μl 0,28 μg/μl 0,29 μg/μl 0,29 μg/μl 0,31 μg/μl

135 Ergebnisse

3.9 DNA-DNA-Hybridisierung Die DNA‐DNA‐Hybridisierungen wurden im Rahmen einer Kooperation mit dem Institut für Angewandte Mikrobiologie der Universität Giessen unter der Leitung von Prof. P. Kämpfer durchgeführt. Dabei wurde mit der nichtradioaktiven Markierungsmethode nach Ziemke et al. (1998) gearbeitet. Bei der Durchführung der Experimente traten jedoch unerwartet große Schwierig‐ keiten auf. So wurden bei einigen Hybridisierungen Werte von annähernd 500 % Ähnlichkeit der DNA erzielt. Bei vielen Experimenten lagen die ermittelten Werte deutlich über 100 % Ähnlichkeit. Dies wurde auf EPS der Bakterien zurückgeführt, die bei der DNA‐Extraktion nicht ausreichend entfernt werden konnten und so die Hybridisierungs‐Ergebnisse negativ beeinflusst (pers. Mitteilung Prof. P. Kämpfer). Auch bei den zuletzt durchgeführten Hybridisierungs‐Studien mit DNA‐ Extrakten die nach der CTAB‐Methode gereinigt wurden (vgl. Kapitel 3.8), konnten keine eindeutigen Ergebnisse erzielt werden, da in einigen reziproken Ansätzen wieder Werte über 100 % erzielt wurden (pers. Mitteilung Prof. P. Kämpfer). Da die einzelnen Hybridisierungs‐Experimente nur innerhalb eines Versuchs‐ ansatzes miteinander verglichen werden sollten (pers. Mitteilung Prof. P. Kämpfer) wurden in Tabelle 3.26 alle Einzelergebnisse dargestellt. Auf eine Berechnung eines Gesamtmittelwerts wurde aus den eben genannten Gründen verzichtet.

Jedoch deuten die Ergebnissen an, dass es sich bei den Stämmen JT1, F3.2, Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Methylobacterium goesingense iEII3 um eine Gruppe genetisch eng verwandter Organismen handelt, wobei eine klare Spezies‐ abgrenzung durch die hohen Abweichungen der einzelnen Versuche nicht möglich ist, da der kritische Wert von 70 % Ähnlichkeit teilweise überschritten wurde (Wayne et al. 1987, Stackebrandt et al. 2002).

136 Ergebnisse

Daten halber

T

* (58,7) (33,2)

|

1708

52,1 36,3

48,1 | |

mesophilicum

ermittelten DSM

65,3 30,1 Mtb. alle Vergleichbarkeit

Der T

* (32,9) (40,2)

wurden |

5686

32,0

31,8 42,9 |

68,3 * | | fujisawaense

DSM 37,5 34,0 Mtb. (Mittelwert).

Wert

T

* (41,7) (41,5) Einzelexperimente

|

1819

49,0 30,5

der 24,0 | |

radiotolerans

ersetzt.

ermittelter DSM

*

34,4 52,5 Mtb. einen

reziprok

|

T

durch (12,9) (30,4) (13,4)

9 Abweichungen

‐

59,3 Wert

jeotgali

14,1 29,1 13,0 |

* | | |

S2R03 hohen wurden Mtb.

11,7 31,8 13,8 Form: %

der

der

100

in T

über

(46,2)

* *

17169 | |

Aufgrund 50,8 * *

(58,3) (53,5) adhaesivum Prozent |

Werte

DSM in

41,6 Mtb.

Genome

geschrieben.

* * (72,7) (55,4)

| | der

43,1 53,2

Hybridisierungen. |86,8 72,1 62,1 54,4 28,0 | | ‐

iEII3

(48,3) (54,8) (53,8) Zeile goesingense * 51,8 91,8 * * | |

73,2 48,7 DNA eine Mtb. ‐

in

DNA Ähnlichkeiten

(33,1) F3.2

der die

55,6 Ansatzes

sp.

29,4 |

(85,5) * |

sind

Mtb. eines

36,8 Ergebnisse

T Dargestellt 3.26: JT1

F3.2

17169 Experimente

sp.

sp.

adhaesivum

Mtb. Tabelle DSM Mtb. Mtb. aufgeführt.

wurden

137 Diskussion

4 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung bei Bakterien der Gattung Methylobacterium untersucht. Hierfür wurden Reinkulturen verschiedener Isolate und Typstämme auf unterschiedlichen Nährmedien angezogen und deren Biofilmbildung und Koloniemorphologie verglichen. Durch die Auswahl der getesteten Stämme, sollte ein phylogenetisch großer Bereich innerhalb der Gattung untersucht werden, um zu klären, ob dabei Spezies‐ oder Taxon‐spezifische Merkmale auftreten. Zur Erforschung der Biofilmbildung bei den Pflanzen‐ assoziierten Bakterien, wurden mikrobiologische und mikroskopische Techniken angewendet. Die Diskussion der Ergebnisse und ein Vergleich dieser mit aktueller Literatur findet sich im dritten Teil dieses Abschnitts (Kapitel 4.3). Nach einer kurzen Diskussion der methodischen Aspekte der vorliegenden Arbeit (Kapitel 4.1) soll zuerst die molekularphylogenetische Analyse zweier Gene (16S rDNA und partielles mxaF‐Gen) diskutiert werden (Kapitel 4.2), da die taxonomische Stellung der Isolate als Grundlage für die Interpretation der weiteren Ergebnisse dient. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde das Lebermoos‐Isolat Mtb. sp. JT1 physiologisch, biochemisch und molekulargenetisch charakterisiert um es taxonomisch einzuordnen und eine Speziesneubeschreibung vorzubereiten. Die Ergebnisse und deren Interpretation sowie der Vergleich mit bereits veröffentlichten Daten findet sich im letzten Teil der Diskussion (Kapitel 4.4).

4.1 Methodische Aspekte

4.1.1 Anzucht der Bakterien Da über die Mechanismen, die zur Biofilmbildung bei Mtb. spp. führen, nur wenige Anhaltspunkte vorlagen, sollte durch den Vergleich der Kolonie‐ morphologie auf unterschiedlichen Nährböden der Einfluss von Nährsalzen und Kohlenstoffverfügbarkeit auf die Bildung der bakteriellen Biofilme untersucht werden. Dabei zeigte sich aber, dass sich der Phänotyp eines Isolats innerhalb weniger Generation drastisch ändern kann. So wurden von zwei Isolaten (Mtb. sp. 5a.1.13 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T) Klone isoliert, die deutlich weniger extrazelluläres Material bildeten und dadurch eine weniger komplexe Kolonie‐ morphologie aufwiesen. Der Phänotyp wurde bei der Subkultivierung meist auf die Tochterzellen weitergegeben, jedoch konnten teilweise wieder Revertanten isoliert werden, die den ursprünglichen Koloniehabitus ausbildeten. Daher ist davon auszugehen, dass der Morphotyp nicht stabil im Genom der Bakterien verankert ist, sondern, als Anpassung an veränderte Umweltbedingungen, in einer Art epigenetischen Gedächtnis gespeichert wird. So postulierten Ben Jacob et al. (2004) dass das grampositive Bakterium Paenibacillus vortex Informationen über zurückliegende Ereignisse transient speichern kann und dadurch seine Überlebenswahrscheinlichkeit steigert. Als möglichen Mechanismus führen die Autoren dabei an, dass durch veränderte Umweltbedingungen ein genotypischer

138 Diskussion

Shift der Population in Richtung einer normalerweise neutralen genomischen Variation erfolgen könnte, die unter den neuen Bedingungen einen Selektionsvorteil aufweist. Jedoch könnten die Bakterien auch über Mechanismen verfügen, die es ihnen erlauben, Zustände ihres Gen‐Netzwerks auf epi‐ genetischer Ebene weiterzugeben (Ben Jacob et al. 2004). Gally et al. (1993) konnten bei E. coli zeigen, dass durch die Inversion eines Genfragments die Produktion von Fimbrien an‐ und abgestellt werden kann. Auch die Konformation der bakteriellen DNA scheint eine Rolle bei der Expression bestimmter Gene zu spielen und kann variiert werden (Kelly et al. 2006). Ein Problem bei der Durchführung der Experimente zur Biofilmbildung und EPS‐ Produktion stellte die oft große biologische Variabilität der Bakterien dar, die bereits bei kleinen Änderungen der Bedingungen zu Tage treten konnten. So beeinflusst die Anzahl der auf einer Agarplatte wachsenden Bakterien die Größe und Morphologie der Kolonien, wobei wahrscheinlich eine durch Quorum Sensing‐ vermittelte Signalübertragung eine wichtige Rolle spielt, durch die unter anderem auch die Produktion von EPS bei Bakterien der Gattung Methylobacterium beeinflusst wird (Penalver et al. 2006). Auch geringe Unterschiede in der Zusammensetzung der Medien könnten als Ursachen für die beobachteten Variationen in der Morphologie und/oder EPS‐Produktion der Bakterien in Frage kommen.

4.1.2 DNA-Isolation Zur Isolation genomischer DNA für die vergleichenden Sequenzanalysen wurden verschiedene kommerziell erhältliche DNA‐Isolationskits8 getestet, wobei sowohl die Herstellerprotokolle für Gram‐negative und Gram‐positive Bakterien befolgt wurden. Dabei konnte nur mit dem ‚Blood & Tissue Kit’ (Qiagen, Hilden) eine detektierbare Menge an DNA isoliert werden, wenn eine Lysozym‐Behandlung der Zellen voraus ging, wie sie für Gram‐positive Bakterien vorgesehen ist. Mit dieser Methode konnten ausreichende Mengen an DNA für die PCR‐ Anwendungen isoliert werden, die eine hinreichend gute Qualität für die Amplifikation der Gen‐Fragmente aufwies. Wurde die DNA auf Agarosegelen aufgetrennt, konnte nur eine Bande mit hochmolekularer DNA detektiert werden. Für die Hybridisierungs‐Experimente wurden jedoch relativ große Mengen an genomischer DNA benötigt, weshalb DNA‐Isolationsmethoden mit einer höheren Ausbeute benutzt werden mussten. Dabei wurden von unseren Kooperations‐ partnern in Gießen verschiedene DNA‐Extraktionsmethoden getestet. Letzt‐ endlich wurde eine von Pitcher et al. (1989) entwickelte Methode verwendet. Jedoch zeigten sich bei den DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Experimenten große Abweichungen innerhalb der einzelnen Versuchsreihen und reziproken Ansätze,

8 u. a. PrestoSpin D Blood & Cells (Molzym, Bremen); Wizard® SV Genomic DNA (Promega GmbH, Mannheim); GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma‐Aldrich, St. Louis, U.S.A.); DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden). 139 Diskussion

(siehe Kapitel 3.9) was auf Kontaminationen der DNA mit Begleitstoffen hinweist (pers. Mitteilung Prof. Kämpfer, Stackebrandt und Ebers 2006). Bei einem Vergleich verschiedener DNA‐Extraktionsmethoden (siehe Kapitel 3.8) zeigte sich, dass bei der Methode nach Pitcher et al. (1989) sowie bei der klassischen Phenol‐Chloroform‐Extraktion die EPS der Bakterien wahrscheinlich nicht entfernt und bei der Alkoholpräzipitation mit ausgefällt werden. Dies machte sich durch ein großes schneeweißes Pellet bemerkbar, das auch nach mehrmaligem Waschen mit 70 % Ethanol – durch das überschüssige Salze entfernt werden können – keine Änderung der Farbe zeigte (Anm.: reine DNA sollte ein durchscheinendes, glasiges Pellet liefern). Bei der spektralphotometrischen Messung der DNA‐Konzentration und Reinheit wurden zwar relativ hohe Ausbeuten berechnet, jedoch wiesen die Proben durchgängig relativ niedrige A260:A230‐Verhältnisse auf. Dabei ist aber fraglich, ob die berechneten DNA‐ Konzentrationen wirklich in der Lösung vorlagen, oder ob die gemessenen optischen Dichten der Lösungen nicht durch die mitpräparierten Substanzen verfälscht wurden. Eine hohe Absorption bei 230 nm deutet dabei auf Kontaminationen mit Polysacchariden, Zuckern, EDTA oder Phenol hin. Für reine Nucleinsäure‐Lösungen sollte das Verhältnis von A230:A260:A280 bei etwa 1:2:1 liegen (Rapley und Heptinstall 1998). Ein weiter Hinweis auf die Kontamination der Proben mit Begleitsubstanzen war die Verschiebung des Absorptionsmaximums von 260 nm auf etwa 256 nm. Interessanterweise konnte bei den Proben mit den geringsten A260:A230‐Werten auch ein größerer Wellenlängenshift beobachtet werden (siehe Tabelle 3.24 f.). Dies deutet auf eine enge Assoziation der DNA mit den EPS hin, wurde jedoch nicht weiter experimentell untersucht. Dafür spricht aber auch, dass bei der Aufreinigung mit der CTAB‐Methode und einigen Extraktionen mit kommerziell erhältlichen Säulen nur sehr geringe Mengen an DNA gewonnen werden konnten. Durch eine starke Interaktion von EPS und Nucleinsäuren könnte die genomische DNA eventuell zusammen mit dem CTAB‐Protein‐Polysaccharid‐Komplexen abgetrennt worden sein. Bei den Säulen auf Anionentauscherbasis wäre denkbar, dass die Begleitsubstanzen ähnliche Bindungseigenschaften wie Nucleinsäuren zeigen und durch die Kompetition um die Bindungsstellen der positiv geladenen Silika‐Matrix die DNA‐Ausbeute reduzieren. Allerdings könnten auch die negativ geladenen Phosphatgruppen des DNA‐Rückgrats mit positiv geladenen Gruppen der EPS interagieren und dadurch maskiert werden. Zum Entfernen störender Exopolysaccharide erwies sich eine modifizierte CTAB‐ Extraktionsmethode nach Murray und Thompson (1980) als besser geeignet. Jedoch konnten auch mit dieser Methode nicht alle Begleitstoffe extrahiert werden, da die UV‐Spektren der DNA‐Lösungen ebenfalls um etwa 4 nm nach links verschoben waren. Zusätzlich konnte nicht bei allen Isolaten eine identische Reinigungswirkung erzielt werden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Stämme verschiedene Exopolysaccharide synthetisieren, welche die DNA‐ Aufreinigungen in unterschiedlichem Maß stören. Eine unterschiedliche

140 Diskussion

Reinigungseffizienz bestätigte sich auch bei der Verwendung des Genomic‐tip 100/G‐Systems (Qiagen, Hilden). Die besten A230:A260:A280‐Verhältnisse wurden durch die mehrfache Aufreinigung der DNA‐Lösungen mit unterschiedlichen Methoden erzielt, wobei allerdings die DNA‐Menge mit jedem Reinigungsschritt deutlich abnahm. Bei allen DNA‐Extraktionsmethoden konnten die Zellen durch eine Vor‐ behandlung mit Lysozym wesentlich besser lysiert werden, wodurch die Ausbeute deutlich gesteigert werden konnte. Daher soll im Folgenden die Wirkung von Lysozym, sowie der Aufbau der gramnegativen Zellwand rekapituliert und mit den erhaltenen Ergebnissen in Beziehung gesetzt werden. Lysozyme (EC 3.2.1.17) sind hydrolytische Enzyme, welche die in den Zellwänden von Prokaryoten vorkommenden Polysaccharide Peptidoglycan und Chitodextrin spalten können (Blake et al. 1965). Peptidoglycan ist ein Heteropolymer mit (β1→4)‐verknüpften, alternierenden N‐Acetylglucosamin‐ und N‐Acetylmuramin‐ säureeinheiten und stellt in Gram‐positiven Bakterien den Hauptbestandteil der Zellwand dar. In gramnegativen Zellen findet sich nur eine dünne Peptido‐ glycanschicht zwischen der Cytoplasmamembran und der äußeren Membran und macht nur etwa 10 % der Zellwand aus. Den Hauptbestandteil der gramnegativen Zellwand stellt die äußere Membran dar, die aus einer asymmetrischen Lipid‐ Doppelschicht besteht und neben Phospholipiden zusätzlich Proteine und Polysaccharide enthält (Smit et al. 1975). Die Lipide und Polysaccharide sind in der äußeren Schicht der Membran eng verbunden und bilden spezifische Lipopolysaccharidstrukturen, weshalb die äußere Membranschicht oft auch Lipopolysaccharidschicht oder kurz LPS bezeichnet wird. Lipopolysaccharide bestehen typischerweise aus Lipid A, einem kurzen Kernpolysaccharid und einem O‐Antigen, das von Spezies zu Spezies stark variieren kann (Nikaido 2003). Das Kernpolysaccharid besteht üblicherweise aus Ketodesoxyoctonat‐Einheiten, über welche die Bindung zum Disaccharid des Lipid A hergestellt wird. Der äußere Teil des Kernpolysaccharids besteht hauptsächlich aus Hexosen. An den Kern gebunden ist das hochvariable O‐Polysaccharid, das vorwiegend aus Hexosen (Galactose, Glukose, Rhamnose, Mannose) aufgebaut ist und in vier‐ oder fünfteiligen Sequenzen, die oft verzweigt sind, vorliegt. Durch Wiederholung der Zuckersequenzen entsteht das lange O‐Polysaccharid. Die LPS vieler gramnegativer Bakterien sind für Menschen und Tiere toxisch („Endotoxine“), wobei vor allem der Lipid A‐Anteil für den toxischen Effekt zuständig ist, während der Polysaccharidanteil die Wasserlöslichkeit und Immunogenität bedingt. Da die äußere Membran als Lipid‐Doppelschicht nur eine geringe Permeabilität für hydrophile Substanzen besitzt, sind in der Membran Kanal‐ formende Proteine (Porine) integriert, die eine relativ unspezifische Aufnahme von Nährstoffen bzw. die Abgabe von Abfallprodukten erlauben. Zusätzlich besitzen gramnegative Bakterien spezifische Kanal‐ und Transportproteine in der Außenmembran, wie die Sekretionssysteme I‐IV oder Exportkanäle für Polysaccharide (Nikaido 2003).

141 Diskussion

Da keine Veröffentlichungen zum Aufbau der Zellwand und deren assoziierter Strukturen für Bakterien der Gattung Methylobacterium bekannt ist, kann über die positive Wirkung der Lysozym‐Behandlung auf die Effizienz der Zell‐Lyse nur spekuliert werden. Evtl. bilden Vertreter der Gattung eine Schicht aus Poly‐ sacchariden, welche die Zellen mit einer schützenden Schicht umgibt, die die Lyse der Zellen erschwert. So sind viele Stämme von E. coli mit einer Schicht aus Oberflächen‐assoziierten Polysacchariden bedeckt, die als Kapsel bezeichnet wird (Whitfield und Roberts 1999). Auch eine Stabilisierung der Zellwand durch Interaktionen der O‐spezifischen Polysaccharidketten ist denkbar. Da Lysozym nicht nur die Peptidoglycanschicht angreift, sondern auch β(1→4)‐Bindungen zwischen N‐Acetylglucosamin‐Einheiten in Chitodextrinen spaltet, müsste das potentielle Polysaccharid ähnlich aufgebaut sein, um die positive Lysozym‐ wirkung zu erklären. Eine Verbesserung der Zell‐Lyse könnte in diesem Fall durch den Vorverdau der Zellen mit weiteren hydrolytischen Enzymen (Cellulasen, Chitinasen etc.) erreicht werden. Jedoch zeigte sich bei einer sequentiellen Verwendung von Cellulase und Lysozym keine eindeutige Verbesserung der Lyse. Dies sollte jedoch unter standardisierten Bedingungen nochmals kritisch evaluiert werden. Der Einsatz von Chitinase oder anderer Polysaccharid‐spaltender Enzyme wurde nicht getestet, stellt aber eine potentielle Ansatzstelle zur Steigerung der Effizienz dar. Eventuell besitzen die Vertreter der Gattung Methylobacterium spp. eine für gramnegative Zellen ungewöhnlich dicke Peptidoglycanschicht, durch welche die Effizienz der Lyseprozedur verringert wird. In diesem Fall ließe sich der positive Effekt der Lysozym‐Behandlung ähnlich wie bei grampositiven Bakterien durch die Hydrolyse der stabilisierenden Peptidoglycanschicht erklären. Hierzu sei ergänzend auch noch angemerkt, dass die Zellen einiger Spezies als gramvariabel beschrieben wurden (Green 2006). Dies könnte auch ein Hinweis auf eine ungewöhnliche Struktur der Zellwand sein. Ob der zur Gram‐Färbung verwendete Farbstoffkomplex dabei von der Peptidoglycanschicht oder anderen Strukturen zurückgehalten wird, bleibt jedoch weiter unklar. Als weitere potentielle Quelle für die Kontaminationen der Proben könnten auch die Lipopolysaccharide (Endotoxine) der äußeren Zellwand in Frage kommen. Endotoxine stellen oft ein Begleitprodukt biologischer Präparationen dar (Cotten et al. 1994, Wicks et al. 1995, Magalhães et al. 2007). Dennoch brachte auch der Versuch, die Präparationen durch eine Phasentrennung mit präkondensiertem Triton X‐114 von den Lipopolysacchariden zu trennen (nach Wissing et al. 2000), keine Verbesserung des A260:A230‐Verhältnis oder eine Änderung des UV‐ Spektrums mit sich. Letztendlich sei hier noch erwähnt, dass die Lysierbarkeit der Zellen auch im Zusammenhang mit dem Zustand der verwendeten Kulturen stand. So konnten Zellen aus exponentiell wachsenden Vollmedium‐Flüssigkulturen meist komplett lysiert werden. Kulturen, die sich bereits in der stationären Wachstumsphase befanden und/oder Biofilme bildeten, konnten hingegen trotz des Einsatzes der Enzyme Cellulase und Lysozym meist nicht komplett aufgelöst werden.

142 Diskussion

Daher sollten für die Aufreinigung von DNA aus Vertretern der Gattung Methylobacterium folgende Punkte befolgt werden:

• Das Medium zur Anzucht der Zellen sollte genügend Nährstoffe für ein schnelles Wachstum der Bakterien bereitstellen. Zusätzlich sollten die Bakterien darin möglichst wenig EPS produzieren. Dabei erwies sich NA‐Flüssigmedium als geeignet, ein schnelles Wachstum aller

Isolate zu unterstützen, jedoch produzieren die Stämme auch in diesem Medium EPS. Bei

Verwendung von Minimalmedium sollte dieses eine ausreichende Menge an Stickstoff, Phosphat und Kohlenstoff beinhalten.

• Durch die Vermeidung langer Kulturzeiten kann die Produktion von EPS durch die Bakterien vermindert werden. Dabei ist hilfreich, die Kulturen mit einer hohen Zahl von Bakterien anzuimpfen, die idealerweise aus einer frischen Vorkultur des gleichen Mediums stammen. Zum

Beimpfen der Hauptkultur verwendet man dabei etwa 1/10 Vol. Vorkultur einer OD600 von etwa

0,1‐0,5. Dadurch können die Zellen der Hauptkultur meist nach 48‐72 h Inkubation bei RT abgeerntet werden.

• Bei der Kultivierung ist auf eine gute Belüftung der Kultur zu achten, jedoch sollte sich auf der

Oberfläche kein Schaum bilden, da dieser die Sauerstoffsättigung der Kultur senken kann. Bei der

Kultivierung auf einem Kreisschüttler erwiesen sich 150 Umdrehungen pro Minute als gut geeignet.

• Die für die DNA‐Extraktion verwendeten Kulturen sollten in einer möglicht frühen Phase des exponentiellen Wachstums geerntet werden (s. o.). Dadurch kann die Menge an EPS und das daraus resultierende Auftreten von Biofilmen minimiert werden.

• Vor der eigentlichen Zell‐Lyse sollte immer eine Lysozym‐Behandlung durchgeführt werden, weil dadurch die Ausbeute deutlich gesteigert wird. Evtl. werden dadurch auch einige EPS‐

Bestandteile zerstört/hydrolysiert, die die Qualität der Proben beeinträchtigen würden.

