Amburana Schwacke & Taub

Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro Escola Nacional de Botânica Tropical Programa de Pós-Graduação

Tese de Doutorado

Amburana Schwacke & Taub. (Leguminosae, Papilionoideae): estudos taxonômicos e sistemáticos

Elidiene Priscila Seleme

Rio de Janeiro

2014

Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro Escola Nacional de Botânica Tropical Programa de Pós-Graduação

Amburana Schwacke & Taub. (Leguminosae, Papilionoideae):

estudos taxonômicos e sistemáticos

Elidiene Priscila Seleme

Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Botânica da Escola Nacional de Botânica Tropical do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Botânica. Orientador: Vidal de Freitas Mansano

Coorientador: Alexandre Magno Sebbenn

Rio de Janeiro

2014

Amburana Schwacke & Taub. (Leguminosae, Papilionoideae): estudos taxonômicos e sistemáticos

Elidiene Priscila Seleme

Tese submetida ao Programa de Pós Graduação em Botânica da Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro – JBRJ, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Doutor.

Aprovada por:

Prof. Dr. Vidal de Freitas Mansano (Orientador)______

Prof. Dr. José Fernando Baumgratz______

Prof. Dr. Sérgio Sodré Cardoso______

Prof. Dra. Aline Lorenz Lemke______

Prof. Dra. Cássia Mônica Sakuragui______

Em 10/06/2014

Rio de Janeiro

2014

iii

Seleme, Elidiene Priscila.

S464s Amburana Schwacke & Taub. (Leguminosae, Papilionoideae): estudos taxonômicos e sistemáticos / Elidiene Priscila Seleme. – Rio de Janeiro, 2014.

xvi, 108f. : il. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro / Escola Nacional de Botânica Tropical, 2014.

Orientador: Vidal de Freitas Mansano.

Coorientador: Alexandre Magno Sebbenn.

Bibliografia.

1. Taxonomia vegetal. 2. Filogenia. 3. Conservação. 4. Leguminosae. 5. Amburana. 6. Dipterygeae. 7. Espécies ameaçadas. I.Título. II. Escola Nacional de Botânica Tropical.

CDD 583.32

Para meu amado Alfredo, de quem muito senti saudade e apoio.

Para meus pais, Roberto e Márcia, que são os maiores responsáveis por mais essa conquista.

E de forma especial, ao meu avô João

(in memorian), que não pôde ver a conclusão deste trabalho e sinto muitas saudades.

Com muito amor, carinho, dedico!

Metade

“Que as palavras que eu falo não sejam ouvidas como prece nem repetidas com fervor, apenas respeitadas como a única coisa que resta a um homem inundado de sentimentos.

Porque metade de mim é o que eu ouço, mas a outra metade é o que eu calo.

Que a arte nos aponte uma resposta, mesmo que ela não saiba, e que ninguém a tente complicar porque é preciso simplicidade para fazê-la florescer.

Porque metade de mim é plateia e a outra metade, é canção.

E que minha loucura seja perdoada.

Porque metade de mim é amor e a outra metade… também…”

Oswaldo Montenegro

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, com meu crescimento pessoal e profissional, durante esses quatro anos, em especial:

Agradeço principalmente a Deus, por ter colocado pessoas tão especiais em meu caminho, pelo Chaco, pela Amburana e por me dar fé e forças.

Ao Vidal pela orientação, pelo acompanhamento em algumas das viagens de campo, pelo apoio ao meu estágio em Kew.

Ao Alexandre pela coorientação, pelos momentos de descontração.

A Ângela Sartori pela colaboração, apoio logístico em algumas coletas e laboratório, e acima de tudo, pela amizade de sempre.

Ao Gwil Lewis pelo apoio durante meu estágio sanduíche, pelas conversas e incentivos.

Ao Felix Forest pela colaboração e desenvolvimento da parte de Filogenia no Jodrell.

Aos membros da banca examinadora por terem aceitado o convite e pelas grandes contribuições neste trabalho. Ao Sérgio pela leitura da tese na pré banca.

A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) pela concessão da bolsa de estudos e ao Programa Institucional de Bolsas de Doutorado Sanduíche no Exterior (PDSE). Ao CNCFlora (Centro Nacional de Conservação da Flora) pela concessão da bolsa no primeiro ano de doutorado.

A Escola Nacional de Botânica Tropical pela estrutura, pela formação, em especial a Hevelise, Ariane, Anibal, Zé Fernando. Obrigada Ariane e Marly pelas contribuições em minha qualificação. Ariane, Renata, Dorothy, Cássia e Maristerra pelas contribuições em Seminários I e II. Obrigada Zé Fernando, pelas palavras, pelos conselhos e pelo apoio em um momento importantíssimo, nunca esquecerei!

Aos docentes que ofereceram disciplinas, em especial Jefferson Prado, de grande importância para minha formação taxonômica.

A Anete e CBMEG - Unicamp, pela disciplina e desenvolvimento da biblioteca de SSRs e a Patrícia e Fábio que muito me auxiliaram. Obrigada! vii

Aos funcionários do Kew Royal Botanic Gardens e do Jodrell Laboratory, em especial Ruth Clark, companheira de herbário e dos chás londrinos de toda manhã; Brian Schrire, que me recebeu e apresentou o herbário; Lulu Rico pelos conselhos e os lindos cartões de despedida, Laszlo, pela ajuda com as extrações e companhia no laboratório; e John pela logística e pelos sequenciamentos, aos funcionários da biblioteca sempre muito solícitos.

Aos companheiros de Londres, Juliana, Lia, Vanessa, Matheus, Floriano, Aristônio, Ruth (as três), Valentina, Esperança, Marcelo, Cíntia, Francine, Fabrício, Ana Luiza, Tânia, Nina, Edeline, que fizeram da minha estadia uma doce lembrança. Vanessa, muito obrigada pela ajuda com o laboratório e pela amizade; Jú, obrigada por me receber, pelas longas conversas sobre estames, estaminódios, vida, jamais esquecerei o que fez por mim; Lia, obrigada pelos momentos de descontração e dos papos sobre filogenia.

A minha landlady Sheila e família, com quem convivi em Londres e corrigia carinhosamente meu inglês.

Ao LEBio (Laboratório de Evolução & Biodiversidade) pela infraestrutura para finalização dos estudos com microssatélites. Agradeço a Aline por me receber e pelas palavras sempre de incentivo; obrigada Priscila, Letícia, Ana Letícia, Luciana, Xuxu e Emerson pela convivência no laboratório e por me aguentarem num momento tão difícil. Obrigada Letícia pelo apoio e ajuda com a centrífuga de placas. De todo o meu coração, agradeço ao Weg (Wellington Fava), quem me ajudou no laboratório, nas análises e sempre com amizade. Obrigada Weg!

Obrigada a EMPRAPA Gado de Corte/ Campo Grande, pela utilização da centrífuga de placas e do laboratório quando necessário.

Aos donos das fazendas, em especial Sérgio e família, onde foram realizadas as coletas para a realização dos estudos com microssatélites.

Aos curadores dos herbários que visitei e os que me enviaram material, para que esse trabalho pudesse ser realizado. Obrigada!

Aos companheiros de JBRJ, Nathália, Richieri, Amanda, Bia, Leonor, Alexandre (in memorian), Maria Lúcia, Rafael, Ricardo, Vivian, Jordana, Karina, Francismeire,

viii

Marcus, Janaína, Nina, Silvana, Jacira, Leandro, Marcelo, Thiago pela convivência em disciplinas, no herbário e em casa também.

Ao Vitor Hugo por sanar algumas de minhas dúvidas quanto às análises filogenéticas.

Aos que me acompanharam em coletas e muito me ajudaram, Ianny, Rafael, Fábio, Jacira, Thayane, Carol, João, Vidal. Obrigada!

Aos companheiros da Unicamp, em especial Carol, Zilda, Ana, Thalita (pela estadia).

Aos meus amigos de Araxá/ MG, por estarem sempre prontos em me ajudar com a distância, em especial Leninha, quem cuidou das minhas plantas e da minha Cereja em muitas das minhas viagens, obrigada!

Aos colegas da UFMG, que me receberam agora no finalzinho, em especial Thaís e Francine, muito obrigada pela ajuda com as análises e pela acolhida. Serei sempre muito grata!

A Ianny e família por todo carinho, apoio, proteção, companhia.

Aos meus avós, pelo apoio, por compreender minha ausência em muitos momentos, em especial, meu avô João, que partiu enquanto eu estava em Londres.

A minha Cereja, que muito tem me ensinado sobre amor, minha companheira, quem passa o dia todo aos meus pés enquanto finalizo a tese.

Aos meus pais, João Roberto e Márcia, pelo amor, carinho, dedicação, compreensão, pelo amor na minha profissão, simplesmente por tudo o que sou hoje.

Ao meu marido, Alfredo, pelo apoio, companheirismo, amizade, respeito, por ser meu grande incentivador, por não me deixar cair. Obrigada amor por fazer parte dessa “empreitada” e por aceitar a minha ausência física em muitos momentos. Te amo!

A TODOS MEUS MAIS SINCEROS AGRADECIMENTOS!

RESUMO

Leguminosae Juss. apresenta ampla distribuição, a família é composta por cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies, distribuídas em três subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae. Papilionoideae é a mais diversa, com 13.800 espécies, 483 gêneros e 28 tribos. Tradicionalmente, as linhagens basais de Papilionoideae têm sido classificadas nas tribos Sophoreae, Swartzieae, Dalbergieae e Dipterygeae, composta principalmente por espécies arbóreas com larga diversificação nos Neotrópicos. Tais tribos são altamente diversas em termos de morfologia floral. Sophoreae e Swartzieae foram consideradas as mais “primitivas” por, geralmente, apresentarem uma combinação de caracteres florais como estames livres ou numerosos, flores muitas vezes actinomorfas com pétalas indiferenciadas, ausentes ou restritas apenas ao estandarte, que contrastam com a flor papilionada da grande maioria das espécies desta subfamília. Este trabalho teve como objetivos realizar a taxonomia do gênero Amburana; entender as relações filogenéticas entre os clados Amburana e Dipterygeae através de uma ampla amostragem usando sequências dos genes plastidiais matK e trnL intron e do DNA nuclear ribossomal ITS; e desenvolver locos microssatélites para Amburana cearensis, espécie ameaçada de extinção. Os resultados apresentados têm várias implicações na sistemática de Papilionoideae. O gênero Amburana apresenta três espécies, sendo que uma nova espécie é descrita aqui, Amburana erythrosperma. É confirmado os clados Amburana e Dipterygeae como grupos-irmãos, e como irmãos das demais Papilionoideae. Foram desenhados 33 locos microssatélites para Amburana cearensis e quatro marcadores microssatélites polimórficos foram isolados e caracterizados em 149 genótipos em uma população de Porto Murtinho (Mato Grosso do Sul, Brasil). O número de alelos por locos variou de 05 a 13, com uma média de 7,5 alelos por loco. As heterozigosidades observada e esperada variaram entre 0,358-0,775 e 0,059-0,214, respectivamente. Estes locos poderão ser utilizados em investigação da estrutura populacional, variabilidade genética, filogeografia de A. cearensis e as outras duas espécies do gênero. PALAVRAS-CHAVE: Amburana, clados Amburana e Dipterygeae, conservação, filogenia, Leguminosae, microssatélites.

ABSTRACT

Leguminosae Juss. is widespread, the family consists of about 727 genera and 19.325 species distributed into three subfamilies: Caesalpinioideae, Mimosoideae and Papilionoideae. Papilionoideae is the largest with an estimated 13,800 species across 28 tribes in 478 genera. The early-branching papilionoid lineages have been traditionally placed in the predominantly neotropical woody tribes Sophoreae, Swartzieae, Dalbergieae, and Dipterygeae. The tribes are highly diverse in their floral morphology and structure. Sophoreae and Swartzieae were believed to be the most “primitive” of the Papilionoideae, mainly because of their for the most part non-papilionate flowers, involving free or numerous stamens, usually actinomorphic corolla, undifferentiated petals, absent or solely restricted to the standard, in contrast with the highly differentiated papilionate flowers that are the main characteristic of the bulk of the papilionoid legumes. The present study is aimed the taxonomy of the Amburana; at better resolving phylogenetic relationships among the Amburana and Dipterygeae clades comprehensively-sampled plastid matK and trnL intron and nuclear ribosomal ITS sequences; and also microsatellite loci were developed for Amburana cearensis, endangered species. The results presented herein have wide-ranging and profound implications for the systematics of Papilionoideae. Three species of Amburana are recognized and a new species is described here, Amburana erythrosperma. The Amburana and Dipterygeae clades is sister, and the two clades are sister to all remaining Papilionoideae. And also, 33 microsatellite loci were designed for Amburana cearensis, and four polymorphic microsatellite markers were isolated and characterized in 149 genotypes from one population of Porto Murtinho (Mato Grosso do Sul, Brazil). The number of alleles for each locus ranged from 05 to 13 with an average of 7.5 alleles per locus. The observed and expected heterozygosities ranged from 0.358-0.775 and 0.059- 0.214, respectively. These loci can be used for investigation of population structure, genetic variability, phylogeography of A. cearensis and the other two species of the genus. KEY WORDS: Amburana, Amburana and Dipterygeae clades, conservation, phylogeny, Fabaceae, microsatellite.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...... vii

RESUMO...... x

ABSTRACT...... xi

Lista de figuras...... xiv

Lista de tabelas...... xvi

Lista de siglas e Abreviaturas...... xvii

INTRODUÇÃO GERAL...... 20

ORGANIZAÇÃO DA TESE...... 24

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 26

CAPÍTULO 1: Revisão taxonômica e uma nova espécie de Amburana Schwacke & Taub. (Leguminosae, Papilionoideae)...... 30

Resumo...... 31

Abstract...... 32

Introdução...... 32

Material e métodos...... 34

Resultados...... 35

Referências bibliográficas...... 55

CAPÍTULO 2: Filogenia dos Clados Amburana e Dipterygeae (Leguminosae, Papilionoideae)...... 57

Resumo...... 58

Abstract...... 59

Introdução...... 59

Material e métodos...... 60 xii

Resultados...... 63

Discussão...... 76

Conclusão...... 77

Referências bibliográficas...... 78

Apêndice...... 82

CAPÍTULO 3: Desenvolvimento de marcadores microssatélites para Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae): espécie ameaçada de extinção...... 83

Resumo...... 84

Abstract...... 85

Introdução...... 85

Material e métodos...... 87

Resultados e discussão...... 89

Conclusão...... 93

Referências bibliográficas...... 94

CONCLUSÕES GERAIS...... 97

Referências bibliográficas...... 98

ANEXOS...... 99

I) Normas editoriais dos periódicos...... 99

xiii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1. Amburana acreana. Flores e botões florais...... 36

Figura 2. Amburana acreana. A. Ramo foliar. B. Inflorescência. C. Folíolo. D. Detalhe de C. E–F. Bractéola (face abaxial e adaxial, respectivamente). G. Botão Floral. H. Flor em vista lateral. J. Flor sem a pétala em vista lateral evidenciando os estames e carpelo. K. Estandarte (face adaxial). L. Corte longitudinal da flor mostrando o hipanto. M. Frutos. N. Semente alada. (A de L. F. G. da Silva et al. 59, B–L de S. Romaniuc Neto et al. 687, M–N de T. D. Pennington et al. 16994)...... 37 Figura 3. Amburana cearensis A. Frutos e sementes; B. Flores e botões florais...... 40

Figura 4. Amburana cearensis A. Ramo com folhas e inflorescências. B. Inflorescência com botões florais. C. Folíolo. D. Detalhe de C. E. Estandarte. F. Fragmento do filete com antera. G. Estames. H. Cálice com hipanto. J. Vista lateral da flor. K. Bractéola. L. Botão floral. M. Estilete e Estigma. N. Carpelo. O. Corte longitudinal da flor evidenciando o hipanto. P. Semente alada. Q. Fruto. (A–N J. R. I. Wood et al. 19592, O–P J. R. I. Wood 10671)...... 41

Figura 5. Amburana erythrosperma Frutos e sementes...... 51

Figura 6. Amburana erythrosperma A. Inflorescência. B. Folhas. C. Detalhe de B. D. Botões florais. E. Estandarte (face adaxial). F. Corte da flor evidenciando hipanto, estames e carpelo. G. Fragmento do filete e antera. H. Carpelo. J. Estilete e estigma. K. Cálice. L. Estames. M. Vista lateral da flor. N. Botão floral. O. Bractéola (face abaxial). P. Fruto Q. Semente. R. Fruto aberto evidenciando as duas sementes. (A–M de G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1876; N–P de G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1997)...... 52 Figura 7. Mapa de distribuição de Amburana acreana (■), A. cearensis (●) e A. erythrosperma (▲)...... 54

CAPÍTULO 2

Figura 1. Árvore de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do

xiv

marcador plastidial matK. Números dos ramos são valores de suporte obtidos por 10000 réplicas de bootstrap...... 66 Figura 2. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região matK inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados...... 67 Figura 3. Árvore de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do marcador plastidial trnL. As relações e monofilia dos táxons não são bem resolvidas...... 68 Figura 4. Árvore de consenso de maioria das análises de máxima parcimônia inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir de sequências do ínton trnL...... 69 Figura 5. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região trnL inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Dipterygeae não monofilético (não inclusão de Monopteryx e Dipteryx panamensis)...70 Figura 6. Árvore de consenso estrito de “bootstrap” das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do marcador nuclear ITS. Setas indicam táxons dos grupos Dipterygeae e Amburana, em politomias (não monofiléticos)...... 71 Figura 7. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região ITS inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Seta indica Monopteryx, não incluso em Dipterygeae. E os táxons do grupo Amburana, não são bem resolvidos, apresentando-se não monofilético...... 72 Figura 8. Árvore de consenso estrito de “bootstrap” das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir dos dados combinados dos marcadores matK, trnL e ITS. Os grupos Dipterygeae e Amburana apresentam-se não monofiléticos. Seta indica Monopteryx não incluso em Dipterygeae...... 74 Figura 9. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados combinados das regiões matK, trnL e ITS inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Seta indica Monopteryx não incluso em Dipterygeae (não monofilético, assim como grupo Amburana)...... 75

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Primers utilizados no presente estudo...... 62 Tabela 2. Síntese das características das sequências e das estatísticas das árvores da análise de máxima parcimônia inferidas para a filogenia dos clados Amburana e Dipterygeae para cada região gênica e dos dados combinados...... 64

CAPÍTULO 3

Tabela 1. Descrição e caracterização dos 33 locos microssatélites de Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae), incluindo nome do loco, sequência do primer (F: foward e R: reverse), motivo, tamanho esperado do produto em pares de bases (pb)...... 90

Tabela 2. Descrição dos quatro microssatélites desenvolvidos para Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae). Ta = Temperatura de anelamento; A =

Número total de alelos em uma amostra de 16 indivíduos; Ho e He = heterozigosidades observada e esperada. Todos os locos apresentaram desvio significativo de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (P < 0.05)...... 93

xvi

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS °C – grau Celsius μL, μg – microlitro, micrograma AIC – Akaike Information Criterion ALCB – Herbário Alexandre Leal Costa BP – bootstrap CEN – Herbário da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia CEPEC – André Maurício Vieira de Carvalho, Centro de Pesquisas do Cacau CGMS – herbário Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande COR – herbário Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Corumbá CPAP – Centro de Pesquisas Agropecuárias do Pantanal cpDNA – DNA cloroplastidial CSTR – Universidade Federal de Campina Grande CVRD – Herbário Reserva Natural Vale do Rio Doce DNA – ácido desoxirribonucleico dNTP – desoxirribunucleotídeos trifosfato E – Herbário Edinburgh, Escócia EAC – Herbário Prisco Bezerra (UFC) EAN – Herbário Jayme Coelho de Moraes EDTA – ácido etileno diamino tetracético ENBT – Escola Nacional de Botânica Tropical ESA – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz g – grama (unidade de peso) / gravidade (centrífuga) GC – guanina-citosina GT – guanina-timina GTR – General Time Reversible HB – Herbarium Bradeanum HRB – Herbário RADAMBRASIL HUEFS – Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana IAN – Herbário da Embrapa Amazônia Oriental IBGE – Herbário da Reserva Ecológica do IBGE IC – índice de consistência ICN – herbário Universidade Federal do Rio Grande do Sul

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IPA – Herbário Dárdano de Andrade Lima INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia IR – índice de retenção ITS – Internal Transcribed Spacer, região espaçadora dos genes ribossomais IUCN – União Internacional para Conservação da Natureza JPB – Herbário Lauro Pires Xavier, Universidade Federal da Paraíba K – herbário Kew Gardens, Londres, Inglaterra LIL – herbário Fundación Miguel Lillo M – Molar (unidade de molaridade) MATAB – Mixed AlkylTrimethylAmmonium Bromide matK – megakaryocyte-associated tyrosine kinase

MBM – Museu Botânico Municipal MCMC – Markov Chain Monte Carlo MG – Museu Paraense Emilio Goeldi mg – miligrama mL – mililitro MMA – Ministério do Meio Ambiente mtDNA – DNA mitocondrial ng – nanograma P – herbário Paris, França pb – pares de bases nucleotídicas PCR – Reação da Polimerase em Cadeia (Polymerase Chain Reaction) pH – inverso do logaritmo da concentração de H + pmol – picomol R – Herbário do Museu Nacional do Rio de Janeiro RB – Herbário do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro RC – índice de consistência rescalonado s.n. – Coletor sem número de coleta MG – Herbário do Museu Paraense Emilio Goeldi PEUFR – Herbário da Universidade Federal Rural de Pernambuco - Herbário Vasconcelos Sobrinho SP – Herbário Instituto de Botânica de São Paulo SPF – herbário da Universidade de São Paulo xviii

TAE – tampão tris (tri-hidroximetil aminometano) acetato EDTA pH 8,0 Taq – Termophylus aquaticus TBR – Tree-Bisection-Reconection trnL – região cloroplastidial que compreende o íntron trnL U – unidade de enzima UEC – Herbário da Universidade Estadual de Campinas UFP – Herbário Geraldo Mariz (UFPE) UFPE – Universidade Federal de Pernambuco UFRN – herbário Universidade Federal do Rio Grande do Norte UC – Unidade de Conservação VIC – herbário Universidade Federal de Viçosa V – volume

xix

INTRODUÇÃO GERAL

A Família Leguminosae Juss.

