MICROINJERTACION in vitro DE Erythrina edulis M. FAMILIA (FABACEAE)

ADRIANA PAOLA BONILLA SÁNCHEZ

Trabajo de grado presentado a la Facultad de Ciencias Básicas como requisito para optar al titulo de Bióloga

Director NEFTALÍ MESA LÓPEZ Mg. en Dirección Universitaria

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ - TOLIMA 2014

AGRADECIMIENTOS

A Dios y mi Madre por ser los motores, fortaleza e inspiración de mi vida.

Al Grupo GEBIUT, porque más allá de hacer investigación, fomentan el desarrollo humano e integral de los estudiantes.

Al profesor Neftalí Mesa, por su guía y acompañamiento en el desarrollo de este trabajo.

A la profesora Martha Lily Ocampo Guerrero, Diana Carvajal, Diana Beltrán y Nataly Ruiz, por su apoyo durante la ejecución de este trabajo.

A Gianina Rozo Rey, por ser una amiga y compañera de trabajo incondicional.

Al profesor Jairo Clavijo, por su colaboración en el análisis estadístico de resultados.

Al Comité Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima, por la financiación de este proyecto.

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CONTENIDO

Pág INTRODUCCIÓN ...... 12

1. OBJETIVOS ...... 14

1.1 OBJETIVO GENERAL ...... 14

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 14

2. MARCO TEORICO ...... 15

2.1 GÉNERO ERYTHRINA...... 15

2.2 Erythrina edulis Micheli...... 15

2.2.1 Descripción Taxonómica...... 15

2.2.2 Descripción Morfológica...... 16

2.2.3 Distribución Geográfica Y Aspectos Ecológicos De La Especie...... 17

2.2.4 Uso E Importancia Económica De Erythrina edulis...... 18

2.2.5 Propagación De La Especie ...... 18

2.3. CULTIVO DE TEJIDOS O PROPAGACIÓN in vitro...... 19

2.3.1 Factores Que Intervienen En La Micropropagación 19

2.3.1.1 El Inoculo o Explante...... 19

2.3.1.2 Factores Físicos ...... 19

2.3.1.3 Factores Químicos ...... 20

2.3.1.4 Principales Reguladores De Crecimiento...... 20

2.4 ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN in vitro...... 21

2.4.1 Etapa 0 ...... 21

4

2.4.2 Etapa I ...... 21

2.4.3 Etapa II...... 24

2.4.4 Etapa III ...... 25

2.4.5 Etapa IV ...... 25

2.5 TÉCNICAS DEL CULTIVO in vitro ...... 25

2.5.1 Propagación A Través Del Rescate De Embriones in vitro.…………………26

2.5.2 Microinjertación...... 27

2.5.3 Antecedentes En Cultivo in vitro De E. edulis...... 28

3. METODOLOGÍA ...... 30

3.1 LUGAR DE TRABAJO ...... 30

3.2 SELECCIÓN DE SEMILLAS ...... 30

3.3 TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN PARA SEMILLAS ...... 31

3.4 EXTRACCIÓN DE EMBRIONES ...... 32

3.5 ETAPA DE MULTIPLICACIÓN in vitro...... 32

3.6 MANEJO DE PLANTAS EN INVERNADERO...... 32

3.7 PROCEDIMIENTO DE INJERTACION...... 33

3.7.1 Preparación del injerto...... 33

3.7.2 Microinjertación...... 33

3.7.2.1 Métodos de incisión ...... 33

3.7.2.2 Aproximación lateral ...... 33

3.7.2.3 Púa ...... 33

3.7.2.4 T. invertida ...... 34

3.8 EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO CON RESPECTO AL CRECIMIENTO DEL MICROINJERTO...... 34

5

3.9 MICROINJERTO A PARTIR DE EXPLANTES ex vitro...... 34

3.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO...... 35

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 37

4.1 GERMINACIÓN DE EMBRIONES PARA PRODUCCIÓN DE PORTA- INJERTOS Y YEMAS VEGETATIVAS ASÉPTICAS...... 37

4.1.1 Contaminación ...... 38

4.1.2 Oxidación...... 40

4.1.3 Germinación...... 41

4.2 ESTABLECIMIENTO DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL RESCATE DE EMBRIONES in vitro...... 43

4.3 FASE DE MULTIPLICACIÓN...... 44

4.4 MICROINJERTACIÓN in vitro de Erythrina edulis...... 45

4.5 EFECTO DEL TIPO DE INCISIÓN EN EL PRENDIMIENTO DE LOS MICROINJERTOS ...... 48

4.6 MICROINJERTOS A PARTIR DE YEMAS AXILARES ex vitro...... 50

5. CONCLUSIONES ...... 52

6. RECOMENDACIONES ...... 53

REFERENCIAS ...... 54

ANEXOS ...... 58

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LISTA DE FIGURAS

Pág Figura 1. Ilustración de las características morfológicas de E. edulis...... 17 Figura 2. Etapas de muestreo: A) árbol de Erythrina edulis en Villarrestrepo, B) frutos de la especie...... 30 Figura 3. Tipos de Incisión: A) Aprox. Lateral, B) Púa y C) T. invertida...... 34 Figura 4. Embriones extraídos a partir de semillas de chachafruto...... 37 Figura 5. Estimación puntual de proporciones de contaminados en los tratamientos de desinfección de E. edulis...... 38 Figura 6. Estimación puntual de proporciones de oxidados en los tratamientos de desinfección de E. edulis...... 40 Figura 7. Estimación puntual de proporciones de germinación en los tratamientos de E. edulis...... 41

Figura 8. Desarrollo de (Erythrina edulis) empleando HgCl2 al 0.2% por 20’. A) embriones a las 3 semanas. B) plántula a las 6 semanas...... 42 Figura 9. Desarrollo de embriones en: A) medio MS + ANA (2 mg/L) y B) MS (nitratos a la mitad) + ANA (2 mg/L)...... 43 Figura 10. Segmentos nodales de E. edulis en medio MS (nitratos a la mitad) + ANA + BAP (1:1)...... 44 Figura 11. Estimación puntual de las proporciones analizando la contaminación y oxidación, en los tres métodos de injertación...... 46 Figura 12. Microinjerto. A) Contaminación fúngica de los microinjertos B )procesos necróticos en la unión del injerto a través del método T. invertida..... 47 Figura 13. Estimaciones puntuales de prendimiento en injertos de E. edulis para tres métodos de microinjertación...... 48 Figura 14. Desarrollo del microinjerto: A) y B) formación de callo en la zona de unión del injerto. C) consolidación de microinjertos a través del método púa y D) Aprox. Lateral...... 49 Figura 15. Contaminación fúngica a partir de yemas ex vitro, en injertos in vitro. . 50

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LISTA DE TABLA

Pág. Tabla 1. Tratamientos de desinfección aplicados a las semillas de E. edulis ...... 31 Tabla 2. Modificación de los tratamientos de desinfección empleados en semillas de E. edulis...... 31 Tabla 3. Reguladores empleados en la etapa de inducción de brotes de E. edulis...... 32

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LISTA DE ANEXOS

Pág Anexo A. Número de observaciones total, analizados en el estudio...... …..59 Anexo B. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable contaminación...... 60 Anexo C. Tabla del análisis de comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable oxidación...... 60 Anexo D. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable germinación...... 61 Anexo E. Estimación del promedio de brotes y prueba de normalidad para la construcción del intervalo de confianza...... 61 Anexo F. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable contaminación...... 61 Anexo G. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable oxidación...... 62 Anexo H. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable prendimiento...... 62 Anexo I. Estimación del promedio de crecimiento y prueba de normalidad, para la construcción del IC...... 62

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RESUMEN

Erythrina edulis, es considerada una especie promisoria en los sistemas de alimentación, debido a los valores proteicos atribuidos a sus hojas y semillas. Por lo que se ha propuesto que la técnica de la microinjertación aporte en la reducción del periodo vegetativo y producción de la especie.

La asepsia de semillas y el establecimiento de embriones in vitro, consistió en la inmersión de la semilla en alcohol 70%, durante 15’, seguida de Tween 80% por 15’,

Benlate 1 g/L durante 20’ y HgCl2 (0.2%) por 20’. Se tomaron epicótilos mayores a 3 cm y como injertos yemas axilares, provenientes de embriones germinados in vitro en medio MS con nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L). Los microinjertos se realizaron a través de los métodos (Aprox. Lateral, Púa y T. invertida). Estos se mantuvieron en medio MS nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L). Se utilizó un análisis de comparación de proporciones evaluando la contaminación, oxidación y germinación y para la variable crecimiento (cm) una estimación de promedio. El establecimiento de los microinjertos se vio afectado por problemas de contaminación fúngica y microbiana, 8 días después de la injertación. El método T. invertida presentó los mayores niveles de oxidación. El prendimiento de los injertos no arrojó diferencias significativas, por lo que no fue posible concluir si el prendimiento de los injertos estaba influenciado por el tipo de incisión. Para los métodos (Aprox. Lateral y Púa) se observó un crecimiento promedio de 2.58 cm, 45 días posteriores a la microinjertación.

Palabras clave: Erythrina edulis, dicloruro de mercurio, microinjerto, métodos de injertación.

