EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium Excelsum FRENTE a MICROORGANISMOS PATOGENOS

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS

ALEXANDER GARCIA CAYCEDO

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de BIOLOGO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE BIOLOGÍA

BOGOTA D.C Enero 2009

NOTA DE ADVERTENCIA

ARTICULO 23 DE LA RESOLUCION N˚ 13 DE JULIO DE 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS

ALEXANDER GARCIA CAYCEDO

APROBADO

______CRISPIN CELIS Z. MSc RUBEN TORRENEGRA Director Codirector

______Dra. ALBA NOHEMI TELLEZ Dr. JULIO PEDROZO Ph. D. Jurado Jurado

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS

ALEXANDER GARCIA CAYCEDO

APROBADO

______DR. INGRID SCHULER Ph.D. Dr. ANDREA FORERO Decana Académica Directora de la carrera de Biología

RESUMEN

La medicina tradicional se ha basado principalmente en las propiedades de las plantas, las cuales han sido usadas para el tratamiento de varias enfermedades humanas durante siglos. Se sabe que las plantas son biológicamente ricas en compuestos activos, como lo son los metabolitos secundarios. Unos de los enfoques que le han otorgado las ciencias al estudio de estos compuestos activos es el descubrimiento de agentes antimicrobianos por medio de métodos de extracción en plantas.

Debido a esto se pretendió investigar a la especie vegetal Anacardium excelsum, perteneciente a la familia de las Anacardiáceas. Este estudio tuvo como objeto, la idea de indagar y encontrar compuestos naturales, con propiedades antimicrobianas frente a microorganismos Gram positivos como Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis y a su vez microorganismos Gram negativos como E.coli y Salmonella; se realizo la exploración de metabolitos secundarios presentes en hojas, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza.

El material vegetal fue colectado en el Municipio de Pie de cuesta, ubicado en el departamento de Santander. Los métodos de extracción, se realizaron por medio de extracción a reflujo con aparato de soxhlet (extracción total), y para las fracciones, se usaron extracciones continuas y discontinuas liquido-liquido; se utilizaron como solventes éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo consecutivamente. Para la elección de los microorganismos se tuvo en cuenta los gérmenes o microorganismos mas frecuentes en las infecciones comunitarias y sepsis intrahospitalarias, además de que recientemente se ha evidenciado, que presentan cierto desarrollo, en la resistencia a nuevos antibióticos y otros

5 problemas epidemiológicos. La actividad antimicrobiana se evaluó por medio de la técnica de pozos.

Para las pruebas antimicrobianas de los extractos totales, se probaron concentraciones de 10, 20 y 40 µg/ml. Los extractos totales de todos los órganos estudiados, obtenidos de Anacardium excelsum, presentaron actividad inhibitoria de crecimiento frente a los dos microorganismos Gram positivos (Staphylococcus y Bacillus subtilis); donde los extractos de tegumento, fruto y testa obtuvieron mayor actividad, con un promedio de 16 a 20 mm de halo de inhibición frente a Bacillus subtilis, con una concentración de 40 µg/ml. En el caso de Staphylococcus aureus, los extractos totales que evidenciaron mayor actividad fueron tegumento, semilla, flor, testa y hoja con un promedio en el halo de inhibición de 16 a 21 mm y una concentración de 40 µg/ml. Con respecto a los microorganismos Gran negativos (Escherichia coli y Salmonella), ningún órgano estudiado de Anacardium excelsum, mostro actividad antimicrobiana.

Con relación a las fracciones, las cuales solo fueron probadas con Bacillus subtilis, tegumento, semilla y testa mostraron actividad con un promedio de 15-20 mm de halo de inhibición, con una concentración de 40 µg/ml.

A estas se les monto una bioautografia en donde la banda mas polar mostro actividad. Finalmente se hizo una cromatografía en columna para la fracción de tegumento, en la cual se obtuvieron 16 fracciones que fueron analizadas en un cromatografo de gases acoplado a masas en donde se encontraron algunos compuestos fenolicos como Fenol, 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) y fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil- A-22-46; los cuales se creen que son los que poseen la actividad antimicrobiana.

INDICE DE FIGURAS

FIGURA No. 1: Fotografia del arbol 13 FIGURA No. 2: Fotografia de la corteza ...... 14 FIGURA No. 3: Fotografia de la plantula con flor y fruto ...... 15 FIGURA No. 4: Fotografia de la Hoja ...... 15 FIGURA No. 5: Fotografia de la Flor ...... 16 FIGURA No. 6: Fotografia de la plantula con flores ...... 17

FIGURA No. 7: Fotografia del fruto ...... 17

FIGURA No. 8: Fotografia de la plantula con fruto ...... 18

FIGURA 9: Staphylococcus aureus ...... 24 FIGURA 10: Bacillus subtilis 25 FIGURA 11: Escherichia Coli ...... 26 FIGURA 12: Salmonella ...... 27 FIGURA 13: Tegumento pulverizado de Anacardium excelsum 37 FIGURA 14: Semilla pulverizada de Anacardium excelsum ...... 38 FIGURA 15: Fruto pulverizado de Anacardium excelsum ...... 38 FIGURA 16: Flor pulverizada de Anacardium excelsum 38 FIGURA 17: Testa pulverizada de Anacardium excelsum ...... 39 FIGURA 18: Corteza pulverizada de Anacardium excelsum ...... 39 FIGURA 19: Hoja pulverizada de Anacardium excelsum ...... 39 FIGURA 20: Actividad antimicrobiana del extracto total de tegumento frente a Bacillus subtillis ...... 48

FIGURA 21: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla frente a Bacillus subtillis ...... 48

FIGURA 22: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Bacillus subtillis; 49 FIGURA 23: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor frente a Bacillus subtillis ...... 49

FIGURA 24: Actividad antimicrobiana del extracto total de testa frente a Bacillus subtillis ...... 50 FIGURA 25: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza frente a Bacillus subtillis; 50 FIGURA 26: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja frente a Bacillus subtillis ...... 51

FIGURA 27: Actividad antimicrobiana del extracto total de tegumento frente a Staphylococcus aureus ...... 51

FIGURA 28: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla frente a Staphylococcus aureus 52 FIGURA 29: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Staphylococcus aureus ...... 52

FIGURA 30: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor frente a Staphylococcus aureus ...... 53 FIGURA 31: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Staphylococcus aureus 53 FIGURA 32: Actividad antimicrobiana del extracto total de testa frente a Staphylococcus aureus ...... 54

FIGURA 33: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza frente a Staphylococcus aureus 54 FIGURA 34: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja frente a Staphylococcus aureus ...... 55

FIGURA 35: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de tegumento ...... 56

FIGURA 36: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de semilla 57 FIGURA 37: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de testa ...... 57

FIGURA 38: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Movil: Petrol: CH2CL2 1:1) de la fracción en éter de petróleo de la testa de A. excelsum frente a bacillus subtillis ...... 58 FIGURA 39: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Movil: CH2CL2: MeOH 1:1) de la fracción en etanol de tegumento de A. excelsum frente a bacillus subtillis ...... 58

FIGURA 40: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Movil: CH2CL2: MeOH 1:1) de la fracción en etanol de semilla de A. excelsum frente a bacillus subtillis ...... 59 FIGURA 41: Cromatograma de la muestra 2 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol 61 FIGURA 42: Cromatograma de la muestra 4 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol 62 FIGURA 43: Espectro de masas a 70 eV de la muestra 5 de la subfracción en metanol ...... 63 FIGURA 44: Estructura del compuesto Fenol 2-(1,1-dimetil) -4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) 63 FIGURA 45: Espectro de masas a 70 eV de la muestra 6 de la subfracción en metanol ...... 64 FIGURA 46: Estructura del compuesto1,2,3 Benzenetriol ...... 64

FIGURA 47: Espectro de masas a 70 eV del la muestra 6 de la subfracción en metanol ...... 65 FIGURA 48: Estructura del compuesto Benzesulfonanilil ...... 65 FIGURA 49: Cromatograma de la muestra 7 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol 66 FIGURA 50: Espectro de masas a 70 eV de la muestra 10 de la subfracción en metanol ...... 67 FIGURA 51: Estructura del compuesto Fenol 2-(1,1-dimetil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) ...... 67 FIGURA 52: Espectro de masas a 70 eV de la muestra 14 de la subfracción en metanol ...... 68 FIGURA 53: Estructura del compuesto Fenol 2,2-metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2- metil (6- ter- butil) ...... 68 FIGURA 54: Cromatograma de la muestra 14 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol 69

INDICE DE TABLAS

TABLA 1: Cromatografia en capa delgada de las fracciones de testa, tegumento y semilla obtenidas a partir del extracto total etanolico ...... 42

TABLA 2: Pesos de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción etanolica de tegumento ...... 43 TABLA 3: Cromatografia en capa delgada de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción etanolica de tegumento ...... 43 TABLA 4: Peso del Material Vegetal seco y molido antes y después de la extracción de cada uno de los órganos estudiados ...... 44 TABLA 5: Peso de las Fracciones Obtenidas a partir del extracto total etanolico de cada uno de los órganos estudiados 45 TABLA 6: Actividad Antimicrobiana de los extractos totales de Anacardium excelsum frente a Bacillus subtillis...... 47 TABLA 7: Actividad Antimicrobiana de los extractos totales de Anacardium excelsum frente a Staphilococcus aureus ...... 47 TABLA 8: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de del extracto total de Anacardium excelsum frente a Bacillus subtillis con una concentración de 40 µg /ml ...... 55 TABLA 9: Compuestos identificados en la subfracción de Metanol por CG-EM Comparados con la biblioteca Wiley ...... 60

TABLA DE CONTENIDO

INDICE DE FIGURAS INDICE DE TABLAS RESUMEN 1.INTRODUCCION ...... 1

2. MARCO TEORICO ...... 6

2.1FAMILIA ANACARDIACEA ...... 6

2.1.1 Numero de Géneros y Especies ...... 6

2.1.2 Distribución y Hábitat ...... 7

2.1.3 Clasificación de la Familia...... 7

2.1.4 Características de la Familia ...... 8

2.1.5 Historia Natural ...... 8

2.1.6 Usos Económicos ...... 9

2.1.7 Antecedentes Químicos y Farmacológicos de las Anacardiaceas ...... 9

2.2 ANACARDIUM EXCELSUM (BER. ET BALB.) ...... 11 2.2.1 Clasificación Taxonómica ...... 11 2.2.2 Sinónimos ...... 11 2.2.3 Nombres Vulgares ...... 11 2.2.4 Distribución Geográfica ...... 11 2.2.5 Descripción Taxonómica ...... 13

2.2.5.1 Fauste ...... 13 2.2.5.2 Corteza ...... 14 2.2.5.3 Hojas ...... 14 2.2.5.4 Flores ...... 16 2.2.5.5 Frutos ...... 17 2.2.5.6 Madera ...... 18 2.2.6 Componentes ...... 18 2.2.7 Importancia de la especie ...... 19 2.2.8 Usos e importancia Económica ...... 19

2.2.9 Propagación y Crecimiento ...... 21 2.2.10 Ecología ...... 21 2.3 MICROORGANISMOS ...... 21 2.3.1 Generalidades ...... 21 2.3.2 Staphilococcus aureus ...... 23

