UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

GIOVANA VECHI

POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)

Itajaí 2015

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

GIOVANA VECHI

POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)

Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho

Itajaí, julho de 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

V494p Vechi, Giovana, 1984- Potencial biológico e composição química das folhas de Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato) / Giovana Vechi, 2015. 80f. ; il., tab. ; fig.

Cópia de computador (Printout(s)). Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em Ciências Farmacêuticas. “Orientador : Prof . Dr Valdir Cechinel Filho ” Bibliografia : p. 70-80

1. Plantas medicinais. 2. Catequina. 3. Eugenia involucrata. 4. Triterpenos. 5. Fitoterapia. I. Título.

CDU: 615.32

Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293

CDU: 612.78

Dedico essa conquista à toda minha família,

em especial aos meus pais Juca e Jane,

que nunca mediram esforços para que meus

sonhos se tornassem realidade.

Obrigada de todo o meu coração!

AGRADECIMENTOS

A Deus, primeiramente, que é a origem e o princípio de tudo, por me proporcionar sabedoria, tranquilidade e paz!

Ao Professor Valdir Cechinel Filho, por acreditar no meu potencial e aceitar me orientar nesses dois anos de caminhada. Por sua paciência e calma diante dos obstáculos dessa trajetória.

Aos meus pais Jane e Juca, por me ajudarem e apoiarem nessa etapa da minha vida em especial, mas também, por toda a educação que me deram e me fazem ser a pessoa que sou hoje.

À toda minha família e ao meu namorado, pelo apoio, carinho, amor e paciência dedicados à mim durante esses dois anos de mestrado.

Aos membros da banca, Professora Dra. Angela Malheiros, Professora Dra.

Tânia Bellé Bresolin e Professor Dr. Walter Antônio Roman Jr, pelas contribuições para conclusão deste trabalho.

À minha grande amiga, desde os primeiros dias da faculdade, Adriana

Campos, que me incentivou à essa busca pelo título de mestre, e além disso, se disponibilizou a me ajudar em todo o aprendizado dentro do laboratório, e em todas as etapas dessa caminhada para a finalização desse trabalho. Obrigada sem fim!

Aos meus colegas do laboratório de Fitoquímica, que sempre se disponibilizaram a tirar minhas dúvidas e me auxiliar no que fosse preciso. Obrigada em especial à Luísa Nathália Bolda Mariano, que esteve presente mais de perto em toda minha caminhada, mas também ao Tiago Bonomini e Marcel Petreanu.

Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Prof. Dr. Clóvis Antonio Rodrigues, Prof. Dra. Tania Mari

Bellé Bresolin, Juliano dos Santos e Helenise Heyse Moreria.

À todas as pessoas que enriqueceram este trabalho com sua disponibilidade e realização dos testes biológicos: Marcélly dos Santos Boera, Prof. Dr. Alexandre

Bella Cruz, Roseane Leandra da Rosa, Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, Karla

Capistrano e Profa. Dra. Fátima de Campos Buzzi.

Ao Prof. Theo, Tailyn Zerminani, Pedro Pablo Perez Netto e Prof. Rogério

Corrêa pela ajuda nas técnicas de CLAE, RMN e CG/EM.

Ao Prof. Dr. Arturo San Feliciano, da Universidade de Salamanca, pela grande ajuda nas avaliação das análises de RMN para determinação estrutural de uma substância inédita.

Às agências de fomento: CAPES, pela concessão da minha bolsa e CNPQ e

FAPESC pelo auxílio financeiro ao laboratório.

“Deus não sabe o que fazer com o nosso saber e com as

nossas obras se nelas não estiver o nosso coração”.

(Pe. Dehon)

POTENCIAL BIOLÓGICO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS DE Eugenia involucrata DC. (cerejinha do mato)

Giovana Vechi Julho/2015

Orientador: Valdir Cechinel Filho, Prof. Doutor. Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 80

O uso de plantas medicinais para tratar doenças é tão antigo quanto a humanidade. A descoberta de novas substâncias através das plantas é uma promissora alternativa para a busca de novos medicamentos. O gênero Eugenia tem apresentado relevantes resultados terapêuticos, mas pouco se conhece sobre o potencial da Eugenia involucrata DC. O presente trabalho teve como objetivo conhecer a composição química das folhas da E. involucrata e avaliar o seu potencial antimicrobiano, gastroprotetor e antinociceptivo. A coleta da planta se deu em três momentos, janeiro, julho e dezembro de 2014. Em todas as coletas, as folhas foram inicialmente maceradas em metanol, resultando em Extratos Metanólico Brutos, EMB-jan, EMB-jul e EMB-dez. Os extratos foram submetidos à partição, gerando a Fração Clorofórmio (FCL) e Acetato de Etila (FAE). A análise fitoquímica foi realizada por meio de técnicas cromatográficas convencionais e as substâncias isoladas analisadas por técnicas espectrométricas usuais. Essa análise permitiu o isolamento da (-)-catequina (substância majoritária), e de outras duas substâncias da FAE-jan. Da FCL-jan foram isoladas outras três substâncias, o fitol e as substâncias 7-9 e 3-6, inéditas, denominadas 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona e 24,25- epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona acetilado. A comparação entre os EMB de inverno e verão por CLAE mostrou algumas diferenças importantes e maior quantidade de catequina no inverno. O extrato e frações de janeiro foram avaliados quanto sua atividade antimicrobiana frente as cepas de B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli e C. albicans pela técnica de microdiluição em caldo, que permitiu a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). O EMB-jul foi avaliado quanto ao seu potencial gastroprotetor, pelo modelo de úlcera induzida por etanol, e antinociceptivo, pelo modelo de contorções induzidas pelo ácido acético, que avaliou também a FCL-jul, FAE-jul, uma substância isolada. O EMB-jan apresentou CIM de 125 µg/ml para S. aureus e C. albicans e 500 µg/ml para E. coli. A FAE-jan foi inativa para todas as cepas e a FCL-jan apresentou CIM de 500 µg/ml para as bactérias Gram-positivas, sendo inativa para as demais. O EMB-jul reduziu a área total lesada e a área relativa de lesão para os tratamentos com as doses de 125 e 250 mg/kg de maneira significativa. Na avaliação da atividade antinociceptiva tanto o extrato quanto as frações apresentaram redução da nocicepção (26,5 a 64,4% na dose de 10 mg/kg), mas a FCL-jul foi mais eficaz, apresentando DI50 de 2,33 mg/kg. A substância 7-9 inédita, também foi testada e apresentou redução do número de contorções abdominais em 50% na dose de 1 mg/kg. Os resultados permitiram concluir que a E. involucrata é uma promissora espécie vegetal com potencial terapêutico, particularmente contra processos dolorosos, embora seja necessário confirmação em outros modelos de dor.

Palavras-chave: Eugenia involucrata; catequina; novos triterpenos, efeito antimicrobiano; gastroproteção; atividade antinociceptiva.

BIOLOGICAL POTENTIAL AND CHEMICAL COMPOSITION OF Eugenia involucrata DC. LEAVES

Giovana Vechi July/2015

Supervisor: Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances Number of pages: 80

The use of medicinal plants to treat diseases is as old as humanity. The discovery of new compounds from these plants is a promising alternative in the search of new medicine drugs. The genus Eugenia has shown relevant therapeutic results, but the potential of E. involucrata is still unknown. This study investigates the chemical composition of E. involucrata leaves and evaluates its antimicrobial, gastroprotective and antinociceptive potential. The leaves were collected at three separate times: in January, July and December 2014. In each case, the leaves were first macerated in methanol, resulting in Crude Methanol Extracts (EMB), denominated EMB-Jan, EMB- Jul and EMB-Dez. The extracts were partitioned to give Chloroform (FCL) and Ethyl Acetate (FAE) Fractions. Phytochemical analysis was performed by conventional chromatographic techniques, and the isolated substances were analyzed by the usual spectroscopic techniques. This analysis allowed the isolation of (-)- catechin (main substance), and two other substances from FAE-Jan. FCL-Jan allowed the isolation of three other substances: phytol, compounds 7-9 and 3-6, two novel substances denominated 24,25-epoxy-28-hydroxycicloartan-3-ona and 24,25-epoxy- 28-hydroxycicloartan-3-ona acetyl respectively. The comparison between winter and summer EMB by HPLC showed some significant differences, and higher amounts of catechin in the winter. The extract and fractions collected in January were evaluated for their antimicrobial activity against strains of B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus, E. coli and C. albicans by determining the Minimum Inhibitory Concentration using the broth microdilution technique. EMB-Jul was evaluated for its gastroprotective activity by the ethanol-induced ulcer model. The same extract, and also FCL-Jul, FAE-Jul and an isolated substance, were evaluated for their antinociceptive activity using the model of writhing induced by acetic acid. The antimicrobial analysis of EMB showed an MIC of 125 µg/ml for S. aureus and C. albicans and 500 µg/ml for E. coli. FAE did not showed any activity, and FCL showed an MIC of 500 µg/ml for Gram-positive bacteria and was inactive for the others. In the gastroprotective evaluation, the extract significantly reduced the total damaged area and the area of injury, compared to the treatments with doses of 125 and 250 mg/kg. In the evaluation of antinociceptive activity both extract and fractions reduced nociception (26.5 to 64.4% at 10 mg/kg), but the FCL-Jul was the most effective, with DI50 of 2.33 mg/kg. The novel compound 7-9 was also tested, and decreased the number of writhes by 50% at a dose of 1 mg/kg. The results showed that E. involucrata is a promising species with therapeutic potential, particularly against pain process, although, other models of pain should be further used to confirm such potential. Keywords: Eugenia involucrata; catechin; new triterpenes; antimicrobial effect; gastroprotection; antinociceptive activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Exemplos de estruturas químicas encontradas no gênero Eugenia..... 22

Figura 2 Ocorrência natural da espécie Eugenia involucrata no Brasil...... 23

Figura 3 Árvore da Eugenia involucrata...... 24

Figura 4 Folhas e flor da Eugenia involucrata...... 25

Figura 5 Frutos da Eugenia involucrata...... 25

Figura 6 Processo de obtenção do extrato e das frações das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014...... 34

Figura 7 Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FCL-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014...... 35

Figura 8 Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014...... 36

Figura 9 CCD comparativa das frações clorofórmio e acetato de etila nas três diferentes coletas, janeiro, julho e dezembro, respectivamente...... 42

Figura 10 Estrutura química da (-)-catequina (substância 11-14)...... 43

Figura 11 Espectro de RMN 1H da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata...... 44

Figura 12 Espectro de RMN 1H aproximado da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata...... 44

Figura 13 Espectro de RMN 13C da substância 11-14, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata...... 45

Figura 14 Estrutura química numerada da (-)-catequina...... 45

Figura 15 Estrutura química do fitol (substância 13)...... 46

Figura 16 Espectro de massas da substância 13, obtido por CG/EM...... 47

Figura 17 Espectro de infravermelho da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata...... 48

Figura 18 Espectro de RMN 1H da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata...... 49

Figura 19 Espectro ampliado de RMN 13C da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata...... 50

Figura 20 Espectro de RMN 13C (A) e modo DEPT (B) da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata...... 51

Figura 21 Estrutura do composto 4 (3-ceto-28-hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata...... 52

Figura 22 Estrutura do composto 4 isolado do própolis...... 52

Figura 23 Estruturas químicas dos compostos 1, 3a e 3b isolados da Borrichia frutescens...... 53

Figura 24 Estrutura química da substância 24,25-epoxi-28-hidroxicycloartan-3- ona, isolado da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata. 54

Figura 25 Análise por CLAE do EMB-jan das folhas de Eugenia involucrata a 280 nm...... 55

Figura 26 Análise por CLAE do EMB-jul das folhas de Eugenia involucrata a 280 nm...... 56

Figura 27 Análise por CLAE da sobreposição do EMB-jan, EMB-jul e (-)-catequina das folhas de Eugenia involucrata a 280nm...... 56

Figura 28 Percentual de inibição de contorções abdominais do EBM-jul, FCL- jul e FAE-jul das folhas de Eugenia involucrata, na dose de 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)...... 60

Figura 29 Percentual de inibição de contorções abdominais da Fração Clorofórmio (FCL-jul) das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)...... 61

Figura 30 Percentual de inibição de contorções abdominais da substância 7-9, isolado da Fração Clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1 e 3mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6)...... 62

Figura 31 Imagens dos estômagos após a indução de úlcera por etanol...... 65

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Eluição utilizada na análise por CLAE do EMB-jan e o EMB-jul...... 38

Tabela 2 Dados de RMN de 1H e 13C da (-)-catequina em comparação com dados da literatura*...... 46

