Synbranchus Spp

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZONIA

Programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da Amazônia central

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Manaus - AM 2011

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da Amazônia central

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra. Co-orientadora: Maria Claudia Gross, Dra.

Manaus – AM 2011 ii

FICHA CATALOGRÁFICA

C331 Carvalho, Natalia Dayane Moura

Uso de marcadores citogenéticos clássicos e moleculares para a caracterização de Synbranchus spp. (Synbranchiformes) da Amazônia Central / Natália Dayane Moura Carvalho. --- Manaus : [s.n.], 2011.

xvi, 57 f. : il. color.

Dissertação (mestrado) -- INPA, Manaus, 2011

Orientador : Eliana Feldberg

Co-orientador : Maria Claudia Gross

Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Mussum (peixe) – Amazônia. 2. Variabilidade cromossômica. 3.Região organizadora de nucléolo. 4. FISH (técnica). I. Título.

CDD 19. ed. 597.10415

Sinopse:

São apresentados dados cromossômicos de quatro espécies de Synbranchus: S. madeirae, S. cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2, coletadas em simpatria e sintopia na região de confluência dos rios Negro e Solimões. As espécies foram estudadas mediante análise de citogenética clássica (coloração convencional, detecção de heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo) e molecular (hibridização fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S, DNAr 5S e sequências teloméricas) e foram comparadas com as espécies descritas na literatura. Foram também discutidas as possíveis tendências evolutivas para este grupo de peixes. Palavras-chave: Mussum, Variabilidade cromossômica, Heterocromatina constitutiva, Região organizadora de nucléolo, FISH, Amazônia

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Dedico esta dissertação aos meus pais

Nilce e Maurício, aos meus irmãos

Maurício, Márcio e Júnior, à minha cunhada Paula, aos meus pequenos sobrinhos Maurício Vinícius e Paula Sofia e ao meu noivo Rogério Neves. iv

A realização deste trabalho foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do INPA.

Ao laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas em

Biologia Aquática (CPBA), onde este trabalho foi desenvolvido, com financiamento proporcionado pelos projetos: “Caracterização genética (cromossomos, proteínas e

DNA) de vertebrados amazônicos” (INPA/MCT) e “Citotaxonomia de Arraias de água doce da Amazônia central: conhecer para conservar” (PIPT/FAPEAM).

À Fundação de Amparo de Pesquisas do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho.

Agradecimentos

Agradeço a TODOS que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

Em especial:

A Deus, pois, sem sua ajuda, nada teria sido possível.

À Dra. Eliana Feldberg pela excelente orientação, amizade, conselhos, ensinamentos, confiança e principalmente por ser essa profissional esplêndida e admirável. Obrigada por ter me acolhido em seu laboratório e por ser tão especial na minha vida, simplesmente a minha mãe científica.

À Dra. Maria Claudia Gross pela primorosa co-orientação, apoio, incentivo, sugestões e principalmente pelo auxílio no laboratório. Sem a sua ajuda este trabalho não teria sido realizado. Obrigada por tudo e principalmente pela confiança depositada em mim.

Ao Dr. Jorge Porto pela amizade e contribuição a este trabalho.

Ao Dr. Jansen Zuanon pela identificação das espécies analisadas.

Aos colegas do laboratório de Genética Animal: Carlos, Leandra, Leila, Heidi, Thatianna, Brenda, Carlos Valentin, Denise e Érica por todos os momentos que passamos juntos, pelos debates, sugestões, críticas científicas e às festinhas no laboratório. Em especial, as minhas amigas Heidi Luz e Thatianna de Lira pela companhia em nossos passeios (grandes aventuras), conversas, discussões científicas, e principalmente por ter me aguentado nesse dois anos de mestrado. Obrigada, vocês já fazem parte da minha vida.

Aos amigos do curso de mestrado – GCBEv/ 2009: Heidi, Alessandro, Carolina, Luciana, Diana, Ramon, Jaqueliny Zocca, Jaqueline Fortuna, Tatiana e Gilson pelos bons momentos extra-laboratório.

Aos meus pais Maurício e Nilce que são a razão da minha vida, para mim motivo de orgulho. Obrigada por tudo e principalmente por acreditarem em mim. Tudo que puder fazer por vocês farei, por que simplesmente amo vocês.

Aos meus irmãos Maurício, Márcio e Junior e minha cunha Paula pelo apoio incondicional, amor e amizade. Ao meu pequeno príncipe Maurício Vinicius e à minha pequena princesa e afilhada Paula Sofia por iluminar minha vida.

Ao meu noivo Rogério de Oliveira Neves pelo amor, carinho, paciência, atenção e por mostrar-me o caminho maravilhoso de um amor e amizade, transmitindo sempre de forma entusiasmada, clara e objetiva.

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Resumo A família Synbranchidae pertence à ordem Synbranchiformes e é composta por quatro gêneros: Macrotrema, Ophisternon, Monopterus e Synbranchus. De acordo com a classificação taxonômica vigente, Synbranchus compreende três espécies válidas: S. marmoratus Bloch, 1795, S. madeirae Rosen & Rumney, 1972 e S. lampreia Favorito, Zanata & Assumpção, 2005. Contudo, estudos citogenéticos têm evidenciado uma variação no número diploide de exemplares identificados como “S. marmoratus”, coletados nas regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil, os quais apresentam 42, 44 e 46 cromossomos e diversas fórmulas cariotípicas. Para as outras duas espécies válidas nenhuma característica citogenética havia sido publicada até o momento. Diante deste contexto, foram realizadas análises citogenéticas clássicas (coloração convencional, Banda C e RON) e moleculares (FISH com sondas de DNAr 18S, 5S e sequências teloméricas) em 14 indivíduos de S. madeirae, oito de S. cf. lampreia, um indivíduo de Synbranchus sp.1 e um de Synbranchus sp. 2, coletados em simpatria e sintopia no lago Catalão, situado na confluência dos rios Negro e Solimões. Para S. madeirae foi encontrado 2n=46 cromossomos, sendo 6m+2st+38a, NF=54, S. cf. lampreia 2n=44 cromossomos, sendo 6m+2st+36a, NF=52, Synbranchus sp.1 2n=42 cromossomos, sendo 6m+4sm+32a, NF=52 e Synbranchus sp.2 2n=42 cromossomos, sendo 6m+2sm+4st+30a, NF=54. A heterocromatina constitutiva apresentou-se distribuída nas regiões centroméricas, intersticiais, terminais, proximais e distais da maioria dos cromossomos para as quatro espécies de Synbranchus. A região organizadora de nucléolo (RON), apresentou-se como RON simples para S. cf. lampreia e múltipla para S. madeirae, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp. 2, com variação interespecífica quanto à sua distribuição, evidenciada tanto por impregnação com AgNO3 como pela hibridização de sondas DNAr 18S. A FISH com sonda DNAr 5S evidenciou uma marcação intersticial nos braços longos do par 7 de S. cf. lampreia e S. madeirae e do par 10 em Synbranchus sp.1. A sonda telomérica evidenciou marcações nos telômeros de todos os cromossomos além de marcações em regiões intersticiais em S. madeirae, S. cf. lampreia e Synbranchus sp.1. O somatório destes dados indica a ocorrência de uma variabilidade cariotípica interespecífica no gênero Synbranchus, incluindo heterocromatinização ou adição de heterocromatina, presença de rearranjos robertsonianos e não-robertsonianos na evolução cromossômica do grupo. Assim, acreditamos que a tendência de evolução cromossômica mais provável para este grupo seja a partir de um ancestral com 2n=48 cromossomos com a redução do número diploide.

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Abstract

Synbranchidae belongs to the Synbranchiformes order and it is composed by four genus: Macrotema, Ophisternon, Monopterus and Synbranchus. According with the present taxonomic arrangement, Synbranchus comprises three valid species: S. marmoratus Bloch, 1795, S. madeirae Rosen & Rumney, 1972, and S. lampreia Favorito, Zanata & Assumpçao, 2005. However, cytogenetic studies has made evident a variance in the diploid number of specimens of S. marmoratus collected in the south, south-east and center-west of Brasil, presenting 42, 44 and 46 chromosomes and diverse karyotypic formulas. Until nowadays, none cytogenetic characteristics have been registered for the two other valid species. Thereafter this contexture, there have been realized classic cytogenetic analysis (conventional coloration, C Band and NOR) and molecular as well (FISH with rDNA 18S, 5S probers and telomeric sequences) in fourteen individuals of S. madeirae, eight of S. cf. lampreia, one individual of Synbranchus sp.1 and one of Synbranchus sp.2 collected in compatibility at the Catalão lake situated at the confluence of the Negro and Solimões rivers next to Manaus, Amazonas. It was found 2n=46 chromosomes for S. madeirae, being 6m+2st+38a, NF=54, S. cf. lampreia 2n=44 chromosomes, being 6m+2st+36a, NF=52, Synbranchus sp1 2n=42 chromosomes, being 6m+4sm+32a, NF =52 and Synbranchus sp2 2n=42 chromosomes, being 6m+2sm+4st+30a, NF=54. Constitutive heterochromatic presented distributed in the centromeric, interstitial, terminal and proximal and distal of chromosomes majority for the four Synbranchus species. It has been inferred by the nucleolus organizer region (NOR) that simple NOR for S. cf. lampreia and multiple for S. madeirae, Synbranchus sp.1 and Synbranchus sp.2, with interspecific variance as for its distribution, being proved by its impregnation with AgNOR, as much as by r DNA 18S hybridization probe. It has also been proved by FISH with rDNA 5S probe an interstitial marker on pair 7 long arms of S. cf. lampreia and S. madeirae and of pair 10 in Synbranchus sp1. A telomeric probe has evinced marks in all telomeric chromosomes beyond marks in interstitial regions in S. madeirae, S. cf. lampreia and Synbranchus sp.1. It was inferred by the amount of this data that the occurrence of an interspecific karyotypic variability on Synbranchus genus, including heterochromatinization or heterochromatin addition, appearance of Robertsonian and non-Robertsonian rearrangements in chromosomic evolution of this group. Meanwhile, we believe that the evolutive tendency most likely for this group is from an ancestor with 2n = 48 chromosomes with reduction of the diploid number.

