REPUBLIQUE DE CÔTE D'IVOIRE 6/,_6uo1b - &tMJâ11,0 - ~ Ministère de 1 'Enseignement Supérieur et de 1a Recherche Scientifique

Université NANGUI ABROGOUA UFR des Sciences de la Nature Laboratoire de Biologie et Cytologie Animales

THESE UNIQUE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE NANGUI ABROGOUA en Gestion et Valorisation des Ressources Naturelles (GVRN) Spécialité: Biodiversité et Gestion Durable des Écosystèmes (BGDE)

Présentée par

M. KONE N'GOLO ABDOULA YE

THÈME:

SYMBIOSE -CHAMPIGNON : origine, co-diversification et déterminisme de la fructification saisonnière du champignon symbiotique ( spp.) ~

Mémoire soutenu publiquement le Jeudi 31 Janvier 2013 devant le Jury composé de:

M. OTCHOUMOU Atcho Professeur Titulaire Président

M. KONATE Souleymane Maître de Conférences Directeur de Thèse

M. KOUASSI Kouassi Philippe Professeur Titulaire Rapporteur

M. KONE Daouda Maître de Conférences Rapporteur

M BAKAY OKO Adama Maître de Conférences Examinateur

M. DOUMBIA Mamadou Maître de Conférences Examinateur ------

• A notre regretté père Barra Be KONE ...

• A notre mère Fatoumata OUATTARA ...

• A notre oncle N'Golo KONE ... RESUME

La symbiose est un facteur clé de l'évolution des espèces. L'évolution est orientée par des phénomènes de coopération, d'interaction et de dépendance mutuelle entre organismes vivants. Cette étude vise principalement à approfondir la compréhension de la symbiose entre les de la sous-famille des Macrotermitinae et les champignons du genre Termitomyces, en vue de la domestication du champignon symbiotique. Spécifiquement, elle a pour but de (i) déterminer les facteurs qui gouvernent et déterminent la fructification saisonnière du champignon, (ii) déterminer le centre d'origine de cette symbiose sur le continent africain et (iii) dater la co-diversification des organismes symbiotiques. La diversité et la distribution des fructifications saisonnières de Termitomyces de deux zones phytogéographiques (Centre et Sud) de la Côte d'Ivoire ont été examinées par des fouilles exhaustives et des méthodes standards, aussi bien pour les termites que pour les sporopbores de leurs symbiotes fongiques. Ces données ont ensuite été complétées avec quelques aspects biologiques des termites hôtes. En second lieu, des analyses moléculaires et phylogénétiques ont permis de tester l'hypothèse de la simultanéité des divergences adaptatives majeures au sein des populations de termites et de champignons, à travers une vérification de la théorie octroyant au centre d'origine d'une symbiose la possibilité d'en être le centre de plus grande diversité génétique des partenaires symbiotiques. Enfin, la co-diversification des organismes symbiotiques a été datée à partir d'une reconstruction phylogénétique. Quatre espèces de Termitomyces ont été collectées dont trois observées pour la première fois en Côte d'Ivoire. Seuls les sporophores des symbiotes fongiques des termites adoptant la transmission horizontale de leur Termitomyces ont été observés. La fructification du champignon survient durant les saisons pluvieuses, d'une manière synchronisée avec l'essaimage des imagos ailés des colonies matures et la production des ouvriers des colonies nouvellement établies du termite hôte respectif L'occurrence des sporophores de Termitomyces et l'abondance des termites champignonnistes dans les habitats se sont avérées significativement corrélées à leur richesse spécifique en plantes ligneuses. Il ressort également que les Termitomyces sont un groupe monophylétique reparti en quatre clades selon les genres de termites hôtes. Toutefois, aucune différenciation biogéographique de la diversité et de la distribution des Termitomyces symbiotiques n'a été observée entre termites hôtes et leurs régions de distribution en Afrique. Par contre, avec les termites, une faible diversité totale tmilaire a certes été observée entre les différentes régions, mais elle a été trouvée relativement plus grande en Afrique de l'Ouest. Enfin, la tentative de révision de l'origine de la co• diversification des partenaires symbiotiques a révélée que les termites champignonnistes proviennent effectivement des forêts humides d'Afrique, à partir desquelles ils ont ensuite colonisé les savanes, il y a environ 31 millions d'années. La radiation adaptative des Macrotermitinae s'étant produite en parallèle avec celle de leurs symbiotes fongiques pour les conduire à adopter cette symbiose particulière.

Mots clés: Termites champignonnistes, Termitomyces, symbiose, fructification saisonnière, sporophores, essaimage, origine, datation, forêts tropicales afiicaines, cc-diversification, Côte d'Ivoire. ABSTRACT

Mutualistic symbiosis has played a major rote in evolution. Througb synergy of combined abilities a mutualistic alliance between two or more species can adapt faster tban individual organism. The mutuaListic symbiosis between -growing termites and the fungi of the genus Termitomyces originated in Africa and shows moderate degree of interaction specificity. The most common and presumably primitive mode of reproduction for the symbiont fungus is to produce basidiocarps on the mounds of the host termite colony. These basidiocarps appear genus-specifically each year at the sarne periods, however only in specific vegetation types while the respective fungus-growing termites are by far wider distributed. ln addition, the exclusive regional biogeographic origin of the symbiosis remind unknown. It is then questionable if: the determination of this exclusive regional center of origin of the syrnbiosis on the African continent could lead to an estimation of the age of the co-evolution of the symbiotic partners? Here we first examined Termitomyces diversity and distribution in two phytogeographic zones (Central and Southern) in Côte d'Ivoire. Data were collected in different habitats in exhaustive searches with standardized methods for termites and basidiocarps as well. The respective findings were complemeoted witb bebavioural and Life cycle data of the associated termite species. Secondly, using molecular and phylogenetic techniques, we test the hypotbesis that the major splits have occurred simultaneously in the host and in the symbiont, through the theory proposing the center of origin of a symbiosis as the center of high diversity of its symbiotic organisms. These results were finally used to update the estimate of the age of the origin of the co-evolution in the mutualistic relationship between termite and Termitomyces. Basidiocarps of four species of Termitomyces were recorded. Three of these species are new records for Côte d'Ivoire. Only those Termitomyces species produced basidiocarps which are associated with termite species that are dependent on horizontal transmission of their fungal symbiont were collected. Termitomyces were observed bearing fruit bodies during rainy seasons. Fructification in the recorded Termitomyces species was found to occur species-specifically after the respective host alates' first swa.rm.ing of mature colonies and the production of first workers in newly established ones. The distribution of the collected fungus-growing termites and their associated fungi were significantly correlated with plant species richness of visited habitats. Monophyletic groups of termites are associated with monophyletic groups of Termitomyces into four main clades. However, there is a lack of geographical differentiation of fungal symbionts diversity and distribution between regions and across host species. In contrast, on the termite side, the low overall mean diversity is also quite similar between regions, although suggesting a slightly higher diversity in western Africa. Finally, fungus-growing termites originated indeed in the African rain forest, just before the expansion of savanna, about 31 mya. The credibility intervals of the split into the four main clades for both symbiotic partners are always overlapping, suggesting tbat these splits occurred simultaneously.

Key words: Fungus-growing termites, Termitomyces, basidiocarps, symbiosis, seasonal fructification, alates nuptial tlight, Origin, Age estimate, African rainforest, co-evolution, Côte d'Ivoire. -- TABLE DES MATIERES

A V ANT PROPOS i

LISTE DES ABBREVJA TIONS ou SIGLES ··············································································· V LISTE DES FIGURES, Il,LUSTRATIONS ET PLANCHES vi LISTE DES TABLEAUX ix

INTRODUCTION GENERALE 1

PREMIERE PARTIE· GENERALITES 6

CHAPITRE 1 : PRESENTATION DU MJLŒU D'ETUDE 6

1.1/ Situation géographique 6 1.2/ Climat. 6 1.2.1/Pluviométrie 6 1.2.2/ Température 7 1.3/ Hydrographie et relief 7 1.4/ Sols 10 1.5/ Végétation 10

CHAPITRE 2 : GENERALITES SUR LA SYMBIOSE ENTRE LES MACROTERMJTlNAE ET LES TERMITOMYCES 12 2.1/ Introduction 12 2.2/ Classes d'interactions entre les organismes vivants 12 2.3/ Classification des termites 13 2.4/ Régime alimentaire des termites 15 2.5/ Diversité et distribution géographique des termites 15 2.6/ Sous-famille des Macrotermitinae ou termites champignonnistes 15 2.6.1/ Symbiose Macrotermitinae-Termitomyces 16 2.6.2/ Association Xy/aria-Macroterrnitinae 16 2.6.3/ Meule à champignon : support exclusif du Termitomyces 17 2.6.3.1/ Origine de la meule à champignon 17 2.6.3.2/ Structure et dynamique de la meule à champignon 18 2.6.3.3/ Classification des meules à champignon 21 2.6.4/ Rôle des organismes partenaires dans la relation symbiotique 22 2.6.5/ Transmission du champignon symbiotique d'une génération de termite à une autre 24 2.6.6/ Co-spéciation des organismes symbiotiques 26 2.6.7/ Spécificité d'interaction et conflit d'intérêt dans la relation de mutualisme entre le termite et le Termitomyces 28 2.6. 7.1/ lnteractions et spécificités 28 2.6.7.2/ Conflit d'intérêt dans la relation de mutualisme entre le termite et le Termitomyces 30 2.6.8/ Diversité et distribution géographique des Macrotermitinae et leurs champignons symbiotiques 31 2.6.9/ Termitomyces 34 2.6.9.1/ Fructification saisonnière des Termitomyces 34 2.6.9.2/ Diversité des termites champignonnistes et des Termitomyces de la zone d'étude 37

DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES 39

CHAPITRE 3 : MATERlEL 39

3.1/ Matériel biologique 39 3.2/ Matériel technique 39 3 .2. 1/ Matériel de terrain 39 3.2.2/Matériel de laboratoire .' 40 3.2.2.1/ Identification et conservation des spécimens 40 3.2.2.2/ Analyse moléculaire 40

CHAPITRE 4: APPROCHES METHODOLOGIQUES 42

4.1/ Choix des sites d'études .42 4.2/ Collecte des terrnites 43 4.2.1/ Transects linéaires 43 4.2.2/ Repérage et fouille des buttes termitiques 43 4.3/ Collecte et identification des sporophores de Termitomyces 46 4.3. 1/ Collecte des sporophores de Termitomyces .46 4.3.2/ Collecte des mycotêtes de Termitomyces 48 4.4/ Identifications des spécimens biologiques .48 4.4.1/ Identification des termites .48 4.4.2/ Identification des sporophores de Termitomyces 51 4.4.2. 1/ Descriptions macroscopiques.... . 51 4.4.2.2/ Réalisation des sporées . 51 4.4.2.3/ Descriptions microscopiques ... 52 4.5/ Collecte des variables environnementales . . .. 52 4.5.1/ Composition floristique...... 52 4.5.2/ Collecte et analyses des échantillons de sol 52 4.5.3/ Distribution spatial et saisonnière des termites champignonnistes et de leurs meules dans les nids hypogés selon un gradient de couverture végétale...... 53 4.6/ Détermination des durées des différents stades de développement des termites champignonnistes de la zone d'étude . . 56 4.7/ Identifications moléculaires et phylogénétiques des termites et des champignons 57 4.7.1/ Extraction d'ADN...... 57 4.7.2/ Réaction de Polymérisation en Chaîne de I' ADN (PCR) . .58 4.7.3/ Purification et séquençage ...... 61 4.8/ Traitements statistiques des données ..... 63 4.9/ Analyses phylogénétiques . .. 64 4.9. 1/ Blast et placement taxonomique des séquences ...... 64 4.9.2/ Alignement des séquences nucléotidiques 64 4.9.3/ Construction des arbres phylogénétiques 65

4.9.3/ Diversité géographique . . ... 66

4.9.4/ Datation des divergences au sein des organismes symbiotiques 66 4.9.4. l/ Datation des divergences au sein des Termitomyces . 66 4.9.4.2/ Datation des divergences des termites champignonnistes 67 TROISIEME PARTIE: RESULTATS ET DISCUSSION 69

CHAPITRE 5: DIVERSITE, DISTRIBUTION SPATIO-TEMPORELLE DES SPOROPHORES DE TERMITOMYCES: DETERMINISME DE LEUR FRUCTIFICATION 69

5. l/ Introduction partielle 69 5 .2/ Résultats 69 5.2. l/ Diversité et distribution spatio-temporelle des sporophores de Termitomyces et de leurs termites hôtes 69 5.2.1. l/ Cas des termites champignonnistes 69 5.2.1.2/ Cas des Termitomyces 70 5.2.2/ Connexion entre la fructification des Termitomyces et les périodes d'essaimage des colonies matures de termites champignonnistes 70 5.2.3/ Connexion entre la fructification des Termitomyces et les durées des différents stades de développement de colonies de termites champignonnistes élevées en conditions contrôlées 73 5.2.4/ Distribution saisonnière des meules de termites champignonnistes selon un gradient de types d'habitats 73 5.2.5/ Déterminants de la fructification des Termitomyces 77 5.2.5.1/ Effet des facteurs environnementaux sur la diversité et l'abondance des termites champignonnistes 77 5.2.5.2/Effet des facteurs environnementaux sur l'occurrence des sporophores de Termitomyces 80 5.3/ Discussion 82 5.3.1/ Diversité des Termitomyces et de Jeurs termites hôtes 82 5.3.2/ Effet des paramètres biologiques et environnementaux sur la diversité et la distribution des termites champignonnistes et leurs champignons symbiotiques 83 5.4/ Conclusion partielle 87 CHAPITRE 6 : DISTRIBUTION BlOGEOGRAPIDQUE DES P ARTENAJRES SYMBIOTIQUES ET DETERMINATION DU CENTRE D'ORIGINE ET DE DIVERSITE DE LA SYMBIOSE 88

6.1/ Introduction partie11e 88 6.2/ Résultats 88 6.2.1/ Blast et placement taxonomique des séquences 88 6.2.2/ Analyse phylogénétique 95 6.2.2. l/ Analyse phylogénétique des séquences d'ITS de Termitomyces 95 6.2.2.2/ Analyse phylogénétique des séquences de COI de termites champignonnistes 95 6.2.3/ Diversité biogéographique 98 6.3/ Discussion 100 6.4/ Conclusion partielle 101

CHAPITRE 7 : DATATION DE L'ORIGINE DE LA CO-DIVERSIFICATION DES PARTENAIRES SYMBIOTIQUES ET SPECIFICITE D'INTERACTION ENTRE TAXONS 102

7.1/ Introduction partielle 102 7 .2/ Résultats 103 7.2.1/ Datation de la divergence adaptative indépendante (dernier ancêtre commun) des termites champignonnistes 103 7.2.2/ Datation de la divergence adaptative indépendante (dernier ancêtre commun) des Termitomyces 107 7.2.3/ Recherche de l'origine de la symbiose Macrotermitinae-Termilomvces 111 7 .2.4/ Spécificité dans l'interaction Macrotennitinae-Termitomyces et récentes propagations sélectives du symbiote fongique 113 7.3/ Discussion 116 7.3.1/ Origine de la co-diversification des organismes symbiotiques 116 7.3.2/ Spécificité de l'interaction chez les espèces sympatriques de termites champignonnistes 117 7.3.3/ Récentes propagations sélectives du symbionte fongique 118 7 .4/ Conclusion partielle 119 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES DE RECHERCHES 121

REFERENCES BIBLIOGRAPIDQUES 125

ANNEXE A V ANT-PROPOS

Cette thèse est le fruit d'un travail mené dans la réserve de Lamto et ses localités avoisinantes. Les travaux ont été effectués dans le sous-projet BIOTA West Africa (W06), CT2/T2/WP5: Ecologie et gestion durable des Termitomyces et leurs termites hôtes. Ils s'intègrent au projet BIOTA AFRICA (BI0diversity monitoring Transect Analysis in Africa) financé par le Ministère de l'Education et de la Recherche de la République Fédérale d'Allemagne (BMBF, projet ID : FKZ 01 LC 00617 A2). Ce projet interdisciplinaire qui a été exécuté sur une durée de 10 années visait dans sa globalité à estimer la biodiversité et sa dynamique en Afrique (Sud, Est, Ouest et Nord), afin de développer des recommandations pour une gestion rationnelle et durable des ressources naturelles sous l'influence des changements globaux en cours (www.biota-africa.org). Au terme de ce travail, je tiens à présenter mes plus vifs remerciements à un certain nombre de personnes pour leur disponibilité et leur sollicitude. Je prie le Professeur Yao TANO, Président de l'Université Nangui Abrogoua (ex. Abobo-Adjamé) d'accepter l'expression de ma profonde gratitude pour avoir bien voulu m'octroyer des années d'études doctorales dans l'université dont il assure la plus haute responsabilité. J'exprime toute ma gratitude à la direction de l'UFR des Sciences de la Nature (UFR• SN) avec à sa tête le Professeur Yao DIB et le Vice-Doyen, Docteur Seydou TilIO pour les facilités administratives. Je n'oublie pas les responsables du Centre de Recherche en Ecologie

(CRE) avec à leur tête le Docteur Martine T AHOUX. J'exprime ma profonde reconnaissance au Professeur Atcho OTCHOUMOU, président du ConseiJ Pédagogique de l'Université Nangui Abrogoua et Responsable de l'Unité

thèse. Grand merci aux Professeurs Souleymane KONATE, Directeur de la Station de Recherche en Ecologie Tropicale de Lamto et Eduard Karl LINSENMAIR (Université Würzburg, Allemagne), coordinateur du projet BIOT A West qui ont bien voulu accepté la direction de cette thèse. Merci pour la confiance que vous avez bien voulu placée en moi. Merci pour votre implication permanente dans la conduite de ce travail : votre soutien moral et financier ainsi que vos conseils constructifs durant toutes mes études doctorales. Particulièrement au Professeur Souleymane KONATE, merci de m'avoir initié à l'écologie, en assumant courageusement la difficile tâche de m'éclairer sur les nécessités et les subtilités d'un travail de recherche en écologie. Je voudrais saluer ici votre humanisme et l'esprit de fraternité qui vous caractérise dans vos relations avec les étudiants dont vous assurez la formation académique. Je suis redevable au Professeur Justin Yatty KOUADIO, Directeur du Laboratoire de Biologie et Amélioration des Productions Végétales de l'Université Nangui Abrogoua, pour avoir accepté la tutelle de mes travaux de recherches du Diplôme d'Etudes Approfondies (DEA) et pour ses conseils et encouragements permanents durant ceux de la thèse de doctorat. J'exprime par ailleurs toute ma reconnaissance au Professeur Daouda KONE, Enseignant-chercheur à l'Université Félix Houphouët Boigny (ex. Cocody), UFR Biosciences pour tout l'intérêt qu'il a porté à ce travail en particulier et à notre réussite académique en général. Merci Professeur pour m'avoir très tôt fait confiance en guidant la progression de mes études depuis la licence. Je vous en serai éternellement reconnaissant. Aux Professeurs Laurent AKE-ASSI et Jérôme E. TONDOH, respectivement Enseignant-chercheurs des Universités Félix Houphouët Boigny et Nangui Abrogoua, j'exprime ma très grande reconnaissance pour vos conseils avisés et encouragements incessants pour l'aboutissement de ce travail. Je suis également très reconnaissant au Docteur Kolo YEO (UFR-SN, Université Nangui Abrogoua), qui n'a jamais ménagé ses efforts dans le suivi de l'évolution de mes recherches. Je ne saurai aller plus loin dans mes propos sans m'acquitter du devoir de dire merci à tous les enseignants qui ont participé à notre formation académique durant toutes ces années d'études universitaires. Aux Professeurs Adjima THIOM.BIANO de l'Université de Ouagadougou (Burkina Faso) et Brice SINSIN de l'Université d' Abomey-Calavy (Bénin) recevez à travers ces quelques mots l'expression de ma très grande considération. Vous représentez de véritables modèles de rigueur et de sérieux dans le travail pour la jeune génération que nous sommes.

Il A Minnattallah BOUTROS dit « Maman Biota ». coordonatrice administrative du projet BIOT A Africa, grand merci pour ton implication personnelle dans la réalisation de me études doctorales. Merci d'avoir été présente quand j'en avais besoin. Merci au Professeur Duur K. AANEN et au Docteur Tânia NOBRE du laboratoire de génétique des populations (évolution) de l'Université de Wageningen en Hollande pour avoir accepté de m'accueillir dans votre laboratoire et guidé mes pas dans la biologie moléculaire et les analyses phylogénétiques. J'ai été honoré de votre franche collaboration. Je remercie les Docteurs Amadé OUEDRAOGO, Oumarou OUEDRAOGO (Université de Ouagadougou, Burkina Faso) et Nourou Soulemane YOROU (Université de Parakou, Bénin) pour leurs conseils fraternels d'aînés et leurs critiques pertinentes pour l'édification de ma personne et l'amélioration de ce mémoire. Je suis également redevable au personnel de la Station de Géophysique de Lamto avec à sa tête le Docteur Adama DIA W ARA (Université Félix Houphouët Boigny, UFR-SSMT), pour m'avoir gracieusement communiqué les données météorologiques nécessaires à la réalisation de ce travail. J'exprime ma profonde reconnaissance aux différents chefs des localités de Zougoussi, Kangagnazé, Kodimanso et Batéra pour m'avoir autorisé à exécuter certains de mes travaux de terrain et de collecte sur des sites de leur circonscriptions respectives mais aussi pour les facilités qu'ils nous ont offerts à mes techniciens et à moi-même lors de nos missions de terrain dans leurs localités respectives. A l'ensemble des docteurs et doctorants de la station d'Ecologie de Lamto: Docteur Kanvaly DOSSO, Docteur Aya Brigitte N'DRI, Docteur Mouhamadou KONE, N'Guetta Moïse EHOUMAN, Aboubacar DEMBELE, Guillaume Ya KOUASSI et mesdemoiselles Tamia Rita Emlyne YAO, N'Datcbob Evelyne TOURE, j'ai passé de merveilleuses années en votre compagnie. Grand merci pour votre esprit d'équipe et de fraternité. Je n'oublie pas monsieur Tahirou TOURE pour les facilités offertes dans sa tâche de chargé de la logistique du projet BlOTA West en Côte d'Ivoire. Je remercie également les doctorants de l'Université de Ouagadougou de l'UFR-SVT pour Jeurs encouragements permanents tout le long de ce périple. J'adresse un merci particulier à mademoiselle Assan GNOUMOU pour son soutien moral constant. A mes camarades et collègues du Laboratoire de physiologie et pathologies végétales de l'Université Félix Houphouët Boigny à savoir messieurs Généfol OUATT ARA, Sibirina SORO, Tchoa KONE et Brice Sidoine ESSIS, merci pour votre amitié.

Ill A l'ensemble des techniciens qui nous ont aidés lors de la collecte des données retrouvez ici l'expression de ma très grande reconnaissance. Je pense particulièrement à messieurs Kouassi KOUASSI dit « JB la foi», Bernard N'GORAN dit « Djigbanni », Richmond AKA et Erneste Konan KOFFI dit « le transporteur». J'ai passé de bons moments en votre compagnie sur le terrain et je salue votre grand esprit de professionnalisme. A l'endroit de monsieur Issa OUATTARA dit «Bobby», mon technicien principal qui nous a quitté lorsque je rédigeais ce document, que la terre te sois légère et qu'Allah le tout puissant te reçoive dans son royaume. Saches que je n'oublierai jamais ce que tu m'as apporté comme aide pour la réalisation de ce travail. Tu as été un grand frère exceptionnel. J'ai été honoré d'avoir fait ta connaissance. A monsieur Drissa COULIBAL Y, merci pour les facilités que tu nous as offert durant nos missions de terrain à la Station d'Ecologie de Lamto. Tes plats étaient impeccables et nous ont procuré beaucoup d'énergie pour tenir le coup. Je remercie toute ma famille et tous ceux qui de près ou de loin m'ont accordé leur confiance et épaulé durant toutes ces années ; notamment monsieur N'Golo Seydou OUA TT ARA et son épouse madame Fatoumata OUATT ARA. A monsieur Lamoussa OUATTARA, mon cousin et« frère jumeau», j'exprime toute ma reconnaissance pour ses encouragements permanents, son soutien moral indéfectible et se conseils avisés. A ma compagne Gnéléwa Aïcha OUATTARA, trouves en ce mémoire l'expression de l'amour que je te porte.

lV LISTE DES ABBREVIATIONS OU SIGLES

ANOVA : Analyse de la variance AFNOR : Association Française de NORmalisation RDA : ReDundancy Analyse ou Analyse de la Redondance ACP : Analyse en Composantes Principales % : pour cent oc degré Celcius ADN : Acide Désoxyribonucléique COI : Cytochrome Oxydase I COii : Cytochrome Oxydase II g : gramme GPS : Global Positioning System ITSI : Internai Transcript Spacer I (espaceur interne transcrit I) ITSII : Internai Transcript Spacer II (espaceur interne transcrit II) j : jour 1 : litre µI : microlitre cm : centimètre m : mètre km : kilomètre ma : millions d'années (en Français) min : minutes mya : millions of years ago: millions d'années (en Anglais) F : degré de variabilité p probabilité ha : hectare NCBl : National Center for Biotechnology Informations (Banque de gènes : GenBank) PCR : Polymerase Chain Réaction (Amplification en Chaine par Polymérase) RAP : Rapid Assessement Protocol (Méthode d'estimation rapide de la biodiversité) TSBF : Tropical Soil Biology and Fertility LAVESO : Laboratoire d'analyses des végétaux et des sols LSD : Least significant difference

V LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Localisation des zones d'étude en Côte d'Ivoire 8 Figure 2 : Données climatiques moyennes mensuelles enregistrées dans la zone d'étude au cours des dix années ayant précédées la période d'exécution de cette étude (1997- 2006 9 Figure 3 : Données climatiques moyennes mensuelles enregistrées dans la zone d'étude pendant la période d'exécution de cette étude (2007 à 2009) 9 Figure 4 : Relation phylogénétique à travers les sept familles de termites et les quatre sous- familles de Termitidae 14 Figure 5 : Meule : support exclusif du Termitomyces 19 Figure 6 : Structure des meules de quelques genres de termites champignonnistes 20 Figure 7 : Vue d'ensemble des constituants des parois cellulaires des plantes, principalement composés de cellulose, hémicellulose et lignine 23 Figure 8 : Modes de transmissions du champignon symbionte chez les Macrotermitinae durant la fondation de la colonie 27 Figure 9 : Schémas théoriques de la spécificité dans les relations de mutualisme entre hôte et symbiote 29 Figure 10: Représentation simplifiée de l'origine biogéographique des termites champignonnistes 32 Figure 11: Fructification saisonnière d'un sporopbore du champignon du genre Termitomyces à la surface de la butte de son termite hôte 36 Figure 12 : Détails d'un transect linéaire de fouille pour la récolte de termite 44 Figure 13 : Vue extérieure et intérieure d'une butte termitique .45 Figure 14 : Spécimens de termites et de sporophores de Termitomyces après ouverture d'une butte termitique 4 7 Figure 15 : Technique de prélèvement de mycotêtes de Termitomyces sur une meule à champignon pour leur conservation dans des Eppendorf contenant de l'éthanol 100% 49 Figure 16 : Intérieur d'une butte termitique renfermant différents genres de termites champignonnistes sympatriques 49 Figure 17: Morphologie générale d'un soldat determite 50 Figure 18 : Fouille stratifiée d'un monolithe à la recherche de termites champignonnistes et de leurs meules 55

Vl Figure 19 : Représentation schématique des différents cycles d'une Réaction de Polymérisation en Chaînes (PCR) 59 Figure 20 : Diagramme montrant la position des sites d'hybridation des amorces JTS IFT et IT~ 00 Figure 21 : Sporophores de Termitomyces collectés dans les zones d'études...... 71 Figure 22 : Biomasses des meules à champignon des genres de termites champignonnistes au cours des saisons selon un gradient de types d'habitats 75 Figure 23: Diagramme d'ordination de l'analyse de redondance (RDA) ordination entre les abondances d'espèces de termites champignonnistes et les variables environnementales . . 79 Figure 24: Diagramme d'ordination de l'analyse de redondance (RDA) entre l'occurrence d'espèces de Termitomyces et les variables environnementales 81 Figure 25 : Relation phylogénétique entre les Termitomyces symbiotiques collectés pendant cette étude et des séquences sélectionnées, disponibles dans la banque de gènes de la NCBl 96 Figure 26 : Relation phylogénétique entre les termites champignonnistes collectés pendant cette étude et des séquences sélectionnées, disponibles dans la banque de gènes de la NCBI 97 Figure 27 : Datation du demier ancêtre commun aux termites champignonnistes . . 106 Figure 28: Datation du premier ancêtre commun aux Termitomyces à l'aide de l'âge de divergence de 73 M.a des Agaricus et des Chlorophyllum 108 Figure 29 : Datation du dernier ancêtre commun aux Termitomyces à l'aide de l'âge de di vergence de 16 M. a des Agaricus et des Chlorophyllum 109 Figure 30 : Datation des périodes de divergence adaptative indépendante des Termitomyces, basée sur un calibrage réalisé à partir des trois âges de divergences probables des Agaricus et des Chlorophyllum 110 Figure 31 : Datation des périodes de divergence adaptative indépendante des Termitomyces, basée sur un calibrage réalisé à partir des trois âges de divergences probables des Agaricus et des Chlorophyllum...... 112 Figure 32 : Datations des périodes de divergences adaptatives des principaux clades de Termitomyces et de termites champignonnistes...... 114 Figure 33 : Arbres phylogénétiques consensuels des termites champignonnistes de Côte d'Ivoire et leurs champignons symbiotiques issus de l'inférence Bayésienne. . 115

vii LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Mode de transmission du champignon symbiote (Termitomyces sp.) chez différentes espèces de termites champignonnistes 25 Tableau Il: Zones de distribution des genres de la sous-famille des Macroterminae (Isoptera : Termitidae) 34 Tableau m : Classification des différentes espèces de termites champignonnistes de la région de Lamto 38 Tableau IV: Conditions d'amplification par Réactions de Polymérisation en Chaîne de l' ADN (PCR) 62 Tableau V: Cartographie des périodes de fructification des Termitomyces et d'essaimage des colonies matures de leur termite hôte selon la saison 72 Tableau VI: Durées moyennes des différents stades de développement (en jours) de quelques termites champignonnistes de la réserve de Lamto en Côte d'Ivoire. en conditions d'élevage 74 Tableau VII: Variation des masses sèches (en gramme) de meules à champignon chez les genres de termites champignonnistes de la région de Lamto à travers différents types d'habitats au cours des saisons 76 Tableau vm: Matrice d'autocorrélation des paramètres environnementaux utilisés dans l'analyse canonique (RDA) 78 Tableau IX: Résumé statistique de l'analyse canonique (RDA) entre les abondances d'espèces de termites champignonnistes et les variables environnementales 79 Tableau X: Résumé statistique de l'analyse canonique (RDA) entre l'occurrence d'espèces de Termitomyces et les variables environnementales 81 Tableau XI: Séquences d'ADN de Termitomyces (ITS) obtenues dans cette étude 90 Tableau XII : Séquences d'ADN de termites champignonnistes (COI) obtenues dans cette étude 91 Tableau XIII: Séquences d'ADN de Termitomyces (ITS) de la Banque de gènes utilisées dans J'analyse 92 Tableau XIV : Séquences d'ADN de termites champignonnistes (COI) de la Banque de gènes utilisées dans l'analyse 93 Tableau XV : Données disponibles sur les termites champignonnistes (COI) et leur Termitomyces symbiotiques (JTS) 99

VIII Tableau XVI : Séquences d'ADN des échantillons de Termitomyces ayant subis des séquençages supplémentaires des régions 25S et I2S de leur ADN ribosomal.. 104 Tableau XVII: Séquences d'ADN des échantillons de termites champignonnistes ayant subis des séquençages supplémentaires des régions COii et ITSII de leur ADN ribosomal. 105

IX INTRODUCTION GENERALE lntroductton générale

Les termites de la sous-famille des Macrotermitinae (Isoptera: Terrnitidae) sont encore appelés termites champignonnistes. Cette sous-famille constitue le groupe le plus important de termites du fait non seulement de son abondance mais surtout en raison de son rôle dans la dynamique, le fonctionnement et la structure des écosystèmes (Josens, 1972; Konaté, 1998). Cette sous-famille représente près de 70 % des espèces de la famille des Termitidae décrites à ce jour (Krishna et Weesner 1969; Grassé, 1986; Rouland-Lefèvre et al., 2006). Elle comporte 11 genres taxonomiques connus repartis en 330 espèces (Kambhampati et Eggleton, 2000). Ces termites vivent en société complexement organisée avec un nombre bien défini de castes. Ils ne possèdent pas de protistes ou de bactéries symbiotiques dans leur intestin (Krishna et Weesner 1969 ; Rouland-Lefèvre et al. 2006). Par contre, ils se caractérisent par une relation de mutualisme avec environ 40 espèces des champignons du genre Termitomyce (Johnson et al., 1981 ; Kirk et al., 2001 ; Osiemo et al., 2010). Cette symbiose est obligatoire puisque les Termitomyces ne croissent nulle part que dans des nids des termites de cette sous• famille. Ces termites sont également dépendants du champignon car les colonies naissantes en conditions contrôlées incapables d'établir une meule à champignon viable survivent difficilement (Darlington, 1994). Dans cette interaction, les termites créent l'unique condition de vie pour les champignons en construisant des nids homéostatiques fortement humides. Les champignons en retour leur donnent accès à une source de nourriture très diversifiée par la prédigestion et la dégradation des composantes structurales complexes de celle-ci (Reuland• Lefèvre, 2000). Toutefois, comme dans d'autres symbioses, des modèles complexes d'interactions au sein de multiples groupes d'espèces sont observés (Mikheyev et al., 2007; Dentinger et al., 2009; Brundett, 2002; Hoeksema, 2010). En effet, les termites champignonnistes montrent une spécificité modérée avec leurs symbiotes c'est-à-dire que des groupes monophylétiques de termites (généralement un ou plusieurs genres) sont associé avec différents groupes monophylétiques de champignons (Aanen et al., 2002: Rouland•

Lefèvre el al., 2002).

Les colonies naissantes de termites champignonnistes sont initiées par un couple d'ailés qui deviennent roi et reine de la future colonie. Pour l'acquisition du champignon symbiotique, chez la majorité de ces espèces de termites, les ouvriers collectent des spores sexuées dans leur environnement immédiat (Aanen, 2006). Ces spores représentent l'inoculum fongique des meules à champignon de la colonie: c'est la transmission horizontale (Aanen et al., 2002; Korb et Aanen, 2003). Dans certains cas, les ailés emportent dans leur Introducuon générale

intestin durant leur vol nuptial l'inoculum fongique, on parle alors de transmission verticale (Grassé et Noirot, 1958; Johnson et al., 1981 ; Leutbold et al., 1989). Selon Johnson et al., (1981), seulement quelques cas de cette transmission sont connus (5 espèces du genre Microtermes et l'espèce Macrotermes bellicosusï. La transmission horizontale représente néanmoins la forme ancestrale et demeure la plus répandue pour le transfert du champignon symbiotique entre colonies matures et colonies naissantes de termites (Korb et Aanen, 2003; De Fine Licht et al., 2005; Aanen et Boomsma, 2005). Toutefois, plusieurs détails de l'établissement et de la survie de ces colonies restent à élucider.

L'une des caractéristiques majeures du maintien de cette symbiose réside certes dans la transmission du symbiote fongique d'une génération de termites à une autre; mais également dans la fructification de celui-ci (Heim, 1977). Les sporophores de Termitomyces s'observent chaque année, durant les mêmes périodes, avec différents niveaux de spécificité d'association avec leurs espèces de termites hôtes. Toutefois, ces sporophores s'observent dans des types particuliers d'habitats, quand leurs termites hôtes sont largement distribués. Selon Tscierpe (1974), cette fructification saisonnière est loin d'être un phénomène hasardeux. La diversité de ces sporophores et les déterminants biologiques et environnementaux de leur fructification saisonnière sont peu étudiés. ~n effet, bien que plusieurs études (Tscierpe, 1974; Grassé, 1982; Degreef, 1990) aient soulignés l'importance relative des facteurs internes et externes affectant la colonie de termites et la vie du symbiote fongique, peu d'entre elles ont identifié, caractérisé ou déterminé ces facteurs. En Côte d'Ivoire, ces sporophores de Termitomyces sont intensivement collectés et vendus par les populations rurales (Koné, 2007 : Koné et al., 2010). La dimension réelle de cette activité et les aspects socio-économiques liés à cette exploitation ont également été énumérés par ce auteurs. En effet, ces champignons représentent une véritable source de revenus, spécialement pour les femmes rurales et les paysans.

Selon Emerson (1955), les termites champignonnistes ont une distribution géographique limitée aux tropiques de l'ancien monde (Afrique tropicale, certaines parties de l'Arabie et de l'Inde). Au cours de leur évolution. une seule et irréversible transition à la «culture du Termitomyces» s'est produite (Aanen et al., 2002), il y a environ 62 [30-108] millions d'années (ma) (Brandi et al., 2007). Durant cette période, le «block» principal de forêts tropicales concentrées dans le bassin du Congo, s'étendait le long de l'Océan Atlantique jusqu'à l'Afrique de l'Ouest (Plana 2004). Les forêts de l'Afrique de l'Ouest et du

2 Introduction gênérale

Centre semblent donc être les habitats ancestraux de ces organismes. Ainsi, leur plus grande richesse génétique devrait s'y rencontrée en comparaison à celle des populations dérivées (Eggleton et al. . 1994; Kambhampati & Eggleton, 2000; Aanen et al., 2002). Des preuves de migrations des termites champignonnistes hors du continent africain, en Asie (Aanen et al., 2002) et à Madagascar (Nobre el al., 2010) existent. Par contre, la distribution géographique de leurs symbiotes fongiques est moins clairement établie puisque plus de migrations intercontinentales semblent s'être produites, plus que cela ne l'a été pour les termites hôtes (Aanen et al., 2002; Nobre et al., 2010). Toutefois, la dynamique migratoire des Termitomyces à travers leurs régions de distribution en Afrique demeure méconnue.

En Afrique, l'ère Oligocène [23-34 ma] s'est caractérisée par une expansion des forêts tropicales (Plana, 2004). Ensuite, il est apparu une tendance à l'aridification avec une expansion des savanes jusqu'à atteindre aujourd'hui des superficies plus larges que celles des forêts primaires (Lancaster, 1984; Plana, 2004). Les savanes occupent aujourd'hui 1/5 du globe terrestre et couvrent 65 % des terres d'Afrique subsaharienne (Scholes et Archer, 1997; Sankaran el al., 2005). La majorité des genres de termites champignonnistes s'y rencontrent (Aanen & Eggleton 2005). En outre, selon Eggleton el al. (1994), les sévères fluctuations climatiques durant l'ère Miocène [5-12 ma] ont généré plusieurs pouls de spéciations au sein des termites. Sur le continent Africain, la distribution de ces partenaires symbiotiques n'a pas été étudiée de manière chronologique. Peu d'études, en nombre croissant tout de même, ont produit des données de séquences d'ADN de termites champignonnistes et de Termitomyces (Aanen el al., 2002; Rouland-Lefèvre et al., 2002 ; Aanen & Eggleton, 2005 ; Aanen et al., 2007; Marten et al., 2009; Nobre et al., 2010; Osiemo et al., 2010) de différentes régions africaines. La Côte d'Ivoire, l'une des régions majeures de distribution de ces organismes symbiotiques, est restée jusqu'ici sous explorée aussi bien en terme de termites champignonnistes que de Termitomyces. Les spécimens de ces partenaires symbiotiques sont, de ce fait, sous représentés dans les études sur l'évolution de leur interaction d'une part et leur distribution biogéographique, d'autre part.

Pour répondre aux problématiques (i) du déterminisme de la fructification saisonnière du champignon symbiotique, (ii) de la dynamique migratoire des partenaires symbiotiques en Afrique et (iii) de l'origine de la symbiose et de la co-diversification des organismes symbiotiques, le cadre conceptuel de cette étude a été structuré autour de 3 hypothèses (H) et de 7 questions (Q) qui en découlent :

3 Introduction générale

Hl : Des facteurs écologiques (environnementaux) et biologiques (intrinsèques) déterminent et gouvernent la fructification saisonnière du Termitomyces symbiotique;

Ql : Quelle est la diversité spécifique des sporophores de Termitomyces de la zone d'étude et quels en sont leur(s) terrnite(s) hôte(s)?

Q2 : Quelle est la phénologie et la distribution des sporophores de Termitomyces de la zone d'étude?

Q3 : Quels facteurs gouvernent et déterminent la fructification saisonnière des sporopbores du Termitomyces symbiotique?

H2 : La symbiose Macrotermitinae/Termilomyces est spécifiquement originaire soit du centre et/ou de l'ouest de l'Afrique;

Q4 : Quel est le centre d'origine exclusif de cette symbiose sur le continent africain?

Q5 : QuelJe est la dynamique migratoire des organismes symbiotiques à travers leurs zones de distribution en Afrique, avant leurs migrations respectives hors de ce continent?

H3 : Les principaux clades de termites hôtes et de champignons symbiotiques ont le même âge.

Q6: La détermination du centre d'origine régional exclusif de la symbiose sur le continent africain peut-il conduire à la mise à jour de la datation de l'origine de la co-évolution des deux organismes symbiotiques?

Q7 : Qu'est ce qui explique le maintien d'une relative spécificité d'interaction entre hôtes et symbiotes malgré une large utilisation du mode de transmission horizontale dans cette symbiose?

Cette étude a été faite dans la zone de mosaïque forêt-savane, au centre de la Côte d'Ivoire (réserve de Lamto : «V» Baoulé) d'une part: et dans la zone forestière constituée de lambeaux de forêts semi-décidues épargnées par la déforestation au sud (Département de Tiassalé) d'autre part. Elle a pour objectif général d'approfondir la compréhension de la relation de mutualisme obligatoire entre les termites champignonnistes et les Termitomyces en vue de la domestication du symbiote fongique. Spécifiquement elle vise à : (i) estimer la

4 Introduction générale

diversité, la distribution, la phénologie et les facteurs écologiques et biologiques qui gouvernent et déterminent la fructification saisonnière des Termitomyces, (ii) déterminer le centre d'origine régional de cette symbiose sur le continent africain avant les migration externes, (iii) déterminer les périodes de divergences des principaux clades de termites hôtes et de Termitomyces symbiotiques et (iv) déterminer les raisons du maintien d'une certaine spécificité d'interaction entre hôte et symbiote malgré une large utilisation du mode de transmission horizontale du symbiote fongique d'une génération de termites hôtes à une autre. La diversité et l'abondance des termites champignonnistes hôtes, ainsi que l'occurrence des sporophores des Termitomyces symbiotiques ont été examinées dans différents types d'habitats par des fouilles exhaustives et des méthodes standards. Une attention particulière a été portée sur les cycles de vie (ou cycle de développement) des termites hôtes et celles de Jeurs champignons symbiotiques. Des techniques de biologie moléculaire et de phylogénie ont conduit à la détermination du centre d'origine et par conséquent au centre de la plus grande diversité de ces organismes symbiotiques à travers leurs différentes régions de distribution en Afrique. La spécificité d'interaction entre les termites champignonnistes et leurs partenaires fongiques dans la zone d'étude a été établie ainsi qu'une mise à jour de la datation de l'origine de cette symbiose.

Après cette introduction générale présentant les objectives de cette étude, une présentation du milieu d'étude et un état des connaissances sur le sujet d'étude sont présentés dans la première partie de ce document. Cette partie est suivie de celle du matériel et des approches méthodologiques utilisés pour la réalisation du travail. La troisième partie comporte les résultats qui sont discutés. Elle est suivie d'une conclusion générale.

5 PREMIERE PARTIE : GENERALITES Générait tés

CHAPITRE 1 : PRESENTATION DU MILIEU D'ETUDE

1.1/ Situation géographique

Cette étude a été réalisée en Côte d'Ivoire, dans la réserve de Lamto (entre les 6°13' et 6°15' latitude Nord et les 4°06' et 5°03' longitude Ouest) et ses localités environnantes (localité de Zougoussi), d'une part, et aux voisinages de trois villages (Batéra, Kodimanso Kangagnazé) non loin de la ville de N'Douci, d'autre part. La réserve de Lamto est localisée à 160 km au nord-ouest d'Abidjan. C'est une réserve .naturelle de 2700 ha située à la pointe du « V Baoulé » dans la zone de transition entre la savane guinéenne et la forêt serni-décidue. La ville de N'Douc.i est située dans le département de Tiassalé, à 125 km au sud du pays dans la zone de forêts semi-décidues (Figure 1). Les habitats étudiés ont été choisis après des enquêtes socio-économiques réalisées sur le commerce des sporophores du champignon du genre Termitomyces dans ces zones, d'une part. et sur la nature des habitats de fructification de ces champignons, d'autre part, de février à avril 2006 (Koné, 2007).

1.2/ Climat 1.2.1/ Pluviométrie Dans la zone d'étude, quatre saisons sont généralement déterminées par le régime des pluies : une grande saison des pluies, d'avril à Juillet, une petite saison sèche en août, une petite saison des pluies de septembre à octobre et une grande saison sèche de novembre à mars (Pagney, 1988). Les précipitations totales annuelles sont de 1200 mm. Cependant, l'analyse des données c1imatiques des 10 dernières années (1997-2006) précédant cette étude ne confirment pas cette subdivision saisonnière (Figure 2). Selon ces données, la grande saison pluvieuse débute en février au Lieu d'avril. En plus, les pluviométries moyennes enregistrées durant les mois d'août et de septembre ne sont pas significativement différentes au cours de cette décennie, rendant ainsi la petite saison sèche du mois d'août moins perceptible. Ainsi. dans la période de 1997 à 2006, nous avons pu distinguer : • une période de grande pluviométrie (grande saison des pluies) allant de mars à juillet; • une courte période de sécheresse (petite saison sèche) en août · • une petite saison de pluies (petite saison des pluies) de septembre à novembre et • une longue période de sécheresse (grande saison sèche) de décembre à février.

