Фармакологично Проучване На Поведенчески Ефекти На Chaenomeles Maulei При Експериментални Животни

МЕДИЦИНСКИ УНИВЕРСИТЕТ ВАРНА

КАТЕДРА ПО ФАРМАКОЛОГИЯ И КЛИНИЧНА ФАРМАКОЛОГИЯ И ТЕРАПИЯ

Весела Ангелинова Борисова-Ненова

ФАРМАКОЛОГИЧНО ПРОУЧВАНЕ НА ПОВЕДЕНЧЕСКИ ЕФЕКТИ НА CHAENOMELES MAULEI ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ЖИВОТНИ

ДИСЕРТАЦИОНЕН ТРУД

За присъждане на образователна и научна степен „ДОКТОР“ по научна специалност „Фармакология (вкл. фармакокинетика и химиотерапия)“

Научен ръководител проф. д-р Стефка Василева Вълчева-Кузманова, д.м.н Варна, 2020 година

Съдържание

I. ВЪВЕДЕНИЕ ...... 6

II. ЛИТЕРАТУРЕН ОБЗОР ...... 9

1. Обща характеристика на видове от род Chaenomeles ...... 9

1.1. Ботанически данни ...... 9

1.2. Таксономия и номенклатура ...... 10

1.3. Исторически преглед ...... 11

1.4. Състав на видове от род Chaenomeles ...... 12

1.5. Съдържание на биологично активни вещества в плодов сок от Chaenomeles maulei ...... 15

2. Фармакокинетична характеристика на биологично активни вещества от плодов сок на Chaenomeles maulei ...... 23

2.1. Резорбция на флавоноиди ...... 23

2.2. Резорбция на процианидини ...... 23

2.3. Резорбция на фенолни киселини ...... 24

2.4. Бионаличност на флавоноиди в мозъка ...... 26

2.5. Бионаличност на процианидини в мозъка ...... 27

2.6. Бионаличност на фенолни киселини в мозъка ...... 28

3. Депресия и депресивно-подобни симптоми - патогенетични механизми ...... 30

4. Тревожност - патогенетични механизми ...... 39

5. Връзка между невродегенеративните и психиатричните заболявания ...... 43

6. Антиоксидантни и психофармакологични ефекти на биологично активните вещества в род Chaenomeles ...... 46

6.1. Психофармакологични ефекти на флавоноиди ...... 46

6.2. Антиоксидантни свойства на флавоноиди...... 49

6.3. Психофармакологични ефекти на проантоцианидини ...... 51

6.4. Антиоксидантни свойства на проантоцианидини ...... 52

6.5. Психофармакологични ефекти на фенолни киселини ...... 53

6.6. Антиоксидантни свойства на фенолни киселини ...... 55

6.7. Проучени досега ефекти на видовете от род Chaenomeles ...... 57

7. Обобщение на литературния обзор ...... 63

III. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ ...... 66

IV. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ ...... 67

1. Материали ...... 67

1.1. Експериментални животни ...... 67

1.2. Плодов сок от Chaenomeles maulei ...... 67

2. Методи ...... 69

2.1. Метод за изследване на двигателната активност и изследователското поведение - тест открито поле (open field test, OFT) ...... 69

2.2. Методи за изследване на тревожността ...... 69

2.3. Метод за изследване на депресивно поведение - тест принудително плуване (forced swim test, FST) ...... 71

2.4. Метод за изследване на паметта - тест разпознаване на обект - object recognition test (ORT) ...... 71

2.5. Биохимични методи ...... 72

2.6. Статистически методи ...... 73

V. СОБСТВЕНИ РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ ...... 74

1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху здрави/млади плъхове ...... 74

1.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле ...... 75

1.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за социално взаимодействие ...... 81

1.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест повдигнат кръстосан лабиринт ...... 83

1.4. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за разпознаване на обект ...... 94

1.5. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване ...... 101

1.6. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху чернодробна и бъбречна функция . 103

1.7. Обсъждане ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei при млади/здрави плъхове . 112

2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху резерпин-индуцирана хипокинезия в плъхове ...... 127

2.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле ...... 128

2.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване ...... 131

2.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху реагиращи с тиобарбитуровата киселина субстанции в мозък ...... 132

2.4. Обсъждане на ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху резерпин-индуцирана хипокинезия в плъхове ...... 134

3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху плъхове, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм (НДР) ...... 138

3.1. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито после ...... 138

3.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за социално взаимодействие ...... 141

3.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване ...... 142

3.4. Обсъждане на ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху плъхове, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм (НДР) ...... 143

VI. ОБОБЩЕНА ДИСКУСИЯ ...... 148

VII. ИЗВОДИ ...... 152

VIII. ПРИНОСИ ...... 153

IX. СПИСЪК НА ПУБЛИКАЦИИТЕ И УЧАСТИЯТА, СВЪРЗАНИ С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД...... 154

Библиография ...... 156

Използвани съкращения

BDNF- brain derived neurotrophic factor (мозъчен невротрофичен фактор) COX-1 и COX-2- cyclooxygenase 1 and 2 (циклооксигеназа- 1 и 2) CREB- c.AMP response element-binding protein EECS- етанолен екстракт от Chaenomeles speciosa G-CSF- Granulocyte-colony stimulating factor HPA- hypothalamus- pituitary- adrenal- хипоталамо-хипофизарно-адренална ос HPLC- high-pressure liquid chromatography (високоефективна течна хроматография) IFN-- Interferon gamma MPTP- 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine NF-B- nuclear factor-B SSRI- selective serotonin reuptake inhibitors VMAT2- vesicular monoamine transporter 2 (везикуларен моноаминен транспортер 2) АД- антидепресанти АКТХ- адренокортикотропен хормон БАВ- биологично активни вещества ГАМК- гамааминомаслена киселина или GABA- gamma aminobutyric acid ДТ- допаминов транспортер ЕРК- екстрацелуларната сигнал- регулирана киназа КРФ- кортикотропин-рилизинг фактор МАО- моноаминооксидаза НДР- нарушен денонощен ритъм ПСХМ- плодов сок от Chaenomeles maulei ПТ- пентациклични тритерпеноиди СРП- С-реактивен протеин ТБК- тиобарбитурова киселина ТБКРС- субстанции реагиращи с тиобарбитуровата киселина ХЕБ- хематоенцефалната бариера ЦНС- централна нервна система

I. ВЪВЕДЕНИЕ

Болестите на централната нервна система, сред които депресия, тревожност и невродегенeративните заболявания са едни от най-често срещаните в модерното общество и могат да засегнат всички възрастови групи - както по-младите, така и възрастните, здрави хора или такива с придружаващи заболявания. Невродегенеративните заболявания се характеризират с прогресираща дисфункция и загуба на неврони. Широкият спектър на тяхната клинична изява се дължи на различните функционални системи, засегнати при тази група заболявания. Всички невродегенеративни заболявания включват в патогенезата си натрупването на протеини (Cornejo et al., 2013; Kovacs, 2017).

Съществува значителна корелация в морфологичните, молекулярни и биохимични промени, които се наблюдават при психиатричните разстройства и невродегенеративните заболявания. Тези неврологични състояния са често съпътствани от дисфункция на кортиколимбичната система, абнормална активност на моноаминната система и оста хипоталамус-хипофиза, нарушения в механизмите на невропластичност и наличието на оксидативен стрес (Galts et al., 2019; Schneider et al., 2011). От невродегенеративните заболявания болест на Паркинсон и болест на Алцхаймер са едни от най-честите, засягащи предимно възрастни хора и тяхната изява расте, поради застаряването на популацията в глобален мащаб (Galts et al., 2019).

Според данни на СЗО върху няколко страни от Европейския съюз, 27% от населението на възраст между 18 и 65 години страда от ментални заболявания, включително депресия, тревожност, психози и хранителни разстройства. Глобално от депресия страдат повече от 264 милиона души или около 4.4% според доклад на СЗО. С това се установява повишаване с 18% в броя на хората, диагностицирани с депресия в периода 2005-2015 (World Health Organization, 2020). С подобряването на качеството на живот на популацията, растат и очакванията за продължителността му , с което зачестяват и случаите на невродегенеративни заболявания. Около 3% от индивидите на възраст между 65 и 74 години страдат от болест на Алцхаймер, 17% са тези на възраст между 75 и 84 години и 32% от популацията са над 85 години (Alzheimer's Association, 2018). Болест на Паркинсон е второто по честота невродегенеративно заболяване, което засяга

около 1% от индивидите на възраст до 70 години и 2% на възраст до 80 години (Pringsheim et al., 2014).

Множество невродегенеративни заболявания са често съпроводени от психични проблеми, които влошават протичането им. В около 40% от случаите на болест на Алцхаймер се установява коморбидна клинична депресия (Zhao et al., 2016). Между 10 и 45% от пациентите, диагностицирани с болест на Паркинсон, са засегнати и от клинична изява на някаква форма на депресия (Pfeiffer et al., 2015). При пациенти, които страдат от двете заболявания, се наблюдава по-агресивна прогресия на когнитивните и моторни симптоми, отколкото при тези, които не страдат от депресия (Starkstein et al., 1992). Данните показват, че всяка година 25% от популацията страда от депресия или тревожност. Невропсихиатричните заболявания обхващат 19.5% от заболяванията на Европейския регион и около 76% до 85% от пациентите с депресия от развиващите се страни не са адекватно лекувани, поради неточно поставяне на диагноза, липса на добре обучени специалисти, социалната стигма или липсата на достатъчно ресурси (Wang et al., 2007);

Пациентите, стадащи от тревожност и депресия, се повлияват добре от лекарствена терапия и внимателно насочена психотерапия. Изборът на едната, другата или двете стратегии на лечение зависи както от лекаря, така и от пациента и от конкретното състояние. Най-често използваните лекарства са от групите на антидепресантите, анксиолитици и бета блокерите (Ahl et al., 2017). Стандартната антидепресивна терапия е обаче слабо ефективна в лечението на коморбидни психиатрични и невродегенеративни заболявания. Това налага търсенето на нови терапевтични опции за стимулиране на неврогенезата, за постигане на невропротективни ефекти и модулация на моноаминната трансмисия (Bonato et al., 2018; Galts et al., 2019; Siarkos et al., 2015). Все още продължава проучването на фармакологични вещества, които освен да повлияват прогресията на заболяванията, да са свързани и с по-малко нежелани ефекти от наличните понастоящем терапии.

Търсенето на нови молекули, които да въздействат на централната нервна система, започва още през 19-ти век и първите продукти за лечение на патология на ЦНС са базирани именно на природни източници. Няколко класа молекули се отличават като терапевтични агенти за повлияване на ЦНС, имащи способността да стимулират или потискат активността на мозъка. Те се разделят химически на алкалоиди, амино киселини, флавоноиди и феноли и фенолни съединения. 7

Понастоящем се използват над 100 различни природни продукта за лечението на невродегенеративни и психиатрични заболявания, което се дължи до голяма степен на сложността на заболяванията, както и на припокриване на част от симптомите им. Най-широко застъпените механизми на действие на биологично активните компоненти на природните продукти включват подобряване на дисрегулацията на кортикотропин-рилизинг хормона и адренокортикотропния хормон, стимулиране на хипоталамичната неврогенеза, модулация на рецепторните места за

различни централни невромедиатори, включително ГАМК и допамин, повлияване на глутаматните рецептори, възпалителните цитокини, NO и мозъчния невротрофен фактор (Yeung et al., 2014).

II. ЛИТЕРАТУРЕН ОБЗОР

1. Обща характеристика на видове от род Chaenomeles

1.1. Ботанически данни

Род Chaenomeles или декоративни дюли от семейство Rosaceae представляват широколистни храсти с местно нахождение Източна Азия - главно региони от Япония, Китай и Корея.

Представителите на рода могат да се срещат като листопадни или полувечнозелени храсти, както и като неголеми дървета с височина 1-6 метра. При някои представители клончетата са с бодли, пъпките са с размер 1-2 мм, листата са правилни, леко назъбени, цветовете са едри, 3-4,5 см, единични или събрани от 2 до 6, обагрени в бяло, розово или рубинено червено. Плодовете, приличащи на малки дюли, са разположени в основата на клоните, трайни са и много тръпчиви на вкус, поради високото съдържание на витамин С, събират се октомври-ноември, Фигура 1.

Фигура 1. Основни видове от род Chaenomeles

Поради произхода си род Chaenomeles не са били известни на европейците до 1794, когато първият вид е описан от шведския ботаник Карл Петер Тунберг под името японска дюля. Често представителите на рода се наричат японски дюли, въпреки че само един, Chaenomeles japonica, е с произход Япония.

Декоративните дюли биват няколко основни вида:

 Chaenomeles cathayensis е вид характерен за Западен Китай и има най-едрия плод в рода. Узрелите плодове са крушовидни и с дължина 10-15 см, цветовете са бели или розови.  Chaenomeles japonica e със страна на произход Япония, притежава малки, ябълко-подобни плодове с 3-4 см диаметър. Цветовете са обикновено червени, но могат да бъдат и бели или розови.  Chaenomeles speciosa произхожда от Китай и Корея. Плодовете наподобяват твърда зелена ябълка. Цветовете са с червена, бяла или червено-бяла петниста окраска.  Chaenomeles thibetica е единият от трите вида срещащи се основно с Китай заедно с C. cathayensis и C. speciosa.  Chaenomeles sinensis расте на 1000 и повече метра надморска височина в области на източна Азия, главно Китай.

Известни са и 4 хибридни варианта, отглеждани в градините предимно с декоративна цел: C. x Superba (C. speciosa x C. japonica), C. x vilmoriniana (C. speciosa x C. cathayensis), C. x clarkiana (C. japonica x C. cathayensis), C. x californica (C. superba x C. cathayensis).

1.2. Таксономия и номенклатура

При задаване името на рода Chaenomeles в The Plant List излизат 49 резултата, от които 5 са в по-тъмен шрифт, одобрени са за самостоятелни видове и не са хибридни. Останалите резултати са на все още неодобрени видове или синонимни на основните представители.

1. Chaenomeles maulei (Mast.) C.K.Schneid. се разглежда като синонимно име на Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach. Среща се още под името Chaenomeles maulei (Mast.) Lavall‚e ex Zabel. 2. Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach със синоними: Cydonia japonica (Thunb.) Pers., Pyrus japonica Thunb. По-често срещани имена на растението и имена, под които е познато в народната медицина - японска цъфтяща круша (Japanese flowering quince) и круша на Мауле (Maule’s quince); (https://www.itis.gov/ 2017)

3. Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai със синоними: Chaenomeles lagenaria (Loisel.) Koidz., Choenomeles lagenaria (Loisel.) Koidz., Cydonia speciosa Sweet. По-често срещани имена и имена, под които е познато растението в народната медицина са цъфтяща круша (flowering quince); 4. Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne със синоними: Pseudocydonia sinensis (Thouin) C.K. Schneid., Cydonia sinensis Thouin, Chaenomeles chinensis (Dum. Cours.) Koehne, Cydonia chinensis Lindl., Malus sinensis Dum. Cours., Cydonia vulgaris Pavol., Pyrus chinensis Spreng., Pyrus sinensis (Dum. Cours.) Poir.; 5. Chaenomeles cathayensis (Hemsl.) C.K.Schneid. със синоними: Chaenomeles lagenaria var. cathayensis (Hemsl.) Rehder, Cydonia cathayensis (Hemsl.) Hemsl., Pyrus cathayensis Hemsl. 6. Chaenomeles thibetica T.T.Yu: без синоними за името.

Съгласно литературните данни, името Chaenomeles maulei (Mast.) C.K.Schneid. представлява синоним на Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach, който е пренесен в Европа (www.theplantlist.org 2017). Расте броят на проучванията, които сравняват и откриват разлики в състава на листата и плодовете на C. maulei и C. japonica. Според някои автори, поради различната ензимна активност в плодовете и листата на видовете, се наблюдават различия в образуваните и натрупвани метаболити. На база това откритие може да се твърди, че C. maulei и C. japonica представляват различни видове от род Chaenomeles (Чулков и сътр., 2011).

1.3. Исторически преглед

С откриването и описването си видовете стават популярни декоративни храсти в части на Европа и Северна Америка, отглеждани главно заради красивите си цветове и използвани като жив плет поради бодливите си клонки. Плодовете са твърди, ароматни и стипчиви на вкус. В хранително-вкусовата промишленост намират употреба поради високото си съдържание на органични киселини, пектин, ароматни вещества, витамин С за приготвянето на компоти, желета и конфитюри (Hamauzu et al., 2005), но също така и за медицински цели. Съдържанието на витамин С варира от 110-223 мг% за различните видове, а това на витамин Р (910 мг%) е десетократно по-високо от това в плодовете на ябълката, което обяснява употребата им в

традиционната китайска медицина. От хилядолетия родът намира приложение за лечението на ревматоиден артрит, хепатит, астма, грипоподобни състояния (Yang et al., 2009; Zhang et al., 2012).

1.4. Състав на видове от род Chaenomeles

Проучванията върху състава на биологично активни вещества (БАВ) в японската дюля засягат предимно видовете C. sinensis, C. speciosa, C. japonica, които не се различават особено. Дрогите, от които се извличат БАВ, са плодовете и семената на растенията, но също и етеричното масло. Различават се 5 диви вида Chaenomeles в Китай според Flora of China, 1974: Chaenomeles speciosa, Chaenomeles thibetica, Chaenomeles cathayensis, Chaenomeles sinensis, Chaenomeles japonica. Счита се, че съдържащите се в тях полифеноли като флавоноиди, фенолни киселини, проантоцианидини и двете тритерпенови производни - олеанова и урзолова киселина са носители на фармакологичната активност на вида. Двете киселини са известни с протективните си свойства спрямо сърдечно-съдови заболявания, изразените си антиадхезивни, противомикробни и противовъзпалителни свойства (Kylli et al., 2011; Rasmussen et al., 2005). Проантоцианидините, които се откриват, са широко разпространени полифеноли, главни съставни компоненти на люспи и семе от грозде, червена боровинка и др., с доказани антиоксидантни свойства (Spranger et al., 2008; Tarascou et al., 2011). За разлика от останалите видове обаче в плодов сок от C. maulei не се откриват олеанова или урзолова киселина, което предполага, че фармакологичната му активност не е свързана с ефектите на тези тритерпени. Данните за състава на основните видове показват:

 C. speciosa: екстрактът се характеризира с противовъзпалителни ефекти, дължащи се главно на хлорогенова киселина, кверцетин, олеанова и урзолова киселина (Zhang et al., 2010);  C. thibetica: установено е наличие на олеанова и урзолова киселина чрез газова хроматография (Yang et el., 2009);  C. cathayensis: освен изследване олеанова и урзолова киселина, доказано е наличие и на витамин С и феноли (Yang et al., 2009);  C. sinensis: кверцетин, лутеолин и 5 деривати на генистеин са установени като главните действащи компоненти. (Lee et al., 2002);

 C. japonica: химични и функционални анализи доказват наличието на проантоцианидини, урзолова и олеанова киселина, пектини, полизахариди, витамин С и феноли. (Ros et al., 2004; Strek et al., 2007).

Някои биологично активните вещества от групата на полифенолите, които се откриват в свежи плодове на видове от род Chaenomeles, са описани в Таблица 1. Съществува висока степен на корелация между способността за улавяне на свободни радикали и съдържанието на полифеноли и флаван-3-оли. Както самите полифеноли, така и техните мономери демонстрират изразен антиоксидантен потенциал (Du et al., 2013).

Таблица 1. Някои по-важни полифеноли, изолирани от плодове на видове Chaenomeles. Източник: (Du et al., 2013)

Растителен Тотални Хлорогенова Катехин Епикатех Проциани Проциани вид полифеноли киселина (мг/г) ин (мг/г) дин Б1 дин Б2 (GAE мг/г) (мг/г) (мг/г) (мг/г) C. speciosa 46.922.76 1.82±0.15 0.54±0.06 2.35±0.26 0.83±0.04 2.96±0.26 C. thibetica 46.280.59 1.17±0.06 1.56±0.13 - 2.22±0.17 - C. sinensis 1280 мг/100 г 0.09±0.00 0.05±0.00 0.54±0.03 0.13±0.01 0.40±0.02 C. japonica 19.35±0.59 0.10±0.00 - 1.02±0.09 - 0.98±0.12

Няколко изследвания демонстрират, че плодовете на видове от род Chaenomeles съдържат компоненти с изразен антиоксидантен потенциал. Счита се, че разнообразните биологични активности и антиоксидантни свойства на рода се дължат на присъствието на полифеноли, проантоцианидини, флавоноиди, фенолни киселини, тритерпеноиди, етерични масла, полизахариди, пектини и някои органични киселини (Sun et al., 2000; Yin et al. 2006; Zhang et al. 2014).

Студено пресованото масло от японска дюля, наред с тези на други растения, се оказва важен източник на хранителни биокомпоненти, като наситени и ненаситени мастни киселини, фосфолипиди, каротеноиди, фитостероли, лигнани, фенолни компоненти, имащи важно значение за правилното функциониране на организмa (Chiou et al., 2012). 13

Семената на японската дюля (Chaenomeles japonica) съставят 5-9% от плода и са страничен продукт от индустриалното производство на сокове и конфитюри - най-честата форма, под която се консумира плодът (Rosa et al., 2004; Wojdyło et al., 2008). Съдържат около 6.1-16.8% масло на семе, измерено в сухо тегло. Маслото от своя страна съдържа 9 мастни киселини с превалиращо количество на ненаситени мастни киселини (средно 89%) от които главно съдържание на линоленова и олеинова киселина съответно до 53% и 44% (Granados et al., 2003).

При сравнение химичния състав на студено пресованото масло от японска дюля с това на 9 други масла от растителни източници се установяват различия в антиоксидантната активност. Това се обяснява с различните концентрации на фенолни компоненти, съдържание на токохроманол, стойности на пероксид, амигдалин, мастни киселини, β-каротен и хлорофил (Gornas et al., 2014). Хлорофилът е ендогенна фоточувствителна молекула, имаща важно значение за оксидативната стабилност на маслата, особено изложени на светлина. Освен това присъствието му е нежелано, поради неприятния зелен или кафяв цвят на маслото. Количеството му е мярка за степента на зрялост и качеството на семената (Daun et al., 1984). Друга група пигменти са каротеноидите, които за разлика от хлорофила са желани БАВ заради антиоксидантните им свойства (Boo et al., 2012). Японската дюля съдържа най-високо количество β-каротен (10.77 мг/кг) в сравнение с другите масла. По отношение съдържанието на фенолни компоненти средните стойности за японската дюля превишават 2 до 10 пъти тези за другите масла. Токоферолите представяват уникални биокомпоненти с много важни фитохимични функции в биологичните мембрани, включително предпазване от мембранна дестабилизация (Dwiecki et al., 2007; Dwiecki et al., 2007). Най-високо съдържание на общи токофероли се установява за японската дюля, достигащо 72.62 мг/100г.

Плодовият сок от видове Chaenomeles съставя около 42-50% от свежия плод и има много ниски стойности на pH от 2.5 до 2.8, което корелира с киселинност от 2.5 до 4.2%. В плодовия сок се откриват 210-592 мг/100 мл феноли, 45-109 мг/100 мл витамин С, както и някои органични киселини като ябълчена киселина (3.06-5.09 г/100 мл) и хининова киселина (0.62-2.27 г/100 мл) (Du et al., 2013). В плодове от Chaenomeles japonica се откриват полифеноли под формата на катехин в концентрации 924 мг/100 г и флавоноиди в концентрации 0.091-0.618 мг/г (Hafez- Taghva et al., 2016). От фенолните компоненти в плодовете на видове от род Chaenomeles се откриват представители на фенолни киселини, флавоноиди и танини:

 C. speciosa: от фенолните киселини се откриват галова, хидроксибензоена, хлорогенова, канелена, кафеена, ферулова, от флавоноидите се срещат кверцетин, рутин, катехин, епикатехин, а танините са представени от процианидини;  C. japonica: фенолните киселини са представени от флорогенова киселина, флавоноидите - от катехин, епикатехин и кверцетин, а танините се откриват под формата на процианидини;  C. sinensis: галова, хлорогенова, ванилова, ферулова киселина са представителите на фенолни киселини, флавоноидите са предстаени от катехин, епикатехин, рутин, лутеолин, кверцетин, танините са отново под формата на процианидини (Watychowicz et al., 2017).

В плодовите сокове на видове от род Chaenomeles се детектират високи концентрации на аскорбинова киселина. След разкриване състава на Chaenomeles maulei може да се направи сравнение между съдържанието му на витамин С и полифеноли спрямо останалите видове от рода. Стойностите са представени в Таблица 2.

Таблица 2. Сравнителна характеристика в съръжанието на витамин С и феноли между някои видове от род Chaenomeles. Стойностите означени с * показват, че витамин С не е детектиран чрез HPLC метод, което предполага, че е под формата на дехидроаскорбинова киселина

Вид Витамин С (мг/100 мл) Феноли (мг/100 мл) C. maulei 22.0 890 GAE C. japonica 67.1±26.0* 228.2±47.1 C. speciosa 101.8±86.8* 367.3±118.1 C. cathayensis 102.8±86.8* 591.5±138.9

1.5. Съдържание на биологично активни вещества в плодов сок от Chaenomeles maulei

Видът C. maulei е пренесен в България от Памирската ботаническа градина преди около 40 години. В плода се открива високо съдържание на пектин, органични киселини, витамин С, както и известно количество каротеноиди, катехини и флавоноли, на които се дължи антиоксидантната

активност и витамин Р-подобното действие на дрогата. Установява се и високо съдържание на желязо и цинк, 4,5 мг/кг и съответно 2,94 мг/кг (Елисеева и сътр., 2012).

След HPLC-анализ на плодовия сок от Chaenomeles maulei, извършен от екипа на Valcheva- Kuzmanova et al. (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018), се детектират високи концентрации на някои от най-добре проучените биологично активни вещества с антиоксидантни свойства, принадлежащи към голямото семейство на фенолните съединения. Техните структурни особености позволяват да се предвидят фармакологичните свойства на плодовия сок, както и да се направи сравнение с ефектите на останалите представители на род Chaenomeles.

Най-разпространените представители на флавоноиди в плодовия сок са епикатехин и катехин. Откриват се също и по-ниски концентрации на други представители като рутин и нарингин. Стойностите за съдържание на епикатехин са 5.59 mg/100 ml, а за катехин са 5.25 mg/100 ml плодов сок. Процианидиновите олигомери са еквивалентни на 280.52 mg/l катехин. С установяване състава на ПСХМ са идентифицирани 8 фенолни киселини: ванилова, кафеена, хлорогенова, неохлорогенова, p-кумарова, елагова, ферулова и 4-хидроксибензоена киселина. Най-високи стойности са детектирани за ваниловата и кафеена киселина - 14.91 mg/100 ml и 14.48 mg/100 ml съответно. Хлорогеновата киселина има стойности 11.00 mg/100 ml. Стойностите за останалите представители на фенолни киселини са под 3 mg/100 ml, като най-ниско е съдържанието на 4-хидроксибензоената киселина. Екипът на Valcheva-Kuzmanova et al. установяват още и високо съдържание на органични киселини и въглехидрати (Valcheva- Kuzmanova et al., 2018). От органичните киселини най-висока е концентрацията на ябълчена, хининова и лимонена киселина, а от въглехидратите - на глюкоза, фруктоза и галактоза, като полизахариди не се откриват.

Фенолните съединения представляват вторични метаболити в растенията и са едни от най- широко разпространените групи на биологично активни вещества с важно физиологично и морфологично значение за растеж, репродукция и защита от патогени в растенията. Те също така имат и широк спектър на фармакологично действие, покриващо антиалергични, противовъзпалителни, антимикробни, антиоксидантни, кардиопротективни и вазодилатиращи ефекти. Освен нутриенти като есенциални витамини и минерали, в плодовете и зеленчуците се откриват още много растителни биокомпоненти като фибри, каротеноиди, фитостероли и фенолни съединения, които имат положителни ефекти върху здравето (Fraga et al., 2019). Класът 16

на полифенолите, например, е един от компонентите на храната най-често свързван със здравни ползи при сърдечно-съдови заболявания, рак, диабет и хронични белодробни болести (World Health Organization, 2016).

Нараства интересът и към антимикробните свойства на полифенолните компоненти. Механизмите им на антибактериално действие варират, но често се дължат на повишаване мембранния пермеабилитет на бактериалната клетка. Тези свойства на полифеноли могат да намерят приложение както за удължаване срока на годност на хранителни продукти и лекарства, така и като допълнение към основната антибактериална терапия (Bouarab Chibane et al., 2019).

Полифенолите представляват голяма група от биоактивни вещества, която съдържа няколко подкласа, разделени на флавоноиди, стилбени, фенолни киселини и лигнани, Фигура 2. Структурно те се състоят от ароматен пръстен, свързан с една или повече хидрокси-групи и могат да варират от прости фенолни съединения до полимерни структури (Bravo, 1998).

Фигура 2. Класификация на полифеноли

1.5.1. Флавоноиди

Флавоноидите представляват нискомолекулярни компоненти, състоящи се от 15 въглеродни атома, изграждащи 2 ароматни ядра (A и B), свързани с мост от 3 въглеродни атома, изграждащ третия пръстен С. Флавоноидите са най-голямата група растителни полифеноли и се разделят на няколко класа, в зависимост от различията в С-пръстена (Фигура 3), докато заместителите при пръстени А и В водят до формиране на представителите в съответните класове.

Фигура 3. Основна структура на фенолно съединение

Идентифицирани са около 8000 уникални в своята структура флавоноиди (Pietta 2000). Те се разделят на флавони, флавоноли, флаванони, флаваноли (или катехини), изофлавони, флаваноноли и антоцианидини, от които най-широко разпространени са флавоните и флавонолите, Фигура 4.

Фигура 4. Химична структура на главните класове флавоноиди

Фенолните съединения са широко познати с антиоксидантните си свойства, които се проявяват чрез тяхната способност да улавят свободни радикали, да са донори на водороден атом или електрон или да свързват метални катиони. Антиоксидантният им капацитет зависи главно от броя и позицията на хидроксилните групи, свързани с функционалните групи. С повишаване степента на хидролиза се повишава и антиоксидантното действие на флавоноиди, а наличието на метокси-групи на 3-то и 5-то място води до понижаването й.

Заместването на хидроксигрупите в пръстен В с метокси-групи води до промени в редокс потенциала и намаляване на антиоксидантните свойства. Заместването на ОН-група при С3 води до промени в ъгъла на равнината и основно повлиява негативно антиоксидантните ефекти. Двойна връзка между С2 и С3, конюгирана с 4-оксо група при пръстен С или с ОН-група при С3‘ засилват антиоксидантната активност (Seeram et al., 2002). Флавоноидите се откриват в растенията под формата на гликозиди и не-гликозидни метаболити. На база вида, в който са натрупани, може да се предвиди и последващата им бионаличност в човешкия организъм (Crozier et al., 2010).

1.5.2. Проантоцианидини и процианидини

Проантоцианидините представляват подклас на полифенолите, подобно на флавоноиди, стилбени, фенолни киселини и лигнани. Освен изброените, към полифеноли принадлежат и танините. Те се подразделят на хидролизируеми танини с мономер галова киселина, флоротанини с мономер флороглюцинол и кондензирани танини, наречени още проантоцианидини. Като компоненти на диетата се срещат под формата на олигомери и се подразделят на галокатехинови олигомери (проделфинидини), катехинови олигомери (процианидини) и афзелехинови олигомери (проперлагонидини), Фигура 5.

Фигура 5. Химична структура на основните типове проантоцианидини. Източник: (Ou et al., 2014)

Проантоцианидините, познати още като кондензирани танини, представляват олигомери или полимери на флаван-3-олите - епикатехин или катехин, свързани чрез вътрешни мостове. Техните молекулни маси варират в зависимост от степента на полимеризация, като могат да бъдат мономери, димери, тримери, тетрамери илиполимери с над 10 мономерни единици, с терминален флаван-3-ол. Обикновено проантоцианидините са с висока степен на полимеризация, което прави техните молекулни маси прекалено големи, за да могат лесно да преминават мембрани и бариери в организма.

Проантоцианидините са олиго- или полимери на мономерни флаван-3-оли, крайни продукти от биосинтетичния път на флавоноидите. Проантоцианидините представляват полимери на катехин, галокатехин и епикатехин, а процианидините - на катехин, като в

хранителните източници те са предимно под формата на полимери. Ползите от ежедневния прием на проантоцианидини са безспорни, като те се дължат най вече на чревния им метаболизъм до по- лесно резорбируеми компоненти като процианидините.

В зависимост от вида на химическите връзки в молекулата на процианидините, биват тип А или тип Б, Фигура 6. Б-тип процианидите са свързани чрез С4-С8 или С4-С6 връзка. А-тип съдържат и допълнителна етерна връзка между С2-О7 (Ou & Gu 2014). В повечето храни се съдържат Б-тип процианидини, като само малко част, червени боровинки, сливи и фъстъци, съдържат тип А.

Фигура 6. Видове химична връзка в процианидини

Най-важните източници на процианидини са какаото, ябълките, крушите, гроздовите семена, черните и червени боровинки. Процианидините от различните хранителни източници може и да са носители на различна фармакологична активност, като антиоксидантна и превантивна по отношение на някои заболявания. Изследвания върху червената боровинка показват, че процианидините съдържащи се в нея са мощни инхибитори на туморния растеж чрез повлияване генната експресия, индуциране на апоптозa и директно нарушаване на туморния клетъчен цикъл (Kresty et al., 2011).

1.5.3. Фенолни киселини

Два са основните класа фенолни киселини, които се срещат в растенията: производни на хидроксибензоената киселина и производни на хидроксиканелената киселина. Хидроксиканелените киселини са доста по-широко разпространени в растенията, като основно представени са от производни на кумариновата, кафеената, феруловата и синаповата киселина. Тези киселини рядко се срещат в свободна форма, а по-често са свързани с други киселини.

Ваниловата киселина представлява производно на бензоената киселина и намира приложение като овкусяващ агент в хранителната индустрия. Разглежда се още като окислена форма на ванилин. Притежава свойствата да прониква през ХЕБ дори след орален прием, като проявява невропротективни и антиоксидантни свойства, които са дозазависими (Jayasingh et al., 2015).

Една от важните фенолни киселини, влизащи в състава на Chaenomeles maulei, е хлорогеновата киселина. По своята химична структура тя представлява естер на кафеената киселина с хининова киселина, Фигура 7. След орален прием хлорогеновата киселина се метаболизира частично до кафеена и m-кумарова киселина, които се резорбират от червата.

Фигура 7. Химична структура на хлорогенова , кафеена и хининова киселина.

2. Фармакокинетична характеристика на биологично активни вещества от плодов сок на Chaenomeles maulei

2.1. Резорбция на флавоноиди

Флавоноидите се срещат най-често под формата на гликозиди, като преди се е считало, че е невъзможно те да бъдат резорбирани, заради липсата на гликозид-разцепващи ензими в червата. Следователно би трябвало само агликоните да могат да достигат до кръвта. В последствие се установява чрез здрави доброволци, че протича резорбция и на гликозидно свързаните флавоноиди. Доброволците следват 12 дневна диета, която не съдържаща кверцетин, обогатявана на 4-ти, 8-ми и 12-ти ден с пържен лук на закуска, който е еквивалентен на 89 mg агликон, чист рутинозид, еквивалентен на 100 mg агликон или 100 mg чист кверцетин. Наблюдава се повишена резорбция на кверцетиновите гликозиди (52%), в сравнение с орално приемания агликон (24%), (Hollman et al. 1995). Бионаличността на флавоноидите може да се повлияе от разлики в структурите на клетъчните стени на растенията, разположение на гликозидите в клетките и свързване на фенолите с компоненти на храната. Флавоноидите под формата на гликозиди не се резорбират добре в тънките черва и обикновено остават в храносмилателната система. Дори компонентите, които се резорбират в някаква степен, се метаболизират в черния дроб и в последствие попадат в дебелото черво чрез жлъчката. Там под действието на дебелочревната микрофлора се осъществява хидролиза на нерезорбираните гликозиди, разкъсване на конюгираните метаболити и разцепване на сложните феноли до по-прости съединения. Флавоноидите се метаболизират основно чрез метилиране, сулфатиране, глюкурониране или комбинация от трите процеса в тънките черва, черния дроб или бъбреците. Главното място, където се осъществява метаболизма им, зависи от приетата доза. По-големите дози се метаболизират от чернодробните ензими, а по-малките - интестиналната флора и в този случай, черният дроб играе второстепенна роля в метаболизма (Scalbert et al., 2000).

2.2. Резорбция на процианидини

Процианидините под формата на твърда, суха хранителна маса не са резорбируеми. Това е възможно само когато са под формата на воден разтвор. Няма данни за транспортери, участващи

в активното им преминаване от мястото на приложение до системното кръвообръщение и тяхната резорбция обикновено се осъществява в тънките черва чрез пасивна дифузия. Поради големия си брой хидрофилни групи, процианидините не могат да преминават директно през двойния липиден слой и се счита, дифузията им се осъществява парацелуларно. Това може да се докаже при намаляване трансепителното електрическо съпротивление, при което се наблюдава повишаване степента им на резорбция (Mila et al., 2001). Както катехиновите, така и епикатехиновите молекули се резорбират на ниво горен отдел на тънките черва. Максимални концентрации на катехин се достигат след около 1.4 часа, а на епикатехин след около 2 часа, приети от хора. След резорбция процианидините претърпяват екстензивен метаболизъм от втора фаза в черния дроб, където се конюгират с глюкуронова киселина, сулфатират се и се метилират. Под формата на метаболити процианидините могат да бъдат засечени в кръвната плазма и тъканите. Проучвания показват, че процианидините под формата на тримери могат да бъдат устойчиви и стабилни при стомашните и дуоденални условия, но затова пък имат намалена бионаличност. In vivo и in vitro модели показват, че процианидиновите олигомери са резорбируеми, когато имат степен на полимеризация по-ниска от 5, като общата им бионаличност възлиза на около 58% (Ou et al., 2014).Свободните форми на процианидини показват най-добра и бърза резорбция и достигат максимална концентрация в кръвта 1 час след орален прием (Serra et al., 2010).

2.3. Резорбция на фенолни киселини

Хлорогеновата киселина, която е една от най-широко разпространените киселини в плодовете на видове Chaenomeles, представлява кафеена киселина свързана с хининова киселина. След орален прием част от хлорогеновата киселина се хидролизира в стомаха и тънките черва до кафеена киселина и хининова киселина, които от своя страна се резорбират бързо (Choudhury et al., 1999). Около 33% от приеманата хлорогенова и 95% кафеена киселина се резорбират в тънкото черво при пациенти. Кафеената киселина се резорбира главно чрез активен транспорт. В здрави доброволци фармакокинетичните профили на кафеена и ванилова киселина показват, че са необходими 42 до 48 минути за достигане на Cmax след орален прием. По-голямата част от фенолните киселина се метаболизира в черния дроб. Метаболити на кафеена и ванилова киселини се откриват в урината в ниски концентрации най-рано 5 часа след орален прием (McKay et al., 2015). Това се дължи на екстензивен метаболизъм в тънките черва или черния дроб чрез реакции 24

от 2-ра фаза, неензимно разграждане или катаболни процеси на бактериалната микрофлора (Del Rio et al., 2010). Поради екстензивния метаболизъм, в урината се откриват много малки проценти на непроменени киселини (Olthof et al., 2001).

Феруловата киселина представлява естерифицирана 4-хидрокси-3-метоксиканелена киселина и е също често срещан компонент на храната. Естерифицираните фенолни киселини се характеризират с намалена резорбция, понеже човешките тъкани и биологични течности не разполагат с естерази, които да хидролизират феруловата киселина. Единствено бактериалната микрофлора на дебелото черво е способна да извърши хидролизата на естерифицирани фенолни киселини. Установени са бактериални щамове, които имат участие именно в този процес и тяхното наличие определя ефикасността на резорбция. Съответно, ефикасността на резорбцията е по-ниска, когато фенолните киселини са представени под формата на естери, отколкото ако са в свободна форма (Gonthier et al., 2003). In sutu и ex vivo модели показват добра резорбция в стомаха, йеюнума и илеума за феруловата киселина. При приложението на 2.25 mol ферулова киселина на плъхове, се установява, че , 25 минути по-късно само около 25% от киселината се откриват в стомаха на плъховете. Само около 0.5-0.8% от приетата ферулова киселина се откриват във фецеса на плъхове, което доказва нейната висока степен на резорбция. Предполага се, че това се осъществява чрез пасивна дифузия през стомашната мукоза. Резорбцията и се благоприятства

от ниски стойности на pH, поради нейното pKa равно на 4. По-късно феруловата киселина се установява както в свободна, така и в конюгирана форма в кръвма плазма, жлъчка и урина, като в стомашното съдържимо тя се детектира само в свободна форма. Транспортът в кръвта на феруловата киселина се осъществява от плазмените албумини (Zhao et al., 2003).

В порталната система се откриват 495% ферулова киселина, което показва, че главното място на нейния метаболизъм е черният дроб (Zhao et al., 2004). При метаболизма на феруловата киселина могат да се открият множество метаболити, като най-важните са глюкурониди, сулфати и сулфоглюконати (Adam et al., 2002). Особено застъпени са сулфоглюконатите, които се откриват в концентрации 32.77.3% от тоталното количество ферулова киселина в кръвна плазма и урина на плъхове (Rondini et al., 2002). Степента на конюгация на метаболитите зависи от приетата доза на киселината, като в по-големи дози се натрупва свободната ѝ форма, което важи и за уринната ѝ екскреция (Zhao et al., 2008). Половин час след орален прием на 521 мол/кг ферулова киселина се отчитат 82 гр/г разпределени в бъбреците и 2.6 гр/г в мозъка (Zhao et al., 25

2008). Плазменият полуживот на феруловата киселина при животни може да варира от 10 до 30 минути, силно зависи от дозата и начина ѝ на приложение (Zhao et al., 2003). При хора е установено, че плазменият полуживот на киселината възлиза на около 42 минути след перорално приложение (Yang et al., 2007).

2.4. Бионаличност на флавоноиди в мозъка

За да могат флавоноидите да въздействат на мозъка, те трябва първо да преминат физическата бариера, която контролира навлизането на ксенобиотици. Флаванони като хесперидин, нарингенин и техните in vivo метаболити се откриват в мозъка, което предполага, че преминават хемато-енцефалната бариера. Степента на преминаване през ХЕБ е силно зависима от липофилността на молекулата, което означава, че слабо полярните О-мерилирани метаболити са с по-голяма бионаличност в мозъка, отколкото по-полярните глукуронирани флавоноиди. Въпреки това има данни показващи, че глюкуронидите също могат да достигнат мозъка чрез специални транспортни механизми. Преминаването зависи пряко от взаимодействията на флавоноидите с ефлукс транспортните системи на организма, като Р-гликопротеин.

