Dizertační Práce

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie

Dizertační práce

Brno 2019 Stanislava Králová

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie

Typizace a taxonomie psychrofilních prokaryot z Antarktidy

Dizertační práce

Stanislava Králová

Školitel: doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Brno 2019

Bibliografický záznam

Autor: RNDr. Stanislava Králová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Česká sbírka mikroorganismů

Název práce: Typizace a taxonomie psychrofilních prokaryot z Antarktidy

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Mikrobiologie

Školitel: doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Česká sbírka mikroorganismů

Akademický rok: 2018/2019

Počet stran: 66 + publikace

Klíčová slova: systematika, taxonomie, klasifikace, typizace, Antarktida, druh, mastné kyseliny, diverzita, adaptace

Bibliografický záznam

Autor: RNDr. Stanislava Králová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Česká sbírka mikroorganismů

Názov práce: Typizácia a taxonómia psychrofilných prokaryot z Antarktídy

Štúdijný program: Experimentálna biológia

Štúdijný odbor: Mikrobiológia

Školiteľ: doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Česká sbírka mikroorganismů

Akademický rok: 2018/2019

Počet strán: 66 + publikácie

Kľúčové slová: systematika, taxonómia, klasifikácia, typizácia, Antarktída, druh, mastné kyseliny, diverzita, adaptácia

Bibliografický záznam

Author: RNDr. Stanislava Králová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Czech Collection of Microorganisms

Title of Dissertation: Typing and taxonomy of psychrophilic prokaryotes from Antarctica

Degree Programme: Experimental Biology

Field of study: Microbiology

Supervisor: Assoc. prof. RNDr. Ivo Sedláček, CSc Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Czech Collection of Microorganisms

Academic Year: 2018/2019

Numer of Pages: 66 + scientific papers

Key Words: systematics, taxonomy, classification, typing, Antarctica, species, fatty acids, diversity, adaptation

Abstrakt

Předkládaná dizertační práce je koncipováná jako soubor komentovaných publikací, jejichž hlavním objektem jsou zástupci početného rodu Flavobacterium. Flavobakterie jsou významnými kolonizátory chladných oblastí, a to hlavně vod a půd. Z toho důvodu představují jeden z nejvíce zastoupených a zároveň kultivovatelných rodů kolonizujících antarktické habitaty. Dizertační práce představuje taxonomické studium flavobakterii vyizolovaných z abiotických vzorků získaných právě na Antarktidě. Izolované kmeny byly charakterizovány polyfázovým taxonomickým přístupem, s využitím fenotypových (biotypizace), chemotaxonomických (mastné kyseliny, polární lipidy, menachinony, polyaminy) a molekulárních metod (PCR, repetitivní PCR, DNA-DNA hybridizace, sekvenování genů pre 16S rRNA, celogenómové sekvenování). Mimo jiné, chemotaxonomické analýzy, konkrétně analýza mastných kyselin, umožnily charakterizovat velmi diskutované adaptační mechanizmy chladnomilných baktérií. Výsledkem této práce byla rozsáhlá charakterizace žlutě pigmentujících izolátů, která vedla až k popisům nových taxonů, a také podrobná charakterizace adaptačních mechanizmů cytoplazmatické membrány, které umožňují přežití flavobakterii v extrémnich antarktických podmínkách.

Abstrakt

Predkladaná dizertačná práca je koncipovaná ako súbor komentovaných publikácií, ktorých hlavným objektom sú zástupcovia početného rodu Flavobacterium. Flavobaktérie sú významnými kolonizátormi chladných oblastí, a to najmä vôd a pôd. Z tohto dôvodu predstavujú aj jeden z naviac zastúpených a zároveň dobre kultivovateľných rodov kolonizujúcich antarktické habitaty. Dizertačná práca predstavuje taxonomické štúdium flavobaktérií vyizolovaných z abiotických vzoriek odoberaných práve na Antarktíde. Izolované kmene boli charakterizované polyfázovým taxonomickým prístupom, s využitím fenotypových (biotypizácia), chemotaxonomických (mastné kyseliny, polárne lipidy, menachinóny, polyamíny) a molekulárnych metód (PCR, repetitívna PCR, DNA-DNA hybridizácia, sekvenovanie génov pre 16S rRNA, celogenómová sekvenácia). Okrem toho, chemotaxonomické analýzy, kontrétne analýza mastných kyselín, umožnili charakterizovať veľmi diskutované adaptačné mechanizmy chladnomilných baktérií. Výsledkom tejto práce bola rozsiahla charakterizácia žlto pigmentovaných izolátov, ktorá vyústila až k popisom nových taxónov, a taktiež podrobná charakterizácia adaptačných mechanizmov cytoplazmatickej membrány, ktoré umožňujú prežitie flavobaktérií v extrémnych antarktických podmienkach.

Abstract

Present Ph.D thesis is compiled as a collection of commented scientific papers focused on members of the genus Flavobacterium. Flavobacterium spp. are important colonizers of cold areas, especially waters and soils. For this reason, they are also found as one of the most abundant and cultivable genus in Antarctica. This Ph.D thesis is compiled as a taxonomic study of Flavobacterium spp. isolated from abiotic samples collected in Antarctica. Isolates were characterized with polyphasic taxonomic approach. Methods including phenotyping (biotyping), chemotaxonomy (fatty acids, polar lipids, menaquinones, polyamines) and methods of molecular biology (PCR, repetitive PCR, sequencing of the 16S rRNA genes, DNA-DNA hybridization, whole genome sequencing) were all used in this study. Moreover, chemotaxonomic approach, analysis of fatty acids, was used in order to determine cold adaptation of this cold-loving bacteria. Findings of this study led to extensive characterization of yellow pigmented isolates followed by description of novel Flavobacterium species. Besides, analysis of fatty acids resulted in characterization of membrane adaptation mechanisms enabling these bacteria to survive in extreme Antarctic conditions.

Poďakovanie

Na tomto mieste by som sa chcela úprimne poďakovať vedúcemu svojej dizertačnej práce docentovi Ivo Sedláčkovi za odborné rady, trpezlivosť a vedenie počas nielen doktorandského šúdia ale aj počas spracovávania dizertačnej práce a publikovania prvých článkov, čo si nesmierne vážim. RNDr. Pavlovi Švecovi srdečne ďakujem za podporu, každú radu, mnohé konzultácie a vylepšenie nálady v stresových obdobiach štúdia. Ďalšie poďakovanie venujem celému kolektívu Českej zbierky mikroorganizmov, nielen za poskytnutie podmienok pre experimenty, ale taktiež za príjemné pracovné podmienky a podporu počas celého doktorandského štúdia. V neposlednom rade by som sa chcela poďakovať všetkým spoluautorom za výborne odvedenú prácu a mnohé konzultácie, ktoré viedli k úspešným publikačným výstupom. Moja veľká vďaka patrí prof. Bussemu na Veterinárnej Univerzite vo Viedni, nakoľko bol ochotný poskytnúť zázemie a taktiež svoj cenný čas a rady pre uskutočnenie chemotaxonomických analýz, súvisiacich nielen s touto dizertačnou prácou. Menovite by som sa tiež rada poďakovala RNDr. Danielovi Krskovi na SZÚ v Prahe za snímky z elektrónového mikroskopu, bez ktorých by ani jedna z tu prezentovaných taxonomických publikácií nevznikla.

Prehlásenie Prehlasujem, že som svoju dizertačnú prácu vypracovala samostatne s využitím informačných zdrojov, ktoré sú v práci a v jej prílohách citované.

Brno 01.01. 2019 ………………………. Stanislava Králová

OBSAH:

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK ...... 12 1. ÚVOD ...... 13 1.1 Mikrobiálna kolonizácia chladných habitatov ...... 13 1.2 Život na Antarktíde ...... 13 1.3 Štúdium antarktických baktérií ...... 14 1.4 Ekológia psychrofilov na Antarktíde ...... 15 1.4.1 Akvatické habitaty ...... 15 1.4.2 Mikrobiálne povlaky ...... 17 1.4.3 Pevninské habitaty ...... 17 1.5 Adaptácia a fyziológia psychrofilných baktérií ...... 18 1.5.1 Environmentálne adaptácie...... 19 1.5.1.1 Výber habitatu ...... 19 1.5.1.2 Dormantný stav ...... 19 1.5.2 Molekulárne adaptácie ...... 20 1.5.2.1 Genóm ...... 20 1.5.2.2 Proteíny a enzýmy ...... 20 1.5.2.3 Odpovede na teplotné šoky ...... 21 1.5.3 Fyziologické adaptácie ...... 21 1.5.3.1 Cytoplazmatická membrána ...... 21 1.5.3.2 Protimrznúce proteíny a kryoprotektanty ...... 22 1.6 História rodu Flavobacterium ...... 23 1.7 Súčasná taxonómia rodu Flavobacterium ...... 23 1.8 Charakteristika rodu Flavobacterium ...... 25 1.9 Ekológia rodu Flavobacterium ...... 26 2. CIELE PRÁCE ...... 28 3. MATERIÁL A METODIKA ...... 29 3.1 Vzorky ...... 29 3.2 Fenotypová charakterizácia ...... 33 3.2.1 Morfológia ...... 33 3.2.2 Biochémia a fyziológia ...... 33 3.3 Genotypová charakterizácia ...... 35 3.3.1 Screeningová PCR ...... 35 3.3.2 Sekvenácia génov pre 16S rRNA ...... 36 10

3.3.3 rep-PCR ...... 39 3.3.4 DNA-DNA hybridizácia ...... 39 3.3.5 Celogenómové sekvenovanie ...... 39 3.4 Chemotaxonomické znaky ...... 40 3.4.1 Analýza mastných kyselín ...... 40 3.4.2 Analýzy menachinónov, polárnych lipidov a polyamínov ...... 41 4. VÝSLEDKY A DISKUSIA ...... 42 4.1 Screening a úvodné roztriedenie izolátov ...... 42 4.2 Flavobacterium circumlabens sp. nov. a Flavobacterium cupreum sp. nov...... 42 4.3 Flavobacterium chryseum sp.nov. a Flavobacterium psychroterrae sp.nov...... 43 4.4 Mastné kyseliny v chladovej adaptácií flavobaktérií ...... 45 5. ZÁVER ...... 47 6. ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ...... 49 7. ODBORNÉ AKTIVITY UCHÁDZAČKY ...... 59 8. PRÍLOHY ...... 65

ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK

CCM - „Czech Collection of Microorganisms“ (Česká sbírka mikroorganismů)

CFB skupina/kmeň - Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroidetes skupina/kmeň

ECL - „ekvivalent chain lenght“ (ekvivalentné dĺžky reťazcov)

EPS - exopolysacharid

FAME analýza - „fatty acid methyl esters analysis“ (analýza metylesterov mastných kyselín)

FID - „flame-ionization detector“ (plameňo-ionizačný detektor)

GC - „gas chromatography“ (plynová chromatografia)

HPLC - „high performance liquid chromatography“ (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia)

MK - mastné kyseliny

ML – „maximum-likelihood“ (štatistická metóda)

NJ – „neighbour-joining“ (štatistická metóda)

PCR - „polymerase chain reaction“ (polymerázová reťazová reakcia) rep-PCR – repetitívna PCR

TLC - „thin-layer chromatography“ (tenkovrstvová chromatografia)

WGS – „whole genome sequencing“ (celogenómové sekvenovanie)

1. ÚVOD

1.1 Mikrobiálna kolonizácia chladných habitatov

Mikroorganizmy sú najúspešnejší kolonizátori našej planéty. Nachádzame ich rozšírené kozmopolitne, od jedného pólu k druhému, v prostrediach ako horúcich tak studených, v hĺbkach pod vysokým tlakom i naopak v stratosfére. Navyše, samostatnú kapitolu tvoria mikroorganizmy kolonizujúce faunu a flóru, či už ako komenzálová mikroflóra, alebo patogénne agens. Naša planéta býva často označovaná ako “chladná“ nakoľko 80-85% biosféry je tvorenej chladnými prostrediami s permanentnými teplotami nedosahujúcimi viac než 15 °C (Margesin a Miteva 2011; Miller a Whyte 2011). Chladné ekosystémy, počnúc Arktídou a končiac Antarktídou zahŕňajú vysokohorské aj hlbokooceánske oblasti, snehom či ľadom pokryté oblasti, permafrost, chladné pôdy, púšte či jaskyne. Všetky tieto oblasti boli mikroorganizmami úspešne kolonizované, a to ako baktériami, archeami a vírusmi, tak aj kvasinkami, vláknitými hubami a riasami (Margesin a Miteva 2011). Mikroorganizmy osídľujúce tieto chladné oblasti sú popisované ako chladovo-adaptované, teda psychrofilné či psychrotolerantné (De Maayer a kol. 2014).

1.2 Život na Antarktíde

Za jednu z najchladnejších a zároveň najextrémnejších oblastí na svete je považovaná práve Antarktída (Reddy a kol. 2016). Tento piaty najväčší kontinent na Zemi je z 98 % pokrytý pevnou vrstvou ľadu s priemernou hrúbkou dosahujúcou až 1,6 km (Miller a Whyte 2011). Nielen ľadová pokrývka, ale aj faktory ako extrémne nízke teploty, extrémy v pH či salinite, nedostatok vody a vlhkosti, nedostatok nutrientov alebo periodizácia tmy a silného UV žiarenia, či cykly zamŕzania a topenia sú zodpovedné za vytvorenie prostredia, ktoré je doslova nevľúdne pre život (D’Amico a kol. 2006; Peeters a kol. 2011; Taylor a Taylor 2012; Makhalanyane a kol. 2015). Napriek všetkému, Antarktída je prekvapujúco osídlená množstvom organizmov, pričom väčšinu biomasy tvoria práve mikroorganizmy (Wynn- Williams 1996) a v menšom množstve je domovom pre stavovce (ryby, vtáky, tulene, tučniaky...), bezstavovce (pomalky, chvostoskoky, hlístovce... ) alebo nižšie rastliny (najmä machy, lišajníky) (Chown a kol. 2015). Je to najmä nedostatok vody a miernejšie teploty, ktoré obmedzili život na Antarktíde, a to málo čo zostalo odsunuli najmä do pobrežných oblastí Antarktického poloostrova (Miller a Whyte 2011). Avšak, v porovnaní s makroskopickými organizmami sa práve mikroorganizmy 13 dokázali rozšíriť naprieč celým antarktickým kontinentom. Z prokaryot sú to práve baktérie, ktoré sa ukázali ako úspešní kolonizátori, osídľujúci celé spektrum antarktických ekologických ník (Reddy a kol. 2016). Distribúcia baktérií v tomto prostredí je ovplyvnená niekoľkými faktormi, a to ako fyzikálne-chemickými vlastnosťami pôd (pH, vlhkosť, obsah živín, salinita), tak aj miestne-špecifickými faktormi (nadmorská výška, stúpanie, slnečná radiácia) (Cameron a kol. 1970).

1.3 Štúdium antarktických baktérií

Počiatky bakteriológie na Antarktíde boli pôvodne pevne späté s využívaním kultivačne-závislých metód. Na ich základe sa zistilo relatívne bakteriálne zastúpenie v rôznych antarktických habitatoch, pričom najbohatšie sú pôdy (105-1010 CFU/g pôdy) nasledované sedimentami (106-107 CFU/g sedimentov), vodou (102-107 CFU/ml vody) a ľadom (102-1012 CFU/g ľadu) (Reddy a kol. 2016). Samotná diverzita bakteriálnych komunít na Antarktíde sa ukazuje výrazne vyššia vo vodách, pôdach a mikrobiálnych povlakoch (z angl. „mats“) v porovnaní so sedimentami či ľadom (Reddy a kol. 2016). V dnešnej dobe je však známym faktom, že väčšina environmentálnych baktérií (až 99 %) je klasifikovaná ako nekultivovateľné, resp. „zatiaľ nekultivovateľné“ (z angl. „yet-to-be cultivable“) (Vartoukian a kol. 2010; Hug a kol. 2016). Kultivačne-závislé štúdie teda vo výraznej miere podhodnocujú informácie o celkových množstvách a diverzite baktérií, ktoré sme doposiaľ získali z antarktických štúdií. Na druhej strane, v posledných rokoch závratným tempom stúpa trend aplikácie molekulárnych metód, ktoré nevyžadujú kultivačný krok. Tieto postupy, zväčša založené na sekvenovaní génov pre 16S rRNA, štúdiu funkčných génov alebo na tzv. shotgun sekvenovaní priamo zo vzoriek, umožňujú hlbšie porozumenie mikrobiálnym komunitám na Antarktíde, nakoľko nie sú zaťažené kultivačnou chybou (Tytgat a kol. 2014; Reddy a kol. 2016). Príkladom môže byť porovnanie bakteriálnej diverzity v mikrobiálnych povlakoch na Antarktíde, kedy pyrosekvenovanie zo vzoriek zachytilo zástupcov z 22 bakteriálnych kmeňov a 285 rodov, v porovnaní s kultivačným záchytom zástupcov spadajúcich do 5 kmeňov a 86 rodov (Tytgat a kol. 2014). Odhliadnúc od presného typu environmentálnych vzoriek, majoritný výskyt bol na základe kultivačných metód pripisovaný zástupcom z fylogenetických skupín Alphaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria a Deinococcus- Thermus (D’Amico a kol. 2006; Peeters a kol. 2011; Wilkins a kol. 2013; Tytgat a kol. 2014). Naproti tomu, po zavedení molekulárne-genetických metód nezávislých na kultivácií sa toto spektrum výrazne obohatilo o zástupcov Verrucomicrobia, Planctomyces, Spirochaetes,

Chloroflexi, Beta,-, Gamma,- a Deltaproteobacteria, Acidobacteria a množstvo ďalších (Shivaji 2005; D’Amico a kol. 2006; Tytgat a kol. 2014).