Sumário

1 Introdução...... 1

1.1 Considerações gerais...... 1

1.2 Biologia de Synbranchidae ...... 1

1.3 Citogenética de Synbranchiformes ...... 3

1.5 Objetivos...... 8

1.5.1 Geral ...... 8

1.5.2 Específicos...... 8

2 Material e Métodos...... 9

2.1 Material...... 9

2.2 Métodos ...... 12

2.2.1 Indução de mitoses...... 12

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 12

2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs...... 13

2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) ...... 13

2.2.5 Extração de DNA total...... 14

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) e marcação por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) ...... 15

2.2.7 Hibridização in situ por fluorescência - FISH...... 16

2.2.8 Análise cariotípica ...... 18

2.2.9 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies de Synbranchus ...... 18

3 Resultados...... 20

3.1 Synbranchus madeirae...... 20

3.2 Synbranchus cf. lampreia ...... 25

3.3 Synbranchus sp. 1 ...... 29

3.4 Synbranchus sp.2 ...... 32

3.5 Medidas cromossômicas ...... 36 x

4 Discussão...... 37

5 Conclusões...... 45

6 Perspectivas ...... 46

7 Referências Bibliográficas...... 47

Lista de figuras

Figura 1 Exemplares de Synbranchus madeirae (a, b), S. cf. lampreia (c, d), Synbranchus sp.1 (e, f) e Synbranchus sp.2 (g, h). Formato da cabeça (a, c, e, g) e o padrão de manchas ao longo do corpo (b, d, f, h)...... 11

Figura 2 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm...... 22

Figura 3 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a-b) localização física cromossômica do DNAr 18S (amarelo); c) localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); d) Localização física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...... 24

Figura 4 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm...... 27

Figura 5 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) Localização física cromossômica do DNAr 18S (amarelo); b) Localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); c) Localização física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barras iguais a 20µm...... 28

Figura 6 Cariótipos de Synbranchus sp. 1: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm...... 30

Figura 7 Cariótipos de Synbranchus sp.1: a) Localização física cromossômica do DNAr 18S (amarelo); b) em destaque os pares portadores dos sítios de DNAr 18S; c) Localização física cromossômica do DNAr 5S (amarelo); d) Localização física cromossômica da sequência telomérica (amarelo). m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...... 31

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Figura 8 Cariótipos de Synbranchus sp. 2: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm...... 33

Figura 9 Cariótipo de Synbranchus sp. 2: a) Localização física cromossômica do DNAr 18S (amarelo). m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 20µm...... 34

Figura 10 Idiograma comparativo de (a) Synbranchus madeirae; (b) Synbranchus cf. lampreia; (c) Synbranchus sp.1; (d) Synbranchus sp.2; em preto, heterocromatina constitutiva; em amarelo, genes de DNAr 18S; em rosa, genes de DNAr 5S...... 35

Figura 11 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies estudadas. Eixo X: número de classes (classe I: 2,53 a 4,40; classe II: 4,41 a 6,28; classe III: 6,29 a 8,16; classe IV: 8,17 a 10,04; classe V: 10,05 a 12,87); eixo Y: número de cromossomos por classe de tamanho...... 36

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Lista de tabelas

Tabela 1 Dados citogenéticos compilados da literatura para a ordem Synbranchiformes. Local de coleta, número diploide (2n), fórmula cromossômica, número fundamental (NF) e região organizadora de nucléolos (RONs). O cálculo do número fundamental considerou como portadores de dois braços os cromossomos metacêntricos (m) e submetacêntricos (sm) e como portadores de braço único os cromossomos subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a)...... 06

Tabela 2 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus madeirae coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM)...... 21

Tabela 3 Número diploide e frequência relativa (%), para indivíduos de Synbranchus cf. lampreia coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM)...... 26

Tabela 4 Número diploide e frequência relativa (%), para um indivíduo de Synbranchus sp.1 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM)...... 29

Tabela 5 Número diploide, frequência relativa (%) e local de coleta, para um indivíduo de Synbranchus sp.2 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM)...... 32

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Lista de abreviaturas

Banda C Técnica de detecção da heterocromatina constitutiva

DNAr DNA ribossomal dNTP Desoxirribonucleotídeo

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FISH Hibridização in situ fluorescente

FITC Fluoresceina isotiocianato

IGS Espaçador intergênico não transcrito

NTS Espaçador não transcrito

PBD Tampão fosfato dextrano

PCR Reação em cadeia da polimerase

Rex Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus

RNAr RNA ribossomal

RON Região organizadora de nucléolo

SDS Dodecil sulfato de sódio

SSC Solução salina de citrato padrão

Tampão C Tampão de acoplamento

1 Introdução

1.1 Considerações gerais A região Neotropical, que compreende a parte sul da América do Norte e as Américas Central e do Sul, abriga a mais rica e diversa fauna de peixes de água doce do mundo, sendo estimada a presença de 8.000 espécies, com 4.475 já descritas (Reis et al. 2003). Dentro desta região, a Bacia Amazônica se sobressai por sua diversidade ictiofaunística, reunindo um grande número de espécies que pode chegar a 5.000, onde são encontrados representantes das ordens Characiformes, Perciformes, Gymnotiformes, Siluriformes, Myliobatiformes, Synbranchiformes, entre outras (Santos e Ferreira 1999).

1.2 Biologia de Synbranchidae A ordem Synbranchiformes compreende três famílias de peixes teleósteos: Chaudhuriidae, Mastacembelidae e Synbranchidae (Nelson 2006). Esta ordem é composta por 99 espécies válidas, as quais encontram-se amplamente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do Novo e Velho Mundo (Rosen e Greenwood 1976; Schofield e Nico 2009).

As espécies de Synbranchidae apresentam corpo cilíndrico na região anterior e comprimido na região posterior, são desprovidas de escamas e na idade adulta chegam a medir cerca de 150 cm de comprimento. As nadadeiras dorsal e anal são rudimentares, a caudal é curta, rudimentar ou ausente, e não possuem as pélvicas e peitorais. Apresentam abertura branquial única localizada na região ventral da cabeça, cabeça proeminente com olhos pequenos, narinas anteriores, boca grande provida de dentes pequenos e não possuem bexiga natatória. A pele produz um muco que recobre todo o corpo (Britski et al. 1999; Kullander 2003; Nelson 2006).

Com relação às características reprodutivas dos Synbranchidae, o hermafroditismo protogínico diândrico é a forma de expressão sexual dominante (Antoneli 2006). Ou seja, ocorre mudança de sexo nos indivíduos adultos, envolvendo a degeneração do tecido gonadal feminino e o crescimento e maturação do tecido sexual masculino, sobretudo apresentando dois tipos diferentes de machos. Os machos do primeiro tipo são aqueles que se desenvolvem diretamente dos ovos e são denominados 1

machos primários, e os do segundo são machos resultantes da mudança de sexo a partir de uma fêmea, por reversão do sexo e são chamados machos secundários (Lo Nostro e Guerrero 1996; Antoneli 2002; Lo Nostro et al. 2003; Ravaglia e Maggese 2003). A reversão do sexo de indivíduos identificados como S. marmoratus ocorre predominantemente durante a estação seca e está relacionada à idade e ao comprimento do indivíduo (Antoneli 2002; 2006). Deste modo, os machos secundários exibem comprimento entre 25 e 54,9 cm, enquanto os machos primários podem ser encontrados em qualquer faixa de comprimento (Lo Nostro e Guerrero 1996; Antoneli 2006).

Com relação à distribuição de Synbranchidae, são encontrados na África, Ásia, Austrália, México e Américas Central e do Sul e compreende quatro gêneros: Synbranchus, Ophisternon, Monopterus e Macrotrema. Na região Neotropical são conhecidos apenas dois gêneros, Ophisternon e Synbranchus. Ophisternon é composto por seis espécies, sendo que nesta região ocorrem duas: O. infernale Hubbs 1938 e O. aenigmaticum Rosen e Greenwood 1976. Synbranchus compreende três espécies válidas: S. marmoratus Bloch 1795, S. madeirae Rosen e Rumney 1972 e S. lampreia Favorito, Zanata e Assumpção 2005 (Nelson 2006). Segundo Favorito-Amorim (1992) Synbranchus marmoratus, considerada por vários autores como um complexo de espécies, é representada por, pelo menos, sete táxons distintos, incluídas provisoriamente dentro de Synbranchus. Deste modo, a autora sugere uma revisão taxonômica mais ampla das espécies de Synbranchidae, para que a caracterização das mesmas possa ser resolvida satisfatoriamente.

