Tese Daniela Núñez
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA TESE DE DOUTORADO Isolamento e caracterização de marcadores moleculares de Hoplias intermedius (Günther, 1864): genética e forense ALUNA: Daniela Núñez Rodriguez ORIENTADOR: Dr. Evanguedes Kalapothakis CO-ORIENTADORA: Dra. Susanne Facchin Belo Horizonte, Fevereiro 2019 Daniela Lidia Núñez Rodriguez ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DE Hoplias intermedius (GÜNTHER, 1864): GENÉTICA E FORENSE Tese apresentada ao curso de pós-graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para à obtenção do título de Doutor em Genética. Orientador: Dr. Evanguedes Kalapothakis Co-orientadora: Dra. Susanne Facchin Belo Horizonte, Fevereiro 2019 i Rodriguez, Daniela Lidia Núñez. Isolamento e caracterização de marcadores moleculares de Hoplias intermedius 103 f. : il. ; 29,5 cm. Orientador: Dr. Evanguedes Kalapothakis. Co-orientadora: Dra. Susanne Facchin. Ficha elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Biológias daCDU: UFMG 575 Ficha elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Biológias da UFMG Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG ii iii DEDICATORIA: À minha avó, Elena de la Torre Bueno, que aprendeu a ler e escrever sozinha, se tornou amante da leitura e educou a dez filhos. Minha vó ensinou a minha mãe a ter a força que uma mulher precisa para alcançar seus sonhos, e ser a mãe amorosa, talentosa e forte que ela é. Ao meu avô, Tomás Núñez Bazalar, filho de agricultor e primeiro doutor em ciências da cidade de Supe. Meu carinhoso avô ensinou ao meu pai com o seu exemplo a ser o melhor professor, cidadão e pai que eu poderia ter. iv AGRADECIMENTOS: Ao meu orientador, Dr. Evanguedes Kalapothakis, pela oportunidade de pertencer ao seu laboratório e por todos os ensinamentos. À minha co-orientadora, Dra. Susanne Facchin, por me ensinar as melhores estratégias de desenho experimental que fizeram a diferença no trabalho. Aos membros da banca, pelo tempo e paciência em avaliar o trabalho. Aos membros da banca de qualificação, Dra. Bárbara Mendes, Dr. Daniel Carvalho e Dr. Jorge Dergam, por suas contribuições. Ao INPA, Alessandro Bifi, professor Efrem Ferreira, Camila Ribas, PUCRS, professor Carlos Lucena, PUCMG, professor Daniel Carvalho, Tiago Pessali, Leandra Formentão, Carlos Mascarenhas Alves e Paulo Formagio, por me fornecerem as amostras e me ajudarem na identificação delas. Aos meus pais, Edith e Tomás por serem meus guias, me ensinar que o esforço e a dedicação por tudo o que fazemos, sempre vale a pena. E porque mesmo a quilômetros de distância, sempre estivemos juntos. Ao amor da minha vida, Emerson, meu melhor amigo e meu grande amor, porque somos amor, amizade e luta. “Juntos, codo a codo, somos mucho más que dos”. À minhas irmãs, Susana e Irene, porque somos três estrelas que sempre se lembram umas as outras do próprio brilho. A todos os colegas, amigos e amigas do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares, por seus ensinamentos e amizade. Ao Leo, porque ainda sem me conhecer me levou até o rio Cipó, marcando o início do doutorado e de uma grande amizade, Emerson e eu nos sentimos felizes de conhecer você e sua família. À Hortênsia, pela amizade tão especial e por ter a paciência de ler todas as esquinas do texto, corregindo e me ensinando a melhorar a escrita em português. À Renata, Danilo, Renato, Fernanda, Bárbara e Douglas, pelos momentos de paz e felicidade na água, os que me permitiram continuar com alegria, imaginação e força em tudo o que faço. Ao Instituto de Ciências Biológicas e Universidade Federal de Minas Gerais, por me permitir cursar meus estudos em suas salas e laboratórios. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa e financiamento da minha pesquisa. Minha gratidão a todos. v SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................... viii LISTA DE TABELAS .................................................................................................................................................. x LISTA DE ABREVIAÇÕES ........................................................................................................................................ xi ABSTRACT ............................................................................................................................................................. 1 RESUMO ............................................................................................................................................................... 2 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................... 3 1.1. A DIVERSIDADE DA ICTIOFAUNA BRASILEIRA, MANEJO E MEDIDAS DE CONTROLE DA PESCA ..............3 1.2. O TRÁFICO ILEGAL DE ESPÉCIES E O USO DE NOMES COMERCIAIS PARA PRODUTOS PESQUEIROS ......4 1.2.1. Sequenciamento Sanger e Sequenciamento de Segunda Geração............................................ 5 1.2.2. DNA barcoding e marcadores espécie-específicos .................................................................... 6 1.2.2.1. Citocromo b (Cyt b) .................................................................................................................... 8 1.2.2.2. Citocromo C Oxidase 1 (COI) ...................................................................................................... 8 1.2.2.3. Genes mitocondriais ribosomais: 12SrRNA e 16SrRNA .............................................................. 8 1.2.2.4. D-loop ......................................................................................................................................... 9 1.3. FERRAMENTAS BIOINFORMÁTICAS PARA DETECÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES ......................9 1.4. O GÊNERO Hoplias Gill, 1903: EXEMPLO DA COMPLEXIDADE TAXONÔMICA EM RECURSOS PESQUEIROS ....................................................................................................................................................11 1.4.1. Histórico taxonômico do gênero Hoplias ................................................................................. 11 1.4.2. Importância comercial e ecológica de Hoplias intermedius e H. malabaricus ........................ 15 1.4.3. Diversidade molecular e citogenética das espécies de Hoplias ............................................... 16 2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 18 2.1. Objetivo geral: .......................................................................................................................................18 2.2. Objetivos específicos: ............................................................................................................................18 3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................................. 18 3.1. Obtenção de amostras ..........................................................................................................................18 3.2. Isolamento do DNA genômico:..............................................................................................................20 3.2.1. Método de extração 1: Fenol e clorofórmio ............................................................................ 20 3.2.2. Método de extração 2: Kit de Extração de DNA GTS (Pht) ....................................................... 21 3.3. Quantificação de DNA genômico e análise de integridade ...................................................................22 3.4. Construção da biblioteca genômica ......................................................................................................23 3.5. Sequenciamento de Nova Geração de H. intermedius ..........................................................................25 3.6. Desenho de primers mitocondriais .......................................................................................................28 vi 3.7. Padronização de Reações em Cadeia da Polimerase ............................................................................29 3.8. Sequenciamento de Sanger ...................................................................................................................29 3.9. Identificação de amostras .....................................................................................................................31 3.10. Testes de validação dos primers ............................................................................................................31 3.10.1. Teste de Sensibilidade .............................................................................................................. 31 3.10.2. Teste de Especificidade ............................................................................................................ 31 3.10.3. Teste de Eficiência .................................................................................................................... 32 4. RESULTADOS .............................................................................................................................................. 33 4.1. Genoma