1.4 Ekológia psychrofilov na Antarktíde

Aj keď je Antarktída nehostinné prostredie, je zaujímavé, že ponúka nie jeden, ale niekoľko rôznych habitatov, ktoré sú domovom pre bakteriálnu mikroflóru. Tieto zahŕňajú: • ľad a kryokonity • jazerá • morskú vodu • mikrobiálne povlaky • skaly a nunataky • sedimenty • permafrost • antarktické terestriálne oblasti (suché údolia, ornitogénne pôdy, termálne oblasti, sezónne či trvalé jazerá, rieky, potoky a ich sedimenty) • Antarktický poloostrov (terestriálne oblasti, pobrežie, rôzne vodné zdroje) Každý z týchto habitatov sa vyznačuje špecifickými vlastnosťami, či už fyzikálne- chemickými alebo lokálnymi, čo vedie vo výsledku k rôznorodej a bohatej bakteriálnej diverzite a tvorbe rozmanitých, často veľmi komplexných, mikrobiálnych komunít.

1.4.1 Akvatické habitaty

Jazerá, rybníky a potoky prevládajú nielen v pobrežných, ale taktiež vo vnútrozemských častiach Antarktídy. Väčšina doterajších výskumov bola zameraná na jazerá formované ľadovcovou eróziou, lokalizované v tzv. suchých antarktických údoliach. Vo všeobecnosti však existujú 3 typy antarktických jazier, podľadovcové, často pospájané systémom podľadovcových vodných tokov, permanentne prekryté ľadovou vrstvou a pobrežné s premenlivou ľadovou vrstvou (Margesin a Miteva 2011). Tieto jazerá sa vyznačujú buď sladkou vodou, alebo hypersalinným charakterom, vertikálnym miešaním vo vodnom stĺpci alebo naopak stabilnou stratifikáciou (Wilkins a kol. 2013). Vo výsledku je síce mikrobiálna fauna v akvatických habitatoch redukovaná napríklad v porovnaní s pôdami, avšak diverzita komunít medzi jednotlivými jazerami alebo nikami v rámci jazier je markantná. Podľadovcové jazerá sú unikátne svojou exkluzívne mikrobiálnou faunou, pričom však obsahujú extrémne malé množstvá mikroorganizmov (400 buniek/ml) (Margesin a Miteva 2011). Doterajšie výskumy týchto jazier využívali hlavne vodu vytekajúcu k povrchu, prípadne vzorky ľadu 15 získané hĺbkovými vrtmi. Oba tieto prístupy sú však značne ovplyvniteľné kontamináciami a vyhodnotenie získaných výsledkov nie je jednoduché (Siegert a kol. 2012; Priscu a kol. 2013). Napríklad, z najznámejšieho subľadovcového jazera Vostok boli zatiaľ spoľahlivo získané len dva mikrobiálne izoláty a to doposiaľ neklasifikovaný izolát (na základe sekvencie génu pre 16S rRNA s 86 % príbuznosťou ku najbližšiemu známemu taxónu) a izolát príbuzný rodu Janthinobacterium (93 % príbuznosť) (Bulat 2016). Na základe molekulárnych analýz je však zrejmé, že mikrobiálna diverzita v podľadovcových jazerách bude väčšia, zahŕňajúca hlavne skupiny Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria a Firmicutes (Christner a kol. 2014). Pre porovnanie, jazerá prekryté ľadovou vrstvou obsahujú oveľa väčšie množstvá mikroorganizmov (105-106 buniek/ml) či už baktérií, vírusov, archeí alebo eukaryot (Margesin a Miteva 2011). Hlbokomorské vodné prostredie predstavuje ďalší extrémny habitat ktorý je kolonizovaný špecifickou mikroflórou. Obvykle ide o tzv. psychropiezofilov, ktorý sú adaptovaní na život v chlade, pri vysokom tlaku (> 0.1 MPa), absencii slnečného žiarenia a nedostatku živín (Margesin a Miteva 2011). Najčastejšími zástupcami sú gammaproteobaktérie (rody Shewanella, Moritella, Photobacterium, Psychromonas, Marinomonas, Halomonas, Colwellia), deltaproteobaktérie (rod Desulfovibrio), grampozitívny rod Carnobacterium a amoniak-oxidujúce archea (Kaneko a kol. 2007; Lauro a Bartlett 2008; Dang a kol. 2009). Novšie analýzy však poukazujú aj na výrazné množstvá alphaproteobaktérií, aktinobaktérií a planctomycét, ktoré sa doposiaľ podarilo detekovať len na základe molekulárnych analýz (Lauro a Bartlett 2008). Morský ľad je sezónne variabilný útvar ktorý je charakterizovaný vysokou salinitou, vysokým pH a nízkou teplotou. Napriek tomu, najvyššie aj najnižšie vrstvy sú úspešne kolonizované vysoko adaptilnými mikroorganizmami, ktoré využívajú hlavne miesta obmývané slanou vodou (Collins a kol. 2008). Pevninské ľadovce predstavujú ďalší z akvatických habitatov, všeobecne označovaný ako najdrsnejší pre život. Okrem nízkych teplôt pohybujúcich sa medzi -10 až -56 °C je toto prostredie chudobné na živiny, využiteľnú vodu aj slnečné svetlo (Margesin a Miteva 2011). Je fascinujúce, že práve ľadovce predstavujú obrovský rezervoár mikrobiálneho života, ktorý je zachovaný v podobe postupne namrznutých vrstiev ľadu, nakumulovaného počas niekoľko tisícročí, a to stále v aktívnom stave (Margesin a Miteva 2011). Hustota kultivovateľných baktérií sa pohybuje okolo 102-107 CFU/ml rozmrazenej vody a na základe fylogenetických analýz sú najčastejšie prítomní zástupcovia Methylobacterium, Rhodococcus, Mycobacterium, Sphingomonas, Arthrobacter a Frigoribacterium (Miteva a kol. 2004; Priscu a kol. 2007). 16

V súvislosti s ľadovcami je nevyhnutné spomenúť existenciu tzv. kryokonitov, ktoré predstavujú odlišný a veľmi špecifický habitat pozostávajúci z vodou vyhĺbených dier a chodbičiek (tzv. žilky) v ľadovcoch, často vyplnených roztopenou vodou, organickou hmotou a otvorených voči atmosfére (ojedinele „zaviečkovaných“ ľadom). Tieto kryokonity disponujú bohatou mikroflórou cyanobaktérií a rias, heterotrofných baktérií, kvasiniek, prvokov i vírusov (Margesin a Miteva 2011). Vzhľadom na túto rozmanitosť sú práve kryokonitové komunity považované za tzv. horúce miesta (z angl. „hot-spots“) metabolickej aktivity v Antarktíde (Anesio a kol. 2009).

1.4.2 Mikrobiálne povlaky

Tzv. mikrobiálne povlaky sú veľmi špecifickým typom habitatu na Antarktíde, pričom ich vznik je viazaný na jazerné oblasti, potoky a rybníky, teda na oblasti s dostupnou vodou (trvalo či sezónne). Ide o hutné, vertikálne stratifikované mikrobiálne komunity, ktoré vznikli postupnou kumuláciou v priebehu tisícročí a podliehajú len minimálnym zmenám (Rojas a kol. 2009). Tieto mikrobiálne povlaky zároveň predstavujú najbohatšie a najproduktivnejšie antarktické ekosystémy vôbec. Hoci skladba týchto komunít je rozdielna v závislosti na lokalite, určité skupiny sú detekované naprieč povlakmi rozmiestnenými po celom kontinente, a to najmä zástupcovia taxónov Cyanobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria a Firmicutes (Van Trappen a kol. 2002; Wilkins a kol. 2013; González-Rocha a kol. 2017). Podľa množstva štúdií je zároveň jasné, že práve mikrobiálne povlaky sú jedným z najväčších rezervoárov mikrobiálnej diverzity na Antarktíde, ktoré sú zároveň bohaté na množstvo nových bakteriálnych taxónov (Brambilla a kol. 2001; Peeters a kol. 2011).

1.4.3 Pevninské habitaty

Územia na Antarktíde, ktoré nie sú pokryté ľadom, tvoria len 2 % celkového povrchu tohto kontinentu (Miller a Whyte 2011). Aj keď táto frakcia sa zdá byť malá, opäť je charakteristická spektrom odlišných habitatov (nunataky, ornitogénne a minerálne pôdy, termálne oblasti, skaly). Najbohatším pevninským habitatom sú tzv. ornitogénne pôdy, ktoré sú asociované najmä s kolóniami tučniakov a vtákmi v pobrežných oblastiach. Práve vďaka tejto kolonizácií sú ornitogénne pôdy bohaté na organický uhlík, zdroje dusíka a fosforu, čo podporuje rozvoj mikrobiálnych komunít v ďaleko väčšej mierke ako je to u pôd minerálneho charakteru (až 2x1010 CFU/g pôdy) (Bowman a kol. 1996; Aislabie a kol. 2009). Zároveň bolo dokázané že ornitogénne pôdy sa vyznačujú taktiež vysokou respiráciou a enzymatickou aktivitou (Tscherko a kol. 2003). Najvýznamnejšími zástupcami v týchto pôdach sú taxóny

Firmicutes a Gammaproteobacteria, konkrétne rody Psychrobacter, Arthrobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Clostridium a mnohé ďalšie (Bowman a kol. 1996; Zdanowski a kol. 2005; Aislabie a kol. 2009; Kim, Chae, a kol. 2012; Rampelotto a kol. 2015). Oproti tomu, minerálne pôdy, chudobnejšie na živiny, vykazujú menšiu mikrobiálnu diverzitu a prítomnosť najmä acidobaktérií a aktinobaktérií (Tytgat a kol. 2016). Špecifickým pevninským habitatom sú porózne skalné materiály, ktoré umožňujú rozvoj mikrobiálnych komunít, nakoľko poskytujú ochranu voči UV žiareniu, vetru a zadržiavajú využiteľnú vodu (Cockell a Stokes 2004). Mikrobiálne komunity utvárajúce sa v asociácií so skalami sa označujú ako tzv. litické, ktoré sa rozlišujú na subtypy podľa špecifickej niky ktorú obsadzujú (Elster a Benson, 2014). Posledným pevninským a pre život krutým habitatom je tzv. permafrost, čo je trvalo zamrznutá pôda (min. po dobu 2 rokov). Permafrost na Antarktíde je charakteristický prekrytím ľadom, alkalickým pH, nízkym obsahom ílu i organickej hmoty a teplotami medzi -18 až -27 °C (Margesin a Miteva 2011). Množstvá mikroorganizmov v antarktickom permafroste sa pohybujú vo vzťahu k lokalite medzi 103-105 buniek/g pôdy (Goordial a kol. 2016). Pre mikroorganizmy permafrostu je charakteristická nielen odolnosť voči teplotám pod bodom mrazu, ale taktiež odolnosť voči striedavému topeniu a zamŕzaniu, radiácií a taktiež voči celému spektru antibiotík (Margesin a Miteva 2011; Mindlin a Petrova 2017). Dlhodobé prežívanie mikroorganizmov v permafroste je neustále predmetom diskusií. Doteraz sa podarilo kultivačne zachytiť pomerne malé množstvo mikroorganizmov, pričom sa zdá, že jednou z príčin je ich existencia v tzv. „viable but not culturable state“ (živé, ale nekultivovateľné) (Margesin a Miteva 2011). Doposiaľ bolo z permafrostu vyizolovaných cca 70 bakteriálnych rodov, ktorým dominujú rody zo skupín Actinobacteria a Firmicutes, v starších permafrostoch aj Gammaproteobacteria (Gilichinsky a kol. 2008).

1.5 Adaptácia a fyziológia psychrofilných baktérií

Prežitie baktérií v extrémnych antarktických podmienkach je podmienené ich adaptívnou kapacitou, teda schopnosťou vyrovnať sa nielen s chladom ale aj aditívnymi stresovými faktormi, ktoré na ne pôsobia (sucho, radiácia, UV žiarenie, extrémy pH, vysoký osmotický tlak, nedostatok nutrientov a pod.). Vo všeobecnosti organizmy adaptované na život v chladným podmienkach označujeme ako psychrofilné, pričom však toto označenie zahŕňa dve fyziologicky odlišné skupiny organizmov. Psychrofilné mikroorganizmy sensu stricto sa vyznačujú optimálnymi rastovými teplotami pod 15 °C (a horným limitom max. 20 °C), zatiaľ 18

čo predstavitelia tzv. psychrotolerantných mikroorganizmov prežívajú teploty pod 0 °C, avšak ich optimálne rastové teploty sa pohybujú medzi 20 – 25 °C (Morita 1975). Spoločné označenie oboch týchto skupín ako tzv. psychrofilných je dané často nepresnými informáciami v publikáciách alebo nedostatkom informácií o rastových teplotách jednotlivých skúmaných mikroorganizmov (De Maayer a kol. 2014). Podmienkou prežitia v Antarktíde je už spomínaná schopnosť adaptácie. Nízka teplota a aditívny stress negatívne ovplyvňujú najmä fluiditu membrán, bunkovú integritu, viskozitu vody, rýchlosť difúzie, enzymatickú kinetiku či makromolekulárne interakcie (Rodrigues a Tiedje 2008). Adaptačné mechanizmy, ktorými baktérie reagujú na meniace sa podmienky prostredia sa dajú podľa De Maayera a kol. (2014) rozdeliť do minimálne troch kategórií: • environmentálne adaptácie • molekulárne adaptácie • fyziologické adaptácie

1.5.1 Environmentálne adaptácie

1.5.1.1 Výber habitatu

Environmentálne stresy selektujú mikroflóru, ktorá je schopná kolonizovať dané oblasti. Mikrobiálne komunity primárne kolonizujú a prežívajú v tzv. refugiách, teda oblastiach ktoré im poskytujú ochranu voči environmentálnym stresom (Cowan a kol. 2010). Typický príklad sú pevninské mikrobiálne komunity kolonizujúce skaly (resp. ich porózne časti), kde sú chránené voči suchu či UV žiareniu a zároveň majú dostatok využiteľnej vody (Cowan 2009). Ďalším príkladom môžu byť psychrofilovia žijúci v ľadovcoch alebo morskom ľade, ktorý využívajú existenciu vodou vyhĺbených dier alebo chodbičiek, ktoré obsahujú nielen využiteľnú vodu, ale taktiež organický materiál ako zdroj živín (Mader a kol. 2006).

1.5.1.2 Dormantný stav

Jednou z možností prežitia, charakteristickou hlavne pre gramnegatívne baktérie, je schopnosť prechodu do dormantného stavu (z angl. „viable but not culturable state“), kedy sú bunky schopné respirácie, metabolizácie obmedzeného množstva živín, ale zároveň neschopné replikácie (McDougald a kol. 1998). Tento stav je reverzibilný a zabezpečuje obnovenie schopnosti replikácie pokiaľ sa zlepšia podmienky prostredia. Na základe analýz izolátov z antarktických jazier a na základe mikroskopických pozorovaní zo vzoriek permafrostu je tento dormantný stav aktívne diskutovaný ako jeden z adaptívnych mechanizmov na extrémne

19 antarktické podmienky, avšak pre potvrdenie týchto teórií sú rozhodne potrebné podrobnejšie štúdie (Chattopadhyay 2000; Margesin a Miteva 2011; De Maayer a kol. 2014).