6 Générabtés

Les histogrammes de précipitations de la période 2007-2009 (Figure 3) correspondant à la période d'exécution de cette étude ne suivent pas la même évolution que celles de la période 1997-2006 (Figure 2). La pluviométrie annuelle totale est de 1208 mm pour les dix années ayant précédé les trois années de cette étude et de 1316 mm pour la période de cette étude. La grande saison sèche est beaucoup arrosée et la petite saison sèche est moins marquée, voire inexistante durant la période d'exécution de ce travail par rapport à celle de la période 1997- 2006. En effet, l'observation des histogrammes de précipitations et de la courbe de température ne montre que l'existence de 2 grandes saisons durant la période de cette étude, au lieu de 4 : (i) une grande saison des pluies de février à novembre et (ii) une grande saison sèche de décembre à janvier. Cette variabilité climatique pourrait être considérée comme un indicateur du changement climatique global qui est en cours actuellement. Par ailleurs, les humidités relatives moyennes annuelles sont sensiblement égales: 78 % pour la période 1997- 2006 et 77 % pour celle de 2007-2009 et les courbes des deux périodes ont approximativement la même évolution.

1.2.2/ Température Les courbes des figures 2 et 3 montrent une évolution similaire entre les températures au cours des périodes 2006-2009 et 1997-2006 dans la zone d'étude. Une baisse et une élévation des valeurs de la température ont été enregistrées respectivement au cours des périodes pluvieuses et sèches. Les valeurs de la précipitation totale annuelle, des températures et des humidités relatives ont été sensiblement égales entre les zones phytogéographiques visitées lors de cette étude, puisque soumis aux mêmes conditions climatiques régionales.

1.3/ Hydrographie et relief

Le réseau hydrologique de la zone d'étude est constitué des fleuves Bandaman à l'ouest et N'Zi à l'est. La topographie de la région de Lamto est influencée par les réseaux hydrologiques de ces fleuves. Vers le Nzi, les formes de reliefs sont relativement douces et les pentes des thalwegs n'excèdent guère 7 à 8 %. Au contraire vers le Bandaman, les profils des thalwegs sont très élevés, allant de 20 à 25 % en moyenne et atteignant 80 % dans certaines sections (Rioux, 1970).

7 Généralités

BURKINA-FASO

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OCEAN ATLAHTIQUE

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8 Généralités

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Figure 2 : Données climatiques moyennes mensuelles enregistrées dans la zone d'étude au cours des dix années ayant précédées la période d'exécution de cette étude (1997- 2006). Données fournies par station de géophysique de Lamto.

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Figure 3: Données climatiques moyennes mensuelles enregistrées dans la zone d'étude pendant la période d'exécution de cette étude (2007 à 2009). Données fournies par tation de géophysique de Larnto

9 Généralités

1.4/ Sols Dans la région d'étude, il existe trois types principaux de sol (Delmas, 1967) : - les sols ferrugineux tropicaux, constitués des sols complexes de teinte variée (ocre, rouge, beige) qui couvrent essentiellement les plateaux et les pentes · - les sols en bas de pente, de nature sableuse, généralement à tendance hydromorphe. Ils occupent la majorité des talwegs et - les sols noirs, moins répandus que les sols des plateaux. Ils ont une texture argileuse et une couleur très foncée.

1.5/ Végétation La végétation de la réserve de Lamto est une mosaïque de forêt-savane, constituée par des galeries forestières riveraines du fleuve Bandaman, des lambeaux de forêts denses semi• décidues et une savane à rôniers (Menaut, 1971 ; Deniveau, 1975). La savane domine le paysage (90%) mais est, incluse entre les galeries forestières. Du fait de sa situation géographique et de la zone climatique concernée, ces savanes sont appelées savanes guinéennes ou savanes pré-forestières (Adjanohoun, 1963). Dans cette réserve, la strate arbustive et arborée sont essentiellement constituée de : Borassus aethiopum Mart. (Arecaceae), Crossopteryx febrifuga (Afzel.Ex G.Don) Benth. (Rubiaceae), Piliostigma thonningii (Schum) Milne-redhead (Césalpiniaceae), Bridelia ferruginea Benth. (Euphorbiaceae), Cusonia barteri A. Rich. (Araliaceae), Annona senegalensis Pers. (Annonaceae) (Menaut et Abbadie, 2006). Selon Gautier (1992), six principaux faciès de savane peuvent être distingués : - les savanes herbeuses de bas-fond ou de plateau qui ont une strate herbacée continue et une strate arborée de palmiers rôniers très lâche, avec un recouvrement inférieur à l %. L'espèce herbacée dominante est Loudetia simplex (Ness) CE Hubb (Poaceae); - la savane arbustive très claire qui présente une strate herbeuse continue à Loudetia simplex. La densité des arbustes y est inférieure à 150 pieds à l'hectare et leur recouvrement est de 5 %. La strate arborée à palmiers rôniers est peu dense· - la savane arbustive claire dont la strate herbeuse est dominée par les Andropogonae (Andropogon sp. et Hyparrhenia sp.). La strate arbustive compte 150 à 300 pieds d'arbres à l'hectare et le recouvrement est compris entre 5 et 25 %. Dans cette savane, la strate arborée à palmiers rôniers devient plus importante ·

10 Généralités

- la savane arbustive dense avec une strate herbeuse continue composée d'Hyparrhenia sp .. La strate arbustive y devient dense (300 à 500 pieds à l'hectare) et le recouvrement est compris entre 25 et 50 %. Le nombre de palmiers rôniers y est assez élevé · - la savane arbustive très dense à strate herbeuse continue, mais variable. La strate arbustive est importante et compte plus de 500 pieds à l'hectare avec un recouvrement supérieur à 50%. La strate arborée à palmier rôniers et à dicotylédones y est importante et - la savane boisée dont la strate herbeuse reste discontinue et la strate arbustive très dense (recouvrement supérieur à 50 %). La strate arborée à dicotylédones y paraît plus importante. Il existe également différents végétaux inférieurs et champignons microscopiques et macroscopiques qui n'ont cependant pas fait l'objet d'inventaire à ce jour. La zone de N'Douci était jadis couverte par les forêts semi-décidues, aujourd'hui remplacées en grande partie par des parcelles agricoles. Toutefois, trois ilots forestiers épargnés par cette déforestation excessive et dont les superficies moyennes sont comprises entre 18 et 30 ha ont été choisis, à raison d'un ilot forestier dans chacun des trois villages visités dans cette zone. Après cette brève présentation du milieu d'étude, une synthèse bibliographique est proposée au prochain chapitre pour permettre une meilleure compréhension du sujet d'étude.

11 Généralités

CHAPITRE 2 : GENERALITES SUR LA SYMBIOSE ENTRE LES MACROTERMITINAE ET LES TERMITOMYCES 2.1/ Introduction partielle Afin d'avoir une meilleure compréhension du sujet traité. un état des connaissances a été fait à travers une synthèse bibliographique. Cette revue bibliographique se rapporte à la connaissance des termites, des champignons du genre Termitomyces et à la compréhension de l'interaction symbiotique qui lie ces deux groupes d'organismes.

2.2/ Classes d'interactions entre les organismes vivants

Les variables qui déterminent l'abondance et la distribution spatio-temporelle d'une population, constituent le« système de population» (Berrymann, 1981). Ce système peut être défini en termes de variables structurales et d'accroissement. Les variables structurales sont la densité, le type de dispersion des individus, la structure d'âge, le sex ratio et la diversité génétique. Les variables d'accroissement sont la natalité, la dissémination et la mortalité au sein de la population (Schowalter, 2000). Les phénomènes affectant ces variables sont les facteurs environnementaux. Par conséquent, les éléments de ce système déterminent non seulement la capacité d'une population à s'adapter, en réponse à l'hétérogénéité spatiale du milieu, mais aussi son statut parmi les autres populations d'espèces c'est-à-dire ses interactions avec elles dans le milieu.

En effet. les organismes vivants entretiennent entre eux divers types d'interactions avec des degrés d'intimité variables. Ainsi, chaque individu peut entrer en compétition avec, s'attaquer à ou être la proie de, interagir de manière aléatoire ou spécifique avec une espèce particulière. De ce fait, les interactions sont classées sur la base du signe de leur impact direct (positif, neutre ou négatif) sur la croissance ou la mortalité de la paire ou du groupe d'espèces en interaction (Schowalter, 2000).

Les grandes classes d'interactions constituent donc la compétition, la prédation et la symbiose. La compétition intervient lorsque des espèces doivent compétir pour l'exploitation d'une ressource limitée (Malthus, 1789 ; Darwin, 1859). L'interaction prédateur-proie nécessite que le prédateur tue et consomme la proie (May, 1981 ; Price, 1997); cela implique alors un impact positif pour le prédateur et négatif pour la proie. La symbiose est une association profonde entre deux espèces. Trois types d'interactions sont considérés comme symbiotiques, même si la symbiose elle-même a toujours été définie comme synonyme de

12 Générahtés l'une d'entre elles: le mutualisme. Le parasitisme c'est l'interaction dans laquelle le symbiote tire un bénéfice aux dépends de l'hôte, comme dans la prédation (Schowalter, 2000). Le commensalisme se produit lorsque le symbiote bénéficie de l'interaction établit avec l'hôte sans affecter significativement la survie de ce dernier (Schowalter et Crossley, 1982). Le mutualisme implique la réciprocité des bénéfices, donc une relation de coopération entre le symbiote et l'hôte (May, 1981). Cette relation de coopération peut être facultative ou obligatoire. Les insectes entretiennent certaines des symbioses les plus intéressantes et des plus complexes du règne animal.

2.3/ Classification des termites Les termites sont des macroarthropodes détritivores ayant une étroite parenté avec les blattes du genre Cryptocercus (Lo el al., 2000; KJass & Meier, 2006). Ils appartiennent à l'ordre des Isoptères (insectes à ailes identiques) et font partie des insectes dits « sociaux» en raison de leur mode de vie social.

Selon Kambhampati & Eggleton (2000), on note environ 2600 espèces décrites à ce jour. Ces espèces appartiennent à 281 genres et à 7 familles. Selon la classification de Grassé ( 1986), 6 de ces familles (Mastotermitidae. Kalotermltidae, Hodotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, Termopsidae) constituent les termites « inférieurs» (Figure 4). Ces 6 familles se caractérisent par la présence de protozoaires flagellés dans leur tube digestif, une organisation sociale plus simple et des nids à architecture moins complexe. Par contre, la septième famille des Termitidae renferme près de 80 % des espèces de termites décrites et constitue le groupe des termites dits «supérieurs». Ceux-ci se distinguent par l'absence de protozoaires flagellés dans le tube digestif. Cette caractéristique a pour conséquence une plus grande diversification de leurs habitudes alimentaires et quelques changements majeurs au niveau de leurs associations symbiotiques (Eggleton & Tayasu, 2001 ; Eggleton, 2006). Entre autres, la considérable diversité structurale de leurs nids est un résultat majeur des différences évolutives, des dimensions des colonies et de l'établissement d'un microclimat particulier adapté à chaque espèce (Abe & Higashi, 2001 ). A l'instar des autres insectes sociaux tels que les abeilles, les fourmis et les guêpes, les termites se caractérisent par la répartition des tâches au sein de la société (le polyéthisme). Chez les termites, ce polyéthisme est structurel (fonction de la morphologie) et temporel (fonction de l'âge) (Konaté, 1992). Les termites sont également caractérisés par leur polymorphisme très accentué; c'est à dire qu'il existe une différence morphologique entre les

13 Généralités différentes castes de la société. En effet, les termites sont répartis en castes fonctionnelles bien définies (ouvriers, soldats et imagos sexués). Les ouvriers fourragent, construisent et entretiennent les nids mais sont également chargés de l'alimentation des autres individus. Les soldats (absents chez certaines familles telles que les Apicotermitinaeï défendent les colonies tandis que les imagos sexués (ailés reproducteurs : rois et reines) sont responsables de la reproduction et de la dispersion des espèces.

Mnstotermitidae

Hodotermitidae

Termopsitidae « Termites infêrieurs » Bactéries et protozoaires symbiotiques Kalotermitidae ::::: 20 % des espèces décrites

Serr'itermitidae

Rhinotermlridae

Termitidae Macrotermirinae 11} Champignons symbiotiques Apicotermitinae « Termites supêrieurs » Bactéries symbionres principalement == 80 % des espèces dêcrtres

Figure 4 : Relation phylogénétique à travers les sept fami Iles de termites (Eggleton, 2001) et les quatre sous-familles de Tennitidae (Miura et al., 1998; Donovan et al., 2000). Source : Aanen & Boornsma (2005).

14 Généralités

2.4/ Régime alimentaire des termites L'influence majeure des termites sur les écosystèmes est non seulement due à leur distribution dans des biotopes variés, à leur organisation sociale. mais surtout à leur association symbiotique avec d'autres organismes (Higashi & Abe, 1996). En effet. leur régime alimentaire est majoritairement constitué de débris végétaux: riches en lignine et cellulose, mais pauvres en azote (Katoh et al., 2002). Pour l'utilisation de ce matériel végétal, ils ont développé des stratégies au nombre desquelles apparaissent les symbioses digestives (Breznak & Brune, 1994 ; Nalepa, 1994). En effet, les termites possèdent une flore intestinale spécialisée contenant des bactéries, des archées et des levures leur permettant de se nourrir de matières végétales lignocellulosiques difficilement dégradables (Kumari el al., 2006). Le rôle de la flore microbienne symbiotique est principalement de sécréter des enzymes non disponibles chez l'insecte hôte et sans lesquelles ce dernier ne pourrait survivre (Bignell 2000). La symbiose la plus performante est réalisée par les termites de la sous famille des Macrotermitinae (termites champignonnistes). Ces termites sont, en effet, capables de recycler 95 % de la production annuelle de litière (Collins, 1981) et ont une influence fonctionnelle 5 à 6 fois plus élevée que celle des autres termites (Bignell & Eggleton, 2000). De ce fait. ces termites supérieurs suscitent un intérêt scientifique particulier.

2.5/ Diversité et distribution géographique des termites La richesse spécifique locale des termites est fortement influencée par la variabilité des facteurs environnementaux incluant l'altitude (Gathorne-Hardy et al., 2001), le type de végétation (Jones, 2000), les perturbations anthropogéniques (Eggleton et al. 1995, 1997, 2002a: De Souza et Brown, 1994) et le climat (Eggleton & Bignell, 1995). Le classement des richesses spécifiques en termites des continents s'établit comme suit: Afrique> Amérique du Sud > Sud-est Asiatique (Eggleton et al., 1994; Eggleton, 2000). Les forêts tropicales humides renferment la plus grande diversité de termites avec 50 à 80 espèces à l'hectare (Eggleton et Bignell, 1995). Toutefois, une asymétrie de diversité existe entre les différents blocs de forêts humides du globe terrestre. La distribution régionale et globale est inévitablement influencée par les assemblages locaux de termites (Comell et Lawton, 1992). Les gradients latitudinaux et longitudinaux influencent cette diversité et sa distribution spatiale (Eggleton, 2000). En effet, une augmentation de la latitude (partant de l'équateur) conduit à une baisse rapide de la diversité en termites.

15 Généraluès

2.6/ Sous-famille des Macrotermitinae ou termites champignonnistes es termites de la sous-famille des Macrotermitinae entretiennent une relation exosymbiotique avec un champignon (Basidiomycète) du genre Termitomyces (Reuland• Lefèvre, 2000; Rouland-Lefèvre et al., 2002, 2006; Reuland-Lefèvre et Bignell, 2001). Cela est différent des associations endosymbiotiques (avec des archées. amibes. levures spirochètes, actinomycètes ou flagellés) existant chez la plupart des autres termites. Cette symbiose est établie avec un champignon qu'ils cultivent sur une structure spéciale construite à l'intérieur de leur nid, appelée meule à champignon.

2.6.1/ Symbiose Macrotermitinae-Termitomyces L'établissement d'une interaction de mutualisme entre deux organismes engendre la mise en place d'une solution adaptative rapide aux conditions du milieu que ne le ferait chacun d'eux de manière indépendante; grâce à la combinaison synergique de leurs différents traits biologiques et écologiques (Maynard et Szathmary, 1997). L'association Macrotermitinae-Termitomyces est définie comme étant une symbiose obligatoire. Elle est largement basée, d'une part, sur l'aide que le Termitomyces apporte aux termites de cette sous famille dans le recyclage du matériel végétal via son complexe enzymatique performant et d'autre part, sur la mise en place d'un environnement extrêmement favorable à la croissance du champignon symbiotique, condition de leur pérennité et de leur propagation lors de l'établissement de nouveaux nids (Thomas, 1987a et b; Wood et Thomas. 1989: Rouland• Lefèvre et Bigne11, 2001). Les deux partenaires impliqués dans cette symbiose ont adapté leur cycle de vie afin d'assurer la transmission effective du champignon symbiotique à chaque colonie naissante de termites. Cette symbiose semble donc être une clé de l'histoire de l'évolution des termites champignonnistes (Mueller et Nicole, 2000; Aanen el al., 2002) et une source de préservation de la biodiversité des termites et de leurs symbiotes fongiques. Elle résulte également selon Aanen et Eggleton (2005) d'un long processus de coévolution ayant une seule origine africaine, avec l'impossibilité de substitution du Termitomyces par d'autres espèces de champignons ou de la suppression de cette symbiose.

16 Généralués

2.6.2/ Association Macrotermitinae- Xylaria Bien qu'en présence des termites le Termitomyces symbiotique soit l'unique souche fongique visible, plusieurs observations faites sur des meules abandonnées ou extraites des termitières révèlent la présence d'autres champignons dont majoritairement un champignon du genre Xylaria (Grassé, 1937; Sands, 1969; Heim, 1977; Batra & Batra, 1979: Wood & Thomas, 1989). Le genre Xylaria (famille des Xylariaceae, classe des Pyrénomycètes) se caractérise par la formation de hampes (Lee et al., 2000). Il contient des champignons communément retrouvés à l'intérieur des tissus végétaux et de ce fait, endophytes de plusieurs plantes tropicales (Rodrigue & Samuel, 1990; Petrini, 1991 ; Rodrigue & Petrini, 1997). Les espèces endophytes peuvent être des pathogènes, des mutualistes et/ou des saprophytes latents (Caroll 1991 ; Fischer & Petrini, 1992). Une des difficultés majeures dans l'étude des Xvlaria est l'identification et la classification des taxons de ce genre. Ceci provient principalement du fait que la couleur, les dimensions, voire l'aspect général des hampes varient énormément avec le stade de développement et la localité, mais aussi qu'il est très difficile d'observer les sites de germination des ascopores (Whalley, 1996; Lee el al., 2000; Rogers et al., 2005). La nature de l'association Xy/aria/Macrotermitinae ainsi que la diversité des Xylaria associés aux Macrotermitinae restent toujours peu connues (Guédégbé, 2010). Les Xylaria sont considérés par certains auteurs comme des saprophytes et par d'autres comme des partenaires de la symbiose Termitomyces-Macrotermitinae. Cependant, bien qu'un parallèle ait été effectué avec les champignons du genre Escovopsis qui sont des parasites spécialisés des meules de fourmis champignonnistes et ayant co-évolué avec ces fourmis hôtes (Mueller & Gerardo, 2002), seule une caractérisation moléculaire pourrait clarifier la relation ambigüe entre les Xylaria qui se développent sur les meules et les termites de la sous-famille des Macrotermitinae (Rogers et al., 2005).

2.6.3/ Meule à champignon: support exclusif du Termitomyces

2.6.3.l/ Origine de la meule à champignon Contrairement aux autres insectes sociaux Hyménoptères tels que les abeilles, les fourmis et les guêpes qui se nourrissent de cytoplasme cellulaire, les termites se nourrissent de parois cellulaires (Abe and Higashi, 1991). Les parois cellulaires sont pourtant une source alimentaire pauvre en nutriment mais riche en cellulose et en lignine. Leurs constituants diffèrent d'une espèce de plante à une autre. Par ailleurs, chez la même espèce de plante la

17 Généralités teneur de ces constituants change avec l'âge, le stage de développement et certaines conditions écologiques. Selon Breznak: & Brune (1994), la cellulose est généralement le principal polysaccharide structural de ces parois (35-50 %), suivi de l'hémicellulose (20-35 %) et de la lignine (10-25 %). Les ouvriers consomment de la litière d'origine diverse lors de leurs excursions de récolte. Ramenés au nid, ces aliments ingérés et ayant subi un court transit intestinal, sont régurgités sous forme de boulettes fécales appelées mylosphères (Josens, 1972). Ces aliments lors de ce transit intestinal ne subissent pas une digestion totale. Rejetées par l'insecte, elles renferment encore de la cellulose, de la lignine, des glucides, des protéines des vitamines et des acides aminés. La superposition de plusieurs de ces mylosphères forme des structures ressemblant à des éponges, appelées « meules à champignon » (Figure 5). Cette meule à champignon constituée de matière végétale pré-dégradée subira une dégradation complète par le champignon du genre Termitomyces préalablement inoculé dans celle-ci par le termite. Les spores de Termitomyces ainsi inoculés trouveront au sein de la butte termitique les conditions optimales (température, humidité, teneur en C02 ... ) pour leur croissance.

2.6.3.2/ Structure et dynamique de la meule à champignon La nature réelle de la meule à champignon est particulière. La meule n'est pas un quelconque amas de matériaux végétaux, car elle possède une texture et une architecture bien définies, caractéristiques du genre, voire de l'espèce de termite constructeur (Grassé et Noiret, 1958: Wood et Thomas, 1989; Reuland-Lefèvre, 2000; Reuland-Lefèvre et Bignell, 2001) (Figure 6). Elle est construite suivant plusieurs modèles architecturaux, mais sa surface est presque toujours cérébriforme ou alvéolée. L'ensemble de la meule est parcouru par des filaments mycéliens. En surface, se différencient de petites masses sphériques. blanches appelées rnycotêtes, nodules, sphérules, synnemata, sphères de conidies ou bromatia selon les auteurs (Leuthold el al. 1989). Nous choisirons le terme 'mycotête' pour les désigner dans ce document. En effet, ces mycotêtes représentent des sporophores immatures du champignon symbiotique.

18 Généralués

,. Perforarorium

Extërieur de la butte .,., Anneau supère descendant ------Interface de la butte '.i------Débris du blèmarogène

. ;. ....------Colier péripilèique :....------Anneau ascendant ______Pseudorhi.ze Intérieur de la butte E ------L-0ge (.) ,------Disque basal U1 CO ,,------Coussinet basal

~ } :::rœum :l , Mycotète

B

Figure 5 : Meule : support exclusif du Termitomyces.

(A) Litière arbustive récoltée et consommée en surface par l'ouvrier de termite, (B) et (C) Mylosphères : stades primaires de la meule à champignon, (D) Nomenclature des termes concernant les diverses parties des Agarics termitophiles associés aux meules des Macrotermitinae. Sources: Heim (1977) et Grassé (1982), modifiés.

19 Générohtes

Meule du genre Macrotertnes Meule du genre Odontotermes

E Meule du genre Microtennes Meule du genre Ancistrotermes

2-cm

Meule du genre Pseudacanthotermes

Figure 6 : Meules à champignons de quelques genres de termites champignonnistes.

20 Généralités

Les Macrotermitinae sont les seuls Isoptères champignonnistes qui construisent des meules ayant sensiblement la même composition et la même évolution (Josens, 1972). Les meules ne sont pas des édifices stables. Elles subissent de perpétuelles transformations : leur taille est donc variable. Toutefois, un autre facteur conditionne leur dimension. celle de la loge (cellule ou chambre à meuJe) qui la contient (Grassé, 1944-1945). Selon plusieurs auteurs (Kalshoven; 1936; Grassé & Noiret, 1957; Grassé, 1982), seule la partie inférieure de la meule (soumise plus longtemps à l'action cellulolytique du Termitomycesï et le mycotêtes de Termitomyces (riche en azote) se trouvant à sa surface sont consommées par le ouvriers. Cette consommation est compensée par l'apport constant de nouvelles mylosphères régurgitées à la face supérieure de la meule chez les espèces des genres Ancistrotermes Macrotermes, Microtermes et Odontotermes (Josens, 1972). Par contre, chez les espèces du genre Pseudacanthotermes, la meule est entièrement consommée par les termites avant d'être remplacée par une nouvelle dans la chambre à meule vide (Rouland-Lefèvre et al., 2000). Le supplément d'azote acquis par la consommation des mycotêtes constituerait un apport nutritionnel important et aiderait les termites dans le développement de leurs glandes labiales pour l'approvisionnement des larves et des reproducteurs, d'une part. et dans le recyclage des débris végétaux via les enzymes contenues dans les mycotêtes, d'autre part (Rou land-Lefèvre, 2000 ; Hongoh et al., 2006).

2.6.3.3/ Classification des meules à champignon

Les variations visibles observées au niveau de la dimension et de l'aspect des meules permettent généralement de différencier les genres de Macrotermitinae de même que les Termitomyces associés. Ainsi, globalement trois types de meules sont observés (Wood et Thomas, 1989; Rouland-Lefèvre, 2000; Rouland-Lefèvre et Bignell, 2001). Le type l de forme alvéolaire, clair à la base et sombre au sommet qui est spécifique des genres de termites Macrotermes, Odontotermes et Protermes. Le type Il sphérique ou globulaire, plus ou moins solide et de faible diamètre est caractéristique des genres Microtermes et Ancistrotermes. Le type ID majoritairement caractéristique des genres Acanthotermes et Pseudacanthotermes est formé de lamelles verticales, de couleur marron, mais blanchissant progressivement avec l'âge.

21 Généralités

2.6.4/ Rôle des organismes partenaires dans la relation symbiotique Plusieurs auteurs (Martin et Martin, 1977; Wood et Thomas, 1989; Veivers et al., 1991 ; Darlington, 1994) ont énuméré les bénéfices que chacun des deux organismes tirent de la relation symbiotique qu'ils entretiennent. Pour les termites, quelques bénéfices sont : • la digestion des substances complexes (lignine, celluJose et tanins) en substances plus simples utilisées par les termites pour leur alimentation (Martin et Martin, 1978 · Reuland-Lefèvre, 2000 ; Hyodo et al., 2003) · • l'augmentation du rapport Azote-Carbone (NIC) du régime alimentaire des termites à travers la fourniture de nutriments concentrés, en particulier l'azote, via les mycotêtes (sporophores immatures) et les parties les plus âgées de la meule couvertes par un vaste réseau de mycélium fongique, que les termites consomment (Rohrmann, 1978 : Wood et Thomas, 1989; Darlington, 1994; Hyodo et al., 2003) · • la production de cellulases et de xylases (Figure 7) pour la dégradation des constituants des parois cellulaires végétaux de manière synergique et/ou complémentaire avec les enzymes endogènes des termites champignonnistes (Martin et Martin, 1978: Reuland• lefèvre et al., 1991) ; • la production de chaleur et d'eau métabolique (Lüscher, 1951). Les champignons en retour obtiennent: • un substrat facilement exploitable pour leur prolifération via la meule · • un microclimat favorable à leur croissance via le nid du termite hôte ; • l'inhibition sélective de la croissance d'autres espèces de champignons parasites et des infections bactériennes pouvant entrer en compétition avec eux pour l'exploitation du substrat (Johnson et al., 1981 ; Thomas, 1985 ; Wood et Thomas, 1989).

22 Généralités

Hèmicellulose (20-30%)

• 11 • •• 1 .,. e 1 1 1 1 1 1 • • • • 1 • • • • • • • • 1 1 • • • •• 1 1 • 1 1 • I t • • • . .• • • •. • • ' • •

1 1 Peroxidase Lignine : Laccase ) La dégradation de la lignine donn acces aux polymères carbohvdraté

Hemicellulose Xylobi lan principalement) 1 Xylana Iigosaccharide B-xy losidase ~ ~

Endoglucanase lucobiose Glucose 1 Glucos : cellobiclzy~rue ligosaccharides B-glucosidase 1 • Figure 7 : Vue d'ensemble des constituants des parois cellulaires des plantes, principalement composés de cellulose, hémicellulose et lignine. Quelques unes des principales enzymes impliquées dans la dégradation des principaux polysaccharides en disaccharides et oligosaccharides, qui sont ensuite dégradés en monosaccharides solubles assimilables sont également présentées. Source : Nobre & Aanen (2012).

23 G énéralnés

2.6.5/ Transmission du champignon symbiotique d'une génération de termite à une autre La transmission du champignon symbiotique des colonies matures de Macrotermitinae aux colonies naissantes peut être soit horizontale, soit verticale (Rouland-Lefèvre et al., 2002 ; Aanen el al., 2002 ; Korb et Aanen, 2003). La transmission verticale du symbiote est effectuée directement par les ailés reproducteurs, par l'ingestion des spores du champignon avant leur départ du nid parental (vol nuptial). Ce mode de transmission peut être uniparentale (à travers l'un des parents) ou biparentale (à travers les deux parents). La transmission horizontale du symbiote quant à elle résulte de l'association entre le champignon et le termite hôte en dehors de la lignée parentale. Elle est directement corrélée à la fructification saisonnière des sporophores du champignon symbiotique. En effet, après fructification du Termitomyces à la surface des nids des colonies matures, les spores ingérées par les ouvriers de la colonie naissante sont inoculées dans les matières fécales servant à la construction de la première meule à champignon encore appelée « meule primordiale». La collecte de ces spores dispersables par le vent est faite soit activement ou passivement par les ouvriers dans l'environnement immédiat de leur nid lors des fourragements (Sand, 1960; Johnson et al. 1981 ; Sieber, 1983 ; Korb et Aanen, 2003 ; De fine Licht et al., 2005). Selon Johnson et al. (1981), Aanen et al. (2002) et Korb et Aanen, (2003) la transmission horizontale est le mode de transmission ancestral maintenu au sein des Macrotermitinae avec seulement deux exceptions chez lesquels la transmission verticale uniparentale du champignon symbiotique s'est développée (Tableau 1). Cette transmission verticale uni parentale est exclusivement paternelle chez Macrotermes bellicosus et maternelle chez cinq des espèces du genre Microtermes (Korb et Aanen, 2003). n faut cependant noter qu'au sein du genre Macrotermes, l'espèce Macrotermes subhyalinus utilise la transmission horizontale pour la transmission de son champignon symbiotique d'une génération à une autre (Johnson et al., 1981 ). Les transmissions verticale et horizontale peuvent être clonales (pas de recombinaison génétique entre symbiotes) ou sexuées (recombinaisons génétiques), mais dans la majorité des cas, la transmission verticale est clonale tandis que la transmission horizontale est sexuée (figure 8). Toutefois, pour stabiliser une telle relation de mutualisme, plusieurs forces sélectives ont été proposées: (i) la transmission verticale (Frank, 1996), l'homogénéité génotypique des symbiotes (Herre et al., 1999) et l'inhibition sélective des hôtes (Frank 1997).

24 Généra Illés

Tableau 1: Mode de transmission du champignon symbiotique (Termitomyces sp.) chez différentes espèces de termites champignonnistes (Korb et Aanen, 2003).

Esp_èces Mode de transmission Références A ncistrotermes guineensis Transmission horizontale Sands (1960) Ancistrotermes crucifer Transmission horizontale Johnson et al. (1981) Ancistrotermes cavithorax Transmission horizontale Johnson el al. (1981) Pseudacanthotermes spiniger Transmission horizontale Johnson et al. (1981) Macrotermes subhyalinus Transmission horizontale Johnson et al. (1981) Macrotermes michaelseni Transmission horizontale Sieber (1983) Odontotermes pauperans Transmission horizontale Johnson et al. (1981) Odontotermes smeathmani Transmission horizontale Johnson et al. (1981) Odontotermes montanus Transmission horizontale Sieber (1983) Macrotermes bellicosus Transmission verticale, paternelle Johnson et al. (1981) 5 esE.èces de Microtermes Transmission verticale, maternelle Johnson (1981); Johnson el al. (1981)

25 énéralités

2. 6.6/ Co-spéciation des organismes symbiotiques La coévolution entre deux organismes entretenant une interaction symbiotique peut être définit comme un changement évolutif au sein d'une des populations en réponse à celui qui s'est préalablement produit au sein de la seconde. Cela entraine également un changement dans la seconde population en réponse à celui intervenu au sein de la première population. C'est en somme un changement évolutif conjoint de deux ou plusieurs espèces en interaction étroite. Si ces changements continuent à travers des évènements de spéciation chez chacun des deux groupes d'organismes, cela peut conduire à une co-spéciation entre les deux populations (Janzen, l 980). Les relations de mutualisme épousent parfaitement les principes de la co-spéciation et cela est plus significatif dans les relations de symbiose obligatoire. De telles relations conduisent généralement en premier lieu à des co-adaptations et à long terme à une co• spéciation (Futuyma et Slatk:in, 1983 cité par Peek et al., 1998). La cc-spéciation entre un hôte et son symbiote a été étudié dans très peu de cas, par exemple chez les mouches tsé-tsé et les blattes (Lo et al., 2000); les pucerons et les fourmis champignonnistes (Bot el al., 2001 ). L'une des principales raisons du manque d'études dans ce champ de recherche réside en la difficulté de cultiver en conditions contrôlées plusieurs des symbiotes microscopiques, due à leur dépendance stricte vis-à-vis de leur hôte (Nishiguchi 2004). Chez les Macrotermitinae, de nombreuses avancées dans la culture du symbiote en conditions contrôlées et la possibilité d'expérimenter sur les deux organismes symbiotique rendent cette symbiose idéale aux études de cc-évolution. Toutefois. la transmission horizontale étant le mode principal de transfert du symbiote fongique au sein de cette sous• famille de termite, cela engendre une grande possibilité de changement d'hôte à chaque génération, diminuant ainsi les chances d'une possible co-spéciation. En effet. seule une transmission verticale stricte du symbiote peut conduire à une cc-spéciation très stricte (Frank, 1997). Sur la base de cette hypothèse, une co-spéciation dans la relation Macrotermitinae-Termitomyces ne pourrait se produire qu'au sein des genres Macrotermes (M bellicosus) et Microtermes (Johnson, 1981 ; Darlington, 1994).

26 Généralités

(a) Erablissements dl'

Inoculation de Cycle de vie meule du termite

Cycle de vie du champignon ouvriers

~eulea,·ec hyphe dicaryotique et sporophores sexuës

(a) Transmission horizontale : un couple d'ailés fonde une nouvelle colonie et les ouvriers qui y sont issus récoltent des spores sexuées sur des sporophores émanant des buttes de colonies matures du même genre ou de la même espèce de termite, pour l'inoculation de leurs nouvelles meules.

(b) Essaimage: l 'un des membres du couple royal porte les spores Asexués du champignon

Colonie mature: meule Etablissement d "une avec des hyphes mono ou Cycle de vie du termite et du nouvelle colonie: dicaryotiques et spore inoculation des meules asexués champignon

(b) Transmission verticale: transmission uniparentale : l'un des membres du couple royal mporte du nid parental des spores asexuées du champignon symbiotique. Ces spores serviront à inoculer les futures meules de la colonie naissante.

Figure 8 : Modes de transmissions du symbiote fongique chez les Macrotermitinae durant la fondation de la colonie. Source : Korb et Aanen (2003) modifié.

27 énéralués

2. 6.7/ Spécificité d'interaction et conflit d'intérêt dans la relation de mutualisme entre le termite et le Termitomyces 2.6. 7.1/ Interactions et spécificités Dans les relations de mutualisme, il est judicieux de faire une subdivision du concept de spécificité d'interaction: la spécificité d'interaction avec l'hôte, d'une part, et la spécificité d'interaction avec le symbiote, d'autre part. La spécificité avec l'hôte est définie selon Aanen (2006) comme l'éventaiJ de symbiotes lié spécifiquement à celui-ci et inversement pour la spécificité d'interaction avec le symbionte (Figure 9). Le principal mécanisme pouvant améliorer cette spécificité d'interaction entre l'hôte et le symbiote est le mode de transmission verticale du symbiote d'une génération d'hôte à une autre. Car, comme l'indique Frank (1996), cela réduit considérablement les fréquences d'échanges de symbiote entre les hôtes. La transmission horizontale est le mode de transfert du symbiote le plus répandu et le plus utilisé dans la symbiose Macrotermitinae-Termitomyces (Korb et Aanen, 2003). Pourtant, il existe tout de même une certaine spécificité d'interaction à l'échelle du genre de termite hôte c'est-à-dire que chaque genre de termite hôte possède un groupe spécifique d'haplotypes du symbiote fongique auxquels il est toujours lié. Selon Aanen et al., (2009) cette relative spécificité pourrait s'expliquer par la mise en place de mécanismes par le termite hôte, pour le contrôle des mutations génétiques du symbiote fongique dans une colonie naissante.

28 Généra lites

HOTE SY-:',IBIOTE

a

Grande spécificité nec le symbiote 'Grande spécificité avec l'hôte

b

Faible spécificité nec le symbiote." Grande spécificité avec l'hôte

C

Grande spécificité nec le symbiote l Faible spécificité avec l'hôte

d

Faible spécificité avec le symbtore I Faible spécificité nec l'hôte

Figure 9 : Schémas théoriques de la spécificité dans les relations de mutualisme entre hôte et symbiote. Source : Aanen el al. (2007).

29 Généralués

En effet, les termites champignonnistes ont élaboré des mécanismes leur permettant d'augmenter les liens de parenté au sein des symbiotes fongiques afin de surmonter l'hétérogénéité génétique des spores du symbiote fongique à la naissance de la colonie. Ce lien contribue à réduire considérablement la compétition entre spores et à sélectionner une transmission horizontale « prudente » causant moins de tort au termite hôte.

2.6. 7.2/ Conflit d'intérêt dans la relation de mutualisme entre le termite et Je Termitomyces En général dans une relation de mutualisme, le conflit intervient tout d'abords lorsque chacun des partenaires impliqués dans la relation subit une pression sélective de co-évolution de l'autre partenaire (Thompson, 1999), mais aussi lorsque chacun des partenaires essaie de tirer un maximum de profit de sa relation avec l'autre (Berre et al., 1999). Dans la relation de mutualisme qui lie les termites champignonnistes aux Termitomyces, les conflits d'intérêts se situent à deux niveaux : (1) bien que cette symbiose soit obligatoire pour les deux groupes d'organismes. la transmission horizontale implique une séparation des cycles de reproduction sexués du termite et du champignon. Pourtant, ce mode de transmission nécessite la fructification saisonnière du champignon symbiotique. Cependant, cette fructification de sporophores que le termite hôte ne consomme pas, ne lui est pas profitable à cours terme (Korb & Aanen, 2003). Par ailleurs, le champignon symbiotique n'a aucun intérêt direct en la production massive d'imagos sexués (ailés) par la colonie de termites, au détriment des ouvriers dont la production les approvisionneraient en une plus grande quantité de substrats de croissance et (2) les variations génétiques au sein des champignons peuvent subvenir par mutation. Cela crée donc une possibilité de compétition entre souches de Termitomyces génétiquement différentes pour leur propagation et leur transmission au sein d'une même colonie de termites. Il semble que les termites hôtes minimisent ces variations génétiques afin que l'interaction compétitive entre souches symbiotiques fongiques ne diminuent la productivité de la colonie (Frank, 1996; Korb et Aanen, 2003).

30 Généralités

2.6.8/ Diversité et distribution géographique des Macrotermitinae et leurs champignons symbiotiques Contrairement aux autres termites, les Macrotennitinae ont une distribution géographique limitée (Darlington, 1994) (Figure 10). Cette sous-famille est abondante dan les écosystèmes africains et asiatiques (Eggleton, 2000). Les premiers travaux sur leur distribution géographique ont été menés par Emerson (1955). Ses études ont montré leur origine africaine à l'Oligocène, puis une migration ultérieure en Asie du sud et du sud-est. Une étude plus récente révèle que ces termites proviennent des forêts humides d'Afrique à partir desquelles ils ont colonisé de manière continue les savanes africaines (Aanen et Eggleton, 2005) il ya près de 62 ma (Brandl et al., 2007). Puis, s'agissant des migrations hors d'Afrique, il en aurait eu au moins S en Asie (Aanen et al., 2002) et une à Madagascar (Nobre et al., 2010), en y incluant le genre Hypotermes qui est exclusif au continent Asiatique. La sous famille des Macrotermitinae est réparti en 11 genres (Acanthotermes, Allodontotermes, Ancistrotermes, Hypotermes, Macrotermes, Megaprotermes, Microtermes, Odontotermes, Pseudacanthotermes, Protermes et Synacanthotermes) comportant environ 330 espèces (Kambhampati et Eggleton, 2000). Dix des onze genres décrits se rencontrent en Afrique (Ouest, Centre et sud), cinq sur le continent Asiatique et un à Madagascar (Tableau II). Certains auteurs classent quelques fois les genres Sphaerotermes, Euscaiotermes et Parahypotermes parmi les genres de Macroterrnitinae. Toutefois, le genre Sphaeroterme avec son espèce unique S. sphaerothorax, construit certes des meules mais qui sont plutôt infestées par des bactéries (meules à bactéries), en lieu et place du champignon Termitomyces (Garnier-Sillam et al., 1989). Selon Engel & Krishna (2004), ce genre n'a donc pas les mêmes caractéristiques que les genres de la sous-famille des Macrotermitinae. Il serait considéré dan l'évolution comme le lien entre les termites non champignonnistes et les termites champignonnistes (Darlington, 1994). De récentes études phylogénétiques ont montré que ce genre n'appartient pas à la sous famille des Macrotermitinae (Aanen et al., 2002) et qu'elle appartiendrait plutôt à celle des Sphaerotennitinae (Engel & Krishna, 2004). Le genre Euscaiotermes est endémique des régions orientales. Toutefois, iJ n'a été collecté qu'une seule fois (Kambhampati et Eggleton, 2000). Son appartenance à la sous-famille des Macrotermitinae reste à confirmer. Enfin, le genre Parahypotermes serait en fait le genre Hypotermes qui lui-même serait un descendant du genre Odontotermes (Aanen et al., 2002).

31 Généralités

Micro termes i't' r -·~·- .-~ ~ .... -- - ,~ -- • - . ___ Ancistrotermes • • •·/ ,. 1 Synacanthotermes •••• f •' ,!I•l ,. ""--'-"'· ''-A/1.odontermes lt r.--c-~:; Macrotermes t- y·,~; ;} ....• '----' ;. <~ ~ Odontotermes ...,~ •• ,• (incl. Hypotermes) 1 ~·

Protermes \jO "-·, '\ Pseudacanthotermes"llla

----Acanthotermes

Figure 10 : Représentation simplifiée de l'origine biogéographique des termites champignonnistes. Source : Aanen et Eggleton (2005).

L'absence de rayure sur les branches de l'arbre indique une origine ancestrale forestière et les rayures une origine ancestrale ambiguë (Microtermes). Les triangles indiquent les types d'habitats colonisés. L'absence de rayures dans ces triangles pour les habitats forestiers et le rayures pour les habitats forestiers et savanicoles. L'origine africaine des Ancistrotermes et Odontotermes Malgaches est incertaine et représentée par des pointillés.

32 Généralités

Tableau Il : Zones de distribution des genres de la sous-famille des Macroterminae (Isoptera: Termitidae).

Zones de distribution

Afrique de l'Ouest Afrique Sous-famille Genres Afrique Centrale Australe Madagascar Asie

Macrotermitinae Acanthotermes

A llodontotermes X

Ancistrotermes X X

Hypotermes X

Macrotermes X X X

Megaprotermes X

Microtermes X X X

Odontotermes X X X

Pseudacanthotermes X

Protermes X

Iynacanthotermes X

33 Général11és

2.6.9/ Termitomyces

Les champignons tennitophiles appartiennent à trois genres : Termitomyces Heim, Podabrella Singer et Sinotermitomyces Zhang (Heim, 1977). Toutefois, le genre Termilomyces est le mieux connu et le mieux étudié. Les champignons du genre Termitomyces doivent leur nom à Heim (1942). Ces champignons sont des Basidiomycètes de l'ordre des , de la famille des et de la tribu des Termitomyceteae (Jülich) Singer. Exclusivement liés aux termites de la sous-famille des Macrotermitinae, on les retrouve seulement dans les régions tropicales de l'ancien monde, depuis l'Ouest de l'Afrique, jusque dans le Sud-est Asiatique, l'lndonésie et les Philippines (Durrieu, 1993). Selon Kirk el al. (2008) et Osiemo et al. (2010), environ 40 espèces sont décrites à ce jour

(Kirk el al., 2001). Ce nombre relativement petit, comparé aux 330 espèces de termites champignonnistes conduit à l'hypothèse que plusieurs espèces de termites partagent la même espèce de Termitomyces. L'homologie totale de certaines régions spécifiques du génome de plusieurs Termitomyces de zones géographiques différentes, d'espéces voir de genres de termites différents explique cette faiblesse de la diversité spécifique de ce groupe d'organisme. Toutefois, leur distribution géographique est intimement liée à celle de leurs termites hôtes compte tenu de leur relation de mutualisme si particulière.