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ABSTRACT

Erythrina edulis, is considered a promising species in food systems because the protein values attributed to their leaves and seeds. As the proposed technique micrografting contribution in reducing the growing season and production of the species.

The aseptic seed and establishment of in vitro embryos, consisted of immersing the seeds in alcohol 70% for 15’, followed by Tween 80 % for 15’, Benlate 1 g/L for 20’ and

HgCl2 (0.2%) for 20’. Epicotyls greater than 3 cm were taken and grafts as axillary buds, embryos from in vitro germinated on MS medium with half nitrates + ANA (2 mg/L). The micro grafts were performed by the methods (Approx. Lateral, Spike and T. reversed). They were kept on MS half nitrates + ANA (2 mg/L). Analysis comparing proportions evaluating contamination, oxidation and germination and for growth variable (cm) the estimated average was used. Establishing micrografting was affected by problems of fungal and microbial contamination, 8 days after grafting. The T. reversed method showed the highest levels of oxidation. The Taking of the grafts showed no significant differences, so it was not possible to conclude whether the take of grafts was influenced by the type of incision. For methods (Approx. Lateral and Spike) an average growth of 2.58 cm, 45 days after the micrografting was observed.

Keywords: Erythrina edulis, mercury dichloride, micrografting, grafting methods.

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INTRODUCCIÓN

Eritrhina edulis o frijol de árbol, es una leguminosa arbórea originaria de América que crece entre los 1.300 y 2.600 msnm; en Colombia se ha observado en la zona cafetera en alturas hasta 2.200 y 2.500 msnm. Tradicionalmente el Chachafruto se ha utilizado como especie de interés alimenticio por el destacado valor nutricional y el tamaño de sus semillas, las cuales contienen un 25% de proteína.

En el ejercicio de la investigación, la irrupción de la biotecnología agrícola se considera una herramienta que permite mejorar la calidad, seguridad y sanidad de los productos agrícolas, genera rendimientos factibles, que propician la búsqueda de una agricultura con un uso más racional de agroquímicos, así como ayudar de manera sostenible en la creciente demanda de alimentos.

En la actualidad, el establecimiento y estandarización de protocolos in vitro en especies alimenticias se considera fundamental para procesos de micropropagación masiva y para facilitar las técnicas que se emplean en el campo de la biotecnología vegetal.

En muchos países del mundo, el cultivo in vitro se utiliza para apoyar programas de mejoramiento genético al mismo tiempo la biotecnología está generando un extraordinario optimismo respecto a la capacidad del mundo para alimentar a futuras poblaciones, ya que uno de los mayores logros de esta ciencia es poder obtener plantas libres de enfermedades, mejora en la adaptación ambiental, entre otras ventajas.

El objetivo de esta tesis se encaminó a estandarizar un protocolo de desinfección y establecimiento de una metodología de propagación in vitro en la especie Erythrina edulis, a través de la técnica de microinjertación in vitro, como alternativa a los métodos de propagación convencional, con la finalidad de buscar nuevas tecnologías que por su eficiencia permitan a futuro contribuir a la seguridad alimentaria de la humanidad, gracias a su establecimiento en bancos de germoplasma. 12

Se aplicaron algunos de los métodos de microinjertación propuestos por otros investigadores, teniendo en cuenta la planta, el tipo de explante y los objetivos planteados en el presente trabajo.

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1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL

Obtener plántulas de Erythrina edulis M. a través de la técnica de microinjertación in vitro.

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Definir un protocolo para el establecimiento aséptico del porta injerto y yemas vegetativas a injertar de Erythrina edulis M. in vitro.

 Evaluar la respuesta del microinjerto con respecto al uso de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo.

 Determinar si el establecimiento del microinjerto está influenciado por el tipo de incisión del injerto, considerados: métodos de Aproximación lateral, Púa y T invertida.

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2. MARCO TEORICO

2.1 GÉNERO ERYTHRINA.

El género Erythrina proviene del griego erythros (que significa rojo) por el color de sus flores. Considerándose un género pantropical, muchas de sus especies son usadas en diferentes países, donde crece bajo distintas condiciones de clima y suelo, llegando hasta los 2.000 msnm (Krukoff, 1976).

Las especies de Erythrina generalmente son árboles o arbustos deciduos, con hojas trifoliadas, alternas y con estipulas glanduliformes. Sus flores tienen cáliz acampanado, oblicuamente trunco o bilabiado; con sus pétalos libres o adheridos por el dorso. El fruto es una legumbre estipitada, bivalvada con semillas ovaladas o reniformes. Tienen un rápido crecimiento y producción de abundante biomasa, aportan nutrientes al suelo, enriqueciéndolo y protegiéndolo contra escorrentía (Jiménez, 1990).

2.2 Erythrina edulis Micheli.

2.2.1 Descripción Taxonómica. Clasificación taxonómica basada en el Sistema de Información de Biodiversidad (SIB) y el Catálogo de la Biodiversidad de Colombia.

Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Fabales Familia: Fabaceae Subfamilia: Faboideae Género: Erythrina Especie: Erythrina edulis Micheli Autor epíteto específico

Nombre común: Balú, Baluy, Calú, Chacha fruto, Chachafruto, Chaporuto, Fríjol nopaz, Nopo, Nupo, Poroto, Poruto, Sachafruto.

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2.2.2 Descripción Morfológica. Erythrina edulis, es una leguminosa arbórea nativa de los Andes Suramericanos, en la cual los arboles alcanzan una altura promedio de 8 a 12 m de altura, con un diámetro de copa de hasta 7 metros (Figura 1).

Su Tronco en árboles adultos mide 69 cm de diámetro, y en su etapa juvenil posee aguijones cortos, copa redondeada y follaje verde oscuro. Factores como la falta de dureza y susceptibilidad a la pudrición al hacer contacto con el suelo, hacen que su madera no sea recomendada para construcción (Esquivel, 2009).

Las Hojas miden 30 cm de largo por 20 cm de ancho, son compuestas, alternas, glabras, coriáceas, trifolioladas con forma triangular, están dispuestas en forma de hélices, terminan en punta aguda, tienen glándulas en la base de sus pecíolos y su borde es entero; presentan estípulas libres.

Las Flores son de color naranja, zigomorfas, y están conformadas por cuatro pétalos que en conjunto parecen una mariposa o un pajarito con sus las abiertas y están congregadas en inflorescencias en forma de racimos cónicos y densos.

El Fruto es una vaina alongada de color verde, que mide entre los 10 y los 30 cm de largo, pendular y contiene numerosas semillas.

Las Semillas son de color café rojizo, miden 3.5 cm de largo, con forma de riñón y sus cotiledones tienen consistencia carnosa.

El embrión de la semilla es pequeño, en relación con el gran tamaño de los cotiledones. (Barrera, 1998).

Fenología: este árbol florece de noviembre a abril y fructifica de marzo a agoto, perdiendo parcialmente su follaje al final de la floración (Esquivel, 2009).

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  2.2.4 Uso E Importancia Económica De Erythrina edulis. La producción de frutos en árboles de chachafruto comienza a partir los 3 años de edad, estabilizando su productividad a los seis años. Se conoce árboles de más de 20 años que producen un promedio de 170 kg de frutos/árbol/año y es utilizado como fuente de alimento humano y animal ya que sus frutos tienen un alto valor nutritivo (23% de proteína), superior al de otras leguminosas como el frijol, la arveja y el haba. Además, sus semillas poseen aminoácidos esenciales similares al huevo de gallina y se considera un alimento completo cuando se mezcla con el maíz (Barrera, 1998; Barrera & Mejía, 1999).

Las hojas y ramas tiernas se ofrecen como alimento forrajero a las cabras, caballos, cerdos y conejos, pues contienen un 24% de proteína, 29% de fibra cruda (en peso seco) y un 21% de hidratos de carbono. Además son ricas en potasio pero pobres en calcio (Surco, 1987). Las vainas contienen 21% de proteína, 23% de fibra cruda (en peso seco), 24% de hidratos de carbono y 91% de humedad. La semilla cocinada puede reemplazar en un 60% el alimento concentrado para pollos y ganado vacuno (Martín & Falla, 1991).

2.2.5 Propagación De La Especie. Erythrina edulis, posee una gran capacidad para multiplicarse, tanto por semilla sexual como por estaca. Según Barrera (1989), el porcentaje de germinación de las semillas sexuales es de un 90%, si se siembra en los primeros 15 días, después de cosechadas las semillas.

Propagación por métodos convencionales de semillas y estacas:

Por semilla: se recolectan las vainas que estén maduras. Se dejan secar a la sombra de forma natural, las vainas se abren, y se dejan caer las semillas que tienen coloración marrón. Se siembran de 2 a 3 semillas en siembra directa, a unos 3 cm de profundidad. A los 10 días brota la plántula que alcanza unos 6 cm, y a los 6 meses su altura llega a los 0.50 m.

Por estaca: deben cortarse luego de que el árbol ha producido frutos. Deben provenir de árboles sanos y bien formados. Las estacas deben ser maduras y se cortan en la

18 parte media de ramas color café-verdoso, teniendo al menos de 2-4 cm de diámetro por 2 cm de longitud. Con este sistema de propagación, la primera brotación aparece aproximadamente a los 45 días de ser sembrado (Aguirre, 1996).