2.3.3 Bacillus subtilis ...... 24 2.3.4 Escherichia Coli ...... 25 2.3.5 Salmonella Sp ...... 27 3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION ...... 28 3.1 PROBLEMA ...... 28 3.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACION ...... 28 4. OBJETIVOS ...... 30 4.1 OBJETIVO GENERAL ...... 30 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 30 5. MATERIALES Y METODOS ...... 31 5.1 MATERIALES ...... 31 5.1.1 Materiales de Laboratorio ...... 31 5.1.2 Reactivos ...... 31 5.2. METODOS ...... 31

5.2.1 Material vegetal ...... 31 5.2.2 Técnicas de extracción ...... 31 5.2.3 Métodos de Evaluación Antimicrobiana ...... 33 5.2.3.1 Técnica de Difusión por Pozos ...... 33 5.2.3.2 Concentración Mínima Inhibitoria ...... 34 5.2.3.3 Cromatografía ...... 34 5.2.3.4 Cromatografía en Capa Delgada (CCD) ...... 34 5.2.3.5 Cromatografia en Columna ...... 35 5.2.3.6 Bioautografia ...... 35 5.2.4 Cromatografía de gases y detector de Masas ...... 36 5.3 METODOLOGIA ...... 37 5.3.1 Recolección y Preparación del Material Vegetal ...... 37 5.3.2 Obtención de los Extractos Vegetales ...... 40

5.3.3 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana de los Extractos y Fracciones ...... 40

5.3.3.1 Microorganismos de Ensayo ...... 40

5.3.3.2 Técnica de Difusión por Pozos ...... 41 5.3.4 Bioautografia ...... 42 5.3.5 Percolación por Cromatografia a Presión Atmosférica de la Fracción etanolica del tegumento ...... 42 5.3.6 Cromatografia en Columna a presión atmosférica de la subfraccion de Metanol ...... 43 6. RESULTADOS ...... 44 6.1 MATERIAL VEGETAL ...... 44 6.2 REVISIÓN DE LOS MICROORGANISMOS DE ENSAYO ...... 45 6.2.1 Staphilococcus aureus ...... 45 6.2.2 Bacillus subtilis ...... 46 6.2.3 Escherichia coli ...... 46 6.2.4 Salmonella Sp ...... 46 6.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA ...... 46 6.3.1 Extractos Totales ...... 46 6.3.2 Fracciones ...... 55 6.3.3 Bioautografia ...... 57 6.3.4 Separación y Análisis de laa subfraccion de Metanol obtenida a partir de la fracción etanolica del tegumento ...... 60 7. DISCUSION DE RESULTADOS ...... 70 8. CONCLUSIONES ...... 73 9. RECOMENDACIONES ...... 75 BIBLIOGRAFIA ...... 76

1. INTRODUCCION

Desde la antigüedad el hombre a utilizado las plantas como fuente para la elaboración de medicamentos, ya sea en fármacos o en las preparaciones tradicionales, con la finalidad de controlar la prevalencia de ciertas enfermedades infecciosas, vencer los problemas de resistencia de los microorganismos y los efectos colaterales que poseen los antimicrobianos. (Ali-Shtayed, 1998), (Sanabria, 1998)

La utilización de plantas medicinales en nuestro medio, y el hecho que en gran cantidad de vegetales se encuentran principios activos empleados en el tratamiento de diversas enfermedades, ha incrementado el interés por su estudio. La OMS (Organización Mundial de la Salud) estima que el 80% de los más de 4.000 millones de habitantes de la tierra confían en las medicinas tradicionales para suplir sus principales necesidades de salud. (Ramírez, 2007)

La actividad antimicrobiana de los extractos vegetales y los productos naturales ha revelado el potencial de las plantas superiores como fuente de agentes anti-infectivos, permitiendo de esta manera un avance al uso empírico de las especies vegetales medicinales con una base científica. (López, 1997)

Desde la producción de la penicilina, en 1941, hasta la actualidad, los antibióticos han curado millones de infecciones que pudieron haber sido letales. Sin embargo, el uso indiscriminado y muchas veces erróneo ha contribuido a la selección de microorganismos resistentes. (Chambers, 1998) Todos los antibióticos usados en la actualidad, incluyendo los nuevos agentes, están sujetos a la aparición de resistencias. La urgente necesidad de hacer frente al problema de la resistencia ha llevado a los investigadores y a la industria farmacéutica a buscar nuevas sustancias con actividad antimicrobiana.

En el último cuarto del siglo XIX, a partir de los estudios de Pasteur y Koch, se demostró la implicación microbiana en la génesis de varias enfermedades epidémicas. (Marcen, 2000) La difusión de la teoría del germen microbiano supuso un importante cambio de paradigma en los estudios epidemiológicos; (Kuhn, 1975) por fin se podía entender un grupo de enfermedades que ocasionaban elevada morbilidad y mortalidad en las poblaciones humanas. Hoy al igual que antes, existe cierto consenso a la hora de implicar a factores no microbianos en la génesis de las enfermedades infecciosas (nutrición, fallos inmunológicos, etc.) pero la antigua creencia en las invisibles causas de la enfermedad ha renacido con los hallazgos de la microbiología clínica y veterinaria. (Fleck, 1986)

El tema de las plantas medicinales ha sido tratado en todos los tiempos de muy diversas maneras y sobre ellas encontramos numerosos enfoques de su estudio, de su manejo y en la interpretación de los datos obtenidos. Se podría afirmar que los trabajos científicos se iniciaron en Colombia con los registros realizados por los cronistas. Con la expedición botánica dirigida por José Celestino Mutis aparecen recopilaciones amplias de flora natural de la Nueva Granada, en algunos casos con énfasis en las plantas medicinales tales como la quina, la zarzaparrilla y la ipecacuana, pero con una visión limitada a la botánica; la materia medica en las facultades de medicina, por su parte, evidenciaban gran influencia de la farmacopea europea y menospreciaba el uso popular, tradicional o indígena de las plantas. (Simposio de plantas medicinales, 1992)

A finales del siglo pasado, con el nacimiento de la química moderna, y por ende de la farmacognosia, se realizan los primeros estudios fitoquímicos principalmente de las plantas traídas del viejo mundo. De la misma época se conoce los trabajos adelantados por naturalistas ingleses sobre la flora de la amazonia, como el muy conocido de Richard Spruce, importante para la taxonomía y la farmacognosia, pero que ignoraban el contexto indígena en el que fueron recopiladas las plantas. Influida por las

15 investigaciones científicas europeas de principios de siglo, la farmacopea Colombiana se dirige mas a la preparación de formulas magistrales y al empleo de sales y otros productos minerales, restándole importancia a las plantas medicinales que antes habían sido conocidas como remedios eficaces. Poco a poco la medicina ha tomado rumbo de la bioquímica, farmacología y de los medicamentos de síntesis, abandonando definitivamente a las plantas.

Sin embargo, por otro lado, comienza el auge de la homeopatía, distinguida como ciencia medica eficaz en Europa; muchos de los científicos colombianos que viajaban al viejo mundo se entusiasmaban con esta disciplina terapéutica y se veían estimulados a estudiar las plantas para la preparación de diluciones homeopáticas. Fueron ellos, de manera paradójica, los que mantuvieron vivo el estudio de las plantas medicinales, como los conocidos trabajos de Mauro Hernández y Daniel Gonzales, con análisis fitoquímicos con alguna utilidad terapéutica. (Simposio de plantas medicinales, 1992)

Actualmente, se puede evidenciar un verdadero renacimiento de la vieja ciencia de las plantas medicinales como consecuencia de diversos factores. En primer lugar, la Organización Mundial de la Salud (OMS) propuso desde 1977 como objetivo para alcanzar en el año 2000 el plan (salud para todos), y considero que para tal empeño era preciso incorporar en las estrategias formales de atención primaria en salud las medicinas tradicionales y los elementos terapéuticos de reconocida utilidad, como los remedios vegetales, fomentando así las investigaciones en botánica, farmacología y fitoquímica. (Simposio de plantas medicinales, 1992)

Por otra parte, el surgimiento de una conciencia ecológica, especialmente en los países desarrollados, obligo a dirigir las miradas hacia las zonas tropicales caracterizadas por su gran diversidad en flora y fauna, y

16 movidos por la necesidad de una inminent e deforestación étnica y biológica, promueven el estudio de la etnobotánica con el propósito de encontrar plantas de utilidad para el hombre, incluyendo el aspecto terapéutico.

Existen varias formas de utilización de las plantas medicinales, entre las cuales tenemos el uso popular, uso tradicional indígena, uso tradicional mestizo, uso naturista y homeopático. Sin embargo el uso por parte de las ciencias naturales como la medicina y la química, se convierten en un tópico importante sobre todo para la elaboración de medicamentos de síntesis química. Esto ha sido considerado como la forma técnica, científica y moderna de emplear las hierbas medicinales; esto nació con la química y la farmacognosia, cuando se empezaron a descomponer las plantas hasta aislar sus componentes y descubrir cual de ellos producía un efecto terapéutico determinado; el primer argumento que justifico este sistema fue el de poder establecer dosificaciones exactas, no sujetas a variaciones condicionadas por el clima, la geografía y la planta misma según su edad o su estado (floración, fructificación, etc.); el segundo argumento fue la facilidad de establecer los efectos farmacológicos, tanto terapéuticos como los de la farmacodinamia y la toxicidad. Así aparecieron la morfina, la cocaína, la digoxina, la hioscina, escopolamina y la colchicina, entre otras. Posteriormente, en los laboratorios se ha logrado el procesamiento para obtener sustancias sintéticas y semisintéticas, con un mismo concepto farmacológico. (Simposio de plantas medicinales, 1992)

Una forma reciente de aplicación por parte de las plantas medicinales, es la elaboración de extractos vegetales, los cuales pretenden ofrecerse como sustitutos de los medicamentos de síntesis química, teniendo el mismo criterio farmacológico con previos estudios bibliográficos y fitoquímicos. De este modo el extracto resulta menos costoso de elaborar

17 y puede tener efectos favorables para síntomas o enfermedades de moderada intensidad.

Entre las ciencias encargadas en la investigación científica de las plantas medicinales, principalmente encontramos a la botánica, seguida de la química. Esta última nació en el siglo XVIII, ya que en el siglo pasado había logrado notables avances en la identificación de sustancias activas, especialmente en lo referente a aceites esenciales, glucósidos y alcaloides, de donde derivo la explosión farmacéutica que aun domina la medicina moderna. Este análisis fitoquímico todavía esta muy restringido, teniendo en cuenta la exorbitante suma de especies vegetales encontradas en el planeta y aun más en nuestras selvas tropicales Colombianas. Estamos muy lejos de poder hacer un minucioso examen de cada una de las nuevas plantas descubiertas, además el problema se amplia si consideramos que ante el descubrimiento de nuevos compuestos químicos y de nuevas reacciones bioquímicas en los seres vivos, como oligoelementos, prostaglandinas, neurotransmisores y neurohormonas, es preciso volver sobre las plantas que ya habían sido investigadas y que considerábamos agotadas desde el punto de vista de la química. Hay mas interrogantes aun, difíciles de resolver: ¿varia la composición química de una planta según su terreno, el clima, la flora concomitante, la estación del año, el periodo de madurez y la parte anatómica utilizada ? todas estas preguntas aumentan significantemente las variables a considerar en la investigación química y nos obligan a llenarnos de paciencia y serenidad para obtener nuevas respuestas. (Simposio de plantas medicinales, 1992)

2. MARCO TEORICO

Algunos de los productos químicos presentes en las plantas, así como la diversidad de sus estructuras, han sido aprovechados en actividades humanas, particularmente en la industria farmacéutica. Los avances en la metodología del estudio de los productos naturales, principalmente las técnicas cromatografícas, la espectrometría de masas y la resonancia magnética nuclear, han permitido la determinación de las estructuras químicas (Guardiola, 1990). Los metabolitos secundarios son productos del metabolismo especial, generalmente sintetizados a partir de metabolitos primarios, y su distribución es limitada a ciertas plantas (Mier, 1990).