As espécies de Synbranchus alimentam-se de peixes, moluscos e pequenos crustáceos e estão presentes em uma variedade de habitats, incluindo estuários, pântanos, riachos, lagoas, charcos e corredeiras, mas têm preferência por águas com baixa concentração de oxigênio e durante os períodos de seca sobrevivem enterradas na lama úmida. Esta adaptabilidade a diferentes ambientes está relacionada aos tipos de respiração, uma vez que além da típica respiração branquial estas espécies apresentam respiração bucofaríngea e acessória, na qual as paredes da câmara branquial são altamente vascularizadas e contribuem para as trocas gasosas, o que possibilita a permanência fora da água por várias horas e a obtenção de oxigênio atmosférico durante períodos de seca (Ghaham et al. 1995; Britski et al. 1999; Shibatta 2006). Segundo

Shibatta (2006) são peixes não migratórios, de hábitos noturnos, fecundação externa e apresentam cuidado parental.

De acordo com a literatura, S. marmoratus tem sua distribuição desde o México até o norte da Argentina; S. madeirae é restrita ao rio Madeira (Rosen e Rumney 1972) e S. lampreia é endêmica da Ilha de Marajó, no estado do Pará (Favorito et al. 2005). Entretanto, em levantamentos ictiofaunísticos recentes foi observado que S. marmoratus parece ocorrer somente no Suriname e as outras duas espécies aparentemente possuem uma ampla distribuição na Bacia Amazônica (T. Roberts comunicação pessoal), estando a taxonomia deste grupo ainda não elucidada, o que enfatiza a necessidade de estudos complementares.

1.3 Citogenética de Synbranchiformes A citotaxonomia pode ser definida como a identificação de táxons, utilizando técnicas de citogenética, a qual permite individualizar espécies por meio de características cromossômicas. A citotaxonomia está intimamente ligada à citogenética, que é a ciência que estuda os cromossomos, seja de forma isolada ou direcionada ao conjunto cromossômico de uma espécie, abrangendo aspectos morfológicos, funcionais e evolutivos (Guerra, 1988). Investigações cromossômicas em espécies de peixes têm contribuído para o entendimento de sua sistemática, conhecimento da diversidade genética e da evolução, principalmente quando combinadas com análises morfológicas e moleculares. Este tipo de análise em peixes amazônicos já possibilitou a identificação de espécies crípticas (Nakayama et al. 2001; Teixeira et al. 2006; Nakayama et al. 2008), detecção de polimorfismos intra-específicos (Nakayama et al. 2000; Centofante et al. 2002; Mesquita et al. 2008), detecção de cromossomos supranumerários (Feldberg et al. 2004), identificação de híbridos (Alves-Brinn et al. 2004), determinação de sistemas de cromossomos sexuais (de Oliveira et al. 2007; 2008; Terencio et al. 2008) e evolução cromossômica (Benzaquem et al. 2008). Os estudos citogenéticos realizados com peixes têm como principais ferramentas para a compreensão da estrutura organizacional dos cromossomos a determinação do número diploide e a fórmula cariotípica. Outros marcadores eficazes na caracterização de espécies são a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), as quais estão envolvidas na transcrição de RNA ribossomal e o padrão de distribuição da 3

heterocromatina constitutiva no cariótipo, que indica como o genoma eucariótico está organizado (Feldberg et al. 1993; Almeida-Toledo 1998; Margarido e Galetti Jr. 1999). Ainda, a utilização de técnicas de manipulação do material genético associada à detecção de sequências específicas de DNA fez surgir o que se conhece hoje por citogenética molecular, sendo o fator fundamental para a expansão desses estudos a utilização de marcações não-radioativas do DNA, com o emprego de corantes fluorescentes. Esta técnica permite a detecção de sequências específicas em cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos através da hibridização de sequências complementares, sendo utilizadas principalmente sequências repetitivas em tandem, tais como genes de RNA ribossomais e sequências teloméricas (Artoni et al. 2000).

Citogeneticamente, a família Synbranchidae é a melhor conhecida da ordem Synbranchiformes, com dados para três espécies dos gêneros Monopterus, Ophisternon e Synbranchus. Monopterus albus apresenta 2n=24 cromossomos telocêntricos (Yu et al. 1987) e Ophisternon bengalense 2n=46 cromossomos, sendo 6m+40st (Arkhipchuk 1999). Já os indivíduos identificados como S. marmoratus provenientes das regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil e da Argentina apresentam uma grande variabilidade, com relação ao número diploide, que varia de 42 a 46 cromossomos e diversas fórmulas cariotípicas (Tabela 1). Para a família Mastacembelidae, também pertencente à ordem Synbranchiformes, duas espécies têm análises cromossômicas publicadas, Mastacembelus armatus e M. aculeatus, ambas com 2n=48 cromossomos (Tabela 1).

Quanto ao padrão de distribuição da heterocromatina neste grupo de peixes, em indivíduos identificados como S. marmoratus foram evidenciados blocos heterocromáticos na região pericentromérica de quase todos os cromossomos, sendo que em alguns foram também evidenciados na região intersticial (Foresti et al. 1992). Em M. armatus foram localizados na região centromérica de quase todos os cromossomos (Oliveira et al. 1997).

Com relação ao número de regiões organizadoras de nucléolo (RONs), todas as populações identificadas como S. marmoratus e amostradas no Brasil, apresentaram RONs simples, enquanto que três populações da Argentina apresentaram RONs múltiplas (Tabela 1). Mastacembelus armatus também apresentou RON simples, que

segundo Oliveira et al. (1997) é uma característica considerada ancestral para a ordem Synbranchiformes.

Análises citogenéticas moleculares até o momento não foram realizadas em espécies da família Synbranchidae, bem como as espécies amazônicas ainda não tiveram a sua composição cariotípica revelada. Deste modo, dada a ampla distribuição de Synbranchus spp, a taxonomia incerta do grupo e a grande variabilidade cariotípica já descrita para S. marmoratus de outras regiões brasileiras e argentina, a caracterização cromossômica das espécies encontradas no lago Catalão, um ecótono de águas mistas, situado na confluência dos rios Solimões (água branca) com o Negro (água preta), é de fundamental importância para o conhecimento do grupo. Ainda, a utilização de elementos repetitivos no mapeamento físico cromossômico em Synbranchus spp. poderá proporcionar uma melhor visão do genoma das espécies, de como este está organizado e como ocorreu a sua evolução.

Tabela 1 Dados citogenéticos compilados da literatura para a ordem Synbranchiformes. Local de coleta, número diploide (2n), fórmula cromossômica, número fundamental (NF) e região organizadora de nucléolos (RONs). O cálculo do número fundamental considerou como portadores de dois braços os cromossomos meta (m) e submetacêntricos (sm) e como portadores de braço único os cromossomos subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a).

Familia Gênero Espécie Localidade 2n Fórmula NF RON Referências cromossômica

Synbranchidae Synbranchus S. marmoratus Coxim, MS, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992 São Simão, GO, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992 Nova Granada, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Foresti et al. 1992 Botucatu, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996 Birigui, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996 Paraguaçu Paulista, SP, BR 42 4m-sm+38st-a 46 Simples Melillo et al. 1996 Pirassununga, SP, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Ribeirão Preto, SP, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Bataguaçu, MS, BR 42 6m-sm+36st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Pereiras, SP, BR 42 4m+6sm+8st+24ª 52 - Torres et al. 2005 Presidente Epitácio, SP, BR 42 4m+6sm+8st+24ª 52 - Torres et al. 2005 Londrina, PR, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005 Guaíra, PR, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005 Miranda, MS, BR 42 4m+2sm+8st+28ª 48 - Torres et al. 2005 Rio Claro, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Foresti et al. 1992

Pentecostes, CE, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Foresti et al. 1992 Botucatu, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Birigui, SP, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Bataguaçu, MS, BR 44 4m-sm+40st-a 48 Simples Melillo et al. 1996 Ituzaingo, Corrientes, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996

Reconquista, Santa Fé, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996 Garabato, Santa Fé, AR 44 4m-sm+40st-a 48 Múltiplas Sanchez e Fenocchio 1996 Pirassununga, SP, BR 44 4m+2sm+8st+30ª 50 - Torres et al. 2005 Pirassununga, SP, BR 46 4m-sm+42st-a 50 Simples Melillo et al. 1996 Ribeirão Preto, SP, BR 46 4m-sm+42st-a 50 Simples Melillo et al. 1996 Bandeirantes, PR, BR 46 4m+2sm+8st+32ª 52 - Torres et al. 2005 Miranda, MS, BR 46 6m+2sm+6st+32ª 54 - Torres et al. 2005 Ophisternon O. bengalense - 46 6m+40st 52 - Arkhipchuk 1999 Monopterus M. albus Wuhan (China) 24 24t 24 Simples, Ji et al. 2003 múltipla- Mastacembelidae Mastacembelus M. armatus - 48 10m+6sm+4st+28a 68 Simples Oliveira et al. 1997 M. aculeatus China 48 - - Liu et al. 2002 Sinobdella S. sinensis - 48 15m+4sm+3st+26a 70 - Yajuan e Qixing 1991 Macrognathus M. aculeatum - 48 8m+2sm+38st,a 58 - Khuda-Bukhsh e Barat 1987 M. pancalus - 48 14m+12sm+14st+8a 88 - Khuda-Bukhsh e Barat 1987 48 16m+6sm+8st+18a 78 - Manna e Prasad 1977

1.5 Objetivos

1.5.1 Geral • Analisar as espécies de Synbranchus da região de confluência dos rios Negro e Solimões, utilizando marcadores citogenéticos clássicos e moleculares.

