Fitoquímica Da Espécie Amaioua Guianensis Aulb

UFG UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS IQ INSTITUTO DE QUÍMICA

P O L L CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DE Y A ESPÉCIES DA FAMÍLIA RUBIACEAE: N FITOQUÍMICA DA ESPÉCIE AMAIOUA N A GUIANENSIS AULB .

L A U R I N D O POLLYANNA LAURINDO DE OLIVEIRA

D ORIENTADORA: PROFA. DRA. CECÍLIA M. A. DE OLIVEIRA. E

O L I V E I R A

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

2009 GOIÂNIA- 2009

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA

CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DE ESPÉCIES DA FAMÍLIA RUBIACEAE: FITOQUÍMICA DA ESPÉCIE AMAIOUA GUIANENSIS AULB .

POLLYANNA LAURINDO DE OLIVEIRA

Dissertação apresentada ao Instituto

de Química da Universidade Federal de Goiás, como exigência parcial

para a obtenção do título de Mestre em Química.

Orientadora: Profa. Dra. Cecília M. A. de Oliveira

Goiânia 2009

DEDICATÓRIA

A minha mãe amada, Carmelita Geralda de Oliveira, pelas angústias e preocupações que passou por minha causa, por ter dedicado sua vida a mim, por todo apoio, amor, compreensão, estímulo, abdicação, sensatez, por estar sempre ao meu lado, dedico essa conquista com muita gratidão.

AGRADECIMENTOS

Acredito na força e energia presentes em atos simples como um abraço, um aperto de mão, um sorriso ou até mesmo um simples olhar de encorajamento e apoio. Acredito ainda na importância de reconhecer e agradecer esses gestos. Sinto, portanto, enorme necessidade de formalizar e registrar a gratidão que tenho por todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, me apoiando, ainda que da maneira mais discreta e inusitada o possível. A Deus pela vida, saúde, perseverança, oportunidade e determinação. À minha mãe Carmelita Geralda de Oliveira, por todo amor, companheirismo, entusiasmo, dedicação, encorajamento, por nunca me deixar desistir, por estar sempre perto de mim me mostrando que sou capaz, por estar sempre me amparando nos momentos mais difíceis em minha vida. Ao meu marido, Daniel Flávio Santos Resende, por me apoiar incondicionalmente, pelo conforto nos momentos de angústia, pela palavra amiga sempre que necessário, por me amar e me fazer sentir uma pessoa melhor. Aos meus avós, Antônio Laurindo e Geralda Cândida de Jesus, que mesmo não estando mais entre nós, proporcionaram com que meus estudos fossem concluídos e que com toda certeza, onde quer que eles estejam, estão muito felizes por mais essa conquista. A todos meus familiares que sempre acreditaram no meu potencial e que sempre me encorajaram a seguir em frente. À Profa. Dra. Cecília M. A. de Oliveira pela disponibilidade em orientar, pelos preciosos conhecimentos transmitidos, por ter ouvido e aceitado minhas sugestões, e principalmente por confiar em mim. À Profa. Dra. Clara M. A. Tanaka, que infelizmente não se encontra mais entre nós, mas que no pouco tempo que pude estar ao seu lado, aprendi a admirá-la por ver seu amor, entusiasmo e dedicação no que fazia de melhor, orientar. Essa vitória também é sua professora... À Profa. Dra. Lucília Kato por sua paciência e disponibilidade em ajudar. À Profa. Dra. Emília Celma por ter me auxiliado na realização do Estágio de Docência.

Ao Prof. Dr. José Ricardo Sabino pela análise de Raios X. À Profa. Dra. Cleuza Conceição da Silva da Universidade Estadual de Maringá pelas análises de RMN. À Ivânia da Universidade Estadual de Maringá pela ajuda na elucidação estrutural dos compostos isolados. A todos os professores e funcionários do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás. A todos do Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá, por terem me acolhido e proporcionado que parte do meu trabalho fosse realizado. Às amigas de Maringá, Franciele, Silvia e Zíbia que me acolheram e me ajudaram na realização do meu trabalho, amenizando toda saudade por estar longe de casa. À Rebeca P. Medina, aluna de Iniciação Científica (UEM), pela realização dos testes de atividade antioxidante e moluscicida. A todo pessoal do laboratório pela amizade, ajuda e companheirismo nos momentos mais difíceis, em especial à Emiret Otoni, minha companheira de mestrado, e à Aline P. Moraes, aluna de Iniciação Científica, por toda determinação e empenho. Ao meu amigo Deomar Plácido, por toda amizade, companheirismo, por estar sempre me ajudando e me salvando nos momentos mais complicados. Aos colegas de mestrado que conviveram comigo e muito auxiliaram neste trabalho. Aos amigos que sempre estiveram ao meu lado, incentivando, sofrendo e comemorando cada vitória, em especial à minha amiga Silvia por toda lealdade e companheirismo. Aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização do meu trabalho. A CAPES pela bolsa de estudos concedida. O mérito desta conquista é a soma dos esforços de todos aqueles que me deram a mão. Muito obrigada a todos...

O principal na ciência não é a perfeição e sim a certeza de estarmos todos lutando por um mesmo ideal.

A vida. Autor desconhecido.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS i LISTA DE FLUXOGRAMAS ii LISTA DE TABELAS iii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS v LISTA DE ANEXOS vii RESUMO xi ABSTRACT xii INTRODUÇÃO 1 1.1 – O Bioma Cerrado 2 1.2 – Família Rubiaceae 3 1.3 – O Gênero Amaioua 6 1.4 – A Espécie Amaioua guianensis Aubl 7 1.5 – Alcalóides Peptídeos 8 1.6 - Atividade Moluscicida 13 1.7 – Atividade Antioxidante 14 2 – Objetivos 15 3 – Parte Experimental 16 3.1 – Material e Métodos 16 3.2 – Estudo Químico de A. guianensis 18 3.2.1 – Coleta e Preparo do Material 18 3.2.2 – Preparo e Fracionamento do Extrato Bruto das Folhas e Caule 18 3.2.3 – Purificação da Fração Diclorometano das Folhas (AGF-DCM) 21 3.2.4 – Purificação da Fração Hidrometanólica das Folhas (AGF-HM) 26 3.2.4.1 – Estudo da Fração AGF-HM-SM 26 3.2.5 – Purificação da Fração Acetato de Etila das 29

Folhas (AGF-AcOEt.) 3.2.6 – Purificação da Fração Hexânica das Folhas (AGF-HEX) 33 3.2.7 – Purificação da Fração Hexânica do Caule (AGC-HEX) 36 3.2.8 – Purificação da Fração Hidrometanólica do Caule (AGC-HM) 37 3.3 – Atividades Biológicas 38 3.3.1 – Atividade Moluscicida 38 3.3.2 – Atividade Antioxidante 39 4 – Resultados e Discussão 40 4.1 – Elucidação Estrutural dos Compostos isolados 43 4.1.1 – Determinação estrutural de AGF 1 (escoparona) 43 4.1.2 – Determinação estrutural de AGF 2 (alcalóide ciclopeptídeo) 45 4.1.3 – Identificação estrutural da mistura AGF 3 (triterpenos) 56 4.1.4 – Identificação estrutural de AGF 4, AGF 6 e AGC 11 (manitol) 61 4.1.5 – Identificação estrutural de AGF 5 ( β-etil glicose) 62 4.1.6 – Identificação estrutural da mistura AGF 7 (ácidos 64 clorogênicos) 4.1.7 – Identificação estrutural da mistura AGF 8 (proantocianidinas) 74 4.1.8 – Identificação estrutural da mistura AGF 9 e AGC 10: 79 Sitosterol e Estigmasterol 4.2 – Atividade Moluscicida 81 4.3 – Atividade Antioxidante 82 Conclusão 83 Anexos 84 Bibiografia 149

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Exemplos de metabólitos secundários com propriedades 5 biológicas isolados de Rubiaceae.

Figura 2 Metabólitos secundários isolados de Duroia hirsuta . 7

Figura 3 Exemplar da espécie Amaioua guianensis Aubl . 8

Figura 4 Exemplos dos diferentes tipos de ciclopeptídeos. 9 Figura 5 Classificação dos alcalóides ciclopeptídeos. 11 Figura 6 Substâncias isoladas das Folhas e Caule de A. guianensis. 41 Figura 7 Correlações observadas no espectro de HMQC, COSY, 46 HMBC e NOESY da unidade fenilalanina.

Figura 8 Correlações observadas no espectro de HMQC, COSY, 47 HMBC e NOESY da unidade fenilalanina β-substituída.

Figura 9 Correlações observadas no espectro de HMQC, COSY, 49 HMBC e NOESY da unidade estirilamina.

Figura 10 Correlações observadas no espectro de HMQC, COSY, 50 HMBC e NOESY do grupo cinamoil.

Figura 11 Correlações observadas no espectro de HMQC, COSY, 52 HMBC e NOESY da unidade prolina.

Figura 12 Ortep do monocristal do composto AGF 2. 54 Figura 13 Principais correlações no espectro de COSY do composto 58 AGF 3.

Figura 14 Estereoquímica relativa dos compostos 7 e 8 67 Figura 15 Correlações no espectro de COSY para os compostos 7 e 8 69 Figura 16 Correlações no espectro de HMBC para os compostos 7 e 8 70

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 Classificação dos alcalóides ciclopeptídeos. 10 Fluxograma 2 Preparo do Extrato Etanólico e Respectivas Partições em Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila das Folhas e 19 Inflorescências de A. guianensis . Fluxograma 3 Preparo do Extrato Etanólico e Respectivas Partições em Hexano, Clorofórmio e Acetato de Etila do Caule de A. 20 guianensis . Fluxograma 4 Fracionamento da fração AGF-DCM. 25 Fluxograma 5 Metodologia utilizada para isolar o composto AGF 4. 26 Fluxograma 6 Fracionamento da fração AGF-HM-SM. 29 Fluxograma 7 Metodologia utilizada no fracionamento de AGF 8. 32 Fluxograma 8 Metodologia utilizada no fracionamento de AGF 9. 35 Fluxograma 9 Metodologia utilizada para isolar AGC 10. 36 Fluxograma 10 Metodologia utilizada para separar o composto AGC11. 37

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Dados da partição do extrato etanólico das folhas. 19 Tabela 2 Dados da partição do extrato etanólico do caule. 20 Tabela 3 Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-DCM (CC 1). 21 Tabela 4 Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração 22 AGF-DCM (CC 1). Tabela 5 Frações obtidas da CCDP da fração 172-233. 23 Tabela 6 Dados da coluna cromatográfica da fração 304-377 (CC 2). 23 Tabela 7 Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração 24 304-377(CC 2). Tabela 8 Dados cromatográficos da fração AGF-HM-SM (CC 4). 27 Tabela 9 Dados da coluna cromatográfica da fração 1 (CC 5). 27 Tabela 10 Massas das frações reunidas da CC da fração 1 (CC 5). 28 Tabela 11 Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-AcOEt. (CC 6). 30 Tabela 12 Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração 30 AGF-AcOEt (CC 6). Tabela 13 Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-Hex (CC 7). 33 Tabela 14 Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração 34 AGF-Hex (CC 7). 1 13 Tabela 15 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 1 (CDCl 3, 44 300 e 75 MHz, ppm). Tabela 16 Dados cristalográficos obtidos para o composto 2. 54 Tabela 17 Dados espectrais de RMN de 1H, 13 C, COSY, HMBC e NOESY 55 do composto 2 (CDCl 3, 300 e 75 MHz, ppm). 1 13 Tabela 18 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 3 (CD 6OD, 59 300 e 75 MHz).

1 13 Tabela 19 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 4 (CD 6OD, 60

iii 300 e 75 MHz). 13 1 Tabela 20 Dados espectrais de RMN C e H do composto 5 (D 2O, 300 e 61 75 MHz). Tabela 21 Dados espectrais de RMN uni e bidimensionais do composto 6 63 (CD 3OD, 300 e 75 MHz). 1 13 Tabela 22 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 7 (D 2O, 300 71 e 75 MHz). 1 13 Tabela 23 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 8 (D 2O, 300 72 e 75 MHz). 1 13 Tabela 24 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 9 (D 2O, 300 73 e 75 MHz). 1 13 Tabela 25 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 10 (C 3D6O, 77 300 e 75 MHz). 1 13 Tabela 26 Dados espectrais de RMN de H e C do composto 11 (C 3D6O, 78 300 e 75 MHz). Tabela 27 Atividade Moluscicida dos Extratos das Folhas de A. guianensis . 81 Tabela 28 Atividade Antioxidante dos extratos obtidos de A. guianensis . 82

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AcOEt Acetato de Etila AGC Amaioua guianensis caule AGC-Hex Fração hexânica do caule AGC-HM Fraçãohidrometanólica do caule AGC-HM-NSM Fração hidrometanólica do caule insolúvel em metanol AGF- HM-SM Fração hidrometanólica do caule solúvel em metanol AGF Amaioua guianensis folhas AGF-AcOEt. Fração acetato de etila das folhas AGF-DCM Fração diclorometano das folhas AGF-EB Extrato bruto das folhas AGF-Hex Fração hexânica das folhas AGF-HM Fração hidrometanólica das folhas AGF- HM-NSM Fração hidrometanólica das folhas insolúvel em metanol AGF- HM-SM Fração hidrometanólica das folhas solúvel em metanol BHT Hidroxitolueno butilado CC Cromatografia em coluna CCDA Cromatografia em camada delgada analítica CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa

C3D6O Acetona deuterada

C3H6O Acetona

CDCl 3 Clorofórmio deulterado

CHCl 3 Clorofórmio COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy d dupleto dd Duplo dupleto ddd Duplo duplo dupleto

v D2O Água deuterada DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH Radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila dq Duplo quarteto EtOH Etanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC Heteronuclear Correlation Spectroscopy

H2O Água IV Infravermelho J Constante de Acoplamento m Multipleto MeOD Metanol Deuterado MeOH Metanol NOESY Nuclear Overharser Enhancement Spectroscopy ∅ x h Diâmetro x Altura RMN Ressonância Magnética Nuclear s simpleto sl Simpleto largo t Tripleto TMS tetrametilsilano δ Deslocamento químico (em ppm) λ Comprimento de onda

ANEXOS

13 Espectro 1 Experimento de RMN C (CDCl 3, 75 MHz) do composto 85 1(AGF 1). 1 Espectro 2 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 86 composto 1 (AGF 1).

Espectro 3 Experimento de COSY (CDCl 3) do composto 1 (AGF 1). 87 1 Espectro 4 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 88 composto 2 (AGF 2). 1 Espectro 5 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 89 composto 2 (AGF 2), expansão I. 1 Espectro 6 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 90 composto 2 (AGF 2), expansão II. 1 Espectro 7 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 91 composto 2 (AGF 2), expansão III. 1 Espectro 8 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 92 composto 2 (AGF 2), expansão IV. 1 Espectro 9 Experimento de RMN H (CDCl 3, 300 MHz) do 93 composto 2 (AGF 2), expansão V. 13 Espectro 10 Experimento de RMN C (CDCl 3, 75 MHz) do composto 94 2 (AGF 2). 13 Espectro 11 Experimento de RMN C (CDCl 3, 75 MHz) do composto 95 2 (AGF 2), Expansão I. 13 Espectro 12 Experimento de RMN C (CDCl 3, 75 MHz) do composto 96 2 (AGF 2), Expansão II. 13 Espectro 13 Experimento de RMN C (CDCl 3, 75 MHz) do composto 97 2 (AGF 2), Expansão III.

Espectro 14 Experimento de DEPT 135 (CDCl 3) do composto 2 98 (AGF 2).

vii Espectro 15 Experimento de COSY (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2). 99

Espectro 16 Experimento de COSY (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2), 100 Expansão I.

Espectro 17 Experimento de COSY (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2), 101 Expansão II.

Espectro 18 Experimento de HMBC (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2). 102

Espectro 19 Experimento de HMBC (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2), 103 Expansão I.

Espectro 20 Experimento de HMBC (CDCl 3) do composto 2 (AGF 2), 104 Expansão II.

Espectro 21 Experimento de NOESY (CDCl 3) do composto 2 (AGF 105 2).

Espectro 22 Experimento de NOESY (CDCl 3) do composto 2 (AGF 106 2), Expansão I . 1 Espectro 23 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 107 compostos 3 e 4 (AGF 3). 1 Espectro 24 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 108 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão I. 1 Espectro 25 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 109 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão II. 13 Espectro 26 Experimento de RMN C (C3D6O, 75 MHz) dos 110 compostos 3 e 4 (AGF 3). 13 Espectro 27 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 111 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão I. 13 Espectro 28 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 112 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão II. 13 Espectro 29 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 113 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão III. 13 Espectro 30 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 114 compostos 3 e 4 (AGF 3), Expansão IV.

Espectro 31 Experimento de HMQC (C 3D6O) dos compostos 3 e 4 115 (AGF 3).

Espectro 32 Experimento de HMQC (C 3D6O) dos compostos 3 e 4 116

viii (AGF 3), Expansão I.

Espectro 33 Experimento de HMQC (C 3D6O) dos compostos 3 e 4 117 (AGF 3), Expansão II.

Espectro 34 Experimento de COSY (C 3D6O) dos compostos 3 e 4 118 (AGF 3).

Espectro 35 Experimento de COSY (C 3D6O) dos compostos 3 e 4 119 (AGF 3), Expansão. 1 Espectro 36 Experimento de RMN H (D2O, 300 MHz) do composto 120 5 (AGF 4, AGF 6 e AGC 11). 13 Espectro 37 Experimento de RMN C (D2O, 75 MHz) do composto 5 121 (AGF 4, AGF 6 e AGC 11). 1 Espectro 38 Experimento de RMN H (CD3OD, 300 MHz) do 122 composto 6 (AGF 5). 13 Espectro 39 Experimento de RMN C (CD3OD, 75 MHz) do 123 composto 6 (AGF 5).

Espectro 40 Experimento de COSY (CD3OD) do composto 6 (AGF 124 5). 13 Espectro 41 Experimento de RMN C (D 2O, 75 MHz) dos compostos 125 7, 8 e 9 (AGF 7).

Espectro 42 Experimento de DEPT 135 (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 126 (AGF 7).

Espectro 43 Experimento de DEPT 135 (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 127 (AGF 7), Expansão I.

Espectro 44 Experimento de DEPT 135 (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 128 (AGF 7), Expansão II. 1 Espectro 45 Experimento de RMN H (D 2O, 300 MHz) dos 129 compostos 7, 8 e 9 (AGF 7). 1 Espectro 46 Experimento de RMN H (D 2O, 300 MHz) dos 130 compostos 7, 8 e 9 (AGF 7), Expansão I. 1 Espectro 47 Experimento de RMN H (D 2O, 300 MHz) dos 131 compostos 7, 8 e 9 (AGF 7), Expansão II. 1 Espectro 48 Experimento de RMN H (D 2O, 300 MHz) dos 132 compostos 7, 8 e 9 (AGF 7), Expansão III.

ix Espectro 49 Experimento de HMBC (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 133 (AGF 7).

Espectro 50 Experimento de HMBC (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 134 (AGF 7), Expansão .

Espectro 51 Experimento de COSY (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 135 (AGF 7).

Espectro 52 Experimento de NOESY (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 136 (AGF 7).

Espectro 53 Experimento de NOESY (D 2O) dos compostos 7, 8 e 9 137 (AGF 7), Expansão. 1 Espectro 54 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 138 compostos 10 e 11 (AGF 8). 1 Espectro 55 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 139 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão I. 1 Espectro 56 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 140 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão II. 1 Espectro 57 Experimento de RMN H (C 3D6O, 300 MHz) dos 141 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão III. 13 Espectro 58 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 142 compostos 10 e 11 (AGF 8). 13 Espectro 59 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 143 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão I. 13 Espectro 60 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 144 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão II. 13 Espectro 61 Experimento de RMN C (C 3D6O, 75 MHz) dos 145 compostos 10 e 11 (AGF 8), Expansão III.

Espectro 62 Experimento de HMBC (C 3D6O) dos compostos 10 e 11 146 (AGF 8).

Espectro 63 Experimento de NOESY (C 3D6O) dos compostos 10 e 11 147 (AGF 8).

Espectro 64 Experimento de COSY (C 3D6O) dos compostos 10 e 11 148 (AGF 8).

RESUMO

Amaioua guianensis Aulb é um arbusto conhecido popularmente como marmelada-brava ou marmelinho-vermelho pertencente à família Rubiaceae. O gênero Amaioua compreende cerca de 10 espécies estando distribuídas enre a Floresta Amazônica, Cerrado, Pantanal e Mata Atlântica. Nenhum estudo fitoquímico foi reportado sobre as folhas e cascas de A. guianensis . Como parte de nossa pesquisa em busca de novos compostos de plantas superiores, nós investigamos o extrato etanólicos de A. guianensis bem como sua atividade antioxidante e moluscicida. No presente estudo nós descrevemos o isolamento e elucidação estrutural de um novo ciclopeptídeo (amaiouína, composto 2), e outros doze compostos já conhecidos: sendo uma cumarina (6,7-dimetóxi-cumarina, composto 1), dois triterpenos pentacíclicos (6β, 19 α, 23-tetrahidroxiurs-12-en-28-oico e 6 β, 19 α, 23-tetrahidroxiolean-12-en-28-oico, compostos 3 e 4), dois açúcares (manitol e β-etil glicose, composto 5 e 6), dois ácidos clorogênicos (3,5-O-dicafeoil-quinato de metila e 3,5-O-dicafeoilquínico, compostos 7 e 8), duas proantocianidinas (10 e 11) e dois esteróides ( β- sitosterol e estigmasterol, compostos 12 e 13) .O extrato etanólico bruto, suas partições em hexano, acetato de etila e metanol e ainda os compostos 10 e 11 reagiram com DPPH levando a uma perda de 50% na absorbância em concentrações de 78, 25, 246, 46 e 4 µg/mL, respectivamente. Os resultados dos ensaios moluscicidas com o extrato etanólico e suas partições indicaram que a fração acetato de etila foi a mais ativa com LC 100 igual a 100 ppm e LC 50 igual a 42,5 ppm .

