Nowe Osiągnięcia W Badaniach Nad Podstawami Molekularnymi Grup Krwi

Nowe osiągnięcia w badaniach nad podstawami molekularnymi grup krwi w świetle doniesień prezentowanych na 23 Zjeździe Międzynarodowego Towarzystwa Przetaczania Krwi w Amsterdamie

The latest news on molecular basis of blood groups presented during the 23rd Regional Congress of the International Society of Blood Transfusion in Amsterdam

Agnieszka Orzińska, Katarzyna Guz, Ewa Brojer Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytut Hematologii i Transfuzjologii

W dniach 2–5 czerwca 2013 roku odbył się szwedzcy zastosowali w swoich badaniach nową w Amsterdamie 23. Regionalny Zjazd Międzyna- metodologię opartą na tak zwanym skanowaniu rodowego Towarzystwa Przetaczania Krwi (ISBT, całego genomu (GWAS, genome-wide association International Society of Blood Transfusion). Jednym studies) przy użyciu testu Illumina HumanOmni z zagadnień poruszanych na zjeździe była najnow- 2,5M BeadChip. Przeprowadzono poszukiwanie sza wiedza o podstawach molekularnych swoi- różnic w DNA od 20 osób Vel-ujemnych i 8 Vel- stości antygenowych krwinki czerwonej. Temat -dodatnich, aby ustalić sekwencje DNA kodującą ten omawiano na wykładach w czasie sesji Novel ten antygen. W wyniku analizy stwierdzono, że Blood Group Findings, Immunohematology — Rh u wszystkich osób Vel-ujemnych na chromosomie oraz Carbohydrate Blood Groups, a także podczas 1p36 występuje region o wielkości 97 tysięcy par sesji dotyczącej nowych technologii do typowania zasad o takim samym „wzorze”, różnym od „wzo- grup krwi metodami biologii molekularnej New ru” u osób Vel-dodatnich. W regionie tym mieści Technology for Blood Group Typing. się gen SMIM1 kodujący białko transbłonowe Podczas otwierającego pierwszą sesję wykładu erytrocytu o nieznanej funkcji. Białko to nie jest pt. Intergrative genomics identities SMIM1 as the polimorficzne — uważa się je za „konserwowane locus of a novel erythrocyte membrane protein and ewolucyjnie”. Dalsze badania techniką sekwen- the Vel blood group system profesor Storry (Lund, cjonowania tego genu ujawniły u 39 Vel-ujemnych Szwecja) przedstawiła wyniki badań, których celem osób różnego pochodzenia homozygotyczną delecję było wykrycie genu i charakterystyka molekularna 17 nukleotydów w eksonie 3 kodującym analizo- cząsteczki noszącej swoistość antygenu Vel [1]. wane białko. Częstość występowania haplotypu Antygen ten opisano w 1952 roku (Sussman i wsp. z delecją w populacji szwedzkiej określono na 1/17. [2]) u chorego, u którego wystąpiła ostra reakcja Badania technikami immunoblotingu i cytometrii hemolityczna po przetoczeniu krwi. W wielu in- przepływowej z użyciem przeciwciał króliczych nych doniesieniach potwierdzono, że przeciwciała anti-SMIM1 lub ludzkich anti-Vel potwierdziły do tego antygenu są klinicznie istotne. Badania korelację między poziomem ekspresji antygenu sugerowały, że antygen Vel jest dziedziczony, jako na krwince czerwonej, a statusem zygotyczności cecha autosomalna recesywna. Do tej pory nie delecji w genie SMIM1. udało się za pomocą żadnych metod biochemicz- Z kolei grupa naukowców holenderskich (Haer- nych i genetycznych ustalić jego podłoża. Autorzy -Wigman i wsp., Amsterdam) zaprezentowała

Adres do korespondencji: dr n. biol. Agnieszka Orzińska, Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej IHiT, 00–975 Warszawa, ul. Chocimska 5, tel.: 22 349 66 00 wew.154, faks: 22 349 66 14, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected]