Leguminosae apresenta distribuição cosmopolita, ocorre desde florestas úmidas até desertos secos e frios, e ambientes aquáticos (Polhill et al. 1981). Análises genéticas mostram que trata-se de uma família monofilética, consistente com sinapomorfias como gineceu unicarpelar súpero que dá origem a frutos do tipo legume ou derivados deste e sementes com placentação marginal ao longo da sutura adaxial (Polhill 1994; Kajita et al. 2001; Wojciechowski et al. 2004). Possui como representantes desde árvores de grande porte até ervas anuais (Lewis et al. 2005). É a terceira maior família entre as angiospermas, composta por cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies, distribuídas em três subfamílias: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae, (Lewis et al. 2005). No Brasil é a família mais diversa dentre as angiospermas, onde ocorrem 2740 espécies nativas reunidas em 213 gêneros, distribuídas por diversos ecossistemas (Lista de Espécies da Flora do Brasil). A subfamília Papilionoideae é monofilética e apresenta 28 tribos, 467 gêneros, 13.800 espécies (Lewis et al. 2005). A subfamília é caracterizada pelas folhas geralmente pinadas, trifolioladas ou plurifolioladas em sua maioria. As flores são papilionáceas com simetria zigomorfa e corola com pré-floração imbricada vexilar, com exceções nas tribos Sophoreae e Swartzieae que podem apresentar flores actinomorfas. Os frutos são do tipo legume e suas variações, como: lomento, folículo, sâmara e drupa. É considerada a subfamília mais representativa de Leguminosae com dois terços dos gêneros (Polhill et al. 1981; Barroso et al. 1999; Doyle et al. 2000; Lewis et al. 2005).

O gênero Amburana

O gênero Amburana foi inicialmente estabelecido por Freire Allemão (1864) com base em Torresea cearensis, homônimo posterior para Torresia Ruiz & Pav. (Poaceae). Em 1894 Schwacke & Taubert estabeleceram o gênero Amburana, baseados na espécie A. claudii. Assim, não mencionando o gênero descrito por Freire Allemão (Engler & Prantl 1894). Em 1935 Ducke descreveu A. acreana, com o nome Torresia acreana, com diferenças taxonômicas entre esta e T. cearensis (Ducke 1935). Finalmente em 1940, Smith propôs Amburana cearensis como sinônimo para Torresea

cearensis Fr. Allem. e A. claudii Schwacke & Taub., porém uma revisão completa do gênero não foi realizada (Smith 1940).

A maioria dos trabalhos realizados sobre Amburana são levantamentos florísticos, entretanto nenhum fornece chaves de identificação para o gênero como um todo. Smith (1940), em uma pequena nota sobre o gênero Amburana, mostrou diferenças na distribuição geográfica, na morfologia de A. cearensis e A. acreana. Macbride (1943), em seu estudo sobre a Flora Peruana, propôs a recombinação de Amburana acreana Ducke como uma variedade de Amburana cearensis. Burkart (1952) em seu estudo sobre as leguminosas argentinas, apresentou descrição e ilustração para Amburana cearensis (a única espécie do gênero que ocorre na Argentina) e mencionou as outras espécies do gênero. Bernardi (1984), em seu trabalho com famílias botânicas paraguaias, aceitou a proposta de Smith e sinonimizou A. cearensis com A. claudii e Torresea cearensis. Este autor também apresentou dados sobre os usos, ecologia, distribuição geográfica e incluiu uma ilustração desta espécie. Lewis et al. (2005) e Queiroz (2009) mencionam a ocorrência de uma espécie inédita para a Bahia, que é confirmada neste trabalho.

O gênero Amburana já foi incluído em diferentes tribos e até subfamília. Quando descrito, Taubert inseriu o gênero na tribo Amherstieae em Caesalpinioideae, próximo a Eperua Aubl. (Engler & Prantl 1894). Entretanto, Harms sugeriu que pertence mais apropriadamente a tribo Sophoreae de Papilionoideae (Engler & Prantl 1897). Outros trabalhos confirmam a proximidade de Amburana e espécies da tribo Sophoreae (Polhill et al. 1981; Wodjciechowski et al. 2004), especificamente com o grupo de Myroxylon, Myrocarpus e Myrospermum. Por se tratar de um grupo altamente heterogêneo morfologicamente, é constituído por gêneros tradicionalmente incluídos em diferentes tribos como Dalbergieae, Dipterygeae e Sophoreae (Doyle et al. 1997; Ireland et al. 2000; Pennington et al. 2001; Mansano et al. 2004a; Wojciechowski et al. 2004). O clado Amburana é proposto com os gêneros Amburana, Myroxylon, Myrospermum, Myrocarpus, Cordyla, Mildbraediodendron e Dussia, irmão do clado Dipterygeae, que inclui Dipteryx, Pterodon, Taralea e Monopteryx, baseado em análises combinadas com as regiões plastidiais matK e trnL (Cardoso et al. 2012).

Amburana figura como um grupo exclusivamente sul-americano e compreende três espécies, distribuídas entre Brasil, Argentina, Bolívia, Paraguai e Peru, sendo uma delas ainda inédita e endêmica da Bahia. Os táxons são muito parecidos nos principais caracteres e em consequência, são incompletamente conhecidos (Queiroz 2009). São árvores encontradas desde a caatinga a regiões subtropicais sazonalmente secas até áreas sazonalmente inundadas e ao longo de rios (Lewis et al. 2005). Amburana acreana (Ducke) A. C. Smith apresenta forma arborescente de alto fuste, ocorre em matas altas e fechadas da Amazônia ocidental do Brasil (AM, AC, RO e MT), da Bolívia e Peru (Carvalho 1994). Possui grande valor econômico, em função da madeira ser utilizada na fabricação de móveis finos, folhas decorativas, esculturas, lambris, balcões e marcenaria em geral (Lorenzi 2002), na obtenção de lenha de boa qualidade, na indústria e uso medicinal no tratamento de doenças respiratórias (Carvalho 1994). Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith é uma árvore de caule ereto, que chega a atingir 10 metros de altura nas regiões da caatinga e até 20m na zona da mata (Lorenzi 1992). Conhecida popularmente como cerejeira, imburana de cheiro, cumaru de cheiro, e por suas qualidades madeireiras, tem sido amplamente explorada nos locais de ocorrência, empregada em movelaria fina, esculturas e marcenaria em geral, estando listada como espécie ameaçada de extinção (Hilton-Taylor 2000). Também apresenta propriedades medicinais, sendo a casca da árvore e as sementes utilizadas no tratamento de doenças respiratórias, como tosse, asma, bronquite e também coqueluche (Berg 1986). A. cearensis apresenta ampla distribuição geográfica na América do Sul, ocorre em toda a caatinga, estendendo-se para o oeste através de matas secas do Brasil central, até o norte do Paraguai, Argentina e Bolívia. Sendo uma espécie típica do padrão do Arco Pleistocênico descrito por Prado & Gibbs (1993). Portanto, as áreas de ocorrência de A. cearensis são sabidamente expostas ao desmatamento, principalmente Mata Atlântica e Cerrado.

Sistemática Molecular

A sistemática molecular abrange várias abordagens de relações filogenéticas, que são inferidas ao utilizar informações de macromoléculas em organismos de estudo (Soltis & Soltis 2000), e o seu emprego vem crescendo cada vez mais, por possibilitar estudos em níveis taxonômicos e relacionamento entre gêneros e espécies, além de

permirtir a identificação de novas linhagens e dados pertinentes ao campo da biologia da conservação (Moritz 1995; Soltis & Gitzendanner 1999; Andreasen 2005).

Marcadores moleculares podem subsidiar estudos de variabilidade adaptativa, sistemática molecular, diversidade genética, sistema de reprodução, distribuição espacial de genótipos, níveis de fluxo gênico. Os dados obtidos podem revelar padrões evolucionários entre espécies congenéricas ou entre populações da mesma espécie, além da influência do clima e das diferentes condições ambientais nos padrões genéticos. Esses marcadores podem diferir em características importantes como abundância genômica, nível de polimorfismo detectado, especificidade dos locos, reprodutibilidade, requerimentos técnicos e investimento financeiro. Uma das técnicas mais indicadas para estudar polimorfismos intraespecíficos é o SSR (“Simple Sequence Repeats” – Repetições Simples de Sequências) ou microssatélites (Litt & Luty 1989; Weber & May 1989), que são repetições em sequência de um a seis nucleotídeos, encontradas em todos os procariotos e eucariotos estudados até o momento (Zane et al. 2002). Os microssatélites vêm sendo muito utilizados para responder várias perguntas relacionadas à genética de populações, como análises de fluxo gênico, paternidade, sistemas de reprodução, diversidade e estrutura genética populacional, medidas estas que são essenciais para a adoção de estratégias de conservação (Oliveira et al. 2006). O desmatamento e a exploração madeireira têm ameaçado a diversidade genética das espécies arbóreas tropicais. Por apresentar reconhecido valor comercial, A. cearensis merece ser investigada nesse aspecto. Objetivos Até o presente momento não houve estudo taxonômico para todo o gênero, não há dados de distribuição geográfica e ambiente preferencial, período fértil, chave de identificação para todas as espécies, desse modo, o presente estudo teve por objetivos realizar a revisão taxonômica de Amburana; o estudo filogenético dos clados Amburana e Dipterygeae para saber se Amburana é um gênero monofilético e das relações entre esses dois clados; e desenvolver locos microssatélites para A. cearensis, espécie ameaçada de extinção.

Organização da tese A tese está dividida em três capítulos. No capítulo 1, é apresentada a revisão taxonômica do gênero Amburana e a descrição de uma nova espécie, A. erythosperma. O capítulo 2 traz análises filogenéticas dos clados Amburana e Dipterygeae. No capítulo 3 foram desenvolvidos locos microssatélites para Amburana cearensis. Todos os capítulos seguem as normas de formatação das revistas às quais os mesmos serão submetidos. Algumas modificações foram realizadas para melhor apresentação e facilidade de leitura.

Figura 1. Árvore filogenética de Leguminosae, mostrando o posicionamento de Dipterygeae. Fonte: Pennington et al. 2001. 24

Figura 1. Árvore filogenética de Leguminosae, mostrando em destaque o posicionamento dos clados Amburana e Dipterygeae. Fonte: Cardoso et al. 2012.

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CAPÍTULO 1. REVISÃO TAXONÔMICA E UMA NOVA ESPÉCIE DE AMBURANA SCHWACKE & TAUB. (LEGUMINOSAE, PAPILIONOIDEAE)

(Esse artigo será submetido para publicação na revista Phytotaxa)

REVISÃO TAXONÔMICA E UMA NOVA ESPÉCIE DE AMBURANA SCHWACKE & TAUB. (LEGUMINOSAE, PAPILIONOIDEAE)

ELIDIENE P. SELEME1*, GWILYM LEWIS2, CHARLIE H. STIRTON3, ÂNGELA L. B. SARTORI4 & VIDAL F. MANSANO5

1Programa de Pós-graduação em Botânica, Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Rua Pacheco Leão, 915, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil. 2Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond Surrey TW9 3AB, United Kingdom. 3Bolus Herbarium, Botany Department, University of Cape Town, Private Bag X3, Rondebosch 7700, South Africa. 4 Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Caixa Postal 549, 79070-900, Campo Grande, MS, Brasil. 5 Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, DIPEQ. Rua Pacheco Leão 915, Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil. *Autor para correspondência: [email protected]

RESUMO

Neste trabalho apresentamos a revisão taxonômica do gênero Amburana, com a descrição e ilustração para A. erythrosperma, uma nova espécie para o gênero. Neste estudo são reconhecidas três espécies para o gênero, sendo Amburana endêmico da América do Sul. Amburana cearensis ocorre amplamente no Brasil, na Argentina, Bolívia e Paraguai; A. acreana ocorre na Amazônia brasileira, peruana e boliviana. Amburana erythrosperma, a nova espécie descrita aqui, é endêmica da Bahia. As espécies são distinguidas pela cor do caule, pelo número e formato dos folíolos, tamanho da inflorescência, cor e tamanho do estandarte, fruto com endocarpo desenvolvido ou não, cor da semente. Uma chave para identificar todas as espécies reconhecidas para Amburana, assim como descrições, comentários taxonômicos, mapas de distribuição geográfica e ilustrações são fornecidas para todas elas. Também foi realizada a tipificação de A. cearensis. Palavras chave: Biodiversidade, Fabaceae, taxonomia

ABSTRACT In this study we present a taxonomic revision of the genus Amburana and A. erythrosperma, a new species is here described and illustrated. With this study, three species of the genus are recognized, being Amburana endemic to South America. Amburana cearensis occurs widely in Brazil, in Argentina, Bolivia and Paraguay; A. acreana occurs in Brazilian, Peruvian and Bolivian Amazon. Amburana erythrosperma, described here, is endemic to Bahia. The species can be distinguished by the stem color, the number and size of leaflets, the size of inflorescence, color and size of standart, fruit with endocarp or not, color of seed. A key to identify all the species recognized for Amburana and descriptions, taxonomic comments, geographic distribution maps and illustrations are provided for all of them. The typification of A. cearensis is also addressed here. Keywords: Biodiversity, Fabaceae, taxonomy

INTRODUÇÃO

Amburana Schwacke & Taub. é um gênero de plantas lenhosas exclusivamente sul- americanas, com ampla distribuição no Brasil, na Argentina, Bolívia, Paraguai e Peru e compreende três espécies, ocorrendo nos mais diversos ambientes, desde a caatinga e matas sazonalmente secas a Bacia Amazônica, em áreas sazonalmente inundadas. Este gênero pode ser identificado pelas suas folhas imparipinadas com folíolos alternos, flores com hipanto longo e tubular com apenas uma pétala (estandarte), estames livres e fruto com apenas uma ou duas sementes distais envoltas ou não por um envoltório formado pelo endocarpo paleáceo (Queiroz 2009).

O gênero Amburana foi inicialmente estabelecido por Freire Allemão em 1864 com o nome Torresea, baseado em Torresea cearensis. No entanto é bom ressaltar que Torresea foi considerado um homônimo posterior para um gênero de Poaceae de grafia muito parecida denominado Torresia Ruiz & Pavón (Allemão 1864). Schwacke & Taubert (1894) estabeleceram o gênero Amburana, baseados na espécie A. claudii (Engler & Prantl 1894). Os mesmos não mencionaram Torresea cearensis descrita por Freire Allemão.

Ducke (1935) descreveu Amburana acreana, com o nome Torresia acreana, apresentando diferenças taxonômicas entre esta e T. cearensis.

A taxonomia supragenérica de Amburana também sofreu alterações ao longo do tempo. Quando descrito, Schwacke & Taubert inseriram o gênero na tribo Amherstieae em Caesalpinioideae, próximo ao gênero amazônico Eperua Aublet (Engler & Prantl 1894). Harms, entretanto, sugeriu que este gênero deveria ser posicionado na tribo Sophoreae de Papilionoideae (Engler & Prantl 1897). Este gênero aparece inserido em diferentes grupos dentro de Papilionoideae, sendo que no trabalho de Polhill et al. (1981) também aparece inserido dentro de Sophoreae, mais especificamente no grupo de Myroxylon L.f. No trabalho de Wodjciechowski et al. (2004) a proximidade de Amburana com Myroxylon e gêneros afins é confirmada. Cardoso et al. (2012) propuseram o clado Amburana, estando Amburana no mesmo clado que os gêneros Myroxylon, Myrocarpus Allemão, Myrospermum Jacq., Cordyla Lour., Dussia Krug & Urb. ex Taub. e Mildbraediodendron Harms.

Além das propostas de classificação muito distintas para Amburana, a taxonomia do gênero nunca foi exaustivamente estudada. A maioria dos estudos publicados sobre Amburana está em floras regionais, e nenhum deles fornece chaves de identificação para o gênero como um todo. Smith (1940), em uma pequena nota sobre o gênero Amburana, mostrou diferenças na distribuição geográfica, na morfologia de A. cearensis e A. acreana. Macbride (1943), em seu estudo sobre a Flora Peruana, propôs a recombinação de Amburana acreana Ducke como uma variedade de Amburana cearensis. Burkart (1952) em seu estudo sobre as leguminosas argentinas, apresentou descrição e ilustração para Amburana cearensis (a única espécie do gênero que ocorre na Argentina) e somente mencionou a outra espécie do gênero (A. acreana). Bernardi (1984), em seu trabalho com famílias botânicas paraguaias, sinonimizou A. cearensis com A. claudii e Torresea cearensis. Este autor também apresentou dados sobre os usos, ecologia, distribuição geográfica e incluiu uma ilustração desta espécie. Lewis et al. (2005) e Queiroz (2009) mencionam a ocorrência de uma espécie inédita para a Bahia, que é aqui descrita e ilustrada.

Visando conhecer a diversidade e a morfologia das espécies de Amburana, o presente estudo tem por objetivo realizar uma revisão taxonômica, fornecendo chave de

identificação, descrições, ilustrações, informações dos períodos de floração e frutificação, e dados de distribuição geográfica e ambientes preferenciais das espécies.

