Etude Phytochimique Et Biologique Des Trois Alphitonia (Rhamnaceae) Endemiques a La Nouvelle-Caledonie

UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE DE PHARMACIE Ecole doctorale Science Technologie Santé

THESE pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE

MENTION : PHARMACIE Spécialité : Phytochimie

présentée et soutenue publiquement par

Dima MUHAMMAD le 25 juin 2013

ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DES TROIS ALPHITONIA

(RHAMNACEAE) ENDEMIQUES A LA NOUVELLE-CALEDONIE

Sous la direction du Pr. Laurence VOUTQUENNE-NAZABADIOKO

JURY Dr. Marc LITAUDON Rapporteur Dr. Mohamed HADDAD Rapporteur Pr. Catherine LAVAUD Président Pr. Sophie GANGLOFF Examinateur Dr. Alexandre MACIUK Examinateur Pr. Laurence VOUTQUENNE-NAZABADIOKO Directeur de Thèse

Remerciements

Ce travail de thèse, dirigé par le Professeur Laurence VOUTQUENNE- NAZABADIOKO, a été réalisé au sein du groupe Isolement et Structure à l’Institut de Chimie Moléculaire de Reims (ICMR, UMR CNRS 7312), Faculté de Pharmacie de l’Université de Reims Champagne-Ardenne, en bénéficiant d’une bourse accordée par le ministère de l’enseignement supérieur de la Syrie.

Tout d’abord, je tiens particulièrement à remercier l'ensemble des membres du jury qui m'ont fait l'honneur de leur présence.

Je remercie Madame le Professeur Catherine LAVAUD tout d’abord pour m’avoir accueillie au sein de l’équipe Isolement et Structure et d'avoir accepté de juger ce travail.

Madame le Professeur Sophie GANGLOFF pour son soutien lors de mon séjour dans le laboratoire de bactériologie, je lui suis également très reconnaissante de m’avoir fait l’honneur de juger ce travail.

Tous mes remerciements à Monsieur le Docteur Marc LITAUDON, de l’Institut de Chimie des Substances Naturelles (CNRS-ICSN) et à Monsieur le Docteur Mohamed HADDAD de l’Université Paul Sabatier PEPS-IRD, d’avoir accepté de se consacrer à la lecture de ce manuscrit et d’en être les rapporteurs, qu’ils soient assurés de ma profonde gratitude.

Je remercie également Monsieur le Docteur Alexandre MACIUK de l’université de Paris Sud UPS-11 d’avoir accepté de juger ce travail.

Je remercie très chaleureusement Madame le Professeur Laurence VOUTQUENNE-NAZABADIOKO d’avoir encadré ce travail. Ses conseils, son soutien et sa gentillesse m’ont été d’une grande aide pour l’aboutissement de ce travail, qu’elle soit assurée de ma profonde reconnaissance.

Je remercie également Monsieur le Professeur Jean-Hugues RENAULT, le Docteur Jane HUBERT et le Docteur Abdulmagid ALABDUL MAGID pour leurs aide et conseils scientifiques qui ont grandement contribué à la richesse de cette thèse.

Madame le Docteur Hélène BOBICHON, je lui adresse mes plus vifs remerciements de m’avoir initiée et guidée à réaliser mes tests en cyto-toxicologie, qu’elle soit assurée de ma profonde gratitude.

Je remercie également Monsieur le Professeur Mohammed NOUR de l’Université de Nouvelle-Calédonie de m’avoir confié ces plantes néo-calédoniennes.

Je remercie le Docteur Dominique HARAKAT pour sa gentillesse et d’avoir accepté de réaliser les analyses en spectrométrie de masse.

Je remercie toute l’équipe de RMN sous la direction de Monsieur le Docteur Jean-Marc NUZILLARD pour leurs conseils et de m’avoir permis de réaliser les analyses spectroscopiques de RMN.

Je remercie également Nathalie LALUN, Chantal GRIMPLET et Mireille COUSINAT pour leur gentillesse et pour toutes les préparations faites pour que les tests biologiques soient réalisés dans les meilleures conditions.

Un grand merci à tous les membres de l’équipe : Agathe, Charlotte, Nicolas, Benjamin, Anthony, à tous les doctorants et stagiaires (Nora et Alban) pour leur aide, leur bonne humeur et les repas partagés ensemble.

Un merci spécial à Naima, qui était toujours présente, malgré la distance, pour m’encourager et m’aider à me redresser après chaque échec.

A ma famille et à tous mes amis qui m’ont soutenue tout au long de ce travail.

Finalement, je remercie toutes les personnes qui ont contribué d’une façon ou d’une autre à l’aboutissement de ce travail.

À mes parents, mes frères et sœurs À la Syrie

SOMMAIRE

Liste d’abréviations 7 Introduction 11 I. Synthèse bibliographique 15 I.1. La Nouvelle-Calédonie "Richesse et Endémisme" 17 I.1.1. Types de végétation 18

I.1.2. Analyse des différentes unités taxonomiques de la flore des plantes 19 vasculaires de Nouvelle-Calédonie I.1.2.1. Les Ptéridophytes 19 I.1.2.2. Les Gymnospermes 19 I.1.2.3. Les Angiospermes monocotylédones 19 I.1.2.4. Les Angiospermes dicotylédones 19 I.2. Etude botanique 20 I.2.1. Place dans la systématique 20 I.2.2. La famille des Rhamnaceae (A. L. de Jessieu 1789) 22 I.2.2.1. Description botanique 23 I.2.2.2. Intérêt économique 24 I.2.2.3. Intoxications 24 I.2.3. Le genre Alphitonia 24 I.2.3.1. L’espèce Alphitonia neocaledonia 25 I.2.3.1.1. Description botanique 25 I.2.3.1.2. Habitat et répartition géographique 26 I.2.3.1.3. Les différentes utilisations d’A. neocaledonica 27 I.2.3.2. L’espèce Alphitonia xerocarpa 27 I.2.3.2.1. Description botanique 27 I.2.3.2.2. Répartition géographique 29 I.2.3.3. L’espèce Alphitonia erubescens Baill 29 I.2.3.3.1. Description botanique 29 I.2.3.3.2. Répartition géographique 30 I.3. Composition chimique des Rhamnaceae 31 I.3.1. Polyphénols 31 I.3.1.1. Les flavonoïdes 31 1.3.1.1.1. Les dérivés du 2-phénylchromone 32 1.3.1.1.2. Les dérivés du 2-phénylchromane 32 1.3.1.1.3. Les chalcones et aurones 33

I.3.1.2. Dérivés polyphénoliques isolés des Rhamnaceae 33 I.3.1.3. Dérivés phénoliques isolés du genre Alphitonia 36 I.3.2. Saponosides et triterpènes 37 I.3.2.1. Triterpènes pentacycliques 39 I.3.2.2. Triterpénoïdes tétracycliques 41 I.3.2.3. Phytostérols 42 I.3.3. Dérivés quinoniques 43 I.3.4. Alcaloïdes 46 I.3.4.1. Alcaloides cyclopeptidiques 47 I.3.4.2. Alcaloides de type isoquinoleïne 48 1.4. Propriétés biologiques des Rhamnaceae 51 1.4.1. Principales propriétés biologiques des métabolites secondaires 51 I.4.1.1. Composés phénoliques 51 I.4.1.2. Dérivés triterpéniques 51 1.4.1.3 Alcaloïdes 52 I.4.2. Approche ethnopharmacologique 52 II. ETUDE PHYTOCHIMIQUE DES TROIS ALPHITONIA 55 II.1. Etude phytochimique d’Alphitonia xerocarpa et Alphitonia erubescens 57 II.1.1. Etude phytochimique des branches d’A. xerocarpa 60

II.1.1.1. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle des 60 branches d’A. xerocarpa II.1.1.1.1. Détermination structurale du composé xb3 61 II.1.1.1.2. Détermination structurale des composés xb1 et xb2 70 II.1.1.1.3. Détermination structurale du composé xb4 75 II.1.2. Etude phytochimique des feuilles d’A. xerocarpa 79 II.1.2.1. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle 81 II.1.2.1.1. Détermination structurale du composé xf4 81 II.1.2.1.2. Détermination structurale du composé xf3 84 II.1.2.1.3. Détermination structurale du composé xf1 85 II.1.2.1.4. Détermination structurale du composé xf2 86 II.1.2.2. Identification des composés isolés de l’extrait hydro-alcoolique 90 II.1.2.2.1. Détermination structurale du composé xf17 90 II.1.2.2.2. Identification des saponosides xf5-xf9 à jujubogénine 97 II.1.2.2.2.1. Détermination structurale de la génine I (jujubogénine) 97 II.1.2.2.2.2. Détermination structurale des composés xf5 et xf6 106 II.1.2.2.2.3. Détermination structurale du composé xf7 111

II.1.2.2.2.4. Détermination structurale des composés xf8 et xf9 113

II.1.2.2.3. Identification des saponosides xf10-xf12 à 22α-hydroxy- 118 jujubogénine II.1.2.2.3.1. Détermination structurale de la génine II (22α-hydroxy- 118 jujubogénine) de xf10 II.1.2.2.3.2. Détermination structurale du composé xf10 119 II.1.2.2.3.3. Détermination structurale du composé xf11 121 II.1.2.2.3.4. Détermination structurale du composé xf12 124 II.1.2.2.4. Détermination structurale du saponoside xf13 128 II.1.2.2.4.1. Détermination structurale de la génine III 128 II.1.2.2.4.2. Détermination structurale de la partie osidique de xf13 131

II.1.2.2.5. Détermination structurale des saponosides xf14-xf16 dérivés du 132 16,17-seco-dammarane II.1.2.2.5.1. Détermination structurale de la partie osidique des composés 133 xf14-xf16 II.1.2.2.5.2. Détermination structurale de la partie aglycone du composé 134 xf16 II.1.2.2.5.3. Détermination structurale de la partie aglycone du composé 140 xf15 II.1.2.2.5.4. Détermination structurale de la partie aglycone du composé 142 xf14 II.1.2.2.5.5. Analyse des spectres de masse 143 II.1.2.2.6. Détermination structurale des flavonoïdes isolés de la fraction hydro- 146 alcoolique II.1.2.2.6.1. Détermination structurale du composé xf18 146 II.1.2.2.6.2. Détermination structurale du composé xf19 150 II.1.2.2.6.3. Détermination structurale des composés xf20 et xf21 153 II.1.2.3. Conclusion sur l’étude phytochimique des feuilles et branches 156 II.1.3. Etude phytochimique des écorces de tronc d’A. xerocarpa 158 II.1.3.1. Identification des triterpènes isolés de la fraction I 159 II.1.3.1.1. Détermination structurale du composé xe1 159 II.1.3.2. Identification des composés isolés de la fraction II 162 II.1.3.2.1. Détermination structurale des composés xe5, xe6 et xe7 162 II.1.3.2.2. Détermination structurale du composé xe2 167 II.1.3.2.3. Détermination structurale du composé xe3 174 II.1.3.2.4. Détermination structurale du composé xe4 178 II.1.3.3. Identification des composés isolés de la fraction IV 179 II.1.3.3.1. Détermination structurale du composé xe8 179 II.1.3.3.2. Détermination structurale des composés xe9-xe14 182 II.1.3.3.2.1. Détermination structurale du composé xe9 182

II.1.3.3.2.2. Détermination structurale des composés xe10-xe14 185 II.1.3.4. Conclusion sur l’étude phytochimique des écorces 191 II.2. Etude Phytochimique des fruits d’Alphitonia neocaledonica 192 II.2.1. Chimie extractive: 192 II.2.2. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle 198 II.2.2.1. Détermination structurale du composé nfr1 198 II.2.2.2. Détermination structurale du composé nfr2 201 II.2.2.3. Détermination structurale du compose nfr3 206

II.2.3. Identification des composés isolés de la fraction butanolique des fruits d’A. 209 neocaledonica II.2.3.1. Détermination structurale du composé nfr4 209 II.2.3.2. Détermination structurale du composé nfr6 212 II.2.3.3. Détermination structurale du composé nfr5 213 II.2.3.4. Détermination structurale du composé nfr7 215 II.2.3.5. Détermination structurale du composé nfr8 216 II.2.3.6. Détermination structurale du composé nfr9 219 II.2.4. Conclusion sur l’étude phytochimique des fruits 221 II.3. Hydrolyse des extraits 223 III. Evaluations des activités biologiques 225 III.1.Travaux antérieurs 227 III.1.1. Activité antioxydante et anti-tyrosinase 227 III.1.2. Activité antiproliférative de cellules cancéreuses 229 III.1.3. Activité antimicrobienne 231 III.1.4. Activité anti-inflammatoire 233 III.1.5. Autres activités biologiques 234 III.2. Résultats : 235 III.2.1 Evaluation de l’activité anti-oxydante 235 III.2.2. Evaluation de l’activité inhibitrice de la tyrosinase 237 III.2.3. Evaluation de l’activité antiproliférative par le test WST-1 240 III.2.4. Evaluation de l’activité antibactérienne 242 III.2.5. Conclusion 244 IV. Conclusion générale 247 V. partie expérimentale 253 V.1. Matériel et appareillage 255 V.1.1. Matériel végétal 255 V.1.2. Matériel chromatographique 255

V.1.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) 255 V.1.2.2. Chromatographie sur colonne ouverte (CC) 255 V.1.2.3. Chromatographie sous pression réduite (VLC) 256 V.1.2.4. Chromatographie sur colonne flash (CCF) 256 V.1.2.5. Chromatographie liquide haute performance (CLHP) 257 V.1.2.5.1. CLHP analytique et semi-préparative 257 V.1.2.5.2. CLHP préparative 258 V.1.2.6. Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) 258 V.1.2.6.1. Définitions 258 V.1.2.6.2. Mode de pompage 259 V.1.2.6.3. Modes de développement 259 V.1.2.6.3.1. Elution isocratique ou graduée 259 V.1.2.6.3.2. Elution en Dual Mode et l’élution extrusion 259 V.1.2.6.3.3. Elution par déplacement 260 V.1.2.6.3.4. pH zone-refining (pHZR°) 260 V.1.2.6.4. Intérêt de la CPC 260 V.1.2.6.5. Appareillage 261 V.1.2.6.5.1. Extracteur de Partage Centrifuge (EPC) 261 V.1.2.6.5.2. Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) 262 V.1.3. Méthodes physico-chimique 263

V.1.3.1. Pouvoir rotatoire 263

V.1.3.2. Spectrométrie Ultra-violette-visible (UV) 263

V.1.3.3. Spectrométrie de masse 264

V.1.3.4. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 264 V.2. Extraction, purification et hydrolyse 265 V.2.1. Composés isolés des branches d’A. xerocarpa 265 V.2.2. Composés isolés des feuilles d’Alphitonia xerocarpa 266 V.2.2.1. Purification de l’extrait acétate d’éthyle A.X.F.AcOEt 266 V.2.2.2. Purification de l’extrait hydro-alcoolique A.X.F.M 268 V.2.2.2.1. Purification de la fraction xf.I 268 V.2.2.2.2. Purification de la fraction xf.II 269 V.2.2.2.3. Purification de la fraction xf.III 271 V.2.3. Composés isolés des écorces d’Alphitonia xerocarpa 273 V.2.3.1. Purification de la fraction xe.I 274 V.2.3.2. Purification de la fraction xe.II 274 V.2.3.3. Purification de la fraction xe.IV 275

V.2.4. Extraction et purification des composés phénoliques des fruits d’Alphitonia 278 neocaledonica V.2.4.1. Purification de la fraction acétate d’éthyle 278 V.2.4.2. Purification de la fraction butanolique 280 V.2.4.2.1. Choix d’un système d’élution 280 V.2.4.2.2. Préparation de l’échantillon 280 V.2.4.2.3. Conditions expérimentales de l’élution 281 V.2.5. L’hydrolyse: 284 V.3. Tests biologiques 285 V.3.1. Activité antioxydante 285 V.3.2. Activité antityrosinase 286 V.3.2.1. Préparation des solutions 286 V.3.2.2. Préparation des plaques 287 V.3.3. Activité antiproliférative 288 V.3.3.1. Lignées cellulaires, matériaux, milieux et les produits à tester 288 V.3.3.2. Test WST-1 288 V.3.3.3. Mode opératoire 289 V.3.4. Activité antibactérienne 290 V.3.3.1. Microorganismes, matériaux, milieux et les produits testés 290 V.3.3.2. Technique de diffusion en milieu gélosé (Antibiogramme) 291 V.3.3.2.1. Préparation de la suspension bactérienne 291 V.3.3.2.2. Préparation des boîtes de Pétri 291

V.3.3.3. La détermination de la CMI par microméthode de dilution en milieu 292 liquide V.3.3.3.1. La préparation des produits 292 V.3.3.3.2. La préparation de l’inoculum 292 V.3.3.3.3. Préparation des microplaques 293 V.3.3.3.4. Incubation et lecture des plaques 293 V.4. Caractéristiques des composés isolés 294 V.4.1. Composés isolés à partir des branches d’A. xerocarpa 294 V.4.2. Composés isolés à partir des feuilles d’A. xerocarpa 295 V.4.3. Composés isolés à partir des écorces d’A. xerocarpa 300 V.4.4. Composés isolés à partir des fruits d’A. neocaledonica 304 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 307

Liste d’abréviations

Extraits et produits isolés

A.E.Bo. extrait des bois d’A. erubescens A.E.E. extrait des écorces d’A. erubescens A.E.F. extrait des feuilles d’A. erubescens A.N.Fr. extrait des fruits d’A. neocaledonica A.X.B. extrait des branches d’A. xerocarpa A.X.E. extrait des écorces d’A. xerocarpa A.X.F. extrait des feuilles d’A. xerocarpa nfr Produit isolé des fruits d’A. neocaledonica xb Produit isolé des branches d’A. xerocarpa xe Produit isolé des écorces d’A. xerocarpa xf Produit isolé des feuilles d’A. xerocarpa fr fraction Solvants et réactifs

AcOEt acétate d’éthyle AlCl3 chlorure d’aluminium BuOH butanol CD3OD méthanol deutéré CHCl3 chloroforme CDCl3 chloroforme deutéré DMSO-d6 diméthylsulfoxyde deutéré D2O eau deutérée H3BO3 Acide borique HCl Acide chlorhydrique H2SO4 acide sulfurique isoPro isopropanol MeCN acétonitrile MeCOEt méthyléthylcétone MeOH : méthanol M-H Mueller-Hinton NaOAc Acétate de sodium NaOH Hydroxyde de sodium PBS Phosphate Buffer Saline, (tampon phosphate salin) TFA acide trifluoroacétique

Technique chromatographique :

CCM Chromatographie sur Couche Mince CC Chromatographie sur Colonne ouverte de silice CLHP Chromatographie Liquide Haute Performance CPP Chromatographie sur Plaque Préparative CPC Chromatographie de Partage Centrifuge EPC Extracteur de Partage Centrifuge

C18 Silice greffée g gramme K Coefficient de partage l Litre ml millilitre min minute

mob phase mobile

SiO2 silice normale stat phase stationnaire tr temps de rétention VLC chromatographie liquide sous vide Détermination structurale

Ara α-L-arabinose Gal β-D-galactopyranose Glc β-D-glucopyranose Rha α-L-rhamnopyranose ax axial COSY COrrelated SpectroscopY d doublet dd doublet de doublets ddd doublet de doublets de doublet dl doublet large dm doublet de multiplet dq doublet de quadruplet dt doublet de triplet eq équatorial HMBC Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Connectivity J (Hz) constante de couplage exprimée en Hertz m multiplet NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY ppm parties par million qt quintuplet RMN Résonance Magnétique Nucléaire RMN 13C Résonance Magnétique Nucléaire du carbone RMN1H Résonance Magnétique Nucléaire du proton rOe rotation Overhauser effect ROESY ROtating Overhauser Effect SpectroscopY s singulet sl singulet large t triplet td triplet de doublet TOCSY TOtal Correlation SpectroscopY

δC Déplacement chimique du carbone en ppm

δH Déplacement chimique du proton en ppm ESI ElectroSpray Ionization (ionisation par électrospray)

HR haute résolution m/z masse/charge d’un ion SM Spectrométrie de Masse UV Ultra-Violet

λmax longeur d’onde maximale

[α] D Pouvoir rotatoire

Activité biologique

ATCC American type culture collection

CI50 Concentration Inhibitrice à 50% CMI Concentration Minimale Inhibitrice DPPH• 1,1-diphényl-2-picryl-hydrazyl TNF α Tumor Necrosis Factor-alpha

Introduction

A partir du milieu de 20ème siècle la recherche de nouvelles molécules à des fins industrielles assiste à une accélération surprenante d’autant plus flagrante aux niveaux thérapeutiques et agroalimentaires.

L’approche ethno-pharmacologique ayant comme objectif la mise en relief des plantes médicinales comme étant une source riche en substances bioactives, ouvre les portes de l’exploitation de ces dernières tout en menant des études phytochimique et biologique.

Que ce soit pour des raisons pharmacologiques, économiques ou écologiques, les travaux de synthèse et d’hémi-synthèse organiques rejoignent cette démarche dans le but de concevoir des molécules plus efficaces et néanmoins moins coûteuses pour l’homme et l’environnement.

La Nouvelle-Calédonie possède un patrimoine naturel exceptionnel caractérisé par une flore unique au monde avec 3332 espèces végétales dont 2551 endémiques [1]. Cet archipel du pacifique intéresse les scientifiques, attirés non seulement par ses atouts géographiques et floristiques mais aussi par le danger d’extinction qui menace plusieurs espèces végétales et animales.

Le présent travail s’inscrit dans le cadre d’une collaboration de recherche développée entre l’Institut de Chimie Moléculaire de Reims (ICMR, CNRS UMR 7312) de l’Université de Reims Champagne-Ardenne et le Laboratoire de Phytochimie des Substances Naturelles de l’Université de Nouvelle-Calédonie visant à valoriser les plantes endémiques de la Nouvelle- Calédonie.

La sélection des plantes étudiées est basée principalement sur leur endémisme. Les trois espèces choisies appartiennent au genre Alphitonia de la famille des Rhamnaceae.

L’objectif étant de contribuer à l’amélioration des connaissances chimio-taxonomique et biologique de ces plantes, nous avons mené une étude phytochimique et biologique sur trois parties végétales d’A. xerocarpa (feuilles, écorces et branches) et trois autres d’A. erubescens (feuilles, écorces et bois), en plus des fruits d’A. neocaledonica.

Seul A. neocaledonica, utilisé en médicine traditionnelle locale, a été partiellement étudié, ainsi trois flavonoïdes ont été isolés de ses feuilles [2]. A. xerocarpa est une espèce abondante principalement dans la région sud de la Grande Terre, tandis que l’apparition d’A. erubescens se fait de plus en plus rare, d’ailleurs cette espèce a été listée parmi les plantes

menacées publiée en 1997 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) [3].

Ce manuscrit sera divisé en cinq principaux chapitres :

le premier chapitre bibliographique sera consacré à une présentation de la flore néo- calédonienne, une étude sur la classification botanique, la description morphologique et chimiotaxonomique de la famille des Rhamnaceae ainsi que celles des trois espèces étudiées, puis nous présenterons les propriétés biologiques de cette famille au travers de quelques travaux ethnopharmacologiques réalisés. les deuxième et troisième chapitres seront dédiés aux travaux personnels. Le second chapitre présentera les résultats des études phytochimiques alors que l’évaluation des activités antioxydante, anti-tyrosinase, antibactérienne et antiproliférative des métabolites secondaires isolés sera présentée dans le troisième chapitre. la conclusion générale de l’ensemble des travaux réalisés. le dernier chapitre évoquera les détails expérimentaux des études phytochimique et biologique.

I. Synthèse bibliographique

I.1. La Nouvelle-Calédonie "Richesse et Endémisme"

La Nouvelle-Calédonie, un archipel isolé situé dans la zone intertropicale dans l’océan pacifique, à 1500 km à l’Est de l’Australie et à 1900 km au Nord de la Nouvelle-Zélande, présente un biotope terrestre caractérisé par une composition globale inhabituelle avec un taux d'endémisme très élevé d’environ 76 %.

Formée il y a quelques 80 millions d’années, son île principale, nommé la « Grande Terre », comporte une côte Est très humide aux vallées encaissées entre des montagnes et une côte Ouest sèche avec de vastes plaines de savanes. Au centre, une chaîne de montagne sépare les deux côtés et s’étend sur toute la longueur.

Une approche a été élaborée par Myers et al [1], dont l’objectif est de déterminer les régions prioritaires exigeant des mesures conservatoires pour la protection d’espèces végétales et animales menacées.

Ces régions correspondent à 25 zones, appelée "biodiversity hotspots" (Figure I-1), ayant les concentrations en espèces endémiques les plus élevées et présentent 133149 espèces endémiques soit 44% des plantes existantes dans le monde.

Figure I-1 : Les 25 "points chauds" selon Myers et al.[1]

Selon cette classification la Nouvelle-Calédonie est considérée comme une unité biogéographique de 18 600 km2 dont 28% sont des régions de végétation primaire soit 5200 km2, avec 3332 espèces végétales dont 2551 endémiques correspondant à un ratio (espèces

endémiques/100 km2 égal à 49,1 ce qui place la Nouvelle-Calédonie en troisième position parmi les 25 "points chauds" après les forêts côtières de Tanzanie / Kenya (75) et les Philippines (64,7).

La flore de la Nouvelle-Calédonie est composée de nombreuses espèces végétales dont 5 familles et 112 genres sont endémiques [1]. Environ 25% des espèces endémiques sont menacées et cinq espèces sont déjà éteintes, d’après Jaffré et al. [4] 83% de ces plantes se distribuent en dehors des régions protégées. Ces dernières géographiquement et floristiquement mal distribuées sont concentrées dans les forêts et les maquis de haute altitude, c’est pour cela que le réseau des régions protégées doit être étendu.

I.1.1. Types de végétation [4]

Cinq types de végétation sont distingués d’un point de vue écologique :

i. la forêt dense humide sempervirente regroupant des forêts de basse et moyenne altitudes. Elle s’étend du nord au Sud, le long de la chaîne centrale et regrouperait près de 80% d’espèces endémiques ii. la forêt sclérophylle appelée aussi « forêt sèche », correspondant à la formation végétale des zones peu arrosées sur roches sédimentaires ou volcaniques. Elle est localisée sur la côte Ouest le long du littoral et se trouve menacées de disparition. iii. le maquis minier, pris ici dans son acception locale, de basse et moyenne altitudes (<900 m) renferme des groupements non forestières sur roches ultramafiques ainsi que des groupements arbustifs ou ligno-herbacés bas sur roches siliceuses [5]; dont près de 90 % d’espèces endémiques, iv. le maquis minier de haute altitude (> 900 m), v. les savanes et les fourrés secondaires : regroupant, entre autres, les savanes herbeuses et les savanes arborées. Sa flore y est assez pauvre. On peut citer les savanes à Niaouli dans le Nord de la Grande Terre.

I.1.2. Analyse des différentes unités taxonomiques de la flore des plantes vasculaires de Nouvelle-Calédonie [5] I.1.2.1. Les Ptéridophytes

Les Ptéridophytes ou fougères rassemblent 259 espèces réparties entre 26 familles et 84 genres autochtones. La famille la plus riche est celle des Hymenophyllaceae, 30 espèces, elle est suivie par la famille des Adiantaceae (25 espèces).

Il est dénombré dans ce groupe 103 espèces endémiques de l'archipel de Nouvelle-Calédonie.

I.1.2.2. Les Gymnospermes

Hormis Cycas celebica de la famille des Cycadaceae, les Gymnospermes autochtones comptent 43 espèces endémiques dans le groupe des conifères. Elles appartiennent à 4 familles et se répartissent entre 14 genres, dont 3 sont endémiques monotypiques (Parasitaxus, Neocallitropsis et Austrotaxus).

La plupart des Gymnospermes se situent en forêt dense humide et parmi les espèces les plus représentatives et ancienne (100 million d’années), on retrouve les Araucaria (Araucariaceae) avec 13 espèces endémiques alors qu’il en existe 19 dans le monde.

I.1.2.3. Les Angiospermes monocotylédones

Cet embranchement regroupe 31 familles, 207 genres et 536 espèces en Nouvelle- Calédonie. La famille des Orchidaceae possède le plus grand nombre de genres (75) et d'espèces (205).

Au total, 244 espèces sont endémiques de la Nouvelle-Calédonie et se répartissent entre 85 genres.

I.1.2.4. Les Angiospermes dicotylédones

Cette flore néo-calédonienne comprend 132 familles, 498 genres et 2422 espèces autochtones. Les familles les plus riches en espèces sont, dans l'ordre, les Myrtaceae (236 espèces), Rubiaceae (228 espèces), Euphorbiaceae (211 espèces), Apocynaceae (103 espèces) puis Rutaceae (94 espèces); Ces 5 familles renferment 36 % des espèces.

On dénombre 2033 espèces endémiques réparties sur un total de 310 genres autochtones appartenant à 100 familles, parmi lesquels 79 genres et 5 familles sont endémiques : Amborellaceae (1 espèce Amborella trichopoda), Paracryphiaceae (1 espèce, Paracryphia alticola), Strasburgeriaceae (1 espèce, Strasburgeria robusta), Oncothecaceae (2 espèces, Oncotheca balanseae, O. humboldtiana) et Phellinaceae (10 espèces).

Les Rhamnaceae sont présentés par 6 genres autochtones renfermant 10 espèces dont 7 endémiques à l’archipel (Tableau I-1).

Tableau I-1 : Les espèces de la famille des Rhamnaceae en Nouvelle-Calédonie Genre espèce Endémisme A. erubescens Baill. + Alphitonia A. neocaledonica (Schltr.) Guillaumin + A. xerocarpa BaiIl. + V. buxoides Baill. + Ventilago V. neocaledonica Schltr. V. pseudocalyculata Guillaumin + Colubrina C. asiatica L. Brongn. Rharnnella R. vitiensis (Benth.) A.C.Smith Ernrnenosperrna E. pancherianurn Baill. + Gouania G. leratii Schltr. +

I.2. Etude botanique I.2.1. Place dans la systématique

Selon la systématique actuelle, les trois Alphitonia originaires de Nouvelle-Calédonie que nous avons étudiées sont des Angiospermes Eudicotylédones appartenant au clade des Rosidées, sous-clade des Fabidées, à l’ordre des Rosales et à la famille des Rhamnaceae.

Selon la classification phylogénétique, les Angiospermes (plantes à ovaires) appartiennent aux Spermatophytes (plantes à graines), Trachéophytes (plantes à vaisseaux), Embryophytes (plantes à archégone) et au règne des Plantae. Cet embranchement est désormais appelé clade dans les dernières classifications dites cladistiques qui essaient de reconstituer l’évolution des végétaux en se basant sur des études moléculaires en comparant les séquences d’ADN. C’est le but que s’est donné l’Angiosperm Phylogeny Group ou APG qui publia en 1998 son premier cladogramme. Depuis celui-ci a été réévalué et la dernière classification en vigueur est l’APG III publié en 2009 [6].

Les Angiospermes avec plus de 250000 espèces représentent 85% des Plantes terrestres ou Embryophytes. On y dénombre 410 familles réparties en 58 ordres.

D’après APG III, les Angiospermes sont divisées en deux clades selon la présence d’un grain de pollen à une seule aperture, Les Monoporés ou à trois apertures les Triporées [6]. Les Triporées ou Eudicotylédones forment l’ensemble le plus vaste des Angiospermes avec 302 familles et 38 ordres. Ils possèdent un embryon dicotylédone. Ils se subdivisent en trois clades principaux les Prototriporées à fleurs primitives trimères généralement formées de tépales, les Triporées centrales à fleurs pentamères souvent dialypétales et les Triporées évoluées à fleurs pentamères évoluant vers la gamopétalie.

Les triporées centrales comprennent le clade des Rosidées et l’ordre des Saxifragales ou Pré-rosidées.

Le clade des Rosidées est le plus vaste des Triporées après les Astéridées avec près de 82 000 espèces. Il est divisés en trois, les Fabidées (Eurosidées I), les Malvidées (Eurosidées II) et l’ordre des Vitales (Figure I-2). Les fleurs des Rosidées sont généralement pentamères et pentacycliques, à sépales et pétales différenciés. Les pétales sont en principe libres entre eux, et parfois aussi les carpelles. L’androcée est souvent méristémone et l’ovaire est infère.

Le clade des Fabidées comprend 9 ordres (Figure I-2) et celui des Malvidées en contient 8. Les Fabidées ont des carpelles libres ou soudés et des feuilles simples, entières ou découpées alors que les Malvidées ont des carpelles toujours soudés et des feuilles composées ou découpées.

L’ordre des Rosales appartient au clade des Fabidées et renferme environ 7725 espèces réparties en 9 familles et 262 genres [6]. Il est fort hétérogène quant à sa morphologie, mais la réduction (ou l’absence) d’un hypanthium (Figure I-3) pourrait aussi être une synapomorphie de ces familles, cet organe creux qui permet à l’ovaire d’être infère et que nous pouvons retrouver dans les Rosaceae, Rhamnaceae et Ulmaceae, a probablement été perdu dans les familles plus évoluées comme les Moraceae, les Cannabaceae et les Urticaceae [7].

Triporées centrales Saxifragales

Vitales• (prér

osidé Zygophyllales• es)(préro Célastraleses sidées )

Fabidées Rosidées Oxalidales•• (préro(préro sidées • (pré sidées • ( Malpighiales• (préro) rosi ) p sidées dées Fabales• (préro r ) ) sidées é Rosales • )(préro r Fagales • sidées(préro o )sidées si Cucurbitales• (préro ) d sidées Malvidées • (préro) é e sidées • (pré s) ) Figure I-2 : Cladogramme des Triporéesrosi Centrales (d’après l’APG III, simplifié) [6]. dée s) Anthère

Pétale Etamine

Stigmate Sépale

Hypanthium Ovaire

Figure I-3 : Coupe schématique d’une fleur de Rosaceae à ovaire infère.

I.2.2. La famille des Rhamnaceae (A. L. de Jessieu 1789)

La Famille des Rhamnaceae, très ancienne (Crétacé supérieur), renferme 950 espèces [6], réparties en 45 genres dont nous citerons les principaux : Rhamnus (150 espèces), Phylica (150 espèces), Zizyphus (100 espèces), Gouania (60 espèces), Pomaderris (55 espèces dont 50 sont endémiques d’Australie) et Ceanothus (50 espèces).

Cette famille est dévisée en 11 tribus repartis en trois sous-familles [8] [9] : les Ziziphoides, les Rhamnoides et le Ampeloziziphoides [8] [9] [10].

Quasi cosmopolites (Figure I-4), cette famille est particulièrement diversifiée dans les régions tropicales, y compris quelques espèces dans les régions arides caractéristiques des sols calcaires.

Figure I-4 : Répartition géographique des espèces de la famille des Rhamnaceae [6].

Sur le territoire de la Nouvelle-Calédonie, les Rhamnaceae sont représentées par une demi-douzaine de genres rassemblant au total dix espèces dont la moitié sont endémiques (Tableau I-1), le genre le mieux représenté étant le genre Alphitonia avec trois espèces toutes endémiques (A. neocaledonica, A. xerocarpa et A. erubescens).

I.2.2.1. Description botanique [11] Les Rhamnaceae sont des arbres, arbustes, souvent épineux, ou des lianes à vrilles, volubiles, ou étayée par les branches axillaires, parfois à nodules symbiotiques abritant des bactéries fixatrices d’azote du genre Frankia. Les feuilles possèdent des stipules, parfois épineuses. Ces feuilles sont alternes ou plus rarement opposées ou palmées, à réseau tertiaire souvent grillagé et en relief.

Les Rhamnaceae ont une inflorescence déterminée en cyme, parfois réduites à une fleur solitaire, axillaire ou terminale.

Les fleurs sont généralement hermaphrodites, actinomorphes, petites à hypanthium discoïdes ou cylindrique, tétra- ou le plus souvent pentamère. Le calice comporte 4-5 sépales libres, la corole 4-5 pétales libres, l’androcée 4-5 étamines opposées aux pétales à anthères à 2 loges, et le gynécée 2-3 carpelles souvent soudés en un ovaire soit supère soit infère.

Formule florale : * 4-5 S, 4-5 P, 4-5 E, 2-3 C.

Les fruits sont généralement charnus en drupe parfois déhiscente ou secs en capsule, s’ouvrant en 2 valves ou en samare.

I.2.2.2. Intérêt économique

Les fruits de Zizyphus jujuba Miller (= Ziziphus zizyphus (L.) Meikle), le jujubier ou Dattier de Chine et les pédicelles charnus de Hovenia dulcis sont comestibles.

Les genres Ceanothus, Colletia, Alphitonia (Pomaderris), Rhamnus et Phylica produisent des espèces ornementales.

Les fruits de divers Rhamnus renferment des principes colorants utilisés par les artistes peintres pour donner des tons jaunes et verts.

Plusieurs espèces renferment des hétérosides hydroxyanthracéniques recherchés pour leurs propriétés laxatives. Les écorces de bourdaine (Frangula alnus) et cascara (Frangula purshiana) et les fruits du nerprun (Rhamnus cathartica) sont diurétiques et laxatifs [12].

I.2.2.3. Intoxications

Les fruits des arbustes de nos régions sont des purgatifs plus ou moins drastiques. Ce sont des drupes, rouges puis noires à maturités.

Les fruits du genre nord-américain sont neurotoxiques et provoquent une paralysie progressive qui peut être irréversible [12].

I.2.3. Le genre Alphitonia

Le genre Alphitonia Reissek ex Endl. appartient à la sous-famille des Ziziphoides comme les genres Ziziphus, Gouania, Pomaderris et Ceanothus mais à l’heure actuelle les études phylogénétiques n’ont pas permis de le classer dans une tribu [9] [10].

Le genre Alphitonia compte une vingtaine d’espèces parmi lesquelles nous pouvons citer : - A. philippinensis Braid ou Tolu, espèce commerciale de philippine utilisée pour son bois [13]. - A. excelsa, A. petriei, et A. whitei d’Australie [14].

- A. zizyphoides, de l’archipel du Tonga dans les îles SAMOA [15] dont les écorces sont utilisées en médecine traditionnelle contre les troubles gastro-intestinaux et uro-génitaux [16]. Ces écorces sont utilisées à Tahiti sous forme de lotion pour traiter l’eczéma, tandis que l’infusion de ces écorces et utilisée dans les îles Tonga contre la toux, les maux de tête et les douleurs menstruelles [17]. - A. neocaledonica, A. xerocarpa et A. erubescens de la Nouvelle-Calédonie [18].

I.2.3.1. L’espèce Alphitonia neocaledonia [19] [20]

Connue comme Alphitonia commun, kùa (xârâcùù), surnommé "bois savon" ou "savon des mineurs" car ses écorces broyées fournissent avec l’eau une écume abondante, cette eau mousseuse agréablement parfumée était couramment utilisée pour la toilette des mains des travailleurs de la mine.

I.2.3.1.1. Description botanique

Alphitonia neocaledonica est un arbuste mince, élancé, de faible diamètre (40 cm) avec une écorce marbrée, une cime ronde, des branches minces, des feuilles petites uniformément clairsemées et un feuillage clair. Il est très ramifié avec des feuilles alternes ce qui donne un aspect en zig-zag aux petites ramifications.

Les rameaux sont veloutés de couleur gris plomb. L’écorce est claire, assez lisse, blanc-verdâtre à l’extérieur; fibreuse, rose carmin et collante à l’intérieur. Elle est mince et se détache facilement. Elle exhale une odeur balsamique très nette de salicylate de méthyle.

L’aubier est rose peu épais et le bois de cœur rouge groseille devenant rose vif en séchant, satiné sans accroissements visibles.

Les feuilles sont entières coriaces, ovales elliptiques, de 10 cm de long (Figure I-5a). Les nervures pennées sont canaliculées en dessus, très saillantes en dessous.

La floraison a généralement lieu de décembre à mai. Les fleurs, 4 mm de diamètre en forme de petites étoiles élégantes, sont disposées en grappes veloutées fauves, naissant à l’aisselle des feuilles terminales aplaties (Figure I-5b). Elles ont 5 sépales charnus, triangulaires, tournés à l’extérieur, lisses, blanc-verdâtre à l’intérieur et 5 étamines alternantes tournées vers l’extérieur. L’ovaire est infère, à deux stigmates entourés d’une plage pubescente jaune vif, le bas du style est entouré d’un anneau de poils [21].

Les fruits murs en août, sont ronds, noirs de la grosseur d’une petite cerise (Figure I- 5c), ils portent une saillie circulaire qui divise la surface en deux, la pulpe est fibreuse, contenant 2-3 noyaux très durs, jaunes, qui se fondent longitudinalement à maturité, puis tombent en laissant chacun une graine recouverte d’un arille rouge membraneuse. Les graines sont lisses, brillantes, noirs et très durs.

(a)

(b) (c)

Figure I-5: (à gauche) Rameau d’Alphitonia neocaledonica GUIL. [22], (à droite) Rameau avec des fruits immatures (a) fleurs en grappes (b), un fruit mature d’Alphitonia neocaledonica (c).

I.2.3.1.2. Habitat et répartition géographique

A. neocaledonica est très commun en forêt basse secondaire ou en forêt claire sur péridotites, moins fréquent sur terrains sédimentaires, capable de germer dans des conditions très spécifiques. Il est surnommé le faux pomaderris et "prépare le lit" car il vient tempérer l’ambiance de la terre rouge ou cuirasse par un feuillage dense qui forme en décomposant une litière qui garde l’humidité bienfaitrice.

On le trouve sur l’ensemble de la Grande Terre, plus l’île des Pins (Province Sud) et les Bélep et à Yandé (Province Nord) (Figure I-6).

Figure I-6 : Répartition géographique d’A. neocaledonica [23].

I.2.3.1.3. Les différentes utilisations d’A. neocaledonica [22] [19]

L’écorce fraîche, amère et astringente, sert au traitement de certaines dermatoses (eczéma, ecthyma, pityriasis) et des douleurs rhumatismales. A cette fin on utilise des lotions préparées avec de l’écorce fraîche, pilée, qui dégage une odeur particulière due sans doute à la présence de salicylate de méthyle. Ce serait aussi un remède contre l’impuissance.

Ses feuilles sont utilisées contes le rhumatisme, dermatoses et en applications locales, facilitent les accouchements [22].

I.2.3.2. L’espèce Alphitonia xerocarpa [24]

I.2.3.2.1. Description botanique

Alphitonia xerocarpa, décrit pour la première fois par Dr. H. Baillon en 1867 [24], est un dense arbuste ou arbrisseau (1 m).

Les feuilles sont totalement glabres en position alternée, elles ont une forme obovale, elliptique (3x6 cm) avec des sommets arrondis (Figure I-7). Coriaces, elles portent des nervures principales convergentes et les nervures secondaires forment une série des boucles à peine visibles. Les jeunes pousses sont de couleur verte pâle.

Figure I-7 : A: Rameau d’Alphitonia xerocarpa Baill [25]. B: fleur, C: sépale, D-E: Pétale +étamine, F-G: étamine, H: ovaire.

La floraison a généralement lieu en octobre sur les montagnes Mont Mou à Paït (1250 m au dessus de la mer) et en novembre à 800 m d’altitude [25]. Les fleurs, hermaphrodites, sont petites, blanchâtres, aplaties à l'intérieur. Elles sont disposées en grappes terminales et portées par des pédicules. Les fleurs portent 5 sépales et 5 pétales dont la longueur égale à la moitié de celle des sépales [21], avec des filets staminaux peu dilatés à la base, longs d’environs 1 mm [18]. L’ovaire est infère, avec un stigmate trifide et un style à pointe conique sans l’anneau de poils observés chez A. neocaledonia.

Les fruits immatures portés par des pédoncules, ont une forme ovoïde ou conique (Figure I-8).

(a) (b)

I.2.3.2.2. Répartition géographique

Alphitonia xerocarpa se trouve principalement sur les montagnes au sud de la Nouvelle-Calédonie à 800-900 m d’altitude (Figure I-9).

Figure I-9 : Répartition géographique d’A. xerocarpa [23].

I.2.3.3. L’espèce Alphitonia erubescens Baill [24]

I.2.3.3.1. Description botanique

C’est un arbrisseau de 2 m environ, avec des branches cylindriques de couleur foncé, en disposition alternées.

Les feuilles coriaces, glabres sont subsessiles (pétiolules 1-2 mm) disposées aux sommets des rameaux. Elles ont une forme obovale (3x5 cm) arrondie souvent émarginé (Figure I-10). Les nervures principales sont pennées à peine visibles.

Les fleurs brun-rougeâtres sont disposées en grappes à l’aisselle des feuilles des branches terminales, avec de longs pédoncules (3 cm) parfaitement glabre. La fleur compte 5 sépales et 5 pétales; contrairement à celle d’A. xerocarpa, les pétales d’A. erubescens sont plus petites et n’égalent pas la ½ longueur des sépales, en plus les filets staminaux sont très dilatés à la base, 0,5 mm de long.

Figure I-10 :( à gauche) A: Rameau d’Alphitonia erubescens [26], B: fleur, C-D: Pétale+étamine, E: étamine, F: ovaire. (à droite) : Rameau d’Alphitonia erubescens à l’Herbier Muséum de Paris.

I.2.3.3.2. Répartition géographique

Les arbres d’A. erubescens se font de plus en plus rares. Des récoltes d’échantillons effectuées par l’institut de recherche pour le développement IRD de Nouméa, ont eu lieu à Yaté et Dumbéa de la Provence sud entre 1972-1987, et à Kaala-Gomén en Province nord en 2005 (Figure I-11).

L’Alphitonia erubescens a été listé dans la liste des plantes menacées publiée en 1997 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) [3]

Figure I-11 : Répartition géographique d’A. erubescens [23].

I.3. Composition chimique des Rhamnaceae

Les différentes études phytochimiques réalisées sur les espèces de la famille des Rhamnaceae ont montré la présence de polyphénols, de saponosides, de dérivés quinoniques, d’alcaloïdes et d’acides organiques [27].

Nous allons présenter les structures de quelques-uns de ces métabolites secondaires isolés de la famille des Rhamnaceae et du genre Alphitonia. Cette liste n’est pas exhaustive et nous présenterons les structures des composés les plus fréquemment rencontrés.

I.3.1. Polyphénols Les investigations phytochimiques menées sur des différentes espèces de la famille des Rhamnaceae, ont montré la présence de polyphénols sous forme de flavonoïdes, tanins et dérivés de l’acide benzoïque.

I.3.1.1. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes sont des molécules en C6-C3-C6 composés de deux cycles benzéniques reliés par un élément en C3. Ils ont une origine biosynthétique commune et possèdent la même structure de base à savoir l’enchaînement 2-phénylchromane (Figure 1-12).

3' 3' 4' 4' 8 1 B 8 1 B O 1' O 1' 7 7 2 A 2 A C C 6 3 6 3 5 4 5 4 O

Figure I-12 : Structures du 2-phényl chromane ou noyau flavane (à gauche) et du 2-phényl chromone (à droite)

Les flavonoïdes sont largement distribués dans le règne végétal où ils existent, le plus souvent sous la forme soluble d'hétérosides. Près de 5000 flavonoïdes ont été décrits.

On distingue plusieurs classes de flavonoïdes [28] [29].

1.3.1.1.1. Les dérivés du 2-phénylchromone

Cette classe regroupe les flavones, flavonols, flavanones et les dihydroflavonols.

Chez ces molécules, le cycle A est dans la plupart des cas substitué par deux hydroxyles phénoliques en position 5 et 7 et le cycle B par un hydroxyle en position 4' ou deux hydroxyles en position 3' et 4' (Figure I-13). Les flavanones et dihydroflavonols sont caractérisés par l’absence de double liaison en position 2, 3 et par la présence de centres d’asymétrie. Chez les flavanones naturelles, le carbone C-2 est normalement de configuration 2S et chez les dihydroflavonols hydroxylés en position 3, la configuration est généralement trans (2R, 3R).

R R 3' OH 3' OH 4' 4'

HO O HO O 7 2 7 2

6 3 3 6 5 5 OH OH O OH O R=H (apigénol) R=H (kaempférol) R=OH (lutéolol) R= OH (quercétol)

Flavones Flavonols

R R 3' OH OH 4'

HO O HO O 7 H H

6 OH 5 R OH O OH O R=H (naringétol) R=H (dihydrokaempférol) R=OH (ériodictyol) R= OH (dihydroquercétol)

Flavanones Dihydroflavonols

Figure I-13 : Structures des flavones, flavonols, dihydroflavonols et flavanones

1.3.1.1.2. Les dérivés du 2-phénylchromane

Les catéchols (flavan-3-ol) et les leucoanthocyanes (flavan-3,4-diols) ne possèdent pas de fonction carbonyle en position 4. Ils sont poly-hydroxylés de la même façon que décrite pour les dérivés du 2-phénylchromone (Figure I-14).

R R OH OH

HO O HO O H H OH OH H OH H OH R=H, afzéléchol OH R=OH, catéchol

Flavan-3-ol Flavan-3,4-diols

Figure I-14 : Structures des flavan-3-ol et flavan-3,4-diols

1.3.1.1.3. Les chalcones et aurones

Les chalcones sont dépourvues de l’hétérocycle central et sont caractérisées par la présence d’un chaînon tricarboné, cétonique, α,β-insaturé (Figure I-15). Les substitutions sur le noyau A sont le plus souvent identiques à celles des autres flavonoïdes mais le noyau B est assez fréquemment monosubstitué ou non substitué.

Les aurones sont des homologues des flavones mais à noyau C pentacyclique.

OH R 3 OH 4 1 HO HO O

R=H, isoliquiritigénine, R=OH, Butéine 1' (Hispidol) 2' O O Chalcones Aurones

Figure I-15 : Structures des chalcones et aurones

I.3.1.2. Dérivés polyphénoliques isolés des Rhamnaceae

Parmi les flavonoïdes les plus répandus dans la famille des Rhamnaceae nous pouvons citer les noyaux flavonols suivant (Figure I-16):

- La quercétine (1): isolée sous forme libre ou souvent 3-O-glycosylé (ex. la rutine) comme à partir des feuilles de Colubrina asiatica [30], des fruits de Zizyphus jujuba et Z. spina-christi [31], des parties ariennes de Z. incurva [32] et des feuilles de Rhamnus alaternus [33] et de Gouania obtusifolia [34].

- Le kaempférol (2): identifié comme aglycone libre dans les écorces des racines de Rhamnus nakaharai [35], il a été également isolé sous forme 3-O-glycoside dans les feuilles de Rhamnus alaternus [36] [37] et R. virgatus [38], des feuilles de Colubrina asiatica [30] et des feuilles de Gouania obtusifolia [34]; et sous forme de 4'-O- glycoside dans les fruits de Rhamnus thymifolius [39]. - La myricétine (3): isolée sous forme glycosylé de Zizyphus incurva [32].

Un dérivé de flavone, la vélutine (4) a été isolée de Ceanothus velutinus [40].

R 3'

OH R3 R7 R3' R5' Flavonoides OH H OH H Quercétine (1)

O OH H H H Kaempférol (2) R7 R 5' OH H OH OH Myricétine(3) H OCH3 OCH3 H Vélutine (4)

R3 OH O

Figure I-16 : Structures des génines des flavonoides isolés des Rhamnaceae.

Des dérivés de catéchine (5) (catéchols) (Figure I-17) sont identifiés sous forme de monomère, l’épi-catéchine (6) et la gallocatéchine (7) isolées des feuilles de Gouania obtusifolia [34], la (+) gallocatéchine (7) et/ou la (-) épi-gallocatéchine (8) sont rencontrées dans les tiges de Berchemia racemosa [41] et de Hovenia dulcis Thunb [42]. Ces dérivés peuvent être présentés également sous forme d’oligomères comme les prodelphinidines C (9) et B3 (10) isolés des tiges de Gouania leptostachya [43] (Figure I-18).

HO O 7 9 2 R3

6 R 10 1

R2 OH

R1 R2 R3 Catéchols OH H H Catéchine (5) H OH H Epi-catéchine (6) OH H OH Gallocatéchine (7) H OH OH Epi-gallocatéchine (8)

Figure I-17 : Structures des dérivés catéchiques.

OH OH

HO O HO O OH OH

OH OH

OH OH OH OH OH OH

HO O HO O OH

OH OH

OH OH 9 10

Figure I-18 : Structures des prodelphinidines C (9) et B3 (10)

Des aurones sont également isolés comme la maesopsine (11) identifiée dans le bois de Maesopsis eminii [44] et Hoveniae lignum [45] et ses deux glycosides appelés hovertrichoside C et D (12 & 13) isolés des écorces d’Hovenia trichocarea [46].

R3'

4' OR4'

HO 8 O OH 1' 6 2 9 10 4 3 O OR4

R4 R3' R4' Aurones H H H Maesopsine (11) β-D-glucopyranose H H hovertrichoside C (12) β-D-glucopyranose H α-L-rhamnopyranose hovertrichoside D (13) H OH H Alphitonine (26)

Figure I-19: Structures des dérivés des aurones.

Un dérivé de l’acide vanillique (14), le berchemolide (15) a été isolé des tiges de Berchemia racemosa [41], l’acide cinnamique (16) a été identifié dans les écorces des racines de Ceanthus velutinus [40] (Figure I-20)

OCH3

OH O O HO

OCH3 O O OH

H CO 3 OH O HO O HO O COOH OH 16 COOH 14 15 O

Figure I-20 : Structures de l’acide vanillique (14), du berchemolide (15) et de l’acide cinnamique (16).

Les acides ellagique (17), caféique (18), férulique (19) et l’acide gallique (20) (Figure I-21) sont isolés de plusieurs espèces appartenant au genre Ziziphus [47].

OCH 3 OH

OH OR O HO OH O

O O

COOH H3CO COOH OH

17 18 R=H 20 19 R=OCH3

Figure I-21 : Structures des composés 17-20.

I.3.1.3. Dérivés phénoliques isolés du genre Alphitonia

Des glycosides de l’isorhamnétine (21), le 3-O-β-D-glucopyranosyl-isorhamnétine (22) et le 3-O-rutinosyl-isorhamnétine (23) ont été isolés des feuilles d’Alphitonia neocaledonica

[2] et des tiges d’A. philippinensis [48], dans cette dernière espèce le 3-O-β-D- glucopyranosyl-quercétine (24) et le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine (25) sont également mis en évidence (Figure I-22).

OR 3'

OH R3 R3' Catéchols H CH3 (21) β-D-glucopyranosyl CH3 (22) HO O rutinosyl CH3 (23) β-D-glucopyranosyl H (24) α-L-rhamnopyranosyl H (25)

OR3 OH O Figure I-22 : Structures de l’isorhamnétine et ses glycosides.

Une aurone, l’alphitonine (26) (Figure I-19) a été isolée des bois d’A. excelsa, tandis que l’acide salicylique (27) (Figure I-23) a été identifié dans les feuilles [49].

La maesopsine (11) (Figure I-19), l’acide benzoïque (27) et l’acide salicylique (28) (Figure I-23) sont identifiés respectivement dans les bois, écorces et feuilles d’A. whitei [49].

L’alphitol (29) (Figure I-23), 3,5-dihydroxy-4-méthoxy phénéthyl-2-ol, a été isolé des écorces d’A. zizyphoides [50]. Cette étude montre pour l’alphitol une action inhibitrice de la biosynthèse des prostaglandines ce qui explique l’utilisation de l’extrait des écorces en médecine traditionnelle des Samoan pour soulager les douleurs abdominales.

COOH 7 HO OH R 1 8 4

H3CO 5

OH R= H 27 R= OH 28 29

Figure I-23 : Structures de l’acide benzoïque (27), l’acide salicylique (28) et l’alphitol (29).

I.3.2. Saponosides et triterpènes

Les saponosides ou saponines sont des métabolites secondaires hétérosidiques à poids moléculaire élevé comprenant une partie hydrophile constituée d’oses liée à une partie lipophile qui est l’aglycone appelée génine ou sapogénine. La génine peut-être triterpénique en C-30 ou stéroïdique en C-27 [29] [51].

Les sapogénines stéroïdiques dérivent pour la plupart des squelettes furostane ou spirostane et les alcaloïdes stéroïdiques des squelettes solanidanes et les spirosolanes [29] [51] (Figure I-24).

O O O

Furostane Spirostane

N H N O

Spirosolane Solanidane

Figure I-24 : Structures des squelettes stéroïdiques

Les sapogénines triterpéniques sont soit tétracycliques (dammarane, cucurbitane, lanostane), soit pentacycliques (oléanane, ursane, lupane, friedelane, hopane, holostane) (Figure I-25). Leurs squelettes possèdent généralement un hydroxyle en position 3 et peuvent être diversement fonctionnalisés par des insaturations ou des hydroxyles. La formation de cycle supplémentaire est possible par éthérification ou lactonisation [29] [51] [52].

21 22 21 21 22 22 18 24 12 17 20 24 12 24 11 12 17 20 17 20 23 11 11 18 26 23 23 19 16 18 26 18 26 1 25 19 16 16 9 1 25 1 25 2 9 9 14 27 2 2 27 14 27 10 8 10 8 14 10 8 5 30 19 5 5 30 29 28 28 29 29 28 dammarane cucurbitane lanostane 30 30 29 29 20 19 20 21 21 19 12 12 11 22 11 22 25 26 17 25 26 17 1 28 1 28 9 9 2 2 10 14 8 10 8 14 27 27 5 5 24 23 24 23 friedelane oléanane ursane 30 30 22 29 20 25 26

28 29 25 26 28 27

27 24 23

24 23 lupane hopane

Figure I-25 : Structures des squelettes triterpéniques

I.3.2.1. Triterpènes pentacycliques

Des nombreux squelettes triterpéniques ont été identifiés dans les différentes espèces de Rhamnaceae, les dérivés du lupane semblent être les triterpènes les plus fréquents comme le lupéol (30) isolé de Gouania ulmifolia [53] et de Ventilago leiocarpa [54], la bétuline (31) et l’acide bétulinique (32), que l’on retrouve chez Ziziphus jujuba [55], des racines de Colubrina greggii [56] et de Gouania ulmifolia [53], et l’acide alphitolique (33) identifié chez Ziziphus jujuba [57] et Gouania ulmifolia [53].

Les investigations menées sur Gouania microcarpa ont permis d’identifier un triterpène à fonction cétone en position 3 : l’acide gouanique (34) [58].

29 20

19 30 30 19

17 28 25 26 25 26 R COOH 1 2 R1 16 2 R R1 2 COOH 30 H CH 3 27 3 27 O HO 5 31 H CH2OH 32 H COOH 33 OH COOH 34 Figure I-26 : Structures des squelettes triterpéniques dérivés du lupane

Les dérivés de A(1)-norlup-20(29)-en à cycle A pentacyclique sont bien répandus dans cette famille comme l’acide céanothique (35) identifié chez Ziziphus cambodiana [59], Ceanthus americanus [60], Colletia paradoxa et Discaria longispina [61], l’acide céanothénique (36) isolé de Colubrina reggii [56] et finalement l’acide zizybéranalique (37) et le zizybéranal (38) isolés des fruits de Z. jujuba [55]. Les acides gouaniques A (39) et B (40) ont été isolés également de Gouania ulmifolia [53].

29 29

30 30

H H H H

25 1 26 COOH HOOC 25 26 28 COOH 28 H 3 27 COOH 27 HO 35 36

Figure I-27: Structures de l’acide céanothique (35) et de l’acide céanothénique (36).

Le taraxérol (41) a squelette oléanane a été identifié des tiges de V. leiocarpa [54].

29 29

30 19 30

H 12 22 H 17 26 COOH 1 HOH2C COOH 2 16 OHC 28

COOH R2 27 3 3 27 6 R1 23 24

R1= α-OH, R2= α-CH3, 2β-CHO acide zizybéranalique (37) acide gouanique A (39) R1= H, R2=α-COOH, 2α-CHO acide zizybéranal (38) 29

19 30

12 22 17 26 COOH 1

2 16 15 COOH 3 27 6 HO 5 7

CH2OH acide gouanique B (40) taraxérol (41)

Figure I-28 : Structures des composés 37-41.

Les acides céanothique, bétulinique et alphitolique sont les triterpènes les plus fréquents dans le genre Alphitonia et on les retrouve chez A. philippinensis [48], A. whitei, A. macrocarpa, A. petriei et A. excelsa, les écorces de cette dernière donne l’alphitexolide (42), un triterpène caractéristique de cette espèce [49].

Les écorces d’A. petriei ont donné l’acide bétulinique (32) et l’acide keto-bétulonique (43) ayant des bonnes activités cytotoxique et antibactérienne [62].

20 20

19 30 30 O

28 25 26 25 26 CO COOH 1 HOOC HO

O 27 27 H CO C O 3 5 O 5

42 43

Figure I-29 : Structures de l’alphitexolide (42) et du keto-bétulonique (43)

I.3.2.2. Triterpénoïdes tétracycliques

En plus des triterpènes dérivés du lupane précités, des saponosides à génine dérivée du dammarane tétracyclique sont identifiés dans différentes espèces appartenant à la famille des Rhamnaceae.

Des saponosides à jujubogénine (44) ont été isolées de Ziziphus lotus [63], comme les jujubosides A (45) et C (46), et d’autres saponines ayant la lotogénine (47) comme les lotosoides I (48) et II (49). D’autres saponosides à jujubogénine sont identifiés dans les écorces de racines d’Hovenia dulcis [64].

27 21 24 26 HO 23 25 HO 22 22 23 25 21 H H 20 26 H H H O 27 O 17 19 18 19 18 15 OH O 15 30 H H OH H H H H H HO H RO H 28 29 28 29 jujubogénine (44) lotogénine (47) R= R= HO OH OH HO O HO O OH O O HO HO O O O HO OH HO O HO OH O O O O HO O HO O HO HO OH HO HO OH OH jujubosides A (45) lotosoide I (48) R= R= HO OH HO O O HO O OH O HO HO HO O O O HO OH HO O HO OH O OH O O O HO HO HO HO OH OH jujubosides C (46) lotosoide II (49)

Figure I-30: Structures des dérivés de dammarane.

D’autres dérivés à 16,17-seco-dammarane, comme les hovenidulciosides A2 (50), A1

(51), B2 (52) et B1 (53) sont isolés d’Hovenia dulcis [65].

22 24 13 20 17 19 18 23 25 27 OAc O 26 15 H 30 O O OH 16 3 O O O H HO HO OR 28 29

R= H Hovenidulciosides A2 (50) ∆24, R= H: Hovenidulciosides B2 (52)

R= Rha Hovenidulciosides A1 (51) ∆24, R= Rha: Hovenidulciosides B1 (53)

Figure I-31 : Structures des composés 50-54

Une étude phytochimique menée sur les écorces d’A. zizyphoides a mis en évidence la présence d’une saponine dérivée de la jujubogénine, le PT-2 (54) [66].

O OH HO H O HO Glc Gal H O HO O O O H OH HO O HO O OH Rha O HO HO OH

Figure I-32 : Structure de PT-2 (54)

I.3.2.3. Phytostérols

Le β-sitostérol (55) et le β-sitostérol 3-O-β-D-glucoside (56) ont également été identifiés chez Gouania ulmifolia [53] et Ventilago bombaiensis [67]. Le stigmastérol (57) a été identifié des tiges de V. leiocarpa [54].

11 13 H 1 14 8 H 57 5 55: R = H RO 56: R = Glc 3 HO

Figure I-33 : Structures des composés 55-57.

I.3.3. Dérivés quinoniques

Les quinones sont des composés oxygénés qui correspondent à l’oxydation de dérivés aromatique et qui sont caractérisés par un motif 1,4-dicéto cyclohexa-2,5-diénique (para- quinone) ou, éventuellement par un motif 1,2-dicéto cyclohexa-3,5-diénique (ortho-quinone) [68]. Les quinones naturelles ont leur dione conjuguée aux doubles liaisons d’un noyau benzénique (benzoquinones) ou à celles d’un système aromatique polycyclique condensé : naphtalène (naphtaquinones), anthracène (anthraquinones), 1,2-benzanthracène (anthracyclines)…

O O O 8

O 1

4 5 O O p-quinone o-quinone Naphtaquinone O O

8 1

5 4 O O Anthraquinone Anthracyclinone

Figure I-34 : Structures de base des quinones naturelles.

Des dérivés anthraquinones sont identifiés chez de nombreuses espèces de Rhamnaceae, particulièrement celles appartenant au genre Ventilago (V. calyculata [69] [70] [71] et V. madaraspatana [72]), et au genre Rhamnus (R. catharticus et R. orbiculatus [73]).

Dans les bois de Maesopsis eminii [74], on retrouve le chrysophanol (58), le physcion (60), la xanthorine (61), l’islandicine (62) et la cynodontine (64).

Ces composés peuvent être présents également sous forme d’hétérosides tels que les 1-

O-α-L-rhamnosyl-émodine (66), 8-O-α-L-rhamnosyl-émodine (67) et 8-O-β-D-glucosyl- émodine (68) isolé de Ventilago calyculata [69].

O OH OH OR3 OH O

R 2 CH3 R3 CH3

O O R R1 1 R2

R1 R2 R3 R1 R2 R3 58 H H H 62 OH H H

59 H H OCH3 63 OCH3 H H 60 H OCH3 H 64 OH OH H 61 OH OCH3 H 71 H H OCH3

chrysophanol (58) l’islandicine (62) chrysophanol 8-methyl ether (59) islandicin 4-méthyl éther (63) physcion (60) cynodontine (64) xanthorine (61) parietine (70)

OR OR1 O 2 OH O OH 8 1 R3 7

3 HO HO CH CH 5 4 3 3 O O O H3C OH R1 R2 R3 65 H H H 66 H Rha H 67 Rha H H 68 Glc H H 71 OH O OH 69 CH3 H OH émodine (65) 1-O-α-L-rhamnosyl-émodine (66) 8-O-α-L-rhamnosyl- émodine (67) skyrine (71) 8-O-β-D-glucosyl- émodine (68) 2-hydroxyémodine 1-méthyléther (69)

Figure I-35 : Structures des dérivés des anthraquinones

Dans le tableau I-2, nous présentons la répartition de ces dérivés chez trois espèces du genre Ventilago, deux de Rhamnus, en plus de l’espèce Maesopsis eminii.

Tableau I-2 : Les dérivés anthraquinones isolés de six espèces de Rhamnaceae.

Maesopsis R. catharticus V. calyculata V. madaraspatana [54] eminii [74] R. orbiculatus [73] [70] [71] [69] V. leiocarpa [72] 58 + + + 59 + 60 + + + + 61 + + 62 + + 63 + 64 + 65 + + + + 66 + 67 + 68 + 69 + 70 + 71 +

Le genre Ventilago constitue également une source riche de quinones et naphtoquinones [75].

Les écorces des racines de Ventilago calyculata contiennent des quinones lactones : ventilatones A (72) et B (73), considérés également comme des dérivés de benzoisochromanquinones, et les ventiléines A (74) et B (75) [76].

CH3 O OH R O O

O O O CH3

O H3C O

H CO O 3 CH3

O R OH O CH3 72 R = H 74 R = H 73 R = OH 75 R = OCH3

Figure I-36 : Structures des composés 72-75 isolés de Ventilago calyculata

Des benzoisochromanquinones, les ventiloquinones A (76), B (77), C (78) D (79), E (80), F (81), K (82) et I (83) ont été identifiés à partir de V. maderaspatana, V. leiocarpa et V. calyculata [75] [54].

CH3 OH O OR O CH3 CH RO OCH3 O 3 O O O O

O CH3 CH3 RO H3CO CH3 OH O OR O O OCH3 76 R = H 78 R = H 77 R = CH 3 79 R = CH3 80

H3C CH O O OH 3

HO O O

2 R O CH3 H CO 3 CH3 1 O R O OH 82 R1 = OH ; R2 = H 83 R1 = H ; R2 = CH 81 3

Figure I-37 : Structures de quelques benzoisochromanquinones

Des naphtoquinones comme la cordeauxione (84) et l’isocordeauxione (85) [77] et des isofuranonaphtoquinones comme les ventilones A (86), B (87) et C (88) [75] ont également été isolées du genre Ventilago.

O OH O OR O OCH3 OCH3 O H3C O O O H3C OR O O

OH O CH3 O OH O

CH3 84 R= CH3 86 R = H OH O 85 R= H 87 R = CH3 88

Figure I-38 : Structures des naphtoquinones et isofuranonaphtoquinones

I.3.4. Alcaloïdes

Déjà au début du siècle le genre Ceanothus a été reconnu (Gordin 1900) [27] [78] pour contenir des alcaloïdes. Néanmoins, 60 ans après la famille des Rhamnaceae n'est pas encore comptée comme une réelle famille aux alcaloïdes. Aujourd’hui, de nombreux alcaloïdes ont été identifiés dans différentes espèces comme le Rhamnus, Ziziphus et Colubrina.

Les alcaloïdes sont des molécules hétérocycliques azotées à structure souvent complexe et dont l’activité physiologique et pharmacologique est souvent marquée. Les alcaloïdes sont classés en fonction de leurs noyaux hétérocyliques [29].

N N H N H Indole Pyridine Pipéridine

N N

N N N N H

Quinoleine Isoquinoléine Purine

N N N

Pyrrolizidine Indolizidine Tropane

Figure I-39 : Structures des squelettes alcaloïdiques

Les alcaloïdes identifiés chez les Rhamnaceae peuvent être répartis en deux groupes : des peptides cycliques et des alcaloïdes de type isoquinoléine (Tableaux I-3 et I-4).

I.3.4.1. Alcaloides cyclopeptidiques

Ce type d’alcaloïdes est rencontré chez plusieurs espèces appartenant aux genres :  Discaria : D. americana, dont les écorces présentent une teneur importante en alcaloïdes comme l’adoutine Y' (89), la franganine (92), la frangulanine (93), et les discarine A-D (94-97), M (98)et N (99) [79].  Ceanothus : - le céanothine B (100),l’adoutine Y (90)et le discarine B (95) ont été identifiés dans les écorces des racines de C. sanguineus [80]. - l’intégerrine (103), l’intégerrenine (104) et l’intégerressine (105) ont été isolés de C. integerrimus [81]. - la céanothine E (101) et D (102) et les adoutines X (91) et Y (90) de C. americanus [82].  Ziziphus : des nombreuses espèces ont montré une teneur importante en alcaloïdes - les lotusines B (106), C (107), E (108) et F (109) de Z. lotus [83].

- les jubanines A (110) et B (111) de Z. jujuba [84]. - la mauritine H (112) et l’hysudricanine A (113) de Z. hysodrica et Z. mauritiana [85].  Rhamnus : - la frangulanine (93) [86] et la franganine (92) [87] ont été identifiées de R. frangula.

I.3.4.2. Alcaloides de type isoquinoleïne

Les alcaloïdes de ce groupe se divisent en deux séries dérivées de la tétrahydro- isoquinoléine : - les dérivés de la benzyl-tétrahydro-isoquinoléine comme la coclaurine (114) et la N-méthylcoclaurine (115) isolés de Phylica rogersii [88]. Ces dérivés peuvent être rencontrés sous forme de dimères comme le O-méthyldauricine (116) isolé des écorces de Colubrina asiatica. - les dérivés de l’aporphine, comme la nuciférine (117) isolée de Colubrina faralaotra [89]. Ces deux types peuvent coexister dans la même espèce comme le C. faralaotra [90] dont les écorces ont fournies plusieurs alcaloïdes comme par exemple la nuciférine (117), O- nornuciférine (118) avec la limacine (119) dérivée du benzyl-tétrahydro-isoquinoléine.

Contrairement aux autres membres de la famille des Rhamnaceae, le genre Alphitonia ne semble pas être un genre à alcaloïdes car seul l’adoutine X (91) a été isolée des feuilles d’A. macrocarpa [49].

Tableau I-3: Structures des alcaloïdes (I).

O O

R1 R1 O O O O N N H H

HN HN HN HN R R3 O 3 O

R2 N

R2 R1 R2 R3 R1 R2 R3

89 98

90 99 HO 91 O

R1 92 O O R N 2 H HN HN 93 R O 3

94 N

N H

95 R1 R2 R3

96 100 H

CH 97 102 3

101 O

O O N H 103 N N O

NH 104 O

N 105 113

Tableau I-4 : Structures des alcaloïdes (II).