2.6.9.1/ Fructification saisonnière des Termitomyces

Selon Heim (1977), la fructification des Termitomyces est une stratégie d'adaptation, de survie et de pérennisation des espèces, liée à la recherche d'une position optimale pour la dispersion de leurs spores en fonction de leur phénologie. Degreef (1990) a avancé une relation entre l'abandon de la butte tennitique et la fructification du mycélium du Termitomyces. Pour lui, les carpophores de Termitomyces ne seraient donc récoltés que sur des termitières mortes. Oei (1993) de son côté, lie cette fructification au déplacement des termites d'un côté à un autre de la butte tennitique due aux variabilités saisonnière de la pluviométrie. Par ailleurs, Tschierpe (1974) explique cette fructification par la chute de la teneur en C02 dans les chambres à meules. Selon lui, le C02 inhibe momentanément la fructification des champignons. Une chute du taux de C02 aurait la propriété de stimuler la croissance du mycélium de nombreuses espèces de champignons, pouvant conduire à sa fructification. Toutefois, les causes de la chute du C02 restent inexpliquées dans cette théorie. D'autres auteurs (Korb et Aanen, 2003 ; Aanen et Boomsman, 2005), lient la fructification saisonnière des Termilomyces au mode de transmission qu'utilisent leurs termites hôtes pour

34 énéralstés la propagation et la pérennisation des spores de leur champignon symbiotique d'une génération à une autre. Les champignons associés aux termites utilisant une transmission horizontale fructifient chaque saison. Par contre. ceux dont les termites hôtes utilisent la transmission verticale ne fructifieraient jamais. En somme, les différents facteurs expliquant le déclenchement de la fructification saisonnière des Termitomyces restent à élucider. L'induction de la formation de ces sporophores de Termitomyces (Figure 11) n'a fait jusqu'ici que l'objet d'hypothèses. sans véritable expérimentation scientifique. Pourtant, il serait judicieux de prendre en compte non seulement les caractéristiques des milieux de fructification, mais aussi le microhabitat que représente la butte termitique. Il est probable que ces différents facteurs agissent ensemble et non indépendamment dans ce phénomène.

35 Généralllé.s

porophore de Termitomyces

Figure 11 : Fructification saisonnière d'un sporophore du champignon du genre Termitomyces à la surface de la butte de son termite hôte.

36 Généralités

2.6.9.2/ Diversité des termites cbampignooni.stes et des Termitomyces de la zone d'étude Le Tableau ID présente les 16 espèces de termites champignonnistes, réparties en 8 genres, répertoriées à ce jour dans la zone d'étude par les travaux de Josens (1972). Konaté (1998) et Dosse et al., (2010). Parmi ces 8 genres, cinq sont très abondants et rencontrés régulièrement dans différents types d'habitats. Ce sont les genres Ancistrotermes Microtermes, Pseudacanthotermes, Odontotermes et Macrotermes. Ces cinq genres constituent les principaux genres de termites champignonnistes de cette zone (Josens, 1972). Le genre Synacanthotermes n'y a à ce jour jamais été décrit. Les études existantes sur les champignons symbiotiques de cette zone sont celles de Koné (2007) sur la fructification saisonnière et l'importance socio-économique des sporophores de Termitomyces. Leur biodiversité, leur répartition spatio-temporelle et la spécificité de leur interaction avec leurs termites hôtes restent jusqu'ici à établir. Après la présentation du milieu d'étude et un état des connaissances sur les termites champignonnistes et les champignons du genre Termitomyces, nous aborderons la partie relative au matériel utilisé, d'une part, et à la méthodologie ayant servi à la réalisation de travaux de terrain et de laboratoire, d'autre part.

37 Ginëral,tès

Tableau Ifl : Classification des différentes espèces de termites champignonnistes de la région de Lamto selon Josens (1972); Konaté (1998) et Dosso et al., (2010).

Famille Sous famille Esp_èces Termitidae Macrotermitinae Acanthotermes acanthothorax (Sjôsted) Ancistrotermes cavithorax (Sjôsted) Ancistrotermes crucifer (Silvestri) Ancistrotermes guineensis (Silvestri) Macrotermes (Holmgren) Macrotermes subhyalinus (Rambur) Megaprotermes giffardi (Silvestri) Microtermes toumodiensis (Grassé) Odontotermes bomaensis (Sjosted) Odontotermes aff. çauperans (Silvestri) Odontotermes smeathmani (Fuller) Odontotermes spA Protermes minutus (Grassé) Pseudacanthotermes militaris (Hagen) Pseudacanthotermes minor (Sjësted) Pseudacanthotermes spiniger (Sjôsted)

38 DEUXIEME PARTIE :

MATERIEL ET METHODES Maténel et méthodes

CHAPITRE 3 : MATERIEL

3.1/ Matériel biologique

Le matériel biologique utilisé dans notre étude est constitué :

• de plantes ligneuses de la zone d'étude ; • de sporophores et de mycotêtes des champignons du genre Termitomyces et • de termites des castes de soldats et d'ouvriers pour les identifications et les analyses moléculaires, d'une part, et d'imagos sexués (ailés) au laboratoire, d'autre part.

3.2/ Matériel technique 3.2.1/ Matériel de terrain

La collecte des données et des spécimens biologiques sur le terrain et leur conditionnement au laboratoire ont nécessité :

• un GPS Garmin 76, pour relever les coordonnées géographiques de nos parcelles et des points de collecte de Termitomyces · • un décamètre graduée de 100 m de long pour la mise en place des transects et des quadrats · • une boussole de visée pour la mise en place des traasects lors de la collecte des termites · • un appareil photographique numérique Olympus µ 725 SW, 7.1 Megapixel pour les photographies présentées dans ce document· • des plaques métalliques pour l'étiquetage des buttes termitiques dans les sites · • du matériel de creusée de sol constitué de houes, de pioches et de pelles utilisés lors des ouvertures de buttes termitiques et le prélèvement et la fouille des monolithes · • une tarière pour le prélèvement stratifié des échantillons de sol · • de l'éthanol pour la collecte in situ et la conservation des termites, des sporophores et des mycotêtes de champignons. Les échantillons prévus pour les analyses moléculaires et phylogénétiques ont été conservés dans de l'éthanol à 100 % tandis que ceux destinés à la morphométrie (identification morphologique). l'ont été dans de l'éthanol dilué à 70 % et • des tubes Eppendorf de 0,5 ml de volume pour la collecte des termites et des mycotêtes de Termi tomyces.

39 Matériel et méthodes

3.2.2/ Matériel de laboratoire

3.2.2.1/ ldentificatioo et conservation des spécimens

L'identification et la conservation des spécimens biologiques ont nécessité :

• une trousse à dissection contenant des pinces (souples et durs), des lames et ciseaux utilisée pendant l'identification des termites · • une loupe binoculaire Leica MZ6, dotée d'un micromètre pour l'identification morphologique des spécimens de termites · • un microscope photonique Nikon ECLIPSE ElOO pour l'observation des caractères microscopiques des sporophores de Termitomyces ; • une étuve pour le séchage des échantillons de sol lors des mesures de l'humidité pondérale, mais également pour le séchage des feuilles de Borassus aethiopum (Mart.) pour nourrir les colonies de termites en élevage · • une balance de précision 10-2 pour la pesée des échantillons de sol lors de la détermination de l'humidité pondérale, mais également pour la mesure du poids sec des meules de termites champignonnistes · • des bocaux en verre de différents volumes (0,5 1; 1 1 ; 1,5 l et 2 1) pour la collection humide de sporophores de Termitomyces · • d'anciens journaux pour la collection sèche de sporophores de Termitomyces et le séchage des échantillons de sol et • des sachets plastiques Minigrip® de différentes tailles pour la conservation des échantillons secs de champignons.

3.2.2.2/ Analyse moléculaire

11 a été utilisé pour cette analyse :

• un therrnocycleur à tubes Eppendorf 0,2 ml de volume, de marque BIOMETRA T• personal pour la réalisation des Réactions de Polymérisation en Chaîne (PCR) ·

• un beadbeater (Silamat", ivoclar vivadent, Germany) pour le broyage des spécimens lors de l'extraction de I' AD

40 Matériel et méthodes

• des billes de zirconium (2-3 mm de diamètre), pour le broyage des spécimens lors de l'extraction del' AD"'' ·

• de 1 'azote liquide, pour congeler les spécimens biologiques dans les tubes Eppendorf avant leur broyage pour l'extraction de I' ADN ;

• deux incubateurs à tubes Eppendorf de 1,5 ml de volume (1.5 ml Termomixer Comfort), pour les incubations à 56 et 95°C lors de l'extraction de I' ADN;

• une centrifugeuse réfrigérante à tubes Eppendorf de 1,5 ml de volume, pour l'extraction et la purification de I' ADN (Biofuge pico Heraeus) ·

• deux appareils d'électrophorèses sur gel (Bio-Rad; Modèle 1000/500);

• un mixeur électrique pour la décongélation rapide et le mélange des réactifs de la PCR ;

• une balance de précision 10-4 pour la pesée de l'agarose ·

• six micropipettes (THERMO labsystems FINNP1PETTE): 100-1000 µ1; 200-1000 µ1; 20-200 µ1; 10-100 µl; 2-20 µl et 0.5-10 µl pour l'extraction, la polymérisation et la purification del' ADN des organismes·

• un four à microonde (Whirlpool PROMICRO 825) pour la préparation du gel d'agarose ;

• trois congélateurs : 4°C ( conservation des spécimens collectés avant les analyses et des produits du PCR avant leur purification), -20°C (conservation des extraits d'ADN) et - 80°C ( conservation des amorces et des produits utilisés pour les PCR) ;

• de l'agarose pour les gels d'électrophorèses·

• une hotte à flux laminaire pour la manipulation des produits toxiques et

• w1 transilluminateur (Gel Doc 2000, Biorad Inc, Italy) pour la photographie du gel d'agarose

41 Maténel et mésbodes

CHAPITRE 4 : APPROClfES METHODOLOGIQUES

4. l/ Choix des sites d'étude

Cette étude a été réalisée dans la zone de mosaïque forêt-savane au centre de la Côte d'Ivoire (Réserve de Lamto: «V» Baoulé), d'une part, et dans la zone forestière proprement dite, constituée de lambeaux de forêts semi-décidues au Sud, épargnés par la déforestation, dans département de Tiassalé, d'autre part.

Les sites situés au sein de la réserve de Lamto ont été choisis à partir des cartes de végétation existantes (Gautier, 1988). Des fragments forestiers et différents types de savanes (herbeuse, arbustive et boisée), classifiés selon Gautier (1992) ont été repérés. Une prospection de terrain a ensuite été faite, afin de constater les observations et les choix qui ont été faits à partir de la carte. La taille de chaque site a été le critère principal dans leur choix respectif. Ainsi, les sites choisis avaient une superficie strictement supérieure à 18 ha.

Des fragments forestiers de Zougoussi, une localité avoisinante de la réserve de Lamto ont également été choisis et prospectés. Les critères de choix de ces fragments forestiers ont été la taille et la capacité de production en sporophores de Termitomyces. Les choix ont été faits avec l'appui des populations locales qui connaissent mieux la localisation des fragments forestiers et leur capacité de production en carpophores de Termitomyces.

Des sites ont également été choisis dans la zone de forêts semi-décidues, à l'issue d'une enquête socio-économique (Koné, 2007). Selon les résultats de cette enquête, la productivité des sites en sporophores de Termitomyces augmente de la zone de mosaïque forêt-savane à la zone forestière. Cette enquête a permis de repérer les localités de grande production de sporophores de Termitomyces. Ces localités sont celles de Kangagnazé, Batéra et Kodimanso dans le département de Tiassalé. Leur production de sporophores de Termitomyces servent à ravitailler le marché (ville de N'Zianoua: autoroute du nord) durant la période de fructification (Koné, 2007).

Trois ilots forestiers, trois forêts galeries, une savane boisée, une savane arbustive et une savane herbeuse ont été visités dans la réserve de Larnto au cours de cette étude. Dans la localité de Zougoussi, trois ilots forestiers sont visités tandis qu'un ilot forestier a été visité dans chacune des localités de la zone de Tiassalé.

42 Matériel et méthodes

4.2/ Collecte des termites

4.2.1/ Transects linéaires

L'estimation de la diversité totale des termites a été évaluée par le protocole d'évaluation rapide (Rapid Assessement Protocol: RAP). avec l'utilisation de la méthode des transects linéaires. Cette méthode permet de faire une estimation de la diversité et de l'abondance des espèces de termites du milieu selon Eggleton et Jones (2000). Elle a consisté en la mise en place d'un transect linéaire de 100 m de long sur 2 m de large. Ce transect est subdivisé en 20 sections contiguës de 5 m x 2 m et numérotées de manière séquentielle (Figure 12). Chaque section est échantillonnée par quatre personnes préalablement entrainé pour 15 min (pour un total d'une heure de collecte par section) (Dosso et al., 2010). Dans une optique de standardisation de l'effort de récolte, les coJlecteurs ont travaillé sans interruption durant toutes les 15 min qu'ont duré leur intervention de collecte dans une section. L'échantillonnage a été basé sur la présence ou non des individus (Anderson, 1991). Dans chaque section, les collecteurs ont recherché tous les microhabitats susceptibles d'abriter de termites : 12 mottes de terre de 12 cm x 12 cm ont été creusées sur une profondeur de lO cm · les accumulations de litière et d'humus à la base des arbres et entre les contreforts de ceux-ci l'intérieur des branches mortes et brindilles, le sol et dans les branches au stade de décomposition avancé, les nids hypogés, les buttes, les placages et galléries de récolte et les nids arboricoles, à une hauteur de 2 m au dessus du sol. Lors de la collecte, la priorité a été donnée aux: soldats et aux ouvriers de termites pour les identifications futures. Les termites collectés ont été conservés dans des tubes Eppendorf de 1.5 ml de volume contenant de l'éthanol 70 % et étiquetés par numéro de section, de transect et de site. Trois transects ont ainsi été échantillonnés dans chacun des sites visités.

4.2.2/ Repérage et fouille des buttes termitiques

Des buttes termitiques épigées ont été repérées, comptées et étiquetées dans les différents sites d'étude. Dans la réserve de Lamto, neuf buttes ont été aléatoirement choisies dans chaque site pour être ouvertes. Dans la zone de N'Douci, quatre buttes ont été ouvertes par site d'étude. Chacune des buttes ainsi choisie a subi une coupe transversale partant du sommet de celle-ci jusqu'à sa base, à une profondeur de 60 cm dans le sol (Figure 13).

43 Matériel el méthodes

2m 2 mètr

"' 20 ., .,. "' .,. .,. .,. "' 19 .,. "' "' .,. "'

18

..• ... 17 ..• ' ' ' ' 16 ' ' ' ..• ..• '1 ' I

Iottes de sol de 12 cm x 12 cm x 10 cm

Section de fouille de 5 m x 2 m 5

4

3

2

1

Figure 12 : Détails d'un transect linéaire de fouille de 100 m x 2 m pour la collecte de termite.

44 Matériel et méthodes

Butte termitique avant OUYerture

Chambre à meule vide Chambre à meule contenant une meule

Figure 13 : Vue extérieure et intérieure d'une butte termitique

45 Matériel et méthodes

Cette ouverture a été faite de manière progressive, avec une fouille systématique de toutes les mottes de terre prélevée de la butte à la recherche d'individus et de meules de termites. Les individus des colonies de termites qui v ont été rencontrées ont été collectés et conservés dans de l'éthanol 100 %. Les mycotêtes ont été également prélevées sur les meules et conservées dans la même concentration d'éthanol. Les échantillons de termites et de mycotêtes ainsi obtenus et conditionnés ont été conservés au frais dans un congélateur à 4°C pour les futures analyses moléculaires et phylogénétiques.

4.3/ Collecte et identification des sporophores de Termitomyces

4.3.1/ Collecte des sporophores de Termitomyces

Tous les sites choisis dans cette étude ont fait l'objet de visites continues de janvier 2007 à décembre 2009, à raison de deux prospections par mois. Les premières et troisièmes semaines de chaque mois ont été destinées aux prospections des sites de la réserve de Lamto, tandis que les deuxièmes et quatrièmes semaines l'ont été pour les sites de la zone de Tiassalé. Au cours de ces prospections, une fouille exhaustive a été faite sur toute l'étendue du site; mais également sur les buttes termitiques préalablement étiquetées à la recherche de sporophores de Termitomyces. Des tranchées ont été réalisées (Levieux, 1967: Josens, 1972: Konaté, 1998) à chaque fois que des sporophores ont été observés jusqu'à atteindre les meules qui portent Jeurs stipes (Figure 14). Ces tranchées ont permis de collecter aussi bien les termites que les sporophores en vue de leur identification au laboratoire. Tous ces échantillons ont été étiquetés et conditionnés pour les analyses au laboratoire. La date de récolte de chaque espèce de Termitomyces a été notée. Des collections humides et sèches des sporophores de chaque espèce de Termitomyces observée sont réalisées et conservées au laboratoire. Une collection humide des échantillons des termites hôtes a été également réalisée et conservée dans le Laboratoire d'Entomologie de la Station d'Écologie de Lamto.

46 Maténel et méthodes

porophores de Iermitontvces

~---- Chambre à meule

Ieule à champignon

Figure 14: Spécimens de termites et de sporophores de Termitomyces après ouverture d'une butte tennitique.

47 Maténel el mefhodes

4.3.2/ Collecte des mycotêtes de Termitomyces

Les rnycotêtes de Termitomyces ont été récoltés par la même méthode d'ouverture de buttes termitiques que celle qui a été utilisée pour la collecte des termites. Elle a permis d'accéder aux meules des colonies de termites. Les mycotêtes prélevées ont été portées dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml de volume contenant de l'éthanol 100 % (Figure 15) et conservées dans un congélateur à 4°C, ainsi que leurs termites hôtes, pour les futures analyses moléculaires. Ces buttes renferment généralement des espèces dites sympatriques. Selon Konaté ( 1998), ces espèces sympatriques appartiennent à différents genres de termites champignonnistes et partagent la même butte (Figure 16).

4.4/ Identifications des spécimens biologiques

4.4. l/ Identification des termites

Les termites ont été identifiés jusqu'au niveau spécifique sous une loupe binoculaire Leica MZ6 au grossissement 3,2 (G=3,2), à l'aide des clés de détermination des termites africains de Bouillon et Mathot (1965, 1966 et 1971) et Webb (1961), des illustrations de Josens ( 1972) sur les termites des savanes de Lamto, des descriptions faites par Grassé ( 1984 & 1986) et de la clé d'identification des Odontotermes de la réserve de Lamto (Konaté, 1998). Ceux qui présentaient certaines ambigüités morphométriques ont été identifiés jusqu'au genre. Ces identifications ont été faites après une série de mesures réalisées sur des individus appartenant à la caste des soldats (Figure 17). Pour les termites sans soldats, l'identification a été basée sur l'observation des individus de la caste des ouvriers. En accord avec Josens (1972), les genres Ancistrotermes. Macrotermes, Microtermes. Odontotermes et Pseudacanthotermes ont été considérés comme les principaux genres de termites champignonnistes, car très répandus dans la zone d'étude. Les moins répandus ont été ceux du genre Acanthotermes, Megaprotermes et Protermes.

48 Matériel et méthodes

Pince souple stérile

Iycotêres de Termitomyces

Tube Eppendorf contenant de l'éthanol 100°0 avec des Iycotêtes déjà prélevées à sa surface

Meule à champigno Détails de la meule à champignon

Figure 15 : Technique de prélèvement de mycotêtes de Termitomyces sur une meule à champignon pour leur conservation dans des Eppendorf contenant de l'éthanol 100%.

Ieule d'A.ncistrotermes

Ieule de Macrotermes

Figure 16: Intérieur d'une butte termitique renfermant quatre genres de termites champignonnistes syrnpatriques.

49 Matériel et méthodes

LA

LO

A

Figure 17 : Morphologie générale d'un soldat de termite.

A : vue ventrale, B : vue latérale, LO : longueur de la tête, LA : largeur de la tête, TI : longueur du tibia postérieur gauche, Ant : antenne, Lg : longueur de la gula, Ga : mandibule gauche, Ab: abdomen, Th : thorax, Te: tête. Source: Konaté (1992)

50 Matériel et méthodes

4.4.2/ Identification des sporophores de Termitomyces A ce niveau, seules les sporophores ont subi une identification morphologique préalable. Les mycotêtes collectés à partir des meules des différents genres de termites étaient différents certes par leur forme et taille ; mais cela a été insuffisant pour en déduire une éparation taxonomique. Ces sporophores de Termitomyces ont donc été identifiés à l'aide des clés de Heim (1977) sur les champignons termitophiles d'Afrique Noire et d'Asie méridionale, des illustrations de Buyck (1994) sur les champignons comestibles de l'Ouest du Burundi et de la contribution de Mossebo et al., (2002) à l'étude du genre Termitomyces au Cameroun. Des descriptions macroscopiques et microscopiques de toutes les espèces récoltées ont ainsi été faites.

4.4.2.1/ Descriptions macroscopiques

Les descriptions macroscopiques des sporophores des espèces de Termitomyces ont été faites sur les échantillons frais in situ, afin de noter les caractères évanescents ou changeants lors du séchage. Ces descriptions ont concerné la taille et la couleur du sporophore, la présence ou absence de mamelon sur le sporophore, présence ou absence d'anneau sur le stipe, la couleur du stipe, la longueur du stipe, la longueur du pseudorhyze et l'odeur du sporophore.

4.4.2.2/ Réalisation des sporées

La sporée des sporophores collectés a été obtenue en recueillant les spores en masse. Ceci a permis d'observer la couleur des spores, un caractère d'une extrême importance pour la systématique des champignons ( elle peut être blanche, rosée, brun rosé, crème, jaune. verte brun rouille, brun pourpre ou même noire). Cette sporée s'obtient facilement en prenant un verre d'eau rempli à moitié et une feuille de papier blanc percée d'un trou au milieu de façon à y faire passer le pied du champignon; la feuille et le champignon sont placés sur le verre, de façon à ce que l'extrémité du pied trempe dans l'eau ; au bout de plusieurs heures. une poussière se dépose sur le papier. Il s'agit des spores, projetées par les basides et tombées à travers l'espace séparant les lamelles ou par la cavité des tubes. Pour les grands champignons

51 Matériel et méthodes

qui ne risquent pas de vite faner, le stipe est simplement coupé et écarté puis le chapeau est déposé sur un papier blanc.

4.4.2.3/ Descriptions microscopiques

Les descriptions microscopiques ont été réalisées à partir des exsiccata (matériei fongique séché). La technique a consistée à monter entre lame et lameJle, une très petite portion d'échantillon (lamelle de préférence) dans le réactif de Melzer (l'iode-ioduré) ou dan du Rouge Congo Ammoniacale. Les éléments tels que les basides, les cystides, la trame (dan le Rouge Congo), les spores et leurs ornementations (dans le Melzer) ont été décrits et illustrés comme observés dans les réactifs. Les dimensions des différents éléments observés (surtout les spores) à savoir la longueur et le diamètre ont été également notées. Ces observations ont été réalisées à l'aide d'un microscope photonique Nikon ECLIPSE EIOO.

4.5/ Collecte des variables environnementales

4.5.1/ Composition floristique

Trois quadrats de 50 m x 50 m ont été établis dans chacun des habitats (sites) prospectés. Les quadrats sont distants d'au moins 30 m les uns des autres dans le même habitat. L'inventaire a consisté à répertorier toutes les espèces de plantes ligneuses sans tenir compte de leur stade de développement. La diversité et l'abondance de ces espèces ligneuses

2 ont été déterminées dans trois sous quadrats de 10 m x 10 m (100 m ) aléatoirement choisi parmi les 25 que forme un quadrat de 50 m x 50 m. Au cours des relevés. le nom et le nombre de pieds de chaque espèce sont notés. L'herbier de la Station d'Ecologie de Lamto a été utilisé pour identifier les espèces végétales qui n'ont pas pu l'être directement sur le terrain.

4.5.2/ Collecte et analyses des échantillons de sol

Les échantillons de sol de chaque habitat ont été prélevés au centre de chacun des neuf sous quadrats dans lesquels ont été effectués les relevés de la composition floristique. A chaque point de collecte, les prélèvements ont été réalisés à l'aide d'une tarière sur trois

52 Matériel et méthodes

différentes strates : 0-20, 20-40 et 40-60 cm. Le sol ainsi collecté a été mis à sécher à l'air libre jusqu'à poids constant. Chaque échantillon a été tamisé à l'aide d'un tamis de maille 2 mm après séchage. Les sols d'une même strate collectés au sein d'un même habitat ont été ensuite mélangés afin d'obtenir un seul échantillon composite par strate.

Les analyses physico-chimiques des sols ont été réalisés au Laboratoire d' Analyse de Sol et de Végétaux (LAY ESO) de l'Institut National Polytechnique Félix Houphouët Boigny de Yamoussoukro (INP-HB). Ces analyses ont consisté en la détermination du pH-eau à l'aide d'un pH-mètre dans des suspensions (eau-sol) de sol. Ces valeurs ont été ajustées par la mesure du pH KCI selon Baize (2000). Le taux de matière organique a été déterminé par la méthode d'Anne (AFNOR, 1996), le phosphore total a été mesuré à partir de solution d'acide fluorhydrique et perchlorique (AFNOR, 1998) et le phosphore assimilable par la méthode de Rouiller et al., (1994). L'azote total et la granulométrie (argile, sable et cendre) ont été déterminés respectivement par les méthodes de Kjieldahl et Robinson (Anderson et Ingram, 1993). Les approches méthodologiques de ces analyses sont présentées dans les annexes 1, 2 et 3.

4.5.3/ Distribution spatial et saisonnière des termites champignonnistes et de leurs meules dans les nids hypogés selon un gradient de couverture végétale

Cette étude a été initiée afin de déterminer l'effet du taux de boisement (densité de ligneux), de la composition floristique (richesse spécifique de ligneux), de l'humidité du sol et de la saison sur la distribution verticale des termites champignonnistes et leurs meules à champignon. L'effet de ces paramètres environnementaux a ensuite été corrélé à la production en sporophores de Termitomyces de chaque type d'habitat. Les sites visités ont fait l'objet de fouille exhaustive durant toute l'année 2009, afin d'y vérifier la production de sporophores de Termitomyces. Quatre visites ont été faites dans chaque type d'habitat au cours des quatre saisons de l'année.

Tous les grands types d'habitats de la réserve de Lamto ont été visités :

• un ilot de forêt semi décidue au sein de la réserve (FSD) · • une galerie forestière le long du fleuve Bandaman (GF) ; • une forêt galerie (FG) ·

53 Maténel et méthodes

• une savane boisée (SB) ; • une savane arbustive (SA) et • une savane herbeuse (SH).

Les coordonnées géographiques de chaque type d'habitat ont été relevées à l'aide d'un GPS de marque Garrnin 76. Dans chaque type d'habitat, trois monolithes de 100 cm x 100 cm (TSBF modifié) ont été creusé sur une profondeur de 60 cm par saison (grande saison des pluies (GSP), petite saison sèche (PSS), petite saison des pluies (PSP), grande saison sèche(GSS)). Les trois monolithes prélevés pendant une même saison étaient distantes d'au moins 30 m les uns des autres. Le lieu de prélèvement des monolithes d'une saison a également été marqué afin d'éviter d'y revenir la saison suivante lorsque la végétation reprendrait. Les monolithes ont été fouillés par strate de 20 cm (0-20 ; 20-30 et 40-60) (Figure 18). Dans chaque strate, les termites et les meules ont été collectés. Les emballages de meules collectées et les tubes Eppendorf contenant des spécimens de leurs termites respectifs ont été rangés par habitat, monolithe, strate et genre de termite.

Les meules à champignon ont ensuite été mises à sécher à l'air libre pendant 48 heures, jusqu'à la perte totale de leur humidité pondérale. Le poids des meules collectées par strate et par genre de termite a ainsi été déterminé à l'aide d'une balance de précision 104.

Trois échantillons de sol ont également été prélevés dans chacune des trois strates du monolithe a pour déterminer l'humidité pondérale (séchage du sol à l'étuve à 105°C pendant 48 heures).

54 Matériel et méthodes

lOucm

------

------4-0-c-m------

60cm

Figure 18 : Fouille stratifiée d'un monolithe TSBF modifié (100 cm x 100 cm x 60 cm) à la recherche de termites champignonnistes et de leurs meules à champignon.

55 Matériel el méthodes

4.6/ Détermination des durées des différents stades de développement des termites champignonnistes de la zone d'étude

Les ailés des genres de termites champignonnistes les plus répandus (Ancistrotermes, Macrotermes, Microtermes, Odontotermes et Pseudacanthotermesï de la zone d'étude ont été collecté durant leur période respective d'essaimage de janvier à décembre 2008. La collecte a été réalisée à la lumière à la Station d'Ecclogie de Lamto. Les ailés ont ensuite été transférés vivant dans des bocaux contenant du sol humidifié au laboratoire. Les dates de collecte de des termites ailés ont été notées. Une identification jusqu'au niveau générique et selon le sexe a été faite sur chaque spécimen récolté. Les ailés du même genre ont été couplé dans des boites plastiques transparentes de 11 x 6 x 3 cm, sur une fine couche de sol humidifiée (Sieber & Leuthold, 1981). Cela a permis l'établissement du copularium au fond de la boîte. Les boîte ont ensuite été conservées au laboratoire à une température de 29 ± l °C. L'établissement et le développement de chaque colonie ont été observés à la base de la boîte transparente. La durée des différents stades de développement (apparition du copularium, des œufs, des premières larves, des premiers ouvriers, des premiers soldats et de la meule primordiale) de chaque boîte a été notée (annexe 4).

Cette partie ayant pour but (1) de comparer le temps nécessaire aux termites de chaque genre pour franchir leurs différents stades de développement et (2) d'établir la relation entre la période de fructification du Termitomyces des colonies matures et la mise en place de la meule primordiale (première meule) chez les colonies naissantes à l'échelle du genre, les observations ont été faites jusqu'à l'apparition de cette meule chez ces colonies naissantes. Des identifications morphologiques de soldats collectés dans les boîtes d'élevage ont été faites afin de confirmer les identifications faites à partir des ailés avant la mise en élevage.

Des feuiUes mortes de palmier rônier (Borassus aethiopum Mart.) collectées dans la savane à rônier de la réserve de Lamto ont été utilisées comme nourriture pour les colonies de termites en élevage. Ces feuilles ont préalablement été séchées dans une étuve à 45°C pendant 24 heures, découpées en très petits morceaux et portées dans les boites. dès l'observation de premiers ouvriers de la colonie de termites.

6 Matériel et méthodes

4. 7 / Identifications moléculaires et phylogénétiques des termites et des champignons

4.7.1/ Extraction d'ADN

L' ADN des termites champignonnistes a été obtenu en séparant la tête du reste du corps (abdomen et thorax). Avec du matériel stérile (sous une hotte à flux laminaire, à côté d'une flamme), la tête a été extraite et bien séchée à l'air libre sur du papier filtre pendant une dizaine de minutes. La tête d'un seul individu (soldat ou ouvrier) a été utilisée pour l'extraction de l' ADN d'une espèce. Chaque tête de termite a ainsi été placée dans un tube Eppendorf de 1,5 ml de volume et étiqueté par espèce.

Avec les sporophores et les mycotêtes de Termitomyces, l' ADN a été directement extrait à partir d'un nodule entier ou d'un fragment de 1 mm2 de sporophore. Le matériel fongique a été retiré de l'éthanol et séché sur du papier filtre pendant environ 10 minutes. Chaque mycotête ou fragment de sporophore a été ensuite placé dans un tube Eppendorf de 1,5 ml de volume. L 'ADN des organismes (termites et Termitomycesï a été extrait selon la méthode d'extraction au Chelex. Le principe et les détails de cette méthode sont présentés dans les annexes 5 et 6.

Les échantillons portés dans les tubes Eppendorf ont d'abord été congelés dans l'azote liquide et ensuite broyés une première fois à l'aide de cinq ou six billes de zirconium (2-3 mm de diamètre) pendant 10 secondes par un beadbeater (Silarnat ®, ivoclar vivadent, Germany). Les tubes Eppendorf ont été portés une seconde fois dans le liquide nitrogène pour la congélation de leur contenu et une nouvelle opération de broyage a été effectuée au beadbeater pendant 10 secondes également. Un volume de 100 µl de Chelex X-100 5 % et 10 µI Proteinase K (20 mg.ml') a été ajouté au contenu de chaque tube Eppendorf Le contenu de chaque tube a préalablement été bien agité à l'aide d'un mixer à un tube Eppendorf. Les tubes ont ensuite été centrifugés à 12000 rpm pendant 1 min à 4°C. Les tubes ont été incubé à 56°C pendant 30 min pour les échantillons de champignons et 12 h pour ceux de termites. Ils ont tous été chauffés à 95°C pendant 10 minutes et enfin centrifugés pour une dernière fois à 12000 rpm pendant 1 min.

L' ADN se trouve, de ce fait, dans le surnagent et est prêt pour usage direct ou conservation à -20°C. Toutefois, il est bon de séparer directement I' ADN du Chelex par une première dilution (1:10), à conserver à -20°C. Cette dilution peut être utilisée pour les

57 Matériel et méthodes

Réactions de Polymérisation en Chaine ou Polymerase Chain Reaction (PCR) au moment opportun.

4. 7.2/ Réaction de Polymérisation en Chaîne de I' ADN (PCR)

La Réaction de Polymérisation en Chaine ou PoJymerase Chain Reaction (PCR) (Saiki et al.. 1985) consiste à amplifier sélectivement une séquence particulière d'ADN par action répétée d'une ADN polymérase, Le but est de recopier un très grand nombre de fois in vitro une portion de séquence dont la longueur ne peut excéder 10 Kb et comprise entre deux amorces d'orientation inverse, s'hybridant chacune sur un des deux brins (Figure 19). Le procédé original de l'amplification par PCR est basé sur l'utilisation d'une enzyme ayant des propriétés particulières. Il s'agit d'une Taq ADN polymérase provenant dune archaebactérie thermophile, Thermophilus aquaticus Broek & Freeze encore appelée Thermus aquaticus. Cette polymérase présente les caractéristiques particulières d'être thermostable à 95°C et d'avoir un optimum d'activité à 72°C. Ces propriétés permettent, par des cycles de copie successifs, la multiplication du nombre de fragments d'ADN correspondant à des copies de la séquence située entre les deux amorces choisies.

Pour les Termitomyces symbiotiques, une partie du ribosome nucléaire incluant le premier Espaceur Interne Transcrit ou Internai Transcribed Spacer I (ITS1), le gène 5.8S RNA et le second Espaceur Interne Transcrit (ITS2) ont été amplifiés par des réactions de polymérisation (PCR) à l'aide d'amorces spécifiques aux Termitomyces d'une part : (ITS IFT: GTT TTC AAC CAC CTG TGC AC) en combinaison avec une amorce universelle d'autre part: (ITS4: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC) comme décrit par Aanen et al. (2007) (Figure 20). La sous unité du gène mitochondrial des termites : le Cytochrome Oxydase l (COI), a pour sa part été amplifié avec la paire d'amorces spécifiques TL1862 (TAC TTC GTA TTC GGA GCT TGA) et TH2877 (T AG GTG TCG TGT AAT ACA ATG TC).

58 Matériel et méthodes

5' 3' 3' 5'

5' :0 3' + 3' .5'

5' ~ 3' 5' 3' ------'"j"'~~~=5"''" 3•- / 5' CD

(D 5' - j' IIF==~y 3·

5' 3' 3' 3' 5' l/.,: 3' 3' ---3' + 3 5'

5' 3' 5' 3' 3• 5• 3' 5' 5' 3' 5' 3' 3' 5• 3' 5' l 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'3'- 5' 3' .. 5' 5'=-==- =~- 5'· ====3' 5'_ 3' 5'_ J' 5'_ 3' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' ===~r

Figure 19: Représentation schématique des différents cycles d'une Réaction de Polymérisation en Chaînes (PCR).

(!) Dénaturation à 95°C. (2) Hybridation à 60°C. (3) Elongation à 72°C (P=Polymérase). (4) Le premier cycle est complet. Les deux brins d'ADN résultants deviennent des matrices pour le cycle suivant, doublant ainsi la quantité d'ADN dupliquée à chaque cycle.

Source: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pcr.png (09/08/2010)

59 Matériel eJ méthodes

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 5.8S 1

_ITS.lFT ITSl ITS2

ITS4

1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200

Figure 20: Diagramme montrant la position des sites d'hybridation des amorces ITSlFT et ITS4.

60 Matériel et méthodes

L'amplification a été effectuée dans des tubes Eppendorf de 0,2 ml de volume, avec de la Taq Polymérase Ready-To-Go (Amersham, Pharmacia) dans 25 µ1 du milieu réactionnel contenant 0.125 µ1 de chaque amorce et 2 µ1 de la dilution 1 : 10 del' ADN matrice (annexe 7). L'amplification a été réalisée par un thermocyleur (Eppendorf) Biometra Tpersonal. Les conditions (températures et nombre de cycles) dépendaient de l'organisme et des couples d'amorces utilisés (Tableau IV).

A la fin de la réaction, Je résultat de l'amplification a été vérifié en déposant 5 µI de produit PCR dans les puits d'un gel d'agarose 1 %. Une migration a ensuite été réalisée dans une cuve d'électrophorèse DcodeTM Universal Mutation Detection System (BioRad) contenant un tampon TAE (40 mmol.l" Tris-acétate, 1 mrnol.1"1 EDTA pH 8) 0,5X. Celle-ci a été effectuée à 100 V pendant 40 à 45 min. Le gel a ensuite été retiré de la cuve d'électrophorèse puis photographié à l'aide d'un Transilluminator (GelDoc 2000, Biorad Inc, Italy). Les profiles des migrations ont ensuite été analysés grâce au logiciel Quantity One. Les bandes bien révélées ont été repérées et leurs produits PCR respectifs sélectionnés pour leur

purification.

Il.7.3/ Purification et séquençage

Les produits de PCR (20 µ\ de volume restants) relatifs aux bonnes bandes détectées à partir de la photographie, ont été purifiés à J'aide de kits GenElute PCR Clean-Up (Sigma). Ces produits purifiés ont ensuite été expédiés à Eurofins MWG Operon DNA Sequencing Departement (Martinsried, Allemagne), où leur séquençage a été réalisé à l'aide de faibles concentrations (2 pmol/µ1) des amorces utilisées lors des réactions de polymérisations.

61 Matériel et méthodes

Tableau IV: Conditions d'amplification par Réactions de Polymérisation en Chaîne de I' ADN (PCR).

Locus Couples Etapes Température Temps Nombre de ciblé d'amorces d'am~lification {°C} {min} cycle Dénaturation initiale 95 10 Dénaturation 95 0,5 ITS ADNr ITS lFT/ITS4 Hybridation 52-55 1 40 Elongation 72 1 Elongation finale 72 5 Dénaturation initiale 95 1 Dénaturation 95 0,5 COI ADN TL1862/TH2877 Hybridation 55-60 0,5 35 ElonBation 72 0,5 Elon~ation finale 72 5

NB: L'étape d'hybridation a nécessité la recherche de la température idéale, optimisant la qualité du résultat de la PCR pour les mycotêtes et les termites à l'échelle du genre, compte tenue de la variation de taille des parties des organismes utilisées pendant l'extraction.

62 Maténel et méthodes

CI.8/ Traitements statistiques des données

Les interactions entre les variables environnementales et les abondances de termites champignonnistes, d'une part, et l'occurrence des Termilomyces, d'autre part, ont été examinées en utilisant le logiciel CANOCO version 4.5 (www.canoco.com). Ce test a été exécuté en appliquant l'analyse de redondance ou ReDundancy Analysis (RDA) qui est fréquemment utilisé pour expliquer la distribution des espèces (terBraak et Smilauer, 2002).

La RDA est une analyse directe de gradient qui combine une analyse en composantes principales (ACP) et une régression linéaire multiple. Alors que I' ACP permet la distribution des espèces, la régression linéaire multiple établit le lien entre les différentes variables environnementales et les axes de I' ACP. Selon un modèle de réponse linéaire, la RDA permet d'obtenir une image graphique de la réponse des espèces aux variables environnementales. Au cours de cette analyse, le test de Monte-Carlo est appliqué pour évaluer la signification et la force des variables. La première variable sélectionnée par le logiciel est celle qui a la valeur propre marginale la plus élevée ; c'est-à-dire la variable environnementale qui explique le mieux la variation dans l'abondance des espèces dans les habitats (Eggleton et al., 2002). Par la suite, les variables sont testées selon l'ordre de grandeur de leurs valeurs propres conditionnelles jusqu'à ce qu'aucune d'eJJes n'explique de variation significative dans l'abondance des termites ou l'occurrence des Termitomyces. Pour tenir compte de la clarté de l'ordination et de la forte corrélation entre certaines variables, une matrice de corrélation des variables est préalablement réalisée afin d'identifier le sous-ensemble à introduire dans l'ordination, en éliminant l'une de celles qui sont fortement corrélées. Cette matrice de corrélation a été exécutée à l'aide du logiciel STATISTICA version 7.1.

Le logiciel STATISTICA version 7.1 a également servi à la comparaison des moyennes à l'aide du test U de Mann-Whitney. Ces comparaisons ont été effectuées après vérification de la variabilité des moyennes à l'aide du test de Kruskal-Wallis (ANOVA). Ces différentes comparaisons sont faites pour les biomasses de meules entre types d'habitats et aisons, d'une part, et pour les durées des différents stades de développement des colonies de termites en élevage, d'autre part.

63 Mo ténei el méthodes

4.9/ Analyses phylogénétiques

4.9.l/ Blast et placement taxonomique des séquences

Les positions taxonomiques des COI termitiques et des ITS fongiques séquencés ont été déterminées par la comparaison des séquences obtenues à celles déjà répertoriées dans la banque de gènes du National Center for Biotechnology Informations (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) à l'aide de l'option « BLAST search ». Le navigateur taxonomique du serveur a permis de retrouver l'affiliation des souches termitiques et fongiques. Les taux de similarités ont été ensuite déterminés entre les séquences isolées au cours de cette étude et celles de la GenBank qui leur sont le plus proche. Deux de ces séquences ne sont considérées comme similaires que lorsqu'elles ont un pourcentage d'homologie d'au moins 97,S %.

4.9.2/ Alignement des séquences nucléotidiques

Pour inférer toute phylogénie à l'instar des termites champignonnistes et des Termitomyces, toutes les séquences doivent être au préalable alignées. Selon Guedegbe (2010), cette étape est primordiale à l'analyse des données car d'elle dépend en partie (en plus de l'algorithme de construction phylogénétique sélectionné) de la topologie de l'arbre obtenu. Elle détermine également l'homologie des sites (Swofford et al., 1996).

Les séquences de Termitomyces (ITS) sélectionnées sont alignées à l'aide du logiciel Multiple Alignment Program for Amine Acid or nucleotide sequences (MAFFT version 6) (Katoh et al., 2005) sous l'option (L-JNS-1: iterative refinement method incorporating local pairwise alignments; gap opening penalty: 1.5 and gap extension penalty 0.14; IPAM /ir-2 scoring matrix for nucleotide sequences). Celles des termites (COI) l'ont été sous les options par défaut (no insertions/infered deletions). Les alignements ont minutieusement été vérifiés et corrigés manuellement. La matrice résultante a ensuite été vérifiée manuellement puis optimisée afin d'obtenir le meilleur alignement. Les séquences ont été refaites pour vérification quand il le fallait.

64 Matériel et méthod.

4.9.3/ Construction des arbres phylogénétiques

Une inférence statistique bayesienne a été conduite à l'aide du logiciel MrBayes version 3.0 (Huelsenbeck et Ronquist, 2001 ; Ronquist et Huelsenbeck, 2003). Cette inférence sur un paramètre est une réévaluation, grâce au théorème de MrBayes et à la lumière de nouvelles données expérimentales, de l'incertitude liée à la valeur de ce paramètre. Cette inférence est donc la démarche logique permettant de calculer ou de réviser la probabilité

d'une hypothèse.

Pour les séquences d'ADN des régions ITS de Termitomyces, le modèle de Hasegawa• Kishino-Yano (HKY+G) a été utilisé. En ce qui concerne les séquences d'ADN de la région COI des termites, le modèle« General Time-Reversible » (GTR) avec des taux de substitution des sites spécifiques (SSR, estimé séparément pour les trois positions des bases nucléotidiques) a été appliqué, comme l'indique de précédentes études, comme étant le meilleur des modèles traitant de l'évolution des séquences (Aanen et Eggleton, 2005 ; Aanen et al., 2002 ; Nobre et al., 2010). Les réglages par défaut de MrBayes ont été utilisés et les méthodes pour Markov Chain Monte Carlo (MCMC) avec une répétition comme garantie contre les faux résultats. Les premiers 103 arbres ont été délaissés, et les restants utilisés pour le calcul d'un arbre de consensuel. La fin de l'analyse des données a été confirmée par une analyse d'estimation du maximum de vraisemblance et de consistance entre des séries de l'analyse. Les séquences de la banque de gènes (GenBank) utilisées dans ces analyses ont été choisies par soucis d'inclure au moins un échantillon par clade phylogénétique de Macrotermitinae (Aanen et al., 2002 ; Nobre et al., 2010) et de couvrir de plusieurs zones biogéographiques.

Par ailleurs, une autre inférence bayesienne a été réalisée en n'utilisant rien que les échantillons dont les séquences des deux organismes symbiotiques (termite et Termitomycesy ont été disponibles (31 sur 46 colonies).

Le logiciel COMPONENT version 2.0 (Page 1993 ; Page, 1995) est utilisé pour tester la justesse de l'assemblage entre les arbres phylogénétiques des hôtes (termites) et des symbiontes (Termitomyces) à travers « l'arbre phylogénétique de réconciliation», pour la détermination de la spécificité d'interaction entre hôte et symbiote. Ce logiciel quantifie la justesse de la réconciliation des arbres des hôtes et ceux des symbiotes par trois différentes mesures : nombre de répétitions, nombre de nœuds terminaux ajoutés et le nombre de pertes

65 Matériel et méthodes

indépendantes. Cette analyse est faite à partir de 100 arbres d'hôtes générés pour comparer les résultats obtenus et les observations liées au facteur chance (Page, 1993).

4.9.4/ Diversité géographique

L'inventaire des données disponibles sur les séquences d'ADN des termites hôtes (COI) et de celles de leur champignon symbionte (ITS) par zone biogéographique a été effectué. Cet inventaire est relatif (l) au nombre de genres (2) au nombre d'haplotypes, (3) à la diversité globale moyenne d'haplotypes et (4) aux plus grandes distances entre couples (terrnite/Termitomyces) d'haplotypes. Une attention particulière a été portée sur la nature de données disponibles dans le souci de rendre l'information substantielle. Le peu de données sur les études de populations ont été couplées soit à celles d'études phylogénétiques précédentes ou à d'autres études plus spécifiques. Il ressort bien évidemment que différents efforts d'échantillonnage ont été utilisés pour acquérir ces données. Par conséquent, ces mesures qui ont été utilisées n'ont été qu'indicatives.