ABSTRACT

Amaioua guianensis Aulb is a shurb best known as marmelada-brava or marmelinho-vermelho belonging to Rubiaceae family. Amaioua genus comprise 10 species which are distributed through Floresta Amazônica, Cerrado, Pantanal and Mata Atlântica. No phytochemical work has been reported on the leaves and bark of A. guianensis . As part of our ongoing search for new compounds from higher plants we undertaken and investigation of the ethanolic extract of A. guianensis as well as their antioxidant na molluscicidal activity. In this study we describe the isolation and structural elucidacion of a new conpound, a cyclopeptide (2), and twelve known compounds: a coumarin (1), two pentacyclic triterpene (3 and 4), mannitol (5), ethylglucose (6), three chorogenic acids (7, 8 and 9), two proanthocyanidins (10 and 11) and two steroids (12 and 13). The crude ethanolic extract, its purified fractions soluble in n-hexane, ethylacetate and methanolic, besides compounds 10 and 11 promptly reacted with DPPH leading to a loss of 50% in the absorbance activity in the concentrations of 78, 25, 246 and 4 µg/mL, respectively. The results of the molluscicidal assays with the crude ethanolic extract and its fractions indicated that ethylacetate fractions is the most active fraction with LC 100 100 ppm and

LC 50 42,5 ppm.

xii INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são recursos naturais que têm merecido destaque pelo seu potencial como medicamentos em benefício da humanidade. As mesmas compreendem um conjunto de espécies pertencentes a diferentes famílias botânicas que são largamente exploradas por vários setores da sociedade, tais como, comunidades tradicionais, indústrias farmacêuticas e empresas que comercializam plantas nativas (SILVA, 1999). No Brasil existe uma grande riqueza em diversidade biológica. Segundo o relatório da Conservation International, o Brasil conta com pelo menos 10 a 20% do número total de espécies do planeta, com a flora diversificada compreendendo 50 a 56 mil espécies descritas de plantas superiores, ou 20 a 22% do total mundial (PIRES, 1999). A utilização das plantas medicinais vem atingindo um público cada vez maior, recebendo incentivo da própria Organização Mundial de Saúde, a qual recomendou aos países membros que desenvolvessem pesquisas visando o uso da flora como propósito terapêutico. O que contribuirá para o crescimento dessa prática terapêutica é o desenvolvimento de estudos químicos e farmacológicos que comprovem cada vez mais a eficácia das plantas medicinais no combate de diversas doenças (CASTRO et al ., 2001). A importância dos produtos naturais é evidenciada nas áreas de câncer e doenças infecciosas, onde 60 e 75% das drogas, respectivamente, são de origem natural (NEWMAN et al ., 2003). O paclitaxel (Taxol ®), por exemplo, usado para o tratamento de câncer de ovário e mama, é o agente antineoplásico mais vendido, com arrecadação de mais de um bilhão e meio de dólares no ano de 2000 (MANN, 2002). Existem vários outros exemplos de drogas obtidas a partir de produtos naturais como a vincristina, vimblastina, etoposideo, tenoposideo e topotecan.

1 1.1 O BIOMA CERRADO

A palavra cerrado tem origem espanhola e significa fechado ou vegetação densa. Convencionou-se chamar de cerrado toda a vegetação característica que ocorre na região central do país (RIBEIRO e WALTER, 1998). O cerrado brasileiro ocupa uma área contínua de cerca de dois milhões de Km 2, que corresponde a cerca de 24% do território nacional, constituindo-se o segundo maior bioma em área do Brasil. A área de abrangência deste domínio engloba Goiás, Tocantins, Distrito Federal, Bahia, Minas Gerais, São Paulo, parte no Paraná, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Rondônia, Maranhão, Piauí e Ceará. Há também áreas de cerrado no Amapá, Pará, Roraima e Amazonas, com encraves dentro da floresta Amazônica (PIRES, 1999). Segundo os estudos de Pires e Santos (2000) as estimativas apontam que no Cerrado existem cerca de 6 mil espécies de árvores, 800 espécies de aves, além de 780 das 3000 espécies de peixes. Calcula-se que mais de 40% das espécies de plantas lenhosas que abarca sejam endêmicas. Gottlieb e Borin (2003) ressaltam a importância do Cerrado como área de “corredores naturais” responsáveis por interações mútuas entre outros ecossistemas. Segundo esses autores, o Cerrado dirige fluxos migratórios de organismos que impedem sua homogeneização e aumentam sua biodiversidade, fazendo com que apresente significantes afinidades tanto com os biomas do sul quanto com o do norte e oriental. A grande diversidade taxonômica apresentada pelos vegetais do cerrado faz com que suas espécies sejam responsáveis pela produção de uma enorme gama de compostos, muitos deles com potencial bioativo. Isso acontece quando há uma maior diversidade taxonômica em níveis superiores, provocando um maior distanciamento filogenético entre as espécies e uma maior diferença e diversidade química entre elas. Segundo Goodland e Ferri (1979), a diversidade de substâncias encontradas nas plantas do Cerrado pode estar relacionada à aridez e acidez do solo, e também ao clima seco e quente da região, uma vez que a tentativa de adaptação das plantas a um ecossistema de características tão peculiares resultaria numa maior diversidade estrutural de seus constituintes químicos.

2 Algumas espécies nativas do Cerrado têm merecido especial atenção pelo uso na medicina popular como também pelo potencial químico e biológico já observado. Espécies como Alibertia edulis (marmelada-bola), A. senssilis (marmelada-preta), Palicourea coriacea (douradinha), P. rígida (douradão) e Randia armata (espinheiro), todas pertencentes à família Rubiaceae, são amplamente utilizadas pela medicina tradicional (NETO e MORAIS, 2003). Um melhor aproveitamento e exploração racional das riquezas do Cerrado podem ser conseguidos através de estudos fitoquímicos, paralelos à investigação do potencial biológico de suas espécies. Estudos fitoquímicos e farmacológicos associados à bioensaios eficientes podem contribuir para descoberta e identificação de novas fontes de medicamentos, fornecer dados que auxiliem em agrupamentos quimiotaxonômicos e alertar a população quanto ao uso indiscriminado de espécies vegetais sem o conhecimento ou preocupação com possíveis efeitos tóxicos.

1.2 FAMÍLIA RUBIACEAE

A família Rubiaceae é a quarta maior família das dicotiledôneas, após Asteraceae, Orchidaceae e Fabaceae. Possui aproximadamente 650 gêneros e cerca de 13.000 espécies, sendo representada por árvores, arbustos e ervas (DELPRETE, 2004a). Segundo recentes estudos filogenéticos, a família subdivide-se em três subfamílias: Cinchonoideae, Ixoroideae e Rubioideae, correspondente a cerca de 50 tribos (BREMER et al ., 1995; ROVA et al ., 2002). A maior parte das espécies da família Rubiaceae é própria de regiões mais quentes, principalmente dos trópicos. Mais de 95% de todas as espécies crescem nessas regiões diminuindo em direção ao norte e ao sul. A América do Sul supera em número de espécies todas as regiões da Terra, tendo 30% do total delas, estando em seguida, a região sul da Ásia o continente africano e o Pacífico. No Brasil as rubiáceas são representadas por aproximadamente 2.000 espécies distribuídas em 110 gêneros (DELPRETE, 1998), e está amplamente distribuída nos principais ecossistemas brasileiros, Amazônia, Cerrado e Floresta Atlântica (BOLZANI et al ., 2001).

3 A família é conhecida devido à importância econômica (Coffea arábica, café) e terapêutica de suas espécies, sendo amplamente utilizadas na medicina popular e na fabricação de fitofármacos e fitoterápicos (Uncaria tomentosa , unha de gato). Estudos fitoquímicos com espécies da família revelaram uma grande diversidade de metabólitos secundários, tais como iridóides (MOURA et al ., 2006), alcalóides (HENRIQUES et al., 2004), antraquinonas (LING et al., 2002), lignanas (SILVA et al., 2006), flavonóides, derivados fenólicos, triterpenos, diterpenos, cumarinas (LUCIANO et al., 2004), etc., sendo que os mesmos possuem alto potencial biológico. Espécies como Palicourea coriacea , popularmente conhecida como “douradinha”, é encontrada no Cerrado goiano e utilizada pela população local como diurético. Estudo químico dessa espécie realizado por nosso grupo de pesquisa demosntrou a presença do alcalóide quinolínico calicantina (1), triterpenos, esteróides e os alcalóides indólicos monoterpênicos glicosilados (2-4). A espécie Palicourea rígida , conhecida popularmente como “douradão”, é usada pela população na forma de decocto ou infusão como depurativo nas doenças renais e nas inflamações do aparelho reprodutor feminino (BOLZANI, et al., 1992; VENCATO et a l., 2004). O estudo fitoquímico dessa espécie levou ao isolamento de triterpenos (BOLZANI, et al ., 1992), iridóides (LOPES, 2004), antraquinonas (5) (ROSA, et. al ., 2006) e um alcalóide indólico (6) (SILVA , et al., 2006). Da tribo Cinchonoideae, os gêneros Cinchona L. e Landenbergia Klotzsch foram utilizados durante muitos anos como única fonte de recurso terapêutico para a malária, por serem fontes de quinina (7). O estudo fitoquímico do caule de Alibertia macrophylla (SILVA, et al.; 2007) levou ao isolamento de derivados fenólicos (8), ácido caféico (9), diterpeno (10), e iridóides (11 e 12), sendo que os ultimos possuem atividade antifúngica. A espécie Psychotria ipecacuanha, popularmente conhecida como ipeca, é utilizada como expectorante, amebicida e no tratamento de disenteria, possuindo como princípio ativo os alcalóides isoquinolínicos emetina (13) e cefalina (14) (FRANÇA, 2004). Segundo estudos de Heitzman e colaboradores (2005), espécies do gênero Uncaria são utilizadas como antiinflamatório, anticâncer, no tratamento de artrites, diabetes, estímulo do sistema imunológico, no combate a doenças cardiovasculares, hipertensão, convulsão infantil, atividade antioxidante, entre outros usos. O gênero possui

4 como principais metabólitos secundários alcalóides, cumarinas, triterpenos (15), taninos (16), flavonóides (17) e proantocianidinas (18). A Figura 1 mostra as estruturas de alguns dos metabólitos secundários isolados da família Rubiaceae.

Figura 1: Exemplos de metabólitos secundários com propriedades biológicas isolados de Rubiaceae.

Figura 1 (continuação): Exemplos de metabólitos secundários com propriedades biológicas isolados de Rubiaceae.

1.3 O GÊNERO AMAIOUA

O gênero Amaioua, pertencente à família Rubiaceae, é posicionado na subfamília Ixoroideae, possuindo como gênero irmão o gênero Duroia (DELPRETE, comunicação pessoal, 2008). Esse gênero possui cerca de 10 espécies naturais do Panamá até o Peru, Venezuela e Brasil, sendo que quatro destas espécies encontram-se no bioma Cerrado (DELPRET et al ., 2004b). Até o presente momento não há dados na literatura sobre o estudo fitoquímico de espécies do gênero Amaioua , bem como de seu uso na medicina popular. O gênero mais próximo de Amaioua , Duroia, apresenta cerca de 30 espécies neotropicais, uma na Costa Rica e as demais na América do Sul, assemelha-se ao gênero Amaioua (TAYLOR et al ., 2007). Até o presente momento, há estudos fitoquímicos somente da espécie D. hirsuta (AQUINO et al ., 1999). Neste estudo foram isolados duas novas metoxiflavonas (19 e 20), um novo flavonóide (21) e um iridóide conhecido como duroína (22) (Figura 4).

Figura 2: Metabólitos secundários isolados de Duroia hirsuta .

1.4 A ESPÉCIE AMAIOUA GUIANENSIS AUBL.

A espécie A. guianensis é conhecida popularmente pelos nomes de carvoeiro, pau-carvão, cinzeiro, coração-de-bugre (Santa Catarina), marmelada- brava, marmelinho-vermelho, canela-de-veado, pimentão, guapeva-forte. Apresenta-se como árvore de 10-20 m de altura e 20-50 cm de diâmetro, possui distribuição geográfica ampla, ocorrendo desde as Guianas, Peru, Amazonas e Costa do Atlântico até Santa Catarina. No Brasil sua ocorrência se expande pela Floresta Amazônica, Cerrado, Pantanal e Mata Atlântica. Floresce desde novembro até março tendo um período predominante em dezembro e janeiro. Apresenta frutos de cor roxa, maduros de maio até outubro, os quais são comestíveis e atraem os pássaros, caracterizando-se como uma bagueira na época de sua frutificação (DELPRET et al , 2004b). De acordo com Delprete (comunicação por e-mail em 09-09-2008) a espécie é classificada da seguinte forma:

7 Divisão Magnoliophyta Classe Rosopsida Subclasse Lamidae Ordem Gentianales Família Rubiaceae Subfamília Ixoroideae Tribo Gardenieae Gênero Amaioua Espécie Amaioua guianensis

Figura 3: Exemplar de Amaioua guianensis (fotos Lucília Kato).

1.5 ALCALÓIDES PEPTÍDEOS

Alcalóides ciclopeptídeos, bases poliamidícas, são produtos naturais que têm sido isolados a partir de caules, raízes, sementes e folhas em uma grande variedade de espécies de plantas em todo mundo (JOULLIÉ e RICHARD, 2004). Segundo Menezes et al . (1995), alcalóides ciclopeptídeos são compostos por anéis macrocíclicos de 13, 14 ou 15 membros contendo um anel aromático. Geralmente possuem como elementos estruturais dois aminoácidos e uma unidade estirilamina. O restante do macrociclo consiste de uma unidade peptídica, que está ligada ao anel benzênico em orientação 1,4 ou 1,3. Alcalóides ciclopeptídeos que possuem um macrociclo de 14-membros representam o maior subgrupo de produtos naturais e têm sido o foco da maioria das pesquisas na área (JOULLIÉ e RICHARD, 2004). A primeira classificação dos alcalóides ciclopeptídeos foi proposta por Pais et al . em 1971, sobre a base dos diversos resíduos de aminoácidos que constituíam a molécula. Mais tarde, segundo ao tamanho do anel, em 1975 Tschesche et al . dividiu os alcalóides ciclopeptídeos em três tipos: Ia, Ib, e Ic, no qual o tipo Ia inclui quatro subtipos Ia1, Ia2, Ia3, e Ia4 com base no resíduo β-hidroxil aminoácido (Figura 2) (JOULLIÉ E NUTT, 1985).

Figura 4: Tipos de alcalóides ciclopeptídeos.

Atualmente, segundo estudos de TAN e ZHOU (2006), com base em seu esqueleto estrutural e sua distribuição, os alcalóides peptídeos de plantas foram divididos em duas classes, cinco subclasses e oito tipos (Fluxograma 1). De acordo com o esqueleto, os alcalóides peptídeos podem ser divididos em duas classes, heterociclopeptídeos e homociclopeptídeos. Em seguida, com base no número de anéis, essas classes podem ser divididas em cinco subclasses, heteromonociclopeptídeo, heterodiciclopeptídeo, homomonociclopeptídeo, homodiciclopeptídeo e homopoliciclopeptídeo. Finalmente de acordo com as características dos anéis, e origens, ciclopeptídeos podem ser divididos em oito tipos. Os números de ciclopeptídeos descobertos a partir de plantas superiores até 2005, que pertencem aos tipos I, II, III, IV, V, VI, VII e VIII são 185, 2, 4, 13, 9, 168, 23 e 51 respectivamente, entre eles os tipos I e VI são os dois maiores (Figura 3). Estudos recentes de TAN e ZHOU (2006) indicam que 455 ciclopeptídicos têm sido encontrados em 26 famílias, 65 gêneros e 120 espécies. As 26 famílias nas quais se encontram os alcalóides ciclopeptídeos são: Amaranthaceae, Annonaceae, Araliaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Caryophyllaceae, Celastraceae, Compositae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Labiatae, Linaceae,

9 Malvaceae, Myrsinaceae, Olacaceae, Pandaceae, Phytolaccaceae, Rhamnaceae, Rubiaceae, Rutaceae, Schizandraceae, Solanaceae, Sterculiaceae, Urticaceae, Verbenaceae, e Violaceae, sendo mais comumente encontrados em plantas das famílias Caryophyllaceae e Rhamnaceae.

ALCALÓIDES CICLOPEPTÍDEOS (TIPO I)

HETEROMONOCICLOPEPTÍDEO DEPSICICLOPEPTÍDEOS (TIPO II)

HETEROCICLOPEPTÍDEOS CICLOPEPTÍDEOS TIPO SOLANACEAE (TIPO III)

HETERODICICLOPEPTÍDEO CICLOPEPTÍDEOS TIPO URTICACEAE (TIPO IV)

CICLOPEPTÍDEOS CICLOPEPTÍDEOS TIPO COMPOSITAE (TIPO V)

HOMOMONOCICLOPEPTÍDEO TIPO CARYOPHYLLACEAE (TIPO VI)

HOMOCICLOPEPTÍDEOS HOMODICICLOPEPTÍDEOS TIPO RUBIACEAE (TIPO VII)

- HOMOPOLICICLOPEPTÍDEOS CICLOTÍDEOS (TIPO VIII)

Fluxograma 1: Classificação dos alcalóides ciclopeptídeos.

Figura 5: Tipos de ciclopeptídeos.

Os alcalóides ciclopeptídeos são encontrados em pequenas quantidades em muitas plantas, geralmente na faixa de 0.0002% - 0.05% (GOURNELIS et al.

11 1997). Sua distribuição pode ser explicada pela diferença de expressão genética ou uma simples perda genética em resposta à convergência de fatores ecológicos (WINK, 2003). Alcalóides ciclopeptídeos funcionam como ionóforos em plantas e podem estar envolvidos no processo de nutrição e absorção de metais (JOULLIÉ e RICHARD, 2004). Essa classe de compostos merece especial atenção devido aos diferentes tipos de atividades biológicas apresentadas, tais como: antiplasmodica (BENTLEY, 2006), bactericida (GIACOMELLI et al ., 2004; MOREL et al ., 2002, 2005), fungicida (GOURNELIS et al . 1997), efeito sedativo (GOURNELIS et al . 1997; El-Seedi et al . 2007), inseticida (SUGAWARA et al ., 1996), citotoxicidade frente a células leucêmicas L1210 de murinos e carcinoma epidermoide humano KB (LIU et al . 1997), entre outras.

12 1.6 ATIVIDADE MOLUSCICIDA

Moluscicidas são agentes tóxicos para caramujos (moluscos). Embora geralmente estes sejam inofensivos para seres humanos, alguns caramujos, principalmente os do gênero Biomphalaria, Bulinus e Oncomelania, estão diretamente relacionados à transmissão da esquistossomose (MARSTON e HOSTEITMANN, 1985). Esquistossomose é uma doença parasitária em contínuo crescimento, afetando mais de 200 milhões de pessoas em mais de 70 países na África, América do Sul, Caribe, Ásia e Oriente Médio (SANTOS et al., 2007). Uma estratégia geral para o controle da esquistossomose é remover o vetor da doença, isto é, o caramujo. A utilização de moluscicidas fornece um caminho para o controle da multiplicação e propagação dos caramujos (BILIA et. al ., 2000). Extratos de plantas têm sido usados para controlar a população de caramujos, com a vantagem de serem menos tóxicos ao meio ambiente que os moluscicidas sintéticos, que se degradam mais lentamente possibilitando a indução de resistência dos caramujos, além de possuírem maior custo e de serem tóxicos a outros organismos vivos (AGRAWAL e SINGH, 1988). Estudos anteriores evidenciam que algumas classes de metabólitos secundários, isolados de extratos vegetais, tais como saponinas, flavonóides, triterpenos e derivados de taninos, mostraram-se ativos como agentes moluscicidas (BILIA et. al ., 2000).

13 1.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

No organismo humano, a atividade metabólica normal produz constantemente radicais livres. Estas moléculas, geradas in vivo, reagem com DNA, RNA, proteínas e outras substâncias oxidáveis, promovendo danos que podem contribuir para o envelhecimento e a instalação de doenças degenerativas, como câncer, aterosclerose, artrite reumática, entre outras (MELO et al ., 2006). Segundo RAMARATHNAM e colaboradores (1995), a autoxidação dos ácidos graxos insaturados, componente da membrana celular, é o processo oxidativo que ocorre com mais freqüência no organismo humano. Os antioxidantes são compostos que atuam inibindo e/ou diminuindo os efeitos desencadeados pelos radicais livres e compostos oxidantes. Entre os antioxidantes mais conhecidos estão as vitaminas, principalmente C e E e os flavonóides, entre os quais pode-se citar a quercetina, rutina, hesperidina, naringina, naringenina, e sakuranetina (SOARES et al ., 2005). Para evitar o desenvolvimento da reação oxidativa, os antioxidantes são empregados como aditivos alimentares. Os antioxidantes sintéticos butil-hidróxi- tolueno (BHT), o butil- hidróxi-anisol (BHA) e o terc -butil-hidroquinona (TBHQ) são amplamente utilizados pela indústria alimentícia. Porém, estudos em animais evidenciaram que a exposição aguda e prolongada destes compostos levou ao desenvolvimento de tumores de fígado, pâncreas e glândulas (HIROSE et al. ,

1986), aumento da formação de H 2O2 nos microssomos, alterando as funções hepáticas (ROSSING, KAHL e HILDEBRANDT, 1985), carcinogênese no estômago de ratos (ITO et al., 1983) e adenomas e carcinomas em células hepáticas (WÜRTZEN e OLSEN, 1986). Dada à importância da atividade antioxidante no tratamento e prevenção de várias doenças, sobretudo as cardiovasculares, cada vez mais se têm realizado pesquisas para busca de antioxidantes de origem natural.

