Contribution À L'étude Phytochimique Et Recherche D'activités

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Aboubekr Belkaïd -Tlemcen- Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l'Univers Département de Biologie

Laboratoire Antibiotiques Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activité Biologique

Thèse en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Biologie

Option : Substances à visée thérapeutique

Présentée par : CHEKROUN Echaimaa

Thème

Contribution à l’étude phytochimique et recherche d’activités antioxydante et antidiabétique de deux cucurbitacées : Bryonia dioica Jacq et Citrullus colocynthis (L.) Schrad

Devant le jury composé de :

Président Dr. LAHFA Farid Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen

Directeur de thèse Pr. DJAZIRI Rabah Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen

Examinateurs Pr. BENAZZOUG Yasmina Université USTHB Alger

Dr. BENMEHDI Houcine Université Mohammed Tahri Béchar

Dr. AZZI Rachid Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen

Année universitaire : 2015-2016

Dédicaces

Je dédie spécialement cette thèse à mes chers parents, pour leurs encouragements, leur tendresse, leur amour et leur soutien durant mes études ; vous trouverez ici le fruit de vos sacrifices et je souhaite que Dieu vous accorder une longue vie pleine de santé et de bonheur

À ma grande mère

À mes frères et ma petite sœur

À mes nièces et mes neveux

À toute ma famille et mes amis

Echaimaa

Remerciements

J’exprime tout d’abord mes remerciements les plus sincères à mon directeur de thèse Mr DJAZIRI Rabah, Professeur au département de Biologie, faculté SNV/STU, Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, d’avoir accepté la charge de m’encadrer, pour son bienveillance au laboratoire et pour l’intérêt qu’il a donné pour accomplir ce travail. Je le remercie pour sa disponibilité, sa patience, ses conseils, sa compréhension, ses qualités pédagogiques et scientifiques. Veuillez trouver Monsieur, dans cette thèse, le témoignage de ma sincère reconnaissance et de mon profond respect.

J’adresse mes sincères remerciements à Mr LAHFA Farid, Maître de conférences Classe A et Doyen de la faculté SNV/STU, Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, pour l’honneur qu’il m’a fait en acceptant de présider le jury de cette thèse, d’évaluer ce travail et de l’intérêt qu’il lui accordé. Je le remercie également pour sa compréhension et son aide précieuse à la réalisation de cette soutenance.

J’exprime mes sincères remerciements à Mm BENAZZOUG Yasmina, Professeur à l’Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediène Alger, d’avoir accepté de participer à l’évaluation de ce travail et de l’enrichir de sa haute compétence scientifique.

Je tiens à remercier Mr BENMEHDI Hocine, Maître de conférences Classe A à l’Université Mohammed Tahri Béchar, pour l’honneur qu’il m’a fait d'être examinateur de cette thèse. Qu’il trouve dans cette thèse le témoignage de mes sincères reconnaissances.

Je suis très honoré que Mr AZZI Rachid, Maître de conférences Classe A au département de Biologie, faculté SNV/STU, Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, ait accepté d’examiner ce travail. Je le remercie vivement pour l’aide varié qu’il m’a donnée tout le long de la réalisation de ce travail, pour sa disponibilité et sa gentillesse. Qu’il trouve ici le témoignage de mon profond respect.

Mes remerciements s’adressent à Mm BOUCHERIT-OTMANI Zahia, Professeur au département de Biologie, faculté SNV/STU, Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, et directrice du Laboratoire «Antibiotiques Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activité Biologique».

Je remercie également Mm BENARIBA Nabila, Maître de conférences Classe B au département de Biologie, faculté SNV/STU, Université Aboubekr Belkaïd Tlemcen, pour sa disponibilité malgré ses nombreuses occupations, et de son aide précieuse pour les publications des résultats dans les revues scientifiques. Je la remercie pour ses conseils, ses encouragements, et son aide moral et scientifique. Qu’elle trouve dans cette thèse l’expression de mes remerciements les plus chaleureux.

Au terme de plusieurs mois de travaux, je tiens à remercier Mm ABBAS-BECHIRI Asma, Melle ADIDA Houria, Mm BEKHTI-MEZERAI Rabiha, Melle DJAZIRI Fatima Zohra et Mm FELAHI-ZERIOUH Wafaa, Doctorantes aux Laboratoires de recherche LAPSAB et LAPRONA, pour leur aide dans la réalisation des essais in vivo et pour les discussions enrichissantes qu’elles ont attribué à ce travail.

Je tiens aussi à remercier l’ensemble des doctorants ainsi que les techniciens du laboratoire «Antibiotiques Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activité Biologique», pour leur amitié, leur bonne humeur et leur aide.

Je remercie tout particulièrement les membres de ma famille, pour leur présence constante, leur soutien et leur aide inestimable.

Aussi, mes remerciements s’adressent à tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué directement ou indirectement à la réalisation de ce modeste travail. Avant-propos

Les travaux qui ont fait l’objet de cette présente thèse ont été réalisés dans le Laboratoire Antibiotiques Antifongiques : Physico-chimie, Synthèse et Activité Biologique (LAPSAB), Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, des Sciences de la Terre et de l’Univers, Université Aboubekr Belkaïd, Tlemcen - Algérie.

Notre problématique s’inscrit dans un axe de recherche pluridisciplinaire qui concerne l’étude des activités biologiques et pharmacologiques des plantes médicinales utilisées pour le traitement du diabète sucré. L’approche ethnopharmacologique est adoptée afin de recenser et inventorier les plantes utilisées par la population diabétique en Algérie. Les plantes sélectionnées sont étudiées pour leur efficacité et leur toxicité chez différents modèles de diabète expérimental, induits par la streptozotocine. L’étude phytochimique du matériel végétal est également entreprise en vue de déterminer leur composition en phytoconstituants, de révéler les substances actives et d’élucider leur mécanisme d’action.

الملخص

نطبنًب سبْى انطب انخقهٛذ٘ كأسبط نهبحذ ػٍ أدٚٔت صذٚذة ػٍ غشٚق انفحص انخضشٚبٙ انكًٛٛبئٙ ٔانبٕٛنٕصٙ نًسخخهصبث انُببحبث انطبٛت. يٍ بٍٛ ْزِ انُببحبث Citrullus colocynthis (L.) Schrad ٔ Bryonia dioica Jacq ارُخٍٛ يٍ انقشٛػبث انًسخخذيت حقهٛذٚب نؼالس يشض انسكش٘، يشض يضيٍ خطٛش ٚخضاٚذ إَخشبسا فٙ صًٛغ أَحبء انؼبنى. انٓذف يٍ ْزِ االغشٔحت ْٕ انذساست انكًٛٛبئٛت انُببحٛت نًسخخهصبث ْخٍٛ انُبخخٍٛ ٔحقٛٛى خصبئصًٓب انًعبدة نألكسذة فٙ انًخخبش ٔ انًعبدة نهسكش٘ فٙ انضسى انحػ ُٙذ انضشراٌ انًصببت ببنسكش٘ ػٍ غشٚق انحقٍ ببنسخشبخٕصٔحٕسػ (STZ) ٍُٛذ انٕالدة.

حى ححعٛش يخخهف انًسخخهصبث يٍ صزٔس Bryonia dioica ٔ فٕاكّ Citrullus colocynthis : يسخخهصبث يبئٛت ٔ بٛخبَٕنٛت ببإلظبفت انٗ يسخخهصبث انبٕنٛفُٕٛل ٔ انصببٍَٕٛ. كشفج انذساست انكًٛٛبئٛت انُببحٛت انٛػُٕت ٔانكًٛت نٓزِ انًسخخهصبث أسبسب ٔصٕد انكَُٕٛبث انحشة ٔانًشكببث انفُٕٛنٛت )انؼفص ٔانفالفَٕٛذاث( ٔانصببٍَٕٛ حشحٛشبٍٛ. ْزٍٚ األخٛشاٌ ٕٚصذاٌ بكًٛبث يشحفؼت َسبٛب فٙ

يسخخهصبث BDRSaponines ٔ BDRPolyphénols يغ ػ 952391 µg eq AO/mg ES ٔ 823326 µg eq AG/mg ESهٗ انخٕانٙ.

دساست انُشبغ انًعبد نألكسذة ببسخخذاو غشٚقخٍٛ : غشٚقت انكسح انشادٚكبنٛت انًعبدة نألكسذة ػهٗ DPPH ٔ غشٚقت إسصبع انحذٚذ

)FRAP(، أظٓشث َشبغ يعبد نألكسذة يخؼهق بخشكٛب انًسخخهص انًخخبش، حٛذ ٚحخٕ٘ انًسخخهص BDRPolyphénols (ػ (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mLهٗ أْى َشبغ يعبد نألكسذة. ٔببإلظبفت إنٗ رنك، فئٌ ْزا انًسخخهص بخشكٛض 1 يهغ / يم ال ٚؤد٘ إنٗ إَحالل انذو غٕال 80 دقٛقت يٍ انحعبَت ػُذ 32 دسصت يئٕٚت. ْزٍٚ انُشبغٍٛ يعبد نألكسذة ٔ ٔاقٙ نهخهٛت يػ ٔ ًٍٛٓهٗ األسصح ْزا ساصغ إنٗ إحخٕائًٓب ػهٗ يسخٕٚبث يشحفؼت يٍ انفُٕٛالث ٔانفالفَٕٛذاث انكهٛت.

أظٓش حقٛٛى انخصبئص انًعبدة نهسكش٘ نضًٛغ يسخخهصبث C. colocynthisٔ B. dioica ، إَخفبظب قهٛال فٙ يسخٕٖ انسكش فٙ انذو ػهٗ انًذٖ انقصٛش )3 سبػبث(، فٙ حٚ ٍٛصبح كبٛشا ػهٗ انًذٖ انًخٕسٚ 21( ػٕيب( ػُذيب حؼطٗ ٚ IPٕيٛب نهضشراٌ انًصببت

بذاء انسكش٘. ببألخص، ٚخًٛض انًسخخهصبٌ (BDRSaponines (8 mg/kg pc) ٔ BDRn-but (40 mg/kg pc بخأرٛش كبٛش صذا فٙ خفط يسخٕٖ انسكش فٙ انذو ػهٗ انًذٖ انًخٕسػ ، فًٓب ٚعًُبٌ انحذ يٍ اسحفبع يسخٕٖ انسكش فٙ انذو بُسبت ػ ٪22- ٔ ٪86-هٗ انخٕانٚٔ ٙشصغ رنك أسبسب إنٗ احخٕائًٓب ػهٗ يسخٕٚبث يشحفؼت يٍ انصببٚٔ .ٍَٕٛشحبػ انًفؼٕل انًعبد نهسكش٘ ػهٗ انًذٖ انًخٕسػ بخحسٍٛ بؼط انًكَٕبث األٚعٛت : انكٕنٛسخشٔل , انذٌْٕ انزالرٛت ٔانٕٛسٚب، ٔغٛشْب يٍ االظطشاببث يزم انُٓبو، انؼطش ٔفقذاٌ انٕصٌ، كهٓب حغٛشاث ححذد بؼذ حقٍ ػ STZُذ انٕالدة. ػٔالٔة ػهٗ رنك، فئٌ انؼًبنضت بًسخخهصبث ْزِ انقشٛػبث نًذة ٚ 21ٕيب نى حظٓش أ٘ سًٛت فٙ انضشراٌ انطبٛؼٛت ٔ انًشٚعت ببنسكش٘.

كم انُخبئش انخٙ حى انحصٕل ػهٛٓب فٙ ْزِ انذساست ٔاػذة، ألَٓب حخبشَب ػٍ انُشبغ انًعبد نألكسذة ٔ انًعبد نهسكش٘ نًسخخهصبث صزٔس B. dioica ٔ فٕاكّ C. colocynthis ٔ ْزا يب ٚؤكذ إنٗ حذ يب اسخخذايًٓب انخقهٛذ٘. ْزِ انخصبئص ْٙ أكزش أًْٛت ببنُسبت ل B. dioica. ْزِ انُخبئش ْٙ أٔنٛت ٔ حسخحق أٌ حؼًق أكزش يٍ أصم ححذٚذ ٔحٕصٛف انًشكببث انًسؤٔنت ػٍ ْزِ األَشطت ٔيحبٔنت يؼشفت آنٛبث ػًهٓب إلدساصٓب فٙ انؼالس انذٔائٗ ظذ داء انسكش٘.

الكلمات المفتاحية : Citrullus colocynthis ، Bryonia dioica ، انُشبغ انًعبد نألكسذة، انُشبغ انًعبد نًشض انسكش٘، انبٕنٛفُٕٛل، انصببٍَٕٛ، يشض انسكش٘ انخضشٚبٙ. Résumé

La médecine traditionnelle a toujours servi comme une base à la recherche de nouveaux agents pharmacologiques actifs via le screening expérimental phytochimique et biologique des extraits de plantes médicinales. Parmi ces plantes Bryonia dioica Jacq et Citrullus colocynthis (L.) Schrad, deux cucurbitacées traditionnellement utilisées pour traiter le diabète sucré, maladie chronique grave dont la prévalence ne cesse d’augmenter à travers le monde. L’objectif de ce travail est consacré à l’étude phytochimique de quelques extraits et fractions de ces deux cucurbitacées ainsi que l’évaluation de leurs activités antioxydante in vitro et antidiabétique in vivo chez des rats rendus diabétiques par l’injection néonatale de la streptozotocine.

Différents extraits aqueux et butanoliques en plus des fractions enrichies de polyphénols et de saponines ont été préparés à partir des racines broyées de B. dioica et des fruits concassés de C. colocynthis. L’étude phytochimique qualitative et quantitative de ces extraits a révélé principalement la présence de quinones libres, composés phénoliques (tanins et flavonoïdes) et de saponines triterpéniques. Ces deux derniers se trouvent à des taux relativement élevés dans les fractions BDRPolyphénols et BDRSaponines, avec des taux de 673,28 µg eq AG/mg ES et 592,51 µg eq AO/mg ES respectivement.

L’étude de l’activité antioxydante, utilisant les méthodes de piégeage du radical libre DPPH et de réduction de fer (FRAP), a montré un effet antioxydant dépendant de la composition de l’extrait testé. En effet, la fraction

BDRPolyphénols (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mL) renferme l’effet antioxydant le plus important. Par ailleurs, cette fraction n’a pas montré un effet hémolytique vis-à-vis des globules rouges humains à une concentration de 1 mg/mL jusqu’à 60 min d’incubation à 37°C. Ces effets antioxydant et cytoprotecteur importants sont dus probablement aux teneurs élevées en polyphénols totaux et flavonoïdes totaux.

L’évaluation de l’activité antidiabétique nous a révélé que l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis montrent un effet antihyperglycémiant peu significatif à court terme (3 heures) mais plus significatif à moyen terme (21 jours) lorsque administrés IP quotidiennement chez les rats rendus diabétiques. En particulier, l’extrait BDRn-but (40 mg/kg pc) et la fraction BDRSaponines (8 mg/kg pc) qui exercent un effet antihyperglycémiant très significatif à moyen terme, ils assurent une réduction de l’hyperglycémie de -68% et -72% respectivement en relation avec leur teneur appréciable en saponines. L’effet antidiabétique à moyen terme est associé par l’amélioration de certains paramètres métaboliques : cholestérol total, triglycérides et urée, et autres perturbations comme la polyphagie, la polydipsie et la chute de poids corporel, altérations apparus après l’injection néonatale de la STZ. Par ailleurs, l’administration IP des extraits et fractions des deux cucurbitacées pendant 21 jours ne présente aucune toxicité chez les rats traités normaux et diabétiques.

Les résultats obtenus au cours de cette étude sont prometteuses, ils nous renseignent sur les activités antioxydante et antidiabétique des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis en confirmant à un certain degré leur utilisation traditionnelle. Ces propriétés sont toutefois plus importantes pour B. dioica. Ces résultats restent préliminaires et méritent d’être approfondis afin d’identifier et caractériser les composés responsables de ces activités et d’étudier leurs mécanismes d’action en vue de leur incorporation dans le système de soin.

Mots clés : Bryonia dioica, Citrullus colocynthis, activité antioxydante, activité antidiabétique, polyphénols, saponines, diabète expérimental. Abstract

Traditional medicine always served as a base in search of new active pharmacological agents via phytochemical and biological experimental screening of medicinal plants extracts. Among these plants Bryonia dioica Jacq and Citrullus colocynthis (L.) Schrad, two cucurbitaceous traditionally used to treat diabetes mellitus, serious chronic disease whose prevalence is increasing worldwide. The aim of this work is devoted to phytochemical investigation of extracts and fractions of these two cucurbitaceous as well as the evaluation of their activities antioxydant in vitro and antidiabetic in vivo in neonatal-streptozotocin diabetic rats.

Different aqueous and butanolic extracts as well as polyphenols and saponins enriched fractions were prepared from Bryonia dioica powdered roots and Citrullus colocynthis crushed fruits. The qualitative and quantitative phytochemical study of these extracts revealed the presence mainly of quinones, phenolic compounds (tannins and flavonoids) and triterpenic saponins. These last two are relatively high in the fractions BDRPolyphenols and

BDRSaponins, with 673.28 µg eq GA/mg DE and 592.51 µg eq OA/mg DE respectively.

The study of the antioxydant activity by using free radical scavenging (DPPH) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays, showed an antioxydant effect dependent to the tested extract composition. In fact, the

BDRPolyphenols fraction (IC50=1.25 μg/mL ; EC50=21.67 µg/mL) exhibits the most important antioxidant effect. In addition, this fraction did not show any hemolytic effect of human red blood cells at a concentration of 1 mg/mL up to 60 min of incubation at 37 °C. These important antioxidant and cytoprotective effects are probably related to the high total polyphenols and flavonoids content.

All extracts and fractions of B. dioica and C. colocynthis evaluated for their antidiabetic activity show a not very significant antihyperglycemic effect in acute term (3 hours), it becomes significant in sub-acute term (21 days).

In particular, the BDRn-but extract (40 mg/kg bw) and BDRSaponins fraction (8 mg/kg bw) exhibit high significant antihyperglycemic effect in the sub-acute term, they ensure a reduction of -68% and -72% respectively in relation to their appreciable content of saponins. The sub-acute term antidiabetic effect is associated by the improvement of certain metabolic parameters: total cholesterol, triglycerides and urea, and other perturbations like polyphagia, polydipsia and falling body weight, deteriorations appeared after the neonatal injection of the STZ. In addition, IP administrations of extracts and fractions of the two cucurbitaceous during 21 days do not have any toxicity in the treated normal and diabetic rats.

The results obtained during this study are promising, they inform us about the antioxydant and antidiabetic activities of B. dioica roots and C. colocynthis fruits by confirming with a certain degree their traditional use. These properties, however, are more important for B. dioica. These results remain preliminary and they deserve to be thorough in order to identify and characterize the compounds responsible for these activities and to try to know their mechanisms of action for their incorporation in the care system.

Keywords: Bryonia dioica, Citrullus colocynthis, antioxydant activity, antidiabetic activity, polyphenols, saponins, experimental diabetes.

Table des matières

Introduction générale ……...... 1

Première partie : Synthèse bibliographique …………………………………………... 4

I. Généralité sur le diabète sucré ………………………………………………………. 4 1. Définition et diagnostic ………………………………………………………………... 4 2. Epidémiologie …………………………………………………………………………. 4 3. Classification …………………………………………………………………………... 5 4. Complications …………………………………………………………………………. 7 5. Traitement ……………………………………………………………………………... 8 6. Diabète sucré et stress oxydant ………………………………………………………... 10 II. Plantes médicinales antidiabétiques ………………………………………………... 12 1. Phytothérapie et diabète sucré …………………………………………………………. 12 2. Modes d’actions des plantes antidiabétiques ………………………………………….. 13 3. Plantes antidiabétiques dans le continent Africain …………………………………… 15 4. Plantes antidiabétiques en Algérie …………………………………………………….. 16 5. Les cucurbitacées ……………………………………………………………………… 16 6. Bryonia dioica (la bryone) …………………………………………………………….. 17 6.1. Taxonomie et description botanique ………………………………………………… 17 6.2. Phytochimie …………………………………………………………………………. 18 6.3. Activités biologiques ………………………………………………………………... 19 6.4. Toxicité ……………………………………………………………………………… 21 7. Citrullus colocynthis (la coloquinte) …………………………………………………... 22 7.1. Taxonomie et description botanique ………………………………………………… 22 7.2. Phytochimie …………………………………………………………………………. 23 7.3. Activités biologiques ………………………………………………………………... 24 7.4. Toxicité ……………………………………………………………………………… 26 III. Diabète expérimentale ……………………………………………………………… 27

Deuxième partie : Matériel et méthodes ………………………………………………. 29

I. Etude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte ……. 29 1. Matériel végétal ……………………………………………………………………….. 29 2. Préparation des extraits ………………………………………………………………... 30 2.1. Dégraissage du matériel végétal …………………………………………………….. 30 2.2. Extrait aqueux ……………………………………………………………………….. 30 2.3. Extrait butanolique …………………………………………………………………... 31 2.4. Fraction enrichie de polyphénols et fraction enrichie de saponines ………………… 31 3. Calcul du rendement d’extraction ……………………………………………………... 33 4. Screening phytochimique ……………………………………………………………… 33 5. Dosage de polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux …………………………….. 35 5.1. Dosage de polyphénols totaux ………………………………………………………. 35 5.2. Dosage de flavonoïdes totaux ……………………………………………………….. 35 5.3. Dosage de saponines totales …………………………………………………………. 36 II. Etude des activités biologiques des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte ………………………………………………………………………………... 37 1. Activité antioxydante ………………………………………………………………… 37 1.1. Test de piégeage du radical libre DPPH …………………………………………….. 37 1.2. Test de pouvoir réducteur du fer …………………………………………………….. 39 2. Activité antidiabétique ……………………………………………………………….. 40 2.1. Les animaux d’expérimentation ……………………………………………………... 40 2.2. Evaluation de la toxicité aiguë des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………... 41 2.3. Induction du diabète expérimental …………………………………………………... 42 2.4. Evaluation de l’effet antidiabétique des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………… 43 2.4.1. Etude à court terme ………………………………………………………………... 43 2.4.2 Etude à moyen terme ………………………………………………………………. 44 2.4.3. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur l’évolution du poids corporel, la consommation d’aliment et d’eau chez les rats normaux et diabétiques …………………………………. 45 2.4.4. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur la biométrie des organes ……………………………... 46 2.5. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose …………………………. 46 2.6. Dosage des paramètres biochimiques sanguins ………………………………...…… 47 2.6.1. Dosage de glucose …………………………………………………………………. 47 2.6.2. Dosage du cholestérol total et triglycérides ……………………………………….. 48 2.6.3. Dosage de l’urée et la créatinine …………………………………………………... 48 2.7. Etude statistique ……………………………………………………………………... 49 3. Activité hémolytique …………………………………………………………………. 50 3.1. Matériel : globules rouges humains ……………………………………………...….. 50 3.2. Préparation de la suspension érythrocytaire ………………………………………… 50 3.3. Mesure de la fuite de l’hémoglobine ………………………………………………… 51

Troisième partie : Résultats et interprétation ….…………………………………...… 52

I. Etude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte ……. 52 1. Caractéristiques des extraits et fractions ………………………………………………. 52 2. Screening phytochimique ……………………………………………………………… 53 3. Teneur en polyphénols, en flavonoïdes et en saponines totaux ……………………….. 55 II. Etude des activités biologiques des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte ………………………………………………………………………………... 59 1. Activité antioxydante ………………………………………………………………… 59 1.1. Activité antiradicalaire des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis (piégeage du radical libre DPPH) ………………………... 59 1.2. Activité réductrice des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis (pouvoir réducteur du fer) ……………………………..… 63 1.3. Corrélation entre les teneurs en polyphénols, flavonoïdes, saponines totaux et l’activité antioxydante des différents extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………... 65 2. Activité antidiabétique ……………………………………………………………….. 67 2.1. Evaluation de la toxicité aiguë des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………... 67 2.2. Caractéristiques générales des rats rendus diabétiques par la streptozotocine ……… 69 2.2.1. Toxicité de la streptozotocine ……………………………………………………... 69 2.2.2. Poids corporel ……………………………………………………………………... 70 2.2.3. Glycémie à jeun …………………………………………………………………… 71 2.2.4. Test de tolérance orale au glucose (TTOG) ……………………………………….. 72 2.2.5. Consommation d’aliment, d’eau et excrétion urinaire …………………………….. 73 2.3. Effet antidiabétique des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………………. 74 2.3.1. Effet à court terme ………………………………………………………………… 75 3.2.2. Effet à moyen terme ……………………………………………………………….. 79 2.3.3. Effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur les paramètres biochimiques sanguins chez les rats normaux et diabétiques ……………………………………………………………………………….. 83 2.3.3.1. Effet sur le taux de cholestérol total et de triglycérides ……………………...….. 83 2.3.3.2. Effet sur le taux d’urée et de la créatinine ……………………………………..... 88 2.3.4. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur le poids corporel chez les rats normaux et diabétiques ……………………………………... 92 2.3.5. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur la consommation d’aliment et d’eau chez les rats normaux et diabétiques ………………… 95 2.3.6. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur la biométrie de certains organes chez les rats normaux et diabétiques ……………………... 97 2.4. Evaluation de l’effet de quelques extraits et fractions des racines de Bryonia dioica chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose ……………...…. 99 3. Activité hémolytique …………………………………………………………………. 101

Quatrième partie : Discussion générale ……………………………………………….. 104

Cinquième partie : Conclusion générale et perspectives ……………………………... 117

Sixième partie : Références bibliographiques ………………………………………… 119

Annexes ……..…………………………………………………………………………… 135

Publications et Communications ………………………………………………………. 137

Liste des tableaux

Tableau 01 : Caractéristiques des agents antidiabétiques oraux et insuline ……...………. 9

Tableau 02 : Composition en métabolites secondaires de différentes parties de Bryonia dioica …………...…………………………..………………………………… 19

Tableau 03 : Composition en métabolites secondaires de différentes parties de Citrullus colocynthis ………………………………………………...………………….. 23

Tableau 04 : Répartition des lots des rats normaux et diabétiques, témoins et expérimentaux, utilisés pour l’évaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis à court et à moyen terme ………………………………………………………………... 45

Tableau 05 : Caractéristiques des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………….……………….……….. 52

Tableau 06 : Screening phytochimique des extraits des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ….……...……………………………………... 54

Tableau 07 : Screening phytochimique des fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……...………………………………………… 54

Tableau 08 : Teneurs en polyphénols totaux, en flavonoïdes totaux et en saponines totales dans les extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………….…………………………. 56

Tableau 09 : Pourcentages de réduction de DPPH en fonction de différentes concentrations de chaque molécule de référence, l'acide ascorbique, l’acide gallique, la catéchine, l’acide oléanolique et le BHT …….…………………………..….. 60

Tableau 10 : Pourcentages de réduction de DPPH en fonction de différentes concentrations de chaque extrait des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis …………………………………………………………….……… 60

Tableau 11 : Pourcentages de réduction de DPPH en fonction de différentes concentrations de chaque fraction des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………………………. 61

Tableau 12 : Corrélation linéaire entre l’activité antioxydante (antiradicalaire, réductrice) et les teneurs en polyphénols totaux, flavonoïdes totaux et saponines totales des différents extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis .…………….……………………………………… 65

Tableau 13 : Doses létales des extraits des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis …………………………………………………………. 67

Tableau 14 : Doses létales des fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis …………………………………………………………. 67

Tableau 15 : Variation du poids corporel chez les rats injectés par la streptozotocine par rapport aux rats injectés par le tampon citrate ……………………………..… 70

Tableau 16 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine par rapport aux rats injectés par le tampon citrate ……………………………….. 71

Tableau 17 : Consommation d’aliment (g) et d’eau (mL) ainsi que volume des urines éliminés (mL) pendant 24 heures chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate ……………………….……………… 73

Tableau 18 : Variations de la glycémie à court terme chez les rats normaux et diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins ………………………………………..……….. 78

Tableau 19 : Variations de la glycémie à moyen terme chez les rats normaux et diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins ……………………………………………….….. 82

Tableau 20 : Variation des taux du cholestérol total et de triglycérides à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins ………………….……….. 87

Tableau 21 : Variation des taux du cholestérol total et de triglycérides à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins …………………………… 87

Tableau 22 : Variation du taux de l’urée et de la créatinine à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins …………………………………….. 91

Tableau 23 : Variation du taux de l’urée et de la créatinine à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins ……………………………..…….. 91

Tableau 24 : Variation du poids corporel à moyen terme chez les rats normaux et diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins …………………………….……….. 94

Tableau 25 : Variation de la glycémie et la charge glycémique chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose et traités par les extraits aqueux et butanolique ainsi que la fraction enrichie de saponines des racines de Bryonia dioica par rapport aux rats témoins ………….…………...……..…… 100

Liste des figures

Figure 01 : Différentes parties de Bryonia dioica (a) racine, (b) tige et feuille, (c) fleure, (d) fruit et (e) graine ………………………………………………………………… 17

Figure 02 : Différentes parties de Citrullus colocynthis (a) racine, (b) tige et feuille, (c) fleure, (d) fruit et (e) graine ……………………………………………………… 22

Figure 03 : Matériel végétal : racines broyées de Bryonia dioica (A) et fruits concassés de Citrullus colocynthis (B) ……………………………….……………..………….. 29

Figure 04 : Schéma explicatif de la préparation des extraits et fractions à partir des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis …………..……...... 32

Figure 05 : Courbes étalons d’acide gallique pour le dosage de polyphénols totaux (A), de catéchine pour le dosage de flavonoïdes totaux (B) et d’acide oléanolique pour le dosage de saponines totales (C) ……………………………..………………… 56

Figure 06 : Activité antioxydante (méthode DPPH), valeurs des CI50 des molécules de références (A) ainsi que des extraits (B) et fractions (C) des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………..………………………. 61

Figure 07 : Pouvoir réducteur du fer des molécules de références (A) ainsi que des extraits (B) et fractions (C) des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………………………………………….. 63

Figure 08 : Activité antioxydante (méthode FRAP), Valeurs des CE50 des molécules de références (A) ainsi que des extraits (B) et fractions (C) des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis ……………………………………... 64

Figure 09: Taux de mortalité chez les rats injectés par la streptozotocine …………………... 69

Figure 10 : Variations du poids corporel chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate ………………………………………………... 70

Figure 11 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate …………………………………………………….. 71

Figure 12 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate soumis à un test de tolérance orale au glucose …… 72

Figure 13 : Variations de la glycémie à court terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………………… 76

Figure 14 : Variations de la glycémie à court terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………………… 77

Figure 15 : Variations de la glycémie à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………………… 80

Figure 16 : Variations de la glycémie à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………………… 81

Figure 17 : Variations du taux de cholestérol total à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis…… 85

Figure 18 : Variations du taux de cholestérol total à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …... 85

Figure 19 : Variations du taux de triglycérides à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………… 86

Figure 20 : Variations du taux de triglycérides à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …... 86

Figure 21 : Variations du taux d’urée à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …….……………. 89

Figure 22 : Variations du taux d’urée à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …...... 89

Figure 23 : Variations du taux de la créatinine à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ………….. 90

Figure 24 : Variations du taux de la créatinine à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …... 90

Figure 25 : Variations du poids corporel à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …...... 93

Figure 26 : Variations du poids corporel à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ……………… 93

Figure 27 : Variations de la consommation d’aliment à moyen terme chez les rats normaux (A) et diabétiques (B) traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ……………………………………………………………... 96

Figure 28 : Variations de la consommation d’eau à moyen terme chez les rats normaux (A) et diabétiques (B) traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis ……………..………………………………………………. 96

Figure 29 : Variations du poids relatif de certains organes à moyen terme chez les rats normaux (A) et diabétiques (B) traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis …………………………………………………… 98

Figure 30 : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose et traités par les extraits aqueux et butanolique ainsi que la fraction enrichie de saponines des racines de Bryonia dioica.…………………… 100

Figure 31 : Activité hémolytique des extraits et fractions de Bryonia dioica, exprimée en pourcentage, à différentes concentrations et en fonction du temps …...... 102

Liste des abréviations

ABTS : 2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6- DPPH : 2,2-Diphényle-1-Picryl- Hydrazyl sulphonic acid ERO : Espèces réactives oxygénées ADA : Association américaine de diabète ES : Extrait sec AG : Acide gallique FID : Fédération internationale du diabète AGE : Produits terminaux de glycation FRAP : Ferric reducing antioxidant power AMPK : Adenosine mono-phosphate-activated protein kinase GLP-1 : Glucagon-like peptide-1

AO : Acide oléanolique GLUT-2 et GLUT-4 : Transporteurs de glucose

APG3 : Groupe phylogénique des angiospermes HbA1c : Hémoglobine glyquée

ASC : Aire sous la courbe HDL : High Density Lipoprotein

BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé IP : Intra-péritonéale par décoction LC50 : Concentration létale médiane BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération LDH : Lactate dehydrogenase

BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica LDL : Low Density Lipoprotein

BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des MODY : Maturity-Onset Diabetes of the Young racines de B. dioica MVS : Matériel végétal sec BDRSaponines: Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica n-STZ : Modèle expérimental de diabète induit chez le nouveau-né de rat par la streptozotocine BHT : Buthyl-hydroxy toluène OMS : Organisation mondiale de la santé Cat : Catéchine PARP : Poly-ADP-ribose polymerase CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction PBS : Tampon phosphate salé

CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis Pc : Poids corporel préparé par macération PKC : Protéine kinase C

CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis ppm : partie par million

CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis PR : Pourcentage de réduction

CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de PUMA : P53 Up-regulated Modulator of Apoptosis C. colocynthis SGLT-1 : Sodium-dependent Glucose Transporter-1 CE50 : Concentration efficace médiane SGLT-2 : Sodium dependent Glucose Transporter-2 CI50 : Concentration inhibitrice à 50% STZ : Streptozotocine CMI : Concentration minimale inhibitrice TGO (AST) : Aspartate aminotransferase DI50 : Dose inhibitrice à 50% TGP (ALT) : Alanine aminotransferase DL100 : Dose létale totale TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate DL50 : Dose létale médiane TTOG : Test de tolérance orale au glucose DPP-4 : Dipeptidyl-peptidase-4 VLDL : Very Low Density Lipoprotein

Introduction générale

Le diabète sucré est devenu un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. D’après l’organisation mondiale de la santé (OMS), le nombre d’adultes affectés par le diabète sucré entre 2014 et 2040 augmentera de 65% passant de 422 à 642 millions de personnes, dont 90% sont des diabétiques de type 2 [OMS. 2016].

Le diabète sucré est une maladie complexe tant par ses mécanismes physiopathologiques que par son déterminisme génétique. C’est une maladie non transmissible grave de par sa chronicité et la sévérité de ses complications, invalidante et dont la prise en charge médicale est très coûteuse. L’obésité, la sédentarité ainsi qu’une alimentation malsaine, conjugués à une prédisposition génétique sont les facteurs de risque majeurs du diabète [Jain et Saraf. 2010].

Le diabète est caractérisé par une hyperglycémie chronique, provoquée par une insuffisance héritée ou acquise de la production d’insuline par le pancréas ou par l’inefficacité de l’insuline produite. L’hyperglycémie chronique dégénère en complications notamment la rétinopathie diabétique, l’insuffisance rénale, la cardiopathie, la neuropathie diabétique, l’ulcération des pieds et l’amputation [Sautou-Miranda et al. 2008]. Par ailleurs, une hyperglycémie prolongée conduit à une production excessive de radicaux libres, perturbant ainsi la défense antioxydante endogène, générant un stress oxydant, à l’origine de l’insulinorésistance du diabète de type 2 [Hokayem et al. 2012].

Les traitements actuels basés sur des règles hygiéno-diététiques, des antidiabétiques oraux et l’insuline visant à contrôler le niveau glycémique des malades d’une part et d’autre part, à contrôler les nombreux facteurs de risque responsables de complications dégénératives [Sautou-Miranda et al. 2008].

Au cours de ces dernières décennies, une attention particulière a été accordée aux plantes médicinales utilisées comme remède traditionnel dans le traitement et le contrôle du diabète sucré. D’après Calleja. 1990, les points essentiels qui sont à l’origine de l’importance des plantes antidiabétiques sont :

 Un intérêt scientifique fondamental cherchant à confirmer si l’utilisation par la médecine traditionnelle de certaines espèces végétales correspondant réellement à une activité pharmacologique scientifiquement prouvée.  Apporter de nouvelles structures chimiques ayant une activité antidiabétique, plus efficaces et moins iatrogènes à l’arsenal thérapeutique existant, ou comme complément (adjuvant) agissant en synergie avec les traitements conventionnels.

Introduction générale

Ceci représente un intérêt spécialement pour les pays en voie de développement qui pourraient utiliser leur propre ressource naturelle, plus accessible et mieux acceptée car faisant partie du patrimoine culturel de leur sociétés respectives. Dans ce sens, l’OMS au cours de sa 31ème assemblée, a recommandé l’inventaire des plantes médicinales utilisées par les populations des différentes régions du monde, l’évaluation de leur efficacité, leur innocuité, ainsi que la standardisation de leur emploi en vue de les intégrer dans les systèmes de soins [OMS. 2000]. En effet, il est estimé que 65% de la population mondiale, davantage dans les continents Africain et Asiatique, pour des raisons socio-économiques et culturelles ont recours à la médecine traditionnelle pour leur soin primaire [Fabricant et Farnsworth. 2001].

Les informations ethnobotaniques recueillies dans plusieurs régions du monde indiquent que plus de 800 espèces végétales sont utilisées traditionnellement pour leur vertu antidiabétique, dont 410 plantes environ ont été étudiées expérimentalement. Mais le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire est élucidé seulement chez 109 plantes [Prabhakar et Doble. 2008].

L’activité antidiabétique des plantes médicinales est attribuée à leur composition en métabolites secondaires, appelés aussi phytoconstituants, dont les composés phénoliques, flavonoïdes, coumarines, alcaloïdes, glycosides, saponines et huiles essentiels. Ils agissent seuls ou d’une manière synergique en modulant directement ou indirectement l’activité d’hormones, d’enzymes et de voies métaboliques, systèmes organiques impliqués dans le métabolisme et l’homéostasie glucidique [Prabhakar et Doble. 2008 ; Kebièche et al. 2011].

Une approche ethnopharmacologique doit être appliquée pour le recensement des plantes antidiabétiques utilisées traditionnellement pour combattre le diabète sucré, afin de conserver le savoir ancestral qui s’appuie essentiellement sur une tradition orale.

Dans ce présent travail, nous avons adopté la voie ethnopharmacologique et chimiotaxonomique comme voies d’approches pour la valorisation thérapeutique de plantes médicinales. Nous nous sommes intéressés à deux espèces végétales appartenant à la famille des cucurbitacées, Bryonia dioica Jacq (Bryone) «Fachira» et Citrullus colocynthis (L.) Schrad (Coloquinte) «Handel». Cette dernière particulièrement, est souvent citée dans de nombreuses enquêtes ethnopharmacologiques car très utilisées dans de nombreux pays tel qu’en Algérie, Maroc, Jordanie, Iran, Inde pour le traitement traditionnel du diabète sucré [Azzi et al. 2012 ; Tahraoui et al. 2007 ; Al-Aboudi et Afifi. 2011 ; Nowbandegani et al. 2015 ; Grover et al. 2002].

Introduction générale

Cette présente thèse a pour objectif d’étudier la composition phytochimique ainsi que les propriétés biologiques d’extraits des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis à savoir : leur pouvoir antioxydant et leur activité antidiabétique chez un modèle de diabète expérimental induit chez le rat par la streptozotocine à la naissance.

Pour ce faire, nous avons adopté la démarche suivante :

L’étude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte qui consiste à la préparation de différents extraits aqueux, butanoliques et fractions enrichies de polyphénols et de saponines. Ces derniers ont fait l’objet de quelques tests phytochimiques qualitatifs de caractérisation de leurs principaux constituants, en plus d’un dosage quantitatif des polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux.

L’étude des activités biologiques des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte qui inclut :

- L’étude de l’activité antioxydante des extraits et fractions de la bryone et la coloquinte, in vitro, en utilisant deux tests différents : le test de piégeage du radical libre DPPH ainsi que le test de pouvoir réducteur du fer.

- L’étude de l’activité antidiabétique qui est une étude pharmacotoxicologique comprenant :

 D’une part l’évaluation de la toxicité des extraits et fractions des deux cucurbitacées par la détermination des doses létales DL50 et DL100 in vivo chez le rat ainsi que l’effet hémolytique in vitro vis-à-vis des globules rouges humains de certains extraits possédant des activités antioxydante et antidiabétique importantes.

 D’autre part, l’évaluation de l’activité antidiabétique chez des rats normaux et rendus diabétiques par l’injection néonatale de la streptozotocine, traités par les extraits et fractions de chacune des plantes étudiées, administrés par voie intra- péritonéale. Leur effet antidiabétique a été suivi à court (3 heures) et à moyen (21 jours) terme par la mesure de certains paramètres, sanguins : glycémie, cholestérol total, triglycérides, urée, créatinine ; anthropométriques : poids corporel, poids d’organes (pancréas, foie, reins, rate) ; et comportementaux : consommation d’aliment et d’eau.

Première partie Synthèse bibliographique

I. Généralité sur le diabète sucré

1. Définition et diagnostic

Le diabète sucré "diabetes mellitus" est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique provoquée par une insuffisance héritée ou acquise de la sécrétion d’insuline par le pancréas ou par l’inefficacité de l’insuline produite sur les tissus cibles. Maladie non transmissible grave causant des complications notamment, la rétinopathie diabétique, l’insuffisance rénale, les cardiopathies, la néphropathie diabétique, l’ulcération des pieds et l’amputation [OMS. 2006 ; Wens et al. 2007].

Le diagnostic précoce du diabète sucré s’avère nécessaire afin d’établir un traitement adéquat. Les critères de diagnostic adoptés par les experts de l’OMS et de l’ADA considèrent une personne comme diabétique si elle présente l’un des critères suivants : Glycémie à jeun ≥ 7,0 mmol/L ; Taux d’HbA1c ≥ 6,5 % ; Glycémie 2 heures après l’ingestion de 75 g de glucose ≥ 11,1 mmol/L [OMS. 1997 ; ADA. 2005]. Le taux d’hémoglobine glyquée (HbA1c) peut être mesuré à tout moment de la journée, ce qui le rend plus commode que la glycémie à jeun ou la glycémie mesurée 2 heures après l’ingestion de 75 g de glucose. Comme le taux d’HbA1c indique la glycémie moyenne au cours des deux ou trois derniers mois, il permet également d’éviter le problème de la variabilité quotidienne de la glycémie [Goldenberg et Punthakee. 2013].

2. Epidémiologie

La progression rapide du diabète sucré au sein de la population mondiale pose un problème majeur de santé publique. Selon la Fédération Internationale du Diabète (FID), le nombre de personnes atteintes de diabète a augmenté dans tous les pays dont la grande partie de cette augmentation concerne les pays en voie de développement. Cette augmentation mondiale sera le fait de l’accroissement et du vieillissement de la population, ainsi que de l'obésité, de régimes alimentaires malsains et d’un mode de vie sédentaire, facteurs étroitement associés à l’urbanisation et l’industrialisation [FID. 2013].

D’après l’OMS, la prévalence du diabète à l’échelle mondiale en 2014 était estimée à 8,5 % chez les adultes âgés de 18 ans et plus soit un nombre de 422 millions de personnes diabétiques. Ce nombre de personnes diabétiques est supposé dépasser les 642 millions dans moins de 25 ans, soit une augmentation de 65% [OMS. 2016].

Première partie Synthèse bibliographique

L’Afrique à son tour reste confrontée au double fardeau de la maladie : les maladies non transmissibles s’ajoutent aux maladies infectieuses et à la malnutrition. Le diabète sucré, par son poids psychosociologique et ses risques, en est la plus commune et dramatique. La prévalence estimée est de 3,8 % en 2010, sera de 5 % en 2030 selon la FID, avec un nombre de cas qui devrait passer de 14 700 000 en 2010 à 28 000 000 en 2030 [Diop. 2013]. Les pays Maghrébins ne sont pas épargnés par cette pandémie, au Maroc la prévalence de diabète est estimée à 8% de la population dont 11,5% ont plus de 40 ans [Ramdani. 2010]. En Tunisie, l’incidence du diabète est beaucoup plus faible dans la population rurale (4,4% chez les hommes et 5,7% chez les femmes) que dans la population urbaine (9,4% chez les hommes et 11,7% chez les femmes) [Bouguerra et al. 2007].

En Algérie, le diabète reste cependant une réalité préoccupante puisqu’il s’agit de la deuxième maladie chronique après l’hypertension. Le nombre des diabétiques en Algérie est passé d’un million de personnes en 1993, à plus de 2,5 millions en 2007 [Institut National de Santé Publique. 2009]. Dans la région de l’Est Algérien (18 wilayas), une étude réalisée sur 86785 personnes âgées de 30 ans et plus a révélé une prévalence du diabète de 5,27% [Malek et al. 2013]. En plus, dans la région de l’Ouest Algérien, une enquête sur le diabète du sujet âgé réalisée en 2012 à Sidi Bel-Abbes et ayant concerné 393 sujets âgés de 65 ans et plus vivant à domicile, a permis d’estimer la prévalence du diabète à 26,7%, essentiellement des sujets atteints de diabète de type 2 [Chami et al. 2015]. De même, une enquête épidémiologique réalisée en 2007 dans la région de Tlemcen (Ouest Algérien) sur un échantillon de la population de 7656 personnes, a montré que la prévalence globale du diabète est de 14,2%, elle est de 15,3% en milieu urbain et 12,9% en milieu rural, ainsi les hommes (20,4%) étant plus touchés que les femmes (10,7%) [Zaoui et al. 2007].

