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56567 6 899:2 Agradecimientos

Quiero agradecer a las personas que han aportado en mi formación de

profesional y más como persona, y que han hecho que este proceso responda a

mis expectativas y culmine de buena manera a través de la presente tesis de

investigación.

En primer lugar quiero agradecer de forma especial a mi núcleo familiar por

su apoyo incondicional en todos mis actos (papá, mamá y Tania), destacando que

en gran parte, gracias a ellos eh logrado cumplir este proceso como una de mis

metas... a ellos dedico este trabajo y dedicare muchos mas.

Por el lado académico agradecer y destacar a Leyla por ser la guía principal

de mi tesis y en esta ultima etapa de formación como profesional ayudarme a

desarrollar nuevas temáticas y actitudes personales, además mención especial

para el espacio físico y apoyo logístico que me otorgo, y que permitieron el

desarrollo de esta tesis de investigación, a Roger por su activa participación

directa, como copatrocinante y en mis primeras asistencias a congresos, y a

Antonio por sumarse a mi tesis, colaborando y mostrando siempre buena disposición a pesar de la distancia.

También de cerca destaco el apoyo de mi polola (Katty), de mi círculo cercano de primos y mis amigos de barrio, y a mis compañeros de laboratorio:

Daniela, Chalo, Jano y Zambra con los cuales afrontamos esta etapa en tiempos similares apoyándonos mutuamente.

A todos... Gracias...

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7 RE SU M E N RESUMEN .

Recientes avances en ecología molecular de especies marinas en otros océanos han mostrado que las bases históricas de diversidad necesitan ser reconocidas y entendidas (i.e. diferentes trayectorias de evolución de las especies). Además a nivel contemporáneo, varios estudios genéticos en especies marinas han demostrado la presencia de subdivisión poblacional, limites a la dispersión y barreras a la conectividad en el ambiente marino. Esto limita nuestro entendimiento de los procesos (históricos y contemporáneos) que conducen a la presente distribución de las especies.

A lo largo del Pacífico Sureste (PSE) numerosos gastrópodos marinos de la familia Muricidae son endémicos de esta costa y constituyen especies claves en las comunidades intermareales de la región. Acanthina monodon (Pallas,

1774), conocido localmente como caracol con diente, se distribuye en el intermareal y submareal somero, desde los 28º a 55º S, posee desarrollo holobentonico, con ausencia de una etapa larval de dispersión en la columna de agua.

En este trabajo se estudia, a través de marcadores moleculares y morfometría geométrica, el patrón geográfico de distribución de la diversidad genética y morfológica de A. monodon. Dada la extensa distribución de A. monodon esta espacie atraviesa todas la zonas biogeográficas propuestas para el PSE (Provincia Peruana, Área Intermedia, Provincia Magallánica) de aquí que, basados en una aproximación filogeográfica, se evalúa el efecto de los quiebres biogeográficos en esta especie. Los resultados indican que este gastrópodo marino presenta una alta diversidad genética a nivel de especie, con fuerte disminución de ésta hacia los extremos del rango de distribución y

8 con marcada estructuración genética-poblacional asociada a la biogeografía de la zona de estudio, sugiriendo influencia de la historia de vida de la especie y eventos históricos del área. Los patrones morfológicos demostraron variabilidad a través del rango estudiado, con variación morfológica asociada a las diferentes localidades y un quiebre morfológico concordante con un cambio en la conformación física de la costa del PSE.

9 ABSTRACT.

Recent advances in molecular ecology of marine species in other oceans have shown that the historical foundations of diversity needs to be recognized and understanding (i.e. different paths of evolution of species). In addition to contemporary level, several genetic studies on marine species have demonstrated the presence of population subdivision, limits to dispersal and barriers to connectivity in the marine environment.

Throughout the Southeast Pacific (SEP) Acanthina monodon (Pallas,

1774) (Gastropoda: Muricidae) is distributed in the intertidal and shallow subtidal, from 28 º to 55 º S, this species has holobenthic development with absence larval dispersal stage in the water column. In this study we analyzed, through molecular markers and geometric morphometrics, the geographical pattern of distribution of genetic diversity and morphology of A. monodon. Given its wide distribution, this species crosses all biogeographic zones proposed for the SEP, and therefore based on a phylogeographical approach; we evaluated the effect of biogeographical breaks in this species.

The results indicate that this marine gastropod has a high genetic diversity at the species level, with sharp decline of this towards the ends of the range of distribution and with and strong population genetic structure correlated with the biogeography pattern of the study area. The morphological patterns showed variability across its range distribution associated with different localities and a morphological break consistent with a change in the physical conformation of the coast along SEP.

10 INTRODUCCIO N.

La filogeografía es el campo de estudio relacionado con los principios y procesos que gobiernan la distribución geográfica de linajes genéticos, sobre todo aquellos entre y dentro de especies cercanamente relacionadas (Avise et al., 2000). Se ha situado a la filogeografía como punto de unión o intersección entre la macroevolución y la microevolución (Avise et al., 1987).

La filogeografía enfatiza aspectos históricos de la distribución espacial actual de linajes de genes utilizando información temporal (histórica) que ha sido posible obtener a partir del uso y análisis de la información contenida en las moléculas de ADN. Por supuesto, para el análisis e interpretación de las distribuciones de linajes se requiere de la contribución teórica, metodológica y/o conceptual de campos de conocimiento muy diversos, como la genética de poblaciones, genética molecular, demografía, etología, filogenia, paleontología, geología y geografía histórica (Avise et al., 2000).

Parte de la historia del surgimiento de la filogeografía viene entrelazada no sólo con el desarrollo de técnicas moleculares, sino también con el conocimiento de la molécula de ADN mitocondrial (mtADN) a mediados de la década de los 70’s. Sus propiedades más interesantes en términos filogeográficos son: (i) su alta tasa de evolución (sustitución) a nivel de secuencias de nucleótidos; (ii) su prácticamente nula recombinación; (iii) su gran variación intraespecífica y; (iv) su herencia estrictamente materna (con algunas excepciones).

Una de las aplicaciones más amplias de los estudios filogeográficos ha sido el poder determinar el grado de estructuración poblacional de las especies a lo largo de su área de distribución, así como descifrar cuáles han sido los

11 procesos que han determinado dicha distribución. Aplicaciones relevantes de los estudios filogeográficos (Eguiarte et al., 2007) corresponden a: (1) Inferir eventos históricos a través de la identificación de patrones geográficos de variación genética y la reconstrucción de rutas de migración de especies. (2)

Interpretar las respuestas bióticas a los cambios paleoclimáticos y paleoecológicos dando lugar a interpretaciones biogeográficas con valor predictivo de frente al inminente escenario de cambio climático acelerado. (3)

Comparar los resultados de especies co-distribuidas a fin de comprender los mecanismos de origen de la biodiversidad a una escala regional. (4) Realizar predicciones acerca de los patrones filogeográficos esperados bajo nuevas condiciones, en el pasado o futuro, o en áreas a ser exploradas por su diversidad. (5) Determinar el lugar de origen y las vías de dispersión de especies consideradas plagas o invasoras. (6) Reconocer poblaciones en riesgo de extinción. (7) Brindar datos teóricos para establecer prioridades de conservación de la biodiversidad, entre otros. (8) También frecuentemente abordados a través de la filogeografía han sido aspectos de sistemática y taxonomía.

En los últimos años, el estudio de patrones filogeográficos se ha extendido al estudio de múltiples especies co-distribuidas en lo que se denomina filogeografía comparada. La filogeografía comparada estudia los efectos de la historia y la biogeografía en la distribución de la variación genética de varias especies de una comunidad, esto es, estudios filogeográficos regionales que consideran los patrones espaciales de los linajes de múltiples taxa co-distribuidos (Eguiarte et al., 2007). La resolución de este tipo de estudios es mayor, puesto que permite evaluar las asociaciones entre procesos

12 poblacionales de diferentes taxa que han evolucionado independientemente, pero en las que los patrones regionales filogenéticos y geográficos son concordantes, lo que se considera como evidencia de la influencia de factores ecológicos y/o evolutivos en la estructura y la distribución de las especies.

Filogeografía en el ambiente marino.

La discusión de mecanismos de diferenciación genética ha sido tradicionalmente clasificada en función de la interacción entre rango geográfico y nivel de dispersión entre las poblaciones de una especie. Estas dinámicas

(espacial y temporal) constituyen factores críticos para definir, por ejemplo, cuando comienza la especiación (Levin, 2006). En ambientes marinos el escenario de “homogeneidad de amplia escala” ha sido ampliamente aceptado por la ausencia aparente de barreras a la dispersión también llamado

“paradigma de la conectividad” (Levin, 2006), que conduce a la expectativa general que invertebrados marinos y peces que poseen una fase larval tienen un mayor potencial de dispersión, y consecuentemente una débil estructura genética (Helberg et al., 2002), mientras que especies que carecen de una fase larval en su ciclo de vida presentaran bajo potencial de dispersión y una fuerte estructura genética. Sin embargo, la dispersión realizada por una especie puede ser influenciada por numerosos factores como procesos oceanográficos que incluyen remolinos y dinámica de surgencia (Moreno et al., 1998), morfología de la costa (Sköld et al., 2003), factores biológicos como comportamiento gregario de larvas (Toonen et al., 2001) o por acción antropogénica. Estudios recientes han reportado resultados inconsistentes con el paradigma de conectividad mostrando una falta de correlación entre el

13 potencial de dispersión (medido por la duración del estado pelágico) y la dispersión realizada (medida como flujo genético entre las poblaciones)

(Ruzzante et al., 1989; Kyle & Boulding 2000; Pogson et al., 2001; Jolly et al.,

2005; Kenchington et al., 2005; Florin & Höglund, 2007).

En cuanto a la distribución geográfica de los linajes genéticos se ha demostrado que patrones filogeográficos muestran concordancia entre quiebres genéticos y límites biogeográficos, existiendo en el ambiente marino varios ejemplos (Collin, 2001; Hellberg et al., 2001; Barber et al., 2002; Jolly et al.,

2005). La identificación de estos quiebres filogeográficos incluso ha llevado al reconocimiento de especies crípticas en ambos lados de las fronteras biogeográficas (Jolly et al., 2005).