Los metabolitos secundarios tienen funciones de interrelación en los organismos vegetales (Bilbao, 1997). Como las plantas carecen de movimiento, se valen de los metabolitos secundarios para tener relaciones con su entorno. Estas relaciones pueden ser de índole atractiva, como los colores llamativos de frutos y flores, lo que nos induce la presencia en ellos de pigmentos compuestos de flavonas, antocianinas y quinonas. (Bilbao, 1997). En su entorno también se puede encontrar situaciones de defensa y stress, estas pueden generan la actividad de los alcaloides sobre el sistema nervioso central de los animales que las atacan, constituyendo elementos de defensa del vegetal contra la predación de animales superiores (Bilbao, 1997).

2.1 FAMILIA ANACARDIÁCEA

2.1.1 Numero de géneros y especies En el mundo, las anacardiáceas comprenden aproximadamente 78 géneros y más de 700 especies. En América tropical hay aproximadamente 33 géneros y 170 especies. Rhus es el género más

19 grande en América tropical, con 25 especies aproximadamente. (Smith, 2004).

2.1.2 Distribución y Hábitat Las Anacardiáceas son nativas del hemisferio occidental (norte y sur de Canadá, sur de la Patagonia), África, sur de Europa, Asia templada y tropical, Australia tropical y subtropical y la mayor parte de Oceanía. (Smith, 2004). Los centros primarios de diversidad de las anacardiáceas se encuentran situados en México, sur América, áfrica ecuatorial, Madagascar, indochina y malasia. Rhus es el género más diverso en México, con solo una especie extendida a costa rica y al sur de panamá. La familia se encuentra en ambientes secos a húmedo, pero la mayoría están en habitas de tierras bajas. En el neotropico, los habitas típicos de Anacardium, Antrocaryon, Spondians, Tapirira y Thyrsodium son tierras bajas y bosques húmedos. (Smith, 2004). Los géneros Apterokarpos, Cardenasiodendron, Cyrtocarpa, Pseudosmodingium y Shinopsis son encontrados solamente en tipos de vegetación seca, incluyendo bosques deciduos tropicales, matorrales áridos tropicales y sabanas. (Smith, 2004). Por otro lado Mauria pude ser solamente encontrada en montaña y premontaña de los bosques de los andes, extendido a América del norte y central. La gran mayoría del genero Schinus esta por encima de los 3000 metros (Smith, 2004).

2.1.3 Clasificación de la Familia Las Anacardiáceas se colocan dentro de las sapindales por Cronquist (Smith, 2004). Esto esta soportado recientemente por análisis filogenéticos moleculares. Un ovulo individual dentro de cada lóculo distinguen a las anacardiáceas de las estrechamente relacionadas Burseráceas. Las Anacardiáceas han sido divididas dentro de cinco tribus: las Anacardieae, con ocho géneros; la generalizada Rhoeae, con aproximadamente 44 géneros; la Semecarpeae, con 5 géneros, restringidos al trópico y subtropico, Asia, Malasia, norte de Australia y

Oceanía; las Spondiadeae, presentan aproximadamente 19 géneros, los cuales son del pantropico y muy probablemente son un grupo monofiletico; y los Dobineae (algunas veces se ha sugerido, separarlos de la familia), se conoce que tiene uno o dos géneros de arbustos o arboles pequeños restringidos al continente asiático. (Smith, 2004).

Publicaciones preliminares, han comunicado que análisis filogenéticos, que han seleccionado secuencias de DNA sugieren que la tribu Spondiadeae, es monofiletica y que varios géneros de Anacardieae y Semecarpeae, han anidado dentro de Rhoeae. (Smith, 2004).

2.1.4 Características de la Familia Hábitos: Arboles o arbustos, algunas veces lianas (toxicodendron); canales de resina presentes, sustancia lechosa, clara o viscosa (en algunos géneros se torna negra después de ser expuesta al aire), en ciertos grupos pueden ser venenosas (Smith, 2004). Estipulas: Ausentes. Hojas: Alternas, a menudo agrupadas al final de las ramas, frecuentemente pinnadas, y a veces simples. Flores: Pequeñas, inospicuas, actinomorfas, algunas presentan discos intraminales y carnosas. Frutos: indehiscentes, usualmente en drupa, rara vez sostenido por una larga y carnosa hypocarpo (Anacardium) (Smith, 2004). Semillas: 1 lóculo, usualmente con falta de endospermo y el cotiledón frecuentemente completo, plano-convexo. (Smith, 2004).

2.1.5 Historia Natural Los miembros de las anacardiáceas usualmente son polinizados por insectos, especialmente abejas y polillas. Los frutos de varios géneros, son modificados en diferentes caminos por los vientos dispersos. Los frutos de Astronium y Myracrodruon son sostenidos por una amplia ala de sépalos. Los frutos de Loxopterygium y Schinopsis tienen un ala o nervación lateral. Los frutos de Cardenasiodendron y Pseudosmodingium están rodeados por un ala marginal que se asemejan Ulmus (elm)

21 samaras; y los frutos de Actinocheita y Ochoteremaea son completos o marginalmente cubiertos por largos tricomas. (Smith, 2004). La mayoría de los frutos de las Anacardiáceas son drupas carnosas, las cuales son dispersas por aves y mamíferos. La amplia carnosidad del hypocarpo es característica de la mayoría de las especies de Anacardium, los cuales son atraídos por murciélagos, primates y aves dispersores de agentes. (Smith, 2004).

2.1.6 Usos Económicos La savia de varios géneros del neotrópico (Anacardium, Comocladia, Lithrea, Loxopterygium, Pseudosmodingium, toxicodendron, Mauria y Metopium) son venenosas y pueden causar casos graves de dermatitis. (Smith, 2004). Las Spondias, algunas especies de Cyrtocarpa y arboles de mango (Mangifera indica) proveen frutos comestibles. Entre las especies mas comerciales a nivel mundial se encuentran Anacardium Occidentale, ya que sus semillas son nutricionales. (Smith, 2004).

2.1.7 Antecedentes de la Familia Se puede evidenciar que tienen especies muy importantes como lo es Pistacia vera, nativa de la región del mediterráneo. Esta especie tiene un valor económicamente significativo, ya que provee frutos comestibles, además de presentar actividad antiinflamatoria, antioxidante e hipoglicemica. (Özcelik, 2005). También se conoce de Mangifera indica, la cual se utiliza como laxante, defensa contra afecciones bronco- pulmonares y como alimento (García, 1992). Estudios de tamizaje fitoquimico demuestran la presencia de esteroides insaturados, cardenolicos, bufadienolicos, polifenoles y leucoantocianinas. La resina contiene mangifereno. (Blair, 2005)

Por otro lado Un análisis fitoquímico del Schinus molle revela que la planta contiene taninos, alcaloides, flavonoides, saponinas esteroidales, esteróles, terpenos, gomas, resinas y aceites esenciales. Estos últimos

22 son productos volátiles de composición química compleja, constituidos por veinte o más compuestos cuyos puntos de ebullición oscilan entre 150° y 300°C; se caracterizan fundamentalmente por impresionar agradablemente al olfato y al gusto, porque son mezclas de distintas sustancias olorosas pudiendo predominar el aroma de uno de sus compuestos (aunque no sea el más abundante) o bien puede estar constituido por la mezcla de los compuestos presentes (Yelasco- Negueruela, 1995). Los aceites esenciales presentes en las hojas, corteza y fruto del aguaribay son una rica fuente de triterpenos, sesquiterpenos y monoterpenos. Los terpenoides son los compuestos que se encuentran en mayor cantidad y la actividad insecticida se debe principalmente a dos compuestos: el cis-menth-2-en-l-ol y el trans-piperitol (Wimalaratneít, 1996), el fruto puede contener hasta un 5% de aceites esenciales además de la presencia de: a-pineno, b-pineno, piperina, (+)-limoneno, piperitona, carvacrol, mirceno, b-espatuleno y b-felandreno, entre otros compuestos.

Anacardium occidentale, presenta en el extracto acuoso de la corteza, efecto hipoglicemico, el extracto alcohólico es antipalúdico y febrífugo, el fruto se emplea como laxativo y expectorante, las hojas en decocción, reportan eficaces tratamientos contra ulceraciones de la boca (Bilbao, 1997). La corteza es rica en taninos y tiene un aceite caustico cuyo principio activo es el acido anacardico, empleado para proteger maderas contra el ataque de insectos; también se dice que la sal de sodio del acido anacardico es un detergente amónico muy activo. Se reporta que inhibe formas vegetativas de bacilos anaerobios y destruye in vitro venenos de Crotalus y Bothrops atrox y las toxinas tetánicas y diftéricas (Bilbao, 1997). Además se reporta, actividad antimicrobiana (Akinpelu, 2001) actividad antitumoral y diarreaica (Kudi, 1999). Se ha nombrado la presencia de los siguientes compuestos en diferentes partes del árbol: acetofenona, (-) –epiafzelequina, agathisflavona, anacardol, apigenina, alcohol araquidilico, acido-p- hidroxibenzoico, cardanol, naringenina, glicósidos de quercetina, selineno y vitamina c (Mahabir, 1995).

2.2 ANACARDIUM EXCELSUM (BER. ET BALB.)

2.2.1 Clasificación Taxonómica Según los ordenes y la clasificación de Engler (Syllabus edición 10 de 1924), Anacardium excelsum, presenta la siguiente clasificación taxonómica (Pérez, 1996)

REINO: Vegetal DIVISION: Angiospermae CLASE: Dicotiledóneas SUBCLASE: Arquiclamideas ORDEN: Sapindales FAMILIA: Anacardiaceas GENERO: Anacardium ESPECIE: A. excelsum

2.2.2 Sinónimos A.rhinocarpus DC, Rhinocarpus excelsa, Ber. et Balb (Bartholomaus, 1995)

2.2.3 Nombres Vulgares Brasil: cajuhy, cashu, cajuy, cajú; Costa Rica; espavel amarillo; Cuba: nariz; Guyana: caschou; Estados Unidos: wild cashew; Ecuador: caracolí, marañón; Honduras: marañón de montaña; Panamá: espavé, caracolí; Venezuela: mija, mijagua, chorote, merey montañero, quina; Colombia: Caracolí, merey. (Cáceres, 1980). (Programa Colombia forestal, 2005)

2.2.4 Distribución Geográfica Desde Honduras hasta el norte de América del Sur, incluyendo Ecuador y las Guayanas. En Nicaragua, es ribereño en el Pacífico, aunque crece también en la pluvioselva del Atlántico. En Costa Rica se encuentra

24 ampliamente distribuido aunque más frecuentemente en la vertiente del Pacífico, del nivel del mar a los 800 m de elevación. (Nichols, 1991) En Colombia, en el valle bajo del Atrato; rio León de Uraba; en las estribaciones de la Cordillera Occidental; en el departamento del Choco, en la cuenca del Sinu y parte del Magdalena Medio. También en el cañón del rio Cauca, en la Amazonia Colombiana y en los departamentos de Santander, Tolima y Huila (Cáceres, Meneses y Quintero, 1980).