MATERIAL E MÉTODOS O estudo foi baseado em revisão bibliográfica, na análise morfológica de caracteres vegetativos e reprodutivos de espécimes depositados nos herbários da Argentina: LIL; Brasil: ALCB, CEN, CEPEC, CGMS, COR, CPAP, CSTR, CVRD, EAC, ESA, HRB, HUEFS, IBGE, ICN, IPA, JPB, MBM, MG, PEUFR, R, RB, SP, SPF, UEC, UFP, UFRN, VIC; Escócia: E; França: P; Inglaterra: K, nas informações das etiquetas das exsicatas e em coletas adicionais. As siglas dos herbários citados estão de acordo com Thiers (continuamente atualizados). Os espécimes coletados em campo foram herborizados e depositados no herbário RB, com duplicatas enviadas para outros herbários. Para a identificação das espécies foram utilizadas descrições originais de todos os táxons estudados e seus sinônimos e a comparação com o material-tipo. A terminologia utilizada para indumento e morfologia das estruturas vegetativas e reprodutivas foi baseada em Font Quer (1953), Radford et al. (1974), Harris & Harris (1994) e Stearn (2004). Os espécimes foram analisados em estereomicroscópio e as medições das estruturas morfológicas foram efetuadas com auxílio de paquímetro digital. As ilustrações foram confeccionadas através de material herborizado e/ou hidratado com o auxílio de câmara-clara acoplada a estereomicroscópio. Medidas de flor e pedicelo foram tomadas de botões em pré-antese, enquanto medidas de peças florais foram obtidas a partir de botões em estádio de desenvolvimento adiantado a fim de garantir a integridade das peças florais analisadas. Informações sobre distribuição geográfica, período fértil e ambiente preferencial foram obtidas através de dados contidos nas etiquetas das exsicatas, bibliografia especializada e em observações de campo. Para a confecção do mapa de distribuição foi utilizado o programa Diva-Gis 7.5 e as coordenadas geográficas dos municípios obtidas através do Google Earth quando não indicadas nas exsicatas. A chave de identificação foi elaborada através de caracteres diagnósticos e de reprodutivos como reforço ou subsídio àqueles.

RESULTADOS Amburana Schwacke & Taubert (1894: 387). Tipo:—Amburana cearensis (Freire Allemão) A. C. Smith Árvores, descamantes no tronco, casca de um agradável odor, escura, ramos jovens cilíndricos, pouco estriados, com lenticelas brancas, glabros. Folhas alternas, dísticas, imparipinadas; pecíolos comumente cilíndricos não sulcados; 1 peciólulo, raramente sulcado; estípulas presente somente nas plântulas; 7–25 folíolos subopostos, ovais a elípticos, base e ápice arredondados ou acuminados, margem inteira, nervura mediana proeminente em ambas as faces, mas mais proeminente abaxialmente. Inflorescência paniculada, flores em muitos ramos axilares ou terminais; pedúnculos ramificados, subestriados, bractéolas caducas; pedicelo curto; cálice longo tubuloso, 5-dentada, base glabra, sinsépalo, 1–2 mm compr., verde; corola com uma única pétala (estandarte) vexilar, branca ou amarelo pálido, geralmente arredondado, breve unguiculado, dorso seríceo-piloso; androceu com 10 estames, aderido ao hipanto, 5 maiores ascendentes, 5 menores não ascendentes; anteras suborbiculares, amarelas; ovário longamente estipitado, estípite aderida longitudinalmente ao hipanto, livre ca. 3 mm compr., densamente pilosa; 2-ovulado; estilete curvado e curto; estigma inconspícuo. Fruto legume alado na base, ápice espesso na região seminífera, oblongo, superfície enrugada reticulada, deiscente em duas valvas, endocarpo desenvolvido ou não envolvendo a semente; 1 semente (raramente duas), ovoide, na ala distal oblonga, tênue, esponjosa, testa lisa, nigrescente ou vermelha; embrião exalbuminoso, cotilédone plano-convexo, base cordiforme; radícula mínima.

Chave de identificação para as espécies de Amburana

1 . Caule ferrugíneo, folíolos (17–25) oval-lanceolados, ápice acuminado; inflorescência

laxa (4–10 cm compr.)...... Amburana acreana

- Caule castanho, folíolos (7–15) elípticos a ovais, ápice obtuso a retuso;

inflorescência congesta (2–5 cm compr.)...... 2

2 . Endocarpo membranáceo desenvolvido envolto a semente, semente

nigrescente...... Amburana cearensis

- Endocarpo não desenvolvido, semente vermelha...... Amburana erythrosperma 35

1. Amburana acreana (Ducke) A. C. Smith (1940: 62). Tipo: —BRASIL, Acre, Seringal Iracema, Rio Acre, Território Acre, em ilha não inundável, May 1933, A. Ducke 23769 (Holótipo Fotos NY!, isótipos K!, P!, RB!) Torresia acreana Ducke (1935: 205) (Fig. 1 e 2)

Figura 1. Amburana acreana. Flores e botões (Foto: V. F. Mansano).

Árvore de 30 m alt. ou mais. Caule liso, ferrugíneo; exsudato com forte odor de cumarina após corte. Folhas 15–35 cm compr.; pecíolo 14–17 mm compr.; folíolos 17– 25, 6 × 3 cm, alternos, oval-lanceolados, ápice acuminado, base arredondada, nervura principal saliente na face abaxial. Inflorescência laxa, 4–10 cm compr.; pedúnculo 1,5– 3 cm compr.; flores ca. 1,5 cm compr.; estandarte branco, 10–15 mm compr.; bractéolas ovais, pilosas; cálice campanulado, subglabro; filetes curvados para cima, o vexilar ca. 1 mm e os carenais ca. 6 mm; ovário ca. 4 mm compr., glabro, estípite aderido ao hipanto. Fruto legume linear-oblongo, 5–7 × 0,6–1 cm, endocarpo membranoso desenvolvido que envolve a semente; sementes 1– (2) localizadas na porção distal do fruto, elipsoides, 12–14 × 7–9 mm, nigrescente.

Distribuição e habitat: Ocorre no norte do Brasil (Bacia Amazônica), Bolívia e Peru, próximo a margens de rios (Fig. 7).

Fenologia: Floresce de abril a maio e frutifica em junho.

Taxonomia: Amburana acreana pode ser distinguida das outras demais espécies pelo caule ferrugíneo e mais escuro (versus castanho em A. cearensis e A. erythrosperma); número e formato de folíolos (17–25 nesta espécie x 7–15 em A. cearensis; oval- lanceolados versus elípticos a ovais em A. cearensis e A. erythrosperma), ápice acuminado (versus ápice obtuso a retuso em A. cearensis e A. erythrosperma); inflorescência laxa (versus congesta em A. cearensis e A. erythrosperma), mais longa (4–10 cm compr. versus 2–5 em A. cearensis e A. erythrosperma); endocarpo desenvolvido envolvendo a semente nigrescente (versus endocarpo parcialmente desenvolvido não envolvendo a semente vermelha em A. erythrosperma).

Espécimes adicionais examinados: —BOLÍVIA. La Paz: S. Yungas, Base do Rio Bopi, 690–750 m, 27–31 July 1939, B. A. Krukoff s.n. (K). BRASIL. Acre: Mâncio Lima, Alto Rio Moa, parque Nacional da Serra do Divisor, comunidade do Igarapé Bruquinez, 217 m, 7°27'19"S e 73°38'80"W, 14 November 2007, H. C. de Lima et al. 6727 (RB). Rio de Janeiro: Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Canteiro 14-A, 05 May 2005, L. F. G. da Silva et al. 59 (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Canteiro 14-A, 16 June 1989, V. F. Gonçalves s.n. (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Canteiro 14-A, 25 April 1986, H. C. de Lima et al. 2682 (RB, HUEFS); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Canteiro 14-A, 10 October 1984, H. C. de Lima 2164 (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de 38

Janeiro, Canteiro 14-A, 26 October 1983, H. C. de Lima 2073 (RB). Rondônia: Alvorada do Oeste, Linha 64, a 04 km da BR 429 em direção a Costa Marques, 11°25'S e 62°30'W, 01 May 1987, C. A. C. Ferreira 8980 (K); Costa Marques, cerca de 5 km NW de Costa Marques, 150 m, 12°25'S e 64°14'W, 29 March 1987, M Nee 34551 (K); Eixo JP 14, 9°15'S e 61°50'W, 21 October 1987, S. Romaniuc Neto et al. 687 (HUEFS, MBM, SP, SPF). PERU. Echarate: San Antonio, 1036 m, 12°38'56"S e 72°55'25"W, 23 March 2006, L. Valenzuela et al. 6698 (K, MO); San Antonio, Rio Sapapoari, 1030 m, 12°38'56"S e 72°55'25"W, 23 March 2006, J. Farfán et al. 968 (K, MO); San Antonio, Cirialo, 1320 m, 12°39'59"S e 72°54'39"W, 25 March 2006, I. Huamantupa et al. 7387 (K, MO); San Antonio, Cirialo, 1320 m, 12°39'59"S e 72°54'39"W, 24 March 2006, I. Huamantupa et al. 7379 (K, MO) - Leoncio Prado: Huanuco, Província Panao, distrito Pachitea, 26 July 1962, R. L. Magin 22 (K); Huanuco, Província Pachitea, distrito Honoria, 220 m, 04 April 1964, R. L. Magin 126 (K); Manu: Manu, Parque Nacional Manu, Rio Manu, Pakitsa Estação, Tachigali Trail para 8 km N do campo, 350 m, 11°56'S e 71°16'W, 25 December 1988, R. B. Foster & S. Baldeon 12804 (K, US); San Martin: Chazuta, Rio Huallaga, 260 m, April 1935, G. Klug s.n. (K); Tarapoto, December 1857, R. Spauce s.n. (K); Ucayali: Pucallpa, Pucallpa para Tingo Maria km 85, reserva Von Humboldt, 250 m, 8°48'12"S e 75°03'79"W, 5 August 2001, T. D. Pennington & A. Daza 17174 (K) - Pucallpa para Tingo Maria km 85, reserva Von Humboldt, 250–350 m, 8°48'12"S e 75°03'79"W, 24 September 2000, T. D. Pennington et al. 16994 (K).

2. Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (1940: 62). Tipo: —BRASIL, Ceará, Pacatuba, 09 July 1859, José s.n. Lectótipo R! (aqui designado): - Allemão, 1864: 115. Torresea cearensis Fr. Allem. (1864:115). Amburana claudii Schwacke & Taubert (1894: 387). (Fig. 3 e 4)

Figura 3. Amburana cearensis A. Frutos e sementes; B. Flores e botões florais (Fotos E. P. Seleme).

Figura 4. Amburana cearensis A. Ramo com folhas e inflorescências. B. Inflorescência com botões florais. C. Folíolo. D. Detalhe de C. E. Estandarte. F. Fragmento do filete com antera. G. Estames. H. Cálice com hipanto. J. Vista lateral da flor. K. Bractéola. L. Botão floral. M. Estilete e Estigma. N. Gineceu. O. Corte longitudinal da flor evidenciando o hipanto. P. Semente alada. Q. Fruto. (A–N J. R. I. Wood et al. 19592, O–P J. R. I. Wood 10671). 41

Árvore 5–20 m alt. Caule casca lisa, castanho; ramos cilíndricos castanhos avermelhados. Folhas 7–25 cm compr.; pecíolo 9–17 mm compr.; folíolos 7–15, alternos, 3–6 × 2,5–3 cm compr., elípticos a ovais, base arredondada, ápice obtuso a retuso, face adaxial glabra, face abaxial glabra a pubescente, nervura principal saliente na face abaxial. Inflorescência congesta, 2–5 cm compr.; pedúnculo 1,5–3 cm compr.; flores ca. 1,5 cm compr.; estandarte branco ou com tons róseos ou amarelo claro, seríceo, 5–6 × 5–6 mm compr., base cordada, ápice emarginado, unguícula cerca de 1 mm compr.; bractéolas ovais alongadas, pilosas; cálice campanulado, truncado; filetes ascendentes, vexilar ca. 1 mm compr., carenal ca. 6 mm compr.; ovário ca. 4 × 1 mm compr., glabro, estípite aderido ao hipanto. Fruto legume linear-oblongo, 5–7 × 0,6–1 cm compr., endocarpo membranoso desenvolvido que envolve a semente; sementes 1– (2) localizadas na porção distal do fruto, elipsoides, 12–14 × 7–9 mm, nigrescente.

Distribuição e habitat: Ocorre no Nordeste brasileiro, Sudeste e Centro-Oeste, em matas secas na caatinga, Florestas Deciduais e Semideciduais, até o Paraguai, Argentina e Bolívia (Fig. 7).

Fenologia: Floresce março a julho; frutifica maio a setembro.

Taxonomia: Amburana cearensis pode ser distinguida das outras espécies pelo caule castanho nesta espécie e ferrugíneo em A. acreana; número e formato de folíolos (7–15 elíptico a oval, ápice obtuso a retuso, base arredondada nesta espécie versus 17–25 oval- lanceolados, ápice acuminado em A. acreana); inflorescência (2–5 cm compr. versus 4– 10 em A. acreana); endocarpo membranáceo desenvolvido envolto a semente nigrescente (versus endocarpo parcialmente desenvolvido envolvendo semente vermelha em A. erythrosperma).

Dos dois nomes disponíveis para esta espécie, Torresea cearensis teria prioridade com base em sua publicação original em 1864 sobre Amburana claudii publicado em 1894. Porém, Torresea é considerado um homônimo posterior para Torresia Ruiz & Pav. (Gramineae). Assim, permaneceu o nome genérico Amburana e o epíteto específico cearensis (Smith 1940).

O holótipo não foi designado pelo autor na descrição da espécie, mas o mesmo foi localizado e aqui é designado como lectótipo.

Espécimes adicionais examinados: —ARGENTINA. Jujuy: Ledesma, 29 October 1911 (LIL); Salta, Orán, Entrando al dique Itayaro, 17 March 1972, P. R. Legname & A. E. Cuezzo 9070 (LIL); San Martín, Caraparí, 22 February 1954, T. Meyer 18174 (LIL); Urundel, Camino de Urundel a Fl Bananal, próximo a Fl Bananal, 08 November 1979, P. R. Legname et al. 7240 (LIL). BOLÍVIA. Chuquisaca: Boeto, ascendente de Rio Grande para Nuevo Mundo, 12 February 1996, J. R. I. Wood 10671 (K); Boeto, 41 km no caminho de Serrano para Valle Grande, passando pela comunidade de Nuevo Mundo, 01 April 2003, J. R. I. Wood et al. 19592 (K, HSB). Santa Cruz: Velasco, Zona mayormente de Ilanura com Bosque Secho Chiquitano, 546 m, 16.7312°S e 60.7248°W, 27 April 2009, J. R. I. Wood et al. 26179 (K, USZ). Tarija: Gran Chaco, 49.2 km (pela estrada) E de Palos Blancos, para Villa Montes, 559 m, 21°13'49"S e 63°34'29"W, 26 March 2007, M. Nee & R. Flores 54951 (K). BRASIL. Alagoas: Pão de Açúcar, Caminho para Entremontes, próximo ao alagado na beira da estrada, 05 May 2002, R. P. Lyra-Lemos et al. 6738 (HUEFS, MAC); Piranhas, Fazenda Picus, 15 July 2001, R. A. Silva 1790 (UFP). Bahia: Abaíra, 500m na rodovia Abaíra/ Catoles, 13°15'S e 41°40'W, 06 January 1994, B. B. Klitgaard & F. C. P. Garcia 79 (AAU, K, RB); Aracatu, estrada que liga Umburanas a Ourives, 14°07'S e 41°24'W, 27 March 1984, J. E. M. Brazão 282 (K, HRB, RB); Barra, Médio São Francisco, Fazenda do Brejo, 16 June 2007, M. L. Guedes et al. 14466 (ALCB); Barreiras, August 1989, M. B. Santos 12 (ALCB); Barreiras, APA - Bacia do Rio de Janeiro, Povoado Vau do Teiú, 27 September 2006, T. F. Nogueira 07 (ALCB); Barreiras, Vale do Rio das Ondas, cerca de 10 km W de Barreiras, 02 March 1971, H. S. Irwin et al. 31341 (MBM, NY); Barro Alto, Comunidade de Lagoa Funda, Fazenda Lagoa Branca, 11°45'12"S e 41°50'8"W, 08 April 2002, T. S. Nunes et al. 924 (HUEFS, MBM); Botuporã, 13°16'S e 42°23'W, 21 March 1984, L. C. Oliveira Filho & J. C. A. Lima 111 (HRB, RB); Brotas de Macaúbas, Associação Comunitária de Jatobá, 12°13'55"S e 42°31'29"W, 10 April 2001, T. S. Nunes et al. 268 (CEN, HUEFS); Brumado, Cerca de 23 km na rodovia de Brumado para Livramento do Brumado, 28 December 1989, A. M. Carvalho et al. 2674 (CEPEC, K, MBM); Caldeirão Grande, Rio São Francisco, cerca de 32 km N.E. para Bom Jesus da Lapa, 498 m, 13°10'S e 43°13'W, 18 April 1980, R. M. Harley et al. 21516 (UEC, K, RB); Campo Alegre de Lourdes, Estrada para Pitomba, cerca de 8 km de Campo Alegre de Lourdes, 9°30'13"S e 43°2'40"W, 14 June 2001, T. S. Nunes et al. 373 (HUEFS); Campo Alegre de Lourdes, cerca de 36 km da cidade e a 2 km do povoado Pitomba,

9°26'25"S e 43°12'3"W, 29 April 2001, R. M. Harley et al. 54381 (HUEFS); Campo Formoso, Arredores de Olho d'água das Pombas, 10°6'14"S e 40°36'23"W, 14 May 1999, F. França et al. 2924 (HUEFS); Central, Fazenda Guaxamim, 30 December 1984, (RB, TEPB); Coribe, cerca de 5 km S em estrada de terra que cruza pequeno ramal que sai a 5,1 km E de Ponto d'água, 13°35'10"S e 44°19'12"W, 11 April 2007, L. P. Queiroz et al. 12833 (HUEFS, RB); Ibipitanga, Próximo a sede do município, 12°52'S e 42°28'W, 22 March 1984, H. P. Bautista & O. A. Salgado 866 (ALCB, HUEFS, MBM, MG, HRB); Ibipitanga, Estrada para Jurema, 12°54'19"S e 42°29'24"W, 03 July 2007, D. Cardoso et al. 2094 (HUEFS); Jussiape, cerca de 5 km N da cidade na estrada para Caraguataí, 650 m, 13°30'20'S e 41°36'8"W, 29 June 2007, D. Cardoso 2079 (HUEFS); Licínio de Almeida, Tigre, 24 October 2001, S. M. de Faria et al. 2231 (RB); Livramento do Brumado, Cerca de 6 km W da estrada de Livramento, entrando cerca de 13,4 km S, 936 m, 13°47'17"S e 41°50'4"W, 15 June 2002, L. P. Queiroz et al. 7075 (HUEFS, RB); Maracás, Faz. Tanquinho, cerca de 20 km N de Maracás, 13°26'19"S e 40°26'2"W, 14 April 2007, D. Cardoso et al. 1798 (HUEFS); Mata de São João, Vila Sauípe, horto, viveiro Fazenda Sauípe, 08 July 2002, E. von S. Medeiros et al. 110 (RB); Monte Santo, Fazenda Pedra d'água, 424 m, 10°22'36"S e 39°25'31"W, 31 March 2000, M. R. Fonseca et al. 1372 (ALCB, CEN, CGMS, HUEFS, RB, SPF); Morro do Chapéu, Distrito de Tamboril, 446 m, 04 April 1986, A. M. Carvalho et al. 2410 (CEPEC, K, MBM, RB); Morro do Chapéu, cerca de 2 km da Comunidade Gruta dos Brejões, 457 m, 11°0'53"S e 41°24'20"W, 02 May 2007, D. Cardoso 2047 (HUEFS, RB); Morro do Chapéu, cerca de 2 km da Comunidade Gruta dos Brejões, 11°0'53"S e 41°24'19"W, 04 May 2007, D. Cardoso & R. M. Santos 1809 (HUEFS, RB); Morro do Chapéu, Parque Estadual Morro do Chapéu, 454 m, 11°29'35"S e 41°19'40"W, 25 August 2006, L. Damascena et al. 07 (HUEFS); Paramirim, Caminho Catuarama / Mateus, 414 m, 13°17'50"S e 42°14'44"W, 28 April 2007, A. A. Conceição et al. 1892 (HUEFS); Oliveira dos Brejinhos, 24 March 1981, S. B. da Silva 253 (HRB, MG); Pilão Arcado, Estrada para Iú Grande, sentido Limoeiro ou Brejo dos Zacarias, 10°0'55"S e 42°44'33"W, 22 May 2010, D. Cardoso et al. 2960 (HUEFS); Pilão Arcado, Estrada para Iú Grande, região do Brejo dos Zacarias, 10°0'55"S e 42°44'32"W, 22 May 2010, L. P. de Queiroz et al. 14752 (HUEFS); Pilão Arcado, 39 km de Remanso na estrada para Pilão Arcado, 9°50'0"S e 42°17'36"W, 28 April 2001, L. P. de Queiroz et al. 6621 (HUEFS, MG, SPF); Remanso, Comunidade