14 2. OBJETIVOS

O presente trabalho tem como objetivo o isolamento e identificação dos constituintes micromoleculares da espécie A. guianensis, bem como a avaliação biológica, com ênfase nas atividades moluscicida e antioxidante de seus extratos, frações e compostos puros. Especificamente, foram traçados os seguintes objetivos: • Estudar a espécie A. guianensis utilizando-se os métodos clássicos de separação e identificação dos seus constituintes micromoleculares. • Avaliar a atividade antioxidante do extrato bruto, frações e substâncias isoladas de A. guianensis utilizando-se o ensaio com o radical 2,2- difenil-1-picrilidrazila (DPPH). • Avaliar a atividade moluscicida do extrato bruto e frações obtidas das folhas de A. guianensis frente a caramujos da espécie Biomphalaria glabrata.

15 3-PARTE EXPERIMENTAL

3.1-MATERIAL E MÉTODOS

O material coletado foi seco em estufa de ventilação forçada da marca FANEM modelo 325 SE e moído em moinho de facas Marconi. Para concentrar as soluções utilizou-se evaporador rotativo, modelo MA 120 da marca MARCONI ®. As cromatografias em coluna foram feitas utilizando sílica gel 60 [(0,063- 0,200 mm (70-230 mesh ASTM)] da Merck, e SEPHADEX LH-20, em colunas de vidro. O acompanhamento do processo cromatográfico foi feito através de cromatografia em camada delgada analítica (CCDA). Para as cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) e camada delgada preparativa (CCDP), empregou-se placas de alumínio (sílica gel 60 F 254 - Merck) ou placas de vidro. As placas de vidro para CCDA e CCDP foram confeccionadas com camada de sílica gel 60 Pf 254+365 –Merck de 0,25 mm e 1,00 mm de espessura respectivamente. No caso da CCDA, as placas de vidro foram de dimensões de 3 x 10 e 5 x 10 cm, e no caso da CCDP 10 x 20 cm. Os solventes utilizados na CC, CCDP, CCDA e recristalizações apresentavam grau de pureza PA ou foram tratados e destilados quando necessário. As técnicas unidimensionais e bidimensionais de RMN (RMN 1H, RMN 13 C, DEPT 135, COSY, HMQC, HMBC e NOESY) foram utilizadas para elucidação estrutural das substâncias. Os espectros de RMN unidimensionais e bidimensionais foram obtidos em espectrômetro Varian, Gemini 2000 BB, operando a 300 MHz (300,6 MHz para 1H e 75,4 MHz para 13 C) no Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá/PR sob coordenação da Profa. Dra. Cleuza C. da Silva e Clara Megume A. Tanaka. Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como padrão de referência interna o TMS ( δ = 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados para diluição das amostras foram

CDCl 3, CD 3OD, C 3D6O e D 2O, Aldrich ou Isotec. Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em espectrofotômetro FTIR da marca Bomem, modelo MB-100, na região de 400 a

16 4000 cm -1, em pastilhas de KBr e filme. Para as medidas dos pontos de fusão utilizou-se equipamento Karl Kolb, Scientific Technical Supplies. A rotação óptica foi medida com polarímetro 341 da Perkin Elmer. Como agentes reveladores para CCDA e CCDP formam empregados: • Luz UV (254 e 365 nm); • Reagente de Dragendorff: 0,85g de subnitrato de bismuto – Merck, 10 mL de ácido acético glacial, 40 mL de água destilada (Solução A); 8,0 g de iodeto de potássio, 20 mL de água destilada (Solução B). As soluções A e B foram misturadas, sendo 20 mL desta solução diluídos com 60 mL e água destilada e 20 mL e ácido acético glacial (UGAZ, 1988) – Merck e Sigma;

• MeOH/H 2SO 4 (1:1 v/v), seguido de aquecimento;

• Anisaldeído/H 2SO 4 – Solução recém preparada de 0,5 mL de

anisaldeído, 50 mL de CH 3COOH glacial, 1 mL de H 2SO 4conc (UGAZ, 1988) – Merck e Sigma. • Iodo molecular – Merck

17 3.2 - ESTUDO QUÍMICO DE A. GUIANENSIS .

3.2.1 - COLETA E PREPARO DO MATERIAL

As partes aéreas de A. guianensis foram coletadas e identificadas pelo Prof. Dr. Piero Giuseppe Delprete, professor do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás em novembro de 2006, no Parque Estadual da Serra dos Pireneus, Pirenópolis/GO. A exsicata está depositada no herbário do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, sob o número de coleta ≠ 9312.

3.2.2 - PREPARO E FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS E CAULE .

As partes aéreas coletadas foram separadas em dois grupos: caules e folhas com inflorescências, os quais foram secos em estufa com ventilação forçada a 40º C, moídos em moinho de facas e submetidos à extração a frio com etanol 95% por percolação. O extrato etanólico total foi concentrado utilizando-se evaporador rotativo e forneceu 12,00 g do extrato etanólico do caule e 38,62 g do extrato etanólico das folhas e inflorescências. O extrato etanólico das folhas e inflorescência (38,62 g) foi solubilizado em uma mistura metanol:água (1:1) e, em seguida, submetido à partição em solventes de polaridades crescentes para fornecer as frações em hexano 5,86 g, diclorometano 0,96 g, acetato de etila 17,16 g e hidrometanólica 14,64 g (Fluxograma 2, Tabela 1).

Fluxograma 2: Preparo do extrato etanólico e respectivas partições em hexano, diclorometano e acetato de etila das folhas e inflorescências de A. guianensis .

TABELA 1: Dados da partição do extrato etanólico das folhas.

Fração Código Massa (g) hexânica AGF-Hex 5,86 diclorometano AGF-DCM 0,96 acetato de etila AGF-AcOEt 17,16 hidrometanólica AGF-HM 14,64

O extrato etanólico do caule (17,20 g) foi solubilizado em uma mistura metanol:água (1:1) e, em seguida, submetido a partições em solventes de

19 polaridades crescentes para fornecer as frações em hexano 0,80 g, clorofórmio 0,90 g, acetato de etila 4,10 g e etanol 6,20 g (Fluxograma 3, Tabela 2).

Fluxograma 3: Preparo do extrato etanólico e respectivas partições em hexano, clorofórmio e acetato de etila do caule de A. guianensis .

TABELA 2: Dados da partição do extrato etanólico do caule.

Fração Código Massa (g) Hexânica AGC-Hex 0,80 Clorofórmica AGC-Cl 0,90 acetato de etila AGC-AcOEt 4,10 hidrometanólica AGC-HM 6,20

20 3.2.3 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO DICLOROMETANO DAS FOLHAS (AGF-DCM).

O extrato AGF-DCM (0,96 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel 60

Merck, (Ø = 2,0 cm e H Si = 15 cm), eluído em hexano, gradientes crescentes de hexano/acetona, acetona, gradientes crescentes de acetona/metanol até acetona/metanol 60%, obtendo-se um total de 516 frações, de aproximadamente 15 mL cada (CC 1). A TABELA 3 apresenta as frações que foram coletadas nesta coluna.

TABELA 3: Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-DCM (CC 1). Frações Eluente Volume (mL) 1-9 Hexano 200 10-177 Hexano:Acetona 5% 2100 178-203 Hexano:Acetona 7% 300 204-248 Hexano:Acetona 9% 600 249-269 Hexano:Acetona 11% 350 270-282 Hexano:Acetona 13% 200 283-309 Hexano:Acetona 16% 300 310-353 Hexano:Acetona 20% 500 354-384 Hexano:Acetona 25% 550 385-405 Hexano:Acetona 30% 300 406-420 Hexano:Acetona 40% 200 421-453 Hexano:Acetona 50% 400 454-462 Hexano:Acetona 60% 100 463-478 Hexano:Acetona 70% 200 479-491 Acetona 200 492-498 Acetona:Metanol 3% 100 499-506 Acetona:Metanol 10% 100 507-509 Acetona:Metanol 15% 100 510-511 Acetona:Metanol 20% 100 512-513 Acetona:Metanol 25% 100 514-515 Acetona:Metanol 35% 100 516 Acetona:Metanol 60% 50

As frações após serem analisadas em CCDA foram reunidas em 18 novas frações de acordo com o perfil cromatográfico apresentado. As frações reunidas da coluna cromatográfica da fração AGF-DCM (CC 1) e suas respectivas massas estão representadas na TABELA 4.

TABELA 4: Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração AGF-DCM (CC 1).

Frações Reunidas Massa (mg) 12-14 8,2 15-18 5,4 19-31 7,2 32-42 4,0 43-59 7,7 60-81 52,9 82-119 120,4 120-140 66,5 141-171 62,5 172-233 158,0 234-293 153,8 294-303 46,2 304-377 232,5 378-414 48,1 415-427 41,9 428-442 35,3 443-445 3,6 446-516 234,6

A fração reunida 172-233 (158,0 mg) após ser analisada por CCDA foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) utilizando-se como eluente acetato de etila/acetona 40%. Ao final da CCDP obteve-se 4 frações como mostra na TABELA 5:

22 TABELA 5: Frações obtidas da CCDP da fração 172-233.

Fração Massa (mg)

1 30,3

2 5,2

3 9.0

4 2,5

A fração 2 após ser analisada por CCDA apresentou-se pura recebendo o código de AGF 1 . A fração reunida 304-377 (232,5 mg) foi submetida a uma nova coluna cromatográfica em sílica gel 60 Merck, (Ø = 1,3 cm e H Si = 19 cm), eluída em gradientes de clorofórmio, clorofórmio/acetato de etila, acetato de etila e metanol, rendendo um total de 139 frações, de aproximadamente 10 mL cada como mostra a TABELA 6 (CC 2).

TABELA 6: Dados da coluna cromatográfica da fração 304-377 (CC 2).

Frações Eluente Volume (mL)

1-8 Clorofórmio 150 9-23 Clorofórmio:Acet. Etila 10% 200 24-47 Clorofórmio:Acet. Etila 20% 300 48-106 Clorofórmio:Acet. Etila 30% 700 107-116 Clorofórmio:Acet. Etila 50% 100 117-125 Clorofórmio:Acet. Etila 60% 100 126-135 Acetato de Etila 150 136-139 Metanol 100

As frações após analisadas em CCDA foram reunidas em 15 novas frações de acordo com o perfil cromatográfico apresentado. As frações reunidas da coluna cromatográfica da fração 304-377 e suas respectivas massas estão representadas na TABELA 7.

23 TABELA 7: Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração 304-377(CC 2).

Frações Reunidas Massa (mg)

l-3 9,8 4-9 2,0 10-24 29,7 25-26 1,8 27-30 1,0 31-37 6,5 38-50 9,2 51-55 4,0 56-79 35,6 80-92 23,2 93-100 6,6 101-125 26,9 126-136 8,9 137 21,0 138-139 3,7

A fração reunida 10-24 após evaporação do solvente levou a formação de cristais incolores na forma de agulhas, os quais foram lavados com acetato de etila, resultando em 12,8 mg do cristal puro. A amostra recebeu o código AGF 2 . A fração reunida 101-125 apresentou resposta positiva ao reagente de Dragendorff, sendo submetida a uma CCDP. Os eluentes utilizados foram acetato de etila/metanol (97,6:2,4) e a separação resultou em 7 novas frações que ao serem analisadas por CCDA foram reunidas em 2 novas frações, 1-4 (7,0 mg) e 5-7 (19,0 mg). A fração 5-7 por apresentar-se impura foi cromatografada em coluna de sílica gel 60 (Ø = 1,0 cm e H Si = 17 cm) (CC 3), eluída em gradientes de hexano/acetato de etila, acetato de etila, acetato de etila/metanol e metanol, levando ao isolamento de um composto puro (15,4 mg) que recebeu o código AGF 3 . O fracionamento destinado à fração AGF-DCM está representado no FLUXOGRAMA 4.

25 3.2.4 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO HIDROMETANÓLICA DAS FOLHAS (AGF-HM).

Ao tentar solubilizar parte da fração AGF-HM (11,6 g) em MeOH, observou- se a precipitação de um sólido branco, o qual foi separado do sobrenadante por filtração. A fração AGF-HM foi dividida em duas novas frações, uma solúvel em metanol (AGF-HM-SM) e outra insolúvel em metanol (AGF-HM-NSM), conforme apresentado no FLUXOGRAMA 5. Após analise do perfil cromatográfico da fração AGF-HM-NSM por CCDA, observou-se que esta apresentava-se pura, recebendo o código de AGF 4.

AGF-HM (11,6 g)

MeOH

Sólido Branco Sobrenadante AGF-HM-NSM (1,5 g) AGF-HM-SM (10,1 g)

CCDA

AGF 4 (1,5 g)

FLUXOGRAMA 5: Metodologia utilizada para isolar o composto AGF 4.

3.2.4.1 - ESTUDO DA FRAÇÃO AGF-HM-SM.

A fração solúvel em metanol, AGF-HM-SM, foi submetida a duas cromatografias sucessivas, utilizando-se 500 mg de amostra (CC 4). A fase estacionária utilizada foi Sephadex LH 20 (Ø = 2,5 cm e H seph .= 7,0 cm) e os eluentes usados foram água, metanol e acetona, puros ou combinados em ordem crescente de polaridade, obtendo-se 5 frações em cada coluna, sendo que as frações foram reunidas com base no perfil cromatográfico em CCDA, conforme a TABELA 8.

26 TABELA 8: Dados cromatográficos da fração AGF-HM-SM (CC 4).

Frações Eluente Volume (mL) Massa (mg) 1 Água 20 772,3 2 Água:Metanol 50% 20 32,8 3 Metanol 40 82,6 4 Metanol:Acetona 50% 42 110,6 5 Acetona 20 1,2

Os compostos da fração 1 após serem analisados por CCDA apresentaram- se como os de menor polaridade e maior quantidade de massa, sendo então submetidos a cromatografia em coluna de sílica gel 60 Merck, (Ø = 1,5 cm, m si =

12,5 g e H Si = 20 cm), eluídos em clorofórmio e gradientes crescentes de clorofórmio/metanol, metanol e finalmente água/acido acético 20%, obtendo-se um total de 58 frações, de aproximadamente 17 mL cada (CC 5). A TABELA 9 apresenta as frações que foram coletadas nesta coluna.

TABELA 9: Dados da coluna cromatográfica da fração 1 (CC 5).

Frações Eluente Volume (mL) 1-3 Clorofórmio 55 4-6 Clorofórmio/Metanol 5% 50 7-12 Clorofórmio/Metanol 10% 100 13-24 Clorofórmio/Metanol 15% 200 25-31 Clorofórmio/Metanol 20% 100 32-38 Clorofórmio/Metanol 30% 100 39-45 Clorofórmio/Metanol 40% 100 46-52 Clorofórmio/Metanol 50% 100 53-57 Metanol 100 58 Água/Ac. Acético 20% 50

As frações após analisadas em CCDA foram reunidas em 7 novas frações de acordo com o perfil cromatográfico apresentado. Os códigos e as massas das frações reunidas da coluna cromatográfica da fração 1 estão representados na TABELA 10.

27 TABELA 10 : Massas das frações reunidas da CC da fração 1 (CC 5).

Frações Reunidas Massas (mg) 1-7 3,5 8-12 18,5 13 6,3 14-38 431,2 39-52 24,0 53-57 24,4 58 45,3

A fração reunida 8-12 (18,5 mg) após ter seu perfil cromatográfico analisado por CCDA apresentou-se pura e recebeu um novo código de AGF 5 . Cristais incolores precipitaram da fração reunida 39-52 (24,0 mg), os quais foram separados do sobrenadante e receberam o código AGF 6 (20,6 mg). A fração 2, obtida da coluna cromatográfica 3, ao ter seu perfil cromatográfico analisado por CCDA apresentou-se pura recebendo o código AGF 7. O fracionamento da fração AGF-HM-SM está representado no FLUXOGRAMA 6.

28 AGF-HM (11,6 g)

AGF-HM-NSM AGF-HM-SM

CCDA CC 4 (Sephadex LH 20) AGF 4 1 2 3 4 5

CC 5 (sílica gel 60) AGF 7

8-12 39-52

AGF 5 AGF 6

FLUXOGRAMA 6: Fracionamento da fração AGF-HM-SM.

3.2.5 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DAS FOLHAS (AGF-AcOEt.)

Parte do extrato acetato de etila (1,0 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel 60 Merck, (Ø = 2,5 cm, H Si = 13 cm e m Si = 31,0 g) eluída em clorofórmio, gradientes crescentes de clorofórmio/acetato de etila, acetato de etila, gradientes crescentes de acetato de etila/metanol, metanol, metanol/água e água, obtendo-se um total de 37 frações, de aproximadamente 35 mL cada (CC 6). A TABELA 11 apresenta as frações que foram coletadas nesta coluna.

29 TABELA 11: Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-AcOEt (CC 6). Frações Eluente Volume (mL) 1-2 Clorofórmio 100 3-11 Clorofórmio/Acet. Etila 10% 400 12-14 Clorofórmio/Acet. Etila 90% 100 15-17 Acetato de Etila 100 18-20 Acet. Etila/Metanol 5% 100 21-24 Acet. Etila/Metanol 10% 100 25-29 Acet. Etila/Metanol 50% 120 30-32 Acet. Etila/Metanol 70% 100 33-35 Metanol 100 36 Metanol/Água 50 37 Água 100

As frações após analisadas em CCDA foram reunidas em 11 novas frações de acordo com o perfil cromatográfico apresentado. Os códigos e as massas das frações reunidas da coluna cromatográfica AGF-AcOEt. estão representados na TABELA 12.

TABELA 12: Massas das frações reunidas da Coluna Cromatográfica da fração AGF-AcOEt (CC 6).

Frações Reunidas Massa (mg) 1-5 10,5 6-12 106,9 13 206,9 14-15 146,9 16-19 132,4 20-24 66,1 25-27 126,9 28 69,8 29-32 18,2 33-36 105,5 37 5,5

30 A fração reunida 6-12 (106,9 mg) foi solubilizada em acetato de etila e a esta solução foi adicionado clorofórmio, observando-se a formação de um precipitado branco. O precipitado foi separado do sobrenadante e após sucessivas lavagens obteve-se um sólido puro (90,6 mg) que recebeu o código AGF 8. A metodologia utilizada para isolar o composto AGF 8 esta representado no FLUXOGRAMA 7.

32 3.2.6 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO HEXÂNICA DAS FOLHAS (AGF- Hex).

Parte do extrato hexânico (2,5 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel

60 da Merck, (Ø = 2,5 cm, H Si = 18 cm e m Si = 39,0 g) eluído em hexano e gradientes crescentes de hexano/acetato de etila, acetato de etila, acetona e metanol, obtendo-se um total de 131 frações, de aproximadamente 20 mL cada (CC 7). A TABELA 13 apresenta as frações que foram coletadas nesta coluna.

TABELA 13: Dados da coluna cromatográfica da fração AGF-Hex (CC 7).

Frações Eluente Volume (mL) 1-4 Hexano 200 5-24 Hexano/Ac. de Etila 1% 500 25-28 Hexano/Ac. de Etila 2% 100 29-40 Hexano/Ac. de Etila 3% 300 41-44 Hexano/Ac. de Etila 4% 100 45-57 Hexano/Ac. de Etila 5% 300 58-80 Hexano/Ac. de Etila 6% 500 81-99 Hexano/Ac. de Etila 7% 300 100-111 Hexano/Ac. de Etila 8% 200 112-117 Hexano/Ac. de Etila 20% 100 118-120 Hexano/Ac. de Etila 50% 100 121-126 Acetato de Etila 100 127 Acetona 40 128-131 Metanol 100

As frações após analisadas em CCDA foram reunidas em 17 novas frações de acordo com o perfil cromatográfico apresentado. As frações reunidas da coluna cromatográfica da fração AGF-Hex (CC 7) e suas respectivas massas AGF-Hex estão representados na TABELA 14.

33 TABELA 14: Massas das frações reunidas da coluna cromatográfica da fração AGF-Hex (CC 7).

Frações Reunidas Massa (mg) 1-4 52,0 5-9 22,5 10-14 221,9 15-17 20,8 18-20 18,7 21-28 74,1 29-35 84,2 36-45 91,3 46-51 18,6 52-60 36,1 61-81 61,3 82-89 12,2 90-94 7,7 95-118 81,9 119 52,5 120-125 529,7 126-131 785,1

A fração 36-45 (91,3 mg) apresentou a formação de cristais incolores na forma de agulhas insolúveis em metanol. O restante da amostra foi solubilizada em metanol possibilitando a separação dos cristais (47,7 mg) do sobrenadante recebendo o código AGF 9. O fracionamento da fração AGF-Hex está representado no FLUXOGRAMA 8.

35 3.2.7 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO HEXÂNICA DO CAULE (AGC- Hex).