3. Classification

L’étiologie du diabète sucré définit différents types, dont deux types sont majoritaires c’est le type 1 et le type 2. Il existe d’autres formes comme le diabète gestationnel qui est défini comme une intolérance au glucose conduisant à une hyperglycémie diagnostiquée pour la première fois au cours de la grossesse et qui peut disparaitre ou pas après l’accouchement. Autres types particuliers comprennent une grande variété de troubles relativement peu courants, surtout des formes de diabète définies génétiquement (diabète MODY : Maturity- Onset Diabetes of the Young) ou associées à d’autres maladies (pancréatite, mucoviscidose) ou à des médicaments (corticoïdes) [ADA. 2012].

Première partie Synthèse bibliographique

Le diabète de type 1, anciennement dénommé diabète insulinodépendant, maigre ou juvénile, touche environ 10% de l'ensemble des diabétiques en particulier les enfants et les jeunes adultes, il survient essentiellement avant 20 ans et est caractérisé par son début clinique brutal [Goddefroy et al. 2009]. Chez l’enfant, le diabète de type 1 se révèle généralement par un syndrome polyuro-polydipsique et un amaigrissement. En cas de méconnaissance de ces symptômes, la découverte se fera devant une acidocétose pouvant être responsable des douleurs abdominales, vomissements, polypnée et troubles de la conscience [Barat et Lévy-Marchal. 2013]. Il résulte principalement de la destruction progressive des cellules bêta du pancréas attribuable à un processus à médiation immunitaire qui est probablement déclenché par des facteurs environnementaux chez les personnes génétiquement prédisposées. Cela va entraîner une carence insulinique majeure, ce qui explique sa tendance à l’acidocétose, le glucose ne peut plus servir de combustible cellulaire et l’organisme mobilise une quantité accrue d’acides gras, d’où l’augmentation des taux sanguins des acides gras et de leurs métabolites : les corps cétoniques [Ekoé et al. 2013 ; ADA. 2012].

Le diabète de type 2, anciennement dénommé diabète non insulinodépendant, diabète gras ou de la maturité, est caractérisé par une insulinorésistance et/ou une insulinopénie (carence insulinique). Il survient essentiellement après 40 ans et représente environ 90% des diabètes rencontrés dans le monde. C’est une maladie multifactorielle, qui associe une dysfonction insulaire d'origine génétique qui comporte des anomalies de la pulsatilité, de la cinétique, des altérations qualitatives et quantitatives de l'insulinosécrétion, une perte de la masse des cellules β s'aggravant avec le temps et un déficit de l'insulinosensibilité touchant le foie, le muscle et le tissu adipeux [Virally et al. 2008].

Le diabète de type 2 est une maladie multifactorielle concourent à son développement des facteurs génétiques et environnementaux qui affectent l'insulinosécrétion et l’action de l’insuline. Une étude réalisée à Tlemcen (Ouest Algérien) reliant le diabète de type 2 aux différents facteurs de risques chez une population répartie au hasard dans cinq zones d’études (Tlemcen ville, Maghnia, Ghazaouet, Sebdou et Sidi Djillali), a montré que les facteurs suivants : hérédité, consanguinité, âge avancé, milieu urbain, surpoids et obésité sont significativement liés au diabète de type 2 chez les 2 sexes [Dali-Sahi et al. 2012].

Première partie Synthèse bibliographique

4. Complications

Avec l’évolution du diabète sucré, de nombreuses complications peuvent apparaître et pouvant faire entrer le sujet dans un état de pré-fragilité puis de fragilité. Ces complications sont de deux formes, métaboliques aiguës et chroniques dégénératives.

Les complications métaboliques aiguës se manifestent par l’acidocétose et le coma hyperosmolaire dans la plupart des cas. L’acidocétose liée à la carence absolue ou relative en insuline apparaît surtout chez le diabétique de type 1. Alors que, le coma hyperosmolaire qui est plus fréquent chez le diabétique de type 2 survient à l’occasion d’une hyperglycémie suffisante pour entraîner une déshydratation. C’est une complication relativement exceptionnelle [Sautou-Miranda et al. 2008].

Les complications chroniques dégénératives surviennent suite à une hyperglycémie à long terme provoquant ainsi des microangiopathies et macroangiopathies. Les microangiopathies sont des détériorations fonctionnelles qui touchent les petits vaisseaux au niveau des reins, des nerfs et de la rétine, d’où les risques de néphropathies, neuropathies et rétinopathies. Au plan ophtalmologique, la rétinopathie diabétique est considérée comme étant la 4ème cause de baisse de l’acuité visuelle chez le sujet âgé, l’œdème maculaire et la cataracte sont plus fréquents dans cette population. De la même manière, l’insuffisance rénale secondaire à la néphropathie diabétique augmente le risque d’accident iatrogène [Lemozy et Villars. 2014].

Par opposition à la microangiopathie, la macroangiopathie désigne l'atteinte des grosses artères et se manifeste par une athérosclérose généralisée et précoce. L’athérosclérose coronarienne et l’artérite des membres inférieurs sont plus fréquentes chez les diabétiques que chez les non diabétiques. En plus, le déséquilibre du diabète favorise les infections qui sont particulièrement redoutables au niveau du pied car les portes d’entrée des germes sont fréquentes et peuvent conduire au mal perforant plantaire, à une gangrène puis une amputation. Egalement, Les infections urinaires sont relativement fréquentes et souvent asymptomatiques. Ces infections sont responsables de décompensations diabétiques [Sautou-Miranda et al. 2008].

Les complications dégénératives du diabète sucré seraient responsables d’une lourde morbi-mortalité partout dans le monde, et leur expansion prend des allures de pandémie. En 2013, il est estimé que le diabète avait été la cause directe de 5,1 millions de décès (personnes âgées de 20 à 79 ans), soit 8,4% de la mortalité mondiale [FID. 2013].

Première partie Synthèse bibliographique

5. Traitement

Dans le but de retarder voire prévenir les complications aiguës et chroniques, une prise en charge médicale demeure indispensable pour les diabétiques. L’objectif prioritaire du traitement pharmaceutique du diabète sucré consiste à maintenir la glycémie autour de sa valeur normale. La thérapeutique vise à prévenir l’hyperglycémie symptomatique et les complications métaboliques, l’acidocétose voire le coma hyperosmolaire tout en minimisant les risques d’hypoglycémie. La thérapeutique du diabète de type 1 repose sur l’insulinothérapie, seul moyen de combler la carence insulinique. Dans le cas du diabète de type 2, des antidiabétiques oraux ayant des mécanismes d’action différents sont utilisés [Sautou-Miranda et al. 2008].

L’insulinothérapie est la pierre angulaire du traitement médical du diabète de type 1. Son objectif est d’atteindre un équilibre glycémique, pour cela des analogues d’insuline basale à action prolongée, des analogues d’insuline à action rapide en bolus et une perfusion sous- cutanée continue d’insuline (emploi d’une pompe à insuline) sont utilisés. Parallèlement, un régime alimentaire adopté et une activité physique régulière sont associés à la thérapeutique médicamenteuse [Wherrett et al. 2013 ; Sautou-Miranda et al. 2008].

Dans le cadre du diabète de type 2, la diététique est le premier geste thérapeutique avec l’instauration d’un régime souvent hypocalorique associé à une activité physique régulière qui tient compte des atteintes secondaires, cardiovasculaires en particulier. En cas d’inefficacité du régime seul, les antidiabétiques oraux seront utilisés dans un premier temps en monothérapie. Des associations médicamenteuses (bithérapie voire trithérapie) seront réalisées en cas d’échec de la monothérapie. Un recours à l’insulinothérapie sera envisagé en cas d’échec des antidiabétiques oraux [Villiot-Danger. 2011 ; Sautou-Miranda et al. 2008].

L’arsenal des antidiabétiques oraux comprend les sulfamides, les biguanides, les inhibiteurs des alphaglucosidases, les glinides, les analogues du glucagon-like peptide-1 (GLP-1), les inhibiteurs du cotransporteur de la dipeptidyl-peptidase-4 (DPP-4) et les inhibiteurs de sodium-glucose de type 2 (SGLT-2) permettent tous de traiter le diabète de type 2 [Pillon et al. 2014]. Les principaux points différentiant ces classes pharmacologiques sont résumés dans le tableau 01 dans lequel les mécanismes d’action, la voie d’administration, les avantages ainsi que les inconvénients sont mentionnés.

Première partie Synthèse bibliographique

Tableau 01 : Caractéristiques des agents antidiabétiques oraux et insuline [Pillon et al. 2014].

Classe Exemple de Mécanisme d’action Voie Avantages Inconvénients molécule Sulfamides Gliclazide Stimulation de la Orale Bonne tolérance Hypoglycémie Glipizide sécrétion d’insuline Faible coût Augmentation du poids Glibenclamide par les cellules β Nécessité de surveiller les glycémies Initiation du traitement de manière prudente (nécessité d’une titration)

Biguanides Metformine Diminution de Orale Bonne tolérance à Diarrhées l’insulinorésistance long terme Possible lien avec la survenu d’une (effet extra- Pas de prise de acidose lactique à éviter en cas pancréatique) poids d’insuffisance rénale Inhibiteurs des Acarbose Diminution de Orale Pas de prise de Flatulences alphaglucosidases Miglitol l’absorption du poids Diarrhées glucose à l’intestin Faible coût Diminution de la dégradation des carbohydrates absorbables Glinides Ripaglinide Stimulation de la Orale Action Prise de poids à long terme sécrétion d’insuline hypoglycémiante Hypoglycémie rapide Nécessité d’une surveillance des glycémies Analogues des Exénatide Augmentation de la Sous Pas de prise de Pancréatite glucagon-like Liraglutide sécrétion d’insuline cutanée poids A évité en cas d’insuffisance rénale peptide-1 (GLP-1) et suppression de la Faible risque sécrétion du d’hypoglycémie glucagon Inhibiteurs du Sitagliptine Augmentation des Orale Faible risque Pancréatite cotransporteur de la Vildagliptine concentrations d’hypoglycémie dipeptidyl- Saxagliptine endogènes peptidase-4 d’incrétines (DPP-4) Inhibiteurs de Dapagliflozine Réduction de la Orale Perte de poids Polyurie sodium-glucose de réabsorption du Insuffisance rénale fonctionnelle par type 2 (SGLT-2) glucose au niveau de déshydratation tubule contourné Hypotension artérielle proximal Infection urinaire Mycose vaginale A éviter en cas d’insuffisance rénale Insuline Active directement Sous Bon équilibre Prise de poids le récepteur à cutanée glycémique Hypoglycémie l’insuline comparativement Nécessité d’une surveillance des aux autres glycémies médicaments

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6. Diabète sucré et stress oxydant

Lorsque la cellule utilise de l’oxygène, il se passe au niveau de la mitochondrie, un grand nombre de réactions d’oxydation. Le résultat est la production d’énergie, mais aussi de différentes espèces réactives oxygénées (ERO), dont font partie les radicaux libres. L’organisme est équipé pour lutter contre ces ERO par un énorme système de défense constitué de molécules antioxydantes. Cependant, ce système de défense est parfois dépassé, surtout quand les ERO sont produites en quantités importantes, on parle alors de stress oxydant [Haleng et al. 2007].

Les espèces réactives oxygénées regroupent des formes radicalaires (radicaux libres) comme l’anion superoxyde (O2•-), radical hydroxyle (OH•), monoxyde d’azote (NO•), et non radicalaires dont la toxicité est moins importante tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le peroxynitrite (ONOO-) [Castro et Freeman. 2001]. Les radicaux libres sont des entités chimiques contenant un électron non apparié et ayant une durée de vie extrêmement courte, par ailleurs ils peuvent agir au niveau moléculaire comme des messagers secondaires capables d’induire le phénomène d’apoptose des cellules évoluant vers un état cancéreux, d’activer les gènes impliqués dans la réponse immunitaire et de moduler l’expression de gènes codants pour les enzymes antioxydantes [Curtin et al. 2002 ; Owuor et Kong. 2002 ; Holgrem. 2003].

Pour se protéger contre les effets délétères des ERO, l’organisme dispose d’un ensemble complexe de défenses antioxydantes renfermant des enzymes (superoxyde dismutase, catalase, glutathion peroxydase), des protéines transporteuses du fer et de cuivre (transferrine, ferritine, céruléoplasmine, albumine), des molécules antioxydantes de petite taille (acide urique, caroténoïdes, bilirubine) et des oligo-éléments indispensables pour l’activité des enzymes antioxydantes (cuivre, zinc, sélénium). Ces défenses sont renforcées par un apport exogène en antioxydants apporté par l’alimentation sous forme de fruits et légumes riches en vitamines A, C, E, ubiquinone, glutathion, acide lipoïque, caroténoïdes, polyphénols et flavonoïdes [Haleng et al. 2007].

De nombreuses pathologies, impliquant le stress oxydant dans leur développement comme facteur déclenchant ou associé à des complications. Outre les maladies cardio-vasculaires (oxydation des lipides) et le cancer (oxydation de l’ADN), c’est certainement dans le cadre du diabète (obésité, syndrome métabolique) que des avancées spectaculaires ont été réalisées au cours des dernières années. 10

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Les anomalies métaboliques du diabète causent la surproduction mitochondriale du radical superoxyde, dans plusieurs tissus comprenant le pancréas endocrinien, qui active consécutivement les voies impliquées dans la pathogénie des complications et l’accroissement ultérieur des ERO intracellulaires. Par conséquent, les ERO semblent être les agents causaux de la pathogénie du diabète par l’endommagement des cellules β [Giacco et Brownlee. 2010 ; Halliwell. 2012]. Plusieurs mécanismes pathogéniques conduisent à une augmentation du stress oxydant et semblent impliqués dans l’apparition des complications du diabète sucré :

 La voie des polyols : En situation d’hyperglycémie, l’hexokinase qui permet la phosphorylation du glucose et son utilisation dans les voies de la glycolyse et des pentoses phosphates est saturée. En conséquence, le glucose est transformé en sorbitol puis en fructose, respectivement sous l’action de l’aldose réductase et de la sorbitol déshydrogénase. Suite à ces réactions, le rapport NADH/NAD+ s’élève, entraînant une inhibition de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase et une accentuation de la formation des AGE. En outre, les taux cellulaires de NADPH, coenzyme nécessaire à l’activité de la glutathion réductase, diminuent avec pour conséquence une diminution des capacités antioxydantes [Haleng et al. 2007].  La production de produits terminaux de glycation (AGE) : Le glucose réagit facilement avec les groupements amines libres des protéines pour former des produits relativement instables qui se dégradent en produits avancés de la glycation (AGE). Ces AGE, retrouvés en concentrations élevées dans la rétine et les glomérules rénaux, jouent un rôle important dans le développement des complications du diabète [Selvaraj et al. 2006].  L’auto-oxydation du glucose : En présence de fer, le glucose s’oxyde, entraînant la génération d’ERO, mais aussi la production de la forme aldéhyde du glucose, le glyoxal. Cette molécule se fixe rapidement sur les protéines dans lesquelles apparaît un résidu carboxyméthyllysine captant facilement le cuivre, ce qui provoque le déclenchement de réactions de type Fenton avec production de radicaux libres : il s’ensuit une augmentation de la peroxydation lipidique. Ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi le diabète est souvent associé à des complications cardiovasculaires [Devaraj et al. 2001].  L’activation de la protéine kinase C (PKC) : L’hyperglycémie intracellulaire entraîne l’activation de la PKC, contribuant ainsi aux anomalies des flux sanguins locaux Haleng et al. 2007]. 11

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II. Plantes médicinales antidiabétiques

1. Phytothérapie et diabète sucré

La phytothérapie, telle que définie par l’OMS, fait partie de la médecine traditionnelle regroupant une somme de connaissances, compétences et pratiques qui reposent sur les théories, croyances et expériences propres à une culture et qui sont utilisées pour maintenir les êtres humains en santé. Dans certains pays, les appellations médecine parallèle, alternative et douce sont synonymes de la médecine traditionnelle [OMS. 2000].

La phytothérapie, basée sur l’utilisation de plantes médicinales, continue à occuper une place de choix malgré le développement des médicaments de synthèse et le progrès de la pharmacologie. D’après l’OMS, 65% de la population mondiale utilise encore les plantes médicinales pour leur soin primaire ou incorporées dans leur système de santé. Dans certains pays d’Asie et d’Afrique surpeuplés et pauvres, cette proportion est encore plus importante [Fabricant et Farnsworth. 2001].

Malgré l’intérêt particulier porté sur l’étude des plantes médicinales par nombreuses voies de recherche, le potentiel des plantes médicinales comme sources pour la production de nouveaux médicaments est largement inexploité eu égard au nombre d’espèces de plantes supérieures (angiospermes et gymnospermes) sur la planète qui est estimé à 250 000. En effet, sur ce nombre, seulement 15 % ont été évaluées sur le plan phytochimique et 6% ont été testées pour leur activité biologique y compris l’activité antidiabétique [Rout et al. 2009]. Selon la bibliographie, différentes enquêtes ethnobotaniques réalisées à travers le monde ont permis le recensement de plus de 800 plantes utilisées traditionnellement pour combattre le diabète sucré et ses complications, dont 410 espèces ont prouvé leur effet antidiabétique suite à l’expérimentation scientifique, tandis que le mécanisme d’action a été élucidé pour 109 plantes seulement [Prabhakar et Doble. 2008].

Les plantes médicinales sont sources de composés naturels qui présentent une grande diversité structurale et peuvent ainsi constituer un réservoir de molécules douées de vertus thérapeutiques comme l’exemple de la galégine isolée de Galega officinalis (Fabacées), plante médicinale utilisée en médecine traditionnelle européenne depuis le Moyen Age pour traiter le diabète sucré, elle a servi de modèle de synthèse de la metformine et d’autres médicaments antidiabétiques appartenant à la classe des biguanides [Oubre et al. 1997].

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D’autres plantes intensivement étudiées pour mettre en valeur leur effet antidiabétique ont été illustrées dans plusieurs rapports, elles sont représentées essentiellement par Allium sativum (Liliacées), Azadirchta indica (Meliacées), Coccinia indica (Cucurbitacées), Gymnema sylvestre (Ascelpidacées), Mamordica charantia (Cucurbitacées), Olea europaea (Oleacées), Punica granatum (Lythracées), Citrullus colocynthis (Cucurbitacées), Trigonella foenum graecum (Léguminosées) et Vaccinium arctostaphylos (Ericacées) [Arulselvan et al. 2014 ; Rios et al. 2015].

2. Modes d’actions des plantes antidiabétiques

L’activité antidiabétique des plantes médicinales peut dépendre de différents mécanismes d’action, elles peuvent exercer un effet direct sur le pancréas en stimulant la sécrétion voire l’inhibition du processus de dégradation d’insuline et la régénération, la réparation ainsi que la cytoprotection des cellules β pancréatiques par la prévention du stress oxydant (piégeage de radicaux libres) qui peut être à l’origine de leur dysfonctionnement. En plus, cet effet antidiabétique peut être extra-pancréatique en stimulant la captation du glucose et son métabolisme dans les cellules cibles à l’insuline, en inhibant la glycogénolyse hépatique et les enzymes intestinaux l’α-amylase et l’α-glucosidase ce qui va contribuer à rétablir l’homéostasie glucidique [Jarald et al. 2008 ; Rios et al. 2015].

L’effet thérapeutique des plantes antidiabétique est étroitement lié à leur composition en phytoconstituants représentés généralement par les métabolites secondaires, substances chimiques de structures très diversifiées produites par les plantes pour se défendre contre les pathogènes microbiens et d’attirer les organismes utiles, comme les polyphénols, flavonoïdes, coumarines, alcaloïdes, glycosides et saponines. Cependant il est essentiel de noter le rôle bénéfique des autres phytoconstituants comme les polysaccharides, peptidoglycanes, acides aminés et les minéraux [Prabhakar et Doble. 2008]. Ces principes actifs qui confèrent l’activité antidiabétique aux plantes peuvent exercer un effet insulino-sécrétagogue (insulinotrope) ou insulino-mimétique (insulino-like) en stimulent diverses cascades métaboliques seuls ou d’une manière synergique en intégrant les uns avec les autres.

Bhushan et al. 2010 ont résumé les mécanismes d’action de certains phytoconstituants, les alcaloïdes peuvent inhiber l'α-glucosidase et diminuer le transport du glucose à travers l'épithélium intestinal.

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Les flavonoïdes agissent comme agents antidiabétiques en diminuant le taux du glucose, en réduisant significativement le taux du cholestérol et des triglycérides plasmatiques, et en améliorant l’activité de la glucokinase hépatique, probablement en stimulant la sécrétion d'insuline à partir des îlots pancréatiques [Bhushan et al. 2010].

A leur tours, les saponines exercent leur effet hypoglycémiant par le bais de la restauration de la réponse d'insuline, l'amélioration de la signalisation d'insuline, l'augmentation du taux d'insuline plasmatique, l’induction de la libération d'insuline du pancréas, l’augmentation l'expression de GLUT-4, l’activation de la synthèse de glycogène ainsi que l’inhibition de la gluconéogenèse, de l'activité de α-glucosidase, et de l'expression de l'ARNm en glycogène phosphorylase et glucose 6-phosphatase [Elekofehinti. 2015].

De même, les polysaccharides augmentent le taux d'insuline sérique, réduisent le taux du glucose dans le sang, et améliorent la tolérance au glucose. Les fibres alimentaires adsorbent efficacement le glucose, retardent la diffusion du glucose, et inhibent l'activité de l'α-amylase, et peuvent également être responsables de la diminution du taux d'absorption du glucose et la concentration post-prandiale du glucose sérique [Bhushan et al. 2010].

Pareillement, différents mécanismes d’action ont été proposés pour plusieurs phytoconstituants isolés et purifiés de plantes médicinales. L’acide gymnémique et l’acide 4-Hydroxybenzoique isolés respectivement de Gymnema sylvestre (Asclepiadacées) et Pandanus odorus (Pandanacées), entrainent la sécrétion d’insuline en stimulant la régénération des cellules β et l’augmentation du contenu du glycogène dans le foie [Grover et al. 2002 ; Bnouham et al. 2006]. La fraction des flavonoïdes représentée majoritairement par l’épicatéchine isolée des écorces de Pterocarpus marsupium (Fabacées), présente un effet insulinotrope (insulino-sécrétagogue) in vitro en stimulant la conversion de la proinsuline en insuline, aussi elle s’est avérée bénéfique dans la protection des cellules β pancréatiques chez les sujets diabétiques [Saxena et Vikram. 2004 ; Modak et al. 2007].

Egalement, il a été démontré que la charantine, un alcaloïde isolé de Momordica charantia (Cucurbitacées) exerce un effet insulino-like, cela en stimulant la sécrétion pancréatique, menant ainsi à la diminution de la gluconéogenèse hépatique [Basch et al. 2003]. La berbérine stimule in vitro la sécrétion d’insuline dose-dépendante avec l’augmentation de la captation du glucose dans les adipocytes 3T3-L1 en culture suite à une phosphorylation des AMPK (Adenosine Mono-Phosphate-activated protein Kinase) [Lee et al. 2006].

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In vivo la christinine-A, une saponine glycoside isolée des feuilles de Zizyphus spina-christi (Rhamnacées) diminue significativement la glycémie ainsi que l’activité des phosphorylases et du glucose-6-phosphatase hépatique [Abdel-Zaher et al. 2005]. De même la momordicoside P, une cucurbitacine isolée de Momordica charantia (Cucurbitacées), stimule in vitro la translocation des GLUT-4 dans les cellules en cultures, les adipocytes 3T3-L1, cet effet est associé à une activation des AMPK impliqués dans la captation du glucose et l’oxydation des acides gras [Tan et al. 2008].

Certains polypeptides isolés des racines de Panax ginseng (Araliacées) induisent in vivo la diminution de la glycémie, l’augmentation du glycogène et la stimulation de la sécrétion d’insuline [Bnouham et al. 2006]. Le 4-Hydroxyleucine, un acide aminé représente jusqu’à 80% des acides aminés libres isolés des graines de Trigonella foenum-graecum (Leguminosées), possède des propriétés insulino-stimulantes [Saxena et Vikram. 2004].

3. Plantes antidiabétiques dans le Continent Africain

Au cours de ces dernières années, le diabète sucré est considéré parmi les maladies les plus intensivement traitées par la médecine traditionnelle en utilisant les plantes médicinales chez la population africaine, c'est évident par la propension des enquêtes ethnobotaniques vers les plantes médicinales utilisées pour la gestion du diabète sucré dans les différentes régions africaines qui incluent l'Ouest [Adebayo. 2009 ; Nʼguessa et al. 2009], l'Est [Moshi et Mbwambo. 2002 ; Keter et Mutiso. 2012 ], le Nord [Bnouham et al. 2002 ; Eddouks et al. 2002 ; Azzi et al. 2012 ], le Sud [Mahop et Mayet. 2007 ; Afolayan et Sunmonu. 2010], et le Centre [Din et al. 2011] Africain. Environ 185 plantes médicinales appartenant aux 75 familles botaniques ont été étudiées pour leur effet antidiabétique en Afrique, dont un pourcentage de 21,91% a été rapporté pour le Nord-Africain, il couvre essentiellement le Maroc, Egypte, Algérie, Tunisie, Soudan, et la Libye. Parmi les plantes antidiabétiques, Ajuga iva (Lamiacées), Allium cepa (Liliacées), Balanites aegyptiaca (Balanitacées), Carum carvi (Apiacées), Chamaemelum nobile (Asteracées), Morus alba (Moracées), Nigella sativa (Ranunculacées) et Ziziphus spina-christi (Rhamnacées) ont reçu beaucoup d'attention chez la population du Nord-Africain [Mohammed et al. 2014].

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4. Plantes antidiabétiques en Algérie

L’Algérie, avec ses milliers d’hectares de forêts et de pâturage, regorge de plantes aromatiques et médicinales qui sont encore méconnues et exploitées de façon artisanale. Les traitements à base de plantes étaient bien développés, mais le recours à la médecine conventionnelle est à l’origine d’un délaissement de ces pratiques ancestrales qui risquent de tomber dans l’oubli. En effet, l’utilisation des plantes médicinales et aromatiques pour l’industrie alimentaire, cosmétique et pharmaceutique reste un domaine vierge en Algérie [Rebbas et al. 2012 ; Reguieg. 2011].

Dans les régions Nord-Ouest et Sud-Ouest Algériens, une étude ethnopharmacologique menée sur l’utilisation des plantes antidiabétiques chez une population de 470 diabétiques, dont 266 présentant un diabète de type 2, localisée dans quatre grandes Wilayas : Tlemcen, Naâma, El Bayadh et Adrar, a révélé que 28,30% des diabétiques font face au diabète en utilisant les plantes antidiabétiques seules ou associées au traitement pharmaceutique [Azzi et al. 2012]. Dans ces régions, un recensement des plantes médicinales utilisées pour le traitement du diabète sucré a répertorié 60 plantes réparties en 32 familles botaniques notamment Trigonella foenum-graecum "Halba" (Fabacées), Rosmarinus officinalis "Yazir" (Lamiacées), Citrullus colocynthis "Handal" (Cucurbitacées), Tetraclinis articulata "Araâr" (Cupressacées), Artemesia herba alba "Chih" (Asteracées), Origanum compactum "Zâtar" (Lamiacées), Punica granatum "Rommane" (Lythracées), Nigella sativa "Sanouj" (Ranunculacées), Berberis vulgaris "Ghris" (Berberidacées), Nerium oleander "Defla" (Apocynacées) et Laurus nobilis "Rand" (Lauracées) [Azzi et al. 2012 ; Allali et al. 2008].

5. Les cucurbitacées

Les cucurbitacées regroupent plus de 825 espèces réparties dans près de 118 genres essentiellement distribuées dans les régions tropicales humides et chaudes [Schaefer et Renner. 2011]. Plusieurs cucurbitacées constituent un apport alimentaire riche et varié (courge, concombre, melon, pastèque), d'autres à graine oléagineuse fournissent de l'huile, certaines constituent des récipients et des poteries (calebasse) ou fournissent des éponges végétales (luffa : courge éponge) [Hammiche et al. 2013].

Première partie Synthèse bibliographique

Plusieurs propriétés médicinales ont été attribuées aux différentes cucurbitacées telles que l’activité antioxydante, antimicrobienne, anti-inflammatoire, cytotoxique et antidiabétique, cette dernière semble intensivement étudiée pour nombreuses espèces dont les plus réputées sont Momordica charantia, Cucurbita pepo, Cucumis sativus, Bryonia alba, Citrullus colocynthis, Momordica dioica, Luffa tuberosa et Tricosanthes dioica [Dhiman et al. 2012 ; Saboo et al. 2013].

Selon leur distribution géographique et leur disponibilité, la fréquence d’utilisation des cucurbitacées en médecine traditionnelle varie d’une région à une autre, en Algérie, Citrullus colocynthis et Bryonia dioica semblent être les fréquentes cucurbitacées utilisées pour le traitement traditionnel du diabète sucré [Azzi et al. 2012 ; Hammiche et al. 2013 ; Benarba. 2015].

6. Bryonia dioica (la bryone)

6.1. Taxonomie et description botanique

Règne : Végétale

Sous règne : Trachéophytes (plantes vasculaires)

Embranchement : Spermaphytes (plantes à graines)

Sous embranchement : Angiospermes (plantes à ovaires) a b c

Classe : Eudicots (plantes à fleurs)

Ordre : Cucurbitales

Famille : Cucurbitacées d e Genre : Bryonia Figure 01 : Différentes parties de Bryonia dioica Espèce : Bryonia dioica (a) racine, (b) tige et feuille, (c) fleure, (d) fruit et (e) graine [Gadoum et Didier. 2008]. [Quézel et Santa. 1962-1963 ; APG III. 2009].

Première partie Synthèse bibliographique

Bryonia dioica Jacq porte divers noms vernaculaires; Aneb el dib, Dalia beida, Fachira en arabe; Tayloula, Tara bouchechen, Tiferdoudi, Zenzou en berbère; Bryone, Couleuvrée, Navet du diable, Vigne blanche en français et Snake bryony, White wild vine en anglais [Hammiche et al. 2013 ; Boustié et al. 2002]. C’est une plante vivace, grimpante, à la croissance vigoureuse très commune dans les haies, les buissons et les broussailles en Europe, dans le Nord de l'Afrique et au Proche-Orient et même en Iran [González-Tejero et al. 2008 ; Hammiche et al. 2013 ; Benarba. 2015 ; Marc et al. 2008 ; Al-Qura’n et al. 2005 ; Bahmani et al. 2014]. La bryone est caractérisée par une racine charnue, volumineuse, parfois bifurquée, ressemblant à un très gros navet, d'odeur nauséeuse, de saveur âcre, amère et caustique. Les tiges, à port de liane, peuvent atteindre 5 mètres et s'enroulent sur divers supports grâce à de longues vrilles. Les feuilles, couvertes de poils rudes, sont lobées, en forme de cœur. La plante fleurit du mai à août et elle est dioïque avec deux sortes de pieds, les uns porteurs de fleurs stériles, les autres, avec des fleurs, petites, blanc-jaunâtre, groupées par deux ou trois, insérées au même niveau qu'une vrille et qu'une feuille. Le fruit est une petite baie globuleuse de la taille d'un pois, verte puis rouge vif à maturité (septembre à décembre) renfermant 3 à 6 graines brunes, aplaties, lisses, de 7 à 8 mm avec couleur jaune puis brunâtre [Garnier et al. 1961 ; Hammiche et al. 2013] (Figure 01).

6.2. Phytochimie

Selon les énoncées bibliographiques, le fruits mature de la bryone contient environ 8,72% de sucres totaux dont 2,95% glucose ; 3,24% fructose ; 2,19% sucrose ; 0,35% tréhalose et 1,90% de lipides totaux dont 17,21% d’acides gras saturés et 53,91% d’acides gras polyinsaturés essentiellement l’acide linoléique (50,49%), l’acide oléique (28,47%) et l’acide palmitique (11,60%) [Rafael et al. 2011]. Les jeunes pousses (les jeunes tiges avec les premières petites feuilles) renferment un profil très diversifié en acides organiques contenant l’acide ascorbique (20,27 mg/100g), oxalique (123,85 mg/100g), malique (2,87 mg/100 g), citrique (3,36 mg/100g) et fumarique (3,04 mg/100g), ainsi différents vitamines sont détectées, essentiellement le tocophérol (1,57 mg/100g) et les caroténoïdes (376,4 µg/g) [Sánchez-Mata et al. 2012 ; Morales et al. 2012 ; García‐Herrera et al. 2013]. De plus, les protéines (16,6 g/100 g de poids secs), les carbohydrates (59,5 g/100 g de poids secs), les cendres (8,79 g/100 g de poids sec), eau (82,9 g/100 g de poids frais), sont aussi présents dans cette partie de la plante [Martins et al. 2011].

Première partie Synthèse bibliographique

Le screening phytochimique réalisé sur de nombreux extraits des différentes parties de la bryone : racine, tige, feuille et fruit, a permis l’identification de certains métabolites secondaires dans cette espèce, ces derniers sont résumés dans le tableau 02.

Tableau 02 : Composition en métabolites secondaires de différentes parties de Bryonia dioica.

Partie de la plante Métabolites secondaires Références

-Saponine : bryonine Garnier et al. 1961 Racine -Hétérosides triterpéniques: bryodulcoside, bryoside, Sturm et Stuppner. 2000 cucurbitacine, bryonidine, bryonosides A à G, Ukiya et al. 2002 cabenoside D, le bryoamaride et l’acide bryonolique Barker et al. 2010

Tige et feuille -Alcaloïde : bryonicine Garnier et al. 1961

-Flavonoïdes : 5 flavones et 9 flavonoles : Barreira et al. 2013 Apigenine-C-hexoside-O-hexoside Barros et al. 2011 Apigenine-6-C-glucoside-8-C-glucoside Apigenine-6-C-glucoside-7-O-glucoside Apigenine-C-hexoside-O-hexoside Fruit Apigenine-6-C-glucoside Quercetine-O-hexoside Quercetine-O-rhamnosyl-pentoside Quercetine-O-rhamnosyl-rhamnoside Quercetine-3-O-neohesperidoside Kaempferole-O-pentosyl-rhamnoside Kaempferole-O-pentosyl-rhamnoside Kaempferole-O-rhamnosyl-hexoside-O-rhamnoside Kaempferole-3-O-neohesperidoside Kaempferole-3,4-di- O-rhamnoside

6.3. Activités biologiques

La bryone a été utilisée de longue date pour ses vertus réelles ou imaginaires, certains usages traditionnels de la bryone se maintiennent au Maghreb, la médecine traditionnelle Algérienne emploie l'infusion de racine, per os, dans le traitement du diabète et de nombreux cancers (colon, abdomen, sein, peau, glande) à tous les stades de la cancérogenèse, ainsi les affections rhumatismales sont traitées, en usage externe, soit par la décoction de plante entière, soit par l'application de cataplasmes à base de parties aériennes pilées. Au Maroc, les baies sont utilisées comme purgatif et vermifuge, le suc de la plante fraiche comme détergent des ulcères et pour traiter la gale et la lèpre [Hammiche et al. 2013].

Première partie Synthèse bibliographique

De plus, la bryone est un remède populaire utilisé comme purgatif drastique et dans le traitement de la goutte, la laryngite, trachéite, bronchite, pneumonie, pleurite, rhumatismes musculaires, polyarthrite aiguë ou chronique, ainsi elle est largement recommandée en médecine vétérinaire, en usage interne, comme vomitifs et comme anti-laiteux (pour arrêter l’allaitement en s’opposant à la montée laiteuse) [Saboo et al. 2013].

Les recherches bibliographiques menées sur les activités biologiques de Bryonia dioica, ont permis de démontrer que les propriétés thérapeutiques de cette dernière sont liées à sa richesse en composés chimiques possédant des propriétés pharmacologiques potentielles. Les travaux de Benarba et al. 2012, ont montré que l’extrait aqueux des racines de B. dioica induit la mort dose-dépendante de lignées cellulaire BL41 du Lymphome de Burkitt (CI50=15,63 µg/mL), via la voie de la médiation mitochondriale en déclenchant l'activation des caspase-9 et -3, le clivage de la PARP (Poly-ADP-ribose polymérase) et la dégradation de PUMA (P53 Up-regulated Modulator of Apoptosis). Selon les auteurs, les flavonoïdes, les stérols et triterpènes détectés pourraient être responsables de cette activité cytotoxique et apoptogénique de l'extrait aqueux de Bryonia dioica. De même, Six triterpènes glycosides isolés à partir de l’extrait méthanolique des racines de la bryone, bryonioside B, C, E, G, cabenoside D, bryoamaride, possèdent une activité anti-inflammatoire (DI50 de 0,2 à 0,6 mg par oreille) chez des souris ayant subis une inflammation auriculaire induite par le TPA (12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate) [Ukiya et al. 2002]. Selon Kadhim. 2014, l’extrait éthanolique des feuilles de B. dioica renferme une activité hépato-protectrice qui peut être due à la richesse de cette partie de la plante en alcaloïdes, flavonoïdes, stéroïdes, anthraquinones et terpénoïdes. Une autre étude montre que la bryodine (protéine toxique) inhibe sélectivement la croissance des lymphocytes T (KE37/1) infectés par le VIH-1 à la concentration de 2 à 20 μg/mL, de plus, une diminution de la production de VIH est constatée dans les cellules survivantes [Wachinger et al. 1993].

D’autres études in vitro ont bien révélé l’activité antioxydante des fruits, feuilles et tige de la bryone. L’extrait méthanolique des fruits matures de B. dioica préparé par macération a fait l’objet d’évaluation de l’activité antioxydante en utilisant quatre méthodes, le pouvoir piégeur du radical libre DPPH, le pouvoir réducteur du fer, le pouvoir piégeur du radical ABTS et la méthode de décoloration du bêta-carotène dont les CI50 sont respectivement 1,21 mg/mL ; 0,40 mg/mL ; 0,22 mg/mL ; 0,58 mg/mL [Rafael et al. 2011].

Première partie Synthèse bibliographique

Le même protocole est repris par Barreira et al. 2013 en utilisant l’éthanol au lieu du méthanol car la toxicité du méthanol le fait peu convenable pour être inclus dans les applications dermo-cosmétiques, l’extrait éthanolique a montré les CI50 suivantes : le pouvoir piégeur du radical libre DPPH (1,5 mg/mL), le pouvoir réducteur du fer (0,9 mg/mL), la méthode de décoloration du bêta-carotène (1,9 mg/mL). De plus, l’extrait méthanolique des jeunes pousses de la bryone a présenté des CI50 s’articulant comme suit : le pouvoir piégeur du radical libre DPPH (3,43 mg/mL), le pouvoir réducteur du fer (1,44 mg/mL), la méthode de décoloration du bêta-carotène (0,47 mg/mL), le pouvoir piégeur du radical ABTS (0,08 mg/mL) [Morales et al. 2012]. D’ailleurs, l’activité antioxydante des feuilles et tiges de la bryone semble être plus importante dans le stade de floraison de la plante [Gholivand et Piryaei. 2012].

6.4. Toxicité

La bryone présente à la fois des effets thérapeutiques et toxiques par sa racine, son suc et ses fruits. La morphologie de sa racine ainsi que ses fruits de couleur attirante en font la bryone comme une plante remarquable et distinguée depuis l’antiquité. D’ailleurs, l’origine de sa toxicité est fréquemment liée aux confusions des baies rouges avec les fruits du groseillier et des racines avec des navets ou avec des racines de panais [Boustié et al. 2002]. Paradoxalement, seuls les bourgeons floraux sont traditionnellement consommés en Espagne, et le sud de la France [Saboo et al. 2013]. De même, dans l’Ouest Algérien particulièrement à Oran, Mascara et à Tlemcen, la racine séchée de la bryone est populairement appelée "Berestom", et la population locale l’utilise pour le traitement du cancer [Chenni. 2010].

Il est à noter que les baies rouges présentent les parties de la plante qui sont considérées responsables des intoxications dues par la bryone. La consommation accidentelle ou à des fins thérapeutiques des baies donne lieu à des intoxications graves parfois mortelles selon la quantité ingérée, 10 à 15 baies chez l'enfant et 40 chez l'adulte pourraient être létales [Boustié et al. 2002]. Ces baies rouges ont une saveur acidulée puis brulante provoquant ainsi des symptômes digestifs : vomissements, diarrhées sanguinolentes et généraux : vertiges, pâleur, sueurs, convulsions, troubles respiratoires et cardiaques [Hammiche et al. 2013 ; Boustié et al. 2002]. Les cucurbitacines (B, D, E, I, J, K, L) constituent les principes toxiques qui sont présents dans toutes les parties de la plante: racines, feuilles et, en particulier, les baies. Dans le fruit, outre les cucurbitacines, une protéine toxique, la bryodiofine, a été identifiée [Hammiche et al. 2013 ; Munoz et al. 1992].

Première partie Synthèse bibliographique

7. Citrullus colocynthis (la coloquinte)

7.1. Taxonomie et description botanique

Règne : Végétale

Sous règne : Trachéophytes (plantes vasculaires)

Embranchement : Spermaphytes (plantes à graines) a b c Sous embranchement : Angiospermes (plantes à ovaires)

Classe : Eudicots (plantes à fleurs)

Ordre : Cucurbitales e Famille : Cucurbitacées d

Genre : Citrullus Figure 02 : Différentes parties de Citrullus colocynthis (a) racine, (b) tige et feuille, (c) fleure, (d) fruit et (e) graine Espèce : Citrullus colocynthis [Wikipédia. 2014].

[Quézel et Santa. 1962-1963 ; APG III. 2009].

Citrullus colocynthis (L.) Schrad est une plante spontanée du pourtour de la Méditerranée, des zones steppiques (arides) d’Afrique et d’Asie et très commune au Sahara. Citrullus colocynthis est connue sous plusieurs noms vernaculaires; Handel, Hadja, Amdal en arabe; Ifersil, Ikam, Tabarka, Tadjellat en berbère et Alkat en touarègue; Coloquinte, Chicotin en français et Colocynth, Bitter apple, Wild gourd en anglais. C’est une plante herbacée, annuelle qui fleurit entre Avril-Mai, entièrement couverte de poils courts, à racine charnue. Les tiges sont rampantes munies de vrilles de 0,5 à 1,5 m de longueur, portant des feuilles alternes de couleur verte, profondément découpées en 3 à 7 lobes velues. Les fleurs sont bisexuées, solitaires, auxiliaires à 5 lobes et de couleur jaune pâle. Le fruit appelé péponide ou gourde est une grosse baie lisse à écorce dure de la taille d'une orange (8 à 10 cm de diamètre), de couleur verte puis brune-jaunâtre à maturité. A l'intérieur, la pulpe spongieuse, dont la grande amertume justifie le superlatif arabe le plus usité «handel», renferme de nombreuses graines brunes, lisses, ovales et insipides de 4 à 6 mm de long (Figure 02) [Hammiche et al. 2013 ; Hammouda et al. 2005].

Première partie Synthèse bibliographique

7.2. Phytochimie

La composition de la coloquinte en nutriments est communément étudiée dans le but de l’intégrer dans l'industrie alimentaire, cette composition varie en fonction de la zone de croissance, le sol, la période de récolte, le processus de culture et, bien sûr, de la partie de plante. Les graines de la coloquinte contiennent environ 13,19% de protéines ; 18,59% de lipides ; 8% de carbohydrates ; 2% de cendres et 4,9% d’eau, ainsi le contenu en sels minéraux (mg/100g) inclue le calcium 569 ; le cuivre 5,1 ; le fer 11,6 ; le magnésium 210 ; le potassium 465 ; le sodium 11,9 et de zinc 1,1 [Sadou et al. 2007].

Autant qu’une plante médicinale, la composition phytochimique de C. colocynthis a été intensivement étudiée dans le but d’essayer d’établir des explications qui relient l’activité biologique à la composition chimique. Le screening phytochimique de différentes parties de la coloquinte (tiges, feuilles, fruits et graines) a permis de caractériser différentes familles de composés chimiques existant dans la plante. Le tableau 03 résume la composition en métabolite secondaire des différentes parties de la coloquinte.

