AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA Turnera Subulata

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA

AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA Turnera subulata

ALUNA: THASSIANY REBECA PAIVA MOURA DA SILVA ORIENTADORA: PROFª. DRª. MARIA TERESA JANSEM DE A. CATANHO CO-ORIENTADORA: PROFª. DRª SIMEY DE SOUZA LEÃO PEREIRA MAGNATA

RECIFE, 2012

Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

THASSIANY REBECA PAIVA MOURA DA SILVA

AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA TURNERA SUBULATA

Dissertação apresentada para o cumprimento parcial das exigências para obtenção do Título de Mestre em Bioquímica e Fisiologia pela Universidade Federal de Pernambuco.

RECIFE, 2012

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Elaine Barroso CRB 1728

Silva, Thassiany Rebeca Paiva Moura da Avaliação de atividades biológicas da Turnera subulata / Thassiany Rebeca Paiva Moura da Silva. – Recife: O Autor, 2012.

51 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Maria Teresa Jansem de A. Catanho Coorientadora: Simey de Souza Leão Pereira Magnata Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas. Ciências Biológicas, 2012. Inclui bibliografia e anexos

1. Turneraceae 2. Matéria médica vegetal 3. Cicatrização de feridas I. Catanho, Maria Teresa Jansem de A. (orientadora) II. Magnata, Simey de Souza Leão Pereira (coorientadora) III. Título

583.626 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2012-208

Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M. ÍNDICE ANALÍTICO AGRADECIMENTOS ...... 04 LISTA DE FIGURAS...... 05 LISTA DE TABELAS...... 06 RESUMO...... 07 ABSTRACT...... 08 1.INTRODUÇÃO...... 09 1.1 TURNERACEAE...... 10 1.2 TURNERA SUBULATA ...... 11 1.3 CICATRIZAÇÃO ...... 13 1.4 FITOQUÍMICA ...... 14 1.5 TOXICIDADE AGUDA ...... 15 1.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA ...... 16 2.REFERÊNCIAS...... 18 3.OBJETIVOS...... 22 3.1GERAL 3.2 ESPECÍFICOS 4.ARTIGO...... 23 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA TURNERA SUBULATA RESUMO...... 24 ABSTRACT...... 25 4.1 INTRODUÇÃO...... 26 5. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 MATERIAL BOTÂNICO ...... 28 5.2 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DE T. SUBULATA ...... 28 5.3 ANÁLISE FITOQUÍMICA ...... 28 5.4 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ...... 28 5.5 TOXICIDADE AG UDA ...... 29 5.6 PRODUÇÃO DO GEL...... 29 5.7 INDUÇÃO DE FERIDA ABERTA EM CAMUNDONGOS ...... 29 5.8 TRATAMENTO DAS FERIDAS ABERTAS...... 30 5.9 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DA FERIDA ...... 30 5.10 FRAGILIDADE OSMÓTICA ...... 30 5.11 AVALIAÇÃO METABOLISMO BIOQUÍMICO ...... 31 5.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...... 32 6. RESULTADOS 6.1 FITOQUÍMICA ...... 32 6.2 TOXICIDADE AGUDA ...... 33 6.3 INDUÇÃO DE FERIDA A BERTA/ CICATRIZAÇÃO ...... 33 6.4 FRAGILIDADE OSMÓTICA ...... 34 6.5 AVALIAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DO METABOLI SMO BIOQUÍMICO ...... 35 7.CONCLUSÕES...... 41 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 42 9.ANEXOS 9.1 SISTEMAS D E ANÁLISES FITOQUÍMICAS ...... 49 9.2 ACOMPANHAMENTO MACROSCÓPICO DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO ...... 49 9.3 ATIVIDADES PARALELAS ...... 51

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AGRADECIMENTOS

À Deus , o único, fortaleza minha, o meu rochedo, o meu lugar forte, em quem confio, o meu escudo, a força da minha salvação e o meu alto refúgio, meu pastor e guia, por todo seu amor incondicional.

“Porque os meus pensamentos não são os vossos pensamentos, nem os vossos caminhos, os meus caminhos, diz o Senhor. Porque, assim como os céus são mais altos do que a terra, assim são os meus caminhos mais altos do que os vossos caminhos, e os meus pensamentos, mais altos do que os vossos pensamentos.” Isaías 55. 8,9

Aos meus Pais e Irmãos por todo amor, apoio, compreensão e renúncia. Vocês são muito especiais. “O filho sábio alegrará a seu pai, mas o homem insensato despreza a sua mãe.” Provérbios 15.20

Aos professores e Amigos por todo apoio, incentivo e paciência. “O Homem que tem muitos amigos pode congratular-se, mas há amigo mais chegado do que um irmão.” Provérbios 18. 24

E por fim a todos... “ O meu Deus, segundo as suas riquezas, suprirá todas as vossas necessidades em glória, por Cristo Jesus.” Filipenses 4.19

“Feliz o homem cuja força está em ti, em cujo coração estão os caminhos aplanados.” Salmos 84 .5

Cada dia aqui e eternamente... Muito Grata por tudo!

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Foto de Arbustos de Turnera subulata : evidenciando as folhas e a flor...... 12

Figura 2: Distribuição geográfica no Brasil da espécie Turnera subulata ...... 12

Figura 3: Gráfico da Fragilidade osmótica de amostras de sangue tratados e não tratados com extrato de T. subulata ...... 35

Figura 4 : Gráfico da cinética da glicose nos tempos de 0,2, 4, 8, 12 e 24horas...... 36

Figura 5: Gráfico das concentrações séricas de colesterol em camundongos tratados com diferentes doses de extrato aquoso de T. subulata ...... 37

Figura 6: Gráfico das concentrações séricas de triglicerídeos em camundongos tratados com diferentes doses de extrato aquoso de T. subulata ...... 38

Figura 7: Gráfico as concentrações séricas de cálcio em camundongos tratados com diferentes doses de extrato aquoso de T. subulata ...... 39

Figura 8: Gráfico as concentrações séricas de proteínas totais em camundongos tratados com diferentes doses de extrato aquoso de T. subulata ...... 40

Figura 9: Epilação do dorso e excisão de fragmento cutâneo com pinça e tesoura cirúrgica até exposição da fáscia muscular dorsal...... 49

Figura 10: Início de tratamento das feridas abertas dos grupos estudados. Salina , Fibrase e Gel de T. subulata...... 50

Figura 11: Acompanhamento da cicatrização. Fotos tiradas no 4º e 14º dia após indução da ferida...... 50

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resultado da análise fitoquímica do extrato aquoso de T. subulata ...... 33