4.9.5/ Datation des divergences au sein des organismes symbiotiques

4.9.5.1/ Datation des divergences au sein des Termitomyces

Une sélection des représentants des principaux clades de termites hôtes et de Termitomyces symbiotiques obtenus, basée sur l'estimation des relations phylogénétiques a été réalisée, pour une analyse plus approfondie à l'aide de données de séquences additionnelles. Avec les séquences de Termitomyces disponibles, une estimation indépendante de l'âge du nœud de divergence des Agaricus selon Gelm et al., (2004) a été utilisée. Ainsi un échantillon de A. bisporus et de A campestris, c'est-à-dire des espèces appartenant à deux clades divergents; (Gelrn et al., 2004) ont été ajoutés aux autres séquences de l'analyse. Par ailleurs, le plus souvent, les méthodes de reconstruction phylogénétiques aboutissent à des arbres phylogénétiques non enracinés. Pour enraciner un arbre phylogénétique, on peut ajouter une séquence dont on sait qu'elle est beaucoup plus ancienne que toutes les autre séquences de l'analyse: c'est le « outgroup » ou « extragroup ». Par conséquent, les séquences de Chlorophyllum molybdites (Johnson & Vilgalys, 1998) ont été utilisées dans cette analyse comme outgoup.

66 Matériel et méthodes

Pour 15 des échantillons de Termitomyces et les deux Agaricus, en plus de la région l'ITS nucléaire ribosomal (gène ITSl, S.8S RNA et ITS2), deux séquences ont été déterminées: (j) les 532 paires de bases (bp) du 25S du gène de l' ARN ribosomal (nLSU• rDNA) à l'aide des amorces 25S4R et ITS4R (Aanen et al. 2002) et (ii) les 602 bp du 12S du gène mitochondrial (mtSSU-rDNA) à l'aide d'amorces universelles MSl et MS2 (White et al.. 1990). Toutefois, pour deux des échantillons les amorces spécifiques ssufwlOS et ssurev475 (Aanen et al., 2002) ont été utilisés. Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées dans J'annexe 8.

Une reconstruction phylogénétique des 15 taxons de Termitomyces sélectionnés, de séquences des deux Agaricus et de I' outgoup Chlorophyllum molybdites a été réalisée. Après alignement dans MAFFT (comme décrit ci-dessus), le modèle optimal d'évolution a été sélectionné. séparément pour chacune des trois régions de l' ADN, à l'aide de MrMODEL TEST v. 2.2 (Posada et Crandall 1998).

La divergence des Agaricus et des Chlorophyllum a été estimée par un calibrage basé sur d'autres études d'horloge moléculaire sur les champignons et des données de fossiles : 15,5 ± 3,8 ma; 32,6 ± 8,1 ma et 73,3 ± 18,1 ma (Gelm et al. 2004). Ces auteurs ayant considéré seulement la plus ancienne de ces périodes de divergence (73,3 ± 18,1 ma), comme la plus probable et vu que cette période a également été utilisée par Mikbeyev et al. (2010) pour la datation de la divergence des champignons symbiotiques des fourmis champignonnistes, nous avons procédé à trois analyses indépendantes. chacune avec l'une de trois dates possibles. Le nœud représentant la divergence des Agaricus et des Chlophyllum a été privilégiée avec une distribution normale d'âge (Moyenne (M) = 16, Déviation Standard (DS) = 2 ; M = 33 ; DS = 4 et M = 73 ; DS = 9).

4.9.5.2/ Datation des divergences des termites champignonnistes

Pour les 19 taxa de termites hôtes, en plus des 931 bp du gène mitochondrial Cytochrome Oxydase 1 (COI), deux autres séquences ont été déterminées : (i) les 684 bp du gène mitochondrial Cytochrome Oxydase 2 (COTI) à l'aide des amorces AtLeu et B-tLys comme suggéré par Brandi et al. (2007) et (ii) les 294 bp de la partie de la région nucléaire ribosomal de l'Intemal Transcribed Spacer (ITS2) à l'aide des amorces ITS2 et ITS2F comme suggéré par Jenkins et al., (2001). Comme outgoups, trois échantillons appartenant au genre

67 Matén'el et méthodes

Amitermes ont été utilisés et leur séquences déterminées comme ci-dessus. Après alignement dans MAFFT, le modèle optimal d'évolution a été sélectionné, séparément pour chacune des trois régions de I' ADN, à l'aide de MrMODELTEST v. 2.2 (Posada et Crandall, 1998).

Pour la détermination des dates de la divergence adaptative des espèces des différents taxons, l'horloge moléculaire flexible de MrBayes à approche exponentielle non corrélée, exécutée à partir du logiciel BEAST version l .5.4 (Drummond et Rambaut, 2007) a été utilisée. Pour les termites hôtes, le nœud d'Odonlolermes a été limité a un âge minimum de 7 ma suivant une distribution normale (M = 1,9, DS = 1, Limite Supérieure (LS) = 7), comme le suggère la datation du fossile d'une meule de ce genre reportée par Duringer el al., (2007). Une seconde limite de nœud a été utilisée simultanément, avec un âge minimum de 3,4 ma (Moyenne= 1,2, DS = 0,5; LS= 3,4), correspondant à l'âge du dernier ancêtre commun de Macrotermes jeanneti etM natalensis selon Darlington (2005).

Aussi bien pour l'analyse des séquences de termites hôtes que les trois analyses indépendantes de symbiotes, les données ont été limitées aux clades obtenus à partir du logiciel MrBayes et des trois recherches Markov Chain Monte Carlo (MCMC). Les analyses ont chacune été réalisées sur 10000000 de générations. La convergence a été estimée par la distribution des probabilités de vraisemblance des chaînes individuelles du logiciel Tracer vl .4 (Drummond et Rambaut, 2007). Les premiers 10 % d'arbres ont été délaissés bien avant la mise en commun des résultats à l'aide du logiciel LogCombiner vl.5.4 et la visualisation des arbres phylogénétiques obtenus.

Toute cette approche méthodologique a permis l'obtention des résultats qui seront exposés et interprétés dans la troisième partie de ce mémoire. Cette partie comporte trois chapitres relatifs aux trois hypothèses de recherche de ce travail.

68 TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSION Résultats et discussion

CHAPITRE 5: DIVERSITE ET DISTRIBUTION SPATIO-TEMPORELLE DES SPOROPHORES DE TERMITOMYCES : DETERMINISME DE LEUR FRUCTJFICATIO

5.1/ Introduction partielle Les sporophores de Termitomyces sont appréciés pour leur intérêt alimentaire et économique. Ils représentent une source de revenu spécialement pour les populations rurales à travers leur collecte et leur commercialisation. Cette grande importance socio-économique a conduit à la nécessité de connaitre les facteurs qui régulent cette fructification. chose inclispensable à leur domestication. Ce chapitre vise principalement à déterminer les facteurs biologiques et environnementaux qui gouvernent la fructification saisonnière des sporopbores de Termitomyces. Spécifiquement, cette étude a pour but (1) d'établir un état des lieux de la diversité et de la distribution spatio-temporelle des sporophores de Termitomyces de la zone d'étude, (2) d'estimer la diversité et l'abondance des termites champignonnistes hôtes, (3) d'établir la spécificité de l'interaction entre les deux taxons symbiotiques, (4) de déterminer l'effet d'une série de facteurs environnementaux, selon un gradient de types d'habitats sur l'abondance et la distribution spatiale des termites champignonnistes d'une part et l'occurrence sporophores de leurs symbiotes fongiques d'autre part et (5) de corréler des mesures de paramètres biologiques propres aux colonies naissantes de termites hôtes élevées en conditions contrôlées et la fructification du symbiote fongique de colonies matures in situ. La connaissance de ces aspects est essentielle pour une future domestication des Termitomyces.

5.2/ Résultats 5.2.1/ Diversité et distribution spatio-temporelle des sporophores de Termitomyces et de leurs termites hôtes 5.2.1.1/ Cas des termites champignonnistes Avec trois transects établis par habitat, une bonne estimation de la composition de la faune termitique a été obtenue. 16 espèces de termites champignonnistes appartenant à 8 genres ont été identifiées. Treize des 16 espèces appartiennent aux 5 principaux genres d termites champignonnistes présents dans la zone d'étude. Une liste des termites collectés

69 Résultats et discussion pendant cette étude ainsi que leur abondance est établie dans l'annexe 9. Toutefois, de sporophores de Termitomyces n'ont été trouvés associés qu'à 7 de ces espèces.

5.2.1.2/ Cas des Termitomyces Les sporophores de 4 espèces de Termitomyces ont été collectés: Temitomyces Ietestui, T. medius, T. eurhizus et T.fu/iginosus (Figure 21). Elles ont été trouvées chacune associée avec une ou deux espèces de termites champignonnistes hôtes (Tableau V). Par contre, aucun sporophore de Termitomyces n'a été observé chez Microtermes toumodiensi Macrotermes bellicosus et M subhyalinus. Les plus longues périodes de fructification ont été observées chez trois espèces de Termitomyces (T. letestui, T. medius et T. eurhizusï, entre le début et la fin de la grande saison des pluies. Seules les sporophores de Tifuliginosus ont été observés durant la petite saison des pluies. Les sporophores de T. eurhizus ont été collectés exclusivement dans la zone de mosaïque forêt-savane, tandis que ceux T' fuliginosus ne l'ont été qu'en zone de forêts semi• décidues. Quant aux sporophores de T. medius et T. letestui, ils ont été collectés dans les deux zones phytogéographiques. Les sporophores de T. letestui ont été trouvés fructifiant particulièrement en abondance durant ]es trois années de cette étude. L'Annexe 10 présente l'occurrence des espèces de Termitomyces collectées dans les différents habitats visités pendant cette étude.

5.2.2/ Connexion entre la fructification des Termitomyces et les périodes d'essaimage des colonies matures de leurs termites hôtes Les périodes d'essaimage des termites champignonnistes ont été observée fréquemment durant les deux premiers mois de la grande saison des pluies (février et mars). Les ailés de Ancistrotermes cavithorax, Macrotermes bellicosus, Macrotermes subhyalinus et Microtermes toumodiensis ont été observés durant cette période tandis que ceux de P. militaris ne l'ont été que durant la petite saison des pluies (Octobre-Novembre). Les ailé d 'A canthotermes acanthothorax n'ont pas été observés durant cette étude. Les fructifications des différentes espèces de Termitomyces ont été observées aprè l'essaimage des ailés des colonies matures de leurs termites hôtes respectifs. Termitomyces medius. T. eurhizus et T letestui ont fructifié respectivement 67,5 ± 5,59; 48,75 ± 4,14 et 81 ± 5,2 j après les périodes d'essaimage respectives des colonies matures de leur termite hôte (Tableau V).

70 Résultats et discussion

5cm

Figure 21: Sporophores de Termitomyces collectés dans les zones d'étude.

A : Termitomyces letestui ; B : Termitomyces eurhizus ; C : Termitomyces fuliginosus et D : Termitomyces mediu

71 Résultats el discussion

Tableau V: Cartographie des périodes de fructification des Termitomyces et d'essaimage des colonies matures de leur termite hôte selon la saison.

Saisons GSS GSS

Termites champignonnistes hôtes Espèces de Termitomyces symbiotes Jan Fev Mar Avr Mai Juin Juil Aoû Sep Oct Nov Déc

Pseudacanthotermes militaris I P. spiniger Termitomyces letestui (Pat.) R. Heim

Acanthotermes acanthothorax Termitomyces fuliginosus R. Heim

Ancistrotermes cavithorax I A. guinensis Termitomyces medius R. Heim & Grassé

Odontotermes aff. Pauperans I O. sp2 Termitomyces eurhizus (Berk.) R. Heim

Microtermes toumodiensis

Macrotermes bellicosus I M. subhyalinus

Les bandes noires représentent les périodes de fructification de chaque espèce de Termitomyces de chaque espèce de termite. Les bandes grises représentent les périodes d'essaimage des colonies matures de l'espèce de termite hôte. Abréviations des saisons: GSP: grande saison pluvieuse (de Février à Juillet); PSS: petite saison sèche (Août); PSP: petite saison pluvieuse (de Septembre i Novembre) et GSS: grande saison sèche (de Décembre à Janvier).

72 Résultats et discussion

5.2.3/ Connexion entre la fructification des Termitomyces et les durées des différents stades de développement des colonies établies en conditions contrôlées Une analyse de la variance à un facteur (ANOVA 1) a montré une variation significative des durées moyennes des différents stades de développement des espèces mises en élevage (N = 10), pour l'apparition des œufs (F = 22,91 ; p < 0,001), des larves (F = 42,39; p < 0,001), des premiers ouvriers (F = 20,28; p < 0,001), des premiers soldats (F = 11,13; p < 0,05) et de la meule primordiale (F = 12,19; p < 0,05). La meule primordiale est établie 115±17,5 j après l'établissement du copularium chez l'espèce A. cavithorax, 91,3 ± 3,06 j chez M. bellicosus, 120 ± 10,2 j chez Microtermes toumodiensis, 95,8 ± 6,28 j chez O. aff pauperans et 208, 1 ± 7,52 j chez P. militaris. La durée des périodes nécessaires à la mise en place de la meule primordiale a été significativement différente d'une espèce à une autre. L'espèce P. militaris a présenté le cycle biologique le plus long parmi les espèces mis en élevage. Les cycles biologiques d'A. cavithorax, Microtermes toumodiensis, d'une part. et ceux de M. bellicosus, O. aff Pauperans, d'autre part, ont également été significativement différents (Tableau VI).

5.2.4/ Distribution saisonnière des meules de termites champignonnistes selon un gradient de types d'habitats Des meules des genres Ancistrotermes, Microtermes, Odontotermes et Pseudacanthotermes ont été collectées dans tous les types d'habitats et pendant toutes les saisons. Leurs biomasses ont été élevées durant les saisons pluvieuses et faibles durant le saisons sèches (Figure 22). Une variation significative de ces biomasses entre saisons, d'une part et à travers différents types d'habitats, d'autre part, a été observée (Tableau VIT). Les savanes arbustive et herbeuse ont montré les plus faibles biomasses de meules durant toutes les saisons (Tableau VII).

73 Résultats et discussion

Tableau VI: Durées moyennes (en jours) des différents stades de développement de quelques termites champignonnistes de la région de la réserve de Lamto en Côte d'Ivoire, en condition d'élevage.

A. cavi thorax M. bellicosus M. subhyalinus M. toumodiensis 0 aff e_au2_erans P. militaris

Œufs 10,] 0 ± 3,323 16,10 ± 4, 12b 19,40 ± 0,64b 16 ± 5,38b 11,40 ± 4,68 24, 70 ± 6,68c

Premières larves 29,60 ± 4,403 20,60 ± 4,08b 61,60 ± 10,6d 31 ± 1 ac 17, 70 ± 4,30b 42,20 ± 3, 76c

Premiers ouvriers 21,10 ± 2,6811b 23,50 ± 4,30b 29,80 ± 9,80b 57 ± 2,10c 15,60 ± 0,8411 18,80 ± 2,88°

Soldats blancs 25,60 ± 5,52° 21,70 ± 2,6811 3l±llb 57 ± 1,90c 23.50 ± 1,5011 35,60 ± 4,64b

11 Meule primordiale 115,50 ± 17,70 91,90 ± 3,06b - 120±10,20° 95,80 ± 6,28b 208,10±7,52c

11. ( essaimage-fructification) 67,50 ± 5,59 48,75 ± 4,14 81 ± 5,52 - - -- -

Pour chaque stade de développement, les comparaisons ont été réalisées avec les durées moyennes des stades de développement par espèce: le valeurs suivies de la même lettre ne sont pas significativement différents (ANOVA 1: Test de Mann-Whitney), N = 10 par espèce.

Abbréviations: A. cavithorax = Ancistrotermes cavithorax , M. bellicosus = Macrotermes bellicosus ; M. subhyalinus = Macroterme subhyalinus ; M. toumodiensis = Microtermes toumodiensis ; 0 aff pauperans = Odontotermes aff pauperans : P. militaris = Pseudacanthotermes militaris

A (essaimage -fructification) correspond à la période écoulée entre les essaimages des colonies matures du termite hôte et la fructification du Termitomyces symbiotique

74 Résultats et discussion

10'> 100] And111-01er111t1 ,0 j sucrotennes -QI, 90 y .._., ~o ,_ ~ ·o ~ '"1.1 ~= 60 ~ 6(l ~ ~o =.•. 'Il ;; e ,n "':I ~o tri }I) "C•"'• M QI '1) ~ =o ~"' :: ,, IO E 10 e ~ Q 0 0 ëo = 'l. 1 ~ ,-I 1-~ 1-~ 1-~ 1-~ 1·~ 1-~ 1-~ ,-~ ,-z 1-~1~·1~-1~-1~-1A-1~-1~-1~-1~-1~-1~- ,~ O~P P~~ f~11e, d'h:11.lilal\ el ,ahOR\ Types d'habit11ts et saison

1/JO 100 Pir1utara11tho1im11, g 90 .s"': ·o .:::, ISII r=J ~o "C 12 0" J'O" 1 ; 20 a ·: 1 1 •..•.• • •. l 1 • t ~ ~ ~ 1 ~ t ~ i ~ ~ ~ ~ ~ ~

p p P)P p p P!>P

Types d'habitats cl saisons T~ pes d'habitat\ et salson Figure 22 : Biomasses des meules à champignon des genres de termites champignonnistes au cours des saisons selon un gradient de types d'habitats. Abréviations des habitats: GF: galerie forestière, FSD: forêt semi-décidue, FG : forêt galerie, SB : savane boisée, SA : savane arbustive, SH: savane herbeuse. Abréviations des saisons: GSP: grande saison pluvieuse, PSS : petite saison sèche, PSP: petite saison pluvieuse, GSS: grande saison pluvieuse.

75 Résultats et discussion

Tableau VII: Variation des masses sèches (en gramme) de meules à champignon chez les genres de termites champignonnistes de la région de Lamto à travers différents types d'habitats au cours des saisons.

Saisons Genres de termite Habitats GSP PSS PSP GSS F p Ancistrotermes GF 60,66±29,83 8,62±0,6 24,03±2,46 4,96±1.56 4,84 0,18 FSD 25,15±1,78 1, 74±0,29 15,37±0,42 12,9±0.59 8,43 0,03 FG 16,62±0,33 9,43±1,51 17,54±3,15 1,39±0.1 9,35 0,02 SB 6,3±0, 15 2,52±0,53 8,54±0,64 3,28±0.52 9,46 0,02 SA 4,92±0,44 9,83±2,7 0,09±0,06 2,07±0.6 9,09 0,005 H 0 0 0 0,91±0,37 Microtermes GF 4,48±2,7 2,65±0,22 5,34±0, 78 3,54±1,22 0,57 0,64 FSD 11,61±0,02 3,25±0,16 0 2,31±0,06 10,53 0,01 FG 1,73±0, 14 3,92±0,09 11,67±0,84 0,58±0,22 125,94 10-7 SB 6,53±0,23 4,99±0,64 3,32±0,36 3,27±0,53 8, 15 0,04 SA 0,67±0,34 9,35±2,58 2,2±0,25 0 10,16 0,01 SH 0 0 0 0 Odontotermes GF 15,15±2,43 2,81±0,1 14,21±0,48 1,6±0,17 9,46 0,02 FSD 11,42±0,35 0 0 0 10,53 0,14 FG 9, 13±0,58 3,24±0,08 0 0 10,64 0,13 SB 9,1±0,55 0 1,85±0,09 0 10,64 0,01 SA 0 5,01±0,58 3,16±0,09 0 71,95 4,10-7 SH 0 6,36±0,98 0 1,34±0,03 6,69 0,08 Pseudacanthotermes GF 40,47±0,27 4,88±0,02 16,75±1,13 0 10,53 0,01 FSD 25,17±0,8 0 0 0 10,73 0,01 FG 13,14±0,57 2,94±0,29 9,87±4,62 0 16,76 0,01 SB 3,41±0,66 7,67±0,27 6,66±1,14 0,89±0, 17 9,46 0,02 SA 1,79±0,6 6,36±1,73 6,34±0,51 5,04±0,86 4,6 0,03 SH 0 0 0 0

Abréviations des habitats : GF : galerie forestière, FSD : forêt semi-décidue, FG : forêt galerie, SB: savane boisée, SA: savane arbustive, SB : savane herbeuse.

Abréviations des saisons : GSP : grande saison pluvieuse, PSS : petite saison sèche, PSP : petite saison pluvieuse, GSS : grande saison pluvieuse.

76 Risultat.s et discussion

5.2.5/ Déterminants de la fructification des Termitomyces L'effet des variables environnementales sur l'abondance des 16 espèces de termites champignonnistes, d'une part, et l'occurrence des quatre espèces de Termitomyces collectées, d'autre part, ont été testés indépendamment. L'analyse préliminaire de la matrice de corrélation des variables environnementales a permis de sélectionner six des neuf variables mesurées pour l'analyse par redondance (Tableau VIll). Cette analyse préliminaire a permis d'éliminer une parmi deux variables dont la valeur absolue du coefficient de corrélation a été supérieure ou égal à 70 % (Irt ~ 0,7%) (Tableau VlII). Les variables telles que la richesse spécifique en ligneux, la densité de ligneux (paramètres végétaux), le pH du sol, le carbone du sol (matière organique), l'argile et le sable (texture du sol) ont donc été retenues pour l'ordination de l'analyse de redondance (RDA). Les annexes l l et 12 présentent respectivement le détail de la flore et des données analytiques relatives aux sols des sites visités pendant cette étude.

5.2.5.l/ Effet des facteurs environnementaux sur la diversité et l'abondance des termites champignonnistes L'ordination de l'abondance des espèces de termites champignonnistes dans les habitats avec les différentes variables environnementales choisies a donné une valeur propre de 0,25 pour le premier axe et 0, 15 pour le second, alors que de faibles valeurs propres ont été obtenues pour le troisième et le quatrième axe (respectivement 0,09 et 0,02) (Tableau IX). Toutefois, tous ces axes ont montré une forte corrélation avec les variables environnementales incluses dans cette ordination. Par ailleurs, une seule variable environnementale (la Richesse spécifique en Ligneux : RSL) explique de manière significative les variations des abondances des termites champignonnistes dans les différents habitats (Test de permutation de Monte• Carlo: F = 2,83; p < 0,01 (Figure 23)).

77 Résultats et discussion

Tableau VIIl: Matrice d'autocorrélation des paramètres environnementaux utilisés dans l'analyse canonique (RDA).

Limon Sable Rsp eHeau eHKcl Carbone Azote P-total P-as Potassium Argile gr fin Densité Lig Canoe• pH eau 1,00 pHKcl 0,98 1,00 Carbone -0,59 -0,49 1,00 Azote -0,51 -0,41 0,97 1,00 P- total -0,70 -0,67 0,58 0,45 1,00 P-as -0,71 -0,68 0,61 0,47 0,99 1,00 Potassium 0,46 0,53 -0,23 -0,23 -0,13 -0,11 1,00 Argile 0,25 0,29 -0,23 -0,21 -0, 11 -0, 13 0,01 1,00 Limon gr -0,71 -0,63 0,66 0,55 0,65 0,68 -0,25 -0,05 1,00 Sable fin 0,74 0,66 -0,74 -0,64 -0,69 -0,71 0,31 0,05 -0,97 1,00 Densité -0,20 -0,09 0,29 0,20 0,33 0,34 0,26 -0,19 0,57 -0,46 1,00 R sp Lig -0,46 -0,38 0,51 0,55 0,27 0,29 -0,02 -0,34 0,27 -0,38 0,10 1,00 Canop_ée -0,43 -0,36 0,44 0,49 0,36 0,36 0,01 -0,53 0,19 -0,26 0,32 0,80 1,00

Les valeurs en gras indiquent les cas où les coefficients de corrélation sont hautement significatifs, c'est à dire pour p < 0,001.

Listes des Abréviations : Pstotal : Phosphore totale; P-as : Phosphore assimilable ; Limon gr : Limon grossier; Densité: Densité de plantes ligneuses; R sp Lig : richesse spécifique en plantes ligneuses; Canopée: Aspect de la canopée.

78 Résultats et discussion

Tableau IX: Résumé statistique de l'analyse canonique (RDA) entre les abondance d'espèces de termites champignonnistes et les variables environnementales.

Axes 1 2 3 4

Valeurs propres 0,23 0,15 0,08 0.02

Corrélation espèces-variables environnementales 0,92 0,84 0,73 0.71 Taux cumulé de la variance des données d'espèces: 23,90 39,60 48,30 51,20 Taux cumulé de la variance de la relation entre espèces-variables environnementales : 45,00 74,70 91,10 96,50 Somme des valeurs propres: 1,00 Somme de toutes les valeurs propres canoniques: 0,53

~1 m.i n ~ su. b pl'.O T opaup O. fPA •

• Acan

• O. spi CO • Q. sp2 pHeou 0 1 cal' roT1111 -1.0 1.0

Figure 23: Diagramme d'ordination de l'analyse de redondance (RDA) entre les abondances d'espèces de termites champignonnistes et les variables environnementales (données avecles flêches). Abbreviations des espèces : Acan : Acanthotermes acanthothorax ; cav : Ancistrotermes cavithorax ; crue: Ancistrotermes crucifer ; gui: Ancistrotermes guinensis ; bel: Macrotermes bellicosus; sub: Macrotermes subhialinus ; opaup: Odontotermes cif Pauperans ; O. spl iOdonuuermes spl ; O. sp2: Odontotermes sp2; prot: Protermes minutus ; min : Pseudacanthotermes a.ff. Minar ; mil : Pseudacanthotermes militaris ; spin : Pseudacanthotermes off. spiniger ; gif: Megaprotermes giffardii ; toum: Microtermes toumodiensis. Abbreviations des variables environnementales : C : carbone du sol : DL: densité de ligneux; RSL: richesse spécifique en ligneux.

79 Résultats et discussion

5.2.5.2/ Effet des facteurs environnementaux sur l'occurrence des sporophores de Termitomyces L'ordination (RDA) de l'occurrence des espèces de Termitomyces dans les habitats avec les différentes variables environnementales choisies (annexe 6) a donnée une valeur propre de 0,54 pour le premier axe et 0,21 pour le quatrième, alors que de faibles valeur propres ont été obtenues pour le deuxième et le troisième axe (respectivement 0, 12 et 0,002) (Tableau X). Toutefois, tous ces axes ont montré une forte corrélation avec les variable environnementales incluses dans cette ordination. Par ailleurs, une seule variable environnementale (la Richesse spécifique en Ligneux: RSL) expliquent de manière significative les variations de l'occurrence des Termitomyces dans les différents habitats (Test de permutation de Monte-Carlo : F = 4,56 ; p = 0,01 (Figure 24)). Le coefficient de corrélation entre l'abondance des termites d'une part et l'occurrence des Termitomyces d'autre part avec les variables environnementales a été estimée par le cosinus de l'angle formée par les vecteurs respectifs de l'espèce (termite ou champignon) et celui de la variable environnementale. Ainsi, les espèces de termites A. acanthothorax. P. spiniger et M. subhyalinus ont été trouvées positivement corrélées avec la richesse spécifique des habitats en ligneux (RSL), ce qui n'a pas été le cas avec P. militaris, A. guinenesis et O. aff. pauperans. Cette même corrélation de l'occurrence des Termitomyces et des variables environnementales a été trouvée positive dans un ordre ascendant de significativité pour les espèces de champignon T. letestui, T. medius et Tifuliginosus avec la même variable que dans le cas des termites. Par contre. cette observation ne s'est pas avérée juste en ce qui concerne 1 'espèce T. eurhizus.

80 Résultats et discussion

Tableau X: Résumé statistique de l'analyse canonique (RDA) entre l'occurrence d'espèces de Termitomyces et les variables environnementales.

Axes 1 2 3 4 Valeurs propres 0,54 0,12 0,002 0.21

Corrélation espèces-variables environnementales 0,95 0,65 0,145 0,00

Taux cumulé de la variance des données d'espèces: 54,10 66,40 66,70 88,10 Taux cumulé de la variance de la relation entre espèces-variables environnementales : 81,10 99,60 100,0 0,0

Sommes des valeurs propres: 1,00

Somme de toutes ]es valeurs propres canoniques: 0,66

CO T. mediu 0 •

• T. fulig CO 0 '.Argile 1 -1.0 1.0

Figure 24: Diagramme d'ordination de l'analyse de redondance (RDA) entre l'occurrence d'espèces de Termitomyces et les variables environnementales (données avec les tlêches).

Abbreviations des espèces : T. mediu : Termitomyces medius ; T. letes : Termitomyces Ietestui ; T. eurhi : Termitomyces eurhizus and T. fulig : Termitomyces fuliginosus.

Abbreviations des variables environnementales: C: carbone du sol ; DL : densité de ligneux ; RSL : richesse spécifique en ligneux.

81 Résultats et discussion

5.3/ Discussion 5.3.1/ Diversité des Termitomyces et de leurs termites hôtes Les résultats obtenus indiquent que la fructification saisonnière d'une espèce de Termitomyces est fortement dépendante de l'espèce de termite hôte. Seuls les sporophores de Termitomyces associés aux termites utilisant la transmission horizontale de leur symbiote fongique d'une génération à une autre ont été collectés dans la zone d'étude. Il s'agit des espèces Pseudacanthotermes militaris, P. spiniger, Ancistrotermes guinensis, A. cavithorax

Acanthotermes acanthothorax, Odontotermes aff. pauperans et O. sp2. Johnson el al. (1981) ont suggéré que pour l'inoculation de leur meule primordiale. les colonies naissantes utilisant le mode de transmission horizontale dépendent des spores des sporophores émanant des buttes des colonies matures (c'est-à-dire ceux produisant des ailés). Par contre, les ailés de termites à transmission verticale (Microtermes toumodiensis et Macrotermes bellicosus dans cette étude), transportent les conidies de leur champignon symbiotique dans leur intestin pour l'inoculation future de leur meule primordiale. En effet, selon Korb et Aanen (2003) dans la majorité des associations Macrotermitinae-Termitomyces. la transmission horizontale du symbiote fongique est la plus répandue. Durant cette étude, les sporophores du champignon symbiotique de Macrotermes subhyalinus qui utilise certes la transmission horizontale n'ont pas été collectés. Johnson et al. (1981) ont montré une rareté des sporophores du champignon ymbiotique de cette espèce de termite. Les sporophores de trois espèces de Termitomyces ont été collectées par zone phytogéographique. Ceux du Termitomyces associé au genre de termite Odontotermes (T eurhizus) ont été observés exclusivement dans la zone de mosaïque forêt-savane tandis que ceux associés à l'espèce de termite Acanthotermes acanthothorax (T fuliginosusï ne l'ont été que dans la zone de forêts semi-décidues. L'exclusivité de la présence de T. fultginosus dan la zone forestière pourrait être liée à l'écologie de son termite hôte, qui selon Aanen et Eggleton (2005) est un termite exclusivement inféodé a ce type d'écosystème. Il en est de même pour certaines espèces de Termitomyces telles que T microcarpus et T striatus respectivement collectées et décrites par Ducousso et al. (1999) et Kouassi et al. (2007) au Centre-Ouest et au Nord-Est de la Côte d'Ivoire et qui n'ont jamais été observés pendant cette étude. Il ressort donc que la distribution spatiale des zones de fructification des Termitomyces pourrait être définie, d'une part, par l'écologie de leurs termites hôtes et, d'autre part, par le microclimat des types d'habitats rencontrés dans chaque zone phytogéographique.

82 Résultats et discussion

De toutes les espèces de Termitomyces collectées, seule Termitomyces letestui a été observée par Heim (1977) en Guinée (Kindia), en Côte d'Ivoire (Tonkui), au Cameroun et au Congo. Cette espèce a également été récoltée dans les deux zones phytogéographiques durant cette étude. Les espèces T. medius, T. eurhizus et T. fuliginosus ont été signalés pour la première fois en Côte d'Ivoire à travers cette étude. Avec 16 espèces appartenant à 8 des 11 genres de Macrotermitinae décrits, une bonne composition de la richesse générique en termites champignonnistes a été observée, reflétant ainsi l'origine biogéographique africaine de ces organismes comme l'ont suggéré Aanen et Eggleton (2005). La symbiose entretenue par les termites champignonnistes avec les Termitomyces serait originaire de ce continent, où la plus grande diversité générique et spécifique est donc supposée présente (Vavilov, 1927). Les abondances de la majorité des principaux genres de termites champignonnistes de la zone d'étude n'ont pas été affectées par la variabilité des habitats, probablement à cause de leur grande plasticité écologique. En effet, selon Josens ( I 977) cette plasticité écologique des termites champignonnistes est basée plus sur l'adaptabilité de leur nid à travers les habitat que sur leur adaptabilité physiologique. Des exceptions ont, cependant, été observées avec les espèces P. spiniger et M. subhyalinus rencontrés particulièrement dans les milieux boisés et leur abondance relative significativement liées à la richesse spécifique en plantes ligneuses des habitats. Cela pourrait s'expliquer par le fait que ces espèces soient capables de se nourrir à partir d'un choix varié de litière arbustive (Josens, 1974). Toutefois, à l'échelle du genre, le choix des habitats par les termites champignonnistes semblent être très flexible. En ce qui concerne les Termitomyces, les conditions de leur croissance sont réunies par le microclimat de la butte termitique. Toutefois, leur fructification saisonnière serait plus sélective quant au type d'habitat dans lequel se trouve la butte du termite hôte. Plusieurs termites champignonnistes se retrouvent aussi bien en forêt qu'en savane, probablement due aux colonisations répétées des savanes par plusieurs genres (Aanen et Eggleton, 2005) et à la relation de symbiotique qu'ils ont adoptés au cours de leur évolution avec les Termitomyces (Abe et Higashi, 2001 ; Eggleton, 2000).

5.3.2/ Effet des paramètres biologiques et environnementaux sur la diversité et la distribution des termites champignonnistes et leurs champignons symbiotiques Les premiers sporophores de l'espèce Termitomyces letestui sont apparus une à deux semaines après les premières pluies du mois de Janvier. Ceux des espèces T. medius et T.

83 Résultats et discussion

urhizus ont respectivement été observés au cours des troisième et cinquième mois de la grande saison des pluies. Au contraire, les sporophores de l'espèce T fuliginosus, ont été observé durant le dernier mois de la petite saison pluvieuse. U découle de cette divergence des périodes respectives de fructification des espèces que les pluies ne constituent pas les seules déclencheuses du phénomène de fructification saisonnière. Il existe également des chevauchements dans les phénologies des espèces de Termitomyces dont les sporophores ont été collectés. Les périodes de fructification des espèces T Ietestui et T. médius chevauchent en avril tandis que celles de T medius et T eurhizus Je sont en juin. L'inexistence de ce périodes de chevauchement pourrait être considérée comme un choix des termites hôtes, leur permettant une reconnaissance plus aisée et plus simple des spores de leur champignon symbiotique respectif En effet, l'occurrence des sporophores de Termitomyces est un phénomène annuel et cyclique. Le déclenchement de la fructification pourrait être engendré par des effets directs ou indirects selon les besoins des termites en nourriture (meules et mycotêtes). Cela pourrait être dû à l'essaimage provoqué par la pluie. avec des différences spécifiques selon les genres de termites, au regard de sa période et de sa fréquence. La théorie selon laquelle il existerait une connexion entre (i) l'essaimage chez une colonie mature d'une espèce de termite donnée, (ü) la fructification de son Termitomyces symbiotique et (w) Ja période à laquelle les colonies naissantes de la même espèce produisent leur meule primordiale et/ou leurs premiers ouvriers se trouverait ainsi confirmée. L'essaimage se produisant selon un rythme annuel, une grande quantité d'imagos sexués (ailés) serait certainement prête avant les premières pluies. Ces ailés essaiment après les premières grande pluies. La pluie est probablement nécessaire pour faciliter la réalisation des copulariums par Jes couples d'ailés, car elle fournit l'humidité nécessaire au sol. Par ailleurs, avec l'essaimage, la consommation des mycotêtes du champignon symbiotique baisse considérablement. Certaines des mycotêtes ainsi épargnées par la consommation de leurs termites hôte pourraient donc croitre et fructifier si les conditions externes sont réunies. La fructification des Termitomyces est restreinte aux habitats boisés, bien que Jeurs termites hôtes (à l'échelle du genre) soient très répandus. L'abondance des termites champignonnistes et l'occurrence de leurs champignons symbiotiques sont significativement corrélés à la richesse spécifique en plantes ligneuses. Eggleton (2000) a signalé également que la plus grande richesse générique des termites champignonnistes se rencontre dans les forêts d'Afrique de l'Ouest et du Centre.

84 Résultats et discussion

Les biomasses moyennes de meules par genre de termite sont dépendantes des saisons et montrent une variation significative entre les types d'habitats. Les fortes biomasses qui ont été observées dans les habitats ayant une grande richesse spécifique en ligneux pourraient être due à la grande disponibilité de la litière arbustive de ces milieux. Généralement. les forte biomasses de meules observées durant les saisons pluvieuses représentent les provisions faites durant les précédentes saisons sèches comme l'a suggère Gillon (1983). Une diminution des activités de récolte durant les saisons pluvieuses conduirait alors à une importante consommation de ces meules stockées durant les saisons sèches. En somme. le flux sortant d'ailés engendré par l'essaimage, réduirait considérablement les besoins alimentaire de la colonie. Toutefois. les détails du comportement du reste de la colonie après l'essaimage demeure peu étudié et l'utiJisation faite des meules restantes reste à déterminer. Cette logique est contraire à nos résultats (faibles biomasses durant les saisons sèches). Cette contradiction pourrait être liée à la période d'exécution de nos travaux de terrain. En effet. toutes les collectes de meules ont été réalisées à chaque mi-saison, ne permettant pas d'estimer l'effet exacte de chaque saison sur la distribution spatio-temporelle des meules des genres de termites respectifs. Selon Wood et Sands (1978), les essaimages sont synchrones et induisent une réduction de près de 40 % de la population de la colonie, conduisant à une faible pression sur les stocks de ressources alimentaires. Cette suggestion est confirmée par la version modifiée de fructification de l'espèce Termitomyces microcarpus, associée à certaines espèces de termites du genre Odontotermes. Ce champignon produit une pile de sporophores de petite tailles (environ 2 cm de diamètre). Il fructifie sur les fragments de meules éjectés du nid du termite hôte lors de l'opération de nettoyage. En effet, cela suggère comme l'a indiqué Coaton (1961) un changement de comportement du termite hôte pour l'induction de la fructification saisonnière du partenaire fongique. Quel que soit le mode de transmission du symbiote fongique, la meule primordiale est établie par toutes les colonies élevées en conditions contrôlées. Toutefois, le problème qui demeure est l'infestation de cette meule avec le champignon symbiotique. Comme l'ont indiqué Johnson et al. (1981) et plusieurs autres auteurs (Grassé et Noirot, 1955; Sands, 1960), toutes les espèces de termites champignonnistes à transmission horizontale. élevées en conditions contrôlées parviennent à établir une meule primordiale. Toutefois. cette meule semble ne jamais être inoculée avec un champignon symbiotique viable. Par contre, cette

85 Résultats et discussion

inoculation est réalisée avec les espèces de termites à transmission verticale. Au cours de cette étude, seule l'établissement de la meule primordiale a été vérifié dans les colonies. Avec l'établissement d'un parallèle entre le temps nécessaire pour la mise en place de meules primordiales et la fructification du partenaire fongique de leurs colonies matures, il ressort que la première génération d'ouvriers apparait dans les colonies naissantes durant la période de fructification du champignon chez les colonies matures. Les sporophores sont observés spécifiquement 67,5 ± 5,59; 48,75 ± 4,14 et 81 ± 5,52jours après les essaimages de leur termites hôtes (respectivement A. cavithorax, O. off Pauperans et P. militaris). Cette ynchronisation entre (i) la fructification du partenaire fongique des colonies matures, (ii) la confection de la meule primordiale et (iii) l'apparition de la première génération d'ouvriers des colonies naissantes semble avoir pour but l'acquisition des spores du symbiote fongique respectif par les ouvriers des colonies dans leur environnement immédiat. Cela pour l'inoculation de la meule et la pérennisation du mode de transmission horizontale. Cette synchronisation est par exemple, bien illustrée chez l'espèce Pseudacanthotermes militaris. Chez cette espèce les essaimages sont d'abords observés durant la petite saison pluvieuse (octobre-novembre). La fructification du symbiote fongique de leurs colonies matures a lieu ensuite durant la grande saison des pluies (février-juillet). Enfin, elle comporte les plus long stades de développement. Cette synchronisation apparait, par conséquent. comme la raison ou la conséquence de la longue période entre l'essaimage des ailés des colonies matures et la fructification de leur symbiontes fongiques. Toutefois, ces observations peuvent ne pa refléter les conditions naturelles. Les conditions expérimentales pourraient avoir favorisée certaines espèces de termites par rapport à d'autres, vu qu'elles n'ont pas les mêmes besoins alimentaires et écologiques. Il est, par ailleurs, connu que certains haplotypes de Termitomyces sont quelques foi partagés par des espèces, voire des genres de termites adoptant différents modes de transmission des spores fongiques. Toutefois, la fructification du Termitomyces ne s'observe que chez l'espèce ou le genre de termite à transmission horizontale: c'est le cas du genre Microtermes et Ancistrotermes (Aanen et al., 2002; Nobre et al., 2010). Cette observation montre que la spécificité de l'interaction termite-champignon à l'échelle du genre pourrait être la raison principale de la fructification du Termitomyces chez certaines espèces de Macrotermitinae. En effet, le rôle exact du champignon symbiotique chez chaque espèce pourrait en être l'explication principale. Vu que ce rôle semble être différent d'un genre de termite à un autre (Hyodo et al., 2003 ; Reuland-Lefèvre et al., 1991 ; Bignell, 2000 ·

86 Résultats et discussion

Ohk:uma, 2003). Les besoins aJimentaires des termites en fonction du genre, voire de l'espèce, et les attentes anthropocentriques du termite vis-à-vis du champignon symbiotique pour combler ces besoins pourraient être les facteurs principaux expliquant la spécificité de l'interaction observée, d'une part, et la fructification du partenaire fongique, d'autre part.

5.4/ Conclusion partielle Les sporopbores de 4 espèces de Termitomyces et 16 espèces de termites champignonnistes ont été collectées dans la zone d'étude. Ces sporophores sont produit durant les saisons pluvieuses (petite et grande), avec des périodes spécifiques à chaque genre, voire chaque espèce de termite. Les Macrotermitinae hôtes dont les sporophores du symbiote fongique sont observées sont ceux utilisant le mode de transmission horizontale des spores de leur partenaire fongique d'une génération à une autre. Les résultats montrent que la distribution spatio-temporelle des meules à champignon des principaux genres de termites champignonnistes de la zone d'étude est significativement corrélée au type d'habitat et à la saison. Par ailleurs, il ressort que les périodes (1) de fructification de chaque espèce de Termitomyces, (2) d'essaimage des colonies matures de leurs termites hôtes et (3) d'apparition des premiers ouvriers des colonies naissantes de leur termites hôtes respectifs, sont synchronisés pour le maintien de la symbiose. La présence saisonnière des sporophores de Termitomyces dans les habitats a enfin été trouvée significativement liée à la richesse spécifique de ceux-ci en plantes ligneuses. En somme, la fructification des Termitomyces est un phénomène annuel cyclique qui serait régulé par : • l'écologie du termite hôte à travers la zone phytogéographique en général et l'habitat particulier dans lequel celui-ci vit · • la biologie du termite hôte à travers (a) le mode de transfert de son champignon symbiotique d'une génération à une autre et (b) une synchronisation de certains stades de développement de ses colonies aussi bien matures que naissantes avec ceux de son symbiote fongique ; • le climat à travers les successions saisonnières.

87 Résultats el discussion

CHAPlTRE 6 : DISTRIBUTION BIOGEOGRAPIDQUE D.ES PARTENAIRES SYMBIOTIQUES ET DETERMlNA TION DU CENTRE D'ORlGINE EXCLUSIF ET DE DIVERSITE DE LA SYMlUOSE

6. l/ Introduction partielle Le chapitre précédent a permis de déterminer la diversité et la distribution spatio• temporelle des sporophores de Termitomyces dans les zones de la réserve de Lamto (Centre) et de Tiassalé (Sud) en Côte d'Ivoire. Toutefois, seuls les Termitomyces fructifiant et leurs termites hôtes ont été collectés et étudiés à l'aide de techniques d'identifications morphologiques. Pourtant, ces fructifications saisonnières n'ont pas été observées chez toutes les espèces de Termitomyces. Cependant, des mycotêtes des champignons symbiotiques collectées sur les meules de leurs espèces de termites champignonnistes hôtes permettront de déterminer la diversité génétique fongique de chaque nid de termites champignonnistes visité au cours de cette étude à travers les techniques de la biologie moléculaire. Les sporophores de Termitomyces collectés et décrits précédemment, les rnycotêtes et leurs termites hôtes respectifs ont fait l'objet d'études moléculaires et phylogénétiques afin (i) d'en déduire leur diversité génétique totale, (ii) la spécificité de l'interaction entre hôtes et symbiontes et (iii) d'établir l'histoire évolutive que ces partenaires symbiotiques entretiennent. Toutes ces données ont ensuite été comparées à celles des autres zones de distribution géographique de ces organismes symbiotiques, pour en ressortir l'origine biogéographique régionale exclusive de la symbiose sur le continent africain. Cela a été réalisé à travers le test de l'hypothèse de la théorie octroyant au centre d'origine de la symbiose termite• Termitomyces la possibilité d'en être le centre de leur diversité génétique.