www.jtm.viamedica.pl 101 Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 3 badania, których celem było ustalenie zależności grupowego Dombrock [5]. U pacjentki pochodzenia wytwarzania przeciwciał anty-Vel u osób Vel-ujem- kaukaskiego wykryto niezidentyfikowane przeciw- -nych od antygenów HLA klasy II [3]. Przebadano ciała niereagujące jedynie krwinkami z Gy(a-)[Do- DNA od 10 osób Vel-ujemnych, z których 6 wytwo- null]. Bezpośrednie sekwencjonowanie genu DO, rzyło przeciwciała anti-Vel po transfuzji lub w ciąży. kodującego antygeny z układu Dombrock, wykazało Wykazano podwyższoną częstość występowa- obecność homozygotycznej mutacji 566C>T nia allelu DRB1*11 w grupie zimmunizowanej. w eksonie 2, przekładającej się na zmianę amino- W tej samej pracy autorzy badali osobę o wyjątkowo kwasową Thr189Met. Badania rodzinne potwier- słabej ekspresji antygenu Vel i postawili hipotezę, dziły dziedziczenie mutacji w trzech pokoleniach że osoby takie noszą mutację obniżającą poziom i stąd autorzy doniesienia postulowali o wprowa- ekspresji białka SMIM1. Badacze zidentyfikowali dzenie antygenu DOLC jako dziewiątego antygenu w intronie 2 genu SMIM1 polimorfizm rs1175550 do układu Dombrock. (G>A) odpowiedzialny za modyfikację wiązania Wykład omawiający ewolucję rodziny superge- białek jądrowych w tym regionie. Badania techni- nów ABO otwierał sesję o węglowodanowych gru- ką cytometrii przepływowej potwierdziły niższy pach krwi. Blancher (Tuluza, Francja) przedstawił poziom ekspresji białka SMIM1 u osób noszących obecny stan wiedzy o genach ABO występujących allel z polimorfizmem A, a wysoką ekspresją u tych w świecie zwierzęcym, ich ewolucji jak również o genotypie GG. scharakteryzował glikotransferazy, przenoszone Grupa badaczy niemieckich (Weinstock wsp., reszty cukrowe i ich produkty [6]. Ulm) przedstawiła glikoproteinę CD59 jako kandy- Dokładną analizę podłoża genetycznego wa- data do utworzenia nowego układu grupowego krwi riantów ABO zaprezentował zespół badaczy chiń- [4]. Białko to, znane od dawna pod nazwą MIRL skich (Cai i wsp., Szanghai) [7]. Spośród 2,1 mln (membrane inhibitor of reactive lysis) w alternatyw- dawców wyłoniono grupę 322 osób z nietypową nej drodze aktywacji dopełniacza blokuje tworzenie ekspresją antygenów grupy głównej. Techniką kompleksu atakującego błonę na etapie wiązania sekwencjonowania zidentyfikowano 61 wariantów składników C8 i C9. Jest ono zakotwiczone w błonie genu ABO, wśród których wykryto 29 nowych alleli komórkowej erytrocytu oraz innych komórek za z mutacjami, przede wszystkim typu zamiany poje- pomocą kotwicy GPI (glycosylphosphatidylinositol). dynczego nukleotydu. Polimorfizmy zlokalizowano Dotychczas jednakże nie wykazano jego immu- głównie w eksonach 6 i 7, ale także w regionie nogenności. Weinstock i wsp. opisali przypadek promotorowym, co wiązało się tworzeniem słabych dziecka pochodzenia tureckiego z homozygotyczną fenotypów antygenów A i B. Przedstawiono także delecją (146del A) w genie kodującym białko CD59, mutacje typu stop kodon (7G>T i 52C>T) w regio- u którego w osoczu wykryto przeciwciała skie- nie 5’ dające fenotypowo podtypy o krańcowo słabej rowane do antygenu powszechnego o nieznanej ekspresji tzw. Ael i Bel. Poziom korelacji genotypu swoistości, wytworzone najprawdopodobniej po z fenotypem w grupie badanej wynosił 68%. transfuzji. W celu określenia swoistości przeciw- W dalszej części sesji badacze japońscy (Oga- ciał wykrytych u dziecka do jego osocza dodano sawara i wsp., Tokio) scharakteryzowali podłoże rekombinowane białko CD59 i techniką cytometrii molekularne fenotypów o bardzo niskiej ekspresji przepływowej oceniono stopień zahamowania antygenów A lub B na krwinkach zwanych Bm aktywności przeciwciał. W eksperymencie tym i ABm dość często występujących w Japonii [8]. uzyskano całkowitą inhibicję aktywności prze- W badanej grupie zidentyfikowano specyficzną dla ciwciał pacjenta przez CD59. Rekombinowane tego fenotypu szeroką delecję 5.8kb w intronie 1 białko hamowało też aktywność komercyjnych genu ABO w regionie zawierającym elementy przy- anti-CD59. Naukowcy przeprowadzili również łączania się czynnika transkrypcyjnego GATA-1. badania rodzinne i wykazali, że allel z delecją W trzech przypadkach za powstanie tego samego kodujący białko CD59 został odziedziczony od fenotypu Bm i Am odpowiadała zamiana jednego heterozygotycznych rodziców. Według obowią- nukleotydu w tym samym regionie regulatorowym zujących kryteriów białko CD59 spełnia formalne w motywie GATA. Tym samym tematem zajmowali kryteria włączenia do rodziny antygenów z ukła- się następni, szwedzcy prelegenci (Thuressoni dów grupowych. i wsp., Lund), którzy przeprowadzili sekwencjono- Kolejne doniesienie grupy naukowców z Bri- wanie intronu 1 genu ABO w podstawowych alle- stolu i Barcelony (Karamatic Crew i wsp.) doty- lach kodujących antygeny tego układu ABO*A1.01, czyło charakterystyki serologicznej i molekularnej *A2.01, *B.01, *01.01, *01.02 i *02.01, a także antygenu DOLC — nowej swoistości z układu u osób o fenotypach Bm i Am [9]. Wykryli 68 miejsc