Tabela 2: Cinética da Glicose. Valores das médias das concentrações séricas de glicose (mg/dL) nos tempos de 0, 2,4, 8, 12 e 24 horas...... 36

Tabela 3: Valores da média e desvio padrão para as concentrações séricas de Colesterol, Triglicerídeos, Cálcio e Proteínas Totais...... 39

Tabela 4: Sistemas das análises fitoquímicas...... 49

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RESUMO Apesar das investigações e estudos científicos sobre plantas com o uso medicinal, não se conhece muito sobre os princípios ativos e as extraordinárias qualidades curativas de muitas espécies vegetais. As espécies de Turnera, da família Turneraceae, são conhecidas no Nordeste brasileiro pelo nome popular de “chanana”, são empregadas na medicina popular no tratamento de amenorréias, dismenorréias e como abortivo. Outras espécies, como Turnera diffusa Willd. e Turnera ulmifolia L., são utilizadas principalmente como afrodisíaco, abortivo, expectorante, no tratamento de úlceras gástricas e do diabetes. Turnera subulata é utilizada contra amenorréia na forma de chá. Materiais e Métodos: O extrato aquoso de T. subulata foi submetido à análise fitoquímica para pesquisa de saponinas, polifenóis, alcalóides e terpenos. Para o preparo do extrato aquoso foram utilizadas 20g folhas de T. subulata , que foram secas e trituradas para obtenção do extrato pelo método de infusão e após liofilizado. Para o teste de toxicidade foram utilizados camundongos Mus musculus pesando em média 30g, o extrato aquoso liofilizado (EAL) de T. subulata foi dissolvido em água destilada e administrado por via oral (Gavagem), a um grupo de 15 animais. As doses administradas foram de 100mg/Kg, 250mg/kg e 500mg/kg de peso, respectivamente. Para o teste de fragilidade osmótica foi utilizado o sangue de ratos Wistar fêmeas, pesando entre 200 e 250g. O sangue heparinizado (500 L) foi incubado por 1 hora na presença de 500 L do extrato bruto, em diferentes concentrações (0%; 50 e 100% volume/volume). Alíquotas de 50 L foram submetidas a um gradiente de NaCl (0%; 0,1%; 0,25%; 0,4%; 0,7% e 0,9%). O percentual de fragilidade osmótica foi determinado por densidade óptica (DO/ 545nm) das amostras. Outro método realizado foi a preparação do gel foram utilizados 2,25 g de Carbopol, 1,25ml de Trietanolamina, 100ml de água destilada e 3g de extrato liofilizado de Turnera subulata para avaliar o potencial cicatrizante em camundongos . A avaliação do metabolismo bioquímico foi realizado com o EAL de T. subulata e administrado por via oral (Gavagem),em ratos Wistar , nas dosagens de 50; 100 e 250 mg/Kg e como controle negativo solução salina, e após 24 horas , os animais foram eutanasiados e o sangue foi coletado para obtenção do soro. As determinações bioquímicas foram glicose, colesterol, triglicerídeos, cálcio e proteínas totais Resultados: A análise fitoquímica do extrato aquoso evidenciou a presença de O-glicosídeos (quercetina e kampferol) e C- glicosídeos(orientina/iso-orientina e vitexina/isovitexina). Na determinação da toxicidade no período de 48 horas, não foi observada letalidade. A avaliação da fragilidade osmótica dos eritrócitos estudados submetidos às diferentes concentrações de extrato aquosa de T.subulata mostrou alteração de 40% nas concentrações de 0% e 0,1% de NaCl quando comparado ao % controle demonstrando que o extrato aquoso de T. subulata diminuiu a fragilidade osmótica. Na determinação bioquímica observa-se um aumento na concentração de colesterol na dose de 250mg/kg de 80,43± 8,3 quando comparado com o controle, enquanto que não foi obervado diferença significativa nas determinações de proteínas totais, cálcio e triglicerídeos. No entanto, observa-se ligeiro aumento na dose de 50mg/kg na determinação da glicose. Conclusões: O EAL de T. subulata não houve toxicidade aguda ( DL 50 ), reduziu a fragilidade osmótica. . A produção de gel de T. subulata promoveu a reparação cutânea de feridas cirúrgicas em camundongos. Quanto ao metabolismo, o EAL alterou nos níveis de colesterol e glicose circulante, provavelmente o extrato altera a enzima responsável pela produção de colesterol (3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) no fígado. O EAL demonstra apresentar vários efeitos biológicos alterando os alguns mecanismos metabólicos pela presença dos flavonóides e outros derivados.

Palavras Chave: Turnera subulata, fitoterápicos, cicatrização, toxicidade. Apoio: FACEPE

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ABSTRACT Despite the research and scientific studies on plants with medicinal uses, not much is known about the active ingredients and the extraordinary healing qualities of many plant species. The species of Turnera , Turneraceae family, are known in the Brazilian Northeast by the popular name of "Chanana,”, are used in folk medicine to treat amenorréias, dismenorréias and as an abortifacient. Other species, such as Turnera diffusa Willd. and Turnera ulmifolia L ., are used primarily as an aphrodisiac, an abortifacient, expectorant, to treat gastric ulcers and diabetes. Turnera subulata is used for amenorrhea in the form of tea. Materials and Methods : The aqueous extract of T. subulata was subjected to phytochemical analysis to search for saponins, polyphenols, alkaloids and terpenes. For the preparation of the aqueous extract were used 20g leaves of T. subulata , which were dried and crushed to obtain the extract by the infusion method and after freeze-dried. For the toxicity test were used Mus musculus mice weighing in average 30 g, the aqueous extract lyophilized (WAR) of T. subulata was dissolved in distilled water and administered orally (gavage) a group of 15 animals. The doses administered were 100mg/kg, 250mg/kg and 500mg/kg body weight, respectively. For osmotic fragility test used was the blood of adult Wistar rats of both sexes weighing 200 to 250g. Heparinized blood (500 L) was incubated for 1 hour in the presence of 500 L of the crude extract at different concentrations (0%, 50 to 100% volume / volume). 50 L aliquots were subjected to a NaCl gradient (0%, 0.1%, 0.25%, 0.4%, 0.7% and 0.9%). The percentage of osmotic fragility was determined by optical density (OD / 545nm) of the samples. Another method was performed to prepare the gel were used 2.25 g of Carbopol, Triethanolamine 1.25 ml, 100 ml of distilled water and 3 g of dry extract of Turnera subulata lyophilized to assess potential healing in mice. The biochemical assessment of metabolism was performed with the EAL T. subulata and administered orally (gavage) in Wistar rats at doses of 50, 100 and 250 mg / kg and saline as negative control, and after 24 hours the animals were sacrificed and blood was collected to obtain serum. Biochemical measurements were glucose, cholesterol, triglycerides, calcium and protein. Results : The phytochemical analysis of the aqueous extract showed the presence of O-glycosides (quercetin and kampferol) and C-glycosides (Orientina / Orientina and iso-vitexin / isovitexin). In determining the toxicity within 48 hours, no lethality was observed. The evaluation of erythrocyte osmotic fragility study submitted to different concentrations of crude extract showed T.subulata change in concentration of 40% 0% NaCl% when compared to control showing that the crude extract of T. subulata decreased osmotic fragility. In determining biochemical there is an increase in the concentration of cholesterol in a dose of 250mg/kg of 80.43 ± 8.3 compared to control, whereas no significant difference in observed determinations of total protein, calcium, and triglycerides. However, there is a slight increase at a dose of 50mg/kg in the determination of glucose. Conclusions : The EAL T. subulata no acute toxicity (LD50), decreased osmotic fragility. . Production of gel T. subulata promoted the repair of cutaneous surgical wounds in mice. As to metabolism, EAL altered levels of circulating glucose and cholesterol, probably alter the extract, the enzyme responsible for the production of cholesterol (3- hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase) in the liver. The EAL shows have various biological effects by changing some metabolic mechanisms by the presence of flavonoids and other derivatives. Key words: Turnera subulata , herbal phytotherapy, cicatrization, toxicity.