Tabela 3 Análise da atividade antimicrobiana do EMB-jan, FAE-jan e FCL-jan das Folhas de Eugenia involucatra...... 57

Tabela 4 Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do EMB-jul da Eugenia involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos (n = 6)...... 65

LISTA DE ABREVIATURAS

AE – acetato de etila AINE – anti-inflamatório não-esteroidal ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CC – coluna cromatográfica CCD – cromatografia em camada delgada CIM – concentração Inibitória Mínima CGMS – cromatografia Gasosa acoplada à Espectro de Massas CLAE – cromatografia líquida de alta eficiência EARP – software de análise de imagens EMB – extrato metanólico bruto i.p. – via intraperitonial IV – infravermelho NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas OMS – Organização Mundial da Saúde PPGCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas RMN-¹H – ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN-¹³C – ressonância Magnética Nuclear de Carbono v.o. – via oral UV – ultravioleta

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 14 2 OBJETIVOS ...... 16 2.1 Objetivo Geral ...... 16

2.2 Objetivos Específicos ...... 16 3 REVISÃO DA LITERATURA ...... 17 3.1 A família Myrtaceae ...... 20

3.2 O gênero Eugenia ...... 21

3.3 A espécie Eugenia involucrata DC ...... 23

3.4 Potencial farmacológico de produtos naturais ...... 26 3.4.1 Aspectos relacionados ao potencial antimicrobiano ...... 26 3.4.2 Aspectos relacionados aos processos dolorosos ...... 28 3.4.3 Aspectos relacionados à gastroproteção ...... 30 4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 33 4.1 Material Vegetal ...... 33

4.2 Análise Fitoquímica ...... 33 4.2.1 Obtenção de extratos e frações e isolamento de substâncias ...... 33 4.2.3 Elucidação estrutural ...... 37 4.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ...... 38 4.3 Análise Farmacológica/Biológica ...... 39 4.3.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana ...... 39 4.3.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva ...... 40 4.3.3 Avaliação da Atividade Gastroprotetora ...... 40 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 42 5.1 Análise Fitoquímica ...... 42 5.1.1 Isolamento e identificação dos princípios ativos ...... 42 5.1.2 Cromatografia Líquida Alta Eficiência ...... 55 5.2 Análise Farmacológica/Biológica ...... 57 5.2.1 Atividade Antimicrobiana ...... 57 5.2.2 Atividade Antinociceptiva ...... 60 5.2.3 Atividade Gastroprotetora ...... 64 6 CONCLUSÕES ...... 69 REFERÊNCIAS…………………………………………………………………………….70

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1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas para tratamento de doenças é tão antigo quanto a humanidade. Durante muito tempo ele foi o único recurso disponível para tratar enfermidades (ALVES, 2013). Atualmente, a química medicinal moderna vem utilizando novas tecnologias que permitem a comprovação científica da utilização e eficácia do uso de diversas plantas medicinais, seus derivados e substâncias isoladas, no tratamento de muitas patologias (CECHINEL FILHO; YUNES, 2012). O Brasil é um dos países mais megabiodiversos do mundo, com seis biomas terrestres bem distintos, o que favorece a busca por novas plantas com potencial terapêutico. Além disso, o país tem tradição na linha de pesquisa em fitoquímica, e vem despontando mundialmente nessa área. Estas características favorecem a parceria com indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novos medicamentos fitoterápicos (BOLZANI; FLAUSINO JUNIOR; VALLI, 2012). Apesar dos avanços contínuos da ciência, ainda existe muito trabalho a ser realizado com plantas medicinais. Muitas espécies ainda são utilizadas empiricamente, sem respaldo científico quanto à sua eficácia e segurança. O alto custo para a pesquisa é um fator limitante para os avanços nessa área de estudos (NEWMAN; CRAGG, 2012). Atualmente muitas pesquisas interdisciplinares tem sido feitas com o esforço de encontrar não somente novas substâncias, mas também no intuito de redescobrir novas aplicações para muitas já utilizados na prática. Dessa forma pode-se tentar reduzir os custos com pesquisas iniciais (CRAGG; GROTHAUS; NEWMAN, 2014). Aproximadamente 64% de todos os medicamentos disponíveis no mercado foram desenvolvidos com o uso, de alguma forma, de produtos naturais. Esse desenvolvimento pode se dar por meio de substâncias isoladas das próprias plantas medicinais, mas também por meio de modificações estruturais feitas a partir de sua estrutura química ou ainda, via síntese de análogos (NEWMAN; CRAGG, 2012). Medicamentos utilizados para tratar problemas comuns na sociedade moderna muitas vezes causam efeitos adversos indesejáveis, como, por exemplo, a resistência microbiana aos antibióticos convencionais (AGUIAR et al., 2012; GOLDSTEIN et al., 2012), a baixa eficácia e os efeitos adversos causados pelos medicamentos disponíveis no mercado para tratar a dor (SILVA et al., 2013) e as 15

recidivas, efeitos colaterais e interações medicamentosas causadas pelos fármacos usados no tratamento da úlcera (LAKSHMI et al., 2010). Por todas essas adversidades, a busca por novos medicamentos baseada em plantas medicinais se faz pertinente. Muitos estudos vem sendo realizados para avaliar o potencial biológico de drogas vegetais utilizadas na medicina popular, através de diferentes modelos farmacológicos. Alguns desses trabalhos já obtiveram resultados expressivos na busca por substâncias ou drogas vegetais provenientes de plantas com poder antimicrobiano, antinociceptivo e gastroprotetor (BAHMANI et al., 2014; CHAVASCO et al., 2014; SRINIVAS et al., 2013). A Família Myrtaceae é conhecida por abrigar grande variedade de plantas medicinais, bem como o gênero Eugenia, que conta com espécies de alto potencial farmacológico. Algumas espécies já estudadas são: Eugenia uniflora, Eugenia dysenterica, Eugenia pyriformis, Eugenia jambolana, Eugenia punicifolia, Eugenia fruticosa e Eugenia umbeliflora (BAG et al., 2012; BASTING et al, 2014; CHATUVERDI et al., 2007; MAGINA et al., 2010; SHAMS-UD-DOHA et al, 2012). Os metabólitos secundários apresentados por estas plantas incluem: terpenos, flavonoides e taninos. O uso medicinal e popular dessas espécies é extenso e por essa razão, tem-se estudado o seu potencial biológico em diversos modelos farmacológicos como atividade antioxidante, diurética, antimicrobiana, gastroprotetora, antiproliferativa, antinociceptiva, anti-inflamatória, anti-hipertensiva, antidiarreica, antidepressiva e hipoglicemiante (BAG et al., 2012, CHATUVERDI et al., 2007; COLLA et al., 2012; MAGINA et al., 2010; SANTOS et al., 2011). A planta Eugenia involucrata DC., conhecida popularmente como cerejinha do mato, araçazeiro ou cereja-do-rio-grande, é ainda pouco estudada, porém muito utilizada popularmente no tratamento de diarreia, má-digestão, infecções e hemorragia (LORENZI, 2002; SAUSEN et al., 2009). Visando contribuir para a caracterização química e biológica da espécie em estudo, este trabalho pretende avaliar a composição química das folhas, comparar os extratos do verão e inverno e testar em modelos biológicos experimentais a atividade antimicrobiana, antinociceptiva e gastroprotetora dos extratos, frações e substâncias isoladas, quando possível.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral Avaliar a composição química e o potencial biológico das folhas de Eugenia involucrata DC.

2.2 Objetivos Específicos 1. Preparar extratos e frações das folhas de E. involucrata em diferentes épocas do ano e testar em distintos modelos biológicos. 2. Selecionar as frações mais ativas para isolamento via métodos de cromatografia convencionais; 3. Identificar os princípios ativos obtidos por técnicas espectrométricas; 4. Avaliar o perfil cromatográfico dos extratos de verão e inverno por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE); 5. Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos e frações pelo método de diluição em ágar (CIM); 6. Avaliar o potencial gastroprotetor pelo modelo de úlcera induzida por etanol em camundongos; 7. Avaliar a atividade antinociceptiva do extrato, frações e substância isolada pelo modelo de dor induzido pelo ácido acético em camundongos. 17

3 REVISÃO DA LITERATURA

As plantas medicinais vêm sendo utilizadas como terapia desde muito tempo em todas as partes do mundo e relatos dessa utilização foram descritos por diversas civilizações antigas como: China, Índia, Egito e Grécia (ALVES, 2013). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), no final da década de 80 cerca de 65% da população mundial utilizava plantas medicinais ou medicamentos derivados de plantas como fonte primária de atenção básica à saúde (CRAGG; NEWMANN, 2013). No Brasil, os números se assemelham, já que 66% da população não tem acesso à medicamentos convencionais, e recorrem à medicina tradicional para tratamento de suas enfermidades. O fácil acesso, o baixo custo e a empatia por este tipo de tratamento, são os principais fatores que justificam esta prática (MAZZARI; PRIETO, 2014). O uso plantas medicinais é relatado no Brasil desde a época dos índios. Mais tarde também foram inseridos conhecimentos dos negros e europeus (principalmente portugueses) na medicina popular brasileira. Naquela época, nas áreas rurais do país, o uso da fitoterapia era imprescindível, já que os médicos se limitavam às áreas urbanas. O conhecimento tradicional dessas culturas fornece importantes informações para o início de pesquisas com plantas medicinais (ALVES, 2013; FIRENZUOLI; GORI; NERI, 2005; NEWMANN; CRAGG, 2012). As plantas têm sido importantes fontes de componentes ativos para a fabricação de novos medicamentos, e as pesquisas envolvendo fitofármacos podem contribuir muito para o desenvolvimento tecnológico nacional. O Brasil ainda possui muitos biomas inexplorados, com plantas de grande interesse farmacológico para serem estudadas (BARREIRO, 2009). O apelo pelo uso de produtos naturais vem crescendo com a ajuda da ciência, que tem comprovado a eficácia do uso tradicional de muitas plantas e estruturado sua utilização de forma segura e eficaz. A indústria, percebendo essa demanda, vem inserindo no mercado novos produtos de origem vegetal a cada ano que passa (BOORHEM; LAGE, 2009; CRAGG; NEWMANN, 2014). Em 2011, o mercado mundial de medicamentos fitoterápicos movimentou cerca de 26 bilhões de dólares, sendo que o maior mercado desses produtos encontra-se na Europa (50% somente na Alemanha). Fato interessante é que a América Latina, com sete países considerados megabiodiversos (Brasil, Colômbia,

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Costa Rica, Equador, México, Panamá e Peru) representam apenas 5% desse mercado. Neste mesmo período o mercado brasileiro de fitoterápicos movimentou cerca de R$ 1,1 bilhão, comercializando 43 milhões de unidades desse tipo de medicamento, um aumento representativo de 13% em relação ao ano de 2010 (ALVES, 2013). A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2014) define que medicamentos fitoterápicos são aqueles obtidos com matérias-primas exclusivamente vegetais, provenientes de plantas medicinais e fabricados com emprego exclusivo da planta, da droga vegetal ou de derivados de droga vegetal como por exemplo: extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco, e outros. No ano de 2014 uma nova Resolução (RDC Nº 26, de 13 de maio de 2014) sobre fitoterápicos foi publicada pela ANVISA e definiu dois tipos de medicamentos fitoterápicos: O “medicamento fitoterápico”, cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade e o “medicamento tradicional fitoterápico”, que se caracteriza por ser também seguro e efetivo, mas baseando-se em dados publicados na literatura técnico-científica e que sejam concebidos para serem utilizados sem a vigilância de um médico para fins de diagnóstico, de prescrição ou de monitorização. Estes últimos não devem então, ser utilizados para tratamento de doenças graves (BRASIL, 2014). A ANVISA não considera medicamento fitoterápico ou produto tradicional fitoterápico aquele que inclua na sua composição substâncias ativas isoladas ou altamente purificadas, sejam elas sintéticas, semissintéticas ou naturais e nem as associações dessas com outros extratos, sejam eles vegetais ou de outras fontes, como a animal (BRASIL, 2014). Além disso, as plantas medicinais e suas partes após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada, passaram a ser denominadas chás medicinais pela nova Resolução. Elas podem ser utilizadas por meio de infusão, decocção e maceração em água pelo consumidor (BRASIL, 2014). A qualidade das matérias-primas ativas vegetais deve ser controlada em todas as etapas do processo, desde o produto até a sua comercialização. Sua eficácia e segurança devem ser validadas por meio de levantamentos 19

etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas (BRASIL, 2014). No ano de 2006 foi criada no Brasil a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que estava associada à Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares do Sistema único de Saúde (SUS). A partir dessas políticas foram criados programas para ampliar as opções terapêuticas ofertadas aos usuários, garantindo o acesso à plantas medicinais e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade. Depois de quase 10 anos de existência observa-se que, apesar de o governo federal ter desenvolvido diversas ações, a implementação da política pouco avançou em função das dificuldades para seu uso no SUS, como o pouco conhecimento que os profissionais de saúde têm sobre a fitoterapia, o entendimento deturpado sobre a eficácia e a segurança deste tratamento por parte de usuários e profissionais de saúde, a dificuldade do acesso à planta medicinal e ao fitoterápico, além da estruturação dos serviços nos moldes que favorecem o uso do medicamento sintético (FIGUEIREDO; GURGEL; GURGEL JR., 2014). O Brasil, dotado de toda sua rica biodiversidade, é uma grande fonte de plantas medicinais. Os esforços empregados na pesquisa básica de análise fitoquimica e farmacológica podem ajudar na descoberta de novos medicamentos fitoterápicos, capazes de tratar diferentes patologias de forma mais eficaz e sem efeitos adversos. Portanto, o estudo da flora brasileira, especialmente a nativa, é relevante e está alinhado à Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (FIGUEIREDO; GURGEL; GURGEL JR., 2014). A pesquisa inicial para avaliação de plantas medicinais começa com uma análise fitoquímica, que tem por objetivo conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais ou avaliar a presença de algum componente específico. O segundo passo é a pesquisa farmacológica, que objetiva testar os extratos, frações e substâncias puras provenientes da análise fitoquímica em diferentes modelos experimentais, com a utilização de animais ou testes in vitro (MALHEIROS et al., 2010). Estudos interdisciplinares são de grande relevância para a área de produtos naturais, que vem crescendo e se fortalecendo a cada dia, com o surgimento de novas ferramentas e métodos analíticos, além do desenvolvimento da biologia molecular. Todas essas mudanças vem agregando valor e gerando grandes oportunidades para o estudo dos produtos naturais (OLIVEIRA; PUPO; VIEIRA,

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2013). Da interação multidisciplinar entre diferentes áreas como a botânica, fitoquímica, síntese, farmacologia, microbiologia, tecnologia farmacêutica, entre outras, podem surgir possibilidades para o desenvolvimento de novos medicamentos ou a validação de uso popular de alguma droga vegetal (MALHEIROS et al., 2010). Quando se trata de plantas é imprescindível levar em conta as variações temporais e espaciais do conteúdo total de metabólitos secundários produzidos por elas nas diferentes horas do dia, épocas do ano ou níveis de maturação. As plantas continuam sendo as mesmas geneticamente mas a expressão gênica pode sofrer modificações resultantes da interação de processos bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos. São relatadas variações sazonais no conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Diante das informações expostas, a família Myrtaceae é considerada uma grande fonte de plantas medicinais, abrigando espécies que já obtiveram importantes descobertas na área da fitoquimica e farmacologia. Essas características justificam o interesse de pesquisadores em trabalhar com espécies desta família, sendo ela, eleita para ser avaliada na presente pesquisa.

3.1 A família Myrtaceae A família Myrtaceae é considerada uma das mais importantes da biodiversidade brasileira. Ela compreende cerca de 100 gêneros e 3.500 espécies de árvores e arbustos que se distribuem por todos os continentes, com predominância nas regiões tropicais e subtropicais. No Brasil ela é encontrada predominantemente no sul e se constitui de um grande número de plantas, desde matas rasteiras a grandes árvores (GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006). A classificação proposta por Wilson et al. (2005) reconhece duas subfamílias (Myrtoideae e Psiloxyloideae) e 17 tribos. Todas as espécies brasileiras são da Tribo Myrteae. Destacam-se os gêneros Eugenia, Myrcia e Calyptranthes (com mais de 100 espécies) enquanto outros gêneros possuem menos de 60 espécies brasileiras. As mirtáceas brasileiras geralmente não produzem madeiras valiosas, mas abrigam numerosas espécies medicinais e frutíferas, algumas exploradas comercialmente, como a Psidium guajava L (goiabeira), a Myrciaria cauliflora Berg (jabuticabeira) e a Eugenia uniflora L. (pitangueira). Essas espécies representam 21

apenas uma pequena fração do grande potencial econômico da família, tendo em vista o grande número de frutos comestíveis produzidos por espécies não comerciais (GRESSLER; PIZO; MORELLATO, 2006).

3.2 O gênero Eugenia O gênero Eugenia é um dos mais importantes da sua família, possuindo 350 espécies nativas no Brasil, muito utilizadas na medicina tradicional para tratar inúmeras enfermidades. O seu potencial biológico vem sendo muito estudado e as pesquisas têm mostrado um grande número de resultados positivos (MAGINA et al., 2009). A espécie Eugenia uniflora, conhecida popularmente como pitangueira, é a planta mais estudada, e tem aplicação diurética, antifúngica, antimicrobiana, antidiabética, antirreumática e gastroprotetora (ALMEIDA; FARIA; SILVA, 2012; SANTOS et al., 2011). A Eugenia dysenterica, conhecida como cagaita, é muito utilizada no tratamento de diarreia (DUARTE et al., 2010), e a Eugenia pyriformis, popular uvaia, tem propriedades antimicrobianas (CHAVASCO et al., 2014; STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009). Eugenia jambolana, nome científico do jamelão ou joão-bolão, é uma planta com potencial gastroprotetor, antidiabético e antimicrobiano (CHATUVERDI et al., 2007; BAG et al., 2012), já a Eugenia brasiliensis, grumixama como é chamada tradicionalmente, é utilizada como agente antimicrobiano e também no tratamento de diarreia e reumatismo (COLLA et al., 2012; MAGINA et al., 2009; MAGINA et al., 2010). A Eugenia umbeliflora (baguaçu) também é utilizada e reconhecida como agente antimicrobiano e gastroprotetor em estudos experimentais (MACHADO, 2005; MAGINA et al., 2009; MEYRE-SILVA et al., 2009). As espécies desse gênero são ricas em flavonoides, com grande capacidade antioxidante e em sua maioria apresentam grandes quantidades de catequinas, sendo que triterpenos e taninos também fazem parte de composição química (MAGINA et al., 2010; NEERGHEEN et al., 2006). Além disso, são ricas em óleos essenciais (compostos principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos) (CARVALHO JUNIOR et al., 2014; COLE; HABER; SETZER, 2007; ROMAGNOLO; SOUSA, 2006).

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Os triterpenos do tipo pentacíclicos, são os mais encontrados na literatura para este gênero, em especial os com esqueleto do tipo lupano e oleanano, como a betulina, ácido 29-hidroxi-oleanólico, α-amirina, β-amirina, isolados das folhas de E. brasiliensis (MAGINA et al, 2012). Alguns outros exemplos encontrados são: o ácido barbinérvico, isolado das folhas da E. punicifolia (LEITE et al., 2014), o taraxerol, α-amirina, β-amirina, betunlina e ácido betulínico, isolados das folhas da E. umbelliflora (MEYRE-SILVA et al., 2009) e os ácidos triterpênicos isolados da E. moraviana, o ácido betulínico, 6α- hidroxibetulínico e o ácido platânico (LUNARDI et al., 2001), entre outros.

Figura 1 – Exemplos de estruturas químicas encontradas no gênero Eugenia.

Legenda: 1 = Alfa-amirina; 2 = Beta-amirina; 3 = betulina; 4 = Ácido betulínico

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3.3 A espécie Eugenia involucrata DC O nome genérico Eugenia é dedicado a Francisco Eugenio de Saboya – Carignan, chamado Príncipe de Saboya, generalíssimo imperial de notável talento militar e protetor das artes. O epíteto específico involucrata é devido à coroa de sépalas e restos de bractéolas na base do fruto, que parecem ser seu invólucro (CARVALHO, 2008). É uma espécie nativa, originária do Sul do Brasil e de grande importância econômica, sendo amplamente encontrada nessa região e ainda em alguns locais da região sudeste, como demonstra a Figura 2 (LATTUADA; SOUZA; GONZATTO, 2010).

Figura 2 - Ocorrência natural da espécie Eugenia involucrata no Brasil.

Fonte: (CARVALHO, 2008).

Esta espécie está inserida no gênero Eugenia, família Myrtaceae, ordem Myrtales Juss, superordem Rosanae Takht, subclasse Magnoliidae Novák e classe Equisetopsida C. Agardh, possuindo alguns sinonímios como: Phyllocalyx involucratus (DC.) O. Berg, Phyllocalyx laevigatus O. Berg, Stenocalyx involucratus

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(DC.) Kausel, Eugenia paraguayensis Barb. Rodr. e Eugenia aemilii Barb. Rodr. (ANGELY, 1970). A E. involucrata é conhecida popularmente por vários nomes como cerejeira- do-mato e pitanga-preta (MG); cereja e cerejeira (PR); cereja, cereja-do-mato, cereja-do-rio-grande, cerejeira, cerejeira-da-terra, cerejeira-do-mato e cerejeira-do- rio-grande (RS); araçazeiro, cereja, cerejeira e cerejeira-do-mato (SC); e araçazeiro, cereja, cereja-do-rio-grande e cerejeira-do-rio-grande (SP) (CARVALHO, 2008; LORENZI, 2002). Segundo Carvalho (2008), a E. involucrata é uma espécie arbustiva a arbórea, de comportamento sempre-verde ou perenifólio de mudança foliar. As árvores maiores atingem dimensões próximas a 15 m de altura e possuem uma copa estreita e alongada. A casca externa é lisa, de coloração acinzentada-clara (FIGURA 3). Suas folhas tem coloração verde-escuras e as flores são hermafroditas, brancas e vistosas, e desabrocham normalmente na primavera (FIGURA 4).

Figura 3- Árvore da Eugenia involucrata.

Fonte: o autor

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Figura 4- Folhas e inflorescências da Eugenia involucrata.

Fonte: o autor

Os frutos desta planta são bagas piriformes, lisas, glabras, de coloração verde quando imaturo, tornando-se vermelho e cor-de-vinho tinto quando maduro, medindo de 1,3 cm a 2,3 cm de comprimento. Eles são próprios para consumo humano e muito saborosos. De coloração esverdeada, a polpa desses frutos é suculenta e agridoce. Os frutos pesam em média 5 g, sendo que no seu interior são encontradas sementes de coloração cinéreo-amarelada com formato irregular (FIGURA 5) (CARVALHO, 2008).

Figura 5- Frutos da Eugenia involucrata.

Fonte: o autor

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Tradicionalmente suas folhas são empregadas em forma de chás no tratamento da diarreia, má digestão, hemorragia e infecções. Os frutos são consumidos in natura, na forma de doces, geleias e licores (LORENZI, 2002; SAUSEN et al., 2009). Uma recente pesquisa desenvolvida por Rosa (2013) demonstrou resultados promissores com os extratos das sementes da E. involucrata em modelos farmacológicos de atividade gastroprotetora e antiúlcera. Outro estudo realizado com diferentes espécies de Eugenia, incluindo a E. involucrata, revelou seu importante potencial antioxidante por diferentes métodos. Além disso, foram identificados (mas não isolados) por meio de cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas (CLAE/EM), compostos fenólicos importantes que podem estar relacionados à essa característica como a (-)epicatequina e a (-)-catequina, substâncias majoritárias no extrato das folhas (INFANTE, 2013). Dametto (2014) observou alto teor de antocianidinas nos frutos da E. involucrata e da E. brasiliensis, além de identificar 10 substâncias em infusões das folhas dessas mesmas espécies por CLAE/EM: ácido gálico, ácido cafeico, ácido quínico, [epi]catequina, [epi]galocatequina, ácido cafeoil-O-glicosídeo, quercetina-3- O-ramnosídeo, [epi]afzelequina-[epi]catequina, [epi]galocatequina-[epi]catequina e [epi]galocatequina-[epi]galocatequina.