• Für die Extraktion der DNA sollte eine Methode gewählt werden, bei der Exopolysaccharide während der Aufreinigung (größtenteils) entfernt werden. Jedoch konnten im Lauf der vorliegenden Arbeit keine Methoden ermittelt werden, mit der sich die Begleitsubstanzen aller getesteten Stämme zuverlässig entfernen ließen.

• Zur Analyse der DNA‐Präparationen sollte neben einer gelektrophoretischen Analyse der

DNA zusätzlich ein Spektrum im Bereich von 200‐340 nm aufgenommen werden, um die Qualität und Menge der DNA abzuschätzen. Für sensitive Applikationen sollte das Verhältnis von

A230:A260:A280 bei etwa 1:2:1 liegen.

143 Diskussion

4.1.3 Phylogenetische Analyse Bei der phylogenetischen Analyse der Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Gattung Methylobacterium wurden unterschiedliche Methoden und Verfahren eingesetzt. Alle Modelle gehen dabei von bestimmten Annahmen über den Prozess der Merkmals‐Substitution aus (Felsenstein 1988). Sie stellen daher nur Annäherungen an die Realität dar und müssen deshalb kritisch betrachtet werden. Ein generelles Problem bei vergleichenden DNA‐Sequenzanalysen ist die geringe Anzahl an Merkmalen dar, wobei jedes Merkmal nur vier unterschiedliche Zustände einnehmen kann (A, T, G, C). Durch Rückmutationen und Mehrfach‐ austausche können dabei die Anzahl der tatsächlich abgelaufenen Substitutionen leicht unterschätzt und falsche Hypothesen gestützt werden. Durch die Wahl eines geeigneten Substitutionsmodells kann dieser Fehler jedoch minimiert werden. Bei der Erstellung der homologen 16S rDNA‐Sequenzalignments konnten nicht alle Merkmale homologisiert werden, wodurch Lücken im Alignment entstanden. Dabei handelte sich meist um Insertionen, die nur in einer einzelnen Sequenz zu finden waren. Durch den Vergleich der Sequenzen mit der in Abbildung 5.1 dargestellten Sekundärstruktur der 16S rDNA wurde jedoch vermutet, dass diese Insertionen auf Sequenzierfehlern beruhen und keine echten evolutionären Neuerwerbungen darstellen. Daher wurden die Bereiche mit Lücken nicht in die Auswertung mit aufgenommen. Die Wahl der Außengruppe kann einen Einfluss auf die Topologie der berechneten Stammbäume ausüben. Daher wurden die NJ‐Analysen – neben den in der vorliegenden Arbeit dargestellten Analysen – mit Agrobacterium tumefaciens und/oder Escherichia coli als zusätzlichen Außengruppentaxa durchgeführt. Für die 16S rDNA‐Sequenzen konnten dabei immer ähnliche Topologien beobachtet werden. Auch gilt die Phylogenie der α‐Proteobacteria als gut gesichert (Tsuji et al. 1990, Gupta 2000). Bei der Analyse des partiellen mxaF‐Genabschnitts zeigte sich unter Verwendung unterschiedlicher Außengruppentaxa auch unterschiedliche Baumtopologien, wobei die einzelnen Gruppen und Subcluster größtenteils erhalten blieben. Indes konnte nach dem Wurzeln der Bäume teilweise eine unterschiedliche Abfolge der Taxa beobachtet werden. Als Außengruppen wurden dabei Sequenzen folgender Spezies verwendet die eine hohe Ähnlichkeit zu den mxaF‐Sequenzen von Methylobacterium spp. aufwiesen: Rps. palustris, Methylorhabdus multivorans, Methylocystis parvus, Methylosinus trichosporium, Methylopila capsulata und Albibacter methylovorans. Dabei zeigte sich, dass unter Verwendung von Rps. palustris eine Baumtopologie erhalten wurde, die auch unter Verwendung anderer Außengruppen/kombinationen erhalten wurde. Daher wurde auch für diese Analysen Rps. palustris als Außengruppe gewählt.

144 Diskussion

4.2 Molekulare Systematik der Gattung Methylobacterium Um die Eigenisolate taxonomisch einzuordnen und um die Verwandtschafts‐ verhältnisse innerhalb der Gattung Methylobacterium zu bestimmen, wurden zwei Gen‐Abschnitte sequenziert und anhand vergleichender Sequenzanalysen ausgewertet. Neben dem Gen für die kleine ribosomale Untereinheit (16S rDNA), wurde ein Abschnitt des Gens für die α‐Untereinheit des Enzyms Methanol‐ Dehydrogenase (mxaF) partiell sequenziert.

4.2.1 Vergleichende Sequenzanalyse des 16S rRNA-Gens In die Analyse der Verwandtschaftsverhältnisse der Gattung Methylobacterium anhand der 16S rDNA‐Sequenzen (~1300 bp) wurden 52 Taxa der Gattung Methylobacterium sowie Rhodopseudomonas palustris als Außengruppe mit einbezogen. Dabei wurden alle bisher beschriebenen Typstämme der Gattung und 17 Eigenisolate mit unterschiedlichen Rekonstruktionsmethoden untersucht. Mit dem NJ‐Verfahren wurden zusätzlich unterschiedliche Substitutionsmodelle getestet, um den Einfluss der Komplexität des Algorithmus auf die Topologie zu testen. In der nachfolgenden Diskussion beziehen sich die Angaben über ausgetauschte Merkmale auf das gekürzte Gesamt‐Alignment. Angaben über Sequenzdivergenzen wurden hingegen durch einen paarweisen Sequenzvergleich der ungekürzten Sequenzen ermittelt. Daher kann es zu Abweichungen zwischen den folgenden Angaben und den in Tabelle 5.3 dargestellten Werten kommen. In allen Analysen zeigten sich dabei identische Gruppierungen aus zwei bis neun Stämmen, die jeweils auf einen gemeinsamen Ursprung zurückgeführt werden können. Meist stimmten auch die Verknüpfungen der einzelnen Gruppen überein, wobei ein Großteil der Isolate in zwei große monophyletische Subcluster eingeteilt werden kann. Da sich die Baumtopologien der unterschiedlichen Rekonstruktions‐ verfahren ansonsten als nahezu identisch erwiesen, ist davon auszugehen, dass die berechneten Bäume die Verwandtschaftsverhältnisse relativ zuverlässig wiedergeben. Die Bezeichnungen der Gruppen und Subcluster im Folgenden bezieht sich auf die in Kapitel 3.6.1.3, Abbildung 5.2 und Abbildung 5.3 (siehe Anhang) dargestellten Stammbäume. Im Subcluster 1 konnten stets die Typstämme der Spezies Mtb. extorquens/Mtb. chloromethanicum/Mtb. dichloromethanicum, Mtb. zatmanii, Mtb. thiocyanatum, Mtb. populi, Mtb. lusitanum, Mtb. rhodesianum, Mtb. podarium, Mtb. aminovorans, Mtb. suomiense, Mtb. salsuginis, Mtb. rhodinum, Mtb. aquaticum, Mtb. platani, Mtb. variabile, Mtb. isbiliense, Mtb. nodulans sowie Mtb. organophilum gefunden werden. Zusätzlich fanden sich fünf Eigenisolate in diesem Subcluster wieder. Alle Stämme können dabei wahrscheinlich auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt werden. Die Hypothese wird dabei durch relativ hohe Bootstrap‐ werte von etwa 70 % bei den NJ‐Analysen sowie einer Kladenwahrscheinlichkeit von 91 % bei der Bayesschen Analyse unterstützt. Das monophyletische Subcluster 2 – das bei den meisten Analysen Subcluster 1 als Schwestergruppe gegenüberstand – setzte sich aus den Typstämmen der Spezies

145 Diskussion

Mtb. komagatae, Mtb. persicinum, Mtb. aerolatum, Mtb. fujisawaense, Mtb. oryzae, Mtb. phyllosphaerae, Mtb. tardum, Mtb. radiotolerans, Mtb. gregans, Mtb. hispanicum sowie Mtb. brachiatum und Mtb. mesophilicum zusammen. Zusätzlich wurden die Sequenzen von vier Eigenisolaten immer in Subcluster 2 aufgefunden. Auch hier bieten Bootstrapwerte von etwa 70 % und eine posteriore Kladenwahrschein‐ lichkeit von 100 % eine gute Unterstützung der Monophylie dieses Subclusters. Die Position der Stämme Mtb. iners, Mtb. adhaesivum, Mtb. goesingense, Mtb. sp. 1c.14 und Mtb. jeotgali konnte anhand der durchgeführten Analysen nicht genau geklärt werden. Unter Verwendung komplexer Substitutionsmodelle (GTR+I+G) wurden die Stämme direkt an der Wurzel der berechneten Bäume platziert und bildeten eine paraphyletische Gruppe, aus der die beiden großen mono‐ phyletischen Subcluster 1 und 2 hervorgingen. Bei NJ‐Analysen mit einfacheren Substitutionsmodellen (p‐Distanz, JC) wurden die Stämme als basale Schwester‐ gruppe zu Subcluster 1 platziert, wobei jedoch nur ein sehr geringer Bootstrap‐ wert von etwa 30 % erzielt werden konnte und die Verknüpfung daher fraglich bleibt. Die Knoten innerhalb dieser Gruppe zeigten eine sehr gute statistische Unterstützung und konnten in einer meist identischen Topologie auch in allen anderen Analysen gefunden werden. Auch die Sequenzen der Isolate um Mtb. sp. JT1 und Mtb. sp. F3.2 wurden bei den meisten Analysen an der Wurzel der Kladogramme platziert. Die Sequenzen der Isolate bildeten in allen Analysen eine monophyletische Einheit, die sich in zwei statistisch gut begründete Schwestergruppen unterteilen ließ. Dabei bildeten Mtb. sp. 1b.3 und die identischen Sequenzen der Isolate JT1 und 5b.2.20 stets eine Schwestergruppe zu den Isolaten um Mtb. sp. F3.2, wobei eine Sequenzdivergenz von 0,21 % zwischen JT1 und 1b.3, sowie 0,78 % zwischen JT1 und F3.2 bestand. Die Sequenzen von F3.2 und 1b.3 unterschieden sich in 0,77 %. Als Typstamm mit dem geringsten Abstand besitzt Mtb. adhaesivum eine Divergenz von 2,11 %. Eine etwas geringere Divergenz zu JT1 weist Mtb. goesingense iEII3 auf (2,04 %). Das Isolat 1c.14 zeigt gegenüber Mtb. goesingense iEII3 eine Sequenzdivergenz von 0,28 %. Gegenüber dem nächsten Typstamm Mtb. adhaesivum AR27T beträgt die Divergenz der 16S rDNA 1,03 %. Da Mtb. goesingense iEII3 und Mtb. adhaesivum AR27T bei den DNA‐DNA‐Hybridisierungen nicht eindeutig voneinander abge‐ grenzt werden konnten und möglicherweise einer Spezies zuzuordnen sind, fällt auch das Isolat 1c.14 wahrscheinlich in diese Speziesgruppe. Innerhalb der großen Subcluster konnten in allen Analysen identische mono‐ phyletische Einheiten wiedergeben werden, deren Zusammensetzung und taxonomische Stellung im Folgenden zusammengefasst wird. Die Gruppierungen sind zum Teil dadurch bedingt, dass einige Sequenzen keine Unterschiede aufweisen und deshalb auch nicht voneinander differenziert werden können. So zeigen die Sequenzen der in Gruppe A zusammengefassten Isolate 1c.5, 5a.1.8, 5b.1.4 und 5b.1.5 keine Unterschiede zu den Sequenzen der Typstämme Mtb. extorquens und Mtb. dichloromethanicum. Die Sequenzen von Mtb. chloromethanicum und Mtb. sp. 1c.1 wiesen im Gesamt‐Alignment jeweils nur eine unterschiedliche Base zur Sequenz von Mtb. extorquens NCIMB 9399T auf. Kato et al. (2005) konnten

146 Diskussion durch DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien zeigen, dass die Stämme Mtb. chloromethanicum und Mtb. dichloromethanicum – nach der heute gültigen Definition – Isolate der Spezies Mtb. extorquens darstellen. Aufgrund der hohen Sequenz‐ ähnlichkeit der untersuchten Eigenisolate mit diesen Typstammsequenzen kann daher davon ausgegangen werden, dass alle zur Speziesgruppe Mtb. extorquens gezählt werden können. Jedoch kann eine eindeutige Zugehörigkeit nur durch eine umfassende Charakterisierung der Isolate erzielt werden (Stackebrandt et al. 2002). Gemeinsam mit diesen Stämmen konnte bei allen Analysen die Sequenz des Typstamms Mtb. zatmanii DSM 5688T gefunden werden, der ein Schwestertaxon zur Mtb. extorquens‐Gruppe darstellt und mit ihr höchstwahrscheinlich auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt werden kann. Mit einer Bootstrap‐ Unterstützung von etwa 70 % und einer Kladenwahrscheinlichkeit von 93 % wird diese Gruppierung auch statistisch relativ gut belegt. In Gruppe B wurden die Sequenzen der Typstämme von Mtb. populi, Mtb. thiocyanatum, Mtb. rhodesianum/Mtb. lusitanum, und Mtb. podarium gefunden. Die Stämme bildeten stets eine monophyletische Schwestergruppe zu A. Die Monophylie der Gruppe B wird dabei durch eine posteriore Kladenwahrschein‐ lichkeit von 100 % bei der Bayesschen Analyse der Daten gestützt. Jedoch wurden bei NJ‐Analysen nur sehr geringe Bootstrapwerte erzielt. Kato und Kollegen (2005) konnten durch DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien zeigen, dass Mtb. lusitanum ein Isolat der Spezies Mtb. rhodesianum darstellt. Aufgrund der geringen Sequenz‐ divergenz (fünf Substitutionen in der V6‐Region) konnten diese beiden Stämme immer in direkter Nachbarschaft zueinander beobachtet werden. Auch die Spezies Mtb. thiocyanatum und Mtb. populi zeigen eine sehr geringe Divergenz von nur zwei Merkmalen und wurden daher immer als Monophylum in Gruppe B platziert. Trotz der geringen Unterschiede der 16S rDNA‐Sequenzen konnten Van Aken et al. (2004) eine DNA‐DNA‐Ähnlichkeit von nur 47 % mit Mtb. thiocyanatum ermitteln. Zusätzlich fand sich die Spezies Mtb. podarium stets in dieser Gruppe. Auf Gruppe A und B folgten basal die Stämme Mtb. aminovorans, Mtb. suomiense, Mtb. salsuginis und Mtb. rhodinum, wobei jedoch keine einheitliche Topologie mit den unterschiedlichen Verfahren erhalten wurde. Da diese Einheit aber in allen rekonstruierten Bäumen in unmittelbarer Nachbarschaft gefunden wurden, kann davon ausgegangen werden, dass diese Spezies in enger Verwandtschaft zueinander stehen. Weiter basal folgte stets die Gruppe C mit den Spezies Mtb. platani und Mtb. aquaticum sowie Mtb. isbiliense und Mtb. nodulans, die untereinander jeweils Schwestergruppen bildeten. Komplettiert wird die Gruppe durch die Spezies Mtb. variabile, deren Stellung in dieser Gruppe nicht eindeutig geklärt werden konnte. In der Mehrzahl der Verfahren wurde Mtb. variabile jedoch in einer Monophylie als Schwestertaxon von Mtb. platani und Mtb. aquaticum gefunden. In diesen Fällen konnten auch hohe Bootstrapwerte von etwa 90 % bzw. eine posteriore Kladen‐ wahrscheinlichkeit von 100 % ermittelt werden, was dafür spricht, dass dieses Verwandtschaftsverhältnis die evolutionäre Abfolge widerspiegelt.

147 Diskussion

Basal wird Subcluster 1 durch die Spezies Mtb. organophilum begrenzt, wobei die Sequenz eine relativ hohe Divergenz zu den benachbarten Spezies besitzt. Der monophyletische Ursprung von Subcluster 1 wurde mit allen Rekonstruktions‐ verfahren gefunden und kann daher als gut gesichert angesehen werden. In Subcluster 2 konnten die Gruppen D bis F gefunden werden. Die basalste Verzweigung teilte dabei stets die Gruppe F – mit den Spezies Mtb. komagatae, Mtb. aerolatum und Mtb. persicinum – vom Rest des Subclusters ab. Da dieser Knoten in allen Baumtopologien gefunden wurde, kann davon ausgegangen werden, dass die Abzweigung den gesuchten Verwandtschaftsverhältnissen entspricht, auch wenn in der NJ‐Analyse keine ausreichende Bootstrap‐ Unterstützung gegeben war. Innerhalb der Gruppe bildete die Spezies Mtb. aerolatum bei allen Analysen das Schwestertaxon von Mtb. persicinum, während Mtb. komagatae basal davon abzweigte und so ein Schwestertaxon der beiden anderen Spezies darstellt. Dabei wurden generell sehr hohe Bootstrapwerte bzw. hohe Kladenwahrscheinlichkeiten berechnet, wodurch die Hypothese dieser Topologie deutlich unterstützt wird. Gruppe D konnte in allen berechneten Bäumen zuverlässig von den restlichen Spezies des Subcluster 2 abgetrennt werden. Innerhalb der Gruppe zweigt das Isolat 1a.16 basal ab, und bildet das Schwestertaxon der restlichen Stämme mit Mtb. mesophilicum, Mtb. brachiatum und drei Eigenisolaten (1c.5, 5a.1.13 und 5b.1.1), die nur eine sehr geringe Sequenzdivergenz untereinander zeigen (≤ 3 Austausche) und daher nicht ausreichend differenziert werden können. Trotz der geringen Divergenz zwischen Mtb. mesophilicum und Mtb. brachiatum (0,21 %) konnten Kato et al. (2008) zeigen, dass es sich dabei um zwei distinkte Spezies handelt. Die Eigenisolate können anhand der Analyse wahrscheinlich der Spezies Mtb. mesophilicum zugeordnet werden, da sie identische Sequenzen besitzen. Lediglich bei 5a.1.13 konnte am 5’‐Ende der Sequenz eine Insertion beobachtet werden, die nicht bei Mtb. mesophilicum und den beiden anderen Stämmen vorlag, aber bei Mtb. brachiatum auftritt. Daher könnte das Isolat 5a.1.13 auch ein Bindeglied zwischen Mtb. brachiatum und Mtb. mesophilicum sein. Die Sequenz des Isolats 1a.16 unterschied sich dagegen deutlich von beiden Typstammsequenzen (0,78 % Divergenz zu Mtb. mesophilicum und 0,92 % zu Mtb. brachiatum). Das Isolat könnte daher eine neue Spezies darstellen, da die Sequenzdivergenzen zwischen einzelnen Spezies innerhalb der Gattung relativ gering ausfallen (s. o.). Jedoch kann auch hier die Spezieszugehörigkeit nur durch eine umfassende Charakterisierung des Isolats sowie umfangreiche DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐ Studien eindeutig geklärt werden (Stackebrandt et al. 2002). Für die hohe Divergenz des Stamms 1a.16 sind dabei vor allem 8 Substitutionen in der V6‐ Region (nach Neefs et al. 1990) verantwortlich, die in der Stamm‐Region der gefalteten rRNA auf vier konjugierende Basenpaare fallen und sich daher gegenseitig bedingen, um die Funktionalität der gefalteten rRNA zu gewährleisten (siehe Abbildung 4.1). Die restlichen Stämme des Subcluster 2 wurden in Gruppe E zusammengefasst. Die Spezies Mtb. phyllosphaerae, Mtb. oryzae, Mtb. fujisawaense, Mtb. tardum und

148 Diskussion

Mtb. radiotolerans zeigten eine geringe Sequenzdivergenz (max. 1,26 % zwischen Mtb. radiotolerans und Mtb. phyllosphaerae) und konnten in allen Analysen als monophyletische Gruppe gefunden werden, wobei die Topologie je nach verwendetem Analyseverfahren geringfügig variierte. Obwohl die beiden Spezies Mtb. oryzae und Mtb. fujisawaense eine fast identische 16S rDNA‐Sequenz aufweisen (0,07 % Divergenz), konnten Madhaiyan und Kollegen (2007a) zeigen, dass Mtb. oryzae – nach der heute gültigen Speziesdefinition – eine eigene Spezies darstellt. Dabei wurde ein DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Wert von 42,09 % für das Paar Mtb. oryzae – Mtb. fujisawaense ermittelt. Interessanterweise wurden auch hier höhere Werte für Spezies ermittelt, die eine größere Divergenz zu Mtb. oryzae zeigen als Mtb. fujisawaense. So wurde mit Mtb. mesophilicum (2,02 % Divergenz der 16S rDNA) ein Hybridisierungs‐Wert von 54,51 % erreicht; Mtb. radiotolerans zeigte bei einer Sequenzdivergenz von 0,57 % einen DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐ Wert von 63,09 % (Madhaiyan et al. 2007a). Jedoch geben die Autoren in der Ver‐ öffentlichung keine Auskunft über die Anzahl der Reproduktionen und führten auch keine reziproken Hybridisierungen durch. Nach Stackebrandt und Ebers (2006) können die Ergebnisse der reziproken Ansätze jedoch um bis zu 15 % voneinander abweichen, wodurch – zumindest bei der Spezies Mtb. radiotolerans – der kritische Wert von 70 % (Wayne et al. 1987) überschritten werden könnte. Auch die Spezies Mtb. tardum und Mtb. radiotolerans trennt nur eine geringe Sequenzdivergenz der 16S rDNA (0,35 %), wodurch die beiden Spezies bei allen Analysemethoden in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander gruppiert wurden. Die Typstämme der beiden Spezies zeigten jedoch nur DNA‐DNA‐Hybridisie‐ rungs‐Werte von 25 % bzw. 31 % (reziprok), weshalb die Eröffnung der neuen Spezies Mtb. tardum gerechtfertigt wird (Kato et al. 2008). Auch Mtb. gregans und Mtb. hispanicum konnten bei den Charakterbasierten Analysen (ML, Bayessche Analyse) in Gruppe E gefunden werden. Diese beiden Spezies, die in allen Analysen auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt werden konnten, zeigten in allen Bäumen jedoch eine relativ große Distanz zum nächstverwandten Schwestertaxon. Bei den Distanzbasierten NJ‐Analysen bildeten Mtb. gregans und Mtb. hispanicum (E2) das Schwestertaxon der Gruppen D und E1, wobei diese Topologie mit Bootstrapwerten von etwa 60 % nur schlecht gestützt wurde. Auch durch eine Analyse der Daten mit dem MP‐Verfahren (Daten nicht dargestellt) konnte die Topologie nicht geklärt werden.

Abbildung 4.1: Ausschnitt aus dem Sequenzalignment der Stämme Mtb. sp. 1a.16, Mtb. brachiatum B0021T und Mtb. mesophilicum DSM 1708T. Über den Sequenzen ist die zur Alignierung verwendete 16S rRNA‐Struktur in Symbolform abgebildet (Punkte: keine Basenpaarung, Klammern: Basen‐ paarungen; die abgebildete Sequenz entspricht den Positionen 1004‐1023 in E. coli). Nur die Sequenz von Mtb. sp. 1a.16 wurde komplett dargestellt. Bei Mtb. brachiatum und Mtb. mesophilicum wurden identische Basen durch Punkte ersetzt.