1.5.2 Molekulárne adaptácie

1.5.2.1 Genóm

Základnými chladovými adaptáciami ktoré sú viditeľné v genóme je zvyšovanie negatívneho vinutia v DNA, multiplikácia kópií pre tRNA a zvýšenie množstva génov kódujúcich chaperóny (Rodrigues a Tiedje 2008; De Maayer a kol. 2014). Hlavne posledné dva mechanizmy naznačujú zvýšenie translačnej kapacity a taktiež post-translačných úprav u psychrofilov čo má pravdepodobne efekt na zvýšenie viability v nepriaznivých podmienkach. Ďalším charakteristickým znakom psychrofilov je aj horizontálny prenos génov a výrazná plasticita genómu súvisiaca s plazmidmi, genomovými ostrovmi či transpozónmi. Zdá sa, že väčšina týchto elementov má pritom vplyv na syntézu nenasýtených mastných kyselín a vo výsledku ovplyvňuje stavbu a funkčnosť membrán v chladných podmienkach (Feng a kol. 2014).

1.5.2.2 Proteíny a enzýmy

Všeobecne známym faktom je, že reakčná rýchlosť je v závislosti na klesajúcej teplote silne redukovaná, čo negatívne ovplyvňuje všetky bunkové pochody. Aby nedochádzalo k spomaľovaniu metabolizmu, musia byť enzýmy psychrofilov schopné zachovať reakčnú rýchlosť adekvátnu pre život buniek, a to aj za nízkých teplôt. Jedným z adaptačných mechanizmov sú zmeny v aminokyselinovom zložení proteínov a enzýmov. Napríklad, redukcia arginínu a prolínu, ktoré sú zodpovedné za tvorbu vodíkových väzieb, zvyšuje konformačnú flexibilitu enzýmov (Michaux a kol. 2008). Podobný efekt má zvýšenie množstiev asparagínu, methionínu, glycínu a pomeru lyzín/arginín, čo znižuje množstvo vodíkových väzieb a zvyšuje tak lokálnu mobilitu (De Maayer a kol. 2014). Ďalšie zmeny zahŕňajú zvýšenie množstiev hydrofóbnych reziduí na povrchu, zmnoženie a zväčšenie katalytických miest alebo ich mobility. Typicky sú psychrofilné enzýmy štrukturálne flexibilnejšie, menej termostabilnejšie a aktívnejšie v nižších teplotách v porovnaní s ich analógmi u mezofilov (De Maayer a kol. 2014). Tieto vlastnosti spôsobujú, že psychrofilné enzýmy majú vyššiu mieru kompatibility svojích katalytických a väzbových miest, čo vedie k redukcii aktivačnej energie a zvýšeniu rýchlosti premeny substrátu (D’Amico a kol. 2006).

1.5.2.3 Odpovede na teplotné šoky

Veľmi špecifickou odpoveďou mikroorganizmov na zmenu teplotných podmienok je tzv. „cold-shock response“ (odpoveď na chladový šok) a tzv. „heat-shock response“ (odpoveď na teplotný šok). Najvážnejším poškodením buniek v závislosti od teploty je okamžitá denaturácia proteínov a enzýmov, čo nevyhnutne vedie k poškodeniu procesov alebo štruktúr v bunkách a následne k ich smrti (Yamauchi a kol. 2013). Reakcia na zvýšenie teploty vedie k zvýšenej syntéze tzv. „heat-shock“ proteínov (Hsp), ktoré sa správajú ako chaperóny, teda molekuly brániace tvorbe nefunkčných proteinových agregátov, nesprávne zložených proteínov, alebo ako proteázy degradujúce chybné proteínové štruktúry (Maleki a kol. 2016). Princípom reakcie na chladový šok je naopak syntéza tzv. „cold-shock“ proteínov (Csp), ktoré regulujú transkripciu, transláciu, skladanie proteínov alebo fluiditu membrán (De Maayer a kol. 2014). Väčšinou majú však Csp proteíny špecifickú a diametrálne odlišnú funkciu, kedy sa správajú ako RNA chaperóny schopné uľahčovať a urýchľovať transláciu pri nízkych teplotách, a to stabilizáciou štruktúry mRNA (Keto-Timonen a kol. 2016).

1.5.3 Fyziologické adaptácie

1.5.3.1 Cytoplazmatická membrána

Plne funkčná cytoplazmatická membrána je charakteristická svojím fluidným (polotekutým) charakterom. Tento stav umožňuje priebeh základných procesov asociovaných s cytoplazmatickou membránou a to neustály transport molekúl, tvorbu energie či bunkové delenie. Pri poklese teplôt má cytoplazmatická membrána tendenciu prechádzať do tzv. kryštalickej (rigidnej) formy, ktorá tieto deje znemožňuje (Shivaji a Prakash 2010). Bakteriálna adaptácia, ktorá bráni prechodu membrány z fluidného do kryštalického stavu sa označuje ako homeoviskózna (Bin Haji Mohd Taha a kol. 2013). Jej podstatou je pritom niekoľko možných zmien týkajúcich sa lipidov, ich mastných kyselín (MK) alebo ich polárnych častí. Najčastejšie ide o zvýšenie množstva nenasýtených a vetvených MK, zvýšenie anteiso vetvených MK, skracovanie dĺžok reťazcov MK či tvorbu polynenasýtených MK, zmenu veľkosti alebo náboja polárnych častí (Shivaji a Prakash 2010; Bin Haji Mohd Taha a kol. 2013). Každá z týchto modifikácií (môže ich nastať viac naraz) vedie vo výsledku k zvýšeniu fluidity membrány a zachovaniu jej fyziologického, teda plne funkčného stavu. Okrem modifikácie lipidickej frakcie majú fluidizačný charakter taktiež alterácie karotenoidných pigmentov v bakteriálnych membránach, či je to ich prostá syntéza a začlenenie do cytoplazmatických membrán, alebo zmeny pomerov rôznych typov týchto pigmentov

(Shivaji a Prakash 2010). Podobný fluidizačný efekt môže mať aj zmena pomeru a typov proteínov, ktoré sú súčasťou cytoplazmatickej membrány (Chintalapati a kol. 2004).

1.5.3.2 Protimrznúce proteíny a kryoprotektanty

Protimrznúce proteíny (z angl. „antifreeze proteins“, AFPs) sú ľad-viažúce proteíny, ktoré ovplyvňujú tvorbu a charakter ľadových kryštáľov v bunkách, čím umožňujú prežitie svojích producentov v nižších teplotách. AFPs pôsobia niekoľkými spôsobmi, ktoré sú podmienené ich adhezivitou na ľadové kryštály. Znižujú bod zamŕzania vody, alterujú kryštalizáciu alebo majú inhibičný vplyv na rekryštalizáciu (Chattopadhyay 2007; Margesin a Miteva 2011; De Maayer a kol. 2014). Druhá skupina proteínov sa označuje ako tzv. nukleačné proteíny (z angl. „ice- nucleating proteins“, IPs), ktoré podporujú tvorbu tzv. zárodočných kryštálov a to pri relatívne vysokých teplotách (-2 °C) (Kawahara 2008). Tieto proteíny, umiestnené v cytoplazmatickej membráne, zabezpečujú pomalú a kontrolovanú tvorbu ľadu, čím znižujú mechanické poškodenie buniek spôsobené kryštáľmi ľadu (Lorv a kol. 2014). Ako kryoprotektanty pôsobia aj malé molekuly ako glycín, betaín, sacharóza, manitol či trehalóza (De Maayer a kol. 2014). Tieto sú akumulované v cytoplazme buniek a znižujú bod zamrznutia cytoplazmy reguláciou osmotického tlaku (Lorv a kol. 2014). Iným príkladom účinku môže byť napr. albumín, ktorý je asociovaný s ochranou teplotne-labilných enzýmov, nakoľko znižuje ich interakciu s vodnými molekulami pri nižších teplotách (Kawahara 2008). V neposlednej rade sa ako ochrana voči zamŕzaniu študuje aj tvorba exopolysacharidov (EPS). Úloha EPS v zmysle chladovej adaptácie je stále predmetom štúdií a diskusií. Bolo zistené že obsahujú vysoký podiel hydroxylových skupín, čím na jednej strane znižujú bod zamŕzania a tvorbu ľadových kryštálov, na strane druhej, pôsobia ako lapač vody, kovov či živín, čím taktiež zvyšujú schopnosť prežitia v chladných podmienkach (De Maayer a kol. 2014). Taktiež bolo dokázané, že u psychrofilného druhu Colwellia psychrerythraea EPS výrazne ovplyvňujú rast ľadových štruktúr (Krembs a kol. 2011), čím sa potvrdzuje ich pôsobenie ako kryoprotektívnych produktov bakteriálnych buniek.

1.6 História rodu Flavobacterium

História rodu Flavobacterium a celej čeľade Flavobacteriaceae, ktorej je typovým rodom, je charakteristická pomerne búrlivým vývojom. Prvý návrh o vzniku čeľade Flavobacteriaceae je datovaný do roku 1985 a dizertačnej práce venovanej taxonómií rodu Flavobacterium a Cytophaga (Jooste 1985). Prvá ďalšia zmienka bola už súčasťou prvej edície Bergeyho manuálu systematickej bakteriológie, avšak validácie sa táto čeľaď dočkala až o 3 roky neskôr (Reichenbach 1992). Bezprostredne nato boli publikované ako prvý kompletný popis tejto čeľade (Bernardet a kol. 1996), tak vzápätí jej rozšírenie o niekoľko ďalších rodov, a tým rozšírenie samotnej charakteristiky čeľade (Bernardet a kol. 2002). Z hľadiska histórie je nutné uviesť, že taxonomická línia smerom k tejto čeľadi bola v literatúre označovaná aj ako kmeň ´flavobacter-bacteroidetes´, komplex Flavobacterium-Cytophaga, rRNA superčeľaď V, alebo doteraz používaným pojmom Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroidetes skupina/kmeň (CFB) (Bernardet a kol. 2002). Rod Flavobacterium bol popísaný v roku 1923 v Bergeyho manuále determinatívnej bakteriológie (Bergey a kol. 1923). Pôvodne tento rod zahŕňal gramnegatívnych, nesporulujúcich zástupcov, ktorý sa vyznačovali len slabou tvorbou kyselín z karbohydrátov a prítomnosťou žltých pigmentov. Táto pomerne vágna definícia spôsobila rýchly nárast flavobakteriálnych druhov a viedla postupom času k vzniku pomerne heterogénneho rodu (Bernardet a kol. 1996). Následnými taxonomickými úpravami, reklasifikáciami a rozšíreniami charakteristík jednotlivých druhov sa postupne podarilo obmedziť rod Flavobacterium na homogénnu skupinu nemotílnych, gramnegatívnych baktérií s typovým druhom Flavobacterium aquatile (Holmes a kol. 1984). Vylúčené druhy boli reklasifikované do už vytvorených alebo nových rodov Bergeyella, Cytophaga, Empedobacter, Sphingobacterium, Weeksella, Pedobacter, Psychroflexus, Chryseobacterium, či iných (Bernardet a kol. 1996; Bernardet a Bowman 2015).

1.7 Súčasná taxonómia rodu Flavobacterium

V súčasnosti spadá rod Flavobacterium do čeľade Flavobacteriaceae, radu Flavobacteriales a triedy Flavobacteriia v kmeni Bacteroidetes (obr. č. 1). Tento rod tvorí veľkú, koherentnú a dobre separovanú skupinu, a stále predstavuje typový rod tejto čeľade, ktorá zároveň zahŕňa ďalších 60 rodov (Bernardet 2015).

Obr. č. 1: Fylogenetická pozícia rodu Flavobacterium (podľa Tree of Life Web Project, https://itol.embl.de/)

Na základe fylogenetických analýz (16S rDNA, gyrB) sa zistilo že tento rod obsahuje dve fylogenetické línie, ktoré korešpondujú s ekofyziológiou. Kým vzdialenejšia línia zahŕňa hlavne druhy zo sladkovodných ekoystémov (napr. Flavobacterium gelidilacus, Flavobacterium columnare, Flavobacterium aquatile); do druhej línie spadajú druhy adaptované na slané ekosystémy (napr. Flavobacterium flevense, Flavobacterium gillisiae, Flavobacterium frigidarium) (Bernardet a Bowman 2015). Vzhľadom ku fylogenéze rodu Flavobacterium je nutné uviesť, že počet jednotlivých druhov v tomto rode narastá exponenciálnym tempom. Kým sa pri prvom popise rodu jednalo o 8 druhov (Bowman a kol. 1996), rozširujúci popis zahŕňal druhov 18 (Bernardet a kol. 2002), následné taxonomické publikácie už hovoria o 26 (Bernardet a Bowman 2006) a najaktuálnejšia verzia Bergeyho manuálu systematickej bakteriológie z roku 2015 o 40 druhoch (Bernardet a Bowman 2015). Dnes, 3 roky po poslednej aktualizácií Bergeyho manuálu, je validne popísaných už 185 druhov flavobaktérií (Parte 2014). Problematickým faktorom tohto exponenciálneho nárastu je fakt, že väčšina nových druhových popisov v rámci rodu Flavobacterium je založená na zisku jediného izolátu, ktorý sa automaticky stáva typovým kmeňom nového druhu. Tento taxonomický trend bol a je neustále diskutovaný, nakoľko popisy nových druhov na základe jediného izolátu zastierajú vnútrodruhovú variabilitu 24 a prakticky znemožňujú spoľahlivú klasifikáciu (Christensen a kol. 2001; Felis a Dellaglio 2007). V rámci rodu Flavobacterium je tento trend a jeho negatívny dopad o to výraznejší, že bežná medzidruhová klasifikácia na základe sekvencií génov pre 16S rRNA v tomto rode nie je spoľahlivá, a musí byť doplnená ďalšími analýzami. Táto nemožnosť využitia klasifikácie na základe sekvencií génov pre 16S rRNA je pritom daná výraznou sekvenčnou homogenitou ribozomálnych sekvencií flavobaktérií, ktorá môže dosahovať až 99 % ale zároveň byť sprevádzaná nízkou celogenómovou príbuznosťou (Yi a Chun 2006; Romanenko a kol. 2015; Králová a kol. 2018).

1.8 Charakteristika rodu Flavobacterium

Súčasná charakteristika rodu Flavobacterium v poslednej edícií Bergeyho manuálu (Bernardet a Bowman 2015) hovorí o baktériách tvaru tyčiniek so zaoblenými koncami s dĺžkou cca 2-5 µm. Pre staršie kultúry sú ďalej charakteristické kratšie, až kokoidné formy (1 µm) a niektoré rody tvoria dlhé, filamentózne a flexibilné štruktúry (10-50 µm). Flavobaktérie sú nesporulujúce baktérie, avšak niektoré tvoria druhy sféroplasty v stacionárnych fázach rastu (Reichenbach 1989). Z hľadiska vzťahu ku kyslíku ide o striktne aeróbne baktérie, z ktorých niektoré sú však schopné rastu v mikroaerofilných až anaeróbnych podmienkach. Kolónie sú často pigmentované dožlta (z toho odvodený názov rodu, flavus - žltý), pričom sa jedná o pigmenty karotenoidného alebo flexirubínového typu (Bernardet a kol. 2002). Flavobaktérie sú považované za nepohyblivé, eventuálne pohyblivé kĺzaním, pričom doposiaľ nebola zaznamenaná tvorba bičíkov (Bernardet a Bowman 2015). Metabolizmus flavobaktérií je chemoorganotrofný bez zvýšených nárokov na živiny. Sú to charakteristicky slabí producenti kyselín z cukrov, avšak zároveň často silne proteolyticky aktívni (Bernardet a Bowman 2006). Flavobacterium spp. sú vo všeobecnosti dobre enzymaticky vybavené, čo dokazuje ich schopnosť hydrolyzovať želatínu, oleáty, kazeín, škroby, chitín, pektín a u niektorých rodov aj agar či karboxymetylcelulózu (Yi a kol. 2005; Bernardet a Bowman 2006; Kim, Choi, a kol. 2014). Z chemotaxonomického hľadiska sú flavobaktérie charakteristické prítomnosťou menachinónu 6 ako hlavného alebo jediného chinónu v respiračnom reťazci a homospermidínom ako hlavným polyamínom (Bernardet a kol. 2002). Spektrum mastných kyselín typických pre tento rod zahŕňa C15:0, C15:0 iso, C15:0 iso 2OH, C15:0 iso 3OH, C15:0 anteiso,

C15:1 ω6c, C15:1 iso G, C16:0 iso 3OH, C17:0 iso 3OH, Summed Feature 3 (C16:1 ω7c/ C16:1 ω6c) (Bernardet a Bowman 2015). Nikdy neobsahujú sfingofosfolipidy, čím sú odlíšiteľné od

25 zástupcov rodu Sphingobacteriia (Bernardet 2015). Obsah guanínu a cytozínu v genóme (G+C mol %) sa pohybuje medzi 30-41 % (Bernardet a Bowman 2015).