2.3. CULTIVO DE TEJIDOS O PROPAGACIÓN in vitro.

Consiste en la multiplicación masiva de un explante con potencial de diferenciarse en condiciones favorables (balance hormonal apropiado y ambiente fisicoquímico controlado). Los individuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son clones, es decir son copias genéticamente idénticas entre ellas e idénticas a la planta madre, exceptuando las plantas propagadas por semillas (Abdelnour & Escalant, 1994).

2.3.1 Factores Que Intervienen En La Micropropagación según Abdelnour & Escalant, (1994).

2.3.1.1 El Inoculo O Explante. Es el órgano, tejido o fragmento de tejido, células, etc., extraído del material parental para iniciar el cultivo in vitro. Elegir el explante adecuadamente es el primer paso para el establecimiento de los cultivo, y varía según el objetivo que se desee alcanzar. Es importante considerar factores como el genotipo, edad de la planta y su estado fisiológico.

2.3.1.2 Factores Físicos. pH: el grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y específico para cada tipo de plantas, al igual que ocurre en el suelo, por lo que se debe ajustar a los requerimientos de la especie en estudio.

La humedad: en condiciones in vitro la humedad dentro de los recipientes es casi 100%. Debido a esto la planta in vitro generalmente no desarrolla adecuados sistemas de regulación hídrica tales como cera, estomas, cutículas, etc.

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La luz: en condiciones in vitro clásicas, la calidad e intensidad de la luz es muy bajo (10 w/m2) ya que en condiciones naturales la luz puede llegar hasta los 900w/m2). Dos fenómenos importantes dependientes de luz son: la fotosíntesis y la fotomorfogénesis.

3.3.1.3 Factores Químicos.

Medio de cultivo: conjunto de elementos abióticos que integran la sustancia nutritiva de diversa consistencia (solida a liquida), suministrando anclaje, nutrición y la estimulación del desarrollo al explante. Un medio de cultivo en forma general está compuesto de:

Sales minerales: sales encargadas de dar el soporte nutritivo de las plántulas. Las sales contienen macronutrientes (N, K, P, Ca, Mg, S) y micronutrientes (Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, B), requeridos por la planta para su desarrollo normal.

Fuentes de energía: son sustancias orgánicas como los azucares que proveen tres de los elementos mayores esenciales: hidrogeno (H), carbono (C) y oxigeno (O).

Agentes solidificantes: estas sustancias crean un medio de soporte de los tejidos u órganos que vamos a sembrar, reemplazando el sustrato natural (suelo), las más empleadas son los agares.

Reguladores de crecimiento: la adición de estas fitohormonas al medio en diferentes proporciones, estimula o detiene el crecimiento o diferenciación de algunos órganos en la planta. Permiten manipular algunos procesos morfogenéticos de la misma.

2.3.1.4 Principales Reguladores De Crecimiento.

Auxinas: sustancias químicas que tienen en común la capacidad de regular el crecimiento, la división celular y la diferenciación de raíces en los cultivos in vitro. Las auxinas más utilizadas son el AIA (ácido indol-3-acético), el ANA (ácido α- naftalenacético), el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), el AIB (ácido indolbutírico).

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Citoquininas: Son derivados de la adenina que promueven la división celular. Entre ellas se destacan las siguientes: BA (bencil adenina), K (cinetina o 6-furfuril aminopurina), Zea (zeatina) y 2-iP (N-isopentenil adenina). Las dos primeras son citocininas sintéticas y las dos últimas naturales. La inclusión de citoquininas en el medio de cultivo permite formar callos en varias especies vegetales, aunque principalmente induce que regiones meristemáticas multicelulares se diferencien en estructuras organizadas.

Giberelinas (GA3): regulan varios procesos del crecimiento y desarrollo como la germinación de semillas, la elongación de tallos, el desarrollo de raíces y la floración. Permiten superar la latencia de semillas y brotes, promueven la floración y retardan la senescencia.

2.4 ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN in vitro.

Cuando se realiza la multiplicación de plantas, aplicando técnicas de cultivo aséptico es fundamental considerar una serie de etapas, establecidas por (Murashige, 1974), las cuales clasifico de la siguiente manera:

2.4.1 Etapa 0: Etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la selección de una modalidad de pretratamiento.

2.4.2 Etapa I: Es la etapa de iniciación, en la que se establece el cultivo primario. Requiere que los explantes se transfieran al medio de cultivo de forma aséptica, incluyendo la desinfección previa tanto del explante como del medio. Esta fase se considerara superada si los inóculos (explantes) sobreviven sin contaminación fúngica, ni bacteriana y se desarrollan adecuadamente (Sierra De Grado, 2003).

A continuación se describen algunas de los métodos de desinfección más utilizados en el cultivo in vitro:

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Métodos de desinfección. La importancia de emplear métodos de desinfección superficial de los explantes elegidos para micropropagar, además de los elementos de trabajo como la cámara de flujo laminar, cuartos de procedimientos, la esterilización del medio de cultivo, es fundamental en la propagación in vitro, teniendo en cuenta que el medio de cultivo y el ambiente controlado genera también las condiciones ideales para el crecimiento y proliferación de microorganismos contaminantes (Abdelnour & Escalant, 1994).

Material vegetal: la desinfección superficial del explante debe eliminar los microorganismos pero a la vez debe causarle el menor daño posible. Lizárraga et al., (1991), señala que dentro de los agentes desinfectantes más recomendados y usados se encuentran:

 El hipoclorito de sodio (Cloro comercial del 2 al 5%): estos productos comerciales contienen normalmente 5,25% NaClO como producto activo. Al ser diluido en agua la solución esterilizadora resultante deberá contener no menos de 0.5 hipoclorito de sodio.

 El Hipoclorito de Calcio (del 6 al 12%): la superficie de material vegetal puede también ser esterilizada con soluciones acuosas a partir de (Ca [OCl]). Esta sal es la más preferida por ser menos fitotóxica.

 Etanol generalmente al (70%): el alcohol es una gente esterilizador común de superficie para eliminar bacterias y hongos. Tiene una baja tensión superficial, penetrando fácilmente en las pilosidades foliares mojando la superficie de la planta.

 Bicloruro de mercurio: el (HgCl2) ha sido utilizado como desinfectante pese a que es altamente tóxico. La solución con bicloruro de mercurio es volátil a temperatura ambiente, por lo cual es pertinente su uso en cámara de flujo laminar, con la protección adecuada.

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En algunos casos resulta útil agregar algún agente tensoactivo o detergente (2 a 4 gotas de Tween-20) para romper la tensión superficial y permitir un mayor contacto del explante con el químico. También se hace uso de antibióticos, aunque su empleo se justifica en casos de excepción y en cultivos de corta duración ya que estos pueden influir negativamente en procesos del cultivo (Roca & Mroginski, 1991). No se puede garantizar sobre el tipo de desinfectante o la concentración de este a utilizar, ya que cada especie y tipo de explante es un caso particular lo que resalta la importancia de experimentar con diferentes métodos.

El medio de cultivo: generalmente los medios de cultivo se esterilizan en autoclave a una presión de 115 lb. (121°C) durante 20 minutos o más, dependiendo del volumen de medio.

La cristalería: su limpieza es de vital importancia en el trabajo de cultivo in vitro. Este material debe lavarse con detergentes que se eliminen fácilmente con agua, y nunca se debe utilizar jabón (Roca & Mroginski, 1991). También existen soluciones inorgánicas para el lavado.

Instrumentos de trabajo: para esterilizar elementos metálicos como pinzas, bisturíes, tijeras. etc. generalmente se utiliza la técnica de flameo previa inmersión en alcohol de 95°. Además cuando se utilicen cajas de Petri o papel, estos se esterilizaran haciendo uso del autoclave.

El área de trabajo: la contaminación en estas áreas generalmente se da por esporas de hongos y bacterias que habitan en el ambiente, por lo que se hace necesario limpiar las paredes y mesas con desinfectantes y trabajar en lo posible durante períodos cortos de tiempo (Roca & Mroginski, 1991).

El investigador: suele ser una fuente primaria de contaminación, por lo que es necesaria una adecuada limpieza de las manos y los brazos antes de iniciar la sesión de trabajo. Para reducir la contaminación también se debe usar batas de laboratorio, guantes limpios, y protección de cabello, boca y nariz. 23

Esterilización: La eficacia en el proceso de esterilización en cualquier preparación está sujeta a factores como: la naturaleza de la sustancia que se esteriliza, el volumen contenido en cada unidad, el tamaño del recipiente y el número de unidades que se pueden manejar en una sola operación (Roca & Mroginski, 1991). Por lo cual no hay una metodología especifica al momento de realizar la esterilización.

Sin embargo en los procesos de esterilización el calor es uno de los agentes que se utiliza con más frecuencia. Empleándose de las siguientes maneras:

 contacto directo con la llama.  calor húmedo (vapor).  calor seco (aire caliente).  agua caliente (no hirviendo).