149 Diskussion

Trotz der hohen Übereinstimmung der rekonstruierten Verwandtschafts‐ verhältnisse müssen die Ergebnisse kritisch betrachtet werden. So konnten Acinas und Kollegen (2004) durch einen Genomvergleich von 76 bakteriellen Genomen zeigen, dass einzelne Bakterien bis zu 15 rRNA‐Operons beinhalten, wobei eine Zahl von 7 Operons keine Seltenheit war. Eine hohe Zahl an rRNA‐Operons stellt wahrscheinlich einen Evolutionsvorteil für die Träger dar, da sie schneller auf veränderte Umweltbedingungen reagieren können und meist ein schnelleres Wachstum zeigen als Stämme mit weniger Kopien (Stevenson und Schmidt 2004). Etwa 40 % der von Acinas et al. (2004) untersuchten Stämme trugen jedoch nur ein bis zwei Operons. Die Divergenz zwischen multiplen, heterogenen Operons fiel dabei mit Mehrheitlich weniger als 1 % relativ gering aus und hat daher nur einen geringen Einfluss auf die Klassifikation der Taxa (Coenye und Vandamme 2003). Nichtsdestotrotz konnten bei dem thermophilen Bakterium Thermoanaerobacter tengcongensis Divergenzen von bis zu 11,6 % zwischen zwei 16S rRNA‐Sequenzen ermittelt werden, wobei dies von den Autoren auf den relativ selten vorkommenden Fall eines horizontalen Gentransfers zurückgeführt wurde (Acinas et al. 2004). Die in der Studie untersuchten α‐Proteobacteria zeigten maximal vier rRNA‐Operons, und in den sieben untersuchten Genomen konnten nur sieben unterschiedliche 16S rDNA‐Sequenzen gefunden werden (Acinas et al. 2004). Diese geringe Divergenz deutet nach den Autoren darauf hin, dass die α‐ Proteobacteria an relativ stabile Umweltbedingungen angepasst sind (Acinas et al. 2004). Ein Vergleich der Operonzahl und Divergenzen der bisher veröffentlichten Genome von Vertretern der Gattung Methylobacterium wurde in Tabelle 4.1 veranschaulicht. Dabei konnten beim Isolat Mtb. sp. 4‐469 sechs Operons gefunden werden, die eine Divergenz von bis zu 0,94 % besitzen. Die Substitutionen waren dabei vor allem in der V6‐Region (nach Neefs et al. 1990) zu finden. Die relativ hohe Divergenz der Operons des Stamms Mtb. sp 4‐46 von 0,94 % hatte jedoch keinen Einfluss auf die taxonomische Einordnung des Stamms. Wurden alle heterogenen Sequenzen des Stamms in die Analyse mit dem Datensatz der Typstämme und Eigenisolate einbezogen, so konnten die Sequenzen in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander gefunden werden (Daten nicht gezeigt). Bei allen anderen Stämmen konnten zwar relativ viele Operons gefunden werden (17 Operons in 6 Stämmen mit insgesamt 11 unterschiedlichen Sequenzen), die sich jedoch nur gering oder gar nicht unterscheiden, wenn mehrere Operons in einem Stamm vorliegen (siehe Tabelle 4.1). Der Stamm Mtb. radiotolerans JCM 2831T trägt sogar auf einem Plasmid zwei komplette rRNA‐Operons, wobei sich die beiden plasmidären 16S rDNA‐Sequenzen in zwei Merkmalen unterscheiden und jeweils eine identische Kopie auf dem Chromosom besitzen. Auch die beiden restlichen chromosomalen Operons unterscheiden sich jeweils nur um zwei Basen von den anderen Sequenzen. Daher ist davon auszugehen, dass die Variabilität der 16S rRNA‐Sequenzen innerhalb eines Stamms relativ niedrig ausfällt. Bei der

9 Anm: nächste Typstammsequenz zu Mtb. sp. 4.46 ist Mtb. isbiliense DSM 17168T (AB302929.1). 150 Diskussion

Primäranalyse der Daten wurde zusätzlich darauf geachtet ob bei der Kapillarelektrophorese uneindeutige Signale erhalten wurden. Dies traf jedoch nur in wenigen Fällen zu. Eine eindeutige Klärung der Kopienzahl kann aber nur durch aufwändige Experimente geklärt werden.

Tabelle 4.1: Vergleich der bisher sequenzierten Genome der Gattung Methylobacterium zur Bestimmung der Anzahl und Divergenz an rRNA‐Operons, mit Angabe der Genom‐Projekt ID (GPID) des jeweiligen Genom‐Projekts, Zahl und Lokalisation der rRNA‐Operons sowie Anzahl der unterschiedlichen 16S rRNA‐Sequenztypen und deren maximaler Divergenz in Prozent (in Klammern: maximale Zahl der beobachteten Unterschiede).

rRNA‐Operons Sequenz‐ Max. Stamm GPID chromosomal plasmidär typen Divergenz Mtb. chloromethanicum CM4T 19527 5 0 1 ‐ Mtb. dichloromethanicum DM4T 16093a 1 ‐ 1 ‐ Mtb. extorquens PA1 18637 5 ‐ 1 ‐ Mtb. nodulans ORS2060T 20477b 1 ‐ 1 ‐ Mtb. populi BJ001T 19559 5 0 3 0,14 % (2) Mtb. radiotolerans JCM 2831T 18817 4 2 4 0,14 % (2) Mtb. sp. 4‐46 18809 6 0 4 0,94 % (14) a Das Projekt wird aktuell bearbeitet (in progress). Teile davon können bereits eingesehen werden. b Das Projekt ist noch nicht abgeschlossen, liegt aber als Entwurf (draft assembly) vor.

4.2.2 Vergleichende Sequenzanalyse des mxaF-Gen Für die vergleichende Sequenzanalyse eines partiellen Abschnitts des Gens für die α‐Untereinheit der Methanol‐Dehydrogenase wurden im Rahmen der vor‐ liegenden Arbeit die Sequenzen von vier Eigenisolaten (JT1, 5b.2.20, F3.2 und F2.1), fünf Typstämmen (Mtb. adhaesivum DSM 17169T, Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. jeotgali S2R03‐9T, Mtb. mesophilicum DSM 1708T und Mtb. radiotolerans DSM 1819T) sowie von Mtb. goesingense iEII3 bestimmt. Zusätzlich wurden alle in den Datenbaken der NCBI verfügbaren, ähnlichen Typstammsequenzen gesammelt und in die Analyse mit einbezogen. Insgesamt konnte so ein Gesamt‐ Alignment von 29 Taxa mit jeweils 517 Merkmalen untersucht werden. Jedoch liegen für diesen Genabschnitt nicht für alle Spezies der Gattung Sequenzen vor. Durch den Vergleich der in dieser Arbeit ermittelten Sequenz von Mtb. jeotgali S2R03‐9T (FJ157952.1) mit der in der Erstbeschreibung der Spezies publizierten (Aslam et al. 2007, EF031552.1), konnte gezeigt werden, dass die hinterlegte Sequenz drei ungeklärte Baseninsertionen enthält, die bei der eigens bestimmten Sequenz sowie allen anderen verwendeten Sequenzen nicht gefunden wurden. Durch diese zusätzlichen Basen wird das Leseraster des Gens verschoben, wodurch bei der Translation in eine Aminosäuresequenz falsche Ergebnisse resultieren. Daher wurde für die Analysen die in dieser Arbeit ermittelte Sequenz (FJ157952.1) verwendet. Die Autoren der Speziesbeschreibung wurden darüber in Kenntnis gesetzt und werden die Sequenz nach Prüfung aktualisieren (pers. Mitteilung Z. Aslam). Der Vergleich der eigens ermittelten Sequenz des Stamms Mtb. radiotolerans DSM 1819T (FJ157954.1) mit der homologen Sequenz des Genomprojekts von Mtb.

151 Diskussion radiotolerans JCM 2831T (CP001001.1, Region 4457490‐4456974) zeigte, dass beide Sequenzen im untersuchten Abschnitt vollkommen identisch sind10. Jedoch ergab eine BLAST‐Suche auch eine Sequenzähnlichkeit von 100 % zu einem GenBank‐Eintrag (EF562470.1) der mit ‚Mtb. mesophilicum DSM 1708T methanol dehydrogenase alpha subunit‐like (mxaF) gene, partial sequence’ bezeichnet ist (Madhaiyan et al. unpubliziert). Dabei handelt es sich wahrscheinlich um eine Sequenz, die aus Mtb. radiotolerans amplifiziert wurde, da die in der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenz von Mtb. mesophilicum DSM 1708T eine Divergenz von 4,06 % zur Sequenz von Mtb. radiotolerans DSM 1819T besaß und somit gut von ihr differenziert werden konnten. Die Autoren wurden auf diese Unstimmigkeiten hingewiesen, dennoch blieb der entsprechende GenBank‐Eintrag bis zum Zeitpunkt der Abgabe dieser Arbeit unverändert. Auch die partiellen mxaF‐Sequenzen wurden mittels unterschiedlicher Substitutionsmodelle und Rekonstruktionsverfahren analysiert, um methodisch bedingte Fehler möglichst auszuschließen. Dabei wurden alle Positionen des 517 bp umfassenden Alignments einbezogen. Bei Protein‐codierenden Genen besteht auch die Möglichkeit, bestimmte Triplett‐Positionen von der Analyse auszuschließen. Dies betrifft meist die dritte Position, die aufgrund des degenerierten Aminosäurecodes Basensubstitutionen oft toleriert, ohne das dadurch die biologisch relevante Polypeptidsequenz verändert wird. Allerdings gehen dabei auch viele relevante Merkmale verloren. Auch eine Translation der Nucleinsäure‐ in Aminosäuresequenzen stellt bei Protein‐codierenden Genen eine Möglichkeit zur Analyse dar. Diese Verfahren wurden in der vorliegenden Arbeit nicht dargestellt, ergaben jedoch sehr ähnliche Verwandtschaftsverhältnisse. Bei allen durchgeführten Analysen konnten die Sequenzen in drei große Sub‐ cluster eingeteilt werden. Die im Folgenden verwendeten Gruppen‐ und Subcluster‐Bezeichnungen beziehen sich auf die Ergebnisse des Kapitels 3.6.2.3 sowie die Stammbäume in Abbildung 5.4 und Abbildung 5.5. Subcluster 1 umfasste dabei stets die Speziesgruppe Mtb. extorquens/Mtb. chloromethanicum/Mtb. dichloromethanicum, Mtb. rhodinum und Mtb. podarium die zu Gruppe a zusammengefasst wurden und in allen Bäumen als monophyletische Einheit auftraten. Die Verzweigung besaß dabei eine mäßige statistische Unterstützung durch Bootstrapwerte von 61 % (NJ) bzw. 66 % (GTR+I+G) und eine posteriore Kladenwahrscheinlichkeiten von 88 %. Die Sequenzen der Spezies‐ gruppe Mtb. rhodesianum/Mtb. lusitanum (Gruppe b) unterschieden sich in keinem Merkmal und bildeten deshalb in allen Analysen Schwestertaxa zueinander. Die Sequenzen von Mtb. populi und Mtb. thiocyanatum trennte eine Divergenz von nur 0,8 % auf Nucleinsäure‐Ebene, wodurch auch diese beiden Stämme immer als Schwestertaxa in Subcluster 1 gefunden und zu Gruppe c zusammengefasst wurden. Die translatierten Sequenzen der Stämme konnten jedoch nicht von‐ einander unterschieden werden (siehe Tabelle 5.4). Auch Mtb. salsuginis sowie

10 Anm.: Mtb. radiotolerans DSM 1718T und Mtb. radiotolerans JCM 2831T sind Klone, die auf den Typstamms Mtb. radiotolerans 0‐1T (Ito und Iizuka 1971) zurückgeführt werden können. 152 Diskussion

Mtb. suomiense konnten immer in Subcluster 1 gefunden werden, allerdings variierte die Stellung der Spezies je nach verwendetem Rekonstruktionsverfahren. Die Spezies Mtb. zatmanii und Mtb. organophilum wurden in nahezu allen ermittelten Bäumen in Subcluster 1 bzw. in direkter Nachbarschaft des Subclusters gefunden; bei einer Analyse der Daten mit dem ML‐Verfahren bildeten Mtb. zatmanii und Mtb. organophilum jedoch eine paraphyletische Schwestergruppe zu Subcluster 1. Wie auch bei der Analyse der 16S rRNA‐Sequenzen grenzte die Spezies Mtb. organophilum meist das Subcluster 1 von Subcluster 2 ab. Jedoch konnte die Zugehörigkeit von Mtb. organophilum zu Subcluster 1 statistisch nicht belegt werden. In allen berechneten Stammbäumen bildeten die Stämme Mtb. fujisawaense, Mtb. oryzae und Mtb. phyllosphaerae eine Polytomie in Subcluster 2, da die Sequenzen vollständig identisch waren und daher nicht voneinander differenziert werden konnten. Zusammen mit Mtb. radiotolerans und Mtb. mesophilicum bildeten die Stämme Gruppe d. Die Zusammengehörigkeit dieser Einheit konnte durch eine posteriore Kladenwahrscheinlichkeit von 100% und ebenso hohen Bootstrap‐ werten sehr gut belegt werden. Die innere Topologie der Gruppe konnte jedoch nicht aufgelöst werden. Die Stämme Mtb. hispanicum und Mtb. jeotgali zweigten basal von Gruppe d ab und wurden meist auch in Subcluster 2 gefunden. Jedoch konnte die genaue Stellung dieser Stämme auf der Grundlage der verwendeten Daten nicht geklärt werden. Unter Verwendung der NJ‐Methode und dem Substitutionsmodell nach Jukes und Cantor (1990) wurde Mtb. jeotgali in Subcluster 1 gefunden, wenn für die Analyse die dritte Codonposition ausge‐ schlossen wurde (Daten nicht gezeigt); die Spezies Mtb. hispanicum bildete hingegen unter den gleichen Analysebedingungen mit Gruppe d ein monophyletisches Subcluster, was durch einen Bootstrapwert von 79 % gut gestützt wurde. Auch unter Verwendung der ML‐Methode fand sich Mtb. jeotgali in Subcluster 1, während Mtb. hispanicum das basalste Taxon des mono‐ phyletischen Subclusters 2 darstellte. Im Subcluster 3 konnte in allen Baumtopologien Gruppe e – mit den Sequenzen der Stämme JT1 und 5b2.20 sowie F3.2 und F2.1 – gefunden werden. Die Stammpaare der beiden Äste zeigen identische Sequenzen, während die Schwestergruppen durch eine Divergenz von 3,68 % getrennt sind. Die Abspaltung dieser monophyletischen Gruppe kann dabei durch relativ hohe Bootstrapwerte (> 75 %) und einer posteriore Kladenwahrscheinlichkeit von 80 % auch statistisch belegt werden. Die Stämme Mtb. goesingense iEII3 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T wurden stets in direkter Nachbarschaft der Gruppe e gefunden, wobei die genaue Topologie nicht ermittelt werden konnte. Die Sequenzen der Stämme zeigen dabei eine Divergenz von 6,58 % zueinander. Gegenüber der Sequenz von JT1 kann eine Divergenz von 5,22 % (Mtb. adhaesivum) sowie 7,16 % (Mtb. goesingense) beobachtet werden. Mit Mtb. sp. F3.2 fällt die Divergenz sogar noch etwas geringer aus (4,64 % mit Mtb. adhaesivum und 6,19 % mit Mtb. goesingense). Werden die translatierten Proteinsequenzen betrachtet, können keine Unterschiede zwischen

153 Diskussion

Mtb. goesingense, JT1/5b.2.20 und F3.2/F2.1 festgestellt werden. Alle Autapo‐ morphien fielen dabei auf die dritte Codonposition in der Nucleinsäuresequenz und hatten keine Auswirkung auf die Primärsequenz des Polypeptids (stille Mutationen). Demgegenüber zeigt die Aminosäuresequenz von Mtb. adhaesivum eine Divergenz von 1,16 % (2 unterschiedliche AS) und kann dadurch bei Analysen auf Aminosäurebasis abgegrenzt werden. Die in Gruppe f zusammengefassten Stämme Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum wurden bei den dargestellten Rekonstruktionsverfahren immer auf einem langen Ast in Subcluster 3 gefunden, wobei die Verzweigung im Consensusbaum der Bayesschen Analyse nicht aufgelöst werden konnte und bei den NJ‐Analysen ein Bootstrapwert von nur knapp über 50 % erhalten wurde. Die bei diesen Analysen ermittelte Position steht dabei im Widerspruch zu den Ergebnissen der 16S rDNA‐ Analysen, bei denen das Stammpaar zuverlässig in Subcluster 1 gefunden wurde. Die Spezies wiesen jedoch auch in den Phylogrammen, die anhand der ribosomalen Sequenzen erstellt wurden, relativ lange Äste auf, die durch eine große genetische Divergenz zur nächstverwandten Spezies zum Ausdruck kommt. Bei schnell evolvierenden Linien kann dabei das Phänomen der so genannten ‚long branch attraction’ (LBA) auftreten, wobei zwei oder mehrere isoliert stehende Linien aufgrund zufälliger Übereinstimmungen konvergenter Evolutionsschritte artifizielle Schwestergruppenverhältnisse ausbilden (Felsenstein 1978, Huelsenbeck 1997, Bergsten 2005). Dieses Problem tritt vor allem bei der Verwendung des ‚Maximum Parsimony’‐Methode (MP) auf, da die konvergenten Merkmale als Synapomorphien interpretiert werden. Bei Analyse der Daten mit MP (Daten nicht gezeigt), bildete Gruppe f eine basale Schwestergruppe zu allen anderen Stämmen der Gattung. Das Problem der LBA kann durch die Verwendung anderer Methoden – die unterschiedliche Substitutionsraten innerhalb einer Abstammungslinie zulassen – jedoch minimiert werden (z. B. ML, Bayessche Analyse). Eine weitere Möglichkeit besteht darin, zusätzliche Taxa in die Analyse einzubeziehen, die den Abstand der Linien untereinander verringern. Dies war jedoch aufgrund fehlender Daten vieler Typstämme nicht möglich. Aufgrund der Analysen der 16S rDNA würden sich hierbei die Typstämme der Spezies Mtb. variabile, Mtb. platani und Mtb. isbiliense anbieten, die eng mit Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum verwandt sind, für die allerdings bisher noch keine Daten zur Sequenz des mxaF‐Gens vorliegen. Auch die Außengruppe, die stets auf einem langen Ast zu finden ist, stellt eine potentielle Quelle für LBA‐Phänomene dar (Bergsten 2005). Daher wurde der Einfluss der Außengruppe auf die innere Topologie exemplarisch getestet, indem einige Rekonstruktionsverfahren ohne Außengruppe durchgeführt wurden. Dabei wurden identische Verwandtschaftsverhältnisse erhalten. Auch die Analyse der Daten unter Ausschluss der dritten Codonposition – die meist am schnellsten evolviert und daher am anfälligsten für konvergente Substitutionen ist – brachte keine grundlegenden Änderungen der Topologie mit sich. Daher kann die Stellung dieser Gruppe außerhalb des Subclusters 1 als relativ gut gesichert angesehen werden; weitere Aussagen sind aber nicht möglich.

154 Diskussion

Die Verknüpfung der einzelnen Subcluster untereinander und die „Richtung“ der Evolution konnten bei den Analysen nicht geklärt werden. So bildete Subcluster 1 bei NJ‐Analysen mit einfachen Substitutionsmodellen und der Bayesschen Analyse eine Schwestergruppe zu Subcluster 2, während unter Verwendung des NJ‐Algorithmus mit dem komplexesten Substitutionsmodell (GTR+I+G) sowie der ML‐Analyse Subcluster 2 und 3 Schwestergruppen darstellten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der 16S rRNA‐Sequenzen wurde Subcluster 1 meist näher an der Wurzel des Baums platziert als Subcluster 2 und 3; jedoch zeigte Subcluster 3 bei der Bayesschen Analyse der Daten die geringste Distanz zur Wurzel. Vergleicht man die unkorrigierten p‐Distanzen der Mtb.‐Stämme mit Rps. palustris kann die geringste Divergenz mit Mtb. rhodesianum/Mtb. lusitanum festgestellt werden (15,09 %), die sich in Subcluster 1 befinden und als Indiz dafür dienen, dass die Spezies des Subcluster 1 näher mit Rps. palustris verwandt sind als die Spezies der anderen Subcluster. In der vorliegenden Arbeit wurde die erste phylogenetische Studie zur Evolution eines partiellen mxaF‐Genabschnitts mit mehr als 20 Sequenzen durchgeführt. Allerdings zeigte sich dabei, dass dieser Genabschnitt nur begrenzt für die Rekonstruktion der Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb der Gattung eingesetzt werden kann, da die Sequenzen zu wenige variable Merkmale tragen um eine verlässliche Phylogenie aufzustellen (siehe Tabelle 3.10). Die Gruppierung in drei große Subcluster stimmte mit den Analysen der 16S rDNA größtenteils überein, wodurch davon ausgegangen werden kann, dass die berechneten Stammbäume trotzdem die wahren Verwandtschaftsverhältnisse gut abbilden. Frühere Studien schlossen nur sehr wenige Vertreter der Gattung ein und besitzen daher nur eine begrenzte Aussagekraft. So publizierten Aslam et al. (2007) mit der Speziesbeschreibung von Mtb. jeotgali ein NJ‐Phylogramm (JC) in dem Mtb. nodulans an der Basis des Baums abzweigte. In jeweils dichotomen Verzweigungen folgten Mtb. jeotgali, Mtb. organophilum, Mtb. zatmanii, Mtb. podarium, Mtb. dichloromethanicum, Mtb. extorquens und Mtb. rhodinum (Aslam et al. 2007). Diese Unstimmigkeit wurde jedoch auf ein unzureichendes Taxon‐ Sampling seitens der Autoren (Aslam et al. 2007) zurückgeführt, da acht neue Spezies erst nach Erscheinen der Publikation beschrieben wurden, unter anderem die Spezies Mtb. platani (Kang et al. 2007), welche relativ eng mit Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum verwandt ist.

155 Diskussion

4.2.3 Zusammenfassung Kombiniert man die gewonnen Ergebnisse beider Analysen, lassen sich folgende Erkenntnisse zusammenfassen. Die Isolate JT1 und 5b.2.20 stellen wahrscheinlich Klone einer genetischen Einheit (Spezies) dar, da keine Unterschiede in den untersuchten Gensequenzen gefunden werden konnten. Auch das Isolat 1b.3 zeigt eine hohe 16S rDNA‐Sequenz‐ ähnlichkeit zu diesen Stämmen. Ebenso bilden auch die Isolate F3.2, F3.1, F2.1 und 5a.1.5 eine genetische Einheit (Spezies), da auch zwischen den Sequenzen dieser Stämme (fast) keine Unterschiede festgestellt wurden. Beide Gruppen stehen sich evolutionär sehr nahe und können auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt werden. Die Gattung Methylobacterium hat wahrscheinlich einen monophyletischen Ursprung und lässt sich in drei große, monophyletische Subcluster unterteilen. Die bei den Analysen ermittelte Einteilung wurde in Tabelle 4.2 zusammengefasst. Die genaue Zuordnung der Spezies Mtb. jeotgali und Mtb. organophilum konnte nicht eindeutig geklärt werden. Auch die Stellung der Speziesgruppe um Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum konnte anhand der analysierten Daten nicht zweifelsfrei bestimmt werden; dessen ungeachtet nimmt diese Gruppe eine Sonderstellung innerhalb der Gattung ein, da diese Spezies scheinbar höhere Substitutionsraten aufweisen als andere Spezies der Gattung.

Tabelle 4.2: Putative Einteilung der Gattung Methylobacterium in drei Subcluster. Die Einteilung beruht auf der Analyse der fast vollständigen 16S rRNA‐Sequenzen und eines Abschnitts des mxaF‐Gens. Die Zuordnung der klein gedruckten Speziesnamen beruht alleine auf der Analyse der 16S rRNA‐Sequenzen.

Subcluster 1 Subcluster 2 Subcluster 3 Mtb. extorquensa Mtb. mesophilicum Mtb. sp. JT1 Mtb. zatmanii Mtb. fujisawaense Mtb. sp. F3.2 Mtb. rhodesianumb Mtb. oryzae Mtb. goesingense Mtb. rhodinum Mtb. phyllosphaerae Mtb. adhaesivum Mtb. podarium Mtb. radiotolerans Mtb. populi Mtb. hispanicum Mtb. iners Mtb. thiocyanatum Mtb. jeotgali Mtb. suomiense Mtb. salsuginis Mtb. brachiatum Mtb. organophilum Mtb. tardum Mtb. gregans Mtb. variabile Mtb. komagatae Mtb. platani Mtb. persicinum Mtb. aquaticum Mtb. aerolatum Mtb. isbiliense Mtb. nodulans a inklusive der Spezies Mtb. chloromethanicum und Mtb. dichloromethanicum, die nach Kato et al. (2005, 2008) heterotypische Synonyme für Mtb. extorquens darstellen. b inklusive der Spezies Mtb. lusitanum, die nach Kato et al. (2005, 2008) ein hetero‐ typisches Synonym für Mtb. rhodesianum darstellt.