R R1 1

O O

O O N H O O N N HN H R O 3 N HN R2 R3 O NH

O R2

R4 N

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R4 HN

N 106 H 110 OCH3

O H 107 H N 111 OCH3

108 OH 112 H -CH3

H 109 OH N OCH3 H3CO OH

N CH3 H3C N

OCH3 H3CO

HO R N H3CO

H3CO 114 R =H 116 115 R= CH3

RO H3CO OCH3

N N N OH H3CO O

OCH3 117 R= CH3 118 R =H 119

1.4. Propriétés biologiques des Rhamnaceae 1.4.1. Principales propriétés biologiques des métabolites secondaires I.4.1.1. Composés phénoliques

La classe des composés phénoliques présente un ensemble vaste de substances ayant des éléments structuraux assez variables. Ces différences structurales importantes sont à l’origine des propriétés biologiques diversifiées, dont nous citerons les activités suivantes :

Activité anti-inflammatoire notamment celle des dérivés salicylés, hétérosides phénylpropanoïque et certains flavonoïdes [91] [92] qui inhibent les enzymes impliquées dans le processus inflammatoire tels que les phosphodiestérases de l’AMPc (Adénosine monophosphate cyclique), les cyclo-oxygénases et la 5- lipoxygénase. Une action vasodilatatrice favorable pour lutter contre l’hypertension artérielle et les troubles de la sénescence cérébrale [68] est observée avec les dérivés coumariniques [93], bien que les flavonoïdes sont connus pour leur effet protecteur vasculaire résultant d’une augmentation de la résistance capillaire. Certaines furanocoumarines sont photo-sensibilisantes et, de ce fait, elles sont utilisées pour le traitement du psoriasis et celui du vitiligo [68]. Les composés phénoliques sont des agents antioxydants redoutables, cette activité se traduit in-vivo par l’inhibition de la formation des dérivés peroxydes responsables du stress oxydatif. Cette activité explique leurs effets bénéfiques comme étant des hépato- protecteurs [94]. Plusieurs dérivés ont également montré des activités bactérienne [95], antileishmanienne [96] et antipaludique [97] [98].

I.4.1.2. Dérivés triterpéniques

D’un point de vu biologique les composés à squelette oléanane, ursane, lupane et dammarane semblent être les plus intéressants, avec des potentiels thérapeutiques importants, tels que :

Activité antiproliférative remarquable des dérivés du lupane [99] [100], ursane [101] et d’oléanane [102], sous forme libre ou glycosylée. Effets anti-inflammatoires [103] résultant d’une inhibition des enzymes impliquées. Effets antimicrobiens [104] et antiplasmodial des dérivés du lupane [105] et de l’ursane [106], en plus de l’activité antivirale (anti-HIV) des dérivés du lupane [107]. Activités hépato- et cardio-protectrice [108] des acides ursolique, oléanolique et bétulinique, expliquée par l’inhibition de la formation des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO), ces derniers ont des effets nocifs sur le foie et le système cardiovasculaire. Activité analgésique démontrée pour les acides ursolique et bétulinique ainsi que la bétuline par l’inhibition de la phospholipase A2 [109].

1.4.1.3 Alcaloïdes

Parmi les métabolites secondaires d’intérêts, le groupe phytochimique des alcaloïdes est considéré comme l’un des plus importants, se distinguant par sa grande diversité structurale d’autant plus flagrante si l’on considère son large spectre d’activité biologique.

Les alcaloïdes naturels et leurs dérivés synthétiques exercent leurs activités dans les domaines les plus variés : analgésique (morphine, codéïne…), anesthésique locaux (cocaïne), spasmolytiques (tubocurarine et papavérine), antitussif (codéine), anti- arythmiques (quinidine), antipaludiques (quinine), anti-tumoraux (vinblastine et taxol), anti-cholinestérase (galanthamine)…

I.4.2. Approche ethnopharmacologique

Le mode d’utilisation des plantes en médecine a évolué avec le temps. Dans cette partie nous présentons les différentes études phytochimiques et/ou biologiques menées sur diveres plantes de la famille des Rhamnaceae, souvent à usage traditionnel multiple.

Dans la liste A de la 11ème édition de la pharmacopée française, nous retrouvons cinq espèces de Rhamnaceae :

1) Les fruits de Rhamnus catharticus (Nerprun), les écorces et tiges de Rhamnus frangula (Bourdaine) et de Rhamnus purshiana (Cascara) : à la faveur d’une teneur en composées anthracéniques, ces drogues sont souvent employées en médecine

occidentale, non seulement en qualité de laxatif convenant bien à ceux qui souffrent aussi d’hémorroïdes mais encore en vertu de son rôle stimulant gastrique et hépatique. 2) les fruits de Paliurus spina-christi : pour leurs vertus diurétiques et hépato-protectrices [110]. 3) les fruits privés des graines de Ziziphus jujuba : utilisés en médecine chinoise pour ces effets toniques, en Australie pour stopper les diarrhées en vertu de leur pouvoir astringent [111]. Néanmoins l’extrait polaire des feuilles de cette espèce sont utilisées contre le diabète en Afrique de Nord, cette activité a été approuvée in-vivo [112] [113].

Une étude biologique menée in-vivo montre que l’extrait aqueux des feuilles de Ziziphus spina-christi exerce une activité hépato-protectrice probablement due à des vertus antioxydantes [114]. Tandis que les écorces de ses racines contiennent l’acide bétulinique dont l’activité antispasmodique a été mise en évidence [115].

Quant à Z. mucronata, ses racines et fruits sont utilisées pour soigner les maladies du tractus urinaire comme l’énurésie, l’hématurie, l’oligurie et autres infections urinaires [111]. Une étude biologique montre une activité antibactérienne de l’extrait méthanolique des écorces [116]. L’activité vermifuge des racines est démontrée grâce à une étude menée in- vitro contre les schistosomiases [117].

Les racines du Z. mauritiana, utilisées en Afrique, présentent de nombreuses vertus thérapeutiques contre les maux de ventre, maladies vénériennes et les diarrhées, tandis que les feuilles sont utilisées pour traiter les abcès et les plaies [118]. L’évaluation biologique des produits isolés de l’extrait méthanolique des racines a permis d’identifier des peptides ayant des activités anti-mycobactérienne et antispasmodique [119].

Une étude biologique montre une activité antipaludique de l’extrait brut des racines de Colubrina reggii et confirme la contribution de l’acide bétulinique isolé de cet extrait à cette activité [56]. Les racines de C. macrocarpa ont été utilisées en médecine traditionnelle mexicaine contre le cancer, ainsi le confirme une étude biologique menée sur trois lignées cancéreuses [120] [121].

Les tiges de Ventilago leiocarpa, nommé "Chin-pi-mao", sont utilisées à Taiwan pour soigner la toux, les plaies contuses et les rhumatismes. Elles ont donné trois dérivés d’anthraquinone (émodine (65), 2-hydroxyémodine 1-méthyl éther (69) et le skyrine (71)

(Figure I-35)) qui montrent une activité cytotoxique intéressante [54]. D’autre part l’émodine (65) (Figure I-35) présente une bonne activité hépato-protectrice [122].

Isolés de V. madaraspatana, l’émodine (65) et le physcione (60) (Figure I-35), montrent tous les deux une bonne activité anti-inflammatoire [72], l’activité antimicrobienne de ces deux dérivés ainsi que celle de l’extrait éthanolique des tiges de V. madaraspatana a été également démontrée contre plusieurs micro-organismes [123] ce qui justifie son utilisation pour le traitement des maladies cutanées. V. madaraspatana est utilisé en médecine traditionnelle indienne comme stomachique, tonique et stimulant.

L’extrait éthanolique des feuilles de V. denticulata, utilisées en médecine traditionnelle thaïlandaise, présentent une activité antivirale conte le virus de l’herpès HSV (Herpes simplex virus) [124].

Tandis que l’extrait méthanolique des bois de V. harmandiana, une liane réputée en Thaïlande contre le diabète, les plaies et les inflammations chroniques, montre une bonne activité anti-inflammatoire, analgésique, et antipyrétique [125].

La décoction des feuilles et tiges de Gouania leptostachya est utilisée en médecine traditionnelle thaïlandaise pour leurs vertus antispasmodiques, ainsi que pour soigner les convulsions du post-partum chez les nouveaux nés, l’engourdissement et l’évanouissement [126]. Cette espèce en Chine est utilisée pour soigner les brûlures et l’acroanesthésie.

L’acivité inhibitrice de l’α-glucosidase des composés isolés ainsi que des extraits butanolique et aqueux de G. leptostachya a été évaluée; Seule la prodelphinidine C (9) (Figure I-18) réduit significativement l’activié α–glucosidase, en inhibant 66% de cette activité à une concentration de 10 µM (CI50=5,52 µM), le témoin positif utilisé pour cette

étude était l’acarbose ayant une CI50 égale à 73,6 µM [43].

Les écorces de G. lupuloides sont utilisées en Equateur par application locale contre la leishmaniose, l’activité anti-protozoaire des écorces et branches de cette espèce a été démontrée contre Leishmania donovani et Plasmodium falciparum [127].

II. ETUDE PHYTOCHIMIQUE DES TROIS ALPHITONIA

II.1. Etude phytochimique d’Alphitonia xerocarpa et Alphitonia erubescens

Trois parties différentes ont été récoltées pour faire l’étude phytochimique d’Alphitonia xerocarpa; les feuilles, les écorces et les branches. Une extraction préliminaire a été effectuée sur 20 g de poudre pulvérisée de chaque partie de plante. L’extraction commence par deux percolations successives à l’aide de l’éther de pétrole et l’acétate d’éthyle, puis un chauffage à reflux pendant 3h avec le mélange CH3OH:H2O (80:20). Après avoir évaporé les solvants, les différents extraits ont été analysés par CCM et par CLHP à polarité de phases inversée (pour les extraits hydro-alcooliques). Les extraits acétate d’éthyle de trois parties montrent un profile qualitativement très proches mais différents quantitativement.

L’analyse par CLHP analytique des extraits hydro-alcooliques (5mg/ml CH3OH) est effectué sur silice greffée C18 à l’aide du gradient CH3CN: H2O TFA 0,025% (0:100 à 45:55) pendant 50 min puis (45:55 à 80:20) pendant 30 min (Figure II-1).

Figure II-1: Profils CLHP des extraits hydro-alcooliques des feuilles (noir), écorces (bleu) et branches (rose) d’Alphitonia xerocarpa.

En examinant les chromatogrammes CLHP des trois extraits, nous remarquons un profil presque identique pour les branches (rose) et les écorces (bleu), exception faite du pic ayant un tr= 28,5 min que l’on retrouve plus intense dans l’extrait des branches et celui des feuilles. Le même protocole d’extraction a été effectué sur les feuilles, écorces et bois d’Alphitonia erubescens.

Tous les extraits hydro-alcooliques (5 mg/ml CH3OH) sont analysés par CLHP sur silice greffée C-18 en utilisant le gradient CH3CN:H2O TFA 0,025% (0:100 à 45:55) pendant 50 min puis (45:55 à 80:20) pendant 20 min.

La comparaison des profils CLHP des extraits des feuilles (Figure II-2), écorces (Figure II-3) et bois (Figure II-4) d’A. erubescens avec ceux obtenus des feuilles, écorces et branches d’A. xerocarpa, montre une similitude qualitative entre les deux espèces.

Figure II-2: Comparaison des profils CLHP des extraits hydro-alcooliques des feuilles d’A. xerocarpa (bleu) et A. erubescens (noir).

Figure II-3: Comparaison des profils CLHP des extraits hydro-alcooliques des écorces d’A. xerocarpa (bleu) et A. erubescens (noir).

Figure II-4: Comparaison des profils CLHP des extraits hydro-alcooliques des bois d’A. xerocarpa (bleu) et A. erubescens (noir).

Vu la grande similitude de composition entre les deux espèces et les quantités fournies pour chaque plante, nous avons choisi de mener l’étude phytochimique sur l’espèce A. xerocarpa et d’étudier les extraits acétate d’éthyle des trois parties, ainsi que les extraits hydro-alcooliques des feuilles et des écorces uniquement en nous basant sur leur profil CLHP. Sachant que Alphitonia erubescens a été listé dans la liste des plantes menacées publiée en 1997 par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) [3], il nous a semblé important de ne pas chercher à exploiter cette espèce mais plutôt A. xerocarpa présente en quantité abondante en Nouvelle-Calédonie.

II.1.1. Etude phytochimique des branches d’A. xerocarpa

Les branches d’A. xerocarpa réduites en poudre sèche (200g) ont été extraites d’abord par deux percolations successives à l’aide de l’éther de pétrole et l’acétate d’éthyle, puis en chauffant à reflux pendant 3h avec le mélange CH3OH:H2O (80:20) (Schéma II-1). Comme nous l’avons signalé précédemment seul l’extrait acétate d’éthyle a été exploité.

La purification de l’extrait acétate d’éthyle des branches d’A. xerocarpa a été effectuée entièrement par des chromatographies «Flash» répétitives en phase normale, ce qui a conduit à l’isolement de quatre triterpènes (xb1-xb4) (Schéma II-1).

Branches d'A. xerocarpa séchées et pulvérisées

Percolation par l'EP

A.X.B.EP marc

Percolation par l'AcOEt

A.X.B.A marc

reflux 3h, CH3OH: CC, SiO2 H2O 80:20

1-29 92-97 135-149 A.X.B.M

CC, SiO2 CC, SiO2 CC, SiO2

xb2 xb1 xb4 xb3

Schéma II-1: Schéma d’extraction et de purification des composés des branches d’A. xerocarpa.

II.1.1.1. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle des branches d’A. xerocarpa

Les quatre triterpènes isolés de l’extrait acétate d’éthyle (xb1-xb4) ont été analysés par RMN 1D & 2D et spectrométrie de masse (HR-ESI-MS). Ce sont des dérivés du squelette lupane (Figure II-5) caractérisé par une double liaison exo-cyclique en C-20 incluse dans un groupe isopropényl. Celui-ci est caractérisé par le déblindage des protons du méthyle CH3-30 (≈ 1,7 ppm) et du proton H-19 (≈ 3 ppm) sous l’effet déblindant exercé par la double liaison adjacente.

20 30

25 26 28

5 27

23 24 Figure II-5: Structure du lupane

L’examen des spectres de RMN 1H des composés considérés montre que tous les quatre présentent deux signaux intégrant chacun pour 1H dans la zone des protons éthyléniques (≈ 4,5 ppm), un signal vers 3 ppm, et finalement un singulet d’intensité 3H (s,

≈1,7 ppm) attribuables aux CH2-29, CH-19 et CH3-30 respectivement. Le composé xb4 présente deux autres protons éthyléniques en plus à 5,38 et 5,93 ppm (d, J= 5,7 Hz) suggérant la présence d’une deuxième double liaison.

Pour faciliter l’élucidation structurale nous avons choisi de commencer par la détermination structurale de xb3, puis nous traiterons ensemble les composés xb1 et xb2, et la structure du xb4 sera détaillée en dernier.

II.1.1.1.1. Détermination structurale du composé xb3

Le spectre de masse HR-ESI-MS du composé xb3 effectué en mode positif montre un + ion pseudo-moléculaire [M+Na] à m/z 954,3448 correspondant à la formule brute C30H48O4.

Analyse du spectre de RMN 1H : (Figure II-6)

A partir du spectre de RMN 1H du composé xb3 on peut distinguer:

- six fins singulets dans la région des méthyles intégrants chacun pour 3H correspondant à six groupes méthyles dont un déblindé vers 1,65 ppm indiquant un environnement électronique différent, - deux protons éthyléniques résonnant à 4,69 et à 4,56 ppm, - trois signaux d’intensité 1H à 3,59 ppm (td, J= 5,1-10,3 Hz), 2,95 ppm (td, J= 4,9-10,7 Hz) et 2,89 ppm (d, J =9,6 Hz). En considérant ces observations nous suggérons la présence d’un ou/et des éléments électronégatifs ou/et une double liaison avoisinants ces protons.

Figure II-6 : Spectre de RMN 1H du composé xb3.

Analyse du spectre de RMN 13C : (Figure II-7)

Le spectre de RMN 13C J-modulé du composé xb3 révèle la présence de 30 carbones parmi lesquels nous pouvons distinguer les carbones caractéristiques suivants:

- un massif de carbones entre 14-50 ppm attribuables aux CH2, CH et Cq quaternaires. - un carbone oxygéné à 83,2 ppm. - les deux carbones éthyléniques détectés, dont un carbone quaternaire situé à 150,6 et un carbone méthylénique à 109,4 ppm. - un carbone de carbonyle à 179, 1 ppm.

Figure II-7 : Spectre de RMN 13C du composé xb3.

Analyse du spectre COSY : (Figure II-10)

En examinant le spectre COSY nous pouvons identifier deux types de corrélations spectroscopiques : 4 Des corrélations J1H-1H (enchaînement en W des protons allyliques): couplage à

longue distance entre les deux protons géminés Ha,b-29 et les protons du méthyle CH3- 30 . 3 Des corrélations J1H-1H : - le proton H-19 présente trois corrélations dont deux avec les deux protons géminés

Ha,b-21 et le troisième appartenant au proton vicinal H-18 (Figure II-8).

- les corrélations des deux protons Ha,b-21 avec les deux protons Ha,b-22. - une corrélation entre les protons vicinaux H-18 et H-13, ce dernier corrélant avec les

deux protons géminés Ha,b-12. 3 - les corrélations JH-H entre les protons Ha,b-12 et Ha,b-11, eux mêmes corrélant avec le proton vicinal H-9.

H2C

H3C CH CH2 19 21 H E 2 18 22 C CH CH2 12 13 H C CH 2 11 C D R 16 CH 15 CH2 9 C H2

Figure II-8 : Corrélations COSY J1H-1H observées sur les cycles C, D et E du composé xb3

- le proton résonant à 2,89 ppm (d, J= 9,6 Hz) corrèle avec celui situé à 3,59 ppm (td,

J= 10,3-5,1 Hz), lui même corrèle avec deux protons géminés à δH 0,79 (t, J= 12,0 Hz)

et δH 1,97 (dd, J= 12,4-4,6 Hz). Ces quatre signaux peuvent être attribués aux protons

H-3, H-2 et Ha,b-1 respectivement. Les déplacements chimiques des protons H-2 (δH

3,59) et H-3 (δH 2,89) suggèrent que le composé xb3 est hydroxylé en position C-2 et C-3 (Figure II-9).

H2 HO C 1 CH 2 A CH 3

Figure II-9: Corrélations COSY J1H-1H observées sur le cycle A du composé xb3.

Figure II-10 : Spectre COSY du composé xb3.

Analyse du spectre HSQC J-modulé : (Figure II-11)

1 Grâce à l’analyse des corrélations hétéro-nucléaires directe JH-C observées sur le spectre HSQC J-modulé nous pouvons dénombrer 7 carbones quaternaires, 7 méthines, 10 méthylènes et 6 méthyles pour le composé xb3.

A partir des protons identifiés sur le spectre COSY, sont attribués les carbones correspondants (Tableau II-1) : C-1 (δC 46,5), C-2 (δC 68,7) et C-3 (δC 83,2) du cycle A, C-9

(δC 50,4), C-11 (δC 20,9), C-12 (δC 25,4)et C-13 (δC 38,1) du cycle C, C-18 (δC 49,1), C-19

(δC 46,9), C-21 (δC 30,5) et C-22 (δC 37,1) du cycle E.

Cette analyse nous permet également d’identifier le degré de substitution de la double liaison déduite par le faite que les deux protons éthyléniques sont portés par le même carbone (109,4 ppm) ce qui confirme la présence d’une double liaison exo-cyclique isopropényl (∆20).

Figure II-11 : Spectre de HSQC J-modulé du composé xb3.

A ce stade, l’ensemble des données spectrales obtenues nous permet de proposer un squelette triterpénique pentacyclique dérivés du noyau lupane.

Analyse du spectre HMBC : (Figure II-14)

Par stratégie nous avons choisi de commencer par l’attribution des carbones du cycle E du triterpène : - les protons du méthyle H-30 corrèlent avec trois carbones, dont un quaternaire C-20,

un carbone méthylénique CH2-29 et un carbone méthine CH-19 identifié à l’aide du spectre HSQC. - au niveau du proton H-19 nous observons cinq corrélations avec les carbones C-18, C- 20, C-21, C-29 et C-30.

- le proton H-18 (δC 1,54) présente sept corrélations dont trois avec des carbones déjà

identifiés C-19, C-20 et C-22, une avec un carbone tertiaire CH-13 (δC 38,1), et les

trois autres avec trois carbones quaternaires dont un carbonyle (δC 179,1) identifiable

comme le substituant C-28 et les carbones C-14 et C-17 (δC 42,4 et 56,2), respectivement.

La distinction entre les deux carbones C-14 et C-17 se fait par la différence de déplacement chimique puisque le C-17 est le plus déblindé (δC 56,2) sous l’effet du groupement carbonyle adjacent (Figure II-12).

- au niveau du carbonyle C-28 quatre corrélations sont mises en évidence avec les

protons géminés Ha,b-22 déjà attribués et les deux protons Ha,b-16. - le proton H-13 corrèlent avec cinq carbones dont quatre déjà attribués les carbones C12, C-14, C-17 et C-18, le dernier est facilement attribué au carbone du méthyle C-

27 (δC 14,5).

- les protons du méthyle CH3-27 nous indiquent le déplacement chimique du carbone

méthylénique CH2-15 (δC 29,6), et du carbone quaternaire C-8 (δC 40,7), grâce à deux 3 corrélations HMBC JH-C en plus de celles avec C-14 et C-13 (Figure II-14).

- les protons géminés Ha,b-15 et Ha,b-16 sont attribués par analyse du spectre HSQC et ils corrèlent entre eux sur le spectre COSY ce qui permet de fermer le cycle D et de confirmer l’enchaînement des cycles C-D-E du noyau lupane (Figure II-12).

- les carbones C-8, C-9 (δC 50,4) et C-14 présentent une corrélation avec les protons

d’un deuxième méthyle d’intensité 3H, ce qui permet de localiser le méthyle CH3-26

(δH 0,90). Ce dernier nous apporte des informations sur le cycle B par une corrélation 3 HMBC JH-C avec le carbone C-7 (δC 34,2) (Figure II-12).

20 30

25 26 COOH 28 9 HMBC 27 COSY

Figure II-12: Corrélations COSY & HMBC des protons des cycles B, C, D et E composé xb3.

1 - les deux protons Ha,b-7 attribués par les corrélations directes HSQC JH-C nous 3 indiquent les deux protons géminés Ha,b-6 sur le spectre COSY JH-H eux même

couplés avec le proton H-5 (δH 0,75, dl, J= 6,5 Hz).

- le carbone C-9 présente une corrélation avec un autre méthyle d’intensité 3H

attribuable au CH3-25 (δH 0,85).

- les protons du méthyle CH3-25 présentent quatre corrélations dont une avec le carbone

quaternaire C-10 (δC 38,3), deux avec deux carbones méthines C-9 et C-5 (δC 55,4), et

une avec le carbone C-1 (δC 46,5) (Figure II-13). - les protons des deux méthyles restants H-23 et H-24 portés par le C-4 sont facilement repérés ayant trois corrélations HMBC identiques avec le carbone tertiaire C-5, le

carbone quaternaire C-4 (δC 39,2) et le carbone C-3, en plus de leurs corrélations 3 3 mutuelles JH-23-C-24 JH-24-C-23.

La distinction des deux méthyles CH3-23 et CH3-24 s’effectue grâce aux valeurs différentes du déplacement chimique des carbones en position α-équatoriale CH3-23 (valeur la plus déblindée de δC 28,3) et β-axiale CH3-24 (valeur la plus blindée de δC 16,5).

- le proton H-3 présente sept corrélations aux niveaux des carbones C-1, C-2, C-4, C-5, C-23 et C-24, le proton H-2 quant à lui il corrèle avec les carbones C-1 et C-3.

- le proton Hb-1 corrèle avec les carbones C-2, C-3, C-5, C-10 et C-25, alors que le Ha-1 présente quatre corrélations avec les carbones C-2, C-9, C-10 et C-25.

HO 9 2 10

5 4 6 HO HMBC COSY 23 24

3 n>1 Figure II-13: Corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C des protons des cycles A et B du composé xb3

Figure II-14 : Spectre HMBC du composé xb3.

Analyse du spectre ROESY : (Figure II-16)

La stéréochimie finale du composé xb3 est mise en évidence par les observations des effets overhauser (rOe) à travers l’espace obtenues sur le spectre ROESY : - la configuration α-axiale du proton H-3 est déterminée par les effets rOe observés avec les protons H-23 α-equatoriale et H-5 α-axiale.

- les effets rOe observés entre les méthyles CH3-24/CH3-25 et CH3-25/CH3-26 (Figure II-15) indique la configuration β-axiale de ces trois méthyles. - la configuration β-axiale de H-2 est déterminée par l’observation d’effet rOe entre le

H-2 et les protons des CH3-25 et CH3-24, ce qui est confirmé par la constante de

couplage J2ax-3ax= 9,6 Hz. - l’orientation α-axiale des protons H-9 et H-18 est déterminée par les effets rOe observés entre H-5/H-9 et H-9/H-18.

- l’orientation α-axiale du méthyle CH3-27 est confirmée par des effets rOe observés

entre H-9/CH3-27 et H-18/CH3-27.

- l’orientation β-axiale des protons H-13 et H-19 est déterminée par les effets rOe entre H-26/H-13 et H13/H-19, et elle est confirmée par la valeur de la constante de couplage 3 3 J18ax-13ax J18ax-19ax≈ 11 Hz.

H H H 28 H COOH 25 26 H CH3 CH3 19 24 13 18 HO CH3 1 9 2 3 HO H H C 5 3 23 H H 27 H

Figure II-15: Effets rOe observés sur le spectre ROESY des protons du composé xb3

Figure II-16 : Importants effets rOe observés sur le spectre ROESY de xb3.

Ces données couplées au spectres de masse nous permettent de décrire ce triterpène xb3 comme étant l’acide alphitolique (Figure II-17) déjà isolé de Ziziphus jujuba (Rhamnaceae) [57], d’Ugni molinae (Myrtaceae) [103] et de Gouania ulmifolia (Rhamnaceae) [53].

H H

H 1 COOH 28 HO 2 H

HO H

Figure II-17: Structure de l’acide alphitolique (xb3).

II.1.1.1.2. Détermination structurale des composés xb1 et xb2

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du composé xb1 montre deux pics appartenant à deux ions pseudo-moléculaires [M+H]+ à m/z 487,3421 et [M+Na]+ à m/z

509,3246, dont la formule brute C30H46O5 est déduite, tandis que celui du composé xb2 présente un ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 477,3339, correspondant à la formule brute C30H46O3.

Analyse des spectres de RMN 1H : (Figure II-18)

La comparaison des spectres de RMN 1H des composés xb1 et xb2 avec celui du xb3 montre une grande similitude entre les trois spectres. Sur ces deux spectres (xb1 & xb2) nous retrouvons la plus part des signaux identifiés sur celui du xb3. Quelques différences sont toutefois observées (Tableau II-1) : - la perte des signaux attribuées aux protons H-2 et H-3 du composé xb3. - l’apparition de deux doublets d’intensité 1H sur le spectre de xb1 à 4,11 et 2,49 ppm avec une constante de couplage chacun de J=1,2 Hz. - la présence de deux signaux distincts pour le composé xb2, dont un à 2,58 ppm (dd, J=7,1-3,5 Hz), et un sous forme de doublet résonnant à 9,84 ppm (d, J=3,5 Hz) dans une zone de champs très faible caractéristique des protons d’une fonction aldéhyde.

Analyse des spectres de RMN 13C : (Figure II-19)

Les spectres de RMN 13C des deux composés (13C J-modulé pour xb1) présentent 30 carbones avec des déplacements chimiques proches de ceux identifiés sur celui du xb3. Cependant quelques différences ont été constatées (Tableau II-1) :  sur le spectre de xb1: - la perte du signal attribué au C-1 de xb3. - deux carbonyles sont repérés à 177,7 et 179,1 au lieu d’un seul carbonyle situé à 179,1 sur celui de xb3.  sur le spectre de xb2:

- la perte des deux pics attribués aux carbones C-2, C-3 (δC 68,7 et 83,2, respectivement) par rapport aux composés xb1 et xb3. - un autre pic est localisé dans la zone de champs très faible à 205,3 ppm appartenant à une fonction aldéhyde, en plus du carbonyle situé à 181,9 ppm.

Figure II-18 : Spectre de RMN 1H des composés xb1, xb2 et xb3.

Les données obtenues à partir des spectres de RMN 1D 1H et 13C suggèrent une modification au niveau du cycle A par rapport à celui du composé xb3. Effectivement, en analysant les corrélations observées sur les spectres de RMN 2D COSY, HSQC, HMBC et ROESY des deux composés xb1 et xb2, les cycles B, C, D et E sont attribués comme précédemment décrit pour xb3. C’est pour cela que seule l’attribution du cycle A des composés xb1 et xb2 sera développée.

Figure II-19 : Spectres de RMN 13C des composés xb1, xb2 et xb3.

Analyse des spectres COSY : (Figure II-20)

Sur les spectres COSY, les corrélations suivantes ont été observées :  pour xb1: entre les protons résonnant sous forme de doublet à 4,11 et 2,49 ppm avec une constante de couplage (J=1,2 Hz).  pour xb2: entre le proton situé à 2,58 ppm et deux protons résonnant à 1,81 (dd, J= 14,6-7,8 Hz) et 1,91 ppm (dd, J=14,5-0,9 Hz).

Analyse des spectres HSQC :

L’analyse des spectres HSQC J-modulé nous a permis de dénombrer 8 carbones quaternaires et 6 méthyles pour xb1 et xb2 et 9 méthylènes et 7 méthines pour le composé xb1, tandis que le composé xb2 présente 10 méthylènes et 6 méthines. Nous avons également attribué les carbones correspondants aux protons caractéristiques précédemment identifiés pour chaque composé xb1 et xb2.

Analyse des spectres HMBC :

 Nous commençons par les corrélations observées au niveau des protons des méthyles

CH3-23 et CH3-24, dont quatre sont déjà identifiées avec les carbones C-4 à δC 43,2

pour xb1 et 38,3 pour xb2, C-5 (CH, δC 56,6 sur le spectre du xb1 et 58,7 sur celui du

xb2), en plus de leurs corrélations mutuelles JH-23-C-24 et JH24-C23 (Figure II-20). La dernière corrélation révèle une grande différence entre les deux composés : - sur le spectre du xb1, cette corrélation est observée avec le carbone hydroxylé

situé à 84,6 ppm (CH, δH 4,11) attribuable au carbone C-3. - sur celui du xb2, il s’agit d’une corrélation avec le carbone méthylénique situé

à 39,1 ppm (CH2, δH 1,81 et 1,91) attribuable au carbone C-3.

A partir des protons H-3, les corrélations localisées sur les spectres COSY et HSQC nous amènent à l’identification des protons H-2 situés à 2,49 ppm (δC 65,5) pour xb1 et à 2,58 ppm (δC 61,5) pour xb2.

 les protons H-3 corrèlent avec les carbones C-2, C-4, C-23 et C-24 précédemment identifiés et le carbone C-1. Celui-ci est situé à 177,7 ppm attribuable à un carbonyle sur le spectre de xb1 et à 205,3 ppm attribuable à un aldéhyde pour xb2.  le proton H-2 de chaque composé présente quatre corrélations avec les carbones C-1, C-3, C-10 et C-25, ainsi le cycle A est identifié comme étant un cycle à cinq carbones.

 les protons du méthyle CH3-25 présentent deux corrélations avec les carbones C-1 et C-2 en plus de trois corrélations déjà identifiées avec les carbones C-5, C-9 et C-10.

25 25 HOOC OHC 9 9 2 10 2 10

5 5 4 6 4 6 HO

23 24 23 24 HMBC COSY Figure II-20: Corrélations COSY & HMBC des protons du cycle A de xb1 (à gauche) et xb2 (à droite).

Analyse des spectres ROESY:

La stéréochimie finale des composés xb1 et xb2 est déterminée comme précédemment pour xb3 sauf pour le cycle A ou les observations suivantes sont obtenues :

- la configuration α-axiale du proton H-3 et déterminée par les effets rOe observés sur les deux spectres avec les protons H-23 et H-5 (Figure II-21).

- les corrélations ROESY entre le proton H-2 et les protons des méthyles CH3-25 et

CH3-24 sur le spectre du composé xb2 indiquent l’orientation β-équatoriale du proton H-2, alors que le spectre ROESY de xb1 ne montre qu’un seul effet rOe avec le 3 méthyle CH3-25, mais la valeur de la constante de couplage JH-2-H-3= 1,2 Hz indique 3 une corrélation de type J2eq-3ax entre les deux protons vicinaux H-2 et H-3.

25 O 25 H CH CH3 3 H 24 C CH HOOC CH3 3 2 H 2

4 4 HO 5 H H C H3C 3 H H H H

Figure II-21: Effets rOe observés sur les spectres ROESY des protons du cycle A de xb1 (à gauche), et xb2.

L’ensemble des données spectrales de RMN et de masse permet d’identifier le composé xb1 comme l’acide céanothique (Figure II-22) isolé précédemment d’Alphitonia philippinensis [48],de Ziziphus jujuba [128], et de Ziziphus cambodiana [59].

H H

25 1 26 COOH HOOC 28

H 3 27

Figure II-22: Structure de l’acide céanothique (xb1)

Les analyses spectrales combinées du composé xb2 montrent qu’il s’agit d’un dérivé de l’acide céanothique possédant une fonction aldéhyde en position C-2 et distingué par la perte de l’hydroxyle en C-3 (Figure II-23). Ce composé est identifié comme étant l’acide 2α- formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique isolé pour la première fois. Deux dérivés possédant une fonction aldéhyde en position 1 ont été isolés du Zizyphus jujuba [55] et sont décrits dans la littérature : l’acide zizybéranal et l’acide zizybéranalique (Figure II-23).

29 29

30 30

H H H H

1 1 OHC COOH COOH 28 OHC 28

H R2 27 3 3 27 R1

xb2 R = H, R =α-COOH, 2α-CHO acide zizybéranal 1 2 R1= α-OH, R2= α-CH3, 2β-CHO acide zizybéranalique

Figure II-23: Structures de xb2, l’acide zizybéranal et l’acide zizybéranalic

II.1.1.1.3. Détermination structurale du composé xb4:

Analyse du spectre de RMN 1H (Figure II-24) :

En comparant les spectres de RMN 1H des composés xb1 et xb4, nous retrouvons 20 aisément tous les signaux caractéristiques du squelette lupane (∆ , CH3-30 ≈ 1,69 ppm et le H-19 ≈ 3,07 ppm), auxquelles s’ajoutent deux protons éthyléniques sous forme de doublets fins résonnant à 5,38 et 5,92 ppm sur le spectre de xb4 attestant la présence d’une deuxième double liaison. Une deuxième différence entre les deux composés est marquée par la disparation de trois signaux correspondant à un méthyle, le proton H-2 et le proton H-3 sur le spectre de xb4 (Tableau II-1). Prenant en considération ces données, une modification fondamentale du cycle A est attendue.

Analyse du spectre de RMN 13C : (Figure II-25)

Le spectre de RMN 13C J-modulé révèle la présence de 29 carbones parmi lesquels nous distinguons, deux carbonyles détectés à 179,1 et 178,3 ppm, quatre carbones éthyléniques confirmant la présence de deux doubles liaisons, résonnant à 140,6, 138,8, 150,3, et 109,6 ppm, les deux derniers pouvant être attribués au C-20 et C-29.

Figure II-24 : Spectres de RMN 1H des composés xb1 et xb4.

Figure II-25 : Spectre de RMN 13C du composé xb4.

Analyse des spectres de RMN 2D :

En comparant ces données et celles obtenues de l’analyse des spectres de RMN 2D (COSY, HSQC et HMBC) du composé xb4 avec celles du composé xb1, nous retrouvons presque les mêmes déplacements chimiques concernant les cinq méthyles et les carbones des cycles B-C-D-E, exception faite de la perte du signal du méthyle CH3-27 et du carbone C-14 qui se retrouve à 59,8 ppm, déblindé de 20 ppm par rapport à celui du xb1.

En tenant compte des constatations faites ci-dessus, nous pouvons localiser la deuxième fonction acide en C-27 ce qui justifie l’action déblindante exercée sur le C-14. 3 3 Ainsi, les corrélations JH-13-C-27 et JH-16a,b-C-27 observées sur le spectre HMBC confirment la position de carbonyle en C27 (Figure II-26).

14 9

COOH 27 HMBC COSY

3 n>1 Figure II-26: Les corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C des protons du cycle C de xb4

Sur le spectre HMBC, les deux protons éthyléniques sont attribués aux protons H-2 et n>1 H-3, par les corrélations JH-C entre ces protons et les carbones C-4, C-5, C-10, C-23, C-24 3 et C-25. La distinction entre les deux protons est possible grâce aux corrélations HMBC JH-C du C-3 avec les protons des méthyles CH3-23 et CH3-24 et du C-2 avec le méthyle CH3-25.

2 10 A 3 5 4

24 23 3 n>1 Figure II-27: Les corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C des protons du cycle A de xb4

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif donne un pic pour l’ion pseudo-moléculaire + [M+Na] à m/z 477,2986 correspondant à la formule brute C29H42O4.

L’ensemble des données spectrales nous permettent d’identifier le composé xb4 comme l’acide céanothénique (Figure II-28) précédemment isolé de Colubrina reggii [56] et d’Alphitonia philippinensis [129].

H H

25 26 COOH 28

COOH 27

Figure II-28: Structure de l’acide céanothénique (xb4).

1 13 Tableau II-1: Déplacements chimiques en RMN H (600 MHz) et RMN C (150 MHz) de xb1 (CD3OD+CDCl3) et 1 13 xb2 (CDCl3) et en RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) de xb3 (CDCl3) et xb4 (DMSO). xb1 xb2 xb3 xb4 δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 177,7 - 205,3 9,84 (d, J=3,5) 46,5 0,79 (t, 12,0) ------1,97 (dd, 12,4-4,6) - - 2 65,5 2,49 (d, 1,2) 61,5 2,58 (dd 7,1-3,4) 68,7 3,59 (td, 10,3-5,1) 140,6 5,92 (d, 5,7) 3 84,6 4,11 (d, 1,2) 39,1 1,81 (dd, 14,6-7,8) 83,2 2,89 (d, 9,6) 138,8 5,38 (d, 5,7) - 1,91 (dd, 14,5-0,9) - - 4 43,2 - 38,3 - 39,2 - 44,5 - 5 56,6 1,65 (dl, 12,1) 58,7 1,25 (dd, 9,1-2,8) 55,4 0,75 (dl, 6,5) 62,4 1,22 (dd, 12,6-2,0) 6 18,5 1,32 (m) 18,5 1,37 (m) 18,3 1,37 (t, 8,5) 17,3 1,41 (m) 1,35 (m) 1,42 (m) 1,48 (m) 1,46 (m) 7 33,9 1,32 (m) 34,0 1,37 (m) 34,2 1,33 (m) 37,4 1,61 (dt, 13,1-2,9) 1,34 (m) - 1,37 (m) 1,36 (m) 41,2 1,71 (t, 8,8) 8 42,9 - 41,6 - 40,7 - 47,8 - 9 44,3 1,69 (dd, 12,6-3,1) 44,9 1,73 (dd, 12,8-2,9) 50,4 1,31 (dd, 15,7-3,4) 47,9 1,85 (dd, 12.5-3,2) 10 49,2 - 52,0 - 38,3 - 50,5 - 11 23,5 1,43 (dd, 12,9-4,5) 23,7 1,51 (dd, 9,6-1,8) 20,9 1,24 (dd, 11,8-3,5) 22,8 1,47 (dd, 15,6-2,9) 1,50 (m) - 1,65 (dd, 13,5-3,9) 1,42 (dd, 12,6-2,4) 1,56 (dd, 12,8-5,1) 12 25,4 1,00 (dd, 13,0-4,7) 24,9 1,09 (dd, 12,9-4,9) 25,4 0,99 (dd, 12,9-4,6) 25,7 1,68 (dd, 13,2-6,4) 1,62 (dd, 12,2-5,2) - 1,72(m) 1,67 (dd, 13,7-2,6) 2,10 (dd, 13,1-5,7) 13 38,7 2,21 (td, 12,3-3,3) 38,6 2,22 (td, 12,2-3,6) 38,1 2,20 (td, 11,9-3,4) 39,5 2,37 (td, 10,3-3,8) 14 41,6 - 42,8 - 42,4 - 59,8 - 15 29,8 1,14 (dt, 13,7-3,2) 29,9 1,20 (dt, 13,7-3,2) 29,6 1,13 (dt, 13,3-3,0) 27,9 1,43 (td, 13,4-3,3) 1,51 (m) 1,58 (td, 12,9-4,2) 1,46 (td, 14,9-3,5) - 2,04 (dt, 13,2-2,9) 16 32,3 1,37 (td, 13,2-3,6) 32,2 1,44 (dd, 9,8-3,4) 32,2 1,37 (tl, J=8,5) 34,2 1,35 (dd, 15,4-3,5) 2,22 (dd, 12,9-3,5) - 2,30 (dt, 12,9-3,3) 2,22 (dt, 12,9-3,4) 2,35 (dt, 14,6-3,7) 17 56,2 - 56,3 - 56,2 - 56,0 - 18 49,2 1,54 (t, 11,4) 49,2 1,62 (t, 11,5) 49,1 1,54 (t, 11,4) 51,4 1,71 (t, 11,4) 19 47,0 2,96 (td, 10,9-4,7) 46,9 3,01 (td, 10,9-4,9) 46,9 2,95 (td, 10,7-4,9) 47,1 3,07 (td, 10,0-4,0) 20 150,5 - 150,2 - 150,6 - 150,3 - 21 30,6 1,34 (m) 30,5 1,43 (dd, 10,1-3,2) 30,5 1.35 (m) 30,3 1.37 (m) 1,92 (td, 10,5-2,4) - 2,01 1,89 (m) 1,94 (dd, 8,7-3,9) 22 37,2 1,41 (dd, 9,9-1,9) 37,1 1,5 37,1 1,38 (td, 10,7-4,9) 37,0 1,37 (m) 1,89 (t, 8,5) - 1,99 (d, 9,1) 1,89 (t, 6,9) 1,94 (dd, 8,7-3,9) 23 30,7 1,07 (s) 32,0 1,12 (s) 28,3 0,96 (s) 29,1 0,97 (s) 24 18,9 0,89 (s) 26,2 0,97 (s) 16,5 0,75 (s) 21,0 0,89 (s) 25 18,6 1,04 (s) 19,3 0,99 (s) 17,2 0,85 (s) 19,8 0,97 (s) 26 16,3 0,93 (s) 16,9 0,96 (s) 15,8 0,90 (s) 17,7 1,05 (s) 27 14,6 0,94 (s) 14,8 0,96 (s) 14,5 0,94 (s) 178,3 - 28 179,1 - 181,9 - 179,1 - 179,1 - 29 109,3 4,54 (d, 2,3) 109,9 4,64 (dd, 2,2-1,5) 109,4 4,69 (d, 2,1) 109,6 4,59 (dd, 2,4-1,4) 4,68 (dd, 2,3-1,3) - 4,75 (d, 2,2) - 4,56 (sl) - 4,73 (d, 2,3) 30 19,1 1,64 (s) 19,3 1,70 (s) 19,2 1,65 (s) 18,4 1,69 (s)

II.1.2. Etude phytochimique des feuilles d’A. xerocarpa.

Les feuilles d’Alphitonia xerocarpa séchées ont été extraites à froid avec l’éther de pétrole puis l’acétate d’éthyle. Les marcs séchés ont ensuite été extraits à reflux à l’aide d’un mélange hydro-alcoolique CH3OH-H2O (80:20) (Schéma II-2).

Grâce à l’utilisation combinée des différentes techniques chromatographiques sur un gel de silice en phase normale ou sur silice greffée C18, l’extrait acétate d’éthyle a permis d’isoler et d’identifier deux phytostérols xf1 et xf2 et trois triterpènes dérivés du lupane, la bétuline xf3, l’acide céanothénique xb4 (Figure II-28), précédemment isolé des branches, comme produit majoritaire et son dérivé xf4.

L’analyse par CCM de l’extrait hydro-alcoolique montre un profile riche en flavonoïdes et saponosides, pour cela un premier fractionnement par VLC sur silice greffée

C18 nous a semblé nécessaire pour faciliter les étapes suivantes de purification. Les fractions I,

II et III éluées respectivement avec le mélange CH3OH:H2O (40:60) (60:40) et (80:20) ont ensuite été purifiées (Schéma II-2).

La fraction I donne par précipitation un flavonoïde connu, xf18. Les fractions II et III ont été fractionnées par chromatographies sur un gel de silice pour donner une dizaine de sous-fractions. Celles qui avaient des profils intéressants et suffisamment de masse ont été purifiés par chromatographies successives sur colonnes en alternant la nature du gel utilisé en phase normale (silice) ou à polarité de phases inversée (silice greffée C18) ou par CLHP sur silice greffée C18. Ainsi quatre flavonoïdes connus (xf18-xf21) et 13 saponines (xf5-xf17) ont été isolés et 12 structures nouvelles ont été identifiées (Schéma II-2).

Feuilles séches et pulvérisées

Percolation par l'EP

A.X.F.EP marc Percolation par l'ACE A.X.F.ACE marc

CC, SiO2 reflux 3h, CH3OH:H2O 80:20

marc A.X.F.M ACE-1 ACE-II ACE-III xf1 xb4 CC, SiO CC, 2 CC, SiO2 SiO2 CC, C18 HPLC, C18 VLC, C18. CH3OH: H2O xf2 xf3 xf4

IV, 100:0 I, 40:60 II, 60:40 III, 80:20 xf18 CC, SiO2 CC, SiO2 II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 III-1 III-2 III-3 III-4 III-5

CC, SiO CC, C CC, SiO2 CC, C 2 18 CC, C18 CC, C CC, C CC, SiO2 18 HPLC, C 18 18 18 HPLC, C18 HPLC, C18 CC, C II-1-1 xf5 xf7 II-3-1 HPLC, C18 xf6 III-4-1 III-4-2 18 xf5 xf17 CC, SiO2 CPP HPLC CCP C xf8 SiO 18 xf11 xf5 xf10 2 CC, SiO2 SiO2 xf6 III-2-1 xf14 xf6 xf12 xf5 III-5-1 III-5-2 III-5-3 xf15 II-2-1 II-2-2 HPLC, C18 CC, SiO2 CC CPP xf16 HPLC SiO2 CPP SiO xf8 SiO2 2 C18 xf11 xf9 xf6 xf10 xf19 xf13 xf6 xf20 xf7 xf21

Schéma II-2 : Schéma d’extraction et de purification des composés des feuilles d’Alphitonia xerocarpa.

II.1.2.1. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle II.1.2.1.1. Détermination structurale du composé xf4

Sur le spectre de masse HR ESI-MS en mode positif de xf4 nous visualisons un pic d’intensité 100% appartenant à un ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 493,2936 ce qui permet de conclure le poids moléculaire de xf4 de 470 uma indiquant la formule brute

C29H42O5, soit un atome d’oxygène de plus par rapport au composé xb4. 1 Sur le spectre de RMN H nous remarquons l’absence du singulet du méthyle CH3-30 et l’apparition de deux protons à 4,05 et 4,16 ppm, ces derniers sont sous forme de doublet (J= 14,8 Hz) sur lesquels nous visualisons une diminution des intensités des branches extérieures au profil de celles des branches intérieures suggérant un effet de toit (Figure II- 29).

Figure II-29 : Spectre de RMN 1H du composé xf4.

Sur le spectre de RMN 13C (Figure II-31) nous retrouvons les mêmes signaux que ceux attribués pour les carbones du composé xb4, exception faite de celui du méthyle CH3-30 qui ne se retrouve pas dans celui du composé xf4. Dans ce dernier apparaît par contre un signal à 64,9 ppm dans la région des carbones hydroxylés (Tableau II-2).

Figure II-30 : Spectre de RMN 13C du composé xf4. 81

Le spectre HSQC permet d’attribuer les deux protons à δH 4,05 et 4,16 au carbone à 1 64,9 ppm par une corrélation directe JH-C. L’analyse du spectre COSY nous permet de mettre 4 en évidence des corrélations à longue distance J1H-1H (enchaînement en W) entre ces deux protons et les protons géminés Ha,b-29 suggérant que l’hydroxyle est en position CH2-30. Le 3 3 spectre HMBC confirme la présence des corrélations JH-30-C-29 et JH-30-C-20, et l’emplacement de l’hydroxyle sur le carbone C-30. (Figures II-31 & II-32)

29 CH2

HOH2C 30 20

19 21 22 12 18 11 13 COOH 16 15 9 COOH HMBC COSY Figure II-31: Importantes corrélations COSY & HMBC des protons du xf4.

Figure II-32 : Spectre COSY du composé xf4.

L’ensemble des informations précédemment citées plus les données obtenues par les analyses des spectres de RMN-2D du composé xf4 confirment qu’il s’agit d’un composé de structure nouvelle identifié à l’acide 30-hydroxycéanothénique (Figure II-33).

HOH2C 30

H H

25 26 COOH 28

COOH 27

Figure II-33: Structure de l’acide 30-hydroxycéanothénique (xf4)

1 13 Tableau II-2: Déplacements chimiques en RMN H (500 MHz) et C (125 MHz) de xf4 dans le CD3OD : Position δC δH (m, J en Hz) COSY HMBC 1 - - - - 2 141,7 5,96 (d, 5,7) H-3, H-25 C-3, C-4, C-5, C-10, C-24, C25 3 140,1 5,43 (d, 5,7) H-2, H-23, H-24 C-2, C-4, C-5, C-10, C-23, C-25 4 45,7 - - H-2, H-3, H-5, H-23, H-24 5 63,8 1,26 (dd, 11,2-3,6) H-6a, H-6b C-4, C-6, C-7, C-9, C-10, C-23, C-24, C-25 6 18,5 1.45 (m) H-5, H-6b, H-7a, H-7b C-5, C-10 1,49 (m) H-5,H-6a, H-7a, H-7b - 7 38,9 1,64 (dl, 13,4) H-7b, H-6a, H-6b C-5, C-8, C26 - 1,77 (dd, 12,6-5,6) H-7a, H-6a, H-6b C-8, C-26 8 42,4 - - H-7a,b, H-9, H-11a,b, H26, H27 9 49,5 1,89 (dd, 12,5-2,9) H-11a, H-11b C-2, C-5, C-8, C-10, C-11, C-12, C-14, C-25, C-26 10 51,8 - - H-2, H-3, H-5, H-6a, H-9, H-25 11 24,2 1,50 (m) H-11b, H-9, H-12a, H-12b C-8, C-9, C-12 - 1,60 (dd, 12,8-4,9) H-11a, H-9, H-12a, H-12b C-8, C-9, C-12 12 27,7 1,55 (dd, 12,2-4,5) H12b, H-11a, H-11b, H-13 C-9, C-11, C-13, C-14 - 2,23 (dd, 12,9-5,5) H-11b, H-12b, H-13 C-11, C-13 13 40,8 2,42 (td, 12,5-5,3) H-18, H-12a, H-12b C-12, C-14, C-17, C-18, C-27 14 61,1 - - H-9, H-12a, H-13, H15a,b, H18, H26 15 29,1 1,46 (dd, 15,3-3,9) H-15b, H-16a, H-16b C-14, C-16, C-17 - 2.06 (dt, 13,5-2,4) H-15a, H-16a, H-16b C-13, C-14, C-16, C-17 16 35,4 1,39 (dd, 12,9-2,9) H-16b, H-15a, H-15b C-15, C-17, C-28 - 2,37(dt, 12,8-3,2) H-16a, H-15a, H-15b C-14, C-15, C-17, C-18, C-28 17 57,2 - - H-13, H-15a,b, H-16a,b, H-18, H-21b, Ha,b-22, 18 52,8 1,83 (t, 11,3) H-13, H-19 C-13, C-14, C-16, C-17, C-19, C-20, C-28 19 44,6 3,03 (td, 12,5-4,0) H-18, H-21a, H-21b C-13, C-18, C-20, C-21, C-29, C-30 20 155,5 - - H-18, H-19, H-21a,b, H-30 21 33,1 1,44 (m) H-21b, H-19, H-22a, H-22b C-17, C-19, C-20, C-22 - 2,06 (m) H-21a, H-19, H-22a, H-22b C-17, C-18, C-19, C-20, C-22 22 37,9 1,44 (m) H-22b, H-21a, H-21b C-17, C-19, C-21, C-28 - 1,94 (dd, 10,7-8,3) H22a, H-21a, H21b C-18, C-19, C-17, C28 23 29,97 1,01 (s) - C-2, C-3, C-4, C-5, C-24 24 21,8 0,94 (s) - C-2, C-3, C-4, C-5, C-23 25 20,7 1,01 (s) - C-2, C-5, C-9, C-10 26 18,7 1,08 (s) - C-7, C-8, C-9, C-14 27 178,6 - - H-13, H-15a,b 28 179,3 - - H-16a,b, H-18, H22a,b 29 107,7 4,95 (sl) H-30 C-19, C-20, C-30 - 4,99 (d, 1,5) H-30 C-19, C-20, C-30 30 64,9 4,05 (d, 14,8) H-29a, H-29b C-20, C-29 - 4,16 (d, 14,8) - C-20, C-29

II.1.2.1.2. Détermination structurale du composé xf3

Le spectre de masse ESI-MS obtenu en mode positif pour xf3 présente un pic pour + l’ion pseudo-moléculaire [M+H] à m/z 443,7 correspondant à la formule brute C30H50O2.

Sur le spectre de RMN 1H nous observons les protons caractéristiques suivants :

- deux singulets éthyléniques à 4,74 et 1,74 ppm ; - trois protons dans la zone des protons portés par un carbone oxygéné dont deux sous

forme de doublet situés à δH 3,38 et 3,85 (d, J= 10,8 Hz) et le troisième à δH (dd, J= 11,4-4,8 Hz). - six singulets intégrant chacun pour 3H attribuables aux six méthyles dont un résonne à 1,74 ppm.

Le spectre de RMN 13C J-modulé présente deux carbones oléfiniques à 150,4 et 109,7 ppm, deux carbones oxygénés à 79,0 et 60,5 ppm et un massif des carbones situés dans une domaine entre 14-56 ppm.

Ces données nous permettent d’identifier un dérivé du lupéol (noyau lupane) caractérisé par le groupement isopropényl exo-cyclique et une fonction hydroxyle en C-3, mais contrairement aux structures identifiées précédemment dans les branches, le composé xf3 ne porte aucune fonction acide.

La présence d’une deuxième fonction hydroxyle est déduite par les déplacements chimiques de deux protons géminés situés à δH 3,85 et 3,38 correspondant à un groupement

CH2OH.

L’ensemble des données spectrales obtenues des spectres de RMN 1D, laisse proposer la présence de la bétuline.

L’analyse des spectres de RMN 2D COSY, HSQC et HMBC est réalisée comme pour le composé xb3, ce qui nous a permis d’attribuer les protons et les carbones de xf3 dont les déplacements chimiques sont répertoriés dans le tableau II-3.

Grâce à une comparaison de ces données spectrales avec celle trouvées dans la littérature, la structure finale de xf3 est confirmée comme étant la bétuline (Figure II-34) isolée précédement des feuilles de Nerium oleander (Apocynaceae) [130], des fruits de Ziziphus jujuba [131] et de Betula spp [132-134].

20 30

18 13 25 26 CH OH 1 2 28

3 27 HO

23 24 Figure II-34 : Structure de la bétuline (xf3)

1 13 Tableau II-3: Déplacements chimiques en RMN H (500 MHz) et C (125 MHz) de xf3 dans le CDCl3 Position δC δH (m, J en Hz) Position δC δH (m, J en Hz) 1 38,7 0,95 (td, 12,9-4,1) 16 29,1 1,27 (td, 14,4-3,9) 1,72 (m) 1,98 (dl, 11,6) 2 27,4 1,65 (m) 17 47,8 - 1,65 (m) 18 48,7 1,65 (m) 3 79,0 3,24 (dd, 11,4-4,8) 19 47,8 2,43 (m) 4 38,8 - 20 150,4 - 5 55,3 0,74 (d, 9,7) 21 29,7 1,46 (m) 6 18,3 1,44 (m) 2,03 (m) 1,59 (m) 22 33,9 1,09 (m) 7 34,2 1,44 (m) 1,91 (dd, 12,2-8,4) 1,44 (m) 23 28,0 1,02 (s) 8 40,9 - 24 15,3 0,82 (s) 9 50,4 1,35 (td, 12,7-2,2) 25 16,1 0,88 (s) 10 37,1 - 26 15,9 1,08 (s) 11 20,8 1,23 (m, 13,1-4,14) 27 14,7 1,04 (s) 1,47 (m) 28 60,5 3,38 (d, 10,8) 12 25,2 1,09 (m) 3,85(d, 10,8) 1,72 (m) 29 109,7 4,63 (sl) 13 37,3 1,71 (m) 4,74 (sl) 14 42,7 - 30 19,1 1,74 (s) 15 27,0 1,09 (dl, 13,2) 1,75 (td, 13,3-4,3)

II.1.2.1.3. Détermination structurale du composé xf1

D’après l’analyse par CCM effectuée dans le but de comparer le composé xf1 avec un échantillon authentique de β-sitostérol (un stérol très fréquent dans le règne végétal), les deux composés présentent le même Rf ainsi que les mêmes aspects visuels après pulvérisation à l’acide sulfurique (solution aqueuse 50%).

Le spectre de masse ESI-MS obtenu en mode positif pour xf1 présente un pic pour l’ion pseudo-moléculaire [M+Li]+ d’intensité 100% à m/z 435 correspondant à la formule brute C35H60O6.

Le spectre de RMN 1H confirme la présence d’un stérol, sur lequel nous distinguons le proton éthylénique H-6 à 5,43 ppm (dl, J= 5,1 Hz), le proton H-3 à 3,58 ppm sous forme de multiplet, les deux singulets d’intensité 3H correspondants aux deux méthyles CH3-18 à 0,74 ppm et le CH3-19 à 1,06 ppm, les trois doublets d’intensité 3H des trois méthyles CH3-21 à

0,96 ppm (d, J=6,5 Hz), CH3-26 (d, J=8,4 Hz) et CH3-27 (d, J=6,8 Hz) et le triplet du méthyle

CH3-29 (t, J=7,5 Hz).

Sur le spectre de RMN 13C nous retrouvons les deux carbones éthyléniques C-5 et C-6 résonnant respectivement à 140,7 et 121,7 ppm, le carbone hydroxylé C-3 à 71,8 ppm, 26 signaux entre 11-57 ppm correspondants aux 6 méthyles, 11 méthylènes, 7 méthines et 2 carbones quaternaires.

Ces informations nous ont permis d’élucider la structure finale du xf1 en comparant ces données spectrales de RMN-1D à celles rapportées dans la littérature [135, 136], il s’agit du β-sitostérol (Figure II-35).

18 24 25

3 5 HO 6 Figure II-35: Structure du β-sitostérol (xf1)

II.1.2.1.4. Détermination structurale du composé xf2

Analyse du spectre de RMN 1H :

Le spectre de RMN 1H de xf2 présente presque les mêmes signaux que le composé xf1, auxquels s’ajoutent des signaux correspondants à la présence d’une unité osidique et ceux d’une chaine aliphatique saturée. La chaine aliphatique présente un grand multiplet à 1,29 ppm et deux triplets, l’un d’intensité 3H pour un méthyle terminal CH3 à 0,91 ppm, et le deuxième d’intensité 2H à 2,38 ppm correspondant au CH2 en position α d’un carbonyle.

La partie osidique est caractérisée par un proton anomérique situé à 4,41 ppm (d, J= 7,7 Hz). Autour de ce dernier deux autres protons résonnent à 4,29 et 4,51 ppm et dans la

zone des protons portés par un carbone hydroxylé nous pouvons également distinguer cinq protons dont le proton H-3 de la génine.

Analyse du spectre de RMN 13C :

Sur le spectre de RMN 13C nous retrouvons les signaux du composé xf1 avec presque les mêmes déplacements chimiques, exception faite du carbone C-3 à 79,6 ppm déblindé sous l’effet de la glycosylation. Nous pouvons également identifier les carbones de la partie osidique dont on distingue d’abord le carbone anomérique à 101,2 ppm et cinq carbones hydroxylés entre 63-76 ppm suggérant un hexose, et les carbones de la chaine aliphatique dont nous situons le groupe carbonyle à 174,6 ppm, le carbone du méthyle terminal CH3 à 14,1 ppm (t, J= 6,47) et un massif de carbones à 29,5-29,7 ppm.

Analyse du spectre COSY :

A partir du proton anomérique résonant à 4,45 ppm sept protons d’un hexose sont attribués à l’aide de spectre COSY, les valeurs des constantes de couplage supérieures à 8 Hz

(Tableau II-4) montrent qu’il s’agit d’un β-glucose. Le déblindage des protons Ha,b-6', comparativement aux valeurs citées dans la littérature, suggère le positionnement de l’estérification en C-6' par l’acide gras.

Pour la chaine aliphatique le groupe méthylène CH2-3" est repéré à 1,65 ppm grâce à 3 une corrélation COSY J1H-1H avec les deux protons CH2-2".

Analyse du spectre HMBC :

3 La corrélation J1H-13C observée sur le spectre HMBC entre le proton anomérique H-1' du glucose et le carbone C-3 de la génine montre que ce sucre est attaché à l’hydroxyle en position C-3 du β-sitostérol. Une autre corrélation entre les protons Ha,b-6' et le carbonyle indique le positionnement de l’estérification en C-6' par un acide gras.

Analyse du Spectre ROESY:

La stéréochimie des carbones asymétriques de la génine est déterminée à l’aide des valeurs des constantes de couplage des protons ainsi que par l’analyse des effets rOe observés sur le spectre ROESY montrant les différents couplages dipolaires entre les protons proches dans l’espace. - la stéréochimie α-axial du proton H-3 est confirmée par l’effet rOe entre ce proton et

le proton H-1' du β-D-glucose.

- l’orientation α-axial du proton H-14 est déterminée par l’effet rOe entre ce proton et le proton H-9 (Figure II-36). - l’orientation β-équatoriale du proton H-20 est déterminée par les effets qu’il présente

avec les protons CH3-18 et les protons CH3-19 - l’orientation α-équatoriale du proton H-21 est confirmée par son couplage avec H-17.

- la conformation pyrane du β-D-glucopyranose est confirmée par les effets rOe observés entre H-3'/H-5' et H-1'/H-3'.

CH3 H

CH3

H CH3

OR H O HO O H HO OH

H H H

Figure II-36: Effets rOe observés sur le spectre ROESY de xf2

Analyse du spectre de masse :

Le spectre de masse ESI-MS en mode positif de xf2 montre un pic appartenant à un ion pseudo-moléculaire à m/z 851, ce qui permet de proposer deux hypothèses pour la masse molaire de xf2: - m/z 851 [M+Na]+ soit une masse molaire 828 uma correspondant à la formule brute

C52H92O7 - m/z 851 [M+Li+2H]+ soit une masse molaire 842 uma correspondant à la formule

brute C53H94O7. En examinant les deux hypothèses nous remarquons une différence d’un groupement

CH2 (14 uma) entre les deux valeurs. Autrement dit deux acides gras proposés soit l’acide octadécanoïque (acide stéarique) ou bien l’acide heptadécanoïque (acide margarique).

+ D’autre part nous distinguons un ion fragment à m/z 455 [C23H43O7+Na-H] correspondant au glucose estérifié par l’acide heptadécanoïque (acide margarique). Ce qui permet de conclure la structure finale du composé xf2 comme étant le 6’-heptadécanoyl-3-O-glucopyranosyl-β- sitostérol (Figure II-37) isolé précédemment de Thalia multiflora (Marantaceae) [137] et de Ficus glumosa (Moraceae) [138].

18 24 25

6' H3C(H2C)15OCO 3 O HO 5 O HO 6 OH Figure II-37: Structure du composé xf2

Tableau II-4: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) de xf1 et xf2 dans le

CDCl3. Position β –sitostérol xf1 xf2 δC δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 37,2 37,3 1,08(m) Glc 1,87 (dt, 13,5-3,1) 1' 101,2 4,41 (d, 7,7) 2 29,6 29,3 1,65 (m) 2' 73,6 3,39 (t, 8,2) 1,98(tl, 14,3) 3' 75,9 3,60 (t, 9,2) 3 71,8 79,6 3,61 (m) 4' 70,1 3,41 (t, 9,2) 4 39,8 39,6 1,20 (m) 5' 73,9 3,47 (m) 2,05 (m) 6' 63,2 4,29 (dd, 12,4-2,4) 5 140,7 140,3 - 4,51 (dd, 12,2-4,7) 6 121,7 122,1 5,39 (dl, 7,1) 7 31,9 31,9 1,29 (m) CO-1" 174,6 2,01 (m) CH2-2" 34,2 2,38 (t, 7,6) 8 31,6 31,9 1,28 (m) CH2-3" 24,9 1,65 (m) 9 50,1 50,2 0,95 (m) CH2-4" à 15" 29,5-29,7 1,23-135 (sl) 10 36,5 36,8 - CH3-17" 14,12 0,91 (t, 7,0) 11 21,1 21,1 1,53 (m) 12 39,8 38,9 2,31 (m) 13 42,3 42,3 2,39 (m) 14 56,7 56,8 1,02 (m) 15 24,3 24,3 1,30 (m) 16 28,1 28,2 1,32 (m) 1,88 (m) 17 56,0 56,1 1,12 (m) 18 11,8 11,9 0,72 (s) 19 19,4 19,4 1,06 (s) 20 36,1 36,2 1,39 (m) 21 18,8 18,8 0,95 (d, 6,4) 22 33,9 33,9 1,05 (dd, 15,6-9,0) 1,35 (m) 23 26,1 26,1 1,2 (m) 24 45,8 45,9 0,95 (d, 6,6) 25 29,1 29,2 1,70 (m) 26 19,8 19,8 0,86 (d, 6,8) 27 19,0 18,9 0,84 (d, 6,9) 28 23,1 23,1 1,31 (m) 29 11,9 11,9 0,87 (t, 7,3)

II.1.2.2. Identification des composés isolés de l’extrait hydro- alcoolique L’interprétation des spectres de masse et de RMN 1D & 2D de ces composés a conduit à l’élucidation structurale de 13 saponines que l’on peut répertorier en trois groupes selon la partie aglycone : l’acide céanothique : xf17. trois génines dérivées du diépoxydammar-24ène-3β,20-diol. - la jujubogénine (génine I) : xf5, xf6, xf7, xf8 et xf9. - la 22α-hydroxy-jujubogénine (génine II): xf10, xf11, xf12. - le 16-β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β-20-diol (génine III): xf13 trois génines dérivées du 16,17-seco-dammarane-16,26-dioique : - le (25S) 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26- dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone (xf15). - le (25R) 3,23,30-trihydroxy-17-methyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26- dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone (xf16). - le 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammar-24-ène-16,26- dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone (xf14).

L’élucidation structurale des génines dérivées du squelette dammarane sera effectuée d’une façon individuelle et leurs différences seront soulignées au cours de l’analyse. L’identification des génines est effectuée à partir des spectres RMN 1D et 2D des saponines correspondantes en faisant la soustraction des signaux appartenant à la partie osidique.

II.1.2.2.1. Détermination structurale du composé xf17

Le spectre de masse HR-ESI-MS obtenu en mode positif donne un ion pseudo- moléculaire d’intensité 100% à m/z 1319,5892 et un autre d’intensité 50% à m/z 1320,5576 correspondant respectivement à [M+Na]+ et [M+Na+H]+, ce qui permet de déduire la masse molaire de xf17 égale à 1296 uma.

Les spectres de RMN 1H et 13C (Figures II-38 & II-39) montrent la présence des mêmes signaux que ceux observés pour le composé xb4, auxquels s’ajoutent des carbones oxygénés laissant supposer qu’il s’agit d’un glycoside de l’acide céanothique. En soustrayant la masse molaire de ce dernier nous obtenons 810 uma correspondant à 5 hexoses.

Sur le spectre de RMN 1H nous distinguons cinq protons anomériques sous forme de doublets à 4,58, 4,68, 4,71, 5,04 et 5,64 ppm, leurs carbones les portants sont repérés à l’aide du spectre HSQC, respectivement à 103,6 (2C), 103,3, 101,2 et 91,9 ppm (Tableau II-6). Les quatre carbones anomériques résonnant entre 101-104 ppm indiquent que ces carbones sont impliqués dans des liaisons éthers contrairement à celui situé à 91,9 ppm (δH 5,64) qui est lié par une liaison ester.

Figure II-38 : Spectre de RMN 1H de xf17 (a) avec des agrandissements de la partie osidique (b).

Figure II-39 : Spectre de RMN 13C de xf17 (b) avec l’agrandissement de la partie osidique (a).

L’interprétation des corrélations observées sur le spectre COSY (Figure II-40) à partir du proton anomérique situé à 5,64 ppm (d, J= 8,3 Hz) permet de repérer le proton H-2' par la corrélation H-1'/H-2' à 4,07 ppm (t, J= 8,8 Hz), puis le proton H-3' situé à 3,76 ppm (dd, J= 9,6-8,8 Hz) par la corrélation H-2'/H-3', ensuite la corrélation H-3'/H-4' permet de localiser ce dernier sous forme d’un triplet à 3,51 ppm (t, J= 9,6 Hz). Le proton H-4' corrèle avec un proton situé à 3,42 ppm (m) attribuable au proton H-5' qui présente deux corrélations avec deux protons géminés résonnant à 3,75 ppm (m) et à 3,86 ppm (dd, J=12,5-2,2 Hz) 3 3 attribuables aux protons H-6'. Les valeurs élevées des constantes de couplage JH1'-H2', JH2'-H3', 3 3 3 JH3'-H4', JH4'-H5', JH5'-Hb6' > 8 Hz indiquent que tous les protons sont transdiaxiaux suggérant qu’il s’agit d’un β-D-glucopyranose. Cette configuration est confirmée par l’analyse des effets rOe observés sur le spectre ROESY (Figure II-43) entre les protons α-axiaux H-1'/H-3' et H-1' et H-5'. Les déplacements chimiques des carbones correspondants sont attribués par analyse du spectre HSQC J-modulé et sont en accord avec un β-D-glucopyranose [139].

En suivant le même raisonnement, les déplacements chimiques des protons des quatre unités osidiques restantes ont été attribués (Tableau II-6). Les déplacements chimiques des carbones, attribués par l’analyse du spectre HSQC J-modulé, et les valeurs élevées des constantes de couplage indiquent qu’il s’agit également de quatre β-D-glucopyranoses.

Figure II-40 : Spectre COSY de la partie osidique de xf17.

Le β-D-glucopyranose dont l’anomère résonne à 5,04 ppm (δC 101,2) possède les carbones C-2" (δC 81,3), C-3" (δC 86,6) et C-6" (δC 68,7) déblindés par rapport à un β-D- glucopyranose en position terminale, ce qui suggère que ce sucre est substitué en position C- 2", C-3" et C-6".

Ces dernières constatations sont confirmées par l’analyse du spectre HMBC (Figure II-41 & II-42), qui permet de localiser le/les points d’ancrage des sucres sur la génine, ainsi que l’enchaînement des différentes unités osidiques. Une corrélation observée entre le proton 1 anomérique H-1' (δH 5,64 ppm) et le carbonyle C-28 indique que le Glc est lié sur la génine par une liaison ester. Le proton H-2' de ce sucre corrèle avec le carbone anomérique C-1" du Glc2 situé à 101,2 ppm et inversement entre le carbone C-2' et le proton H-1". Sur ce Glc2 trois substitutions sont localisées grâce aux corrélations H2"-C1''', H-3''-C-1'''', Ha,b-6'' -C-1''''' (Figure II-41). La confirmation de l’enchaînement des sucres est confirmée par l’analyse des effets rOe observés sur le spectre ROESY (Figure II-43) entre H2'/H1", H-2"/H-1''', H-3"/H-

1'''' et Ha-6" /H-1'''''.

Figure II-41 : Spectre HMBC de la partie osidique de xf17. 93

Figure II-42 : Corrélations HMBC des protons anomériques des sucres de xf17.

Figure II-43 : Effets rOe observés des protons de la partie osidique de xf17.

La structure finale du composé xf17 (Figure II-44) est ainsi déterminée comme étant l’acide 28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)- [β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-[β-D-glucopyranosyl-

(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-céanothique.

OH OH HO HO Glc4 OH 3 Glc HO O OH 1'''' H O H OH H O 2'' 3' OH ' 6 1''' '' H O H O O H H H 1'' 2 O O Glc H 1''''' 28 O H 2' H OH C 1' HO HOOC 5 O H Glc O HO HO H Glc1 OH HMBC HO OH ROESY H OH

Figure II-44: Structure du composé xf17

Tableau II-5 : Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie aglycone de xf17

(CD3OD).