Изследване върху фармакокинетиката и способността на флавоноидите да преминават ХЕБ се провежда с орален екстракт на Gingko biloba. Доза от 600 mg/kg екстракт води до максимални плазмени концентрации от 176, 341 и 183 ng/mL съответно кверцетин, кемпферол и изорамнетин и максимални концентрации в мозъка, отговарящи на 291 ng/g протеин за кемпферол и 161 ng/g протеин за изорамнетин. Поради чернодробния си метаболизъм, флавоноиди обикновено се детектират в кръвта в наномоларните си концентрации (De Boer et al., 2005). Установено е, че при продължителна суплементация с кверцетин, плазмените му нива могат да достигнат микромоларни концентрации (Manach et al., 2005). В ЦНС се откриват само метаболити на кверцетин и по-специално на кверцетин-3-О-глюкуронида (Ishisaka et al., 2014). Счита се, че именно липофилните метаболити на флавоноиди осъществяват фармакологични ефекти (Terao et al., 2011).

Съществуват доказателства, че флавоноиди могат да преминават кръвно-мозъчната бариера и да взаимодейства с мозъчните клетки, като най-високи концентрации от тях се откриват

в хипокампа, стриатума и хипоталамуса. Най-ясните доказателства са тези, подчертаващи антиоксидантните и невропротективни свойства на флавоноиди в различни модели на заболявания (Dajas et al., 2015). Всички тези факти сочат, че флавоноидите са способни да преминат ХЕБ и без значение от концентрацията, в която достигат мозъка, могат да окажат невропротективно и невромодулаторно действие (Spencer et al., 2012).

2.5. Бионаличност на процианидини в мозъка

Счита се, че терапевтичният потенциал на процианидините е ограничен, поради слабата системна резорбция след орален прием, фармакокинетика и бионаличност, оскъдното разпределение и ниска степен на акумулация в тъканите. В същото време биологичната им активност in vitro е много ясно изразена, което може да се дължи на химична нестабилност в организма (Krupkova et al., 2016). Повишаването на дозата им води до подобрена системна биодостъпност, но и до доза-зависима токсичност (Murakami, 2014). Катехините са субстрати на ефлукс протеини като P-гликопротеин, което допълнително ограничава резорбцията и разпределението им (Song et al., 2014). Добър подход, който повишава бионаличността на катехините е добавянето на аскорбинова киселина. Освен нея, синергични взаимодействия показват и комбинациите със сукроза, други въглехидрати и някои лекарства (Son et al., 2016).

В клетъчен модел на ХЕБ се установява, че флавоноиди, процианидини и техни метаболити пенетрират чрез доза и време-зависимо поведение (Youdim et al., 2003). Лекарствената формата на полифенолите, както и присъствието на други представители може да доведе до синергизъм. В мозъка могат да се открият високи нива на комбинации от полифеноли, най-вече след хронично приложение (Ferruzzi et al., 2009). Едновременният прием на токоферол, кверцетин, епигалокатехин и рутин в диетата води до подобрена бионаличност на кверцетин в ЦНС (Ferri et al., 2015).

Концентрациите на някои процианидини и техните главни метаболити, които се откриват в мозъка, са представени в Таблица 3.

Таблица 3. Концентрации на някои процианидини и техни метаболити в мозъка след орален прием. Източник: (Wang et al., 2014).

Полифенол Метаболит Орална доза Мозък (pmol/g) Кверцетин-3-О- 0.09 mg/g 2.410.47 глюкуронид Кверцетин ОМе-кверцетин-О- 0.09 mg/g 0.690.05 глюкуронид Катехин-5-О- 5.6 mg/g 485.7986.07 глюкуронид Катехин 3-О-Ме-катехин-5- 5.6 mg/g 664.29133.65 О-глюкуронид Епикатехин-5-О- 6.49 mg/g 637.2293.85 глюкуронид Епикатехин 3-О-Ме-епикатехин- 6.49 mg/g 853.83142.77 5-О-глюкуронид

Има данни за ЦНС ефектите на някои процианидинови олигомери, дължащи се на инхибиция на натрупването на тау протеин при болест на Алцхаймер, без да се нарушава нормалната му функция (Peterson et al., 2009). Окислената форма на епикатехин може да потисне агрегацията на тау и образуването на високо молекулни съединения, с което се избягва невроналната загуба като следствие на оксидативен стрес (George et al., 2013). Установено е, че диета, обогатена с проантоцианидини, катехин и епикатехин, може да стимулира когнитивните способности и паметта при пациенти с болест на Алцхаймер. Мономерните метаболити на проантоцианидините могат да се натрупват в мозъка (Wang et al., 2012).

2.6. Бионаличност на фенолни киселини в мозъка

Доказано е, че ваниловата киселина при интраперитонеално приложение преминава бързо ХЕБ, но се открива в мозъка и след орално приложение (Guest et al., 2012). Приемана перорално

субхронично, ваниловата киселина оказва невропротективно действие в модел на стрептозоцин- индуциран оксидативен стрес. В подкрепа на твърдението, че киселината достига ефективни концентрации в ЦНС, е наблюдаваният невропротективен ефект, който се дължи на понижаване нивата на TNF и активността на ацетилхолинестеразата, съпроводени с повишаване нивата на антиоксиданти в мозъка (Singh et al., 2015).

Под 1% от оралната концентрация на ферулова киселина се откриват в мозъка 30 минути след приема й. В рамките на още половин час, концентрацията на свободна ферулова киселина намалява с около 50% в повечето тъкани, но може да се задържи и до 24 часа в черния дроб, тънкото черво и кожата (Teuchy et al., 1971).

Пероралният прием на хлорогенова киселина и кафеена киселина в животни води до значително удължаване на времето нужно за заспиване, като ефектите на кафеената киселина са по-изразени. Кафеената киселина може да активира адренергичните 1-рецептори в ЦНС, като се счита, че ефектите ѝ да стимулира бодростта се дължат на този механизъм (Cheng et al., 2000). Например възбудните ефекти на кофеин са свързани с намаляване на аденозиновата медиация (Fisone et al., 2004), което може да се различава от механизма на действие на хлорогенова и кафеена киселина. От своя страна хлорогеновата и кафеена киселина не повлияват фазите на съня, поради кратките им полуживоти (Takenaka et al., 2000) и могат да бъдат полезни заместители на кофеина (Shinomiya et al., 2004).

Двете фенолни киселини имат и доказани невропротективни свойства чрез въздействие върху ацетилхолинестеразата и намаляване на оксидативния стрес при невродегенерация, което предполага способностите им да достигат терапевтични концентрации в ЦНС (Oboh et al., 2013).

3. Депресия и депресивно-подобни симптоми - патогенетични механизми

Според СЗО депресията е често срещано ментално заболяване, което се характеризира с постоянни епизоди на тъга, загуба на интерес или удоволствие от дейности, които преди са носели такова, чувство на вина, нарушения в съня или апетита, умора и промени в концентрацията и вниманието (World Health Organization, 2020). Депресията представлява комплексно заболяване, често с различен курс на протичане, разнороден отговор към използваните терапевтични похвати и без ясен механизъм.

Депресията може да бъде хронично протичаща или периодично появяваща се, но във всички случаи засяга работоспособността на индивида. Това се проявява не само във влошаване качеството на живот на пациентите и на техните семейства, но също така и с повишена нужда от специализирана помощ. Счита се, че в основата на заболяването лежат в различна степен застъпени биологични, генетични фактори и фактори на средата (American Psychiatric Association, 2013).

Депресивно-подобните симптоми често включват тревожност, която се явява самостоятелно или е коморбидна с други медицински състояния като диабет, ревматоиден артрит, сърдечно-съдови заболявания, особено хроничните, туморни заболявания и възпалителни процеси.

Понастоящем се счита, че симптомите на депресията са комбинация от генетични фактори и фактори на средата, които нарушават реципрочното взаимодействие на множество невронални пътища. След анализ на данни от наблюдения на близнаци се установява, че депресията се унаследява в около 38% от популацията (Kendler et al., 2006). Проучванията дискутират още, че характерните поведенчески прояви се асоциират с промени в гени, свързани с отговор към стрес, ефекти върху ДНК метилирането и други епигенетични регулаторни механизми (Massart et al., 2012).

Моноаминна хипотеза През втората половина на 20ти век се проучват нови вещества, които повлияват моноаминния метаболизъм, особено на серотонин и норадреналин, с което облекчават депресивните симптоми. Първите антидепресанти, навлезли в клиничната практика, МАО

инхибитори и трициклични антидепресанти, са неспецифично действащи и асоциирани с нежелани ефекти. По-селективно действащи и ефективни са инхибиторите на серотониновото обратно връщане (SSRI) и норадреналиновите инхибитори (Ramachandraih et al., 2011). Половин век на проучване по-късно и наличието на множество вещества за лечението на депресия, все още половината от пациентите не постигат задоволителен клиничен отговор към терапията на първа линия, а повече от 65% не постигат ремисия (Nierenberg et al., 2010).

Счита се, че възпалителният процес и съответните му медиатори могат да намалят концентрациите на прекурсори на моноамините чрез инактивиране на ензимни системи. Тези ензими са разграждащи триптофан и могат да увеличат активността на моноаминните транспортери, с което да намалят нивата на самите моноамини в синаптичното пространство (Raison et al., 2013).

Този дефицит на моноаминни невромедиатори като норадреналин, серотонин и допамин, лежи в основата на моноаминната теория на клиничната депресия. Тази хипотеза се формира на база механизма на действие на откритите и използвани в съвремието антидепресанти и е довела до разработването на SSRI. Понастоящем съществува консенсус, че повишаването нивата на моноамини подобрява депресивните симптоми, но употребата на АД се свързва също със сравнително ниска ефикасност, честа повторяемост на депресивния епизод и забавено начало на действие (Nestler et al., 2002).

MRI проучвания на пациенти страдащи от депресия показват структурни изменения в мозъка, свързани със загуба в обема на хипокампа. Загубата на обем е 4% в левия и 4.5% в десния регион на хипокампа при сравнение със здравите контроли (Cole et al., 2011). В пациентите, при които не се постига адекватен антидепресивен ефект, се отчитат и промени в лимбично- кортикалните невронални пътища свързващи предния таламус към кортекса и хипокампа. Връзките между серотонинергичните, допаминергични и норадренергични неврони се осъществява именно чрез тези невронални пътища (Hamon et al., 2013).

В астроцитите се откриват транспортери за норадреналин и серотонин, които са таргети за много от класическите АД. Това предполага, че лекарствата имат директно инхибиторно действие върху реъптейка на моноамини в астроцитите. Установено е още, че върху астроцитите се експресират адренергични рецептори, както и някои серотонинови, които са астроцит- 31

специфични като 5-НТ5А и са чувствителни на АД-индуцирани промени в моноаминните концентрации (Berumen et al., 2012). Стимулирането на тези адренергични рецептори, особено 

и 1 водят до индукция норадреналин-медиирания BDNF. Стимулирането на -рецепторите води до активация на аденилат циклазата, което повишава CREB-зависимата транскрипция на BDNF (Marathe et al., 2018).

В здрави доброволци е установено, че изчерпването на L-триптофан и серотонин не води до значителни прояви на депресия, което предполага, че тяхното повлияване не е достатъчно в патофизиологията на депресията (Toker et al., 2010). При намален невроендокринен отговор към серотонин и ниска плътност на рецепторите му в префронталния кортект, в комбинация с понижени нива на серотонин и норадреналин, може да се наблюдават промени в емоционалните реакции (Toker et al., 2010).

Функцията на МАО и генната ѝ експресия също имат отношение към развитието на клинична депресия. Понижена активност на МАО се свързва със симптоми на антисоциално личностно разстройство, както и агресивно-импулсивно поведение. Това показва, че функцията на МАО се регулира от взаимодействие между генетични и социални фактори в психиатричните заболявания (Naoi et al., 2016).

Възпалителна хипотеза По време на стресово събитие се освобождава кортикотропин- рилизинг хормон и аргинин вазопресин. Чрез понататъшно стимулиране на хипоталамо-хипофизарната ос, се освобождава адренокортикотропен хормон (АКТХ). АКТХ от своя страна стимулира продукцията и освобождаването на кортизол от надбъбрека, който директно и индиректно води до повишени нива на цитокини в кръвта. Цитокините са отговорни за проявите на алергичния отговор, ендокринната регулация чрез хипоталамус-хипофиза оста, предаването на информация между ЦНС и имунна система. Дисфункцията на системата хипоталамус-хипофиза, както и дисфункция в освобождаването на про- и антиинфламаторни медиатори води до развитие на тревожност и депресивно-подобни симптоми (Peacock et al., 2017).

Все повече са данните, подкрепящи участието на възпалителния процес в депресивните заболявания. Пациентите с депресивни епизоди имат всички белези на възпаление, включително повишена експресия на възпалителни цитокини и техни рецептори, повишени нива на медиатори на острата фаза на възпаление, хемокини и разтворими адхезионни молекули в периферната кръв и гръбначномозъчната течност.

Проинфламаторните цитокини са субстанции, имащи способността да индуцират треска, активация на хипоталамус-хипофизарната ос и да стимулират поведение на болестност (Miller et al., 2016). Това е състояние, което се характеризира с поведенчески симптоми, наблюдавани у болен човек или животно, включващи депресивно-подобно поведение, ахедония, умора, забавена двигателна активност, намален апетит, повишена чувствителност към болка и др.

Болестното поведение много наподобява депресивните симптоми, което свързва психиатричната коморбидност с хроничните възпалителни заболявания като ревматоиден артрит, ракови заболявания, автоимунни процеси, сърдечно-съдови заболявания. При тези патологични процеси се наблюдават високи нива на цитокини, хемокини, адхезионни молекули в кръвта и гръбначномозъчната течност (Zou et al., 2018).

Цитокините представляват големи молекули, които не преминават свободно през кръвно- мозъчната бариера, но сигналите им достигат мозъка чрез хуморален, неврален и клетъчен път, включващи следните механизми:

 Преминаване на част от цитокините през по-пропускливи места на хематоенцефалната бариера;  Активен транспорт чрез цитокин-специфични транспортни молекули на мозъчния ендотел;  Активация на ендотелните клетки, водеща до освобождаване на вторични молекули посредници като простагландини в мозъчния паренхим;  Предаване на цитокинови сигнали чрез аферентните пътища;  Навлизане на периферно активирани моноцити в мозъчния паренхим.

Таблица 4. Връзка на някои имунни клетки и продуцираните от тях цитокини с възпалителния отговор и депресията. Източник: (Mikkelsen et al., 2017)

Тип клетка Цитокин Действие Връзка с депресия и Моноцити и IL-1, 6, 8, IL-1 дава начало на  Провокира реакциите на остра макрофаги TNF. възпалителната каскада и активира фаза и депресия в животни; другите цитокини  Високите му нива се асоциират със склонност към самоубийство.

IL-6 инхибира IL-1 и TNF и  Високите му нива се асоциират инициира диференциация на Th-2 със склонност към самоубийство и клетките депресия или психози

IL-8 свързва неутрофили,  Високите му нива се асоциират с микроглия, ендотелни клетки и риск от самоубийство; подобрява проникването на Т-  Нивата му корелират с тежестта лимфоцити във възпалените на депресията тъкани Т- хелпери 2 IL-1, 3, 4, IL-4 стимулира развитието на Th2  Намалените му серумни нива в (Th2) клетки 5, 6, 10, клетките; инхибира мишки водят до повишена 13 възпалителните цитокини; податливост на стрес, а стимулира Б- клетъчната инжектирането му я пролиферация предотвратява

IL-10 инхибира продукцията на  Намалените му серумни нива в цитокини от моноцити/макрофаги, мишки водят до повишена неутрофили податливост на стрес, а инжектирането му я предотвратява

IL-13 има 30% структурно подобие  Намалените му серумни нива в с IL-4 и участие в алергичното мишки водят до повишена възпаление податливост на стрес, а инжектирането му я предотвратява

Т-хелпери IL-17A, IL-17 е медиатор на късния тип  Провокира депресивно поведение 17 (Th17) 17F, реакции на свръхчувствителност; в животни; клетки 17AF, IL- активира моноцити и неутрофили  Повишени нива при депресия, 21, 22, свързана с ревматоиден артрит и 24, 26 псориазис

IL-21 стимулират  Повишени нива при депресия, диференциацията на Б-клетките и съпътстваща автоимунни съзряването на Th17 клетките заболявания

IL-22 участва в отговора към  Повишени нива при депресия, хроничните възпалителни процеси съпътстваща автоимунни като инфекции заболявания

NK (natural Интерфе IFN- инхибира пролиферацията  Стимулира депресивно- подобно killer) рон  на Th-2 клетките; експресира се поведение, инжектиран в мишки клетки (IFN-), при алергии, диабет, автоимунни тумор- заболявания и инфекции некротиз иращ TNF е фактор на вродения и  Стимулира депресивно-подобно фактор адаптивен имунитет; индуцира поведение, инжектиран в мишки; (TNF) клетъчната пролиферация и  Анти-TNF терапията води до възпалителен отговор; индуцира регресия на депресивното IL-1, 6, 8. поведение, а в комбинация с антидепресанти и до намаляване на неврохимичните промени

Цитокините са част от мрежа, която действа на каскаден принцип - активирането на един цитокин води до синтез на други възпалителни медиатори, сред които TNF, IL-1 и IL-6. В мозъка тази мрежа включва клетки, неврони, микроглия, астроцити, които синтезират цитокини, експресират рецептори за тях и могат да усилват сигналите за тях. Освободените цитокини водят до активиране на хипоталамус-хипофизарната ос, кортикотропин-рилизинг хормона и до промени в метаболизма на някои моноамини като серотонин, допамин и норадреналин. Веднъж достигнали до мозъка цитокините могат да взаимодействат с всеки елемент, имащ значение за настроението и поведението - растежни фактори, неврогенеза и синаптична пластичност (Kim et al., 2016). Във физиологични условия цитокините са трофични по отношение на неврогенезата, но в условията на хроничен стрес тяхната свръхпродукция води до промени в синтеза на растежни фактори. Намалената неврогенеза в областта на хипокампа е показател за хроничен стрес в лабораторни условия и се наблюдава като депресивно-подобно поведение (Mouihate, 2014).

Фигура 8. Взаимовръзка между имунна система и сигнални пътища в мозъка, върху които цитокините могат да въздействат

Мета-анализи на литературата показват, че нивата на IL-6, 8, TNF и С-реактивен протеин в периферна кръв са най-надеждните биомаркери за възпалителен процес при пациентите с депресия. Полиморфизъм в гените, кодиращи именно тези цитокини, се свързва с развитието депресия. Въвеждане на възпалителни цитокини, например интерферон алфа или техни индуктори в пациенти, които не страдат от депресия, води до депресивно-подобни симптоми. 36

Блокирането на цитокините или компонентите, участващи в техните сигнални пътища, като циклооксигеназа-2, намалява проявата на депресия в пациенти с хронични възпалителни заболявания, както и в тези, страдащи само от депресивен епизод (Miller et al., 2016).

Клинично проучване на връзката между нивата на хронично възпаление и вероятността за бъдещи депресивни симптоми се провежда в рамките на 4 години и обхваща 1963 пациенти. Най- висок риск от депресивна симптоматика се установява за групата пациентите с хронично заболяване и с изразено възпаление (Bella et al., 2016). Провежда се друго клинично проучване сред 852 пациенти на възраст между 40 и 75 години с диагностициран тип 2 диабет в рамките на 2010-2012 година. Установява се, че по-високите нива на биомаркерите С-реактивен протеин и TNF се асоциират значително с депресивна симптоматика, независимо от възраст, пол, тежест на диабетното заболяване, степента на гломерулна филтрация, съпътстващо сърдечно-съдово заболяване и фактори като пушене, алкохол, индекс на телесна маса (ИТМ).

При наличието на тютюнопушене, алкохолизъм и високи стойности на ИТМ, се забелязва засилване на връзката между ендотелна дисфункция и депресия, каквито се откриват при диабетно болните пациенти (Dooren et al., 2016). Наличието на възпаление и оксидативен стрес са тясно свързани с развитието на ендотелната дисфункция (Halaris, 2017). Повишени нива на оксидативен стрес може да се наблюдават при потискане на NO-зависими механизми на дилатация и да доведат до микроваскуларна дисфункция при пациенти с депресия. В този смисъл може да се спекулира, че ендотелното увреждане, особено на церебралната микроциркулация, може да допринесе за развитието на симптоми на депресия при млади хора (Greaney et al., 2019).

NO-зависимите механизми на дилатация имат директно отношение върху развитието на депресивната симптоматика. Серотонинови неврони се откриват в средномозъчните raphe nuclei и съдържат голям брой NO синтетаза, отговорна за продукцията на азотен оксид за нуждите на мозъка. Тези 5-HT рецептори модулират множество мозъчни функции и имат важно участие в стимулиране поведението на тревожност и депресия. Активирането на тези ядра води до повишена невронална активност на ниво амигдала и стимулиране на безпомощно поведение, което може да се използва като модел на депресия (Galecki et al., 2018). Физиологичните ефекти на азотния оксид, образуван в средномозъчните ядра, се осъществяват чрез стимулиране на разтворимата гуанилат циклаза за продукцията на цикличен гуанозин монофосфат. Крайните

ефекти включват регулация на функционалното състояние на таргетните неврони и състава на екстрацелуларната течност (Ghasemi, 2019).

При инхибиране на невроналната NO синтетаза в хипокампа намалява развитието на депресивна симптоматика, като такъв ефект се наблюдава и при инжектиране на селективен инхибитор на индуцируемата NO синтетаза. При повторяемо въвеждане на инхибитор на NO синтетазата в хипокaмпа, се наблюдава редуциране на депресивното поведение (Wang et al., 2008).

Невротрофна хипотеза Невроналната пластичност е фундаментално понятие, отнасящо се до способността на ЦНС да възприема информация и да отговаря по определен начин на еднакви или подобни стимули. Това включва сензорни, познавателни, емоционални, социални и ендокринни сигнали, както и комбинации от изброените. Затова промени в пластичността може да играят важна роля в патофизиологията и лечението на психиатрични заболявания.

Невротрофната хипотеза предполага, че наличието на стрес води до атрофия на зрелите неврони в хипокампа. Подобни структурни промени се счита, че се свързват с намален обем на хипокампа в пациентите, диагностицирани с клинична депресия. Стесът може да бъде разглеждан като 2 типа: остър и хроничен стрес. Хроничният стрес е този, който е обвързан с характерните поведенчески особености на пациентите с депресия, което предполага, че той е причината за морфологичните изменения на хипокампа (Boku et al., 2018).

В пациентите с депресия се наблюдават няколко значими промени, свързани със структурата на мозъка:

 Хипокампът е един от регионите в мозъка, където все още се наблюдава делене на невронални прогениторни клетки, които дават начало на нови неврони във възрастни животни. В пациентите с депресия се демонстрира намален обем на хипокампа;  Има данни за изменения в церебралния кортекс в пациентите с депресия, включващи намален обем на префронталния кортекс и намален брой неврони и глия.

Няколко транскрипционни и невротрофични фактора имат отношение към процесите на запаметяване и памет - цАМФ отговорен елемент-свързващ протеин (CREB) и мозъчния невротрофичен фактор (BDNF).

CREB се регулира главно от каскадата на цАМФ. Функциите и експресията на този фактор могат да се повлияят при лечение с антидепресанти. В депресивни пациенти нивата на CREB в префронталния кортекс са намалени, но при лекуваните с антидепресантна терапия се установяват повишени нива.

BDNF има отношение към развитието и съзряването на невроните и неговата експресия се регулира от множество стимули, сред които стрес и психотропни лекарства. Внасянето на мозъчния невротрофичен фактор в средния мозък продуцира дълготраен и мощен антидепресивен ефект (Duman 2002). Дефицит на BDNF се открива като патогенетичен фактор за развитието на депресия и свързани афективни разстройства. Инхибитори на МАО могат да индуцират експресията на BDNF.

4. Тревожност - патогенетични механизми

Тревожността се дефинира като повтарящо се или продължително емоционално състояние, характеризиращо се със субективно чувство на нервност, раздразнимост, неприятни усещания и възприятия, съпроводени от физиологични феномени на интензивни емоции - диспнея, чувство на задушаване, палпитации, повишено кръвно налягане, изпотяване и горещи вълни (Tully et al., 2013). Тя се проявява като страх в отговор на настоящи, осезаеми заплахи или като предчувствие за бъдещи такива, които често не са дефинирани. Тревожността е нормална част от човешкия живот и има адаптивна функция. Но тя може и да достигне нива, които сериозно да пречат на продуктивността и способността на хората да вършат всекидневните си задачи. Всеки четвърти възрастен изживява тревожност в даден момент от живота си (Murrough et al., 2015). При пациентите, страдащи от тревожност, се наблюдава значителен психически и емоционален дискомфорт, както и повишена употреба на лекарства (Murrough et al., 2015). Тревожността се открива в до около 70% от хората с хронични сърдечни заболявания и може да засегне от 3.8 до 25% от популацията в зависимост от държавата (Remes et al., 2016).

Съществуват няколко форми на тревожните разстройства, които се разделят на няколко групи, в зависимост от характерните симптоми, които ги съставят. Според Диагностичното и статистическо ръководство (DSM-V) на американската психиатрична асоциация, тревожните разстройства могат да се класифицират на следните типове (American Psychiatric Association, 2013):

 Паническо разстройство - отделни епизоди, продължаващи в рамките на няколко минути със симптоми на учестена сърдечна дейност, изпотяване, треперене, недостиг на въздух, гръдна болка, замайване, чувството, че пациентът полудява и ще умре;  Пост-травматичен стрес - идва от сериозна заплаха за индивида, която се проявява със страх или ужас, като болният преживява събитието неколкократно и избягва стимули, напомнящи на травмата;  Генерализирано тревожно разстройство - чувство на обща тревога, продължаващо повече от 6 месеца и засягащо различни аспекти на живота;  Социална тревожност - страх, породен от попадането в социални ситуации, които могат да доведат до отхвърляне или засрамване на пациента;  Агорафобия - чувство на страх от попадането в ситуации, от които би било трудно да се избяга или да се получи помощ, най-честите от които са открити пространства и градски транспорт;  Сепарационна тревожност - представлява страх от раздяла с човек/ обект, към които пациентът е силно привързан;  Фобии - постоянен и засилен страх от конкретни обекти, ситуации или дейности, които като цяло не носят опасност.

Множество са патофизиологичните механизми, които се предполага, че имат участие в тревожността. Сред тях са нарушения в ГАМК-ергичната, сетонинергичната, норадренергичната медиация и невропептидите. Хиперактивност на норадренергичните неврони и повишеното отделяне на невромедиатори от терминалите им, което се наблюдава при тревожност, води до повишен брой сигнали на пост-синаптичните -рецептори, ефектите на които се разпознават като типични симптоми на заболяването.

При наличието на стрес и емоционално-натоварващи обстоятелства, се наблюдава повишено освобождаване на допамин, който достига амигдалата и потенцира функциите ѝ и поведение на отбягване. В латералната амигдала, допаминът осъществява директна инхибиция на ГАМК-трансмисията (Bissière et al., 2003). ГАМК е централният потискащ невромедиатор в ЦНС и анксиолитичните лекарства, бензодиазепини, използвани за терапия на тревожността, модулират именно неговата функция (Luscher et al., 2015). Освобождаването на ГАМК се намалява от пресинаптични допаминови рецептори (Bissière et al., 2003). Друг медиатор, който има връзка с ГАМК, е серотонинът. Серотонинови рецептори се разполагат върху ГАМК- интерневроните на хипокампа и се счита, че при хронично повишаване нивата на серотонин се наблюдава подобрена ГАМК-ергична трансмисия (Lüscher et al., 2011).

Активирането на ГАМК-интерневроните се осъществява по кортикостерон-зависим механизъм (Möhler, 2012). В частност хиперактивност на хипоталамус-хипофизарната ос води до намалено освобождаване на ГАМК и се наблюдава в пациентите с диагноза тревожност. Повишени нива на цитокини като TNFα и IL-6 имат важна роля в патофизиологията на пост- травматичните състояния и обсесивно-компулсивното разстройство и тяхното повишено ниво се асоциира с влошаване на състоянията (Furtado et al., 2015).

Постоянните промени в кортикотропин-рилизинг факторът (КРФ) се счита, че медиират връзката между стресови събития и развитието на тревожност. Клетките, съдържащи КРФ, се откриват във висока плътност в медиалния парвоцелуларен регион на хипоталамичното паравентрикуларно ядро. КРФ се освобождава в порталната васкуларна система, свързваща хипоталамус и хипофиза. Парвоцелуларните неврони представляват централният градиент на невроендокринната система, отговаряща на стрес. Висока концентрация на КРФ неврони се открива също в централните ядра на амигдалата, отговаряща за емоционалната обработка на информацията. Ендокринологично отговорите на стрес се характеризират с активиране на оста хипоталамус-хипофиза-надбъбрек. Това води до стимулация и секреция на КРФ, свързване с рецепторите му върху аденохипофизата и продукция на андренокортикотропин и -ендорфин. Адренокортикотропният хормон от своя страна стимулира секрецията на глюкокортикостероиди, чиито имуномодулиращи и метаболитни ефекти са важни за поддържане хомеостазата по време на стрес. Директното въвеждане на КРФ в мозъка на опитни животни води до множество физиологични и поведенчески промени, характерни за стрес, като намален прием на храна,

намалена репродукция, нарушения на бавновълновия сън и повишена двигателна активност в позната обстановка (Kalin, 1990). Пациентите с паническо разстройство обикновено имат нормални базални плазмени концентрации на кортизол. При пациентите с генерализирана тревожност и тези с обсесивно-компулсивно разстройство обаче не се наблюдава супресия при приложение на дексаметазон, което не е свързано със съпътстваща депресия. Счита се, че тази ендокринна проява се дължи на хипоталамична свръхсекреция на КРФ, което от своя страна води до десенситизация на хипофизните КРФ-рецептори.

При пациентите, страдащи от пост-травматичен стрес, се наблюдава повишено освобождаване на адренокортикотропин. При блокиране освобождаването на кортизол се наблюдава повишена обратна връзка на HPA оста, но също така и повишена секреция на КРФ. При пост-травматичната тревожност се откриват още повишени плазмени нива на катехоламини

и поведенческа чувствителност към 2-блокера йохимбин, който стимулира норадренергичната система по механизма на пресинаптичната обратна връзка. Тази хиперактивност на норадренергичната система отчасти може да се дължи и на повишено освобождаване на КРФ (Heim et al., 1999).

Екипът на Salari et al. проучват връзката между смущения в ГАМК-ергичната система по време на постнаталното развитие и последствията му върху индивидуалния отговор към стрес.

Активацията на ГАМКА рецептора може да повлияе поведението при тревожност и депресия в опитни животни. Установено е, че ранното постнатално приложение на ГАМК-агонист повишава тревожността и нивата на стрес-индуциран кортикостерон. Ранното постнатално третиране повишава и депресивно-подобното поведение с повишен базов кортикотропин. Тези ефекти се антагонизират с приема на ГАМК-антагонист. Това е показател за ролята на ГАМК в ранните етапи на живота, като може да повлияе тревожността и депресията чрез време- и дозазависим механизъм (Salari et al., 2015).

Съществува връзка и между нивата на серотонин и тревожността, като повишеното му освобождаване в базолатералната и латерална амигдала води до тревожност и страх. При повишаване освобождаването на серотонин, експериментални животни показват повишено време на социално взаимодействие, което предполага намалено тревожно-подобно поведение (Johnson et al., 2015).

5. Връзка между невродегенеративните и психиатричните заболявания

Под невродегенерация се разбира прогресивната загуба на функционални неврони, често свързана със структурни и невроморфологични изменения. Болест на Алцхаймер и болест на Паркинсон са двете най-разпространени форми на невродегенеративни заболявания и техния ръст расте с увеличаване продължителността на живота. Макар тези заболявания да имат различна етиология, се наблюдава значително припокриване на невробиологичните им механизми, сред които натрупването на атипични протеини, клетъчна смърт, митохондриална дисфункция и оксидативен стрес, намалена невротрофика и възпаление (Kumar et al., 2015). Когнитивният дефицит, психиатричните и поведенчески промени са част от клиничната им изява, което предполага общи патогенетични механизми (Aarsland et al., 2011). При пациентите, страдащи от невродегенеративни заболявания често се развиват като коморбидни и психиатрични такива, от които депресия и тревожност имат най-голям дял в епидемиологичнитe проучвания. В болест на Алцхаймер, честотата на тревожност варира между 32% до 46%, докато честотата на депресивната симптоматика е между 37% до 46% (Zhao et al., 2016). Психиатрична симптоматика може да се наблюдава във всеки един етап от развитието на заболяването. Депресия при пациентите, страдащи от болест на Паркинсон, се открива с честота от 50% до 75% от болните. При болните от Паркинсон с коморбидна депресия се наблюдава по-бърза когнитивна и моторна дисфункция, водещи до сериозно влошаване в качеството на живот (Reijnders et al., 2008). Честота на пациентите, които развиват тревожност, варира от 25% до 45% и нерядко тревожността съпътства депресията при страдащите от болест на Паркинсон (Leentjens et al., 2008). При такива пациенти, симптомите на болест на Паркинсон са сериозно влошени, имат значително увреждане на нормалните функции и слабо се повлияват от антидепресивна терапия (Dissanayaka et al., 2011). Рискът от развитие на психиатрична симптоматика зависи пряко от тежестта или продължителността на заболяването. Вероятните общи патофизиологични механизми между невродегенеративни и психиатрични заболявания са представени в Таблица 5.

Таблица 5. Някои общи патофизиологични механизми, лежащи в основата на психиатрични и невродегенеративни заболявания

Болест на Алцхаймер Болест на Паркинсон Намалена серотонинергична Намалена допаминергична и трансмисия (Chen et al., 2011) серотонинергична трансмисия (Konieczny et al., 2017) Променен отговор към стрес (дисфункция на HPA оста) (Morgese et al., 2014) Невровъзпалителни промени Депресия и (Gao et al., 2018) тревожност Оксидативен стрес (Rosa et al., Оксидативен стрес (Antunes et al., 2018) 2014) Нарушения в сигналните Нарушения в експресията на пътища на BDNF (Gao et al., BDNF (Caudal et al., 2015) 2018) Намалена синаптична плътност Лекарство-индуцирани промени и функция (Hao et al., 2015) в неврогенезата (Chiu et al., 2015) Когнитивен дефицит (Ledo et Когнитивен дефицит (Goes et al., al., 2013) 2014)

Връзка между болест на Алцхаймер и психиатрични заболявания

При възрастни пациенти, страдащи от болест на Алцхаймер в ранен етап се забелязва атрофия в лимбичната система и фронталния кортекс, които се откриват и при пациентите, страдащи от хронична депресивна симптоматика (Sacuiu et al., 2016). Счита се, че засягането на кортиколимбичната система е критично за фундаментални аспекти на когнитивните и емоционални процеси, сред които взимането на решения, адекватния отговор към стимули на средата и регулация на настроението (Anand et al., 2009). При пациентите, страдащи от болест на 44

Алцхаймер се забелязва намаляване в броя на серотониновите и норадренергични неврони, както и в нивата на самите медиатори (Hendricksen et al., 2004). Наблюдава се още нелективна загуба на допаминергични неврони в мезолимбичната система, което допринася за невропсихиатричните симптоми (Trillo et al., 2013). Нараства ролята и на други медиатори като глутамат и ГАМК, които допринасят за моноаминния дисбаланс при болест на Алцхаймер. Това е в съотвествие с факта, че антидепресантната терапия има бързи ефекти върху нивата на моноамини, но отложената и терапевтична полза се дължи вероятно на промени в глутаматните, ГАМК-рецепторите и невропластичните процеси (Khundakar et al., 2015). При болест на Алцхаймер и психиатрични заболявания се наблюдава дисрегулация на HPA оста. Съгласно литературните данни, хроничният стрес е важен фактор за развитието на депресия и стимулира натрупването на протеини и изявата на когнитивен дефицит (Dong et al., 2012). Дисфункцията на хипоталамус-хипофизарната ос може да е резултат и от прогресията на заболяването (Du et al., 2015). Друг важен общ механизъм на болест на Алцхаймер и депресия е наличието на невронално възпаление с повишени концентрации на възпалителни цитокини като IL-1, IL-6 и TNF. Тези медиатори могат да повлияят патогенезата на двете заболявания чрез взаимодействие с невроналния растеж, диференциация и оцеляване, както и със синаптичната активност (Santos et al., 2016). Повишеното освобождаване на възпалителни протеини може да допринесе за натрупването на А и формирането на плаки, което медиира синаптичната дисфункция на кортекса (Glass et al., 2010). Повишените нива на кортикостероиди, при наличието на възпаление, може да променят експресията на невротрофични фактори като BDNF (Suri et al., 2013). Това предполага, че намалените нива на BDNF и дисфункцияta на HPA оста водят до субкортикални и кортикални промени в болест на Алцхаймер и депресия (Duman et al., 2006).

Връзка между болест на Паркинсон и психиатрични заболявания

Съгласно литературните данни, при пациентите с болест на Паркинсон и депресия се откриват промени в обема и плътността на кортекса във фронтотемпоралния лоб, амигдалата и региони от малкия мозък (Chagas et al., 2017). Намален обем на хипокампа се детектира при болест на Паркинсон с коморбидна депресия (van Mierlo et al., 2015). Нарушения в серотониновата невромедиация увеличават риска от развитие на депресия и тревожност при болест на Паркинсон.

При модели на болест на Паркинсон се наблюдава намалена експресия на серотонинов транспортер и развитие на не-моторни симптоми, сред които и депресивно-подобно поведение (Taylor et al., 2009). Понастоящем се приема, че ключовите невропатологични изяви на депресия и болест на Паркинсон се дължат на повишен клирънс на серотонин и загуба на серотонинергични неврони (Politis et al., 2015). При двете заболявания се отчита още загуба на допаминергични и норадренергични неврони в лимбичната система (Remy et al., 2005). При болест на Паркинсон се установява повишена активност на невроните за кортикотропин-освобождаващ хормон и наличието на хроничен стрес води до обостряне на поведенческата дисфункция и дегенерация на допаминергичната система (Hemmerle et al., 2014). Невроналното възпаление също играе роля в развитието на болест на Паркинсон. Установени са повишени нива на IL-1, IL-6 и TNF в мозъка и кръвната плазма, като нивата им корелират с присъствието и тежестта на депресивна симптоматика. Пациентите, при които болест на Паркинсон протича с коморбидна депресия имат значително повишени нива на тези маркери в гръбначно-мозъчната течност (Lindqvist et al., 2012).

6. Антиоксидантни и психофармакологични ефекти на биологично активните вещества в род Chaenomeles

6.1. Психофармакологични ефекти на флавоноиди

Счита се, че са няколко невромедиаторите, участващи в патофизиологията на

тревожността, сред които е и ГАМК. ГАМКА рецепторът е йонен канал, който позволява навлизане на хлоридни йони под действието на гамааминомаслена киселина, водещо до хиперполяризация и намалена способност за генериране на нервни импулси. Повлиявайки

ГАМКА рецептора действат и едни от най-широко използваните лекарства за облекчаване на тревожност - бензодиазепините. По подобен механизъм оказват влиянието си и флавоноидите еквол и 7,3‘-дихидроксиизофлавон - като лиганди на бензодиазепиновите рецептори. Счита се, че тези полифенолни компоненти могат да потиснат невродегенерацията при болест на Алцхаймер, болест на Паркинсон, епилепсия и да подобрят паметта и когнитивните функциии (Rehman et al., 2019).

Краткосрочен прием на двата флавоноида апигенин и хризин показва сравним потенциал да повлияват двигателната активност и тревожното поведение на плъхове. И двете вещества се инжектират на плъховете в минималните им ефективни дози - 25 mg/kg, като хризин води до изразен анксиолитичен ефект при 1 mg/kg, докато апигенин проявява подобна активност при по- висока доза (Zanoli et al., 2000). Хризинът, тестван в модел на тревожност, показва анксиолитично-подобно действие чрез активация на бензодиазепинови рецептори. Действието на флавоноида е по-слабо от това на стандарт, Diazepam, и затова се приема, че е парциален агонист (Paladini et al., 1999). Апигенин дължи анксиолитичните си свойства на стимулиране на ГАМК- активността. Инжектиран интраперитонеално, апигенин предизвиква седация в мъжки плъхове, без да проявява чист анксиолитичен ефект и миорелаксиращ ефект. Подложени на тест открито поле, животните, третирани с апигенин, показват значително редуциране на двигателната активност в сравнение с контролните животни (Avallone et al., 2000).

За облекчаване на депресивна симптоматика, полезни се оказват ефектите на флавоноиди върху моноаминергичната медиация в ЦНС. Опити с кверцетин показват антидепресивно- подобна активност при мишки със стрептозотоцин-индуциран диабет (Anjaneyulu et al., 2003). Според авторите кверцетинът има потенциал да бъде използван като терапия при депресия, коморбидна с диабет. Кверцетинът е един от флавоноидите, които се откриват в ПСХМ и е считан за един от най-важните носители на неврофармакологична активност в класа на фенолните съединения.

Антидепресивно-подобната си активност кверцетин дължи на взаимодействие с HPA оста, което се изразява в намаляване експресията на КРФ (Holzmann et al., 2015). Друг механизъм, обясняващ активността на кверцетин е чрез инхибиране на оксидативния стрес и предотвратяване на поведенческите и биохимични ефекти, до които стресът води (Rinwa et al., 2013). Флавонолите кверцетин и кемпферол, флавонът апигенин и стилбена транс-резвератрол инхибират активността на МАО. В резултат на това се повишават нивата на серотонин, норадреналин и допамин, на които може да се дължи антидепресивно-подобното действие на гореизброените БАВ. Освен това флавоноидите намаляват оксидативния стрес на невроналната ДНК и инхибирайки МАО-А и МАО-Б проявяват невропротективен ефект (Manach et al., 2004).

Флавоноидната фракция от сух екстракт на Hypericum perforatum се състои в голяма степен от кверцетин и негови метаболити. При приложението ѝ значително намалява неподвижността на 47

плъхове в тест принудително плуване, което се обяснява с антидепресивно-подобен ефект. Понастоящем Hypericum perforatum се приема като добра алтернатива на конвенционалните антидепресанти за лечението на лека до умерена форма на депресия. Според авторите на изследването, флавоноидната фракция от Hypericum perforatum повишава нивата на серотонин, норадреналин и допамин и по този начин намалява депресивната симптоматика (Calapai et al., 2001).

Други флавоноиди, които се откриват в ПСХМ, са катехин и епикатехин. И двете вещества проявяват антидепресивно-подобни свойства, оценени чрез намаляване времето на неподвижност в тест за принудително плуване. Един от механизмите, на които може да се дължи психофармакологичната им активност, е чрез стимулация на мелатониновите рецептори. Тъй като катехин е по-мощен агонист на тези рецептори, се оказва, че антидепресивно-подобния му ефект е по-изразен от този на епикатехин и е доза-зависим (Geng et al., 2019). Литературните данни сочат още, че антидепресивно-подобната активност на катехин може да се дължи на блокиране обратното връщане на моноамини в ЦНС (Rocha et al., 2007). Приложението на катехин се свързва с анксиолитично-подобни и антидепресивно-подобни ефекти, които частично се обясняват с невропротективните и противовъзпалителните му свойства (Liu et al., 2013). Последните се дължат на намалено освобождаване на КРФ при хроничното третиране с катехин (Lee et al., 2013).

