%N VUE DE LOBTENTION DU %0$503"5%&-6/*7&34*5² %&506-064& $ÏLIVRÏ PAR Université Toulouse III Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier) $ISCIPLINE OU SPÏCIALITÏ Gènes, Cellules et Développement 0RÏSENTÏE ET SOUTENUE PAR Stéphanie BRAS LE vendredi 8 juin 2012 4ITRE Etude des fonctions normales et pathologiques des facteurs de transcription de type RUNX au cours de l’hématopoïèse chez Drosophila melanogaster. %COLE DOCTORALE Biologie, Santé, Biotechnologies (BSB) 5NITÏ DE RECHERCHE Centre de Biologie du développement, CNRS UMR 5547 $IRECTEURS DE 4HÒSE Dr. Lucas Waltzer Dr. Marc Haenlin 2APPORTEURS Dr. Marie Meister Dr. Georges Lacaud MEMBRES DU JURY : Pr David Cribbs, président Dr. Marie Meister, rapportrice Dr. Georges Lacaud, rapporteur Dr. Estelle Duprez, examinatrice Dr. Lucas Waltzer, directeur de thèse Dr. Marc Haenlin, directeur de thèse
Je voudrais tout d’abord remercier les membres du jury : David Cribbs, Georges Lacaud, Marie Meister et Estelle Duprez qui ont accepté de lire et de juger mes travaux de thèse.
Je remercie également mes deux directeurs de thèse, Lucas et Marc pour ces six ans passés au sein de leur équipe. Et oui, je n’étais pas rassasiée de mes deux années de master passée dans votre équipe, il a fallu que je m’accroche encore 4ans pour faire ma thèse dans votre équipe !
Ma première pensée va vers Lucas : Merci Lucas pour toutes ces discussions qui m’ont permis de me recentrer sur les questions essentielles à des moments où les résultats n’étaient pas des plus clairs. Tu m’as soutenu. Tu as été toujours plus disponible au fil des années pour m’encadrer et me permettre de mener à bien mes deux projets de thèse. Même si parfois la réussite n’était pas évidente, tu as su croire en mes résultats et en ma capacité à rebondir et grâce à ton soutien je suis arrivée au bout de cette folle aventure ! Au fil des années que j’ai passé dans ton équipe, j’ai beaucoup appris à tes côtés, aussi bien scientifiquement que humainement ; Encore merci pour tout Lucas, c’est un bien faible mot pour exprimé à quel point je te suis reconnaissante mais tu l’auras compris je ne suis pas la meilleure pour les remerciements !
Je remercie également notre cher directeur qui est aussi mon directeur de thèse, Marc, fantaisiste mais tellement philosophe. Avec toi les discussions sont toujours très riche et tu m’as permis de voir la science avec un autre regard !
Je tiens également à remercier tous les membres de l’équipe Waltzer/Haenlin, ceux d’hier et d’aujourd’hui. Merci Benoit pour le soutien que tu m’as témoigné depuis le jour où j’ai mis les pieds dans notre cher labo. Merci de ta présence, de ton soutien technique exceptionnel, de ta joie de vivre et pour toutes les blagues et les parties de rigolades qu’on a pu avoir au cours de ces 6années. Je crois que je ne t’ai jamais assez remercié pour toutes les attentions et le soutien que tu as pu me donner. Ces quelques mots sont bien faibles compte tenu de tout ce que tu as pu m’apporter durant ma thèse. Sincèrement, Merci Benoit. Je voulais aussi remercier Assia, avec qui j’ai passé de super moment au labo. Grâce à ton sourire quotidien, tu m’as fait retrouvé le mien à bien des reprises. Merci de ton soutien, de ta bonne humeur permanente. Tu es partie vers de nouveaux horizons maintenant, mais tu resteras toujours ma Boudinette préférée ! Bien sûr je tiens à remercier notre grand thésard, Bilel ou notre glandeur pour les intimes ! Très discret et réservé au début, j’ai appris à te connaître et j’ai découvert une personne sincère, drôle et en somme une personne exceptionnelle ! Je te remercie pour ta bonne humeur, tes blagues toujours bien placées et ton sens du partage ! Bilel, tu es formidable, ne change pas : tu vas devenir un grand scientifique !! Bon courage pour la suite… Bien sûr je remercie également Vanessa, pour m’avoir fait progresser sur bien des points durant ma thèse ; Osman, pour ta bonne humeur et ta simplicité : je n’ai pas eu le temps de bien te connaître mais ton arrivée au labo a été bénéfique pour l’ambiance musicale durant nos manip du lundi matin !!! Fernando, pour ta présence bien que discrète à mes côtés mais pour tes conseils toujours avisés qui m’ont permis de recentrer mon attention. Merci pour ton regard critique mais toujours valorisant sur mon travail. J’ai aussi une attention envers Marion, notre nouvelle thésard, arrivée depuis peu au labo et que je n’aurai pu que croiser durant cette dernière année. Bien que je n’ai pas pu passé trop de temps à tes côtés, j’ai découvert une personne généreuse, très sympathique et joyeuse : bon courage pour ta thèse Marion, ne lâche jamais rien, et je sais que tu vas faire une super thèse !!
Ces remerciements n’auraient pas de sens si je ne remerciais pas notre Dani international !! Et oui Dani, c’est en fait grâce à toi que j’ai pu arriver jusque là. Après une année en tant que stagiaire à tes côtés, où oui je l’avoue je t’en ai fait baver : entre mes blagues fouareuses, mon sale caractère et ma naïveté scientifique…. Tu m’as tout de même soutenu comme un frère, un ami et un maitre de stage !! Grâce à toi j’ai progresser pour arriver à passer le cap du master et obtenir mon concours qui n’était pas gagné d’avance : Tu m’as soutenu quotidiennement, parfois à la limite du harcèlement scientifique, mais je ne te remercierai jamais assez pour tout ça ! Tu es parti très vite ensuite vers la Suisse avec ta petite famille mais malgré la distance, ton soutien est resté entier et tu resteras mon modèle scientifique !!!! MERCI de tout cœur Dani !
Bien sûr, je ne peux oublier de remercier Cédric pour sa présence à mes côtés durant ces 4ans de thèse : pour ta bonne humeur, ton soutien et ton réconfort plus que précieux ! C’est court mais je ne trouve pas de mot assez fort pour t’exprimer au combien je suis touché par ton soutien durant ma thèse. C’est aussi tout naturellement que mes pensées vont maintenant vers Julie, ma tutrice de thèse. Et là, les mots sont encore moins faciles à trouver pour exprimer toute ma reconnaissance…..Pour moi, ça a été une révélation : tu m’as soutenu sans limites au moment les plus difficiles de ma thèse, grâce à ton énergie débordante et à ta présence quotidienne, tu m’as fait relativiser et grâce à toi j’ai toujours pu avancer encore plus loin….Tu as une joie de vivre communicative et un sens de la vie exceptionnel : Plus qu’une tutrice de thèse, tu es devenue mon allier indispensable durant ces dernières années. Merci pour tout Julie !
Bien évidemment je ne pourrais pas terminer ces remerciements sans penser à mon allier de tous les jours, depuis les pauses tisanes jusqu’aux discussions philosophiques….Et oui Yacine, effusif souvent mais toujours tellement généreux, attentionné et énormément adorable : j’ai appris à te connaître durant ces années et j’ai découvert que tu étais une personne exceptionnellement gentille, dévouée et intelligente. A tes côtés, j’ai appris à relativiser et un nouveau mode de vie : le mode toile cirée !!! Merci pour tout Yac’ ! Je remercie aussi mes autres accolites de M2R, Hadi (alias Jacques), Tim, Lisa, Magalie et les autres pour cette année de fou rire.
J’ai également une pensée pour l’ensemble des membres du CBD, les thésards, avec une mention spéciale à Laurence qui m’a supporté pendant 15jours à Shéffield !!
Je terminerai ces remerciements en remerciant de tout cœur ma famille et mes amis qui m’ont soutenus, écoutés et surtout supportés durant ces années pleines de rebondissement… Malgré la distance qui nous séparait, mes parents ont toujours su trouver les mots pour me pousser toujours plus loin : je leur dois ma réussite ! Bien sûr, mon remerciement le plus émus se dirige vers celui qui m’a supporté au quotidien (dans tous les sens du terme) : Jérôme !!!! Tu as été présent à chaque minute de ma thèse et tu as vu les facettes les plus cachées de mon caractère, mais tu as toujours été là : un simple merci n’est pas suffisant, mais tu sais à quel point je te suis reconnaissante !
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6<6 RESUME/ABSTRACT
Titre: Etude des fonctions normales et pathologiques des facteurs de transcription de type RUNX au cours de l’hématopoïèse chez Drosophila melanogaster.
Résumé
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Au cours de ma thèse, je me suis attachée à mieux comprendre comment les facteurs RUNX régulent d’une part le développement normal des cellules sanguines, et d’autre part le développement des leucémies. Pour cela, j’ai tiré profit de la conservation des réseaux géniques régulant la formation des cellules sanguines des vertébrés à la Drosophile. En particulier, les facteurs Lozenge (LZ) et Serpent (SRP), homologues des facteurs RUNX1 et GATA1 respectivement, participent à l’hématopoïèse chez cet insecte.
Afin de comprendre comment les facteurs RUNX et GATA contrôlent l’hématopoïèse, nous avons réalisé un crible in cellulo par RNAi pour identifier des régulateurs de l’activité du complexe SRP/LZ. Parmi les candidats issus de ce crible, je me suis concentrée sur l’étude de MLF (Myeloid Leukemia Factor), dont l’homologue chez l’Homme (hMLF1) a été identifié comme cible de la translocation t(3;5) dans des LAM. Les résultats que nous avons obtenus montrent que mlf contrôle l’homéostasie du système hématopoïétique de la Drosophile. et que MLF participe à une boucle de rétrocontrôle positif au cours de la différenciation du lignage LZ+ en stabilisant la protéine LZ.
D’autre part, j’ai réalisé un crible génétique chez la Drosophile afin d’identifier de nouveaux régulateurs de RE, dont l’expression induit des phénotypes de type « pré- leucémique » chez la Drosophile. Ainsi, en induisant par RNAi la perte de fonction de gènes
RESUME/ABSTRACT spécifiquement dans les cellules LZ+, j’ai pu identifier 26 gènes candidats requis pour l’activité de RE chez la Drosophile. De plus, j’ai pu montrer que l’inhibition de l’un de ces gènes, Pontin52, réduit la clonogénicité des cellules leucémiques humaines exprimant RE. Enfin, mes données montrent que MLF est requis pour l’induction des phénotypes préleucémiques par RE chez la Drosophile et pour l’expression stable de cette protéine chez la Drosophile et dans des cellules humaines leucémiques. Nos résultats suggèrent que le contrôle de la stabilité des facteurs RUNX par MLF pourrait jouer un rôle important dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse.
Mots clés : Leucémie Myéloïde Aiguë, Drosophile, RUNX1-ETO, Pontin52, LZ, MLF.
RESUME/ABSTRACT
Title: Exploring normal and pathological functions of RUNX transcription factor during hematopoiesis in Drosophila melanogaster.
Abstract
Hematopoiesis is the physiological process allowing the production of blood cells. This process is finely tuned by many transcription factors and in particular by members of the GATA and RUNX families, which play essential roles at different stages, from the emergence of hematopoietic stem cells up to their differentiation into multiple lineages. In humans, many genetic alterations affecting RUNX1 are associated with blood cell diseases. In particular, the t(8; 21) translocation, which causes the expression of the fusion protein RUNX1-ETO (RE), is associated with ± 12% of cases of acute myeloid leukemia (AML).
During my PhD, I studied how RUNX factors regulate both normal and leukemic blood cell development. For this, I took advantage of the conservation of the gene networks regulating hematopoiesis from vertebrates to Drosophila. In particular, Lozenge (LZ) and Serpent (SRP), the respective homologues of RUNX1 and GATA1, also control blood cell development in this insect.
To decipher how the activity of RUNX and GATA factors is regulated, we performed an in cellulo RNAi screen to identify regulators of SRP/LZ. Among the candidates from this screen, I focused on MLF (Myeloid Leukemia Factor), whose counterpart in humans (hMLF1) was identified as the target of the t(3; 5) translocation associated with AML. The results we obtained show that MLF controls drosophila hematopoietic system homeostasis is involved in a positive feedback loop controlling during LZ+ cell differentiation by stabilizing LZ protein.
Moreover, I made a genetic screen in vivo in Drosophila to identify new regulators of the human oncogenic protein RE, which induces leukemic like phenotypes in Drosophila. By screening for genes whose loss of function, induced by RNAi specifically in the LZ+ cells, I recovered 26 candidate genes required for RE activity in Drosophila. Then, I could show that inhibition of one of these genes, Pontin52, reduced the clonogenicity of human leukemic cells expressing RE. Finally, my results show that MLF is required for RE-induced preleukemic
RESUME/ABSTRACT phenotypes in Drosophila as well as for the stable expression of RE in fly and in human leukemic cells. These results suggest that the control of RUNX factors stability by MLF may play an important role in hematopoiesis and leukemogenesis.
Keywords: Acute Myeloid Leukemia, Drosophila, RUNX1-ETO, Pontin52, LZ, MLF.
TABLE DES FIGURES
Figure 1. Mise en place de l’hématopoïèse chez la souris.
Figure 2. Représentation schématique des lignages hématopoïétiques chez les mammifères.
Figure 3. Estimation de la répartition des nouveaux cas de leucémies (%) en 2011 aux Etats-
Unis.
Figure 4. Classification FAB des LAM.
Figure 5. Coopération de deux types d’évènements dans une LAM.
Figure 6. Structure des protéines de la famille RUNX.
Figure 7. Représentation de l’épissage alternatif des transcrits de RUNX1.
Figure 8. Représentation schématique des mécanismes de régulation de la transcription par
RUNX1.
Figure 9. Représentation schématique de RUNX1b, de 2 de ces partenaires de translocation
(MDS1/EVI1 et TEL) et des protéines de fusion associées.
Figure 10. Myéloblastes leucémiques présentant un corps d’Auer.
Figure 11. Structure génomique de la translocation t(8;21).
Figure 12. Structure de la protéine de fusion RUNX1-ETO.
Figure 13. Modèle d’action de la protéine de fusion RUNX1-ETO.
Figure 14. Modèle de tétramère de protéines RUNX1-ETO.
Figure 15. Phénotypes d’embryons de souris Runx1-Eto+/- et sauvage à 12,5 jours.
Figure 16. Cycle de développement de Drosophila melanogaster.
Figure 17. Les trois types d’hémocytes chez Drosophila melanogaster.
Figure 18. Hématopoïèse embryonnaire chez la Drosophile.
TABLE DES FIGURES
Figure 19. Morphologie de la glande lymphatique au troisième stade larvaire.
Figure 20. Cellules sessiles marquées par la GFP (hml-gal4 ; UAS-GFP) chez la larve de
Drosophile.
Figure 21. Encapsulation et mélanisation de l’œuf de guêpe.
Figure 22. Contrôle moléculaire de l’hématopoïèse embryonnaire.
Figure 23. Transcrits et protéine MLF.
Figure 24. Patron d’expression du transcrit mlf durant le développement embryonnaire.
Figure 25. Schéma de la voie de signalisation Hedgehog chez la Drosophile.
Figure 26. Effet de l’expression de RUNX1-ETO chez la Drosophile.
Figure 27. L’expression de RUNX1-ETO induit un état préleucémique.
Figure 28. Schéma de la stratégie employée pour déterminer les gènes testés lors du crible.
Figure 29 a, b, c et d. Suppresseurs de l’activité de RUNX1-ETO.
Figure 30. Schéma des croisements réalisés durant le crible.
Figure 31. Nombre absolu de cellules Lz-GFP+ circulantes dans des larves L3 dans un
contexte lz-Gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO (sauf contrôle : lz-Gal4,UAS-
GFP /+).
Figure 32. Effet des dsRNA sur le nombre de cellules LZ+ circulantes au stade L3 en
contexte sauvage.
Figure 33. Proportion de cellules LZ+ à l’état progéniteurs (GFP+mpo-) ou différenciées en
cellules à cristaux (GFP+ mpo+) dans des larves L3 dans un contexte lz-
gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO (sauf contrôle : lz-gal4,UAS-GFP /+).
TABLE DES FIGURES
Figure 34. Effet du traitement siRNA (si) RUNX1-ETO sur l’expression de 7 gènes
candidats (gauche) et de RUNX1-ETO (droite) dans les Kasumi-1.
Figure 35. Validation du siRNA Pontin52 et effet sur le niveau d’expression de RUNX1-
ETO.
Figure 36. Effet de traitements siRNA RUNX1-ETO sur l’expression de Pontin52 dans
les Kasumi-1.
Figure 37. Effet des traitements siRNA RUNX1-ETO et Pontin52 sur l’expression des gènes
activés (panel de gauche) ou réprimés (panel de droite) par RUNX1-ETO dans les
Kasumi-1.
Figure 38. Effet des traitements siGFP, siRUNX1-ETO et siPontin52 sur la prolifération
(gauche) et la clonogénicité (droite) des cellules Kasumi-1.
Figure 39. Effet de la déplétion de RUNX1-ETO ou Pontin52 sur la différenciation des
cellules Kasumi-1.
Figure 40. Schéma de la stratégie du crible in cellulo.
AGM : Aorte-Gonade-Mesonephros AML1 : Acute Myeloid Leukemia 1 CBF : Core Binding Factor CBP : CREB Binding Protein CBFA2 : Core Binding Factor 2 Cdk : Cyclin Dependant Kinase CI : Cubitus Interruptus CRQ : Croquemort CSH : Cellule Souche Hématopoïétique CSN3 : COP9 Signalosome subunit 3 dpn : Deadpan DREF : DNA Replication related Element binding Factor dsRNA : Double Stranded RNA dSU(FU) : drosophila Suppressor of Fused ENU : N-Ethyl-N-nitrosourea ETO : Eight Twenty One FAB : French-American-British FLT3 : Fms-Like Tyrosine Kinase 3 FOG : Friend Of GATA FPD : Familial Platelet Disorder GCM : Glial Cell Missing GM-CSF : Granulocyte/macrophage Colony Stimulation Factor HDAC : Histone Deacetylase HH : Hedgehog HLS7 : Hematopoietic Lineage Switch hnRNP-U : heterogeneous nuclear Ribonucleoprotein IL-3 : Interleukin-3 JAK/STAT : Janus Kinase/ Signal Transducer and Activators of Transcription LAM : Leucémie Aigüe Myéloïde LLA : Leucémie Lymphoïde Aigüe LLC : Leucémie Lymphoïde Chronique LMC : Leucémie Myéloïde Chronique LZ : Lozenge MADM : Mlf1-ADaptator Molecule
Manp : Mlf1-associated nuclear protein MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase MLF : Myeloid Leukemia Factor MTG8 : Myeloid Tumor Gene 8 NCoR : Nuclear receptor co-Repressor NES : Nuclear Export Signal NHR : Nervy Homology Region NLS : Nuclear Localization Signal NMTS : Nuclear Matrix attachment Signal NPM : Nucléophosmine OMS : Organisation Mondiale de la Santé PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PEBP2b : Polyoma virus Enhancer Binding Protein 2b PMD : Pathologie Myélodysplasique ProPO : prophénoloxydases PSC : Posterior Signaling Center PVR : PDGF/VEGF-relared Receptor RNAi : RNA interference ROS : Reactive Oxygen Species RUNX : Runt related protein SMD : Syndrome Myélodysplasique SMMHC : Smooth Muscle Myosin Heavy Chain SMRT : Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid hormone receptor SRP : Serpent STAT : Signal Transducer and Activators of Transcription SVP : Seven up TEL-PDGFR : récepteur tyrosine kinase, Platelet-Derived Growth Factor Receptor TLE :Transducin-Like Enhancer of split UAS : Upstream Activating Sequence UPD : Unpaired UPD3 : Unpaired 3 UTR : Untranslated Region WHO : World Health Organization
L’hématopoïèse est le processus au cours duquel les différentes cellules qui composent le sang vont être formées. Ce processus est finement régulé par un ensemble de voies de signalisation et de facteurs de transcription conservés au cours de l’évolution. La dérégulation de l’activité de ces facteurs, en affectant la prolifération ou la différenciation des cellules hématopoïétiques, est à l’origine de nombreuses pathologies chez l’Homme, dont des leucémies. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à comprendre comment est régulée l’activité de facteurs de transcription clés pour le développement normal ou leucémique en utilisant comme système modèle intégré la mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster.
Dans cette introduction, je décrirai succinctement le déroulement normal de l’hématopoïèse chez les mammifères ainsi que les différents lignages hématopoïétiques qui en découlent. Parmi les facteurs de transcription contrôlant ce processus, le facteur RUNX1, est une cible très fréquente de mutations et remaniements génétiques conduisant au développement de leucémies chez l’Homme. Je détaillerai la structure et les fonctions connues de RUNX1 ainsi que les différents types de mutations pouvant l’affecter. Je me focaliserai plus particulièrement sur une des translocations affectant ce gène, la translocation t(8 ;21) associée à des Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) chez l’Homme. En effet, cette translocation produit une protéine chimérique nommée RUNX1-ETO, dont j’ai cherché à mieux cerner le mode d’action durant ma thèse. Je décrirai donc la structure et le mécanisme d’action proposé pour cette oncoprotéine. Au cours de ma thèse, je me suis également intéressée au gène MLF, impliqué dans la translocation chromosomique t(3 ;5) associée à des LAM chez l’Homme, et dont je décrirai les fonctions. Pour étudier le développement normal et pathologique du système hématopoïétique, j’ai utilisé la Drosophile comme système modèle. En effet, les réseaux géniques et les mécanismes contrôlant le développement des cellules sanguines sont très conservés des mammifères à la Drosophile. Aussi, pour terminer cette introduction, je décrirai l’hématopoïèse chez la Drosophile ainsi que le facteur de type RUNX Lozenge et l’homologue de MLF1 (dMLF) chez la Drosophile.
Figure 1. Mise en place de l’hématopoïèse chez la souris. (A) L’hématopoïèse débute dans le sac vitellin, puis prend place dans la région de l’AGM (Aorte-Gonade-Mésonephros), le placenta et le foie fœtal. (B) Différents types de cellules sanguines sont produits dans chaque compartiment hématopoïétique. CE : Cellules Endothéliales ; CSR : Cellules Sanguines Rouges ; LT-CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques à Long Terme ; CT-CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques à Court Terme ; PCM : Progéniteurs Communs Myéloïdes ; PCL : Progéniteurs Communs Lymphoïdes ; PME : Progéniteurs Mégacaryocytes/Erythroïdes ; PMG : Progéniteurs Macrophages/Granulocytes. (C) Les différents sites hématopoïétiques au cours du temps chez la souris. (d’après Orkin et al., 2008)
INTRODUCTION
Le développement du système hématopoïétique chez les mammifères (et plus généralement chez les vertébrés) se déroule en deux vagues distinctes. La première vague est nommée hématopoïèse primitive et se déroule dans le sac vitellin aux alentours du 7,5e jour de développement embryonnaire chez la souris. Cette vague permet principalement la production de cellules érythrocytaires primitives exprimant des hémoglobines embryonnaires. Ces cellules faciliteront l’oxygénation des tissus pour permettre la croissance de l’embryon (Orkin and Zon, 2008).
La seconde vague hématopoïétique est connue sous le nom de vague définitive car elle va générer des Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) définitives, caractérisées par deux propriétés fondamentales : leur capacité d’auto renouvellement « indéfini » et leur capacité à se différencier dans tous les types cellulaires sanguins. Elles servent donc de réservoir pour la production quotidienne de l’ensemble des lignages hématopoïétiques de l’individu pendant toute la durée de sa vie. Les CSH émergent à partir du 9,5e jour embryonnaire dans le placenta et la région AGM (Aorte-Gonade-Mesonephros) puis colonisent les différents sites hématopoïétiques (le foie fœtal, le thymus, la rate) qui vont permettre leur expansion et la différenciation des cellules sanguines embryonnaires. A l’issue du développement du fœtus, les CSH migrent vers la moelle osseuse qui devient le site principal de l’hématopoïèse post- natale (Figure 1).
Figure 2. Représentation schématique des lignages hématopoïétiques chez les mammifères. LT-CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques à Long Terme ; CT-CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques à Court Terme ; PMP : Progéniteur Multipotent ; PMC : Progéniteur Myéloïde Commun ; PME : Progéniteur Mégacaryocyte/Erythroïde ; PGM : Progéniteur Granulocyte/Macrophage; PLC : Progéniteur Lymphoïde Commun; Pro-NK : cellules progénitrices des cellules dites tueuses ou « Natural Killer ». (D’après Passegué et al., 2003) INTRODUCTION
La production des cellules sanguines durant la vie adulte se déroule au sein de la moelle osseuse à partir des CSH. La représentation classique de l’hématopoïèse est un modèle pyramidal/hiérarchique : les cellules souches, au sommet de la pyramide, génèrent des cellules de plus en plus restreintes dans leur potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation par une succession de choix de lignages irréversibles. En aval des CSH, on distingue de façon dichotomique deux lignages, myéloïdes et lymphoïdes, générés respectivement par les progéniteurs communs myéloïdes et les progéniteurs communs lymphoïdes (Figure 2) (Smith, 2003). Cependant des études récentes ont montré l’existence de progéniteurs intermédiaires qui auraient un potentiel à la fois lymphoïde et myéloïde (Ceredig et al., 2009 ; Kawamoto et al., 2010). Ainsi, les relations de lignage entre les différents types de cellules sanguines sont sans doute plus complexes que ne le laisse penser la représentation classique que l’on en fait et il semble y avoir une certaine flexibilité des progéniteurs quant à leur destin.
Les cellules myéloïdes incluent différents lignages possédant des fonctions spécifiques (Hartenstein, 2006) :
- Les érythrocytes, plus communément nommés globules rouges, occupent 45% du volume total sanguin et assurent le transport des gaz respiratoires (O2 et CO2) entre les poumons et les tissus.
- Les plaquettes, ou thrombocytes, sont des petits fragments de cellules issus des mégacaryocytes ; leur fonction principale est de garantir la coagulation du sang lors d’une blessure ou d’une hémorragie en s’agrégeant et en libérant des facteurs permettant la formation d’un caillot sanguin.
- Les granulocytes permettent la mise en place d’une réaction immunitaire innée. Il y a trois types de granulocytes : les neutrophiles, ou phagocytes, les basophiles,
INTRODUCTION impliqués au cours de réactions inflammatoires et allergiques, et les éosinophiles, qui initient la destruction des parasites.
- Les macrophages sont capables de phagocyter des corps nécrotiques et apoptotiques, mais ils peuvent également attaquer et digérer des bactéries et d’autres corps étrangers. Ces cellules sont aussi impliquées dans l’immunité adaptative ; en effet, lorsqu’elles phagocytent un pathogène, elles vont présenter un antigène à leur surface afin d’induire une réaction immunitaire adaptative plus spécialisée.
La lignée lymphoïde qui joue un rôle essentiel dans l’immunité adaptative. Au sein de cette lignée trois grands types de lymphocytes existent (Hartenstein, 2006) :
- Les lymphocytes T jouent un rôle au cours de l’immunité cellulaire : ils détruisent les cellules reconnues comme étrangères (bactéries, cellules cancéreuses) par un mécanisme complexe.
- Les lymphocytes B jouent un rôle au cours de l’immunité humorale par opposition à l’immunité cellulaire : ces cellules vont produire des anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques. Cette lignée est responsable de la mise en place de la mémoire immunitaire de l’organisme.
- Les Lymphocytes NK (Natural Killer) sont des cellules impliquées dans la réponse immunitaire innée. Ces cellules sont capables de lyser des cellules étrangères à l’organisme indépendamment de l’expression d’antigènes, contrairement aux lymphocytes T et B.
Au niveau moléculaire, le destin des cellules sanguines est ultimement gouverné par un réseau complexe de facteurs de transcription qui vont généralement agir non seulement en activant l’expression d’un nouveau programme génétique spécifique d’un lignage sanguin mais aussi en réprimant les programmes des lignages alternatifs (Friedman, 2007). Ainsi, de nombreuses études dans des organismes modèles et en culture cellulaire ont permis d’identifier des facteurs de transcription qui, comme RUNX1, SCL, GATA2, PU.1, C/EBP, PU.1, ou Pax5, vont être requis pour les CSH ou pour le développement d’un lignage sanguin
INTRODUCTION particulier. De plus, des modifications de l’activité de ces facteurs de transcription sont à l’origine de nombreuses hémopathies malignes chez l’Homme.
Le terme « leucémie » vient du grec leukos, signifiant « blanc » et aima, pour « sang ». Ainsi, les leucémies sont des cancers du sang induisant une prolifération anormale des globules blancs, souvent bloqués à un stade de différenciation particulier, associée à une forte diminution de la production des globules rouges. Les causes directes du développement de telles pathologies ne sont pas encore bien définies, mais certains facteurs de risque sont unanimement reconnus tels que les expositions à certains produits chimiques (benzène, pesticides ou encore certains engrais), exposition in utero aux rayons X, expositions accidentelles à la radioactivité ou encore les prédispositions génétiques (trisomie 21).
Les leucémies sont classées en fonction de leur rapidité d’évolution (chronique ou aiguë) et selon le type cellulaire affecté (myéloïde ou lymphoïde).
- Les leucémies aiguës sont caractérisées par la prolifération rapide de cellules immatures non fonctionnelles de la moelle osseuse qui vont envahir tout l’organisme en quelques jours ou semaines. Ce type de leucémie se voit à tout âge, mais l’incidence augmente avec l’âge. En France 508 enfants âgés de 0 à 14 ans, seraient atteints de leucémies aiguës chaque année, contre environ 800 personnes âgées de 75 à 80 ans (selon le rapport de l’institut de veille sanitaire 2011). Les leucémies chroniques ont une progression plus lente dans le temps permettant le développement de cellules sanguines normales et fonctionnelles. Ce type de leucémie est moins dramatique que les leucémies aiguës et se voit principalement chez les personnes de plus de 50 ans, mais en l’absence de traitement, elles peuvent progresser vers une forme aiguë.
Figure 3. Estimation de la répartition des nouveaux cas de leucémies (%) en 2011 aux Etats-Unis. LAM : Leucémies Myéloïdes Aiguës ; LLC : Leucémies Lymphoïdes Chroniques ; LLA : Leucémies Lymphoïdes Aiguës ; LMC : Leucémies Myéloïdes Chroniques. D’après le rapport de 2011 de l’ « American cancer society ». INTRODUCTION
Selon le type de cellules affectées, cette pathologie est divisée en leucémies myéloïdes ou lymphoïdes.
Une des formes prédominantes de leucémies aiguës est la Leucémie Aiguë Myéloïde (LAM). Ainsi, les LAM représenteront environ 29% de l’ensemble des nouveaux cas de leucémies aux Etats-Unis en 2011 (Figure 3) et plus de 250 000 nouveaux cas de LAM sont diagnostiqués chaque année dans le monde.
Les LAM sont souvent associées à des mutations ponctuelles mais également à des remaniements chromosomiques, tels que les translocations, altérant de manière récurrente la fonction de régulateurs hématopoïétiques cruciaux (cf. ci-dessous). Ces mutations induisent une dérégulation de l’hématopoïèse et provoquent une accumulation de progéniteurs myéloïdes qui perdent leur capacité à se différencier en cellules fonctionnelles. Les patients présentent alors une baisse du nombre de globules blancs matures associée à la prolifération de blastes ainsi qu’à une forte réduction des globules rouges ; ceci induit une anémie sévère, des hémorragies spontanées et des infections à répétitions.
Le traitement des patients atteints d’une LAM passe par une première phase visant à initier une rémission par des traitements chimiques (anthracycline, ou anthracénédione et cytarabine). Une fois la rémission induite, en moyenne dans 60% des cas, cette première phase est généralement suivie d’une phase de « consolidation » avec plusieurs cycles de chimiothérapie intensive (Gilliland and Tallman, 2002). Globalement, les LAM restent un cancer de mauvais pronostic, avec un taux de rechute et de mortalité très important (Rowe and Tallman, 2010).
Sous-types Fréquences Noms FAB (/LAM totales)
M0 LAM avec différenciation minimale 3%
M1 LAM sans différenciation 15-20%
M2 LAM avec différenciation 25-30%
M3 Leucémie aigüe pro-myélocytaire 5-10%
M4 Leucémie aigüe myélomonocytaire 20%
Leucémie aigüe myélomonocytaire avec M5 5-10% éosinophiles anormaux
M6 Leucémie érythrocytaire 3-5%
M7 Leucémie aigüe mégacaryocytaire 3-12%
Figure 4. Classification FAB des LAM. (D’après Lowenberg et al., 1999) INTRODUCTION
La première classification des LAM a été présentée dans les années 1970 par un groupe international de chercheurs Français, Américains et Britanniques et est connue sous le nom de FAB (French-American-British). La classification FAB divise les LAM en 8 sous-types, M0 à M7, en tenant compte du type cellulaire impliqué au cours du développement de la leucémie mais aussi de leur état de différenciation (Figure 4). Une classification plus récente de l’OMS prend en compte d’autres éléments tels que les caractéristiques cytogénétiques (translocations) et moléculaires, et les caractéristiques phénotypiques des cellules malignes (Gilliland and Tallman, 2002). En 2008, cette dernière classification a été mise à jour, incluant de nouveaux éléments dans les critères de classification des LAM (Vardiman et al., 2009). La classification de ces pathologies permet de diviser en plusieurs catégories les patients selon un pronostic favorable, intermédiaire ou défavorable et procure des informations précieuses pour la mise en place d’un traitement adapté (Frankfurt et al., 2007).