Tableau 03 : Composition en métabolites secondaires de différentes parties de Citrullus colocynthis. Partie de la plante Métabolites secondaires Références

-Flavonoïdes glycosides : isovitexine, iso-orientine Delazar et al. 2006 3'-methyl ether iso-orientine Maatooq et al.1997

- Cucurbitacines glycosides : Seger et al. 2005 2-O-β-D-glucopyranosyl-cucurbitacine I Sturm et Stuppner. 2000 Fruit 2-O-β-D-glucopyranosyl-cucurbitacine E Nayab et al. 2006 2-O-β-D-glucopyranosyl-cucurbitacine L 2-O-β-D-glucopyranosyl-hexano cucurbitacine I

- Cucurbitacines glycosides triterpéniques : Yoshikawa et al. 2007 colocynthosides A et B

-Alcaloïdes : C10H15NO3, C20H32NO et C16H24NO7 Afifi et al. 1973

-Stérols: n-octacosanol (n-C28H58O) et Hatam et al. 1990 n-hexacosan-diol (n-C26H54O2)

Pulpe -Alcaloïdes: Choline Mukherjee et Patil. 2012

Tige et feuille -Flavonoïdes: Maatooq et al. 1997 6-C-p-hydroxylvitexine 8-C-p-hydroxybenzoyl- iso-vitexine, 8-C-p-hydroxybenzoyl- iso-vitexine 4’-O-glucoside

Première partie Synthèse bibliographique

7.3. Activités biologiques

La coloquinte est largement utilisée en médecine traditionnelle comme une panacée. De nombreuses enquêtes ethnobotaniques ont permis de répertorier et comparer les utilisations traditionnelles de la coloquinte, d’où Il en ressort des indications identiques concernant l'action antidiabétique, purgative, abortive, diurétique, herbicide et insecticide [Hammiche et al. 2013 ; Hammouda et al. 2005 ; Azzi et al. 2012]. Elle est également recommandée pour le traitement de l’asthme, la jaunisse, le rhumatisme, la goutte, les atteintes urogénitales, les désordres biliaires, l'ictère, et les algies de toutes sortes (arthralgies, myalgies, algies dentaires), et aussi contre les piqures de scorpions et la gale du dromadaire, de même son action contre les leucémies et les tumeurs abdominaux du foie et de la rate est signalée [Duke et al. 2002].

Le fruit et la graine de la coloquinte sont les parties de la plante qui sont particulièrement les plus étudiées dans le but de valider leur usage traditionnel. Plusieurs activités biologiques de Citrullus colocynthis ont été étudiées et justifiées suite aux nombreuses expérimentations scientifiques dont certains ont été démontré une activité antibactérienne des extraits aqueux et hydro-alcoolique des fruits et des graines de cette plante contre Escherichia coli (CMI = 0,2 mg/mL), Pseudomonas aeruginosa (CMI = 0,2 mg/mL), Mycobacterium tuberculosis (CMI = 31,2 mg/mL) et Staphylococcus aureus (CMI = 5 mg/mL), et une activité antifongique contre Aspergillus fumigatus et Aspergillus niger, et quatre souches de Candida : C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii et C. kreusei [Marzouk et al. 2010 ; Najafi et al. 2010 ; Mehta et al. 2013 ; Eidi et al. 2015]. De plus, les travaux de Mukherjee et Patil. 2012, ont montré un effet cytotoxique in vitro de l’extrait enrichi des alcaloïdes du fruit de la coloquinte contre les cellules cancéreuses humaines MCF-7 (IC50=17,20 μg/mL) et HepG-2 (IC50=12,54 μg/mL). Tandis que Torkey et al. 2009, ont révélé un effet insecticide contre Aphis craccivora des extraits héxanique, chloroformique et éthanolique avec CL50 de l’ordre de 23,065 ppm ; 17,328 ppm et 11,003 ppm respectivement.

D'autres travaux révèlent une activité antioxydante prometteuse, Kumar et al. 2008 ont révélé que l’extrait méthanolique du fruit assure une réduction de 88% de DPPH à une concentration de 2,5 g/mL, en plus, l’activité antioxydante de trois flavonoïdes, isosaponarine, isovitexine et l'éther isoorientine 3-O-methyl isolés du fruit de C. colocynthis, a été déterminée in vitro par le DPPH, les valeurs des CI50 trouvées ont été de l’ordre de 0,56 à 71,3 µg/mL en comparent au contrôle positif, la quercétine avec 0,02 µg/mL.

Première partie Synthèse bibliographique

Marzouk et al. 2010, ont rapporté que l'activité de piégeage du radical libre DPPH de l'extrait aqueux des graines était très puissante avec CI50 de 0,021 mg/mL. De même, les glucosides cucurbitacines extraites de C. colocynthis exposent des propriétés antiradicalaires contre le radicale ABTS (CI50=145 µM), cela est probablement lié à un effet piégeur direct des radicaux libres [Tannin-Spitz et al. 2007]. Ces résultats peuvent soutenir l'utilisation de C. colocynthis comme une source de substances antioxydantes naturelles [Hussain et al. 2014].

Par ailleurs, 1'usage traditionnel de la coloquinte comme remède antidiabétique a conduit plusieurs équipes à rechercher cette activité, ils ont pu démontrer que divers extraits de fruit et de graines présentent des effets bénéfiques sur l’amélioration des perturbations glycémiques. Abdel-Hassan et al. 2000 ont révélé que l'extrait aqueux des écorces de C. colocynthis présente un effet hypoglycémiant et antihyperglycémiant chez les lapins normaux et rendus diabétiques par l’alloxane respectivement, ils ont attribué cet effet aux saponines et aux glycosides présents dans cette plante. Al Ghaithi et al. 2004 ont démontré que l’administration orale de l’extrait aqueux de graines améliore certains paramètres biochimiques (LDH, TGO, TGP) perturbés par l’injection de la STZ chez les rats Wistar. Benariba et al. 2009 ont documenté que l'administration intra-péritonéale de l’extrait aqueux de graines de C. colocynthis à long terme (21 jours) renferme des effets bénéfiques sur l’homéostasie de la glycémie et le maintien du poids corporel des rats rendus diabétiques par la streptozotocine. L’étude clinique de Huseini et al. 2009 a montré que l'administration orale de 300 mg/kg/jour de poudre de fruit de C. colocynthis sous forme de capsules, produit une diminution significative de l’hyperglycémie, de l’hémoglobine glyquée et du taux de triglycérides sans noter aucune affection gastro-intestinale chez les patients diabétiques de type 2. Benmehdi et al. 2011 ont révélé que l’extrait brut de saponosides des graines injecté par voie intra-péritonéale (20 mg/kg) chez des rats rendus diabétiques par la STZ, diminue significativement l’hyperglycémie au bout de 48 heures, cette diminution est maintenue durant les quatre semaines de suivi. Khoshvaghti et Hamidi. 2012 ont montré que l'administration orale quotidienne d'une capsule de 100 mg/kg de la poudre de C. colocynthis pendant 8 jours diminue la concentration du glucose sérique vers la valeur normale chez les chiens rendus diabétiques par l'alloxane. Lahfa et al. 2015 ont rapporté que les extraits aqueux, de saponosides, d’alcaloïdes totaux et de glycosides cucurbitacines de graines de C. colocynthis possèdent un effet antihyperglycémiant chez les rats rendus diabétiques par la STZ et maintiennent la stabilité de la glycémie à des valeurs normales chez les rats normaux.

Première partie Synthèse bibliographique

7.4. Toxicité

La notion de traitement du diabète sucré par une plante amère est bien ancrée dans les traditions populaires et plus particulièrement la population maghrébine, cela conduit la coloquinte à être utilisée fréquemment comme remède antidiabétique, expliquant ainsi la fréquence des intoxications graves, parfois fatales [Hammiche et al. 2013].

La toxicité de C. colocynthis est probablement due aux cucurbitacines (B, D, E, I, J, K, L) et leurs glycosides présents dans toutes les parties de la plante, particulièrement dans le fruit et les graines [Seger et al. 2005].

Les symptômes d'intoxication peuvent se résumer à des vomissements, douleurs abdominales, diarrhées sanglantes, état confusionnel, congestion et érosion des muqueuses [Goldfain et al. 1989]. En effet certains tradipraticiens recommandent de s'en tenir avec prudence à l'usage externe, ceci est aussi signalé en Algérie [Hammiche et al. 2013].

La prise orale d’un décocté de fruit de la coloquinte provoque une diarrhée, une hypotension, une hypoglycémie et une augmentation du taux des transaminases sériques [Rezvani et al. 2011]. De même, Shafaei et al. 2012 ont montré que l’administration orale de l’extrait hydrométhanolique de la pulpe de la coloquinte (100 et 200 mg/kg) pendant 4 semaines chez des lapins provoque une forte toxicité au niveau de l’intestin, foie et reins par rapport aux graines dans les mêmes conditions expérimentales. En plus, une infertilité irréversible est observée chez les deux sexes mâle (rat) et femelle (sourie) suite à une administration orale de l’extrait du fruit (éthanolique, hydroéthanolique), cela se traduit par un arrêt de la spermatogénèse et une défaillance au cours du stade de l'implantation des embryons [Chaturvedi et al. 2003 ; Dehghani et al. 2003].

Première partie Synthèse bibliographique

III. Diabète expérimental

Les modèles d'animaux expérimentaux présentent l'une des meilleures stratégies pour la compréhension de la pathophysiologie de n'importe quelle maladie. De nombreux modèles d’animaux ont été développés pour étudier le diabète sucré et examiner les agents antidiabétiques, ces modèles peuvent être induits par des manipulations chimiques (streptozotocine, alloxane), chirurgicales (pancréatectomie) ou génétiques (modèles transgéniques) et même par un régime alimentaire hypercalorique (rat Psammomys obesus) [Chatzigeorgiou et al. 2009 ; Etuk. 2010].

L'utilisation des substances chimiques telle que la streptozotocine et l’alloxane pour l’induction expérimentale du diabète sucré a été comme la procédure la plus courante. Ainsi, ce modèle de diabète semble être facile, plus fiable, plus reproductible et capable de causer un diabète de types 1 et 2 chez les animaux d'expérience. Cependant, les méthodes chirurgicales et génétiques d'induction de diabète ont été alliées avec le niveau élevé de la morbidité et la mortalité des animaux d'expérience [Ali et al. 2011].

L'expression et la sévérité des anomalies métaboliques, hormonales et pathologiques du diabète expérimental induit chez différents animaux s’expriment selon l’espèce, la race, le contexte génétique, la nutrition, l'âge et le sexe de l’animal. Généralement, les modèles animaux du diabète montrent des caractéristiques semblables telles que l'hyperglycémie chronique, l’hyper ou l’hypo ou la normo-insulinémie. En plus, les symptômes cliniques du diabète comme la polyurie, polydipsie, polyphagie et la léthargie peuvent également apparaître dans plusieurs modèles de diabète expérimental [Srinivasan et Ramarao. 2007].

Selon Fröde et Medeiros. 2008, la majorité des études publiées dans le domaine de l'ethnopharmacologie entre 1996 et 2006 emploient des modèles animaux pour étudier l’activité antidiabétique des produits issus de plantes (extrait, molécule purifiée). Les modèles expérimentaux du diabète induits par la streptozotocine (69%) et l'alloxane (31%) sont les plus fréquemment utilisés dans le but d’étudier les différents aspects de la maladie. Ces deux substances chimiques exercent leur l'action diabétogène lorsqu’ils sont administrées par voie parentérale qui peut être intraveineuse, intra-péritonéale ou sous- cutanée. L’âge de l’animal, la dose et la voie d’administration de la substance diabétogène sont tous des paramètres influant la manifestation du diabète expérimental, un état semblable au diabète de type 1, au diabète de type 2 ou une intolérance au glucose peut être observé [Mythili et al. 2004]. 27

Première partie Synthèse bibliographique

Le modèle néonatal induit par la streptozotocine (n-STZ) est un modèle animal reproductible et bien établi en laboratoire puisque le développement de l'hyperglycémie, la tolérance anormale au glucose ainsi que l’hypoinsulinémie restent presque asymptomatiques au début puis s’agravent à l'âge adulte, cela est accompagné par l’apparition des différents symptômes décrits chez les patients diabétiques : polyphagie, polydipsie et polyurie. De ce fait, ce modèle permit de reproduire de près les conditions du diabète de type 2 humain que les autres modèles expérimentaux [Portha et al. 1989 ; Arulmozhi et al. 2004 ; Takada et al. 2007].

Plusieurs études précédentes ont rapporté qu’une seule administration intra-péritonéale de la streptozotocine à une dose allant de 90 à 100 mg/kg pc chez les nouveau-nés de rats Wistar durant les premiers cinq jours de vie, développe à l’âge adulte des modèles expérimentaux appropriés au diabète de type 2 [Wang et al. 2011 ; Patil et al. 2014 ; Ashokkumar et Pari. 2005 ; Andrade-Cetto et Wiedenfeld. 2011 ; Takada et al. 2007]. Cette administration néonatale de streptozotocine cause la diminution de la masse des cellules ß et développe l'hyperglycémie, polyphagie, polydipsie, polyurie, la résistance d'insuline et l’intolérance de glucose chez le rat adulte, ces caractéristiques sont fréquemment observées chez les malades diagnostiqués par un diabète sucré de type 2 [Oguanobi et al. 2012 ; Kulkarni et al. 2012].

Le modèle n-STZ, avec la modification de la dose et le jour d'injection de la STZ, expose plusieurs phases de diabète de type 2 comme l’intolérance au glucose ainsi qu’une hyperglycémie douce, modérée ou sévère [Kaya-Dagistanli et Ozturk. 2013]. Quand la streptozotocine est administrée aux nouveau-nés de rats, une hyperglycémie aiguë est exprimée dans les premiers jours ensuite le niveau de glucose sanguin diminue progressivement secondaire à une régénération spontanée et rapide des cellules ß, cela est approximativement une semaine après l'administration de la STZ, la masse des cellules ß soit environ la moitié de l’originale [Wang et al. 2011 ; Kataoka et al. 2013]. De la 6ème à la 15ème semaine après l'administration de la STZ, les rats survivants exposent une masse diminuée de cellules ß ce qui développe un diabète expérimental de type 2 avec des caractéristiques décrites dans le diabète de type 2 des patients (l'hyperglycémie, polyphagie, polydipsie, polyurie, la résistance d'insuline et l’intolérance au glucose). Donc, ce modèle fournit une plate-forme idéale pour le screening des substances antidiabétiques [Wang et al. 2011 ; Kulkarni et al. 2012].

Deuxième partie Matériel et méthodes

I. Etude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte

Les plantes qui ont fait l’objet de ce travail sont : Bryonia dioica Jacq et Citrullus colocynthis (L.) Schrad appartenant à la famille des cucurbitacées.

Dans le but de contribuer à une meilleure connaissance de la composition phytochimique de deux cucurbitacées Bryonia dioica (racines) et Citrullus colocynthis (fruits), nous avons réalisé une étude phytochimique qui a débuté par la préparation de différents extraits et fractions de ces deux plantes. Ils ont fait l’objet d’un screening phytochimique qualitatif en vue de mettre en évidence les principales familles chimiques de métabolites secondaires : tanins, flavonoïdes, coumarines, saponines, alcaloïdes, quinones libres et anthraquinones. Les polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux ont été dosés quantitativement.

1. Matériel végétal

Les racines de B. dioica sont récoltées à maturité durant le mois de mai (2012) dans la région de Tighennif, Wilaya de Mascara, Nord-Ouest Algérien. Tandis que les fruits de C. colocynthis sont récoltés à maturité durant le mois de juin (2012) dans la région d’Ain Sefra, Wilaya de Naâma, Sud-Ouest Algérien. L’identification botanique des plantes a été effectuée au sein du laboratoire de l'écologie et de la gestion des écosystèmes naturels à l'Université de Tlemcen, en se basant sur les références Quézel et Santa. 1962-1963 et APG III. 2009.

Au laboratoire, les racines de B. dioica ainsi que les fruits de C. colocynthis sont triés et nettoyés puis mis à sécher à l’abri de la lumière et l’humidité. Ensuite, les racines séchées sont broyées en une poudre fine à l’aide d’un moulin à café alors que les fruits sont concassés soigneusement à l’aide d’un mortier dans le but de garder les graines à l’état entière (Figure 03). Les racines broyées et les fruits concassés sont conservés à l’abri de la lumière et à une température ambiante jusqu’à leur utilisation ultérieure pour la préparation des extraits.

A B

Figure 03 : Matériel végétal : racines broyées de Bryonia dioica (A) et fruits concassés de

Citrullus colocynthis (B) «photos prise par moi-même».

Deuxième partie Matériel et méthodes

2. Préparation des extraits

Les racines de B. dioica ainsi que les fruits C. colocynthis ont été utilisés pour la préparation de différents extraits et fractions en utilisant des solvants (eau, solvants organiques ou mixtes) et en suivant différentes méthodes d’extractions (décoction, macération). Les extraits préparés sont : l’extrait aqueux, l’extrait butanolique, la fraction enrichie de polyphénols ainsi que la fraction enrichie de saponines (Figure 04). La préparation de certains extraits et fractions nécessite un dégraissage du matériel végétal, dans le but d’éliminer les lipides et les pigments.

2.1. Dégraissage du matériel végétal

Les racines broyées ainsi que les fruits concassés sont dégraissés par l'hexane pendant trois heures en utilisant un montage de dégraissage: un Soxhlet qui contient une cartouche remplie de 50 g de matériel végétal, est monté sur un ballon rempli par 150 mL d’hexane et est surmonté d’un réfrigérant. Après dégraissage, les échantillons sont séchés à l’étuve (37°C) pendant 24 heures, puis stockés à l’abri de la lumière et à température ambiante.

2.2. Extrait aqueux

Des extraits aqueux des racines broyées de B. dioica et des fruits concassés de C. colocynthis ont été préparés selon deux modes d’extraction : décoction et macération.

 Par décoction, nous procédons comme suit: 100 mL d’eau distillée bouillante sont ajoutées à 10 g de matériel végétal, racines broyées ou fruits concassés. Ces mélanges sont laissés infuser pendant 1 heure à 50°C dans une étuve. L’extraction est ensuite poursuivie sous reflux pendant 15 min à chaud. Les décoctés obtenus sont filtrés, centrifugés (3000 tours/min, 10 min) et évaporés à sec dans l’étuve (40°C). Les

extraits aqueux des racines de B. dioica (BDRaqDe) et des fruits de C. colocynthis

(CCFaqDe) obtenus à l’état secs sont conservés hermétiquement, à l’abri de la lumière et à 4°C jusqu’à leur utilisation.  Par macération, nous procédons comme suit: 100 mL d’eau distillée sont ajoutées à 10 g de matériel végétal (racines broyées ou fruits concassés). Ces mélanges sont laissés macérer pendant 24 heures à température ambiante et sous agitation. Ensuite les préparations obtenues sont filtrées, centrifugées (3000 tours/min, 10 min) et évaporées à sec dans l’étuve (40°C). Les extraits aqueux des racines de B. dioica

(BDRaqMa) et des fruits de C. colocynthis (CCFaqMa) obtenus à l’état secs sont conservés hermétiquement, à l’abri de la lumière et à 4°C jusqu’à leur utilisation.

Deuxième partie Matériel et méthodes

2.3. Extrait butanolique

Les extraits butanoliques BDRn-but et CCFn-but sont obtenus à partir des racines broyées et dégraissées de B. dioica et des fruits concassés et dégraissés de C. colocynthis respectivement suivant le protocole décrit par Makkar et al. 2007. Une extraction par macération sous agitation pendant 48 heures de 10 g matériel végétal dégraissé dans 100 mL d’eau/méthanol (v/v) est effectuée. Ensuite, les préparations sont filtrées et centrifugées (3000 tours/min, 10 min) et le surnagent est collecté. Après, chaque solution est concentrée sous vide à 40°C afin d’éliminer le méthanol. La phase aqueuse restante est ensuite soumise à une extraction liquide/liquide dans une ampoule à décanté d’abord par un volume égal de chloroforme (2 fois) afin d’éliminer les pigments encore présents dans l’extrait. Cela est suivi par une seconde extraction liquide/liquide par un volume égal de n-butanol (2 fois). Enfin, la phase n-butanol est évaporée à sec à l’aide d’un rotavapor à 45°C. Les extraits butanoliques secs des racines de B. dioica (BDRn-but) et des fruits de C. colocynthis (CCFn-but), ainsi obtenus, sont conservés hermétiquement, à l’abri de la lumière et à 4°C jusqu’à utilisation ultérieure.

2.4. Fraction enrichie de polyphénols et fraction enrichie de saponines

Les fractions enrichies de polyphénols et de saponines de B. dioica et de C. colocynthis sont préparées selon la méthode décrite par Ribeiro et al. 2013. Le matériel végétal dégraissé de chacune des plantes (10 g) est extrait par macération (48 heures) dans 100 mL d’eau/méthanol (v/v). Après élimination du résidu solide et du méthanol, la solution aqueuse est lavée avec du chloroforme, puis partagé par le n-butanol. Dans cette étape, la phase butanolique obtenue contient des composés phénoliques, des saponines, et probablement d’autres composés.

 Afin de préparer une phase enrichie de polyphénols, la phase butanolique est lavée avec une solution de soude à 1%, ensuite la phase NaOH obtenue est neutralisée par quelques gouttes d’HCl concentré (37%) puis évaporée à sec dans une étuve (40°C).  Afin de préparer une phase enrichie de saponines, la phase butanolique traitée par NaOH 1% est neutralisée par l’eau, puis le n-butanol est éliminé par évaporation à l’aide d’un rotavapor à 45°C.

Les fractions enrichies de polyphénols et de saponines respectivement des racines de

B. dioica (BDRPolyphénols , BDRSaponines) et des fruits de C. colocynthis (CCFPolyphénols ,

CCFSaponines) sont conservées hermétiquement, à l’abri de la lumière et à 4°C jusqu’à utilisation ultérieure.

Deuxième partie Matériel et méthodes

Matériel végétal : racines de la bryone / fruits de la coloquinte

Racines broyées et dégraissées / Fruits Racines broyées / Fruits concassés concassés et dégraissés

Macération par épuisement (48 h) Infusion (1h) puis Macération (24h) dans dans eau/méthanol (v/v) décoction (15min) dans l’eau distillée l’eau distillée

Filtration et centrifugation

Filtration et Filtration et centrifugation centrifugation Evaporation du méthanol Evaporation à sec du Evaporation à sec du surnageant surnageant Extraction liquide/liquide de la phase aqueuse

Extrait aqueux préparé par Extrait aqueux préparé par

décoction: BDRaqDe , CCFaqDe macération: BDRaqMa , CCFaqMa Chloroforme (v/v)

n-butanol (v/v)

Evaporation à sec

Extrait butanolique :

BDRn-but , CCFn-but

Evaporation à sec Lavage par une solution de Fraction enrichie de polyphénols : NaOH 1%, la phase NaOH BDRPolyphénols , CCFPolyphénols est neutralisée par HCl 37%

Evaporation à sec Neutralisation de la Fraction enrichie de saponines : phase n-butanol par BDRSaponines , CCFSaponines

l’eau distillée

Figure 04 : Schéma explicatif de la préparation des extraits et fractions à partir des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Deuxième partie Matériel et méthodes

3. Calcul du rendement d’extraction

Le rendement d’extraction est défini comme étant le rapport entre la masse du résidu sec (poudre ou pate) obtenu après l’évaporation du solvant d’extraction et la masse de la matière végétale sèche initiale ayant servi pour l’extraction. Exprimé en pourcentage, il est calculé à partir de la formule suivante :

Rendement (%) = (M0/M1) × 100

M0 : Masse en gramme du résidu sec obtenu après évaporation du solvant d’extraction.

M1 : Masse en gramme de la matière végétale sèche initiale.

4. Screening phytochimique

Les extraits et fractions préparés : BDRaqDe et CCFaqDe, BDRaqMa et CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols ainsi que BDRSaponines et CCFSaponines ont fait l’objet d’un screening phytochimique qui est un groupe de tests qualitatifs pouvant détecter la présence ou l’absence de certaines familles chimiques en se basant sur des méthodes standards décrites par Bruneton. 1999, Karumi et al. 2004 et Oloyede. 2005. Pour ce faire, des solutions sont préparées à partir du résidu sec de chaque extrait et fraction puis soumis aux différents tests phytochimiques suivants :

 Les tanins

La détection des tanins est réalisée par l’ajout de 2 à 3 gouttes de la solution de FeCl3 (1%) à 2 mL de chaque extrait ou fraction en solution. Après agitation et au bout de quelques minutes, la réaction avec le chlorure ferrique développe une coloration verdâtre qui indique la présence des tanins catéchiques ou bleu-noirâtre qui révèle l’existence des tanins galliques.

 Les flavonoïdes

5 mL de chaque extrait ou fraction en solution sont ajoutés à quelques gouttes d´acide chlorhydrique (HCl) concentré et quelques milligrammes de tournures de magnésium. La présence des flavonoïdes est confirmée par l’apparition d’une couleur rouge, rose ou orange.

 Les quinones libres

À 1 mL de chaque extrait ou fraction, quelques gouttes de NaOH à 1% sont ajoutées. L’apparition d’une coloration jaune, rouge ou violet indique la présence des quinones libres.

Deuxième partie Matériel et méthodes

 Les coumarines

Une quantité de quelques milligrammes d’extrait ou fraction à l’état sec est solubilisée dans 2 mL d’eau chaude. La solution obtenue est partagée en deux parties égales dont la première représente un témoin, la deuxième est traitée avec 0,5 mL de NH4OH à 10%. L’examen est réalisé sous la lumière ultraviolette UV à 366 nm et l’apparition d’une fluorescence intense révèle la présence de coumarines.

 Les saponines

Test de mousse : Dans un tube à essai, 10 mL d’extrait ou fraction sont agités pendant 15 secondes. Laisser reposer pendant 15 min et mesurer la hauteur de la mousse produite dans le tube. Une hauteur de mousse persistante, supérieur à 1 cm indique la présence des saponines.

La réaction de Liebermann-Burchard : À 5 mL de chacun des extraits et fractions, 5 mL d’anhydride acétique et quelques gouttes d’H2SO4 concentrée sont ajoutés. L’apparition d’une couleur verte ou rouge révèle la présence de saponines triterpéniques ou stéroïdiques respectivement.

 Les alcaloïdes

La recherche des alcaloïdes est effectuée par la procédure suivante: 5 mL d’HCl 1% sont ajoutés à 1 mL de chaque extrait ou fraction, le tout est chauffé au bain marie pendant 10 min, puis la solution obtenue est divisée en deux volumes égaux. Un volume est traité par le réactif de Mayer, l’autre par le réactif de Wagner. L’apparition d’un précipité blanc ou brun révèle la présence des alcaloïdes.

 Les anthraquinones libres

À 10 mL de chacun des extraits et fractions, 5 mL de NH4OH à 10% sont ajoutés puis le tout est agité. L’apparition de couleur violette indique un test positif.

 Les sucres réducteurs

À 2 mL de chaque extrait ou fraction, 2 mL de la liqueur de Fehling sont ajoutés (1 mL réactif A et 1 mL réactif B), l’ensemble est incubé pendant 8 min dans un bain marie bouillant. L’apparition d’un précipité rouge brique indique la présence des sucres réducteurs.

Deuxième partie Matériel et méthodes

5. Dosage de polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux

Pour la réalisation de ces dosages, des solutions sont préparées à partir d’extraits et fractions secs (BDRaqDe et CCFaqDe, BDRaqMa et CCFaqMa, BDRn-but et CCFn-but, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols ainsi que BDRSaponines et CCFSaponines) dissouts dans le méthanol à une concentration de 1 mg/mL.

5.1. Dosage de polyphénols totaux

Le principe de dosage des polyphénols totaux repose sur la capacité réductrice des complexes ioniques polymériques formés à partir des acides phosphomolybdiques et phosphotungstique (constituants du réactif de Folin-Ciocalteu) par les composés phénoliques. En présence de carbonate de sodium (Na2CO3), il en résulte la formation d’un complexe bleu qui accompagne l’oxydation des composés phénoliques. La coloration bleue produite est proportionnelle à la quantité de composés phénoliques présents dans l’extrait testé [Bonnaillie et al. 2012].

Pour ce faire, nous avons suivi le protocole décrit par Vermerris et Nicholson. 2006 en utilisant l'acide gallique (AG) (Sigma Aldrich) comme étalon. Un aliquote de 100 µL de chaque extrait/fraction est mélangé avec 2 mL d’une solution de carbonate de sodium

(Na2CO3) à 2% fraîchement préparée. Après 5 minutes, 100 µL de réactif de Folin-Ciocalteu (0,2 N) sont ajoutés au mélange, le tout est agité puis incubé pendant 30 minutes à l'obscurité et à température ambiante. La lecture est effectuée contre un blanc (méthanol) au spectrophotomètre UV-VIS à une longueur d’onde (λ) de 700 nm. Une courbe d'étalonnage est réalisée, en parallèle, dans les mêmes conditions opératoires à l'aide de l'acide gallique utilisé comme étalon dissout dans le méthanol à des concentrations croissantes variant de 50 à 1000 µg/mL. Les résultats sont exprimés en µg équivalent d'acide gallique par mg d'extrait sec (µg eq AG/mg ES).

5.2. Dosage de flavonoïdes totaux

La quantification du contenu en flavonoïdes dans les extraits de plantes est estimée par la méthode du trichlorure d’aluminium (AlCl3) dont le principe est basé sur l’oxydation des flavonoïdes par ce réactif (AlCl3), ce qui entraîne la formation d’un complexe jaune-orange qui absorbe à 510 nm. La coloration jaune-orange produite est proportionnelle à la quantité de flavonoïdes présents dans l’extrait testé [Basli et al. 2012].

Deuxième partie Matériel et méthodes

La teneur en flavonoïdes totaux de chaque extrait ou fraction est déterminée par une méthode colorimétrique selon le protocole décrit par Ardestani et Yazdanparast. 2007. Un volume de 0,5 mL de chaque échantillon, est mélangé avec 2 mL d'eau distillée et 0,15 mL d'une solution de nitrite de sodium (NaNO2) à 15%. Après 6 minutes d’incubation à température ambiante,

0,15 mL d’une solution de trichlorure d’aluminium (AlCl3) à 10% et 2 mL de la solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) à 4% sont ajoutés. Puis le volume total est complété à 5 mL avec l'eau distillée. Le mélange est soumis à une agitation au vortex et incubé pendant 15 minutes à température ambiante. L'absorbance est lue contre un blanc (méthanol) au spectrophotomètre UV-VIS à une longueur d’onde (λ) de 510 nm. Une courbe d’étalonnage réalisée par la catéchine (Sigma Aldrich) à différentes concentrations (50-100-200-300-400- 500-600-700-800-900-1000 µg/mL) et pratiquée dans les mêmes conditions opératoires que celles des échantillons servira à la quantification des flavonoïdes totaux. Les résultats sont exprimés en µg équivalent de catéchine par mg d'extrait sec (µg eq Cat/mg ES).

5.3. Dosage de saponines totales

Le principe de dosage des saponines totales repose sur la réaction d’oxydation des saponines avec la vanilline. Dans cette réaction, l’acide sulfurique est utilisé comme étant l’agent oxydant. Cette réaction est caractérisée par le développement d’une coloration violette qui absorbe à 544 nm et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de saponines présentes dans l’échantillon d’extrait testé [Hiai et al. 1976 ; Cheok et al. 2014].

La teneur en saponines totales dans les extraits et fractions est déterminée selon la procédure décrite par Hiai et al. 1976 et Patel et al. 2015. 50 µL de chaque échantillon sont mélangés avec 0,5 mL d’une solution de vanilline (8% dans l’éthanol) et 5 mL d'acide sulfurique (72%). Puis, le mélange est soumis à une agitation au vortex et incubé dans un bain-marie à 60°C pendant 10 minutes, ensuite rapidement refroidi dans un bain de glace pendant 15 minutes. L’absorbance est mesurée par spectrophotométrie contre un blanc (méthanol) à une longueur d'onde d'absorption maximale de 544 nm. Dans les mêmes conditions opératoires une courbe d'étalonnage de l'acide oléanolique (Sigma Aldrich) à différentes concentrations (de 50 à 1000 µg/mL) est réalisée. Les résultats sont exprimés en µg équivalent d'acide oléanolique par mg d'extrait sec (µg eq AO/mg ES).

Deuxième partie Matériel et méthodes

II. Etude des activités biologiques des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte

1. Activité antioxydante

Les antioxydants sont des molécules qui, lorsqu’elles sont présentes à faibles concentrations par rapport aux substrats oxydables, retardent ou stoppent le processus d’oxydation. L’activité antioxydante des molécules peut être évaluée in vivo comme in vitro. Pour évaluer l’activité antioxydante, in vitro, des extraits de plantes, différentes méthodes ont été développées. Ces méthodes impliquent le mélange d’espèces oxydantes, tels que des radicaux libres ou des complexes métalliques oxydés, avec un échantillon qui contient des antioxydants capables de piéger les radicaux libres et réduire les complexes métalliques. Ces antioxydants peuvent agir selon deux mécanismes majeurs, par transfert d’atome d’hydrogène ou par transfert d’électron. Ainsi, compte tenu des différents facteurs impliqués, tels que les propriétés physico-chimiques des molécules, il est recommandé d’utiliser plusieurs tests pour confirmer l’activité antioxydante d’un échantillon testé [Prior et al. 2005]. Pour cela, deux tests différents ont été utilisés, in vitro, afin d’évaluer l’activité antioxydante des extraits et fractions de la bryone et de la coloquinte à savoir le test de piégeage du radical libre DPPH ainsi que le test de pouvoir réducteur du fer.

1.1. Test de piégeage du radical libre DPPH

Le 2,2-DiPhényl-1-Picryl-Hydrazyl (DPPH) (Sigma Aldrich) est généralement le substrat le plus utilisé pour l’évaluation rapide et directe de l’activité antioxydante en raison de sa stabilité sous forme de radical libre en plus de la simplicité et la reproductibilité de la méthode. Le principe de ce test est basé sur le fait que le DPPH est un radical libre qui présente une coloration violette foncée en solution méthanolique et une bande d’absorption caractéristique à 515 nm liée à la résonance des électrons non appariés. En présence d’une substance chimique anti-radiculaire, il y a capture des électrons non appariés et les produits de la réaction n’absorbent plus que vers 470 nm. Cela se traduit par une baisse de l’absorption à 515 nm liée à la décoloration de la solution de DPPH. Il est donc possible de suivre la réaction par spectrophotométrie dans le visible et de comparer l’intensité de la coloration de la substance étudiée à celle d’un antioxydant de référence tel que l’acide ascorbique. Cette comparaison se fait en utilisant leur CI50 (concentration inhibitrice à 50%) respective [Popovici et al. 2009].

Deuxième partie Matériel et méthodes

La capacité de piégeage des radicaux libres par les extraits ainsi que les fractions préparés à partir de deux cucurbitacées (B. dioica, C. colocynthis) est déterminée en utilisant le radical libre DPPH selon le protocole décrit par Atoui et al. 2005. 50 µL de chaque échantillon (extrait, fraction) préparé à différentes concentrations sont ajoutés à 1,95 mL d’une solution méthanolique de DPPH (6,34 x 10-5 M). Après agitation par un vortex, le mélange est incubé à l'obscurité pendant 30 minutes. L'absorbance a été mesurée à 515 nm contre un blanc pour chaque concentration et qui contient 50 µL de l’échantillon testé et 1,95 mL du méthanol. Le contrôle contient 50 µL du méthanol et 1,95 mL de la solution de DPPH, son absorbance est mesurée à 515 nm contre un blanc qui contient 2 mL du méthanol.

En parallèle et dans les mêmes conditions opératoires, différentes molécules de références ont été utilisées pour pouvoir évaluer l’activité anti-radicalaire des extraits et fractions à savoir l'acide ascorbique, l’acide gallique, la catéchine, l’acide oléanolique ainsi que l’antioxydant de synthèse le Butyl-Hydroxy Toluène (BHT).

Les absorbances mesurées servent à calculer le pourcentage de réduction du radical DPPH (PR), qui est proportionnel au pouvoir anti-radicalaire de l’échantillon testé (extrait, fraction ou molécule de référence). Les essais sont répétés trois fois, la valeur moyenne est retenue pour le calcul du pouvoir réducteur selon la formule suivante :

PR (%) = (A Contrôle - A Echantillon) / A Contrôle x 100

PR: Pourcentage de réduction A contrôle: Absorbance de la solution méthanolique de DPPH A échantillon: Absorbance de l’échantillon testé (extrait, fraction ou molécule de référence)

En plus du calcul des pourcentages de réduction du DPPH, l’activité anti-radicalaire est aussi estimée par le calcul de la CI50 (concentration inhibitrice à 50%) qui représente la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire (inhiber) 50% des radicaux DPPH. Elle est déterminée graphiquement sur les graphes tracés : pourcentages de réduction en fonction de différentes concentrations de l’échantillon testé (extrait, fraction ou molécule de référence), en utilisant le logiciel statistique Origine 50 version 5.0, 1997. Plus la valeur de CI50 est petite, plus l’activité antioxydante (anti-radicalaire) de l’échantillon testé est grande [Maisuthisakul et al. 2007].

Deuxième partie Matériel et méthodes

1.2. Test de pouvoir réducteur du fer

Le test de pouvoir réducteur du fer (Ferric reducing antioxidant power, FRAP) est un test simple, rapide et reproductible. L’activité réductrice d’un extrait est évaluée par la réaction d’oxydo-réduction entre l’extrait et les ions métalliques de transition, notamment le fer. 3+ Le ferricyanure de potassium [K3Fe(CN)6] fournit des ions ferriques (Fe ) qui seront réduits en ions ferreux (Fe2+) par les antioxydants présents dans l’extrait végétal. Une coloration 2+ bleue est formée après l’ajout du chlorure de fer (FeCl3) aux ions ferreux (Fe ). Par conséquent, le pouvoir réducteur du fer peut être évalué en mesurant l’augmentation de l’intensité de la couleur bleue dans le milieu réactionnel à 700 nm. L'augmentation de l'absorbance du mélange réactionnel est proportionnelle à l’augmentation du pouvoir de réduction de fer [Li et al. 2008 ; Bursal et Köksal. 2011].

Le pouvoir réducteur du fer des extraits et fractions préparés à partir des cucurbitacées (B. dioica, C. colocynthis) est déterminé en suivant le protocole expérimental décrit par Karagôzler et al. 2008. Dans des tubes à essai contenant 1 mL de la solution de chaque échantillon à différentes concentrations (25-50-100-150-200-250-300 µg/mL), 2,5 mL de tampon phosphate (0,2 M ; pH 6,6) puis 2,5 mL de ferricyanure de potassium [K3Fe(CN)6] à 1% sont ajoutés. Le mélange est incubé à 50°C pendant 20 minutes. Un volume de 2,5 mL d’acide trichloracétique (TCA) à 10% a été ensuite ajouté et le mélange a été centrifugé à 3000 tours/min pendant 10 minutes. Puis 2,5 mL du surnageant sont mélangés avec 2,5 mL d'eau distillée et 0,5 mL de chlorure de fer (FeCl3) à 1%. La lecture des absorbances se fait contre un blanc à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS. De même, différentes molécules de références ont été évaluées dans les mêmes conditions opératoires à savoir l'acide ascorbique, l’acide gallique, la catéchine, l’acide oléanolique et le BHT afin de pouvoir comparer les pouvoirs réducteurs du fer des extraits et fractions à ceux des molécules de références.

Les résultats sont exprimés en CE50 : concentration efficace de l’extrait, fraction ou de la molécule de référence correspondant à une absorbance égale à 0,5 [Barreira et al. 2013]. Celle-ci est obtenue graphiquement à partir des graphes tracés : les absorbances en fonction de différentes concentrations de l’échantillon testé (extrait, fraction ou molécule de référence), en utilisant le logiciel statistique Origine 50 version 5.0, 1997. Plus la valeur de CE50 est petite, plus l’activité antioxydante (réductrice) de l’échantillon testé est grande.

Deuxième partie Matériel et méthodes

2. Activité antidiabétique

L’activité antidiabétique peut être évaluée en effectuant des études pharmaco-toxicologiques par le bais des tests in vitro et in vivo. Les méthodes in vivo utilisent différents modèles d’animaux afin de déterminer l’activité antidiabétique des extraits de plantes. La grande majorité des études expérimentales in vivo est réalisée chez les rongeurs, rat et souris, ces modèles rendus diabétiques servent de référence pour l’étude et la compréhension de la genèse et les complications de la pathologie.

Cette partie de notre étude a pour but d’évaluer d’abord la toxicité aiguë puis l’effet antidiabétique des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis.

L’effet antidiabétique est recherché chez des rats normaux et rendus diabétiques par l’injection néonatale de la streptozotocine. Ces animaux qui reçoivent les extraits et les fractions de la bryone et de la coloquinte par voie intra-péritonéale sont suivis à court terme et à moyen terme, trois heures et trois semaines respectivement. Chez les animaux d’expérimentation, nous avons testé l’effet des extraits et fractions des deux cucurbitacées sur les variations de la glycémie, de quelques paramètres biochimiques sanguins (cholestérol total, triglycérides, urée, créatinine) ainsi que sur le poids corporel, la consommation d’aliment et d’eau, la biométrie des organes et la tolérance orale au glucose.

2.1. Les animaux d’expérimentation

Cette étude a porté sur des rats blancs « Rattus norvegicus », de souche Wistar, de sexe mâle et femelle, âgés de 2 à 3 mois ayant un poids de 180 à 240 g. L’élevage de ces animaux s’est déroulé au sein de l’animalerie de département de Biologie, Faculté des sciences de la nature et de la vie et sciences de la terre et de l’univers, Université Abou Bekr Belkaïd (Tlemcen). Les rats Wistar sont nourris d’un aliment standard de commerce "EL ALF" composé de: 14% humidité, 49,5% glucides, 18,5% protéines brutes, 3,5% matière grasse, 3% cellulose, 5,7% cendres, 1% complexe minéralo-vitaminiques. L'eau et l'aliment leur sont fournis ad libitum.

Deuxième partie Matériel et méthodes

2.2. Evaluation de la toxicité aiguë des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis

Avant d’entreprendre l’étude de l’activité antidiabétique de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis chez le rat de laboratoire, il est nécessaire d’examiner au préalable leur toxicité aiguë chez l’animal. Il s’agit de déterminer expérimentalement la dose létale pour chacun des extraits et fractions des plantes étudiées et à partir de laquelle sera définie la dose de travail : la dose non toxique applicable pour l’étude de leur effet antidiabétique.

La détermination des doses létales médianes (DL50) et totales (DL100) peut nous renseigner sur la toxicité aiguë des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis. La DL50 signifie la dose unique qui provoque la mort de 50% des animaux traités, alors que la DL100 indique la dose unique qui provoque la mort de tous les animaux traités (100%).

Pour ce faire, des solutions d’extraits et fractions secs sont préparées dans du sérum physiologique (NaCl 9‰) à des doses croissantes dont chacune d’elles est administrée par voie intra-péritonéale (IP), à un lot de rats femelles (n=4) maintenues à jeun pendant 16 heures environ. Les animaux sont répartis et traités comme suit :

 Les extraits aqueux préparés par décoction BDRaqDe et CCFaqDe ont été testés pour leur toxicité sur 32 rats femelles pour chacun (8 lots), ayant un poids de 180,6±2,61 g, par l’administration intra-péritonéale de doses croissantes de ces extraits: 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 250 ; 300 ; 350 et 400 mg/kg pc.

 Les extraits aqueux préparés par macération BDRaqMa et CCFaqMa ont été testés sur 32 rats femelles pour chacun (8 lots), ayant un poids de 183,5±11,18 g en administrant par voie IP des doses croissantes de ces extraits: 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 250 ; 300 ; 350 et 400 mg/kg pc.

 Les extraits butanoliques BDRn-but et CCFn-but ont été testés sur 32 rats femelles pour chacun (8 lots), ayant un poids de 184,56±5,82 g, des doses croissantes de ces extraits (100 ; 200 ; 300 ; 400 ; 500 ; 600 ; 700 et 800 mg/kg pc) ont été administrées par voie intra-péritonéale.

 Les fractions enrichies de polyphénols et de saponines BDRPolyphénols , CCFPolyphénols et

BDRSaponines , CCFSaponines ont été testés pour leur toxicité sur 28 rats femelles pour chacune (7 lots), ayant un poids de 183,8±4,25 g, par l’administration IP de doses croissantes de ces fractions : 50 ; 60 ; 70 ; 80 ; 90 ; 100 et 200 mg/kg pc.

Deuxième partie Matériel et méthodes

L’évaluation de la toxicité aiguë de chacun des extraits et fractions testés se fait par le relevé du nombre de rats morts dans chaque lot durant les 72 heures qui suivent leur administration. La DL50 est déterminée selon la formule de Dragstedt et Lang. 1957, comme suit :

DL50 = [50 (X2-X1) + (X1Y2-X2Y1)] / (Y2-Y1)

X1 : Dose inférieure encadrant la DL50

X2 : Dose supérieure encadrant la DL50

Y1 : Pourcentage de mortalité correspondant à X1

Y2 : Pourcentage de mortalité correspondant à X2

2.3. Induction du diabète expérimental

Le diabète expérimental a été induit par l’injection néonatale de la streptozotocine (STZ) à des nouveau-nés de rats Wistar de sexe mâle et femelle âgés de cinq jours selon le protocole décrit par Andrade-Cetto et Wiedenfeld. 2011.

Des rattes gravides sont isolées dans des cages individuelles afin de les habituer aux conditions de laboratoire. Pour induire le diabète expérimental, la streptozotocine (STZ) (Sigma Aldrich) est fraîchement préparée dans une solution de tampon citrate (0,1 M ; pH 4,5) puis administrée par voie intra-péritonéale (IP) à une dose de 90 mg/kg pc à des nouveau-nés de rats âgés de cinq jours, pesant 11,57±0,46 g. Le groupe témoin (10,98±0,34 g) a reçu seulement une injection IP de tampon citrate. Après le sevrage (28 jours), les rats ayant subis l’injection intra-péritonéale de streptozotocine ou de tampon citrate sont maintenus sous les conditions classiques d’élevage et bénéficiés d'un régime alimentaire standard et de l'eau ad libitum.