En la actualidad uno de los métodos más empleados en el laboratorio es el vapor bajo presión o (autoclave). Es muy eficiente para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo (siempre y cuando no tenga componentes termolábiles), ya que destruye todas las formas de bacterias, hongos y sus esporas. La autoclave más utilizada es la contraparte de mayor tamaño de la olla de presión común. La temperatura dentro de la autoclave se regula mediante la presión y es directamente proporcional a ésta; la presión se observa en un manómetro que forma parte de la autoclave. Con respecto al tiempo de exposición requerido dependerá tanto del tipo de material que se va a usar como su cantidad.

Con respecto a la esterilización de material proveniente del cultivo de tejidos, se suele manejar una presión de 15 lb durante 20 minutos (T° vapor aprox. 121°C) suficiente para matar todas las formas de vida en cinco minutos. Si se desea que la esterilización sea completa, el calor debe penetrar en cada porción del material; finalmente ninguna sustancia es estéril si queda en ella un organismo viable.

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2.4.3 Etapa II: Etapa de la multiplicación o proliferación. Se busca la multiplicación de propágalos de gran número, que den lugar a nuevas plantas. La duración de esta etapa depende de la especie (Sierra De Grado, 2003).

 Subcultivo: a medida que el explante comienza a crecer y multiplicarse es subdividido y cada nuevo propágulo es cultivado individualmente en un nuevo medio de cultivo (Rojas et al., 2004), una vez se multiplique y crezca, será subdividido nuevamente.

 La regeneración del explante depende de muchos factores como el medio de cultivo, el ambiente de incubación, el genotipo y su origen.

Según Simón Martínez & Moysset Agustí (2006), en la etapa de multiplicación, las citoquininas per se o reguladores de tipo auxínico inducen la formación y brotación de yemas adventícias y axilares. Por lo que unan relación citoquininas/auxinas elevada actuaría en la formación del brote y por el contrario una elevada relación auxinas/citoquininas favorecería la diferenciación de raíces. Lo anterior no implica que ambas hormonas deban encontrarse en el medio ya que los requerimientos exógenos de estos reguladores, dependen de los niveles en endógenos de la planta; pues en ciertos casos, la adición de citoquininas al medio nutritivo estimula la multiplicación (brotación de yemas axilares y adventicias). A partir de 4 a 8 semanas, el explane original generara numerosos brotes, los cuales pueden aislarse de forma individual o en pequeños grupos y transferirse a un medio de multiplicación fresco. De esto modo se iniciara otro ciclo de multiplicación y en un tiempo relativamente corto, podrá obtenerse un número elevado de brotes.

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2.4.4 Etapa III: se refiere al enraizamiento o etapa de pretransplante; su finalidad es producir una planta autotrófica que sea capaz de sobrevivir en las condiciones de trasplante al suelo (Roca & Mroginski, 1991).

2.4.5 Etapa IV: Transferencia final a la etapa de medio ambiente o aclimatización

2.5 TÉCNICAS DEL CULTIVO in vitro

El cultivo de tejidos vegetales in vitro comprende un grupo de técnicas heterogéneas, que el operario debe conocer, con la finalidad de resolver numerosos problemas en la multiplicación de las plantas, entre los cuales se cuentan la micropropagación masiva de plantas elites, la limpieza de material libre de virus y otros patógenos, el rescate de especies en peligro de extinción, la propagación de especies con problemas en la viabilidad de las semillas, la conservación del germoplasma de plantas de interés comercial y la posibilidad de establecer programas de mejoramiento genético más rápidos que en los cultivos tradicionales, por técnicas biotecnológicas e ingeniería genética (Alfaro, 2004).

3.5.1 Propagación a través del rescate de embriones in vitro. El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento in vitro, en condiciones estériles de un embrión inmaduro, con el objetivo de obtener una planta viable.

Pierik (1990), Señala dos tipos de cultivo de embriones:

1. Cultivo de embriones inmaduros: se origina en semillas no acabadas de madurar. Este tipo de cultivo se emplea para evitar la muerte prematura del embrión, con el fin de obtener una planta viable. El éxito en este tipo de cultivo depende en gran parte del desarrollo del embrión en el momento de su extracción, por lo que se requiere un medio de cultivo complejo y habilidades en el momento de la disección.

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2. Cultivo de embriones maduros: aplica para semillas maduras, y se desarrolla sobre todo para superar problemas de germinación de las semillas. En este caso suele emplearse medios de cultivo simple, suplementados con agar, azúcar y minerales.

Las principales ventajas que se obtienen al cultivar embriones son:

- Prevención del aborto embrionario. - acorta el ciclo de germinación. - Elimina la inhibición de la germinación de las semillas. - Los embriones se utilizan como material inicial para la propagación vegetativa.

Sin embargo, se deben considerar factores adversos que disminuyen la viabilidad de los embriones como:

- Pérdidas causadas por infección - Daños en los embriones - Interrupción del desarrollo embrionario.

2.5.2 Microinjertación. El método de la microinjertación tiene como finalidad el acoplamiento de tejidos a partir de dos individuos, generando un crecimiento como resultado de la unión. Así la planta mejorara problemas asociados con juvenilidad, oxidación, perdida de estabilidad genética y resistencia a enfermedades con patrones resistentes (Criollo, 2008).

El procedimiento estándar para la mayoría de los laboratorios consiste en los siguientes pasos: 1.Preparación del portainjerto, 2. Preparación de la copa, 3. Injerto in vitro y 4. Crecimiento de las plantas injertadas in vitro. Sin embargo Criollo (2008), considera que el éxito de la injertación se refleja en el prendimiento o la unión que se produce entre el ápice y el portainjerto, determinada por la compatibilidad dada entre las dos partes. El parámetro de compatibilidad es decisivo pues si las dos especies no tienen un parentesco genético, muy difícilmente puede ocurrir una unión y un crecimiento normal del injerto.

El principal enfoque de esta técnica es el de obtener plantas limpias, eliminando la contaminación causada por virus, así Navarro (1979), emplea la técnica de microinjerto 27 de ápices caulinares in vitro, a fin de obtener plantas de agrarios libres de virus. Una variante de la microinjertación podría permitir la obtención de plantas injertadas en mayor volumen, que con los métodos convencionales.

En Pinus radiata D., se ha empleado esta técnica injertando braquiblastos de seis años de edad sobre portainjertos de la misma especie, con el objetivo de reactivar el material adulto élite de pino (Materán et al., 2008). De igual manera, la microinjertación ha sido realizada en cacao (Theoroma cacao L.) utilizando como patrones plántulas y como injertos embriones somáticos. En este estudio, los resultados prueban la confiabilidad de este método para regenerar plantas de cacao (Aguilar, 1990; Aguilar et al., 1992).

Respecto a los factores que intervienen en la microinjertación, Criollo (2008) hace referencia a Navarro et al., (1975), quien señala que el porcentaje de microinjertos exitosos se ve influenciado por una serie de factores como lo son: el efecto de la luz en la germinación de la semilla, la edad de la plántula al realizar el microinjerto y la especie utilizada como patrón. De igual manera estos autores consideran fundamental analizar el tamaño del ápice antes de injertar. Actualmente, para lograr la asepsia de virus en cítricos, se recomienda injertar un ápice caulinar compuesto por un el meristemo apical con tres primordios foliares (0,1 – 0,2 mm). Respecto a la posición del injerto, Navarro et al., (1975) lograron mejores resultados al colocar el ápice sobre el anillo vascular en la superficie del corte de epicótilo o en una incisión tipo T invertida, en la zona decapitada del epicótilo.

2.5.3 Antecedentes En Cultivo in vitro De E. edulis. En las técnicas de cultivo in vitro, la principal limitación que suele presentarse, es la contaminación de los cultivos por microorganismos. Por lo anterior, Valdieri citado por Acosta & Zamora (2004), afirma que la propagación de chachafruto a través de semillas, es imposible por el alto porcentaje de contaminación bacteriana. Sin embargo actualmente se hace uso de un gran número de desinfectantes de alto espectro bacteriano y fúngico, que permiten alcanzar en la mayoría de los casos el éxito en la propagación in vitro. 28

En el año 1994, M. C. Vieites, Jaramillo, & Cancino, adaptaron los sistema de cultivo 'in vitro' enfocados en micropropagar los tejidos vegetales de Erythrina edulis. Así, formularon un protocolo general para la micropropagación y endurecimiento de plantas obtenidas 'in vitro' a partir de material juvenil germinado en el invernadero. El establecimiento de los cultivos a partir del explante yemas apicales, se logró empleando el medio Murashige & Skoog (MS 1962) con los macro y micronutrientes completos, sin adición de reguladores de crecimiento, agregando como suplemento orgánico glicina (2mg/L), agar (6.5%) como agente solidificarte del medio y sacarosa al 3%. Una vez establecidas y elongadas las yemas apicales, se tomaron segmentos nodales para iniciar la etapa de multiplicación.

Un nuevo ensayo realizado en el 2004, por M. Acosta, & Zamora establece un protocolo de desinfección para Erythrina edulis Triana, usando Hipoclorito al 5.5%, y Cloranfenicol 1250 mg/L en el explante embrión, obteniendo una germinación del 100% en medio MS ½ enriquecido con vitaminas y ácido naftalenacético (ANA) 2.0 mg/L, tomaron hojas de 2 cm retirando su epidermis, realizándoles cortes de 2 mm; aislando los protoplastos con el uso de un protocolo de digestión enzimática de la pared celular para evitar la plasmólisis.