102 www.jtm.viamedica.pl Agnieszka Orzińska i wsp., Badania podstaw molekularnych grup krwi polimorficznych specyficznych dla danego allelu, protokół badań techniką dyskryminacji alleli pozwa- a 26 specyficznych dla 2 alleli. Badania próbek lający na ich identyfikację [13]. Opisała 9 nowych o słabych fenotypach nie wykryły obecności delecji mutacji w genie ABCB6, kodującym antygen Lan, występującej w populacji japońskiej, lecz zmianę z których 7 przekładało się na fenotyp null. Wy- typu SNP w motywie GATA w regionie przyłączania kryte przez Haer-Wigman i wsp. warianty kodu- czynnika transkrypcyjnego GATA-1, co potwierdza jące antygen Jra ABCG2 *376C>T i *706C>T rolę intronu 1 w prawidłowości ekspresji antyge- zostały już wcześniej opisane. Z kolei zespół ja- nów grupy głównej. poński (Yamamuro i wsp.) prezentował doniesienie Z doniesień w sesji plakatowej zespół polski o wykryciu 10 nowych alleli genu ABCB6 u osób (Karolak i wsp., Wrocław i Opole) zaprezentował Lan-ujemnych w populacji japońskiej, z których ciekawe doniesienie o badaniach częstości wystę- najczęściej wykrywany wariant nosi delecję jed- powania polimorfizmów w genie FY kodującym nego nukleotydu w obrębie eksonu 1 [14]. W sesji swoistości antygenowe z układu Duffy w populacji plakatowej dwa zespoły japońskie (Tobita i wsp. polskiej przy użyciu analizy krzywych topnienia i Tanaka i wsp., Tokio) przedstawiły analizę podłoża o wysokiej rozdzielczości (HRM, high resolution genetycznego antygenu Jra w populacji japońskiej melting) [10]. W przebadanej grupie 495 dawców u osób Jra-ujemnych [15, 16]. Badacze wykryli wa- pochodzenia polskiego częstość występowania alle- riant ABCG2 *376C>T u 80% badanych dawców lu FY*A wynosiła 69%, a FY*B — 77%, a częstość i 13 nowych mutacji, które przekładały się na feno- polimorfizmu FY*B298G>A, kodującego wariant typ Jra-ujemny, a także 2 nowe mutacje typu mis- fenotypu słabe Fyb, określono na 30%. Zastosowa- sens o bardzo słabej ekspresji Jra+w. Doniesienia na technika pozwoliła zidentyfikować 3 nowe, ciche te ukazują szeroką heterogenność podłoża moleku- mutacje dotyczące zmiany jednego nukleotydu larnego grupy o fenotypie Lan-ujemny w różnych w regionie promotorowym lub kodującym. rasach, co przekłada się na zrozumienie, jak trudny Doniesienie zespołu polsko-szwedzkiego (Mi- będzie screening rzadkich dawców Lan-ujemnych chalewska i wsp., Warszawa i Lund) przedstawiało metodami biologii molekularnej. Natomiast wiedza nowe podłoże genetyczne fenotypu cis-AB wy- o genetyce fenotypu Jra-ujemnego pozwala przy- krytego u pacjentki polskiego pochodzenia [11]. puszczać, że identyfikowanie dawców o rzadkim Podstawy genetyczne fenotypu cis-AB w 2000 roku fenotypie Jra-ujemnym techniką genotypowania opisali Mifsud et al. [12], a obecna nazwa zgodna pozycji 376 i 706 genu ABCG2 jest możliwe. Ze z nomenklaturą ISBT wariantu to cisAB.02. Meto- względu na niską częstość tego allelu w kierun- dami SSP i RFLP-PCR określono genotyp pacjent- ku jego wykrycia może być wykonywane nawet ki, jako ABO*cisAB.02/0.01, a sekwencjonowanie w pulach przygotowanych ze zlania wielu próbek. eksonów 1-7 allelu cisAB ujawniło polimorfizm C Podsumowując, wiele zaprezentowanych do- w pozycji 796 charakterystyczny dla allelu A, ale niesień o nowych polimorfizmach czy allelach obecny w allelu B- tak jak to opisali Mifsud i wsp. wykrytych w genach kodujących swoistości antyge- Jednakże równocześnie wykryto sekwencję na nowe pozwala na dalsze poszerzanie i uaktualnianie końcu eksonu 7 genu ABO — specyficzną jedynie wiedzy o ich podłożu molekularnym, co prowadzi dla alleli nie-B, co jest nowym odkryciem, gdyż we do lepszego zrozumienia i przełożenia wyników wspomnianej wcześniej pracy nie sekwencjonowa- otrzymywanych metodami biologii molekularnej no tego regionu. na prawdopodobny fenotyp. Z sesji plakatowej warto wspomnieć o doniesieniach na temat badań podłoża molekularnego Piśmiennictwo antygenów powszechnych Lan i Jra u osób nieposia- dających tych swoistości. Typowanie serologiczne 1. Storry J., Joud M., Kronberg Christophersen M. i wsp. Intergrative genomics identities SMIM1 as the locus of a novel erythrocyte dawców zgodnych z takim biorcą jest wyjątkowo membrane protein and the Vel blood group system. Vox Sang. trudne ze względu na ograniczony dostęp do uni- 2013; 105 (supl. 1): 29. katowych surowic z przeciwciałami. Stąd techniki 2. Sussman L., Miller E. New blood factor: Vel. Rev Hematol. 1952; genotypowania alleli kodujących te powszechne 7: 368–371. swoistości antygenowe stanowią szybką i tanią 3. Haer-Wigman L., de Haas M., van der Schoot C. The immune alternatywę identyfikowania dawców o rzadkim response to the Vel antigen is HLA-class II DRB1*11 restricted. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 29. genotypie. Haer-Wigman i wsp. prezentowała 4. Weinstock C., von Zabern I., Hochsmann B. i wsp. CD59 defines wyniki sekwencjonowania tych genów u 6 osób a new blood group system. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 29–30. a Lan-ujemnych i 4 osób Jr -ujemnych pochodzenia 5. Karamatic Crew V., Thornton N, Bullocck T. i wsp. Serological holenderskiego. Przedstawiła też opracowany and molecular characterization of DOLC, a novel high incidence