1.9 Ekológia rodu Flavobacterium

Flavobacterium spp. sú pomerne široko zastúpené v rôznych habitatoch. Celkovo môže byť ich distribúcia rozdelená do troch veľkých typov prostredia ktoré kolonizujú, a to chladné environmenty, mierne teplé sladké vody a pôdy, a nakoniec sladkovodné ryby (Bernardet a Bowman 2006). Zdá sa, že akvatické environmenty prevládajú nad tými pôdnymi, sladkovodné nad salinnými a chladné nad teplejšími. Aj keď veľké množstvo flavobaktérií bolo vyizolované z Antarktídy (Van Trappen a kol. 2002; Van Trappen a kol. 2005; Yi a kol. 2005; Kim, Choi, a kol. 2014; Králová a kol. 2018), väčšina týchto druhov je prekvapivo psychrotolerantných (nie psychrofilných), t.j. rastúcich pri teplotách okolo 0 °C, ale zároveň majúcich optimálnu rastovú teplotu okolo 20-25 °C (Morita 1975). V chladných environmentoch boli flavobaktérie nájdené v organicky bohatých pôdach, mikrobiálnych povlakoch, zamrznutých pôdach či ľadovcoch, v sladkovodných potokoch, riekach či jazerách, ale taktiež v morských sedimentoch alebo slaných jazerách (Bernardet a Bowman 2006). Iná skupina flavobaktérií, kolonizujúcich teplejšie oblasti, zahŕňa druhy vyizolované zo sladkovodných zdrojov (jazerá, rieky, riečne sedimenty), pôd, kompostov, z rhizosféry rastlín (rajčiaky, orchideje), ale aj z aerosólu z klimatizácie, z pivovarských odpadných vôd alebo z améb (Müller a kol. 1999; Aslam a kol. 2005; Bernardet a Bowman 2006; Bernardet a Bowman 2015). Vzhľadom na svoju enzymatickú vybavenosť sa flavobaktérie v týchto habitatoch významne podieľajú na rozkladných pochodoch rôznych polysacharidov alebo proteínov, a tým na kolobehu látok v prírode (Bernardet a Bowman 2015). Na rozdiel od minimálneho významu v humánnej medicíne, sú flavobaktérie významným objektom veterinárnej medicíny. Rada flavobaktérií sa vo vodách totiž vyskytuje nielen ako bežné saprofytické organizmy, ale taktiež významní patogéni sladkovodných rýb. Tri druhy flavobaktérií, Flavobacterium columnare, Flavobacterium branchiophilum a Flavobacterium psychrophilum sú považované za obligátne patogénne pre sladkovodné ryby (Loch a Faisal 2015). Posledné dva menované druhy sa zároveň vyznačujú svojím výrazným tropizmom k lososovitým rybám (Bernardet a Bowman 2006). Okrem toho, ďalšie druhy ako Flavobacterium hydatis, Flavobacterium johnsoniae, Flavobacterium spartansii alebo Flavobacterium succinicans boli a sú pravidelne izolované z kožných lézií u rýb (Austin a Austin 2016; Chen a kol. 2017), zdá sa však, že ide skôr o saprofytov, schopných kolonizovať 26 už vytvorené lézie, čo dokazuje aj ich jednoduchá kultivácia v laboratóriu v porovnaní s nutrične náročnými Flavobacterium columnare, Flavobacterium branchiophilum a Flavobacterium psychrophilum (Bernardet a Bowman 2015).

2. CIELE PRÁCE

Cieľom tejto dizertačnej práce je zhrnúť výsledky a vyhodnotiť výskum zameraný na klasifikáciu psychrofilných baktérií vyizolovaných na Antarktíde.

1. Screening izolátov zo vzoriek vôd, pôd, regolitov a iných abiotických materiálov pre determináciu skupiny CFB. 2. Charakterizácia vybraných kmeňov polyfázovým taxonomickým prístupom. 3. Aplikácia analýzy mastných kyselín pre štúdium chladovej adaptácie vybraných kmeňov.

Tieto výsledky boli dosiahnuté na pracovisku Českej zbierky mikroorganizmov (CCM), ÚEB, PřF MU v priebehu rokov 2015 až 2018 a sú prezentované formou troch samostatných publikácií, ktoré sú priložené v kompletnej forme v časti Prílohy (str. 65):

3. MATERIÁL A METODIKA

3.1 Vzorky

Vzorky boli odoberané z abiotických materiálov rôzneho charakteru a v rôznych lokalitách či habitatoch v priebehu rokov 2008-2015 na ostrove Jamesa Rossa v Antarktíde (obr. č. 2). Odber vzoriek sa uskutočňoval počas českých vedeckých expedícií v tejto lokalite, a to vždy v období antarktického leta. Prehľad odberových miest je uvedený v tabuľke č. 1 a graficky znázornený na obr. č. 3. Vzorky pôdy, kamenných materiálov a sedimentov boli spracované homogenizáciou 1 g materiálu v 5 ml sterilného fyziologického roztoku na trepačke. Následne bolo 100 µl tejto suspenzie vyočkovaných na misky s R2A agarom (Oxoid) pomocou L-kľučky. Vzorky vôd boli spracovávané analogicky, s použitím väčšieho množstva inokula (150 µl). Misky boli kultivované v 15 °C po dobu 5-7 dní. Predmet záujmu, pigmentované kolónie, boli náhodne vybrané a prečisťované preočkovaniami až do získania čistých kultúr. Takto pripravené kultúry boli uchované na šikmých agaroch a po prevezení do Českej republiky spracované v zmysle overenia čistoty a uloženia do hlbokomraziacich boxov (-70 °C).

Obr. č. 2: Poloha ostrova Jamesa Rossa, Antarktída (upravené podľa https://earth.google.com/web/)

Tabuľka č. 1: Prehľad odberových lokalít vzoriek

Rok Lokalita odberu Popis Typ materiálu odberu

machový kanál voda 2013 Algal Stream spodná časť voda 2014

severná stena pieskovcový materiál 2013

potôčik voda 2013 Berry Hill východná strana, machový voda 2014 potok

regolit 2008 Bibby Point úpätie svahu regolit (z hniezdišťa skuí) 2008

Bohemian Stream ľavý prítok voda 2013

Crame Col breh potoka regolit 2013

Devils Rocks svah kamenný materiál 2009

horná časť toku voda 2014

Dirty Creek stredná časť toku voda 2014

machové jazierko voda 2013

Halozetes Valley breh potoka regolit 2011

Interlagos jazerá voda 2013

J.G. Mendel Station k moru orientovaná strana riasovitý materiál 2008

Komárek Wall štrbina v stene kamenný materiál 2011

východné svahy regolit 2012

Lachman Crags vodopád, západne svahy kamenný materiál 2009

západne svahy kamenný materiál 2009

nepomenovaný potok so sinicovými 2014 voda potok povlakmi

horná časť dočasného 2014 Panorama Pass voda potoka

Rok Lokalita odberu Popis Typ materiálu odberu

spodná časť dočasného 2014 Panorama Pass voda potoka rybník Dulánek podľadovcový drift voda 2009

Small Lachman 2008 breh jazera regolit Lake

regolit s machovým 2012 svah materiálom Solorina Valley dolná časť potoka č. 3 voda 2014

dolná časť potoka č. 4 voda 2014

Obrázok č. 3: Lokalizácia jednotlivých odberových miest.

3.2 Fenotypová charakterizácia

3.2.1 Morfológia

Základné morfologické testovanie bolo postavené na farbení podľa Grama, hodnotení bunkovej morfológie, a to ako makroskopickej, tak mikroskopickej. Morfológia kolónií (makroskopická) bola vždy hodnotená po kultivácií na R2A agare. U typových kmeňov nových druhov bola okrem svetelnej mikroskopie nutná aj transmisná elektrónová mikroskopia s využitím Morgagni 268D Philips (FEI Company) (snímky vznikli v spolupráci s RNDr. Danielom Krskom, Národní referenční laboratoř pro průkaz infekčních agens elektronovou mikroskopií, Státní zdravotní ústav, Praha). Špecifické morfologické testy vyžadované pre rod Flavobacterium zahŕňali dôkaz flexirubínových pigmentov pomocou 20 % roztoku KOH, dôkaz tvorby kapsuly tzv. Kongo červeň adsorbčným testom a dôkaz motility pomocou metódy vysiacej kvapky (Bernardet a kol. 2002).

3.2.2 Biochémia a fyziológia

Prvotné rozdelenie množstva izolátov bolo postavené na základnej sade biochemických a fyziologických testov: tvorba katalázy (ID colour Catalase; bioMérieux) a oxidázy (OXI test; ERBA Lachema); oxidácia a fermentácia glukózy (Hugh a Leifson 1953); produkcia fluoresceínu na King B médiu (King a kol. 1954); produkcia ureázy (Christensen 1946); produkcia arginín dihydrolázy, ornithín a lyzín dekarboxyláz (Brooks a Sodeman 1974); hydrolýza želatíny a Tweenu 80 (Pacova a Kocur 1984); hydrolýzy kazeínu a tyrozínu (Kurup a Babcock 1979), škrobu a eskulínu (Barrow a Feltham 1993), lecitínu (Owens 1974) a DNA (CM321; Oxoid); redukcia nitrátov a nitritov, produkcia indolu a utilizácia Simmon´s citrátu (Barrow a Feltham 1993); utilizácia acetamidu (Oberhofer a Rowen 1974); ONPG test (ortho- nitrophenyl-β-galaktozidáza) (Lowe 1962); okysľovanie D-fruktózy, D-xylózy, D-glukózy, D- mannitolu a D-maltózy (Sedláček 2000); rast v 15 a 37 °C (R2A agar).

U vybraných kmeňov boli následne biochemické a fyziologické charakteristiky rozšírené o doplňujúce testy: teplotná tolerancia v 1 - 40 °C (R2A, interval 5 °C), tolerancia k salinite v koncentráciách 0,5 - 4 % NaCl (R2A, 20 °C) a pH tolerancia testovaná v rozmedzí 5 – 10 (R2A, interval 1,0; 20 °C); schopnosť rastu na nutričnom agare (NA, Oxoid), tryptón- sójovom agare (TSA, Oxoid), Mac-Conkey agare (HiMedia), Endo agare (HiMedia); schopnosť anaeróbneho rastu na R2A agare s využitím Anaerocult A system (Merck),

33 schopnosť mikroaerofílneho rastu na R2A agare v prostredí 5% CO2; dôkaz lecitinázy (Owens 1974); utilizácia malonátu sodného (Ewing 1960); degradácia celulózy v R2A bujóne s prúžkom filtračného papiera Whatman č. 1 (Ali a kol. 2009). Všetky hore uvedené fyziologické a biochemické testy boli očkované čerstvými kultúrami (48h, 20 °C) a odčítavané priebežne po dobu 7 dní s výnimkou testu hydrolýzy tyrozínu, ktorý vyžadoval predĺženie až na 10 dní. Pre dôkladnú biotypizáciu boli u týchto kmeňov využité aj dve komerčné súpravy. Pre testovanie využiteľnosti rôznych karbohydrátov ako zdrojov uhlíka a dusíka bol použitý BIOLOG GEN III MicroplateTN (Biolog Inc., USA). Kultivácia doštičiek zodpovedala optimálne rastovej teplote jednotlivých kmeňov. Výsledky testov boli odčítané po 48 hod. pomocou automatickej čítacej stanice BIOLOG MicroStation (MicroLog3 4.20.05). Druhou komerčnou súpravou bol API ZYM (bioMérieux, USA) nutný pre popis enzymatického profilu analyzovaných kmeňov. Testovanie a odčítanie výsledkov testov podliehalo v oboch prípadoch návodom od výrobcov.

Biotypizácia bola uzavretá testovaním vybraných kmeňov na citlivosť voči antibiotikám pomocou difúznej diskovej metódy. Pre naočkovanie Mueller-Hinton agaru (Oxoid) bola použitá bunková suspenzia so zákalom zodpovedajúcim 0,5 na McFarlandovej stupnici (kultivačné podmienky: 48h, 20 °C). Testovanými antibiotikami (antibiotické disky, Oxoid) boli: penicilín G (10 µg), ampicilín (10 µg), chloramfenikol (30 µg), tetracyklín (30 µg) a vibriostatické agens O/129 (150 µg). Kultivácia a odčítanie diskov podliehali štandardom CLSI (The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI 2015) s výnimkou penicilínu (Nokhal a Schlegel 1983) a citlivosti k vibriostatickému agens (Whitman 2004). Pre porovnávacie účely boli použité referenčné kultúry typových flavobaktérií uložené na Českej zbierke mikroorganizmov uvedené v tabuľke č. 2 (CCM; http://www.sci.muni.cz/ccm/).

Tabuľka č. 2: Referečné kultúry typových flavobaktérií analyzované pre porovnávacie účely.

Flavobacterium spp. Označenie CCM kmeňa

Flavobacterium aquidurense CCM 8768T

Flavobacterium chilense CCM 7940T

Flavobacterium collinsii CCM 8772T

Flavobacterium frigidimaris CCM 8771T

Flavobacterium hydatis CCM 8769T

Flavobacterium saccharophilum CCM 8770T

Flavobacterium piscis CCM 8773T

3.3 Genotypová charakterizácia

Genotypová charakterizácia bola založená na niekoľkých metódach. Prvým molekulárne-genetickým prístupom bola screeningová PCR nutná pre pretriedenie veľkého množstva izolátov. Ďalšou bola iniciačná fylogenetická analýza na základe sekvenovania génov pre 16S rRNA, nasledovaná repetitívnou PCR (rep-PCR). U vybraných kmeňov boli následne aplikované DNA-DNA hybridizácia (DDH) a celogenómové sekvenovanie pre finálne potvrdenie jedinečnosti genómov.

3.3.1 Screeningová PCR

Screeningová PCR bola jednoduchou amplifikáciou génov pomocou primerov špecificky navrhnutých pre taxonomickú skupinu označovanú ako Cytophaga-Flavobacterium- Bacteroides, resp. taxonomicky korektne, pre kmeň Bacteroides (Pfeiffer a kol. 2014). Pre túto rýchlu PCR boli použité nasledujúce tri primery: • S-P-Bdet-0107-a-S-21 (5´-GCACGGGTGMGTAACRCGTAT-3´) (Pfeiffer a kol. 2014) • S-P-Bdet-0309-a-A-21 (5´-GTRTCTCAGTDCCARTGTGGG-3´) (Pfeiffer a kol. 2014) • cfb967R (5´-GGTAAGGTTCCTCGCGTAT-3´) (Bacchetti De Gregoris a kol. 2011) Postupnou optimalizáciou a overením špecifity primerov na sade bakteriálnych kultúr získaných z CCM bola pre screeningové reakcie zvolená dvojica S-P-Bdet-0107-a-S-21 a cfb967R, aplifikujúca 843bp fragment z hypervariabilnej oblasti V2 génu pre 16S rRNA. Podmienky PCR a zloženie reakčných zmesí bolo upravené a optimalizované pre termocycler Biometra TProfessional (Analytik Jena, Nemecko) a sú uvedené v tabuľkách 3 a 4. DNA pre

35 screeningovú PCR bola izolovaná metódou alkalickej lýze (Švec a kol. 2008). Ako pozitívna kontrola bol zvolený typový kmeň Bacteroides fragilis CCM 4712T získaný z CCM.

Tabuľka č. 3: Zloženie reakčnej zmesi pre detekciu zástupcov kmeňa Bacteroidetes.

reagencie objem (µl)

deionizovaná voda 18,80

Taq polymeráza 0,40

ThermoPol pufer 2,50

dNTP mix (každý 10 mM) 0,50

S-P-Bdet-0107-a-S-21 (10 pM/µl) 0,90

cfb967R (10 pM/µl) 0,90

Tabuľka č. 4: Podmienky PCR pre detekciu zástupcov kmeňa Bacteroidetes.

počiatočná denaturácia 7 min pri 95 °C

30 cyklov - denaturácia 1 min pri 94 °C

- pripojenie primerov 1 min pri 52 °C

- elongácia 8 min pri 65 °C

koncová elongácia 16 min pri 65 °C

3.3.2 Sekvenácia génov pre 16S rRNA

Celogenómová DNA bola vyizolovaná a purifikovaná pomocou komerčnej súpravy (High Pure Template Preparation Kit; Roche Diagnostics). Fragmenty génu pre 16S rRNA boli amplifikované pomocou mastermixu FastStart PCR Master (Roche Diagnostics) s použitím primerov pA (5´- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3´) a pH (5´ - AAGGAGGTGATCCAGCCGCA - 3´) podľa práce Edwardsa a kol. (1989) a následne purifikované komerčne dodávanou súpravou (High Pure PCR Product Purification Kit; Roche Diagnostics). Purifikované amplikóny boli servisne sekvenované v zahraničnej spoločnosti Eurofins MWG Operons (Ebersberg, Nemecko). Získané sekvencie boli zložené do celých 36 dlhších úsekov (tzv. kontigov) pomocou online softwéru PRABI-Doua s využitím programu CAP3 Sequence Assembly (Huang a Madan 1999). Na vstupnú identifikáciu sekvencií bola použitá databáza EzTaxon (Kim, Cho a kol. 2012). Táto umožnila porovnanie sekvencií s validne popísanými druhmi flavobaktérií a vymedzenie najbližšie príbuzných druhov na základe podobnosti génov pre 16S rRNA. Fylogenetická analýza získaných sekvencií zahŕňala nielen sekvencie analyzovaných antarktických kmeňov, ale taktiež spektrum validne popísaných flavobakteriálnych druhov (vybraných na základe podobnosti sekvencií génov pre 16S rRNA). Na fylogenetickú analýzu a tvorbu fylogenetických stromov bol použitý softwér MEGA 7.0 (Tamura a kol. 2013). Fylogenetické analýzy pracovali výlučne s prekrývajúcimi sa úsekmi sekvencií všetkých kmeňov. Fylogenetické stromy boli skonštruované na základe výpočtu evolučnej vzdialenosti metódami „neighbour-joining“ (NJ) a „maximum-likelihood“ (ML). Nukleotidové sekvencie typových kultúr použité v týchto analýzach boli získané z GenBank a prístupové čísla spolu s príslušným typovým kmeňom sú uvedené v tabuľke č. 5.