3.4 Potencial farmacológico de produtos naturais

3.4.1 Aspectos relacionados ao potencial antimicrobiano Atualmente pode-se perceber um aumento exacerbado no número de casos de doenças infecciosas. Esse problema está diretamente ligado às mudanças que permeiam a sociedade moderna e pode em alguns casos levar o indivíduo à morte. Entre essas mudanças podemos citar as imigrações, alterações do ambiente, aumento da população, sedentarismo e má-alimentação, além de um consumo indiscriminado de agentes antimicrobianos. Todos esses fatores associados às limitações dos medicamentos antibióticos disponíveis são relacionados ao aumento da resistência antimicrobiana (GOLDSTEIN et al., 2012; AGUIAR et al., 2012) As bactérias vem desenvolvendo mecanismos de resistência aos medicamentos disponíveis no mercado, gerando um grave problema de saúde 27

pública no Brasil. Um problema tão importante que mobilizou a ANVISA à publicar uma Resolução (RDC 20/2011) com o objetivo de racionalizar o consumo de antimicrobianos, que passaram a ser vendidos somente sob prescrição médica (BRASIL, 2011). O fenômeno da resistência bacteriana é complexo e tem causas variadas, pois, ao longo dos anos, as bactérias desenvolveram mecanismos capazes de diminuir ou mesmo inativar a ação dos fármacos. As cepas podem adquirir resistência por meio de mutações genéticas, produção de enzimas, alteração dos sítios receptores impedindo a absorção do fármaco ou, ainda, podem sintetizar proteínas que inibem a ação dos antibióticos. Na maioria das vezes, esta resistência ocorre quando o tratamento não é seguido de forma adequada como, por exemplo, no uso de subdoses, duração prolongada ou insuficiente dos medicamentos (TANWAR et al., 2014). Outro fator importante são as resistências microbianas indiretas, transmitidas principalmente por alimentos de origem animal. O uso indiscriminado de antibióticos para tratar doenças infecciosas de vacas leiteiras, bois, peixes, frangos e outros que são abatidos para o consumo humano também produz bactérias resistentes e seus genes podem ser transmitidos para o homem por contato direto com os animais ou suas fezes ou na forma de alimento. Além disso, as fezes animais podem contaminar a água dos rios e também transmitir genes resistentes (GASTALHO; SILVA; RAMOS, 2014) Entre os principais agentes etiológicos das infecções, encontra-se o Staphylococcus aureus, uma bactéria que é encontrada normalmente no corpo humano mas que pode desencadear infecções quando o hospedeiro encontra-se fragilizado (BASSETTI; RIGHI, 2013). A pneumonia causada por S. aureus é responsável por aproximadamente 18% das infecções hospitalares no Brasil e é a primeira em morbidade e mortalidade, com taxas de mortalidade de 60%. Em UTIs, a taxa de mortalidade de pacientes com pneumonia é de aproximadamente 50% (MARTINELLI et al., 2010). Uma recente revisão estima que a maioria dos medicamentos utilizados no controle de infecções é proveniente de insumos naturais. As plantas já fazem parte dessa evolução e ainda representam uma estratégia atual de obtenção de novos compostos que possam ter ação antimicrobiana (NEWMAN; CRAGG, 2012).

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Muitas plantas vem sendo estudadas nesse sentido, e compostos como cumarinas, flavonoides, taninos, alcaloides e terpenóides tem sido considerados substâncias chaves para resultados positivos na atividade antimicrobiana. Há de se levar em conta que a medicina tradicional deve ser bem acompanhada, pois existe sinergismo e interações entre plantas e medicamentos tradicionais (SILVA; FERNANDES JÚNIOR, 2010). O gênero Eugenia vem apresentando resultados interessantes em diversos estudos sobre a atividade antimicrobiana. Alguns autores atribuem os bons resultados encontrados à presença de compostos mais polares como os flavonoides, outros por sua vez acreditam nos compostos mais apolares como os terpenos. Algumas espécies que apresentaram resultados expressivos de atividade antimicrobiana foram a Eugenia pyriformis (CHAVASCO et al., 2014; STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009), Eugenia jambolana (BAG et al., 2012), Eugenia umbelliflora (MACHADO, 2005; GILIOLI, 2010), Eugenia dysenterica (SILVA, 2013) e Eugenia brejoensis (AZEVEDO et al., 2012).

3.4.2 Aspectos relacionados aos processos dolorosos A dor, apesar de representar uma sensação desagradável, é um processo fisiológico muito importante para o ser humano, porque ela permite que o indivíduo tenha consciência de que sua integridade está sendo ameaçada ou que ocorre alguma disfunção em seu organismo. A IASP (International Association for the Study of Pain) descreve a dor como uma “experiência sensorial e emocional desagradável que está associada com lesões reais ou potenciais”. Muitas vezes a dor representa o único sintoma para o diagnóstico de várias doenças (NETO; COSTA; SIQUEIRA, 2009). A dor é caracterizada por experiências sensoriais e emocionais, podendo ser crônica (quando perdura por um longo tempo) ou aguda (quando finda em um curto espaço de tempo). O conjunto das percepções de dor que somos capazes de distinguir denomina-se nocicepção e pode ser induzida em um receptor de três formas específicas: a indução de forma mecânica, capaz de excitar um mecanorreceptor; a do tipo térmica, capaz de excitar um termorreceptor; e também a indução do tipo química, que afeta quimioceptores. Este estímulo é então transmitido até o sistema nervoso central e interpretado no córtex cerebral como dor (KLAUMANN; WOUK; SILLAS, 2008; ROCHA et al., 2007) 29

A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que, para o tratamento da dor, seja seguido um protocolo chamado Escada Analgésica. O primeiro degrau recomenda o uso de medicamentos analgésicos simples e anti-inflamatórios para dores fracas. O segundo degrau sugere opioides fracos, que podem ser associados aos analgésicos simples ou anti-inflamatórios do primeiro degrau, para dores moderadas. O terceiro degrau consta de opioides fortes, associados ou não aos analgésicos simples ou anti-inflamatórios, para dores fortes. Os adjuvantes podem ser usados nos três degraus da escada (WHO, 1996). O problema do tratamento para a dor é que até os medicamentos do primeiro degrau causam efeitos adversos indesejáveis aos pacientes com o uso contínuo, como náuseas, dor de cabeça, vômitos, gastrites e úlceras. Já os opioides podem levar aos sintomas descritos anteriormente, além de tolerância ao medicamento, dependência ou crises de abstinência (POLSKI et al., 2014). Muitas pessoas ao redor do mundo perdem diariamente sua qualidade de vida por sofrerem de dor, crônica ou aguda. Por todos os efeitos adversos apresentados pelos analgésicos convencionais, existe uma grande necessidade de encontrar medicamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Nesse sentido a busca por fármacos provenientes das plantas medicinais se faz justificável e imprescindível para a saúde pública (BAHMANI et al., 2014). Ao longo da história o homem tem usado diversas formas de terapia para o alívio da dor, e muitas vezes acabam recorrendo às plantas medicinais. Um exemplo é a Papaver somniferum, da qual a morfina foi isolada. A partir dela foi possível sintetizar outros analgésicos opioides, mas não sem apresentar efeitos colaterais consideráveis, tais como depressão respiratória, sonolência, diminuição da motilidade gastrointestinal, náuseas e diversas alterações dos sistemas endócrino e nervoso autônomo (ALMEIDA; NAVARRO; BARBOSA-FILHO, 2001). Muitas outras plantas tem acompanhado a humanidade nessa busca pelo tratamento da dor. Entre elas podemos citar a Cannabis sativa, conhecida popularmente no Brasil como maconha, e amplamente utilizada para o tratamento da dor até 1937, quando seu uso foi vetado pelo governo americano e passou-se a considera-la uma droga em todo o mundo. A capsaicina, substância isolada de várias espécies de Capsicum, as populares pimentas, também foi uma importante descoberta comercial para o alivio da dor (CALIXTO et al., 2000).

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No entanto, talvez nenhuma descoberta tenha sido tão documentada quanto a da salicina, isolada de espécies de Salix e testada primeiramente no ano de 1763. Após muitos anos de modificações estruturais e testes, em 1899 Dreser descobriu que além de analgésico, o ácido acetilsalicílico abaixava a febre, e nomeou essa nova substância de Aspirina®, amplamente consumida até os dias atuais (CALIXTO et al., 2000). Plantas do gênero Eugenia tem apresentado potencial antinociceptivo em alguns estudos realizados como o de Basting e colaboradores (2014) e Shams-Ud- Doha e colaboradores (2012), que estudaram as folhas da Eugenia punicifolia Eugenia fruticosa e encontraram resultados bastante promissores. Os óleos essenciais Eugenia uniflora (AMORIM, 2009) e Eugenia candolleana (GUIMARÃES, 2009) também apresentaram promissores resultados quanto ao seu potencial antinociceptivo.

3.4.3 Aspectos relacionados à gastroproteção A gastrite e a úlcera péptica não tem uma etiologia bem compreendida, a principal suposição é o desequilíbrio entre os fatores de proteção da mucosa gástrica (muco, fluxo sanguíneo, mecanismo antioxidante) e os fatores agressores (ácido clorídrico, espécies reativas de oxigênio) gerando lesões, inflamações e necroses na área atingida (BRZOZOWSKI, 2003; FLOCH, 2007). Estas doenças podem estar associadas a diversos fatores internos como a genética, patologias infecciosas e/ou patologias granulomatosas associadas a doenças crônicas e a fatores externos como qualidade de vida, estresse, consumo de álcool, cafeína, drogas e medicamentos como aspirina e anti-inflamatórios não esteroidais e/ou a infecção pela bactéria Helicobacter pilory (MALFERTHEINER et al., 2007; SOLL; GRAHAM, 2009). O etanol é um dos grandes agentes lesivos da mucosa gástrica. Ele promove distúrbios como, isquemia, aparecimento de radicais livres, degranulação de mastócitos, inibição da produção de prostaglandinas e diminuição na produção do muco gástrico (HIRUMA-LIMA et al., 2000). Entre os mecanismos de defesa do estômago, podemos citar primeiramente a reconstituição do epitélio a cada 2-4 dias, característica importante para a integridade da mucosa. A produção de suco gástrico também é uma importante defesa, pois previne o desenvolvimentos de bactérias (TULASSAY; HERSZENYI, 31

2010). Outro mecanismo indispensável, considerado a primeira linha de defesa da mucosa, é a barreira de muco e bicarbonato, que tem uma função estrutural de reter o bicarbonato secretado pelas células epiteliais, aproximando o pH do estômago à neutralidade (ALQASOUMI et al., 2009). Também, no epitélio ocorre a secreção de proteínas de choque térmico, com função de manter a homeostase celular mediante o estresse oxidativo e aumento da temperatura evitando a desnaturação das proteínas de proteção (TULASSAY; HERSZENYI, 2010). Uma perfusão adequada de sangue no trato gastrintestinal também evita danos epiteliais nas camadas mais profundas da mucosa, pois mantém as células nutridas e com oxigênio, evitando agentes irritantes e vasoconstritores (WALLACE; MILLER, 2000). Outro fator relevante na proteção da mucosa são as prostaglandinas, que atuam como agentes facilitadores da maioria dos outros mecanismos gastroprotetores: inibe a liberação de ácido gástrico, aumenta o fluxo sanguíneo, estimula a produção de muco e bicarbonato e acelera o processo de cicatrização (TULASSAY; HERSZENYI, 2010). Os sintomas descritos normalmente pelos acometidos desse problema são dor epigástrica, sintomas dispépticos (plenitude), distensão abdominal, saciedade precoce, náuseas e dispepsia (PRIMROSE, 2004). As terapias mais utilizadas para tratamento de úlceras gástricas são os fármacos inibidores ou neutralizadores da secreção de ácido gástrico: antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio, bicarbonato de sódio, trissilicato de magnésio, gel de hidróxido de alumínio); antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina, famotidina); inibidores da bomba de prótons (omeprazol, pantoprazol, lansoprazol, esomeprasol, rabeprazol). Além desses também existe a classe de fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralfato, misoprostol) (HUNT, 2005.; SCARPIGNATO, 2007). As plantas medicinais apresentam muitos metabólitos secundários capazes de proteger o estômago e até de tratar lesões já instaladas. Diversas substâncias das classes dos flavonóides, terpenos, polisacarídeos, alcalóides, e alguns outros em menor escala, já foram pesquisadas e algumas delas obtiveram comprovação científica de seu potencial gastroprotetor, sendo levadas à outras fases de estudos (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012).