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1. INTRODUÇÃO O uso dos produtos naturais aumentou muito no mundo nas últimas décadas, isso porque, vem ganhando grande credibilidade em decorrência das importantes pesquisas farmacêuticas (STEEP, 2004; SOUZA et al., 2005). Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos remotos. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas, talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. (VIEGAS, et al, 2006). A pesquisa em produtos naturais é uma das áreas mais tradicionais da pesquisa cientifica no Brasil, devido a fatores históricos amplamente discutidos e à grande biodiversidade do país. A formação cientifica dos pesquisadores e a infraestrutura dos laboratórios são bastante adequadas para o desenvolvimento de pesquisa de qualidade na área (PUPO; GALLO, 2007). Nos últimos anos tem-se verificado um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas. (CECHINEL FILHO, YUNES, 1998). Apesar das investigações e estudos científicos sobre plantas com o uso medicinal, não se conhece muito sobre os princípios ativos e as qualidades curativas de muitas espécies vegetais. Dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial de cura, número que cai para 10% no Brasil, quando deveria ser mais alto, já que o país representa a maior diversidade genética vegetal do mundo (SIMÕES et al., 1999; MIGUEL, MIGUEL 2000). No Brasil existem 55 mil espécies vegetais (22% do total registrado no planeta). A humanidade, ao longo do tempo selecionou apenas cerca de 300 plantas para a alimentação e, de um pouco mais de uma centena, obteve princípios ativos puros para o tratamento de doenças. Estes números são bem modestos quando se está diante de um universo de aproximadamente 250.000 espécies de plantas superiores. (PINTO, et al. 2002) . Durante muito tempo, o uso dos remédios naturais e as plantas medicinais baseadas no conhecimento popular foram os principais e únicos recursos disponíveis aos médicos. Isto produziu um grande conhecimento, ainda que empírico, sobre as espécies vegetais que possuem propriedades medicinais e ampliou experiências no uso de produtos extraídos destas espécies. A validação cientifica das propriedades características das plantas, tornam-

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se necessários para evitar o surgimento dos chamados “produtos milagrosos” e combater o charlatanismo que cerca tais produtos. Após a comprovação da eficácia ou mesmo a descoberta de novas atividades medicinais das plantas já usadas popularmente, pode-se informar à comunidade a maneira correta de utilização de tais plantas (GRACIOSO et al., 2002). A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de alguns de seus constituintes, tais como flavonóides, alcalóides, triterpenos, sesquiterpenos, taninos, ligninas, e outros, tem sido objeto de incessantes estudos, nas quais são estudadas as ações farmacológicas através de testes pré-clínicos com animais. Muitas destas substâncias têm grandes possibilidades de futuramente virem a ser aproveitadas como agentes medicinais. (CECHINEL FILHO, YUNES, 1998).

1.1 TURNERACEAE No Brasil, a família Turneraceae é composta de 2 gêneros (Piriqueta e Turnera ), 155 espécies, 12 subespécies e 37 variedades (CATÁLOGO JARDIM BOTÂNICO, 2010). A família Turneraceae é encontrada em diversas partes do mundo, com aplicação na medicina popular. As plantas que compõem a família Turneraceae são típicas de florestas úmidas, campos e jardins tropicais, por isso, são consideradas como erva daninha. (ARBO, 2007). No Brasil, apresenta como domínios fitogeográficos Amazônia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Pampa, Pantanal . Está presente nas regiões: Norte (Roraima, Amapá, Pará, Amazonas, Tocantins, Acre, Rondônia), Nordeste (Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso do Sul), Sudeste (Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Rio de Janeiro), Sul (Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul) (ARBO, 2010). O gênero Turnera vem sendo estudado sob vários aspectos e atividades, como exemplo antioxidante, antiinflamatória, antiulcerogênica. Coutinho, et al. (2009), estudaram o potencial antibiótico da Turnera ulmifolia l. frente a staphylococcus aureus.; Santos, et al. (2010), avaliaram a atividade moluscicida e toxicidade frente artemia salina pelo extrato bruto de Turnera ulifolia l . Sethi e Ramasamy (2012) avaliaram o potencial antibacteriano do extarto etanólico das folhas de T. ulmifolia frente a bactérias gram

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negativas, bem como outros estudos com as espécies de Turnera tem obtido resultados positivos quanto suas aplicações. Kumar et al. (2005), através de um levantamento exaustivo na literatura sobre o gênero Turnera , verificaram que algumas espécies de Turnera tem sido utilizadas pela população para tratamento de várias doenças. A T. aphrodisiaca ward, tem sido utilizada como estimulante afrodisíaco, no combate à disfunções sexuais, diurético, tratamentos de sintomas da menopausa e menstruação, dores de cabeça, doenças gastrointestinais; a infusão de folhas frescas de T. guaianensis é indicada para o tratamento de doenças inflamatórias; a T. ulmifolia linn , tem sido utilizada para doenças do trato respiratório e no combate à ulceras gástricas e sua ação antiinflamatoria e antioxidante tem sido bastante estudada. A T. subulata sm . Tem sido usada para tratar furúnculos. Dentre as espécies de Turnera apenas de 27 (vinte e sete) espécies se tem informações esporádicas, apenas 10 (dez) espécies foram investigadas quanto aos seus fitoconstituintes e estudos farmacológicos foram realizados apenas de 02 (duas) espécies, a T. aphrodisiaca e T. ulmifolia. (KUMAR, TANEJA E SHARMA, 2005).