2.2.5 Descripción Taxonómica

2.2.5.1 Fauste El árbol llega hasta los 45 metros de altura total; uno de los árboles más grandes de América Central y del sur, con el tronco derecho y libre de ramas en los primeros 15 metros. fauste comercial recto y cilíndrico; diámetro a la altura del pecho entre 100 y 150 cms, color caoba con lenticelas equidimencionales de tamaño mediano, poco conspicuas. (Maderas Colombianas, 1970).

FIGURA No. 1: Fotografia del arbol (Anacardium exelsum)

2.2.5.2 Corteza Viva, blanda y suculenta; la capa interna es de color amarillo rosado y la externa de color rosado. Resinosa y poco espesa; de 1.4 a 2.0 centímetros de espesor; algunas especies presentan exudados de color amarillo-rojizo que fluyen lentamente y en poca cantidad; apariencia fisurada. (Jiménez, 1970).

FIGURA No. 2: Fotografia de la corteza (Anacardium exelsum)

2.2.5.3 Hojas Presenta hojas simples, alternas, helicoidales, coriáceas y sin estipulas, agrupadas al final de las ramas. La corteza interior es gruesa, rosada y algo resinosa, con olor parecido a la trementina. Las hojas más jóvenes son alargadas y de ápice un poco agudo; las adultas son transovadas y de ápice redondeado, cuando se secan toman un color rojizo. (Cáceres, Meneses y Quintero, 1980).

FIGURA No. 3: Fotografia de la plantula con flor y fruto (Anacardium exelsum)

FIGURA No. 4: Fotografia de la Hoja (Anacardium exelsum)

2.2.5.4 Flores Flores, blancas, pequeñas y se presentan en panículas terminales. (Espinal, 1963).

FIGURA No. 5: Fotografia de la Flor (Anacardium exelsum)

FIGURA No. 6: Fotografia de la plantula con flores (Anacardium exelsum)

2.2.5.5 Frutos Sus frutos son una drupa reniforme, de forma arriñonada, de 2 a 3.5 cm de largo; sostenidos por un pedúnculo verde y a veces retorcidos (Cáceres, 1980).

FIGURA No. 7: Fotografia del fruto (Anacardium exelsum)

FIGURA No. 8: Fotografia de la plantula con fruto (Anacardium exelsum)

2.2.5.6 Madera La Madera seca al aire libre presenta el duramen de color marrón Bermejo bastante uniforme, con tono verdoso hasta rojizo o dorado. La albura bien diferenciada del duramen, es de color grisáceo blanquecino, con tono rosado más o menos acentuado. Olor y sabor no característico. Grano generalmente entrecruzado dispuesto en bandas de 2.5 a 6.5 centímetros de ancho. Su textura de mediana a gruesa, veteado de mediado a acentuado. Lustre mediano. La madera del caracolí es liviana, poco flexible y en general sus propiedades mecánicas son bajas. (Maderas Colombianas, 1970), (Cáceres, 1980).

2.2.6 Componentes Prácticamente no existe ningún trabajo que mencione los principales componentes químicos de anacardium excelsum, sin embargo Hernán Cáceres Rojas y Alberto Benavides Jiménez realizaron un trabajo en los años ochenta, donde desarrollaron la extracción y evaluación de los

31 taninos presentes en la corteza de Caracolí, para la contribución al estudio sobre el aprovechamiento químico de los extractos forestales (Cáceres, 1980). Este estudio, demostró la influencia de la edad sobre el porcentaje de taninos presentes en la corteza de caracolí. Donde los árboles con edades entre 30-35 años presentaron cifras de 17.2% de taninos en la base de la corteza seca y en los arboles entre 40-45 años de edad obtuvieron porcentajes de taninos de 13.2%. (Cáceres, 1980).

2.2.7 Importancia de la especie La importancia del Anacardium excelsum se basa en los siguientes aspectos:

A. Es una especie que esta ampliamente distribuida en todo el país y constituye un alto porcentaje del volumen disponible, en pie, de los bosques Colombianos. (Barghoorn, 1968)

B. Su madera presenta una amplia variedad de usos. Se le emplea en la construcción de viviendas, en ebanistería y en la fabricación de triplex. (Cáceres, 1980).

C. Es de las pocas especies tropicales que crece formando bosques densos y homogéneos, a veces asociado con las especies Prioria copaifera y Carapa spp. (Cáceres, 1980).

D. Debido a su rápido crecimiento y adaptabilidad a diversos climas, se considera como una especie apta para la reforestación en terrenos con altitud inferior a los 1000 metros sobre el nivel del mar. (Cáceres, Meneses y Quintero, 1980).

2.2.8 Usos e importancia Económica En condiciones tropicales y bajo cubierta, se dice que su mejor uso es la carpintería en general y la ensambladura de partes inferiores de muebles.

Es utilizada en construcción de interiores, pues sirve para elementos estructurales que soporten poco peso en tejados, paredes y suelos, por presentar una densidad media. Se usa en canoas, postes, utensilios livianos, muebles rústicos, centro de contrachapados. (Nichols, 1991)

Es apropiada para chapas desenrolladas, no requiere tratamientos térmicos. Tiene baja resistencia al corte, pero presenta superficies lanosas. Ejerce un efecto severo sobre los filos de las herramientas debido a los contenidos de Sílice. La madera es difícil de cepillar, con regulares propiedades de torneado y taladrado. Es fácil de moldurar. Tiene buenas propiedades para el escopleado. Es fácil de encolar. Fija bien clavos y tornillos. Se comporta bien con herramientas manuales. La madera tiene pobres propiedades de lijado. Es fácil de pulir. (Programa Colombia forestal, 2005)

Es importante en la construcción de vigas, viguetas, tableros, marcos, escaleras, montajes, encofrados, puertas; muebles (gabinetes); chapas y contrachapados (chapas decorativas); artículos torneados (muebles, cuchillería); herramientas (manuales, agrícolas); empaque (liviano, estibas); modelos a escala; usos navales; pilotes, tableros de partículas, molduras. (Programa Colombia forestal, 2005)

La corteza es usada como barbasco en Panamá. El macerado de corteza, ramas y hojas se usó como preservante de madera en el Medio Orinoco. (Programa Colombia forestal, 2005)

La madera es empleada en la fabricación de botes, remos, muebles ordinarios, formaletas y tableros de partículas. Las semillas tostadas al fuego son comestibles, pero sí se comen crudas resultan tóxicas debido a que contienen un aceite volátil llamado cardol. Los árboles de esta especie se pueden utilizar para reforestar y proteger los causes de los ríos. (Programa Colombia forestal, 2005)

2.2.9 Propagación y Crecimiento (Por semilla). Los frutos se secan al sol durante 12 horas y luego se extraen las semillas; estas se dejan en agua 1 día y posteriormente se siembran en semillero a 3 cm de profundidad, a 5 cm entre si, en líneas separadas de 10 cm. El trasplante se efectúa cuando la plántula alcanza 20 cm. Exige suelos húmedos. (Bartholomaus, 1995)

2.2.10 Ecología En América central y del sur es un árbol ribereño del bosque seco tropical, se desarrolla sobre las faldas y aluviones en las zonas de vida tropical y sobre aluviones en bosque muy húmedo tropical. También crece en regiones costeras con suelos bien drenados. No crece en elevaciones muy altas y alcanza su desarrollo óptimo en los suelos más bajos y bien drenados. Requiere suelos con una capa freática alta, por lo que a menudo se encuentra a la orilla de ríos y quebradas, incluso en rodales puros llamados "espavelares", donde muestra una vigorosa regeneración natural. ( Nichols 1991).

Deja caer parcialmente sus hojas durante la estación seca, pero las repone a inicios de la estación lluviosa. Antes de caer las hojas se tornan amarillas en la copa del árbol. Florece y fructifica de febrero a mayo. Las flores son visitadas por abejas y otros insectos. Las semillas son dispersadas por animales. Algunas especies de murciélagos se alimentan de los pedúnculos maduros de los frutos y ayudan en la dispersión de las semillas. ( Nichols 1991).

2.3 MICROORGANISMOS

2.3.1 Generalidades Las bacterias son organismos unicelulares que pueden ser nocivos para la salud de los seres vivos y pueden producir enfermedades e incluso hasta la muerte, pero también existen algunos tipos de bacterias que son

34 indispensables para el funcionamiento del cuerpo del individuo. (López, 2001).

Una bacteria simple esta formada por tres capas externas que envuelven las estructuras internas; la capa pegajosa protege la pared celular rígida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable. (López, 2001)

El material genético esta contenido en el ADN que forma el nucleoide. Los ribosomas que flotan en el citoplasma intervienen en la síntesis de proteínas. Todas las bacterias son organismos unicelulares, aunque en algunos casos pueden formar agregados y parecer multicelulares, siendo mucho más pequeñas que los protozoarios y los hongos verdaderos. (López, 2001)

Algunas especies de bacterias poseen apéndices, los cuales se pueden observar por medio de técnicas especiales de tinción al microscopio electrónico. (Wesley, 1996).

Las diferentes agrupaciones de cocos se presentan debido a la particularidad en la reproducción de las diferentes células. Las bacterias se multiplican por el proceso conocido como fisión binaria, por medio del cual una célula se divide transversalmente produciendo dos nuevas células. (López, 2001)

Las células bacterianas cilíndricas o bacilos no tienen la misma variedad de arreglos que los cocos. Ocasionalmente ellos se presentan en pares denominados diplobacilos o en cadenas llamadas estreptobacilos. En algunos casos estos arreglos no son modelos característicos morfológicos, sino que son debidos al estado de crecimiento o de las condiciones de cultivo de las bacterias. (Brock, 2001).

2.3.2 Staphilococcus aureus El termino Staphilococcus aureus deriva de la expresión griega staphyle (racimo de uvas) y fue escogida por el cirujano escocés Alexander Ogdson debido a su característica disposición microscópica en racimos. (Waldvogel, 2001).