Position δC δH (m, J en Hz) COSY HMBC 1 177,4 - - H-2, H-3, H-25 2 65,6 2,50 (sl) H-3 C-1, C-3, C-4, C-5, C-10, C-25 3 84,5 4,10 (sl) H-2 C-1,C-2, C-4, C-5, C-10, C-23, C-24 4 42,9 - - H-2, H-3, H-5, H-23, H-24 5 56,7 1,70 (m) H-6a, H-6b C-4, C-10, C-23, C-24, C-25 6 18,3 1,35 (m) H-5, H-6b, H-7a, H-7b _ 1,54 (m) H-5,H-6a, H-7a, H-7b _ 7 34,1 1,37(m) H-7b, H-6a, H-6b _ 1,45 (m) H-7a, H-6a, H-6b _ 8 41,7 - - H-9, H-26, H-27 9 44,4 1,78 (dd, 12,5-2,5) H-11a C-8, C-10, C-25, C-26 10 49 - - H-2, H-3, H-5, H-9, H-25 11 23,2 1,50 (m) H-11b, H-9, H-12a _ 1,59 (m) H-11a, H-9, H-12b _ 12 25,3 1,09 (m) H-11a _ 1,68 (m) H-11b, H-12b, H-13 _ 13 38,3 2,25 (td, 11,8-3,6) H-18, H-12b C-14 14 42,8 - - H-13, H-18, H-26, H-27 15 30,9 1,13 (m) H-15b, H-16a H-27 1,59 (m) H-15a, H-16a, H-16b C-14, C-27 16 31,3 1,45 (m) H-16b, H-15a, H-15b _ 2,57 (dm, 12,7) H-16a, H-15a, H-15b _ 17 56,7 - - H-15a, H-18, H-21b, H-22a, H-22b 18 49,4 1,65 (t, 11,0) H-13 C-13, C-14, C-16, C-17, C-19, C-20, C-28 19 46,9 3,02 (td, 11,0-4,8) H-18, H-21a, H-21b C-13, C-18, C-20, C-21, C-24 20 150,4 - - H-18, H-19, H-21b, H-29 21 30,2 1,38 (m) H-21b, H-19 C-17 1,90 (t, 10,7) H-21b, H-19, H-22b C-20 22 36,2 1,50 (t, 12,5) H-22b C-17, C-28 2,04 (dd, 12,4-8,2) H-22a, H-21b C-18, C-19, C-17, C-28 23 30,0 1,10 (s) - C-3, C-4, C-5, C-24 24 18,5 0,94 (s) - C-3, C-4, C-5, C-23 25 17,9 1,09 (s) - C-2, C-5, C-9, C-10 26 16,4 1,02 (s) - C-7, C-8, C-9, C-14 27 14,0 1,01 (s) - C-8, C-14, C-13, C-15 28 174,5 - - H-1', H-18, H-22a, H-22b 29 18,2 1,71 (s) H-30a, H-30b C-20, C-29, C-30 30 108,8 4,61 (sl) H-30a, H-29 C-19, C-29 4,73 (sl) H-30b, H-29 C-19, C-29

Tableau II-6 : Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie osidique de xf17

(CD3OD).

Position δC δH (m, J en Hz) COSY HMBC

Glc1 en COO-28 1' 91,9 5,64 (d, 8,3) H2' C28, C3' 2' 75,7 4,07 (t, 8,8) H1', H3' C1'', C1', C3' 3' 77,1 3,76 (dd, 9,6-8,8) H2', H4' C1', C2', C4' 4' 69,3 3,5 (t, 9,6) H3', H5' C3', C5', C6' 5' 77,6 3,42 (m) H4', H6'a, H6'b C4' 6' 61,0 3,76 (m) H5', H6'b C4', C5' 3,86 (dd, 12,5-2,2) H5', H6'a C4', C5' Glc2 en C-2' Glc1 1" 101,2 5,04 (d, 7,6) H2'' C2' 2" 81,3 3,68 (m) H1'', H3'' C1''', C1'', C3'' 3" 86,6 3,68 (m) H2'', H4'' C1'''', C2'', C4'' 4" 69,6 3,32 (m) H5'', H3'' C3'' 5" 75,7 3,58 (ddd, 9,8-7,8-2,4) H4'', H6''a, H6''b C4'', C6'' 6" 68,7 3,74 (dd, 9,9-7,8) H5'', H6''b C1''''', C5'' 4,17 (dd, 10,0-2,5) H5'', H6''a C1''''', C5'' Glc3 en C-2'' Glc2 1"' 103,3 4,71 (d, 7,8) H2''' C2'', C2''', C3''', C5''' 2"' 74,4 3,24 (t, 8,2) H1''', H3''' C3''' 3"' 76,1 3,40 (t, 8,9) H2''', H4''' C4''' 4"' 70,0 3,37 (t, 9,0) H5''', H3''' C3''', C5''' 5"' 77 3,36 (m) H4''', H6'''a, H6'''b C4''' 6"' 61,3 3,77 (dd, 11,8-6,0) H5''', H6'''b C5''' 3,99 (d, 11,8) H5''', H6'''a C4''' Glc4 en C-3'' Glc2 1'''' 103,6 4,58 (d, 7,8) H2'''' C3'', C5'''' 2'''' 74,0 3,30 (t, 9,5) H1'''', H3'''' C3'''', C4'''' 3'''' 76,9 3,42 (t, 9,0) H2'''', H4'''' C2'''', C4'''' 4'''' 70,3 3,31 (m) H5'''', H3'''' C3'''', C5'''' 5'''' 76,8 3,39 (m) H4'''', H6''''a, H6''''b C3'''' 6'''' 61,3 3,64 (dd, 11,9-6,7) H5'''', H6''''b C4'''', C5'''' 3,93 (dd, 11,8-2,0) H5'''', H6''''a C4'''' Glc5 en C-6'' Glc2 1"''' 103,6 4,68 (d, 7,8) H2'''' C6'', C5''''' 2"''' 73,9 3,22 (t, 9,0) H1'''', H3'''' C1''''', C3''''' 3"''' 76,4 3,49 (t, 9,3) H2'''', H4'''' C2''''', C4''''', C5''''' 4"''' 70,3 3,31 (t, 8,2) H5'''', H3'''' C3''''', C5''''' 5"''' 76,3 3,37 (m) H4'''', H6''''a, H6''''b C4''''' 6"''' 61,4 3,69 (dd, 9,7-5,6) H5'''', H6''''b C4''''', C5''''' 3,87 (dd, 11,8-2,0) H5'''', H6''''a C4'''''

II.1.2.2.2. Identification des saponosides xf5-xf9 à jujubogénine

Les différentes techniques séparatives et spectrales ont permet d’isoler et identifier cinq saponines à jujubogénine dont la partie osidique, liée en C-3, varie selon le nombre des sucres constituants la chaîne osidique, trois (xf5, xf6), quatre (xf7) ou cinq sucres (xf8, xf9), les deux derniers se différenciant par le sucre terminal (Figure II-45).

HO 24 21 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H H HO Glc1 Ara1 O R1O O H 1''' O 1' O H HO 2' 3' OR2 O 28 29 Rha O 1'' HO HO Xyl O OH HO 1 2 O R =R = H 1 2 xf5: xf8: R = H R = HO O OH HO 1 2 HO xf6: R = SO3H R = H OH 2 Ara2 Glc OH HO Glc2 O 1 2 O HO xf9: R = H R = 1 2 O xf7: R = H R = HO Glc2 HO O OH OH HO HO OH Figure II-45 : Structures des composés xf5-xf9.

II.1.2.2.2.1. Détermination structurale de la génine I (jujubogénine)

Pour élucider la structure de la génine I, nous allons prendre comme exemple le composé xf6.

Analyse du spectre de RMN 1H du composé xf6 (Figure II-46)

L’examen du spectre de RMN 1H nous permet de distinguer les signaux caractéristiques suivants : - sept singulets d’intensité 3H correspondant à sept méthyles dont deux déblindés situés à 1,71 et 1,74 ppm. - quatre protons résonnant dans la zone des protons portés par des carbones oxygénés à 3,15 ppm (dd, J= 11,6-4,4 Hz), 3,97 ppm (d, J= 7,4 Hz), 4,05 ppm (d, J= 7,0 Hz) et 4,70 ppm (td, J= 9,2-2,0 Hz). - un proton éthylénique situé à 5,18 ppm (dt, J=8,3-1,4 Hz).

Figure II-46 : Spectre de RMN 1H du composé xf6.

Analyse du spectre de RMN 13C de xf6 (Figure II-47)

Le spectre de RMN 13C montre trente carbones parmi lesquels nous distinguons les signaux suivants : - quatre carbones hydroxylés résonnant à 66,9, 69,4, 69,7 et 89,6 ppm. - deux carbones éthyléniques situés à 136,7 et 126,3 ppm attribuables à une double liaison. - un carbone résonnant à 111,4 ppm. Aucun indice de la présence d’une autre double liaison ne se manifeste pour justifier ce déblindage. Des données dans la littérature indiquent qu’il s’agit d’un cétal [63], un carbone quaternaire dioxygéné caractéristique de la jujubogénine (Figure II-54). - un massif de carbones résonnant entre 15-57 ppm.

Figure II-47 : Spectre de RMN 13C du composé xf6.

Analyse du spectre COSY de xf6 : (Figure II-48)

- A partir du proton H-3 situé à 3,15 ppm, les deux protons géminés Ha,b-2 sont localisés

à 1,71 et 1,84 ppm. Eux-mêmes corrèlent avec les deux protons géminés Ha,b-1 résonnant à 0,98 et 1,71 ppm, ainsi les protons du cycle A sont attribués.

- A partir du proton situé à 2,51 ppm (m), trois corrélations sont observées dont une avec le proton résonnant à 1,03 ppm (dd, J= 7,2-1,4 Hz) et deux autres avec deux protons situés à 1,71 (m) et 1,87 ppm (dl, J=12,8 Hz) corrélant entre eux. Les quatre

signaux sont attribués respectivement aux protons H-13, H-17 et Ha,b-12. Ces derniers

présentent chacun deux corrélations identiques avec les deux protons géminés Ha-11

(δH 1,51, dl, J=12,8 Hz) et Hb-11 (δH 1,66, dd, J=12,8-2,4 Hz).

- Les deux protons géminés Ha,b-11 corrèlent avec un proton résonnant à 0,90 ppm (dd, J= 10,0-3,9 Hz) attribuable au H-9.

- D’autre part, en examinant le spectre au niveau du proton oléfinique H-24 à 5,18 ppm, nous observons trois corrélations dont deux avec les signaux des deux méthyles

singulets déblindés à 1,74 ppm (CH3-26) et 1,71 ppm (CH3-27) et le troisième avec un proton résonnant à 4,70 ppm (td, J= 9,8-2,0 Hz) attribuable au proton H-23.

- Au niveau du proton H-23 deux corrélations sont observées avec deux protons situés à 1,40 ppm (dd, J= 13,8-11,1 Hz) et 1,49 ppm (dl, J= 10,2 Hz), eux même corrélant

entre eux et attribuables aux protons géminés Ha,b-22 (Figure II-50).

Figure II-48 : Spectre COSY de la génine de xf6.

Analyse du spectre HSQC J-modulé de xf6 (Figure II-49)

Les données obtenues sur le spectre HSQC J-modulé permettent d’attribuer les carbones suivants :

- les carbones de sept méthyles dont deux sont attribués CH3-26 (δC 25,8), CH3-27 (δC 18,4).

- les neuf carbones méthyléniques dont cinq sont attribués aux carbones CH2-1 (δC

40,0), CH2-2 (δC 27,3), CH2-11 (δC 22,5), CH2-12 (δC 29,2) et CH2-22 (δC 45,4). Parmi les quatre carbones méthyléniques restant nous distinguons un oxygéné situé à 66,9

ppm portant deux protons géminés à δHa 3,97 (d, J=7,2 Hz) et δHb 4,05 (d, J=7,2 Hz), caractéristique du carbone C-30 de la jujubogénine, lié à l’atome d’oxygène formant le pont oxygéné.

- les sept carbones méthiniques dont un oléfinique CH-24 (δC 126,3), deux oxygénés

CH-3 (δC 89,6) et CH-23 (δC 69,7), les carbones CH-9 (δC 54,1), CH-13 (δC 38,0),

CH-17 (δC 54,4) et le dernier attribué, par élimination, au CH-5 (δC 57,5, δH 0,75).

Sur le spectre de RMN 13C reste sept carbones quaternaires dont un carbone éthylénique C-25 situé à 136,7 ppm, le carbone cétal C-16 à 111,4 ppm et un carbone oxygéné résonnant à 69,4 ppm.

Figure II-49 : Spectre HSQC du composé xf6.

100

Analyse du spectre HMBC de xf6 (Figure II-51)

n>1 Parmi les corrélations JH-C observées sur le spectre HMBC nous citerons les plus importantes pour élucider la structure finale de la génine (Figure II-50) :

- quatre corrélations sont observées au niveau du proton H-3 (δH 3,15) dont une avec

le carbone C-2, deux avec deux carbones à δC 28,5 et δC 17,1 attribuables aux

méthyles CH3-28 et CH3-29 et la dernière avec un carbone quaternaire attribuable au

carbone C-4 (δC 40,5 ppm). La distinction des deux méthyles CH3-28 et CH3-29 s’effectue grâce aux valeurs différentes de leur déplacement chimique. Le carbone α-

équatoriale CH3-28 (δC 28,5) est plus déblindé que le carbone β-axiale CH3-29 (δC 17,1).

- les protons des méthyles CH3-28 et CH3-29 présentent trois corrélations identiques

avec le C-3 (δC 89,6, valeur du C-3 glycosylé), C-4 et le C-5 (δC 57,5 ppm) en plus de leurs corrélations mutuelles. - au niveau du carbone C-5 nous visualisons une corrélation avec un singulet

d’intensité 3H à δH 0,90 (CH3-19) dont le carbone attribué par l’analyse de spectre

HSQC résonne à δC 16,9. Les protons du méthyle CH3-19 corrèlent avec les carbones

CH2-1, CH-9 et un carbone quaternaire situé à 38,3 ppm attribuable au carbone C-10.

A partir du proton H-5 attribué grâce à l’analyse du spectre HSQC à 0,75 ppm, les

deux protons géminés Ha,b-6 sont localisés à l’aide des corrélations observées sur le

spectre COSY à δHa-6 1,53 (dl, J=14,8 Hz) et δHb-6 1,59 (t, J=10,5 Hz). Ces derniers

corrèlent avec deux protons situés à 1,49 et 1,56 ppm attribuables au CH2-7. L’analyse du

spectre HSQC nous a permis d’attribuer les deux carbones CH2-6 (δC 19,1) et CH2-7 (δC 36,9).

- le carbone C-9 corrèle avec les protons d’un méthyle situé à 1,16 ppm attribuable au

CH3-18. Ces derniers corrèlent avec trois carbones dont un attribué au carbone CH2-7

et deux quaternaires situés à 38,5 et 54,6 ppm attribuables au Cq-8 et Cq-14. La

distinction entre les deux carbones Cq-14 et Cq-8 est possible car le Cq-14 est plus déblindé par le fait qu’il est en position β par rapport au pont oxygéné, en plus des 2 corrélations JH-C observées entre les protons Hb-30, H-13 et le Cq-14 à 54,6 ppm.

- deux autres corrélations sont observées au niveau du carbone Cq-14 avec deux

protons géminés (δHa 1,20, d, J=8,6 Hz; δHb 2,09, dd, J=8,5-1,6 Hz) attribuables aux

101

protons CH2-15 portés par un carbone localisé par l’analyse du spectre HSQC à δC 37,1.

- les protons Ha,b-15 corrèlent également avec le carbone C-13 (δC 38,0), le carbone

cétal attribué comme Cq-16 (δC 111,4) et le carbone oxygéné CH2-30 (δC 66,9).

- les protons Ha,b-30 corrèlent avec les carbones C-13, C-14, C-15 et C-16.

- le proton H-17 (δH 1,03) montre trois corrélations avec les trois carbones identifiés

CH2-12, CH2-13 et Cq-16.

- le proton H-13 (δH 2,51) présente trois corrélations avec des carbones déjà identifiés

CH2-12, Cq-14 et CH-17.

- les protons du dernier méthyle non identifié (δH 1,16) corrèlent avec deux carbones

déjà attribués, les carbones CH-17 et CH2-22, et un carbone quaternaire oxygéné

résonnant à 69,4 ppm attribuable au Cq-20, ce qui permet d’attribuer ce méthyle à

CH3-21.

- les protons géminés Ha,b-22 présentent également des corrélations avec les carbones

C-20, C-21 (δC 29,6), C-23 et C-24.

- le proton identifié comme étant H-23 (δH 4,70) montre des corrélations avec les carbones C-22, C-24 et C-25.

- les protons des méthyles CH3-26 et CH3-27 corrèlent ente eux et avec les carbones C-24 et C-25.

21 24 26 HO 22 23 25 H H H O 27

19 18

15 O

H 30

R1O HMBC 28 29 COSY

n>1 Figure II-50: Les corrélations COSY & HMBC JH-C des protons de la jujubogénine.

102

Figure II-51 : Spectre HMBC du composé xf6.

Analyse du spectre ROESY de xf6 (Figure II-53) La détermination de la stéréochimie des carbones asymétriques est effectuée par l’analyse des valeurs de constante de couplage JH-H et des corrélations observées sur le spectre ROESY : - la configuration α-axiale du proton H-3 est déterminée grâce aux effets rOe observés

avec le proton H-5 et ceux du méthyle CH3-28 α-équatoriale. - des effets rOe observés entre H-29/H-19, H-19/H-18, H-18/H-13 confirment leur orientation β-axiale (Figure II-52).

- l’orientation α-axiale de H-5, H-9, Hb-30 et H-17 est déterminée par les effets rOe

observés entre H-5/H-9, H-9/Hb-30, Hb-30/H-17. - la stéréochimie des protons H-17 et H-13 est confirmée avec la valeur de la constante

de couplage Jα17-β13= 7,2 Hz.

- une corrélation observée entre H-17/Ha-22α (δH 1,40, dd, J= 13,8-11,1 Hz) indique la configuration α axiale de ce dernier. De même la position α-équatoriale du méthyle

CH3-21 est déduite par un effet rOe observé entre les protons H-17/H-21.

- l’orientation β-axiale du H-23 est déduite par l’effet rOe observé avec le proton Hb-

22β (δH= 1,49, d, J= 10,2 Hz) et est confirmée par la valeur de la constante de

couplage transdiaxiale J23-22a= 9,8 Hz.

103

Hb 21 22 CH3 Ha 20 H HO 23 24 H H 25 CH 17 3 13 H H 18 CH3 15 O CH3

CH3 19 H 29 9 H3C Hb O 30 H Ha 5 RO 28 H H

Figure II-52: Les effets rOe observés sur le spectre ROESY de la jujubogénine.

Figure II-53 : Importants effets rOe observés sur le spectre ROESY de xf6.

L’ensemble de nos analyses et la comparaison avec les données rapportées dans la littérature, nous permet de conclure que la structure de la génine I est la jujubogénine (Figure II-54) déjà isolée sous forme glycosylée d’Alphitonia zizyphoides (Rhamnaceae) [66], de Ziziphus lotus (Rhamnaceae) [63], de Bacopa monnieri (Scrophulariacae) [140] et d’Anomospermum grandifolium (Menispermaceae) [141].

104

21 24 26 HO 22 23 25 H H H O 27

19 18 15 O 30 H H H H HO H 28 29 Figure II-54: Structure de la jujubogénine.

Tableau II-7: Déplacements chimiques* en RMN 1H (500 MHz) RMN 13C (125 MHz) des génines I, II et III dans le CD3OD. Génine I (xf6) Génine II (xf10) Génine III (xf13)

Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 40,0 0,98 (m) 38,3 1,01 (td, 14,0-3,1) 38,4 0,99 (t, 11,8) 1,71 (dl, 11,2) - 1,72 (dl, 13,3) - 1,73 (dd, 11,3-1,3) 2 27,3 1,71 (m) 25,8 1,69 (dl, 16,4) 25,8 1,67 (t, 9,5) 1,84 (dd, 14,9-5,2) - 1,95 (dd, 15,3-3,7) - 1,94 (dd, 13,4-3,8) 3 89,6 3,15 (dd, 11,6-4,4) 89,1 3,19 (dd, 7,1-4,7) 89,1 3,19 (dd, 7,3-4,8) 4 40,5 - 39,0 - 39,0 - 5 57,5 0,75 (dl, 11,1) 55,9 0,78 (dl, 11,1) 55,8 0,77 (dd, 12,0-1,6) 6 19,1 1,53 (dl, 14,8) 17,7 1,52 (dl, 11,1) 17,7 1,52 (dl, 13,3) 1,59 (tl, 10,5) - 1,58 (t, 9,8) - 1,59 (t, 14,0) 7 36,9 1,49 (d, 11,9) 35,5 1,46 (m) 35,5 1,48 (m) 1,56 (tl, 10,5) - 1,56 (t, 10,9) - 1,57 (m) 8 38,5 - 37,1 - 37,5 - 9 54,1 0,90 (dd, 10,0-3,9) 52,7 0,92 (dd, 11,1) 52,3 0,79 (dd, 13,1-2,4) 10 38,3 - 36,9 - 36,8 - 11 22,5 1,51 (dl, 12,8) 21,1 1,49 (d, 11,8) 20,8 1,47 (dd, 13,8-7,3) - 1,66 (dd, 12,8-2,4) - 1,69 (dd, 17,3-5,3) - 1,65 (m) 12 29,2 1,71 (m) 27,9 1,72 (dl, 16,0) 26,9 1,67 (m) - 1,87 (d, 12,8) 1,85 (dd, 13,1-5,6) - 1,89 (m) 13 38,0 2,51 (m) 36,1 2,55 (m) 36,9 2,43 (m) 14 54,6 - 53,4 - 56,2 - 15 37,1 1,20 (d, 8,6) 35,6 1,19 (dd, 8,9-1,7) 37,3 1,41 (dd, 8,9-1,4) 2,09 (dd, 8,5-1,6) 2,11 (d, 8,5) 1,69 (d, 9,0) 16 111,4 _ 109,7 _ 117,5 - 17 54,4 1,03 (dd, 7,2-1,4) 48,1 1,35 (d, 8,5) 61,6 1,81 (dd, 7,3-1,3) 18 19,2 1,16 (s) 17,8 1,17 (s) 17,8 1,06 (s) 19 16,9 0,90 (s) 15,4 0,91 (s) 15,4 0,91 (s) 20 69,4 - 70,9 - 75,1 - 21 29,6 1,16 (s) 24,2 1,21 (s) 22,1 1,21 (s) 22 45,4 1,40 (dd, 13,8-11,1) 73,8 3,01 (s) 94,1 4,14 (t, 6,6) 1,49 (dl, 10,2) - - - - 23 69,7 4,70 (td, 9,8-2,0) 70,1 4,85 (d, 8,4) 27,3 2,29 (tl, 6,6) ------24 126,3 5,18 (dq, 8,3-1,4) 122,1 5,46 (dq, 9,2-1,7) 120,7 5,22 (tq, 7,3-0,7) 25 136,7 - 136,1 - 132,6 - 26 25,8 1,74 (s) 24,5 1,78 (s) 24,5 1,71 (s) 27 18,4 1,71 (s) 17,1 1,72 (s) 16,5 1,65 (s) 28 28,5 0,88 (s) 27,0 1,07 (s) 27,0 1,07 (s) 29 17,1 1,03 (s) 15,5 0,87 (s) 15,5 0,87 (s) 30 66,9 3,97 (d, 7,2) 65,5 3,95 (d, 7,0) 65,4 3,96 (dd, 8,3-1,6) 4,05 (d, 7,2) - 4,07 (d, 7,0) - 3,99 (d, 8,3) * les valeurs des déplacements chimiques appartiennent aux composés glycosylés en C-3. 105

II.1.2.2.2.2. Détermination structurale des composés xf5 et xf6

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du xf5 montre un ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 935,4984 correspondant à la formule brute C47H76O17.

L’analyse des spectres de RMN suggère la présence de saponosides à jujubogénine composés de trois sucres.

Sur le spectre de RMN 1H de xf5 (Figure II-55), trois protons anomériques sont localisés à 5,24 ppm (d, J= 1,8 Hz) et deux superposés à 4,51 ppm (d, J= 7,8 Hz). Leurs carbones respectifs tsont attribués à l’aide du spectre HSQC J-modulé à 100,6, 102,9 et 103,8 ppm.

Figure II-55 : Spectres de RMN 1H des composés xf5 et xf6.

106

Figure II-56 : Spectre de RMN 13C du composé xf5.

L’analyse des corrélations sur les spectres COSY (Figure II-57) et TOCSY de xf5 nous permet d’identifier un système de spin à huit protons à partir du proton anomérique H-1" résonnant à 5,24 ppm qui corrèle avec le proton H-2" (3,93 ppm, dd, J= 3,3-1,7 Hz). Ce dernier présente une corrélation avec le proton H-3" (3,73 ppm, dd, J= 9,6-3,5 Hz) qui couple avec le proton H-4" (3,41 ppm, t, J= 9,5 Hz). Le proton H-4" quant à lui présente une corrélation avec le proton H-5" (3,89 ppm, m) qui corrèle lui-même avec un doublet intégrant pour trois protons (1,24 ppm, d, J= 6,1 Hz) indiquant la présence d’un 6-désoxyhexose. Les valeurs de constante de couplage indiquent une configuration transdiaxiale des protons H-3",

H-4" et H-5" (JH3"-H4"= JH4"H5"= 9,5 Hz) et une position équatoriale des protons H-1" et H-2"

(JH1"-H2"= 1,7 Hz, JH2"-H3"=3,3 Hz) suggérant un α-L-rhamnopyranose. La configuration α est confirmée par un effet rOe observé entre les protons H-1"/H-2" sur le spectre ROESY et l’absence d’effets rOe entre les protons H-1"/H -5". Les déplacements chimiques des carbones de ce sucre (Tableau II-8) attribués par analyse du spectre HSQC J-modulé sont en accord avec un α-L-rhamnopyranose en position terminale [139].

L’analyse des corrélations observées sur le spectre COSY (Figure II-57) à partir du doublet anomérique H-1''' (4,51 ppm, d, J= 7,8 Hz) nous indique la présence d’un hexose dont le proton H-2''' résonne sous forme d’un triplet à 3,31 ppm (J= 8,3 Hz) en corrélant avec le proton H-3''' (3,40 ppm, t, J= 8,7 Hz). Ce dernier corrèle avec le proton H-4''' (3,36 ppm, t, J= 9,1 Hz) qui couple avec le proton H-5''' (3,33 ppm, m) qui corrèle avec les deux protons géminés Ha-6''' (3,70 ppm, dd, J= 11,9-3,5 Hz) et Hb-6''' (3,85 ppm, dd, J= 11,9-2,2 Hz). Les valeurs élevées des constantes de couplage indiquent que tous les protons sont en position transdiaxiale suggérant la présence d’un β-D-glucopyranose. La comparaison des déplacements chimiques δC des carbones correspondants à ces protons avec ceux rapportés dans la littérature [139] le confirme. 107

La dernière unité osidique est identifiée comme étant un pentose dont le proton anomérique résonne sous la forme d’un doublet à 4,51 ppm (H-1', d, J= 7,8 Hz). Le proton H- 2 4' (4,05 ppm, m) forme un système ABX avec les deux protons géminés H-5' ( JHa5'.ax-Hb5'.eq= 12,1 Hz) dont le proton Hb-5' résonne à 3,89 ppm (dd, J= 12,1-3,5 Hz) et le proton Ha-5' à

3,52 ppm (dd, J= 12,1-2,4 Hz). Les valeurs de constante de couplage JH4'-Ha-5' =2,4 Hz et JH4'-

Hb-5' = 3,4 Hz indiquent une position équatoriale du proton H-4'. Les déplacements chimiques de leurs carbones, attribués par l’analyse du spectre HSQC, laisse supposer qu’il s’agit d’un

α-L-arabinose, et la comparaison de ces données avec celles rapportées dans la littérature [139] le confirme.

Figure II-57 : Spectre COSY du composé xf5.

L’enchaînement des unités osidiques ainsi que le point d’ancrage des sucres sur la génine sont élucidés grâce à l’analyse du spectre ROESY. Des effets rOe sont observés entre les protons H-1' et H-3, H-2' et H-1'' et H-3' et H-1''' suggérant que l’arabinose est relié à la génine et qu’il est disubstitué en position 2 par le rhamnose et en 3 par le glucose. Ceci est confirmé par l’analyse du spectre HMBC (Figure II-58) sur lequel nous distinguons les corrélations suivantes : H-3 de la génine et C-1' Ara, H-2' Ara et C-1'' Rha et H-3' Ara et C-1''' Glc. 108

Figure II-58 : Corrélations HMBC de la partie osidique de xf5.

L’ensemble de nos données nous permet d’identifier le composé xf5 au 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine (Figure II-60), identifié pour la première fois.

Les spectres de RMN 1D & 2D du composé xf6 présentent les mêmes signaux que ceux de xf5, exception faite des déplacements chimiques des protons anomériques H-1' (Ara) et H-1''' (Glc) (Figure II-55) et de la position 4''' du glucose dont le carbone et proton subissent un déblindage à δC 77,4 et δH 4,18 (t, J= 9,4 Hz) (Figure II-59) par rapport à ceux de xf5 (δC 69,8 et δH 3,36). Cette dernière constatation suggère la présence d’un substituant inorganique sur l’OH en C-4''' du glucose car seul son effet déblindant est détecté sur les spectres de RMN. L’analyse du spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif montre un ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 1037,4360 soit 102,93 de plus que xf5, indiquant la présence d’un groupement sulfate de sodium correspondant à la formule brute C47H75NaO20S.

109

Figure II-59 : Spectre HSQC de la partie osidique du composé xf6.

La structure finale du xf6 (Figure II-60) est déterminée comme étant le 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[ 4-O-(sodium sulfonato)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L- arabinopyranosyl-jujubogénine, le sel sodique du 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[(4- sulfo)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine, ce dernier a été isolé précédemment des feuilles de l’espèce Zizyphus Lotus [142].

HO 24 21 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H H HO Glc Ara O RO O H 1''' O 1' O H HO 2' 3' OH O 28 29 Rha O 1'' HO R= H xf5 HO OH R= SO3Na xf6

Figure II-60: Structures des composés xf5 et xf6

110

II.1.2.2.2.3. Détermination structurale du composé xf7

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif de xf7 montre un ion pseudo- moléculaire [M+Na]+ à m/z 1097,5522 et un ion fragment à m/z 935,5248 [M+Na-162]+ qui correspond à la perte d’un hexose en position terminale et à la masse de xf5 indiquant un hexose supplémentaire dans xf7. Sur le spectre de RMN 1H (Figure II-61) du composé xf7 nous retrouvons presque les mêmes signaux que ceux observés pour xf5, auxquels s’ajoutent dans la zone des sucres un quatrième proton anomérique et d’autres signaux appartenant à l’hexose supplémentaire.

L’analyse du spectre COSY permet d’attribuer les sept protons de l’hexose. Les valeurs des constantes de couplage obtenues sur le spectre de RMN 1H indiquent une position transdiaxiale de tous les protons H-1'''', H-2'''', H-3'''', H-4'''' et H-5'''' suggérant la présence d’un second β-D-glucopyranose (Tableau II-9). Les carbones correspondants sont attribués au moyen du spectre HSQC J-modulé (Tableau II-8).

Le déblindage du carbone C-2''' (δC 79,6 ppm) par rapport à celui du xf5 (≈+5 ppm) (Tableau II-8) permet de supposer le site de substitution du second glucose sur le Glc1 en C- 2'''. Cela est confirmé par l’effet rOe observé sur le spectre ROESY entre les protons H-2''' (Glc1) et H-1'''' (Glc2), ainsi que par la corrélation H1''''/C2''' observée sur le spectre HMBC (Figure II-63).

Figure II-61 : Spectre de RMN 1H du composé xf7 (b), agrandissement de la partie osidique (a).

111

Le composé xf7 (Figure II-62) est ainsi identifié comme le 3-O-β-D-glucopyranosyl-

(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl- jujubogénine.

HO 24 21 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H H HO Glc1 Ara O O H HO 2''' 1' O 1''' O H HO 2' HO 3' O O O 28 29 HO Rha 1'' HO 1'''' O 2 Glc OH HO HO OH

Figure II-62: Structure du composé xf7

Figure II-63 : Corrélations HMBC de la partie osidique de xf7.

112

II.1.2.2.2.4. Détermination structurale des composés xf8 et xf9

Les deux composés ont été isolés sous forme d’un mélange 60:40, malheureusement aucun essai pour les séparer n’a pu aboutir. L’élucidation structurale des deux composés a donc été établie à partir des spectres RMN 1D (Figure II-64, II-65) & 2D du mélange.

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du mélange xf8+xf9 montre un ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 1229,5923 laissant supposer là aussi la présence d’un sucre supplémentaire par rapport à xf7 (m/z 1097). La différence de masse de 132 uma suggère un pentose supplémentaire en position terminale, contrairement au spectre de RMN 1H qui montre deux doublets anomériques supplémentaires à 4,34 ppm (xf8, d, J= 7,5 Hz) et à 4,36 ppm (xf9, d, J= 6,8 Hz).

A partir des protons anomériques résonnant à δH 4,39 (d, J = 6,5 Hz), 4,69 (d, J = 7,8 Hz), 4,89 (d, J = 6,9 Hz) et 5,26 (d, J = 1,5 Hz) sont attribués comme pour xf7 respectivement un arabinose, deux glucoses et un rhamnose (Tableaux II-8 et II-9).

Figure II-64 : Spectre de RMN 1H du mélange xf8+xf9 (b) avec l’agrandissement de la partie osidique (a).

113

Figure II-65 : Spectre de RMN 13C du mélange xf8+xf9 (c) avec l’agrandissement de la partie osidique (a,b).

3 Afin d’identifier le pentose supplémentaire, nous relions les corrélations JH-H observées sur le spectre COSY à partir du proton anomérique H-1''''' à 4,34 ppm (d, J= 7,5 Hz). Ce dernier corrèle avec le proton H-2''''' situé à 3,32 ppm (dd, J=9,5-7,5 Hz) qui possède une corrélation avec le proton H-3''''' résonnant sous forme d’un triplet à 3,38 ppm (t, J=9,5 Hz), ce dernier quant à lui corrèle avec le proton H-4''''' situé à 3,53 ppm (td, J= 9,5-5,5 Hz).

Au niveau du proton H-4''''' deux corrélations sont observées avec deux protons géminés Ha-

5''''' (3,25 ppm, t, J= 9,9 Hz) et Hb-5''''' (3,89 ppm, dd, J= 9,9-2,6 Hz). Les valeurs des constantes de couplages élevées indiquent que tous les protons du pentose sont en position transdiaxiale suggérant qu’il s’agit d’un β-D-xylopyranose. Cette dernière constatation est confirmée par l’analyse des effets rOe observés sur le spectre ROESY entre le proton H-1''''' et les protons H-3''''' et H-5''''' (Figure II-66). Les déplacements chimiques des carbones, attribués par l’analyse sur spectre HSQC J-modulé, sont en accord avec un β-D-xylopyranose terminal [139].

Un effet rOe (Figure II-66) observé au niveau du proton H-1''''' avec le proton Hb-6'''' 2 du Glc et une corrélation HMBC entre H-1'''''/C-6'''' indiquent le point d’ancrage du β-D- 2 2 xylose en C-6'''' Glc . Cette substitution explique le fait que le carbone C-6'''' Glc (δC 68,0 ppm) soit déblindé (+ ≈7 ppm) comparativement avec celui du xf7 (Tableau II-8).

114

Figure II-66 : Importants effets rOe observés sur le spectre ROESY du mélange xf8+xf9.

La structure finale du xf8 (Figure II-67) est établie comme étant le 3-O-β-D- xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine.

Le pentose supplémentaire du composé xf9 dont l’anomère résonne à 4,36 ppm, est identifié comme un second α-L-arabinopyranose grâce à l’analyse du spectre COSY et la mesure des constantes de couplage qui révèlent une position équatoriale du proton 4'''''-Ara2

(J3/4= J4/5a=3,4 Hz) (Tableau II-9). Les spectres ROESY & HMBC indiquent le point 2 d’ancrage de l’α-L-arabinose en C-6'''' Glc .

La saponine xf10 est l’isomère de xf9 au niveau du sucre terminal en C-6'''' Glc2, il s’agit de la 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine (Figure II-67).

OH 24 26 21

20 23 25 H H O 27 17 19 18 xf8 OH eq 15 xf9 OH ax O H OH 30 Glc1 Ara H H HO HO O O 1' H O HO 1''' 1''''' O O H HO O 29 HO 2''' 3' 2' 28 O O O HO Rha OH 1'' HO Glc2 1'''' O OH HO HO OH Figure II-67: Structures des composés xf8 et xf9.

115

Le fait d’avoir deux sucres différents liés en C-6'''' Glc2 n’apporte guère de changement sur les différents atomes des autres unités osidiques, exception faite des protons H-1'', H-2'' et H-6'' du rhamnose terminal attaché en C-2' Ara1 qui subissent une modification au niveau des déplacements chimiques probablement liée aux interactions stériques avec le sucre terminal en C-6''''-Glc2 (Tableaux II-8 et II-9).

Tableau II-8: Déplacements chimiques en RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique des composés xf5-xf9 à jujubogénine dans le CD3OD. xf5 xf6 xf7 xf8 xf9 δC δC δC δC δC Ara1 en C-3 1' 103,8 105,3 104,5 104,7 104,7 2' 73,8 75,4 73,8 75,0 74,7 3' 80,9 82,7 80,7 81,1 81,1 4' 67,2 68,8 68,2 68,7 68,7 5' 63,3 65,0 65,5 64,7 64,7 Rha en C-2' 1" 100,6 102,1 100,2 100,8 100,6 2" 70,7 72,1 71,0 70,5 70,5 3" 70,7 72,1 71,0 70,8 70,8 4" 72,4 73,9 72,3 72,5 72,5 5" 68,9 70,2 68,7 68,7 68,7 6" 16,6 18,0 18,1 16,8 16,8 Glc1 en C-3' 1"' 102,9 104,2 101,3 101,6 101,6 2"' 73,7 75,0 79,6 80,2 80,1 3"' 76,6 76,7 76,1 76,9 76,9 4"' 69,8 77,4 75,7 69,8 69,8 5"' 76,6 76,3 75,4 76,1 76,1 6"' 60,1 62,2 61,4 61,1 61,1 Glc2 en C-2"' 1"" 103,2 102,7 102,6 2"" 74,6 73,8 73,8 3"" 76,6 76,6 76,6 4"" 70,0 69,5 69,5 5"" 77,5 75,8 75,8 6"" 61,2 68,0 68,0 R en C-6"" Xyl Ara2 1""' 104,4 104,1 2""' 73,3 71,0 3""' 76,6 72,6 4""' 69,7 68,3 5""' 65,6 65,5

116

1 Tableau II-9: Déplacements chimiques en RMN H (500 MHz) de la partie osidique de xf5-xf9 à jujubogénine dans le CD3OD

xf5 xf6 xf7 xf8 xf9 δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) Ara1en C-3 1' 4,51 (d, 7,8) 4,49 (d, 5,4) 4,27 (d, 6,1) 4,39 (d, 6,5) 4,39 (d, 6,5) 2' 3,90 (m) 3,90 (t, 5,8) 3,72 (t, 7,0) 3,89 (t, 9,4) 3,89 (t, 9,4) 3' 3,89 (m) 3,88 (t, 4,6) 3,74 (dd, 7,0-2,8) 3,86 (m) 3,86 (m) 4' 4,05 (m) 4,05 (d, 4,1) 3,81 (d, 2,8) 4,07 (m) 4,07 (m) 5' 3,52 (dd, 12,1-2,4) 3,53 (dd, 11,1-2,3) 3,39 (dd, 13,1-6,5) 3,55 (dd, 12,6-2,5) 3,55 (dd, 12,6-2,5) 3,89 (dd, 12,1-3,4) 3,89 (dd, 11,1-3,1) 3,67 (dd, 13,1-2,7) 3,87 (dd, 12,6-3,4) 3,87 (dd, 12,6-3,4) Rha en C-2' 1" 5,24 (d, 1,8) 5,25 (d, 1,5) 5,20 (sl) 5,26 (d, 1,5) 5,31 (d, 1,5) 2" 3,93 ( dd, 3,3-1,7) 3,94 (dd, 3,4-1,7) 3,72 (m) 4,07 (m) 4,03 (m) 3" 3,73 (dd, 9,6-3,5) 3,74 (dd, 9,6-3,5) 3,46 (t, 9,3) 3,73 (dd, 9,1-3,5) 3,73 (dd, 9,4-2,7) 4" 3,41 (t, 9,5) 3,41 (t, 9,7) 3,20 (t, 9,4) 3,43 (t, 8,4) 3,43 (t, 8,4) 5" 3,89 (m) 3,90 (m) 3,83 (m) 3,97 (m) 3,97 (m) 6" 1,24 (d, 6,1) 1,24 (d, 6,1) 1,07(d, 6,2) 1,25 (d, 6,2) 1,25 (d, 6,4) Glc1 en C-3' 1"' 4,51 (d, 7,8) 4,55 (d, 7,4) 4,55 (d, 7,4) 4,69 (d, 7,8) 4,69 (d, 7,8) 2"' 3,31 (t, 8,3) 3,42 (dd, 9,1-7,4) 3,70 (dd, 8,5-7,4) 3,70 (dd, 8,6-7,8) 3,70 (dd, 8,6-7,8) 3"' 3,40 (t, 8,7) 3,71 (t, 9,1) 3,72 (t, 8,5) 3,63 (t, 8,6) 3,63 (t, 8,6) 4"' 3,36 (t, 9,1) 4,18 (t, 9,4) 3,86 (t, 9,3) 3,04 (t, 9,0) 3,04 (t, 9,0) 5"' 3,33 (m) 3,36 (ddd, 9,8-5,3-2,2) 3,36 (m) 3,46 (m) 3,46 (m) 6"' 3,70 (dd, 11,9-3,5) 3,78 (dd, 11,8-5,3) 3,42 (dd, 11,5-5,9) 3,68 (dd, 11,8-5,4) 3,68 (dd, 11,8-5,4) 3,85 (dd, 11,9-2,2) 3,89 (dd, 11,8-2,2) 3,67 (dd, 11,5-3,3) 3,87 (dd, 11,8-3,0) 3,87 (dd, 11,8-3,0) Glc2 en C-2''' 1"" 4,70 (d, 7,7) 4,89 (d, 6,9) 4,89 (d, 6,9) 2"" 3,05 (t, 7,9) 3,43 (t, 8,4) 3,43 (t, 8,4) 3"" 3,14 (t, 7,9) 3,38 (t, 8,8) 3,38 (t, 8,8) 4"" 3,12 (t, 8,4) 3,47 (t, 8,9) 3,47 (t, 8,9) 5"" 3,09 (m) 3,46 (m) 3,46 (m) 6"" 3,48 (dl, 11,1) 3,79 (dd, 11,3-4,4) 3,79 (dd, 11,3-4,4) 3,67 (dd, 10,9-4,3) 4,16 (dd, 11,3-2,7) 4,16 (dd, 11,3-2,7) R en C-6"" Xyl Ara2 1""' 4,34 (d, 7,5) 4,36 (d, 6,8) 2""' 3,32 (dd, 9,5-7,5) 3,66 (t, 7,7) 3""' 3,38 (t, 9,5) 3,61 (dd, 8,9-3,4) 4""' 3,53 (td, 9,5-5,5) 3,83 (m) 5""' 3,25 (t, 9,9) 3,61 (dd, 9,0-3,4) 117 3,89 (dd, 9,9-2,6) 3,89 (dd, 9,0-2,6)

II.1.2.2.3. Identification des saponosides xf10-xf12 à 22α-hydroxy- jujubogénine

Les trois composés identifiés (xf10, xf11 et xf12) sont des saponines à 22α-hydroxy- jujubogénine glycosylée en position C-3 (Figure II-68). Tous les trois possèdent une partie osidique identique constituée de deux β-D-glucopyranoses reliés en (1→6). Dans le cas de xf11 et xf12 l’hydroxyle en position 6 du sucre terminal est estérifié par un acide aromatique.

OH HO 24 26 21 20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O RO Glc2 30 HO O H 6' 1'' O H H HO Glc1 O H OH HO 1' O H HO OH 28 29

H3CO

O O HO C C C HO C C C xf10: R= H xf11: R= H H xf12: R= H H

H3CO Figure II-68 : Structures des composés xf10, xf11 et xf12.

II.1.2.2.3.1. Détermination structurale de la génine II (22α-hydroxy- jujubogénine) de xf10

Une simple comparaison du spectre de RMN 1H de la génine II du composé xf10 avec celui de la jujubogénine montre la présence d’un dérivé de ce dernier, car nous retrouvons presque tous les signaux de la jujubogénine auxquels s’ajoute un singulet à 3,01 ppm. L’examen du spectre de RMN 13C confirme la grande similitude entre les deux génines avec la présence d’un carbone oxygéné supplémentaire situé à 73,8 ppm sur le spectre de la génine II (Tableau II-7). En analysant les corrélations observées sur le spectre COSY, nous retrouvons toutes les corrélations attribuées précédemment sur le spectre de la jujubogénine, exception faite des corrélations entre les protons Ha,b-22/H-23 qui ne se trouvent plus sur le spectre de la génine II. En revanche une nouvelle corrélation est observée entre le proton H-23 et le singulet

118

résonnant à 3,01 ppm indiquant une substitution en position C-22 par un hydroxyle ayant une action déblindante.

Sur le spectre HSQC, nous attribuons les déplacements chimiques de tous les carbones et protons en suivant le même raisonnement que celui utilisé pour l’identification de la jujubogénine. Seul le C-22 montre une modification fondamentale car il se manifeste sous forme d’un méthine (δC 73,8).

Les résultats obtenus à ce stade sont confirmés par l’analyse des corrélations observées sur le spectre HMBC, qui montre cinq corrélations au niveau du proton H-22 (δH 3,01) avec les carbones C-17 (δC 48,1), C-20 (δC 70,9), C-21 (δC 24,2), C-23 (δC 70,1) et C-24 (δC 122,1) (Figure II-69). Le C-20 quant à lui, présente deux corrélations dont une avec les protons du méthyle CH3-21 et la deuxième avec le proton H-23 (δH 4,85, d, J= 8,4 Hz).

Les déplacements chimiques des carbones CII-17 (δC 48,1), CII-21 (δC 24,2) et CII-24

(δC 122,1) sont blindés de 4 à 6 ppm par rapport aux valeurs enregistrées pour la jujubogénine

CI-17 (δC 54,4), CI-21 (δC 29,6) et CI-24 (δC 126,3) (Tableau II-7) ce qui indique la présence d’une fonction hydroxyle en position C-22 qui exerce un effet γ-blindant sur les trois carbones précités.

Le proton H-22 résonne sous la forme d’un singulet indiquant une position β-

équatoriale qui est confirmée par la présence d’un effet rOe entre CH3-21/CH-22. Ces données permettent de placer l’hydroxyle en position α-axiale.

21 H 22 CH OH 3 H HO 20 H 23 24 25 CH3 H 17 O CH3

16 HMBC ROESY

Figure II-69: Effets rOe et corrélations HMBC du cycle E de la génine II.

Ainsi la génine des trois composés xf10, xf11 et xf12 est identifiée comme étant la 22α- hydroxy-jujubogénine décrite pour la première fois.

II.1.2.2.3.2. Détermination structurale du composé xf10

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du composé xf10 montre un pic + pseudo-moléculaire [M+Na] à m/z 835,4463 correspondant à la formule brute C42H68O15. En

119

soustrayant la masse molaire de la génine (488 uma) nous obtenons 2x162 uma correspondant à deux hexoses.

Sur les spectres de RMN 1H (Figure II-70) et 13C (Figure II-71) nous retrouvons tous les signaux identifiés précédemment correspondants à la génine 22α-hydroxy-jujubogénine, auxquels s’ajoute un massif de signaux dans la zone des sucres dont nous distinguons deux anomères.

À partir des protons anomériques situés à 4,35 et 4,42 ppm, deux systèmes de sept spins sont identifiés par l’analyse des corrélations observées sur le spectre COSY, ainsi tous les protons impliqués sont identifiés. Leurs carbones correspondants sont également localisés grâce à l’analyse du spectre HSQC (Tableau II-10). Les différents déplacements chimiques et les valeurs élevées des constantes de couplage indiquent qu’ils s’agissent de deux unités de β-

D-glucopyranose (Tableaux II-10 et II-11). La dernière constatation rejoint celles obtenues sur le spectre ROESY, sur lequel des effets rOe entre les protons axiaux (H-1 Glc/H-3 Glc et H-1 Glc /H-5 Glc) sont observés pour chaque sucre.

Figure II-70 : Spectre de RMN 1H du composé xf10 (b) avec l’agrandissement de la partie osidique (a).

Figure II-71 : Spectre de RMN 13C du composé xf10 (b) avec l’agrandissement de la partie osidique (a).

120

L’enchaînement (1→6) des sucres est déduit par l’effet rOe observé entre le H-1" 2 1 1 Glc /Ha,b-6' Glc , de même l’effet rOe entre H-1' Glc /H-3 de la génine indique le point d’ancrage en position C-3 de la chaîne osidique. Les corrélations H-1' /C-3, H-3/C-1', H-6'/C- 1" et H-1"/C-6' observées sur le spectre HMBC confirment le résultat obtenu par analyse du spectre ROESY.

La structure finale de xf10 (Figure II-72) est identifiée comme le 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy-jujubogénine isolé pour la première fois.

OH HO 24 26 21 20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O HO Glc2 30 HO O H 6' 1'' O H H HO Glc1 O H OH HO 1' O H HO OH 28 29 Figure II-72: Structure du composé xf10.

II.1.2.2.3.3. Détermination structurale du composé xf11

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du xf11 donne un pic pseudo- + moléculaire à m/z [M+Na] 1041,5024 correspondant à la formule brute C53H78O19.

Sur le spectre de RMN 1H du composé xf11 (Figure II-73) nous retrouvons les signaux correspondant au composé xf10, dont les protons géminés en position 6 du glucose terminal (Glc2) sont déblindés vers les champs faibles (4,30 et 4,61 ppm) indiquant une substitution en C-6" du glucose terminal (Tableau II-10). Cette substitution est confirmée par l’apparition de nouveaux signaux dont nous distinguons un singulet à 3,92 ppm intégrant pour six protons, un autre singulet à 6,98 ppm intégrant pour deux protons et finalement deux doublets avec une constante de couplage ≈16 Hz résonnant à 6,47 et 7,67 ppm. Ces deux derniers sont vicinaux comme le prouve une corrélation observée sur le spectre COSY.

121

Figure II-73 : Spectre de RMN 1H de xf11 (b) avec l’agrandissement des parties osidique et aromatique (a).

Le spectre de RMN 13C (Figure II-74) montre également 11 nouveaux carbones, dont un carbonyle à 167,6 ppm, deux carbones C-sp3 oxygénés superposés à 55,5 ppm et le reste des carbones résonnent dans un domaine entre 105-149 ppm indiquant un noyau aromatique. Les protons correspondants sont attribués grâce à l’analyse du spectre HSQC. Les signaux à

δH 3.92 et δC 55.5 sont caractéristiques de deux groupements méthoxyles.

Les données obtenues à ce stade confirment la présence d’une estérification en C-6" du glucose terminal avec un acide aromatique dont le cycle présente une symétrie déduite par la superposition des signaux (deux quaternaires à 148,1 ppm, deux CH à 105,1 ppm et deux méthoxyles à 55,5 ppm).

Figure II-74 : Spectre de RMN 13C du composé xf11 (b) avec l’agrandissement de la partie aromatique (a). 122

L’élucidation finale de la structure est effectuée grâce à l’analyse du spectre HMBC qui a permis d’identifier les corrélations suivantes (Figure II-75):

- entre les protons géminés du C-6" du glucose terminal avec le carbonyle qui corrèle lui-même avec les deux doublets à 6,47 ppm (d, J= 15,9 Hz) et 7,67 ppm (d, J= 15,9 Hz) attribuables respectivement aux C-7''' (114,3 ppm) et C-8''' (146,0 ppm). - les deux protons vicinaux H-7''' et H-8''' corrèlent avec le carbone C-1''' situé à 125,1 ppm. - le proton H-7''' corrèle avec le signal à 105,1 ppm correspondant à deux carbones CH superposés indiquant leur position en meta sur le cycle (C-2"'+ C-6"'). - les deux protons superposés H-2'''+ H-6''' corrèlent avec les deux carbones quaternaires superposés à 148,1 ppm (C-3'''+ C-5''') et le carbone quaternaire à 138,4 ppm (C-4'''). Les déplacements chimiques de ces trois derniers carbones indiquent qu’ils sont oxydés. - les protons des méthoxyles présentent des corrélations avec les carbones à 148,1 ppm indiquant leur position en C-3''' et C-5'''.

H3CO H

7''' 8''' O 4''' HO 1''' C C C H H 6'' O Glc2 HO O HO H3CO H OH Figure II-75 : Corrélations HMBC du sinapoyl- du composé xf11.

La grande constante de couplage ≈16 Hz entre les protons H-7''' et H-8''' indique une double liaison trans et donc d’un acide trans-sinapique estérifiant le sucre, comme le confirme la comparaison des données avec celles citées dans la littérature [143].

Le cis-sinapoyl (δH 5.89 (d, J= 13 Hz), H-7''' et δH 6.90 (d, J= 13 Hz), H-8''') est identifié dans le même mélange avec une intensité moins importante 1:3 (cis: trans) cette modification entraine une légère modification des déplacements chimiques des protons CH2- 6" Glc2 (Tableaux II-9 et II-10).

La structure finale du composé xf11 (Figure II-76) est identifiée comme le mélange 3-

O-[6-O-(trans,cis)-sinapoyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy- jujubogénine isolé pour la première fois.

123

OH HO 24 26 21 20 23 25 H H3CO H O 17 27

8''' O 19 18 4''' 15 HO C C C H H 6'' O 1''' O Glc2 30 HO O H 6' H O 1 H H CO HO Glc 3 O H OH HO 1' O H HO OH 28 29 Figure II-76: Structure du composé xf11.

II.1.2.2.3.4. Détermination structurale du composé xf12

Sur le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du composé xf12 nous visualisons un pic pour l’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 981,4822 correspondant à une formule brute C51H74O17.

Sur le spectre de RMN 1H (Figure II-77) nous retrouvons tous les signaux obtenus sur le spectre de xf11, sauf les deux singulets correspondant aux protons H-2''', H-6''' et les deux méthoxyles qui disparaissent sur celui de xf12 laissant supposer une modification au niveau du noyau aromatique. Cette hypothèse est soutenue par l’apparition de deux doublets intégrants chacun pour deux protons à 6,84 et 7,51 ppm avec une constante de couplage (J= 8,7 Hz) correspondant au couplage entre protons en position ortho attestant la perte de la substitution en C-3''' et C-5'''. Ceci confirme la présence d’un dérivé p-coumaroyl [144].

Figure II-77 : Spectre de RMN 1H de xf12 (c) avec l’agrandissement des parties osidique (b) et aromatique (a).

124

Figure II-78 : Spectre de RMN 13C du composé xf12 (b) avec l’agrandissement de la partie aromatique (a).

Tous les carbones sont attribués (Figure II-78) grâce aux corrélations observées sur les spectres HSQC et HMBC (Tableau II-9). La distinction entre les deux doublets H-2''' + H-6''' et H-3'''+H-5''' est possible grâce aux corrélations observées sur le spectre HMBC entre H-2'''+ H-6'''/C-7'''.

Les spectres de RMN 1D & 2D montrent que xf12 est un mélange 50:50 de deux dérivés isomères trans (JH7'''-H8'''= 16Hz) et cis (JH7'''-H8'''≈ 13Hz)-p-coumaroyl. Le changement de la configuration de la double liaison entraîne une modification au niveau des déplacements chimiques (δH et δC) des constituants de l’acide p-coumarique. Un blindage des protons du H- 6" d’une valeur de ≈ 0,05 ppm est également observé dans le cas du dérivé cis-p-coumaroyl comparativement à ceux du dérivé trans-p-coumaroyl, cela peut être expliqué par les effets des interactions stériques avec le p-coumaroyl [145].

La structure finale du composé xf12 est identifiée comme le mélange 3-O-[6-O-

(trans,cis)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy- jujubogénine (Figure II-79).

OH HO 24 26 21 20 23 25 H H O 17 27

8''' O 19 18 HO C C C 15 H H O 2 O Glc 30 HO O H 6' H 1'' O H HO Glc1 O OH H HO 1' O H HO OH 28 29 Figure II-79: Structure du composé xf12.

125

Aucune purification supplémentaire n’a été effectuée pour essayer de séparer les deux composés à cause de leur faible quantité. De plus une étude précédente montre que les deux formes cis et trans p-coumaroyl peuvent s’isomériser en solution [146].

Tableau II-10: Déplacements chimiques en RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique des saponines xf10-xf12

à 22α-hydroxy-jujubogénine dans le CD3OD xf10 xf11 xf12 C-6Glc2-R - trans-sinapoyl cis- sinapoyl trans-p-coumaroyl cis-p-coumaroyl δC δC δC δC δC Glc1 en C-3 1' 105,3 105,1 105,1 105,2 105,1 2' 74,2 74,3 74,3 74,1 74,1 3' 76,7 76,7 76,7 76,7 76,7 4' 70,1 70,3 70,3 70,3 70,3 5' 75,6 75,2 75,2 75,2 75,2 6' 68,4 68,7 68,7 68,9 68,7 Glc2 en C-6' Glc’’ 1" 103,4 103,3 103,3 103,3 103,4 2" 73,8 73,8 73,8 73,7 73,7 3" 76,6 76,5 76,5 76,5 76,5 4" 70,2 70,2 70,2 70,3 70,3 5" 76,6 73,9 73,9 73,9 73,9 6" 61,4 63,1 63,4 63,2 63,2 C=O -9"' - 167,6 166,6 167,7 166,7 α -8"' - 114,3 115,3 113,6 114,9 β -7"' - 146,0 144,7 145,5 144,0 1"' - 125,1 125,5 125,7 126,2 2"'-6"' - 105,1 108,7 129,9 132,5 3"'-5"' - 148,1 147,2 115,5 114,6 4"' - 138,4 137,7 160,0 158,8 3"'-OCH3 - 55,5 55,5 - - 5"'-OCH3 - 55,5 55,5 - -

126

Tableau II-11: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) de la partie osidique des saponines xf10- xf12 à 22α-hydroxy-jujubogénine dans le CD3OD. xf10 xf11 xf12 C-6Glc2-R trans-sinapoyl cis-sinapoyl trans-p-coumaroyl cis-p-coumaroyl δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) Glc1 en C-3 1' 4,35 (d, 7,8) 4,34 (d, 7,9) 4,34 (d, 7,9) 4,34 (d, 7,8) 4,34 (d, 7,9) 2' 3,21 (t, 8,1) 3,21 (t, 8,5) 3,21 (t, 8,5) 3,21 (t, 8,4) 3,21 (t, 8,4) 3' 3,35 (t, 8,3) 3,37 (t, 9,0) 3,37 (t, 9,0) 3,37 (t, 9,1) 3,37 (t, 9,1) 4' 3,32 (t, 8,3) 3,30 (t, 9,2) 3,30 (t, 9,2) 3,32 (m) 3,32 (m) 5' 3,46 (td, 7,7-2,2) 3,49 (m) 3,49 (m) 3,48 (m) 3,48 (m) 6' 3,81 (dd, 11,7-5,7) 3,82 (dd, 11,7-5,9) 3,82 (dd, 11,7-5,9) 3,82 (dd, 11,7-5,8) 3,80 (dd, 11,7-6,0) 4,12 (dd, 11,7-1,7) 4,09 (dd, 11,7-1,9) 4,09 (dd, 11,7-1,9) 4,09 (dd, 11,7-2,0) 4,07 (dd, 11,7-3,2) Glc2 en C-6' 1" 4,42 (d, 7,8) 4,43 (d, 7,8) 4,43 (d, 7,8) 4,43 (d, 7,7) 4,40 (d, 7,8) 2" 3,22 (t, 8,4) 3,26 (t, 8,6) 3,26 (t, 8,6) 3,25 (t, 8,5) 3,25 (t, 8,5) 3" 3,38 (t, 8,8) 3,40 (t, 9,2) 3,40 (t, 9,2) 3,39 (t, 9,0) 3,39 (t, 9,0) 4" 3,30 (t, 8,9) 3,40 (t, 9,2) 3,40 (t, 9,2) 3,38 (m) 3,31 (m) 5" 3,29 (m) 3,52 (m) 3,52 (m) 3,51 (m) 3,51(m) 6" 3,69 (dd, 11,9-5,4) 4,30 (dd, 11,9-5,7) 4,25 (dd, 12,0-6,3) 4,29 (dd, 11,9-5,7) 4,24 (dd, 11,9-5,8) 3,89 (dd, 11,9-2,1) 4,61 (dd, 11,9-2,1) 4,52 (dd, 12,0-2,2) 4,60 (dd, 11,9-2,2) 4,53 (dd, 11,9-2,1) C=O -9"' - - - - α -8"' 6,47 (d, 15,9) 5,89 (d, 13,0) 6,40 (d, 16,0) 5,84 (d, 12,8) β -7"' 7,67 (d, 15,9) 6,90 (d, 13,0) 7,68 (d, 16,2) 6,91 (d, 12,9) 1"' - - - 2"'-6"' 6,98 (s) 7,33 (s) 7,51 (d, 8,7) 7,70 (d, 8,7) 3"'-5"' - - 6,84 (d, 8,7) 6,80 (d, 8,7) 4"' - - - -

3"'-OCH3 3,92 (s) 3,89 (s) - - 5"'-OCH3 3,92 (s) 3,89 (s) - -

127

II.1.2.2.4. Détermination structurale du saponoside xf13

Le composé xf13 est le seul composé isolé qui possède la génine III 16β,22:16α,30- diépoxydammar-24-ène-3β,20-diol [142] [147].

La détermination structurale de ce composé sera effectuée en deux étapes la partie aglycone puis la partie osidique.

II.1.2.2.4.1. Détermination structurale de la génine III

Analyse du spectre de RMN 1H (Figure II-80)

En examinant la partie aglycone sur le spectre de RMN 1H du composé xf13, nous pouvons distinguer comme pour la jujubogénine les signaux suivants : - Sept singulets d’intensité 3H correspondant à sept méthyles facilement attribués car

aucun changement significatif n’est à signaler, CH3-18 (δH 1,06), CH3-19 (δH 0,91),

CH3-21 (δH 1,21), CH3-26 (δH 1,71), CH3-27 (δH 1,65), CH3-28 (δH 1,07) et CH3-29

(δH 0,87). - un nouveau signal résonnant sous forme d’un triplet apparaît à 2,29 ppm (tl, J= 6,6 Hz) intégrant pour 2H. - dans la zone des protons portés par des carbones oxygénés quatre protons sont distingués après avoir éliminé les signaux appartenant à la partie osidique. Parmi ces

protons nous pouvons attribuer le proton H-3 (δH 3,19, dd, J= 7,3-4,8 Hz), les deux

protons géminés du CH2-30 (δHa-30 3,96, dd, J= 8,3-1,6 Hz) (δHb-30 3,99, d, J= 8,3 Hz), et un quatrième sous forme de triplet situé à 4,14 ppm (J= 6,6 Hz). - un proton éthylénique résonne à 5,22 ppm (tq, J= 7,3-0,7 Hz) attribuable au H-24.

Figure II-80 : Spectre de RMN1H de xf13. 128

Analyse du spectre de RMN 13C (Figure II-81)

Sur le spectre de RMN 13C nous dénombrons 30 carbones dont nous pouvons citer les carbones caractéristiques suivants : - cinq carbones résonnent dans une zone entre 60-95 ppm dont les carbones C-3 à 89,1 ppm et C-30 à 65,4 ppm. Les trois carbones restants montrent des déplacements chimiques différents par rapport à ceux attribués à la jujubogénine dans la même région (Tableau II-7). - trois carbones résonnent dans une région de champ faible à 117,5, 120,7 et 132,6 ppm, dont deux appartenant à une double liaison.

Figure II-81 : Spectre de RMN13C du composé xf13.

En analysant les corrélations observées sur les spectres de RMN-2D (COSY, HSQC, HMBC et ROESY) du composé xf13, nous retrouvons le même enchaînement des cycles A-

B-C-D-F attribué à la jujubogénine. Seuls les deux carbones quaternaires C-16 (δC 117,5), et

C-17 (δC 61,6) présentent des déplacements chimiques déblindés par rapport à ceux enregistrés pour la jujubogénine CI16 (δC 111,4), et CI-17 (δC 54,4), cela peut être justifié par le fait que le cycle E présente un réarrangement fondamental. Nous détaillerons donc l’analyse des spectres de RMN-2D concernant le cycle E uniquement.

Analyse du spectre COSY

4 Les deux méthyles CH3-26 et CH3-27 présentent des couplages à longue distance JH-H (enchaînement en W) avec le proton H-24 situé à 5,22 ppm, et ce dernier montre une corrélation avec le triplet résonnant à 2,29 ppm intégrant pour 2H attribuable aux CH2-23. Ces deux protons H-23 corrèlent avec le proton situé à 4,14 ppm (t, J= 6,6 Hz) attribuable au proton H-22 (Figure II-82).

129

A ce stade nous pouvons déjà proposer un réarrangement du cycle E déduit par le fait que la chaine aliphatique est allongée par un CH2-23, ce qui laisse supposer que le cycle E est réduit en un cycle à cinq (oxolane substitué).

Analyse du spectre HSQC J-modulé

L’analyse du spectre HSQC J-modulé permet d’attribuer les carbones C-22 (δC 94,1),

C-23 (δC 27,3) et C-24 (δC 120,7) à partir des protons correspondants.

Analyse du spectre HMBC

- Les protons des méthyles CH3-26 et CH3-27 corrèlent entre eux et avec les carbones

C-24 (δC 120,7) et C-25 (δC 132,6) de la double liaison qui les portent (Figure II-82).

- Le proton H-24 (δH 5,22) corrèle avec les carbones C-22, C-23, C-25, C-26 et C-27. - Les protons H-23 montrent des corrélations avec les carbones C-22, C-24 et C-25.

- Le proton H-22 (δH 4,14) couple avec les carbones déjà identifiés C-21 (δC 22,1), C-

23, C-24 et un carbone quaternaire à δC 75,1 attribuable au C-20.

- Les protons du méthyle CH3-21 corrèlent avec les carbones de C-17, C-20 et C-22.

26 21 23 22 25 HO

H 24 27 O 17 HMBC COSY Figure II-82: Les corrélations COSY et HMBC du cycle E de la génine III (xf13).

Analyse du spectre ROESY

Les résultats obtenus par l’analyse des effets rOe des protons des cycles A-B-C-D et F rejoignent ceux établis pour la jujubogénine. Les protons H-3, H-5, H-9, H-17, H3-28 et Hb-30 sont en position α, tandis que les protons H-13, H-18, H-19 et H3-29 sont en position β.

La configuration α-axiale des protons H3-21 et H-22 est déterminée grâce aux effets rOe observés entre les protons H-17, H-22 et H3-21(Figure II-83).

130

21 CH3 HO 23 22 17 H H O

Figure II-83: Effets rOe observés sur les spectres ROESY du cycle E de la génine III (xf13)

La génine III est identifiée au 16β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β,20-diol déjà isolé de Ziziphus lotus et Z. jujuba [142] [147].

II.1.2.2.4.2. Détermination structurale de la partie osidique de xf13

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif de xf13 montre un ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 819,4529 correspondant à une formule brute C42H68O14 et suggérant la présence de deux hexoses.

Le spectre de RMN 1H montre deux doublets anomériques résonnant à 4,35 (d, J= 7,8) et 4,42 ppm (d, J= 7,8). À partir de ces deux protons, deux systèmes à sept spins sont identifiés à l’aide des corrélations observées sur le spectre COSY. Les valeurs des constantes de couplage mesurées à partir du spectre de RMN 1H et les effets rOe entre les protons H-1

Glc/H-3 Glc et H-5 Glc observés pour chaque sucre indiquent la présence de deux β-D- glucopyranoses. Les carbones correspondants attribués grâce à l’analyse du spectre HSQC (Tableau II-12), confirment la présence de deux glucoses comme dans xf10.

Sur le spectre ROESY les effets rOe observés entre H-1'/H-3 et H-6'/H-1" indiquent le point d’ancrage du disaccharide sur l’hydroxyle en C-3 de la génine ainsi que la liaison en 6' du second glucose, ce qui est confirmer par les corrélations entre H-3/C-1' et H-6'a,b/C-1" sur le spectre HMBC.

L’ensemble de nos données RMN nous permettent d’attribuer pour le composé xf13 une structure nouvelle (Figure II-84) le 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- 16β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β,20-diol.

131

HO 23 25 22 21 20 26 H H O 17 19 18 OH 15 Glc2 O O 30 HO 6' H 1'' O H H HO Glc1 OH O H HO 1' O H HO OH 28 29 Figure II-84: Structure du composé xf13.

Tableau II-12: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie osidique du composé xf13 dans le CD3OD

δc (ppm) δH (m, J en Hz) δc (ppm) δH (m, J en Hz) Glc1 en C-3 Glc2 en C-6' 1' 106,7 4,35 (d, 7,8) 1" 104,8 4,42 (d, 7,8) 2' 75,6 3,21 (t, 8,5) 2" 75,2 3,23 (t, 8,5) 3' 78,2 3,34 (t, 9,1) 3" 78,0 3,38 (t, 8,8) 4' 71,7 3,34 (m) 4" 71,6 3,30 (t, 8,8) 5' 77,0 3,46 (m) 5" 78,0 3,28 (m) 6' 69,9 3,81 (dd, 11,8-5,7) 6" 62,8 3,69 (dd, 11,8-5,4) 4,12 (dd, 11,8-2,3) 3,89 (dd, 11,8-2,2)

II.1.2.2.5. Détermination structurale des saponosides xf14-xf16 dérivés du 16,17-seco-dammarane

L’analyse des spectres de RMN 1D & 2D des composés xf14-xf16 indique que ce sont des O-glycosides avec une séquence di-osidique identique liée en position C-3 de la génine. Ils diffèrent donc par la partie aglycone et les trois composés sont identifiés comme des dérivés du squelette 16,17-seco-dammarane. Ce type de composé est issu d’un clivage de la liaison C-16-C-17 du noyau dammarane (Figure II-85), migration du méthyle CH3-21 et oxydation des carbones C-20 et C-26 [65]

24 21 25 27 20 23 H H 17 26 16 19 18 13

15 H 30 3 H

28 29 Figure II-85 : Structure de noyau dammarane

132

21 H 22 H 24 13 20 17 19 18 23 25 H 27 O O 26 15 H 30 O Glc O OH 16 3 O O O HO 1' H HO 2' O 28 29 Rha 1'' O HO xf14  24 HO xf15 CH3 OH xf16 CH3

Figure II-86 : Structures des composés xf14-xf16

Pour faciliter l’élucidation structurale nous commencerons par décrire la partie osidique commune aux trois composés puis nous verrons l’élucidation structurale des trois génines en commençant par celle du composé xf16.

II.1.2.2.5.1. Détermination structurale de la partie osidique des composés xf14, xf15 et xf16

Les trois composés possèdent la même partie osidique dont nous distinguons deux protons anomériques à 5,39 ppm (d, J= 1,3 Hz) et 4,42 ±0,01 ppm (d, J= 7,6 Hz) (Tableau II- 13). L’analyse du spectre COSY permet d’identifier un système à huit spins à partir du proton anomérique à 5,39 ppm et un autre à sept spins à partir de celui situé à 4,43 ppm (Tableau II-13) : - les valeurs des constantes de couplage élevées du système à sept spins indiquent que

tous les protons sont en position transdiaxiale, il s’agit d’un β-D-glucopyranose comme le confirment les effets rOe observés entre les protons H-1', H-3' et H-5'. - le deuxième sucre est un 6-désoxyhexose qui possède un méthyle en position 6, les

protons H-1" et H-2" en position équatoriale (JH1"-H2" ≈ 1,3 Hz), et les protons H-3",

H-4" et H-5" en position transdiaxiale (JH3"-H4", JH4"-H5"> 9 Hz). Il s’agit d’un α-L- rhamnopyranose.