1.2 TURNERA SUBULATA • Classificação taxonômica da Turnera subulata :

REINO Plantae DIVISÃO Magnoliophyta CLASSE Magnoliopsida ORDEM Malpighiales FAMÍLIA Turneraceae GÊNERO Turnera ESPÉCIE Turnera subulata

No Brasil, a Turnera subulata , é conhecida como chanana, ela é de fácil cultivo e bastante adaptável aos diversos climas, podendo resistir até uma temperatura de 85ºC em algumas ocasiões (ARBO, 2007). A Turnera subulata, é um arbusto denso perene, 30- 80 cm de altura, com folhas lanceoladas ou estreita-elíptica. Suas flores são formadas por pétalas que variam do amarelo a brancas-amareladas de cor marrom na base. Suas flores se abrem logo pela

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manhã, depois de receber a luz direta do sol, e se fecham após o meio-dia (SHORT & COWIE, 2011) (Figura 1).

Figura 1 : Foto de Arbustos de Turnera subulata : evidenciando as folhas e a flor. Fonte: http://plantes-rizieres guyane.cirad.fr/dicotyledones/turneraceae/turnera_subulata

Segundo Arbo (2010) a Turnera subulata apresenta como domínios fitogeográficos a Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica e a sua distribuição geográfica no Brasil está nas regiões: Norte (Amapá, Pará, Amazonas, Rondônia), Nordeste (Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso do Sul) e Sudeste (Espírito Santo, São Paulo, Rio de Janeiro) (Figura 2).

Figura 2. Ampla distribuição geográfica no Brasi l da espécie Turnera subulata . As cores variadas mostram a distribuição de espécies de Turnera em vários estados do Brasil.Disponível em: (http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2010/FB021354 ).

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Testes fitoquímicos mostraram que a chanana possui uma variedade de flavonóides glicosilados. Popularmente vem sendo usada em alguns países contra amenorréia, cólicas menstruais e como antipiréticas. A chanana pode ser ainda usada no combate a úlceras gástricas e duodenais, segundo a medicina popular. (GRACIOSO et al., 2002). Brito Filho (2011) em um estudo pioneiro com a espécie Turnera subulata , isolou e identificou seis constituintes: Feofitina Purpurina 18 fitil éster (Ts-5); Feofitina (a) (Ts-1); 132-hidroxi- (132-S)-feofitina (a) (Ts-2); Feofitina (b) (Ts-4) e uma mistura dos esteróides glicosilados sitosterol-3-O-D-glicopiranosídeo e estigmasterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo (Ts-3), através dos métodos cromatográficos usuais, e posterior caracterização estrutural dos mesmos, utilizando os métodos espectroscópicos de IV(infravermelho) e RMN 1H e 13C (ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono 13) uni e bidimensionais.

1.3 CICATRIZAÇÃO A cicatrização de feridas consiste em uma perfeita e coordenada cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a reepitelização e a reconstituição do tecido. Tal evento é um processo dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos que se comportam de forma harmoniosa a fim de garantir a restauração tissular (CONTRAN et al., 2000). Cicatrização é o processo pelo qual um tecido lesado é substituído por tecido conjuntivo vascularizado, sendo semelhante quer a lesão tenha sido traumática, quer ocasionada por necrose. O primeiro passo é a instalação de uma reação inflamatória, cujo exsudato de células fagocitárias reabsorve o sangue extravasado e os produtos da destruição tecidual, em seguida há formação do tecido conjuntivo cicatricial, proliferação fibroblástica e endotelial. Macroscopicamente este tecido tem coloração rósea e aspecto granuloso. Posteriormente, este tecido sofre remodelação, que resulta em redução de volume da cicatriz, podendo chegar até o seu desaparecimento. (BOGLIOLO; BRASIEIRO FILHO, 2009). Os processos de cicatrização tecidual, de um modo geral, podem ser subdivididos em quatro fases: fase de coagulação, inflamatória, fase de proliferação e reparadora (ROBINS et al., 2005). A cicatrização pode ser primária, primeira intenção, ou secundária, por segunda intenção. A cicatrização por primeira intenção é mais rápida e forma cicatrizes menores,

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visto que a fenda da ferida é mais estreita e a destruição tecidual nas suas bordas é menor. Já a por segunda intenção, a ferida é extensa e tem margens afastadas, forma-se um grande coagulo; se há infecção associada, surge reação inflamatória exuberante, e forma-se abundante tecido de granulação, assim a regeneração é mais lenta e demora mais tempo para se completar (BOGLIOLO; BRASIEIRO FILHO, 2009). Trabalhos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de estudar o processo de cicatrização, em feridas cutâneas abertas em animais, sob influência do tratamento tópico com extratos de plantas. Vários extratos de plantas tem se mostrado promissores no processo de cicatrização de feridas (NITZ et al. 2006; FALEIRO et al. 2009; BARACHO, et al. 2009 ).

1.4 FITOQUÍMICA

Desde os tempos mais remotos, as plantas são usadas pelo homem como alimento e no tratamento de doenças, assim, a humanidade foi descobrindo as propriedades tóxicas ou curativas das plantas. Esse conhecimento etnofarmacológico culminou com o desenvolvimento de fármacos de grande importância na terapêutica atual, tais como o ácido salicílico, a atropina, a pilocarpina, o quinino, a artemisinina, o taxol, a digoxina e a morfina (ALVES, 2001). Nos anos 80, o desenvolvimento da pesquisa científica resultou na identificação de 121 compostos de origem vegetal, provenientes de 95 espécies de plantas. Na década de 90, 6% dos medicamentos aprovados foram extraídos diretamente de espécies vegetais; outros 24% foram de produtos derivados e 9% foram desenvolvidos através de modelagem molecular. Atualmente, metade dos 25 medicamentos mais vendidos no mundo tem sua origem em metabólitos secundários de origem vegetal (ALVES, 2001). Através de vias metabólicas secundárias os vegetais produzem compostos como os alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO , YUNES, 1998). Os produtos fitoterápicos são preparações (extratos, tinturas, pomadas e cápsulas) de ervas medicinais, obtidas a partir de uma ou mais plantas, que podem ser utilizadas para o tratamento de várias doenças. Dentre as inúmeras vantagens dos fitoterápicos estão seu

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largo uso terapêutico, seu baixo custo e a grande disponibilidade para a população de baixa renda (CALIXTO, 2000). Através de testes pré-clínicos com animais se tem comprovado as ações farmacológicas e o potencial terapêutico de plantas utilizadas na medicina popular, bem como, a ação de seus fitoconstituintes também tem sido objeto de estudos (RODRIGUES, et al. 2010). O principal fator a contribuir consideravelmente para o crescimento em questão consista na evolução dos estudos científicos, particularmente os estudos químicos e farmacológicos, que comprovam, cada vez mais, a eficácia das plantas medicinais, principalmente aquelas empregadas na medicina popular com finalidades terapêuticas. (CECHINEL FILHO , YUNES, 1998).