Uno de los factores abióticos, que según la literatura, es relevante para la distribución de la biota marina es el patrón de circulación de las corrientes marinas. La circulación general del mar en las costas del Pacífico Sureste

(PSE) esta fuertemente influenciada por la circulación atmosférica de los vientos en esta área. Una corriente oceánica superficial conocida como Deriva del Oeste se divide al acercarse al continente (entre los 40º - 45º S), originando y regulando la circulación en las costas de Chile. Hacia el norte fluye la corriente de Humboldt, la cual es dividida en una rama oceánica y una Costera, alcanzando una profundidad aproximada de 300 a 400 metros. Ambas transportan aguas de origen subantártico de baja salinidad y de baja temperatura siendo la Corriente Costera más fría que la Oceánica (Camus,

2001). Por debajo de la rama costera de la Corriente de Humbolt, viaja una contracorriente subsuperficial, la Subcorriente Peruana Chilena, ubicada entre los 100 y 400 metros de profundidad. Fluye desde la zona norte del Perú hasta

14 la isla Grande de Chiloé transportando agua subsuperficial ecuatorial de alta salinidad y bajo contenido de oxígeno entre los 100 y 400 metros de profundidad. Junto a las anteriores, la costa del norte de Chile presenta una corriente superficial débil, denominada Contracorriente Costera de Chile que afecta hasta aproximadamente los 150 metros de profundidad y que transporta agua subtropical salada, cálida, rica en oxígeno desde el noroeste hacia el sur entre la Corriente Costera del Perú y la costa y parcialmente sobre la

Subcorriente Perú-Chile. La rama sur de la Corriente de Deriva del Oeste, la

Corriente del Cabo de Hornos, fluye paralela a la costa, bordeando hasta el extremo sur del archipiélago chileno continuando hacia el Este hasta unirse a la corriente de Falkland en el Atlántico. Las aguas superficiales transportadas por esta corriente, son una mezcla entre las aguas provenientes de los canales y

Agua Subantártica, conformándose un Agua Subantártica modificada, ya que presenta una menor salinidad. Esta corriente se une a la corriente circumpolar

Antártica en el Paso de Drake.

Otros factores abióticos relevantes en la distribución de la biota marina son 1) la forma de la costa y ancho de la plataforma continental, donde la forma de la costa influye en la intensidad de la surgencia costera (Figueroa & Moffat,

2000), mientras que la forma de la plataforma continental afecta la calidad de las aguas de surgencia. 2) Los vientos en la zona costera determinan parte importante de la circulación costera, y por lo tanto afectan aspectos importantes de la biología de las especies como tiempos de residencia o la simple advección de aguas. 3) La temperatura superficial del mar (TSM) en la zona costera donde los gradientes latitudinales de TSM explican una proporción significativa de las variaciones regionales en la abundancia de los grupos

15 funcionales más abundantes en la zona intermareal chileno (Broitman et al.,

2001). Por su parte factores históricos que determinan la distribución de las especies marinas a los largo del PSE son los eventos ENSO. En la fase de “El

Niño”, en la zona norte ocurre un aumento de la TSM, profundización de la termoclina y una disminución en el contenido de oxígeno en el agua, produciendo cambios ambientales que incluso pueden causar mortalidades masivas en invertebrados marinos, como se ha reportado para el molusco bivalvo Mesodema donacium (Miranda, 2001). También eventos como las glaciaciones afectan periódicamente la región sur austral desde el Pleistoceno dejando cubierta con una densa capa de hielo la costa desde los 41º S aproximadamente hacia el sur (Hulton, 2002).

La clasificación biogeográfica de Camus, (2001) para el PSE ha sido ampliamente aceptada y es utilizada frecuentemente como base para estudios científicos en macro-escalas espaciales, por el hecho de que en este estudio se integran y consideran gran parte de las clasificaciones biogeográficas existentes para la región. De acuerdo a esta, en el PSE existen tres grandes áreas biogeográficas : (i) la Provincia Peruana (PP), que corresponde a un área norte que incluye una biota templada-cálida desde los 6º a los 30° S aproximadamente; (ii) el Área Intermedia (AI), que corresponde a una zona extensa que incluye componentes de biota mixtos de ambas provincias biogeográficas contiguas, sin carácter ni rango biogeográfico definido, y la cual abarca desde los 30º a los 42º S aproximadamente.; (iii) y la Provincia

Magallánica (PM), la cual corresponde a un área con biota austral y que abarca desde los 42º a los 56º S aproximadamente (Fig. 1). Además, se han descrito dos zonas de transición, la primera alrededor de los 30° S, que ha sido descrita

16 como una zona de contacto, formada por difusión y migración secular entre la

Provincia Peruana y el Área intermedia, y otra alrededor de los 42º S la cual ha sido descrita como zona de transición inducida, producida por el régimen glacio- tectónico del Pleistoceno y la cual ha sido mantenida por barreras hidrológicas actuales (Camus, 2001) dejando aislada la Provincia Magallánica.

Filogeografía marina en Chile.

En esta área estudios filogeográficos son prácticamente ausentes. Esto limita nuestro entendimiento de los procesos (históricos y contemporáneos) que conducen a la presente distribución de las especies y el efecto de las transiciones entre las unidades biogeográficas, y en términos prácticos lo que conlleva al manejo de especies y políticas de conservación en la región. A la fecha existen sólo tres trabajos publicados con especies marinas de amplia distribución cuyos resultados son contrastantes y parecen estar ligados a la historia de vida de las especies y a eventos históricos de la región (Cárdenas et al., 2009; Tellier et al., 2009; Zakas et al., 2009).

Tellier et al., (2009) estudiaron el patrón filogeográfico en el alga parda intermareal Lessonia nigrescens, la cual se caracteriza por un escaso potencial de dispersión. Estos autores investigaron la concordancia entre el patrón filogeográfico y la transición biogeográfica situada en la zona de los 30-33° S.

La distribución de esta alga es continua a través de esta zona de transición.

Utilizando varios marcadores genéticos encontraron dos principales grupos divergentes, posiblemente especies crípticas, asociadas y concordantes con la transición biogeográfica, sugiriendo un origen común. Esta diferenciación estaría asociada a eventos históricos y contemporáneos en la región.

17 Por su parte, Zakas et al., (2009) analizaron dos especies de cirripedios

(Jehlius cirratus & Notochthamalus scabrosus) co-distribuidas abarcando desde los 28° a 34º S. Ambas especies presentan una etapa larval de duración similar en la columna de agua (~1 mes) (Venegas et al., 2000). Análisis con marcadores mitocondriales demostraron la presencia de un quiebre genético en la especie N. scabrosus que no muestra la especie J. Cirratus. Lo anterior correlacionado con una restricción en el reclutamiento de haplotipos de las poblaciones ubicadas al norte de los 30° S de N. scabrosus, sugiriendo diferencias significativas en presiones de selección o en la habilidad de dispersión entre ambas especies.

El gastrópodo murícido Concholepas concholepas, presenta una larva planctónica de gran duración (más de 3 meses en la columna de agua) y una amplia distribución geográfica que incluye las tres zonas biogeográficas de la costa del PSE. Cárdenas et al., (2009) realizaron un estudio de estructuración filogeográfico concluyendo que un escenario de “homogeneidad a gran escala” explica la presente distribución de la diversidad genética en C. concholepas y postulando que su extensa etapa larval le otorga una alta capacidad de dispersión, y consecuentemente una débil estructura genética. Una perspectiva comparativa con otros gastrópodos marinos nos dará una idea sobre la evolución de especies marinas en el PSE y la influencia de factores oceanográficos y biológicos.

Otro de los gastrópodos murícidos de amplia distribución a lo largo de las costas del PSE es Acanthina monodon (Pallas, 1774) conocido localmente como caracol con diente. A. monodon es abundante en el intermareal rocoso bajo y submareal somero (Osorio et al., 1979; Reid & Osorio, 2000)

18 distribuyéndose desde los 28º S hasta los 55º S sobre la costa de Chile (Fig. 2)

(Gallardo, 1979; Valdovinos, 1999), logrando establecer una conexión entre las tres provincias biogeográficas descritas anteriormente. Este murícido carnívoro se caracteriza por presentar desarrollo directo, donde los juveniles eclosionan directamente desde cápsulas ovígeras al ambiente marino (Gallardo, 1979). En la región central de Chile, las hembras mayores a 30 mm son sexualmente maduras, y depositan sus cápsulas entre Febrero y Julio (Soto, 2001), las cuales son adheridas al sustrato en estrechas agrupaciones sobre plataformas de rocas y/o cantos de rocas rodados en zonas de alta exposición al oleaje

(Gallardo, 1979). El desarrollo intracapsular de los embriones es directo y depende de embriones nutricios. El desarrollo del huevo dura alrededor de 70-

80 días a una temperatura de 10°C, y entre 55 y 65 días en temperaturas que varían entre 11º y 14°C (Gallardo, 1979). En el sur de Chile, entre el 6,6 y el

7,9% de los embriones completan su desarrollo, mientras que el resto es canibalizado por sus hermanos sobrevivientes (Gallardo, 1979).

Desde un punto de vista morfológico, A. monodon se caracteriza por poseer una concha espiral, oblicua, delgada o gruesa, la cual presenta un diente cercano al canal sifonal (Osorio et al., 1979), presenta un alto grado de polimorfismo que se ve reflejado a lo largo de su rango de distribución, donde exhibe gran variabilidad morfológica de la concha en términos de forma, color y tamaño (Osorio et al., 1979; Wu, 1985). Reid & Osorio, (2000) sugieren que esta especie se caracteriza por presentar, a nivel local, una concha gruesa de apertura estrecha y marcados dentículos en hábitat protegidos, mientras que exhibe una concha mas delgada, de apertura mayor y ausencia de marcados dentículos en hábitats expuestos, como producto de su capacidad de adhesión

19 al sustrato y resistencia al oleaje. Estas diferencias incluso, han hecho replantear su estatus taxonómico en variadas oportunidades, describiendo dos subespecies (i.e., A. monodon monodon (Solander, 1786) y A. monodon crassilabrum (Lamarck, 1789)) (Wu, 1985), o concretamente, dos especies para la región (i.e., A. unicornis (Bruguière, 1789) y A. monodon. (Pallas, 1774) basándose en análisis morfológicos (DeVries, 2003).

El ciclo de vida de esta especie carece de una etapa larval de dispersión, por lo tanto, siguiendo el “paradigma de conectividad”, se puede hipotetizar que entre las poblaciones de A. monodon existe poco o escaso nivel de conectividad espacial. Por otro lado, es una especie que atraviesa las tres zonas biogeográficas de Chile, convirtiéndose en un excelente modelo biológico para estudiar el efecto de las zonas de transición sobre la distribución de la diversidad genética en el PSE.

En este trabajo se estudia, a través de marcadores moleculares y morfometría geométrica, el patrón geográfico de distribución de la diversidad genética y morfológica de A. monodon. Dada la extensa distribución de A. monodon, la cual atraviesa todas la zonas biogeográficas propuestas para el

PSE (Provincia Peruana, Área Intermedia, Provincia Magallánica) y, basados en una aproximación filogeográfica, se evalúa el efecto de los quiebres biogeográficos en esta especie.