Desde el punto de vista microscopio S. aureus, es un microorganismo Gram positivo caracterizado por cocos individuales con un diámetro de o.5 a 1.7 µm. Estos cocos aparecen en forma individual, en pares o en cadenas cortas y tienen una fuerte tendencia a formar racimos debido a que la división celular que se produce en los tres planos perpendiculares no conduce a la separación total de las células hijas. S. aureus se caracteriza por el rápido crecimiento en el agar sangre y otros medios de cultivo no selectivo. Las colonias individuales están claramente definidas, lisas, opacas y convexas, con un diámetro de 1 a 3 mm dentro de las 24 horas; son betahemoliticas. En ciertas condiciones (ejemplo: crecimiento en condiciones anaerobias o en medios liquidos) la pigmentación es cremoso-amarilla a dorada clásica causada por los carotenoides. Casi todas las cepas de S. aureus producen hemolisis dentro de las 24 a 36 horas. Cuando están encapsulados los microorganismos aparecen como colonias mucosas y pegajosas. Ocasionalmente, por ejemplo después de un tratamiento con aminoglucosidos, pueden aparecer como colonias pequeñas diferentes, no pigmentadas, no hemolíticas que revierten al estado normal con un suplemento con hemina y menadiona. (Waldvogel, 2001). Los estafilococos se encuentran entre las bacterias no esporuladas mas resistentes y pueden sobrevivir en muchas condiciones ambientales no fisiológicas. Estos microorganismos pueden ser cultivados a partir de material clínico desecado después de varios meses, son relativamente resistentes al calor y pueden tolerar medios con mucha sal. Por consiguiente, no es sorprendente que pese a la disponibilidad de agentes antimicrobianos potentes, al mejoramiento de las condiciones de salud publica y a las mejores medidas de control de las infecciones

36 hospitalarias Staphylococcus aureus siga siendo un patógeno importante en las enfermedades humanas. Básicamente produce enfermedades en la piel, puede producir neumonía, artritis y endocarditis, etc.

FIGURA 9: Staphylococcus aureus

2.3.3 Bacillus subtilis Es un bacilo Gram positivo, posee esporas centrales ovaladas o cilíndricas, es aerobio facultativo, capaz de hidrolizar caseína y almidón; tiene esporangios no inflados y esporas de pared delgada. Produce subtilisina agente que inhibe o mata a especies estrechamente relacionadas o incluso cepas diferentes de la misma especie. El antibiótico se libera cuando el cultivo alcanza la fase estacionaria de su crecimiento, tras la cual inicia la esporulación. Puede aislarse fácilmente del suelo o de partículas de polvo en suspensión y es uno de los organismos mas corrientes cuando se siembra por estrías. Los formadores de esporas pueden aislarse selectivamente a partir de suelo,

37 de los alimentos o de los materiales, dejando las muestras a 80 grados centígrados durante 100 minutos; este tratamiento destruye completamente las células vegetativas, mientras que muchas de las esporas presentes se mantienen viables (Brock, 2001).

FIGURA 10: Bacillus subtilis

2.3.4 Escherichia Coli Escherichia Coli es el microorganismo de vida libre mejor estudiado. Los gérmenes pueden ser móviles o inmóviles y la mayoría fermenta la lactosa. (Waldvogel, 2001). Es un bacilo de 1 – 3 µm por 0.5 µm, que se presenta solo, en pares, en cortas cadenas o formando grupos. En general es móvil (flagelos peritricos), aunque existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general no es capsulado y Gram negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente. (Carmona, 1997).

E.coli crece bien en medios comunes de laboratorio. El caldo simple crece en abundancia, formando una turbiedad uniforme, y un anillo, pero no en película, con fuerte olor fecaloide. En agar forma colonias circulares de 3- 5 mm convexas, de borde continuo o un tanto ondulado, brillantes y de

38 coloración blanca un poco amarillenta. Las pruebas bioquímicas utilizadas con frecuencia para identificar a E.coli en el laboratorio son: la reacción de rojo de metilo es positiva, la prueba de Voges-Proskauer (VP) es negativa, la actividad de ureasa y fenilalanina dreaminasa esta ausente, no se produce H2S, no se puede utilizar el citrato como la única fuente de carbono y el microorganismo no crece en presencia de KCN4. (Waldvogel, 2001).

Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37 C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de temperaturas; el pH favorable es de 7 y algunas cepas producen hemolisina. El bacilo coli es relativamente resistente; permanece vivo por algún tiempo por fuera del organismo, en especial en condiciones de humedad y en aguas contaminadas. Tiene una estructura antigénica bastante heterogénea y al igual que otros géneros pertenecientes a la familia se divide en grupos con base en un antígeno somático (O) termoestable, de naturaleza lipopolisacarida, presente en la pared celular. (Carmona, 1997). La E.coli es la causa más frecuente de algunas de las infecciones bacterianas más comunes, incluyendo las infecciones del tracto urinario, la bacteriemia y la diarrea bacteriana. También es una causa importante de meningitis neonatal y puede producir otras infecciones clínicas incluyendo la neumonía. (Waldvogel, 2001).

FIGURA 11: Escherichia Coli

2.3.5 Salmonella Sp Salmonella Sp. son bacilos Gram negativos no esporulados de esporas de la familia Enterobacteriaceae. Son móviles por medio de flagelos peritricos; crecen fácil y rápidamente en medios simples, en condiciones aerobias o anaerobias; pueden hacerse cultivos de muestras que normalmente son estériles, como sangre liquido articular, en medios comunes como agar-sangre. En la gran mayoría de los casos, los seres humanos adquieren el microorganismo por la ingesta de agua o alimentos contaminados. También se han producido infecciones por la ingesta de medicamentos o agentes diagnósticos contaminados (Gerald, 2002). La amplia distribución de las Salmonellas en el medio ambiente, la prevalencia creciente de estos microorganismos en la cadena alimentaria general, la virulencia y la capacidad de adaptación de estas bacterias determinan que revistan una enorme importancia medica, sanitaria y económica en todo el mundo (Waldvogel, 2001).

FIGURA 12: Salmonella

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

3.1 PROBLEMA ¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos de hojas, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza de la especie vegetal Anacardium excelsum, frente a microorganismos como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis (Gram positivos), Escherichia coli y Salmonella (Gram negativos)?

3.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACION Es conocido que las plantas han cumplido un papel importante en el área de la terapéutica gracias a las múltiples propiedades que ellas poseen. Debido a esto en los últimos años ha ido tomando cada día mayor importancia su estudio y el desarrollo de técnicas analíticas que permitan la determinación e identificación de las sustancias o principios activos contenidos en un vegetal (Ortiz, 2003). El poder constatar la presencia de estos principios activos es un resultado de gran ayuda para la creación de nuevas técnicas de control biológico y antimicrobiano.

Colombia es poseedora de una gran variedad de plantas cuyas propiedades no han sido descubiertas por completo, como aporte a este tipo de investigación se ha escogido a la especie Anacardium excelsum. Esta especie se caracteriza por estar ampliamente distribuida en todo el país y constituye un alto porcentaje del volumen disponible, en pie, de los bosques Colombianos (Diez, 1998). Además, es un árbol de unos 45m de altura lo cual lo hace atractivo para cualquier tipo de trabajo ya que esto permite pensar que puede ser importante a nivel de producción y demás tipos de estudios, en comparación con otras especies e incluso la misma Anacardium occidentale, la cual tiene un tamaño poco considerable con tan solo 8 metros de altura (Mahabir, 1995).

Se analizaron varios órganos de planta como los son, hojas, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza; debido a que estos organismos multicelulares (plantas) tienen partes orgánicas constituidas diferencialmente, todas ellas mantenidas en una compleja interdependencia. Durante su entero ciclo vital sufren un crecimiento, desarrollo y diferenciación continuos. En relación con el metabolismo secundario, significa que una sustancia particular puede ser sintetizada solamente en una determinada parte de la planta, en una etapa determinada de su desarrollo y a un determinado tiempo en el ciclo vital y progresión estacional de la planta (Bulock, 1969).

Por otro lado se conoce que especies del mismo genero (Anacardiaceas), entre ellas la especie Anacardium occidentale posee, actividad antimicrobiana frente a varios microorganismos importantes, como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Salmonella (Akinpelu, 2001), (Kudi, 1999), (Ozcelik, 2005), los cuales recientemente han evidenciado, que presentan cierto desarrollo, en la resistencia a nuevos antibióticos y otros problemas epidemiológicos. Además se ha determinado, que estos microorganismos, volvieron a ser patógenos importantes en las enfermedades humanas (Waldvogel, 2001). Es por estos aspectos que Anacardium excelsum, es una posible alternativa para estos tópicos de interés.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos a partir de hoja, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza de la especie vegetal Anacardium excelsum, frente a microorganismos patógenos como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Salmonella.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Recolectar el material vegetal en el Municipio de Piedecuesta Santander y realizar su identificación taxonómica. Obtener los extractos etanolicos de hoja, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza de la planta seleccionada. Fraccionar los extractos totales de hoja, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza de Anacardium exselsum en diferentes polaridades, éter de petróleo (baja polaridad), diclorometano (medianamente polar) y etanol/butanol (polar) Realizar ensayos antimicrobianos biodirigidos mediante La técnica de difusion por pozos frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Salmonella Sp.. Realizar la separación de los extractos y fracciones que presenten actividad antimicrobiana en los ensayos biodirigidos, por medio de cromatografía de columna; y la identificación de sus tipos de metabolitos por cromatografía de gases y masas.

5. MATERIALES Y METODOS

5.1.1 Materiales de Laboratorio Molino, aparato de soxhlet, rotavapor Buchi, incubadora, nevera, mecheros, horno, cámaras y placas cromatografícas, pipetas, micropipetas; botellas ámbar, frascos de vidrio, cajas de petri, embudo de decantación, erlenmeyer, beaker

5.1.2 Reactivos Agar Mueller Hinton, etanol, diclorometano, éter de petróleo, metanol, cloroformo, silica gel, Dimetilsulfoxido (DMSO), Gentamicina.

5.2. METODOS 5.2.1 Material vegetal El material vegetal fresco, se debe extraer dentro de un plazo máximo de 24 horas desde la recolección. También las plantas pueden ser secadas para su extracción, lo cual requiere de algunas condiciones especiales para que el procedimiento sea controlado. Los órganos vegetales deben ser secados lo mas rápido posible, usando bajas temperaturas (por debajo de 40 °C) y preferiblemente con una buena corriente de aire, asegurando que el contenido de humedad no sea mayor del 10%. Una vez seco, el material entero puede ser almacenado para el análisis posterior, incluso hasta por largos periodos de tiempo, en lugares frescos, secos y protegidos de la luz, en recipientes herméticamente cerrados. (Pedrozo, 1999)

5.2.2 Técnicas de extracción La investigación fitoquímica se apoya en un tratamiento general de extracciones y sucesivas separaciones mediante solventes de diferentes polaridades, con el fin de agrupar en fracciones los metabolitos estructuralmente semejantes y posteriormente caracterizarlos (Bilbao, 1997).

Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los diversos compuestos encontrados en el material vegetal, así, para las sustancias de baja polaridad se utilizan solventes como éter de petróleo y diclorometano; para sustancias de mediana y alta polaridad se utiliza acetato de etilo, etanol y acetona. (Torrenegra, 1983).

Se usa etanol al 96% como solvente para obtener el extracto total ya que este infiltra en los órganos de los tejidos vegetales, liberando sustancias naturales como resinas, ceras, bálsamos y gomas (Roncancio, 2001). El etanol se utiliza porque es un solvente frio y es uno de los solventes con mayor polaridad, extrayendo mayor cantidad de sustancias, lo que es de gran importancia para la actividad biológica de un vegetal (Roncancio, 2001).