Ces animaux ainsi traités sont suivis régulièrement par la révélation de : La toxicité de la STZ durant les 20 premiers jours qui suivent son injection ; La mesure de leur poids corporel du 5ème au 60ème jour de leur âge ; La mesure de la glycémie à jeun a été effectuée périodiquement, chaque semaine après le sevrage, aux 30 ; 37 ; 44 ; 51 et 58 jours de leur âge ; Ils ont été également soumis à un test de tolérance orale au glucose ; En plus de la détermination de la consommation alimentaire, la prise d’eau et le volume des urines éliminés pendant 24h, au bout de la 9ème semaine de leur âge (du 60ème au 67ème jour de leur âge).

Deuxième partie Matériel et méthodes

La variation de chacun de ces paramètres chez les rats ayant subis l’injection néonatale de la streptozotocine sont exprimées en moyenne±ESM ou en pourcentage par rapport aux rats témoins ayant subis une injection intra-péritonéale de tampon citrate.

Les rats mâles et femelles ayant subis l’injection néonatale de la streptozotocine, présentant à l’âge adulte les symptômes du diabète à savoir la polyphagie, la polydipsie, la polyurie et l’intolérance orale au glucose ainsi qu’une glycémie à jeun supérieure à 1,50 g/L, sont considérés comme diabétiques et retenus pour les travaux expérimentaux ultérieurs.

2.4. Evaluation de l’effet antidiabétique des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis

Dans le but de rechercher l’effet antidiabétique des extraits et des fractions préparés à partir des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis : BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa,

CCFaqMa, BDRn-but, CCFn-but, BDRPolyphénols, CCFPolyphénols, BDRSaponines, CCFSaponines, nous avons utilisés des rats Wistar mâles normaux chez lesquels l’effet hypoglycémiant de chacun des extraits et fractions a été évalué. L’effet antihyperglycémiant a été évalué chez des rats Wistar mâles diabétiques. Chez ces animaux normaux et diabétiques, une étude à court terme pendant trois heures en plus d’une étude à moyen terme pendant 21 jours ont été effectuées.

2.4.1. Etude à court terme

Afin d’évaluer l’effet aiguë de chacun des extraits et fractions sur la glycémie, 115 rats mâles normaux et diabétiques répartis en 23 lots ont été utilisés (Tableau 04). Les rats des lots expérimentaux sont injectés (IP) par l’un des extraits et fractions solubilisé dans le sérum physiologique, à la dose, comme suit: BDRaqDe (30 mg/kg pc), CCFaqDe (20 mg/kg pc),

BDRaqMa (25 mg/kg pc), CCFaqMa (25 mg/kg pc), BDRn-but (40 mg/kg pc), CCFn-but (60 mg/kg pc), BDRPolyphénols (6 mg/kg pc), CCFPolyphénols (8 mg/kg pc), BDRSaponines (8 mg/kg pc),

CCFSaponines (10 mg/kg pc). Les rats des lots témoins et contrôle positif reçoivent (IP) en respect le sérum physiologique (5 mL/kg pc) et le glibenclamide (10 mg/kg pc).

Les prélèvements sanguins sont effectués à partir du sinus rétro-orbital chez les rats maintenus à jeun (une nuit) à l’aide d’une pipette Pasteur à T0 min, ce qui représente la glycémie basale. D’autres mesures de la glycémie ont été effectuées à partir d’une goutte de sang prélevée au niveau de l’extrémité caudale après 30, 60, 120 et 180 min de l’administration IP des extraits et fractions, du sérum physiologique ou du glibenclamide, à l’aide d’un glucomètre à bandelettes réactives (Accu-Check active, Roche, Germany).

Deuxième partie Matériel et méthodes

2.4.2 Etude à moyen terme

Les mêmes groupes de rats témoins et expérimentaux, normaux et diabétiques utilisés précédemment dans l’étude à court terme, sont suivis durant une période de trois semaines (21 jours) (Tableau 04). Au cours de cette période les rats des lots expérimentaux normaux et diabétiques, sont traités par administration quotidienne (IP) de chacun des extraits et fractions

(dose), comme suit : BDRaqDe (30 mg/kg pc), CCFaqDe (20 mg/kg pc), BDRaqMa (25 mg/kg pc),

CCFaqMa (25 mg/kg pc), BDRn-but (40 mg/kg pc), CCFn-but (60 mg/kg pc), BDRPolyphénols

(6 mg/kg pc), CCFPolyphénols (8 mg/kg pc), BDRSaponines (8 mg/kg pc), CCFSaponines (10 mg/kg pc). Les rats des lots témoins et contrôle positif reçoivent (IP) le sérum physiologique

(5 mL/kg pc) et le glibenclamide (10 mg/kg pc) respectivement.

Les prélèvements sanguins sont effectués au niveau du sinus rétro-orbital de l’œil à l’aide d’une pipette Pasteur à T0 et aux 7ème, 14ème et 21ème jours d’expérimentation chez les rats maintenus à jeun pendant une nuit. La glycémie est évaluée par dosage colorimétrique en utilisant un kit de dosage enzymatique (SPINREACT, Espagne).

La glycémie est exprimée en g/L et les variations de la glycémie chez les expérimentaux à court et à moyen terme, sont exprimées en pourcentage par rapport aux rats témoins.

Le sang prélevé au niveau du sinus rétro-orbital de l’œil à T0 et aux 7ème, 14ème et 21ème jours est recueilli dans des tubes secs, puis centrifugé à 3000 tours/min pendant 10 minutes à 4°C. Le sérum récupéré fera l’objet d’un dosage par spectrophotométrie de quelques paramètres biochimiques à l'aide de kits de dosages standards commercialisés (SPINREACT, Espagne) à savoir le dosage du cholestérol total, triglycérides, urée et créatinine.

Les paramètres biochimiques sériques sont exprimés en taux de : cholestérol total (g/L), triglycérides (g/L), urée (mg/dL) et créatinine (mg/dL).

L’évolution de ces paramètres biochimiques et leur variation chez les expérimentaux sont exprimées en pourcentage par rapport aux témoins.

Deuxième partie Matériel et méthodes

Tableau 04 : Répartition des lots de rats normaux et diabétiques, témoins et expérimentaux, utilisés pour l’évaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis à court et à moyen terme.

Lots Solutions (IP) Doses (mg/kg pc) Nombre de rats Normaux Témoins Sérum physiologique 5 mL/kg pc 5

Expérimentaux BDRaqDe 30 5

CCFaqDe 20 5

BDRaqMa 25 5

CCFaqMa 25 5

BDRn-but 40 5

CCFn-but 60 5

BDRPolyphénols 6 5

CCFPolyphénols 8 5

BDRSaponines 8 5

CCFSaponines 10 5 Diabétiques Témoins Sérum physiologique 5 mL/kg pc 5 Expérimentaux Glibenclamide (contrôle positif) 10 5

BDRaqDe 30 5

CCFaqDe 20 5

BDRaqMa 25 5

CCFaqMa 25 5

BDRn-but 40 5

CCFn-but 60 5

BDRPolyphénols 6 5

CCFPolyphénols 8 5

BDRSaponines 8 5

CCFSaponines 10 5

2.4.3. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur l’évolution du poids corporel, la consommation d’aliment et d’eau chez les rats normaux et diabétiques

Au cours de l’étude à moyen terme (21 jours), l’évolution du poids corporel ainsi que la consommation d’aliment et d’eau ont été suivies chez les rats des lots normaux et diabétiques, témoins et expérimentaux. Le poids corporel a été mesuré périodiquement tout au long de l’expérimentation, au jour : 0 ; 7 ; 14 et 21. Les variations du poids corporel des rats expérimentaux sont exprimées en pourcentage de gain ou de perte de poids par rapport aux rats témoins. Par ailleurs, la consommation d’aliment et d’eau a été mesurée quotidiennement et les résultats sont exprimés en g/jour et mL/jour respectivement.

Deuxième partie Matériel et méthodes

2.4.4. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur la biométrie des organes

A la fin de la période expérimentale, au 22ème jour, les rats témoins et expérimentaux, normaux et diabétiques maintenus à jeun (une nuit) sont anesthésiés par le chloral hydraté

(C2H3Cl3O2) à 8% (p/v) puis sacrifiés. Pancréas, foie, reins et rate ont été prélevés, lavées dans une solution de sérum physiologique, essuyés et pesés. Les résultats sont exprimés en poids relatif, calculé comme suit :

Poids relatif (%) = (Poids organe / Poids corporel) x 100

2.5. Evaluation de l’effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose

Dans le but de vérifier l’effet des extraits et fractions de B. dioica sur l’hyperglycémie temporaire provoquée par l’administration orale du glucose (2 g/kg pc) chez les rats diabétiques, nous avons utilisé 25 rats femelles diabétiques âgées de 3 mois, réparties en 5 lots (n=5), quatre lots expérimentaux et un lot témoin.

Les lots expérimentaux reçoivent, à l’aide d’une sonde intra-gastrique, un mélange de solution

(v/v) de glucose (2 g/kg pc) avec l’un des extraits et fractions de B. dioica : BDRaqDe

(30 mg/kg pc) ou BDRn-but (40 mg/kg pc) ou BDRSaponines (8 mg/kg pc). Chez le lot témoin et le lot contrôle positif, l’extrait ou la fraction est remplacé par le sérum physiologique (5 mL/kg pc) et le glibenclamide (10 mg/kg pc) respectivement.

Chez tous les rats des lots témoins et expérimentaux, des mesures de la glycémie sont effectuées à T0 (glycémie basale) avant le gavage du mélange : glucose-sérum physiologique ou glucose-extrait/fraction/glibenclamide, ensuite aux temps 30, 60, 120 et 180 min après leur administration. Les prélèvements sanguins ont été effectués au niveau de la veine caudale, après une légère incision. La glycémie a été mesurée à l’aide d’un glucomètre à bandelettes réactives (Accu-Check active, Roche, Germany).

La glycémie est exprimée en g/L et les variations de la glycémie chez les expérimentaux sont exprimées en taux de variation (%) par rapport aux rats témoins.

Deuxième partie Matériel et méthodes

 Estimation de la charge glycémique

L’évaluation de la charge glycémique est estimée par le calcul de l’aire sous la courbe (ASC) qui représente une surface mesurée à partir des chiffres de la glycémie de 0 à 180 min. L’ASC (g/L/180min) est calculée selon la formule ci-dessous.

ASC = (Gt0+Gt30)x30/2+(Gt30+Gt60)x30/2+(Gt60+Gt120)x60/2+(Gt120+Gt180)x60/2

2.6. Dosage des paramètres biochimiques sanguins

Chez les rats témoins et expérimentaux, normaux et diabétiques, le sang prélevé au niveau du sinus rétro-orbital de l’œil à T0 et aux 7ème, 14ème, 21ème jours, a été recueilli dans des tubes secs, puis centrifugé à 3000 tours/min pendant 10 minutes à 4°C. Le sérum récupéré a fait l’objet de dosages par spectrophotométrie de quelques paramètres biochimiques sériques à l'aide de kits de dosages standards commercialisés (SPINREACT, Espagne) : le dosage du glucose, cholestérol total, triglycérides, urée et créatinine. En plus du dosage sérique du glucose par spectrophotométrie à l'aide du kit de dosage (étude à moyen terme). Le glucose est aussi dosé sur du sang total en utilisant un glucomètre à bandelettes réactives Accu-Check active, Roche, Germany (étude à court terme). Le principe de chaque dosage est résumé ci-dessous.

2.6.1. Dosage de glucose

 Dosage du glucose dans le sang total par le glucomètre

La mesure de la glycémie a été effectuée en utilisant un glucomètre à bandelettes réactives (Accu-Check active, Roche, Germany), dont le principe de mesure repose sur l’électrochimie. Au niveau de la bandelette, le glucose est transformé en acide glucuronique par la glucose oxydase, ce qui engendre potentiel électrique, détectable par le glucomètre, proportionnelle à la quantité de glucose [Mério. 2008].

 Dosage du glucose sérique par spectrophotométrie

Le dosage du glucose sérique a été réalisé par une technique enzymatique colorimétrique à l’aide d’un kit SPINREACT en se basant sur la méthode de Trinder. 1969. L’intensité de la coloration développée au cours de la réaction est mesurée à 505 nm contre un blanc. L’absorbance mesurée est proportionnelle à la concentration en glucose (glycémie).

Deuxième partie Matériel et méthodes

La glycémie est exprimée en g/L et les variations de la glycémie chez les expérimentaux à court et à moyen terme, sont exprimées en pourcentage (%) par rapport aux rats témoins selon la formule suivante :

% G = (GExpérimentaux – GTémoins) / GTémoins x 100

% G : Pourcentage de variation de la glycémie

GExpérimentaux: Glycémie chez les expérimentaux

GTémoins : Glycémie chez les témoins

2.6.2. Dosage du cholestérol total et triglycérides

Le dosage du cholestérol total sérique a été réalisé par une technique enzymatique colorimétrique à l’aide d’un kit SPINREACT en se basant sur la méthode de Fasce. 1982. L’intensité de la coloration développée au cours de la réaction est mesurée à 505 nm contre un blanc. L’absorbance mesurée est proportionnelle à la concentration en cholestérol total exprimée en g/L.

Le dosage des triglycérides sériques a été réalisé par une technique enzymatique colorimétrique à l’aide d’un kit SPINREACT en se basant sur la méthode de Fossati et Prencipe. 1982. L’intensité de la coloration développée au cours de la réaction est proportionnelle à la concentration en triglycérides exprimée en g/L. L’absorbance est mesurée à 505 nm contre un blanc.

2.6.3. Dosage de l’urée et la créatinine

Le dosage de l’urée sérique a été réalisé par une technique enzymatique colorimétrique à l’aide d’un kit SPINREACT en se basant sur la méthode de Tietz. 1995. L’intensité de la coloration développée au cours de la réaction est proportionnelle à la concentration en urée exprimée en mg/dL. L’absorbance est mesurée à 580 nm contre un blanc.

Le dosage de la créatinine sérique a été réalisé par une technique chimique colorimétrique et cinétique en milieu alcalin à l’aide d’un kit SPINREACT selon la méthode de Jaffé décrite dans le protocole de Jacobs et al. 1991. L’absorbance du picrate de créatinine est mesurée à 492 nm contre un blanc. Les résultats sont exprimés en mg/dL.

Deuxième partie Matériel et méthodes

2.7. Etude statistique

Des études statistiques ont été réalisées afin de pouvoir comparer les différents résultats. Les résultats pour les variations quantitatives sont exprimés sous forme de moyennes±l’erreur standard à la moyenne (m±ESM).

La moyenne (m) 1 X   X1 n 1

L’écart type ()  x  VX

 L’erreur standard de la moyenne (ESM) ESM  n

La signification statistique des différences observées entre les valeurs moyennes obtenues pour chaque lot d’animaux (n=5) a été évaluée par le test de Student (te). Pour comparer les moyennes de deux échantillons indépendants, nous avons appliqué le test de Student (te) à un degré de liberté qui dépend de la taille de l’échantillon.

m1  m2 te  2  1 1      n1 n2 

La valeur de « te » donne le degré de signification « p » lu sur la table de Student. La différence entre deux moyennes est :

Peu significative si p<0,05 (*) Significative si p<0,01 (**) Très significative si p<0,001 (***) Hautement significative si p<0,0001(****)

Deuxième partie Matériel et méthodes

3. Activité hémolytique

L’utilisation des plantes à des fins thérapeutiques peut être limitée par leur effet toxique notamment hémolytique, ce dernier qui peut être un indicateur de cytotoxicité. Les érythrocytes constituent un modèle cellulaire très adéquat pour l’évaluation de l’activité hémolytique, en raison de la richesse de leurs membranes en lipides (cholestérol, phospholipides, acides gras polyinsaturés) et la concentration cellulaire élevée en oxygène et en hémoglobine. Ces cellules sont extrêmement susceptibles aux dommages oxydatifs et la stabilité de leurs membranes est un bon indicateur de l'effet hémolytique d’un extrait ou substance testé in vitro dont l’exposition de ces érythrocytes à un agent hémolytique conduit donc à une lyse de leurs membranes plasmiques avec libération du contenu cellulaire mesurable à 540 nm [Lee et al. 2002].

Dans cette partie de notre étude, nous sommes intéressés à l’évaluation de l’activité hémolytique des extraits et fractions des racines de B. dioica (BDRaqDe, BDRn-but,

BDRPolyphénols, BDRSaponines) en se basant sur le protocole décrit par Lee et al. 2002. L’activité hémolytique a été suivie par dosage spectrophotométrique de l’hémoglobine libérée. En présence d’une substance hémolytique (extrait ou fraction), les hématies se lysent et libèrent l’hémoglobine intracellulaire en rendant le surnageant rouge, les hématies qui restent intactes se sédimentent.

3.1. Matériel : globules rouges humains

Pour l’évaluation de l’activité hémolytique des extraits et fractions des racines de B. dioica, nous avons utilisé un modèle universel de cellules animales, les globules rouges humains provenant d’un donneur unique sain.

3.2. Préparation de la suspension érythrocytaire

Du sang fraîchement prélevé dans un tube hépariné est centrifugé à 4000 tours/minutes à 4°C pendant 5 minutes. Après élimination du surnageant, le culot est lavé deux fois avec le tampon phosphate de sodium salé (PBS) (10 mM ; pH 7,4) puis resuspendu dans le PBS, à raison de 4000 cellules/mL.

Deuxième partie Matériel et méthodes

3.3. Mesure de la fuite de l’hémoglobine

À un volume de 0,5 mL de la suspension érythrocytaire, 8,5 mL de tampon phosphate salé de sodium (PBS) (10 mM, pH 7,4) sont ajoutés. La suspension érythrocytaire est incubée à 37°C sous agitation continue pendant 120 minutes. Dès l’addition de l'extrait ou la fraction (1 mL) qui correspond au temps zéro, des prélèvements de 0,4 mL à partir de la solution réactionnelle sont réalisés à intervalle régulier de temps (5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 min), pour être resuspendus dans 2 mL d’une solution de lavage glacée composée de MgCl2 (2 mM) et NaCl (150 mM). Après centrifugation à 4000 tours/min pendant 5 minutes (4°C), nous avons récupéré le surnagent sur lequel nous avons dosé la fuite d’hémoglobine par mesure de l’absorbance à une longueur d’onde de 548 nm à l'aide d'un spectrophotomètre [Lee et al. 2002].

Pour le contrôle positif, l’hémolyse totale est obtenue par la mise en suspension des globules rouges dans de l’eau distillée. Le tampon seul est utilisé comme contrôle négatif.

Pour chaque échantillon le pourcentage de l'activité hémolytique maximale est déterminé par l’équation suivante:

Taux d’hémolyse (%) = [(A Extrait/Fraction A Contrôle négatif) / A Contrôle positif] x 100

Les résultats de l'activité hémolytique sont exprimés en pourcentage du taux d’hémolyse en fonction du temps à différentes concentrations de l’extrait ou la fraction testé.

Troisième partie Résultats et interprétation

I. Etude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte

1. Caractéristiques des extraits et fractions préparés

Le dégraissage des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis par l’hexane pendant trois heures a permis l’extraction de 6,40% et 8,98% respectivement de lipides sous forme d’huile. Après évaporation à sec du solvant d’extraction (eau, solvant organique) les différents extraits et fractions sont récupérés sous forme solide (poudre ou pâte). Le tableau 05 résume respectivement quelques caractéristiques des extraits et fractions récupérés à savoir le rendement d’extraction, la couleur, l’aspect physique et la solubilité de chacun.

Tableau 05 : Caractéristiques des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Extraits / Fractions Rendement % Couleur Aspect physique Solubilité

BDRaqDe 14,28 marron poudre eau distillée

CCFaqDe 5,41 marron poudre eau distillée

BDRaqMa 11,26 marron-noir pâte eau distillée

CCFaqMa 10,68 jaune poudre eau distillée

BDRn-but 1,90 orange poudre eau distillée

CCFn-but 2,61 marron poudre eau distillée

BDRPolyphénols 1,20 orange pâte eau distillée/MeOH v/v

CCFPolyphénols 1,12 marron-orange pâte eau distillée/MeOH v/v

BDRSaponines 0,80 marron poudre eau distillée

CCFSaponines 0,61 jaune poudre eau distillée

BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

Les résultats mentionnés dans le tableau 05 montrent que l’ensemble des extraits et fractions préparés à partir de racines de B. dioica et de fruits de C. colocynthis sont récupérés sous forme de poudre de couleur caractéristique pour chacun, à l’exception de l’extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération (BDRaqMa) et les fractions enrichies de polyphénols des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis (BDRPolyphénols,

CCFPolyphénols) qui sont récupérés sous forme de pâte hygroscopique.

Le rendement d’extraction varie selon le matériel végétal ainsi que la méthode et le solvant d’extraction. L’extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction (BDRaqDe) donne le rendement le plus élevé, il est de 14,28% suivi par l’extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération (BDRaqMa) 11,26%, l’extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération (CCFaqMa) 10,68%, l’extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction (CCFaqDe) 5,41% et enfin l’extrait butanolique des fruits de

C. colocynthis (CCFn-but) avec 2,61% et l’extrait butanolique des racines de B. dioica

(BDRn-but) avec 1,90%. Concernant les fractions, extraites sélectivement à partir de l’extrait eau/méthanol à l’aide du butanol sous certaines conditions de milieu : pH et polarité du solvant, les rendements les plus élevés sont ceux des fractions enrichies de polyphénols des racines de B. dioica (BDRPolyphénols) et des fruits de C. colocynthis (CCFPolyphénols) 1,20% et 1,12% respectivement. Tandis que les fractions enrichies de saponines des racines de

B. dioica (BDRSaponines) et des fruits de C. colocynthis (CCFSaponines) présentent les rendements les plus faibles 0,80% et 0,61 % respectivement (Tableau 05).

Les extraits et fractions des racines de B. dioica sont récupérés avec un meilleur rendement par rapport aux extraits et fractions des fruits de C. colocynthis à l’exception de l’extrait butanolique. Le rendement d’extraction primaire des extraits des deux cucurbitacées

(BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but, CCFn-but) varie largement, du 1,90% à

14,28%. Alors que, chez les fractions enrichies de polyphénols et de saponines (BDRPolyphénols,

CCFPolyphénols, BDRSaponines, CCFSaponines) le rendement est plus faible, de 0,61% à 1,20%, car il s’agit d’une extraction secondaire plus sélective ciblant ces familles chimiques.

2. Screening phytochimique

Les résultats de l’analyse phytochimique qualitative des différents extraits et fractions des deux cucurbitacées sont indiqués dans les tableaux 06 et 07. L’apparition d’une coloration ou précipitation voire floculation par le biais de certains réactifs spécifiques utilisés, témoigne la présence de certains familles de composés chimiques dans les extraits et fractions testés.

Troisième partie Résultats et interprétation

Tableau 06 : Screening phytochimique des extraits des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Extraits

Métabolites BDRaqDe CCFaqDe BDRaqMa CCFaqMa BDRn-but CCFn-but Tanins Catéchiques + + ++ + ++ - Galliques ------Flavonoïdes + ++ + + + + Coumarines + ++ - - - - Saponines Triterpéniques ++ ++ ++ - ++ ++ Stéroïdiques ------Hauteur de la mousse (cm) 1,6 0,6 0,9 0,4 1,7 0,8 Alcaloïdes Mayer + ++ - - - - Wagner + ++ - - - - Quinones libres ++ ++ ++ ++ + + Anthraquinones ------Sucres réducteurs + ++ + ++ ++ -

Tableau 07 : Screening phytochimique des fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Fractions

Métabolites BDRPolyphénols CCFPolyphénols BDRSaponines CCFSaponines Tanins Catéchiques ++ - - - Galliques - - - - Flavonoïdes + ++ - - Coumarines + + - - Saponines Triterpéniques - - ++ ++ Stéroïdiques - - - - Hauteur de la mousse (cm) 0,3 0 2,1 1,1 Alcaloïdes Mayer - - - - Wagner - - - - Quinones libres + + + + Anthraquinones - - - - Sucres réducteurs + + + +

BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica ; CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis (-): absent, (+): présent, (++): fortement présent

Troisième partie Résultats et interprétation

Ces résultats ont révélé la présence dans les extraits aqueux des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte des tanins catéchiques, flavonoïdes, coumarines, alcaloïdes, saponines triterpéniques, quinones libres et sucres réducteurs et l’absence des tanins galliques, saponines stéroïdiques et des anthraquinones. Notons aussi l’absence de coumarines et d’alcaloïdes dans les extraits obtenus par macération, ce qui laisse supposer que la chaleur favorise leur extraction à partir de la matière végétale lors de la décoction. Les extraits butanoliques,

BDRn-but et CCFn-but, se caractérisent par la présence de : flavonoïdes, saponines triterpéniques et quinones libres. L’extrait BDRn-but contient en plus les tanins catéchiques et les sucres réducteurs (Tableau 06).

En ce qui concerne les fractions enrichies de polyphénols issues par extraction secondaire de l’extrait butanolique, nous constatons que les composés phénoliques des racines de la bryone sont des tanins catéchiques alors que ceux des fruits de la coloquinte sont des flavonoïdes. Enfin, dans les fractions enrichies de saponines, se retrouvent les saponines triterpéniques, révélées par la réaction de Liebermann-Burchard et le test de mousse, aussi bien dans celle des racines de la bryone que dans celle des fruits de la coloquinte (Tableau 07).

3. Teneur en polyphénols, en flavonoïdes et en saponines totaux

La teneur en polyphénols, en flavonoïdes et en saponines totaux dans les extraits et fractions préparés à partir des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, est quantifiée par un dosage colorimétrique en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu, le réactif de chlorure d’aluminium et le réactif de vanilline-acide sulfurique respectivement.

Les résultats obtenus sont exprimés en microgrammes équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait sec (µg eq AG/mg ES), en microgrammes équivalent de catéchine par milligramme d’extrait sec (µg eq Cat /mg ES) et en microgrammes équivalent d’acide oléanolique par milligramme d’extrait sec (µg eq AO/mg ES) respectivement. Cela est effectué en utilisant l’équation de la régression linéaire de la courbe d’étalonnage tracée de l’acide gallique, de la catéchine et de l’acide oléanolique (Figure 5 A, B, C).

Les résultats relatifs aux dosages quantitatifs des polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux dans les extraits et fractions des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte sont consignés dans le tableau 08.

Troisième partie Résultats et interprétation

Acide gallique y = 0,0199x A R² = 0,9911

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Absorbance à 700 nm 700à Absorbance 0 200 400 600 800 1000 Concentrations (µg/mL)

Catéchine y = 0,0102x Acide oléanolique y = 0,0110x

B R² = 0,9958 C R² = 0,9815

1,2 1 1 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4

0,2 0,2 Absorbance à 544 nm 544à Absorbance Absorbance à 510 nm 510à Absorbance 0 0 0 500 1000 0 500 1000 Concentrations (µg/mL) Concentrations (µg/mL)

Tableau 08 : Teneurs en polyphénols totaux, en flavonoïdes totaux et en saponines totales dans les extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Extraits / Fractions Polyphénols totaux Flavonoïdes totaux Saponines totales (µg eq AG/mg ES) (µg eq Cat /mg ES) (µg eq AO/mg ES)

BDRaqDe 33,96±6,39 14,10±3,94 178,69±13,15

CCFaqDe 219,58±5,11 46,13±1,49 79,71±4,37

BDRaqMa 226,87±27,81 53,67±12,46 100,87±5,25

CCFaqMa 71,29±9,32 22,43±3,61 33,78±7,04

BDRn-but 541,78±26,46 120,60±16,21 406,62±32,24

CCFn-but 221,85±8,86 61,20±8,92 295,13±4,14

BDRPolyphénols 673,28±36,85 171,03±4,11 3,16±1,04

CCFPolyphénols 389,36±19,54 96,77±4,16 0,51±0,32

BDRSaponines 7,60±3,52 2,27±0,15 592,51±17,06

CCFSaponines 3,13±0,72 1,33±0,32 368,44±20,34

BDRaqDe : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par décoction ; CCFaqDe : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par macération ;CCFaqMa :Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique de racines de B. dioica ; CCFn-but : Extrait butanolique de fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de racines de B. dioica ;CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines de racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines de fruits de C. colocynthis Valeur moyenne ± ESM (n=3)

Troisième partie Résultats et interprétation

D’après les résultats présentés dans le tableau 08, nous remarquons que les teneurs en polyphénols, flavonoïdes et saponines totaux varient considérablement entre les extraits et fractions des deux cucurbitacées et même entre les différents extraits et fractions au sein de la même plante.

Concernant les taux de polyphénols totaux et de flavonoïdes totaux, la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols et l’extrait butanolique BDRn-but, renferment simultanément les taux les plus élevés en polyphénols totaux et en flavonoïdes totaux, 673,28 µg eq AG/mg ES ; 171,03 µg eq Cat/mg ES et 541,78 µg eq AG/mg ES ; 120,60 µg eq Cat/mg ES respectivement. Ils sont suivis par la fraction enrichie de polyphénols CCFPolyphénols avec un taux en polyphénols totaux et en flavonoïdes totaux respectivement de : 389,36 µg eq AG/mg ES ; 96,77 µg eq Cat/mg ES.

Elle est suivi à son tour et selon un ordre décroissant par CCFn-but (221,85 µg eq AG/mg ES ;

61,20 µg eq Cat/mg ES), BDRaqMa (226,87 µg eq AG/mg ES ; 53,67 µg eq Cat/mg ES),

CCFaqDe (219,58 µg eq AG/mg ES ; 46,13 µg eq Cat/mg ES), CCFaqMa (71,29 µg eq AG/mg

ES ; 22,43 µg eq Cat/mg ES) et BDRaqDe (33,96 µg eq AG/mg ES ; 14,10 µg eq Cat/mg ES). Des teneurs trop faibles en polyphénols et flavonoïdes totaux sont observés chez les fractions enrichies de saponines BDRSaponines et CCFSaponines (Tableau 08).

De plus, les résultats du dosage des saponines totales dans les extraits et fractions rassemblés dans le tableau 08 indiquent que la teneur la plus élevée en saponines totales est celle de la fraction enrichie de saponines BDRSaponines avec 592,51 µg eq AO/mg ES, suivie par l’extrait butanolique BDRn-but, la fraction enrichie de saponines CCFSaponines, l’extrait butanolique

CCFn-but, l’extrait aqueux BDRaqDe, l’extrait aqueux BDRaqMa, l’extrait aqueux CCFaqDe et l’extrait aqueux CCFaqMa avec des taux de 406,62; 368,44; 295,13; 178,69; 100,87; 79,71 et 33,78 µg eq AO/mg ES respectivement. En revanche, seules les fractions enrichies de polyphénols BDRPolyphénols et CCFPolyphénols renferment les taux les plus faibles de saponines totales, elles contiennent environ 3,16 et 0,51 µg eq AO/mg ES respectivement.

Troisième partie Résultats et interprétation

Les principaux résultats issus de cette étude phytochimique nous permet de faire les observations suivantes :

 La composition phytochimique des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, révélée qualitativement, varie selon le matériel végétal (racines, fruits), la nature du solvant (aqueux, organique) et la méthode d’extraction (décoction, macération) utilisés.

 Les racines de B. dioica ainsi que les fruits de C. colocynthis sont riche en métabolites secondaires, tous les deux se caractérisent par la présence des tanins, flavonoïdes, saponines triterpéniques et quinones libres. En revanche, les tanins galliques, les saponines stéroïdiques ainsi que les anthraquinones sont absents dans l’ensemble des extraits de B. dioica et de C. colocynthis. Les deux plantes montrent un profil chimique similaire car appartenant à la même famille (parenté chimiotaxonomique).

 En plus, la composition phytochimique des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, révélée quantitativement, indique que les teneurs en polyphénols totaux, en flavonoïdes totaux et en saponines totales varient considérablement entre les extraits et fractions des deux cucurbitacées et même entre les différents extraits et fractions au sein de la même plante.

 Les composés phénoliques et les flavonoïdes sont plus concentrés dans : la fraction

enrichie de polyphénols des racines de B. dioica BDRPolyphénols (673,28 µg eq AG/mg

ES et 171,03 µg eq Cat/mg ES), l’extrait butanolique des racines de B. dioica BDRn-but (541,78 µg eq AG/mg ES et 120,60 µg eq Cat/mg ES) et la fraction enrichie de

polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols (389,36 µg eq AG/mg ES et 96,77 µg eq Cat/mg ES) respectivement.

 De même, les saponines sont plus concentrées dans la fraction enrichie de saponines

BDRSaponines (592,51 µg eq AO/mg ES) et l’extrait butanolique BDRn-but (406,62 µg eq AO/mg ES) des racines de B. dioica ainsi que la fraction enrichie de saponines des

fruits de C. colocynthis CCFSaponines (368,44 µg eq AO/mg ES).

Troisième partie Résultats et interprétation

II. Etude des activités biologiques des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte

1. Activité antioxydante

L’évaluation de l’activité antioxydante des extraits et fractions de B. dioica (racines) et de C. colocynthis (fruits) a été effectuée par deux méthodes. Ces deux méthodes sont basées sur deux mécanismes antioxydants différents : l’effet piégeur des radicaux libres, évalué par le test de piégeage du radical libre DPPH, et le pouvoir réducteur en utilisant le test de pouvoir réducteur du fer.

1.1. Activité antiradicalaire des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis (piégeage du radical libre DPPH)

Afin d’évaluer l’activité antiradicalaire des extraits, fractions ainsi que les molécules de références. Trois gammes de concentrations croissantes ont été établies : la première couvrant l’intervalle de 0,5 à 10 µg/mL effectuée pour l’acide ascorbique, l’acide gallique, la catéchine, le BHT, l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols. La deuxième allant de 10 à 250 µg/mL effectuée pour les extraits aqueux préparés par décoction

BDRaqDe et CCFaqDe, l’extrait aqueux préparé par macération BDRaqMa, l’extrait butanolique

CCFn-but et la fraction enrichie de polyphénols CCFPolyphénols. Alors que la troisième est comprise entre 250 et 1250 µg/mL effectuée pour l’acide oléanolique, l’extrait aqueux préparé par macération CCFaqMa et les fractions enrichies de saponines BDRSaponines et

CCFSaponines.

Les résultats indiqués dans les tableaux 09, 10 et 11 représentent les pourcentages de réduction de DPPH en fonction des différentes concentrations des échantillons testés : molécules de références, extraits ou fractions. Les valeurs de leurs CI50 respectives déterminées graphiquement sont représentées dans la figure 6 (A, B, C).

Troisième partie Résultats et interprétation

Molécules de Concentrations µg/mL (Pourcentage de réduction de DPPH %) références Acide 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 ascorbique (13,86%) (50,43%) (69,90%) (88,05%) (96,70%) (98,03%) (99,60%) Acide 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 gallique (31,04%) (47,90%) (71,48%) (75,97%) (87,99%) (95,66%) (96,08%) 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 Catéchine (26,58%) (44,01%) (53,68%) (61,82%) (78,50%) (82,74%) (87,27%) Acide 250 350 550 750 1000 1125 1250 oléanolique (26,66%) (30,41%) (33,01%) (49,15%) (63,81%) (65,30%) (69,68%) 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 BHT (9,17%) (20,49%) (35,54%) (39,73%) (43,24%) (55,80%) (70,71%)

Tableau 10 : Pourcentages de réduction de DPPH en fonction de différentes concentrations de chaque extrait des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Extraits Concentrations µg/mL (Pourcentage de réduction de DPPH %)

BDRaqDe 10 50 75 100 150 200 250 (25,76%) (35,83%) (39,73%) (45,31%) (50,67%) (58,63%) (62,93%)

CCFaqDe 10 50 75 100 150 200 250 (11,20%) (23,68%) (28,29%) (31,81%) (38,11%) (44,97%) (50,79%)

BDRaqMa 10 50 75 100 150 200 250 (31,02%) (48,00%) (56,37%) (65,41%) (76,48%) (89,50%) (95,85%)

CCFaqMa 250 350 550 750 1000 1125 1250 (25,50%) (36,03%) (41,45%) (50,92%) (58,69%) (60,24%) (64,27%)

BDRn-but 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 (10,65%) (31,81%) (52,52%) (62,84%) (69,28%) (84,59%) (94,00%)

CCFn-but 10 50 75 100 150 200 250 (32,68%) (43,34%) (52,82%) (60,39%) (74,63%) (81,59%) (85,74%)

BDRaqDe : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par décoction

CCFaqDe : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par décoction

BDRaqMa : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par macération

CCFaqMa : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par macération

BDRn-but : Extrait butanolique de racines de B. dioica

CCFn-but : Extrait butanolique de fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

Tableau 11 : Pourcentages de réduction de DPPH en fonction de différentes concentrations de chaque fraction des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Fractions Concentrations µg/mL (Pourcentage de réduction de DPPH %)

BDRPolyphénols 0,5 1,5 2,5 3,5 5 7,5 10 (18,53%) (56,04%) (74,11%) (89,92%) (93,47%) (98,10%) (99,67%)

CCFPolyphénols 10 50 75 100 150 200 250 (29,14%) (52,23%) (56,84%) (60,83%) (73,19%) (84,67%) (90,21%)

BDRSaponines 250 350 550 750 1000 1125 1250 (25,50%) (36,03%) (41,66%) (54,91%) (58,69%) (64,67%) (75,80%)

CCFSaponines 250 350 550 750 1000 1125 1250 (1,98%) (8,07%) (14,83%) (29,62%) (37,83%) (48,70%) (54,06%)

BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de racines de B. dioica

CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de fruits de C. colocynthis

BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines de racines de B. dioica

CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines de fruits de C. colocynthis

A 779,35

800

600 400 200 1,5 1,65 1,79 6,25

CI50 (µg/mL) CI50 0

Les molécules de références

B 726,75 C 800 1500

1171,5

600 1000 627,75 400 241,25 500

143,5 1,25 51,25 CI50 (µg/mL) CI50 200 47,25 2,25 61 (µg/mL) CI50 0 0

Les extraits Les fractions

Figure 06 : Activité antioxydante (méthode DPPH), valeurs des CI50 de molécules des références (A) ainsi que des extraits (B) et fractions (C) des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Troisième partie Résultats et interprétation

Les résultats illustrés dans les tableaux 09, 10 et 11 montrent une augmentation proportionnelle des pourcentages de réduction de DPPH en fonction des concentrations de l’échantillon testé : molécule de référence, extrait ou fraction des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis.

À une concentration de 10 µg/mL, les molécules de références : acide ascorbique, acide gallique, catéchine et BHT ainsi que l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols révèlent une activité antiradicalaire importante avec un pourcentage de réduction de DPPH de 99,60%; 96,08%; 87,27%; 70,71%; 94,00% et 99,67% respectivement. À cette même concentration (10 µg/mL), les extraits aqueux préparés par décoction BDRaqDe et CCFaqDe, l’extrait aqueux préparé par macération BDRaqMa, l’extrait butanolique CCFn-but et la fraction enrichie de polyphénols CCFPolyphénols montrent une faible activité antiradicalaire avec un pourcentage de réduction de DPPH de 25,76%; 11,20%; 31,02%; 32,68% et 29,14% respectivement. Tandis qu’à la forte concentration de 1250 µg/mL le pourcentage de réduction de DPPH est de l’ordre de 69,68%; 64,27%; 75,80% et 54,06% pour l’acide oléanolique, l’extrait aqueux préparé par macération CCFaqMa et les fractions enrichies de saponines BDRSaponines et CCFSaponines respectivement (Tableaux 09, 10 et 11).

Les résultats des IC50 présentés dans la figure 06 (A) montrent que les molécules de références : acide ascorbique, acide gallique et catéchine possèdent une activité antiradicalaire très élevée et supérieure à celle du BHT (6,25 μg/mL) et de l’acide oléanolique (779,35 μg/mL). L'acide ascorbique est le plus actif avec une CI50 égale à 1,5 μg/mL, suivi par l’acide gallique et la catéchine avec 1,65 μg/mL et 2,23 μg/mL respectivement.

Cependant les résultats des CI50 illustrés dans la figure 06 (B) montrent que l’extrait butanolique BDRn-but renferme une activité antiradicalaire très élevée avec une CI50 de

2,25 μg/mL par rapport aux autres extraits: BDRaqMa (47,25 μg/mL), CCFn-but (61 μg/mL),

BDRaqDe (143,5 μg/mL), CCFaqDe (241,25 μg/mL) et CCFaqMa (726,75 μg/mL).

De même, les résultats des CI50 indiqués dans la figure 06 (C) montrent que la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols présente une activité antiradicalaire très élevée proche de celle des molécules de références (acide ascorbique, acide gallique, catéchine et BHT) avec une CI50 de 1,25 μg/mL. Elle est suivie par la fraction enrichie de polyphénols CCFPolyphénols avec CI50 égale à 51,25 μg/mL. En revanche, les fractions enrichies de saponines BDRSaponines et CCFSaponines semblent moins actifs avec des CI50 de 627,25 μg/mL et 1171,5 μg/mL respectivement.

Troisième partie Résultats et interprétation

1.2. Activité réductrice des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis (pouvoir réducteur du fer)

3+ L’activité réductrice du fer se traduit par la réduction du fer ferrique (Fe ) en fer ferreux (Fe2+) en présence de molécules antioxydantes dans l’échantillon testé. La quantité du Fe2+ formé est suivie par la mesure de l’absorbance à 700 nm. Une gamme de concentrations allant de 25 à 300 µg/mL a été réalisée. Les absorbances obtenues ont permet de tracer des courbes ayant des allures linéaires et logarithmiques avec R2 compris entre 0,94 et 0,99 (Figure 07 A, B, C). Cette activité est aussi exprimée par la concentration efficace CE50 déterminée graphiquement et qui représente la concentration des molécules de références, extraits ou fractions de B. dioica (racines) et de C. colocynthis (fruits) correspondant à une absorbance de 0,5 à 700 nm (Figure 08 A, B, C).

A Acide ascorbique Acide gallique Catéchine Acide oléanolique BHT 3

2 2,5 R = 0,9951 R2 = 0,9861 2 R2 = 0,9909 R2 = 0,9953 1,5 R2 = 0,9808 1

Absorbance à 700nmà Absorbance 0,5

0 0 50 100 150 200 250 300 Concentrations (µg/mL)

B BDRaqDe CCFaqDe C BDR Polyphénols CCF Polyphénols BDRaqMa CCFaqMa BDR Saponines CCF Saponines BDRn-but CCFn-but

2,50 3,00

2,00 R2 = 0,9422 2,50 2 R = 0,9863

2,00 1,50 R2 = 0,9959 1,50 2 1,00 R2 = 0,9870 R = 0,9891 R2 = 0,9915 R2 = 0,9990 1,00 2 Absorbance à 700nmà Absorbance R2 = 0,9805 R = 0, 9754

2 700nmà Absorbance 0,50 R = 0,9724 0,50

0,00 0,00 0 100 200 300 0 100 200 300 Concentrations (µg/mL) Concentrations (µg/mL)

Figure 07 : Pouvoir réducteur du fer des molécules de références (A) ainsi que des extraits (B) et fractions (C) des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Troisième partie Résultats et interprétation

70,92

A 80 65,35

60 46,37

40 24,56 20,73

20 CE50 (µg/mL) CE50 0

Les molécules de références

B 300 261,72 C 150 122,28

250 97,58 195,3 80,49 200 173,49 100 129,82 150 94,76 50 21,67

100 CE50 (µg/mlL CE50

CE50 (µg/mL) CE50 22,68 50 0 0

Les extraits Les fractions

D’après les résultats représentés dans la figure 07, nous remarquons que l’activité réductrice du fer est proportionnelle à la concentration des molécules de références, extraits ou fractions de B. dioica (racines) et de C. colocynthis (fruits). À la concentration de 150 µg/mL les molécules de références, les extraits et les fractions présentent des absorbances qui varient dans un intervalle de 0,24 à 1,87.

Les valeurs des concentrations efficaces CE50 représentées dans la figure 08 indiquent que l’ensemble des extraits et fractions possèdent des CE50 superieures à celles des molécules de références à savoir, la catéchine, l’acide ascorbique, l’acide gallique, et le BHT qui ont des CE50 de 20,73 µg/mL; 24,56 µg/mL; 46,37 µg/mL et 65,35 µg/mL respectivement. Toutefois, l’acide oléanolique montre une activié réductrice très faible (CE50= 90,92 µg/mL) par rapport aux autres molécules de références. Seule l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols renferment des CE50 les plus basses comparativement aux autres extraits et fractions, elles sont de l’ordre de 22,68 µg/mL et 21,67 µg/mL ce qui indique une activité reductrice relativement plus importante.

