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5 Resultados E Discusses Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Química Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Processos Químicos e Bioquímicos PRODUÇÃO DE CELULASES POR Penicillium funiculosum EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA DE BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO E SUA APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO Roberto Nobuyuki Maeda Orientador: Nei Pereira Jr., PhD (EQ/UFRJ) Igor Polikarpov, PhD (IFSC/USP) Rio de Janeiro Outubro de 2010 PRODUÇÃO DE CELULASES POR Penicillium funiculosum EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA DE BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO E SUA APLICAÇÃO NA PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO ROBERTO NOBUYUKI MAEDA Tese submetida ao Programa de Pós- Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de doutor em ciências (DSc.). Orientador: Nei Pereira Jr., PhD. (EQ/UFRJ) Igor Polikarpov, PhD. (IFSC/USP) Rio de janeiro, RJ – Brasil Outubro 2010 M184p Maeda, Roberto Nobuyuki Produção de celulases por Penicillium funiculosum em fermentação submersa de bagaço de cana pré-tratado e sua aplicação na produção de etanol de segunda geração / Roberto Nobuyuki Maeda, 2010. xxiv, 197 f.: il Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2010. Orientadores: Nei Pereira Jr. (PhD.) Igor Polikarpov (PhD.) 1. Celulases. 2. Penicillium funiculosum. 3. Etanol de segunda geração – Teses. I. Pereira Junior, Nei & Polikarpov, Igor (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química. III. Título. CDD: 661.82. iii Aos meus pais, Reiichi Maeda e Haruko Maeda Dedico iv A riqueza do conhecimento não pode ser usurpada por ladrões, confiscada por reis ou dividida entre irmãos. Quanto mais se gasta mais ela cresce. (Vijay V. Joshi) Para ser grande, sê inteiro: nada Teu exagera ou exclui. Sê todo em cada coisa. Põe quanto és No mínimo que fazes. Assim em cada lago a Lua toda Brilha, porque alta vive. (Fernando Pessoa) v Agradecimentos Aos meus pais Reiichi Maeda e Haruko Maeda pelo incentivo; Ao professor Nei pela orientação, ensinamentos (sempre com muita sapiência), exemplo e confiança em mim depositada para realização deste trabalho e pela amizade e incentivos desde os tempos de graduação; Ao professor Igor pela orientação nas etapas de purificação e caracterização das enzimas e por me receber tão bem em seus laboratórios no IFSC/USP; À Vanessa Rocha pela amizade, incentivo, auxílio, pelas palavras sempre sinceras e momentos de descontração; À Carolina Barcelos pela amizade, diversão, incentivo e estar sempre disposta a ajudar; À Mariana Mello por toda a ajuda, dedicação, amizade e diversão; À Viviane Serpa por toda sua ajuda, amizade, diversão e ensinamentos nas fases de purificação e caracterização de proteínas; À Neumara Luci pela amizade e momentos de descontração; Ao Gabriel Betancur pela amizade e companheirismo; À amiga Mariana Peñuela pela valiosa colaboração no início dos trabalhos experimentais e por toda a força e incentivos; À grande amiga Ângela Cordeiro, pelo incentivo e confiança; À Isislayne, que mesmo chegando ao final desta fase, me deu grande auxílio, com dedicação, tanto em bancada quanto na parte textual. Além dos bons momentos de descontração; A todos os estagiários e/ou alunos de Iniciação Científica do LADEBIO que tiveram contribuição direta na realização deste trabalho: Daniele Fernandes, Mariana Mello, Daniele Silveira, Eleandro Walverde, Kelly Cristina, Ludymilla Bastos, Ághata Rodrigues, Letícia Félix, Sabrina Mesquita, Daiane Santos, Isislayne Sabino; A todos os estagiários do LABCRISTAL/IFSC Renata Alves, Maria Luiza, Flávio, Gabriela Medeiros, por toda ajuda e momentos de diversão; Aos funcionários do LADEBIO Jorge e Luiz; Aos técnicos do IFSC Bianca, Suzana, Kelvin e especialmente para Maria por toda ajuda durante os trabalhos realizados no LABCRISTAL; À professora Maria Isabel Rodrigues/Unicamp pelas valiosas dicas nos planejamentos experimentais; Aos amigos e colegas de laboratório Elisa, Marcelle, Aline Lima, Verônica, Élcio, Patrícia, Paulo, Daiana, Elaine, Juliana, Felipe, Isadora, Eloísa, Gabriela, Fabiano; Aos professores da Escola de Química que contribuíram com a minha formação; À Universidade Federal do Rio de Janeiro pela oportunidade; Ao CNPq pela bolsa de doutorado concedida e auxílio financeiro; À PETROBRAS pelo auxílio financeiro. vi SUMÁRIO Capítulo 1 1 APRESENTAÇÃO DO TEMA DA TESE 1 Capítulo 2 7 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7 2.1. Celulases 7 2.1.1. Classificação e nomenclatura das celulases 8 2.1.2. Mecanismos de hidrólise 12 2.1.3. Ação sinérgica das celulases 16 2.1.4. Substratos para enzimas celulolíticas 19 2.1.5. Produção de celulases 23 2.1.6. Microrganismos produtores de celulases 23 2.1.7. Mecanismo de regulação da síntese de celulases em fungos 29 filamentosos 2.1.8. Formação