Parte do extrato Hexânico (0,68 g) foi submetido a cromatografia em coluna de sílica gel 60 da Merck, (Ø = 1,0 cm, H Si = 16 cm) eluída em hexano, gradientes crescentes de hexano/clorofórmio, clorofórmio, gradientes crescentes de clorofórmio/metanol e metanol, obtendo-se um total de 102 frações, de aproximadamente 20 mL cada (CC 8). Das frações 28, 29 e 30 eluídas em clorofórmio 100% (28 e 29) e em clorofórmio/metanol 1 % (30), precipitaram cristais incolores em formato de agulhas, os quais foram separados do sobrenadante. Após analisados em CCDA foram reunidos por apresentarem o mesmo perfil cromatográfico, e receberam o código de AGC 10 (5,0 mg). O fracionamento da fração AGC-Hex está representado no FLUXOGRAMA 9.

AGC-Hex (0,68 g)

Coluna Silica Gel 60 (CC 8)

28 29 30

EtOH EtOH EtOH 28 29 30 cristais cristais cristais

CCDA

AGC 10 5,0 mg

FLUXOGRAMA 9: Metodologia utilizada para isolar AGC 10.

36 3.2.8 – PURIFICAÇÃO DA FRAÇÃO HIDROMETANÓLICA DO CAULE (AGC-HM).

Ao tentar solubilizar parte da fração AGC-HM (3,2 g) em MeOH, observou-se a precipitação de um sólido branco, o qual foi separado do sobrenadante por filtração. A fração AGC-HM foi dividida em duas novas frações, uma solúvel em metanol (AGC-HM-SM) e outra não solúvel em metanol (AGC-HM-NSM), conforme apresentado no FLUXOGRAMA 10. Após análise do perfil cromatográfico da fração AGC-HM (insolúvel em metanol) por CCDA, observou- se que esta se apresentava pura, recebendo o código de AGC 11.

AGC-HM (3,2 g)

MeOH

Sólido Branco Sobrenadante AGC-HM-NSM (150,0 mg) AGC-HM-SM (3,05 g)

CCDA

AGC 11 (150,0 mg)

FLUXOGRAMA 10: Metodologia utilizada para separar o composto AGC11.

37 3.3 – ATIVIDADES BIOLÓGICAS

3.3.1 – ATIVIDADE MOLUSCICIDA

Os bioensaios foram realizados de acordo com método descrito na literatura (BILIA et al ., 2000) utilizando-se caramujos da espécie Biomphalaria glabrata criados em aquário com contínua circulação de água através de um sistema de filtragem, com temperatura próxima de 24º C. Os caramujos aquáticos empregados para os testes eram jovens, de tamanho e idade uniformes (diâmetro médio de 14 mm). A toxicidade aguda frente a B. glabrata foi avaliada pelo procedimento rápido de rastreio: os extratos AGF-Bruto, AGF-HM e AGF-AcOEt foram dissolvidos ou suspensos em água do aquário na concentração de 1.000 ppm. Os testes foram feitos em duplicata, utilizando-se dois caramujos em cada, e um volume de 50 mL de água do aquário por caramujo. Como controle, utilizou-se dois recipientes contendo apenas água do aquário com dois caramujos em cada. No caso de todos os caramujos estarem mortos, uma série de diluições foram feitas e testadas (400, 200, 100, 50 e 25 ppm). Os testes foram feitos em duplicata utilizando-se três caramujos para cada concentração, e um volume de 50 mL de água do aquário por caramujo. Como controle, dois recipientes contendo apenas água do aquário com três caramujos em cada também foram inclusos. Após 24 horas, confirmada ou não a mortalidade dos caramujos, eles foram colocados em um béquer contendo apenas água do aquário, sendo novamente avaliados após 24 horas. A morte dos caramujos foi confirmada pela observação de descoloração, freqüência cardíaca, atividade dos músculos e/ou esmagamento dos animais.

38 3.3.2 – ATIVIDADE ANTIOXIDANTE PELO MÉTODO DO DPPH.

As frações AGF-EB, AGF-AcOEt, AGF-Hex, AGF-HM e a mistura dos compostos 10 e 11 tiveram sua atividade antioxidante avaliadas pelo método do DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila). Neste método o antioxidante reage com o radical DPPH, convertendo-o em sua forma reduzida (2,2-difenil-1-picrilidrazila). Nesta reação, a solução etanólica de DPPH, inicialmente de coloração violeta, torna-se amarelada e o grau deste descoramento indica a habilidade do antioxidante em seqüestrar o radical livre. A atividade antioxidante foi feita utilizando-se a metodologia proposta por Roesler e colaboradores (2006). A análise fotocolorimétrica foi feito em triplicata com o radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazila) na concentração inicial de 40 ppm em etanol. Preparou-se a solução trabalho de DPPH 40 ppm, leu-se a absorbância da mesma a 515 nm. Retirou-se 150 L dos extratos com diferentes concentrações, colocou-os em tubos de ensaio e adicionou-se 2850 L da solução trabalho. As concentrações finais dos extratos variaram de 20 a 100 g.mL -1 do AGF-EB, 20 a 90 g.mL -1 de AGF-AcOEt, 250 a 800 g.mL -1 de AGF- Hex, 20 a 100 g.mL -1 de AGF-HM e 2 a 12 g.mL -1 da mistura dos compostos 10 e 11. Preparou-se um controle com 150 L de água destilada e 2850 L da solução trabalho. O BHT (hidroxitolueno butilado) foi introduzido como controle positivo. A mistura reacional foi deixada por 30 min no escuro em temperatura ambiente. A medida de absorbância foi feita a 515 nm no espectro de luz UV.

39 4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico das folhas e do caule de A. guianensis resultou no isolamento e identificação da cumarina escoparona (1), do alcalóide ciclopeptídico (2), de dois triterpenos pentacíclicos ( 3 e 4 ), do açúcar álcool manitol ( 5), da β-etil glicose (6), da mistura dos ácidos clorogênicos 3,5-di-O-Z-cafeoil-quinato de metila (7) e 3,5-O-dicafeoilquínico (8), da mistura de duas proantocianidinas ( 10 ) e (11), e dos esteróides β-sitosterol ( 12) e estigmasterol ( 13) (Figura 6). Dentre as substâncias isoladas, destaca-se a substância 2 por ser inédita na literatura. As demais substâncias já foram isoladas anteriormente de outras espécies vegetais. Outro ácido clorogênico isolado não teve sua estrutura confirmada devido à impossibilidade de confirmar a posição de substituição no ácido quínico pelo ácido caféico. As estruturas dos compostos isolados foram elucidadas com base nos dados de espectroscopia de infravermelho (IV), ultravioleta (UV), ressonância magnética nuclear (RMN 1D e 2D), além da comparação com dados da literatura.

40 O H O O H NH HN N H MeO O O H

N H MeO O O

AGF 1 = 1 Escoparona Folhas AGF 2 = 2 Amaiouina Folhas

CO2H CO2H

HO HO OH OH OH OH AGF 3 = 3 3ß, 6ß, 19α, 23-tetrahidroxiurs-12-en-28-oico 4 3ß, 6ß, 19α, 23-tetrahidroxiolean-12-en-28-oico Folhas Folhas

OH OH OH O OH HO HO HO OCH2CH3 OH OH OH

AGF 4, AGF 6 e AGC 11 = 5 Manitol AGF 5 = 6 β−Etil Glicose Folhas e Caule Folhas

O HO C OCH3 O O HO C C OH O O OH HO OH AGF 7 = 7 ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila

Folhas Figura 6: Substâncias isoladas das Folhas e Caule de A. guianensis .

41 O HOC OH O O HO C C OH O O OH HO OH AGF 7 = 8 ácido 3,5-O-dicafeoilquínico Folhas O HO C OH R1 = H, R2 = cafeoil ou 1 2 R2O OR1 R = cafeoil, R = H O OH C cafeoil = ácido 5-O-cafeoilquínico AGF 7 = 9 ou ácido 3-O-cafeoiquínico

Folhas

OH OH OH OH B OH O OH O

C O O OH OH OH OH D O OH OH O F OH OH

OH OH OH OH 10 11 AGF 8 = Folhas Folhas

H H

H H H H HO HO

12 Sitosterol 13 Estigmasterol AGF 9 e AGC 10 = Folhas e Caule Folhas e Caule Figura 6 (continuação) : Substâncias isoladas das folhas e caule de A. guianensis .

42 4.1 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS ISOLADOS.

4.1.1 – Determinação estrutural de AFG 1 (ESCOPARONA)

5 4 MeO 6 10 3

2 7 MeO 9 O 8 O

1 Escoparona O composto 1 foi isolado como um óleo de coloração verde, solúvel em clorofórmio. O espectro de absorção na região do IV para o composto 1 apresentou quatro principais bandas de absorção, sendo uma banda de deformação axial C=O em 1650 cm -1, uma deformação axial de C-H de aromáticos em 3015 cm -1 , uma banda de deformação axial da ligação C=C de -1 aromáticos em 1600 cm e uma banda de deformação axial da ligação OCH 3 em 2800 cm -1. 13 O espectro de RMN de C (CDCl 3, 75 MHz, p. 86) confirmou o esqueleto básico C 6.C 3 de uma cumarina, com sinais correspondentes a um carbono carbonílico em δ 168,2 (C-2), e a outros carbonos sp 2, em δ 112,4 (C-3) e 144,2 (C-4), os quais foram atribuídos à lactona α-β-insaturada do anel B cumarínico. Os outros sinais em δ 108,3 (C-5) e 103,4 (C-8) foram atribuídos aos carbonos metínicos do anel aromático. 1 Os dados de RMN de H (CDCl 3, 300 MHz, p. 87) confirmaram a presença da dupla α-β-insaturada pela presença de dois dupletos em δ 7,60 (H-4) e 6,27 (H-3), ambos com constantes de acoplamento de 9,6 Hz, os quais apresentaram correlação entre si no espectro de COSY (p. 88). Dois simpletos em δ 6,92 e 6,84, com integração para um hidrogênio cada, foram atribuídos aos hidrogênios H-5 e H-8 do anel aromático tetrassubstituído. Um simpleto em δ 3,96 com integração para seis hidrogênios foi atribuído as metoxilas do anel aromático. No espectro de RMN de 13 C não se observou os sinais dos carbonos C-6 e C-7, porque os carbonos em questão apresentam maior tempo de relaxação e provavelmente o intervalo de tempo entre um scan e outro não foi suficiente para adquirir esses sinais. Porém, apesar disso, os outros dados apresentados confirmaram a estrutura proposta como sendo da 6,7-dimetóxi-cumarina,

43 conhecida como escoparona. Os dados espectrais da escoparona, juntamente com os dados descritos por Yang e colaboradores (2008), estão representados na TABELA 15. Os demais sinais observados nos espectros analisados foram atribuiídos ao fitalato presente na amostra. Os espectros de RMN de 1H, 13 C e COSY do composto 1 estão apresentados em anexo (p. 86-88).

TABELA 15 . Dados espectrais de RMN de 1H e 13 C do composto 1 .

Yang et al ., 2008 b Composto isolado a No δ 13 C DEPT/135 δ 1H (m, J Hz) δ 13 C δ H (mult., J Hz) 2 161,6 Co - 168,2 - 3 113,8 CH 6,29 ( d, 9,5) 112,4 6,27 ( d, 9,6) 4 143,5 CH 7,63 ( d, 9,5) 144,2 7,60 ( d, 9,6) 5 108,3 CH 6,87 ( s) 108,2 6,92 ( s) 6 146,3 Co - C - 7 153,1 Co - C - 8 100,3 CH 6,84 ( s) 103,4 6,84 ( s) 9 150,3 Co - 151,0 - 10 111,7 Co - 112,9 -

OCH 3 56,60 CH 3 3,93 ( s) 56,4 3,96 ( s)

OCH 3 56,62 CH 3 3,96 ( s) 56,4 3,96 ( s)

a 1 13 b 1 13 – RMN de H e C (CDCl 3, 300 e 75 MHz); – RMN de H e C (CDCl 3, 500 e 125 MHz); c – sinal não observado

44 4.1.2 – Determinação estrutural de AGF 2 (ALCALÓIDE CICLOPEPTÍDEO)

14 13

2 19 12 O 1 11 17 H 15 16 3 10 4 O O 21 8 NH H 6 45 HN 23 N H O 7 24 H 39 43 O 40 32 25 30 N 29 H 42 33

37 27

35 2

O composto AGF 2 (2) foi isolado como um sólido cristalino incolor na forma o 25 o de agulhas com PF 248-249 C, [ α] D = - 87,67 (MeOH; c 1,27), apresentando bandas de absorção no espectro de IV na região de 3060 cm -1, referente à deformação axial da ligação C-H, em 1600 e 1490 cm -1, referentes a deformação axial da ligação C=C de anel aromático, em 3280 cm -1, referente a deformação axial da ligação N-H, e em 1660 cm -1, referentes a vibração de deformação axial da ligação C=O. As absorções observadas indicam a presença dos grupos aromáticos e de carbonilas de amidas na molécula. 1 O espectro de RMN de H de AGF 2 (300 MHz, CDCl 3, p. 89-94) apresentou sinais de hidrogênios olefínicos, hidrogênios ligados a anel aromático, hidrogênios metínicos de carbonos ligados a heteroátomos e hidrogênios metilênicos. Além disso, três sinais correspondentes a hidrogênios ligados a nitrogênio foram observados em δ 5,89, 6,58 e 7,48 ppm, os quais, juntamente com as carbonilas, sugeriram a presença das ligações peptídicas na estrutura do composto AGF 2. 13 A comparação dos espectros de RMN C (75 MHz, CDCl 3, p. 95-98) e DEPT 135 (p. 99) revelou a presença de 40 carbonos, sendo nove carbonos quaternários, incluindo quatro carbonilas em δ 171,0, 170,6, 167,1 e 166,2 ppm, vinte e sete carbonos metínicos incluindo quatro carbonos sp 3 em δ 82,2, 59,0 , 56,9 e 54,2 ppm e quatro grupos metilênicos em δ 24,7, 26,0, 36,3 e 47,0 ppm.

45 O uso combinado dos espectros 1D e 2D (HMQC, COSY, HMBC e NOESY, p. 100-107) e dados da literatura permitiu a identificação de ressonâncias típicas dos aminoácidos fenilalanina, fenilalanina β-substituída, prolina, da unidade estirilamina e do grupo cinamoil. As unidades que compõem a estrutura do composto 2 serão detalhadas a seguir.

Unidade Fenilalanina: O 167,1 128,8 128,7 (7,06-7,09) N 54,2 (7,17-7,20) (4,58 ddd; 4,2; 8,7 e 10,2) (5,89 d; 10,5 Hz) H 132,1 36,3 136,5 (7,11-7,12) (2,78 dd; 15,0 e 10,2 Hz 3,37 dd; 15,0 e 3,6 Hz) 128,7 128,8 (7,17-7,20) (7,06-7,09)

a O O

8 8 6 45 45 N 7 N 7 39 H 39 H 43 43 40 H 40 H 42 42

b c FIGURA 7: Correlações observadas no espectro de HMQC (a), COSY (b), HMBC

( ) e NOESY ( ) (c) da unidade fenilalanina.

No espectro de RMN 1H foram observados hidrogênios metilênicos em δ 2,78 (dd; J = 15,0 e 10,2 Hz, H39) e 3,37 ( J = 15,0 e 3,6 Hz, H39), um hidrogênio metínico em δ 4,58 (ddd; J = 4,2; 8,7 e 10,2 Hz, H7), hidrogênios de anel aromático entre δ 7,06-7,20 (m, H41-45) e um sinal de hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 5,89 (d, J = 10,5 Hz, H6). Pelo espectro de HMQC foram observadas as correlações entre os hidrogênios citados acima (com exceção do

46 hidrogênio ligado a nitrogênio) com os carbonos em δ 36,3, 54,2, 128,7, 128,8 e 132,1, respectivamente. No espectro de COSY pode ser verificada a correlação existente entre o hidrogênio metínico em δ 4,58 (H7) com os hidrogênios metilênicos em δ 2,78 e 3,37 (H39) e com hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 5.89 (H6). Pelo espectro de HMBC observou-se a correlação do carbono metínico em δ 54,2 com os hidrogênios metilênicos em δ 2,78 e 3,37 (H39), e entre o carbono metilênico em δ 36,3 com hidrogênio de anel aromático em δ 7,06-7,09 (m, H41). O espectro NOESY exibiu correlação entre o hidrogênio de anel aromático em δ 7,06-7,09 (m, H41) com os hidrogênios metilênicos em δ 2,78 e 3,37 (H39) e com o hidrogênio ligado ao nitrogênio em δ 6,59 (H9) da outra unidade de aminoácido. Esses sistemas de spins observados e a comparação com dados da literatura (MOREL et al ., 2002) confirmaram a presença do aminoácido fenilalanina como parte da estrutura do composto AGF 2.

Unidade Fenilalanina β-substituída:

128,1 126,9 (7,52-7,56; m) (7,11-7,12; m)

128,9 137,5 82,2 (7,06-7,09; m) (5,92; d;7,2HzO ) 126,9 128,4 56,9 171,8 (7,11-7,12; m) (7,34-7,37; m) (4,76; dd; 7,2 e 2,7 Hz) HN (7,47; s) a

19 19 17 3 17 3 4 O 4 4 O 21 4 21 HN23 HN23

FIGURA 8: Correlações observadas no espectro de HMQC (a), COSY (b),

HMBC( ) e NOESY ( ) (c) da unidade fenilalanina β-substituída. No espectro de RMN 1H foram observados hidrogênios metínicos em δ 4,76 (dd; J = 7,2 e 2,7 Hz, H4) e em δ 5,92 (d; J = 7,2 Hz, H3), hidrogênios de anel aromático entre δ 7,06-7,56 (m, H18-H22) e um sinal de hidrogênio ligado a

47 nitrogênio em δ 7,47 (s, H23). Pelo espectro de HMQC foram observadas as correlações entre os hidrogênios citados acima com os carbonos em δ 56,9, 82,2, 126,9, 128,1, 128,4 e 128,9, respectivamente. Pelo espectro de COSY verificou- se que os prótons metínicos em δ 4,76 (H4) e 5,92 (H35) estão correlacionados entre si, com constante de acoplamento de 7,6 Hz indicando uma relação trans . A correlação entre o próton metínico em δ 4,76 (H4) e próton ligado a nitrogênio em δ 7,47 (s, H23) tambem foi observada no mesmo espectro. A constante de acoplamento entre os prótons metínicos em δ 4,76 e δ 5,92 e a presença do carbono metínico em δ 82,2, indicaram a configuração relativa do tipo L-erythro para fenilalanina β-substituída (VERPOORTE, 1985). O espectro HMBC exibiu correlação entre o carbono metínico em δ 82,2 (H, δ 5,92, C3) com próton de anel aromático em δ 7,34-7,37 (m, H22), correlação entre um carbono carbonílico em δ 171,8 (C5) com os prótons metínicos em δ 4,76 (H4) e 5,92 (H5) e correlação de um carbono quaternário de anel aromático em δ 137,5 (C17) com o próton metínico em δ 5,92 (H3). Pelo espectro de NOESY verificou-se a correlação entre o hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 7,47 (H23) com o hidrogênio metínico α carbonílico em δ 3,90 (H25) de outra unidade de aminoácido e entre o hidrogênio metínico α carbonílico em δ 4,76 (H4) com o hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 5,89 (H6) de outra unidade de aminoácido. Esses sistemas de spins observados e a comparação com dados da literatura (MOREL et al ., 2005) confirmaram a presença do aminoácido fenilalanina β-substituída como parte da estrutura do composto AGF 2.

48 Unidade Estirilamina:

128,6 123,7 (7,34-7,37; m) (7,23-7,26; m)

132,6 116,3 O 155,3 (6,40 d; 7,6Hz) 130,5 123,7 125,8 (7,06-7,09; m)(7,23-7,26; m) (6,74 dd; 7,6 e 10,0Hz) NH (6,59 d; 10,0Hz) a

14 13 14 13

2 2

O 12 O 12 1 11 1 11

15 16 15 16 10 10 NH NH 9 9

b c FIGURA 9: Correlações observadas no espectro de HMQC (a), COSY (b), HMBC

( ) e NOESY ( ) (c) da unidade estirilamina.

No espectro de RMN 1H foram observados hidrogênios olefínicos em δ 6,74 (dd, J = 10,0 e 7,6 Hz, H10) e 6,40 (d, J = 7,6 Hz, H11), hidrogênios de anel aromático entre δ 7,06-7,37 (m, H13-16) e um sinal de hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 6,59 (d, J = 10,0 Hz, H9). Pelo espectro de HMQC foram observadas as correlações entre os hidrogênios citados acima com os carbonos em δ 125,8, 116,3, 123,7, 128,6 e 130,5, respectivamente. Os hidrogênios olefínicos em δ 6,74 (H10) e 6,40 (H11) apresentaram-se acoplados entre si com constante de acoplamento de 7,6 Hz indicando configuração Z. Pelo espectro de COSY verificou-se a correlação entre o hidrogênio olefínico em δ 6,74 (dd, J = 10,0 e 7,6 Hz, H10) com o hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 6,59 (d, J = 10,0 Hz, H9). O espectro HMBC evidenciou a correlação entre o carbono quaternário de anel aromático em δ 132,6 (C12) com hidrogênio olefínico em δ 6,40 (d, J = 10,0 Hz, H11) e com hidrogênios de anel aromático em δ 7,23-7,26 (m, H13 e H16). Observou-se também pelo espectro de HMBC a correlação de um carbono

49 quaternário de anel aromático ligado a heteroátomo em δ 155,3 (C1) com hidrogênios metínicos de anel aromático em δ 7,34-7,37 (m, H14) e 7,06-7,09 (m, H15), indicando que o anel aromático é para substituído. Pelo espectro de NOESY verificou-se a correlação existente entre o hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 6,59 (H9) com hidrogênio de anel aromático em δ 7,06-7,09 (H45) de outra unidade de aminoácido e com o hidrogênio olefínico em δ 6,74 (H10). Os sistemas de spins observados e a comparação com dados da literatura (MENEZES et al ., 1995) confirmaram a presença da unidade estirilamina como parte da estrutura do composto AGF 2.