1.5.2 Específicos • Determinar o cariótipo de indivíduos de Synbranchus spp., coletados na região de confluência dos rios Negro e Solimões.

• Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda C) e da região organizadora de nucléolo (RONs) em cromossomos mitóticos.

• Localizar as sequências de DNA ribossômico 5S e 18S e sequências teloméricas em cromossomos mitóticos pela técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH).

• Verificar se os cariótipos observados correspondem às espécies válidas e se existe variabilidade cromossômica inter e intraespecífica.

• Inferir possíveis tendências evolutivas para o gênero Synbranchus.

2 Material e Métodos

2.1 Material Foram efetuadas preparações cromossômicas de 96 indivíduos de Synbranchus, coletados no lago Catalão (03º10’45” S; 59º54’25.4” W) situado na confluência dos rios Solimões e Negro, Amazonas, Brasil, porém, apenas 21 apresentaram metáfases em boas condições de análise. Destes, 14 indivíduos foram classificados como Synbranchus madeirae, oito como Synbranchus cf. lampreia, um como Synbranchus sp.1 e outro como Synbranchus sp.2 (Figura 1). Entretanto, somente foi possível identificar o sexo de três indivíduos de Synbranchus madeirae, sendo 2 machos e uma fêmea. Todos os exemplares foram identificados pelo pesquisador Dr. Jansen Zuanon (CPBA/INPA).

Para uma melhor caracterização das espécies estudadas foi feita uma breve descrição morfológica das mesmas com base no formato da cabeça e padrão de coloração.

Synbranchus madeirae

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo escuro com manchas claras circulares bem definidas; a região ventral com coloração de fundo marrom claro com manchas escuras. A cabeça bastante afilada, tanto lateralmente quanto dorsalmente e apresenta uma faixa negra alongada abaixo dos olhos, iniciando- se na extremidade anterior do focinho e estendendo-se até aproximadamente a extremidade posterior do osso maxilar.

Synbranchus cf. lampreia

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo marrom com manchas escuras, inclusive na cabeça, onde são menores; a região ventral com coloração de fundo claro, com manchas escuras. A cabeça com saliência muscular dorsal.

Synbranchus sp.1

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo cinza escuro com ausência de manchas; na região ventral, coloração de fundo cinza claro. A cabeça bastante afilada, tanto lateralmente quanto dorsalmente.

Synbranchus sp. 2

Esta espécie apresenta a região dorsal do corpo com coloração de fundo escuro quase preto com ausência de manchas; a região ventral com coloração de fundo claro. A cabeça com saliência muscular dorsal.

Os peixes foram capturados com o uso de redes e rapichés e transportados vivos em caixas térmicas tipo isopor, para o Laboratório de Genética Animal do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática ou para o laboratório flutuante do Lago Catalão, onde foram preparadas as suspensões celulares. Para tanto, os peixes foram submetidos a uma dose letal do anestésico eugenol (2%) e após terem sido retirados os tecidos de interesse, os mesmos foram numerados, registrados, fixados em formol 10% por 24h, lavados em água corrente e acondicionados em recipientes contendo álcool 70%, visando seu depósito na Coleção de Peixes do INPA (Licença IBAMA: Número 10609-1 de 21/11/2007).

2.2 Métodos

2.2.1 Indução de mitoses Para se obter um maior número de células em metáfase foi utilizada a técnica de indução de mitoses descrita por Oliveira et al. (1988), que consiste em preparar uma solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 20 mL de água destilada. Em seguida, esta solução foi incubada em banho-maria ou estufa a 40 °C por cerca de 20 minutos, e posteriormente injetada na região intraperitoneal do animal, na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso vivo. Os peixes foram mantidos em aquários aerados por um período de 24 horas antes da coleta das amostras para análise citogenética.

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos Após 24 horas da aplicação da solução de fermento, foi injetada, intraperitonealmente uma solução aquosa de colchicina 0,0125% na proporção de 1 mL para cada 100 g de peso vivo, por 45 a 60 minutos (Bertollo et al. 1978). Após esse tempo, os peixes foram submetidos a uma dose letal do anestésico eugenol 2% e procedeu-se a retirada da porção anterior do rim, que é o órgão hematopoiético. Este tecido foi lavado em solução hipotônica de KCl a 0,075M e transferido para outro recipiente de vidro contendo cerca de 10 mL da solução hipotônica de KCl, onde foi dissociado com pinças de dissecação. A suspensão celular obtida foi colocada em estufa a 37 °C por 20 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido cuidadosamente com o auxílio de uma seringa desprovida de agulha e transferido para um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Foram adicionadas 4 gotas de fixador Carnoy 3:1 (metanol: ácido acético), recém preparado e gelado e a amostra foi centrifugada por 10 minutos a 900 rpm, descartando-se o sobrenadante. Adicionou-se com cuidado 8 mL de fixador Carnoy 3:1, ressuspendeu-se o material cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur e esta lavagem foi repetida por mais duas vezes. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante foram adicionados 1,5 mL de fixador e o material foi ressuspendido com cuidado. Esta suspensão celular foi guardada em tubos eppendorf e mantida em freezer para posterior utilização.

Para a preparação das lâminas, as mesmas foram colocadas em solução sulfocrômica por 24 horas. Após este período, foram retiradas, lavadas em água corrente 12

e destilada e armazenadas em álcool 100%. As lâminas foram imersas em água destilada a 45 °C, em banho-maria. Após 5 minutos, foram retiradas da água e a suspensão celular foi gotejada sobre três pontos diferentes da lâmina, que foi seca diretamente ao ar. Em seguida, as amostras foram coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8, por 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.

2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo – RONs Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi utilizada a técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre as lâminas com a suspensão foram adicionadas 2 a 3 gotas de uma solução coloidal de gelatina (2 g de gelatina comercial sem sabor, dissolvida em 100 mL de água destilada, acrescida de 1mL de acido fórmico) e, sobre cada gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, durante 3 a 8 minutos. Após esse tempo, quando a lâmina adquiriu uma coloração marrom dourada, a mesma foi lavada em água destilada, permitindo que a lamínula fosse retirada naturalmente pela própria água e seca ao ar.

2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica descrita por Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a suspensão celular foram tratadas com HCl 0,2N a 45 °C, por 2 minutos, lavadas rapidamente em água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Após isso as lâminas foram incubadas por cerca de 40 segundos em solução de hidróxido de bário a 5%, recém preparada e filtrada a 42 °C. Posteriormente, a ação do hidróxido de bário foi interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (temperatura ambiente), lavada em água destilada e deixada secar ao ar. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho- maria a 60 °C, por 15 minutos. Em seguida, foram lavadas várias vezes em água destilada e secas ao ar. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa (diluída a 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.

2.2.5 Extração de DNA total A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular, utilizando o protocolo básico de Sambrook e Russel (2001) com algumas modificações. Foram macerados aproximadamente 20 mg de tecido muscular e transferidos para um tubo de volume de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 500 µL de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, SDS 1%) conforme Estoup et al. (1993) e com o acréscimo de Uréia 4 M conforme Asahida et al. (1996). Posteriormente foram acrescentados: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas a 60 ºC por aproximadamente 2 horas para que o tecido fosse totalmente digerido. Foram adicionados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e agitado por inversão, por alguns minutos. Após isso as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 14.000 rpm em temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, adicionados 600 µL de clorofórmio e misturado, cuidadosamente, por alguns minutos, por inversão. Em seguida, a mistura foi centrifugada por 20 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e foram acrescentados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de isopropanol gelado e misturado gentilmente por inversão. O precipitado foi deixado a -20 °C por cerca de 14 horas ou a -80 °C por 1 hora. O material foi retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a 14.000 rpm, descartando-se o sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol 70% e centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi descartado, o pellet foi seco em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 μl de TE 0,2X ou água milli- Q e deixado eluindo por 14 horas. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de DNA bacteriófago Lambda, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

2.2.6 Isolamento de sequências repetitivas por PCR (Polymerase Chain Reaction) e marcação por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) Sequências repetitivas já identificadas e caracterizadas como conservadas em outras espécies de peixes, tais como 18S, 5S e teloméricas foram estudadas. Para a obtenção das sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e sequências teloméricas foi utilizado o DNA genômico extraído do músculo de Synbranchus madeirae e Synbranchus cf. lampreia. As sondas foram obtidas por amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), conforme Saiki et al. (1988) utilizando os primers: -DNAr 5S (A 5’-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3’ e B 5’- CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3’) (Komiya e Takemura 1979);

-DNAr 18S (IpF 5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR 5’CCGAGGACCTCACTAAACCA) (Gross et al. 2010b).

- Sequências teloméricas (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991).

Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas:

a) 5S: 5 minutos a 94 ºC (desnaturação); 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 59 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 2 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 57 ºC e 45 segundos a 72 ºC; 25 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 61 ºC e 45 segundos a 72 ºC (amplificação); 7 minutos a 72 ºC (extensão);

b) 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC, 30 segundos a 55 ºC, 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC (amplificação); 7 minutos a 72 ºC (extensão).

c) Telomérica: 10 minutos a 94 ºC (desnaturação); 30 segundos a 55 ºC; 1 minuto a 72 ºC (amplificação); 30 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 30 segundos a 60 ºC e 1 minuto e 30 segundos a 72 ºC (amplificação); 5 minutos a 72 ºC (extensão).

