Towards the Elucidation of Orphan Lysosomal Transporters Quentin Verdon To cite this version: Quentin Verdon. Towards the Elucidation of Orphan Lysosomal Transporters. Cancer. Université Paris Saclay (COmUE), 2016. English. NNT : 2016SACLS144. tel-01827233 HAL Id: tel-01827233 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01827233 Submitted on 2 Jul 2018 HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. NNT : 2016SACLS144 THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY PREPAREE A L’UNIVERSITE PARIS-SUD ECOLE DOCTORALE N°568 BIOSIGNE | Signalisations et réseaux intégratifs en biologie Spécialité de doctorat : aspects moléculaires et cellulaires de la biologie Par Mr Quentin Verdon Towards the elucidation of orphan lysosomal transporters: several shots on target and one goal Thèse présentée et soutenue à Paris le 29/06/2016 » : Composition du Jury : Mr Le Maire Marc Professeur, Université Paris-Sud Président Mr Birman Serge Directeur de recherche, CNRS Rapporteur Mr Murray James Assistant professor, Trinity college Dublin Rapporteur Mr Goud Bruno Directeur de recherche, CNRS Examinateur Mr Gasnier Bruno Directeur de recherche, CNRS Directeur de thèse Mme Sagné Corinne Chargée de recherche, INSERM Co-directeur de thèse Table of contents Remerciements (acknowledgements) 6 Abbreviations 7 Abstracts 10 Introduction 12 1 Physiology of lysosomes 12 1.1 Discovery and generalities 12 1.2 Degradative function 13 1.3. Integral membrane proteins of lysosomes 14 1.4. Biogenesis of lysosomes 17 1.4.1. Formation of the compartment 17 1.4.2. Sorting and activation of lysosomal enzymes 19 1.4.3. Sorting of lysosomal membrane proteins. 20 1.5. Entry of macromolecules into lysosomes 21 1.5.1 Autophagies 21 1.5.2. Endocytosis and phagocytosis 23 1.5.3. Transport through the lysosomal membrane 24 1.6. Lysosomes and signaling pathways 24 2. Dysfunction of lysosomes: the lysosomal storage disorders (LSDs) 27 2.1. Generalities on LSDs 27 2.1.1 Types of LSDs 27 2.1.2. Treatments 28 2.2. LSDs due to a defective lysosomal membrane protein 29 2.2.1. Defect in ion transport 29 2.2.2. Defect in cholesterol trafficking 30 2.2.3. Defect in an enzyme/transporter 31 2.2.4. Defect in LAMP2 31 2.2.5. Defect in transport of catabolites 31 Chapter 1: functional study of putative lysosomal transporters 34 1. Introduction 34 2. How to screen for new lysosomal transporters 54 1 2.1. Step 1: is the candidate lysosomal? 54 2.2. Step 2: is it possible to express the candidate at plasma membrane? 55 2.3. Step 3: functional assays 56 2.4 Summary of the screening method 59 3. Study of five proteins of the lysosomal membrane: TMEM104, SLC37A2, TTYH3, MFSD1 and SPINSTER1 59 3.1. TTYH3, a chloride channel 59 3.1.1. Introduction 59 3.1.2. Screening of the putative lysosomal sorting motif 60 3.2. TMEM104, a putative amino acid transporter 60 3.2.1. Introduction 60 3.2.2. Screening of the putative lysosomal sorting motif 61 3.3. SLC37A2, a putative glucose-6-phosphate transporter? 62 3.3.1. Introduction and sorting motif 62 a- Former results on SLC37A2 62 b- A natural variant of SLC37A2 is sorted to lysosomes 63 3.3.2. Functional assays 64 3.3.3 Phosphoglycerate lysosomal transporters: a gap in the catabolism of lipids 66 3.4. hSPINSTER1, a putative transceptor 67 3.4.1 Introduction 67 3.4.2 Screening of the putative lysosomal sorting motif 69 3.5. MFSD1, a protein belonging to the major facilitator superfamily 72 3.5.1 Introduction 72 3.5.2. Topology issue and screening of the putative lysosomal motif 72 3.5.3 Functional assays on MFSD1 73 4. Conclusion 75 Chapter 2: study of two lysosomal membrane proteins implicated in neurodegenerative disorders: CLN3 and CLN7 77 1. Introduction 77 1.1 On neuronal ceroid lipofuscinosis 77 1.1.1 Generalities 77 2 1.1.2 Pattern of neurodegeneration in brain 78 1.1.3 Genetic determinants of NCLs 78 1.1.4 Therapies 79 1.2 CLN3 81 1.3 CLN7 82 2. Functional characterization of CLN7 by TEVC 83 2.1 Expression of human CLN7 at plasma membrane in Xenopus oocytes 83 2.2 Functional study of CLN7 using TEVC 85 3. Lysosomal proteolysis is impacted by CLN3 malfunction 89 3.1 Metabolomics of Cln3 KI mice 89 3.2 Evaluation of proteolysis in neurons of CLN3 KI mice 94 3.3 Measure of long-lived protein degradation in CLN3 WT and KI primary fibroblasts 97 3.4 Rescue of lysosomal proteolysis by CLN3 overexpression 100 4. Conclusion 103 4.1 Other approaches to identify CLN7 substrate 103 4.1.1 Widening the electrophysiological screen 103 4.1.2 Checking for a non-electrogenic transport of amino