1.5 TOXICIDADE AGUDA

Atualmente, apesar da crescente importância do uso de produtos naturais, relativamente poucos estudos foram realizados a fim de comprovar sua eficácia e segurança, sendo que muitas plantas ainda são utilizadas com base somente no uso popular estabelecido. Sabe-se que muitas plantas medicinais apresentam compostos orgânicos, produtos do metabolismo primário e secundário, que podem exercer efeitos benéficos ou maléficos sobre o organismo e desencadear reações adversas (TUROLLA & NASCIMENTO, 2006). O uso milenar de plantas medicinais mostrou, ao longo dos anos, que determinadas plantas apresentam substâncias potencialmente perigosas. Do ponto de vista científico, pesquisas mostraram que muitas delas possuem substâncias potencialmente agressivas e, por esta razão, devem ser utilizadas com cuidado, respeitando seus riscos toxicológicos. A toxicidade de plantas medicinais é um problema sério de saúde pública. Os efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a ação sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. As pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes (VEIGA JR; PINTO, 2005).

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O estudo da toxicidade de produtos naturais devem seguir determinações específicas. O protocolo experimental de cada estudo deverá ser elaborado de forma a permitir a demonstração da ausência ou da eventual toxicidade do produto fitoterápico. Os animais a serem usados devem ser jovens, com saúde e idênticos com relação a peso e idade; condições de ambiente e alimentação devem permanecer constantes, durante a realização dos experimentos. No caso de toxicidade aguda os parâmetros a serem observados são: sinais tóxicos de caráter geral, efeitos sobre a locomoção, comportamento, respiração, número de mortes, a forma de sua ocorrência, exames bioquímicos, hematológicos e histopatológicos (ANVISA, 1996).

Em se tratando de plantas, uma avaliação da toxicologia pré-clínica deve fornecer um grau de confiabilidade para o uso de um determinado extrato, através da execução dos testes com animais de laboratório, utilizando protocolos estabelecidos internacionalmente para este tipo de avaliação. A avaliação pré-clínica deve contemplar estudos histopatológicos associando as lesões em órgãos afetados com alterações bioquímica, plasmática, urinária e hematológica (COBEA,1991).

1.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA

Um importante fator na vida da maioria das células é a osmose, que é definido pelo movimento da água através de uma membrana semipermeável impelido por diferenças na pressão osmótica. As células em solução isotônica, mesma osmolaridade, nem ganha e nem perde água. Em uma solução hipertônica, que apresenta uma osmolaridade maior que a do citosol, a células murcham à medida que a água flui para a solução. Já em uma solução hipotônica, a célula entumece, o movimento de água para dentro distende a membrana plasmática e causa o rompimento da célula (lise osmótica) (Nelson; Cox, 2002).

A resistência da membrana do eritrócito à hemólise caracteriza o que chamamos de fragilidade osmótica da membrana celular. A curva de fragilidade reflete a mudanças

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estruturais na membrana do eritrócito e a hemólise é o resultado dessa perturbação estrutural (DIDELON, 2000).

A ação de drogas sintéticas ou naturais podem causar perturbações na membrana dos eritrócitos, causando alterações estruturais e/ou na sua permeabilidade. Através do estudo da fragilidade osmótica, pode-se avaliar o comportamento da membrana eritrocitária em diferentes soluções hipotônicas (PEREIRA, et al. 2007).

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2. REFERÊNCIAS

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22 Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

3.OBJETIVOS

3.1 GERAL

• Avaliar as propriedades biológicas presentes no extrato aquoso da Turnera subulata.

3.2 ESPECÍFICOS

• Realizar o perfil fitoquímico do extrato aquoso de Turnera subulata;

• Determinar a toxicidade aguda ( DL 50 ) da Turnera subulata; • Avaliar a atividade cicatrizante de um gel de Turnera subulata em ferida aberta em camundongos; • Avaliar a fragilidade osmótica na presença de extrato aquoso de Turnera subulata; • Investigar as possíveis alterações do metabolismo bioquímico em camundongos, na presença de extratos brutos aquosos de Turnera subulata .

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ARTIGO

AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA TURNERA SUBULATA

A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO: REVISTA BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA /BRAZILIAN JOURNAL OF PHARMACOGNOSY

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RESUMO Apesar das investigações e estudos científicos sobre plantas com o uso medicinal, não se conhece muito sobre os princípios ativos e as qualidades curativas de muitas espécies vegetais. As espécies de Turnera, da família Turneraceae, são conhecidas no Nordeste brasileiro pelo nome popular de “chanana”, são empregadas na medicina popular no tratamento de amenorréias, dismenorréias e como abortivo. Outras espécies, como Turnera diffusa Willd. e Turnera ulmifolia L., são utilizadas principalmente como afrodisíaco, abortivo, expectorante, no tratamento de úlceras gástricas e do diabetes. Turnera subulata é utilizada contra amenorréia na forma de chá. Materiais e Métodos: O extrato aquoso de T. subulata foi submetido à análise fitoquímica para pesquisa de saponinas, polifenóis, alcalóides e terpenos. Para o preparo do extrato aquoso foram utilizadas 20g folhas de T. subulata pelo método de infusão e após liofilizado. O extrato aquoso liofilizado (EAL) de T. subulata foi administrado por via oral (Gavagem), foram utilizados camundongos albinos swiss. As doses administradas foram de 100mg/Kg, 250mg/kg e 500mg/kg de peso, para o teste de toxicidade. Para o teste de fragilidade osmótica foi utilizado o sangue de ratos Wistar . O sangue foi incubado na presença do extrato bruto, em diferentes concentrações (volume/volume). Alíquotas foram submetidas a um gradiente de NaCl e o percentual de fragilidade osmótica das amostras foi determinado por absorbância (545nm). Outro método realizado foi a preparação do gel a partir do extrato liofilizado de Turnera subulata para avaliar seu potencial cicatrizante em camundongos . A avaliação do metabolismo bioquímico foi realizado com o EAL de T. subulata nas dosagens de 50; 100 e 250 mg/Kg. As determinações bioquímicas foram glicose, colesterol, triglicerídeos, cálcio e proteínas totais. Resultados: A análise fitoquímica do extrato aquoso evidenciou a presença de O- glicosídeos (quercetina e kampferol) e C-glicosídeos(orientina/iso-orientina e vitexina/isovitexina). Na determinação da toxicidade no período de 48 horas, não foi observada letalidade. A avaliação da fragilidade osmótica dos eritrócitos estudados submetidos às diferentes concentrações de extrato aquosa de T. subulata mostrou alteração de 40% nas concentrações de 0% e 0,1% de NaCl quando comparado ao % controle demonstrando que o extrato aquoso de T. subulata diminuiu a fragilidade osmótica. Na determinação bioquímica observa-se um aumento na concentração de colesterol na dose de 250mg/kg de 80,43± 8,3 quando comparado com o controle, enquanto que não foi obervado diferença significativa nas determinações de proteínas totais, cálcio e triglicerídeos. No entanto, observa-se ligeiro aumento na dose de 50mg/kg na determinação da glicose. Conclusões: O EAL de T. subulata não houve toxicidade aguda ( DL 50 ), reduziu a fragilidade osmótica. . A produção de gel de T. subulata promoveu a reparação cutânea de feridas cirúrgicas em camundongos. Quanto ao metabolismo, o EAL alterou nos níveis de colesterol e glicose circulante, provavelmente o extrato altera a enzima responsável pela produção de colesterol (3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) no fígado. O EAL demonstra apresentar vários efeitos biológicos alterando os alguns mecanismos metabólicos pela presença dos flavonóides e outros derivados.