133

Tableau II-13: Déplacements chimiques en RMN-1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie osidique des composés xf14, xf15 et xf16 dans le CD3OD

xf14 xf15 xf16 δc δH (m, J en Hz) δc δH (m, J en Hz) δc δH (m, J en Hz) Glc en C-3 1' 104,2 4,43 (d, 7,6) 104,2 4,42 (d, 7,5) 104,2 4,42 (d, 7,6) 2' 77,5 3,42 (t, 8,3) 77,5 3,42 (t, 8,3) 77,5 3,43 (t, 8,5) 3' 78,1 3,48 (t, 8,9) 78,1 3,48 (t, 8,8) 78,1 3,48 (t, 9,0) 4' 70,6 3,30 (t, 9,2) 70,7 3,31 (t, 9,4) 70,6 3,30 (t, 9,1) 5' 76,3 3,24 (m) 76,2 3,24 (m) 76,3 3,24 (m) 6' 61,4 3,68 (dd, 11,9-5,6) 61,4 3,68 (dd, 11,8-5,5) 61,4 3,68 (dd, 11,7-5,5) 3,86 (dd, 11,9-2,2) 3,86 (dd, 11,8-1,7) 3,86 (dd, 11,7-2,3) Rha en C-2' 1" 100,4 5,39 (d, 1,3) 100,4 5,39 (d, 1,4) 100,4 5,39 (d, 1,8) 2" 70,6 3,97 (m) 70,7 3,97 (m) 70,6 3,97 (m) 3" 70,7 3,76 (dd, 9,5-3,4) 70,8 3,76 (dd, 9,5-3,4) 70,7 3,76 (dd, 9,6-3,3) 4" 72,6 3,40 (t, 9,6) 72,6 3,40 (t, 9,7) 72,6 3,40 (t, 9,6) 5" 68,6 3,99 (m) 68,6 3,99 (m) 68,6 3,99 (m) 6" 16,6 1,23 (d, 6,7) 16,6 1,23 (d, 6,1) 16,6 1,23 (d, 6,5)

Le point d’ancrage sur la génine en C-3 ainsi que l’enchainement α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl sont déduits par les effets rOe (H-1'/H-3) et (H- 1"/H-2') observés sur le spectre ROESY.

Les corrélations observées sur le spectre HMBC entre H-3/C-1', H-1'/C-3, H-2'/C-1" et H-1"/C-2' confirment le résultat obtenu par l’analyse ROESY.

II.1.2.2.5.2. Détermination structurale de la partie aglycone du composé xf16 Analyse du spectre de RMN 1H (Figure II-87)

Parmi les signaux observés sur le spectre de RMN 1H de xf16, nous distinguons :

- six méthyles dont quatre sous forme d’un singulet (δH 0,88, 0,89, 1,06, 1,08) et deux sous forme de doublet à 1,10 et 1,24 ppm. - un proton résonne à 3,20 ppm (dd, J= 11,5-4,3 Hz) probablement lié au carbone hydroxylé C-3. - un massif de protons intégrant pour 8H résonne dans une région entre 2,2-3,2 attribuables aux protons portés par des carbones avoisinants des fonctions déblindantes (p.ex. C=O…). - trois protons portés par des carbones oxygénés résonnant à 4,37, 4,49 et 4,83 ppm.

134

Figure II-87 : Spectre de RMN 1H de xf16 (b) avec un agrandissement de la partie aglycone (a).

Analyse du spectre de RMN 13C (Figure II-88) Sur le spectre de RMN 13C nous visualisons les signaux caractéristiques suivants : - un carbone à 88,5 ppm correspondant à un carbone hydroxylé substitué (glycosylé), le carbone C-3. - deux carbones oxygénés résonnant à 70,3 et 74,6 ppm. - trois carbonyles résonnant à 178,4, 180,3 et 210,7 ppm.

Figure II-88 : Spectre de RMN 13C de xf16 (b) avec un agrandissement de la partie aglycone (a).

135

Analyse du spectre COSY

À partir des corrélations observées sur le spectre COSY, nous pouvons donner les informations suivantes (Figure II-89) :

- le proton H-3 (3,20 ppm) corrèle avec les deux protons géminés Ha-2 (1,69 ppm) et

Hb-2 (1,99 ppm) qui corrèlent aux protons Ha-1 (1,03 ppm) et Hb-1 (1,72 ppm), pour le cycle A.

- les protons du méthyle situé à 1,10 ppm (d, J= 7,1 Hz) corrèlent avec le proton situé 2,61 ppm. Ce dernier corrèle avec le proton situé à 2,48 (td, J= 14,2-4,4 Hz),

lui même corrélant avec deux protons géminés (δHa 1,29, δHb 1,67). Ces derniers

corrèlent avec deux autres protons géminés (δHa 1,47, δHb 1,63) qui corrèlent avec le proton résonnant à 0,75 ppm (dd, J= 12,5-2,6 Hz). L’enchaînement

CH3→CH→CH→CH2→CH2→CH rappelle celui du dammarane CH-17→CH-

13→CH2-12→CH2-11→CH-9, sur lequel se greffe un méthyle en position 17.

- le proton résonnant à 0,83 ppm corrèle avec deux protons géminés à δH 1,54 et

1,69, eux même corrélant avec deux protons qui leur sont vicinaux (δHa 1,47, δHb

1,58), cet enchaînement rejoint celui des carbones CH-5→CH2-6→CH2-7.

Analyse du spectre HSQC J-modulé

Grâce à l’analyse du spectre HSQC J-modulé, les déplacements chimiques de 12 carbones sont attribués : CH2-1 (δC 38,3), CH2-2 (δC 25,9), CH-3 (δC 88,5), CH-5 (δC 55,2),

CH2-6 (δC 17,7), CH2-7 (δC 34,2), CH-9 (δC 52,6), CH2-11 (δC 20,1), CH2-12 (δC 24,2), CH-

13 (δC 37,5), CH-17 (δC 45,9) et CH3-21 (δC 11,6).

Analyse du spectre HMBC

L’analyse des corrélations visibles sur le spectre HMBC en partant des protons H-3, H-5 et H-9 nous permet d’attribuer comme décrit précédemment pour les autres triterpènes, les méthyles CH3-28, CH3-29, CH3-19 et CH3-18 et les carbones quaternaires C-4, C-10, C-8 et C-14 des cycles A, B et C du noyau dammarane (Figure II-89).

136

21 H 12 H

17 19 18 13

9 1 14 10 8 3 H 5 6 HMBC R1O COSY 28 29

3 n>1 Figure II-89: Corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C des cycles A, B et C de la partie aglycone de xf16.

Les deux carbones C-8 et C-14 présentent également quatre corrélations avec deux paires de protons géminés dont un méthylène oxygéné à δH 4,37 et 4,49 (d, J=11,0 Hz) et le second méthylène à δH 2,18 et 2,71 (d, J= 19,1 Hz). Ces deux paires de protons géminés présentent tous des corrélations identiques avec les carbones C-8, C-13, C-14, et un carbonyle situé à 178,4 ppm, en plus de leurs corrélations mutuelles JH-C.

L’analyse de ces corrélations et les valeurs des déplacements chimiques des protons géminés et de leurs carbones respectifs, attribués par analyse du spectre HSQC à 70,3 et 33,7 ppm, suggère qu’une fonction carboxylique relie les deux carbones méthyléniques, dont l’un est adjacent du carbonyle (δC 33,7, C-15) et porte les protons géminés H-15 (δHa 2,18 et δHb

2,71), et l’autre est oxygéné (δC 70,3, C-30) et porte les deux protons H-30 (δHa 4,37 et δHb

4,49). Ayant des corrélations identiques avec les carbones C-8, C-13, C-14 et C-16 (C=O, δC

178,4), les protons précités CH2-15 et CH2-30, présentent la même distance par rapport aux carbones C-8 et C-13 suggérant une configuration spiro en C-14 (Figure II-90).

15 14 8 HMBC 30 16 O O COSY 3 n>1 Figure II-90: Corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C de la lactone en C-14 de l’aglycone de xf16.

Le proton H-13 montre sept corrélations dont six avec les carbones identifiés C-12, C- 14, C-15, C-17, C-21 et C-30, et la dernière avec le carbonyle situé à 210,7 ppm attribuable au carbone C-20 (Figure II-91).

137

Au niveau du carbonyle résonnant à 210,7 ppm, nous observons six corrélations dont trois avec des protons identifiés H-13, H-17 et H-21, et trois avec des protons non identifiés dont un proton d’un méthyne oxygéné situé à 4,83 ppm et deux protons géminés à δH 2,86 et 3,09. Les déplacements chimiques de ces derniers suggèrent une position α par rapport au carbonyle et sont attribués au CH2-22 (Figure II-91).

À ce stade d’analyse, il nous semble utile pour continuer l’attribution des constituants 3 de la chaîne latérale d’examiner les corrélations JH-H COSY à partir des deux protons géminés H-22. Ces protons corrèlent avec le proton du méthine oxygéné à 4,83 ppm que nous attribueront au H-23, qui corrèle également avec deux autres protons géminés CH2-24 (δHa

1,64 et δHb 2,61). Ces deux derniers corrèlent avec un proton H-25 situé à 2,80 ppm qui présente une corrélation avec le méthyle CH3-27 situé 1,24 ppm (Figure II-91).

À l’aide du spectre HSQC, nous attribuons les carbones C-22 (δC 45,4), C-23 (δC 74,6), C-

24 (δC 36,2), C-25 (δC 35,5), C-27 (δC 13,7) à partir des protons correspondants.

H2 H2 CH C C 12 20 17 22 CH CH 27 13 23 O O 14 15 26 30 16 O HMBC O O COSY 3 n>1 Figure II-91: Corrélations COSY JH-H & HMBC JH-C de la partie aglycone de xf16.

Afin de confirmer l’enchaînement obtenu par l’analyse du spectre COSY, nous continuons à identifier les corrélations observées sur le spectre HMBC (Figure II-92): - les deux protons H-22 corrèlent avec les carbones C-20, C-23 et C-24. - le proton H-23 montre des corrélations au niveau des carbones C-20, C-22, C-24 et le carbonyle situé à 180,3 ppm. - les protons H-24 présentent les corrélations avec les carbones C-22, C-23, C-25, C-27 et le carbonyle situé à 180,3 ppm. - le proton H-25 corrèle avec les carbones C-24, C-27 et le carbonyle situé 180,3 ppm. - le carbonyle résonnant à 180,3 ppm appelé C-26, corrèle avec les protons H-23, H-24, H-25 et H-27, ce qui permet de conclure qu’il est inclus dans un cycle et que le carbone C-23 est lié au carbonyle C-26 via un atome d’oxygène formant une seconde lactone dans la génine. 138

Figure II-92 : Importantes correlations HMBC de la partie aglycone de xf16.

Analyse du spectre ROESY

La stéréochimie des carbones asymétriques est déterminée après analyse des effets rOe en suivant ce raisonnement (Figure II-93) : - la configuration α-axiale du proton H-3 est déterminée grâce aux effets rOe observés

avec le proton H-5 et ceux du méthyle CH3-28 dont la stéréochimie α-équatoriale est confirmée par le fait qu’il soit déblindé (26,9 ppm). - les effets rOe observés entre H-29 et H-19, H-19 et H-18, H-18 et H-13 confirment leur orientation β-axiale. - l’orientation β-équatoriale du H-17 est déduite par l’effet rOe observé avec H-13.

139

- la configuration α-axiale du méthyle CH3-21 est déduite par les effets rOe avec Ha-12

et Ha-30.

- des effets rOe observés entre Hb-30 et H-9 confirment l’orientation α-axiale des CH2-

30 en dessous du plan du système tricyclique, contrairement au CH2-15 β-équatoriale

dont le proton Ha-15 présente des effets rOe avec les protons H-17 et H-13.

- l’orientation β du Ha-22 est déduite des effets rOe avec les protons H-13 et H-17. - la configuration du cycle de la chaîne latérale est déduite des effets rOe observés entre

Ha-22 et H-23, H-23 et H-25 et l’absence d’effet rOe entre H-23 et H-27.

O H H H H 13 20 27 22 H CH 17 H 25 3 18CH3 H H CH 23 14 3 21 CH3 15 O 26 19 9 H 16 O O H H 29 CH 7 3 H 30 O H H 5 H 3 RO H3C 28 H H Figure II-93: Effets rOe observés sur le spectre ROESY de la partie aglycone de xf16

La génine du composé xf16 est identifiée comme étant le (25R) 3,23,30-trihydroxy- 17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone.

II.1.2.2.5.3. Détermination structurale de la partie aglycone du composé xf15

Les spectres de RMN 1D 1H (Figure II-94) et 13C (Figure II-95) du composé xf15 montrent les mêmes signaux que ceux du composé xf16 avec des déplacements chimiques identiques, exception faite des CH-23, CH2-24 et CH3-27 (Tableau II-14). Ces derniers présentent des déplacements chimiques légèrement différents suggérant une configuration stérique différente de la lactone en C-23. L’interprétation des spectres de RMN 2D (COSY, HSQC, HMBC et ROESY) confirment qu’il s’agit d’un isomère du composé xf16.

140

Figure II-94 : Spectre de RMN 1H de xf15 (b) avec un agrandissement de la partie aglycone (a).

Figure II-95 : Spectre de RMN 13C du composé xf15.

Le spectre ROESY du composé xf15 présente les mêmes effets rOe observés que ceux du composé xf16, exception faite de l’absence de l’effet rOe entre le proton H-23 et H-25, et l’apparition d’un effet entre H-23 et H-27. Il y aurait donc eu un réarrangement du méthyle 27 en position 25, qui est en position axiale au lieu de équatoriale (Figure II-96).

H 27 H H H 25 H 23 22 26 O H O Figure II-96: Effets rOe observés sur le spectre ROESY du cycle E de xf15

Ainsi la génine du composé xf15 est identifié comme étant le (25S) 3,23,30- trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30; 25,23-di-γ- lactone. 141

II.1.2.2.5.4. Détermination structurale de la partie aglycone du composé xf14

Les spectres de RMN 1H, 13C (Figure II-97), et HSQC indiquent la présence d’un dérivé du composé xf16 dont nous retrouvons tous les signaux sur le spectre HSQC, exception faite de ceux appartenant aux CH-24 et CH2-25 qui ne se retrouvent pas dans celui du xf14 (Tableau II-14). Par contre deux carbones éthyléniques supplémentaires apparaissent dont un quaternaire (δC 129,4 ppm) et un tertiaire (δC 149,6 ppm) portant le proton situé à δH 7,32 (dt, J= 6,2-1,7 Hz).

Les protons du méthyle CH3-27 résonnent sous forme d’un singulet large à 1,90 ppm (δC 15,1 ppm), déblindé car porté par une double liaison.

Figure II-97 : Spectres de RMN 1H (a) 13C (b) du composé xf14.

En tenant compte des constatations faites ci-dessus, le composé xf14 présente une double liaison en C-24 et C-25, comme le confirment les spectres de RMN-2D (HMBC, COSY et ROESY) :

n>1 Sur le spectre HMBC, nous identifions les corrélations JH-C suivantes : entre les protons du méthyle CH3-27 et les carbones C-26 (δC 174,8), C-24 (δC 149,6) et C-25 (δC 129,4) et entre les protons H-22 et le carbone C-24 (Figure II-98).

Sur le spectre ROESY des effets rOe sont observés entre H-23/H-24 et H-23/H-27.

142

CH3 H2 C H H 25 23 HMBC 26 ROESY O O COSY

n>1 Figure II-98: Les effets rOe et les corrélations COSY & HMBC JH-C du cycle E de xf14

Finalement la structure finale de la partie aglycone du composé xf14 est élucidée comme étant le 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammar-24-ène-16,26- dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone.

II.1.2.2.5.5. Analyse des spectres de masse

Les analyses spectrales menées par spectroscopie de masse HR-ESI-MS en mode positif rejoignent les résultats obtenues par les analyses des spectres RMN. Les composés xf15 et xf16 montrent tous les deux, un pic pour l’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z

833,4286 et 833,4298, respectivement, correspondant à la formule brute C42H66O15. Le composé xf14 quant à lui, donne un ion pseudo-moléculaire [M+Na+H]+ d’intensité 100% à m/z 832,4063 et [M+Na]+ d’intensité 85% à m/z 831,4138 correspondant à la formule brute

C42H64O15, soit 2 uma de moins que xf15 et xf16, confirmant la double liaison.

L’ensemble des données de RMN et de masse permettent d’établir les trois nouvelles structures finales comme suit :

Le composé xf14 est le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammar-24-ène-16,26-dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone (Figure II-99).

H H 22 H 13 20 24 17 19 18 23 25 H 27 O O 26 15 H 30 O O OH Glc 16 3 O O O H HO 1' HO 2' O 28 29 Rha 1'' O HO HO OH

Figure II-99: Structure du composé xf14. 143

Le composé xf15 est le (25S) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- 3,23,30- trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30;25,23-di-γ- lactone (Figure II-100).

Le composé xf16 est le (25R) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- 3,23,30- trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30;25,23-di-γ- lactone (Figure II-100).

21 H 22 H 24 13 20 17 19 18 23 25 H 27 O O 26 15 H 30 O O OH Glc 16 3 O O O HO 1' H HO 2' O 28 29 xf15: β CH3-27 Rha 1'' xf16: α CH3-27 O HO HO OH

Figure II-100: Structures des composés xf15 et xf16.

Des dérivés de 16,17-seco-dammarane, principalement l’ébeline lactone [148], sont considérés comme étant des artéfacts issus de la dégradation de la jujubogénine par une hydrolyse acide, [149] (0,25N HCl/MeOH à reflux pendant 45 minutes [150], 1ml dioxane+2M H2SO4 (2ml) + 1ml H2O à reflux pendant 5h [64]), ce qui ne peut pas être le cas des composés xf14, xf15 et xf16 car aucune exposition à des températures élevées ou/et à un acide concentré, n’a eu lieu au cours de la purification.

De plus une étude menée sur la préparation d’Hoveniae Semen Seu préparée à partir des graines et fruits d’Hovenia dulcis Thumb (Rhamnaceae) [65, 151], a conduit à l’isolement de deux saponines ayant une structure très proche de celles de xf14, xf15 et xf16, le hovenidulcioside A1 et B1 (Figure II-101). Cette préparation est utilisée en médecine traditionnelle chinoise principalement comme diurétique, néanmoins l’étude montre une activité anti-histaminique de ces saponines [65].

144

22 24 13 20 17 19 18 23 25 27 OAc O 26 15 H 30 O Glc O OH 16 3 O O O H HO 1' HO 2' O 28 29 ∆24 Hovenidulcioside A1 Rha 1'' O HO Hovenidulcioside B1 HO OH

Figure II-101: Structures des Hovenidulcioside A1 et B1

Tableau II-14: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie aglycone des composés xf14, xf15 et xf16 dans le CD3OD xf16 xf15 xf14 Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 38,3 1,03 (td, 15,9-6,5) 38,3 1,01 (td, 12,6-3,7) 38,3 1,02 (t, 13,6) 1,72 (dl, 13,4) 1,72 (dl, 11,5) 1,72 (dl, 10,8) 2 25,9 1,69 (t, 14,2) 25,9 1,69 (t, 12,1) 25,9 1,70 (t, 14,5) 1,99 (dd, 14,4-4,1) 1,99 (dd, 13,8-3,1) 1,99 (dl, 10,7) 3 88,5 3,20 (dd, 11,5-4,3) 88,5 3,19 (dd, 11,4-4,0) 88,5 3,20 (dd, 11,7-3,6) 4 38,9 - 38,9 - 38,9 - 5 55,2 0,83 (dl, 11,6) 55,2 0,83 (dl, 10,9) 55,2 0,83 (dl, 14,5) 6 17,7 1,54 (dt, 12,1-3,8) 17,7 1,49 (m) 17,7 1,55 (dl, 7,0) 1,69 (m) 1,56 (m) 1,70 (dl, 14,5) 7 34,2 1,47 (dd, 17,3-4,6) 34,2 1,48(dd, 15,1-7,3) 34,1 1,47 (dl, 11,3) 1,58 (dd, 9,2-3,4) 1,58 (dd, 13,9-4,2) 1,58 (m) 8 40,8 - 40,9 - 40,9 - 9 52,6 0,75 (dd, 12,5-2,6) 52,7 0,73 (dd, 12,5-2,8) 52,6 0,74 (dl, 11,8) 10 36,5 - 36,5 - 36,5 - 11 20,1 1,47 (dd, 12,8-4,2) 20,00 1,49 (dd, 15,6-3,9) 20,1 1,52 (m) 1,63 (dl, 12,2) 1,61 (m) 1,62 (m) 12 24,2 1,29 (dd, 13,4-4,4) 23,6 1,30 (dl, 10,4) 23,5 1,32 (m) 1,67 (dl, 16,7) 1,58 (dl, 13,8) 1,58 (dl, 12,7) 13 37,5 2,48 (td, 14,2-4,4) 37,3 2,42 (td, 13,0-3,3) 37,2 2,43 (td, 13,0-3,5) 14 51,9 - 51,9 - 51,9 - 15 33,7 2,18 (d, 19,1) 33,8 2,24 (d, 19,1) 33,7 2,23 (d, 18,8) 2,71 (d, 19,0) 2,74 (d, 18,9) 2,74 (d, 18,8) 16 178,4 - 178,3 - 178,2 - 17 45,9 2,61 (m) 45,8 2,60 (m) 45,8 2,61 (m) 18 17,4 1,06 (s) 17,5 1,05 (s) 17,5 1,05 (s) 19 15,2 0,89 (s) 15,1 0,89 (s) 15,1 0,90 (s) 20 210,7 - 210,3 - 209,3 - 21 11,6 1,10 (d, 7,1) 10,6 1,07 (d, 7,5) 10,4 1,07 (d, 4,0) 22 45,4 2,86 (dd, 17,6-4,6) 45,2 2,82 (d, 17,1-5,1) 43,3 2,87 (d, 8,6) 3,09 (dd, 17,6-7,5) 3,06 (dd, 17,3-8,2) 2,93 (d, 7,4) 23 74,6 4,83 (m) 74,8 5,01 (m) 77,8 5,39 (m) 24 36,2 1,64 (qd, 13,0) 34,5 2,14 (dd, 14,3-6,4) 149,6 7,32 (dt, 6,2-1,7) 2,61 (ddd, 13,5-7,6-4,7) 2,22 (td, 8,7-4,6) - 25 35,5 2,80 (ddd, 13,8-6,7-5,4) 33,7 2,83 (m) 129,4 - 26 180,3 - 180,8 - 174,8 - 27 13,7 1,24 (d, 7,3) 14,5 1,27 (d, 7,3) 9,1 1,90 (sl) 28 26,9 1,08 (s) 26,9 1,08 (s) 26,9 1,08 (s) 29 15,6 0,88 (s) 15,6 0,88 (s) 15,6 0,88 (s) 30 70,3 4,37 (d, 11,0) 70,1 4,39 (d, 10,6) 70,0 4,39 (d, 10,6) 4,49 (d, 11,0) 4,49 (d, 10,6) 4,49 (d, 10,6)

145

II.1.2.2.6. Détermination structurale des flavonoïdes isolés de la fraction hydro-alcoolique

Quatre flavonoïdes ont été isolés et identifiés comme étant des flavonol-3-O- glycosides. Un seul flavonoïde, le composé majoritaire, possède la quercétine xf18 comme génine et les trois restants (xf19-xf21) ont le kaempférol comme génine. Les parties osidiques sont constituées de deux sucres qui varient d’un composé à l’autre.

II.1.2.2.6.1. Détermination structurale du composé xf18

Le spectre UV du composé xf18, enregistré dans le MeOH (Figure II-102-a) montre deux bandes d’absorbance maximales, la bande I (caractéristique du cycle B) à 358 nm et la bande II (caractéristique du cycle A) à 256 nm, caractéristiques d’un chromophore flavonol-3- OR, en plus de la coloration violette noire sous la lampe UV.

Le fait d’ajouter quelques gouttes d’une solution aqueuse de NaOH provoque un déplacement bathochromique fort de 50 nm pour la bande I avec une augmentation de son intensité lumineuse (Figure II-102-b) indiquant la présence d’un OH libre en position 4', l’apparition d’un épaulement à 330 nm indique la présence d’un OH libre en position 7. L’ionisation de ces groupements hydroxyles est à l’origine de ces déplacements bathochromiques.

L’ajout de 3 gouttes d’une solution méthanolique de NaOAc (50g/100 ml) provoque un déplacement bathochromique de la bande II de 8 nm (Tableau II-15) par rapport au spectre enregistré dans le MeOH (Figure II-102-c) et confirme la présence d’un OH libre en position 7, seuls les groupements hydroxyle en position 3, 7 et 4' sont ionisés sous l’effet d’acétate de sodium.

Le groupement hydroxyle libre en position 5 est mis en évidence par le déplacement bathochromique de 17 nm de la bande II sur le spectre UV enregistré dans le MeOH avec la présence de chlorure d’aluminium AlCl3 (Figure II-102-d) comparativement au spectre enregistré dans le MeOH seul.

La présence d’un système ortho-dihydroxylé sur le cycle B est mise en évidence par le déplacement hypsochromique de 30 nm de la bande I observé sur le spectre enregistré dans le

146

MeOH avec la présence de AlCl3+HCl (Schéma II-3) par rapport à celui effectué en présence d’AlCl3 dans un milieu non acidifié.

Al Complexe labile OH O OH

OH O OH

HO O HO O HO O HCl AlCl3

OR OR OR

OH O O O O O Complexe stable Al Al Cl Cl 1 Cl Cl 2 Schéma II-3 : Formation des complexes avec le chlorure d’aluminium dans un milieu neutre (1) puis acidifié par l’acide HCl (2) pour le composé xf18

Ceci est confirmé par le déplacement bathochromique de 20 nm de la bande II (Figure

II-102-c) résultant de l’addition de NaOAc+H3BO3 (Schéma II-4) par rapport au spectre dans le MeOH.

B OH OH O

OH O

HO O HO O H3BO3

OR OR

OH O OH O

Schéma II-4: Formation du complexe en présence de H3BO3 pour le composé xf18.

Figure II-102 : Spectres UV du composé xf18 enregistrés en présence de différents réactifs.

147

Ces données spectrales UV sont en accord avec celles rapportées dans la littérature pour la quercétine substituée en position 3 [152].

B HO O

A C

OH O Figure II-103 : Structure de la quercétine.

Tableau II-15: Les données spectrales UV du composé xf18. λ Solvants-réactifs max Bande I (cycle B) Bande II (cycle A) Autres bandes MeOH 358 256 NaOH 408 272 330 AlCl3 430 274 AlCl3+HCl 400 268 NaOAc 360 265 NaOAc+H3BO3 378 260

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à 633,1433 correspondant à la formule brute C27H30O16.

Le spectre de RMN 1H (Figure II-104) montre les signaux caractéristiques d’un flavonoïde auxquels s’ajoutent des signaux appartenant à deux unités osidiques. La partie aglycone est présentée par cinq signaux aromatiques dont deux doublets aromatiques, intégrant chacun pour 1H avec une constante de couplage Jméta ≈ 2,3 Hz, situés à 6,43 et 6,24 ppm attribuables à H-8 et H-6 du cycle A. Les trois signaux restants sont des protons d’un système ABX caractéristiques des protons du cycle B attribuables aux H-2' (δH 7,69, d, J= 2,0

Hz), H-5' (δH 6,90, d, J= 8,5 Hz) et H-6' (δH 7,66, dd, J= 8,6-2,2 Hz). Ces constatations confirment la présence de la quercétine.

La partie osidique est distinguée par deux protons anomériques situés sur le spectre de 1 RMN H à δH 5,13 (d, J= 7,7 Hz) et δH 4,54 (d, J= 0,8 Hz), un doublet intégrant pour 3H à δH 1,14 (d, J= 6,1 Hz) et un massif des protons entre [3,2-3,9 ppm].

148

Figure II-104 : Spectre de RMN 1H du composé xf18.

Les résultats obtenus par l’analyse des spectres COSY, HSQC rejoignant les observations faites à partir du spectre de RMN 1H, nous ont permis d’identifier les deux sucres comme suis :

- à partir du doublet anomérique résonnant à 5,13 ppm, un β-D-glucopyranose est identifié par la position trans-diaxiale des protons H-1", H-2", H-3", H-4" et H-5" déduite par les valeurs de constante de couplage calculées à partir du spectre de RMN 1H (Tableau II-16).

- le proton situé à 4,54 ppm (d, J=0,8 Hz) nous amène à identifier un α-L-

rhamnopyranose caractérisé par le méthyle situé à δH 1,14 (d, J= 6,1 Hz) et les protons trans-diaxiaux H-3"', H-4"' et H-5"'. (Tableau II-16)

L’enchaînement des sucres (1'"→6") et la position de la chaîne diosidique sur l’hydroxyle de la génine en position 3 sont mis en évidence grâce aux corrélations HMBC observées entre H-1"Glc et C-3, H-6"Glc et C-1'" Rha et inversement entre H-1'" Rha et C-6"

Glc. Le déplacement chimique de ce dernier à δC 67,1 confirme la substitution en C-6".

L’ensemble des analyses spectrales nous a conduit à identifier le composé xf18 comme étant le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-quercétine (quercétine- 3-O-β-rutinoside) appelé rutine ou rutoside (Figure II-105).

C’est un flavonoïde très fréquent dans le règne végétale, isolé par exemple précédemment de Chenopodium pallidicaule (Chenopodiaceae) [153] et des fruits de Ziziphus jujuba et Z. spina-christi [154] et des feuilles de Ziziphus lotus [155].

149

OH 4'

B 8 1' HO O

A C HO Glc 1" OH 6 OH 3 O O 6" OH O O Rha HO O 1'''

HO OH

Figure II-105 : Structure du composé xf18 Tableau II-16: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé xf18 dans le CD3OD. Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Glc en C-3 2 157,9 - 1" 103,3 5,13 (d, 7,7) 3 134,2 - 2" 74,3 3,49 (t, 8,5) 4 178,0 - 3" 76,8 3,43 (t, 8,7) 5 161,6 - 4" 70,0 3,29 (t, 8,7) 6 98,6 6,22 (d, 2,5) 5" 75,8 3,34 (m) 7 164,7 - 6" 67,1 3,41 (dd, 11,1-5,8) 8 93,4 6,43 (d, 2,5) 3,82 (dd, 11,0-2,2) 9 157,1 - 10 104,2 - Rha en C-6" - 1"' 101,0 4,54 (d, 0,8) 1' 121,7 - 2"' 70,7 3,56 (dd, 3,5-1,2) 2' 116,3 7,69 (d, 2,0) 3"' 70,8 3,49 (dd, 9,2-3,4) 3' 144,5 - 4"' 72,5 3,30 (t, 9,1) 4' 148,4 - 5"' 68,3 3,47 (dq, 9,2-6,1) 5' 114,6 7,00 (d, 8,5) 6"' 16,5 1,14 (d, 6,2) 6' 122,1 7,66 (dd, 8,5-2,1)

II.1.2.2.6.2. Détermination structurale du composé xf19

Le spectre UV du composé xf19 dans le MeOH montre deux bandes d’absorbance maximales la bande I à 350 nm et la bande II à 266 nm (Figure II-106-a), ce qui laisse supposer qu’il s’agit d’un flavonol substitué en 3.

Un déplacement bathochromique de 50 nm de la bande I (Figure II-106-b), avec une augmentation de son intensité lumineuse sont enregistrés après avoir ajouté du NaOH, indiquant la présence d’un groupement OH libre en position 4'. Sur ce même spectre un épaulement apparaît à 326 nm suggérant la présence d’un OH libre en position 7, comme le confirme un déplacement bathochromique de 8 nm de la bande II enregistré avec la présence de NaOAc par rapport au spectre effectué en MeOH. (Figure II-106-c)

150

Le déplacement bathochromique de la bande II de 7 nm, observé après l’addition de

AlCl3+HCl (Figure II-106-d) comparativement à celui enregistré dans le MeOH, confirme la présence d’un OH libre en position 5.

L’absence d’un système ortho-dihydroxylé du cycle B est attendu car aucun déplacement hypsochrome significatif de la bande I est observé entre les spectres AlCl3+HCl et AlCl3.

Les données spectrales UV obtenues sont en accord avec celles rapportées dans la littérature pour le kaempférol substitué en position 3 [156].

Figure II-106 : Spectres UV du composé xf19 enregistrés en présence de différents réactifs.

Tableau II-17 : Les données spectrales UV du composé xf19. λ Solvants-réactifs max Bande I (cycle B) Bande II (cycle A) Autres bandes MeOH 350 266 NaOH 400 274 326 AlCl3 398 274 AlCl3+HCl 396 274 NaOAc 360 274 NaOAc+H3BO3 350 266

151

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif du composé xf19 montre un pic d’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 617,1481 correspondant à la formule brute

C27H30O15.

L’analyse du spectre de RMN 1H (Figure II-107) permet d’identifier un dérivé des flavonoïdes glycosylé distingué par quatre signaux aromatiques dont deux intégrant chacun pour 2H caractéristiques de la génine kaempférol : - les deux protons H-6 et H-8 du cycle A sont repérés à 6,23 et 6,42 ppm sous forme

d’un doublet avec un constante de couplage Jméta= 2,1 Hz.

- le doublet, d’intensité 2H, situé à δH 8,09 (d, J= 8,9 Hz) est attribué aux protons H-2'

et H-6'. De même pour celui résonnant à δH 6,91 (d, J= 8,9 Hz), il correspond à la paire des protons superposés H-3', H-5'.

Figure II-107 : Spectres de RMN 1H (a) et 13C (b) du composé xf19.

L’analyse des spectres COSY, HSQC et HMBC montre que la partie osidique du composé xf19 superpose parfaitement à celle du composé xf18 soit un β-D-glucose substitué en C-6" par un α-L-rhamnose (Tableau II-18).

L’ensemble des analyses spectrales effectués indique la structure finale de ce composé qui est le 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-kaempférol (Figure II-108), isolé précédemment des fleurs de Morinda citrifolia (Rubiaceae) [157] et des feuilles de Delonix regia (Fabaceae) [158].

152

OH 4'

B 8 1' HO O

A C HO Glc 1" OH 6 OH 3 O O 6" OH O O Rha HO O 1'''

HO OH Figure II-108 : Structure du composé xf19.

Tableau II-18: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du composé xf19 dans le CD3OD. Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Glc en C-3 2 158,0 - 1" 103,3 5,15 (d, 7,5) 3 134,1 - 2" 74,3 3,45 (t, 7,3) 4 178,0 - 3" 76,8 3,42 (t, 9,2) 5 161,6 - 4" 70,0 3,28 (t, 9,1) 6 98,6 6,23 (d, 2,1) 5" 75,8 3,36 (m) 7 164,6 - 6" 67,1 3,40 (dd, 11,1-5,0) 8 93,4 6,42 (d, 2,1) 3,83 (dd, 10,9-1,5) 9 157,1 - 10 104,3 - Rha en C-6" - 1"' 101,0 4,54 (d, 1,5) 1' 121,3 - 2"' 70,7 3,66 (dd, 3,4-1,5) 2' 131,0 8,09 (d, 8,9) 3"' 70,8 3,55 (dd, 9,5-3,5) 3' 114,7 6,91 (d, 8,9) 4"' 72,5 3,30 (t, 9,5) 4' 160,1 - 5"' 68,3 3,47 (dq, 9,6-6,3) 5' 114,7 6,91 (d, 8,9) 6"' 16,5 1,15 (d, 6,4) 6' 131,0 8,09 (d, 8,9)

II.1.2.2.6.3. Détermination structurale des composés xf20 et xf21 Les deux composés sont des isomères, étant co-présents dans la même fraction, ils se sont avérés très difficiles à purifier. Seul le composé xf20, étant présent en quantité supérieure à celle de xf21, a été purifié, en revanche la structure de xf21 a été élucidée à partir des spectres de RMN du mélange xf20:xf21 (50:50).

Les spectres de masse HR-ESI-MS (mode positif) donnent pour chacun un ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 587,1364 correspondant à la formule brute C26H28O14.

Les spectres de RMN 1H des deux composés xf20 et xf21 présentent les signaux du kaempférol déjà identifié sur le spectre du composé xf19, ce que confirme l’analyse des spectres de RMN 2D.

En revanche la partie osidique semble être variable d’un produit à l’autre : 153

- Dans le cas du composé xf20, deux protons anomères sont repérés à 5,50 ppm (d, J= 1,5 Hz) et à 4,29 ppm (d, J= 7,3 Hz). L’analyse des spectres COSY et HSQC, à partir de ces deux protons, et les valeurs des constantes de couplages nous a conduit à

identifier un α-L-rhamnopyranose substitué en position 2" et un α-L-arabinopyranose terminal. Ce dernier est caractérisé par un proton H-4"' en position équatoriale

présentant des petites constantes de couplage avec H-3"' et H-5"' (J3"'-4"'=3,5 Hz, J3"'-

5b"'= 2,7 Hz et J3"'-5a"'= 1,5 Hz) (Tableau II-19). - le composé xf21 quant à lui, présente deux signaux anomères à 5,46 et à 4,31 ppm. A partir de celui repéré à 5,46 ppm (d, J= 1,6 Hz) nous identifions, grâce à l’analyse des

spectres COSY et HSQC, un α-L-rhamnopyranose substitué en position 2" comme pour le composé xf20, alors que le deuxième doublet résonnant à 4,31 (d, J= 7,7 Hz)

nous conduit à identifier un β-D-xylopyranose terminal caractérisé par six protons en position trans-diaxiale.

L’enchaînement des sucres et leur positionnement sur la génine sont mis en évidences grâce aux corrélations HMBC observés entre H-1"/C-3, H-2"/C-1'" et inversement H-1'"/C-2" dans les deux composés.

L’ensemble des analyses spectrales de RMN et de masse nous a permis d’identifier le composé xf20 comme étant le 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl- kaempférol (Figure II-109), isolé de Kalanchoe pinnata (Crassulaceae) [96].

OH 4'

C 8 1' HO O

A B 6 3 O

OH O Rha O 1'' HO HO Ara HO OH O 1"' O OH

Figure II-109 : Structure de xf20.

La structure de xf21 quant à elle a été déterminée comme le 3-O-β-D-xylopyranosyl-

(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-kaempférol (Figure II-110), identifié précédemment dans les

154

feuilles de Licania licaniaeflora [159] et Licania pyrifolia (Chrysobalanceae) [160] et les feuilles de Moghania faginea (Fabaceae) [161].

OH 4'

C 8 1' HO O

A B 6 3 O

OH O Rha O 1'' HO HO Xyl HO OH O 1"' OH O

Figure II-110 : Structure de xf21.

Tableau II-19: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) du

composé xf20 et xf21 dans le CD3OD.

Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - - 2 157,8 - 2 157,8 - 3 135,4 - 3 135,4 - 4 178,4 - 4 178,4 - 5 161,9 - 5 161,9 - 6 98,5 6,23 (d, 2,1) 6 98,5 6,23 (d, 1,9) 7 164,5 - 7 164,5 - 8 93,4 6,40 (d, 2,1) 8 93,4 6,41 (d, 1,9) 9 157,2 - 9 157,2 - 10 104,5 - 10 104,5 - - - 1' 121,2 - 1' 121,1 - 2' 130,5 7,80 (d, 8,8) 2' 130,5 7,80 (d, 8,9) 3' 115,2 6,97 (d, 8,8) 3' 115,2 6,97 (d, 8,9) 4' 160,2 - 4' 160,3 - 5' 115,2 6,97 (d, 8,8) 5' 115,2 6,97 (d, 8,9) 6' 130,5 7,80 (d, 8,8) 6' 130,5 7,80 (d, 8,9)

Rha en C-3 Rha en C-3 1" 101,7 5,50 (d, 1,5) 1" 101,8 5,46 (d, 1,6) 2" 81,2 4,24 (dd, 3,5-1,6) 2" 81,3 4,22 (dd, 3,6-1,7) 3" 70,6 3,85 (dd, 9,8-3,5) 3" 70,5 3,85 (t, 9,7-3,7) 4" 72,3 3,36 (t, 9,8) 4" 72,3 3,35 (t, 9,6) 5" 70,4 3,70 (dq, 9,8-6,2) 5" 70,4 3,69 (m) 6" 16,3 1,00 (d, 6,3) 6" 16,3 1,02 (d, 6,5)

Ara en C-2" Xyl en C-2" 1"' 106,3 4,29 (d, 7,3) 1"' 106,3 4,31 (d, 7,6) 2"' 71,4 3,59 (dd, 9,2-7,3) 2"' 73,9 3,21 (dd, 9,1-7,6) 3"' 72,9 3,51 (dd, 9,1-3,5) 3"' 76,4 3,31 (t, 8,9) 4"' 68,4 3,36 (t, 9,8) 4"' 69,6 3,43 (dd, 9,6-5,4) 5"' 66,00 3,45 (dd, 12,6-1,5) 5"' 65,7 3,10 (dd, 11,6-10,1) 3,73 (dd, 12,4-2,) 3,70 (dd, 11,5-5,3)

155

II.1.2.3. Conclusion sur l’étude phytochimique des feuilles et branches

L’étude phytochimique réalisée sur les feuilles d’Alphitonia xerocarpa a conduit à l’isolement et à l’identification de 22 composés dont 5 isolés à partir de l’extrait acétate d’éthyle et 17 à partir de l’extrait hydro-méthanolique des feuilles et 4 triterpènes à partir de l’extrait acétate d’éthyle des branches.

Les quatre triterpènes isolés à partir de l’extrait acétate d’éthyle sont des dérivés du lupane dont un à squelette du lupéol, et trois ayant en commun l’acide A(1)norlup-20(29)-èn- 28-oique comme squelette, parmi ces derniers, le produit majoritaire xb2, l’acide 2α-formyle- A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique est un composé décrit pour la première fois.

Les produits provenant de l’extrait acétate d’éthyle sont de nature triterpénique dont deux phytostérols bien connus : le β-sitostérol xf1 et le 6’-heptadécanoyl-3-O- glucopyranosyl-β-sitostérol xf2, et trois dérivés du lupane : la bétuline xf3, l’acide céanothénique xb4 et un produit nouveau xf4 (30-hydroxycéanothénique).

Les phytostérols ont fait l’objet de nombreuses études pharmacologiques qui ont montré qu’ils possèdent des propriétés antibactérienne [162], cytotoxique [138] et anti- inflammatoire [163]. La bétuline est connu pour ses nombreuses propriétés biologiques notamment cytotoxique [164] [165], antibactéienne [105] [166]. L’acide céanothénique présente également une activité antiproliférative contre des lignées cellulaires [167].

L’extrait hydro-méthanolique s’est révélé très riches en saponoides en plus de la présence abondante des flavonoïdes. Ces derniers sont la rutine xf18 (quercétine-3-O-β- rutinoside), un des produits majoritaires de cet extrait, et trois flavonoïdes minoritaires xf19- xf21 ayant le kaempférol comme aglycone. Les flavonoïdes sont connus pour être des agents antioxydants, inhibiteurs d’enzymes, protecteurs vasculaire et hépatique [168].

Les 13 saponosides isolés peuvent être classés selon la partie aglycone comme suit : cinq glycosides à jujubogénine (xf5-xf9), dont le produit majoritaire (xf6) est le sel sodique d’un composé isolé précédemment des feuilles de Ziziphus lotus [142]; la partie osidique de ces composés, liée en C-3, varie selon le nombre des sucres la constituant, trois (xf5, xf6), quatre (xf7) ou cinq sucres (xf8, xf9);

156

trois glycosides de la 22α-hydroxy-jujubogénine (xf10-xf12), ayant une chaîne

osidique identique (3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl), estérifiée en C-6" par le sinapoyl dans le cas de xf11 et par le p-coumaroyl dans la structure de xf12; un glycoside du 16-β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β-20-diol (xf13)

ayant l’enchaînement (β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl) comme partie osidique; trois saponosides dérivés de l’acide 16,17-seco-dammarane-16,26-dioique

(xf14-16), substitués par l’enchaînement 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-

D-glucopyranosyl; un glycoside de l’acide céanothique (xf17) ayant une chaîne osidique branchée

constituée de cinq unités β-D-glucopyranose.

Contrairement aux triterpènes, les activités biologiques reportées dans la littérature des saponines à jujubogénine sont limitées à une activité antimycobactérienne des saponosides isolés des tiges de Colubrina retusa (Rhamnaceae) [144] et une activité antifongique modeste [169]. D’autres dérivés de l’acide 16,17-seco-dammarane-16,26-dioique, les hovenidulcioside

A1 et B1 isolés des fruits d’Hovenia dulcis, ont montré une activité anti-histaminique [65].

157

II.1.3. Etude phytochimique des écorces de tronc d’A. xerocarpa

Les écorces séchées et broyées ont été extraites à chaud avec le mélange méthanol/eau 80:20. L’extrait hydro-alcoolique (80 g) a été fractionné par VLC sur silice en utilisant le gradient (CHCl3/CH3OH 100:0 à 0:100) pour donner cinq fractions dont trois ont été purifiées

(Schéma II-5). La fraction I (100% CHCl3) a permis d’isoler trois triterpènes (xb1, xb2 et xe1), alors que la fraction II (CHCl3:CH3OH 75:25) a conduit à l’isolement de l’uridine (xe4) et de cinq composés phénoliques (xe2, xe3, xe5-xe7). La fraction IV (CHCl3:CH3OH 25:75) donne un flavonoïde xf18 et douze saponosides dont six ont déjà été décrits et isolés des feuilles de la même espèce (xf5-xf9, xe8-xe13).

Ecorces séchées et pulvérisées

CH3OH: H2O 80:20 à reflux 3h A.X.E.M marc

VLC, SiO2 CHCl3:CH3OH I, 100:0 II, 75:25 III, 50:50 IV, 25:75 V, 0:100 CC, VLC, SiO SiO2 2 IV, 1g IV, 2g I-1 xe1 II-1 CLHP , C18 CC, CC, Préparative SiO2 SiO2 xb1 II-3-1 II-3-2 IV-6 IV-7 IV-8 CC, C18 xb2 CLHP CC, C CC, SiO2 CC, C18 18 C18 CLHP, C18 CC-C18 xe2 xe2 xf18 CLHP C xe4 xe3 18 xe6 IV-1 IV-2 IV-3 IV-4 IV-5 xe5 xf5 xf5 xe7 CLHP xf7 CLHP C CLHP xf7 xf8 SiO2 18 xe8 C18 xe9 xf9 xf18 xe9 xe8 xe10 xf6 xe11 xe13 xe12 xe14

Schéma II-5 : Schéma d’extraction et de purification des composés des écorces d’Alphitonia xerocarpa.

158

II.1.3.1. Identification des triterpènes isolés de la fraction I

L’analyse des spectres de RMN 1D et 2D des trois triterpènes isolés indique la présence de trois dérivés du lupane. Les composés xb1 et xb2 sont identifiés respectivement comme l’acide céanothique, le produit majoritaire, et l’acide 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)- èn-28oique, tous les deux déjà isolés des branches et décrits dans la partie II.1.1. Seul le composé xe1 est nouveau.

H H

R1 COOH 28

xb1: R1= α-COOH, R2= β-OH. 27 xb2: R1= α-CHO, R2= H. 3 xe1: R = β-CHO, R = H. R2 1 2

Figure II-111 : Structures des composés xb1, xb2 et xe1.

II.1.3.1.1. Détermination structurale du composé xe1

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif donne un pic pour l’ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 477,3329 correspondant à la formule brute C30H46O3.

Les spectres de RMN 1D (Figure II-113) & 2D montrent les mêmes signaux que ceux présents pour le composé xb2, exception faite de ceux appartenant aux constituants du cycle

A (CHO-1, CH-2, CH2-3, CH-5, CH3-25 et C-4), qui présentent des déplacements chimiques différents (Tableau II-20). Cela suggère une stéréochimie différente du carbone 2 ce qui est confirmé par l’analyse des effets rOe observés sur le spectre ROESY.

Sur le spectre ROESY de xe1 nous signalons l’absence des effets rOe entre les protons H-2/H-24 et H-2/H-25 et H-1/H-5 observés précédemment sur celui du xb2 (Figure II-112), et l’apparition d’effets rOe entre les protons H-2/H-23, H-2/H-9, H-1/H-25, H-1/H-3. L’aldéhyde CHO-1 se trouve en position β dans le cas du composé xe1 et le proton H-2 en position α équatoriale, contrairement à celui du xb2 qui présente le CHO-1 en position α et le H-2 en position β-axiale (Figure II-112).

159

H 25 O 25 C CH3 H CH3 CH CH 3 O 3 9 H 2 C 2 H H 4 4 5 5 H H H C H3C 3 H H H H

Figure II-112: Les effets rOe observés sur le cycle A des composés xe1 et xb2.

Figure II-113 : Spectres de RMN 1H et 13C du composé xe1.

La structure finale du composé xe1 (Figure II-114) est déterminée comme étant l’acide 2β-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique, isolé pour la première fois [55].

H H

1 COOH OHC 28

27 3

xb2: R1= α-CHO, R2= H xe1: R1= β-CHO, R2= H

Figure II-114: Structures des composés xb2 et xe1.

160

Tableau II-20: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 1 13 MHz) de xb2 (CDCl3) et en RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) de xe1

(CD3OD+CDCl3) xb2 xe1 Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 205,3 9,84 (d, 3,5) 206,6 9,73 (d, 4,7)

2 61,5 2,58 (dd 7,8-3,5) 64,1 2,25 (ddd, 9,8-4,7-3,6) 3 39,1 1,81 (dd, 14,6-7,8) 40,4 1,61 (dd, 13,5-3,7) 1,91 (dd, 14,5-0,9) 1,99 (dd, 13,7-9,8) 4 38,3 - 37,7 - 5 58,7 1,25 (dd, 9,1-2,8) 63,1 1,07 (dd, 8,9-2,6) 6 18,5 1,37 (m) 17,9 1,40 (m) 1,42 (m) 1,40 (m) 7 34,0 1,37 (m) 34,3 1,40 (m) 1,37 (m) 1,40 (m) 8 41,6 - 41,7 - 9 44,9 1,73 (dd, 12,8-2,9) 50,1 1,65 (dd, 16,3-3,7) 10 52,0 - 51,1 - 11 23,7 1,51 (dd, 9,6-1,8) 24,3 1,23 (m) 1,65 (dd, 13,5-3,9) 1,50 (dd, 13,3-4,7) 12 24,9 1,09 (dd, 12,9-4,9) 25,1 1,15 (dd, 11,7-5,1) 1,72 (m) 1,71 (dd, J=5,8) 13 38,6 2,22 (td, 12,2-3,6) 38,3 2,19 (td, 12,2-3,8) 14 42,8 - 42,6 - 15 29,9 1,20 (dt, 13,7-3,2) 29,9 1,21 (dt, 13,8-3,5) 1,58 (td, 12,9-4,2) 1,59 (tm, 13,5) 16 32,2 1,44 (dd, 9,8-3,4) 32,2 1,47 (dd, 13,5-3,3) 2,30 (dt, 12,9-3,3) 2,30 (td, 13,0-3,3) 17 56,3 - 56,2 - 18 49,2 1,62 (t, 11,5) 49,3 1,62 (t, 11,5) 19 46,9 3,01 (td, 10,9-4,9) 47,0 3,01 (td, 10,8-5,1) 20 150,2 - 150,1 - 21 30,5 1,43 (dd, 10,1-3,2) 30,5 1,44 (dd, 13,1-3,1) 2,01 (m) 2,01 (m) 22 37,1 1,5 (m) 37,1 1,5 (m) 1,99 (d, 9,1) 2,00 (dd, 11,3-4,3) 23 32,0 1,12 (s) 32,5 1,03 (s) 24 26,2 0,97 (s) 25,8 0,98 (s) 25 19,3 0,99 (s) 13,5 1,03 (s) 26 16,9 0,96 (s) 16,6 0,94 (s) 27 14,8 0,96 (s) 14,7 1,02 (s) 28 181,9 - 181,0 - 29 109,9 4,64 (dd, 2,2-1,5) 110,0 4,63 (dd, 2,2-1,4) 4,75 (d, 2,2) 4,75 (d, 2,3) 30 19,3 1,70 (s) 19,3 1,70 (s)

161

II.1.3.2. Identification des composés isolés de la fraction II

À l’aide de différentes techniques chromatographiques, cette fraction nous a permis d’identifier six composés dont un lignane glycosylé xe2 (4-O-β-glucopyranosyl-lyoniresinol), le produit majoritaire, un dérivé des aurones xe3 (maesopsin), un nucléoside xe4 (uridine), trois phénols glycosylés (xe5, xe6 et xe7).

II.1.3.2.1. Détermination structurale des composés xe5, xe6 et xe7

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif du composé xe5 présente un pic pour l’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 353,1216 correspondant à la formule brute + C15H22O8, celui du xe6 montre un ion pseudo-moléculaire [M+Na] à m/z 339,1056 + correspondant à la formule brute C14H20O8, alors que xe7 donne un ion [M+Na] à m/z

471,1481 correspondant à la formule brute C19H28O12.

Analyse des spectres de RMN 1H

Les spectres de RMN 1H (Figure II-116) des trois composés montrent 3 protons aromatiques [6,5-7,5 ppm] indiquant la présence d’un noyau benzène tri-substitué. Sur les spectres de xe5 et xe7 un singulet intégrant pour 3H est situé à ≈ 3,85 ppm attribuable à un groupement méthoxy, alors que les spectres de xe5 et xe6 présentent deux triplets intégrant chacun pour 2H (groupements méthylènes), dont un -CH2 localisé à ≈2,7 ppm (t, J≈ 7,0 Hz) et le deuxième oxygéné -CH2OH à ≈3,7 ppm (t, J= 7,0 Hz).

Les signaux des protons aromatiques et les valeurs des constantes de couplages indiquent qu’ils sont positionnés en ortho (d, Jortho≈ 8 Hz), ortho et meta (dd, Jmeta≈ 8 et Jortho≈

2,0 Hz) et meta (d, Jmeta≈ 2 Hz) sur le noyau aromatique trisubstitué (Figure II-115).

H Jmeta≈ 2 Hz

H R3

Jortho≈ 8 Hz

R1 H

Figure II-115: Couplages meta et ortho des protons aromatiques

162

Le composé xe7 présente deux hexoses dont nous distinguons les deux protons anomériques superposés à 4,73 ppm et 10 protons oxygénés et un doublet intégrant pour 3H à 1,24 (d, J = 6,2 Hz), tandis que la zone des protons oxygénés semble être identique sur les deux spectres des composés xe5 et xe6 et présente un proton anomérique ≈ 4,8 ppm (d, J≈ 7,5 Hz) et six autres protons attribuables à un hexose.

Figure II-116 : Spectres de RMN 1H des composés xe5 (a), xe6 (b) et xe7 (c).

Analyse des spectres de RMN 13C

Sur le spectre de RMN 13C (Figure II-117) du composé xe5 nous distinguons 6 carbones aromatiques résonnant dans une zone entre (113-150 ppm), 6 carbones résonnant dans une région entre (61-102 ppm) appartenant à une unité osidique dont l’anomère est détecté à 101,7 ppm, un méthoxy à 55,3 ppm (δH 3,88, s (3H)) et deux autres carbones situés à 38,4 et 62,9 ppm. Les protons correspondants à ces deux derniers carbones sont attribués par analyse du spectre HSQC à 2,79 et 3,75 ppm et correspondent à la présence d’une chaîne éthyle hydroxylée.

Sur celui de xe6 nous retrouvons presque les même signaux que ceux du composé xe5, sauf l’absence du signal du au méthoxy. 163

Le spectre de xe7 présente 6 carbones aromatiques (102-151 ppm), 11 carbones oxygénés et un carbone d’un méthyle à 16,6 ppm appartenant à deux unités osidiques, un hexose et un désoxy-6-hexose dont les anomères sont localisés à 102,3 et 100,8 ppm, respectivement. Il ne possède pas de chaîne éthyle hydroxylée comme les deux précédents.

Figure II-117 : Spectres de RMN 13C des composés xe5 (a), xe6 (b) et xe7 (c).

Analyse des spectres COSY

Une corrélation COSY observée sur les spectres du xe5 et xe6 entre les deux groupements méthylènes à ≈ 2,79 et ≈3,75 ppm.

L’analyse des spectres COSY et les constantes de couplage calculées à partir des 1 spectres de RMN H (Tableau II-21) confirme la présence d’un β-D-glucopyranose sur les trois spectres et d’un α-L-rhamnopyranose dans le cas de xe7.

Analyse des spectres HMBC & NOESY (ROESY pour xe7)

La structure finale de chaque composé est élucidée grâce à l’analyse du spectre HMBC et confirmée par les effets NOE observés sur le spectre NOESY.

Sur le spectre HMBC de xe5 :

164

3 2 3 - les corrélations JH7-C3, JH7-C4 et JH7-C5 permettent de localiser la substitution du 2- hydroxyéthyle en C-4 qui corrèle également avec les protons H-3 (6,91 ppm, d, J=2,0 Hz), H-5 (6,79 ppm, dd, J=8,2-2,0 Hz) et H-6 (7,11 ppm, d, J=8,2 Hz).

- la corrélation entre les protons du -OCH3 et le carbone C-2 (149,3 ppm) indique la substitution de l’OH en C-2. Ce dernier est placé grâce à sa corrélation avec les protons H-3 (en ortho) et H-6 (en meta).

- la corrélation au niveau du doublet anomérique (4,86 ppm, d, J=7,5 Hz) avec le carbone C-1 (145,0 ppm), indique la glycolysation sur l’hydroxyle en position 1. Le carbone C-1 a été attribué au préalable par ses corrélations avec les protons H-3, H-5 et H-6.

Cette attribution est confirmée par les effets NOE observés sur le spectre NOESY entre OCH3 et H-3 et entre H-1’ et H-6.

H 7 H OH

OH 4 8 Glc 1 O HO O H HO 2 OH OCH3 H COSY

HMBC NOE

Figure II-118 : Principales corrélations COSY, HMBC et les effets NOE du composé xe5.

La structure finale du composé xe5 est établie comme le 1-O-β-D-glucopyranosyl-4- (8-hydroxyéthyl)-2-méthoxyphényl (Figure II-118), isolé précédemment de Saussurea medusa (Asteraceae)[170], et des feuilles de Cinnamomum reticulatum (Lauraceae) [171].

En suivant le même raisonnement la structure du composé xe6 a été identifiée comme une structure proche du composé xe5 mais avec un hydroxyle libre non méthylé en position para de la chaîne hydroxyéthyle et un autre glucosylé en position méta. Les déplacements chimiques des protons et carbones sont répertoriés dans le tableau II-21.

165

Le composé xe6 (Figure II-119) est identifié comme étant le 1-O-β-D- glucopyranosyl,5-(8-hydroxyéthyl)-phényl, isolé des feuilles d’Osmanthus asiaticus NAKAI (Oleaceae) [172].

7 OH

5 8 2 HO OH 1 Glc O O HO HO OH

Figure II-119: La structure du composé xe6.

L’analyse du spectre HMBC du composé xe7 permet de placer les hydroxyles en positions 1, 3 et 4 du noyau aromatique et un méthyle sur l’hydroxyle en position 3.

L’enchainement α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl est déterminé par l’effet rOe entre les protons H-1" et Hb-6' observés sur le spectre ROESY de xe7, comme le confirme le spectre HMBC en montrant le couplage JHa,b6'-C1". La chaîne diosidique est reliée à l’hydroxyle en position 1 comme le montre la corrélation HMBC entre le proton H-1' et le carbone C-1.

Le composé xe7 est donc le 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-3- méthoxy-4-hydroxyphényl (Figure II-120), déjà isolé de Sargentodoxa cuneata (Sargentodoxaceae) [173].

4 OH

6' Rha O Glc 1 O 1'' O 3 1' OCH3 O HO HO HO OH HO OH

Figure II-120: La structure du composé xe7.

166

Tableau II-21: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et 13C (150 MHz) des composés xe5-xe7 xe5 xe6 xe7 Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 145,0 - 145,2 - 151,3 - 2 149,3 - 145,3 - 102,5 6,76 (d, 2,6) 3 113,2 6,91 (d, 2,0) 115,5 6,78 (d, 8,1) 147,9 - 4 134,1 - 130,7 - 141,7 - 5 121,1 6,79 (dd, 8,2-2,0) 123,8 6,79 (dd, 7,6-1,3) 114,7 6,73 (d, 8,6) 6 116,9 7,11 (d, 8,2) 118,2 7,10 (d, 1,7) 108,7 6,60 (dd, 8,7-2,6) 7 38,4 2,79 (t, 7,0) 38,1 2,74 (t, 7,1) 8 62,9 3,75 (t, 7,0) 62,9 3,73 (t, 7,1) -OCH3 55,3 3,88 (s) - 55,1 3,85 (s)

Glc en C-1 1' 101,7 4,86 (d, 7,5) 103,0 4,77 (d, 7,4) 102,3 4,73 (d, 7,3) 2' 73,5 3,50 (t, 9,4) 73,5 3,51 (t, 8,0) 73,6 3,42 (t, 9,2) 3' 76,8 3,47 (t, 9,3) 76,9 3,48 (t, 8,5) 76,6 3,45 (t, 9,1) 4' 70,0 3,41 (t, 9,2) 70,0 3,41 (t, 8,6) 70,2 3,36 (t, 9,2) 5' 76,4 3,40 (m) 76,3 3,43 (ddd, 8,6-4,6-2,0) 75,5 3,53 (ddd, 9,2-6,5-4,0) 6' 61,1 3,71 (dd, 12,1-5,2) 61,1 3,73 (dd, 12,0-4,6) 66,5 3,61 (dd, 11,0-6,5) 3,88 (dd, 12,2-2,3) 3,92 (dd, 12,0-2,0) 4,04 (dd, 11,0-4,0)

Rha en C-6' 1" - 100,8 4,74 (d, 1,2) 2" - 70,8 3,85 (dd, 3,5-1,6) 3" - 71,0 3,69 (dd, 9,5-3,4) 4" - 72,6 3,38 (t, 9,5) 5" - 68,4 3,67 (dd, 9,4-6,2) 6" - 16,6 1,24 (d, 6,2)

II.1.3.2.2. Détermination structurale du composé xe2

Le composé xe2 est isolé en mélange racémique (xe2.I et xe2.II), mais la détermination structurale sera détaillée pour l’isomère xe2.I est les différences seront soulignées en analysant le spectre NOESY. Il ne présente qu’un seul ion pseudo-moléculaire + [M+Na] à m/z 605,2219 correspondant à la formule brute C28H38O13, sur le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif.

Analyse du spectre de RMN 1H (Figure II-121)

Le spectre de RMN 1H montre les signaux suivants : - deux singulets résonnant dans la zone des protons aromatiques dont un intégrant pour 1H situé à 6,60 ppm et l’autre intégrant pour 2H résonnant à 6,43 ppm suggérant une symétrie du noyau aromatique auquel il appartient.

- deux doublets déblindés résonnant à δH 4,24 (d, J=6,4 Hz) et δH 4,15 (d, J=7,8 Hz). - un massif de protons dans la zone des protons hydroxylés.

- quatre méthoxy résonnant à δH 3,87, 3,35 et deux superposés à δH 3,77.

- deux signaux intégrant chacun pour 1H résonnant à δH 2,69 (m ; dd, J= 7,9-2,9 Hz).

- deux signaux résonnant sous forme de multiplets à δH 2,14 et δH 1,70. 167

Figure II-121 : Spectre de RMN 1H du composé xe2.

Analyse du spectre de RMN 13C (Figure II-122)

En couplant les données obtenus sur les spectres de RMN 1H & 13C nous pouvons distinguer les signaux suivants :

- trois signaux correspondant aux quatre méthoxy résonnent à δC 55,2, 55,6 (2 C) et 58,7. - 12 carbones aromatiques résonnent entre [105-148 ppm] suggérant la présence de deux noyaux aromatiques. - 7 carbones hydroxylés sont détectés entre [60-77 ppm], dont cinq appartiennent à une unité osidique.

- le carbone anomérique appartenant à ce sucre résonne à δC 102,9. - quatre carbones résonnent à 45,2, 41,9, 39,8 et 32,4 ppm.

Figure II-122 : Spectre de RMN 13C du composé xe2.

168

Analyse du spectre COSY

Grâce à l’analyse des corrélations observées sur le spectre COSY, nous avons réussis à trouver l’enchaînement suivant :

- au niveau du proton situé à δH 4,24 (d, J= 6,4 Hz, H-4) deux corrélations sont

observées dont une avec le multiplet détecté à δH 2,14, et l’autre avec le singulet

aromatique intégrant pour 2H situé à δH 6,43. Cette dernière corrélation explique le déblindage de ce proton H-4 car il est porté par un carbone substitué par un noyau 4 aromatique d’où la corrélation COSY JH-H avec les deux protons aromatiques superposés (Figure II-123).

- le proton à δH 2,14 (m, H-3) présente trois corrélations, en plus de celle attribuée au

proton H-4, dont une avec le multiplet à δH 1,70 (m, H-2) et deux avec les protons

géminés Ha,b-3α [δHa 3,62 (dd, J=10,9-5,2 Hz), δHb 3,87 (dd, J=10,9-6,5 Hz)]. - en plus de la corrélation détectée avec le proton H-3, le multiplet H-2 montre quatre corrélations avec quatre protons correspondant à deux paires de protons géminés; dont

l’un Ha,b-1 [δHa 2,69 (m), δHb 2,69 (dd, J= 7,9-2,9 Hz)] et l’autre oxygéné Ha,b-2α (δHa 3,63, m).

- les deux protons géminés Ha,b-1 montre une corrélation avec le singulet aromatique situé à 6,60 indiquant la substitution par un deuxième noyau aromatique (Figure II- 123)

2a H H2 C C CH2OH 1 8 CH 2

4 CH 3a 3 CH CH2OR

HC CH

Figure II-123 : Corrélations COSY des protons du composé xe2.

- à partir du proton anomérique situé à δH 4,15 (d, J= 7,8 Hz), nous pouvons analyser six corrélations COSY successives appartenant à un hexose et attribuer les protons H-2"

(δH 3,23, dd, J= 9,1-7,6 Hz), H-3" (δH 3,32, t, J= 9,1 Hz), H-4" (δH 3,32, t, J= 9,0 Hz),

H-5" (δH 3,18, m), Ha-6" (δH 3,71, dd, J= 12,1-5,6 Hz), Hb-6" (δH 3,86, dd, J= 12,1-3,1

169

Hz). Les déplacements chimiques ainsi que les constantes de couplage des protons de

l’unité osidique (Tableau II-22) suggèrent la présence d’un β-D-glucopyranose à confirmer par l’analyse du spectre HSQC.

Analyse du spectre HSQC

Grâce à cette analyse la plus part des carbones sont attribués à partir des protons correspondant (Tableau II-22) :

- six carbones appartenant au sucre C-1" (δC 102,9), C-2" (δC 73,7), C-3" (δC 76,8), C-

4" (δC 70,0), C-5" (δC 76,6) et C-6" (δC 61,3).

- neuf carbones de la partie aglycone : C-1 (δC 32,4), C-2 (δC 39,8), C-2α (δC 64,8), C-3

(δC 45,2), C-3α (δC 70,6), C-4 (δC 41,9), C-8 (δC 106,4) et les deux carbones C-6' et C-

2' superposés à (δC 105,7). - les quatre carbones des méthoxy détectés à 55,2, 58,7 ppm et 55,6 (2C) ppm.

Analyse du spectre HMBC

A ce stade de l’analyse nous pouvons proposer une structure d’un lignane monoglucosylé qui sera élucidée à l’aide des corrélations HMBC comme suit :

- le singulet aromatique situé à 6,43 ppm présente cinq corrélations HMBC dont une avec le carbone C-4 et quatre autres au niveau des carbones quaternaires situés à 147,6, 138,1, 133,2, et 105,7 ppm correspondant aux carbones du cycle aromatique. - le signal détecté sur le spectre de RMN 13C à 147,6 ppm montre une corrélation intense avec les deux méthoxys superposés à 3,77 ppm indiquant la position de substitution de ces derniers en meta C-3' et C-5' déduite par la symétrie de ce noyau aromatique.

- la distinction entre les carbones C-1' (δC 138,1) et C-4' (δC 133,2) se fait grâce à des

corrélations observées au niveau de carbone C-1' (δC 138,1) avec les protons H-4 et H- 3, ainsi le premier cycle aromatique est attribué (Figure II-124). - au niveau du proton H-4 nous observons trois corrélations avec les carbones situés à 146,1, 128,8 et 124,8 ppm, en plus des corrélations avec des carbones déjà identifiés (C-1', C-2', C-6', C-3, C-3α, C-2).

170

- le proton H-3 corrèle avec les carbones C-1, C-2, C-2α, C-3α, C-4, C-1' en plus de 3 celui situé à 124,8 ppm, cette dernière corrélation de couplage JH-C permet d’attribuer

ce carbone à C-10 (δC 124,8) (Figure II-124).

- les deux protons géminés H-3α couplent avec les carbones C-2, C-3, C-4 et C-1" (δC 102,9) indiquant la position de la glycolysation en C-3α. - le proton H-2 situé à 1,70 ppm corrèle avec les carbones C-1, C-2α, C-3, C-3α, C-4 et celui détecté à 128,8 ppm, cette dernière corrélation indique la présence d’un couplage 3 JH-C ce qui permet d’attribuer le carbone C-9 (δC 128,8).

- les deux protons géminés Ha,b-2α couplent avec les carbones C-1, C-2 et C-3.

- les deux protons géminés Ha,b-1 présentent deux corrélations avec des carbones non identifiés situés à 147,3 et 146,1 ppm, en plus des corrélations avec les carbones C-8

(δC 106,4), C-9 (δC 128,8), C-10 (δC 124,8), C-2, C-2α et C-3. - le carbone situé à 146,1 ppm présente cinq corrélations dont quatre avec des protons

déjà attribués H-4, H-8 et Ha,b-1 et la dernière corrélation est avec les protons du

méthoxy situé à 3,35 ppm (δC 58,7) ce qui permet de localiser la place de ce dernier. 3 Ce carbone est identifié comme étant le C-5 car il présente un couplage JH-C avec le 4 H-4 et un couplage JH-C avec le Ha,b-1. - de même pour le carbone résonnant à 147,3 qui présente quatre corrélations dont trois

avec les protons Ha,b-1 et H-8 et la dernière avec les protons du méthoxy à δH 3,87, ce qui permet de localiser ce dernier et d’attribuer le C-7 au signal situé 147,3 ppm. - la dernière corrélation non identifiée au niveau du proton H-8 avec le carbone situé à

δC 137,5 nous permet d’attribuer ce dernier au carbone C-6. - les corrélations HMBC des protons de l’unité osidique observées confirment les attributions déjà établies par l’analyse du spectre COSY.

H3CO 7 CH2OH 9 1 1'' Glc 3 HO 5 OH 10 4 OH HO C O H2 O HO OCH3 1' 2'

H3CO 4' OCH3

OH Figure II-124 : Corrélations HMBC du composé xe2. 171

Les données obtenues nous ont permis d’identifier le composé xe2 comme le 3α-O-β-

D-glucopyranosyl-lyonirésinol.

Tous les signaux observés sont dédoublés sur les spectres de RMN 1H & 13C. L’interprétation des signaux restant confirme la présence de l’isomère xe2.II, et les déplacements chimiques des protons et carbones sont répertoriés dans le tableau II-22.

Analyse du spectre NOESY

Sur le spectre NOESY, les effets NOE observés, entre les protons H-3/H-2α, H-2/H-3,

H-2/H-3α, H-2'/OCH3-3', H-6'/OCH3-5', OCH3-5/H-4 et H-8/OCH3-7, semblent être identiques entre les deux isomères (Figure II-125) et confirment les attributions effectuées par l’analyse du spectre HMBC.

3 La constante de couplage JH-4-H-3 = 6,4 Hz et 6,2 Hz pour les deux isomères, suggère que les protons H-3 et H-4 sont en position trans-diaxiale.

Seule la corrélation observée entre les protons H-1" Glc/H-3 de l’isomère xe2.I indique une configuration α-axiale du proton H-3 et la configuration α du CH2-2α est déduite par l’effet rOe entre H-3/H-2α.

Figure II-125 : Effets NOE observés des protons de xe2.

La position β-équatoriale du proton H-4 de l’isomère xe2.I est déduite par l’effet rOe observé entre les protons H-4/H-2 et H-4/H-3α.

172

H CO CH OH 3 7 2 H3CO 7 CH2OH 9 1 9 1 H H H H 1'' Glc Glc 3 H 3 H 1'' 5 OH 5 OH 10 4 OH 4 HO C O HO 10 C O OH H O H O H 2 H 2 HO CH O CH O HO 3 H H 3 H 1' H 1' 2' 2'

H CO OCH 3 4' 3 H3CO 4' OCH3 OH OH

Figure II-126 : Les effets NOE observés sur le spectre NOESY de deux isomères xe2.1 (à gauche) et xe2.II.