acids 103 4.1.3 Enriching oocytes in CLN7 substrate 103 4.1.4 Metabolomic profiling of CLN7 KO mice 104 4.2 Relevance of the lack of lysosomal proteolysis in the context of CLN3 deficiency 104 4.2.1 Checking the selectivity of the proteolysis defect 105 4.2.2 A need for a better model to study CLN3 dysfunction 106 4.2.3 Generalization to other NCLs 107 4.2.4 Increasing lysosomal proteolysis: a potential therapeutic target 108 Chapter 3: Identitification of SNAT7 as a lysosomal glutamine transporter essential to the opportunistic nutrition of cancer cells 109 1. Introduction 109 1.1 The SLC38 family 109 1.2 About SNAT7 112 1.2.1. Results from Hägglung et al 112 1.2.2. SNAT7 could still be a lysosomal transporter 112 3 2. SNAT7 is a lysosomal transporter for glutamine and asparagine 113 2.1 Radioactive uptake in Xenopus oocytes 113 2.2. Sorting of SNAT7 116 2.3 Sending SNAT7 to plasma membrane by activating lysosomal exocytosis 119 2.4 Confirming SNAT7 function as lysosomal transporter for glutamine by developing an indirect assay 122 2.4.1 Principle of the test 122 2.4.2 Quantification method and determination of the optimal ester concentration 123 2.4.3 Proof of principle 125 2.4.4 Application to SNAT7 126 2.4.5 Localization of endogenous SNAT7 127 2.4.6 Direct transport assay 131 2.4.7. Control experiment: are lysosomes from SNAT7 KO cells more fragile? 134 2.4.8 Further characterization of SNAT7 activity 135 3. Does SNAT7 play a role in the nutrition of cancer cells? 140 3.1 Glutamine and cancer cells 140 3.2 SNAT7 is necessary for cancer cells to obtain glutamine from extracellular proteins 142 3.2.1 BSA can be used as a source of glutamine 142 3.2.2. SNAT7 is critical to use BSA as a source of glutamine 143 3.2.3 Control experiment: is BSA degraded properly in SNAT7 deficient cells? 147 4. Conclusion 148 4.1. Function of SNAT7 as a lysosomal transporter for glutamine and asparagine 148 4.2. Role of SNAT7 in cancer cell nutrition 149 4.2.1 Role of SNAT7 in in vivo cancer models 149 4.2.2 Relevance of macropinocytosis in the nutrition of cancer cells 149 4.2.3 Advantages and development of a SNAT7-based anti-cancer therapy 150 4.3 Importance of SNAT7 in other mechanisms 151 Conclusion: emerging roles for lysosomal membrane proteins 153 Material and methods 157 4 DNA and RNA constructs 157 Antibodies 158 Expression of proteins in Xenopus oocytes 158 Uptake of glutamine in oocytes 159 Cell-surface biotinylation 159 Electrophysiological recordings 160 Cell culture and transfection 160 Western Blot 161 Immunofluorescence 161 TFEB test 162 CRISPR-Cas9 163 Sialic acid uptake 163 Mice models 163 Preparation of hippocampal neurons 163 DQ-red-BSA uptake 163 Flow cytometry 164 Lysosomal proteolysis measures in primary fibroblasts 165 Cellular fractionation 165 Transport assay on lysosomal preparations 165 Latency test 166 Growth assays 166 References 167 5 Remerciements Je souhaite remercier Bruno Gasnier et Corinne Sagné pour m’avoir accueilli dans leur équipe et m’avoir confié ces projets. Je me sens exceptionnellement privilégié d’avoir pu compter en toutes circonstances sur deux encadrants aussi brillants que disponibles. Je souhaite remercier particulièrement Cécile Jouffret et Christopher Ribes, qui ont participé avec beaucoup d’entrain et de disponibilité à la plupart des expériences décrites dans cette thèse. Mes plus vifs remerciements aux autres membres de l’équipe : Xavier Leray, Christine Anne et Seana O’Regan pour leur soutien, leur écoute, leur patience, mais aussi pour leurs dons désintéressés de calories et de caféine, sous des formes diverses. Je souhaite également remercier les autres membres du laboratoire : Isabelle Fanget, Claire Desnos, Damien Carrel, Dany Khamsing et Solène Lebrun pour tous les bons moments passés ensemble. Je remercie également particulièrement François Darchen et Valentina Emiliani, les deux directeurs successifs du laboratoire, pour m’avoir accueilli en thèse. Je souhaite exprimer ma gratitude à l’Ecole Normale Supérieure et à Vaincre les maladies lysosomales qui ont successivement financé ma bourse de thèse, ainsi qu’à la Ligue contre le cancer qui a par ailleurs financé l’un de mes projets. Je remercie également Marielle Boonen, Michel Jadot, Agnès Journet et Jérôme Garin pour des collaborations fructueuses. Je souhaite également remercier et recommander la plate-forme de cytométrie du site des Saints-Pères de l’université Paris-Descartes et remercier plus particulièrement Stéphane Dupuy, mon interlocutrice sur place, pour ses précieux conseils.