Tabuľka č. 5: Prehľad sekvencií Flavobacterium spp. použitých vo fylogenetických analýzach.

Flavobacterium spp. kmeň prístupové číslo v GenBank

Flavobacterium saccharophilum DSM 1811T AM230491

Flavobacterium collinsii 983-08T HE612088

Flavobacterium hercynium WB 4.2-33T AM265623

Flavobacterium oncorhynchi 631-08T FN669776

Flavobacterium chilense LMG 26360T LSYT01000001

Flavobacterium chungangense LMG 26729T JASY01000008

Flavobacterium plurextorum 1126-1H-08T HE612094

Flavobacterium frigidimaris KUC-1T AB183888

Flavobacterium araucananum DSM 24704T FR774916

Flavobacterium piscis 412R-09T HE612101

´Flavobacterium panaciterrae´ DCY69 JX233806

Flavobacterium pectinovorum DSM 6368T AM230490

Flavobacterium branchiicola 59B-3-09T HE612102

Flavobacterium tructae 435-08T HE612100

Flavobacterium spartansii T16T JX287799

Flavobacterium resistens BD-b365T EF575563

Flavobacterium aquidurense WB 1.1-56T AM177392

Flavobacterium hibernum DSM 12611T JPRK01000008

Flavobacterium limicola ST-82T AB075230

Flavobacterium faecale WV33T KF214259

Flavobacterium hydatis DSM 2063T AM230487

Flavobacterium branchiarum 57B-2-09T HE612097

Flavobacterium glaciei 0499T Dq515962

3.3.3 rep-PCR

Repetitívna PCR s primerom (GTG)5 bola použitá ako typizačná technika s cieľom bližšie charakterizovať genetickú variabilitu medzi jednotlivými analyzovanými kmeňmi. Izolácia DNA, podmienky amplifikácie a numerická analýza s využitím softwéru BioNumerics 7.6 boli uskutočnené podľa protokolu popísaného Švecom a kol. (2008).

3.3.4 DNA-DNA hybridizácia

DDH bola donedávna považovaná za tzv. zlatý štandard mikrobiálnej taxonómie, ktorým je možné spoľahlivé odlíšenie jednotlivých druhov. Umožňuje vzájomné porovnanie dvoch (alebo viacerých) genómov medzi sebou a stanovenie ich vzájomnej príbuznosti. Štandardnou hodnotou, ktorá je považovaná za spoľahlivú pre odlíšenie dvoch druhov je pritom hranica 70 % (Wayne a kol. 1987). Celá metóda je založená na hybridizácii fragmentov genómov analyzovaných kmeňov a detekcii tzv. teplôt topenia, ktoré sa líšia v závislosti na komplementarite jednotlivých DNA reťazcov. Celogenómová, vysokomolekulárna DNA pre DDH bola extrahovaná postupom uvedeným v literatúre (Cleenwerck a kol. 2002). Na hybridizáciu boli použité mikrotitračné doštičky (Ezaki a kol. 1989) a protokoly pracovného postupu popísané v literatúre (Goris a kol. 1998; Cleenwerck a kol. 2002). Súčasťou analýzy boli i recipročné reakcie (považované za samostatný experiment) a štandardná odchýlka medzi recipročnými a opakovanými experimentami bola popísaných cca 7 % (Goris a kol. 1998).

3.3.5 Celogenómové sekvenovanie

Celogenómová DNA bola extrahovaná pomocou komerčne dodávanej súpravy ako v kapitole 3.3.1. Koncentrácia DNA bola meraná pomocou systému SparkTM multimode microplate reader (Tecan, Švajčiarsko). Sekvenovanie prebehlo na pracovisku CEITEC s využitím sekvenátoru Illumina NextSeq (Illumina Inc., USA). Skladanie sekvencií uskutočnila Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D. (Oddělení genetiky a molekulární biologie, PřF MU). Z čiastočne zoskladaného genómu boli vyexportované kompletné sekvencie génu pre 16S rRNA pomocou online softwéru RNAmmer 1.2 (Lagesen a kol. 2007). Okrem toho boli z čiastočne zoskladaného genómu získané hodnoty zastúpenia guanínu a cytozínu (G+C % mole) v genómoch. Pre porovnanie príbuznosti celých genómov s najbližšie príbuznými druhmi (vybrané podľa podobnosti sekvencií génov pre 16S rRNA) boli vykalkulované tzv. ANI hodnoty (z angl. average nucleotide identity), opäť s využitím online serveru (Rodriguez a Konstantinidis 2014).

3.4 Chemotaxonomické znaky

Chemotaxonómia je založená na použití analytických metód pre získavanie informácií o chemických zložkách mikrobiálnych, resp. bakteriálnych buniek. Použitie týchto metód sa výrazne rozšírilo po výrazných pokrokoch v extrakčných, purifikačných a vlastných analytických krokoch týchto metodík. Hoci sú tieto metódy presné, a s využitím analytických postupov často aj veľmi objektívne, majú taktiež určité nevýhody. Chemické zloženie buniek alebo bunkových obalov sa výrazne mení v závislosti na kultivačných podmienkach a taktiež v závislosti na genetickom podklade (Rosselló-Mora a Amann 2001). Je teda nutné aby akékoľvek chemotaxonomické metódy dodržiavali presné a štandardizované postupy a taktiež využívali špecifické databáze. Splnenie týchto podmienok je nevyhnutným predpokladom pre reprodukovateľnosť a porovnateľnosť výsledkov v laboratóriách i medzi nimi. Spektrum chemotaxonomických metód je široké a medzi najčastejšie analyzované chemické zložky bakteriálnych buniek patria: mastné kyseliny (a ich deriváty), peptidoglykán, polárne lipidy, chinóny, lipopolysacharidy, mykolové kyseliny a napokon nelipidické zložky (polyamíny). Z taxonomického hľadiska je voľba jednotlivých metód určená skúmaným taxónom.

3.4.1 Analýza mastných kyselín

Analýza mastných kyselín (MK) (označovaná ako FAME, z angl. „fatty acid methyl esters analysis“) je jedným z najčastejšie aplikovaných chemotaxonomických postupov v bakteriálnej taxonómií. Výhody sú nesporné, pomerne jednoduchá extrakcia a detekovateľnosť spojenené s výraznou kvalitatívnou a kvantitatívnou variabilitou totiž zaručujú silnú diskriminačnú schopnosť a zároveň spoľahlivosť tejto metódy (Embley a Wait 1994). Princíp metódy spočíva v extrakcii hydrofóbnych zložiek lipidickej frakcie bakteriálnych buniek (majoritne z bunkových obalov) a ich následnú derivatizáciu na metylestery MK, vyznačujúce sa vyššou prchavosťou ako samotné MK. Nižšia prchavosť je nutná z dôvodu vaporizácie vzoriek na plynné zložky, ich následnej separácie a detekcie pomocu plynového chromatografu (GC). Výsledkom analýzy je tzv. chromatogram, teda grafický záznam analýzy zobrazujúci elučné krivky jednotlivých zložiek vzorky. Vo výsledku metodika poskytne údaje nielen kvantitatívneho charakteru (spektrum MK vo vzorke), ale aj kvalitatívneho charakteru (teda percentuálne zastúpenie jednotlivých zložiek). Každá vzorka je automaticky identifikovaná na základe porovnania chromatogramov s dostupnými, presne špecifikovanými databázami komerčného systému MIDI Sherlock® 40

Microbial Identification System (verzia 6.2B, MIDI, Inc.; Newark, DE, USA; http://midi- inc.com/). Pre taxonomické a systematické štúdie je možné identifikáciu vynechať a vyhodnotiť profily MK ručne alebo prostredníctvom grafov a diagramov v komparatívnych alebo sledovacích štúdiách. V prípade potreby boli profily MK analyzované pomocou programu Bionumerics (verzia 7.6, Applied Maths) s využitím Pearsonovej korelácie.

3.4.2 Analýzy menachinónov, polárnych lipidov a polyamínov

Vzhľadom na fakt, že počas spracovávania dizertačnej práce boli analyzované gramnegatívne bakteriálne druhy, z chemotaxonomických metód bolo nutné zaradiť najmä analýzy menachinónov, polárnych lipidov a polyamínov. Tieto analýzy vyžadujú špecifické laboratórne zázemie, ktoré poskytol profesor Busse na Oddelení mikrobiológie Veterinárnej Univerzity vo Viedni. (https://www.vetmeduni.ac.at/de/mikrobiologie/). Chemotaxonomické analýzy boli uskutočňované samostatnou prácou pod vedením prof. Busseho, ktorá bola následne zakončená konzultáciami s prof. Bussem pri vyhodnocovaní výsledkov. Všetky tri analýzy vychádzali z lyofilizovanej bakteriálnej biomasy, ktorá bola získaná po kultivácií v tekutom R2A médiu pri 20 °C po dobu 72h. Extrakcia chinónov a polárnych lipidov vychádza zo spoločných protokolov (Tindall 1990a; Tindall 1990b; Altenburger a kol. 1996), pričom výsledné extrakty sú v prípade chinónov analyzované pomocou kvapalinovej chromatografie (HPLC), a polárne lipidy pomocou dvojdimenzionálnej tenkovrstvovej chromatografie (TLC). Extrakcia polyamínov je samostatný proces vyžadujúci využitie špecifických vnútorných štandardov, pričom výsledné extrakty sú analyzované opäť pomocou HPLC (Busse a Auling 1988; Busse a kol. 1997).

4. VÝSLEDKY A DISKUSIA

4.1 Screening a úvodné roztriedenie izolátov

Úvodné roztriedenie izolátov bolo založené na kombinácií molekulárne-genetického prístupu, teda jednoduchej PCR optimalizovanej na detekciu zástupcov z kmeňa Bacteroidetes, a na sade fyziologických a biochemických testov, spolu s hodnotením morfológie. V priebehu rokov 2008-2014 sa podarilo vyizolovať 864 izolátov gramnegatívnych pigmentujúcich baktérií. Spoločnými znakmi tejto skupiny boli ďalej: mikroskopická morfológia (tyčky); nechopnosť fermentovať glukózu; schopnosť rastu pri 15 °C a naopak neschopnosť rastu pri 37 °C; prítomnosť katalázy; neschopnosť tvorby ureázy, arginín dihydrolázy a ornitín dekarboxylázy, neschopnosť produkovať indol a tvoriť fluoresceín na King B médiu. Z pôvodného počtu izolátov bolo PCR screeningom vyselektovaných 220 izolátov spadajúcich do kmeňa Bacteroidetes. Ďalšie zúženie tejto skupiny pred iniciačnými analýzami na základe sekvenovania génov pre 16S rRNA bolo založené na profilovaní MK týchto kmeňov. Pomocou FAME bolo z tejto skupiny vybraných 78 izolátov s podobnou štruktúrou cytoplazmatickej membrány, publikačne odpovedajúcej MK zástupcov rodu Flavobacterium. Toto užšie spektrum izolátov bolo podrobené ďalším analýzam opísaným v dvoch priložených publikáciách (Prílohy č. 1-2). Nasledujúce podkapitoly 4.2-4.3 v stručnosti komentujú získané výsledky. Posledná kapitola, 4.4, sa venuje štúdií zameranej na chladovú adaptáciu antarktických flavobaktérií v zmysle prestavby cytoplazmatickej membrány alteráciou MK.

4.2 Flavobacterium circumlabens sp. nov. a Flavobacterium cupreum sp. nov.

Táto kapitola obsahuje skrátený komentár, pričom výsledky sú spracované v nasledujúcej publikácii:

Králová S., Busse H.-J., Švec P., Mašlaňová I., Staňková E., Barták M., Sedláček I. (2018) Flavobacterium circumlabens sp. nov. and Flavobacterium cupreum sp. nov., two psychrotrophic species isolated from Antarctic environmental samples. Syst. Appl. Microbiol. [In Press]. Doi: 10.1016/j.syapm.2018.12.005.

Na základe fylogenetických analýz s využitím sekvenovania génov pre 16S rRNA sa v skupine antarktických flavobaktérií separovali dve samostatné a koherentné skupiny. Skupina č. 1 pozostávala z 20 kmeňov, so vzájomnou podobnosťou v sekvenciách génov pre 16S rRNA 98,9-100 %. Ako typová kultúra bol vybraný kmeň P5626T (F. circumlabens sp. nov.), ktorého najbližším príbuzným podľa databáze EzTaxon bolo F. aquidurense WB 1.1-56T (98,3 %). 42

Skupina č. 2 pozostávala zo štyroch kmeňov so vzájomnou sekvenčnou podobnosťou 99,9-100 %. Ako typová kultúra bol vybraný kmeň P2683T (F. cupreum sp. nov.), ktorého najbližším príbuzným podľa databáze EzTaxon bolo F. hydatis DSM 2063T (98,9 %). Hoci hranica pre odlíšenie druhov na základe sekvencií génu pre 16S rRNA je 98,65 % (Kim, Oh a kol. 2014), ďalšie 3 kmene zo skupiny č. 2 sa nachádzali pod touto hranicou (98,5 % podobnosti sekvencií voči F. hydatis DSM 2063T). Fylogenetické analýzy s konštrukciou NJ a ML dendrogramov potvrdili samostatné postavenie oboch skupín. DDH hodnoty medzi P5626T a F. aquidurense WB 1.1-56T boli 23 %, medzi P2683T a F. hydatis DSM 2063T 13 %, a medzi P5626T a P2683T 53 %. Všetky tieto hodnoty sa pohybujú výrazne pod hranicou 70 %, ktorá je považovaná za spoľahlivú pre odlíšenie jednotlivých druhov (Wayne a kol. 1987). ANI hodnoty získané porovnaním osekvenovaných genómov medzi dvojicami P5626T-WB 1.1-56T, P2683T-DSM 2063T a P5626T-P2683T boli 82,69 %, 80,50 % a 89,28 %, čo opäť spĺňa navrhovanú 95-96% hranicu pre odlíšenie jednotlivých druhov (Kim, Oh a kol. 2014). Z fenotypového hľadiska je odlíšenie novo popísaných druhov od fylogeneticky najbližších príbuzných možné na základe 10 testov uvedených v tabuľke č. 1 v priloženej publikácií (príloha č. 1). Chemotaxonomické analýzy potvrdili obdobné charakteristiky analyzovaných kmeňov voči ostatným druhom flavobaktérií. Zároveň, spektrum MK a polárnych lipidov umožňuje odlíšenie týchto druhov navzájom na základe zistených rozdielov v získaných profiloch. Získané výsledky boli publikované formou taxonomického článku popisujúceho dva nové antarktické druhy F. circumlabens sp. nov. (s typovým kmeňom P5626T = CCM 8828T = LMG 30617T) a F. cupreum sp. nov. (s typovým kmeňom P2683T = CCM 8825T = LMG 30614T).

4.3 Flavobacterium chryseum sp. nov. a Flavobacterium psychroterrae sp. nov.

Táto kapitola obsahuje skrátený komentár, pričom výsledky sú spracované v nasledujúce publikácií:

Králová S., Švec P., Busse H.-J., Staňková E., Váczi P., Sedláček I. (2018). Flavobacterium chryseum sp. nov. and Flavobacterium psychroterrae sp. nov., novel environmental bacteria isolated from Antarctica. Int J Syst Evol Microbiol. 68 (10):3132-3139. Doi: 10.1099/ijsem.0.002952.