Notre compréhension des leucémies a largement bénéficié d’études cytogénétiques qui ont mis en évidence la présence de translocations chromosomiques récurrentes associées à certains types d’hémopathies malignes, par exemple la translocation t(9;22) (chromosome Philadelphie) dans les LMC ou t(8;21) dans les LAM. Depuis, la recherche de gènes affectés par des translocations, des amplifications, des mutations ponctuelles ou des modifications épigénétiques dans les leucémies a permis de mieux comprendre les bases moléculaires de la leucémogenèse.
Ces dernières années, il a été établi que la coopération de deux classes de remaniements moléculaires était cruciale pour promouvoir le développement des LAM (Gilliland and Tallman, 2002). La première classe d’évènement génétique (classe I) correspond aux mutations conférant aux cellules une capacité de prolifération/survie accrue tandis que le
Figure 5. Coopération de deux types d’évènements dans une LAM. Les mutations de classe I confèrent un avantage prolifératif et de survie aux cellules hématopoïétiques. Les mutations de classe II induisent une perte de fonction de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation des cellules hématopoïétiques. Dans le cas où ces mutations sont présentes seules, elles peuvent induire différentes pathologies telles que les SMD (Syndromes Myélodysplasiques) ou les PMP (Pathologies Myéloprolifératives). (D’après Kelly et Gilliland 2002) INTRODUCTION second type d’évènement génétique (classe II) induit le blocage de la différenciation des cellules myéloïdes (Figure 5). Lorsque les mutations de classe I sont exprimées seules, elles induisent des pathologies de types myéloprolifératives. Au contraire, lorsque les mutations de classe II sont retrouvées seules, elles peuvent induire des syndromes myélodysplasiques. Les résultats obtenus dans des modèles murins de leucémie suggèrent que la combinaison de ces deux types de mutations va induire le développement de LAM chez l’Homme (Kelly and Gilliland, 2002).
Les mutations de classe I affectent souvent des gènes impliqués dans des voies de transduction du signal ou le contrôle du cycle cellulaire tels que C-KIT, RAS ou FLT3 (Fms- Like Tyrosine kinase3). Le plus souvent, il s’agit de substitutions ou de délétions/insertions ayant pour conséquence l’activation constitutive de ces kinases ce qui favorise la prolifération des cellules hématopoïétiques (Rulina et al., 2010 ; Wang et al., 2010 ; Hayakawa et al., 2000 ; Radomska et al., 2006).
Les leucémies sont également associées aux mutations de classe II telles que des translocations qui vont affecter des facteurs de transcription contrôlant la différenciation des cellules sanguines (Gilliland and Tallman, 2002). Ces translocations génèrent des protéines de fusion dont les fonctions sont différentes de celles des protéines initiales. C’est le cas par exemple de la translocation t(15;17), dont le produit est la protéine PML-RAR. Cette protéine de fusion joue le rôle de dominant négatif transcriptionnel de RAR en recrutant de manière aberrante un complexe corépresseur et bloque la différenciation myéloïde (Lallemand-Breitenbach et al., 2005).
L’identification de gènes impliqués dans les remaniements chromosomiques responsables de leucémies a aussi conduit à l’identification de nouveaux facteurs ayant un rôle dans l’hématopoïèse. C’est le cas pour le gène codant Runx1 qui est altéré par la translocation t(8;21). Mais c’est également le cas pour hMLF1 qui est affecté par la translocation t(3;5). Dans les chapitres suivants, je présenterai plus en détail les fonctions de ces deux gènes.
Figure 6. Structure des protéines de la famille RUNX. Les protéines de la famille RUNX contiennent un domaine de liaison à l’ADN dans leur partie N-terminale, nommé le domaine Runt. Mais également trois autres domaines important localisés dans la partie C-terminale : un domaine de transactivation, un domaine d’attachement à la matrice nucléaire (NMTS) et le domaine conservé VWRPY, requis pour l’interaction avec des corépresseurs transcriptionnels. (Adaptée de Blyth et al., 2005).
INTRODUCTION
II. LE FACTEUR RUNX1 CHEZ LES MAMMIFÈRES
Le gène RUNX1 a été identifié lors du clonage des gènes affectés par la translocation t(8;21) associée aux développements de LAM chez l’Homme (Miyoshi et al., 1991). RUNX1 appartient à la famille des gènes RUNX codant pour des facteurs de transcription conservés au cours de l’évolution des métazoaires. Ces facteurs comportent un domaine de liaison à l’ADN de 128 acides aminés, nommé le domaine Runt, en référence au gène fondateur de cette famille : le gène runt de la Drosophile (Figure 6). Grâce à ce domaine, les facteurs RUNX forment un hétérodimère avec le facteur CBF (Core Binding Factor ) ce qui augmente leur affinité de liaison à l’ADN au niveau de la séquence consensus TGYGGTY présente les gènes cibles des RUNX (Blyth et al., 2005). Bien que la séquence C-terminale de ces facteurs soit moins conservée que le domaine Runt, elle contient presque toujours le motif VWRPY requis pour l’interaction avec des corépresseurs transcriptionnels de la famille de Groucho/TLE (Aronson et al., 1997 ; Robertson et al., 2009).
Cette famille comporte trois membres chez les vertébrés : RUNX1, RUNX2 et RUNX3. Ces trois facteurs sont requis au cours de développement de tissus spécifiques (Cohen, 2009). En particulier, RUNX1 est requis au cours de l’hématopoïèse et il est fréquemment muté dans des leucémies chez l’Homme (cf. ci-dessous). Il est aussi essentiel pour l’émergence des cellules souches du follicule pileux (Raveh et al., 2006 ; Osorio et al., 2011). RUNX2 a un rôle essentiel dans la différenciation des ostéoblastes et la vascularisation osseuse (Komori, 2010). En effet, des souris mutantes pour RUNX2 présentent une ossification incomplète et meurent à cause de défauts respiratoires, expliqués par l’absence de cage thoracique (Komori et al., 1997). Chez l’Homme des mutations haplo-insuffisantes dans RUNX2 sont à l’origine de dysplasies cléido-crâniennes. Enfin, RUNX3 est requis pour le développement des cellules T (Woolf et al., 2003) et joue un rôle crucial pour la projection des neurones sensoriels cutanés (Chen et al., 2006). Ce dernier contrôle également le développement des cellules gastriques endothéliales et en son absence, les souris développent des adénocarcinomes
RUNX1a
RUNX1b
RUNX1c
Figure 7. Représentation de l’épissage alternatif des transcrits de RUNX1. La position des deux promoteurs P1 et P2 est indiquée par des flèches. Les boîtes noires représentent les régions codantes et les boîtes blanches les régions non traduites 5’ et 3’. Les positions des signaux de poly-adénylation sont indiquées par des A. (D’après Miyoshi et al., 2005).
INTRODUCTION gastriques (Li et al., 2002). De plus, RUNX3 est fréquemment méthylé dans les cancers gastriques chez l’Homme.
RUNX1 est également connu sous les noms AML1 (Acute Myeloid Leukemia 1), CBFA2 (Core Binding Factor 2) ou encore PEBP2B (Polyoma virus Enhancer Binding Protein 2b). Chez les vertébrés, la transcription du gène Runx1, comme celle des deux autres gènes RUNX, est sous le contrôle de deux promoteurs alternatifs, l’un distal (P1) et l’autre proximal (P2), générant au moins trois transcrits (1a, 1b et 1c) différant par leur région 5’ UTR (« Untranslated Région ») et par leur région codante N-terminale (Figure 7) (Miyoshi et al., 1995). Durant l’hématopoïèse embryonnaire chez la souris, le transcrit Runx1 proximal est majoritairement exprimé jusqu’au stade embryonnaire 10,5 jours, tandis que chez l’adulte la forme prédominante détectée dans les cellules hématopoïétiques provient du promoteur distal (Telfer and Rothenberg, 2001 ; Bee et al., 2009). Il a été montré que l’activité des deux promoteurs varie selon l’état de maturation des cellules hématopoïétiques. En effet, l’expression du transcrit Runx1 proximal est prédominante dans les cellules hématopoïétiques progénitrices tandis que l’expression du transcrit Runx1 distal est enrichie dans les cellules hématopoïétiques matures (Sroczynska et al., 2009 ; Lam and Zhang, 2012).
Les trois isoformes, Runx1a, Runx1b et Runx1c possèdent le domaine Runt. Les formes b et c proviennent respectivement du promoteur P2 et P1 (Figure 7) et ont toutes deux un rôle activateur dans la transcription de leurs gènes cibles (Tanaka et al., 1995). En plus des domaines Runt et WRPY décrits ci-dessus, d’autres séquences importantes sont contenues dans la partie C-terminale codée par Runx1a et Runx1b telles que des domaines de transactivation et des signaux d’attachement à la matrice nucléaire (NMTS, « Nuclear-Matrix- Attachment Signal »). Runx1a est l’isoforme la plus courte (250 acides aminés) et provient du promoteur P2. Elle ne contient pas la partie C-terminale transactivatrice, et pourrait agir comme inhibiteur compétitif des isoformes Runx1b et Runx1c (Tanaka et al., 1995). Cependant, une étude récente montre que Runx1a pourrait promouvoir l’expansion des CSH (Tsuzuki and Seto, 2012). Si l’isoforme la plus abondante et la plus étudiée est Runx1b, le rôle respectif des différentes isoformes de Runx1 dans la fonction de ce gène reste peu connu.
INTRODUCTION
Les fonctions de RUNX1 durant le développement hématopoïétique normal ont été caractérisées grâce à l’utilisation de modèles murins. De fait, les souris déficientes pour Runx1 sont caractérisées par une morphogenèse normale ainsi qu’une érythropoïèse primitive normale au sein du sac vitellin, cependant ces animaux ne présentent pas de progéniteurs hématopoïétiques définitifs au sein du foie fœtal (Okuda et al., 1996 ; Wang et al., 1996). Les cellules présentes dans le foie fœtal ne sont pas capables de se différencier en lignées hématopoïétiques matures et les animaux meurent précocement (après 12,5 jours de développement) à cause d’hémorragies. Depuis, d’autres études ont confirmé le rôle essentiel de RUNX1 dans l’émergence des cellules souches hématopoïétiques définitives. En particulier il a été montré que Runx1 est exprimé dans plusieurs sites hématopoïétiques distincts durant le développement embryonnaire, tels que le sac vitellin, les artères vitellines et ombilicales et la région AGM, mais aussi dans les CSH (North et al., 1999) et que Runx1 est requis pour la transition des hémangioblastes en CSH (Chen et al., 2009 ; Lancrin et al., 2009). Le dosage de Runx1 au cours de l’hématopoïèse embryonnaire est également crucial. En effet, des embryons hétérozygotes pour Runx1 présentent une apparition précoce des CSH dans le sac vitellin après 10 jours de développement embryonnaire. Cette apparition précoce est associée à l’extinction prématurée de l’émergence des CSH dans la région AGM (Cai et al., 2000) et à une diminution du nombre de CSH chez la souris adulte (Sun and Downing, 2004).
INTRODUCTION
Runx1 est également exprimé dans la moelle osseuse où il joue un rôle important au cours de l’hématopoïèse adulte. En effet, l’étude de souris knock-in GFP ou LacZ dans le locus de Runx1 a montré que ce gène est exprimé dans les CSH de la souris au niveau de la moelle osseuse (Lorsbach et al., 2004 ; North et al., 2004). De plus l’expression de Runx1 varie énormément selon les lignages hématopoïétiques considérés, et diminue lorsque les cellules sont dans une phase terminale de leur différenciation (Lorsbach et al., 2004).
Grâce au système de recombinaison Cre/loxP, la fonction de Runx1 a été abolie dans les CSH de souris adultes (Ichikawa et al., 2004). Contrairement à ce qui a pu être observé chez des embryons Runx1-/-, la délétion de Runx1 chez l’adulte n’affecte pas les CSH. Ceci indique que les mécanismes moléculaires impliqués dans l’établissement du système hématopoïétique embryonnaire sont différents de ceux requis pour la maintenance de ce système. Par contre, Runx1 est impliqué au cours de la différenciation des mégacaryocytes et du développement des lymphocytes B et T (Ichikawa et al., 2004 ; Kitoh et al., 2009).
3.
Il a été montré que RUNX1 agit comme régulateur clé de la transcription d’un grand nombre de gènes impliqués au cours de la différenciation hématopoïétique. RUNX1 est capable d’activer ou de réprimer la transcription des gènes selon le contexte.
La plupart des gènes connus pour être activés par RUNX1 sont impliqués au cours de l’hématopoïèse. Ces gènes incluent des cytokines telles que l’Interleukine 3 (IL-3), le facteur GM-CSF (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulation Facteur) ainsi que des facteurs granulocytaires comme l’élastase des neutrophiles, l’enzyme myélopéroxydase, TNF et granzyme B. Les sites de liaison de RUNX1 présents dans les séquences régulatrices de ces gènes sont nécessaires mais pas suffisants pour que RUNX1 induise leur transcription et RUNX1 peut jouer le rôle de chef d’orchestre dans l’assemblage d’un complexe activateur
.
Figure 8. Représentation schématique des mécanismes de régulation de la transcription par RUNX1. RUNX1 se lie à ses gènes cibles grâce à son domaine de liaison à l’ADN et se dimérise avec CBFβ. Selon les lignages hématopoïétiques et les gènes cibles, RUNXl peut agir soit comme activateur de la transcription en recrutant un ensemble de coactivateurs (ex : CBP, p300) (A) ou comme répresseur grâce au recrutement de corépresseurs tels que HDAC, TLE et mSin3A (B). (D’après de Lutterbach et al., 2000) INTRODUCTION impliquant d’autres facteurs de liaison à l’ADN et des coactivateurs transcriptionnels tels que l’Histone Acétyl-transférase p300/CBP (p300/ CREB Binding Protein) (Figure 8) (Lutterbach and Hiebert, 2000).
RUNX1 va aussi réguler la transcription en interagissant avec d’autres facteurs de transcription spécifiques d’un lignage cellulaire hématopoïétique. Par exemple, RUNX1 interagit avec C/EBP et PU.1 afin d’activer le promoteur du récepteur humain M-CSF lors du développement des cellules myéloïdes (Zhang et al., 1996 ; Petrovick et al., 1998). De même, RUNX1 est capable d’interagir avec le facteur GATA1, requis au cours de la différenciation des mégacaryocytes, et ces deux facteurs coopèrent pour activer la transcription de l’intégrine 2b, ainsi que de nombreux autres gènes spécifiques des mégacaryocytes (Elagib et al., 2003 ; Pencovich et al., 2011 ; Tijssen et al., 2011). Des expériences de ChIP-seq ont aussi permis de mettre en évidence le rôle crucial de la combinaison des facteurs RUNX1, GATA2, SCL et ERG dans la régulation des gènes spécifiquement exprimés dans les CSH (Wilson et al., 2010).
En plus de sa capacité à activer ses gènes cibles, RUNX1 est également un répresseur transcriptionnel. Son domaine WRPY lui permet de recruter les corépresseurs transcriptionnels de la famille TLE (Transducin-Like Enhancer of split1) (Figure 8) (Lutterbach et al., 2000 ; Aronson et al., 1997), et RUNX1 interagit aussi avec d’autres corépresseurs comme l’histone méthyltransferase SUV39H1 (Reed-Inderbitzin et al., 2006). Parmi les gènes réprimés par RUNX1, l’exemple probablement le mieux caractérisé est celui de CD4 dont la répression par RUNX1 est essentielle pour la maturation des lymphocytes T (Taniuchi et al., 2002). De façon intéressante, la répression de CD4 par RUNX1 est aussi associée à l’activation de l’expression de CD8 par un mécanisme d’association physique de ces loci qui ferait intervenir une réorganisation nucléaire à grande échelle du positionnement de ces gènes (Collins et al., 2011).
Un autre exemple est celui de la répression de p21waf1, qui est une protéine inhibitrice des CDK capable d’induire l’arrêt du cycle cellulaire lorsque des dommages sont détectés sur l’ADN (Lutterbach et al., 2000). De manière intéressante, la répression de la transcription de p21waf1 est indépendante de l’interaction de RUNX1 avec TLE, mais requiert l’interaction
INTRODUCTION avec les corépresseurs mSin3A et mSin3B. Il semble donc qu’il y ait différents mécanismes de répression induits par RUNX1, spécifiques de ses différentes cibles transcriptionnelles.
4.
De nombreux facteurs de transcription, dont RUNX1, subissent des modifications post- traductionnelles telles que la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation. Ces modifications peuvent influencer la localisation cellulaire et la dégradation de ces facteurs mais aussi leur interaction avec d’autres protéines, ce qui va permettre de réguler finement leur activité et l’expression de leurs gènes cibles (Wang et al., 2009). Ainsi, il a été montré que l’ubiquitinylation de RUNX1 favorise sa dégradation par le protéasome (Huang et al., 2001). De façon intéressante, la dimérisation de RUNX1 avec CBF va non seulement promouvoir la fixation à l’ADN du complexe mais aussi empêcher l’ubiquitinylation et la dégradation de RUNX1.
D’autre part, RUNX1 interagit avec la serine/thréonine kinase ERK1/2 ce qui induit la phosphorylation de différents sites situés dans son domaine de transactivation (Hamelin et al., 2006). Cette modification post-traductionnelle de RUNX1 va permettre d’augmenter son activité transcriptionnelle, facilitant à la fois son association avec le coactivateur p300 et sa dissociation de mSin3A (Imai et al., 2004). Cependant, la phosphorylation de RUNX1 favorise aussi son adressage au protéasome et donc sa dégradation (Biggs et al., 2006). Ces données révèlent une interaction complexe entre RUNX1 et la kinase ERK1/2 qui, dans un premier temps, favorise son activité mais qui va ensuite provoquer sa dégradation.
Il a également été montré que RUNX1 est méthylé par l’arginine méthyltransferase PRMT1 ce qui a pour conséquence d’inhiber son interaction avec mSIN3A. Ainsi, selon les niveaux respectifs de PRMT1 et de RUNX1 présents dans les cellules, la répression ou l’activation des gènes cibles de RUNX1 sera favorisée ce qui va influencer la différenciation des cellules hématopoïétiques (Zhao et al., 2008 ; Huang et al., 2008 ; Wang et al., 2009).
INTRODUCTION
Enfin, il a été montré que le recrutement de l’acétyltransférase p300 par RUNX1 participe à son activation transcriptionnelle non seulement en acétylant les histones des gènes cibles de RUNX1 mais aussi en acétylant directement deux lysines de RUNX1 ce qui augmente significativement son activité de liaison à l’ADN (Yamaguchi et al., 2004) et va promouvoir la différenciation des cellules myéloïdes.
L’ensemble de ces données montre que les modifications post-traductionnelles de RUNX1 régulent son activité transcriptionnelle. Cependant, les relations entre ces différents types de modifications ne sont pas encore bien définies.
5.
Chez l’Homme, Runx1 est affecté par de nombreuses altérations génétiques telles que des mutations ponctuelles (somatiques ou familiales) et des translocations. Ces mutations perturbent les fonctions de RUNX1 au cours de l’hématopoïèse ce qui induit de nombreuses pathologies.
Ainsi 5 à 10% des LAM et Syndromes Myélodysplasiques (MDS) présentent des mutations somatiques affectant le gène Runx1 (Blyth et al., 2005 ; Harada and Harada, 2009). Ces mutations sont retrouvées dans le domaine Runt mais aussi dans le domaine C-terminal de RUNX1 et peuvent être divisées en plusieurs groupes(Osato et al., 1999 ; Preudhomme et al., 2000). Le premier groupe inclut des mutations bi-alléliques provoquant un changement du cadre de lecture ou une terminaison prématurée de la traduction de RUNX1. La protéine tronquée qui en dérive est non fonctionnelle et la différenciation des cellules hématopoïétiques est alors bloquée. Le second groupe englobe des mutations mono-alléliques faux-sens ou non sens qui conduisent à un défaut partiel des fonctions de RUNX1 : ses capacités de liaison à l’ADN ou de transactivation sont altérées mais il peut toujours former des hétérodimères avec CBFß. Ainsi, ces formes mutées pourraient jouer le rôle de dominant négatif en entrant en compétition avec la fonction normale de RUNX1. Enfin, le troisième groupe est plus énigmatique puisqu’il comprend des mutations mono-alléliques faux-sens qui ne semblent pas altérer les fonctions de RUNX1 in vitro. L’ensemble de ces mutations
Figure 9. Représentation schématique de RUNX1b, de 2 de ces partenaires de translocation (MDS1/EVI1 et TEL) et des protéines de fusion associées. Les flèches indiquent les points de cassures dans RUNX1 (1ère ligne), MDS1/EVI1 (ligne 2) et TEL (ligne 4). Les Lignes 3 et 5 représentent les protéines de fusion issues de ces translocations et les flèches indiquent les points de fusion. Toutes les protéines de fusion conservent le domaine de liaison à l’ADN de RUNX1 (RHD : Runt Homology Domain). TD : Transactivation Domain ; PR : PR domain ; ZF : Zinc Finger Domain ; HLH : Helix-Loop- Helix domain.
INTRODUCTION somatiques est associé au développement des LAM les plus indifférenciées (LAM de type M0).
D’autres mutations mono-alléliques sont retrouvées dans une pathologie héréditaire très rare nommée FPD (Familial Platelet Disorder). Cette pathologie est caractérisée par une thrombocytopénie (diminution du nombre de plaquettes), empêchant alors une coagulation efficace et rapide (Michaud et al., 2002), et elle est associée à une forte prédisposition au développement de LAM. Les mutations dans RUNX1 chez ces patients sont monoalléliques et agiraient soit de façon haplo-insuffisante (délétion d’un allèle ou mutation ponctuelle générant une protéine non fonctionnelle) soit par effet dominant-négatif (mutations ponctuelles affectant l’activité de liaison à l’ADN ou de transactivation de RUNX1) (Ho et al., 1996 ; Song et al., 1999).
Enfin, de nombreuses leucémies sont associées à des translocations chromosomiques affectant RUNX1 (Figure 9). Une des plus fréquentes et la première translocation découverte est la translocation t(8;21), qui est presque exclusivement associée à des LAM de type M2, et qui génère la protéine de fusion RUNX1-ETO (Cf. ci-après). Alors que la plupart des translocations affectant RUNX1 sont associées à des MDS et des LAM, la translocation t(12;21) est exclusivement retrouvée dans des cas de leucémies aiguës lymphoïdes. Cette translocation, présente dans près de 25% des cas de LAL chez l’enfant, fusionne la quasi- totalité de la protéine RUNX1 à la protéine TEL, un facteur de transcription de la famille ETS (TEL-RUNX1). La présence récurrente de ces translocations dans des leucémies particulières suggère fortement que les protéines de fusion qu’elles génèrent jouent un rôle moteur dans le processus de cancérogenèse et, avec les mutations ponctuelles évoquées précédemment, elles font de RUNX1 un des gènes les plus fréquemment mutés dans des hémopathies malignes.
On notera aussi que l’inversion inv(16) affectant le facteur CBF, un partenaire essentiel de RUNX1, est aussi fréquemment associée à des cas de LAM. Il est considéré que la protéine de fusion issue de cette inversion agit comme dominant négatif sur l’activité de RUNX1. En effet, le facteur CBF se retrouve associé à la chaîne lourde de la myosine (SMMHC) ce qui va créer un nouveau site de liaison à RUNX1 qui permettrait à cette protéine de fusion d’entrer en compétition avec CBF pour interagir avec RUNX1 et
Figure 10. Myéloblastes leucémiques présentant un corps d’Auer (flèches). (D’après Lowenberg et al., 1999)
INTRODUCTION empêcherait la transcription de ses gènes cibles (Kamikubo et al., 2010). Néanmoins, il a été montré récemment qu’une protéine CBF-SMHCC dépourvue de ce domaine supplémentaire de liaison à RUNX1 possède tout de même une activité leucémogène. Ceci remet donc en cause le mécanisme d’action proposé pour CBF-SMMHC.
Durant ma thèse, je me suis attachée à l’étude de la protéine oncogénique résultant de la translocation t(8;21), RUNX1-ETO, et la partie suivante vise à décrire cette protéine, son incidence chez les patients, sa structure et ses fonctions.
La translocation t(8;21) est associée à près de 15% des nouveaux cas de LAM et 40% des LAM de type M2 (selon la classification FAB) (Peterson and Zhang, 2004). Les signes et symptômes cliniques sont divers et souvent aspécifiques mais les patients présentent typiquement des signes de fatigue, des hémorragies ou des infections dues respectivement à la baisse du nombre de globules rouges, de plaquettes et de globules blancs. Le diagnostique primaire consiste en une identification morphologique des myéloblastes leucémiques. Ces cellules présentent des signes caractéristiques tels qu’un noyau rond et irrégulier, un cytoplasme très réduit, la présence de granules azurophiles prenant la forme de petits bâtonnets et appelés corps d’Auer (Figure 10).
Les translocations chromosomiques sont associées à de nombreuses hémopathies malignes. L’analyse moléculaire des points de cassures impliqués dans ces translocations a permis d’isoler de nouveaux gènes localisés dans ces régions puis de montrer leur rôle crucial au cours de l’hématopoïèse. C’est notamment le cas pour la translocation t(8;21) qui a permis
Figure 11. Structure génomique de la translocation t(8;21). Le gène ETO, situé sur le chromosome 8, contient 13 exons et mesure 87kb. Le gène RUNX1, situé sur le chromosome 21, est composé de 9 exons et s’étend sur 260kb. RUNX1 produit plusieurs ARNm générés par épissage alternatif et par l’utilisation de deux promoteurs (P1 et P2). Les points de cassures sont identifiés par les lignes croisées entre les gènes ETO et RUNX1. Etant donné l’absence d’accepteur d’épissage dans l’exon 1b du gène ETO, l’ARNm du transcrit fusionné ne contient pas ce dernier. Les boites noires et de couleurs (vertes ou bleues) représentent respectivement les séquences non traduites et traduites. Les chiffres soulignés dans l’ARNm RUNX1-ETO identifient les exons de ETO. (D’après de Peterson et al., 2004).
INTRODUCTION d’identifier le gène RUNX1 (Miyoshi et al., 1991) ainsi que le partenaire auquel il est fusionné : ETO (Erickson et al., 1992). Chez les patients présentant cette translocation, un seul allèle de RUNX1 et de ETO sont affectés.
La protéine chimérique issue de cette translocation est RUNX1-ETO (Figure 11 et 12) (Peterson and Zhang, 2004). Cette protéine contient les 177 acides aminés N-terminaux de RUNX1, dont le domaine de liaison à l’ADN, fusionnés avec la quasi-totalité de la protéine ETO (575 acides aminés) (Peterson et al., 2007). De nombreuses études ont permis de mieux comprendre comment RUNX1-ETO pouvait agir.
2.
La protéine ETO appartient à la famille ETO incluant ETO (connu également sous le nom de MTG8 pour Myeloid Tumor Gene 8), ETO2 (MTG16) et MTGR1 (MTG Related 1). Ces trois membres de la famille partagent quatre domaines d’homologie (NHR1-4, pour Nervy Homology Region) avec la protéine Nervy de Drosophila melanogaster. NHR1 présente une homologie de séquence avec TAF110 chez la Drosophile. NHR2 contient une structure avec une séquence répétée de huit acides aminés hydrophobes requis pour une homo et hétérodimérisation entre les membres de la famille ETO. NHR3 contient une structure prédite enroulée et NHR4, aussi nommé domaine MYND, possède deux motifs en doigts de zinc impliqués dans les interactions protéine-protéine (Peterson and Zhang, 2004).
Grâce à des expériences de doubles hybrides, il a été montré que ETO pouvait interagir avec NCo-R (Nuclear Recepteur Co-Repressor) et SMRT (Silencing Mediator for Retinoid and Thyroid hormone receptor) via le domaine NHR4. Ces co-répresseurs sont connus pour interagir avec d’autres répresseurs transcriptionnels tels que HDAC1 (Histone Deacetylase 1) et mSin3A, définissant ETO comme un co-répresseur transcriptionnel. De nombreuses données indiquent que les NMTS de certains facteurs de transcription peuvent influencer leur localisation spécifique. De manière intéressante, ETO contient deux NMTS, N- et C- terminaux dirigeant ce répresseur dans des compartiments intra-nucléaires différents de ceux occupés par RUNX1. Chez l’Homme, ETO est fortement exprimé dans le cerveau et le cœur,
Figure 12. Structure de la protéine de fusion RUNX1-ETO. La protéine oncogénique RUNX1-ETO contient la partie N-terminale de RUNX1, comprenant le domaine de liaison à l’ADN Runt, fusionnée avec la quasi-totalité de la protéine ETO. NHR1-3 : Nervy Homology Region 1-3.
INTRODUCTION mais aussi dans les reins, le placenta et la langue (Wolford and Prochazka, 1998). Enfin, ETO est exprimé dans les cellules CD34+ (progéniteurs hématopoïétiques) et dans les mégacaryocytes (Erickson et al., 1996).
L’ensemble de ces données suggère que ETO peut agir en tant que répresseur transcriptionnel mais la fonction précise de ce facteur reste encore peu caractérisée.
3.
Le modèle d’action initialement proposé pour RUNX1-ETO définit cette oncoprotéine comme un antagoniste des fonctions de RUNX1. En effet, RUNX1-ETO en se fixant à l’ADN via le domaine Runt et en recrutant des corépresseurs via la partie ETO réprimerait l’expression des gènes cibles de RUNX1. Ainsi RUNX1-ETO bloque la différenciation des cellules hématopoïétiques en réprimant par exemple la transcription de certains gènes normalement activés par RUNX1 tels que GM-CSF et p14ARF (Figure 13) (Elagib and Goldfarb, 2007 ; Matsuura et al., 2012). Cependant, le mécanisme d’action de RUNX1-ETO est plus complexe.
D’une part, il a été montré que RUNX1-ETO n’agit pas uniquement comme répresseur transcriptionnel des cibles de RUNX1, mais qu’il peut aussi agir comme activateur. De plus, il a été montré que RUNX1-ETO se lie préférentiellement au niveau de séquences contenant des sites consensus RUNX1 dupliqués et que seulement 70% des gènes sur lesquels RUNX1- ETO se lie contiennent un site consensus RUNX1 (Okumura et al., 2008 ; Ptasinska et al., 2012). Ceci suggère que cette protéine chimérique régule de manière sélective un sous ensemble de gènes cibles de RUNX1 (Okumura et al., 2008). D’autre part, RUNX1-ETO régule aussi directement des gènes qui ne sont pas des cibles de RUNX1 (Gardini et al., 2008). En effet, outre sa capacité à réguler directement la transcription en se fixant à l’ADN, RUNX1-ETO peut interagir avec d’autres facteurs de transcription et interférer avec la régulation de leurs gènes cibles. C’est notamment le cas de PU.1, qui est un facteur de transcription de la famille Ets, essentiel pour la différenciation myéloïde. La fixation de RUNX1-ETO à PU.1, en déplaçant son coactivateur c-JUN, va bloquer la transactivation par
Figure 13. Modèle d’action de la protéine de fusion RUNX1-ETO. Tandis que RUNX1 est connu pour activer la transcription de ses gènes cibles (A), il est proposé que RUNX1-ETO agit principalement comme répresseur transcriptionnel des gènes cibles de RUNX1 en se fixant sur ces cibles via son domaine RUNX et en recrutant un complexe répresseur contenant les facteurs mSin3A, HDAC et N-CoR via sa partie ETO (B). (Elagib et al., 2006) INTRODUCTION
PU.1 (Vangala et al., 2003). De même, RUNX1-ETO peut interagir avec C/EBP et réprimer son expression en inhibant l’autorégulation positive de C/EBP. RUNX1-ETO est aussi connu pour réprimer l’activité des protéines E et de GATA-1 (Elagib and Goldfarb, 2007).
De nombreuses études montrent l’importance de certains domaines de RUNX1-ETO pour son activité oncogénique. En particulier, sa capacité de liaison à l’ADN via son domaine Runt est essentielle, mais l’importance de son interaction avec CBF est plus controversée (Roudaia et al., 2009 ; Kwok et al., 2009). Au niveau des domaines de ETO, il a été montré que le domaine NHR2 joue un rôle crucial en permettant l’oligomérisation de RUNX1-ETO (Figure 14) (Liu et al., 2006 ; Kwok et al., 2009). De plus, le domaine NHR4, en coopération avec le domaine NHR2, participe au recrutement des corépresseurs de la transcription et au blocage de la différentiation induit par RUNX1-ETO (Wichmann et al., 2010). Par contre, l’interaction avec les protéines E comme HEB via le domaine NHR1 ne semble pas importante pour l’activité transformante de RUNX1-ETO (Park et al., 2009).