www.jtm.viamedica.pl 103 Journal of Transfusion Medicine 2013, tom 6, nr 3

antigen in the Dombrock blood group system. Vox Sang. 2013; 11. Michalewska B., Hellberg A., Pelc-Kłopotowska M. i wsp. Genetic 105 (supl. 1): 30. basis of cis-AB in a woman from Poland where the phenotype was 6. Blancher A. Evolution of the ABO supergene family. Vox Sang. first described. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 228. 2013; 105: (supl. 1): 43. 12. Mifsud N., Watt J., Condon J., Haddad A., Sparrow R. A novel cis-AB 7. Cai X, Jin S., Liu X., Xiang D. Molecular genetic analysis of ABO variant allele arising from a nucleotide substitution A796C in the blood group variations reveals 29 novel ABO subgroup alleles. B transferase gene. Transfusion 2000; 40: 1276–1277. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 43–44. 13. Haer-Wigman L., Soussan A.,de Haas M., van der Schoot C. Mo- 8. Ogasawara K., Isa K., Tsuneyama H. i wsp. Molecular basis for Japane- lecular analysis of immunized Lan- or Jra- negative patients and

se individuals with Bm and Am. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 44. validation of genotyping assays to screen blood donors for Lan- or 9. Thuresson B., Hellberg A., Olsson M. Disruption of a binding site Jra-negativity. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 229. for the erythroid transcription factor GATA-1 in intron 1 of the 14. Yamamuro Y., Isa K., Ogasawara K. i wsp. The new mutation of

ABO gene in Am and Bm subgroup samples. Vox Sang. 2013; 105 ABCB6 gene i Lan- Japanese. Vox Sang. 2013; 105 (supl.1): 230. (supl. 1): 44. 15. Tobita R., Kaito S., Osabe T. i wsp. Genetic analysis of the Jr(a-) 10. Karolak E., Waśniowska K., Grodecka M., Klausa E., Misiaszek A. in Japanese people. Vox Sang. 2013; 105 (supl. 1): 230. Frequency of Duffy gene polymorphism in Polish population studied 16. Tanaka M., Kamada I., Takahashi J., Kimura K., Matsukura H., by high resolution melting (HRM) analysis. Vox Sang. 2013; 105 Tani Y. Novel Jr null allele in the Japanese population. Vox Sang. (supl. 1): 198. 2013; 105 (supl. 1): 230.

104 www.jtm.viamedica.pl