Na základe fylogenetických analýz s využitím sekvenovania génov pre 16S rRNA sa v ďalšej analyzovanej skupine antarktických flavobaktérií separovali dve samostatné dobre 43 odlíšiteľné skupiny. Osem kmeňov tvorilo skupinu č. 1, pričom vzájomná podobnosť v ich sekvenciách génov pre 16S rRNA bola 99,9-100 %, podobne ako u skupiny č. 2, pozostavajúcej zo štyroch kmeňov. Ako typová kultúra bol vybraný kmeň P3160T (F. chryseum sp. nov.), ktorého najbližším príbuzným podľa databáze EzTaxon boli F. collinsii 983-08T (98,8%) a F. saccharophilum DSM 1811T (98,4 %). Ako typová kultúra druhej skupiny bol vybraný kmeň P3922T (F. psychroterrae sp. nov.), ktorého najbližším príbuzným podľa databázy EzTaxon bolo F. aquidurense WB 1.1-56T (99,6 %). V prípade oboch skupín boli sekvenčné podobnosti v génoch pre 16S rRNA za hranicou 98,65 % navrhovanej Kim, Cho a kol. (2014), avšak konštrukcie NJ a ML fylogenetických stromov poukazovali na výraznú separáciu oboch skupín od doteraz popísaných druhov. Vzhľadom nato, že u flavobaktérií bolo popísaných niekoľko prípadov kedy vysoká podobnosť v týchto sekvenciách nekorešpondovala s nízkou celogenómovou podobnosťou (Yi a Chun 2006; Romanenko a kol. 2015), bola taxonomická pozícia oboch druhov potvrdená pomocou DDH. Podobnosť P3160T ku F. collinsii 983-08T a F. saccharophilum DSM 1811T bola 18 % a 28 % a podobnosť P3922T ku F. aquidurense WB 1.1-56T 27 %. Tieto nízke hodnoty potvrdili novosť analyzovaných antarktických kmeňov. Na základe biotypizácie bola zistená výrazná intradruhová heterogenita oboch skupín, čo limitovalo ich vzájomné odlíšenie na základe biochemických a fyziologických charakteristík na 4 testy a ďalších 9, ktorými je možné odlíšenie od najbližšie príbuzných druhov (uvedené v príslušnom článku v tabuľke č. 2, príloha č. 2). Chemotaxonomickými metódami bolo opäť potvrdené splnenie základných charakteristík rodu Flavobacterium. Zároveň boli popísané odlišnosti ako v profiloch MK, tak polárnych lipidov, ktoré umožňujú vzájomné odlíšenie týchto nových druhov. Získané výsledky boli publikované formou taxonomického článku popisujúceho dva nové antarktické druhy F. chryseum sp. nov. (s typovým kmeňom P3160T = CCM 8826T = LMG 30615T) a F. psychroterrae sp. nov. (s typovým kmeňom P3922T = CCM 8827T = LMG30616T).

4.4 Mastné kyseliny v chladovej adaptácií flavobaktérií

Táto kapitola obsahuje skrátený komentár, pričom výsledky sú spracované v nasledujúce publikácií: Králová S. (2017). Role of fatty acids in cold adaptation of Antarctic psychrophilic Flavobacterium spp. Syst. Appl. Microbiol., 40 (6): 329-333. Doi: 10.1016/j.syapm.2017.06.001

Jedna z otázok, ktorá vznikla počas práce s antarktickými flavobaktériami bola podstata ich chladovej adaptácie. Ako bolo uvedené v kap. 1.5.3, jednou zo základných fyziologických adaptácií na chlad je alterácia cytoplazmatickej membrány, konkrétne mastných kyselín, alebo v menšej miere nelipidických, polárnych zložiek. Vzhľadom na prístup k širokému súboru psychrofilných/psychrotrofných flavobaktérií z Antarktídy a tiež mezofilných a jedného termofilného druhu v kolekcii CCM, sa zamerala táto práca na rozdiely v cytoplazmatickej membráne týchto troch termotypov, a taktiež na zmeny kompozície MK sprevádzajúce chladový šok (zníženie teploty o 10 °C). Pri skúmaní kompozície MK u antarktických flavobaktérií bolo zistené, že vetvené a nenasýtené MK tvoria až 83% celkového obsahu MK v ich bunkových obaloch. Podľa viacerých publikácií je zrejmé, že práve tieto typy MK sa podieľajú na fluidizácií, teda skvapalňovaní biomembrán pri znižovaní teplôt prostredia (Kaneda 1991; Annous a kol. 1997; Diomandé a kol. 2015). Pri skúmaní jednotlivých MK sa zistilo, že chladová adaptácia psychrofilných/psychrotrofných Flavobacterium spp. je založená primárne na tvorbe nenasýtených MK, čo je rýchly modifikačný proces zasahujúci už vytvorené MK v bakteriálnych membránach. Druhým významným adaptačným mechanizmom sa ukázalo zvýšenie pomeru vetvených MK, čo je pomalší proces, nakoľko ide o syntézu de novo. Obe tieto zmeny boli popísané ako štandardné reakcie bakteriálnych membrán na chladové šoky, často doprevádzané modifikáciami MK alebo skracovaním reťazcov MK (Kaneda 1991; Bin Haji Mohd Taha A.I a kol. 2013). Zaujímavým zistením bolo, že adaptačné mechanizmy antarktických flavobaktérií boli obmedzené na vyššie uvedené mechanizmy a ďalšie zmeny neboli detekované vôbec alebo v nevýznamnej miere. Komparatívna časť štúdie zameraná na všetky tri termotypy, ich prirodzený profil MK a alterácie v prípade chladového šoku poukázal na dva aspekty. V prvom rade bolo zistené že psychrotrofné/psychrofilné flavobaktérie disponovali výrazne bohatšou kompozíciou MK než mezo,- a termofilné druhy. Hlavné MK (>10%) tvorili u chladovo adaptovaných druhov taktiež vyšší podiel z celkového zloženia než u porovnávaných druhov. Napriek týmto rozdielom sa

45 však zistilo, že reakcia na chladový šok je založená na podobných mechanizmoch u všetkých termotypov flavobaktérií. U všetkých troch išlo teda primárne o tvorbu nenasýtených MK rýchlou modifikáciou, sprevádzanú syntézou vetvených MK syntézou de novo.

5. ZÁVER

Antarktída predstavovala donedávna len ťažko dostupný kontinent, čím však ostala ochránená pred antropogénnym zásahom a zachovala si svoju prirodzenú podobu. S odstupom času sa však možnosti transportu na Antarktídu značne vylepšili, tak isto ako výskumné zázemie vytvorené vďaka výstavbám niekoľkých polárnych staníc. Tento pokrok otvoril dvere aj pre výskum mikrobiálnej ekológie, diverzity či úlohy mikrorganizmov v tejto neprebádanej oblasti. V podstate by sa zámery a výsledky mikrobiologického výskumu na Antarktíde dali zhrnúť do 4 častí: diverzita mikroorganizmov na Antarktíde, ich fyziológia a metabolická aktivita, adaptačné mechanizmy ktoré umožňujú prežitie v tejto extrémnej oblasti a napokon ekológia a biogeochemické cykly na ktorých sa mikroorganizmy podieľajú.

Výsledky tejto dizertačnej práce spadajú do dvoch vyššie zmienených oblastí: • Analýza veľkého množstva izolátov získaných z rôznych abiotických materiálov vedie k postupnému odhaľovaniu mikrobiálnej diverzity na ostrove Jamesa Rossa. Bolo zistené že jedným z majoritných zástupcov sú rody z kmeňa Bacteroidetes, pričom hlavným objektom bol jeden z predominantných rodov, rod Flavobacterium. Taxonómia rodu Flavobacterium zažila niekoľko významných zmien, úprav popisov a reklasifikácií (Holmes a Owen 1979; Bernardet a kol. 1996; Bernardet a kol. 2002; Kang a kol. 2013). V dnešnej dobe, pri existencii 185 validne popísaných druhov flavobaktérií a neustálom pribúdaní nových, je absolútne nevyhnutné venovať každému kandidátovi na nový druh pozornosť zo všetkých uhlov. V rámci tejto dizertačnej práce bol teda zvolený polyfázový taxonomický prístup, teda aplikácia fenotypových, genotypových aj chemotaxonomických metód pre dôkladnú charakterizáciu antarktických izolátov. Výsledkom tohto postupu bola klasifikácia štyroch nových druhov, zahŕňajúcich viac než jeden izolát pre zachytenie vnútrodruhovej variability, a to a to F. psychroterrae sp.nov., F. cupreum sp.nov., F. chryseum sp.nov. a F. circumlabens sp.nov.

• Okrem klasifikácie izolovaných bakteriálnych kmeňov bola počas doktorandského štúdia skúmaná aj chladová adaptácia flavobaktérií z hľadiska výstavby a zmien výstavby bunkových obalov pomocou alterácie mastných kyselín. V rámci tejto časti práce bolo vďaka kultúram z CCM možné porovnať tri základné termotypy

flavobaktérií, psychrofilné/trofné, mezofilné a jeden termofilný druh. Výsledky ukázali rozdiely v stavbe hlavne cytoplazmatickej membŕany antarktických kmeňov v porovnaní s dvoma ostávajúcimi termotypmi. Zistená bola tiež skutočnosť že chladová adaptácia, resp. odpoveď na chladový šok je u všetkých troch termotypov flavobaktérií založená na dvoch základných a zhodných princípoch, teda modifikačnej tvorbe nenasýtených mastných kyselín a de novo sysntéze vetvených mastných kyselín.

Vzhľadom na získané výsledky a dosiahnuté publikačné výstupy sa dá zhrnúť, že ciele tejto dizertačnej práce boli splnené.

Okrem troch vyššie uvedených publikácií bola problematika polyfázovej klasifikácie bakteriálnych antarktických izolátov a využitie FAME analýzy realizovaná v ďalších 8 publikáciách (uvedené v kapitole č. 7), na ktorých sa autorka tejto dizertačnej práce aktívne podieľala.

6. ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY

Aislabie J., Jordan S., Ayton J., Klassen J. L., Barker G. M., Turner S. (2009): Bacterial diversity associated with ornithogenic soil of the Ross Sea region, Antarctica. Can. J. Microbiol. 55: 21–36.

Ali Z., Cousin S., Frühling A., Brambilla E., Schumann P., Yang Y., Stackebrandt E. (2009): Flavobacterium rivuli sp. nov., Flavobacterium subsaxonicum sp. nov., Flavobacterium swingsii sp. nov. and Flavobacterium reichenbachii sp. nov., isolated from a hard water rivulet. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 2610–2617.

Altenburger P., Kämpfer P., Makristathisc A., Werner L., Busse H.-J. (1996): Classification of bacteria isolated from a medieval wall painting. J. Bacteriol. 47: 39– 52.

Anesio A. M., Hodson A. J., Fritz A., Psenner R., Sattler B. (2009): High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle. Glob. Change Biol. 15: 955–960.

Annous B. A., Becker L. A., Bayles D. O., Labeda D. P., Wilkinson B. J. (1997): Critical role of anteiso-C15:0 fatty acid in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3887–3894.

Aslam Z., Im W.-T., Kim M. K., Lee S.-T. (2005): Flavobacterium granuli sp. nov., isolated from granules used in a wastewater treatment plant. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 747–751.

Austin B., Austin D. A. (2016): Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 732 p. Springer. Cham, Switzerland.

Bacchetti De Gregoris T., Aldred N., Clare A. S., Burgess J. G. (2011): Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa. J. Microbiol. Methods 86: 351–356.

Barrow G. I., Feltham R. K. A. (1993): Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd Ed. 321 p. Cambridge University Press. Camridge, UK.

Bergey D. H., D.H., Harrison, F.C., Breed, R.S., Hammer, B.W., Huntoon, F.M. (1923): Bergey’s manual of determinative bacteriology. 1st ed. 442 p. Williams & Wilkins Co. Baltimore, Maryland, USA.

Bernardet J.-F. (2015): Flavobacteriaceae. In Whitman W. B., Rainey F., Kämpfer P., Trujillo M., Chun J., DeVos P., Hedlund B., Dedysh S. (Eds.), Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria, pp. 1–18. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, New Jersey, USA.

Bernardet J.-F., Bowman J. P. (2006): The Genus Flavobacterium. In Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. (Eds.), The Prokaryotes: Volume 7: Proteobacteria: Delta, Epsilon Subclass, pp. 481–531. Springer, New York, NY, USA.

Bernardet J.-F., Bowman J. P. (2015): Flavobacterium. In Whitman W. B., Rainey F., Kämpfer P., Trujillo M., Chun J., DeVos P., Hedlund B., Dedysh S. (Eds), Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria, pp. 1-75. John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, New Jersey, USA.

Bernardet J.-F., Nakagawa Y., Holmes B., Subcommittee on the taxonomy of Flavobacterium and Cytophaga-like bacteria of the International Committee on Systematics of Prokaryotes. (2002): Proposed minimal standards for describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1049–1070.

Bernardet J., Segers P., Vancanneyt M., Berthe F., Kersters K., Vandamme P. (1996): Cutting a gordian knot: Emended classification and description of the genus Flavobacterium, emended description of the family Flavobacteriaceae, and proposal of Flavobacterium hydatis nom nov (basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1978). Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 128–148.

Bin Haji Mohd Taha A. I. I., Ahmed, R.Z., Motoigi, T., Watanabe, K., Kurosawa, N., Okuyama, H. (2013): Lipids in cold-adapted microorganisms. In Yumoto I. (Ed.), Coldadapted Microorganisms. pp. 189-214. Caister Academic Press; Norfolk, UK.

Bowman J. P., Cavanagh J., Austin J. J., Sanderson K. (1996): Novel Psychrobacter species from Antarctic ornithogenic soils. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 841–848.

Brambilla E., Hippe H., Hagelstein A., Tindall B. J., Stackebrandt E. (2001): 16S rDNA diversity of cultured and uncultured prokaryotes of a mat sample from Lake Fryxell, McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Extrem. Life Extreme Cond. 5: 23–33.

Brooks K., Sodeman T. (1974): A rapid method for determining decarboxylase and dihydrolase activity. J. Clin. Pathol. 27: 148–152.

Bulat S. A. (2016): Microbiology of the subglacial Lake Vostok: first results of borehole-frozen lake water analysis and prospects for searching for lake inhabitants. Phil Trans R Soc A 374: 20140292.

Busse J., Auling G. (1988): Polyamine Pattern as a Chemotaxonomic Marker within the Proteobacteria. Syst. Appl. Microbiol. 11: 1–8.

Busse H.-J., Bunka S., Hensel A., Lubitz W. (1997): Discrimination of Members of the Family Pasteurellaceae Based on Polyamine Patterns. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 47: 698–708.

Cameron R. E., King J., David C. N. (1970): Microbiology, ecology and microclimatology of soil sites in dry valleys of southern Victoria land, Antarctica. In Holdgate M. W. (Ed.) Antarctic Ecology. pp. 702-716. Academic Press Inc. (London) Ltd. London, UK.

Chattopadhyay M. K. (2000): Cold-adaptation of Antarctic microorganisms – possible involvement of viable but nonculturable state. Polar Biol. 23: 223–224.

Chattopadhyay M. K. (2007): Antifreeze proteins of bacteria. Resonance 12: 25–30.

Chen S., Blom J., Loch T. P., Faisal M., Walker E. D. (2017): The Emerging Fish Pathogen Flavobacterium spartansii Isolated from Chinook Salmon: Comparative Genome Analysis and Molecular Manipulation. Front. Microbiol. e-Collection 8: article 2339.

Chintalapati S., Kiran M. D., Shivaji S. (2004): Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation. Cell. Mol. Biol. 50: 631–642.

Chown S. L., Clarke A., Fraser C. I., Cary S. C., Moon K. L., McGeoch M. A. (2015): The changing form of Antarctic biodiversity. Nature 522: 431–438.

Christensen W. B. (1946): Urea Decomposition as a Means of Differentiating Proteus and Paracolon Cultures from Each Other and from Salmonella and Shigella Types 1. – J. Bacteriol. 52: 461–466.

Christensen H., Bisgaard M., Frederiksen W., Mutters R., Kuhnert P., Olsen J. E. (2001): Is characterization of a single isolate sufficient for valid publication of a new genus or species? Proposal to modify recommendation 30b of the Bacteriological Code (1990 Revision). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 2221–2225.

Christner B. C., Priscu J. C., Achberger A. M., Barbante C., Carter S. P., Christianson K., Michaud A. B., Mikucki J. A., Mitchell A. C., Skidmore M. L., Vick-Majors T. J., the WISSARD Science Team. (2014): A microbial ecosystem beneath the West Antarctic ice sheet. Nature 512: 310–313.

Cleenwerck I., Vandemeulebroecke K., Janssens D., Swings J. (2002): Re-examination of the genus Acetobacter, with descriptions of Acetobacter cerevisiae sp. nov. and Acetobacter malorum sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1551–1558.