156 Diskussion

Auch bei einer phylogenetischen Analyse der partiellen Gensequenzen der Gyrase B Untereinheit (gyrB) durch Kato et al. (2008) konnten die beiden Typstämme der Spezies Mtb. nodulans und Mtb. aquaticum keinem Subcluster zugeordnet werden und zweigten basal an der Wurzel ab. Die restlichen Stämme fanden sich in zwei monophyletischen Subclustern (Kato et al. 2008), wobei sich die ermittelten Verwandtschaftsverhältnisse mit den in dieser Arbeit ermittelten Ergebnissen decken. Jedoch wurde keine Spezies des Subcluster 3 in die Analysen von Kato et al. (2008) mit einbezogen.

4.3 Biofilmbildung Alle in dieser Arbeit getesteten Mtb. spp. bilden Biofilme, wobei sich deutliche Unterschiede in Quantität und Qualität zeigten. Anhand der im Folgenden diskutierten Ergebnisse konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit grund‐ legende Erkenntnisse über die Mechanismen der Biofilmbildung bei Bakterien der Gattung Methylobacterium gewonnen werden. Zwar ist bereits bekannt, dass Vertreter der Gattung Biofilme bilden (Green und Bousfield 1983, Kelley et al. 2004, Dempsey et al. 2007, Simões et al. 2007), jedoch wurden über die Mechanismen die zur Ausprägung der Biofilme führen nur wenige Publikationen gefunden (Oh et al. 1996, Breuer und Babel 1999, Nieto Penalver et al. 2006).

4.3.1 Matrixkomponenten der Biofilme Verhoef und Kollegen (2005) konnten bei der Analyse von 30 Exopolysacchariden aus unterschiedlichen Bakterien, diese in vier große Gruppen einteilen. Die EPS der untersuchten Mtb. spp. waren hauptsächlich aus Galactose und Pyruvat aufgebaut und bildeten eine eigenständige Gruppe. Die Autoren konnten dabei aus einem Methylobacterium Isolat vier verschiedene Hoch‐, Mittel‐ und Nieder‐ molekulare Exopolysaccharide auftrennen, die sich in ihrer chemischen Zusammensetzung deutlich unterschieden. Die kleineren Moleküle enthielten dabei auch beträchtliche Anteile an Glukose und Mannose, jedoch kein Pyruvat (Verhoef et al. 2005). Ein zweiter Methylobacterium Stamm bildete nur ein hochmolekulares Exopolysaccharid aus Galactose und Pyruvat (Verhoef et al. 2005). In einer detaillierten Studie zur Zusammensetzung und Struktur dieses Exopolysaccharids konnten die Autoren zeigen, dass es sich um ein α‐(1→3)‐ verknüpftes Galactan‐Rückgrat handelt, das sich aus einer Abfolge von jeweils drei aufeinander folgenden D‐Galactopyranosen zusammensetzt, von denen zwei mit Pyruvat substituiert sind (Verhoef et al. 2003). Bei der Aufreinigung des etwa 2000 kDa großen Exopolysaccharids konnte nur ein geringer Proteinanteil von etwa 4 % ausgemacht werden (Verhoef et al. 2003). Choi et al. (1991) identifizierten Mannose, Galactose und Glukose (im Verhältnis 2:3:2) als Hauptbestandteil (80 %) des hochviskosen, sauren Polysaccharids Methylan aus Mtb. organophilum. Zusätzlich enthält Methylan ca. 5 % Pyruvat, einen Uronsäureanteil von etwa 10 % und ca. 6 % Protein (Choi et al. 1991). Bakterien der Gattung Agrobacterium und Rhizobium, zwei mit Methylobacterium phylogenetisch nahe verwandten, Pflanzen‐assoziierten Bakteriengattungen,

157 Diskussion bilden Cellulose‐Fibrillen zur Anheftung an Pflanzenoberflächen aus (Matthysse 1983), die einen Durchmesser von etwa 5‐6 nm aufweisen (Smith et al. 1987). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden jedoch Durchmesser von etwa 20‐50 nm für die extrazellulären Fibrillen des Stamms A. tumefaciens B6 ermittelt. Auch Balneimonas flocculans, eine phylogenetische eng verwandte Gruppe zur Gattung Methylobacterium, synthetisiert Cellulose‐Fibrillen (Takeda et al. 2004). Sowohl bakterielle als auch pflanzliche Zellulosefasern werden an membran‐ integrierten Proteinkomplexen synthetisiert, die aufgrund ihrer Form als Rosetten bezeichnet werden (Ross et al. 1991, Somerville 2006). Bei elektronen‐ mikroskopischen Studien der Fibrillen konnten Durchmesser von 5‐10 nm bei den meisten Pflanzen gefunden werden (Ha et al. 1998, Herth 1983). Bei Grünalgen können die Fibrillen jedoch Durchmesser von 25‐30 nm besitzen (Somerville 2006). Die Dicke der Fibrillen ist dabei von der Zahl an Microfibrillen abhängig aus denen sie sich zusammensetzt. Diese Microfibrillen bestehen wiederum aus sechs Einzelfibrillen, die jeweils 6‐10 Glucanketten beinhalten (Somerville 2006). Decho (1999) konnte bei Alginat‐Filamenten einen Durchmesser von 1,4‐4,7 nm für Microfibrillen sowie 3,7‐18,2 nm für Fibrillen messen, die sich vor allem durch die Zugabe von Ca2+ und Mg2+ aus mehreren Microfibrillen zusammenlagerten. In der vorliegenden Arbeit konnten typischerweise Durchmesser von 20‐40 nm für die extrazellulären Fibrillen von Mtb spp. und Agrobacterium tumefaciens bestimmt werden (vgl. Kapitel 3.5.2.4). Teilweise konnte auch eine Aufspaltung der Fibrillen in kleinere Bestandteile beobachtet werden. Daher kann gemutmaßt werden, dass die Fibrillen bei Mtb. spp. einen ähnlichen Aufbau und eine ähnliche Entstehung wie Cellulose‐Fibrillen besitzen. Dickere Fibrillen (Durchmesser > 30 nm) bestehen wahrscheinlich aus mehreren zusammen gelagerten Einzelsträngen. Es konnte gezeigt werden, dass die Vertreter der Gattung Methylobacterium exopolymere Substanzen synthetisieren, die mit CFW und einigen Lektinen spezifisch wechselwirken (siehe Kapitel 3.5.2.2 und 3.5.2.3). Die EPS werden von einigen Stämmen bevorzugt an einem polaren Ende der Zelle synthetisiert, wodurch sich die bei Methylobacterium spp. häufig beobachtete sternförmige Aggregatbildung erklären lässt (Green 2006). Die Bindung von CFW sowie der Lektine Con A, WGA und RCA120 an Biofilme deutet darauf hin, dass die struktur‐ gebenden Substanzen der Biofilme aus Polysacchariden bzw. Polysaccharid‐ haltigem Material bestehen. Während CFW relativ unspezifisch an β‐(1→4) und β‐(1→3) verknüpfte Polysaccharide bindet, kann die Bindung der Lektine einen Hinweis auf die Zusammensetzung geben. So bindet RCA120 spezifisch an Lactose und β‐D‐Galactose. Da auch die von Verhoef et al. (2003) sowie Choi et al. (1991) charakterisierten Polysaccharide einen hohen Galactose‐Anteil enthielten, kann davon ausgegangen werden, dass auch die im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten Exopolysaccharide Galactose enthalten. WGA bindet spezifisch an N‐Acetylglucosamin, Sialinsäure und N‐Acetylgalactosamin; Con A kann spezifisch an α‐Methyl‐Mannopyranosid, α‐D‐Mannose, α‐D‐Glukose und α‐N‐ Acetyl‐D‐Glucosamin binden. Daher lässt sich vermuten, dass die EPS mindestens zwei Zuckergruppen enthalten (evtl. GlcNAc und Galactose) und somit ein

158 Diskussion

Heteropolymer darstellen. Jedoch lässt sich aufgrund der vorliegenden Daten keine genauere Aussage über die Zusammensetzung der Polysaccharide treffen. Da sich die Bindungen‐Affinitäten der einzelnen Zucker unterscheiden und die Lektin‐Zucker‐Bindung nicht kovalent stattfindet, könnten durch Zugabe der Zucker‐Haptene zu den gefärbten Präparaten Kompetitionsexperimente durch‐ geführt werden um ein genaueres Bild zu erhalten. Dennoch ist nicht auszuschließen, dass es sich bei den gefärbten Strukturen um Glykoproteine, ‐lipide bzw. Lipopolysaccharide oder andere Moleküle mit Oligosaccharidanteil handelt. Aufgrund der vorliegenden Literatur und Daten ist jedoch davon auszugehen, dass die Vertreter der Gattung Methylobacterium Exopolysaccharide synthetisieren (Choi et al. 1991, Verhoef et al. 2003, 2005), um sich an Oberflächen anzuheften und Biofilme auszubilden. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um Heteropolysaccharide, die an der Außenmembran der Bakterien synthetisiert werden und meist in Form von Fibrillen mit einem Durchmesser von etwa 20‐30 nm auftreten. Diese Fibrillen setzen sich aus vielen zusammen gelagerten Einzelfilamenten zusammen. Jedoch ist dabei auch zu bedenken, dass diese Fibrillenform auch als Trocknungsartefakt auftreten könnte, da die Proben vor der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung entwässert werden müssen. So könnten die hoch‐hydratisierten EPS in vivo auch als schleimige Stränge vorliegen, die durch den Wasserentzug zu definierten Fibrillen kondensieren. Bei einigen Isolaten konnten aber teilweise auch flächige Exopolysaccharidstrukturen beobachtet werden, was dafür spricht, dass die Strukturen ihre „natürliche Form“ bei der Präparation beibehalten. Auch die Zellen selbst zeigten keine Hinweise auf Trocknungsartefakte. Lediglich die Zelldimensionen fielen meist geringer aus, als im Phasenkontrast‐ mikroskopischen Bild. Diese Unterschiede sind jedoch methodisch bedingt. Durch die EPS können die Bakterien an Oberflächen oder andere Bakterien binden. Die Isolate 5a.1.13, 1c.1 und Mtb. adhaesivum DSM 17169T stellen Vertreter der Gattung dar, die eine besonders starke Produktion exopolymerer Substanzen zeigen. Diese Stämme nehmen bei der Analyse der Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Gattung relativ weit voneinander entfernte Stellungen ein. So findet sich das Isolat 1c.1 in Subcluster 1 in der Speziesgruppe um Mtb. extorquens; 5a.1.13 stellt wahrscheinlich ein Isolat der Spezies Mtb. mesophilicum oder Mtb. brachiatum dar und findet sich bei den phylogenetischen Analysen in Subcluster 2 wieder (siehe Kapitel 4.2.1), während der Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T im Rahmen der vorliegenden Arbeit dem Subcluster 3 zugeordnet wird. Die Produktion extrazellulärer Substanzen ist daher wahrscheinlich ein universelles Merkmal der Gattung Methylobacterium. Jedoch ist die Bildung der Biofilmmatrix Isolat‐spezifisch und stark von den Umweltbedingungen abhängig (siehe Kapitel 4.3.2). Zusätzlich kann sich durch spontane Ereignisse – die noch nicht näher verstanden sind – die Menge an produzierten EPS in einem Isolat ändern. So konnten von den stark Biofilm‐bildenden Stämmen Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. sp. 5a.1.13 Klone isoliert werden, die nur noch wenig EPS bilden. Bei der Kultivierung der „EPS‐negativ“‐Klone konnten aber wieder spontane Transitionen

159 Diskussion zurück zum Ursprungs‐Phänotyp beobachtet werden. Diese Morphotyp‐ Transitionen wurden vor allem auf dem nährstoffreichen GP‐Medium (nach Green und Bousfield 1982) beobachtet. Dies könnte aber auch darauf zurückgeführt werden, dass die Stämme auf dem Medium die auffälligsten Kolonien ausbildeten und der Unterschied zwischen beiden Morphotypen auf diesem Medium am deutlichsten ausfiel. Evtl. hat auch das Alter und Herkunft der zur Inokulation der Medien verwendeten Zellen einen Einfluss auf die EPS‐ Synthese. Dies wurde allerdings nicht weiter experimentell untersucht. Eine starke Produktion exopolymerer Substanzen führte zu einer strukturierten Koloniemorphologie. Zusätzlich konnten diese Kolonien nur sehr schwer von der Agaroberfläche gelöst und suspendiert werden. Die Konsistenz der Kolonien reichte dabei von trocken‐bröselig bis gummiartig. Diese Beobachtung steht dabei im Gegensatz zur weit verbreiteten Ansicht, dass Bakterien die viel EPS ausbilden eine schleimige Koloniemorphologie zeigen. So bildeten die Klone mit reduzierter EPS‐Produktion Kolonien, die feuchter und schleimiger erschienen als die Ursprungsmorphotypen. Dies könnte evtl. darauf zurückgeführt werden, dass die EPS dieser Methylobacterium‐Stämme andere physikalische Eigenschaften aufweisen als die EPS anderer Bakterien. Klärung könnte hier nur durch weiter‐ führende Untersuchungen zur chemischen Zusammensetzung sowie der physikalischen Eigenschaften der Polysaccharide geschaffen werden. Für weiterführende Experimente zur Biofilmbildung und Exopolysaccharid‐ produktion wurden mit der Isolation der Morphotypen der beiden Stämme Mtb. adhaesivum DSM 17169T und 5a.1.13 die Voraussetzungen geschaffen, ver‐ gleichende Analysen innerhalb einer Spezies durchzuführen. Jedoch muss dabei der Phänotyp der Klone regelmäßig geprüft werden, da die Unterschiede in der Synthese der EPS wahrscheinlich nicht fest im Genom der Bakterien verankert sind, sondern über andere Mechanismen transient gespeichert werden (Ben Jacob 2004, Kelly et al. 2006). Neben den eben diskutierten Exopolysaccharid‐Fibrillen, die eine Länge von mehreren μm einnehmen können, bilden die phylogenetisch eng verwandten Stämme um JT1 und F3.2 zusätzlich zahlreiche Strukturen auf der Zelloberfläche aus, die eine Breite von etwa 25‐40 nm und eine Länge von bis zu 300 nm aufweisen und im folgenden Abschnitt diskutiert werden sollen. Auch bei allen anderen untersuchten Stämmen konnten kleine Zellaufwüchse beobachtet werden, die einen vergleichbaren Durchmesser aufwiesen, aber nur in geringer Zahl auf der Zelloberfläche zu finden waren (< 20). Diese Strukturen stellen wahrscheinlich Reste der gebildeten exopolymeren Fibrillen dar, die an diesen Orten synthetisiert wurden. Bei der rasterelektronischen Analyse der Bakterienoberflächen zeigten die Isolate um JT1 und F3.2 eine auffällige Oberflächenstruktur mit vielen Zellaufwüchsen, die im Folgenden als Fimbrien bezeichnet werden. Nach Ottow (1975) besitzen Fimbrien (von lat. Fimbriae, Faden, Faser) oder Pili (von lat. Pilus, Haar) typischerweise Durchmesser von 3‐25 nm. Beide Begriffe werden synonym verwendet, jedoch wird der Begriff Fimbrie meist für alle nicht‐flagellären

160 Diskussion bakteriellen Zellanhänge benutzt, die eine Rolle bei der Adhäsion der Bakterien spielen und nicht am Transfer bakterieller oder viraler Nucleinsäuren beteiligt sind. Der Begriff Pili wird hingegen meist für nicht‐flagelläre Strukturen verwendet, die dazu benutzt werden Nucleinsäuren auszutauschen (Ottow 1975). Im Gegensatz zu Flagellen (Durchmesser etwa 12‐13 nm) sind Fimbrien flexibler, meist dünner, gerade geformt und kommen meist in größerer Anzahl (bis zu 1000) auf den Zellen vor. Dabei bilden besonders frisch isolierte Stämme Fimbrien aus (Ottow 1975, Gally et al. 1993). Fimbrien spielen vor allem bei der Adhäsion der Zellen eine wichtige Rolle. Zusätzlich wird durch Fimbrien die Oberfläche des Organismus vergrößert, wodurch Nährstoffe besser akkumuliert und aufgenommen werden können. Fimbrien und Pili bestehen oft aus Proteinbausteinen. Über die chemische Zusammensetzung der Fimbrien bei den Isolaten JT1 und F3.2 liegen keine experimentellen Erkenntnisse vor, dennoch ließe sich vermuten, dass diese wie die exopolymeren Fibrillen aus Polysaccharidbausteinen bestehen, da die Durchmesser beider Strukturen ähnlich ausfallen. Dagegen spricht jedoch die Beobachtung, dass die Bindung der fluoreszenzmarkierten Lektine meist nur in den zentralen Strukturen der Biofilme beobachtet werden konnte. Sollten die Fimbrien aus Polysacchariden bestehen, müsste die gesamte Zelloberfläche mit den Lektinen wechselwirken und nach Anregung fluoreszieren. Jedoch könnten die Fibrillen und Fimbrien aus unterschiedlichen Zuckerbausteinen bestehen und nur durch spezifische Lektine nachweisbar sein. Ob es sich bei den Fimbrien um zuckerhaltige Strukturen handelt, könnte durch Lektine nachgewiesen werden, die an Metallpartikel gekoppelt wurden. Nach Inkubation der Zellen mit diesen Lektinen können die Proben im SEM untersucht werden. Hierbei besteht jedoch wieder das Problem ein spezifisches Lektin zu finden. Der Proteinnachweis könnte durch einen Verdau der Zellen mit einer unspezifischen Proteinase und der anschließenden rasterelektronenmikroskopischen Analyse erfolgen. Bei Hinweisen auf proteinöse Bestandteile besteht zusätzlich die Möglichkeit Antikörper zur Detektion zu verwenden. Weitere denkbare Vorgehensweisen zur Analyse der Strukturen wären auch eine fraktionierte Aufreinigung der Zellwand mit einer anschließenden Analyse der Bestandteile (Proteinprofil, chemische Analysen etc.).

4.3.2 Einfluss des Mediums auf die Biofilmbildung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmbildung von Vertretern der Gattung Methylobacterium durch den Vergleich des Wachstums auf unterschiedlichen Nährböden erforscht. Dabei wurden am Beginn der Arbeit verschiedene Standardmedien verwendet, auf denen einige Isolate unter‐ schiedliche Koloniemorphologien ausbildeten. Durch den Vergleich der Zusammensetzung der Medien wurde herausgearbeitet, dass vor allem die Konzentration an verfügbarem Stickstoff als entscheidender Faktor für die Biofilmbildung der Isolate verantwortlich ist. Diese Ergebnisse können mit den Arbeiten von Choi et al. (1996), Breuer und Babel (1999) verglichen werden, die

161 Diskussion auch eine erhöhte EPS‐Produktion unter Stickstoff‐limitierten Bedingungen beobachteten. Jedoch ist bei Methylobacterium spp. wahrscheinlich nicht allein die Konzentration an Stickstoff entscheidend, sondern das Zusammenspiel mehrerer Faktoren. So konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass auch die Menge an verfügbarem Phosphat Einfluss auf die Form und Struktur der Kolonien ausübt. Für die Untersuchung der Auswirkung unterschiedlich zusammengesetzter Nährmedien wurden Stämme und Isolate verwendet, die sich in vorausgegangenen Experimenten als starke Biofilmproduzenten herausgestellt hatten. Auf Stämme die generell nur sehr wenig EPS bilden (wie z. B. Mtb. mesophilicum DSM 1708T) hatte eine Änderung des C:N:P‐Verhältnis fast keine Auswirkungen auf die Morphologie der Kolonien. Bei den getesteten Isolaten ließ sich jedoch kein generelles Verhalten erkennen. So bildete der Stamm 5a.1.13 unter Stickstoff‐limitierten Bedingungen deutlich strukturierte Kolonien, während höhere Stickstoffmengen zu relativ einfach geformten Kolonien führten. Zwar zeigten auch die Stämme Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. sp. 1c.1 eine ähnliche Abhängigkeit der Koloniemorphologie von der Menge verfügbaren Stickstoffs, jedoch nur wenn gleichzeitig wenig Phosphat verfügbar war. Bei diesen beiden Stämmen kann auch eine deutliche Abhängigkeit der Koloniemorphologie von der Menge verfügbaren Phosphats beobachtet werden, wobei auch eine zunehmende Strukturierung der Kolonien mit steigender Phosphatkonzentration einherging. Danhorn und Kollegen (2004) konnten bei Agrobacterium tumefaciens zeigen, dass die Biofilmbildung unter Phosphat‐ limitierten Bedingungen stimuliert wird. Auch bei Pseudomonas aureofaciens wurde ein ähnlicher Regulationsmechanismus gefunden (Monds et al. 2001). Alle starken Biofilmproduzenten bildeten auf GP‐Medium (Green und Bousfield 1982) deutlich strukturierte Kolonien. Das Medium besteht aus Glycerol (das als Kohlenstoffquelle dient) und enzymatisch hydrolysiertem Sojapepton, das aus Aminosäuren und Oligopeptiden besteht, die den Bakterien als potentielle Stickstofflieferanten dienen können. Zusätzlich sind Mineralsalze, Kohlenhydrate und Vitamine enthalten. Dem Medium wird jedoch kein Phosphat zugesetzt, wodurch man von einem deutlichen Überschuss an Kohlenstoff und Stickstoff ausgehen kann. Dieses Medium stellte sich auch bei den durchgeführten Versuchen mit CFW als das Medium heraus, bei dem die deutlichste Fluoreszenz – und folglich die stärkste Produktion CFW‐bindender EPS – beobachtet werden konnte. In weiterführenden Untersuchungen sollte daher geklärt werden, ob sich die EPS der auf Komplexmedien gebildeten Biofilme in ihrer Zusammensetzung von den EPS unterscheiden, die auf Minimalmedien gebildet werden. Zumindest die deutlich unterschiedliche Ausprägung der Koloniemorphologie spricht dabei für eine andere Zusammensetzung. Wahrscheinlich werden auf unterschiedlichen Nährmedien auch EPS mit unterschiedlicher Zusammensetzung produziert. So zeigten einige Biofilme bei Wachstum in GP‐Medium auch andere Lektinbindungs‐Eigenschaften als bei Wachstum in Minimalmedium. Rode (2004) konnte zeigen, dass Pseudomonas aeruginosa in verschiedenen Nährmedien

162 Diskussion unterschiedliche Proteingehalte in den gebildeten Biofilmen aufweist. Dadurch könnten andere Wechselwirkungen in der Biofilmmatrix herrschen, durch welche die Koloniemorphologie auch anders ausfallen kann. Auch auf den beiden Stickstoff‐armen Minimalmedien AMS und Medium nach Choi et al. (1989) wurde von den Bakterien deutlich mehr CFW‐bindendes Material gebildet, als auf dem Phosphat‐ und Stickstoff‐reichen Medium 4 (nach Bourque et al. 1995). Dies deutet ebenfalls auf eine erhöhte Produktion exopoly‐ merer Substanzen unter Stickstoff‐limitiertem Wachstum hin. Breuer und Babel (1999) konnten nach Mutagenese einen Mtb. rhodesianum‐Klon isolieren der unter Stickstoff‐limitierten Bedingungen Exopolysaccharide bildete. Dabei nahm die Menge an intrazellulär gebildetem PHB gegenüber dem Wildtyp deutlich ab. Unter Phosphat‐ oder Sauerstoff‐limitierten Bedingungen bildete der Stamm keine EPS. Die Autoren führten dies darauf zurück, dass unter Stickstoff‐ limitierten Bedingungen die zum Aufbau beider Substanzen benötigten Kohlen‐ stoffatome zwischen PHB‐ und EPS‐Synthese aufgeteilt werden. Die Synthese von EPS kann nur stattfinden wenn Energie in Form von ATP verfügbar ist. Für die Bildung von ATP durch die oxidative Phosphorylierung werden jedoch Sauerstoff und organisches Phosphat benötigt, was die Abwesenheit der EPS unter Sauerstoff‐ oder Phosphatmangel erklären könnte (Breuer und Babel 1999). Mtb. organophilum bildet bei niedrigen Ammonium‐Konzentrationen im Medium (< 10 mM) eine konstant hohe Menge an EPS pro Zelle, während bei Konzentrationen von > 20 mM nur noch wenig Exopolysaccharide von den Zellen gebildet werden (Oh et al. 1996). Diese Werte können durchaus mit den Ergebnissen verglichen werden, die in der vorliegenden Arbeit ermittelt wurden. Der Stamm 5a.1.13 bildete bei niedrigen Ammoniumionen‐Konzentrationen von < 10 mM eine strukturierte Kolonie‐ morphologie, was auf eine hohe Synthese von EPS zurückgeführt werden kann. Bei einem höheren Stickstoffangebot bildete der Stamm relativ glatte Kolonien, die weniger EPS beinhalten. Diese Abhängigkeit konnte auch bei Mtb. adhaesivum DSM 17169T beobachtet werden. Die Biofilmbildung des Stamms 1c.1 scheint hingegen stärker von der Verfügbarkeit organischen Phosphats abzuhängen.