6.2/ Résultats 6.2.1/ Blast et placement taxonomique des séquences Dans la réserve de Lamto, 34 échantillons de Termitomyces et de leurs termites hôtes ont été obtenus à partir de 7 colonies d'Ancistrotermes, 2 colonies deMacrotermes, 9 colonies de Microtermes, 6 colonies ë'Odontotermes et 7 colonies de Pseudacanthotermes. Les nids matures du genre Macrotermes ayant été difficilement observés dans cette réserve, 3 colonies de ce genre ont été collectées en dehors de ses limites. Dans le département de Tiassalé, 2 colonies d'Ancistrotermes, 2 colonies de Microtermes, 1 colonie d'Odo11101ermes et 4 colonies de Pseudacanthotermes ont été collectées avec les mycotêtes de leurs partenaires

88 Résultats et discussion

fongiques. Les échantillons ont ainsi été obtenus à partir de 46 colonies de termite champignonnistes. Les séquences d'ADN de Termitomyces (ITS) et de termites champignonnistes (COI) obtenus à partir des échantillons ont été présentées dans les tableaux XI et XII. Ces tableaux comportent : • les partenaires symbiotiques ; • les codes qui leur ont été attribués durant l'étude; • leur origine dans le cas spécifique des Termitomyces (meules ou sporophores) ·

• leur point de collecte et • les numéros d'accession (N° d' Ace.) qui leur ont été attribués après leur soumission à la

banque de gènes (NCBI). Le navigateur taxonomique du serveur de la banque de gènes du NCBI a permis de retrouver l'affiliation des souches termitiques et fongiques, confirmant en premier lieu toute les identifications morphologiques préalablement établies sur les sporophores de Termitomyces ainsi que celles des termites champignonnistes, selon un taux d'homologie au moins égal à 97,5 %. Par ailleurs, les séquences d'ADN de Termitomyces et de termites champignonniste obtenues lors de précédentes études et déjà répertoriées dans la banque de gènes de la NCBI ont également été choisis en fonction de Jeurs zones de distribution géographique (Tableaux XIII et XIV), afin de déceler leur affiliation phylogénétique. Ces Tableaux comportent, d'une part, les espèces de termites champignonnistes hôtes, le numéro d'accession à la banque de gènes (NCBI) de l'ITS de leur Termitomyces symbiotique et son origine biogéographique (Tableau XIII). D'autre part, différentes espèces de termites champignonnistes ainsi que le numéro d'accession de leur COI dans la banque de gènes et leur origine biogéographique ont également été présentés dans le tableau XIV. Ces choix ont été faits dans un souci d'inclure dans l'analyse phylogénétique au moins un représentant de chaque zone de distribution géographique, en fonction de leur disponibilité dans la banque de gène.

89 Résultats et discussion

Tableau XI: Séquences d'ADN de Termitomyces (ITS) obtenues dans cette étude

Espèces de termites champignonnistes Code Origine* Origine géographique N° d'ace. Ancistrotermes cavithorax (Sjësted) Wla M N'Douci, Côte d'Ivoire JF302810 Ancistrotermes cavithorax (Sjôsted) KlAE S Lamto, Côte d'Ivoire JF30281 l Ancistrotermes cavithorax (Sjësted) Vla M Douci, Côte d'Ivoire JF302812 Ancistrotermes guinensis (Sjësted) KlAg s Lamto, Côte d'Ivoire JF302813 Ancistrotermes sp. Bla M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Ancistrotermes sp. Gla M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Ancistrotermes sp. Nla M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Ancistrotermes sp. KlAz s Lamto, Côte d'Ivoire JF302814 Ancistrotermes sp. Qla M Lamto, Côte d'Ivoire JF302811 Ancistrotermes sp. KlAc s Lamto, Côte d'Ivoire JF302812 Macrotermes bellicosus (Smeathman) Mb] M Lamto, Côte d'Ivoire JF3028]5 Macrotermes subhyalinus (Rambur) Klm M Lamto, Côte d'Ivoire JF302816 Microtermes sp. Elmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Microtermes sp. Ulmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Microtermes sp. Mlmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302810 Microtermes jp. Vlmi M N'Douci, Côte d'Ivoire JF302817 Microtermes sp. Xlmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302811 Microtermes sp. Ylmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302811 Microtermes sp. l mi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302818 Microtermes sp. Glmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302819 Microtermes sp. Qlmi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302820 Microtermes sp. WIMi M N'Douci, Côte d'Ivoire JF30282] Microtermes sp. Blrni M Lamto, Côte d'Ivoire JF302822 Microtermes sp. KlMi M Lamto, Côte d'Ivoire JF302823 Odontotermes sp. KIOdl s Lamto, Côte d'Ivoire JF302824 Odontotermes sp. Kl0d2 s Lamto, Côte d'Ivoire JF302824 Odontotermes sp. X10 M Lamto, Côte d'Ivoire JF302824 Odonlotermes sp. ElO M Lamto, Côte d'Ivoire JF302826 Odontotermes sp. KlO M Lamto, Côte d'Ivoire JF302826 Odontotermes sp. BlO M Lamto, Côte d'Ivoire JF302825 Odontotermes sp. MIO M Lamto, Côte d'Ivoire JF302827 Pseudacanthotermes militaris (Hagen) MlP M Lamto, Côte d'Ivoire JF302812 Pseudacanthotermes militaris (Hagen) KIP M Lamto, Côte d'Ivoire JF302812 Pseudacanthotermes militaris (Hagen) KIP2 s Lamto, Côte d'Ivoire JF302812 Pseudacanthotermes sp. XlP M Lamto, Côte d'Ivoire JF302829 Pseudacanthotermes sp. ElP M Lamto, Côte d'Ivoire JF302812 Pseudacanthotermes sp. NlP M Lamto, Côte d'lvoire JF302812 Pseudacanthotermes spiniger (Sjôsted) VlP M N'Douci, Côte d'Ivoire JF302830 Pseudacanthotermes spiniger (Sjësted) UlP M N'Douci, Côte d'Ivoire JF302812 Pseudacanthotermes spiniger (Sjôsted) WlP M N'Douci. Côte d'Ivoire JF302828

Origine des séquences fongiques (M = meule, S = sporophore). Les espèces de Termitomyces dont la première lettre du code est identique proviennent de la même butte terrnitique.

90 Résultats et discussion

Tableau XII : Séquences d'ADN de termites champignonnistes (COI) obtenues dans cette étude.

Espèces de termites champignonnistes Codes Origine géographique N° d'ace. Acanthotermes acanthothorax (Sjësted) K2Aa N'Douci, Côte d'Ivoire JF302852 Ancistrotermes cavithorax (Sjosted) K2Ae Lamto, Côte d'Ivoire JF302841 Ancistrotermes cavithorax (Sjësted) W2a N'Douci, Côte d'Ivoire JF302842 Ancistrotermes cavithorax (Sjësted V2a N'Douci, Côte d'Ivoire JF302842 Ancistrotermes 5p. B2a Lamto, Côte d'Ivoire JF302843 Ancistrotermes sp. Y2a Larnto, Côte d'Ivoire JF302843 Ancistrotermes sp. K2a Lamto, Côte d'Ivoire JF302843 Ancistrotermes sp. Q2a Lamto, Côte d'Ivoire JF302841 Macrotermes bellicosus (Smeathman Mb Lamto, Côte d'Ivoire JF302840 Macrotermes subhyalinus (Rambur) K2m Lamto, Côte d'Ivoire JF302839 Macrotermes subhyalinus (Rambur) Ms Lamto, Côte d'Ivoire JF302837 Macrotermes subhyalinus (Rambur) 2m Lamto, Côte d'Ivoire JF302838 Microtermes sp. K2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302845 Microtermes sp. Y2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302845 Microtermes sp. B2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302845 Microtermes sp. M2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302845 Microtermes sp. W2mi 'Douci, Côte d'Ivoire JF302844 Microtermes sp. Q2mj Lamto, Côte d'Ivoire JF302846 Microtermes sp. G2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302848 Microtermes sp. E2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302847 Microtermes sp. X2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302849 Microtermes 5p. 2mi Lamto, Côte d'Ivoire JF302850 Odontotermes ajf. pauperans (Silvestri) Op Lamto, Côte d'Ivoire JF302834 Odontotermes sp Osp Lamto, Côte d'Ivoire JF302834 Odontotermes sp. X20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302831 Odontotermes sp. E20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302831 Odontotermes sp. P20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302831 Odontotermes sp. Y20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302833 Odontotermes sp. K20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302833 Odontotermes sp. V20 'Douci, Côte d'Ivoire JF302832 Odontotermes sp. K20d Lamto, Côte d'Ivoire JF302835 Odontotermes sp. B20 Lamto, Côte d'Ivoire JF302836 Odontotermes spA OspA Lamto, Côte d'Ivoire JF302831 Pseudacanthotermes militaris (Hagen K2P Lamto, Côte d'Ivoire JF302851 Pseudacanthotermes militaris (Hagen) K2P2 Lamto, Côte d'Ivoire JF302851 Pseudacanthotermes militaris (Hagen) M2P Lamto, Côte d'Ivoire JF302851 Pseudacanthotermes spiniger (Sjôsted) U2P N'Douci, Côte d'Ivoire JF302851 Pseudacanthotermes spiniger (Sjësted) V2P Douci, Côte d'Ivoire JF302851 Pseudacanthotermes spiniger (Sjôsted) W2P 'Douci. Côte d'Ivoire JF302851

NB : Les espèces de termites dont les premières lettres du code sont identiques proviennent de la même butte termitique.

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Tableau XIlI: Séquences d'ADN de Termitomyces (ITS) de la Banque de gènes utilisées dans l'analyse.

Termite hôte ITS Origine biogéographique Allodontotermes sp. GQ922653 Kruger National Park, Afrique du Sud Macrotermes bellicosus (Smeathman) GQ383675 Marigat, Kenya Macrotermes bellicosus (Smeathrnan) GQ922679 Kolga, 1, Sénégal Macrotermes heru. GQ383684 Kakamega, Kenya Macrotermes jeanneli (Gassé GQ383679 Kapenguira, Kenya Macrotermes michaelseni GQ383674 Salama, Kenya Macrotermes michaelseni GQ383676 Magadi, Kenya Macrotermes michae/seni GQ383680 Kajiado, Kenya Macrotermes michaelseni GQ383685 Kajiado, Kenya Macrotermes michaelseni GQ383686 Kajiado, Kenya Macrotermes natalensis (Haviland) DQ436953 Afrique du Sud Macrotermes nobilis (Sjosted) GQ922687 Afrique du Sud Microtermes sp. EF636922 PPRI,-farm, Pretoria, Afrique su Sud Microtermes sp. EF636923 Vygeboomdam, Afrique du Sud Microtermes sp. EF636926 PPRI,-farm, Pretoria, Afrique du Sud Microtermes sp. EF636927 PPRI,-farm, Pretoria, Afrique du Sud Microtermes sp. GQ383696 Kak:amega, Kenya Microtermes sp. GQ922659 Tanambao Marivorahona, Madagascar Odontotermes badius (Haviland) EF636907 PPRI,-farm, Pretoria, Afrique du Sud Odontotermes latericius (Havi land) EF636915 PPRI, -farm, Pretoria, Afrique du Sud Odontotermes latericius (Havi land) EF636919 Tambacounda, Sénégal Odontotermes latericius (Havi land) EF636920 PPRI,-farm, Pretoria, Afrique du Sud Odontotermes sp. GQ383693 Kakamega, Kenya Odontotermes sp. GQ383694 Kajiado, Kenya Odontotermes sp. GQ383695 Kajiado, Kenya Odontotermes transvalensis (Sjësted) EF636905 SABS Farm, radium, Afrique du Sud Protermes minutus (Grassé) GQ922689 SABS Farm, radium, Afrique du Sud Pseudacanthotermes spiniger (Sjësted) GQ383688 Eldoret, Kenya Pseudacanthotermes spiniger (Sjësted) GQ383690 Marigat, Kenya Synacanthotermes heterodon (Sjôsted) GQ922654 Marigat, Kenya

92 Résultats et discussion

Tableau XIV : Séquences d'ADN de termites champignonnistes (COI) de la Banque de gènes utilisées dans l'analyse.

Espèces de termites champignonnistes COI Origine biogéographique Acanthotermes acanthothorax (Sjësted) AY127732 kolfoulo Il, Cameroun Acanthotermes acanthothorax (Sjôsted) AYl27704 Mbalmayo, Cameroun A llodontotermes sp. GQ922747 Afrique du Sud A llodontotermes sp. GQ922748 Afrique du Sud Allodontotermes tenax (Silvestri) AY818085 Kenya Ancistrotermes cavithorax (Sjôsted) AYl27712 Kolda, Sénégal Ancistrotermes cavithorax (Sjësted) AY127715 Kolda, Sénégal Ancistrotermes crucifer (Sjësted) AYl27733 Nkolfoulo, Cameroun Ancistrotermes pakistanicus (Ahmad) AY818078 Kalimanta, Lndonésie Ancistrotermes pakistanicus (Ahmad) AY818079 Tong National Park, Thailand Foraminitermes valens (Holmgren) AYl27737 Mbalmayo, Cameroun Hypotermes !>p. AY818081 Karnataka, Inde Hypotermes xenotermitis (Wasmann) AY127742 Kalirnanta, Indonésie Hypoterms sp. AY818082 Kamataka, Lnde Labritermes butelreepeni (Holmgren) AYl27745 Danurn, Sabah, Malaisie Macrotermes ahmadi (Tho) AY127747 Kalimanta, Indonésie Macrotermes bellicosus (Smeathman) AY127702 Kolda, Sénégal Macrotermes bellicosus (Smeathman) AYl2771 I Kolda, Sénégal Macrotermes jeanneli (Grassé) GQ922749 Afrique du Sud Macrotermes /illjeborgi (Sjôsted) AYI27734 kolfoulo, Cameroun Macrotermes malaccensis (havi land) AY127748 Kalirnanta, Indonésie Macrotermes muelleri (Sjôsted) AYl27703 Gabon Macrotermes natalensis (Havi land) AY818067 Pretoria, Afrique du Sud Macrotermes natalensis (Havi land) AY818088 Vygeboomdam, Afrique du Sud Macrotermes nobilis (Sjësted) AYl27705 Gabon Macrotermes subhyalinus (Rambur) AY127708 Thiès, Sénégal Macrotermes subhyalinus (Rambur) AY127709 Kolda, Sénégal Macrotermes subhyalinus (Rambur) EU253856 Microtermes obsesi (Holmgren) AY818080 Tong national Park, Thailand Microtermes sp. AYl27707 Thiès, Sénégal Microtermes sp. AYl27713 Kolda, Sénégal Microtermes sp. AYI27736 Mbalmayo, Cameroun Microtermes sp. GQ922703 Madagascar Microtermes 5p. GQ922718 Madagascar Microtermes sp. GQ922730 Madagascar Microtermes sp. GQ922732 Madagascar Microtermes 5p. GQ922735 Afrique du Sud Microtermes sp. GQ922741 Afrique du Sud Microtermes sp. GQ922742 Afrique du Sud Odontotermes badius (Haviland) AY818073 Pretoria, Afrique du Sud Odontotermes billitoni (Holmgren) AY127744 Kalimanta, Indonésie Odontotermes hainanensis (Lignt) EU253857 Odontotermes javanicus (Holmgren) AYI27741 Kalimanta, Indonésie Odontotermes latericius (Haviland) AYl27714 Kolda, Sénégal Odontotermes latericius (Haviland) AYl27716 Tambacounda, Sénégal Odontotermes latericins (Haviland) AY818072 Pretoria, Afrique du Sud

93 Résultats et discussion

Suite du Tableau XIV Espèces de termites champignonnistes COI Origine biogéograpbique Odontotermes minutus (Amir) AY127738 Kalimanta, Indonésie Odontotermes nilensis (Emerson) AY127717 Tambacounda, Sénégal Odontotermes oblongatus (Holmgren) AY127739 Kalimanta, Indonésie Odonlotermes sarawakensis (Holmgren) AY127743 KaJimanta, Indonésie Odontotermes silvicolus (Roy-Noel) AY127710 Thiès, Sénégal Odontotermes sp. AY127724 Mbalmayo, Cameroun Odontotermes sp. AY127728 Mbalmayo, Cameroun Odontotermes sp. AY127740 Sri Lanka Odomotermes sp. AY127746 Cameroon Odontotermes transvalensis (Sjësted) AY818076 Pietersburg, Afrique du Sud Odontoterms sp. AY127730 Mbalrnayo, Cameroun Protermes minutus (Grassé) AY127706 Gabon Protermes propepens (Sjësted) AY127729 MbaJmayo, Cameroun Pseudacanthotermes militaris (Hagen) AY127731 Yaoundé, Cameroun Synacanthotermes heterodon (Sjësted) AY127726 Mbalmayo. Cameroun Synacanthotermes zanzibarensis (Sjosted) AY818077 Kenya

94 Résultats et discussion

6.2.2/ Analyse phylogénétique 6.2.2.1/ Analyse phylogénétique des séquences d'ITS de Termitomyces Les séquences d'ITS des échantiUons de Termitomyces symbiotiques (sporophores et mycotêtes) collectés pendant cette étude ont été analysées avec celles d'autres régions africaines (Bénin, Gabon, Kenya, Sénégal, Afrique du Sud et Madagascar) et Asiatiques. Quatre clades bien distincts ont été observé (Figure 25) : • le clade I qui regroupe la majorité des symbiotes du genre Microtermes et ceux du genre Ancistrotermes d'une part, mais également les symbiotes des genres Synacanthotermes et Allodontotermes d'autre part (clade I); • le clade II constitué de tous les Termitomyces associés au genre Macroterme • le clade III constitué des symbiotes fongiques associés aux espèces d'Odontotermes et • le clade IV regroupant les symbiotes d'espèces du genre de termite Pseudacanthotermes.

6.2.2.2/ Analyse phylogénétique des séquences de COl de termites champignonnistes Les séquences de COI des espèces de termites champignonnistes hôtes obtenues au cours de cette étude ont également été analysées avec celles issues des mêmes région africaines et asiatiques de leur champignon symbiotique. La phylogénie obtenue a été analogue à celle de précédentes analyses phylogénétiques (Figure 26). Elle montre la monophylie de tous les genres de Macroterrnitinae avec l'exception connu du genre Hypotermes. Par ailleurs, mis à part le clade distinct formé spécifiquement d'espèce Ma]gaches de Microtermes (clade I), aucune autre distribution géographique évidente na pu être déduite.

95 Résultats et discussion

1 Synacsnthothermes (GQ922654); 1 Acsnthotermes (GQ922655) 6 Ancistrotermes (GQ922656, AF321365, B1a, G1a, N1a, W1a) 6 Microtermes (EF636924, AF321376, GQ922657, E1mi, U1mi, M1mi) Microlermes (V1mi) 98 J Ancistrolermes (K1Az) 2 Ancistrotermes (K1AE, Q1a); 2 Microtermes ( X1ml, Y1mi) Microlermes (N1mi) Microtermes (G1mi) 100 Microlermes (Q1 mi) Microlermes (W1Mi) Microtermes (81 mi) 13 Microtermes (13-EF636926) ._,__ A/lodontolermes (GQ922653) 9 Microlermes (7-EF636927, GQ922661, GQ92260) ll4 Microtermes (GQ922659) ..,_ __ 14 Microtermes (4-EF636922, GQ922663-GQ922671, GQ922675) Microlermes (GQ383696), Ancislrolermes (K1Ag) sa: 4 M. m/chselseni, 1 M. subhys/inus (5-GQ383676) 1 M. jeenneli (GQ383677), 1 Macrolermes (K1m), 1 Microlermes (K1Mi) 100 M. michae/seni (GQ383674) 5 M. be/1/cosus, 1 M. herus (3-GQ383675, GQ922683-GQ92285) 98 ---- M. nobiKs (GQ922687) Il 58 2 M. beNicosus (GQ922679, GQ922680) M. michaelseni (GQ383686) 32 M. nsta/Msis (00436953) M. herus (GQ383684) M. be/ïcosus (Mb1) M. jesnnef (GQJ83S?~fu 4 O. /slericius (EF636919) 1 Lo. /stericius (EF636920) O.lnlnsvsslensis(EF636905) 88 Odonlotermes (Y10) 80 O. badius (EF36907) Odontotermes (GQ383694) 67 3 Odontolermes {K10d2, K10d1, X10) O. lstericius (EF636915) m Odontotermes (GQ383693) Odontotermes (E10, K10), O. syfvico/us (AF32137S) 100 Protermes minutus (GQ922689) Odontotermes (810) Odontotermes (GQ383695) 88 Odontotermes (M10) .._ 2 Microtermes (EF636923) .._ __ Acsnthoiermesacanthothorsx (AF321374) Pseudscantholermes (V1 P) P. spiniger (GQ383688) P. spinif}er (GQ383690) IV . Pseudscantholermes (X1P) 7 Pseudacantholermes (E1P, M1P, K1P, N1P, K1P2, U1P, GQ383692) 2 Ancistrotermes (V1a, K1Ac) Pseudacsnthotermes (W1 P) .._ Lyophyllum semits/e (AF357049)

0.1

Figure 25 : Relation phylogénétique entre les séquences des Termitomyces symbiotique collectés pendant cette étude et celles sélectionnées dans la banque de gènes de la NCBI.

La phylogénie a été enracinée à l'aide de l'espèce de champignon Lyophyllum semital. (Genbank N°. AF357049), considéré comme le outgroup. Les nombres qui surmontent les branches représentent la probabilité postérieure de MrBayes des nœuds des branches(< 50 %) et dérivent de 19500 échantillons d'arbres phylogénétiques issus du test de Markov Chain Monte Carlo. Les nombres à la droite de l'arbre phylogénétique correspondent à la subdivision des clades.

96 Résultats et discussion

I

: Il

m

: IV '

005 Figure 26 : Relation phylogénétique entre les séquences de termites champignonnistes collectés pendant cette étude et celles sélectionnées, disponibles dans la banque de gènes de la NCBI.

La phylogénie correspond à un arbre phylogénétique consensuel des différents arbres issus de l'analyse Bayesienne. Des espèces de la famille des Termitidae (Foraminitermes valens et Labritermes butelreepeni) ont servi à l'enracinement de l'arbre (Genbank N°. AY127737 et AY127745). Les nombres qui surmontent les branches représentent la probabilité postérieure de MrBayes des nœuds (< 50 %) et dérivent de 19500 échantiJlons d'arbres issus du test de Markov Chain Monte Carlo. Les nombres à la droite de l'arbre correspondent à la subdivision des clades.

97 Résultats et discussion

6.2.3/ Diversité biogéographique Le tableau XV présente une synthèse des données de séquences de COI de différents genres de Macrotermitinae et d'ITS de Termitomyces publiées par régions selon leurs zones distributions. Chez les Termitomyces, l'analyse de la diversité génétique s'est plutôt effectuée au niveau spécifique (haplotype). Notons qu'un haplotype (contraction de la locution anglaise haploid genotype ou génotype haploïde) est un groupe d'allèles de différents gènes situés côte à côte sur un même chromosome. Ils sont généralement transmis ensemble à la génération suivante et sont dits « génétiquement liés». Cependant, bien que la diversité moyenne d'haplotypes de Termitomyces soit similaire (à une exception près, celle de Madagascar), les Termitomyces d'Afrique du Sud présentent la plus grande distance par paire d' haplotypes ( entre les symbiotes de Macrotermes natalensis et un symbiote d' Odontoterme ,. latericiusy. Certains haplotypes de Termitomyces ont montrés une large distribution à travers les régions et les espèces de Macrotermitinae : un même haplotype de Termitomyces a été retrouvé en Côte d'Ivoire, au Sénégal et en Afrique du Sud, associés à différents genres de termites hôtes : Synacanthotermes, Acanthotermes, Ancistrotermes et Microtermes. Par ailleurs, d'autres haplotypes sont spécifiques à certaines régions. C'est le cas de l'haplotype du symbiote fongique de l'espèce Macrotermes natalensis, exclusivement collecté en Afrique du Sud et dans tous Jes nids visités de cette espèce. Il ressort chez les termites champignonnistes hôtes que la diversité génétique moyenne est faible. En outre, cette faible diversité est similaire entre les régions, bien que suggérant une diversité relativement grande en Afrique de l'Ouest selon les données de la présente étude (8 genres en Côte d'Ivoire).

98 Résultats et discussion

Table XV : Données disponibles sur les termites champignonnistes (COI) et leur Termitomyces symbiotiques (ITS).

Genres de Ter. Div moy 1 > distance I Références bibliographique. Cht>· totale Afrique (Ancisirotermes", Acanthotermes, Allodontermes, Macrotermes, Microtermes, Odontotermes, Protermes, Pseudacanthotermes, Synacanthotermesï Af1. del'O __ ..,_ 22 20 Côte d'Ivoire 8 0,13 0,18 0,06 0,10 Présente étude (x) (41) (41) 4 11 6 Sénégal 0,12 0,16 0.10 (l) 0,15 (Aanen el al., 2002; Rouland-Lefevre el al., 2002) (x) (10) (?) • Afri ue du Sud 4 20 20 (Aanen and Eggleton, 2005; Aanen et al., 2007: De Fine Afrique du Sud 0,11 0.15 2 0,10 0,22 (x) (23) (87) ( ) Licht et al., 2006; Nobre et al., 2010) • Afrigue Centrale 1 Gabon 1 0,10 1 0,14 1 ~')\ 0,llCIJ 1 0,14 1 (Aanen et al., 2002; Rouland-Lefevre et al., 2002 1 ~x) 1 ~3) Af1. de l'Est 6 17 23 (Aanen and Eggleton, 2005; Martenet al., 2009; Kenya 0,04 0,10 0,09 0, 14 (x) (19) ()) (39) Osiemo et al., 2010) 1 25 12 Madagascar 0,07 0.13 0,03 0,07 (Nobre et al., 2010) (1) (51) (20) Asie (Anctstrotermes, Macrotermes, Microtermes and Odontotermes**) 2 8 lndonésie 0,09 0,14 - (Aanen et al., 2002) (4) (8) - - 3 34 Thailand - 0,07 0,14 (Moriya et al., 2005, Taprab el al., 2002) (4) - - (61)

Le nombre de genres collectés (nombre total de genre références), nombre d'haplotypcs (nombre de spécimens collectés) et diversité moyenne totale d'haplotypes et la plus grande distance par paire ont été calculée avec Tarnura-Nei distance. * Ancistrotermes est un genre inféodé à la savane Africaine, toutefois, une espèce de ce genre se retrouve en Asie (Eggleton 2000). ** Cela inclus le genre Hypotermes et une espèce d'Euscaiotermes, qui n'est plus considéré comme un genre à part entière. (1) Aucune 2 référence n'est faite au nombre d'échantillons; mais plutôt que sur le nombre d'haplotypes; c > De Fine Licbt el al. (2006) se sont référé à 31 colonies de Macroterme 3 natalensis; C >Marten el al. (2009) se sont référé uniquement qu'au genreMacrotermes. La nature des études référencées dans cc tableau sont complètement différentes. avec différents objectifs et différentes efforts d'échantillonnage à l'échelle régionale. Par conséquent, cette présente comparaison n'est qu'indicative.

99 Résultats el discussion

6.3/ Discussion L'hypothèse du « centre d'origine» a été introduite par Darwin (1859) en tant que « centre de création». Elle stipule que les espèces sont originaires d'une région source et s'en dispersent pour peupler ses périphéries. La théorie octroyant le centre de la plus grande diversité générique ou spécifique à ce centre d'origine a été développée par Vavilov (1927) sur l'origine des plantes cultivées. Bien qu'il soit nécessaire de prendre en compte certaines considérations des évènements biogéographiques historiques et l'histoire évolutive des populations, le concept de centre d'origine comme centre de plus grande diversité générique ou spécifique effectivement vérifié. En effet, plusieurs études sur différents taxons ont montré que les centres d'origine sont généralement des centres de plus grande diversité génétique pour les plantes pathogènes (Banke et McDonald, 2005 ; Stukenbrock et al., 2007) et les poissons (Maran et al., 2003). Au regard de cette hypothèse, le centre d'origine de la symbiose Macrotermitinae• Termitomyces, pourrait en être le centre de plus grande diversité générique ou spécifique aussi bien pour les termites champignonnistes que pour leurs symbiotes fongiques. Les Macroterrnitinae se rencontrent sous les tropiques, dans l'ancien monde, avec la plus grande diversité en Afrique. Leurs différentes migrations « hors d'Afrique» ont déjà été clairement établies (Aanen & Eggleton, 2005), et semblent également être similaires à celles de leurs symbiotes fongiques (Nobre et al., 2010). Toutefois, aucune évidence de la distribution de cette diversité n'existait entre les différentes régions africaines. Cette étude aura permis de faire une synthèse de cette distribution. Ces résultats suggèrent clairement une grande diversité des partenaires symbiotiques dans les régions Centre et Ouest d'Afrique. Protermes, Pseudacanthotermes, Acanthotermes et Synacanthotermes sont des genres endémiques des tropiques africains. Par contre, le genre de termites Ancistrotermes est inféodé aux savanes africaines (et se retrouve en dehors des régions Centre et Ouest Africaines) tandis que Macrotermes, Odontotermes et Microtermes sont les genres les mieux répandus comme l'a indiqué Eggleton (2000). En outre, l'Afrique de l'Ouest a montré des niveaux relativement élevés de diversité moyenne et la plus grande distance par paire d'haplotypes. Toutefois, le grand effort d'échantillonnage fait en Côte d'Ivoire en comparaison aux autres régions, exception faite de Madagascar, ne doit pas être ignoré. La diversité moyenne et la plus grande distance par paire d'haplotypes de Termitomyces observées en Afrique de l'Ouest est similaire à celle des autres régions, exception faite de Madagascar (plus faible diversité) et del' Afrique du Sud (plus grande diversité). Le cas de l'Afrique du Sud pourrait également s'expliquer par

100 Résultats et discussion

le grand effort d'échantillonnage réalisé dans cette région (Aanen et al., 2007), augmentant ainsi les chances de collecte d'espèces rares. Cette absence de différenciation biogéographique dans la diversité des Termitomyces pourrait impliquer l'existence d'un flux constant de gènes entre les différentes régions africaines. En effet, les basidiospores peuvent se disperser à travers le vent, les eaux, les animaux ou les plantes et être collectées dans le milieu par les termites champignonnistes. Un bon exemple de cette dispersion sur de longues distances se retrouve à Madagascar, ou au moins trois évènements de colonisation à traver les océans par le symbiote fongique ont dû se faire, expliquant sa distribution actuelle (Nobre et al. 2010).

6.4/ Conclusion partielle Il ressort de cette étude, que l'origine de la symbiose Macrotermitinae-Termitomyces est africaine. En effet, la plus grande diversité génétique de termites champignonnistes a été observée dans les régions Centre et Ouest de ce continent. Par contre, aucune différenciation biogéographique de cette diversité et de la distribution des symbiotes fongiques n'a été observée. Par conséquent, cela rend difficile l'établissement d'un centre d'origine régional exclusif de cette symbiose sur le continent africain. Par conséquent, La recherche de ce centre d'origine exclusif pourrait se faire à travers une datation de la co-diversification des partenaires symbiotiques. En effet, la datation des divergences adaptatives (dernier ancêtre commun) des différents clades des partenaires symbiotiques pourrait permettre de déceler l'origine biogéographique de cette symbiose particulière.

101 Résultats et discussion

CHAPITRE 7: DATATION DE L'ORIGINE DE LA CO-DIVERSIFICATION DES PARTENAIRES SYMBIOTIQUES ET SPECIFICITE D'INTERACTION ENTRE TAXONS

ID. li Introduction partielle

Le manque de différenciation biogéographique dans la diversité et la distribution des Termitomyces entraîne une impossibilité d'établissement d'un centre d'origine exclusif de la ymbiose Macrotermitinae-Termitomyces entre les différentes régions du continent africain. Cette observation impose donc une tentative de datation des derniers ancêtres communs respectifs des partenaires symbiotiques, afin de dater l'origine de leur co-diversification.

En biologie de l'évolution, le concept de dernier ancêtre commun à deux lignées d'êtres vivants correspond à l'organisme le plus récent que ces deux lignées ont en commun. Il s'agit d'une entité théorique qui correspond au dernier nœud de l'arbre phylogénétique à partir duquel divergent les branches de chacune des lignées d'un groupe d'organismes. Toutefois, cela ne correspond pas forcément à un individu particulier ayant réellement existé. on le dit alors hypothétique.

Dans cette étude, l'hypothèse selon laquelle les principaux clades de termites hôtes et de symbiotes fongiques observés précédemment ont le même âge est testée. Par ailleurs. une estimation de l'origine des Termitomyces est faite suivie d'une mise à jour de l'origine de leurs termites champignonnistes hôtes. Pour se faire, (i) de nouvelles données de séquences d'ADN des partenaires symbiotiques, (ii) un échantillonnage compréhensif, couvrant tous les principaux clades d'hôtes et de symbiotes et (iii) des points de calibrage plus précis basés sur des fossiles nouvellement découverts ont été utilisés.

102 Résultats et discussion

7 .2/ Résultats 7. 2.1/ Datation de la divergence adaptative indépendante (dernier ancêtre commun) des termites champignonnistes Les séquences d'ADN utilisées pour la datation des divergences indépendantes chez les symbiotes fongiques sont celles des échantillons de Termitomyces ayant subi de équençages supplémentaires des régions 25S et 12S del' ADN ribosomal {Tableau XVI). Les échantillons de termites champignonnistes ayant subi des séquençages supplémentaires des régions COTI et ITS2 de leur ADN ribosomal ont également été utilisés pour la datation des divergences indépendantes des termites hôtes (Tableau XVII). Ces tableaux comportent l'espèce de termite hôte, le code de l'échantillon de termite ou de champignon et les différents numéros d'accession attribués aux régions séquencées après leur soumission à la banque de gènes. Les datations ont été faites à partir de points de calibrage de deux fossiles disponibles de Macrotermitinae: celui des meules du termite du genre Odontotermes (Duringer et al., 2007) et la date de divergence de l'espèce Macrotermes jeanneli (Darlington, 2005). La relation phylogénétique a été établie entre les séquences des termites champignonnistes collectés pendant cette étude et celles sélectionnées dans la banque de gènes. Des espèces de la famille des Termitidae (2 espèces du genre Amitermes: 673370 et 673402) ont servi à l'enracinement de l'arbre phylogénétique: Genbank N° accession AY127737 et AY127745. En définitive, l'origine des termites champignonnistes a été estimée à 30,96 ma, selon un intervalle de confiance de 16,74 à 48,8 ma (Figure 27).

103 Résultats et discussion

Tableau XVI : Séquences d'ADN des échantillons de Termitomyces ayant subis de séquençages supplémentaires des régions 25S et 12S de leur ADN ribosomal.

Termite hôte Codes N° Ace. (12S) N um. Ace. {25S} Ancistrotermes sp. Gla JF302780 JF302797 Ancistrotermes guinensis KlAg JF302782 JF302799 Macrotermes bellicosus Mbl JF302787 JF302806 Macrotermes natalensis ZA4 EF667086 EF667071 Macrotermes subhyalinus Klm JF302792 JF302805 Microtermes sp. Blrru JF302781 JF302798 Microtermes sp. T42k JF302788 GQ922670 Odontotermes latericius T69 JF302789 JF302807 Odontotermes sp. BIO JF302786 JF302801 Odontotermes ~P- MJO JF302785 JF302802 Odontotermes sp. KIO JF302784 JF302800 Odontotermes sp. XlO JF302783 JF302803 Odontotermes sp. YlO JF302790 JF302804 Pseudacanthotermes spiniger YlP JF302779 JF302795 Pseudacanthotermes sp. ElP JF302791 JF302796 Outgroups Code N° Ace. (12S) N° Ace. {25S} Agaricus bisporus Abl JF302793 JF302808 Agaricus campes/ris Acl JF302794 JF302809

Abréviations: N° Ace.= numéro d'accession attribué à la séquence après sa soumission à la banque de gènes de la NCBI.

104 Résultats el discussion

Tableau XVJI: Séquences d'ADN des échantillons de termites champignonnistes ayant subis des séquençages supplémentaires des régions COil et ITSil de leur AD ribosomal.

Termites chameignonnistes Codes N° Ace. {COI!} N° Ace. QTS2} Acanthotermes acanthotorax K2Aa IF302863 JF302883 Ancistrotermes cavitorax W2a IF302860 IF302878 Macrotermes Jea1111e/i MJ2625 IF302856 IF30288l Macrotermes lilljeborgi dkal43 JF302858 GQ922803 Macrotermes ma/accensis dkal60 JF302857 GQ922802 Macrotermes subhyalinus dka64 JF302854 GQ922806 Macrotermes subhyalinus Ms IF302855 IF302882 Macrotermes natalensis ZAl36 JF302853 GQ922804 Microtermes sp. 746171 IF302870 GQ922762 Microtermes sp. 746185 JF302871 GQ922821 Microtermes sp. B2mi JF30286] JF302877 Microtermes sp. X2mi JF302862 JF302876 Microtermes sp. Mic00205b JF302872 GQ922752 Odontotermes off. pauperans Op JF302867 JF302879 Odontotermes badius ZA7 JF302868 GQ922809 Odontotermes latericius dka81 JF302864 GQ922812 Odontotermes mi1111111s dkal61 JF302866 GQ92281 I Odontotermes sp. dka303 JF302865 GQ922814 Odontotermes sp. OspA JF302869 JF302880 Pseudocanthotermes spiniger E2P JF302859 JF302884 Outgroups Code N° Ace. {COm N° Ace. (!TS2} Microcerotermes sp. 746175b JF302875 GQ922821 Microcerotermes sp. 673370b JF302873 GQ922819 Microcerotermes sp. 673402b JF302874 GQ922820

Abréviations: N° Ace.= numéro d'accession attribué à la séquence après sa soumission à la banque de gènes de la NCBl.

105 Résultats et discussion

Microtermes sp. (746171) ~ •.

1 Mlcrotermes sp. (746185) 12.4 (6.08,19.78]

Microtermes sp. (B2mi) 2.85 [0.94,5.12) 1 15.09 (7.57,23.76] 1 Microtermes sp. (X2ml)

Miaotermes sp. (Mlc00205b)

Macrotermes malaccetuis (dka160)

16.12 (ll.88,2S.T2] Macrotermes 111/jeborgi (dka143)

U.21 117.24.20.14] Moaotermes subhya/inus (dka64)

26.69 (15.06,41.8] 4.61 l3.57.6.19)tl Mocrotermes subhyollnus (Ms) tl.37 (12.35,34.30] -~ T Macroterme.s jf'CJnneli (Mj2625)

Andstrotermes œvîthorox (W2a)

Odontotermes sp. (OspA) 20.S(ll.4~•

Odontotermes /aterlcius (dka81) l.5711.09,4.4311 13.63 (7.51,20.81) 1 (dka303) 24.68[13.:~ 8.4614.24,03.911 Odontoterme.s sp. 30.96 (16.74, ~8] 1 Odontotermes minutus (dka161) n.62 fE .27.17.91]

Odontotermes bodius (ZA7) 434 [l.96,7.19]1

1 Odontotermes aff. pauperons (Op)

At:anthotermes acanthothorax (K2Aa) 19.49 [9.5.9,JUB]I l Pseudacanthatermes spiniger (E2P)

,------Miaocerotermes sp. [746175) 4.011.67,7.nJ Micracrrotermes sp. (673370) 0.18 (0.02,0.39' Miaocerorermes sp. (673402)

4.0

Figure 27 : Relation phylogénétique des termites champignonnistes basée sur trois gènes.

Des espèces de la famille des Termitidae ont été utilisées pour enraciner l'arbre phylogénétique. Les points de calibrage sont indiqués avec de gros hexagones rouges C•). La phylogénie correspond à un arbre phylogénétique consensuel issu de trois tests de permutation de Markov Chain Monte Carlo exécutés sur 10.000.000 de générations chacune. Chaque nœud interne est surmonté de l'âge et de l'intervalle de confiance du clade correspondant. Les nœuds sans intervalle de plus haute densité à posteriori ont un intervalle de confiance s 50 %.

106 Résultats et discussion

7. 2.2/ Datation de la divergence adaptative indépendante (dernier ancêtre commun) des Termitomyces Notons d'abord que les topologies des phylogénies obtenues à partir de BEAST sont en harmonie sans toutefois être totalement égales, avec celles obtenus à partir de MrBayes. Les principales différences résident dans la position des symbiotes du termite du genre Pseudacanthotermes. Ses symbiotes avaient une position basale dans l'analyse faite à l'aide de MrBayes, mais pas dans celle réalisée avec BEAST. Les trois dates (73 ; 33 et 15,5 ma) de divergence adaptative possibles des Agaricus et des Chlorophyllum, ont donné respectivement des intervalles de dates de [51,9-176,3 ma], [23,5-79,0 ma] et [11,2-38,5 ma]. L'estimation de l'âge de la divergence adaptative indépendante des Termitomyces a conduit à de trop grands intervalles de confiance avec certains des dates utilisées. Cet intervalle a été particulièrement plus grand avec le calibrage basé sur les 73 ma de divergence des Agaricus (Figure 28). Par contre, il a été très réduit avec le point de calibrage des 15,5 ma, ne prenant ainsi pas en compte la date estimée des 30,96 ma [16, 74-48,8 ma] de la divergence adaptative indépendante des termites champignonniste (Figure 29). L'estimation de la datation réalisée avec le point de calibrage des 33 ma [23,5-79,0 ma] comme période de divergence adaptative indépendante des Termitomyces s'intègre parfaitement dans l'intervalle de confiance des 30,96 ma [16,74-48,8 ma] d'estimation de l'origine des termites champignonnistes. En l'absence de critères indépendants pour la sélection du meilleur intervalle de confiance, le choix a été fait dans cette étude de se focaliser ur l'estimation d'âge du symbiote fongique qui correspond le mieux à l'origine des termites champignonnistes: le point de calibrage des 33 ma de divergence des Agaricus. Selon cette datation, les Termitomyces seraient apparus il y a 48,99 ma, avec un intervalle de confiance relativement réduit, variant de 23,5 à 79,0 ma (Figures 30).

107 Résultats et discussion

Ancistrotermes sp. {Gla)

16.65 (3.5,28. Microtermes sp. {Blmi)

16.29 (4.2,31.1 '-----Microtermes sp. (T42k)

'------Ancistrotermes guinensis {K1Ag) 29.81 (10.2..,.,. Mocrotermes notalensis (ZA4) 2.87 (0.2,7.0

96 Macrotermes be/licosus (Mb1) 35.51 (12.9,62.!1- (~40.8 ~------Macrotermes subhyalinus {Klm)

---- Pseudacanthotermes spiniger (V1P) n.ss (2.3,24.1 ~--- Pseudacanthatermes sp. (E1P)

Odantotermessp. (810) 43.84 (16.1,n.s1

11.02 [2.9,21.4) Odontotermes sp. (M10)

~-- Odontatermes sp. {K10)

21.03 (6.1,39.3 ~---- Odontotermes sp. (X10)

--0----1108.36 (51.9,f76.3) 37.36 (11.fl,67.S) '------Odontotermes sp. {Y10)

.__ Odontotermes latericius {T69)

------Agoricus bisporus (Ab1) 22.74(6.2,42.14

66.87 (47.8,84.9) .__ Agoricus campestris (Ac1)

L------C. molybdites (DukeJJ162)

5.0

Figure 28: Datation du premier ancêtre commun aux Termitomyces à l'aide de l'âge de divergence de 73 ma des Agaricus et des Chlorophyllum.

La divergence adaptative indépendante des derniers genres il y a 73 ma a été utilisé comme point de calibrage (Geml et al., 2004). Le point de calibrage est indiqué par le gros hexagone bleu C•). La phylogénie correspond à un arbre phylogénétique consensuel issu de trois tests de permutation de Markov Chain Monte Carlo exécutés sur 10000000 de générations chacune. Chaque nœud interne est surmonté de l'âge et de l'intervalle de confiance du clade correspondant. Les nœuds sans intervaJle de plus haute densité à posteriori ont un intervalle de confiance ~ 50 %.

108 Résultats et discussion

Ancistrotermes sp. (Gla)

3.17 f0.8,6.2) Microtermes sp. (B1mi)

~-52 f0.9,6.711 L----Microtermes sp. (T42k)

.__ Ancistrotermes guinensis (K1Ag) 6.47 [2.2,11.6 Macrotermes notalensis (ZA4) 0.63 [0.0,1.S)

. 4.78 Jl.4,9.0 Macrotermes bellicosus (Mb1) 7.72 (2.9,13.6) ...._ Mocrotermes subhyalinus (Klm)

---- Pseudaconthotermes spiniger (V1P) 2.52 [O.S,5.1) ~--- Pseudacanthotermes sp. (ElP)

9.5 [3.6,16.7] Odontotermes sp. (B10)

2.43 (0.6,4.7) Odontotermes sp. (M10)

~-- Odontotermes sp. (K10)

4.6 (1.3,8.0) .__ Odontotermes sp. (X10)

~23.6 (11.2,38.5) 8.08 (2.J;, 14. 7 ..__ Odontotermes sp. (Y10)

L------Odontotermes lotericius (T69)

------Agaricus bisporus (Ab1) 5.07 (1.4,9.4)

14.6 (10.3, 18.6) ~------Agaricus campestris (Ac1)

'------C. molybdltes (DukeJJ162)

5.0

Figure 29 : Datation du dernier ancêtre commun aux Termitomyces à l'aide de l'âge de divergence de 15,5 ma desAgaricus et des Chlorophyllum.

La divergence adaptative indépendante des derniers genres il y a 15,5 ma a été utilisé comme point de calibrage (Geml et al., 2004). Le point de calibrage est indiqué par le gros hexagone vert(•). La phylogénie correspond à un arbre phylogénétique consensuel issu de trois tests de permutation de Markov Chain Monte Carlo exécutés sur 10000000 de générations chacune. Chaque nœud interne est surmonté de l'âge et de l'intervalle de confiance du clade correspondant. Les nœuds sans intervalle de plus haute densité à posteriori ont un intervalJe de confiance ~ 50 %.