20 HIP O HIPO TESIS.

De lo anteriormente expuesto se desprenden tres hipótesis de trabajo, las cuales han sido evaluadas en el desarrollo de esta tesis de investigación:

(H1) A. monodon presenta poblaciones genéticamente estructuradas a lo largo de su rango de distribución.

(H2) A. monodon presenta quiebres genéticos concordantes con los dos quiebres biogeográficos identificados y descritos para el PSE.

(H3) A. monodon presenta un patrón de variabilidad morfológica que es concordante y sustentado por el patrón genético, y acorde a la biogeografía del

área.

21 OBJETIVO GENERAL .

(1) Estudiar la variabilidad genética y morfológica de las poblaciones de

A. monodon y relacionarla con los patrones biogeográficos descritos

para el PSE.

OBJETIVOS ESPECI FICOS.

(1) Caracterizar la diversidad genética de A. monodon a lo largo de su rango de distribución utilizando marcadores moleculares mitoncondriales.

(2) Determinar los patrones de estructuración espacial de la diversidad genética en las poblaciones de A. monodon.

(3) Determinar la variabilidad morfológica de A. monodon a lo largo de su rango de distribución.

(4) Relacionar las características biogeográficas del PSE con la distribución de los linajes genéticos y rasgos morfológicos de A. monodon.

22 MATERIALES Y METODOS . a.- Zonas de muestreo y Colecta de muestras.

Nueve poblaciones de A. monodon provenientes de nueve localidades del gradiente latitudinal de la costa del PSE (i.e., un total de 2.800 km aproximadamente), fueron analizadas con el objetivo de evaluar la variabilidad genética y morfológica. Con el fin de relacionar esta variabilidad con la biogeografía del área, se muestrearon al menos dos localidades por provincia biogeográfica siguiendo la caracterización propuesta por Camus. (2001). Los sitios de muestreos y la ubicación geográfica en cada provincia biogeográfica son mostrados en la Tabla 1. Se trabajó con un tamaño de muestra poblacional

(N) que permita inferencias estadísticas del polimorfismo en el nivel intra- poblacional (Waples, 1998). Un total de 30 individuos por localidad fueron colectados principalmente en épocas de marea baja desde el intermareal rocoso a través de colecta manual.

b.- Análisis Moleculares.

Inmediatamente después de la colección de los individuos, un trozo de tejido de 1 cm2 fue obtenido desde el borde del pie muscular de cada individuo y fue almacenado en etanol al 95% antes de la extracción de ADN.

Desarrollo de marcadores moleculares:

Durante el transcurso de la presente propuesta se estandarizaron marcadores genético moleculares para esta especie. Los datos genéticos fueron obtenidos a través de secuenciación de ADN mitocondrial. El marcador escogido fue el gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI) amplificado mediante los partidores descritos por Folmer et al., (1994). El gen COI ha

23 probado ser un poderoso marcador para muchas especies de invertebrados

(Folmer et al., 1994). Este marcador ha sido satisfactoriamente amplificado para otros gastrópodos murícidos endémicos del PSE, Thais chocolata (Genbank accesión number FJ610235F ) y Concholepas concholepas (Accesión number

EU517122–EU517458). Por otro lado, el uso de este marcador universal permitirá comparar los resultados de este estudio con otros resultados en diferentes océanos y con otras especies con diferentes ciclos de vida.

Amplificación mediante PCR y secuenciación del gen COI:

El ADN total fue extraído usando el protocolo del método extracción

Fenol: cloroformo (Sambrook et al., 1989). La amplificación, mediante PCR, fue realizada en una reacción de 25 µl conteniendo 5-50 ng ADN, 10 µM de cada

primer, 0,2 mM dNTPs, 3,0 mM MgCl2, 1x reacción Buffer y 0,125 U TaqDNA polimerasa (Fermentas 5 U/ µl). Para el PCR, se uso el siguiente perfil de ciclos: denaturación inicial a 95º C (5 min.) seguida por 40 ciclos de denaturación a 95º

C (45 s), alineamiento a 50º C (45s), y extensión a 72º C (45 s) con un paso final de extensión en los 72º C (10 min.).

Con el fin de eliminar impurezas post-reacción el producto final del PCR fue purificado usando E.Z.N.A. Cycle Pure Kit y fue enviado a secuenciar a la empresa Macrogen, Korea (www.macrogen.com). Tanto la extracción de ADN como la PCR (incluida purificación) fueron corroboradas a través de electroforesis en geles de agarosa al 1% y 1,5% respectivamente (ver Anexo I).

En función de minimizar los errores de secuenciación, ambas hebras fueron secuenciadas para cada individuo usando un secuenciador automático modelo ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (ver Anexo I).

Las secuencias fueron editadas usando el programa Proseq v2.91 (Filatov,

24 2002) y fueron alineadas mediante el programa ClustalX 2.0.9 (Thompson,

1997) y BIOEDIT (Hall, 1999) utilizando la opción de alineamiento completo incorporado en el primer programa. Posteriormente, los resultados fueron corroborados en forma manual a través de visualización de mutaciones.

Análisis de datos moleculares en A. monodon .

Diversidad genética

Indicadores de diversidad genética estándar tales como número de haplotipos mitocondriales (Nhap), número de sitios polimórficos (S), diversidad genética (He), número promedio de diferencias entre pares de secuencias (П1), así como diversidad nucleótidica (П2), fueron estimados tanto para A. monodon de forma integral como especie, así como también para cada localidad y cada provincia biogeográfica, usando el programa ARLEQUIN v3.11 (Excoffier et al.,

1992).

Estructura genética

Para probar las hipótesis de concordancia entre quiebres genéticos y limites biogeográficos reconocidos en el PSE sobre el rango de distribución de

A. monodon, se realizó un AMOVA (análisis de variancia molecular) (Excoffier et al., 1992) implementado en ARLEQUIN. La diferenciación y estructura genética fue estudiada usando un análisis jerárquico de la variación genética dividiendo la estructuración genética poblacional en tres componentes: Fst

(estructuración genética entre todas las poblaciones), Fsc (estructuración genética dentro de cada provincia biogeográfica) y Fct (estructuración genética entre provincias biogeográficas). Información molecular, i.e. el número de

25 diferencias entre haplotipos fue tomada en cuenta a la hora de realizar el análisis AMOVA. La significancia de los valores estimados de Fst, Fsc y Fct fue calculada por permutación no-paramétrica implementada en ARLEQUIN. Con el objetivo de determinar el agrupamiento que representa mejor los datos se realizó un análisis de SAMOVA (Dupanloup, 2002), el cual optimiza el valor de

Fct, agrupando las localidades de tal manera que se obtenga el mayor valor posible de este índice.

Relaciones entre haplotipos

Para analizar los patrones filogeográficos en A. monodon, árboles genealógicos conocidos como redes de haplotipos fueron construidos. Para la construcción de estas redes de haplotipos y con el fin de tomar en cuenta homoplasias y múltiples reticulaciones que son esperadas en el nivel intra- poblacional, se uso el algoritmo de Median Joining (Bandelt et al., 1999) el cual esta implementado en el programa Network 4.510 (Röhl, 1999).

Demografía histórica

Cuando el tamaño de muestra lo permite, se pueden inferir aspectos de la historia reciente de las poblaciones al llevar a cabo análisis basados en la teoría de coalescencia (Slatkin & Hudson, 1991), ya que ésta proporciona métodos para detectar eventos en el pasado de las poblaciones, tales como el incremento exponencial en tamaño, cuellos de botella o eventos fundadores

(Zink & Blackwell-Rago, 2000).

De manera sencilla, la distribución “mismatch” cuenta el número de diferencias entre cada par de secuencias en una población (Rogers, 2002) y el

26 resultado permite construir un histograma. Los datos de este histograma se comparan con el modelo de una población en expansión repentina. A través de la significancia estadística del estadígrafo χ2 estadísticamente significativa se acepta que la diferencia entre ambas no es debida al azar, y se observa en la estructura de la gráfica si las poblaciones experimentaron recientemente un crecimiento exponencial (Zink & Blackwell-Rago, 2000). La distribución mismatch es usualmente multimodal en muestras tomadas de una población en equilibrio demográfico, pero es generalmente unimodal en poblaciones que han sufrido una reciente expansión demográfica (Schneider et al., 2000). Un análisis de la distribución de “mismatch” fue calculado dentro de los principales linajes genéticos de A. monodon y comparado con un ajuste al modelo de Poisson usando el programa DNAsp (Rozas et al., 2003).

Por otro lado también el estadístico D de Tajima (Tajima, 1989) permite inferir parámetros demográficos históricos ayudando a verificar si la población se encuentra en expansión.

El estadístico D de Tajima se construye a través del computo del número total de sitios segregantes (es decir, S; sitios polimórficos) en la muestra y el número promedio de diferencias entre pares de secuencias (∏1). Las dos cantidades son estimadores del parámetro θ=4Nµ; y por lo tanto se esperan valores similares siempre y cuando la muestra se encuentre en equilibrio mutación-deriva (Simonsen et al., 1995). De aquí que si D= 0, entonces ambos estimadores dan el mismo resultado, el polimorfismo observado es neutro y se encuentra distribuido aleatoriamente. En cambio, si D resulta negativo indica un exceso de polimorfismos de baja frecuencia indicando expansión del tamaño población o selección positiva. Un valor D positivo indica bajos niveles de

27 polimorfismos de baja frecuencia y de alta frecuencia, mostrando una disminución en el tamaño poblacional o selección balanceante. Para probar la hipótesis de cambio demográfico histórico en A. monodon, el estadístico D será calculado para los principales linajes encontrados.

c.- Análisis de variación morfológica en A. monodon.

Para poner a prueba la hipótesis de que la variabilidad morfológica de A. monodon es concordante y sustentada por un patrón genético, y esta relacionada con la biogeografía del PSE se utilizó un modelo geométrico de análisis de forma por medio de coordenadas morfológicas (hitos) sobre las conchas de A. monodon. Este método consiste en estudiar la co-variación entre variables de forma (Bookstein, 1991), y considera la superposición de dos coordenadas de hitos, biológicamente homólogos, entre varios individuos que son proyectadas sobre un espacio tangente común en el cual se obtienen las variables de forma (i.e., “Relative warps”), libres de efectos de traslación, rotación y escala matemática (Rohlf & Slice, 1990), las cuales describen variaciones localizadas en la forma de la concha (i.e., cambios puntuales de coordenadas morfométricas). Aquellas variables de forma son usadas para generar análisis estadísticos y determinar la representación espacial de la forma y su variación.

Fotografías de la cara ventral de cada individuo de A. monodon fueron tomadas con una cámara digital modelo Power Shot A620 Canon 7,1x y un aumento de 4,7x. Para este análisis, a cada individuo se le digitalizaron 10 hitos morfológicos (Fig. 3), con el programa tpsDig2 (Rohlf, 2008). A partir de las imágenes digitalizadas de cada individuo de cada localidad, se generaron

28 sistemas de coordenadas x-y, las cuales fueron posteriormente alineadas a través del método GPA (“Generalized Procrustes Analysis”), permitiendo la remoción de varianza no atribuible la forma (Bookstein, 1997).