4.3.3 Vergleichende Analyse verschiedener mutmaßlicher Mtb. mesophilicum Isolate Mit dem Isolat 5a.1.13 wurde von Schauer (2004) ein pink‐pigmentierter Vertreter der Gattung Methylobacterium aus der Rhizosphäre von Helianthus annuus isoliert, das durch seine strukturierte Koloniemorphologie auf einigen Agarnährböden auffiel. Erste Versuche das Isolat taxonomisch einzuordnen ergaben eine Zugehörigkeit zur Mtb. mesophilicum (Schauer 2004). Auch in der vorliegenden Arbeit deutet sich aufgrund der 16S rDNA‐Sequenzanalysen eine Zugehörigkeit des Isolats zur Spezies Mtb. mesophilicum an, da beide Stämme eine Sequenzdivergenz von nur 0,07% aufwiesen. Weil der Typstamm der Spezies, Mtb. mesophilicum DSM 1708T, relativ einfach gestaltete Kolonien hervorbringt,

163 Diskussion konnten so zwei Stämme vergleichend untersucht werden, die mutmaßlich einer Spezies angehören. Allerdings wurde nach dem Beginn der Studien – mit Mtb. brachiatum – von Kato et al. (2008) eine neue Spezies beschrieben, die mit 0,21% Divergenz (oder 3 Substitutionen) zur Sequenz von Mtb. mesophilicum nur ebenfalls geringe Unterschiede in der 16S rDNA‐Sequenz aufweist. Außer einer etwas dunkleren Pigmentierung unterscheiden sich die beiden Spezies phänotypisch aber nicht und können nur über einen Vergleich der Gesamt‐DNA unterschieden werden. In der Arbeit von Kato und Kollegen (2008) wurden drei Mtb. brachiatum Stämme charakterisiert, von denen zwei Isolate auf GP‐Agar strukturierte Kolonien hervorbrachten. Gleichwohl wurde als Typstamm ein Isolat gewählt, dass auf GP‐ Agar eine glatte Morphologie ausbildet (Kato et al. 2008). Da diese Merkmale (strukturierte Kolonien auf GP, etwas dunklere Pigmentierung als Mtb. mesophilicum) auch auf das Isolat 5a.1.13 zutreffen, und die genetische und physiologische Divergenz zwischen diesen drei Stämmen nur sehr gering ist, kann der taxonomische Status des Isolats 5a.1.13 nur durch aufwändige DNA‐DNA‐ Hybridisierungs‐Experimente bestimmt werden. Weil die genetische Ähnlichkeit zu Mtb. mesophilicum jedoch etwas höher ausfällt, wird das Isolat mutmaßlich der Spezies Mtb. mesophilicum zugeordnet. Dagegen spricht jedoch das unter‐ schiedliche Wachstumsverhalten des Stamms 5a.1.13, der keine Stimulation durch Pantothenat erfährt und auf GP‐Agar problemlos wächst. Bei Mtb. brachiatum ist nicht bekannt, ob Pantothenat eine Stimulation des Wachstums bewirkt. Auch wurde von Kato et al. (2008) nicht geprüft, ob das Wachstum auf GP‐Medium zur Differenzierung der Stämme verwendet werden kann. Da die Spezies‐ beschreibung erst 2008 erfolgte, wurde der Stamm nicht in die Analysen mit einbezogen. Diese Experimente sollten aber noch erfolgen. Zusätzlich wurden drei weitere putative Mtb. mesophilicum Isolate analysiert um die Variationsbreite der Biofilmbildung innerhalb einer Spezies zu untersuchen. Die Isolate JT2 (isoliert vom Thallus eines Lebermooses Marchantia polymorpha, Thomas 2003) und Fu5 (isoliert vom Phylloid des Laubmooses Funaria hygrometrica, (Hornschuh 2001) wurden im Rahmen einer assoziierten Diplom‐ arbeit charakterisiert (Kikutt 2006). Auch diese Mtb.‐Isolate 1c.5, Fu5 und JT2 besaßen nur eine geringe / keine 16S rDNA‐Sequenzdivergenz zum Typstamm (siehe Tabelle 5.3). Dabei bildete der Stamm Mtb. sp. Fu5 überwiegend eine dem Typstamm Mtb. mesophilicum DSM 1708T ähnliche Morphologie, während JT2 ähnliche Koloniemorphologien wie 5a.1.13 hervorbrachte. Teilweise wurden jedoch auch beim Stamm Fu5 Kolonien gefunden, die eine strukturierte Kolonieoberfläche bildeten. Das Isolat 1c.5 (isoliert von der Zungenblüte einer Sonnenblumenpflanze) brachte bei den Untersuchungen zur Biofilmbildung auf Festmedium immer Kolonien hervor, die dem Typstamm glichen und wurde daher nicht weiter untersucht. Die Stämme Mtb. mesophilicum DSM 1708T, 1c.5 und Fu5 zeigten eine deutliche Stimulation des Wachstums in Minimalmedium‐Flüssigkulturen durch die Zugabe von Pantothenat. Pantothensäure (Vitamin B5) wird für den Aufbau von

164 Diskussion

Coenzym A benötigt, dass eine wichtige Rolle in verschiedenen Stoffwechsel‐ vorgängen spielt. Unter anderem ist Coenzym A am Auf‐ und Abbau von Kohlenhydraten, Fetten und Aminosäuren beteiligt. Neben der Stimulation des Wachstums bildeten beide Stämme deutlich mehr Aggregate, wenn Pantothenat im Medium vorlag. Allerdings kann auch ohne Zusatz ein verzögertes Wachstum und verklumpen der Kulturen beobachtet werden. Es scheint so, als ob die betreffenden Stämme eine deutlich verminderte Menge an Pantothensäure (oder einem für die Pantothensäuresynthese benötigten Intermediat) produzieren, was sich limitierend auf das Wachstum und die Produktion extrazellulärer Substanzen bemerkbar macht. Dieser Effekt konnte bei den Isolaten 5a.1.13 und JT2 nicht festgestellt werden, wodurch davon ausgegangen werden kann, dass diese Stämme eine ausreichende Menge endogener Pantothensäure bilden Die deutlichen Unterschiede in der Morphologie der Kolonien konnten auf die Produktion extrazellulärer Substanzen zurückgeführt werden, die die Struktur und Konsistenz der Kolonien bestimmen. Die Stämme 5a.1.13 und JT2 produzieren unter bestimmten Umweltbedingungen (v. a. bei limitiertem Stick‐ stoff) sehr viel EPS, durch welche die Zellen untereinander vernetzt werden und sich an Oberflächen anheften können. Die extrazellulären Substanzen können dabei als Filamente mit einem Durchmesser von etwa 30‐60 nm oder als schleimartiger Film, der die ganze Kolonie bedeckt, auftreten. Evtl. setzen sich die EPS, die auf unterschiedlichen Nährmedien und/oder unterschiedlichen Umwelt‐ bedingungen gebildet werden, aus anderen Grundbausteinen zusammen und unterscheiden sich dadurch in ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften. Nach den Ergebnissen dieser Untersuchungen stellen die Stämme Mtb. sp. 5a.1.13 und JT2 Vertreter eines bakteriellen Ökotypen dar, der durch die Produktion von EPS eine deutlich strukturierte Koloniemorphologie auf bestimmten Nährmedien ausbildet. Die Stämme reagieren nicht auf die Zugabe von Pantothenat. Im Gegensatz dazu bilden Mtb. mesophilicum DSM 1708T, 1c.5 und Fu5 wenig EPS und werden durch die Zugabe von Pantothenat stimuliert. Daher können diese Stämme auch einem Ökotypen zugeordnet werden. Die Synthese der EPS wird hauptsächlich durch die Verfügbarkeit von Stickstoff bestimmt. Jedoch scheint auch die Verfügbarkeit von Phosphat im umgebenden Medium, bzw. das Verhältnis der beiden Stoffe zueinander einen Einfluss auf die Menge und Eigenschaften der EPS darzustellen. Die Versorgung mit Kohlenstoff schien nur eine untergeordnete Rolle zu spielen, allerdings wurden hierzu nur begrenzt Experimente durchgeführt. So stand den Bakterien bei allen Versuchen ein deutlicher Überschuss an Kohlenstoff bereit. Daher sollte bei einer Reproduktion der Versuche, ein Ansatz mit einem ausgeglichenen C:N:P‐ Verhältnis eingeschlossen werden. Statt Methanol als Kohlenstoffquelle anzubieten, könnten die Versuche auch mit anderen Substraten durchgeführt werden.

165 Diskussion

4.3.4 Zusammenfassung Als Matrixkomponenten der Biofilme bilden die Bakterien Exopolysaccharide bzw. Exopolysaccharid‐haltige Substanzen, die meist als verzweigte Fibrillen mit einem Durchmesser von etwa bis 20‐40 nm und einer Länge von teilweise mehreren μm auftreten und die Zellen untereinander vernetzen. Diese Fäden setzen sich aus wesentlich dünneren Einzelfibrillen zusammen, die von spezialisierten Strukturen an der äußeren Bakterienmembran gebildet werden und sich dort vereinigen. Bei einigen Isolaten findet die Synthese der EPS vor allem an den Zellpolen statt, wodurch sternförmige Aggregate entstehen können. Die Stabilität der Biofilme wird vor allem durch die Menge an EPS bestimmt. Die Isolate der genomisch kohärenten Gruppe um Mtb. sp. JT1 besitzen auf ihrer Zelloberfläche zusätzlich kurze, fragile Fimbrien, die einen Durchmesser von 25‐40 nm sowie eine Länge von bis zu 300 nm aufweisen und der Adhäsion an andere Zellen und Oberflächen dienen. Zwischen der Biofilmproduktion und der phylogenetischen Stellung innerhalb der Gattung konnte kein Zusammenhang gefunden werden. Verschiedene Isolate einer Spezies können sich deutlich in ihrer EPS‐Produktion und Biofilmbildung unterscheiden; teilweise ändern sogar Klone eines Isolats ihre EPS‐Synthese, woraus unterschiedliche Koloniemorphologien resultieren. Diese Änderungen sind wahrscheinlich bis zu einem gewissen Grad nur transient. Die Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen scheint daher ein allgemeines Merkmal der Gattung Methylobacterium zu sein. Jedoch bilden viele Vertreter nur sehr wenig Exopolysaccharide. Dies könnte eventuell darauf zurückgeführt werden, dass die Bakterien im Labor immer unter optimalen Bedingungen wachsen. Durch den fehlenden Selektionsdruck könnte die Bildung des extrazellulären Materials verloren gehen, wenn die Gesamtpopulation dadurch keinen Vorteil erfährt. Die Biofilmbildung könnte im Laboralltag der Bakterien sogar eher nachteilig sein, da sie dadurch keine Möglichkeit haben, auf einer Agarplatte neue Nahrungsquellen zu „erschließen“. Unter natürlichen Bedingungen (z. B. Blattoberfläche oder aquatische Umgebung) werden die Bakterien jedoch regelmäßig mit frischer Nahrung „beliefert“ wenn ein geeignetes Habitat gefunden wurde und eine sessile Lebensweise würde eher einen Selektionsvorteil darstellen. Auch die Über‐ impfung und Kultivierung stark biofilmbildender Klone ist mit Problemen verbunden, wodurch evtl. auch ein systematischer Fehler bei der Isolation und Kultivierung der Bakterien vorliegen könnte. So wurden von Kato und Kollegen (2008) drei Stämme isoliert, die der Spezies Mtb. brachiatum zugeordnet wurden. Zwei dieser Stämme zeigten auf GP‐Agar einen runzeligen Koloniehabitus; jedoch wurde als Typstamm ein Isolat definiert, das auf GP‐Medium glatte Kolonien hervorbringt (Kato et al. 2008). Daher sollte bei der Isolation und Kultivierung der Bakterien immer auf Veränderungen der Koloniemorphologie geachtet werden, die einen Hinweis auf die Menge der produzierten EPS geben kann. Dabei gilt für die Vertreter der Gattung Methylobacterium: je strukturierter die Kolonieoberfläche

166 Diskussion und je besser die Haftung der Kolonie am Untergrund, desto mehr EPS werden gebildet. Glatte, leicht suspendierbare Kolonien bilden dagegen nur wenig EPS. Abschließend muss jedoch noch angemerkt werden, dass in dieser Arbeit immer mit Reinkulturen (d. h. mit Klonen einer einzigen Vorläuferzelle) gearbeitet wurde, in der Natur jedoch meist sehr heterogene Biofilme aus Bakterien mehrerer Gattungen, Pilzen, Protozoen und Algen gefunden werden, wodurch die Komplexität und Dynamik innerhalb der Mikroorganismen‐Gemeinschaft deutlich zunimmt. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit kann jedoch abgeleitet werden, dass die Vertreter der Gattung Mtb. spp. am Aufbau einer Biofilm‐Matrix aktiv beteiligt sind. Sie schützen sich damit wahrscheinlich vor Austrocknung und können an sich an Orten festsetzen, an denen ausreichend Nährstoffe zur Verfügung stehen. Auch können die von den Bakterien sezernierten Stoffe (z. B. Auxin, Cytokinine usw.) erst durch das kooperative Zusammenspiel der Mikroben im Biofilm „konzentriert“ wirken.

4.4 Charakterisierung des Marchantia-Isolats Mtb. sp. JT1 Um die taxonomische Stellung des Isolats JT1 zu untersuchen, wurde der Stamm und einige nahe verwandte Isolate und Typstämme weitestgehend nach den von Imhoff und Caumette (2004) vorgeschlagenen Standards zur Beschreibung neuer anoxygener phototropher Spezies charakterisiert, da für die Gattung Methylobacterium selbst keine offiziellen Standards definiert wurden. Neben der in Kapitel 4.2.1 bereits diskutierten phylogenetischen Analyse der 16S rDNA‐ Sequenz sollen möglichst viele morphologische, physiologische, ökologische und chemische Merkmale bestimmt werden, um neue Spezies von bereits bestehenden abgrenzen zu können (Imhoff und Caumette 2004). Die heute gültige Einteilung der Spezies beruht hauptsächlich auf der Analyse der Nucleinsäuren (G+C‐Gehalt, 16S rDNA‐Sequenzen, gegebenenfalls DNA‐DNA‐ Hybridisierungen) sowie auf phänotypischen Eigenschaften wie Physiologie, Wachstumscharakteristika, Morphologie und Pigmentzusammensetzung (Wayne et al. 1987, Rosselló‐Mora und Amann 2001, Stackebrandt et al. 2002, Imhoff und Caumette 2004).

4.4.1 Phänotypische Charakterisierung Die Vertreter der Gattung Methylobacterium zeigen nur eine geringe phänotypische Variabilität und können nach einer großen Zahl an Speziesneubeschreibungen daher meist nur aufgrund von DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien unterschieden werden (Green und Bousfield 1983, Madhaiyan et al. 2007a, Kato et al. 2008). Zudem können physiologische Merkmale innerhalb einer Speziesgruppe variieren (Green 2006, Madhaiyan et al. 2007a, Kato et al. 2008). Das langsame Wachstum und die damit verbundene schlechte Reproduzierbarkeit physiologischer und biochemischer Tests erschweren zusätzlich die eindeutige Identifizierung. Dies bestätigte sich auch bei der Charakterisierung des Isolats JT1. Jedoch konnten einige charakteristische morphologische und physiologische Merkmale ermittelt

167 Diskussion

werden, die den Stamm eindeutig von allen bisher beschriebenen Taxa abgrenzen. Diese Merkmale sowie die Daten der nächstverwandten Isolate und Typstämme wurden in Tabelle 4.3 zusammengefasst.

Tabelle 4.3: Differentielle Charakteristika der in dieser Arbeit charakterisierten Stämme und ihrer nächstverwandten Typstämme (nach Analyse der 16S rRNA‐Sequenzen). Stämme: 1, Mtb. sp. JT1; 2, Mtb. sp. F3.2; 3, Mtb. adhaesivum AR27T (Daten aus Gallego et al. 2006); 4, Mtb. goesingense iEII3 (Daten aus Idris et al. 2006); 5, Mtb. oryzae CBMB20T (Daten aus Madhaiyan et al. 2007a); 6, Mtb. fujisawaense 0‐31T (Daten aus Green et al. 1988, Urakami et al. 1993 und Doronina et al. 2002); 7, Mtb. jeotgali S2R03‐9T (Daten aus Aslam et al. 2007); 8, Mtb. radiotolerans 0‐1T (Daten aus Green et al. 1988, Urakami et al. 1993, Doronina et al. 2002 und Ito und Iizuka 1971); 9, Mtb. tardum RB667T (Daten aus Kato et al. 2008); 10, Mtb. organophilum XXT (Daten aus Patt et al. 1974, Patt et al. 1976, Green et al. 1988, Urakami et al. 1993 und Doronina et al. 2002). Fett gedruckte Ergebnisse wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelt. Abkürzungen: +, positiv; ‐, negativ; w, schwach (weak); nd, keine Angabe/nicht durchgeführt.

Charakteristikum 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Koloniedurchmesser 2,0 2,0 1,0‐1,2 1,0‐1,5 0,2‐1,2# 2,0 1,0‐2,0 2,0 0,7‐0,8§ nd (mm)* Koloniepigmentierung* pink pinka pink pinkc/ pink bis rot rot keine pink§ pinkh bis rot bis rot bis rot# rot rotf Motilität+ ‐ + + + nd + ‐ + nd nd Zellbreite (μm) 1,0‐1,3 1,0‐1,4 1,0‐1,4 1,1‐1,5 0,6‐0,8 1,0‐1,6 0,8‐1,2 1,0‐1,4 1,3‐2,1 0,8‐1,0h Zelllänge (μm) 1,9‐3,9 1,7‐3,4 1,3‐3,2 1,6‐4,0 2,1‐2,8 1,8‐3,8 1,8‐3,5 1,9‐3,4 2,0‐5,1 1,5‐2,0h NaCl‐Bereich (%) 0‐1 0‐2 <1 0‐1 0 (<2) 0‐1 0‐1 0‐1 nd nd Temperaturbereich (°C) 4‐32 nd 15‐35 4‐30 20‐30 10‐37 25‐30 20‐32f 15‐35 25‐31h Optimum 25‐30 nd 28 25 28 nd 30 nd 30 nd pH‐Bereich 6,0‐9,0 6,0‐10 5,0‐9,0 nd 5,0‐10 nd 6,0‐10 nd nd nd Optimum 7,0 nd 6,5 6,5‐7,9 6,8 nd 7,0‐8,0 nd nd 6,6‐7,0h Oxidase w w +/wa + + + + + + +h Urease + + + + ‐ + + + nd nd Kohlenstoffverwertung D‐Glukose ‐ nd ‐ ‐ ‐ +c,d,e/‐a,b ‐ +a,b,c,d,e,f ‐ +c,h/‐d,e D‐Xylose ‐ ‐ ‐ a ‐ ‐ +c,d,e/wa + +a,c,d,e ‐ ‐c,d,e L‐Arabinose ‐ nd ‐ ‐/+b + +a,b,c,d ‐ +a,b,c,d w ‐c,d D‐Fructose + nd + + ‐ ‐a,b,d,e ‐ ‐a,b,c,d,e ‐ +c,d,e L‐Glutamat + + + a +/‐b + +c,d,e/‐b nd +b,c,d,e + +e/wd Citrat w w + a +/‐b ‐ +c,d,e/‐b ‐ +c,d,e,f/‐b + ‐c,d,e/+h Acetat + nd + ‐ ‐ +a,c,e/‐b + +a,c,e/‐b ‐ +c,e,g Betain ‐ nd nd ‐ ‐ ‐a,b,c,d,e + +a,b,c,d,e ‐ ‐c,e Tartrat + ‐ ‐ ‐ ‐ ‐d nd ‐c/wd nd ‐c,d * nach einer Woche Inkubation auf R2A‐Agar (außer anders angegeben). # nach 96 h Wachstum auf AMS bei 28 °C (Madhaiyan et al. 2007a). § nach 9 d Wachstum auf GP‐Agar (Kato et al. 2008). + getestet auf R2A‐Medium (0,1x konzentriert) mit 0,2 % (w/v) Agar (nach Weon et al. 2007). a Daten aus Kato et al. (2008). b Daten aus Idris et al. (2006). c nach Green et al. (1988). In der Arbeit wurden mehrere Stämme der jeweiligen Spezies untersucht. Zeigten sich dabei variable Resultate innerhalb der Spezies, wurde dies in der Tabelle nicht aufgeführt, da hier nur die Charakteristika der Typstämme wiedergegeben werden sollen. d nach Urakami et al. (1993). e nach Doronina et al. (2002). f nach Ito und Iizuka (1971). g nach Patt et al. (1974). h nach Patt et al. (1976).

168 Diskussion

Die Ergebnisse der Teststreifen‐Analysen wurden dabei nicht berücksichtigt, da sich die Durchführung der Tests nach Herstellerangaben als nicht geeignet herausgestellt hatte. Auch durch eine Steigerung der Inokulationsmenge und Verlängerung der Inkubationsdauer wurden keine verlässlichen Resultate für die Kohlenstoffassimilationstests erzielt. Dies ist hauptsächlich auf das langsame Wachstum von Mtb. spp. zurückzuführen, da die Tests hauptsächlich für klinisch relevante Mikroorganismen entwickelt wurde, die meist ein schnelles Wachstum und eine hohe Stoffwechselaktivität aufweisen. Daher wurden in Tabelle 4.3 nur die Assimilationstests angeführt, die in Flüssig‐Schüttelkulturen durchgeführt wurden.