As reações de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, para volume final de 15 μL (1 μL de DNA genômico (100 ng); 1,5 μL de Tampão 10X com cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 μL de Taq DNA

polimerase (5U/µl); 3,0 μL de dNTP (1 mM); 0,6 μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para completar o volume).

As sondas foram marcadas por biotina 14-dATP por nick translation, seguindo protocolo do fabricante (Bionick labeling system-Invitrogen). Para tanto, em um tubo de eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparada uma solução contendo 1 μL de Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/ μL); 1 μL de Mix de enzima 10x; 6 μL de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina que foi hibridizada. Esta solução foi homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 ºC por 45 minutos no termociclador. Em seguida, para interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop buffer contendo 1 μL de acetato de sódio 3M e após isso foi mantida em freezer para posterior utilização.

2.2.7 Hibridização in situ por fluorescência - FISH Foi utilizada a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) descrita por Pinkel et al. (1986) com algumas modificações.

Tratamento das lâminas As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada. Em seguida foram tratadas com 90 µl de RNase 10 µg/mL (5 µL de RNase 10 mg/mL e 975 µL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, as lâminas foram lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.

Fixação

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM MgCl2 durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por 5 minutos. Após, as lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada. Deixou-se secar ao ar. Em seguida foram desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5 minutos e novamente desidratadas em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5 minutos cada. Deixou-se secar ao ar.

Solução de hibridização

Em um tubo eppendorf, foram adicionados 6 µl de sonda, 15 µl de formamida, 6 µl de sulfato de dextrano 50% e 3 µl de 20xSSC. A sonda foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e passada imediatamente ao gelo.

Hibridização

Foram colocados 30 µl de solução de hibridização sobre uma lamínula e a lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material voltado para baixo em câmara úmida (H20 destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas.

Lavagens

As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida foram lavadas em 2xSSC a 72 °C por 5 minutos. Após, foram transferidas para solução de PBD 1x (leite em pó desnatado; Triton X-100; 20xSSC; diluído em água destilada ajustando para pH 7,0) a temperatura ambiente.

Detecção Foram colocadas sobre cada lâmina 30 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Em seguida foram cobertas com lamínula e deixadas por 30 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente as lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em solução de PBD 1x recém preparado a 45 ºC por 2 minutos cada. Após a lavagem, foi colocada sobre cada lâmina 20 µL de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (1 µL de anti-avidina estoque em 19 µL de PBD 1x), coberta com lamínula e deixada em câmara úmida com água destilada a 37 °C por 10 minutos. Após, as lâminas foram lavadas três vezes em solução de PBD 1x a 45 ºC por 2 minutos cada. Posteriormente, foi colocada sobre cada lâmina 30 µL de avidina-FITC 0,07% em tampão C, coberta com lamínula e deixada em câmara úmida com água destilada a 37 °C por 10 minutos.

Montagem das lâminas Adicionou-se a cada lâmina solução de iodeto de propídio diluído em antifade Vector (20 µL de antifade e 0,4 µL de iodeto de propídio).

2.2.8 Análise cariotípica Após a análise e contagem dos cromossomos ao microscópio óptico foi estabelecido o número diploide modal e suas frequências relativas para cada indivíduo. As melhores metáfases obtidas com as técnicas clássicas (convencional, RON e banda C) foram fotografadas, com objetiva de imersão em câmera digital Canon Power shot A 650 IS. As metáfases submetidas a técnicas moleculares (FISH) foram analisadas e capturadas em um fotomicroscópio de epifluorescência Olympus Bx-51, em objetiva de imersão.

Para a montagem dos cariótipos foi utilizado o programa Adobe Photoshop 7.0, versão CS3, a partir de cromossomos metafásicos mitóticos, os quais foram recortados e tentativamente emparelhados. Os cromossomos foram medidos, utilizando o programa livre ImageJ, agrupados de acordo com a sua morfologia e colocados em ordem decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os critérios de relação de braços (RB=BM/Bm, onde BM = braço maior e Bm = braço menor) segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos foram separados em metacêntricos (m), que apresentam RB=1,00 a 1,70, submetacêntricos (sm) RB=1,71 a 3,00, subtelocêntricos (st) RB=3,01 a 7,00 e acrocêntricos (a) RB > 7,00. O número fundamental (NF) foi determinado de acordo com o número de braços cromossômicos, considerando-se os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e acrocêntricos como tendo apenas um braço.

2.2.9 Análise comparativa das medidas cromossômicas entre as espécies de Synbranchus A partir dos dados obtidos com as medidas cromossômicas foi feita uma análise comparativa entre as espécies estudadas. De cada espécie obteve-se a frequência do comprimento relativo dos pares cromossômicos por classes de tamanho. Para determinar o número ideal de classes, para a distribuição dos pares por classe de tamanho relativo, foi utilizada a formula de Sturges (Fonseca e Martins 1982): n= 1+ 3,32 * LogN, onde n= número de classes e N= lote haplóide (em número).

Depois de determinar o número ideal de classes, foi feita a subtração entre o maior e o menor valor do comprimento relativo dos cromossomos, em µm, de cada espécie. O valor encontrado foi dividido pelo número ideal de classes, e o resultado

encontrado corresponde ao intervalo de cada classe, onde: classe 1=2,53-4,40; classe 2=4,41-6,28; classe 3=6,29-8,16; classe 4=8,17-10,04; classe 5=10,05-12,87.

3 Resultados De um total de 24 indivíduos coletados, 14 foram identificados como Synbranchus madeirae, oito como Synbranchus cf. lampreia, um foi nomeado de Synbranchus sp.1 e um de Synbranchus sp. 2.

3.1 Synbranchus madeirae A Tabela 2 mostra o número dos exemplares, número diploide e total de células analisadas. O número diploide modal determinado para esta espécie foi igual a 46 cromossomos, sendo 6m+2st+38a e o número fundamental (NF) foi igual a 54 (Figura 2a). Nenhum heteromorfismo relacionado à presença de cromossomos sexuais foi observado.

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e terminal da maioria dos cromossomos, mas também foram observados blocos intersticiais e distais em alguns pares cromossômicos (Figura 2b; 4).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato de prata, foi evidenciada com até cinco marcações, sendo considerada múltipla, localizadas nas regiões terminais dos braços longos do par 2, dos braços curtos do par 6 e na região intersticial do braço longo de um dos homólogos do par 7. Porém, nem sempre todas estiveram ativas (Quadro 1; Figura 2c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S também evidenciou até cinco marcações, porém dois padrões de distribuição foram encontrados. No primeiro padrão (10 indivíduos), um dos homólogos dos pares 1, 2, e 7 apresentou marcações, assim como ambos os homólogos do par 6 e para um indivíduo foi observado em ambos os homólogos dos pares 2 e 21 apresentaram sítios ribossomais 18S, bem como um dos homólogos dos pares 6 e 7. Entretanto, para o primeiro padrão e para um individuo, apenas as marcações dos pares 6 e 7 foram coincidentes com as marcações com nitrato de Prata. Do par 2 apenas um dos homólogos coincidiu com AgRON e do par 1, um dos homólogos também apresentou uma marcação na região terminal dos braços longos (Figura 3 a, b; 4; Quadro 1). A sonda DNAr 5S evidenciou um sítio localizado na região intersticial dos braços longos do par 7, sendo sintênico e adjacente a um dos sítios de DNAr 18S (Figura 3c, 4). A sonda telomérica evidenciou sequências apenas nas regiões teloméricas de todos os cromossomos (Figura 3d). 20

Tabela 2 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus madeirae coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diplóide Indivíduos Total de (Nº de 40 41 42 43 44 45 46 47 48 células registro) 10202 0 0 0 0 0 05 26 01 0 32

10212 0 0 0 0 02 04 24 0 0 30

10213 0 0 0 0 02 09 21 0 0 32

10230 0 0 0 0 0 05 25 0 0 30

10247 0 0 0 02 0 09 19 0 0 30

10250 0 0 0 0 01 06 26 0 0 33

10253 0 0 0 06 04 0 21 0 0 31

10254 0 0 0 0 0 03 27 0 0 30

10336 0 0 01 01 0 0 34 0 0 36

10342 0 0 0 02 02 0 27 0 0 31

10346 0 0 0 02 01 0 30 0 0 33

7532 0 0 0 0 0 0 32 0 0 32

7533 0 0 0 0 0 2 28 0 0 30

7446 0 0 0 0 0 0 30 0 0 30

Total 0 0 01 13 12 43 370 01 0 440

% - - 0,23 2,95 2,73 9,77 84,09 0,23 - 100

Figura 2 Cariótipos de Synbranchus madeirae: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm.

Quadro 1 Padrões de RONs e DNAr 18S encontrados em indivíduos de S. madeirae, coletados mo lago Catalão (Iranduba, AM).

3.2 Synbranchus cf. lampreia A Tabela 3 mostra o número dos exemplares, número diploide e total de células analisadas. O número diploide modal determinado para esta espécie foi igual a 44 cromossomos, sendo 6m+2st+36a e o número fundamental (NF) foi igual a 52 (Figura 4a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões proximal, terminal, distal, centromérica e intersticial da maioria dos cromossomos (Figura 4b).