De manière surprenante, il a été montré que l’expression d’une forme tronquée de RUNX1-ETO ou d’un variant d’épissage (RUNX1-ETO9a) dépourvu des domaines NHR3 et NHR4 est capable d’induire le développement de leucémies chez la souris contrairement à l’expression de la forme pleine taille (Yan et al., 2004 ; Yan et al., 2006). Des travaux ultérieurs ont permis d’établir que c’est l’interaction de la protéine SON avec le domaine NHR4 qui inhibe l’activité leucémogène de RUNX1-ETO (Ahn et al., 2008). Cette protéine pourrait induire l’arrêt de la croissance des cellules exprimant RUNX1-ETO.
Pour mieux comprendre le mode d’action de RUNX1-ETO dans le développement de LAM, plusieurs groupes ont analysé l’effet de cette protéine chimérique sur le comportement cellulaire en utilisant des cellules primaires ou des lignées de cellules hématopoïétiques.
Figure 14. Modèle de tétramère de protéines RUNX1-ETO. L’oligomérisation de RUNX1-ETO lui permet d’augmenter son affinité de liaison à l’ADN et le recrutement de ses corépresseurs. Runt : domaine de liaison à l’ADN, NHR : Nervy Homology Region, NHR2 : domaine d’oligomérisation de ETO, N : domaine N-terminal de RUNX1-ETO. (D’après Okumura et al., 2008)
INTRODUCTION
Les lignées dérivées de patients atteints de LAM t(8;21) sont parmi les modèles les plus fréquemment utilisés. En 1991, Asou et al. ont établi pour la première fois une lignée cellulaire humaine présentant la translocation t(8;21) (Asou et al., 1991). Cette lignée, nommée Kasumi-1 provient d’un jeune patient japonais présentant une LAM de type M2 associée à cette translocation. Cette lignée présente des caractéristiques morphologiques de type myéloïdes immatures. Quelques années plus tard, le groupe de Sakakura et al. a examiné la fonction de RUNX1-ETO sur la prolifération et la différenciation des lignées cellulaires Kasumi-1 et SKNO-1 (une seconde lignée leucémique, dérivée de patients portant la translocation t(8;21)) (Sakakura et al., 1994). En surexprimant une forme tronquée de RUNX1 (contenant le domaine runt) ou en utilisant des oligonucléotides dirigés contre RUNX1-ETO, ils ont observé une inhibition de la croissance et une induction de la différenciation de ces cellules leucémiques. Plus récemment, l’utilisation de siRNA dirigés spécifiquement contre RUNX1-ETO a permis de confirmer que cette protéine chimérique est requise pour le blocage de la différenciation et la prolifération de ces cellules (Heidenreich et al., 2003 ; Martinez et al., 2004).
D’autres modèles classiques incluent la lignée promonocytaire humaine U937 qui a été utilisée pour établir des clones exprimant RUNX1-ETO de façon inductible. L’expression de RUNX1-ETO bloque non seulement la différenciation de ces cellules mais induit également un arrêt du cycle cellulaire et de l’apoptose (Gelmetti et al., 1998 ; Lu et al., 2006 ; Burel et al., 2001). Enfin, plus récemment, le transfert de gène par infection rétroviral a été utilisé pour étudier l’effet de RUNX1-ETO dans des cellules sanguines progénitrices (CD34+) humaines ce qui a permis de montrer que cette protéine augmente leur capacité d’auto-renouvellement (Mulloy et al., 2002). Ces différents modèles et des cellules primaires de patients ont aussi été utilisés pour tenter d’établir le profil d’expression génique induit par RUNX1-ETO et d’identifier des cibles transcriptionnelles importantes dans l’émergence des leucémies.
Figure 15. Phénotypes d’embryons de souris Runx1-Eto+/- et sauvage à 12,5 jours. Les embryons Runx1-Eto+/- (knock-in hétérozygote dans Runx1) sont identiques en taille aux embryons sauvages, mais facilement identifiable par la présence d’un foie fœtal pâle, expliqué par l’absence d’hématopoïèse définitive, et de grosses hémorragies dans le système nerveux central. Ces phénotypes induisent une létalité précoce des embryons Runx1-Eto+/-(D’après Okuda et al., 1998).
INTRODUCTION
La souris est le modèle animal le plus utilisé pour étudier les pathologies humaines mais également pour tester de nouvelles thérapies avant de les administrer à l’Homme. Pour l’étude de RUNX1-ETO, différents types de modèles murins ont été établis.
Dans un premier modèle, une copie du gène Runx1 a été remplacée par « knock-in » par la version Runx1-Eto (Yergeau et al., 1997 ; Okuda et al., 1998). L’expression de RUNX1- ETO sous le contrôle du promoteur Runx1 endogène induit une létalité embryonnaire précoce (Figure 15). Ces phénotypes sont identiques à ceux observés lorsque les gènes Runx1 ou CBF sont délétés. Cependant, contrairement aux embryons Runx1-/-, les embryons exprimant Runx1-Eto génèrent des progéniteurs hématopoïétiques multipotents avec une capacité anormalement élevée d’auto-renouvellement, caractéristique d’une population préleucémique.
Afin de contourner la létalité induite par l’expression de RUNX1-ETO, un modèle murin « knock-in » conditionnel (CRE/Lox) a été développé (Higuchi et al., 2002). Dans ces conditions, RUNX1-ETO est seulement exprimé dans les CSH adultes ainsi que dans les cellules matures. Cependant, aucune perturbation du système hématopoïétique n’a été observée et les souris ne développent pas de leucémie. Néanmoins, le traitement de ces souris par un agent chimique mutagène (N-nitroso-N-éthylurée : ENU) induit des sarcomes granulocytaires ou des LAM chez 40% des animaux. Ainsi, ce modèle murin a permis de montrer l’importance de mutations secondaires associées à la présence de RUNX1-ETO pour le développement de LAM.
Deux groupes ont aussi généré des souris transgéniques dans lesquelles l’expression de RUNX1-ETO est sous le contrôle d’un promoteur inductible à la tétracycline (Rhoades et al., 2000) ou du promoteur myéloïde humain MRP8 (Yuan et al., 2001). Là encore, l’expression de RUNX1-ETO n’est pas suffisante pour induire des leucémies mais l’exposition à un traitement ENU conduit 55% des souris à développer une LAM (Yuan et al., 2001).
L’activité de RUNX1-ETO est aussi étudiée par transplantation dans des souris irradiées de progéniteurs hématopoïétiques murins infectés avec des rétrovirus recombinants
INTRODUCTION permettant l’expression de RUNX1-ETO. Ces souris chimériques ne développent pas de leucémies mais présentent des défauts du système hématopoïétique et en particulier une accumulation de myéloblastes (de Guzman et al., 2002). Ce type d’expérience a notamment permis de caractériser les domaines fonctionnels de RUNX1-ETO importants pour son activité (cf. ci-dessus).
L’étude de RUNX1-ETO grâce à l’ensemble de ces modèles murins a permis de montrer que les lignées cellulaires non leucémiques exprimant RUNX1-ETO sont cytokines dépendantes, tandis que celles dérivées de tumeurs myéloïdes exprimant RUNX1-ETO formées suite au traitement ENU sont indépendantes des facteurs de croissance (Higuchi et al., 2002). Ces données suggèrent que des mutations affectant des composants des voies de signalisation contrôlant la croissance et la prolifération collaborent avec RUNX1-ETO pour induire des LAM. De manière cohérente avec cette hypothèse, plusieurs modèles murins ont permis de montrer que l’expression de RUNX1-ETO avec d’autres types de mutations induit le développement de LAM. Cette coopération a notamment été mise en évidence entre RUNX1-ETO et la protéine de fusion TEL-PDGF-R (Grisolano et al., 2003) ainsi qu’avec une forme activée de FLT3 (Schessl et al., 2005) ou de c-KIT (Wang et al., 2011). Ces résultats concordent avec les observations réalisées chez l’Homme puisque des mutations activatrices dans FLT3 ou c-KIT sont fréquemment associées à la translocation t(8;21) dans les LAM. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris soutiennent l’hypothèse selon laquelle la translocation t(8,21) agirait comme un événement initiateur qui permettrait le développement de LAM suite à l’accumulation d’autres altérations génétiques (de classe II) dans les progéniteurs sanguins où RUNX1-ETO est exprimé.
La conservation des réseaux génétiques qui contrôlent l’hématopoïèse de l’Homme au poisson zèbre a incité des chercheurs à utiliser cet organisme modèle pour étudier RUNX1- ETO. Ainsi, il a été montré que, comme chez les mammifères, RUNX1 est requis pour le développement des cellules sanguines chez le poisson zèbre et l’expression transitoire de
INTRODUCTION
RUNX1-ETO interfère avec la fonction de RUNX1. De plus, RUNX1-ETO induit des phénotypes similaires à ceux observés chez la souris, dont une létalité précoce. Pour pallier à ce dernier phénotype, un modèle transgénique a été généré permettant une expression inductible de RUNX1-ETO chez le poisson zèbre (Yeh et al., 2008). Ce modèle a permis de montrer que RUNX1-ETO peut reprogrammer le destin des progéniteurs sanguins notamment en inhibant l’expression de SCL. De manière intéressante, les effets induits par RUNX1-ETO sont bloqués quand les embryons sont traités avec de la trichostatine A suggérant ainsi que l’action de cette protéine est dépendante de l’activité HDAC. Plus récemment, un crible a été mené avec ce modèle afin d’identifier des inhibiteurs pharmacologiques de l’activité de RUNX1-ETO (Yeh et al., 2009). Ces travaux montrent l’intérêt que peuvent avoir des organismes modèles alternatifs à la souris dans lesquels on peut réaliser plus aisément des cribles (chimiques ou génétiques) à grande échelle pour identifier des régulateurs de l’activité de RUNX1-ETO.
L’ensemble de ces travaux ont mis à jour le rôle de RUNX1-ETO dans la dérégulation des gènes requis pour une hématopoïèse normale, et donc le développement de leucémies associées à t(8;21), mais également un mode d’action complexe. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à cette protéine oncogénique et plus particulièrement à l’identification de régulateurs de l’activité de RUNX1-ETO (Cf. partie résultats).
Chez l’Homme, la famille des facteurs MLF (Myeloid Leukemia Factor) est constituée de deux membres : hMLF1 et hMLF2. Le facteur hMLF1 a été initialement identifié dans des remaniements génétiques associés aux syndromes myélodysplasiques et aux LAM (Cf. ci- après). Ces deux facteurs sont très conservés au cours de l’évolution (Figure 23). En effet, ils présentent 90% d’homologie avec mMLF1/HLS7 (Hematopoietic Lineage Switch 7), chez la souris, et environ 25% d’homologie avec MLF/dMLF chez la Drosophile. Les régions
INTRODUCTION centrales de hMLF 1 et 2 sont les parties les plus conservées (environ 60% d’identité avec dMLF). Cependant ces protéines ne possèdent pas de motifs structuraux particuliers, à l’exception d’un domaine de liaison aux protéines 14-3-3 également retrouvé dans les autres espèces, dont la Drosophile (Ohno et al., 2000).
La translocation chromosomique t(3;5) (q25.1; q34) est une translocation rare qui a été identifiée dans des MDS et apparaît dans tous les sous-types de LAM (selon la classification FAB), à l’exception des LAM M3 (Leucémies aigües promyélocytaires) (Yoneda-Kato et al., 1999). Ce remaniement chromosomique induit la formation de la protéine de fusion NPM- MLF. Dans cette chimère, la partie N-terminale de Nucléophosmine (NPM), qui est pourvue d’un signal de localisation nucléaire et d’un domaine de dimérisation, est fusionnée à la quasi- totalité de hMLF1. NPM est une protéine nucléaire (principalement nucléolaire) assurant de multiples fonctions telles que le transport de protéines ribosomales, le contrôle de la progression du cycle cellulaire, le maintien de la stabilité du génome. Elle assure aussi une fonction de protéine chaperonne permettant l’assemblage/désassemblage des nucléosomes (Colombo et al., 2011). NPM est impliquée dans deux autres translocations : NPM-ALK (dans les lymphomes anaplasiques à grandes cellules) et NPM-RAR (dans des leucémies aiguës promyélocytaires). Ces deux dernières contiennent une partie plus restreinte de NPM par rapport à celle contenue dans NPM-MLF. Ceci suggère que la modification fonctionnelle de hMLF1 par sa fusion avec NPM est différente de celle subie par ALK et RAR.
Le mode d’action de cette protéine de fusion pourrait s’expliquer par un changement de localisation subcellulaire de hMLF1. En effet, hMLF1 a été initialement décrit comme exclusivement cytoplasmique (Yoneda-Kato et al., 1996). Au contraire, dans des cellules de patients ou après transfection, la protéine de fusion NPM-MLF est principalement nucléaire et nucléolaire tout comme NPM. Il est donc possible que l’accumulation de MLF dans le noyau/nucléole lui confère des propriétés leucémogènes (Yoneda-Kato et al., 1999 ; Falini et al., 2006).
D’autre part, l’expression de hMLF1 a été étudiée chez des patients atteints de MDS et LAM ne présentant pas la translocation t(3;5) et une corrélation a été faite entre un fort niveau
INTRODUCTION d’expression de hMLF1, une progression des MDS en LAM et un mauvais pronostic. Ces données suggèrent que la dérégulation de hMLF1 pourrait participer à la transformation maligne des cellules myéloïdes (Matsumoto et al., 2000). De la même façon, il a été montré que hMLF1 est surexprimé dans les carcinomes squameux du poumon (Sun et al., 2004) et amplifié dans des carcinomes de l’œsophage (Chen et al., 2008). hMLF1 pourrait donc avoir une fonction oncogénique.
hMLF1 est fortement exprimé dans les cellules hématopoïétiques progénitrices (CD34+) et son expression diminue au cours de leur différenciation (Matsumoto et al., 2000). Jusqu’à présent, les éventuelles fonctions de hMLF1 durant l’hématopoïèse n’ont pas été caractérisées. Cependant, certaines données suggèrent que l’orthologue murin de hMLF1 est impliqué au cours de l’hématopoïèse. En effet, un crible a été mené afin d’identifier les gènes qui contrôlent la transition spontanée de cellules érythroleucémiques (J2E) vers des cellules présentant une morphologie typique de cellules myéloïdes immatures (J2E-m2) (Williams et al., 1999). Cette étude a montré que l’expression de HSL7/mMLF1 augmente au cours de cette transition et que l’expression ectopique de HLS7 dans les cellules J2E (érythrocytes immatures) conduit à une transition de ces cellules vers des cellules de types monocytaires immatures, et inhibe leur différentiation en érythrocytes en réponse à l’érythropoïétine (Epo). D’autre part, la surexpression de HSL7 dans des cellules monoblastiques M1 favorise leur maturation en monocytes. L’expression de HSL7 dans des cellules hématopoïétiques primaires issues de foie fœtal a permis de confirmer ces observations. Ces données suggèrent donc que HSL7 peut influencer le changement de lignage érythrocytes/myéloïdes ainsi que le développement normal des cellules hématopoïétiques.
Plusieurs études ont montré que MLF1 pouvait réguler la progression du cycle cellulaire (Winteringham et al., 2004). La différenciation des progéniteurs érythrocytaires induite par l’Epo implique l’accumulation de p27Kip1 et la suppression de l’activité de Cdk2, ce qui
INTRODUCTION permet l’arrêt du cycle cellulaire. Lorsque hMLF1 est surexprimé dans les cellules J2E, ces deux évènements ne se produisent pas. Il semble que hMLF1 n’interfère pas directement avec la signalisation induite par l’Epo mais permette le maintien de niveaux élevés de composants de l’ubiquitine E3 ligase (Cul1 et Skp2) qui dégradent p27Kip1.
Une autre étude a montré que hMLF1 pouvait inhiber la progression du cycle cellulaire via un mécanisme dépendant de p53. Au cours du cycle cellulaire, COP1 peut ubiquitinyler p53 ce qui induit sa dégradation par le protéasome et favorise la progression du cycle cellulaire. Il a été montré que hMLF1 interagit avec la sous unité 3 du signalosome Cop9 (CSN3) ce qui diminue le niveau d’expression de l’ubiquitine ligase COP1 (Yoneda-Kato et al., 2005). De ce fait, p53 est stabilisé, et cette accumulation de p53 permet à MLF1 d’induire l’arrêt du cycle cellulaire.
Plus récemment, une étude du même groupe a montré la présence de motifs d’export nucléaire (NES) N-terminal et de localisation nucléaire (NLS) C-terminal dans la séquence de MLF1. Ces deux motifs permettent à MLF1 de naviguer entre le noyau et le cytoplasme et de réguler l’arrêt du cycle cellulaire (Yoneda-Kato and Kato, 2008). De manière intéressante, cette séquence NES est essentielle à la transformation de fibroblastes primaires par NPM- MLF1. Ainsi, la séquence NES permettrait aux cellules exprimant NPM-MLF1 d’échapper à l’arrêt du cycle cellulaire induit par p53 et favoriserait la transformation cellulaire.
Un crible double hybride a permis d’identifier MADM comme partenaire de hMLF1 (Lim et al., 2002). Cette protéine, conservée chez la Drosophile, possède un domaine kinase et une séquence d’export nucléaire. hMLF1 et MADM co-localisent dans une région périnucléaire. MADM en phosphorylant le motif de liaison aux protéines 14-3-3 de hMLF1 permet l’association de hMLF1 avec les protéines 14-3-3 et favoriserait sa rétention dans le cytoplasme (Lim et al., 2002 ; Winteringham et al., 2006). Contrairement à hMLF1, la surexpression de MADM dans les cellules monoblastiques M1 inhibe leur différenciation. Ces données suggèrent que la formation de ce complexe hMLF1, MADM et 14-3-3 pourrait affecter le transport nucléaire de ces protéines et avoir un effet inhibiteur sur l’induction de la différenciation monocytaire par hMLF1.
Figure 16. Cycle de développement de Drosophila melanogaster. Au cours du développement de Drosophila melanogaster, trois stades se succèdent : le premier est le stade embryonnaire, subdivisé lui-même de 17 stades; le second est le stade larvaire constitué des stades larvaires L1, L2 et L3 au cours desquels sont élaborés les ébauches des organes et tissus (disques imaginaux) ; enfin le troisième est le stade pupal au cours duquel la larve s’immobilise dans une cuticule rigide (nommée pupe). Une fois ces trois stades achevés, une métamorphose va avoir lieu au cours de laquelle tous les tissus larvaires sont histolysés et l’adulte émerge alors.
INTRODUCTION
Au cours de ce même crible, la protéine Manp (Mlf1-associated nuclear protein), l’homologue de hnRNP-U (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U), a également été identifiée comme interacteur de hMLF1. L’interaction entre ces deux protéines induit la translocation de hMLF1 vers le noyau où il est capable de s’associer avec l’ADN pour influencer l’expression de divers gènes (Winteringham et al., 2006). Enfin, il semblerait que hMLF1 soit exclusivement nucléaire dans des cellules hématopoïétiques immatures et qu’au cours de leur différenciation hMLF1 soit exporté vers le cytoplasme. Cette étude suggère à nouveau que le transport cellulaire de hMLF1 peut jouer un rôle important au cours de la différenciation des cellules hématopoïétiques.
Chez la Drosophile, comme chez l’Homme, l’hématopoïèse se déroule en deux vagues distinctes et les cellules sanguines, ou hémocytes, produites chez la Drosophile présentent des fonctions similaires à celles des cellules myéloïdes des mammifères. En plus de ces similarités, il a été montré que de nombreuses voies de signalisations et des facteurs de transcription contrôlant le développement des cellules sanguines sont conservés des mammifères à la Drosophile (Crozatier and Meister, 2007). Ainsi, cet insecte est un modèle intéressant pour étudier les bases conservées de l’hématopoïèse.
De manière frappante, plus de 75% des gènes associés à une pathologie chez l’Homme possèdent un homologue chez la Drosophile (Reiter et al., 2001). Grâce à cette forte conservation génétique, à la rapidité du cycle de vie (Figure 16) et aux nombreux outils disponibles chez cet insecte, Drosophila melanogaster est apparue comme un système modèle puissant pour décrypter in vivo les mécanismes moléculaires de diverses pathologies humaines. Ainsi, des études menées chez la Drosophile ont permis d’apporter de nombreux éléments pour la compréhension de pathologies telles que les maladies neurologiques (Alzheimer, Parkinson) et certains cancers (Doronkin and Reiter, 2008). Plus récemment, les parallèles entre la Drosophile et l’Homme, ont amené certaines équipes, dont la nôtre, à utiliser cet insecte pour étudier le développement des leucémies.
Figure 17. Les trois types d’hémocytes chez Drosophila melanogaster. (A) Cellule à cristaux (bleu : dapi, rouge : LZ, vert : lz-gfp, noir : inclusions « cristallines » (d’après Evans et al., 2003) ; (B) Plasmatocyte phagocytant un débris cellulaire (rouge) (D’après Stramer et al.,2005) ; (C) Lamellocyte permettant l’encapsulation des pathogènes (d’après la Thèse de Joanna Krzemien).
INTRODUCTION
Dans ce chapitre, je présenterai les trois lignages hématopoïétiques de la Drosophile ainsi que le processus de formation de ces cellules, puis les facteurs que j’ai particulièrement étudiés au cours de ma thèse : le facteur RUNX Lozenge et dMLF.
Contrairement aux vertébrés, chez qui les cellules souches génèrent un très grand nombre de lignages cellulaires hématopoïétiques, l’hématopoïèse de la Drosophile est un processus plus simple qui aboutit à la formation de trois types cellulaires sanguins ou hémocytes : les cellules à cristaux, les plasmatocytes et, dans certains contextes, les lamellocytes (Figure 17). Tout comme chez les mammifères, il y a deux vagues hématopoïétiques : une vague embryonnaire et une vaque larvaire (Holz et al., 2003).
La vague hématopoïétique embryonnaire débute au sein du mésoderme procéphalique, qui génère un nombre restreint (±80) de progéniteurs hématopoïétiques (Figure 18). Ceux-ci vont migrer, proliférer et se différencier rapidement en cellules à cristaux et en plasmatocytes. Les plasmatocytes, au nombre de 700 environ, vont coloniser tout l’embryon tandis que les cellules à cristaux (±30) restent localisées en deux clusters près de leur point d’origine, autour du proventricule (Lebestky et al., 2000) avant de se disperser à la fin de l’embryogenèse. Ces hémocytes embryonnaires sont retrouvés dans l’hémolymphe de la larve et persistent au stade adulte (Holz et al., 2003 ; Makhijani et al., 2011). Leur nombre est d’environ 5000 cellules circulantes au troisième stade larvaire.
La seconde vague hématopoïétique a lieu dans la larve au sein d’un organe spécialisé nommé la glande lymphatique qui dérive du mésoderme dorsal embryonnaire (Krzemien et al., 2010). Au cours des stades larvaires, la glande lymphatique (Figure 19) grossit et, au troisième stade larvaire, elle est composée d’une paire de lobes primaires antérieurs et de plusieurs lobes secondaires postérieurs. Les lobes primaires sont constitués de trois zones distinctes : la zone médullaire, contenant les prohémocytes ; la zone corticale, dans laquelle se retrouvent les hémocytes différenciés ; la troisième zone est le Centre Signalisateur Postérieur (PSC), constitué d’un petit nombre de cellules localisées dans la partie postérieure du lobe primaire et défini comme une niche hématopoïétique. En effet, cette zone est requise pour le maintien du pool de progéniteurs hématopoïétiques de la zone médullaire dans un état indifférencié (Krzemie et al., 2007 ; Mandal et al., 2007). Les trois lignages
Figure 18. Hématopoïèse embryonnaire chez la Drosophile. Représentation schématique de l’hématopoïèse embryonnaire (A) (D’après Lebestky et al. 2000). Au stade 5, les prohémocytes sont spécifiés au niveau du mésoderme procéphalique (he, en vert) ; au stade 11, les plasmatocytes (en gris) commencent à migrer et les cellules à cristaux (ccp, en rouge) se différencient dans la région antérieure. Au stade 17, les plasmatocytes ont colonisé tout l’embryon tandis que les cellules à cristaux restent localisées au niveau du proventricule (pv). Les précurseurs de la glande lymphatique (lg, en bleu) sont issus du mésoderme latéral et migrent dorsalement. En fin d’embryogenèse, la glande lymphatique est située au niveau du vaisseau dorsal (dv). (B) Visualisation du territoire d’apparition des prohémocytes par hybridation in situ dirigée contre gcm. (C, E) marquage des plasmatocytes grâce au marqueur pxn respectivement au stade 11 et 17. (D, F) marquage des cellules à cristaux grâce au marqueur doxA3 respectivement au stade 11 et 17.
INTRODUCTION hématopoïétiques peuvent être générés par la glande lymphatique et en condition normale, cet organe libère son contenu en circulation lors de la métamorphose. A ce jour, aucun organe hématopoïétique n’a été identifié au stade adulte.
En plus des hémocytes présents dans la glande lymphatique, on retrouve dans la larve les hémocytes d’origine embryonnaire qui sont soit en circulation libre soit attachés à l’épiderme où ils forment des « îlots sessiles» (Figure 20). Il a été proposé que ces îlots sessiles jouent un rôle important dans la réponse immunitaire larvaire (Márkus et al., 2009). En effet, lors d’une infection par un parasite ces cellules se détachent de l’épiderme et peuvent se différencier en lamellocytes, les cellules responsables de la destruction du parasite (cf. ci-après). D’autre part, une étude récente a montré que certains hémocytes d’origine embryonnaire n’expriment pas de marqueurs de différenciation de cellules à cristaux ou de plasmatocytes et pourraient avoir conservé un caractère de progéniteur (Sinenko et al., 2010). Ainsi, il est possible que l’hématopoïèse larvaire ait lieu non seulement dans la glande lymphatique mais aussi en circulation et/ou dans les cellules sessiles (Makhijani et al., 2011).
Les plasmatocytes constituent le type cellulaire sanguin majoritaire (plus de 90% en condition normale) retrouvé en circulation à la fois au stade embryonnaire et larvaire. Ce sont les seules cellules sanguines capables de phagocytose. Elles jouent un rôle crucial au cours du développement de la Drosophile. En effet, grâce à la présence du récepteur Croquemort (Crq) exprimé à leur surface, les plasmatocytes reconnaissent et détruisent les corps apoptotiques afin d’assurer un remodelage correct des tissus (Franc et al., 1996). Ces cellules apparentées à des macrophages sont extrêmement mobiles, et fournissent un modèle d’étude in vivo de la migration cellulaire (Evans et al., 2003). Elles synthétisent aussi différents composants de la matrice extra cellulaire, tels que péroxydasine, viking, laminine et plusieurs protéines collagènes (Evans et al., 2003), requis pour le processus de morphogénèse (Bunt et al., 2010).
Outre ces rôles développementaux, les plasmatocytes remplissent un rôle dans la réponse immunitaire cellulaire en phagocytant les petits pathogènes. Les plasmatocytes expriment notamment un récepteur membranaire, Eater, ce qui leur permet de reconnaitre et
Figure 19. Morphologie de la glande lymphatique au troisième stade larvaire. (A) Localisation de la glande lymphatique dans la larve. Vue dorsale d’une larve au troisième stade (D’après la thèse de Rami Makki). (B) Glande lymphatique vue en microscopie électronique à balayage (Meister et al., 2003). (C) Image confocale d’une glande lymphatique (image de Joanna Krzemien) où la zone médullaire (ZM) est marquée en vert, la zone corticale (ZC) contient des cellules à cristaux marquées par à un anticorps contre proPO (rouge), et le PSC est marqué par Collier, en bleu. INTRODUCTION de phagocyter les bactéries à Gram positif et à Gram négatif (Kocks et al., 2005). De plus, les plasmatocytes participent à la réponse immunitaire humorale non seulement en sécrétant des peptides antimicrobiens (Evans et al., 2003) mais aussi en produisant des cytokines qui vont favoriser la réponse immunitaire humorale par le corps gras (Agaisse and Perrimon, 2004 ; Shia et al., 2009). Enfin, il a été montré que ce type d’hémocyte est recruté au niveau de tumeurs chez la Drosophile et qu’il peut soit empêcher soit promouvoir le développement de ces tumeurs (Pastor-Pareja et al., 2008 ; Cordero et al., 2010).
Les cellules à cristaux doivent leur nom à la présence dans leur cytoplasme d’inclusions cristallines formées par les enzymes nécessaires au processus de mélanisation : les proPhénolOxydases (proPO) (Söderhäll and Cerenius, 1998). La mélanisation constitue une réponse immune spécifique aux insectes qui est impliquée dans la cicatrisation et l’encapsulation de corps étrangers. Durant le stade larvaire, lors d’une infection ou d’une blessure, les cellules à cristaux éclatent pour libérer leur proPO qui vont être activées par une cascade protéolytique impliquant des sérines protéases. Les phénoloxydases actives catalysent l’oxydation des phénols en quinones qui polymérisent alors de manière non enzymatique pour former la mélanine. La mélanine est déposée au niveau d’une blessure pour faciliter la cicatrisation ou autour d’un microorganisme étranger, ce qui pourrait participer à la mort du pathogène. En effet, les composants intermédiaires produits lors de la synthèse de la mélanine sont potentiellement cytotoxiques.
Les lamellocytes sont de grandes cellules aplaties requises pour l’encapsulation de corps étrangers trop gros pour être phagocytés par les plasmatocytes (Lanot et al., 2001). La formation de ces cellules est induite uniquement au cours de l’hématopoïèse larvaire, dans des conditions spécifiques telles que le parasitisme de la larve par un œuf de guêpe. Ces cellules vont alors adhérer au parasite pour former une capsule, qui sera ensuite mélanisée, et ainsi provoquer la mort du parasite (Figure 21) (Crozatier et al., 2004).
Figure 20. Cellules sessiles marquées par la GFP (hml-gal4 ; UAS-GFP) chez la larve de Drosophile. On distingue la glande lymphatique (flèche blanche), des cellules circulantes (flèche jaune), et les cellules sessiles (flèche rouge). INTRODUCTION
Le lignage de ces cellules n’est pas encore clairement défini. Certains lamellocytes semblent se différencier à partir de progéniteurs dans la glande lymphatique (Crozatier et al., 2004), d’autres à partir de cellules sanguines (dont des plasmatocytes) d’origine embryonnaire (Márkus et al., 2009 ; Avet-Rochex et al., 2010).
L’hématopoïèse chez la Drosophile est régulée par de nombreux facteurs de transcription (GATA/SRP, RUNX/LZ…) mais également par un ensemble de voies de signalisation (Notch, JAK/STAT, wnt..) conservés au cours de l’évolution.
Au stade embryonnaire, l’expression du facteur de type GATA Serpent (SRP) dans le mésoderme antérieur définit la population de précurseurs hématopoïétiques (les prohémocytes) (Rehorn et al., 1996 ; Waltzer et al., 2010). Son expression est requise pour l’apparition de ces progéniteurs, puis est maintenue dans les hémocytes, lors de leur différenciation en plasmatocytes ou en cellules à cristaux. Au stade 7, l’expression du facteur RUNX lozenge (lz) est détectée dans une sous-population de cellules exprimant srp, correspondant aux précurseurs des cellules à cristaux (Figure 22) (Bataillé et al., 2005). La différenciation des cellules à cristaux est notamment régulée par l’interaction entre les facteurs LZ et SRP (cf. ci-dessous). Enfin, l’expression des facteurs gcm, gcm2 (Glial Cell Missing) et ush (U-shaped : un facteur de la famille Friend Of GATA (FOG)) est détectée très précocement dans l’ensemble des précurseurs des hémocytes et leur expression est ensuite restreinte aux plasmatocytes (Bataillé et al., 2005 ; Bernardoni et al., 1997 ; Muratoglu et al., 2006). Il a été montré que ces facteurs sont requis pour la formation de ces cellules et leur différenciation en macrophages fonctionnels (Bernardoni et al., 1997 ; Alfonso and Jones, 2002 ; Waltzer et al., 2002).
Figure 21. Encapsulation et mélanisation de l’œuf de guêpe. Lorsque la larve de Drosophile est infectée par un œuf pondu par la guêpe Leptopilina boulardi (Flèche blanche) (A), l’œuf est entouré de lamellocytes (C2 : marqués par la phalloïdine) puis mélanisé (C1). L’œuf mort et mélanisé est encore observable chez l’adulte (flèche noire) (B). Lorsque la Drosophile est incapable de mettre en place cette réaction de défense, l’œuf de guêpe se développe (D) au détriment de la larve de Drosophile, et une guêpe adulte émergera (E).