La función matemática “Thin-Plate Spline” (TPS), fue utilizada para inspeccionar visualmente los cambios morfométricos entre las diferentes localidades con respecto a su configuración de referencia. En forma paralela, configuraciones consenso para cada localidad y estimadores del tamaño geométrico (i.e., tamaño del centroide) fueron obtenidas. Con el objetivo de comparar la morfología entre localidades, un análisis de varianza (ANDEVA) fue realizado sobre la primera variable de forma (“Relative warp I”). Pruebas a posteriori HSD-Tukey fueron usadas como pruebas de comparación pareada

(Zar, 1999).

29 RESULTADOS .

Diversidad genética

Se analizó un fragmento del gen COI de un total de 605 bp para un total de 259 individuos desde nueve poblaciones a lo largo de la costa del PSE, desde los 28° S a los 53° S (2.728 Km). Sobre el total de los datos provenientes de la secuencias del gen COI se encontraron 52 sitios polimórficos (con un número total de 56 mutaciones), lo que ha llevado a un total de 46 haplotipos

(Tabla 1). El número promedio de haplotipos por población en la Provincia

Peruana (PP) fue de 4,5, en el Área Intermedia (AI) de 8,8 y en la Provincia

Magallánica (PM) de 3,7. No se encontraron haplotipos comunes a todas las poblaciones ni entre las tres provincias biogeográficas estudiadas. Solo un haplotipo se presento con alta frecuencia, con un 35% de frecuencia sobre el total haplotipos encontrados, correspondiendo al más representado en el AI, encontrándose en seis de las nueve localidades, cuatro en el AI (25%) y dos en la PM (10%).

La diversidad genética total (He) mostró un valor de 0,53 ± 0,27, sin embargo se encontraron fuertes variaciones entre poblaciones (Fig. 4). Se observa que la diversidad nucleotídica (π) fue baja en todas las poblaciones estudiadas (π < 0,005; Tabla 1). El promedio de He fue comparado entre las tres provincias biogeográficas no encontrándose diferencias significativas entre ellas (Kruskal Wallis; P = 0,677). El resto de los índices de diversidad genética tampoco presentó diferencias estadísticamente significativas entre provincias biogeográficas. En conclusión, a nivel regional no se observó algún patrón de concordancia entre la diversidad genética y el gradiente latitudinal ni con la clasificación biogeográfica trabajada, pero destacan los valores bajos de las

30 poblaciones provenientes de las localidades de los extremos de la distribución geográfica de A. monodon, comparado a las otras áreas geográficas muestreadas (i.e., Huasco, Pta. Arenas, ver Tabla 1).

A nivel local, la mayor diversidad genética fue encontrada en las poblaciones de Concepción (N=27) y Fiordos I.O. (N=26) con un total de nueve y ocho haplotipos respectivamente y un valor de He = 0,78 para ambas, mientras que las menores diversidades fueron encontradas en las poblaciones

Huasco (N=29) y Pta. Arenas (N=30) con un total de dos y un haplotipo, y valores de He = 0,25 y He = 0 respectivamente.

Estructura genética geográfica

El análisis de estructuración genética entre pares de poblaciones (Fst pareado) es mostrado en la Tabla 2. Se observa que las localidades con menor diferenciación genética están dentro del AI, siendo el Seno de Reloncaví y

Valdivia las localidades menos distantes genéticamente (Fst=0,041; P<0,001).

Por otra parte, las localidades de los extremos, Huasco y Totoralillo de la PP, y

Pta. Arenas de la PM, son genéticamente diferentes a todas las localidades analizadas (Tabla 2).

En cuanto a la distribución espacial de la diversidad genética, se encontraron resultados concordantes con la biogeografía descrita para el área estudiada (Tabla 3). El AMOVA reveló que las provincias biogeográficas (PP,

AI, PM) son significativamente diferentes entre sí (Fct=0,572; P<0,001). La estructuración entre poblaciones fue también significativa (Fst=0,799; P<0,001) y finalmente la diferenciación genética entre grupos dentro de provincias fue también significativa (Fsc=0,572, P<0,001). Los resultados del SAMOVA son

31 mostrados en la Tabla 3. Se observa que el agrupamiento que optimiza el valor de Fct, con un mayor valor de este (i.e., el que muestra un mayor nivel de estructura entre provincias) fue aquel correspondiente a cuatro grupos (análisis

3 de SAMOVA en Tabla 3).

Un patrón de aislamiento por distancia, típico de poblaciones que se conectan bajo un modelo poblacional de “stepping stone” fue evaluado mediante la realización de un test de Mantel (Fig. 5). Este análisis, donde se espera bajo comportamiento normal, una relación lineal directa positiva, ósea que a medida que aumenta la distancia geográfica (Km) aumente la diferenciación genética (medida como Fst) mostró un coeficiente de correlación bajo pero significativo (R2 = 0,549; P = 0,001), donde los datos forman dos agrupaciones de puntos (Fig. 5), con las mayores diferenciaciones genéticas mostradas por aquellas variaciones entre dos localidades que pertenecen a diferentes provincias biogeográficas y aquellas variaciones entre localidades de los extremos de la distribución (Huasco, Totoralillo, Pta. Arenas y Fiordos), de acuerdo a Guillot et al. (2009) este resultado en el test de Mantel corresponde a presencia de barreras históricas al flujo genético entre poblaciones, más que a un modelo poblacional genuino de aislamiento por distancia, pese a tener un valor medio-alto y estadísticamente significativo.

Patrones filogeográficos

La red de haplotipos construida para observar la distribución espacial de la diversidad genética se muestra en la Figura 6. En este análisis se observa la presencia dominante del Haplotipo 1 (H1), el cual es el más ampliamente disperso, encontrándose en todas las localidades de AI y dos de las tres

32 estudiadas en la PM. Este haplotipo presenta una ubicación central en la red por lo que se podría sugerir que corresponde a un haplotipo ancestral (ver

Posada & Crandall, 2001). A partir del Haplotipo 1 surgen numerosos haplotipos alejados, principalmente, por solo un paso mutacional de este, la mayoría pertenecientes al AI y en menor grado a la PM. Un segundo haplotipo de alta frecuencia corresponde al Haplotipo 2 (H2), el cual esta presente sólo en el AI, lo que la diferencia de la PM. En resumen, el AI corresponde a la zona donde se observa mayor diversidad de haplotipos organizados en un patrón llamado

“tipo estrella”, donde sólo un haplotipo central y muy poca diferenciación entre haplotipos, sugiriendo un origen común y una reciente expansión demográfica en esta área.

Al mirar en detalle la distribución de los haplotipos en la PM y considerar la presencia del H1, se observa que dos de las tres localidades (Fiordos) lo comparten en una proporción similar a las localidades del AI surgiendo los haplotipos de estas localidades desde el H1. Una situación particular se observa en la localidad de Punta Arenas, con la menor diversidad genética y donde se encontró un haplotipo único, el cual está alejado del resto de las poblaciones, destacando que esta localidad está relativamente más alejada también en términos geográficos.

Con respecto a la PP, en esta área se encuentran las localidades más alejadas genéticamente en esta red (Fig. 6). En esta zona, las dos localidades consideradas están alejadas por 5 pasos mutacionales con respecto al

Haplotipo 1. Se observó un gran número de haplotipos únicos y casi todos son privados pertenecientes exclusivamente a la PP, excepto un haplotipo que es compartido con una localidad del AI (Las Cruces), la cual corresponde a la

33 localidad más cercana a la PP. destaca la distribución de haplotipos dentro de la PP donde se observa una clara diferenciación entre sus dos localidades, las cuales no comparten ningún haplotipo, además se hace evidente la escasa diversidad genética de esta zona (i.e. población Huasco).

Demografía histórica

La distribución de “mismatch” y el estadístico D de Tajima (Fig. 7A) muestran que para todas las localidades integradas existe un patrón multimodal con un test de Tajima negativo pero estadísticamente no significativo (P>0,05).

Debido a que el patrón de la red de haplotipos y los análisis de estructuración genética demuestran la presencia al menos tres linajes mayores asociados a la biogeografía del área, las localidades estudiadas se agruparon de acuerdo a su provincia biogeográfica. Los resultados para la PP y la PM (Fig. 7 B-D) muestran un patrón multimodal y un valor de D de Tajima negativo y positivo respectivamente, pero no significativo sugiriendo que estas regiones están en equilibrio mutación-deriva (Schneider et al., 2000; Rogers, 2002).

Sin embargo en el AI (Fig. 7C), se observó un patrón de distribución mismatch del tipo unimodal, donde los valores observados se sobreponen de forma total a los valores esperados bajo un modelo de expansión repentina, lo cual se correlaciona con el hecho de que el estadístico D de Tajima entregó un valor negativo y significativo (Tajima D= -2,434; P=0,01), sugiriendo un crecimiento demográfico reciente para las localidades de esta área biogeográfica.

34 Variabilidad morfológica en A. monodon

Los resultados mostraron variabilidad morfológica de la concha con presencia de varios morfos a través de las nueve poblaciones analizadas en este estudio en las costas del PSE. Con respecto a la varianza morfológica, la variable de forma I (Rw I) explicó un 67,70% y la variable de forma II (Rw II) explicó un 17,14%, sumando entre ambos un 84,84% de la varianza total explicada. La función matemática “Thin-Plate Spline” (TPS) mostró que los hitos que contribuyeron de mayor forma a la variación morfológica de A. monodon fueron aquellos relacionados con el grosor del labrum sobre el eje x (hitos 6 - 7), y aquellos relacionados con la longitud de la espira en el eje y (hitos 1 - 9 - 10).

La variación espacial morfológica de las poblaciones de A. monodon es mostrada en la Fig. 8A, donde se observaron dos grupos de localidades diferenciados por la primera variable de forma. Aquí, los dos grupos muestran una diferenciación dada sobre todo por los hitos 1, 9 y 10 sobre el eje y. En el primer grupo se encuentran las localidades de Huasco y Totoralillo pertenecientes a la Provincia Peruana que pasan a agruparse con las localidades de Las Cruces, Concepción y Valdivia del Área Intermedia, y la localidad de Punta Arenas de la Provincia Magallánica. El segundo grupo esta compuesto por las localidades del Seno de Reloncaví y las dos localidades de los Fiordos pertenecientes a la Provincia Magallánica.