Grupo Cinamoil: O 143,6 166,2 (7,50 d; 15,6 Hz) 129,3 117,5 (6,27 d; 15,6 Hz) (7,43-7,46; m) 135,0

128,6 129,3 (7,34-7,37; m) (7,43-7,46; m)

130,4 128,6 (7,06-7,09; m) (7,34-7,37; m) a O O

32 30 32 30 31 31 33 33

37 37

ba c FIGURA 10: Correlações observadas no espectro de HMQC (a), COSY (b),

HMBC ( ) e NOESY ( ) (c) do grupo cinamoil.

No espectro de RMN 1H foram observados hidrogênios olefínicos em δ 7,50 (d; J = 15,6 Hz, H32) e 6,27 (d; J = 15,6 Hz, H31) e hidrogênios de anel aromático entre δ 7,06-7,46 (m; H33-38). Pelo espectro de HMQC foram observadas as

50 correlações entre os hidrogênios citados acima com os carbonos em δ 143,3, 117,5, 128,6, 129,3 e 130,4, respectivamente. Pelo espectro de COSY verificou- se correlação entre os hidrogênios olefínicos δ 7,50 (H32) e 6,27 (H31), cuja constante de acoplamento de 15,6 Hz indica relação E entre eles. Observou-se também correlação entre os hidrogênios de anel aromático em δ 7,43-7,46 (m, H38 e H34) com o hidrogênio olefínico em δ 7,50 (H32). Pelo espectro de NOESY verificou-se correlação entre os hidrogênios olefínicos em δ 6,27 (H31) e 7,50 (H32) com os hidrogênios de anel aromático em δ 7,43-7,46 (m, H38 e H34) e entre o hidrogênio olefínico em δ 6,27 (H31) com prótons metilênicos em δ 3,02 e 3,21 (H28) de outra unidade de aminoácido . Pelo espectro de HMBC observou-se correlação entre o carbono carbonílico em δ 166,2 (C30) com os hidrogênios E olefínicos em δ 7,50 (H32) e 6,27 (H31). Também pelo espectro de HMBC verificou-se a correlação de um carbono quaternário de anel aromático em δ 135,0 (C33) com os hidrogênios E olefínicos em δ 7,50 (H32) e 6,27 (H31). O conjunto de sinais observados e a comparação com dados da literatura (GIACOMELLI et al ., 2004) confirmaram a presença do grupo cinamoil como parte da estrutura do composto AGF 2

51 Unidade Prolina:

170,6 O N 59,0 (3,90 d; 6,9 Hz) 47,0 26,0 (3,02 t; 9,1 Hz; (1,36-1,48 m; 2,20 dd; 11,5 e 5,1 Hz) 3,21 dd; 9,1 e 6,9 Hz) 24,7 (1,36-1,48 m; 1,82 dd; 11,5 e 5,1 Hz) a

24 O 24 O 25 N 25 N 29 29

27 27

b c FIGURA 11: Correlações observadas no espectro de HMQC (a), COSY (b),

HMBC ( ) e NOESY ( ) (c) da unidade prolina.

No espectro de RMN 1H foi observado um conjunto de hidrogênios metilênicos entre δ 1,36-1,48 (m, H27 e H26), 1,82 (dd, J = 11,5 e 5,1 Hz, H27), 2,20 (dd, J = 11,5 e 5,1 Hz, H26), 3,02 (t, J = 9,1 Hz, H28), 3,21 (dd, J = 9,1 e 6,9 Hz, H28) e um hidrogênio metínico em δ 3,90 (d, J = 6,9 Hz, H25). Pelo espectro de COSY observou-se que os hidrogênios metilênicos estão todos correlacionados entre si e que o hidrogênio metínico em δ 3,90 (H25) se correlaciona com hidrogênios metilênicos em δ 1,36-1,48 (m, H26) e 2,20 (dd, J = 11,5 e 5,1 Hz, H26). Pelo espectro de HMBC verificou-se a correlação entre o carbono carbonílico em δ 170,6 (C24) e hidrogênio metínico em δ 3,90 (H25). Pelo espectro de NOESY observou-se a correlação entre os hidrogênios metilênicos em δ 3,02 e 3,21(H28) com o hidrogênio olefínico em δ 6,27 (H31) de outra unidade de aminoácido e também a correlação entre o hidrogênio metínico

52 α carbonílico em δ 3,90 (H25) com o hidrogênio ligado a nitrogênio em δ 7,47 (H23) de outra unidade de aminoácido. O conjunto de sinais observados e a comparação com dados da literatura (EL-SEEDI et al ., 1999) confirmaram a presença do aminoácido prolina como parte da estrutura do composto AGF 2. Todas as unidades foram identificadas, mas a complexidade dos espectros impediu a determinação das posições de cada unidade na molécula. Os cristais obtidos do composto AGF 2 permitiram a obtenção de dados de Raios-X (TABELA 16). Os dados cristalográficos foram obtidos pelo cristalógrafo professor Dr. José Ricardo Sabino do Instituto de Física da UFG, em um difratômetro CAD 4 de monocristais, operando sob radiação de cobre (Cu) a temperatura ambiente. Os dados cristalográficos obtidos indicaram que os cristais encontravam-se geminados, sendo cristais do tipo Twin pseudo-merohédrico. O diagrama ORTEP da estrutura cristalina deste composto (Figura 12) estabeleceu tanto a seqüência dos aminoácidos como a configuração relativa do composto. Os dados obtidos nas análises de RMN uni e bidimensionais estão apresentados na TABELA 17 . Os espectros de RMN de 1H, 13 C, DEPT 135, COSY, HMBC e NOESY do composto 2 estão apresentados em anexo (p.89- 107).

53 TABELA 16: Dados cristalográficos obtidos para o composto 2.

Fórmula Empírica C80 H76 N8 O10

Peso Molecular 1309.49

Temperatura 299(2) K

Radiação 1.5418 Å (Cu-Kα)

Sistema Cristalino Monoclínico

Grupo Espacial P2 (Twin pseudo-merohédrico-P4 ) 1 1 Dimensão da Célula Unitária a = 12.827(2) Å

b = 20.944(4) Å β = 90.26(2)°

c = 13.013(2) Å

Volume 3495.9(10) Å 3

Z 2

Densidade (calculada) 1.244 Mg/m 3

Tamanho do Cristal 0.50 x 0.15 x 0.15 mm 3

Reflexões Coletadas 19232

Reflexões Independentes 9871 [R(int) = 0.11]

Goodness-of-fit (Chi quadrado) 1.080

σ Final R índices [I>2 (I)] R1 = 0.0945, wR2 = 0.2328 Parâmetro de estrutura absoluta -0.3(4)

FIGURA 12: Ortep do monocristal do composto AGF 2. .

54 TABELA 17: Dados espectrais de RMN de 1H, 13 C, COSY, HMBC e NOESY do

composto 2 (CDCl 3, 300 e 75 MHz, ppm). N0 δ 13 C δ 1H ( J Hz) HMBC COSY NOESY 1 155,3 H14, H15 H4, H6, 3 82,2 5,92, d (7,2) H4, H22 H4 H22 4 56,1 4,76, dd (7,2; 2,7) H23, H3 H3, H22 5 171,1 H3, H4 7 54,3 4,58, ddd (4,2; 8,7 e 10,2) H39 H39, H6 8 167,1 10 125,8 6,74, dd (10,0 e 7.6) H11 H9, H11 H9, H11 11 116,3 6,40, d (7, 6) H10 12 132,6 H11 13 123,7 7,23-7,26, m H11 H15 14 128,6 7,34-7,37, m H13 H13 15 130,5 7,067,09, m H16 16 123,7 7,23-7,26, m H11 H15 17 137,5 H3 18 128,1 7,52-7,56, m H3, H22 19 126,9 7,11-7,12, m 20 128,9 7,06-7,09, m 21 126,9 7,11-7,12, m 22 128,4 7,34-7,37, m H4, H3 24 170,6 H25, H26 25 59,0 3,90, d (6,9) H27 H23 26 26,0 1,36-1,48, m e 2,20, dd (11,5 e 5,1) H25, H28 H25 27 24,7 1,36-1,48, m e 1.82, dd (11,5 e 5,1) H25, H28 H28, H25 28 47,0 3,02, t (8,4) e 3,21, m H25 H27 30 166,2 H31, H32 H28, H32, 31 117,5 6,27, d (15,6) H32 H34 32 143,6 7,50, d (15,6) H34 H31 H31, H38 33 135,0 H31, H32 34 129,3 7,43-7,46, m H35 H32 H31 35 128,6 7,347,37, m H34 H34 36 130,4 7,06-7,09, m H35 37 128,6 7,34-7,37, m H38 H38 38 129,3 7,43-7,46, m H37 H32 H32 2,78, dd (15,0 e 10,2) 39 36,3 H41 H39, H7 H41, H45 3,37, dd (15,0 e 3,6) 40 136,6 41 128,8 7,06-7,09, m H39 42 128,7 7,17-7,20, m 43 132,1 7,11-7,12, m 44 128,7 7,17-7,20, m 45 128,8 7,06-7,09, m H39, H7 NH-6 5,89, d (10,5) H4 NH-9 6,59, d (10,0) H10 H10, H45 NH-23 7,47, s H4 H25 N-29 ------

55 4.1.3 - Identficação estrutural da mistura AGF 3 (TRITERPENOS)

30 29 30 29 HO 20 20 HO 19 21 19 21 12 22 12 22 18 18 11 17 25 11 26 13 17 25 26 13 CO2H CO2H 14 16 14 16 28 28 9 15 1 9 15 1 2 10 8 2 10 8 3 5 7 27 3 5 7 27 6 HO 4 6 HO 4 23 23 24 OH 24 OH OH OH 3 4 A mistura das substâncias 3 e 4 (AGF 3) foi isolada das folhas de A. guianensis como um sólido amorfo branco, apresentando fluorescência sob luz ultravioleta ( λ = 254 e 365 nm) e cor azul quando revelado com anisaldeído. O espectro na região do infravermelho da mistura mostrou intensa absorção em 1690 cm -1, característica do estiramento da ligação C=O, além de uma absorção em 3400 cm -1, típica de estiramento O-H sugerindo a existência de um grupo –COOH na molécula. 13 Através da análise do espectro de RMN C (CD 6OD, 75 MHz, p. 112-115), foi possível observar quatro sinais referentes a carbonos olefínicos em δ 129,2 (C- 12 , 3), 139,0 (C-13 , 3), 124,6 (C-12 , 4) e 143,7 (C-13 , 4), dois sinais de carbonos alílicos em δ 54,6 (C-18, 3) e 44,7 (C-18, 4), dois sinais de carbonos metínicos em δ 49,2 (C-5, 3) e 49,7 (C-5, 4), um sinal de carbono carbinólico em δ 73,9 (C-3, 3 e 4), dois sinais de carbonos carbonílicos em δ 179,5 e 179,3 referentes aos carbonos C-28 dos compostos 3 e 4 respectivamente, além dos carbonos em δ 14,1 (C-24, 3), 14,2 (C-24, 4), 17,6 (C-25, 3), 16,7 (C-25, 4), 18,4 (C-26, 3 e 4), 25,1 (C-27, 3), 24,8 (C-27, 4), 27,4 (C-29, 3), 25,0 (C-29, 4), 17,4 (C-30, 3) e 28,6 (C-30, 4) referentes a sinais de metilas. O conjunto de sinais observados acima é característico dos esqueletos triterpênicos do tipo ursólico e oleanólico. Ademais, foram observados mais cinco sinais de carbonos carbinólicos em δ 68,5 (C-6, 3), 68,4 (C-6, 4), 82,1 (C-19, 4), 73,4 (C-19, 3), 67,9 (C-23, 3 e 4), sendo que os sinais em δ 68,5, 68,4 e 82,1 correspondem a

56 carbonos metínicos e o sinal em δ 73,4 corresponde a um carbono quaternário e o sinal em δ 67,9 a um carbono metilênico. Pelo espectro de COSY (p. 119-120) pode-se observar para o composto 3 correlações entre o hidrogênio carbinólico H-3 em δ 3,57 (dd, J = 9,6 Hz), com os hidrogênios diastereotópicos ligados ao C-2 em δ 1,52 (sl, H2) e 1,54 (m, H2), correlações entre o hidrogênio carbinólico H-6 em δ 4,48 (sl) com os hidrogênios diastereotópicos ligados ao C-7 em δ 1,47 (d, J = 2,4 Hz, H7) e 1,64 (d, J = 4,5 Hz, H7), correlações entre os hidrogênios metilênicos H-11 em δ 2,02 (m, H11) com o hidrogênio metínico H-9 em δ 1,76 (d, J = 1,8 Hz, H9) e com o hidrogênio olefínico H-12 em δ 5,33 (m, H12). Ainda pelo espectro de COSY, pode-se observar para o composto 4 correlações entre o hidrogênio carbinólico H-3 em δ 3,57 (dd, J = 9,6 Hz, H3), com os hidrogênios diastereotópicos ligados ao C-2 em δ 1,69 (d, J = 2,1 Hz, H2) e 1,73 (sl, H2), correlações entre o hidrogênio carbinólico H-6 em δ 4,48 (sl, H6) com os hidrogênios diastereotópicos ligados ao C-7 em δ 1,58 (d, J = 3,3 Hz, H7) e 1,78 (d, J = 1,8 Hz, H7), correlações entre os hidrogênios metilênicos H-11 em δ 2,02 (m, H11) com o hidrogênio metínico H-9 em δ 1,76 (d, J = 1,8 Hz, H9) e com o hidrogênio olefínico H-12 em δ 5,33 (m, H12) e uma correlação entre o hidrogênio alílico H-18 em δ δ 3,12 (sl) com o hidrogênio carbinólico H-19 em δ 3,32 (d, J = 3,3 Hz). A estereoquímica relativa do composto 3 foi proposta com base na constante de acoplamento observada para o hidrogênio carbinólico H-3, cujo valor de 9,6 Hz condiz com o acoplamento axial-axial, fixando H-3 na posição axial e a hidroxila com configuração β. O hidrogênio em 4,48 apresentou-se como um simpleto largo, mas as constantes de acoplamento observadas para os hidrogênios diastereotópicos ligados ao C-7 em δ 1,47 (d, J = 2,4 Hz, H7) e 1,64 (d, J = 4,5 Hz, H7) sugeriram um acoplamento equatorial-equatorial e equatorial-axial, respectivamente, posicionando H-6 na posição equatorial e a hidroxila com configuração β, A estereoquímica relativa do composto 4 foi proposta com base na constante de acoplamento observada para o hidrogênio carbinólico H-3, cujo valor de 9,6 Hz condiz com o acoplamento axial-axial, fixando H-3 na posição axial e a hidroxila com configuração β, pelas constantes de acoplamento observadas para os

57 hidrogênio diastereotópicos ligados ao C-7 em δ 1,58 (d, J = 3,3 Hz, H7) e 1,78 (d, J = 1,8 Hz, H7), cujos valores das constantes de acoplamento de 3,3 Hz e de 1,8 Hz condiz com acoplamento equatorial-axial e equatorial-equatorial, fixando H-6 na posição equatorial e a hidroxila com configuração β, comuns à maioria dos triterpenos. A estereoquímica para hidroxila no carbono C-19 pode ser inferida com base nas constantes de acoplamento observada para o hidrogênio carbinólico H-19 em δ 3,32 (d, J = 3,3 Hz), cujo valor da constante de acoplamento de 3,3 Hz condiz com acoplamento equatorial-equatorial, fixando H-19 na posição equatorial e a hidroxila na posição axial, com configuração α. A partir dos dados apresentados e com base em dados fornecidos pela literatura, foi possível identificar o composto 3, como sedo o triterpeno pentacíclico da série dos urs-12-enos, o ácido 3 β, 6 β, 19 α, 23-tetrahidroxiurs-12- en-28-oico (FANG et al ., 1996) e o composto 4 como sendo o triterpeno pentacíclico da série dos olean-12-enos, o ácido 3 β, 6 β, 19 α, 23-tetrahidroxiolean- 12-en-28-oico (KHAN e STICHER, 1993). As principais correlações observadas no espectro de COSY para os compostos 3 e 4 estão representadas na figura 13. Os espectros de RMN 1H, 13 C, HMQC e COSY dos compostos 3 e 4 estão apresentados em anexo (p. 108-120). Os dados espectrais de RMN 13 C e 1H dos triterpenos 3 e 4 serão apresentados na TABELA 18 e 19.

HO HO 3,32 (d, 3,3 Hz) H 82,1 3,12 (sl) H 1,52 (sl) 49,7 1,54 (nd) 1,69 (d, 2,1 Hz) CO H 1,73 (sl) H 2 H CO2H H H 3,57 (dd, 9,6 Hz) H 3,57 73,9 41,3 H 73,9 41,4 68,5 (dd, 9,6 Hz) 68,4 HO H 1,47 (d, 2,4 Hz) H HO 1,58 (d, 3,3 Hz) H 1,64 (d, 4,5 Hz) H 3,46 (10,1) H 67,9 HOH H 67,9 HOH 1,78 (d, 1,8 Hz) 3,67 (10,1) H 3,46 (10,1) H OH 4,48 (sl) 3,67 (10,1) OH 4,48 (sl)

3 4 3ß, 6ß, 19α, 23-tetrahidroxiursano-12-en-28-oico 3ß, 6ß, 19α, 23-tetrahidroxioleano-12-en-28-oico

FIGURA 13: Principais correlações no espectro de COSY do composto AGF 3.

58 1 13 TABELA 18: Dados espectrais de RMN de H e C do composto 3 (CD 6OD, 300 e 75 MHz).

FANG et al ., 1996 Composto isolado No δ 13 C DEPT δ 1H (m, J Hz) δ 13 C δ 1H (m, J Hz) /135 1 41,3 CH 2 41,4 2 28,1 CH 2 27,9 3 73,9 CH 4,26 (dd, 3,6 e 11,2) 73,9 3,57 (dd, 3,9 e 9,6) 4 44,0 Co 43,8 5 49,9 CH 49,2 1,72 (sl) 6 68,0 CH 5,03 sl 68,5 4,48 (s) 7 41,6 CH 2 41,4 1,64 (d, 4,5) e 1,47 (d, 2,4) 8 39,9 Co 39,9 9 48,5 CH 48,6 1,76 (d, 1,8) 10 37,1 Co 37,4 11 24,4 CH 2 24,4 2,02 (m) 12 128,5 CH 5,67 (m) 129,2 5,33 (m) 13 139,5 Co 139,0 14 42,5 Co 42,8 15 29,4 CH 2 29,0 16 26,7 CH 2 26,5 17 48,5 Co 48,4 18 54,9 CH 3,11 sl 54,6 2,57 (sl) 19 73,0 Co 73,4 20 42,8 CH 42,8 21 27,1 CH 2 27,0 22 38,6 CH 2 38,6 23 68,0 CH 2 4,38 (d, 10,3) 67,9 3,46 (d, 10,1) 4,03 (d, 10,3) 3,67 (d, 10,1) 24 14,6 CH 3 1,71 (s) 14,1 1,12 (s) 25 17,6 CH 3 1,70 (s) 17,6 1,32 (s) 26 18,5 CH 3 1,67 (s) 18,4 1,08 (s) 27 24,8 CH 3 1,67 (s) 25,1 0,95 (s) 28 180,9 Co 179,5 29 27,3 CH 3 1,46 (s) 27,4 1,22 (s) 30 16,8 CH 3 1,10 (d, 6,0) 16,6 0,93 (d, 6,0) a 1 13 b 1 13 RMN de H e C (C 5D5N, 400 e 100 MHz), RMN de H e C (C 3D6O, 300 e 75 MHz).

59 1 13 TABELA 19: Dados espectrais de RMN de H e C do composto 4 (CD 6OD, 300 e 75 MHz).

KHAN e STICHER, 1993 a Com posto isolado b

No δ 13 C DEPT δ 1H (m, J Hz) δ 13 C δ 1H (m, J Hz) /135 1 41,3 CH 2 41,2 2 28,6 CH 2 29,2 3 73,4 CH 4,0 (dd, 11,4) 73,9 3,57 (dd, 3,9 e 9,6) 4 43,9 Co 43,8 5 49,7 CH 49,7 1,73 (sl) 6 67,9 CH 4,83 (m, W ½ = 5 Hz) 68,4 4,48 (sl) 7 40,8 CH 2 41,5 1,58 (d, 3,3) e 1,78 (d, 1,8) 8 39,3 Co 39,6 9 49,0 CH 48,6 1,76 (d, 1,8) 10 37,1 Co 37,1 11 24,7 CH 2 24,4 2,02 (m) 12 123,8 CH 5,44 (m) 124,6 5,33 (m) 13 144,7 Co 143,7 14 42,6 Co 42,7 15 28,7 CH 2 28,6 16 27,9 CH 2 27,9 17 46,3 Co 46,2 18 45,0 CH 3,55 (dd, 10, 6) 44,7 3,12 (sl) 19 81,6 CH 3,44 (d, W ½ = 8,0 Hz) 82,1 3,32 (d, 3,3) 20 35,7 Co 35,9 21 29,2 CH 2 29,3 22 33,9 CH 2 33,7 23 67,3 CH 2 4,19 (d, 10,2) 67,9 3,46 (d, 10,1) 3,85 (d, 10,2) 3,67 (d, 10,1) 24 14,6 CH 3 1,53 (s) 14,2 1,14 (s) 25 17,3 CH 3 1,48 (s) 16,7 0,92 (s) 26 18,4 CH 3 1,46 (s) 18,4 1,09 (s) 27 24,8 CH 3 1,42 (s) 24,8 1,28 (s) 28 180,0 Co 179,3 29 25,0 CH 3 0,99 (s) 25,0 0,96 (s) 30 28,8 CH 3 0,92 (s) 28,6 0,96 (s) a 1 13 b 1 13 RMN de H e C (C 5D5N, 300 e 75 MHz), RMN de H e C (C 3D6O, 300 e 75 MHz).