Los métodos más utilizados en la extracción total son maceración en frio y extracción por soxhlet con reflujo, el cual se basa en una extracción con calor, para facilitar la obtención de las sustancias presentes en el material vegetal. El equipo consta de un balón en donde se deposita el material vegetal, un refrigerante que evita la evaporación del solvente y ayuda a la circulación del mismo (Pomilio, 1985). En la maceración con frio, el material se mezcla con el solvente triturado constantemente en frio. (Deanna, 1991)

El fraccionamiento del extracto total se realiza por medio de extracciones continuas y discontinuas liquido-liquido; las extracciones continuas se efectúan con solventes, de diferentes polaridades. Estos deben disolver sustancias con polaridad similar, teniendo en cuenta que el coeficiente de reparto es independiente de la cantidad de sustancia pero es función de la presión y la temperatura. (Pedrozo, 1999). En la extracción discontinua liquido-liquido, se toma del extracto total de cada parte de la planta, estos se colocan en un embudo de decantación. Posteriormente se adiciona éter de petróleo y por diferencias de densidad el extracto total queda

45 abajo, y el éter queda arriba. Acá se ve claramente separada las dos sustancias por colores, texturas y espesor. Es en este punto se agita el embudo para que el solvente se mezcle con el extracto. Después de agitar 5 minutos, el solvente que se encontraba arriba cambia de color, indicando que separo las moléculas de su misma polaridad del extracto total, se abre la llave del embudo que se encuentra en la parte inferior de este para que salga el extracto total. Cuando este sale queda el solvente y este se concentra en un rotavapor tipo flash Buchi 461, con el fin de obtener los solventes y las sustancias extraídas o metabolitos. Este procedimiento se debe hacer una y otra vez hasta que el solvente que esta en la parte superior del embudo quede de color transparente indicando que ya no contiene más metabolitos del extracto total. Cabe anotar que este procedimiento se debe hacer con los solventes de diferentes polaridades como el éter de petróleo, diclorometano y butanol.

5.2.3 Métodos de Evaluación Antimicrobiana Se conoce como agente antimicrobiano a un producto químico que mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos (Brock, 2001). Tal sustancia puede ser un producto químico de síntesis o un producto natural (Brock, 2001).

5.2.3.1 Técnica de Difusión por Pozos Esta técnica permite medir el efecto del extracto mediante la presencia o ausencia de un halo de inhibición de crecimiento alrededor de un pozo (Sánchez, 2006).

Por otro lado, para detectar la actividad antimicrobiana se debe tener en cuenta las siguientes condiciones:

A. El extracto de la planta debe ponerse en contacto con la pared celular del microorganismo seleccionado para la prueba.

B. Debe existir un medio de cultivo para observar la cantidad de crecimiento del microorganismo durante el periodo de tiempo elegido para la prueba (control de crecimiento). . (Roncancio, 2001)

5.2.3.2 Concentración Mínima Inhibitoria Para poder medir la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico determinado, se debe tener en cuenta la concentración mínima inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. Así se logra alcanzar en el organismo la (CMI) con dosis terapéuticas, podremos afirmar que la cepa es sensible al antibiótico (Pulido, 2002). Son muchas las técnicas de medición de la actividad antimicrobiana, entre ellas se encuentra la técnica de difusión por pozos, la cual permite medir el efecto del extracto mediante la presencia o ausencia de un halo de inhibición de crecimiento alrededor del pozo (Sánchez, 2006).

5.2.3.2 Cromatografía En la separación de compuestos, la cromatografía es un método importante. La cromatografía es un método de separación basado en el retardo de las sustancias durante su paso por una matriz adsorbente, lo que implica la presencia de una fase móvil y una estacionaria (Chaves, 2002). Es posible que el reparto se deba a una disolución, adsorción, absorción, intercambio de iones o a propiedades de exclusión por tamaño de una de las fases. Esta técnica permite separar muestras en pequeña escala e identificar sustancias orgánicas e inorgánicas tales como aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, esteroles, hormonas esteroides, ácidos grasos, nucleótidos y ácidos nucleicos (Chaves, 2002).

5.2.3.3 Cromatografía en Capa Delgada (CCD) Esta técnica también comprende una fase móvil, la cual es el solvente o las mezclas de solventes y una fase estacionaria que es la silica gel. Sobre las placas se coloca la muestra de los extractos seleccionados

47 previamente según su capacidad antimicrobiana; estos se colocan por medio de capilares, para después introducirlas en una cámara cromatografíca con el solvente o la mezcla de ellos. Después, se dejan secar las placas y se colocan bajo luz ultravioleta para observar las fluorescencias. Se comprueba la detención de compuestos antimicrobianos, humedeciendo la placa con un revelador químico, en este caso vainillina H2SO4 al 0.1%, y finalmente se evidencia la efectividad de la prueba, colocando las placas en un horno durante 3 a 6 minutos. La cromatografía en capa delgada es una técnica muy utilizada ya que presenta algunas condiciones favorables como:

A. Velocidad en el desarrollo de separación de los componentes. B. Sensibilidad, ya que separa cantidades muy pequeñas. C. Se utiliza un equipo simple y de bajo costo. D. Utiliza una pequeña cantidad de solvente y muestra a ser analizada. E. Posibilidad de revelar las placas con reactivos cromogenicos, lo cual hace posible detectar sustancias que no absorben en la región UV visible. F. Posibilidad de analizar varias muestras en una sola placa cromatografíca. (Roncancio, 2001)

5.2.3.4 Cromatografia en Columna La cromatografía de columna consta de una fase estacionaria dentro de un cilindro o columna de vidrio, con una llave de paso de sustancias, obteniéndose una columna del material retenedor (Pedrozo, 1999). Aquí se usa silica gel para separar las sustancias de baja polaridad y las sustancias de alta y media polaridad se separan por RP-18.

5.2.3.5 Bioautografia Es una técnica que involucra un método de separación (CP, CCD) y una biológica (difusión en gel) en el cual se pueden evaluar tanto hongos (saprofitos) como bacterias. Esta técnica es mas utilizada para compuesto lipofilicos en CCD y para compuestos polares en CP. (Kline, 1975)

Básicamente la técnica consiste en separar la mezcla vegetal a ensayar, por cromatografía en capa delgada y se desarrolla por duplicado. Luego, se coloca uno de los cromatogramas realizados sobre las cajas de agar previamente inoculado con la bacteria a estudiar; se debe colocar la placa cromatografíca (dentro de la caja de petri) en una nevera a temperatura aproximada de 4 °C alrededor de 16 horas, para que las sustancias sean difundidas hacia el medio. Después se retira la cromatoplaca de la caja de petri y se lleva a la incubadora a una temperatura de 37 °C durante 24 horas; aquí se debe observar las zonas de inhibición de crecimiento, posteriormente con la segunda placa se debe revelar en vainillina para establecer la posición de las fracciones obtenidas en la cromatografía para su posterior comparación con la actividad antimicrobiana. (Mclaughlin, 1991)

5.2.4 Cromatografía de gases y detector de Masas La cromatografía de gases tiene dos importantes campos de aplicación; por una parte su capacidad para separar mezclas orgánicas complejas, compuestos organometálicos y sistemas bioquímicos; su otra aplicación es como método para determinar cuantitativa y cualitativamente los componentes de la muestra. Para el análisis cualitativo se suele emplear el tiempo de retención, que es único para cada compuesto, dadas unas determinadas condiciones (mismo gas portador, rampa de temperatura y flujo), o el volumen de retención. En aplicaciones cuantitativas, se desarrolla integrando las áreas de cada compuesto o midiendo su altura, con los calibrados adecuados y se obtiene la concentración o cantidad presente de cada analito (Skoog, 1994).

5.3 METODOLOGIA 5.3.1 Recolección y Preparación del Material Vegetal El material vegetal fue recolectado en el Municipio de Pie de Cuesta, ubicado en el departamento de Santander; bajo las coordenadas de 7˚06’32.51”N y 73˚06’15.19”O, a una elevación de 986 msnm; Su determinación taxonómica fue realizada por O.A Jara en el Herbario Nacional de Colombia, dependencia del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, en donde el ejemplar se encuentra identificado bajo el numero COL 520397, y con el nombre de Anacardium excelsum (Bertero & Balb. ex Kunth) Skeels. El material vegetal colectado, comprendió hojas, frutos, testa, tegumento, semilla, flor y corteza, los cuales se separaron individualmente, para ser secados a temperatura ambiente (18 °C aproximadamente) durante unos 12 días, para liberarlo de agua y evitar la disolución de los solventes miscibles en ella (Pedrozo, 1999). Luego el material ya seco se pulverizo en un molino, para que así se pueda permitir fácilmente la entrada del solvente a los tejidos vegetales. Las hojas, frutos, testa, tegumento, semilla, flor y corteza, se estudiaron por separado, para poder obtener resultados independientes según el órgano de la planta.

FIGURA 13: Tegumento pulverizado de Anacardium excelsum

FIGURA 14: Semilla pulverizada de Anacardium excelsum

FIGURA 15: Fruto pulverizado de Anacardium excelsum

FIGURA 16: Flor pulverizada de Anacardium excelsum

FIGURA 17: Testa pulverizada de Anacardium excelsum

FIGURA 18: Corteza pulverizada de Anacardium excelsum

FIGURA 19: Hoja pulverizada de Anacardium excelsum

5.3.2 Obtención de los Extractos Vegetales Para la obtención del extracto total de cada órgano seleccionado de la planta, cada órgano pulverizado se monto en aparato de soxhlet y se dejo a una temperatura de 45 grados centígrados hasta que el solvente desarrollara la extracción, lo cual duro aproximadamente 48 horas. Durante este tiempo el disolvente se infiltra en los tejidos de los órganos vegetales, liberando sus sustancias naturales. Posteriormente el extracto total etanolico se filtro y se concentro en un rotavapor a 40 °C a 175 mbar de presión. El fraccionamiento del extracto total etanolico, se realizo a partir de extracciones discontinuas liquido-liquido en un embudo de decantación, los solventes utilizados fueron éter de petróleo, diclorometano y etanol/butanol; Finalmente tanto la destilación de los solventes como la concentración de los extractos fueron realizados en un rotavapor tipo flash Buchi 461

5.3.3 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana de los Extractos y Fracciones Después de la obtención del extracto y de las fracciones, se procedió a desarrollar las pruebas de actividad antimicrobiana siguiendo todas las técnicas de ensayo aprobadas por la Organización Mundial para la Salud. Los métodos aplicados se realizaron por triplicado y bajo estrictas medidas de higiene y esterilidad exigidas para este tipo de pruebas.

5.3.3.1 Microorganismos de Ensayo Cuando se hacen bioensayos sobre microorganismos, es importante obtener el cultivo de una fuente confiable, donde exista una confirmación del cultivo. Estas fuentes incluyen colecciones nacionales e internacionales de cultivo y colecciones universitarias. En este estudio se utilizaron cepas bacterianas Gram positivas como Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis y microorganismos Gram negativos como Escherichia coli y salmonella. Estas cepas fueron obtenidas del cepario de la Facultad de Ciencias Básicas de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.3.3.2 Técnica de Difusión por Pozos Para observar la actividad antimicrobiana de los extractos etanolicos , principalmente las pruebas se hicieron por triplicado. Se realizo una siembra masiva de las cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli y salmonella sobre la superficie del medio de cultivo Mueller Hinton. Posteriormente se efectuaron 4 perforaciones por caja de petri; en cada una de las perforaciones se vertió 50 µl del extracto total en diferentes concentraciones (10, 20 y 40 µg /ml) disueltas en DMSO; y en la perforación restante se difundió el control positivo (gentaminicina) o el control negativo (DMSO). Después se llevo a la incubadora por un tiempo de 24 a 48 horas y se realizo la lectura. Los correspondientes extractos que mostraron actividad antimicrobiana, se les volvió a practicar ensayos antimicrobianos biodirigidos, pero con las fracciones de diferentes polaridades obtenidas a partir del extracto total; vale la pena mencionar que el procedimiento fue igual al anteriormente mencionado.