Al graficar la distribución latitudinal de la variable de forma I (Fig. 8B), junto con las configuraciones consenso para cada localidad, se evidencia el patrón anterior, no observándose relación con la clasificación biogeográfica trabajada, pero si una discontinuidad morfológica discreta ca. 41º S, con una diferenciación en dos grupos, las localidades al norte y sur de esta latitud. Esta

35 discontinuidad es coincidente con un cambio en la conformación física de la costa del PSE, donde se pasa de una costa típicamente expuesta y abierta a una costa más bien protegida, caracterizada por canales y fiordos. Sin embargo también se observa la particularidad de la localidad austral de Punta Arenas, la cual morfológicamente, y de acuerdo a la variable de forma I, pasa a agruparse con las localidades del norte. Otro punto relevante es que esta localidad fue la que presentó la menor desviación estándar.

El patrón de variación morfológica, a nivel regional, se resume en una mayor variación sobre el eje y, donde las poblaciones al sur de los 41° S (con excepción de Punta Arenas), presentan una espira de mayor longitud que las poblaciones del norte, presentando una extensión del ápice en los individuos en las poblaciones del sur del quiebre en lo que se refiere a la concha de A. monodon.

Sobre la variable de forma I, el análisis estadístico mostró que las medias fueron significativamente diferentes entre localidades (ANDEVA, F(8g.l.) =

169,877; P < 0,001). Las comparaciones pareadas entre localidades mostraron diferencias entre los dos grupos de poblaciones antes descritos y diferencias entre localidades dentro de estos también (Tabla 4). Además no se atribuye relación con el tamaño de los individuos (Fig. 9).

36 DIS CU SIO DISCUSIO N

Los análisis realizados entregan nueva información acerca de la historia ecológica y evolutiva de A. monodon. Los patrones de diversidad, estructura genética, y variabilidad morfológica en nueve localidades distribuidas a lo largo del rango de distribución de A. monodon en las costas del PSE (i.e 2800 km de costa aproximadamente) demostraron que este gastrópodo marino presenta una alta diversidad genética a nivel de especie, con fuerte disminución de ésta hacia los extremos del rango de distribución y con marcada estructuración genética-poblacional asociada a la biogeografía de la zona de estudio. Los patrones morfológicos demostraron variabilidad a través del rango estudiado, con variación morfológica asociada a las diferentes localidades y un quiebre morfológico concordante con un cambio en la conformación física de la costa del PSE.

La diversidad genética encontrada (He total = 0,53) en este estudio para

A. monodon se encuentra dentro del rango reportado para otras especies de gastrópodos marinos en otras áreas geográficas (Tabla 5). Sin embargo, esta diversidad genética muestra fuertes fluctuaciones entre las poblaciones analizadas, demostrando disminución de la diversidad hacia los extremos del rango de distribución de la especie. Esta situación es esperada en poblaciones periféricas donde al menos dos características son consideradas importantes en definir la estructura de estas poblaciones. Primero, poblaciones periféricas están generalmente fragmentadas en parches siguiendo la parchosidad de ambiente (Brown et al., 1996), una característica que favorece procesos mutacionales (Holt & Keitt, 2000). Segundo, debido a que hábitats marginales son menos apropiados que aquellos del centro del rango de distribución, la

37 adecuación biológica individual y la tasa de crecimiento poblacional será menor en poblaciones periféricas que en aquellas del centro del rango de distribución

(Maurer & Taper, 2002). De este modo, se espera que las poblaciones marginales presenten un tamaño efectivo poblacional reducido y experimenten fuerte deriva genética. Como consecuencia de lo anterior se observa reducida diversidad genética dentro de estas poblaciones periféricas y un incremento de la diferenciación genética entre ellas (e.g. Faugeron et al., 2004). Además, la diferenciación genética en estas poblaciones periféricas también podría surgir por procesos de adaptación local a estos ambientes marginales (van Rossum et al., 1997).

La diversidad genética en A. monodon presentan un patrón de estructuración genética-poblacional asociado a la biogeografía del área. Uno de los mecanismos que podrían explicar esto es el propuesto en el “paradigma de conectividad” (Levin, 2006). De acuerdo a este paradigma para el caso de A. monodon, con un ciclo de vida holobentónico que carece de una etapa larval de dispersión (Gallardo, 1979), se espera un mayor grado de estructuración genética-poblacional debido al escaso o nulo flujo genético entre sus poblaciones. A lo largo de la costa del PSE son escasos los trabajos que han puesto a prueba este paradigma. Cárdenas et al., (2009) estudiaron el gastrópodo murícido C. concholepas. Este gastrópodo tiene un ciclo de vida indirecto con una extensa fase larval. En esta especie se reportó débil estructuración genética-poblacional sin relación con la biogeografía del área. De aquí que, las hasta ahora dos especies de gastrópodos marinos estudiados en la costa PSE (A. monodon y C. concholepas) muestran patrones de diversidad y estructuración genética concordante con el paradigma de conectividad. Otros

38 ejemplos acordes a este paradigma han sido reportados en otros invertebrados marinos, como por ejemplo en el género Littorina en el Pacífico Noroeste (Lee &

Boulding, 2009) y Crepidula en el Atlántico Norte (Collin, 2001). Sin embargo,

Weersing & Toonen, (2009) mediante un meta-análisis evaluaron la correlación entre el potencial de dispersión y el nivel de conectividad en organismos marinos. De acuerdo a estos autores, la duración de la larva en el plancton por si sola no explica todos los patrones genéticos encontrados y por lo tanto, otros factores como la conducta de la especie y la variabilidad ambiental debieran ser considerados.

La hipótesis de concordancia entre quiebres genéticos con límites biogeográficos ha sido documentada en otras partes del mundo (Avise, 2000;

Collin, 2001; Hellberg et al., 2001; Barber et al., 2002; Jolly et al., 2005). Con respecto al PSE, quiebres genéticos en el limite biogeográfico cercano a los 30°

S han sido reportados previamente en organismos marinos con diferente potencial de dispersión. En algas pardas que poseen escasa capacidad de dispersión, se encontraron dos grupos divergentes, posiblemente especies crípticas asociados a este quiebre biogeográfico (Lessonia nigrescens, Tellier et al., 2009) y en cirripedios, con una etapa larval de dispersión dada por una fase larval de alrededor de un mes en la columna de agua se encontraron restricciones al reclutamiento de ciertos haplotipos (Notochthamalus scabrosus,

Zakas et al., 2009). Contrario a estos patrones previos, C. concholepas, con extensa fase larval no evidencia efectos del quiebre biogeográfico (Cárdenas et al., 2009). A estos resultados se suma el presente estudio en A. monodon en donde las poblaciones de la Provincia Peruana se encuentran diferenciadas

39 genéticamente del resto, reportándose un quiebre genético concordante con el biogeográfico ca. 30° S.

Con respecto al límite biogeográfico cercano a los 42° S, a pesar de ser un quiebre biogeográfico mayor (Camus, 2001) con fuerte evidencia de la existencia de este quiebre en organismos marinos (Valdovinos et al., 2003;

Hernández et al., 2005; Moreno et al., 2006), no existen estudios filogeográficos previos a excepción de Cárdenas et al (2009), donde no se encontró ningún efecto sobre la estructuración genética-poblacional de C. concholepas. En el caso de A. monodon un quiebre genético concordante con los 42º S es reportado, aunque con menor diferenciación genética que el quiebre de los 30º

S. La historia de este quiebre podría ser la esperada en áreas donde las glaciaciones han tenido un efecto fuerte en la estructuración genética de las poblaciones (Hewitt, 2000). Ambas regiones biogeográficas muestran un haplotipo común y dominante (H1). Lo anterior, sugiere un origen común para las poblaciones de ambas provincias biogeográficas, lo cual es concordante con la historia del área donde el efecto de las glaciaciones pudo haber erosionado las poblaciones del sur de los 42º S (Hulton et al., 2002). Estas poblaciones fueron posteriormente recolonizadas por poblaciones refugio ubicadas al norte de los 42º S. Este proceso generó la presencia de un haplotipo ancestral común entre ambas provincias biogeográficas (H1). Siendo la actual constitución de metapoblaciones responsable de que nuevos haplotipos surjan aumentando gradualmente la diferenciación hacia el sur, siendo la población mas austral la más diferente genéticamente del resto (Pta. Arenas, un haplotipo único) (Hewitt,

2000).

Un resultado que llama la atención es que las diferentes provincias

40 biogeográficas PP y AI comparten un haplotipo en común, dado sólo por dos individuos, localizados específicamente entre las poblaciones de Las Cruces y

Totoralillo, las cuales son mas cercanas a ambos lados del limite biogeográfico.

De acuerdo con esto, esta situación parece ser una situación fuera del patrón conocido y no representa al patrón general dado por el resto de las poblaciones, siendo producto de factores externos como acción antropogénica.

Variación morfológica de A. monodon

Los moluscos gastrópodos marinos exhiben una variedad de formas en su concha, ya que muchos de ellos están expuestos a condiciones ambientales que desestabilizan un patrón de variación. Así, la variabilidad morfológica de A. monodon en la costa del PSE, parece seguir un patrón de variación (i.e., presencia de varios morfos a través de su distribución), debida a su tipo de desarrollo y a la heterogeneidad ambiental en la cual habita, lo cual concuerda con los múltiples replanteamientos taxonómicos propuestos por varios autores

(e.g., Forcelli, 2000; DeVries, 2003).

Los resultados morfométricos mostraron una discontinuidad morfológica discreta cercana a los 41° S, respaldada por un 67% de varianza morfológica, lo cual es coincidente con un cambio en la conformación física de la costa del

PSE, donde a partir de esta latitud se pasa de una costa típicamente expuesta en el norte a una costa mas bien protegida hacia el sur, separando dos grupos de localidades. De acuerdo a los análisis morfológicos, esta separación estaría dada por la variación en la longitud de la espira. Vermeij (1974) sugirió que gastrópodos marinos que presentan una espira de menor longitud estarían bajo presiones de depredación. En este mismo sentido Reid & Osorio, (2000), en

41 una escala espacial local, sugirieron que A. monodon se caracteriza por presentar una concha de mayor grosor y menor apertura en ambientes costeros protegidos, mientras que presenta conchas más delgadas y mayores aperturas en ambientes costeros expuestos, de acuerdo a estos autores, condiciones que estarían sujetas a la exposición al oleaje y a la capacidad de adhesión al sustrato por parte del pie de los organismos, en nuestros resultados este patrón no se observó a macro-escala a pesar de analizar poblaciones en un gradiente latitudinal en el PSE que va desde una costa abierta (28 a 41º S) a una costa protegida (42 a 53º S).