dos Negos, Faz. Campo Verde, Beira da Lagoa do Campo Verde, 9°27'16"S e 42°18'06"W, 04 July 2000, M. M. da Silva et al. 451 (HUEFS); Remanso, Baixo Médio São Francisco, BR 324, estrada Remanso/ Piauí, 9°26'27"S e 42°17'47"W, 24 September 2009, F. S. Gomes et al. 285 (ALCB, HUEFS); Remanso, BR 235, Remanso/ Pilão Arcado, 09°55'01"S e 42°17'05"W, 29 May 1989, H. P. Bautista 1449 (HUEFS, RB); Remanso, BR 324, estrada para Piauí, 9°26'15"S e 42°17'59"W, 24 August 2009, E. Melo et al. 6567 (HUEFS); Remanso, Estrada para Pilão Arcado, entrada direita, cerca de 4 km da estrada principal, 9°45'29"S e 42°20'8"W, 16 June 2001, T. S. Nunes et al. 486 (HUEFS); Riachão das Neves, Floresta Estacional, São José do Rio Branco, 11°44'52.8"S e 44°44'46.3"W, 12 March 2010, K. Yoshida-Arns et al. 444 (CSTR, RB, UFP); Rio das Contas, Estrada de Rio das Contas a Arapiranga, 14 February 1999, R. M. Harley & A. M. Giulietti 53465 (HUEFS); São Gabriel, Faz. Boa Sorte, 11°2'S e 41°40'W, 02 April 2009, R. F. Machado et al. 124 (HUEFS); Tanhaçu, 13°53'38"S e 41°04'22"W, 08 August 1979, A. P. de Araújo 149 (HRB, RB); Teofilândia, Fazenda Lagoa do Canto, Povoado de Mirante, estrada de Bola Verde, a 10 m da casa, 14 September 2002, R. B. Almeida 11 (HRB, ICN); Tucano, Cachoeira do Inferno, margens Rio Itapicuru, 10°55'S e 39°04'W, 09 June 2007, D. Cardoso & A. M. Bastos 2056 (CEN, HUEFS). Ceará: Aiuaba, Estação Ecológica de Aiuaba, Grota do Sebo, 21 June 1991, M. A. Figueiredo et al. 180 (EAC); Aiuaba, Arara, 40°08' 22"W , 06°22' 25"S, 30 May 1996, L. W. Lima-Verde et al. 247 (EAC, HUEFS); Aiuaba, Entorno na Estação Ecológica de Aiuaba, 6°40'50"S e 40°11'1"W, 12 February 2007, D. Cardoso 1782 (HUEFS); Aiuaba, E. E. Aiuaba, 06°36'01"S e 40°07'15"W, 25 May 2004, J. R. Lemos & P. Matias 197 (HUEFS, K, SPF); Campas Salas, 2-4km S de Campas Salas, 7°14'S e 40°25'W, 15 February 1985, A. Gentry et al. 50127 (K, MO); Capistrano, Fazenda Araçanga/ Serra de Baturité, 09 March 1994, J. B. L. P. Medeiros & F. S. de Araújo s.n. (EAC, HUEFS); Caridade, Faz. Feijão, 22 April 1990, B. Freitas s.n. (EAC); Caucaia, 03 June 2007, A. S. F. Castro s.n. (EAC, HUEFS); Cratéus, Serra das Almas, 25 May 2005, J. R. Lima 72 (EAC); Fortaleza, Estrada Fortaleza a Crato, 02 August 1948, I. Duarte 1243 (RB); Itapipoca, Estrada para Brotas, 25 May 2000, A. S. F. Castro 856 (EAC, HUEFS); Itatira, Fazenda Itataia, 09 December 2011, R. Martins s.n. (EAC); Jaguaribara, Fazenda Muriá, 22 July 1995, D. Macêdo 36 (EAC); Morada Nova, Barra das Flores, 01 June 1941, P. Bezerra s.n. (EAC); Pacajús, 18 July 1974, A. Fernandes s.n. (EAC, HUEFS); Quixadá, 21 June 1946, G. A. Black s.n. (EAC);

Quixadá, 23 June 1946, G. A. Black s.n. (EAC); Quixadá, Fazenda Olho d'água, 15 June 1993, Ivanilza s.n. (EAC, HUEFS); Quixadá, Sertão dos arredores da Pedra Riscada, 21 June 1946, A. Ducke 1965 (K, IPA); Quixadá, 06 July 1908, A. Ducke & H. Goeldi 1110 (RB); Quixeramobim, Serrote d'água (EAC, HUEFS); Quixeré, Chapada do Apodi, Faz. Mato Alto, 5°11'648"S e 37°49'191"W, 16 September 1996, L. W. Lima- Verde et al. 315 (HUEFS); Sertânia, Centro da Caprinovinocultura do IPA. Pimenteira, área potencial 4 do projeto madeira, 8°4'25" S e 37°12'24"W, 06 April 2001, R. M. Harley & A. M. Giulietti 54186 (HUEFS); Sobral, Fazenda Crioula, 18 June 1993, M. A. P. Silva s.n. (EAC). Distrito Federal: Brasília, APA do Cafuringa, 15°30" S e 47°50'W, 10 November 1991, G. Damasceno Jr. s.n. (COR). Espírito Santo: Baixo Guandu, Estrada Baixo Guandu/ Palmeiras, 17 May 2006, A. A. Luz 330 (CVRD); Jaguaré, Córrego das Abóboras, 28 June 2001, D. A. Folli 3954 (CVRD, RB); Linhares, Área experimental da Reserva Natural Vale, 19°8'40"S e 40°4'8"W, 15 May 1980, I. A. Silva 165 (CVRD, RB); Linhares, Área experimental da Reserva Natural Vale, 19°8'40"S e 40°4'8"W, 29 March 1989, M. S. Menandro 150 (CVRD, RB). Goiás: Campos Belos, km 18 da Rodovia Campos Belos (GO)/ Taguatinga (TO), 13 September 1991, B. S. A. Pereira et al. 1704 (RB); Cavalcante, Km 15 da estrada Teresina de GO/ Cavalcante, 13°50'S e 47°30'W, 29 April 1996, B. A. S. Pereira & D. Alvarenga 3035 (IBGE, , RB, UEC); Formosa, Fazenda Vargem Grande, Vale do Paraná, margem esquerda da BR 020, 1984, I. C. A. Mendes 55 (SPF, UEC); Formosa, Fazenda Santa Fé, km 35 da rodovia Formosa/ Alvorada do Norte, 300 m, 15°20'S e 46°50'W, 26 April 1996, B. S. A. Pereira & D. Alvarenga 2968 (IBGE, RB); Formosa, Fazenda Vargem Grande, 07 June 1992, I. C. A. Mendes 95 (RB); Nova Roma, Estrada para Ouro Minas, 13°45'17"S e 46°53'20"W, 22 April 2009, D. Cardoso et al. 2512 (HUEFS); Posse, km 19 da estrada Posse/ Iaciara, 14°10'S e 46°15'W, 28 April 1996, B. A. S. Pereira & D. Alvarenga 3009 (IBGE, , RB, UEC); São Domingos, Fazenda São Domingos, próximo aos estábulos, 15 April 1999, A. A. Santos et al. 401 (CEN); São Domingos, Fazenda Ipê, estrada de acesso a sede, 13°41'S e 46°40'W, 05 March 2002, E. S. G. Guarino et al. 962 (CEN, RB); São Domingos, Fazenda São Domingos, lado direito da estrada para Manguinha, 15 April 2002, A. C. Sevilha et al. 2136 (CEN, RB). Mato Grosso do Sul: Corumbá, Rua Colombo, entre Sete de Setembro e Quinze de Novembro, próximo a SAMEC (quintal), 19°01'S e 57°39'W, 06 April 1993, A. A. Bueno Sobrinho et al. s.n. (CPAP, MBM); Corumbá, Perto do aeroporto, Morro Zé Feliciano, 19°01'S e 57°39'W,

08 October 1985, J. A. Ratter et al. s.n. (K); Corumbá, Estrada Corumbá/ Campo Grande, 14 November 1992, S. M. de Faria 521 (RB); Corumbá, Serra São Domingos, Planalto Residual do Urucum. Cerradão, 297 m, 19°15'62.2"S e 57°36'76.7"W, 26 April 2004, R. R. Silva & J. S. Velasquez 892 (CGMS, COR, CPAP, UEC); Corumbá, Jacadigo, 14 March 1992, M. F. Reis s.n. (COR); Corumbá, Serra Grande, Planalto Residual do Urucum. Interior de Floresta Estacional Decidual, 310 m, 19°13'80.3"S e 57°30'09.5"W, 31 March 2004, R. R. Silva & J. S. Velasquez 905 (COR, UEC); Corumbá, Serra Urucum, Planalto Residual do urucum, vale de Floresta Estacional Semidecidual, 115 m, 19°10'93.3"S e 57°37'86.8"W, 12 May 2004, R. R. Silva & V. V. Filho 944 (COR, UEC); Corumbá, Serra do Jacadigo, planalto residual do Urucum, acesso pela Faz. Nossa Sra. Auxiliadora, floresta estacional decidual, 312 m, 19°13'91.1"S e 57°50'45.3"W, 30 July 2004, R. R. Silva & J. S. Velasquez 1050 (UEC); Corumbá, Serra do Jacadigo, planalto residual do Urucum, acesso pela Faz. Nossa Sra Auxiliadora, floresta estacional decidual, 100 m, 19°13'38.7"S e 57°50'15.6"W, 30 July 2004, R. R. Silva e J. S. Velasquez 933 (COR, UEC); Ladário, Fazenda Uruba, 08 June 1994, G. Hatschbach et al. 60801 (MBM); Ladário, Serra do Rabichão, Planalto Residual do Urucum, interior de floresta estacional decidual, 19°04'90.1"S e 57°29'22.2"W, 19 May 2004, R. R. Silva & M. V. Silva 957 (UEC); Ladário, Serra do Rabichão, Planalto Residual do Urucum, Lajedo (Banca Laterítica), 19°04'34.3"S e 57°28'87.2"W, 19 April 2004, R. R. Silva & M. V. da Silva 864 (CGMS, COR, CPAP, UEC); Ladário, Serra do Rabichão, planalto Residual do Urucum, acesso pela Faz. Uruba, 19°06'92.1"S e 57°30'40.1"W, 21 July 2004, R. R. Silva & M. V. Silva 979 (UEC); Porto Murtinho, Faz. Oasis, 20 km E de Porto Murtinho, BR 267, 21°42'S e 57°40'W, 18 February 1989, A. Pott et al. s.n. (CPAP, K). Minas Gerais: Aimorés, Estrada Aimorés/ Tabaúna, 08 April 2004, A. A. Luz 174 (CVRD, RB); Belo Horizonte, 03 April 1934, M. Barreto s.n. (K, RB); Itinga, Fazenda Lajedão, 01 July 2003, R. D. Botelho s.n. (BHZB, RB); Itinga, 25 March 1984, A. de Mattos Filho & C. T. Rizzini 1623 (RB); Manga, Brejo São Caetano, 19 April 2007, J. M. Silva & O. S. Ribas 5797 (MBM); Montes Claros, Engenheiro Dolabella, 07 March 1929, J. G. Kuhlmann 62 (RB); Viçosa, UFV, Jardim Botânico, 20°45'54"S e 45°52'54"W, 11 March 1981, A. Julio Filho & N. M. Julio s.n. (RB, VIC). Paraíba: Campina Grande, Horto Florestal/ CSTR, final da trilha, próxima ao riacho, 07°03'3.48"S e 37°16'25"W, 12 June 2010, M. Kicia s.n. (CSTR, RB); Catingueira, Sítio Bento Sousa, 16 July 2012, M. F. A. Lucena

& D.S. Lucena 2086 (CSTR, RB); Coremas, Área de tensão ecológica próxima a serra, 25 April 2010, J. R. Andrade et al. 351 (PEUFR); Santa Terezinha, Fazenda Tamanduá, 07°01'S e 37°24'W, 18 July 2010, S. R. Guedes s.n. (CSTR, RB); São João do Cariri, Riacho Aveloz, 26 May 2004, A. V. Lacerda & F. M. Barbosa 143 (HUEFS, JPB); São José das Espinharas, Assentamento Cachoeira, 521 m, 06°47'23.1"S e 37°19'16.9"W, 16 May 2011, P. F. Souza 23 (CSTR); São José dos Cordeiros, RPPN Fazenda Almas, 7°47'08"S e 36°89'75"W, 15 May 2010, Z. G. M. Quirino 101 (UFP); São José dos Cordeiros, RPPN Fazenda Almas/ Lageado para Pedra da Bola, 7°27'59"S e 36°53'20"W, 31 May 2003, I. B. Lima et al. 111 (HUEFS, JPB); Solânea, Curimataú, 30 August 2001, T. M. G. Velôso 290 (IPA, JPB); Soledade, Comunidade Bom Sucesso, interior da mata, 07°03'26"S e 36°21'46"W, 28 June 2006, R. F. P. Lucena et al. 240 (PEUFR); Soledade, Comunidade Barrocas, interior da mata, 07°03'26"S e 36°21'46"W, 04 June 2006, R. F. P. Lucena & G. R. Almeida 242 (PEUFR); Soledade, Bom Sucesso, caatinga hiperxerófita, 28 June 2006, C. Almeida & I. Silva 117 (UFP). Pernambuco: Alagoinha, Sítio Laje Carrapicho, 06 February 1999, U. P. Albuquerque et al. 166 (UFP); Alagoinha, Fazenda Serrinha, caatinga agreste, 24 August 2001, P. G. G. Silva 41 (UFP); Altinho, 13 June 2008, L. L. Santos et al. 520 (PEUFR); Bodocó, Km 4 estrada Bodocó/ Sipaúba, 11 December 1983, G. Fotius 3629 (HUEFS, HTSA); Custódia, Fazenda Samambaia, 18 March 1989, E. L. Araújo s.n. (IPA); Mirandiba, Amburanas, 08°12'00"S e 38°34'50"W, 10 February 2007, E. Córdula et al. 209 (UFP); Mirandiba, Serra das Umburanas, 23 June 2007, E. Córdula et al. 310 (K, RB, UFP); Mirandiba, Serra do Tigre, 04 October 2006, E. Córdula et al. 198 (HUEFS, UFP); Mirandiba, Serra do Tigre, 08°03'35"S e 38°43'07"W, 18 April 2007, K. Pinheiro 265 (K, UFP); Ouricuri, Fazenda Tabuleiro, July 1984, G. C. Lima 76 (IPA, RB); Ouricuri, Sítio Ponta da Serra Jatobá, 30 May 2003, S. K. Rocha 38 (UFP); Petrolândia, Margem da estrada Ibimirim/Petrolândia, 08 May 1950, A. Lima 50-538 (IPA); Petrolina, 07 August 2007, A. M. Miranda & J. Ferraz 5478 (HUEFS, HST); Salgueiro, 09 June 2005, F. França et al. 5246 (HUEFS); Santa Cruz do Capibaribe, 24 July 2000, M. V. B. de M. A. Carvalho 131 (HUEFS, HST); Santa Maria da Boa Vista, cerca de 80 km nordeste do CPATSA, 8°54.17'S e 40°16.67'W, 12 April 1990, G. Fotius 4261 (HUEFS, HTSA); Serra Talhada, Estrada Carqueja/ Serra Talhada, BR 232, 32 km para a ponte sobre o Rio Pajeú, 16 July 1980, Andrade Lima et al. 21 (IPA, MBM, RB). Piauí: Buriti dos Lopes, Canto do Morro, 20 June 1972, D. Sucre & J. F. Silva 9214

(MBM, RB); Campo Grande do Piauí, 6°37'3"S e 37°12'30"W, 26 June 2007, R. M. Santos et al. 1526 (HUEFS, RB); Campo Maior, PI 115, entre Campo Maior e Castelo do Piauí, 11 June 1979, E. Nunes & A. J. Castro s.n. (EAC); Canto do Buriti, Fazenda Boa Vista, 10 June 1974, F. B. Ramalho 337 (HST, RB); Dirceu Arco Verde, Fazenda Queimadas do Bonfim, 08°54'S e 42°35'W, 11 August 1984, H. P. Bautista & R. P. Orlandi 974 (MBM, HRB); Jaicós, Santana próximo a barragem, 26 April 2002, R. Barros s.n. (HUEFS, TEGB); Raimundo Nonato, 1 km W da Fundação Ruralista 9°0'S e 42°0'W, November 1981, G. P. Lewis & H. P. N. Pearson 1080 (K); Serra da Capivara, 1979, L. Emperaire 354 (IPA). Rio de Janeiro: Itaocara, Rio Paraíba do Sul, área da UHE Itaocara, Rodovia RJ 158, entre Batatal e Porto Marinho, 21°43'40"S e 42°16'54"W, 17 November 2011, H. C. de Lima et al. 7419 (RB); Itaocara, Rio Paraíba do Sul, área da UHE Itaocara, Rodovia RJ 158, entre Batatal e Porto Marinho, 21°42'01"S e 42°12'54"W, 18 November 2011, H. C. de Lima et al. 7428 (RB); Itaocara, Rio Paraíba do Sul, área da UHE Itaocara, Rodovia RJ 158, entre Batatal e Porto Marinho, 21°41'34"S e 42°11'11"W, 18 November 2011, H. C. de Lima et al. 7427 (RB); Macaé, Bairro Novo Cavaleiros, 02 October 2005, R. D. Ribeiro et al. 534 (RB); Macaé, Granja dos Cavaleiros, Estrada do bosque, acesso a lagoa encantada, 21 February 2006, R. D. Ribeiro et al. 581 (RB); Quissamã, Fazenda São Miguel, 22°04'S e 41°31'W, 14 February 2007, H. C. de Lima et al. 6512 (RB); Quissamã, Machadinha, próximo Fazenda Palmeira, 14 February 2007, H. C. de Lima et al. 6504 (RB); Rio das Ostras, Balneário Morada das Garças, última guarda, 22°44'37"S e 41°51'15"W, 07 December 2003, R. D. Ribeiro & N. M. S. Ribeiro 71 (HUEFS, CEPEC, RB, SPF); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, canteiro, 22°58'03"S e 43°13'26"W, 04 May 2007, N. L. Nunes & R. D. Ribeiro 19 (HUEFS, RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, indivíduo 2981, 22°58'03"S e 43°13'26"W, 15 April 1991, V. F. Gonçalves s.n. (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, indivíduo 3082, 07 March 1991, V. F. Gonçalves s.n. (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, indivíduo 3035, 18 March 1991, V. F. Gonçalves s.n. (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 10 October 1984, H. C. de Lima 2163 (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, canteiro 14-A, 03 October 2006, L. F. G. da Silva et al. 20 (RB); Rio de Janeiro, Jardim Botânico do Rio de Janeiro, 22°58'03"S e 43°13'26"W, 01 May 2008, B. M. Torke et al. 390 (RB); São Pedro da Aldeia, Via Lagos km 40, próximo a base de apoio, 25 May 2006, R. D. Ribeiro et al.