4.4.2 Analyse der Nucleinsäuren Stackebrandt und Ebers (2006) konnten zeigen, dass bei einer 16S rDNA‐ Ähnlichkeit von weniger als 98,7‐99,0 % keine DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Werte von über 70 % zu erwarten sind und – bei Vorliegen weiterer phänotypischer Unterschiede zu bereits benannten Spezies – die Eröffnung einer neuen Spezies gerechtfertigt werden kann (Wayne et al. 1987, Stackebrandt und Goebel 1994, Rosselló‐Mora und Amann 2001, Stackebrandt et al. 2002). Daher schlagen die Autoren vor, den kritischen Wert der 16S rDNA‐Sequenzähnlichkeit, ab dem DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien zwingend erforderlich werden, von 97 % auf 98,7‐99,0 % anzuheben (Stackebrandt und Ebers 2006). Voraussetzung hierfür ist eine gute Qualität der ermittelten 16S r DNA‐Sequenzen. Der Vorschlag wurde jedoch noch nicht fest im ‚Bacteriological Code’ verankert. In Tabelle 4.4 wurden daher die Sequenzdivergenzen der Stämme aufgeführt, die 16S rDNA‐Sequenzähnlichkeiten von ≥ 97 % zu JT1 aufweisen (Stackebrandt und Goebel 1994) und somit nach der heute gültigen Definition in DNA‐DNA‐ Vergleichsstudien einbezogen werden sollten. Die Divergenzen wurden durch paarweisen Vergleich der Sequenzen erstellt (Option: Pairwise deletion). Die Isolate JT1 und 5b.2.20 besitzen identische Sequenzen und weisen zu den nächsten benannten Spezies der Gattung Divergenzen von 2,04 % (zu Mtb. goesingense iEII3) und 2,10% (zu Mtb. adhaesivum DSM 17169T) auf. Dies liegt deutlich über dem von Stackebrandt und Ebers (2006) vorgeschlagenen Grenzwert von 1,0‐1,3 %. Daher sollten die Stämme nicht mehr als 70 % Gesamtgenom‐ Ähnlichkeit mit bereits beschriebenen Arten der Gattung besitzen. Jedoch wurden bei den in Gießen durchgeführten Hybridisierungs‐Experimenten mit JT1 und dem Stamm Mtb. goesingense iEII3 teilweise Werte von mehr als 70 % Ähnlichkeit ermittelt. Zu Mtb. adhaesivum DSM 17169T hatte das Isolat JT1 nur einen Wert von etwa 50 % Ähnlichkeit. Trotz der uneindeutigen Ergebnisse der Hybridisierungs‐ Experimente wird davon ausgegangen, dass JT1 und 5b.2.20 Vertreter einer neuen Spezies darstellen, da sich die Isolate phänotypisch deutlich von anderen Spezies abgrenzen ließen. Hybridisierungen des Stamms JT1 gegen Mtb. fujisawaense DSM 5686T, Mtb. radiotolerans DSM 1819T, Mtb. jeotgali S2R03‐9T und Mtb. mesophilicum DSM 1708T zeigten Werte von < 50 % (siehe Kapitel 3.9).

169 Diskussion

Die Isolate um F3.2 besitzen leicht unterschiedliche 16S rDNA‐Sequenzen, wobei die beobachteten Unterschiede eventuell durch multiple rRNA‐Operons in einem Stamm bedingt sein könnten, die eine leicht unterschiedliche Sequenz aufwiesen. Multiple Operons können mit der in dieser Arbeit verwendeten Sequenzier‐ methode nicht voneinander differenziert werden und führen zu uneindeutigen Signalen bei der Detektion der Amplifikations‐Produkte. Die Isolate weisen eine geringe Divergenz von etwa 0,8 % zu JT1 und 5b.2.20 auf. Dennoch konnten beide Gruppen bei der phylogenetischen Analyse eindeutig voneinander abgegrenzt werden. Auch der in dieser Arbeit sequenzierte partielle Abschnitt des mxaF‐Gens zeigt deutliche Unterschiede. Wird dagegen die translatierte AS‐Sequenz von JT1 und F3.2 verglichen, können keine Unterschiede beobachtet werden. Auch Mtb. goesingense iEII3 besitzt eine identische AS‐ Teilsequenz (siehe Tabelle 5.4). Wegen der hohen Sequenzähnlichkeiten wurden von unseren Kooperations‐ partnern in Giessen DNA‐DNA‐Hybridisierungen mit JT1 und F3.2 durchgeführt, die jedoch kein eindeutiges Ergebnis brachten. So wurde bei den letzen Experimenten – mit CTAB‐gereinigter DNA (siehe Kapitel 3.8) – ein Wert von 85,5 % Ähnlichkeit ermittelt. Bei den vorausgehenden Experimenten wurden allerdings nur Ähnlichkeiten von < 56 % bestimmt. Aufgrund der in dieser Arbeit dargestellten Unterschiede von F3.2 und JT1 kann aber davon ausgegangen werden, dass es sich um zwei getrennte Spezies oder Ökotypen (Cohan und Perry 2007) handelt, die auf einen gemeinsamen Ursprung zurückgeführt werden können. Auch das Isolat 1b.3 weist eine hohe 16S rDNA‐Sequenzähnlichkeit von 99,79 % zu JT1 bzw. 99,22 % zu F3.2 auf. Jedoch liegen für dieses Isolat keine weiteren molekularen und nur eine begrenzte Zahl physiologischer Daten vor. Zwischen den Stämmen Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. goesingense iEII3 kann eine Divergenz der 16S rDNA‐Sequenzen von 1,01 % beobachtet werden. Daher können diese Stämme nur durch die Bestimmung der Gesamtgenom‐ Ähnlichkeit zuverlässig unterschieden werden. Doch lieferten zwei Hybridisierungs‐Experimente keine eindeutigen Ergebnisse. So wurde einmal ein Wert von 28 % ermittelt, während bei der Reproduktion 72,7 % Ähnlichkeit ermittelt wurden. Aufgrund der geringen 16S rDNA‐Sequenzdivergenz und den uneindeutigen Ergebnissen der DNA‐DNA‐Reassoziations‐Studien kann daher die Berechtigung der Art Mtb. goesingense nicht bestätigt werden. Allerdings zeigen die partiellen mxaF‐Sequenzen der beiden Stämme deutliche Unterschiede in der Basenabfolge. Auch die Habitate der beiden Stämme und die Biofilmbildung auf unterschiedlichen Nährmedien sprechen dafür, dass es sich um zwei getrennte Spezies oder Ökotypen handelt. Bei der Durchführung der DNA‐DNA‐Hybridisierungen traten unerwartet große Schwankungen und Probleme auf. So wurden oft Gesamtgenom‐Ähnlichkeiten von über 100 % ermittelt, was auf eine Kontamination der verwendeten DNA mit Begleitstoffen zurückzuführen ist (pers. Mitteilung Prof. P. Kämpfer). Dabei handelt es sich wahrscheinlich um von den Bakterien gebildeten exopolymere Substanzen, die eine enge Assoziation mit der DNA eingehen und durch konventionelle DNA‐

170 Diskussion

Extraktionsmethoden nicht abgetrennt werden konnten. Für weitere Hybridisierungs‐Experimente sollte daher die Qualität der DNA durch die Aufnahme eines UV‐Absorptions‐Spektrums (200‐340 nm) überprüft werden. Das Verhältnis A230:A260:A280 sollte bei mindestens 1:2:1 liegen (Rapley und Heptinstall 1998). Ob die beobachtete Verschiebung des Absorptionsmaximums der Nuclein‐ säuren von 260 nm auf 256 nm im Zusammenhang mit der Qualität der DNA steht, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden. Sollte ein Zusammenhang bestehen, könnte auch über diesen Parameter eine grobe Abschätzung der DNA‐Reinheit erfolgen. Um zuverlässige Daten aus weiteren DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Experimenten zu erhalten, muss erst noch eine Methode entwickelt werden bei der möglichst wenige Begleitstoffe mitpräpariert werden. Dabei könnte versucht werden, die EPS vor der Zell‐Lyse zu entfernen (z. B. wiederholtes waschen der Zellen mit Pufferlösungen definierter Salzkonzentrationen). Ein weiterer Ansatzpunkt würde die Verwendung hydrolytischer Enzyme (Cellulasen, Pektinasen, Chitinasen etc.) darstellen, welche die fraglichen EPS eventuell gezielt abbauen können.

171 Diskussion

die der von

nach

von Analyse

wurde 20 0,00

Die

können

Sequenzen,

Wert 19 3,93 3,96

und

alle Sequenzen

Prozent.

18 0,00 0,00 3,91 in der Dieser

gedruckt wurden 17

0,77 0,70 0,78 3,58

fett

Distanz)

‐ 16 1,69 4,47 2,34 1,69 1,69 hinterlegt. (p

Vergleichen

15 Aufgeführt 3,68 3,71 3,35 3,64 3,73 3,71 wurden

%

Merkmal 14

1,17 2,03 3,84 1,54 3,27 2,05 2,03 3,0 dunkelgrau

paarweisen

pro > Stämme.

werden

13 0,35 1,25 1,96 3,63 1,62 3,35 1,98 1,97 den

12 wurden 0,63 0,56 0,88 2,03 3,84 1,40 3,49 2,05 2,03 bei

%

betrachtet

verwandter nur 11

0,07 0,57 0,50 0,81 1,99 3,83 1,49 3,41 2,00 1,99 Divergenzen 1,3

<

nahe 10

Spezies 3,76 3,62 3,91 4,41 4,70 4,27 4,06 4,10 4,44 3,82 4,41

Basenunterschieden von

wurden

und an 9

1,02 3,67 3,32 3,52 3,74 4,16 3,67 3,58 4,10 3,75 3,78 3,74 JT1

Daten

getrennte

8 vorgeschlagen.

0,28 1,01 3,63 3,28 3,49 3,70 4,26 3,65 3,63 4,10 3,75 3,75 3,72 Anzahl von Divergenz

als

7 die

2,42 2,42 2,79 2,94 3,08 3,30 3,52 3,30 2,43 3,11 3,10 3,30 2,71 3,30 einer fehlende

Studien 6 ‐ 0,22 2,39 2,40 2,74 2,88 3,02 3,09 3,44 2,95 2,24 2,98 3,15 3,11 2,70 3,02 mit wurde und

Sequenzen

‐

5 2,46 2,46 0,07 0,29 2,82 2,97 3,11 3,18 3,55 3,04 2,36 3,11 3,18 3,18 2,75 3,11 Speziesabgrenzung

rDNA

Lücken

4 2,40 2,41 0,00 0,07 0,29 2,75 2,89 3,03 3,10 3,45 2,96 2,32 3,06 3,15 3,11 2,70 3,03 Dargestellt 16S

eine

Reassoziations ‐

Sequenzpaare 3

der für 2,03 2,04 0,77 0,80 0,70 0,81 2,31 2,52 2,45 2,87 3,08 2,74 2,24 2,40 2,86 2,90 2,27 2,87 ).

zeigen.

DNA

‐ 2 Wert 2,07 2,07 0,21 0,79 0,80 0,79 0,88 2,36 2,43 2,65 3,00 3,00 2,93 2,13 2,66 2,87 3,00 2,31 3,00

JT1 durchgeführt.

deletion’

DNA

1 von 2,04 2,05 0,00 0,21 0,78 0,80 0,77 0,88 2,32 2,39 2,60 2,95 2,95 2,88 2,10 2,62 2,86 2,97 2,28 2,95

2007) Divergenzen

‐

ohne 6 2 3 4 1 8 9 7 5

12 13 14 18 19 17 10 15 16 21 11 20 kritischer al.

‚Pairwise

et als

Sequenz auch

Isolat Sequenz

/

zur

(FJ157965) (FJ157960) (FJ157972) (FJ157961) (FJ157975) (FJ157968) (FJ157976) (FJ157964) (FJ157974) (FJ157973) (FJ157963) 1994)

(EF126746) (2006) % (AY683045) (AY364020) (Option:

(AB175634) (AB175640) (AB252208) (AB175636) (AB175639)

(DQ471331)

(AM040156)

T

T

T T T T T T (Tamura T JT1 9

1c.5 Stamm 1b.3 F3.2 F3.1 F2.1 ‐

3,0

1c.14 1a.16

5a.1.5

iEII3 5b.1.1

2833 1819 5686 1708 sp. < 5b.2.20

sp.

sp. sp. sp. sp.

RB677 AR27 Ebers sp. sp.

sp.

sp. Goebel 4.0.1

CBMB27 sp. S2R03

CBMB20

JCM Mtb.

DSM DSM DSM Mtb. von Mtb. Mtb. Mtb. Mtb.

Beobachtbare

Mtb. Mtb.

Mtb. Mtb. und und Mtb. tardum

oryzae goesingense jeotgali

4.4: MEGA

adhaesivum

Mtb. ausgeschlossen

Mtb. Mtb. Mtb. in

fujisawaense phyllosphaerae Mtb. radiotolerans

organophilum

mesophilicum

Divergenz

Tabelle Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Mtb. Stackebrandt Analyse eine Stackebrandt

wurde

172 Diskussion

4.4.3 Carotinoide Die pigmentierten Spezies der Gattung Methylobacterium bilden Carotinoide (Urakami et al. 1993, Konovalova et al. 2007) sowie Bacteriochlorophyll (Bchl) a (Sato 1978, Nishimura et al. 1981, 1989, Urakami et al. 1993, Urakami und Komagata 1984) und werden zur Gruppe der aeroben anoxygenen phototrophen Bakterien gezählt (Yurkov und Beatty 1998, Hiraishi und Shimada 2001). Viele Vertreter dieser Gruppe bilden zwar Bchl und Carotinoide, betreiben aber wahrscheinlich keine anoxygene Photosynthese (Yurkov und Beatty 1998, Hiraishi und Shimada 2001). Diese Bakterien werden daher einfach als ‚aerobic Bchl‐ containing (ABC) bacteria’ bezeichnet (Shiba et al. 1979, Imhoff und Hiraishi 2005), zu denen auch die Gattung Methylobacterium gezählt werden kann (Hiraishi und Shimada 2001). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Pigmente von Mtb. sp. JT1 sowie sieben weiteren Eigenisolaten und vier Typstämmen mit Methanol extrahiert und spektrometrisch vermessen (300‐900 nm). Bis auf die unpigmentierte Spezies Mtb. jeotgali S2R03‐9T wurde bei allen untersuchten Stämmen ein ähnliches UV/Vis‐ Absorptions‐Spektrum erhalten, das einen für Carotinoide charakteristischen, dreigipfeligen Peak zwischen 400 und 600 nm zeigt (Strain et al. 1971). Die Maxima der methanolischen Extrakte dieses Peaks liegen bei etwa 465, 490 und 520 nm (siehe Kapitel 3.7.4). Eine Unterscheidung der Stämme anhand der Spektren war nicht möglich. Auch Urakami und Komagata (1984) sowie Doronina et al. (2002) und Madhaiyan et al. (2007a) publizierten ähnliche Absorptionsmaxima für Vertreter der Gattung. Konovalova et al. (2007) konnten zeigen, dass 3,4‐ Didehydrolycopin („Oscilloxanthin“) etwa 80 % der Gesamt‐Carotinoidfraktion ausmacht. Die Menge der synthetisierten Carotinoide lag zwischen 0,23‐0,45 mg pro Gramm Bakterien‐Trockenmasse (Konovalova et al. 2007). Urakami und Komagata (1986) konnten aus verschiedenen Mtb. extorquens Stämmen 0,06‐0,41 mg Carotinoide pro Gramm Bakterien isolieren. Die Menge der produzierten Carotinoide scheint daher ein Stamm‐spezifisches Merkmal zu sein und eignet sich nicht um verschiedene Spezies voneinander zu differenzieren. In einigen wenigen Pigmentextrakten konnte ein Peak bei 770 nm nachgewiesen werden, der auf das Vorhandensein von Bchl a schließen lässt (Yurkov und Beatty 1998). Die Bchl‐Synthese ist nach Sato (1978) vor allem von der angebotenen Kohlenstoffquelle sowie einem Licht/Dunkel‐Rhythmus abhängig. Im Gegensatz zu den von Sato (1978) publizierten Ergebnissen, konnte jedoch auch aus Zellen Bchl extrahiert werden, die mit Methanol als alleiniger Kohlenstoff‐ und Energiequelle gewachsen waren. Auch Okubo et al. (2007) konnten bei Microarray‐ Analysen zur Genexpression von Mtb. extorquens AM1 zeigen, dass unter methylotrophen Wachstumsbedingungen u. a. die Expression der Gene gesteigert wird, die an Photosynthese‐Prozessen beteiligt sind. Da jedoch nur sehr selten Bchl nachgewiesen werden konnte, wurden diese Versuche nicht weiter vertieft. Zusätzlich zeigten die methanolischen Pigmentextrakte einen Peak bei etwa 360 nm, dessen relative Höhe zum Carotinoidpeak mit fortschreitender Kultur‐

173 Diskussion dauer zunahm (Daten nicht gezeigt). Wurden die Pigmente mit Ethanol extrahiert, konnte dieser Peak nicht beobachtet werden. Der Peak könnte evtl. durch das Coenzym PQQ verursacht werden, dass in seiner reduzierten Form PQQH2 (in Pufferlösung) ein Absorptionsmaximum von 320 nm (Itoh et al. 1986) aufweist. PQQ ist in Methanol nur schlecht löslich, jedoch zeigen methanolische Lösungen ein Absorptionsmaximum bei etwa 360 nm (Dekker et al. 1982). Als Feststoff weist PQQ eine dunkelrote Farbe auf, die zur Färbung der Bakterien beitragen könnte. Allerdings sind auch die unpigmentierten Spezies der Gattung Methylobacterium in der Lage Methanol zu oxidieren und müssen deshalb auch vergleichbare Mengen PQQ in ihren Zellen enthalten. Die Kolonien von Mtb. jeotgali S2R03‐9T und Mtb. nodulans ORS2060T sind aber weiß bis beige, weshalb ein nennenswerter Beitrag von PQQ zur Färbung der Kolonien ausgeschlossen werden kann.

4.4.4 Zusammenfassung Die Isolate Mtb. sp. JT1 und 5b.2.20 stellen Vertreter einer genetischen und morphologischen Einheit (Ökotyp) dar. Die sequenzierten Bereiche (nahezu vollständige 16S rDNA und partielle mxaF‐Gensequenz) der Isolate zeigen keine Unterschiede. Auch bei der Kultivierung der Isolate auf unterschiedlichen Standardnährböden sowie den Experimenten zur Biofilmbildung konnten keine Unterschiede festgestellt werden. Beide Stämme besitzen auf ihrer Außenmembran zahlreiche Fimbrien über die vor allem der Kontakt zu anderen Zellen hergestellt wird um Biofilme auszubilden. Zusätzlich können die Fimbrien bei der Adhäsion an Oberflächen eine Rolle spielen. Die 16S rDNA‐Sequenz der nächsten benannten Spezies, Mtb. goesingense iEII3, weist eine Ähnlichkeit von 97,96 % auf; der nächste Typstamm Mtb. adhaesivum DSM 17169T hat eine zu 97,90 % ähnliche 16S rDNA‐Sequenz. Nach Stackebrandt und Eberl (2006) kann daher davon ausgegangen werden, dass die beiden Stämme JT1 und 5b.2.20 Mitglieder einer neuen Spezies (Mtb. fimbriae sp. nov.) darstellen (siehe Kapitel 4.4.5), auch wenn die DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien keine eindeutigen Aussagen zuließen. Typstamm der Spezies ist Mtb. fimbriae JT1T. Der Typstamm der Spezies ließ sich durch mehrere Merkmale eindeutig von allen bisher benannten Spezies der Gattung unterscheiden (siehe Kapitel 4.4.1). Die Isolate F3.2, F3.1, F2.1 und 5a.1.5 stellen ebenfalls eine genetische und morphologische Einheit dar. Auf Ebene der 16S rDNA‐Sequenzen unterscheiden sich die Isolate nur minimal (für diese Divergenzen könnten unter Umständen multiple rRNA‐Operons in Frage kommen). Auch bei der Kultivierung der Stämme konnten keine Unterschiede festgestellt werden. F3.2 und F2.1 besitzen darüberhinaus identische mxaF‐Sequenzen. Die Sequenzähnlichkeit der 16S rDNA zur nächsten Typspezies, Mtb. adhaesivum DSM 17169T, beträgt 97,68 % und liegt deutlich unter dem von Stackebrandt und Eberl (2006) vorgeschlagenen Wert von 98,7 %. Jedoch zeigten die Sequenzen von Mtb. fimbriae sp. nov. eine Ähnlichkeit von 99,23 %. Bei drei durchgeführten DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Experimenten wurden meist Gesamtgenom‐Ähnlichkeiten von 30‐50 % ermittelt. Lediglich bei den letzten Hybridisierungen resultierte ein Wert von > 80 % Ähnlichkeit.

174 Diskussion

Aufgrund der beobachteten Unterschiede in Morphologie und Physiologie von Mtb. fimbriae JT1T und der Gruppe um F3.2 kann davon ausgegangen werden, dass auch die Isolate F3.2, F3.1, F2.1, und 5a.1.5 Mitglieder einer neuen Spezies (Ökotyp) sind, die nach dem Wirtsorganismus des Typstamms F3.2 benannt wird (Mtb. funariae sp. nov.). Das Isolat 1b.3 hat eine höhere 16S rDNA‐Sequenzähnlichkeit mit Mtb. fimbriae JT1T (99,79 %) als mit Mtb. funariae F3.2T (99,23 %), was sich auch bei der Rekonstruktion der Verwandtschaftsverhältnisse widerspiegelt, wobei 1b.3 und Mtb. fimbriae wahrscheinlich auf einen gemeinsamen Vorfahren zurückgeführt werden können. Auch die Ausprägung der Fimbrien glich beim Isolat 1b.3 eher der Spezies Mtb. fimbriae; dennoch zeigte das Isolat bei der Kultivierung auf Standardnährböden einen Phänotyp, der Mtb. funariae F3.2T ähnelte. Möglicherweise wird die Koloniemorphologie vor allem durch die Produktion extrazellulärer Fibrillen bestimmt, die häufiger bei 1b.3 und Mtb. funariae anzutreffen waren als bei Mtb. fimbriae. Aufgrund der geringen Sequenzdivergenz zu den benachbarten Spezies Mtb. fimbriae und Mtb. funariae, als auch der fehlenden physiologischen und biochemischen Charakteristika, kann das Isolat keiner der beiden neuen Spezies zugeordnet werden. Die Spezieszugehörigkeit des Isolats könnte nur durch eine umfassende Charakterisierung des Isolats und DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Studien mit den nächstverwandten Typstämmen Mtb. fimbriae JT1T und Mtb. funariae F3.2T geklärt werden (Stackebrandt et al. 2002). Allen Isolaten gemeinsam sind die zahlreichen, charakteristischen Strukturen auf der Zelloberfläche, durch welche die evolutionäre Zusammengehörigkeit der Spezies Mtb. fimbriae und Mtb. funariae verdeutlicht wird. Diese Strukturen konnten bei keinem anderen untersuchten Vertreter der Gattung nachgewiesen werden.

175 Diskussion

4.4.5 Beschreibung von Mtb. fimbriae sp. nov. und Mtb. funariae sp. nov. Methylobacterium fimbriae (abgeleitet von lat. fimbria, Franse; Faser), aufgrund der zahlreichen Fimbrien mit einem Durchmesser von 20‐40 nm und einer Länge von bis zu 300 nm auf der Zelloberfläche. Die Zellen sind Gram‐negativ und rot pigmentiert. Bilden Carotinoide (λmax in 80 % Methanol: 465, 490 und 520 nm), Bacteriochlorophyll, Exopolysaccharide und intrazelluläre Einlagerungen (PHB). Die Zellen messen in der exponentiellen Wachstumsphase 1,0‐1,3 × 1,9‐3,9 μm, sind durch ein polares Flagellum beweglich und treten einzeln, in Paaren oder Rosetten auf. Nicht motil in halbfestem Nähragar (1/10 R2A, 0,2 % Agar). Kolonien werden auf GP‐ und NA‐Agar nach 3‐4 d Inkubation bei 28 °C sichtbar. Durchmesser nach 14 d Inkubation bei 28 °C ca. 2‐3 mm. Zellen können Nitrat zu Nitrit reduzieren. Keine Indolproduktion. Oxidase, Katalase und Urease positiv. Der Typstamm kann D‐Fructose, L‐Aspartat, L‐Glutamin, L‐Glutamat, Formiat, Citrat, Acetat, Tartrat, Glycerol, Succinat, Methanol und Ethanol assimilieren. Kein Wachstum mit D‐Glukose, D‐Xylose, L‐Arabinose, Mannose, Saccharose und Betain. Aspartat und Glutamat werden als Stickstoffquelle assimiliert. Gutes Wachstum im pH‐Bereich zwischen 6,0 und 9,0 (Optimum: 7,0‐7,2). Wachstumsbereich von 4‐32 °C (Optimum: 25‐28 °C). Kein Wachstum bei 35 °C. Salzkonzentrationen von 0,5 % inhibieren das Wachstum um etwa 50 %. Kein Wachstum bei > 2 % NaCl im Medium. Der Typstamm ist JT1 und wurde 2003 vom Thallus einer Brunnenlebermoos‐Pflanze (Marchantia polymorpha L.) aus dem Bergpark Wilhelmshöhe, Kassel isoliert. Mtb. funariae (von Funaria hygrometrica (Hedw.), Echtes Drehmoos) abgeleitet von der Speziesbezeichnung des Wirtsorganismus. Die Zellen sind Gram‐negativ und rot pigmentiert. Bilden Carotinoide (λmax in 80 % Methanol: 465, 490 und 520 nm), Bacteriochlorophyll und Exopolysaccharide. Die Zellen messen in der exponentiellen Wachstumsphase 1,0‐1,4 × 1,7‐3,4 μm, sind durch ein polares Flagellum beweglich und treten einzeln, in Paaren oder Rosetten auf. Motil auf halbfestem Nähragar (1/10 R2A, 0,2 % Agar). Kolonien werden auf GP‐ und NA‐ Agar nach 3‐4 d Inkubation bei 28 °C sichtbar. Durchmesser nach 14 d Inkubation bei 28 °C ca. 2‐3 mm. Zellen können Nitrat zu Nitrit reduzieren. Keine Indolproduktion. Oxidase, Katalase und Urease positiv. Der Typstamm kann L‐ Aspartat, L‐Glutamin, L‐Glutamat, Formiat, Citrat, Glycerol, Succinat, Methanol und Ethanol assimilieren. Kein Wachstum mit D‐Xylose und Tartrat. Aspartat und Glutamat werden als Stickstoffquelle assimiliert. Gutes Wachstum im pH‐Bereich zwischen 6,0 und 10,0. Kein Wachstum bei 35 °C. Wachstum bis zu 2,0 % NaCl im Medium. Der Typstamm ist F3.2 und wurde 2002 vom Phylloid einer Funaria hygrometrica (Hedw.) Moospflanze (Gärtnerei der Universität Kassel) isoliert.