Por otro lado, y considerando la división mayor en dos grupos de localidades, podemos decir que se observaron diferencias significativas dentro de estos también, esto sumado a los resultados obtenidos para la localidad de

Punta Arenas, donde esta última se agrupa morfológicamente con las localidades al norte de los 41º S, de acuerdo a la variable de forma I. Esta agrupación sugiere que las condiciones ambientales de esta localidad podrían ser similares a las del norte del gradiente, y que la morfología física de las conchas de A. monodon no tiene relación sólo con el patrón general mayor de la costa del PSE, sino que además las localidades tendrían un componente

“adaptativo” localidad–específico importante. Así, la variabilidad morfológica de

A. monodon podría estar sujeta a variaciones ambientales dadas por la variación biológica del micro-hábitat de cada localidad, como por ejemplo la presencia de depredadores, ya que se ha descrito que la presencia de depredadores puede influir sobre la variabilidad morfológica en moluscos

(Palmer, 1979; Reimer & Harms-Ringdahl, 2001; Caro & Castilla, 2004).

42 Análisis integrado

Los análisis genéticos complementados por análisis morfométricos han sido realizados en algunos moluscos a menor escala en el hemisferio norte

(Souza et al., 2007; Guerra-Varela et al., 2006). En el caso de A. monodon, este es el primer ejemplo que integra ambas aproximaciones, abarcando todo el rango de distribución de la especie, por lo que estos datos pueden considerarse pioneros en el estudio de la diversidad genética y morfológica a lo largo de la costa del PSE. Los resultados muestran diferentes morfos provenientes de diferentes poblaciones que presentan una misma constitución del gen COI

(haplotipo 1) (Fig. 10). Esto evidencia la presencia de un solo taxa con alta variabilidad morfología.

Por otro lado, el quiebre entre la PP y el AI resultó evidente en los análisis genéticos contrario a lo mostrado en los análisis morfométricos. Por ejemplo, las localidades de Totoralillo (~30º S) y Las Cruces (~33º S) presentaron altos valores de diferenciación genética (Fst=0,783, p<0,001) pero la diferenciación morfológica entre ambas localidades no fue significativa.

Situación contraria ocurre con las localidades de Valdivia y S. Reloncaví, dos localidades que son cercanas y se diferencian morfológicamente (Rw1, p<0,001) pero genéticamente son similares (Fst=0,041, p=0,012). Por otro lado no se observa alguna relación entre los índices de diversidad genética y la variabilidad morfológica (medida por la desviación estándar en la variable de forma I), salvo en la localidad más austral de Punta Arenas que fue la localidad que presentó la menor diversidad genética y la menor variabilidad morfológica, indicando grado de homogeneidad de los individuos de esta población.

El ambiente intermareal se caracteriza por una gran variabilidad espacio-

43 temporal, consecuencia de esto es la gran variación de formas en la morfología de las conchas de gastrópodos marinos. Guerra-Varela et al. (2009) estudiaron el valor adaptativo a nivel local en la morfología de la concha del gastrópodo carnívoro Nucella lapillus, un murícido con desarrollo directo que habita el intermareal rocoso de la costa noroeste de España. Utilizando marcadores mitocondriales y nucleares, estos autores encontraron baja diferenciación genética entre las localidades estudiadas. Sin embargo, reportaron diferencias significativas en la morfología de la concha entre localidades estudiadas y altos niveles de heredabilidad de estos rasgos (h2 promedio= 0,55 ± 0,13), las cuales parecen estar asociadas al grado de exposición al oleaje y al nivel en el que se encuentran los organismos en el intermareal. De acuerdo a lo sugerido por estos autores, la falta de correlación entre la variabilidad de rasgos morfológicos y genéticos podría deberse al uso de genes neutrales y no relacionados a la morfología de la concha. De aquí sugerimos la necesidad de estudios de plasticidad fenotípica y genética cuantitativa para determinar si el patrón latitudinal de la concha reportado en este estudio se debe a procesos regionales de selección natural o eventos específicos de adaptación local.

Implicancias taxonómicas de este estudio

En moluscos, las características de la concha han sido ampliamente usadas en la identificación de especies. Sin embargo, su uso exclusivo para estudios sistemáticos y taxonómicos es controversial y, en al menos algunos casos necesitan ser complementados por análisis genéticos (Wilke &

Falniowski, 2001). La última clasificación propuesta para A. monodon en el

PSE fue efectuada por DeVries (2003) en base a morfología y evidencia fósil

44 reciente. El autor describe dos especies contemporáneas para PSE: A. unicornis (Bruguière, 1789) caracterizada por una concha gruesa y por el borde interior del labio externo a veces fuertemente dentado, con una distribución geográfica que abarca desde los 29° a los 42°S y A. monodon (Pallas, 1774) caracterizada por una concha típicamente imbricada y usualmente un labio exterior no grueso con un rango de distribución desde los 45°S en el Pacífico hasta la provincia de Santa Cruz, Argentina en el Atlántico. Sin embargo,

DeVries, (2003) destaca la dificultad de diferenciar ambas especies morfológicamente, debido al grado de combinación de rasgos morfológicos que se produce en algunas zonas, nombrando incluso una forma intermedia “A. acuminata” (Sowerby, 1835) que estaría en el sur de Chile (~ 40º - 45º S).

En base a lo anterior y de acuerdo a nuestros resultados, que abarcaron todo el rango de distribución en cuestión para el PSE y tomando en cuenta el amplio espectro de morfos que tienen la misma composición genética (Fig. 10), destacando que ocurren morfos probables tanto para A. unicornis y A. monodon es que se propone que a lo largo de la costa PSE existe sólo una unidad taxonómica, la cual estaría denominada como A. monodon.

45 REFERENCIAS .

Avise, J.C., Arnold, J., Bal, R.M., Bermingahm, E., Lamb, T., Neigel, J.E., Reeb, C.A. & Saunders N.C. (1987). Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics 18: 489-522.

Avise, J.C. (2000). Phylogeography, the history and formation of species. Harvard University Press, Cambridge, MA. 447 pp.

Bandelt, H.J., Forster, P. & Röhl, A. (1999). Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution 16: 37-48.

Bookstein, F.L. (1991). Morphometric tools for landmark data. Geometry and biology. Cambridge University. Press, New York. 435 pp.

Broitman, B.R., Navarrete, S.A., Smith, F. & Gaines, S.D. (2001). Geographic variation of southeastern Pacific intertidal communities. Marine Ecology Progress Series 224: 21–34.

Brown, J.H., Stevens, G.C. & Kaufman, D.M. (1996). The geographic range: size, shape, boundaries, and internal structure. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 27: 597–623.

Camus, P.A. (2001). Biogeografía marina de Chile continental. Revista Chilena de Historia Natural 74: 587-617.

Cárdenas, L., Castilla, J.C. & Viard F. (2008). A phylogeographical analysis across three biogeographical provinces of the south-eastern Pacific: the case of the marine gastropod Concholepas concholepas. Journal of Biogeography. 36: 969–981.

46 Caro, A. U. & Castilla, J.C. (2004). Predator-induced defences and local intra- population variability of the mussel Semimytilus algosus in central Chile. Marine Ecology Progress Series Vol. 276: 115–123.

Collin, R. (2001). The effects of mode of development on phylogeography and population structure of North Atlantic Crepidula (Gastropoda: Calyptraeidae) Molecular Ecology 10: 2249–2262.

DeVries, T.J. (2003). Acanthina Fischer von Waldheim, 1807 (Gastropoda: Muricidae) an Ocenebrine Genus Endemic to South America. The Veliger, 46 (4): 332-350.

Dupanloup, I., Schneider, S. & Excooffier, L. (2002). A simulated annealing approach to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology 11 (12): 2571-81.

Eguiarte, L.E., Souza, V. & Aguirre, X. (2007). Ecología Molecular. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Instituto Nacional de Ecología. Universidad Nacional Autónoma de México. 608 pp.

Excoffier, L., Laval, G. & Schneider, S. (2005). Arlequin (version 3.0): An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47-50.

Excoffier, L., Smouse, P.E. & Quattro, J.M. (1992). Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479-491.

Faugeron, S., Martínez, E.A., Correa, J.A. & Cárdenas, L. (2004). Reduced genetic diversity and increased population differentiation in peripheral and overharvested population of Gigartina skottsbergii (Rhodophyta, Gigartinales) in southern Chile. Journal of Phycology. 40: 454–462.

47 Figueroa, D. & Moffat, C. (2000). On the influence of topography in the induction of coastal upwelling along the Chilean coast. Geophysical Research Letters 27: 3905-3908.

Filatov, D.A. (2002). Proseq: software for preparation and evolutionary analysis of DNA sequence datasets. Molecular Ecology Notes 2: 621-624.

Florin, A.B. & Höglund, J. (2007). Absence of population structure of Turbot (Psetta maxima) in the Baltic Sea. Molecular Ecology 16: 115-126.

Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial Cytochrome C Oxidase subunit 1 from diverse metozoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299.

Forcelli, D. O. (2000). Moluscos magallánicos. Guía de moluscos de Patagonia y sur de Chile. Vázquez Mazzini Eds., Buenos Aires, Argentina. 200 pp.

Gallardo, C.S. (1979). Developmental pattern and adaptations for reproduction in Nucella crassilabrum and other muricacean gastropods. Biological Bulletin 157: 453-463.

Guerra-Varela, J., Colson, I., Backeljau, T., Breugelmans, K., Hughes, R.N. & Rolán-Alvarez, E. (2009). The evolutionary mechanism maintaining shell shape and molecular differentiation between two ecotypes of the dogwhelk Nucella lapillus. Evolutionary Ecology 23:261–280.

Guillot, G., Leblois, R., Coulon, A. & Frantz A. (2009). Statistical methods in spatial genetics. Molecular Ecology 18: 4734–4756

Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium 41: 95- 98.

48 Helberg, M.E., Burton, R.S., Neigel, J.E. & Palumbi, S. (2002). Genetic assessment of connectivity among marine populations. Bulletin of Marine Science 70 (1).

Hernández, C.E., Moreno, R.A. & Rozbaczylo, N. (2005). Biogeographical patterns and Rapoport’s rule in southeastern Pacific benthic polychaetes of the Chilean coast. Ecography 28: 1:/11, 2005.

Hewitt, G.M. (2000). The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature, 405, 907-9013.

Holt, R.D. & Keitt, T.H. (2000). Alternative causes for range limits: a metapopulation perspective. Ecology Letters. 3: 441–7.

Hulton, N.R.J., Purvesa, R.S., McCullocha, R.D., Sugdena, D.E. & Bentleyb, M.J. (2002). The Last Glacial Maximum and deglaciation in southern South America Quaternary. Science Reviews 21 233–241.

Jolly, M.T., Jollivet, D., Gentil, F., Thiebaut, E. & Viard, F. (2005). Sharp genetic break between Atlantic and English Channel populations of the polychaete Pectinaria koreni, along the coast of France. Heredity, 94: 23-32.