60 4.1.4 – Identificação Estrutural de AGF 4, AGF 6 e AGC 11 (MANITOL)

OH OH 6 5 4 3 2 OH HO 1 OH OH

5 Manitol

1 Os espectros de RMN H (D 2O, 300 MHz, p. 121) das amostras AGF4 , AGF6 2 AGC 11 apresentaram sinais na região entre 3,5 - 4,0 ppm, região 13 característica de açúcares. Os espectros de RMN C/DEPT 135 (D 2O, 75 MHz, p.122) apresentaram três sinais para carbonos, sendo um CH 2 em δ 66,2 (C1 e C6), um CH em δ 72,1 (C3 e C4) e outro CH em δ 73,8 (C2 e C5), sugerindo um monossacarídeo para substância AGF 2, AGF 4 e AGC 11. A comparação dos dados espectroscópicos de RMN 1H e 13 C da substância AGF 4, AGF 6 e AGC 11 com os dados da literatura (RAVEN et al ., 2001) confirmou a estrutura como sendo o manitol (5) . A quantidade de manitol isolado representa aproximadamente 20% de toda fração aquosa, sendo este o composto majoritário da fração AGF-HM. Os espectros de RMN de 13 C, 1H e DEPT 135 do composto 5 estão apresentados em anexo (p. 121-122). Os dados espectrais de RMN 13 C e 1H do composto 5 estão apresentados na TABELA 20.

13 1 TABELA 20: Dados espectrais de RMN C e H do composto 5 (D 2O, 300 e 75 MHz) . RAVEN et al ., 2001 Composto isolado

No δ 13 C DEPT /135 δ 13 C δ 1H (m, J Hz)

1 e 6 64,6 CH 2 66,2 3,5-4,0 (m) 2 e 5 72,2 CH 72,1 3,5-4,0 (m) 3 e 4 70,7 CH 73,8 3,5-4,0 (m)

4.1.5 – Identificação estrutural de AGF 5 (β-ETIL GLICOSE)

HO 6 4 HO 5 O HO 2 OCH2CH3 3 1 7 8 OH β− 6 Etil Glicose

1 O espectro de RMN H (CD 3OD, 300 MHz, p. 123) da substância AGF5 apresentou sinais na região de 3,15 - 4,25 ppm, característica de açúcares. Observou-se também a presença de um sinal na região mais blindada do espectro em δ 1,22 (t, J = 7,2 Hz, H-8) com integração para três prótons e sinais de prótons metilênicos em δ 3,59 (dq, J = 9,6 e 7,2 Hz, H-7) e 3,95 (dq, J = 9,6 e 7,2 Hz, H-7) que se apresentaram correlacionados entre si pelo espectro de 13 COSY (p. 125). Os espectros de RMN C/DEPT 135 (CD 3OD, 75 MHz, p.124) apresentaram sete sinais para carbonos na região de 62,8 – 104,1 ppm, sendo cinco CH e dois CH 2 e um sinal em δ 15,4 ppm referente a um CH 3, sugerindo um monossacarídeo para substância AGF5. A partir dos dados apresentados e da comparação com dados da literatura (BREITMAIER e VOELTER, 1990) foi possível propor a estrutura do composto 6 como sendo a β- etil glicose. Os dados espectrais, obtidos pela analise de RMN uni e bidimensionais, do composto 6, juntamente com os dados espectrais da β–glicose fornecidos pela literatura (BREITMAIER, 1990) estão representados na TABELA 21. Os demais sinais observados nos espectros de RMN uni e bidimensionais foram atribuídos a glicerol presente na amostra. Os espectros de RMN de 13 C, 1H e COSY do composto 6 estão apresentados em anexo (p. 123-125).

62 TABELA 21 : Dados espectrais de RMN uni e bidimensionais do composto 6

(CD 3OD, 300 e 75 MHz).

BREITMAIER, 1990 Composto isolado No δ 13 C DEPT /135 δ 13 C δ H (mult., J Hz) COSY 1 97,4 CH 104,1 4,25 (d, 7,8) 3,15 2 75,9 CH 75,1 3,15 (t, 8,1) 4,25 e 3,34 3 77,5 CH 78,1 3,34 (t, 9,0) 3,24-3,27 e 3,15 4 71,3 CH 71,6 3,24-3,27 (m) 3,34 5 77,4 CH 77,9 3,24-3,25 (m) 3,65 e 3,85

6 62,5 CH 2 62,8 3,85 (dd, 12,0 e 1,8) e 3,65 e 3,24-3,25 3,61 (dd, 12,0 e 5,4) 3,85 e 3,24-3,25

7 ----- CH 2 66,2 3,95 (dq, 9,6 e 7,2) e 3,60 e 1,22 3,59 (dq, 9,6 e 7,2) 3,95 e 1,22

8 ----- CH 3 15,4 1,22 (t, 7,2) 3,95 e 3,65

63 4.1.6 – Identificação estrutural da mistura AGF 7 (ÁCIDOS CLOROGÊNICOS)

O HO C 7 OCH3 8 O O ' 2" 7" 7 2' HO C C 1' ' OH 3" 1" O 3 9" O 9' " 8' 8 ' 4" OH 4 " 6' HO 6 OH 5" 5'

7 ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila

O HO C OH O O HO C C OH O O OH HO OH

8 ácido 3,5-O-dicafeoilquínico

O HO C OH R1 = H, R2 = cafeoil ou R2O OR1 R1 = cafeoil, R2 = H O OH C OH ácido 5-O-cafeoilquínico cafeoil = 9 ou ácido 3-O-cafeoiquínico OH

A mistura das substâncias 7, 8 e 9 (AGF 7) foi isolada da fração hidrometanólica das folhas de A. guianensis como um óleo amarelo solúvel em metanol e água, apresentando fluorescência sob luz ultravioleta ( λ = 254 e 365 nm) e cor azul quando revelado com anisaldeído.

64 O espectro na região do infravermelho mostrou uma banda de absorção em 1250 cm -1, característica da deformação axial da ligação C-O de fenóis, uma banda referente a deformação axial da ligação C=C de aromáticos em 1575 cm -1, uma intensa banda de absorção em 1700 cm -1, característica do estiramento da ligação C=O, além de uma banda de absorção larga e intensa em 3400 cm -1, típica do estiramento da ligação O-H, sugerindo a existência de um grupo –COOH na molécula. 13 O espectro de RMN C (75 MHz, D 2O, p. 126) associado ao espectro de DEPT 135 (p. 127-129) sugeriu a presença de cinco unidades cafeoílas pela observação dos sinais para cinco carbonos carbonílicos em δ 171,8 (C9’, 9) 172,0 (C9’ e C9”, 7), e 172,1 (C9’ e C9”, 8), sinais para dez carbonos olefínicos em δ 148,9 (C7’, 7 e 8), 149,0 (C7”, 7 e 8), 149,3 (C7’, 9), 117,5 (C8’, C8”, 7), 117,7 (C8’, C8”, 8), 117,2 (C8’, 9) e sinais para quinze carbonos de anel aromáticos tetrassubstituídos em δ 129,8 (C1’, 7 e 8), 129,9 (C1’, 9), 129,9 (C1”, 7 e 8 ), 149,88 (C3’ 7, 8 e 9), 149,88 (C3” 7 e 8), 149,89 (C4’ e C4”, 7 e 8), 150,0 (C4’, 9). Ainda pela analise dos espectros de RMN 13 C e DEPT 135, observou-se a presença de três unidades derivadas do ácido quínico através de três sinais de carbonos carbonílicos em δ 183,7 (C7, 7), 184,0 (C7, 9) e 184,4 (C7, 8), sinais para seis carbonos metilênicos em δ 38,7 (C2, 7 e 9), 40,2 (C6, 9), 41,3 (C2, 7 e 8) e 43,6 ( C6, 8), três sinais de carbonos tetrassubstituídos em δ 79,7 (C1, 8 e 9), 79,4 (C1, 7) e sinais para nove carbonos oximetínicos em δ 69,9 (C3 ou C5, 9), 70,5 (C4, 9), 73,9 (C3, 7 e 8) e 74,0 (C5, 7, 8; C3 ou C5, 9), 67,8 (C4, 7), 70,4 (C4, 8). A confirmação da presença dos grupos cafeoílas e dos esqueletos do ácido 1 quínico foram baseados no espectro de RMN H (D 2O, 300 MHz, p 130-133) pela observação dos sinais de dois grupos de hidrogênios trans olefínicos em δ 7,55 (d, 3H, J = 15,9 Hz, H7’ e 7”), 7,58 (d, 2H, J = 15,9 Hz, H7’ e 7”), 6,30 (d, 3H, J = 15,9 Hz, H8’ e 8”) e 6,38 (d, 2H, J = 15,9 Hz, H8’ e 8”), além dos dupletos referentes a hidrogênios ligados a anel aromático em δ 7,02 (d, 3H, J = 10,8 Hz, H6’ e H6”), 7,06 (d, 2H, J = 10,8 Hz, H6’ e H6”) e 7,13 (d, 5H, J = 10,8 Hz, H5’ e H5”) e um simpleto alargado em δ 6,91 (sl,5H, H2’ e H2”) . O espectro de RMN 1H exibiu também multipletos entre δ 1,98-2,27 atribuídos aos hidrogênios

65 metilênicos (H2 e H6) da unidade quinato, um grupo metoxila em δ 3,45 (s, 3H, H8), além de sinais para nove hidrogênios oximetínicos em δ 5,32 (ddd, 5H, J = 4,2; 9,9 e 10,5 Hz, H3 e H5), 4,33 (t, 3H, J = 2,7 Hz, H4) e 4,16 (ddd, 1H, J = 3,6; 8,7 e 9,6 Hz, H3 ou H5). Os sinais acima indicaram a presença de cinco unidades cafeoílas e três unidades derivadas do ácido quínico. A identificação dos nove hidrogênios oximetínicos em δ 5,32, 4,33 e 4,16 foi determinante para identificação dos compostos uma vez que os efeitos de desproteção observados para H3 e H5 quando comparados ao H4 indicaram que as hidroxilas nas posições 3 e 5 do ácido quínico estavam esterificadas pelas unidades cafeoílas. As constantes de acoplamento observadas para os hidrogênios H3 e H5 em δ 5,32 (J = 4,2; 9,9 e 10,5 Hz) e 4,16 (J = 3,6; 8,7 e 9,6 Hz) condizem com acoplamento axial-equatorial, axial-axial, axial-axial, respectivamente, fixando os hidrogênios H3 e H5 nas posições axiais e os grupos cafeoílas nas posições equatoriais (figura 14). A estereoquímica relativa das substancias 7, 8 e 9 foram sugeridas com base no mapa de contornos NOESY (p. 137-138). A ausência de correlação entre os sinais δH 4,33 (H-4) e 5,32 (H-3 e H-5), no mapa de contorno NOESY, sugere que H-3 e H-5 encontram-se do mesmo lado da molécula e que H-4 encontra-se em posição oposta aos mesmos. As correlações observadas entre os sinais δH 4,33 (H-4) e 4,16 (H-3 ou H-5) e a ausência de correlação desses hidrogênios com δH 5,32 (H-3 ou H-5), no mapa de contorno NOESY, sugerem que H-4 encontra-se do mesmo lado da molécula que o hidrogênio da posição não substituída pela unidade cafeoíla e em posição oposta ao hidrogênio da posição substituída pela unidade cafeoíla. A partir dos dados apresentados e da comparação com dados da literatura (David et al., 2008) e (Kwon et al ., 2000), foi possível propor a estrutura dos compostos 7 e 8 como sendo os ácidos 3,5-O-dicafeoil-quinato de metila e 3,5-O- dicafeoilquínico, respectivamente. Os dados espectrais de RMN 13 C e 1H dos compostos 7, 8 e 9 estão apresentados na TABELA 22, 23 e 24, respectivamente. As principais correlações nos espectros de COSY (p. 136) e HMBC (p. 134- 135) estão representadas nas figuras 15 e 16, respectivamente.

66 Os espectros de RMN de 13 C, 1H, HMBC, COSY e NOESY dos compostos 7, 8 e 9 estão apresentados em anexo (p. 126-138).

O ΝΝΝοοο δδδ 1 OCH3 H (mult., J Hz) C 1 ------H O H H HO H OH 2 2,27-1,98 (m) O H H 3 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) H HO O H HO 4 4,33 (t; 2,7) H O H 5 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) H 6 2,27-1,98 (m)

7' 7,55 (d; 15,9)

7" 7,55 (d; 15,9)

HO OH 8' 6,30 (d; 15,9) 7 ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila 8" 6,30 (d; 15,9)

O OH οοο 1 C ΝΝΝ δδδ H (mult., J Hz) H O H H 1 ------OH HO H 2 2,27-1,98 (m) O H H H HO 3 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) O H HO H O 4 4,33 (t; 2,7) H 5 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) H 6 2,27-1,98 (m)

7' 7,58 (d; 15,9)

7" 7,58 (d; 15,9)

HO OH 8' 6,38 (d; 15,9)

8 ácido 3,5-O-dicafeoilquínico 8" 6,38 (d; 15,9)

FIGURA 14: Estereoquímica relativa dos compostos 7 e 8.

67 O OH C H O H H OH HO H O H H H HO HO H HO H οοο ΝΝΝ δδδ 1H (mult., J Hz) ácido 5-O-cafeoilquínico 1 ------

ou 2 2,27-1,98 (m) 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) ou O OH 3 C 4,16 (ddd; 3,6, 8,7 e 9,6) H H 4 4,33 (t; 2,7) 9 OH 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) ou H 5 HO 4,16 (ddd; 3,6, 8,7 e 9,6) H H HO 6 2,27-1,98 (m) O H 7,55 (d; 15,9) H O 7' H 8' 6,30 (d; 15,9) H

HO OH

ácido 3-O-cafeoilquínico FIGURA 14 (continuação): Estereoquímica relativa do composto 9.

68 O OCH3 C H H O H H OH HO H O H H οοο H HO ΝΝΝ δδδ 1H (mult., J Hz) δδδ 1H (COSY) O H HO H H O H 2 2,27-1,98 (m) 2,27-1,98; 4,33; 5,32 H 3 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) 2,27-1,98 H H 4 4,33 (t; 2,7) 2,27-1,98 HH 5 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) 2,27-1,98

6 5,32 HO OH 2,27-1,98 (m) 2,27-1,98; 4,33; 2' 7 ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila 6,91 (sl) 7,55 e 7,58 2" 6,91 (sl) 7,55 e 7,58

O OH 5' 7,13 (d; 10,8) 7,02 e 7,06 C 5" 7,13 (d; 10,8) 7,02 e 7.06 H H O H H OH 6' HO H 7,02 (d; 10,8) e 7,06 (d; 10,8) 7,13 O H H 6" 7,02 (d; 10,8) e 7,06 (d; 10,8) 7,13 H HO O H HO H 7' O 7,55 (d; 15,9) e 7,58 (d; 15,9) 6,91; 6,30 e 6,38 H H H 7" 7,55 (d; 15,9) e 7,58 (d; 15,9) 6,91; 6,30 e 6,38 H H 8' 6,30 (d; 15,9) e 6,38 (d; 15,9) 7,55 e 7,58 8" 6,30 (d; 15,9) e 6,38 (d; 15,9) 7,55 e 7,58 HH

HO OH

FIGURA 15: Correlações no espectro de COSY para os compostos 7 e 8.

69 O OCH3 C

H H O H H OH HO H O H οοο H ΝΝΝ (((Compostos) δδδ 1H (mult., J Hz) 13C (HMBC) H HO O H HO H O 2 7 e 8 2,27-1,98 (m) C1; C3; C4 e C5 H H H 3 7 e 8 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) ------H H 4 7 e 8 4,33 (t; 2,7) C3 e C5

HH 5 7 e 8 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) ------

6 7 e 8 2,27-1,98 (m) C1; C3; C4 e C5 HO OH 8 7 3,45 (s) C1 7 ácido 3,5-O-dicafeoil-quinato-de metila 2' 7 e 8 6,91 (sl) C1' e C7'

O OH 2" 7 e 8 6,91 (sl) C1" e C7" C 5' 7 e 8 7,13 (d; 10,8) H H O H H C3' C4' e C6' H OH 5" HO 7 e 8 7,13 (d; 10,8) C3"; C4" e C6" O H H 6' H HO 7 e 8 7,02 (d; 10,8) e 7,06 (d; 10,8) C3'; C4'; C5'; C7' eC8' O H HO H O 6" 7 e 8 7,02 (d; 10,8) e 7,06 (d; 10,8) C3"; C4"; C5"; C7" e C8" H H H 7' 7 e 8 7,55 (d; 15,9) e 7,58 (d; 15,9) C1'; C2'; C6'; C8' e C9' H H 7" 7 e 8 7,55 (d; 15,9) e 7,58 (d; 15,9) C1"; C2"; C6"; C8" e C9" 8' 7 e 8 HH 6,30 (d; 15,9) e 6,38 (d; 15,9) C1'; C7' e C9' 8" 7 e 8 6,30 (d; 15,9) e 6,38 (d; 15,9) C1"; C7" e C9" HO OH

8 ácido 3,5-O-dicafeoilquínico

FIGURA 16: Correlações no espectro de HMBC para os compostos 7 e 8.

70 TABELA 22: Dados espectrais de RMN de 1H e 13 C do composto 7. DAVID et al ., 2008 a Composto isolado b

N0 δ 13 C DEPT/135 δ 1H (m, J Hz) δ 13 C δ 1H (m, J Hz) 1 74,6 Co 79,4

2 38,4 CH 2 2,30-2,19 (m) 41,3 2,27-1,98 (m) 3 71,9 CH 5,40 (m) 73,9 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) 4 69,1 CH 3,98 (dd; 3,3 e 9,3) 67,8 4,33 (t; 2,7) 5 72,2 CH 5,30 (m) 74,0 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5)

6 35,6 CH 2 2,30-2,19 (m) 40,2 2,27-1,98 (m) 7 175,6 Co 183,7

8 53,0 CH 3 3,69 (s) 59,6 3,45 (s) 1’ 127,5 Co 129,8 2’ 115,1 CH 7,07 (d; 2,4) 119,0 6,91 (sl) 3’ 146,7 Co 149,88 4’ 149,7 Co 149,89 5’ 123,1 CH 6,97 (d; 8,1) 117,9 7,13 (d; 10,8) 6’ 116,4 CH 6,79 (dd; 8,1 e 2,4) 125,5 7,02 (d; 10,8) 7’ 147,1 CH 7,62 (d; 15,9) 148,9 7,55 (d; 15,9) 8’ 115,4 CH 6,34 (d; 15,9) 117,5 6,38 (d; 15,9) 9’ 168,7 Co 172,0 1” 127,8 Co 129,9 2” 115,1 CH 7,07 (d; 2,4) 119,0 6,91 (sl) 3” 146,7 Co 149,88 4” 149,7 Co 149,89 5” 123,1 CH 6,97 (d; 8,1) 117,9 7,13 (d; 10,8) 6” 116,5 CH 6,79 (dd; 8,1 e 2,4) 125,6 7,06 (d; 10,8) 7” 147,4 CH 7,55 ( d; 15,9) 149,0 7,55 (d; 15,9) 8” 114,8 CH 6,22 (d; 15,9) 117,5 6,30 (d; 15,9) 9” 167,9 Co 172,0 a 1 13 b 1 13 RMN de H e C (CD 3OD, 300 e 75 MHz), RMN de H e C (D 2O, 300 e 75 MHz).

71 TABELA 23: Dados espectrais de RMN de 1H e 13 C do composto 8. KWON et al ., 2000 a Composto isolado b

N0 δ 13 C DEPT/135 δ 1H (m, J Hz) δ 13 C δ 1H (m, J Hz) 1 73,7 Co 79,7

2 35,9 CH 2 2,15-1,96 (m) 41,3 2,27-1,98 (m) 3 72,0 CH 5,13 (sl) 73,9 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) 4 68,8 CH 3,83 (sl) 70,4 4,33 (t; 2,7) 5 71,8 CH 5,19 (sl) 74,0 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5)

6 37,0 CH 2 2,15-1,96 (m) 43,6 2,27-1,98 (m) 7 176,5 Co 184,4 1’ 126,7 Co 129,8 2’ 115,3 CH 7,04 (d; 2,5) 119,0 6,91 (sl) 3’ 146,7 Co 149,88 4’ 149,4 Co 149,89 5’ 122,5 CH 6,99 (d; 8,0) 117,9 7,13 (d; 10,8) 6’ 116,0 CH 6,77 (d; 8,0) 125,5 7,02 (d; 10,8) 7’ 146,2 CH 7,46 (d; 16,0) 148,9 7,55 (d; 15,9) 8’ 117,0 CH 6,23 (d; 16,0) 117,7 6,38 (d; 15,9) 9’ 167,2 Co 172,1 1” 126,8 Co 129,9 2” 115,3 CH 7,04 (d; 2,5) 119,0 6,91 (sl) 3” 146,7 Co 149,88 4” 149,5 Co 149,89 5” 122,2 CH 6,98 (d; 8,0) 117,9 7,13 (d; 10,8) 6” 115,9 CH 6,73 (d; 8,0) 125,6 7,06 (d; 10,8) 7” 145,8 CH 7,43 (d; 16,0) 149,0 7,55 (d; 15,9) 8” 116,9 CH 6,14 (d; 16,0) 117,7 6,30 (d; 15,9) 9” 166,7 Co 172,1 a 1 13 b 1 13 RMN de H e C (DMSO-d6, 500 e 125 MHz), RMN de H e C (D 2O, 300 e 75 MHz).