Ментоловият екстракт от цветове на Hibiscus rosa-sinensis Linn. е с богато съдържание на флавоноиди. Антидепресивната им активност се оценява в поведенчески тестове - тест провисване на опашка и принудително плуване. Животните са третирани с ниски дози Haloperidol, Prazosin и p-chlorophenylalanine, които водят до изразено време на неподвижност.След това на животните се прилага екстрактът. Резултатите от приложението му показват намаляване на времето на неподвижност. Антидепресивно-подобният му ефект е сравним с този на стандарт като Imipramine. Удълженото време на неподвижност, предизвикано от приложението на Haloperidol, Prazosin и p-chlorophenylalanine също се антагонизира от приложението на екстракта. Тези ефекти показват, че екстрактът и съдържащите се в него флавоноиди взаимодействат с допамин, норадреналин и серотонин, за да постигнат антидепресивния си ефект (Shewale et al., 2012).

Екстрактът от семки на Monodora tenuifolia е богат на флавоноиди и се счита, че на него се дължи антидепресивното действие на растението. Изследван върху експериментални животни в 48

модел на стрес, екстрактът води до значително повлияване на депресивно-подобното поведение в тест за принудително плуване. Резултатите могат да се сравнят с антидепресивните ефекти, постигати при третиране с Fluoxetine. Флавоноидната фракция в голяма степен подобрява действието на антиоксидантните ензими супероксид дисмутаза, намалява нивата на глутатион, протеини и нитрати в мозъка на стресираните животни, с което се обяснява антидепресивно- подобния ефект (Ekeanyanwu et al., 2015).

Все повече доказателства сочат, че полезните ефекти на флавоноиди върху мозъка се дължат на способността им да модулират клетъчните функции, отговорни за процесите на запаметяване. Флавоноидите достигат мозъка в достатъчни концентрации, дори в рамките на нанограмове, които повлияват рецептори, кинази и транскрипционни фактори. Повлияването на CREB от флавоноидите се дължи на екстрацелуларната сигнал-регулирана киназа (ЕРК). Фисетин, изолиран от ягоди, подобрява разпознаването на обекти по механизъм, зависещ от активирането на ЕРК и CREB. По подобен начин флавонолът епикатехин индуцира ЕРК и CREB в коровите неврони и повишава CREB-регулираната генна експресия (Schroeter et al., 2007). Други флавоноиди, като хесперетин, също са способни да повлияят активирането на ЕРК сигнализацията в мозъка в наномоларни концентрации. Флавоноидите, екстрахирани от боровинки, активират CREB и повишават експресията на мозъчния невротрофен фактор (Williams et al. 2008). Това може пряко да повлияе региони на мозъка, отговорни за подобряване на паметта и контрола на синаптичната пластичност. Понижени нива на мозъчния невротрофен фактор се асоциират със загубата на дългосрочната памет про невродегенративни заболявания като болест на Алцхаймер и болест на Паркинсон (Peng et al. 2005). Счита се, че приемът на флавоноиди може да подобри паметта и особено да запази познавателните функции в процеса на стареене (Spencer et al., 2009).

6.2. Антиоксидантни свойства на флавоноиди

Антиоксидантни свойства са описани в литературата за всички видове Chaenomeles, изследвани чрез нивата на ABTS, FRAP и DPPH. Нивата на ABTS показват активност на пероксидазни ензими и позволяват да се определи количествено водородния пероксид в дадена проба. FRAP намира приложение за характеристика на антиоксидантния капацитет на храни и 49

напитки, съдържащи полифеноли. DPPH-анализът се използва при оценка на антиоксидантна активност, тъй като самото вещество DPPH представлява стабилни молекули от свободни радикали. Веществата, които допринасят най-изразено за антиоксидантния капацитет на плодовете от род Chaenomeles, са полифенолите. От флавоноидите в най-високи концентрации са катехин, епикатехин, кверцетин и процианидинови олигомери (Du et al., 2013).

При изследване антиоксидантната активност на Chaenomeles japonica се установява, че отговорни за активността ѝ са главно флавоноиди и фенолни киселини, както и витамин С до по- слаба степен (Nowak et al., 2018).

Катехин и епикатехин проявяват антиоксидантен потенциал, който се осъществява чрез директни и индиректни механизми. Директните механизми включват улавяне на свободни радикали и хелатиране на метални йони. Индиректните механизми са свързани с индуциране на антиоксидантни ензими, инхибиране на про-оксидантни езними и продуциране на детоксикиращи ензии (Youn et al., 2006). Катехин и епикатехин дължат директните си механизми на действие на фенолните хидроксилни групи, които са способни да стабилизират свободни радикали (Fraga et al., 2010). Фенолните хидрокси групи могат да реагират с реактивните кислородни и азотни радикали, с което водят до прекъсване генерирането на нови радикали. Катехините са донори на електрони от фенолните хидрокси групи, чрез които могат да редуцират свободните радикали, запазвайки стабилността на ароматните си ядра (Fan et al., 2017). Следователно антиоксидантният капацитет е в пряка връзка с броя на хидроксилните групи. От катехините, епикатехин има по-изразени антиоксидантни свойства от катехин и по-ефективно предотвратява окислението на клетъчните липиди (Bernatoniene et al., 2018).

Индиректните антиоксидантни механизми на катехин и епикатехин включват регулация на протеиновата синтеза и сигнални пътища (Fan et al., 2017). Приложението на катехин води до значително повишена активност на супероксид дисмутазата, каталазата и глутатион пероксидазата, които са антиоксидантни ензими. Катехините могат да инхибират про-оксидантни ензими или да модулират взаимодействието на TNF с рецепторите му, с което да потискат възпалителни процеси, свързани с високи нива на оксидативен стрес (Fan et al., 2017).

Друг флавоноид, който се открива с ПСХМ, е кверцетин, който е считан за един от най- силните антиоксиданти в семейството на флавоноидите. Притежава улавяща свободни радикали 50

активност и инхибира липидната пероксидация, която има роля в развитието на невродегенеративни като болест на Алцхаймер и болест на Паркинсон (D'Andrea, 2015). Кверцетин повишава нивата на глутатион, с което допринася за превенция генерирането на нови радикали (Ansari et al., 2009). С намаляване на оксидативния стрес, кверцетин допринася и за намаляване на възпалителните отговори (Hollman et al., 1997).

6.3. Психофармакологични ефекти на проантоцианидини

Процианидините представляват вид полифеноли, съдържащи различни количества катехин и епикатехин в структурите си (Jinjing et al., 2013). В зависимост от степента на полимеризация, могат да бъдат диполимери-тетрамери, означавани накратко като олигомери или да бъдат процианидинови полимери (Wiesneth et al., 2015). Процианидин Б представлява димер, състоящ се от две молекули флаван-3-ола епикатехин и се открива в ПСХМ. Литературните данни сочат, че приложението му води до подобряване на моторната координация, изследователското поведение и когницията, свързани с модел на шизофрения при мишки (Tian et al., 2018). В допълнение, приложението му показва и противовъзпалителни свойства (Zhang et al., 2006). Процианидини, съдържащи се в дроги от канела, водят до активация на протеин киназа-А и CREB, при което се наблюдава завишена експресия на невротрофни фактори, сред които и на BDNF, имащи роля в патогенезата на депресия, тревожност и невродегенративни заболявания (Jana et al., 2013).

Някои компоненти на храната, сред които и проантоцианидини, могат да потискат активността на МАО в глиални клетки, чиято абнормална активност се свързва с психиатрични и неврологични заболявания като депресия и болест на Паркинсон (Xu et al., 2005). Проантоцианидините имат способността след еднократен орален прием да намаляват времето на неподвижност в поведенчески тестове за депресивно-подобно поведение в мишки. Проучванията показват, че проантоцианидини повлияват главно концентрациите на серотонин във фронталния кортекс, хипокампа и хипоталамуса след 7-дневна употреба. Подобни са ефектите върху нивата на норадреналин, като концентрациите му търпят повишение в хипокампа и фронталния кортекс. След 7-дневно приложение на проантоцианидините са установени и завишени стойности на допамин в същите мозъчни зони (Xu et al., 2010). 51

Счита се, че в пациентите, които страдат от депресия с намалена моторна активност, се откриват ниски нива на метаболити на допамина (Clausius et al., 2009). Проантоцианидините в по- ниските си дози могат да инхибират МАО-А, а в по-високите и МАО-Б. МАО-Б инхибиторите повишават главно нивата на допамин, имат роля в патогенезата на депресията и могат да проявяват невропротективни свойства (Bortolato et al., 2008). В модел на липополизахарид- индуцирана депресия и тревожност, приложението на процианидини води до модулация на NF- B в хипокампа, префронталния кортекс и амигдалата. Чрез този механизъм се постига намалена експресия на COX-2 и някои възпалителни цитокини, както и анксиолитично-подобни ефекти в поведенчески тестове при мишки (Jiang et al., 2017).

6.4. Антиоксидантни свойства на проантоцианидини

Процианидините са добри антиоксиданти, чиито антиоксидантни свойства надвишават тези на витамини С и Е (Feng et al., 2010). Способни са да подобряват антиоксидантната ензимна активност главно в тъканите и по-слабо в серума. Процианидините съдържат множество фенолни хидрокси групи, които могат да освобождават протони, да свързват кислородни радикали и да блокират каскадното освобождаване на още свободни радикали (Bagchi et al., 2000). Също така е установено, че приемът на процианидини може да антагонизира етанол-индуциран оскидативен стрес. Острото третиране с различни концентрации на етанол се съпровожда с увреждане на ДНК в хипокампа и церебелума, а хроничното води до засягане още и на хипоталамуса и кортекса. Олигомерни и полимерни процианидини от гроздови семки, приемани преди третирането с етанол, водят до протективни ефекти спрямо ДНК увреждането (Guo et al., 2007). Процианидини имат невропротективни свойства и при мозъчна исхемия, при която се наблюдават понижени нива на глутатион пероксидаза и завишени нива на малоналдехид. Последните се считат за индекс на повишен оксидативен стрес. Приложението на гроздови процианидини води до повишена активност на глутатион пероксидазата и понижени нива на малоналдехид (Kong et al., 2017).

При изследването на процианидин Б се установява, че има преки ефекти върху възстановяването и поддържането на хомеостазата на организма (Martinez-Micaelo et al., 2015). Проучвания показват, че процианидин Б подобрява функциите на антиоксидантните ензими и предпазва от възникването на оксидативен стрес чрез регулация на клетъчните защитни 52

механизми (Yang et al., 2015). Ефектите на процианидин Б са свързани с протективно действие спрямо миелиновата обвивка при наличието на интоксикация (Tian et al., 2018).

Оксидативният стрес е фактор, който може да доведе до понижаване нивата на pH и оттам - тъканна ацидоза (Patel, 2017). Това може да е свързано с прояви на болка и възпаление, например при подагра. Приемът на процианидини намалява болката, дължаща се на подагра и облекчава отока на ставите. Също така процианидини потискат завишените от натриев урат нива на IL-1, както и освобождаването на кислородни радикали (Liu et al., 2017). Процианидини са способни да инхибират транслокацията на NF-B в микроглията и клетъчния отговор към някои възпалителни маркери, което облекчава невропатична болка (Pan et al., 2018).

Процианидини и проантоцианидини показват невропротективни свойства в модели на болест на Паркинсон и болест на Алцхаймер. Последните са свързани с намаляване увреждането на допаминергичните неврони в присъствието на токсин, както и с подобряване паметта и заучаването на информация, повишаване нивата на глутатион пероксидаза и експресията на някои протеини, имащи отношение към невроналната протекция в хипокампа (Strathearn et al., 2014). В модели на болест на Алцхаймер, проантоцианидините потискат агрегацията и продукцията на бета-амилоид, формирането на плаки и дължащата се на това невротоксичност (Wang et al., 2009).

6.5. Психофармакологични ефекти на фенолни киселини

Фармакотерапията с антидепресанти се базира именно на лекарства, повлияващи моноаминните медиатори, повишавайки техните, най-често чрез блокиране на механизмите им за обратно връщане в пренасинаптичните неврони. Доказано е, че повлияването само на един моноамин облекчава депресивната симптоматика в твърде ограничен процент от пациентите (Hamon and Blier, 2013).

Повечето от растителните видове, които имат доказани ефекти върху депресия и тревожност, имат в състава си високо ниво на фенолни киселини. Фенолните киселини имат често ефекти и върху тревожността, въздействайки върху описаните медиатори (Tyrer and Baldwin, 2006). Хлорогеновата киселина е един от компонентите на ПСХМ, които са често срещани и в

други растителни видове и имат доказани антидепресивни, анксиолитични и антиноцицептивни свойства при остро приложение. Установено е, че тези ефекти са свързани с въздействие върху

бензодиазепиновия рецептор на ГАМКА, както и с участие на опиоидната система (Yasar et al., 2013). Изследвана в тест повдигнат кръстосан лабиринт, хлорогеновата киселина повишава времето прекарано в откритите рамена до стойности сравними с тези на Diazepam. При въвеждане на блокер на бензодиазепиновите рецептори, Flumazenil, този ефект не се наблюдава, което

доказва алостеричното ѝ въздействие върху ГАМКА. Има данни, че в различните си дози хлорогеновата киселина може да повлиява двигателната активност, но също и чувството на страх и тревожност при мишки (Bouayed et al., 2007).

Хлорогеновата киселина и нейният метаболит, кафеената киселина, подобряват паметта, намаляват тревожността и предпазват от продукцията на ТБКРС в модел на диабет при мишки. Счита се, че тези ефекти се дължат на намаляване активността на ацетилхолинестеразата (Stefanello et al., 2014). Хлорогеновата киселина повишава доза-зависимо нивата на -ендорфин, което може да се окаже важен фактор за повлияване на депресивни състояния (Park et al., 2010).

Хлорогеновата киселина се съдържа в големи количества в зърната от кафе и нейните ефекти наподобяват тези на кофеина, който предизвиква повишпена двигателна активност като резултат от психомоторна стимулация (Ammon and Künkel, 1976). Психостимулиращият ефект на хлорогеновата киселина се обяснява с частичното ѝ превръщане в кафеена киселина. Ефектът може да бъде проследен чрез измерване на спонтанната двигателна активност на мишки след прием на горепосочените вещества. Установява се доза-зависимо повишаване на локомоцията, подобно на приема на кофеин (Ohnishi et al., 2006). Този ефект обаче не се дължи на блокиране на аденозинови рецептори, както е при кофеин.

Феруловата киселина, като още един важен компонент на ПСХМ, достига до терапевтични нива в хипокампа и тънките черва, откъдето се наблюдават паралелно антидепресивни и прокинетични свойства, които са сравними с контролните лекарства. Тези ефекти се свързват с инхибиране обратното връщане на серотонин в мозъка и периферията и съответно повишаване нивата му. Освен 5-НТ, феруловата киселина повишава още и нивата на допамин и норадреналин (Zhang et al., 2011). Приемана по време на алкохолна абстиненция, феруловата киселина доказано намалява проявите на тревожност и депресия, чийто невробиологичен произход се обяснява с

повлияване на ГАМКА, серотониновите, адренергични и аденозинови рецептори (Kotwal et al., 54

2015). Приложението на ферулова киселина в пациенти, страдащи от деменция и деменция с телца на Леви, води до ефективно подобряване на поведенческите и психологични симптоми на заболяванията (Kimura et al., 2011). Промените в настроението, които могат да се характеризират и като депресивно-подобни при тези заболявания, са свързани с променени нива на моноаминни медиатори в регионите на хипокампа и фронталния кортекс.

Феруловата киселина в дози 10, 20, 40 и 80 мг/кг в животни повишава нивата на серотонин и норадреналин, без да има ефект върху двигателната активност. Счита се, че феруловата киселина инхибира главно МАО-А в дози 40 и 80 мг/кг, без да се засяга особено активността на МАО-Б (Chen et al., 2015). Феруловата киселина проявява значими анксиолитични свойства в дози 100 и 200 мг/кг при плъхове в модел на тревожност и моторна дискоординация индуцирани от натриев глутамат (Sandeep et al., 2018). Наблюдават се и антидепресивно-подобни ефекти на ферулова киселина в модел на хроничен непредсказуем стрес се обясняват чрез способността ѝ да повлиява активирането на про-инфламаторните цитокини в префронталния кортекс (Liu et al., 2017).

6.6. Антиоксидантни свойства на фенолни киселини

Формирането на свободни кислородни радикали се приема като един от важните механизми, водещи до клетъчна смърт в множество невродегенеративни заболявания, като болест на Алцхаймер и болест на Паркинсон. Свободните радикали са способни да окисляват различни биологични макромолекули и особено чувствителни на това действие са невроните. В серумните гранулоцити на мишки с индуцирана тревожност се откриват по-високи нива на оксидативен стрес, отколкото при животни без тревожност или с умерена тревожност (Bouayed et al., 2007). Претретиране на гранулоцитите с хлорогенова киселина потиска генерирането на кислородни радикали. Възможно е също така този антиоксидантен ефект да се дължи на директно свързване

на фенолните ѝ хидроксилни групи с H2O2 радикалите (Bouayed et al., 2007).

В последните години нараства ролята на оксидативния стрес като фактор в патофизиологията на депресията и тревожността, както и опитите за техното лечение с антиоксиданти. Хроничното приложение на ферулова киселина модулира антиоксидантните

системи в кръвта, хипокампа и церебралния кортекс, като повишава нивата на супероксид дисмутаза в кръвта, каталазата в кръвта и церебралния кортекс, глутатион пероксидазата в церебралния кортекс и намалява ТБКРС. Тези свойства на феруловата киселина се проявяват в ниски дози и са свързани с антиоксидантна активност (Lenzi et al., 2015).

В модел на пентилен тетразол-индуцирана епилепсия се наблюдава влошаване на заучаването и паметта, невронално увреждане и загуба на неврони в лимбичната система, както и образуване на свободни радикали и глутамат. Приложена в този модел феруловата киселина потенцира ГАМК-невротрансмисията, намалява образуването на маркери на апоптозата и на свободни радикали (Kanski et al., 2002), с което демонстрира протективни ефекти спрямо загубата на неврони и невродегенерацията (Hassanzadeh et al., 2017). Образуването на свободни радикали се асоциира още с повишаване нивата на кортикостероиди в мозъка на гризачи, чиито структури са силно податливи на увреждане от оксидативен стрес. В зависимост от увредените региони е възможно да се наблюдават поведенчески промени включително депресивно-подобни (Freitas et al., 2016). Феруловата киселина може да повлияе благоприятно тези промени чрез активиране на сигнални пътища, отговорни за невропластичността, неврогенезата и клетъчното оцеляване (Zeni et al., 2012). Също така приемът на ферулова киселина намалява оксидативния стрес при хроничното приложение на кортикостероиди и антагонизира индуцирания от тях модел на депресия (Zeni et al., 2017).

Някои химични структури от растителни източници показват обещаващи резултати като антиоксиданти в терапията на невропатии в животни (Aswar, 2016). Като такива се обсъждат хлорогенова, кафеена и ферулова киселина за лечение на невропатична болка (Sanklecha et al., 2017). Ваниловата киселина също демонстрира способност да инхибира освобождаването на TNF, IL-6, циклооксигеназа-2 и азотен оксид, които имат роля във възпалителните процеси (Kim et al., 2011). В модел на невропатична болка в животни се наблюдава понижаване в нивата на редуциран глутатион, чийто нива се възстановяват значително след приложението на ванилова киселина. Това откритие затвърждава антиоксидантните ѝ свойства. Приложението ѝ също така води до частично възстановяване на засегнатите нервни влакна с отслабване на отока и неутрофилната инфилтрация (Pawar et al., 2020).

6.7. Проучени досега ефекти на видовете от род Chaenomeles

6.7.1. Ефекти на видове от род Chaenomeles върху възпалителните процеси

Важни компоненти на етанолния екстракт на Chaenomeles speciosa (EECS), притежаващи биологична активност, са епикатехин и хлорогенова киселина. Tяхната биологична активност е тясно свързана със способността им да взаимодействат с двойния липиден слой на мембраните (Strugala et al., 2016). Амфифилните им свойства са отговорни за взаимодействията не само с повърхностния липиден бислой чрез полярните глави, но също и с по-дълбоко разположената хидрофобна част. Нарушения в структурата и функциите на мембраните често се дължат на пероксидация на липидите им. Образуването на свободни радикали е процес, важен за нормалната физиология на живия организъм, но по време на оксидативен стрес нивата им се покачват и могат да отключат различни заболявания като атеросклероза, инсулт, сърдечно-съдови заболявания и други.

Chaenomeles speciosa показва противовъзпалителен потенциал, дължащ се главно на инхибиране ензимите от циклооксигензаната група - COX-1 и COX-2 (Таблица 6). COX-1 е отговорна за продукцията на простагландини, имащи протективни свойства по отношение мукозата на гастроинтестиналния тракт, докато COX-2, наричана още индуцируема форма, участва в синтеза на простагландини, които медиират процесите на възпаление, болка и треска. Алкохолният екстракт от Chaenomeles speciosa има способността да блокира и двете форми на циклооксигеназа и постига 18% инхибиция на липоксигеназа-1 при концентрации 8µg/mL (Zhu et al., 2012).

Таблица 6. Стойности на IC50 за екстракт от японска дюля и индометацин, концентрации, при които се постига инхибиция на 50% от активността на циклооксигеназа- 1(COX-1) и циклооксигеназа-2 (COX-2). Източник: (Strugala et al., 2016)

Вещество IC50 (µg/ mL) COX-1 COX-2 Екстракт от C. speciosa 150.44±11.15 72.10±8.10 Indomethacin 9.15±0.23 7.60±0.68

При сравнение на противовъзпалителните свойства на екстракта от Chaenomeles speciosa със стандарт като индометацин се вижда, че нестероидното противовъзпалително потиска циклооксигеназните ензими при по-ниски концентрации, но има странични ефекти, свързани с храносмилателен тракт и бъбреци. Индометацин потиска в по-голяма степен COX-1, което е пряко свързано с нежеланите му ефекти, докато ЕЕСS показва по-голяма селективност към COX- 2, отколкото към COX-1.

Важна биологична способност на етанолния екстракт е и възможността му да взаимодейства с мембранния бислой на клетките. Установява се, че компонентите на екстракта се разполагат в липидния бислой и особено край групите, носители на хидрофобния му характер и могат да инхибират взаимодействието на свободни радикали с клетъчната мембрана. EECS проявява мембранно-стабилизиращ ефект, който може да се дължи на антиоксидантните свойства на съдържащите се в него флавоноиди (Strugala et al., 2016).

Видът Chaenomeles speciosa се характеризира с разнообразна фармакологична активност като имуномодулаторна, антитуморна и антиоксидантна (Xie et al., 2007). С висок противовъзпалителен и имуномодулиращ потенциал се открояват гликозидите, съдържащи се във вида, които показват полезни терапевтични ефекти върху колаген-индуциран артрит. Етанолният екстракт от Chaenomeles speciosa и негов водноразтворим полизахарид се изследват за противовъзпалителни и имуномодулиращи свойства върху клетъчни култури, подложени на липополизахарид-индуцирано възпаление. Проследяват се производството на азотен оксид и виталността на клетките, както и нивата на клетъчна апоптоза и гените, отговорни за възпалителен отговор. Липополизахаридът има способността да индуцира възпаление, което се инхибира в значителна степен от етилацетатната фракция на Chaenomeles speciosa и неговия полизахарид. Етанолният екстракт на плода значително потиска индуцируемата форма на NO синтетаза чрез намаляване нивата на иРНК, докато водноразтворимият полизахарид намалява генната индукция на IFN-y, TNFα, G-CSF и други цитокини (Lee et al., 2007; Zhu et al., 2012).

Фигура 9. Ефекти на Chaenomeles speciosa върху липополизахарид-индуцираното възпаление. Механизми на инхибиция и активация на фактори на възпалението. Източник: (Zhu et al., 2012)

Противовъзпалителните ефекти на Chaenomeles sinensis се доказват и в колаген-индуциран артрит у мишки, имунизирани на 2 пъти с говежди колаген тип 2 и след това третирани с екстракт от японска дюля. Установява се значително повишаване продукцията на цитокини и генна експресия. След орален прием на есктракт от растението се наблюдава потискане прогресията на заболяването с намалена деструкция на колянния хрущял, инхибирана продукция на TNFα и IL-6 в серум, редуцирано освобождаване на хистамин от мастоцитите, потискане липооксигеназната и циклооксигеназната активност чрез инхибиране възпалителни фактори от каскадата на

арахидоновата киселина - левкотриен В и PGE2 (Park et al., 2014).

Полифенолите са известни отдавна със своите положителни ефекти върху възпаление и оксидативен стрес, като проучвания върху тях доказват имуномодулаторен потенциал (Decendit et al. 2013; Mossalayi et al., 2014; Riegsecker et al., 2013). Химически полифенолите притежават едно или няколко ароматни ядра с една или повече хидрокси-групи позволяващи „улавянето” на свободни радикали (Rahman et al., 2006). Противовъзпалителният им капацитет се дължи на способността им да регулират експресията на антиоксидатни ензими на ниво генна експресия (Wallerath et al., 2002).

6.7.2. Ефекти на видове Chaenomeles върху ЦНС

Загубата на допаминергични неврони е една от водещите причини за развитие на болест на Паркинсон, депресия и депресивно-подобни състояния. Допаминовият транспортер (ДТ) представлява регулиращ протеин, участващ в предаването на информация в допаминергичната система. Той представлява мембранен протеин, експресиран предимно в екстрапирамидната система и принадлежи към Na+/Cl—зависимите транспортери. ДТ се експресира от всички допаминергични неврони в substantia nigra и вентралната тегментална зона, като неговата плътност е най-висока в стриатума и nucleus accumbens (Brooks, 2016). При животни с дефицит на ДТ се наблюдават двигателна хиперактивност и импулсивност (Salatino-Oliveira et al., 2018).

Вещества, които директно или индиректно инхибират ДТ, могат да се използват за подобряване моторните симптоми на болест на Паркинсон. Такава терапия се основава на факта, че с блокиране допаминовия транспортер се намалява обратното връщане на допамин и съответно се удължава действието на медиатора върху рецепторите му. Допаминергичната система участва в регулацията на множество функции в ЦНС, сред които сензорните възприятия, освобождаването на пролактин, телесната температура, апетита, поведенческите процеси и взимането на решения (Bodea and Blaess, 2015). При приложението на психостимуланти като Amphetamine, които действат главно чрез ДТ, може да се забележи повишена двигателна активност и мотивация (Verma, 2015).

Изследван е водният екстракт от изсушен плод на Chaenomeles speciosa върху клетки от яйчници на китайски хамстери, експресиращи допаминов транспортер, серотонинов транспортер, миши ГАМК транспортер или човешки транспортер за норадреналин. Проучването се провежда in vitro. Проследени са също така и поведенческите реакции на животни след третиране с екстракта. Използвани са мъжки Sprague-Dawley плъхове, които първо са анестезирани и след това третирани с 6-хидроксидопамин, за да се предизвикат леки или средни по тежест паркинсоноподобни симптоми. В последствие на животните е приложен екстракта от Chaenomeles speciosa за 8- или 14-седмичен период за лекия и средно тежкия модел на Паркинсон съответно.

Ефектите на водният екстракт върху поведенческите и невродегенеративните промени се проследяват чрез ротарод тест, който измерва времето, което животното прекарва преди да падне 60

от колелото. Животните от различните групи са третирани с различни концентрации на 1-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), който предизвика допълнителна токсичност и изчерпване на допамин в клетките, експресиращи ДТ (Фигура 10). Животните, третирани с MPTP показват спонтанен моторен дефицит, изразяващ се в неподвижност и тремор (Song et al., 2012).

Фигура 10. Връзка между растителни източници с анти-паркинсонови свойства и невротоксични модели на болест на Паркинсон. Източник: (Song et al., 2012)

Екстрактът от Chaenomeles speciosa в концетрации 1-1000g/ ml показва доза-зависимо инхибиране на допаминовото обратно връщане. Инхибиторният ефект се проявява върху допаминергичните синаптозоми от стриатума. Третираните с воден екстракт животни имат повишен брой клетки, експресиращи ДТ и повишени на нивата на допамин в синаптичното пространство (Song et al., 2012).

Приложението на екстракта води до частично възстановяване на допаминовата загуба в лезирана substantia nigra от 6-хидроксидопамин. Особено добре се повлияват животните с лекия модел на болест на Паркинсон, на които е приложен екстракта. Според авторите на проучването, това се дължи на инхибиране на ДТ (Song et al., 2012).

Фигура 11. Селективен инхибиторен ефект на различни концентрации воден екстракт от Chaenomeles speciose върху допамоновия ъптейк на D8-клетки от яйчници на китайски хамстер, експресиращи ДТ. Резултатите показват и повлияването на N1, S6 и G1-клетки, експресиращи транспортери съответно за норадреналин, серотонин и ГАМК. Източник: (Zhao et al., 2008).

Свръхчувствителността на допаминовите рецептори може да доведе до абнормно поведение в ротарод теста. Хроничното повишаване на допамин в синаптичното пространство чрез ДТ-инхибиция може да доведе до загуба на чувствителност на рецепторите и по този начин забавяне на абнормалните ротации. Това подкрепя доказателствата за невропротективното действие на екстракта от Chaenomeles speciosa. Приемът му селективно инхибира допаминовия транспортер, като намалява и спонтанните моторни прояви на неподвижност и тремор, които са характерни за болест на Паркинсон. Установено е, че екстрактът няма ефекти върху ГАМК- транспортера или серотониновия транспортер и само много слаби ефекти върху норадреналиновото обратно връщане (Zhao et al., 2008).

Установено е, че приложението на плодове от видове Chaenomeles имат положителни ефекти върху функциите на невроните и предовратяват навлизането на токсични лиганди в тях. Натрупването на токсични лиганди води до смущения в когнитивната функция. Третирането на мишки с етанолен екстракт от Chaenomeles sinensis води до подобрение на когнитивната функция чрез активиране на холин ацетилтрансферазата. Счита се, че при деменция, функцията на този ензим е нарушена, а приложението на етанолния екстракт частично я възстановява (Kwon et al., 2015). 62

7. Обобщение на литературния обзор

Според доклад на Световната здравна организация афективните разстройства засягат над 264 милиона хора по света и са водеща причина за продължаваща с години непълноценност на живота за хората от всички възрастови групи (GBD Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators, 2018). Депресията е едно от най-често срещаните психиатрични разстройства, характеризиращо се с тежко протичане и висока смъртност (World Health Organization, 2020). На световно ниво нараства и броят на хората, страдащи от неврологични заболявания, като над 6 милиона годишно умират от инсулт. Над 45 милиона са пациентите, страдащи от деменция и всяка година броят им нараства с 7.7 милиона. Болестта на Алцхаймер се наблюдава в до 70% от случаите на деменция и е най-честата причина за развитието ѝ.

Наблюдава се значителна корелация в морфологичните, молекулярни и биохимични механизми, които обуславят клиничната изява на психиатричните разстройства и невродегенеративните заболявания. Всички тези заболявания са често съпътствани от дисфункция на кортиколимбичната система, абнормална активност на моноаминната система и оста хипоталамус-хипофиза, нарушения в механизмите на невропластичност и наличието на оксидативен стрес (Schneider et al., 2011), (Galts et al., 2019). Споделените патогенетични механизми между невродегенеративни и психиатрични заболявания може да обясни високата честота на депресия и тревожност при пациентите с болест на Алцхаймер или с болест на Паркинсон.

Основните лекарства за лечение на депресивните и тревожни разстройства са от групата на антидепресантите. По химичния си състав, те спадат към разнообразни химични групи, но общо за всички, механизмът им на действие цели повишаване нивата на мозъчните моноаминни медиатори серотонин, норадреналин и/или допамин. Основните проблеми при тяхното приложение са свързани с различията в клиничния отговор към тях и нежеланите лекарствени реакции, които причиняват.

Понастоящем фармакотерапевтичното внимание е насочено към медицински растения, притежаващи психофармакологични ефекти, които могат да бъдат използвани като алтернатива на конвенционалните лекарства, но заедно с това могат и да допълват лечението с тях. Основна

цел е комбинираната терапия на фитопродуктите с лекарства да се асоциира с по-малко на брой и тежест нежелани ефекти при запазена или подобрена полза.

В литературата до момента има твърде оскъдна информация за вида Chaenomeles maulei. Основните проучвания на свойствата и състава на видовете се базират главно върху Chaenomeles sinensis, Cheanomeles japonica и Chaenomeles speciosа. Самият Chaenomeles maulei се класифицира като синоним на Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex Spach.

На база проведените изследвания върху видовете от род Chaenomeles, до момента са разкрити антиоксидантни, противовъзпалителни и модулиращи норадренергичната, серотонинергичната и допаминергичната невротрансмисия свойства, които могат да се окажат ценни в лечението на психиатрични и невродегенеративни заболявания. Не съществуват литературни данни, които да доказват наличие на нежелани или токсични ефекти на видовете в използваните им дози, без значение от тяхната форма - екстракт, плодов сок, етерично масло или отделни компоненти. Напротив, нараства броят на изследванията, които демонстрират органно- протективни ефекти на видовете (Kwon et al., 2015; Ma et al., 2016).

С разкриване състава на плодовия сок от Chaenomeles maulei (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018), както и от литературните данни за видовете от род Chaenomeles, може да се очаква, че плодовият сок от Chaenomeles maulei ще проявява благоприятен ефект върху тревожността и депресивно-подобното поведение на опитни животни, което следва да се верифицира чрез поведенчески и биохимични методи. Макар фитопрепаратите да са възприемани като добре поносима алтернатива на конвенционалната терапия, обикновено е необходимо време докато се проявят клиничните им ефекти. Затова е важно да се направи и оценка на безопасността на плодовия сок от Chaenomeles maulei.

Няколко изследвания демонстрират, че главната биологична активност на рода се дължи на присъствието на полифеноли като фенолни киселини и флавоноиди, витамин С, полизахариди, пектини и някои органични киселини (Sun and Hong, 2000; Yin et al., 2006). В плодов сок от Chaenomeles maulei особено високи са концентрациите на фенолни киселини като ванилова и хлорогенова, флавоноиди и процианидини, както и витамин С, които са определящи за антиоксидантен потенциал.

Изследвания с полифеноли показват антидепресивна активност при мишки със стрептозотоцин-индуциран диабет (Anjaneyulu et al., 2003). Съгласно литературните данни различни полифеноли имат потенциал да бъдат използвани като терапия при депресия, свързана с диабет. Флавоноиди, проантоцианидини, фенолни киселини, откриващи се в плодовия сок от Chaenomeles maulei, имат способността да инхибират активността на МАО, метаболизираща катехоламините серотонон, норадренали и допамин (Manach et al., 2004).

Резултатите от настоящите експерименталните проучвания биха могли да помогнат за създаване на лекарствени продукти и/или хранителни добавки с полезни за здравето свойства. Това включва и такива препарати, които да подпомагат основната терапия на заболявания, които все още представляват предизвикателство за съвременната медицина като психиатричните и невродегенеративни заболявания.

III. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

Цел

Цел на тази дисертация е да се изследват субхроничната токсичност на плодов сок от Chaenomeles maulei, както и неговите психофармакологични ефекти при млади/здрави плъхове и при експериментални модели на тревожно-депресивно поведение и нарушена двигателна активност.

Задачи:

1. При млади/здрави плъхове да се изследват ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei след субхронично приложение върху: o Двигателната активност и поведението в тест открито поле; o Тревожността в тест повдигнат кръстосан лабиринт и тест на социално взаимодействие; o Депресивното поведение в тест принудително плуване; o Паметта в тест разпознаване на обект.

2. При субхронично приложение да се проследят ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху показатели на чернодробната и бъбречна безопасност.

3. В модел на резерпин-индуцирана хипокинезия при плъхове да се проследят ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху: o Нарушената двигателна активност в тест открито поле; o Депресивното поведение в тест принудително плуване; o Оксидативния стрес в мозъка.

4. В модел на нарушен светлинен денонощен ритъм при плъхове да се изследват ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху: o Двигателната активност; o Социалното взаимодействие; o Депресивното поведение.

IV. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Материали

1.1. Експериментални животни

Всички описани опити са проведени върху мъжки Wistar плъхове с тегло в рамките на 250- 300 гр, отглеждани в пластмасови клетки, с постоянна вентилация и температура от 20-22, неограничен достъп до вода и храна при 12-часов режим светлина/ тъмнина.

Всички процедури по третиране на животните и експериментите с тях са извършени с получено разрешение за работа с експериментални животни от Българска агенция по безопасност на храните (Разрешение 141/23.06.2016) и в съответствие с националните и международни изисквания за защита и хуманно отношение към опитните животни и изискванията към обектите за използването, отглеждането и/или доставката им (Европейска директива 2010/63/EU).

1.2. Плодов сок от Chaenomeles maulei

За целта на експерименталната работа е използван плодов сок от Chaenomeles maulei в различни дози.

В България плодовете от Chaenomeles maulei се отглеждат в района на Троян, централен Балкан. След бране, пресните плодове се смилат, намачкват и изстискват. Полученият сок се филтрира, добавя се консервиращ агент калиев сорбат (1.0 g/l) и се съхранява при 0°C до момента на използването му. Съставът на сока е определен преди използването му в настоящите експерименти от Valcheva-Kuzmanova et al. (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018) и е представен в таблицата по-долу. За определяне общото съдържание на фенолни вещества е използван спектрофотометричен анализ по Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi, 1965). Абсорбцията се отчита при 760 nm. Като стандарт е използвана галова киселина. Спектрофотометричният анализ показва високо съдържание на фенолни съединения, еквивалентни на 890.00 mg галова киселина на литър сок. Последващият HPLC-анализ потвърждава и високото съдържание на полифеноли под формата главно на процианидинови олигомери, фенолни киселини и флавоноиди (Таблица 7). От 67

киселините в най-високи концентрации са установени ванилова, кафеена и хлорогенова киселина. Епикатехин, катехин и кверцетин са основните представители от флавоноиди, открити в плодовия сок. Процианидиновите олигомери са еквивалентни на 280.52 единици катехин в 100 мл плодов сок (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018).

Таблица 7. Съдържание на биологично активни вещества в плодов сок от Chaenomeles maulei; СЕ-катехинови еквиваленти, (GAE)-еквиваленти галова киселина. Източник: (Valcheva- Kuzmanova et al., 2018).

Биологично активни вещества Съдържание (мг/100 мл) Тотални полифеноли 890.00 GAE Тотални проантоцианидини 253.29 Процианидинови олигомери 280.52 CE

Фенолни киселини Ванилова киселина 14.91 Кафеена киселина 14.48 Хлорогенова киселина 11.00 Неохлорогенова киселина 2.44 Р-кумарова киселина 1.52 Ферулова киселина 1.26 Флавоноиди Епикатехин 5.59 Катехин 5.25 Кверцетин-3--гликозид 3.58 Кверцетин 3.43 Рутин 2.72 Органични киселини Ябълчена киселина 3647.0 Лимонена киселина 51.0 Аскорбинова киселина 22.0

2. Методи

2.1. Метод за изследване на двигателната активност и изследователското поведение - тест открито поле (open field test, OFT)

Тестът открито поле дава уникалната възможност за проследяване изследователското поведение на плъхове, общата двигателна активност и първоначални данни за тревожно поведение. Значение за тревожността, проследявана с OFT, има най-вече социалната изолация (Lister, 1990).

Откритото поле представлява затворена дървена арена с размери 100×100×40 см, с непрозрачни дървени стени, боядисани в бяло. Подът е разграфен на еднакви по размер полета със синя линия с размери 20×20 см. Резултатите се отчитат мануално. Опитното животно се поставя в центъра на полето, което се обособява като централен регион. На всяко животно се дава свобода на движение в рамките на 5 минути в откритото поле. Отчитат се броят на хоризонталните движения (полетата, които животното преминава с четирите си лапи), вертикалните движения (брой изправяния на задни лапи, включително подпирането до стените на полето с предни лапи) и времето, прекарано в централното поле в секунди.

Приема се, че централните полета се свързват със заплаха за гризачите в по-голяма степен отколкото периферията. По този начин времето, прекарано в периферията (тигмотаксис) също може да се счита за показател на нивото на тревожност (Simon et al., 1994), а удължаването на времето в централните полета е резултат от намалено ниво на тревожност. След прием на анксиолитични субстанции се повишава времето, прекарано от животните в центъра. Тестът е използван като мярка за двигателна активност и степен на тревожност.

2.2. Методи за изследване на тревожността

2.2.1. Тест за социално взаимодействие - social interaction test (SIT)

Тестът за социално взаимодействие, развит от File and Hyde (1978), дава информация за тревожно поведение, при което на животните се разрешава да контактуват свободно в отделено

за целта празно пространство и времето на контакт се измерва. По време на този тест животни от случайни групи се разделят на двойки, като времето на взаимодействие на всяко едно директно се влияе от поведението на партньора му. В случай, че тестът се провежда при едно третирано животно, а другото - контрола, тогава времето за взаимодействие, необходимо на третираното животно, се приема за правдоподобна мярка. Намаленото време на социално взаимодействие е индикация за тревожно поведение, докато повишеното време и непроменена моторна активност говорят за анксиолитичен ефект.

За целите на теста обикновено се подбират млади мъжки плъхове с относително еднакво тегло, като се избягват агресивни, доминантни, групово отглеждани плъхове, защото това може да компроментира резултатите. Прието е да се подбират плъхове, които са един групово отглеждан, а другият - изолиран или и двата непознати, но групово отглеждани, като най-добри резултати дават плъховете в самостоятелни клетки.

Преди започване на теста на плъховете се дава време да се приспособят към средата. В рамките на един ден преди самия експеримент, за 5 минутен период, животните се оставят в тестовото пространство. На 2-ия ден двойката плъхове се поставя в полето за 5 минутна сесия, като се записва времето на социален контакт за всяко животно (File, 1980).

2.2.2. Тест повдигнат кръстосан лабиринт - elevated plus maze (EPM)

Този тест дава възможност да се проследи естественото поведение на плъховете при изследване на непозната обстановка. На животното се дава възможност да избере дали да прекара време в откритите, незащитени рамена на лабиринта или в закритите, защитени рамена, издигнати на около 1 метър от пода. Животните показват тенденция на предпочитание към по-тъмните затворени пространства, избягвайки осветените рамена. Това поведение корелира пряко с промените във физиологичните нива на стресови индикатори. Приемът на вещества с анксиолитични ефекти води до повишено изследване на отворените рамена на лабиринта, без да засяга общата мотивация или двигателна активност на животните.

Оборудването включва 2 перпендикулярни рамена 30 х 5 см, пресичащи се в центъра. Две от рамената са преградени с 15 см стена, а другите две са оставени отворени. 70

С началото на опита всяко животно се поставя в центъра на лабиринта със свободен достъп до всяко едно от рамената в рамките на 5 минути. Броят навлизания и времето, прекарано в открито или закрито рамо, се отчитат (Elliott et al., 1992; Pellow et al., 1985).

2.3. Метод за изследване на депресивно поведение - тест принудително плуване (forced swim test, FST)

Тестът за принудително плуване се използва за определяне и оценка на антидепресанти и антидепресивна активност на нови вещества. Опитните животни се поставят в предварително напълнени с вода цилиндри и се проследяват тяхното поведение и движения за оцеляване.

