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Entwicklung Eines Real-Time-PCR-Systems Für Den Spezifischen Nachweis Von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln

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Entwicklung Eines Real-Time-PCR-Systems Für Den Spezifischen Nachweis Von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln Entwicklung eines Real-Time-PCR-Systems für den spezifischen Nachweis von Enterobacteriaceae in Lebensmitteln vorgelegt von Diplom-Biologin Barbara A. E. Heinze Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften – Dr. rer. nat. – genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. D. Knorr Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichterin: Dipl.-Ing. Dr. K. Berghof-Jäger Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10.09.2007 Berlin 2007 D 83 DANKSAGUNG Mein Dank gilt an erster Stelle meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit. Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger, Geschätsführerin der BIOTECON Diagnostics GmbH, danke ich für die Möglichkeit, die vorliegende Arbeit anzufertigen sowie für die ständige Hilfestellung und zielorientierte Diskussionsbereitschaft. Herrn Dr. Cordt Grönewald danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, wertvolle Anregungen, Ratschläge und Gespräche und für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Frau Astrid Schneider gilt mein herzlicher Dank für die hilfreichen fachlichen Diskussionen und auch die weniger fachlichen Gespräche sowie für das kritische Lesen des Manuskripts. Frau Astrid Seemann danke ich für ihre fachliche Unterstützung und Diskussion zu allen Fragen der Mikrobiologie. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics GmbH bin ich sehr dankbar für ihre Hilfsbereitschaft, die gute Zusammenarbeit und freundliche Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders bedanke ich mich bei Herrn Dirk Eimer für seine intensive Auseinandersetzung mit mir und meiner Arbeit, das Korrekturlesen, seine unermütliche Diskussionsbereitschaft und seine starken Nerven. Ich bedanke mich ganz herzlich für die Motivierung und Stärkung bei meiner Familie Christiane, Erika und Joachim Heinze. Frau Sonja Körber bin ich sehr dankbar für ihre entscheidende Unterstützung. Inhalt INHALT Seite Inhalt I Verzeichnis der Abbildungen IV Verzeichnis der Tabellen V Verzeichnis der Abkürzungen und Zeichen VI I EINLEITUNG 1 THEORETISCHER TEIL ENTEROBACTERIACEAE IN LEBENSMITTELN 1 1.1 Lebensmittel als Überträger von Infektionskrankheiten 1 1.2 Enterobacteriaceae als Ursachen für Lebensmittelinfektionen 5 1.2.1 Häufigster Vertreter lebensmittelassoziierter Enterobacteriaceae: Salmonella 8 1.2.1.1 Enteritis-Salmonellose 9 1.3 Enterobacteriaceae als Markerorganismen 14 2 PRAKTISCHER TEIL DETEKTION BAKTERIELLER KONTAMINATIONEN IN 16 LEBENSMITTELN 2.1 Mikrobiologischer Nachweis von Enterobacteriaceen 16 2.2 Molekularbiologischer Bakterien-Nachweis mittels PCR 18 2.2.1 Aspekte der PCR 21 2.3 Zielsetzung der Arbeit 24 II MATERIAL UND METHODEN 1 MATERIAL 26 1.1 Bakterienstämme 26 1.2 Nährmedien 28 1.3 Reagenzien 29 1.4 Enzyme 31 1.5 Reaktionskits 32 1.6 Primer und Sonden 32 1.7 Lebensmittelproben 35 1.8 Software 36 I Inhalt Seite 2 METHODEN 37 2.1 Anzucht von Mikroorganismen 37 2.2 Quantifizierung von Bakterienzellen 37 2.3 DNA-Extraktion 37 2.3.1 DNA-Präparation mit enzymatischem Zellaufschluss 38 2.3.2 DNA-Extraktion ShortPrep 38 2.4 DNA-Quantifizierung 38 2.4.1 DNA-Quantifizierung im Photometer 38 2.4.2 DNA-Quantifizierung im LightCycler® 39 2.4.3 Quantifizierung von Amplifikaten 39 2.5 Endonukleasenverdau 39 2.5.1 Restriktionsverdau 39 2.5.2 DNase I-Verdau 39 2.6 Polymerase-Kettenreaktion 40 2.6.1 Standardbedingungen für die konventionelle PCR 40 2.6.2 Standardbedingungen für die Real-Time-PCR 41 2.6.3 Für den Nachweis von Enterobacteriaceae mittels Real-Time- PCR optimierte Reaktionsbedingungen 43 2.7 Gelelektrophorese 44 2.7.1 Agarosegelelektrophorese 44 2.7.2 Präparative Gelelektrophorese 44 2.8 Klonierung von DNA-Amplifikaten 45 2.8.1 Ligation präparierter Amplifikate 45 2.8.2 Transformation in Escherichia coli 45 2.9 Präparation und Restriktionsverdau von Plasmid-DNA 46 2.9.1 Präparation von Plasmid-DNA 46 2.9.2 Restriktionsverdau präparierter Plasmid-DNA 46 2.10 Sequenzanalyse 47 2.10.1 DNA-Sequenzierung und Sequenzauswertung 47 2.10.2 Bearbeitung von DNA-Sequenzdaten 47 2.11 Überprüfung der Spezifität der Real-Time-PCR-Methode zum Nachweis von Enterobacteriaceae 47 2.