667 (RB); São Pedro da Aldeia, Via Lagos km 39.5, antes do SOS Via Lagos, 22°48'56"S e 42°17'54"W, 12 February 2007, H. C. de Lima et al. 6493 (RB). Rio Grande do Norte: Açu, EFLEX-IBDF, esquerda da linha de transmissão CHESF, 10 February 1987, R. L. C. Ferreira 154 (IPA, RB); Almino Afonso, Sítio Grossos, 3 km antes da cidade, 21 June 2003, M. A. G. Paiva 15 (UFRN); Almino Afonso, 08 September 2003, M. A. G. Paiva & E. Paiva 40 (UFRN); Almino Afonso, 21 June 2003, M. A. G. Paiva 24 (UFRN); Caicó, Estação Ecológica do Seridó ESEC, 05 July 2005, R. Pereira & C. Ferreira 3026 (IPA); Caicó, Saída para São José do Seridó, RN 288, entrada cerca de 1 km E vicinal para Serra da Formiga, Serra da Formiga, 6°21'18"S e 36°57'17"W, 28 May 2010, J. G. Jardim et al. 5755 (UFRN); Jucurutu, RPPN Stoessel de Britto, 01 June 2008, A. A. Roque 584 (UFRN); Mossoró, 29 June 1979, O. F. Oliveira et al. 745 (MOSS, UFRN); Serra Negra do Norte, 03 June 2006, R. Queiroz 52 (CSTR, RB). São Paulo: Araraquara, Bairro Quitandinha, área do Instituto e Química/ UNESP, 09 August 2000, G. L. Pozetti s.n. (UEC); Pereira Barreto, Praça Central, 20°51'S e 51°07'W, 06 February 1982, J. G. Guimarães 1407 (HRB, RB); Pindorama, Est. Exp. Sede Nova, 07 November 1938, O. T. Mendes s.n. (ESA); Piracicaba, Parque da Esalq, 22°42'45"S e 47°37'33"W, 08 July 1993, K. D. Barreto et al s.n. (ESA); Ribeirão Preto, 17 April 1954, A. Grotta s.n. (MBM, RB, SPF, UEC). Tocantins: Aurora do Norte, Km 69 da estrada Taguatinga/ Combinado, 12°50'S e 46°30'W, 16 August 1995, B. A. S. Pereira & D. Alvarenga 2870 (CEN, EAC, RB).

3. Amburana erythrosperma E. P. Seleme, C. H. Stirton & V. F. Mansano sp. nov. (Fig. 5 e 6) Amburana erythrosperma difere das espécies A. acreana e A. cearensis por apresentar a semente de coloração vermelha, desprovida de endocarpo membranáceo que envolve a semente.

Tipo: —BRASIL, Bahia: Livramento do Brumado, 13°43'S e 41°50'W, 25 March 1991, G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1876 (Holótipo CEPEC!, isótipos BR, K! , MEXU, MO, NY).

Figura 5. Amburana erythrosperma. Frutos e sementes (Fotos: G. Lewis e E.P. Seleme).

Figura 6. Amburana erythrosperma A. Inflorescência. B. Folha. C. Detalhe de B. D. Botões florais. E. Estandarte (face adaxial). F. Corte da flor evidenciando hipanto, estames e carpelo. G. Fragmento do filete e antera. H. Gineceu. J. Estilete e estigma. K. Cálice. L. Estames. M. Vista lateral da flor. N. Botão floral. O. Bractéola (face abaxial). P. Fruto Q. Semente. R. Fruto aberto evidenciando as duas sementes. (A–M de G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1876; N–P de G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1997).

Árvore 5–6 m alt. Caule casca lisa, castanho; ramos cilíndricos castanho- avermelhados. Folhas 7–25 cm compr.; pecíolo 9–18 mm compr.; folíolos 7–13, alternos, 2–5 × 2–3 cm, elípticos a ovais, base arredondada, ápice obtuso a retuso, face adaxial glabra, face abaxial glabra a pubescente, nervura principal saliente na face abaxial. Inflorescência congesta, 2–5 cm; pedúnculo 0,5–2 cm compr.; flores ca. 1,5 cm compr.; estandarte branco ou com tons róseos ou amarelo claro, seríceo, 6–8 × 6–10 mm, base cordada, ápice emarginado, unguícula cerca de 1 mm compr.; bractéolas ovais a triangulares, pilosas; cálice campanulado, truncado, 1–2 mm compr.; filetes ascendentes, vexilar ca. 1 mm, carenal ca. 7 mm; ovário ca. 4 × 1 mm, glabro, estípite aderido ao hipanto. Fruto legume linear-oblongo, 5–8 × 0,6–1 cm, endocarpo membranoso parcialmente desenvolvido, não envolvendo a semente; sementes 1– (2) na porção distal do fruto, elipsoides, 12–15 × 7–9 mm, vermelha.

Distribuição e habitat: Endêmica da região Centro-Sul da Bahia (Fig. 7).

Fenologia: Floresce em março; frutifica em abril.

Taxonomia: Amburana erythrosperma difere das outras duas espécies (A. acreana e A. cearensis) por apresentar a semente de coloração vermelha, com o endocarpo parcialmente desenvolvido, não envolvendo a semente.

Etimologia: O epíteto específico refere-se à cor da semente, que a diferencia das demais espécies.

Espécimes adicionais examinados (parátipos): —BRASIL. Bahia: Livramento do Brumado, 27 km S de Livramento, próximo a duas comunidades Fazendinha e Itapicuru, 593 m, 13°53'S e 41°45'W, 22 April 1991, G. P. Lewis & S. M. M. Andrade 2002 (BR, CEPEC, K, MBM, MEX, NY); Livramento do Brumado, cerca de 30 km na estrada de Brumado para Livramento do Brumado, 12 March 1991, H. S. Brito & G. P. Lewis 292 (CEPEC, HUEFS, MBM, UEC); Livramento do Brumado, 10 km S de Livramento do Brumado para Brumado, lado esquerdo da estrada, 13°43'S e 41°50'W, 17 April 1991, G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1997 (CEPEC, K, NY); Livramento do Brumado, 10 km S de Livramento do Brumado para Brumado, lado esquerdo da estrada, 13°43'S e 41°50'W, 25 March 1991, G. P. Lewis & S. M. M. de Andrade 1876 (BR, CEPEC, K, MEXU, MO, NY).

Figura 7. Mapa de distribuição de Amburana acreana (■), A. cearensis (●) e A. erythrosperma (▲).

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CAPÍTULO 2. FILOGENIA DOS CLADOS AMBURANA E DIPTERYGEAE (LEGUMINOSAE, PAPILIONOIDEAE)

(Esse artigo será submetido para publicação na revista Phytotaxa)

FILOGENIA DOS CLADOS AMBURANA E DIPTERYGEAE (LEGUMINOSAE, PAPILIONOIDEAE)

ELIDIENE P. SELEME1*, GWILYM LEWIS2, FELIX FOREST3, ÂNGELA L. B. SARTORI4 & VIDAL F. MANSANO5

1Programa de Pós-graduação em Botânica, Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Rua Pacheco Leão, 915, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil. 2Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond Surrey TW9 3AB, United Kingdom. 3Jodrell Laboratory, Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, Surrey, TW9 3DS, United Kingdom. 4Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Caixa Postal 549, 79070-900, Campo Grande, MS, Brasil. 5Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, DIPEQ. Rua Pacheco Leão 915, Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil. *Autor para correspondência: [email protected]

RESUMO Este estudo teve como objetivo elucidar as relações entre os gêneros dos clados Amburana e Dipterygeae, e o seu posicionamento na subfamília Papilionoideae. Foram inferidas filogenias através de diferentes abordagens analíticas como Máxima Parcimônia e Análise Bayesiana utilizando os marcadores trnL, matK e ITS, incluídos 75 táxons para os marcadores matK e trnL e 62 táxons para ITS. Os clados Amburana e Dipterygeae se sustentam como grupos monofiléticos para o marcador matK, que as relações são melhor resolvidas. Para os marcadores ITS e trnL as relações entre os gêneros dentro destes grupos não são bem resolvidas e estes aparecem como grupos não monofiléticos. Esta filogenia inclui uma vasta amostragem dos clados Amburana e Dipterygeae e clados afins (Angylocalyx, Swartzioid e Cladrastis), além de uma espécie nova de Amburana. Palavras-chave: Fabaceae, Filogenia Molecular, matK, trnL, ITS.

ABSTRACT This study in order to elucidate the relationship among the genera of Amburana and Dipterygeae clades, and their placement in Papilionoideae subfamily. Different phylogenetic inference approaches like maximum parsimony and Bayesian analysis were carried out based on DNA regions: trnL, matK and ITS, included 75 taxa to matK and trnL regions and 62 taxa to ITS. The Amburana and Dipterygeae clades are monophyletics to the matK region, and the relationship are well resolved. To the trnL and ITS regions, the relationships among these genera within these groups are not well resolved and these not appear as monophyletics groups. This phylogeny includes wide sampling of Amburana and Dipterygeae clades and allies (Angylocalyx, Swartzioid e Cladrastis clades), furthermore a new specie of Amburana. Key Words: Fabaceae, Molecular Phylogeny, matK, trnL, ITS.

INTRODUÇÃO

Leguminosae Juss. é uma família monofilética dividida em três subfamílias, Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae, sendo as duas últimas monofiléticas e Caesalpinioideae parafilética (Chappill 1995; Doyle 1994; Kajita et al. 2001; Lavin et al. 2001; Wojciechowski et al. 2004; Cardoso et al. 2012). A família apresenta distribuição cosmopolita, sendo um dos grupos mais ricos em espécies em muitos levantamentos florísticos do Neotrópico, e de grande importância econômica, como alimentos, ornamentais e arborização de ruas, forrageiras, fornecedoras de madeira, medicinais e além de aumentarem a quantidade de compostos nitrogenados no solo por sua associação com bactérias fixadoras de nitrogênio (Lewis et al. 2005).

Papilionoideae apresenta 467 gêneros, 13.800 espécies e é considerada a subfamília mais representativa de Leguminosae com dois terços dos gêneros e espécies (Kajita et al. 2001; Wojciechowski et al. 2004; Lewis et al. 2005). O gênero Amburana, quando descrito, foi inserido na tribo Amherstieae em Caesalpinioideae, próximo a Eperua Aublet (Engler & Prantl 1894). Entretanto, sugeriu-se que pertence mais apropriadamente a tribo Sophoreae de Papilionoideae (Engler & Prantl 1897). No trabalho de Polhill et al. (1981) este gênero também aparece incluído dentre as Sophoreae, a Myroxylon. Wodjciechowski et al. (2004) confirmaram

a proximidade de Amburana com Myroxylon e gêneros afins baseados em análises moleculares do marcador matK. Cardoso et al. (2012) propuseram o clado Amburana, com os gêneros Amburana, Myroxylon, Myrospermum, Myrocarpus, Cordyla, Mildbraediodendron e Dussia, irmão do clado Dipterygeae, que inclui Dipteryx, Pterodon, Taralea e Monopteryx, baseado em análises combinadas com as regiões plastidiais matK e trnL.

Membros dos clados Amburana e Dipterygeae são considerados heterogêneos em termos morfológicos, como as estruturas florais por exemplo. Estudos filogenéticos devem contribuir para elucidar as relações intra e intergenéricas destes clados posicionados na base de Papilionoideae. (Pennington et al. 2001).

Desse modo, visando conhecer as relações filogenéticas entre os gêneros dos clados Amburana e Dipterygeae, o presente estudo tem como objetivos realizar uma filogenia molecular, e assim fornecer subsídios para estudos aplicados à taxonomia. Foram amostradas espécies dos clados Angylocalyx, Swartzioid, Cladrastis e os gêneros Amphimas Pierre ex Dalla Torre & Harms, Dermatophyllum Scheele e Aldina Endl. do grande clado que possui a inversão de 50-kb do DNA do cloroplasto para maior amostragem e confiança dos dados.

MATERIAL E MÉTODOS 1. Análise cladística

1.1. Amostragem de táxons – Foram coletados materiais botânicos em populações naturais ou plantas cultivadas e espécimes de herbário. A análise filogenética foi feita com base no sequenciamento dos genes trnL do DNA do cloroplasto e ITS do DNA nuclear. Foi usado como grupo externo Dalbergia congestiflora Pittier. O material testemunho foi depositado no Herbário do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RB).

Parte do material selecionado encontrava-se depositado no banco de DNA do Jodrell Laboratory (Kew, Reino Unido). E também foram utilizadas amostras de herbário para extração de DNA e sequências já depositadas no GenBank (National Center for Biotechnology, website http://www.ncbi.nlm.nhi.gov). As diferenças na amostragem nas análises individuais foram causadas por falta de disponibilidade de

DNA para um determinado táxon para o qual já tínhamos sequência de apenas uma região no GenBank ou quando o DNA foi amplificado apenas para uma ou outra região. Para estudos com o marcador matK, foram utilizadas sequências disponíveis no GenBank.

1.2. Extração de DNA – O DNA do material extraído foi depositado no Banco de DNA do Jodrell Laboratory. Para a extração foi utilizado o método do CTAB, descrito por Doyle & Doyle (1987), onde cerca de 100 mg de folhas secas foram maceradas em nitrogênio líquido num macerador automático (Mixer Mill, Retsch). Às folhas pulverizadas, foi acrescentado 1 mL de tampão de isolamento (100 mM Tris-HCl pH

8.0; 1,4 M NaCl; 2% CTAB; 20 mM EDTA; 1% PVP40000 e 2% -Mercaptoetanol). As amostras foram agitadas vigorosamente e incubadas a 65ºC por 30 minutos. Depois de um resfriamento a temperatura ambiente, adicionados 700 L de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), e misturado por inversão dos tubos por 20 minutos. As amostras foram submetidas à centrifugação de 8000 a 9000 rpm a 25°C por 10 minutos. Aproveitando-se somente a fase aquosa, foi adicionado 1 V de isopropanol e os tubos deixados em repouso por 24 horas à -20ºC. Passado este período, os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 3000 rpm e o sobrenadante foi descartado. Os pellets foram lavados com 300 L de etanol 70% por cerca de 10 minutos. Após, os pellets foram deixados para o álcool evaporar e o DNA ressuspendido em 3 mL 1,5g/mL de CsCl e solução de brometo de etídeo, no escuro de 8 a 10 h. Para verificar a qualidade do DNA extraído e quantificá-lo, uma alíquota de 2 L desse DNA foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% em TAE 0,5X, corado com brometo de etídeo. Juntamente com as amostras, foram aplicados padrões de quantificação (de concentração conhecida) de DNA para que a concentração do DNA extraído fosse inferida.

1.3. Reações de Amplificação e Sequenciamento - A partir do DNA extraído foram amplificadas, pela reação em cadeia da polimerase (PCR), e sequenciadas regiões de DNA nuclear e DNA de cloroplasto: ITS e trnL, respectivamente, que já mostraram em trabalhos prévios serem regiões filogeneticamente informativas ao nível genérico para Leguminosae (Hu et al. 2002; Lavin et al. 2003; Steele & Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2004; Cardoso et al. 2012). As reações de PCR foram feitas num volume final de 25 L, contendo cerca de 1 L de DNA diluído 10 vezes, 1 mM de 61

dNTPs, Tampão 1X (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1% Gelatina; 2mM MgCl2), 5 pmol de cada primer e 1 U de Taq DNA polimerase. Os produtos de PCR foram purificados e, posteriormente, feito o sequenciamento em sequenciador automático ABI (Jodrell Laboratory, United Kingdom).

Os primers usados na amplificação e sequenciamento para a região trnL foram descritos por Taberlet et al. (1991), e os primers para a amplificação e sequenciamento da região nuclear ITS foram descritos por Sun et al. (1994) e White et al. (1990) (tabela 1).

Tabela 1. Primers utilizados no presente estudo. Referência Primers Sequência (5’ 3’) Região Bibliográfica ITSAB101 ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG Sun et al. 1994 ITSAB102 GAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC ITS ITS 2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al. ITS 3 GCATCGATGAAGAACGCAGC 1990 trnK685F GTATCGCACTATGTATCATTTGA matK4La CCTTCGATACTGGGTGAAAGAT Wojciechowski matK matK1932Ra CCAGACCGGCTTACTAATGGG et al. 2004 trnK2R* CCCGGAACTAGTCGGATGG c CGAAATCGGTAGACGCTACG d GGGGATAGAGGGACTTGAAC Taberlet et al. trnL-F e GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 1991 f ATTTGAACTGGTGACACGAG

1.4. Montagem, Edição e Alinhamento das Sequências - As sequências obtidas foram examinadas para atestar sua qualidade e, posteriormente, montadas no programa Geneious 6.1 (Biomatters Ltd Auckland, N.Z). Os alinhamentos das sequências foram feitos com o auxílio do aplicativo ClustalX (Thompson et al. 1997) implementado no programa Mesquite (Maddison & Maddison 2011), utilizando o padrão do programa para todos os parâmetros.

1.5. Análise dos Resultados – As análises filogenéticas, por marcador e combinadas, foram feitas utilizando dois métodos, o de máxima parcimônia e inferência Bayesiana. Para análise de máxima parcimônia foi utilizado o programa PAUP* 4.0b10 (Swofford 2002) que, em princípio, dá peso maior aos caracteres que são mais constantes ou menos homoplásicos, sendo assim mais confiáveis como prováveis sinapomorfias. Foram conduzidas buscas heurísticas das árvores mais parcimoniosas, com adição 62

aleatória de sequências (opção RANDOM) com 10000 réplicas, rearranjo de ramos por “tree-bisection-reconection” (TBR), a partir do método de otimização dos caracteres ACCTRAN (“accelerated transformation optimization”), desordenados e sem peso, com retenção de múltiplas árvores mais parcimoniosas (opção MAXTREES foi configurada para aumentar ilimitadamente). Para cada análise foram inferidas as árvores de consenso estrito e de maioria e os valores de suporte de “bootstrap” foram inferidos usando um algoritmo de busca heurística, com 10000 réplicas e com uma réplica de adição de sequência por busca aleatória, mantendo uma árvore por réplica. Para as árvores mais parcimoniosas encontradas foram calculados tais índices: índice de consistência (IC), índice de retenção (IR) e índice de consistência rescalonado (RC). O IC mede a quantidade relativa de homoplasias na árvore, sendo calculado como o número de passos esperados para um número de estados de caracteres no conjunto de dados, dividido pelo número real de passos da árvore e multiplicado por 100. O IR é a quantidade de sinapomorfias encontradas nos dados analisados e o RC é o produto de IC e IR (Kluge & Farris 1969; Farris 1989). A análise bayesiana foi realizada com o programa MrBayes versão 3.2.1 (Ronquist et al. 2012) usando o Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research (CIPRES) Portal 2.0 (Miller et al. 2010). O melhor modelo de substituição estimado para cada partição de acordo com Critério Akaike de informação (AIC) (Akaike 1974) usando ModelTest 2 (Darriba et al. 2012) foi GTR+G para ambos trnL e matK e GTR+I+G para ITS. Duas análises independentes, com quatro cadeias, foram realizadas com cinco milhões de gerações de Markov Chain Monte Carlo (MCMC) e uma frequência de amostragem de 1000. As árvores geradas foram visualizadas com FigTree 1.4 (Rambaut 2012).

RESULTADOS As informações sobre as características das sequências e alinhamento de cada região sequenciada e as estatísticas da análise filogenética de parcimônia estão sumarizadas na tabela 2.