CLSI (2015): Performance Standards for Antimicrobial Suspectibility Testing. Twenty-Fifth Informational Supplement (M100-S25).

Cockell C. S., Stokes M. D. (2004): Ecology: Widespread colonization by polar hypoliths. Nature 431(7007): 414.

Collins R. E., Carpenter S. D.,Deming J. W. (2008): Spatial heterogeneity and temporal dynamics of particles, bacteria, and pEPS in Arctic winter sea ice. J. Mar. Syst. 74: 902– 917.

Cowan D. A. (2009): Cryptic microbial communities in Antarctic deserts. Proc. Natl. Acad. Sci. 106: 19749–19750.

Cowan D. A., Khan N., Pointing S. B., Cary S. C. (2010): Diverse hypolithic refuge communities in the McMurdo Dry Valleys. Antarct. Sci. 22: 714–720.

D’Amico S., Collins T., Marx J.-C., Feller G., Gerday C. (2006): Psychrophilic microorganisms: challenges for life. EMBO Rep. 7: 385–389.

Dang H., Zhu H., Wang J., Li T. (2009): Extracellular hydrolytic enzyme screening of culturable heterotrophic bacteria from deep-sea sediments of the Southern Okinawa Trough. World J. Microbiol. Biotechnol. 25: 71–79.

De Maayer P., Anderson D., Cary C., Cowan D. A. (2014): Some like it cold: understanding the survival strategies of psychrophiles. EMBO Rep. 15: 508–517. 51

Diomandé S. E., Nguyen-The C., Guinebretière M.-H., Broussolle V., Brillard J. (2015): Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front. Microbiol. e-Collection 6: article 813.

Edwards U., Rogall T., Blöcker H., Emde M., Böttger E. C. (1989): Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 17: 7843–7853.

Elster J, Benson E. E. (2004) Life in the Polar Terrestrial Environment with a Focuson Algae and Cyanobacteria. In: Fuller B. J., Lane N., Benson E. E. (Eds.), Life in the Frozen State pp. 111–150. Libro, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.

Embley T. M., Wait R. (1994): Structural Lipids of Eubacteria. In Goodfellow M., O´Donnell A. G. (Eds.), chemical methods in prokaryotic systematics, pp 121-161. John Wiley & Sons, Inc., West Sussex, UK.

Ewing W. H. (1960): Enterobacteriaceae. Biochemical Methods for Group Differentation. Pub. Health Service Publication No. 734. 33 p. U.S. Govt. Printing Office. Georgia, USA.

Ezaki T., Hashimoto Y.,Yabuuchi E. (1989): Fluorometric Deoxyribonucleic Acid- Deoxyribonucleic Acid Hybridization in Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization in which Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among Bacterial Strains. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 39: 224–229.

Felis G. E., Dellaglio F. (2007): On species descriptions based on a single strain: proposal to introduce the status species proponenda (sp. pr.). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 2185– 2187.

Feng S., Powell S. M., Wilson R., Bowman J. P. (2014): Extensive gene acquisition in the extremely psychrophilic bacterial species Psychroflexus torquis and the link to sea-ice ecosystem specialism. Genome Biol. Evol. 6: 133–148.

Gilichinsky D., Vishnivetskaya T., Petrova M., Spirina E., Mamykin V., Rivkina E. (2008): Bacteria in Permafrost. In Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. (Eds.), Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, pp. 83–102. Springer. Berlin, Heidelberg, Germany.

González-Rocha G., Muñoz-Cartes G., Canales-Aguirre C. B., Lima C. A., Domínguez- Yévenes M., Bello-Toledo H., Hernández C. E. (2017): Diversity structure of culturable bacteria isolated from the Fildes Peninsula (King George Island, Antarctica): A phylogenetic analysis perspective. PLoS ONE e-Collection 12 (6):e0179390.

Goordial J., Davila A., Lacelle D., Pollard W., Marinova M. M., Greer C. W., DiRuggiero J., McKay C. P., Whyte L. G. (2016): Nearing the cold-arid limits of microbial life in permafrost of an upper dry valley, Antarctica. ISME J. 10: 1613–1624.

Goris J., Suzuki K., Vos P. D., Nakase T., Kersters K. (1998): Evaluation of a microplate DNA - DNA hybridization method compared with the initial renaturation method. Can. J. Microbiol. 44: 1148–1153.

Holmes B. Owen R. J. (1979): Proposal That Flavobacterium breve be substituted as the type species of the genus in place of Flavobacterium aquatile and emended description of the genus Flavobacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 29: 416–426.

Holmes B., Owen J. G., McMeekin T. A. (1984): Genus Flavobacterium. In Krieg N. R., Holt J. G. (Eds.), Bergey´s manual of systematic bacteriology. pp. 353–361. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA.

Huang X., Madan A. (1999): CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Res. 9: 868–877.

Hug L. A., Baker B. J., Anantharaman K., Brown C. T., Probst A. J., Castelle C. J., Butterfield C. N., Hernsdorf A. W., Amano Y., Ise K., Suzuki Y., Dudek N., Relman D. A., Finstad K. M., Amundson R., Thomas B. C., Banfield J. F. (2016): A new view of the tree of life. Nat. Microbiol. 1: Article No. 16048.

Hugh R., Leifson E. (1953): The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram negative bacteria. J. Bacteriol. 66: 24– 26.

Jooste P. J. (1985): The taxonomy and significance of Flavobacterium–Cytophaga strains from dairy sources. PhD thesis. Department of Microbiology, University of the Orange Free State, Bloemfontein, South Africa.

Kaneda T. (1991): Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function, and taxonomic significance. Microbiol. Rev. 55: 288–302.

Kaneko R., Hayashi T., Tanahashi M., Naganuma T. (2007): Phylogenetic diversity and distribution of dissimilatory sulfite reductase genes from deep-sea sediment cores. Mar. Biotechnol. N. Y. N 9: 429–436.

Kang J. Y., Chun J., Jahng K. Y. (2013): Flavobacterium aciduliphilum sp. nov., isolated from freshwater, and emended description of the genus Flavobacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63: 1633–1638.

Kawahara H. (2008): Cryoprotectants and Ice-Binding Proteins. In Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. (Eds.), Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, pp. 229–246. Springer. Berlin, Heidelberg, Germany.

Keto-Timonen R., Hietala N., Palonen E., Hakakorpi A., Lindström M., Korkeala H. (2016): Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front. Microbiol.e-Collection 7: article 1151.

Kim O.-S., Chae N., Lim H. S., Cho A., Kim J. H., Hong S. G., Oh J. (2012): Bacterial diversity in ornithogenic soils compared to mineral soils on King George Island, Antarctica. J. Microbiol. Seoul Korea 50: 1081–1085.

Kim O.-S., Cho Y.-J., Lee K., Yoon S.-H., Kim M., Na H., Park S.-C., Jeon Y. S., Lee J.- H., Yi H., Won S., Chun J. (2012): Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 716–721.

Kim J. H., Choi B. H., Jo M., Kim S. C., Lee P. C. (2014): Flavobacterium faecale sp. nov., an agarase-producing species isolated from stools of Antarctic penguins. – Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 64: 2884–2890.

Kim M., Oh H.-S., Park S.-C., Chun J. (2014): Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 64: 346–351.

King E. O., Ward M. K., Raney D. E. (1954): Two simple media for demonstration of phycocyanin and fluorescein. J. Lab. Clin. Med. 301–307.

Králová S., Švec P., Busse H.-J., Staňková E., Váczi P., Sedláček I. (2018): Flavobacterium chryseum sp. nov. and Flavobacterium psychroterrae sp. nov., novel environmental bacteria isolated from Antarctica. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 68 (10):3132-3139.

Krembs C., Eicken H., Deming J. W. (2011): Exopolymer alteration of physical properties of sea ice and implications for ice habitability and biogeochemistry in a warmer Arctic. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108: 3653–3658.

Kurup V. P., Babcock J. B. (1979): Use of casein, tyrosine, and hypoxanthine in the identification of nonfermentative gram-negative bacilli. Med. Microbiol. Immunol. 167: 71–75.

Lagesen K., Hallin P., Rødland E. A., Staerfeldt H. H., Rognes T., Ussery D. W. (2007): RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res 35: 3100–3108.

Lauro F. M., Bartlett D. H. (2008): Prokaryotic lifestyles in deep sea habitats. Extrem. Life Extreme Cond. 12: 15–25.

Loch T. P., Faisal M. (2015): Emerging flavobacterial infections in fish: A review. J. Adv. Res. 6: 283–300.

Lorv J. S. H., Rose D. R., Glick B. R. (2014): Bacterial Ice Crystal Controlling Proteins. Scientifica. 20 p. Article ID 976895.

Lowe G. H. (1962): The Rapid Detection of Lactose Fermentation in Paracolon Organisms by the Demonstration of beta-D-Galactosidase. J. Med. Lab. Technol. 19: 21–25.

Mader H. M., Pettitt M. E., Wadham J. L., Wolff E. W., Parkes R. J. (2006): Subsurface ice as a microbial habitat. Geology 34 (3): 169-172.

Makhalanyane T. P., Valverde A., Velázquez D., Gunnigle E., Goethem V., W M., Quesada A., Cowan D. A. (2015): Ecology and biogeochemistry of cyanobacteria in soils, permafrost, aquatic and cryptic polar habitats. Biodivers Conserv 24 (4):819-840.

Maleki F., Khosravi A., Nasser A., Taghinejad H., Azizian M. (2016): Bacterial Heat Shock Protein Activity. J. Clin. Diagn. Res. 10 (3): BE01–BE03.

Margesin R., Miteva V. (2011): Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms. Res. Microbiol. 162: 346–361.

McDougald D., Rice S. A., Weichart D., Kjelleberg S. (1998): Nonculturability: adaptation or debilitation? FEMS Microbiol. Ecol. 25: 1–9.

Michaux C., Massant J., Kerff F., Frère J.-M., Docquier J.-D., Vandenberghe I., Samyn B., Pierrard A., Feller G., Charlier P., Van Beeumen J., Wouters J. (2008): Crystal structure of a cold-adapted class C beta-lactamase. FEBS J. 275: 1687–1697.

Miller R. V., Whyte L. (2011): Polar Microbiology: Life in a Deep Freeze. 312 p. ASM Press. Washington, DC, USA.

Mindlin S. Z., Petrova M. A. (2017): On the Origin and Distribution of Antibiotic Resistance: Permafrost Bacteria Studies. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 32: 169–179.

Miteva V. I., Sheridan P. P., Brenchley J. E. (2004): Phylogenetic and Physiological Diversity of Microorganisms Isolated from a Deep Greenland Glacier Ice Core. Appl. Environ. Microbiol. 70: 202–213.

Morita R. Y. (1975): Psychrophilic bacteria. Bacteriol. Rev. 39: 144–167.

Müller K. D., Schmid E. N., Michel R. (1999): Intracellular bacteria of Acanthamoebae resembling Legionella spp. turned out to be Cytophaga sp. Zentralbl Bakteriol. 289 (4):389-97.

Nokhal T.-H., Schlegel H. G. (1983): Taxonomic Study of Paracoccus denitrificans. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 33: 26–37.

Oberhofer T. R., Rowen J. W. (1974): Acetamide Agar for Differentiation of Nonfermentative Bacteria. Appl. Microbiol. 28: 720–721.

Owens J. J. (1974): The Egg Yolk Reaction Produced by Several Species of Bacteria. J. Appl. Bacteriol. 37: 137–148.

Pacova Z., Kocur. (1984): New Medium for Detection of Esterase and Gelatinase Activity. – Zentralblatt Für Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. Med. Microbiol. Infect. Dis. Virol. Parasitol. 258: 69–73.

Parte A. C. (2014): LPSN—list of prokaryotic names with standing in nomenclature. Nucleic Acids Res. 42: D613–D616.

Peeters K., Hodgson D. A., Convey P., Willems A. (2011): Culturable diversity of heterotrophic bacteria in Forlidas Pond (Pensacola Mountains) and Lundström Lake (Shackleton Range), Antarctica. Microb. Ecol. 62: 399–413.

Pfeiffer S., Pastar M., Mitter B., Lippert K., Hackl E., Lojan P., Oswald A., Sessitsch A. (2014): Improved group-specific primers based on the full SILVA 16S rRNA gene reference database. Environ. Microbiol. 16: 2389–2407.

Priscu J.C., Christner B., Christine F., George R.B. (2007). Biological Material in Ice Cores. In Elias S.A., Mock C.J. (Eds), Encyclopaedia of Quaternary Sciences, 2nd ed. pp. 1156-1167, Elsevier. London, UK.

Priscu J. C., Achberger A. M., Cahoon J. E., Christner B. C., Edwards R. L., Jones W. L., Michaud A. B., Siegfried M. R., Skidmore M. L., Spigel R. H., Switzer G. W., Tulaczyk S., Vick-Majors T. J. (2013): A microbiologically clean strategy for access to the Whillans Ice Stream subglacial environment. Antarct. Sci. 25: 637–647.

Rampelotto P. H., Barboza A. D. M., Pereira A. B., Triplett E. W., Schaefer C. E. G. R., Oliveira Camargo F. A. de, Roesch L. F. W. (2015): Distribution and interaction patterns of bacterial communities in an ornithogenic soil of Seymour Island, Antarctica. Microb. Ecol. 69: 684–694.

Reddy G. S., Chattopadhyay M. K., Shivaji S. (2016): Biodiversity, Adaptation and Biotechnological Importance of Bacteria Occurring in Cold Climates. In Biotechnology of Extremophiles, pp. 47–81. Grand Challenges in Biology and Biotechnology. Springer, Cham, Switzerland.

Reichenbach H. (1989): Genus I. Cytophaga. In Stanley J.T., Bryant M.P., Pfennig N., Holt J.G. (eds.), Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 3. pp. 2015-2050. Williams & Wilkins Co., Baltimore, Maryland, USA.

Reichenbach H. (1992): Flavobacteriaceae fam. nov.: Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. Int. J. Syst. Bacteriol. 327–329.

Rodrigues D. F., Tiedje J. M. (2008): Coping with Our Cold Planet. Appl Env. Microbiol 74: 1677–1686.

Rodriguez-R L. M., Konstantinidis K. T. (2014): Bypassing Cultivation To Identify Bacterial Species. Microbe Mag. 9: 111–118.

Rojas J. L., Martín J., Tormo J. R., Vicente F., Brunati M., Ciciliato I., Losi D., Van Trappen S., Mergaert J., Swings J., Marinelli F., Genilloud O. (2009): Bacterial diversity from benthic mats of Antarctic lakes as a source of new bioactive metabolites. Mar. Genomics 2: 33–41.

Romanenko L. A., Tanaka N., Svetashev V. I., Kurilenko V. V., Mikhailov V. V. (2015): Flavobacterium maris sp. nov. isolated from shallow sediments of the Sea of Japan. – Arch. Microbiol. 197: 941–947.

Rosselló-Mora R., Amann R. (2001): The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 25: 39–67.

Sedláček I. (2000): Biochemical and physiological properties of gram-negative nonfermenting rods. Metodické Postupy V Mikrobiol. 4: 89–93.

Shivaji S. (2005): Microbial diversity and molecular basis of cold adaptation in Antarctic bacteria. In Satyanarayana T. (Ed.), Microbial Diversity: Current Perspectives and Potential Applications. pp 3-24. I. K. International Pvt Ltd. New Dehli, India.

Shivaji S., Prakash J. S. S. (2010): How do bacteria sense and respond to low temperature? Arch. Microbiol. 192: 85–95.

Siegert M. J., Clarke R. J., Mowlem M., Ross N., Hill C. S., Tait A., Hodgson D., Parnell J., Tranter M., Pearce D., Bentley M. J., Cockell C., Tsaloglou M.-N., Smith A., Woodward J., Brito M. P.,Waugh E. (2012): Clean access, measurement, and sampling of Ellsworth Subglacial Lake: A method for exploring deep Antarctic subglacial lake environments. Rev. Geophys. 50: article RG1003.

Švec P., Nováková D., Žáčková L., Kukletová M., Sedláček I. (2008): Evaluation of (GTG)5- PCR for rapid identification of Streptococcus mutans. Antonie Van Leeuwenhoek 94: 573–579.

Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013): MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725–2729.

Taylor T. N., Taylor E. L. (2012): Antarctic Paleobiology: Its Role in the Reconstruction of Gondwana. 261 p. Springer Science & Business Media. Springer-Verlag. New York, USA.

Tindall B. J. (1990a): A Comparative Study of the Lipid Composition of Halobacterium saccharovorum from Various Sources. Syst. Appl. Microbiol. 13: 128–130.

Tindall B. J. (1990b): Lipid composition of Halobacterium lacusprofundi. FEMS Microbiol. Lett. 66: 199–202.