Palavras chave : Turnera subulata, fitoterápicos, cicatrização, toxicidade.

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ABSTRACT

Despite the research and scientific studies on plants with medicinal uses, not much is known about the active ingredients and the healing qualities of many plant species. The species of Turnera , Turneraceae family, are known in the Brazilian Northeast by the popular name of "Chanana," are used in folk medicine to treat amenorréias, dismenorréias and as an abortifacient. Other species, such as Turnera diffusa Willd . and Turnera ulmifolia L., are used primarily as an aphrodisiac, an abortifacient, expectorant, to treat gastric ulcers and diabetes. Turnera subulata is used for amenorrhea in the form of tea. Materials and Methods : The aqueous extract of T. subulata was subjected to phytochemical analysis to search for saponins, polyphenols, alkaloids and terpenes. For the preparation of the aqueous extract were used 20g leaves of T. subulata by the infusion method and after freeze-dried. The extract (EAL) T. subulata was administered orally (gavage) albino swiss mice were used. The doses administered were 100mg/kg, 250mg/kg body weight and 500mg/kg, for toxicity testing. For osmotic fragility test used was the blood of rats. The blood was incubated in the presence of the crude extract at different concentrations (volume / volume). Aliquots were subjected to an NaCl gradient and the percentage of the osmotic fragility of the samples was determined by absorbance (545nm). Another method was performed to prepare the gel from freeze-dried extract of Turnera subulata , to evaluate their potential healing in mice. The biochemical assessment of metabolism was performed with the EAL T. subulata at doses of 50, 100 and 250 mg / kg. Biochemical measurements were glucose, cholesterol, triglycerides, calcium and protein. Results: The phytochemical analysis of aqueous extract showed the presence of O-glycosides (quercetin and kampferol) and C- glycosides (Orientina / Orientina and iso-vitexin / isovitexin). In determining the toxicity within 48 hours, no lethality was observed. The evaluation of the erythrocyte osmotic fragility was evaluated subjected to different concentrations of an aqueous extract of T. subulata showed a change of 40% at concentrations of 0% and 0.1% NaCl% when compared to control showing that the aqueous extract of T. subulata decreased osmotic fragility. In determining biochemical there is an increase in the concentration of cholesterol in a dose of 250mg/kg of 80.43 ± 8.3 compared to control, whereas no significant difference was observable by the determination of total protein, calcium, and triglycerides. However, there is a slight increase at a dose of 50mg/kg in the determination of glucose. Conclusions: The EAL T. subulata no acute toxicity (LD50), decreased osmotic fragility. . Production of gel T. subulata promoted the repair of cutaneous surgical wounds in mice. As to metabolism, EAL altered levels of circulating glucose and cholesterol, probably alter the extract, the enzyme responsible for the production of cholesterol (3-hydroxy-3- methylglutaryl-CoA reductase) in the liver. The EAL shows have various biological effects by changing some metabolic mechanisms by the presence of flavonoids and other derivatives.

Key words: Turnera subulata , herbal phytotherapy, cicatrization, toxicity.

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4.1 INTRODUÇÃO Algumas plantas medicinais utilizadas de uma maneira empírica ao longo dos milênios passaram a receber, atualmente, uma atenção científica (NITZ, et al. 2006). Durante muito tempo, o uso dos remédios naturais e as plantas medicinais baseadas no conhecimento popular foram os principais e únicos recursos disponíveis aos médicos. Isto produziu um grande conhecimento, ainda que empírico, sobre as espécies vegetais que possuem propriedades medicinais e ampliou experiências no uso de produtos extraídos destas espécies. (GRACIOSO et al., 2002). Apesar das investigações e estudos científicos sobre plantas com o uso medicinal, não se conhece muito sobre os princípios ativos e as extraordinárias qualidades curativas de muitas espécies vegetais. (SIMÕES et al., 1999; MIGUEL & MIGUEL, 2000). Aproximadamente 80% da população brasileira não têm acesso aos medicamentos essenciais. Como as plantas medicinais apresentam maior facilidade quanto ao acesso, custo e manipulação, passou a atuar como escolha para o acesso à saúde (NOLLA & SEVERO, 2005). Os produtos fitoterápicos são preparações (extratos, pomadas e cápsulas) de ervas medicinais, obtidas a partir de uma ou mais plantas, que podem ser utilizadas para o tratamento de várias doenças (CALIXTO, 2000). Após a comprovação da eficácia ou mesmo a descoberta de novas atividades medicinais das plantas já usadas popularmente, pode-se informar à comunidade a maneira correta de utilização de tais plantas (GRACIOSO et al., 2002). A família Turneracea é encontrada em diversas partes do mundo, com aplicação na medicina popular. No Brasil, a Turnera subulata , é conhecida como chanana, ela é de fácil cultivo e bastante adaptável aos diversos climas. As plantas que compõem a família Turneraceae são típicas de florestas úmidas, campos e jardins tropicais, por isso, são consideradas como erva daninha (ARBO, 2007). A Turnera subulata, é um arbusto denso perene, 30-80 cm de altura, com folhas lanceoladas ou estreita-elíptica. Suas flores são formadas por pétalas que variam do amarelo a brancas-amareladas de cor marrom na base. Suas flores se abrem logo pela manhã, depois de receber a luz direta do sol, e se fecham após o meio-dia (SHORT & COWIE, 2011).