Tabela 2. Síntese das características das sequências e das estatísticas das árvores da análise de máxima parcimônia inferidas para a filogenia dos clados Amburana e Dipterygeae para cada região gênica e dos dados combinados. Características ITS matK trnL Combinada N° de Táxons Analisados 62 75 75 94 Características das Sequências Caracteres totais 838 2780 1194 3618 Caracteres variáveis 132 288 213 420 Caracteres informativos 390 415 174 805 Estatísticas das Árvores N° de árvores mais parcimoniosas 21 91050 32140 28590 Índice de Consistência (IC) 0,388 0,784 0,787 0,501 Índice de Retenção (IR) 0,676 0,907 0,838 0,750 Índice Rescalonado (RC) 0,262 0,712 0,659 0,376

Análises dos dados de matK – os táxons incluídos nas análises estão especificados no Apêndice 1. A análise de máxima parcimônia mostrou 2780 caracteres, sendo 2077 constantes, 288 variáveis e não informativos e 415 informativos (IC = 0,784; IR = 0,907) (Tabela 2). A análise bayesiana usou o modelo de substituição GTR + G, selecionado pelo AIC. As árvores de consenso estrito da máxima parcimônia e de consenso de maioria da bayesiana foram altamente resolvidas. Os clados Amburana e Dipterygeae mostraram-se monofiléticos, assim como os clados Angylocalyx, Swartzioid e Cladastris (Figuras 1 e 2). Os gêneros Amphimas, Aldina e Dermatophyllum não são resolvidos. Já os gêneros Cladrastis Raf., Myrocarpus e Myrospermum não são monofiléticos. Análises dos dados de trnL - os táxons incluídos nas análises estão especificados no Apêndice 1. O alinhamento para análise da região trnL apresentou 1194 caracteres, sendo 807 constantes, 213 variáveis e não informativos e 174 informativos e os seguintes índices de parcimônia: IC = 0,787; IR = 0,838 (Tabela 2). A análise bayesiana usou o modelo GTR + G. Para ambas as análises, máxima parcimônia e bayesiana, as relações entre os táxons e a monofilia dos clados não são bem resolvidas como encontrado para o marcador matK (Figuras 3, 4 e 5). Apesar do fraco suporte (53%), na análise bayesiana, o íntron trnL confirma o monofiletismo do gênero

Amburana. E os gêneros Myrocarpus, Myrospermum e Cladrastis novamente aparecem como não monofiléticos. Análises dos dados de ITS - os táxons incluídos nas análises estão especificados no Apêndice 1. A análise de máxima parcimônia mostrou 838 caracteres, sendo 316 constantes, 132 variáveis e não informativos e 390 informativos (IC = 0,388; IR = 0,676) (Tabela 2). A análise bayesiana usou o modelo de substituição GTR + I + G. Como encontrado para a região trnL, o marcador ITS, para ambas as análises, máxima parcimônia e bayesiana, a relação entre os táxons e a monofilia dos grupos não apresentam-se bem resolvidas, como encontrado para o marcador matK (Figuras 6 e 7). Assim como para os outros dois marcadores, para ITS, é confirmado o monofiletismo do gênero Amburana (100% de suporte), embora para o clado Amburana não há a inclusão de todos os táxons. E Monopteryx não aparece inserido no clado Dipterygeae.

Figura 1. Árvore de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do marcador plastidial matK. Números dos ramos são valores de suporte obtidos por 10000 réplicas de bootstrap. 66

Figura 2. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região matK inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados.

Figura 3. Árvore de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do marcador plastidial trnL. As relações e monofilia dos táxons não são bem resolvidas. 68

Figura 4. Árvore de consenso de maioria das análises de máxima parcimônia inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir de sequências do ínton trnL.

Figura 5. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região trnL inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Dipterygeae não monofilético (não inclusão de Monopteryx e Dipteryx panamensis).

Figura 6. Árvore de consenso estrito de “bootstrap” das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir das sequências do marcador nuclear ITS. Setas indicam táxons dos grupos Dipterygeae e Amburana, em politomias (não monofiléticos).

Figura 7. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados da região ITS inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Seta indica Monopteryx, não incluso em Dipterygeae. E os táxons do grupo de Amburana, não são bem resolvidos, apresentando-se não monofilético. 72

As regiões matK e trnL são mais conservadas, em contraste, a região ITS mostrou-se muito variável, o que pode ser observado pelo número de sítios variáveis. Por causa dessas características, foram geradas numerosas árvores parcimoniosas para as regiões matk e trnL, enquanto para ITS foram geradas apenas 21 árvores parcimoniosas. Porém, o marcador matK mostrou-se melhor resolução entre os clados, enquanto ITS e trnL apresentaram baixo suporte para alguns clados e politomias. Análises dos dados combinados – para as análises combinadas foram utilizados os marcadores matK, trnL e ITS. A matriz dos dados moleculares combinados possui 3618 caracteres, dos quais 2393 são constantes, 420 variáveis e não informativos e 805 informativos (tabela 2). A análise de parcimônia resultou em 28590 árvores igualmente parcimoniosas, com índice de consistência (IC) de 0,501 e índice de retenção (IR) de 0,750. A árvore de consenso estrito de “bootstrap” (figura 8) não sustenta os grupos Amburana e Dipterygeae como monofiléticos, pois não há a inclusão de Monopteryx em Dipterygeae, e Amburana emerge em uma politomia. Para a análise bayesiana (figura 9), os grupos Amburana e Dipterygeae também não são bem resolvidos (com fraco suporte 54%) e não há sustentação de monofiletismo para ambos. Já o gênero Amburana aparece como monofilético com 100% de suporte, assim como Myroxylon, Dipteryx, Taralea e Pterodon.

Figura 8. Árvore de consenso estrito de “bootstrap” das análises de máxima parcimônia inferidas para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados a partir dos dados combinados dos marcadores matK, trnL e ITS. Os grupos Dipterygeae e Amburana apresentam-se não monofiléticos. Seta indica Monopteryx não incluso em Dipterygeae. 74

Figura 9. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados combinados das regiões matK, trnL e ITS inferida para os clados Amburana e Dipterygeae e gêneros relacionados. Seta indica Monopteryx não incluso em Dipterygeae (não monofilético, assim como grupo Amburana).

DISCUSSÃO 1. Relações filogenéticas de Amburana O clado Amburana, como descrito por Cardoso et al. (2012) e antes classificado como tribos Swartzieae e Sophoreae, utilizando as regiões matK e trnL, mas tendo melhor resolução entre os grupos com o marcador matK, engloba os gêneros Dussia, Cordyla, Myrocarpus, Myrospermum, Myroxylon, Mildbraediodendron e Amburana. No presente estudo, esse mesmo clado é confirmado com as regiões matK e trnL, já para ITS e análise de dados combinados, a relação entre esses táxons não é bem resolvida. Este grupo aparece como um dos mais basais dentro da subfamília (Pennington et al. 2001; Wojciechowski et al. 2004; Cardoso et al. 2012), contudo, tais análises, incluíram um número menor de espécies. E no presente trabalho se fez necessário amostrar o maior número possível de espécies com o objetivo de confirmar o monofiletismo do clado e dos gêneros e esclarecer as relações entre eles. Então, optamos por utilizar sequências de duas regiões do DNA plastidial (trnL, matK) e uma região do DNA nuclear (ITS), que ainda não haviam sido utilizadas em outros estudos para este clado. Para os marcadores trnL e matK é apresentada relação entre Amburana, Cordyla, Dussia e Mildbraediodendron com o grupo que compreende Myroxylon, Myrocarpus e Myrospermum, como encontrado por Pennington et al. (2001) e Cardoso et al. (2012). O clado Amburana apresenta gêneros de distribuição principalmente neotropical, exceto Cordyla e Mildbraediodendron que ocorrem na África e Ilha de Madagascar. Os representantes deste clado apresentam características morfológicas florais diferentes entre si. Amburana apresenta apenas uma pétala (estandarte). Myrospermum tem flores pentâmeras e papilionáceas. Myrocarpus apresenta flor com cinco pétalas semelhantes entre si (não papilionácea) e Myroxylon possui apenas o estandarte diferenciado e as demais pétalas (quatro) iguais. Dussia também apresenta flores papilionáceas, enquanto Cordyla e Mildbraediodendron são apétalas e tem numerosos estames, como as swartzióides. Mildbraediodendron ainda não havia sido estudado em outras filogenias. A relação entre as espécies Myrospermum frutescens Jacq. e Myrocarpus emarginatus A.L.B.Sartori & A.M.G. Azevedo, revelados neste estudo com as três regiões corroboram os dados de Cardoso et al. (2012), podendo tratar-se de um novo gênero. Através das análises de parcimônia e bayesiana para todos os marcadores aqui estudados, o gênero Amburana se sustenta como monofilético, já as relações

infragenéricas não ficaram bem claras. Para as análises das regiões trnL e ITS realizadas no presente estudo, há a inclusão de uma nova espécie (A. erythrosperma) descrita para o gênero (conforme capítulo 1). As três espécies do gênero apresentam grande semelhança morfológica entre si, sendo características diagnósticas número e formato de folíolos, cor do estandarte e cor da semente, com presença ou ausência de endocarpo envolvendo a semente. 2. Relações filogenéticas de Dipterygeae O clado Dipterygeae, antes denominado como tribo Dipterygeae, engloba os gêneros Dipteryx, Pterodon e Taralea como um grupo monofilético (Pennington et al. 2001; Wojciechowski et al. 2004), apesar de terem amostrado apenas uma espécie de cada gênero, e corrobora com os resultados obtidos neste estudo. Monopteryx emerge como grupo irmão do subclado que inclui Dipteryx, Pterodon e Taralea (Cardoso et al. 2012), conforme encontrado para a região matK deste presente estudo (Figura 1 e 2). Monopteryx foi classificado anteriormente próximo a Dussia, na tribo Sophoreae (Polhill 1981), por apresentar corola não papilionácea, onde as asas (pétalas laterais) são muito reduzidas e as pétalas da quilha (abaxiais) são intrínsecas, o que contrasta com as flores papilionáceas dos outros gêneros de Dipterygeae. Em contraste, Monopteryx e os demais gêneros de Dipterygeae apresentam os dois lobos do cálice superiores distintos e ampliados e os inferiores reduzidos a pequenos lobos (Pohlill 1981), sendo esta uma sinapomorfia morfológica. Além desta característica, os frutos de Monopteryx e Taralea são constituídos por valvas com deiscência elástica, já Dipteryx tem frutos drupáceos protegidos por um endocarpo lenhoso de difícil rompimento e Pterodon o fruto é uma criptossâmara, sendo está uma das características diagnóstica para os gêneros de Dipterygeae (Cardoso et al. 2012). Estes também podem ser distinguidos com base na morfologia foliar. Dipteryx e Taralea possuem raque foliar alada, sendo que Dipteryx possui nervura primária excêntrica. Pterodon e Monopteryx não apresentam tais características. Já as folhas de Dipteryx, Pterodon e Taralea são pinadas e de Monopteryx são imparipinadas (Francisco 2010).

CONCLUSÃO A filogenia inferida para os clados Amburana e Dipterygeae, baseada em marcadores moleculares trnL, matk e ITS confirmam o monofiletismo do gênero Amburana. O marcador matK mostrou melhor resolução entre os clados de

Papilionoideae, já os marcadores ITS e trnL não mostraram boa resolução entre esses clados, e Dipterygeae e Amburana aparecem como não monofiléticos. Neste estudo há uma amostragem mais ampla destes clados, incluindo táxons não amostrados numa mesma filogenia, mais espécies por gêneros estudados, e uma espécie nova de Amburana. O marcador nuclear aqui estudado, que não havia sido utilizado em outros estudos com estes clados.

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Apêndice 1. Lista das amostras utilizadas. As amostras estão representadas pelo nome e autor do táxon, coletor e número de coleta (sigla do herbário), o número do Banco de DNA do Jodrell laboratory.

Táxon: Voucher (Herbário), acessos Jodrell DNABank 1trnL, 2ITS.

Aldina heterophylla Spruce ex Benth.: Prance et al. 29956 (K), 1,243566. Amburana acreana (Ducke) A.C.Sm.: Farfán et al. 968 (K), 1,243556. M. Nee 34551(K), 1,243557. Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm.: Wood 10671(K), 1,243560. Amburana erythrosperma: Lewis & Andrade 2002(K), 1,243558. Lewis & Andrade 1876(K), 1,243559. Amburana sp.: Bridgewater 1011 (E) 1,29475. Cordyla madagascariensis R. Vig.: Du Puy, M. 755 (K), 29476. Dipteryx odorata Willd.: Pedroga 533 (K), 243573. Dipteryx panamensis (Pittier) Record & Mell: Pennington et al. 613 (K), 143572. Dussia mexicana (Standl.) Harms: Thomsen 579 (K), 239217. Mildbraediodendron excelsum Harms: Lye & Lye 24452 (K), 1,243571. Myrocarpus emarginatus A.L.B.Sartori & A.M.G.Azevedo: Wood, J.R.J. et al. 21245 (K), 1,233896. Myrospermum frutescens Jacq.: Hughes 761 (K), 1,243562. Myroxylon balsamum Harms: Pennington et al. 647 (K), 1,243565. Pterodon emarginatus Vogel: Lewis et al. 3838 (K), 243574.

CAPÍTULO 3. DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA AMBURANA CEARENSIS (FR. ALLEM.) A. C. SMITH (LEGUMINOSAE): ESPÉCIE AMEAÇADA DE EXTINÇÃO

(Esse artigo será submetido para publicação na revista Conservation Genetics Resources)

DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES PARA AMBURANA CEARENSIS (FR. ALLEM.) A. C. SMITH (LEGUMINOSAE): ESPÉCIE AMEAÇADA DE EXTINÇÃO

Elidiene P. Seleme • Alexandre M. Sebbenn • Wellington Fava • Ângela L. B. Sartori • Vidal F. Mansano

Elidiene P. Seleme Programa de Pós-graduação em Botânica, Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Rua Pacheco Leão, 915, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil.

Alexandre M. Sebbenn Instituto Florestal de São Paulo. Rodovia Luiz de Queiroz Km 149,5. CP 339, 13400- 970, Piracicaba, São Paulo, Brasil. Wellington Fava Laboratório de Evolução & Biodiversidade - LEBio - CCBS - UFMS, 79070-900, Campo Grande, MS, Brasil

Ângela L. B. Sartori Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Departamento de Biologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, CP 549, 79070-900, Campo Grande, MS, Brasil.

Vidal F. Mansano Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, DIPEQ. Rua Pacheco Leão 915, Jardim Botânico, Rio de Janeiro, RJ, 22460-030, Brasil.

RESUMO

Amburana cearensis é uma árvore hermafrodita de Leguminosae, que ocorre em floresta estacional semidecidual e decidual submontana e em floresta ombrófila densa, podendo ser encontrada até na Caatinga. Quatro marcadores microssatélites polimórficos foram isolados e caracterizados em 149 genótipos de A. cearensis em uma população de Porto Murtinho (Mato Grosso do Sul, Brasil). O número de alelos por locos variou de 05 a 13, com uma média de 7,5 alelos por loco. As heterozigosidades observada e esperada variaram 0,358-0,775 e 0,059-0,214, respectivamente. Esses marcadores microssatélites poderão ser utilizados em estudos genéticos, planos de conservação e ecologia ao longo da distribuição geográfica.

PALAVRAS CHAVE: Cerejeira • Conservação genética • Fabaceae • Polimorfismo

ABSTRACT

Amburana cearensis is a hermaphroditic tree of the Leguminosae, occurs in deciduos and semideciduous forests, in dense rain forest, which can be found even in the savanna and dry forest. Four polymorphic microsatellite markers were isolated and characterized in 149 genotypes of A. cearensis from one population of Porto Murtinho (Mato Grosso do Sul, Brazil). The number of alleles for each locus ranged from 05 to 13 with an average of 7,5 alleles per locus. The observed and expected heterozygosities ranged from 0,357-0,775 and 0,058-0,214, respectively. These microsatellite markers will be useful for assessing genetic studies, conservation management and ecological evaluations along the geographic distribution. KEY WORDS: Cerejeira • Conservation genetics • Fabaceae • Polymorphism

INTRODUÇÃO

Amburana cearensis é uma árvore que chega a atingir 10m de altura nas regiões da Caatinga e até 20m em matas fechadas (Lorenzi 1992). Conhecida popularmente como cerejeira, imburana de cheiro, cumaru de cheiro, e por suas qualidades madeireiras, tem sido amplamente explorada nos locais de ocorrência, empregada em movelaria fina, esculturas e marcenaria em geral, estando listada como espécie ameaçada de extinção (Hilton-Taylor 2000). A espécie também apresenta propriedades medicinais, sendo a casca da árvore e as sementes utilizadas no tratamento de doenças respiratórias, como tosse, asma, bronquite e também coqueluche (Berg 1986). Amburana cearensis apresenta ampla distribuição geográfica na América do Sul (Argentina, Bolívia, Brasil e Paraguai), ocorre em floresta estacional semidecidual, restrita aos afloramentos rochosos ou calcários; em floresta estacional decidual submontana; em floresta ombrófila densa (Floresta Atlântica), podendo ser encontrada tanto na Caatinga, onde é frequente, como em região chaquenha. A sua ocorrência no Cerrado e no Pantanal restringe-se às manchas de florestas estacionais de afloramento calcário e suas zonas de transição com o Cerrado sensu stricto em áreas bem drenadas e de moderada a elevada fertilidade (Mendonça et al. 1998).

O Chaco ocorre nas planícies do norte da Argentina, oeste do Paraguai, sudeste da Bolívia e no oeste do Brasil, totalizando 800.000 km2 de extensão na América do

Sul. É caracterizado por uma formação vegetacional savânica, xeromórfica e de florestas úmidas, caducifólias, micrófilas e espinescentes, geralmente associada a solos salinos, originários da erosão de recente soerguimento dos Andes (Prado 1993a). Apresenta uma região seca, ao oeste, e outra úmida, ao leste, o que determina sua variação florística (Ramella and Spichiger 1989; Lewis 1991). No Brasil ocupa uma área com cerca de 70.000 km2 e situa-se na sub-região do Pantanal de Porto Murtinho (Abdon and Silva 2006), sendo área única em território brasileiro. A região de Porto Murtinho é descrita como uma área de elevada importância biológica (Ministério do Meio Ambiente 2002), porém há grande ação antrópica pelo avanço das fronteiras agrícolas. E não existem Unidades de Conservação (UCs) para preservar a diversidade das espécies contidas no bioma.

Dentro deste contexto, A. cearensis por seu reconhecido valor comercial merece ser investigada em termos de diversidade genética. Atualmente sabe-se que a fragmentação florestal pode reduzir a diversidade genética e o tamanho efetivo e aumentar a taxa de autofecundação, a endogamia, a estrutura genética espacial intrapopulacional e isolar reprodutivamente populações (Hall et al. 1994; Bittencourt and Sebbenn 2007; Aguilar et al. 2008, Sebbenn et al. 2011). A diversidade genética tem grande importância na conservação de espécies ameaçadas e na manutenção de suas populações ao longo do tempo (Frankham 1995) e um modo de se avaliar essa diversidade é através do uso de marcadores moleculares.

Os marcadores moleculares são utilizados para estudos de sistemática molecular, diversidade genética, sistemas de reprodução, distribuição espacial de genótipos, fluxo gênico. Uma das técnicas mais indicadas para análises populacionais é estudar os polimorfismos entre sequências de DNA ou SSR (Simple Sequence Repeats – Repetições Simples de Sequências) ou microssatélites (Litt and Luty 1989; Weber and May 1989), que são repetições em sequência de um a seis nucleotídeos, encontrados em todos os procariotos e eucariotos estudados até o momento (Zane et al. 2002). Os microssatélites vêm sendo muito utilizados para responder várias perguntas relacionadas à genética de populações, como os citados acima, os quais são essenciais para a adoção de medidas de conservação.

O objetivo deste estudo é desenvolver primers para microssatélites para Amburana cearensis, e que possam eventualmente ser empregados em estudos de genética de populações, bem como transferibilidade para as espécies congenéricas.

MATERIAL E MÉTODOS 1. Coleta de Material Botânico - Os indivíduos de A. cearensis foram amostrados em um fragmento florestal de Chaco no município de Porto Murtinho, Mato Grosso do Sul. Como a densidade populacional nesse fragmento é baixa, foram avaliadas todas as árvores adultas reprodutivas e todas as plântulas deste fragmento. Também foram coletadas sementes de polinização aberta de árvores matrizes as quais foram germinadas. Foram amostrados 149 genótipos, sendo 22 indivíduos adultos, 18 plântulas e 109 sementes coletadas de quatro árvores matrizes de A. cearensis. Os indivíduos adultos e regenerantes coletados foram georreferenciados (GPS) e amostras de folhas foram armazenadas inicialmente em sílica gel e, posteriormente depositadas em freezer a -80°C.