A região organizadora de nucléolo (RON) submetida à impregnação com nitrato de prata foi evidenciada como RON simples, localizada na região terminal dos braços longos do par 19, com um bloco de heterocromatina distal, adjacente à RON (Figura 4c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH), com sonda de DNAr 18S, evidenciou um par cromossômico portador deste sítio, coincidente com a marcação por nitrato de Prata (Figura 5a). A sonda de DNAr 5S evidenciou um sítio localizado na região intersticial dos braços longos do par 7 (Figura 5b). A sonda telomérica evidenciou sequências em todas as regiões teloméricas, além de uma marcação centromérica em um dos homólogos do par 3 (Figura 5c).

Tabela 3 Número diploide e frequência relativa (%) para indivíduos de Synbranchus cf. lampreia coletados no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduos (Nº de 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Total de células registro) 9885 0 0 02 04 37 0 0 0 0 43 9911 0 0 0 08 22 0 0 0 0 30 9912 0 0 0 0 31 0 0 0 0 31

10186 01 0 0 07 24 0 0 0 0 32

10210 0 0 02 08 20 0 0 0 0 30

10340 0 0 0 04 27 0 0 0 0 31

10345 0 0 0 08 22 0 0 0 0 30

10349 0 03 0 09 19 0 0 0 0 31

Total 01 03 04 48 202 0 0 0 0 258

% 0,39 1,16 1,55 18,6 78,30 - - - - 100

Figura 4 Cariótipos de Synbranchus cf. lampreia: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da

técnica de banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm.

3.3 Synbranchus sp. 1 A Tabela 4 mostra o número do exemplar, número diploide e total de células analisadas do único individuo identificado de Synbranchus sp.1. O número diploide para este indivíduo foi igual a 42 cromossomos, sendo 6m+4sm+32a e o número fundamental (NF) foi igual a 52 (Figura 6a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e terminal da maioria dos cromossomos, além de marcações intersticiais nos cromossomos dos pares 4 e 13 (Figura 6b).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato de prata, foi evidenciada como RON múltipla com até cinco marcações, localizadas na região terminal do braço curto de um dos homólogos do par 4, dos braços longos do par 13 e na região terminal dos braços longos do par 16 (Figura 6c), todas coincidentes com regiões de heterocromatina constitutiva.

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S evidenciou até cinco marcações, coincidentes com as marcações por nitrato de Prata, além de uma marcação localizada na região centromérica do braço longo de um dos homólogos do par 4 (Figura 7a,b). A sonda DNAr 5S evidenciou um sítio localizado na região intersticial dos braços longos do par 10 (Figura 7c). A sonda telomérica evidenciou sequências em todas as regiões teloméricas e marcações intersticiais nos cromossomos dos pares 4, 6, 8, 9, 12, 15, 20 (Figura d).

Tabela 4 Número diploide e frequência relativa (%), para um indivíduo de Synbranchus sp.1 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduo Total de (Nº de células registro) 40 41 42 43 44 45 46 47 48 9915 10 0 24 0 0 0 0 0 0 34 Total 10 0 24 0 0 0 0 0 0 34

% 29,4 - 70,6 ------100

Figura 6 Cariótipos de Synbranchus sp. 1: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque os pares nucleolares impregnados por AgNO3. m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10µm.

3.4 Synbranchus sp.2 A Tabela 5 mostra o número do exemplar, número diploide e total de células analisadas do único individuo identificado de Synbranchus sp.2. O número diploide para este indivíduo foi igual a 42 cromossomos, sendo 6m+2sm+4st+30a e o número fundamental (NF) foi igual a 54 (Figura 8a).

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e terminal da maioria dos cromossomos, um dos homólogos do par 1 apresentou dois blocos intersticiais, sendo um no braço curto e um no longo e alguns cromossomos apresentaram blocos intersticiais (Figura 8b).

A região organizadora de nucléolo (RON), submetida à impregnação com nitrato de prata, foi evidenciada como RON simples, localizada na região terminal do braço curto de um dos homólogos do par 4 (Figura 8c).

A hibridização in situ fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S evidenciou até 14 marcações, sendo oito conspícuas. Estas foram intersticiais no braço longo e curto de um dos homólogos do par 1, terminal nos braços curtos e intersticial nos braços longos do par 4, intersticial nos pares 12 e 15, terminal nos braços longos do par 13 e distal nos braços longos do par 14 (Figura 9a). Porém, somente um dos homólogos do par 4 foi coincidente com o nitrato de Prata.

Tabela 5 Número diploide e frequência relativa (%), para o indivíduo identificado como Synbranchus sp.2 coletado no Lago Catalão (Iranduba, AM).

Número diploide Indivíduo Total de (Nº de células registro) 40 41 42 43 44 45 46 47 48 10209 5 0 15 0 0 0 0 0 0 20 Total 5 0 15 0 0 0 0 0 0 20

% 25 - 75 ------100

Figura 8 Cariótipos de Synbranchus sp. 2: a) em coloração convencional Giemsa; b) regiões de heterocromatina constitutiva evidenciada por meio da técnica de

banda C; c) em destaque o par nucleolar impregnado por AgNO3. m=Metacêntrico, sm=Submetacêntrico, st=Subtelocêntrico, a=Acrocêntrico. Barra igual a 10 µm.

Figura 10 Idiograma comparativo de (a) Synbranchus madeirae;(b) Synbranchus cf. lampreia; (c) Synbranchus sp.1; (d) Synbranchus sp.2; em preto, heterocromatina constitutiva; em amarelo, genes de DNAr 18S; em rosa, genes de DNAr 5S.

3.5 Medidas cromossômicas O comprimento total médio dos cromossomos de Synbranchus cf. lampreia variou entre 19,255 a 44,049 μm, de S.madeirae variou entre 12,364 a 62,936 μm, de Synbranchus sp1 variou entre 43,281 a 186,274μm e de Synbranchus sp2 variou entre 41,381 a 183,215μm. O agrupamento dos cromossomos em cinco classes de tamanho também evidencia a distinta composição cromossômica das quatro espécies (Figura 11). As classes 1 e 2 fornecem resultados mais expressivos na diferenciação das espécies, uma vez que na classe 3 ocorre sobreposição entre S. cf. lampreia e Synbranchus sp1, e na classe 5 entre as espécies S. madeirae, Synbranchus sp1 e Synbranchus sp2.

4 Discussão Synbranchiformes é uma ordem de peixes com representantes tanto no Velho como no Novo Mundo e com ampla distribuição (Nelson 2006). Alguns estudos envolvendo o conteúdo de DNA nuclear já foram efetuados em algumas espécies desta ordem, sendo possível evidenciar que Mastacembelus armatus apresenta menor conteúdo de DNA (1.39 ± 0.08 pg) quando comparado a Macrognathus aculeatus (1,61 pg), ambas espécies com o mesmo número diploide (2n= 48). Em Monopterus albus, que apresenta somente 2n=24 cromossomos, o conteúdo de DNA (1,24 pg) é muito similar ao observado para outras espécies de Synbranchiformes, o que indica que ocorreram poucas alterações na quantidade de DNA durante o processo evolutivo deste grupo (Jianxun et al. 1991; Oliveira et al. 1997). Em contrapartida, apesar dos estudos cariotípicos ainda serem escassos comparado com outros grupos de peixes, verifica-se uma grande variabilidade cromossômica entre as espécies (Tabela 1). O número diploide varia de 42 a 48 e o no número fundamental (NF) de 24 a 88, sendo que as espécies do Velho Mundo têm 2n=48 cromossomos.

O número diploide igual a 48 cromossomos acrocêntricos foi considerado por Ohno (1974) como o cariótipo básico dos teleósteos e segundo Foresti et al. (1992), este número também seria o ancestral para Synbranchiformes. Visto que a família Synbranchidae apresenta origem Gondwânica (Rosen 1976), e considerando que as espécies irmãs do Velho Mundo têm 2n=48 cromossomos (Tabela 1), o cariótipo ancestral desta família também pode ter sido 2n=48. Porém, não existe consenso com relação ao número diploide considerado basal para o gênero Synbranchus. Melillo et al. (1996) sugerem que este número seria 2n=42. Em contrapartida, Sanchez e Fenocchio (1996) propuseram que as populações de Synbranchus marmoratus da Argentina teriam se originado a partir de um ancestral com 2n=44, o que teria favorecido a alteração da fórmula cariotípica e a presença de RONs múltiplas. Ainda, os dados citogenéticos recentes referentes à S. marmoratus evidenciaram a ocorrência de cinco citótipos, sugerindo que os números diploides 42 e 44 teriam se originado de um ancestral com 2n=46 cromossomos, com a redução do número cromossômico por meio de rearranjos robertsonianos do tipo fusão (Torres et al. 2005). Parte desta confusão pode estar relacionada ao fato de que os indivíduos e populações identificados como S. marmoratus não formam um grupo monofilético, evidenciado por dados morfológicos

(Favorito-Amorim 1992) e moleculares (dois genes mitocondriais) (Perdices et al. 2005).