Troisième partie Résultats et interprétation

1.3. Corrélation entre les teneurs en polyphénols, flavonoïdes, saponines totaux et l’activité antioxydante des différents extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis

L’étude de l’influence des teneurs en composés phénoliques, flavonoïdes et saponines des différents extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis sur l’activité antioxydante évaluée selon deux méthodes : le test du piégeage du radical libre DPPH et le test de pouvoir réducteur du fer, a été réalisée en impliquant le test de corrélation en utilisant EXCEL (2010). La détermination du coefficient de corrélation (r) permettant de chiffrer la force de liaison entre la teneur en composés et l’activité antioxydante des extraits de plantes. Les résultats obtenus sont démontrés dans le tableau 12.

r Pouvoir piégeur du radicale libre DPPH Pouvoir réducteur du fer Polyphénols totaux 0,85 0,84 Flavonoïdes totaux 0,86 0,83 Saponines totales 0,36 0,06

L’activité antioxydante des extraits et fractions semble être influencée par la teneur en polyphénols totaux et en flavonoïdes totaux. Nous remarquons des coefficients de corrélation élevés entre la teneur en polyphénols totaux et le pouvoir piégeur du radical libre DPPH ainsi que le pouvoir réducteur de fer 0,85 et 0,84 respectivement (Tableau 12).

De même, les corrélations entre les activités antiradicalaire et réductrice avec la teneur en flavonoïdes totaux sont assez importantes, notons un coefficient de corrélation r de l’ordre de 0,86 et 0,83 respectivement (Tableau 12).

Par contre, le pouvoir piégeur du radical libre DPPH ainsi que le pouvoir réducteur du fer présentent de faibles corrélations avec la teneur en saponines totales, elles sont de l’ordre de 0,36 et 0,06 respectivement (Tableau 12).

Troisième partie Résultats et interprétation

À la lumière des résultats obtenus dans cette partie de notre travail portant sur l’étude de l’activité antioxydante des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, nous pouvons conclure que :

 Les extraits et fractions des racines de B. dioica possèdent une activité antioxydante plus élevée que celle des extraits et fractions des fruits de C. colocynthis, suivant les deux méthodes évaluant l’activité antioxydante (DPPH, FRAP).

 La méthode de piégeage du radical libre DPPH ainsi que celle du pouvoir réducteur du fer sont complémentaires car l’ordre d’efficacité des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis révélé par la première méthode (DPPH) est respecté dans la deuxième méthode (FRAP).

 L’activité antioxydante des extraits et fractions des deux cucurbitacées, évaluée par deux différentes méthodes, a révélé que la fraction enrichie de polyphénols des racines

de B. dioica (BDRPolyphénols) renferme l’activité antioxydante la plus puissante (IC50 = 1,25 μg/mL; EC50 = 21,67 µg/mL) comparativement aux autres extraits et fractions, elle est proche de celle des molécules de références (acide ascorbique, acide gallique, catéchine et BHT).

 La relation entre la composition chimique et l’activité antioxydante révélée par le test de corrélation a montré que les composés phénoliques ainsi que les flavonoïdes présentent une bonne corrélation avec les deux méthodes évaluant l’activité antioxydante (DPPH, FRAP), alors que les saponines présentent une faible corrélation, ce qui laisse supposer que l’activité antioxydante est due aux composés phénoliques et aux flavonoïdes.

Troisième partie Résultats et interprétation

2. Activité antidiabétique

2.1. Evaluation de la toxicité aiguë des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis

L’administration intra-péritonéale de chacun des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis à des doses croissantes, à différents lots de rats, provoque la mort d’un certain nombre de rats dans chaque lot au bout de 72 heures. Les tableaux ci-dessous (tableau 13, tableau 14) présentent en respect le nombre de rats morts dans chaque lot en fonction des doses croissantes de l’extrait ou de la fraction administré.

Tableau 13 : Doses létales des extraits des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Doses administrées mg/kg pc (nombre de rats morts) Lot 1 (n=4) 2 (n=4) 3 (n=4) 4 (n=4) 5 (n=4) 6 (n=4) 7 (n=4) 8 (n=4)

BDRaqDe 50 (0) 100 (0) 150 (0) 200 (0) 250 (1) 300 (2) 350 (3) 400 (4)

CCFaqDe 50 (0) 100 (0) 150 (1) 200 (2) 250 (3) 300 (3) 350 (4) 400 (4)

BDRaqMa 50 (0) 100 (0) 150 (0) 200 (1) 250 (2) 300 (3) 350 (3) 400 (4)

CCFaqMa 50 (0) 100 (0) 150 (0) 200 (0) 250 (2) 300 (3) 350 (4) 400 (4)

BDRn-but 100 (0) 200 (1) 300 (1) 400 (2) 500 (2) 600 (3) 700 (4) 800 (4)

CCFn-but 100 (0) 200 (0) 300 (0) 400 (0) 500 (1) 600 (2) 700 (3) 800 (4)

Tableau 14 : Doses létales des fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis.

Doses administrées mg/kg pc (nombre de rats morts) Lot 1 (n=4) 2 (n=4) 3 (n=4) 4 (n=4) 5 (n=4) 6 (n=4) 7 (n=4)

BDRPolyphénols 50 (0) 60 (2) 70 (2) 80 (3) 90 (3) 100 (4) 200 (4)

CCFPolyphénols 50 (0) 60 (0) 70 (1) 80 (2) 90 (2) 100 (3) 200 (4)

BDRSaponines 50 (0) 60 (0) 70 (1) 80 (2) 90 (3) 100 (3) 200 (4)

CCFSaponines 50 (0) 60 (0) 70 (0) 80 (1) 90 (1) 100 (2) 200 (4)

BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

En appliquant la formule de Dragstedt et Lang. 1957 et d’après les résultats indiqués dans les tableaux 13 et 14, nous pouvons déterminer la valeur de la DL50 et estimer celle de la DL100 de chacun des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, elles sont comme suit:

 Les DL50 et DL100 des extraits aqueux préparés par décoction sont respectivement,

BDRaqDe (300 mg/kg pc et 400 mg/kg pc) et CCFaqDe (200 mg/kg pc et 350 mg/kg pc).  Les DL50 et DL100 des extraits aqueux préparés par macération sont respectivement,

BDRaqMa (250 mg/kg pc et 400 mg/kg pc) et CCFaqMa (250 mg/kg pc et 350 mg/kg pc).

 Les DL50 et DL100 des extraits butanoliques sont respectivement, BDRn-but

(400 mg/kg pc et 700 mg/kg pc) et CCFn-but (600 mg/kg pc et 800 mg/kg pc).  Les DL50 et DL100 des fractions enrichies de polyphénols sont respectivement,

BDRPolyphénols (60 mg/kg pc et 100 mg/kg pc) et CCFPolyphénols (80 mg/kg pc et 200 mg/kg pc).  Les DL50 et DL100 des fractions enrichies de saponines sont respectivement,

BDRSaponines (80 mg/kg pc et 200 mg/kg pc) et CCFSaponines (100 mg/kg pc et 200 mg/kg pc).

Les résultats des DL50 obtenus ont permis de classer les différents extraits et fractions des deux cucurbitacées selon l’échelle de toxicité de Hodge et Sterner. 1980. En se basant sur cette référence, nous constatons que la DL50 révélée se situe dans un intervalle de 50 à 500 mg/kg pc, donc les extraits aqueux et butanoliques ainsi que les fractions de polyphénols et de saponines des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis administrés par voie intra- péritonéale chez le rat, peuvent être considérés comme moyennement toxiques.

Á l’issue de cette étude de la toxicité aiguë des extraits et fractions des deux cucurbitacées, il nous a été possible de déduire et définir la dose de travail (dose pharmacologique) qui doit représenter au plus 1/10 de la DL50, utilisable par la suite lors de l’étude de leur effet antidiabétique chez le rat dans le but d’éviter leur effet toxique. De ce fait, les différents extraits et fractions ainsi que les doses de travail (mg/kg pc) testés au cours de notre expérimentation sont les suivants : BDRaqDe (30), CCFaqDe (20), BDRaqMa (25), CCFaqMa (25),

BDRn-but (40), CCFn-but (60), BDRPolyphénols (6), CCFPolyphénols (8), BDRSaponines (8),

CCFSaponines (10).

Troisième partie Résultats et interprétation

2.2. Caractéristiques générales des rats rendus diabétiques par la streptozotocine

Le diabète expérimental a été induit chez les nouveau-nés de rats Wistar, âgés de 5 jours, pesant environ 11,57±0,46 g, par une injection intra-péritonéale, unique de la streptozotocine à une dose de 90 mg/kg pc. Les rats témoins (10,98±0,34 g) reçoivent du tampon citrate (véhicule). Ces animaux, traités par la streptozotocine et le tampon citrate, sont suivis durant 2 mois et une semaine de leur âge (environ 62 jours après l’administration IP de la STZ). L’installation du diabète, ses conséquences et effets toxique, métabolique et physiologique ont été suivis périodiquement chez les rats traités par la STZ par rapport aux rats témoins (tampon citrate) par la mesure des paramètres suivants :

 La toxicité de la streptozotocine (nombre de rats morts après l’injection IP de la STZ) ;  Le poids corporel ;  La glycémie à jeun ;  La tolérance orale au glucose ;  Consommation d’aliment, d’eau et excrétion urinaire.

2.2.1. Toxicité de la streptozotocine

La STZ provoque la mort d’un certain nombre d’animaux dans les 20 jours qui suivent son administration IP à des nouveau-nés de 5 jours. Les résultats obtenus, représentés dans la figure 09, sont exprimés en taux de mortalité sur un total de 218 nouveau-nés ayant reçu une seule injection intra-péritonéale de streptozotocine (90 mg/kg pc).

45,00 42,66% 40,00

35,00 30,00 25,00 18,81% 20,00 15,00 Taux de mortalité (%) mortalité de Taux 9,17% 10,00 6,42% 5,50% 5,00 2,75% 0,00 2 4 8 15 20 Total

Jours aprés injection de STZ

Figure 09 : Taux de mortalité chez les rats injectés par la streptozotocine.

Troisième partie Résultats et interprétation

D’après la figure 09, nous constatons que la mortalité est plus élevée au 2ème jour après l’injection de la STZ, puis elle diminue progressivement jusqu’au 20ème jour, au-delà duquel elle s’annule complètement. Ce qui en résulte en définitif un taux de mortalité total de 42,66% à l’issue de cette opération d’induction du diabète expérimental chez le nouveau-né de rat. Notons par ailleurs que chez les animaux témoins ayant reçu le tampon citrate (n=100), aucune mortalité n’est observée.

2.2.2. Poids corporel

L’évolution du poids corporel aussi bien des rats injectés par la STZ que des rats injectés par le tampon citrate, a été régulièrement suivie du 5ème au 60ème jour de leur âge. La figure 10 et le tableau 15, montrent l’évolution et la variation (gain, perte) du poids corporel relevées tous les 5 jours jusqu’à l’âge de 2 mois (60 jours) de ces animaux.

250,00 Rats injectés par la streptozotocine

200,00 Rats injectés par le

tampon citrate 150,00

100,00 ** Poids corporel (g) corporelPoids 50,00 **

0,00

5 ↓ 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

STZ Temps (jours) (*) Comparaison entre le poids des rats injectés par la streptozotocine et le poids des rats injectés par le tampon citrate p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***) ; p<0,0001 (****)

Figure 10 : Variations du poids corporel chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate.

Tableau 15 : Variation du poids corporel chez les rats injectés par la streptozotocine par rapport aux rats injectés par le tampon citrate.

Rats Variation du poids corporel (%) 5 j 10 j 15 j 20 j 25 j 30 j 35 j 40 j 45 j 50 j 55 j 60 j Rats injectés par la STZ +5 -42 -2 +5 -9 +7 -8 -1 -7 +2 -6 -7 j : jour, (+): gain de poids, (-): perte de poids.

Troisième partie Résultats et interprétation

D’après ces résultats (Figure 10, Tableau 15), nous observons que le profil d’évolution du poids corporel des rats dans les deux groupes (STZ, tampon citrate) est comparable. Le poids moyen relevé chez les rats traités par la STZ est de 170,53 g alors que chez les rats témoins (tampon citrate), il est de 184,12 g après 60ème jour, mais cette différence n’est pas statiquement significative. Toutefois, les rats traités par la STZ subissent une importante chute de poids, elle est hautement significative (-42%), cinq jours après leur traitement comparativement aux rats témoins.

2.2.3. Glycémie à jeun

La figure 11 montre les valeurs de la glycémie mesurée périodiquement, chaque semaine après le sevrage, aux 30, 37, 44, 51 et 58 jours d’âge des rats injectés par la STZ ou le tampon citrate à la naissance. Le tableau 16 montre les variations relatives de la glycémie des rats traités par la STZ calculées par rapport à la glycémie des rats traités par le tampon citrate et exprimées en pourcentage, durant les 4 semaines qui suivent le sevrage.

** 2,5 Rats injectés par la ** streptozotocine

2 ** ** Rats injectés par le ** tampon citrate 1,5 ** **

1 Glycémie (g/L) Glycémie 0,5

5 ↓ 30 37 44 51 58

STZ Temps (jours)

(*) Comparaison entre la glycémie des rats injectés par la streptozotocine et la glycémie des rats injectés par le tampon citrate (n=30) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***) ; p<0,0001 (****) Figure 11 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate.

Tableau 16 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine par rapport aux rats injectés par le tampon citrate.

Rats Glycémie (%) 30 j 37 j 44 j 51 j 58 j Rats injectés par la STZ +27 +24 +32 +52 +108 j : jour, (+): augmentation de la glycémie.

Troisième partie Résultats et interprétation

D’après les résultats représentés dans la figure 11 et le tableau 16, nous constatons qu’à l’âge de 30 jours (25 jours après l’administration de la STZ), les rats traités (STZ, 90 mg/kg pc) présentent une glycémie de 1,14 g/L en moyenne, significativement plus élevée que celle des rats traités par le tampon citrate ayant une glycémie de 0,90 g/L, qui est une valeur physiologique normale chez le rat selon Giknis et Clifford. 2008. Durant les semaines suivantes, la glycémie augmente progressivement et significativement chez le groupe de rats traités par la STZ, pour atteindre une valeur de 2,15 g/L, soit une augmentation de 108%, alors que chez le groupe de rats traités par le tampon citrate, la glycémie reste constante dans les limites physiologiques (de 0,90 à 1,12 g/L).

2.2.4. Test de tolérance orale au glucose (TTOG)

Les résultats du test de tolérance orale au glucose (2 g/kg pc, pendant 120 min) effectué chez les rats traités par la STZ et les rats traités par le tampon citrate, à de la 9ème semaine de leur âge (60ème au 67ème jour de leur âge), sont indiqués dans la figure 12.

3,50 Rats injectés par la 3,00 **** streptozotocine

2,50 Rats injectés par le **** **** tampon citrate 2,00

1,50

Glycémie (g/L) Glycémie 1,00

0,50

0,00 0 60 120 Temps (minutes) (*) Comparaison entre la glycémie des rats injectés par la streptozotocine et la glycémie des rats injectés par le tampon citrate p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***) ; p<0,0001 (****), (n=20) Figure 12 : Variation de la glycémie chez les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate soumis à un test de tolérance orale au glucose.

Durant le TTOG, nous constatons une augmentation hautement significative de l’hyperglycémie au 60 et 120 min après le gavage d’une solution de glucose (2 g/kg pc) avec un taux de +79% et +75% respectivement chez le groupe injecté par la STZ par rapport au groupe injecté par le tampon citrate. En plus, la charge glycémique estimée par le calcul de l’ASC/120min est de l’ordre de 295,37±13,29 g/L/120min chez les rats injectés par la STZ, elle est plus élevée que celle des rats injectés par le tampon citrate (147,95±2,55 g/L/120min), indiquant en conséquence que les rats traités par la STZ à la naissance ont développé une intolérance orale au glucose à l’âge adulte.

Troisième partie Résultats et interprétation

2.2.5. Consommation d’aliment, d’eau et excrétion urinaire

Dans le tableau 17 sont consignés les résultats relatifs à la consommation moyenne d’aliment (g/24h) et d’eau (mL/24h) ainsi que le volume d’urines éliminé (mL/24h) pendant 24 heures, mesurés durant la 9ème semaine d’âge (60ème au 67ème jour de leur âge) chez le groupe de rats traité par la STZ et celui traité par le tampon citrate.

Aliment (g) Eau (mL) Urines (mL) Rats injectés par la STZ 33±3,09 *** 66±12,27 ** 26±5,92 ** Rats injectés par le tampon citrate 20±1,17 29±1,79 7±0,62

moyenne±ESM, (n=20), (*) Comparaison entre les rats injectés par la streptozotocine et les rats injectés par le tampon citrate p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***) ; p<0,0001 (****)

Ces résultats révèlent que la consommation d’aliment, d’eau et l’excrétion urinaire sont significativement plus élevées chez les rats injectés par la STZ par rapport aux rats injectés par le tampon citrate. Cela nous montre que les rats traités par la STZ présentent les symptômes caractéristiques du diabète à savoir : polyphagie, polydipsie et polyurie (Tableau 17).

En définitif, les rats (mâles et femelles) traités par la STZ (90 mg/kg pc, IP) à la naissance (5 jours) et ayant survécus après les 20 jours qui suivent l’injection néonatale de STZ (57,33%), sont tous devenus diabétiques à l’âge adulte (2 mois et 2 semaines) présentant une hyperglycémie comprise entre 1,50 et 2,80 g/L, une intolérance orale au glucose et des symptômes caractéristiques du diabète à savoir : polyphagie, polydipsie et polyurie. Ces animaux sont considérés, en conséquence, comme diabétiques et retenus pour la suite de l’expérimentation. En revanche, les rats traités par le tampon citrate montrent une glycémie physiologique (0,90 à 1,12 g/L) et sont considérés donc comme normaux.

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3. Effet antidiabétique des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis

L’évaluation de l’effet antidiabétique des extraits préparés à partir des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, a été réalisée chez des rats mâles diabétiques et normaux, recevant les extraits et fractions suivants : BDRaqDe (30 mg/kg pc), CCFaqDe (20 mg/kg pc),

BDRaqMa (25 mg/kg pc), CCFaqMa (25 mg/kg pc), BDRn-but (40 mg/kg pc), CCFn-but

(60 mg/kg pc), BDRPolyphénols (6 mg/kg pc), CCFPolyphénols (8 mg/kg pc), BDRSaponines

(8 mg/kg pc), CCFSaponines (10 mg/kg pc). Les rats témoins et contrôle positif reçoivent le sérum physiologique (5 mL/kg pc) et le glibenclamide (10 mg/kg pc) respectivement. Ces animaux normaux et diabétiques, expérimentaux et témoins sont suivis à :

 Court terme afin d’évaluer l’effet immédiat des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis sur la glycémie durant les trois premières heures qui suivent l’injection intra-péritonéale de chaque extrait ou fraction.

 Moyen terme pendant 21 jours, dans le but d’évaluer l’effet général des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis sur les perturbations métaboliques induites par la STZ (agent diabétogène), et cela par le bais du dosage de certains paramètres biochimiques sanguins : glycémie, cholestérol total, triglycérides, urée et créatinine, et leur effet sur l’évolution du poids corporel, prise d’eau et d’aliment et la biométrie des organes.

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.1. Effet à court terme

Les résultats relatifs de l’effet des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis sur la glycémie durant les trois premières heures après leur administration IP (de 0 à 180 min), obtenus chez les rats normaux et diabétiques sont représentés dans les figures 13 (A, B, C, D, E, F, G) et 14 (A, B, C, D, E, F, G) respectivement et le tableau 18.

Dans la figure 13 (A, B, C, D, E, F, G), nous remarquons que les rats traités par les extraits et les fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis ne présentent aucune variation significative de la glycémie chez les rats normaux. Ces extraits n’ont donc aucun effet sur la glycémie des rats normo-glycémiques.

En revanche, l’effet de ces mêmes extraits et fractions chez les rats diabétiques, illustré dans la figure 14 (A, B, C, D, E, F, G), montre une réduction de l’hyperglycémie comparativement aux rats diabétiques témoins. Le même effet est observé chez les rats contrôle positif traités par le glibenclamide 10 mg/kg pc. L’administration intra-péritonéale de l’extrait aqueux CCFaqDe ainsi que les fractions enrichies de polyphénols et de saponines

BDRPolyphénols, CCFPolyphénols, BDRSaponines et CCFSaponines, provoquent une diminution progressive et non significative de l’hyperglycémie à 30, 60 et 120 min, ainsi elle devient peu significative à 180 min avec un pourcentage de réduction de -35%, -37%, -44%, -43% et

-38% respectivement. Par contre, les extraits aqueux préparés par macération BDRaqMa,

CCFaqMa ainsi que l’extrait butanolique CCFn-but entrainent une augmentation non significative de l’hyperglycémie à 60 min avec +1%, +3% et +18% respectivement, alors qu’à 180 min ces extraits BDRaqMa, CCFaqMa et CCFn-but montrent une diminution peu significative de l’hyperglycémie avec -45%, -30% et -49% respectivement. En plus, l’extrait aqueux BDRaqDe et l’extrait butanolique BDRn-but ainsi que le glibenclamide exercent un effet similaire car ils entrainent une diminution progressive de l’hyperglycémie, elle devient significative à 180 min avec des pourcentages de réduction de -59%, -57% et -51% respectivement (Tableau 18).

D’après ces résultats, nous constatons que l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis présentent un effet antihyperglycémiant peu significatif à court terme chez les rats diabétiques. Toutefois, l’extrait aqueux BDRaqDe et l’extrait butanolique BDRn-but des racines de B. dioica présentent l’effet antihyperglycémiant le plus élevé, ils entrainent une réduction significative de l’hyperglycémie à court terme chez les rats diabétiques. Chez les normaux aucun effet hyper ou hypoglycémiant n’a été observé pour ces extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis.

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins Témoins Témoins A BDRaq De 30mg/kg B BDRaq Ma 25mg/kg C BDRn-but 40mg/kg CCFaq De 20mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCFn-but 60mg/kg 1,5 1,4

1,2 1,4

1,2 1,0 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,5 0,6

0,4 Glycémie (g/L) Glycémie

Glycémie (g/L) Glycémie 0,4 Glycémie (g/L) Glycémie 0,2 0,2 0,0 0,0 0,0 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180

Temps (minutes) Temps (minutes) Temps (minutes)

Témoins Témoins D BDR Polyphénols 6mg/kg E BDR Saponines 8mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg 1,5 1,4 1,2

1,0

0,8 1,0 0,6 0,4

0,2

Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L)Glycémie 0,5 0,0 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180

Temps (minutes) Temps (minutes)

Témoins BDRaq De 30mg/kg Témoins F CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg G BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg 2,0 CCF Saponines 10mg/kg

1,5

1,0 1,0

0,5

Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie 0,0 0 30 60 120 180 0,0 0 30 60 120 180 Temps (minutes) Temps (minutes)

Figure 13 : Variations de la glycémie à court terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits aqueux préparés par décoction, BDRaqDe et CCFaqDe

B : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits aqueux préparés par macération, BDRaqMa et CCFaqMa

C : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits butanoliques, BDRn-but et CCFn-but

D : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols

E : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines F : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les différents extraits G : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les différentes fractions

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins Témoins Témoins A Glibenclamide 10mg/kg B Glibenclamide 10mg/kg C Glibenclamide 10mg/kg BDRaq De 30mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFaq De 20mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCFn-but 60mg/kg

2,5 2,5 2,5

2,0 2,0 2,0 1,5 * 1,5 1,5

* *

1,0 ** 1,0 1,0

Glycémie (g/L) Glycémie

** Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie ** 0,5 ** 0,5 0,5 ** 0,0 0,0 0,0 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 Temps (minutes) Temps (minutes) Temps (minutes)

Témoins Témoins D Glibenclamide 10mg/kg E Glibenclamide 10mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDR Saponines 8mg/kg 3,0 CCF Polyphénols 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

3,0

2,0 2,0

* 1,0 *

1,0 * * Glycémie (g/L) Glycémie ** (g/L) Glycémie ** 0,0 0,0 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 Temps (minutes) Temps (minutes)

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins F G Glibenclamide 10mg/kg BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg 2,5 CCF Saponines 10mg/kg

2,5

2,0 2,0 1,5 1,5 * * 1,0 * 1,0 *

** (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie ** * 0,5 0,5 ** 0,0 0,0 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 Temps (minutes) Temps (minutes)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (eau physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 14 : Variations de la glycémie à court terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits aqueux préparés par décoction, BDRaqDe et CCFaqDe

B : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits aqueux préparés par macération, BDRaqMa et CCFaqMa

C : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits butanoliques, BDRn-but et CCFn-but

D : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols

E : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines F : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les différents extraits G : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les différentes fractions

Troisième partie Résultats et interprétation

Extrait / Fraction Variation de la glycémie (%) par rapport aux rats témoins administré IP Rats diabétiques Rats normaux 0 30 60 120 180 0 30 60 120 180 Glibenclamide -12 -31 -36 -34 -51 / / / / /

BDRaqDe +6 -17 -33 -29 -59 -4 +16 +18 -7 -2

CCFaqDe -10 -20 -30 -23 -35 +5 +9 +11 +1 +14

BDRaqMa -22 +4 +1 -21 -54 -3 -9 -7 -12 +1

CCFaqMa -4 -14 +3 +8 -30 -5 +1 +9 -15 +11

BDRn-but -18 -8 -29 -40 -57 -3 +2 +12 -8 -3

CCFn-but -22 +11 +18 -8 -49 -1 -7 -8 -7 0

BDRPolyphénols -21 -20 -29 -24 -37 -7 -7 -2 -10 +7

CCFPolyphénols -18 -10 -13 -28 -44 -1 -8 -9 -7 0

BDRSaponines -22 -10 -14 -27 -43 -2 -11 -11 -7 +2

CCFSaponines -7 -13 -26 -22 -38 -4 -12 0 -3 -3

Glibenclamide : contrôle positif BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

3.2.2. Effet à moyen terme

Les résultats relatifs à l’effet des différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis administrés quotidiennement par voie intra-péritonéale pendant 21 jours chez les rats normaux et diabétiques (expérimentaux et témoins) sont représentés dans les figures 15 (A, B, C, D, E, F, G) et 16 (A, B, C, D, E, F, G) respectivement et le tableau 19.

Dans la figure 15 (A, B, C, D, E, F, G), nous remarquons que les extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis n’ont aucun effet sur la glycémie des rats normo-glycémiques.

Chez les rats diabétiques (figure 16 A, B, C, D, E, F, G), l’injection IP de l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis provoquent une diminution variable, selon l’extrait administré, de l’hyperglycémie aux 7ème, 14ème et 21ème jours d’expérimentation comparativement aux rats diabétiques témoins, cette diminution peut être significative ou très significative. Au 21ème jour, tous les extraits et les fractions préparés à partir des racines de B. dioica présentent un effet antihyperglycémiant plus important que ceux préparés à partir des fruits de C. colocynthis, à l’exception de la fraction enrichie de polyphénols CCFPolyphénols qui a présenté une diminution significative (-61%) comparable à celle de la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols (-59%) (Tableau 19). Parmi l’ensemble des extraits, nous constatons que les extraits BDRn-but, BDRaqDe et CCFn-but montrent un effet antihyperglycémiant relativement plus important que les autres extraits, induisant une baisse de glycémie de -68%, -64% et -63% respectivement au 21ème jour. Concernant les fractions de

B. dioica et de C. colocynthis, les fractions BDRSaponines et CCFPolyphénols exercent l’effet antihyperglycémiant le plus élevé par rapport aux autres fractions, qui est de -72% et -61% respectivement au 21ème jour d’expérimentation. L’administration du glibenclamide (10 mg/kg pc) entraine une diminution significative au 7ème (-41%), 14ème (-39%) et au 21ème (-58%) jours du traitement par rapport aux rats diabétiques témoins (Tableau 19).

Á la lumière de ces résultats, nous constatons que les extraits et fractions testés à moyen terme chez les rats diabétiques présentent tous un effet antihyperglycémiant, à des degrés variables selon leur origine (B. dioica ou C. colocynthis) et leur mode de préparation. Parmi ces extraits, en particulier, l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de saponines

BDRSaponines exercent un effet antihyperglycémiant très significatif à moyen terme. Par ailleurs, l’ensemble des extraits et fractions testés ne montrent aucune influence sur la glycémie des rats normaux.

Troisième partie Résultats et interprétation

A Témoins B Témoins C Témoins BDRaq De 30mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFaq De 20mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCFn-but 60mg/kg 1,2 1,2 1,2 1,0

1,0 1,0

0,8 0,8 0,8

0,6 0,6 0,6

0,4 0,4 0,4

Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie 0,2 0,2 0,2

0,0 0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours) Temps (jours)

D Témoins Témoins BDR Polyphénols 6mg/kg E BDR Saponines 8mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

1,5 1,5

1,0 1,0

0,5 0,5

Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie

0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

F Témoins BDRaq De 30mg/kg G Témoins BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCF Saponines 10mg/kg CCFn-but 60mg/kg

1,5 1,2

1,0

1,0 0,8 0,6

0,4 Glycémie (g/L) Glycémie

Glycémie (g/L) Glycémie 0,5 0,2 0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

Figure 15 : Variations de la glycémie à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits aqueux préparés par décoction, BDRaqDe et CCFaqDe

B : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits aqueux préparés par macération, BDRaqMa et CCFaqMa

C : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les extraits butanoliques, BDRn-but et CCFn-but

D : Variation de la glycémie chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols

Troisième partie Résultats et interprétation

2,5

2,5 2,5

2,0 *** ***

*** 2,0 **

*** 2,0

***

** ** **

1,5 **

* ***

***

1,5 1,5 **

1,0

Glycémie (g/L) Glycémie

1,0 1,0

Glycémie (g/L) Glycémie Glucémie (g/L) Glucémie 0,5 0,5 0,5 0,0 0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours) Temps (jours)

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins Glibenclamide 10mg/kg D E BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg

3,0 3,0

2,5 2,5 2,0

2,0 ***

***

** ***

1,5

1,0 1,0

Glycémie (g/L) Glycémie Glycémie (g/L) Glycémie 0,5 0,5 0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

F Témoins Glibenclamide 10mg/kg G Témoins Glibenclamide 10mg/kg BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg 3,0 3,0

2,5 2,5

2,0

***

*** ***

2,0 ***

***

*** **

** ***

** ** ** ** **

***

*** **

*** 1,5

** *** **

1,5

Glycémie (g/L) Glycémie

1,0

Glycémie (g/L) Glycémie 1,0 0,5 0,5 0,0 0,0 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 16 : Variations de la glycémie à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits aqueux préparés par décoction, BDRaqDe et CCFaqDe

B : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits aqueux préparés par macération, BDRaqMa et CCFaqMa

C : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les extraits butanoliques, BDRn-but et CCFn-but

D : Variation de la glycémie chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols

Troisième partie Résultats et interprétation

Extrait / Fraction Variation de la glycémie (%) par rapport aux rats témoins administré IP Rats diabétiques Rats normaux 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j Glibenclamide -12 -41 -39 -58 / / / /

BDRaqDe +6 -60 -39 -64 -4 -9 -6 -8

CCFaqDe -10 -51 -32 -51 +5 +11 +3 +9

BDRaqMa -22 -29 -50 -54 -3 -7 -2 +1

CCFaqMa -4 -42 -47 -53 -5 -12 -19 +4

BDRn-but -18 -35 -33 -68 -3 +3 -8 +10

CCFn-but -22 -33 -56 -63 -1 +19 -10 -4

BDRPolyphénols -21 -37 -40 -59 -7 -13 -10 +8

CCFPolyphénols -18 -40 -53 -61 -1 -15 -5 +10

BDRSaponines -22 -36 -49 -72 -2 -3 +2 -6

CCFSaponines -7 -34 -44 -57 -4 +1 -2 +8

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.3. Effet des extraits et fractions des racines de Bryonia dioica et des fruits de Citrullus colocynthis sur les paramètres biochimiques sanguins chez les rats normaux et diabétiques

2.3.3.1. Effet sur le taux de cholestérol total et de triglycérides

Les résultats relatifs aux effets des extraits et fractions sur les taux de cholestérol total et des triglycérides sériques chez les rats normaux (expérimentaux et témoins) ainsi que chez les rats diabétiques (expérimentaux et témoins) sont représentés dans les figures 17 à 20 et tableaux 20 et 21 respectivement.

 Le cholestérol total

Les variations du taux de cholestérol total sérique chez les rats normaux (Figure 17, Tableau 20), montrent que l’administration quotidienne des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis ne présentent aucune influence significative sur ce paramètre durant toute la durée de l’expérimentation. Notons toutefois des diminutions non significatives dans le cas des extraits BDRaqDe, CCFaqDe, BDRn-but, CCFn-but, alors que les autres extraits et fractions présentent une augmentation non significative par rapport aux témoins. La cholestérolémie chez le groupe de rats témoins traité par le sérum physiologique, varie entre 0,68 et 0,74 g/L.

Chez les rats diabétiques, les variations du taux de cholestérol total sérique (Figure 18, Tableau 21) indiquent que tous les extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis diminuent significativement l’hypercholestérolémie aux 7ème, 14ème et 21ème jours par rapport aux témoins. Une diminution très significative est notée au 21ème jour principalement pour les extraits butanoliques BDRn-but (-78%) et CCFn-but (-76%) suivis par les extraits aqueux préparés par décoction BDRDe (-65%) et CCFDe (-63%). Tandis que chez les rats contrôle positif traités par le glibenclamide (10 mg/kg pc), nous observons une diminution non significative de l’hypercholestérolémie qui passe de 1,50 g/L (T0) à 1,33 g/L (21ème jour).

Troisième partie Résultats et interprétation

 Les triglycérides

Concernant les variations du taux de triglycérides sériques chez les rats normaux indiquées dans la figure 19 et le tableau 20, nous observons une diminution non significative chez les rats traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis à l’exception des extraits aqueux CCFaqDe et BDRaqMa qui ont tendance à augmenter le taux du triglycérides d’une manière non significative dès le 7ème jour de la période expérimentale.

Chez les rats diabétiques (Figure 20, Tableau 21) nous remarquons une diminution progressive à moyen terme chez les rats traités par les différents extraits et fractions par rapport aux rats témoins, cette diminution est très significative au 21ème jour. Le glibenclamide à son tour diminue le taux du triglycérides d’une manière progressive mais non significative.

Á propos de ces résultats, nous constatons que l’administration des différents extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis à moyen terme provoquent une diminution significative du taux de cholestérol total et des triglycérides sériques chez les rats diabétiques, alors que cet effet n’est pas observé chez les rats normaux qui ne sont pas influencés par le traitement.

Troisième partie Résultats et interprétation

A Témoins BDRaq De 30mg/kg B Témoins BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg CCF Saponines 10mg/kg 1,20 1,20

1,00 1,00

0,80 0,80

0,60 0,60

0,40 0,40

Cholestérol total (g/L) total Cholestérol 0,20 0,20 Cholestérol total (g/L) total Cholestérol 0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

Figure 17 : Variations du taux de cholestérol total à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du cholestérol total chez les rats normaux traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but

B : Variation du cholestérol total chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins Glibenclamide 10mg/kg A BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg B BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg 1,80

1,60 1,80

1,40 1,60 ***

** 1,40 **

1,20 **

***

1,20

***

*** ***

1,00 ***

***

1,00

0,80 ***

*** ***

0,80

0,60 0,60

0,40 (g/L) total Cholestérol 0,40 Cholestérol total (g/L) total Cholestérol 0,20 0,20 0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 18 : Variations du taux de cholestérol total à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du cholestérol total chez les rats diabétiques traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but

B : Variation du cholestérol total chez les rats diabétiques traités par les différentes fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Troisième partie Résultats et interprétation

A Témoins BDRaq De 30mg/kg B Témoins BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCFn-but 60mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

1,20 1,20

1,00 1,00

0,80 0,80

0,60 0,60 Triglycérides (g/L) Triglycérides Triglycérides (g/L) Triglycérides 0,40 0,40

0,20 0,20

0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

Figure 19 : Variations du taux de triglycérides à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du triglycérides chez les rats normaux traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but

B : Variation du triglycérides chez les rats normaux traités par les différentes fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins A BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg B Glibenclamide 10mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

1,60

1,40

1,40 **

***

1,20 *

1,20

***

** ***

1,00 * ***

1,00

***

0,80

***

*** ***

0,80

*** **

0,60 ***

0,60

Triglycérides (g/L) Triglycérides

0,40 Triglyycérides (g/L) Triglyycérides 0,40 0,20 0,20 0,00 0 7 14 21 0,00 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 20 : Variations du taux de triglycérides à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du triglycérides chez les rats diabétiques traités par les extraits BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but CCFn-but

B : Variation du triglycérides chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Troisième partie Résultats et interprétation

Tableau 20 : Variation des taux du cholestérol total et de triglycérides à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis

par rapport aux rats témoins. Extrait / Fraction Variation du cholestérol total (%) Variation du triglycérides (%) administré IP 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j

BDRaqDe +11 -9 -17 -25 -4 -4 -9 -12

CCFaqDe +8 -4 -9 -33 -8 +9 +2 +15

BDRaqMa +13 +19 +8 +4 -2 +2 +9 +14

CCFaqMa -5 +31 +15 +40 0 -13 -44 -24

BDRn-but +19 -4 -6 -12 +5 -18 -26 -4

CCFn-but +4 -11 -15 -41 +3 -35 -20 -34

BDRPolyphénols +9 +18 +35 +20 -3 -18 -23 -6

CCFPolyphénols +16 +26 +19 +23 -4 -8 -18 -2

BDRSaponines +9 +19 +23 +4 +12 -4 -1 -2

CCFSaponines +6 +18 +10 +16 +2 -23 -34 -8

BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction ; CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération ; CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica ; CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica ; CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis Tableau 21 : Variation des taux du cholestérol total et de triglycérides à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis par rapport aux rats témoins.

Extrait / Fraction Variation du cholestérol total (%) Variation du triglycérides (%) administré IP 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j Glibenclamide +1 -26 -21 -19 -5 -3 -22 -24

BDRaqDe -7 -42 -54 -65 -1 -27 -47 -60

CCFaqDe -1 -46 -63 -63 -5 -10 -14 -34

BDRaqMa +4 -47 -51 -45 -6 -53 -49 -35

CCFaqMa +5 -42 -45 -43 -4 -27 -60 -59

BDRn-but -9 -60 -76 -78 -2 -77 -77 -79

CCFn-but +12 -62 -66 -76 -2 -45 -59 -72

BDRPolyphénols +2 -21 -61 -53 -2 -4 -50 -54

CCFPolyphénols -4 -31 -53 -51 +2 -14 -23 -30

BDRSaponines -6 -47 -40 -52 -1 -34 -54 -54

CCFSaponines -2 -38 -41 -54 -4 -8 -65 -73 Glibenclamide : contrôle positif BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction ; CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération ; CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica ; CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica ; CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.3.2. Effet sur le taux d’urée et de la créatinine

Les résultats relatifs aux variations du taux d’urée et de créatinine sériques mesurés chez les rats normaux et diabétiques traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis à moyen terme, sont représentés dans les figures 21 à 24 et les tableaux 22 et 23.

 Urée

Chez les rats normaux, nous remarquons que le traitement pendant 21 jours par les différents extraits et fractions des deux cucurbitacées, ne provoque aucun changement significatif du taux d’urée chez les différents groupes de rats témoins et expérimentaux (Figure 21, Tableau 22).

Chez les rats diabétiques, nous observons une diminution peu significative au 21ème jour seulement chez les groupes expérimentaux traités par les extraits aqueux : BDRaqDe (-29%),

CCFaqDe (-16%), BDRaqMa (-27%), CCFaqMa (-25%), l’extrait butanolique BDRn-but (-29%) ainsi que la fraction enrichie de saponines BDRSaponines (-30%) (Figure 22, Tableau 23).

L’urémie chez les animaux témoins diabétiques est presque doublée, lorsque comparée à celle des rats témoins normaux (45 mg/dL vs 25 mg/dL) consécutivement à l’installation du diabète.

 Créatinine

Concernant les variations du taux de la créatinine à moyen terme, l’ensemble des extraits et fractions n’entrainent pas de variations significatives de ce paramètre chez les rats normaux et diabétiques traités pendant 21 jours par rapport aux rats témoins (Figure 23, Tableau 22) ; (Figure 24, Tableau 23).

Contrairement à l’urémie, la créatinine ne semble pas être influencée par l’installation du diabète, sa valeur absolue se situe au voisinage de 1,2 mg/dL.

En tenant compte de ces résultats, nous constatons que les extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis administrés chez les rats diabétiques, entrainent à des degrés variables la diminution du taux d’urée sans aucun effet sur le taux de la créatinine, ils ont tendance à diminuer la polyurie apparue dans l’état diabétique. Ces extraits et fractions administrés quotidiennement pendant 21 jours par voie intra-péritonéale ne semblent pas provoquer une toxicité (néphrotoxicité particulièrement) chez les rats normaux et diabétiques traités.

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins BDRaq De 30mg/kg Témoins A CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg B BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg 45,00 35,00 40,00 30,00

35,00

30,00 25,00 25,00 20,00 20,00 15,00

15,00 (mg/dL) Urée Urée (mg/dL) Urée 10,00 10,00

5,00 5,00 0,00 0 7 14 21 0,00 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

Figure 21 : Variations du taux d’urée à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de l’urée chez les rats normaux traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et CCFn-but

B : Variation de l’urée chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

A Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg B Glibenclamide 10mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg 60,00 70,00

50,00 * 60,00

* ** 40,00 * 50,00 40,00 * 30,00

30,00

Urée (mg/dL) Urée Urée (mg/dL) Urée 20,00 20,00

10,00 10,00

0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 22 : Variations du taux d’urée à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de l’urée chez les rats diabétiques traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et CCFn-but

B : Variation de l’urée chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Troisième partie Résultats et interprétation

1,20

1,00 1,00 0,80 0,80 0,60 0,60

0,40 (mg/dL) Créatinine Créatinine (mg/dL) Créatinine 0,40 0,20 0,20

0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

Figure 23 : Variations du taux de la créatinine à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la créatinine chez les rats normaux traités par les extraits BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but, CCFn-but

B : Variation de la créatinine chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins A B Glibenclamide 10mg/kg BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg

1,40 1,40

1,20 1,20

1,00 1,00

0,80 0,80

0,60 0,60 Créatinine (mg/dL) Créatinine Créatinine (mg/dL) Créatinine 0,40 0,40

0,20 0,20

0,00 0,00 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 24 : Variations du taux de la créatinine à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation de la créatinine chez les rats diabétiques traités par les extraits BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but, CCFn-but

B : Variation de la créatinine chez les rats diabétiques traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Troisième partie Résultats et interprétation

Extrait / Fraction Variation d’urée (%) Variation de créatinine (%) administré IP 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j

BDRaqDe +21 -8 -16 -23 -22 -4 -31 +6

CCFaqDe +22 -3 -21 -8 -15 -12 -29 -4

BDRaqMa -3 +10 -1 -5 -4 +21 -13 +6

CCFaqMa +9 +7 +22 +4 -15 +13 -11 -3

BDRn-but -2 +26 -12 -8 -9 +2 -19 -15

CCFn-but +20 +27 -11 -14 -20 +3 -28 -7

BDRPolyphénols +17 -6 -26 -30 +3 -7 -10 +7

CCFPolyphénols +2 -5 -34 -33 -3 +15 -22 +13

BDRSaponines +19 +2 -15 -33 -10 -11 -5 +10

CCFSaponines +14 -6 -20 -31 -19 -9 -20 +8

BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction ; CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par macération ; CCFaqMa : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica ; CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica ; CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Extrait / Fraction Variation d’urée (%) Variation de créatinine (%) administré IP 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j Glibenclamide -8 -10 -8 -14 -8 -2 +4 +4

BDRaqDe -2 -9 -23 -29 -11 -22 -7 -15

CCFaqDe -5 -24 -24 -16 -16 -28 -16 +7

BDRaqMa +2 +2 +5 -27 -14 -23 -7 -17

CCFaqMa -10 -11 -7 -25 -18 -28 -16 +7

BDRn-but -7 -4 -7 -29 -29 -29 -22 -19

CCFn-but +6 -10 -9 -25 -27 -31 +4 +3

BDRPolyphénols +24 -6 -3 -32 -18 -10 -14 -14

CCFPolyphénols +26 -7 -19 -29 -14 -34 +3 -18

BDRSaponines +8 -10 -1 -30 -9 -5 -1 -6

CCFSaponines +33 -4 -8 -28 -5 -24 -16 -11 Glibenclamide : contrôle positif BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction ; CCFaqDe : Extrait aqueux des fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par macération ; CCFaqMa : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica ; CCFn-but : Extrait butanolique des fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica ; CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols des fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica ; CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines des fruits de C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.4. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur le poids corporel chez les rats normaux et diabétiques

Les résultats de l’effet des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis administrés par voie intra-péritonéale pendant 21 jours sur le poids corporel chez les rats normaux et diabétiques sont représentés dans les figures 25 et 26. Le gain ou la perte du poids corporel (%) calculé chez les différents groupes de rats expérimentaux par rapport aux groupes de rats témoins sont représentés dans le tableau 24.

