EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS ALEXANDER GARCIA CAYCEDO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de BIOLOGO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS CARRERA DE BIOLOGÍA 1 BOGOTA D.C Enero 2009 NOTA DE ADVERTENCIA ARTICULO 23 DE LA RESOLUCION N˚ 13 DE JULIO DE 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.” 2 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS ALEXANDER GARCIA CAYCEDO APROBADO ____________________ ____________________ CRISPIN CELIS Z. MSc RUBEN TORRENEGRA Director Codirector ________________________ _______________________ Dra. ALBA NOHEMI TELLEZ Dr. JULIO PEDROZO Ph. D. Jurado Jurado 3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES OBTENIDOS DE LA ESPECIE VEGETAL Anacardium excelsum FRENTE A MICROORGANISMOS PATOGENOS ALEXANDER GARCIA CAYCEDO APROBADO _________________________ ____________________ DR. INGRID SCHULER Ph.D. Dr. ANDREA FORERO Decana Académica Directora de la carrera de Biología 4 RESUMEN La medicina tradicional se ha basado principalmente en las propiedades de las plantas, las cuales han sido usadas para el tratamiento de varias enfermedades humanas durante siglos. Se sabe que las plantas son biológicamente ricas en compuestos activos, como lo son los metabolitos secundarios. Unos de los enfoques que le han otorgado las ciencias al estudio de estos compuestos activos es el descubrimiento de agentes antimicrobianos por medio de métodos de extracción en plantas. Debido a esto se pretendió investigar a la especie vegetal Anacardium excelsum, perteneciente a la familia de las Anacardiáceas. Este estudio tuvo como objeto, la idea de indagar y encontrar compuestos naturales, con propiedades antimicrobianas frente a microorganismos Gram positivos como Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis y a su vez microorganismos Gram negativos como E.coli y Salmonella; se realizo la exploración de metabolitos secundarios presentes en hojas, fruto, testa, tegumento, semilla, flor y corteza. El material vegetal fue colectado en el Municipio de Pie de cuesta, ubicado en el departamento de Santander. Los métodos de extracción, se realizaron por medio de extracción a reflujo con aparato de soxhlet (extracción total), y para las fracciones, se usaron extracciones continuas y discontinuas liquido-liquido; se utilizaron como solventes éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo consecutivamente. Para la elección de los microorganismos se tuvo en cuenta los gérmenes o microorganismos mas frecuentes en las infecciones comunitarias y sepsis intrahospitalarias, además de que recientemente se ha evidenciado, que presentan cierto desarrollo, en la resistencia a nuevos antibióticos y otros 5 problemas epidemiológicos. La actividad antimicrobiana se evaluó por medio de la técnica de pozos. Para las pruebas antimicrobianas de los extractos totales, se probaron concentraciones de 10, 20 y 40 µg/ml. Los extractos totales de todos los órganos estudiados, obtenidos de Anacardium excelsum, presentaron actividad inhibitoria de crecimiento frente a los dos microorganismos Gram positivos (Staphylococcus y Bacillus subtilis); donde los extractos de tegumento, fruto y testa obtuvieron mayor actividad, con un promedio de 16 a 20 mm de halo de inhibición frente a Bacillus subtilis, con una concentración de 40 µg/ml. En el caso de Staphylococcus aureus, los extractos totales que evidenciaron mayor actividad fueron tegumento, semilla, flor, testa y hoja con un promedio en el halo de inhibición de 16 a 21 mm y una concentración de 40 µg/ml. Con respecto a los microorganismos Gran negativos (Escherichia coli y Salmonella), ningún órgano estudiado de Anacardium excelsum, mostro actividad antimicrobiana. Con relación a las fracciones, las cuales solo fueron probadas con Bacillus subtilis, tegumento, semilla y testa mostraron actividad con un promedio de 15-20 mm de halo de inhibición, con una concentración de 40 µg/ml. A estas se les monto una bioautografia en donde la banda mas polar mostro actividad. Finalmente se hizo una cromatografía en columna para la fracción de tegumento, en la cual se obtuvieron 16 fracciones que fueron analizadas en un cromatografo de gases acoplado a masas en donde se encontraron algunos compuestos fenolicos como Fenol, 2-(1,1- dimetiletil)-4- (1,1,3,3 tetrametilbutil) y fenol 2,2- metil 6(1,1 dimetiletil) – 4 metil- cresol 2,2 – metil (6- ter-butil- A-22-46; los cuales se creen que son los que poseen la actividad antimicrobiana. 