INTRODUCTION
Le facteur SRP est également impliqué dans la spécification de la glande lymphatique, puisqu’en son absence les précurseurs de cet organe hématopoïétique perdent leur identité (Mandal et al., 2004). Au cours des différents stades larvaires, l’expression de Srp perdure dans la totalité des cellules de la glande lymphatique (Jung et al., 2005). Au sein de la glande lymphatique, le maintien des progéniteurs hématopoïétiques indifférenciés au niveau de la zone médullaire dépend de l’activation dans ces cellules des voies de signalisation JAK/STAT, HH et Wg en réponse aux ligands produits par les cellules du PSC (Mandal et al., 2007 ; Krzemie et al., 2007 ; Sinenko et al., 2009). De plus, le niveau de ROS dans les progéniteurs hématopoïétiques, en régulant la voie JNK de façon endogène, régule aussi le maintien de ces cellules (Owusu-Ansah and Banerjee, 2009). Il a été montré que la différenciation des plasmatocytes est régulée par la voie PVR (Jung et al., 2005) ainsi que par le facteur GATA Panier, lui-même régulé par l’effecteur STAT92E de la voie JAK/STAT (Minakhina et al., 2011). L’engagement vers le destin cellules à cristaux et le nombre de cellules à cristaux est lui contrôlé par la voie Notch (Lebestky et al., 2003 ; Mukherjee et al., 2011) et leur différenciation requiert le facteur Lozenge (Lebestky et al., 2000).
Le PSC est une région particulièrement importante de la glande lymphatique pour le contrôle de l’équilibre entre les progéniteurs et les hémocytes différenciés. Les cellules du PSC expriment de manière spécifique les gènes Antennapedia et collier, requis pour la spécification de ces cellules (Mandal et al., 2007 ; Crozatier et al., 2004), alors que leur nombre est contrôlé par la voie de signalisation Wingless (Wg) (Sinenko et al., 2009). De plus, le PSC est requis pour la différenciation des lamellocytes (Crozatier et al., 2004). Récemment il a été montré que l’infection de la larve par un parasitoïde induit un stress oxydatif au niveau du PSC, ce qui active la production de ligands pour l’EGFR et induit la différenciation des lamellocytes (Sinenko et al., 2011).
Au niveau des cellules sanguines circulantes, il a été montré que LZ est requis pour la différenciation des cellules à cristaux (Lebestky et al., 2000) dont le nombre est contrôlé par la voie Notch (Duvic et al., 2002). D’autre part, le nombre et la différenciation des plasmatocytes circulants sont régulés par les facteurs de transcription de type NfB Dif et Dorsal et par Myb, respectivement (Matova and Anderson, 2006 ; Davidson et al., 2005). Enfin, des cellules du système nerveux périphériques semblent fournir une niche favorisant la
Lz/
Figure 22. Contrôle moléculaire de l’hématopoïèse embryonnaire. (A) srp est exprimé dans les prohémocytes et son expression est maintenue dans les hémocytes différenciés. gcm est nécessaire à la différenciation des plasmatocytes tandis que lz est requis pour la différenciation des cellules à cristaux. (B) Représentation schématique du destin cellulaire durant l’embryogenèse. Initialement tous les prohémocytes expriment gcm mais pas lz. La transcription de gcm est ensuite éteinte et celle de lz activée uniquement dans la première rangée de prohémocytes, tandis que les autres se différencient en plasmatocytes. 60% de ces cellules maintiennent l’expression de lz grâce à une boucle d’auto-activation et se différencient en cellules à cristaux. Dans les 40% restants, la présence résiduelle de Gcm interfère avec l’expression de lz et induit la différenciation de ces cellules en plasmatocytes. (D’après Bataillé et al., 2005)
INTRODUCTION prolifération et la survie des plasmatocytes au niveau des ilôts sessiles (Makhijani et al., 2011).
Lozenge (LZ) est un membre de la famille RUNX. Chez la Drosophile, lz est situé sur le chromosome X et code pour deux isoformes : LZ3.5 (84,7kDa) et LZ5 (72,2kDa). L’isoforme la plus courte, LZ5, issue d’un épissage alternatif éliminant l’exon 5, est dépourvue du domaine d’interaction avec le facteur ETS Pointed. La fonction de ces isoformes a été décrite au cours du développement de l’œil chez la Drosophile (Daga et al., 1996) et il a été montré que la forme prédominante est l’isoforme pleine taille LZ3.5 (Jackson Behan et al., 2005). Il semble que le ratio des deux isoformes régule la détermination d’un type cellulaire spécifique dans l’œil.
Le domaine Runt de LZ présente 71% d’identité avec celui du facteur de transcription humain RUNX1 (Daga et al., 1996). LZ possède également le motif C-terminal VWRPY ce qui lui permet de recruter le répresseur transcriptionnel Groucho (Wheeler et al., 2000). LZ est connu pour avoir un rôle essentiel au cours du développement de l’œil, des antennes ainsi qu’au cours de l’hématopoïèse (Canon and Banerjee, 2000). LZ est notamment requis pour la détermination du destin cellulaire et son implication au cours du développement de l’œil et des cellules à cristaux sont les processus les mieux caractérisés. En effet, l’étude des 21 allèles mutants lz a débuté en 1925 et a permis d’élucider le rôle de ce facteur dans ces processus (Jackson Behan et al., 2005).
L’œil de la Drosophile adulte est composé de multiples unités nommées les ommatidies, chacune comprenant 8 neurones photorécepteurs (R1 à R8) ainsi qu’un ensemble de cellules comme les cellules pigmentaires et les cellules coniques. Les cellules du disque imaginal d’œil commencent à se différencier pour former les ommatidies au cours de la vie larvaire. LZ joue un rôle critique au cours de ce processus et notamment pour la différenciation des photorécepteurs R1, R6 et R7 (Daga et al., 1996). Durant ce processus, LZ régule positivement la transcription de nombreux facteurs de transcription impliqués dans le choix du destin cellulaire. Par exemple, le gène bar dans les photorécepteurs R1 et R6, DPax-2 dans les cellules coniques, ou encore pros dans les photorécepteurs R7 et les cellules coniques. LZ est aussi capable de réprimer la transcription de sevenup, un membre de la famille des
INTRODUCTION récepteurs aux hormones stéroïdes, et le gène neuronal deadpan (Canon and Banerjee, 2000). De plus, LZ contrôle le programme de mort cellulaire intervenant au stade pupal et essentiel pour la formation finale de l’œil de la Drosophile. Ainsi, LZ est capable d’activer la transcription des gènes argos et klumpfuss au sein des cellules coniques et pigmentaires ce qui permet la diminution de l’activité EGFR et favorise l’entrée en apoptose des cellules excédentaires présentes dans l’œil (Wildonger et al., 2005).
D’autre part, il a été montré que lz est spécifiquement exprimé dans le lignage des cellules à cristaux embryonnaires et larvaires et qu’il est requis pour leur différenciation (Lebestky et al., 2000). Au laboratoire, il a été montré que seulement 60% des cellules hématopoïétiques embryonnaires ayant initiées l’expression de lz vont se différencier en cellules à cristaux, le reste des progéniteurs se dirigeant vers le destin plasmatocytaire (Bataillé et al., 2005). En fait, le maintien de l’expression de lz au sein des progéniteurs LZ+ dépend de la balance entre LZ, qui va activer sa transcription, et les facteurs GCM/GCM2 qui vont inhiber sa transcription et favoriser le choix de destin plasmatocytaires (Figure 22) (Bataillé et al., 2005). D’un point de vue moléculaire, SRP et LZ forment un complexe qui va activer le programme de différenciation des cellules à cristaux (Waltzer et al., 2003 ; Fossett et al., 2003). Cette coopération fonctionnelle se fait via la liaison du complexe SRP/LZ sur un module cis-régulateur présent dans la séquence de nombreux gènes spécifiques des cellules à cristaux dont lz et les gènes des prophénoloxydases (Ferjoux et al., 2007).
En 2005, Wildonger et al. ont utilisé la Drosophile comme système modèle pour étudier le mode d’action de RUNX1-ETO in vivo en tirant profit du fait que le contrôle transcriptionnel de LZ dans l’œil soit très bien établi (Wildonger and Mann, 2005). Ainsi, en exprimant cette protéine oncogénique humaine dans l’œil de la Drosophile, ils ont pu montrer que RUNX1-ETO pourrait agir plutôt comme répresseur constitutif puisque deux cibles de LZ, Dpax2 et deadpan respectivement activées et réprimées par LZ, sont toutes deux réprimées par RUNX1-ETO. Cependant, cette étude n’explorait pas la fonction de RUNX1- ETO au cours de l’hématopoïèse chez la Drosophile.
Au laboratoire, nous avons développé une stratégie permettant pour la première fois d’étudier l’influence de cette protéine oncogénique sur le développement des cellules
Figure 23. Transcrits et protéines MLF. (A) Structure des transcrits dmlf. L’étendue des délétions de mlf dans chacun des deux allèles mutants disponibles (dmlfΔC1 et dmlfΔ5-3) sont représentées en bas de la figure A. (B) Séquences codées par les exons 1-2-5-7. (C) Alignement des séquences protéiques MLF de plusieurs espèces : Apis melifera (AmMLF), Caenorhabditis elegans (CeMLF), Drosophila melanogaster (DmMLFA), Ciona intestinalis (CiMLF), Mus musculus (MmMLF1 and 2) et Homo sapiens (HsMLF1 and 2). Acides aminés (aa) conservés dans toutes les espèces : rouge ; dans la plupart des espèces : jaune ; dans trois espèces : gris ; aa caractérisant MLF1 : bleu ; aa caractérisant MLF2 : vert. Les résidus conservés entre la Drosophile et les vertébrés sont notés par un astérix. La séquence de liaison aux protéines 14-3-3 est soulignée (exon 4). Les lignes jaune et orange représentent les exons 3 et 4 respectivement. (D’après Martin-Lannerée et al., 2006)
INTRODUCTION sanguines chez la Drosophile. Ainsi, nous avons pu identifier de nouveaux régulateurs potentiels de l’activité de RUNX1-ETO (cf. ci-après).
Enfin, très récemment l’équipe de U. Banerjee a également utilisé la Drosophile comme système modèle pour étudier le rôle de RUNX1-ETO au sein du système hématopoïétique. Dans cette étude, RUNX1-ETO est exprimé dans la majorité des hémocytes en circulation et dans la glande lymphatique (Sinenko et al., 2010). Dans ce contexte, RUNX1-ETO induit une forte augmentation du nombre de progéniteurs hématopoïétiques, ce qui est en accord avec nos résultats (Osman et al., 2009). De plus, grâce à un crible génétique par haploinsuffisance, les auteurs ont recherché des modificateurs de RUNX1-ETO et, ainsi, ils ont pu montrer que la production de ROS est cruciale pour que RUNX1-ETO induise la prolifération des prohémocytes larvaires.
Contrairement aux vertébrés, la Drosophile ne possède qu’un seul gène codant pour MLF (dMLF). Celui-ci code pour quatre isoformes issues d’épissages alternatifs (dmlf A-D) (Martin-Lannerée et al., 2006). Tous les variants incluent les exons 3 et 4 mais d’autres exons peuvent être également présents (1, 2, 5, 6 or 7). Les protéines issues de ces différentes isoformes contiennent de 273 à 376 acides aminés (Figure 23). La comparaison de la séquence du variant dmlf-A avec d’autres espèces vertébrés montre que dmlf-A partage 23.1% d’identité avec son homologue humain hMLF1 et 27,8% avec hMLF2 (Ohno et al., 2000). Enfin, ces différentes isoformes présentent des localisations subcellulaires différentes. En effet, dMLF-A est exclusivement nucléaire tandis que dMLF-B est à la fois nucléaire et cytoplasmique (Martin-Lannerée et al., 2006).
Le profil d’expression de dMLF établit en 2006 (Figure 24), montre une forte contribution maternelle aux stades embryonnaires précoces puis, après le stade blastoderme, MLF est exprimé ubiquitairement dans l’embryon et plus fortement dans le système nerveux central, le tube digestif, les gonades, et de manière intéressante dans deux groupes de cellules localisés au niveau du mésoderme procéphalique, qui pourraient correspondre aux cellules à cristaux. Au stade larvaire, MLF est également exprimé de manière ubiquitaire (Martin- Lannerée et al., 2006). L’expression de MLF est dynamique au cours du développement, et selon les stades et organes étudiés, sa localisation subcellulaire est plutôt cytoplasmique (au
Figure 24. Patron d’expression du transcrit mlf durant le développement embryonnaire. Vues latérales d’embryons sauvages (A-G) et mutants dMLF (H-I) marqués par hybridation in situ avec une sonde dmlf reconnaissant les quatre isoformes. L’ARNm dmlf s’accumule fortement au stade 5 (A) et s’exprime tout particulièrement aux stades tardifs (B-G) dans le système nerveux central, les intestins, les gonades et les cellules à cristaux (F) (flèche blanche). Les embryons mutants dMLF ne présentent pas de marquage par la sonde dmlf. (D’après Martin-Lannerée et al., 2006)
INTRODUCTION stade blastoderme précoce) ou nucléaire (dans les ovaires). Une étude a identifié deux sites de localisation nucléaire (NLS) dans la séquence de MLF, et montré, en utilisant des cellules de Drosophile en culture, que ces deux sites sont requis pour un adressage nucléaire de dMLF-A (Sugano and Yamaguchi, 2007).
Enfin, pour faciliter l’étude de ce gène, deux mutants ont été générés (Martin-Lannerée et al., 2006) : dmlf5-3 et dmlfC1. Dans le mutant dmlf5-3, le codon d’initiation et la partie la plus conservée sont éliminés et dans le second mutant, la majeure partie de la région codante est éliminée (Figure 23). Ces deux mutants sont donc probablement des allèles nuls. Ces mutations provoquent une forte létalité embryonnaire sans défaut morphogénétique marqué. De plus, quelques individus mutants survivent jusqu’au stade adulte et ne montrent que quelques défauts qui n’ont pas permis de mettre en évidence un rôle précis pour mlf au cours du développement.
Si la fonction de MLF au cours du développement (et en particulier de l’hématopoïèse) de la Drosophile reste inconnue, plusieurs partenaires de MLF ont été mis à jour. Ainsi, un crible double hybride a permis d’identifier MLF comme partenaire du facteur de transcription DREF (Ohno et al., 2000). Ce facteur est connu pour réguler des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, tels que PCNA, la cycline A et DRaf. De plus, le phénotype induit par la surexpression de DREF dans le disque imaginal d’œil est quasiment supprimé par la surexpression de dMLF. Cependant, cette interaction génétique n’a pas été confirmée dans une autre étude (Kazemi-Esfarjani and Benzer, 2002).
De façon similaire, un crible en double hybride a révélé l’interaction de dMLF avec SU(FU) ; interaction qui a pu être reproduite in vitro (GST pull-down) et in vivo (Immuno- Précipitation) (Fouix et al., 2003). SU(FU) est connue pour être un régulateur de la voie de signalisation Hedgehog (HH) : elle forme un complexe avec la sérine-thréonine kinase Fused (FU), la kinase Costal-2 (COS2), et le facteur de transcription de la famille Gli CI dont ils inhibent la fonction (Figure 25) (Ogden et al., 2004). De manière intéressante, la surexpression de dMLF dans les disques imaginaux d’œil ou d’aile de Drosophile induit des défauts structuraux chez l’adulte et ces phénotypes sont aggravés par la perte de fonction de
Figure 25. Schéma de la voie de signalisation Hedgehog chez la Drosophile.
La régulation du signal se fait grâce à la présence de deux protéines transmembranaires : PATCHED (PTC), le récepteur de HH, et SMOOTHENED (SMO). (A) La voie est inactive lorsque ptc (Patched) se lie à la protéine smo (smoothened) et en inhibe l’activité. Un complexe de protéines cytoplasmiques liées aux microtubules permet le clivage de ci (facteur de transcription Cubitus interruptus) en un répresseur transcriptionnel qui exerce son action dans le noyau. (B) Voie active : la liaison du ligand hh (hedgehog) à ptc libère smo de l’action répressive de cette dernière, ce qui entraîne la dissociation du complexe cytoplasmique. ci ne subit plus de clivage et agit comme activateur de la transcription de divers gènes dont ptc lui-même. cos-2: protéine costal-2; fu: sérine-thréonine kinase fused; su(fu): suppresseur de fused. (D’après Médecine Sciences, Volume 19, numéro 10, octobre 2003, p. 920-925) INTRODUCTION
SU(FU). Ceci suggère que dMLF intervient dans la transduction du signal HH, tout comme SU(FU). Cependant, certains phénotypes induits par la surexpression de dMLF ne peuvent être expliqués par son implication dans la signalisation HH. De plus, cette étude a montré que dMLF se lie à différents sites sur les régions les moins condensées des chromosomes et que la surexpression de dMLF semble induire l’apoptose mais également une augmentation du nombre de cellules en phase S. Il est possible que ce phénotype soit dû à son interaction avec DREF : dMLF et DREF pourraient coopérer pour contrôler l’expression de gènes impliqués dans l’entrée en phase S des cellules ou dans le contrôle de l’apoptose.
Enfin, comme chez l’Homme, il a été montré que MLF interagit avec CSN3. En effet, des analyses biochimiques et génétiques ont révélé l’interaction de dMLF et CSN3 in cellulo via le domaine PCI de CSN3 (Sugano et al., 2008), considéré comme une structure chaperonne permettant l’assemblage des sous-unités du complexe COP9/signalosome, dont CSN3 fait partie. Il est donc possible que dMLF empêche l’intégration de CSN3 et induise le désassemblage complet de COP9. De plus, il a été montré que COP9 est capable d’induire la dégradation de la cycline E et ainsi de contrôler la progression du cycle cellulaire (Doronkin et al., 2003). Il est donc possible que dMLF intervienne dans la régulation du cycle cellulaire via son interaction avec CSN3.
Les expansions de poly-glutamines sont à l’origine d’au moins huit pathologies neurodégénératives héréditaires humaines telles que les ataxies spino-cérébelleuses de type 1, 3 et 7 ou encore la maladie de Huntington (Kaytor and Warren, 1999). Ces expansions s’accumulent dans le noyau et/ou dans le cytoplasme et s’agrègent entre elles ce qui est toxique pour les cellules. De nombreuses équipes ont utilisé la Drosophile comme modèle d’étude de la toxicité de ces poly-glutamines et établi que l’expression de ces expansions est également toxique pour les cellules de l’œil de la Drosophile. Ainsi, différents cribles ont été réalisés afin d’identifier des protéines capables de diminuer cette toxicité. Ce type de crible a permis d’identifier dMLF comme suppresseur de la toxicité induite par l’expression de ces expansions dans l’œil de la Drosophile (Kazemi-Esfarjani and Benzer, 2002). Cette étude montre également que dMLF est capable de réduire la toxicité des expansions poly- glutamines dans le système nerveux central de la Drosophile. Cette réduction de la toxicité
INTRODUCTION n’est pas associée à la disparition des agrégats de poly-glutamine, mais il apparaît que dMLF (surexprimé ou endogène) est recruté au niveau de ces agrégats. De façon intéressante, cette fonction semble conservée entre la Drosophile et l’Homme (Kim et al., 2005). En effet, la transfection de poly-glutamines dans des cellules primaires neuronales de rat induit la formation d’inclusions intranucléaires toxiques pour les cellules et la surexpression de dMLF ou de hMLF1 et 2 supprime ces phénotypes.
INTRODUCTION
Le projet de thèse que j’ai mené vise à mieux comprendre comment les facteurs RUNX contrôlent le développement normal ou pathologique (leucémie) des cellules sanguines en tirant profit de la conservation phylogénétique des processus régulant l’hématopoïèse chez l’Homme et la Drosophile.
Dans un premier chapitre, je décrirai les résultats que j’ai obtenus concernant l’étude de la protéine oncogénique RUNX1-ETO chez Drosophila melanogaster. Je présenterai le crible que j’ai réalisé afin d’identifier des régulateurs de cette protéine de fusion ainsi que les candidats dont j’ai initié la caractérisation.
Dans le second chapitre, je présenterai la caractérisation du rôle de MLF, comme régulateur du facteur LZ au cours de l’hématopoïèse. Nous avons d’abord identifié MLF au cours d’un crible pan-génomique par RNAi en culture cellulaire comme coactivateur du complexe GATA/RUNX SRP/LZ. J’ai ensuite étudié l’implication de MLF au cours du développement des hémocytes chez la Drosophile.
Figure 26. Effet de l’expression de RUNX1-ETO chez la Drosophile. (A) L’expression de RUNX1-ETO sous le contrôle du pilote lz-gal4 induit une létalité au stade pupe. Contrairement à RUNX1-ETO, l’expression de RUNX1, RUNX1ΔETO ou ETO n’induit pas cette létalité. Le graphique représente le pourcentage des individus atteignant chacun des stades indiqués pour les différents génotypes testés. (B-E) Photographie de têtes adultes de Drosophile, excepté pour (C) qui provient de la dissection d’une pupe n’ayant pas éclos. RUNX1-ETO induit des défauts de différenciation de l’œil (Wildonger et al. 2005) et une ablation de la trompe. Ces phénotypes et la létalité sont partiellement sauvés en augmentant la dose de LZ. Génotypes : lz-gal4/+ (B), lz-gal4/+ ; UAS-runx1eto (C), lz- gal4/UAS-LZ ; UAS-runx1eto (D) et lz-gal4/UAS-LZ (E). (D’après Osman et al., 2009)
RESULTATS
Au laboratoire, nous nous intéressons à la protéine oncogénique RUNX1-ETO, produit de la translocation t(8;21). Au cours d’une étude précédente, il a été montré dans l’équipe que la Drosophile peut servir de modèle d’étude de l’activité leucémogène de RUNX1-ETO (Osman et al., 2009).
D’une part, l’expression de RUNX1-ETO selon le même patron que le facteur LZ induit une létalité au stade pupe (Figure 26). Cette létalité est spécifique de la protéine de fusion puisqu’elle n’est pas observée suite à l’expression de RUNX1, RUNX1ETO ou ETO. De plus, tout comme ce qu’il avait été montré par l’étude de Wildonger et al., l’expression de cette protéine chimérique induit des défauts de formation de l’œil, partiellement restaurés par la surexpression de LZ (Figure 26) (Wildonger and Mann, 2005).
D’autre part, au niveau du système hématopoïétique, l’expression de RUNX1-ETO induit une accumulation des progéniteurs exprimant LZ (LZ+) et un blocage de leur différenciation en cellules à cristaux (Figure 27). Ce blocage de la différenciation des cellules LZ+ est observé très tôt au cours du développement de la Drosophile (dès le stade embryonnaire) mais l’effet de RUNX1-ETO sur le nombre de ces cellules n’est pas observé avant le stade larvaire. Le blocage de la différenciation des cellules à cristaux n’est pas lié à un défaut de spécification des cellules LZ+ mais à l’inhibition de la transactivation de certaines cibles de LZ, dont les prophénoloxydases, par RUNX1-ETO. Ainsi, les résultats obtenus dans l’équipe montrent que RUNX1-ETO affecte le développement du lignage sanguin RUNX+ de la Drosophile en rentrant en compétition avec le facteur RUNX endogène LZ et induit un phénotype de type préleucémique évoquant celui observé dans les modèles vertébrés. Un des objectifs de ma thèse a été d’utiliser ce modèle pour identifier des gènes régulant l’activité leucémogène de RUNX1-ETO.
Pour étudier l’effet de l’expression de RUNX1-ETO chez la Drosophile, nous avons utilisé le système UAS/GAL4. En effet, nous disposons d’une lignée transgénique de Drosophile portant un élément P inséré dans la partie régulatrice du gène lz et permettant
Figure 27. L’expression de RUNX1-ETO induit un état préleucémique. Des larves de stade L3 lz-gal4 ; UAS-GFP exprimant les transgènes indiqués ont été saignées et le nombre absolu de cellules GFP+ (A) ou la proportion de cellules lz-GFP+ exprimant le marqueur de différenciation des cellules à cristaux PO45 (B) a été déterminé. RUNX1-ETO, mais pas RUNX1ΔETO ou ETO, induit une nette augmentation de cellules LZ+ circulantes en comparaison aux larves contrôles (A). En présence de RUNX1-ETO, le ratio de progéniteurs (GFP+, PO45-) par rapport aux cellules à cristaux différenciées (GFP+ PO45+) est totalement inversé (B). Ni RUNX1ΔETO ni ETO n’affecte ce ratio. (D’après Osman et al., 2009) RESULTATS l’expression du facteur de transcription de levure Gal4 selon le même patron d’expression que LZ, c’est-à-dire dans les gonades, la trompe, les yeux et le lignage des cellules à cristaux. Cette lignée « pilote » lz-gal4 est utilisée pour induire, dans les cellules LZ+, l’expression de transgènes placés sous le contrôle de séquences UAS (Upstream Activating Sequence : séquence de réponse au facteur GAL4). Ainsi RUNX1-ETO est placé en aval de la séquence UAS et son expression est dirigée par lz-gal4.
Dans ce cadre, l’expression de RUNX1-ETO induit une létalité 100% pénétrante lorsque les Drosophiles sont élevées à 22°C. Néanmoins, des adultes peuvent émerger lorsque les mouches sont élevées à une température de 18°C. En effet, du fait de la thermo-sensibilité de l’activité du système UAS/GAL4, l’expression de RUNX1-ETO à 18°C est plus faible. De plus, si l’on interfère avec l’activité de RUNX1-ETO, notamment en surexprimant LZ, on peut aussi obtenir des adultes viables. De fait, la létalité induite par RUNX1-ETO est modulable ce qui suggère que ce phénotype n’est pas du à un effet toxique aspécifique mais plutôt à une interférence avec la fonction du facteur de type RUNX LZ.
Afin d’identifier des régulateurs de l’activité de RUNX1-ETO, nous avons réalisé un crible génétique reposant sur la suppression de la létalité induite par RUNX1-ETO chez la Drosophile. Ainsi, j’ai recherché des gènes qui, quand on inhibe leur fonction spécifiquement dans les cellules LZ+ par interférence à l’ARN, permettent l’émergence d’adultes vivant exprimant le transgène RUNX1-ETO.
Figure 28. Schéma de la stratégie employée pour déterminer les gènes testés lors du crible. RESULTATS
Pour réaliser ce crible, nous avons choisi de sélectionner des gènes potentiellement exprimés dans des cellules où RUNX1-ETO agit. Pour cela, nous avons utilisé les résultats d’analyse transcriptome des cellules Kasumi-1 réalisés par le Dr O. Heidenreich ce qui m’a permis de pré-sélectionner 7516 gènes (Figure 28). J’ai ensuite recherché (grâce aux bases de données http://www.genenames.org et http://flight.icr.ac.uk) chez la Drosophile les homologues de chacun de ces gènes (soit 2558 gènes chez la Drosophile). Une fois cet ensemble de gènes à tester identifié, j’ai recherché ceux pour lesquels des lignées transgéniques UAS-dsRNA étaient disponibles au centre de stocks Japonais NIG (National Institut of Genetics). En effet, le Dr. R. Ueda (NIG, Japon) a généré une collection de lignées transgéniques UAS-dsRNA qui permettent d’inactiver les gènes de Drosophile par RNAi (ARN interférence) et ce de façon inductible et tissus spécifique (système d’expression UAS/GAL4). Pour limiter les risques d’effet « off-target » associé au RNAi, j’ai uniquement utilisé des lignées pour lesquelles le dsRNA n’avait pas d’ « off-target » prédit (soit 591 gènes). Nous avons ainsi pu tirer profit de cette collection pour co-exprimer RUNX1-ETO et chacun des dsRNA dans les cellules LZ+.
Au final, sur les 591 gènes testés au cours de mon crible, j’ai identifié 26 gènes candidats supprimant la létalité induite par RUNX1-ETO (Figure 29 a, b, c et d). Pour chaque gène, j’ai réalisé deux croisements indépendants et criblé environ 100 individus pour chaque condition (Figure 30). Le nombre d’individus sauvés varie selon les gènes testés, par exemple la proportion de sauvetage par le dsPontin52 est de l’ordre de 20% tandis que celui du dsJARID2 est de 1%. Pour la suite de mon étude, je n’ai pas pris en compte cette variabilité du nombre d’adultes émergeants (Cf. partie discussion ci-après). Ces adultes présentent des phénotypes d’œil, et une absence de labium ainsi que de gonades dans certains cas (Figure 26), ce qui indique qu’ils ne suppriment pas les phénotypes induits par l’expression de RUNX1-ETO dans tous les territoires LZ+ .
Suppression Symboles des Numéro Suppression Noms des gènes Symboles prolifération/dif gènes Fonctions CG létalité homologues férenciation homologues CG1847 CG1847 + non/non AIP Aryl-hydrocarbon Joue un rôle dans la signalisation AHR receptor-interacting (aromatic hydrocarbon receptor), protein CG3654 Jarid2 + non/oui JARID2 jumonji, AT rich Requis pour la formation du tube neural. interactive domain 2 Essentiel pour le développement du cœur. Co-répresseur transcriptionnel de GATA4 et NKX2-5. Participe à la régulation négative de la prolifération cellulaire.
CG3821 Aats-asp ++ DARS aspartyl-tRNA Catalyses l’attachement spécifique d’un synthetase acide aminé à l’ARNt. CG3944 ND23 + NDUFS8 NADH Sous-unité de la chaine respiratoire dehydrogenase membranaire mitochondriale NADH reductase) déshydrogénase (Complex I). CG4003 pont ++++ oui/50-50 RUVBL1 RuvB-like 1 Composant du complexe histone acetyltransferase NuA4 impliqué dans l'activation de la transcription de gènes via l'acétylation des histones H4 et H2A.
CG4164 CG4164 ++ non/50-50 DNAJB11 DnaJ homolog Protéine chaperonne de HSPA5. subfamily B member 11 Precursor
Figure 29a. Suppresseurs de l’activité de RUNX1-ETO. Le pourcentage d’adultes émergeants est représenté par le symbole +. 0-5% adultes vivant : + ; 5-10% : ++ ; 10-15% : +++ ; 15-20% :++++. Les numéros de CG en rouge correspondent aux UAS-dsRNA aussi testés sur les phénotypes préleucémiques induits par RUNX1-ETO.
Suppression Symboles des Numéro Suppression Noms des gènes Symboles prolifération/dif gènes Fonctions CG létalité homologues férenciation ? homologues CG6136 CG6136 ++ CUTC Copper homeostasis Impliqué dans l'homéostasie du cuivre. protein cutC homolog CG6251 Nup62 + non/50-50 NUP62 nucleoporin 62kDa Composant essentiel de complexe des pores nucléaires. Impliqué dans le transport nucléocytoplasmique. CG6501 ns2 + oui/oui GNL2 guanine nucleotide GTPase associée à la sous-unité ribosomale binding protein-like pré-60S dans le nucléole et requise pour son 2 export nucléaire et sa maturation.
CG7006 CG7006 + oui/oui NIP7 nuclear import 7 Requis pour l'assemblage de l'ARNr 27S de homolog la sous-unité ribomale 60S. CG7340 granny-smith + NPEPL1 aminopeptidase-like Catalyse le retrait d'acides aminés N- 1 terminaux non substitués de peptides. CG7610 ATPsyn- + oui/oui ATP5C1 ATP synthase, H+ ATP synthase mitochondriale membranaire gamma transporting, (F(1)F(0) ATP synthase ou Complex V) mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1 CG7823 RhoGDI + non/oui ARHGDIA Rho GDP Régule la réaction d'échange GDP/GTP de dissociation protéines Rho en inhibant la dissociation du inhibitor (GDI) GDP et la liaison de GTP. alpha
Figure 29b. Suppresseurs de l’activité de RUNX1-ETO. Le pourcentage d’adultes émergeants est représenté par le symbole +. 0-5% adultes vivant : + ; 5-10% : ++ ; 10-15% : +++ ; 15-20% :++++. Les numéros de CG en rouge correspondent aux UAS-dsRNA aussi testés sur les phénotypes préleucémiques induits par RUNX1-ETO. Suppression Symboles des Numéro Suppression Noms des gènes Symboles prolifération/dif gènes Fonctions CG létalité homologues férenciation ? homologues CG9242 bur + oui/non GMPS guanine Impliqué dans la synthèse de novo de monophosphate nucléotides guanine essentiels non seulement synthetase pour la synthèse de l'ADN et l'ARN mais aussi pour fournir du GTP. CG10545 + GNB1 guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 1 (GNB1) CG10681 + MGC2749
CG10850 ida + oui/oui ANAPC5 anaphase promoting Composant du complexe APC/Cyclosome, complex subunit 5 Régule la progression du cycle cellulaire.