A análise de mais quatro espécies de Synbranchus identificadas como S. madeirae (2n=46), S. cf. lampreia (2n=44), Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2 (2n=42), coletadas em simpatria e sintopia no lago Catalão, Iranduba, no estado do Amazonas, revelou variabilidade cariotípica interespecífica, sendo verificados três números diploides e quatro fórmulas cromossômicas. Números diploides semelhantes aos encontrados no Amazonas foram visualizados em diferentes populações identificadas de S. marmoratus (Tabela 1). Porém, quando comparamos os dados do presente trabalho com os disponíveis na literatura, é possível verificar que nenhuma fórmula cromossômica foi idêntica, ressaltando a presença de rearranjos cromossômicos não-robertsonianos na evolução cromossômica do grupo. Ainda, apesar de não haver consenso com relação ao número diploide considerado basal para o gênero Synbranchus, a evolução cromossômica das espécies deste grupo também englobou rearranjos robertsonianos que possibilitaram o aparecimento das composições cariotípicas atuais, os quais favoreceram mudanças no número diploide. Segundo Sumner (2003), a alteração mais comumente envolvida na evolução cromossômica é o rearranjo robertsoniano do tipo fusão, mecanismo responsável pela redução do número diploide e aumento no número de cromossomos com dois braços. No presente trabalho as duas espécies que apresentaram menor número cromossômico (Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2, ambas com 2n=42 cromossomos) também evidenciaram mais cromossomos do tipo meta-submetacêntricos quando comparado à S. cf. lampreia e S. madeirae, corroborando a possível ocorrência de fusões cromossômicas. A presença destes rearranjos cromossômicos também pode ser visualizada pelo mapeamento físico cromossômico de sequências teloméricas, que consistem de repetições curtas, ricas em guanina (TTAGGG)n e amplamente conservadas nos genomas de vertebrados (Guerra 2004), sendo regiões de extrema importância para manutenção da estabilidade e integridade cromossômica (Nanda et al. 2002; Multani et al. 2006; Monagham 2010). A hibridização com sonda telomérica evidenciou marcações nos telômeros de todos os cromossomos das três espécies (S. madeirae, S. cf. lampreia e Synbranchus sp.1) (não foi obtida para Synbranchus sp. 2), além disso, foram encontradas marcações intersticiais em duas espécies, o que comprova que na

evolução cariotípica do grupo houve a ocorrência de evento de fusão, com a redução do número diploide. Ainda, essas sequências teloméricas intersticiais podem ser consideradas resquícios ancestrais de rearranjos cromossômicos, produzidos durante a evolução cariotípica (Metcalfe et al. 2007). Deste modo, isto é indicativo de um processo de rearranjo recente ocorrido durante a evolução do grupo (Nanda et al. 2002). Além disso, rearranjos cromossômicos do tipo inversões e translocações não podem ser descartados. Estes rearranjos podem contribuir para a reorganização do genoma, oferecendo novas fórmulas cromossômicas e novos números de braços nos cariótipos. Assim, os dados do presente trabalho corroboram com a hipótese de Foresti et al. (1992) e sugerem que o ancestral de Synbranchus possuía 2n=48 cromossomos. Além da variação interespecífica na fórmula cariotípica e número de cromossomos, a análise comparativa do tamanho dos cromossomos de S. marmoratus, S. cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2 também evidenciou diferenças na organização do genoma das mesmas. Apesar das quatro espécies apresentarem a maioria dos cromossomos distribuídos na classe de menor tamanho, a frequência dos cromossomos que estão agrupados nesta classe variou, sendo que 70% dos cromossomos de S. madeirae apresentam de 2,53 a 4,4µm, 50% dos de S. cf. lampreia, 42% dos de Synbranchus sp.1 e 52% dos de Synbranchus sp.2. Atualmente é amplamente aceito que a diversidade de tamanho e de organização dos genomas é influenciada por regiões de DNA repetitivo não codificante, como pseudogenes, retrotransposons, transposons, DNA satélite e outros, estando a maioria destes elementos alocados em regiões heterocromáticas (Leitch 2007).

O padrão de distribuição da heterocromatina de algumas espécies de Synbranchiformes foi estudado e blocos heterocromáticos foram visualizados nas regiões centromérica e pericentromérica de quase todos os cromossomos, sendo que em alguns foram também evidenciados em regiões intersticiais (Foresti et al. 1992; Sanchez e Fenocchio 1996; Oliveira et al. 1997; Liu et al. 2002). As quatro espécies de Synbranchus analisadas no presente trabalho apresentaram padrões de heterocromatina espécie-específicos, sendo possível observar além das marcações já encontradas para as outras espécies, blocos heterocromáticos nas regiões terminal, proximal e distal da maioria dos cromossomos, caracterizando um padrão muito diferente daqueles já descritos. Esse padrão distinto de distribuição de heterocromatina, com um possível

aumento da mesma, pode ser devido a um processo de heterocromatinização ou adição de heterocromatina nos indivíduos de Synbranchus spp. coletados no lago Catalão. Esta diferenciação pode ter ocorrido por trocas desiguais durante processos de crossing over, transposições ou duplicações dessas sequências, ou mesmo por mecanismos epigenéticos, como o remodelamento da cromatina e a metilação do DNA, os quais auxiliam na compactação e organização do genoma em domínios cromáticos (Grewal e Jia 2007).

Variação na quantidade e localização da heterocromatina constitutiva tem sido considerada como importante marcador de alguns gêneros de peixes amazônicos, como observado em Serrasalmus (Characidae, Serrasalminae), onde sete espécies apresentam um grande bloco proximal no braço longo de um par de cromossomos, coincidente com o DNAr 5S (Nakayama et al. 2008; Nakayama et al. no prelo). Ainda, em alguns casos, este marcador pode ser populacional, como evidenciado em diferentes populações de Geophagus brasiliensis (Vicari et al. 2006). A heterocromatina é atualmente reconhecida como uma parte importante do genoma dos eucariotos, cujas funções incluem segregação cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão gênica, e também pode afetar o processo de recombinação gênica (Grewal e Jia 2007; Skipper 2007; Bühler 2009).

Ainda, evidências mostram que as regiões heterocromáticas podem ter funções adicionais, incluindo a regulação da mitose, progressão do ciclo celular e proliferação das células assim como, podem estar associadas a respostas a mudanças no ambiente como muitas formas de estresses exógenos, como trocas de temperatura, choques térmicos e hipóxia (Burt e Trivers 2006; Varriale et al. 2008). Para espécies de peixes amazônicos já foi evidenciado que o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva nas três espécies de acarás-disco (Symphysodon spp., Cichlidae) pode estar relacionado ao ambiente em que vivem, visto que cada espécie ocorre preferencialmente em águas que apresentam padrões físico-químicos distintos (Gross et al. 2010a).

De maneira geral, em peixes, a heterocromatina é rica em sequências repetitivas e estas têm merecido atenção especial em estudos relativos à estrutura centromérica e telomérica (Lanfredi et al. 2001; Vicente et al. 2001), origem e evolução de cromossomos sexuais (Devlin et al. 1998; Stein et al. 2001; Venere et al. 2004),

cromossomos supranumerários (Mestriner et al. 2000; Jesus et al. 2003) e evolução dos genomas (da Silva et al. 2002). Dentre estas sequências repetitivas destacam-se os genes ribossomais e sequências teloméricas. Os DNAs codificadores de RNAs ribossomais podem ser divididos em duas famílias multigênicas, repetidas em tandem, a primeira classe, representada pelo DNAr 45S, que compreende as regiões que transcrevem os genes RNAs 28S, 18S e 5,8S, além de espaçadores intergênicos, estando estes genes relacionados com as regiões organizadoras de nucléolo; e a segunda classe, DNAr 5S, consiste de uma sequência altamente conservada de 120 pares de bases e espaçadores não transcritos (NTS) de tamanho variável (Martins 2007). Segundo revisão de Galetti Jr. e Martins (2004), estudos realizados em peixes neotropicais, como Astyanax spp, Brycon spp., Hoplias malabaricus, Leporinus spp., entre outros, têm utilizado a técnica da hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNA ribossômico, para compreender a organização das regiões organizadoras de nucléolo e inferir sobre a evolução cromossômica das espécies. Este método é considerado mais sensível que a impregnação por nitrato de prata porque localiza as sequências de DNA ribossômico da família 45S em metáfases mitóticas e células interfásicas, ao invés de marcar as proteínas nucleolares envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais como ocorre com a prata (Miller et al. 1976; Pendás et al. 1993; Phillips e Reed 1996).