L’absence d’une corrélation H-1" Glc/H-3 de l’isomère xe2.II suggère une orientation β-axiale du proton H-3. En respectant les autres corrélations observées sur le spectre NOESY nous pouvons déduire la configuration α-axiale des protons H-1 et H-4 et β pour le proton H-3 de ce composé (Figure II-126)

La distinction entre les deux isomères est effectuée grâce à une étude menée, par des techniques spectroscopiques et optiques, sur les deux isomères (-)-3α-sulfo-lyonirésinol et (+)-3α-sulfo-lyonirésinol isolés des racines de Polygonum cuspidatum (Polygonaceae) [174]. En comparant les résultats que nous avons obtenus à ceux de la littérature, nous avons identifié xe2.I comme étant l’isomère (-) et xe2.II comme l’isomère (+).

Les analyses des données spectrales obtenues pour le composé xe2 nous permettent de l’identifier comme le (±) 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol, dont l’isomère ( ) 3α-O-β-

D-glucopyranosyl-lyonirésinol (Figure II-127) a déjà été isolé des tiges de Berchemia racemosa (Rhamnaceae) [175] et l’isomère ( ) 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol a été isolé des écorces de Cinnamomum cassia (Lauraceae) [176].

H3CO 7 CH2OH 9 1 HO 3 1'' 5 OH 10 4 OH HO C O H2 O HO CH3O Glc 1' 2'

H3CO 4' OCH3

Figure II-127 : Structure du composé xe2. 173

Tableau II-22 : Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) des composés xe2.I, xe2.II.

xe2.I xe2.II Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) 1 32,4 2,69 (m) 32,4 2,63 (dd, 14,9-11,7) 2,69 (dd, 7,9-2,9) 2,74 (dd, 15,2-4,7) 2 39,8 1,70 (m) 39,2 1,72 (m) 2α 64,8 3,63 (m) 64,8 3,57 (dd, 11,0-6,6) 3,63 (m) 3,65 (dd, 11,0-4,6) 3 45,2 2,14 (m) 45,3 2,10 (m) 3α 70,6 3,62 (dd, 10,9-5,2) 70,3 3,48 (dd, 9,9-5,8) 3,87 (dd, 10,9-6,5) 3,91 (dd, 9,9-4,0) 4 41,9 4,24 (d, 6,4) 41,4 4,44 (d, 6,2) 5 146,1 - 146,2 - 6 137,5 - 137,5 - 7 147,3 - 147,2 - 8 106,4 6,60 (s) 106,4 6,60 (s) 9 128,8 - 128,8 - 10 124,8 - 125,0 - 1' 138,1 - 138,0 - 2' 105,7 6,43 (s) 105,5 6,45 (s) 3' 147,6 - 147,6 - 4' 133,2 - 133,1 - 5' 147,6 - 147,6 - 6' 105,7 6,43 (s) 105,5 6,45 (s) 1" 102,9 4,15 (d, 7,8) 103,4 4,30 (d, 7,8) 2" 73,7 3,23 (t, 9,6) 73,8 3,26 (t, 7,8) 3" 76,8 3,32 (t, 9,1) 76,8 3,26 (t, 8,6) 4" 70,0 3,32 (t, 9,0) 70,1 3,29 (t, 8,9) 5" 76,6 3,18 (m) 76,5 3,39 (t, 9,0) 6" 61,3 3,71 (dd, 12,1-5,6) 61,4 3,67 (dd, 12,2-5,6) 3,86 (dd, 12,1-3,1) 3,86 (dd, 12,1-3,1) 5-OCH3 58,7 3,35 (s) 58,8 3,35 (s) 7-OCH3 55,2 3,87 (s) 55,2 3,87 (s) 3'-OCH3 55,6 3,77 (s) 55,5 3,77 (s) 5'-OCH3 55,6 3,77 (s) 55,5 3,77 (s)

II.1.3.2.3. Détermination structurale du composé xe3

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du composé xe3 montre un pic d’ion + pseudo-moléculaire [M+Na] à m/z 473,1059 correspondant à la formule brute C21H22O11.

Analyse du spectre de RMN 1H

Les signaux observés sur le spectre de RMN 1H (Figure II-128) peuvent être partagés en deux parties : une partie osidique représentée par l’anomère situé à 4,89 ppm (d, J= 7,4 Hz) et un massif de protons résonnant dans une zone entre [3,4-4 ppm], la deuxième partie est distinguée par un singulet intégrant pour 2H situé à 3,10 ppm et six protons aromatiques dont deux sous forme de doublets intégrant chacun pour 1H situés à 6,04 et 5,93 ppm (d, J= 1,6

174

Hz) et quatre sous forme de deux doublets intégrant chacun pour 2H résonnant à δH 7,01 (d,

J= 8,2 Hz) et δH 6,59 (d, J= 8,2 Hz).

Figure II-128 : Spectre de RMN 1H du composé xe3.

Analyse du spectre de RMN 13C

Le spectre de RMN 13C (Figure II-129) montre 19 signaux dont deux d’intensité plus importante à δC 114,4 et 131,1. Nous pouvons distinguer six carbones appartenant à la partie osidique, un carbone résonnant à 40,6 ppm, un carbone de carbonyle situé à 195,3 ppm et le reste sont des carbones aromatiques résonnant dans une zone entre [100-173 ppm].

Figure II-129 : Spectre de RMN 13C du composé xe3.

Les signaux observés sur les deux spectres de RMN 1H & 13C sont dédoublés indiquant la présence d’un centre asymétrique réversible et/ou d’un mélange racémique de deux isomères.

Analyse du spectre COSY

Les protons de la partie osidique sont attribués à partir de l’anomère H-1" (δH 4,89) grâce à l’analyse du spectre COSY et un système de sept spins est attribué. Les déplacements chimiques et les valeurs des constantes de couplage suggèrent un β-D-glucopyranose (Tableau II-21). 175

Les deux doublets d’intensité 2H à 7,01 et 6,59 corrèlent entre eux suggérant qu’ils appartiennent au même noyau aromatique. La constante de couplage J = 8,2 Hz indique une position ortho des 4 protons et une symétrie dans le noyau.

Les deux doublets d’intensité 1H à 5,93 et 6,04 ppm corrèlent entre eux et la constante de couplage J = 1,6 Hz indique une position méta des 2 protons dans le même noyau aromatique.

Analyse du spectre HSQC J-modulé

L’analyse du spectre HSQC J-modulé nous a permis d’attribuer les carbones suivants :

- à partir des protons osidiques, nous attribuons les carbones correspondants du β-D-

glucopyranose : C-1" (δC 100,3), C-2" (δC 72,7), C-3" (δC 76,0), C-4" (δC 69,8), C-5"

(δC 77,0) et C-6" (δC 60,9). - les carbones portants les protons aromatiques situés à 5,93 et 6,04 ppm, sont

respectivement à δC 92,1 (C-5) et δC 96,6 (C-7). - les doublets aromatiques situés à 7,01 et 6,59 ppm, donnent respectivement les

carbones à δC 155,9 (C-2' et C-6') et δC 114,4 (C-3' et C-5').

Les dernières attributions permettent de confirmer la présence d’une structure proche de celle d’un flavane avec deux noyaux aromatiques substitués A et C (Figure II-130) sauf que dans notre cas le cycle B subit un réarrangement car nous signalons la perte du carbone

CH2-3 du flavane et l’apparition d’un carbone méthylènique à 40,8 ppm (δH.3,10, s) et un carbone hémi-cétalique à 106,2 ppm.

OH 4' OH 4' C C O 1' HO 7 8 2 HO 6 8 O 1' OH A B A B 2 10 3 3 5 4 O OH O OH

Figure II-130 : Les structures du flavane (à gauche) et de l’aglycone du composé xe3 (à droite).

La structure de la partie aglycone proposée est celle de la maesopsine isolée pour la première fois de Maesopsis eminii (Rhamnaceae) [177] d’où son nom.

La structure reste à confirmer par les analyses des corrélations HMBC. 176

Analyse du spectre HMBC

Les corrélations HMBC observées sont attribuées comme suit (Figure II-131)

- les protons H-2' et H-6', en plus de leur corrélation mutuelle, corrèlent avec les carbones C-3' et C-5', un carbone aromatique oxygéné à 155,9 ppm attribuable au C- 4', le carbone hémi-cétal situé à 106,2 ppm attribuable au C-2 et le carbone méthylène

(δC 40,8) attribuable au C-10. - les deux protons H-3' et H-5' corrèlent avec les carbones C-2', C-6' et C-4' et un carbone quaternaire situé à 124,3 ppm attribuable au C-1' en plus de leur corrélation mutuelle.

- le proton H-5 (6,04 ppm, d, J= 1,6 Hz) corrèle avec le carbone C-7 (δC 92,1), le carbone situé à 195,3 ppm attribuable au carbonyle C-3 et trois carbones quaternaires résonnant à 101,9, 157,1 et 171,1 ppm. - le proton H-7 (5,93 ppm, d, J= 1,6 Hz) corrèle avec le carbone C-5, les carbones quaternaires situés à 101,9, 171,1 et 173,8 ppm.

En comparant les corrélations des protons H-5 et H-7 nous pouvons attribuer les carbones C-4, C-6, C-8 et C-9 au signaux situés respectivement à 157,1, 171,1, 173,8 et 101,9 ppm, comme le confirment les données dans la littérature [46].

- les protons Ha,b-10 (3,10 ppm, s) corrèlent avec les carbones déjà identifiés C-2 , C-3

(δC 195,3), C-1', C-2' et C-6'.

- le proton anomère (δH 4,88, d, J=7,4 Hz) corrèle avec les carbones C-3", C-5" et C-4, cette dernière corrélation indique la position de la glycosylation en C-4.

OH 4'

HO 8 O OH 1' 6 2 OH 9 10 5 4 3 O O HO O HO OH

Figure II-131 : Les corrélations HMBC du composé xe3.

177

L’analyse des données de RMN 1D & 2D couplées à celles du spectre de masse confirme l’identification du composé xe3 étant le 4-O-β-D-glucopyranosyl-maesopsine appelé hovertrichoside C (Figure II-131) isolé des écorces de Hovenia trichocarea (Rhamnaceae) [46].

Sur les spectres de RMN 1H et 13C nous signalons un dédoublement des signaux suggérant la présence des deux diastéréoisomères glycosylés xe3.I et xe3.II correspondants aux deux énantiomères de la maesopsine ayant un centre asymétrique en C-2.

Tableau II-23: les déplacements chimique en RMN 1H (500 MHz) et en RMN 13C (125 MHz) du composé xe3. xe3.I xe3.II Position δC (ppm) δH (m, J en Hz) δC (ppm) δH (m, J en Hz) 1 - - - - 2 106,2 - 106,2 - 3 195,3 - 195,2 - 4 157,1 - 156,9 - 5 96,6 6,04 (d, 1,6) 96,2 6,03 (d, 1,6) 6 171,1 - 171,1 - 7 92,1 5,93 (d, 1,6) 92,0 5,93 (d, 1,6) 8 173,2 - 173,2 - 9 101,9 - 101,7 - 10 40,8 3,10 (s) 40,6 3,10 (s) 1' 124,3 - 124,2 - 2', 6' 131,1 7,01 (d, 8,2) 131,1 7,01 (d, 8,2) 3', 5' 114,4 6,59 (d, 8,2) 114,4 6,57 (d, 8,2) 4' 155,9 - 155,9 - Glc en C-4 1" 100,3 4,88 (d, 7,4) 100,3 4,86 (d, 7,4) 2" 72,7 3,55 (t, 9,2) 72,7 3,52 (t, 9,2) 3" 76,0 3,48 (t, 8,8) 76,0 3,48 (t, 8,8) 4" 69,8 3,41 (t, 8,7) 69,8 3,41 (t, 8,7) 5" 77,0 3,43 (m) 77,0 3,43 (m) 6" 60,9 3,70 (dd, 12,2-4,8) 60,9 3,70 (dd, 12,2-4,8) 3,89 (dd, 12,4-3,4) 3,89 (dd, 12,4-3,4)

II.1.3.2.4. Détermination structurale du composé xe4

Ce composé a été facilement identifié comme étant l’uridine, en attribuant les signaux appartenant à une unité de ribose et un noyau de pyrimidine substitué (uracile). Une comparaison des déplacements chimiques obtenus avec ceux trouvés dans la littérature confirme cette structure (Tableau II-24, Figure II-132) [178].

178

Tableau II-24: les déplacements Chimique en RMN 1H (500 MHz) OH et en RMN 13C (125 MHz) du composé xe4. a

N b

d δC δH (m, J en Hz) c O a 164,8 - N i b 101,3 5,72 (d, 8,4) HOH2C O c 141,3 8,03 (d, 8,3) h e d 151,1 - e 89,3 5,92 (d, 4,9) g f f 74,3 4,20 (t, 5,24) HO OH g 69,9 4,17 (t, 4,9) h 84,8 4,02 (m) i 60,8 3,75 (dd, 12,2-3,0) Figure II-132 : Structure de xe4. 3,86 (dd, 12,2-2,5)

II.1.3.3. Identification des composés isolés de la fraction IV

Les différentes techniques séparatives de la fraction polaire des écorces d’Alphitonia xerocarpa ont permis d’isoler un flavonoïde et douze saponosides triterpéniques.

L’analyse des spectres de RMN ont permis d’identifier six composés que nous avions déjà isolés des feuilles de la même plante dont le rutoside (xf18) et les cinq saponines xf5, xf6, xf7, xf8 et xf9. Les structures des sept produits restants sont élucidées pour la première fois, dont six composés à squelette dérivé du dammarane (xe9, xe10, xe11, xe12, xe13 et xe14) et une saponine à acide céanothique glycosylée en C-28 (xe8).

II.1.3.3.1. Détermination structurale du composé xe8

Le spectre de masse HR-ESI-MS (mode positif) donne un pic pour l’ion + pseudomoléculaire [M+Na] à m/z 1157,5349 correspondant à la formule brute C54H86O25.

L’analyse des spectres de RMN 1H (Figure II-133), 13C (Figure II-134), COSY, HSQC HMBC et ROESY (Figure II-135) du composé xe8 montre presque les mêmes signaux que ceux identifiés pour le composé xf17 (Figure II-44), isolé des feuilles, à savoir un acide céanothique glycosylé en C-28 mais avec seulement 4 unités osidiques au lieu des 5 identifiées dans xf17 (Figure II-44). Les différentes corrélations observées sur les spectres de

RMN 2D montrent la disparition des signaux appartenant au β-D-glucopyranose terminal (Glc5) attaché en C-6" du glucose Glc2. Le blindage d’environ 8 ppm du carbone C-6" (Tableau II-25) par rapport à celui du xf17 confirme l’absence de substitution en C-6"du Glc2. 179

Les quatre autre unités osidiques sont identifiées comme étant des β-D-glucopyranoses reliés entre eux comme pour xf17 ce qui confirme que xe8 est le composé xf17 amputé d’un glucose.

Figure II-133 : Spectre de RMN 1H de xe8 (b,c) comparé à celui de xf17 (a).

Figure II-134 : Spectre de RMN 13C de xe8 (a) avec un agrandissement de la partie osidique (b).

Figure II-135 : Effets rOe des protons anomériques des sucres de xe8. 180

La structure finale du composé xe8 est ainsi déterminée comme étant l’acide 3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl-28-céanothique isolé pour la première fois (Figure II-136).

OH OH HO HO OH 3 Glc HO O 4 OH 1'''' Glc H O H OH H O 2'' 3'' OH 1''' 6'' O H OH H O 1'' H 2 O Glc 28 O H C 1' 2' H HOOC H O O HMBC H 1 OH Glc ROESY

HO OH H OH

Figure II-136: Structure du xe8.

Tableau II-25: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et 13C (125 MHz) de la partie osidique du composé xe8 dans le CD3OD.

δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) Glc1 en C-28 Glc3 en C-2''' 1' 92,0 5,62 (d, 7,9) 1"' 103,4 4,73 (d, 7,8) 2' 76,4 3,87 (t, 8,6) 2"' 74,5 3,24 (t, 8,4) 3' 77,0 3,80 (dd, 9,6-8,5) 3"' 76,1 3,40 (t, 8,0) 4' 69,3 3,43 (t, 9,6) 4"' 70,0 3,37 (m) 5' 77,4 3,43 (m) 5"' 76,9 3,36 (m) 6' 60,9 3,72 (dd, 12,3-4,7) 6"' 61,1 3,77 (dd, 12,0-4,1) 3,86 (dd, 12,3-1,7) 3,99 (dd, 12,1-1,7) Glc2 en C-2' Glc4 en C-3''' 1" 101,2 5,04 (d, 7,4) 1'''' 103,4 4,59 (d, 7,8) 2" 81,2 3,65 (t, 8,0) 2'''' 74,0 3,30 (t, 8,4) 3" 86,2 3,69 (t, 8,4) 3'''' 76,8 3,42 (m) 4" 69,7 3,30 (m) 4'''' 70,2 3,30 (t, 8,9) 5" 75,4 3,32 (m) 5'''' 76,8 3,38 (m) 6" 69,9 3,60 (dd, 11,6-6,5) 6'''' 61,2 3,65 (dd, 11,9-6,7) 3,93 (dd, 11,6-2,2) 3,92 (dd, 11,9-2,3)

181

II.1.3.3.2. Détermination structurale des composés xe9-xe14

L’analyse des données RMN montre que les six composés (xe9-xe14) partagent la même partie aglycone qui se montre très proche de la jujubogénine (génine I) des composés xf6-xf10, isolés des feuilles.

II.1.3.3.2.1. Détermination structurale du composé xe9

Le composé xe9 est un triterpène non glycosylé comme le confirme le déplacement chimique du carbone C-3 à 78,0 ppm. Ceci est confirmé par le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif qui présente un ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 477,3341 correspondant à la formule brute C30H46O3.

Sur le spectre de RMN 13C (Figure II-137) du composé xe9, nous dénombrons 30 carbones : 8 quaternaires, 7 méthyles, 6 méthines et 9 méthylènes. Nous pouvons identifier le

CH2-30 (δC 66,1 et δH 4,08), le CH-23 (δC 69,0 et δH 4,71), le CH-24 (δC 124,4 et δH 5,19) et le C-25 (δC 135,5) caractéristiques de la jujubogénine (Tableau II-26). Deux autres carbones oléfiniques sont apparus à 133,6 (C-17) et 124,1 (C-20) ppm que nous avons facilement localisés en ∆17(20), en prenant en compte l’absence des signaux dus à ces deux carbones à

54,4 et 69,4 ppm et l’action blindante exercée sur les carbones C-21 (δC 16,2) et C-22 (δC

35,6) localisés précédemment sur le spectre du jujubogénine à δC≈ 29,6 et à 45,4 ppm.

Figure II-137 : Spectr de RMN 13C du composé xe9

1 En RMN H (Figure II-138), les protons correspondants sont déblindés à δH 1,67 (H-

21) et δH 1,81 et 1,92 (Ha,b-22) confirmant la présence de la double liaison ∆17(20), vraisemblablement formée par perte d’une molécule d’eau à partir de l’hydroxyle en position 20 de la jujubogénine.

182

Figure II-138 : Spectr de RMN 1H du composé xe9.

2 2 3 Ceci est confirmé par l’observation des corrélations HMBC JH21-C20, JHb22-C20 JH21- 3 C17 et JHb15-C20 (Figure II-139).

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H H H H HO H 28 29 Figure II-139: Structure du xe9.

Le composé xe9 est donc identifié comme étant la 17-déhydro-20-déhydroxy- jujubogénine isolée pour la première fois à l’état non glycosylé, comme le confirme la comparaison des déplacements chimiques avec une saponine isolée de Bacopa monniera (Rhamnaceae) [179].

183

Tableau II-26: Déplacements chimiques en RMN-1H (500, 600 MHz) et 13C (125, 150 MHz) de la partie aglycone des composés xf6, xe9 et xe14 dans le CD3OD.

xf6 (jujubogénine) (500Mhz) xe9 (500Mhz) xe14 (600Mhz) Position δC δH (m, J en Hz) δC δH (m, J en Hz) δC δH (ppm, J en Hz) 1 40,0 0,98 (m) 38,3 0,99 (td, 13,2-3,9) 38,6 0,98 (td, 14,2-5,0) 1,71 (d, 11,2) 1,74 (ddd, 12,3-4,3-2,2) 1,71 (m) 2 27,3 1,71 (m) 26,6 1,60 (ddd, 11,6-6,3-3,7) 26,0 1,73(dl, 16,9-5,9) 1,84 (dd, 14,9-5,2) 1,64 (dd, 13,3-3,8) 1,87 (dd, 18,5-4,6) 3 89,6 3,15 (dd, 11,6-4,4) 78,0 3,15 (dd, 11,4-5,0) 88,2 3,14 (dd, 11,9-4,7) 4 40,5 _ 38,7 - 39,1 - 5 57,5 0,75 (dl, 11,1) 55,6 0,76 (dd, 11,3-2,4) 56,1 0,78 (dl, 11,2) 6 19,1 1,53 (d, 14,8) 17,8 1,55 (dd, 9,6-3,6) 17,7 1,53 (dl, 9,5) 1,59 (t, 10,5) 1,63 (m) 1,63 (dd, 13,5-8,2) 7 36,9 1,49 (d, 11,9) 34,9 1,52 (dd, 13,3-2,6) 34,9 1,52 (dd, 10,6-2,5) 1,56(d, 10,5) 1,62 (dd, 12,0-1,3) 1,63 (dd, 13,5-8,2) 8 38,5 - 36,7 - 36,7 - 9 54,1 0,90 (dd, 10,0-3,9) 52,4 0,92 (dd, 13,1-3,3) 52,5 0,91 (dd, 12,9-5,8) 10 38,3 _ 37,1 _ 36,8 - 11 22,5 1,51 (d, 12,8) 20,7 1,54 (dd, 16,7-3,8) 20,7 1,54 (dd, 11,4-2,5) 1,66 (dd, 12,8-2,4) 1,70 (m) 1,70 (dd, 9,4-1,5) 12 29,2 1,71 (m) 25,3 1,74 (dd, 13,2-2,1) 25,3 1,75 (dd, 8,0-6,3) 1,87 (dm, 12,8) 2,23 (ddd, 13,5-5,0-2,3) 2,21 (ddd, 16,1-9,6-4,6) 13 38,0 2,51 (m) 41,4 2,87 (dl, 11,7) 41,3 2,87 (d, 10,6) 14 54,6 - 53,5 - 53,4 - 15 37,1 1,20 (d, 8,6) 39,9 1,38 (d, 9,2) 39,9 1,38 (d, 9,2) 2,09 (dd, 8,5-1,6) 1,80 (d, 9,3) 1,80 (d, 9,2) 16 111,4 - 106,8 - 106,8 - 17 54,4 1,03 (dd, 7,2-1,4) 133,6 - 133,5 - 18 19,2 1,16 (s) 17,8 1,13 (s) 17,8 1,12 (s) 19 16,9 0,90 (s) 15,2 0,90 (s) 15,4 0,90 (s) 20 69,4 - 124,1 - 124,1 - 21 29,6 1,16 (s) 16,2 1,67 (s) 16,2 1,67 (s) 22 45,4 1,40 (dd, 13,8-11,1) 35,6 1,81 (dt, 18,6-3,4) 35,6 4,70 (dd, 20,4-10,1) 1,49 (d, 10,2) 1,92 (ddd, 11,2-3,6-1,2) 1,93 (ddd, 20,1-4,6-2,8) 23 69,7 4,70 (td, 9,8-2,0) 69,0 4,71 (ddd, 11,5-7,9-3,4) 69,0 4,70 (ddd, 15,8-8,1-3,5) - 24 126,3 5,18 (dt, 8,3-1,4) 124,4 5,19 (dt, 8,4-1,4) 124,4 5,20 (dt, 8,5-1,4) 25 136,7 - 135,5 - 136,5 - 26 25,8 1,74 (s) 24,4 1,76 (s) 24,4 1,76 (s) 27 18,4 1,71 (s) 17,0 1,72 (s) 17,0 1,72 (s) 28 28,5 0,88 (s) 27,2 0,99 (s) 27,0 1,05 (s) 29 17,1 1,03 (s) 14,7 0,80 (s) 15,7 0,89 (s) 30 66,9 3,97 (d, 7,4) 66,1 4,08 (sl) 66,1 4,08 (sl) 4,05 (d, 7,0) -

184

II.1.3.3.2.2. Détermination structurale des composés xe10-xe14 Les composés xe10-xe14 sont identifiés comme des glycosides de xe9 avec une partie osidique attachée en position 3, comme le montre le déblindage du carbone C-3 à 88,2 ppm (Tableau II-27).

L’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 771,4286 du composé xe10, obtenu en HR-

ESI-MS (mode positif), correspond à une formule brute C41H64O12, soit la présence de deux unités osidiques, un pentose et un hexose supplémentaires par rapport à xe9.

Les deux unités osidiques de xe10, un α-L-arabinopyranose et un β-D-glucopyranose ont été identifiées grâce à l’analyse conjointe des spectres RMN 1D (Figure II-140) & 2D.

L’enchaînement β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl est établi d’après les corrélations observées sur le spectre HMBC et est confirmé par les effets rOe.

Figure II-140 : Spectres de RMN 1H (a) et 13C (b) du composé xe10.

La saponine xe10 est identifiée comme étant le 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L- arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine (Figure II-141).

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H HO 1 H Glc1 Ara O O H HO 2''' 1' 1''' O O H HO 2' 3' OH OH 28 29

Figure II-141: Structure de xe10.

185

Les analyses des spectres de RMN 1D & 2D des composés xe11, xe12, xe13 et xe14 montrent qu’ils possèdent respectivement un sucre supplémentaire, deux sucres et trois sucres par rapport à xe10 et que la partie osidique se superpose parfaitement avec celles observées sur les spectres des composés xf5, xf7, xf8 et xf9 précédemment identifiés des feuilles et des écorces de cette plante.

La saponine xe11 est donc la 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-

(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine (Figure II-142). La structure de ce composé nouveau est confirmée par deux pics d’ion pseudo-moléculaires, observés sur le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif, [M+H]+ à m/z 895,5056 et + [M+Na] à m/z 917,5215, correspondant à la formule brute C47H74O16.

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H 1 H HO Glc1 Ara O O H HO 2''' 1' 1''' O O H HO 2' 3' OH O 28 29 Rha 1'' O HO HO OH

Figure II-142: Structure de xe11.

Le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif du composé xe12 présente un pic d’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 1079,5399 correspondant à la formule brute

C53H84O21 en accord avec la structure du 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20- déhydroxy-jujubogénine (Figure II-143) établie pour xe12.

186

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H 1 H HO Glc1 Ara O O H HO 2''' 1' 1''' O O H 6'''' HO 2' HO 3' O O O 28 29 Rha HO 1'' HO 1'''' O 2 Glc OH HO HO OH

Figure II-143: Structure de xe12.

Les deux composés xe13 et xe14 sont des isomères (Figure II-144) possédant le même ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ sur le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif à m/z 1211,5817 correspondant à la formule brute C58H92O25.

Figure II-144 : Spectres de RMN 1H des composés xe13 (a) et xe14 (b)

La saponine xe13 est identifiée comme la 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L- arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine, de structure nouvelle (Figure II- 145).

187

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H 1 H HO Glc1 Ara O Xyl O H HO 2''' 1' O 1''' O O H HO 1''''' 6'''' HO 2' O 3' HO O O O 28 29 OH Rha HO 1'' HO 1'''' O 2 Glc OH HO HO OH

Figure II-145: Structure de xe13.

Le composé xe14 est la 3-O-α-L-arabinospyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-

(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17- déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine (Figure II-146).

21 24 26

20 23 25 H H O 17 27 19 18 15 O 30 H OH H 1 H HO Glc1 Ara OH O Ara2 O H HO 2''' 1' O 1''' O O H 1''''' 6'''' HO 2' O 3' HO O O O 28 29 OH Rha HO 1'' HO 1'''' O 2 Glc OH HO HO OH

Figure II-146: Structure de xe14.

188

Tableau II-27: Déplacements chimiques en RMN 13C (125 ou 150 MHz) de la partie osidique des composés xe10-xe14 dans le CD3OD. xe10 xe11 xe12 xe13 xe14

(150 MHz) (125 MHz) (125 MHz) (150 MHz) (150 MHz) δC δC δC δC δC Ara1 en C-3 1' 105,7 106,8 104,6 104,7 104,7 2' 70,7 73,9 73,9 75,0 74,7 3' 82,4 80,9 81,7 80,9 81,0 4' 68,1 67,2 69,3 69,0 68,8 5' 65,2 63,3 65,1 64,7 64,7 Rha en C-2' 1" 100,6 99,8 100,8 100,6 2" 70,7 70,9 70,5 70,5 3" 70,7 70,8 70,8 70,8 4" 72,4 72,5 72,5 72,4 5" 68,9 68,7 68,7 68,7 6" 16,6 16,4 16,8 16,7 Glc1 en C-3' 1"' 104,0 102,9 104,4 101,6 101,6 2"' 76,5 73,7 76,5 80,2 80,1 3"' 76,3 70,7 74,4 76,9 76,9 4"' 69,8 69,8 69,4 69,8 69,7 5"' 73,9 70,7 77,2 76,6 76,6 6"' 61,0 61,0 60,8 61,1 61,1 Glc2 en C-2"' 1"" 102,0 102,7 102,6 2"" 82,4 73,8 73,8 3"" 76,8 76,7 76,7 4"" 69,7 69,6 69,9 5"" 76,6 75,8 75,9 6"" 61,1 68,1 68,1 R en C-6"" Xyl Ara2 1""' 104,3 104,1 2""' 73,3 71,0 3""' 76,1 72,6 4""' 69,8 68,2 5""' 65,6 65,5

189

1 Tableau II-28: Déplacements chimiques en RMN- H (500, 600 MHz) de la partie osidique des composés xe10-xe14 dans le CD3OD. xe10 (600 MHz) xe11 (500 MHz) xe12 (500 MHz) xe13 (600 MHz) xe14 (600 MHz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) δH (m, J en Hz) Ara1en C-3 1' 4,30 (d, 7,4) 4,52 (d, 7,7) 4,39 (d, 6,5) 4,40 (d, 6,5) 4,40 (d, 6,5) 2' 3,73 (dd, 9,4-7,4) 3,90 (dd, 8,5-7,5) 3,90 (dd, 8,9-6,5) 3,90 (dd, 9,2-6,5) 3,91 (dd, 8,7-6,5) 3' 3,66 (dd, 9,4-3,3) 3,88 (dd, 8,5-3,3) 3,88 (t, 9,1) 3,87 (t, 9,2) 3,87 (dd, 9,0-2,7) 4' 4,05 (m) 4,04 (m) 4,07 (m) 4,07 (m) 4,07 (m) 5' 3,57 (dd, 12,6-1,3) 3,52 (dd, 11,9-1,4) 3,57 (dd, 12,5-1,6) 3,55 (dd, 12,5-1,4) 3,55 (dd, 12,5-1,8) 3,87 (dd,12,5-2,5) 3,89 (dd, 11,9-2,5) 3,86 (dd, 12,5-2,6) 3,87 (dd, 12,5-3,0) 3,87 (dd, 12,5-3,0) Rha en C-2' 1" 5,24 (d, 1,5) 5,20 (d, 1,6) 5,27 (d, 1,4) 5,31 (d, 1,3) 2" 3,93 (dd, 3,3-1,7) 3,94 (dd, 3,3-1,7) 4,06 (m) 4,03 (dd, 3,2-1,7) 3" 3,73 (dd, 9,7-3,6) 3,72 (dd, 9,7-3,7) 3,73 (dd, 9,5-3,4) 3,74 (dd, 9,6-3,4) 4" 3,41 (t, 9,6) 3,44 (t, 9,8) 3,43 (t, 9,5) 3,44 (t, 9,6) 5" 3,88 (m) 3,37 (dq, 9,8-6,3) 3,97 (m) 3,97(dq, 9,6-6,3) 6" 1,24 (d, 6,2) 1,24 (d, 6,3) 1,25 (d, 6,2) 1,25 (d, 6,2) Glc1 en C-3' 1"' 4,57 (d, 7,7) 4,51 (d, 7,7) 4,66 (d, 7,3) 4,70 (d, 7,5) 4,70 (d, 7,5) 2"' 3,31 (m) 3,31 (dd, 8,9-7,6) 3,62 (dd, 9,1-7,2) 3,71 (t, 8,1) 3,71 (dd, 9,0-7,5) 3"' 3,40 (t, 8,9) 3,40 (t, 8,8) 3,61 (t, 9,1) 3,63 (dd, 9,0-8,1) 3,64 (t, 9,0) 4"' 3,36 (t, 8,9) 3,36 (t, 8,7) 3,39 (t, 9,0) 3,40 (t, 9,0) 3,40 (t, 9,6) 5"' 3,31 (m) 3,33 (d, 8,2) 3,32 (m) 3,34 (m) 3,34 (m) 6"' 3,86 (dd, 11,6-5,2) 3,70 (dd, 12,0-2,1) 3,68 (dd, 11,9-5,5) 3,69 (dd, 11,9-5,6) 3,69 (dd, 12,0-5,2) 3,70 (dd, 11,4-2,8) 3,86 (dd, 12,0-2,1) 3,88 (dd, 11,9-2,3) 3,86 (dd, 8,8-3,0) 3,86 (dd, 12,0-2,5) Glc2 en C-2''' 1"" 4,77 (d, 7,4) 4,89 (d, 7,3) 4,88 (d, 7,3) 2"" 3,39 (m) 3,43 (t, 8,9) 3,43 (t, 8,8) 3"" 3,39 (m) 3,38 (t, 9,0) 3,40 (t, 9,0) 4"" 3,39 (t, 8,6) 3,45 (t, 8,9) 3,42 (t, 9,2) 5"" 3,31 (m) 3,39 (m) 3,47 (m) 6"" 3,68 (dd, 11,9-5,5) 3,79 (dd, 11,4-4,6) 3,80 (dd, 11,4-5,6) 3,91 (dd, 12,0-2,6) 4,16 (dd, 11,4-1,5) 4,16 (dd, 11,4-2,4) R en C-6"" Xyl Ara2 1""' 4,34 (d, 7,5) 4,36 (d, 6,8) 2""' 3,31 (t, 8,6) 3,65 (dd, 9,1-6,9) 3""' 3,38 (t, 9,0) 3,61 (dd, 9,1-3,4) 4""' 3,52 (ddd, 10,6-9,0-5,4) 3,83 (td, 3,4-2,5) 5""' 3,25 (dd, 11,4-10,5) 3,61 (dd, 11,4-3,4) 3,90 (dd, 11,4-5,4) 3,90 (dd, 11,3-2,5)

190

II.1.3.4. Conclusion sur l’étude phytochimique des écorces

La purification des extraits chloroformique et hydro-méthanolique des écorces d'Alphitonia xerocarpa, a été affinée par l’identification et la détermination structurale de 22 composés isolés dont 13 produits nouveaux.

L’extrait chloroformique a conduit à l’isolement de l’acide céanothique xb1 comme produit majoritaire et deux nouvelles structures dérivées de la famille du lupane, les acides 2α/β-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique xb2 et xe1.

De l’extrait hydro-alcoolique, nous avons isolé 19 composés dont un lignane glycosylé xe2 ((±) 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol), un dérivé des aurones xe3 (4-O-β-D- glucopyranosyl-maesopsine), un nucléoside xe4 (uridine), trois phénols glycosylés xe5-7, un flavonoïde, la rutine xf18 déjà isolée des feuilles de la même espèce et 12 saponosides dont une saponine à jujubogénine sulfatée xf6 déjà isolée des feuilles de Ziziphus lotus [142], et onze structures nouvelles. Parmi ces composés nous identifions une saponine à acide céanothique xe8, les quatre saponines à jujubogénine xf5, xf7-xf9 identifiées également à partir des feuilles, ainsi que la 17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine xe9 et ses cinq glycosides xe10-xe14.

Le composé xe8 a le même enchaînement osidique que celui de xf17 avec un sucre de moins, les parties osidiques des saponines ayant la 17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine comme aglycone se superposent parfaitement avec celles des saponines à jujubogénine.

191

II.2. Etude Phytochimique des fruits d’Alphitonia neocaledonica : II.2.1. Chimie extractive:

Une extraction préliminaire a été effectuée sur 20 g des fruits secs réduits en poudre pulvérisée. Deux percolations successives à froid ont été effectuées à l’aide de l’éther de pétrole et de l’acétate d’éthyle, puis le marc récupéré a été extrait à reflux pendant 3h avec le mélange CH3OH:H2O (80:20). Après avoir évaporé les solvants, les différents extraits ont été analysés par CCM et par CLHP à polarité de phases inversée (pour les extraits hydro- alcooliques).

L’extrait éther de pétrole au profil riche en acides gras n’a pas été étudié, alors que l’analyse de l’extrait acétate d’éthyle montre la présence des composés terpéniques. L’extrait hydro-alcoolique présente une fraction très polaire avec une teneur dominante des composés phénoliques révélés par la vanilline sulfurique avec une coloration rougeâtre. (Figure II-147). Compte tenu de la quantité abondante des tanins dans cet extrait et afin de faciliter les travaux de purification, nous avons cherché à réaliser un fractionnement primaire en essayant différents supports séparatifs comme la résine HP20 et le gel de sephadex; malheureusement les deux essais ont échoués à cause de la mauvaise séparation de la résine HP20 et le piégeage de l’extrait sur le gel de sephadex. Seule une extraction liquide-liquide, effectuée à l’aide du butanol, semble être bénéfique pour éliminer une masse importante des tanins polymérisés présents.

Dans le but de s’affranchir des problèmes des supports solides les travaux de séparation de cet extrait ont été effectués en exploitant des techniques de séparation liquide- liquide sans support solide : l’Extraction et la Chromatographie de Partage Centrifuges. Ces travaux ont été réalisés avec l’aide du Pr. Jean-Hugues RENAULT, du Dr. Jane HUBERT et du Dr. Abdulmagid ALABDUL MAGID.

L’Extracteur de Partage Centrifuge (EPC) est une technologie récente, développée au sein de notre laboratoire depuis 3 ans et qui présente des potentialités académiques et industrielles intéressantes. Dans notre cas, le fractionnement de l’extrait butanolique effectué

192

par EPC avait pour but l’élimination des tanins présents en grande quantité et l’enrichissement en composés d’intérêt des fractions obtenues.

La Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) a été ensuite mise en œuvre pour purifier les produits phénoliques. Elle s’est avérée plus performante que la CLHP à polarité de phases inversée en permettant notamment un gain de sélectivité pour la classe des composés polyphénoliques (Figure II-150).

Les tableaux V-2 et V-3 (page 262) et les figures V-1 et V-2 (page 261-262) présentent les caractéristiques des 2 appareillages utilisés pour ce travail.

Les fruits secs broyés (475 g) ont été extraits par lixiviation à froid à l’aide du mélange

MeOH:H2O (80:20). Après avoir évaporé le méthanol et avoir concentré l’extrait dans 1 l d’eau, nous avons procédé à une extraction liquide-liquide effectuée à l’aide de trois solvants de polarité croissante : cyclohexane, acétate d’éthyle et butanol pour donner les fractions correspondantes après évaporation.

La phase aqueuse restante, qui représente 75,7 % en masse de l’extrait hydro- alcoolique, montre un profil riche en tanins polymérisés non exploitables.

La fraction acétate d’éthyle (1,9 % de l’extrait hydro-alcoolique) a été purifiée grâce à des chromatographies répétitives réalisées sur un gel de silice en phase normale pour donner trois composés, nfr1 et xb3, comme produits majoritaires et nfr2 (Schéma II-6). Le produit nfr3 quant à lui est issu d’une purification par CLHP sur gel de silice greffée C18 d’une sous-fraction polaire de cet extrait.

La fraction butanolique (22% de l’extrait hydro- alcoolique), comme le montre son profil en CCM (Figure II-147), présente trois zones de produits ayant des polarités différentes.

Le fractionnement de cette dernière, dont les composés couvrent une large gamme de polarité et riche en tanins, a été réalisé par extraction de partage Figure II-147 : Profil CCM de la fraction butanolique (à droite). 193

centrifuge (EPC) en mettant en œuvre un protocole original d’élutions séquentielles utilisant un système de solvant quaternaire tri-phasique afin d’une part de gérer la large gamme de polarité et d’autre part de "piéger" les tanins dans la phase aqueuse.

Des essais préliminaires de modification de pH n’ayant pas montré de modification de comportement des composés, le choix du mode élution s’est trouvé conforté comparativement au mode déplacement.

Le système de solvants tri-phasique choisi est un système historiquement utilisé pour le fractionnement de milieux fermentaires dans une démarche de screening d’agents antibiotiques potentiels. Ce système quaternaire est composé de n-heptane/ méthyle tert- butyle éther (MtBE)/acétonitrile/eau (1:1:1:1, v/v) [180]. Généralement, les composés les plus polaires se partagent préférentiellement dans la phase inférieure aqueuse, les moins polaires dans la phase supérieure riche en heptane et MtBE, le reste des métabolites se solubilisant dans la phase intermédiaire riche en acétonitrile. Néanmoins, lors des essais préliminaires de partage en pilulier, il est apparut que ce système de solvant tri-phasique ne permettait pas de suffisamment "piéger" les tanins dans la phase aqueuse, une partie non négligeable d’entre eux se partageant dans la phase intermédiaire, trop polaire. Le système a donc été modifié selon la séquence suivante (Figure II-148) :

- Le mélange n-heptane/MtBE/CH3CN/eau (1/1/1/1, v/v) est préparé (agitation, puis décantation), - La phase supérieure est séparée des 2 autres et gardée, - Les phases inférieure et intermédiaire sont contactées avec un volume de MtBE, agitées puis décantées.

Figure II-148 : Etapes de préparations du système tri-phasique. 194

L’intérêt de cette dernière étape était d’une part de diminuer la polarité de la phase intermédiaire et d’autre part d’augmenter le volume de cette phase avec laquelle l’élution principale sera effectuée. Néanmoins, la phase supérieure n’est alors plus en équilibre thermodynamique avec les 2 autres. Il convient de vérifier que les compositions des phases supérieure et inférieure sont compatibles avec une utilisation conjointe en EPC. La composition de chacune des phases, avant et après ajout de MtBE a été déterminée par RMN 1H (Tableau II-29).

Tableau II-29 : Compostions des différentes phases du système tri-phasique avant et après l’ajout d’un volume de MtBE Système initial (% v) Après l’ajout d’un volume de MtBE (% v) solvant ϕ sup ϕ inter.I ϕ inf.I ϕ inter.II ϕ inf.II n-heptane 52,3 5,3 0 5,8 0,3 MtBE 37,9 29,9 5,8 63,2 5,8 CH3CN 9,9 54,0 30,9 26,3 18,7 H2O 0,02 11,5 63,3 4,7 75,2

La caractérisation des phases montre une diminution de la polarité de la phase intermédiaire déduite par la diminution du pourcentage de l’acétonitrile, 26,3 % comparé à celui obtenu pour le système initiale 54,0%, l’inverse est observé pour le MtBE qui présente 63,2 % dans la même phase par rapport à 29,9 % dans le système de départ. En revanche les modifications apportées sur la composition de la phase inférieure semblent être moins importantes distinguées par une augmentation de la polarité avec 75,2 % d’eau, ce qui assure une bonne rétention des tanins.

Le fait que l’élution primaire se fasse par la phase supérieure, il était d’une importance cruciale de vérifier les compositions de cette phase avec celle de la phase inférieure (phase stationnaire) après les avoir remises en contact, aucune modification significative n’a pas été remarquée (Tableau II-30).

Tableau II-30 : Compostions des phases inférieure et supérieure du système tri-phasique avant et après équilibration. Avant la 2ème équilibration Après la 2ème équilibration solvant ϕ sup ϕ inf.II ϕ sup ϕ inf.II n-heptane 52,3 0,3 53,2 0 MtBE 37,9 5,8 39,8 2,4 CH3CN 9,9 18,7 6,4 21,4 H2O 0,02 75,2 0,5 76,2

La phase aqueuse du système a été utilisée comme phase stationnaire tout au long du protocole. Les 2 élutions successives, respectivement par les phases supérieure et intermédiaire sont donc réalisées en mode ascendant. La première élution, utilisant la phase

195

supérieure, permet l’obtention des composés triterpéniques apolaires. La seconde, mettant en œuvre la phase intermédiaire riche en acétonitrile, permet quant à elle l’élution de composés poly-phénoliques de polarité intermédiaire.

Ainsi trois lots de fractions (I, II et III) ont été obtenus dont la composition se répartit comme suit : (Figure II-149) - des triterpènes dans le premier lot I (élution par la phase supérieure) ayant le même profil CCM que ceux obtenus à l’acétate d’éthyle, avec un rendement de 15,1%* par rapport à la fraction butanolique. - des composés phénoliques moyennement polaires dans le deuxième lot II (5,6 %)* (élution par la phase intermédiaire). - des composés très polaires non exploitables dans le dernier lot III qui représente 61,7%* de la fraction butanolique. Cette dernière est obtenue en appliquant un dual- mode (inversion conjointe des phases stationnaire et mobile ainsi que du mode de pompage). * : Les pourcentages sont calculés à partir d’un fractionnement mené sur 1 g de la fraction butanolique brute.

CHCl3: CH3OH 95:5 Toluène: Acétone: Ac. Formique 6:6:1

I II III

Figure II-149 : Analyses CCM du fractionnement d’un gramme de N.Fr.But effectué par EPC.

Les sous-fractions fr3-fr6 ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée, en utilisant une élution par gradient (CH3CN/H2O). Au cours de cette purification cinq flavonoïdes nf4-nr8 ont été purifiés, tandis que les composés phénoliques sont obtenus en mélange (Figure II-150-a).

Issues d’un deuxième fractionnement par EPC, deux autres sous-fractions (fr3 et fr4) ont subi une purification par CPC réalisée en utilisant un système bi-phasique (n- heptane/AcOEt/MeOH/H2O 1:9:1:9). Pour cette purification la phase aqueuse a été utilisée

196

comme phase stationnaire et l’élution en mode ascendant a été réalisée pendant 3h, puis un dual-mode a été effectué et nous avons continué l’élution en mode descendant pendant 50 minutes. Les sous-fractions [186-192] obtenues de cette dernière séparation (Figure II-150-b), ont été éluées à travers une colonne C18 en CLHP semi-préparative à l’aide d’une élution en gradient pour donner nfr9 et nfr5.

Figure II-150 : Analyse CCM des fractions obtenues par CLHP semi-préparative (a) et par CPC (b).

Fruits d'A. neocaledonica séchés et pulvérisés

Lixiviation

CH3OH:H2 O 80:20 A.N.Fr.M

Extraction liquide-liquide

A.N.Fr.Cyhex A.N.Fr.AcOEt A.N.Fr.But A.N.Fr.Aq CC, EPC SiO2 8-9 xb3 42-44 57-56 I II III CC, CC-CPP CLHP SiO2 C18 SiO2 II-1 II-2 nfr1 nfr2 nfr3 II-2-a II-2-b II-2-d CPC II-2-c CLHP CLHP CLHP CLHP C C18 C C II-1-a nfr6 18 18 18 nfr4 nfr5 nfr8 CLHP, nfr6 C 18 nfr6 nfr7 nfr9

Schéma II-6: Schéma d’extraction et de purification des composés des fruits d’Alphitonia neocaledonica.

197

L'analyse des spectres de RMN 1D & 2D et de masse réalisés sur les produits purs nous a permis d’identifier trois triterpènes, deux dérivés du lupéol (nfr1 et xb3) et un de l’ursane (nfr2), six flavonoïdes (nfr3-nfr8) et un dérivé de la catéchine (nfr9). Les flavonoïdes nfr3, nfr4 et nfr6 sont des glycosides de la génine isorhamnétine; les deux flavonoïdes nfr5 et nfr7 ont la quercétine comme génine, tandis que le nfr8 est un flavonoïde à tamarixétine.

II.2.2. Identification des composés isolés de l’extrait acétate d’éthyle

La structure de l’acide alphitolique a été déterminée pour le composé xb3, comme lors de l’étude phytochimique des branches d’Alphitonia xerocarpa.

II.2.2.1. Détermination structurale du composé nfr1

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- moléculaire [M+Na]+ à m/z 479,3508, soit une masse molaire de 456,3 correspondant à la formule brute C30H48O3.

Analyse du spectre de RMN 1H

Une grande similitude est observée par comparaison des spectres de RMN 1H de xb3 et de nfr1 (Figure II-151), sur lesquels nous distinguons six singulets d’intensité 3H et deux protons éthyléniques situés à 4,56 et 4,69 ppm (d, 2,3 Hz). Néanmoins nous remarquons l’absence des signaux situés à δH 3,59 et 2,89 identifiés respectivement comme étant les protons H-2 et H-3 du composé xb3 et l’apparition d’un signal sous forme d’un triplet à 3,13 ppm (J= 8,2 Hz) pour nfr1.

198

Figure II-151 : Spectres de RMN 1H des composés xb3 (a) et nfr1 (b).

Analyse du spectre de RMN 13C

La superposition des spectres de RMN 13C des deux composés montre la perte de deux signaux identifiés sur le spectre de xb3 comme étant les carbones C-2 (δC 68,7) et C-3 (δC 83,2) et l’apparition de deux signaux à 26,9 et 78,8 ppm sur celui de nfr1. Ces constatations suggèrent une modification au niveau du cycle A.

L’analyse des spectres de RMN 2D permettent d’attribuer les carbones et les protons des cycles B, C, D, E tout comme pour le composé xb3 sans modification significative (Tableau II-31). Nous allons discuter seulement les corrélations du cycle A.

Analyse des spectres de RMN 2D

Sur le spectre COSY, une corrélation intense est repérée entre le proton situé à 3,13 ppm (H-3) et le signal situé à 1,55 ppm, ce dernier présentant deux autres corrélations à 0,87 et 1,63 ppm. Ces données suggèrent l’absence d’hydroxyle en position C-2 de la génine.

Les résultats de l’analyse du spectre HSQC J-modulé confirment les constatations faites ci-dessus et nous permettent les attributions suivantes :

- à partir du proton situé à 3,13 ppm nous localisons le carbone oxygéné le portant à 78,8 ppm. - les deux protons situés à 0,87 et 1,63 ppm sont géminés et portés par le carbone résonnant à 38,7 ppm. 199

- les deux protons géminés superposés à 1,55 ppm sont portés par un carbone situé à 26,9 ppm.

Sur le spectre HMBC, le proton H-3 résonnant à 3,13 ppm donne quatre corrélations avec le carbone situé à 26,9 ppm, et les carbones identifiés C-4 (δC 38,7), C-23 (δC 27,8) et C-

24 (δC 15,3), et inversement son carbone (δC 78,8) corrèle avec les protons des CH-5, CH3-23 et CH3-24 en plus des protons non identifiés à 1,55 et 1,63 ppm (Figure II-152).

En analysant ces données avec celles obtenues de l’analyse des spectres COSY et

HSQC J-modulé, nous pouvons attribuer les CH2-2 et CH2-1 respectivement aux signaux situés à 26,9 et 38,7 ppm, comme le confirment les corrélations observées entre Ha,b-1/C-2,

Hb-1/C-5, Ha,b-1/C-9, Hb-1/C-10 et Hb-1/C-25.

1 2

3 HMBC HO COSY

Figure II- 152 : Corrélations COSY et HMBC du cycle A de nfr1.

Les données spectrales établies et celles trouvées dans la littérature nous ont permis d’identifier le composé nfr1 comme étant l’acide bétulinique (Figure II-153), isolé précédemment des fruits [181], des écorces et racines de Ziziphus jujuba [128], des racines de Colubrina greggii [56] et de Gouania ulmifolia [53].

H H

COOH 1 28

2 H H

Figure II-153 : Structure de l’acide bétulinique (nfr1).

200

II.2.2.2. Détermination structurale du composé nfr2

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- moléculaire [M+Na]+ à m/z 495,3450, soit une masse molaire de 472,3 correspondant à la formule brute C30H48O4.

Analyse du spectre de RMN 1H

Nous remarquons pour le composé nfr2 l’absence du groupement isopropényl caractéristique du noyau lupane. Cependant nous distinguons les signaux suivants :

- sept signaux d’intensité 3H résonnant dans un domaine entre [0,8-1,1] ppm, attribuables aux sept méthyles, dont deux sous forme de doublet et cinq sous forme de singulet. - deux signaux dans la zone des protons portés par des carbones oxygénés, dont un sous forme d’un doublet situé à 2,94 ppm (J= 9,9 Hz) et un deuxième à 3,62 ppm (td, J= 10,0-4,6 Hz). - un proton éthylénique à 5,20 (t, J= 3,6 Hz).

Analyse du spectre de RMN 13C

Sur le spectre de RMN 13C nous distinguons deux carbones oxygénés résonnant à 68,4 et 83,3 ppm, deux carbones éthyléniques situés à 124,0 et 139,6 ppm et un carbone de carbonyle situé à 184,8 ppm.

En examinant les spectres de RMN 1D nous pouvons distinguer un triterpène ayant une structure pentacyclique de type oléanane ou ursane caractérisés par la double liaison et les sept méthyles mais le faite d’avoir deux méthyles sous forme de doublet nous suggère l’ursane comme squelette de base (Figure I-25).

Une analogie entre les composés nfr2 et xb3 au niveau de l’enchaînement des cycles A-B est déduite par les déplacements chimiques des carbones et protons des cycles A et B et leurs corrélations attribuées sur les spectres COSY, HSQC et HMBC. Nous pouvons à ce stade proposer la structure partielle de 2-hydroxyl-α-amyrine. (Figure II-154)

201

25 26 28 1 HO

3 27 HO

23 24

Figure II-154 : Structure du 2-hydroxyl-α-amyrine

Les corrélations observées sur les spectres de RMN 2D seront illustrées à partir du CH-

9 (δC 47,7, δH 1,57) attribué grâce à deux corrélations HMBC avec les protons des méthyles

CH3-25 et CH3-26.

Analyse du spectre COSY

Les corrélations COSY (Figure II-155) sont attribuées comme suit :

- le proton H-9 situé à δH 1,57 (t, J= 8,9 Hz) montre deux corrélations avec les protons à

1,57 et 1,93 ppm attribuables aux protons CH2-11, eux mêmes corrélant avec le proton situé à 5,20 ppm identifié comme CH-12, ce qui permet de localiser la double liaison en C-12. 4 - au niveau du proton H-12 une troisième corrélation JH-H est localisée au niveau du signal situé à 2,24 ppm attribuable au CH-18 (d, J=11,3Hz). 3 - le proton H-18 montre deux autres corrélations dont une JH-H à 1,31 ppm attribué au proton H-19 et la deuxième au niveau du signal non identifié résonnant à 1,62 ppm. - le proton H-19 présente une corrélation d’intensité 3H au niveau du méthyle situé à

0,85 ppm (d, 6,5) attribué au CH3-29.

- le dernier méthyle situé à 0,93 ppm (attribuable au CH3-30) couple avec un signal résonnant à 0,99 ppm attribuable au CH-20, lui même corrélant avec deux protons

géminés résonnant à 1,30 et 1,42 ppm attribués aux protons CH2-21.

- les deux protons géminés CH2-21 couplent entre eux, en plus de leur corrélation intense avec un signal situé à 1,64 ppm identifié par le spectre HSQC comme les deux

protons géminés CH2-22.

202

Analyse du spectre HSQC

L’analyse des corrélations observées sur le spectre HSQC nous a permis d’attribuer les carbones à partir des protons correspondant identifiés grâce à l’analyse du spectre COSY. Leurs déplacements chimiques listés dans le tableau II-31 seront utiles pour continuer l’attribution des corrélations HMBC.

Analyse du spectre HMBC

Nous citons les corrélations HMBC les plus importantes (Figure II-155):

- au niveau de proton H-12 quatre corrélations sont observées dont trois avec des

carbones identifiés C-9, C-11 (δC 23,2) et C-18 (δC 53,7), et la dernière avec un carbone quaternaire situé à 42,2 ppm attribué au C-14.

- le carbone C-14 corrèle également avec les protons de deux méthyles CH3-26 et CH3- 27 situés respectivement à 0,88 et 1,08 ppm. - le proton H-18 présente sept corrélations dont quatre avec des carbones identifiés C-

12, C-13 (δC 139,6), C-14 et C-19 (δC 39,4), deux avec deux quaternaires situés à 48,7 et 184,8 ppm attribuables respectivement à C-17 et C-28, ainsi la fonction acide et

localisée en C-28; la dernière corrélation est avec un carbone méthylénique situé à δC

24,7 attribuable à CH2-16.

- les protons du méthyle CH3-29 corrèlent avec les carbones C-18, C-19 et C-20 (δC 39,2).

- de même pour ceux du méthyle CH3-30, ils corrèlent avec les carbones C-19, C-20 et

C-21 (δC 31,1).

19 12 18

26 13 COOH 28 9 15 HMBC

27 COSY

Figure II-155 : Prinicpales corrélations COSY & HMBC des cycles C-D-E de nfr2.

203

Le spectre HSQC nous a permis d’identifier les deux protons géminés restants au CH2-

15 (δC 28,2, δH 1,02 et 2,01).

L’ensemble de nos données spectrales de RMN et de masse comparées avec celles trouvées dans la littérature nous a permis d’identifier le composé nfr2 (Figure II-156) comme étant l’acide corosolique (2α-,3β-dihyroxyurs-12-ène-28-oique) isolé précédemment des feuilles d’Ugni molinae (Myretaceae) [103] et des fruits de Ziziphus jujuba (Rhamnaceae) [131].

COOH 1 HO 28 2

Figure II-156 : Structure de l’acide corosolique (nfr2).

204

Tableau II-31: Déplacements chimiques en RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) de nfr1 et nfr2. nfr1 nfr2

Position δC δH (ppm, J en Hz) Position δC δH (ppm, J en Hz) 1 38,7 0,87 (ddd, 12,7-6,7-5,1) 1 46,7 0,92 (d, 12,1) 1,63 (dd, 12,4-3,4) 1,97 (dd, 12,0-4,6) 2 26,9 1,55 (m) 2 68,4 3,62 (td, 10,8-5,6) 1,55 (m) 3 78,8 3,13 (t, 8,2) 3 83,3 2,94 (d, 9,8) 4 38,7 - 4 39,2 - 5 55,3 0,65 (dd, 10,7-1,9) 5 55,3 0,83 (dl, 11,5) 6 18,2 1,35 (m) 6 18,3 1,39 (m) 1,47 (m) 1,52(m) 7 34,3 1,33 (td, 8,2-4,7) 7 33,1 1,36 (dd, 13,2-4,6) 2,29 (t, 8,0) 1,52(m) 8 40,6 - 8 39,6 - 9 50,5 1,25 (dd, 11,1-2,9) 9 47,7 1,57 (t, 8,9) 10 37,1 - 10 38,0 - 11 20,8 1,21 (td, 11,5-5,3) 11 23,2 1,57 (m) 1,39 (m) 1,93 (m) 12 25,5 0,98 (td, 12,8-6,4) 12 124,0 5,20 (t, 3,6) 1,66 (ddd, 13,1-6,5-4,1) 13 38,3 2,21 (td, 12,5-3,1) 13 139,6 - 14 42,4 - 14 42,2 - 15 29,6 1,14 (dt, 13,3-3,0) 15 28,2 1,02 (m) 1,47 (td, 13,4-3,5) 2,01 (td, 12,8-4,9) 16 32,2 1,36 (td, 13,1-3,5) 16 24,7 1,60 (td, 11,9-2,7) 2,21 (dt, 12,8-3,1) 1,90 (dd, 12,0-3,7) 17 56,2 - 17 48,7 _ 18 49,2 1,55 (t, 11,0) 18 53,7 2,24 (d, 11,3) 19 47,0 2,97 (td, 10,8-4,6) 19 39,4 1,31 (m) 20 150,7 - 20 39,2 0,99 (m) 21 30,5 1,35 (m) 21 31,1 1,30 (m) 1,93 (td, 9,7-4,5) 1,42 (dt, 12,3-4,3) 22 37,1 1,39 (dd, 9,5-4,5) 22 37,4 1,64 (m) 1,89 (t, 9,4) 1,64 (m) 23 27,8 0,92 (s) 23 28,3 1,02 (s) 24 15,3 0,71 (s) 24 16,5 0,88 (s) 25 16,0 0,79 (s) 25 16,2 1,00 (s) 26 15,8 0,91 (s) 26 17,1 0,88 (s) 27 14,6 0,94 (s) 27 23,2 1,08 (s) 28 179,2 - 28 184,8 - 29 109,4 4,56 (d, 2,5) 29 16,9 0,85 (d, 6,5) 4,69 (d, 2,1) 30 19,2 1,65 (s) 30 20,94 0,93 (d, 6,4)

205

II.2.2.3. Détermination structurale du compose nfr3

Sur le spectre de masse HR-ESI-MS nous visualisons un pic d’ion pseudo-moléculaire [M+H]+ à m/z 677,1477 soit une masse molaire de 654,2 correspondant à la formule brute de

C32H30O15.

Analyse du spectre de RMN 1H

Nous repérons les signaux caractéristiques d’un flavonoïde glycosylé sur le spectre de RMN 1H, sur lequel nous distinguons une unité aromatique en plus des signaux attribuables au flavonoïde. La présence de la partie osidique est déduite par le proton anomérique situé à 5,37 ppm et le massif des protons osidiques intégrant pour 6 H résonnant dans un domaine entre [3,3-4,4 ppm]. Deux méthoxyles sont détectés à 3,94 et 3,92 ppm.

Analyse du spectre de RMN 13C

Sur le spectre de RMN 13C nous distinguons les deux carbones des méthoxyles situés à 55,0 et 55,3 ppm, cinq carbones hydroxylés résonnant entre [62-77 ppm] appartenant au sucre en plus d’un carbone anomérique situé à 102,3 ppm. Le reste des carbones sont détectés dans une zone comprise entre [93-178 ppm].

Analyse du spectre COSY

Nous avons identifié la partie osidique en analysant les corrélations observées sur le spectre COSY. A partir du doublet anomérique (δH 5,37, J=7,6 Hz) six protons sont attribués dont les déplacements chimiques et les constantes de couplage élevées (Tableau II-32) sont caractéristiques d’un β-D-glucopyranose.

L’analyse des corrélations COSY et des constantes de couplage calculées pour les protons aromatiques nous a amené à identifier deux systèmes ABX, le premier est constitué des protons situés à δH 6,87 (d, J= 8,4 Hz), δH 7,57 (dd, J= 8,4-1,8 Hz) et δH 7,88 (d, J= 1,7 Hz), ces valeurs de constantes de couplage sont caractéristiques d’un noyau aromatique 1,3,4 trisubstitué. De même les trois protons résonnant à δH 6,82 (d, J= 8,2 Hz), δH 6,93 (dd, J= 8,2-

1,7 Hz) et δH 7,08 (d, J= 1,8 Hz) appartiennent à autre cycle aromatique trisubstiué.

Les deux doublets ayant chacun une constante de couplage (J= 15,8 Hz) détectés à 7,39 et 6,12 ppm corrèlent entre eux.

206

Analyse du spectre HSQC

A partir des protons caractéristiques nous attribuons les carbones correspondant grâce à l’analyse des corrélations observées sur le spectre HSQC. L’examen des déplacements chimiques des carbones et protons (Tableau II-32) suggèrent une substitution par un acide organique en position C-6'' Glc (δH-6"a 4,34 et δH-6"b 4,29) à confirmer par l’analyse des corrélations HMBC.

Analyse du spectre HMBC

L’analyse des corrélations HMBC nous a permis d’identifier la génine isorhamnétine caractérisée par une substitution O-méthyl sur le cycle B en position C-3' (δC 146,9).

Les corrélations HMBC des protons restants confirment la présence d’un deuxième noyau aromatique 1''',3''',4''' trisubstitué, sur lequel nous localisons la position du méthoxyle

(δH 3,92) en 3''' par la corrélation C-3'''/3'''-OCH3. Ceci est confirmé par une corrélation observée sur le spectre ROESY entre les protons du méthoxyle en position 3''' et le proton H-

2'" (δH 7,88, d, J= 2,0 Hz).

Les deux protons oléfiniques situés à 6,12 et 7,39 ppm présentent une corrélation avec le carbonyle résonnant à 167,3 ppm et indiquent la présence d’un cétone α,β- insaturée.

Les corrélations HMBC H-8'"/C-1''', H-7'"-/C-2''', H-7'"/C-6''', en plus de l’effet rOe observé entre les protons du méthoxyle 3'''-OCH3 (δH 3,92) et le proton H-2''' (δH 7,08), nous ont permis d’identifier l’acide férulique.

Le point d’attache de la partie osidique a été mis en évidence par une corrélation entre

H-1'' Glc et le carbone C-3 (δC 133,7), les corrélations entre les deux protons géminés Ha,b-6" Glc et le carbonyle de l’acide confirment l’acylation en C-6" Glc suggérée par le déblindage de ces protons (δHa-6" 4,34 et δHb-6" 4,29).

Les analyses combinées de RMN et de masse permettent d’identifier la structure finale du composé nfr3 (Figure II-157) comme étant le 3-O-[6"-E-féruloyl]-β-D-glucopyranosyl- isorhamnétine, isolé précédemment de Sarcopyramis bodinieri (Melastomataceae) [182].

207

OCH3

1' HO O

HO Glc OH OH O 1'' O OH O 6''

9''' O HO 1''' 7''' O H3CO

Figure II-157 : Structure de nfr3.

Tableau II-32 : Déplacements chimiques en RMN 1H(600 MHz) et RMN 13C (150

MHz) de nfr3 (CD3OD).

Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Glc en C-3 2 157,5 - 1" 102,3 5,37 (d, 7,6) 3 133,7 - 2" 76,6 3,50 (t, 8,3) 4 178,0 - 3" 74,5 3,49 (t, 8,4) 5 161,6 - 4" 70,5 3,36 (t, 8,0) 6 98,5 6,13 (d, 1,9) 5" 74,5 3,52 (m) 7 164,5 - 6" 62,7 4,34 (dd, 11,8-6,5) 8 93,3 6,30 (d, 1,9) 4,29 (dd, 11,7-2,2) 9 157,0 - 10 104,2 - 1"' 126,2 - - 2"' 110,1 7,08 (d, 2,0) 1' 121,6 - 3"' 147,9 - 2' 112,9 7,88 (d, 1,7) 4"' 149,2 - 3' 146,9 - 5"' 115,4 6,82 (d, 8,1) 4' 149,5 - 6"' 122,8 6,93 (dd, 8,2-1,7) 5' 114,6 6,87 (d, 8,4) 7"' 145,5 7,39 (d, 15,8) 6' 122,5 7,57 (dd, 8,4-1,8) 8"' 113,5 6,12 (d, 15,8)

3'-OCH3 55,3 3,94 (s) 9"' 167,3 -

3"'-OCH3 55,0 3,92 (s)

208

II.2.3. Identification des composés isolés de la fraction butanolique des fruits d’A. neocaledonica

Les différentes techniques chromatographiques de CLHP et de CPC nous ont permis d’isoler un dérivé de la catéchine et cinq flavonoïdes glycosylés en C-3.

L’analyse combinée de spectres de RMN 1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC et ROESY nous a conduits à répertorier les flavonoïdes en deux groupes selon le type de la génine comme suit :

deux flavonoïdes à isorhamnétine : avec un seul sucre pour le composé nfr4, deux dans le cas de nfr6. deux flavonoïdes à quercétine : nfr5 et nfr7 avec une unité osidique pour le premier nfr5 et deux enchaînées pour le nfr7. un flavonoïde à tamarixétine (4'-O-méthyl-quercétine) : le composé nfr8 glycosylé en C-3 par une partie osidique renferment trois sucres dont un substitué par un acide aromatique.

La quercétine a été identifiée lors de l’élucidation structurale détaillée du composé xf19, de même pour le squelette isorhamnétine que nous venons de développer pour le composé nfr3.

II.2.3.1. Détermination structurale du composé nfr4

La mesure de l’absorbance en spectroscopie UV a été effectuée dans le but de caractériser le squelette de la génine du composé nfr4.

Le spectre enregistré dans le MeOH montre deux bandes maximales à 356 et 254 nm (Figure II-158-a) caractéristiques respectivement des bandes I et II d’un flavonol substitué en C-3.

L’addition de NaOH induit un déplacement bathochromique de 56 de la bande I avec augmentation de l’intensité lumineuse significative (Figure II-158-b) indiquant la présence d’un OH libre en position 4'. Un épaulement apparaît à 330 nm attestant la présence d’un OH libre en position 7.

209

L’ajout de NaOAc provoque un déplacement bathochrome de la bande II de 18 nm (Figure II-158-c) par rapport au spectre enregistré dans le MeOH, confirmant ainsi la présence d’un OH libre en position 7.

Deux autres spectres sont enregistrés à partir d’une solution du composé nfr4 dans le MeOH contenant du chlorure d’aluminium, avant est après l’ajout d’acide chlorhydrique (Figure II- 158-d). Sur les deux spectres nous remarquons un déplacement bathochromique de 14 nm de la bande II par rapport à celui enregistré dans le MeOH indiquant la présence d’un groupement OH libre en position 5. En revanche l’absence du déplacement hypsochrome significatif de la bande I signifie l’absence de système ortho dihydroxylé du cycle B, responsable du déplacement hypsochromique provoqué par l’ajout de l’HCl.

Les données spectrales ne donnent pas assez d’information sur l’état de substitution du cycle B et la structure finale sera élucidée par l’analyse des spectres de RMN et de masse.

Figure II-158 : Les spectres UV du composé nfr4 enregistrés en présence de différents réactifs. (c) MeOH +NaOAc Tableau II-33 : Les données spectrales UV du composé nfr4. λmax +NaOAc+H3BO3 Solvants-réactifs Bande I (cycle B) Bande II (cycle A) Autres bandes MeOH 356 254 NaOH 412 270 330 AlCl3 398 268 AlCl3+HCl 398 268 NaOAc 364 272 NaOAc+H3BO3 358 254 210

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- moléculaire [M+Na]+ à m/z 501,1008 correspondant à la formule brute C22H22O12.

Sur le spectre de RMN 1H, nous distinguons deux groupes de protons dont un renferme sept protons appartenant à un sucre et le reste sont attribuables à un flavonoïde substitué par un méthoxyle (δH 3,99, s).

Le spectre de RMN 13C montre également un profil d’un flavonoïde monoglycosylé.

L’analyse des spectres de RMN 2D couplée à celui de masse nous a conduits à attribuer les carbones et protons du composé nfr4 (Tableau II-34). La génine a été identifiée comme étant l’isorhamnétine comme pour le composé nfr3, caractérisée par deux doublets fins (d, J= 2,0 Hz) H-6 et H-8, un système ABX constitué des protons H-2', H-5', H-6' et le singulet du méthoxyle résonnant à (δH 3,99, δC 55,5).

La substitution du carbone C-3' par un méthoxyle est confirmée par une corrélation observée sur le spectre NOESY entre les protons du méthoxyle et le proton H-2' (δH 8,06, d, J= 2,0 Hz).

La partie osidique est facilement identifiée comme étant un β-D-galactopyranose grâce à l’analyse des corrélations COSY et des valeurs de constante de couplage calculées à partir du spectre de proton (Tableau II-34). Une corrélation HMBC observée au niveau de carbone

C-3 de la génine avec le proton anomérique (δH 5,36) indique la position de glucosylation en C-3.

L’ensemble des analyses spectrales UV, RMN et masse confirment la structure finale du composé nfr4 comme le 3-O-β-D-galactopyranosyl-isorhamnétine (Figure II-159), isolé de Lysimachia fortunei (Primulaceae) [183], d’Amblyolepis setigera [184], et d’Artemisia capillaris [185] (Asteraceae).