1.2 Extração de DNA e Construção dos bancos de Microssatélites - A extração de DNA foi realizada através do uso da técnica CTAB (2%), descrita por Doyle and Doyle (1990). A construção da biblioteca enriquecida em microssatélites foi efetuada de acordo com a metodologia proposta por Billotte et al. (1999). O DNA foi digerido com enzimas de restrição Rsal e os fragmentos de DNA resultantes foram ligados a adaptadores Rsal de corte frequente objetivando a obtenção de fragmentos de 280 a 600pb. Logo, foram selecionados os fragmentos com microssatélites por meio da hibridização de tais fragmentos com oligonucleotídeos biotinilados complementares a sequências repetitivas (CT)8 e (GT)8 e posterior recuperação por partículas paramagnéticas “Streptavidina MagneShere” (Promega, Fitchburg, WI, EUA), tal como indicado pelo fabricante. Dos fragmentos recuperados, foram construídas as bibliotecas genômicas enriquecidas em microssatélites de Amburana cearensis. Os fragmentos selecionados foram amplificados por PCR usando os adaptadores (Rsa21 5’-CTCTTGCTTACGCGTGGACTA-3’ e Rsa25 5’- TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA-3’) e, em seguida, clonado no vetor pGEM T-Easy (Promega). Os plasmídeos foram introduzidos em Escherichia coli XL1-blue eletrocompetentes e as células transformadas foram cultivadas em placas de ágar contendo 100 ug ml-1 de ampicilina (Sigma, Alemanha), 50 ug ml-1 X-galactosidase e

isopropyl b-D-1-thiogalacto7 pyranoside (IPTG) (MBI Fermentas, Glen Burnie, MD, EUA). Um total de 96 clones positivos foram bidirecionalmente sequenciados em sequenciador automático ABI 377 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems) usando primers T7 e SP6 e o kit de sequenciamento Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems).

Foram desenhados oligonucleotídeos complementares às sequências flanqueadoras dos microssatélites utilizando-se o programa Primer Select (DNAStar

Inc.) seguindo os seguintes critérios: primers com no máximo, 27 pb; Tm maior ou superior a 46ºC e com concentração de sal de 50 mM, para assegurar a amplificação específica e abrangente; foi tolerada uma diferença de 3ºC as Tm entre os oligonucleotídeos de um mesmo par de primers, conteúdo de GC entre 40 e 60%, e observou-se total ausência de complementaridade entre os primers do mesmo par; observaram-se os limites de tamanho dos produtos obtidos após amplificação por PCR entre 100 e 330 pb, afim de garantir uma fácil diferenciação dos alelos em géis de poliacrilamida corados com prata ou em eletroforese capilar.

As demais extrações de DNA genômico da população foi realizada com auxílio de Kit de Extração da NucleoSpin® Plant II (Macherey-Nagel), seguindo o manual de instruções.

1.3 Polimorfismo e Genotipagem - Para cada SSR, os primers Foward foram sintetizados com a cauda de M13 - 19 pb (5'-CACGACGTTGTAAAACGAC-3') seguindo o método de Schuelke (2000), que envolveu três primers: um primer Foward específico do SSR com a cauda de M13, um primer Reverse específico, e um primer marcado M13 universal com um dos quatro corantes fluorescentes (6-FAM, VIC, NED e PET; Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Todas as amplificações por PCR foram realizadas num termociclador Veriti® (Applied Biosystems) contendo um total de 10 l em reações 10ng de DNA, 1x de tampão Taq, 2 mM de MgCl2, 200 M de dNTP , 1 pmol primer foward, 4 pmol de primer reverse, 0,4 pmol do primer universal de M13, e 0,5 U de Taq DNA polimerase (GoTaq; Promega, Madison, WI, EUA). Inicialmente testou-se o programa de amplificação TouchDown para todos os locos: 95°C durante 3 min, 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 58°C decrescendo para 48°C a 1°C por ciclo durante 30 s, 72°C por 30 s, seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30 s , 48°

C por 30 s , e 72°C durante 30 s, e concluindo com 10 min a 72°C. Para os locos para os quais não foi possível realizar a amplificação por TouchDown, aplicou-se diferentes temperaturas de anelamento para verificar a mais adequada. As temperaturas de anelamento foram testadas em sistema de gradiente, avaliando-se três temperaturas para cada primer nas seguintes condições: 95°C durante 3 min, 35 ciclos de 94°C durante 30 s, 30 s na temperatura de anelamento (variando de 60°C a 64°C), 72°C por 30 s, e concluindo com 10 min a 72°C. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose. A genotipagem dos alelos microssatélites foi realizada utilizando ABI3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems; Macrogen - Seul, Coreia do Sul) e comparado com um marcador de peso molecular de GS500 LIZ (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) utilizando GeneMarker DEMO versão 1.97 (SoftGenetics, State College, PA, EUA). 1.4 Análise estatística dos dados - A diversidade genética intrapopulacional foi caracterizada pelos índices: número médio de alelos por loco ( A ), número efetivo de alelos por locos ( Ae ), heterozigosidade observada ( H o ) e heterozigosidade esperada segundo as proporções do equilíbrio de Hardy-Weinberg ( H e ). O número de alelos e heterozigosidades esperada e observada foram analisados com o software MSA 4.00 (Dieringer and Schlötterer 2003). O programa Genepop 4.1 (Raymond and Rosset 1995) foi utilizado para testar o desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Frequências dos alelos nulos foram calculadas de acordo com Brookfield (1996) para a população, usando o software Micro-Checker versão 2.2.3 (van Oosterhout et al. 2004).

RESULTADOS E DISCUSSÃO Quarenta e cinco por cento dos clones continham motivos microssatélites com mais de cinco repetições e regiões flanqueadas adequadas para o desenho do primer, e foi possível identificar 63 microssatélites e destes desenhar e sintetizar 33 primers para A. cearensis, já que alguns se apresentavam no início ou no final das sequências, impossibilitando o desenho (Tabela 1).

Loco Sequências de nucleotídeos dos primers (°C) Motivos Tam. (pb) F: GGAAACAATTAAAAGAATATCTGAAAG Ac1 51.0 (GT)27 242 R: CTGTTCAGAAATGGTAAGCCC F: ATATGTAGGGCCACCAGGAGAA Ac2 54.2 (TG)11 286 R: AGGTCGTTGAAGAAGTTTAGAGCA F: TTGCTGGTTCTAAGGTATCTCCC Ac3 53.4 (TC)6 317 R: GCCCAGGCATCAAGTATGTG F: CTTGCCTTGATCTCTGCTGTG Ac4 52.5 (AC)6(ACAC)3 200 R: GGGAAACCTGAACCGAACTAAA F: GCCGGTTGCATTTACTGA Ac5 49.2 (TG)8 225 R: GCATATCACATATTTCACTCCAG F: TCGGCCCTCTGGTTTTTGT Ac6 54.4 (TTTA)4 335 R: GGGGGAGTATGATGTCTTCGTC F: GTTGCCTAATGATTCTACTCTTC Ac7 46.6 (CT)17 264 R: CAATAAATGGTTGAAATAATAGC F: TGCATTTGTTGACTCACTCTTTG Ac8 52.2 (TG)10 331 R: CACCACCTGCTTTTCTTTATTTT F: AATTCAAGCAAATCCACAAAAGT Ac9 51.7 (AC)8 318 R: AGCGCTAACCTTCCCACAC F: GGCTTTAAACCCAGTGATGCT Ac10 52.7 (CA)8 290 R: TAGTAGTTTGTTTTTGGTGGCTGTAT F: ATCTCTTTTGTTATTTCGTCCAGTTA Ac11 52.1 (TAAT)3 248 R: ACGTCTTGTATGTTGATGTTTTCTTG F: GGGGCTGTCCTGAGAAGAG Ac12 53.8 (CA)12 200 R: AAAAGGAGTAAGAGATGCCACAAATA F: GTTTGCAGCACTACCCACTCAC Ac13 53.8 (TC)9 254 R: ATCCCCTAATCAATCTCCATCTTT F: CCCCAAACAAAACCCTTCC Ac14 53.2 (TG)7 138 R: AGTGGCAATTGTGTCTCTATCTCTC F: AGCTTTGCGATTCGGTCTCTTCC Ac15 59.7 (TC)14 218 R: ATTTCCACAGCCGCATTAGTTTCATT F: TCTCTGGGTTTTCCTTCTTTT Ac16 49.2 (AC)9 289 R: CTGTTCTGGGATCTTAGTTCG F: GCTTGTATAACTTCTTTTTCTGG Ac17 47.2 (AG)15 304 R: TATTTGTATGCTTATTTGTATTTGAT F: AAGGCCCGAGTTATTTGTGATG Ac18 54.8 (TG)8 252 R: CCTGCTTTCTGCGGTTTTTG F: GGACTACCCCACCCATCTT Ac19 50.0 (CA)7 329 R: ATCAAATTAATACAAACCAACCAA F: AGCTTTTTCTTCCTCCTCCTTTTT Ac20 54.6 (AC)10 218 R: ACCTTTCCTTAGTGGGCAGACC 90

F: TGCTGTACGCGTGGGACTA Ac21 52.4 (AC) 262 R: GCTCGTGCTTGACTTGTAACTC 10 F: ACCATCTTTCTCTGTGCCTCCTT Ac22 55.0 (GT) 228 R: AATTATTCCGATGTTCCCTTTTGA 8 F: TTCTTCATGACAGCTGCAGGACCAAC Ac23 62.3 (TTG) 130 R: AACAGCAACAACAGCCGCAAAAGAGA 4 F: ACTAGTGATTCTCTTGCTTACGC Ac24 49.5 (TTAAT) 277 R: GAAGTCCATCTTTCACTTTCCTA 3 F: TATCAGTTGGGTATGGCTCTTA Ac25 48.7 (AC) 198 R: TTATCTCAAAACCTGGACTTCA 9 F: TGCGCACGCCTCCACA Ac26 56.0 (TTTAT) 314 R: TTACACCATCATACTATCCCACCATTA 3 F: TGCCCACCAATGAAAATAAC Ac27 50.0 (TG) 229 R: GCAGTAGCACGGACAGGAG 7 F: GCCAAAACCATAGGAGCACAG Ac28 53.8 (TC) 253 R: GAGAGAGAGGAAGGGCAATGAT 8 F: GCCAAATCCTCAAATGCTTATG Ac29 53.2 (AC) 143 R: CTCTTTCTCCGTCTTTCCACAA 10 F: CTCTTGCTAACGCGTGGACTAA Ac30 54.1 (CT) 259 R: AATGAGAATGTTTTGGGGTTGTAAT 12 F: CCTATGTTGTGGGTTTCTTTGTTA Ac31 52.1 (AC) 173 R: ACGCATTACGGCACTTTTTC 7 F: CCGGGTCTCCTGGTTAGA Ac32 49.5 (AC) 242 R: AAAAAGGGTGGGTTCTGG 11 F: CTCTCTTTCTCTACACTATTTCACTG Ac33 48.0 (GT) 287 R: ACTTCTGTTTCTGCTCGTCAA 15

Vinte e nove marcadores microssatélites foram amplificados com sucesso por PCR, sendo que destes, quatro foram polimórficos. O número de alelos variou entre estes quatro locos de 05 a 13, com uma média de 7,5 e totalizando 30 alelos. As heterozigosidades esperada e a observada variaram de 0,358 a 0,775 e 0,059 a 0,214, respectivamente (Tabela 2). A heterozigosidade observada é uma medida da diversidade genética que estima o quanto desta diversidade há em uma população e como os alelos estão organizados nos genótipos. Os quatro locos mostraram desvios significativos do equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) (p < 0,05). Tal desvio do EHW pode ter sido causado pela presença de alelos nulos (Tabela 2). A frequência estimada de alelos nulos

foi alta nos locos, variando de 0,182 a 0,431. Alelos nulos são alelos que consistentemente não são amplificados na PCR, e, portanto, não são detectados quando os indivíduos são genotipados. Tais alelos são originados em geral por mutações no sítio de anelamento de pelo menos um dos primers e/ou na região amplificada do microssatélite. A consequência é a detecção errônea de maior quantidade de genótipos homozigóticos do que realmente existe em uma população (Aldrich et al. 1998; White et al. 1999). Em locos microssatélites, a ocorrência de alelos nulos pode causar desvios fictícios do EHW e, portanto a conclusões incorretas sobre a diversidade genética das populações. Alelos nulos têm sido encontrados em mais de 25% dos locos de microssatélites, chegando a atingir frequências superiores a 15% (Jarne & Lagoda 1996). Contudo, é importante ressaltar que estimativas de alelos nulos pelo método de Brookfield (1996) podem ser errôneas, visto ser baseada em parte nos desvios do EHW e poder ser aplicado apenas quando não existem dados perdidos na amostra (Kalinowski and Taper 2006). Estimativas confiáveis na freqüência de alelos nulos só podem ser obtidas utilizando-se estrutura de progênies e análise de segregação.

Outra causa para os desvios observados do EHW pode ser a existência de endogamia advinda de autofecundações e cruzamentos entre indivíduos parentes. Esta é uma explicação plausível para a amostra visto que a autofecundação pode desencadear a depressão por endogamia, caracterizada por mortalidade, perda de fertilidade, má formação das plantas, ocorrência de albinismo, etc. Durante a etapa de germinação das sementes foram detectadas plântulas albinas e poucas matrizes frutificaram no período de quatro anos (apenas quatro). A causa desta endogamia pode possivelmente ser atribuída a fragmentação florestal da população em estudo, sendo composta atualmente por apenas 22 indivíduos adultos reprodutivos.

Alternativamente, outra explicação plausível para os desvios do EHW é o efeito de Wahlund, causado pela mistura de diferentes gerações da população (adultos, regenerantes e sementes). Este fenômeno causa um aparente excesso de homozigose devido à mistura de amostras de diferentes gerações de uma população ou mistura de populações ou subpopulações na análise.

Tabela 2. Descrição dos quatro microssatélites desenvolvidos para Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae). Ta = Temperatura de anelamento; A = Número total de alelos em uma amostra de

16 indivíduos; Ho e He = heterozigosidades observada e esperada. Todos os locos apresentaram desvio significativo de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (P < 0.05).

Null Repeat Null allele Locus Primer sequences (5' - 3') T (°C) Size (bp) A H H allele motif a o e frequency presence F: GGAAACAATTAAAAGAATATCTGAAAG Ac1 (GT)27 58-48 160-302 13 0.196 0.773 yes 0.356 R: CTGTTCAGAAATGGTAAGCCC

F: CCGGGTCTCCTGGTTAGA Ac32 (AC)11 58-48 164-261 7 0.192 0.358 yes 0.181 R: AAAAAGGGTGGGTTCTGG

F: GCCGGTTGCATTTACTGA Ac5 (TG)8 58-48 164-260 5 0.214 0.680 yes 0.299 R: GCATATCACATATTTCACTCCAG

F: AGCTTTGCGATTCGGTCTCTTCC Ac15 (TC)14 58-48 151-254 5 0.059 0.775 yes 0.431 R: ATTTCCACAGCCGCATTAGTTTCATT

CONCLUSÕES

Foram identificados 33 locos microssatélites e destes 29 amplicaram, que poderão ser utilizados em investigação da estrutura populacional, variabilidade genética, ecologia ao longo da distribuição geográfica, filogeografia de Amburana cearensis e outras espécies do gênero. E as informações geradas poderão ajudar na conservação da flora e na elaboração de planos de manejo para a preservação da espécie, que encontra-se ameaçada de extinção e em pequenas populações.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CONCLUSÕES GERAIS

A revisão taxonômica das espécies de Amburana ampliou o conhecimento sobre a diversidade do gênero e atestou três espécies, sendo uma nova para a ciência (A. erythrosperma). Amburana apresenta distribuição sul-americana, ocorrendo na Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai e Peru. Amburana cearensis é uma das espécies típicas que representa distribuição do padrão do arco pleistocênico descrito por Prado & Gibbs (1993). Amburana acreana ocorre no norte no Brasil, Bolívia e Peru. E A. erythrosperma é endêmica da Bahia.

Características quanto ao número e dimensões dos folíolos, inflorescências laxas vs congestas, coloração das pétalas (branco-esverdeadas vs amareladas-róseo), a presença ou ausência de endocarpo membranoso, coloração das sementes (nigrescentes vs vermelhas) se mostraram diagnósticas para as espécies de Amburana.

As regiões de cpDNA matK e trnL se mostraram informativas para inferências filogenéticas sobre as relações supragenéricas e infragenéricas em Amburana. O monofiletismo do gênero foi confirmado nas análises bayesiana e de máxima parcimônia com as regiões aqui estudadas, matK, trnL e ITS. Apesar do marcador DNA nuclear ITS ter mostrado menor resolução para os clados Dipterygeae e Amburana e nas análises combinadas também não ter sido bem resolvida as relações supragenéricas e infragenéricas. Contudo, os resultados corroboraram o monofiletismo do gênero Amburana e dos clados Amburana e Dipterygeae como apontado por Cardoso et al. (2012).

Neste trabalho foram desenvolvidos 33 pares de primers para loci de microssatélites isolados de Amburana cearensis. Informações importantes que servirão de base para outros estudos de genética de populações e taxonomia, dentre outros. Este estudo abre a perspectiva de diferentes trabalhos dentro do gênero Amburana com a disponibilização de primers para amplificação de microssatélites que são ferramentas potenciais para aplicação em estudos de variabilidade e taxonomia. Além dos loci de microssatélites caracterizados neste trabalho, outros microssatélites foram isolados e podem ser utilizados em estudos de parentesco.

A frutificação irregular dificultou a realização de estudos com a progênie. No período de estudo, apenas quatro indivíduos, dos 22 adultos, frutificaram. Os 97

microssatélites caracterizados neste trabalho podem ser utilizados em estudos de parentesco para estimativas diretas do fluxo gênico (por pólen ou sementes) e de tamanhos de vizinhanças genéticas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Prado, D.E. & Gibbs, P.E. 1993. Patterns of species distributions in the dry seasonal forest South America. Annals of the Missouri Botanic Garden 80: 902-927.

ANEXOS

I) Normas editoriais dos periódicos

Phytotaxa ISSN 1179-3155 (print); ISSN 1179-3163 (online)

Type of Manuscripts

Based on their length, three categories of papers are considered:

1) Research article

Research articles are significant papers of four or more printed pages reporting original research. Papers between 4 and 59 printed pages are published in multi-paper issues of ca. 60 pages. Monographs (60 or more pages) are individually issued and bound and will receive ISBN numbers as well as being part of the Phytotaxa series.

Phytotaxa encourages large comprehensive taxonomic works. There is no upper limit on the length of manuscripts, although authors are advised to break monographs of over 1000 pages into multi-volume contributions simply because books over 1000 pages are difficult to bind and too heavy to carry.

Short papers on species of economic, environmental or phylogenetic importance may be accepted at the discretion of editors, who will generally encourage and advise authors to add value to the paper by providing more information (e.g. key to species of the genus, biological information, ecology, etc.). Papers of 4 or 5 pages accepted for publication may be shortened for publication in the Correspondence section.

2) Correspondence

Manuscripts of one to four pages are welcome. We can publish these fairly rapidly because they are useful to fill blank pages in multi-paper issues. Phytotaxa publishes the following six types of correspondence:

· 1. Opinions and views on current issues of interests to systematic botanists.

· 2. Commentaries on or additions/corrections to papers previously published in Phytotaxa or elsewhere.

· 3. Obituaries of botanists.

· 4. Taxonomic/nomenclatural notes.

· 5. Book reviews meant to introduce readers to new or noteworthy taxonomic works (interested authors/publishers are advised to contact the editor before submitting books for review; editors then prepare the book review or invite colleagues to write the review; unsolicited reviews are not usually published).

· 6. Short papers converted from manuscripts submitted as research articles but too short to qualify as such.