Необходими са стъклени цилиндри с 60 см височина и 17 см диаметър на плъх. Нивото на вода достига 30 см от дъното, като не се дава възможност на животното да може да докосва дъното с лапички или с опашка. Цилиндрите се пълнят с вода със стайна температура - 20-22 . Животното се въвежда в цилиндъра за опашката. Обикновено тестът изисква провеждането на 2 сесии, първата от които е тренировъчна. Втората сесия е тестова и е с продължителност 5 минути като резултати се записват само от нея. Неподвижността на животните или липсата на движения, освен тези достатъчни за оцеляване във водата, се определят като депресивно-подобно поведение.

Намаляване на времето на неподвижност, без да се повишава общата двигателна активност, се интерпретира като антидепресивно-подобен ефект (Kathleen R., 2009; Slattery and Cryan, 2012).

2.4. Метод за изследване на паметта - тест разпознаване на обект - object recognition test (ORT)

Тестът е широко използван за поведенческа оценка паметта на животните, но също така и на вниманието, тревожността и предпочитанието към непознатото в гризачи (Ennaceur, 2010). Тестът не разчита на външна мотивация, награда или наказание, а на природното любопитство на животните към непознат обект. Самият тест е разделен на три фази: хабитуация, опознаване и тестова фаза (Taglialatela et al., 2009). По време на фаза хабитуация, на животното се разрешава

свободно да изследва открито поле при липсата на обекти в рамките на 5 минути. Деня след хабитуационната сесия, животното се поставя във вече познатото открито поле в присъствието на обект отново в рамките на 5 минути. Експерименталната фаза се осъществява 1 час след фазата на опознаване, като в откритото поле се откриват два обекта, единият от които е идентичен на „опознатия“, а другият е нов, непознат за животното (Gaskin et al., 2010). Двата обекта се поставят в двата края на полето симетрично един спрямо друг, а животното се въвежда с гръб към тях. Експерименталната сесия е с продължителност 3 минути. Отчита се времето на активно опознаване на новия и познат обект по време на тестовата сесия.

2.5. Биохимични методи

Определяне нивa на оксидативен стрес

Определяне на субстанции реагиращи с тиобарбитурова киселина в хомогенат от мозък. Реагиращи с тиобарбитуровата киселина субстанции в мозъка (ТБКРС) представлява метод, който измерва спектрофотометрично цвета, получаващ се при реакция на тиобарбитуровата киселина (ТБК) с липидни пероксиди. Методът е описан от екипа на Ohkawa et al. (Ohkawa et al., 1979).

За целите на изследването един грам от мозъчен хомогенат се смесва с 5 ml ледено студен TRIS/HCL буфер и се центрофугиран с 2000 rpm при температура 4С за 10 минути. Полученият супернатант е използван за биохимично изследване. При тази реакция, проведена в кисела среда, pH= 7.4, се образуват розови на цвят продукти, които могат да бъдат детектирани при 532 nm (Aurius 2021 UV-VIS spectrophotometer, Cecil Instruments Ltd, UK). Концентрациите на ТБКРС са измервани в nmol/g в мозък.

Образуването на малонов диалдехид се използва като стандарт. Това е главният реактивен алдехид, който се асоциира с оксидативен стрес във физиологичните системи (Del Rio et al., 2005).

Определяне на чернодробна и бъбречна безопасност

За определяне на чернодробната безопасност при субхронична употреба на плодовия сок са използвани стандартни китове за аспартат аминотрансфераза, аланин аминотрансфераза и алкална фосфатаза в кръвния серум на плъхове. Серумните нива на креатинин и урея са използвани като маркери за бъбречна безопасност.

2.6. Статистически методи

Получените резултати са обработени с помощта на статистически пакет GraphPad Prism (Version 5.00, GraphPad Software, Inc.). Използван е еднофакторен вариационен анализ (one-way ANOVA), последван от Dunnett’s Multiple Comparison Post Test. Student’s t-test е използван за сравняване резултатите на две независими групи. Всички резултати са представени като средна стойност ±S.E.M. Стойности, попадащи в p< 0.05, са приемани за статистически значими.

V. СОБСТВЕНИ РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху поведението на здрави/млади плъхове

За разкриване ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei, сокът е изследван върху 64 здрави/млади мъжки плъха от порода Wistar. При здрави животни, приложението на плодовия сок е субхронично и е разделено на 2 периода на третиране. През първия са третирани общо 32 животни в рамките на 16 дни, а през втория още 32 животни за 32-дневен период. Плъховете са разпределени в 8 групи по 8 плъха в група. Четири от групите са третирани интрагастрално посредством сонда веднъж дневно в продължение на 16 дни, а останалите 4 са третирани в рамките на 32 дни. Групите, в които са разпределени животните са както следва: Контрола –

получават физиологичен разтвор в доза 10 мл/кг; група ПСХМ2.5 получават ПСХМ в доза 2.5

мл/кг, разреден с дестилирана вода до 10 мл/кг; група ПСХМ5 – прилаган е ПСХМ в доза 5 мл/кг,

разреден с дестилирана вода до 10 мл/кг и група ПСХМ10 са третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг.

Поведенческите тестове се провеждат между 14ти до 16ти ден за първия период на третиране и между 30ти до 32ри ден за втория период. Тестовете са проведени в следната последователност за 16-дневното третиране:  Ден 14: провежда се тест открито поле 60 минути след последното третиране в интервала между 9 и 12 часа и тест за социално взаимодействие в интервала от 13 до 17 часа;  Ден 15: провежда се тест повдигнат кръстосан лабиринт 60 минути след последното третиране межди 9 и 12 часа, тест за разпознаване на обект между 13 и 16 часа и тренировъчна сесия на тест за принудително плуване в интервала от 16 до 18 часа;  Ден 16: провежда се тест за принудително плуване 60 минути след последното третиране в интервала от 9 до 12 часа;  Ден 17: животните са анестезирани, евтаназирани и са взети проби за биохимичен анализ.

Последователността на тестовете за 32-дневно третираните животни е следната:

 Ден 30: провежда се тест открито поле 60 минути след последното третиране в интервала между 9 и 12 часа и тест за социално взаимодействие в интервала от 13 до 17 часа;  Ден 31: провежда се тест повдигнат кръстосан лабиринт 60 минути след последното третиране межди 9 и 12 часа, тест за разпознаване на обект между 13 и 16 часа и тренировъчна сесия на тест за принудително плуване в интервала от 16 до 18 часа;  Ден 32: провежда се тест за принудително плуване 60 минути след последното третиране в интервала от 9 до 12 часа;  Ден 33: животните са анестезирани, евтаназирани и са взети проби за биохимичен анализ.

1.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле

1.1.1. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле след 14-дневно приложение

Тестът открито поле се провежда на 14тия ден от началото на експеримента, 1 час след последното третиране на животните. На всяко животно се предоставя 5-минутен период от време в откритата арена на теста, през което се отчитат брой преминати полета (хоризонтална активност), брой изправяния на задни лапи (вертикална активност) и време, прекарано в централните полета. Хоризонталната и вертикална активност се разглеждат като индекси за локомоция. Повишаване на времето на престой в централните полета се интерпретира като анксиолитично-подобен ефект.

Хоризонтална активност

Трите дози на ПСХМ водят до повишена двигателна активност, отчетена като брой преминати полета от откритото поле. Статистически значимо повишение на хоризонталната активност се отчита за дозите на ПСХМ от 2.5 мл/кг (p<0.05 спрямо контролната група) и 5 мл/кг (p<0.01 спрямо контролните животни).

При животните от контролната група броят на хоризонталните движения е 21.86±5.96, при

животните от група ПСХМ2.5 тя е 44.0±7.97, при животните от група ПСХМ5 - 61.0±8.27 и при

животните от група ПСХМ10 се отчитат 35.0±8.58 общо за 5-те минути продължителност на теста (Фигура 12).

Брой преминати полета 80 **

60 *

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 12. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя преминати полета (хоризонтална активност) на плъхове в тест открито поле след 14-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата; **р<0.01 спрямо Контролата

Вертикална активност

Общо за 5-те минути продължителност на теста, броят на вертикалните движения на кон-

тролната група животни е 11.57±2.72, при група ПСХМ2.5 тя е 18.75±2.09, при група ПСХМ5 -

20.5±2.32 и при група ПСХМ10 - 16.75±4.66 (Фигура 13).

След статистическа обработка на резултатите се установява, че ПСХМ в доза 5 мл/кг повишава броя изправяния на задни лапи на животните със статистическа значимост (p<0.05 спрямо Контролата). Oстаналите групи, третирани с по-ниската и по-висока дози на ПСХМ, също

демонстрират повишаване на броя изправяния на задни лапи, но тези резултати не достигат статистически значими стойности спрямо Контролата.

Брой изправяния на задни лапи

25 * 20

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 13. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя изправяния на задни лапи (вертикална активност) на плъхове в тест открито поле след 14-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата

Време, прекарано в централните полета

При групите с животни, третирани с ПСХМ в дози 2.5 мл/кг и 5 мл/кг не се установяват статистически промени в резултатите спрямо Контролата. Времето, прекарано в централните полета на откритото поле за животните от контролната група, е 8.7±2.56 sec, за животните, третирани с ПСХМ в доза 2.5 мл/кг, то е 12.53±2.18 sec, за животните, третирани с ПСХМ в доза

5 мл/кг, то е 12.01±1.6 sec и за животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг - 21.18±4.38 sec (p<0.05 спрямо Контролата). При животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг (p<0.05 спрямо Контролата), се наблюдава най-изразено повишаване на времето, прекарано в централната зона на полето, докато за останалите дози резултатите са близки до тези на контролните животни (Фигура 14). 77

Време, прекарано в централните полета 30 *

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 14. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето, прекарано в централните полета на плъхове в тест открито поле след 14-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата

1.1.2. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле след 30-дневно приложение

Тестът открито поле се провежда на 30тия ден, 1 час след последното третиране на животните, аналогично на 14-дневния период на третиране. Разпределението и броят на плъховете съответства на първия период на третиране. Отчитат се същите показатели за двигателна активност и време, прекарано в централната зона на откритото поле.

Хоризонтална активност

Повишен брой преминати полета в рамките на 5 минути се установяват за всички животни, третирани с ПСХМ, като този ефект достига статистическа достоверност в сравнение с контролните животни (Фигура 15). Броят на хоризонталните движения при животните от

Контрола е 27.4±7.2, при животните от група ПСХМ2.5 е 55.7±10.7 (p<0.05 спрямо Контролата),

за животните от група ПСХМ5 - 68.9±11.7 (p<0.01 спрямо Контролата) и при животните от група

ПСХМ10 е 53.4±6.8 (p<0.05 спрямо Контролата). За всички дози на ПСХМ се отчита статистически значимо повишаване в броя преминати полета, като най-изразен е този ефект за

ПСХМ в доза 5 мл/кг.

Брой преминати полета 100 ** 80 * * 60

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 15. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя преминати полета (хоризонтална активност) на плъхове в тест открито поле след 30-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата; **р<0.01 спрямо Контролата

Вертикална активност

Всички дози на ПСХМ водят до слабо повишаване в броя на изправянията на задни лапи в тест открито поле спрямо контролните животни. В дози 2.5 и 10 мл/кг, ПСХМ най-изразено стимулира вертикалната активност на животните без обаче да се достига статистическа значимост

(Фигура 16). Броят изправяния на задни лапи за Контролата е 14.52.8, за група ПСХМ2.5 е

20.83.1 и за група ПСХМ10 е 21.12.4. ПСХМ в доза 5 мл/кг води до по-слабо изразена вертикална активност, която все пак е по-висока от тази за Контролата (19.82.4).

Брой изправяния на задни лапи 30

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 16. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя изправяния на задни лапи (вертикална активност) на плъхове в тест открито поле след 30-дневно третиране

Време, прекарано в централните полета

Резултатите след 30-дневното приложение на ПСХМ показват, че нито една от дозите му не води до значима промяна във времето, прекарано в централните полета на откритото поле (Фигура 17). За контролните животни се установява време на престой 8.71.5 sec, което е най-

близко до това, отчетено при ПСХМ5 – 8.31.4 sec. При животните, третирани с ПСХМ в доза 2.5 мл/кг се отчита най-дълъг престой в централната зона (10.71.3), а най-кратък е престоят при

група ПСХМ10 (6.81.3) при сравнение с контролните животни. Наблюдава се доза-зависима тенденция с повишаване дозата на ПСХМ да намалява престоя в централните полета. Най-

изразено време в централните полета се отчита за животните от група ПСХМ2.5, докато за група

ПСХМ10, то е по-кратко дори от това за контролните животни.

Време, прекарано в централните полета 15

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 17. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето прекарано в централните полета на плъхове в тест открито поле след 30-дневно третиране

1.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест на социално взаимодействие

Тестът на социално взаимодействие се провежда с млади/здрави плъхове на 14тия и съответно на 30тия ден от началото на експеримента. Поведението на всички 32 животни от първия период на третиране и 32 животни от втория се проследява един час след приключване на тест открито поле. Тъй като тестът на социално взаимодействие изисква животните да бъдат в среда с минимален стрес, той се провежда в апарата за тест открито поле. На едновременно поставени в апарата 2 плъха от различни групи се предоставят 5 минути за опознаване. За всеки плъх се отчита времето на движенията, които са свързани с активно взаимодействие между непознатите партньори. Удължено време на социална активност се интерпретира като анксиолитично-подобен ефект.

1.4.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест на социално взаимодействие след 14-дневно приложение

Резултатите от теста показват, че след 14-дневно приложение ПСХМ не променя значимо времето на социален контакт между тестовите партньори. Времето на социално взаимодействие в контролната група е 17.89±2.3 sec. Наблюдава се леко понижение на продължителността му до

15.71±1.31 sec в група ПСХМ2.5. Времето на взаимодействие се изравнява спрямо контролната

група до 17.58±2.75 sec в група ПСХМ5 и леко се понижава до 16.03±2.16 sec за животните от

група ПСХМ10 спрямо Контролата (Фигура 18).

Време на социално взаимодействие 25

секунди (sec) 5

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 18. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на социално взаимодействие при плъхове след 14-дневно третиране

1.4.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест на социално взаимодействие след 30-дневно приложение

Прилаган 30 дни, ПСХМ показва само тенденция към намаляване на времето на социален

контакт между тестовите партньори, което важи най-силно за група ПСХМ5 и по-слабо за група

ПСХМ10. ПСХМ в доза 2.5 мл/кг води до слабо повишаване на времето на социално 82

взаимодействие спрямо контролната група, но този ефект не постига статистическа значимост. За Контролата времето на социално взаимодействие е 16.3±2.5 sec. Останалите резултати са

17.72±3.7 sec, 12.13±2.7 sec и 12.65±1.4 sec, респективно за група ПСХМ2.5, група ПСХМ5 и група

ПСХМ10 (Фигура 19). Най-изразена е промяната във времето за социално взаимодействие в

групите ПСХМ5 и ПСХМ10 при сравнение със стойностите от 14-дневното третиране. Отбелязва се намаляване в това време и за двете групи в порядъка на 4 до 5 секунди.

Време на социално взаимодействие 25

секунди (sec) 5

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 19. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на социално взаимодействие при плъхове след 30-дневно третиране

1.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест повдигнат кръстосан лабиринт

Тест повдигнат кръстосан лабиринт се провежда между 9 и 12 часа на 15ти и 31ви ден, като всяко животно е изложено еднократно на експерименталната постановка. Тестът се провежда в тиха, осветена обстановка 60 минути след последното третиране с ПСХМ или дестилирана вода. По време на опитната сесия с продължителност 5 минути се отчитат следните показатели за всяко животно:

 брой влизания в откритите рамена,  време, прекарано в откритите рамена,  брой влизания в закритите рамена, 83

 време, прекарано в закритите рамена,  общ брой влизания в открити и закрити рамена,  съотношение на влизания в откритите рамена към общ брой влизания.

Повишаване на общия брой влизания и влизанията в закритите рамена, без да се променя активността в откритите, се интерпретира като показател за неспецифична двигателна активност. Повишена активност или време на престой в откритите рамена на лабиринта е индикатор за анксиолитично-подобен ефект (Ennaceur, 2014).

1.3.1. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно приложение

Резултатите, които се регистрират по време на 5-минутната продължителност на теста, са представени в Таблица 8 и Фигура 20, Фигура 21, Фигура 22, Фигура 23, Фигура 24 и Фигура 25. Животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг показват статистически завишен брой навлизания (p<0.05 спрямо Контролата) и престой в отворените рамена (p<0.01 спрямо Контролата) на тест повдигнат кръстосан лабиринт. Приложението на ПСХМ в доза 2.5 мл/кг също води до изразено повишаване на активността в отворените рамена, което обаче не достига статистически достоверен ефект спрямо Контролата. ПСХМ в доза 5 мл/кг води до резултати, които са най- близки до контролните по отношение на броя влизания и времето, прекарано в отворените рамена на лабиринта.

С нарастване дозата на ПСХМ се забелязва намаляване на броя влизания в затворените рамена на лабиринта. Общият брой навлизания в отворени и затворени рамена (p<0.05 спрямо Контролата), както и съотношението брой влизания в отворени рамена/общ брой влизания (p<0.01 спрямо Контролата) са статистически значимо повишени за най-високата доза на ПСХМ, докато при приложението на другите дози от 2.5 и 5 мл/кг не се достига до статистически различия спрямо контролната група.

Таблица 8. Изследвани показатели в тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг; **p<0.01, *р<0.05 спрямо Контролата. Резултатите са представени като средна стойност S.E.M.

Група Контрола ПСХМ2.5 ПСХМ5 ПСХМ10

Показател Брой влизания в 0.140.14 0.570.2 0.140.14 1.00.26* отворени рамена Време на престой в 1.771.77 13.215.51 1.141.14 23.296.94** отворени рамена (sec) Брой влизания в 1.6250.32 3.881.14 3.631.32 2.430.61 затворени рамена Време на престой в 292.95.32 279.58.42 293.84.98 274.67.15 затворени рамена (sec) Общ брой влизания в 1.570.3 4.881.48 4.131.32 3.00.63* отворени и затворени рамена Брой влизания в 0.130.08 0.180.07 0.130.08 0.330.07* отворени рамена/ Общ брой влизания

Брой влизания в отворените рамена 1.5 *

1.0

0.5

0.0

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 20. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя влизания в отворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

Време, прекарано в отворените рамена 30 **

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 21. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето, прекарано в отворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране; *p<0.05, **p<0.01 спрямо Контролата

Брой влизания в затворените рамена 6

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 22. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя влизания в затворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране

Време, прекарано в затворените рамена 400

300

200

100

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 23. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето, прекарано в затворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране

Общ брой влизания 8

6 * 4

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 24. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху общия брой влизания в рамената на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

Влизания в отворените рамена към общ брой влизания 0.5 * 0.4

0.3

0.2

0.1

0.0

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 25. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху съотношението на влизания в отворените рамена към общия брой влизания в рамената на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата

1.3.2. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно приложение

Резултатите, получени след 31-дневно третиране, са представени в Таблица 9 и Фигура 26, Фигура 27, Фигура 28, Фигура 29, Фигура 30 и Фигура 31. Приложението на ПСХМ в доза 2,5 мл/кг се съпровожда с най-изразено повишаване на активността в отворените рамена на повдигнатия лабиринт. Времето, прекарано в тях достига до статистическа достоверност при сравнение с контролната група (p<0.05). Забелязва се, че с повишаване на дозата, намаляват броя и времето, прекарано в отворените рамена на лабиринта.

Таблица 9. Изследвани показатели в тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг; *р<0.05 спрямо Контролата

Група Контрола ПСХМ2.5 ПСХМ5 ПСХМ10 Показател Брой влизания в 1.130.23 1.630.26 1.140.14 1.130.13 отворените рамена Време на престой в 16.063.61 28.994.68* 17.943.6 20.263.24 отворените рамена (sec) Брой влизания в 1.430.3 1.430.3 4.131.25* 1.140.14 затворени рамена Време на престой в 283.93.64 270.74.47* 277.95.17 279.83.24 затворени рамена (sec) Общ брой влизания в 2.430.37 3.50.68 5.51.28* 2.290.18 отворените и затворени рамена Брой влизания в 0.370.07 0.490.04 0.340.07 0.460.05 отворените рамена/ Общ брой навлизания

Брой влизания в отворените рамена 2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 26. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя влизания в отворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране

Време, прекарано в отворените рамена 40 * 30

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 27. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето, прекарано в отворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

Броят влизания в затворените рамена на лабиринта е значително повишен за животните от

група ПСХМ5 и този резултат достига статистическа значимост (p<0.05) спрямо Контролата. За останалите групи животни, третирани с ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг се наблюдават резултати, които са много близки до тези на контролната група животни.

Брой влизания в затворените рамена 6 *

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 28. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху броя влизания в затворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

В група ПСХМ2.5 се установява статистически значимо понижаване на времето, прекарано в затворените рамена на лабиринта (p<0.05) при сравнение с Контролата. В останалите групи времето на престой също е редуцирано, като с нарастване на дозата на плодовия сок, се отчита тенденция към изравняване с резултатите, отчетени за контролната група (283.93.64). За

ПСХМ10 тези стойности достигат 279.83.24 секунди (Фигура 29).

Време, прекарано в затворените рамена 400

300 *

200

100

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 29. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето, прекарано в затворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

Общ брой влизания 8 * 6

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 30. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху общия брой влизания в рамената на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране; *p<0.05 спрямо Контролата

Общият брой влизания представлява сбора от влизанията в отворените и затворени рамена на лабиринта. Най-ниската и средна доза на ПСХМ водят до повишаване на общия брой

навлизания, като само за група ПСХМ5, този ефект достига статистическа достоверност (p<0.05)

спрямо Контролата (Фигура 30). В група ПСХМ10 се наблюдава дори понижаване на общия брой влизания (2.290.18) спрямо тези за контролната група (2.430.37).

При оценка съотношението влизания в отворени рамена към общ влизания, се наблюдават

повишени стойности за групи ПСХМ2.5 (0.490.04) и ПСХМ10 (0.460.05) спрямо контролните. За

група ПСХМ5 (0.340.07) не се отчита съществена разлика от стойностите получени за Контролата (0.370.07). Нито една доза на ПСХМ обаче не постига статистическа достоверност за този показател на кръстосания лабиринт спрямо контролната група (Фигура 31).

Влизания в отворените рамена към общ брой влизания

0.6

0.4

0.2

0.0

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 31. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху съотношението на влизания в отворените рамена към общия брой влизания в рамената на тест повдигнат кръстосан лабиринт след 31-дневно третиране

1.4. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за разпознаване на обект

За изследване ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху паметта и обучението на млади/здрави плъхове, е използван тест за разпознаване на обект.

Тестът за разпознаване на обект се провежда 60 минути след тест повдигнат кръстосан лабиринт на 15тия и 31вия ден от началото на експеримента. Тестът се състои от 3 сесии- една на хабитуация, една тренировъчна (или опознавателна) и една тестова (или експериментална).

Хабитуационната сесия се провежда на 14тия ден по времето на тест открито поле. За теста за разпознаване на обект се използва същата дървена арена с цел да се намали влиянието на външни фактори и стрес. По време на сесията на хабитуация, на животното се предоставят 5 минути да опознае пространството. На 15тия ден, точно 24 часа след хабитуацията, се провеждат опознавателната и тестовата сесия. При 32-дневно третираните животни, хабитуационната сесия съвпада с теста открито поле на 30тия ден, а тренировъчната и тестовата сесия се провеждат на 31- вия ден, точно 24 часа след сесията на хабитуация.

Опознавателната сесия е с продължителност 5 минути. По време на нея до една от стените на арената се оставя непознат обект без да се засича времето, което животното прекарва в опознаването му. Тестовата сесия се провежда 1 час по-късно и е с времетраене от 3 минути. По време на тестовата сесия в двата ъгъла на арената се поставят обект, еднакъв по форма до първоначалния и втори, напълно различен нов обект. Регистрира се времето, което животните прекарват при новия обект, времето, което прекарват при познатия по форма обект и общо времето, прекарано в изследване на двата обекта.

Проследени и анализирани са следните показатели за всеки един от двата периода на третиране:

 Индекс на разграничение (discrimination index);

Индексът на разграничение отразява продължителността на опознаване на новия обект спрямо познатия като пропорция от общото време на опознаване. Индексът на разграничение се изчислява по следната формула:

푑1 퐷퐼 = където DI – индекс на разграничение; 푡(푡표푡푎푙) d1 – разликата между времето на опознаване на новия обект и познатия обект в тестовата сесия; t(total) – общо време на опознаване на новия и познат обект в тестовата сесия;  Тотално време на опознаване на новия и познатия обект (sec);  Индекс на опознаване (recognition index);

Силно зависи от времето за опознаване на познатия обект, предоставено на животното по време на тренировъчната сесия. Изчислява се по следната формула:

푑2 푅퐼 = където RI – индекс на опознаване; 푡(푡표푡푎푙)

d2 – времето на опознаване на новия обект, разделено на тоталното време на опознаване в тестовата сесия.

1.5.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за разпознаване на обект след 15- дневно приложение

Резултатите, които са регистрирани по време на теста след 15-дневно третиране, са представени както следва в Таблица 10, Фигура 32, Фигура 33 и Фигура 34.

Индексът на разграничение има най-ниски стойности в контролната група (-0.350.18), предполагащи най-дълго време, прекарано с познатия обект. Ниските и средни дози на ПСХМ водят отново до отрицателни стойности на този индекс, без обаче да се наблюдава статистическа достоверност в този резултат. ПСХМ в доза 10 мл/кг постига положителни стойности на индекса на разграничение, които не са статистически значими (-0.350.18) спрямо Контролата.

Таблица 10. Изследвани показатели в тест за разпознаване на обект след 15-дневно третиране с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг. Резултатите са представени като средна стойност S.E.M.

Група Контрола ПСХМ2.5 ПСХМ5 ПСХМ10

Показател Индекс на -0.350.18 -0.070.12 -0.110.11 -0.350.18 разграничение Тотално време на 25.394.85 20.704.72 29.013.07 19.995.24 опознаване (sec) Индекс на опознаване 0.360.11 0.480.07 0.420.04 0.540.1

Индекс на разграничение 0.4

0.2

-0.0

-0.2

-0.4

5 -0.6 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 32. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху индекса на разграничение в тест за разпознаване на обект при плъхове след 15-дневно третиране

Тотално време на опознаване 40

секунди (sec) 10

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 33. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху тоталното време на опознаване на нов и познат обект в тест за разпознаване на обект при плъхове след 15-дневно третиране

Резултатите за тоталното време на опознаване на нов и познат обект също не достигат статистическа достоверност в групите животни, третирани с ПСХМ. Наблюдава се намалено

време на опознаване в групи ПСХМ2.5 (20.704.72) и ПСХМ10 (19.995.24) спрямо Контролата. В

група ПСХМ5 времето на опознаване е слабо повишено (29.013.07) спрямо това за контролната група (25.394.85).

Индексът на опознаване е още един критерий за оценка предпочитанието на животните към познат или нов обект. Отчита се статистически незначимо повишаване в индекса на

опознаване за групите, третирани с ПСХМ в доза 2.5 мл/кг (0.480.07) и ПСХМ в доза 10 мл/кг

(0.540.1) спрямо контролните животни (0.360.11). При плъховете от група ПСХМ5 се наблюдава най-слабо повишаване (0.420.04) в индекса на опознаване спрямо Контролата.

Индекс на опознаване 0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

ПСХМ5 ПСХМ10 Контрола ПСХМ2.5

Фигура 34. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху индекса на опознаване в тест за разпознаване на обект при плъхове след 15-дневно третиране

1.5.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за разпознаване на обект след 31- дневно приложение

Резултатите, които са регистрирани по време на теста след 31-дневно третиране са представени както следва в Индексът на разграничение има най-високи стойности в контролната група (0.00020.08), предполагащи най-дълго време, прекарано с непознатия обект. Всички дози на ПСХМ водят до отрицателни стойности на индекса, без обаче да се достига до статистическа значимост в този ефект. ПСХМ в доза 5 мл/кг постига най-изразените отрицателни стойности на индекса на разграничение, които не са статистически значими (-0.280.10) спрямо Контролата.

Таблица 11, Фигура 35, Фигура 36 и Фигура 37.

Индексът на разграничение има най-високи стойности в контролната група (0.00020.08), предполагащи най-дълго време, прекарано с непознатия обект. Всички дози на ПСХМ водят до отрицателни стойности на индекса, без обаче да се достига до статистическа значимост в този

ефект. ПСХМ в доза 5 мл/кг постига най-изразените отрицателни стойности на индекса на разграничение, които не са статистически значими (-0.280.10) спрямо Контролата.

Таблица 11. Изследвани показатели в тест за разпознаване на обект след 31-дневно третиране с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг. Резултатите са представени като средна стойност S.E.M.

Група Контрола ПСХМ2.5 ПСХМ5 ПСХМ10

Показател Индекс на 0.00020.08 -0.130.11 -0.280.10 -0.200.13 разграничение Тотално време на 34.046.24 27.983.82 28.645.05 28.803.70 опознаване (sec) Индекс на опознаване 0.480.08 0.440.06 0.360.05 0.400.06

Индекс на разграничение 0.1

-0.0

-0.1

-0.2

-0.3

-0.4

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 35. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху индекса на разграничение в тест за разпознаване на обект при плъхове след 31-дневно третиране

Тотално време на опознаване 50

секунди (sec) 10

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 36. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху тоталното време на опознаване нов и познат обект в тест за разпознаване на обект при плъхове след 31-дневно третиране

Тоталното време на опознаване след 31-дневно третиране показва най-високи стойности за контролната група (34.046.24). Третирането с различни дози на ПСХМ не води до статистически значими разлики от отчетеното за Контролата време. Демонстрира се обаче тенденция за доза-

зависимо повишаване на тоталното време на опознаване. Стойностите за група ПСХМ10 са най- близки (28.803.70) до тези за Контролата.

При отчитане резултатите за индекса на опознаване, се установяват най-високи стойности за контролната група (0.480.08). В групите, третирани с ПСХМ, се наблюдават много близки до контролните стойности и съответно липсва статистическа значимост на този ефект. Най-нисък е

индексът на опознаване в група ПСХМ5 (0.360.05).

100

Индекс на опознаване 0.6

0.4

0.2

0.0

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 37. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху индекса на опознаване на нов и познат обект в тест за разпознаване на обект при плъхове след 31-дневно третиране

След еднофакторнен ANOVA анализ, последван от Dunnett’s Multiple Comparison Post Test, се забелязва, че получените резултати не показват статистическа значимост за фактора доза, нито за фактора време. Стойностите на всяка една от групите са много близки и не се наблюдава значима промяна в индекса на разграничение и индекса на опознаване спрямо контролните животни. След unpaired t-test нито една от стойностите не достига статистическа достоверност спрямо контролната група. Също така нито една от дозите на ПСХМ не води до статистически значима промяна в тоталното време на опознаване на новия и познат обект.

1.5. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване

Тестът за принудително плуване се провежда на 16тия и 32рия ден от началото на експеримента. Тестът се състои от 2 сесии – тренировъчна и тестова, които се провеждат в 2 последователни дни. Тренировка за принудително плуване се прави на 15тия и 31вия ден, 1 час след провеждане на тест за разпознаване на обект и е с продължителност 5 минути. Тестовата сесия е с времетраене от 5 минути и се провежда на 16тия и 32рия ден, 1 час след последното третиране на

101

животните с ПСХМ или дестилирана вода. По време на тестовата сесия се измерва времето на неподвижност на животните. По-дългото време на неподвижност се интерпретира като показател за поведение на отчаяние.

1.3.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване след 16- дневно приложение

Резултатите от третирането с ПСХМ в тест принудително плуване са представени на Фигура 38.

При 16-дневно приложение, ПСХМ предизвиква статистически значимо понижаване на времето на неподвижност във всички групи с животни (p<0.05 спрямо Контролата). За група

ПСХМ2.5 се отчитат 41.05.2 sec (p<0.05), за животните от група ПСХМ5 времето на

неподвижност е 37.98.3 (p<0.05) и за група ПСХМ10 е 39.55.6 sec (p<0.05). Резултатите на контролната група са 66.48.4 sec.

Време на неподвижност 80

60 * * * 40

секунди (sec) 20

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 38. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на неподвижност в тест принудително плуване след 16-дневно третиране; *р<0.05 спрямо Контролата

102

1.3.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване след 32- дневно приложение

В тест принудително плуване животните, третирани с ПСХМ в дози от 2.5 и 5 мл/кг, показват най-изразено понижаване във времето на неподвижност. Тези резултати обаче не достигат статистическа значимост спрямо Контролата (Фигура 39). Отчитат се 20.36.5 sec за

група ПСХМ2.5 и 20.84.4 sec за животните от група ПСХМ5. За контролната група животни, времето на неподвижност е 44.910.0 sec. Забелязва се, че приложението на най-високата доза на ПСХМ води до слабо удължаване на времето на неподвижност, чиито стойности обаче са много

по-ниски от тези за контролната група. За група ПСХМ10 времето на неподвижност на животните е 39.55.6 sec.

Време на неподвижност 60

секунди (sec)

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 39. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на неподвижност в тест принудително плуване след 32-дневно третиране

1.6. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху чернодробната и бъбречна функция

За проследяване безопасността на ПСХМ са анализирани бъбречната и чернодробна функция на 64 здрави мъжки плъха, които са третирани перорално за 16 и за 32 дни. На 17-тия и 103

33-тия ден, след провеждане на поведенческите тестове, животните са анестезирани и са взети проби от серум за биохимичен анализ. В деня на взимане на проби животните не са третирани с дестилирана вода или плодов сок. Използваните маркери за чернодробна функция са аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT) и алкална фосфатаза (ALP). Показателите за бъбречна функция са серумните концентрации на креатинин и урея от 16- и 32- дневното третиране. Нивата им са установени чрез спектрофотометричен анализ (Aurius 2021 UV- VIS, Cecil Instruments Ltd, UK) и стандартни маркери. Повишени нива на горепосочените показатели се асоциират с чернодробна или бъбречна токсичност.

1.6.1 Нива на аспартат аминотрансфераза (AST)

Серумните нива на AST след 16-дневно приложение на ПСХМ не са променени значително при сравнение с Контролата. Слабо понижение в нивата на AST се наблюдава при животните от

група ПСХМ5 (176.912.5 U/L) при сравнение със стойностите на Контролата - 215.519.9 U/L.

Групите ПСХМ2.5 и ПСХМ10 имат стойности на AST 229.518.1 U/L и 230.422.8 U/L съответно.

Приложението на ПСХМ в рамките на 32 дни води до значително намаляване нивата на

AST в група ПСХМ10 (157.822.8 U/L, p<0.05) спрямо Контролата (250.332.2 U/L). Резултатите

за групи ПСХМ2.5 (210.319.9 U/L) и ПСХМ5 (236.254.8 U/L) са близки до контролните (Фигура 40 и Фигура 41).

104

AST 300

200

U/L 100

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 40. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на аспартат аминотрансфераза (AST) при плъхове след 16-дневно третиране

400 AST

300

200 *

U/L

100

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 41. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на аспартат аминотрансфераза (AST) при плъхове след 32-дневно третиране; р<0.05 спрямо Контролата

105

1.6.2 Нива на аланин аминострансфераза (ALT)

След 16-дневно приложение на ПСХМ не се наблюдават значими промени в нивата на ALT в изследваните групи (Фигура 42). Отчетени са следните резултати: за контролните животни -

45.64.1 U/L, за група ПСХМ2.5 - 48.95.2 U/L, за група ПСХМ5 - 58.94.4 U/L и 59.24.5 U/L за

животните от група ПСХМ10.

Без статистически значителна промяна в нивата на ALT са и групите след 32-дневно

приложение на ПСХМ в трите дози (Фигура 43). Само при група ПСХМ10 (29.68.9 U/L) се забелязва слабо понижаване в нивата на ALT при сравнение с Контролата (34.35.1 U/L). За групи

ПСХМ2.5 и ПСХМ5 нивата на ALT са съответно 45.57.6 U/L и 46.312.0 U/L.

80 ALT

U/L

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 42. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на аланин аминотрансфераза (ALT) при плъхове след 16-дневно третиране

106

80 ALT

U/L

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 43. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на аланин аминотрансфераза (ALT) при плъхове след 32-дневно третиране

1.6.3 Нива на алкална фосфатаза (ALP)

Групите третирани с ПСХМ за 16-дневен период не показват статистически значими разлики в нивата на ALP при сравнение с контролната (284.214.1 U/L). За животните от трите

групи ПСХМ се отчитат следните резултати: 323.323.4 U/L за ПСХМ2.5, 340.117.6 U/L за

ПСХМ5 и за ПСХМ10 - 340.117.1 U/L.

След 32-дневно третиране с ПСХМ също не се установяват значими разлики в серумните концентрации на ALP, като за Контролата те са 534.474.7 U/L. За останалите групи са отчетени:

519.916.3 U/L за ПСХМ2.5, 688.845.1 U/L за група ПСХМ5 и за група ПСХМ10 са 597.126.7 U/L (Фигура 44 и Фигура 45).

107

ALP 400

300

200

U/L

100

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 44. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на алкална фосфатаза (ALP) при плъхове след 16-дневно третиране

1000 ALP

800

600

U/L 400

200

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 45. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на алкална фосфатаза (ALP) при плъхове след 32-дневно третиране

108

1.6.4. Нива на креатинин

За 16 дни приложение на ПСХМ в три нарастващи дози не се наблюдават статистически значими промени в бъбречната функция на животни, измерена чрез нивата на креатинин при сравнение с Контролата (61.515.3 mol/L). При всички групи животни се наблюдават сходни

резултати, като тези за група ПСХМ2.5 (58.314.1 mol/L) и група ПСХМ5 (62.514.7 mol/L) са

най-близки до контролните. За група ПСХМ10 се отчитат серумни нива 47.99.7 mol/L (Фигура 46).

След 32-дневното приложение нито една доза на ПСХМ не води до статистически значими разлики в нивата на креатинин в сравнение с Контролата (50.410.3 mol/L). За третираните с

ПСХМ животни са отчетени следните резултати: за група ПСХМ2.5 - 65.313.4 mol/L, за група

ПСХМ5 - 71.96.2 mol/L и 69.56.5 mol/L за група ПСХМ10 (Фигура 47).

100 Креатинин

µmol/L 40

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 46. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на креатинин при плъхове след 16-дневно третиране

109

100 Креатинин

µmol/L

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 47. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на креатинин при плъхове след 32-дневно третиране

1.6.5. Нива на урея

Уреята е друг показател за бъбречна функция и след 16 дни приложение на различни дози ПСХМ не се отчитат значими промени в нивата ѝ при сравнение с контролните резултати (8.60.6 mmol/L). За група ПСХМ2.5 са отчетени нива 7.20.6 mmol/L, за животните от група ПСХМ5 -

6.80.6 mmol/L и 7.00.7 mmol/L за група ПСХМ10.

Нивата на урея след 32-дневен период на приложение на ПСХМ са също много близки до

тези на Контролата (7.60.8 mmol/L). За група ПСХМ2.5 са регистрирани 7.40.5 mmol/L, за група

ПСХМ5 са 8.60.5 mmol/L и за група ПСХМ10 - 8.00.3 mmol/L. Получените резултати за двата периода на третиране са представени на Фигура 48 и Фигура 49.

110

10 Урея

mmol/L

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 48. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на урея при плъхове след 16-дневно третиране

Урея 10

mmol/L

5 2.5 10

ПСХМ ПСХМ ПСХМ Контрола

Фигура 49. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху серумните нива на урея при плъхове след 32-дневно третиране

111

1.7. Обсъждане на ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei при млади/здрави плъхове

Плодовете на видове от род Chaenomeles намират широка употреба като медицински растения с разнообразни и повлияващи благоприятно здравето свойства. Това твърдение се подкрепя от пряката връзка между богатия полифенолен състав на ПСХМ и нивото на антиоксидантна активност. Счита се, че фитопродуктите, богати на антиоксиданти, са безопасна алтернатива на конвенционалните лекарства или могат да бъдат подпомагащ терапията компонент, който води до по-малко нежелани ефекти. Видовете от род Chaenomeles и по- специално Chaenomeles maulei са слабо проучени по отношение на техните психофармакологични ефекти и безопасност (Zhang et al., 2014).

Тест открито поле

Тестът открито поле представлява подходящ метод за изследване на двигателната активност, изследователското поведение и любопитството на животни като реакция към непозната среда. Повишена локомоция в теста се отчита чрез оценка броя на преминатите полета и изправяния на задни лапи. Тъй като плъховете изпитват страх от открити и осветени пространства, повишено време в централните полета се интерпретира като анксиолитично- подобен ефект (Valvassori et al., 2017).

За оценка ефектите на ПСХМ върху локомоцията, сокът е изследван в тест открито поле. След 14-дневно третиране на здрави мъжки плъхове с ПСХМ се установява повишаване на общата двигателна активност на животните, изразена като съвкупност от вертикалните и хоризонтални движения в тест открито поле. Резултатите от теста показват, че статистически значимо повишаване на хоризонталната активност се наблюдава при ПСХМ в дози 2.5 и 5 мл/кг спрямо Контролата. Броят изправяния на задни лапи е статистически достоверно повишен само в

група ПСХМ5 спрямо контролната група след 14-дневно приложение.

Статистически достоверно повишение на хоризонталната активност се регистрира при всички дози на ПСХМ, приложен в рамките на 30 дни, като при животните, третирани с ПСХМ в доза 5 мл/кг, този ефект е най-силно изразен. Наблюдава се минимално повишаване на вертикалната активност при всички групи животни след 30-дневно приложение на ПСХМ, но без да се достига до статистическа значимост спрямо контролните. 112

Повишената двигателна активност може да бъде обяснена със стимулиращо действие върху ЦНС, докато понижени хоризонтална и вертикална активност се свързват със седативни ефекти (Prut and Belzung, 2003). Резултатите от настоящото изследване показват, че ПСХМ повишава локомоцията и не проявява седативен ефект върху млади/здрави плъхове. Третираните с ПСХМ животни демонстрират подобрена двигателна активност след 14- и 30-дневно приложение. Получените резултати дават основание да се предположи наличието на психостимулиращ ефект на ПСХМ, приложен върху млади/здрави плъхове. Литературните данни показват, че двигателната активност може да бъде повишена от веществата, действащи като психостимуланти (Cuhna and Masur, 1978). Повишената спонтанна локомоция може да се дължи на повишена възбудимост на централната нервна система, което да е пряко свързано с модулация на моноаминната система, например чрез повишаване нивата на допамин в ЦНС.