OCH3

1' HO O

HO Gal OH O 1'' O OH O HO OH

Figure II-159 : Structure du composé nfr4. 211

Tableau II-34 : Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé nfr4. Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) 2 157,3 - 3'-OCH3 55,5 3,98 (s) 3 134,0 - Gal en C-3 4 178,2 - 1" 103,0 5,36 (d, 7,8) 5 161,7 - 2" 71,8 3,84 (dd, 9,7-7,8) 6 98,5 6,24 (d, 1,7) 3" 73,6 3,59 (dd, 9,7-3,5) 7 164,6 - 4" 68,6 3,86 (dd, 3,4-0,7) 8 93,3 6,44 (d, 1,7) 5" 75,9 3,50 (dd, 6,0-1,1) 9 157,1 - 6" 60,8 3,60 (dd, 11,2-3,5) 10 104,4 - 3,68 (dd, 11,3-5,9) - 1' 121,6 - 2' 113,1 8,06 (d, 2,0) 3' 147,0 - 4' 149,4 - 5' 114,5 6,93 (d, 8,4) 6' 122,2 7,61 (dd, 8,4-2,1)

II.2.3.2. Détermination structurale du composé nfr6

La formule brute C28H32O16 a été déduite par la présence d’un pic d’ion pseudo- moléculaire [M+Na]+ détecté sur le spectre de masse HR-ESI-MS en mode positif, à m/z 647,1575, soit une masse molaire de 624,5 uma. En faisant la soustraction de la masse molaire du nfr4, nous obtenons 146 uma correspondant à une unité osidique en plus.

En comparant les spectres de RMN 1H de nfr4 et nfr6, nous retrouvons les signaux de nfr4 auxquels s’ajoutent les protons d’un deuxième sucre caractérisé par un proton anomérique situé à 4,55 ppm (sl) et un doublet intégrant pour 3H situé à 1,20 ppm (d, J= 6,2 Hz). Les déplacements chimiques et les constantes de couplages (Tableau II-35) nous permettent d’identifier un α-L-rhamnopyranose.

L’analyse des spectres de RMN 1D et 2D confirme la présence d’un squelette d’isorhamnétine glycosylé en position 3 par un chaîne osidique renferment les deux sucres β-

D-galactopyranose et α-L-rhamnopyranose. L’enchaînement des sucre est mis en évidence par les corrélations HMBC observées entre H-6"/C-1'" et inversement H-1'"/C-6".

L’ensemble des données spectrale de RMN, UV et de masse nous a permis d’identifier le composé nfr6 (Figure II-160) comme étant le 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D- galactopyranosyl]-isorhamnétine, déjà isolé et identifié de Gomphrena martiana

212

Amaranthaceae) [186], de Lysimachia fortunei [183] et de Genista pichisermolliana (Fabaceae) [187].

OCH3

1' HO O

HO Gal OH O 1'' O OH O 6'' OH O Rha 1''' O HO HO OH Figure II-160 : Structure du composé nfr6.

Tableau II-35 : Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé nfr6.

Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Gal en C-3 2 157,4 - 1" 103,6 5,24 (d, 7,9) 3 134,1 - 2" 71,7 3,84 (dd, 9,4-8,0) 4 178,0 - 3" 73,6 3,59 (dd, 9,5-3,4) 5 161,6 - 4" 68,6 3,81 (dl, 3,3) 6 98,6 6,22 (d, 2,0) 5" 74,1 3,68 (t, 6,2) 7 164,9 - 6" 66,0 3,48 (dd, 10,3-6,3) 8 93,5 6,41 (d, 2,0) 3,77 (dd, 10,2-6,0) 9 157,1 - Rha en C-6" 10 104,2 - 1"' 100,5 4,55 (sl) - 2"' 70,7 3,61 (dd, 2,9-1,5) 1' 121,6 - 3"' 70,9 3,52 (dd, 9,4-3,6) 2' 113,2 8,04 (d, 1,9) 4"' 72,4 3,30 (t, 9,5) 3' 147,0 - 5"' 68,3 3,56 (dq, 9,5-6,2) 4' 149,5 - 6"' 16,6 1,20 (d, 6,2) 5' 114,6 6,92 (d, 8,4) 6' 122,4 7,61 (dd, 8,5-1,9) 3'-OCH3 55,5 3,99 (s)

II.2.3.3. Détermination structurale du composé nfr5

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 487,0848 correspondant à la formule brute en C21H20O12.

Le spectre de RMN 1H présente les cinq protons caractéristiques de la quercétine (Tableau II-36) auxquels s’ajoutent sept protons appartenant à une unité osidique dont l’anomère est détecté à 5,16 ppm (d, J=7,8 Hz). Sur le spectre de RMN 13C nous pouvons dénombrer 15 carbones appartenant à la génine et six à la partie osidique dont nous distinguons le carbone anomérique à 104,0 ppm. 213

L’analyse des corrélations COSY des protons osidiques nous a conduits à l’identification d’un système à sept spins. Les constantes de couplage calculées (Tableau II- 36) sur le spectre de proton laissent supposer qu’il s’agit d’un galactose caractérisé par la position équatoriale du proton H-4" (δH 68,6, dl, J= 2,9 Hz), tandis que le reste des protons sont en position trans-diaxiale. L’analyse du spectre HSQC nous ont permis d’attribuer les carbones correspondant à ces protons. (Tableau II-36)

La corrélation HMBC observée entre H-1"/C-3 indique le point d’attache du sucre en C-3. L’analyse du reste des corrélations confirment la structure finale du composé nfr5 comme étant le 3-O-β-D-galactopyranosyl-quercétine, précédement isolé des fruits de cranberry Vaccinium macrocarpon (Ericaceae) [188] et d’Amblyolepis setigera (Asteraceae) [184].

1' HO O

HO Gal OH O 1'' O OH O OH HO

Figure II-161 : Structure du composé nfr5.

Tableau II-36 : Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé nfr5.

Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) 2 157,5 - Gal en C-3 3 134,4 - 1" 104,0 5,16 (d, 7,8) 4 178,2 - 2" 71,7 3,84 (dd, 9,3-7,7) 5 161,6 - 3" 73,7 3,59 (dd, 9,0-2,8) 6 98,5 6,24 (d, 1,7) 4" 68,6 3,88 (dl, 2,9) 7 164,7 - 5" 75,8 3,50 (dd, 6,1) 8 93,3 6,44 (d, 1,7) 6" 60,5 3,58 (dd, 11,4-6,3) 9 157,1 - 3,67 (dd, 11,3-5,9) 10 104,2 - 1' 121,5 - 2' 116,4 7,86 (d, 1,9) 3' 144,4 - 4' 148,6 - 5' 114,7 6,89 (d, 8,5) 6' 121,6 7,61 (dd, 8,4-1,9)

214

II.2.3.4. Détermination structurale du composé nfr7

Le spectre de masse HR-ESI-MS effectué en mode positif montre un pic d’ion pseudo- + moléculaire [M+Na] à m/z 633,1442 correspondant à la formule brute C27H30O16.

L’analyse des spectres de RMN 1D & 2D nous ont permis d’attribuer sans difficulté les carbones et les protons du composé nfr7 correspondant au squelette quercétine glycosylée en position 3 par une chaine osidique comprenant deux sucres le α-L-rhamnopyranose et β-D- glucopyranose (Tableau II-37). L’enchaînement de deux unités osidiques (1"' Glc→2" Rha) est mis évidence par les corrélations HMBC H-2"/C-1"' et H-1"'/C-2".

Le composé nfr7 est identifié comme étant le 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L- rhamnopyranosyl-quercétine, isolé précédemment des feuilles de Ginkgo biloba (Ginkgoaceae) [189] [190] et de Saururus chinensis (Saururaceae) [191].

1' HO O

O OH O Rha 1'' O HO HO HO 2'' OH O 1''' OH O Glc OH Figure II-162 : Structure du composé nfr7.

Tableau II-37: Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et en RMN 13C (150 MHz) du composé nfr7. Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Rha en C-3 2 157,8 - 1" 101,2 5,67 (d, 0,9) 3 135,1 - 2" 81,4 4,29 (dd, 3,3-1,1) 4 178,2 - 3" 70,4 3,87 (dd, 10,2-3,5) 5 161,7 - 4" 72,1 3,35 (t, 10,1) 6 98,8 6,22 (d, 2,0) 5" 70,6 3,62 (dq, 9,9-6,2) 7 165,5 - 6" 16,2 1,00 (d, 6,2) 8 93,6 6,39 (d, 2,0) 9 157,2 - Glc en C-2" 10 104,2 - 1"' 105,8 4,40 (d, 7,8) - 2"' 73,9 3,25 (t, 8,2) 1' 121,5 - 3"' 76,4 3,37 (t, 9,1) 2' 115,5 7,38 (d, 2,0) 4"' 68,6 3,36 (t, 9,0) 3' 145,1 - 5"' 76,4 3,18 (m) 4' 148,6 - 6"' 60,8 3,67 (dd, 12,3-3,0) 5' 115,1 6,95 (d, 8,4) 3,69 (dd, 12,5-5,3) 6' 121,4 7,34 (dd, 8,5-2,1) 215

II.2.3.5. Détermination structurale du composé nfr8

La formule brute C42H46O23 a été déduite par l’analyse de spectre de masse HR-ESI- MS en mode positif qui montre un pic d’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 941,2324 soit une masse molaire de 918,2 uma.

Sur le spectre de RMN 1H (Figure II-163) nous retrouvons des signaux proches de ceux de l’isorhamnétine à savoir un méthoxyle (δH 3,79), un singulet intégrant pour 2H à 6,14 ppm en plus de trois protons ayant un profil d’un système ABX : H-2' (δH 7,36, d, J= 2,2 Hz),

H-5' (δH 6,92, d, J= 8,4 Hz) et H-6' (δH 7,27, dd, J= 8,4-2,2 Hz).

La partie osidique est mise en évidence par la présence de trois protons anomériques détectés à 4,72 (d, 2,0 Hz), 4,53 (d, 8,1 Hz) et 4,50 ppm (d, 7,7 Hz) et un massif des protons résonnant entre [3,2-4,5 ppm].

Sur le même spectre nous signalons la présence d’un deuxième système ABX H-2"'''

(δH 6,93, d, J= 1,9 Hz), H-5"''' (δH 6,69, d, J= 8,2 Hz) et H-6"''' (δH 7,87, dd, J= 8,4-2,2 Hz) indiquant la présence d’un deuxième noyau aromatique trisubstitué, ces derniers signaux avec les deux doublets oléfiniques (d, J=15,9 Hz) situés à 7,45 et 6,13 ppm suggèrent une substitution par un acide organique dérivé de l’acide cinnamique.

Figure II-163 : Spectre de RMN 1H de nfr8 (b) avec un agrandissement des parites osidique et aromatique (a). 216

L’analyse du spectre de RMN 13C (Figure II-164) nous a permis de distinguer les signaux appartenant au flavonoïde et à trois sucres présentés par trois carbones anomériques et un massif des carbones résonnant dans la zone des carbones oxygénés.

Figure II-164 : Spectre de RMN 13C de nfr8 (b) avec un agrandissement (a).

La génine a été identifiée comme la tamarixétine (4'-O-methyl-quercétine) glycosylée en position 3 par le rhamnose (H-1"/C-3) grâce à l’analyse des corrélations HMBC, ainsi de celles observées sur le spectre NOESY qui nous ont permis de localiser le méthoxyle en C-4' en montrant une corrélation entre les protons du méthoxyle (δH 3,79) et le proton H-5' (δH 6,92, d, J=8,4 Hz).

L’analyse des corrélations sur le spectre COSY combinée avec l’analyse des constantes de couplage calculées à partir du spectre de RMN 1H et l’attribution des carbones à partir du spectre HSQC J-modulé nous a conduits à l’identification des trois sucres α-L- rhamnopyranose, β-D-glucopyranose et α-L-arabinopyranose (Tableau II-38). L’enchaînement des trois sucres Xyl-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha, a été établie à partir des corrélations HMBC observées entre H-1"' Glc/C-2'' Rha et H-1"" Xyl/C-2"' Glc et inversement H-2" Rha/C-1"' Glc et H-2'" Glc/C-1"" Xyl. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par l’analyse du spectre NOESY qui montre les corrélations entre H-2" Rha/H-1"' Glc et H-2'" Glc/H-1"" Xyl.

Les deux protons oléfiniques situés à 6,13 et 7,45 ppm corrèlent en HMBC avec le carbonyle résonnant à 167,4 ppm indiquant la présence d’une cétone α,β- insaturée. Ce

217

carbonyle montre deux corrélations HMBC avec les deux protons géminés Ha,b-6"' Glc indiquant la position de l’estérification en C-6"' Glc.

Les données obtenus par l’analyse des corrélations COSY, HSQC et HMBC des signaux restants et la comparaison avec des données retrouvées dans la littérature [192] nous ont permis d’identifier l’acide organique estérifiant le sucre comme étant l’acide caféique.

L’ensemble des analyses spectrales de RMN 1D & 2D et de masse nous ont amené à identifier le composé nfr8 (Figure II-165) comme étant le 3-O-(6-E-caféoyl)-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-] α-L-rhamnopyranosyl-tamarixétine isolé pour la première fois.

OCH3

1' HO O

O Xyl OH OH O Rha 1'''' 1'' OH O OH HO O O HO 2'' 2''' OH 1''' OH O O Glc 6'''

O 1''''' 9''''' HO 7''''' O HO

Figure II-165 : Structure du composé nfr8.

218

Tableau II-38 : Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé nfr8. Position δC δH (m, J= Hz) Position δC δH (m, J= Hz) - Glc en C-2" 2 156,7 - 1"' 104,0 4,53 (d, 8,1) 3 135,2 - 2"' 83,7 3,42 (t, 8,1) 4 178,0 - 3"' 76,0 3,62 (t, 9,2) 5 161,6 - 4"' 70,2 3,38 (t, 9,5) 6 98,9 6,14 (sl) 5"' 73,9 3,47 (ddd, 9,7-6,2-2,6) 7 165,9 - 6"' 62,7 4,16 (dd, 11,9-6,0) 8 93,7 6,14 (sl) 4,53 (dd, 11,7-2,9) 9 157,0 - 10 104,1 - Xyl en C-2"' - 1"' 106,2 4,50 (d, 7,7) 1' 121,5 - 2"' 74,5 3,28 (dd, 9,7-7,6) 2' 115,5 7,36 (d, 2,2) 3"' 76,4 3,31 (t, 9,9) 3' 148,6 - 4"' 69,4 3,47 (dd, 10,1-5,4) 4' 145,0 - 5"' 65,7 3,25 (ddd, 11,2-10,0-5,3) 5' 115,0 6,92 (d, 8,4) 3,99 (dd, 11,4-5,3) 6' 121,4 7,27 (dd, 8,4-2,2) E-caféoyl en C-6"' 3'-OCH3 54,8 3,79 (s) 1"''' 126,0 - 2"''' 109,8 6,93 (d, 1,9) Rha en C-3 3"''' 149,1 - 1" 98,9 4,72 (d, 2,0) 4"''' 147,8 - 2" 82,6 4,43 (dd, 2,7-1,9) 5"''' 114,8 6,69 (d, 8,2) 3" 70,6 3,78 (dd, 10,8-2,8) 6"''' 122,7 6,87 (dd, 8,3-1,9) 4" 72,8 3,28 (t, 9,4) 7"''' 145,5 7,45 (d, 15,9) 5" 70,4 3,73 (dq, 9,6-6,2) 8"''' 113,7 6,13 (d, 15,9) 6" 16,3 1,09 (d, 6,2) 9"''' 167,4 -

II.2.3.6. Détermination structurale du composé nfr9

La formule brute C15H14O7 a été déduite par l’analyse de spectre de masse ESI-MS en mode positif qui montre un pic d’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z 329,1 soit une masse molaire de 306,1 uma.

Sur le spectre de RMN 1H nous distinguons un singulet intégrant pour 2H à 6,42 ppm, deux doublets (d, J= 2,3 Hz) résonnant à 5,94 et 5,88 ppm, un doublet à 4,54 ppm (d, J= 7,7 Hz), un proton situé à 3,98 ppm et deux doublets de doublets situés à 2,83 et 2,52 ppm.

Le spectre de RMN 13C du composé nfr9 peut être divisé en trois régions :

- de 130 à 157 ppm, nous dénombrons six signaux dont un intégrant pour deux carbones, soit sept carbones quaternaires. - de 94 à 106 ppm, quatre signaux dont un intégrant pour 2C à 105,76 ppm. - dans la troisième région deux carbones oxygénés sont détectés à 81,5 et 67,5 ppm et un carbone comparativement blindé à 26,7 ppm. 219

Sur le spectre COSY, les deux protons géminés à 2,83 ppm (dd, J= 16,0-5,3 Hz) et 2,52 ppm (dd, J= 16,0-7,5 Hz) sont facilement repérés par une corrélation intense ; en plus de leur corrélation mutuelle ils corrèlent avec le proton situé à 3,98 ppm (ddd, J= 7,7-7,5-5,3 Hz). Ce dernier corrèle avec le doublet situé à 4,54 ppm, lui même présentant une corrélation moins intense avec le singulet situé à 6,42 ppm.

L’enchaînement trouvé par l’analyse du spectre COSY et les observations sur les spectres de RMN-1D 1H et 13C suggère la présence d’un noyau flavane dont les carbones ont été attribués par analyse de spectre HSQC J-modulé à partir des protons correspondants (Tableau II-34).

L’analyse du spectre HMBC a conduit à l’identification d’un dérivé de la catéchine, le 5'-hydroxy-catéchine appelé gallocatéchine (Figure II-166). Cette structure est confirmée par les corrélations HMBC entre les deux protons géminés Ha,b-4 et les carbones C-2 (δC 81,5), C-

3 (δC 67,4), C-6 (δC 94,8), C-9 (δC 156,2) et C-10 (δC 99,3). Le proton H-3 (δH 3,98) qui présente quatre corrélations avec les carbones C-1' (δC 130,1), C-2 (δC 81,5), C-4 (δC 26,7) et

C-10 (δC 99,3).

La configuration de la gallocatéchine est proposée du faite d’avoir les deux protons H-

2 et H-3 en position trans déduite par la valeur de constante de couplage JH-2/H-3= 7,2 Hz, ainsi que par l’absence d’effet NOe entre les deux protons.

Une comparaison avec les donnés spectrales retrouvées dans la littérature confirme la structure de la gallocatéchine pour le composé nfr9 [193].

3' OH

HO 8 1 1' O OH 2

6 3 4 OH OH

Figure II-166 : Structure du composé nfr9.

220

Tableau II-39 : Déplacements chimiques en RMN 1H (600 MHz) et RMN 13C (150 MHz) du composé nfr9.

Position δC (ppm) δH (m, J= Hz) Position δC (ppm) δH (m, J= Hz) - - 2 81,5 4,55 (d, 7,2) 1' 130,1 - 3 67,4 3,98 (ddd, 7,8-7,2-5,3) 2' 105,8 6,42 (s) 4 26,7 2,83 (dd, 16,1-5,3) 3' 145,5 - 2,52 (dd, 16,1-7,8) 4' 132,6 - 5 156,2 - 5' 145,5 - 6 94,8 5,94 (d, 2,3) 6' 105,8 6,42 (s) 7 156,4 - 8 94,1 5,88 (d, 2,3) 9 155,4 - 10 99,3 - II.2.4. Conclusion sur l’étude phytochimique des fruits La fraction acétate d’éthyle des fruits d’A. neocaledonica a été purifiée en exploitant les techniques chromatographiques classiques pour donner trois triterpènes dont deux produits majoritaires dérivés du lupéol: l’acide bétulinique nfr1 et l’acide alphitolique xb3 et un troisième dérivé de l’ursane, l’acide corosolique nfr2, en plus d’un flavonoïdes nfr3 (3-O-

[6"-E-féruloyl]-β-D-glucopyranosyl-isorhamnétine) isolé précédemment de Sarcopyramis bodinieri (Melastomataceae) [182].

Les trois triterpènes ont déjà été isolés de plusieurs espèces de Rhamnaceae et ont fait l’objet de nombreuses études biologiques. Ainsi il a été démontré des propriétés antiproliférative [194] [101] et antibactérienne [105] [106] de l’acide bétulinique et de l’acide corosolique, mais une activité inférieure pour l’acide alphitolique [100] [195]. D’autres propriétés biologiques seront détaillées dans le chapitre IV.

La purification de la fraction butanolique au profil riche en tanins polymérisés, a exigé l’exploitation d’une nouvelle méthodologie : un fractionnement par l’Extracteur de Partage Centrifuge (EPC) suivit d’une purification des fractions par Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC) pour obtenir les composés nfr6 et nfr8 (gallocatéchine) ou par CLHP sur silice greffée C-18 pour isoler les cinq flavonoïdes nfr4-nfr8.

Malgré le grand écart entre les deux méthodologies CPC et CLHP en termes de plateaux théoriques, la CPC permet un gain de sélectivité pour la classe des composés polyphénoliques (dérivés de la catéchine), tandis que la CLHP s’est avérée plus efficace pour la purification des flavonoïdes, d’ou l’intérêt d’alterner, parfois, les techniques de purification.

221

Tous les produits isolés ont des structures déjà décrites dans la littérature sauf celle de nfr8 (3-O-(6-E-caféoyl)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-] α-L- rhamnopyranosyl-tamarixétine).

222

II.3. Hydrolyse des extraits

Après avoir réalisé l’hydrolyse acide des extraits (A.X.F.AcOEt, A.X.F.M, A.X.E.M et A.N.Fr.M), avec une solution de TFA 2N à reflux, l’hydrolysat a été extrait par l’acétate d’éthyle pour éliminer les parties aglycones et la phase aqueuse renfermant les sucres libres a été neutralisée par du KOH 50 mM. Après évaporation, le mélange est analysé par CCM avec des témoins de monosaccharides, dans le solvant MeCOEt-isoPrOH-Me2CO-H2O (20:10:7:6), cette analyse montre une présence dominante de glucose dans tous les hydrolysats.

Dans un premier temps chaque extrait de sucres subit une séparation par CLHP semi- préparative sur une colonne ROA en éluant les sucres avec une solution aqueuse d’acide sulfurique à 2,5 mM, en mode isocratique.

Les différentes fractions obtenues ont été neutralisées par KOH 50 mM en faisant un suivit au pH-mètre, puis la solution a été mise à sec pour donner un mélange des sucres avec les sulfates de potassium formés K2SO4. Les sucres ont été récupérés avec de la pyridine et le mélange filtré puis évaporé pour obtenir les sucres purifiés.

La dernière étape consiste à identifier les sucres par chromatographie chirale analytique sur une colonne chiralpak® IC éluée en mode isocratique avec le mélange n- Hexane/EtOH/TFA: 80/20/0,1. Le suivi des analyses chromatographiques est effectué à l’aide d’un détecteur à indice de réfraction IR-410 et l’identification des sucres est effectuée en comparant les temps de rétention des sucres obtenus avec ceux des témoins (Tableau II-40).

Tableau II-40 : Temps de rétention des sucres identifiés dans les différents extraits

Sucre tr (min) remarques D-glucose (α & β) 18,3–23,2 bon rapport signal sur bruit Faible rapport signal sur bruit faute de mauvaise D-galactose (α & β) 24,8-26,8 solubilité dans le mélange de l’injectât L-rhamnose (α & β)* 11,7 bon rapport signal sur bruit L-arabinose (α & β) 14,6-15,5 bon rapport signal sur bruit D-xylose (α & β) 16,6-18,5 bon rapport signal sur bruit

*N’ayant pas de témoin de D-rhamnose commercialisé, nous avons effectué une mesure [α]D de ce sucre afin de confirmer la présence de L-rhamnose dans nos échantillons. La valeur obtenue est égale à + 11,1° correspondant au pouvoir rotatoire du L-rhamnose.

Ainsi cinq sucres ont été identifiés dans les extraits hydrolysés (Tableau II-41), il s’agit du D-glucose, du D-galactose, du L-rhamnose du, L-arabinose et du D-xylose.

223

Bien que le D-galactose ait été identifié dans certaines structures isolées à partir des fruits d’A. neocaledonica, nous n’avons pas réussit à mettre en évidence sa présence dans l’hydrolysat de cet extrait, ce qui peut être justifié par la faible quantité ou/et la mauvaise solubilisation dans le mélange utilisé pour préparer l’injectât (n-C6H14/EtOH/TFA 70:30:1). Tableau II-41 : Les différents sucres mis en évidence dans les différents extraits

Extrait D-glucose D-galactose L-rhamnose L-arabinose D-xylose A.X.F.AcOEt + + + + A.X.F.M + + + + + A.X.E.M + + + + + A.N.Fr.M + + +

224

III. Evaluations des activités biologiques

225

226

Nous avons pu observer une importante biodiversité moléculaire lors de l’étude phytochimique des trois espèces d’Alphitonia, ce qui implique la mise en œuvre d’une recherche des activités biologiques et biochimiques des métabolites isolés.

Guidées par les utilisations en médecine traditionnelle et/ou par les profils phytochimiques des plantes, de nombreuses études ont montré des propriétés biologiques variées pour les métabolites secondaires isolés.

Nous citerons les activités biologiques les plus importantes mentionnées dans la littérature pour les différentes classes de molécules auxquelles appartiennent les composés isolés pendant nos travaux, puis nous présenterons nos résultats obtenus suite aux tests effectués sur les produits isolés.

III.1.Travaux antérieurs

III.1.1. Activité antioxydante et anti-tyrosinase

Les antioxydants et les inhibiteurs de tyrosinases occupent une zone d’exploitation assez importante dans les domaines de l’industrie agroalimentaire, de la cosmétologie et de la pharmacologie.

Les radicaux libres sont impliqués dans plusieurs pathologies comme étant la cause ou/et la conséquence. Ils sont produits par des voies enzymatiques ou non-enzymatiques et au sein de cellules saines, des mécanismes sont naturellement fonctionnels afin de contrôler la réactivité de ces dérivés. Dans le moindre déséquilibre, ces dérivés attaqueront des molécules, cellules ou/et tissus et par conséquence, ils vont être à l’origine de nombreux phénomènes physiopathologiques ou maladies telles que inflammations (arthrites et rhumatoïdes), maladies cutanées et immunologiques, cataracte, diabète, maladies hépatiques et cardiovasculaires, lésions d'ischémie-reperfusion du cœur, du cerveau et du pancréas…etc [196].

Une étude a montré qu’un apport quotidien d’antioxydants améliore le pronostic des maladies coronariennes [197].

La tyrosinase est une métallo-enzyme à cuivre (polyphénoloxidase) responsable du phénomène de brunissement enzymatique végétale (Schéma III-1). Chez l’homme, elle est

227

impliquée dans la biosynthèse de la mélanine en catalysant deux réactions oxydatives successives : l’oxydation de la tyrosine en L-DOPA (3,4-dihydroxyphénylalanine), elle-même oxydée en dopaquinone (dopachrome), qui sera transformée en mélanine grâce à une série de réactions de cyclisation et d’oxydation. Ces réactions peuvent conduire à deux dérivés différents de mélanine [198]: l’eumélanine aux propriétés protectrices contres les radiations UV, produite spontanément au pH physiologique, et la phoemélanine formée en présence de cystéine et de glutathion.

Tyrosinase

HO O COOH COOH COOH O2 O2 Mélanine Rapide NH2 Lent NH2 NH2 HO HO O

L-tyrosine L-dopa L-dopaquinone

Schéma III-1 : Biosynthèse de la mélanine

La phoemélanine est capable de produire des radicaux libres aux propriétés nocives [199] plutôt que protectrices, en plus de troubles hyperpigmentaires provoqués par des médicaments, produits chimiques ou bien certaines maladies.

Les inhibiteurs de la tyrosinase sont des agents potentiels pour le traitement de l’hyperpigmentation en médicine comme en cosmétologie, ainsi que des additifs conservateurs dans l’industrie agroalimentaire.

Afin de satisfaire aux exigences réglementaires des molécules utilisées dans les produits alimentaires et médicamenteux, la recherche de nouvelles molécules bioactives s’oriente vers les ressources naturelles durables en particulier celles du règne végétal.

Plusieurs études ont montré les activités inhibitrices de l’acide bétulinique [200] [201] et de la bétuline [202] vis à vis de la tyrosinase.

Les produits phénoliques, en plus d’être de meilleurs antioxydants, se sont avérés également de bons inhibiteurs de la tyrosinase, tels que les catéchines [203] [204], gallocatéchines [205], les flavonoïdes (quercétine [206], kaempférol) ayant un 3-OH libre qui sont capables de chélater le cuivre du site actif de l’enzyme [207].

228

III.1.2. Activité antiproliférative de cellules cancéreuses

Suite aux échecs chimio-thérapeutiques des cancers, la recherche de nouveaux agents thérapeutiques efficaces présente un vrai défi qui s’impose aux laboratoires de recherche.

De nombreux triterpènes se sont avérés cytotoxiques, parmi lesquels nous placerons l’acide bétulinique (nfr1) (Figure III-1) en tête de série avec une activité antiproliférative mise en évidence contre plus de 40 lignées cellulaires provenant des cancers humains les plus fréquents (sein, colonne, cerveau, poumon et prostate) avec des CI50 variées (1,0-11,6 µg/ml) selon le test MTT [208]. Il inhibe la prolifération des cellules KB avec une CI50 > 20 µg/ml [99]. En 1999 l’acide bétulinique a fait l’objet d’essais cliniques de phase II [209], avec une bonne sélectivité sur les lignées cancéreuses vis-à-vis des cellules humaines saines [194], une faible toxicité [210] et une marge thérapeutique large (500mg/Kg poids corporel) [211].

Avec une activité inférieure, la bétuline (xf3) (Figure III-1) s’est avérée inactive sur les NSCLC-N6 (None-Small-Cell Lung Carcinoma) [164], mais elle déclenche l’apoptose des cellules de carcinome de poumon A549 (ATCC) avec une CI50= 20 µM [165], cette activité s’améliore avec la présence du cholestérol [212]. Paradoxalement une étude menée en 1996 montre que la bétuline à 23 nM augmente le taux de prolifération des cellules MCF-7 (Michigan Cancer Foundation -7, cellules tumorales mammaires) estrogène-dépendantes [213], la même chose est observée avec la lignée T-47D (cellules tumorales mammaires) traitée par le β-sitostérol à 1 µM.

L’acide alphitolique (xb3) (Figure III-1) a montré une activité antiproliférative faible (324 µM) contre les cellules MCF-7 [100] et à 20 µM aucune activité cytotoxique n’est observée contre les cinq autres lignées cancéreuses contrairement à ses deux dérivés l’acide 3- O-cis/trans-p-coumaryl-alphitolique qui présentent une activité antiproliférative significative [57], indiquant le rôle du p-coumaryl indispensable à l’activité cytotoxique de l’acide alphitolique. Cette dernière étude montre une très faible voir aucune activité de l’acide zizibérénalique (Figure II-23) ayant une structure très proche de xb2.

229

29 29 30 30

H H H H

H 1 COOH 28 CH2OH R 1 28 2 H 2 H

HO H HO R = H (acide btulinique) H R= OH (acide alphitolique)

Figure III-1 : Structures des acides bétulinique (nfr1) et alphitolique (xb3) (à gauche) et de la bétuline (xf3) (à droite)

L’acide céanothénique (xb4) (Figure III-2) a montré une activité cytotoxique contre deux lignées cellulaires BGC-823 (CI50 >10 µg/ml) et Hela (CI50= 7,55 µg/ml), alors que l’acide céanothique ne présente aucune activité antiproliférative [167].

29 29

30 30

H H H H

25 1 26 COOH 25 26 HOOC COOH 28 28 H 3 27 COOH 27 HO

xb1 xb4

Figure III-2: Structures de l’acide céanothique (xb1) et de l’acide céanothénique (xb4).

Une autre étude a montré une très faible activité cytotoxique de l’acide céanothique comparativement à celle de l’acide bétulinique, en revanche deux dérivés hémi-synthétiques de l’acide céanothique (l’acide 1-decarboxy-céanothique et l’acide 1-decarboxy-3-oxo- céanothique) montrent une activité significative contre trois lignées OVCAR-3 (Human ovarian adenocarcinom), Hela et FS-5 (fibroblaste de la peau) [214].

L’acide corosolique (acide 2α-hydroxy-ursolique) (nfr2) (Figure III-3) a présenté une bonne activité antiproliférative qui a été démontrée contre plusieurs lignées cancéreuses [101], et son mécanisme d’action a été discuté [215] [216].

230

COOH 1 HO 28 2

Figure III-3 : Structure de l’acide corosolique (nfr2).

III.1.3. Activité antimicrobienne

Les résistances croissantes développées par les micro-organismes pathogènes aux médicaments comme les antibiotiques ne font que se multiplier. Ceci est due en partie à une sur-prescription et/ou une mauvaise compliance des patients, d’où la nécessité de trouver de nouvelles molécules plus efficaces.

Selon le type de micro-organismes, les composés isolés présentent des activités biologiques variées. Cette variation d’efficacité est observée même entre les composés appartenant à la même classe de métabolites secondaires (triterpènes, polyphénols, alcaloïdes ….etc), ce qui permet de développer une approche appelée Relation Structure-Activité (RSA), désignée parfois sous le nom de Relation Quantitative Structure-Activité (QRSA) basée sur la détermination de la concentration et du pharmacophore (propriétés physico-chimiques ou/et structurales) d’une molécule, indispensables à une activité biologique donnée.

L’activité antituberculeuse contre Mycobacterium tuberculosis a été évaluée à partir de plusieurs triterpènes et saponosides. L’acide bétulinique (nfr1) comme la bétuline (xf3) sont actifs avec une CMI de 32 µM [105] [166], une activité inférieure est observée pour l’acide alphitolique, l’acide zizybéranalique et l’acide zizybérénalique [195]. En revanche ce dernier acide montre une activité antipaludique intéressante (CI50= 3,0 µg/ml).

Une activité antifongique est reportée dans la littérature [106] pour l’acide bétulinique (nfr1) et l’acide corosolique (nfr2) contre sept espèces fongiques avec des valeurs de CMI variables de 8 à 63 µg/ml.

L’activité antibactérienne de l’acide bétulinique et de l’acide corosolique a été évaluée précédemment (Tableau III-1). L’acide bétulinique présente une activité modeste contre 231

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli avec une CMI = 250 µg/ml [106], en revanche l’acide corosolique montre une activité supérieure contre P. aeruginosa (CMI = 7,8 µg/ml) et S. aureus (CMI = 32,0 µg/ml) [106] [104] et une activité inférieure (CMI= 38,6 µg/ml) contre E. faecalis [106] par rapport à celle de l’acide bétulinique (CMI = 16,0 µg/ml).

Une autre étude [217] montre une bonne activité de l’acide bétulinique contre Bacillus cereus et Streptococcus pneumoniae.

L’acide bétulinique et ses dérivés naturels [107] et semi-synthétiques [218] [219] [220] (C-3 et/ou C-28 substitués) ont aussi montrés des potentialités comme agents thérapeutiques ayant des activités inhibitrices intéressantes vis-à-vis du virus de l’immunodéficience humaine (VIH).

L’acide céanothique (xb1) présente une activité antimicrobienne contre trois microorganismes responsables des pathologies orales : Actinomyces viscosus (CMI =42 µg/ml), Prevotella intermedia et Porphyromonas gingivalis (CMI= 62 µg/ml) [60].

Une saponine isolée des tiges de Colubrina retusa (Rhamnaceae) [144], 3-O-α-L- arabinofuranosyl-(1→2)-[3-O-(trans)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L- arabinopyranosyl-jujubogénine, a présenté une bonne activité inhibitrice contre Mycobacterium intracellulare avec une CMI = 10 µg/ml, tandis que son isomère substitué par le p-coumaryl en C-2 du glucose montre une activité inférieure avec une CMI= 50 µg/ml. Ceci illustre l’influence de la position de cette substitution sur l’activité antimicrobienne.

Cette dernière saponine (substitué en C-2) présente une activité antifongique modeste uniquement contre Cryptococcus neoformans tandis que la saponine ayant la même structure non substituée par le p-coumaryl montre le même niveau d’activité (CMI= 50 µg/ml) contre les trois espèces testées Candida albicans, Aspergillus fumigatus et C. neoformans [169].

D’autres saponines à jujubogénine (Figure III-4) isolées des tiges d’Anomospermum grandifolium ont été testées sur quatre souches pathogènes : Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli, sans avoir montré une activité bactérienne. Par contre, une faible activité antifongique contre C. albicans a été reportée pour les deux saponines ayant une chaîne de 3-4 unités osidiques [141].

232

21 24 26 HO 22 23 25 H H H O 27

19 18 15 O 30 H H H H HO H 28 29

Figure III-4: Structure de la jujubogénine.

Tableau III-1 : CMI des activités antimicrobiennes les plus marquées des triterpènes isolés : Bétuline Ac. bétulinique Ac. alphitolique Ac. céanothique Ac. corosolique Microorganismes xf3 nfr1 xb3 xb1 nfr2 M. tuberculosis + + + S. aureus + + P. aeruginosa + +++ E. coli + E. faecalis ++ + S. pneumoniae + Bacillus cereus ++ A. viscosus + P. intermedia + P. gingivalis + Anti-HIV +++ Antifongique ++ ++ Avec +++ <10 µg/ml, ++ [10-20 µg/ml] et + > 20 µg/ml.

III.1.4. Activité anti-inflammatoire Une étude biologique [103], menée sur l’investigation in-vivo de l’activité anti- inflammatoire de l’acide alphitolique (xb3) (Figure III-1), l’acide corosolique (nfr2) (Figure III-3) et l’acide asiatique, a montré les effets bénéfiques des trois dérivés comparables à ceux de l’indométacine dans le cas d’inflammation provoquée par l’application du 12-O- tetradécanoylphorbol-13 acétate (TPA). Seul l’acide corosolique a soulagé l’inflammation provoquée par l’acide arachidonique (AA) avec une activité comparable à celle du nimésulide.

Bernard et al. [109] ont réussi à identifier l’acide bétulinique comme étant le composé responsable de l’activité inhibitrice de l’enzyme phospholipase A2 (PLA2) obtenue par des extraits de sept espèces utilisées comme remèdes anti-inflammatoires en médecine traditionnelle en Amérique de Sud. La bétuline inhibe également l’activité de la PLA2 mais

233

avec une activité inférieure à celle de l’acide bétulinique, ce qui confirme le pharmocophore proposé par l’approche bioinformatique qui explique l’interaction inhibiteur-PLA2.

L’alphitol (Figure III-5), 3,5-dihydroxy-4-méthoxy-8-hydroxy-phényléthyle isolé d’Alphitonia zizyphoides, inhibe la biosynthèse de prostaglandine in-vitro avec une CI50 =123 µg/ml comparable a celle de l’acide acétylsalicylique. L’acide bétulinique montre une activité légèrement inférieure avec une CI50= 200 µg/ml, mais il inhibe la formation de l’œdème provoqué par l’application de éthylphényl-propiolate (EPP) chez les rats [50].

D’autres composés phénoliques comme l’hovertrichoside C ou 4-O-β-D- glucopyranosyl-maesopsine (xe3) et le 3-O-β-D-glucopyranosyl-kaempférol, ont montré une activité anti-inflammatoire modérée [221] contre l’arthrite chez les rats.

HO 7 O OH HO OH

1 8 OH 4 O H CO O 3 5 HO O HO OH OH xe3

Figure III-5: Structures de l’alphitol (à gauche) et du l’hovertrichoside C (xe3)

III.1.5. Autres activités biologiques L’activité antidiabétique de l’acide corosolique (nfr2) a été testée in vivo en montrant des effets bénéfiques sur le diabète de type II [222] [223].

Un effet protecteur de l’acide bétulinique et de la bétuline, contre la fibrose hépatique, a été démontré par une étude effectuée in-vitro sur des cellules stellaires hépatiques (CSHs) traitées par l’éthanol, en inhibant la production des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO : ROS : reactive oxygen species) ainsi que la production des cytokines telles que le TNF-α (Tumor necrosis factor α) et TGF-β (Transforming Growth Factor β) [224].

L’activité antiallergique des saponines à jujubogénine, isolées des graines de Zizyphus jujuba, a été démontrée en inhibant la libération de l’histamine des cellules péritonéales [225]. Il en va de même pour quatre saponines ayant le 16,17-seco-dammarane comme la génine, isolées de Hovenia dulcis [65].

234

III.2. Résultats

Afin de valoriser et promouvoir l’usage d’Alphitonia xerocarpa et Alphitonia neocaledonica par les tribus de Nouvelle-Calédonie, nous avons essayé de mettre en évidence quels composés isolés possédaient des activités biologiques en nous basant sur les données bibliographiques précédemment citées.

Les activités anti-oxydante, anti-tyrosinase, cytotoxique et antibactérienne ont été évaluées sur les extraits des différentes parties de plantes et/ou sur les composés purs obtenus en quantité suffisante.

III.2.1 Evaluation de l’activité anti-oxydante

Plusieurs protocoles physico-chimiques peuvent être mis en œuvre afin d’évaluer l’activité anti-oxydante des produits. Nous avons utilisé le protocole basé sur la mesure de la capacité d’un produit à céder un radical hydrogène H• au radical DPPH• (1,1-diphényl-2- picryl-hydrazyl).

Le DPPH• (Figure III-6) est un radical stable de couleur violette intense (mesurée à 515 nm) qui vire à l’incolore lorsque un antioxydant lui cède un H•. La diminution de la coloration est suivie au spectrophotomètre à λ= 515 nm [226] [227].

Le protocole choisi est rapide, simple et applicable en plaques 96 puits pour tester des produits purs comme pour des extraits.

NO2 N N

O2N

NO2

Figure III-6: Structure de DPPH•.

Un criblage préliminaire a été effectué sur les extraits acétate d’éthyle provenant des feuilles, écorces et branches d’A. xerocarpa et des fruits d’A. neocaledonica (Figure III-7).

235

Les trois extraits AcOEt d’A. xerocarpa ne présentent pas d’activité significative (Tableau III-2), tandis que celui des fruits d’A. neocaledonica testé à 200 µg/ml permet d’obtenir 44% de capture du radical DPPH• à 30 min, cette activité est facilement justifiée par la présence des tanins qui sont passés de la phase aqueuse à l’acétate d’éthyle lors de l’extraction liquide-liquide.

Activité antioxydante des extraits AcOEt 0.45 0.4 0.35 0.3 Contrôle négatif

0 .25 A.X.F.AcOEt 200 µg/ml

DO 0.2 0.15 A.X.E.AcOEt 200 µg/ml 0.1 A.X.B.AcOEt 200 µg/ml 0.05 A.N.Fr.AcOEt 200 µg/ml 0 0 10 20 30 Ac. Ascorbique 5 µg/ml Temps en min

Figure III-7 : Activité anti-oxydante des extraits AcOEt d’A. xerocarpa et A. neo-caledonica

Les extraits des feuilles, écorces et branches d’A. xerocarpa, obtenus avec le mélange hydro-alcoolique MeOH:H2O (80:20) en plus de l’extrait butanolique des fruits d’A. neocaledonica, testés à 200 µg/ml présentent une activité anti-oxydante supérieure à celle des extraits acétate d’éthyle et assez intéressante pour continuer à chercher les CI50 de ces extraits. Pour cela une gamme de dilutions de chaque extrait (200, 100, 50 et 10 µg/ml) a été préparée.

Tableau III-2 : Les pourcentages d’activité antio-xydante (test du DPPH) des extraits AcOEt

Extrait 200 µg/ml % d’inhibition à 30 min Extrait CI50 (µg/ml) A.X.F.AcOEt 9,6 - - A.X.E.AcOEt 22,6 - - A.X.B.AcOEt 18,5 - - A.N.Fr.AcOEt 44,0 - - A.X.F.M 53,4 A.X.F.M 180 A.X.E.M 82,5 A.X.E.M 73 A.X.B.M 78,5 A.X.B.M 73 A.N.Fr.M 93,2 A.N.Fr.M 20

La CI50 de l’extrait des feuilles reste assez élevée (180 µg/ml) malgré la présence dominante du rutoside (CI50= 15,3 µg/ml) [228] et contrairement à ceux des écorces et des branches d’A. xerocarpa (CI50= 73 µg/ml) ayant une composition identique avec une teneur

236

importante en polyphénols comme la maesopsine xe3 (CI50=5,3 µg/ml) [229] et les phénols glycosylés (xe5, xe6 et xe7).

L’extrait des fruits d’A. neocaledonica donne une activité anti-oxydante très importante (CI50 = 20 µg/ml) provenant d’un profil très riche en flavonoïdes et polyphénols.

III.2.2. Evaluation de l’activité inhibitrice de la tyrosinase

L’activité anti-tyrosinase a été évaluée grâce à une méthode colorimétrique basée sur la mesure de la densité optique du dopachrome obtenu à partir de L-DOPA (substrat) sous l’action de la tyrosinase T3824-50KU.

La tyrosinase (T3824-50KU) isolée du champignon Agaricus bisporus, a une grande ressemblance avec celle de l’homme [230] et est utilisée pour évaluer l’activité anti-tyrosinase en exploitant une méthode spectrophotométrique applicable au test de screening en plaque 96 puits.

Les extraits polaires et ceux obtenus avec l’acétate d’éthyle provenant des quatre parties étudiées ont été testé à 4 mg/ml. Les extraits acétate d’éthyle ne donnent pas d’activité inhibitrice significative. Les taux d’inhibition des extraits hydro-alcooliques des feuilles, écorces et branches d’A. xerocarpa, eux même ne correspondent pas à une activité très marquée (10,0, 29,9 et 49,6 % respectivement), l’activité supérieure des branches et écorces par rapport à celle des feuilles peut être expliquée par la présence des produits polyphénoliques et des tanins, ces derniers sont considérés comme des inhibiteurs non- spécifiques d’enzymes. Les quatre flavonoïdes isolés des feuilles (xf18-xf21) se sont avérés inactifs ce que nous pouvons justifier par le fait qu’ils soient glycosylés en C-3 [207].

Néanmoins l’extrait butanolique des fruits d’A. neocaledonica montre une activité très importante avec un pourcentage d’inhibition de 92,1%. Vu la teneur dominante des tanins dans cet extrait nous avons voulu vérifier si les tanins polymérisés sont seuls à l’origine de cette activité ou s’il existe d’autres métabolites qui y participent. Pour cela nous avons tout d’abord testé les fractions obtenues par l’extraction de partage centrifuge (EPC), puis les produits purs isolés.

Les fractions obtenues par EPC présentent toutes une activité inhibitrice importante (Figure III-8) mise à part la fraction fr1 avec une teneur principale en triterpènes (25,6 %), les

237

deux fractions fr3 et fr4, ayant un profil proche (flavonoïdes et polyphénols), donnent deux activités proches (67,4 et 68,0 %), et comme attendu les deux fractions fr5 et fr6 riches en tanins ont les deux une activité marquée.

Activité antityrosinase de la fraction butanolique des Fruits d'A. neocaledonica et ses fractions CPE

100 92,1 % 90 73,3 % 80 68,9 % 67,4 % 70 60,7 % 60 50 40

% d'inhibition% 30 25,6 % 20 10 0 fr1 fr3 fr4 fr5 fr6 A.N.Fr.But

Figure III-8 : Activité anti-tyrosinase des fractions CPE de l’extrait butanolique des fruits d’A. neocaledonica.

Les produits isolés des fractions fr3 et fr4 (nfr4-nfr9) ont été testés à 1 mg/ml et aucune activité intéressante des cinq flavonoïdes isolés (nfr4-nfr8) n’est observée (Figure III- 9) probablement pour la même raison que précitée pour les flavonoïdes des feuilles (glycosylation en C-3) [207]. La gallo-catéchine nfr9 inhibe quant à elle 87,4 % de l’activité enzymatique, cette activité a été déjà démontrée avec une CI50 = 4,8 µg/ml [205].

activité anti-tyrosinase des produits isolés des fractions fr3 et fr4. 100 87.4 % 90 80

70 60 50 40

% d'inhibition% 30 9.2 % 14.5 % 20 6.4 % 2.5 % 14 % 10 0 nfr4 nfr5 nfr6 nfr7 nfr8 nfr9

Figure III-9 : Activité anti-tyrosinase des produits isolés des fractions fr3 et fr4 des fruits d’A. neocaledonica.

238

Dans le but de déterminer les métabolites terpéniques susceptibles d’être responsables de l’activité anti-tyrosinase de la fraction fr1, nous avons testé les triterpènes nfr1 et xb3 provenant de cette fraction plus ceux d’A. xerocarpa isolés en quantité importante (xb1, xb2, xb4). Tous les triterpènes isolés présentent des activités modérées assez proches laissant aucune possibilité pour établir une relation structure-activité (Figure III-10).

Activité anti-tyrosinase des triterpènes isolés. 50 44.8 % 45.5 % 45 36.6 % 40 36.5 %

35 28.4 % 30 25 20

% d'inhibition% 15 10 5 0 xb1 xb2 xb3 xb4 nfr1

xb1 : Ac. céanothique. xb2 : 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique. xb3 : Ac. alphitolique. xb4 : Ac. céanothenique. nfr1 : Ac. bétulinique.

Figure III-10 : Activité anti-tyrosinase des triterpènes xb1-xb4 et nfr1.

Néanmoins, l’acide bétulinique (nfr1) à noyau lupane est déjà connu pour posséder une activité inhibitrice vis-à-vis de la tyrosinase [200] [201]. Les composés xb1-xb4 possèdent le même cycle E pentacyclique et le groupe isopropényl mais ils diffèrent entre eux et vis-à-vis de l’acide bétulinique par la structure du cycle A (5 ou 6 atomes) et de ses substituants (Figure III-11). Il semblerait donc que le cycle A n’a que peu d’influence sur l’activité anti-tyrosinase.

29 29 29 30 30 30 R

H H H H H H

25 26 2 COOH 25 1 R 26 COOH H 1 COOH 28 28 28 R H 2 H 3 27 COOH 1 27 R HO H 1 2 nfr1 : R = H xb1: R = OH, R = COOH xb4 : R = H 1 2 xb3 : R= OH xb2: R H , R = CHO xf4 : R = OH

Figure III-11 : Structures des composés dérivés du lupane testés

239

III.2.3. Evaluation de l’activité antiproliférative par le test WST-1

L’évaluation de l’activité cytotoxique a été effectuée dans le laboratoire de l’unité de recherche "Matrice Extracellulaire et Dynamique Cellulaire" MEDyC-Faculté de Pharmacie de l’Université de Reims Champagne-Ardenne, sous l’encadrement du Dr. Hélène BOBICHON et Nathalie LALUN.

Nous avons utilisé une méthode colorimétrique basée sur la mesure de la capacité réductrice mitochondriale des cellules vivantes : le WST-1(Roche) [4-[3-(4-iodophényl)-2-(4- nitrophényl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene-disulfonate est réduit sous l’action d’une succinate déshydrogénase en dérivé formazan détecté par spectrophotométrie.

Après une adhérence des cellules cancéreuses KB (ATTC® CCLTM-17) dans les plaques 96 puits, elles sont mises en contact avec les solutions des produits à tester pendant 48h. La lecture par spectrophotométrie est effectuée à λ= 450 nm.

20 produits purs ont été testés à 10 µg/ml avec une concentration finale de DMSO 1%. Il s’agit de 10 saponosides (dont deux en mélange 50:50 xf8+xf9), 8 triterpènes et les composés phénoliques xe2 et xe3 (Tableau III-3).

Parmi les produits testés les 2 saponosides ayant l’acide céanothique comme génine (xf17 et xe8) et les 8 saponines dérivées du damarane (xf6-xf9, xf10, xf16, xe11 et xe12), n’ont montré aucune une activité antiproliférative marquée sur les cellules KB, de même pour les produits phénoliques testés : le 4-O-β-D-glucopyranosyl-maesopsine (xe3) et le 3α-O-β-D- glucopyranosyl-lyonirésinol (xe2).

Tableau III-3 : Activité cytotoxique sur cellules KB de 20 composés testés à 10 µg/ml % % % Produits testés Produits testés Produits testés d’inhibition d’inhibition d’inhibition Triterpènes Saponosides polyphénols xb1 30,8 xf6 16,4 xe2 13,0 xb2 72,9 xf7 19,6 xe3 2,5 xb3 79,3 xf8+xf9 22,9 xb4 79,5 xf10 6,6 xf4 58,4 xf16 10,5 xe1 77,0 xf17 7,8 nfr1 45,7 xe8 14,8 nfr2 49,3 xe11 9,2 xe12 10,3

240

Les 8 produits restants sont des triterpènes dont un dérivé de l’acide ursolique nfr2 (l’acide corosolique), alors que les 7 autres composés sont dérivés du lupane (xb1-xb4, xf4, xe1 et nfr1). Une activité importante, correspondant à des pourcentages d’inhibition de la prolifération cellulaire supérieurs à 60%, est observée pour 4 composés : l’acide alphitolique (xb3), l’acide céanothénique (xb4), le 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique (xb2) et son isomère le 2β-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique (xe1) (Tableau III-3). Les quatre autres triterpènes (xb1, xf4, nfr1 et nfr2) présentent des activités modérées variées [30-58%].

La détermination de la concentration inhibitrice CI50 est effectuée pour les quatre composés ayant une activité inhibitrice supérieure à 60% en préparant une gamme de dilutions (1, 2, 3, 4, 5 et 6 µg/ml) (Tableau III-4).

Tableau III-4: Activité cytotoxique sur cellules KB des composés xb2-xb4 et xe1 avec (σ=Ecart type)

Produits CI50 (µg/ml) CI50 ± σ (µM) xb2 3,6 7,9±0,12 xb3 4,0 8,5±0,25 xb4 1,2 2,6±0,16 xe1 3,2 7,0±0,17

En comparant l’activité des deux isomères xb2 et xe1, nous pouvons conclure que la stéréochimie de la fonction aldéhyde n’influence guère sur l’activité antiproliférative, d’autre part l’activité supérieure de ces deux composés par rapport à celle de xb1 (l’acide céanothique) indique que la présence de la fonction aldéhyde en C-1 et l’absence de l’hydroxyle en C-3 sont favorables à l’activité cytotoxique contrairement à la fonction carboxylique en C-1 (le cas de xb1). La fonction carboxylique C-27 des composés xb4 (l’acides céanothénique) et xf4 (l’acide 30-hydroxycéanothénique) semble intensifier l’activité antiproliférative en la comparant avec celle de xb1, tandis que l’hydroxyle en C-30 de xf4 diminue l’activité cytotoxique.

La différence significative de l’activité entre les deux dérivés du lupéol, xb3 (l’acide alphitolique) et nfr1 (l’acide bétulinique), laisse supposer que l’hydroxyle en C-2 (xb3) influence positivement l’activité.

L’activité de l’acide corosolique (nfr2) comparable à celles de xf4 et nfr1 (l’acide bétulinique) laisse supposer que le groupement isopropényl 20(29) n’est pas indispensable à l’activité cytotoxique.

241

III.2.4. Evaluation de l’activité antibactérienne

Les tests antibactériens ont été réalisés dans le laboratoire de Microbiologie et au sein de l’unité de recherche EA 4691 "Biomatériaux et Inflammation en site osseux", Faculté de Pharmacie de l’Université de Reims Champagne-Ardenne, sous la direction du Professeur Sophie Gangloff.

Dans le cadre de notre étude, l’antibiogramme par la méthode de diffusion en milieu gélosé MH (Mueller Hinton) est effectué sur quatre souches bactériennes dont deux bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Enterococcus faecalis CIP 10907) et deux bactéries à Gram négatif (Escherichia coli ATCC 2592 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853).

Dix-huit produits purs isolés en quantité suffisante ont été testés selon cette méthode (Tableau III-5), soit huit triterpènes (xb1-xb4, xf3, xf4, xe1 et nfr2), huit saponosides dont deux en mélange (xf8+xf9) et (xf5-xf7, xf10, xf17 et xe11), le lyonirésinol (xe2) et la maesopsine 4-O-glucoside (xe3).

Les 8 saponines dont 5 à jujubogénine (xf5, xf6, xf7 et xf8+xf9), une à 22α-hydroxy- jujubogénine (xf10), une à 17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine (xe11) et une dernière à l’acide céanothique (xf17), ayant des chaînes osidiques différentes (2-5 sucres) ne montrent aucune activité antibactérienne (Tableau III-5). De même pour les deux dérivés phénoliques xe2 et xe3.

Tableau III-5 : Antibiogramme des composés testés, zone d’inhibition (Ø, mm) Composés (µg/disque) S. aureus E. faecalis E. coli P. aeruginosa xb1 (500) - - - - xb2 (500) 10 12 - - xb3 (500) - - - - xb4 (500) 16 14 - - xf3 (500) - - - - xf4 (100) 14 14 - - xf5 (500) - - - - xf6 (500) - - - - xf7 (500) - - - - xf8+xf9 (500) - - - - xf10 (500) - - - - xf17 (500) - - - - xe1 (500) - - - - xe2 (500) - - - - xe3 (500) - - - - xe11 (500) - - - - nfr2 (500) 13 12 - - 242

Les triterpènes dérivés du lupéol comme la bétuline (xf3), l’acide alphitolique (xb3) et l’acide bétulinique (nfr1) ne présentent aucune activité marquée contre les quatre souches bactériennes. Ce résultat rejoint les données reportées dans la littérature concernant l’activité modeste de l’acide bétulinique contre S. aureus, E. coli et P. aeruginosa avec une CMI = 250 µg/ml [106], exception faite de l’activité contre E. faecalis CMI = 16 µg/ml.

Parmi les quatre composés dérivés du A(1)nor-lupane, trois des composés : l’acide céanothénique (xb4), l’acide 30-hydroxycéanothénique (xf4) et l’acide 2α-formyle- A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique (xb2) présentent une activité significative contre les bactéries à Gram positif En revanche aucune zone d’inhibition n’est observée pour l’acide céanothique (xb1)

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des trois triterpènes xb2, xb4 et xf4 à A(1)nor-lupane et de l’acide corosolique (nfr2) dérivé de l’ursane qui se sont avérés actifs contre les bactéries à Gram positif, ont été déterminées par la micro-méthode de dilution en milieu liquide (Tableau III-6).

Tableau III-6 : Activité antibactérienne des composés xb2, xb4, xf4 et nfr2 CMI (µg/ml) Composés S. aureus E. faecalis xb2 4 4 xb4 8 16 xf4 4 16 nfr2 32 32

L’analyse de ces derniers résultats nous permet d’attribuer plusieurs pharmacophores susceptibles d’apporter une contribution importante à l’activité antibactérienne. En comparant les activités différentes des acides isolés ayant une fonction carboxylique en position C-28 avec celle de la bétuline, nous pouvons conclure que cette fonction est indispensable pour l’activité antibactérienne. D’autre part, le groupement isopropényl-20(29) s’est avéré favorable mais non indispensable pour l’activité car il est absent dans le cas de l’acide corosolique (nfr2) (Figure III-3).

La fonction carboxylique C-27 semble être favorable à l’activité antibactérienne de xb4 et xf4 comparativement à xb1 qui ne possède pas de fonction carboxylique en C-27 (Figure III-11), mais non indispensable dans le cas de xb2 et nfr2. Il en est de même pour la double liaison ∆2 présente dans le cycle A de xb4 et xf4 mais pas dans xb2 et nfr2.

243

En comparant les deux composés xb1 et xb2, nous remarquons que la fonction aldéhyde en C-1 avec l’absence de l’hydroxyle en C-3 semblent avoir une influence positive sur l’activité antibactérienne.

III.2.5. Conclusion

L’ensemble des résultats obtenus laisse ressortir que les triterpènes sont les composés majoritairement responsables des activités cytotoxiques (sur cellules KB), antibactériennes contre les bactéries à Gram positif et avec un degré moindre de l’activité anti-tyrosinase. Alors que l’activité anti-oxydante est due aux flavonoïdes et polyphénols, eux-mêmes présentant une activité anti-tyrosinase importante (gallocatéchine).

Aucun saponoside n’a montré d’activité alors que certaines saponines à jujubogénine Colubrina retusa (Rhamnaceae) [144] ont montré une bonne activité contre M. intracellulare et une activité antifongique modeste [169].

La comparaison des différentes activités antibactériennes des triterpènes dérivés du lupane, nous a permis de déterminer quelques éléments structuraux favorables à cette activité. La fonction acide en C-28 semble être indispensable pour l’activité antibactérienne, alors que celle en C-27 intensifie cette propriété biologique. Le même phénomène est remarqué pour l’hydroxyle en C-30 qui augmente l’activité antibactérienne contrairement à ce qui est observé pour l’activité antiproliférative.

Grâce à l’analyse des résultats obtenus sur les cellules KB, nous pouvons conclure que la fonction aldéhyde en C-1 est favorable à l’activité cytotoxique néanmoins la stéréochimie de cette substitution n’influence guère cette propriété.

Les différentes substitutions du cycle A semblent avoir une influence importante sur l’activité biologique de ces dérivés.

Les triterpènes et en particulier l’acide céanothénique (xb4) et le 2α-formyle- A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique (xb2), qui sont les composés majoritaires isolés respectivement des feuilles et des branches d’A. xerocarpa, ont une bonne activité antibactérienne et cytotoxique sur les cellules KB, il serait intéressant de poursuivre ces activités sur d’autres souches bactériennes et d’autre lignées cellulaires, et éventuellement de déterminer leur mécanisme d’action.

244

Une évaluation de la sélectivité de ces composés vis-à-vis des cellules humaines saines s’impose afin de valoriser leur usage thérapeutique.

245

246

IV. Conclusion générale

247

248

A l’issue de l’étude phytochimique menée sur les trois espèces d’Alphitonia : A. xerocarpa (feuilles, écorces et branches), A. erubescens (feuilles, écorces et bois) et A. neocaledonica (fruits), 48 composés ont été isolés à l’aide de différentes méthodes chromatographiques classiques sur support solide, ainsi que par Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC).

L’identification structurale a été réalisée par l’analyse des données spectrales obtenues par des méthodes spectroscopiques de RMN mono et bidimensionnelle, homo et hétéronucléaires classiques et de spectrométrie de masse ESI-MS.

L’analyse par CLHP analytique des extraits des feuilles d’A. xerocarpa et d’A. erubescens a montré une similitude qualitative entre les deux espèces, le même résultat a été obtenu en comparant les extraits des écorces, branches et bois des deux espèces. Les extraits hydro-alcooliques des écorces et branches d’A. xerocarpa montrent un profil phytochimique quasi identique en CLHP analytique, néanmoins les extraits acétates d’éthyle présentent une composition différente. Au vu des résultats analytiques obtenus, l’investigation phytochimique a été réalisée sur les deux extraits hydro-méthanoliques des feuilles et écorces de l’espèce A. xerocarpa, des extraits acétates d’éthyle des trois parties (feuilles, branches et écorces) de la même espèce et des extraits acétate d’éthyle et butanolique des fruits d’A. neocaledonica.

Les composés isolés, dont 23 nouveaux, peuvent être classés comme suit :

2 stérols dont un glycosylés ; 10 triterpènes : parmi lesquels 8 dérivés du lupane, dont trois nouveaux, un dérivé de l’ursane, et un nouveau dérivé de la jujubogénine ont été identifiés ; 19 saponosides dont 18 correspondants à des structures nouvellement décrites, ayant des génines différentes : l’acide céanothique et 5 aglycones dérivés du dammarane ; 12 flavonoïdes dont un aurone, un flavan-3-ol et 10 flavonols glycosylés en C-3 dont un nouveau ; un lignane glycosylé ; trois glycosides phénoliques ; un nucléoside.

Les triterpènes isolés sont très fréquents chez les différentes espèces de la famille des Rhamnaceae. L’originalité des trois composés nouveaux provient soit d’une oxydation (xf4, 249

30-hydroxycéanothénique), soit d’une élimination d’une molécule d’eau (xe9, 17-déhydro-20- déhydroxy-jujubogénine) ou bien d’une perte d’un hydroxyle (xb2, xe1, 2α/β-formyle- A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique).

Parmi les nouveaux saponosides isolés, nous pouvons citer deux glycosides de l’acide céanothique qui portent une chaîne osidique branchée constituée de quatre ou cinq unités de

β-D-glucopyranose.

Les autres saponines de structures nouvelles sont des glycosides de l’acide 16,17-seco- dammarane-16,26-dioique, de la jujubogénine et de ses dérivés : la 22α-hydroxy- jujubogénine, le 16-β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β-20-diol et la 17-déhydro-20- déhydroxy-jujubogénine.

Les saponosides dérivés de la jujubogénine sont fréquemment rencontrés chez les Rhamnaceae et plus particulièrement dans la sous-famille des Ziziphoides. Les différentes parties osidiques identifiées dans les saponines à jujubogénine, isolées des feuilles, se superposent parfaitement à celles des glycosides de 17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine, isolés des écorces. Cette chaîne varie selon le nombre de sucres : deux, trois, quatre ou cinq unités osidiques.

La chaîne osidique du reste des saponines comprend deux unités osidiques, α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranose ou β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranose sans ou avec estérification par un acide organique en C-6".

Les flavonoïdes isolés sont des glycosides de quercétine, kaempférol et d’isorhamnétine précédemment isolés des espèces de la famille des Rhamnaceae, tout comme le 4-O-β-D-glucopyranosyl-maesopsine. Au cours du présent travail un seul flavonoïde est décrit pour la première fois, il s’agit d’un glycoside de tamarixétine.

L’évaluation de l’activité anti-oxydante effectuée sur les différents extraits obtenus à partir des différentes parties étudiées, a montré une bonne activité antioxydante des extraits hydro-alcooliques contrairement aux extraits acétates d’éthyle, ce qui peut être facilement justifié par la présence des composés phénoliques, réputés comme d’excellents agents antioxydants, dans les fractions polaires.

Seul l’extrait butanolique des fruits d’A. neocaledonica a montré une activité anti- tyrosinase intéressante, cette activité peut être expliquée par les effets synergiques des 250

composés phénoliques polymérisés (tanins) et de la gallo-catéchine, ce dernier ayant un CI50 = 4,8 µg/ml. Une activité anti-tyrosinase modérée des acide bétulinique, alphitolique, céanothique et céanothénique a été également démontrée.

Les tests biologiques effectués sur les produits isolés en quantité suffisante, ont permis d’identifier les triterpènes comme étant les composés responsables en majorité des activités des activités antibactérienne et antiproliférative contre les cellules KB.

La présence de huit composés dérivés du lupane, a permis d’évaluer l’influence de certaines propriétés chimiques sur l’activité biologique, comme par exemple la fonction acide en C-28 qui semble être indispensable pour l’activité antibactérienne, alors que celle en C-27 intensifie cette propriété biologique, il en est de même pour l’hydroxyle en C-30. Ce dernier semble avoir un effet négatif sur l’activité antiproliférative sur les cellules KB, tandis que la présence d’une fonction aldéhyde en C-1 influence positivement cette activité.

A ce stade nous pouvons conclure que les deux espèces A. xerocarpa et A. erubescens présentent toutes les deux un profil phytochimique assez proche de ceux établis pour des espèces appartenant à la sous-famille des Ziziphoides particulièrement les espèces appartenant au genre Ziziphus spp, ce qui rejoint parfaitement la classification chimiotaxonomique du genre Alphitonia. Quant aux fruits d’A. neocaledonica, eux même ont un profil typique des fruits riche en polyphénols avec une teneur importante en triterpènes très fréquents chez les Rhamnaceae.

Sur le plan biologique, les triterpènes isolés montrent des activités antibactérienne et antiproliférative intéressantes. L’importance de cette information provient d’une part du faite que les composés actifs sont des produits majoritaires des feuilles (xb4, l’acide céanothénique), des branches (xb2, l’acide 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique) et des fruits (xb3, l’acide alphitolique et nfr1, l’acide bétulinique), et d’autre part que les parties végétales concernées (feuilles, branches et fruits) sont des ressources inépuisables et leur exploitation peut être menée sans destruction des plantes. Ces plantes pourraient donc être pour les neo-calédoniens une nouvelle source d’exploitation dans les domaines cosmétique et médical.

Au vu de l’ensemble des résultats obtenus, nous pouvons proposer quelques perspectives :

251

 afin de compléter ce travail, une étude phytochimique sur les feuilles et les écorces d’Alphitonia neocaledonica devrait être réalisée.  il serait intéressant de poursuivre l’évaluation des activités biologiques des composés majoritaires sur d’autres souches bactériennes et d’autres lignées cellulaires, et éventuellement de déterminer leur mécanisme d’action.  il est important tout de même d’évaluer la sélectivité des composés actifs vis-à-vis des cellules humaines saines afin de valoriser leur usage thérapeutique.  la plus part des composés majoritaires et leurs dérivés semi-synthétiques ont montré des vertus thérapeutiques intéressantes, d’où l’intérêt de développer des méthodes de purification de ces composés applicables à l’échelle industrielle (CPC et EPC).

252

V. partie expérimentale

253

254

V.1. Matériel et appareillage V.1.1. Matériel végétal

Alphitonia neocaledonica 09NM001 (feuilles, fruits et écorces) et A. xercocarpa 09NM002 (feuilles, écorces et branches) ont été récoltés en septembre 2009 à la fin de la saison fraîche en province sud. Alphitonia erubescens 09NM003 (feuilles, écorces et bois) a été récolté en novembre 2009, début de la saison chaud en province sud.

L’identification botanique a été faite par l’équipe de Phytochimie des Substances Naturelles de l’Université de Nouvelle-Calédonie avec l'aide de l'équipe de l'herbier de Nouméa.

V.1.2. Matériel chromatographique V.1.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

Utilisée à chaque étape pour le suivi et le contrôle des purifications, les chromatogrammes sur couche mince permettent de vérifier la présence et l’état de pureté des produits isolés.

Nous avons utilisé essentiellement des plaques de silice prêtes à l’emploi sur support en aluminium ou en verre (Merck) : en phase normale, Silicagel 60 F254, 250 μm (Merck) ou

Alugram UV254 (Macherey-Nagel) et en phase inverse, RP 18 F254S, 200 μm (Merck).

Les plaques utilisées pour la réalisation des chromatographies sur plaques préparatives

(CPP) sont en verre recouvertes de silice Kieselgel 60 F254 Merck, 250 μm (20 x 20 cm).

Le développement des plaques s’effectue dans des cuves en verre saturées avec un éluant approprié. Cette phase mobile est constituée d’un mélange binaire ou tertiaire de solvants selon le type de séparation souhaitée. Les mélanges de solvant utilisés pour les CCM en phase normale sont : Cyclohex/AcOEt, Toluène/Acétone, Toluène/Acétone/ac Formique,

CHCl3/CH3OH, CHCl3/CH3OH/H2O et MeCOEt/isoPro/Acetone/H2O et en phase inverse

CH3OH/H2O.

L’observation des CCM s’effectue en lumière visible et sous UV (254 et 365 nm), avant la révélation par un révélateur approprié, Les révélateurs utilisés au laboratoire sont l’acide 255

sulfurique à 50% dans l’eau ou la vanilline sulfurique (une solution composée de 1 g de vanilline, 2 ml d’acide sulfurique et de l’éthanol à 95% q.s.p. 100).

V.1.2.2. Chromatographie sur colonne ouverte (CC)

Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont été mises en œuvre dans des colonnes en verre, dont la taille et le diamètre sont choisis en fonction de la quantité d’échantillon à purifier.

Les phases stationnaires utilisées sont :

- en phase normale, une silice Kieselgel Merck (63-200 µm), en utilisant une quantité de silice généralement 40 fois supérieure à la quantité de l’échantillon à déposer.

- en phase inverse, une silice greffée Lichroprep RP-18 Merck (40-63 μm), en utilisant 30-40 fois le poids de l’échantillon à purifier, et dans ce cas l’élution est effectuée à l’aide d’air comprimé.

Dans le cas d’un dépôt solide, l’extrait à fractionner est adsorbé sur une quantité de silice correspondant à environ 2 fois sa masse.

V.1.2.3. Chromatographie sous pression réduite (VLC)

Cette technique est utilisée pour réaliser un fractionnement grossier et rapide des extraits. Elle nécessite moins de solvants que les techniques classiques. La silice est conditionnée dans un entonnoir cylindrique filtrant sur verre fritté n° 4 en utilisant 10 fois le poids de l’extrait à fractionner. Le support utilisé en phase normale est du silicagel Merck 60 (63-200 µm) ou en phase inverse de la silice greffée Lichroprep. RP-18 Merck (40-63 µm).

V.1.2.4. Chromatographie sur colonne flash (CCF)

L’appareil utilisé GRACE Reveleris est muni d’un détecteur DEDL (Détecteur évaporatif à diffusion de Lumière), d’une vanne de purge pour la ligne DEDL (isopropanol) et d’une vanne de purge pour les 4 lignes de solvant. Le déroulement de la manipulation est suivi grâce à l’écran associé, le tout est piloté par le logiciel Reveleris® Flash System. Il permet le recueillement automatique des fractions. La phase stationnaire est contenue dans

256

des cartouches en plastiques de différents diamètres contenant de la silice normale ou greffée

C18.