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3. METODOLOGÍA

3.1 LUGAR DE TRABAJO.

La presente investigación se desarrolló en las instalaciones del Laboratorio de Protección de Plantas y Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad del Tolima, entre los meses de marzo y diciembre.

3.2 SELECCIÓN DE SEMILLAS.

Esquivel (2009), reporta un bajo número de ejemplares en Ibagué, confirmando su presencia en solares de casas aledañas del Cañón del Rio Combeima. La recolecta de semillas se realizó en dos puntos de muestreo (área poblada Pico de Oro y el corregimiento de Villarestrepo), ubicados en la Zona rural del Cañón del Combeima a una altura aproxima de 1600 msnm. De los árboles selectos, se tomaron las vainas o legumbres cerradas, de coloración verde intensa con características fitosanitarias idóneas, como ausencia de daños mecánicos o de insectos y sin afectación externa por hongos o bacterias (Figura 2).

Figura 2. Etapas de muestreo: A) árbol de Erythrina edulis en Villarrestrepo, B) frutos de la especie.

A B

Fuente: el Autor

30

3.3 TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN PARA SEMILLAS.

Las legumbres fueron llevadas al laboratorio de Protección de Plantas, donde se les realizó un lavado con agua corriente para retirar cualquier partícula, seguido de una limpieza superficial con Hipoclorito de Sodio al 5.25%. Luego de la desinfección de las vainas se tomaron las semillas, las cuáles fueron sometidas a diferentes protocolos de desinfección, como se registra en las Tablas (1 y 2) realizando tres lavados sucesivos con agua destilada estéril, después de la inmersión en cada uno de los agentes desinfectantes.

Tabla 1. Tratamientos de desinfección aplicados a las semillas de E. edulis

Benlate Tween Etanol NaClO Cloranfenicol Tratamiento Tetraciclina 1 g/L 80% 70% 5. 25% 1.250 mg/L

1 20’ 10’ 5’ 5’ 20’ 2 20’ 10’ 5’ 10’ 20’ 3 20’ 10’ 5’ 15’ 20’ 4 20’ 10’ 5’ 20’ 20’ 5 20’ 10’ 5’ 30’ 20’ 6 20’ 10’ 5’ 20’ 20’ 7 20’ 10’ 5’ 20’ 20´ * 8 20’ 10’ 5’ 20’ 20´ ** 7) * Inmersión de embriones en Sol. 10% de Cloranfenicol. 8) ** Medio de cultivo suplementado con 50 mg de Cloranfenicol.

Tabla 2. Modificación de los tratamientos de desinfección empleados en semillas de E. edulis. Etanol Tween Benlate HgCl2 PPM Tratamientos 70% 80% 1 g/L 0.2 % 0.3% 0.2 % 9 10’ 10 20’ 5’ 15’ 20’ 11 20’ 12 20’** 13 6 H 14 14 H 12) ** Medio de cultivo suplementado con PPM (2 ml/L) 31

3.4 EXTRACCIÓN DE EMBRIONES.

De las semillas desinfectadas se aislaron los embriones intactos, los cuales se inocularon en dos medios de cultivo suplementados con vitaminas y reguladores de crecimiento, con pH ajustado a 5.8 para la obtención de vitroplantas, así:

 Medio básico Murashige & Skoog (MS) + ANA (2 mg/L).  Medio básico (MS) con nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L).

Los embriones fueron incubados en oscuridad por un periodo de 10 días, posteriormente bajo fotoperiodo de 12 horas luz (lámparas fluorescentes de 1000 lux), a una temperatura de 23-25°C.

3.5 ETAPA DE MULTIPLICACIÓN in vitro.

Se tomaron vitroplantas de 7 meses de edad, a partir de las cuales se aislaron segmentos nodales (brote de tallo con una yema axilar), inoculándolos en un medio MS (nitratos a la mitad), con reguladores de crecimiento vegetal (Tabla. 3) citoquinina: 6- Bencilaminopurina (BAP), más auxina: Ácido naftalenacético (ANA).

Tabla 3. Reguladores empleados en la etapa de inducción de brotes de E edulis.

Número de Tratamientos ANA mg/l BAP mg/l explantes 1 1 1 12 Fuente: el Autor

3.6 MANEJO DE PLANTAS EN INVERNADERO.

Las plantas madre, donantes de yemas vegetativas ex vitro (explantes para la microinjertación in vitro), fueron tratadas con riego manual tres veces por semana. Y para el control de las condiciones fitosanitarias se efectuó una aspersión foliar con (Benlate® 2 g/L) como fungicida sistémico y (Lorsban 2.5% DP), como insecticida de contacto. Alternando el producto tanto en la fertilización como en el control fitosanitario,

32 así como la aplicación de un fungicida sistémico tres días antes de la colecta de los explantes.

3.7 PROCEDIMIENTO DE INJERTACIÓN.

3.7.1 Preparación Del Injerto. Yemas axilares de aproximadamente 2 mm de longitud fueron utilizadas como injerto. Estas fueron tomadas a partir de plantas madre producidas in vitro de seis meses de edad. Con el fin de garantizar la asepsia en el momento de realizar el injerto.

3.7.2 Microinjertación. En el procedimiento se usaron vitroplantas de 3 meses de edad, las cuales se podaron en su parte apical dejando una porción del epicótilo de 3-4 cm; eliminando sus yemas axilares y una porción del ápice de la raíz dejando un trozo de 2- 3 cm.

4.7.2.1 Métodos De Incisión:

3.7.2.2 Aproximación Lateral: a las yemas vegetativas asépticas “injerto”, se les realizó un corte en forma de bisel en la parte basal, la cual entró en contacto con la zona vascular de la plántula podada, la cual también presentaba una incisión en bisel (Figura 3.A).

3.7.2.3 Púa: a partir de plántulas in vitro, se tomaron yemas vegetativas de 2 a 3 cm de longitud realizándoles un corte en forma de “v” invertida en la parte terminal; por otro lado a los portainjertos se les eliminó las hojas y luego en la porción basal del mismo se realizaron dos cortes en forma de “v” invertida para formar una cuña, que luego fue insertada dentro de la hendidura del cubreinjerto (Figura 3.B).

En los dos métodos previamente descritos, el contacto entre el injerto y portainjerto, se mantuvo utilizando anillos de silicona estériles.

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3.7.2.4 T. Invertida: luego de extraer las yemas vegetativas, se le depositó dentro del corte (1x2mm) hecho, como su nombre lo dice, en forma de t invertida en la parte superior del patrón, abrazando las yemas con los tejidos al lado y lado de la incisión (Figura 3.C).

Figura 3. Tipos de incisión: A) Aprox. Lateral, B) Púa y C) T. invertida.

A B C

Fuente: el Autor

3.8 EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO CON RESPECTO AL CRECIMIENTO DEL MICROINJERTO.

Los microinjertos fueron cultivados en medio Murashige y Skoog (MS) (nitratos a la mitad) suplementado con 2 mg/L de ANA, con el fin de observar el desarrollo de las yemas injertadas sobre el patrón.

3.9 MICROINJERTO A PARTIR DE EXPLANTES ex vitro.

A partir de plantas madres germinadas en invernadero, se tomaron ápices caulinares con yemas axilares desarrolladas, se sometieron a un protocolo de antisepsia, que consistió en un enjuague con agua destilada más Tween 80 por 15’, inmersión en etanol 70% durante 10’, inmersión en una solución de Benlate 2 g/L durante 10’, y posteriormente se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 2% durante 10’. Finalmente los ápices se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril, y se colectaron en un recipiente que también contenía agua destilad estéril.

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Como portainjertos se utilizaron microtallos, mayores a 3 cm de longitud, provenientes de vitroplantas de chachafruto. Todos los cultivos se colocaron en un cuarto de crecimiento con un fotoperiodo de 12 horas luz oscuridad y temperatura de 23°C–24°C. Una semana después se evaluó el porcentaje de contaminación, oxidación y prendimiento; a las cuatro semanas el crecimiento de los microinjertos.

3.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Se utilizaron 12 explantes por tratamiento, sin embargo en algunos ensayos se optó por aumentar el número de observaciones (Anexo A). En los ensayos de desinfección, control de oxidación y germinación evaluando variables de tipo categóricas como: contaminación, oxidación y desarrollo, se realizó un análisis de estimación de proporciones, para la comparación de los tratamientos.

Este análisis se hace usualmente bajo el supuesto de que el tamaño de las muestras permite utilizar aproximación normal en la prueba. Ya que el tamaño de la muestra es pequeño, se hace necesario aplicar un método especial de estimación de proporciones (Blyth & Hutchinson) para construir el Intervalo de confianza del 95% mediante la siguiente formula:

Esta fórmula, no depende explícitamente del tamaño de muestra; siendo ejecutada mediante el uso de la calculadora on line www.statpages.org y hojas de cálculo de Microsoft Excel del paquete de office 2013.

35

La viabilidad de la microinjertación in vitro, a través de los tres métodos (púa, incisión lateral y T invertida), se midió sobre las variables categóricas Contaminación, Oxidación y Prendimiento (adhesión y formación de callo), a través de la comparación de proporciones de éxito en cada uno de los tratamientos.