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Os medicamentos mais utilizados para o tratamento da úlcera apresentam recidivas, efeitos colaterais e interações medicamentosas. Por essa razão, justifica- se a busca de substâncias novas provenientes de plantas medicinais, que pssam oferecer opções de tratamento melhores e com menos adversidades (KLEIN- JÚNIOR et al., 2012; LAKSHMI et al., 2010). A grande quantidade de flavonoides, considerados potentes antioxidantes, presentes nas plantas do gênero Eugenia é um dos principais motivadores da pesquisa gastroprotetora e antiúlcera de espécies deste gênero (CRUZ; KAPLAN, 2004; MAGINA et al., 2010). Algumas delas já foram estudadas quanto ao seu potencial gastroprotetor. Trabalhos realizados com as folhas da Eugenia jambolana (DONATINI et al., 2009), Eugenia umbeliflora (MEYRE-SILVA, 2009), Eugenia punicifolia (BASTING et al., 2014) demostraram resultados promissores. Além disso, outra espécie do mesmo gênero, já bastante conhecida e descrita na literatura apresenta um grande potencial gastroprotetor, a Eugenia caryophyllata, popularmente conhecida como cravo-da-índia (SRINIVAS et al., 2013). 33

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material Vegetal A planta foi coletada no município de Itajaí-SC, segundo as coordenadas geográficas 26°54'17.7"S e 48°40'17.0"W. Ela foi identificada pelo Prof. Oscar Iza, da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Uma excicata foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí) sob o código n˚55283. As coletas foram realizadas em três diferentes momentos, em janeiro (210 g), em julho (240 g) e em dezembro (234 g) de 2014. As folhas frescas foram picadas em pedaços pequenos para a obtenção dos extratos e posterior análise fitoquímica.

4.2 Análise Fitoquímica

4.2.1 Obtenção de extratos e frações e isolamento de substâncias

Em todas as coletas, as folhas foram submetidas ao processo de maceração estática com metanol (foi utilizada em média 1 L), em temperatura ambiente, por um período de sete dias. Posteriormente, o solvente foi removido por destilação em evaporador rotatório sob pressão reduzida, para obtenção do extrato metanólico bruto (EMB). Eles foram designados respectivamente, EMB-jan, EMB-jul e EMB-dez.

O EMB-jan foi utilizado para realizar a análise fitoquímica convencional, sendo submetido à partição com solventes de polaridade crescente (clorofórmio e acetato de etila), conforme metodologia anteriormente descrita (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998, 2001; MALHEIROS et al., 2010; NIERO et al., 2003). Dessa partição foram geradas duas frações, designadas FCL-jan (Fração Clorofórmio), com uma massa de 2,5419 g e FAE-jan (Fração Acetato de Etila), com uma massa de 8,839 g, conforme o fluxograma apresentado (FIGURA 6).

As frações foram então submetidas à uma série de Colunas Cromatográficas (CC) e Cromatografias em camada delgada (CCD) para isolamento de substâncias, de acordo com as Figuras 7 e 8 (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; 2001; MALHEIROS et al., 2010; NIERO et al., 2003; VILEGAS; CARDOSO, QUEVEDO, 2012).

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A coleta de julho e dezembro seguiu o mesmo padrão de partição e análises por CC e CCD’s da coleta de janeiro, no entanto, o extrato e as frações destas coletas foram utilizados principalmente para os ensaios farmacológicos e para comparação com a coleta de janeiro.

Figura 6. Processo de obtenção do extrato e das frações das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.

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Figura 7. Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.

Legenda: FE = fase estacionária; FM = fase móvel; H = hexano; A = acetona

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Figura 8. Processo de obtenção de substâncias isoladas a partir da FAE-jan das folhas de Eugenia involucrata da coleta de janeiro de 2014.

Legenda: FE = fase estacionária; FM = fase móvel; C = clorofórmio; M = metanol 37

4.2.3 Elucidação estrutural

Para elucidar e caracterizar quimicamente as substâncias purificadas foram utilizadas técnicas espectrométricos usuais como Infra-vermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-¹H) e carbono 13 (RMN-¹³C) e Espectrometria de Massa (EM), todos disponíveis no Curso de Farmácia e PPGCF da UNIVALI. Os espectros de RMN foram realizados por Pedro Pablo Perez Netto no espectrômetro BRUKER AC-300F 300 MHz, tendo como referência interna o tetrametilsilano (TMS) ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos foram registrados em valores adimencionais ᵟ (ppm). A avaliação dos espectros obtidos das substâncias isoladas foram acompanhadas com o auxílio de tabelas que indicam deslocamentos químicos para hidrogênios e carbonos em comparação com trabalhos encontrados na literatura. A análise espectrométrica por IV foi realizada pelo Prof. Rogério Corrêa em espectômetro interfotométrico Fourier Transform Infrared IR Prestige 21 (SHIMADZU), pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e foram corrigidos pelo algoritmo Kubelka Munk. Para fazer o espectro de massa foi utilizado o cromatógrafo gasoso acoplado ao detector de massas da marca Shimadzu modelo GCMS - QP2010S, apresentando interface acoplada a um computador para controle e aquisição de dados com sistema de amostragem automatizada. A coluna utilizada foi da marca Marca DB-1 (USA): 0,25 mm (d.i.) x 30 m (comprimento), espessura do filme 0,25 μm de 100% de dimetil polisiloxano, com volume de injeção: 1,0 μL (injetor modo Splitless (razão do split 40,0:1) a 300˚C). O eluente foi o gás hélio (0,79 mL/min) e a temperatura inicial foi 80 ˚C e permaneceu desta maneira por 1 min, quando foi elevada até 200 ˚C a uma velocidade de 25 ˚C /min, logo após a 10 ˚C /min até 230 ˚C, em seguida 20 ˚C /min até 310 ficando por 10 min. O detector MS – razão m/z com scan 40 a 450 D foi utilizado e as análises dos espectros de massas foram feitos por comparação aos espectros encontrados na biblioteca NIST 8.0. Estas análises foram realizadas pelo Prof. Theodoro Marcel Wagner.

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4.2.4 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A análise por CLAE foi realizada visando comparar as substâncias encontradas no EMB-jan (verão) e no EMB-jul (inverno) e identificar as classes de compostos presentes nos extratos. Esta técnica foi realizada pela mestranda Tailyn Zermiani. Para fazer a análise do EMB das folhas de E. involucatra foi utilizado o cromatógrafo líquido da marca Shimadzu® LC 20-AT, equipado com uma bomba quaternária, detector de varredura de espectro no ultravioleta por arranjo de fotodiodos (diodo array) e injetor automático SIL-20A. O software LC Solution® foi utilizado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de comprimentos de onda entre 190 nm até 400 nm. A separação dos fitoconstituintes das folhas de E. involucatra foi executada com uma coluna de fase reversa C18 (250 X 4,6 mm X 5 µm) da marca Phenomenex. Os solventes utilizados foram grau HPLC, filtrados a vácuo com membrana de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45 μm de porosidade (RC-L 58 Schleicher e Schuell) e degaseificados em ultrassom (UltraSonic Cleaner Unique® USC 1400) por sonicação sob vácuo (Bomba de Vácuo Tecnal TE® – 058). Como marcador químico foi utilizada a catequina. A eluição foi realizada com fluxo de 1,0 mL/min, utilizando como fases móveis acetonitrila:água (acidificada com H3PO4 pH 2,53), em modo gradiente, conforme apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Eluição utilizada na análise por CLAE do EMB-jan e o EMB-jul. Tempo Acetonitrila (%) Água* (%) 0 15 85 25 35 65 30 80 20 32 15 85 35 15 85 *Acidificada com ácido fosfórico pH 2,53.

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4.3 Análise Farmacológica/Biológica

Os experimentos de análise da atividade antimicrobiana, gastroprotetora e antinociceptiva foram realizados por acadêmicos orientados por professores vinculados ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas e ao Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas da Univali - NIQFAR/CCS/UNIVALI.

4.3.1 Avaliação da Atividade Antimicrobiana A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pela acadêmica Marcélly dos Santos Boera sob orientação do Prof. Alexandre Bella Cruz. A avaliação do EMB-jan, FCL-jan e FAE-jan quanto ao seu potencial antimicrobiano foi realizada pela metodologia da diluição em ágar, e os resultados permitiram a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em µg/mL. As cepas utilizadas nos experimentos foram as das bactérias gram-positivas Bacillus subtilis (ATCC 23858), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Staphylococcus saprophyticus (ATCC 35552), da bactéria gram-negativa Escherichia coli (ATCC 25922) e da levedura Candida albicans (ATCC 10231) (BELLA CRUZ et al., 2010). Os valores da CIM foram determinados pela diluição dos componentes obtidos da planta em ágar empregando a metodologia descrita por CLSI (2009) para as bactérias e Espinel-Ingroff e Pfaller (1995) para a levedura, com pequenas modificações. Os extratos e frações foram dissolvidos em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) e água destilada (4:6), foram adicionados em séries de 10 frascos com capacidade para 5 mL em diferentes concentrações (1000 a 2 μg/mL). Em seguida, a cada frasco foi adicionado 1 mL de meio agar Mueller-Hinton para as bactérias e 1 mL de ágar Sabouraud dextrosado para a levedura, seguido de imediata homogeneização da mistura. Após a solidificação dos respectivos meios de cultura, os micro-organismos, previamente ativados, foram inoculados nas séries correspondentes, sendo então incubados a 35 ºC por 18 a 24 horas para as bactérias, 30 ºC por 24 a 48 horas para o fungo leveduriforme. Após esse período de incubação, foram realizadas leituras da CIM através da verificação visual do crescimento microbiano. Para a interpretação dos resultados foi considerada CIM a inibição total do crescimento microbiano. Durante os testes foram utilizados controles, como os meios de cultura e solvente utilizado na solubilização do extrato e das frações, a fim de verificar seu

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efeito sobre o micro-organismo. A concentração final de DMSO nos ensaios não excedeu 2%. A leitura dos resultados foi considerada válida somente quando houve crescimento microbiano nos controles. Foram utilizados como controles, antimicrobianos empregados na clínica e os ensaios foram feitos em triplicata.

4.3.2 Avaliação da Atividade Antinociceptiva A avaliação da atividade antinociceptiva foi realizada pela acadêmica Karla Capistrano sob orientação da Profª. Fátima de Campos Buzzi. Os animais utilizados neste estudo foram mantidos segundo as normas e cuidados com animais de laboratório, bem estar e biossegurança na experimentação, conforme descritas na Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Os experimentos foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de Animais da Universidade do Vale do Itajaí, sendo aprovado sob protocolo n° 599-07. Para esta avaliação foram utilizados camundongos Swiss machos pesando entre 25 a 35 gramas, aclimatados a temperatura de 22 ± 2 °C com ciclo claro/escuro de 12 horas mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados com água e ração “ad libitum”. Os animais foram levados ao ambiente do teste 1 h antes da realização do experimento para se adaptarem, e 30 minutos antes do mesmo, receberam uma injeção via i. p., do EMB-jul, FCL-jul e FAE-jul nas doses de 10 mg/kg. A FCL-jul também foi avaliada nas doses de 6 e 3 mg/kg e a substância isolada 7-9 na dose de 3 mg/kg e 1 mg/kg. Os animais do grupo controle receberam somente veículo. O modelo utilizado foi o de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, que consistiu na aplicação por via i. p., depois do tratamento, do ácido acético (0.6 %), dissolvido em NaCl 0.9% previamente tamponado em pH 7.4 numa dose de 0,15 mL/10 g de peso (SOUZA et al., 2003). As contorções foram quantificadas acumulativamente durante 20 minutos e o indicativo de antinocicepção foi a redução da resposta nociceptiva à contorção, em relação ao grupo controle.

4.3.3 Avaliação da Atividade Gastroprotetora A avaliação da atividade gastroprotetora foi realizada pela doutoranda Roseane Leandra da Rosa sob orientação do Prof. Sérgio Faloni de Andrade. 41

Os animais utilizados neste estudo foram mantidos segundo as normas e cuidados com animais de laboratório, bem estar e biossegurança na experimentação, conforme descritas na Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Os experimentos foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de Animais da Universidade do Vale do Itajaí, sendo aprovado pelo protocolo n° 019/13. Neste ensaio foram utilizados 30 camundongos fêmeas Swiss, pesando entre 25–50 g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, em sala com temperatura média de 22 ºC e ciclo controlados (claro/escuro 12 horas cada), tendo ração e água ad libitum. Nas doze horas anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum e com livre acesso à água, sendo adicionada a caixa uma grade para inibir a coprofagia. No estudo farmacológico de plantas utilizam-se normalmente concentrações crescentes, correlacionadas para possível observação da relação dose-resposta. Neste estudo, avaliou-se efeito do extrato (EMB-jul) utilizando as concentrações de 50 mg/kg, 125 mg/kg e 250 mg/kg. A metodologia utilizada no experimento foi descrita por Mizui e Doteuchi (1983), com algumas modificações. Os camundongos foram divididos em diferentes grupos (n = 6), pré-tratados por via oral com cimetidina (controle positivo – 100 mg/kg), veículo (controle negativo – água destilada) e o EMB-jul nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg. Após uma hora do tratamento, foram administrados por via oral nos animais, 0,1 mL/10 g (peso animal) de etanol (agente lesivo). Uma hora após a administração do agente lesivo, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior e esticados em placas de parafina. As imagens foram digitalizadas e analisadas por programa de computador de análise de imagens EARP, a fim de determinar o número de lesões e o seu tamanho, para determinação da área total de lesão (mm2) e da área relativa lesada (%). Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média. A análise estatística dos resultados foi realizada por meio de análise de variância seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnett. Valores de p<0,05 ou menos foram considerados como indicativos de significância.