109 Résultats et discussion

Ancistrotermes sp. (G1a)

6.67 (1.5,13.1] Microtermes sp. (B1mi)

7.41 (1.9,14.4] '-----Microtermes sp. (T42k)

'------Ancistrotermes guinensis (K1Ag)

13 .. 51 [4.8_d4.1 Macrotermes nototensis (ZA4) 1.31 f0.1,3.1] Macrotermes be/licosus (Mb1)

.__ Macrotermes subhyalinus (K1m)

~--- Pseudacanthotermes spiniger (V1P) 5.28 (1.0,TI.O] ,....___ _ Pseudaconthotermes sp. (E1P)

Odantotermes sp. (B10) 19.99 p.6,35.1)

5.00 fl.3,9.9) Odontotermes sp. (M10)

9.65 (2.7,18.1)

---,~-4.8.99123.5,79.0] 17.03 [5.f,31.Zf ,__ Odantotermes sp. (Y10)

.__ Odontotermes latericius (T69)

~------Agaricus bisporus (Ab1) 10.20 l2.S,19.0]

30.28 (22.0,38.5] .__ Agoricus campestris (Ac1)

'------C. mo/ybdites (DukeJJ162)

5.0

Figure 30 : Datation du premier ancêtre commun aux Termitomyces à l'aide de l'âge de divergence de 33 ma des Agaricus et des Chlorophyllum.

La divergence adaptative indépendante des derniers genres il y a 33 ma a été utilisé comme point de calibrage (Geml et al. 2004). Le point de calibrage est indiqué par le gros hexagone rouge (•). La phylogénie correspond à un arbre phylogénétique consensuel issu de trois tests de permutation de Markov Chain Monte Carlo exécutés sur 10000000 de générations chacune. Chaque nœud interne est surmonté de l'âge et de l'intervalle de confiance du clade correspondant. Les nœuds sans intervalle de plus haute densité à posteriori ont un intervalle de confiance ~ 50 %.

110 RésulLDts el discussion

7.2.3/ Recherche de l'origine de la symbiose Macrotermitinae-Termitomyces La séparation entre les clades contenant les genres Pseudacanthotermes et Acamhotermes et ceux des autres genres (Figure 28) est faible. En effet, l'analyse à l'aide de BEAST (Figure 27) a indiqué une séparation initiale entre le clade des genres Microtermes, Pseudacanthotermes et Ancistrotermes, d'une part, et celui de tous les autres genres, bien que la plus haute densité a posteriori ait un intervalle de confiance inférieure à 50 %, d'autre part. Quelle que soit la base exacte des relations phylogénétiques, la radiation adaptative initiale au sein des genres semble s'être faite juste après la séparation avec les termites non champignonnistes. Cela a été indiqué par le chevauchement entre l'estimation d'âge des nœuds récents et celui de l'origine des termites champignonnistes. La figure 31 représente un diagramme de juxtaposition des périodes de divergence adaptative indépendante des Termitomyces, basée sur le calibrage réalisé à partir des trois âges de divergences probables des Agaricus et des Chlorophyllum et celle de la divergence de leurs termites hôtes. La figure 32 montre les datations des périodes de divergences adaptatives des principaux clades de Termitomyces et de termites champignonnistes, définis respectivement dans les figures 25 et 26. La période de divergence de chaque clade de termite champignonniste a été estimée pour : • le clade l (Microtermes, Ancistrotermes, Allodontotermes, Acanthotermes et synacanthtermes) à 15, 1 ma [8-24 ma] • le clade Il (Macrotermes) à 16, 1 ma [9-25 ma] • le clade m (Odontotermes) à 13,6 ma [8-2 ma] • le clade IV (Pseudacanthotermesï à 19,5 ma [ 10-31 ma]. Les périodes de divergence des clades des symbiotes de ces termites hôtes ont également été estimées à l'aide des mêmes trois dates (73; 33 et 15,5 ma) de divergence adaptative indépendante des Agaricus et des Chlorophyllum. Les résultats obtenus à partir de la date des 33 ma estimant le mieux la période de divergence des Agartcus et des Chlorophyllum a permis d'obtenir pour: • le clade I (symbiotes des genres Microtermes, Ancistrotermes, Allodontotermes, Acanthotermes et synacanthtermesy 7,4 ma [2-14 ma]; • le clade Il (symbiotes du genre Macrotermesï 10,0 ma [3-19 ma] ; • le clade m (symbiotes du genre Odontotermesï 17, 1 ma [6-31 ma] et • le clade IV (symbiotes du genre Pseudacanthotermesy 5,3 ma [1-11 ma].

111 Résultats et discussion

0

20

40

-E"' 60 i -tl \J ::a... 801 E .s 100 ~ ·-Ê ~ 120 1 140

160

180 73ma 33ma 15,5 ma

Divergence desAgaricus (âge du nœud)

Figure 31 : Datation des périodes de divergence adaptative indépendante des Termitomyces, basée sur un calibrage réalisé à partir des trois âges de divergences probables des Agaricus et des Ch/orophyllum.

Le rectangle gris correspond à l'intervalle de confiance de la période de divergence adaptative indépendante des termites champignonnistes (Macrotermitinae)

112 Résultats et discussion

Par ailleurs. les datations faites à partir des deux autres dates de divergence des Agaricus et des Chlorophyllum (73 et 15,5 ma) ont également été notés dans la figure 32. L'absence d'une stricte correspondance entre les dates de divergences des termites hôtes et celles de leurs symbiotes fongiques a été noté. même si les intervalles de confiance de la séparation au sein de ces principaux clades chevauchent presque toujours, suggérant que ces séparations se sont produites à la même période chez les organismes symbiotiques. Toutefois. quelques exceptions existent. En plus, ces symbiotes fongiques se retrouvent dans différentes régions (Côte d'Ivoire, Sénégal, Madagascar, Afrique du Sud) (Figure 25). Par exemple, le sous-groupe de symbiotes du clade I, partagé par les genres divergents de termites hôtes Synacanthotermes, Acanthotermes, Ancistrotermes et Microtermes est plus jeune (LO ma [0-2 ma]) que le clade de leurs termites hôtes, dont la période d'apparition se situe entre 8 et 31 ma.

7.2.4/ Spécificité dans l'interaction Macrotermitinae-Termitomyces et récentes propagations sélectives du symbiote fongique Les termites champignonnistes et leurs Termitomyces symbiotiques collectés en Côte d'Ivoire et représentés dans la figure 33, montrent une bonne correspondance « hôte• symbionte » avec trois clades majeurs : • clade A : constitué des termites du genre Macrotermes ; • clade B : qui comprend les termites du genre Odontotermes et • clade C : composé des termites du genre Pseudacanthotermes. Toutefois. au niveau des Termitomyces, des évènements de spéciations indépendantes de celles de leurs termites hôtes peuvent être déduites. En outre, chez les genres de termites Microtermes et Ancistrotermes en particulier, des évènements de fréquents changements de symbiotes s'observent à l'analyse des phylogénies des deux groupes d'organismes. En effet ces deux genres de termites champignonnistes partagent plusieurs haplotypes du symbiote fongique.

113 Résultats et discussion

Termites champignonnistes Termitomyces

0.5 (0-1)

3.5(1-7] . Q 15. 1 (8·24) 7.4(2·14)

16.3 (4-31) ' ' . Mlcrorermes ,,~d Anefrrotermes .. ' r. - . 4,8(1·9) 16.1 1'·25) . 10.0 (3-19) ttl 1 1 ---""l'VJ.-i . 22.0 [7-41) . " Mfrorcrmcs -- ...... 8.1 (3·15) 13. .6(8-21] 17.1 (6-31) . . 37 .4 (11-67] •

Odontotermes

. ' 2.5(1-5]- . ' 19.5 (10-31) 5.3 (1·11) •• 12 (2·24) •• Ac.,nrhorermes .tnd Pseudoc.,n1ho1crmcs

-•

Figure 32 : Datations des périodes de divergences adaptatives des principaux clades de Termitomyces et de termites champignonnistes.

Relation phylogénétique entre les termites champignonnistes (à gauche) et leurs symbiotes fongiques (à droite) utilisés dans cette étude (une combinaison de nouvelles séquences obtenues et une sélection représentative des zones de distribution des partenaires symbiotiques disponibles dans la banque de données de gènes : GenBank). La phylogénie correspond à l'arbre phylogénétique consensuel de ceux obtenus à partir des anaJyes bayésiennes. Deux espèces appartenant à la famille des Termitidae (Foraminitermes valens et Labritermes butelreepenîï ont été utilisées pour enraciner l'arbre phylogénétique des termites et l'espèce de champignon Lyophyllum semita/e pour l'enracinement de celui des symbiotes fongiques. Les nombres qui surmontent les branches des arbres phylogénétiques représentent la probabilité postérieure de MrBayes des nœuds et dérivent de J 9500 échantillons d'arbres phylogénétiques issus du test de Markov Chain Monte Carlo. Les échantillons soulignés ont été utilisé dans une autre analyse de datation de divergence indépendante par l'usage de deux loci supplémentaires pour les deux partenaires symbiotiques. Pour plus de détails se référer aux figures 27 (termites champignonnistes), 28, 29 et 30 (Termitomyces). Une attention particulière est portée au clade répandu de Termitomyces partagé par les genres divergents de termites hôtes Synacanthothermes, Acanthotermes, Ancistrotermes et Microtermes. *un seul échantillon du genre Ancistrotermes a été utilisé pour dater la phylogénie et dans la reconstruction phylogénétique réalisée à partir de BEAST, cet échantillon est basal au genre Odontotermes avec une estimation d'âge de 20,5 ma [ 13,8-38,9). **l'estimation d'âge se fonde sur anaJyse à partir de BEA ST dans laquelle les échantillons du genre Pseudacanthotermes inclus forment un jeune groupe monophylétique.

114 Résultats et discussion

Termites champignonnistes Termitomyces

------100 --.• ....- :-:-.: 7 Pseudacanthotermes 100 (' 55 83 100 -.,:_------_-_-_·: ::~------100 -~::---.:: .... :-., 6 Odontotermes ::~:::-~ ------~--1100 1 B I JOOI , , - , B ------,:~;,~~~---- - 100 ~r ----. - :::.:, ·------:::=:;/"' 1 t ------:__ - :_ ------.• -' -----, ILQ~ --. 10 Microtermes ·- .•. --:-··"-·-~_,,--· 99rL_ ---· ·- .. -_ __ -·------~~- , ..•.. , .•.. -~--;,.,-~ ..• - - - - - .,; ::::;~~~=:=;:.~:_~;~~~~;::: :·:.,_ ·_- ·- - . - . ·- - JOQ 80 ,' ,:"<., ,,' ,,"'",.:'...... •...•.. , ... ,,··---- .•.•. :~_ ,,>;:.._------___1_ 00-1r '"·::=,..-·:_ 6 Ancistrotermes • -.__ ·-. 991 • .. ' .. .. 100 2 Macrotermes 100

H O.ü2 0.02

Figure 33: Arbres phylogénétiques consensuels des termites champignonnistes de Côte d'Ivoire (à gauche) et Jeurs champignons symbiotiques (à droite) issus de l'inférence Bayésienne.

Les nombres au-dessus des branches représentent la probabilité postérieure de MrBayes des nœuds (plus d 50%) et dérivent de 19500 échantillons d'arbres du test de permutation de Markov Chain Monte Carlo. Les arbres phylogénétiques ont été enracinés à l'aide de « mid-point rooting », c'est-à-dire que la racine de l'arbre est à équidistance de tous les OTUs (Operational Taxonomie subUnits, correspondant le plus souvent aux séquences). Pseudacanthotermes (N=7 colonies), Odontotermes (N=6), Microtermes (N=lO), Ancistrotermes (N=6) et Macrotermes (N=2). Les traits colorés relient les termites hôtes à leurs champignons symbiotiques respectifs: - - -Macrotermes: - - -Ancistrotermes: - - - Micotermes: - - - Odontotermes: - - -Pseudacanthotermes.

115 R6ultats et discussion

7.3/ Discussion 7.3.1/ Origine de la co-diversification des organismes symbiotiques Dater les phylogénies demeure, à ce jour, un processus ambigu. En effet, une estimation de la divergence adaptative est fonction des régions d'ADN cibles, des méthodes de calibrages, des points de calibrage des fossiles de l'organisme cible, du nombre de taxons échantillonnés et de la précision ou consistance de la phylogénie préalablement établie (Magallon et Sandderson, 2005 ; Britten et al., 2007 ; Ho et Philips 2009, Battistuzzi et al., 2010; Skinner, 2010). Par conséquent, les dates de divergence obtenues doivent toujours être vues comme des indicateurs de périodes et non comme des âges absolus. Sur la base des analyses phylogénétiques de plusieurs espèces de termites champignonnistes connues, à l'aide d'un calibrage réalisé avec deux fossiles, l'origine de la symbiose a été estimée dans la présente étude à 30,96 ma [16,7- 48,8 ma]. Cette origine est plus récente que celle proposée par Brandi et al. (2007) qui l'ont estimé à 62 ma [30-108 ma]. Les deux périodes diffèrent certes, toutefois, leurs intervalles de confiance sont chevauchants. La différence entre ces deux estimations pourrait s'expliquer par l'utilisation (i) d'un second point de calibrage dans la présente étude et (ii) d'un plus grand nombre de genres de termites hôtes et d'espèces de Termitomyces. En effet, la datation réalisée par Band! et al. (2007) ne s'est faite qu'avec des échantillons appartenant exclusivement au genre Macrotermes. Par ailleurs, les méthodes d'analyses utilisées dans les deux études diffèrent. Brandi et al. (2007) ont utilisé MultiDivTime, qui suppose des taux de variations autocorrélés entre lignées ancestrales et descendantes. Par contre, la présente étude a utilisé BEAST, qui permet une variation indépendante de ces taux. Par ailleurs, la présente étude propose également une première tentative de datation de la divergence adaptative indépendante (dernier ancêtre commun) des Termitomyces. Toutefois, ne possédant pas de fossiles de Termitomyces, un calibrage indirect a été utilisé. L'incertitude de l'estimation de l'âge du nœud de l'arbre phylogénétique utilisé pour leur calibrage (divergence adaptative entre les Agaricus et les Chlorophyllum), rend incertain les valeurs absolues des âges estimées pour les Termitomyces. Les présentes estimations de l'origine de la symbiose entre les termites champignonnistes et les Termitomyces coïncident avec le début de l'Oligocène. A cette période les forêts primaires (habitat originel de ces organismes) selon Aanen et Eggleton (2005) étaient au maximum de leur couverture spatiale en Afrique (Plana, 2004). Cette symbiose semble avoir été initiée par ces organismes, juste avant l'expansion des savanes.

116 Résultats et discussion

En plus de l'harmonie des estimations à l'échelle des principaux clades, l'analyse de Termitomvces symbiotiques a révélé de récents évènements de changement de symbiote et de mode de transmission chez le genre Microtermes. Par exemple, la majorité des espèces de Microtermes possèdent des symbiotes ayant une origine relativement récente. En effet, les symbiotes fongiques ont une origine plus récente que leurs termites hôtes. L'âge maximum de divergence de ces séquences de Termitomyces est en effet estimé à 7.41 ma. Par ailleurs. ces séquences de Termitomyces sont également partagées par plusieurs genres divergents de termites (Synacanthotermes, Acanthotermes, Ancistrotermes et Microtermes), de différentes zones biogéographiques. Toutefois, l'âge minimum du dernier ancêtre commun à ces genres est à la limite inférieure de l'origine de cette symbiose, c'est-à-dire 16,7 ma. Par ailleurs, les termites ont été collectés à travers différentes régions du continent africain et à Madagascar. En effet, cela traduit un manque de différenciation géographique des symbiotes fongique s'expliquant par un probable échange continu et permanent des espèces de symbiotes fongiques entre différentes espèces de termites hôtes à travers différentes régions.

7.3.2/ Spécificité de l'interaction chez les espèces sympatriques de termites champignonnistes L'analyse phylogénétique des séquences d'ITS de Termitomyces symbiotiques des Macrotermitinae collectés dans la même butte termitique (espèces sympatriques) a révélé qu'ils partagent la même butte mais pas forcement Je même inoculum du champignon symbiotique. Cela pourrait s'expliquer par le fait que ces espèces ou genres de termites partagent la même butte termitique afin d'exploiter soit les grandes capacités constructrices de certains d'entre eux ou qu'il existe une absence totale de compétition entre eux (parfaite ségrégation des niches écologiques). En effet, Konaté (1998) a octroyé la construction de ce buttes termitiques au statut d'ingénieur de ]'écosystème du termite du genre Odontotermes, comme conséquence de la forte corrélation entre la taille de celles-ci et celle du nid é'Odontotermes (nombre de chambres à meule et poids de la reine). Par ailleurs. la similitude de la répartition horizontale et la dissimilitude de la répartition verticale au sein d'une butte d'espèces sympatriques leur permet d'éviter d'entrer en compétition pour l'espace (Josens, 1972 et Konaté, 1998), surtout que leurs préférences alimentaires diffèrent (Garcia, 1996). Toutefois, cette observation pose le problème crucial de la reconnaissance des spores du champignon symbiotique propre à chaque espèce, dans cet espace commun de vie. Cette reconnaissance pourrait en effet être possible grâce au décalage périodique de la fructification

117 Résultats et discussion

du symbiote fongique associé à chaque espèce de termite. En effet. la minimisation des chevauchements des différentes périodes de fructification des espèces de Termitomyces, conduirait à une reconnaissance plus simple des spores de leur symbiote fongique respectif aux termites hôtes.

7.3.3/ Récentes propagations sélectives du symbiote fongique Le mode de transmission n'est pas un estimateur adéquat ni du degré de spécificité entre hôte et symbiote, ni de la distribution géographique des partenaires fongiques. Paradoxalement, notre reconstruction a montré, d'une part, que les principales radiations adaptatives des genres de termites champignonnistes se sont produites simultanément avec celles de leurs symbiotes fongiques, d'autre part. Toutefois, plusieurs propagations récentes de symbiotes fongiques se seraient produites à travers des genres divergents de Macrotermitinae et dans toutes les régions de leur distribution géographique. Par conséquent, comment expliquer ces différences dans la spécificité de l'interaction et quels facteur déterminent son maintien ou sa perte? L'un des facteurs pourrait être le rôle du champignon dans la relation symbiotique entre le termite et son Termitomyces hôte. En effet, le symbiote fongique est considéré comme le principal agent de décomposition du complexe lignocellulosique des débris végétaux consommés par leur termite hôte, bien que sa fonction exacte ne soit jusqu'ici pas très clairement établi. Plusieurs fonctions ont été proposées et synthétisées par Bignell (2000), tel que être une source additionnelle de protéine, riche en azote (Collins, 1983; Tayasu et al., 1997) et/ou une chambre extradigestive (Wood et Thomas. 1989), aidant à la dégradation de la cellulose à travers les cellulases et les xylanases agissant de manière synergique et/ou complémentaire avec les enzymes endogènes des termites champignonnistes (Martin et Martin, 1978). Toutefois, la possibilité que cette fonction diffère d'un genre voir d'une espèce de termite à une autre, existe (Hyodo et al., 2003, Reuland-Lefèvre et al., 1991; Bignell, 2000; Ohkuma, 2003). Des différences dans les besoins nutritifs des termites au niveau générique. votre spécifique conduisant à une différenciation des attentes des termites vis à vis de leur Termitomyces pour combler ces besoins, pourrait être l'explication principale de la spécificité de l'interaction observée. Par exemple, Macrotermes natalensis est associé à une seule lignée de Termitomyces, horizontalement transmis: un symbiote spécialiste. comme le définit Rouland-Lefèvre et al., (2006). Cela implique qu'à chaque génération. une même et nouvelle association est établit. Cela impose donc au termite ou au champignon la possession d'un

118 Résultats et discussion mécanisme performant de sélection de son organisme symbiotique pour le maintien de cette spécificité à travers plusieurs générations successives. Alternativement, la spécificité d'interaction chez cette espèce de Macrotermes pourrait s'expliquer par sa distribution exclusive dans la partie australe du continent africain et non par une propriété de stricte association spécifique avec son symbiote. Par ailleurs, les espèces du genre Microtermes (utilisant la transmission verticale de leur symbiote) et celles des genres Synacanthotermes, Ancistrotermes et Acanthotermes (utilisant la transmission horizontale de leurs symbionte respectifs) partagent le même champignon symbiotique dit «généraliste». Apparemment, un symbiote particulier semble avoir émergé, s'est répandu et a remporté un immense succès auprès de plusieurs espèces de Macrotermitinae, en comparaison aux autres espèces de Termitomyces. Cela aurait conduit cette espèce de Termitomyces à devenir le symbiote de différents genres de termites hôtes à travers différentes zones géographiques. En somme, le maintien d'une certaine spécificité d'interaction dans cette relation de mutualisme obligatoire n'est pas lié au mode de transmission du symbiote fongique d'une génération de termite hôte à une autre (c'est-à-dire horizontale ou verticale). En effet, ce maintien serait plutôt lié au rôle exact du champignon dans sa colonie de termite hôte. Par conséquent, pour tester la création des associations et le maintien de la spécificité de l'interaction entre l'hôte et le symbiote, des études se focalisant sur la distribution fonctionnelle de l'interaction entre les Macrotermitinae et leur Termitomyces devront être entreprises. Ces études devront s'appesantir sur les détails de la transmission du symbiote fongique et la fréquence des transmissions horizontales ou verticales au sein des genres, puisque les seules preuves existantes ne sont basées que sur très peu d'études (Grassé et Noiret, 1955; Johnson, 1981 ; Johnson et al., 1981).

7.4/ Conclusion partielle Les termites champignonnistes proviennent des forêts humides d'Afrique, à partir desquelles ils ont colonisés de façon continue les savanes, il y a 30,96 ma [16, 7-48,8 ma] d'où ont lieu les radiations adaptatives conduisant aux genres existants. Ces radiations adaptatives des termites se sont produites en parallèle avec celles de leurs symbiotes fongiques. Toutefois, de nombreux évènements de changement d'hôtes par ces champignons à travers différents genres de termites se sont également produits. Ces évènements ont été suivis d'une expansion de partenaires fongiques à travers de vastes aires géographiques. au sein de genres de termites hôtes divergents. Par ailleurs, malgré l'établissement de L'origine africaine

119 Résultats et discussion de la symbiose aucune différentiation régionale exclusive n'a été observée à travers ce continent. Cela est particulièrement visible avec les populations de Termitomyces, montrant ainsi l'existence d'un flux génétique continu entre leurs régions de distribution. Ainsi l'origine ancienne de la symbiose, l'existence d'expansion sélective des Termitomyces et leur grand flux de gènes à travers les régions rendent discutable la reconstruction d'un centre d'origine de cette symbiose parmi les régions de distribution des partenaires symbiotiques en Afrique. Les reconstructions phylogénétiques ont montré une simultanéité des principales radiations adaptatives au niveau des genres de termites hôtes et leurs Termitomyces. Toutefois, plusieurs propagations récentes de symbiotes fongiques se sont produites à travers certains genres divergents de Macroterrnitinae et dans différentes régions de leur aire de distribution géographique en Afrique, conduisant également à un manque de spécificité d'interaction entre espèces de Macrotennitinae et de Termitomyces.

120 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES DE RECHERCHES Condusion 9énérale et perspectives de recherches

Ce travail articulé autour de 3 hypothèses de recherches a apporté une contribution à la compréhension de la symbiose entre les termites de la sous famille des Macrotermitinae ou termites champignonnistes et les Basidiomycètes du genre Termitomyces.

La vérification de la première hypothèse a permis de caractériser les déterminants biologiques et abiotiques qui gouvernent le décJenchement de la fructification saisonnière des sporophores de Termitomyces symbiotique. La diversité des sporophores de Termitomyces fructifiant dans la zone d'étude a ainsi été estimée. Quatre espèces de Termitomyces ont été collectées dont trois observées pour la première fois en Côte d'Ivoire. TI a également été montré que la fructification survient durant les saisons des pluies de chaque année, d'une manière synchronisée avec l'essaimage des imagos ailés des colonies matures et la production des ouvriers des colonies nouvellement établies du termite hôte respectif L'occurrence des sporophores de Termitomyces et l'abondance des termites champignonnistes dans les habitats se sont avérées significativement corrélées à leur richesse spécifique en plantes ligneuses. Par ailleurs, les biomasses de meules à champignons sont fonction des saisons et dépendantes de l'espèce de termite et du type d'habitat. Cette étude a confirmé une fois de plus que les sporophores saisonniers du symbiote fongique s'observent exclusivement chez les termite champignonnistes adoptant la transmission horizontale des spores de leur Termitomyces symbiotique de génération en génération. La vérification de la seconde hypothèse à travers des études moléculaires et phylogénétiques a permis d'établir la diversité génétique totale des partenaires symbiotiques dans la zone d'étude. Cette diversité a ensuite été comparée à celles d'autres régions géographiques, afin de vérifier si l'origine géographique de cette symbiose est Je centre de la plus grande diversité génétique de ses organismes symbiotiques. En effet, les régions Centre et Ouest africains renferment les derniers « blocks » de forêts primaires considérés comme les habitats originels de cette symbiose. Par conséquent, les plus grandes diversités de deux partenaires symbiotiques devraient y être rencontrées. Cette étude a révélé que les Termitomyces sont un groupe monophylétique reparti en quatre clades selon les genres de termites hôtes. Par ailleurs. aucune différenciation biogéographique de la diversité et de la distribution des Termitomyces symbiotiques n'a été observée entre leurs régions de distribution. Une homologie totale entre les ITS du génome de plusieurs Termitomyces de zones géographiques différentes et de genres, voire d'espèces de termites hôtes différents a été observée. Par contre, avec les termites champignonnistes. une faible diversité totale

121 Conclusion 9énérale et perspectives de recherches

similaire entre différentes régions est certes observée, mais il existe tout de même une diversité relativement plus grande en Afrique de l'Ouest.

La dernière hypothèse selon laquelle les principaux clades de Macrotermitinae et de Termitomyces ont le même âge a permis de déterminer l'origine de la principale radiation adaptative au sein des genres de Macrotermitinae. Il est ressorti que les termite champignonnistes proviennent effectivement des forêts humides d'Afrique, à partir desquelles ils ont colonisés de façon répétitive les savanes, il y a 30,96 ma [16, 74-48,8 ma], d'où a lieu les radiations adaptatives conduisant aux genres existants. Cette origine est plus récente mais chevauche tout de même avec celle proposée par Brandl et al. (2007) qui l'estime à 62 ma (30-108 ma]. Cette radiation adaptative des Macrotermitinae s'est produite en parallèle avec celle de leurs Termitomyces symbiotiques. La spécificité de l'interaction entre partenaire symbiotiques de la zone d'étude a enfin été vérifiée. Les termites champignonnistes de Côte d'Ivoire et leurs symbiotes fongiques ont montré une bonne correspondance << hôte• symbiote » avec trois clades majeurs (regroupant les genres Macrotermes, Odontotermes et Pseudacanthotermesy. Les genres Microtermes et Ancistrotermes adoptant des modes de transmissions différentes, partagent les mêmes symbiotes. Toutefois, de nombreux évènements de changement d'hôtes par les Termitomyces, suivis de leur expansion à travers de vastes aires géographiques et au sein de genres de termites hôtes divergents se sont également produits. Cela a ainsi conduit à des différences dans la spécificité d'interaction des partenaires symbiotiques dans la relation Macrotermitinae-Tennitomyces. Enfin, malgré l'établissement de l'origine africaine de cette symbiose, il semble y avoir un manque de différenciation géographique de la diversité des organismes symbiotiques à travers les régions de ce continent. Cela est particulièrement visible avec les populations du champignon symbiotique, montrant ainsi l'existence d'un flux génétique continu entre ces régions. L'origine ancienne de la symbiose, l'existence d'expansion sélective des Termitomyces et le grand flux de gènes entre différentes régions rendent incertaine la possibilité de reconstruction d'un centre d'origine de cette symbiose parmi ces régions.

Pour renforcer les acquis de cette étude, nous suggérons d'autres voies de recherche telles que:

• cartographier la diversité et l'abondance des sporophores de Termitomyces sur toute l'étendue du territoire Ivoirien, selon un gradient phytogéographique, Cela pourrait

122 Conclusion générale et perspectives de recherches

contribuer à établir un catalogue des Termitomyces de la Côte d'Ivoire à l'image des pays d'Afrique Centrale (Cameroun, Burundi ... ) et du Bénin en Afrique de l'Ouest·

• étudier la symbiose Macrotermitinae-Termitomyces à travers une collecte qui sera réalisée dans l'un des derniers blocks de forêts primaires de l'Afrique de l'Ouest: Le Parc National de Taï. Cela pourrait contribuer à compléter la diversité totale d'baplotype d'hôtes et de symbiotes de l'Afrique de l'Ouest;

• déterminer les fonctions exactes des meules à champignon au niveau du genre ou de l'espèce des termites champignonnistes ;

• établir la préférence alimentaire des termites champignonnistes, à travers des techniques moléculaires. En effet. les préférences alimentaires des termites champignonnistes pourraient s'avérer cruciale dans la sélection du symbiote fongique, considérant que celui• ci joue un rôle différent en fonction du genre, voire de 1 'espèce de termite hôte ;

• établir la fonction exacte de la meule à champignon à l'échelle du genre, voire de l'espèce de termite champignonniste, pour la détermination de la composition du substrat idéal à la culture du Termitomyces en milieu contrôlé ·

• étudier le mécanisme adopté par les Macrotermitinae ayant un mode de transmission horizontale des spores de leur symbionte fongique, pour la détection et la sélection des spores de leur Termitomyces symbiotique au cours de leurs différents stades de développement. Cela pourrait permettre (ii) de déterminer l'occurrence des associations Macrotermitinae-Termitomyces (ii) de comprendre si un changement de symbiote fongique peut intervenir au cours de l'existence d'une colonie de termites et (iii) d'élucider les causes du maintien d'une certaine spécificité d'interaction malgré une large utilisation du mode de transmission horizontale dans cette symbiose ·

• établir des colonies de Macrotermitinae en conditions contrôlées afin d'estimer l'âge de la colonie à partir duquel la fructification du symbiote fongique intervient. Une telle étude pourrait permettre la détermination de l'âge de maturité d'une colonie de Macrotermitinae (essaimage et/ou production de sporophores de Termitomyces). Une parfaite maîtrise des techniques d'élevage des termites champignonnistes hôtes pourrait conduire à terme à une domestication des Termitomyces ; donc à une production de leurs sporophores à grande échelle pour la consommation et la commercialisation. Des études au laboratoire, en

123 Conclusion générale et perspectives de recherches

mésocome et in situ de la biologie des partenaires symbiotiques et des facteurs influençant la fructification des Termitomyces seraient nécessaires. Cela pourrait apporter des éléments nouveaux à la connaissance des facteurs régulant la biologie et la croissance de Termitomyces ; élément indispensable à leur domestication ;

• estimer les conséquences écologiques causées par la collecte anarchique et incontrôlée des sporophores de Termitomyces pour leur consommation et leur commercialisation, à travers une étude socio-économique et des campagnes de sensibilisation.

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142 ANNEXES Al'.1NEXE1

Mesure du pH des sols

Matériel Electrode de verre, pH-mètre ., Réactifs ·1

1. Chlorure de calcium à 0,01M 2. Eau distillé€ 3. Chlorure de potassium t:!.

Mode opèra,. l olrc # (B) pH CaCl2 {0.01 M) (A) pli eau (rapport sol/eau : 1/1)

1. Préparer une suspension sol/CaCI 2 1. Peser 20 g de terre séchée à l'air et broyée à 2 mm dans un bécher de 50 ml. Ajouter (0,01 Ml selon le rapport 1/2, soit 10 g de terre pour 20 ml de solution. 20 ml d'eau distillé. Laisser au repos pendant 30 min. Agiter régulièrement il l'aide d'une 2. Laisser la suspension au repos pendant 30 min. Agiter rê:gulieremcnt la baguette de verre. suspension l'aide d'un agitateur en 2. Introduire res . électrodes du pj-t-mctrc il dans la suspension partiellernènt verre. déposée. Relever le pH. Ne pas remuer 3. Relever le pH. Enregistrer la valeur et la suspension durant la lecture. inscrire la mention "pH CaCI 2 0,01 M" 3 Noter le ré;.ullélt élVCC 1:i mention "pl-l eau" (C) pH l(CI t:! (rapport so/solulion : 1/1.)

Rernarc ;e; ( 1) Après chaque mesure, rincer les ércctroocs à l'eau dctonicce. sccncr 1. Mettre en suspension 20 g de terre dans a raioc d'un chillon propre ou d'un 20 ml de KCI !:::!- Laisser reposer pendant papier filtre. 30 minutes tout en remuant (2) Etalonner le pi+-rnèue avec une occasionnellement. solution tamponnôc à pH 7 cl 2. Mesurer le pH avec le pH-mètre. à pH 4.

C3/bl/OlJr~plilo: 1. Gate: R.G .. 1954 - Electromclric pH Oeterrninalions. 2. Clark W.M .. 1923 • The Dctcrmina\ion of Hydr,,gen Ions. 3. /\SA Monograph No. 9 • Mclhods of Soil Analysis.

.. " ANNEXE2

Dosaqe de l'azote total (Méthode de Kjeldhal)

Mntéri-cl .apèclal

1. Appareil à minéralisation de Kjeldt1al 2. Matras typo Kjeldhal de 500 cl 750 ml

Ré~cilfs ballon en pyrex à parois épaisses d'une 1. Pastilles de catalyseur mercurique contenance de 5 litres. Ajouter 2 litres d'eau En l'absence de telles pastilles, préparer le distillée et imprimer un mouvement circulaire catalyseur de la façon suivante: au récipient jusqu'à dissolution totale de la pese~90gdeK2 S0( etSgdeHgOdansun base. Laisser re!roidir dans la fiole obturée à mortier. Broyer finement. l'aide d'un bouchon en vue de prévenir toute absorption de CO 2 de l'air. Laisser reposer 2. Solution indicatrice: acide borique: quelques jours pour permettre la Dissoudre 80 g d'acide borique (H J Bo3) sédimentation du Na 2 COJ Siphonner le dans 3800 ml d'eau distillée ou déionisée sur liquide surnageant dans une grande fiole une plaque chauffante modérément chaude. en pyrex de 5 litres contenant environ 1 litre Laisser refroidir la soiution puis ajouter d'eau bouillie. Compléter au trait par addition 80 ml de l'ir1dicateur composé (dissoudre d'eau bouillie. Faire tourner le récipient pour 0,099 g de vert de bromocrésol et 0,066 g de tavotiser le mélange de ses composants. rouge de méthyle dans 100 ml d'éthanol à Placer un piège sur le col pour retenir le C0.2. 95%). A l'aide d'une burette, ajouter NaOH 0,1 ~ jusqu'au virage de la solution au rouge pourpre {pH 5). Amener à 4 litres 4. H SO 4 concentré RP avec de l'eau distillée ou déionisée. Mélanger 2 soigneusement la solution avant emploi. 5. HC 1 (ou H 2 SOA ) à 0,01 ~ 6. K 2 S04 RP pour toxicologie 3. Hydroxyde de sodium (NaOH à:!: 10 ~).

Peser 2, 1 kg de NaOH en pastilles dans un c :

Me>de opératoire 10 g de K2SO-l. A l'aide d'une pipette 1. Prélever 5 à 10 g d'un échantillon de sol automatique, ajouter 30 ml d'H2S04 contenant environ 10 mg de ~ (sol séché à l'air, broyé et passé au tamis de 0,5 mm): concentré. Placer dans un matras Kjeldhal de 500 ml. 3. Chauffer lentement sur ramp r, d'attaque. Ajouter 20 ml d'eau distillée. Secouer le Après évaporation de l'eau el disparition récipient pondant quelques minutes et de ln mousse, augmenter le chautlaçe laisser reposer 30 minutes. jusqu'à éclaircissement du résidu Ensuite, porter à ébullition pendant 5 2. Introduire une pastille de catalyseur mercurique (ou 1 g de K2SQ4-HgO) ainsi que ANNEXE 2 (suite)

heures. Régler le chaulfage de sorte que le 7. Relier Je matras de 750 ml à \'alambic. H2SO, se condense à mi-hauteur du col Introduire quelque 150 ml de NaOH 10 ~ en actionnant le robinet de l'entonnoir. du matras. Démarrer la distillation.· 4. Laisser refroidir et ajouter lentement 100 ml O. Conserver lo réfrigérant ~ uno tomoèraturo d'eau. ir,férieure à 30° C en assurant un bon écoulement de l'eau. Régler la flamme afin de 5. Transvaser prudemment la solution dans un autre matras Kjeldhal de 750 ml. Laisser contrôler la production de mousse et décanter les particules de sable qui d'éviter les risques de reflux. pourraient encrasser l'appareil à Ar.coller un distillat de ml. Interrompre, minérnlisatioh. Rincer quatre fois les 9. 150 parois du Kjeldahl avec 50 ml d'eau distillée la distillation. et transvaser l'aliquole dans le· second 10. Doser la teneur en ammoniaque du distillat matras. par titrage au HC 1 0,01 1'! (o:0 H2SO, ). A cette fin, utiliser une burette de 25 ml graduée au 6. Verser 50 ml d'acide borique (Ha Boa) dans dizième de ml. La solution vire du vert un erlenmeyer de 500 ml quo l'on place sous le tube ·a dégagement de l'appareil au rose. à minéralisation. L'extrémité du tube Calculer la teneur en N du sol(%). d'écoulement sera placée à 4 cm au-dessus 11. de la surface du liquide.

Variantes 2. La digestion peut s'elfectuer avec un appareil 1. L'azote total (NH,·N) de la solution peut également être dosé par colorimétrie à l'aide à minéralisation Tecator modèle 20. (Adresse du fou~nisseur: Tecator, Facks • de l'autoanalyseur. La distillation devient 26301, Hoganas, Sweden). alors inutile.

Blbl\gn,phlo:

1. ASA Monograph No. 9 Mcthods of Soil Analysis, Part Il, 1965. 2. Jackson, M.L. 1962. Soi/ Chomlcal Ano!ysls ANNEXE3

7. PROTOCOLE D'ANALYSE Pour toute sene d'échantillons, les recommandations des « Lignes directrices concernant l'application des contrôles de la qualité en physico-chimie », DR-12-SCA-0 l, sont suivies afin de s'assurer d'une fréquence d'insertion adéquate en ce qui concerne les éléments de contrôle et • d'assurance de la qualité (blanc, matériaux de référence, duplicata, etc.). Tous ces éléments d'assurance et de contrôle de la qualité suivent les mêmes étapes du protocole analytique que les échanti I Ions. Les renseignements sur la préparation des échantillons de sol agricole sont présentés dans le ~- document intitulé « Préparation des échantillons de sol agricole».

7.1. PRÉPARATION DE L'ÉCHANTILLON

L'échantillon de sol doit être broyé et tamisé à 2 111111 ( \ 0 Mesh) pour cette méthode.

7.2. DOSAGE .,_. Sécher l'échantillon de sol pendant une nuit (16 heures) à 150 °C.

Nettoyer les creusets en les chauffant au rouge, puis laisser refroidir au dessicateur pendant 10 minutes.

Prendre le poids du creuset vide. Ajouter 10 g de sol séché. Noter le poids final.

Cà\ciner le sol au four à moufle à 375 °C pendant 16 heures.

Laisser refroidir dans un dessicateur et peser le creuset contenant les cendres.

PRÉPARATION SPÉCIALE DE LA VERRERIE 7.3. Aucun soin autre que le lavage et le séchage de la verrerie n'est nécessaire pour la détermination de la matière organique par incinération.

8. CALCUL ET EXPRESSION DES RÉSULTATS Les résultats de l'échantillon sont calculés à partir de l'une ou l'autre des équations suivantes:

poids sol sec (g) - poids sol incinéré (g} % M. O. = -=-----~~-=------==- x / 00 poids sol sec (g)

MA. 1010- PAF 1.0 ANNEXE 3 (suite)

où

M. O. : matière organique; Po: poids du creuset vide; P1 : poids final; P : poids du creuset contenant les cendres. 2 Régression pour faire une équivalence entre les résultats par la méthode de perte au feu (PAf) et la méthode Walkley Black (WB) pour une étendue de O à 8 % de matière organique:

% M.0. (PAF)= 0,9932 x M.0.(WB) + 0.587

10. BIBLIOGRAPHIE BELL D. F., Loss-on-i rnition as an estimate of or anic matter and ornanic carbon m non• c~lcareous soils,Jou rnal of Soi! Science, Volume 15, 1964, p. 84-92.

CENTRE D'EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC et MINISTÈRE DE L'AGRICULTURE, DES PÊCHERIES ET DE L'ALIMENTATION DU QUÉBEC, Préparation des échantillons de sol agricole, DR-12-PEA, Ministère de l'Environnement du Québec, 2003, 8 p. CENTRE D'EXPERTISE EN ANALYSE EN\f!RONNEMENTALE DU QUÉBEC, Lignes directrices concernant l'a licatio'n des· contrôles de la ualité en h sico-chimie, DR-12-SCA-01, Ministère de l'Environnement du Québec, 1996.

CENTRE D'EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC, Protocole pour la validation d'une méthode d'analyse en chimie, DR-12-VMC, Ministère de l'Environnement du Québec, 2002, 27 p. CENTRE D'EXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUÉBEC et MINISTÈRE DE L'AGRICULTURE, DES PÊCHERIES ET DE L'ALIMENTATION DU QUÉBEC, Détermination de la matièr~ or ani ue ar dosa e du carbone or ani ue dans les sols agricoles; méthode Walkley-Black modifiée, MA. 1010 - WB 1.0, Ministère de l'Environnement du Québec, 2003, 12 p. CONSEIL DES PRODUCTIONS VÉGÉTALES DU QUÉBEC, Détermination de la matière orn.anigue par incinération, Agdex 533, Méthode MA-2, juin 1988, 1 p.

------Annexes

ANNEXE 4: Fiche de relevés utilisée pour le suivi des stades de développement des termites au laboratoire

Espèce: Date: Lieu de collecte: Heure: No Poids Poids Petite Grande Soldat Petit Grand Boîtes reme rot Copulariurn Œufs Larve Larve blanc Ouvrier Ouvrier Nourriture Meule Mort Annexes

ANNEXE 5 : DNA EXTRACTION

Biotechniques, 1991 Apr ;10:506-13 1867860 (P,S,E,B) Favorite: 1 Cited:64

Chelex J 00 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.

P S Walsh, DA Metzger, R Higuchi

Iluman Genelics Department Cetus Corporation, Emervville, CA 94608.

Procedures utilizing Chelex 100 chelating resin have been developed for extracting DNA from forensic-type samples for use with the PCR. The procedures are simple, rapid, involve no organic solvents and do not require multiple tube transfers for most types of samples. The extraction of DNA from semen and very small bloodstains using Chelex 100 is as efficient or more efficient th.an using proteinase K and phenol-chloroform extraction. DNA extracted from bloodstains seerns Jess prone to con tain PCR inhibitors when prepared by this method, The Chelex method has been used with amplification and typing at the HLA DQ alpha locus to obtain the DQ alpha genotypes of man.y diffèrent types of samples, including whole blood, bloodstains, seminal stains, buccal swabs, hair and post-coital samples. The results of a concordance study are presented in which the DQ alpha genotypes of84 samples prepared using Chelex or using conventional phenol-chloroform extraction are compared. The genotypes obtained. using the two diffèrent extraction methods were identical for ail samples lested. Mesh-terms: Chelating Agents; DNA :: blood; DNA :: isolation & purification; Forensic Medicine :: methods; Genotype; HLA-DQ Antigens :: genetics; Human; Male; Polymerase Chain Reaction :: methods; Semen :: chemistry; Support, Non• U.S. Gov't;

DNA extraction of termites using the Chelex method

1. Allow specimens to dry on a fiJter paper 2. Using sterile forceps (flame over humer to sterilize) ex:tract the individual termite heads and place each in a 1.5 ml. sterilize forceps between samples, 3. Place bottle with 5% chelex X- 100 suspension on the rnagnete stirrer, 4. Turn on heating black and set it to 56°C, 5. Add ± 5 glass beads (2-3 mm diameter), freeze with liquid nitrogen and grind for 10 seconds with a bead beater machine, 6. Freeze again in liquid nitrogen and grind for 10 seconds with a bead beater machine, 7. Add 100 µI 5% Chelex X-100 and 10 µI Proteinase K (20 mg.ml-I), 8. Vortex and spin, 9. Incubate for 12 hours at 56°C and with minimum shaking (be sure not to heat it above 60°C before digestion, as this will denature DNA and prevent digestion, 10. Hear the tubes for 10 min at 95°C 11. Centrifuge the DNA extract for 1 min at 12000 rpm (the DNA is in the supernatant and ready for use or storage at -20°C; only use supernatant for PCR as Chelex will inactivate the Taq-polymarase. Note: Sarnples seem to work best if supernatant is immediately separated from the Chelex bead. Therefore, do a 1: 10 dilution of template and store. This wilJ then be used for the PCR reaction. Annexes

ANNEXE 6: Fungus DNA extraction, method adapted from the DNA extraction of P. anserina using the Chelex-method

Chelex X-100 is a substance that binds positively charged ions like Mg2+, and Fe3+. 2 Because DNA degrading enzymes need Mg • as a co-enzyme, the Chelex indirectly protects DNA against degradation by DNases. By adding Proteinase K, DNases are degrading while more DNA is liberated from the cells.

Materials

-5% Chelex X-100 in Bidest. -Proteinase K, 20 mg/ml (stored in -20 °C)

Procedure

l. Grow mycelium on ComMeal Agar+ cellophane for 2-3 days, 27°C for 24-48 h. 2. Harvest the mycelium, avoiding as muchas possible the heavy pigmented parts (This can be stored in -20 or -80 °C until further use), in a 1.5 ml eppendorftube. 3. Add ± 5 glass beads of approx. 2-3 mm diameter and add bit of mycelium. Freeze the mycélium with liquid nitrogen; grind the mycelium for 10 seconds with a bead beater machine. 4. Freeze again in liquid nitrogen and grind the mycelium for the second time for 10 seconds with a bead beater machine. 5. Add 100 µI 5% Chelex X- 100 (stir the Chelex before pipetiting) and 10 µI Proteinase K (20 mg/ml). Incubate for 30 min. at 56°C 6. Heat the tubes for 10 min. at 95 °C (to inactivate the Proteinase K). 7. Centrifuge the DNA extract for 1 min at 12000 rpm. The DNA (in the supematant) is now ready for use in the PCR., you can also store it at -20 °C.