Las respuestas de tipo cuantitativas como: número de brotes y magnitud del crecimiento (cm), se evaluaron mediante la estimación de los respectivos promedios, con un nivel de confianza del 95%, y la construcción de los respectivos intervalos de confianza haciendo uso del programa estadístico InFostat versión 2013.

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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En esta investigación se evaluaron las condiciones de cultivo, la edad de los porta- injertos, el tipo de injerto y la respuesta del injerto al medio de cultivo. Se observaron los resultados utilizando, injertos de tres semanas de edad, con porta-injertos de dos meses de cultivo.

4.1 GERMINACIÓN DE EMBRIONES PARA PRODUCCIÓN DE PORTA-INJERTOS Y YEMAS VEGETATIVAS ASÉPTICAS.

Los tratamientos de desinfección aplicados en este estudio se desarrollaron con el explante semillas, de las cuales se extrajo el embrión (Figura 4), por lo que él % de contaminación, oxidación y germinación se evaluó, teniendo en cuenta el desarrollo de los embriones.

Figura 4. Embriones extraídos a partir de semillas de chachafruto.

Fuente: el Autor

37

4.1.1 Contaminación: En la evaluación de la contaminación, se observó que en el explante embrión, los tratamientos de menor efectividad para controlar la contaminación fueron aquellos en los que se empleó NaClO en concentración 5.25%, generando la perdida de material entre un (75 y 100%), por contaminación de tipo bacteriano. De igual modo, Acosta & Zamora (2004), describen la presencia de un bacilo Gram - formador de colonias de color amarillo en embriones cultivados in vitro de E. edulis.

Figura 5. Estimación puntual de proporciones de contaminados en los tratamientos de desinfección de E. edulis.

1,2 1 1 1 1 1 1 0,9 0,91 0,92

0,83 0,83 0,8 0,75

0,6 0,46 0,4 0,37

CONTAMINACIÓN CONTAMINACIÓN 0,2 0,14

0 10 12 11 9 3 5 4 2 8 1 6 7 13 14 TRATAMIENTOS

Fuente: el Autor

En la (Figura 5) las estimaciones puntuales para las proporciones de contaminados, refleja que a partir del tratamiento 9 con una estimación puntual de 0.75 (o 75% de contaminación), la desinfección de los embriones con Hipoclorito de Sodio resulto negativa o en otras palabras “se contaminó”. De igual modo se descartan los tratamientos con estimación puntual igual a 1 (100% contaminación) (T1, T6, T7 T13 y T14) puesto que no presentaron significancia estadística, siendo poco efectivos para impedir la acción bactericida.

De acuerdo con las pruebas estadísticas de comparación de proporciones entre todos los tratamientos de desinfección evaluando la variable respuesta “contaminación”, con un 95% de confiabilidad se observa que los tratamientos más efectivos son los 38 tratamientos 10, 11 y 12 ya que estos difieren significativamente de los demás (Anexo B), demostrando la efectividad del dicloruro de mercurio, para controlar la contaminación bacteriana. Ya que estos tratamientos no difieren entre sí, se considera al T10 (HgCl2 0.2% por 20'), como el más sobresaliente, con una estimación puntual de (0,14) (o 14% de contaminación). De igual forma Beltrán Pedroza (2011), menciona la efectividad de este desinfectante, para controlar bacterias y hongos en yemas in vitro de A. perutilis Hansley en igual concentración y tiempo de exposición.

Por otra parte la interacción de las semillas con el hipoclorito de sodio 5.25%, a diferentes tiempos de exposición (T1 a T5), seguido del uso de Cloranfenicol (1250 mg/L) antibiótico bacteriostático de alto espectro (Mendoza, 2008), no mostró significancia estadística respecto a los demás tratamientos (Anexo B), lo mismo que el T6, en el cual se utilizó la tetraciclina como desinfectante, sin resultados positivos. Concluyéndose que estos tratamientos son deficientes para el establecimiento de los embriones in vitro. Este resultado difiere con lo reportado por Acosta & Zamora (2004), quienes lograron eliminar la presencia de bacterias in vitro usando Cloranfenicol.

El tratamiento 7 fue el único ensayo en el que se realizó una desinfección directa a los embriones, sumergiéndolos en una solución de cloranfenicol al 10% por 3’, retirando con papel estéril el exceso de la solución antimicrobiana, desinfección recomendada por Acosta & Zamora (2004), quienes lograron un éxito del 100% en el control de la contaminación en embriones de chachafruto. Sin embargo, al seguir esta referencia, se observó el crecimiento de hongos en el 100% de los casos.

Vargas y Abdelnour (2010), expresan la necesidad de adicionar antibiótico en el medio de cultivo, cuando los microorganismos son un factor limitante para el establecimiento de material in vitro, siguiendo este sugerencia en el T8 se agregó (50 mg/l) de Cloranfenicol al medio de cultivo, sin embargo el alto valor de la estimación en la proporción (0,92) revela que la contaminación persistió en un 92%. Sin embargo en estudios desarrollados a partir de segmentos nodales de Mentha arvensis L, fue posible establecer un 65%, de explantes sanos in vitro, al combinar la exposición previa 39 al cloranfenicol y su presencia como constituyente del medio de cultivo (Héctor et al, 2005).

4.1.2 Oxidación: La variable oxidación es determinante en la viabilidad del explante, en la (Figura 6) se aprecia que los tratamientos (11, 12, 10, 8, 4, 9 y 1) sin equivalentes desde el punto de vista estadístico, con una baja producción de sustancias fenólicas en el explante “embrión”, (13%, 14%, 20%, 35%, 40% y 50% de oxidación, respectivamente). Sin embargo la viabilidad de los embriones se vio comprometida al emplear hipoclorito de sodio al 5.25% pues la etapa de contaminación no pudo ser superada, por lo cual en este estudio se descartan los tratamientos (8, 4, 9, 1) dando prioridad a los ensayos (11, 12 y 10), en los que se empleó dicloruro de mercurio en un rango de concentración (0.2 y 0.3) porciento.

Figura 6. Estimación puntual de proporciones de oxidados en los tratamientos de desinfección de E. edulis.

1,2 1 1 0,83

0,76 0,8 0,66 0,67 0,5 0,6 0,35 0,4 0,4 0,4 0,2 Oxidación Oxidación 0,13 0,14 0,2 0 0 0 6 7 11 12 10 8 4 9 1 3 5 13 2 14 Tratamientos Fuente: el Autor

Los Niveles de oxidación más altos (76% y 100%), se presentaron al emplear como único agente desinfectante PPM (Plant Preservative Mixture) al 0.2%, siendo los tratamientos (13 y 14), los más oxidativos al presentar significancia estadística respecto a los demás tratamientos (Anexo C). Igualmente la acción biostática del PPM, se vio inhibida por la presencia de bacterias en un 100% aun cuando los tiempos de exposición fueron de 5 y 14 horas para cada tratamiento (figura 5), lo que indica que la acción de este biocida químico al 0.2% no cubre el rango de efectividad para controlar contaminantes bacterianos. Este resultado coincide con (Digonzelli et al., 2005) quien 40 expresa que concentraciones menores a 0.25 ml/L de PPM, no impide el crecimiento de bacterias como Pseudomona. Así mismo (Lunghusen, 1998; Kalin, & Guri, 1999), citado por (Digonzelli et al., 2005) recomiendan su uso en concentraciones de 0.5 a 2 ml/L.

4.1.3 Germinación: Los tratamientos que presentan una estimación puntual igual a (0), corresponde a ensayos en los que no fue posible evaluar la variable germinación por razones de contaminación y/o oxidación (figura 7). Hubo algunos tratamientos en los que se evidenció significancia estadística pero que se descartaron por la misma razón (T4 y T2).

Figura 7. Estimación puntual de proporciones de germinación en los tratamientos de E. edulis.

0,8 0,67 0,64 0,7 0,60

0,6 0,5 0,4 0,33 0,3 0,25 0,16 0,2 0,08

Germinación Germinación 0,06 0,1 0 0 0 0 0 0 0 1 6 7 8 13 14 4 2 3 9 11 12 10 5 Tratamientos

Fuente: el Autor

Por otra parte, los tratamiento (3, 9, 11, 12, 10 y 5), no presentaron diferencias significativas entre ellos, lo que indica que estadísticamente son equivalentes y por consiguiente, cualquiera de estos puede ser apropiado para el desarrollo de los embriones cigóticos de chachafruto (Anexo D). Si se atiende a otras razones podemos dar prioridad al tratamiento (T10) ya que fue el mejor en el control de la contaminación (14%) y oxidación (20%), empleando dicloruro de mercurio en una concentración de [0.2%] x 20 min, acompañado de la acción desinfectante del alcohol 70%, Tween 80% y Benlate. Este tratamiento propició el desarrollo de los embriones en un 64%, al cabo

41 de 5 semanas se establecieron plántulas sanas sin daños por contaminación u oxidación (Figura 8).