Приложението на психостимуланти като кофеин и Modafinil, също води до повишена двигателна активност, подобряване на когнитивните способности и настроението (Cappelletti et al., 2015). Тези ефекти на кофеин са доза-зависими, като в по-ниските си дози кофеин показва анксиолитични ефекти и повишава двигателната активност в по-високите дози (Yamada et al., 2014). Механизмът на действие на Modafinil е чрез инхибиране транспортера за обрано връщане на допамин, да повишава нивата на този медиатор в префронталния кортекс, с което се обяснява и повишената двигателна активност при приложението му (Minzenberg and Carter, 2008; Rasetti et al., 2010). Приложението на комбинация от Modafinil и кофеин в плъхове води до повишена двигателна активност в тест открито поле и редуцирани нива на възпалителни цитокини (Wadhwa et al., 2018). Приложението само на Modafinil води и до доза-зависимо повишаване в екстрацелуларните нива на серотонин главно във фронталния кортекс (Ferraro et al., 2002). При приложението на ПСХМ се наблюдава подобрена локомоция в плъхове, която може да се дължи на психостимулиращ ефект. Възможно е механизмът на действие на ПСХМ да се осъществява чрез блокиране на допаминовия обратен транспорт, което се наблюдава при приложение на други видове от род Chaenomeles (Zhao et al., 2008). Вследствие на това се повишават нивата на допамин и се наблюдава повишена локомоция (Dobbs et al., 2016).

Възможно е хлорогеновата киселина и нейният главен метаболит, кафеената киселина, които се детектират в ПСХМ, да са отговорни за наблюдаваната психостимулация. Има данни, които посочват, че приложението на хлорогенова киселина води до психомоторна стимулация.

113

По-изразена такава се наблюдава при приложението на кафеена киселина (Ohnishi et al., 2006). Комбинираното приложение на хлорогенова киселина с кофеин води до доза-зависимо централно стимулиращо действие (Czok and Lang, 1961). Хлорогеновата и кафеена киселина в доза 2.8 mmol/kg водят до изразена локомоторна активация в мишки, 10 до 60 минути след приложението им (Ohnishi et al., 2006). Приложението на хлорогенова киселина стимулира спонтанната двигателна активност и подобрява когнитивните функции в скополамин-индуциран модел на когнитивно нарушение (Kwon et al., 2010). Антиоксидантните свойства на хлорогенова киселина показват невропротективен потенциал в модели на невродегенеративни заболявания, при които се засяга моторната функция като болест на Алцхаймер и болест на Паркинсон (Heitman and Ingram, 2017).

За оценка ефектите на ПСХМ върху тревожността, е измерено времето на престой в централните квадрати на откритото поле. След 14-дневно третиране времето на престой в централното поле статистически значимо се повишава при животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг. Повишаване на времето, прекарано в централните полета, може да се интерпретира като анксиолитично-подобен ефект. Следователно ПСХМ в доза 10 мл/кг проявява анксиолитично- подобен ефект след 14-дневно третиране. Възможно е този ефект на ПСХМ да се обясни с БАВ в състава му. Претретирането на плъхове с ванилова киселина, която се открива в най-високи концентрации в ПСХМ, води до подобряване на сензорните моторни функции, намаляване на мозъчната хиперемия и стимулиране на анксиолитично-подобно поведение (Khoshnam et al., 2018).

Нито една доза на ПСХМ след 30-дневно приложение не води до статистически значими промени във времето на престой в централните полета спрямо Контролата. Възможно е статистически непромененото време в централните полета да се обясни и с превалиране на повишената двигателна активност на животните над анксиолитичния ефект след 30-дневно приложение на ПСХМ. Тъй като във всяка доза на ПСХМ се наблюдава повишаване на броя преминати полета, може да се предположи, че с нарастване периода на третиране анксиолитично- подобния ефект се измества от психомоторна стимулация.

114

Тест за социално взаимодействие

Тестът за социално взаимодействие (File and Hyde, 1978) представлява поле, в което се оставят двойка опитни животни и се проследява времето, което прекарват в социален контакт. Избират се животни от различни групи, така че партньорите да бъдат непознати. Тъй като взаимодействието на всеки един от партньорите пряко зависи от поведението на другото животно, то се счита, че двойката се брои за една единица. Анксиолитично-подобно поведение се наблюдава, когато времето за социално общуване се повишава, докато общата двигателна активност остава непроменена. Обратно, понижено време на социален контакт предполага анксиогенно-подобно поведение (Bailey and Crawley, 2009).

Резултатите от теста за социално взаимодействие показват липсата на анксиолитичен ефект както след 14-, така и след 30-дневно третиране. Нито една доза на ПСХМ не води до повишена социална активност спрямо контролните животни.

Веществата, които действат като психостимуланти, също показват разнопосочно взаимодействие с компоненти на социалното поведение (Sommers et al., 2006). Methamphetamine води до понижаване на социалното поведение, съпроводено с повишаване двигателната активност и повишено освобождаване на допамин (Clemens et al., 2007). Острото приложение на Methamphetamine намалява доза-зависимо времето на социално взаимодействие между животните (Šlamberová et al., 2010). С повишаване нивата на допамин се обяснява само повишената локомоция, тъй като социалното поведение включва взаимодействието между няколко невромедиаторни системи, сред които опиоидната, допаминергичната и серотонинергична. Така че предпочитанието на животните към несоциални дейности може да се дължи на намалена мотивация или интерес към социално взаимодействие (Trezza et al., 2011).

Важно е да се отбележи, че поведението в тест за социално взаимодействие може да бъде повлияно индиректно от повишената двигателна активност. Така че наблюдаваното намалено социално взаимодействие при приложението на психостимуланти може да е поне частично следствие от повишената локомоция и изследователско поведение (Šlamberová et al., 2015). В същото време с приложението на ПСХМ също се повишават статистически значимо индексите за двигателна активност спрямо Контролата, но социалното взаимодействие не се променя значимо. Тези резултати са статистически достоверни както за 14-, така и за 30-дневното му приложение. 115

Интересно е, че ниските дози психостимуланти също повишават локомоцията, но без да променят значимо социалната активност (Sams-Dodd, 1998). С повишаване дозата на психостимуланта, животните показват изразено предпочитание към несоциални активности, което предполага хипервъзбудимост/хиперактивност (Šlamberová et al., 2015). При психостимуланти механизмите, които подчертават ефектите им върху социалното поведение и двигателната активност, са свързани с модулиране на моноаминергичната система в мозъка (Iversen et al., 2014).

Вероятно някои от сложните механизми на ниските дози психостимуланти лежат в основата на ефектите на ПСХМ, сред които селективно повлияване нивата на невромедиатори като серотонин, норадреналин и допамин. В резултат на това при приложението на ПСХМ се наблюдава ефект подобен на ниски дози психостимуланти – повишена двигателна активност и непроменена социална активност.

Тест повдигнат кръстосан лабиринт

Повдигнатият кръстосан лабиринт е ефективен метод за оценка на поведенческия профил на експериментални животни. Показателите, които изследва този тест, са полезни при характеризиране нивото на тревожност на експерименталните животни. Естественото предпочитание на животните към слабо осветени пространства е показател за страх и нужда от сигурност. Анксиолитично действащите лекарства се характеризират със способността да повишават както навлизанията, така и времето, прекарано в отворените рамена на лабиринта, без да водят до промени в двигателната активност (Ennaceur, 2014). Този ефект на анксиолитици се подчертава от естествената склонност на гризачите да отбягват високи и открити пространства (Schmidt-Mutter et al., 1998).

В този експеримент се установява, че 15-дневното третиране с ПСХМ в доза 10 мл/кг води до статистически значимо повишаване на активността на здрави животни в отворените рамена на лабиринта. Повишени са както броя навлизания, така и времето, прекарано в откритите

пространства на лабиринта. В същото време третирането с ПСХМ10 не променя статистически достоверно броя навлизания и времето, прекарано в затворените рамена на лабиринта. Общият брой влизания в отворените и затворени рамена на лабиринта, както и съотношението на

116

влизанията в отворените рамена спрямо общия броя влизания е повишено със статистическа

достоверност за животните от група ПСХМ10 спрямо контролните. Тези резултати се дължат главно на повишаване активността на животните в отворените рамена на лабиринта и може да се

интерпретират като анксиолитично-подобен ефект след 15-дневно приложение на ПСХМ в доза 10 мл/кг.

При 30-дневно третираните животни се отчита, че ПСХМ в доза 2.5 мл/кг повишава времето, прекарано в отворените рамена на лабиринта със статистическа значимост спрямо

Контролата. Времето на престой в затворените рамена след приложение на ПСХМ в доза 2.5 мл/кг е статистически значимо намалено спрямо контролната група. Повишеното време на престой в отворените рамена и намаленото време в затворените предполага, че ПСХМ в доза 2.5 мл/кг проявява анксиолитично-подобен ефект след 30-дневно приложение.

Третирането с ПСХМ в доза 5 мл/кг води до статистически достоверно повишен брой влизания в затворените рамена на лабиринта спрямо Контролата след 30-дневно приложение. Общият брой влизания също е повишен и постига статистическа достоверност спрямо контролните животни. Повишеният общ брой влизания при приложението на ПСХМ в доза 5 мл/кг, се дължи на повишената активност в затворените рамена на лабиринта, което е свързано с повишена двигателна активност, проявяваща се главно като психомоторна стимулация.

Описаният по-горе анксиолитично-подобен ефект на ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг се съпровожда с повишена активност в отворените рамена на лабиринта. Възможна причина за наблюдаваният анксиолитично-подобен ефект на ПСХМ е високото съдържание на полифеноли в състава на плодовия сок. От тях вероятни носители на фармакологична активност са фенолните киселини ванилова, хлорогенова и нейният метаболит, кафеена киселина. Установено е, че кафеената киселина проявява антидепресивно-подобни и анксиолитично-подобни ефекти, които

се дължат на индиректна модулация на адренергичните 1А-рецептори (Takeda et al., 2003). Хлорогенова киселина демонстрира повишен брой влизания и време на престой в отворените рамена на тест повдигнат кръстосан лабиринт. Установява се, че тези резултати се антагонизират при приложението на бензодиазепинов антагонист (Bouayed et al., 2007). Следователно анксиолитичните ефекти на хлорогенова киселина се дължат на стимулиране на бензодиазепинови рецептори. Не е напълно изяснено взаимодействието на хлорогенова киселина

с ГАМКА-рецептора, но се знае, че влиянието ѝ върху тревожността не е свързано с 117

антиоксидантния ѝ потенциал. Хлорогеновата киселина проявява анксиолитично-подобен ефект, който е измерим с този на стандарт като Diazepam (Heitman and Ingram, 2017).

Проучване ефектите на полифеноли от други растителни видове показват потенциал за успешно повлияване на тревожност, най-вече поради високо съдържание на флавоноиди. Влиянието на флавоноидите се отчита главно върху ГАМК-рецепторите (Kavvadias et al., 2004).

Счита се, че някои флавоноиди дължат анксиолитичните си свойства на модулация на ГАМКA и

ГАМКC-рецептори (Goutman et al., 2003). Приложението на епигалокатехин води до поведенчески отговори, които се описват като бензодиазепин-подобни. Счита се, че епигалокатехин

взаимодейства с ГАМКА-рецепторите и на това се дължат анксиолитично-подобните му свойства (Vignes et al., 2006). Друг флавоноид, който демонстрира значителни анксиолитични ефекти в тест повдигнат кръстосан лабиринт, е кверцетин. Интересно е, че този ефект се наблюдава в по-ниския диапазон от дози, при които е изследван и само след орално приложение. Счита се, че анксиолитичната му активност се дължи на модулация на ГАМК-ергичната система (Grundmann et al., 2008).

Намаляване времето, прекарано в отворените рамена и броят навлизания в тях, се разглеждат като индикатори за тревожно-подобно поведение в тест повдигнат кръстосан лабиринт. Счита се, че това поведение може да се обясни с повишаване нивата на серотонин в различни региони на мозъка (Prajapati et al., 2019). Повишената серотонинергична медиация води до намалено активиране на допаминергични неврони (Di Giovanni et al., 2008). Има данни, че полифеноли дължат някаква част от анксиолитичните си ефекти на допаминергична активация, без да предизвикват промени в нивата на норадреналин и серотонин (Kita et al., 2019). По- вероятно е полифенолите от ПСХМ да повишават нивата на моноамини в хипокампа чрез инхибиране ензимната активност на МАО (Nabavi et al., 2017). Възможно е част от наблюдаваните ефекти на ПСХМ в повдигнатия лабиринт да са свързани именно с инхибиране на транспортера за обратно връщане на допамин и норадреналин (Zhao et al., 2008). Установен е анксиолитично- подобен ефект в тест повдигнат кръстосан лабиринт при приложението на допаминов агонист, като този ефект не се обяснява с повишена локомоция в други поведенчески тестове (Garcia et al., 2005). Активиране на допаминергичната медиация е и механизмът на действие на някои психостимуланти, водещи до подобрено навлизане в отворените рамена на повдигнатия лабиринт и повишена двигателна активност в откритото поле (Wang et al., 2015).

118

Интересно е, че психостимуланти като Methamphetamine, които въздействат главно върху допаминергичната система, с промяна на дозата могат да проявяват анксиолитично-подобен ефект в тест повдигнат кръстосан лабиринт или да не проявяват никакъв ефект. При приложението на психостимуланта се наблюдава повишаване двигателната активност в откритото поле, намалено социално взаимодействие и липса на промени в повдигнатия кръстосан лабиринт (Schutová et al., 2010). Според екипа на Herbert and Hughes, приложението на Methamphetamine в плъхове намалява тревожно-подобното поведение в тест открито поле, но само в ниските му дози (Herbert and Hughes, 2009). В тези дози на психостимуланта, при които се отчита анксиолитично-подобен ефект в откритото поле, обаче се наблюдава завишен брой навлизания в затворените рамена на теста повдигнат кръстосан лабиринт. Това предполага, че анксиолитично-подобния му ефект се дължи на повишената локомоция (Loxton and Canales, 2017). С повишаване дозата на психостимуланта превалират психомоторните ефекти над анксиолитично-подобните.

Възможно е разнопосочните ефекти на психостимуланти в поведенческите тестове да се дължат не само на дозата, но и на продължителността на приложение. Острото приложение на Methamphetamine се свързва с повишено освобождаване на допамин, докато при хроничното се наблюдава намаление на нивата на допамин в хипокампа и развитието на зависимост (Melo et al., 2012). При острото приложение се наблюдава повишена активност на плъхове в отворените рамена на лабиринта, което предполага анксиолитично-подобен ефект, докато хроничното приложение се свързва с повишена локомоция и прояви на тревожност (Tamaki et al., 2008).

Анксиолитично-подобен ефект се наблюдава за ПСХМ10 в по-краткия период на третиране от 15 дни. Възможно е най-високата доза на ПСХМ след 15-дневно приложение да постига комбинация от механизма на действие на ниски дози психостимуланти при остро приложение и ГАМК- модулиращите свойства на полифеноли. Анксиолитично-подобен ефект се наблюдава и след 30-

дневното третиране с ПСХМ2.5. Възможно е в по-ниската доза на ПСХМ и с удължаване периода на третиране да превалират ГАМК-модулиращите ефекти на полифенолите. С повишаване дозата на ПСХМ след 30-дневно приложение се отчита превалиране на психомоторната активност без

анксиолитично-подобен ефект. Може да се предположи, че приложението на ПСХМ5 се свързва с повишаване главно нивата на допамин и по-слабо повлияване на ГАМК-трансмисията. В тази доза на ПСХМ е най-изразена двигателната активност както в тест открито поле така и в тест повдигнат кръстосан лабиринт. 119

Тест за разпознаване на обект

Поведенческите тестове, целящи да оценят способността на животно да разпознае вече представян стимул, спадат към моделите на амнезия при човека (Baxter, 2010). Тестът за разпознаване на обект е поведенчески метод за изследване паметта, който разчита на естественото любопитство на плъхове при липсата на награда. Но също така може да се тълкува и като подход за отчитане на работна памет, внимание и предпочитание към новото (Silvers et al., 2007). Тестът за разпознаване на обект е ефикасен метод, съпровождащ се с относително ниски нива на стрес и позволяващ детектирането на невропсихологически промени след фармакологични, биологични или генетични манипулации (Goulart et al., 2010). Важно е да се отбележи, че този тест се прави еднократно и има чувствително отношение към епизодичната памет, много по-изразено отколкото към когнитивните функции, при което се изискват неколкократни повторения на опитните постановки. За детектиране на епизодичната памет, този тест разчита на структури от медиалния темпорален лоб, най-вече на хипокампа (Fole et al., 2015).

Тестът за разпознаване на обект може да се раздели на 3 фази - фаза на хабитуация, опознаване и тестова. По време на хабитуацията, на всяко животно се дава възможност да се запознае с откритата арена. Целта на тази фаза е да се намали наличието на стреса от новата среда. Опознавателната фаза включва въвеждане на нов обект в арената, като по време на тестовата фаза се използва подобен обект и допълнително нов обект. Нормално, животните прекарват повече време в проучване на новия обект и когато тази склонност се наблюдава през тестовата фаза, се приема, че животното е запомнило познатия обект (Antunes and Biala, 2012). Приема се, че наличието на мозъчно увреждане или действието на лекарство водят до промени в моторната функция, следователно повлияват изследването на новия и познатия обект по един и същи начин, независимо от периода на пауза между опознавателната и експерименталната сесия.

Съществуват няколко индекса за оценка поведението на животните: индекс на разграничение, тотално време на опознаване и индекс на опознаване.

Индексът на опознаване е въведен с цел оценка на времето, прекарано в изследване на новия обект спрямо тоталното време на опознаване (Gaskin et al., 2010). Разпознаването на нов обект се влияе много силно от околната среда. Възможно е предпочитанието към който и да е обект в тестовата сесия да се дължи на реплики или подобни форми от околната среда, с които 120

животното да прави асоции (Bevins et al., 2002). Разграничаването на нов обект изисква повече когнитивни умения, отколкото отчитането на предпочитание към него (Ennaceur, 2010). При никоя от групите животните, третирани с ПСХМ не се постига статистически значимо отклонение в индекса на опознаване спрямо Контролата.

Третирането с ПСХМ в нито една доза не води до статистически значими промени в индекса на разграничение. Индексът на разграничение позволява да се проследи разликата във времето на опознаване на нов обект спрямо познат обект. Тази разлика след това се дели на сумата от време прекарано с новия и познатия обект. Получават се числа вариращи между +1 и -1, като отрицателните стойности предполагат повече време прекарано с познатия обект (Burke et al., 2010).

Тоталното време на опознаване на новия и познат обект също не се променя статистически значимо спрямо Контролата при приложението на ПСХМ. Възможно е това да се дължи на психомоторна стимулация, поради която животните да прекарват малко време при който и да е от обектите в арената. Такава психомоторна стимулация е в съответствие с данните от тест открито поле и предполага ефекти на ПСХМ върху двигателната активност. Подобно поведение с липса на промени в теста за разпознаване на нов обект се наблюдава при приложението на психостимуланти (García-Pardo et al., 2017). Приложението на MDMA в плъхове не води до промени в показателите за памет в теста за разпознаване на обект (Piper and Meyer, 2006). Хроничното му приложение обаче води до по-продължително време в изследване на познатия обект и това предполага засягане на епизодичната памет (Cohen et al., 2005). При приложението на ПСХМ не се наблюдава предпочитание към познатия обект, което предполага, че ПСХМ не повлиява паметта при млади/здрави плъхове. Приложението на друг психостимулант, Methamphetamine, също не води до промени в индексите на теста за разпознаване на обект (Fialová et al., 2015).

Някои психостимуланти намират приложение за лечението на синдром на хиперактивност с дефицит на вниманието, като подобряват вниманието чрез повишаване нивата на допамин без да намаляват хиперактивността (Carmack et al., 2014). Установено е, че с повишаване нивата на допамин не се подобрява епизодичната памет освен ако в експерименталната постановка не участва стимул или награда (McNamara et al., 2014). Възможно е наблюдаваната липса на ефект в теста за разпознаване на обект да се дължи на повишена локомоция. Последната може да се очаква 121

при въздействие на БАВ, откриващи се в ПСХМ, върху нивата на допамин. Литературните проучвания демонстрират, че флавоноидът кверцетин и неговите метаболити стимулират пресинаптичното навлизане на прекурсори на катехоламините, сред които и на допамин (Dhiman et al., 2019; Samoylenko et al., 2010). Възможно е чрез селективно стимулиране на моноаминергичната трансмисия, полифенолите от ПСХМ да повишават двигателната активност на животните без да повлияват паметта, което би допринесло за терапията на невродегенеративни заболявания като болест на Паркинсон.

Тест принудително плуване

Тестът принудително плуване дава възможност да се изследва реакцията на животните в обстановка на безпомощност, от която няма как да се спасят. Времето на неподвижност на животното се отчита като състояние, наподобяващо примирението и отчаянието при депресивно болните пациенти. Времето на неподвижност е сумарното време, през което животното не изследва цилиндъра с вода и не се опитва да избяга. Това са само движенията необходими да поддържа главата си над водното ниво. Антидепресивно действие на лекарство се отчита чрез намаляване времето на неподвижност по време на теста, ако то не повишава двигателната активност на животното в други поведенчески тестове. От друга страна, скъсено време на неподвижност може да бъде и в резултат на повишена двигателна активност.

Този тест е въведен отдавна и все още служи като широко застъпен метод в изследването на депресивно-подобно поведение в плъхове. Едно от предимствата му е, че животните са подложени на стрес, който подобрява възможността за развитие на характерните симптоми на клинична депресия (Doron et al., 2014). Патогенезата на депресията се свързва до голяма степен с моноаминната теория, която обаче не е способна да обясни бавно настъпващите клинични ефекти при третиране (Slattery et al., 2004). Главният проблем на съвременната антидепресивна терапия е, че трудно постига пълно възстановяване на пациентите и поради продължителността на лечението, често се наблюдават нежелани ефекти.

Настоящите резултати показват, че ПСХМ в доза 2.5 мл/кг и 5 мл/кг води до статистически значимо намаляване на времето на неподвижност спрямо Контролата след 16-дневно

122

приложение. Това са двете дози на ПСХМ, при които се наблюдава и статистически достоверно повишаване на двигателната активност в тест открито поле след 14-дневно приложение. Може да

се предположи, че 16-дневното приложение на ПСХМ2.5 и ПСХМ5 води до антидепресивно- подобен ефект, който обаче може да се дължи и на повишаване двигателната активност на

животните. В същия период на третиране, ПСХМ10 води до статистически значимо намаляване на времето на неподвижност, без да се наблюдава промяна в индексите за двигателна активност в тест открито поле. ПСХМ в доза 10мл/кг проявява антидепресивно-подобен ефект.

При 32-дневно третираните с ПСХМ в трите дози животни, нито една доза на ПСХМ не скъсява статистически значимо времето на неподвижност в тест за принудително плуване. Може да се забележи обаче, че приложението на ПСХМ води до тендеция към нямаляване времето на неподвижност. Тези резултати показват, че след 30-дневно третиране, ПСХМ не проявява антидепресивно-подобен ефект.

Наблюдаваните резултати при приложението на ПСХМ в доза 10 мл/кг в теста за принудително плуване показват антидепресивно-подобен ефект за по-краткосрочния период на третиране. Възможно е наблюдаваният антидепресивно-подобен ефект да се дължи на фармакологичните свойства на полифеноли, съдържащи се в ПСХМ. Литературните данни сочат, че полифеноли имат способността да инхибират активността на глиалната МАО, което се свързва с намалено ензимно разграждане на серотонин и повишеното му освобождаване (Mazzio et al., 1998). Един от флавоноидите, които се откриват във висока концентрация в ПСХМ, е катехин. Установено е, че третирането с катехин подобрява депресивно-подобното и тревожно-подобното поведение в плъхове. Приложението му води до модулация на моноаминната система и се изразява в намалено време на неподвижност в тест принудително плуване (Lee et al., 2013). Възможно е антидепресивно-подобният ефект на ПСХМ да се дължи частично и на повишаване нивата на допамин. Чрез завишаване нивата на серотонин и допамин действат някои антидепресанти. При тяхното приложение също се отчита значително понижено време на неподвижност в тест за принудително плуване (Lee et al., 2017).

Установено е, че вещества с психофармакологична активност могат да имат разнопосочни ефекти върху депресивното поведение в зависимост от дозата и срока си на приложение. Литературните данни показват, че психостимуланти като Ketamine могат да подобрят депресивната симптоматика в рамките на няколкото часа от приложението му (Zarate et al., 2006). 123

В ниските си дози, Ketamine проявява антидепресивно-подобни ефекти, които се наблюдават като намалена неподвижност в теста за принудително плуване (Thelen et al., 2016). Счита се, че ниските дози на Ketamine стимулират серотонинергичната активност в хипокампа и са отговорни за антидепресивно-подобните ефекти (Gigliucci et al., 2013; Li et al., 2010). Повишаването на дозата му води до доза-зависима двигателна хиперактивност (Imre et al., 2006), която се дължи на повишаване нивата на допамин в ЦНС (McCullough and Salamone, 1992). Антидепресивен ефект на Ketamine се наблюдава само при острото му приложение, докато хроничната му употреба в същата доза не променя депресивно-подобното поведение (Kara et al., 2017).

Биохимични показатели за чернодробна и бъбречна безопасност

Едни от основните индекси за правилна функция или токсичност на черния дроб и сърцето са серумните нива на аминотрансферази, чиито нива се повишават при увреждане на чернодробните клетки (Lehmann-Werman et al., 2018). Това може да се дължи на тъканна некроза, сърдечно-съдово увреждане или неалкохолен стеатохепатит (Nathwani et al., 2005). Нивата на AST и ALT могат да нараснат 20 до 50 пъти при наличието на патология и често се използва отношението AST/ALT за предсказване кой точно орган е увреден (Jacobs, 1996). Лабораторните тестове, които проследяват нивата на AST и ALT имат важно клинично значение, но имат и своите ограничения. Чернодробните трансаминази не са с абсолютна чернодробна специфичност, понеже AST се открива експресиран и в сърдечната мускулатура, бъбреците, мозъка, панкреаса и белия дроб. ALT присъства главно в черния дроб и бъбреците, а концентрациите му в миокарда и скелетната мускулатура са ниски, но могат да са показател за сърдечносъдово заболяване (Ndrepepa et al., 2019). И двата ензима представляват биологични катализатори, като ALT е вътреклетъчен ензим, чийто нива се поддържат от обновяването на клетките.

От двата маркера по-голяма роля за тъканното увреждане има ALT, понеже е фактор за оценка на мембранния интегритет (Shahjahan et al., 2004). 16-дневното приложение на ПСХМ не предизвиква статистически значими промени в нивата на AST, ALP или АLT при сравнение с контролната група. След 32-дневно третиране с ПСХМ се забелязва значимо намаляване на

серумните нива на AST в група ПСХМ10. Нивата на ALT и ALP остават близки до контролните след 30-дневно приложение на всички дози на ПСХМ. 124

Алкалната фосфатаза е мембранно свързан ензим, чийто стойности в серума се повишават при развитие на раково, сърдечно или чернодробно заболяване (Shamban et al., 2014). Приложението на ПСХМ в нито един от двата тестови периода не предизвика промени в нивата на алкалната фосфатаза. Тези резултати показват не само чернодробната безопасност на плодовия сок, но и възможността за хепатопротективно действие при субхронично приложение. В настоящия експеримент, приложението на ПСХМ е върху здрави животни, но дава възможност да се оцени хепатопротективния му потенциал и безопасност без наличието на увреда. Потенциал да предпазват от чернодробно увреждане показват някои БАВ, които се откриват и в ПСХМ. Например, установено е, че кафе с високо съдържание на хлорогенова киселина намалява развитието на неалкохолна чернодробна стеатоза в плъхове (Panchal et al., 2012). Консумацията на кафе се свързва с намалени нива на чернодробни ензими, което може да се дължи на наличието на полифеноли в него (Ikeda et al., 2010).

За БАВ, които се откриват в ПСХМ също има данни за хепатопротективен ефект при наличието на чернодробно увреждане. В модел на парацетамол-индуцирана хепатотоксичност, хлорогеновата киселина значително намалява нивата на AST и ALT, чиито стойности са повишени от парацетамол. Също така, хлорогеновата киселина намалява апоптозата и оксидативния стрес, като ефектите и се дължат главно на повлияване метаболизма на парацетамол и на антиоксидантните и свойства (Pang et al., 2015). Приложението на естер на кафеената киселина също намалява хепатотоксичността, предизвикана от алкохол и високомастна диета чрез подобряване на чернодробната архитектоника и намаляване нивара на билирубин, ALT и AST. Наблюдават се още намаляване нивата на оксидативен стрес и повишаване тъканните нива на глутатион (Li et al., 2015; Meydan et al., 2019).

Хепатопротективен ефект се наблюдава при други видове от род Chaenomeles. Третиране с плодов екстракт от Chaenomeles thibetica води до намаляване на патологично завишените нива на AST, ALT, алкална фосфатаза и билирубин, както и до повишаване на антиоксидантни фактори като супероксид дисмутаза, каталаза и глутатион. Счита се, че наблюдаваната хепатопротективна активност се дължи на високото съдържание на фенолни съединения, флавоноиди и проантоцианидини (Ma et al., 2016).

Серумните нива на креатинин и урея са широко използвани маркери за оценка на бъбречна функция. Креатининът се получава при разграждането на креатин фосфата в мускулите и 125

неговите нива зависят от вида и функцията на мускула, степента на движение, диетата и здравния статут (Banfi and Del Fabbro, 2006; Zuo et al., 2008). Често използван индекс е за филтрационната способност на бъбреците и позволява проследяването на бъбречна увреда. Кумулацията на креатинин води до невротоксичност и сърбеж (Nisha et al., 2017). Уреята е краен продукт от метаболизма на протеини и нейните нива нарастват при бъбречна недостатъчност, проявяваща се с уремия (Entedhar and Nawal, 2016).

През двата експериментални периода на третиране с ПСХМ не се наблюдават отклонения в нивата на креатинин нито на урея при сравнение с Контролата. Тези резултати предполагат, че използваните дози ПСХМ са напълно безопасни и не компрометиращи бъбречната функция. В подкрепа на това съществуват данни, които доказват наличието на нефропротективен ефект на екстракт от Chaenomeles sinensis в мишки с хиперурикемия (Zhang et al., 2018).

От БАВ, които се откриват в ПСХМ, кафеената киселина показва нефропротективни свойства, които се изразяват в антиоксидантен ефект и намаляване нивата на креатинин в толуен- индуцирана нефротоксичност в плъхове (Meydan et al., 2016). Подобни ефекти са описани и за хлорогенова киселина в модели на цисплатин- и арсен-индуцирана бъбречна токсичност. Приложението ѝ намалява нивата на серумен креатинин и урея, потиска оксидативния стрес, възпалението, апоптозата и стимулира бъбречната регенерация (Al-Megrin et al., 2020; Domitrović et al., 2014).

126

2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху резерпин-индуцирана хипокинезия в плъхове

Общо 50 мъжки Wistar плъхове са разпределени в 5 групи от по 10 животни.

Разпределението на животните става в следните групи: Контрола, Р (Резерпин), Р+ПСХМ2.5,

Р+ПСХМ5 и Р+ПСХМ10. На всички животни, с изключение на контролните, е прилаган еднократно, интраперитонеално резерпин в доза 6мг/кг (разтворен в 5% диметил сулфоксид - ДМСО, в обем 1 мл/кг). Контролата са инжектирани еднократно, интраперитонеално само с 5%

ДМСО в обем 1 мл/кг. Животните, спадащи в групите Р+ПСХМ2.5, Р+ПСХМ5 и Р+ПСХМ10,

получават орално различни дози ПСХМ. Животните от група Р+ПСХМ2.5 са третирани с ПСХМ

в доза 2.5 ml/kg (разтворен с вода до общ обем 10 ml/kg), тези от Р+ПСХМ5 - с ПСХМ в доза 5 ml/kg (разтворен с вода до общ обем 10 ml/kg), а група Р+ПСХМ10 - с ПСХМ в доза 10 ml/kg. Животните от група Р и Контролата са третирани с дестилирана вода в обем 10 мл/кг.

Експерименталният протокол се провежда в рамките на 4 последователни дни.

Първи експериментален ден

Животните от групи Р, Р+ПСХМ2.5, Р+ПСХМ5 и Р+ПСХМ10 са инжектирани с резерпин, а контролните животни - с 5% ДМСО. Непосредствено след инжектирането и на 19тия час животните са третирани интрагастрално с ПСХМ или дестилирана вода.

Втори експериментален ден

На следващия ден, точно 23 часа след инжектирането, животните са третирани за трети път с ПСХМ или дестилирана вода. Един час след третирането е проведен тест открито поле. Един час след приключването му се състои тренировъчна сесия на тест принудително плуване.

Трети експериментален ден

Около 24 часа след последното третиране, животните получават за последно ПСХМ и дестилирана вода. Точно 1 ден след тренировъчната сесия на тест принудително плуване е проведена тестовата сесия.

127

Четвърти експериментален ден

През последния експериментален ден всички животни са анестезирани и след умъртвяване е взета мозъчна тъкан за изследване. На получените резултати е направен еднофакторен ANOVA анализ, последван от Dunnett's Multiple Comparison Post Test. Две независими групи са сравнявани посредством Student's t-test.

2.1. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле

Хоризонтална активност

Резултатите от хоризонталната активност, измерена като брой преминати полета в откритото поле, са показани на Фигура 50. Преминатите полета за животните от група Контрола възлиза на 74.811.5. Приложението на резерпин води до статистически значимо понижение в хоризонталната активност (36.68.0; p<0.05 спрямо Контролата).

Приемът на ПСХМ частично антагонизира ефектите на резерпин върху двигателната

активност, като група Р+ПСХМ10 (56.612.0) показва най-близки резултати до тези на

Контролата. Броят преминати полета за животните от група Р+ ПСХМ2.5 е 45.010.5, а за група

Р+ПСХМ5 е съответно 43.210.5. Нито една доза на ПСХМ не води до статистически значими промени в хоризонталната активност спрямо Контролата.

128

100 Брой преминати полета

60 * 40

Р 5 2.5 10

Р+ПСХМ Контрола Р+ПСХМ Р+ПСХМ

Фигура 50. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг и резерпин (Р) върху броя преминати полета (хоризонтална активност) на плъхове в тест открито поле; *p<0.05 спрямо Контрола

Вертикална активност

Установява се намалена вертикална активност за животните от група Р (14.72.1) спрямо Контролата (22.13.2), но този ефект не постига статистически достоверна разлика (Фигура 51). Третирането с ниските и средни дози на ПСХМ води до резултати, които са сходни до тези за група Р. Резултатите, които се отчитат, са съответно 16.62.3 за животните принадлежащи към

група Р+ПСХМ2.5 и 15.82.3 за тези от група Р+ПСХМ5. Най-високата доза на ПСХМ (10мл/кг) води до статистически значимо повишаване на броя изправяния на задни лапи спрямо група Р (26.34.0; p<0.05 спрямо група Р).

129

Брой изправяния на задни лапи 40 & 30

Р 5 2.5 10

Р+ПСХМ Контрола Р+ПСХМ Р+ПСХМ

Фигура 51. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг и резерпин (Р) върху броя изправяния на задни лапи (вертикална активност) на плъхове в тест открито поле); &p<0.05 спрямо група Р

Време, прекарано в централните полета

Приложението на резерпин води до понижаване на времето, прекарано в централните полета на теста (2.60.2 sec), но този ефект не е статистически достоверен при сравнение с

Контролата (3.41.0 sec). При животните от група Р+ПСХМ2.5 се отчитат близки резултати до тези

на група Р (3.00.5 sec). За животните от група Р+ПСХМ5 се установява най-дълго време, прекарано в централната част на откритото поле (4.10.8 sec), но този резултат не е статистически значим спрямо група Р, което е представено на Фигура 52. Резултатите на животните от група

Р+ПСХМ10 (4.01.0 sec) са сходни до тези на животните третирани с ПСХМ в доза 5 мл/кг и статистически незначими при сравнение с група Р. Наблюдава се обаче тенденция по-високите дози на ПСХМ да повлияват изразено активността на животните в централните полета на теста спрямо третираните с резерпин.

130

Време прекарано в централните полета 6

секунди (sec)

Р 5 2.5 10

Р+ПСХМ Контрола Р+ПСХМ Р+ПСХМ

Фигура 52. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг и резерпин (Р) върху времето прекарано в централните полета на плъхове в тест открито поле

2.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване

В тест принудително плуване времето на неподвижност за група Р (60.07.4 sec) не се различава статистически значимо от времето, проследено за Контролата (56.54.0 sec). Приложението на ПСХМ в различни дози предизвиква тенденция на намаляване неподвижността на плъхове с нарастване на дозата. Резултатите за животните, третирани с ПСХМ, са както следва

56.76.2 sec за група Р+ПСХМ2.5, 48.37.9 sec за група Р+ПСХМ5 и 45.34.4 sec за животните от

група Р+ПСХМ10, съответно. Времето на неподвижност за група Р+ПСХМ10 достига стойности по-ниски дори от тези на контролната група, но без да се наблюдава статистическа разлика спрямо Контролата или резерпиновата група (Фигура 53).

131

Време на неподвижност 80

секунди (sec)

Р 5 2.5 10

Р+ПСХМ Контрола Р+ПСХМ Р+ПСХМ

Фигура 53. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг и резерпин (Р) върху времето на неподвижност на плъхове в тест принудително плуване

2.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху реагиращи с тиобарбитуровата киселина субстанции в мозък

Реагиращи с тиобарбитуровата киселина субстанции в мозъка (ТБКРС) представлява метод, който измерва спектрофотометрично цвета, получаващ се при реакция на тиобарбитуровата киселина (ТБК) с липидни пероксиди. Методът е описан от екипа на Ohkawa et al. (Ohkawa et al., 1979).

За целта един грам от мозъчен хомогенат е смесен с 5 ml ледено студен TRIS/HCL буфер и е центрофугиран с 2000 rpm при температура 4С за 10 минути. Полученият супернатант е използван за биохимично изследване. При тази реакция, проведена в кисела среда, pH= 7.4, се образуват розови на цвят продукти, които могат да бъдат детектирани при 532 nm (Aurius 2021 UV-VIS spectrophotometer, Cecil Instruments Ltd, UK).

Концентрациите на ТБКРС са измервани в nmol/g в мозък. Образуването на малонов диалдехид се използва като стандарт. Това е главният реактивен алдехид, който се асоциира с 132

оксидативен стрес във физиологичните системи (Del Rio et al., 2005). Получените резултати са представени в Таблица 12 и Фигура 54.

Таблица 12. Нива на ТБКРС (nmol/g) в мозък на плъхове, третирани с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 ml/kg след инжектиране на резерпин (Р)

Група Контрола Резерпин Р+ПСХМ2.5 Р+ПСХМ5 Р+ПСХМ10

Показател

ТБКРС (nmol/g) 0.480.04 0.470.04 0.440.04 0.40.03 0.320.03&&

ANOVA анализът на резултатите показва, че нивата на ТБКРС в мозъка на животните от група Р и на тези от контролната група са много близки. Еднократното приложение на резерпин не води до статистически значими промени в нивата на ТБКРС спрямо Контролата. Концентрациите на ТБКРС в мозъците на плъхове, третирани с ПСХМ, също са близки до тези

на Контролата, но само за групи ПСХМ2.5 и ПСХМ5. При животните от група ПСХМ10 се наблюдава значимо понижение в нивата на ТБКРС спрямо Контролата и резерпиновата група (p<0.01), както е представено на Фигура 54. Може да се отчете тенденция за намаляване нивата

на ТБКРС с повишаване дозата на ПСХМ. За ПСХМ2.5 се установяват най-близки стойности (0.440.04) до тези на резерпиновата група (0.470.04).

133

ТБКРС 0.6

&& 0.4 **

0.2

nmol/g

0.0

Р 5 2.5 10

Р+ПСХМ Контрола Р+ПСХМ Р+ПСХМ

Фигура 54. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг и резерпин (Р) върху нивата на реагиращи с тиобарбитурова киселина субстанции (ТБКРС) в мозък на плъхове; **р<0.01 спрямо Контрола, р<0.01 спрямо група Р

2.4. Обсъждане на ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху резерпин- индуцирана хипокинезия в плъхове

Резерпин е добре познато лекарство, използвано в миналото за лечението на хипертония. Скоро след въвеждането му в клиничната практика се установяват нежелани ефекти, включващи депресия и поведенчески промени. Биохимичната основа лежаща зад тях показва намалени нива на норадреналин, допамин и 5-хидрокситриптамин, вследствие изпразване на везикулите им. Този ефект е особено изразен първите 24 до 48 часа след приложението на резерпин и може да продължи над 7 дни (Pirch et al., 1967). Наблюдаваните клинични промени се изразяват в нарушена моторна функция (хипокинезия, тремор и мускулна ригидност), нарушена температурна регулация (хипотермия) и намален апетит (Calderon et al., 2011; Nammi et al., 2005). Тези прояви са много близки до симптомите на депресия при човека и дават основание за въвеждането на резерпин-индуциран модел при животни, като множество проучвания доказват неговата валидност (Minor and Hanff, 2015).

134

С резерпин-индуцираната хипокинезия се потвърждава и моноаминната хипотеза за невробиологичния произход на депресията (Elhwuegi, 2004). Ефектите на резерпин могат да се разглеждат и като Паркинсон-подобни с намалена двигателна активност. Болестта на Паркинсон и депресията споделят общи патогенетични механизми като намалени нива на моноамини и най- вече на допамин и норадреналин (Chaudhury et al., 2013).

Приложението на резерпин води до намаляване броя преминати полета в тест открито поле и този ефект постига статистическа достоверност при сравнение с Контролата. Нито една доза на ПСХМ не повишава хоризонталната активност на животните със статистическа достоверност спрямо група Резерпин. При животните, третирани с резерпин, не се наблюдава намаляване в броя изправяния на задни лапи, което да постига статистическа значимост спрямо Контролата. Броят на изправянията на задни лапи е статистически достоверно завишен при животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг спрямо група Резерпин. Отчетената вертикална активност е по-висока дори от тази за Контролата.

Наблюдаваното възстановяване в двигателната активност на животните може да се дължи на блокиране активността на МАО и по този начин противопоставяне на резерпин-индуцираното намаляване в нивата на моноаминни медиатори. Възможно е възстановяването на двигателната

активност при приложението на ПСХМ10 да се дължи и на повишаване нивата на допамин. Такъв механизъм е описан от екипа на Zhao (Zhao et al., 2008) за вида Chaenomeles speciosa и се осъществява чрез блокиране обратното поемане на допамин. С инхибиране на допаминовия транспортер в substantia nigra се избягва лекарство-индуцирана дискинезия, а в мезолимбичната система - се антагонизира състояние на ахедония (Willner et al., 2005). Блокери на допаминовото обратно поемане, както и агонисти на рецепторите за допамин водят до повишена двигателна активност в опитни животни (Schindler and Carmona, 2002). Тези данни са в съответствие с наблюдаваните ефекти на ПСХМ върху двигателната активност на плъхове в доза 10 мл/кг.

В тест открито поле приложението на резерпин не води до статистически значими промени във времето, прекарано в централните полета, спрямо Контролата. Времето, прекарано в централните полета, не се променя статистически достоверно при приложението на която и да е доза ПСХМ.

135

За оценка на депресивно-подобното поведение е измерено времето на неподвижност в тест за принудително плуване. Приложението на резерпин не предизвиква значимо повишаване на времето на неподвижност в тест за принудително плуване. С повишаване дозата на ПСХМ се забелязва плавно намаляване на време на неподвижност, без този ефект да постига статистическа значимост спрямо група Резерпин. Възможно е еднократното приложение на резерпин да не повлиява достатъчно ефективно нивата на моноамини или продължителността на третиране да е недостатъчна, понеже развитието на депресия изисква време. Има данни, че поне 2-седмичен период на приложение на резерпин е необходим за развитието на депресивно-подобно поведение (Ikram and Haleem, 2017).