Chez les rats normaux (Figure 25, Tableau 24), nous observons une évolution progressive du poids corporel aussi bien chez les rats expérimentaux que chez les rats témoins tout le long de l’expérimentation. Au 21ème jour, les groupes expérimentaux traités par les extraits butanoliques BDRn-but et CCFn-but ainsi que les fractions CCFPolyphénols et BDRSaponines montrent une augmentation pondérale très significative par rapport au groupe témoins, elle est de l’ordre de +14%; +13%; +9% et +14% respectivement. Il en est de même chez les rats traités par les extraits BDRaqDe, BDRaqMa et la fraction BDRPolyphénols, ils présentent une augmentation pondérale significative, elle est de +9%; +10% et +6% respectivement. Contrairement aux précédents, les rats traités par les extraits CCFaqDe, CCFaqMa et la fraction CCFSaponines ne présentent aucune évolution significative du poids corporel pendant 21 jours d’expérimentation.

Chez les rats diabétiques (Figure 26, Tableau 24), nous remarquons une chute de poids corporel chez les témoins pendant toute la durée de l’expérimentation, passant de 193 g à 183 g. Concernant les groupes expérimentaux, nous notons au contraire un gain significatif de poids corporel dès le 7ème jour du traitement, il est très significatif aux 14ème et 21ème jours. ème Au 21 jour, les rats traités par les extraits butanoliques BDRn-but, CCFn-but et la fraction enrichie de saponines BDRSaponines présentent un gain de poids corporel de +49% ; +40% et +40% respectivement par rapport aux rats témoins, suivis par les rats traités par les extraits et fractions CCFaqDe, BDRaqDe, CCFSaponines, BDRPolyphénols, CCFPolyphénols avec +38%; +37%; +36%; +34% et +32% respectivement, ensuite les rats traités par le glibenclamide et les extraits CCFaqMa, BDRaqRe avec +29%; +29% et +26% respectivement.

Á l’issue de ces résultats, nous pouvons conclure que l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis possèdent la capacité de prévenir la chute de poids corporel chez les rats diabétiques suite d’un traitement pendant 21 jours.

Troisième partie Résultats et interprétation

A Témoins BDRaq De 30mg/kg B Témoins CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg

CCF Saponines 10mg/kg ***

350 ***

***

*** ***

** 350

***

** **

300

250 250 200 200

150 150 Poids corporel (g) corporelPoids

Poids corporel (g) corporelPoids 100 100

50 50

0 0 0 7 14 21 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours) (*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 25 : Variations du poids corporel à moyen terme chez les rats normaux traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du poids corporel chez les rats normaux traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but

B : Variation du poids corporel chez les rats normaux traités par les fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Témoins Glibenclamide 10mg/kg Témoins A BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg B Glibenclamide 10mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Saponines 8mg/kg

CCF Saponines 10mg/kg

***

*** ***

350 ***

*** ***

300 ***

***

*** *** ***

***

*** ***

300

***

** **

250

200 200 150 150

100 (g) corporelPoids 100 Poids corporelPoids(g) 50 50 0 0 7 14 21 0 0 7 14 21 Temps (jours) Temps (jours)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Figure 26 : Variations du poids corporel à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variation du poids corporel chez les rats diabétiques traités par les extraits, BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but et

CCFn-but

B : Variation du poids corporel chez les rats diabétiques traités par les différentes fractions enrichies de polyphénols, BDRPolyphénols et

CCFPolyphénols et enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines

Troisième partie Résultats et interprétation

Extrait / Fraction Gain ou perte de poids corporel (%) par rapport aux rats témoins administré IP Rats diabétiques Rats normaux 0 7ème j 14ème j 21ème j 0 7ème j 14ème j 21ème j Glibenclamide +6 +18 +24 +29 / / / /

BDRaqDe +1 +17 +27 +37 +1 +1 +6 +9

CCFaqDe +2 +21 +30 +38 +3 +4 +9 +6

BDRaqMa 0 +18 +19 +26 +3 +13 +13 +10

CCFaqMa +3 +17 +23 +29 -2 +6 +5 +3

BDRn-but +4 +31 +41 +49 +2 +8 +13 +14

CCFn-but +3 +23 +39 +40 +5 +10 +16 +13

BDRPolyphénols +2 +27 +34 +34 +3 +6 +6 +6

CCFPolyphénols 0 +16 +27 +32 -1 +7 +10 +9

BDRSaponines +1 +23 +33 +40 +5 +14 +14 +14

CCFSaponines +2 +19 +26 +36 +3 +3 +8 +9

Glibenclamide : contrôle positif BDRaqDe : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par décoction CCFaqDe : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par décoction BDRaqMa : Extrait aqueux de racines de B. dioica préparé par macération CCFaqMa : Extrait aqueux de fruits de C. colocynthis préparé par macération BDRn-but : Extrait butanolique de racines de B. dioica CCFn-but : Extrait butanolique de fruits de C. colocynthis BDRPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de racines de B. dioica CCFPolyphénols : Fraction enrichie de polyphénols de fruits de C. colocynthis BDRSaponines : Fraction enrichie de saponines de racines de B. dioica CCFSaponines : Fraction enrichie de saponines de fruits de C. colocynthis

(+): gain de poids, (-): perte de poids.

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.5. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur la consommation d’aliment et d’eau chez les rats normaux et diabétiques

La consommation d’aliment (g/jour) et d’eau (mL/jour) a été suivie durant les trois semaines d’expérimentation (S1, S2, S3) chez les rats normaux et diabétiques, expérimentaux et témoins. Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 27 (A, B) et 28 (A, B) respectivement.

 La consommation d’aliment

Dans la figure 27 (A), nous remarquons que la consommation d’aliment est comparable entre les différents groupes de rats normaux, expérimentaux et témoins, dont la quantité d’aliment consommée varie entre 55 et 69 g/jour. Chez les rats diabétiques figure 27 (B), nous observons une augmentation de la consommation d’aliment chez le groupe témoin (sérum physiologique) et le groupe contrôle positif (glibenclamide 10 mg/kg pc) à la troisième semaine du traitement (S3), elle est respectivement 115 et 113 g/jour. Tandis que chez les groupes expérimentaux traités par les différents extraits et fractions des deux cucurbitacées, nous remarquons que la consommation d’aliment demeure stable avec une diminution non significative au S3 par rapport au groupe témoin se situant à environ 100 g/jour.

 La consommation d’eau

Les résultats illustrant la consommation d’eau chez les rats normaux figure 28 (A), indiquent que l’administration intra-péritonéale des extraits et fraction de B. dioica et C. colocynthis ne provoque aucune variation significative de la consommation d’eau chez les rats expérimentaux par rapport aux rats témoins. Par contre chez les rats diabétiques figure 28 (B), nous constatons une réduction non significative de la consommation d’eau chez les rats expérimentaux traités par les différents extraits et fractions par rapport aux rats témoins. Au contraire, chez les groupes témoin diabétique (sérum physiologique) et contrôle positif (glibenclamide), la consommation d’eau est comparable et reste très élevée durant toute la durée de l’expérimentation.

D’après ces résultats, nous constatons que le traitement par les extraits et les fractions de B. dioica et C. colocynthis pendant 21 jours entrainent une diminution non significative de la consommation d’aliment et d’eau chez les rats diabétiques, ils ont tendance à atténuer la polyphagie et la polydipsie consécutives à l’état diabétique.

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins BDRaq De 30mg/kg Témoins Glibenclamide 10mg/kg A CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg B BDRaq Re 30mg/kg CCFaq Re 20mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg

CCF Saponines 10mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

80 140

70 120

60 100

50 80 40 60 30 40 20

Consommation d'alimentConsommation (g/jour) 20 10 Consommation d'aliment (g/jour) d'aliment Consommation 0 0 S1 S2 S3 S1 S2 S3 Temps (semaines) Temps (semaines)

Figure 27 : Variations de la consommation d’aliment à moyen terme chez les rats normaux (A) et diabétiques (B) traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variations de la consommation d’aliment à moyen terme chez les rats normaux traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis B : Variations de la consommation d’aliment à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis

A Témoins BDRaq De 30mg/kg B Témoins Glibenclamide 10mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg BDRaq Re 30mg/kg CCFaq Re 20mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg 140

300

120 250 100 200 80 150 60

40 100

20 50

Consommation d'eau (mL/jour) d'eau Consommation Consommation d'eau (mL/jour) d'eau Consommation 0 0 S1 S2 S3 S1 S2 S3 Temps (semaines) Temps (semaines)

Figure 28 : Variations de la consommation d’eau à moyen terme chez les rats normaux (A) et diabétiques (B) traités par les extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis.

A : Variations de la consommation d’eau à moyen terme chez les rats normaux traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis B : Variations de la consommation d’eau à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

2.3.6. Effet des extraits et fractions de Bryonia dioica et Citrullus colocynthis sur la biométrie de certains organes chez les rats normaux et diabétiques

L’effet des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis sur le poids de certains organes suite à leur administration intra-péritonéale et quotidienne à moyen terme chez les rats normaux et diabétiques, expérimentaux et témoins, est représenté dans la figure 29 (A, B).

Chez les rats normaux, figure 29 (A), nous n’observons aucune variation significative du poids relatif des organes étudiés : pancréas, foie, reins et rate chez les rats expérimentaux traités par les différents extraits et fractions par rapport aux rats témoins.

Chez les rats diabétiques, figure 29 (B), nous remarquons que le groupe témoin montre un poids relatif du foie très élevé par rapport aux groupes expérimentaux, il est de l’ordre de 5,65%. Concernant le poids relatif du pancréas, foie, reins et rate chez les expérimentaux, aucune variation significative n’est observée pour l’ensemble des extraits et fractions de

B. dioica et de C. colocynthis, à l’exception de l’extrait BDRaqDe et la fraction BDRSaponines qui ont diminué peu significativement le poids relatif du pancréas, foie, reins et rate.

Les variations du poids relatif des organes peuvent être un signe révélateur de la toxicité des extraits et fractions testés. De ce fait, les extraits et fractions des deux cucurbitacées, administrés par voie intra-péritonéale pendant 21 jours chez les rats normaux et diabétiques semblent dépourvus de toxicité car aucune variation significative du poids relatif des organes n’est observée.

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg BDRaq Ma 25mg/kg A CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

4,00

3,50

3,00

2,50

2,00

1,50 Poids relatif (%) relatifPoids 1,00

0,50

0,00 Pancréas Foie Reins Rate

Témoins Glibenclamide 10mg/kg BDRaq De 30mg/kg CCFaq De 20mg/kg B BDRaq Ma 25mg/kg CCFaq Ma 25mg/kg BDRn-but 40mg/kg CCFn-but 60mg/kg BDR Polyphénols 6mg/kg CCF Polyphénols 8mg/kg BDR Saponines 8mg/kg CCF Saponines 10mg/kg

7,00

6,00

5,00

4,00 * *

3,00

Poids relatif (%) relatifPoids

2,00 *

1,00 * * * * * 0,00 Pancréas Foie Reins Rate

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

A : Variations du poids relatif des organes à moyen terme chez les rats normaux traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis B : Variations du poids relatif des organes à moyen terme chez les rats diabétiques traités par les différents extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis

Troisième partie Résultats et interprétation

2.4. Evaluation de l’effet de quelques extraits et fractions des racines de Bryonia dioica chez les rats diabétiques soumis à un test de tolérance orale au glucose

L’effet de la co-administration orale de l’extrait aqueux préparé par décoction BDRaqDe, l’extrait butanolique BDRn-but ainsi que la fraction enrichie de saponines BDRSaponines de B. dioica avec le glucose (2 g/kg pc) chez les rats diabétiques, est représenté dans la figure 30 et le tableau 25.

D’après les résultats du TTOG obtenus chez les rats diabétiques, nous observons que chez les témoins (glucose 2 g/kg pc) le pic d’hyperglycémie atteint son maximum 30 min après le gavage de la solution du glucose, notons une glycémie de 2,59 g/L. Par la suite, cette hyperglycémie diminue progressivement pour arriver à une glycémie de 2,15 g/L à 180 min restant plus élevée à sa valeur initiale (1,79 g/L). La charge glycémique étant de 403,26 g/L/180min.

Chez les différents groupes de rats expérimentaux traités par l’extrait BDRaqDe (30 mg/kg pc), l’extrait BDRn-but (40 mg/kg pc), la fraction BDRSaponines (8 mg/kg pc) et le glibenclamide (10 mg/kg pc) (co-administrés avec le glucose), nous remarquons que le pic d’hyperglycémie apparait au 30 min comme chez les témoins, soit une glycémie de 2,13 ; 2,21 ; 2,19 et 2,20 g/L respectivement. Ensuite l’hyperglycémie diminue progressivement jusqu’à 180 min avec une glycémie de 1,31 ; 1,24 ; 0,88 et 1,01 g/L pour BDRaqDe, BDRn-but, BDRSaponines et le glibenclamide respectivement, soit une réduction significative de -39%, -42%, -59% et -53% respectivement par rapport aux témoins. La charge glycémique calculée pour ces groupes expérimentaux atteint sa valeur la plus basse chez les rats traités par BDRSaponines (8 mg/kg pc), qui est de 254,28 g/L/180min contre 282,60 g/L/180min pour le groupe de rats traités par le glibenclamide (10 mg/kg pc).

Ces résultats obtenus montrent que les extraits BDRaqDe et BDRn-but ainsi que la fraction

BDRSaponines ont tendance à améliorer l’intolérance orale au glucose chez les rats diabétiques lorsqu’ils sont administrés simultanément avec le glucose (2 g/kg pc). L’effet antihyperglycémiant de la fraction BDRSaponines, à la dose de 8 mg/kg pc, apparant être le plus important, car montrant un profil comparable à celui du glibenclamide (agent antihyperglycémiant de référence) administré à la dose de 10 mg/kg pc. Cela nous permet de supposer que cette fraction BDRSaponines agit en inhibant les transporteurs du glucose (GLUT-2, SGLT-1) au niveau de l’intestin, ou bien favorisant l’utilisation périphérique du glucose par les cellules cibles ou en exerçant un effet insulino-sécréteur.

Troisième partie Résultats et interprétation

Témoins Glibenclamide 10mg/kg BDRaq Re 30mg/kg BDRn-but 40mg/kg BDR Saponines 8mg/kg

3,00

2,50

2,00 ** 1,50 ** ** ** Glycémie (g/L) Glycémie 1,00 ** ** ** 0,50

0,00 0 30 60 120 180

Temps (minutes)

(*) Comparaison entre les rats traités par extrait/fraction et les rats témoins (sérum physiologique) p<0,05 (*) ; p<0,01 (**) ; p<0,001 (***)

Solution administrée Glycémie g/L (% de variation par rapport aux rats témoins) (voie orale) 0 30 min 60 min 120 min 180 min ASC Glucose à 2 g/kg pc 1,79±0,09 2,59±0,10 2,31±0,19 2,17±0,08 2,15±0,14 403,26±11,41 Glucose+Glibenclamide 1,84±0,09 2,20±0,13 1,72±0,05 1,36±0,04 1,01±0,02 282,60±9,11 à 10mg/kg pc (+3%) (-15%) (-25%) (-38%) (-53%)

Glucose+BDRaqDe à 1,75±0,17 2,13±0,07 1,89±0,14 1,79±0,37 1,31±0,18 322,29±27,06 30mg/kg pc (-2%) (-18%) (-18%) (-17%) (-39%)

Glucose+BDRn-but à 1,82±0,10 2,21±0,18 1,50±0,06 1,49±0,09 1,24±0,07 287,94±13,41 40mg/kg pc (+2%) (-15%) (-35%) (-31%) (-42%)

Glucose+BDRSaponines à 1,90±0,11 2,19±0,15 1,50±0,12 1,10±0,02 0,88±0,01 254,28±10,11 8mg/kg pc (+6%) (-16%) (-35%) (-49%) (-59%) Glibenclamide : contrôle positif BDRaqDe : Extrait aqueux des racines de B. dioica préparé par décoction BDRn-but : Extrait butanolique des racines de B. dioica BDRSaponines : Fraction enrichie des saponines de racines de B. dioica moyenne±ESM ; ASC : aire sous la courbe (charge glycémique)

100

Troisième partie Résultats et interprétation

3. Activité hémolytique

Dans cette partie de notre travail, les extraits ainsi que les fractions qui ont montré des activités antioxydante et antidiabétique les plus importantes, ont fait l’objet de l’évaluation in vitro de leur activité hémolytique vis-à-vis des globules rouges humains.

Parmi tous les extraits et les fractions de B. dioica et de C. colocynthis testés, nous avons constaté que l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols renferment une activité antioxydante très élevée selon la méthode DPPH et FRAP. En plus, l’extrait aqueux BDRaqDe, l’extrait butanolique BDRn-but ainsi que la fraction enrichie de saponines BDRSaponines possèdent une activité antidiabétique importante aussi bien à court qu’à moyen terme. De ce fait, nous nous sommes intéressés à étudier leur activité hémolytique.

Les extraits et fractions des racines de B. dioica (BDRaqDe, BDRn-but, BDRPolyphénols,

BDRSaponines,) ont été testés à différentes concentrations (0,1; 0,5; 1; 5; 10; 20 mg/mL) pendant 5, 10, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes d’incubation à 37°C. La figure 31 (A, B, C, D, E, F), représente l’activité hémolytique des extraits et fractions de B. dioica, exprimée en pourcentage, à différentes concentrations et en fonction du temps.

101

Troisième partie Résultats et interprétation

A Concentration à 0,1 mg/mL B Concentration à 0,5 mg/mL

60 60 50 50 40 40 30 30 20 20

10 Taux d'hémolyse (%) (%) d'hémolyse Taux

Taux d'hémolyse (%) d'hémolyse Taux 10 0 0 5 10 15 30 60 90 120 0 0 5 10 15 30 60 90 120 Temps (minutes) Temps (minutes)

BDRaqDe BDRn-but BDRaqDe BDRn-but BDR Polyphénols BDR Saponines BDR Polyphénols BDR Saponines

C Concentration à 1 mg/mL D Concentration à 5 mg/mL

60 60

50 50 40 40 30 30

20 20 Taux d'hémolyse (%) d'hémolyse Taux Taux d'hémolyse (%) d'hémolyse Taux 10 10 0 0 0 5 10 15 30 60 90 120 0 5 10 15 30 60 90 120 Temps (minutes) Temps (minutes)

BDRaqDe BDRn-but BDRaqDe BDRn-but BDR Polyphénols BDR Saponines BDR Polyphénols BDR Saponines

E Concentration à 10 mg/mL F Concentration à 20mg/mL

60 60 50 50 40 40 30 30 20 20

Taux(%) d'hémolyse 10 10 (%) d'hémolyse Taux 0 0 0 5 10 15 30 60 90 120 0 5 10 15 30 60 90 120 Temps (minutes) Temps (minutes)

BDRaqDe BDRn-but BDRaqDe BDRn-but BDR Polyphénols BDR Saponines BDR Polyphénols BDR Saponines

Figure 31 : Activité hémolytique des extraits et fractions de Bryonia dioica, exprimée en pourcentage, à différentes concentrations et en fonction du temps.

A : Concentration à 0,1 mg/mL D : Concentration à 5 mg/mL

B : Concentration à 0,5 mg/mL E : Concentration à 10 mg/mL

C : Concentration à 1 mg/mL F : Concentration à 20 mg/mL

102

Troisième partie Résultats et interprétation

Les résultats obtenus illustrés dans la figure 31 (A, B, C, D, E, F), montrent que les pourcentages de l’activité hémolytique sont proportionnels à l’augmentation des concentrations des extraits et fractions en fonction du temps. A une faible concentration de 0,1 mg/mL, l’ensemble des extraits et fractions ne renferment aucune activité hémolytique pendant 60 minutes d’incubation. Tandis qu’à une concentration plus élevée (20 mg/mL), le taux d’hémolyse est de l’ordre de 9,15%; 15,33%; 33,6% et 59,65% pour BDRPolyphénols,

BDRaqDe, BDRn-but et BDRSaponines respectivement.

En plus, une absence de l’activité hémolytique de la fraction enrichie de polyphénols

BDRPolyphénols est observée aux concentrations 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL et 1 mg/mL durant 60 minutes d’incubation. En revanche, la fraction enrichie de saponines BDRSaponines montre une activité hémolytique plus élevée par rapport aux extraits BDRaqDe et BDRn-but ainsi que la fraction BDRPolyphénols pendant 120 minutes d’incubation, elle présente aux différentes concentrations 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL et 20 mg/mL des taux d’hémolyse respectifs de 4,86%; 6,34%; 13,10%; 25,57%; 39,96% et 59,65%.

De ce fait, nous pouvons classer l’activité hémolytique des différents extraits et fractions de B. dioica testés à la concentration de 20 mg/mL après 120 minutes de contact avec les

érythrocytes humains, comme suit : BDRSaponines > BDRn-but > BDRaqDe > BDRPolyphénols.

D’après les résultats obtenus dans cette partie de notre travail (étude de l’activité hémolytique), nous pouvons constater que :

 L’ensemble des extraits et fractions des racines de B. dioica analysés ne provoquent aucun effet hémolytique à la concentration de 0,1 mg/mL pendant 60 minutes d’incubation.

 La fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols semble être la moins toxique par

rapport à l’extrait aqueux BDRaqDe, l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction

enrichie de saponines BDRSaponines, cette dernière qui a induit la fuite d’hémoglobine la plus importante.

103

Quatrième partie Discussion générale

La progression des connaissances à propos des propriétés thérapeutiques de plantes médicinales antidiabétiques traditionnellement utilisées par nos ancêtres pourrait faciliter leur intégration dans les systèmes de soins de santé. De telles investigations doivent être d’ordre ethnobotanique, toxicologique, phytochimique et pharmacologique, dans le but de déterminer les principes actifs ainsi que leur mode d’action, cela nécessite donc la collaboration de toutes ces disciplines si l’on veut apprécier ces richesses à leur juste valeur.

Divers travaux scientifiques ont permis de démontrer expérimentalement l’intérêt des plantes médicinales dans l’amélioration du dysfonctionnement métabolique provoqué par le diabète sucré, contribuant notamment au maintien de l’homéostasie glucidique. L’exemple de Galega officinalis est éloquent, historiquement connue pour ses vertus antidiabétiques depuis le Moyen Age en Europe, contient la galégine, un guanidine. Ce dernier est à l’origine de l’hémisynthèse de la metformine (biguanides) agent antidiabétique moins toxique et plus efficace, utilisé dans la pharmacopée moderne.

En se basant sur les recommandations de l’OMS, la valorisation des plantes antidiabétiques utilisées en médecine traditionnelle semble très importante, car le règne végétal est, à l’évidence, un gisement de molécules ayant une authentique action hypoglycémiante et dont l’isolement pourrait conduire à la mise au point de nouveaux agents antidiabétiques [Arulselvan et al. 2014 ; Schlienger. 2014].

Notre choix s’est porté sur deux plantes appartenant à la famille des cucurbitacées, Bryonia dioica Jacq (bryone) et Citrullus colocynthis (L.) Schrad (coloquinte), dont nous avons tenu à évaluer expérimentalement leurs activités biologiques. Ces plantes appartiennent à l’arsenal thérapeutique traditionnel Algérien, et sont réputées pour leur action bénéfique contre le diabète sucré [Azzi et al. 2012 ; Hammiche et al. 2013 ; Benarba. 2015].

Ce travail a été réalisé en deux parties expérimentales complémentaires : une étude phytochimique des racines de la bryone et des fruits de la coloquinte, en plus de l’évaluation de leurs activités biologiques dont l’activité antioxydante et antidiabétique.

104

Quatrième partie Discussion générale

L’étude phytochimique a été initiée par la préparation de différents extraits aqueux et butanoliques (BDRaqDe, CCFaqDe, BDRaqMa, CCFaqMa, BDRn-but, CCFn-but) et fractions enrichies de polyphénols et de saponines (BDRPolyphénols, CCFPolyphénols, BDRSaponines et CCFSaponines) des racines broyées de B. dioica et des fruits concassés de C. colocynthis, en adoptant une proportion de 1/10 (p/v) de la matière végétale par rapport au solvant, suivant deux méthodes d’extraction : décoction et macération, et par l’utilisation de solvants aqueux, organiques ou mixtes. L’homogénéisation du tissu végétal dans un solvant de polarité variable avec la proportion 1/10 (p/v) est idéale pour l’extraction d’une large gamme des phytoconstituants [Green. 2004]. Le dégraissage des racines broyées de B. dioica et des fruits concassés de C. colocynthis par l’hexane a permis l’extraction de 6,40% et 8,98% de lipides respectivement. D’autres travaux ont révélé un taux de 1,90% et 23,16% de lipides dans les fruits de B. dioica et les graines de C. colocynthis respectivement. Les lipides dans ces deux cucurbitacées sont essentiellement représentés par les acides gras insaturés dont l’acide linoléique et l’acide oléique qui jouent un rôle important dans la nutrition humaine [Rafael et al. 2011 ; Nehdi et al. 2013].

Le screening phytochimique préliminaire a révélé la richesse en métabolites secondaires présents dans les racines de la bryone ainsi que les fruits de la coloquinte. Tous les deux se caractérisent par la présence des tanins, flavonoïdes, saponines triterpéniques et quinones libres. Les composés phénoliques fortement présents dans les racines de la bryone sont des tanins catéchiques alors que ceux des fruits de la coloquinte sont des flavonoïdes. En revanche, les tanins galliques, les saponines stéroïdiques ainsi que les anthraquinones sont absents dans l’ensemble des extraits et fractions des deux cucurbitacées.

Nos résultats sont en accord avec ceux de Benarba et al. 2012, qui ont révélé dans l’extrait aqueux des racines de B. dioica la présence des polyphénols, triterpènes, alcaloïdes et des saponines. Kadhim. 2014 ont démontré l’absence des tannins et des saponines ainsi que la présence des anthraquinones dans les feuilles de B. dioica. Concernant le screening phytochimique réalisé sur le fruit de la coloquinte, nos résultats concordent avec ceux trouvés par Najafi et al. 2010 ; Koko et al. 2009, qui ont rapporté que l’extrait éthanoliques (80%) du fruit de C. colocynthis contient des flavonoïdes et des saponosides triterpéniques avec l’absence des anthraquinones et des tanins.

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Quatrième partie Discussion générale

De plus, la composition phytochimique des extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis, révélée quantitativement, indique que les teneurs en polyphénols, en flavonoïdes et en saponines totaux varient considérablement entre les différents extraits et fractions des deux cucurbitacées. Les composés phénoliques et les flavonoïdes sont plus concentrés dans la fraction enrichie de polyphénols des racines de B. dioica obtenue par extraction sélective, BDRPolyphénols (673,28 µg eq AG/mg ES et 171,03 µg eq Cat/mg ES). Ainsi, les saponines sont plus concentrées dans la fraction enrichie de saponines des racines de B. dioica, BDRSaponines (592,51 µg eq AO/mg ES).

Comparativement à d’autres études, Rafael et al. 2011, ont trouvé que le taux des polyphénols et flavonoïdes totaux dans l’extrait méthanolique des fruits matures de B. dioica est de l’ordre de 150,12 mg eq AG/g ES et 15,77 mg eq Cat/g ES respectivement. Ces teneurs sont relativement plus faibles dans l’extrait méthanolique des jeunes pousses de B. dioica révélées par Morales et al. 2012, elles sont de l’ordre de 35,10 mg eq AG/g ES et 16,31 mg eq Cat/g ES respectivement. Ainsi, l’étude de Kumar et al. 2008 effectuée sur l’extrait méthanolique des fruits de C. colocynthis récoltés dans la région de Haryana en Inde, a montré des teneurs de polyphénols et de flavonoïdes totaux de 740 mg eq AG/100g MV et 130 mg eq Cat/100g MV respectivement. Hussain et al. 2013 ont rapporté dans les extraits hexanique et éthanolique des fruits de C. colocynthis, des teneurs de polyphénols (84 mg eq AG/100g MVS ; 307 mg eq AG/100g MVS) et flavonoïdes totaux (46 mg eq Cat/100g MVS ; 51 mg eq Cat/100g MVS) respectivement. De même, Sultan et al. 2010 ont déterminé dans 100 g de la coloquinte (plante entière) : 1,64 mg de composés phénoliques, 1,39 mg de flavonoïdes, 1,64 mg d’alcaloïdes et 0,52 mg de saponosides.

La sélection de méthode et conditions appropriées pour l'extraction des phytoconstituants est une étape cruciale dans le processus analytique. D’après nos résultats, la macération avec agitation semble être l’idéale méthode d’extraction car elle permet d’extraire une quantité relativement importante de composés phénoliques à partir des racines de B. dioica, mais ce n’est pas le cas avec les fruits de C. colocynthis où l’extraction nécessite une décoction (chauffage). En plus, l'impact de type du solvant sur l’extraction des composés phénoliques est largement discuté dont l’utilisation de mélange de solvants organiques polaires (éthanol, méthanol) avec de l'eau est souvent recommandé [Sultana et al. 2009 ; Pietrzak et al. 2014].

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Quatrième partie Discussion générale

Le profil phénolique de la bryone (jeunes pousses et fruits) a été rapporté de contenir quatorze flavonoïdes glycosylés dont le kaempferol 3-O-neohesperidoside (flavonole) et l’apigenin-6- C-glucoside-8-C-glucoside (flavone) sont les plus abondants [Barros et al. 2011 ; Barreira et al. 2013]. En plus, les racines contiennent sept nouveaux triterpènes glycosides (bryonosides A à G) qui ont été isolés avec deux autres connus, bryoamaride et cabenoside D [Ukiya et al. 2002].

De même, plusieurs composés chimiques ont été identifiés dans les extraits de différentes parties de C. colocynthis (graine, pulpe, fruit, feuille et racine), particulièrement les alcaloïdes

(C10H15NO3 ; C20H32NO ; C16H24NO7), stérols (C29H48O ; C29H50O), cucurbitacines (I, E, L, J) ainsi que les flavonoïdes comme la quercétine, myrcétine, kaemoferol, isovitexine, iso- orientine, iso-orientine-3’-methylether et les dérivés du C-phydroxybenzyl (8-C-p hydroxybenzoylisovitexine, 6-C phydroxybenzoylvitexine et 8-C-p-hydroxybenzoyl isovitexine-4’-O glucoside) [Afifi et al. 1973 ; Hatam et al. 1990 ; Seger et al. 2005 ; Nayab et al. 2006 ; Mahesh et Vidya. 2008 ; Delazar et al. 2006 ; Maatooq et al. 1997].

Nous avons pu constater par l’étude qualitative et quantitative des deux cucurbitacées (racines de la bryone et fruits de la coloquinte) la diversité structurale de leurs phytoconstituants. Par ailleurs, les deux plantes montrent un profil chimique voisin car appartenant à la même famille phylogénique (parenté chimiotaxonomique). La différence de la composition en métabolites secondaires, substances extractibles, obtenue dans ce travail et celle rapportée par la littérature est probablement liée aux différents facteurs en relation avec la croissance et le développement de la plante (facteurs écologique et bioclimatique), et aussi à la matière végétale utilisée : période la récolte, partie de plante, conditions de stockage, sa granulométrie, le mode et la durée d’extraction (température, polarité du solvant). Ce dernier permet de solubiliser et extraire les composés de polarité similaire [Karlovsky. 2008 ; Gairola et al. 2010].

Les métabolites secondaires, produits par les plantes, présentent un grand intérêt surtout dans le domaine thérapeutique car ils sont doués de nombreuses activités dont l’activité antioxydante, ce qui les rend utiles dans le traitement des maladies dans lesquels le stress oxydant est considéré comme facteur déclenchant ou aggravant la maladie, tel que le diabète sucré.

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Quatrième partie Discussion générale

Le stress oxydant induit par l’hyperglycémie génère des radicaux libres contribuant fortement à l’évolution du diabète et ses complications. Les cellules β du pancréas sont particulièrement sensibles aux effets délétères des espèces réactives oxygénées (ERO) à cause de leur faible aptitude d’expression de gènes codant pour les enzymes antioxydants comparativement à d’autres cellules. En conséquence, une apoptose des cellules β est induite suivie par la suppression de la biosynthèse de l’insuline [Ceriello. 2008]. Certains antioxydants naturels peuvent atténuer, inhiber ou retarder l’effet délétère du stress oxydant consécutif au diabète, ceci est l’un des mécanismes d’action prometteurs des plantes médicinales antidiabétiques.

Dans le but d’évaluer l’activité antioxydante des extraits et fractions de B. dioica (racines) et C. colocynthis (fruits), nous avons utilisé deux méthodes basées sur deux mécanismes antioxydants différents : l’effet piégeur des radicaux libres évalué par le test de piégeage du radical libre DPPH et le pouvoir réducteur en utilisant le test de pouvoir réducteur du fer.

Les racines de B. dioica renferment des composés présentant une forte activité antioxydante par rapport aux fruits de C. colocynthis, selon les deux méthodes complémentaires évaluant l’activité antioxydante, DPPH et FRAP respectant le même ordre de pouvoir antioxydant des extraits et fractions de la bryone et de la coloquinte. Cela peut être due aux différences de la quantité des métabolites secondaires, de leur nature et structure chimique (groupement OH) entre les deux cucurbitacées, leur composition chimique complexe renfermant plusieurs composés peuvent agir en synergie pour assurer un effet antioxydant global. Certains auteurs ont observé que les extraits de C. colocynthis présentent in vitro un effet antioxydant dose- dépendant, c’est-à-dire que le pourcentage de réduction du DPPH est proportionnel à la concentration de l’extrait testé [Kumar et al. 2008 ; Benariba et al. 2013].

La fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mL) et l’extrait butanolique BDRn-but (CI50=2,25 μg/mL ; CE50=22,68 µg/mL) des racines de B. dioica renferment l’activité antioxydante la plus élevée comparativement aux autres extraits et fractions des deux cucurbitacées. Leur pouvoir antioxydant est nettement proche à celui des molécules de références : acide ascorbique (CI50=1,5 μg/mL ; CE50=24,56 µg/mL), acide gallique (CI50=1,65 μg/mL ; CE50=46,37 µg/mL) et catéchine (CI50=2,23 μg/mL ; CE50=20,73 µg/mL). Cette activité semble principalement liée à la richesse de la fraction

BDRPolyphénols et l’extrait BDRn-but en polyphénols et flavonoïdes.

108

Quatrième partie Discussion générale

L’activité antioxydante importante de B. dioica révélée dans note étude, est soutenue par les résultats de quelques études antérieures sur d’autres parties de la plante, les fruits et les jeunes pousses. Ces travaux montrent que les extraits méthanolique et éthanolique des fruits matures testés en utilisant trois méthodes, le pouvoir piégeur du radical libre DPPH, le pouvoir réducteur du fer et la méthode de décoloration du bêta-carotène, renferment des CI50 de l’ordre de 1,21 mg/mL et 1,5 mg/mL ; 0,40 mg/mL et 0,9 mg/mL ; 0,58 mg/mL et 1,9 mg/mL respectivement contre : 43 µg/mL (DPPH), 30 µg/mL (FRAP) et 3 µg/mL (β-carotène) pour le standard trolox [Rafael et al. 2011 ; Barreira et al. 2013]. A son tour, l’extrait méthanolique des jeunes pousses de la bryone a présenté des CI50 dont les valeurs, selon la méthode utilisée, sont les suivantes : 3,43 mg/mL (DPPH), 1,44 mg/mL (FRAP) et 0,47 mg/mL (β-carotène) [Morales et al. 2012].

Comme l’activité antioxydante des extraits de plantes est étroitement liée à leurs teneurs en phytoconstituants, il nous a semblé intéressent d’explorer cette relation en appliquant le test de corrélation. Ce dernier a montré une bonne corrélation entre les teneurs en polyphénols (r=0,85 ; r=0,84) et flavonoïdes totaux (r=0,86 ; r=0,83) et les deux méthodes évaluant l’activité antioxydante (DPPH ; FRAP) respectivement, tandis que les saponines présentent une faible corrélation (r=0,36 ; r=0,06), ce qui laisse supposer que l’activité antioxydante est due aux composés phénoliques. La plupart des études précédentes convergent vers et confirment cette hypothèse, ils ont montré que ce sont les composés phénoliques qui sont responsables des activités antioxydantes élevées [Liu et al. 2009 ; Turumtay et al. 2014].

L’activité antioxydante de polyphénols dépend généralement de leurs structures chimiques, du nombre et de la distribution des groupements hydroxyles [Popovici et al. 2009]. Ils peuvent piéger et neutraliser les radicaux libres, inhiber les enzymes responsables de la formation des radicaux libres et être des chélateurs de certains ions métalliques [Dugas et al. 2000 ; Spiridon et al. 2011]. L’effet piégeur "scavanger" des radicaux libres est essentiellement lié à la configuration des groupements 3 et 4-orthodihydroxyle sur le cycle B et le groupement 4-carbonyle sur le cycle C, ainsi le groupement 3-OH et/ou 5-OH sur le cycle C déterminant le pouvoir antioxydant [Pyo et al. 2004 ; Wojdylo et al. 2007]. Les polyphénols qui contiennent le noyau catéchol dans leur structure présentent un pouvoir réducteur du fer élevé, cela est due à la participation des groupements OH liés au noyau catéchol [Degraft-Johnson et al. 2007].

109

Quatrième partie Discussion générale

Les flavonoïdes sont susceptibles de réagir avec la plupart des espèces réactives oxygénées. L’action antioxydante de ces phytoconstituants ne s’exerce pas seulement par l’inhibition et la désactivation des radicaux libres, elle se manifeste aussi par la neutralisation d’enzymes oxydantes et par la chélation des ions métalliques traces responsables de la production des ERO [Cotelle. 2000]. Ainsi, selon Cos et al. 1998, les flavonoïdes sont des bons inhibiteurs d’enzymes responsables de la production des radicaux libres comme la xanthine oxydase qui est une source biologique importante du radical superoxyde.

Outre les polyphénols et les flavonoïdes, certaines saponines sont douées d’activité antioxydante en piégeant les radicaux libres, en stimulant les systèmes enzymatiques et en inhibant la formation des complexes radicaux libres-ions métalliques [Huong et al. 1998 ; Xi et al. 2008]. Selon Nzowa et al. 2010, les saponines d’Entada rheedii n’inhibent pas seulement la xanthine oxydase mais elles peuvent aussi capturer les radicaux superoxydes. Ryu et al. 2012, ont prouvé que les saponines de Platycodon grandiflorum qui contiennent dans leur structure des groupements hydroxyles au C-23 et C-24, sont capables de piéger les radicaux peroxynitrites et avec plus de groupements monosaccharides liés à la partie aglycone, la capacité de capturer les radicaux peroxydes s’accroit.

Dans notre étude les fractions enrichies de saponines, BDRSaponines et CCFSaponines, ont présenté des valeurs très élevées de l’CI50 : 627,75 et 1171,5 μg/mL respectivement, c’est à dire une faible activité antioxydante. Ces résultats sont renforcés par l’acide oléanolique (AO), un triterpène utilisé comme molécule de référence, il possède une faible activité antioxydante (CI50=779,35 μg/mL) par rapport aux autres molécules de références (acide ascorbique, acide gallique, catéchine, BHT). Dans les travaux de Wang et al. 2010, l’acide oléanolique présente un pourcentage de réduction de DPPH de 2,9% à une concentration de 1 mg/mL.

La coloquinte et à un degré moindre la bryone, sont deux plantes largement utilisées en médecine traditionnelle dans le traitement du diabète sucré, malgré leur toxicité. Dans ce travail, une étude pharmaco-toxicologique a été entreprise afin d’évaluer leur toxicité aiguë et leur efficacité dans le traitement du diabète sucré chez le rat de laboratoire.

En effet, nombreuses plantes réputées possédant des vertus médicinales sont toxiques, à titre d’exemple : Citrullus colocynthis, Artemesia herba alba, Nigella sativa. Toutefois, le mode de préparation des remèdes traditionnels est élaboré en connaissance de cause, en procédant au séchage, chauffage, cuisson de la matière végétale, à la dose utilisée et à la voie d’application (externe) permettant d’atténuer ou réduire leur toxicité [Bnouham et al. 2002].

110

Quatrième partie Discussion générale

L’étude de la toxicité aiguë in vivo a été effectuée par la détermination des doses létales DL50 et DL100 après l’administration IP des différents extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis chez des rats femelles. Les résultats obtenus ont révélé des DL50 situant dans un intervalle de 50 à 500 mg/kg pc, par conséquence les extraits aqueux et butanoliques ainsi que les fractions de polyphénols et de saponines des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis administrés par voie intra-péritonéale chez le rat sont considérés comme moyennement toxiques selon l’échelle de toxicité de Hodge et Sterner. 1980. Ce test étudiant la toxicité aiguë des deux cucurbitacées est préliminaire et permet de révéler la dose toxique moyenne qui pourrait aider à déduire et définir la dose pharmacologique qui est généralement une dilution de 1/10 de la DL50, utilisable par la suite lors de l’étude de l’effet antidiabétique chez le rat dans le but d’éviter tout risque de toxicité par les extraits et fractions testés [Barile. 2008].

La toxicité de B. dioica et de C. colocynthis est liée à leur contenu en cucurbitacines, toutes les deux renferment en commun les cucurbitacines B, D, E, I, J, K et L, d'autres ont été identifiées chez la bryone (S), et la coloquinte (T) [Oobayashi et al. 1992]. Ces cucurbitacines à squelette triterpénique tétracyclique sont amères, hautement oxygénées, présentes dans tous les organes, elles sont particulièrement abondantes dans les racines fraiches et le suc des fruits [Mira. 1995]. L’effet toxique de ces composés est généralement lié à leur structure chimique, il a été démontré que les cucurbitacines D et I, les plus toxiques, présentant une chaine latérale insaturée (∆23) et un hydroxyle libre en C25 [Edery et al. 1961].

L'évaluation de la toxicité in vitro de certains extraits et fractions de B. dioica ayant montré des activités antioxydante et antidiabétique les plus importantes, a été effectuée en déterminant leur pouvoir hémolytique vis-à-vis des globules rouges humains. Les résultats obtenus ont révélé que la fraction enrichie de polyphénols BDRPolyphénols est la moins toxique par rapport à l’extrait aqueux BDRaqDe, l’extrait butanolique BDRn-but et la fraction enrichie de saponines BDRSaponines, cette dernière a induit la fuite d’hémoglobine la plus importante. Ces résultats peuvent être s’expliquer par le fait que la fraction BDRSaponines renferme des quantités importantes de saponines, 592,51 µg eq AO/mg ES, alors qu’au niveau de la fraction

BDRPolyphénols des quantités beaucoup plus faibles sont présentes (3,16 µg eq AO/mg ES).

111

Quatrième partie Discussion générale

En outre, il est important de noter que les valeurs de CI50 et CE50, trouvées lors de l'évaluation de l'activité antioxydante (DPPH, FRAP) de la fraction BDRPolyphénols (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mL) sont largement inférieur à 1 mg/mL et qu’à une concentration 20 fois plus élevée (20 mg/mL), le taux d’hémolyse ne dépasse pas 10%. Donc, il est probable que la fraction BDRPolyphénols renferme des activités antioxydante et cytoprotectrice importantes.

Les saponines sont connues pour leur effet hémolytique qui est dû à leur interaction avec les stérols de la membrane cellulaire. Cette interaction induit une augmentation de la perméabilité membranaire et un mouvement des ions : le sodium et l’eau entrent, le potassium fuit, la membrane éclate, permettant ainsi la fuite de l’hémoglobine [Quijanoa et Lemeshko. 2008]. De plus, l’activité hémolytique des saponines peut être liée au type aglycone et aux chaines glucidiques. Selon Takechi et Tanaka. 1995, l’activité hémolytique des saponines stéroïdiques est considérée plus grande et plus rapide que celle des saponines triterpéniques. Alternativement, elle décroit lorsque la chaine osidique s’allonge [Sun et al. 2005].

Paradoxalement, l’effet cytoprotecteur des polyphénols envers les globules rouges est dû principalement à leur effet antioxydant. Il est connu que les polyphénols, comme les flavonoïdes, bloquent la production des ERO en inhibant leurs effets apoptotiques et cytotoxiques, aussi les globules rouges possèdent la capacité de stocker les flavonoïdes dans leur cytoplasme, ce qui conduit à leur protection [Fiorani et al. 2003]. En plus, nombreuses études ont démontré l’effet protecteur des flavonoïdes (extraits bruts ou molécules purifiées) vis-à-vis des effets délétères du diabète expérimental provoqué par la streptozotocine ou l’alloxane. Ils ont montré l’évidence de l’effet cytoprotecteur et antiradicalaire des flavonoïdes contre la peroxydation lipidique et la formation donc des radicaux libres chez le rat rendu diabétique [Coskun et al. 2005 ; Kebièche et al. 2011].

L’évaluation de l’activité antidiabétique des différents extraits et fractions des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis a été effectuée sur un modèle expérimental de diabète sucré, induit par l’injection néonatale de la streptozotocine (agent diabétogène) à des nouveau-nés de rats âgés de cinq jours. Ces animaux développent un diabète modéré à l’âge adulte, proche du diabète de type 2 humain. Selon Arulmozhi et al. 2004 ; Portha et al. 1989, le modèle néonatal induit par la streptozotocine se manifeste par une hyperglycémie, intolérance orale au glucose et une hypoinsulinémie débutant asymptomatiques et devenant grave à l'âge adulte, ce qui reproduit des conditions proches du diabète de type 2 humain.