6 INDICE DE FIGURAS FIGURA No. 1: Fotografia del arbol 13 FIGURA No. 2: Fotografia de la corteza .................................................. 14 FIGURA No. 3: Fotografia de la plantula con flor y fruto ......................... 15 FIGURA No. 4: Fotografia de la Hoja ...................................................... 15 FIGURA No. 5: Fotografia de la Flor ....................................................... 16 FIGURA No. 6: Fotografia de la plantula con flores ................................ 17 FIGURA No. 7: Fotografia del fruto ......................................................... 17 FIGURA No. 8: Fotografia de la plantula con fruto ................................. 18 FIGURA 9: Staphylococcus aureus ......................................................... 24 FIGURA 10: Bacillus subtilis 25 FIGURA 11: Escherichia Coli .................................................................. 26 FIGURA 12: Salmonella .......................................................................... 27 FIGURA 13: Tegumento pulverizado de Anacardium excelsum 37 FIGURA 14: Semilla pulverizada de Anacardium excelsum .................... 38 FIGURA 15: Fruto pulverizado de Anacardium excelsum ....................... 38 FIGURA 16: Flor pulverizada de Anacardium excelsum 38 FIGURA 17: Testa pulverizada de Anacardium excelsum ....................... 39 FIGURA 18: Corteza pulverizada de Anacardium excelsum ................... 39 FIGURA 19: Hoja pulverizada de Anacardium excelsum ........................ 39 FIGURA 20: Actividad antimicrobiana del extracto total de tegumento frente a Bacillus subtillis .......................................................................... 48 FIGURA 21: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla frente a Bacillus subtillis ....................................................................................... 48 FIGURA 22: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Bacillus subtillis; 49 FIGURA 23: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor frente a Bacillus subtillis ....................................................................................... 49 7 FIGURA 24: Actividad antimicrobiana del extracto total de testa frente a Bacillus subtillis ....................................................................................... 50 FIGURA 25: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza frente a Bacillus subtillis; 50 FIGURA 26: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja frente a Bacillus subtillis ....................................................................................... 51 FIGURA 27: Actividad antimicrobiana del extracto total de tegumento frente a Staphylococcus aureus .............................................................. 51 FIGURA 28: Actividad antimicrobiana del extracto total de semilla frente a Staphylococcus aureus 52 FIGURA 29: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Staphylococcus aureus ........................................................................... 52 FIGURA 30: Actividad antimicrobiana del extracto total de flor frente a Staphylococcus aureus ........................................................................... 53 FIGURA 31: Actividad antimicrobiana del extracto total de fruto frente a Staphylococcus aureus 53 FIGURA 32: Actividad antimicrobiana del extracto total de testa frente a Staphylococcus aureus ........................................................................... 54 FIGURA 33: Actividad antimicrobiana del extracto total de corteza frente a Staphylococcus aureus 54 FIGURA 34: Actividad antimicrobiana del extracto total de hoja frente a Staphylococcus aureus ........................................................................... 55 FIGURA 35: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de tegumento ............................................... 56 FIGURA 36: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de semilla 57 FIGURA 37: Actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas a partir de los extractos etanolicos de testa ......................................................... 57 FIGURA 38: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Movil: Petrol: CH2CL2 1:1) de la fracción en éter de petróleo de la testa de A. excelsum frente a bacillus subtillis ....................................................... 58 FIGURA 39: Bioautografia en CCD (Fase estacionaria: Silica gel y Fase Movil: CH2CL2: MeOH