Резерпинът дължи депресивно-подобните си ефекти на блокиране везикуларния моноаминен транспортер, който спомага по-бързото инактивиране на моноаминните медиатори от ензими като МАО и КОМТ. При блокиране на допаминовия везикуларен транспортер може да се наблюдава формиране на допаминови хинони и хидроген пероксиди, което се дължи на окисление на допамина от МАО (Bilska et al., 2007). Тези радикали могат да се натрупват в базалните ганглии в следствие на ускорен допаминов метаболизъм и да участват в развитието на дегенеративни процеси (Fuentes et al., 2007).

Острото приложение на резерпин в настоящия ескперимент не води до статистически значими промени в нивата на оксидативен стрес, измерени чрез ТБКРС, спрямо Контролата. Възможно е еднократното приложение на резерпин да не води до ефективно изчерпване на депата на медиатори и последващо натрупване на кислородни радикали. Наблюдава се намаляване в нивата на ТБКРС при приложението на ПСХМ в доза 10 мл/кг, като този ефект постига достоверност както спрямо група Резерпин, така и спрямо Контролата. Може да се отчете тенденция с повишаване дозата на ПСХМ да намаляват нивата на оксидативен стрес в мозъка на плъхове.

Получените резултати са в съответствие с тези от поведенческите тестове, при които

ПСХМ10 води до най-изявено антагонизиране на резерпин-индуцираната хипокинезия. Ефектите

на ПСХМ10 върху двигателната активност може да се обяснят с вероятния инхибиторен ефект на полифенолите в състава му върху активността на допаминовия транспортер за обратно връщане (Zhao et al., 2008). Възможно е при инхибирането обратното връщане на допамин да намаляват нивата му в пресинаптичното окончание и съответно да намалява окислението му от МАО до 136

реактивни радикали. Възможно е този механизъм да лежи в основата на намалените нива на

ТБКРС след приложението на ПСХМ10.

В подкрепа на това твърдение, екипът на Valcheva-Kuzmanova et al. (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018) изследват състава на ПСХМ и установяват високо съдържание на полифеноли в него. При сравнение на ПСХМ с плодов сок от Aronia melanocarpa се установява значително по-висок антиоксидантен потенциал за ПСХМ in vitro (Valcheva-Kuzmanova et al., 2018). Антиоксидантната му активност пряко корелира с високото съдържание на полифеноли и витамин С. Възможно е с нарастване дозата на ПСХМ да се повишава и способността му да улавя свободни радикали, което е в пряка връзка с нарастване концентрацията на полифеноли и витамин С (Miao et al., 2018).

В този модел на резерпин-индуцирана хипокинезия, най-високата доза на ПСХМ я антагонизира. Еднократното приложение на резерпин не води до оксидативен стрес, но най- високата доза на ПСХМ демонстрира свойството да предотвратява образуването на кислородни радикали, благодарение на което може да се очакват невропротективни свойства.

137

3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei върху поведението при плъхове, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм (НДР)

За целите на този експеримент, мъжки плъхове от порода Wistar са разпределени в пет

групи, всяка състояща се от 10 животни. Групите са съответно: Контрола, НДР, НДР+ПСХМ2.5,

НДР+ПСХМ5 и НДР+ПСХМ10.

Третирането на животните се осъществява по следния начин:

o Животните от групи Контрола и НДР са третирани еднократно дневно с вода (10 мл/кг) чрез орогастрална сонда;

o Животните от група НДР+ПСХМ2.5 получават ПСХМ в доза 2.5 мл/кг разредена до 10 мл/кг еднократно дневно;

o Животните от група НДР+ПСХМ5 са третирани еднократно дневно с ПСХМ в доза 5 мл/кг, разредена до 10 мл/кг;

o На животните от група НДР+ПСХМ10 е прилаган ПСХМ в доза 10 мл/кг еднократно дневно.

Периодът на третиране е 14 дни, през които животните от групи НДР, НДР+ПСХМ2.5,

НДР+ПСХМ5 и НДР+ПСХМ10 са подложени на нарушен денонощен ритъм чрез непрекъснато осветяване. Животните от Контролата са с нормален режим на осветяване през продължителността на опита. На 15тия ден е проведен тест открито поле, а 24 часа след него - тест за социално взаимодействие. Последните два дни са отделени за тренировъчна и експериментална сесия на тест принудително плуване. На получените резултати е направен еднофакторен ANOVA анализ, последван от Dunnett's Multiple Comparison Post Test. Две независими групи са сравнявани посредством Student's t-test.

3.1. Ефект на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест открито поле

В тест открито поле са проследени показателите за двигателна активност - брой преминати полета и брой изправяния на задни лапи, както и показатели за стрес и тревожност - време

138

прекарано в централните полета и брой преминати полета от централното поле. Резултатите са представени в Таблица 13 и Фигура 55 и Фигура 56.

Броят хоризонтални движения в група НДР показва почти двойно завишаване спрямо резултатите, получени за контролните животни (39.76.2). Този ефект достига статистическа достоверност (p<0.05) спрямо Контролата. С повишаване дозата на ПСХМ, се установява, че ниските (43.26.8) и средни дози (59.97.5) на плодовия сок водят до слабо повишаване на хоризонталната активност спрямо контролната група, без да постигат стойностите на група НДР.

Приложението на ПСХМ10 редуцира статистически значимо броя на хоризонталните движения спрямо група НДР (p<0.05). Намален е броят им също така спрямо Контролата, но без да се наблюдава достоверност в този ефект (Фигура 55).

Таблица 13. Проследени показатели в тест открито поле след 14-дневно третиране с ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг в плъхове с нарушен денонощен режим (НДР); *p<0.05 спрямо Контролата; &р<0.05 спрямо НДР

Група Контрола НДР НДР+ПСХМ2.5 НДР+ПСХМ5 НДР+ПСХМ10 Показател Брой преминати 39.76.2 63.46.8* 43.26.8 59.97.5 29.85.2& полета Брой изправяния 12.91.9 22.42.3* 18.32.1 17.52.4 14.32.2& на задни лапи

139

Брой преминати полета 80 *

& 40

5 2.5 10 НДР

Контрола НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ

Фигура 55. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг върху броя преминати полета (хоризонтална активност) на плъхове с нарушен денонощен режим (НДР) в тест открито поле; *p<0.05 спрямо Контрола; &<0.05 спрямо НДР

При оценка на вертикалната активност на животни, подложени на нарушен денонощен ритъм, се наблюдават резултати съответстващи на тези за хоризонталните движени. В група НДР се отчита повишена вертикална активност (22.42.3), достигаща статистическа разлика спрямо Контролата (p<0.05). В групите, третирани с ПСХМ, се наблюдава намаляване на броя вертикални движения с повишаване дозата на ПСХМ, отразено на Фигура 56. При животните от група

НДР+ПСХМ10 се отчита най-ниска стойност за вертикална активност (14.32.2), която постига

статистическа достоверност спрямо група НДР (p<0.05). Стойностите за НДР+ПСХМ10 са близки до тези на Контролата (12.91.9).

140

Брой изправяния на задни лапи 30 *

20 &

5 2.5 10 НДР

Контрола НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ

Фигура 56. Ефекти на ПСХМ в дози 2.5, 5 and 10 мл/кг върху броя изправяния на задни лапи (вертикална активност) на плъхове с нарушен денонощен режим (НДР) в тест открито поле; *p<0.05 спрямо Контрола; &<0.05 спрямо НДР

3.2. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест за социално взаимодействие

Тестът за социално взаимодействие между 2 животни от различни групи се провежда на 15тия ден от началото на третирането. В този тест се наблюдава слабо скъсяване на времето на взаимодействие между тестовите партньори, дължащо се на нарушения денонощен ритъм (31.84.04 sec), но без да се отчита статистическа достоверност на този резултат спрямо Контролата (Фигура 57). Третирането с ПСХМ в най-ниската и най-висока доза води до

статистически достоверно повишаване във времето на социален контакт. За група НДР+ПСХМ2.5

резултатите са 52.92.1 sec (p<0.01 спрямо Контролата), докато за група НДР+ПСХМ10 са 51.66.8 sec (p<0.05 спрямо Контролата). За животните от контролната група и група НДР+ПСХМ5 са отчетени съответно 36.810.3 и 26.11.5 sec време на социално взаимодействие.

141

Време на социално взаимодействие 80 && & 60

секунди (sec)

5 2.5 10 НДР

Контрола НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ

Фигура 57. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на социално взаимодействие при плъхове с нарушен денонощен ритъм (НДР); &<0.05 спрямо група НДР; &&<0.01 спрямо група НДР

3.3. Ефекти на плодов сок от Chaenomeles maulei в тест принудително плуване

Тест принудително плуване се провежда на 16тия и 17тия ден от началото на третирането и е обособен в тренировъчна и експериментална сесия с разлика 24 часа една от друга. Животните от контролната група и от група НДР постигат близки времена на неподвижност като резултатите за НДР са завишени, но без да постигат статистическа значимост и са съответно 105.815.1 за Контролата и 115.611.4 sec за група НДР. Сходни резултати се отчитат и за животните от група

НДР+ПСХМ5 - 100.318.9 sec (Фигура 58). В групите НДР+ПСХМ2.5 и НДР+ПСХМ10 се наблюдава статистически значимо намаляване на времето на неподвижност, като за

НДР+ПСХМ2.5 резултатите са 84.97.7 sec (p<0.01 спрямо Контролата), а за НДР+ПСХМ10 са 73.811.7 sec (p<0.05 спрямо Контролата).

142

Време на неподвижност 150

&& 100 &

секунди (sec)

5 2.5 10 НДР

Контрола НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ НДР+ПСХМ

Фигура 58. Ефект на ПСХМ в дози 2.5, 5 и 10 мл/кг върху времето на неподвижност при плъхове с нарушен денонощен ритъм (НДР) в тест принудително плуване; &<0.05 спрямо група НДР; &&<0.01 спрямо група НДР

3.4. Обсъждане на ефектите на плодов сок от Chaenomeles maulei върху поведението при плъхове, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм (НДР)

Епифизата е главният източник на мелатонин в организма и неговата ритмична секреция модулира множество физиологични функции (Reiter et al., 2014). Излагането на светлина през нощта потиска освобождаването на мелатонин, с което се губят синхронизиращите му ефекти върху периферните клетки. Светлината е изключително важен абиотичен фактор на околната среда, който влияе на поведението и физиологията на лабораторни животни, както и на хората (Danilenko et al., 2011). Плъховете са активни през нощта и добре се приспособяват на слаба осветеност. Продължителното излагане на животни на ярка светлина води до потискане на денонощния ритъм, приема на храна и вода, кръвното налягане и телесната температура, чиято регулация се осъществява в хипоталамуса (Gorwood, 2007; Stephan and Zucker, 1972). Константното наличие на светлина повишава нивата на кортизол в мъжки и женски животни и се

143

използва като модел на хроничен стрес (Prendergast and Kay, 2008). Нарушенията на денонощния ритъм в експериментални животни водят също така до депресивно-подобна симптоматика, тревожност и ахедония (Tapia-Osorio et al., 2013).

При пациентите, диагностицирани с депресия, се откриват флуктуиращи депресивни симптоми, засягащи главно съня, настроението, телесната температура и секрецията на хормони. При тези пациенти циркадианните цикли обикновено са с променен порядък, намалени са по продължителност или несинхронизирани едни с други (Tchekalarova et al., 2018), което се свързва с променена секреция и на други хормони освен мелатонин. Наблюдават се още изменения в нивата на кортизол, като промени в нивата на мелатонин и кортизол се свързват със симптоматичната природа на афективни заболявания, включително депресия и тревожност (Monteleone et al., 2011).

Примамлива особеност на режима с постоянна осветеност като модел на хроничен лек стрес е, че води до съвкупност от поведенчески и физиологични промени. Такъв е например намаленият отговор към стимули, носещи удоволствие, който кореспондира с главния симптом на депресия - ахедонията (Willner, 2016). Наблюдават се още сексуални промени и агресия, намаляване на теглото, изменения в двигателната активност. В животински модели на хроничен лек стрес често описвано в литературата е развитието на тревожно-подобно поведение (Papp et al., 2016; Wang et al., 2014). Животните подложени на хроничен лек стрес, се повлияват добре от продължителното приложение на субстанции и процедури, които имат антидепресивна ефективност (Papp et al., 2017).

Резултатите от тест открито поле потвърждават наличието на промени в двигателната активност на опитни животни вследствие на непрекъсната осветеност. Животните, подложени на нарушен денонощен ритъм показват повишаване на броя преминати полета в тест открито поле,

което е статистически значимо спрямо Контролата. При животните, третирани с ПСХМ в доза 10 мл/кг се отчита намаляване на хоризонталната активност, като този ефект е статистически достоверен спрямо група НДР. Броят изправяния на задни лапи също е значимо повишен за група НДР спрямо Контролата. ПСХМ в доза 10 мл/кг понижава вертикалната активност, като този ефект има статистическа достоверност спрямо група НДР и отчетените стойности са почти идентични с тези на контролната група. Може да се предположи, че най-високата доза на ПСХМ проявява анксиолитично-подобен ефект чрез антагонизиране на стрес-индуцираната 144

хиперкинезия в тест открито поле. Възможно е повишената двигателна активност на животните от група НДР да се дължи на повишените нива на стрес хормони като кортизол, което да обясни тревожно-подобното им поведение. Най-високата доза на ПСХМ намалява двигателната активност, което може да се дължи на намаляване на тревожно-подобното поведение в модел на стрес. ПСХМ в доза 10мл/кг показва анксиолитично-подобен ефекти и в тест повдигнат кръстосан лабиринт при здрави животни.

За допълнителна оценка на тревожно-подобното поведение, животните са изследвани в тест за социално взаимодействие. В този тест, нарушеният денонощен режим не променя със статистическа значимост времето за социално взаимодействие спрямо Контролата. Приложението на ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг води до статистически достоверно повишаване на социалното взаимодействие при сравнение с група НДР. Повишено време на социална активност

се свързва с анксиолитично-подобен ефект, който се отчита при приложението на ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг.

Наличието на стрес е един от основните фактори за развитието на психиатрични разстройства и води до стимулиране освобождаването на адренокортикотропен хормон от хипофизата (Sapolsky, 2000). Високи нива на стрес предизвикват невронална атрофия на хипокампа, която допринася за някои от молекулните промени, наблюдавани при депресия и тревожност (Sheline et al., 1996). Проявите на тревожно-подобно поведение могат да се наблюдават при наличието на остър стрес. Литературните данни показват, че краткосрочно излагане на животни, до 2 седмици, на нарушен денонощен ритъм значително повишава нивата на кортикостерон и активира моноаминната система (Van der Meer et al., 2004). Повишените им нива се свързват с поведение за справяне със стреса и хиперреактивност (Belda et al., 2015).

Възможно е повишената двигателна активност на животните от група НДР да се обясни именно с повишените нива на моноамини и активация на HPA оста. В същото време, приложението на ПСХМ антагонизира повишената двигателна активност и проявява анксиолитично-подобен ефект. Може да се приеме, че при наличието на стрес, полифенолите от ПСХМ потискат главно активността на HPA оста. Такъв ефект е описан в литературата за полифеноли от зелен чай. Счита се, че приложението му води до потискане хиперактивност на хипоталамус-хипофизарната ос и намаляване нивата на адренокортикотропен хормон. Този ефект

145

не се наблюдава при нормални физиологични нива на адренокортикотропния хормон, а само при повишени такива. (Zhu et al., 2012).

Константното излагане на светлина води до депресивно-подобно поведение и завишена реакция към стрес, изразяваща се в тревожност (Fonken et al., 2009). В тест за принудително плуване, времето на неподвижност е слабо повишено при животните от група НДР без да се постига статистическа значимост спрямо контролните животни. ПСХМ в дози 2.5 мл/кг и 10 мл/кг статистически значимо понижават този показател на теста, като в доза 2.5 мл/кг ефектът е най- изявен спрямо група НДР. В тест открито поле, тези дози на ПСХМ се свързват с понижени показатели на двигателна активност. Съчетанието на резултатите от двата теста, дават основание да се предположи, че при наличието на слаб стрес, ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг проявява антидепресивно-подобен ефект.

Развитието на депресивно-подобно поведение изисква излагане на хроничен стрес с продължителност поне 4 седмици. За този период на време се развиват типичните биохимични и поведенчески показатели на депресивно поведение при животните. Установено е, че хроничният стрес води до намалена двигателна активност в тест открито поле, която се дължи на намалени нива на допамин и серотонин в кортекса и хипокампа (Janakiraman et al., 2016). Тъй като излагането на животни на нарушен денонощен ритъм не води до депресивно-подобен ефект, можем да приемем, че 14-дневното наличие на константна светлина не е достатъчно за развитието на депресия. Приложението на ПСХМ обаче показва потенциал да предпазва от стрес- индуцирани поведенчески промени. Намаленото време на неподвижност в тест за принудително плуване може да се обясни с полифенолите от състава на ПСХМ.

Приложението на флавоноида кверцетин в модел на хроничен лек стрес води до намаляване повишената двигателна активност и намаляване времето на неподвижност в тест за принудително плуване. Кверцетин се открива в ПСХМ и е възможно на неговата фармакологична активност да се дължат анксиолитично-подобните и антидепресивно-подобни ефекти на ПСХМ. Механизмите на действие на кверцетин се свързват с възстановяване на някои биохимични показатели като оксидативен стрес, МАО-А активността и нивата на серотонин в мозъка на животни (Singh et al., 2019).

146

Кверцетин също така има свойството да предпазва организа от развитието на възпалителни промени и оксидативен стрес, свързани със стрес-индуцирана депресия (Şahin et al., 2020). Приложението на кверцетин намалява нивата на глутамат, TNF и IL-6, които се повишават при наличието на хроничен лек стрес. Кверцетин повишава и продукцията на антиоксидантни ензими в организма и нивата на серотонин (Khan et al., 2019). Възможно е комбинацията от антиоксидантни, противовъзпалителни и модулиращи моноамините свойства да е отговорна за наблюдаваните анксиолитично-подобен и антидепресивно-подобен ефект на различните дози ПСХМ.

147

VI. ОБОБЩЕНА ДИСКУСИЯ

Плодовият сок от Chaenomeles maulei е богат източник на полифеноли, от които главно флавоноиди и фенолни киселини. Фенолните компоненти са едни от най-широко проучваните биологично активни вещества заради свойството им да повлияват различни заболявания, сред които и такива на ЦНС (Kam et al., 2012). От фенолните киселини най-застъпени в плодовия сок са ванилова, кафеена, хлорогенова и ферулова киселина.

Фенолните киселини, влизащи в състава на ПСХМ притежават потенциал на невропротективни агенти в модел на болест на Алцхаймер (Amin et al., 2017), приложението им се свързва с изразени антимикробни, аналгетични, противовъзпалителни и антиоксидантни свойства (Calixto-Campos et al., 2015; Delaquis et al., 2005; Tai et al., 2012).

Плодовият сок от Chaenomeles maulei демонстрира психофармакологични ефекти, както при млади/здрави животни, така и в експериментални модели. Част от наблюдаваните резултати са свързани с промени в поведението на животните, които се дължат на психомоторна активация. Тя се проявява като подобрена двигателна активност след 14- и 30-дневно приложение на ПСХМ в здрави животни. Би могла да бъде обяснена с някои литературни данни, които демонстрират, че видове от род Chaenomeles могат да повишават допаминергичната невротрансмисия (Zhao et al., 2008). Тъй като локомоцията се повишава при всички дози на ПСХМ след 30-дневно приложение, може да се направи сравнение с механизма на действие на психостимуланти. Последните модулират моноаминергичната система. Вследствие на това, при употребата на психостимуланти се отчита повишаване нивата на допамин и се наблюдава завишена локомоция (Dobbs et al., 2016). Възможно е хлорогеновата киселина и нейният главен метаболит, кафеената киселина, които се детектират в ПСХМ, да са отговорни за наблюдаваната психостимулация. Има данни, които посочват, че приложението на хлорогенова киселина води до психомоторна стимулация. По- изразена такава се наблюдава при приложението на кафеена киселина (Ohnishi et al., 2006). Медицинската полза от подобрението на моторната функция би била в лечението на бради- и хипокинезията при болест на Паркинсон.

Приложението на ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг се съпровожда с анксиолитично-подобен ефект. Възможна причина за този ефект на ПСХМ е високото съдържание на полифеноли в състава му. От тях вероятни носители на фармакологична активност са фенолните киселини и 148

флавоноидите. Хлорогеновата киселина демонстрира анксиолитичен ефект, който се дължи на стимулиране на бензодиазепинови рецептори. Знае се, че влиянието ѝ върху тревожността не е свързано с антиоксидантния ѝ потенциал, а анксиолитично-подобния ѝ ефект е измерим с този на стандарт като Diazepam (Heitman and Ingram, 2017). Флавоноидите епигалокатехин и кверцетин също демонстрират анксиолитично-подобни свойства, които се дължат на взаимодействие с

ГАМКА-рецепторите (Vignes et al., 2006), (Grundmann et al., 2008).

Субхроничното приложение на ПСХМ в нито една доза не води до седативни ефекти, нито повлиява паметта на животните. Възможно е чрез селективно стимулиране на моноаминергичната трансмисия, полифенолите от ПСХМ да повишават двигателната активност на животните без да повлияват паметта, което би допринесло за терапията на невродегенеративни заболявания като болест на Паркинсон.

При приложение на ПСХМ в доза 10 мл/кг се установява антидепресивно-подобен ефект, който се проявява в по-краткосрочния период на третиране. Възможно е наблюдаваният антидепресивно-подобен ефект да се обясни с присъствието на полифеноли във високи концентрации в ПСХМ. Полифенолите имат способността да инхибират активността на глиалната МАО, което се свързва с намалено ензимно разграждане на серотонин и повишеното му освобождаване (Mazzio et al., 1998). Един от флавоноидите, които се откриват във висока концентрация в ПСХМ, е катехин. Установено е, че третирането с катехин подобрява депресивно- подобното и тревожно-подобното поведение в плъхове. Приложението му води до модулация на моноаминната система и се изразява в намалено време на неподвижност в тест принудително плуване (Lee et al., 2013). Възможно е антидепресивно-подобният ефект на ПСХМ да се дължи частично и на повишаване нивата на допамин. Чрез завишаване нивата на серотонин и допамин действат някои антидепресанти (Lee et al., 2017). При тяхното приложение се отчита въздействие върху депресивно-подобното поведение на животни, подобно на наблюдаваното с приложението на ПСХМ.

Резултатите от субхроничното приложение на ПСХМ във всяка негова доза върху здрави животни показват чернодробна и бъбречна безопасност. Показателите за чернодробна функция са близки до контролните, като нивата на AST дори са значимо понижени, което може да се дължи на БАВ, откриващи се в ПСХМ. Понижаването на нивата на трансаминазите се разглежда като потенциал за хепатопротективно действие Полифеноли от ПСХМ, намалявайки нивата на AST 149

проявяват хепатопротективен потенциал, който може да се дължи на антиоксидантните и противовъзпалителни им свойства. Установено е, че консумацията кафе с висока концентрация на хлорогенова киселина намалява развитието на неалкохолна чернодробна стеатоза в плъхове (Panchal et al., 2012). Консумацията на кафе се свързва с намалени нива на чернодробни ензими, което може да се дължи на наличието на полифеноли в него (Ikeda et al., 2010). Индексите за бъбречна функция не търпят особено промени без значeние от дозата на ПСХМ или периода на приложение, което предполага липсата на токсичност. Тези резултати показват, че използваните дози на ПСХМ са напълно безопасни и не компрометиращи бъбречната функция. В подкрепа на това съществуват данни, които доказват наличието на нефропротективен ефект на екстракт от Chaenomeles sinensis в мишки с хиперурикемия (Zhang et al., 2018). Има данни, че приложението на хлорогенова киселина намалява нивата на серумен креатинин и урея, потиска оксидативния стрес, възпалението, апоптозата и стимулира бъбречната регенерация (Al-Megrin et al., 2020; Domitrović et al., 2014).

В животни с резерпин-индуцирана хипокинезия се наблюдава антагонизиране ефектите на резерпин след приложението на ПСХМ. Наблюдаваното възстановяване в двигателната активност на животните може да се дължи на блокиране активността на МАО и по този начин противопоставяне на резерпин-индуцираното намаляване в нивата на моноаминни медиатори.

Възможно е възстановяването на двигателната активност при приложението на ПСХМ10 да се дължи и на повишаване нивата на допамин. Такъв механизъм е описан от екипа на Zhao (Zhao et al., 2008) за вида Chaenomeles speciosa и се осъществява чрез блокиране обратното поемане на допамин. С инхибиране на допаминовия транспортер в substantia nigra се подобрява лекарство- индуцираната дискинезия, а в мезолимбичната система - се антагонизира състоянието на ахедония (Willner et al., 2005). Блокери на допаминовото обратно поемане, както и агонисти на рецепторите за допамин водят до повишена двигателна активност в опитни животни (Schindler and Carmona, 2002). Еднократното приложение на резерпин не води до депресивно-подобно поведение, понеже развитието на депресия изисква време. Има данни, че поне 2-седмичен период на приложение на резерпин е необходим за развитието на депресивно-подобно поведение (Ikram and Haleem, 2017). Острото приложение на резерпин не води до значими промени в нивата на оксидативен стрес, измерени чрез ТБКРС. Наблюдава се намаляване в нивата на ТБКРС при приложението на ПСХМ в доза 10 мл/кг и може да се отчете тенденция с повишаване дозата на ПСХМ да намаляват нивата на оксидативен стрес в мозъка на плъхове. Възможно е с нарастване 150

дозата на ПСХМ да се повишава и способността му да улавя свободни радикали, което е в пряка връзка с нарастване концентрацията на полифеноли и витамин С в състава му (Miao et al., 2018).

Приложението на ПСХМ в модел на нарушен денонощен светлинен ритъм позволява да се изследват неговите ефекти върху поведението на животни при наличието на стрес. Животните, подложени на нарушен денонощен ритъм показват повишаване на двигателната активност. Литературните данни показват, че краткосрочно излагане на животни, до 2 седмици, на нарушен денонощен ритъм значително повишава нивата на кортикостерон и активира моноаминната система (Van der Meer et al., 2004). Приложението на ПСХМ антагонизира повишената двигателна активност и проявява анксиолитично-подобен ефект. При наличието на константна светлина, ПСХМ в дози 2.5 и 10 мл/кг проявява антидепресивно-подобен ефект. Възможно е наблюдаваните ефекти на ПСХМ при наличието на стрес да се дължат на полифенолите от състава му. Кверцетин, който се открива в ПСХМ, проявява анксиолитично-подобни и антидепресивно-подобни ефекти. Механизмите на действие на кверцетин се свързват с възстановяване на някои биохимични показатели като оксидативен стрес, МАО-А активността и нивата на серотонин в мозъка на животни (Singh et al., 2019).

151

VII. ИЗВОДИ

1. Субхроничното приложение на плодов сок от Chaenomeles maulei върху млади/здрави плъхове:

o Води до повишена двигателна активност в тест открито поле след 14- и 30-дневно приложение и анксиолитично-подобен ефект след 14-дневно приложение; o Не повлиява поведението в тест за социално взаимодействие; o Демонстрира анксиолитично-подобен ефект в тест повдигнат кръстосан лабиринт след 15-дневно третиране; o Няма значими ефекти върху паметта след 15- и 30-дневно третиране в тест за разпознаване на обект; o Проявява антидепресивно-подобен ефект в тест принудително плуване след 16- дневно приложение. o Проявява бъбречна и чернодробна безопасност, както и хепатопротективен потенциал, като понижава нивата на аспартат аминотрансфераза; не променя значимо нивата на аланин аминотрансфераза и алкална фосфатаза и не предизвиква изменения в показателите на бъбречна функция - креатинин и урея при 32-дневно приложение.

2. При плъхове с резерпин-индуцирана хипокинезия, плодовият сок от Chaenomeles maulei антагонизира резерпин-индуцираното понижаване на двигателната активност в тест открито поле и намалява нивата на оксидативен стрес в мозъка на животните;

3. При плъхове, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм, третирането с ПСХМ води до антагонизиране на тревожно- и депресивно-подобните прояви, като:

o Намалява стрес-индуцираното повишаване на двигателната активност в тест открито поле; o Проявява анксиолитично-подобен ефект в тест за социално взаимодействие; o Намалява депресивно-подобното поведение в тест принудително плуване.

152

VIII. ПРИНОСИ

1. За пръв път е установено, че субхроничното приложение на плодов сок от Chaenomeles maulei при млади/здрави плъхове:

o Повишава общата двигателна активност; o Води до антидепресивно-подобен ефект; o Не предизвиква промени в паметта; o Демонстрира анксиолитичен потенциал; o Показва чернодробна и бъбречна безопасност.

2. За пръв път е установено, че плодовият сок от Chaenomeles maulei антагонизира резерпин- индуцирана хипокинезия при плъхове и понижава оксидативния стрес в мозъка.

3. За пръв път е изследван ефектът на плодов сок от Chaenomeles maulei при животни, подложени на нарушен светлинен денонощен ритъм, като е установено, че той:

o понижава стрес-индуцираната хиперкинезия; o демонстрира антидепресивно-подобни и анксиолитично-подобни ефекти.

4. Направените проучвания с плодов сок от Chaenomeles maulei позволяват да се хвърли нова светлина върху ефектите на познати вещества и тяхната комбинация в състава на плодовия сок може да се използва за обогатяване на фармакологичните усилия в лечението на тревожно-депресивните и невродегенеративните заболявания.

153

IX. СПИСЪК НА ПУБЛИКАЦИИТЕ И УЧАСТИЯТА, СВЪРЗАНИ С ДИСЕРТАЦИОННИЯ ТРУД

Списък на публикациите

1. Борисова В, Ефтимов М, Вълчева-Кузманова С. Изследване на поведението в тест открито поле на плъхове, третирани с плодов сок от Chaenomeles maulei. Варненски медицински форум 2017(6): 375-80 2. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Assessment of Chaenomeles maulei fruit juice effects in tests for depression and anxiety. Acta Medica Bulgarica, Vol. XLVI, 2019: 34-9 3. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Effects of Chaenomeles maulei fruit juice on reserpine-induced behavioral changes in rats. Folia Medica 2019(61) No. 4: 579-83 4. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Biochemical evaluation of liver and kidney function after subchronic administration of Chaenomeles maulei fruit juice in rats. Bulgarian

Chemical Communications 2019(51), Special Issue A: 29-34 (IF2017: 0.238)

Списък на участията

1. Borisova V, Valcheva-Kuzmanova S. Review on Central nervous system effects and antioxidant activity of Chaenomeles species. Jubilee Conference “Audacity and youth in pharmacology”. Zigov Chark, October 7 to 9, 2016, At Zigov Chark, Bulgaria; 2. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Assessment of Chaenomeles maulei fruit juice effects in the forced swim test in rats, 2nd International Conference in Pharmacology: From Cellular Processes to Drug Targets, Riga, Latvia, 19-20 October 2017, Intrinsic Activity: 5 (Suppl. 2); 3. Борисова В, Ефтимов М, Вълчева-Кузманова С. Изследване на поведението в тест открито поле на плъхове, третирани с плодов сок от Chaenomeles maulei, Шеста Научна Сесия „75 Години Медицински Колеж - Варна“ 17 и 18 ноември 2017 Варненски медицински форум, т. 6, 2017, прил. 2;

154

4. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Antidepressant potential of Chaenomeles maulei fruit juice in reserpine-induced bradykinesia in rats, 22nd International Congress PHYTOPHARM 2018, 25-27 June, 2018, Horgen and ZHAW Wädenswil, Switzerland 5. Борисова В, Ефтимов М, Вълчева-Кузманова С. Анксиолитично-подобни ефекти на плодов сок от Сhaenomeles maulei в тест повдигнат кръстосан лабиринт, Сборник статии от Национална научна конференция „15 години фармация в Медицински университет - Пловдив“ СПА хотел „Орфей“ гр. Девин, 1 - 3 юни 2018. Стр. 93 - 98 6. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Biochemical evaluation of liver and kidney function after subchronic administration of Chaenomeles mauleifruit juice in rats. 2nd International Conference on Bio-antioxidants, 07-10 September 2018, Varna, Bulgarian Chemical Communications 2019(51), Special Issue A: 29-34; 7. Borisova V, Eftimov M, Valcheva-Kuzmanova S. Behavioral effects of the subchronic Chaenomeles mauleifruit juice administration to healthy male rats. 2nd International Conference on Bio-antioxidants, 07-10 September 2018, Varna, Bulgarian Chemical Communications 2019(51), Special Issue A: 18-21

155

X. Библиография

1. Aarsland, D, Påhlhagen, S, Ballard, C, Ehrt, U & Svenningsson, P 2011, 'Depression in Parkinson disease—epidemiology, mechanisms and management', Nat Rev Neurol, vol 8, pp. 35-47. 2. Adam, A, Crespy, V, Levrat-Verny, MA, Leenhardt, F, Leuillet, M, Demigne, C & Remesy, C 2002, 'The bioavailability of ferulic acid is governed primarily by the food matrix rather than its metabolism in intestine and liver in rats', J of Nutrition, vol 132, pp. 1962-8. 3. Ahl, R, Barmparas, G, Riddez, L, Ley, E, Wallin, G & et al. 2017, 'Does Beta- Blockade Reduce the Risk of Depression in Patients with Isolated Severe Extracranial Injuries?', World J Surg, vol 41, pp. 1801-6. 4. Al-Megrin, W, Metwally, D, Habotta, O, Amin, H, Abdel Moneim, A & El- Khadragy, M 2020, 'Nephroprotective Effects of Chlorogenic Acid Against Sodium Arsenite- Induced Oxidative Stress, Inflammation, and Apoptosis', J Sci Food Agric, vol Online ahead of print, pp. doi: 10.1002/jsfa.10565. 5. Alzheimer's Association 2018, '2018 Alzheimer's disease facts and figures', Alzheimer's Dement, vol 14, pp. 367-429. 6. American Psychiatric Association 2013, Diagnostic and statistical manual of mental disorders, Washington, DC. 7. Amin, F, Shah, S & Kim, M 2017, 'Vanillic acid attenuates A(1-42-induced oxidative stress and cognitive impairment in mice', Sci Rep, vol 7. 8. Ammon, HP & Künkel, H 1976, 'Significance of chlorogenic acid in the centrally-stimulating effect of coffee', Dtsch Med Wochenschr, vol 101, pp. 460-4. 9. Anand, A, Li, Y, Wang, Y, Lowe, M & Dzemidzic, M 2009, 'Resting state corticolimbic connectivity abnormalities in unmedicated bipolar disorder and unipolar depression', Psychiatry Res - Neuroimaging, vol 171, pp. 189-98. 10. Anjaneyulu, M, Chopa, K & Kaur, I 2003, 'Antidepressant activity of quercetin, a bioflavonoid, in streptozotocin-induced diabetic mice', J. Med. Food, vol 6, no. 4, pp. 391- 395.

156

11. Ansari, M, Hafiz, M, Joshi, G, Opii, W & Butterfield, D 2009, 'Protective effect of quercetin in primary neurons against Aβ (1–42): relevance to Alzheimer's disease', J Nutr Biochem, vol 20, pp. 269-75. 12. Antunes, M & Biala, G 2012, 'The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications', Cogn Process, vol 13, no. 2, pp. 93-110. 13. Antunes, M, Goes, A, Boeira, S, Prigol, M & Jesse, C 2014, 'Protective effect of hesperidin in a model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine in aged mice', Nutrition, vol 30, pp. 1415-22. 14. Aswar, MA 2016, 'Systematic Review on Neuropathy', Int J Drug Discovery, vol 8, no. 2, pp. 29-34. 15. Avallone, R, Zanoli, P, Puia, G, Kleinschnitz, M, Schreier, P & Baraldi, M 2000, 'Pharmacological profile of apigenin, a flavonoid isolated from Matricaria chamomilla', Biochemical Pharmacology, vol 59, no. 11, pp. 1387-1394. 16. Bagchi, D, Bagchi, M, Stohs, SJ, Das, DK, Ray, SD, Kuszynski, CA & et al. 2000, 'Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention', Toxicol, vol 148, no. 23, pp. 187-97. 17. Bailey, KR & Crawley, JN 2009, 'Anxiety- Related Behavior in Mice', in Methods of Behavior Analysis in Neuroscience, 2nd edition, CRC Press/ Taylor & Francis, Boca Raton (FL). 18. Banfi, G & Del Fabbro, M 2006, 'Serum Creatinine Values in Elite Athletes Competing in 8 Different Sports: Comparison with Sedentary People', Clin Chem, vol 52, no. 2, pp. 330-1. 19. Baxter, M 2010, '“I’ve seen it all before”: explaining age-related impairments in object recognition. Theoretical Comment on Burke et al. (2010)', Behav Neurosci, vol 124, pp. 706-9. 20. Belda, X, Fuentes, S, Daviu, N, Nadal, R & Armario, A 2015, 'Stress-induced Sensitization: The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis and Beyond', Stress, vol 18, no. 3, pp. 269-79. 21. Bella, J, Bullmore, E, Kivimaki, M & Steptoea, A 2016, 'Is there a causal association between inﬂammation and depression?', Brain, Behavior, and Immunity, vol 57. 22. Bernatoniene, J & Kopustinskiene, D 2018, 'The Role of Catechins in Cellular Responses to Oxidative Stress', Molecules, vol 23, no. 4, p. 965. 157

23. Berumen, L, Rodriguez, A, Miledi, R & Garcia-Alcocer, G 2012, 'Serotonin receptors in hippocampus', ScientificWorldJournal, pp. 823-493. 24. Bevins, R, Besheer, J, Palmatier, M, Jensen, H, Pickett, K & Eurek, S 2002, 'Novel-object place conditioning: behavioral and dopaminergic processes in expression of novelty reward', Behav Brain Res, vol 129, pp. 22-50. 25. Bilska, A, Dubiel, M, Sokolowska-Jez'ewicz, M, Lorenc-Koci, E & Wlodek, L 2007, 'Alpha-lipoic acid differently affects the reserpine-induced oxidative stress in the striatum and prefrontal cortex of rat brain', Neurosci, vol 146, no. 4, pp. 1758-71. 26. Bissière, S, Humeau, Y & Lüthi, A 2003, 'Dopamine gates LTP induction in lateral amygdala by suppressing feedforward inhibition', Nat Neurosci, vol 6, pp. 587-92. 27. Bodea, G & Blaess, S 2015, 'Establishing diversity in the dopaminergic system', FEBS Letters, vol 589, pp. 3773-85. 28. Boku, S, Nakagawa, S, Toda, H & Hishimoto, A 2018, 'Neural Basis of Major Depressive Disorder: Beyond Monoamine Hypothesis', Psychiatry Clin Neurosci, vol 72, pp. 3- 12. 29. Bonato, J, Bassani, T, Milani, H, Vital, M & de Oliveira, R 2018, 'Pioglitazone reduces mortality, prevents depressive-like behavior, and impacts hippocampal neurogenesis in the 6-OHDA model of Parkinson's disease in rats', Exp Neurol, vol 300, pp. 188-200. 30. Boo, H, Hwang, S, Bae, C, Park, S & et al. 2012, 'Extraction and characterization of some natural plant pigments', Ind. Crops Prod., vol 40, pp. 129–135. 31. Bortolato, M, Chen, K & Shih, J 2008, 'Monoamine oxidase inactivation: from pathophysiology to therapeutics', Adv Drug Deliv Rev, vol 60, pp. 527-33. 32. Bouarab Chibane, L, Degraeve, P, Ferhout, H, Bouajila, J & Oulahal, N 2019, 'Plant Antimicrobial Polyphenols as Potential Natural Food Preservatives', J Sci Food Agric, vol 99, no. 4, pp. 1457-74. 33. Bouayed, J, Rammal, H, Dicko, A, Younos, C & Soulimani, R 2007, 'Chlorogenic acid, a polyphenol from Prunus domestica (Mirabelle), with coupled anxiolytic and antioxidant effects', J Neurol Sci, vol 262, no. 1-2, pp. 77-84. 34. Bouayed, J, Rammal, J, Younos, C & Soulimani, R 2007, 'Positive correlation between peripheral blood granulocyte oxidative status and level of anxiety in mice', Eur J Pharmacol, vol 564, no. 1-3, pp. 146-9.

158

35. Bravo, L 1998, 'Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance', Nutrition Reviews, vol 56, pp. 317-333. 36. Brooks, D 2016, 'Molecular imaging of dopamine transporters', Ageing Res Rev, vol 30, pp. 114-21. 37. Burke, S, Wallace, J, Nematollahi, S, Uprety, A & Barnes, C 2010, 'Pattern separation deficits may contribute to age-associated recognition impairments', Behav Neurosci, vol 124, pp. 559-73. 38. Calapai, G, Crupi, A, Firenzuoli, F, Inferrera, G, Squadrito, F, Parisi, A, De Sarro, G & Caputi, A 2001, 'Serotonin, Norepinephrine and Dopamine Involvement in the Antidepressant Action of Hypericum Perforatum', Pharmacopsychiatry, vol 34, no. 2, pp. 45- 49. 39. Calderon, J, Bolaños, R, Carrillo, J, Escamilla, C, Salazar, S, Moreno, G & Rivera, G 2011, 'Behavioral analysis of the reserpine induced motor changes in a Parkinsonian mouse model', Revista Neuropsicología, Neuropsiquiatría y Neurociencias, vol 11, no. 2, pp. 49-61. 40. Calixto-Campos, C, Carvalho, T, Hohmann, M, Pinho-Ribeiro, F, Fattori, V, Manchope, M, Zarpelon, A, Baracat, M, Georgetti, S & Casagrande, R 2015, 'Vanillic acid inhibits inflammatory pain by inhibiting neutrophil recruitment, oxidative stress, cytokine production, and NFkB activation in mice', J Nat Prod, vol 78, no. 8, pp. 1799-1808. 41. Cappelletti, S, Piancentino, D, Sani, G & Aromatario, M 2015, 'Caffeine: cognitive and physical performance enhancer or psychoactive drug', Curr Neuropharmacol, vol 13, pp. 71-88. 42. Carmack, S, Howell, K, Rasaei, K, Reas, E & Anagnostaras, S 2014, 'Animal model of methylphenidate’s long-term memory-enhancing effects', Learn Mem, vol 21, no. 2, pp. 82-9. 43. Caudal, D, Alvarsson, A, Björklund, A & Svenningsson, P 2015, 'Depressive- like phenotype induced by AAV-mediated overexpression of human α-synuclein in midbrain dopaminergic neurons', Exp Neurol, vol 273, pp. 243-52. 44. Chagas, M, Tumas, V, Pena-Pereira, M, Machado-de-Sousa, J, Carlos Dos Santos, A, Sanches, R, Hallak, J & Crippa, J 2017, 'Neuroimaging of major depression in Parkinson's disease: cortical thickness, cortical and subcortical volume, and spectroscopy findings', J Psychiatr Res, vol 90, pp. 40-5. 159

45. Chaudhury, D, Walsh, JJ, Friedman, AK & et al. 2013, 'Rapid regulation of depression-related behaviours by control of midbrain dopamine neurons', Nature, vol 493, no. 7433, pp. 532-6. 46. Cheng, J & Liu, I 2000, 'Stimulatory effect of caffeic acid on α1A-adrenoceptors to increase glucose uptake into cultured C2C12 cells', Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol, vol 362, pp. 122-7. 47. Chen, J, Lin, D, Zhang, C & et al. 2015, 'Antidepressant-like effects of ferulic acid: involvement of serotonergic and norepinergic systems', Metab Brain Dis, vol 30, pp. 129- 36. 48. Chen, K, Reese, E, Kim, H, Rapoport, S & Rao, J 2011, 'Disturbed neurotransmitter transporter expression in Alzheimer's disease brain', J Alzheimer's Dis, vol 26, pp. 755-66. 49. Chiou, A, Kalogeropoulos, N, Boskou, G & Salta, F 2012, 'Migration of health promoting microconstituents from frying vegetable oils to French fries', Food Chem., vol 133, pp. 1255–1263. 50. Chiu, W, Depboylu, C, Hermanns, G, Maurer, L, Windolph, A, Oertel, W, Ries, V & et al. 2015, 'Long-term treatment with l-DOPA or pramipexole affects adult neurogenesis and corresponding non-motor behavior in a mouse model of Parkinson's disease', Neuropharmacology, vol 95, pp. 367-76. 51. Choudhury, R, Srai, SK, Debnam, E & Rice-Evans, CA 1999, 'Urinary excretion of hydroxycinnamates and flavonoids after oral and intravenous administration', Free Radic Biol, vol 27, pp. 278-86. 52. Clausius, N, Born, C & Grunze, H 2009, 'The relevance of dopamine agonists in the treatment of depression', Neuropsychiatr, vol 23, pp. 15-25. 53. Clemens, K, Cornish, J, Hunt, G & McGregor, I 2007, 'Repeated weekly exposure to MDMA, methamphetamine or their combination: long-term behavioural and neurochemical effects in rats', Drug Alcohol Depend, vol 86, pp. 183-90. 54. Cohen, M, Skelton, M, Schaefer, T, Gudelsky, G, Vorhees, C & Williams, M 2005, 'Learning and memory after neonatal exposure to 3, 4-methylenedioxymethamphetamine (ecstasy) in rats: Interaction with exposure in adulthood', Synapse (New York), vol 57, no. 3, pp. 148-59.