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5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise Fitoquímica

Os extratos obtidos com as folhas da Eugenia involucrata nas coletas de janeiro, julho e dezembro apresentaram rendimentos diferentes, não somente devido à produção dos metabólitos pela planta nas distintas épocas do ano, mas possivelmente também devido a variações na quantidade de material coletado e possivelmente na quantidade de solvente utilizada na maceração. O EMB-jan obteve o maior rendimento, 5,63%, seguido pelo EMB-jul (rendimento de 3,75%) e EMB-dez (rendimento de 3,19%).

5.1.1 Isolamento e identificação dos princípios ativos

A análise comparativa entre as frações das diferentes coletas, feita por CCD está descrita na Figura 9, onde pode-se observar similaridade entre os extratos, tanto para os compostos polares, como os compostos fenólicos (FAE eluída em Clorofórmio:Metanol na proporção de 8:2 e revelada com Cloreto Férrico) quanto para os mais apolares, como os terpenos e esteróides (FCL eluída em Hexano:Acetona na proporção de 7:3 e revelada com Anisaldeído).

Figura 9. CCD comparativa das frações Clorofórmio e Acetato de Etila nas três diferentes coletas, janeiro, julho e dezembro, respectivamente.

A B

A - Fase móvel utilizada: Hexano:Acetona (7:3) e revelador anisaldeído B – Fase móvel: Clorofórmio:Metanol (8:2) e revelador cloreto férrico 43

As análises cromatográficas permitiram o isolamento de três substâncias da fração acetato de etila das folhas da E. involucrata (coleta de janeiro), uma delas, a subfração 11-14 foi identificada como a (-)-catequina (FIGURA 10). As outras duas substâncias isoladas (3-5 e 6-8) que estão em fase de elucidação estrutural.

Figura 10. Estrutura química da (-)-catequina (substância 11-14).

A identificação da (-)-catequina foi realizada pela comparação dos espectros de RMN de 1H e 13C (FIGURAS 11,12 e 13) com dados da literatura, como expressa a Tabela 2 (AYRES et al., 2009). A principal diferença observada nos sinais de deslocamentos químicos entre a (+)-catequina e a (-)-catequina estão nos sinais dos hidrogênios e carbonos 2 e 3.

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Figura 11. Espectro de RMN 1H da substância 11-14, identificada como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.

Figura 12. Espectro de RMN 1H aproximado da substância 11-14, identificada como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.

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Figura 13. Espectro de RMN 13C da substância 11-14, identificada como (-)-catequina, isolada da fração acetato de etila das folhas de Eugenia involucrata.

Figura 14. Estrutura química numerada da (-)-catequina

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Tabela 2. Dados de RMN de 1H e 13C da (-)-catequina em comparação com dados da literatura.

(-)-catequina (+)-catequina (Substância 11-14) (AYRES et al., 2009) δH (m;J) δC δH (m;J) δC 2 4,87 (s) 79,46 4,59 (d; J=7,4 Hz) 82,6 3 4,20 (d; J=4,5 Hz) 67,01 4,01 (ddd; J=8; 7,4 e 5,4 Hz) 68,6 4a 2,72 (dd; J=16,5 e 3 Hz) 2,52 (dd; J=16,0 e 8,0 Hz 4b 2,85 (dd; J=16,5 e 4,5 Hz) 29,04 2,84 (dd; J=16 e 5,4 Hz) 28,2 5 157,63 157,3 6 6,01 (d; J=2,1 Hz) 96,26 5,96 (d; J=2,2 Hz) 96,4 7 157,68 157,4 8 5,91 (d; J=2,1 Hz) 95,73 5,89 (d; J=2,2Hz) 95,6 9 157,17 156,7 10 99,83 100,9 1ʹ 132,27 132,0 2ʹ 7,04 (d; J=1,5 Hz) 115,31 6,85 (d; J=1,8 Hz) 115,2 3ʹ 145,47 146,0

4ʹ 145,34 146,0 5ʹ 6,84 (d; J=8,1 Hz) 115,54 6,79 (d; J=8,1 Hz) 116,0 6ʹ 6,79 (dd; J=1,8 e 8,1 Hz) 119,38 6,72 (dd; J=1,8 e 8,1 Hz) 120,1

A partir da Fração Clorofórmio (FCL-jan) foram isoladas outras três substâncias. A substância 13 foi identificada por CG/EM como Fitol (4mg) (FIGURA 15 e 16). A estrutura do fitol foi confirmada pela biblioteca NIST versão 6, com similaridade próxima à 100%. Os dados de EM estão de acordo com a literatura para a estrutura proposta (SOUZA et al, 2012).

Figura 15. Estrutura química do fitol (substância 13).

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Figura 16. Espectro de massas da substância 13, obtido por CG/EM.

A determinação estrutural da substância 7-9 foi realizada mediante a análise dos espectros de IV, RMN 1H e 13C. Ela apresentou ponto de fusão de 212 ˚C e foi isolada uma quantidade de 8 mg. O espectro de absorção no IV da substância 7-9 apresentou bandas de absorção com intensidade máxima em 3450 cm-1 referente a estiramento de ligação OH. Bandas de intensidade máxima entre 2960 a 2870 cm-1, referente à deformação axial de Csp3H. O estiramento em 1700 cm-1 caracteriza C=O e bandas de intensidade máxima entre 1200 a 1050 cm-1 caracterizam deformação axial de C-O. A análise do espectro de IV da substância 7-9 permitiu evidenciar as funções álcool e cetona, além da cadeia de hidrocarboneto alifático (FIGURA 17).

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Figura 17. Espectro de infravermelho da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.

No espectro de RMN 1H (FIGURA 18) foi possível observar inicialmente sinais que podem ser atribuídos a um triterpenóide pelos múltiplos sinais entre 1 e 3 ppm (5 a 6 grupos metilas). Dois simpletos na região de 1,3 ppm indicam a existência de grupamentos metila próximo a carbono oxigenado com diferença estérica para os grupos metila. Dois dupletos entre 0,5-0,8 ppm são característicos de hidrogênios de ciclopropano, que se orientam à esqueletos de cicloartanos ou phylanthanos ou outros menos comuns. O sistema AB em 3,4-3,8 ppm é característico de um metileno alcoólico isolado, sobre um carbono quaternário, sem hidrogênios vizinhos. A ausência de sinais acima de 4 ppm indica que não há insaturações na molécula.

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Figura 18. Espectro de RMN 1H da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.

No espectro de RMN13C (FIGURA 19 e 20) se confirma a natureza triterpênica da substância, no entanto só foi possível observar claramente 28 sinais de carbono. Não se observa sinais na região posterior à 66 ppm, além do sinal referente à carbonila em 218 ppm.

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Figura 19. Espectro ampliado de RMN 13C da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.

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Figura 20. Espectro de RMN 13C (A) e modo DEPT (B) da substância 7-9, isolada da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.

A

B

Com a proposta de carbonila em C-3 e hidroximetil em C-4 foi realizada uma busca em Scifinder e foram encontradas poucas substâncias contendo essa função, mas distintos da substância previamente isolada da E. involucrata. Uma das substâncias encontradas foi o composto 4 (3-ceto-28- hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata (FIGURA 21), cujos deslocamentos de RMN¹³C nos espectros permitiram identificar a funcionalidade e o esqueleto de cicloartano (sinonímia CAs: Ciclolanostano), sem outra funcionalidade da mencionada para o 7-9 da E. involucrata em todo sistema polinuclear (AHMED et al., 2010). Além da disposição alfa do grupo hidroximetil, foi possível afirmar todos os sinais do sistema policíclico, do ciclopropano e dos grupos metil substituintes, pela coincidência quase perfeita de sinais (0,1-0,3 ppm de diferencias máximas) com as descritas no presente trabalho.

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Esse composto contém 3 funções hidroxila na cadeia e se observa que particularmente o grupamento com ponte de hidrogênio vizinho 24,25-dihidroxi induz diferenças de deslocamentos das substanciais (FIGURA 21).

Figura 21. Estrutura do composto 4 (3-ceto-28-hidroxicicloartano) isolado da Amoora cucullata.

Esta mesma coincidência foi encontrada para outra substância, também nomeada composto 4, mas esta, isolada do própolis por Li e colaboradores (2009) (FIGURA 22).

Figura 22. Estrutura do composto 4 isolado do própolis. O

H3C OH

CH3 H CH3

H

CH3

O H OH H3C 53

A funcionalidade na cadeia lateral foi deduzida das absorções dos grupos metil diasterópicos diferenciados (sinais em 1,3 ppm do RMN-¹H) e geminais com função oxigenada e pela presença de um sinal de metino oxigenado em 64,7 ppm no RMN¹³C e de outro carbono protonado, de menor intensidade, em 58,4. Essas características levariam à existência de um grupamento oxirânico nas posições 25,25 do triterpenóide. A presença de um epóxido seria também existente pelo multipleto em 2,7 ppm presente no espectro de RMN-¹H, característico de hidrogêncio metínico H-24. Foi possível confirmar a constituição de uma cadeia lateral mediante a busca bibliográfica das numerosas substâncias descritas com função 24,25-epoxi em uma cadeia de triterpeno ou esterol colestánico isenta de outras funções. Foram encontrados vários compostos com essa funcionalidade de cadeia e a comparação dos espectros permitiu constatar a coincidência de sinais da substância 7-9 da E. involucrata com as descritas na literatura para esse tipo de compostos (compostos 1, 3a e 3b isolados da Borrichia frutescens), como observado na Figura 23 (CANTRELL et al., 1996).

Figura 23. Estruturas moleculares dos compostos compostos 1, 3a e 3b isolados da Borrichia frutescens.

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A constituição molecular da substância 7-9 sugerida é 24,25-epoxi-28- hidroxicicloartan-3-ona, representada na Figura 24. Essa substância não aparece no Chem. Abstracts segundo as buscas realizadas no Scifinder (até 30 de junho de 2015) dessa forma, esta é primeira vez que essa substância é descrita. Foi realizada uma busca bibliográfica em importantes bases de dados, incluindo Scielo, PubMed, SciFinder e Science Direct e não foram encontrados resultados relacionados à presença de triterpenos do tipo cicloartano no gênero Eugenia, sendo esta uma das raras citações. Para a identificação inequívoca falta realizar alguns experimentos adicionais (bidimensionais), espectro de massas de alta resolução e determinação da rotação ótica.

Figura 24. Estrutura química da substância 24,25-epoxi-28-hidroxicicloartan-3-ona, isolado da fração clorofórmio das folhas de Eugenia involucrata.

Para a identificação da substância 3-6, uma pequena quantidade da substância 7-9 foi acetilada usando metodologia convencional (piridina e anidrido acético sob aquecimento), cujo produto não foi isolado, mas por CCD comparativa o Rf foi similar ao 3-6, sugerindo que a substância 3-6 consiste no 7-9 acetilado.

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5.1.2 Cromatografia Líquida Alta Eficiência

Com o intuito de avaliar a diferença entre as épocas de coleta (verão e inverno), considerando os aspectos sazonais que influenciam na produção de metabólitos secundários (GOBBO-NETO; LOPEZ, 2007), foi realizada uma análise qualitativa por CLAE dos extratos obtidos das coletas de janeiro e julho (EMB-jan e EMB-jul) (FIGURAS 25 e 26). Os perfis de absorção no UV foram detectados entre 200 a 400nm, sendo observados máximos de absorbância em 280 nm e 300nm, um perfil característico de compostos fenólicos (MAATTA; KAMAL-ELDIN; TORRONEN, 2003; ZHANG et al., 2013).

Figura 25. Análise por CLAE do EMB-jan das folhas de Eugenia involucrata a 280nm. mAU Extract-280nm4nm (1.00)

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35

30

25

20

15 /8.637

/11.746

/14.877

/22.547

/15.609

/9.417 10

/14.343

/17.058

/15.183

/18.965

5 /10.157

0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

A Figura 27 mostra a sobreposição do EMB-jul e EMB-jan usando a (-)-catequina, isolada das folhas da E. involucrata como marcador químico.