176 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Erkenntnisse über das Vorkommen und die Mechanismen der Biofilmbildung von Pflanzen‐assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium (Mtb.) zu erarbeiten. Die Mikroben wurden im Freiland isoliert und im Labor in Reinkultur kultiviert. Weiterhin sollte das bisher taxonomisch nicht einzuordnende Lebermoos (Marchantia polymorpha)‐Isolat Mtb. sp. JT1 physiologisch und molekularphylogenetisch charakterisiert werden.

Die wichtigsten Resultate können wie folgt zusammengefasst werden:

1. Die Gattung Methylobacterium besteht aus 34 beschriebenen Arten (bakterielle Ökotypen), die über DNA‐Sequenz‐Stammbaumanalysen in drei große Subcluster eingeteilt werden konnten. 2. Alle untersuchten 28 Vertreter der Gattung Mtb. (8 Typstämme und 20 weitere Isolate) kommen nicht nur in der freien (planktonischen) Form vor, sondern bilden bevorzugt Biofilme aus. Diese überzellulären Strukturen wurden unter Einsatz verschiedener mikroskopischer Methoden analysiert. 3. Die Ausprägung des Biofilms, d. h. der Übergang von der planktonischen zur sessilen Lebensweise der Einzelzellen, ist Isolat‐spezifisch und von Umweltfaktoren abhängig. Dabei spielt vor allem die Menge an verfügbarem Stickstoff eine wichtige Rolle. Dennoch sind wahrscheinlich auch Quorum Sensing‐Prozesse sowie andere Umweltreize entscheidend für die Bildung von Biofilmen bei Vertretern der Gattung Methylobacterium und können daher nicht auf einen einzelnen Mechanismus zurückgeführt werden. 4. Die Biofilme der Bakterien werden meist durch ein extrazelluläres, Faden‐ artiges Netzwerk stabilisiert, das (zu großen Teilen) aus Exopolysacchariden besteht und von den Bakterien synthetisiert und sezerniert wird. Die Menge und Zusammensetzung der Fibrillen bestimmt dabei die mechanisch‐ physiologischen Eigenschaften des Biofilms. 5. Die monophyletische Mtb.‐Gruppe mit den Isolaten JT1, 5b.2.20 und 1b.3 bildet ihre Biofilm‐Matrix vor allem durch zahlreiche, kurze Fimbrien (Auswüchse) aus, die über die gesamte Zell‐Oberfläche verteilt vorliegen. Auch die eng verwandten Mtb.‐Isolate F3.2, F2.1 und 5a.1.5 zeigen eine ähnliche unebene Oberflächenstruktur. 6. Das Lebermoos (Marchantia polymorpha)‐Isolat Mtb. sp. JT1 und die Sonnenblumen (Helianthus annuus)‐Isolate 5b.2.20 (sowie möglicherweise das Isolat 1b.3) bilden eine genetische und morphologische Einheit (Spezies), die klar von den bisher beschriebenen Typstämmen der Gattung Methylobacterium abgetrennt werden kann. Als Artname wird aufgrund der auffälligen und ungewöhnlichen Oberflächenstrukturen Methylobacterium fimbriae sp. nov. vorgeschlagen. Der Typstamm dieses neuen Taxons ist JT1.

177 Zusammenfassung

7. Die Laubmoos (Funaria hygrometrica)‐Isolate Mtb. sp. F3.2, F3.1 und F2.1 sowie das Isolat 5a.1.5 [isoliert aus der Rhizosphäre einer Sonnenblume (Helianthus annuus)] bilden ebenfalls eine genetische und morphologische Einheit (Spezies). Diese Gruppe um F3.2 bildet mit der Gruppe um Mtb. fimbriae JT1 ein monophyletisches Cluster. Eine Abgrenzung beider Gruppen konnte über DNA‐DNA‐Hybridisierungen nicht klar belegt werden, jedoch deuten die Ergebnisse der physiologischen und morphologischen Charakterisierung darauf hin, dass es sich um eine neue Spezies handelt. Als Artname wird aufgrund der Isolationsquelle des Typstamms Methylobacterium funariae sp. nov. vorgeschlagen. Der Typstamm dieses neuen Taxons ist F3.2.

Schlussfolgerungen: Wie viele andere Pflanzen‐assoziierte Bakterien bilden Vertreter der Gattung Methylobacterium Biofilme aus, um ihr Überleben zu sichern. Durch die Produktion von exopolymeren Substanzen können sich die Mikroben an andere Zellen oder Oberflächen anheften und schaffen sich unter geeigneten Bedingungen so ihr eigenes Mikro‐Habitat (Nischenbildung). Erst durch die Bildung von Biofilmen können die Bakterien wirksame Wechselwirkungen mit ihren Wirtspflanzen eingehen. Diese Bakterien‐Pflanzen‐Interaktion kann dabei zu symbiotischen Beziehungen führen (auch in der Gattung Mtb. nachgewiesen), wobei die Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen ein integraler Bestandteil dieser Assoziationen ist. Wie in dieser Arbeit bei Bakterien der Gattung Methylobacterium und bei vielen anderen Mikroorganismen gezeigt werden konnte, stellt das planktonische „Single‐Dasein“ der prokaryotischen Zellen nur einen kleinen Teil der Gesamt‐ Entwicklung dar. Bakterien leben bevorzugt in Biofilmen und können selbst in dieser Form neue Habitate erschließen, wenn sich größere Bruchstücke des überzellulären Systems ablösen. Somit besteht nicht einmal für die Verbreitung der Art die Notwendigkeit, bewegliche Formen auszubilden. Das Lehrbuch‐Bild der beweglichen Bakterienzellen mit Geißel, muss daher revidiert werden, da diese Lebensweise in vivo deutlich unterrepräsentiert ist und vermutlich nur bei künstlichen Laborbedingungen in gewissen Populationen dominiert. Nach molekulargenetisch‐, physiologisch‐biochemischer‐ und morphologischer Charakterisierung des Lebermoos‐Isolats Mtb. sp. JT1 sowie einiger eng verwandter Stämme, konnten zwei neue Spezies beschrieben werden (Mtb. fimbriae sp. nov. und Mtb. funariae sp. nov.), die sich phylogenetisch nahe stehen. Da die Daten der DNA‐DNA‐Hybridisierungs‐Experimente jedoch aufgrund experimenteller Schwierigkeiten bisher keine eindeutige Abgrenzung der beiden Spezies zulassen, konnte noch keine offizielle Speziesbeschreibung publiziert werden. Diese kritischen Experimente müssen wiederholt werden, um Klarheit über den taxonomischen Status der Isolate zu erhalten. Da jedoch sonst alle Voraussetzungen für eine valide Speziesbeschreibung gegeben sind, wurden in der vorliegenden Dissertation zwei vorläufige Art‐Beschreibungen vorgenommen.

178 Ausblick

Ausblick

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Vertreter der Gattung Methylobacterium Biofilme bilden. Dabei synthetisieren sie exopolymere Substanzen, die Saccharidbausteine enthalten. In folgenden Arbeiten könnten diese exopolymeren Substanzen fraktioniert aufgereinigt und chemisch sowie physikalisch charakterisiert werden. Zuerst sollte dabei der Zucker‐, Protein, und DNA‐Gehalt über klassische Methoden bestimmt werden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse könnten die EPS weiter analysiert werden. Handelt es sich dabei um Polysaccharidstrukturen, könnten diese (nach Hydrolyse in ihre Monosaccharidbausteine) mit chromatographischen Verfahren (z. B. Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie, HPLC) weiter charakterisiert werden. Bei der Aufreinigung müssen die Zellen aber möglichst intakt bleiben, um das Ergebnis nicht zu verfälschen. Wenn dabei eine Methode gefunden werden kann, mit der die EPS zuverlässig quantifiziert und analysiert werden können, wäre es auch interessant die EPS eines stark Biofilm‐bildenden Stamms zu untersuchen, die auf unterschiedlichen Nährmedien (mit variierenden C:N:P‐Verhältnissen) gebildet werden. Eine ähnliche Vorgehensweise wäre auch für die weitere Charakterisierung der Fimbrien von Mtb. fimbriae sp. nov. und Mtb. funariae sp. nov. denkbar.

Um eine valide Speziesneubeschreibung zu publizieren müssen die DNA‐DNA‐ Hybridisierungs‐Experimente reproduziert werden. Durch die experimentellen Probleme, die sich aufgrund nicht ausreichend gereinigter DNA ergaben, sollte eine Extraktionsmethode erarbeitet werden, bei der möglichst wenige Begleitstoffe mit präpariert werden. Ansatzpunkte für die Verbesserung bestehender DNA‐ Extraktionsmethoden wurden in der vorliegenden Arbeit aufgezeigt. In den Hybridisierungs‐Studien sollten die paarweisen Vergleiche der Stämme Mtb. fimbriae JT1T, Mtb. funariae F3.2T, Mtb. adhaesivum DSM 17169T und Mtb. goesingense iEII3 zwingend wiederholt werden. Optional können noch die Stämme Mtb. fimbriae 5b.2.20 sowie Mtb. funariae 5a.1.15 aufgenommen werden. Auch die Zuordnung des „Bindeglieds“ zwischen Mtb. fimbriae und Mtb. funariae Mtb. sp. 1b.3 wäre hochinteressant. Zusätzlich sollten die eben genannten Stämme weitergehend physiologisch und biochemisch charakterisiert werden. Auch der Stamm Mtb. sp. 1a.16 (isoliert aus der Phyllosphäre von Helianthus annuus) zeigt eine relativ hohe Divergenz der 16S rDNA‐Sequenz zu den nächsten Typstämmen und könnte daher ein Vertreter einer noch nicht beschriebenen Bakterienspezies sein. Jedoch liegen zu diesem Isolat bisher nur Sequenz‐Daten (16S rDNA) vor, auf deren alleiniger Grundlage keine Spezieszuordnung getroffen werden kann. Die nächstverwandten Arten zu 1a.16 sind Mtb. mesophilicum und Mtb. brachiatum (mit 0,8 bzw. 0,9 % 16S rDNA‐Sequenzdivergenz).

179 Publikation

Publikation

Teile der vorliegenden Arbeit wurden in der folgenden Originalarbeit bereits veröffentlicht:

Schauer, S., Kutschera, U. 2008. Methylotrophic bacteria on the surfaces of field‐ grown sunflower plants: a biogeographic perspective. Theory Biosci. 127: 23‐29.

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194 Anhang

Anhang

Abbildung 5.1: Sekundärstuktur der 16S rRNA von Mtb. sp. BF15 (Z23160). Aus der Datenbank der ‚Comparative RNA Website and Project’ (CRW) (Cannone et al. 2002).

195 Anhang

Tabelle 5.1: Ergebnisse des API 50 CH‐Teststreifens (Kapitel 3.7.14). +, positive Reaktion (Säurebildung/Wachstum); ‐, negativ (keine Reaktion). n, Anzahl der Wiederholungen.

Mtb. fujisawaense Mtb. sp. JT1 Reaktion DSM 5686T (n=3) (n=4) Glycerin + + Erythrit ‐ ‐ D‐Arabinose + ‐ L‐Arabinose + ‐ D‐Ribose ‐ ‐ D‐Xylose ‐ ‐ L‐Xylose + ‐ D‐Adonit ‐ ‐ Methyl‐βD‐Xylopyranosid ‐ ‐ D‐Galactose + ‐ D‐Glukose + ‐ D‐Fructose + ‐ D‐Mannose ‐ ‐ L‐Sorbose ‐ ‐ L‐Rhamnose ‐ ‐ Galaktit (Dulcit) ‐ ‐ Inosit ‐ ‐ D‐Mannit ‐ ‐ D‐Sorbit ‐ ‐ Methyl‐αD‐Mannopyranosid ‐ ‐ Methyl‐αD‐Glucopyranosid ‐ ‐ N‐Acetylglucosamin ‐ ‐ Amygdalin ‐ ‐ Arbutin ‐ ‐ Esculin, Eisencitrat ‐ ‐ Salicin ‐ ‐ D‐Cellobiose ‐ ‐ D‐Maltose ‐ ‐ D‐Lactose (bovin) ‐ ‐ D‐Melibiose ‐ ‐ D‐Saccharose ‐ ‐ D‐Trehalose ‐ ‐ Inulin ‐ ‐ D‐Melezitose ‐ ‐ D‐Raffinose ‐ ‐ Stärke ‐ ‐ Glycogen ‐ ‐ Xylit ‐ ‐ Gentiobiose ‐ ‐ D‐Turanose ‐ ‐ D‐Lyxose + ‐ D‐Tagatose ‐ ‐ D‐Fucose + ‐ L‐Fucose + ‐ D‐Arabit ‐ ‐ L‐Arabit ‐ ‐ Kaliumgluconat ‐ ‐ Kalium‐2‐Ketogluconat ‐ ‐ Kalium‐5‐Ketogluconat ‐ ‐

196

Tabelle 5.2: verwendete Lektinkonjugate des ‚Fluorescein Lectin Kit I’ (Vector Laboratories, Inc., U.S.A).

Fluorescein‐Lektin Abk. Herkunft F/P* Spezifitätb Concanavalin A Con A Canavalia ensiformis 7,5 α‐Methyl‐Mannopyranosid > α‐D‐Mannose > α‐D‐Glukose > α‐N‐Acetyl‐D‐Glucosamin Dolichos biflorus‐Agglutinin DBA Dolichos biflorus 2,5 endständiges α‐N‐acetyl‐D‐Galactosamin Peanut‐Agglutinin PNA Arachis hypogaea 5,2 Lactose > β‐D‐Galactose Ricinus communis‐Agglutinin RCA120 Ricinus communis 5,4 Lactose > Galactose Sojabohnen‐Agglutinin SBA Glycine max 4,1 endständiges α‐ und β‐N‐Acetyl‐D‐Galactosamin; (β‐D‐)Galactose Ulex europaeus‐Agglutinin UEA I Ulex europaeus 2,5 α‐L‐Fucose Wheat germ‐Agglutinin WGA Triticum vulgare 3,5 GlcNAcβ(1,4)GlcNAcβ(1,4)GlcNAc > GlcNAcβ(1,4)GlcNAc > GlcNAc >> Sialinsäure (Neu5Ac) >> GalNAc * F/P = Mol Fluorescein pro Mol Lektin b die Zucker‐Spezifitäten der jeweiligen Lektine wurden in absteigender Reihenfolge angegeben.

Anhang 197

Tabelle 5.3: Abschätzung der evolutionären Sequenz‐Divergenzen. Dargestellt wurde die Anzahl an Basenunterschieden pro Merkmal in Prozent. Die Resultate beruhen auf der Analyse von 53 Sequenzen. Die Analyse wurde in MEGA 4.0.1 (Tamura et al. 2007) durchgeführt. Alle Lücken und fehlende Daten wurden von der Analyse ausgeschlossen (Option: ‚Complete deletion’). Insgesamt wurden 1278 Positionen analysiert. Identische Sequenzpaare wurden dunkelgrau hinterlegt. Werte < 3,0 % Sequenzdivergenz wurden hellgrau hinterlegt (kritischer Wert für Speziesabgrenzung nach Stackebrandt und Goebel 1994). Fortsetzung folgende Seiten.

Stamm / Isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Mtb. sp. JT1 (FJ157976) 1 Mtb. sp. F3.2 (FJ157975) 2 0,5 Mtb. sp. F3.1 (FJ157974) 3 0,5 0,0 Mtb. sp. F2.1 (FJ157973) 4 0,5 0,0 0,0 Mtb. sp. 1a.16 (FJ157960) 5 3,1 3,1 3,1 3,1 Mtb. sp. 1b.3 (FJ157961) 6 0,2 0,5 0,5 0,5 2,9 Mtb. sp. 1c.1 (FJ157962) 7 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 Mtb. sp. 1c.5 (FJ157963) 8 2,9 2,9 2,9 2,9 0,5 2,7 4,8 Mtb. sp. 1c.14 (FJ157964) 9 1,8 2,0 2,0 2,0 3,6 1,6 4,1 3,6 Mtb. sp. 5a.1.5 (FJ157965) 10 0,5 0,0 0,0 0,0 3,1 0,5 3,5 2,9 2,0 Mtb. sp. 5a.1.8 (FJ157966) 11 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 Mtb. sp. 5a.1.13 (FJ157967) 12 2,9 2,9 2,9 2,9 0,5 2,7 4,8 0,0 3,6 2,9 4,8 Mtb. sp. 5b.1.1 (FJ157968) 13 2,9 2,9 2,9 2,9 0,5 2,7 4,8 0,0 3,6 2,9 4,8 0,0 Mtb. sp.5b.1.4 (FJ157969) 14 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 0,0 4,8 4,8 Mtb. sp.5b.1.5 (FJ157970) 15 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 0,0 4,8 4,8 0,0 Mtb. sp.5b.2.1 (FJ157971) 16 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 0,0 4,8 4,8 0,0 0,0 Mtb. sp.5b.2.20 (FJ157972) 17 0,0 0,5 0,5 0,5 3,1 0,2 3,7 2,9 1,8 0,5 3,7 2,9 2,9 3,7 3,7 3,7 Mtb. adhaesivum AR27T (AM040156) 18 1,8 2,0 2,0 2,0 4,1 1,8 3,9 4,1 0,8 2,0 3,9 4,1 4,1 3,9 3,9 3,9 1,8 Mtb. aerolatum 5413S‐11T (EF174498) 19 3,8 3,8 3,8 3,8 2,3 3,7 4,7 2,4 3,9 3,8 4,7 2,4 2,4 4,7 4,7 4,7 3,8 4,3 Mtb. aminovorans JCM8240T (AB175629) 20 3,9 3,8 3,8 3,8 4,5 3,8 0,5 4,7 4,0 3,8 0,5 4,7 4,7 0,5 0,5 0,5 3,9 3,8 4,4 Mtb. aquaticum GR16T (AJ635303) 21 5,3 5,3 5,3 5,3 4,8 5,2 3,6 4,7 5,7 5,3 3,6 4,7 4,7 3,6 3,6 3,6 5,3 5,7 5,6 3,5 Mtb. brachiatum B0021T (AB175649) 22 2,9 2,9 2,9 2,9 0,5 2,7 4,8 0,0 3,6 2,9 4,8 0,0 0,0 4,8 4,8 4,8 2,9 4,1 2,4 4,7 4,7 Mtb. chloromethanicum NCIMB 13688T (AB1756) 23 3,6 3,4 3,4 3,4 4,9 3,6 0,1 4,9 4,1 3,4 0,1 4,9 4,9 0,1 0,1 0,1 3,6 3,8 4,8 0,5 3,7 4,9 Mtb. dichloromethanicum DSM 6343T (AB17563) 24 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 0,0 4,8 4,8 0,0 0,0 0,0 3,7 3,9 4,7 0,5 3,6 4,8 0,1 Mtb. extorquens NCIMB 9399T (AB175633) 25 3,7 3,5 3,5 3,5 4,8 3,5 0,0 4,8 4,1 3,5 0,0 4,8 4,8 0,0 0,0 0,0 3,7 3,9 4,7 0,5 3,6 4,8 0,1 0,0 198 Mtb. fujisawaense DSM 5686T (AB175634) 26 2,3 2,6 2,6 2,6 1,3 2,3 5,0 1,6 3,5 2,6 5,0 1,6 1,6 5,0 5,0 5,0 2,3 3,4 2,3 4,8 5,8 1,6 4,9 5,0 5,0