These short contributions should generally have no more than 20 references (exceptions may be considered), and the total length should not exceed four printed pages. Neither an abstract nor a list of key words is needed; major headings (Introduction, Material and Methods, etc.) should not be used, except for new taxon headings and References. A typical correspondence should consist of (1) a short and concise title, (2) author name, affiliation, address and e-mail address, (3) a series of paragraphs being the main text, and (4) a list of references (if any). The first or last paragraph may be a short summary.

Commentaries on published papers are intended for scholarly exchange of different views or interpretations of published data and should not contain personal attack; note that authors of the papers concerned may be invited to reply to comments on their papers.

3) Monographs, floras and other articles of more than 60 printed pages

Appear in book-form with their own ISBN number. They may be different from the standard formatting when the author provides reasonable arguments for doing so. Please consult the editor in such cases.

Special issues

Special issues with collected papers on a selected topic in the scope of the journal are also published. Potential guest editors should send a proposal to the chief editor for approval and instructions. Although guest editors for special issues are responsible for organizing the peer review of papers in these issues, they must follow the style of Phytotaxa (as laid out in this author guide) and peer review procedures. If any papers by the guest editors are to be included in the special issue, these papers must be handled by editors/colleagues other than the editor(s) involved. Special issues must be 60 or more pages. Funding may be required to offset part of the production costs. Author payment for Open Access is strongly encouraged. Reprints can be ordered for the entire issue or for individual papers.

Preparation of manuscripts

General

Please read the guidelines below and additionally consult a recent article published inPhytotaxa and follow the style therein.

Language. The article has to be written in British or American English throughout the manuscript. Authors whose native language is not English are encouraged to ask colleagues familiar with the field of research and fluent in English (preferably a native speaker) to correct the language in the manuscript before submission. An article may be returned to the author without review if the language is not of an acceptable standard.

The author is also responsible for the correct usage of other languages, be it a Latin diagnosis or an abstract in a foreign language. The grammar of texts in foreign languages needs to be checked by the author before submission, and again after review if the English from which it is translated (e.g. an abstract) has changed. Latin scholars who are consulted for the correcting of diagnoses should be acknowledged.

Metric mearures should be used. Please use the common font Times New Roman, 12 pt and as little formatting as possible (apply only bold and italics where necessary and indent paragraphs except the first). Special symbols can be used but need to be carefully checked by the author at proof stage, because they may be altered due to incompatibility of files.

Hyphens ‘-’ are used to link words such as personal names, topographical names, some prefixes and compound adjectives that could otherwise be confused (examples: well-established, 5-sided, Kingston- upon-Thames, Kingdon-Ward, co-operation, etc.).

100

En-dash or en-rule ‘–’ (a dash the length of the letter ‘n’') should be used for ranges or spans. In the context of Phytotaxa it is mainly used for ranges of numbers, most frequently size ranges, elevational ranges, dates and page numbers (e.g. 500–1000 m, 1–3 May, 1976–1977, figs 5–7). Remember also to apply them in the reference section for ranges of volumes, years and pages. The en-dash is also used in name associations ( e.g. a Federal–State agreement) and in phenology (e.g. flowering May–September).

Em-dash or em-rule ‘—’ (the length of the letter ‘m’) is used infrequently; they are used for breaks in the text or subject. In contrast to parentheses an em-dash can be used alone; e.g. “What could these results mean—that John discovered the meaning of life?” Em-dashes are also used after a subheading, for instance:

“Type:—BRAZIL . Paraná: Ponta Grossa, Furnas Gêmeas, remnant Araucaria forest below large sandstone cliff, 25.145°S, 049.958°W, 950–1000 m, 16 February 2008, Christenhuszet al. 4790 (holotype SP!, isotypes K!, MBM, NY!, P!, TI, TUR!, UC!, UPCB).”

Exclamation mark ‘!’ is used to indicate after the herbarium acronym to indicate that this voucher specimen has been seen by the author (see above).

Multiplication or times sign ‘×’. The multiplication sign × is not to be confused with the letter x. It should always be used in hybrid taxa (e.g. Equisetum × schaffneri) and in measurements of length and width (of leaves or petals, for example), for example: “leaves 1.0–4.2 × 0.4–0.8 cm”.

Dashes and hyphens should not be spaced. Please feel free to copy these symbols from this author guide and paste them into your manuscript. Using the correct symbols will speed up the editing process. Editors may return the manuscript to the author if dashes, hyphens and multiplication signs are not correctly used.

Italicisation. Generic names and all ranks below are italicised. Book and journal titles are also in italics, as well as diagnoses in Latin and Latin abbreviations (such as sp. nov., comb. nov., nom. illeg., et al.). “subsp.”, “ser.”, “var.”, “cv.” and “f.” (for forma or filius) are not italicised, nor are names above the rank of genus. The abbreviation “ssp.” should be avoided and replaced by “subsp.” (for subspecies) to prevent confusion with the abbreviation spp. (= species in plural). As a general rule abbreviations are discouraged.

Abbreviations of certain words are standardised: ca. = circa, m = meter, cm = centimeter, dbh = diameter at breast height, elev. = elevation (altitude is not used for heights of land surfaces above sea level; altitude is used for heights above the earth surface, e.g. of an airplane), sp. nov. = new species, comb. nov. = new combination, gen. nov. = new genus, subsp. = subspecies, sect. = section, pers. comm. = personal communication, etc. Herbarium acronymsfollow Index Herbariorum http://sweetgum.nybg.org/ih/

Citation of author names

Author abbreviations are seldom used (generally only for basionym authors and new taxa proposed in the manuscript); they are generally cited fully in the references. This means that the name is not abbreviated but the surname is written in full, followed in brackets by the year of publication, a colon, and the page number of the page where the name was published. This is treated as a normal citation, and thus the full article in which the species was published has to be cited in the references. (Include full title of the article, full journal title and full page range.) This is obligatory for all taxonomic articles and articles in which fewer than 30 taxa are mentioned. In articles that deal with a larger number of species (such as ecological or phylogenetic studies or checklists) this is not encouraged because it is impractical. If uncertain, please contact an editor about this matter.

Author abbreviations (strictly following IPNI) are only used in larger monographs and checklists, but even in these articles names in introductions and running text are properly cited in the references. Taxon author names should be cited only once, when the taxon/species first appears in the

101

text. Phytotaxa aims to have all taxonomic sources cited included in the reference section. Citation of species authors is as follows:

· Hymenophyllopsis asplenioides A.C.Sm. in Gleason (1931: 302). Smith is abbreviated here because it is published in Gleason, which is the proper article to cite.

· Cyathea asplenioides (A.C.Sm.) Christenhusz (2009: 39). Smith is abbreviated here because the basionym is already given above.

· Cyathea gibbosa (Klotzsch 1844: 542) Domin (1929: 262). Both the basionym and new combination are cited because the basionym is not given above.

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Klotzsch, J.F. (1844) Beiträge zu einer Flora der Äquinoctial-Gegenden der neuen Welt, Filices. Linnaea 18: 525–556.

Deposition of voucher specimens and GenBank numbers

Authors of new taxa are required to deposit type specimens in national or international public museums or collections, preferably ones listed in the Index Herbariorum that are provided with a corresponding acronym.

Authors are also advised to request registration numbers of deposited sequences in GenBank in advance of the submission of papers to avoid unnecessary delay of publication. Descriptions of species can also be linked to other sources such as the Encyclopedia of Life. For fungi MycoBank numbers need to be provided.

Some countries (e.g. Australia, Brazil, Peru) require that primary type specimens (holotypes) be deposited in collections in the country of origin; authors are advised to take this into consideration.

Geography and elevation

Please apply the word ‘elevation’ when dealing with geological features. ‘Altitude’ is here defined as the distance above the surface of the Earth, whereas ‘elevation’ applies to the height of an earth surface above sea level.

For country names (always capitalised in specimen citations) and provinces (followed by a colon), the standard spellings in English followed by the UN apply (e.g. Kyrgyzstan notKirghizia , Madagascar not Malagasy Republic etc.). For a standard list of countries and areas see: http://unstats.un.org/unsd/methods/m49/m49alpha.htm. Exceptions may be discussed with the editor.

Title

The title should be concise and informative and should cover the content of the article. No author names of taxa are given in the title. Family names should always be included. The higher taxa containing the

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taxa dealt with in the paper (when appropriate) should be indicated in parentheses, example: A taxonomic revision of the genus Aa (Cranichidae, Orchidoideae, Orchidaceae).

Names and affiliations of article author(s)

Names of all authors must be given below the title and should be typed in upper case (e.g. ADAM J. SMITH, BRIAN SMITH & CAROL SMITH). Inclusion of all major contributors to the work should be considered.

Below the names, the address(es) of professional affiliation for each author should be given in italics each starting on a separate line. E-mail address(es) should be provided if available. Affiliation addresses are linked to the author names by numbers in superscript and are provided in corresponding order.

Abstract

The abstract should cover concisely contents of the paper and should be phrased such that additional key words are not necessary. Any new names or new nomenclatural acts proposed in the article should be mentioned. No taxon author names are to be included in the abstract. Introductory information should not be included in the abstract, neither should be the citation of references.

Abstracts in other languages using the Latin alphabet may also be included in addition to English and should be a direct translation of the English abstract. The spelling and grammar of these abstracts in other languages is the responsibility of the author. An abstract in another language should be corrected if there are any changes in the English abstract during the editorial process.

Key words

Key words may be given when the abstract does not already cover these. The key words may not include words that are already in the title, and they should be given in alphabetical sequence.

Abstracts and key words are not included in short Communications.

Introduction

The introduction should place the study in context, and it should provide recent or historical background relevant to the study. This information should not be included in the abstract. Author names of a taxon should be cited only once, when the taxon/species first appears in the text.

Material & Methods

Materials and methodology used in empirical studies should be concisely provided. Herbaria consulted can be listed here, if not done so in the Acknowledgements. Field work should be highlighted. Floras and other taxonomic works consulted to identify the plant material involved in a study should be cited.

Results

The results section should only present the results of the study. Do not mix results and discussion. Combined Results/Discussion sections are discouraged. Citations of other literature are not normally permitted in the Results section.

Discussion

Discuss your results and place these in the context of the introduction.

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Conclusion

The conclusion should state what the scientific contribution of your study is (ask yourself the question: ‘What can we learn from this study and how do the results help us to understand the questions asked in the introduction and discussion?’). It is helpful for other researchers to point out further studies that may be needed in the future.

Taxonomy

A taxonomy section should start with each taxon in bold italics. Abbreviations of authors ofnew species should be given (following IPNI, not bold), and these should be followed by the correct designation (in italics, not bold, e.g. comb. nov., nom. nov., spec. nov., stat. nov., etc.). When species are not newly described, the author names should be followed by the year and page of publication (and the full article should be included in the references).

All new taxa need to be accompanied by short diagnoses in English or Latin that describe the new taxa. If you prefer Latin, please make sure the language is used correctly. The editors will generally not correct your Latin diagnoses. A specimen needs to be designated as its type (following the ICBN), and the holotype must have been studied by the author of the species. It is encouraged that, when possible, the holotype is deposited in the country of origin, and that two or isotypes are deposited in major herbaria where the specimens will be available for public study.

Taxonomic descriptions should be organised describing the plants from below to above and from outside towards the inner parts. Of course, this is different for each taxon and can thus follow a variable. Subsections of descriptions can be highlighted using italics. Additional data (e.g. distribution, ecology, etymology, etc.) may follow. Often these are subheaded by ‘:—‘ (m-dash).

Specimens are cited as follows:

COUNTRY. Province: Locality, elevation, coordinates, date (day month (in full) year),Collector number (herbarium acronym in upper case). All specimens studied should be cited. Lectotypes, neotypes and epitypes should always be followed by the reference where they are designated, for example:

Lectotype (designated by Smith 2000/designated here):—FINLAND . Uusimaa: Helsinki,Kaisaniemi Park, 27 April 1976, Virtanen 22 (H!).

Keys

Identification keys should be dichotomous, and the leads should (preferably) be opposite to each other in meaning so that the species can be easily distinguished. Please do not format the key; provide it in the following simple layout:

1. Bracts longer than pedicels; filaments with 1 acute lobe at apex on either side of anther …Ornithogalum nutans

- Bracts shorter than pedicels; filaments without apical lobes on anther ... 2.

2. Inflorescence corymbose; tepals longer than 14 mm ... Ornithogalum angustifolium

- Inflorescence racemose; tepals shorter than 14 mm ... Ornithogalum pyrenaicum

Acknowledgements

The format for the Acknowledgements is variable, and anyone can be thanked for their contribution. Please consider co-authorship for people that contributed to the study in a major way, especially contributors of specimens or laboratory work. 104

References

All literature cited in the text (including full articles of taxon authors) should be included. Please check this carefully before submission because errors are common. References should be cited in the text as Smith (1999), Smith & Jones (2000) or Smith et al. (2001), the latter when there are three or more authors, or alternatively in a parenthesis (Adams 2000, Smith & Jones 2000, Jones 2001, Smith et al. 2001). The citation of floras, revisions and monographs used to identify the collections on which the study is based is strongly encouraged.

Please include DOI for papers that have these. This facilitates linking to papers that have online versions.

Journal article: Author, A. & Author, B.C. (YEAR) Title of the paper. Title of the journal in full in italics volume: x–y. For example:

Christenhusz, M.J.M., Zhang, X.-C. & Schneider, H. (2011) Linear sequence of extant families and genera of lycophytes and ferns. Phytotaxa 19: 7–54.

Book chapter: Author, A. & Author, B.C. (YEAR) Title of the chapter. In: Author, A., Author, B.C. & Author, D. (eds.) Title of book in italics. Publisher name, City, pp. x–y. For example:

Schneider, H., Kreier, H.-P., Janssen, T., Otto, E., Muth, H. & Heinrichs, J. (2010) Key innovations versus key opportunities: identifying causes of rapid radiations in derived ferns. In: Glaubrecht, M. (ed.) Evolution in action. Springer, Berlin , pp. 61–76.

Book: Author, A. & Author, B.C. (YEAR) Title of book in italics. Publisher name, location, xyz pp. For example:

Copeland, E.B. (1947) Genera filicum. Chronica Botanica, Waltham , Massachusetts, 247 pp.

Internet source: Author, A. (YEAR) Title of website, database or other resources, Publisher name and location (if indicated), number of pages (if known). Available from: http://xxx.xxx.xxx/ (Date of access). For example:

IUCN (2010) The IUCN red list of threatened species, version 2010.4. IUCN Red List Unit, Cambridge U.K. Available from: http://www.iucnredlist.org/ (accessed: 19 May 2011 ).

Dissertations resulting from graduate studies and non-serial proceedings of conferences/symposia are to be treated as books and cited as such. Articles not cited in the manuscript should not be included in the References section.

Figures and Tables

Legends of figures and tables should be listed after the list of references within the same file of the manuscript. Legends for tables and figures should start with TABLE or FIGURE followed by its number and a full stop. Illustrators and photographers should be mentioned in the figure legend, and if the illustrator is not one of the authors he/she should also be acknowledged. All figures and tables need to be referred to in the text.

Example:

FIGURE 1. Distribution map of Psilotum nudum in the Caribbean region.

When preparing illustrations, authors should bear in mind that the journal has a matter size of 25 cm by 17 cm and is printed on A4 paper. For species illustrations, line drawings are preferred, although good quality black and white or colour photographs are also acceptable. See a guide here for detailed

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information on preparing plates for publication; this guide was prepared by Dr Daniel Geiger for Zootaxa, but it applies equally to Phytotaxa.

Line drawings must be scanned at 600 to 1200 dpi as line art (bitmap, =1 bit); they must NOT be scanned as 8 bit or full colour images. Pictures and line drawings should be saved as TIFF files. In some cases PDF or DOC files are acceptable. JPG is not an accepted format. Do not scan line drawings as JPG files because this creates blurry or pixellated images. Sufficient resolution should be provided, but it is up to the author to do so. Low resolution figures can only be printed at a small size.

Tables, if any, should be provided at the end of the manuscript. Please use the table function in your word processor to build tables such that the cells, rows and columns remain aligned when font size and width of the table are changed. Please do not use the tab key or space bar to type tables.

Conservation Genetics Resources

Manuscript Submission Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before; that it is not under consideration for publication anywhere else; that its publication has been approved by all co- authors, if any, as well as by the responsible authorities – tacitly or explicitly – at the institute where the work has been carried out. The publisher will not be held legally responsible should there be any claims for compensation.

Permissions Authors wishing to include figures, tables, or text passages that have already been published elsewhere are required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print and online format and to include evidence that such permission has been granted when submitting their papers. Any material received without such evidence will be assumed to originate from the authors.

Technical Notes: Technical notes must be no longer than 1000 words and can include a maximum of two display items and 20 references. They must also include an abstract of no more than 150 words. The word count includes figure captions, abstract and text, but excludes the title page and references. Please add the word count at the top of your submission. The text should not be subdivided into sections. Technical notes are intended to provide a rapid means of publishing resources useful to research in conservation genetics including protocols (over a broad range of relevant, novel methodological advances), novel microsatellite DNA primer sequences, other genomic resources (such as new SNP, Y-chromosome or plastid markers), or information on computer packages/programmes. Computer programmes should be made accessible on an identified web page or FTP site. Primer notes should focus exclusively on species of conservation value and this must be explained in the introduction of the paper (if possible, IUCN status should be provided). They should provide a minimum of eight useful microsatellite DNA loci, and should not be based exclusively on the cross-species application of previously published primers. If derived from EST markers, they must be determined to be novel. Cross-species testing of new primers is, however, very

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much encouraged as part of the primer note where new primers are reported. We do not publish notes on the development of RAPDs, ISSRs and similar dominant markers. Application Essays: Application essays report on the implementation of genetic data towards the development of a specific management or conservation policy. The idea is to share experiences relevant to the successful incorporation of genetic data into policy development, to highlight problems encountered and solutions found, and thereby facilitate the process for others. These should be no longer than 3500 words long including an abstract of up to 250 words (word count based on all text: title page, abstract, text, figure & table captions and references). The text can be subdivided into sections, but there is no specified format for this. Technical Reviews: Reviews will be an occasional section in the journal, and should be based on major technological developments in the field with important application potential for practical conservation and management. For example, the incorporation of new generation DNA sequencing technologies. These should be no longer than 4500 words long including an abstract of up to 250 words (word count based on all text: title page, abstract, text, figure & table captions and references). The text can be subdivided into sections, but there is no specified format for this. Microsatellite Letters: From 01 May 2013 all papers on microsatellite data should be submitted as microsatellite letters and should conform to the following format. Microsatellite letters might be no longer than 800 words, can include a maximum of 5 references, abstract must include rationale for conservation angle, method should refer to standard methodology and detail only deviations or specific details, sequences should be submitted as Electronic Supplementary Material. The word count should include title, abstract, keywords, body of the text, figures, and tables but excluding authors affiliations, references and on-line supplementary material. Citation Cite references in the text by name and year in parentheses. Some examples:

 Negotiation research spans many disciplines (Thompson 1990).  This result was later contradicted by Becker and Seligman (1996).  This effect has been widely studied (Abbott 1991; Barakat et al. 1995; Kelso and Smith 1998; Medvec et al. 1999). Reference list The list of references should only include works that are cited in the text and that have been published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works should only be mentioned in the text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for a reference list.

Reference list entries should be alphabetized by the last names of the first author of each work.

 Journal article Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009) Effect of high intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent children. Eur J Appl Physiol 105:731-738. doi: 10.1007/s00421-008-0955-8 Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long author lists will also be accepted: Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J Med 965:325–329  Article by DOI Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production. J Mol Med. doi:10.1007/s001090000086  Book 107

South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London  Book chapter Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern genomics, 3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257  Online document Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb. http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007  Dissertation Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title Word Abbreviations, see  Tables:  All tables are to be numbered using Arabic numerals.  Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.  For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of the table.  Identify any previously published material by giving the original source in the form of a reference at the end of the table caption.  Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data) and included beneath the table body.

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