CG10954 Arc-p34 ++ non/oui ARPC2 actin related protein Se lie à l'actine pour réguler sa 2/3 complex, polymérisation. subunit 2, 34kDa CG13849 Nop56 + oui/oui NOP56 NOP56 Requis pour la biogenèse de la sous-unité ribonucleoprotein ribosomale 60S homolog
Figure 29c. Suppresseurs de l’activité de RUNX1-ETO. Le pourcentage d’adultes émergeants est représenté par le symbole +. 0-5% adultes vivant : + ; 5-10% : ++ ; 10-15% : +++ ; 15-20% :++++. Les numéros de CG en rouge correspondent aux UAS-dsRNA aussi testés sur les phénotypes préleucémiques induits par RUNX1-ETO.
Suppression Symboles des Numéro Suppression Noms des gènes Symboles prolifération/dif gènes Fonctions CG létalité homologues férenciation ? homologues CG13922 mRpL46 + MRPL46 mitochondrial ribosomal protein L46 CG15433 Elp1 + ELP1 elongation protein 3 Sous-unité catalytique histone homolog acétyltransférase du complexe d'élongation de l’ARN polymerase II. CG16708 CG16708 + CERK ceramide kinase Catalyse spécifiquement la phosphorylation de céramides. CG17149 Su(var)3- + non/non KDM1 lysine (K)-specific Histone déméthylase qui déméthyle la lysine- 3/Lsd1 demethylase 1 4 de l'histone H3. CG17565 + FNTB farnesyltransferase, CAAX box beta
CG17870 14-3-3zeta + oui/oui YWHAZ tyrosine 3- Protéine adaptatrice impliquée dans la monooxygenase/try régulation de nombreuses voies de ptophan 5- signalisation. Se lie à de nombreux facteurs monooxygenase via la reconnaissance de motifs activation protein, phosphoserine ou phosphothréonine. zeta polypeptide CG18332 CSN3 +++ oui/oui COPS3 COP9 constitutive Composant du complexe signalosome COP9 photomorphogenic (CSN). Le complexe CSN est essentiel pour homolog subunit 3 réguler l'ubiquitinylation.
Figure 29d. Suppresseurs de l’activité de RUNX1-ETO. Le pourcentage d’adultes émergeants est représenté par le symbole +. 0-5% adultes vivant : + ; 5-10% : ++ ; 10-15% : +++ ; 15-20% :++++. Les numéros de CG en rouge correspondent aux UAS-dsRNA aussi testés sur les phénotypes préleucémiques induits par RUNX1-ETO.
Figure 30. Schéma des croisements réalisés durant le crible. L’expression de RUNX1-ETO par le pilote lz-gal4 chez la Drosophile est létale au stade pupe. La souche établie pour ce crible (A) présente à la fois le pilote lz-gal4, le transgène UAS- RUNX1-ETO, et le transgène TUBULINE-Gal80 (tub-Gal80) ; dans cette lignée l’expression ubiquitaire de GAL80 inhibe l’activation de la transcription de l’UAS-RUNX1-ETO par GAL4. Suite au croisement de femelles issues de cette lignée avec des mâles présentant le transgène UAS-dsRNA (B), nous obtenons principalement des adultes CyO (ailes courbées) n’exprimant pas RUNX1-ETO (C) mais parfois, nous pouvons obtenir des adultes non CyO viables coexprimant RUNX1-ETO et le dsRNA dans les cellules LZ+ (D).
RESULTATS
J’ai ensuite cherché à savoir si les suppresseurs de létalité, identifiés dans le crible, affectent aussi les phénotypes hématopoïétiques induits par RUNX1-ETO (augmentation du nombre de cellules LZ+ et blocage de leur différenciation). Pour 16 de ces candidats, j’ai donc saigné des larves exprimant RUNX1-ETO et le dsRNA sélectionné sous le contrôle de lz-gal4 et j’ai quantifié le nombre de cellules LZ+ circulantes ainsi que leur état de différenciation. De plus, pour chaque condition, le nombre total d’hémocytes a été contrôlé. Celui-ci ne présentait pas de variation majeure : il n’est pas influencé par l’expression de RUNX1-ETO uniquement dans les cellules LZ+ (qui constituent ±5% des hémocytes) ni par la coexpression de ces dsRNA ou le contexte génétique utilisé.
De façon intéressante, mes résultats montrent que l’inhibition de 9 des gènes candidats (CG7610, CG4003, CG18332, CG6501 CG7006, CG17870, CG9242, CG10850 et CG13849) par RNAi permet de rétablir tout ou en partie le nombre absolu de cellules LZ+ (Figure 31). Pour vérifier que ces gènes ne sont pas requis pour la viabilité/prolifération de ces cellules, j’ai aussi quantifié le nombre de cellules LZ+ présentes en l’absence de RUNX1-ETO (Figure 32). L’inhibition de 8 d’entre eux ne semble pas affecter le nombre de cellules LZ+ dans ces conditions, ce qui suggère qu’ils participent spécifiquement à l’activité de RUNX1- ETO pour la prolifération de ces cellules. De manière étonnante, l’inhibition de CSN3/CG18332 induit une augmentation du nombre de cellules LZ+, ce qui suggère que CSN3 empêche la prolifération de ces cellules en contexte normal mais la favorise en présence de RUNX1-ETO (Cf. partie discussion ci-après).
D’autre part, j’ai pu montrer que dans des larves exprimant RUNX1-ETO, l’inhibition de 10 des candidats (CG7823, CG3654, CG10954, CG7610, CG18332, CG6501, CG7006, CG17870, CG13849 et CG10850) permet de rétablir l’équilibre normal entre progéniteurs et cellules à cristaux différenciées (Figure 33). Pour 3 autres candidats (CG4003, CG4164 et CG6251) on observe une augmentation significative du taux de différenciation qui n’atteint cependant pas le niveau sauvage.
Figure 31. Nombre absolu de cellules Lz-GFP+ circulantes dans des larves L3 dans un contexte lz-Gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO (sauf contrôle : lz-Gal4,UAS-GFP /+). L’expression de RUNX1-ETO (UAS-RE) et des différents dsRNA (ds) est induite dans le lignage LZ+ en utilisant le pilote lz-gal4.
Figure 32. Effet des dsRNA sur le nombre de cellules LZ+ circulantes au stade L3 en contexte sauvage. L’expression des différents UAS-dsRNA est induite en utilisant le pilote LZ-gal4 et la présence des cellules LZ+ est révélée par la GFP grâce au transgène UAS-gfp. Contrôle : LZ-gal4,UAS-gfp/+ .
Figure 33. Proportion de cellules LZ+ à l’état progéniteur (GFP+mpo-) ou différencié en cellules à cristaux (GFP+ mpo+) dans des larves L3 dans un contexte lz-gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO (sauf contrôle : lz-gal4,UAS-GFP /+). L’expression de RUNX1-ETO (RE) et des différents dsRNA (ds) est induite dans le lignage LZ+ en utilisant le pilote lz-gal4.
RESULTATS
Au vue de ces résultats, nous avons poursuivi la caractérisation de 6 gènes candidats: CG7006/NIP7, CG6501/GNL2, CG18332/CSN3, CG4003/Pontin52, CG4164/Hsp40 et CG3654/JARID2. Les 3 premiers gènes restaurent les deux phénotypes induit par RUNX1- ETO tandis que les 3 autres ne restaure que partiellement ou seulement un des deux phénotypes hématopoïétiques (Figure 31 et 33). Le but de mon projet étant de mieux comprendre le mode d’action de RUNX1-ETO, il est essentiel d’étudier les homologues humains des gènes identifiés chez la Drosophile. Pour cela, nous utilisons la lignée Kasumi-1, exprimant RUNX1-ETO constitutivement. Dans un premier temps, nous avons vérifié que ces gènes sont bien exprimés dans ces cellules et nous avons cherché à savoir si leur expression est régulée par RUNX1-ETO. Pour cela, nous avons traité les cellules Kasumi-1 avec un siRNA contrôle (siGFP) ou un siRNA dirigé contre RUNX1-ETO (siRE) et nous avons quantifié par RT-qPCR l’expression de chacun des 6 gènes candidats sur lesquels nous nous focalisons (Figure 34). Dans les cellules traitées avec le siRE, le niveau de transcrit RUNX1- ETO est réduit de 77% environ par rapport aux cellules contrôles. Alors que l’expression de HSP40, CSN3, GLN2 n’est pas significativement affectée par l’inhibition de RUNX1-ETO, celle de JARID2 augmente de 53% et celle de NIP7 et PONTIN52 diminue respectivement de 38 et 29 %. Ces résultats confirment que ces gènes sont exprimés dans les cellules Kasumi-1 et suggèrent que RUNX1-ETO pourrait promouvoir l’expression de NIP7 et PONTIN52 et inhiber celle de JARID2.
Dans un second temps, nous avons recherché si ces gènes régulent la prolifération et/ou la différenciation des cellules leucémiques exprimant RUNX1-ETO chez l’Homme, comme ce que nous avons observé chez la Drosophile. Nous avons choisi de commencer par étudier Pontin52. En effet, des études ont montré que l’expression de Pontin52 (aussi appelé RUVBL1) est fortement augmentée dans plusieurs types de cancers : les hépatocarcinomes et le cancer colorectal (Grigoletto et al., 2011), et que cette augmentation est corrélée à un mauvais pronostic. De plus, d’un point de vu moléculaire, Pontin52 fait partie d’un complexe
Figure 34. Effet du traitement siRNA (si) RUNX1-ETO sur l’expression de 7 gènes candidats (gauche) et de RUNX1-ETO (droite) dans les Kasumi-1. Panel gauche : l’inhibition de RUNX1-ETO a un effet sur l’expression de HSP40, NIP7, Jarid2 et Pontin52. Panel droit : le traitement siRNA dirigé contre RUNX1-ETO réduit de 77% son expression.
La quantité d’ARNm de chaque gène candidat est normalisée par rapport à la quantité d’ARNm de Gapdh. RESULTATS de remodelage de la chromatine et interagit avec des facteurs de transcription dont certains sont impliqués dans la carcinogénèse (cf aussi discussion ci-après) (Bauer et al., 2000) (Jin et al., 2005). L’ensemble de ces données suggère que Pontin52 pourrait être impliqué dans le développement des phénotypes induit par RUNX1-ETO et nous a amené à tester le rôle de ce candidat en priorité. Mes expériences chez la Drosophile ont montré que la coexpression d’un dsRNA Pontin52/CG4003 et de RUNX1-ETO, permet de restaurer un nombre normal de cellules LZ+ mais ne rétablie que partiellement leur différenciation. De plus, l’inhibition de Pontin52 n’affecte pas le nombre de cellules LZ+ dans un contexte normal. En collaboration avec le Dr Osman Breig, nous avons amorcé l’étude de Pontin52 dans les cellules Kasumi-1. Dans un premier temps, nous avons montré que le traitement des cellules Kasumi-1 par le siPontin52 réduit de 84% l’ARNm de ce gène mais n’affecte pas le niveau d’expression de RUNX1-ETO (Figure 35). Inversement, Nous avons montré que le siRE réduit non seulement le transcrit Pontin52 mais aussi la quantité de protéine Pontin52 présente dans ces cellules (Figure 36). Ainsi, il est possible que cette protéine oncogénique favorise l’expression ou la stabilité de Pontin52 pour induire son effet leucémogène. Dans un second temps, étant donné le rôle de Pontin52 dans la régulation de la transcription, nous avons cherché à savoir si Pontin52 était un cofacteur de RUNX1-ETO. D’une part, nous avons testé si la déplétion de Pontin52 affectait l’expression de gène activés ou réprimés par RUNX1-ETO (Figure 37). Contrairement au siRE, le traitement des cellules Kasumi-1 avec un siPontin52 ne modifie que faiblement l’expression des cibles de RUNX1- ETO que nous avons testé. Pontin52 ne semble donc pas jouer un rôle essentiel dans la régulation de la transcription par RUNX1-ETO. D’autre part, j’ai réalisé des expériences d’immunoprécipitation à partir d’extraits de cellules Kasumi-1 et de cellules U937 exprimant une forme étiquetée de RUNX1-ETO pour tester si Pontin52 et RUNX1-ETO interagissent. Ces expériences ne révèlent aucune interaction physique entre Pontin52 et RUNX1-ETO. En parallèle, nous avons testé si un traitement siPontin52 permettait de réduire la prolifération et la différenciation des cellules Kasumi-1 de manière comparable à un traitement siRE (Heidenreich et al., 2003). De manière très intéressante, le siPontin52 comme le siRE réduisent considérablement la prolifération et la clonogénicité des cellules Kasumi-1 (Figure 38). Par contre, nos résultats préliminaires semblent indiquer que la déplétion de Pontin52 n’induit pas la différenciation des cellules Kasumi-1 : le pourcentage de cellules exprimant CD11b (marqueur de la différenciation) reste aux alentours de 1.5% en présence de siPontin52 alors qu’il passe à 23% avec le siRE (Figure 39). L’ensemble de ces données
Figure 35. Validation du siRNA Pontin52 et effet sur le niveau d’expression de RUNX1-ETO. Cinq jours après traitement avec les siRNA indiqués, la quantité d’ARNm Pontin52 et RUNX1-ETO a été quantifiée par RT-qPCR et normalisée par rapport à Gapdh. Le siPontin52 permet de réduire de 84% le transcrit Pontin52 mais n’a pas d’effet significatif sur le transcrit RUNX1-ETO.
Figure 36. Effet de traitements siRNA RUNX1-ETO sur l’expression de Pontin52 dans les Kasumi-1. Panel gauche : Effet d’un traitement siRNA (si) dirigé contre RUNX1-ETO (RE) ou la GFP (siGFP) sur les niveaux d’ARNm Pontin52 et RUNX1-ETO mesurés par RT-qPCR. Les quantités d’ARNm de RUNX1-ETO et Pontin52 sont normalisées par rapport à la quantité d’ARNm de Gapdh. Panel droite : Western blot montrant l’expression de Pontin 52 et RUNX1-ETO 5 jours après traitement des cellules Kasumi-1 avec les siRNA indiqués dans la partie supérieure du panel. Grb2 est utilisé comme contrôle de charge.
Kasumi-1 Kasumi-1 siRUNX1-ETO siPontin52 5jours 5jours
RUNX1-ETO 0,23 1,25 Pontin 0,51 0,18 NKG7 82,12 1,29 NFE2 78,29 2,12 CEBPA 1,76 1,41 OGG1 21,32 1,46 MS4A3 317,10 1,46
Figure 37. Effet des traitements siRNA RUNX1-ETO et Pontin52 sur l’expression des gènes activés (panel de gauche) ou réprimés (panel de droite) par RUNX1-ETO dans les Kasumi-1. Panel gauche : les quantités d’ARNm des différents gènes ont été mesurées par RT-qPCR 5 jours après traitement avec les siRNA indiqués et rapportées au niveau d’expression de Gapdh. Panel droit : la quantité des ARNm des gènes réprimés par RUNX1-ETO, déterminée par RT-qPCR, est représentée ici par le ratio Quantité ARNm après traitement siRUNX1-ETO (ou siPontin52) / Quantité ARNm après traitement siGFP. Par exemple, NKG7 est environ 82 fois plus exprimé après le traitement siRUNX1-ETO. Le traitement siRUNX1-ETO diminue de 77% l’ARNm RUNX1-ETO et le siPontin52 n’a quasiment aucun effet sur RUNX1-ETO et les autres gènes réprimés par RUNX1-ETO.
Figure 38. Effet des traitements siGFP, siRUNX1-ETO et siPontin52 sur la prolifération (gauche) et la clonogénicité (droite) des cellules Kasumi-1.
Traitement siRNA % de cellules CD11b+ siGFP 1.31% siRUNX1-ETO 23.24% siPontin52 1.16%
Figure 39. Effet de la déplétion de RUNX1-ETO ou Pontin52 sur la différenciation des cellules Kasumi-1. Le niveau de différenciation a été mesuré 5 jours après traitement avec les siRNA indiqués en quantifiant par FACS le pourcentage de cellules exprimant le marqueur de différenciation myéloïde CD11b. RESULTATS suggère que Pontin52 pourrait avoir un rôle important en aval de RUNX1-ETO dans le contrôle de la prolifération et/ou de la viabilité des cellules leucémiques.
Le but du crible que j’ai réalisé était d’identifier des régulateurs de l’activité de RUNX1-ETO. L’expression de cette protéine oncogénique humaine dans les cellules LZ+ induit une létalité précoce chez la Drosophile qui est 100% pénétrante lorsque les mouches sont élevées à 22°C. Ainsi, pour identifier des régulateurs potentiels de RUNX1-ETO, j’ai criblé sur la suppression de cette létalité suite à l’inhibition de l’expression de différents gènes par RNAi spécifiquement dans les cellules LZ+. Cette stratégie présente plusieurs avantages. D’une part, le phénotype que nous observons, i.e. l’émergence d’adultes viables, est très facile à suivre et permet de réaliser un crible à assez grande échelle. D’autre part, contrairement à une stratégie utilisant une mutagenèse à l’EMS ou un kit de déficiences, l’utilisation des lignées UAS-dsRNA nous permet de savoir quels sont les gènes affectés. Enfin, le fait de cibler la perte de fonction de ces gènes spécifiquement dans les cellules LZ+ nous abstrait d’éventuels effets délétères dus à l’inhibition de ces gènes dans d’autres tissus. Par contre, l’utilisation de dsRNA peut induire des effets « off-target » et même si nous avons choisi des dsRNA ne présentant pas d’ «off-Target » prédits, il est possible que certaines des lignées aient supprimé la létalité par effet « off-target » plutôt qu’en inhibant leur gène cible. Des lignées UAS-dsRNA secondaires ciblant une autre région du transcrit auraient pu être utilisées pour valider l’identité des gènes candidats. Une autre limitation est liée au fait que l’efficacité du RNAi est très variable et donc certaines lignées dsRNA peuvent ne pas inhiber (suffisamment) la fonction du gène ciblé pour mettre en évidence un phénotype. Pour augmenter l’efficacité du système, il aurait pu être possible de co-exprimer les dsRNA avec DICER2 (Dietzl et al., 2007) en ajoutant un transgène UAS-dicer2 dans le fond génétique des Drosophiles que nous avons utilisé pour le crible.
RESULTATS
Lors du crible, le taux de sauvetage de la létalité varie de 1 à 20% selon les candidats. Je n’ai pas observé de corrélation directe entre un taux élevé de sauvetage de la létalité et le sauvetage des phénotypes hématopoïétiques. L’origine de la létalité induite par RUNX1-ETO n’étant pas clairement établie, je n’ai pas pris en compte cette variabilité pour le reste de mon étude. De manière intéressante, nous avons pu identifier des gènes candidats permettant de sauver soit les deux phénotypes hématopoïétiques, soit un seul de ces phénotypes. Ceci suggère que l’action de RUNX1-ETO sur la différenciation et la prolifération des cellules hématopoïétiques est génétiquement découplable. Ainsi, RUNX1-ETO pourrait recruter ou collaborer avec des cofacteurs différents pour réguler l’expression de gènes impliqués soit dans le contrôle de la prolifération/survie soit dans le contrôle de la différenciation. L’utilisation des modèles murins et les données cliniques montrent que RUNX1-ETO n’est pas suffisant pour induire des leucémies mais que des mutations secondaires (activatrices ou inactivatrices) sont requises pour la transformation maligne. L’identification des gènes qui régulent, positivement ou négativement, l’activité de RUNX1-ETO est essentielle pour comprendre comment cette protéine agit et pouvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, cette tâche est difficile dans les modèles vertébrés. Grâce à la Drosophile, on peut espérer identifier les réseaux géniques conservés qui sont impliqués dans la leucémogenèse par des approches génétiques comme celle que nous avons utilisée. Nous avons basé notre crible sur l’identification de suppresseurs de la létalité induite par RUNX1-ETO. Il serait intéressant de développer un crible visant à identifier des gènes augmentant l’activité de RUNX1-ETO et/ou basé sur l’observation des phénotypes hématopoïétiques et notamment sur l’aggravation de la prolifération des cellules LZ+ induite par RUNX1-ETO chez la larve. Récemment, un crible similaire a été réalisé afin d’identifier des régulateurs de l’activité de RUNX1-ETO en utilisant des mutations monoalléliques et en observant le nombre d’hémocytes larvaires (Sinenko et al., 2010). Les auteurs ont ainsi pu identifier aussi bien des gènes suppresseurs que des gènes aggravant les phénotypes induits par RUNX1-ETO chez la Drosophile. De même, il serait envisageable de tester l’effet de gain de fonction de gènes sur l’activité de RUNX1-ETO, notamment sur la létalité mais aussi sur les phénotypes hématopoïétiques retrouvés dans un contexte RUNX1-ETO. En effet, de nombreux outils sont disponibles chez la Drosophile et notamment des constructions permettant de surexprimer certains gènes de manière tissus spécifiques.
RESULTATS
Au final, grâce à cette panoplie d’outils, la Drosophile représente un modèle puissant pour étudier par des approches génétiques le mécanisme d’action de RUNX1-ETO. Plus généralement, la Drosophile pourrait aussi être utilisé pour étudier d’autres types de protéines de fusion associées à des leucémies chez l’Homme.
Nos résultats suggèrent que Pontin52 est un gène important pour la leucémogenèse induite par RUNX1-ETO chez la Drosophile et chez l’Homme. En particulier, l’inhibition de l’expression de Pontin52 dans les cellules Kasumi-1 réduit le caractère clonogénique de ces cellules. Il est important de noter qu’un traitement siPontin52 sur des cellules U937 n’exprimant pas RUNX1-ETO n’a aucun effet sur leur prolifération. D’autre part, nous n’avons pas encore pu mettre en évidence un rôle de Pontin52 dans le blocage de la différenciation des cellules Kasumi-1. Pontin52 pourrait servir de cofacteur pour la régulation de l’expression des cibles de RUNX1-ETO. Cependant, nos expériences montrent que la déplétion de Pontin52 n’affecte que très modestement la transcription des cibles de RUNX1- ETO que nous avons testé. Il se peut que Pontin52 n’agisse pas sur l’ensemble des cibles mais uniquement sur quelques une d’entres elles. Alternativement, Pontin52 pourrait contrôler la prolifération des cellules Kasumi-1 indépendamment ou en aval de RUNX1-ETO du fait de son interaction avec d’autres facteurs de transcription.
Ainsi, Pontin52 est connu pour former un complexe avec la -caténine et LEF-1/TCF-1 (Lymphocyte Enhancer Factor-1/T-Cell Factor) et jouer le rôle de coactivateur de la - caténine au sein de la voie wnt (Bauer et al., 1998 ; Bauer et al., 2000). De manière intéressante, il a été montré que RUNX1-ETO augmente la transactivation par TCF1 et donc l’activation de la transcription des gènes cibles de la voie wnt tels que c-myc et cyclinD1 en augmentant l’expression de -caténine et de son paralogue plakoglobine (Müller-Tidow et al., 2004). De plus, le blocage de la voie wnt par l’expression d’un dominant négatif TCF, diminue la clonogénicité des Kasumi-1. Ces données suggèrent donc que la voie wnt pourrait être impliquée dans l’activité leucémogène de RUNX1-ETO et Pontin52 pourrait agir sur la prolifération en coopération avec -caténine/TCF-1. Il serait intéressant de tester la capacité des différents composants de la voie wnt à supprimer la létalité induite par RUNX1-ETO chez
RESULTATS la Drosophile. Nous pourrions par exemple tester l’effet d’un dominant négatif de TCF, ou de dsRNA dirigés contre Armadillo, l’homologue de la -caténine chez la Drosophile. Nous pourrions aussi combiner le dsArmadillo avec le dsPontin52 afin de tester une interaction génétique entre ces deux gènes dans un contexte où RUNX1-ETO est exprimé.
Pontin52, récemment identifié comme requis pour la viabilité des CSH murines (Bereshchenko et al., 2012), est aussi capable d’interagir avec c-Myc et cette interaction est requise pour la transformation de cellules en culture par c-Myc (Wood et al., 2000). Il est possible que cette coopération soit aussi importante pour la prolifération des cellules leucémiques induite par RUNX1-ETO. De plus, nous avons pu voir que l’expression d’un dsc-myc dans un contexte RUNX1-ETO supprime la létalité induite par cet oncogène humain. Etant donné que l’interaction Myc/Pontin52 est conservée chez la Drosophile (Bellosta et al., 2005), cette hypothèse pourrait elle aussi être testée dans notre modèle.
Au vue de ces résultats, il sera intéressant de poursuivre l’étude de Pontin52 que nous avons entamé afin d’élucider sa fonction dans le développement de leucémies induites par RUNX1-ETO et de caractériser plus précisément son mode d’action. Des expériences de transcriptome et/ou de ChIP-Seq pourraient notamment permettre d’identifier les gènes régulés par Pontin52 dans les cellules Kasumi-1 et de savoir s’il agit en conjonction avec RUNX1-ETO ou avec d’autres facteurs de transcription. Par la suite, l’étude de la fonction de Pontin52 dans la leucémogenèse pourrait être réalisée sur des modèles murins ainsi que des cellules primaires de patients. Enfin, Pontin52 appartenant à un complexe de remodelage de la chromatine, il serait intéressant de tester si les autres membres de ce complexe sont impliqués dans cette fonction.
Parmi les 26 suppresseurs de létalité identifiés dans le crible, 2 gènes sont connus pour avoir un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire (CSN3 et ANAPC5), 7 peuvent être impliqués dans la régulation de la transcription (Pontin52, JARID2, AOF2, MRPL46, GMPS, NIP7, GNL2), 2 ont une activité anti-apoptotique (ARHGDIA, 14-3-3), 3 ont un rôle dans le transport protéique (Hsp40, NUP62, AIP) et les 12 autres ne présentent pas de fonctions connues en lien apparent avec celles de RUNX1-ETO. Sur ces 26 candidats, j’ai pu montrer que 12 (Hsp40, NIP7, CSN3, Pontin52, JARID2, GNL2, ATP5C1, ARHGDIA, 14-3-3,
RESULTATS
Burgundi, AIP et ARPC2) sur les 14 testés suppriment au moins un des deux phénotypes hématopoïétiques induits par RUNX1-ETO chez la Drosophile. De manière intéressante, nous avons identifié deux gènes candidats potentiellement impliqués dans la régulation de l’activité de RUNX1-ETO, qui pourraient agir via la formation d’un complexe : CSN3, 14-3-3 et MLF (Cf. Discussion Partie 2).
Le gène GNL2, également nommé NGP-1, appartement à la famille des Nucléostémines (Tsai and Meng, 2009) et fut initialement identifié comme auto antigène du cancer du sein (Racevskis et al., 1996). Récemment, une étude a montré que NGP-1 est très fortement exprimé dans des cellules primaires humaines prolifératives et que son expression diminue lorsque ces cellules se différencient (Chennupati et al., 2011). Ces données suggèrent que NPG-1 est requis pour la prolifération des cellules et pourrait être associé à la transformation des cellules cancéreuses. De manière très intéressante, il a été montré qu’un autre membre de la famille des nucléostémines (GNL3) interagissait non seulement avec c-Myc, grâce à la présence de domaine E-Box dans sa séquence; mais qu’il était également une cible transcriptionnelle de c-Myc requis pour la prolifération des cellules cancéreuses associé à c- Myc (Zwolinska et al., 2011). Le fait que GNL2 possède également ces domaines E-box suggère que GNL2 pourrait interagir avec c-Myc et être impliqué dans la prolifération de cellules cancéreuses, et notamment celle des Kasumi-1. Nous pourrions donc tester une relation potentielle entre GNL2, c-Myc et RUNX1-ETO dans notre modèle.
D’autre part, GNL3 est également connu pour être impliqué dans la maturation des ARN ribosomiques (Du et al., 2006) et il est probable que GNL2 possède cette même fonction. Or, parmi les gènes candidats identifiés NIP7 est également connu pour intervenir dans ce processus (Morello et al., 2011). Il est donc possible que NIP7 et GNL2 agissent conjointement pour favoriser l’activité de RUNX1-ETO.
Il serait donc intéressant d’amorcer l’étude de ces autres gènes candidats et de continuer la caractérisation dans les Kasumi-1 de ceux qui ont été validés chez la Drosophile. En effet, il est possible que l’interaction directe ou indirecte de ces gènes avec RUNX1-ETO permette à cette protéine oncogénique d’agir à différents points de contrôle du cycle cellulaire afin de favoriser une prolifération des cellules précurseurs tout en inhibant leur différenciation.
En conclusion, grâce au modèle Drosophile que j’ai utilisé, nous disposons maintenant d’une liste conséquente de gènes potentiellement requis pour l’activité de RUNX1-ETO. La caractérisation fonctionnelle de l’activité de ces gènes dans les cellules humaines exprimant
RESULTATS
RUNX1-ETO permettra de savoir s’ils sont des régulateurs conservés de l’activité leucémogène de cette protéine chimère et de mettre en évidence leur mode d’action.
Lignées de Drosophile et croisements. Nous avons utilisé les lignées suivantes : lz-gal4, UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO ; UAS-dsRNA (NIG) et lz-gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1- ETO/CyO-Tub-gal80. Les croisements ont été réalisés à 22°C. Pour le crible, les femelles lz- gal4,UAS-GFP ; UAS-RUNX1-ETO/CyO-Tub-gal80 sont croisées avec des mâles de chaque lignée UAS-dsRNA et la progéniture résultant de ce croisement est criblée pour l’émergence d’adultes viables non CyO.
Comptage des hémocytes. Pour déterminer le nombre d’hémocytes circulant larvaire, 12 larves femelles (au minimum) du stade L3 sont individuellement saignées comme décrit dans Osman et al., 2009. Les hémocytes de chaque larve sont collectés sur une lame dans 20l de PBS ; 15l de la saignée sont ensuite transférés sur une lame de comptage (cellules de mallassez). Le pilote lz-gal4, UAS-GFP a été utilisé pour évaluer le nombre de cellules LZ + (GFP+). Pour évaluer l'état de différenciation des cellules circulantes LZ +, des larves femelles du stade L3 ont été saignées sur des lamelles recouvertes de poly-lysine. Les hémocytes récoltés sont fixés 20min dans un mélange PBS/paraformaldehyde 4% puis lavés trois fois avec du PBS-0.1% Tween20 (PBST). Pour l’hybridation in situ couplée à l’immunomarquage, les lames sont pré-incubées 1h à 60°C dans un tampon d’hybridation. Après l’incubation avec une sonde ARN anti-sens contre PO45, durant une nuit à 60°C dans une chambre humide, les lames sont lavées et incubées avec les anticorps primaires anti-DIG et anti-GFP 2h à température ambiante. Le signal de l’hybridation in situ est révélé en fast-red (1h30) avant d’incuber les lames avec l’anticorps secondaire 2h à température ambiante. Les lames sont enfin montées dans du Vectashield-DAPI et la proportion de cellules GFP + exprimant PO45 est évaluée (pour plus de détails voir : Osman et al. 2009).
Culture cellulaire. Les lignées cellulaires Kasumi-1 et U937 sont mises en culture dans un milieu RPMI-1640 (Sigma) complémenté avec 1% de L-glutamine et de 10% de FCS. Ces cellules sont maintenues en culture à 37°C, 5%CO2 et 95% d’humidité.
Traitement siRNA et RT-qPCR. Pour le traitement siRNA et les RT-qPCR, les cellules ont été traitées essentiellement comme décrit dans O.Heidenreich et al. 2003. Pour les traitements
RESULTATS siRNA, les cellules (concentration finale 5,105cellules/ml) sont électroporées avec les siRNA (200nM) deux fois à 3jours d’intervalle. Les niveaux des ARNm des gènes candidats et de RUNX1-ETO ont été mesurés par PCR quantitative (Biorad TFSHGKD kit) après avoir été rétro-transcrits. Toutes les expériences ont été reproduites au moins trois fois. Les moyennes et les écarts-types ont été calculés à partir de triplicats indépendants.
Clonogénité, prolifération et différenciation. La clonogénicité des cellules Kasumi-1 a été évaluée comme décrit dans Osman et al. 2009, 7jours après l’électroporation des siRNA. Pour évaluer la prolifération des cellules, celles-ci sont comptées après un marquage au bleu-trypan 3 jours et 6 jours après la seconde transfection des siRNA. Le test de différenciation des Kasumi-1 est réalisé comme décrit dans O.Heidenreich et al. 2003. Les cellules sont également transfectées deux fois à 3 jours d’intervalle puis sont stimulées au TPA pour induire la différenciation. Après 2 jours d’incubation, les cellules sont immuno-marquées avec un anti-CD11b (marqueur de différenciation myéloïde, conjugué à l’APC). Les cellules sont analysées en cytométrie de flux (FACS).