160

55. Cole, J, Costafreda, S, McGuffin, P & Fu, C 2011, 'Hippocampal atrophy in first episode depression: a meta-analysis of magnetic resonance imaging studies', J Affect Disord, vol 134, pp. 483-7. 56. Cornejo, V & Hetz, C 2013, 'The unfolded protein response in Alzheimer's disease', Semin Immunopathol, vol 35, pp. 277-92. 57. Crozier, A, Del Rio, D & Clifford, M 2010, 'Bioavailability of dietary flavonoids and phenolic compounds', Mol Aspects Med, vol 31, pp. 446-67. 58. Cuhna, J & Masur, J 1978, 'Evaluation of psychotropic drugs with a modified open field test', Pharmacology, vol 16, no. 5, pp. 259-67. 59. Czok, G & Lang, K 1961, 'On the stimulationg effect of chlorogenic acid', Arzneimittelforschung, vol 11, pp. 448-50. 60. Dajas, F, Abin-Carriquiry, J, Arredondo, F, Blasina, F, Echeverry, C, Martínez, M & et al. 2015, 'Quercetin in brain diseases: Potential and limits', Neurochem Int, vol 89, pp. 140-8. 61. D'Andrea, G 2015, 'Quercetin: A Flavonol With Multifaceted Therapeutic Applications?', Fitoterapia, vol 106, pp. 256-71. 62. Danilenko, K, Plisov, I, Cooper, H, Wirz-Justice, A & Hebert, M 2011, 'Human cone light sensitivity and melatonin rhythms following 24-hour continuous illumination', Chronobiol Int, vol 28, pp. 407-14. 63. Daun, J & Burch, L 1984, 'Oilseeds grading – Quality control in oilseeds marketing', J. Am. Oil Chem. Soc., vol 61, pp. 1117– 1122. 64. De Boer, V, Dilah, A, van der Woude, H, Arts, I, Wolffram, S, Alink, G, Rietjens, I & et al. 2005, 'Tissue distribution of quercetin in rats and pigs', J Nutr, vol 135, pp. 1718-25. 65. Decendit, A, Mamani-Matsuda, M, Aumont, V, Waffo-Teguo, P, Moynet, D, Boniface, K & et al. 2013, 'Malvidin-3-O-beta glucoside, major grape anthocyanin, inhibits human macrophage-derived inflammatory mediators and decreases clinical scores in arthritic rats', Biochem Phamacol, vol 86, pp. 1461-1467. 66. Del Rio, D, Borges, G & Crozier, A 2010, 'Berry flavonoids and phenolics: bioavailability and evidence of protective effects', British J Nutrition, vol 104, pp. S67-90.

161

67. Del Rio, D, Stewart, AJ & Pellegrini, N 2005, 'A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress', Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, vol 15, no. 4, pp. 316-28. 68. Delaquis, P, Stanich, K & Toivonen, P 2005, 'Effect of pH on the inhibition of Listeria spp. by vanillin and vanillic acid', J Food Prot, vol 68, no. 7, pp. 1472-6. 69. Dhiman, P, Malin, N, Sobarzo-Sánchez, E, Uriarte, E & Khatkar, A 2019, 'Quercetin and Related Chromenone Derivatives as Monoamine Oxidase Inhibitors: Targeting Neurological and Mental Disorders', Molecules, vol 24, no. 3, p. 418. 70. Di Giovanni, G, Di Matteo, V, Pierucci, M & Esposito, E 2008, 'Serotonin- dopamine interaction: electrophysiological evidence', Prog Brain Res, vol 172, pp. 45-71. 71. Dissanayaka, N, Sellbach, A, Silburn, P, O'Sullivan, J, Marsh, R & Mellick, G 2011, 'Factors associated with depression in Parkinson’s disease', J Affect Disord, vol 132, pp. 82-8. 72. Dobbs, L, Kaplan, A, Lemos, J, Matsui, A, Rubinstein, M & Alvarez, V 2016, 'Dopamine regulation of lateral inhibition between striatal neurons gates the stimulant actions of cocaine', Neuron, vol 90, no. 5, pp. 1100-13. 73. Domitrović , R, Cvijanović , O, Šušnić, V & Katalinić, N 2014, 'Renoprotective Mechanisms of Chlorogenic Acid in Cisplatin-Induced Kidney Injury', Toxicology, vol 324, pp. 98-107. 74. Dong, H, Murphy, K, Meng, L, Montalvo-Ortiz, J, Zeng, Z, Kolber, B, Zhang, S, Muglia, L & Csernansky, J 2012, 'Corticotrophin releasing factor accelerates neuropathology and cognitive decline in a mouse model of Alzheimer's disease', J Alzheimer's Dis, vol 28, pp. 579-92. 75. Dooren, F, Schram, M, Schalwijk, C, Stehouwer, C & et al. 2016, 'Associations of low grade inflammation and endothelial dysfunction with depression- The Maastricht Study', Brain, Behavior and Immunity, vol 56, pp. 390-396. 76. Doron, R, Lotan, D, Einat, N, Yaffe, R, Winer, A, Marom, I, Meron, G, Kately , N & Rehavi, M 2014, 'A novel herbal treatment reduces depressive-like behaviors and increases BDNF levels in the brain of stressed mice', Life Sci, vol 94, no. 2. 77. Duman, R 2002, 'Pathophysiology of depression: the concept of synaptic plasticity', European Psychiatry, vol 17, pp. 306–310.

162

78. Duman, R & Monteggia, L 2006, 'A neurotrophic model for stress-related mood disorders', Biol Psychiatry, vol 59, pp. 1116-27. 79. Du, X & Pang, T 2015, 'Is dysregulation of the HPA-axis a core pathophysiology mediating co-morbid depression in neurodegenerative diseases?', Front Psychiatry, p. 10.3389/fpsyt.2015.00032. 80. Du, H, Wu, J, Li, H, Zhong, P, Xu, Y & et al. 2013, 'Polyphenols and triterpenes from Chaenomeles fruits: Chemical analysis and antioxidant activities assessment', Food Chemistry, vol 141, no. 4, pp. 4260-8. 81. Dwiecki, K, Górnas, P, Jackowiak, H, Nogala‐Kałucka, M & Polewski, K 2007, 'The effect of D‐alpha‐tocopherol on the solubilization of dipalmitoylphosphatidylcholine membrane by anionic detergent sodium dodecyl sulfate', J. Food Lipids, vol 14, pp. 50–61. 82. Dwiecki, K, Górnas, P, Wilk, A, Nogala‐Kałucka, M & Polewski, K 2007, 'Spectroscopic studies of D‐a‐tocopherol concentration‐induced transformation in egg phosphatidylcholine vesicles', Cell. Mol. Biol. Lett., vol 12, pp. 51–69. 83. Ekeanyanwu, RC & Njoku, OU 2015, 'Flavonoid-rich fraction of the Monodora tenuifolia seed extract attenuates behavioural alterations and oxidative damage in forced-swim stressed rats', Chinese Journal of Natural Medicines, vol 13, no. 3, pp. 183-191. 84. Elhwuegi, A 2004, 'Central monoamines and their role in major depression', Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry, vol 28, no. 3, pp. 435-51. 85. Elliott, J, Heal, D & Masden, C 1992, 'Behavioural detection of anxiolytic action', Experimental approaches to anxiety and depression, John Wiley & Sons Ltd, New York, pp. 25-44. 86. Ennaceur, A 2010, 'One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues', Behavioural Brain Research, pp. 244-254. 87. Ennaceur, A 2014, 'Tests of unconditioned anxiety - pitfalls and disappointments', Psysiol Behav, vol 135, pp. 55-71. 88. Entedhar, RS & Nawal, AM 2016, 'Biochemical Changes in Chronic Renal Failure Pre and Post Hemodialysis', J Environ Sci Eng Technol, vol 5, pp. 190-5. 89. Fan, F, Sang, L & Jiang, M 2017, 'Catechins and Their Therapeutic Benefits to Inflammatory Bowel Disease.', Molecules, vol 22, no. 3, p. 484.

163

90. Feng, G, Kun, Z, Xintian, S, Xiaogang, W & Jingying, Z 2010, 'Study on Anti- Oxidation Function of Extraction from Grape Seed to Human', Chin J Pub Health Eng, vol 9, no. 2, pp. 99-100. 91. Ferraro, L, Fuxe, K, Tanganelli, S, Tomasini, MC, Rambert, FA & Antonelli, T 2002, 'Differential enhancement of dialysate serotonin levels in distinct brain regions of the awake rat by modafinil: possible relevance for wakefulness and depression', J Neurosci Res, vol 68, pp. 107-12. 92. Ferri, P, Angelino, D, Gennari, L, Benedetti, S, Ambrogini, P, Del Grande, P & Ninfali, P 2015, 'Enhancement of flavonoid ability to cross the blood-brain barrier of rats by co- administration with alpha-tocopherol', Food Funct, vol 2, pp. 394-400. 93. Ferruzzi, MG, Lobo, JK, Janle, EM, Cooper, B, Simon, JE, Wu, QL, Welch, C & et al. 2009, 'Bioavailability of gallic acid and catechins from grape seed polyphenol extract is improved by repeated dosing in rats: implications for treatment in Alzheimer's disease', J Alzheimers Dis, vol 1, pp. 113-24. 94. Fialová, M, Šírová , J, Bubeníková-Valešová, V & Šlamberová, R 2015, 'The Effect of Prenatal Methamphetamine Exposure on Recognition Memory in Adult Rats', Prague Med Rep, vol 116, no. 1, pp. 31-9. 95. File, S 1980, 'The use of social interaction as a method of detecting anxiolytic activity of chlordiazepoxide-like drugs', Journal of Neuroscience. Methods, pp. 219-238. 96. File, SE & Hyde, JR 1978, 'Can social interaction be used to measure anxiety?', British Journal of Pharmacology, pp. 19-24. 97. Fisone, G, Borgkvist, A & Usiello, A 2004, 'Caffeine as a psychomotor stimulant: mechanism of action', Cell Mol Life Sci, vol 61, pp. 857-72. 98. Fole, A, Martin, M, Morales, L & Del Olmo, N 2015, 'Effects of chronic cocaine treatment during adolescence in Lewis and Fischer-344 rats: Novel location recognition impairment and changes in synaptic plasticity in adulthood', Neurobiology of Learning and Memory, vol 123, pp. 170-86. 99. Fonken, L, Finy, M, Walton, J, Weil, Z, Workman, J, Ross, J & Nelson, R 2009, 'Influence of light at night on murine anxiety- and depressive-like responses', Behav Brain Res, vol 205, no. 2, pp. 349-54. 100. Fraga, C, Croft, K, Kennedy, D & Tomas-Baberan, F 2019, 'The Effects of Polyphenols and Other Bioactives on Human Health', Food Funct, vol 10, no. 2, pp. 514-28. 164

101. Fraga, C, Galleano, M, Verstraeten, S & Oteiza, P 2010, 'Basic biochemical mechanisms behind the health benefits of polyphenols', Mol Aspects Med, vol 31, pp. 435-45. 102. Freitas, AE, Egea, J, Buendia, I, Gomez-Rangel, V, Parada, E & et al. 2016, 'Agmatine, by improving neuroplasticity markers and inducing Nrf2, prevents corticosterone- induced depressive-like behavior in mice', Mol Neurobiol, vol 53, pp. 3030-45. 103. Fuentes, P, Paris , I, Nassif, M, Caviedes, P & Segura-Aguilar, S 2007, 'Inhibition of VMAT-2 and DT-diaphorase induced cell death in a substantia nigra-derived cell line-na experimental cell model for dopamine toxicity studies', Chem Res Toxicol, vol 20, pp. 776-83. 104. Furtado M, KM 2015, 'Neuroinflammatory pathways in anxiety, posttraumatic stress, and obsessive compulsive disorders', Psychiatry Res. 105. Galecki, P & Talarowska, M 2018, 'Inflammatory Theory of Depression', Psychiatr Pol, vol 52, no. 3, pp. 437-47. 106. Galts, C, Bettio, L, Jewett, D, Yang, C, Brocardo, P, Rodrigues, A, Thacker, J & et al. 2019, 'Depression in Neurodegenerative Diseases: Common Mechanisms and Current Treatment Options', Neurosci Biobehav Rev, vol 102, pp. 56-84. 107. Gao, J, Su, D, Marshall, C & Xiao, M 2018, 'Depressive- and anxiety-like phenotypes in young adult APPSwe/PS1dE9 transgenic mice with insensitivity to chronic mild stress', Behav Brain Res, vol 353, pp. 114-23. 108. Garcia, A, Martinez, R, Brandão, M & Morato, S 2005, 'Effects of apomorphine on rat behavior in the elevated plus-maze', Physiol Behav, vol 85, no. 4, pp. 440-7. 109. García-Pardo, MP, Roger-Sánchez, C, Rodríguez-Arias, M, Miñarro, J & Aguilar, MA 2017, 'Cognitive and behavioural effects induced by social stress plus MDMA administration in mice', Behav Brain Res, vol 319, pp. 63-72. 110. Gaskin, S, Tardif, M, Cole, E, Piterkin, P, Kayello, L & Mumby, D 2010, 'Object familiarization and novel-object preference in rats', Behav Proc, vol 83, pp. 61-71. 111. Gaskin, S, Tardif, M, Cole, E, Piterkin, P, Kayello, L & Mumby, DG 2010, 'Object familiarization and novel-object preference in rats', Behavioural Processes, pp. 61-71. 112. GBD Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators 2018, 'Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017', The Lancet, vol 392, no. 10159, pp. 1789-1858. 165

113. Geng, C, Yang, T, Huang, X, Ma, Y, Zhang, X & Chen, J 2019, 'Antidepressant potential of Uncaria rhynchophylla and its active flavanol, catechin, targeting melatonin receptors', J Ethnopharmacol, vol 232, pp. 39-46. 114. George, RC, Lew, J & Graves, DJ 2013, 'Interaction of cinnamaldehyde and epicatechin with tau: implications of beneficial effects in modulating Alzheimer’s disease pathogenesis', J Alzheimers Dis, vol 36, pp. 21-40. 115. Ghasemi, M 2019, 'Nitric oxide: Antidepressant mechanisms and inflammation', Adv Pharmacol, vol 86, pp. 121-52. 116. Gigliucci, V, O'Dowd, G, Casey, S, Egan, D, Gibney, S & Harkin, A 2013, 'Ketamine elicits sustained antidepressant-like activity via a serotonin-dependent mechanism', Psychopharmacol, vol 228, pp. 157-66. 117. Glass, C, Saijo, K, Winner, B, Marchetto, M & Gage, F 2010, 'Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration', Cell, vol 140, pp. 918-34. 118. Goes, A, Souza, L, Filho, C, Del Fabbro, L, De Gomes, M, Boeira, S & Jesse, C 2014, 'Neuroprotective effects of swimming training in a mouse model of Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine', Neuroscienxe, vol 256, pp. 61-71. 119. Gonthier, M, Verny, M, Besson, C, Remesy, C & Scalbert, A 2003, 'Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats', Journal of Nutrition, vol 133, pp. 1853-1859. 120. Gornas, P, Siger, A, Juhnevica, K, Lacis, G, Šne, E & Seglina , D 2014, 'Cold‐ pressed Japanese quince (Chaenomeles japonica(Thunb.) Lindl. ex Spach) seed oil as a rich source of ‐tocopherol, carotenoids and phenolics: A comparison of thecomposition and antioxidant activity with nine other plant oils', European Journal of Lipid Science and Technology, vol 116, no. 5, pp. 563-570. 121. Gorwood, P 2007, 'Depression and circadian rhythm disturbances', Medicographia, vol 29, no. 1, pp. 22-7. 122. Goulart, BK, de Lima, M, de Farias, C, Reolon, G, Almeida , V, Quevedo, J, Kapczinski, F, Schröder, N & Roesler, R 2010, 'Ketamine impairs recognition memory consolidation and prevents learning-induced increase in hippocampal brain-derived neurotrophic factor levels', Neuroscience, vol 167, pp. 969-73.

166

123. Goutman, JD, Waxemberg, MD, Donate-Oliver, F & al., E 2003, 'Flavonoid modulation of ionic currents mediated by GABA A and GABA C receptors', European Journal of Pharmacology, pp. 79-87. 124. Granados, M, Vila, R, Laencina, J, Rumpunen, K & Ros, J 2003, 'Japanese Quince Potential Fruit Crop for Northern Europe, Alnaph, Kristianstad, Sweden', pp. 141-147. 125. Greaney, J, Saunder, E, Santhanam, L & Alexander, L 2019, 'Oxidative Stress Contributes to Microvascular Endothelial Dysfunction in Men and Women with Major Depressive Disorder', Circ Res, vol 124, no. 4, pp. 564-74. 126. Grundmann, O, Wang, J, McGregor, G & Butterweck, V 2008, 'Anxiolytic activity of a phytochemically characterized Passiflora incarnata extract is mediated via the GABAergic system', Planta Med, vol 74, pp. 1769-73. 127. Guest, J & Grant, R 2012, 'Effects of dietary derived antioxidants on the central nervous system', Int J Nutr Pharmacol Neurol Dis, vol 2, pp. 185-97. 128. Guo, L, Wang, L, Sun, B & et al. 2007, 'Direct in Vivo Evidence of Protective Effects of Grape Seed Procyanidin Fractions and Other Antioxidants Against Ethanol-Induced Oxidative DNA Damage in Mouse Brain Cells', J Agric Food Chem, vol 55, no. 14, pp. 5881- 91. 129. Hafez-Taghva, P, Zamzad, M & Khalafi, L 2016, 'Total flavonoid content and essential oil composition of Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. Ex Spach from North of Iran', IJNPR, vol 7, no. 1, pp. 90-2. 130. Halaris, A 2017, 'Inflammation-Associated Co-morbidity Between Depression and Cardiovascular Disease', Curr Top Behav Neurosci, vol 31, pp. 45-70. 131. Hamauzu, Y, Yasui, H, Inno, T, Kume, C & Omanyuda, M 2005, 'Phenolic profile, antioxidant property, and anti-influenza viral activity of Chinese quince (Pseudocydonia sinensis Schneid.), quince (Cydonia oblonga Mill.), and apple (Malus domestica Mill. fruits', Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 53, no. 4, pp. 928-934. 132. Hamon, M & Blier, P 2013, 'Monoamine neurocircuitry in depression and strategies for new treatments', Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, vol 45C, pp. 54- 63. 133. Hao, J, Sun, N, Lei, L, Li, X, Yao, B, Sun, K, Hu, R & et al. 2015, 'L- Stepholidine rescues memory deficit and synaptic plasticity in models of Alzheimer's disease

167 via activating dopamine D1 receptor/PKA signaling pathway', Cell Death Dis, vol 6, p. 10.1038/cddis.2015.315. 134. Hassanzadeh, P, Arbabi, E, Atyabi, F & Dinarvand, R 2017, 'Ferulic acid exhibits antiepileptogenic effect and prevents oxidative stress and cognitive impairment in the kindling model of epilepsy', Life Sci, vol 179, pp. 9-14. 135. Heim, C & Nemeroff, CB 1999, 'The impact of early adverse experiences on brain systems involved in the pathophysiology of anxiety and affective disorders', Biological Psychiatry, vol 46, no. 11, pp. 1509-1522. 136. Heitman, E & Ingram, D 2017, 'Cognitive and Neuroprotective Effects of Chlorogenic Acid', Nutr Neurosci, vol 20, no. 1, pp. 32-9. 137. Hemmerle, A, Dickerson, J, Herman, J & Seroogy, K 2014, 'Stress exacerbates experimental Parkinson's disease', Mol Psychiatry, vol 19, pp. 638-40. 138. Hendricksen, M, Thomas, A, Ferrier, I, Ince, P & O'Brien, J 2004, 'Neuropathological study of the dorsal raphe nuclei in late-life depression and Alzheimer's disease with and without depression', Am J Psychiatry, vol 161, pp. 1096-102. 139. Herbert, C & Hughes, R 2009, 'A comparison of 1-benzylpiperazine and methamphetamine in their acute effects on anxiety-related behavior of hooded rats', Pharmacol Biochem Behav, vol 92, pp. 243-50. 140. Hollman, P, de Vries, J, van Leeuven, S, Mengelers, M & Katan, M 1995, 'Absorption of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers', American Journal of Clinical Nutrition, vol 62, pp. 1276-1282. 141. Hollman, P & Katan, M 1997, 'Absorption, metabolism and health effects of dietary flavonoids in man', Biomed Pharmacother, vol 51, pp. 305-10. 142. Holzmann, I, da Silva, L, da Silva, J, Steimbach, V & de Souza, M 2015, 'Antidepressant-like effect of quercetin in bulbectomized mice and involvement of the antioxidant defenses, and the glutamatergic and oxidonitrergic pathways', Pharmacol Biochem Behav, vol 136, pp. 55-63. 143. https://www.itis.gov/ 2017, < HYPERLINK "https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=508021" \l "null" https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=508021#n ull >. 168

144. Ikeda, M, Maki, T, Yin, G & et al. 2010, 'Relation of coffee consumption and serum liver enzymes in Japanese men and women with reference to effect modification of alcohol use and body mass index', Scand J Clin Lab Investig, vol 70, pp. 171-9. 145. Ikram, H & Haleem, D 2017, 'Repeated Treatment With Reserpine as a Progressive Animal Model of Depression', Pak J Pharm Sci, vol 30, no. 3, pp. 897-902. 146. Imre, G, Fokkema, D, Boer, J & Ter Horst, G 2006, 'Dose–response characteristics of ketamine effect on locomotion, cognitive function and central neuronal activity', Brain Res Bull, vol 69, pp. 338-45. 147. Ishisaka, A, Mukai, R, Terao, J, Shibata, N & Kawai, Y 2014, 'Specific localization of quercetin-3-O-glucuronide in human brain', Arch Biochem Biophys, vol 557, pp. 11-7. 148. Iversen, L, White, M & Treble, R 2014, 'Designer psychostimulants: pharmacology and differences', Neuropharmacology, vol 87, pp. 59-65. 149. Jacobs, DS 1996, Laboratory Test Handbook, 4th edn, Lexi-Comp Inc, Cleveland. 150. Janakiraman, U, Manivasagam, T, Thenmozhi, A, Essa, M, Barathidasan, R & et al. 2016, 'Influences of Chronic Mild Stress Exposure on Motor, Non-Motor Impairments and Neurochemical Variables in Specific Brain Areas of MPTP/Probenecid Induced Neurotoxicity in Mice', PLoS One, vol 11, no. 1, p. e0146671. 151. Jana, A, Modi, K, Roy, A, Anderson, J & et al. 2013, 'Up-regulation of neurotrophic factors by cinnamon and its metabolite sodium benzoate: therapeutic implications for neurodegenerative disorders', J Neuroimmune Pharmacol, vol 8, p. 739. 152. Jayasingh, S, Rahul, K, Rahul, K, Boyina, K, Sai, K & Prakash, D 2015, 'Cognitive effects of vanillic acid against streptozotocin-induced neurodegeneration in mice', Pharm Biol, vol 53, no. 5, pp. 630-6. 153. Jiang, X, Liu, J, Lin, Q & et al. 2017, 'Proanthocyanidin prevents lipopolysaccharide-induced depressive-like behavior in mice via neuroinflammatory pathway', Brain Res Bull, vol 135, pp. 40-6. 154. Jinjing, W, Yan, S, Chunfeng, L & Qi, L 2013, 'Study on the anti-oxidative capability of proanthocyanidins from hops', Sci Technol Food Ind, vol 34, no. 8, pp. 118-22. 155. Johnson, P, Molosh, A, Fitz, S, Arendt, D, Deehan, G, Federici, L, Bernabe, C, Engleman, E, Rodd, Z, Lowry, C & Shekhar, A 2015, 'Pharmacological depletion of serotonin 169 in the basolateral amygdala complex reduces anxiety and disrupts fear conditioning', Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol 138, pp. 174-179. 156. Kalin, NH 1990, 'Behavioral and endocrine studies of corticotropin-releasing hormone in primates', in Corticotropin-Releasing Factor: Band and Clinical Studies of a Neuropeptide, CRC Press, Boca Raton, FL. 157. Kam, A, Li, K, Razmovski-Naumovski, V, Nammi, S, Chan, K, Li, Y & Li, G 2012, 'The protective effects of natural products on blood-brain barrier breakdown', Curr Med Chem, vol 19, no. 12, pp. 1830-45. 158. Kanski, J, Aksenova, M, Stoyanova, A & Butterfield, DA 2002, 'Ferulic acid antioxidant protection against hydroxyl and peroxyl radical oxidation in synaptosomal and neuronal cell culture systems in vitro: structure-activity studies', J Nutr Biochem, vol 13, pp. 273-81. 159. Kara, N, Agam, G, Anderson, G, Zitron, N & Einat, H 2017, 'Lack of effect of chronic ketamine administration on depression-like behavior and frontal cortex autophagy in female and male ICR mic', Behav Brain Res, vol 317, pp. 579-80. 160. Kathleen R. B., JNC 2009, 'Anxiety-Related Behaviors in Mice', Methods of Behavior Analysis in Neuroscience, vol 2, p. chapter 5. 161. Kavvadias, D, Sand, P, Youdim, K, Qaiser, AM, Rice-Evans, C, Baur, R, Sigel, E, Rausch, WD, Riederer, P & Schreier, P 2004, 'The flavone hispidulin, a benzodiazepine receptor ligand with positive allosteric properties, traverses the blood-brain barrier and exhibits anticonvulsive effects', British Journal of Pharmacology, pp. 811-820. 162. Kendler, K, Gatz, M, Gardner, C & Pedersen, N 2006, 'A Swedish national twin study of lifetime major depression', Am J Psychiatry, vol 163, pp. 109-14. 163. Khan, K, Najmi, A & Akhtar, M 2019, 'A Natural Phenolic Compound Quercetin Showed the Usefulness by Targeting Inflammatory, Oxidative Stress Markers and Augment 5-HT Levels in One of the Animal Models of Depression in Mice', Drug Res, vol 69, no. 7, pp. 392-400. 164. Khoshnam, S, Farbood, Y, Moghaddam, H, Sarkaki, A, Badavi, M & Khorsandi, L 2018, 'Vanillic Acid Attenuates Cerebral Hyperemia, Blood-Brain Barrier Disruption and Anxiety-Like Behaviors in Rats Following Transient Bilateral Common Carotid Occlusion and Reperfusion', Metab Brain Dis, vol 33, no. 3, pp. 785-93.

170

165. Khundakar, A & Thomas, A 2015, 'Neuropathology of depression in Alzheimer's disease: current knowledge and the potential for new treatments', J Alzheimer's Dis, vol 44, pp. 27-41. 166. Kim, MC, Kim, SJ, Kim, DS, Jeon, YD & et al. 2011, 'Vanillic acid inhibits inflammatory mediators by supressing NF-kB in lipopolysaccharide-stimulated mouse peritoneal macrophages', Immunopharmacol Immunotoxicol, vol 33, no. 3, pp. 525-32. 167. Kim, Y, Na, K, Myint, A & Leonard, B 2016, 'The role of pro-inflammatory cytokines in neuroinflammation, neurogenesis and the neuroendocrine system in major depression', Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, vol 64, pp. 277-84. 168. Kimura, T, Hayashida, H, Murata, M & Takamatsu, J 2011, 'Effect of ferulic acid and Angelica archangelica extract on behavioral and psychological symptoms of dementia in frontotemporal lobar degeneration and dementia with Lewy bodies', Geriatr Gerontol Int, vol 11, pp. 309-14. 169. Kita, M, Uchida, S, Yamada, K & Ano, Y 2019, 'Anxiolytic Effects of Theaflavins via Dopaminergic Activation in the Frontal Cortex', Biosci Biotechnol Biochem, vol 83, no. 6, pp. 1157-62. 170. Kong, X, Guan, J, Gong, S & Wang, R 2017, 'Neuroprotective Effects of Grape Seed Procyanidin Extract on Ischemia-Reperfusion Brain Injury', Chin Med Sci J, vol 32, no. 2, pp. 92-9. 171. Konieczny, J, Czarnecka, A, Lorenc-Koci, E, Kamińska, K & Lenda, T 2017, 'Depressive-like neurochemical and behavioral markers of Parkinson's disease after 6-OHDA administered unilaterally to the rat medial forebrain bundle', Pharmacol Reports, vol 69, pp. 985-94. 172. Kotwal, S, Upaganlawar, A, Mahajan, M & Upasani, C 2015, 'Protective Effects of Ferulic Acid in Alcohol Withdrawal', Malays J Med Biol Res, vol 2, no. 3, pp. 231-6. 173. Kovacs, G 2017, 'Concepts and Classification of Neurodegenerative Diseases', Handb Clin Neurol, vol 145, pp. 301-7. 174. Kresty, L, Howell, A & Baird, M 2011, 'Cranberry proanthocyanidins mediate growth arrest of lung cancer cells through modulation of gene expression and rapid induction of apoptosis', Molecules, vol 16, pp. 2375-2390.

171

175. Krupkova, O, Ferguson, SJ & Wuertzkozak, K 2016, 'Stability of (−)- epigallocatechin gallate and its activity in liquid formulations and delivery systems', J Nutr Biochem, vol 37, pp. 1-12. 176. Kumar, A, Singh, A & Ekavali 2015, 'A review on Alzheimer's disease pathophysiology and its management: an update', Pharmacol Reports, vol 67, no. 2, pp. 195- 203. 177. Kwon, Y, Choi, S, Kim, C, Kim, J, Kim, H, Choi, J, Song, S, Kim, C, Park, G, Park, C & Shin, D 2015, 'Effect of Chaenomeles sinensis Extract on Choline Acetyltransferase Activity and Trimethyltin-Induced Learning and Memory Impairment in Mice', Chem. Pharm. Bull, vol 63, no. 12, pp. 1076-80. 178. Kwon, S, Lee, H, Kim, J, Hone, S, Kim, H, Jo, T & et al. 2010, 'Neuroprotective effects of chlorogenic acid on scopolamine-induced amnesia via anti-acetylcholinesterase and anti-oxidative activities in mice', Eur J Pharmacol, vol 649, pp. 210-7. 179. Kylli, P, Nohynek, L, Puupponen-Pimia, R, Westerlund-Wikstrom, B, Leppanen, T, Welling, J & et al. 2011, 'Lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) and European cranberry (Vaccinium microcarpon) proanthocyanidins: Isolation, identification, and bioactivities', Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 59, no. 7, pp. 3373-3384. 180. Ledo, J, Azevedo, E, Clarke, J, Ribeiro, F, Figueiredo, C, Foguel, D & De Felice, F 2013, 'Amyloid-β oligomers link depressive-like behavior and cognitive deficits in mice', Mol Psychiatry, vol 18, pp. 1053-4. 181. Lee, K, Coelho, M, Sern, K, Class, M, Bocz, M & Szumlinski, K 2017, 'Anxiolytic Effects of Buspirone and MTEP in the Porsolt Forced Swim Test', Chronic Stress, vol 1, p. 2470547017712985. 182. Lee, M, Lee, J, Jun, S, Lee, S, Kim, N, Lee, J & et al. 2007, 'The antiinflammatory effects of Pyrolae herbal extract through the inhibition of the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and NO production', Journal of Ethnopharmacology, vol 112, pp. 49-54. 183. Leentjens, A, Dujardin, K, Marsh, L, Martinez-Martin, P, Richard, I & Starkstein, S 2008, 'Anxiety rating scales in Parkinson’s disease: Critique and recommendations', Mov Disord, vol 23, pp. 2015-25.

172

184. Lee, B, Sur, B, Kwon, S & et al. 2013, 'Chronic administration of catechin decreases depression and anxiety-like behaviors in a rat model using chronic corticosterone injections', Biomol Ther, vol 21, pp. 313-22. 185. Lehmann-Werman, R, Magneheim, J, Modd , J, Neiman, D & Abraham, O 2018, 'Monitoring liver damage using hepatocyte-specific methylation markers in cell-free circulating DNA', JCI Insight, vol 3, no. 12, p. e120687. 186. Lenzi, J, Rodrigues, AF, Ros, ADS & et al. 2015, 'Ferulic acid chronic treatment exerts antidepressant-like effect: role of antioxidant defense system.', Metab Brain Dis, vol 30, pp. 1453-63. 187. Li, N, Lee, B, Liu, RJ, Banasr, M, Dwyer, JM, Iwata, M & et al. 2010, 'mTOR- Dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists', Science, vol 329, pp. 959-64. 188. Lindqvist, D, Kaufman, E, Brundin, L, Hall, S, Surova, Y & Hansson, O 2012, 'Non-motor symptoms in patients with Parkinson's disease—correlations with inflammatory cytokines in serum', PLoS One, vol 7, p. e47387. 189. Lister , R 1990, 'Ethologically-based animal models of anxiety disorders', Pharmacological Theory, vol 46, pp. 321-340. 190. Liu, Y, Jia, G, Gou, L, Sun, L, Fu, X, Lan, N, Li, S & et al. 2013, 'Antidepressant-like effects of tea polyphenols on mouse model of chronic unpredictable mild stress', Pharmacol Biochem Behav, vol 104, pp. 27-32. 191. Liu, H, Pan, X, Liu, B & et al. 2017, 'Grape seed-derived procyanidins alleviate gout pain via NLRP3 inflammasome suppression', J Neuroinflammation, vol 14, p. 74. 192. Liu, Y, Shen, J, Xu, L, LI, H & et al. 2017, 'Ferulic acid inhibits neuroinflammation in mice exposed to chronic unpredictable mild stress', Intern Immunopharm, vol 45, pp. 128-34. 193. Li, M, Wang, X, Shi, J, Li, Y, Yang, N, Zhai, S & et al. 2015, 'Caffeic Acid Phenethyl Ester Inhibits Liver Fibrosis in Rats', World J Gastroenterol, vol 21, no. 13, pp. 3893-903. 194. Loxton, D & Canales, J 2017, 'Long-term cognitive, emotional and neurogenic alterations induced by alcohol and methamphetamine exposure in adolescent rats', Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, vol 74, pp. 1-8.

173

195. Luscher, B & Fuchs, T 2015, 'GABAergic Control of Depression-Related Brain States', Advances in Pharmacology, vol 73, pp. 97-144. 196. Lüscher, B, Fuchs, T & Kilpatrick, C 2011, 'GABA-A receptor trafficking- mediated plasticity of inhibitory synapses', Neuron, vol 70, pp. 385-409. 197. Manach, C, Scalbert, A, Morand, C, Remesy, C & Jimenez , L 2004, 'Polyphenols: food sources and bioavailability', Am. J. Clin. Nutr., vol 79, no. 5, pp. 727-747. 198. Manach, C, Williamson, G, Morand, C, Scalbert, A & Rémésy, C 2005, 'Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies', Am J Clin Nutr, vol 81, pp. 230S-42S. 199. Marathe, S, D'almeida, P, Virmani, G, Bathini, P & Alberi, L 2018, 'Effects of Monoamines and Antidepressants on Astrocyte Physiology: Implications for Monoamine Hypothesis of Depression', J Exp Neurosci, vol 12, pp. 1-7. 200. Martinez-Micaelo, N, Gonzalez-Abuin, N, Pinent, M, Ardevol, A & Blay, M 2015, 'Procyanidin B2 inhibits inflammasome-mediated IL-1β production in lipopolysaccharide-stimulated macrophages.', Mol Nutr Food Res, vol 59, no. 2, pp. 262-9. 201. Massart, R, Mongeau, R & Lanfumey, L 2012, 'Beyond the monoaminergic hypothesis: neuroplasticity and epigenetic changes in a transgenic mouse model of depression', Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, vol 367, pp. 2485-94. 202. Ma, B, Wang, J, Tong, J, Zhou, G, Chen, Y & et al. 2016, 'Protective Effects of Chaenomeles Thibetica Extract Against Carbon Tetrachloride-Induced Damage via the MAPK/Nrf2 Pathway', Food Funct, vol 7, pp. 492-500. 203. Mazzio, E, Harris, N & Soliman, K 1998, 'Food Constituents Attenuate Monoamine Oxidase Activity and Peroxide Levels in C6 Astrocyte Cells', Planta Med, pp. 603- 606. 204. McCullough, L & Salamone, J 1992, 'Increases in extracellular dopamine levels and locomotor activity after direct infusion of phencyclidine into the nucleus accumbens', Brain Res, vol 577, pp. 1-9. 205. McKay, D, Chen, O, Zampariello, C & Blumberg, J 2015, 'Flavonoids and phenolic acids from cranberry juice are bioavailable and bioactive in healthy older adults', Food Chem, vol 167, pp. 233-40.

174

206. McNamara, C, Tejero-Cantero, Á, Trouche, S, Camparo-Urriza, N & Dupret, D 2014, 'Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence', Nat Neurosci, vol 17, no. 12, pp. 1658-60. 207. Melo, P, Magalhaes, A, Alves, C, Tavares, M, de Sousa, L, Summavielle, T & Moradas-Ferreira, P 2012, 'Methamphetamine mimics the neurochemical profile of aging in rats and impairs recognition memory', Neurotoxicology, vol 33, pp. 491-9. 208. Meydan, S, Esrefoglu, M, Selek, S & Akbas Tosunoglu, E 2019, 'Protective Effects of Caffeic Acid Phenethyl Ester and Thymoquinone on Toluene Induced Liver Toxicity', Biotech Histochem, vol 94, no. 4, pp. 277-82. 209. Meydan, S, Nacar, A, Oztürk, H, Tas, U, Köse, E, Zararsiz, I, Yilmaz, N & Kus, I 2016, 'The Protective Effects of Caffeic Acid Phenethyl Ester Against Toluene-Induced Nephrotoxicity in Rats', Toxicol Ind Health, vol 32, no. 1, pp. 15-21. 210. Miao, J, Li, X, Zhao, C, Gao, X, Wang, Y & Gao, W 2018, 'Active Compounds, Antioxidant Activity and α-glucosidase Inhibitory Activity of Different Varieties of Chaenomeles Fruits', Food Chem, vol 248, pp. 330-9. 211. Mikkelsen, K, Stojanovska, L, Prakash, M & Apostolopoulos, V 2017, 'The effects of vitamin B on the immune/cytokine network and their involvement in depression', Maturitas, vol 96, pp. 58-71. 212. Mila, I, Deprez, S, Huneau, J, Tome, D & Scalbert, A 2001, 'Transport of proanthocyanidin dimer, trimer, and polymer across monolayers of human intestinal epithelial Caco-2 cells', Antioxidants and Redox Signaling, vol 3, pp. 957-967. 213. Miller, AH & Raison, CL 2016, 'The role of inflammation in depression: from evolutionary imperative to modern treatment target.', Nat Rev Immunol, vol 16, pp. 22-34. 214. Miller, А & Raison, C 2016, 'The role of inflammation in depression:', NATURE REVIEWS | IMMUNOLOGY, vol 16. 215. Minor, T & Hanff, T 2015, 'Adenosine signaling in reserpine-induced depression in rats', Behav. Brain Res., vol 286, pp. 184-91. 216. Minzenberg, M & Carter, C 2008, 'Modafinil: A Review of Neurochemical Actions and Effects on Cognition', Neuropsychopharmacology, vol 33, no. 7, pp. 1477-502. 217. Möhler , H 2012, 'The GABA system in anxiety and depression and its therapeutic potential', Neuropharmacology, vol 62, pp. 42-53.