72 1 13 TABELA 24: Dados espectrais de RMN de H e C do composto 9 (D 2O, 300 e 75 MHz). Composto isolado N0 δ 13 C DEPT/135 δ 1H (m, J Hz) 1 79,7 Co

2 38,7 CH 2 2,27-1,98 (m) 3 69,9 ou 74,0 CH 4,16 (ddd; 3,6, 8,7 e 9,6) ou 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5) 4 70,5 CH 4,33 (t; 2,7) 5 69,9 ou 74,0 CH 4,16 (ddd; 3,6, 8,7 e 9,6) ou 5,32 (ddd; 4,2, 9,9 e 10,5)

6 40,2 CH 2 2,27-1,98 (m) 7 184,0 Co 1’ 129,9 Co 2’ 119,0 CH 6,91 (sl) 3’ 149,88 Co 4’ 150,0 Co 5’ 117,9 CH 7,13 (d; 10,8) 6’ 125,6 CH 7,02 (d; 10,8) 7’ 149,3 CH 7,58 (d; 15,9) 8’ 117,2 CH 6,30 (d; 15,9) 9’ 171,8 Co

73 4.1.7 – Identificação estrutural da mistura AGF 8 (PROANTOCIANIDINAS)

OH OH

OH OH 12 B 11 B 8 O 15 8 11 HO 9 2 HO 9 O 15 7 16 7 2 16 A C O AC O 6 3 3 10 OH 6 10 5 4 7 5 4 7' OH 6' 8' 8' OH D OH 6' 5' D 9' 5' 9' O OH HO O 10' 10' 12 2' F F 2' 12' HO 13' 11' 4' 4' 11' 13' OH 3' 3' E E 14' OH OH 14' HO 16' 16' OH 15' 15' 11 10

A mistura das substâncias 10 e 11 (AGF 8) foi isolada das folhas de A. guianensis como um sólido amorfo branco solúvel em acetona, apresentando fluorescência sob luz ultravioleta ( λ = 254 e 365 nm) e cor marrom quando revelado em anisaldeído. O espectro de absorção na região do IV para os compostos 10 e 11 (AGF 8) mostrou absorções típicas de unidades flavonoídicas, com bandas de absorção larga e intensa na região de 3330 cm -1 típica de estiramento O-H em ligações de hidrogênio inter e intramoleculares, banda média e fina em 1610 cm -1 referente à deformação axial C=C de anel aromático, banda curta em 1450 cm -1 referente à deformação angular C-H de aromáticos, além de bandas de deformação axial C-O em 1200 e 1000 cm -1. 13 O espectro de RMN C (CD 6OD, 75 MHz, p.143-146) sugeriu a presença de duas substâncias muito semelhantes estruturalmente. A presença das quatro unidades referentes aos anéis C e F para os dois compostos foi indicada pela 13 análise do espectro de RMN C (CD 6OD, 75 MHz), com sinais em δ 67,6 (C-3, 10 ), 29,0 (C-4, 10 ), 81,7 (C- 2’, 10 ), 66,0 (C-3’, 10 ), 30,5 (C- 4’, 10 ), 67,4 (C-3, 11 ), 29,0 (C- 4, 11 ), 84,8 (C- 2’, 11 ), 67,5 (C- 3’, 11 ), 29,9 (C- 4’, 11 ). Além disso,

74 também foram observados dois sinais referentes a carbonos cetais em δ 100,0 (C-2, 10 ) e 100,1 (C-2, 11 ) sugerindo a presença da estrutura básica de diflavonoides, proantocianidinas do tipo A. A identificação das duas proantocianidinas como sendo do tipo A foi obtida 1 através da análise do espectro de RMN H (CD 6OD, 300 MHz, p.139-142) pela presença dos hidrogênios metínicos do anel C em δ 4,20 (d, J = 3,3 Hz, H-4, 10 ), 4,27 (d, J = 5,2 Hz, H-4, 11), 4,32 (d, J = 3,3, H-3, 10 ) e em δ 4,02 (d, J = 5,2, H-3, 11 ) e pelas correlações no espectro de HMBC (p. 147) entre os hidrogênios metínicos em δ 4,20 (H4, 10 ), 4,27 (H4, 11 ), 4,32 (H3, 10 ) e 4,02 (H3, 11 ) com os carbonos cetais em δ 100,0 (C2-10 ) e 100,1 (C2-11). As duas unidades flavan-3-ol do tipo A da proantocianidina I (composto 10 ) estão conectadas através de C-4 (anel C) e C-8’ (anel D), devido à correlação entre o C-5’ (anel D) em δ 155,7 com o próton H-6’ (anel D) em δ 6,15 (d, J = 3.0 Hz) pelo espectro de HMBC, e através de C-2 (anel C) e o oxigênio da hidroxila ligado ao C-7’ (anel D). As outras duas unidades flavan-3-ol do tipo A do composto 11 estão conectadas através de C-4 (anel C) e C-6’ (anel D), devido à correlação entre o C-9’ (anel D) em δ 151,9 com o próton H-8’ (anel D) em δ 6,15 (d, J = 3.0 Hz) pelo espectro de HMBC (p. 147), e através de C-2 (anel C) e o oxigênio da hidroxila ligado ao C-7’ (anel D). 1 A análise do espectro de RMN H (CD 6OD, 300 MHz) revelou a presença de dois hidrogênios carbinólicos em δ 4,98 (H2’, 10 ) e 4,71 (H2’, 11 ), correlacionados pelo espectro de HMQC aos carbonos em δ 81,7 e 84,8, respectivamente. Tais hidrogênios apresentaram-se como um simpleto largo (δ 4,98) e como um dupleto (δ 4,71) com constante de acoplamento de 8,1 Hz, indicando que o anel F da unidade flavan-3-ol terminal do composto 10 possui configuração 2’,3’ cis , e que o anel F da unidade flavan-3-ol terminal do composto 11 possui configuração 2’,3’ trans. O mapa de contorno NOESY (p. 148) confirma a estereoquímica relativa proposta aos anéis F dos compostos 10 e 11 . Pela análise do espectro de NOESY pôde-se identificar correlação entre o hidrogênio metínico em δ 4,98 (H2’, 10 ) com o hidrogênio carbinólico em δ 4,13-4,16 (H3’, 10 ), mostrando que H2’ e H3’ do composto 10 estão do mesmo lado da molécula, porém não foi possível

75 identificar correlação entre o hidrogênio metínico em δ 4,71 (H2’, 11 ) com o hidrogênio carbinólico em δ 4,13-4,16 (H3’, 11), indicando assim que H2’ e H3’ do composto 11 estão em lados opostos da molécula. A substituição nos anéis aromáticos foi inferida a partir da análise do 1 espectro de RMN de H (CD 6OD, 300 MHz) , no qual observou-se dupletos em δ 5,96 (d, J = 2,2 Hz, C-6, 11 ), 5,97 (d, J = 2,2 Hz, C-6, 10 ), e 6,06 (d, J = 2,2 Hz, C- 8, 10 e 11 ), característicos de hidrogênios com acoplamento meta, que estão correlacionados entre si pelo espectro de COSY (p. 149). Tais sinais observados foram atribuídos ao anel A das proantocianidinas 10 e 11 , concluindo que as proantocianidinas 10 e 11 são hidroxiladas na posição 5 e 7 do anel A, sendo assim proantocianidinas do tipo A-I. A partir dos dados apresentados e com base em dados da literatura (KAMIYA et al ., 2001), foi possível sugerir a estrutura dos compostos 10 e 11. Os dados espectrais de RMN 13 C e 1H das proantocianidinas 10 e 11 juntamente com os dados fornecidos pela literatura (KAMIYA et al ., 2001) serão apresentados nas TABELAS 25 e 26. Os espectros de RMN de 13 C, HMBC, 1H, COSY e NOESY da mistura dos compostos 10 e 11 estão apresentados em anexo (p. 139-149).

76 1 13 TABELA 25: Dados espectrais de RMN de H e C do composto 10 (C 3D6O, 300 e 75 MHz). KAMIYA, K. et al., 2001 a Composto Isolado b Anel No C δ 13 C δ 1H (mult., J Hz) δ 13 C δ 1H (mult., J Hz) 2-Co 100,2 ----- 100,0 ----- C 3-CH 68,1 4,06(d, 3,4) 67,6 4,32 (d, 3,3) 4- CH 29,3 4,41(d, 3,4) 29,0 4,20 (d, 3,3) A 5- Co 157,0 ----- 156,6 ----- 6- CH 98,3 6,01(d, 2,4) 98,2 5,97 (d, 2,3) 7- Co 158,1 ----- 158,0 ----- 8- CH 96,7 6,07(d, 2,4) 96,3 6,06 (d, 2,3) 9- Co 154,2 ----- 154,0 ----- 10- Co 104,3 ----- 104,1 ----- B 11- Co 132,5 ----- 132,4 ----- 12- CH 115,7 7,14 (d, 2,2) 116,3 7,30 (d, 2,1) 13- Co 145,7 ----- 146,5 ----- 14- Co 146,8 ----- 145,1 ----- 15- CH 116,1 6,81 (d, 8,3) 115,3 6,85 (dd, 0,9 e 8,4) 16- CH 119,8 7,02 (dd, 8,3) 120,8 7,07 (dd, 8,4 e 2,2) F 2’- CH 81,8 4,92(sl) 81,7 4,98 (sl) 3’- CH 67,0 4,24(m) 66,0 4,13 - 4,16 (m) # 4’- CH 2 29,9 2,95 (dd, 17,2 e 4,9) 30,5 2,59 (dd, 16,9 e 8,7) 2,76 (dd, 17,2 e 2,3) 2,81 (dd,16,9 e 1,8) D 5’- Co 156,6 ----- 155,7 ----- 6’- CH 96,5 6,10 (s) 96,5 6,15 (d, 3,0) 7’- Co 152,3 ----- 151,3 ----- 8’- Co 107,2 ----- 106,7 ----- 9’- Co 152,1 ----- 151,9 ----- 10’- Co 102,5 ----- 102,4 ----- E 11’- Co 131,19 ----- 130,9 ----- 12’- CH 116,0 7,15 (d, 2,1) 115,7 7,19 (t, 2,2) 13’- Co 146,0 ----- 146,1 ----- 14’- Co 146, ----- 146,3 ----- 15’- CH 115,6 6,81 (d, 8,.2) 115,7 6,82 (dd, 8,4 e 0,9) 16’- CH 120,4 6,98 (dd, 8,2 e 2,1) 119,8 6,87 (dd, 8,4 e 2,1)

# a 1 13 -hidrogênios quimicamente não equivalentes; RMN de H e C (CD 3OD, 400 e 100 b 1 13 MHz), RMN de H e C (C 3D6O, 300 e 75 MHz).

77 1 13 TABELA 26: Dados espectrais de RMN de H e C do composto 11 (C 3D6O, 300 e 75

MHz).

KAMIYA, K. et al., 2001 a Composto Isolado b Anel No C δ 13 C δ 1H (mult., J Hz) δ 13 C δ 1H (mult., J Hz) C 2-Co 100,5 ----- 100,1 ----- 3-CH 67,6 4,08(d, 3,6) 67,4 4,02 (d, 5,2) 4- CH 29,7 4,29(d, 3,6) 29,0 4,27 (d, 5,2) A 5- Co 155,3 ----- 156,2 ----- 6- CH 97,0 6,09(d, 2,2) 98,0 5,96 (d, 2,3) 7- Co 158,1 ----- 158,0 ----- 8- CH 96,6 6,04(d, 2,2) 96,3 6,06 (d, 2,3) 9- Co 154,4 ----- 154,1 ----- 10- Co 104,2 ----- 103,9 ----- B 11- Co 132,2 ----- 132,3 ----- 12- CH 115,8 7,17(d, 2,1) 116,1 7,01 (d, 1,8) 13- Co 145,7 ----- 146,6 ----- 14- Co 146,8 ----- 154,7 ----- 15- CH 115,7 6,83(d, 8,3) 115,3 6,85 (dd, 0,9 e 8,4) 16- CH 120,0 7,05(dd, 8,3 e 2,1) 121,0 7,05 (dd, 2,2 e 8,4) F 2’- CH 79,8 4,78(sl) 84,8 4,71 (d, 8,1) 3’- CH 67,4 4,14(m) 67,5 4,13-4,16 (m) # 4’- CH 2 29,5 2.90(dd, 17,0 e 4,5) 29,9 2.59 (dd, 16,9 e 8.7) 2.79(dd, 17,0 e 3,0) 2.81 (dd,16,9 e 1.8) D 5’- Co 155,7 ----- 156,9 ----- 6’- Co 108,8 ----- 106,9 ----- 7’- Co 152,8 ----- 151,7 ----- 8’- CH 97,0 6,11(s) 96,6 6,15 (d, 3,0) 9’- Co 151,7 ----- 151,9 ----- 10’- Co 103,1 ----- 103,3 ----- E 11’- Co 132,1 ----- 130,7 ----- 12’- CH 115,2 6.95(d, 1,7) 115,7 7,19 (t, 2,2) 13’- Co 145,6 ----- 146,0 ----- 14’- Co 145,9 ----- 146,3 ----- 15’- CH 115,9 6,75 (d, 7,8) 116,1 6,82 (dd, 8,4 e 0,9) 16’- CH 119,4 6,77 (d, 7,8 e 1,7) 119,8 6,87 (dd, 8,4 e 1,8)

# a 1 13 -hidrogênios quimicamente não equivalentes; RMN de H e C (CD 3OD, 400 e 100 b 1 13 MHz), RMN de H e C (C 3D6O, 300 e 75 MHz).

78 4.1.2 – Determinação estrutural da mistura de AGF 9 e AGC 10: SITOSTEROL E ESTIGMASTEROL

21 22 21 22 27 24 18 24 18 20 23 25 20 25 12 12 23 17 17 11 11 26 19 13 26 19 13 H 16 H 16 1 9 14 1 9 14 2 15 10 8 15 10 8 H H H H 3 7 HO 5 7 HO 5 4 6 4 6 13 ß-Estigmasterol 12 ß-Sitosterol

A mistura das substâncias 12 e 13 (AGF 9) e (AGC 10) foi obtida a partir da fração hexânica das folhas (AGF-Hex) e a partir da fração hexânica do caule (AGC-Hex), respectivamente, como cristais incolores na forma de agulhas, não visível sob luz UV ( λ = 254 e 365 nm) , e apresentando coloração azul, quando revelado em anisaldeído. Inicialmente o sólido obtido foi comparado por CCDA com amostra padrão de β-sitosterol, onde se observou o mesmo Rf. A mistura possui ponto de fusão entre 138-141 oC, condizendo com o observado na literatura (JUNGES et al ., 2000). A amostra foi submetida à análise por espectroscopia na região do infravermelho. Em seu espectro, destacou-se uma banda principal na região de 3400 cm -1, referente ao estiramento O-H em ligações de hidrogênio intermoleculares, confirmando a presença da função álcool do esteróide, e uma banda em 1650 cm -1, referente a deformação axial C=C de alcenos. O espectro de RMN de 1H da mistura das duas substâncias apresenta sinais peculiares: δ 3,47-3,58 (m; J = 5,1; 10,8 e 11,1 Hz, H 3) referente ao hidrogênio da posição 3 e δ 5,35 (d, J = 5,1 Hz, H 6) relativo ao hidrogênio ligado ao átomo de carbono 6, ambos os sinais do sitosterol ( 12) e estigmasterol ( 13 ); δ 5,11 (dd; J = 8,5 e 15,3 Hz) relativo ao hidrogênio da posição 22 e δ 4,82 (simpleto largo) pertencente ao hidrogênio ligado ao átomo de carbono 23, ambos os sinais

79 característicos da ligação dupla do estigmasterol, além de outros sinais de metilas dos dois esteróide.

Dados do β-Sitosterol. 1 RMN H (300 MHz, CDCl 3, TMS): δ (ppm) 0,68-1,01 (envelope de sinais de metilas; H 18 , H 19 , H 21 , H 26 , H 27 e H 29 ), 3,47-3,58 (m; J = 5,1; 10,8 e 11,1 Hz, H 3),

5,35 (d, J = 5,1 Hz, H 6).

13 RMN C (75 MHz, CDCl 3, TMS): δ (ppm) 12,1 (C 18 ), 12,2 (C 29 ), 18,9 (C 21 ), 19,2

(C 27 ), 19,6 (C 19 ), 19,7 (C 26 ), 21,3 (C 11 ), 23,3 (C 28 ), 24,5 (C 15 ), 26,3 (C 23 ), 28,4

(C 16 ), 29,3 (C 25 ), 31,9 (C 2), 32,0 (C 7 e C 8), 34,1 (C 22 ), 36,3 (C 20 ), 36,7 (C 10 ), 37,4

(C 1), 39,9 (C 12 ), 40,7 (C 13 ), 42,5 (C 4), 46,0 (C 24 ), 50,3 (C 9), 56,2 (C 17 ), 56,9 (C 14 ),

72,0 (C 3), 121,9 (C 6), 141,0 (C 5).

Dados do β-Estigmasterol. 1 RMN H (300 MHz, CDCl 3, TMS): δ (ppm) 0,68-1,01 (envelope de sinais de metilas; H 18 , H 19 , H 21 , H 26 , H 27 e H 29 ), 3,47-3,58 (m; J = 5,1; 10,8 e 11,1 Hz, H 3),

4,82 (sl, H 23 ), 5,11 (dd; J = 8,5 e 15,3 Hz, H 22 ), 5,35 (d, J = 5,1 Hz, H 6).

13 RMN C (75 MHz, CDCl 3, TMS): δ (ppm) 12,1 (C 18 ), 12,2 (C 29 ), 21,3 (C 21 ), 19,2

(C 27 ), 19,6 (C 19 ), 20,0 (C 26 ), 21,3 (C 11 e C 21 ), 24,5 (C 15 e C 28 ), 28,4 (C 16 ), 31,9

(C 2), 32,0 (C 7, C 8 e C 25 ) 36,7 (C 10 ), 37,4 (C 1), 39,9 (C 12 ), 40,7 (C 13 ), 42,3 (C 20 ),

42,5 (C 4), 50,3 (C 9), 51,5 (C 24 ), 56,2 (C 17 ), 56,9 (C 14 ), 72,0 (C 3), 121,9 (C 6), 131,1

(C 23 ), 138,2 (C 22 ), 141,0 (C 5).

80 4.2- ATIVIDADE MOLUSCICIDA

As folhas da espécie A. guianensis foram investigadas para um total de 3 extratos. A análise preliminar, por meio de testes na concentração de 1000 ppm/24 horas, foi feita para diferenciar extratos sem qualquer atividade moluscicida dentre aqueles com atividade. Todos os extratos examinados apresentaram atividade contra os caramujos, matando-os em uma concentração de 1000 ppm no prazo de 24 h. Os extratos foram sucessivamente diluídos para determinar a concentração mínima tóxica, ou seja, a concentração letal matando

100% dos caramujos expostos (LC 100 ). De acordo com a literatura (MOTT, 1987), os dados foram avaliados positivamente, se o extrato vegetal possui LC 100 para os caramujos menor ou igual a 100 ppm. Entre os extratos investigados, apenas o extrato AGF-AcOEt apresentou LC 100 igual a 100 ppm e LC 50 igual a 42,5 ppm . Através de dados de RMN unidimensionais, constatou-se a presença majoritária de flavonóides e taninos condensados no extrato AGF-AcOEt, podendo ser estes os responsáveis pelo valor de atividade encontrado. A atividade moluscicida dos extratos das folhas de A. guianensis após 24h frente ao caramujo Biomphalaria glabrata está representada na TABELA 27.

TABELA 27: Atividade Moluscidida dos Extratos das Folhas de A. guianensis .

EXTRATOS ATIVIDADE MOLUSCICIDA (%) EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES (ppm) 400 200 100 50 25 AGF-Bruto 100% 16% 0 0 0 AGF-HM 100% 0 0 0 0

AGF-AcOEt 100% 100% 100% 75% 16%

Dentre os extratos analisados frente atividade moluscicida, o extrato acetato de etila foi o que apresentou melhor resultado, apresentando LC 100 igual 100 ppm e uma LC 50 igual a 42,5 ppm.

81 4.3- ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Os resultados mostraram que concentrações de 78, 25, 246, 46 e 4 g.mL -1 dos extratos AGF-EB, AGF-AcOEt, AGF-Hex, AGF-HM e mistura dos compostos 7 e 8, respectivamente, permitiram reduzir a concentração inicial de DPPH em 50% (TABELA 28).

TABELA 28: Atividade Antioxidante dos extratos obtidos de A. guianensis .

-1 Extrato CE 50 (g.mL ). AGF-Hex 246,2 AGF-EB 78,5 AGF-HM 46,10 AGF-AcOEt 24,7 Compostos 10 e 11 3,9 BHT (padrão) 12,0

A fração AGF-AcOEt e a mistura dos compostos 10 e 11 isolados da fração

AGF-AcOEt apresentaram o melhor valor de CE50 para atividade antioxidante. A mistura dos compostos 10 e 11 são os compostos majoritários da fração AGF- AcOEt, possuem atividade antioxidante mais acentuada que o BHT. Os compostos 10 e 11 podem ser os responsáveis pelo alto valor de atividade antioxidante encontrado para fração AGF-AcOEt.