de indutores por transglicosilação 29 2.1.9. Repressão catabólica na produção de celulases 32 2.1.10. Via de secreção 33 2.1.11. Proposta para produção industrial de celulases 34 2.1.12. Separação, concentração e purificação de enzimas 37 2.1.12.1. Etapas iniciais de separação e concentração do preparado 37 enzimático 2.1.12.2. Engenharia de Produto Enzimático (etapas finais de acabamento e melhoramento de desempenho) 40 2.1.13. Mercado de celulases e perspectivas 41 2.2. Penicillium funiculosum: posição taxonômica e características 44 2.3. Materiais lignocelulósicos 45 2.3.1. Celulose 46 2.3.2. Hemiceluloses 47 2.3.3. Interação hemicelulose-celulose 49 2.3.4. Lignina 50 2.4. Biotecnologia para produção de etanol de segunda geração 51 2.4.1. Conceito de SSF 53 2.4.2. Pré-tratamento do material lignocelulósico 54 2.4.3. Hidrólise enzimática e fatores limitantes 56 2.4.4. Microrganismos produtores de etanol de segunda geração 57 vii 2.4.5. Carga enzimática 58 2.4.6. Carga de substrato 58 2.4.7.Biomassa celular (tamanho de inóculo) 59 2.4.8. Breve sumário de produção de etanol por processo SSF de hexoses 60 2.5. Considerações gerais 63 Capítulo 3 64 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 64 Capítulo 4 66 MATERIAIS E MÉTODOS 66 4.1. Microrganismo e padronização do inóculo 66 4.2. Pré-tratamento do bagaço 67 4.3. Caracterização do bagaço de cana e celulignina 68 4.4. Avaliação do caráter constitutivo das celulases e papel indutor da celulose na produção de enzimas celulolíticas por P. funiculosum 70 4.5. Produção de celulases por P. funiculosum: planejamentos experimentais para otimização da concentração das fontes de nitrogênio 71 4.5.1. Validação da otimização da fonte de nitrogênio 74 4.6. Produção de celulases em biorreator: avaliação do tipo e tamanho de inóculo 74 4.7. Concentração dos extratos brutos enzimáticos 76 4.7.1. Concentração em evaporador rotativo 76 4.7.2. Concentração por ultrafiltração tangencial em sistema de membranas de fibras ocas 77 4.8. Avaliação da estabilidade do preparado enzimático 78 4.9. Identificação pré-eliminar das enzimas com atividade CMCásica e β- glucosidasica por meio de zimograma 78 4.9.1. Eletroforese SDS-PAGE e gel nativo 78 4.9.2. Revelação das bandas 79 4.10. Purificação e caracterização de enzimas do preparado celulásico LADEBIO/PETROBRAS 80 4.10.1. Concentração e troca de tampão do extrato enzimático - Precipitação com sulfato de amônio 80 4.10.2. Separação de proteínas do extrato total por cromatografia de toca iônica 82 4.10.3. Digestão com tripsina das bandas da eletroforese SDS-PAGE das viii amostras purificadas 83 4.10.4. Identificação das proteínas isoladas por espectrometria de massa 83 4.10.5. Cromatografia de interação hidrofóbica 84 4.10.6. Determinação da massa molecular das enzimas purificadas 85 4.10.7. Eletroforese em gel nativo 85 4.10.8. Atividade enzimática das enzimas purificadas 86 4.10.9 Ensaios de fluorescência 86 4.10.10. Determinação dos parâmetros cinéticos KM e VMAX, aparentes, para atividade CMCásica e β-glucosidásica do preparado celulásico 86 4.10.10.1. Efeito da concentração de substrato na velocidade de reação de β-glucosidásica e CMCásica 86 4.10.10.2. Cálculo dos parâmetros KM e VMAX 87 4.11. Hidrólise da celulignina utilizando extrato enzimático concentrado de P. funiculosum 88 4.12. Avaliação de diferentes níveis de deslignificação e efeito do BSA na hidrólise de celulignina 89 4.13. Produção de etanol de segunda geração por processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) utilizando o preparado celulásico LADEBIO/BR 89 4.13.1. Produção de células de Sacharomyces cerevisiae JP1 em biorreator 90 4.13.2. Avaliação da fermentabilidade do hidrolisado enzimático: ensaios em fermentômetro 90 4.13.3. Produção de etanol usando celulignina em processo SSF alimentado 91 4.14. Procedimentos analíticos 91 4.14.1. Quantificação da atividade em papel de filtro 91 4.14.2. Quantificação da atividade CMCásica 92 4.14.3. Quantificação da atividade β-glucosidásica 92 4.14.4. Quantificação da atividade xilanásica 93 4.14.5. Determinação do teor de proteínas 93 4.14.6. Quantificação de glicose, celobiose, xilose e etanol por CLAE 93 Capítulo 5 94 RESULTADOS E DISCUSSÃO 94 5.1. Composição do bagaço e celulignina de bagaço de cana-de-açúcar 95 ix 5.2. Avaliação do caráter constitutivo e papel indutor da celulose na produção de celulases por Penicillium funiculosum 96 5.3. Planejamento sequencial para otimização da fonte de nitrogênio para produção de celulases por fermentação submersa de celulignina 101 5.4. Validação da otimização das fontes de nitrogênio 118 5.5 Produção de celulases em biorreator 120 5.5.1 Avaliação da forma de obtenção do inóculo 120 5.5.2 Efeito do tamanho de inóculo 123 5.5.3 Produção de xilanases por P. funiculosum em biorreator 126 5.5.4 Considerações gerais sobre a produção de celulases 127 5.6.
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