Aunque el tratamiento 11, también mostró ser eficiente para establecer embriones asépticos de chachafruto, Torres et al., (1998) citado por (García, 2013), consideran que una desinfección eficaz es aquella en la que los explantes han sido expuestos a una baja concentración desinfectante, presentando tasas reducidas de contaminación microbiana y oxidación, razón por la cual se decidió no emplear (HgCl2 0.3%), ya que la concentración del desinfectante es mayor a la del tratamiento 10.

Respecto al (T12), se podría decir que su efectividad obedeció principalmente, a la adición de PPM (2 ml/l) en el medio de cultivo, que sumado a la metodología de desinfección estándar, generó bajos niveles de contaminación (37%) y oxidación (14%) con una germinación del (60%). Sin embargo, se debe considerar que el PPM, es una sustancia antibacteriana que puede interferir en el crecimiento de las plántulas (Digonzelli et al, 2005), por lo cual muchos autores recomiendan su uso con moderación, ya que podrían modificar la composición del medio de cultivo y generar problemas de fitotoxicidad. Dada esta razón y teniendo el alto costo del producto, en este estudio se descarta su empleo.

Figura 8. Desarrollo de (Erythrina edulis) empleando HgCl2 al 0.2% por 20’. A) embriones a las 3 semanas. B) plántula a las 6 semanas.

B A

Fuente: el Autor 42

En general el dicloruro de mercurio (HgCl2), fue el agente desinfectante que resultó menos permisible a la contaminación y permito el establecimiento aséptico de embriones de chachafruto en cultivo in vitro, con altos niveles de germinación y bajos porcentajes de oxidación (Figura 8). Si bien el dicloruro de mercurio, se clasifica dentro de los desinfectantes de mayor toxicidad por la presencia de metales pesados, esto no ha impedido su uso en el establecimiento de especies maderables como el pilón

(Hieronyma alchorneoides) usando (HgCl2) al 0,095% por 5 min (Abdelnour, 2011), y en concentración de 0.005% por 10 min, efectivo para eliminar microorganismos exófitos en tejidos de caña de azúcar in vitro (Niubó et al., 2002). Su efectividad a bajas concentraciones, sumado a la actividad enzimática por acción de los grupos sulfhidrilo (SF), lo hacen accesible en numerosas investigaciones (Roca & Mroginski, 1991).

4.2 ESTABLECIMIENTO DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL AISLAMIENTO DE EMBRIONES in vitro.

Al realizar la siembra de los embriones cigóticos al medio de cultivo, se evaluaron dos tratamientos, los dos con medio MS e igual concentración de la Auxina (ANA), pero uno de ellos con la concentración de nitratos a la mitad.

Figura 9. Desarrollo de embriones en: A) medio MS + ANA (2 mg/L) y B) MS (nitratos a la mitad) + ANA (2 mg/L).

A B

Fuente: El Autor

43

Los dos medios de cultivo propuestos en la fase de establecimiento para los embriones de chachafruto, resultaron ser efectivos para obtener plántulas completas en un 100%, por lo tanto desde el punto de vista estadístico, no hay diferencias, sin embargo se optó por emplear el medio MS (concentración de nitratos a la mitad) suplementado con ANA (2 mg/L), ya que se observó mayor elongación de la parte apical, buen desarrollo en la parte radicular, así como un mayor número de entrenudos por vitroplantula y una vigorosidad y coloración intensa (Figura 9). En relación con este resultado, Abedini et al., (2000), citado por Acosta & Zamora (2004), afirma, que al usar medios de cultivo con las concentraciones completas de nitratos en leguminosas como Erythrina crista-galli, se disminuye, en forma sustancial, la expresión del material vegetal en condiciones in vitro, debido, entre otras causas, al aumento de la oxidación y desorden fisiológico como consecuencia de la hiperhidratación.

Estos autores también destacan la importancia de adicionar al medio de cultivo, fitoreguladores de tipo auxínico, pues participan y aceleran el proceso de germinación, de allí su importancia en ensayos donde se aísla el embrión de su endospermo, o se aplican técnicas como el rescate de embriones.

4.3 FASE DE MULTIPLICACIÓN.

Una vez establecidos los embriones de E. edulis y obtenido un stock considerable de vitroplantas, se realizó una etapa de multiplicación, subdividiendo la plántula según los brotes y yemas formados, para tomar segmentos nodales, los cuales se sembraron en medio nutritivo MS (nitratos a la mitad) + ANA + BAP (1:1) mg/L (Figura 10).

Figura 10. Segmentos nodales de E. edulis en medio MS (nitratos a la mitad) + ANA + BAP (1:1).

44

Fuente: al Autor

La prueba de Shapiro-Wilks determinó la normalidad de los datos. El análisis de estimación paramétrica, afirma que el promedio estimado de brotes a partir de segmentos nodales de chachafruto, es igual a 2.58 en un periodo de 2 meses, con un intervalo de confianza del 95% dado entre 1.80 y 3.37 (Anexo E), a partir de los dos meses de subdivisión. Esto ratifica que la respuesta del explante “segmento nodal”, al medio MS con nitratos a la mitad, más la combinación de los reguladores ANA y BAP en igual proporción, estimuló la formación de múltiples brotes y permitió el crecimiento de las ramas axilares y laterales (Figura 10).

De igual manera Montiel & Villalva (2007), lograron estimular la brotación de meristemas en dos variedades de Piña con igual combinación de reguladores, demostrando un efecto de sinergia al asociar auxinas y citoquininas a igual concentración, expresado en la formación de brotes. Así mismo, en especies forestales como el comino Aniba perutilis (Beltrán, 2011), confirma desarrollo caulinar por efecto del BAP, pero inhibición en el proceso de enraizamiento, aun en presencia de ANA en concentración 1mg/L. Esto coincide con lo observado en este estudio, ya que en la (Figura 10), se aprecia la presencia de una masa tipo callosa, en la zona de caulinar.

4.4 MICROINJERTACIÓN in vitro de Erythrina edulis. La variable contaminación, no presentó diferencias significativas al comparar las proporciones en los tres métodos de injertación (Anexo F). La viabilidad de los

45 microinjertos se vio afectada negativamente por una alta contaminación fúngica posterior a los doce días de la microinjertación (Figura 12 A).

Figura 11. Estimación puntual de las proporciones analizando la contaminación y oxidación, en los tres métodos de injertación.

1,6

1,4

1,2

0,8 1

0,29 0,23 0,8 oxidación contaminación 0,6

0,4 0,76 0,7059 0,66 0,2

0 Aprox. Lateral Púa T. invertida Fuente: el Autor

Cabe resaltar que en la consolidación del microinjerto, se emplearon explantes asépticos producidos in vitro, lo que en este estudio no fue garantía de éxito en la etapa de establecimiento de los mismos, pues los niveles de contaminación fueron del (66%, 70% y 76%) empleando los métodos de incisión (T. invertida, Aprox. Lateral y Púa), (Figura 11). Debido a que no se encontró reportes de microinjertos in vitro, en los que la unión del injerto y portainjerto fuera de procedencia in vitro, no fue posible justificar estos resultados en base a otros estudios.

Respecto a la variable oxidación, se encontró diferencia significativa entre los métodos T. invertida y Púa (Anexo G), siendo el primero el que registró un mayor nivel de oxidación (80%) (Figura 11), lo que impidió el prendimiento del injerto y por lo tanto su evaluación como método de injertación.

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Figura 12. Microinjerto. A) Contaminación fúngica de los microinjertos B) procesos necróticos en la unión del injerto a través del método T. invertida.

A B

Fuente: el Autor

Otra de las causas que posiblemente contribuyó a la contaminación y oxidación de los injertos puede estar relacionada con una excesiva manipulación de los tejidos durante la realización de los tres tipos de incisión (Rache et al., 2008; Materán et al., 2008), en este punto es importante resaltar que los tallos que sirvieron como portainjerto, presentaban un diámetro de 0.2 a 0.3 mm, lo que hizo más susceptibles los tejidos a la deshidratación al momento en que se realizaban los cortes bajo el estereoscopio. Razón por la cual se sugiere considerar lo expresado por Murashige et al., (1972), quien plantea la posibilidad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas obtenidas a partir de semillas al lograrse un mayor diámetro del portainjerto. En el caso de chachafruto se escogió el embrión dado el gran tamaño de la semilla.

4.5 EFECTO DEL TIPO DE INCISIÓN EN EL PRENDIMIENTO DE LOS MICROINJERTOS

En los microinjertos que superaron la contaminación, y mostraron un desarrollo de las yemas injertadas, se evaluó si el tipo de incisión favorecía el prendimiento del injerto, así como su capacidad de adaptación.

47

Figura 13. Estimaciones puntuales de prendimiento en injertos de E. edulis para tres métodos de microinjertación.