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Figura 26. Análise por CLAE do EMB-jul das folhas de Eugenia involucrata a 280nm. mAU Extract-280nm4nm (1.00) 27.5

/8.665 25.0

22.5

20.0

17.5

15.0

/34.288

12.5 /9.484

/10.074 10.0 /15.656

/11.799

/22.595

/13.007

7.5 /6.662

/14.402

/13.748

/17.138

/17.447 5.0 /7.086

2.5

0.0

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

Figura 27. Análise por CLAE da sobreposição do EMB-jan, EMB-jul e (-)-catequina das folhas de Eugenia involucrata a 280nm.

uV (x10,000)

8.0

7.0

6.0

5.0

4.0 (-)-Catequina Fr 11-14

3.0 EMB-jul 2.0

1.0 EMB-jan 0.0

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min

Conforme demonstrado pelos perfis de CLAE, a catequina é a substância majoritária dos extratos, e aparentemente está presente em maior quantidade no inverno. Há similaridade em relação à coleta do verão e do inverno, mas existem algumas diferenças importantes, destacando-se algumas substâncias, como as que apresentam tempo de retenção de ~3, ~7, ~10, ~14,5 e ~35 minutos (UV=280 nm) na coleta de inverno, que não aparecem na coleta do verão, ou aparecem em menor quantidade. 57

5.2 Análise Farmacológica/Biológica

5.2.1 Atividade Antimicrobiana

A triagem inicial da atividade antimicrobiana foi realizada com o extrato bruto e testada em três micro-organismos padrões, sendo uma bactéria gram-positiva (Staphylococcus aureus), uma bactéria gram-negativa (Escherichia coli) e uma levedura (Candida albicans). Os resultados relacionados à atividade antimicrobiana obtidos para o EMB-jan e as frações obtidas a partir da mesma coleta estão demostrados na tabela 3. Os valores encontrados foram considerados da seguinte maneira, em relação ao CIM: >1000 µg/mL inativo, entre 500 e 1000 µg/mL atividade fraca, entre 100 e 500 µg/mL atividade moderada e <100 µg/mL boa atividade antimicrobiana (HOLETZ et al., 2002).

Tabela 3. Análise da atividade antimicrobiana do EMB-jan, FAE-jan e FCL-jan das folhas de Eugenia involucrata (µg/mL)

Material Staphylococcus Staphylococcus Bacillus subtilis Escherichia Candida Testado aureus saprophyticus coli albicans EMB-jan 125 - - 500 125 FCL-jan 500 500 500 1000 > 1000 FAE-jan > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000

EMB-jan = Extrato Metanólico Bruto de janeiro; FCL-jan = Fração Clorofórmio de janeiro; FAE-jan = Fração Acetato de Etila de janeiro.

Segundo a tabela 3, o EMB-jan apresentou CIM de 125 µg/mL para Staphylococcus aureus e Candida albicans e CIM de 500 µg/mL para Escherichia coli, sendo esses três resultados considerados como atividade antimicrobiana moderada (entre 100 e 500 µg/mL). Diante destes resultados iniciais, foi então avaliada a atividade das frações acetato de etila e clorofórmio, acrescentando à avaliação duas outras bactérias Gram-positivas (Staphylococcus saprophyticus e Bacillus subtilis), levando em consideração que o resultado inicial para esse tipo de bactéria foi melhor do que para as bactérias gram-negativas. A FAE-jan apresentou CIM >1000 µg/mL para todas as cepas, não demonstrando nenhuma atividade antimicrobiana. Dessa forma pode-se sugerir que a atividade encontrada no extrato bruto não seja proveniente dos compostos mais

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polares encontrados nas folhas e solubilizados nesta fração e provavelmente não tem relação com a (-)-catequina. A FCL-jan apresentou CIM de 500 µg/mL para Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus e Bacillus subtilis, resultado considerado fraco, 1000 µg/mL para Escherichia coli e >1000 µg/mL para Candida albicans, indicando inatividade frente à estas duas cepas. O fitol, diterpeno isolado desta fração, apresenta propriedade antimicrobiana, segundo a literatura (SANTOS, 2013), e pode ser um dos responsáveis pela melhor ação antimicrobiana encontrada para a FCL em relação à FAE. Os resultados encontrados frente às cepas de bactérias Gram-positivas foram melhores que para as outras cepas testadas, tanto no extrato quanto na fração clorofórmio. O EMB-jul apresentou ação antibacteriana superior, quando comparada às frações, em todas as cepas testadas. A explicação para estes resultados pode estar na associação de duas ou mais substâncias ativas encontradas na planta ou no sinergismo entre elas. Além da possibilidade de efeito aditivo ou sinergismo, embora imperceptível na realização do experimento, a influência da solubilidade dos constituintes pode também ser uma possibilidade que explica esses resultados. Não foram encontrados outros estudos avaliando o potencial antimicrobiano da E. involucrata, porém, outras espécies do mesmo gênero já foram avaliadas e podem ser utilizadas para comparação dos resultados. Chavasco e colaboradores (2014) observaram um potencial antimicrobiano do extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia pyriformis para algumas cepas também testadas na presente pesquisa. O extrato apresentou atividade moderada S. aureus e B. subtilis, E. coli e C. albicans. Outras partes da planta como semente, fruto e caule também apresentaram bons resultados. Ferreira e colaboradores (2014) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato e de frações das folhas de Eugenia calycina e não encontraram atividade antimicrobiana frente nenhuma bactéria testada. A Eugenia brejoensis, característica do cerrado brasileiro, apresentou atividade antimicrobiana tanto para bactérias Gram-positivas quanto para as Gram- negativas. O extrato metanólico, a fração acetato de etila e a fração ciclohexano demonstraram atividade fraca para S. aureus e atividade moderada para E. coli e B. subtilis (AZEVEDO et al., 2012). 59

As folhas da planta Eugenia dysenterica, conhecida popularmente como cagaita, foram avaliadas por Silva (2013), que encontrou seu resultado mais relevante frente à cepa de S. aureus, com CIM de 250 µ/mL tanto para o extrato aquoso quanto para as frações acetônica, isopropanólica e metanólica. Neste mesmo trabalho foi verificada a presença de catequina e epicatequina nas folhas da E. dysenterica, mesma classe de substâncias encontradas na E. involucrata. A Eugenia umbelliflora também possui atividade antimicrobiana, como descrito em trabalho realizado por Machado e colaboradores (2005), que revelou seu potencial contra bactérias Gram-positivas em concentrações de CIM que variaram de 2 a 400 µg/mL (atividade considerada de boa a moderada). Assim como no presente estudo, os resultados alcançados pela E. umbelliflora foram melhores na fração mais apolar (diclorometano) e no extrato bruto. Em outro estudo realizado com a mesma espécie, foi avaliado o potencial antibacteriano do extrato bruto, das frações e de uma mistura de triterpenos isolados contra quatro bactérias Gram-positivas e seis bactérias Gram-negativas. Os melhores resultados foram obtidos para o extrato bruto, e para as frações hexano, diclorometano e acetato de etila, que mostraram atividade que variou de moderada a excelente contra todas as bactérias Gram-positivas testadas (GILIOLI, 2010). Alguns estudos também comprovam o potencial antimicrobiano de outras partes de plantas do gênero Eugenia, como as sementes da Eugenia jambolana, popular joão-bolão (BAG et al., 2012) e as flores da Eugenia caryophyllata, popular cravo-da-índia (JOSHI et al., 2011). Os óleos essenciais desse gênero também são amplamente estudados e com resultados expressivos na atividade antimicrobiana (MAGINA et al., 2009; STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009). A busca por novas opções terapêuticas para infecções que afligem a sociedade contemporânea é muito evidente. Dentre os agentes etiológicos de processos infecciosos, S. aureus é considerado um dos mais importantes patógenos oportunistas e está frequentemente associado a infecções comunitárias e hospitalares (ANDERSON et al., 2012). Por essa razão, o potencial antimicrobiano encontrado para esse micro-organismo específico é importante. Os resultados encontrados demonstram ainda que a utilização popular das folhas da cerejinha na forma de chás para tratar infecções tem fundamento, no entanto, a diferença de solventes utilizados para a extração das substâncias pode

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modificar os resultados apresentados. Por esta razão, outros experimentos adicionais e pormenorizados precisam ser realizados para confirmar esta hipótese.

5.2.2 Atividade Antinociceptiva

A triagem da atividade antinociceptiva foi realizada com o extrato bruto e as duas frações (Clorofórmio e Acetato de Etila), no modelo de dor induzida pelo ácido acético, que é um modelo inicial para realizar esse tipo de teste, devido à simplicidade, rapidez, reprodutibilidade e baixo custo (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). O modelo supracitado tem sido empregado amplamente para análise da atividade analgésica de diferentes tipos de compostos, pois mostra boa correlação com a ação analgésica encontrada em outros modelos pré-clínicos e também em estudos clínicos (CALIXTO et al., 2000; CAMPOS-BUZZI et al., 2006). Os resultados dos primeiros testes realizados estão expressos na Figura 28.

Figura 28. Percentual de inibição de contorções abdominais do EBM-jul, FCL- jul e FAE-jul das folhas de Eugenia involucrata, na dose de 10mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6) em comparação com o grupo controle.

Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.

De acordo com os resultados apresentados na figura acima, pode-se observar que tanto o extrato bruto quanto as frações inibiram significativamente as contorções, no entanto, a FCL-jul foi a mais eficaz, com um percentual de 64,4%. 61

Os resultados sugerem que as substâncias menos polares, como os terpenos evidenciados, são os principais compostos ativos do extrato. A título de comparação, fármacos usados na clínica, como a aspirina e o paracetamol, apresentam inibição de cerca de 35% nas mesmas condições (COSTA et al., 2007) Tendo em vista esse importante resultado, foi realizado um segundo teste, para calcular a DI50 (dose mínima capaz de inibir em 50% as contorções em relação ao grupo controle) dessa fração (FIGURA 29).

Figura 29. Percentual de inibição de contorções abdominais da FCL-jul das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1, 3 e 10 mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6).

Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.

Como mostra a figura 28, todas as três doses testadas da FCL-jul apresentaram redução significativa das contorções. A DI50 foi calculada e a dose de 2,33 mg/kg foi encontrada como a dose mínima para inibir 50% das contorções abdominais nos camundongos. A DI50 da aspirina e paracetamol nestas mesmas condições é de cerca de 25 mg/kg, sendo a FCL-jul cerca de 10 vezes mais potente (SERAFIN et al., 2007). O fitol foi uma das substâncias isoladas desta fração, sendo um diterpeno de cadeia aberta amplamente encontrado na natureza e já se conhece seu potencial analgésico (SANTOS, 2013). Esta substância pode ser uma das responsáveis pelo efeito antinociceptivo da FCL-jul. No entanto, levando em consideração o isolamento

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de uma substância inédita (7-9) a partir dessa mesma fração, foi decidido testá-la para verificar se ela também poderia contribuir para a atividade encontrada. Os resultados estão apresentados na Figura 30.

Figura 30. Percentual de inibição de contorções abdominais da substância 7-9, isolada das folhas de Eugenia involucrata, nas doses de 1 e 3mg/kg, via i.p. pelo modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos (n = 6).

Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.

Observando os resultados é possível perceber uma redução significativa do número de contorções nas doses testadas (50% na dose de 1 mg/kg e 58,2% na dose de 3 mg/kg), confirmando a suposição de que essa substância é um dos principais responsáveis pela atividade antinociceptiva apresentada pela FCL-jul.