Tableau V-1 : Les différentes cartouches utilisées pour les colonnes flash avec les débits des solvants adaptés. Masse de l’échantillon N°Colonne flash Support Poids silice Débit prescrit à déposer 1 Silica 40 µm 4 g 5 ml-18 ml/mn (4 mg-0,8 g) 2 Silica 40 µm 12 g 36 ml/mn (12 mg-2,4 g) 3 Silica 40 µm 40 g 40 ml/mn (40 mg- 8 g) 4 RP-C18 4 g 5 ml-18 ml/mn 5 mg-0,2 g

5 RP-C18 12 g 36 ml/mn 12 mg-2,4 g

6 RP-C18 40 g 40 ml/mn 40 mg-8,0 g

V.1.2.5. Chromatographie liquide haute performance (CLHP)

V.1.2.5.1. CLHP analytique et semi-préparative

V.1.2.5.1.1. Chaîne Dionex chromatographique

Le système d’appareil (Dionex) utilisé consiste en une pompe Ultimte 3000 avec un dégazeur intégré, un injecteur ASI-100, un détecteur UVD 340S et un four STH 585. Cette chaîne chromatographique est pilotée par le logiciel Chromeleon®. Les différents types de colonnes CLHP utilisé sont décrits ci-dessous :

® - CLHP analytique : Phenomenex Luna C18, 5µ, 100 A, 250x4,6 mm, ® - CLHP semi-préparative : Phenomenex Luna C18, 5µ, 100 A, 250x10 mm.

Le système de solvants employé est MeCN ou MeOH (qualité-CLHP Carlo erba®), et l’eau distillée additionnée de 0,025 % TFA. Les conditions chromatographiques (débit, détection et gradient) sont précisées pour chaque analyse.

V.1.2.5.1.2. Chaîne Waters chromatographique

L’appareillage comprend un système de pompage (pompe 600 E), un passeur d'échantillons (auto-sampler 717 plus), la détection est effectuée à l’aide d’un détecteur à indice de réfraction RI (Waters 410) et l’enregistrement et l’interprétation des résultats sont réalisés par le logiciel Empower®.

257

Cette chaîne, équipée d’un détecteur RI, est exploitée pour la purification et l’identification des monosaccharides issus de l’hydrolyse des extraits bruts contenant les différents métabolites glycosylés.

Deux types de colonne sont utilisés pour cette analyse : - Colonne Rezex ROA 250x21.2 mm (Phenomenex®) pour la purification des sucres par CLHP semi-préparative. - Colonne chiralpak IC, 5µm, 4,6x250 mm, (Chiraltech®) pour l’identification des sucres.

V.1.2.5.2. CLHP préparative

Une chaîne ARMEN consiste d’une pompe Armen AP 250/500 avec un injecteur Armen ACC 250/500 et un détecteur UV Merck K-2501 Knauer. Le suivi de purification est effectué à l’aide d’un enregistreur Kipp & Zonen et les fractions sont récoltées grâce à un collecteur BÜCHI C-660. Le remplissage de la colonne Merck 180x50 mm est réalisé au laboratoire avec de la silice greffée Lichroprep. RP-18 (40-63 µm) Merck. V.1.2.6. Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC)

V.1.2.6.1. Définitions

La CPC est une méthode de chromatographie liquide-liquide sans support solide, basée sur les différences de partage des solutés entre deux phases non miscibles préparées par mélange de plusieurs solvants ou solutions. La phase stationnaire liquide est maintenue dans des cellules orientées radialement, par une force centrifuge appliquée par rotation autour d'un axe unique.

Les trois paramètres principaux sont le débit de la phase mobile, la vitesse de rotation de la colonne et le transfert de matière. L’augmentation du débit et de la vitesse de rotation favorise la dispersion de la phase mobile dans la phase stationnaire, autrement dit augmenter la surface d’échange qui permet une bonne séparation chromatographique. Cependant cette augmentation de ces deux paramètres est limitée pour éviter le phénomène d’émulsion.

Le troisième paramètre est le transfert de matière, c’est à dire la répartition des solutés entre les deux phases selon leur coefficient de partage K, défini comme étant le rapport des

258

concentrations d’un soluté dans la phase stationnaire et dans la phase mobile d’un système biphasique. Plus le K est grand, plus le soluté est retenu.

K =

Cstat: Concertation du soluté dans la phase stationnaire. Cmob : Concertation du soluté dans la phase mobile. V.1.2.6.2. Mode de pompage Le mode d’élution est déterminé par le choix de la phase mobile si cette dernière est constituée par la phase la plus dense le mode d’élution sera dit descendant et mode ascendant dans le cas contraire.

V.1.2.6.3. Modes de développement

Les principaux modes d’élution appliqués en chromatographie liquide sur support solide peuvent être procédés en chromatographie de partage centrifuge.

V.1.2.6.3.1. Elution isocratique ou graduée

La force motrice est essentiellement la force éluante de la phase mobile, la composition de la phase mobile est inchangeable en mode isocratique, contrairement au mode gradient qui consiste à faire varier, de façon progressive, au cours de la séparation les propriétés physico-chimiques de la phase mobile. Cette approche est très utile pour la séparation des composées ayant une grande différence de polarité et de constante de distribution, toutefois l’emploi d’un gradient est soumis à une contrainte majeure, la perturbation de l’équilibre hydrodynamique du système.

V.1.2.6.3.2. Elution en Dual Mode et l’élution extrusion :

Le principe du Dual Mode consiste en l'inversion du rôle des phases stationnaire et mobile à un moment donné de l’analyse, c’est à dire basculer le mode de pompage (ou inversement), tout en pompant de la phase stationnaire.

Le principe de l’élution extrusion repose sur la possibilité d’alterner la nature de la phase mobile et de pomper de la phase stationnaire sans changer le mode de pompage.

Ces deux approches permettent de séparer des composés de polarité différente et ainsi de gagner du temps. 259

V.1.2.6.3.3. Elution par déplacement

Dans les deux modes d’élution précédents, les solutés ne se partagent pas entre les deux phases. Dans le cas d’une élution par déplacement : une espèce chimique est ajoutée dans la phase stationnaire et sert de site d’échange. Ce dernier retient les solutés qui ne progresseront dans la colonne qu'après l'introduction d’un déplaceur dans la phase mobile. Cette méthode concerne les espèces ioniques, telles que les sulfates ou les ammoniums quaternaires.

V.1.2.6.3.4. pH zone-refining (pHZR°)

La force motrice ici est le changement d'état d'ionisation des solutés ionisables comme les acides carboxyliques et les amines. Les solutés sont retenus dans la phase stationnaire par des espèces chimiques ayant un caractère acido-basique identique à celui des solutés, l’avancement des ces derniers dans la colonne dépendra de la concentration du déplaceur dans la phase mobile st de sa capacité à changer l’état d’ionisation des solutés et ainsi à les entraîner dans la phase mobile.

V.1.2.6.4. Intérêt de la CPC

Les avantages de la CPC sont nombreux surtout dans une optique préparative, dont nous citons les principaux :

 Absence de support solide permettant de s'affranchir des problèmes d'adsorption irréversible et/ou de dégradation des solutés;  Choix des phases quasi-illimité;  Différents modes de développement possibles, notamment le mode par déplacement, très adapté à des applications préparatives;  Rendements globaux excellents;  Facilité de récupération des composés non-élués par évaporation de la phase stationnaire;  Grande capacité des colonnes, suscitant de plus en plus l'intérêt de nombreux industriels;  Faible coût de phase stationnaire, par rapport à celles classiquement utilisées en CLHP ainsi que la consommation de solvants diminuée (toujours par rapport à la CLHP);  Automatisation possible de toutes les opérations. 260

V.1.2.6.5. Appareillage

V.1.2.6.5.1. Extracteur de Partage Centrifuge (EPC)

L’appareil utilisé est un FCPE300 de chez Kromaton Technologies® (Angers, France) avec un rotor (colonne) d’un volume de 300 ml, constitué de 7 disques (Ø = 250mm) contenant chacun 33 cellules de partage (Twin-cell) interconnectées par des conduits de 0,8 mm.

(b)

Conduits de connection Twin-cell

Disque de partition

(a)

Figure V-1 : (a) Rotor du FCPE300, (b) les cellules de partage (Twin-cell).

L’EPC est intégré dans une chaîne chromatographique complète constituée des éléments suivants :

- une pompe gradient 1800-V7115 (Berlin, Allemagne) - un système d'injection Isco 500D (Teledyne IscoInc, lincoln-Nebraska, USA) - un détecteur UVD170s (Dionex, sunnyvale, CA-USA) - un collecteur de fractions Pharmacia Superfrac (Uppsala, Sweden). Le logiciel d’acquisition est le Chromeleon®.

261

Tableau V-2: Caractéristiques du FCPE300 Kromaton® utilisé :

Caractéristiques FCPC Kromaton® Capacité de la colonne 303,5 ml Volume mort 72,8 ml Matériau du rotor Inox Nombre de disques de partition 7 Nombre de cellules 231 Volume d'une cellule 0,986 ml

V.1.2.6.5.2. Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC)

Le Chromatographe de Partage Centrifuge utilisé est un FCPC de chez Kromaton Technologies® (Angers, France). Il s’agit d’un appareil mono axe de capacité volumique de 200 ml environ, comportant un rotor issu de l’empilement de 20 disques en Acier inox 316 L dans lesquels sont gravés 1320 cellules de partage (66 cellules/disque). Les cellules de partage sont de géométrie rectangulaire légèrement inclinées par rapport au rayon du disque.

(a) (b)

Figure V-2 : (a) Rotor du FCPC, (b) photo d'un disque de partage.

Les principales caractéristiques de cet appareillage sont rassemblées dans le tableau ci- dessous.

Tableau V-3: Caractéristiques du FCPC Kromaton® utilisé :

Caractéristiques FCPC Kromaton® Capacité de la colonne 205 ml Volume mort 32,3 ml Matériau du rotor Acier Inox téflon Nombre de disques de partition 20 Nombre de cellules 1320 Volume d'une cellule 0,13 ml Pression maximum 60 bars Masse totale 90 kg Dimensions (L x P x H cm) 58 x 36 x 61

262

La chaîne chromatographique de CPC est automatisée et constituée des éléments suivants :

- une pompe gradient haute pression quatre voies P580HPG Dionex (Sunnyvale, CA, USA) - une valve d'injection "Dual mode" préparative PEEK 3125 Rheodyne (Rohnert Park, CA, USA) - un détecteur UV-visible Dionex, équipe avec une cellule préparative - un collecteur de fractions Pharmacia Superfrac (Uppsala, Sweden). L’ensemble de ces constituants est piloté par le logiciel Armen Glider®.

Les solvants utilisés pour la purification menée par la CPC sont l’acétate d’éthyle, le n- heptane provenant de Carlo Erba Reactifs SDS (Val de Reuil, France).

V.1.3. Méthodes physico-chimique

V.1.3.1. Pouvoir rotatoire

Les pouvoirs rotatoires spécifiques sont mesurés sur un polarimètre électronique Perkin- Elmer, Model 341 à 20°C en utilisant la raie D du sodium (λ=589 nm) comme source lumineuse. La cuve utilisée pour les différentes mesures a un volume de 1 ml et une longueur de 10 cm. Le pouvoir rotatoire spécifique [α]D, exprimé en degré, est calculé à partir de la formule suivante : [α]D =

(α : angle de rotation, en degré, lu sur le polarimètre, l : longueur, en dm, de la cuve de mesure, c : concentration de la molécule en solution en g/100 ml).

V.1.3.2. Spectrométrie Ultra-violette-visible (UV)

Les spectres UV des composés ont été mesurés dans le méthanol à l’aide d’un spectrophotomètre de type Shimadzu UV/Vis U-2450, double faisceau permettant des lectures directes contre témoin. Les mesures se font dans des cuves en quartz à trajet optique de 1 cm.

Les spectres d’absorbance UV des flavonoïdes, ont été enregistrés avec la présence des réactifs suivants :

- une solution d’AlCl3 5% dans le méthanol, - une solution d’HCl 50% v/v dans le méthanol,

263

- une solution de NaOH 2,5% dans l’eau, - une solution de NaOMe 2,5% dans le méthanol.

V.1.3.3. Spectrométrie de masse

Les spectres de masse en basse et haute résolution ont été enregistrés en électro-spray sur un appareil micromasse ESI-Q-TOF.micro (Manchester, UK).

V.1.3.4. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire

(RMN)

Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton et du carbone (RMN-1H et 13C) ont été enregistrés à 500 et 125 MHz sur un appareil BRUKER AVANCE DRX-500 ou à 600 et 150 MHz sur un appareil BRUKER AVANCE DRX-600 équipé d’une cryoplateforme. Les microprogrammes BRUKER et le logiciel de traitement des données Topspin 2.1 sont exploités. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane (TMS); les constantes de couplage sont exprimées en Hz.

Les échantillons ont été solubilisés dans les solvants deutérés CDCl3, DMSO-d6 et

CD3OD (précisés pour chaque produit) dans des tubes analytiques de 5 mm de diamètre.

Les programmes de séquences impulsionnelles standard fournies par Brüker ont permis de réaliser les expériences bidimensionnelles : COSY 1H-1H courte distance (2J, 3J), HSQC-J modulé 1H-13C direct (1J), HMBC 1H-13C (longue distance (2J, 3J, 4J), NOESY 1H- 1H ou ROESY 1H-1H (couplage à travers l’espace).

264

V.2. Extraction, purification et hydrolyse

V.2.1. Composés isolés des branches d’A. xerocarpa

L’extraction a été réalisée à l’aide de solvants de polarité croissante. Les branches réduites en poudre sèche (200 g) ont été macérées pendant une nuit avec 4 l d’éther de pétrole puis extraites par percolation goutte à goutte. Le filtrat obtenu a été mis sous vide pour donner 1,6 g de l’extrait éther de pétrole A.X.Br.EP (rdt= 0,8 %). Ensuite nous avons réalisé la même extraction en utilisant l’acétate d’éthyle pour donner 3,8 g, (rdt= 1,9%) de l’extrait

A.X.Br.AcOEt. Le marc séché a été mis en contact avec deux litres du mélange CH3OH/H2O (40:60) et extrait à reflux pendant 3h. Après filtration sur un verre frité, nous avons évaporé le filtrat pour obtenir l’extrait hydro-alcoolique A.X.Br.M (33,4 g) soit un rendement de 16,7%.

L’extrait acétate d’éthyle, sous forme de dépôt solide, a été soumis à une chromatographie Flash (CCF) sur silice (Reveleris® 40 g) éluée avec un gradient d’élution

CHCl3/n-C6H14 (20:80 à 100:0) pendant 30 minutes, ensuite par CHCl3/ACE (100:0 à 0:100) pendant 30 minutes. La détection est principalement effectuée par le DEDL. Les fractions recueillies (Tableau V-4) sont regroupées en fonction de leurs profils analysés par CCM avec l’éluant toluène/acétone (90:10).

Tableau V-4° : Fractionnement par CCF de l’extrait acétate d’éthyle des branches d’A. xerocarpa

n-C6H14/CHCl3/AcOEt/CH3OH Fractions Masse mg Produits isolés 80:20:0:0 1-29 118 xb2 30-33 114 34-43 167,7 0:100:0:0 44-57 184,5 58-70 109,9 71-89 165,3 90-91 77,3 0:0:100:0 92-97 121,8 xb1 & xb3 98-110 351,2

111-134 296,1 0:0:95:5 135-149 680 xb4 150-206 427,6

- Les fractions [1-29] ont donné le composé xb2 (53,3 mg) grâce à une purification par CCF sur silice (Reveleris® 4g). L’élution est effectuée avec un débit de 12 ml/min

avec le gradient CHCl3/n-C6H14 (00:100 à 40:60) pendant 20 minutes.

265

- Les fractions [92-97] ont été purifiées par CCF sur un gel de silice (Reveleris® 4g) éluée avec un débit de 15 ml/min avec le gradient toluène/AcOEt (100:00 à 70:30) pendant 35 minutes. De cette chromatographie les sous-fractions [23-30], éluées avec le mélange toluène/AcOEt (80:20), ont été purifiées de nouveau par CCF sur silice éluée par le gradient toluène/AcOEt (100:00 à 85:15) pendant 30 minutes pour donne xb3 (6,9 mg) dans les fractions [26-27]. Les sous fractions [20-23], éluées avec le mélange toluène/AcOEt (85:15), de cette dernière CCF ont été purifiées sur une colonne ouverte de silice éluée par le gradient toluène/AcOEt (100:00 à 93:7) pour obtenir les composés xb3 (3,3 mg, fractions [68-74]) et xb1 (3,3 mg, fractions [62- 64]).

- Les fractions [135-149] ont été purifiées par CCF (Reveleris® 12g) sur gel de silice

éluée avec le gradient CHCl3/CH3OH (100:00 à 85:15) pendant 20 minutes pour donner xb4 (6,2 mg) dans les fractions [36-40].

V.2.2. Composés isolés des feuilles d’Alphitonia xerocarpa

Les feuilles pulvérisées desséchées (150 g) ont été macérées à froid pendant une nuit avec 2,5 l d’éther de pétrole puis extraites par percolation goutte à goutte. Le filtrat d’éther de pétrole à été mis à sec à l'aide d'un évaporateur rotatif pour donner l’extrait A.X.F.EP (2,8 g) soit un rendement de 1,9%. La même procédure à été répétée avec 2,5 l d’acétate d’éthyle pour obtenir l’extrait A.X.F.AcOEt avec un rendement de 2,3% soit 3,5 g.

Les feuilles séchées sous la hotte, ont été mises en contact avec 2,5 l d’un mélange hydro-alcoolique MeOH/H2O (80:20) et extraites à reflux pendant 3h. Après filtration sur un verre frité, nous avons évaporé le filtrat pour obtenir l’extrait hydro-alcoolique A.X.F.M (52 g) soit un rendement de 35%.

V.2.2.1. Purification de l’extrait acétate d’éthyle A.X.F.AcOEt

Un fractionnement primaire sur une colonne de silice (150 g, Ø= 3,5 cm) a été effectué avec un gradient d’élution CHCl3/CH3OH (100:00 à 60:40). Les 3,5 g de l’extrait ont été déposés en tête de la colonne sous forme de dépôt solide mélangé avec de la silice. Les fractions récoltées de 200 ml sont regroupées en fonction de leurs profils chromatographiques 266

sur couche mince (CCM) en phase normale réalisés avec différents systèmes d’élution mentionnés ci-dessous (Tableau V-5).

Tableau V-5°: Fractionnement par CC de l’extrait acétate d’éthyle des feuilles d’A. xerocarpa.

CHCl3/CH3OH Fractions Masse (mg) Remarques/ Produits isolés Éluants des CCM 100:00 1-20 128,5 CyHex/AcOEt (90:10) Fractions non exploitables 21-36 31,9 99,5:0,5 CHCl /CH OH (97,5/2,5) 37-39 4,3 xf1 3 3

99:1 40-52 108,3 53-65 133 xf3 98:2 66-78 15,5 Fractions non exploitables 79-81 37,5 faible quantité 95:5 CHCl /CH OH (95:5) 82-89 276 Profil idem à celui de la 3 3 90:10 90-117 521,1 fraction (118-123) 85:15 118-123 380,8 xf2 124-126 237,7 xb4 80:20 127-138 127,3 Mélange complexe

139-150 152,7 inséparable 70:30 151-153 46,1 xf4 154-163 112,4 60:40 CHCl3/CH3OH/H2O 164-175 45,1 (70:30:5) 50:50 176-193 59,2 Fractions non exploitables 00:100 194-200 144,7

- Les fractions [37-39] ont donné le composé xf1 (2,8 mg) sans aucune purification supplémentaire.

- Les fractions [53-65] ont été chromatographiées sur une colonne de silice en phase normale (5g, Ø= 1,3 cm). L’élution est réalisée à l’aide de chloroforme avec une

addition progressive de méthanol (CHCl3/CH3OH 100:00 à 90:10) pour donner 4 mg de xf3 dans les fractions [37-40].

- Les fractions [118-123] ont été purifiées avec une simple précipitation dans un

mélange de (CHCl3/CH3OH 97,5:2,5) pour obtenir 207 mg de xb4 dans.

- Les fractions [124-126] ont subi deux étapes chromatographiques, la première est effectuée sur une colonne de silice en phase normale (8 g, Ø= 1,5 cm) avec un système

d’élution C7H8/CH3OH de polarité croissante (100:00 à 70:30). Issues de cette

colonne, les sous-fractions [91-103] éluée avec C7H8/CH3OH (98:2) ont été purifiées

sur une colonne de silice greffée C18 à l’aide d’un mélange de solvants CH3OH/H2O de polarité décroissante (60:40 à 100:00) afin d’isoler 2,5 mg de xf2 (fraction [247]).

267

- Sur les fractions [151-163] une première chromatographie a été effectuée sur un gel de

silice (5 g, Ø= 1,3 cm) élué par un gradient CHCl3/CH3OH (99:1 à 90:10) suivie par

une purification par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée C18

CH3OH/H2O (81:19 à 86:14) pendant 15 minutes des fractions [57-189] pour donner

le composé xf4 (7,5 mg, tr= 9,58 min).

V.2.2.2. Purification de l’extrait hydro-alcoolique A.X.F.M

Dans un premier temps nous avons procédé à un fractionnement par VLC à polarité de phases inversée C18 de 19 g de l’extrait hydro-alcoolique en utilisant le gradient (CH3OH/H2O 40:60 à 100:00). Des fractions de 350 ml ont été collectées et réunies après analyse par chromatographie sur couche mince (CCM) pour obtenir quatre lots présentant des profils plus au moins différents (Tableau V-6).

Tableau V-6°: Fractionnement par VLC de l’extrait hydro-alcoolique des feuilles d’A. xerocarpa.

CH3OH/H2O Fractions Masse (g) Observations à partir de CCM C18 (CH3OH/H2O 65:35) 40:60 xf.I 7,74 Mélange de produits polaires (sucres) et flavonoïdes 60:40 xf.II 5,9 Mélange de saponosides et flavonoïdes 80:20 xf.III 3,6 Mélange complexe de saponosides 100:00 xf.IV 0,88 Idem à celui de 80:20

V.2.2.2.1. Purification de la fraction xf.I

D’après l’analyse par CCM éluée avec le mélange CHCl3/CH3OH/H2O 1% TFA (70:30:5), cette fraction offre une teneur importante en flavonoïdes qui ont commencé à précipiter dans la chambre froide avant toute intervention séparative. Après filtration le précipité a donné le composé xf18. Nous avons procédé au fractionnement de 5 g de cette fraction sur une résine polymérique HP-20 à l’aide d’un gradient CH3OH/H2O (00:100 à 100:00) pour obtenir de nouveau le composé xf18 (Tableau V-7).

Tableau V-7: Fractionnement sur HP-20 de la fraction xf.I de l’extrait hydro-alcoolique des feuilles d’A. xerocarpa. Système d’élution Masse (g) Observations CCM (CHCl3/CH3OH/H2O 1% TFA (70:30:5) CH3OH/H2O 00:100 3,5 Produits polaires (sucres) 50:50 0,203 Présence dominante de xf18 100:00 0,371 xf18

268

V.2.2.2.2. Purification de la fraction xf.II

Pour commencer, 5 g de cette fraction ont été déposés en tête d’une colonne de silice

(150 g, Ø= 3,5 cm) et élués par le gradient CHCl3/CH3OH/H2O (100:00:00 à 60:40:7). Des fractions de 200 ml ont été recueillies et regroupées en fonction de leurs profils analysés par CCM (Tableau V-8).

Tableau V-8 : Fractionnement par CC de la fraction xf.II de l’extrait hydro-alcoolique des feuilles d’A. xerocarpa.

CHCl3/CH3OH/H2O Fractions Masse mg Observations Produits isolés 1-26 80,2 90:10:00 Fractions non exploitables 27-32 56,9 33-36 133,6 Mélange séparable xf5, xfm14-16

37-39 84,9 Mélange complexe faible quantité 80:20:00 40-42 123,4 deux lots des fractions sont xf10, xf20-22 43-45 160,7 réunis (mélange séparable) 46-48 425 70:30:00 49-56 1242 Contenant des produits déjà isolés de la fraction 80:20 57-61 519,7 62-71 378 70:30:1 72-78 317,5 Contenant des produits déjà isolés de la fraction 80:20 79-87 385,5 70:30:2 88-97 225,6 Mélange séparable xf5, xf7 98-114 278,9 Fractions non exploitables 70:30:5 115-116 188,3 Mélange séparable xf5, xfm19 117-119 323,5 Fractions non exploitables 120-122 390,6 60:40:7 123 94,2 Mélange séparable xf17, xf18 124-125 264,5 00:00:100 126-128 259,4 Fractions non exploitables

- Les fractions [33-36] (133,6 mg) ont été déposées sous forme de dépôt solide, après les avoir mélangées avec de la silice, sur une colonne de silice (5 g, Ø= 1,3 cm) et

éluées par un gradient CHCl3/CH3OH (90:10 à 80:20). Nous avons obtenu le composé

xf5 (13,3 mg), dans les fractions [90-103] éluées avec CHCl3/CH3OH (80:20). Les sous-fractions [44-52] issues de cette chromatographie, éluées avec le mélange

CHCl3/CH3OH (85:15), ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité de

phases inversée éluée en mode isocratique [CH3CN/H2O 0,025% TFA (35:65)]

pendant 20 minutes, pour donner 2,3 mg de xf14 (tr= 15,44 min), 5 mg de xf15 (tr=

16,62 min) et 11 mg de xf16 (tr= 17,5 min).

269

- Les fractions [40-45] (284,1 mg) ont été chromatographiées sur une colonne de silice

(13 g, Ø= 1,3 cm) éluée par un gradient C7H8/CH3OH (90:10 à 70:30). De cette colonne deux lots ont été soumis à une purification supplémentaire :

 les sous-fractions [40-54] (57,9 mg) éluées avec le mélange C7H8/CH3OH (85:15)

ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée C18,

éluée en mode isocratique [CH3CN/H2O 0,025% TFA (25:75)] pendant 25 minutes

pour conduire aux composés xf20 (8,5 mg, tr= 11,1 min), xf21 (10,5 mg, tr= 12,9

min) et xf22+xf21 (3,6 mg, tr= 13,1 min).

 les sous-fractions [55-64] (35,3 mg) élués avec le mélange C7H8/CH3OH (80:20) ont été purifiées par CCM préparative en phase normale en utilisant l’éluant

CHCl3/CH3OH/H2O (70:30:5) pour donner le composé xf10 (14 mg).

- Les fractions [88-97] (225,6 mg) ont été chromatographiées sur colonne de silice

greffée C18 éluée par le gradient CH3OH/H2O (30:70 à 70:30) pour donner le composé xf5 (7,6 mg) dans les fractions [71-73]. De cette chromatographie les sous-fractions

[74-79] (18,5 mg), éluées avec le mélange CH3OH/H2O (40:60), ont été purifiées par

CCM préparative éluée avec le mélange CHCl3/CH3OH/H2O (70:30:5) pour donner le composé xf7 (9 mg).

- Les fractions [115-116] (188,3 mg) ont été chromatographiées sur une colonne de

silice (8 g, Ø= 1,5 cm) éluée par un gradient C7H8/CH3OH (85:15 à 60:40), puis les sous fractions [43-81](26,2 mg), éluées de cette colonne avec le mélange

C7H8/CH3OH (75:25), ont été purifiées par CLHP semi-préparative sur RP C18 à l’aide

du gradient d’élution CH3CN/H2O 0,025% TFA (20:80 à 35:65) pendant 15 min pour

donner les composés xf19 (2,1 mg, tr = 8,23 min) et xf5 (3,8 mg, tr = 16.9 min).

- Les fractions [123-125] (358,7 mg) ont été soumises à une chromatographie sur silice

greffée C18 en éluant avec le gradient CH3OH/H2O (30:70 à 60:40). De cette

chromatographie les sous-fractions [55-67], éluées avec le mélange CH3OH/H2O

(45:55), ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée C18

en mode isocratique CH3CN/H2O 0,025% TFA (22:88) pour obtenir le composé xf17

(13 mg, tr= 19,75 min).

270

V.2.2.2.3. Purification de la fraction xf.III

Intéressés par sa richesse en saponosides nous avons purifié 3 g de cette fraction sur une colonne de silice en phase normale (100 g). Après avoir déposé l’échantillon sous forme de dépôt solide en tête de colonne, le fractionnement est réalisé en éluant avec un gradient de solvants CHCl3/CH3OH/H2O de polarité croissante (100:00:00 à 70:30:5). Des fractions de 135 ml recueillies ont été regroupées selon leurs profils similaires démontrés à l’aide d’une analyse par CCM (Tableau V-9).

Tableau V-9 : Fractionnement par CC de la fraction xf.III de l’extrait hydro-alcoolique des feuilles d’A. xerocarpa.

CHCl3/CH3OH/H2O Fractions Masse mg Observations Produits isolés 99,5:0,5 1-9 15,4 10-12 20

95:5 13 5,4

14-17 10,7

18-25 18,1

90:10 22-25 14 Faible quantité 26-29 10,3 30 5,3 31 29,6 Mélange complexe - faible quantité 32 139,5 xf6, xf11-12 33-34 178,6 xf6, xf11, xf13 80:20 35-39 346,1 xf5 40-42 191 43-44 97,1 Mélange séparable xf5, xf6, xf10 45-48 332 49-51 307 Profil identique à celui des 52-53 165 fractions précédentes 70:30 54-55 147,5 56-58 163,1 Mélange séparable xf5-9 59 109,8 60-64 174,3 Mélange séparable xfm2 70:30:1 65-67 54 Profil identique à celui des 68-73 73,4 fractions précédentes 74 32,3 70:30:5 75-80 66,8 Fractions non exploitables 00:100:00 81-82 18

- De la fraction [32] (139,5 mg) nous avons obtenu le composé xf6 (3,5 mg) grâce à une

purification sur une colonne de silice greffée C18 (6,5 g, Ø= 1,5 cm) réalisée en éluant

avec un gradient CH3OH/H2O (30:70 à 70:30). Les sous-fractions [161-182] (25,1 mg)

issues de cette colonne, éluées avec le mélange CH3OH/H2O (55:45), ont permis

d’isoler les deux composés xf11 (2,1 mg, tr= 6,7) et xf12 (5,5 mg, tr= 8,7). Ces

271

derniers ont été purifiés par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée C18

en utilisant un gradient d’élution CH3CN/eau 0,025% TFA (39:61 à 40:60) pendant 15 minutes.

- Il en est de même pour les fractions [33-34] (178,6 mg) desquelles le composé xf6 (4

mg) a été élué avec le mélange CH3OH/H2O (45:55) à travers une colonne de silice

greffée C18 (7,5 g, Ø= 1,5 cm). Cette purification est effectuée avec un gradient

CH3OH/H2O (40:60 à 80:20) en récoltant des fractions de 5 ml. Issues de cette

colonne les sous-fractions [59-63], éluées avec le mélange CH3OH/H2O (60:40), ont

subi une purification par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée C18

avec une élution isocratique [CH3CN/H2O 0,025% TFA (39:61)] pendant 15 minutes

pour obtenir 4 mg de xf11 (tr= 8,5 min) et 2,5 mg de xf13 (tr= 11,5 min).

- Les fractions [35-39] (346,1 mg) ont été chromatographiées sur une colonne de silice

(17 g Ø=1,8 cm) au moyen d’une élution avec le gradient CHCl3/CH3OH/H2O (100:00:00 à 70:30:5), des fractions de 20 ml ont été recueillies et réunies après analyse par CCM. De cette colonne les sous-fractions [47-54] (40,5 mg), éluées avec

le mélange CHCl3/CH3OH 80:20, ont été purifiées par CLHP sémi-préparative à

polarité de phases inversée C18 avec une élution utilisant un gradient CH3CN/H2O

0,025% TFA (35:65 à 45:55) pendant 15 minutes, le composé xf5 (2,7 mg, tr= 14,17) est ainsi isolé.

- A partir des fractions [40-48] (260,1 mg) nous avons obtenu le produit majoritaire xf6

(98,6 mg) par chromatographie sur colonne de silice greffée C18 (18 g, Ø= 2 cm) en

éluant avec un gradient CH3OH/H2O (40:60 à 70:30). De cette colonne, deux lots de sous-fractions ont été purifiés différemment :

 les sous-fractions [110-125] (31 mg), éluées avec le mélange CH3OH/H2O (50:50), ont subi une chromatographie sur colonne de silice (1,5 g, Ø= 1 cm) éluée avec un

gradient de CHCl3/CH3OH (90:10 à 85:15) pour isolé 3,1 mg de xf10 (fractions [15-36]).

 les sous-fractions [137-143] (54,8 mg), éluées par le mélange CH3OH/H2O (60:40), ont été chromatographiées sur gel de silice (2,7 g, Ø= 1 cm) à l’aide d’un

gradient d’élution CHCl3/CH3OH (100:00 à 70:30). Puis les regroupements [90-

137], issus de cette colonne avec le mélange CHCl3/CH3OH (85:15), ont été

272

purifiés par CCM préparative en utilisant un système d’élution

CHCl3/CH3OH/H2O 1% TFA (75:25:3) pour donner xf5 (7,7 mg).

- Les fractions [56-59] (272,9 mg) ont été chromatographiées sur gel de silice greffée

C18 (7,8 g, Ø= 1,5 cm) à l’aide du gradient d’élution CH3OH/H2O (30:70 à 90:10), puis trois lots de sous-fractions recueillies ont subis des purifications supplémentaires:

 les sous-fractions [62-108] (37,8 mg), éluées avec le mélange CH3OH/H2O (30:70), ont été purifiées par CCM préparative en phase normale (20 mg par

plaque 20x20 cm) éluée dans un système de solvants CHCl3/CH3OH/H2O 1% TFA (70:30:5) pour donner xf7 (10 mg) et xf5 (12 mg).

 les sous-fractions [142-156] (33,4 mg), éluées avec le mélange CH3OH/H2O (50:50), ont donné le composé xf6 (16 mg) suite à une purification sur gel de silice

(2,5 g, Ø= 1 cm) éluée avec le gradient CHCl3/CH3OH (90:10 à 70:30).

 les sous-fractions [171-174] (35 mg), éluées avec le mélange CH3OH/H2O (80:20), ont été chromatographiées sur un gel de silice (1,5 g Ø= 1 cm) pour donner les composés xf8 et xf9 en mélange inséparable (6 mg).

V.2.3. Composés isolés des écorces d’Alphitonia xerocarpa

Après les avoir séchées et pulvérisés, 500 gr des écorces ont été extraites à reflux pendant 3h à l’aide du mélange hydro-alcoolique CH3OH/H2O (80:20). Après filtration sur un verre fritté, nous avons évaporé le filtrat pour obtenir l’extrait hydro-alcoolique A.X.E.M (85 g) soit un rendement de 17%. Ensuite nous avons procédé au fractionnement par VLC de 80 g de l’extrait A.X.E.M en deux fois sur un gel de silice (400 g à chaque fois) en éluant avec le gradient CHCl3/CH3OH (100:00 à 00:100). Les fractions recueillies sont regroupées et analysées par CCM (Tableau V-10).

Tableau V-10 : Fractionnement par VLC de l’extrait hydro-alcoolique des écorces d’A. xerocarpa. Système d’élution Fractions Masse (g) Observations-CCM

CHCl3/CH2OH 100:0 xe.I 3,2 Tritèrpènes 75:25 xe.II 13,5 Composés phénoliques 50:50 xe.III 23,7 Mélange de deux fractions voisines (II et IV) 25:75 xe.IV 15,6 saponosides 0:100 xe.V 8,9 Idem IV

273

V.2.3.1. Purification de la fraction xe.I

Un dépôt solide de 3 g de cette fraction xe.I a été préparé avec de la silice, puis soumis à une chromatogaphie flash (CCF) sur une cartouche de silice (Reveleris® 40 g) éluée avec un débit de 35 ml/min par le gradient CHCl3/n-C6H14 (0:100 à 100:0) pendant 20 minutes, ensuite par CHCl3/AcOEt (100:0 à 0:100) pendant 15 minutes. La détection est principalement effectuée par le DEDL (ELSD: Evaporative Light Scattering Detector) et par UV à deux longueurs d’ondes (205 nm & 254 nm). Les fractions recueillies sont regroupées en fonction de leurs profils CCM analysés avec l’éluant CHCl3/CH3OH (95:5) (Tableau V-11).

Tableau V-11 : Fractionnement par CCF de la fraction xe.I de l’extrait hydro-alcoolique des écorces d’A. xerocarpa. n-C6H14/CHCl3/AcOEt/CH3OH Fractions Masse mg Observations Produits isolés 80:20:0:0 1-8 8,4 9-12 103,8 Mélange séparable xb2 & xe1 13-17 116,5 0:100:0:0 18-21 74,6 mélange complexe 22-29 127,5 30-42 46,1 0:0:100:0 43-48 98,6 49 150,3 produit majoritaire xb1

50-55 183,1 0:0:95:5 56-70 355,9

- Les fractions [9-12] ont été soumises à une CCF sur silice (cartouche 4 g) éluée avec

un débit de 13 ml/ min à l’aide d’un gradient CHCl3/n-C6H14 (10: 90 à 40:60) pendant 40 minutes, pour donner xb2 (57,9 mg, fractions [13-18]) et xe1 (4,3 mg, fractions [21-22]). - La fraction [49] a été purifiée par une simple précipitation dans le mélange

CHCl3/CH3OH (95:5) pour donner 59 mg de xb1.

V.2.3.2. Purification de la fraction xe.II

Les 13,5 g sont soumis à une VLC sur gel de silice (135 g) éluée avec un gradient

CHCl3/CH3OH (Tableau V-12). Des fractions de 300 ml sont récoltées et analysées par CCM pour donner cinq sous-fractions (xe.II-1 à xe.II-5).

274

Tableau V-12 : Fractionnement par VLC de la fraction xe.II de l’extrait hydro-alcoolique des écorces d’A. xerocarpa. Système d’élution CHCl3/CH2OH Fractions Masse (g) Observations-CCM 100:00 xe.II-1 1,3 Composés peu polaires 90:10 xe.II-2 2,8 // 80:20 xe.II-3 3,2 Composés phénolique 50:50 xe.II-4 3,1 Idem xe.II-3 00:100 xe.II-5 0,6 Fraction non exploitable

- La sous-fraction xe.II-3 a été chromatographiée sur un gel de silice (100 g, Ø= 3,5

cm) élué avec un gradient CHCl3/CH3OH (100:00 à 75:25) et deux lots de fractions issus de cette colonne ont subi des purifications supplémentaires en phases inverse :

 les sous-fractions [44-49] (834 mg), éluées avec le mélange CHCl3/CH3OH

(85:15), ont été purifiées sur une colonne de silice greffée C18 (35g, Ø= 2,2 cm)

éluée avec le gradient CH3OH/H2O (10:90 à 50:50) pour donner les composés xe4 (5,5 mg, fraction [4]), xe5 (6,6 mg, fractions [22-24]) et xe2 (236 mg, fractions [48-54]) en mélange racémique.

 les sous-fractions [53-62] (530 mg), éluées avec le mélange CHCl3/CH3OH (80:20), ont été soumises au même procédé que celui utilisé afin de purifier le lot précédent, pour isoler les composés xe7 (3,4 mg, fractions [8-9]), xe6 (2,5 mg, fractions [10-11]), xe3 (25,3 mg, fractions [33-39]) et xe2 (11,4 mg, fractions [45- 47]).

V.2.3.3. Purification de la fraction xe.IV

Sur une colonne de silice greffée C18 (50 g, Ø= 2,5 cm) pré-conditionnée avec le mélange CH3OH/H2O (40:60), nous avons déposé 1g de la fraction xe.IV mélangé avec de la silice greffée C18 sous forme de dépôt solide pour être par la suite éluée avec le gradient

CH3OH/H2O (40:60 à 90:10). Des fractions de 15 ml ont été récoltées et réunies en fonction de leurs profils analysés par CCM (Tableau V-13).

275

Tableau V-13 : Fractionnement par CC de la fraction xe.IV de l’extrait hydro-alcoolique des écorces d’A. xerocarpa. CH3OH/H2O Fractions Masse mg Observations Produits isolés 1-4 433,9 Sucres - 5-8 112,5 Fractions non exploitables - 40:60 9-12 33,4 Mélange séparable par CLHP xf18 13-14 9,2 Faible quantité* - 15-20 24,5 Mélange complexe-faible quantité - 21-27 88,6 Produit pur xf7 50:50 28-39 20,7 Faible quantité* - 40-41 65 Mélange séparable par CLHP xem10 60:40 42-44 156,4 Produits déjà isolés des feuilles dont un majoritaire xf6 45-49 26,1 Faible quantité* - 50-52 99,6 xf8 et le xf9 en mélange inséparable 70:30 53-55 12,4 Fractions non exploitables 90:10 56-65 6,9 (traînées)

- Une analyse des fractions [9-12] par CCM à polarité de phases inversée C18

[CH3OH/H2O (60:40)] a démontré une présence dominante d’un produit majoritaire qui a été purifié par la suite sur une colonne de silice pour donner le composé xf18

élué avec le mélange CHCl3/CH3OH (75:25).

- Les fractions [21-27] ont donné le composé xf7 (88,6 mg) sans aucune purification supplémentaire.

- Les fractions [40-41] (65 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité

de phases inversée C18 en utilisant un gradient d’élution CH3CN/H2O 0,05% TFA

(10:90 à 50:50) pendant 15 minutes pour donner le composé xe8 (8 mg, tr=12,8 min).

- Les fractions [42-44] (156,4 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative à

polarité de phases inversée à l’aide du gradient d’élution CH3CN/H2O 0,025% TFA

(45:55 à 60:40) pendant 10 minutes pour donner le composé xf6 (13 mg, tr=6,8 min).

- Malgré la quantité considérablement importante du mélange de xf8+xf9 que nous avons obtenue à partir des fractions [50-52], aucun essai pour les séparer n’a pu aboutir.

Certaines fractions ont montrées des profils intéressants par CLHP analytique, malheureusement faute de quantité aucune purification n’a pu être réalisée. Pour cela nous avons procédé à un fractionnement par CLHP préparative à polarité de phases inversée C18 de la fraction xe.IV (2 g). Une colonne de silice greffée C18 (160 g, Ø= 5 cm) maintenue sous contre pression (90 bar) a été éluée avec un débit de 120 ml/min du gradient CH3OH/H2O 276

(20:80 à 70:30). Des fractions de 100 ml ont été recueillies et regroupées en fonction de leurs profils analysés par CCM CHCl3/CH3OH/H2O 1,1% TFA (70:30:5) (Tableau V-14).

Tableau V-14 : Fractionnement par CLHP-préparative à polarité de phases inversée de la fraction xe.IV de l’extrait hydro-alcoolique des écorces d’A. xerocarpa. CH3OH/H2O Fractions Masse mg Observations Produits isolés 20:80 7-20 127,4 Fractions non exploitables 30:70 21-31 64,5 (sucres) 32-34 49 Mélange séparable xfm14 40:60 35-38 71,6 39-40 26,6 Mélange contenant des produits déjà isolés 41-42 67 43-44 324 50:50 45-46 179 xf5, xf7 Mélange séparable 47-48 92,6 xe9-12 49-52 154,2 Mélange contenant des produits déjà isolés 60:40 xf5, xf8+xf9 53-55 156,3 Mélange séparable xe13, xe14 70:30 56-57 84,2 Fractions non exploitables 58-67 17,2 (traînées)

- Les fractions [32-34] (49 mg) ont été purifiées par CLHP semi-préparative à polarité

de phases inversée C18 avec un gradient d’élution [CH3CN/H2O 0,025% TFA (18:82 à

22:78)] pendant 10 minutes pour donner le composé xf18 (8,9 mg, tr=10,4 min).

- Les fractions [45-48] (271,6 mg) ont subi une CCF sur silice (cartouche 12 g) et l’élution a été effectuée avec un débit de 15 ml/min en utilisant le gradient

CHCl3/CH3OH (100:00 à 80:20) pendant 40 minutes. Ensuite des sous-fractions éluées

(80-85) avec le mélange CHCl3/CH3OH (80:20), ont été purifiées par CLHP semi-

préparative à polarité de phases inversée C18 en utilisant un gradient d’élution

[CH3CN/H2O 0,025% TFA (45:55 à 60:40)] pendant 15 minutes suivie par un lavage à 100% avec de l’acétonitrile pendant 5 minutes, pour obtenir les composés xf7 (4,5 mg,

tr=5,4 min), xf5 (6,7 mg, tr=6,23 min), xe12 (7mg, tr=12,95 min), xe11 (10 mg,

tr=15,28 min), xe10 (1,3 mg, tr=18,4 min) et xe9 (1,6 mg, tr=19,8 min).

- Les fractions [53-55] ont donné cinq composés grâce à une purification par CLHP semi-préparative à polarité de phases inversée à l’aide d’un gradient d’élution

[CH3CN/H2O 0,025% TFA (40:60 à 50:50)] pendant 15 minutes pour donner le

mélange xf8+xf9 (4 mg, tr= 6,5 min), xf5 (6,3 mg, tr=8,25 min), xe13 (3,5 mg, tr= 14,9min) et xe14 (2,5 mg, tr= 15,2 min).

277

V.2.4. Extraction et purification des composés phénoliques des fruits d’Alphitonia neocaledonica

Les fruits secs broyés (475 g) ont été mis en contact avec 5 l de mélange MeOH:H2O (80:20) puis laissés macérer pendant une nuit. L’extraction a été effectuée à froid par percolation goutte à goutte à l’aide de 15 l du mélange hydro-alcoolique. Le filtrat a été concentré à 1 l d’eau à l’aide d’un évaporateur rotatif. Puis une extraction liquide-liquide a été effectuée à l’aide de trois solvants de polarité croissante, le cyclohexane, l’acétate d’éthyle et le n-butanol (3x1l de chaque) pour donner après évaporation les fractions correspondantes

A.N.Fr.Cyclohex, A.N.Fr.AcOEt, A.N.Fr.BuOH et A.N.Fr.H2O (Tableau V-15).

Tableau V-15 : Résultat de l’extraction liquide/liquide de l’extrait hydro-alcoolique des fruits d’A. neocaledonica Masse % l’extrait hydro- % matière Remarques (profils CCM & Extrait (g) alcoolique végétale CLHP) riche en acides gras non A.N.Fr.Cyclohex 0,75 0,40 0,16 exploitable A.N.Fr.AcOEt 3,6 1,94 0,76 Triterpènes Mélange des flavonoïdes et A.N.Fr.BuOH 41,2 22,19 8,68 polyphéols Tanins et produits très polaires A.N.Fr.H O 140,3 75,49 29,54 2 non exploitables A.N.Fr.MeOH+H2O 185,85 % 39,13

V.2.4.1. Purification de la fraction acétate d’éthyle

La fraction acétate d’éthyle (3,6 g), après dépôt sous forme solide, a été soumise à une chromatographie sur une colonne de silice (Ø 4 cm, 130 g) éluée avec un gradient d’élution

CHCl3:C6H12 (70:30 à 100:0), puis avec le gradient CHCl3:CH3OH (100:0 à 95:5), et pour finir avec 100% méthanol. Des fractions de 150 ml sont recueillies et regroupées en fonction de leurs profils analysés par CCM selon le tableau V-16.

278

Tableau V-16 : Fractionnement par CC de la fraction acétate d’éthyle des fruits d’A. neocaledonica

C6H12:CHCl3:CH3OH Fractions Masse Observations Produits (mg) isolés 30 :70 :00 1-7 116,4 Non exploitable 8-9 443,8 Mélange séparable nfr1 10-19 434,1 Profil idem à celui des 20-29 100,5 fractions 8-9 00 :100 :00 30-40 124,5 41 325,3 Produit pur xb3 42-44 659,3 Mélange séparable nfr2 00 :95 :5 45-56 108,5 Idem à celui de 42-44 Mélange complexe des 00 :00 :100 57-58 597,2 nfr3 produits polaires 59-63 3,7

- Les sous-fractions [8-9] (443,8 mg), éluées avec le mélange C6H12:CHCl3 25 :75, ont été chromatographiées sur une colonne de silice (Ø= 1,8 cm, 13,5 g) éluée au toluène

auquel nous avons ajouté progressivement de l’acétone selon le gradient C7H8:C3H6O 100:0 à 90:10 en sept étapes, pour donner 35,6 mg de nfr1 (élué avec le mélange

C7H8:C3H6O 97:3).

- La sous-fraction 41 (325,3 mg) renferme le composé pur xb3.

- Les sous-fractions [42-44] (659,3 mg) ont subi un fractionnement sur une colonne de

silice à l’aide du gradient d’élution C6H12:AcOEt de 90:10 à 0:100. Issues de cette dernière colonne, les sous-fractions [62-65] éluées avec 100 % d’AcOEt ont été purifiées par CCM préparative pour donner le composé nfr2 (6,5 mg) dans le système

d’élution C6H12:AcOEt:MeOH (60:40:1).

- Les sous-fractions [57-58] (597,2 mg) éluées au méthanol montrent une composition très complexe, malgré cela et vu la quantité importante nous avons procédé à une

purification en CLHP semi-préparative sur une colonne de silice greffée C18 éluée

avec un débit de 35 ml/min en utilisant un gradient d’élution CH3OH:H2O (20:80 à 100:00) et la détection est suivie à 254 nm. Les sous-fractions [111-113], éluées avec

le mélange CH3OH:H2O (90:10), ont été purifiées par CLHP semi-préparative à

polarité de phases inversée C18 à l’aide d’un gradient d’élution CH3CN:H2O 30:70 en mode isocratique pendant 10 min, puis (30:70 à 60:40) pendant 6 min, pour donner le

composé nfr4 (3,4 mg) avec un tr= 9,8 min.

279

V.2.4.2. Purification de la fraction butanolique

Compte tenu de la quantité abondante des tanins dans cet extrait (Figure II-147, page 193) et afin de faciliter les travaux de purification, nous avons cherché un fractionnement primaire afin de faciliter les étapes de purification suivantes.

Les différents supports séparatifs solides se sont avérés inefficaces faute de la forte solubilité des composées dans l’eau responsable de la mauvaise séparation sur des gels comme la silice gréffée C18 et la résine HP20, le deuxième problème est le piégeage de l’extrait dans la phase stationnaire (silice, sephadex); d’où l’intérêt d’exploiter les techniques de chromatographie liquide/liquide.

L’extrait, comme le montre son profil en CCM (Figure II-147, page 193), présente trois zones des produits ayant des polarités différentes, d’où l’intérêt d’utiliser un système de solvant triphasique afin d’assurer une zone de polarité suffisante pour l’élution des produits.

V.2.4.2.1. Choix d’un système d’élution

Le système choisi est une combinaison entre deux systèmes différents n- heptane/acétonitrile (non polaire) et méthyle tert-butyle éther (MtBE)/eau (polaire). Il a été préparé en deux étapes :

- les quatre solvants avec des proportions équivalentes, n-heptane/MtBE/CH3CN/eau (1/1/1/1, v/v) 600 ml de chaque, sont mélangés dans une ampoule à décanter et laissés reposer afin d’assurer le bon équilibre et la bonne saturation, puis la phase supérieure a été récupérée.

- les deux phases inter & inf sont remises en contact et un volume de 600 ml de MtBE a été ajouté au mélange. A la fin de l’équilibre les deux phases sont récupérées et un dosage des solvants a été effectué par RMN pour déterminer les compositions des différentes phases obtenues (Tableaux II-29 et II-30, page 195).

V.2.4.2.2. Préparation de l’échantillon

4 g de l’extrait a été solubilisé dans 30 ml du mélange (ϕ inf /ϕ sup 80 :20).

280

V.2.4.2.3. Conditions expérimentales de l’élution

Le remplissage de la colonne de 300 ml a été faite à l’aide de la phase inférieure (600 ml au moins) avec une rotation minimale de la colonne avec 200 rpm.

La rotation a été augmentée jusqu’à arriver à 1000 rpm, l’injection de l’échantillon dans la colonne a été effectuée en mode ascendant à l’aide de la phase supérieure avec un débit en gradient de 0 à 20 ml/min pendant 2 minutes, le débit de 20 ml/min a été maintenu durant l’analyse.

Avec un taux de rétention de phase stationnaire de 65%, l’élution par la phase supérieure était d’une durée de 27 min afin d’éluer les triterpènes, puis l’élution par la phase intermédiaire a été procédé pendant 30 minutes. Ensuite afin de récupérer les produits polaires piégés dans la colonne nous avons procédé à un dual-mode basé sur l’échange des rôles de deux phases en pompant la phase inférieure en mode descendant pendant 15 minutes. Le rendement final par rapport à l’extrait de départ était de 72,2%.

Le fractionnement est suivit à la longueur d’onde de λ=254 nm (Figure V-3) et les fractions collectées sont analysées par CCM (Figure V-4) puis regroupées selon leur profil chromatographique (Tableau V-17). Les fractions ainsi regroupées ont été purifiées par CLHP semi-préparative.

4000 EPC_alphitonia #13 Alphitonia 4g triphasique revisit 2eme 21/12/2011 UV_VIS_1 mAU WVL:254 nm

3000

2000

1000

-1000

-2000

-3000 min 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 70,0 75,0 80,0 85,0 90,0 98,7 Figure V-3 : Chromatogramme du fractionnement effectué par CPE (λ=254 nm)

Le premier pic négatif observé de 16 min à 22 min, correspond aux produits triterpéniques non visibles à cette longueur d’onde (254 nm), ce signal peut être expliqué par l’apparition d’une émulsion formée à cause d’une forte concentration des triterpènes présents 281

dans un mélange de deux phases, concernant le pic large apparu vers 50 minutes, il correspond au passage des flavonoïdes et les composés phénoliques moyennement polaires. Suite à l’application de dual-mode à t = 57 min, les tanins retenus dans la phase stationnaire ont été élus.

Figure V-4 : CCM analytique du fractionnement effectué en CPE.

Tableau V-17 : Fractionnement en CPE de la fraction butanolique des fruits d’A. neocaledonica. Fractions Masse (mg) Fractions Masse (mg) fr1 471 fr5 87,8 fr2 30,4 fr6 149,9 fr3 151,2 fr7 140,5 fr4 96,8 fr8 1761,3

Toutes les sous-fractions obtenues ont été analysées par CLHP analytique à polarité de phases inversée, les sous-fractions fr3-fr6 semblent être exploitables.

- Les sous-fractions fr3 et fr4 ont été purifiées par CLHP semi-préparative à travers une ® colonne de silice greffée C18 (Luna 250x15 mm) éluée avec un débit de 5ml/min par

le gradient CH3CN:H2O 0,025% TFA (7:93 à 20:80) pendant 25 min puis de 20:80 à

25:27 pendant 7 min pour donner 10,1 mg de nfr5 (tr= 29,2 min) et 14,1 mg de nfr4

(tr= 33,5 min), cette purification n’était pas assez efficace pour purifier les produits phénoliques présents (Figure II-150, page 197) qui seront purifier grâce à une séparation par CPC que nous aborderons plus tard.

- La sous-fraction fr5 a été purifiée sur la même colonne éluée avec un débit de 5ml/min

par le gradient CH3CN:H2O (10:90 à 23:77) pendant 5 min puis de 23:77 à 27:73 pendant 4 min, ce mélange a été maintenu pendant 14 min pour donner 2,4 mg de nfr6

(tr= 15,5 min) et 3,1 mg de nfr8 (tr= 21,4 min).

282

- Le même procédé appliqué à la sous-fraction fr6 nous a donné 2,2 mg de nfr7 (tr=

11,1 min), 13,1 mg de nfr6 (tr= 15,2 min) et 2,8 mg de nfr8 (tr= 21,1 min).

Dans le but de purifier les composés phénoliques, les deux sous-fractions fr3 et fr4, issues d’un deuxième fractionnement effectué par EPC dans les mêmes conditions que précitées, ont été regroupées (290 mg) et soumises à une purification par CPC en utilisant le système n-heptane:AcOEt:MeOH:H2O (1:9:1:9) [231].

Après le remplissage de la colonne par la phase aqueuse, elle a été maintenue sous rotation à 1200 rpm.

Les deux sous-fractions fr3 et fr4, solubilisées dans 20 ml (80:20 ϕ aqueuse : ϕ organique), ont été injectées et éluées avec un débit de 4 ml/min par la phase organique en mode ascendant (37 bars) pendant 3h, puis un dual-mode a été procédé en pompant la phase aqueuse en mode descendant (27 bars) pendant 50 min, des fractions de 4 ml ont été récoltées. Le suivi de l’analyse est effectué par une détection à deux longueurs d’onde (205 et 254 nm) et par CCM (Figure II-150, page 197). Le taux de rétention de la phase stationnaire était de 72%.

Les produits recherchés ont été élués avec la phase aqueuse et nous obtenons un mélange de (+) gallocatéchine nfr9 (8,5 mg) pur dans les fractions [184-185] et du flavonoïde nfr4 (15 mg) dans les fractions [109-202].

Les sous-fractions [186-192] (27,5 mg) ont subies une deuxième purification à travers une colonne de CLHP sur silice greffée C18 éluée avec un débit de 4 ml/min en utilisant un gradient du mélange CH3CN/H2O (Figure V-5), pour donner 2,4 mg de nfr9 (tr= 6,8 min) et 5 mg de nfr5 (tr= 20,1 min).

30 23 min, 25 % 25 13 min, 23%

15 t min t 10 10 min, 10% 0 min, 10 % 5 0 0 5 10 15 20 25 CH3CN %

Figure V-5 : Gradient d’élution utilisé en CLHP sémi-préparative.

283

V.2.5. L’hydrolyse

1g de chaque extrait méthanolique (X.F.M, X.E.M, N.Fr.M) et 200 g de l’extrait acétate d’éthyle des feuilles d’A xerocarpa (X.F.A) ont subit une procédure d’hydrolyse acide. Chaque extrait a été mis en contact avec 25 ml (TFA 2N) et chauffé à reflux pendant 4h. Après refroidissement, le mélange a été soumis à une extraction liquide-liquide à l’aide de l’acétate d’éthyle. Les deux phases ont été mises à sec pour donner les génines (la phase AcOEt) et les sucres (la phase aqueuse). Les mélanges bruts des sucres ont été analysés par

CCM sur silice en utilisant l’éluant MeCOEt/isoPrOH/MeCO/H2O (20:10:7:6).

Les différents sucres ont été purifiés par CLHP semi-préparative sur une colonne spécifique ROA (250x15 mm, T= 35°C) éluée avec un débit de 3,5 ml/min d’une solution

(eau 0,25 µM H2SO4) en mode isocratique, la détection est effectué par un détecteur à indice de réfraction RI (410, T=35°C).

Les différentes fractions recueillies ont été neutralisées à l’aide d’une solution de KOH (50 mM) en suivant la variation de pH par un pH-mètre. Les solutions ont été mises à sec et les sucres ont été solubilisés dans la pyridine puis la solution a été filtré sur fritée N°4.

Après l’évaporation de la pyridine, les sucres obtenus ont été solubilisés (0,1-0,5 mg/ml) avec le mélange n-C6H14/EtOH/TFA 70:30:1 pour être analysés par CLHP analytique sur une colonne chirale CHIRALPAK® ICA. L’élution est effectuée avec un débit de 0,5 ml/min du mélange n-C6H14/EtOH/TFA (80:20:0,1) en mode isocratique.

284

V.3. Tests biologiques

V.3.1. Activité antioxydante

Une solution mère de DPPH est préparée à 316 µM dans l’éthanol à 99°. Elle peut être conservée pendant un mois maximum à 4°C à l’abri de la lumière. Puis une solution à 158 µM est préparée extemporanément par une dilution au demi de la solution mère avec de l’eau distillée (50% de l’éthanol dans la solution de test).

Le témoin positif : une solution mère d’acide ascorbique à 4 mg/ml est préparée dans le DMSO, puis la solution témoin est préparée par une dilution au 1/40 (soit 5µg/ml dans les puits = CI50).

Les solutions d’échantillons sont préparées en série de dilutions à partir d’une solution mère de 4 mg/ml de DMSO détaillée dans le tableau V-18.

Les solutions d’échantillons sont préparées à partir des extraits bruts acétates d’éthyle et les extraits hydro-alcooliques des feuilles, écorces et branches d’A. xerocarpa en plus de celles des fruits d’A. neocaledonica.

Tableau V-18: Préparation des gammes de dilution des échantillons. Solutions préparées Concentration finale dans les puits 4mg/ml DMSO (S1) 200 µg/ml 0,5 ml (S1) +0,5 ml DMSO →(S2) 100 µg/ml 0,5 ml (S2) +0,5 ml DMSO→ (S3) 50 µg/ml 0,2 ml (S2) +0,8 ml DMSO →(S4) 10 µg/ml 0,5 ml (S1) +0,5 ml DMSO →(S5) 5 µg/ml

Des plaques 96 puits ont été utilisés (Greiner® F bottom), et la lecture a été réalisée sur le lecteur de microplaque (FLUOstar® Omega).

Dans les puits de 100µl, nous introduisons 95 µl de solution DPPH à 158 µM (150 µM dans les puits) + 5 µl de solution d’échantillon, ou du témoin positif (ac. ascorbique) ou du témoin négatif (5µl DMSO).

Pour chaque échantillon (préparés en triplicates), nous préparons des puits blancs (sans DPPH) pour éliminer l’absorbance propre à l’échantillon.

La lecture des plaques se fait à 37°C à λ=515 nm en mode cinétique pendant 30 minutes.

285

V.3.2. Activité antityrosinase

Le dopachrome (dopaquinone), indicateur de l’activité oxydative de la tyrosinase, absorbe la lumière à 480 nm, donc la formation de cette molécule peut être suivie par spectrophotométrie.

Pour cette mesure nous utilisons les réactifs et appareils suivants :

- L-Dopa (Sigma®), acide kojique (Figure V-6) (Alfa Aesar® GmbH&Co KG), Tyrosinase (Sigma Aldresh®), - pHmètre (pH 510, Syberscan, EUtech instruments), - Des plaques 96 puits ont été utilisés (Greiner® F bottom), et la lecture a été réalisée sur le lecteur de microplaque (FLUOstar® Omega).

V.3.2.1. Préparation des solutions - Le tampon PBS avec lequel les solutions seront préparées, dont le pH est ajusté par pH-mètre à 6,8, est préparée à partir d’une solution de phosphate disodique

(Na2HPO4.12H2O) à 0,02M et d’une solution d’acide citrique monohydrate

(C6H8O7.H2O) à 0,01 M. - La L-Dopa (Sigma®) à 0,5 mM dans le PBS, utilisée comme substrat de l’enzyme. - Une solution mère de la tyrosinase à 1350 U/ml dans le PBS (conservée pendant 2 jours dans le congélateur), la solution de test à 135 U/ml est à préparer extemporanément par une dilution au 1/10.

- Une gamme de dilution de l’acide kojique (C6H6O4, inhibiteur de référence, Figure IV-9) dans le PBS à 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM, 0,125 mM et 0,0625 mM. - Les échantillons : les solutions mères sont préparées dans le DMSO 10% dans l’eau pour les extraits (4 mg/ml) et les produits purs (1 mg/ml).

O CH2OH

O Figure V-6: Structure de l’acide kojique.

286

Les solutions d’échantillons sont préparées et testées en trois étapes :

1) Les extraits acétate d’éthyle et les extraits hydro-alcooliques des trois parties étudiées d’A. xerocarpa, plus la fraction butanolique des fruits d’A. neocaledonica. 2) Les sous-fractions issues d’un fractionnement par EPC : fr1, fr3, fr4, fr5 et fr6. 3) Les produits purs obtenus de la sous-fraction fr1 (xb3 et nfr1), plus l’acide céanothique (xb1), l’acide 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique (xb2) et l’acide céanothénique (xb4), représentant les produits majoritaires isolés respectivement des écorces, branches et feuilles d’A. xerocarpa.

V.3.2.2. Préparation des plaques

Pour chaque échantillon à tester en triplicates (Tyrosinase+échantillon DMSO10%+substrat), trois puits de blancs sont à prévoir (PBS+échantillon DMSO10%+ substrat).

Pour chaque plaque nous préparons en triplicate également : un Blanc (B) (PBS+DMSO10%+ substrat), témoin négatif (A) (PBS+Tyrosinase+ substrat), et l’acide kojique en référence.

L’ajout des différentes solutions se fait selon l’ordre suivant : A (µl) B (µl) C (µl) D (µl) Tyrosinase à 135 U/ml 100 - 100 - Echantillon dans le DMSO 10% dans l’eau - - 100 100 PBS 100 100 - 100 DMSO 10% dans l’eau - 100 - - 10 minutes du repos à 25°C L-Dopa (0,5 mM) 100 100 100 100 10 minutes repos, lecture à 475 nm

La tyrosinase est mise à incuber pendant 10 minutes à 25°C avec les produits à tester (C) ou le tampon seul (A) puis la L-Dopa est ajoutée. Après 10 minutes d’incubation à 25°C (dans le cas où on ne mesure pas une cinétique) l’absorbance est mesurée à 475 nm.

Le pourcentage de l’inhibition est calculé selon la formule suivante:

% inhibition= [[(A-B)-(C-D)]/(A-B)] x 100

287

V.3.3. Activité antiproliférative

V.3.3.1. Lignées cellulaires, matériaux, milieux et les produits à tester

Les lignées cellulaires et les milieux de cultures utilisés pour l’expérience sont :  Les cellules cancéreuses KB (ATCC® CCLTM-17), carcinome épithéliale.  Le WST-1 de chez Roche, Meylan-France.  Le milieu DMEM (Dulbecco Minimum Essential Medium), DMEM F12, sérum de veau fœtal et la trypsine de chez Gibco-Invitrogen, France.  Les boîtes de culture Nunc (25 cm2) de chez Dutscher, France. 20 produits purs ont été testés :  10 saponosides (dont deux en mélange 50 :50 xf8+xf9), xf6, xf7, xf10, xf16, xf17, xe8, xe11 et xe12).  8 triterpènes xb1-xb4, xf4, nfr1, nfr2 et xe1.  2 produits phénoliques : xe2 et xe3. -hédérine commerciale (Sigma) a été utilisée comme témoin. Ce saponoside synthétisé au laboratoire a été évalué précédemment pour son activité

cytotoxique sur les mêmes cellules KB et présente une CI50 de 5,5µM [102].

V.3.3.2. Test WST-1

288

NO2 NO2

Succinate dh ydr ogn ase NA D N A D H

I I EC -H EC N NH N N N N N N

SO3 Na SO3 Na

W ST -1 Form azan

Schéma V-1 : Schéma de réduction de WST-1 en Formazan.

V.3.3.3. Mode opératoire

Les cellules KB (ATCC® CCLTM-17) sont cultivées dans 5 ml de milieu DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal, dans des boîtes Nunc de 25 cm2. L’entretien est réalisé 2 fois par semaine à raison d’une dilution de la population cellulaire au 1/10, après trypsinisation.

Pour les tests, nous avons d’abord standardisé les conditions de culture de manière à utiliser des cellules en phase proliférative : après trypsinisation et comptage en cellule de malassez, les cellules sont ensemencées à 100x103 ₵/ml en milieu DMEM/ SVF et utilisées après 72h de culture.

Les tests ont été effectués en 2 temps. Tout d’abord, tous les produits ont été évalués à une concentration de 10µg/ml en milieu DMEM F12, ce qui permet de ne pas utiliser de SVF, qui peut interagir avec les produits testés [102]. Ensuite, en fonction des résultats obtenus, une gamme de concentration adaptée a été faite pour déterminer les CI50 des produits actifs. - Les tests sont faits en microplaque 96 puits à raison de 200 µl/puits d’une suspension ajustée à 50x103 ₵/ml en triplicates. - Après 24 h d’incubation, les cellules ont adhéré et nous retirons délicatement le milieu (DMEM+10% SVF) qui est remplacé par 200 µl de chaque produit à une concentration de 10 µg/ml préparée dans le milieu DMEM F12. Les solutions de produits étant initialement préparées dans du DMSO, un contrôle de ce composé est fait à sa concentration finale soit 1%. La croissance témoin des cellules est obtenue en 289

présence de DMEM F12. Un crontrôle positif est effectuée en mettant par plaque une solution d’α-hédérine à 10 µg/ml. - Après incubation de 48h avec les échantillons, nous ajoutons 20 µl de la solution WST-1 [4-[3-(4-iodophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene- disulfonate, qui sous l’action de succinate déshydrogénase est réduit en dérivé

formazan détecté par spectrophotométrie à λmax= 450 nm. - L’ensemble est incubé à nouveau pour une durée de 2h. - Une agitation d’une durée de 30 secondes suivie par une lecture à la longueur d’onde 450 nm sont effectuées à l’aide d’un lecteur microplaque (FLUOstar® Omega) EA 4691 BIOS "Biomatériaux et Inflammation en site osseux" UFR Pharmacie-URCA, C. Guillaume, Pr. S. Gangloff.

Le pourcentage d’inhibition de prolifération cellulaire est calculé grâce à la formule suivante

% d’inhibition = x 100

DO.témoin : densité optique obtenue avec des cellules KB non-traitées avec la présence de DMSO en proportion équivalente de celle des puits à tester.

DO.testé : densité optiques obtenue avec des cellules KB traitées.

DO.blanc : densité optique obtenue du WST-1 avec le milieu de culture seul.

Pour les produits présentant une activité inhibitrice d’au moins 50%, nous avons réalisé des gammes de dilution (1, 2, 3, 4, 5, 6 µg). Les solutions préparées sont testées selon le protocole précité et une gamme de dilution de DMSO correspondant à ses concentrations finales est utilisée en contrôle.

La valeur de l’CI50 est déterminée selon la méthode précédemment décrite [232].

V.3.4. Activité antibactérienne

V.3.3.1. Microorganismes, matériaux, milieux et les produits testés

Les souches bactériennes utilisées dans cette étude sont des souches références : Staphylococcus aureus ATCC 25923 et Enterococcus faecalis CIP10907 qui sont des

290

bactéries à Gram positif et Escherichia coli ATCC 2592 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 qui sont des bactéries à Gram négatif.

Dix-huit produits purs isolés ont été testés selon la méthode de diffusion en milieu gélosé:

- huit triterpènes (xb1-xb4, xf3, xf4, xe1 et nfr2); - huit saponosides dont deux en mélange (xf8+xf9) et (xf5-xf7, xf10, xf17 et xe11); - deux dérivés phénoliques : le lyonirésinol (xe2) et la maesopsine 4-O-glucoside (xe3).

La détermination de la CMI est effectuée pour quatre produits (xb2, xb4, xf4 et nfr2).

V.3.3.2. Technique de diffusion en milieu gélosé (Antibiogramme)

V.3.3.2.1. Préparation de la suspension bactérienne

Les bactéries sont ensemencées sur une gélose nutritive à partir du stock de bactéries congelées à -80°C. Après avoir vérifié l’aspect macroscopique des colonies et l’aspect microscopique après coloration de Gram, deux petites colonies (ou une grande colonie) sont prélevées, à l’aide d’une anse stérile et dispersées dans 10 ml de l’eau stérile pour préparer les suspensions de chacune des quatre souches. La densité de la suspension est ajustée à 0,5 McFerland à l’aide d’un refractomètre, puis une dilution supplémentaire au 1/10 est effectuée pour les bactéries à Gram négatif (E.coli et P. aeruginosa).

V.3.3.2.2. Préparation des boîtes de Pétri

Le milieu MH gélosé en surfusion a été coulé en boîtes de Pétri (20 ml par boîte), et laissé à refroidir préalablement à tout ensemencement.

L’ensemencement des boîtes est effectué selon la méthode d’inondation, 2-3 ml de l’inoculum sont versés et dispersés sur toute la surface du milieu gélosé MH, ensuite la suspension a été aspirée à l’aide d’une pipette en plastique, les boîtes sont séchées sous une hotte à flux laminaire stérile pendant 15 minutes. Puis des disques de 8 mm imprégnés par les molécules à tester sont déposés délicatement à l’aide d’une pince stérile sur la gélose (5 disques par boîte). Des disques imprégnés de gentamicine (50 µg/disque) d’autres avec du DMSO (50 µl/disque) servant respectivement de témoin positif et négatif, ont été aussi déposés sur la surface de la gélose ensemencée.

291

L’imprégnation des disques a été faite, au préalable, à l’aide de micropipette, 50 µl de la solution (10 µg/µl) est déposée à la surface du disque (soit 500 µg de l’extrait brut). Tous les produits purs sont testés avec 500µg/disque exception faite de xf5 (100µg/disque).

Après 30 minutes de pré-diffusion des solutions, les boîtes de Pétri sont incubées à 37°C pendant 18h.

L’activité antibactérienne est exprimée par la mesure de diamètre (en millimètres) de la zone translucide autour des disques, correspondante à la zone d’inhibition de croissance bactérienne.