Região organizadora de nucléolo simples pode ser considerada uma característica plesiomórfica em estudos de evolução cromossômica de qualquer grupo de organismos, e para a ordem Synbranchiformes, a RON simples é considerada uma condição ancestral (Oliveira et al. 1997). Dentro desta ordem, foram analisadas espécies das famílias Mastacembelidae e Synbranchidae. Na espécie Mastacembelus armatus, pertencente à primeira família, RON simples foi verificada e em Synbranchus marmoratus foi identificada RON simples em pelo menos 15 populações coletadas no Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil, porém em posições distintas, enquanto que três populações da Argentina apresentaram RON múltipla (Tabela 1). Porém, é necessário enfatizar que estes resultados para M. armatus e S. marmoratus referem-se apenas à impregnação com nitrato de prata, que tem afinidade com proteínas nucleolares envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais da família 45S,

identificando apenas as RONs que estiveram ativas durante a intérfase precedente (Miller et al. 1976; Howell e Black 1980; Boisvert et al. 2007). Ou seja, não é possível determinar com exatidão quantos são os sítios ribossomais encontrados nos indivíduos das diferentes populações de S. marmoratus já analisadas. Entretanto, em M. albus com o menor número diploide do grupo (2n=24 telocêntricos), o padrão da RONs evidenciada tanto pela impregnação com AgNO3 como pela FISH com sonda DNAr 18S foi simples e múltipla (Ji et al. 2003). Esses autores acreditam que essa variabilidade intraespecífica encontrada em M. albus, pode estar relacionada com a atividade transcricional dos genes ribossomais. No presente estudo, a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), detectada tanto pela impregnação com

AgNO3 como pela FISH com sonda DNAr 18S constituiu num excelente marcador espécie-específica para as quatro espécies de Synbranchus, ou seja, S. cf. lampreia apresentou RON simples, evidenciada tanto pela impregnação com AgNO3 como pela hibridização da sonda homóloga DNAr 18S; Synbranchus sp.1 apresentou RON múltipla, em ambas as técnicas e Synbranchus sp.2 mostrou apenas um cromossomo marcado pelo AgNO3 e até 14 marcações pela FISH com a sonda DNAr 18S. Já, S. madeirae apresentou RON múltipla e com variação intraespecífica para ambas as técnicas (Quadro1).

A discordância entre os números de RONs e sítios ribossomais 18S encontrada em S. madeirae provavelmente está relacionada com a atividade transcricional dos cístrons ribossomais, porém a detecção de dois padrões de distribuição dos genes RNAr 18S demonstra a presença de rearranjos cromossômicos do tipo não-robertsonianos nos indivíduos desta espécie, os quais podem ser facilitados pela presença de regiões heterocromáticas adjacentes ou coincidentes a estes cístrons. Ainda, estas regiões heterocromáticas podem estar abrigando elementos transponíveis, os quais parecem afetar a mobilidade dos cístrons ribossomais (Guerra 2004). Este fato corroboraria a hipótese de Sanchez e Fenocchio (1996), que analisando populações de S. marmoratus da Argentina, sugeriram que a localização da RON em regiões terminal e intersticial facilitaria eventos de translocação destes sítios no genoma, o que poderia explicar a origem de RON múltipla nestas populações.Variabilidade inter e intraespecífica quanto ao número e tamanho dos sítios ribossomais 18S relacionada à mobilização de

elementos transponíveis durante a evolução já foram descritas para outras espécies de peixes amazônicos, tais como os acarás-disco (Gross et al. 2010a).

Em relação ao gene DNAr 5S, para a maioria dos organismos ele está presente em apenas um par cromossômico, embora sua localização possa ser em região intersticial ou terminal, e só podem ser observados com a técnica de hibridização in situ (Martins e Galetti Jr 1999; Guerra 2004; Martins e Wasko 2004; Galetti Jr e Martins 2004). Entretanto, Martins e Galetti Jr. (1999) consideram que a localização desse sítio em posição intersticial nos cromossomos estaria mais protegida de eventos de transposição, os quais poderiam agir na dispersão dessas sequências. Esses autores hipotetizaram que a localização deste gene em apenas um par cromossômico seja a condição ancestral entre os organismos (Guerra 2004; Martins e Galetti Jr. 1999). A FISH com a sonda DNAr 5S, nas espécies de Synbranchus aqui analisadas, evidenciou uma marcação intersticial nos braços longos de um par cromossômico para três espécies, sendo que em S. cf. lampreia e em S. madeirae foi o par 7 e em Synbranchus sp.1 o par 10 (dado não obtido para Synbranchus sp 2). Porém, como as fórmulas cariotípicas são diferentes, pode-se considerar o sitio de DNAr 5S homeólogo para as três espécies de Synbranchus, sugerindo uma conservação para este gene, e que os diversos rearranjos ocorridos na evolução cariotípica deste gênero não afetaram o sítio DNAr 5S. Ainda, em peixes o DNAr 18S e 5S podem estar localizados em sintenia (Morán et al. 1996; Almeida-Toledo et al. 2002; Cross et al. 2006) ou localizados em diferentes pares cromossômicos (Martins e Galleti Jr 2001). Em S. madeirae a marcação 5S foi sintênica com uma das marcações do DNAr 18S.

A variabilidade cariotípica encontrada nas espécies de Synbranchus pode estar associada às características da biologia, fisiologia e reprodução desses peixes, e tais características podem ter favorecido o surgimento de mecanismos de isolamento reprodutivo ou interrupção do fluxo gênico (Futuyma, 2002; Ridley 2006), possibilitando a fixação de rearranjos cromossômicos. De acordo com Galleti Jr. et al. (2000), grupos de peixes com variação cariotípica apresentam possibilidade de formar populações isoladas, o que favorece a especiação e a formação de novos táxons, que nem sempre são reconhecíveis morfologicamente.

Nakamoto et al (1986a, b) analisando populações identificadas como S. marmoratus coletadas em diferentes regiões de São Paulo, observaram dois padrões de fenótipos eletroforéticos para a hemoglobina. O primeiro padrão, fenótipo 1, apresentou três bandas distintas de hemoglobinas: Hb1 (hemoglobina catódica), Hb 2 (hemoglobina intermediária) e Hb 3 (hemoglobina anódica) nos indivíduos das regiões de Botucatu, Rio Claro e Ribeirão Preto. O segundo fenótipo também apresentou os três tipos de hemoglobinas, mas com 12 bandas. Foresti et al (1992), estudando citogeneticamente os mesmos indivíduos, verificaram uma variação no número diploide (2n=42 a 46). Esses autores sugerem uma correlação entre o número diploide e o tipo de hemoglobina, ou seja, os indivíduos identificados pelo fenótipo 1 das hemoglobinas estão associados com números diploides iguais a 44 e 46 cromossomos, enquanto o fenótipo 2 relaciona-se apenas com 2n = 42 cromossomos.

Até o momento, apesar da presença de grande variabilidade cariotípica, cromossomos sexuais diferenciados não foram observados em espécies do gênero Synbranchus, e esta característica pode facilitar a reversão sexual descrita para essas espécies. Fato semelhante também ocorre em duas espécies de peixes hermafroditas sequenciais protogínicos Epinephelus guttatus (Perciformes, Serranidae) e Thalassoma bifasciatum (Perciformes. Labridae), cujos machos e fêmeas possuem constituição cromossômica idêntica e a determinação do sexo ocorre por mecanismos gênicos (Ruiz- Carus 2002). Diante da variabilidade cromossômica encontrada no presente trabalho e com base nos dados disponíveis na literatura para o gênero Synbranchus, acreditamos que a tendência mais provável de evolução cromossômica para este grupo seja a partir de um ancestral com 2n=48 cromossomos (extinto ou ainda não encontrado) com a redução do número diploide. Portanto, para que se possa realmente compreender os mecanismos envolvidos no processo da evolução cariotípica deste grupo de peixes, faz-se necessário elucidar a sistemática do mesmo, bem como, ampliar os locais de coleta e associar estudos que envolvam ecologia, biologia e genética de cada táxon.

5 Conclusões Através dos estudos citogenéticos realizados no presente trabalho, pode-se concluir que:

• Foi possível diferenciar quatro espécies de Synbranchus, tanto pela morfologia como pelos dados cromossômicos, sendo identificadas como: Synbranchus madeirae, Synbranchus cf. lampreia, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2.

• A variabilidade cariotípica interespecífica do gênero Synbranchus pode ser atribuída a rearranjos robertsonianos e não-robertsonianos.

• O padrão da heterocromatina constitutiva das quatro espécies de Synbranchus do lago Catalão caracterizou-se como um padrão muito diferente daqueles já descritos para Synbranchus marmoratus, sugerindo um processo de heterocromatinização ou adição de heterocromatina, ou ainda por fatores epigenéticos.

• A variabilidade da RON, simples para uma espécie (S. cf. lampreia) e múltipla para as outras três (S. madeirae, Synbranchus sp.1 e Synbranchus sp.2), tanto

por impregnação com AgNO3 como por FISH com DNAr 18S, pode estar relacionada com a atividade transcricional dos cístrons ribossomais ou com uma possível mobilização de elementos transponíveis.

• O sítio de DNAr 5S pode ser considerado homeólogo para S. madeirae, S. cf. lampreia e Synbranchus sp.1, sugerindo uma conservação para este gene ribossomal.

• A hibridização com sondas teloméricas evidenciou a presença destas sequências em posição intersticial, o que pode sugerir que rearranjos cromossômicos do tipo fusão e/ou inversão ocorreram em S. madeirae, S. cf. lampreia e Synbranchus sp.1.

6 Perspectivas No decorrer deste trabalho surgiram novas perspectivas de pesquisas. • A ampliação dos locais de coleta, para verificar se a variabilidade cariotípica encontrada em Synbranchus no lago Catalão é encontrada em outros locais. • Mapeamento cromossômico de outras sequências repetitivas como histonas, elementos transponíveis (Rex1, Rex3, Rex6, entre outros), para que seja possível compreender os mecanismos evolutivos que provocaram a variação do número de sítios DNAr 18S em S. madeirae. • Comparação da organização genômica dos diferentes táxons de Synbranchus por meio da GISH (hibridização genômica in situ). • Realização de estudos histológicos para que seja possível determinar o sexo dos indivíduos de Synbranchus. • Realização de estudos citogenéticos clássicos e moleculares de outras espécies da ordem Synbranchiformes, pois existem poucos dados citogenéticos para esta ordem.

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