N.B.: Be careful while pipetting not to take any Chelex-precipitate with your sampling. Also the Taq-polymerase needs Mg2+ as coenzyme and PCR reactions may fail if not enough is available. Annexes

ANNEXE 7: Polymerase Chain Reaction ( common method)

Method

The polymerase chain reaction is based on the DNA-polymerase from bacteria living in hot water pool and is thermostable up to 96°C. The principle of this method is multiple cycles of diffèrent temperatures. First a high temperature (94°C) to make aU template DNA single• stranded, secondly a low annealing temperature ( 40- 70°C) in which the primers (mostly 20- mers) can stick to tbere complementary strand and final the optimal température (72°C) at which the DNA polymerase complements the single stranded piece after the primer. This cycle is repeated 30 times.

Materials

• Taq polymerase, 5 units/µJ (-20 °C, keep in ice) • 10 x PCR buffer (-20 °C, keep in ice) • Primer set, forward and reverse, 10-20 pmol/ul (-20 °C, keep in ice). • dNTP's, lOmM (-20 °C, keep in ice) • Autoclaved Bidest (Mill Q water). (portions of 1ml in -20°C).

Procedure

The PCR is done in a 0.2 ml thin-wall eppendorftube; the total reaction volume will be 25 µJ. Recipe for l sample: • 10 x reaction buffer: 5µ1 • 10 mM dNTP: 1 µI • 25 mM MgCl2: 1 µl • Primer, forward: 0.5µ1 • Primer, reverse: 0.5 µI • Taq-polymerase: 0.125 µl • Bidest (Milli Q water): 14.85 µI • Template DNA: 2 µl Total volume should be 25 µI

To overcome the problem of pipeting very smaU amounts and making mistakes, a Mixture is made of all the ingredients, except for the template DNA. Calculate very carefully how many reactions you want to do, and bow the mixture is made. Always ioclude a blanc, meaning bidest instead oftemplate DNA. Use a new tip for each oew iogredieot and only after allotting out the PCR-mixture, the DNA template is added. Annexes

ANNEXE 8: Détail des paires d'amorces utilisées pour les analyses moléculaires et phylogénétiques.

ITS1FT (5'-GTTTTCAACCACCTGTGCAC-3') et ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')

25S4R (5'-ACAAGTGCTGAGTTCCTCAG-3') et ITS4R (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3')

MSI (5'-CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG-3') et MS2 (5'-GCGGATTATCGAATTAAATAAC-3')

TL1862 (5'-TACTTCGTATTCGGAGCTTGA-3') et IB2877 (5'-TAGGTGTCGTGTAATACAATGTC-3')

AtLeu (5'-ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3') et B-tLys (5'-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3')

ITS2R (5'-GACTACCCCCT AAATTT AAGC-3') et ITS2F (5'-TGTGAACTGCAGGACACAT-3') Annexes

ANNEXE 9: Abondance des termites des habitats visités pendant cette étude (pour les abréviations voir l'annexe 10)

Famille Sous-fnmllle Es~ccs FONI FON2 FON3 F. lie F.Mot 11. Pt Sil SA SH FZI FZ2 FZ3 KNZ llAT .KOD Rhlnotermitidae Rhtnotermttinae Shedorhiroterme» lamaniam1sSjôstdt il911l 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Termitidae Amitermltinae A mitermes

,If acrotermitinae Acanthotermes O(Janthothorax Sjilsledl (1898) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 20 27

Ancistrotermes cavithorax Sjostedt (1912) 12 0 12 13 Il Il 40 38 9 4 17 4 7 6 3 Andstrotermes crucifer Sjêlstedt (1912) 7 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

Ancistrotermes guinee,uis Sllvestri (1912) 15 1 2 0 0 1 10 0 0 0 0 0 1 0

Microtermes toumodlensls Gassé (1937) 5 0 2 s t 3 2 25 5 8 2 1 2 5

,If acrotl!rmes bellicosus Smeathman (1781) 0 0 0 0 0 0 10 0 1 0 0 0 0 0 0

Mncrotl!rmes

Protermes minitus Crassé (1937) 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pseudacanthotermes militnris Hagen (1858) li 1 12 2 15 0 20 3 0 8 12 9 25 Il 0

Pseudaeanthotermes minor Sjilsledl (1913) 0 3 0 15 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0

Pseudacanthotermes spiniger Sj6stedl (1926) 0 0 0 0 0 0 8 0 0 2 0 0 15 20 27

Odontotermu .ipA 0 0 0 1 7 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Odomotermes sp] 0 0 0 0 0 0 8 8 8 0 0 0 0 0 0

Odontotermes sp2 0 0 0 0 0 0 4 1 1 0 0 0 0 0 0 Odot1totermes aff. Pauperans Silvcslri (1914) 0 1 5 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ,He&ae.rotermes sJVartlii Ruelle !1978} 0 0 0" 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 Apicotermitinae Adaiphrotermes sp. 0 0 0 0 0 0 0 15 " 0 0 0 0 0 0 Aderitotermes sp: 0 0 0 0 0 0 2 17 6 0 0 0 0 0 0 Astrototermes "l!:. 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0 0 Termitinae Basidentitermes potens Silvestri (1914) 0 2 0 l 0 0 l 0 " 0 0 0 0 0 0 Mtcrocerotermes parvus Haviland (1898) 2 0 7 0 3 3 2 3 1 0 0 0 0 1 0 Microcerotermes fuscotibiolts SjOstedt (1896) 2 6 2 0 2 5 1 1 0 1 2 1 3 4 Microcerotermes parvulus SjOstedt (1896) 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pericaprüermës urgens Silvestri (1914} 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perioapntermes socialts SjOstedt (1965) 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Procubitermes !i_osredrl Silvestri (1914) 0 2 0 1 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0

Nasutitermitinae Fulleritermes tenebricus Silvcstri ( 1915) 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0

Nasutitermes arborum Smeathrnan (1781) 2 20 12 3 5 2 0 0 0 0 2 0 4 3 0 Nasutitermes Iatifrons Sjëstedt ( 1896) 0 J 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Nasutitermes sp: 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 Trinervitermes gentinatus Wasmann (1897) 0 0 0 0 0 0 2 26 JO 0 0 0 0 0 0 Trinervitermes oeconamus T râgardh ( 1904) 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 Annexes

ANNEXE 10: Occurrence des espèces de Termitomyces collectées dans les différents habitats visités pendant cette étude

Genre Esp_èce FGNl FGN2 FGN3 F. ile F. Mot F. Pt SB SA SH FZl FZ2 FZ3 KNZ BAT KOD

Termitomyces letestui 0 0 0 1 1 0 l 0 0 1 1 1 1 1 1 medius 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1

fuliginosus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 l 1

eurhizus 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Habitats visités dans la réserve de Lamto: FGNl, FGN2, FGN3, F. ile, F. Mot, F. Pt, SB, SA, SH · Habitats visités dans la localité de Zougoussi : FZ1, FZ2, et FZ3 · Habitats visités dans la localité de N'Douci: KNZ, BAT et KOD.

• FGNJ et FGN3 = ilots forestiers visités au sein de la réserve de Lamto; F. ile et F. Mot = galerie forestière le long du fleuve Bandaman; F. Pt et FGN2 = forêts galeries au sein de la réserve de Lamto ; SB = savane boisée au Nord de la réserve de Lamto ; SA = savane arbustive et SH = savane herbeuse. • FZl, FZ2 et FZ3 = respectivement ilot forestiers de Zougoussi 1, 2 et 3 • KNZ = Ilot forestier visité dans la localité de Kanga Gnazé, BAT= Ilot forestier visité dans la localité de Batéra et KOD = Ilot forestier visité dans la localité de Kodimanso Annexes

ANNEXE 11 : Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de Tiassalé en Côte d'Ivoire) (pour les abréviations voir J'annexe 10).

NO Espèces Famille Fmt Fîl Fpt FNl FN2 FNJ FZl FZ2 FZJ Bnt K1!Z Kod SB SA SB 1 Acacia pennata (L.) Willd. Leguminosae X 2 Adenia cissampeloides (Plancb. Ex Hook.) Harms Passifloraccae 3 Adenia lobata (Jacq.) Engl, Passifloraceae 4 Afrormosia laxiflora (Baker) Hanns Lezuminosae X X 5 A{zelia ofricana Pers. Lezuminosae X 6 Agelaea obliqua (P. Beauv.) Baill. Connaraceae X X X X X 7 Albizia adianthifolia W. F. Wight. Mimosaceae X X 8 Albizia zveia mC.)Mmacbr. Mimosaccae X X 9 Allophylus spicatus (Poir.) Radlk. Sapindaceae X X 10 Anchomanes difformis (Blume) Engl. Araceae X X X X 11 Andropogon schirensis Hochst. Poaceae 12 Anona senezalensis Pers. Annonaceae X X 13 Antiaris africana Engl. Moraceae X X X X X X X X X 14 A1111bias so Araceae X X X X 15 Aiaenidia c011fe11a (Benth.) Milne-Redh, Marantaceae X X X X 16 Baphia pubescens Hook. f. Leauminosae X X X X X Annexes

ANNEXE 11 : Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de Tiassalé en Côte d'Ivoire (suite) (pour les abréviations voir l'annexe 10).

N• E,DèCCli Famille Fmt Fil Fot FNI FN2 FNJ FZI FZ2 FZJ Bat 11(.,., Kod SB SA SH 17 Bersama abvssinica Freseu. Mclianthaccae X X X l 8[B/i2/,ia sapida K.D. Konia, Sapindaceac X 19 Blighia uniiueata Baker Sapindaccae X 20 Bridelia ferrusinea Benth, Phvllantaceae X 21 Calamus sp ~ccaccae X 22 Canthium sn Rubiaceae X X 23 Ceiba oeutadra (L.) Gaertner Bombacaceae X X X X X X X 24 Ce/ris Bra1111ii Rendle Cannabaceae X X X X 25 Celtis zenkeri Enel. Cannabaceae X 26 Chaetacme aristata rPlanch.) E. Mcv. Ulmaceac X X X 27 Chtoroobora excelsa (Welw.) Benth. Mornceae X X X 28 Chromolaena odorata (L.) R. M. Kina & H. Rob. Comoositae X 29 Cissus a11n11a Hook. f. Vitaceae X X X X X X X X X 30 Clausena anisata (WiUd ) J. Hook. Ex Bcnth Rutaceae 0 X 31 Cofïea ruoestris Hiem Rubiaceae X 32 Cola caricae{olia (G. Don.). Schum, Malvaceae X 33 Cola cordifolia (Cav.) R.Br. Malvaceae X 34 Cola sieantea A. Chcv. Malvuceae X X X X X X X Annexes

ANNEXE 11: Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de Tiassalé en Côte d'Ivoire (suite) (pour les abréviations voir l'annexe 10).

No Genre Famille Fmt Fil Fpt FNl FN2 FNJ FZt FZ2 FZJ Bat K!!Z Kod SB SA SB 35 Cola mtllenii K. Schum. Malvaceae X X 36 Cola nitida (Vent.) Schott & EndJ. Malvaceae X 37 Combretum racemosum P.Beauv. Combretaceae X X X 38 Cos/us ofer Ker-Gawl. Costaceae X 39 Cremaspora trtfolia (Tbonn.) K. Schum, Rubiaceae X X X X X X 40 Crossopteryxfebrijuga (Afzel. Ex G. Don.) Benth. Rubiaceae X 41 Cussonia barteri Seem. Araliaceae X 42 Cynometra megalophylla Harms Leauminosae X X X X X 43 Dalbergia hostilis Benth, Leguminosae X X 44 Deinbo/1/a pinnata (Poir.) Schumach. & Thonn. Sapindaceae X X 45 Dialium guineense Willd. Leauminosae X X X X X X X X X 46 Dichapelatum euineense (DC.) Keay. Dichaoetalaceae X X X X X X X 47 Diospyros abyssinica (Hiem.) F. White Ebenaceae X X X 48 Diospyros [errea (WilJd.) Bakb. Ebenaceae X 49 Diosovros monbuttennis Gürke Ebenaceae X 50 Diosovros mespiltformls (A DC.) Hochst. Ebenaceae X X X X X X 51 Dracaena arborea (WilJd.) Link Asparagaceae X X X 52 Drypetes floribunda (Müll. Arg.) Hutch, Putranjivaceae X X X X X 53 Drvaetes parvlfolia (Mill!. Arg.) Pax & K Hoffm. Putraniivaceae X X X X Annexes

ANNEXE 11 : Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de TiassaJé en Côte d'Ivoire (suite) (pour les abréviations voir l'annexe 10).

ND Esoèces Famille Fmt Fil Fpt FNl FN2 FN3 FZl FZ2 FZJ Bat Kin Kod SB SA SR 54 Elaeis euineensis Jaco. Arecaceae X X X X 55 Entada mannii (Oliv.) Tisser. Lezuminosae X X X 56 Ervthroohleum suaveolens (GuiJJ. & Perr.) Brenan Lezuminosae X X 57 Ervthroxvùtm emarzinatum Thonn, Erythroxvlaceae X X X X X 58 Faeara macrophvlla Oliv. Engl, Rutaceae X X X X 59 Ficus ovata Vahl Moraceae X X 60 Ficus sur Forssk, Moraceae X 61 Gardenia temifolia Schumach. & Thonn. Rubiaceae X 62 Grewia carpinifolia Juss. Malvaceae X 63 Gritïonia sintolicifolia (DC.) Baill. Leauminosae X X X X X X X X X 64 Guaduella oblonea Hutch. Ex Clavton Poaceae X X X 65 Holarrhena floribunda (G.Don.) T.Durand & Schinz Aoocvnaceae X 66 Hugonia platysepala Welw, ex Oliv, Linaceae X X X X 67 Hvparrhenia diplandra (Hack.) Staf. Poaceae 68 Hvselodelohis so Marantaceae X X X 69 lmperata cvlindrica (L.) Raeusch, Poaceae X 70 Lasiodiscus mildbraedii Enal. Rbamnaceae X X X X 71 Lecaniodiscus cunanioides Planch, ex BenU1. Sapindaceae X X X X X X X X X 72 Leea euineensis G. Don Leeaceae X 73 Liooia multiflora Moldenke Verbenaceae X X 74 Lonchocarpus sereceus (Poir.) Hunth ex DC. Leauminosae X 1 Annexes

ANNEXE 11 : Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de Tiassalé en Côte d'Ivoire (suite) (pour les abréviations voir l'annexe 10).

NO Espèces Famille Fmt Fil Fpt FNt FN2 FNJ FZl FZ2 FZJ Bat IKfl°L Kod SB SA SH 75 ILandolpltia sp Apocynaceae X X X X X X X X 76 1La11dolpltia hirsuta (Hua) Pichon Apocynaceae X X X X 77 Landolohia owariensis P. Beauv. Aoocvnaceae X 78 Loudetia simplex (Ness) CE Hubb. Poaceae 79 IMacrolobium macrophzllum Macbr. Lezuminosae X 80 IMalacantha alni{olia (Baker) Pierre Saootaceae X X X X X X 81 Mallotus oppositifolius (Geisel.) Müll.Ara. Euohorbiaceae X X X X X 82 Mansonia altissima (A.Cbev.) A.Chev Malvaceae X X X 83 Mezo11eun1111 benthamianum Baill, Caesal pinaceae X X X 84 Microdesmis puberula (Planch.) Hook. F. Pandaceae X X X 85 1/.,!illetia zechiana Harms Papilionaceae X X X X X X X X 86 l/.,lin111so1JS kummel (DC.) Bruce Sapotaceae 87 Nanoleonaea vozelii Hook. & Planch. Lecythidaceae X X X X 88 Nesogordonia papaverifera (A. Chev.) Capuron ex N. Hallé Malvaceae X 89 Olax subscortnoidea Oliv, Olacaceae X X X 90 Oxvanthus unilocularis Hiem Rubiaceae X X X 91 'Pa11covia biiuga Willd Sapindaceae X X X X X 92 lfaullinia pinnata L. Sapindaceae X X X X 93 Phoenix reclinata Jacq. Arecaceae X X X 94 lpifiosfüm1a thonningii (Schurn.) Milne-Redh Fabaceae X Annexes

ANNEXE 11 : Flore des habitats visités lors de cette étude (réserve de Lamto et localités avoisinantes+ région de Tiassalé en Côte d'Ivoire (suite et fin) (pour les abréviations voir l'annexe 10).

NO Espèces Famille Fmt Fît Fpt FNI FN2 FN3 FZl FZ2 FZ3 Bat Kin Kod SB SA SH 95 Pseudosaondias microcarpa (A. Rich.) Engl. Anacardiaceae X X 96 Pterocarpus erinaceus Poir. Lezuminosae X X X X X X 97 Pterocarpus santalinoides OC. Leauminosae X 98 Ricinodendron heudelotii (Baill.) Heckel Eunhorbiaceae X 99 Rinorea breviracemosa Chipp Violaceae X X X 100 Salacia erecta (G. Don.) Walp. Celastraceae X X X X X X 101 Smeathmannia pubescens Sol. ex R.Br Passifloraceae X 102 Sorindeia wameckei Engl, Anacardiaceae X X X X X 103 Spondias mombin L. Anacardiaceae X X X X X 104 Sterculia tragacantha Lindl. Malvaceae X X X X X X 105 Strychnos usambarensis Gila, Lozaniaceae X X X X X 106 Teclea verdoomiana Exell & Mendonça Rutaceae X X X X X 107 Terminalia glaucescens Planch. ex Benth Combretaceae X X 108 Tetracera a/11/foliaWilld. Dilleniaceae X 109 Thaumatococcus daniellii (Benn.) Benth. Marantaceae X X X X 110 Trachvphrvnium brr11111ia1111m (K.Schum.) Baker Marantaceae X X X X X 111 Trichtlta prieuriana A. Juss. Meliaceae X X X X X 112 Triplochiton scleroxvlon K. Schum, Malvaceae X 113 Uvaria ovata (Vahl ex Dunals) A. OC. Annonaceae X X X X X X X X X X X 114 Voacanga a/ricana Stanf ex Scott-Elliot. Apocynaceae X 115 Xylopia aethiopica (Dunal.) A. Rich. Annonaceae X 116 Zanthoxvlum zanthoxyloides (Lam.) Zepernick & Timler Rutaceae X X Annexes

ANNEXE 12 : Données analytiques relatives aux sols des habitats visités pendant cette étude (valeurs obtenues à partir d'échantillons composites)

SITES STRATES pH Matière organique(%) Phosphore (ppm) méq/10011: Granulométrie Eau Kcl C N Total Assim K+ A Lg Lf Sg Sf FZ3 0-20 6,4 6,1 0,66 0,06 589 59 0,21 5,68 5,64 6,8 60,04 19,97 20-40 5,8 5,4 0,58 0,05 598 62 0,11 4,98 6,81 7,15 55,83 23,31 40-60 5,4 5 0,9 0,07 1176 118 0,06 6,48 6,68 8,55 51,61 25,13 FGNl 0-20 6 5,6 1,8 0,13 1278 127 0,12 7,25 5,02 6,23 52,06 25,81 20-40 6 5,7 1,36 0,13 1082 107 0,08 6,6 5,16 5,78 54,48 25,29 40-60 5,9 5,5 0,66 0,06 687 72 0,05 6,7 5,89 6,43 51,33 28,27 F. ne 0-20 5,4 4,8 1,32 0,13 814 81 0,05 6,78 5,7 2,95 30,2 52,05 20-40 5,3 4,7 0,78 0,07 802 80 0,04 7,28 5,23 3,42 31,84 50,38 40-60 5,2 4,8 0,62 0,06 738 75 0,03 8,33 6,41 3,4 29,29 51,49 SA 0-20 6 5,8 0,98 0,09 448 45 0,1 9,35 5,79 7,43 45,63 29,31 20-40 6,5 6,1 0,78 0,07 601 59 0,06 7,93 I0,58 6,05 54,12 19,95 40-60 5,8 5,4 0,7 0,06 776 78 0,05 10,8 6,37 6,7 50,17 24,65 SB 0-20 6,1 5,6 1,17 0,09 897 91 0,1 13,2 7,54 6,93 42,38 27,4 20-40 6 5,4 1,05 0,08 654 65 0,1 13,1 8,13 6,15 42,6 28,2 40-60 6 5,6 0,86 0,07 500 59 0,09 11,5 7,25 5,2 46,44 28,09 SH 0-20 5,9 5,6 0,62 0,06 571 56 0,04 3,48 2,57 3,37 65,27 24,2 20-40 5,8 5,5 1,25 0,09 660 65 0,04 5,53 7,4 4,12 60,05 20,1 40-60 6 4,8 0,39 0,03 485 48 0,02 0,45 1,98 1,95 76,57 16,39 Bat 0-20 5,5 4,8 1,27 0,1 1115 112 0,04 20,4 17,55 6,5 8,23 45,09 20-40 5,2 4,7 1,17 0, li 755 75 0,02 25,7 17,33 6,58 8,24 39,27 40-60 5,1 4,81 0,98 0,07 712 78 0,03 22,2 15,4 9,63 7,98 42,61 F.Mot. 0-20 4,6 4,3 2,89 0,21 2108 211 0,03 17,9 37,07 24,88 l,46 13,44 20-40 4,6 4,2 1,56 0,15 1255 124 0,07 21,2 36,82 26,42 2, Il 10,61 40-60 5 4,6 1,36 0,1 958 97 0,04 23 32,04 24,3 1,33 16,19 Annexes

ANNEXE 12 (suite et fin) : Données analytiques relatives aux sols des habitats visités pendant cette étude (valeurs obtenues à partir d'échantillons composites)

SITES STRATES pH Matière oraanique (%) Phosphore (ppm) méa/1002 Granulométrie Eau Kcl C N Total Assim K+ A Le Lf S2 sr F.Pt 0-20 5,3 4,9 2,98 0,22 1124 127 0,04 11,9 41,01 28,15 5,5 8,22 20-40 4,9 4,5 1,07 0,1 1045 103 0, l 16,3 42,36 30,6 3,42 5,39 40-60 5 4,8 0,78 0,09 698 72 0,03 22,5 41,12 29,2 2,36 3,15 FGN2 0-20 5,4 5 1,6 0,12 678 68 0,11 3,03 4,45 6,97 58,16 24,5 20-40 5,3 4,9 0,9 0,09 670 68 0,08 2,8 3,38 7,53 57,98 23,81 40-60 5,5 5, L 0,39 0,03 570 56 0,04 2 5,39 7,45 63,6 20, L4 FGN3 0-20 6 5,6 l,74 0,14 567 56 0, l 3,53 6,57 9,02 51,65 25,42 20-40 5,8 5,5 1,27 0, l 500 65 0,07 3,93 7,22 9,65 51,03 25,62 40-60 5,5 5,1 0,92 0,09 488 65 0,07 3,3 7,06 9,05 52,53 26,07 GNZ 0-20 5,7 5,3 2,48 0,24 900 100 0,09 14,4 10,43 9,9 21,52 39,07 20-40 5,8 5,4 1,21 0,09 852 85 0,04 18, l 9,66 10,68 24,87 24,12 40-60 5,5 5,1 1,05 0,11 571 56 0,04 20,7 9,77 9,65 23,2 34,89 Kod 0-20 5,5 5,2 2,77 0,28 489 50 0,12 14,7 7,04 9,57 19,97 43,74 20-40 5,2 4,8 1,25 0, 12 1172 116 0,04 19,6 6,89 10,5 21,57 38,79 40-60 5,3 4,9 1,09 0,09 625 62 0,04 20,7 7,54 10,1 21,14 37,94 FZl 0-20 6 5,7 1,56 0,14 788 81 0,11 10,1 4,69 6,55 57,29 18,1 20-40 6,2 5,8 1,13 0,1 602 59 0,07 11,4 5,78 7 52,1 21,66 40-60 6 5,7 l,37 0, 13 499 50 0,05 10,1 5, 1 7,1 57,24 17,98 FZ2 0-20 6,2 5,9 1,56 0, 15 339 33 0,07 6,7 7,15 7,2 51,45 24,36 20-40 6 5,7 0,92 0,09 299 30 0,07 6,93 7,69 8,6 50,09 24,93 40-60 6 5,6 0,66 0,06 277 28 0,03 6,53 8,65 9,52 49,22 24,48 PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES PUBLICATION 1

Koné N. A., Dosso K., Konaté S., Kouadio J. Y. and Linsenmair K. E. 2011. Environmental and biological determinants of Termitomyces species seasonal fructification in central and southem Côte d'Ivoire. Insectes Sociaux. 58 (3): 371-382

PUBLICATION 2

Nobre T., Koné N. A., Konaté S., Linsenmair K. E. and Aanen D. K. 2011. Dating the fungus-growing termites mutualism shows a mixture between ancient codiversification and recent symbiont dispersal across divergent hosts. Molecular Ecology. 20 (12): 2619-2627. PUBLICATION 1 Environmental and biological determinants o/Termitomyces species seasonal fructification in central and southern Côte d'Ivoire

N. A. Koné, K. Dosso, S. Konaté, J. Y Kouadio & K. E. Linsenmair

Insectes Sociaux International Journal for the Study of Social Arthropods

ISSN 0020-1812 Volume 58 Number 3 lnsect. Soc. (2011) 58:371-382 DOi 10.1007/ s00040-011-0154-1

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Insect. Soc. (2011) 58:371-382 DOI I0.1007/s00040-011-0154-I Insectes Sociaux

RESEARCH ARTICLE

Environmental and biological determinants of Termitomyces species seasonal fructification in central and southern Côte d'Ivoire

N. A. Koné · K. Dosso · S. Konaté · J. Y. Kouadio · K. E. Linsenmair

Received: 30 July 2010/Revised: 13 December 2010/ Accepted: 21 January 201 I / Published online: 10 February 2011 © international Union for the Study of Social lnsects (fUSS[) 2011

Abstracl The Macrotermilinae subfamily is characterized the associated termite species. Basidiocarps occur species• by its symbiosis witb fungi of the geous Termitomyces. The specifically either during the long or the short rainy season in most common and prcsumably primiLive mode of repro• woodcd habitats. The diversity and abundance of termites duction for these fungi is to produce basidiocarps on the and their associated basidiocarps were significantly corre• mounds of the host termite colony. The seasonal fructifica• lated only with woody plant species richness. Nuptial fügbt tion pattern of the fungi seems to depend on the habitat type of termites, comb biomass and Termitomyces fructification and termite ecology. We examined Termitomyces diversity periods were correlated. Termitomyces appear to fructify and distribution in two phytogéographie zones in central and during (1) the period of strong precipitation, (2) in habitats southern Côte d'Ivoire. Data were collected in different with appropriate microclimatic characterisrics, habitats in exhaustive searcbes witb standardized method for termites and basidiocarps as well. Tbe respective fi ndiog Keywords Fungus-growing termites· were cornplemented witb behavioral and life cycle data of Termitomyces basidiocarps · Seasonal fructification · nvironmental variables · Fuogus combe: · Alates nuptial ûight

N. A. Koné (181) · K. Dosse · S. Konaté Introduction UFR-Sciences de la Nature et de l'Environnement, Station d'Ecologie de Lamro, Université d'Abobo-Adjamé (Côte d'Ivoire), BP 28, N'Douci, Côte d'Ivoire The termite subfamily Macrotermitinae (lsoptera: Termiti• e-mail: ngolol [email protected] dae), the so called "fungus-growing termites" is the major K. Dosso group of bigber termites (Termiùdae), which accounts for e-mail: [email protected] 70% of the k:nown species (Reuland-Lefèvre et al., 2006). . Konaté They live in societies wilh a complex organization. with a e-mail: [email protected] number of well-defined castes and do not have symbiotic protists in lheir gut (Rouland-Lefèvre et al., 2006). lnstead . A. Koné · J. Y. Kouadio UFR-Sciences de la Nature et de l'Environnement, they bave developcd a symbiotic relationship with basidio• Laboratoire de Biologie et Amélioration des Productions mycetes of the genus Termitomyces (e.g. Johnson el al., Végétales. Université d'Abobo-Adjamé (Côte d'Ivoire), 1981). This symbiosis is obligatory as, under narural con• 22 BP 461, Abidjan 22, Côte d'Ivoire ditions, Termitomyces has noi been found growing anywhere e-mail: [email protected] else lhan in termite nests. Likewise. the termites are depen• K. E. Liusenmair dent on the fongus, as incipient colonies tbat fait lO establish Lehrsruhl Tierëkologie uod Tropenbiologie (Zoologie Dl), a viable fungus comb do not survive (Darlington. 1994). Theodor-Bcveri-Institut filr Biowissenschaften der Universitât ln this interaction. the termite creates the essential living Würzburg (Biozentrurn), Am Hubland, 97074 Würzburg, German nditions for the fungus by building a highly bomeosiatic e-mail: [email protected] bumid nest. ln turn, fungi allow the termites to forage on

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372 N. A. Koné et al. several types of abundant, yct for the termites mostly indi• is under some conditions a regular event. Basidiocarps appear gcstivc plant material of low nutritional value which nccds cach year at the samc periods, however, only in specific Lo be onJy partly pre-digested by the termites lo serve as vegetarion types while the respective fungus-growing termite. fungal substrate (e.g. Reuland-Lefèvre, 2000). The co• are by far more widely distributed. Little is known on the evolutionary patterns of this symbiosis arc bcginning Lo be fungal divcrsity and also on the biological and environmental beuer understood (Rouland-Lefèvre et al., 2002; Katoh dererminants of the fructification of the diffèrent Termitomy- et al., 2002; Taprab el al., 2002; Aanen et al., 2002); but they es species. Although several authors (Tschierpe, 1974; are far from being really comprebended. Contrary 10 most Grassé. 1982) uoderlined the relative importance of both other subfamilies and familles of termites, fongus growers interna! and external factors affecling the termite society and are restricted Lo lhe Old World (Batra and Barra, 1979). Up determining its contrai on the fungus, few studies bave iden• to date about 330 species belooging to 11 generahave beeo tified, characterized and determined the importance of such described (Kambhampati and Eggleton, 2000). Fungus• diffèrent factors. Korb and Linsenrnair (1998a, b. 2000) growing termites bave likely originated in the African rain howed thar Macrotermes bellicosus modifies the architecture forest (Aanen and Eggleton, 2005). This origin bas hap• of its epigeous nests according to environmentaJ conditions. pened fairly late and is estimated to be not more than ca, Their results suggesi tbat fungus-growing termites are able Lo 62 mya (30-108) old (Brand! et al., 2007). modulate their mound building according to differing eco• The taxonomy of Termitomyces bas been mainly based logical requiremems. We also bypotbesize ihai the seasonal on the basidiocarps and wbat we know is that a significani fructification of Tennitomyces basidiocarps is influenced by number of the strains do not fruit, or at least not regularly extrinsic ecological as well as intrinsic species-specific bio• (Moncalvo et al., 2002). Recent studies on co-evolution of logical factors. The aim of this study was to correlate in a first the symbiotic partners (Aanen et al., 2002, 2007; Reuland• tep the seasonal occurrence of Termitomyces species and the Lefèvre et al., 2002; Nobre el al., 2010) bave provided new distribution and abundance of the fungns-growing termites insights into the diversity of Termitomyces and have proven with a set of environmental variables. The study was con• a stiU iocompletely defined level of symbiont specificity in ducied in Côte d'Ivoire. We assessed the diversity and fuugus-growing termites, particularly at the genus level, abundance of the most common fuogus-growiog termites, as New colonies of fungus-growing termites are usually initi• weU as the diversity and occurrence oftbeir spccific symbiotic ated by a pair of alates that become king and queen of the fungi across habitats differing in (1) their vegetation cover, (2) society. Sorne termite species show a vertical symbiont their woody plant density, (3) plant species richness and (4) transmission, meaning that reproductives carry asexual types of soils. We paid special attention to spccificities in the spores of the symbionts from their parental nest with them termites' and fungi's life cycles: the period of nuptial fligbt (Grassé and Noirot. 1958; Johnson et al., 1981; Leuthold and primordial fungus comb establishment of incipient colo• et al .. 1989). However, in most fungus-growing termite nies under laboratory conditions. species, new colonies acquire their symbiotic fungal part• ners via horizontal transmission. Mushrooms growing out of the termite colonies produce large amounts of basidiospore Materials and methods (Aanen, 2006). Tbese widely wind-dispersed sexual spores are eitber passively or actively collecied by the first worker Study area generntion from the direct environment of the founder col• ony. 111is seems to be the ancestral form of transmission We carried out this study in Côte d'Ivoire at iwo main (Korb and Aanen, 2003; de Fine Licht cl al., 2005; Aanen locations: in the reserve of Lamto (6° 13'N and 5°02'W) and and Boomsma, 2006). However, many details of colony around three villages (Batéra, Kodimanso and Kangagnazé establishment still wait for their unveiling. in the vicinity of the city of N' Douci. The Lamto reserve i A key feature of thèse symbiotic systems, relying on located 160 km north-west of Abidjan. This natural reserve horizontal spore transfer, is thus the seasonal fructification of 2,700 ha is located in the transition zone between semi• of the respecti ve Termi tomyces species (Heim, 1977), being deciduous forest and the Guinean savanna in the so called of mutual benefit for the two partners. It allows on the one "V" -Baoulé (central Côte d' Ivoire). Tbe city of N' Douci i band the recombina lion and the dissemination of the fungal located 125 km south-east in the semi-deciduous forest zone spores; and it secures on the other band the vital spore (southem Côte d'Ivoire). Study habitats were cbosen based acquisition by tbose termite species dependent on horizontal on socio-economical surveys that we had carricd out on transfer (Korb and Aanen, 2003). harvest and trade of the basidiocarps of Termitomyces from The occurrence of these basidiocarps on the termite' s nesis February to April 2006. Thèse surveys sbowed lhat the was so far often considered to be somewhat of a chance event mushrooms were a key source of income for local people in (Tschierpe, 1974). However on closer scrutiny, fructification the study area, especialJy for women and the youth.

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Déterminants of Termitomvces seasonal fructification 373

Tbc landscapc of the Lamto réserve is a forcst-savanna widc, wcrc establishcd through cach sclcctcd habitat. A 2 mosaic. Forests are located in the thalwegs. along seasonal transect is divided into 20 sections of JO m (2 01 x 5 m). rivers (gallery forests), or along the permanent Badaman ln cach habitat, transects were separated by ai least 50 m. River (riparian forest), while semi-deciduous forests are ensuring a good represemaiion of the srudy areas. The tran• located on plateaus (Abbadie et al., 2006). Twelve habitats sects' starting points were at lcast 10 m distant from any were studied: four semi-deciduous forests, three gallery habitat edge to avoid border effects on the species compo• forests, two riparian forests, a sa vanna woodland (tree cover sition. Twelve soil sarnples (12 cm x 12 cm x 10 cm over 62%), a tree savanna (tree cover between 19 and 36%) deep) were Laken in each section al raodom locations and and a grass savanna (tree cover below 7%). earched for termites. Termites were hand-searched in Tbe area of N'Douci was formerly covered by forest known suitable microhabitats, sucb as leaf liner and humus. which bas mosùy been converted to agriculrural land. Three the base of trees and between buuress roots, rwigs and fallen forest islands (18 ba ~ surface area ~ 30 ba) spared by branches, etc. As tbis method was designed for use in for• this excessive deforestation for agricultural areas were ests, il was modificd for savanna habitats by including tudied. arcb between grass tufts or by uprooling tbem (Dosso Four seasons cbaractcrize the rninfall régime of the study et al., 2010). Termites were collected and hand-sorted in area: a long rainy season from February to July, a short dry itu. Around Len individuals per casre (workers and soldiers season in August, a short rainy season from Septernber io were collected and put into 70% ethyl alcohol. As suggested November and a long dry season in Decernber and January by Dosso el al. (2010), for sarnpling all the 20 sections in (Pagney, 1988). The mean annual precipitation is about l day. 4 trained collectors were deployed on a tra.nsect, with 1,200 mm. The analysis of the climatic features over the 2 collectors al a lime sampling 10 sections for 30 min per decade preceding our study coufirms the seasonal subdivision section. Sampling was based on the occurrence of individ• just described, with an average raiufall of 1,208 mm. Aver• uals (presence-absence) rather than ou their numbers, with age temperature and relative humidiry were 28°C and 78%. respect to the social habit of termites (Andersen, 1991). Toi During the 3 years of this study (from January 2007 to part of the smdy was done in the field from July to August December2009) the average rainfall amounted Lo 1,316 mm, 2008, corresponding to the short dry season in the study witb an average temperature of28°C and a relative humidity area, This period is considered to be especially favorable for of 77% (Fig. 1). There are no différences in these values termite sampling (Dosso et al., 2010) becanse their foraging between the Lamto reserve and the N'Douci region. activities are more evident during the dry season (as they consume preferentially dry plant mauer on the soi] surface). Sampling design Assessing Termitomyces diversity, fructification period Assessing termite diversity and abundance and hast termite species

For sampling we used a standardized method designed for The diversity and fructification period of Termitomyces rapid assessmenl of termite diversity by Jones and Eggleton were assessed using field observations in the chosen habitats. (2000). Three separate belt transects, 100 m long and 2 m The fungi were sorted according to morpbospecies of the respective fungus-growing termite. From January 2007 Lo December 2009, the occurrence of Termitomyces basidio•

- Ra,nlall (mm) --Relati\G humfd'ly (%) ·••••·· Tcmpon,turo ("C) carps was foUowed oo epigeal mounds in the chosen habitats.

300 1 T 150 These mounds were located, counted and marked during the search protocol just described before the first fungi appeared 240 120 in the respective year. Basidiocarps of subterranean nests were also collected by thorough searcbes in the established I 180 ;§ plots. This metbod was combined witb opportunistic sear• ·~ 120 cbes in the remaining habitats. Field surveys for collecting °' Termitomyces were done twice a month in each habitat (first 60 and third week of each mouth for habitats of me Lamto reserve and second and last week for habitats near N'Douci). Termites and fuogi were collecicd by brcak:ing open the mounds. Wben a Termitomyces basidiocarp was observcd, oil pits were dug out. up to the fungus comb [rom which the Fig. l Mean monthly precipitation, ternperature and relative air humidity at Larnro ove.r the 3 years of the study (2007-2CX>9). Data basidiocarp of Termitomyces grew. The soil pits aJlowed source: Geopbysics Station of Lamto (Côte d'Ivoire) collecting both termites and basidiocarps for identification

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374 N. A. Koné et aL

in the laboratory. Termitomyces basicliocarps sampling was correlations berween the fructification period of a gi ven based on presence-absence in habitats. Termitomyces species and the establishment of the primor• Termites were identified to the species Ievel under a low• clial combin newly founded colonies of termites belonging to power stereo microscope with a reticle (Nikon MZ6) by uch genera associated witb the respective species of Ter- means of standard identification keys of African termites by mitomyces. Observations werc donc until the appcarancc of Bouillon and Matbot (1965, 1966, 1971), Webb (1961), tbe primordial comb. This first comb consists of slender illustrations by Josens (1972) of Lamto savanna termites pillars of spheres (focal pellets) which later develop into and the cliffcrent descriptions made by Grassé (1986). la aggregations of serpentine sbape. Tbese are auached to the agreement witb Josens (1972), we considered the genera floor of the copularium (Johnson, 1981). Morphological Ancistrotermes. Macrotermes, Microtermes, Odontotermes, identifications based on the soldiers collected from the reared and Pseudacanthotermes, widely distributed across ail colonies were done to check the correctness of the genus habitat rypes in the study area, as common fungus-growing level identifications on tbe basis of the examination of al a tes. termite genera, Less common genera in our area were Ten colonies of each genus were used for the calculation of Acanthotetmes, Megaprotermes and Protennes. Ail sam• the average duration of the diffèrent developmental stages. pled termites were morpbologically identified at the Royal Dead leaves of the palm Borassus aethiopum were used as Museum for Central Africa in Tervuren (Belgium). material for tbe primordial comb of tbe colonies. The leaves Fungi were identified using the identification keys of were furtber dried in an electric dryer at 45°C for 24 b. eut Heim (1977), tbe illustrations of Buyck (1994) on edible inro small pieces and put into the boxes, wben the first mushrooms of western Burundi and the study of Mossebo workers were observed. et al. (2002) on the genus Termitomyces in Cameroon. Morphologie characterisiics were observed and noted in situ Characterization of environmental variable from tbe fresb sample. The microscopie characieristics of basidiocarps were then observed uoder a high-magnifying ln each habitat, three plots of 50 m x 50 m were estab• stereo microscope (Nikon ECLIPSE ElOO). Ali sampled lished. Woody plant species richoess and species abundaoce fuogi (basicliocarps) as well as their host termite species were determined in three subplots of 10 m x 10 m, ran• were identified using molecular biology techniques (Gued• domly chosen within each of tbese plots. Soil characteristics egbe el al., 2008; Nobre et al., in preparation) at the were detemùned by collecting samples with a ground auger Laboratory of Geneiics, Wageningen University. at three layers of 20 cm (0-20, 2~0 and 40-60) at oioe points in each habitat. Samples were collected in the middle Periods of nuptial fiigbt of alates and establishment of tbe randomly chosen subplots. A11 rune samples of each of primordial fungus combs in newly founded colonies layer obtained in a habitat were roixed to gel a composite in the laboratory sample. Three composite samples were thus analyzed per habitat. The samples were air-dried and passed through a Alates of tbe common fungus-growing termites were col• 2-mm sieve before aoalyziog tbeir physico-chemical prop• lected during their respective nuptial Iligbt period from erties in the laboratory as follows: pH (water) and pH KCJ January 2007 to December 2008. The samples were collected values were measured electronically in soil-to-water and from light traps at the Ecologica1 Station of Lamto and its soil-to-potassium cWoàde suspensions, respectively (Baize, surroundiog areas and transported alive in glass container: 2000), soi! organic carbon was determined by the metbod of with soil to the Iaboratory. The alales were later identified to Anne (AFNOR, 19%), the total pbosphorus was measured tbe genus level and sorted according to sex. Pairs were then by means of .tluorhydric and perchloric acid solution (AF• placed in plastic boxes of l J cm x 6 cm x 3 cm, witb a NOR, 1998), "assimilated" phospborus by the methods of fine layer of moistened soi! to allow the reproductive pair to Rouiller et al ( 1994-), total nitrogen and particle size (clay establisb their copularium. This soiJ was collected from an silt and sand) by Kjieldabl and Robinson methods, respec• abandoned epigeal ncst of Odontotermes sp. and sterilized by tively (Anderson and Ingram, 1993). drying it at 105°C for 48 b. The termites were kept at a constant temperature of 29°C (Sieber and Leuthold. 1981). Seasonal vertical distribution of fungus-growiog We started with 50 colonies per genus. The colony estab• termites and tbeir fungns combs in different habitats lishment and development was observed trougb the bortom of the plastic box. Duratious of diffèrent growtb stage This part of the work was performed in order to analyze the (copularium, eggs, fust workers, first soldiers, and first comb vertical distribution of soil-dwelling termites. Following appearance) in each box were noted. The aim of this part of Anderson and Ingram (1993) (however increasing the the study was just to compare the time needed for passing monolitbs' size). tbrec monoliths of 100 cm x 100 cm through each growth stage of every species. We looked al and 60 cm depth were excavated in the six habitat type

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Determinants of Tetmitomyces seasonal fructification 375

(a riparian forcst, a scmi-dcciduous forcst, a gaUcry forcst, samc software was uscd for average comparisoo using savanna woodland, a trce savanna, and a grassy savanna) of the U test of Mann-Whitney after analyzing abundance the Lamto reserve. Each rnonolith was subdivided in three variability with ANOVA of Kruskal-Wallis. Thcsc corn• layers of 20 cm (0--20, 20-40 and 40-60 cm) Lo be hand• parisons werc performed for fungus-comb biomasses sorted in situ. The field work Look its course during the four between habitats, for seasons and for the duralions of seasons of the year (2009) and was carricd out in each mid• developmcntal stages of the rcared termite colonies. season. Fungus-comb biomasses were determincd by the measurement of their respective dry weight, As it is not easy to rccognize the différences between fongus combs of ter• Rcsults mites of the same genus. tbey weresortcd al the genus level. Comb biomasses were determined after drying combs ut Diversity and spalio-tcmporul distribution room ternpcrarure until achicving constant weight. Combs of Termitomyces and its host termites of a given genus pcr layer were combincd beforc weighing. Termite diversity and comb biomasses wcre dctermincd With three transects per habitat wc obtnincd a good picrure aecording to the termite gcnus pcr habitat type and season. of the community composition. At least 70% of ail locally known and 90% of the fungus-growing termite spccies were Statistics sampled in each habitat. Of the latter, 16 species from 8 gencra were collected, l3 beJonging to the 5 most comrnon Redundancy analysis (RDA) was uscd to investigate the genera Of the 16 collected species, Termitomyce., basid• effects of environmental variables (woody plant richness, iocarps could only be found in 7 spccics (Table 1 ). woody plant density, soi) pli. soi) carbon. soil nilrogcn, Termitomyces basidiocarps fructification occurred every clay, silt and sand) on termite species abundances and year within species-specific periods, These pcriods were Termitomyces species occurrences (ter Braak and Smilauer, close.ly connected to determinate seasons. The respective 2002) using CANOCO for Windows 4.5. For the clarity of fructification lime span was also found Lo be species the ordination and because of a sirong colinearity between dependanl. Four species of Termitomyces were collected some variables, we made first a detuiled examinalion of the (T. letestui, T. medius, T. eurhizus and T. [uliginosus} wbich correlation matrix of the environmental variables in order to were in our study area associated wilh a single or max.imally identify the subset to be used for the ordination by removing two termite spccics (sec Table 1 ). No fruit bodies were found one of the highly correlated variables from the relative in the fungus-growing termites Microtennes toumodiensis, composition data of the RDA. The correlarion matrix test M. bellicosus and M. subbyalinus. Only T.fuliginn.«L< yielded was performed with the software Staristica version 7.1. This fruit bodies in colonies of Acanthotermes acanthothorax