Es importante la incorporación de controles positivos y negativos dentro del bioensayo. El control negativo asegura que no sea el ensayo mismo el responsable de cualquier actividad que se observe, mientras que el control positivo suministra un punto de reparto frente al cual la potencia de la actividad de un extracto o compuesto activo puede ser medido. (López, 2001)

5.3.4 Bioautografia Se realizo una siembra masiva de Bacillus subtillis en tres cajas de petri con agar Muller Hinton. Posteriormente se corrieron las fracciones que obtuvieron actividad antimicrobiana en los ensayos antimicrobianos. Estas fracciones fueron la de tegumento y semilla en etanol y la de testa en éter de petróleo, estas se corrieron en una cromatografía de capa delgada por duplicado, las cuales se dejaron secar a temperatura ambiente (Ver tabla

1). Una de las dos placas de cada fracción se revelo con vainillina y la otra se uso para la bioautografia. Las cromatoplacas hechas para la bioautografia se pusieron en contacto directo con la siembra realizada en las cajas de petri con Bacillus subtillis durante 17 horas a 4°C posteriormente se retiraron las placas de cada una de las cajas y se llevaron a la incubadora a 35°C por 24 horas.

FRACCIONES FASE MOVIL FASE ESTACIONARIA Éter de Petróleo Petrol: CH2Cl2 (1:1) testa Silica Gel

Etanol CH2CL2:MeOH (8:2) Tegumento Silica Gel

Etanol CH2CL2: MeOH (8:2) Semilla Silica Gel TABLA 1: Cromatografía en capa delgada de las fracciones de testa, tegumento y semilla obtenidas a partir del extracto total etanolico.

5.3.5 Percolación por Cromatografia a Presión Atmosférica de la Fracción etanolica del tegumento Se tomaron 5 gramos de la fracción de tegumento en etanol y se mezclo con 50 gramos de silica gel. Luego se eluyo con 500ml de éter de petróleo, cloroformo, diclorometano y metanol de cada uno, para extraer las subfracciones de la fracción de tegumento en etanol. Cuando se obtuvieron los subfracciones de cada solvente, se realizaron placas cromatograficas; en la tabla 3 se observan la fase móvil y estacionaria de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción etanolica del tegumento .

SUBFRACCION PESO (g) Éter de Petróleo 0.71 Cloroformo 0.47

Diclorometano 0.54 Metanol 2.8715 TABLA 2: Pesos de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción etanolica de tegumento

SUBFRACCIONES FASE MOVIL FASE ESTACIONARIA

Éter de Petróleo CH2CL2 :MeOH (8:2) RP-18 Cloroformo CH2CL2 : MeOH (8:2) RP-18 Diclorometano CH2CL2 :MeOH (8:2) RP-18 Metanol H2O + MeOH (1:1) y (4:3) RP-18 TABLA 3: Cromatografía en capa delgada de las subfracciones obtenidas a partir de la fracción etanolica de tegumento

La subfracción de metanol fue la única que logro arrastrar sustancias, por lo cual se prepararon dos placas. Las proporciones utilizadas fueron 1:1 agua-metanol y 4:3 agua-metanol.

5.3.6 Cromatografía en Columna a presión atmosférica de la subfracción de Metanol A la subfracción de metanol obtenida a partir de la fracción etanolica de tegumento se le monto una cromatografía en columna, para poder separar sus grupos de compuestos, para así desarrollar un análisis en cromatografía de gas acoplado a masas. Se tomaron 650 mg de la subfracción en metanol, esta se percolo en una columna. La fase estacionaria se hizo con RP-18 y se eluyo con la fase móvil en H2O: MeOH (1:1). Se obtuvieron 16 muestras las cuales fueron analizadas en un CG-MS para la identificación de sus metabolitos.

6. RESULTADOS

6.1 Material Vegetal Resultado de los pesos de los órganos seleccionados de Anacardium excelsum antes y después de la extracción (Ver tabla 4)

PESO DEL ORGANOS PESO (g) EXTRACTO TOTAL ETANOLICO (g) A: Tegumento 53.4 23.8 B: Semilla 614.8 180.7 C: Fruto 39.2 14.1 D: Flor 263.1 53.3 E: Testa 476.7 61.3 F: Corteza 273.3 73.1 G: Hoja 325.7 73.2 TABLA 4: Pesos del Material Vegetal seco y molido antes y después de la extracción de cada uno de los órganos estudiados

ORGANO FRACCION PESO (g) Éter de Petróleo 7.9 A: Tegumento Diclorometano 6.9 Etanol 8.9 Éter de Petróleo 13.9 B: Semilla Diclorometano 12.1 Etanol 9.8

Éter de Petróleo 1.9 C: Fruto Diclorometano 3.9 Etanol 0.8 Éter de Petróleo 8.9 D: Flor Diclorometano 5.4 Etanol 7.7 Éter de Petróleo 10.1 E: Testa Diclorometano 11.1 Etanol 4.5 Éter de Petróleo 7.9 F: Corteza Diclorometano 4.2 Etanol 12.9 Éter de Petróleo 17.3 G: Hoja Diclorometano 1.9 Etanol 12.8 TABLA 5: Peso de las Fracciones Obtenidas a partir del extracto total etanolico de cada uno de los órganos estudiados

6.2 Revisión de los Microorganismos de Ensayo

6.2.1 Staphilococcus aureus Las colonias de S. aureus presentaron un color amarillo, redondas, cremosas y brillantes con borde regular. Al ser observadas en el microscopio se aprecian cocos Gram positivos agrupados en racimos. Al realizar la prueba de coagulasa su reacción fue positiva y al crecer sobre agar sangre presento hemolisis. (Ortiz, 2003)

6.2.2 Bacillus subtilis Al observar este microorganismo al microscopio se observan bacilos largos Gram positivos. Macroscópicamente se observan colonias grandes extendidas, de color blanco grisáceo, con bordes irregulares. Prueba de catalasa positiva y glucosa, manitol y sacarosa positiva. (Ortiz, 2003)

6.2.3 Escherichia coli Microscópicamente se observo bacilos rectos Gram negativos y macroscópicamente se evidencio colonias planas, poco convexas húmedas con superficie brillantes y bordes enteros. Con respecto a las pruebas bioquímicas reacciono; oxidasa negativa, indol positivo, urea negativo y motilidad positivo.

6.2.4 Salmonella Sp Bacilos Gram negativos no esporulados

6.3 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana

6.3.1 Extractos Totales Con respecto a la actividad biológica de los extractos etanolicos de los órganos estudiados de Anacardium excelsum se puede decir que en primera medida, ningún extracto total presento actividad frente a los microorganismos Gran negativos Escherichia coli y Salmonella, mientras que con respecto a los microorganismo Gram positivos Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis si se evidencio actividad antimicrobiana; en donde la actividad fue medida con el tamaño que presenta el halo de inhibición. Se utilizaron concentraciones de 10, 20 y 40 µg /ml, en donde se utilizo DMSO para disolver el extracto. El control positivo fue gentamicina y el control negativo fue DMSO. A. Presenta actividad: (Halo mayor a 5mm) B. No presenta actividad: (Halo igual o menor a 5mm)

A continuación presentaremos las tablas que muestran la actividad antimicrobiana de los extractos totales de Anacardium excelsum: ORGANO CONCENTRACI CONCENTRACION CONCENTRACION ON (10) µg /ml (20) µg /ml (40) µg /ml A:Tegumento 12 mm 15 mm 19 mm B: Semilla 0 mm 11 mm 12 mm C: Fruto 12 mm 14 mm 18 mm D: Flor 11 mm 12 mm 14 mm E:Testa 13 mm 14 mm 16 mm F: Corteza 9 mm 10 mm 12 mm G: Hoja 12 mm 14 mm 14 mm TABLA 6: Actividad Antimicrobiana de los extractos totales de Anacardium excelsum frente a Bacillus subtillis

ORGANO CONCENTRACI CONCENTRACION CONCENTRACION ON (10) µg /ml (20) µg /ml (40) µg /ml A:Tegumento 14 mm 16 mm 20 mm B: Semilla 13 mm 15 mm 17 mm C: Fruto 10 mm 13 mm 13 mm D: Flor 14 mm 15 mm 17 mm E:Testa 10 mm 13 mm 16 mm F: Corteza 7 mm 10 mm 12 mm G: Hoja 15 mm 15 mm 18 mm TABLA 7: Actividad Antimicrobiana de los extractos totales de Anacardium excelsum frente a Staphilococcus aureus

FIGURA 20: Actividad antimicrobiana del extracto total de Tegumento de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 40 µg /ml, B: 20 µg /ml, C: 10 µg /ml.

FIGURA 21: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml.

FIGURA 22: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml.

FIGURA 23: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml

FIGURA 24: Actividad antimicrobiana del extracto total de Testa de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml.

FIGURA 25: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml.

FIGURA 26: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja de A. excelsum frente a Bacillus subtillis; A: 20 µg /ml, B: 10 µg /ml, C: 40 µg /ml.

FIGURA 27: Actividad antimicrobiana del extracto total de Tegumento de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 28: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 29: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 30: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 31: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 32: Actividad antimicrobiana del extracto total de Testa de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 33: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

FIGURA 34: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja de A. excelsum frente a Staphylococcus aureus; A: 10 µg /ml, B: 40 µg /ml, C: 20 µg /ml.

6.3.2 Fracciones Según los resultados de la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de Anacardium excelsum, las fracciones de fruto, flor, corteza y hoja no presentaron actividad frente a Bacillus subtillis; (cabe anotar que se uso solo este microorganismo ya que los extractos totales tuvieron inhibición y además porque es la Bacteria que más se utiliza debido a su incidencia en enfermedades y sus características metabólicas.) mientras que las fracciones de tegumento, semilla y testa si evidenciaron actividad (Ver tabla 8). La concentración de las fracciones fue de 40 µg /ml y se disolvieron en DMSO. El control positivo fue gentamicina y el control negativo fue DMSO.

ORGANO FRACCION HALO DE INHIBICION

Éter de Petróleo 15 mm A: Tegumento Diclorometano 16 mm Etanol/Butanol 19 mm Éter de Petróleo 13 mm B: Semilla Diclorometano 13 mm Etanol/Butanol 16 mm Éter de Petróleo 17 mm E: Testa Diclorometano 11 mm Etanol/Butanol 13 mm TABLA 8: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir del extracto total de Anacardium excelsum frente a Bacillus subtillis con una concentración de 40 µg /ml

FIGURA 35: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de Tegumento; A: Eter de petroleo, B: Diclorometano; C: Control positivo (gentamicina); D: Etanol.

FIGURA 36: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de semilla; A: Éter de petróleo, B: Diclorometano; C: Etanol; D: Etanol.

FIGURA 37: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de Testa; A: Éter de petróleo, B: Diclorometano; C: Control positivo (gentamicina); D: Etanol.