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Trabalhos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de estudar o potencial curativos das plantas utilizadas através do conhecimento empírico pela população. Vários extratos de plantas tem se mostrado promissores nas mais diversas áreas no qual vem sendo estudados (FALEIRO et al. 2009; BARACHO, et al. 2009; RODRIGUES, et al. 2010; SILVA, 2010). Através de vias metabólicas secundárias os vegetais produzem compostos como os alcalóides, flavonóides, isoflavonóides, taninos, cumarinas, glicosídeos, terpenos, poliacetilenos e substâncias oleosas, que por vezes, são específicos a determinadas famílias, gêneros ou espécies (CECHINEL FILHO , YUNES, 1998), e estes metabólitos são alvo de uma diversidade de estudos que vão desde sua estrutura molecular até suas aplicações ( FANCIS et al. 2002; FERREIRA et al. 2008; VIEIRA et al., 2008). Muitos flavonóides agem como protetores químicos, protegendo as plantas dos efeitos causados pela fotoxidação e também contra insetos, então, tendo um melhor conhecimento desses compostos químicos, é possível entender mais sobre sua dinâmica biológica (FERREIRA, et al. 2008). O presente trabalho teve por objetivo avaliar possíveis atividades biológicas do extrato aquoso da T. subulata , através de um estudo fitoquímico, da avaliação da toxicidade aguda, da fragilidade osmótica, do efeito sobre a cicatrização e da avaliação bioquímico- metabólica.

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5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1 Material Botânico A coleta do material foi realizada no período da manhã, onde as plantas encontram- se mais vigorosas, com flores aparentes, com isso facilitando a identificação, pois ainda não estavam sobre forte influência do sol. A Turnera subulata utilizada no estudo foi coletada na região metropolitana, Olinda-PE, onde as plantas crescem sob condições naturais. A exsicata foi feita e depositada no Herbário Dárdano de Andrade Lima do Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA, sob o número de registro 85651 .

5.2 Obtenção do Extrato Aquoso: Após coleta, selecionou-se as folhas, e foram descartadas as que apresentaram fungos e insetos. As folhas ficaram submetidas à secagem (de forma natural) ao abrigo de sol, calor, vento e à temperatura ambiente até completa desidratação. Através de uma balança de precisão pesou-se 20g das folhas trituradas, em seguida foi adicionada 500 mL de água destilada aquecida a temperatura de 90ºC, para obtenção da infusão. As folhas ficaram em contato com a água destilada por 30 (trinta) minutos. Em seguida, o conteúdo foi filtrado em funil de vidro simples na presença de algodão, sendo posteriormente submetido à liofilização.

5.3 Abordagem Fitoquímica: O extrato aquoso de T. subulata foi submetido à análise fitoquímica no departamento de Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). Para análise fitoquímica, foram realizadas pesquisas de saponinas, polifenóis, alcalóides e terpenos, segundo os procedimentos descritos no manual de análise fitoquímica e cromatografia de extratos vegetais (BARBOSA et al., 2004), e no Plant Drug Analysis (WAGNER E BLADT, 1996).

5.4 Animais Experimentais: O estudo foi realizado com camundongos albinos suíços, fêmeas, com 60 dias de idade, pesando em média de 30 a 35 gramas. Os animais foram abrigados em gaiolas de

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plástico, em estantes com ventilação interna, temperatura e umidade controlada e mantidos em ciclo de 12 horas de claro e de 12 horas de escuro, de acordo com as normas internacionais do conselho de laboratório de animais experimentais (ICLAS). Os procedimentos experimentais apresentados nesta pesquisa foram submetidos e aprovados pelo comitê de ética e experimentação animal da Universidade Federal de Pernambuco (Comitê de Ética em Experimentação Animal / Centro de Ciências Biológicas / Universidade Federal de Pernambuco – CEUA-UFPE, ofício nº 143/09).

5.5 Toxicidade Aguda ( DL 50 ): O extrato aquoso liofilizado de Turnera subulata foi dissolvido em água destilada e administrado por via oral (Gavagem), a um grupo de 15 animais. Os animais foram divididos em 3 (três) grupos de 5 (cinco) animais cada. O Grupo I recebeu uma dose de 250mg/Kg, o grupo II recebeu 100mg/kg e o grupo III recebeu 500mg/kg de peso. Após administração os animais foram observados nos primeiros 30 minutos, após 2 horas, 24 horas e 48 horas. Foram observados sinais tóxicos de caráter geral, sendo avaliados os seguintes parâmetros: atividade motora, piloereção, sensibilidade, tremores, irritabilidade, contorções e respiração. A toxicidade aguda foi definida como a mortalidade observada 24 horas após a administração oral (gavagem) e expressa em termos de DL 50 , que é definida como a quantidade de sólidos solúveis capaz de causar morte em 50% dos animais testados.

5.6 Produção do Gel do Extrato Aquoso de Turnera subulata : Para preparação do gel foram utilizados 2,25 g de Carbopol, 1,25ml de Trietanolamina, 100ml de água destilada e 3g de extrato aquoso liofilizado (EAL) de Turnera subulata. O gel apresentou propriedades características como boa viscosidade e pH de 6,5. Foram realizados testes farmacotécnicos que comprovaram a consistência ideal do gel com o apoio do Departamento de Farmácia da UFPE. 5.7 Indução de Ferida Aberta em Camundongos: Os animais foram pesados e separados em 3 grupos contendo 5 animais cada. Os animais foram pesados, marcados e anestesiados por via intraperitonial. A solução

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anestésica foi composta por Cloridrato de xilazina (Rompum®) a 20 mg/mL, e Cloridrato de ketamina (Ketalar®). A dose injetada foi calculada para cada animal por Kg de peso. Após assepsia do dorso dos animais com álcool 70% e retirada do pêlo de uma área de aproximadamente 1 cm², foi feita uma incisão da pele, com auxílio de tesoura e pinça cirúrgica, expondo-se a fáscia muscular dorsal. Para animais que apresentaram hemorragia na ferida, a hemostasia foi feita por compressão com gaze estéril embebida em solução salina a 0,9%.