Kenchington, E.L., Patwary, M.U., Zouros, E. & Bird, C.J. (2006). Genetic differentiation in relation to marine landscape in a broadcast-spawning bivalve mollusk (Placopecten magellanicus) Molecular Ecology 15: 1781-1796.

Kyle, C. & Boulding, E.G. (2000). Comparative population genetic structure of marine gastropods (Littorina ssp.) with and without pelagic larval dispersal. Marine Biology 137: 835-845.

49 Lee, H.J. & Boulding, E.G. (2009). Spatial and temporal population genetic structure of four northeastern Pacific littorinid gastropods: the effect of mode of larval development on variation at one mitochondrial and two nuclear DNA markers. Molecular Ecology 18, 2165–2184.

Leiva, G. & Castilla, J.C. (2002). A review of the world gastropod fishery: evolution of catches, management and the Chilean experience. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 11, 283–300.

Levin, L.A. (2006). Recent progress in Understanding Larval Dispersal: New Directions and Digressions. Integrative and Comparative Biology 46: 282-297.

Maurer, B.A. & Taper, M.L. (2002). Connecting geographical distributions with populations processes. Ecology Letters. 5: 223–31.

Miranda, C. (2001). La desaparición del banco de machas Mesodesma donacium (Lamarck, 1818) (Mollusca: Bivalvia: Mesodesmatidae) en la bahía de Coquimbo IV Región, Chile: sus probables causas. Tesis de Biología Marina, Universidad Católica del Norte, Coquimbo, 50 pp.

Moreno, C.A., Asencio, G., Duarte, W.E. & Marín, V. (1998). Settlement of the muricid Concholepas concholepas and its relationship with El Niño and coastal upwellings in southern Chile. Marine. Ecology Progress Series 167: 171-175.

Moreno, R.A., Hernández, C.E., Rivadeneira, M.M., Vidal, M.A. & Rozbaczylo, N. (2006). Patterns of endemism in south-eastern Pacific benthic polychaetes of the Chilean coast. Journal of Biogeography 33, 750–759.

Osório, C., Atria, J. & Mann, S. (1979). Moluscos marinos de importancia económica en Chile. Biología Pesquera 11: 3-47.

Palmer, R. A. (1979). Fish predation and the evolution of gastropod shell sculpture. Evolution 33: 697-713.

50 Pobrete, T., Toledo, H., Arteaga, R., Cárdenas, R. & Toledo, M. (1987). Estimación de la estructura por clases anuales de tamaño en una población de Nucella crassilabrum (Gastropoda, Muricidae). Biota (Chile) 3: 9-31.

Pogson, G.H., Taggart, C.T., Mesa, K.A. & Boutilier, R.G. (2001). Isolation by distance in the Atlantic cod, Gadus morhua, at large and small geographic scales. Evolution 55: 131-146.

Posada, D. & Crandall, K.A. (2001). Intraspecific gene genealogies: trees grafting into networks. Ecology & Evolution 16: 37-45.

Reid, D.G. & Osorio, C. (2000). The shallow-water marine Mollusca of the Estero Elefantes and Laguna San Rafael, southern Chile. Bulletin Natural History Museum of London (Zoology) 66: 109-146.

Reimer, O. & Harms-Ringdahl, S. (2001). Predator-induble changes in the blue mussels from the predator-free Baltic Sea. Marine Biology 139: 959-965.

Rogers, A.R. (2002). The theoretical mismatch distribution. Lecture Notes on Gene Genealogies 7: 30-46.

Röhl, A. (1999). Phylogenetische Netzwerke. PhD Thesis, Department of Mathematics, University of Hamburg.

Rohlf, F.J. & Slice, D. (1990). Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Systematic Zoology 39: 40-59.

Roh lf Rohlf , F.J. (2008 ). tpsDig2, version 2.12 Available from: . Revisada Agosto, 2008, en línea.

Rozas, J., Sanchez-DelBarrio, J.C., Messeguer, X. & Rozas R. (2003). DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19: 2496-2497.

51 Ruzzante, D.E., Taggard, C.T. & Cook, D. (1998). A nuclear DNA basis for shelf-and bank-scale population structure in Atlantic cod (Gadus morhua). Labrador to Georges Bank. Molecular Ecology 7: 1663-1680.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. 1659 pp.

Schneider, S., Roessli, D. & Excoffier, L. (2000). Arlequin ver. 2000: a software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. URL: http://lgb.unige.ch/arlequin.

Sköld, M., Wing, S.R. & Mladenov, P.V. (2003). Genetic subdivision of a sea star with high dispersal capability in relation to physical barriers in a fjordic seascape Marine Ecology Progress Series. Vol. 250: 163–174.

Slatkin, M. & Hudson, R.R. (1991). Pairwise comparisons of mitochondrial DNA sequences in stable and exponentially growing populations. Genetics 129: 555- 562.

Soto, R. (2001). Decisiones de forrajeo del gastrópodo murícido Nucella crassilabrum: rol de los componentes asociados a las restricciones fisiológicas, experiencia digestiva y al riesgo de la mortalidad. PhD thesis, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Soto, R.E., Castilla, J.C. & Bozinovic, F. (2004). Conducta de forrajeo del gastrópodo Acanthina monodon Pallas, 1774 (Gastropoda: Muricidae) en el intermareal rocoso de Chile central. Revista chilena historia natural 77: 157-175.

52 Sousa, R., Freire, R., Rufino, M., Méndez, J., Gaspar, M., Antunes, C. & Guilhermino, L. (2007). Genetic and shell morphological variability of the invasive bivalve Corbicula fluminea (Müller, 1774) in two Portuguese estuaries Estuarine. Coastal and Shelf Science 74 166-174.

Tajima, F. (1983). Evolutionary relationship of ADN sequences in finite populations. Genetics 105:437-460.

Tajima, F. (1989). Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123:585–595.

Templeton, A. (1998). Nested clade analysis of philogeographic data. Testing hypotheses about gene flow and population history. Molecular Ecology 7: 381- 397.

Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins D.G. (1997). The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 25: 4876- 4882.

Tellier, F., Meynard, A.P., Correa, J.A., Faugeron, S. & Valero M. (2009). Phylogeographic analyses of the 30°S south-east Pacific biogeographic transition zone establish the occurrence of a sharp genetic discontinuity in the kelp Lessonia nigrescens: vicariance or parapatry?, Molecular Phylogenetics and Evolution. In press.

Toonen, R.J. & Pawlik, J.R. (2001). Foundations of gregarious: a dispersal polymorphism among the larvae of a marine invertebrate. Evolution 55: 2439- 2454. van Rossum, F., Vekemans, X., Meerts, P., Gratia, E. & Lefêbvre, C. (1997). Allozyme variation in relation to ecotypic differentiation and population size in marginal populations of Silene nutans. Heredity 78: 552–60.

53 Valdovinos, C.R. (1999). Biodiversidad de moluscos chilenos: base de datos taxonómica y distribucional. Gayana Zoología (Chile) 63: 59-112.

Valdovinos, C., Navarrete, S. & Marquet, P. (2003). Mollusk species diversity in the southeastern pacific: Why are the most species towards the pole? Ecography 26: 139-144.

Venegas, R.M., Ortiz, V., Olguin, A. & Navarrete, S.A. (2000). Larval development of the intertidal barnacles Jehlius cirratus and Notochthamalus scabrosus (Cirripedia: Chthamalidae) under laboratory conditions. Journal of Crustacean Biology 20: 495–504.

Verneij, G. J. (1974). Marine faunal dominance and moluscan shell form. Evolution 28: 656-664.

Waples, R.S. (1998). Separating the wheat from the chaff. Pattern of genetic differentiation in high gene flow species. Journal of Heredity 89: 438–450.

Weersing, K. & Toonen, R.J. (2009). Population genetics, larval dispersal, and connectivity in marine systems Marine Ecology Progress Series 393: 1–12.

Wilke, T. & Falniowski, A. (2001). The genus Adriohydrobia (Hydrobiidae: Gastropoda): polytypic species or polymorphic populations. Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 39: 227-234.

Wu, S.K. (1985). The genus Acanthina (Gastropoda: Muricacea) in West America. Special Publication of the Mukaishima Marine Biological Station 236: 45-66.

Zakas, C., Binford, J., Navarrete, S.A. & Wares, J.P. (2009). Restricted gene flow in Chilean barnacles reflects an oceanographic and biogeographic transition zone Marine Ecology Progress Series. En press.

54 Zar, J.H. (1999). Biostatistical analysis. Cuarta edición. Prentice Hall, Upper Saddle River.

Zink, R.M. & Blackwell-Rago, R.C. (2000). Species limits and recent population history in the Curve-billed Trasher. The Condor 102:881-886.

55 TABLAS

56 Tabla 1. Diversidad genética basada en el gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I por provincia biogeográfica y localidad utilizada en este estudio para A. monodon.

Prov. Biog. Localidad Lat.S - long.W N Nhap S He π1 π2

PP 1. Huasco 28°24'-71°11' 29 2 1 0.25 (0.09) 0.25 (0.29) 0.000 (0.000) 2. Totoralillo 30°04'-71°22' 27 7 13 0.68 (0.07) 1.39 (0.88) 0.002 (0.002) Total 56 9 14 0.73 (0.04) 1.86 (1.08) 0.003 (0.002) Promedio 28 4.5 7 0.47 (0.30) 0.82 (0,81) 0.001 (0,001) AI 3. Las Cruces 33°29'-71°38' 30 11 10 0.67 (0.09) 1.35 (0.86) 0.002 (0.002) 4. Concepción 36°48'-73°10' 27 9 11 0.78 (0.07) 1.83 (1.09) 0.003 (0.002) 5. Valdivia 39°46'-73°23' 30 7 6 0.42 (0.11) 0.52 (0.45) 0.001 (0.001) 6. S. Reloncavi 41°40'-72°39' 30 8 7 0.75 (0.07) 0.99 (0.69) 0.002 (0.001) Total 117 35 34 0.68 (0.05) 1.22 (0.78) 0.002 (0.001) Promedio 29.3 8.8 8.5 0.66 (0.16) 1.17 (0.55) 0.002 (0.001) PM 7. Fiordos I.O. 44°03'-73°43' 26 8 9 0.78 (0.05) 2.38 (1.34) 0.004 (0.003) 8. Fiordos C.V. 44º59'-74º01' 30 2 1 0.48 (0.05) 0.48 (0.43) 0.001 (0.001) 9. Pta. Arenas 52°59'-70°40' 30 1 0 0 0 0 Total 86 11 10 0.77 (0.03) 2.80 (1.49) 0.005 (0.003) Promedio 28.7 3.7 3.3 0.42 (0.39) 0.95 (1.25) 0.002 (0.002)

PP = Provincia Peruana; AI = Área Intermedia; PM = Provincia Magallánica. Nhap, número de haplotipos; S, número de sitios polimórficos; He, diversidad haplotipica; π1, número medio de diferencias pares; π2, diversidad nucleotídica. Entre paréntesis desviación estándar.