6.3.3 Bioautografia

Al observar las cromatoplacas de control de las fracciones de Tegumento y semilla en etanol y la cromatoplaca de testa en éter de petróleo, (se usaron específicamente estas fracciones, debido a que fueron las que mayor actividad antimicrobiana mostraron) con la luz U.V. de onda larga, se evidencia fluorescencia en las manchas que posiblemente poseen los compuestos antimicrobianos. En la lectura de las cajas de petri incubadas con las laminas de silica gel, se pudo apreciar que hubo inhibición de crecimiento por parte de los tres extractos seleccionados frente a Bacillus subtillis.

FIGURA 38: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Móvil: Petrol: CH2CL2 1:1) de la fracción en éter de petróleo de la Testa de A. excelsum frente a Bacillus subtillis

FIGURA 39: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Móvil: CH2CL2: MeOH 1:1) de la fracción en etanol de tegumento de A. excelsum frente a Bacillus subtillis

FIGURA 40: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Móvil: CH2CL2: MeOH 1:1) de la fracción en etanol de semilla de A. excelsum frente a Bacillus subtillis

6.3.4 Separación y análisis de la subfracción de Metanol obtenida a partir de la fracción etanolica del tegumento Se obtuvieron 16 muestras en la separación por cromatografía en columna, estas se pasaron por cromatografía de gases, para su posterior identificación (Ver tabla 9).

MUESTRA TIEMPO (M) % DE MOLECULA COINCIDENCIA Monocarbonil – (1, 3 2 16.871 74% butadieno-1, 4- acido dicarbonico, dietil ester)

6.302 86% 4- metoxy-6- (trimetilsilil)- 1,3- diazabifenil 4

8.907 80% Hexadecano – Cetano- isohexadecano

5 15.721 80% Fenol, 2-(1,1- dimetiletil)- 4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) 7.359 91% 1,2,3 Benzenetriol 6 16.751 93% Benzenesulfonanilil 7 11.258 74% 9- acido octadecenoico, 12- hydroxi-, metil ester, 10 15.751 80% Fenol, 2-(1,1- dimetiletil)- 4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) 4.6 86% Fenanthrenedicarboximida

9.940 72% 5,12-Diazaindeno[1,2- a]fenalene-3-carbonitrilo, 12(12ah)-oxo

14 11.576 98% fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil-

13.562 78% metill 2-(2-etil-1,3- dioxolan-2- metil)-1- hydroxypentano-4 TABLA 9: Compuestos Identificados en la subfracción de metanol por CG-EM, Comparados con la biblioteca Wiley

FIGURA 41: Cromatograma de la muestra 2 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol

FIGURA 42: Cromatograma de la muestra 4 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol

FIGURA 43: Espectro de masas a 70 ev de la muestra 5 de la subfracción en Metanol

FIGURA 44: Estructura del compuesto Fenol 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil)

FIGURA 45: Espectro de masas a 70 ev de la muestra 6 de la subfracción en Metanol

FIGURA 46: Estructura del compuesto 1,2,3 Benzenetriol

FIGURA 47 Espectro de masas a 70 ev de la muestra 6 de la subfracción en Metanol

FIGURA 48: Estructura del compuesto Benzesulfonanil

FIGURA 49: Cromatograma de la muestra 7 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol

FIGURA 50: Espectro de masas a 70 ev de la muestra 10 de la subfracción en Metanol

FIGURA 51: Estructura del compuesto Fenol 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil)

FIGURA 52: Espectro de masas a 70 ev de la muestra 14 de la subfracción en Metanol

FIGURA 53: Estructura del compuesto Fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil)

FIGURA 54: Cromatograma de la muestra 14 obtenida de la subfracción del tegumento en metanol

7. DISCUSION DE RESULTADOS

La especie vegetal Anacardium excelsum genera un gran interés desde el punto de vista biológico y químico ya que mostro actividad antimicrobiana por parte de algunos de sus metabolitos; teniendo en cuenta que esta especie vegetal no reporta estudios de su posible actividad antimicrobiana.

Los extractos totales de hojas, frutos, testa, tegumento, semilla, flor y corteza, de la especie vegetal Anacardium excelsum no evidenciaron Actividad antimicrobiana frente a los microorganismos Gram negativos, evaluados como Escherichia coli y Salmonella. Posiblemente estos microorganismos Gram negativos no generaron cierta sensibilidad frente a los extractos totales, tal vez por la complejidad de su pared celular. Las bacterias Gram negativas, contienen una capa no muy gruesa de peptidoglucano la cual esta compuesta por polisacáridos que desarrollan enlaces entre ellos mismos y también de aminoácidos los cuales no permiten fácilmente la entrada de sustancias, sin mencionar que además del peptidoglucano también poseen una membrana exterior que hace parte de la pared celular. En el caso de Escherichia coli se sabe que con el tiempo puede producir algunos tipos de esporas, las cuales generan resistencia bajo condiciones poco óptimas y además estas esporas son envueltas en una capa de acido dipicolinico, que es soluble en etanol (Dictionary of organic compounds. 1965)

Con respeto a las bacterias Gram positivas Bacillus subtillis y Staphilococcus aureus los extractos totales si mostraron actividad antimicrobiana (halo mayor a 5mm) en donde la concentración 40 µg /ml disuelto con DMSO fueron los que presentaron mayor actividad antimicrobiana.( Ver tabla 6 y 7.)

También se evaluó la actividad antimicrobiana de las fracciones que presentaron actividad, obtenidas de los extractos etanolicos, los cuales fueron solo probado en Bacillus subtillis, cabe anotar que se uso solo este microorganismo ya que los extractos totales tuvieron inhibición y además porque es la Bacteria que más se utiliza debido a su incidencia en enfermedades y sus características metabólicas. Aquí solo las fracciones de tegumento, testa y semilla presentaron actividad antimicrobiana. (Ver tabla 8).

Al observar estos resultados los cuales nos indican de que las fracciones de tegumento y semilla en etanol y testa en éter de petróleo con una concentración de 40 µg /ml obtuvieron el mayor porcentaje de inhibición, se realizo una bioautografia, la cual arrojo como resultado por parte de cada una de las tres fracciones utilizadas tres bandas de diferente polaridad baja, media y alta, donde la banda de alta polaridad mostro inhibición frente a B. subtillis. (Ver graficas 38-40)

En la percolación, se tomo la fracción de tegumento en etanol, ya que esta fue la fracción junto a las fracciones de semilla y testa que mostraron actividad, además de ser la fracción que tuvo mayor cantidad (en gramos) con respecto a las fracciones de semilla y testa. Posteriormente se le agrego éter de petróleo, cloroformo, diclorometano y metanol continuamente, para extraer las subfracciones en diferentes polaridades, la subfracción de metanol fue la única que logro arrastrar sustancias y a esta se le hizo una cromatografía en columna donde se obtuvieron 16 muestras.

Según los resultados obtenidos del cromatografo de gases, acoplado a masas, se observo que de las 16 muestras obtenidas en la cromatografía en columna del extracto de tegumento, solo se obtuvieron datos de las muestras 2,4,5,6,7,10,14 , los cuales nos indican que existen algunos conjuntos de compuestos derivados de los grupos terpenoicos, como

84 monoterpenos y derivados del benceno, como los fenoles, los cuales tienen poderosas propiedades antimicrobianas y antisépticas dando como resultado una acción germicida activa, debido a su gran potencial toxico. (Routh, J.I. 1990)

En estos resultados se sugiere que posiblemente los compuestos que presentan actividad antimicrobiana son el Fenol 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) presente el fracción 5 en un tiempo de 15.721 minutos y en la fracción 10 con un tiempo de 15.751 minutos. (ver tabla 9). También se encontró un compuesto en la fracción 14 con un tiempo de 11.576 el cual se denomino como fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil (ver tabla 9).

Cabe anotar, que se sugiere que los compuestos anteriormente mencionados son los posibles compuesto que presentan actividad, ya que son compuestos fenolicos, los cuales son sustancias de alta polaridad; como se vio anteriormente en la bioautografia, de las tres bandas presentadas, la banda de alta polaridad, muy bajo Rf, fue la que presento la actividad antimicrobiana frente a bacillus subtillis.

Hoy en día se conocen algunos compuestos presentes en la familia de las Anacardiaceas, especialmente de la especie Anacardium occidentale, la cual contiene compuestos en diferentes partes del árbol como acetofenona, (-) –epiafzelequina, agathisflavona, apigenina, alcohol araquidilico, acido-p- hidroxibenzoico, cardanol, naringenina, glicósidos de quercetina, selineno , vitamina c y anacardol (Mahabir, 1995). El compuesto de anacardol es una molécula que contiene grupos fenoles, los cuales se encuentran presentes en el tegumento de anacardium excelsum, lo cual muestra similitud entre este tipo de compuestos en la familia de las anacardiáceas.

8. CONCLUSIONES

Los extractos totales de hojas, frutos, testa, tegumento, semilla, flor y corteza, de las especie vegetal Anacardium excelsum presentaron actividad antimicrobiana frente a las bacterias Gram positivas Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis .

Los extractos totales de hojas, frutos, testa, tegumento, semilla, flor y corteza, de las especie vegetal Anacardium excelsum no presentaron actividad antimicrobiana frente a las bacterias Gram negativas Escherichia coli y salmonella.

Las fracciones de los extractos totales de tegumento, semilla y testa presentaron actividad antimicrobiana frente a Bacillus subtilis.

Las fracciones etanolicas de tegumento y semilla y la fracción de éter de petróleo de testa fueron las que obtuvieron mayor actividad antimicrobiana.

En la bioautografia realizada con las placas hechas de las fracciones de tegumento y semilla (etanol) y la placa de cascara (éter de petróleo) se evidencio actividad antimicrobiana.

De las 16 muestras obtenidas de la fracción de tegumento, las cuales fueron pasadas por un cromatografo de gases acoplado a masas, solo se genero información de las fracciones 2,4,5,6,7,10,14 , indicando que existen conjuntos de compuestos derivados de los grupos terpenoicos, como monoterpenos y derivados del benceno, como los fenoles.

Los posibles grupos que presentan actividad antimicrobiana presentes en la fracción de tegumento de Anacardium excelsum son Fenol 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) presente el fracción 5 en un tiempo de 15.721 minutos y en la fracción 10 con un tiempo de 15.751 minutos. También se encontró un compuesto en la fracción 14 con un tiempo de 11.576 el cual se denomino como fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil

El compuesto de anacardol es una molécula que contiene grupos fenoles, los cuales se encuentran presentes en la tegumento de anacardium excelsum, así como también se encuentra en la especie vegetal anacardium occidentale, lo cual muestra semejanza entre este tipo de compuestos en la familia de las anacardiáceas.

RECOMENDACIONES

Continuar con las investigaciones científicas sobre Anacardium excelsum ya que es una especie, que no reporta estudios en la literatura.

Desarrollar estudios sobre los tipos de compuestos que se encuentran en los demás órganos de la planta, ya que en esta investigación solo se hizo con la fracción tegumento

Investigar e indagar sobre las especies vegetales de nuestro país, ya que Colombia es uno de los países con mayor diversidad a nivel mundial de plantas las cuales se han constituido actualmente en un recurso importante para la investigación de nuevas sustancias con actividad antioxidante, antimicrobiana, anti cancerígena etc.

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