175

218. Monteleone, P, Martiadis, V & Maj, M 2011, 'Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry', Circadian rhythms and treatment implications in depression, vol 15, pp. 1569- 74. 219. Morgese, M, Tucci, P, Colaianna, M, Zotti, M, Cuomo, V, Schiavone, S & Trabace, L 2014, 'Modulatory activity of soluble beta amyloid on HPA axis function in rats', Curr Pharm Des, vol 20, pp. 2539-46. 220. Mossalayi M, Rambert J, Renouf E, Micouleau M & JM., M 2014, 'Grape polyphenols and propolis mixture inhibits inflammatory mediator release from human leukocytes and reduces clinical scores in experimental arthritis', Phytomedicine, vol 21, pp. 290–297. 221. Mouihate, A 2014, 'TLR4-mediated brain inflammation halts neurogenesis: impact of hormonal replacement therapy', Front Cell Neurosci, vol 8, p. 146. 222. Murakami, A 2014, 'Dose-dependent functionality and toxicity of green tea polyphenols in experimental rodents', Arch Biochem Biophys, vol 557, pp. 3-10. 223. Murrough, J, Yaqubi, S, Sayed, S & Charney, D 2015, 'Emerging Drugs for the Treatment of Anxiety', Expert Opin Emern Drugs, vol 3, pp. 393-406. 224. Nabavi, S, Daglia, M, Braidy, N & Nabavi, SF 2017, 'Natural products, micronutrients, and nutraceuticals for the treatment of depression: A short review', Nutr Neurosci, vol 20, no. 3, pp. 180-94. 225. Nammi, S, Boini, K, Koppula, S & Sreemantula, S 2005, 'Reserpine-induced central effects: pharmacological evidence for the lack of central effects of reserpine methiodide', Can. J. Physiol. Pharmacol, vol 83, no. 6, pp. 509-15. 226. Naoi, M, Riederer, R & Maruyama, W 2016, 'Modulation of monoamine oxidase (MAO) expression in neuropsychiatric disorders: genetic and enviromental factor involved in type A MAO expression', J Neural Transm, vol 123, pp. 91-106. 227. Nathwani, R, Pais, S, Reynolds, T & Kaplowitz, N 2005, 'Serum alanine aminotransferase in skeletal muscle disease', Hepatology, vol 41, no. 2, pp. 380-2. 228. Ndrepepa, G, Holdenrieder, S, Colleran, R, Cassese, S, Xhepa, E, Fusaro, M & et al. 2019, 'Inverse association of alanine aminotransferase within normal range with prognosis in patients with coronary artery disease', Clin Chim Acta, vol 496, pp. 55-61. 229. Nestler, E, Barrot, M, DiLeione, R, Eisch, A, Gold, S & Monteggia, L 2002, 'Neurobiology of depression', Neuron, vol 34, pp. 13-25. 176

230. Nierenberg, A, Husain, M, Trivedi, M, Fava, M, Warden, D & et al. 2010, 'Residual symptoms after remission of major depressive disorder with citalopram and risk of relapse: a STAR*D report', Psychol Med, vol 40, pp. 41-50. 231. Nisha, R, Srinivasa Kannan , SR & Thanga Mariappan, K 2017, 'Biochemical evaluation of creatinine and urea in patients with renal failure undergoing hemodialysis', J Clin Path Lab Med, vol 1, no. 2, pp. 1-5. 232. Nowak, D, Gośliński , M, Wojtowicz, E & Przygoński, K 2018, 'Antioxidant Properties and Phenolic Compounds of Vitamin C-Rich Juices', J Food Sci, vol 83, no. 8, pp. 2237-46. 233. Oboh, G, Agunloye, O, Akinyemi, A & et al. 2013, 'Comparative Study on the Inhibitory Effect of Caffeic and Chlorogenic Acids on Key Enzymes Linked to Alzheimer’s Disease and Some Pro-oxidant Induced Oxidative Stress in Rats’ Brain-In Vitro', Neurochem Res, vol 38, pp. 413-9. 234. Ohkawa, H, Ohishi, N & Yagi, K 1979, 'Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction', Anal Biochem, vol 95, pp. 351-8. 235. Ohnishi, R, Ito, H, Iguchi, A, Shinomiya, K, Kamei, C, Hatano, T & et al. 2006, 'Effects of Chlorogenic Acid and Its Metabolites on Spontaneous Locomotor Activity in Mice', Biosci Biotechnol Biochem, vol 70, no. 10, pp. 2560-3. 236. Olthof, M, Hollman, P & Katan, M 2001, 'Chlorogenic Acid and Caffeic Acid Are Absorbed in Humans', J of Nutrition, vol 131, no. 1, pp. 66--71. 237. Ou, K & Gu, L 2014, 'Absorption and metabolism of proanthocyanidins', Journal of Functional Foods, vol 7, pp. 43-53. 238. Paladini, AC, Marder, M, Viola, H, Wolfman, C, Wasowski, C & Medina, JH 1999, 'Flavonoids and the Central Nervous System: from Forgotten Factors to Potent Anxiolytic Compounds', J. Pharm. Pharmacol., vol 51, pp. 519-526. 239. Panchal, S, Poudyal, H, Waanders, J & et al. 2012, 'Coffee extract attenuates changes in cardiovascular function and hepatic structure and function without decreasing obesity in high-carbohydrate, high-fat diet-fed male rats', J Nutr, vol 142, pp. 690-7. 240. Pang, C, Sheng, Y, Jiang, P, Wei, H & Ji, L 2015, 'Chlorogenic Acid Prevents Acetaminophen-Induced Liver Injury: The Involvement of CYP450 Metabolic Enzymes and Some Antioxidant Signals', J Zhejiang Univ Sci B, vol 16, no. 7, pp. 602-10.

177

241. Pan, C, Wang, C, Zhang, L & et al. 2018, 'Procyanidins attenuate neuropathic pain by suppressing matrix metalloproteinase-9/2', J Neuroinflammation, vol 15, no. 1, p. 187. 242. Papp, M, Gruca, P, Lason-Tyburkiewicz, M & Willner, P 2016, 'Antidepressant, anxiolytic and procognitive effects of rivastigmine and donepezil in the chronic mild stress model in rats', Psychopharmacol, vol 233, pp. 1235-43. 243. Papp, M, Gruca, P, Lason-Tyburkiewicz, M & Willner, P 2017, 'Antidepressant, anxiolytic and pro-cognitive effects of subacute and chronic ketamine in the chronic mild stress model of depression', Behav Pharmacol, vol 28, pp. 1-8. 244. Park, D, Lee, Y & Lee, J 2014, 'Inhibitory Effect of a decoction composed of Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. and Chaenomeles sinensis Koehne and its component herbal medicines on Collagen Ⅱ-induced Arthritis Mice', The Korea Journal of Herbology, vol 4. 245. Park, S, Sim, Y, Han, P, Lee, J & Suh, H 2010, 'Antidepressant-like effect of chlorogenic acid isolated from Artemisia capillaris Thunb', Anim Cell Sys, vol 14, no. 4, pp. 253-9. 246. Patel, S 2017, 'Stressor-driven extracellular acidosis as tumor inducer via aberrant enzyme activation: A review on the mechanisms and possible prophylaxis', Gene, vol 626, pp. 209-14. 247. Pawar, S, Khairnar, S, Patil, V & Bhambar, R 2020, 'Effect of Vanillic Acid on Nerve Conduction Velocity in Chronic Constriction Injury Model of Neuropathy', Ind J Pharm Education Res, vol 54, no. 1, pp. 108-14. 248. Peacock, B, Scheiderer, D & Kellermanna, G 2017, 'Biomolecular aspects of depression: A retrospective analysis', Comprehensive Psychiatry, vol 73, pp. 168–180. 249. Pellow, S, Chopin, P, File, S & Briley, M 1985, 'Validation of open: closed arm entries in an elevated plus- maze as a measure of anxiety in the rat', Journal of Neuroscience Methods, vol 14, pp. 149-167. 250. Peng, S, Wuu, J, Mufson, E & Fahnestock, M 2005, 'Precursor form of brain- derived neurotrophic factor and mature brain-derived neurotrophic factor are decreased in the pre-clinical stages of Alzheimer's disease', Journal of Neurochemistry, vol 93, no. 6, pp. 1412- 1421. 251. Peterson, DW, George, RC, Scaramozzino, F, LaPointe, NE, Anderson, RA, Graves, DJ & Lew, J 2009, 'Cinnamon extract inhibits tau aggregation associated with Alzheimer’s disease in vitro', J Alzheimers Dis, vol 17, pp. 585-97. 178

252. Pfeiffer, R, Bomasang-Layno, E, Fadlon, I, Murray, A & Himelhoch, S 2015, 'Antidepressive treatments for Parkinson's disease: a systematic review and meta-analysis', Parkinsonism Relat Disord, vol 21, pp. 833-42. 253. Pietta, P 2000, 'Flavonoids as antioxidants', Journal of Natural Products, vol 63, pp. 1035-1042. 254. Piper, B & Meyer, J 2006, 'Increased responsiveness to MDMA in adult rats treated neonatally with MDMA', Neurotoxicology and Teratology, vol 28, no. 1, pp. 95-102. 255. Pirch, J, Rech, R & Moore, K 1967, 'Depression and recovery of the electrocorticogram, behavior, and brain amines in rats treated with reserpine', Int J Neuropharm, vol 6, no. 5, pp. 375-85. 256. Politis, M & Niccolini, F 2015, 'Serotonin in Parkinson's disease', Behav Brain Res, vol 277, pp. 136-45. 257. Prajapati, S, Dangi, D & Krishnamurthy, S 2019, 'Repeated caffeine administration aggravates post-traumatic stress disorder-like symptoms in rats', Physiol Behav, vol 211, p. 112666. 258. Prendergast, B & Kay, L 2008, 'Affective and adrenocorticotrophic responses to photoperiod in Wistar rats', Journal of Neuroendocrinology, vol 20, no. 2, pp. 261-7. 259. Pringsheim, T, Jette, N, Frolkis, A & Steeves, T 2014, 'The prevalence of Parkinson's disease: a systematic review and meta-analysis', Mov Disord, vol 29, pp. 1583-90. 260. Prut, L & Belzung, C 2003, 'The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review', Eur J Pharmacol, vol 463, no. 1-3, pp. 3-33. 261. Rahman, I, Biswas, S & Kirkham, P 2006, 'Regulation of inflammation and redox signaling by dietary polyphenols', Biochem Pharmacol, vol 72, pp. 1439–1452. 262. Raison, CL, Rutherford, RE, Woolwine, BJ, Shuo, C, Schettler, P, Drake, DF, Haroon, E & Miller, AH 2013, 'A randomized controlled trial of the tumor necrosis factor antagonist infliximab for treatment-resistant depression: the role of baseline inflammatory biomarkers', Jama Psychiatry, vol 37, pp. 31-41. 263. Ramachandraih, C, Subramanyam, N, Bar, K, Baker, G & Yeragani, V 2011, 'Antidepressants: From MAOIs to SSRIs and more', Indian J Psychiatry, vol 53, no. 2, pp. 180- 2.

179

264. Rasetti, R, Mattay, V, Stankevich, B, Skjei, K, Blasi, G, Sambataro, F & et al. 2010, 'Modulatory effects of modafinil on neural circuits regulating emotion and cognition', Neuropsychopharmacology, vol 35, pp. 2101-9. 265. Rasmussen, S, Frederiksen, H, Krogholm, K & Poulsen, L 2005, 'Dietary proanthocyanidins: Occurrence, dietary intake, bioavailability, and protection against cardiovascular disease', Molecular Nutrition & Food Research, vol 49, no. 2, pp. 159–174. 266. Reijnders, J, Ehrt, U, Weber, W, Aarsland, D & Leentjens, A 2008, 'A systematic review of prevalence studies of depression in Parkinson's disease', Mov Disord, vol 23, pp. 183-9. 267. Rehman, M, Wali, A, Ahmad, A, Shakeel, S, Rasool, S, Ali, R et al. 2019 ‘Neuroprotective Strategies for Neurological Disorders by Natural Products: An update’, Curr Neuropharmacol, vol 17, pp. 247-67. 268. Reiter, R, Rosales-Corral, S, Coto-Montes, A, Boga, J & et al. 2014, 'Acute and chronic effects of agomelatine on intravenous penthylenetetrazol-induced seizure in mice and the probable role of nitric oxide', Eur J Pharmacol, vol 736, pp. 10-5. 269. Remes, O, Brayne, C, van der Linde, R & Lafortune, L 2016, 'A systematic review of reviews on the prevalence of anxiety disorders in adult populations', Brain Behav, vol 6, no. 7, p. e00497. 270. Remy, P, Doder, M, Lees, A, Turjanski, N & Brooks, D 2005, 'Depression in Parkinson's disease: loss of dopamine and noradrenaline innervation in the limbic system', Brain, vol 128, pp. 1314-22. 271. Riegsecker, S, Wiczynski, D, Kaplan, M & Ahmed, S 2013, 'Potential benefits of green tea polyphenol EGCG in the prevention and treatment of vascular inflammation in rheumatoid arthritis', Life Science, vol 72, pp. 307–312. 272. Rinwa, P & Kumar, A 2013, 'Quercetin suppress microglial neuroinflammatory response and induce antidepressant-like effect in olfactory bulbectomized rats', Neuroscience, vol 255, pp. 86-98. 273. Rocha, F, Lima-Landman, M, Souccar, C, Tanae, M, De Lima, T & Lapa, A 2007, 'Antidepressant-like effect of Cecropia glazioui Sneth and its constituents–in vivo and in vitro characterization of the underlying mechanism', Phytomedicine, vol 14, pp. 396-402.

180

274. Rondini, L, Peyrat-Maillard, M, Marsset- Baglieri, A & Berset, C 2002, 'Sulfated ferulic acid is the main in vivo metabolite found after short-term ingestion of free ferulic acid in rats', Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 50, pp. 3037-3041. 275. Rosa, J, Laencina, J, Hellin, P, Jordan, M & et al. 2004, 'Characterization of juice in fruits of different Chaenomeles species', Lebensm. Wiss. Technol., vol 37, pp. 301–307. 276. Rosa, J, Pazini, F, Cunha, M, Colla, A, Manosso, L, Souza, A, de Bem, A & et al. 2018, 'Antidepressant effects of creatine on amyloid β1-40-treated mice: the role of GSK- 3β/Nrf2 pathway', Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry, vol 86, pp. 270-8. 277. Sacuiu, S, Insel, P, Mueller, S, Tosun, D, Mattsson, N, Jack, C, DeCarli, C, Petersen, R, Aisen, P, Weiner, M & Mackin, R 2016, 'Chronic depressive symptomatology in mild cognitive impairment is associated with frontal atrophy rate which hastens conversion to Alzheimer dementia', Am J Geriatr Psychiatry, vol 24, pp. 126-35. 278. Şahin , T, Gocmez, S, Duruksu, G, Yazir, Y & Utkan, T 2020, 'Resveratrol and Quercetin Attenuate Depressive-Like Behavior and Restore Impaired Contractility of Vas Deferens in Chronic Stress-Exposed Rats: Involvement of Oxidative Stress and Inflammation', Naunyn Scmiedebergs Arch Pharmacol, vol 393, no. 5, pp. 761-775. 279. Salari, A, Bakhtiari, A & Homberg, J 2015, 'Activation of GABA-A receptors during postnatal brain development increases anxiety- and depression-related behaviors in a time- and dose-dependent manner in adult mice', European Neuropsychopharmacology, vol 25, no. 8, pp. 1260-1274. 280. Salatino-Oliveira, A, Rohde, L & Hutz, M 2018, 'The dopamine transporter role in psychiatric phenotypes', Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, vol 177, no. 2, pp. 211- 31. 281. Samoylenko, V, Rahman, M, Tekwani, B, Tripathi, L, Wang, Y, Khan, S, Khan, I & et al. 2010, 'Banisteriopsis caapi, a unique combination of MAO inhibitory and antioxidative constituents for the activities relevant to neurodegenerative disorders and Parkinson’s disease.', J Ethnopharmacol, vol 127, pp. 357-67. 282. Sams-Dodd, F 1998, 'Effects of continuous D-amphetamine and phencyclidine administration on social behaviour, stereotyped behaviour, and locomotor activity in rats', Neuropsychopharmacol, vol 19, pp. 18-25.

181

283. Sandeep, K, Rajmeet, S & Poonam, A 2018, 'Pharmacological Studies on Protective Effect of Ferulic Acid in Monosodium Glutamate Induced Anxiety and Motor Incoordination', Curr Psychopharm, vol 7, no. 2, pp. 208-14. 284. Sanklecha, D, Upaganlawar, A & Upasani, C 2017, 'Neuroprotective Effects of Protocatechuic Acid in Diabetes Induced Neuropathic Pain', American Journal of Biochemistry and Molecular Biology, vol 7, pp. 111-7. 285. Santos, L, Beckman, D & Ferreira, S 2016, 'Microglial dysfunction connects depression and Alzheimer's disease', Brain Behav Immun, vol 55, pp. 151-65. 286. Sapolsky, R 2000, 'Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders', Arch Gen Psychiatry, vol 57, pp. 925-35. 287. Scalbert, A & Williamson, G 2000, 'Dietary intake and bioavailability of polyphenols', Journal of Nutrition, vol 130, pp. 2073-2085. 288. Schindler, C & Carmona, G 2002, 'Effects of dopamine agonists and antagonists on locomotor activity in male and female rats', Pharm Biochem Behav, vol 72, no. 4, pp. 857- 63. 289. Schmidt-Mutter, C, Pain, L, Sandner, G & et al. 1998, 'The anxiolytic effect of g-hydroxybutyrate in the elevated plus maze is reversed by the benzodiazepine receptor antagonist, flumazenil.', Eur J Pharmacol, vol 342, pp. 21-7. 290. Schneider, B, Prvulovic, D, Oertel-Knöchel, V, Knöchel, C, Reinke, B, Grexa, M, Weber, B & Hampel, H 2011, 'Biomarkers for major depression and its delineation from neurodegenerative disorders', Prog Neurobiol, vol 95, no. 4, pp. 703-17. 291. Schroeter, H, Bahia, P, Spencer, JPE, Sheppard, O, Rattray, M, Rice-Evans, C & Williams, RJ 2007, '(-)Epicatechin stimulates ERK-dependent cyclic AMP response element activity and up-regulates GluR2 in cortical neurons', J. Neurochem., vol 101, pp. 1596-1606. 292. Schutová, B, Hrubá, L, Pometlová, M, Rokyta, R & Šlamberová, R 2010, 'Responsiveness to methamphetamine in adulthood is altered by prenatal exposure in rats', Physiol Behav, vol 99, pp. 381-7. 293. Seeram, N & Nair, M 2002, 'Inhibition of lipid peroxidation and structure– activity related studies of the dietary constituents anthocyanins, anthocyanidins, and catechins', Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol 50, pp. 5308-5312.

182

294. Serra, A, Macia, A, Romero, M, Valls, J, Blade, C, Arola , L & Motilva, M 2010, 'Bioavailability of procyanidin dimers and trimers and matrix food effects in in vitro and in vivo models', British Journal of Nutrition, vol 103, pp. 944-952. 295. Shahjahan, M, Sabitha, K, Jainu, M & Devi, C 2004, 'Effect of Solanum Trilobatum against carbon tetrachloride induced hepatic damage in albino rats', Ind J Med Res, vol 120, pp. 194-8. 296. Shamban, L, Patel, B & WIlliams, M 2014, 'Significantly Elevated Liver Alkaline Phosphatase in Congestive Heart Failure', Gastroenterology Res, vol 7, no. 2, pp. 64-8. 297. Sheline, Y, Wang, P, Gado, M, Csernansky, J & Vannier, M 1996, 'Hippocampal atrophy in recurrent major depression', Proc Natl Acad Sci USA, vol 93, pp. 3908-13. 298. Shewale, P, Patil, R & Hiray, Y 2012, 'Antidepressant-like activity of anthocyanidins from Hibiscus rosa-sinensis flowers in tail suspension test and forced swim test', Indian Journal of Pharmacology, vol 44, no. 4, pp. 454-457. 299. Shinomiya, K, Omichi, J, Ohnishi, R, Ito, H, Yoshida, T & Kamei, C 2004, 'Effects of chlorogenic acid and its metabolites on the sleep–wakefulness cycle in rats', Eur J Pharmacol, vol 504, no. 3, pp. 185-9. 300. Siarkos, K, Katirtzoglou, E & Politis, A 2015, 'A review of pharmacological treatments for depression in Alzheimer's disease', J Alzheimer's Dis, vol 48, pp. 15-34. 301. Silvers, J, Harrod, S, Mactutus, C & Booze, R 2007, 'Automation of the novel object recognition task for use in adolescent rats', J Neurosci Met, vol 166, pp. 99-103. 302. Simon, P, Dupuis, R & Costentin, J 1994, 'Thigmotaxis as an index of anxiety in mice. Influence of dopaminergic transmissions', Behav Brain Res, vol 61, no. 1, pp. 59-64. 303. Singh, V, Chauhan, G & Shri, R 2019, 'Anti-depressant Like Effects of Quercetin 4'-O-glucoside From Allium cepa via Regulation of Brain Oxidative Stress and Monoamine Levels in Mice Subjected to Unpredictable Chronic Mild Stress', Nutr Neurosci, pp. 1-10. 304. Singh, J, Kaklij, R, Kshirsagar, R, Kumar, B, Komakula, S & Diwan, P 2015, 'Cognitive effects of vanillic acid against streptozotocin-induced neurodegeneration in mice', Pharm Biol, vol 55, no. 5, pp. 630-636. 305. Singleton, VL & Rossi, JA 1965, 'Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagents', AM J Enol Vitic, vol 16, pp. 144-58.

183

306. Šlamberová, R, Mikulecká, A, Macúchová, E, Hrebíčková, I, Ševčíková, M, Nohejlová, K & Pometlová, M 2015, 'Effects of Psychostimulants on Social Interaction in Adult Male Rats', Behav Pharmacol, vol 26, pp. 776-85. 307. Šlamberová, R, Mikulecká, A, Pometlová, M, Schutová, B, Hrubá, L & Deykun, K 2010, 'The effect of methamphetamine on social interaction of adult male rats', Behav Brain Res, vol 214, pp. 423-7. 308. Slattery, D & Cryan, J 2012, 'Using the rat forced swim test to assess antidepressant-like activity in rodents.', Nature Protocols 7, vol 7, pp. 1009–1014. 309. Slattery, D, Hudson, A & Nutt, D 2004, 'Invited review: The evolution of antidepressant mechanisms', Fundam Clin Pharmacol., pp. 1-21. 310. Sommers, I, Baskin, D & Baskin-Sommers, A 2006, 'Methamphetamine use among young adults: health and social consequences', Addict Behav, vol 31, pp. 1469-76. 311. Son, YR, Chung, JH, Ko, S & Shim, SM 2016, 'Combinational enhancing effects of formulation and encapsulation on digestive stability and intestinal transport of green tea catechins', J Microencapsul, vol 33, pp. 183-90. 312. Song, Q, Li, D, Zhou, Y, Yang, J, Yang, W, Zhou, G & Wen, J 2014, 'Enhanced uptake and transport of (+)-catechin and (−)-epigallocatechin gallate in niosomal formulation by human intestinal Caco-2 cells', Int J Nanomed, vol 9, pp. 2157-65. 313. Song, J, Sze, S, Ng, T, Lee, C, Leung, G, Shaw, P & Tong, Y 2012, 'Anti- Parkinsonian drug discovery from herbal medicines: What have we got from neurotoxic models?', Journal of Ethnopharmacology, vol 139, pp. 698–711. 314. Spencer, JP & Crozier, A 2012, Flavonoids and Related Compounds: Bioavailability and Function, CRC Press. 315. Spencer, J, Vauzour, D & Rendeiro, C 2009, 'Flavonoids and cognition: The molecular mechanisms underlying their behavioural effects', Archives of Biochemistry and Biophysics, vol 492, no. 1-2, pp. 1-9. 316. Spranger, I, Sun, B, Mateus, A, de Freitas, V & Ricardo-Da-Silva, J 2008, 'Chemical characterization and antioxidant activities of oligomeric and polymeric procyanidin fractions from grape seeds', Food Chemistry, vol 108, no. 2, pp. 519–532. 317. Starkstein, S, Mayberg, H, Leiguarda, R, Preziosi, T & Robinson, R 1992, 'A prospective longitudinal study of depression, cognitive decline, and physical impairments in patients with Parkinson's disease', J Neurol Neurosurg Psychiatry, vol 55, pp. 377-82. 184

318. Stefanello, N, Schmatz, R, Peteira, LB & et al. 2014, 'Effects of chlorogenic acid, caffeine, and coffee on behavioral and biochemical parameters of diabetic rats', Mol Cell Biochem, vol 388, pp. 277-86. 319. Stephan, F & Zucker, I 1972, 'Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions', Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol 69, pp. 1583-6. 320. Strathearn, K, Yousef, G, Grace, M & et al. 2014, 'Neuroprotective effects of ,'s disease׳anthocyanin- and proanthocyanidin-rich extracts in cellular models of Parkinson Brain Res, vol 25, pp. 60-77. 321. Strugala, P, Mikolajczyk, S, Dudra, A & et al. 2016, 'Biological Activity of Japanese Quince Extract and Its Interactions with Lipids, Erythrocyte Membrane, and Human Albumin', J Membr Biol., vol 249, pp. 393–410. 322. Sun, L & Hong, Y 2000, 'Studies on the chemical constituents of Chaenomeles sinensis (Thouin.) Koehne', J. Chinese Pharm. Sci., vol 9, no. 1, pp. 6–9. 323. Suri, D & Vaidya, V 2013, 'Glucocorticoid regulation of brain-derived neurotrophic factor: relevance to hippocampal structural and functional plasticity', Neuroscience, vol 239, pp. 196-213. 324. Taglialatela, G, Hogan, D, Zhang, W & Dineley, KT 2009, 'Intermediate- and long-term recognition memory deficits in Tg2576 mice are reversed with acute calcineurin inhibition', Behavioural Brain Research, pp. 95-99. 325. Tai, A, Sawano, T & Ito, H 2012, 'Antioxidative properties of vanillic acid esters in multiple antioxidant assays', Biosci Biotechnol Biochem, vol 76, no. 2, pp. 314-8. 326. Takeda, H, Tsuji, M, Miyamoto, J, Masuya, J, Iimori, M & Matsumiya, T 2003, 'Caffeic Acid Produces Antidepressive- And/or Anxiolytic-Like Effects Through Indirect Modulation of the Alpha 1A-adrenoceptor System in Mice', Neuroreport, vol 14, no. 7, pp. 1067-70. 327. Takenaka, M, Nagata, T & Yoshida, M 2000, 'Stability and bioavailability of antioxidants in garland (Chrysanthemum coronarium L.)', Biosci Biotechnol Biochem, vol 64, pp. 2689-91. 328. Tamaki, R, Yoshikawa, M, Shinomiya, T, Hashimoto, A, Kawaguchi, M, Byrne, D & Kobayashi, H 2008, 'Acute administration of methamphetamine decreases the mRNA expression of diazepam binding inhibitor in rat brain', Tokai J Exp CLin Med, vol 33, pp. 51-6. 185

329. Tapia-Osorio, A, Saldago-Delgado, R, Angeles-Castellanos, M & Escobar, C 2013, 'Disruption of circadian rhythms due to chronic constant light leads to depressive and anxiety-like behaviors in the rat', Behav Brain Res, vol 252, pp. 1-9. 330. Tarascou, I, Mazauric, J, Meudec, E, Souquet, J, Cunningham, D, Nojeim, S & et al. 2011, 'Characterisation of genuine and derived cranberry proanthocyanidins by LC-ESI- MS', Food Chemistry, vol 128, no. 3, pp. 802–810. 331. Taylor, T, Caudle, W, Shepherd, K, Noorian, A, Jackson, C, Iuvone, P, Weinshenker, D, Greena, J & Miller, G 2009, 'Nonmotor symptoms of Parkinson's disease revealed in an animal model with reduced monoamine storage capacity', J Neurosci, vol 29, pp. 8103-13. 332. Tchekalarova, J, Stoynova, T, Ilieva, K, Mitreva, R & Atanasova, M 2018, 'Agomelatine Treatment Corrects Symptoms of Depression and Anxiety by Restoring the Disrupted Melatonin Circadian Rhythms of Rats Exposed to Chronic Constant Light', Pharmacol Biochem Behav, vol 171, pp. 1-9. 333. Terao, J, Murota, K & Kawai, Y 2011, 'Conjugated quercetin glucuronides as bioactive metabolites and precursors of aglycone in vivo', Food Funct, pp. 11-7. 334. Teuchy, H & Van Sumere, CF 1971, 'The metabolism of (1-14C) phenylalanine, (3-14C) cinnamic acid and (2-14C) ferulic acid in the rat', Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie, vol 79, pp. 589-618. 335. Thelen, C, Sens, J, Mauch, J, Pandit, R & Pitychoutis, PM 2016, 'Repeated ketamine treatment induces sex-specific behavioral and neurochemical effects in mice', Behav Brain Res, vol 312, pp. 305-12. 336. Tian, H, Sun, W, Zhang, Q, Li, X & et al. 2018, 'Procyanidin B2 mitigates behavioral impairment and protects myelin integrity in cuprizone-induced schizophrenia in mice', RSC Adv, vol 8, pp. 23835-46. 337. Toker, L, Amar, S, Bersudsky, Y, Benjamin, J, Klein, E & Agam, G 2010, 'The biology of tryptophan depletion and mood disorders', Isr J Psychiatry Relat Sci, vol 47, pp. 45- 55. 338. Trezza, V, Campolongo, P & Vanderschuren, L 2011, 'Evaluating the rewarding nature of social interactions in laboratory animals', Dev Cogn Neurosci, vol 1, pp. 444-58. 339. Trillo, L, Das, D, Hsieh, W, Medina, B, Moghadam, S, Lin, B, Dang, V, Sanchez, M, De Miguel, Z & et al. 2013, 'Ascending monoaminergic systems alterations in 186

Alzheimer's disease. Translating basic science into clinical care', Neurosci Biobehav Rev, vol 37, pp. 1363-79. 340. Tully, P, Cosh, S & Baune, B 2013, 'A review of the affects of worry and generalized anxiety disorder upon cardiovascular health and coronary heart disease', Psychol Health Med, vol 18, no. 6, pp. 627-44. 341. Tyrer, P & Baldwin, D 2006, 'Generalised anxiety disorder', Lancet, vol 368, pp. 2156-66. 342. Valcheva-Kuzmanova, SV, Denev, PN & Ognyanov, MH 2018, 'Chemical composition and antioxidant activity of Chaenomeles maulei fruit juice', J Biomed Clin Res, vol 11, no. 1, pp. 41-8. 343. Valvassori, S, Valera, R & Quevedo, J 2017, 'Animal Models of Mood Disorders: Focus on Bipolar Disorder and Depression', in Animal Models for the Study of Human Disease, 38th edn. 344. Van der Meer, E, Van Loo, P & Baumans, V 2004, 'Short-term Effects of a Disturbed Light-Dark Cycle and Environmental Enrichment on Aggression and Stress-Related Parameters in Male Mice', Lab Anim, vol 38, no. 4, pp. 376-83. 345. van Mierlo, T, Chung, C, Foncke, E, Berendse, H & van den Heuvel, O 2015, 'Depressive symptoms in Parkinson's disease are related to decreased hippocampus and amygdala volume', Mov Disord, vol 30, pp. 245-52. 346. Verma, V 2015, 'Classic studies on the interaction of cocaine and the dopamine transporter', Clin Psychopharmacol Neurosci, vol 13, pp. 227-38. 347. Vignes, M, Maurice, T, Lanté, F, Nedjar, M, Thethi, K, Guiramand, J & et al. 2006, 'Anxiolytic properties of green tea polyphenol (−)-epigallocatechin gallate (EGCG)', Brain Res, vol 1110, pp. 102-15. 348. Wadhwa, M, Chauhan, G, Roy, K, Sahu, S, Deep, S, Jain, V & et al. 2018, 'Caffeine and Modafinil Ameliorate the Neuroinflammation and Anxious Behavior in Rats During Sleep Deprivation by Inhibiting the Microglia Activation', Front Cell Neurosci, pp. 12- 49. 349. Wallerath, T, Deckert, G, Ternes, T, Anderson, H, Li, H, Witte, K & et al. 2002, 'Resveratrol, a polyphenolic phytoalexin present in red wine, enhances expression and activity of endothelial nitric oxide synthase', Circulation, vol 106, pp. 1652–1658.

187

350. Wang, P, Aguilar-Gaxiola, S, Alonso, J, Angermeyer, M, Borges, G & et al. 2007, 'Use of Mental Health Services for Anxiety, Mood, and Substance Disorders in 17 Countries in the WHO World Mental Health Surveys', Lancet, vol 370, pp. 841-50. 351. Wang, D, An, S & Zhang, X 2008, 'Prevention of chronic stress- induced depression- like behavior by inducible nitric oxide inhibitor', Neuroscience Letters, vol 433, pp. 59- 64. 352. Wang, J, Bi, W, Cheng, A, Freire, D, Vempati, P, Zhao, W, Gong, B & et al. 2014, 'Targeting multiple pathogenic mechanisms with polyphenols for the treatment of Alzheimer's disease-experimental approach and therapeutic implications', Front Aging Neurosci, vol 42. 353. Wang, J, Ferruzzi, MG, Ho, L, Blount, J, Janle, EM, Gong, B, Pan, Y & et al. 2012, 'Brain-targeted proanthocyanidin metabolites for Alzheimer’s disease treatment', J Neurosci, vol 32, pp. 5144-50. 354. Wang, K, Penmatsa, A & Gouaux, E 2015, 'Neurotransmitter and psychostimulant recognition by the dopamine transporter', Nature, vol 521, pp. 322-7. 355. Wang, Y, Thomas, P, Zhong, J & et al. 2009, 'Consumption of Grape Seed Extract Prevents Amyloid-β Deposition and Attenuates Inflammation in Brain of an Alzheimer’s Disease Mouse', Neurotox Res, vol 15, pp. 3-14. 356. Wang, H, Wang, L, Zhang, R, Chen, Y, Liu, L & et al. 2014, 'Anti-depressive mechanism of repetitive transcranial magnetic stimulation in rat: the role of the endocannabinoid system', J Psychiatr Res, vol 51, pp. 79-87. 357. Watychowicz, K, Janda, K, Jakubczyk, K & Wolska, J 2017, 'Chaenomeles- Helath Promoting Benefits', Rocz Panstw Zakl Hig, vol 68, no. 3, pp. 217-27. 358. Wiesneth, S, Petereit, F & Juergenliemk, G 2015, 'Salix daphnoides: A Screening for Oligomeric and Polymeric Proanthocyanidins', Molecules, vol 20, no. 8, pp. 13764-79. 359. Williams, C, Mohsen, M, Vauzour, D, Rendeiro, C, Butler, L, Ellis, J, Whiteman, M & Spencer, J 2008, 'Blueberry-induced changes in spatial working memory correlate with changes in hippocampal CREB phosphorylation and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels', Free Radical Biology and Medicine, vol 45, pp. 295-305. 360. Willner, P 2016, 'The chronic mild stress (CMS) model of depression: History, evaluation and usage', Neurobiol Stress, vol 6, pp. 78-93. 188

361. Willner, P, Hale, AS & Argyropoulos, S 2005, 'Dopaminergic mechanism of antidepressant action in depressed patients', J Affect Disord, vol 86, pp. 37-45. 362. Wojdyło, A, Oszmianski, J & Bober, I 2008, 'The effect of addition chokenberry, Flowering quince fruits and rhubarb juice to strawberry jams on their polyphenol content, antioxidant activity and colour', Eur. Food Res. Technol., vol 227, pp. 1043–1051. 363. World Health Organization 2016, 'World Health Statistics 2016 Monitoring Health for the SDGs, Sustainable Development Goals', World Health Organization, Geneva, Switzerland. 364. World Health Organization 2020, 'Depression'. 365. www.theplantlist.org 2017, viewed 18 October 2011, < HYPERLINK "http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/rjp-19753" http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/rjp-19753 >. 366. Xie, X, Cai, X, Zhu, S & Zou, G 2007, 'Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils of Chaenomeles speciosa from China', Food Chemistry, vol 100, pp. 1312–1315. 367. Xu, Y, Ku, B, Yao, H, Lin, Y & et al. 2005, 'Antidepressant effects of curcumin in the forced swim test and olfactory bulbectomy models of depression in rats', Pharmacol Biochem Behav, vol 82, pp. 200-6. 368. Xu, Y, Li, S, Chen, R, Li, G & et al. 2010, 'Antidepressant-like effect of low molecular proanthocyanidin in mice: Involvement of monoaminergic system', Pharmacol Biochem Behav, vol 94, no. 3, pp. 447-53. 369. Yamada, K, Kobayashi, M & Kanda, T 2014, 'Involvement of adenosine A2A receptors in depression and anxiety', Int Rev Neurobiol, vol 119, pp. 373-93. 370. Yang, G, Fen , W, Lei, C, Xiao, W & Sun, H 2009, 'Study on determination of pentacyclic triterpenoids in Chaenomeles by HPLC-ELSD', Journal of Chromatographic Science, vol 47, no. 8, pp. 718-22. 371. Yang, C, Tian, Y, Zhang, ZJ, Xu, FG & Chen, Y 2007, 'High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry determination of sodium ferulate in human plasm', J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 43, pp. 945-50. 372. Yang, B, Zhang, X, Guan, S & Hua, Z 2015, 'Protective Effect of Procyanidin B2 against CCl4-Induced Acute Liver Injury in Mice', Molecules, vol 20, no. 7, pp. 12250-65.

189

373. Yasar, S, Can, Ö, Öztürk , N, Sagratini, G, Ricciutelli, M, Vittori, S & Maggi, F 2013, 'Central Nervous System Activities of Hypericum origanifolium Extract via GABAergic and Opioidergic Mechanisms', Phytother Res, vol 27, no. 6, pp. 877-84. 374. Yeung, W, Chung, K, Ng, K, Eriz, Z & Ng, B 2014, 'A systemic review on the efficacy, safety and types of Chinese herbal medicine for depresiion', Journal of Psychiatric Research, vol 57, pp. 165-175. 375. Yin, K, Gao, H, Li, X & Wu, L 2006, 'Chemical constituents of Chaenomeles Sinensis (Thouin.) Koehne', J. Shenyang Pharm. Univ., vol 23, no. 12, pp. 1273–1275. 376. Youdim, KA, Dobbie, MS, Kuhnle, G, Proteggente, AR, Abbott, NJ & Rice- Evans, C 2003, 'Interaction between flavonoids and the blood-brain barrier: in vitro studies', J Neurochem, vol 1, pp. 180-92. 377. Youn, H, Lee, J, Saitoh, S, Miyake, K, Kang, K, Choi, Y & Hwang, D 2006, 'Suppression of MyD88- and TRIF-dependent signaling pathways of Toll-like receptor by (−)- epigallocatechin-3-gallate, a polyphenol component of green tea', Biochem Pharmacol, vol 72, pp. 850-9. 378. Zanoli, P, Avallone, R & Balardi, M 2000, 'Behavioral characterisation of the flavonoids apigenin and chrysin', Fitoterapia, vol 71, no. 1, pp. 117-123. 379. Zarate, C, Singh, J, Carlson, P, Brutsche, N, Ameli, R, Luckenbaugh, D & et al. 2006, 'A randomized trial of an N-methyl-D-aspartate antagonist in treatment-resistant major depression', Arch Gen Psychiatr, vol 63, pp. 856-64. 380. Zeni, AL, Camargo, A & Dalmagro, AP 2017, 'Ferulic acid reverses depression- like behavior and oxidative stress induced by chronic corticosterone treatment in mice', Steroids, vol 125, pp. 131-6. 381. Zeni, A, Zomkowski, AD, Maraschin, M, Rodrigues, AL & Tasca, CI 2012, 'Involvement of PKA, CaMKII, PKC, MAPK/ERK and PI3K in the acute antidepressant-like effect of ferulic acid in the tail suspension test', Pharmacol Biochem Behav, vol 103, pp. 181-6. 382. Zhang, L, Cheng, Y, Liu, AL, Wang, HD, Wang, YL & Du, G 2012, '-3-Zhang et al., 2010 L. Zhang, Y.X. Cheng, A.L. Liu, Antioxidant, anti-inflammatory and anti-influenza properties of components from Chaenomeles speciosa', Molecules, vol 15, no. 11, pp. 8507– 8517. 383. Zhang, S, Han , L, Zhang, H & Xin, H 2014, 'Chaenomeles speciosa: A review of chemistry and pharmacology', Biomed Rep, vol 2, no. 1, pp. 12-8. 190

384. Zhang, S, Han, L, Zhang, H & Xin, H 2014, 'Chaenomeles speciosa: A review of chemistry and pharmacology', Biomedical Reports, vol 2, no. 1, pp. 12-18. 385. Zhang, Y, Huang, X, Wang, Y, Xie, Y & et al. 2011, 'Ferulic acid-induced anti- depression and prokinetics similar to Chaihu–Shugan–San via polypharmacology', Brain Res Bull, vol 86, no. 1-3, pp. 222-8. 386. Zhang, W, Liu, H, Xie, K & et al. 2006, 'Procyanidin dimer B2 [epicatechin-(4β- 8)-epicatechin] suppresses the expression of cyclooxygenase-2 in endotoxin-treated monocytic cells', Biochem Biophys Res Comm, vol 345, no. 1, pp. 508-15. 387. Zhang, R, Zhan, S, Li, S, Zhu, Z, He, J & et al. 2018, 'Anti-hyperuricemic and nephroprotective effects of extracts from Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne in hyperuricemic mice', Food Funct, pp. 5778-90. 388. Zhao , G, Jianga, Z, Zheng, X, Zang, S & Guo, L 2008, 'Dopamine transporter inhibitory and antiparkinsonian effect of common flowering quince extract', Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol 90, pp. 363–371. 389. Zhao, Z, Egashira, Y & Sanada, H 2003, 'Ferulic acid sugar esters are recovered in rat plasma and urine mainly as the sulfoglucuronide of ferulic acid', J of Nutrition, vol 133, pp. 1355-61. 390. Zhao, Z, Egashira, Y & Sanada, H 2004, 'Ferulic acid is quickly absorbed from rat stomach as the free form and then conjugated mainly in liver', The Journal of Nutrition, vol 134, pp. 3083-3088. 391. Zhao, G, Jianga, Z, Zheng, X, Zang, S & Guo, L 2008, 'Dopamine transporter inhibitory and antiparkinsonian effect of common flowering quince extract', Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol 90, pp. 363–371. 392. Zhao, Z & Moghasasian, M 2008, 'Chemistry, natural sources, dietary intake and pharmacokinetic properties of ferulic acid: A review', Food Chemistry, vol 109, no. 4, pp. 691- 702. 393. Zhao, Q, Tan, L, Wang, H, Jiang, T, Tan, M, Tan, L, Xu, W & et al. 2016, 'The prevalence of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease: Systematic review and meta- analysis', J Affect Disord, vol 190, pp. 264-71. 394. Zhao, Q, Tan, L, Wang, H, Jiang, T, Tan, M, Tan, L, Xu, W & et al. 2016, 'The prevalence of neuropsychiatric symptoms in Alzheimer's disease: Systematic review and meta- analysis', J Affect Disord, vol 190, pp. 264-71. 191

395. Zhu, Q, Liao, C, Liu, Y, Wanga, P, Guo, W, He, M & et al. 2012, 'Ethanolic extract and water-soluble polysaccharide from Chaenomeles speciosa fruit modulate lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7 macrophage cells', Journal of Ethnopharmacology, vol 144, pp. 441-447. 396. Zhu, W, Shi, H, Wei, Y, Wang, S, Sun, C, Ding, Z & Lu, L 2012, 'Green tea polyphenols produce antidepressant-like effects in adult mice', Pharmacol Res, vol 65, no. 1, pp. 74-80. 397. Zou, W, Feng, R & Yang, Y 2018, 'Changes in the serum levels of inflammatory cytokines in antidepressant drug-naive patients with major depression.', PLoS One, vol 13, no. 6, p. e0197267. 398. Zuo, Y, Wang, C, Zhou, J & Ruelos, VC 2008, 'Simultaneous Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine by High-Performance Liquid Chromatography', Anal Sci, vol 24, pp. 1589-92. 399. Елисеева, ЛГ, Блинникова, ОМ & Пехташева, ЕЛ 2012, 'Оценка Потребительских Свойств Плодов Хеномелеса Маулея', Товаровед Продовольственных Товаров, no. 6, pp. 4-7. 400. Чулков, А, Дейнека, В, Навальнева, И, Дейнека, Л & Сорокопудов, В 2011, 'Антоцианы Лепестков Цветков Chaenomeles Japonica И C. Maule', Серия Естественные науки, vol 9, pp. 379-85.

192