Devido à quantidade limitada da substância não foi possível calcular a DI50 exata, mas estima-se estar próxima à de 1 mg/kg, com potência cerca de 25 vezes maior que os fármacos de referência. Resultados encontrados em trabalho semelhante à este, realizado com o extrato metanólico bruto das folhas da Eugenia fruticosa, no qual foi avaliando o potencial antinociceptivo em camundongos por meio do mesmo modelo, mas com administração via oral, mostram um percentual de inibição de 51,02% na dose de 200 mg/kg e 72,1% na dose de 400 mg/kg, comparados ao grupo controle. Ambos resultados foram significativos estatisticamente, numa relação dose-dependente e 63

muito próximos ao percentual de inibição do fármaco de referência (Diclofenaco de sódio, 65,31% de inibição) (SHAMS-UD-DOHA et al., 2012). Basting e colaboradores (2014) avaliaram o potencial antinociceptivo do extrato hidroalcóolico das folhas da Eugenia punicifolia em dois diferentes modelos de dor, com doses administradas via oral. No modelo de dor induzida por formalina foi observada inibição da nocicepção foi de 25% a 35%, além da redução da inflamação de 41 a 63% quando comparados ao grupo controle. O segundo modelo utilizado foi o da dor induzida por placa quente, direcionado a investigar o efeito central de drogas analgésicas e determinar o seu mecanismo de ação. Os resultados foram estatisticamente significantes para a dose de 250 mg/kg e os autores sugeriram, mediante a outros testes realizados, que a atividade antinociceptiva demostrada tem relação com a redução ou inibição da síntese de óxido nítrico e envolve o sistema glutamatérgico, não demostrando relação com o sistema opioide (BASTING et al., 2014) Embora apresentem diferentes constituintes, os óleos essenciais de algumas espécies do gênero Eugenia também apresentaram resultados significativos para a redução de nocicepção em camundongos, como é o caso do óleo essencial extraído das folhas da Eugenia candolleana, e da Eugenia uniflora (AMORIM et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2009). A Eugenia jambolana é uma planta já bastante estudada e caracterizada na literatura. Alguns estudos demostram atividade antiniciceptiva em diferentes modelos e com diferente partes dessa planta. As cascas das raízes, por exemplo, foram avaliados por Saha e colaboradores (2013) e foi encontrada uma significativa atividade antinociceptiva, principalmente na fração éter de petróleo, a qual diminuiu as contrações no modelo de ácido acético em 54,28% e em 73,77% no modelo de formalina (dose de 400 mg/kg). Das folhas desta mesma planta foi avaliado um substância isolada da fração acetato de etila, um flavonóide chamado dicamferol ramnosídio. No modelo do ácido acético essa substância inibiu as contrações nas doses de 10 e 30 mg/kg, não mostrando significância na dose de 3 mg/kg (LINGARAJU et al., 2014). Os terpenos constituem uma das maiores classes de metabólitos secundários encontrados nas plantas, sendo o seu potencial analgésico bastante conhecido e descrito na literatura. Eles atuam principalmente na inibição da agregação plaquetária e interferem no meio intracelular de diferentes estágios do mecanismo de

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tradução da dor (CALIXTO et al., 2000; GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS, 2013). Os sequiterpenos são em sua maioria encontrados nos óleos essenciais e são responsáveis pela atividade antinociceptiva encontrada em muitas espécies (PADUCHI et al., 2007). Em uma busca bibliográfica por patentes de medicamentos para a dor que continham em sua formulação terpenos (isolados ou não), Oliveira e colaboradores (2014) encontraram 39 patentes que se encaixavam à busca. Destas, 54% provinham de medicamentos compostos das classes de mono e sequiterpenos, 36% de triterpenos, 8% de diterpenos e 2% de canabinóides (terpenofenólicos). Muitos medicamentos comercializados nos dias atuais são compostos por terpenóides isolados, como o mentol, um monoterpeno encontrado no medicamento Salonpas®. Mais recentemente um exemplo de medicamento fitoterápico composto de sesquiterpenos foi incluído no mercado farmacêutico do tratamento da dor, o Acheflan® (OLIVEIRA et al., 2014). Dado o importante valor dos terpenóides no tratamento da dor, sua presença na fração clorofórmio pode explicar o potencial antinociceptivo encontrado neste trabalho.

5.2.3 Atividade Gastroprotetora A avaliação da atividade gastroprotetora foi realizada com um método de triagem que procura se aproximar ao máximo da etiologia da doença no homem: o uso abusivo de bebidas alcoólicas. Por isso foi selecionado o modelo de úlcera induzida por etanol. No presente estudo, o potencial gastroprotetor das folhas da E. involucrata foi inicialmente evidenciado pela redução significativa da área lesada do estômago dos camundongos induzidos a úlcera por etanol, um agente necrozante (LEMOS et al., 2011; ROSA, 2013). Apesar de não representar fielmente a patologia humana, esse modelo é muito utilizado na triagem de estudos de fármacos com atividade gastroprotetora, podendo inclusive evidenciar possíveis mecanismos de ação dos extratos, os quais podem estar associados a fatores antioxidantes e/ou fatores anti-inflamatórios, relacionados à manutenção ou aumento dos mecanismos de defesa da mucosa gástrica (LEMOS et al., 2011; ROSA, 2013). 65

O EMB-jul das folhas da E. involucrata apresentou capacidade de defesa da mucosa gástrica frente ao agente agressor etanol, reduzindo a área total lesada e a área relativa de lesão para os tratamentos com as doses de 125 e 250 mg/kg de maneira significativa quando comparados com o controle negativo, no entanto, a dose de 125 mg/kg demostrou melhor resultado quando comparada a maior dose testada, de 250 mg/kg. A dose de 50 mg/kg apresentou redução das lesões também, mas não de maneira significativa. Esse dado leva a crer na possibilidade de bons resultados para uma dose menor, entre 50 e 125 mg/kg, que pode ser testada futuramente. A cimetidina (controle positivo) também comprovou seu efeito gastroprotetor, validando o experimento (Tabela 3).

Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do EMB-jul da Eugenia involucrata (50, 125 e 250 mg/kg) em úlcera gástrica aguda induzida por etanol em camundongos (n = 6).

Tratamento Dose Área total de lesão Área relativa de lesão (mg/kg) (mm2) (%) Controle Veículo 42,86 ± 10.60 10,57 ± 3,61 50 23,76 ± 5,63 6,31 ± 1,96 EBM-jul da E. 125 4,61 ± 2,03** 1,21 ± 0,56* involucrata 250 6,67 ± 1,81** 2,13 ± 0,54* Cimetidina 100 1,98 ± 0,44** 0,75 ± 0,17** Diferença significativa em relação ao grupo controle (**p<0,01 e *p<0,05), ANOVA, expressos como média ± EPM, teste a posteriori de Dunnett.

Figura 31. Imagens dos estômagos após a indução de úlcera por etanol.

Legenda: A - controle negativo (sem tratamento); B - EMB-jul 50mg/kg; C – EMB-jul 125mg/kg; D – EMB-jul 250mg/kg; E - controle positivo (cimetidina 100 mg/kg);

Como é possível observar na figura 31, o modelo de lesão gástrica induzida por etanol danifica e necrosa a mucosa gástrica ocasionando extensas áreas hemorrágicas, principalmente no grupo controle negativo (A), comprovando a

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gastrotoxicidade desse agente, que promove alteração da homeostase celular desencadeando danos teciduais resultantes de sua ação na mucosa e aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) (BASTING et al., 2014). As plantas possuem alguns nutrientes que funcionam como agentes antioxidantes, ou seja, combatem ou diminuem a geração de ERO’s. Os seres humanos podem se beneficiar dessas substâncias por meio da alimentação, principalmente das vitaminas e minerais como o α-tocoferol (vitamina E), -caroteno, selênio e ácido ascórbico (vitamina C) (ROSA, 2013). Além desses nutrientes, o seu sistema de defesa das plantas produz metabólitos secundários, de acordo com sua necessidade. Muitos metabólitos secundários possuem atividade antioxidante e são testados em modelos de gastroproteção, dentre eles os flavonoides e terpenos, que foram os principais metabólitos encontrados nas folhas da E. involucrata (KLEIN-JÚNIOR et al., 2012). A atividade antioxidante é amplamente estudada no gênero Eugenia, e muitas espécies tem essa capacidade já foi comprovada em estudos, como é o caso da Eugenia dysenterica (PRADO et al., 2014), Eugenia bracteata (HEMALATHA; SATYANARAYANA; ALEKHYANJALI, 2008) e a Eugenia copacabanensis (CARVALHO JR. et al., 2014). Essa capacidade pode ser atribuída a grande quantidade de compostos fenólicos encontrados nesse gênero. Dentre os compostos fenólicos mais encontrados nas espécies de Eugenia, podemos citar as catequinas, substância que também foi isolada no presente estudo (MAGINA, 2008). A presença de terpenos nesse gênero também é comum, e levando em conta que esses compostos são potentes gastroprotetores, pesquisadores avaliaram a atividade antiúlcera e gastroprotetora do extrato metanólico bruto das folhas Eugenia umbelliflora e os resultados foram muito significativos. No modelo de úlcera induzida por etanol o percentual de inibição variou de 64,8-82,8% nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg administradas em camundongos por via oral. No modelo da indometacina foi avaliada apenas a dose de 250 mg/kg e o percentual de inibição foi de 76,9%. No modelo de úlcera induzida por stress o potencial antiúlcera na dose de 50mg/kg foi de 61,7, na dose de 125 mg/kg foi de 91,3% e na dose de 250 mg foi observada uma inibição de 94-6%. Os autores atribuíram a forte atividade gastroprotetora e antiúlcera à grande quantidade de triterpenos presentes no extrato (MEYRE-SILVA et al., 2009). 67

Em estudo recente, Basting e colaboradores (2014) avaliaram o potencial gastroprotetor do extrato hidroalcólico das folhas de Eugenia punicifolia em camundongos. As doses utilizadas foram de 125, 250 e 500 mg/kg em dois modelos distintos, o de úlcera induzida por etanol e também por indometacina. No primeiro modelo houve uma diminuição de 88,4 a 99,8% de lesões nos estômagos e no segundo modelo foi observada uma diminuição de 53 a 72,3% de lesões. Os autores analisaram também o mecanismo de ação do extrato e concluíram que o efeito gastroprotetor ocorreu devido ao aumento da produção de muco, sem produzir nenhum efeito antisecretor. No modelo de indução com etanol, o extrato hidroetanólico da folha de Eugenia jambolana, apresentou atividade gastroprotetora, sendo que a dose de 400 mg/kg apresentou em relação ao grupo controle resultados extremamente significativos, demonstrando mais eficácia que o fármaco empregado como referência (lansoprazol) (DONATINI et al., 2009). Os autores sugeriram que a presença de flavonoides e taninos, verificados na triagem fitoquímica da planta, pode ter sido responsáveis pela ação antiúlcera do extrato, já que os taninos possuem a propriedade de formar complexos com macromoléculas, como proteínas e polissacarídeos levado à formação de uma camada protetora na mucosa do estômago, possibilitando mais resistência a agressões químicas e/ou mecânicas (DONATINI et al., 2009). O trabalho de Prado e colaboradores (2014) encontrou ótimos resultados de gastroproteção para folhas de Eugenia dysenterica e os autores também relacionaram a atividade gastroprotetora à presença de taninos condensados no extrato aquoso testado. Além disso, também foi identificada a presença da catequina no mesmo extrato. Dessa maneira, levando em consideração a presença dos compostos químicos encontrados na espécie estudada no presente trabalho e as atividades biológicas documentadas, sugere-se que os compostos fenólicos (como a (-)- catequina) e os terpenos presentes podem ser responsáveis por parte da atividade gastroprotetora do EMB das folhas de E. involucrata na úlcera aguda induzida por etanol. Os mecanismos de ação pelo qual o extrato age precisam ser avaliados com metodologia específica, no entanto, de acordo com a literatura relatada, pertinente à

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plantas do mesmo gênero, sugere-se que o potencial gastroprotetor do extrato se dê pela atividade antioxidante e aumento da produção de muco. Os resultados encontrados no presente estudo corroboram com a utilização das folhas da E. involucrata em forma de chás para o tratamento de má-digestão, que acontece com frequência na medicina tradicional. Os solventes utilizados para a extração no presente estudo são distintos daquele utilizado na medicina tradicional, geralmente a água quente. Esta diferença pode modificar os resultados encontrados. Por esta razão, é preciso realizar testes adicionais, com outro tipo de extração, outras doses e em outros modelos experimentais para validar o uso popular.

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6 CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico das folhas da Eugenia involucrata possibilitou o isolamento de três substâncias da Fração Clorofórmio, duas delas inéditas, a substância 7-9 e a 3-6 (que foi confirmada como um acetilado da 7-9) e outra identificada como fitol. Outras três substâncias foram isoladas da Fração Acetato de Etila, uma delas já identificada como (-)-catequina e outras duas em fase de elucidação estrutural. Os extratos de verão e inverno comparados por CLAE se mostraram semelhantes, mas com diferenças importantes em alguns tempos de retenção específicos. Observou-se ainda, predominância da catequina no inverno, sendo ela a substância majoritária em ambos os extratos. A triagem dos extratos e frações realizada por diferentes testes biológicos evidenciou resultados promissores. No ensaio microbiológico foi possível observar uma moderada atividade antimicrobiana, principalmente no extrato bruto metanólico para algumas bactérias Gram-positivas e a levedura Candida albicans. Nos testes in vivo, evidenciou-se uma eficaz atividade antinociceptiva, observada com maior potência na Fração Clorofórmio e na substância 7-9, isolada desta mesma fração, com resultados superiores aos dos fármacos utilizados convencionalmente. Observou-se também uma redução de lesões gástricas induzidas por etanol no teste de atividade gastroprotetora. Os resultados encontrados fundamentam, em parte, o uso popular da planta para o tratamento de má-digestão e infecções, no entanto, a forma diferenciada de extração realizada no estudo em comparação com os chás utilizadoss na medicina tradicional precisam ser melhor avaliados para validar o uso popular desta planta.

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