V.3.3.3. La détermination de la CMI par microméthode de dilution en milieu liquide

V.3.3.3.1. La préparation des produits

Une série de dilution de chaque produit à tester est préparée à des concentrations allant de 256 µg/ml à 4 µg/ml (256, 128, 64, 32, 16, 8, et 4 µg/ml). Pour cela, 1,28 mg de chaque produit ont été dissous d’abord dans 500 µl DMSO auxquels nous avons ajouté 4,5 ml de MH, afin d’obtenir une concentration maximale de DMSO à 5% dans les puits. A partir de cette solution mère, la 2eme concentration à tester a été préparée par dilution au 1/2 et ainsi de suite jusqu’à arriver à 4 µg/ml.

V.3.3.3.2. La préparation de l’inoculum

A partir des colonies bactériennes (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis CIP10907) isolées sur gélose nutritive, Un premier repiquage en prenant 2-5 colonies dans 10 ml de MH est réalisé à 37° C pendant 18h dans l’étuve. Ensuite 0,3 ml de la suspension bactérienne sont prélevés et dispersé dans 10 ml de MH, puis remis en culture pendant 3-5 h sous agitation à 37°C. La culture est arrêtée lorsqu’une concentration bactérienne de 5x107 CFU/ml environ est atteinte. Ceci est vérifiée par la mesure de la densité optique OD ∈ [0,08-0,13] à la longueur d’onde 625 nm. Une dilution au 1/10 dans du milieu MH est effectuée pour obtenir la concentration bactérienne de 5X106 CFU/ml qui sera utilisée dans les microplaques.

292

V.3.3.3.3. Préparation des microplaques

100 µl de chaque dilution des produits à tester sont répartis en triplicate à l’aide d’une micropipette de 100 µl dans les cupules des microplaques de 96 puits (Greiner® U bottom), puis 100µl de la suspension bactérienne à 5x106 CFU/ml est ajoutée dans chaque puits (une souche bactérienne par plaque). Chaque puits contient un volume final de 200 µl (concentration des produits sont diluées au ½).

Dans chaque plaque 96 puits nous avons préparé en triplicate, comme témoin négatif, une gamme de DMSO aux concentrations correspondantes à celles utilisées pour préparer les solutions à tester et comme témoin positif d’inhibition de croissance des puits contenant une série de dilutions de gentamicine (25, 12,5, 5, 2,5 µg/ml).

V.3.3.3.4. Incubation et lecture des plaques

Les plaques sont incubées pendant 18h à 37°C.

La CMI correspond à la concentration minimale de produit pour laquelle aucune croissance bactérienne n’est visible après 18h d’incubation (absence de trouble ou de dépôt bactérien au fond des puits).

293

V.4. Caractéristiques des composés isolés

V.4.1. Composés isolés à partir des branches d’A. xerocarpa

V.4.1.1. Composé xb1 Acide céanothique H H Formule brute : C30H46O5 + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 487,3421 [M+Na] COOH HOOC RMN 1H (600 MHz) & RMN 13C (150 MHz) (Tableau II-1, page 78). H

V.4.1.2. Composé xb2 Acide 2α-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique H Formule brute : C30H46O3 H [α] D +1,5° (c 0,83, CHCl3) + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 477,3339 [M+Na] OHC COOH RMN 1H (600 MHz) & RMN 13C (150 MHz) (Tableau II-1, page 78). H

V.4.1.3. Composé xb3 Acide alphitolique H Formule brute : C30H48O4 H HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 954,3448 [M+Na] + 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau II-1, H COOH page 78). HO H

HO H

V.4.1.4. Composé xb4 Acide céanothénique Formule brute : C29H42O4 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 477,2986 [M+Na] + RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-1, page 78). COOH

COOH

294

V.4.2. Composés isolés à partir des feuilles d’A. xerocarpa

V.4.2.1. Composé xf1 β-sitostérol Formule brute : C29H50O

ESI-SM: (mode positif) à m/z : 435 [M+Li] + RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-4, page 89). HO

V.4.2.2. Composé xf2

6’-heptadécanoyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitostérol Formule brute : C52H92O7

+ ESI-SM: (mode positif) à m/z : 851 [M+Na] H3C(H2C)15OCO O 1 13 HO O RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau HO II-4, page 89). OH

V.4.2.3. Composé xf3

Bétuline Formule brute : C30H50O2 CH2OH ESI-SM: (mode positif) à m/z : 443,7 [M+H] + RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-3, page 85). HO

V.4.2.4. Composé xf4 HOH2C

Acide 30-hydroxycéanothénique Formule brute : C29H42O5 [α]D +3,2° (c 0,16, CHCl3) COOH HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 493,2936 [M+Na] + 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau COOH II-2, page 83).

295

V.4.2.5. Composé xf5 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine

HO Formule brute : C47H76O17 H H [α]D -26,8° (c 0,32, CH3OH) O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 935,4984 [M+Na] + O H OH H H HO O HO O H O O H HO OH O

O HO HO OH 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-9, page 117) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-8, page 116) de la partie osidique.

V.4.2.6. Composé xf6 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[ 4-O-(sodium sulfonato)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-α-L- arabinopyranosyl-jujubogénine HO Formule brute : C47H75NaO20S [α]D -2,8° (c 1,26, CH3OH) O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1037,4360 [M+Na] + O

OH HO O O NaO3SO O O HO OH O

O HO HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-9, page 117) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-8, page 116) de la partie osidique.

V.4.2.7. Composé xf7 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L- arabinopyranosyl-jujubogénine. HO Formule brute : C53H86O22

O [α]D -10,5° (c 0,2, CH3OH) + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1097,5522 [M+Na] O OH HO O O HO O O HO HO O O O HO HO O OH HO HO OH 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-9, page 117) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-8, page 116) de la partie osidique.

V.4.2.8. Composé xf8 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine OH Formule brute : C58H94O26

O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1229,5923 [M+Na] + O

OH HO O O O HO O O HO O HO HO O O O OH HO HO O OH HO HO OH

1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-9, page 117) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-8, page 116) de la partie osidique.

296

V.4.2.9. Composé xf9 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-jujubogénine OH Formule brute : C58H94O26 + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1229,5923 [M+Na] O

O OH HO HO O O O HO O O O HO HO O O O OH HO HO O OH HO HO OH 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-9, page 117) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-8, page 116) de la partie osidique.

V.4.2.10. Composé xf10

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy-jujubogénine OH Formule brute : C42H68O15 HO

[α] -27,8° (c 0,18, CH OH) H D 3 O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 835,4463 [M+Na] + O HO HO O O HO O OH HO O HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-11, page 127) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-10, page 126) de la partie osidique.

V.4.2.11. Composé xf11

3-O-[6-O-(trans,cis)-sinapoyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy-jujubogénine Formule brute : C53H78O19

OH HO

[α] -22,9° (c 0,28, CH OH) H CO D 3 3 + O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1041,5024 [M+Na] O 4''' HO C C C H H O O HO O O HO H3CO O OH HO O HO OH

1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 105). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-11, page 127) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-10, page 126) de la partie osidique.

V.4.2.12. Composé xf12

3-O-[6-O-(trans,cis)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-22α-hydroxy- jujubogénine Formule brute : C51H74O17

[α] -15,8° (c 0,18, CH OH) OH D 3 HO HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 9,81,4822 [M+Na] + H O

O HO C C C H H O O HO O H HO O O OH HO O HO OH 29

297

V.4.2.13. Composé xf13 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-16β,22:16α,30-diépoxydammar-24-ène-3β,20-diol Formule brute : C42H68O14 HO 21 [α]D -8,3° (c 0,12, CH3OH) O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 819,4529 [M+Na] + OH O HO O HO O OH O HO O HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-7, page 105). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-12, page 132).

V.4.2.14. Composé xf14

3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17-seco- dammar-24-ène-16,26-dioique, 15,30; 25,23-di-γ-lactone Formule brute : C42H64O15 [α]D -14,1° (c 0,14, CH3OH) + O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 831,4138 [M+Na] O

O O OH O O O HO HO O

O HO HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-14, page 145). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-13, page 134).

V.4.2.15. Composé xf15

(25S) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17- seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30;25,23-di-γ-lactone Formule brute : C42H66O15 [α]D -46,6° (c 0,42, CH3OH) + O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 833,4286 [M+Na] O

O O OH O O O HO HO O

O HO HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-14, page 145). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-13, page 134).

V.4.2.16. Composé xf16

(25R) 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl- 3,23,30-trihydroxy-17-méthyl-20-oxo-16,17- seco-dammarane-16,26-dioique, 15,30;25,23-di-γ-lactone Formule brute : C42H66O15 [α]D -38,9° (c 0,38, CH3OH) + O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 833,4286 [M+Na] O

O O OH O O O HO HO O

O HO HO OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-14, page 145). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-13, page 134).

298

V.4.2.17. Composé xf17 Acide 28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)- [β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D- glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-céanothique OH OH HO HO Formule brute : C60H96O30 OH [α] -26,4° (c 0,17, CH OH) HO O D 3 OH + H O H OH H HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1319,5892 [M+Na] O OH H O H O H O H O H O H 28 O H H OH C HO HOOC O H O HO HO H OH

HO OH H OH RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-5, page 95). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-6, page 96).

V.4.2.18. Composé xf18 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-quercétine OH Formule brute : C27H30O16 OH + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 633,1433 [M+Na] HO O 1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) (Tableau HO OH II-16, page 150). OH O O

OH O O

HO O

HO OH

V.4.2.19. Composé xf19 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-kaempférol OH Formule brute : C27H30O15 + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 617,1481 [M+Na] HO O 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau HO OH OH II-18, page 153). O O

OH O O

HO O

HO OH

V.4.2.20. Composé xf20 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-kaempférol OH Formule brute : C26H28O14 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 587,1364 [M+Na] + O RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau HO II-19, page 155). O

OH O O HO HO HO O OH O HO

299

V.4.2.21. Composé xf21

3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosyl-kaempférol OH Formule brute : C26H28O15 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 587,1364 [M+Na] + RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau HO O II-19, page 155). O

OH O O HO HO HO O OH OH O V.4.3. Composés isolés à partir des écorces d’A. xerocarpa

V.4.3.1. Composé xe1

Acide 2β-formyle-A(1)norlup-20(29)-èn-28-oique

Formule brute : C30H46O3

[α]D -3,8° (c 0,26, CHCl3) OHC COOH HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 477,3329 [M+Na] + RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-20, page 161).

V.4.3.2. Composé xe2 H3CO CH2OH HO OH (±) 3α-O-β-D-glucopyranosyl-lyonirésinol OH HO C O H O Formule brute : C28H38O13 2 HO HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 605,2219 [M+Na] + CH3O RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) (Tableau

II-22, page 174). H3CO OCH3

V.4.3.3. Composé xe3 OH

D 4-O-β- -glucopyranosyl-maesopsine HO O OH Formule brute : C21H22O11 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 473,1059 [M+Na] + OH 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau O O HO O II-23, page 178). HO OH

300

V.4.3.4. Composé xe4 OH Uridine N

Formule brute : C9H12N2O6 ESI-SM: (mode positif) à m/z : 267,1 [M+Na] + O N 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) (Tableau II-24, HOH2C O page 179).

HO OH

V.4.3.5. Composé xe5

1-O-β-D-glucopyranosyl-4-(8-hydroxyéthyl)-2-méthoxyphényl H Formule brute : C15H22O8 + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 352,1216 [M+Na] H OH 1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) (Tableau II-21, OH page 167). O HO O H HO OH OCH3 H

V.4.3.6. Composé xe6 OH

1-O-β-D-glucopyranosyl,5-(8-hydroxyéthyl)-phényl HO Formule brute : C14H20O8 OH HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 339,1056 [M+Na] + O O 1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) (Tableau II-21, HO HO page 167). OH

V.4.3.7. Composé xe7

1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-3-méthoxy-4-hydroxyphényl OH Formule brute : C19H28O12 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 471,1481 [M+Na] + O 1 13 O RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) (Tableau II-21, O OCH3 O HO HO HO page 167). OH HO OH

301

V.4.3.8. Composé xe8 Acide 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl-28-céanothique OH OH HO HO Formule brute : C54H86O25 OH HO O OH [α]D +01,7° (c 0,23, CH3OH) O OH + O OH O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1157,5349 [M+Na] O OH

O O C HOOC O O OH

HO OH OH 1 13 RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-5 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 95). RMN 1H (500 MHz) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-25, page 181).

V.4.3.9. Composé xe9 17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C30H46O3

[α]D +10,74° (c 0,31, CH3OH) O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 477,3341 [M+Na] + O RMN 1H (600 MHz) & RMN 13C (150 MHz) (Tableau II- 26, page 184). HO

V.4.3.10. Composé xe10 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C41H64O12 O [α]D +18,0° (c 0,08, CH3OH) + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 771,4286 [M+Na] O OH HO O O HO O O HO OH OH

1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-26 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 184). RMN 1H (600 MHz) (Tableau II-28, page 190) & RMN 13C (150 MHz) de la partie osidique (Tableau II-27, page 189).

V.4.3.11. Composé xe11 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20- déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C47H74O16 O [α]D -29,7° (c 0,19, CH3OH) + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 917,5215 [M+Na] O OH HO O O HO O O HO OH O

O HO HO OH 1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-26 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page184). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-28, page 190) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-27, page 189).

302

V.4.3.12. Composé xe12

3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L- arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C53H84O21 O [α]D +8,9° (c 0,11, CH3OH) O + OH HO HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1079,5399 [M+Na] O O HO O O HO HO O O O HO HO O OH HO HO OH 1 13 RMN H (600 MHz) & RMN C (150 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-26 δC ±0,1 ppm, δH ±0,05 ppm, page 184). RMN 1H (500 MHz) (Tableau II-28, page 190) & RMN 13C (125 MHz) de la partie osidique (Tableau II-27, page 189).

V.4.3.13. Composé xe13

3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C58H92O25 O [α] +12,0° (c 0,1, CH OH) D 3 O

OH + HO O O HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1211,5817 [M+Na] HO O O O HO HO O HO O O O OH HO HO O OH HO HO OH

V.4.3.14. Composé xe14

3-O-α-L-arabinospyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl-17-déhydro-20-déhydroxy-jujubogénine

Formule brute : C58H92O25

O [α]D -4,3° (c 0,23, CH3OH) O

+ OH HO HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 1211,5817 [M+Na] OH O O HO O O O HO O HO O O O OH HO HO O OH HO HO OH RMN 1H (600 MHz) & RMN 13C (150 MHz) de la partie aglycone (Tableau II-26, page 184). RMN 1H (600 MHz) (Tableau II-28, page 190) & RMN 13C (150 MHz) de la partie osidique (Tableau II-27, page 189).

303

V.4.4. Composés isolés à partir des fruits d’A. neocaledonica

V.4.4.1. Composé nfr1 Acide bétulinique

Formule brute : C30H48O3 COOH HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 479,3508 [M+Na] + RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) (Tableau II-31, page 205). HO

V.4.4.2. Composé nfr2 Acide corosolique

Formule brute : C30H48O4 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 495,3450 [M+Na] + 1 13 COOH RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau HO II-31, page 205). HO

V.4.4.3. Composé nf3 OCH3 OH 3-O-[6"-E-féruloyl]-β-D-glucopyranosyl-isorhamnétine O Formule brute : C32H30O15 HO + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 677,1477 [M+Na] HO OH OH 1 13 O RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau O OH O II-32, page 208). O HO

O H3CO

V.4.4.4. Composé nfr4 OCH3 OH 3-O-β-D-galactopyranosyl-isorhamnétine

Formule brute : C22H22O12 HO O [α] D HO HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 501,1008 [M+Na] + OH O 1 13 O RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau OH O HO OH II-34, page 212).

304

V.4.4.5. Composé nfr5 OH

3-O-β-D-galactopyranosyl-quercétine OH

Formule brute : C21H20O12 + HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 487,0848 [M+Na] HO O 1 13 RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau HO OH II-36, page 214). O O OH O OH HO

V.4.4.6. Composé nfr6

3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranosyl]-isorhamnétine

OCH3 Formule brute : C28H32O16 HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 647,1575 [M+Na] + OH 1 13 RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau HO O II-35, page 213). HO OH O O OH O OH O

O HO HO OH

V.4.4.7. Composé nf7

3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-rhamnopyranosyl-quercétine OH Formule brute : C27H30O16 OH HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 633,1442 [M+Na] + 1 13 RMN H (500 MHz) et RMN C (125 MHz) (Tableau HO O II-37, page 215).

O OH O O HO HO HO OH O OH O

V.4.4.8. Composé nfr8

3-O-(6-E-caféoyl)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-xylopyranosyl-(1→2)-] α-L-rhamnopyranosyl-tamarixétine OH Formule brute : C42H46O23 OCH3 [α] D -44,0 (c 0,1, CH3OH) + 1' HR-ESI-SM: (mode positif) à m/z : 941,2324 [M+Na] HO O RMN 1H (500 MHz) et RMN 13C (125 MHz) (Tableau

II-38, page 219). O OH O OH OH O OH HO O O HO OH OH O O

O HO

305

V.4.4.9. Composé nfr9 (+) gallocatéchine OH Formule brute : C15H14O7

OH ESI-SM: (mode positif) à m/z 329 [M+Na] + HO 1 13 O RMN H (500 MHz) & RMN C (125 MHz) OH (Tableau II-39, page 212).

OH OH

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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1. Myers, N., R.A. Mittermeier, C.G. Mittermeier, F.G.A.B. Da, J. Kent, Biodiversity hotspots for conservation priorities. Nature (London), 2000. 403: p. 853-858. 2. Lin, R.C., G. Bourdy, M.A. Lacaille-Dubois, Flavonoids from Alphitonia neocaledonica. Planta Med., 1995. 61: p. 197. 3. Walter, K., S., Gillett, H., J., 1997 IUCN Red List of threatened Plants1998. 486. 4. Jaffre, T., P. Bouchet, J.-M. Veillon, Threatened plants of New Caledonia: Is the system of protected areas adequate? Biodiversity & Conservation, 1997. 7(1): p. 109-135. 5. Jaffré, T., Morat, P., Veillon, J-M., Rigault, F., Dagostini, G., Composition et caractéristiques de la flore indigène de Nouvelle-Calédonie Vol. II. 2001 Nouméa, Nouvelle-Calédonie Centre lRD de Nouméa 11-22. 6. Dupont, F., Guignard, J. L., Botanique, Les Familles de Plantes. 2012: Elsevier. P. 136. 7. Judd, W.S., Campbell C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P.F., Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. 1999: Sinauer Associates, Inc. p. 291-292. 8. Stevens, P.F. Angiosperm Phylogeny Website, version 12, july 2012 http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/. 9. Correa, E., C. Jaramillo, S. Manchester, M. Gutierrez, A fruit and leaves of Rhamnaceous affinities from the late Cretaceous (Maastrichtian) of Colombia. Am J Bot, 2010. 97: p. 71-9. 10. Richardson, J.E., M.F. Fay, Q.C.B. Cronk, D. Bowman, M.W. Chase, A phylogenetic analysis of Rhamnaceae using rbcL and trnL-F plastid DNA sequences. Am. J. Bot., 2000. 87: p. 1309- 1324. 11. Judd, W.S., Campbell C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P.F., Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. 1999: Sinauer Associates, Inc. p. 299. 12. Botineau, M., Botanique systématique et appliqué des plantes à fleurs 2010: Edition Tec & Doc-Lavoisier 13. Tavita Y. L., P.J.G., Morphological Characteristic of some Philippine Hardwoods and Other Plant Fibres. Forpride Digest, 1979. 8: p. 31-35. 14. Branch, G.B.B., D. V., Dunstan, P. J., Fool, Y., Green, G. H., Mack, J.P.G., Ritchie, E. and Taylor, W.C., Constituents od Alphitonia species III, alphitexolide, a new triterpen, and other extractives. Aust. J. Chem., 1975. 25 (10): p. 2209-16. 15. Cox, P.A., Ethnopharmacology and searche for the new drugs. Bioactive compounds from plants. Ciba fondation symposium, 1990. 154: p. 40-55. 16. Cox, P.A., Ethnopharmacology and the search for new drugs. Ciba Found. Symp., 1990. 154: p. 40-55. 17. Weiner, M., A., , Ethnomedicine in Tonga. Economic Botany, 1971. 25(4): p. 423-50. 18. Guillaumin, A., Flore de la Nouvelle calédonie. 1948: p. 202-203. 19. Suprin, B., Le (Faux) Pomaderris. Parc forestier, Maison de la nature Province sud. 1992: Nature. 20. Sarlin, P., Bois et forêts de la Nouvells-Calédonie., ed. C.T.F. tropical.1954. 192-193. 21. Bulletin de la Société botanique de France. Vol. 73. 1926, Paris: Société botanique de France 107. 22. Rageau, J., Schmid, M., , Les plantes médicinales de la Nouvelle Calédonie. 1973, Paris, ORSTOM. 64-65. 23. Herbier du centre IRD de Nouméa (NOU), version 7, septembre 2012. http://herbier- noumea.plantnet-project.org/. 24. Baillon, H., Adansonia; recueil d'observations botaniques. . Vol. 11. 1876, Paris. 270. 25. Schlechter, R., Beitäge zur kenntnis der Flora von Neu-Kaledonien. Vol. 39. 1907, Stuttgart Botanische Jahrbücher fur Systematik, Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie. 179. 26. Schlechter, R., Beitäge zur kenntnis der Flora von Neu-Kaledonien. Vol. 32. 1903, Stuttgart, Schweizerbart: Botanische Jahrbücher fur Systematik, Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie. 27. Hegnauer, R., Chemotaxonomie der Pflazen Vol. 6. 1973: Birkhänuser. 726-727. 28. Ghedira, K., Les flavonoïdes: structure, propriétés biologiques, rôle prophylactique et emplois en thérapeutique. Phytotherapie, 2005. 3(4): p. 162-169.

308

29. Bruneton, J., Pharmacognosie-Phytochimie, Plantes médicinales, 4e éd.,2009: Tec & Doc- Editions médicales internationales, Paris 30. Lee, S.-S., W.-C. Chen, C.-H. Chen, New jujubogenin glycosides from Colubrina asiatica. J. Nat. Prod., 2000. 63: p. 1580-1583. 31. Pawlowska, A.M., F. Camangi, A. Bader, A. Braca, Flavonoids of Zizyphus jujuba L. and Zizyphus spina-christi (L.) Willd (Rhamnaceae) fruits. Food Chem., 2008. 112: p. 858-862. 32. Devkota, H.P., T. Watanabe, S. Yahara, Flavonoids and saponins from Zizyphus incurva. Nat. Prod. Res.: p. Ahead of Print. 33. Ben, A.R., W. Bhouri, S.M. Ben, J. Boubaker, et al., Antioxidant and free radical-scavenging properties of three flavonoids isolated from the leaves of Rhamnus alaternus L. (Rhamnaceae) : A structure-activity relationship study. Food Chem., 2009. 116: p. 258-264. 34. Li, X., T. Ohtsuki, S. Shindo, M. Sato, et al., Mangiferin identified in a screening study guided by neuraminidase inhibitory activity. Planta Med., 2007. 73: p. 1195-1196. 35. Wei, B.L., S.N. Lin, S.J. Won, The constituents of Formosan Rhamnus species. VI. Nakahalene and cytotoxic principles of Formosan Rhamnus species. J. Nat. Prod., 1992. 55: p. 967-9. 36. Bhouri, W., I. Bouhlel, J. Boubaker, S. Kilani, K. Ghedira, L.C. Ghedira, Induction of apoptosis in human lymphoblastoid cells by kaempferol 3-O-β-isorhamninoside and rhamnocitrin 3-O-β-isorhamninoside from Rhamnus alaternus L. (Rhamnaceae). Cell Prolif, 2011. 44: p. 283-90. 37. Bhouri, W., M.B. Sghaier, S. Kilani, I. Bouhlel, et al., Evaluation of antioxidant and antigenotoxic activity of two flavonoids from Rhamnus alaternus L. (Rhamnaceae): Kaempferol 3-O-β-isorhamninoside and rhamnocitrin 3-O-β-isorhamninoside. Food Chem. Toxicol., 2011. 49: p. 1167-1173. 38. Prasad, D., G. Pant, M.S.M. Rawat, A. Nagatsu, Constituents of Rhamnus virgatus (Rhamnaceae). Biochem. Syst. Ecol., 2000. 28: p. 1027-1030. 39. Satake, T., K. Hori, K. Kamiya, Y. Saiki, et al., Studies on the constituents of Turkish plants. I. Flavonol triglycosides from the fruit of Rhamnus thymifolius. Chem. Pharm. Bull., 1993. 41: p. 1743-5. 40. Craig, A.R., K.C. Das, W.J. Farmer, Y.-Y. Lin, W.-K. Woo, B. Weinstein, Constituents of the leaves and root bark of Ceanothus velutinus. Phytochemistry, 1971. 10: p. 908. 41. Sakurai, N., M. Kobayashi, A. Shigihara, T. Inoue, Berchemolide, a novel dimeric vanillic acid glucoside from Berchemia racemosa. Chem Pharm Bull (Tokyo), 1992. 40: p. 851-3. 42. Li, G., B.-S. Min, C. Zheng, J. Lee, et al., Neuroprotective and free radical scavenging activities of phenolic compounds from Hovenia dulcis. Arch Pharm Res, 2005. 28: p. 804-9. 43. Yao, C., S.-J. Zhang, Z.-Z. Bai, T. Zhou, L.-J. Xuan, Two new benzopyran derivatives from Gouania leptostachya DC. var. tonkinensis Pitard. Chin. Chem. Lett., 2011. 22: p. 175-177. 44. Bowie, J.H.J.W.W. Morgan, The structure of the alkali fusion product derived from maesopsin. The evidence based on mass spectrometry and N.M.R. spectroscopy. Aust. J. Chem., 1967. 20: p. 117-22. 45. An, R.-B., E.-J. Park, G.-S. Jeong, D.-H. Sohn, Y.-C. Kim, Cytoprotective constituent of Hoveniae Lignum on both Hep G2 cells and rat primary hepatocytes. Arch Pharm Res, 2007. 30: p. 674-7. 46. Yoshikawa, K., K. Eiko, N. Mimura, Y. Kondo, S. Arihara, Hovetrichosides C-G, five new glycosides of two auronols, two neolignans, and a phenylpropanoid from the bark of Hovenia trichocarea. J. Nat. Prod., 1998. 61: p. 786-790. 47. Gao, Q.-H., C.-S. Wu, J.-G. Yu, M. Wang, Y.-J. Ma, C.-L. Li, Textural characteristic, antioxidant activity, sugar, organic acid, and phenolic profiles of 10 promising jujube (Ziziphus jujuba Mill.) selections. J. Food Sci., 2012. 77: p. C1218-C1225. 48. Jou, S.-J., C.-H. Chen, J.-H. Guh, C.-N. Lee, S.-S. Lee, Flavonol glycosides and cytotoxic triterpenoids from Alphitonia philippinensis. J. Chin. Chem. Soc. (Taipei, Taiwan), 2004. 51: p. 827-834.

309

49. Branch, G.B., D.V. Burgess, P.J. Dunstan, L.Y. Foo, et al., Constituents of Alphitonia species. III. Alphitexolide, a new triterpene, and other extractives. Aust. J. Chem., 1972. 25: p. 2209- 16. 50. Dunstan, C.A., B. Liu, C.J. Welch, P. Perera, L. Bohlin, Alphitol, a phenolic substance from Alphitonia zizyphoides which inhibits prostaglandin biosynthesis in vitro. Phytochemistry, 1998. 48: p. 495-497. 51. Hostettmann, K., Marston, A., Chemistry and Pharmacology of natural products Saponins1995: Cambridge university press. 52. Sparg, S.G., M.E. Light, S.J. Van, Biological activities and distribution of plant saponins. J. Ethnopharmacol., 2004. 94: p. 219-243. 53. Giacomelli, S.R., G. Maldaner, C. Stucker, C. Marasciulo, et al., Triterpenoids from Gouania ulmifolia. Planta Med., 2007. 73: p. 499-501. 54. Lin, L.-C., C.-J. Chou, Y.-C. Kuo, Cytotoxic Principles from Ventilago leiocarpa. J. Nat. Prod., 2001. 64: p. 674-676. 55. Guo, S., Y.P. Tang, J.A. Duan, S.L. Su, A.W. Ding, Two new terpenoids from fruits of Ziziphus jujuba. Chin. Chem. Lett., 2009. 20: p. 197-200. 56. Dominguez-Carmona, D.B., F. Escalante-Erosa, K. Garcia-Sosa, G. Ruiz-Pinell, et al., Metabolites from roots of Colubrina greggii var. yucatanensis and evaluation of their antiprotozoan, cytotoxic and antiproliferative activities. J. Braz. Chem. Soc., 2011. 22: p. 1279-1285. 57. Lee, S.M., B.S. Min, C.-G. Lee, K.-S. Kim, Y.H. Kho, Cytotoxic triterpenoids from the fruits of Zizyphus jujuba. Planta Med., 2003. 69: p. 1051-1054. 58. Nair, S.P.J.M. Rao, Guoanic acid from the leaves of Guoania microcarpa. Phytochemistry, 1993. 33: p. 711-12. 59. Suksamrarn, S., P. Panseeta, S. Kunchanawatta, T. Distaporn, S. Ruktasing, A. Suksamrarn, Ceanothane- and lupane-type triterpenes with antiplasmodial and antimycobacterial activities from Ziziphus cambodiana. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2006. 54: p. 535-7. 60. Li, X.-C., L. Cai, C.D. Wu, Antimicrobial compounds from Ceanothus americanus against oral pathogens. Phytochemistry, 1997. 46: p. 97-102. 61. Merkuza, V.M., O.A. Mascaretti, R. Crohare, E.A. Ruveda, Triterpenoids from Discaria longispina and Colletia paradoxa. Phytochemistry, 1971. 10: p. 908-10. 62. Setzer, W.N., J.L. Petty, J.M. Schmidt, M.C. Setzer, R.B. Bates, B.R. Jackes, Bioactive lupane triterpenoids in Alphitonia petriei from Paluma, north Queensland, Australia. Curr. Top. Phytochem., 2004. 6: p. 145-148. 63. Renault, J.-H., K. Ghedira, P. Thepenier, C. Lavaud, M. Zeches-Hanrot, L.L. Men-Olivier, Dammarane saponins from Zizyphus lotus. Phytochemistry, 1997. 44: p. 1321-1327. 64. Kimura, Y., Y. Kobayashi, T. Takeda, Y. Ogihara, Three new saponins from the leaves of Hovenia dulcis (Rhamnaceae). J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1981: p. 1923-7. 65. Yoshikawa, M., T. Murakami, T. Ueda, H. Matsuda, J. Yamahara, N. Murakami, Bioactive saponins and glycosides. IV. Four methyl-migrated 16,17-seco-dammarane triterpene glycosides from Chinese natural medicine, Hoveniae Semen Seu Fructus, the seeds and fruit of Hovenia dulcis Thunb.: absolute stereostructures and inhibitory activity on histamine release of hovenidulciosides A1, A2, B1, and B2. Chem. Pharm. Bull., 1996. 44: p. 1736-1743. 66. Li, D., N.L. Owen, P. Perera, C. Andersson, et al., Structure elucidation of three triterpenoid saponins from Alphitonia zizyphoides using 2D NMR techniques. J. Nat. Prod., 1994. 57: p. 218-24. 67. Pepalla, S.B., S.R. Jammula, K.V.J. Rao, R.H. Thomson, Quinones and tetracosanolide in Ventilago bombaiensis. Phytochemistry, 1992. 31: p. 2103-4. 68. Bruneton, J., Pharmacognosie-Phytochimie, Plantes médicinales, 2e éd.1993: Tec & Doc- Editions médicales internationales, Paris. 69. Rao, J.U.M., T. Hanumaiah, B.K. Rao, K.V.J. Rao, Emodin glycosides from Ventilago calyculata. J. Nat. Prod., 1986. 49: p. 343-5.

310

70. Rao, B.K., T. Hanumaiah, C.P. Rao, G.S.R. Rao, K.V.J. Rao, R.H. Thomson, Anthraquinones in Ventilago species. Phytochemistry, 1983. 22: p. 2583-5. 71. Rao, B.K., T. Hanumaiah, J.U.M. Rao, K.V.J. Rao, R.H. Thomson, Two anthraquinones from Ventilago calyculata. Phytochemistry, 1984. 23: p. 2104-5. 72. Ghosh, S., S.M. Das, A. Patra, B. Hazra, Anti-inflammatory and anticancer compounds isolated from Ventilago madraspatana Gaertn., Rubia cordifolia Linn. and Lantana camara Linn. J. Pharm. Pharmacol., 2010. 62: p. 1158-1166. 73. Locatelli, M., F. Epifano, S. Genovese, G. Carlucci, et al., Anthraquinone profile, antioxidant and antimicrobial properties of bark extracts of Rhamnus catharticus and R. orbiculatus. Nat. Prod. Commun., 2011. 6: p. 1275-1280. 74. Cumming, A.M.R.H. Thomson, Anthraquinones in Maesopsis eminii. Phytochemistry, 1970. 9: p. 2399-400. 75. Jammula, S.R., S.B. Pepalla, H. Telikepalli, K.V.J. Rao, R.H. Thomson, Benzisochromanquinones from Ventilago goughii. Phytochemistry, 1991. 30: p. 3741-4. 76. Hanumaiah, T., D.S. Marshall, B.K. Rao, J.U.M. Rao, K.V.J. Rao, R.H. Thomson, Naphthoquinone-lactones and extended quinones from Ventilago calyculata. Phytochemistry, 1985. 24: p. 2669-72. 77. Hanumaiah, T., B.K. Rao, C.P. Rao, G.S.R. Rao, et al., Naphthalenes and naphthoquinones from Ventilago species. Phytochemistry, 1985. 24: p. 1811-15. 78. Clark, A.H., The alkaloids of Ceanothus americanus. II. Am. J. Pharm. (1835-1936), 1928. 100: p. 240-2. 79. Giacomelli, S.R., G. Maldaner, W.A. Gonzaga, C.M. Garcia, et al., Cyclic peptide alkaloids from the bark of Discaria americana. Phytochemistry (Elsevier), 2004. 65: p. 933-937. 80. Lagarias, J.C., D. Goff, H. Rapoport, Cyclopeptide alkaloids. Phencyclopeptines from Ceanothus sanguineus. J. Nat. Prod., 1979. 42: p. 663-8. 81. Lagarias, J.C., D. Goff, F.K. Klein, H. Rapoport, Cyclopeptide alkaloids. Phencyclopeptines from the polymorphic species Ceanothus integerrimus. J. Nat. Prod., 1979. 42: p. 220-7. 82. Servis, R.E., A.I. Kosak, R. Tschesche, E. Frohberg, H.W. Fehlhaber, Ceanothus alkaloids. II. Peptide alkaloids from Ceanothus americanus. J. Amer. Chem. Soc., 1969. 91: p. 5619-24. 83. Ghedira, K., R. Chemli, C. Caron, J.-M. Nuzillard, M. Zeches, M.-O.L. Le, Four cyclopeptide alkaloids from Zizyphus lotus. Phytochemistry, 1995. 38: p. 767-72. 84. Tschesche, R., I. Khokhar, H. Wilhelm, G. Eckhardt, Alkaloids from Rhamnaceae. Part 27. Jubanine-A and jubanine-B, new cyclopeptide alkaloids from Ziziphus jujuba. Phytochemistry, 1976. 15: p. 541-2. 85. Tschesche, R., D. Hillebrand, H. Wilhelm, E. Ammermann, G. Eckhardt, Alkaloids from Rhamnaceae. Part 29. Hysodricanine A, mauritine A, scutianine F, and aralionine C, four new cyclopeptide alkaloids from Ziziphus, Scutia, and Araliorhamnus. Phytochemistry, 1977. 16: p. 1025-8. 86. Tschesche, R., H. Last, H.W. Fehlhaber, Frangulanin, a peptide alkaloid from Rhamus frangula L. Chem Ber, 1967. 100: p. 3937-43. 87. Tschesche, R.H. Last, Rhamnaceae alkaloids. V. Franganine and frangufoline, two additional peptide alkaloids from Rhamnus frangula. Tetrahedron Lett., 1968: p. 2993-8. 88. Arndt, R.R., (-)-N-Methylcoclaurine from Phylica rogersii. J. Chem. Soc., 1963: p. 2547-9. 89. Guinaudeau, H., A. Cave, R.R. Paris, Isolation of nuciferine from the bark of Colubrina faralaotra. Phytochemistry, 1971. 10: p. 1963-6. 90. Guinaudeau, H., M. Leboeuf, A. Cave, S. Duret, R.R. Paris, Alkaloids and polyphenolic compounds from Colubrina faralaotra ssp. sinuata; and polyphenolic compounds from Colubrina faralaotra ssp. faralaotra (Rhamnacees). Planta Med., 1976. 30: p. 201-10. 91. Chen, H.-J., C.-P. Chung, W. Chiang, Y.-L. Lin, Anti-inflammatory effects and chemical study of a flavonoid-enriched fraction from adlay bran. Food Chem., 2011. 126: p. 1741-1748. 92. Inoe, T., K. Harada, H. Naeshiro, K. Nakada, A. Takahashi, Anti-inflammatory and anti- itching compositions containing flavonoid glycosides, 1996, Ogawa Koryo Kk, Japan; Sunstar Kk . p. 9 pp.

311

93. Dongmo, A.B., A.G.B. Azebaze, T.B. Nguelefack, B.M. Ouahouo, et al., Vasodilator effect of the extracts and some coumarins from the stem bark of Mammea africana (Guttiferae). J. Ethnopharmacol., 2007. 111: p. 329-334. 94. Hwang, J.-M., C.-J. Wang, F.-P. Chou, T.-H. Tseng, et al., Protective effect of baicalin on tert-butyl hydroperoxide-induced rat hepatotoxicity. Archives of Toxicology, 2005. 79(2): p. 102-109. 95. Soberon, J.R., M.A. Sgariglia, D.A. Sampietro, E.N. Quiroga, M.G. Sierra, M.A. Vattuone, Purification and identification of antibacterial phenolics from Tripodanthus acutifolius leaves. J. Appl. Microbiol., 2010. 108: p. 1757-1768. 96. Muzitano, M.F., L.W. Tinoco, C. Guette, C.R. Kaiser, B. Rossi-Bergmann, S.S. Costa, The antileishmanial activity assessment of unusual flavonoids from Kalanchoe pinnata. Phytochemistry (Elsevier), 2006. 67: p. 2071-2077. 97. Chandrashekaran, I.R., C.G. Adda, C.A. MacRaild, R.F. Anders, R.S. Norton, Inhibition by Flavonoids of Amyloid-like Fibril Formation by Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein 2. Biochemistry, 2010. 49: p. 5899-5908. 98. Murakami, H., S. Tamura, Y. Urade, B.K. Kubata, T. Horii, Flavonoid C glycosides from Hymenocardia acida as antimalarial medicines, 2005, Saneigen F.F.I. Inc., Japan . p. 22 pp. 99. Kim, D.S.H.L., J.M. Pezzuto, E. Pisha, Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998. 8: p. 1707-1712. 100. Spatafora, C.C. Tringali, Valorization of vegetable waste: identification of bioactive compounds and their chemo-enzymatic optimization. Open Agric. J., 2012. 6: p. 9-16. 101. Wang, Y., L. Xiang, M. Chen, Z.-x. Zhang, X. He, Substrate specificity for the 2α- hydroxylation of ursolic acid by Alternaria alternata and the antitumor activities of those metabolites. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2012. 83: p. 51-56. 102. Chwalek, M., N. Lalun, H. Bobichon, K. Ple, L. Voutquenne-Nazabadioko, Structure-activity relationships of some hederagenin diglycosides: Haemolysis, cytotoxicity and apoptosis induction. Biochim. Biophys. Acta, Gen. Subj., 2006. 1760: p. 1418-1427. 103. Aguirre, M.C., C. Delporte, N. Backhouse, S. Erazo, et al., Topical anti-inflammatory activity of 2α-hydroxy pentacyclic triterpene acids from the leaves of Ugni molinae. Bioorg. Med. Chem., 2006. 14: p. 5673-5677. 104. Acebey-Castellon, I.L., L. Voutquenne-Nazabadioko, D.T.M. Huong, N. Roseau, et al., Triterpenoid Saponins from Symplocos lancifolia. J. Nat. Prod., 2011. 74: p. 163-168. 105. Wachter, G.A., S. Valcic, M.L. Flagg, S.G. Franzblau, et al., Antitubercular activity of pentacyclic triterpenoids from plants of Argentina and Chile. Phytomedicine, 1999. 6: p. 341- 345. 106. Shai, L.J., L.J. McGaw, M.A. Aderogba, L.K. Mdee, J.N. Eloff, Four pentacyclic triterpenoids with antifungal and antibacterial activity from Curtisia dentata (Burm.f) C.A. Sm. leaves. J. Ethnopharmacol., 2008. 119: p. 238-244. 107. Fujioka, T., Y. Kashiwada, R.E. Kilkuskie, L.M. Cosentino, et al., Anti-AIDS agents, 11. Betulinic acid and platanic acid as anti-HIV principles from Syzigium claviflorum, and the anti-HIV activity of structurally related triterpenoids. J. Nat. Prod., 1994. 57: p. 243-7. 108. Dzubak, P., M. Hajduch, D. Vydra, A. Hustova, et al., Pharmacological activities of natural triterpenoids and their therapeutic implications. Nat. Prod. Rep., 2006. 23: p. 394-411. 109. Bernard, P., T. Scior, B. Didier, M. Hibert, J.Y. Berthon, Ethnopharmacology and bioinformatic combination for leads discovery: application to phospholipase A(2) inhibitors. Phytochemistry, 2001. 58: p. 865-74. 110. Kemertelidze, E.P., T.M. Dalakishvili, S.D. Gusakova, K.G. Shalashvili, et al., Chemical composition and pharmacological activity of the fruits of Paliurus spina-christi Mill. Pharm. Chem. J., 2000. 33: p. 591-594. 111. Boullard, B., Plantes médicinales du monde-Rélaités et Croyances . 2001, Paris Editions ESTEM. 574. 112. Abdel-Zaher, A.O., S.Y. Salim, M.H. Assaf, R.H. Abdel-Hady, Antidiabetic activity and toxicity of Zizyphus spina-christi leaves. J Ethnopharmacol, 2005. 101: p. 129-38.

312

113. Avizeh, R., H. Najafzadeh, M. Pourmahdi, M. Mirzaee, Effect of glibenclamide and fruit extract of Zizyphus spina-christi on alloxan- induced diabetic dogs. Int. J. Appl. Res. Vet. Med., 2010. 8: p. 109-113. 114. Mohamed, E.A.K., Hepatoprotective effect of aqueous leaves extract of Psidium guajava and Zizyphus spina-christi against paracetamol induced hepatotoxicity in rats. J. Appl. Sci. Res., 2012. 8: p. 2800-2806. 115. Adzu, B., A.K. Haruna, M. Ilyas, U.U. Pateh, et al., Structural characterization of ZS - 2A: an antiplasmodial compound isolated from Zizyphus spina-christi root bark. J. Pharm. Nutr. Sci., 2011. 1: p. 48-53. 116. Olajuyigbe, O.O.A.J. Afolayan, In vitro antibacterial activities of the methanol extract of Ziziphus mucronata Willd. subsp. mucronata Willd. J. Med. Plants Res., 2011. 5: p. 3791- 3795. 117. Molgaard, P., S.B. Nielsen, D.E. Rasmussen, R.B. Drummond, N. Makaza, J. Andreassen, Anthelmintic screening of Zimbabwean plants traditionally used against schistosomiasis. J Ethnopharmacol, 2001. 74: p. 257-64. 118. Boullard, B., Plantes médicinales du monde-Réalités et Croyances.2001, Paris Editions ESTEM. 573. 119. Panseeta, P., K. Lomchoey, S. Prabpai, P. Kongsaeree, et al., Antiplasmodial and antimycobacterial cyclopeptide alkaloids from the root of Ziziphus mauritiana. Phytochemistry (Elsevier), 2011. 72: p. 909-915. 120. Alonso-Castro, A.J., M.L. Villarreal, L.A. Salazar-Olivo, M. Gomez-Sanchez, F. Dominguez, A. Garcia-Carranca, Mexican medicinal plants used for cancer treatment: Pharmacological, phytochemical and ethnobotanical studies. J. Ethnopharmacol., 2011. 133: p. 945-972. 121. Popoca, J., A. Aguilar, D. Alonso, M.L. Villarreal, Cytotoxic activity of selected plants used as antitumorals in Mexican traditional medicine. J Ethnopharmacol, 1998. 59: p. 173-7. 122. Lin, C.-C., C.-H. Chang, J.-J. Yang, T. Namba, M. Hattori, Hepatoprotective effects of emodin from Ventilago leiocarpa. J. Ethnopharmacol., 1996. 52: p. 107-111. 123. Basu, S., A. Ghosh, B. Hazra, Evaluation of the antibacterial activity of Ventilago madraspatana Gaertn., Rubia cordifolia Linn. and Lantana camara Linn: isolation of emodin and physcion as active antibacterial agents. Phytother. Res., 2005. 19: p. 888-894. 124. Lipipun, V., M. Kurokawa, R. Suttisri, P. Taweechotipatr, et al., Efficacy of Thai medicinal plant extracts against herpes simplex virus type 1 infection in vitro and in vivo. Antiviral Res., 2003. 60: p. 175-180. 125. Panthong, A., D. Kanjanapothi, T. Taesotikul, A. Phankummoon, K. Panthong, V. Reutrakul, Anti-inflammatory activity of methanolic extracts from Ventilago harmandiana Pierre. J Ethnopharmacol, 2004. 91: p. 237-42. 126. Panyaphu, K., T.V. On, P. Sirisa-ard, P. Srisa-nga, S. ChansaKaow, S. Nathakarnkitkul, Medicinal plants of the Mien (Yao) in Northern Thailand and their potential value in the primary healthcare of postpartum women. J Ethnopharmacol, 2011. 135: p. 226-37. 127. Gachet, M.S., J.S. Lecaro, M. Kaiser, R. Brun, et al., Assessment of anti-protozoal activity of plants traditionally used in Ecuador in the treatment of leishmaniasis. J Ethnopharmacol, 2010. 128: p. 184-97. 128. Kundu, A.B., B.R. Barik, D.N. Mondal, A.K. Dey, A. Banerji, Zizyberanalic acid, a pentacyclic triterpenoid of Zizyphus jujuba. Phytochemistry, 1989. 28: p. 3155-8. 129. Ji, C.-J., G.-Z. Zeng, J. Han, W.-J. He, Y.-M. Zhang, N.-H. Tan, Zizimauritic acids A-C, three novel nortriterpenes from Ziziphus mauritiana. Bioorg Med Chem Lett, 2012. 22: p. 6377-80. 130. Siddiqui, S., F. Hafeez, S. Begum, B.S. Siddiqui, Oleanderol, a new pentacyclic triterpene from the leaves of Nerium oleander. J. Nat. Prod., 1988. 51: p. 229-33. 131. Guo, S., J.-a. Duan, Y. Tang, Y. Qian, J. Zhao, D. Qian, Triterpenoids from the fruits of Ziziphus jujuba var. spinosa. Biochemical Systematics and Ecology, 2011. 39(4–6): p. 880- 882. 132. Dehelean, C.A., C. Soica, I. Ledeti, M. Aluas, et al., Study of the betulin enriched birch bark extracts effects on human carcinoma cells and ear inflammation. Chem. Cent. J., 2012. 6: p. 137. 313

133. Kolomitsyn, I.V., J. Holy, E. Perkins, P.A. Krasutsky, Analysis and antiproliferative activity of bark extractives of Betula neoalaskana and B. papyrifera. Synthesis of the most active extractive component - betulin 3-caffeate. Nat. Prod. Commun., 2007. 2: p. 17-26. 134. Seshadri, T.R.T.N.C. Vedantham, Chemical examination of the barks and heartwoods of Betula species of American origin. Phytochemistry, 1971. 10: p. 897-8. 135. McCarthy, F.O., J. Chopra, A. Ford, S.A. Hogan, et al., Synthesis, isolation and characterization of β-sitosterol and β-sitosterol oxide derivatives. Org. Biomol. Chem., 2005. 3: p. 3059-3065. 136. Kovganko, N.V., Z.N. Kashkan, E.V. Borisov, E.V. Batura, 13C NMR spectra of β-sitosterol derivatives with oxidized rings A and B. Chem. Nat. Compd., 2000. 35: p. 646-649. 137. Gutierrez-Lugo, M.-T., Y. Wang, S.G. Franzblau, E. Suarez, B.N. Timmermann, Antitubercular sterols from Thalia multiflora Horkel ex Koernicke. Phytother. Res., 2005. 19: p. 876-880. 138. Nana, F., L.P. Sandjo, F. Keumedjio, P. Ambassa, et al., Ceramides and cytotoxic constituents from Ficus glumosa Del. (Moraceae). J. Braz. Chem. Soc., 2012. 23: p. 482-487. 139. Bock, K., C. Pedersen, H. Pedersen, Carbon-13 nuclear magnetic resonance data for oligosaccharides. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 1984. 42: p. 193-225. 140. Sivaramakrishna, C., C.V. Rao, G. Trimurtulu, M. Vanisree, G.V. Subbaraju, Triterpenoid glycosides from Bacopa monnieri. Phytochemistry (Elsevier), 2005. 66: p. 2719-2728. 141. Plaza, A., M. Cinco, A. Tubaro, C. Pizza, S. Piacente, New Triterpene Glycosides from the Stems of Anomospermum grandifolium. J. Nat. Prod., 2003. 66: p. 1606-1610. 142. Maciuk, A., C. Lavaud, P. Thepenier, M.-J. Jacquier, K. Ghedira, M. Zeches-Hanrot, Four new dammarane saponins from Zizyphus lotus. J Nat Prod, 2004. 67: p. 1639-43. 143. Xu, W.-H., M.R. Jacob, A.K. Agarwal, A.M. Clark, Z.-S. Liang, X.-C. Li, ent-Kaurane glycosides from Tricalysia okelensis. Chem. Pharm. Bull., 2010. 58: p. 261-264. 144. ElSohly, H.N., S. Danner, X.C. Li, A.C. Nimrod, A.M. Clark, New Antimycobacterial Saponin from Colubrina retusa. J. Nat. Prod., 1999. 62: p. 1341-1342. 145. Li, X.C., H.N. ElSohly, A.C. Nimrod, A.M. Clark, Antifungal jujubogenin saponins from Colubrina retusa. J Nat Prod, 1999. 62: p. 674-7. 146. Potterat, O., M. Saadou, K. Hostettmann, Iridoid glucosides from Rogeria adenophylla. Phytochemistry, 1991. 30: p. 889-92. 147. Yoshikawa, K., N. Shimono, S. Arihara, Antisweet natural products. VI. Jujubasaponins IV, V and VI from Zizyphus jujuba Mill. Chem. Pharm. Bull., 1992. 40: p. 2275-8. 148. Eade, R.A., L.P. Rossler, H.V. Simes, J.J.H. Simes, Extractives of Australian timbers. VI. Ebelin lactone. Aust. J. Chem., 1965. 18: p. 1451-70. 149. Kawai, K.S. Shibata, Pseudojujubogenin, a new sapogenin from Bacopa monniera. Phytochemistry, 1978. 17: p. 287-9. 150. Okamura, N., T. Nohara, A. Yagi, I. Nishioka, Studies on the constituents of Zizyphi Fructus. III. Structures of dammarane-type saponins. Chem. Pharm. Bull., 1981. 29: p. 676-83. 151. Yoshikawa, M., T. Ueda, O. Muraoka, H. Aoyama, et al., Absolute stereostructures of hovenidulciosides A1 and A2, bioactive novel triterpene glycosides from Hoveniae Semen Seu Fructus, the seeds and fruit of Hovenia dulcis Thunb. Chem. Pharm. Bull., 1995. 43: p. 532-4. 152. Mabry, T.J., Markham, K.R. and Thomas,M.B., The systematic identification of flavonoids. Vol. 1. 1970, Berlin, Heidelberg, New York Springer-Verlag New York. 130. 153. Rastrelli, L., P. Saturnino, O. Schettino, A. Dini, Studies on the Constituents of Chenopodium pallidicaule (Canihua) Seeds. Isolation and Characterization of Two New Flavonol Glycosides. J. Agric. Food Chem., 1995. 43: p. 2020-4. 154. Pawlowska, A.M., F. Camangi, A. Bader, A. Braca, Flavonoids of Zizyphus jujuba L. and Zizyphus spina-christi (L.) Willd (Rhamnaceae) fruits. Food Chem., 2008. 112(Copyright (C) 2013 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): p. 858-862. 155. Maciuk, A., K. Ghedira, P. Thepenier, C. Lavaud, M. Zeches-Hanrot, A new flavonol glycoside from leaves of Zizyphus lotus. Pharmazie, 2003. 58(Copyright (C) 2013 American Chemical Society (ACS). All Rights Reserved.): p. 158-159.

314

156. Mabry, T.J., Markham, K.R. and Thomas,M.B., The systematic identification of flavonoids. Vol. 1. 1970: Springer-Verlag 119. 157. Deng, S., B.J. West, A.K. Palu, C.J. Jensen, Phytochemical, antioxidant and toxicological investigation of Morinda citrifolia L. blossoms. ISRN Anal. Chem., 2012: p. 160871, 5 pp. 158. Azab, S.S., M. Abdel-Daim, O.A. Eldahshan, Phytochemical, cytotoxic, hepatoprotective and antioxidant properties of Delonix regia leaves extract. Med. Chem. Res.: p. Ahead of Print. 159. Braca, A., C. Sortino, M. Politi, I. Morelli, J. Mendez, Antioxidant activity of flavonoids from Licania licaniaeflora. J. Ethnopharmacol., 2002. 79: p. 379-381. 160. Bilia, A.R., L. Ciampi, J. Mendez, I. Morelli, Phytochemical investigations of Licania genus. Flavonoids from Licania pyrifolia. Pharm. Acta Helv., 1996. 71: p. 199-204. 161. Soicke, H., K. Goerler, H. Waring, Flavonol glycosides from Moghania faginea. Planta Med., 1990. 56: p. 410-12. 162. Singh, B.M.M. Dubey, Estimation of triterpenoids from Heliotropium marifolium Koen. ex Retz. in vivo and in vitro. I. Antimicrobial screening. Phytother. Res., 2001. 15: p. 231-234. 163. Singh, B., P.M. Sahu, M.K. Sharma, Anti-inflammatory and antimicrobial activities of triterpenoids from Strobilanthes callosus Nees. Phytomedicine, 2002. 9: p. 355-359. 164. Mutai, C., D. Abatis, C. Vagias, D. Moreau, C. Roussakis, V. Roussis, Cytotoxic lupane-type triterpenoids from Acacia mellifera. Phytochemistry (Elsevier), 2004. 65: p. 1159-1164. 165. Pyo, J.S., S.H. Roh, D.K. Kim, J.G. Lee, et al., Anti-cancer effect of betulin on a human lung cancer cell line: a pharmacoproteomic approach using 2 D SDS PAGE coupled with nano- HPLC tandem mass spectrometry. Planta Med., 2009. 75: p. 127-131. 166. Cantrell, C.L., S.G. Franzblau, N.H. Fischer, Antimycobacterial plant terpenoids. Planta Med., 2001. 67: p. 685-694. 167. Ji, C.-J., G.-Z. Zeng, J. Han, W.-J. He, Y.-M. Zhang, N.-H. Tan, Zizimauritic acids A-C, three novel nortriterpenes from Ziziphus mauritiana. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012. 22: p. 6377- 6380. 168. Di, C.G., N. Mascolo, A.A. Izzo, F. Capasso, Flavonoids: old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs. Life Sci., 1999. 65: p. 337-353. 169. Li, X.-C., H.N. ElSohly, A.C. Nimrod, A.M. Clark, Antifungal jujubogenin saponins from Colubrina retusa. J. Nat. Prod., 1999. 62: p. 674-677. 170. Fan, C.-Q.J.-M. Yue, Biologically active phenols from Saussurea medusa. Bioorg. Med. Chem., 2003. 11: p. 703-708. 171. Kuo, Y.H.M.J. Shue, New esters, 2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)ethyl hexa- and octacosanoates from the leaves of Cinnamomum reticulatum hay. J. Chin. Chem. Soc. (Taipei), 1991. 38: p. 65-9. 172. Sugiyama, M.M. Kikuchi, Studies on the constituents of Osmanthus species. X. Structures of phenolic glucosides from the leaves of Osmanthus asiaticus Nakai. Chem. Pharm. Bull., 1992. 40: p. 325-6. 173. Chang, J.R. Case, Phenolic glycosides and ionone glycoside from the stem of Sargentodoxa cuneata. Phytochemistry (Elsevier), 2005. 66: p. 2752-2758. 174. Xiao, K., L. Xuan, Y. Xu, D. Bai, D. Zhong, Constituents from Polygonum cuspidatum. Chem. Pharm. Bull., 2002. 50: p. 605-608. 175. Inoshiri, S., M. Sasaki, H. Kohda, H. Otsuka, K. Yamasaki, Aromatic glycosides from Berchemia racemosa. Phytochemistry, 1987. 26: p. 2811-16. 176. Miyamura, M., T. Nohara, T. Tomimatsu, I. Nishioka, Studies on the constituents of Cinnamomi Cortex. Part 8. Seven aromatic compounds from bark of Cinnamomum cassia. Phytochemistry, 1983. 22: p. 215-18. 177. Covell, C.J., F.E. King, J.W.W. Morgan, Constitution of katonic acid, a triterpene from Sandoricum indicum XXXI. 2-Acetyl-1,8-dihydroxy-3-methylnaphthalene (musizin), a constituent of Maesopsis eminii. J. Chem. Soc., 1961: p. 702-6. 178. Pretsch, E., Clerc, T., Seibl, J., Simon, W., Tables of spectral data for structure determination of organic compounds1989, Berlin Heidelberg Springer-Verlag

315

179. Pawar, R.S., S.I. Khan, I.A. Khan, Glycosides of 20-deoxy derivatives of jujubogenin and pseudojujubogenin from Bacopa monniera. Planta Med., 2007. 73: p. 380-383. 180. Renault, J.-H., J.-M. Nuzillard, O. Intes, A. Maciuk, Chapter 3 Solvent systems, in Comprehensive Analytical Chemistry, A. Berthod, Editor 2002, Elsevier. p. 49-83. 181. Lee, S.-M., J.-G. Park, Y.-H. Lee, C.-G. Lee, et al., Anti-complementary activity of triterpenoides from fruits of Zizyphus jujuba. Biol Pharm Bull, 2004. 27: p. 1883-6. 182. Wang, X.M., C.P. Wan, S.R. Zhou, Y. Qiu, Two new flavonol glycosides from Sarcopyramis bodinieri var. delicata. Molecules, 2008. 13: p. 1399-1405. 183. Yasukawa, K., H. Sekine, M. Takido, Studies of the constituents of genus Lysimachia. Part 4. Two flavonol glycosides from Lysimachia fortunei. Phytochemistry, 1989. 28: p. 2215-16. 184. Bierner, M.W., Flavonol 3-glycosides in Amblyolepis setigera. Phytochemistry, 1979. 18: p. 358. 185. Kim, D.-W., H.-I. Cho, K.-M. Kim, S.-J. Kim, et al., Isorhamnetin-3-O-galactoside protects against CCl4-induced hepatic injury in mice. Biomol. Ther., 2012. 20: p. 406-412. 186. Buschi, C.A.A.B. Pomilio, Isorhamnetin 3-O-robinobioside from Gomphrena martiana. J. Nat. Prod., 1982. 45: p. 557-9. 187. Noccioli, C., L. Meini, M.C. Loi, D. Potenza, L. Pistelli, A new alpinumisoflavone derivative from Genista pichisermolliana. Phytochem. Lett., 2011. 4: p. 342-344. 188. Yan, X., B.T. Murphy, G.B. Hammond, J.A. Vinson, C.C. Neto, Antioxidant Activities and Antitumor Screening of Extracts from Cranberry Fruit (Vaccinium macrocarpon). J. Agric. Food Chem., 2002. 50: p. 5844-5849. 189. Hasler, A., G.A. Gross, B. Meier, O. Sticher, Complex flavonol glycosides from the leaves of Ginkgo biloba. Phytochemistry, 1992. 31: p. 1391-4. 190. Agnolet, S., J.W. Jaroszewski, R. Verpoorte, D. Staerk, 1H NMR-based metabolomics combined with HPLC-PDA-MS-SPE-NMR for investigation of standardized Ginkgo biloba preparations. Metabolomics, 2010. 6: p. 292-302. 191. Lee, Y.J., J. Kim, J.-M. Yi, S.-M. Oh, et al., Anti-proliferative neolignans from Saururus chinensis against human cancer cell lines. Biol. Pharm. Bull., 2012. 35: p. 1361-1366. 192. Fico, G., A. Braca, T.N. De, F. Tome, I. Morelli, Flavonoids from Aconitum napellus subsp. neomontanum. Phytochemistry, 2001. 57: p. 543-546. 193. Foo, L.Y., Y. Lu, W.C. McNabb, G. Waghorn, M.J. Ulyatt, Proanthocyanidins from Lotus pedunculatus. Phytochemistry, 1997. 45: p. 1689-1696. 194. Zuco, V., R. Supino, S.C. Righetti, L. Cleris, et al., Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Lett. (Shannon, Irel.), 2002. 175: p. 17-25. 195. Suksamrarn, S., P. Panseeta, S. Kunchanawatta, T. Distaporn, S. Ruktasing, A. Suksamrarn, Ceanothane- and lupane-type triterpenes with antiplasmodial and antimycobacterial activities from Ziziphus cambodiana. Chem. Pharm. Bull., 2006. 54: p. 535-537. 196. Bergendi, L., L. Benes, Z. Durackova, M. Ferencik, Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci., 1999. 65: p. 1865-1874. 197. Hertog, M.G., E.J. Feskens, P.C. Hollman, M.B. Katan, D. Kromhout, Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen Elderly Study. Lancet, 1993. 342: p. 1007-11. 198. Schallreuter, K., A. Slominski, J.M. Pawelek, K. Jimbow, B.A. Gilchrest, What controls melanogenesis? Exp. Dermatol., 1998. 7: p. 143-150. 199. Peles, D.N.J.D. Simon, The Ultraviolet Absorption Coefficient of Melanosomes Decreases with Increasing Pheomelanin Content. J. Phys. Chem. B, 2010. 114: p. 9677-9683. 200. Ullah, F., H. Hussain, J. Hussain, I.A. Bukhari, et al., Tyrosinase inhibitory pentacyclic triterpenes and analgesic and spasmolytic activities of methanol extracts of Rhododendron collettianum. Phytother. Res., 2007. 21: p. 1076-1081. 201. Sultana, N.N.H. Lee, Antielastase and free radical scavenging activities of compounds from the stems of Cornus kousa. Phytother. Res., 2007. 21: p. 1171-1176.

316

202. Magid, A.A., L. Voutquenne-Nazabadioko, G. Bontemps, M. Litaudon, C. Lavaud, Tyrosinase inhibitors and sesquiterpene diglycosides from Guioa villosa. Planta Med., 2008. 74: p. 55-60. 203. Nagendra, P.K., B. Yang, S. Yang, Y. Chen, et al., Identification of phenolic compounds and appraisal of antioxidant and antityrosinase activities from litchi (Litchi sinensis Sonn.) seeds. Food Chem., 2009. 116: p. 1-7. 204. Gao, D.-F., Y.-J. Zhang, C.-R. Yang, K.-K. Chen, H.-J. Jiang, Phenolic antioxidants from green tea produced from Camellia taliensis. J. Agric. Food Chem., 2008. 56: p. 7517-7521. 205. Ko, R.K., G.-O. Kim, C.-G. Hyun, D.S. Jung, N.H. Lee, Compounds with Tyrosinase Inhibition, Elastase Inhibition and DPPH Radical Scavenging Activities from the Branches of Distylium racemosum Sieb. et Zucc. Phytother. Res., 2011. 25: p. 1451-1456. 206. Kubo, I., Y. Yokokawa, I. Kinst-Hori, Tyrosinase inhibitors from Bolivian medicinal plants. J. Nat. Prod., 1995. 58: p. 739-43. 207. Kubo, I.I. Kinst-Hori, Flavonols from Saffron Flower: Tyrosinase Inhibitory Activity and Inhibition Mechanism. J. Agric. Food Chem., 1999. 47: p. 4121-4125. 208. Kessler, J.H., F.B. Mullauer, R.G.M. De, J.P. Medema, Broad in vitro efficacy of plant- derived betulinic acid against cell lines derived from the most prevalent human cancer types. Cancer Lett. (Amsterdam, Neth.), 2007. 251: p. 132-145. 209. Krasutsky, P.A., Birch bark research and development. Nat. Prod. Rep., 2006. 23: p. 919-942. 210. Pisha, E., H. Chai, I.S. Lee, T.E. Chagwedera, et al., Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis. Nat Med, 1995. 1: p. 1046-51. 211. Cichewicz, R.H.S.A. Kouzi, Chemistry, biological activity, and chemotherapeutic potential of betulinic acid for the prevention and treatment of cancer and HIV infection. Med Res Rev, 2004. 24: p. 90-114. 212. Mullauer, F.B., J.H. Kessler, J.P. Medema, Betulin is a potent anti-tumor agent that is enhanced by cholesterol. PLoS One, 2009. 4: p. No pp. given. 213. Mellanen, P., T. Petaenen, J. Lehtimaeki, S. Maekelae, et al., Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol. Appl. Pharmacol., 1996. 136: p. 381-8. 214. Lee, S.-S., W.-C. Chen, C.-F. Huang, Y. Su, Preparation and Cytotoxic Effect of Ceanothic Acid Derivatives. J. Nat. Prod., 1998. 61: p. 1343-1347. 215. Uto, T., A. Sakamoto, N.H. Tung, T. Fujiki, et al., Anti-proliferative activities and apoptosis induction by triterpenes derived from Eriobotrya japonica in human leukemia cell lines. Int. J. Mol. Sci., 2013. 14: p. 4106-4120. 216. Cai, X., H. Zhang, D. Tong, Z. Tan, et al., Corosolic Acid Triggers Mitochondria and Caspase-dependent Apoptotic Cell Death in Osteosarcoma MG-63 Cells. Phytother. Res., 2011. 25: p. 1354-1361. 217. Setzer, W.N., M.C. Setzer, R.B. Bates, B.R. Jackes, Biologically active triterpenoids of Syncarpia glomulifera bark extract from Paluma, north Queensland, Australia. Planta Med., 2000. 66: p. 176-177. 218. Qian, K., R.-Y. Kuo, C.-H. Chen, L. Huang, S.L. Morris-Natschke, K.-H. Lee, Anti-AIDS Agents 81. Design, Synthesis, and Structure-Activity Relationship Study of Betulinic Acid and Moronic Acid Derivatives as Potent HIV Maturation Inhibitors. J. Med. Chem., 2010. 53: p. 3133-3141. 219. Qian, K., I.D. Bori, C.-H. Chen, L. Huang, K.-H. Lee, Anti-AIDS Agents 90. Novel C-28 Modified Bevirimat Analogues as Potent HIV Maturation Inhibitors. J. Med. Chem., 2012. 55: p. 8128-8136. 220. Dang, Z., P. Ho, L. Zhu, K. Qian, et al., New Betulinic Acid Derivatives for Bevirimat- Resistant Human Immunodeficiency Virus Type-1. J. Med. Chem., 2013. 56: p. 2029-2037. 221. Dang, D.T.N., E. Eriste, E. Liepinsh, T.T. Trinh, et al., A novel anti-inflammatory compound, artonkin-4'-O-glucoside, from the leaves of Artocarpus tonkinensis suppresses experimentally induced arthritis. Scand. J. Immunol., 2009. 69: p. 110-118.

317

222. Miura, T., N. Ueda, K. Yamada, M. Fukushima, et al., Antidiabetic effects of corosolic acid in KK-Ay diabetic mice. Biol. Pharm. Bull., 2006. 29: p. 585-587. 223. Wen, X., J. Xia, K. Cheng, L. Zhang, et al., Pentacyclic triterpenes. Part 5: Synthesis and SAR study of corosolic acid derivatives as inhibitors of glycogen phosphorylases. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007. 17: p. 5777-5782. 224. Szuster-Ciesielska, A., K. Plewka, J. Daniluk, M. Kandefer-Szerszen, Betulin and betulinic acid attenuate ethanol-induced liver stellate cell activation by inhibiting reactive oxygen species (ROS), cytokine (TNF-α, TGF-β) production and by influencing intracellular signaling. Toxicology, 2011. 280: p. 152-163. 225. Yoshikawa, M., T. Murakami, A. Ikebata, S. Wakao, et al., Bioactive saponins and glycosides. X. On the constituents of Zizyphi Spinosi Semen, the seeds of Zizyphus jujuba Mill. var. spinosa Hu (1): structures and histamine release-inhibitory effect of jujubosides A1 and C and acetyljujuboside B. Chem. Pharm. Bull., 1997. 45: p. 1186-1192. 226. Cheng, Z., J. Moore, L. Yu, High-Throughput Relative DPPH Radical Scavenging Capacity Assay. J. Agric. Food Chem., 2006. 54: p. 7429-7436. 227. Lee, S.K., Z.H. Mbwambo, H. Chung, L. Luyengi, et al., Evaluation of the antioxidant potential of natural products. Comb Chem High Throughput Screen, 1998. 1: p. 35-46. 228. Lue, B.-M., N.S. Nielsen, C. Jacobsen, L. Hellgren, Z. Guo, X. Xu, Antioxidant properties of modified rutin esters by DPPH, reducing power, iron chelation and human low density lipoprotein assays. Food Chemistry, 2010. 123: p. 221-230. 229. Krenn, L., A. Presser, R. Pradhan, B. Bahr, et al., Sulfemodin 8-O-β-D-glucoside, a new sulfated anthraquinone glycoside, and antioxidant phenolic compounds from Rheum emodi. J. Nat. Prod., 2003. 66: p. 1107-1109. 230. Schoot, U.A.J.M.H.S. Mason, Magnetic dipole-dipole coupled copper(II) pairs in nitric oxide- treated tyrosinase. Structural relation between the active sites of tyrosinase and hemocyanin. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1973. 70: p. 993-6. 231. Delannay, E., Valorisation de l'huile de gluten de blé comme actif anti-âge en dermatocosmétique, 2005, Université de Reims Champagne Ardenne-: Reims. 232. Alabdul Magid, A., N. Lalun, C. Long, N. Borie, et al., Triterpene saponins from Antonia ovata leaves. Phytochemistry, 2012. 77: p. 268-274.

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Dima MUHAMMAD

Thèse de doctorat intitulée :

ETUDE PHYTOCHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DES TROIS ALPHITONIA (RHAMNACEAE) ENDEMIQUES A LA NOUVELLE-CALEDONIE. Discipline : PHARMACIE-Phytochimie

Résumé :

Ce travail est consacré à l’étude phytochimique des feuilles, branches et des écorces de tronc d’Alphitonia xerocarpa et Alphitonia erubescens, ainsi que celle des fruits d’Alphitonia neocaledonica. Cette étude a permis d’isoler et d’identifier 48 composés dont 23 correspondent à de nouvelles molécules. Les composés isolés peuvent être classés en sept groupes : 2 stérols dont un glycosylés, 10 triterpènes, 19 saponosides, 12 flavonoïdes, un lignane glycosylé, trois glycosides phénoliques, et un nucléoside. La détermination structurale des composés isolés a été réalisée à l’aide des techniques spectroscopiques de RMN 1D & 2D et par la spectrométrie de masse ESI-MS.

L’évaluation de l’activité anti-oxydante effectuée sur les différents extraits obtenus a montré une bonne activité des extraits hydro-alcooliques, seul l’extrait butanolique des fruits d’A. neocaledonica a donné une activité anti-tyrosinase intéressante dans le domaine dermato- cosmétique.

Les tests biologiques menés en bactériologie et en toxicologie cellulaire a conduit à l’identification des composés ayant des activités importantes antibactérienne contre deux bactéries à Gram positif (CMI [4-32 µg/ml]) et antiproliférative contre les cellules KB (CI50 [2,6-7,9 µM/ml]).

Ces plantes pourraient donc être une nouvelle source d’exploitation durable néo- calédonienne dans le secteur de l’industrie cosmétique ou/et pharmaceutique, car les composés actifs sont des produits majoritaires provenant des matières végétales régénérables (feuilles, branches et fruits).

Mots Clés : Alphitonia, Rhamnaceae, saponine, flavonoïde, activité biologique, Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire RMN et spectroscopie de masse.

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