Stamm / Isolat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Mtb. goesingense iEII3 (AY364020) 27 1,8 2,0 2,0 2,0 3,6 1,6 3,9 3,6 0,3 2,0 3,9 3,6 3,6 3,9 3,9 3,9 1,8 0,8 4,0 3,8 5,6 3,6 4,0 3,9 3,9 3,5 Mtb. gregans 002‐074T (AB252200) 28 3,4 3,4 3,4 3,4 3,2 3,2 5,4 3,1 4,2 3,4 5,4 3,1 3,1 5,4 5,4 5,4 3,4 4,2 4,1 5,3 5,9 3,1 5,5 5,4 5,4 2,7 Mtb. hispanicum GP34T (AJ635304) 29 3,8 3,8 3,8 3,8 3,6 3,6 5,5 3,4 4,5 3,8 5,5 3,4 3,4 5,5 5,5 5,5 3,8 4,6 4,4 5,4 5,8 3,4 5,6 5,5 5,5 3,1 Mtb. iners 5317S‐33T (EF174497) 30 3,2 3,2 3,2 3,2 5,2 3,1 3,7 5,2 2,1 3,2 3,7 5,2 5,2 3,7 3,7 3,7 3,2 1,9 5,6 3,9 5,6 5,2 3,7 3,7 3,7 4,6 Mtb. isbiliense AR24T (AJ888239) 31 4,8 5,1 5,1 5,1 4,9 4,7 4,3 4,6 5,1 5,1 4,3 4,6 4,6 4,3 4,3 4,3 4,8 4,9 6,1 4,2 3,2 4,6 4,4 4,3 4,3 5,0 Mtb. jeotgali S2R03‐9T (DQ471331) 32 2,0 2,3 2,3 2,3 3,1 1,8 4,1 2,9 2,9 2,3 4,1 2,9 2,9 4,1 4,1 4,1 2,0 3,3 3,7 4,5 5,7 2,9 4,2 4,1 4,1 3,0 Mtb. komagatae 002‐079T (AB252201) 33 4,0 4,1 4,1 4,1 2,6 3,9 4,3 2,9 4,1 4,1 4,3 2,9 2,9 4,3 4,3 4,3 4,0 4,5 2,2 4,1 5,6 2,9 4,4 4,3 4,3 2,6 Mtb. lusitanum NCIMB 13779T (AB175635) 34 3,9 3,8 3,8 3,8 4,7 3,8 0,7 4,7 4,0 3,8 0,7 4,7 4,7 0,7 0,7 0,7 3,9 3,8 4,5 0,5 3,8 4,7 0,8 0,7 0,7 4,9 Mtb. mesophilicum DSM 1708T (AB175636) 35 2,9 2,9 2,9 2,9 0,5 2,7 4,8 0,0 3,6 2,9 4,8 0,0 0,0 4,8 4,8 4,8 2,9 4,1 2,4 4,7 4,7 0,0 4,9 4,8 4,8 1,6 Mtb. nodulans ORS2060T (AF220763) 36 5,0 5,2 5,2 5,2 5,7 5,1 4,8 5,4 5,6 5,2 4,8 5,4 5,4 4,8 4,8 4,8 5,0 5,5 6,4 4,7 3,6 5,4 4,7 4,8 4,8 5,6 Mtb. organophilum JCM 2833T (AB175639) 37 2,7 2,8 2,8 2,8 3,2 2,7 2,9 3,4 3,8 2,8 2,9 3,4 3,4 2,9 2,9 2,9 2,7 4,1 3,5 3,3 4,9 3,4 3,0 2,9 2,9 3,8 Mtb. oryzae CBMB20T (AY683045) 38 2,3 2,5 2,5 2,5 1,4 2,3 4,9 1,6 3,6 2,5 4,9 1,6 1,6 4,9 4,9 4,9 2,3 3,4 2,3 4,9 5,7 1,6 4,9 4,9 4,9 0,1 Mtb. persicinum 002‐165T (AB252202) 39 4,2 4,2 4,2 4,2 2,8 4,1 4,9 3,0 4,2 4,2 4,9 3,0 3,0 4,9 4,9 4,9 4,2 4,7 1,3 4,6 5,6 3,0 5,0 4,9 4,9 2,7 Mtb. phyllosphaerae CBMB27T (EF126746) 40 2,3 2,6 2,6 2,6 1,8 2,3 5,2 1,3 3,7 2,6 5,2 1,3 1,3 5,2 5,2 5,2 2,3 3,5 2,7 5,1 5,9 1,3 5,1 5,2 5,2 0,5 Mtb. platani PMB02T (EF426729) 41 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,2 3,6 4,7 5,9 5,1 3,6 4,7 4,7 3,6 3,6 3,6 5,2 5,6 5,9 3,5 1,1 4,7 3,5 3,6 3,6 5,8 Mtb. podarium FM4T (AF514774) 42 4,0 4,0 4,0 4,0 5,0 4,1 1,4 4,9 5,2 4,0 1,4 4,9 4,9 1,4 1,4 1,4 4,0 4,9 5,4 1,4 3,9 4,9 1,3 1,4 1,4 5,2 Mtb. populi BJ001T (AY251818) 43 4,1 3,9 3,9 3,9 4,9 4,1 0,5 5,0 4,3 3,9 0,5 5,0 5,0 0,5 0,5 0,5 4,1 4,0 4,7 0,4 3,8 5,0 0,5 0,5 0,5 4,9 Mtb. radiotolerans DSM 1819T (AB175640) 44 2,4 2,7 2,7 2,7 1,4 2,4 4,9 1,6 3,4 2,7 4,9 1,6 1,6 4,9 4,9 4,9 2,4 3,6 2,3 4,9 5,8 1,6 5,0 4,9 4,9 0,4 Mtb. rhodesianum DSM 5687T (AB175642) 45 4,1 4,0 4,0 4,0 4,8 4,0 0,5 4,9 4,2 4,0 0,5 4,9 4,9 0,5 0,5 0,5 4,1 4,1 4,6 0,3 3,8 4,9 0,5 0,5 0,5 5,0 Mtb. rhodinum DSM 2163T (AB175644) 46 3,8 3,8 3,8 3,8 4,0 3,8 1,8 4,1 4,9 3,8 1,8 4,1 4,1 1,8 1,8 1,8 3,8 4,5 4,5 1,8 4,0 4,1 1,7 1,8 1,8 3,9 Mtb. salsuginis MRT (EF015478) 47 4,3 4,1 4,1 4,1 4,5 4,1 1,6 4,5 4,1 4,1 1,6 4,5 4,5 1,6 1,6 1,6 4,3 4,0 3,8 1,1 3,8 4,5 1,6 1,6 1,6 4,7 Mtb. suomiense NCIMB 13778T (AB175645) 48 3,8 3,7 3,7 3,7 4,5 3,7 0,7 4,6 3,9 3,7 0,7 4,6 4,6 0,7 0,7 0,7 3,8 3,8 4,3 0,2 3,4 4,6 0,8 0,7 0,7 4,7 Mtb. tardum RB677T (AB252208) 49 2,6 2,8 2,8 2,8 1,4 2,4 5,1 1,6 3,6 2,8 5,1 1,6 1,6 5,1 5,1 5,1 2,6 3,8 2,3 5,0 5,9 1,6 5,2 5,1 5,1 0,4 Mtb. thiocyanatum DSM 11490T (AB175646) 50 3,9 3,8 3,8 3,8 4,7 3,9 0,4 4,9 4,1 3,8 0,4 4,9 4,9 0,4 0,4 0,4 3,9 3,8 4,5 0,2 3,7 4,9 0,3 0,4 0,4 4,8 Mtb. variabile GR3T (AJ851087) 51 5,4 5,3 5,3 5,3 4,4 5,4 3,9 4,3 5,8 5,3 3,9 4,3 4,3 3,9 3,9 3,9 5,4 5,7 6,1 3,8 2,1 4,3 3,9 3,9 3,9 5,4 Mtb. zatmanii DSM 5688T (AB175647) 52 4,1 3,9 3,9 3,9 4,9 4,0 0,5 5,1 4,3 3,9 0,5 5,1 5,1 0,5 0,5 0,5 4,1 4,1 4,9 0,5 3,9 5,1 0,5 0,5 0,5 5,1 Rps. palustris BisB5 (NC 007958) 53 8,8 8,5 8,5 8,5 8,8 8,8 9,5 8,8 8,8 8,5 9,5 8,8 8,8 9,5 9,5 9,5 8,8 8,4 8,8 9,6 10 8,8 9,4 9,5 9,5 9,1 Fortsetzung Tabelle 5.3 199

Fortsetzung Tabelle 5.3

Stamm / Isolat 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Mtb. goesingense iEII3 (AY364020) 27 Mtb. gregans 002‐074T (AB252200) 28 4,2 Mtb. hispanicum GP34T (AJ635304) 29 4,6 0,4 Mtb. iners 5317S‐33T (EF174497) 30 2,1 4,9 4,9 Mtb. isbiliense AR24T (AJ888239) 31 4,9 5,2 5,2 4,5 Mtb. jeotgali S2R03‐9T (DQ471331) 32 3,0 4,0 4,3 4,2 5,2 Mtb. komagatae 002‐079T (AB252201) 33 4,4 4,7 4,6 5,1 5,6 3,8 Mtb. lusitanum NCIMB 13779T (AB175635) 34 3,8 5,2 5,2 3,8 4,2 4,4 4,3 Mtb. mesophilicum DSM 1708T (AB175636) 35 3,6 3,1 3,4 5,2 4,6 2,9 2,9 4,7 Mtb. nodulans ORS2060T (AF220763) 36 5,5 5,6 5,6 4,6 1,6 6,1 6,4 4,7 5,4 Mtb. organophilum JCM 2833T (AB175639) 37 4,0 4,3 4,4 4,2 5,3 2,8 3,1 3,1 3,4 5,7 Mtb. oryzae CBMB20T (AY683045) 38 3,6 2,6 3,0 4,7 4,9 2,9 2,6 5,0 1,6 5,6 3,7 Mtb. persicinum 002‐165T (AB252202) 39 4,4 4,4 4,1 5,7 6,3 4,3 1,9 4,8 3,0 6,6 3,8 2,7 Mtb. phyllosphaerae CBMB27T (EF126746) 40 3,7 2,7 3,1 4,8 4,9 3,0 3,0 5,1 1,3 5,5 4,1 0,4 3,1 Mtb. platani PMB02T (EF426729) 41 5,8 5,7 5,5 5,6 3,1 5,7 5,6 3,5 4,7 3,4 5,0 5,7 5,8 5,6 Mtb. podarium FM4T (AF514774) 42 5,0 5,6 5,6 4,7 4,4 4,7 5,1 1,3 4,9 4,7 3,0 5,2 5,8 5,3 3,5 Mtb. populi BJ001T (AY251818) 43 4,1 5,4 5,5 3,9 4,5 4,7 4,5 0,6 5,0 4,8 3,4 5,0 4,9 5,2 3,7 1,5 Mtb. radiotolerans DSM 1819T (AB175640) 44 3,4 2,6 3,0 4,8 5,0 2,9 2,5 5,0 1,6 5,8 3,5 0,3 2,7 0,7 5,8 5,2 5,2 Mtb. rhodesianum DSM 5687T (AB175642) 45 4,1 5,4 5,5 4,0 4,5 4,6 4,4 0,2 4,9 4,9 3,2 5,1 4,9 5,3 3,8 1,3 0,4 5,1 Mtb. rhodinum DSM 2163T (AB175644) 46 4,7 5,4 5,5 4,5 3,9 4,2 4,1 2,0 4,1 4,7 3,3 3,8 4,9 4,2 4,0 1,8 1,9 4,1 2,0 Mtb. salsuginis MRT (EF015478) 47 4,0 5,2 5,2 4,1 4,1 4,9 4,2 1,5 4,5 4,6 3,6 4,8 4,1 4,9 4,0 2,5 1,5 4,8 1,4 1,8 Mtb. suomiense NCIMB13778T (AB175645) 48 3,8 5,2 5,3 3,8 4,3 4,5 4,1 0,8 4,6 4,9 3,2 4,8 4,5 5,0 3,6 1,6 0,6 4,8 0,5 1,7 1,0 Mtb. tardum RB677T (AB252208) 49 3,6 2,4 2,8 4,9 5,1 2,9 2,6 5,2 1,6 5,9 3,7 0,3 2,7 0,7 6,0 5,5 5,3 0,3 5,2 4,1 4,9 4,9 Mtb. thiocyanatum DSM11490T (AB175646) 50 4,0 5,3 5,4 3,8 4,4 4,5 4,3 0,5 4,9 4,7 3,3 4,9 4,8 5,1 3,5 1,3 0,2 5,0 0,2 1,7 1,3 0,5 5,2 Mtb. variabile GR3T (AJ851087) 51 5,6 5,6 5,3 5,6 3,1 5,8 4,7 3,8 4,3 3,8 5,1 5,3 5,8 5,4 1,9 3,9 4,1 5,3 4,1 3,4 3,9 4,0 5,6 3,9 Mtb. zatmanii DSM 5688T (AB175647) 52 4,1 5,6 5,7 3,9 4,6 4,6 4,5 0,8 5,1 5,0 3,4 5,2 5,1 5,4 3,8 1,3 0,5 5,2 0,5 1,7 1,6 0,8 5,4 0,4 4,1 Rps. palustris BisB5 (NC 007958) 53 8,6 10 10 9,2 9,9 9,0 9,0 9,7 8,8 9,9 8,7 9,0 9,0 9,1 10 9,6 9,5 9,0 9,8 9,1 9,0 9,4 9,2 9,5 10 9,8

200

Tabelle 5.4: Abschätzung der evolutionären Sequenz‐Divergenzen. Dargestellt wurde die Anzahl an Basenunterschieden pro Merkmal in Prozent. Die Analyse wurde mit MEGA 4.0.1 (Tamura et al. 2007) durchgeführt. Insgesamt wurden 517 Nukleotide (Matrix unten links) bzw. 172 Aminosäuren (Matrix oben rechts) analysiert. Identische Sequenzpaare wurden dunkelgrau hinterlegt. Werte über 10,0 % wurden gerundet.

Stamm / Isolat (GID) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Mtb. sp. JT1 (FJ157956) 1 0,0 0,0 0,0 1,2 4,7 4,7 7,0 4,7 0,0 6,4 3,5 3,5 3,5 4,1 2,9 8,1 5,2 4,7 4,7 4,7 2,9 2,9 4,1 3,5 3,5 2,9 2,9 16 Mtb. sp.5b.2.20 (FJ157957) 2 0,0 0,0 0,0 1,2 4,7 4,7 7,0 4,7 0,0 6,4 3,5 3,5 3,5 4,1 2,9 8,1 5,2 4,7 4,7 4,7 2,9 2,9 4,1 3,5 3,5 2,9 2,9 16 Mtb. sp. F3.2 (FJ157958) 3 3,7 3,7 0,0 1,2 4,7 4,7 7,0 4,7 0,0 6,4 3,5 3,5 3,5 4,1 2,9 8,1 5,2 4,7 4,7 4,7 2,9 2,9 4,1 3,5 3,5 2,9 2,9 16 Mtb. sp. F2.1 (FJ157959) 4 3,7 3,7 0,0 1,2 4,7 4,7 7,0 4,7 0,0 6,4 3,5 3,5 3,5 4,1 2,9 8,1 5,2 4,7 4,7 4,7 2,9 2,9 4,1 3,5 3,5 2,9 2,9 16 Mtb. adhaesivum DSM 5686T (FJ157950) 5 5,2 5,2 4,6 4,6 4,7 5,8 7,0 4,7 1,2 7,6 4,7 4,7 4,7 5,2 4,1 8,1 5,2 4,7 4,7 5,8 4,1 4,1 5,2 3,5 4,7 4,1 4,1 16 Mtb. fujisawaense DSM5686T (FJ157951) 6 8,7 8,7 8,1 8,1 8,5 4,1 4,1 0,0 4,7 8,1 4,7 4,7 4,7 3,5 4,7 9,3 6,4 0,0 0,0 5,8 4,1 4,7 5,2 3,5 4,1 4,1 4,7 16 Mtb. jeotgali S2R03‐9T (FJ157952) 7 9,3 9,3 8,7 8,7 8,7 7,2 7,0 4,1 4,7 6,4 2,9 2,9 2,9 5,8 2,9 8,7 4,7 4,1 4,1 4,1 2,3 2,9 3,5 2,9 2,3 2,3 2,9 15 Mtb. mesophilicum DSM 1708T (FJ157953) 8 11 11 10 10 11 4,1 7,5 4,1 7,0 9,9 7,0 7,0 7,0 5,2 6,4 9,9 8,7 4,1 4,1 8,1 7,0 6,4 7,6 6,4 7,0 7,0 6,4 18 Mtb. radiotolerans DSM 1819T (FJ157954) 9 8,3 8,3 7,5 7,5 8,3 1,5 6,4 4,1 4,7 8,1 4,7 4,7 4,7 3,5 4,7 9,3 6,4 0,0 0,0 5,8 4,1 4,7 5,2 3,5 4,1 4,1 4,7 16 Mtb. goesingense iEII3 (FJ157955) 10 7,2 7,2 6,2 6,2 6,6 9,5 9,7 11 9,3 6,4 3,5 3,5 3,5 4,1 2,9 8,1 5,2 4,7 4,7 4,7 2,9 2,9 4,1 3,5 3,5 2,9 2,9 16 Mtb. aquaticum DSM 16371T (EF562464) 11 8,7 8,7 7,9 7,9 8,3 11 11 11 10 10 7,6 7,6 7,6 7,6 7,6 4,1 8,1 8,1 8,1 8,7 7,6 7,6 8,1 8,1 7,6 7,6 7,6 15 Mtb. chloromethanicum CM4T (156448562) 12 8,5 8,5 7,9 7,9 8,5 8,5 7,9 10 8,5 9,5 9,9 0,0 0,0 4,1 0,6 9,9 2,3 4,7 4,7 1,2 1,7 0,6 0,6 2,3 0,6 1,7 1,2 16 Mtb. dichloromethanicum DM4T (AJ878068) 13 8,3 8,3 7,7 7,7 8,5 8,5 7,7 10 8,3 9,3 10 1,4 0,0 4,1 0,6 9,9 2,3 4,7 4,7 1,2 1,7 0,6 0,6 2,3 0,6 1,7 1,2 16 Mtb. extorquens DSM 1337T (EF562466) 14 8,3 8,3 7,7 7,7 8,5 8,5 7,7 10 7,9 9,7 9,9 1,4 1,2 4,1 0,6 9,9 2,3 4,7 4,7 1,2 1,7 0,6 0,6 2,3 0,6 1,7 1,2 15 Mtb. hispanicum DSM 16372T (EF562468) 15 9,1 9,1 7,2 7,2 8,7 6,6 8,1 7,9 6,6 10 9,9 7,2 7,4 7,4 3,5 9,3 5,8 3,5 3,5 5,2 4,1 3,5 4,7 4,7 4,1 4,1 3,5 15 Mtb. lusitanum KCTC 12964T (EF562469) 16 8,3 8,3 7,4 7,4 7,4 7,7 6,0 9,1 7,4 8,9 9,7 3,3 3,5 3,5 6,6 9,9 2,9 4,7 4,7 1,7 1,2 0,0 1,2 1,7 0,6 1,2 0,6 16 Mtb. nodulans ORS2060T (AF220764) 17 9,7 9,7 9,9 9,9 8,7 12 10 12 12 10 7,9 13 13 13 12 12 11 9,3 9,3 11 9,9 9,9 11 9,3 9,9 9,9 9,9 17 Mtb. organophilum ATCC 27886T (M22629) 18 7,7 7,7 7,5 7,5 8,3 7,4 5,8 8,5 7,0 9,7 10 5,0 5,2 5,2 6,8 4,1 10 6,4 6,4 3,5 3,5 2,9 2,9 4,1 2,9 3,5 2,9 16 Mtb. oryzae CBMB20T (EF562478) 19 8,7 8,7 8,1 8,1 8,5 0,0 7,2 4,1 1,5 9,5 11 8,5 8,5 8,5 6,6 7,7 12 7,4 0,0 5,8 4,1 4,7 5,2 3,5 4,1 4,1 4,7 16 Mtb. phyllosphaerae CBMB27 (EF562496) 20 8,7 8,7 8,1 8,1 8,5 0,0 7,2 4,1 1,5 9,5 11 8,5 8,5 8,5 6,6 7,7 12 7,4 0,0 5,8 4,1 4,7 5,2 3,5 4,1 4,1 4,7 16 Mtb. podarium FM4T (AY468366) 21 9,7 9,7 8,3 8,3 9,1 8,7 7,2 10 8,1 9,5 11 3,5 3,3 3,3 7,2 2,9 12 4,6 8,7 8,7 2,9 1,7 1,7 3,5 1,7 2,9 2,3 17 Mtb. populi BJ001T (CP001029) 22 7,0 7,0 5,6 5,6 7,2 7,4 6,4 9,1 6,6 9,3 8,5 3,5 3,7 3,3 6,2 2,9 12 4,1 7,4 7,4 3,9 1,2 2,3 1,2 1,7 0,0 1,2 16 Mtb. rhodesianum DSM 5687T (EF562473) 23 8,3 8,3 7,4 7,4 7,4 7,7 6,0 9,1 7,4 8,9 9,7 3,3 3,5 3,5 6,6 0,0 12 4,1 7,7 7,7 2,9 2,9 1,2 1,7 0,6 1,2 0,6 16 Mtb. rhodinum ATCC 14821T (U70527) 24 8,1 8,1 7,5 7,5 8,3 8,7 8,3 11 8,1 9,5 9,7 1,5 1,4 0,8 7,5 3,3 13 5,4 8,7 8,7 3,1 3,1 3,3 2,9 1,2 2,3 1,7 16 Mtb. salsuginis MRT (EF030550) 25 8,3 8,3 7,4 7,4 7,4 7,4 6,8 8,5 7,2 9,3 9,3 4,3 4,1 3,7 7,2 3,3 12 5,4 7,4 7,4 4,3 2,7 3,3 3,9 2,3 1,2 1,2 16 Mtb. suomiense KCTC 12963T (EF562474) 26 7,2 7,2 7,0 7,0 8,9 8,7 7,2 10 7,7 10 10 4,6 4,4 4,1 7,7 3,5 12 4,3 8,7 8,7 4,3 3,3 3,5 3,9 3,7 1,7 1,2 16 Mtb. thiocyanatum DSM 11490T (EF562475) 27 6,6 6,6 6,0 6,0 7,2 7,4 6,0 9,1 6,6 9,3 8,5 3,5 3,7 3,7 6,6 2,9 12 3,7 7,4 7,4 4,3 0,8 2,9 3,5 3,1 3,7 1,2 16 Mtb. zatmanii DSM 5688T (EF031553) 28 8,1 8,1 7,5 7,5 8,3 7,7 7,5 9,5 7,9 9,3 11 4,1 4,1 3,7 7,4 3,1 12 4,1 7,7 7,7 3,7 3,3 3,1 3,9 3,5 3,7 4,1 16 Rps. palustris BisB18 (CP000301.1) 29 17 17 17 17 17 18 17 19 17 18 16 17 17 17 17 15 18 15 18 18 16 16 15 17 16 16 16 16 Anhang 201

Anhang

Abbildung 5.2: Evolutionäre Beziehung von 53 Taxa basierend auf einer NJ‐Analyse der 16S rDNA‐Sequenzen unter Annahme des Modells von JC (1969). Abgebildet wurde der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 0,42. Bootstrapwerte über 50 % sind über den Ästen angegeben (basierend auf 10000 Replikaten). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Messbalken: 0,01 Substitutionen pro Merkmal.

202 Anhang

Abbildung 5.3: Evolutionäre Beziehung von 53 Taxa basierend auf einer ML‐Analyse der 16S rDNA‐Sequenzen unter Annahme des GTR+I+G‐Modells. Abgebildet wurde der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 0,82. Verzweigungen, die in allen Analysen gefunden werden konnten, wurden mit einem Punkt markiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Messbalken: 0,01 Substitutionen pro Merkmal.

203 Anhang

Abbildung 5.4: Evolutionäre Beziehung von 29 Taxa basierend auf einer NJ‐Analyse der partiellen mxaF‐Sequenzen unter Annahme des Modells von JC (1969). Abgebildet wurde der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 0,72. Bootstrapwerte über 50 % sind über den Ästen angegeben (basierend auf 10000 Replikaten). Im Rahmen der Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Messbalken: 0,01 Substitutionen pro Merkmal.

Abbildung 5.5: Evolutionäre Beziehung von 29 Taxa basierend auf einer ML‐Analyse der partiellen mxaF‐Sequenzen unter Annahme des GTR+I+G‐Modells. Abgebildet wurde der beste Baum mit einer Gesamt‐Astlänge von 1,08. Die Knoten, die in allen Analysen gefunden werden konnten, wurden mit einem Punkt markiert. Im Rahmen der Arbeit ermittelte Sequenzen wurden mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Messbalken: 0,01 Substitutionen pro Merkmal. 204 Danksagung

Danksagung

Hiermit möchte ich mich bei allen bedanken, die mich während dieser Arbeit ermutigt und unterstützt haben.

Mein besonderer Dank gilt dabei Herrn Prof. Dr. U. Kutschera für die Bereit‐ stellung des Arbeitsplatzes, das hochinteressante Forschungsprojekt sowie die Unterstützung während meiner Doktorarbeit.

Prof. Dr. H. Follmann danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.

Herrn Dipl.‐Ing. H. Rühling möchte ich für die stets engagierte Bereitschaft, die Proben im SEM zu untersuchen, danken.

Bei Herrn Prof. Dr. Grotha möchte ich für die Bereitstellung von Literatur sowie für viele anregenden Diskussionen und Vorschläge bedanken.

Ein großes Dankeschön gilt den Mitarbeitern und Ehemaligen der Arbeitsgruppe Pflanzenphysiologie, insbesondere Matthias Hornschuh für seine Unterstützung im Labor und sonstigen Problemen. Jan Hellmuth und Thomas Hoppe danke ich für anregende Diskussionen und die gemeinsamen Kaffee‐Pausen. Aber auch Sonja Rau, Tina Roth, Peggy Paschke, Birgit Teubert, Heidemarie Gärtner, Sophia Eichel und Ortrud Brand möchte ich für das gute Arbeitsklima und ihre Hilfestellungen danken.

Ein herzliches Dankeschön geht an Sabine Krolczyk für die Durchsicht meiner Arbeit sowie viele nette Schwätzchen und Diskussionen über „die kleinen Biester“. Danke auch an die ganze Abteilung Mikrobiologie, die mir immer mit Bakterien, Chemikalien und sonstigen Gerätschaften ausgeholfen haben.

Meiner Familie danke ich für die finanzielle und moralische Unterstützung. Ihr habt großen Anteil an dieser Arbeit!

Ein liebevoller Dank geht an Marina Schäfer. Danke für deine Korrekturen, deine Geduld und dein Verständnis für die langen Arbeitstage.

205 Erklärung

Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und andere als der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions‐ oder Habilitationsverfahren verwendet worden.

Kassel, im Januar 2009 ______Stefan Schauer

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