Immunoprécipitation et Western Blot. Ces expériences sont réalisées selon le protocole décrit dans Gobert et al. 2009. Les cellules sont lysées dans un tampon d’immunoprécipitation (12.5 mL Tris pH8 1M, 7.5 mL NaCl 5M, 1.25 mL NP40, 0.5 mL EGTA 0.5M) durant 20min à 4°C. Pour l’immunoprécipitation, 1mg d'extrait cellulaire total pré-adsorbé a été incubé avec 1g d’IgG de rat ou de souris, ou avec 5L d’anti-Pontin52 (souris) ou 1g d’anti-RUNX1 (rat, Santa Cruz) et des billes de protéine-sépharose (A ou G) durant une nuit à 4°C. Pour le Western Blot, les échantillons sont déposés sur un gel SDS-PAGE 10% et migrés durant 1h à 180V dans un tampon TGS 1X. Le transfert est réalisé dans un tampon phosphate 1X durant 2h à 0.7A. La membrane est ensuite lavée dans du PBS 1X puis bloquée avec une solution PBS/Tween20/Lait 10%. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti-Pontin52 (1/5000 souris), anti-RUNX1 (1/2000 souris), anti--tubuline (1/2000 souris, Sigma-Aldrich). Après une nuit d’incubation, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires couplés à la péroxydase puis révélées par ECL.
Figure 40. Schéma de la stratégie du crible in cellulo. (A) Les régions régulatrices spécifiques des gènes exprimés dans les cellules à cristaux (mpo par exemple) ont été identifiées puis clonées dans un vecteur en amont du gène rapporteur Firefly Luciferase. Cette construction est co-transfectée dans les cellules Kc167 avec le plasmide d’expression pour LZ. Ceci induit une activation de la transcription du gène rapporteur (B) quantifiable et qui peut être modulée par la présence de dsRNA visant à inhiber spécifiquement l’expression de gènes présents dans ces cellules de Drosophile. Par ce crible, il est possible d’identifier des coactivateurs du complexe LZ/SRP (dsX) ou encore des corépresseurs (dsY). PR : Promoteur répondant à SRP/LZ. RESULTATS
Chez les mammifères comme chez la Drosophile, les facteurs des familles GATA et RUNX jouent des rôles essentiels au cours de l’hématopoïèse. De plus, il a été montré au laboratoire et dans d’autres équipes que ces deux familles de facteurs de transcription peuvent interagir et coopérer pour réguler le développement des cellules sanguines. Ainsi, chez les mammifères, la coopération entre GATA1 et RUNX1 participe à la différenciation mégacaryocytaire (Elagib et al., 2003 ; Pencovich et al., 2011 ; Tijssen et al., 2011) et le couple GATA2/RUNX1 joue un rôle clé dans la régulation des gènes exprimés dans les CSH (Wilson et al., 2010). De même, chez la Drosophile, les facteurs SRP et Lz coopèrent pour promouvoir la différenciation des prohémocytes en cellules à cristaux comme nous l’avons vu précédemment.
Au vue de ces similitudes, la coopération du complexe SRP/LZ durant le développement des cellules à cristaux pourrait servir de modèle pour comprendre le mode d’action des facteurs GATA et RUNX durant la détermination du destin des cellules sanguines et leur différenciation.
L’identification de modules cis-régulateurs liant et répondant au complexe GATA/RUNX SRP/LZ a permis au laboratoire de développer un crible visant à identifier des régulateurs de ce complexe (cf. publication en annexe). En effet, ce module est suffisant pour récapituler l’expression de gènes spécifiques des cellules à cristaux in vivo et peut être induit de manière ectopique par la coexpression de SRP/LZ (Ferjoux et al., 2007). Ainsi, sur la base de cette étude, un plasmide contenant ce module multimérisé a été généré et associé au gène rapporteur Firefly luciférase. Cette construction peut ainsi servir de plasmide rapporteur pour mesurer l’activation transcriptionnelle par SRP/LZ en culture cellulaire (Figure 40). La lignée cellulaire de Drosophile Kc167 est dérivée d’hémocytes embryonnaires : elle exprime constitutivement SRP mais pas LZ. La co-transfection de LZ avec le vecteur rapporteur dans
RESULTATS les cellules Kc167 est suffisante pour activer l’expression de la luciférase. Une fois les conditions de transfection optimisées, une collection de 14 000 dsRNA ciblant 90% du génome de Drosophila melanogaster a été utilisée pour réaliser un crible par RNAi permettant de trouver des gènes qui modifient le niveau d’expression de ce rapporteur de l’activité du complexe SRP/LZ.
En résumé, ce crible a permis d’identifier 129 candidats, dont 113 semblent être des régulateurs positifs de l’activité SRP/LZ tandis que les 16 autres seraient des régulateurs négatifs de l’activité de ce complexe. Les candidats ont été classés selon leurs fonctions prédites, et les régulateurs transcriptionnels représentent 58% des gènes identifiés. De manière très intéressante, 90% de ces gènes possèdent un orthologue chez l’Homme ce qui suggère que ces gènes pourraient également réguler la fonction du complexe GATA/RUNX chez l’Homme. Parmi ces gènes, cinq d’entre eux (CDKD9, SIN3A, MED1, l’homologue de MYST3/MOZ enok et l’homologue de ETS1 pnt) ont été précédemment reliés à l’activité GATA et/ou RUNX chez les mammifères ; et quatre autres gènes (Pcf11, CtBP, med13 et Sin3A) sont connus pour être impliqués dans le développement des cellules à cristaux chez la Drosophile. Ces données montrent donc que ce crible in cellulo est tout à fait approprié pour identifier des régulateurs de l’activité de SRP/LZ et plus généralement, des facteurs GATA/RUNX.
Au cours de ce crible, le facteur MLF a été identifié comme coactivateur potentiel du complexe SRP/LZ. Etant donné les liens entre MLF et leucémies chez l’Homme et le peu de données disponibles sur les fonctions de ce gènes (cf Partie Introduction), j’ai initié la caractérisation de ce gène chez la Drosophile afin de connaître le rôle de MLF au cours de l’hématopoïèse et de savoir si et comment il modulait l’activité de SRP/LZ.
RESULTATS
ARTICLE 1
Myeloid leukemia factor is a conserved regulator
of RUNX transcription factor activity involved
in hematopoiesis
Stéphanie Bras, Séverine Martin-Lannerée, Vanessa Gobert, Benoît Augé, Osman Breig, Matthieu Sanial, Masamitsu Yamaguchi, Marc Haenlin, Anne Plessis and Lucas Waltzer.
Myeloid leukemia factor is a conserved regulator of RUNX transcription factor activity involved in hematopoiesis
Stéphanie Brasa, Séverine Martin-Lanneréeb, Vanessa Goberta, Benoît Augéa, Osman Breiga, Matthieu Sanialb, Masamitsu Yamaguchic, Marc Haenlina, Anne Plessisb,1, and Lucas Waltzera,1 aCentre de Biologie du Développement, Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 5547, Université de Toulouse, 31062 Toulouse, France; bInstitut Jacques Monod, Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 7592, Université Paris Diderot, F-75205 Paris, France; and cDepartment of Applied Biology, Insect Biomedical Research Center, Kyoto Institute of Technology, Kyoto 606-8585, Japan
Edited by Kathryn V. Anderson, Sloan-Kettering Institute, New York, NY, and approved February 17, 2012 (received for review October 20, 2011) Defining the function of the genes that, like RUNX1, are deregu- and lymphocyte differentiation in mammals, and mutations af- lated in blood cell malignancies represents an important challenge. fecting RUNX1 are among the most frequent genetic abnormalities Myeloid leukemia factors (MLFs) constitute a poorly characterized associated with blood cell malignancies in humans. These alter- family of conserved proteins whose founding member, MLF1, has ations promote leukemia by altering RUNX1 dosage or by been associated with acute myeloid leukemia in humans. To gain producing mutant proteins that act as dominant negative and/or insight into the functions of this family, we investigated the role display neomorphic activities, as for RUNX1-ETO, the prod- of the Drosophila MLF homolog during blood cell development. uct of the t(8;21)(q22;q22) translocation, which comprises the Here we report that mlf controls the homeostasis of the Drosoph- RUNX1 DNA-binding domain fused to the transcriptional co- ila hematopoietic system. Notably, mlf participates in a positive repressor ETO (5). In Drosophila, the RUNX factor Lozenge feedback loop to fine tune the activity of the RUNX transcription (LZ) is specifically expressed in and required for development of factor Lozenge (LZ) during development of the crystal cells, one of one of the two main blood cell types: the crystal cells, a mega- the two main blood cell lineages in Drosophila. At the molecular karyocyte-like lineage that participates in clotting (6). In fact, LZ GENETICS level, our data in cell cultures and in vivo strongly suggest that interacts and cooperates with the pan-hematopoietic GATA MLF controls the number of crystal cells by protecting LZ from transcription factor Serpent (SRP) to activate the crystal cell degradation. Remarkably, it appears that the human MLF1 protein differentiation program (7–9). This cooperation is conserved in can substitute for MLF in the crystal cell lineage. In addition, MLF mammals, where it controls megakaryopoiesis (10–12) and he- stabilizes the human oncogenic fusion protein RUNX1-ETO and is matopoietic stem cell development (13). Moreover, reminiscent – Drosoph- required for RUNX1-ETO induced blood cell disorders in a of the situation in humans, RUNX1-ETO expression in the ila model of leukemia. Finally, using the human leukemic blood cell Drosophila + MLF1 LZ blood cell lineage induces a preleukemic phe- line Kasumi-1, we show that depletion impairs RUNX1-ETO notype characterized by a switch of cell fate from differentiation accumulation and reduces RUNX1-ETO–dependent proliferation. to self-renewal (14). Thus, Drosophila provides a valuable model Thus, we propose that the regulation of RUNX protein levels is for studying the normal and oncogenic functions of RUNX a conserved feature of MLF family members that could be critical factors during hematopoiesis. for normal and pathological blood cell development. The myeloid leukemia factor (MLF) family comprises a small group of evolutionarily conserved genes whose founding member fruit fly | cancer | proteasome was first identified as the target of the t(3;5)(q25;q35) trans- location associated with myelodysplastic syndrome (MDS) and evelopment of the hematopoietic system relies on the ac- AML (15). This translocation generates a fusion protein between Dtivity of several signaling pathways and transcription factors the N-terminal region of nucleophosmin (NPM; a multifunc- fl Drosophila that have been conserved from mammals to y (1). tional nucleolar protein) and most of MLF1. Whereas NPM, has emerged as a model organism to gain insight into the gene which is involved in other translocations, seems to act by pro- regulatory networks controlling hematopoiesis. Deregulation of viding a dimerization domain and a nucleolar targeting sequence these networks lies at the origin of several diseases in humans, (16), little is known about MLF1 activity. Significantly, however, including leukemia and lymphoma. Interestingly, these hemato- increased MLF1 expression correlates with poor prognosis in logic malignancies are frequently associated with recurring chro- AML and with malignant progression in MDS (17), and MLF1 mosomal abnormalities (2). Along with their clinical prognostic fi ectopic expression affects the myeloerythroid lineage switch and value, these rearrangements have led to the identi cation of cell cycle progression in cell cultures (18–20). Nonetheless, many genes involved in the etiology of cancer; thus, characteriz- MLF1 function in hematopoiesis remains poorly defined. Only ing the function of these genes in normal and pathological blood one MLF gene is present in Drosophila, whereas there are two cell development is of particular interest. MLF paralogs in vertebrates (21). As in mammals, MLF encodes One notorious gene identified by cloning translocation for a nucleocytoplasmic shuttling protein with no recognizable breakpoints is RUNX1/AML1, which is affected by the t(8;21) (q22;q22) translocation found in ∼15% of all cases of acute myeloid leukemia (AML) (3). RUNX1 belongs to the RUNX Author contributions: S.B., S.M.-L., V.G., B.A., and O.B. performed research; M.H., A.P., transcription factor family, which is characterized by the pres- and L.W. designed research; M.S. and M.Y. contributed new reagents/analytic tools; A.P. ence of a highly conserved DNA binding domain (4). RUNX and L.W. analyzed data; and L.W. wrote the paper. proteins activate or repress transcription in a context-dependent The authors declare no conflict of interest. manner, thereby regulating cell proliferation and differentiation This article is a PNAS Direct Submission. RUNX in a variety of metazoans. In particular, genes have been 1To whom correspondence may be addressed. E-mail: [email protected] or shown to regulate hematopoiesis in both vertebrates and Dro- [email protected]. sophila RUNX1 fi . For instance, plays a prominent role in de nitive This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10. hematopoietic stem cell emergence, as well as in megakaryocyte 1073/pnas.1117317109/-/DCSupplemental. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1117317109 PNAS Early Edition | 1of6 structural domain apart from a 14-3-3 binding motif (22). However, its in vivo function remains unclear, given that mlf mutant flies are subviable and do not exhibit any obvious de- velopmental defect (23). Given the conservation between MLF proteins and the paral- lels between mammalian and fly blood cell development, we assessed whether MLF controls hematopoiesis in Drosophila.In particular, we found that mlf expression is activated in the crystal cells by SRP/LZ, and that mlf regulates the expansion of this lineage. At the molecular level, our data indicate that MLF controls the number of crystal cells by protecting LZ from pro- teasome-mediated degradation. Interestingly, human MLF1 is able to substitute for mlf function in the crystal cell lineage. Furthermore, mlf is required for the activity and stable expression of the human leukemogenic protein RUNX1-ETO in Drosophila, whereas human MLF1 depletion causes a decrease in RUNX1- ETO protein and impairs RUNX1-ETO–dependent proliferation in human leukemic blood cells. Thus, we propose that the control of RUNX levels is a conserved function of MLF proteins that play an important role in the control of blood cell homeostasis. Results mlf Is Expressed in the Crystal Cell Lineage in Response to SRP/LZ. We first explored mlf expression in the Drosophila hematopoietic sys- tem. As in vertebrates, in Drosophila hematopoiesis occurs in dif- Fig. 1. mlf expression is activated by SRP/LZ in the crystal cell lineage. (A–C) ferent waves (1). In the embryo, prohemocytes emerge from the mlf is expressed in crystal cells. A and B, in situ hybridization; C, coimmu- head mesoderm and differentiate into plasmatocytes and crystal nostaining with GFP (expressed under the control of lz-Gal4). Embryonic cells. In the larva, blood cell progenitors, plasmatocytes, and crystal stages are indicated. (D) Schematic representation of mlf regulatory cells are present in the body cavity and in a specialized organ, the sequences. The two alternative promoters and first exons are shown. Con- lymph gland, that will release its content at pupariation. Previous served GATA (WGATAR) and RUNX (TGYGGTY) consensus binding sites are work suggested that mlf is expressed in embryonic crystal cells (23). indicated by blue and red triangles, respectively. The genomic region used to In line with these results, in situ hybridization and immunostaining generate the transgenic lines is boxed. (E–G) lacZ expression driven by mlf showed that mlf is expressed from stage 11 in a bilateral cluster of enhancer is detected in crystal cells. E and F, in situ hybridization; G, coim- munostaining with GFP (expressed under the control of lz-Gal4). Embryonic cells that correspond to the crystal cells, as demonstrated by cos- – lz A–C stages are indicated. (H K) Twist-driven coexpression of SRP and LZ activates taining with -driven expression of GFP (LZ-GFP) (Fig. 1 ). mlf-lacZ expression throughout the mesoderm. lacZ in situ hybridization on Moreover, high levels of nuclear MLF were detected in larval stage 11 embryos of the indicated genotypes. crystal cells both in the lymph gland and in circulation (Fig. S1). In addition, low levels of MLF were consistently detected throughout the lymph gland (Fig. S1). Thus, mlf may control crystal cell de- tions were seen using transheterozygous null mutations in mlf Δ5–3/ΔC1 velopment and larval lymph gland homeostasis. (mlf ). Furthermore, counting LZ-expressing cells from Our analysis of mlf cis-regulatory regions revealed that its first embryonic stages 11–16 showed that their number was initially WT intron contains closely linked GATA and RUNX consensus but decreased progressively in the absence of mlf (Fig. 2E). There- binding sites that are conserved in other Drosophila species (Fig. fore, MLF is necessary for crystal cell maintenance in the embryo, 1D), a hallmark of SRP/LZ direct target genes (9). To test and it acts cell-autonomously after the onset of lz expression. whether this cis element is sufficient to recapitulate mlf expres- We also assessed the function of mlf in the larval lymph gland. sion in crystal cells, we generated transgenic lines expressing lacZ In third instar larvae, the lymph gland consists of a pair of primary mlf lacZ under its control. Interestingly, - expression was detected lobes with prohemocytes in their medullary zone and differenti- E–G in embryonic (Fig. 1 ) and larval crystal cells (Fig. S1). In ated cells in their cortical zone, and several smaller secondary lacZ mlf addition, and transcription was activated throughout the lobes containing only prohemocytes (1). In mlf mutant larvae, the mesoderm in response to the ectopic expression of both SRP and lymph glands were hypertrophied and displayed aberrant pre- LZ, but not in response to SRP or LZ alone (Fig. 1 H–K and Fig. cis cocious differentiation (Fig. S4); the expression of the prohe- S2). These results suggest that this regulatory module is a mocyte marker tepIV was strongly reduced, whereas both crystal target of the SRP/LZ complex, and that SRP/LZ activates mlf cells and plasmatocytes were present in the secondary lobes. expression in the crystal cell lineage. Thus, mlf is required to maintain lymph gland homeostasis, and mlf Controls Crystal Cell Development. We then asked whether mlf it prevents premature blood cell differentiation in this organ. controls hematopoiesis. In situ hybridizations against the plasma- Remarkably, by monitoring circulating larval blood cells, we peroxidasin pxn observed that mlf loss induced an increase in the number of LZ- tocyte differentiation marker ( ) and the crystal cell + differentiation marker PO45 were used to monitor hemocyte dif- GFP cells, whereas the total hemocyte population was not fi F ferentiation in embryos carrying a homozygous null mutation in mlf signi cantly changed (Fig. 2 ). Consequently, the proportion of Δ5–3/Δ5–3 + (mlf ) (23). Consistent with the mlf expression pattern, mlf circulating LZ-GFP cells rose from 4.8% in WT to 10.3% in mlf + loss did not impair plasmatocyte differentiation (Fig. S3). In con- larvae. As in the embryo, LZ-GFP cell count was restored to trast, mlf loss affected crystal cell development (Fig. 2). PO45 levels WT when mlf was specifically reexpressed in this lineage (Fig. + were lower in mlf embryos compared with WT or heterozygous 2F). However, the proportion of LZ-GFP cells expressing PO45 siblings (Fig. 2 A–C), and the number of PO45-expressing cells was was similar in WT and mlf mutant larvae (Fig. 2G), suggesting reduced (Fig. 2D). Importantly, reexpressing mlf solely in the crystal that mlf loss does not prevent LZ-GFP+ cell differentiation in cells using the lz-Gal4 driver restored normal crystal cell numbers crystal cells. Consistent with these results, heat treatment, which Δ5–3 in mlf homozygous embryos (Fig. 2D), and similar observa- activates the melanization cascade in mature crystal cells, re-
2of6 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1117317109 Bras et al. Fig. 2. mlf controls embryonic and lar- val crystal cell homeostasis. (A–C) De- creased expression of the crystal cell differentiation marker PO45 is observed in the absence of mlf. Dorsal (Upper) and lateral (Lower) views showing PO45 expression in stage 15 embryos of the indicated genotypes. (D) Stage 15 mlf embryos have fewer PO45-expressing cells. Expression of mlf or its human ho- molog MLF1 under the control of lz-Gal4 in mlf mutant backgrounds restores WT crystal cell number. (E) Immunostaining against LZ reveals a progressively de- creasing number of LZ-expressing hemo- cytes in mlf embryos. (F and G) lz-Gal4, UAS-GFP third instar wandering larvae of the indicated genotypes were bled to determine the relative number of circu- lating hemocytes or LZ-GFP+ cells (F), as well as the proportion of differentiated − (PO45+) and progenitor (PO45 ) LZ-GFP+ cells (G). (F)Lossofmlf induces an in- crease in the number of circulating larval LZ-GFP+ cells that is suppressed by ex- pression of mlf or human MLF1 in this lineage. (G) mlf does not affect the ratio of progenitor to differentiated LZ-GFP+ cells. (H and I) Posterior segments of third instar larvae showing that mlf loss induces an increase in the number of crystal cells, as demonstrated by their blackening after heat treatment. ***P < 0.0001 compared with WT, Student t test. GENETICS vealed the presence of more crystal cells in mlf mutants than in transcription is pivotal for crystal cell differentiation. In- WT controls (Fig. 2 H and I). Thus, although mlf loss results in terestingly, in a genome-wide RNAi screen, we recently identi- fewer crystal cells in the embryo, it promotes crystal cell ex- fied mlf as a potential regulator of SRP/LZ in the Drosophila Kc pansion in the larvae. Of note, MLF overexpression did not seem blood cell line (24). We thus used this system to decipher MLF’s to affect crystal cell number or differentiation in either the em- mechanism of action. As reported previously (24), transfection of bryo or the larva (Fig. 2 D, F, and G), suggesting that MLF is not an expression plasmid for LZ (pAc-LZ) activated a reporter a limiting factor. gene under the control of the PO45 crystal cell-specific enhancer We then asked whether human MLF1 could replace mlf func- (4xPO45-Fluc), and knockdown endogenous srp expression by tion in the crystal cell lineage. Accordingly, we expressed MLF1 dsRNA impaired this transactivation, indicating that 4xPO45- under the control of the lz-Gal4 driver, and determined the Fluc activity reflects SRP/LZ-induced transcription (Fig. 3A). number of crystal cells present in the embryo or in circulation in Using three different dsRNAs targeting mlf, we showed that mlf the larvae. Although MLF1 expression did not alter the number of depletion strongly reduced 4xPO45-Fluc activation by SRP/LZ. crystal cells in a WT background, it did rescue mlf-associated he- Conversely, cotrans- matopoietic defects (Fig. 2 D and F). This suggests that although fection of increasing amounts of pAc-MLF with pAc-LZ resulted MLF1 exhibits only 23% of identity with MLF (21), the function of in a dose–response enhancement of the reporter gene activity MLF proteins has been conserved from Drosophila to human. (Fig. 3B). To extend these observations, we asked whether mlf also controls the induction of SRP/LZ target genes within their mlf Promotes SRP/LZ-Induced Transactivation by Interfering with LZ genomic context. Real-time quantitative PCR (qPCR) experi- Degradation. As mentioned above, SRP/LZ-induced gene ments demonstrated that the transactivation of PO45 and Bc/
Fig. 3. MLF is required for LZ transactivation and stability in Kc cells. (A and B) Luciferase reporter assays. (A) dsRNA against mlf impairs LZ-induced transactivation of the p45PO45-Fluc plasmid. Three different dsRNA probes targeting mlf were tested. (B) Increasing amounts of pAc-MLF expression plasmid enhance pAc-LZ–induced transactivation of p45PO45-Fluc. (C and D) Real-time qPCR assays. (C) dsRNAs against mlf inhibit LZ-induced activation of PO45 and PO54 transcription. (D) Increasing levels of pAc-MLF expression plasmid promote pAc-LZ–induced PO45 and PO54 expression. (E) Western blot analysis showing that LZ levels decrease on depletion of MLF by dsRNA (Left) and increase on cotransfection of pAc-MLF with pAc-LZ (Right). Endogenous tubulin (TUB) and pAc-expressed Renilla luciferase (RLUC) were used as loading and transfection controls. (F) Inhibition of the proteasome by MG132 increases LZ levels in MLF-depleted Kc cells. The relative levels of LZ (normalized to RLUC) are shown in the lower part of the panel.
Bras et al. PNAS Early Edition | 3of6 PO54 (another crystal cell-specific differentiation marker) ob- increasing LZ expression might rescue the crystal cell defects served on LZ expression was also impaired in the presence of caused by mlf loss. Consequently, we generated mlf mutants dsRNA against mlf and was enhanced when mlf expression carrying the lz-Gal4 driver together with a UAS-GFP transgene plasmid was cotransfected (Fig. 3 C and D). Therefore, MLF and a UAS-lz transgene. In these conditions, we observed strong behaves as a coactivator for SRP/LZ. LZ expression in the crystal cells of mlf mutant larvae (Fig. 4C Strikingly, Western blot analysis revealed that mlf dsRNA not and Fig. S6A). Furthermore, the expression of the UAS-lz only efficiently knocked down MLF expression, but also strongly transgene suppressed not only the drop in crystal cell number in decreased pAc-driven expression of LZ (Fig. 3E). In contrast, mlf embryos, but also the rise in crystal cell number in mlf larvae pAc-driven expression of Renilla luciferase was not affected. (Fig. 4 E and F). Therefore, these two apparently opposed phe- Conversely, overexpression of MLF increased LZ levels. Thus, it notypes likely stem from a common cause—a decrease in LZ levels. appears that MLF regulates LZ expression posttranscriptionally. Furthermore, treatment with the proteasome inhibitor MG132 Human Leukemic Fusion Protein RUNX1-ETO Is Regulated by MLF Proteins. We recently showed that expression of the human resulted in increased LZ levels and partially restored LZ accu- + mulation in MLF-depleted cells (Fig. 3F). These data raise the RUNX oncogenic fusion protein RUNX1-ETO in the LZ fl possibility that MLF promotes SRP/LZ-induced transactivation blood cell lineage induces a preleukemic switch in ies (14). by protecting LZ from degradation by the proteasome. Indeed, it inhibits crystal cell differentiation and promotes LZ- GFP+ progenitor amplification in the larvae (14) (Fig. 5 A and mlf Controls Crystal Cell Development by Impinging on LZ Levels in B). In light of the foregoing results and of the link between MLF mlf Vivo. The foregoing results suggested that MLF might regulate and leukemia in humans, we wondered whether interacted crystal cell development by controlling LZ levels. This hypothesis genetically with RUNX1-ETO in our model. Strikingly, we found is consistent with the drop in LZ+ cell number in mlf embryos that RUNX1-ETO leukemogenic activity was almost abolished mlf + but seems at odds with its increase in mlf larvae. However, in line in mutant larvae; the number of circulating LZ-GFP cells fi with our observation in Kc cells, immunofluorescent labeling was signi cantly decreased, and their differentiation was restored A B mlf revealed significantly reduced LZ expression in LZ-GFP+ cir- (Fig. 5 and ). Furthermore, in the absence of , RUNX1- culating cells of mlf mutant larvae compared with control larvae ETO expression was barely detected, whereas robust staining (Fig. 4 A and B). Of note, GFP expression, which is driven under the control of lz, did not seem markedly affected by the loss of mlf, indicating that mlf is not required for lz transcription but is critical for LZ protein accumulation. Moreover, in the eye disk, where mlf is ubiquitously expressed but not up-regulated in the LZ+ cells, mlf loss also decreased LZ levels, but only modestly (Fig. S5), suggesting that LZ stability is differentially regulated in the hematopoietic and visual systems. Importantly, expressing human MLF1 in a mlf mutant background not only rescued crystal cell number (Fig. 2 D and F), but also restored LZ ex- pression (Fig. 4D and Fig. S6A), providing further evidence that MLF proteins regulate LZ levels. We thus reasoned that
Fig. 5. MLF is required for RUNX1-ETO activity. (A and B) The phenotypes induced on expression of RUNX1-ETO in the LZ+ blood cell lineage are sup- pressed in the absence of mlf.(A) Absolute number of circulating LZ-GFP+ − cells in third instar larvae. (B) Ratio of circulating progenitors (GFP+, PO45 ) to differentiated (GFP+, PO45+)LZ+ cells in third instar larvae. (C–E) MLF is required for RUNX1-ETO expression in Drosophila.(C and D) Fluorescent Fig. 4. Decreased LZ levels are responsible for MLF-associated crystal cell immunostaining against RUNX1-ETO in lz-Gal4,UAS-GFP;UAS-RUNX1-ETO Δ – Δ – Δ – Δ – phenotypes. (A–D) MLF stabilizes LZ in vivo. Fluorescent immunostaining (C,control)andlz-Gal4,UAS-GFP;mlf 5 3/ 5 3;UAS-RUNX1-ETO (D, mlf 5 3/ 5 3) against LZ in circulating larval blood cells from lz-Gal4, UAS-GFP third instar circulating larval blood cells. Nuclei were stained with DAPI. (E) Western blot larva of the indicated genotype is shown. Nuclei were stained with DAPI. The analysis shows that RUNX1-ETO levels decrease after depletion of MLF by lower panels show LZ immunostaining only. (E and F) Reexpression of LZ dsRNA in Kc cells. (F and G) In Kasumi-1 cells, MLF1 depletion by siRNA does under the control of the lz-Gal4 restores WT LZ-GFP+ cell number in the not affect RUNX1-ETO mRNA levels (F; real-time qPCR), but does reduce embryo (E) and in third instar larvae circulation (F). GFP expression was used RUNX1-ETO protein levels (G; Western blot analysis). The asterisk indicates to score the number of LZ-GFP+ cells in stage 14–15 embryos (E) or in third a nonspecific band that provides a loading control. (H) Knockdown of MLF1 instar wandering larvae (F) of the indicated genotypes. expression inhibits Kasumi-1 cell growth.