Fuente: el Autor

La (Figura 13), refleja que a través de los métodos de injertación (Púa y Aprox. lateral) se logró un prendimiento promedio del 23% y 29% respectivamente; a diferencia del método de T. invertida, donde no fue posible observar la presencia de hojas, ni desarrollo de las yemas injertadas debido fundamentalmente al efecto de la oxidación y contaminación. Sin embargo, el análisis de comparación de proporciones evaluando el prendimiento, no reflejó diferencias significativas entre los tres métodos (Anexo H), Esta no significancia, se debe a que los tamaños de muestra estadísticamente no permiten detectar las diferencias, en caso de que las haya. Aun así, en los métodos de Aproximación lateral y Púa, se logró observar en los microinjertos que prosperaron, la formación de un callo translucido a las tres semanas de ser realizada la microinjertación, señal de que en la zona de injertación se favoreció la unión vascular (Figura 14 A). Aguilar et al. (1990), citado por Juárez Gómez (2013), señala que al injertarse dos especies, las partes afectadas inicialmente desarrollan un callo, producto de la intensa actividad mitótica, que posibilita la unión (figura 14 B). Por lo cual este

48 estudio se limitará a seleccionar el método que obtuvo mayor prendimiento y su facilidad para su implementación, como lo fue el de aproximación lateral.

Respecto a la poca viabilidad presentada en el método T. invertida, Navarro (1979), señala que el método de colocación del ápice en el patrón influye significativamente en el grado de prendimiento. Igualmente este autor reporta que al colocar el ápice dentro de la incisión tipo T. invertida, pero con su superficie basal de corte en contacto con el tejido de la médula, dio un bajo porcentaje de prendimiento. Esto se debe a que el injerto no queda realmente en contacto directo con el tejido vascular sino con tejido medular.

Figura 14. Desarrollo del microinjerto: A) y B) formación de callo en la zona de unión del injerto. C) consolidación de microinjertos a través del método púa y D) Aprox. Lateral.

A D B C

Fuente: el Autor

El medio básico MS (con nitratos a la mitad), suplementado con ANA (2 mg/L), permitió el desarrollo las plantas microinjertadas, logrando estimular el crecimiento de las yemas vegetativas del injerto, 45 días después de realizada la incisión (Figuras 14 C y D). Este comportamiento, puede estar influenciado por la acción hormonal del ácido naftalenacético (ANA). Chinchilla (2008), citado por Ayala (2011), considera que su presencia promueve la organogénesis, e induce la generación de callo como parte del rejuvenecimiento o en respuesta a heridas por cortes y manipulación.

49

Por otra parte, el análisis estadístico permite inferir que en un lapso de 45 días, el crecimiento promedio de las yemas injertadas es de 1.58 cm, con un intervalo de confianza del 95% dado entre 0.89 y 2.22. Se comprobó la normalidad de los datos (Anexo I). Este crecimiento se considera un indicador morfológico que ratifica la unión de los tejidos en el microinjerto.

Criollo (2008), señala que el medio ideal para cualquier microinjerto es el que permite un desarrollo del portainjerto en su estructura y en su sistema radical, lo que garantiza la vitalidad del mismo. Por lo anterior, se considera el medio MS (nitratos a la mitad) + ANA (2mg/L) cumple con estos criterios. Sin embargo no se debe descartar el efecto de otros reguladores de crecimiento y su influencia en el desarrollo de los microinjertos, en estudios futuros.

4.6 MICROINJERTOS A PARTIR DE YEMAS AXILARES ex vitro.

En los ensayos generados a partir de yemas provenientes de plantas establecidas en invernadero (nueve meses de edad), injertadas sobre portainjertos in vitro, se observó presencia de hongos en todos los casos.

Figura 15. Contaminación fúngica a partir de yemas ex vitro, en injertos in vitro.

Fuente: el Autor

50

Aun cuando la planta madre fue sometida a un pretratamiento con Benlate y Lorsban, previo a la aplicación del protocolo de desinfección con el hipoclorito de sodio, se observó un alto nivel de contaminación de las yemas, lo que mostró que la desinfección con NaClO no resultó efectiva para el control de microorganismos contaminantes. Por lo anterior, se hace necesario implementar nuevos protocolos de desinfección para materiales provenientes de vivero, ya que toda la literatura encontrada sobre técnicas de microinjertación se ha realizado introduciendo al cultivo in vitro ápices caulinares tomados de árboles adultos mantenidos en invernadero o campo, con la finalidad de sanear, reactivar y juvenilizar material adulto de diferentes especies (Soto, 2003; Rache et al., 2008 y Materán et al., 2007).

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5. CONCLUSIONES

 El Protocolo de desinfección más efectivo para controlar la contaminación de los embriones a partir de semillas de Erythrina edulis, es: alcohol 70%, durante 15 min, seguida de Tween 80% por 15 minutos, Benlate 1 g/L, durante 20 minutos y dicloruro de mercurio (0.2%) por 20 min.

 La reducción de la concentración de nitratos a la mitad en el medio de cultivo MS con la adición de ANA 2mg/L, permitió la obtención de plántulas completas de chachafruto; de igual manera fue el medio de cultivo seleccionado para el prendimiento del injerto.

 Se selecciona el método de aproximación lateral para la microinjertación por ser el de mayor prendimiento y facilidad de ejecución. La microinjertación in vitro con los métodos de Púa y T. invertida, deben excluirse hasta tanto no se logre controlar la contaminación y oxidación.

 Las yemas axilares tomadas de plantas ex vitro, microinjertadas sobre patrones in vitro, no fueron viables por presentar altos niveles de contaminación fúngica.

 Es posible lograr la microinjertación de Erythrina edulis, utilizando explantes provenientes de plántulas producidas in vitro ya que se garantiza la asepsia del material.

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6. RECOMENDACIONES

Se sugiere ampliar la investigación en la fase de microinjertación, evaluando el efecto de las diferentes concentraciones y reguladores de crecimiento (auxinas, citoquininas) en el desarrollo de los injertos y elongación del tallo.

Evaluar si la imbibición de la parte decapitada del patrón y los brotes a injertar en distintos reguladores de crecimiento influye en el prendimiento de los microinjertos.

Continuar los estudios para introducir material ex vitro a in vitro libres de contaminación.

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ANEXOS

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Anexo A. Número de observaciones total, analizados en el estudio. Tabla 1. Número de individuos empleados en la fase de desinfección.

Número total de Tratamientos Contaminados Oxidados Germinados individuos n: 1 12 12 6 0 2 12 11 10 1 3 12 10 8 2 4 30 27 12 2 5 12 10 8 2 6 20 20 0 0 7 20 20 0 0 8 40 37 14 0 9 20 15 8 5 10 34 5 7 22 11 15 7 2 5 12 35 13 5 21 13 26 26 20 0 14 27 27 27 0 Fuente: el Autor

Tabla 2. Número de individuos empleados en la fase de Microinjertación.

N° individuos Prendimiento Contaminados Oxidados Aprox. lateral 17 5 12 5 Púa 17 4 13 4 T. invertida 15 0 10 12

Fuente: el Autor

De acuerdo con la teoría estadística, dos proporciones difieren si y solamente si sus correspondientes intervalos de confianza tienen “intersección vacía”, y esto se aplica haciendo las comparaciones de todos los pares de tratamientos como se expresa en las siguientes tablas.

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Anexo B. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable contaminación.

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T1 ------* ? * - - T2 ------* - * - - T3 ------* - - - - T4 ------* ? * - - T5 ------* - - - - T6 ------* * * - - T7 ------* * * - - T8 ------* * * - - T9 ------* - - - - T10 * * * * * * * * * - - * * T11 ? - - ? - * * * - - - * * T12 * * - * - * * * - - - * * T13 ------* * * - T14 ------* * * - Fuente: el Autor

*: Indica diferencia significativa. ?: Indica casos dudosos. -: indica la no significancia.

Anexo C. Tabla del análisis de comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable oxidación.

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T1 - - - - * * ------* T2 - - - - * * ? - * * * - - T3 - - - - * * - - - - * - - T4 - - - - * * ------* T5 - - - - * * - - - - * - - T6 * * * * * - * * - - - * * T7 * * * * * - * * - - - * * T8 - - - - - * * - - - - * * T9 - - - - - * * - - - - - * T10 - * ------* * T11 - * ------* * T12 - * * - * ------* * T13 - - - - - * * * * * * - T14 * - - * - * * * * * * * - Fuente: el Autor

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*: Indica diferencia significativa. -: indica que no hay diferencia.

Anexo D. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable germinación.

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T1 - - - * - - - - * - * - - T2 ------* - * - - T3 ------T4 - - - * - - - - * - * - - T5 * - - * * * * - - - - * * T6 - - - - * - - - * - * - - T7 - - - - * - - - * - * - - T8 - - - - * - - - * * * - - T9 ------T10 * * - * - * * * - - - * * T11 ------* - - - - - T12 * * - * - * * * - - - * * T13 - - - - * - - - - * - * - T14 - - - - * - - - - * - * - Fuente: el Autor

*: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.

Anexo E. Estimación del promedio de brotes y prueba de normalidad para la construcción del intervalo de confianza.

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Anexo F. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable contaminación.

aprox. Lateral Púa T invertida aprox. Lateral - - Púa - - T invertida - - Fuente: el Autor

*: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.

Anexo G. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable oxidación.

aprox. Lateral Púa T invertida aprox. Lateral - - Púa - * T invertida - * Fuente: el Autor

*: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.

Anexo H. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable prendimiento.

aprox. Lateral Púa T invertida aprox. Lateral - - Púa - - T invertida - - Fuente: el Autor

*: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.

Anexo I. Estimación del promedio de crecimiento y prueba de normalidad, para la construcción del IC.

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