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Quatrième partie Discussion générale

L’administration néonatale de la streptozotocine (n5-STZ, 90 mg/kg pc, IP) a provoqué un taux de mortalité de 42,66% durant les 20 premiers jours qui suivent son injection. Dans des études précédentes, l’injection néonatale de STZ (n5-STZ, IP) aux doses 80 µg/g pc et 150 mg/kg pc a provoqué une mortalité de 50% et 75,4% respectivement durant les premiers jours qui suivent l’injection de STZ [Serradas et al. 1989 ; Takada et al. 2007].

Les rats traités par la STZ à la naissance (n5-STZ, 90 mg/kg, IP) sont tous devenus diabétiques à l’âge adulte (2 mois et 2 semaines) présentant une hyperglycémie comprise entre 1,50 et 2,80 g/L, une intolérance orale au glucose (2 g/kg pc) et des symptômes caractéristiques du diabète à savoir : polyphagie, polydipsie et polyurie. Ces résultats vont de même sens que ceux de Takada et al. 2007, qui ont révélé une hyperglycémie de 1,75 g/L en plus de la présence des signes classiques : polyphagie, polydipsie, polyurie et glycosurie ce qui augmente la sévérité de l’état diabétique.

Ainsi, il est intéressant de noter que malgré cet état diabétique, les animaux n’ont pas été dans le besoin d’une thérapie en insuline pendant toute la période d’expérimentation afin d’assurer leur survie. Takada et al. 2007 ont estimé que le contenu en insuline dans les ilots isolés du groupe de rats traités par n5-STZ (150 mg/kg, IP, 12 semaines d’âge) est de 95,5 μU/100 ilots contre 1625,7 μU/100 ilots pour le groupe témoin. Par ailleurs, plusieurs études ont montré que la destruction des cellules β pancréatiques par la STZ au stade néonatal est suivie par une régénération spontanée mais incomplète des cellules productrice d’insuline, dont le taux circulant est abaissé entrainant en conséquence une hyperglycémie [Kergoat et Portha. 1985 ; Movassat et Portha. 2007].

L’effet antidiabétique est recherché chez des rats normaux et rendus diabétiques par l’injection néonatale de la streptozotocine. Ces animaux reçoivent les extraits et les fractions de la bryone et de la coloquinte, le sérum physiologique ou le glibenclamide par voie intra- péritonéale, ils sont suivis à court terme et à moyen terme, trois heures et trois semaines respectivement. Chez les animaux d’expérimentation, nous avons testé l’effet des extraits et fractions des deux cucurbitacées sur les variations de la glycémie, de quelques paramètres biochimiques sanguins (cholestérol total, triglycérides, urée, créatinine) ainsi que sur le poids corporel, la consommation d’aliment et d’eau, la biométrie des organes et la tolérance orale au glucose.

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Quatrième partie Discussion générale

Les principaux résultats obtenus ont révélé que l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis montrent un effet antihyperglycémiant peu significatif à court terme (3 heures) mais plus significatif à moyen terme (21 jours) lorsque administrés quotidiennement par voie intra-péritonéale chez les rats diabétiques. En particulier, la fraction

BDRSaponines (8 mg/kg pc) ainsi que les extraits BDRn-but (40 mg/kg pc) et BDRaqDe (30 mg/kg pc) qui exercent un effet antihyperglycémiant très significatif à moyen terme, ils assurent une réduction de l’hyperglycémie de -72%, -68% et -64% respectivement par rapport aux témoins.

Cet effet est probablement lié aux saponines présentes à des proportions appréciables dans la fraction BDRSaponines (592,51 µg eq AO/mg ES) ainsi que les extraits BDRn-but (406,62 µg eq

AO/mg ES) et BDRaqDe (178,69 µg eq AO/mg ES). Ces composés se caractérisent aussi par leur action dose-dépendante.

Lorsqu’elle est administrée par voie orale, la fraction BDRSaponines, à la dose de 8 mg/kg pc, a tendance d’améliorer l’intolérance orale au glucose chez les rats diabétiques (TTOG, glucose 2 g/kg pc). Elle montre un profil comparable à celui du glibenclamide (agent antihyperglycémiant de référence) administré à la dose de 10 mg/kg pc, soit une réduction significative de -59% et -53% respectivement par rapport aux témoins. Cela nous permet de supposer que cette fraction BDRSaponines assure le ralentissement ou l’inhibition de l’absorption intestinale du glucose en agissant probablement sur l’inhibition des transporteurs du glucose GLUT-2 et SGLT-1 localisés au niveau des membranes apicales des entérocytes.

Les saponines, les plus abondantes, pourraient être responsables de la propriété antidiabétique de la bryone. Elles pourraient agir, outre sur l’absorption intestinale du glucose, au niveau pancréatique direct en stimulant la sécrétion et la libération de l’insuline et/ou à un effet extra- pancréatique en augmentant l’effet de l’insuline sur la captation, le métabolisme et le stockage du glucose au niveau des cellules cibles : adipocytes, myocytes et hépatocytes.

Selon la bibliographie, les saponines peuvent exercer leur activité antidiabétique par différents mécanismes d’action : par le bais de l'amélioration de la signalisation d'insuline, l’induction de la libération d'insuline par le pancréas, l’augmentation l'expression de GLUT-4, l’activation de la synthèse de glycogène ainsi que l’inhibition de la gluconéogenèse, et l’inhibition de l'expression de l'ARNm en glycogène phosphorylase et glucose 6-phosphatase [Elekofehinti. 2015].

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Quatrième partie Discussion générale

Les extraits préparés à partir de différentes plantes appartenant à la famille des cucurbitacées sont connus d’exercer une activité antidiabétique significative. Rammal et al. 2009 ont révélé que l’extrait aqueux du fruit frais de Momordica charantia, administré par voie orale (200 mg/kg pc) montre une activité antihyperglycémique plus importante que celle obtenue par le glibenclamide (10 mg/kg pc) après trois semaines de traitement. Abdel-Hassan et al. 2000 ont démontré que l’administration chez des lapins rendus diabétiques par l’alloxane, des extraits d’alcaloïdes (50 mg/kg pc), de saponosides (50 mg/kg pc) et de glycosides (50 mg/kg pc) isolés de l’épicarpe du fruit de Citrullus colocynthis, diminuent significativement l’hyperglycémie à court terme (2 et 3 heures après traitement), l’effet de l’extrait de saponosides en particulier, a été le plus important. Il en est de même dans l’étude de Benmehdi et al. 2011, l’extrait de saponosides des graines de la coloquinte (20 mg/kg pc) administré par voie IP chez des rats rendus diabétiques par la STZ, diminue significativement l’hyperglycémie à court et à long terme, 48 heures et plus de 4 semaines de suivi respectivement. Les travaux de Patel et al. 2012 ont révélé que l’extrait éthanolique ainsi que la fraction enrichie de saponines des graines de Bryonia laciniosa sont doués d’effets antihyperglycémiant et antihyperlipidémiant chez des rats rendus diabétiques par la STZ. Singh et al. 2012 ont démontré que l’administration orale de l’extrait éthanolique des racines de Bryonia alba (200 mg/kg pc), diminue significativement l’hyperglycémie pendant 7 jours de traitement chez des rats rendus diabétiques par l’alloxane.

Au cours de notre étude, nous avons également testé l’effet de différents extraits et fractions de B. dioica et de C. colocynthis sur les variations de certains paramètres biochimiques sanguins : cholestérol total, triglycérides, urée et créatinine. Les principaux résultats obtenus ont montré que l’administration IP des différents extraits et fractions à moyen terme entraine à des degrés variables la diminution du taux de cholestérol total, du triglycérides et d’urée sériques sans aucun effet sur le taux de la créatinine. Donc, l’ensemble des extraits et fractions des deux cucurbitacées ont tendance à assurer la correction de certaines perturbations du métabolisme lipidique et diminuer la polyurie apparus dans l’état diabétique.

La perturbation des taux de la cholestérolémie et la triglycéridémie est généralement associée à l’hyperglycémie secondaire au déficit de l’insuline, une hormone importante dans la régulation du métabolisme lipidique.

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Quatrième partie Discussion générale

Le modèle néonatal induit par la streptozotocine reflète les signes classiques du diabète humain passant d’une intolérance orale au glucose aboutissant à un taux élevé de glycémie avec une augmentation significative des taux de lipides circulants. Les travaux de Patel et al. 2015 ont démontré que l’injection de la STZ (n2-STZ, 90 mg/kg pc, IP) chez des nouveau-nés de rats Sprague-Dawley, provoque l’augmentation des taux de cholestérol total, triglycérides, LDL, VLDL et la diminution du taux de HDL par rapport aux rats témoins (sérum physiologique, IP). Par contre, l’administration orale et quotidienne pendant 4 semaines chez les rats diabétiques de l’extrait ethanolique (250 et 500 mg/kg pc) ainsi que la fraction des saponines (100 et 200 mg/kg pc) de Bryonia laciniosa, diminue significativement les taux du cholestérol total, triglycérides, VLDL et LDL avec sans effet sur le taux du HDL lorsque comparés avec les rats diabétiques témoins [Patel et al. 2015].

Le poids corporel, la consommation d’aliment et d’eau ainsi que la biométrie des organes sont des autres paramètres qui peuvent nous renseigner sur la toxicité des extraits et fractions administrés quotidiennement pendant 21 jours. L’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis possèdent la capacité de prévenir la chute de poids corporel chez les rats diabétiques sans aucun effet sur le poids relatif des organes, ainsi qu’ils ont tendance à atténuer la polyphagie et la polydipsie apparus dans l’état diabétique. Ce qui en résulte que l’administration IP des extraits et fractions des deux cucurbitacées pendant 21 jours ne présente aucune toxicité apparente chez les rats traités normaux et diabétiques.

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Cinquième partie Conclusion générale et perspectives

Ce travail est une contribution à l’étude phytochimique d’extraits et fractions des racines de Bryonia dioica Jacq (Bryone) et des fruits de Citrullus colocynthis (L.) Schrad (Coloquinte), ainsi que l’évaluation de leurs activités antioxydante in vitro et antidiabétique in vivo chez un modèle de diabète expérimental induit chez le rat par la streptozotocine à la naissance.

Guidé par l’usage vernaculaire de ces deux cucurbitacées, les parties les moins toxiques, les racines de la bryone et les fruits de la coloquinte sont utilisés comme matériel végétal pour préparer les extraits aqueux et butanoliques ainsi que les fractions enrichies de polyphénols et de saponines.

Nous avons pu mettre en évidence par l’étude phytochimique qualitative et quantitative des plantes étudiées, la diversité structurale des phytoconstituants représentés essentiellement par les quinones libres, les composés phénoliques (tanins et flavonoïdes) et les saponines triterpéniques. Par ailleurs, les racines de la bryone renferment des teneurs plus élevées en polyphénols et saponines totaux par rapport aux fruits de la coloquinte.

La fraction BDRPolyphénols renferme une activité antioxydante importante selon les tests de piégeage du radical libre DPPH et de réduction du fer (FRAP), elle est nettement proche à celle des molécules de références (acide ascorbique, acide gallique, catéchine). Par ailleurs, cette fraction n’a pas montré un effet hémolytique vis-à-vis des globules rouges humains à une concentration de 1 mg/mL jusqu’à 60 min d’incubation à 37°C. Ces effets antioxydant et cytoprotecteur sont liés aux taux élevés en polyphénols et flavonoïdes totaux.

Le modèle expérimental du diabète utilisé dans ce travail présente un certain nombre d’avantage, outre le taux de mortalité élevé lors de l’induction par la streptozotocine, par rapport au modèle adulte. En effet, il présente une intolérance orale au glucose en plus d’une hyperglycémie modérée relativement stable raprochant du diabète de type 2 humain, ce qui s’y prête mieux à ce genre d’étude pharmacologique.

Les résultats de ce travail rejoignent et confortent ceux des précédents travaux qui montrent bien les propriétés antidiabétiques de la plupart des plantes appartenant à la famille des cucurbitacées dont Citrullus colocynthis et Bryonia dioica. Cette propriété serait due à leur composition riche et variée en composés naturels qu’elles contiennent.

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Cinquième partie Conclusion générale et perspectives

L’activité antidiabétique est toutefois plus importante pour B. dioica. Les saponines, les plus abondantes, pourraient être responsables de la propriété antidiabétique de la bryone. Elles pourraient exercer leur effet en agissant à différents niveaux de processus biologique, stimulation de la sécrétion et la libération de l’insuline et/ou augmentation de l’effet de l’insuline sur la captation, le métabolisme et le stockage du glucose au niveau des cellules cibles, concurant ainsi au rétablissement de l’homéostasie glucidique et correction d’autres dysfonctionnements métaboliques.

Cependant, il est nécessaire d’approfondir cette étude par un fractionnement bioguidé de extraits et fractions des deux cucurbitacées, notament ceux de la bryone qui montrent une activité antioxydante et antidiabétique plus importante, dans le but de déterminer, isoler et caractériser le (s) composé (s) actif (s) responsable (s) de ces activités, puis aprofondir l’étude de leur toxicité et leurs mécanismes d’action.

L’Algérie par sa situation géographique, l’étendu de son territoire et la diversité de son climat possède une flore riche très diversifiée d’une part; d’autre part, le savoir faire traditionnel dans le domaine de la phytothérapie très répandu chez la population, méritent d’être exploré à la lumière des connaissances scientifiques et techniques modernes, en vue de son valorisation et intégration dans le système de soin.

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Annexes

Annexe 01 : Préparation des réactifs pour les tests phytochimiques

 Réactif de Mayer : Dissoudre 1,358 g de chlorure de mercure (HgCl2) dans 60 mL d’eau distillée puis 5g d’iodure de potassium (KI) dans 10 mL d’eau distillée. Mélanger les deux solutions et ajuster le volume total à 100 mL avec l’eau distillée.

 Réactif de Wagner : Dans 75 mL d’eau distillée, dissoudre 2 g de KI et 1,27 g de I2. Le volume obtenu est ajusté à 100 mL avec l’eau distillée.  La liqueur de Fehling : C’est un mélange de deux solutions à volumes égaux.

Fehling A : Dissoudre 3,5 g de sulfate de cuivre pentahydraté (CuSO4, 5H2O) dans 50 mL d’eau distillée;

Fehling B : Dissoudre 6,5 g d’ammoniaque (NH4OH) et 17,3 g de tartrate de sodium-potassium dans 35 mL d’eau distillée puis compléter le volume à 50 mL.

Annexe 02 : Préparation des tampons

 Tampon phosphate (0,2 M ; pH 6,6)

Solution A : 0,2 M phosphate monosodique (NaH2PO4 2H2O) (31,20 g dans 1000 mL)

Solution B : 0,2 M phosphate disodique (Na2HPO4) (28,39 g dans 1000 mL)

Pour un pH de 6,6 mélanger 87,7 mL de A + 12,3 mL de B puis ajuster à 200 mL.

 Tampon citrate (0,1 M ; pH 4,5)

Solution A : 0,1 M acide citrique (C6H8O7 H2O) (21,01 dans 1000 mL)

Solution B : 0,1 M citrate de sodium tribasique dihydraté (Na3C6H5O7 2H2O) (29,41 dans 1000 mL)

Pour un pH de 4,4 mélanger 28,0 mL de A + 22,0 mL de B puis ajuster à 100 mL.

Pour un pH de 4,6 mélanger 25,5 mL de A + 24,5 mL de B puis ajuster à 100 mL.

 Tampon phosphate de sodium salé (10 mM ; pH 7,4)

Pour préparer 1L de PBS (10 mM ; pH 7,4) il faut solubiliser dans un litre d’eau distillée : 8 g de NaCl

(137 mM), 0,2 g de KCl (2,7 mM), 1,44 g Na2HPO4 (10 mM) et 0,24 g KH2PO4 (1,76 mM).

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Annexes

Annexe 03 : Valeurs usuelles de quelques paramètres biochimiques sériques chez le rat Wistar âgés de 8 à 16 semaines d’après Giknis et Clifford. 2008.

Paramètres Unité Minimum Maximum Moyenne Glucose g/L 0,38 1,20 1,00 Cholestérol total g/L 0,37 0,85 0,58 Triglycérides g/L 0,20 1,14 0,44 Urée mg/dL 12,3 24,6 17,1 Créatinine mg/dL 0,2 0,5 0,3

Annexe 04 : Échelle de toxicité proposée par Hodge et Sterner. 1980 chez le rat ou la souris qui permet de classer les extraits de plantes selon la valeur de la DL50.

Extrêmement toxique : DL50 < 1 mg/kg pc ;

Très toxique : DL50 de 1 à 50 mg/kg pc ;

Moyennement toxique : DL50 de 50 à 500 mg/kg pc ;

Faiblement toxique : DL50 de 500 à 5000 mg/kg pc ;

Pratiquement non toxique : DL50 de 5000 à 15000 mg/kg pc ;

Relativement sans danger : DL50 > 15000 mg/kg pc.

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Publications

Publication N°1

Asian Pac J Trop Dis 2015; 5(8): 632-637 632

Contents lists available at ScienceDirect Asian Pacific Journal of Tropical Disease

journal homepage: www.elsevier.com/locate/apjtd

Antioxidant activity and phytochemical screening of two Cucurbitaceae: Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots

Echaimaa Chekroun, Nabila Benariba, Houria Adida, Asma Bechiri, Rachid Azzi, Rabeh Djaziri Laboratory of Antibiotic and Antifungal, Physico-Chemistry, Synthesis and Biological Activity, University of Tlemcen, Tlemcen, Algeria

ARTICLE INFO ABSTRACT

Article history: Objective: To evaluate antioxidant activity and quantify total content of polyphenols and Received 25 May 2015 flavonoids in two Cucurbitaceae plant extracts, Citrullus colocynthis (C. colocynthis) fruits and Accepted 28 Jun 2015 Bryonia dioica (B. dioica) roots. Available online 8 Jul 2015 Methods: Qualitative and quantitative analysis of aqueous and butanolic extracts, prepared from C. colocynthis fruits and B. dioica roots was carried out using standard methods. Estimation of their antioxidant activity was determined by free radical scavenging activity assay using 2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl and ferric reducing antioxidant power assay. Results: Preliminary phytochemical screening of the aqueous and organic extracts showed the Keywords: presence of tannins, flavanoids, terpenoids, saponins and quinones. The content of phenolic Citrullus colocynthis fruits compounds varies among the two species of cucurbits and even in the different extracts of Bryonia dioica roots the same species. The most important amount of total polyphenols and flavanoids expressed Polyphenols respectively as gallic acid and catechin equivalent per gram extract, was determined in Free radical scavenging activity butanolic extract of B. dioica roots (541.78 mg/g, 120.60 mg/g). The lowest values were noted Reducing power in C. colocynthis fruit aqueous extract (219.58 mg/g, 46.13 mg/g). Butanolic extract of B.

dioica roots exhibited an interesting free radical scavenging activity with IC50 = 2.25 µg/mL compared to IC50 = 1.5 µg/mL of ascorbic acid, followed by B. dioica roots aqueous extract (IC50 = 47.25 µg/mL), butanolic C. colocynthis fruit extract (IC50 = 61 µg/mL) and C. colocynthis fruit aqueous extract (IC50 = 241.25 µg/mL). A highest reducing power was observed in B. dioica roots butanolic extract compared to other extracts (C. colocynthis fruit aqueous and butanolic extracts and B. dioica roots aqueous extract). Conclusions: The results indicate that the wealth of B. dioica roots extracts on polyphenols and flavonoids is more than C. colocynthis fruit extracts. These phytoconstituents ensure an interesting free radical scavenging activity and reducing power for the B. dioica roots extracts especially butanolic extract.

1. Introduction many scientific studies have been interested in medicinal plants, an important source of secondary metabolites as natural antioxidants, Antioxidants are widely interesting because of their potential role whose phenolic compounds, flavonoids and terpenes reported to be in food industry and human health. In small quantities, they are potent free radical scavengers[3]. In this context, a large number of able to inhibit or delay oxidation of easily oxidizable molecules[1]. medicinal plants used in traditional medicine around the world were Numerous studies showed that many natural and synthetic analyzed for their antioxidant activity. Among these plants, many antioxidants were reported to prevent various diseases. However, for species of Cucurbitaceae family traditionally used as antidiabetic their efficiency and less side effects on health, natural antioxidants remedies are currently studied for their antioxidant capacity[4-6]. are more used and preferred relatively to synthetic antioxidants Cucurbitaceae includes 118 genera with 825 species[7]. The most which increase liver damage and carcinogenesis[2]. Last decades, important genus are Cucurbita, Cucumis, Ecballium, Citrullus, Luffa, Bryonia, Momordica and Trichosanthes distributed over *Corresponding author: Echaimaa Chekroun, Department of Biology, University of Tlemcen, PO box 119, 13000, Algeria. the world, many of them are edible while others are medicinal or Tel: +213699034398 ornamental plants[8-10]. They grow in tropical, subtropical, arid E-mail: [email protected] Foundaton Project: Supported by CNEPRU project N°F02020120097, Ministry of deserts and temperate areas[11]. Pharmacological activity of many Higher Education and Scientific Research (MESRS) Algerian Government. Echaimaa Chekroun et al./Asian Pac J Trop Dis 2015; 5(8): 632-637 633 cucurbit species is related to their secondary metabolites content, samples were extracted twice in 100 mL of aqueous methanol essentially cucurbitacins, saponins, polyphenols, flavonoids, mixture (v/v) at room temperature over night with continuous alkaloids and terpenoids[5,9,12,13]. In Algeria, Citrullus colocynthis stirring. Extracts were then centrifuged at 4 316 r/min for 10 min (C. colocynthis) and Bryonia dioica (B. dioica), are the frequent and the supernatant was collected. After elimination of methanol, Cucurbitaceae used for the treatment of infectious diseases, the aqueous phase was then transferred into a separating funnel inflammation, hemorrhoids, diabetes and cancers[6,14-16]. The to be extracted three times with an equal volume of chloroform to aim of the present study is to evaluate the antioxidant capacity of remove pigments. The recovered aqueous phase was extracted twice C. colocynthis fruit and B. dioica roots extracts (the parts of the with n-butanol, which was completely evaporated to dryness under plants used locally in traditional medicine), using two conventional pressure[17]. Obtained extracts were C. colocynthis fruit butanolic methods: free radical scavenging activity assay [2,2-diphenyl-l- (CCFn-but) extract and B. dioica roots butanolic (BDRn-but) extract. picrylhydrazyl radical (DPPH)] and ferric reducing antioxidant power assay (FRAP). A phytochemical screening and quantitative analysis of 2.4. Phytochemical screening total polyphenols and flavonoids were also carried out on aqueous and organic plant extracts. Prepared extracts were subjected to preliminary phytochemical screening in order to qualitatively determine some of the secondary 2. Materials and methods metabolites: saponins, terpenoids, flavonoids, tannins, alkaloids, quinones, anthraquinones and reducing sugar using appropriate 2.1. Chemicals and reagents methods[6,16,18].

DPPH, Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid (GA), catechin, ascorbic 2.5. Total polyphenols content acid, sodium carbonate (Na2CO3), sodium hydroxide (NaOH), sodium nitrite (NaNO2), aluminium chloride (AlCl3), potassium The total polyphenols content of aqueous (CCFaq, BDRaq) ferricyanide (K3Fe(CN)6), trichloroacetic acid, ferric chloride (FeCl3) and butanolic (CCFn-but, BDRn-but) extracts, prepared from and all organic solvents (hexane, methanol, chloroform, n-butanol) C. colocynthis fruits and B. dioica roots was assessed by Folin- were purchased from Sigma-Aldrich chemie GmbH (Germany). Ciocalteu reagent with GA as standard. Aliquots of test samples (100 μL) containing 1 mg/mL, were mixed with 2 mL of freshly prepared

2.2. Plant materials Na2CO3 (2%) solution. After 5 min, 100 μL of Folin-Ciocalteu reagent (0.2 N) were added to the mixture, all was left for 30 min C. colocynthis fruits and B. dioica roots were collected respectively in obscurity at room temperature and the reading was performed from Naâma and Mascara in the west of Algeria during spring and against a blank at 700 nm. A calibration curve was performed in summer 2012. Botanical identification was performed in Laboratory parallel under the same operating conditions using GA as a positive of Ecology And Management of Natural Ecosystems at Tlemcen control. The results are expressed as mg GA equivalent per gram of University (Algeria). In the laboratory, both fruits and roots were dry extract (mg GA eq/g)[6,19]. cleaned and dried at room temperature. Fruits were crushed into small pieces and roots were ground to fine powder using laboratory 2.6. Total flavonoids content grinder (Mortar Grinder km 100, Retsch) and conserved for further extractions. The total flavonoids content of each aqueous (CCFaq, BDRaq) and butanolic (CCFn-but, BDRn-but) extracts of C. colocynthis fruits 2.3. Preparation of extracts and B. dioica roots was determined by a colorimetric method. Each sample (0.5 mL) containing 1 mg/mL, was mixed with 2 mL of

2.3.1. Aqueous extracts distilled water and 0.15 mL of NaNO2 solution (15%). After 6 min,

C. colocynthis fruit aqueous (CCFaq) extract was prepared as 0.15 mL of AlCl3 (10%) and 2 mL of NaOH (4%) solutions were follows: 10 g of crushed fruits are infused for 1 h in 100 mL added. Immediately, water was added to bring the final volume to 5 of distilled water at 50°ºC, then boiled under reflux for 15 min. mL and tubes were thoroughly mixed and incubated for 15 min at Regarding the B. dioica roots aqueous (BDRaq) extract, 10 g of room temperature. The absorbance was measured at 510 nm. Results powdered roots were extracted in 100 mL of distilled water at were expressed as catechin equivalent per gram of dry extract (mg room temperature over night with continuous stirring. After that, Cat eq/g)[6,19]. preparations were filtered, centrifuged and evaporated to dryness. 2.7. Antioxidant activity 2.3.2. Butanolic extracts Both C. colocynthis fruits and B. dioica roots were defatted with 2.7.1. DPPH free radical scavenging activity hexane in Soxhlet for 3 h. After air drying, 10 g of the defatted The free radical scavenging activity of C. colocynthis fruit and B. Echaimaa Chekroun et al./Asian Pac J Trop Dis 2015; 5(8): 632-637 634 dioica roots extracts was determined using DPPH according to the Table 1 protocol of El-Haci et al. Briefly, 50 μL of each aqueous (CCFaq, Characteristics of C. colocynthis fruit and B. dioica roots extracts. BDRaq) and butanolic (CCFn-but, BDRn-but) extracts solutions at Extract Physical aspect Color Yield (%) Solubility different concentrations were added to 1.95 mL of DPPH solution (6 CCFaq Powder Brown 5.41 Water × 10-5 mol/L in methanol). The mixture was vigorously shaken and CCFn-but Powder Brown 2.61 Water BDRaq Paste Brown 11.26 Water incubated for 30 min in obscurity[20]. Absorbance was measured at BDRn-but Powder Orange 1.90 Water 515 nm and ascorbic acid was used as antioxidant reference. The absorbance (A) of the control and samples was measured, and the Table 2 free radical scavenging activity in percentage was determined as Phytochemical screening of C. colocynthis fruit and B. dioica roots extracts. follow: CCFaq CCFn-but BDRaq BDRn-but Flavonoids ++ + + + Acontrol – Asample Tannins + – ++ ++ Free radical scavenging activity (%) = ×100 Acontrol Alkaloids ++ – ––

IC50 was determined graphically from nonlinear regression analysis, Terpenoids ++ ++ + + Saponins + ++ ++ ++ and the inverse of the value of IC50 means antiradical activity (ARA) Coumarins ++ – –– value[21]. Quinones ++ + ++ + ARA = 1/IC50 Anthraquinones – – –– Amines ++ – ++ – 2.7.2. FRAP ++: Strong positive test; +: Low positive test; –: Negative test. FRAP assay measures the reduction of ferric iron to the ferrous form in the presence of the antioxidant components[22]. The reducing 3.2. Total polyphenols and flavonoids content power of both C. colocynthis fruit and B. dioica roots extracts was evaluated according to the method of Karagözler et al. To 1 mL The results reported in Table 3 showed that the BDRn-but extract of each extract solution (CCFaq, CCFn-but, BDRaq, BDRn-but) at contains the higher rate of total polyphenols, 541.78 mg followed different concentrations (0.25, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00 mg/ by BDRaq, CCFn-but and CCFaq extracts with 226.87, 221.85 and mL), 2.5 mL of 0.2 mol/L phosphate buffer (pH 6.6) and 2.5 mL of 219.58 mg GA eq/g dry extract respectively. Similarly, the rate of

K3Fe(CN)6 (1%) were added. The mixture was incubated at 50 ºC for total flavonoids rises in the same extracts to 120.60, 61.20, 53.67 and 20 min, after that 2.5 mL of trichloroacetic acid (10%) were added. 46.13 mg Cat eq/g dry extract in BDRn-but, CCFn-but, BDRaq and The mixture was centrifuged at 3 000 r/min for 10min, then 2.5 mL CCFaq extracts respectively. Results relatively expressed to 100 g of of the supernatant were mixed with 2.5 mL of distilled water and 0.5 plant matter are dependent on extraction yield of each extract. mL of FeCl3 (1%)[23]. The absorbance was measured at 700 nm against a blank sample Table 3 Total polyphenols and flavonoids content of C. colocynthis fruit and B. and ascorbic acid was used as antioxidant reference. Increased dioica roots extracts. absorbance of the reaction mixture indicated increased reducing Extract Polyphenolsa Polyphenolsb Flavonoidsa Flavonoidsb power. CCFaq 219.58 1187.90 46.13 249.58 CCFn-but 221.85 579.04 61.20 159.73 BDRaq 226.87 2554.56 53.67 604.29 3. Results BDRn-but 541.78 1029.38 120.60 229.14 a: mg gallic acid (catechin) equivalent per g extract; b: mg gallic acid 3.1. Phytochemical screening (catechin) per 100 g plant matter.

Some characteristics of C. colocynthis fruit and B. dioica roots 3.3. Antioxidant activity extracts were illustrated in Table 1. After evaporation to dryness, all extracts were obtained as powder (CCFaq, CCFn-but, BDRn-but), 3.3.1. Free radical scavenging activity on DPPH except for BDRaq extract which was recovered as hygroscopic paste. The test is based on evaluation of different extracts (CCFaq, BDRaq, The extraction yield of aqueous extract from the roots of B. dioica CCFn-but, BDRn-but) effect on scavenging free radicals using was 11.26% than the yield of CCFaq 5.41%. Phytochemical analysis DPPH. Ascorbic acid is used as a reference molecule. According (Table 2) revealed the presence of the majority of phytoconstituents to the results (Table 4) we found that the free radical scavenging in CCFaq extract except anthraquinones. In its butanolic fraction activity increased with concentration of reference molecule or tested (CCFn-but), we found mainly terpenoids, saponins and flavonoids, extracts. The butanolic B. dioica roots extract (BDRn-but) shows quinones at lesser degree. BDRaq extract is characterized by the an interesting free radical scavenger activity compared to the other presence of tannins, saponins, quinones, amines, flavonoids and extracts, 10µg/mL of this extract decrease 94% of the DPPH and the terpenoids. Its butanolic fraction (BDRn-but) contained mainly IC50 found was to be 2.25μg/mL. Butanolic B. dioica roots (BDRn- tannins, saponins, terpenoids, flavonoids and quinones. but) extract at high concentrations quickly reduces DPPH, for this Echaimaa Chekroun et al./Asian Pac J Trop Dis 2015; 5(8): 632-637 635 reason it has been tested at low concentrations from 1.25 to 10 µg/ 1.79 respectively. Among aqueous and organic extracts, butanolic B. mL. The other three extracts, BDRaq, CCFn-but and CCFaq show IC50 dioica roots extract BDRn-but provided the highest reducing power, values of 47.25, 61 and 241.25μg/mL respectively. comparable with ascorbic acid (1.89 at 3 mg/mL).

Table 4 4. Discussion DPPH inhibition percentage of ascorbic acid and C. colocynthis fruit, B. dioica roots extracts.

Extract Concentration DPPH inhibition IC50 ARA Scientific and pharmaceutical researches have recently interested in (µg/mL) percentage (%) (µg/mL) cucurbitaceae medicinal plants, which are mainly used in traditional Ascorbic 0.5 13.86 1.50 0.6667 medicine for their therapeutic properties as antidiabetic and anti- acid 1.0 35.68 1.5 50.43 inflammatory remedies[6,14,24]. Thus, their therapeutic property is 2.0 61.97 probably related to their content of phytochemicals. 4.0 91.60 This study and other previous studies Kumar et al. Hussain et CCFaq 200 44.97 241.25 0.0041 al. Benariba et al. Barreira et al. and Rafael et al. illustrated the 225 48.13 250 50.79 phytoconstituents contain and antioxidant activity of C. colocynthis 300 67.28 fruits and B. dioica roots collected at maturity and prepared in 350 81.63 various aqueous and organic extracts[4-6,25,26]. 400 91.95 The qualitative analysis of the C. colocynthis fruit extracts revealed CCFn-but 25 32.68 61.00 0.0164 50 43.34 the presence of terpenoids, saponins, flavonoids and quinones and 75 52.82 the absence of anthraquinones. These results are in confirmation 125 68.06 with a recent study of Najafi et al. in which it was reported that the 175 76.12 250 85.74 aqueous and ethanolic (80%) extracts of both C. colocynthis fruits BDRaq 25 31.02 47.25 0.0212 and leaves contained flavonoids, glycosides and saponosides[12]. 50 48.00 A number of chemical compounds were already identified in 75 56.37 different extracts obtained from different parts of C. colocynthis 125 71.19 175 84.36 (seeds, pulps, leaves and roots), particularly alkaloids (C10H15NO3;

250 95.85 C20H32NO; C16H24NO7), sterols (C29H48O; C29H50O), cucurbitacins BDRn-but 1.25 23.52 (I, E, L, J) and flavonoids such as quercetin, myrcetin, kaemoferol, 1.87 36.49 isovitexin, iso-orientin, iso-orientin-3’-methylether and C-p- 2.50 52.52 2.25 0.4444 5.00 69.28 hydroxybenzyl derivatives (8-C-p hydroxybenzoylisovitexin, 6-C 7.50 84.59 phydroxybenzoylvitexin and 8-C-p-hydroxybenzoyl isovitexin-4’-O- 10.00 94.00 glucoside)[6]. In our phytochemical screening on B. dioica roots extracts we have 3.3.2. FRAP revealed the existence of tannins, flavonoids, terpenoids, saponins Results of the reducing power of C. colocynthis fruit and B. and quinones. Recently, Barros et al. have reported that the phenolic dioica roots extracts measured for the concentration up to 3 mg/mL profile of B. dioica shoots, identifying mainly C-glycosylated increased with concentration as presented in Figure 1. flavonoids[27]. Moreover, the study of Barreira et al. identified fourteen chemical compounds in the fruit of B. dioica, nine flavonols 2 and five flavones, which kaempferol 3-O-neohesperidoside and apigenin-6-C-glucoside-8-C-glucoside were the main flavonol and 1.5 flavone respectively[25]. Other several active chemical constituents

1.0 of B. dioica plant extracts were recorded, they are grouped as polyphenols, saponins and alkaloids[16,28]. In addition, the roots 0.5 contain seven new triterpene glycosides, bryoniosides, which have

Absorbance (700 nm) been isolated with two known triterpene glycosides, cabenoside D 0 and bryoamarid[29]. 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Concentrations (mg/mL) The therapeutic properties of plant extracts, antioxidant, are Ascorbic acid CCFaq CCFn-but generally related to the rate of phytoconstituents mainly polyphenols BDRaq BDRn-but and flavonoids. The pivotal role of phenolic compounds as Figure 1. Reducing power of ascorbic acid, C. colocynthis fruit extracts scavengers of free radicals is emphasized in several reports[30,31]. In and B. dioica roots extracts. fact, polyphenols and flavonoids are reported powerful antioxidants At the concentration of 3 mg/mL, CCFaq, CCFn-but, BDRaq and and have been consistently protective through scavenging numerous BDRn-but extracts showed a reducing power of 0.36, 0.55, 0.74 and diverse reactive oxygen species including hydroxyl radical, peroxyl Echaimaa Chekroun et al./Asian Pac J Trop Dis 2015; 5(8): 632-637 636 radical, hypochlorous acids, superoxide anion, and peroxynitrite[32]. reduce iron has been evaluated using different assays. According In this study, the level of total polyphenols determined vary in the to Rafael et al. the methanolic extract of B. dioica ripened fruits different extracts of the cucurbit plants, in either C. colocynthis fruits presented IC50 by DPPH assay and FRAP assay (1.21 ± 0.02) and as B. dioica roots, the organic extracts contain more than the aqueous (0.40 ± 0.00) mg/mL respectively[26]. The same is also reported by extracts. Therefore, it suggests a high correlation between the rate the results of Barreira et al. showing that the ethanolic extract of B. of polyphenols in each plant extracts and the free radical scavenging dioica ripened fruits was characterized by IC50 value of (1.5 ± 0.1) activity as the ferric reducing power. mg/mL in DPPH assay and (0.9 ± 0.1) mg/mL in FRAP assay[25]. The results show that BDRn-but has an interesting scavenging Another study, documented the DPPH free radical scavenging activity (IC50 = 2.25 µg/mL) than the other plant extracts (BDRaq IC50 activity of three parts of B. dioica methanolic extract, during

= 47.25 µg/mL, CCFn-but IC50 = 61.00 µg/mL, CCFaq IC50 = 241.25 flowering the polar subfraction of stems, leafs and flowers showed a

µg/mL). As well as, reducing power assay revealed that BDRn-but IC50 value of (285.67 ± 9.38), (48.32 ± 3.86) and (31.25 ± 3.38) μg/ showed the highest power to reduce iron followed by BDRaq, CCFn- mL respectively[34]. but and CCFaq. This antioxidant activity of BDRn-but extract may According to our knowledge, no earlier reports are available be attributed to its high total content of polyphenols and flavonoids, regarding the antioxidant activity of the roots extracts of B. dioica. 541.78 mg GA eq/g and 120.60 mg Cat eq/g dry extract respectively. Our study revealed that roots extracts of B. dioica are characterized The ability of BDRn-but to scavenge free radicals (DPPH) and reduce by a high antioxidant activity, comparatively to other parts of the iron (FRAP) is related to polyphenols considered as electron donors, plant as reported by previous studies[25,26,34]. This property can be which can react with free radicals and convert them to more stable attributed to high amounts of polyphenols as evaluated by qualitative products. and quantitative phytochemical analysis. Antioxidant activity of phenolic compounds such as flavonoids In conclusion, the present study has demonstrated that B. dioica depends on their chemical structure, especially of the distribution of roots extracts contain relatively large amounts of polyphenols and hydroxyl groups. The scavenging of free radicals is tightly linked to flavonoids compared to C. colocynthis fruit extracts. Furthermore, the configuration of the 3’,4’-orthodihydroxy on the B cycle and the the butanolic extract of B. dioica roots possesses an interesting 4-carbonyl group on the C cycle, the 3-OH and 5-OH groups on the free radical scavenging activity, which could be related to the total C cycle are also relevant to the antioxidant effect[6,33]. content of polyphenols and flavonoids. Thus, it seems pertinent to Various extracts from C. colocynthis seeds were also reported identify the majority chemical components of this butanolic extract by Benariba et al. to contain polyphenols, 61.62–298.88 mg GA of B. dioica roots and to document its other therapeutic effects in equivalent per g extract, and flavonoids, 24.49–219.18 mg catechin further phytochemical and pharmacological studies. equivalent per g extract. Besides, the results of IC50 revealed that ethyl acetate extract represented the most important antioxidant Conflict of interest statement activity with 350 µg/mL[6]. Furthermore, the antioxidant activity and phenolic content of C. colocynthis fruits collected from the We declare that we have no conflict of interest. desert area of Pakistan were investigated by Hussain et al. results of free radical scavenging activity assay (DPPH) revealed IC50 Acknowledgements value of 8.15 µg/mL and 7.14 µg/mL for the hexane and ethanol extracts respectively; again the ethanol extract showed better This work was supported by CNEPRU project N°F02020120097, reducing power than hexane extract according to FRAP; As well Ministry of Higher Education and Scientific Research (MESRS) as, the total polyphenols and flavonoids values were reported as Algerian Government. respect 0.84–0.46 mg/g of dry plant material for the hexane extract and 3.07–0.51 mg/g of dry plant material for the ethanol extract[5]. References Moreover, the methanolic extract of C. colocynthis fruits collected from the Haryana area in India, contained 740 mg of GA equivalent [1] Brewer MS. 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Publication N°2

Pharmacognosie

Antidiabetic activity of two aqueous extracts of two Cucurbitaceae: Citrullus colocynthis and Bryonia dioica

Activité antidiabétique des extraits aqueux de deux cucurbitacées : Citrullus colocynthis et Bryonia dioica

E. Chekroun, A. Bechiri, R. Azzi, H. Adida, N. Benariba, R. Djaziri Laboratory of Antibiotic and Antifungal: Physico-Chemistry, Synthesis and Biological Activity, University of Tlemcen, Algeria e-mail [email protected] Keywords: Experimental type 2 diabetes mellitus, neonatal-streptozotocin diabetic rats, antidiabetic activity, Citrullus colocynthis, Bryonia dioica.

Mots clés: Le diabète sucré type 2 expérimental, n5-streptozotocine rats diabétiques, activité antidiabétique, Citrullus colocynthis, Bryonia dioica.

Abstract

The aim of the present study was to evaluate the antidiabetic activity of the aqueous extract of Citrullus colocynthis L Schrad. (Colocynth) fruits, CCFaq and Bryonia dioica Jacq. (White bryony) roots, BDRaq in neonatal-streptozotocin diabetic rats (n5-STZ diabetic rats). Experimental type 2 diabetes mellitus was induced by neonatal injection of streptozotocin (90 mg/kg i.p.) to pups of rats on 5th day of birth. After 9 weeks, experimental type 2 diabetes mellitus was confirmed by polyphagia, polydipsia, polyuria, glucose intolerance and fasting blood glucose levels >1.50 g/L. Antidiabetic effect of CCFaq (20 mg/kg, i.p.) and BDRaq (30 mg/kg, i.p.) extracts as well as standard- glibenclamide (10 mg/kg, i.p.) was evaluated on acute (3 hours) and sub-acute (21 days) administration. Variations of body and same organs weight (pancreas, liver, kidney, spleen) were recorded. Biochemical estimations of glucose, total cholesterol, triglycerides and urea levels were carried out during the experimentation. Intraperitoneal administration of CCFaq and BDRaq extracts as well as standard-glibenclamide for 21 days to n5-STZ diabetic rats significantly (P < 0.01) decreased the level of serum glucose by -51%, -64% and -58% reductions respectively. The body weight as well as serum levels of total cholesterol, triglycerides and urea were markedly reversed secondary to sub-acute administration of aqueous extracts. In addition, changes in the weight of internal organs were restored to normal by the prolonged effect of BDRaq extract treatment. When compared with CCFaq extract, BDRaq extract appeared to have maximum antidiabetic activity in normalizing all studied parameters during the acute and sub-acute treatment. This study reveals the interesting antidiabetic effect of C. colocynthis and B. dioica and supports their traditional use for the treatment of diabetes mellitus.

Résumé

Le but de la présente étude était d'évaluer l'activité antidiabétique de l’extrait aqueux du fruit de Citrullus colocynthis L Schrad. (Coloquinte), CCFaq et des racines de Bryonia dioica Jacq. (Bryone), BDRaq chez les rats rendus diabétiques par l’injection néonatales de la streptozotocine (n5-STZ rats diabétiques). Le diabète sucré type 2 expérimental est induit par l’injection néonatale de la streptozotocine (90 mg/kg i.p.) chez les nouveau-nés rats wistar ayant cinq jours de naissance. Après 9 semaines, le diabète sucré type 2 expérimental a été confirmé par une polyphagie, polydipsie, polyurie, intolérance au glucose et une glycémie à jeun > 1,50 g/L. L’effet antidiabétique des extraits aqueux

CCFaq (20 mg/kg, ip) et BDRaq (30 mg/kg, ip) ainsi que le standard-glibenclamide (10 mg/kg, ip) a été évalué à court (3 heures) et à moyen terme (21 jours) de leur administration. Les variations du poids corporel ainsi que le poids des organes (pancréas, foie, reins, rate) ont été enregistrés. L’estimation biochimique du taux de glucose, cholestérol total, triglycérides et d'urée a été réalisée au cours de l'expérimentation. L'administration intrapéritonéale des extraits aqueux CCFaq et BDRaq ainsi que du standard-glibenclamide pendant 21 jours chez les n5-STZ rats diabétiques provoque une diminution significative (P <0,01) du taux de glucose sérique par -51%, -64% et -58% respectivement. Le poids corporel ainsi que les taux du cholestérol total, triglycérides et d'urée sériques ont été nettement inversés suite à l'administration des extraits aqueux à moyen terme. De plus, les changements dans le poids des organes ont été restaurés à la normale par l'effet prolongé de l'extrait BDRaq. Lorsqu’il est comparé avec l'extrait CCFaq, l’extrait BDRaq semble avoir une activité antidiabétique maximale dans la normalisation de tous les paramètres étudiés à court et à moyen terme. Cette étude révèle que C. colocynthis et B. dioica possèdent un effet antidiabétique intéressant et soutient leur utilisation traditionnelle pour le traitement du diabète sucré.