4of6 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1117317109 Bras et al. was observed in control larvae (Fig. 5 C and D and Fig. S6B). from the Notch pathway, which regulates larval crystal cell Thus, we propose that the suppression of RUNX1-ETO–induced numbers (32, 33). In mammals, RUNX1 acts mostly as a brake blood cell phenotypes observed in the absence of mlf reflects the on blood cell progenitor proliferation, and decreased RUNX1 role of MLF in RUNX1-ETO stabilization. In line with this dosage, as well as MDS/AML-associated mutations or trans- hypothesis, Western blot analysis showed that the expression of locations affecting RUNX1, tend to promote aberrant self-renewal RUNX1-ETO transfected in Kc cells was strongly down-regu- (34). Interestingly, RUNX1-ETO also promotes hematopoietic lated on dsRNA-mediated depletion of MLF (Fig. 5E). progenitor cell expansion in Drosophila (14, 35), and both WT1 Finally, we asked whether MLF1 also regulates RUNX1-ETO overexpression and activation of the Notch signaling pathway expression in human. Kasumi-1 cells derived from a patient with have been linked to RUNX1-ETO–induced AML (36, 37). Given AML carrying the t(8;21) translocation were found to constitu- these similarities, characterizing the function of LZ in the control tively express RUNX1-ETO, which is required for their pro- of crystal cell number may have broader implications. liferation (25). On transfection of an siRNA against MLF1,we Notwithstanding the evolutionary distance between human found a significant reduction of MLF1 transcript levels, but no and fly, the human MLF1 protein rescued mlf-associated crystal effect on RUNX1-ETO mRNA expression (Fig. 5F). However, cell defects, including LZ down-regulation, whereas mlf and consistent with our observations in Drosophila, Western blot MLF1 were required for the stable expression of RUNX1-ETO analysis showed strongly decreased RUNX1-ETO protein levels in Drosophila and human leukemia cells, respectively. Thus, the (Fig. 5G), paralleled by reduced cell growth (Fig. 5H). Taken regulation of RUNX turnover seems to be a conserved function together, our results reveal a conserved functional relationship of MLF family members. The proteasome was found to regulate between MLF family members and the leukemogenic fusion RUNX1-ETO as well as other RUNX proteins in human cells protein RUNX1-ETO. (38, 39), and our data indicate that LZ is degraded in a protea- some-dependent manner in the absence of mlf. An important Discussion area of future inquiry will be to determine more precisely how Although deregulation of MLF1 has been linked to AML, the RUNX stability is regulated by MLF. This is of particular in- physiological role of MLF family members in hematopoiesis terest given that altered RUNX levels are associated with several remains largely unknown. Focusing our analysis on Drosophila diseases in humans, including familial platelet disorders and hematopoietic development, we have demonstrated that MLF AML for RUNX1 and cleidocranial displasia for RUNX2 (40). controls blood cell homeostasis. In particular, we provide strong Actually, the slightly reduced LZ levels that we observed in mlf GENETICS evidence that MLF is required to stabilize the RUNX factor LZ mutant eye discs suggests that the regulation of RUNX stability during crystal cell development. In addition, our findings suggest by MLF is not restricted to the hematopoietic system. Moreover, that the regulation of RUNX activity by MLF is conserved in few genes required for RUNX1-ETO–induced AML have been humans, where it could play an important role in leukemogenesis. identified so far, and our data suggest that MLF1 is a critical Our findings reveal MLF’s regulatory function in the control component for RUNX1-ETO leukemogenic activity. Indeed, of crystal cell production. Actually mlf, which exhibits a rather along with the MDS/AML-associated t(3;5) translocation that ubiquitous expression pattern, is highly expressed in these blood generates the NPM-MLF1 fusion protein, MLF1 overexpression cells, and mlf expression in this lineage is activated by SRP/LZ. was correlated with malignant progression (17). The mechanisms We found that MLF controls crystal cell number in a cell-au- underlying the oncogenic activity of NPM-MLF1 or MLF1 re- tonomous manner, chiefly by impinging on LZ levels. We pro- main largely unknown, however. Similarly, the function of MLF1 pose that the induction of mlf expression by SRP/LZ contributes in mammals remains poorly characterized. Exploring the re- to crystal cell development by stabilizing LZ. As such, this gene lationship between MLF and RUNX factors could shed further regulatory network forms a two-component positive feedback light on MLF’s role and mode of action. loop that drives development forward by stabilizing the expres- Blood cell development is controlled by an intricate network of fi fi sion of lineage-speci c regulators (26). Our ndings also show genes, the activity of which must be tightly controlled to ensure that MLF controls lymph gland homeostasis, where it seems to proper cell lineage choice, proliferation, and differentiation. Our promote hematopoietic progenitor maintenance. Although some present findings show that the dynamic and coordinated control of the factors controlling lymph gland development have been of gene expression through positive feedback loops participates in fi identi ed, no RUNX factor has been implicated in prohemocyte the fine-tuning of hematopoiesis, and provides a framework for maintenance (1), suggesting that MLF has other partners in future investigations of the cross-regulatory interactions that these cells. Of interest, MLF has been shown to bind Su(fu) and control blood cell fate. Finally, our results open up new avenues to possibly antagonize its function (27). Because Su(fu) nega- of research into the mode of action of MLF family members as tively regulates both Hh and Wnt pathways (28, 29), which are conserved regulators of RUNX protein stability, and we envision required for prohemocyte maintenance (30), their premature that Drosophila will provide a powerful model for deciphering mlf differentiation in mutants could result from increased Su(fu) MLF’s function in hematopoiesis and leukemia. activity. We anticipate that deciphering MLF’s mode of action in the lymph gland will provide valuable insight into the regulation Materials and Methods Δ – of blood cell progenitor fate. Fly Strains. We used the following Drosophila melanogaster strains: mlf 5 3, Δ Along with revealing the role of MLF in hematopoiesis, our mlf C1 (23), UAS-mlfA (23), UAS-RUNX1-ETO (14), UAS-lz (P. Gergen, Stony findings shed light on the function and regulation of LZ. We Brook University, NY), lz-Gal4, UAS-GFP,andUAS-MLF1 (Bloomington Stock found that decreased LZ levels in mlf mutant larvae resulted in Center). To generate mlf-lacZ transgenic reporter lines, the mlf first intron an increased number of circulating LZ+ cells, but did not block was PCR-amplified from D. melanogaster genomic DNA and cloned into these cells’ differentiation, suggesting that low levels of LZ are a pCasper-hsp43-lacZ vector. The resulting vector was used to produce 1118 fl sufficient to induce crystal cell differentiation. In addition, ex- transgenic lines by P element-mediated transformation into w ies. pansion of the pool of LZ+ cells might reflect a slowdown in the cells’ rate of differentiation or a direct function of LZ in con- In Situ Hybridization, Immunostaining, and Hemocyte Counts. Immunostaining and in situ hybridization were performed as described previously (9). For in trolling blood cell proliferation or apoptosis. Along this line, LZ situ hybridization, we used digoxigenin-UTP–labeled RNA probes and sheep was shown to promote cell death in the eye, notably by regulating anti-digoxigenin coupled to alkaline phosphatase (Roche). For immunos- the expression of the Drosophila homolog of the Wilms’ tumor taining, we used mouse anti-LZ (Developmental Studies Hybridoma Bank), gene 1 (WT1) (31). Alternatively, decreased LZ levels may make rabbit anti-MLF (27), rabbit anti–β-galactosidase (Cappel), mouse or rabbit crystal cell progenitors more susceptible to proliferative cues anti-GFP (Torrey), mouse anti-P1/NimC1 (a kind gift from I. Ando, Biological
Bras et al. PNAS Early Edition | 5of6 Research Center, Szeged, Hungary), rabbit anti-AML1 (Calbiochem), and by real-time qPCR (24). For proteasome inhibition, Kc cells were incubated for 8 h secondary antibodies coupled to Alexa Fluor 488 or 555 (Molecular Probes). with MG132 (or DMSO) before being processed for analysis. Kasumi-1 cells were + Circulating larval hemocyte counts and LZ cell differentiation status were grown in RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) supplemented with 2 mM L-glu- assessed as described previously (14). In brief, GFP expression from lz-Gal4 tamine and 10% FBS. siRNAs against MLF1 (5′-GGUGCUGGGUAAUAAGCAU-3′) and UAS-GFP was used to determine LZ+ cell number, and DAPI staining was or GFP (5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3′) were transfected on day 0 and used to count the whole hemocyte population on individually bled third every 48 h thereafter by electroporation, as described previously (25). RNA and + instar female larvae. To monitor LZ cell differentiation status, female third proteins were extracted on days 3 and 5. For real-time qPCR, MLF1 and RUNX1- instar larvae were bled on polylysine-coated slides, and the proportion of LZ- ETO mRNA levels were normalized to GAPDH expression. Kasumi-1 cell numbers + GFP cells expressing PO45 was assessed after in situ hybridization coupled were counted every 3 d using the trypan blue exclusion assay. The following to immunostaining. Counts were performed on a minimum of 12 samples for primary antibodies were used for Western blot analyses: mouse anti-V5 (Invi- each genotype. trogen), rabbit anti-MLF (27), mouse anti-ETO (Calbiochem), mouse anti-tubulin (Sigma-Aldrich), and rabbit anti-Renilla luciferase (MBL International). All Cell Culture, Transfection, Luciferase and Western Blot Assays, and qPCR. For experiments were reproduced at least three times. Means and SDs were calcu- transfection, dsRNA treatment, luciferaseassays, Western blot analyses, and real- lated from independent triplicates. time qPCR, Drosophila Kc cells were treated essentially as described previously ’ (24). In brief, Kc cells were grown at 25 °C in Schneider s medium supplemented ACKNOWLEDGMENTS. We thank members of our teams for fruitful discus- μ with 10% (vol/vol) FBS and 50 g of penicillin/streptomycin. For dsRNA treat- sions and Y. Nakao and W. Sugano for their participation. We thank staff at ment and transfections, cells were plated on in vitro-transcribed and purified the Toulouse (RIO) and Institut Jacques Monod (ImagoSeine) imaging plat- dsRNA at 24 h before transfection with Effectene (Qiagen). We used the fol- forms for assistance with confocal microscopy. S.B. was supported by fellow- lowing plasmids: pAc-MLFA (23), pAc-V5 (Invitrogen), pAc-LZ-V5, and p4xPO45- ships from the Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche and Firefly luciferase (24). pAc-RUNX1-ETO was generated by subcloning RUNX1- the Fondation pour la Recherche Médicale. S.M.-L. received fellowships from ’ ETO ORF from pUAST-RUNX1-ETO (14) into pAc-V5. pAc-Renilla luciferase was the Ministère de l Enseignement Supérieur et de la Recherche and the Ligue Contre le Cancer. V.G. was supported by a postdoctoral fellowship from the used for transfection normalization. Three independent dsRNA targeting dif- Association pour la Recherche sur le Cancer. O.B. was supported by the ferent regions of mlf were produced. The sequences of the T7-containing pri- Association for International Cancer Research. A.P. was supported by a grant fl mers used to generate the dsRNA are available on request. Fire yandRenilla from the Association pour la Recherche sur le Cancer. L.W. was supported by luciferase activity was measured using the Promega Dual Luciferase Reporter grants from the Association for International Cancer Research, Association Assay System. PO45, Bc/PO54,andRP49 mRNA expression levels were measured pour la Recherche sur le Cancer, and Ligue Midi-Pyrénée Contre le Cancer.
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6of6 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1117317109 Bras et al. Supporting Information
Bras et al. 10.1073/pnas.1117317109
Fig. S1. mlf is expressed in larval crystal cells. Immunostaining against MLF (A and B)orβ-galactosidase (mlf-lacZ)(C and D) on third instar larval lymph glands (A and C) or circulating blood cells (B and D). Crystal cells are labeled by GFP (lz-Gal4, UAS-GFP). (Insets, A and C) Higher-magnification views of LZ-GFP+ cells.
Fig. S2. mlf expression is activated by SRP/LZ in Drosophila. Lateral views of stage 11 embryos showing mlf expression as revealed by in situ hybridization. (A–D) Expression of the indicated UAS transgenes was driven in the mesoderm under the control of twi-Gal4. twi-Gal4–driven ectopic coexpression of SRP and LZ induces mlf transcription throughout the mesoderm.
Fig. S3. mlf mutation does not impair embryonic plasmatocyte development. In situ hybridization against pxn was used to monitor plasmatocyte differ- entiation in WT (A) and mlf mutant (B) stage 16 embryos. (Upper) Lateral views. (Lower) Dorsal views.
Bras et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1117317109 1of3 − − Fig. S4. mlf is required to maintain lymph gland homeostasis. Lymph glands from WT (Left)ormlf / (Right) third instar larvae are shown. In the absence of mlf, the lymph gland is hypertrophied, and both crystal cell differentiation and plasmatocyte differentiation are increased, notably in the secondary lobes (which normally contain only prohemocytes), whereas the prohemocyte population is decreased in the primary lobes. (A and B) In situ hybridization against PO45 was used to monitor crystal cell differentiation. (C and D) Immunostaining against Nimrod/P1 was used to assess plasmatocyte differentiation. (E and F)In situ hybridization against tepIV was used to label the prohemocytes.
Δ – Δ – Fig. S5. MLF weakly stabilizes LZ expression in the eye. Immunostaining against MLF (red) and LZ (green) in third instar larvae eye disk carrying mlf 5 3/ 5 3 clones. High-magnification views of the boxed areas are shown in the lower panels. Dotted lines represent the boundaries of the clones. Mutant clones were induced 48 h after egg-laying by a 1-h heat shock at 37 °C in yw, hs-flp; FRT42D mlfΔ5–3/FRT42D arm-lacZ M(2)58F larvae.
Bras et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1117317109 2of3 Fig. S6. MLF stabilizes LZ and RUNX1-ETO protein levels in vivo. (A) Fluorescent immunostaining against LZ was used to monitor LZ expression levels in circulating larval blood cells from lz-Gal4, UAS-GFP third instar larvae of the indicated genotype. (B) Fluorescent immunostaining against RUNX1-ETO was used Δ – Δ – to assess RUNX1-ETO expression levels in circulating larval blood cells from lz-Gal4, UAS-GFP;UAS-RUNX1-ETO (control) or lz-Gal4, UAS-GFP;ml 5 3/mlf 5 3;UAS- Δ – Δ – RUNX1-ETO (ml 5 3/mlf 5 3) third instar larvae. Fluorescent intensities were measured using ImageJ software on a minimum of 15 LZ-GFP+ cells of each ge- notype. ***P < 0.0001, Student t test.
Bras et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1117317109 3of3 RESULTATS
La caractérisation du rôle du facteur MLF au cours de l’hématopoïèse chez la Drosophile nous a permis de montrer que dMLF était une cible du complexe SRP/LZ requise pour le maintien de l’homéostasie des hémocytes et en particulier pour le développement des cellules à cristaux. De plus, nos résultats montrent que MLF est requis pour l’activité de ce complexe car il empêche la dégradation de LZ ce qui est essentiel pour contrôler le nombre de cellules à cristaux. Ainsi, l’induction de l’expression de dMLF par le SRP/LZ contribue au développement des cellules à cristaux par une boucle de rétrocontrôle positif sur l’activité de LZ. Cette fonction de dMLF évoque celle de mMlf1/Hls7 dont l’expression augmente durant la différenciation myéloïde et promeut ce destin cellulaire (Williams et al., 1999). Cependant, le mécanisme d’action de MLF1 dans les cellules myéloïdes reste à établir.
Nos résultats montrent que la diminution de l’expression de LZ semble être à l’origine des phénotypes induits par la perte de MLF dans les cellules à cristaux. Par contre, le mode d’action de MLF sur la stabilité de LZ reste encore inconnu. Chez l’homme, hMLF1 est connu pour interagir avec CSN3 ce qui régule la stabilité de p53 et la progression dans le cycle cellulaire (Yoneda-Kato et al., 2005). Ainsi, il est envisageable qu'en l’absence de dMLF, CSN3 puisse déstabiliser LZ et induire la prolifération des cellules LZ+ ce qui pourrait expliquer les phénotypes larvaires observés dans un contexte mutant mlf. De fait, pour mieux comprendre le mécanisme d’action de MLF au sein des cellules LZ+, il serait intéressant de tester si MLF cible CSN3 afin de réguler la prolifération des progéniteurs hématopoïétiques chez la Drosophile. Cependant, j’ai aussi montré dans l’étude de RUNX1- ETO, que l’inhibition de l’expression de CSN3 dans les cellules LZ+ augmente leur nombre au stade larvaire. Il est donc possible que le niveau d’expression de CSN3 soit important pour réguler le taux de prolifération des cellules LZ+. Les relations croisées qui pourraient exister entre le niveau d’expression et d’activité de MLF, CSN3 et LZ dans le contrôle de la prolifération restent à élucider.
La diminution du nombre de cellules à cristaux dans les embryons mutants pour mlf
RESULTATS peut s’expliquer par le fait que la baisse du niveau de LZ va rompre la boucle d’autorégulation de l’expression de lz qui est nécessaire pour le maintien de ces cellules au stade embryonnaires (Bataillé et al., 2005 ; Ferjoux et al., 2007). Le devenir des cellules qui n’expriment plus LZ reste néanmoins à éclaircir et il serait intéressant de savoir si elles meurent par apoptose, si elles se différencient en plasmatocytes (comme c’est le cas dans une situation sauvage pour une partie des cellules qui initient l’expression de lz mais n’arrivent pas à la maintenir), ou si elles persistent dans un état intermédiaire. L’augmentation du nombre de cellules LZ+ dans les larves mutantes pour mlf suggère que LZ exerce normalement un rôle de frein sur leur prolifération. Alors que l’on sait peu de choses sur la prolifération des cellules à cristaux embryonnaires, il a été montré que le nombre de cellules à cristaux larvaire est contrôlé par la voie Notch (Lebestky et al., 2003 ; Duvic et al., 2002 ; Mukherjee et al., 2011). Des expériences futures permettront peut-être de savoir si le niveau d’expression de lz influence la capacité des cellules à répondre à cette voie de signalisation.
D’autre part, nous avons mis en évidence une interaction génétique entre dMLF et RUNX1-ETO chez la Drosophile. En effet, les phénotypes induits par RUNX1-ETO (prolifération des cellules LZ+ et blocage de leur différenciation) ne sont pas retrouvés en l’absence de dMLF. De plus, dans un contexte mutant mlf, RUNX1-ETO est très faiblement détectée dans les cellules LZ+ en circulation chez la larve. Ces résultats suggèrent que MLF régule l’activité de RUNX1-ETO en stabilisant son expression. Nos résultats montrent que MLF inhibe la dégradation de LZ par le protéasome et il est envisageable qu’il puisse agir de la même façon sur RUNX1-ETO. De plus, nous avons pu montrer que MLF était requis pour la prolifération des cellules Kasumi-1. De fait, MLF est probablement un composant crucial pour l’activité de RUNX1-ETO et il serait très intéressant de rechercher si et comment cette relation fonctionnelle entre MLF et facteurs RUNX se met en place dans l’hématopoïèse et les leucémies chez l’Homme.
Deux autres protéines que j’ai identifiées comme suppresseur de la létalité induite par RUNX1-ETO chez la Drosophile au cours de mon crible RNAi in vivo, sont connues pour
RESULTATS interagir avec MLF1 et dMLF : CSN3 et 14-3-3. Ainsi, il est tentant de proposer que ces trois protéines agissent ensemble pour favoriser l’activité de RUNX1-ETO durant le développement de leucémie chez l’Homme. Alternativement, il est tout à fait possible que RUNX1-ETO recrute MLF pour agir à trois niveaux : premièrement, MLF serait requis pour stabiliser RUNX1-ETO ; deuxièmement, RUNX1-ETO empêcherait MLF d’exercer une régulation négative sur CSN3 et ainsi favoriserait la prolifération cellulaire ; troisièmement, RUNX1-ETO modifierait l’activité du complexe MLF1/14-3-3 pour inhiber la différenciation myéloïde (Lim et al., 2002 ; Winteringham et al., 2006).
Ainsi, MLF pourrait être au cœur de l’activité de RUNX1-ETO et requis pour induire le développement de LAM chez l’Homme. Il serait donc très instructif d’étudier l’implication de ces trois facteurs dans des cellules Kasumi-1, mais aussi au cours du développement normale des cellules sanguines chez l’Homme et des cellules à cristaux chez la Drosophile. Ceci nous permettrait de mieux comprendre les relations qui existent entre MLF et la stabilité des facteurs RUNX dans le développement normal et pathologique de l’hématopoïèse.
CONCLUSION GENERALE
Durant ma thèse, je me suis attachée à mieux comprendre comment les facteurs RUNX contrôlent le développement normal ou pathologique (leucémie) des cellules sanguines en tirant profit de la conservation phylogénétique des processus régulant l’hématopoïèse chez l’Homme et la Drosophile.
Au cours du crible que j’ai réalisé chez la Drosophile, j’ai pu identifier 26 gènes candidats pouvant intervenir dans la régulation de l’activité de la protéine oncogénique RUNX1-ETO. Parmi ces gènes, nous avons tout particulièrement porté notre attention sur Pontin52. L’ensemble de nos résultats indique que Pontin52 pourrait avoir un rôle essentiel dans le développement de l’activité leucémogène de RUNX1-ETO. D’autre part, la caractérisation de MLF au cours de l’hématopoïèse chez la Drosophile nous a permis de montrer que ce facteur est requis pour le maintien de l’homéostasie des cellules à cristaux en stabilisant le facteur LZ mais également pour le développement d’un état préleucémique induit par RUNX1-ETO chez la Drosophile. Nos résultats suggèrent donc que le contrôle par MLF de la stabilité des facteurs RUNX joue un rôle important et conservé dans le développement normal des cellules sanguines de la Drosophile à l’Homme. Ainsi, la modulation de la stabilité des facteurs RUNX est impliqué à la fois au cours du déroulement normal de l’hématopoïèse mais également dans le développement de leucémies chez l’Homme.
Les résultats que j’ai pu obtenir au cours de ma thèse montrent que la Drosophile est un modèle puissant d’étude pour mieux comprendre comment une oncoprotéine humaine peut agir. En effet, la Drosophile présente de nombreux avantages. D’une part, le cycle de vie de ces insectes est très rapide et un grand nombre d’individus peut être obtenu à chaque génération. D’autre part, de nombreux outils sont disponibles chez la Drosophile, notamment des collections de lignées transgéniques dsRNA et shRNA permettant de cibler l’essentiel des 14 000 gènes codés par le génome de la Drosophile. Enfin, de nombreuses similitudes existent entre la Drosophile et l’Homme, et notamment au niveau de l’hématopoïèse.
La Drosophile pourrait alors être utilisée pour développer de nouveaux modèles visant à analyser le mécanisme d’action de protéines de fusion connues pour être associées au développement de leucémies chez l’Homme telle que NPM-MLF. En effet, très peu de données sont disponibles sur cette protéine de fusion et l’utilisation de ce type de modèle pourrait permettre d’élucider son mode d’action.
Néanmoins, ce modèle animal présente aussi des limitations. En effet, le système hématopoïétique et circulatoire est minimaliste et la durée de vie d’une mouche est limitée.
CONCLUSION GENERALE
De fait, l’analyse de la progression tumorale chez la Drosophile est difficile. De plus l’existence des cellules souches hématopoïétiques chez la Drosophile reste un sujet controversé. Enfin, le microenvironnement dans lequel se développent les cellules sanguines de la Drosophile reste très différent de celui qui permet le développement des lignages hématopoïétiques vertébrés. Cependant, la simplicité de ce modèle permet d’aborder in vivo des questions fondamentales sur le mode d’action des gènes qui contrôlent le devenir des cellules sanguines et dont la dérégulation est à l’origine de pathologies. Chaque modèle animal présente des limitations mais leur complémentarité nous permet de progresser plus rapidement. Ainsi l’utilisation de la Drosophile combinée avec d’autres modèles devrait nous permettre d’améliorer notre compréhension de la leucémogenèse et ainsi de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
ANNEXE
ARTICLE 2 : LE CRIBLE
A genome-wide RNA interference screen identifies a differential role of the mediator CDK8 module subunits for GATA/ RUNX-activated transcription in Drosophila.
Gobert V, Osman D, Bras S, Augé B, Boube M, Bourbon HM, Horn T, Boutros M, Haenlin M, Waltzer L.
Mol Cell Biol. 2010 Jun ; 30(11) : 2837-48. Epub 2010 Apr 5.
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, June 2010, p. 2837–2848 Vol. 30, No. 11 0270-7306/10/$12.00 doi:10.1128/MCB.01625-09 Copyright © 2010, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
A Genome-Wide RNA Interference Screen Identifies a Differential Role of the Mediator CDK8 Module Subunits for GATA/ RUNX-Activated Transcription in Drosophilaᰔ§ Vanessa Gobert,1 Dani Osman,1 Ste´phanie Bras,1 Benoit Auge´,1 Muriel Boube,1 Henri-Marc Bourbon,1 Thomas Horn,2 Michael Boutros,2 Marc Haenlin,1* and Lucas Waltzer1* Universite´de Toulouse, Centre de Biologie du De´veloppement, and CNRS, CBD UMR 5547, Baˆtiment 4R3, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse, France,1 and German Cancer Research Center and Division of Signaling and Functional Genomics, University of Heidelberg, Faculty of Medicine Mannheim, Department of Cell and Molecular Biology, Im Neuenheimer Feld 580, D-69120 Heidelberg, Germany2
Received 18 December 2009/Returned for modification 13 January 2010/Accepted 23 March 2010
Transcription factors of the RUNX and GATA families play key roles in the control of cell fate choice and differentiation, notably in the hematopoietic system. During Drosophila hematopoiesis, the RUNX factor Lozenge and the GATA factor Serpent cooperate to induce crystal cell differentiation. We used Serpent/ Lozenge-activated transcription as a paradigm to identify modulators of GATA/RUNX activity by a genome- wide RNA interference screen in cultured Drosophila blood cells. Among the 129 factors identified, several belong to the Mediator complex. Mediator is organized in three modules plus a regulatory “CDK8 module,” composed of Med12, Med13, CycC, and Cdk8, which has long been thought to behave as a single functional entity. Interestingly, our data demonstrate that Med12 and Med13 but not CycC or Cdk8 are essential for Serpent/Lozenge-induced transactivation in cell culture. Furthermore, our in vivo analysis of crystal cell development show that, while the four CDK8 module subunits control the emergence and the proliferation of this lineage, only Med12 and Med13 regulate its differentiation. We thus propose that Med12/Med13 acts as a coactivator for Serpent/Lozenge during crystal cell differentiation independently of CycC/Cdk8. More gen- erally, we suggest that the set of conserved factors identified herein may regulate GATA/RUNX activity in mammals.
During hematopoiesis, multipotent progenitors or stem specialized organ, the lymph gland, in the larva (36). These cells generate a large spectrum of specialized cell types progenitors differentiate into two main cell types, most closely through the progressive deployment of cell-specific gene related to vertebrate myeloid lineages: plasmatocytes, which expression programs (59). In that respect, it is of particular function as macrophages, and crystal cells, which participate in interest to understand how combinatorial inputs from gen- melanization and clotting (53). So far, we have a better under- eral and lineage-specific transcription factors converge to standing of the transcriptional network controlling blood cell modulate RNA polymerase II machinery and establish the development in the embryo. In particular, it appears that tran- gene expression programs intrinsic to cell diversification. scription factors of the GATA and RUNX families, which Over the last decade, cross-species conservation has shown regulate several steps of hematopoiesis in vertebrates, act to- that Drosophila is a valuable model system to gain insights gether to control Drosophila blood cell fate choice and differ- into the mechanisms controlling blood cell fate choice and entiation. differentiation at the transcriptional level (36). Indeed, sev- First, the GATA factor Serpent (Srp) is expressed in all eral key transcription factors and cofactors regulating blood hemocytes and is required not only for the specification of the cell development in vertebrates also participate in hemato- blood cell progenitors (52, 61) but also for the proper differ- poiesis in Drosophila. entiation of the different blood cell lineages (28, 29, 31, 64, 69, Reminiscent of the situation in vertebrates, hematopoiesis in 70). Members of the GATA transcription factor family are the fruit fly occurs in two temporally and spatially distinct characterized by the presence of at least one GATA-type zinc waves: blood cell progenitors (prohemocytes) arise first from finger, which binds the (A/T)GATA(A/G) consensus se- the head mesoderm in the early embryo and then from a quence, and one of their most prominent and conserved func- tions in metazoa is during blood cell formation (34). In verte- brates, three of six GATA genes (GATA1, -2, and -3) are * Corresponding author. Mailing address: Universite´de Toulouse; UPS, CBD (Centre de Biologie du De´veloppement), Baˆtiment 4R3, involved at various stages of hematopoiesis, from stem cell 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse, France. Phone: (33) development to the differentiation into various lineages, such 5.61.55.82.85. Fax: (33) 5.61.55.65.07. E-mail for Lucas Waltzer: as T helper cells, erythrocytes, or megakaryocytes (35, 49, 62). [email protected]. E-mail for Marc Haenlin: [email protected]. In humans, somatic or germ line mutations affecting GATA1 § Supplemental material for this article may be found at http://mcb .asm.org/. are associated, respectively, with acute megakaryoblastic leu- ᰔ Published ahead of print on 5 April 2010. kemia in patients with Down syndrome and with closely related
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X-linked hematological disorders, ranging from mild thrombo- show that components of each Mediator module participate in cytopenia to severe anemia (11). the activation of Srp/Lz target genes. Further focusing on the Second, the Drosophila RUNX factor Lozenge (Lz) is re- function of the four subunits of the accessory “CDK8 module,” quired for crystal cell differentiation (47). In the embryo, lz we demonstrate that Med12 and Med13, but not CycC and expression is first detected in a subset of prohemocytes slightly Cdk8, are required for Srp/Lz-induced transactivation in cell after the onset of srp expression (4). Only a fraction of these culture and that the CDK8 module interacts with Srp and Lz. cells maintains lz transcription and differentiates into crystal Furthermore, by studying the function of the CDK8 module cells that will populate the larval hemocel (4, 47). Members of components during crystal cell development, we find that the the RUNX transcription factor family are characterized by the emergence and the proliferation of this lineage depend on its presence of a highly conserved 128-amino-acid runt homology four subunits. However, our results indicate that only the domain that recognizes the consensus DNA sequence TG(T/ Med12/Med13 pair participates in crystal cell differentiation, C)GGTT (16). In addition, metazoan RUNX proteins contain which is directly controlled by Srp/Lz. All together, our data a C-terminal WRPY motif that interacts with corepressors of strongly suggest that Med12/Med13 acts as a coactivator mod- the Groucho/TLE class, although it has become clear over the ule for Srp/Lz independently of CycC/Cdk8 in vivo. Finally, our years that they can function as either transcriptional repressors screen results raise the exciting possibility that the numerous or activators, depending on the target gene and the cellular conserved factors identified may also regulate GATA/RUNX context (16). In mammals, two of the three RUNX genes con- activity in mammals. trol blood cell development (17, 19): RUNX1 is required for the development of definitive hematopoietic stem cells as MATERIALS AND METHODS well as for the correct differentiation of lymphocytes and megakaryocytes, whereas RUNX3 is a key regulator of T-lym- Plasmids. The expression vector pAc-Lz-V5 was generated by inserting the phocyte differentiation. In humans, somatic point mutations or cDNA encoding the full-length Lz (70) in pAc5.1/V5-HisA in frame with the V5 C-terminal tag (Invitrogen). Similarly, we subcloned the full-length Flag-Srp chromosomal translocations affecting RUNX1 are among the cDNA from pT7ß-Flag-SrpNC (70) into pAc5.1/V5-HisA to build pAc-Flag-Srp. most frequent genetic abnormalities in patients with acute To generate the firefly luciferase reporter plasmid p4ϫPO45-Fluc, a tetramer- myeloid leukemia (AML) and haploinsufficient mutations in ized version of the PO45{143} enhancer (26) was cloned into pGL4.23[luc2/ RUNX1 are associated with familial platelet disorder with pre- minP] vector (Promega). As transfection normalization plasmids, we used either pAc-RLuc (55) or pPol⌱⌱⌱-RLuc (58), which drive Renilla luciferase expression disposition to AML (57). under the control of the Drosophila actin5C promoter or the RNA polymerase Importantly, GATA and RUNX transcription factors have III 128 subunit promoter, respectively. Details of the constructs are available been shown to physically and functionally interact during he- upon request. Cell culture, dsRNA treatment, and transfections. matopoiesis. In Drosophila, the expression of both Srp and Lz Drosophila Kc167 cells were is required and sufficient to promote crystal cell differentiation grown at 25°C in Schneider’s medium (Invitrogen) supplemented with 10% fetal bovine serum (PAA Cell Culture Company) and 50 g of penicillin/streptomycin in vivo (28, 70). This cooperation is mediated on the one hand (Invitrogen). Double-stranded RNA (dsRNA) treatment was performed as fol- by a direct interaction between Srp and Lz (70) and on the lows: cells were incubated with dsRNA (1 g/well for 96-well-plate assays and 16 other hand at the level of several crystal cell-specific genes that g/well for 6-well plate assays) in a serum-free medium for 40 min; serum- harbor a particular cis-regulatory module composed of GATA containing medium was subsequently added, and after a 24-h incubation period, cells were transfected using Effectene (Qiagen) according to the supplier’s in- and RUNX binding sites in close association (26, 30, 56). structions. Similarly in mammals, GATA1 and RUNX1 are both involved Luciferase reporter assays. A mix of 55 ng Fluc reporter/20 ng pAc-Rluc in megakaryopoiesis and synergize to activate the transcription plasmid was cotransfected with various amounts of pAc-Lz-V5 per well (96-well of megakaryocytic promoters in cultured cells (25, 37, 72). plate). With the exception of the dose-response experiments, p4ϫPO45-Fluc was Interestingly, deregulation of GATA1/RUNX1 activity might induced with 10 ng pAc-Lz-V5 per well. Cells were lysed 72 h after transfection, and activities of firefly and Renilla luciferases were measured using the Dual be implicated in the development of human blood cell pathol- luciferase reporter assay system (Promega). Each transfection was performed at ogies such as familial platelet disorders and acute megakaryo- least in triplicate. blastic leukemia (23). Given that mammalian GATA and Genome-wide RNA interference (RNAi) screen for modulators of the Srp/Lz RUNX factors are coexpressed and required in other blood complex activity and retests. For the main screen, methods and optimization steps were adapted from references 9 and 55. Kc167 cells were seeded in serum- cell types, notably in hematopoietic stem cells and in T cells, free medium into 384-well screening plates (15,000 cells/well) containing the GATA/RUNX cooperation may also play a role in these situ- prespotted dsRNA library and incubated for 40 min. Each plate was then com- ations. Hence, Srp/Lz cooperation during crystal cell develop- pleted with serum-containing medium and incubated for 24 h at 25°C. Cells were ment may serve as a paradigm to understand conserved aspects subsequently transfected with a mix of plasmids (for one plate: 7 g of pAc-Rluc, ϫ of GATA and RUNX modes of action during blood cell fate 5.43 gofp4 PO45-Fluc, and 75 ng of pAc-Lz-V5) and grown under normal cell culture conditions. At 72 h after transfection, the screen was read out as choice and differentiation. described in reference 55. The screen was performed in duplicate. Sequence In the present study, we carried out a genome-wide RNA information about the BKN dsRNA library are deposited in a database that can interference screen in cultured Drosophila cells to systemati- be accessed at http://www.genomernai.org (32). For the retests, the same proce- cally search for regulators of Srp/Lz. This screen identified 129 dure was employed to test the selected candidates in quadruplicate. Assays were performed using resynthesized dsRNA and two different transfection mixes: the factors, including a number of transcription cofactors, which first one contained pAc-Rluc as a normalization vector, while the second con- either promote or impair Srp/Lz-induced transactivation. tained pPol⌱⌱⌱-Rluc. Among the factors that positively regulate Srp/Lz activity are Secondary dsRNA probe design and production. Secondary dsRNA probes several components of the Mediator, a conserved multisubunit were either recovered from existing libraries (HFA and MRC probes) or de- complex organized in different biochemical and functional signed de novo in nonoverlapping regions (NOP probes) using the E-RNAi web service (http://e-rnai.dkfz.de//) (3). T7-containing primers were used to produce modules that link DNA-bound transcriptional activators and the amplicon of interest from w1118 fly genomic DNA. Purified PCR fragments repressors to the general transcription machinery (6, 46). We were then used as templates for in vitro transcription with the T7 megascript kit VOL. 30, 2010 A GENOME-WIDE SCREEN FOR REGULATORS OF GATA/RUNX 2839
(Ambion). After an annealing step, dsRNA probes were purified using the appropriate cellular model system. Accordingly, we developed RNeasy cleanup protocol (Qiagen). Primer sequences are listed in Table S4 in a reporter assay suitable for high-throughput screening to the supplemental material. monitor Srp/Lz activity in Kc167 cells. In vivo, Srp and Lz are Western blot and immunoprecipitation. For Western blot experiments, Kc167 cells were lysed on ice in 200 l of ice-cold lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM both required and sufficient to activate the expression of the Tris, pH 8, 0.5% NP-40, 1 mM EGTA, supplemented with protease inhibitor PO45{143} enhancer: a 143-nucleotide-long enhancer, harbor- cocktail [Roche]). After material was cleared by centrifugation at 14,000 rpm for ing Srp and Lz binding sites, that recapitulates the endogenous 10 min, samples containing 30 g of proteins were resolved by SDS-PAGE and expression of the crystal cell differentiation marker PO45 (26). transferred to nitrocellulose membranes. Western blot experiments were per- formed using standard techniques, and the blots were developed by the ECL We thus generated a plasmid containing a multimerized ver- photoluminescence procedure (Pierce). Polyclonal antibodies against purified sion of this enhancer upstream of a minimal promoter and of GST-Cdk8 and GST-CycC fusions (48) were raised in guinea pigs (Eurogentec, the firefly luciferase reporter gene. Consistent with the fact Belgium). Antibodies against Med12 and Med13 are kind gifts from J. Treisman ϫ that Kc167 cells express Srp but not Lz, the 4 PO45-Fluc (67). For detection of tagged Lz and Srp we used mouse Anti-V5 (Invitrogen) reporter gene had minimal basal activity in Kc cells but was and mouse anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich). Mouse antitubulin (Sigma-Aldrich) or 167 mouse antiactin (Calbiochem) was used as a protein loading control. For immu- strongly activated in a dose-dependent manner upon cotrans- noprecipitations, 800 g of protein extract prepared as described above was fection of increasing doses of Lz expression plasmid (Fig. 1A). preadsorbed for 2 h with 40 l of protein A-Sepharose beads and immunopre- As a control, Lz transfection did not activate luciferase expres- cipitated overnight with 5 l of either anti-Med13, anti-Med12, or anti-Cdk8 sion from the backbone pGL4.23 plasmid. We also examined antibody and 10 l of protein A beads. As a control antibody, we used either 1 ϫ g of rabbit IgG (SantaCruz) or 5 l of guinea pig anti-Trinity antibody (kind gift whether the induction of the 4 PO45-Fluc reporter gene from F. Payre). The beads were spun down and washed three times in lysis buffer, could be inhibited by depleting either Srp or Lz by RNAi. As and the immunoprecipitated proteins were processed for Western blotting anal- shown in Fig. 1B, the treatment of Lz-transfected cells with two ysis as described above. pairs of nonoverlapping dsRNA targeting either srp or lz RNA extraction, reverse transcription (RT), and real-time quantitative PCR mRNA resulted in a strong drop in reporter activity compared (qPCR). Cells were seeded into 6-well plates, transfected with 1 g of pAc-lz-V5 per well, incubated at 25°C for 72 h, and then collected for total RNA extraction to that in cells treated with dsRNA against GFP. All together, (RNeasy kit; Qiagen) with an additional on-column DNase treatment step. Total these results indicate that 4I´PO45-Fluc gene activity reflects RNA (1 g) was reverse transcribed using Superscript II (Invitrogen) and ran- Srp/Lz-induced transcriptional activation in Kc cells. Fi- 167 dom primers (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. A 10- l nally, transfection conditions were optimized for a 384-well portion of a 1:250 dilution of cDNA was used as a template for real-time PCRs (SYBR green Jumpstart Taq ready mix; Sigma-Aldrich). Each condition tested format and a pilot RNAi screen showed that this cell-based corresponds to three independent transfected wells. Primer sequences are listed assay was sufficiently robust and stable for a genome-wide in Table S4 in the supplemental material. screen (data not shown). Fly strains. We used the following D. melanogaster strains: ktoT631 (med12) A genome-wide RNAi screen for modulators of Srp/Lz ac- T606 K185 and skd (med13) mutant lines were kind gifts from J. Treisman (67); cdk8 tivity. To systematically identify genes required for Srp/Lz- and cycCY5 mutant lines were described in reference 48. The TM3, Ser,{twi-lacZ} balancer was used to genotype the mutant embryos. w1118 flies were used as induced transactivation, we used a second-generation RNAi wild-type controls. Transgenic UAS-dsRNA lines w1118;P{GD13207}v23143 library of 14,224 dsRNA probes targeting about 90% of the (dsMed12), w1118,P{GD4134}v13777 (dsMed13), w1118;P{GD7022}v45370 predicted transcripts in the Drosophila genome (T. Horn and 1118 (dsCdk8), and w ;P{GD17120}v48834/CyO (dsCycC) were obtained from the M. Boutros, unpublished). This library was tested in duplicate Vienna Drosophila RNAi Center and recombined to P{w[ϩmC] ϭ UAS-Dcr- 2.D}1, w1118 and w1118;P{w[ϩmC] ϭ UAS-Dcr-2.D}2 (Bloomington) to enhance as described in Materials and Methods to perform a genome- RNA interference. lz-GAL4,UAS-GFP was used as a GAL4 driver and as a way wide screen for modifiers of Srp/Lz activity. Normalized to visualize lz-expressing cells. 4ϫPO45-Fluc gene activities were calculated, and z scores In situ hybridization and immunostaining. Immunostaining and in situ hybrid- (fold standard deviation from the whole-screen mean) were ization of embryos were performed as described in reference 26. Circulating assigned to each candidate. Analysis of the z scores of replicate hemocyte counts, as well as immunostaining and in situ hybridization on circu- lating larval blood cells, were performed as described in reference 60. We used plates showed that the assay was highly reproducible (coeffi- DIG-UTP labeled PO45-antisense RNA probe and sheep anti-DIG (1:2,000; cient of correlation of 0.92; see Fig. S1 in the supplemental Roche) as well as rabbit anti-green fluorescent protein (anti-GFP) antibodies material). A plot of the distribution of all mean z scores is (1:200; Torrey) and goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1/400; Molecular Probes) shown in Fig. 1C. Candidates with a z score above 4 or below secondary antibody. Counts were performed in triplicate on a minimum of 12 Ϫ age-matched individuals of each genotype collected at 25°C. 4 were selected for retests. dsRNA against 206 genes were resynthesized from the BKN library and retested on the 4ϫPO45-Fluc reporter gene using either pAc-Rluc (as in the RESULTS primary screen) or pPolIII-Rluc as normalization vectors to A high-throughput assay for Srp/Lz-induced transcriptional minimize false positives. These experiments confirmed the activation in cultured Drosophila blood cells. Over the years, identification of 113 dsRNAs that decreased Srp/Lz-induced different cofactors regulating the activity of particular GATA transcription (putative positive regulators) and 16 dsRNAs or RUNX factors have been identified using different strate- that increased Srp/Lz-induced transcription (putative negative gies, from a candidate gene approach to two-hybrid screen or regulators) by at least 1.5-fold with both normalization vectors TAP-tag purification (37, 71). However, many of their cofac- (see Table S1 in the supplemental material). tors may not be identified by such methods if they do not stably Interestingly, 8 of these 129 modifiers of Srp/Lz activity have interact with GATA or RUNX factors. We reasoned that been previously linked either to GATA and/or RUNX func- RNAi-mediated depletion of transcripts in cultured Drosophila tions in mammals or to crystal cell development in Drosophila, cells might provide a complementary strategy to systematically thereby validating our screen strategy (see Discussion). All the identify regulators of Srp/Lz activity. In addition, Drosophila candidates were classified according to their predicted func-
Kc167 cells, which are derived from embryonic hemocytes and tions based on Interpro and gene ontology (GO) annotations have been widely used for RNAi screens (8, 15), seemed an (Fig. 1D; see Table S2 in the supplemental material). Tran- 2840 GOBERT ET AL. MOL.CELL.BIOL.
