Modelo De Dissertação
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ GIOVANA VECHI POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato) Itajaí 2015 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS GIOVANA VECHI POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato) Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho Itajaí, julho de 2015 FICHA CATALOGRÁFICA V494p Vechi, Giovana, 1984- Potencial biológico e composição química das folhas de Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato) / Giovana Vechi, 2015. 80f. ; il., tab. ; fig. Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof . Dr Valdir Cechinel Filho ” Bibliografia : p. 70-80 1. Plantas medicinais. 2. Catequina. 3. Eugenia involucrata. 4. Triterpenos. 5. Fitoterapia. I. Título. CDU: 615.32 Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293 CDU: 612.78 Dedico essa conquista à toda minha família, em especial aos meus pais Juca e Jane, que nunca mediram esforços para que meus sonhos se tornassem realidade. Obrigada de todo o meu coração! AGRADECIMENTOS A Deus, primeiramente, que é a origem e o princípio de tudo, por me proporcionar sabedoria, tranquilidade e paz! Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por acreditar no meu potencial e aceitar me orientar nesses dois anos de caminhada. Por sua paciência e calma diante dos obstáculos dessa trajetória. Aos meus pais Jane e Juca, por me ajudarem e apoiarem nessa etapa da minha vida em especial, mas também, por toda a educação que me deram e me fazem ser a pessoa que sou hoje. À toda minha família e ao meu namorado, pelo apoio, carinho, amor e paciência dedicados à mim durante esses dois anos de mestrado. Aos membros da banca, Professora Dra. Angela Malheiros, Professora Dra. Tânia Bellé Bresolin e Professor Dr. Walter Antônio Roman Jr, pelas contribuições para conclusão deste trabalho. À minha grande amiga, desde os primeiros dias da faculdade, Adriana Campos, que me incentivou à essa busca pelo título de mestre, e além disso, se disponibilizou a me ajudar em todo o aprendizado dentro do laboratório, e em todas as etapas dessa caminhada para a finalização desse trabalho. Obrigada sem fim! Aos meus colegas do laboratório de Fitoquímica, que sempre se disponibilizaram a tirar minhas dúvidas e me auxiliar no que fosse preciso. Obrigada em especial à Luísa Nathália Bolda Mariano, que esteve presente mais de perto em toda minha caminhada, mas também ao Tiago Bonomini e Marcel Petreanu. Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Prof. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria. À todas as pessoas que enriqueceram este trabalho com sua disponibilidade e realização dos testes biológicos: Marcélly dos Santos Boera, Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz, Roseane Leandra da Rosa, Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, Karla Capistrano e Profa. Dra. Fátima de Campos Buzzi. Ao Prof. Theo, Tailyn Zerminani, Pedro Pablo Perez Netto e Prof. Rogério Corrêa pela ajuda nas técnicas de CLAE, RMN e CG/EM. Ao Prof. Dr. Arturo San Feliciano, da Universidade de Salamanca, pela grande ajuda nas avaliação das análises de RMN para determinação estrutural de uma substância inédita. Às agências de fomento: CAPES, pela concessão da minha bolsa e CNPQ e FAPESC pelo auxílio financeiro ao laboratório. “Deus não sabe o que fazer com o nosso saber e com as nossas obras se nelas não estiver o nosso coração”. (Pe. Dehon) POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato) Giovana Vechi Julho/2015 Orientador: Valdir Cechinel Filho, Prof. Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 80 O uso de plantas medicinais para tratar doenças é tão antigo quanto a humanidade. A descoberta de novas substâncias através das plantas é uma promissora alternativa para a busca de novos medicamentos. O gênero Eugenia tem apresentado relevantes resultados terapêuticos, mas pouco se conhece sobre o potencial da Eugenia involucrata DC. O presente trabalho teve como objetivo conhecer a composição química das folhas da E. involucrata e avaliar o seu potencial antimicrobiano, gastroprotetor e antinociceptivo. A coleta da planta se deu em três momentos, janeiro, julho e dezembro de 2014. Em todas as coletas, as folhas foram inicialmente maceradas em metanol, resultando em Extratos Metanólico Brutos, EMB-jan, EMB-jul e EMB-dez. Os extratos foram submetidos à partição, gerando a Fração Clorofórmio (FCL) e Acetato de Etila (FAE). A análise fitoquímica foi realizada por meio de técnicas cromatográficas convencionais e as substâncias isoladas analisadas por técnicas espectrométricas usuais. Essa análise permitiu o isolamento da (-)-catequina (substância majoritária), e de outras duas substâncias da FAE-jan. Da FCL-jan foram isoladas outras três substâncias, o fitol e as substâncias 7-9 e 3-6, inéditas, denominadas 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona e 24,25- epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona acetilado. A comparação entre os EMB de inverno e verão por CLAE mostrou algumas diferenças importantes e maior quantidade de catequina no inverno. O extrato e frações de janeiro foram avaliados quanto sua atividade antimicrobiana frente as cepas de B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli e C. albicans pela técnica de microdiluição em caldo, que permitiu a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). O EMB-jul foi avaliado quanto ao seu potencial gastroprotetor, pelo modelo de úlcera induzida por etanol, e antinociceptivo, pelo modelo de contorções induzidas pelo ácido acético, que avaliou também a FCL-jul, FAE-jul, uma substância isolada. O EMB-jan apresentou CIM de 125 µg/ml para S. aureus e C. albicans e 500 µg/ml para E. coli. A FAE-jan foi inativa para todas as cepas e a FCL-jan apresentou CIM de 500 µg/ml para as bactérias Gram-positivas, sendo inativa para as demais. O EMB-jul reduziu a área total lesada e a área relativa de lesão para os tratamentos com as doses de 125 e 250 mg/kg de maneira significativa. Na avaliação da atividade antinociceptiva tanto o extrato quanto as frações apresentaram redução da nocicepção (26,5 a 64,4% na dose de 10 mg/kg), mas a FCL-jul foi mais eficaz, apresentando DI50 de 2,33 mg/kg. A substância 7-9 inédita, também foi testada e apresentou redução do número de contorções abdominais em 50% na dose de 1 mg/kg. Os resultados permitiram concluir que a E. involucrata é uma promissora espécie vegetal com potencial terapêutico, particularmente contra processos dolorosos, embora seja necessário confirmação em outros modelos de dor. Palavras-chave: Eugenia involucrata; catequina; novos triterpenos, efeito antimicrobiano; gastroproteção; atividade antinociceptiva. BIOLOGICAL POTENTIAL AND CHEMICAL COMPOSITION OF Eugenia involucrata DC. LEAVES Giovana Vechi July/2015 Supervisor: Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of pages: 80 The use of medicinal plants to treat diseases is as old as humanity. The discovery of new compounds from these plants is a promising alternative in the search of new medicine drugs. The genus Eugenia has shown relevant therapeutic results, but the potential of E. involucrata is still unknown. This study investigates the chemical composition of E. involucrata leaves and evaluates its antimicrobial, gastroprotective and antinociceptive potential. The leaves were collected at three separate times: in January, July and December 2014. In each case, the leaves were first macerated in methanol, resulting in Crude Methanol Extracts (EMB), denominated EMB-Jan, EMB- Jul and EMB-Dez. The extracts were partitioned to give Chloroform (FCL) and Ethyl Acetate (FAE) Fractions. Phytochemical analysis was performed by conventional chromatographic techniques, and the isolated substances were analyzed by the usual spectroscopic techniques. This analysis allowed the isolation of (-)- catechin (main substance), and two other substances from FAE-Jan. FCL-Jan allowed the isolation of three other substances: phytol, compounds 7-9 and 3-6, two novel substances denominated 24,25-epoxy-28-hydroxycicloartan-3-ona and 24,25-epoxy- 28-hydroxycicloartan-3-ona acetyl respectively. The comparison between winter and summer EMB by HPLC showed some significant differences, and higher amounts of catechin in the winter. The extract and fractions collected in January were evaluated for their antimicrobial activity against strains of B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli and C. albicans by determining the Minimum Inhibitory Concentration using the broth microdilution technique. EMB-Jul was evaluated for its gastroprotective activity by the ethanol-induced ulcer model. The same extract, and also FCL-Jul, FAE-Jul and an isolated substance, were evaluated for their antinociceptive activity using the model of writhing induced by acetic acid. The antimicrobial analysis of EMB showed an MIC of 125 µg/ml for S. aureus and C. albicans and 500 µg/ml for E. coli. FAE did not showed any activity, and FCL showed an MIC of 500 µg/ml for Gram-positive bacteria and was inactive for the others. In the gastroprotective evaluation, the extract significantly reduced the total damaged area and the area of injury, compared to the treatments with doses of 125 and 250 mg/kg. In the evaluation of antinociceptive activity both extract and fractions reduced nociception (26.5 to 64.4% at 10 mg/kg), but the FCL-Jul was the most effective, with DI50 of 2.33 mg/kg. The novel compound 7-9 was also tested, and decreased the number of writhes by 50% at a dose of 1 mg/kg. The results showed that E. involucrata is a promising species with therapeutic potential, particularly against pain process, although, other models of pain should be further used to confirm such potential.