Tscherko D., Bölter M., Beyer L., Chen J., Elster J., Kandeler E., Kuhn D., Blume H.-P. (2003): Biomass and Enzyme Activity of Two Soil Transects at King George Island, Maritime Antarctica. Arct. Antarct. Alp. Res. 35: 34–47.

Tytgat B., Verleyen E., Obbels D., Peeters K., De Wever A., D’hondt S., De Meyer T., Van Criekinge W., Vyverman W., Willems A. (2014): Bacterial Diversity Assessment in Antarctic Terrestrial and Aquatic Microbial Mats: A Comparison between Bidirectional Pyrosequencing and Cultivation. PLoS ONE 9 (6): e97564.

Tytgat B., Verleyen E., Sweetlove M., D’hondt S., Clercx P., Van Ranst E., Peeters K., Roberts S., Namsaraev Z., Wilmotte A., Vyverman W., Willems A. (2016): Bacterial community composition in relation to bedrock type and macrobiota in soils from the Sør Rondane Mountains, East Antarctica. FEMS Microbiol. Ecol. 92 (9): fiw126.

Van Trappen S., Mergaert J., Van Eygen S., Dawyndt P., Cnockaert M. C., Swings J. (2002): Diversity of 746 Heterotrophic Bacteria Isolated from Microbial Mats from Ten Antarctic Lakes. Syst. Appl. Microbiol. 25: 603–610.

Van Trappen S., Vandecandelaere I., Mergaert J., Swings J. (2005): Flavobacterium fryxellicola sp. nov. and Flavobacterium psychrolimnae sp. nov., novel psychrophilic bacteria isolated from microbial mats in Antarctic lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 769–772.

Vartoukian S. R., Palmer R. M., Wade W. G. (2010): Strategies for culture of “unculturable” bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309: 1–7.

Wayne L. G., Brenner D. J., Colwell R. R., Grimont P. A. D., Kandler O., Krichevsky M. I., Moore L. H., Moore W. E. C., Murray R. G. E., Stackebrandt E., Starr M. P., Truper H. G. (1987): Report of the Ad Hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 37: 463–464.

Whitman K. A. (2004): Finfish and shellfish bacteriology manual: techniques and procedures. 258 p. Wiley-Blackwell. Iowa State Press. Ames, Iowa, USA.

Wilkins D., Yau S., Williams T. J., Allen M. A., Brown M. V., DeMaere M. Z., Lauro F. M., Cavicchioli R. (2013): Key microbial drivers in Antarctic aquatic environments. FEMS Microbiol. Rev. 37: 303–335.

Wynn-Williams D. D. (1996): Antarctic microbial diversity: the basis of polar ecosystem processes. Biodivers. Conserv. 5: 1271–1293.

Yi H., Chun J. (2006): Flavobacterium weaverense sp. nov. and Flavobacterium segetis sp. nov., novel psychrophiles isolated from the Antarctic. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 1239–1244.

Yi H., Oh H.-M., Lee J.-H., Kim S.-J., Chun J. (2005): Flavobacterium antarcticum sp. nov., a novel psychrotolerant bacterium isolated from the Antarctic. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55: 637–641.

Yamauchi S., Fuakata S., Haayashi H. (2013): Heat Shock Response in Psychrophilic Microorganisms. In Yumoto I. (Ed.): Cold-adapted Microorganisms. pp. 116-136. Caister Academic Press. Norfolk, USA.

Zdanowski M. K., Zmuda M. J., Zwolska I. (2005): Bacterial role in the decomposition of marine-derived material (penguin guano) in the terrestrial maritime Antarctic. Soil Biol. Biochem. 37: 581–595.

Internetové zdroje: • MIDI, Inc.; Newark, DE, USA; www.midi-inc.com • Oddelenie mikrobiológie na Veterinárnej Univerzity vo Viedni; https://www.vetmeduni.ac.at/de/mikrobiologie/ • Česká zbierka mikroorganizmov; http://www.sci.muni.cz/ccm/ • Tree of Life Web Project; https://itol.embl.de/

7. ODBORNÉ AKTIVITY UCHÁDZAČKY

Články v odborných časopisoch s IF:

Sedláček I., Pantuček R., Králová S., Mašlaňová I., Holochová P., Staňková E., Vrbovská V., Švec P., Busse H.-J. (2018) Hymenobacter amundsenii sp. nov. resistant to ultraviolet radiation, isolated from regoliths in Antarctica. Syst. Appl. Microbiol. [In Press]

Mašlaňová I., Wertheimer Z., Sedláček I., Švec P., Indráková A., Kovařovic V., Schumann P., Spröer C., Králová S., Šedo O., Krištofová L., Vrbovská V., Füzik T., Petráš P., Zdráhal Z., Ružičková V., Doškař J., Pantuček R. (2018) Description and Comparative Genomics of Macrococcus caseolyticus subsp. hominis subsp. nov., Macrococcus goetzii sp. nov., Macrococcus epidermidis sp. nov., and Macrococcus bohemicus sp. nov., Novel Macrococci From Human Clinical Material With Virulence Potential and Suspected Uptake of Foreign DNA by Natural Transformation. Front. Microbiol., Article 1178. Doi: 10.3389/fmicb.2018.01178.

Pantůček R., Sedláček I., Indráková A., Vrbovská V., Mašlaňová I., Kovařovic V., Švec P., Králová S., Krištofová L., Kekláková J., Petráš P., and Doškař J. (2018) Staphylococcus edaphicus sp. nov., isolated in Antarctica, harbours mecC gene and genomic islands essential to adaptation to extreme environment. Appl. Environ. Microbiol. 84(2): e01746-17. Doi: 10.1128/AEM.01746-17.

Králová S. (2017) Role of fatty acids in cold adaptation of Antarctic psychrophilic Flavobacterium spp. Syst. Appl. Microbiol. 40(6):329-333. Doi: 10.1016/j.syapm.2017.06.001.

Sedláček I., Pantůček R., Králová S., Mašlaňová I., Holochová P., Staňková E., Sobotka R., Barták M., Busse H.-J., Švec P. (2017) Mucilaginibacter terrae sp. nov., isolated from Antarctic soil. Int J Syst Evol Microbiol. 67: 1-6. Doi:10.1099/ijsem.0.002240.

Švec P., Králová S., Busse H.-J., Kleinhagauer T., Kýrová K., Pantůček R., Mašlaňová I., Staňková E., Němec M., Holochová P., Barták M., Sedláček I. (2017) Pedobacter psychrophilus sp. nov., isolated from Antarctic fragmentary rock. Int J Syst Evol Microbiol. 67(8): 2538-2543. Doi:10.1099/ijsem.0.001962.

Sedláček I., Králová S., Kýrová K., Mašlaňová I., Busse H.-J., Staňková E., Vrbovská V., Němec M., Barták M., Holochová P., Švec P., Pantůček R. (2017) Red-pink pigmented Hymenobacter coccineus sp. nov., Hymenobacter lapidarius sp. nov., and Hymenobacter glacialis sp. nov. isolated from rocks in Antarctica. Int J Syst Evol Microbiol. 67(6):1975-1983. Doi: 10.1099/ijsem.0.001898.

Švec P., Králová S., Busse H.-J., Kleinhagauer T., Pantůček R., Mašlaňová I., Cnockaert M., Vandamme P., Staňková E., Gelbíčová T., Holochová P., Barták M., Kýrová K., Sedláček I. (2017) Pedobacter jamesrossensis sp. nov., Pedobacter lithocola sp. nov., Pedobacter mendelii sp. nov., and Pedobacter petrophilus sp. nov., isolated from Antarctic environment. Int J Syst Evol Microbiol. 67(5):1499-1507. Doi: 10.1099/ijsem.0.001749.

Kýrová K., Sedláček I., Pantůček R., Králová S., Holochová P., Mašlaňová I., Staňková E., Kleinhagauer T., Gelbíčová T., Sobotka R., Švec P., Busse H. (2016) Rufibacter ruber sp. nov., isolated from fragmentary rock. Int J Syst Evol Microbiol 66(11):4401 4405. Doi:10.1099/ijsem.0.001364.

Králová S., Staňková E., Sedláček I. (2016) Classification of Aeromonas spp. isolated from water and clinical sources and distribution of virulence genes. Folia Microbiol. 61(6): 513-521. Doi: 10.1007/s12223-016-0464-9.

Švec P., Černohlávková J., Busse H.-J., Vojtková H., Pantůček R., Cnockaert M., Mašľanová I., Králová S., Vandamme P., Sedláček I. (2015) Classification of strain CCM 4446T as Rhodococcus degradans sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 65: 4381-4387. Doi: 10.1099/ijsem.0.000584.

Pekarová M., Kubala L., Martišková H., Papežiková I., Králová S., Baldus S., Klinke A., Kuchta R., Kadlec J., Kuchtova Z., Kolářová H. and Lojek A. (2013) The unique role of dietary L-arginine in the acceleration of peritoneal macrophage sensitivity to bacterial endotoxin. Immunol. Res. 56(1): 73-84. Doi: 10.1007/s12026-012-8379-2.

Kapitoly v knihách:

Skwor T., Králová S. (2018). Aeromonas. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, 5. American Society for Microbiology. [In Press].

Prezentácie na seminároch a odborných konferenciách:

Králová S., Busse H.-J., Švec P., Staňková E., Sedláček I. (2018) Two Novel Gliding Flavobacterium Species Isolated from Antarctica. In ASM Microbe 2018, Microbial Ecology and Evolution (MEE) Abstracts. Session 260. abstract N. 7610. Atlanta, Gerogia, USA.

Švec P., Králová S., Laichmanová M., Sedláček I. (2017) ECCO XXXVI Abstracts. Brno: Masaryk University, pp 1-74, 74 s. ISBN 978-80-263-1327-4.

Králová S., Šedo O., Sedláček I. (2017) Comparison of typing methods for classification of Antarctic Flavobacterium spp. In European Culture Collections´ Organisation Annual Meeting. 66 p. Brno, Czech Republic

Králová S., Staňková E., Sedláček I. (2017) Classification of psychrophilic gliding bacteria isolated from Antarctica. In: Abstract book FEMS 2017. 2318 p. Valencia, Spain.

Králová S., Staňková E., Sedláček I. (2017) Applicability of fatty acid composition for separating clinical and environmental Aeromonas spp. In: 12th International Symposium on Aeromonas & Plesiomonas. 34 p. Mexico City, Mexico. 61

Sedláček I., Vrbovská V., Holochová P., Králová S., Krištofová L., Švec P. (2017) Legitimacy of Aeromonas salmonicida subspecies. In: 12th International Symposium on Aeromonas & Plesiomonas. 33 p. Mexico City, Mexico.

Sedláček I., Králová S., Pantůček R., Švec P. , Holochová P., Staňková E., Vrbovská V., Busse H.-J. (2017) Hymenobacter amundsenii sp. nov., isolated from regoliths in Antarctica. In: Programme book IUMS 2017. 29 p. Singapore.

Králová S., Sedláček I. (2017) Cold adaptation of cell membrane in Antarctic bacteria. In Lenka Ondráčková, Klára Ambrožová, Klára Čížková, Filip Hrbáček, Jakub Ondruch. Proceedings: Students in Polar and Alpine Research Conference 2017. 1. ed. Masaryk University. 30 p. Brno, Česká Republika. ISBN 978-80-210-8564-0.

Sedláček I., Králová S., Sedláčková M., Kroupová E., Gelbíčová T., Švec P. (2014) Classification of Aeromonas popoffii strains isolated from fresh water sources. In: Abstracts IUMS 2014. 472 p. Montréal, Canada.

Králová S., Gelbíčová T., Švec P., Kroupová E. and Sedláček I. (2014) Classification of Aeromonas spp. isolated from water and clinical sources. In: 11th Symposium of Aeromonas & Plesiomonas. 59 p. Monpellier, France.

Králová S., Švec P., Kroupová E., Sedláček I. (2014) Identifikácia aeromonád. Čo nového v mikrobiológií – konferencia mladých mikrobiológov, Zborník Krátkých článkov, [CD- ROM]. pp. 104-109. Štrbské pleso, Slovenská republika. ISBN 978-80-971422-2-3.

Králová S. (2013) Identifikácia a typizácia aeromonád. 26. kongres ČSSM, Zborník abstraktov. p. 72. Brno, Česká republika. ISBN 978-80-260-4507-6.

Grantové projekty:

Projekt OPVK, CZ.1.07/2.3.00/20.0183 (2012 - 2015): Centrum experimentální biomedicíny (CEB), (Hlavní řešitel: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc., Ústav experimentální biologie PřF MU Brno)

Štipendiá a ocenenia:

2. miesto v súťaži „The best Antarctic publication of Masaryk University scientists and students“ (2018). Cenu udelil Český Antarktický Výskumný Program, Masarykova Univerzita, Brno, Česká republika

Výskumné štipendium „FEMS Research Grant“ (2017). Štipendium udelila Federácia európskych mikrobiologických spoločností FEMS za projekt: Phylogenetic and biochemical classification of soil bacteria. Delft, Holandsko

PhD. Talent Štipendium vyhrané v súťaži Brno PhD Talent (2014). Cenu udelilo Jihomoravské centrum pro mezinárodní mobilitu , Z. S. P. O., Brno, Česká republika

Akademické štipendium za absolvovanie magisterského štúdia s vyznamenaním (2014). Přirodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita, Brno, Česká republika

Štipendium Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity za tvůrčí a vědeckou činnost (udelené v rokoch 2017, 2016, 2015, 2014, 2013). Masarykova Univerzita, Brno, Česká republika

Prospechové štipendium Oddělení Mikrobiologie a molekulárních biotechnologií udelené na základe excelentných štúdijných výsledkov (2012). Masarykova Univerzita, Brno, Česká republika.

Zahraničné pobyty:

Polročná stáž na University of Auburn, Department of Biological Sciences, Alabama, USA (08.01.2018 – 30. 06. 2018)

Krátkodobé stáže na Veterinärmedizinische Universität Wien, Viedeň, Rakúsko (24.04- 29.04.2017; 27.06.-01.07.2016; 06.06.-10.06.2016; 15.12-18.12.2015; 10.11.-13.11.2015)

Krátkodobá stáž na Universiteit Gent, Gent, Belgicko (06. 07.-09. 07. 2015)

Stáž na Oddelení Bakteriologie, Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno, Česká Republika (25.06 -18.07.2012)

Stáž na Oddelení mikrobiológie v Labor INVITRO - Veterinary Diagnostic and Hygiene Laboratory, Viedeň, Rakúsko (01.07- 23.07. 2014)

Výuka počas štúdia: Taxonomie prokaryot – cvičení (Bi6700c): podiel na výuke (chemotaxonomické metódy)

Bakalářská práce z Mikrobiologie a molekulární biotechnologie I a II (Bi5006 a Bi6007) vedenie bakalárskej práce: názov: Ekologie a taxonomie gramnegativních bakterií v Antarktidě študent: Bc. Veronika Dvořáčková obhajoba: úspešná, 2017

oponentúra diplomovej práce: názov: Molekulární charakterizace multirezistetních kmenů vybraných bakterií izolovaných od pacientů s hematologickými malignitami študent: Mgr. Zuzana Skokanová obhajoba: úspešná, 2018

8. PRÍLOHY

Časť prílohy obsahuje kompletné kópie štúdií prezentovaných v tejto dizertačnej práci, spolu s doprovodnými materiálmi (z angl. „supplementary materials“). Publikácie sú zoradené v nasledujúcom poradí:

1. Králová S., Busse H.-J., Švec P., Mašlaňová I., Staňková E., Barták M., Sedláček I. (2018). Flavobacterium circumlabens sp. nov. and Flavobacterium cupreum sp. nov., two psychrotrophic species isolated from Antarctic environmental samples. Syst. Appl. Microbiol. [In Press]. Doi: 10.1016/j.syapm.2018.12.005.

podiel autorky (70 %):

• úvodný screening izolátov pomocou PCR • sekvenácia génov pre 16S rRNA – uskutočnenie a vyhodnotenie • fylogenetické analýzy • rep-PCR • DDH • chemotaxonomické analýzy • spísanie publikácie

2. Králová S., Švec P., Busse H.-J., Staňková E., Váczi P., Sedláček I. (2018). Flavobacterium chryseum sp. nov. and Flavobacterium psychroterrae sp. nov., novel environmental bacteria isolated from Antarctica. Int J Syst Evol Microbiol. 68(10): 3132-3139. Doi: 10.1099/ijsem.0.002952.

podiel autorky (80 %):

3. Králová S. (2017). Role of fatty acids in cold adaptation of Antarctic psychrophilic Flavobacterium spp. Syst. Appl. Microbiol., 40(6): 329-333. Doi: 10.1016/j.syapm.2017.06.001.

podiel autorky (100 %)