FIG. 1. A genome-wide RNA interference screen for regulators of Srp/Lz-mediated transactivation in cultured Drosophila cells. (A) Drosophila ϫ Kc167 cells were cotransfected with p4 PO45-Fluc reporter plasmid and increasing amounts of pAc-Lz-V5 expression vector; pGL4.23-Fluc backbone vector, which does not contain Srp/Lz-responsive enhancers, was cotransfected with the maximum amount of pAc-Lz-V5 as a control. Under all conditions, pAc-Rluc was cotransfected for internal normalization. Cells were grown for 72 h, and then luciferase activities were measured; normalized firefly luciferase signal yielded by cells transfected with p4ϫPO45-Fluc and empty pAc-V5 vector is set as one unit. Each condition was tested in triplicate; standard deviations of results for triplicates are indicated. (B) Kc167 cells were treated with the indicated dsRNA probes for 24 h and subsequently cotransfected with 55 ng of p4ϫPO45-Fluc and 10 ng of pAc-Lz-V5 vectors; pAc-Rluc was cotransfected for internal normalization. Normalized firefly luciferase signal of each sample is represented as a percentage of that yielded by dsGFP-treated cells. Two nonoverlapping dsRNA probes targeting either srp or lz were tested. Each condition was tested in triplicate; standard deviations of results for triplicates are indicated. (C) High-throughput screen of the BKN dsRNA library; Kc167 cells were treated with 14,224 dsRNA probes and assessed for p4ϫPO45-Fluc reporter induction by pAc-Lz-V5. Here is represented the distribution of the z scores that were individually attributed to each dsRNA probe. Probes that displayed a z score above 4 or below Ϫ4 were selected for retests as putative negative regulators or putative positive regulators, respectively. (D) Repartition of confirmed candidates according to their attributed functional group. The number of hits per group is indicated. See Table S2 in the supplemental material for functional group assignment.
scriptional regulators cumulatively represent 58% of the iden- The Mediator complex plays a crucial role in Srp/Lz-in- tified genes. Furthermore, Homologene query and “reciprocal duced transcriptional activation in cultured blood cells. The best blast” analysis revealed that 90% of the candidates have multiprotein Mediator complex was first identified in Saccha- potential human orthologs (see Table S2 in the supplemental romyces cerevisiae and then in all eukaryotes (7). It is a core material), indicating that these genes may also regulate integrator of the transcriptional response, bridging DNA- GATA/RUNX function in humans. Moreover, STRING anal- bound transcriptional activators and repressors to RNA poly- ysis (http://string.embl.de) (38) and manual data mining merase II and the general transcription machinery (46). On the showed that 70% of the factors identified in the screen are basis of electron microscopic, biochemical, and genetic data, it connected to at least another one in the list by high-confidence was proposed that the Mediator complex can be divided into physical or functional interaction (Fig. 2; see Table S3 in the head, middle, and tail modules and a separable regulatory supplemental material). An important node of cointeracting entity called the CDK8 module (14) (Fig. 3A). In our screen, factors that came out of the screen was composed of Mediator dsRNA against 20 of the 30 Mediator subunits reduced Srp/ subunits, on which we focused the rest of our analysis. Lz-induced activation by 50% or more (Fig. 3A and B). To VOL. 30, 2010 A GENOME-WIDE SCREEN FOR REGULATORS OF GATA/RUNX 2841
FIG. 2. Interaction map between the modulators of Srp/Lz-induced transactivation. The analysis of the interactions between all the confirmed candidates was performed with STRING (http://string.embl.de) using high-confidence scores for experimental evidences (pink lines), text mining (green lines), databases (blue lines), and homology (purple lines). In addition, a similar analysis, performed with a list of manually curated mammalian homologs of the candidates, allowed an extension of the interaction network (black lines) in 16 cases.
confirm that suppression of Srp/Lz activity by dsRNA against endogenous srp mRNA were not affected in the presence of Mediator components was specific and not due to off-target the dsRNA targeting med1, med15, med12,ormed13, although effects, we tested two additional nonoverlapping dsRNA med19 dsRNA slightly decreased Lz but not srp levels (Fig. 3E probes against selected components of each Mediator module. and F, respectively). In addition, using a Srp-responsive re- These secondary dsRNAs against med19 (head module), med1 porter plasmid (ush-luc), we found that depletion of med1, (core module), med15 (tail module), or med12 and med13 med15,ormed19 but not that of med12 or med13 induced a (CDK8 module) also impaired Srp/Lz-induced activation of decrease in ush-luc activity, suggesting that the three constitu- the 4ϫPO45-Fluc reporter gene (Fig. 3C), demonstrating that tive MED modules are required also for Srp-induced transcrip- components of the four Mediator modules participate in Srp/ tion, contrary to the CDK8 regulatory module (see Fig. S2 in Lz-induced transactivation. the supplemental material). All together, these data are con- To extend these observations, we asked whether Mediator sistent with the hypothesis that the Mediator complex directly components also control Srp/Lz-induced transactivation of an participates in the regulation of Srp/Lz target genes as a coac- endogenous gene within its normal genomic context. We thus tivator and underscore the particular requirement of the monitored the expression of PO45 by reverse transcription- CDK8 regulatory module in this process. quantitative PCR (RT-qPCR) in Kc167 cells. As shown in Fig. Med12 and Med13 act as coactivators of Srp/Lz indepen- 3D, PO45 mRNA was not expressed in nontreated cells but dently of CycC and Cdk8. Biochemical and genetic data indi- was robustly induced upon transfection of Lz expression plas- cate that the CDK8 module forms a stable subcomplex that mid, and this induction was lost in the presence of dsRNA reversibly associates with the rest of the Mediator complex and against either srp or lz. Thus, PO45 is also an Srp/Lz-responsive regulates its biochemical function (5, 44, 45). In addition, sev- target gene in cultured cells. Importantly, we found that eral lines of evidence suggest that this module is primarily dsRNA against med19, med1, med15, med12,ormed13 implicated in transcriptional repression and behaves as a single strongly impaired the activation of PO45 expression, indicating entity whose function largely relies on Cdk8 kinase activity (1, that these Mediator subunits are required for PO45 induction 5, 44, 68). However, it emerged that this module is also linked by Srp/Lz. to transcriptional activation and that the CycC/Cdk8 pair may Given the broad function of Mediator in transcription (46), not be required for all its functions (12, 22, 40, 48). Based on depletion of Mediator subunits may affect Srp/Lz activity by the analysis of med12 and med13, the above data indicated that impinging on the expression levels of these two factors. How- the CDK8 regulatory module participates as a coactivator for ever, Western blot and RT-qPCR experiments, respectively, Srp/Lz. However, neither Cdk8 nor CycC was identified as a showed that the levels of the transfected Lz protein and of the modulator of Srp/Lz in our screen. We thus specifically asked 2842 GOBERT ET AL. MOL.CELL.BIOL.
FIG. 3. All Mediator complex modules are required for the Srp/Lz complex to promote transcription of its target genes in Kc167 cells. (A) Schematic representation of the Mediator complex and its four modules. Blue, head module subunits; green, core module subunits; yellow, tail module subunits; red, regulatory CDK8 module subunits. Subunits Med25 and Med26, in gray, have no homologs in yeast, where the complex structure was resolved, and therefore cannot be attributed to one of the four modules. All subunits that were confirmed as positive regulators during retests are underlined. (B) Cotransfection of p4ϫPO45-Fluc, pAc-Lz-V5, and pAc-Rluc plasmids for genome-wide screen retest step. Normalized firefly luciferase signal of each sample is represented as a percentage of that yielded by dsGFP-treated cells. Each condition was tested in quadruplicate; standard deviations are indicated. (C) Validation of a subset of Mediator complex subunits: secondary nonoverlapping dsRNA probes targeting selected candidates in the four modules were tested for their effect on the transactivation of p4ϫPO45-Fluc by 10 ng of pAc-Lz-V5 in a luciferase assay as for Fig. 1B. (D) Endogenous PO45 mRNA levels measured by real-time quantitative PCR. Twenty-four hours after a dsRNA treatment, Kc167 cells were transfected with 1 g of pAc-Lz-V5 and incubated for 72 h before RNA extraction and reverse transcription were performed. PO45 transcript levels are represented as a percentage of that measured in pAc-Lz-V5-transfected dsGFP-treated cells. Untr., untransfected cells. Each condition corresponds to three independent transfections; standard deviations are indicated. (E) Western blot analysis of proteins extracted from the same samples that were also analyzed by RT-qPCR for panel D; levels of Lz-V5 protein produced upon transfection were assessed using an anti-V5 antibody; antitubulin was used as a protein loading control. ␣, anti; Untr., untransfected cells. (F) Endogenous srp mRNA levels measured by real-time quantitative PCR. Twenty-four hours after a dsRNA treatment, Kc167 cells were transfected with 1 g pAc-Lz-V5 and incubated for 72 h before RNA extraction and reverse transcription. srp transcript levels are represented as a percentage of that measured in pAc-Lz-V5-transfected dsGFP-treated cells. VOL. 30, 2010 A GENOME-WIDE SCREEN FOR REGULATORS OF GATA/RUNX 2843
FIG. 4. (A) Western blot analysis of Kc167 cells treated with dsRNA targeting each subunit of the CDK8 module. Cells were collected for protein extraction 96 h after performing the dsRNA treatment. Whole-cell extracts were immunoblotted with anti-Med12, anti-Med13, anti-Cdk8, and anti-CycC antibodies; antitubulin and antiactin were used as protein loading controls. (B) Kc167 cells were transfected with pAc-Flag-Srp and/or pAc-Lz-V5 as indicated in the upper part of the panel (Untr., untransfected controls). Cell extracts were immunoprecipitated (IP) either with anti-Med12, anti-Med13, or anti-Cdk8 or with an irrelevant antibody and immunoblotted with anti-Med12, anti-Med13, anti-Cdk8, anti-Flag, and anti-V5 antibodies as indicated to the left of each panel. The Ig chains revealed in the anti-Cdk8 Western blot IP experiments are indicated by a star. ␣, anti.
whether the CycC/Cdk8 pair was also required for Srp/Lz- were also coimmunoprecipitated with Flag-tagged Srp or V5- induced transactivation. Strikingly though, dsRNA targeting tagged Lz, transfected either alone or in combination. None of cdk8 or cycC mRNA did not interfere with Srp/Lz-induced these factors were immunoprecipitated by an irrelevant anti- transactivation of the p4ϫPO45-Fluc reporter plasmid (Fig. body, indicating that the observed interaction between CDK8 3C). Similarly, the induction of endogenous PO45 mRNA was module components and Srp/Lz is specific. Of note, we failed not significantly affected by cdk8 or cycC inhibition (Fig. 3D). to detect a direct interaction between in vitro-translated Med12 To ascertain that the different subunits of the CDK8 module or Med13 and Srp or Lz (data not shown). All together, these were efficiently knocked down upon dsRNA treatment, we results suggest that Srp/Lz can recruit the CDK8 module and monitored their expression levels by Western blotting. As that the Med12/Med13 pair is directly involved as a coactivator shown in Fig. 4A, dsRNA against each of the four subunits of Srp/Lz target genes. strongly decreased the expression of the corresponding pro- The CDK8 module regulates crystal cell development in tein. Hence, these data indicate that within the CDK8 module, vivo. Having shown the differential role of Med12/Med13 and only Med12 and Med13 are required for Srp/Lz-induced trans- CycC/Cdk8 in the transcriptional activation by Srp/Lz in a activation, whereas CycC and Cdk8 are dispensable. Of note, well-defined cell-based assay, we then explored the functions consistent with a previous report (12), med13 dsRNA also of the CDK8 module subunits in vivo during the development induced the knockdown of Med12, whereas Med13 was unaf- of the crystal cell lineage. Indeed, the Srp/Lz complex is nec- fected by med12 dsRNA. In addition, depletion of Med12 or essary and sufficient to induce the differentiation of this blood Med13 induced a slight decrease in CycC and Cdk8 levels, cell lineage (26, 28, 70). Also, a mutation in med13 was previ- suggesting that the CycC/Cdk8 pair is stabilized upon incorpo- ously reported to impair crystal cell development (54). To ration in the CDK8 module. assess the function of the four CDK8 module subunits during To gain further insights into the mechanism of action of the this process, we first used available null alleles of the corre- CDK8 module, we tested whether it interacted with Srp and or sponding genes (48, 67). In wild-type embryos, crystal cells
Lz in Kc167 cells. We thus performed immunoprecipitation differentiate as two pools of approximately 15 cells each, form- experiments using antibodies against either Med12, Med13, or ing a bilateral cluster in the proventriculus region by stage 14. Cdk8. Consistent with the fact that the CDK8 module is a To monitor crystal cell development, we first looked at the stable complex, endogenous Med12, Med13, and Cdk8 were expression of the crystal cell-specific differentiation marker efficiently coimmunoprecipitated with each other (Fig. 4B). PO45 by in situ hybridization. In embryos carrying a mutation Interestingly, endogenous Med12 and Med13 as well as Cdk8 for med12, med13, cycC,orcdk8, differentiated crystal cells 2844 GOBERT ET AL. MOL.CELL.BIOL.
ment, we monitored the number of lz-expressing cells. Under wild-type conditions, lz expression is initiated in a subpopula- tion of prohemocytes and is maintained in differentiated crys- tal cells. To label these cells, we used the lz-GAL4 insertion, which recapitulates the expression pattern of lz (4), and a UAS-GFP reporter transgene. We found that mutations in each of the CDK8 subunits resulted in a similar reduction of around 30% in the number of Lz-GFP-positive (Lz-GFPϩ) blood cell hemocytes (Fig. 5C). These data suggest that the CDK8 module impinges on crystal cell development at least in part by regulating either the specification or the proliferation/ survival of this lineage. Also, the relatively weak phenotypes we observed might be due to the presence of maternally contrib- uted CDK8 subunits. The Med12/Med13 pair controls crystal cell differentiation status independently of the CycC/Cdk8 pair. In order to more specifically tackle the cell-autonomous function of the CDK8 module in the development of the crystal cell lineage, we used UAS-dsRNA transgenic lines to target the downregulation of each of its four subunits in a tissue-specific manner (21). We have recently shown that the number and differentiation status of the circulating larval Lz-GFPϩ blood cells can be efficiently assessed and that these two parameters provide robust assays to address gene function in this lineage (60). Accordingly, we expressed dsRNA against med12, med13, cycC,orcdk8 under the control of the lz-GAL4 driver, and the corresponding third- instar larvae were bled. The total number of circulating hemo- cytes in these larvae remained similar to that for the control, indicating that expressing these dsRNA in the Lz-GFPϩ cells does not generally (or nonautonomously) affect larval blood cell homeostasis (Fig. 6A). However, we found that med12, cdk8, and cycC dsRNA significantly reduced the total number of circulating Lz-GFPϩ cells (Fig. 6A). Also, given that Med12, CycC, and Cdk8 have never been found to function indepen- dently of Med13, it is likely that the wild-type number of Lz-GFPϩ cells observed upon expression of the med13 dsRNA reflect a lower RNAi efficiency rather than a functional differ- ence. These results indicate that the CDK8 module is cell autonomously required for Lz-GFPϩ cell maintenance or pro- FIG. 5. Mutations in the CDK8 regulatory module subunits impair liferation. embryonic crystal cell development. (A) In situ hybridization showing PO45 expression in stage 14 embryos of the indicated genotypes. Dor- In addition, we examined the differentiation status of the Lz- ϩ sal views of the head region, anterior to the left. (B) Corresponding GFP blood cells. Consistent with a previous report (60), we quantifications of the number of PO45-expressing cells. At least 12 found that under wild-type conditions, 88% of the Lz-GFPϩ cells stage 14 embryos of the indicated genotypes were used for cell counts; express PO45 (differentiated crystal cells) whereas 12% do not absolute number of PO45-positive cells per embryo is indicated, as well as standard deviations. Three stars indicate a P value of Ͻ0.0005 (procrystal cells) (Fig. 6B). Interestingly, while this ratio remained (Student t test). (C) Absolute number of Lz-GFP-expressing cells in all unchanged in larvae expressing either cycC or cdk8 dsRNA, we four mutant genetic contexts and control stage 14 embryos. The lz- observed a sharp drop in the proportion of differentiated Lz- GAL4 insertion was used to drive UAS-GFP expression, allowing us to ϩ ϩ GFP cells in larvae expressing either med12 or med13 dsRNA visualize and count cells of the Lz lineage. At least 12 embryos of the (Fig. 6B). Of note, this differentiation block was more pro- indicated genotypes were analyzed; three stars indicate a P value of Ͻ0.0005. nounced with med12 than with med13 dsRNA, consistent with the above hypothesis that med13 dsRNA is less efficient. Since the Srp/Lz complex promotes and coordinates crystal cell differenti- were present and correctly localized, but we observed a de- ation (26), we propose that, as in cultured blood cells, the Med12/ crease in PO45 staining compared to that of wild-type embryos Med13 pair acts as a coactivator of Srp/Lz during crystal cell (Fig. 5A). Comparable results were obtained using other crys- differentiation independently of the CycC/Cdk8 pair. tal cell differentiation markers, such as PO59 (data not shown). Actually, quantification of the number of PO45-expressing DISCUSSION cells per embryo showed that mutations in CDK8 module subunits reduced the crystal cell number (Fig. 5B). To further During development, a combination of general and lineage- examine the function of this module in crystal cell develop- specific transcription factors integrate different regulatory in- VOL. 30, 2010 A GENOME-WIDE SCREEN FOR REGULATORS OF GATA/RUNX 2845
The activity of GATA and RUNX transcription factors has been shown to be regulated by interaction with several factors, such as the coactivator CBP/p300 or the corepressors HDAC and Sin3A (10, 16). However, proper transcriptional regulation relies on the coordinated action of several transcription factors binding a particular cis-regulatory element. Notably, GATA and RUNX factor have been shown to cooperate in both mammals and Drosophila to regulate the expression of specific target genes (25, 37, 70, 72). Hence, we used Srp/Lz coopera- tion as a paradigm to identify putative coregulators of GATA/ RUNX activity. Among the genes we identified, five (CKD9, SIN3A, MED1, enok homolog MYST3/MOZ, and pnt homolog ETS1) have been linked previously to GATA and/or RUNX activity in mammals (20, 24, 33, 39, 41, 43, 50, 65), and four (Pcf11, CtBP, med13, and Sin3A) have been linked to crystal cell development in flies (54). This brings strong support to the conclusion that our cell-based assay is suitable to identify gen- uine modulators of Srp/Lz activity and, more generally, of GATA/RUNX factors. However, further work will be required to discriminate between factors affecting GATA/RUNX inter- play specifically or impinging also on either GATA or RUNX activity. Along this line, our results suggest that the three MED core modules but not the CDK8 regulatory module participate in Srp-induced transactivation. Importantly, too, 117 (90%) of the genes identified in the screen have well-conserved human homologs, suggesting they may regulate GATA/RUNX activity in humans. Actually, this sharp bias toward conserved genes underscores the fact that cell-based assays in Drosophila can serve as a powerful system to identify and characterize genes that may play similar roles in humans. Moreover, some ho- mologs of Srp/Lz modifiers that we identified have been im- plicated in human diseases. These notably include MLF1, which is translocated in t(3;5)(q25.1;q34)-associated AML (73) FIG. 6. Knockdown of CDK8 module subunits specifically in the ϩ and whose Drosophila homolog is a target of Srp/Lz expressed Lz lineage affects circulating larval hemocyte features. (A) Third- instar larvae of the indicated genotypes were bled, and total circulating in the crystal cells (26), as well as DDX10, which is translocated hemocytes as well as Lz-GFPϩ circulating cells were quantified. At in inv(11)(p15q22)-associated AML (2). Whether these genes least 24 larvae of each genotype were bled; standard deviations are participate in GATA and/or RUNX function in normal or Ͻ indicated. Three stars indicate a P value of 0.0005. Complete geno- pathological situations in humans remains to be determined. types are indicated at the bottom of the figure. (B) Proportion of crystal cell precursors (Lz-GFPϩ PO45Ϫ) and differentiated crystal Our data show that the Mediator complex plays a central cells (Lz-GFPϩ PO45ϩ), as quantified by double fluorescent immuno- role in Srp/Lz-induced transactivation. Studies of yeast and staining (against GFP) and in situ hybridization (against PO45)on metazoa highlighted the critical role of Mediator in both tran- circulating cells from third-instar larvae. At least 24 larvae of each scriptional activation and repression and showed that different genotype were bled; standard deviations are indicated. Three stars Mediator subunits are required for the regulation of specific indicate a P value of Ͻ0.0005. Complete genotypes are indicated at the bottom of the figure. sets of genes or developmental processes (5, 18). In addition, different transcription factors interact directly with specific Mediator subunits (42, 51). Hence, the prevailing view is that different transcription factors depend on particular target pro- puts at the transcriptional levels to unfold the proper gene teins of the Mediator complex to regulate transcription. How- expression program (13). The identification of the complete ever, we found that 20 of the 30 Mediator subunits were im- panel of genes that participate in the regulation of the activity plicated as positive coregulators of Srp/Lz. Although some of these transcription factors is critical to understand the fine- Mediator subunits, notably in the head module, play a global tuning of transcription that underlies cellular differentiation. role in transcription (46, 66), a general defect in transcription In this study, we have conducted a genome-wide RNAi screen is unlikely to account for the observed decrease in Srp/Lz to uncover regulators of the activity of the GATA/RUNX activity under our RNAi conditions, as we did not observe complex Srp/Lz. This approach highlighted the function of the significant changes in srp and Lz expression levels, except with Mediator complex in Srp/Lz-induced transcriptional activa- Med19, a component of the head module, whose depletion tion. Moreover, we found that, within the Mediator CDK8 decreased Lz levels. We thus propose that the integration of module, Med12 and Med13 act independently of CycC and Srp/Lz transcriptional output requires the coordinated action Cdk8 to promote Srp/Lz-dependent transactivation and blood of the different Mediator modules. However, we cannot ex- cell differentiation. clude that some of the Mediator subunits that we did not 2846 GOBERT ET AL. MOL.CELL.BIOL. identify in our screen may actually be dispensable for Srp/Lz and Med13 in the activation of the crystal cell differentiation activity. program by Srp/Lz independently of CycC and Cdk8. All to- Remarkably, the CDK8 module, which is generally consid- gether, these data underline the functional flexibility of the ered an accessory repressor module (5), was also required as a CDK8 module, which appears to be reiteratively and specifi- coactivator of Srp/Lz. Furthermore, in line with recent results cally used at different stages of crystal cell development. revealing that all the functions of the CDK8 module do not In conclusion, it is anticipated that the results presented rely on the CycC/Cdk8 pair (12, 48), we provide strong evi- here lay the foundation for future investigations aiming at dence that only Med12/Med13 are required for the activation understanding the different levels of regulation of GATA and of Srp/Lz target genes in cell culture and in vivo. While differ- RUNX transcription factor activity not only in Drosophila but ent molecular mechanisms of repression by Cdk8/CycC and also in other species. Med12/Med13 have been described (5, 45, 51, 68), how Med12/ Med13 may promote transcription remains elusive. These sub- ACKNOWLEDGMENTS units may serve as an anchor to recruit the Mediator complex, We are grateful to members of our teams for fruitful discussions. We as they have been shown to bind to Pygopus or ß-catenin to thank the Toulouse RIO imaging platform for assistance with confocal promote Wnt signaling (12, 40) and to Gli3 to inhibit Shh microscopy as well as S. Bernat-Fabre and Y. Carrier for excellent technical assistance. We deeply thank J. Treisman, the Bloomington signaling (74). Accordingly, we found that Srp and Lz inter- stock center, and the Vienna Drosophila RNAi Center for antibodies acted with Med12 and Med13. However, this interaction could and fly stocks. be due to another Mediator subunit required for Srp/Lz-in- This work was supported by grants from the Association Interna- duced transactivation. Alternatively, Med12/Med13 may be re- tional for Cancer Research to L.W. and from the Agence Nationale quired for the proper folding of the Mediator complex to pour la Recherche to M.H. D.O. and V.G. are supported by fellow- ships from the Association pour la Recherche contre le Cancer. Work promote its interaction either with Srp/Lz or with downstream in the M.B. laboratory was supported by grants from the German components of the transcriptional initiation machinery. Research Council and the Helmholtz Alliance for Systems Biology. In vivo, our analysis of CDK8 module subunits shows that, REFERENCES reminiscent of what has been observed in larval imaginal discs 1. Andrau, J. C., L. van de Pasch, P. Lijnzaad, T. Bijma, M. G. Koerkamp, J. (12, 48), CycC/Cdk8 and Med12/Med13 have both common van de Peppel, M. Werner, and F. C. Holstege. 2006. Genome-wide location and specific functions during crystal cell development. Indeed, of the coactivator mediator: binding without activation and transient Cdk8 interaction on DNA. Mol. Cell 22:179–192. in the embryo, mutations in any of the four CDK8 module 2. Arai, Y., F. Hosoda, H. Kobayashi, K. Arai, Y. Hayashi, N. Kamada, Y. components resulted in a similar reduction in the absolute Kaneko, and M. Ohki. 1997. The inv(11)(p15q22) chromosome translocation number of Lzϩ blood cells and, concomitantly, of differenti- of de novo and therapy-related myeloid malignancies results in fusion of the nucleoporin gene, NUP98, with the putative RNA helicase gene, DDX10. ated crystal cells, indicating that the whole CDK8 module Blood 89:3936–3944. controls the emergence of the crystal cell lineage. While the 3. Arziman, Z., T. Horn, and M. Boutros. 2005. E-RNAi: a web application to signaling that induces lz expression in the prohemocytes re- design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res. 33:W582–W588. 4. Bataille, L., B. Auge, G. Ferjoux, M. Haenlin, and L. 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