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben im Vergleich mit mikrobiologischen Methoden 48 III ERGEBNISSE 3.1 Auswahl der DNA-Zielregion 50 3.2 Erstellen von Sequenzalignments und Generieren möglicher Primer für den Nachweis von Enterobacteriaceen-DNA 51 3.3 Amplifikation der 23S-5S-DNA von Enterobacteriaceen 53 3.4 Dekontamination der Taq-Polymerase 55 3.5 Testung der Primer für Enterobacteriaceen 56 II Inhalt Seite 3.6 Generieren der Primer und Sonden für das System zum Nachweis von Enterobacteriaceae 58 3.7 Anwendung und Überprüfung der generierten Oligonukleotide und der dekontaminierten Taq-Polymerase in der Real-Time- PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceen 60 3.7.1 Amplifikation 60 3.7.1.1 Hook-Effekt 61 3.7.2 Schmelzkurvenanalyse 62 3.8 Interne Amplifikationskontrolle 63 3.8.1 Konstruktion der Internen Amplifikationskontrolle 64 3.8.2 Integration der Internen Amplifikationskontrolle in das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.9 Optimierung der Reaktionsbedingungen für das Enterobacteriaceen-Nachweissystem 66 3.10 Spezifität des Enterobacteriaceen-Nachweissytems 67 3.10.1 Inklusivität 68 3.10.2 Exklusivität 69 3.11 Sensitivität des Enterobacteriaceen-Nachweissystems 70 3.11.1 Überprüfung der Sensitivität mit genomischer DNA von Bakterien 71 3.11.2 Überprüfung der Sensitivität mit bakteriellen Zelllinien 74 3.12 Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 75 IV DISKUSSION 4.1 Entwicklung eines spezifischen Real-Time-PCR-Systems für den 84 Nachweis von Enterobacteriaceae 4.2 Kulturelle Anreicherung und DNA-Extraktion 86 4.3 Dekontamination der Taq-DNA-Polymerase 88 4.4 Kompetitive PCR mit Interner Amplifikationskontrolle 90 4.5 Spezifität und Sensitivität 91 4.6 Ausblick 96 V ZUSAMMENFASSUNG 98 VI LITERATUR 99 III Inhalt VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Seite Abb. 1.1 Prozentuale Verteilung der bekannten mit Mikroorganismen kontaminierten Lebensmittel, deren Verzehr im Jahr 2000 zu Ausbrüchen von Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten von Amerika führten 4 Abb. 1.2: An das Robert Koch Institut in Berlin übermittelte Fälle von Enteritis-Salmonellosen in Deutschland in den Jahren 1991 bis 2004 12 Abb. 3.1: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH am rRNA-Operon von Eubakterien 50 Abb. 3.2: Sequenzen der universellen Primer fw23S und rev5S der Firma BIOTECON Diagnostics GmbH für die Amplifikation der 23S-5S- DNA im rRNA-Operon von Bakterien 51 Abb. 3.3: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) für die spezifische Amplifikation von Enterobacteriaceae-DNA 53 Abb. 3.4: Agarosegelelektrophorese einer PCR für die spezifische Amplifikation der 23S-5S-Region mit dem Primerpaar fw1/rev3 54 Abb. 3.5: Agarosegelelektrophorese nach PCR mit Perpetual Taq, ohne und mit DNase I-Verdau der Taq-Polymerase 56 Abb. 3.6: Hybridisierungsbereiche und Orientierung der Oligonukleotide für das Real-Time-PCR-System zum Nachweis von Enterobacteria- ceae-DNA 59 Abb. 3.7: Amplifikationskurven der Real-Time-PCR zum Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 61 Abb. 3.8: Schmelzkurven der Real-Time-PCR für den Nachweis von Enterobacteriaceae-DNA 63 Abb. 3.9: Konstruktion des mutagenisierten DNA-Fragments für die Interne Amplifikationskontrolle des Enterobacteriaceen-Nachweises 65 Abb. 3.10: Fluoreszenz bei Anwendung des Enterobacteriaceen- Nachweissystems während der Amplifikation von Ziel- und IAK- DNA im LightCycler® 67 Abb. 3.11: Sensitivitätstest der Real-Time-PCR für den Enterobacteria- ceen-Nachweis durch Amplifikation genomischer DNA von Serratia marcescens 72 Abb. 3.12: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit genomischer DNA von Bakterien 73 Abb. 3.13: Überprüfung der Sensitivität des Enterobacteriaceen- Nachweissystems mit bakteriellen Zelllinien 75 Abb. 3.14: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Lebensmittelproben 78 Abb. 3.15: Überprüfung des Enterobacteriaceen-Nachweissystems in der Untersuchung von Säuglingsnahrung 81 IV Inhalt VERZEICHNIS DER TABELLEN Seite Tab. 1.1: Häufig vorkommende, lebensmittelübertragene Gattungen und Spezies der Familie Enterobacteriaceae sowie Beispiele für deren Vorkommen und Bedeutung 7 Tab. 1.2: Taxonomische Einteilung der Gattung Salmonella in Spezies und Subspezies sowie Anzahl der Serovare im Jahr 2002 8 Tab. 2.1: Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitäts- und Sensitivitäts- tests 26 Tab. 2.2: Nicht-Enterobacteriaceae-Stämme für Spezifitätstests 27 Tab. 2.3: Generierte Primer und Sonden mit Bindungsstellen innerhalb des DNA-Bereichs für 23S rRNA – Spacer – 5S rRNA im ribosomalen Operon 32 Tab. 2.4: Generierte Primer und Sonde für die Konstruktion und Detektion der internen Amplifikationskontrolle 34 Tab. 2.5: Tiefgefrorene Lebensmittel 35 Tab. 2.6: Säuglingsnahrung und Volleipulver 36 Tab. 3.1: Bakterienstämme der Familie Enterobacteriaceae, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap. II 1.6) dienten 52 Tab. 3.2: Bakterienstämme diverser taxonomischer Gruppen, deren 23S- 5S-Sequenzen im Alignment als Grundlage für das Generieren der Primer fw1 - fw8 und rev1 - rev8 (Kap.
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