Tabla 2. Matriz de distancia genética, medida como diferencias entre pares de poblaciones (Fst, todos p<0.05) (inferior izquierda), y matriz de distancia geográfica entre localidades (Km). Localidades ordenas de norte a sur (superior derecha).

Localidad 1. Huasco 2.Totoralillo 3.Las Cruces 4.Concepcion 5. Valdivia 6.S. Reloncavi7. Fiordos I.O.8. Fiordos C.V.9.Pta. Arenas 1. Huasco 186 566 950 1278 1476 1750 1857 2728 2. Totoralillo 0.725 379 764 1091 1291 1563 1670 2544 3. Las Cruces 0.880 0.783 393 714 1292 1185 1291 2116 4. Concepcion 0.850 0.760 0.065 330 542 805 914 1808 5. Valdivia 0.940 0.842 0.076 0.093 219 473 580 1483 6. S. Reloncavi 0.906 0.809 0.043 0.074 0.041 278 384 1266 7. Fiordos I.O. 0.836 0.740 0.208 0.195 0.220 0.206 107 1015 8. Fiordos C.V. 0.944 0.849 0.193 0.184 0.207 0.181 0.275 981 9. Punta Arenas 0.988 0.932 0.859 0.821 0.939 0.890 0.770 0.945

57 Tabla 3. Análisis de Variación Molecular (AMOVA) para tres provincias biogeográficas del PSE (PP-AI-PM) y Análisis Espacial de Variación Molecular (SAMOVA) para 2, 3, 4 y 5 grupos de localidades.

AMOVA groups of locs. Struture tested F statistic P-values Fsc = 0.572 0.000 1 3 (Huasc, Totora) (Las Cru, Concep, Valdi, S. Rel) (Ova.F2, Vic.F1, P. Are) Fst = 0.799 0.000 PP AI PM Fct = 0.529 0.005

SAMOVA Fsc = 0.593 0.000 1 2 (Huasc, Totora) (Las Cru, Concep, Valdi, S. Rel, Ova.F2, Vic.F1, P. Are) Fst = 0.860 0.000 Fct = 0.654 0.024

Fsc = 0.353 0.000 2 3 (Huasc, Totora) (Las Cru, Concep, Valdi, S. Rel, Ova.F2, Vic.F1) ( P. Are) Fst = 0.843 0.000 Fct = 0.758 0.005

Fsc = 0.193 0.000 3 4 (Huasc) (Totora) (Las Cru, Concep, Valdi, S. Rel, Ova.F2, Vic.F1) ( P. Are) Fst = 0.843 0.000 Fct = 0.806 0.010

Fsc = 0.114 0.000 4 5 (Huasc) (Totora) (Las Cru, Concep, Valdi, S. Rel, Vic.F1) (Ova.F2) ( P. Are) Fst = 0.818 0.000 Fct = 0.794 0.010

Tabla 4. Valores de significancia de la prueba de comparación pareada entre localidades (Tukey HSD) sobre la variable de forma I. Localidades ordenadas de norte a sur. (* = p > 0,05).

L o c a lid a d 1. Huasco 2.Totoralillo3.Las Cruces4.Concepcion5. Valdivia6.S. Reloncavi7. Fiordos I.O.8. Fiordos C.V. 2. Totoralillo 0 ,0 0 0 - 3. Las Cruces 0,000 *0,835 - 4. Concepcion *0,999 0,000 0,000 - 5. Valdivia 0,000 *0,675 *1,000 0,000 - 6. S. Reloncavi 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 - 7. Fiordos I.O. 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 *1,000 - 8. Fiordos C.V. 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,031 0,029 - 9. Pta. Arenas 0,002 0,011 *0,353 0,000 *0,558 0,000 0,000 0,000

58 Tabla 5. Comparación de la diversidad genética entre gastrópodos marinos de diferentes áreas geográficas y con distintos tipos de desarrollo. Nhap, número de haplotipos; He, diversidad haplotipica; π, diversidad nucleotídica. Entre paréntesis desviación estándar.

Tipo de Rango Presencia π Especie organismo distribución Desarrollo N Nhap He estructura Referencia

Acanthina Gastrópodo Pacífico 0.53 0.004 Sánchez et al. monodon marino Sureste Desarrollo directo 227 43 (0.27) (0.003) si in prep

Littorina Gastrópodo Pacífico 0.09 0.0004 Lee & Boulding sitkana marino Noroeste Desarrollo directo 146 2 (0.03) (0.0006) si (2009)

Littorina Gastrópodo Pacífico 0.30 0.001 Lee & Boulding subrotundata marino Noroeste Desarrollo directo 229 11 (0.04) (0.001) si (2009)

Batillaria Gastrópodo Pacífico 0.85 0.012 Kojima et al. cumingi marino Noroeste Desarrollo directo 507 33 (0.01) (0.007) si (2004)

Concholepas Gastrópodo Pacífico Larva planctónica 0.89 0.004 Cárdenas et al. concholepas marino Sureste (3-6 meses) 337 179 (0.05) (0.002) no (2009)

Littorina Gastrópodo Pacífico Larva planctónica 0.39 0.003 Lee & Boulding scutulata marino Noroeste (3-6 meses) 265 31 (0.04) (0.002) no (2009)

Littorina Gastrópodo Pacífico Larva planctónica 0.78 0.006 Lee & Boulding plena marino Noroeste (64 dias) 135 46 (0.04) (0.004) no (2009)

Littorina Gastrópodo Pacífico Larva planctónica 0.82 0.003 Lee & Boulding keenae marino Noreste (varios dias) 584 177 (0.02) (0.002) no (2007)

59 FIGURAS

60 Provincia Peruana

Área Intermedia

Provincia Magallánica

Figura 1. Representación de la actual clasificación biogeográfica para la costa continental del PSE y las principales características oceanográficas. Línea punteada delimita los limites biogeográficos.

61 2 1 3 4

6

5

Figura 2. Distribución geográfica de las especies de gastrópodos de la familia Muricidae de importancia comercial en Chile 1) Concholepas concholepas, 2) Thais chocolata, 3) Xanthochorus cassidiformis, 4) Chorus giganteus, 5) Trophon gervesianus y de 6) Acanthina monodon.

62 1 Y

10

9 2

8 7 6

3 5

4 X

Figura 3. 10 hitos morfológicos analizados en la concha de cada individuo de A. monodon para análisis de morfometría geométrica.

63 PP AI PM 1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5 He

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 55,0 latitud ( Sº ) Figura 4. Distribución latitudinal de la diversidad genética (He, diversidad haplotipica) de A. monodon a través del PSE, evidenciada en este estudio,. Línea punteada delimita los limites biogeográficos (PP, Provincia Peruana; AI, Área Intermedia; PM, Provincia Magallánica).

64 1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

distancia genética (Fst) genética distancia 0,2

0,1

0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 distancia geográfica (Km 1:1000)

variación entre 2 localidades de diferentes Prov. Biog. variación entre 2 localidades de una misma Prov. Biog.

Figura 5. Test de Mantel. Cada punto representa la distancia geográfica (Km.

1:1000) y diferenciación genética (Fst) entre dos localidades. R2 = 0,549, P = 0,001.

65 3.Las Cruces 7.Fiordos I.O 1.Huasco Provincia 4.Concepción Área Provincia 8.Fiordos C.V. 2.Totoralillo Peruana 5.Valdivia Intermedia Magallánica 9.Pta. Arenas 6.S. de Reloncaví

4 pm

H1 H2

Figura 6. Red de haplotipos sobre 259 individuos de A. monodon analizados. 46 haplotipos encontrados en nueve localidades. Cada círculo representa un haplotipo y la coloración una localidad. El tamaño de los círculos es proporcional a los individuos que presentan ese haplotipo y la distancia entre ellos es proporcional a la distancia en pasos mutacionales (pm). Haplotipo 1 (H1), Haplotipo 2 (H2).

66 A B

C D

Figura 7. Análisis “mismatch”. Distribución de la frecuencia de diferencias entre pares de haplotipos de A. monodon para (A) todas las localidades integradas. D de Tajima: -1,701, p = 0,10, (B) Provincia Peruana. D de Tajima: -1,291, p > 0,10, (C) Área Intermedia. D de Tajima: -2,434, p = 0,01, (D) Provincia Magallánica. D de Tajima: 0,229, p > 0,10. Exp = frecuencia esperada bajo un modelo de una población en expansión repentina. Obs = frecuencia observada.

67 Huasco (PP) Totoralillo (PP) Las Cruces (AI) Concepción (AI) A Valdivia (AI) 0,08 S. Reloncaví (AI) Fiordos I. Ovalada (PM) Fiordos C. Vicuña (PM) P. Arenas (PM) 0,06

0,04

0,02

0,00

-0,02

-0,04

-0,06 variablede formaII (17,14%varianza)

-0,08 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 variable de forma I (67,70 % varianza)

B 0,08 PP AI PM

0,06

0,04

0,02

0,00

-0,02

-0,04

-0,06 variable de forma I (67,70% varianza) -0,08 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 37,5 40,0 42,5 45,0 47,5 50,0 52,5 55,0 Costa expuesta Costa protegida latitud (Sº) Figura 8.A) Variable de forma I v/s variable de forma II. Cada punto representa un individuo. B) Distribución latitudinal de la variable de forma I. Cada punto representa una localidad (acompañada de su configuración consenso), barras = desviación estándar, líneas punteadas indican los límites entre provincias biogeográficas. Misma leyenda para ambos gráficos.

68 Huasco (PP) Totoralillo (PP) Las Cruses (PP) 3500 Concepción (AI) Valdivia (AI) S. Reloncaví (AI) 3000 Fiordos I. Ovalada (PM) Fiordos C. Vicuña (PM) Pta. Arenas (PM) 2500

2000

1500 centroide

1000

500

0 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 variable de forma I Figura 9. Variación del tamaño geométrico (centroide) de la variable de forma I de los individuos de A. monodon de cada localidad analizada en este estudio.

69 Figura 10. Espectro de morfos de individuos de A. monodon provenientes de diferentes localidades que presentan la misma composición genética a nivel de gen COI (haplotipo 1). C = Concepción, M = Valdivia, R = Seno de Reloncaví, F = Fiordos I.O. todos a la misma escala.

70 ANEXOS

71 ANEXO I

Visualización de amplificación, mediante PCR, gen Citocromo Oxidasa I (COI) en A. monodon en gel de agarosa 1,5% (24 muestras).

ladder PCR muestras A. Monodon COI

1 Kb 750 bp

72 ANEXO II

Cromatograma resultante secuenciación gen COI A. monodon.

73