Table: 1 Diagram of Termitomyces ~ies diversity and fr. uct.ificatioo period accordi.ng to the associmed termite and the sca...orwlity of ruinfoll

Sea.sons LDS~ SOS~ LOS

Fungus-growlng lennilcs specics Tumilomyc~s associaled species Jan Fdl Mar Apr May Jun Jul Au& Sep Oct Nov Dec

P,\·eudaca111hoœnne.t miUtariJ I P. •t pirli~r Termiw,nyces lt'lt'.ttui (Pa1.) R.. lfcim

J\ra11tlintrrmr.t a('tmthnthnm.r Trrmitnmyre,ffu/i,:ùratu.t R. Meim Ancistmtermes cavùharax I A. guint'mÛN Tenniu,myces medius R. Hcim & Gr.JS~ - Odummennes a.ff. po.upu,111., / O. sp2 7~rmil0rrt)U,f eurhh.u.1 (Bcrk.) R. Hcim

Micror,m11e., 10111,io,Hm.ti.,

Mncrotem1es lwllirn.ms I M. .m bhyalinu,

Black bands rcprcscnt the fructification period of the symbiotic Tennitomyu,f specics of each füngus-growing termite specics; gray bands rcprescnt the aleres' nuptial Oight pcriod of the mature estobtished fungus-growing 1.crmitc colonies, Season abbreviations: LRS long rainy season (from Fcbruary 10 July). SDS sbon dry season (Augusa), SRS short dry season (from Scptcmbcr l'O Novcmbcr), LSD long dry seasou (from Deccmbcr to January}

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376 . A. Koné et al. du ring the short rainy season. BasidiocarpsofT. letestui wete and 81 ± 5.2 days (11 = 10 per species) after the respective recorded during the first 3 months of the long rainy season host alates' first swarming period. while those of T. medius occurred from the third Lo the fifth month of this season. Termitomyces eurhizus occurred in Species-specific relationship between alates' nuptial colonies of Odontotermes aIT. pauperans and O. sp2 during ûight, the fructification of Termitomyces in mature the last 2 months of the long rainy scason (see Table l; colonies and the durations of the early developmenral Fig. 1). BasidiocarpsofT. eurhizuswererecordedonly in the stages of newly founded colonies up to the production forest-savanna mosaic zone white those of T. fuliginosu of the primordial comb were found onJy in the semi-deciduous Forest On the con• trary, basidiocarps of T. letestui and T. medius occurred in Using ooe-way ANOV A, the duratioo of developmentaJ both zones. stages varied significanily between reared species for eggs Basidiocarps of T. letestui were fouod fruiting abun• (F = 22.91; P < 0.001),larvac (F = 42.39;P < 0.001, first dantly in ail 3 years of this srudy. They generate a high workers (F = 20.28; P < 0.001), first soldiers (F = J 1.13; income for the local inbabitants during their fructification P < 0.05) and primordial comb (F = 12.19; P < 0.05). The period, specifically in the locality of N'Zianouan which i primordial combs in oew colonies were established the trade center of Termitomyces basidiocarps. Termitomy• ll5 ± 17.5 days after the establishment of the copularium ces medius is also relatively abundant but their basidiocarps in J\. cavithorax, alter 91.3 ± 3.06 days in M. bellicosus, are uot sold. This species was not lrnown as a Termitomyce. 120 ± J0.2 days in M. toumodiensis, 95.8 ± 6.28 days in pecies (i.e. as an also edible mushroom) by the local pop• O. aff. pauperans and 208.1 ± 7.52 days in P. militaris. The ulation since it bears fruits from subterranean nests. As for species P. militaris oceded the longest lime for the estab• T. eurhizus and Ti fuliginosus, they were Loo rare and thu lishment. The period required by A. cavithorax and M. too much effort were needed Lo collect them in rewarding toumodiensis on the one band and M. bellicosus and O. aff. quantity. pauperans, on the other, were not significantly diffèrent. The first workers of a newly establisbed colony of a given Relationship between Termitomyces fructification termite species occur whcn the related fungi of the mature and nuptial fügbt periods of alates colonies are still bearing fruit bodies and producing spores (Tables 2, 3). A temporal extended nuptial füght period of alates was observed during the two first months of the long rainy season Seasonal distribution of fungus combs in dependence (February and Marcb). For instance, alates of Ancistrotermes of the termite genera and habitat types cavithorax, M. bellicosus, M subhyalinus and M. toumodi• ensis were seen swarming several times and always closely Comb biomass in monoliihs was dependeot on termite correlated witb rainfalls while those of Pseudacanthotermes pecies and habitat type. The combs of the genera Ancistro• militaris were only observed during the short rainy season.A. termes, Microtermes, Odontotermes, and Pseudacanihoter• acauthothorax alates were never observed swarming. Ter• mes were abundant in al1 habitats during the diffèrent mitomyces fructification occurred after the host alares seasons. Dry comb biomasses were high in the rainy season warming period. On average fructification in T. medius, and lower in the dry seasons (Fig. 2). Significant scasonal T. eurhizus and T. letestui started 67 .5 ± 5.59. 48. 75 ± 4.1.4 effects (one-way ANOV A) on comb biomasses and between

Table 2 Average developmental duroôon (in dnys) of the living stages of the most common fungus-growing termites' species of the study area

A. cavithorax M. bellicosus M. subhyalinus M. toumodiensis O. aff. pauperan.v P. militari

Eggs 10.1 ± 3.32" 16.1 ± 4.12" 19.4 ± 0.64" 16 ± 5.38" ll.4 ± 4.6" 24.7 ± 6.68c First larvae 29.6 ± 4.4" 20.6 ± 4.08" 61.6 ± 10.6d 31 ± I'"' 17.7 ± 4.3" 42.2 ±3.W Firsr workers 21.1 ± 2.68.b 23.5 ± 4_3b 29.8 ± 9.8b 57 ± 2.lc 15.6 ± 0.84" 18.8 ± 2.88" Wbite soldiers 25.6 ± 5.52" 21.7 ± 2.68" 31 ± IL" 57 ± 1.9" 23.5 ± 1.5" 35.6 ± 4.64b Primordial comb 115.S ± 17.7" 91.9 ± 3.06b - 120 ± 10.2" 95.8 ± 6.28b 208.1 ± 7.52" I:,'. (nuptial flight - fructification) 67.5 ± 5.59 - - - 48.75 ± 4.14 81 ± 5.52

For the same stage, comparisons were done berween speeies average developmemal duration: values witb the same lerter were not significantly diffèrent (one-way ANOVA: Mann-Whitney test, eacb species: n = 10. I:,'. (nuptial flight - fructification) = span time between the nuptial. flight of alares and the fructification of tbe associated fungus in species. For eacb developmerual stage. value baving the sarne Iener (a, b, c and d) are not significantly different ar P = 0.05 level (LSD test post hoc comparison)

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Dererminants of Termitomyces seasonal fructification 377

Table 3 Summary statistic for Axes 2 3 4 RDA ordination of fungus• growing termites' diversity and Eigen values 0.250 0.158 0.093 0.029 abuudances in dependence of environmenral variables pecies-environment correlations 0.948 0.843 0.765 0.717 Cumulative percentage variance of species data 25.0 40.9 50.2 53.1 urnularive percentage variance of species-environmeot relation 45.0 73.5 90.3 95.5 Sum of ail eigenvalues: 1.000 Sum of alJ canonical eigenvalues: 0.556

.:. ';' 100 Ancistrotermes ~ 100 90 g 90 ~ Microtermes =.. 80 a 70 .. 70 0 E :ë 60 .,.5,,! 60 .,,, se .,,, 30 E ,o 40 0 E .., )0 e lO :, 20 .. 2-0 ~ 10 ::, C 10 0 C•• ..". ..::,. 0

.:. ~ 100 Odontotermes - 100) Pseudocamhotermes ~ 90 ~ 90 .. 80 .• sa - 70 E 70 E 0 60 .2 60 :0 .&> so .&> lO .,,, E 40 E 40 g 30 8 ;o ., 20 :, 20 •:,. CG 10 .., 10 C C 0 ..". 0 ..'".

Habitai typrs and seuons Elabilat types aad UUODS

Fig. 2 Average dry biomasses of genus-specific fungus oombs of the savanna, TS tree savanna, GS grassy savanaa, Seasoo abbreviarions: rnost common fuogus-growing termites in response to seasouality of US long rainy season, SOS short dry season, SRS short rainy season, rainfall in diffèrent habitat types. Habitats abbreviations: RF riparian LDS long dry season forest, SDF serni-deciduous foresi, GF gallery Iorest, WS woodland different habi lat types were observed in al I seasons. The tree The ordination (RDA) of the fungus-growing termites and grassy savannas bad the lowest fungus-comb biomasses species with the selected variables yielded eigenvalues of in ail seasons and in all species (Fig. 2).1\.ncistrotennes and 0.25 for the first axis and 0.158 for the second while lower Pseudacanthotermes had the highest fungus-cornb bio• eigenvalues were found for the third and the fourtb ax masses during al! seasons. (0.093 and 0.029, respectively) (Table 3). AH axes showed bigh correlations between termite species and variables Effects of environmental variables on the diversiry included in the ordination. Only one variable (woody plant and distribution of termites and their associated pecies richness: WPS) explained a significant part of the Termitomyces variation in species abundances (Monte-Carlo permutation tests for the WPS: F = 2.83; P < 0.01; Fig. 3). The effect of environmental variables on the 16 collected The ordination (RDA) of Termitomyces species richnes fungus-growiug termite species and the four Termitomyces with the selected variables yielded eigenvalues of0.541 for species recorded was tested iodepeodently. Preliminary the first axis and 0.2 L2 for the fourth while lower eigen• analysis of the correlatioo matrix of eavironmental varia• values were found for the second and the third axes (0.131 bles allowed selecting six oftbe aine variables measured for and 0.004, respectively) (Table 4). Only the first and the RDA; these were woody plant densiry, woody plant specie econd axes sbowed high corrélations between Termito• richness, soil pl-1, soil carbon, clay and silt. myces species and variables included in the ordination and

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C0 min seems to be the sole exception (Korb and Aanen, 2003). This ci result agrees with the assumption of Johnson et al. (1981), prpt that for inoculation of the primordial comb, colony founders

opaup' using the horizontal transmission depend on spores of the O. :y,A • fruit bodies emanating from mouods of established mature (i.e. alates producing) colonies. TI1is author also noted U1e great rarencss of basidiocarp production by the symbiotic fungus of M. subhyalinus. According to these authors. ÏJ1 most of the hitherto studied Macrotermitinae-Terrnitornyces Acon associations, horizontal transmission of the symbiont fun gus spin occurs. ln contrast, the alates of the termites with proven

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Determinants of Termitomyces seasonal fructification 379

Table 4 Summary statistics for Axes 1 2 3 4 RDA ordination of Termitomyces species diversity Eigen values 0.541 0.131 0.004 0.212 and occurrences in dependence of environmenral variables Species-environment correlations 0.951 0.678 0.178 0.000 Cumulative percentage variance of species data 54.1 67.2 67.6 88.7 umulative percentage variance of species-environment relation 80.1 99.4 100.0 0.0 Sum of all eigenvalues: 1.000 Sum of all canonicat eigenvalues: 0.676

C0 Effects of biological and environmental factors d T. medsu on fungus-growing termites and their associated WPD Termitomyces species diversity and distribution

First basidiocarps of T. letestui appeared in February J or 2 weeks after the first rain in January. Tbose of T. mediu. and T. eurhizus, respectively, started appearing during the third and fifth months of the long rainy season while T. fuliginosus were observed bearing fruit bodies during the last montb of the short rainy season. However, the periods of fructification among the diffèrent species are so diffèrent that rain alone can bardJy be the sole releaser, if it partiel• pates at ail as a releasing agent Yei, living Termitomyces -1.0 1.0 basidiocarps phenologicaUy overlapped, respectively, in Fig. 4 Diagram of RDA ordination of Termltomyces species richness April (T. letestui and T. medius) and June (T. medius and and environmental variables (data wilh arrowsï. Species abbrevia• T. eurhizus). lf this time ls minimized, then avoidance of lions: T. mediu, Termitomyces medius; T. letes, Termitomyces letestui: overlapping fructification periods could have been selected T. eurhi, Termitomyces eurhizus, T. fulig, Termitomyces fuliginosus. Environmental variables: C soil carbon. WPD woody plant density, for, which might help the work.ers to select the correct WPS woody plant species richness spores. The very basis of the reliable appearance of the fungi could be an endogenous circa-annual cycle and the imme• diate releaser some indirect or also direct effect of a sudden drop in food consumpüon due 10 the exodus of the alates common fungus-growing termites of the study area were not definitely released by rainfall, but wiih species-specific strongly affected by habitat variabilily; probably because of différences in regard to lime of the main exodus and fre• their high ecological plasticity based more on the adapt• quency of swarming cvents. The main support for our ability of their ncsts across habitats tban their own pbysio• hypothesis that there is a fixed connection between swar• logical adaptability (Josens, 1977). Exceptions were observed ming, fructification and lime, wbere incipient colonies of in P. spiniger and M. subhyalinus prefcrcntially found in the next generation bave produced their primordial comb woody habitats and significanùy correlated wilh the woody is that only those colonies which produced sexuals were plant species richness, probably due to the face that they are observed to produce basidiocarps. The production of assumed Lo be able to use a wide range of plant species liner alates foUows a yearly rhythm. Many sexuals of the early (Josens, 1974). On the genus level most termites seem to be warming species are ready before the first rain and thus are rather flexible concerning the habitat type lhey live in. able to swarm with the first heavy rain (which lhey probably Obviously also tbeir fungi are able to live in different hab• need because they wou]d olherwise not be able to dig their itats; however, most fungi species are more restricted wben burrows). It is likely that the production of nodules (whicb it cornes 10 fructification. thcn requiring special habitats. are the primordials of rousbrooms) remains rather constant Most fungus-growing termites can be prcsently found in for some tirne, but, as there are fewer workers (wben alates forests as well as in savanna habitats, likely due to several bave been raised, also fewer workers will be raised), fewer repeated colonization of savannas by different gcncra (Aancn nodules are consumed, and more will get the chance to grow and Eggleton, 2005) and the sophisticated mutualisùc asso• to the size of mushrooms as suggested by Aanen (2006). ciation developed with (be Termitomyces during their However, good exiernal (i.e. rainfall) conditions are needed évolution (Abe and Higashi. 2001; Egglcton, 2006). for Lbis fructification.

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380 N. A. Koné cl ni.

Termitomyces Iructification was found to be restricted to A. cavithorax, O. aff. pauperans and P. milita ris). This syn• woody habitats, although the respective termites (on the chronization may allow the first workers to acquire iheir gcnus Ievel) are more widely distributed. The distribution of symbiotic fungal partners by collecting passively or actively the collected fungus-growing termites and their associated wind-dispersed sexual spores stiJI available in the direct fungi wcre correlated with plant species richness. vicinity of their bide and therewith sccure the horizontal Termites' gcnus-specific average dry biomasses of al! transfcr. '[bis synchronization is well illustrated in P. mili• lungus combs per m2 (0.6 m in depth) monolith were taris. Alates swarm duri.ng the short rainy scason when the dependent or scasons and also showed significant variation fructification of tbeir symbiotic fungus occurs during across habitat types. High fungus-comb biomasses respec• the long rainy season. These observations combined with tive of the genera living in habitats with high woody plant the longest durations of dcvclopmental stages in this specics species richness could be duc to the ample availability or could be considered as the reason or the consequence of the plant material. Generally high fungus-comb dry biomasses longest span time noted between their alate nuptial flight observed during the rainy seasons might represent the for• and symbiont fructification (sec Table 2). Whether this age provision (fungus combs and Termitomyces nodules) reflects the natural conditions remains, however, question• stored during the previous dry scasons as suggestcd by able, because the controlled expérimental conditions (see Gillon (1983). A decrease in termite foraging activities "Materials and methods") might have favored some and during rainy seasons (Dosso et al., 2010) might lcad to an disfavorcd other species. important consumption of these combs. ln addition. con• lt is known that the sarne fungal haplotype is sometimes sumption will probably be much reduced after the alates' sharcd between species wilh different transmission modes. nuptial ûight, but how the behavior of the remaining part of Fructification of their respective symbionL, however, only the colony changes and whetbcr some combs will then be occurs in species using horizontal transfc r and not in the oncs disused are unresolved questions. Howcver, one should using vertical transmission (e.g. Microtermes and Ancistro• cxpect a considerable growib of the comb biomasses during termes; Aanen et al., 2002; Nobre et al., 2010). The fungal the dry seasons, leading to a contradiction with our findings symbiont is thought to be the main dccomposer of ligno• (smallest biomasses during the dry seasons). Thcsc opposcd cellulose, although the exact function of the symbiont is still observations may be due to the fact that our field work was unclear and seems 10 differ between gencra and species carried out in the respective mid-seasons. (Reuland-Lefèvre et al., 1991; Bignell, 2000; Hyodo el al., According 10 Wood and Sands (1978) the nuptial füghts 2003; Ohkuma, 2003). Differences in nutritional require• may lead to a sudden Joss of 40% of the colony's biomass. ments of termites between genera and evcn species, and Hints of a changing behavior of the rcmaining part of the hcncc diffcrenccs in dcmands of the termites on their fungal colon y (Coaton, 1961) corne from the association of species symbiont to fulfill thcse requirements, may be a main from the genus Odontotermes with 7: microcarpus: here explanatory factor for the observed speci.ficity berween host termites seern Lo reduce some of their combs by ejecting and fungus and for the seasonal fructification of Termiro• piles of thcm (which laier on produce small basidiocarps). myces species, Whatcver their fungal spore transmission mode, the primordial comb was established in ail cxperimcntally kept Acknowledg.n.ents We would panicularly like to thank Jean-Bap• riste Kocassi. lssa Ouattara, Bcmnrd N'Goran and Richmond Aka for• ulate pairs that succeeded in rearing a fi.rst generalion of tbeir technical assistaace during the fieldworks. We aJso expressec our larvae. However, the problcm for lhe furthcr growth of such gratitude te Dr. Adamo Diawnra. Director of lhe GeophysicnJ Researcb incipleut colonies Lies in the succcssfuJ infestation of the Station of Lanuc for- free climatic data. We are most gratefu! to Pro• primordial comb with the specific viable fongus. As repor• fessor Dr. Ouur K. Aanen, Dr. Tânia Nobre (Plant Science Group, tcd by Johnson et al. ( 1981) and several othcrs (Grassé and Population Genetie Laborotory, University of Wageningen. The Netherlunds), Dr. Kolo Yéo (UFR-SN. Université d'Abobo-Adjamé, Noiret, 1955; Sands. 1960), all newly founded colonies of Côte d'Ivoire) and Prof. Guy Joscns (Systématique et Ecologie Ani· fungus-growing termite species with horizontal fongus male. Université Libre de Bruxelles. Belgique) and rwc anooymous transmission kept under luboratory conditions construci a rcviewcrs for- tbeir valuablc commcots nnd hclp in 1hc improvcmenl of this manuscript. 1be work was supponed by tbe Bioclîver-sity Transect comb. evcn though the comb is never inoculaied with a Analysis wesr Africa (BI0fA-Wes1) fonded by the Gennnn Fcderal viable fungus. Given that tbe lime needed for the production Ministry of Education and Resean:h (BMBF. FKZ 01 LC 00617A2). of primordial combs (Table 2) under our laboratory condi• tions parallels that in nature. the first generaLion of workers still appears during the fructification period of the genus• References specific symbiotic fungus. Fructification in the rccorded Tennitomyces species was found to occur species-specifi• Aa.nen D.K.. 2006. 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Dererminants of Termitomyces seasonal fructification 381

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Dating the fungus-growing termites' mutualism shows a mixture between ancient codiversification and recent symbiont dispersal across divergent hosts

T. NOBRE,"1 N. A. KONÉ,"t1 S. KO~ATÉ,t K. E. LINSENMAIR:j: and D. K. AA~EN• ·Laboratory of GeneHcs, Wageningen University, Droevendaalsestceg 1, Radix West, Building 107, 6708 PB Wageningen, The Netherlands, +UFR des Sciences de la Nature et de l'Environnement, Station d'écologie de Lamto, Université d'Abobo-Adja111é, BP 28 Nâouci, Côte d'Ivoire, :j:Theodor-B0ve1i-lnstih1t fiir Biouiissenschaiien der Unioersitiit Würzburg (Biozenirum), Lehrstuhl Tierokologie und Trapenbiologie (Zoologie Lli), Am Hubland, D-97074 Wiirzlmrg, Gl!mzany

Abstract The mutualistic symbiosis between fungus-growing termites and Termitomsjces fungi originated in Africa a.nd shows a mode.rate degrec of interaction specificity. Herc we estimate the age of the mutualism and test the hypothesis that the major splits have occurred simultaneously in the host and in the symbionL We present a scénario where fungus-growing termites originatcd in the African rainforest just before the expansion of the savanna, about 31 Ma (19-49 Ma). Whereas rougb age correspondence is observed for the four main clades of host and symbiont, the analysis reveals several recent events of host switching followed by dispersal of the symbiont throughout large areas and throaghout diffèrent host genera. The most spectacular of these is a group of closely related fungi (the maximum age of which is estimated to be 2.4 Ma), shared between the divergent genera Microtermes, Ancistroiermes, Acanihotermes and Sy11aca11thotermes (which diverged at least 16.7 Ma), and found throughout the African continent and on Madagascar. The lack of geographical differcntiation of fungal symbionts shows that continuous cxchange has occurrcd betwee.n regions and across host species. Keywords: African rainforest, age estimate, co-evolution, fungus-growing termites, mutualism origin, Termitonujces Receiued 23 f 11/y 2010; retnsian receioeâ 10 Felmtary 2011; accepteâ 2 March 2011

ploit complex plant substrates. As in other symbioses, Introduction complex patterns of interactions among groups of mul• Fungus-growing termites (subfamily Macrotermitinae) tiple species are observed (e.g. leaf-cutting ants: Mikh• have developed a sophisticated mutualistic symbiosis eyev et al. 2007; Dentinger et al. 2009; mycorrhiza: with a fungus (genus Tennitomyces), which they culti• Brundrett 2002; Hoeksema 2010). Fungus-growing ter• vate on combs constructed from faecal rnaterial within mites show moderate spedficity with their symbionts: their nests (Wood & Thomas 1989; Darlington 1994). monophyletic groups of the termites (i.e. usually either This mutualistic symbiosis is obligate for both partners: a single genus or several genera) are associated with the termites provide a constant, highly regulated monophyletic groups of fungi (Aanen et al. 2002; Rou• growth environment for their fungal symbionts, while land-Lefevre et al. 2002). the fungi provide food for the termites. Entering the ln most species of fungus-growing termites, a new symbiosis has allowed the fungi to overcome highly ymbiont is acquired when the first foraging workers unfavourable ecological conditions, and the termites to collect Termitomyces sexual spores from the environment, and thèse spores will becorne the inoculum for the fun• Correspondenœ: Tânia Nobre, Fax: +31317483146; gus garden of the new colony. This transmission mode E-mail: [email protected] is referred to as horizontal symbiont transmission 1These authors contributed equally ta this work; (reviewed in Korb & Aanen 2003). Only two cases of

© 2011 BlackweU Publishlng Ltd 2620 T. NOBRE F.T AL. vertical transmission are known, i.e., where Ter,uitomyces cover some 65% of the land surface of sub-Saharan vegetative spores are transported in the gut of alates, Africa (Scholes & Archer 1997; Sankaran el al. 2005). from a parental colony and used to inoculate the fungus Most extant fungus-growing termite genera can be comb of the newly founded colonies. Phylogenetic found in savanna habitats, probably due to several reconstructions indicate that this transmission mode has repeated colonizations by dilferent genera (Aanen & originated independently twiœ, once in the anœstor of Eggleton 2005). According to Eggleton et al. (1994), the the genus Microtennes and once in the species Macrotermes severe climatic fluctuations duri.ng the late Miocene bellicoeu« (Crassé & Noirot 1955; Johnson 1981; Johnson generated several pulses of speciation in termites. et al. 1981; Nobre et al. 2011). Severa! stud.ies have shown Recently, the date of origin of taxa of fungus-growing that transmission mode is not a strong predictor for the tennites has been estimated by Brandi el ai. (2007) and levels of host-symbiont specificity observed, and other obre el al. (2010). However, in both cases, the sam• factors need to be considered to explain the observed pied taxa were biased towards the taxonomical groups specificity patterns between fungus-growing te.nnites and being studied, the genera Macrotermes and Microtenm.>s, their symbionts (e.g. Aanen et al. 2002; Taprab el al. 2002; respectively. No corresponding estimates for the age of Nobre et al. 2010, 2011; Osiemo et al. 2010). the lungal symbionts have been made yet. ln this study. Fungus-growing termites are restricted to the Old• we estimate the age of the origin of Temtitomyces. World tropics (tropical Africa and parts of Arabia and Furthermore, we update the estimate of the age of lndomalaya). Phylogenetic reconstructions indicate that fungus-growing termites, using new seque.nce data, a within the termites, the transition to fungus cultivation compre.hensive sampling covering the main clades and has occurred only once, with no reversions to free• more accurate calibration based on newly discovered living states (Aanen el al. 2002), at least 30 Ma (Brandi fossils (Duringer et al. 2007). Specifically, we test the et al. 2007). This transition probably occurred in the hypothesis that the main associated clades of host and African rainforest, and the main radiation teading to symbiont have the same age. Alternatively, reœnt host• the extant genera probably took place in this habitat symbiont switches, possibly followed by dispersion of (Aanen & Eggleton 2005). The main African rainforest the lungal symbiont across divergent hosts, will give block is centred in the Congo Basin and extends to the different age estimates of associated partner clades. Atlantic ocean in the west (Plana 2004), so that west• central Africa is likely to be the central ancestral a.rea of Material and methods fungus-growing termites. Furthermore, the highest gen• eric richness of fungus-growing termites is found in the Taxon sampling tropical forests of west-œntral Africa, where all the described genera are found Œggleton el al. 1994; Kaml>• Samples were col.lected in Ivory Coast at two main hampati & Eggleton 2000; Aanen et al. 2002). For the localities: the reserve of Lamto located at 160 km north• termites, there is already support for this pattern of westem of Abidjan (a natural réserve of 2700 ha situ• 'out-of-Africa' migrations: into Asia, with only four ter• ated in the transition zone between semi deciduous mite genera occurring (exclud.ing the Asiatic genus forest and Guinean savanna) and in tree forests islands Hypotenm.'S which is derived from Odontotenues; Aanen of Ndouci, a city located at 125 km southeastem of et al. 2002) and into Madagascar, with only the genus Abidjan in the semi deciduous forest zone. At Ndouci, Microtermes being present (Nobre el al. 2010), whereas known to be a site of intense and permanent act.ivity of ail 10 genera are found in Africa. For Termitomyces, in termites, with mainly four sympatrie fungus·growing contrast, the pattern is less clear as more intercontinen• termite genera present-Ancistrotennes, Microtennes, tal migrations have occurred Lhan for their tennite hosts Odontotennes and Pseudacanthotennes (Josens 1972; (Aanen el al. 2002; Taprab el al. 2002; Nobre el al. Konaté 1998}-termites and nodules (modified unripe 2010). The dynamics within Africa remain unknown for mushroorns) were sampled while excavaring 12 mounds both symbiotic partners. in 12 diffèrent forest islands. Severa] species of termites ln Africa, the Oligocene (34--23 Ma) was characterized can (and were) recovered from a single mound, gener· by widespread rainforests throughout much of the ally be.longing to genera such as Andstrotermes, Microt• equatorial region and probably extending from coast to ermes and Pseudacanthotenues. At Lamto réserve, three coast (Pla.na 2004). Afterwards, Africa became more arid additional mounds were sampled: two colonies of and the sa.vanna habitats expanded to an actual area Ancistrotermes, two colonies of Microtemœs, one colony much larger than rainforest and by the late Miocene of Odontotermes, four colonies of Pseudacanthotermes and (12-5 Ma), rainforest were limited to small patches three colonies of Macrotemres. Altogether, termites and (Lancaster 1984; Plana 2004). At present, savanna Tennitomyces nodules were collected from 47 colonies ecosystems occupy a 61th of the global land surface and (10 Ancistrotermcs, 4 Macrotenues, 12 Microtermes, 11

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Odontotermes, 9 Pseudacanthotermes and 1 Acanthotennesï, cal regions were added to the tree, so that the 80 ter• by breaking down the mound until the comb was mites' haplotypes represent 102 sequences and the 47 exposed. Termites were hand-sorted in situ at the genus Termitomvœs haplotypes correspond to 116 sequences. level, and around 10 individuals per caste (workers and soldiers) were collected. Nodules on combs were Plzylogenetic nnnlysi directly collected using forceps. Ali samples wer stored in 1()0% alcohol and kept at 4° C. Termitomgces Bayesian inference was conducted using MrBayes basidiocarps coUected in the study area were also anal• version 3.0 (Huelsenbec.k & Ronquist 2001; Ronquist & ysed. These basidiocarps and their termite host were Huelsenbeck 2003). For the ITS fungal séquences, we collected by disrupting the mounds until the comb on used the Hasegawa-Kishino-Yano model (HKY + G), which the basidiocarp grew could be reached. and for the COI region, we used the general time-revers• ible (GTR) model with site-specific substitution rates (SSR, estimated separately for the three nucleotide posi• Data collection tions) as it was previously found to be the best fit model Termite workers were dried on filter paper previous to of sequenœ evolution (Aa.ne.n et al. 2002). The default DNA extraction. DNA was extracted separately from settings of MrBayes were used and with MCMC runs individual heads and abdomens using the Chelex being repeated twice as a safeguard against spurious method. The DNA extracted from the head capsules results. The first JD3 trees were discarded as hum-in, and was used for the termites' analyses. Fungal DNA was the remaining trees were used to calculate a majority rule obtained from fruiting bodies, nodules or from the ter• consensus tree. Stationarity was confirmed by analysis of mite abdom.ina. AU extraction products were stored at the log likelihoods and the consistency between runs. -20 °C. For the Tennitomyces symbiont, part of the nuclear Divergence dating ribosomal region induding the first intemaJ transcribed spacer (IT51), the 5.85 RNA gene and the second inter• Based on the estimated phylogénies, a selection of rep• na] transcribed spacer (ITS2) was amplified using a resentatives of the main host and symbionts' clades was standard PCR and the Termitomyces-speci.fic primer made for a more in-depth analysis using additional TTS1Fr in combination with an universal primer ITS4 as sequence data. For the symbionts, we used the indepen• described by Aanen et al. (2007). The termite mitochon• dent estimates for the age of the Agaricus node by Geml drial gene cytochrome oxidase subunit [ (COI) was el al. (2004). Therefore, we added to the analysis one amplified using a standard PCR and the primer pair sample of A. bisporus and one of A. campestris (species TL1862 and TH2877 (Aanen et al. 2002). AJJ PCR belonging to two divergent clades; Geml et al. 2004). products were then purified using the GenElute PCR Data on their outgroup, Chloropliy/111111 molybdites, wer clean-up kit (Sigma) and directly sequenced with the obta.ined from the work by Johnson & Vilgalys (1998). amplification primers. Sequencing was performed by For 15 selected symbiont samples and the two Agari• MWG Biotech. Throughout this manuscript, the symbi• CIIS taxa, in addition to the nudear ribosomal ITS region ont is identified usi.ng the name (or code) of the host (ITSl, 5.85 RNA gene and ITS2), two sequences were with which it was associated. determined: (i) 532 bp of the 255 nuclear RNA gene From the samples collected, we obtained 40 termites' (nLSU-rDNA) by using the primers 25S4R and ITS4R sequences and 41 Termitomgces' sequences. We induded (Aa.nen et al. 2002) and (il) 602 bp of the 125 mitochon• a selection of GenBank sequences that were chosen in drial RNA gene (mtSSU-rD~A) by using the universal such a way as to include at least one sample per clad primers MSl and MS2 (Whlte et al. 1990), but for two of earlier Macrotermitinae or Tennitomyces phylogenies samples, the specific primers ssufw105 and ssurev475 and span different geographical areas (Aanen et al. (Aanen et al. 2002) were used. 2002; Nobre et al. 2010; Osierno et al. 2010) (Supporting We reconstructed the phylogeny of the 15 selected information). ln this way, a total of 80 COI termite hapl• Tennitomyces taxa, together with the two Agaricu otypes were straightforward aligned, as no inser• séquences and their outgroup. After alignment of data tions/deletions had to be inferred and 47 fungaJ in MAFFT (as described above), the optimal model of haplotypes were aligned in MAFFT (Katoh et al. 2005) evolution was selected, separately for each of the under the option (L-INS-1: iterative refi.nement method three regions, using MrMODELTEST v. 2.2 (Posada & incorporating local pairwise alignments; gap opening Crandall 1998). penalty: 1.5 and gap extension penalty 0.14; The divergence of Agarirns frorn Chlorophvllum was 1PAM/ic = 2 scoring matrix for nucleotide sequences). estimated using calibrations based on other molecular Jdentical GenBank sequences from different geographi- dock studies on fungi and fossil data, as 15.5 ± 3.8,

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32.6 ± 8.1 and 73.3 ± 18.1 Ma (Geml et al. 2004), respec• Results tively. Although the authors refer preferably to the most ancient divergence time, and although th.is date has Phylogenetic nnnlysic been used by Mikheyev et al. (2010) to date the age of The reconstructed phylogeny of fungus-growing ter• the attine ant symbionts, we decided to perform three mites based on COI was congruent with previous anal• independent analyses, each using one of the three possi• yses (Fig. 1, left), with all genera being monophyletic, ble divergence times. Similar to the approach taken by with the known exception of Odontotermes, which Mikheyev et al. (2010), the node representing the diver• includes the exclusively Asian genus Hypotennes (Aanen gence of Agaricus from Chlorophyl/11111 was given a prior et al. 2002). Apart from the distinct geographical clade with a normal age distribution (mean = 16, 50 = 2; formed by the Malagasy Microtemres samples (Nobre mean = 33, 50 = 4 and mean = 73, 50 == 9). el al. 2010), and the Asiatic clades within each of the For 19 selected host taxa, in addition to the 931 bp of four genera Odontotermes, Macrotennes, Ancistroterme. the mitochondrial gene COI, two séquences were deter• and Microtemies, no other obvious geographical pattern mined: (i) 684 bp of the mitochondrial cytochrome oxi• was inferred. dase subunit Il gene (COU) using AtLeu and B-tLys as On the fungal symbiont side, the newly obtained Ter• in Brandi et al.(2007) and (ü) 294 bp of part of the mitomyces samples were analysed together with avail• nuclear ribosomal interna] transcribe spacer (ITS2) able ITS sequences from Africa (Benin, Gabon, Kenya, region using the primers ITS2 and lTS2F as in Jenkins Madagascar, Senegal and South Africa) and Asia. Sev• et al. (2001). As outgroups, three samples belonging to era! well-supported clades can be distinguished (Fig. 1, the Amitermes group-belonging to the subfamily Ter• right), e.g., the clade comprising aJJ symbionts of Mac• mitinae-were used and their sequences determined as roiermes and the clade comprising all symbionts associ• described earlier. Separately for each gene, the optimal ated with Odontoiermes and Protermes. The majority of mode] of evolution was selected using MrMODELTEST fungi associated with M.icrotennes form a clade together v. 2.2 (Posada & Crandall 1998). with most symbionts associated with A11cistrotermes, To détermine divergence dates, we used the Bayesian Synacanthotemzes and Allodontotermes, as well as with relaxed-clock uncorrelated exponential approach imple• two samples associated with Acanthotermes. A further mented in BEAST, version 1.5.4 (Drummond & Rambaut clade comprises the majority of the Pse11daca11thotermes 2007). For the host, the Odontotermes node was con• samples. strained to a minimum age of 7 Ma following a lognor• mal distribution Oognonnal mean = l .9, lognormal SD = 1.5, zero offset = 7) according to the dating of the Divergence dnting fossilized fungus comb reported by Duringer et al. The origin of fungus-growing termites was estimated to (2007). A second constrained node was used simulta• be at 31 Ma (credibility interval 16.7-48.8) using the neously, with a minimum age of 3.4 Ma Oognormal two fossil calibration points available (Odontotermes, mean = J .2, lognormal SD = 1, zero offset == 3.4) and Duringer et al. 2007 and M. jeanneli, Darlington 2005). corresponding to the age of the ancestor of Macrotenn The independent estimates for the Termitomuces symbi• jecmneli according to Darlington (2005). ont (Fig. 2) resulted in a large credibility interval in ail Both for the host and for the three independent sym• calibrations used, but in particular for the calibration biont analyses, the data were constrained to the clades based on the 73-Ma divergence date of Agariws. The obtained in MrBayes, and three Markov chain Monte calibration at 33 Ma dates the origin of Tennitomyces at Carlo searches were run for 10 000 000 generations 49 Ma (credibility interval 23.5-79.0). This estimate each. Convergence was assessed by using the log likeli• overlaps ·with the credibility interval estimated for the hood distributions of individual chains in Tracer vl.4 origin of the fungus-growing termites, ln the absence of (Drummond & Rambaut 2007). Typically, the fust 10 % an independent criterion to select the different esti• of the trees were discarded as barn-in, prior to results mates, we discuss this age estimate to illustrate the time being pooled in LogCombiner vl .5.4 and the trees being dynamics of the host-symbiont relationship, but we visualized. The topologies of the phylogenies obtained mention also the estimates obtained with the other from BEAST were similar to but not identic.aJ with the calibration ages. MrBayes phylogenies, and the main difference was the The credibility intervals for the age of the splits into position of the genera Microtermes and of the symbiont the extant termite genera are large. The support for the of Pseudacanihotermes: the fi.rst has a basal position in plit between the clade comprising Pseudncanthotenne. BEAST and not in MrBayes and the second is basal in the and Acanthotermes and the clade comprising ail the analysis with MrBayes and not with BEAST (see Support• other genera (Fig. 1) is low. lndeed, the BEAST analysi mg information).

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Fungus-growing termites Termitomyces D.5 (D-1] , .•.•.••••••..• -ta:541·.---- ~~ ·~ tl)Ctj""4A'l1'>161'1,.,.~,","IJ 1.D (0-2] f,,car,w_..,_~RtAIU'JrLOOEllll,El-t ...-.111•• M'oal--~·-i ,, ,. _ ••• ,,V" 2.3 (0-5] ,,, ,' I . 3,5 (1-7] 15.1 (8-24) 7.4 [2-14]

16.3 [4-31] I 1 I I I I Mk,oterme.a and A..nclal:rol•rm• I I I ï I ' ,.,_,,_·_-~..,._~--~mi, 4.8 [1-9] ,111--- -~.,..~_ '_°'-" .> _ ~,.,0.. •. 11:·t ·-li I !·J.~GG1t:iv1, &on-all~"- "l:"."f'ti• 16.1 [9-25] ,' 1D.D (3-19] ..,,O\....._ .•.•.•• ,oan~ ,' 22.D {741] 1

' I' I I B.1 [3-15] I 13.6 (8-21) 17.1 (6-31] I I 37.4[11-67]

I 2.5(1"'5)- I' ' 19.5 [1D--31J 5.3 [1-11]•• 12[2-Z

(Supporting information) indicates an initial split nonfungus growers, as the age estimates for the deepest between a clade comprising Microll!rmes and a clade nocles largely overlap with the estimates for the origin comprising ail the other genera. However, irrespectively of fungus-growing termites (Fig. 1). of the exact basal phylogenetic relationships, the initial The credibiliry intervals of the split into the main radiation into the genera is probably to have occurred clades for the symbiotic partners are always overlapping, shortly after the origin of fungus-growing termites from uggesting that these splits occurred simultaneously.

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0 two calibration points, we estimated the orlgin of the fungus-growing termites at 31.0 Ma (16.7-48.8). This is . ,..--,, ---·. -~ ----·-~- ~ ·- - J 20 J younger than the previous estimation at 62 Ma (30-108) (Brandi et al. 2007), although crectibility intervals over• 40 .l 1 t lap. The differenœ in both estimates results from the use of a second calibration point in the present study 60 and from a better coverage of Macrotennitinae species ni' .s>- and genera, as BrandJ and coworkers focused their (1) 80 work on the genus Macrolen11es. Another difference is ~ the methods used: whereas BrandJ et al. (2007) used Ê' MultiDivTime, which assumes that the rate variation is .~ 100 ê autocorrelated in ancestral and descendant lineages, we ~ have used BEAST, which allows rates to vary indepen• 120 dently. For the first time, we attempted to date the most 140 recent common ancestor of Termitomyces. However, in the absence of Termitomyces fossils, we used an indirect 160 calibration-the divergence of Agaric11s from Chloropltyl• /rm1 (Geml et al. 2004). Uncertainty on the estimated age 180-+------~-----~ of this node contributed to the uncertainty of the esti• 73 mya 33 mya 15.5 mya mation of the age of Termitomyces. Agaricus divergence (age of the node) The present age estimates for the origin of the hm• Fig. 2 Comparative dating of Termitomyces calibrated using gus-growing termite symbiosis (both for the host and three different ages for the Agaricus divergence according to for the symbiont) coincides with the beginning of the Geml et 11/. (2004). The grey box corresponds to the credibility Iigocene, when the rainforests (the reconstructed interval for Macrotermitinae. ancestral habitat of the group; Aanen & Eggleton 2005) were at the maximum of covered area in Africa (Plana 2004). Termite fungiculture is thus likely to have origi• However, some exceptions exist. For example, the wide• nated just before the expansion of the savanna began spread Termitomyces clade that Is shared between the (at the cost of rainforest area). The ambiguity in the divergent host genera Synacanthothemzes, Acanthatermes, phylogenetic identification of the first radiation event Ancistrotermes and Microtennes (Fig. 1), and between -reflected in basal relationships with low branch regions-lvory Coast, SenegaJ, Madagascar and South upport (e.g. this work, Aanen et al. 2002; Aanen & Africa-is of recent origin, 1.0 Ma (0.1-24). The most Eggleton 2005)-is consistent with a fast radiation into reœnt common aneestor of its hosts coincides with the the main genera shortly after the origin of the fungus• MRCA of ail fungus-growing termites, dated at 31.0 Ma growing termites and therefore still in the original (16.7-48.8). habitat. Whereas there is congruence between host and sym• biont estimates at the level of the main clades (Fig. 1), a Discussion comparison of the estimated age of particular host and symbiont clades also revealed severaJ inconsistencies, Phylogenetic analysis and divergence datin probably reflecting recent events of host switching fol• Dating phylogerues still remains unœrtain, with esti• lowed by dispersal through specific groups of the ter• mated divergence times varying with the DNA mite population. for example, most of the Microtermes region(s), calibration methods and the fossil calibration species have symbionts with a relatively recent origin point(s) used, as well as the number of taxa sampled (about twiœ as young as the genus Microtennes). How• and the accuracy of the recovered phylogeny (e.g. Mag• ever, even more striking is the Termitomuces clade of aUôn & Sanderson 2005; Britten et al. 2007; Ho & Phil• identical sequences shared between regions and lips 2009, Battistuzzi et al. 2010; Skinner 2010). between divergent genera (Sy11aca11thothennes, Acanthot• Therefore, the obtained divergence dates should be ermes, Ancistrotermes and Microtenues), of whlch the carefully interpreted as indicators of a time frame and maximum age is estimated to be 2.4 Ma. The minimum notas absolute ages. age of the most récent common ancestor of all these ter• Based on a phylogenetic analysis of a comprehensive mite genera would only correspond to the lower sample of species of fungus-growing termites, using boundary for the origin of the symbiosis, i.e., 16.7 Ma.

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host genera, becoming associated with several different Differe11ces in interaction specificily and recent host hosts across a large geographical area. To test how asso• swilches and dispersion eoents ciations arise and how specificity is maintained, future Transmission mode is not a strong predictor for the studies shou.ld focus on the fu.nctional patterns of the observed degree of host-syrnbiont specificity and geo• interaction between fungus-growing te.rmites a.nd their graphical patterns are not either. Pa.radoxically, our symbiont, on düferences in behaviour, nest architecture reconstructions show that on the one hand, the main and microdimate and on the deta.ils of symbiont trans• radiations into the extant genera of fungus-growing ter• mission and the frequency of horizontal vs. vertical mites have ocœrred simuJtaneously with their symbi• transmission across gene.ra, as the ex.isting evidenœ is ont, but on the other hand, several recent host switches based on only few studies (Grassé & Noirot 1933; John• of symbionts seem to have occurred across divergent son 1981; Johnson et al. 1981; Nobre et al. 2011). genera and throughout geographical areas. How can we explain these differences in interaction specificity and Acknowledgements which factors determine whether specificity wil.1 be maintained or Iost? One factor rnay be the role of the T .N. was supported by a Marie Curie lntra European Fellow• lungal symbiont. snip within the 7Ut European Community Framework Pro• The lungal symbiont is thought to be the main gramme UEF l'roject No 220077). N.A.K. and K.E.L. were supported by the Biodiversity Tmnsect Analysis Project in decomposer of lignoœUulose, although the exact lunc• West Africa 0310TA-West) funded by the German Federal tion of the symbiont is still unclear. Severa] lunctions Ministry of Education and Resean:h (BMBF, FKZ Ol LC have been proposed (recently reviewed in BigneU 00617 A2). OJ<.A. was supported by the Netherlands Organiza• 2011)-such as being an additionaJ source of protein• tion for Scientific Research (VTDI). rich and higher nitrogen value food (CoUins 1983; Tayasu et al. 1997) and/or an extra digestive chamber (Wood & Thomas 1989), helping in cellulose degrada• References tion through providing cellulases and xylanases to work Aanen OK. 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