Introduction

Non-insulin-dependent diabetes mellitus or type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a complex and heterogeneous disorder with increasing prevalence worldwide which causing serious socio-economic problems during recent years. Type 2 diabetes mellitus is characterized by the progression of diminishing insulin sensitivity and impaired pancreatic function [1]. Without proper management, type 2 diabetes mellitus can lead to various complications such as cataract, retinopathy, nephropathy, neuropathy, and cardiovascular problems [2]. Various oral antidiabetic drugs and insulin are currently available to reduce, control and manage type 2 diabetes mellitus. The current treatment of type 2 diabetes mellitus involves insulin and four main classes of oral antidiabetic agents that stimulate pancreatic insulin secretion (sulphonylureas), reduce hepatic glucose production (biguanides), delay digestion and absorption of intestinal carbohydrate (α-glucosidase inhibitors) or improve insulin action (thiazolidinediones) [3]. However, most classes of these pharmaceutical drugs produce multiple side effects in addition to high cost [4].

Therefore, searching for more effective and safer antidiabetic compounds is of great interest [1]. Currently, plants used in traditional medicine constitute a promising source of potential therapeutic compounds. The effects of these plants may delay the development of diabetic complications and correct the metabolic abnormalities. However, more investigations must be carried out to evaluate the mechanism of action of medicinal plants with antidiabetic effect [5].

In this context, cucurbitaceae family includes a large number of medicinal plants that used in traditional medicine around the world as antidiabetic remedies. In Algeria, Citrullus colocynthis L Schrad. Colocynth (C. colocynthis) and Bryonia dioica Jacq. White bryony (B. dioica), are the frequent cucurbitaceae used by the population to treat diabetes and probably other ailments.

The potential role of C. colocynthis as antidiabetic agent has been reviewed by Hussain et al 2014 [4], supported by the ethnobotanical surveys and traditional medicines of different countries. Numerous extracts and fractions prepared from both fruits and seeds of C. colocynthis tested in vitro in the isolated rat pancreas and in vivo by oral or intraperitoneal administration at multiple doses to experimental diabetic animals, have been shown to possess reduction in hyperglycemia, enhancement of insulin secretion and significant amelioration of some toxic effects of streptozotocin or alloxan [4].

This antidiabetic activity of C. colocynthis is probably related to its phytochemical composition. Several bioactive compounds of C. colocynthis fruit have been recorded in the literature. They are 2 grouped as glycosides, flavonoids, alkaloids, carbohydrates, fatty acids, essential oils and cucurbitacins which have been reported as the main components of C. colocynthis fruits [4].

With respect, B. dioica also reported to contain polyphenols, flavonoids, saponins and alkaloids which have been proposed as responsible for the antioxidant, cytotoxic and apoptogenic properties of this cucurbitaceae [6,7]. There are other two species of Bryonia reported earlier in the literature, B. alba and B. laciniosa which are known to possess antidiabetic activity [8,9]. According to our knowledge, no earlier reports are available regarding the antidiabetic activity of B. dioica. Consequently, the present study was designed to investigate and compare the antidiabetic effect of aqueous extract of both C. colocynthis and B. dioica in neonatal streptozotocin-induced diabetic rats (n5-STZ diabetic rats).

Previous studies reported that single injection of streptozotocin at the dose range of 90-100 mg/kg b.w. administered intraperitoneally to two or five days old wistar rats develops suitable experimental models of T2DM [1,2,10,11, 12]. This neonatal administration of streptozotocin cause decrease in β-cell mass and develop hyperglycemia, polyphagia, polydipsia, polyuria, insulin resistance and abnormal glucose tolerance in adult rat that closely resemble to human T2DM. Therefore, n-STZ model provides a suitable experimental model of T2DM for antidiabetic drug evaluation [13,14].

In this study, the acute and sub-acute antidiabetic effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts were studied in neonatal streptozotocin-induced diabetic rats (n5-STZ diabetic rats).

Materials and methods Plant materials and extraction C. colocynthis fruits and B. dioica roots were collected respectively from Naâma and Mascara in the west of Algeria during spring and summer 2012. Botanical identification was performed in laboratory of ecology and management of natural ecosystems at Tlemcen University (Algeria). In the laboratory, both fruits and roots were cleaned and dried at room temperature. Fruits were crushed into small pieces and roots were ground to fine powder and conserved for further extractions. C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts, (CCFaq, BDRaq) were prepared as follows: 10 g of crushed fruits or powdered roots are infused for 1 h in 100 mL of distilled water at 50°C, then boiled under reflux for 15 min. After that, preparations were filtered and evaporated to dryness. Aqueous extracts (CCFaq, BDRaq) were subjected to various phytochemical tests and determination of total polyphenols and flavonoids content to detect qualitatively as well as quantitatively the different classes of phytoconstituents using appropriate methods [15-17].

Animals

Adult rats of wistar strain were obtained from animal colony of Pasteur Institute of Algiers, Algeria. The rats were housed under conventional conditions, at a temperature of 24±2°C, relative humidity 50- 60% and a 12 h light and dark cycle. A standard commercial rodent diet and tap water were given ad libitum. The animals were handled according to ethical recommendations for use of laboratory animals universally recognized.

Determination of lethal doses (LD50 and DL100) of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts

Healthy wistar female rats weighing about 180.6±2.61 g, fasted overnight (16 h), were divided into ten groups of four each. Aqueous extracts (CCFaq, BDRaq) were administered intraperitoneally with increasing doses (50, 100, 200, 300 and 400 mg/kg b.w.) to determine the LD50 and DL100. The animals were observed continuously for 1 hour, then frequently for 24 hours and later at the end of 72 hours for toxic signs and mortality.

Induction of experimental type 2 diabetes mellitus

The pregnant rats were isolated and habituated to laboratory conditions to minimize if any of non- specific stress. To induce the experimental T2DM, streptozotocin (Sigma Aldrich) freshly prepared (90 mg/kg b.w. in citrate buffer 0.1M, pH 4.5) was administered intraperitoneally to five-day-old wistar male rat pups, weighing 8-14 g. Non-diabetic control group received only intraperitoneal injection of citrate buffer [11]. High mortality (42.66%) occurred in the STZ-treated group during the first days after the STZ injection (data not shown). Therefore, the data here refer to the surviving animals. After weaning, rats of the experimental and control groups were housed under conventional conditions and provided with a standard commercial diet and water ad libitum. During the 9th week of age, experimental T2DM was confirmed by various tests; Measure of fasting blood glucose levels of the animals using test strips and glucometer (Accu-check Active, Roche, Germany) after pricking the tail of the rats; Measure of water and food intake, body weight and urine excretion by keeping of the animals in individual metabolic cages; As well as evaluation of glucose tolerance by the oral glucose tolerance test: glucose (2 g/kg b.w.) was administered to fasted rats and blood glucose levels were measured as previously indicated at 0 (before glucose administration), 60 and 120 min after glucose administration.

The area under the curve (AUC) was calculated accounting only for area under curve of incremental blood glucose level (BGL) during the 120 min test period (AUC0-120min), to estimate postprandial glycemic load, on the basis of trapezoidal rule using the following formula:

AUC 0-120 (g/L.min) = 1/2[(a+b)t1+(b+c)t2] where a, b and c are BGL=(BGLt-BGL0) at corresponding time: 0, 60 and 120 min; t1 and t2 are the differences between the two consecutive times.

The n5-STZ diabetic rats showing the symptoms of diabetes (polyphagia, polydipsia, polyuria) and fasting blood glucose levels >1.50 g/L as well as glucose intolerance (high AUC) were incorporated in the study [11,18].

Experimentation

After 10 weeks, a total of 25 rats (twenty n5-STZ diabetic rats, five non-diabetic control rats) were divided into five groups of five rats each: group 1, non-diabetic control rats (5 mL/kg b.w./day of saline solution NaCl 9‰; i.p.); group 2, diabetic control rats (5 mL/kg b.w./day of saline solution NaCl 9‰; i.p.); group 3, diabetic rat treated with C. colocynthis fruits aqueous extract CCFaq (20 mg/kg b.w./day; i.p.); group 4, diabetic rat treated with B. dioica roots aqueous extract BDRaq (30 mg/kg b.w./day; i.p.) and group 5, diabetic rats treated with standard-glibenclamide (10 mg/kg b.w./day; i.p.).

Acute effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on blood glucose levels in n5-STZ diabetic rats

The effects of CCFaq (20 mg/kg b.w.) and BDRaq (30 mg/kg b.w.) extracts as well as standard- glibenclamide (10 mg/kg b.w.) were evaluated after acute (3h) intraperitoneal administration in group 3, group 4 and group 5 respectively. The acute study involved estimation of blood glucose levels at 0, 4

30, 60, 120 and 180 min after administration of both aqueous extracts and standard-glibenclamide via blood collected from vein tail using test strips and glucometer (Accu-check Active, Roche, Germany).

Sub-acute effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on serum glucose level in n5-STZ diabetic rats

This experiment involved repeated administration of standard-glibenclamide and aqueous extracts once daily for 21 days. Serum glucose levels were measured on day 1, 7, 14 and 21. Blood sample from the experimental and control rats was collected under fasting conditions in the morning before administration of drugs, by retro orbital plexus technique using capillary glass tubes. Blood samples were collected and centrifuged. The serum glucose level was determined using enzymatic kits (Spinreact, Spain) as per manufacturer's instruction [19].

Effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on body weight in n5-STZ diabetic rats (sub-acute study)

Body weight measurement was done on day 1, 7, 14 and 21 of the study period. Body weight of each rat in both experimental and control groups is noted.

Biochemical assays

Blood samples were collected on 21st day and centrifuged. Serum was evaluated for the estimation of various biochemical parameters such as total cholesterol, triglycerides and urea using enzymatic kits (SPINREACT, Spain) as per manufacturer's instruction [20,21,22].

At the end of experimental period (day 22), the rats were deprived of food overnight, euthanized by chloral 0.8 g/kg b.w. and sacrificed. Pancreas, liver, kidney and spleen were dissected out, washed in cold saline, patted dry and weighed.

Statistical analysis

Results were expressed as the mean ± standard error of mean (SEM). Differences between the treated groups by CCFaq, BDRaq, standard-glibenclamide and diabetic control group were assessed using Student’s t-test. P-values of <0.05 were considered statistically significant.

Results

Phytochemical screening The percentage yield of the aqueous extract of both C. colocynthis fruits and B. dioica roots was found to be 5.41% (w/w) and 11.26% (w/w) respectively as compared to the initial plant weight. Phytochemical screening (Table 1) revealed the presence of the majority of phytoconstituents in C. colocynthis fruit aqueous extract (CCFaq) except anthraquinones. In the aqueous extract of B. dioica roots (BDRaq) we found mainly saponins and flavonoids, alkaloids, coumarins as reducing compounds at lesser degree compered to C. colocynthis fruit aqueous extract. Moreover, the results reported in Figure 1 showed that the CCFaq extract contains the higher rate of total polyphenols, 219.58 mg Gallic acid eq/g dry extract compared to BDRaq extract with 33.96 mg Gallic acid eq/g dry extract. Similarly, the rate of total flavonoids rises in the same extracts to 46.13 and 14.10 mg Catechin eq/g dry extract in CCFaq and BDRaq extracts respectively (Fig. 1). Determination of lethal doses (LD50 and DL100) of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts

The acute toxicity of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts showed increasing mortality with increased doses of both CCFaq and BDRaq as reported in Table 2. The lethal doses LD50 and LD100 values were found to be 200 mg/kg b.w. and 400 mg/kg b.w. for CCFaq extract and 300 mg/kg b.w. and 400 mg/kg b.w. for BDRaq extract respectively. The testing dose used in this 1 study present /10 of LD50, it is estimated to be safe. Therefore, doses of 20 mg/kg b.w. and 30 mg/kg b.w. for CCFaq and BDRaq extracts respectively are retained as therapeutic doses during acute and sub-acute experiment.

Characteristics of n5-STZ diabetic rats

Some characteristics of nine week-old n5-STZ diabetic and non-diabetic control rats are shown in Table 3. There was a significant increase (P <0.01) in food and water intake as well as urine excretion in n5-STZ diabetic rats when compared with non-diabetic control rats. Despite increased food intake, the body weight of n5-STZ diabetic rats was significantly decreased (P <0.01), when compared with non-diabetic control rats. Moreover, fasting blood glucose levels as well as area under the curve during 120 min after glucose loading (AUC) of the n5-STZ diabetic rats were significantly higher (P <0.01) as compared with non-diabetic control rats. This result may indicate that the n5-STZ diabetic rats were indeed glucose intolerant. Taken together, this characteristics presented by the n5-STZ diabetic rats and compared with the non-diabetic control rats (Table 3) can confirm the diabetic condition of the n5- STZ diabetic rats.

Acute effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on blood glucose levels in n5-STZ diabetic rats

Table 4 presents the effect of acute intraperitoneal administration of CCFaq extract (20 mg/kg i.p.) and BDRaq extract (30 mg/kg i.p.) on blood glucose levels. Single administration of vehicle NaCl 9‰ (5ml/kg i.p.) to diabetic control rats did not show any change in blood glucose levels. Single administration of CCFaq extract (20mg/kg i.p.) produced significant reduction in blood glucose levels from the baseline level of 1.87±0.12 g/L to 1.29±0.23 g/L at 180 min (-35% reduction, P <0.05). intraperitoneal administration of BDRaq extract (30 mg/kg i.p.) produced significant reduction in blood glucose levels from the baseline level of 2.20±0.32 g/L to 0.82±0.06 g/L at 180min (-59% reduction, P <0.01). Acute administration of glibenclamide (10 mg/kg i.p.) resulted in -51% reduction (from 1.81±0.10 to 0.98±0.05 g/L, P <0.001) in the same period.

Sub-acute effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on serum glucose level in n5-STZ diabetic rats

The antihyperglycemic effects of repeated intraperitoneal administration during 21 days of both CCFaq and BDRaq extracts as well as glibenclamide in n5-STZ diabetic rats are shown in Table 5. After the period of 21 days, the n5-STZ diabetic rats that received CCFaq extract (20 mg/kg i.p.), BDRaq extract (30 mg/kg i.p.) and glibenclamide (10 mg/kg i.p.) had significantly (P < 0.01) decreased serum glucose levels by -51%, -64% and -58% reductions respectively.

Effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on body weight in n5-STZ diabetic rats (sub-acute study)

In the present study, the diabetic control group showed significant and progressive reduction in body weight, which is a symptom of T2DM (Figure 2). This reduction in body weight induced by n5-STZ was significantly (P < 0.01) reversed by CCFaq extract, BDRaq extract and glibenclamide in the 7th, 14th and 21st days of sub-acute study when compared with diabetic control group (Figure 2).

Effect of sub-acute administration of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on the serum total cholesterol, triglycerides and urea levels in n5-STZ diabetic rats

The effect of sub-acute (21 days, intraperitoneal, once daily) administration of CCFaq (20 mg/kg i.p.), BDR aq (30 mg/kg i.p.) extracts and standard-glibenclamide (10 mg/kg i.p.) on serum cholesterol, serum triglycerides and serum urea levels is presented in Table 6. Repeated administration (once a day for 21 days) of both CCFaq (20 mg/kg i.p.) and BDRaq (30 mg/kg i.p.) caused significant reduction in serum cholesterol (P <0.01), serum triglycerides (P <0.01) and serum urea (P <0.05) levels as compared to diabetic control group. Besides, treatment with standard-glibenclamide (10 mg/kg i.p.) for 21 days showed no significant reduction in serum cholesterol, serum triglycerides and serum urea as compared to diabetic control group.

Effect of sub-acute administration of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts on the on the weight of organs in n5-STZ diabetic rats

Table 7 presents the weight of organs of rats in control and treated groups. As compared to diabetic control group, the CCFaq extract and standard-glibenclamide showed no significant increase in the weight of pancreas and spleen with any significant decrease in the weight of liver and kidney. Whereas, BDRaq extract increased significantly (P <0.05) the weight of pancreas and decreased significantly (P <0.05) the weight of liver and kidney compared with diabetic control group.

Discussion

In spite of prevention and management of diabetes mellitus, identification of active compounds with no/minimal adverse effects is still a major challenge to the biomedical and scientific community. Researchers utilize various animal models to understand regulatory as well as metabolic pathways, for diabetes mellitus and insulin resistance and for discovery of novel therapeutic agents. The n-STZ model, with modification of dose and day of STZ injection, exhibits several phases of type 2 diabetes mellitus such as impaired glucose tolerance, and mild, moderate or severe glycemia [2].When streptozotocin is administered to neonatal rats, the neonates experience acute hyperglycemia within the first few days and the blood glucose level gradually decreases thereafter secondary to a rapid remission by spontaneous β-cell regeneration, so that approximately one week after STZ administration, the b-cell mass was about half of the original one [1,24]. At the 6 to 15 weeks after STZ administration, the surviving rats exhibit decreased β-cell mass which can develops T2DM in the adult age with the features described in type 2 diabetes mellitus patients (hyperglycemia, polyphagia, polydipsia, polyuria, insulin resistance and abnormal glucose tolerance). Therefore, this model provides an ideal platform for new anti-diabetic drug screening [1,14]. In this study, administration of streptozotocine (90 mg/kg, i.p.) to five day old wistar rats resulted in the development of experimental type 2 diabetes mellitus in adult age of wistar rats. Measurements of fasting blood glucose levels, glucose tolerance, body weight, food and water intake as well as urine excretion made in n5-STZ diabetic rats confirmed the classic signs of T2DM: altered glucose levels, glucose intolerance, decreased body weight, polyphagia, polydipsia and polyuria. On the basis of these findings, we chose the n5-STZ diabetic model to test the antidiabetic effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts. The present study has demonstrated a significant antidiabetic effect of C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts in both acute and sub-acute study. Twenty one day of daily treatment of CCFaq (20 mg/kg i.p.) and BDRaq (20 mg/kg i.p.) extracts decrease serum glucose levels by -51% and -64% respectively. Also, it was observed that standard- glibenclamide and aqueous extract of B. dioica exhibit similar effect in reduction of blood glucose levels by -51% and -59% respectively

7 versus -35% for aqueous extract of C. colocynthis in 180 min of acute study. Furthermore, these findings may confirm that the aqueous extract of B. dioica roots possesses an interesting antidiabetic effect more than the aqueous extract of C. colocynthis fruits. The destruction of β-cells during type 2 diabetes mellitus ultimately causes physico-metabolic abnormalities such as a decrease in body weight gain, and an increase in food intake. A considerable reduction in the body weight change observed in the n5-STZ diabetic rats group might be the result of protein wasting due to the unavailability of carbohydrates for energy metabolism and the loss or degradation of structural proteins [25]. This reduction in body weight is reversed by CCFaq (20 mg/kg i.p.) and BDRaq (30 mg/kg i.p.) extracts as well as standard-glibenclamide after 21 days of treatment. Regarding the biochemical parameters, neonatal intraperitoneal injection of streptozotocine increased the serum cholesterol, serum triglycerides and serum urea levels [2]. But CCFaq (20 mg/kg i.p.) and BDRaq (30 mg/kg i.p.) extracts reversed the above streptozotocine induce changes. In addition, changes in the weight of internal organs were restored to normal by the prolonged effect of BDRaq extract treatment. A number of researches have been published on cucurbitaceae screened for antidiabetic activity [8,9,26,27]. This anti-diabetic activity of medicinal plants belonging to cucurbitaceae family is may related to their phytochemical composition. The phytochemicals identified from cucurbit medicinal plants are presenting an exciting opportunity for the development of new types of therapeutics. The qualitative analysis of the C. colocynthis fruits and B. dioica roots aqueous extracts revealed the presence of saponins, flavonoids, tannins, alkaloids and quinones and the absence of anthraquinones. These results correlated with previous reports [6,7,28]. In this study, the level of total polyphenols and flavonoids determined vary in the aqueous extracts of the cucurbit plants, the aqueous extract of C. colocynthis fruits contain more than the aqueous extract of B. dioica roots. Therefore, our results show that both cucurbit plants contained active principles which could back up their use in the treatment of type 2 diabetes. It would be interesting to know which molecule or group of molecules are responsible of this activity in each extract. Biological effect-guided fractionation is currently in progress.

The results of this investigation indicate that aqueous extracts of C. colocynthis fruits and B. dioica roots have an interesting antidiabetic effect in neonatal streptozotocin induced diabetic rats. When our cucurbit aqueous extracts treated groups were compared with diabetic control, non-diabetic control and standard-glibenclamide groups, BDRaq extract appeared to have maximum antidiabetic activity in normalizing all studied parameters during the acute and sub-acute treatment. Moreover, the intraperitoneal injection used in this study is one of the direct ways of crude extracts administration, because it insures the contact between the active phytoconstituants of the extract and interstitial liquids and avoids the passage through the digestive tract which could be breakdown by the enzymes of digestive tract. In this case the material must be sterilized as well as all injected solutions must be filtered through syringe filter to eliminate every risk of infections. The present findings are supported by numerous studies reported in both animals and humans which confirmed the anti-diabetic properties of C. colocynthis extracts. Abdel-Hassan et al [29] showed that the C. colocynthis rind aqueous extract had a hypoglycemic effect in rabbit and they attributed this effect to the saponin and glycosidic components present in this plant [30]. Khoshvaghti and Hamidi [31] showed that daily oral administration of a 100 mg/kg capsule of C. colocynthis powder for 8 days decreased the serum glucose concentration to normal range in the alloxan induced diabetic dogs [31]. Similar to the findings of the present study, Benariba et al [27] documented that intraperitoneal administration of C. colocynthis seeds extracts has beneficial long-term effects on glucose homeostasis and body weight maintenance in streptozotocin-induced diabetic rats [27]. As well as, Lahfa et al [28] reported that C. colocynthis seeds extracts have an antihyperglycemic effect on diabetic rats and stability of the blood glucose level to normal values on the normal rats [28].

Moreover, Huseini et al [32] showed that oral administration of 300 mg/kg/day of C. colocynthis fruits extract as capsules produced a significant effect on the glucose profile in human with type 2 diabetes mellitus [32]. The antidiabetic effect of C. colocynthis extracts could be linked to more than one mechanism, because it has been stated that this plant not only stimulate the beta cells and subsequently facilitate release of insulin but it also participates in activation of the insulin receptors too. Also, it has been stated that the anti-diabetic action of C. colocynthis is probably due to enhanced insulin secretion, decreased gluconeogensis, and inhibited release of counter regulatory hormones including cortisol, glucagon, and growth hormone [33]. On the other hand, according to our knowledge, no earlier reports are available regarding the antidiabetic activity of B. dioica. Our study revealed that aqueous extract of B. dioica roots are characterized by an interesting antidiabetic activity in neonatal streptozotocin induced diabetic rats, comparatively to aqueous extract of C. colocynthis fruits. This property can be attributed to high content of saponins as evaluated by qualitative phytochemical analysis. However, there are other two species of Bryonia reported earlier in the literature, B. alba and B. laciniosa which are known to possess antidiabetic activity [8,9]. In the study of Patel et al [9] ethanolic extract and saponin rich fraction of B. laciniosa seeds are shown to possess antihyperglycemic and antihyperlipidemic effects in streptozotocin-induced diabetic rats [9]. Furthermore, Singh et al [8] revealed that the ethanolic extract from B. alba roots (200 mg/kg) orally administered for 7 days produced a significant decrease in the blood glucose level in the model of alloxan-induced diabetes in rats [8]. Conclusion In conclusion, our in vivo studies indicate that aqueous extracts of C. colocynthis fruits and B. dioica roots possess a significant antidiabetic effect when they are administered intraperitoneally in neonatal streptozotocin induced diabetic rats. Moreover, after the acute and sub-acute study we can suggest that the aqueous extract of B. dioica roots possesses an interesting antidiabetic effect more than the aqueous extract of C. colocynthis fruits. The results of this study may confirm the traditional use of C. colocynthis and B. dioica as an antidiabetic agent. However, further pharmacological and phytochemical studies are needed to determine the specific bioactive compounds responsible for the antidiabetic activity and investigate the mode of action of these tow cucurbitaceae.

Acknowledgements

This work was supported by CNEPRU project N°F02020120097, Ministry of Higher Education and Scientific Research (MESRS) Algerian Government.

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Table 1 Phytochemical screening of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts. Phytoconstituents CCFaq BDRaq

Flavonoids ++ +

Tannins + +

Alkaloids ++ +

Saponins + ++

Coumarins ++ +

Quinones ++ ++

Anthraquinones ‒ ‒

Reducing compounds ++ +

++: highly present; +: present; ‒: not present ; CCFaq: Citrullus colocynthis fruit aqueous extract ; BDRaq: Bryonia dioica roots aqueous extract.

Table 2 Acute toxicity of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts. Number of dead rats Administered doses (mg/kg b.w.) 50 100 200 300 400 CCFaq 0 0 2 3 4 BDRaq 0 0 0 2 4

CCFaq: Citrullus colocynthis fruit aqueous extract ; BDRaq: Bryonia dioica roots aqueous extract.

Table 3 General characteristics of nine week-old n5-STZ diabetic and non-diabetic control rats. Parameter n5-STZ diabetic rats (n=20) non-diabetic control rats (n=5) Food intake/24h (g) 33.79±3.09** 20.25±1.17 Water intake/24h (mL) 66±12.27** 28.55±1.79 Urine volume/24h (mL) 26±5.92** 7.32±0.62 Body weight (g) 185±4.51** 223±4.48 Fasting blood glucose (g/L) 2.15±0.13** 1.04±0.03

AUC 0-120 (g/L.min) 295.37±13.29** 147.95±2.55 Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with non-diabetic control rats.

Table 4 Acute effect of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts on blood glucose level of n5-STZ diabetic rats. Group (n=5) Dose (i.p.) Blood glucose level (g/L)

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Non-diabetic 5 mL/kg NaCl 1.00±0.03 1.06±0.07 0.99±0.06 1.07±0.06 0.96±0.12 control 9‰ Diabetic control 5 mL/kg NaCl 2.07±0.39 1.89±0.33 1.92±0.32 1.70±0.29 1.99±0.22 9‰ CCFaq extract 20 mg/kg 1.87±0.12 1.51±0.07 1.35±0.10 1.30±0.07 1.29±0.23* BDRaq extract 30 mg/kg 2.20±0.32 1.57±0.13 1.30±0.07 1.20±0.13 0.82±0.06** Standard- 10 mg/kg 1.81±0.10 1.30±0.02 1.23±0.06 1.12±0.07 0.98±0.05** glibenclamide

Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with diabetic control rats.

Table 5 Sub-acute effect of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts on serum glucose level in n5-STZ diabetic rats. Group (n=5) Dose (i.p.) Serum glucose level (g/L) 1st day 7th day 14th day 21st day Non-diabetic control 5 mL/kg NaCl 9‰ 1.00±0.03 0.88±0.06 1.03±0.06 0.97±0.06 Diabetic control 5 mL/kg NaCl 9‰ 2.07±0.39 1.77±0.11 1.89±0.04 2.56±0.26 CCFaq extract 20 mg/kg 1.87±0.12 0.86±0.13** 1.29±0.04** 1.26±0.04** BDRaq extract 30 mg/kg 2.20±0.32 0.71±0.11** 1.16±0.22** 0.93±0.19** Standard- 10 mg/kg 1.81±0.10 1.04±0.10** 1.15±0.05** 1.09±0.04** glibenclamide Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with diabetic control rats.

Table 6 Effect of sub-acute administration of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts on the serum total cholesterol, triglycerides and urea levels of n5-STZ diabetic rats. Group (n=5) Dose (i.p.) Total cholesterol Triglycerides Urea (g/L) (g/L) (mg/dL) Non-diabetic control 5 mL/kg NaCl 0.74±0.07 0.82±0.05 29.74±3.95 9‰ Diabetic control 5 mL/kg NaCl 1.65±0.07 1.40±0.04 52.91±2.36 9‰ CCFaq extract 20 mg/kg 0.61±0.16** 0.92±0.04** 44.69±2.04* BDRaq extract 30 mg/kg 58±0.14** 0.55±0.10** 37.70±4.55* Standard- 10 mg/kg 1.33±0.15 1.06±0.19 45.72±3.40 glibenclamide

Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with diabetic control rats.

Table 7 Effect of sub-acute administration of Citrullus colocynthis fruits and Bryonia dioica roots aqueous extracts on the weight of organs of n5-STZ diabetic rats. Group (n=5) Dose (i.p.) Pancreas (g) Liver (g) Kidney (g) Spleen (g) Non-diabetic control 5 mL/kg NaCl 9‰ 1.07±0.05 8.02±0.61 0.71±0.04 0.68±0.03 Diabetic control 5 mL/kg NaCl 9‰ 0.75±0.07 10.34±0.47 0.97±0.06 0.70±0.11 CCFaq extract 20 mg/kg 0.94±0.02 9.74±0.59 0.81±0.03 0.90±0.24 BDRaq extract 30 mg/kg 1.03±0.04* 8.15±0.46* 0.75±0.06* 0.67±0.22 Standard- 10 mg/kg 0.99±0.13 9.20±0.25 0.81±0.04 0.92±0.18 glibenclamide Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with diabetic control rats.

250,00 219,58 200,00

150,00 CCFaq extract 100,00 BDRaq extract 46,13 50,00 33,96 14,10 0,00 Total polyphenols content (mg gallic Total flavonoids content (mg catechin acid equivalent per g extract) equivalent per g extract) Figure 1 Total polyphenols and flavonoids content of Citrullus colocynthis fruit and Bryonia dioica roots aqueous extracts.

Non-diabetic control Diabetic control CCFaq extract

BDRaq extract Standard-glibenclamide

** **

300 **

250

200 150 100

Body weight weight Body (g) 50 0 1 7 14 21 Time (days)

Values were expressed as mean ± SEM ; * Significant difference (P <0.05) ; ** Highly significant difference (P <0.01) as compared with diabetic control rats.

Figure 2 Effect of sub-acute administration of Citrullus colocynthis fruit and Bryonia dioica roots aqueous extracts on the body weight of n5-STZ diabetic rats.

Communications

4th International workshop on industrial biotechnology

10-11/04/2013. Antihyperglycemic effect of Citrullus colocynthis (L) seeds in streptozotocin Tlemcen induced diabetic rats Algérie Chekroun E., Benariba N., Belkacem N., Djaziri R.

Forum sur le développement des sciences de la vie et de l’univers

14-15/05/2013. Effet de l’administration orale de l’extrait eau-méthanol de graines entières de Tlemcen Citrullus colocynthis chez le rat Wistar rendu diabétique par la streptozotocine Algérie Chekroun E., Benariba N., Belkacem N., Djaziri R.

3ème Congrès International sur les Molécules bioactives, Aliments fonctionnels et Maladies associées au stress oxydant 21-23/03/2014. Hammamet Antidiabetic activity of Citrullus colocynthis aqueous fruit extract in neonatal Tunisie streptozotocin-induced diabetic rats Chekroun E., Djaziri R., Bachiri A., Adida H.

Journées scientifiques et pédagogiques organisées dans le cadre du 40ème anniversaire de la création de l’USTHB 20-24/04/2014. Alger Screening of radical scavenging activity of same Citrullus colocynthis fruit Algérie extracts Chekroun E., Djaziri R., Adida H., Bachiri A.

1ère Journée Scientifique des Sciences de l’Agriculture, Environnement et Santé 03/06/2014. Tlemcen Teneurs en polyphénols et pouvoir antioxydant d’une plante médicinale utilisée Algérie traditionnellement pour le traitement du diabète sucré Chekroun E., Djaziri R., Adida H., Bachiri A.

2ème Journée Scientifique des Sciences de l’Agriculture, Environnement et Santé 15/04/2015. Tlemcen In vitro antioxidant potentiel of Citrullus colocynthis fruit extract and its relation Algérie with total polyphenols content Chekroun E., Bachiri A., Adida H., Benariba N., Djaziri R.

The first international congress of nutrition and food science "from bench to bedside" 20-22/11/2015. Tlemcen Antidiabetic activity of Bryonia dioica aqueous roots extract in neonatal Algérie streptozotocin-induced diabetic rats Chekroun E., Azzi A., Bachiri A., Djaziri R., Adida H., Benariba N., Laoufi H.

الملخص : نطبنًب سبْى انطب انخقهٛذ٘ كأسبط نهبحذ ػٍ أدٚٔت صذٚذة ػٍ غشٚق انفحص انخضشٚبٙ انكًٛٛبئٙ ٔانبٕٛنٕصٙ نًسخخهصبث انُببحبث انطبٛت. يٍ بٍٛ ْزِ انُببحبث انفبششا Bryonia dioica Jacq ٔ انحُعم Citrullus colocynthis (L.) Schrad ارُخٍٛ يٍ انقشٛػبث انًسخخذيت حقهٛذٚب نؼالس يشض انسكش٘، يشض يضيٍ خطٛش ٚخضاٚذ إَخشبسا فٙ صًٛغ أَحبء انؼبنى. انٓذف يٍ ْزِ االغشٔحت ْٕ انذساست انكًٛٛبئٛت انُببحٛت نًسخخهصبث ْخٍٛ انُبخخٍٛ ٔحقٛٛى خصبئصًٓب انًعبدة نألكسذة فٙ انًخخبش ٔ انًعبدة نهسكش٘ فٙ انضسى انحػ ُٙذ انضشراٌ انًصببت ببنسكش٘ ػٍ غشٚق انحقٍ ببنسخشبخٕصٔحٕسػ (STZ) ٍُٛذ انٕالدة. حى ححعٛش يخخهف انًسخخهصبث يٍ صزٔس Bryonia dioica ٔ فٕاكّ Citrullus colocynthis : يسخخهصبث يبئٛت ٔ بٛخبَٕنٛت ببالظبفت انٗ يسخخهصبث انبٕنٛفُٕٛل ٔ انصببٍَٕٛ. كشفج انذساست انكًٛٛبئٛت انُببحٛت انٛػُٕت ٔانكًٛت نٓزِ انًسخخهصبث أسبسب ٔصٕد كَُٕٛبث حشة ٔانًشكببث انفُٕٛنٛت )انؼفص ٔانفالفَٕٛذاث( ٔانصببٍَٕٛ حشحٛشبٍٛ. ْزٍٚ األخٛشٚ ٍٕٚصذاٌ بكًٛبث يشحفؼت َسبٛب فٙ يسخخهصبث BDRSaponines ٔ BDRPolyphénols يغ ػ µg eq AO/mg ES 952391 ٔ µg eq AG/mg ES 823326هٗ انخٕانٙ .دساست انُشبغ انًعبد نألكسذة ببسخخذاو غشٚقخٍٛ : غشٚقت انكسح انشادٚكبنٛت انًعبدة نألكسذة ػهٗ DPPH ٔ غشٚقت إسصبع انحذٚذ )FRAP(، أظٓشث َشبغ يعبد نألكسذة يخؼهق بخشكٛب انًسخخهص انًخخبش، حٛذ ٚحخٕ٘ انًسخخهص BDRPolyphénols (ػ (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mLهٗ أْى َشبغ يعبد نألكسذة. ٔببإلظبفت إنٗ رنك، فئٌ ْزا انًسخخهص بخشكٛض 1 يهغ / يم ال ٚؤد٘ إنٗ إَحالل انذو غٕال 80 دقٛقت يٍ انحعبَت ػُذ 32 دسصت يئٕٚت. ْزٍٚ انُشبغٍٛ يعبد نألكسذة ٔ ٔاقٙ نهخهٛت يػ ٔ ًٍٛٓهٗ األسصح ْزا ساصغ إنٗ إحخٕائًٓب ػهٗ يسخٕٚبث يشحفؼت يٍ انفُٕٛالث ٔانفالفَٕٛذاث انكهٛت. أظٓش حقٛٛى انخصبئص انًعبدة نهسكش٘ نضًٛغ يسخخهصبث C. colocynthisٔ B. dioica ، إَخفبظب قهٛال فٙ يسخٕٖ انسكش فٙ انذو ػهٗ انًذٖ انقصٛش )3 سبػبث(، فٙ حٚ ٍٛصبح كبٛشا ػهٗ انًذٖ انًخٕسٚ 21( ػٕيب( ػُذيب حؼطٗ ٚ IPٕيٛب نهضشراٌ انًصببت بذاء انسكش٘. ببألخص، ٚخًٛض انًسخخهصبٌ BDRSaponines ٔ BDRn-but بخأرٛش كبٛش صذا فٙ خفط يسخٕٖ انسكش فٙ انذو ػهٗ انًذٖ انًخٕسػ ، فًٓب ٚعًُبٌ انحذ يٍ إسحفبع يسخٕٖ انسكش فٙ انذو بُسبت ػ ٪22- ٔ ٪86-هٗ انخٕانٚٔ ٙشصغ رنك أسبسب إنٗ احخٕائًٓب ػهٗ يسخٕٚبث يشحفؼت يٍ انصببٚٔ .ٍَٕٛشحبػ انًفؼٕل انًعبد نهسكش٘ ػهٗ انًذٖ انًخٕسػ بخحسٍٛ بؼط انًكَٕبث األٚعٛت : انكٕنٛسخشٔل 3انذٌْٕ انزالرٛت ٔانٕٛسٚب، ٔغٛشْب يٍ االظطشاببث يزم انُٓبو، انؼطش ٔفقذاٌ انٕصٌ، كهٓب حغٛشاث ححذد بؼذ حقٍ ػ STZُذ انٕالدة. ػٔالٔة ػهٗ رنك، فئٌ انؼًبنضت بًسخخهصبث ْزِ انقشٛػبث نًذة ٚ 21ٕيب نى حظٓش أ٘ سًٛت فٙ انضشراٌ انطبٛؼٛت ٔ انًشٚعت ببنسكش٘. كم انُخبئش انخٙ حى انحصٕل ػهٛٓب فٙ ْزِ انذساست ٔاػذة، إلَٓب حخبشَب ػٍ انُشبغ انًعبد نألكسذة ٔ انًعبد نهسكش٘ نًسخخهصبث صزٔس B. dioica ٔ فٕاكّ C. colocynthis ٔ ْزا يب ٚؤكذ إنٗ حذ يب اسخخذايًٓب انخقهٛذ٘. ْزِ انخصبئص ْٙ أكزش أًْٛت ببنُسبت ل .B. dioica . ْزِ انُخبئش ْٙ أٔنٛت ٔ حسخحق أٌ حؼًق أكزش يٍ أصم ححذٚذ ٔحٕصٛف انًشكببث انًسؤٔنت ػٍ ْزِ األَشطت ٔيحبٔنت يؼشفت آنٛبث ػًهٓب إلدساصٓب فٙ انؼالس انذٔائٗ ظذ داء انسكش٘.

الكلمات المفتاحية : Citrullus colocynthis ، Bryonia dioica، انُشبغ انًعبد نألكسذة، انُشبغ انًعبد نًشض انسكش٘، انبٕنٛفُٕٛل، انصببٍَٕٛ، يشض انسكش٘ انخضشٚبٙ.

Résumé : La médecine traditionnelle a toujours servi comme une base à la recherche de nouveaux agents pharmacologiques actifs via le screening expérimental phytochimique et biologique des extraits de plantes médicinales. Parmi ces plantes Bryonia dioica Jacq et Citrullus colocynthis (L.) Schrad, deux cucurbitacées traditionnellement utilisées pour traiter le diabète sucré, maladie chronique grave dont la prévalence ne cesse d’augmenter à travers le monde. L’objectif de ce travail est consacré à l’étude phytochimique de quelques extraits et fractions de ces deux cucurbitacées ainsi que l’évaluation de leurs activités antioxydante in vitro et antidiabétique in vivo chez des rats rendus diabétiques par l’injection néonatale de la streptozotocine. Différents extraits aqueux et butanoliques en plus des fractions enrichies de polyphénols et de saponines ont été préparés à partir des racines broyées de B. dioica et des fruits concassés de C. colocynthis. L’étude phytochimique qualitative et quantitative de ces extraits a révélé principalement la présence de quinones libres, composés phénoliques (tanins et flavonoïdes) et de saponines triterpéniques. Ces deux derniers se trouvent à des taux relativement élevés dans les fractions BDRPolyphénols et BDRSaponines, avec des taux de 673,28 µg eq AG/mg ES et 592,51 µg eq AO/mg ES respectivement. L’étude de l’activité antioxydante, utilisant les méthodes de piégeage du radical libre DPPH et de réduction de fer (FRAP), a montré un effet antioxydant dépendant de la composition de l’extrait testé. En effet, la fraction BDRPolyphénols (CI50=1,25 μg/mL ; CE50=21,67 µg/mL) renferme l’effet antioxydant le plus important. Par ailleurs, cette fraction n’a pas montré un effet hémolytique vis-à-vis des globules rouges humains à une concentration de 1 mg/mL jusqu’à 60 min d’incubation à 37°C. Ces effets antioxydant et cytoprotecteur importants sont dus probablement aux teneurs élevées en polyphénols totaux et flavonoïdes totaux. L’évaluation de l’activité antidiabétique nous a révélé que l’ensemble des extraits et fractions de B. dioica et C. colocynthis montrent un effet antihyperglycémiant peu significatif à court terme (3 heures) mais plus significatif à moyen terme (21 jours) lorsque administrés IP quotidiennement chez les rats rendus diabétiques. En particulier, l’extrait BDRn- but et la fraction BDRSaponines qui exercent un effet antihyperglycémiant très significatif à moyen terme, ils assurent une réduction de l’hyperglycémie de -68% et -72% respectivement en relation avec leur teneur appréciable en saponines. L’effet antidiabétique à moyen terme est associé par l’amélioration de certains paramètres métaboliques : cholestérol total, triglycérides et urée, et autres perturbations comme la polyphagie, la polydipsie et la chute de poids corporel, altérations apparus après l’injection néonatale de la STZ. Par ailleurs, l’administration IP des extraits et fractions des deux cucurbitacées pendant 21 jours ne présente aucune toxicité chez les rats traités normaux et diabétiques. Les résultats obtenus au cours de cette étude sont prometteuses, ils nous renseignent sur les activités antioxydante et antidiabétique des racines de B. dioica et des fruits de C. colocynthis en confirmant à un certain degré leur utilisation traditionnelle. Ces propriétés sont toutefois plus importantes pour B. dioica. Ces résultats restent préliminaires et méritent d’être approfondis afin d’identifier et caractériser les composés responsables de ces activités et d’étudier leurs mécanismes d’action en vue de leur incorporation dans le système de soin.

Mots clés: Bryonia dioica, Citrullus colocynthis, activité antioxydante, activité antidiabétique, polyphénols, saponines, diabète expérimental.

Abstract : Traditional medicine always served as a base in search of new active pharmacological agents via phytochemical and biological experimental screening of medicinal plants extracts. Among these plants Bryonia dioica Jacq and Citrullus colocynthis (L.) Schrad, two cucurbitaceous traditionally used to treat diabetes mellitus, serious chronic disease whose prevalence is increasing worldwide. The aim of this work is devoted to phytochemical investigation of extracts and fractions of these two cucurbitaceous as well as the evaluation of their activities antioxydant in vitro and antidiabetic in vivo in neonatal-streptozotocin diabetic rats. Different aqueous and butanolic extracts as well as polyphenols and saponins enriched fractions were prepared from Bryonia dioica powdered roots and Citrullus colocynthis crushed fruits. The qualitative and quantitative phytochemical study of these extracts revealed the presence mainly of quinones, phenolic compounds (tannins and flavonoids) and triterpenic saponins. These last two are relatively high in the fractions BDRPolyphenols and BDRSaponins, with 673.28 µg eq GA/mg DE and 592.51 µg eq OA/mg DE respectively. The study of the antioxydant activity by using free radical scavenging (DPPH) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays, showed an antioxydant effect dependent to the tested extract composition. In fact, the BDRPolyphenols fraction (IC50=1.25 μg/mL ; EC50=21.67 µg/mL) exhibits the most important antioxidant effect. In addition, this fraction did not show any hemolytic effect of human red blood cells at a concentration of 1 mg/mL up to 60 min of incubation at 37 °C. These important antioxidant and cytoprotective effects are probably related to the high total polyphenols and flavonoids content. All extracts and fractions of B. dioica and C. colocynthis evaluated for their antidiabetic activity show a not very significant antihyperglycemic effect in acute term (3 hours), it becomes significant in sub-acute term (21 days). In particular, the BDRn-but extract and BDRSaponins fraction exhibit high significant antihyperglycemic effect in the sub-acute term, they ensure a reduction of -68% and -72% respectively in relation to their appreciable content of saponins. The sub-acute term antidiabetic effect is associated by the improvement of certain metabolic parameters: total cholesterol, triglycerides and urea, and other perturbations like polyphagia, polydipsia and falling body weight, deteriorations appeared after the neonatal injection of the STZ. In addition, IP administrations of extracts and fractions of the two cucurbitaceous during 21 days do not have any toxicity in the treated normal and diabetic rats. The results obtained during this study are promising, they inform us about the antioxydant and antidiabetic activities of B. dioica roots and C. colocynthis fruits by confirming with a certain degree their traditional use. These properties, however, are more important for B. dioica. These results remain preliminary and they deserve to be thorough in order to identify and characterize the compounds responsible for these activities and to try to know their mechanisms of action for their incorporation in the care system.

Keywords: Bryonia dioica, Citrullus colocynthis, antioxydant activity, antidiabetic activity, polyphenols, saponins, experimental diabetes.