82 CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico de A. guianensis , resultou até o momento, no isolamento e identificação de uma cumarina, um alcalóide ciclopeptídeo, dois triterpenos, dois açúcares, duas proantocianidinas e dois esteróides. Sendo que dos compostos isolados, o alcalóide ciclopeptídeo é inédito na literatura, e é um dos poucos representantes dessa classe de compostos dentro da família Rubiaceae. Segundo a atual classificação para os alcalóides peptídeos de TAN e ZHOU (2006), o alcalóide isolado pertence ao tipo Ia2, sendo este tipo de alcalóide ciclopeptídeo ja isolado em algumas espécies da família Rubiaceae, porém o tipo mais comumente encontrado é o tipo VII. As frações AGF-EB, AGF-HM e AGF-AcOEt foram avaliados quanto à atividade moluscicida frente a caramujos da espécie Biomphalaria glabrata , pelo método de WHO (BILIA et al ., 2000), mostraram que somente a fração AGF-

AcOEt possui LC 100 menor ou igual a 100 ppm, que é o recomendado pelo protocolo (MOTT, 1987), e possui LC 50 igual a 42,5 ppm. As frações AGF-EB, AGF-AcOEt, AGF-Hex, AGF-HM e a mistura dos compostos 10 e 11 foram avaliados quanto à atividade antioxidante pelo método do DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil), utilizando a metodologia proposta por Blois (YILDIRIM et al ., 2001) e mostraram que concentrações de 78, 25, 246, 46 e 4 g.mL-1, respectivamente, permitiram reduzir a concentração inicial de DPPH em 50%. A mistura dos compostos 10 e 11, os compostos majoritários da fração AGF-AcOEt, possuem atividade antioxidante mais acentuada que o BHT e podem ser os responsáveis pelo alto valor de atividade antioxidante encontrado para fração AGF-AcOEt.

83 BIBLIOGRAFIA

AGRAWAL, R. A.; SINGH, D. K. Acta Hydrochem. Hydrobiol . v. 16, p. 113-138, 1988.

AQUINO, R.; TOMMASI, N.; TAPIA, M.; LAURO, M. R.; RASTRELLI, L. New 3- Methyoxyflavones, an Iridoid Lactone and a Flavonol from Duroia hirsuta . J. Nat. Prod . v. 62 , 560-562, 1999.

BENTLEY, K. W. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep . v. 23 , p. 444-463, 2006.

BILIA, A. R.; BRACA, A.; MENDEZ, J.; MORELLI, I. Molluscicidal and Piscicidal Activities of Venezuelan Chrysobalanaceae Plants. Pharmacology Letters . v. 66 , nº 4, p. 53-59, 2000.

BOLZANI, V. S.; YOUNG, M. C. M.; FURLAN, M.; CAVALHEIRO, A. J.; ARAÚJO, A. R.; SILVA, D. H. S.; LOPES, M. N. Recent Res. Devel. Phytochemistry . v. 5, p. 19, 2001.

BOLZANI, V. S.; TREVISAN, L. M. V.; YOUNG, M. C. M. Rev. Latinoamer. Quim ., v. 23, n. 1, p. 20-21, 1992.

BREITMAIER, E.; VOELTER, W. Carbon-13 NMR spectroscopy: high resolution methods and applications in organic chemistry and biochemistry. 3 ed. New York: VCH, 1990.

BREMER, B.; ANDREASEN, K.; OLSSON, D. Subfamilial and tribal relationships in the Rubiaceae based on rbcL sequence data. Annals of the Missouri Botanic Garden , v. 82 , p. 383-397, 1995.

CASTRO, H. G. Contribuição ao Estudo das plantas medicinais: metabólitos secundários. Viçosa, Editora Suprema, p. 104, 2001.

DAVID, J. P.; ARAÚJO, S. V.; REGIS, T. L.; MEIRA, M.; D. J.M.; GIULIETTI, A. M.; QUIRÓZ, L. P. Constituintes químicos de Ipomoea subincana MEISN. (CONVOLVULACEAE). Química Nova . v. 31 , p. 751-754, 2008.

DELPRETE, P.G. Rubiaceae. In: SMITH, N.P. et al . Flowering Plant Families of the American Tropics. Ed. Princeton University Press/ New York Botanical Garden Press. p. 328-333, 2004a.

DELPRETE, P. G., SMITH, L. B., KLEIN, R. M. Rubiáceaes, Vol. I – Gêneros de A-G: 1. Alseis até 19. Galium. In: A. Reis. (Ed), Flora Ilustrada Catarinense. Itajaí, SC. 344 p, 2004b

DELPRETE, P.G. Sinopse dos gêneros de Rubiaceae do Brasil. 49 ° Congresso Nacional de Botânica (26 Julho - 1 Agosto), Resumos, Salvador, Bahia, p. 85-86, 1998.

EL-SEEDI, H. R.; GOHIL, S.; PERERA, P.; TORSSELL, K. B. G.; BOHLIN, L. Cyclopeptide alkaloids from Heisteria nitida . Phytochemistry . v. 52 , p. 1739-1744, 1999.

149

FANG, SHI-YUE.; HE, ZHI-SHENG.; FAN, GAO-JUN. Triterpenoids from Adina rubella . Journal of Natural Products . v. 59 . p. 304-307, 1996.

FRANÇA, S. C. Abordagens biotecnológicas para a obtenção de substâncias ativas. In: SIMÕES, C. M. O., et al. (orgs). Farmacognosia: Da Planta ao Medicamento . 5ª ed. Porto Alegre: UFRS, Florianópolis: UFSC, 2004. p. 123-146.

GIACOMELLI, S. R.; MALDANER, G.; GONZAGA, W. A.; GARCIA, C. M.; SILVA, U. F.; DALCOL, I. I.; MOREL, A. F. Cyclic peptide alkaloids from the bark of Discaria americana. Phytochemistry . v. 65 , p. 933-937, 2004.

GOODLAND, R. J. A.; FERRI, M. G. Ecologia do Cerrado . Belo Horizonte, Editora Itatiaia, 1979, p.193.

GOTTLIEB, O. R.; BORIN, M. R. M. B. Quantitative chemo-biology: a chemical paradigm to understand biological phenomena. Arkivoc . p. 356-365, 2003.

GOURNELIS, D. C.; LASKARIS, G. G.; VERPOORTE, R. Cyclopeptide alkaloids. Natural Product Reports . v. 14 , p.75-82, 1997.

HEITZMAN, M. E.; NETO, C. C.; WINIARZ, E.; VAISBERG, A. J.; HAMMOND, G. B. Rev. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaria (Rubiaceae). Phytochemistry . v. 66 , p. 5-29, 2005.

HENRIQUES, A. T. ; LOPES, S. O.; PARANHOS, J. T.; GREGIANINI, T. S.; POSER, G. L. V.; FETT-NETO, A. G.; SCHRIPSEMA, J. N. β-D-Glucopyrnosyl vincosamide, a light regulated indole alkaloid from the shoots of Psychotria leiocarpa . Phytochemisty . v. 65 , p. 449-454, 2004.

HIROSE, M.; HAGIWARA, A.; HASUI,; INOVE, K.; ITO, N. Combinated effects of BHA and other antioxidants in induction of forestomach lesions in rats. Cancer Lett., Shannon , v. 30 , n.2, p. 169-174, 1986.

ITO, N.; FUKUSHIMA, S.; HAGIWARA, A.; SHIBATA, M.; OGISO, T. Carcinogenicity of butylated hydroxyanisole in F 344 rats. J. Natl. Cancer Inst., Cary , v. 70 , p. 343- 352, 1983.

JOULLIE, M. M.; NUTT, R. F. In Alkaloids: Chemical and Biological Perspectives; Pelletier, S.W., Ed.; John Wiley & Sons: New York, 1985; v. 3, p 113.

JOULLIÉ, M. M.; RICHARD, D. J. Cyclopeptide alkaloids : chemistry and biology. Chem. Commun . p. 2011-2015. 2004.

JUNGES, M. J.; FERNANDES, J. B.; VIEIRA, P. C.; FERNANDES, M. F. G. S.; FILHO, E. R.; FRUHAUF, M.; BARAÑANO, A. G. Triterpenos Ursânicos e Oleanânicos Isolados do Caule de Eugenia Florida DC. Revista de Pesquisa e Pós-Graduação, Erechim, RS, Brasil, v. 01 , p. 13-30, 2000.

150 KAMIYA, K.; WATANABE, C.; ENDANG, H.; UMAR, M.; SATAKE, T. Studies on the Constituents of Bark of Parameria laevigata MOLDENKE. Chem. Pharm. Bull., v 49 (5), 551-557, May 2001.

KHAN, I. A.; STICHER, O. NEW TRITERPENES FROM THE LEAVES OF TZMONZUS TZMON. Journal of Natural Products . v. 56 . p. 2163-2165, 1993.

KWON, H. C.; JUNG, C. M.; SHIN, C. G.; LEE, J. K.; CHOI, S. U.; SIM, S. Y. LEE, K. R. A new caffeoyl quinic acid from Aster scaber and its inhibitory activity against human immunoleficiency Virus-1 (HIV-1) integrase. Chem. Pharm. Bull . v. 48 , p. 1796-1798, 2000.

LING, S-K.; LOMORITA, A.; TANAKA, T.; FUJIOKA, T.; MIHASHI, K.; KOUNO, I. Iridoids and Anthraquinones from the Malaysian Medicinal Plant, Saprosma scortechinii (Rubiaceae). Chem. Pharm. Bull . v. 50 , n. 8, p. 1035-1040, 2002.

LIU, R.; ZHANG, P.; GAN, T.; COOK, J. M. Regiospecific Bromination of 3-Methylindoles with NBS and Its Application to the Concise Synthesis of Optically Active Unusual Tryptophans Present in Marine Cyclic Peptides. J. Org. Chem . v. 62, p. 7447-7456, 1997.

LOPES, S.; POSER, G. L.; KERBER, V. A.; FARIAS, F. M.; KONRATH, E. L.; MORENO, P.; SOBRAL, M. E.; ZUANAZZI, J. A. S. e HENRIQUES, A. T. Biochem. Syst. Ecol. , v. 32 , p. 1187-1195, 2004.

LUCIANO, J. H. S.; LIMA, M. A. S.; SOUZA, E. B.; SILVEIRA, E. R. Chemical constituents of Alibertia myrciifolia Spruce ex K. Schum. Biochemical systematics and ecology . v. 32 , p. 1227-1229, 2004.

MANN, J. Natural products in câncer cgenitgerapy: past, present and future. Natural Reviews in Cancer . v. 2, p. 143-148, 2002.

MARSTON, A.; HOSTEITMANN, K. Plant Molluscicides. Phytochemistry. v. 24 (4), p. 639-652, 1985.

MELO, E. A.; MACIEL, M. I. S.; LIMA, V. L. A. G.; LEAL, F. L. L.; CAETANO, A. C. S.; NASCIMENTO, S. J. Capacidade antioxidante de hortaliças usualmente consumidas. Ciênc. Tecnol. Aliment. , Campinas, v. 26 no 3, p. 639-644, jul.-set. 2006.

MENEZES, A. S.; MOSTARDEIRO, M. A.; ZANATTA, N.; MOREL, A. F. Scutianine-J, a cyclopeptidic alkaloid isolated from Scutia buxifolia . Phytochemistry . v. 38 , p. 783-786, 1995.

MOREL, A. F.; ARAUJO, C. A.; SILVA, U. F.; HOELZEL, S. C. S. M.; ZÁCHIA, R.; BASTOS, N. R. Antibacterial cyclopeptide alkaloids from the bark of Condalia buxifolia. Phytochemistry. v. 61 , p. 561-566, 2002.

151 MOREL, A. F.; MALDANER, G.; ILHA, V.; MISSAU, F.; SILVA, U. F.; DALCOL, I. I. Cyclopeptide alkaloids from Scutia buxifolia Reiss and their antimicrobial activity. Phytochemistry . v. 66 , p. 2571-2576, 2005.

MOTT, K. E. (Ed.), Plant Molluscicides. John Wiley & Sons LTD. Chichester, Great Britain, 1987.

MOURA, V. M.; SANTOS, D. P.; SANTIN, S. M. O. Constituintes químicos de Galianthe brasiliensis (Rubiaceae). Química Nova . v. 29 , n. 3, p. 452-455, 2006.

NETO, G. G.; MORAIS, R. G. Recursos medicinais de espécies do cerrado de Mato Grosso: Um estudo bibliográfico. Acta bot. bras . v. 17 , n. 4, p. 561-584, 2003.

NEWMAN, J. D., CRAGG, G. M., SNADER, K. M. Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002. Journal of Natural Products . v. 66 , p. 1022-1037, 2003.

PIRES, M. O. Cerrado: Sociedade e Biodiversidade. In: IORIS, E. (coord.). Plantas medicinais do cerrado: Perspectivas comunitárias para a saúde, o meio ambiente e o desenvolvimento sustentável . Anais do Workshop Plantas Medicinais do Cerrado. Mineiros-GO, 1999, p. 159-164.

PIRES, M. O.; SANTOS, I. M. (Orgs). REDE CERRADO –Construindo o Cerrado Sustentável. Experiências e Contribuições das ONG’s – Brasília: Gráfica Nacional, 2000.

Primeiro relatório nacional para convenção sobre diversidade biológica – Brasil. Brasília, p. 283, 1988.

RAMARARHNAM, N.; OSAWA, T.; OCHI, H.; KAWAKISHI, S. The contribution of plant food antioxidants to human health. Trends Food Sci. Technol ., v. 6, n. 3, p. 75-82, 1995.

RAVEN, J. A.; BEARDALL, J.; CHUDEK, J. A.; SCRIMGEOUR, C. M.; CLAYTON, M. N.; McINROY, S. G. Altritol synthesis by Notheia anomala. Phytochemistry . v. 58 , p. 389- 394, 2001.

RIBEIRO, J. F.; WALTER, B. M. T. Fitofisionomias do bioma Cerrado. In: SANO, Sueli; ALMEIDA, Semíramis. Cerrado: ambiente e flora . Brasília: EMBRAPA. 1998, p.89-167.

ROESLER, R.; MALTA, L. G.; CARRASCO, L. C.; PASTORE, G. Evaluation of the Antioxidant Properties of the Brazilian Cerrado Fruit Annona crassiflora (Araticum). JOURNAL OF FOOD SCIENCE . v. 71 , n. 2, 102-107, 2006. ROSA, E. A.; SILVA, C. C.; TANAKA, C. M. A.; OLIVEIRA, C. M. A.; KATO, L.; FERREIRA, H. D. Antraquinona de Palicourea rígida (Rubiaceae). 29 a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química – SBQ. Águas de Lindóia, SP. 2006. PN-025.

ROSSING, D.; KAHL, R.; HILDEBRANDT, A. G. Effect of synthetic antioxidants on hydrogen peroxide formation, oxyferro cytocrome P450 concentration and oxygen

152 consumption in liver microssomes. Toxicology. Amsterdam , v. 34 , n.1, p. 67-77, 1985.

ROVA, J. H. E.; DELPRETE, P. G.; ANDERSSON, L.; ALBERT, V. A. A trn L-F cpDNA sequence study of the Condamineeae-Rondeletieae-Sipaneeae complex with implications on the phylogeny of the Rubiaceae. American Journal of Botany . v. 89 , p. 145-159, 2002.

SANTOS, A. F.; AZEVEDO, D. P. L.; MATA, R. C. S.; MENDOÇA, D. I. M. D.; SANT’ANA, A. E. G. The lethality of Euphorbia conspicua to adults of Biomphalaria glabrata , cercaria of Schistosoma mansoni and larvae of Artemia salina. Bioresource Technology. v. 98 , p. 135-139, 2007.

SILVA, F. M.; KATO, L.; OLIVEIRA, C. M. A.; SILVA, C. C.; TANAKA, C. M. A.; SOARES, P. R. O.; GUILLO, L. A. Vallesiachotamina e atividade citotóxica de Palicourea rigida Kunth. 29 a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química – SBQ Águas de Lindóia, SP. 2006. QB-050.

SILVA, S. R. Uma Nota Sobre a Exploração de Plantas Medicinais do Cerrado. In: IORIS, E. (coord.). Plantas medicinais do cerrado: Perspectivas comunitárias para a saúde, o meio ambiente e o desenvolvimento sustentável , 1999, Mineiros. Anais do Workshop Plantas Medicinais do Cerrado. Mineiros-GO, 1999. 237.

SILVA, V. C.; FARIA, A. O.; BOLZANI, V. S.; LOPES, M. N. Diterpeno, derivados fenólicos e iridóides glicosilados isolados dos caules de Alibertia macrophylla. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química-SBQ. Águas de Lindóia, SP. 2007. PN-013.

SILVA, V. C.; SILVAB, G. H.; BOLZANI, V. S.; LOPES, M. N. Isolation of lignans glycosides from Alibertia sensilis (Vell) k. Schum. (Rubiaceae) by preparative high- performance liquid chromatography. Ecética Química . v. 31 , p. 55-58, 2006.

SOARES, D. G.; ANDREAZZA, A. C.; SALVADOR, M. Avaliação de compostos com atividade antioxidante em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas . v. 41, n. 1, p. 95-100, jan./mar., 2005.

SUGAWARA F.; ISHIMOTO, M.; LE-VAN, N.; KOSHINO, H.; UZAWA, J.; YOSHIDA, S.; KITAMURA, K. Insecticidal peptide from mungbean: aresistant factor against infestation with azuki bean weevil. J Agric Food Chem. v. 44, p. 3360-3364, 1996.

TAN, N. H.; ZHOU, J. Plant Cyclopeptides. Chem.Rev . v. 106, p. 840-895, 2006.

TAYLOR, C. M.; CAMPOS, M. T. V. A.; ZAPPI, D. FLORA DA RESERVA DUCKE, AMAZONAS, BRASIL: RUBIACEAE. Rodriguésia . v. 58 , n 3, p. 549-616, 2007.

VENCATO, I.; SILVA, F. M.; OLIVEIRA, C. M. A.; KATO, L.; TANAKA, C. M. A.; SILVA, C. C.; SABINO, J. R. Acta Cryst . E62, p. 429-431, 2004.

153 VERPOORTE, R; GOURNELIS, D. C.; LASKARIS, G. G. Cyclopeptide alkaloids. Previous review: The Alkaloids, ed. A. Brossi, Academic Press, New York, v. 26 , p. 299- 306, 1985.

WINK, M. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry (Elsevier) v. 64 , p. 3-19, 2003.

WÜRTZEN, G.; OLSEN, P. Chronic study on BHT in rats. Food Chem. Toxicol. , Amsterdam , v. 24 , n. 10-11, p. 1121- 1125, 1986.

YANG, Y. J.; LEE, H. J.; CHOI, D. H.; HUANG, H. S.; LIM, S. C. ; LEE, M. K. Effect of scoparon on neurite outgrowth in PC 12 cells. Neuroscience Letters . v. 440 , p. 14-18, 2008.

154 Pollyanna Laurindo de Oliveira Curriculum Vitae ______Dados Pessoais

Nome Pollyanna Laurindo de Oliveira Filiação Omar José de Oliveira e Carmelita Geralda de Oliveira Nascimento 05/08/1985 - Trindade/GO - Brasil Carteira de Identidade 4494437 DGPC - GO - 08/06/2000 CPF 00386903140

Endereço residencial Rua S3, Qd. S11 Lt. 19 e 20 Ed. Bucareste Apt. 1004 Bela Vista - Goiânia 74823-440, GO - Brasil Telefone: 62 85246997

Endereço eletrônico e-mail para contato : [email protected] e-mail alternativo : [email protected]

______

Formação Acadêmica/Titulação

2009-Atual Doutoranda em Química Universidade Federal de Goiás, UFG, Goiânia, Brasil Orientador: Cecília Maria Alves de Oliveira Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Áreas do conhecimento : Química

2007-2009 Mestrado em Química. Universidade Federal de Goiás, UFG, Goiânia, Brasil Título: CONTRIBUIÇÃO AO ESTUDO DE ESPECIES DA FAMÍLIA RUBIACEAE: FITOQUÍMICA DA ESPECIE AMAIOUA GUIANENSIS AULB. Orientador: Cecília Maria Alves de Oliveira Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Áreas do conhecimento : Química

2008 - 2009 Complementação de Licenciatura em Química. Fundação Antares de Ensino Superior, Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão, FAESPE, Brasil

2003 - 2006 Graduação em Química/Bacharelado. Universidade Federal de Goiás, UFG, Goiânia, Brasil

Produção bibliográfica

Artigos aceitos para publicação

1. OLIVEIRA, C. M. A., OLIVEIRA, P. L., TANAKA, C. M. A., SABINO, J. R., KATO, L., SILVA, C. C., MORAES, A. P., MEDINA, R. P.

Amaiouine, a Cyclopeptide Alkaloid from the Leaves of Amaioua guianensis. Journal of Natural Products. , 2009. Palavras-chave: Cyclopeptide Alkaloid, Amaiouine, Amaioua guianensis Áreas do conhecimento : Química de Produtos Naturais

2. TANAKA, C. M. A.; RADKE, V. S. C. O.; SILVA, C. C.; NAKAMURA, C. V.; OLIVEIRA, C. M. A., OLIVEIRA, P. L.; KATO, L.

Abietatrienes diterpenoids from Sagittaria montevidensis SPP montevidensis . Química Nova., 2009. Palavras-chave: Sagittaria, abietatrienes, antimicrobial activity. Áreas do conhecimento : Química de Produtos Naturais