5.8 Tratamento das Feridas Abertas : Os tratamentos se iniciaram logo após a indução das feridas operatórias e prosseguiram diariamente, por 14 (catorze) dias. Os animais tiveram suas feridas avaliadas macroscopicamente até a completa reepitelização. Os animais foram tratados e distribuídos aleatoriamente em 3 grupos de 5 animais como representados abaixo: GRUPO I (Controle negativo) – animais com feridas operatórias tratados topicamente com 0,4mL de solução salina a 0,9%. GRUPO II (Gel de T. subulata ) – animais com feridas operatórias tratados topicamente com 0,5g de gel de T. subulata. GRUPO III (Controle positivo) - animais com feridas operatórias tratadas topicamente com 0,5g de pomada constituída de desoxiribonuclease 6,66%, fibrolisina 0,1% e cloranfenicol 1% (Fibrase ®- Laboratório Pfizer, Brasil).

5.9 Avaliação Macroscópica da Ferida (lesão): Após induzidas, as feridas foram avaliadas quanto aos aspectos clínicos e suas áreas mensuradas até completa reepitelização. Clinicamente foram avaliados os seguintes aspectos: hemorragia, crosta (parcial ou total, seca ou com secreção), tecido de granulação, cor e crescimento de pelos na área da lesão e epitelização.

5.10 Fragilidade Osmótica: Para avaliar a fragilidade osmótica, amostras de sangue de Ratos Wistar foram utilizadas. Aliquotas de sangue heparinizado foram incubadas por 1 hora na presença do

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extrato (15mg/ml), em diferentes concentrações (0, 50 e 100% volume/volume) e em temperatura ambiente: Grupo Controle 0% (salina 0,9%), Grupo 1 – 100% (500µl de extrato bruto+ 500µl sangue), Grupo 2 - 50% (250µl extrato bruto+250µl salina+500µl Sangue). Em seguida o sangue foi lavado por 3 vezes com solução salina (NaCl a 0,9%) para retirar o excesso de extrato e as alíquotas de sangue (50 L) foram submetidas a um gradiente de NaCl (0, 0,1; 0,25; 0,4; 0,7 e 0,9%) por 1 hora. Após este período de incubação, a amostras foram centrifugadas (1000 Gx5min) e as absorbâncias (nm) dos sobrenadantes isolados foram determinadas em placa de ELISA (Bio-Rad Xmark Microplate Spectrophotometer) a 545nm. O percentual de fragilidade osmótica foi determinado considerando o valor obtido como densidade óptica no animal controle como equivalente a 100% de hemólise.

5.11 Avaliação do Metabolismo Bioquímico: Os animais foram pesados e marcados de acordo com cada grupo de estudo. Utilizou-se 28 animais, sendo cada grupo composto por 07 animais. Foram testadas três doses de extrato bruto aquoso liofilizado de Turnera subulata . Os grupos foram divididos em: Grupo I (salina 0,9%); Grupo II 50mg/kg; Grupo III 150mg/kg e Grupo IV 250mg/kg. As doses foram obtidas através da diluição em água destilada e o veículo de administração foi por via oral (gavagem). Após 24 horas, a avaliação bioquímica foi realizada através da dosagem sérica de colesterol, triglicerídeos, proteínas totais, cálcio e glicose (cinética da glicose), em cada grupo. Após 24 horas da administração, os animais foram sacrificados e através de punção cardíaca o sangue foi coletado em tubo seco para obtenção do soro. As dosagens de colesterol, triglicerídeos, proteínas totais e cálcio foram realizadas através de kit comercial LABTEST. Já a glicose foi dosada nos tempos de 0, 2, 8, 12 e 24h, a partir de um glicosímetro.

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5.12 Análise Estatística: Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Para análise estatística dos dados e para comparação entre as médias e desvio padrão foi utilizado o Teste t de Student. Foram considerados como estatisticamente significativos os valores com p<0,05.

6. RESULTADOS E DISCUSSÕES 6.1 Fitoquímica

A análise fitoquímica do extrato aquoso de T. subulata mostrou a presença de O- glicosídeos (quercetina e kampferol) e C-glicosídeos(orientina/iso-orientina e vitexina/isovitexina, porém, foi negativo para os outros testes fitoquímicos realizados, conforme evidenciado na tabela 1. Os compostos fenólicos de origem vegetal têm sido alvo de muitas pesquisas atuais por causa de suas ações biológicas associadas à prevenção de doenças e com potencial curativo (VINUEZA, FARIA, CESAR, 2008). Silva (2010) em um estudo utilizando a planta Turnera ulmifolia obteve a presença positiva de cumarina e flavonóides no extrato aquoso a partir das folhas. Em um estudo fitoquímico da T. ulmifolia , Gracioso et. al. (2002), obteve flavonóides (flavonas C-glicosiladas) como constituintes majoritários da fração aquosa, como também saponinas, terpenos e taninos foram positivos utilizando outros solventes. A investigação fitoquímica da Turnera diffusa foi positiva para flavonóides (luteolina e apigenina), terpenos, sacarídeos e derivados cianogênicos, dados obtidos por Zhao et. al. (2002). A infusão das partes aéreas (folhas) da T. diffusa foi examinada fitoquimicamente e também foi positiva para flavonóides (PIANCENTE et. al. 2007). Correia, et. al. (2010), observaram a presença de saponinas, taninos, açúcares redutores e alcalóides ao analisar o extrato alcoólico obtido das a partir das folhas de T. ulmifolia .

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Tabela 1 . Resultado da análise fitoquímica do extrato aquoso de T. subulata . TESTES FITOQUIMICOS RESULTADO Pesquisa de Saponinas Negativo Pesquisa de Polifenóis Positivo: presença de O-glicosídeos (quercetina e kampferol) e C-glicosídeos(orientina/iso-orientina e vitexina/isovitexina). Pesquisa de Alcalóides Negativo Pesquisa de Terpenos Negativo

6.2 Toxicidade Aguda ( DL 50 ) Segundo Gracioso et al. (2002), preparações como infusões, extratos ou frações contendo flavonóides como maior componente geralmente não se apresentam toxicas in vivo . Durante o período de até 48 horas, não foram observadas letalidade dos animais após administração das doses de 100, 250 e 500mg/kg do extrato bruto aquoso de Turnera subulata. Este dado corrobora com o achado de Gracioso et al. (2002) para os extratos alcoólico 100%, diclorometano e hexânico de folhas de Turnera ulmifolia , onde estes não apresentaram nenhum efeito tóxico até a dose de 5000mg/kg. Dados semelhantes foram encontrados por Silva (2010) após administração dos extratos aquoso, n-hexano, acetato de etila e n-butanol de Turnera ulmifolia na dose de 300mg/kg.

6.3 Indução de Ferida Aberta/ Cicatrização Durante a avaliação clínica diária, não se constataram alterações quanto ao estado geral dos animais, tampouco quanto ao aspecto da urina e das fezes. O gel do extrato bruto aquoso de T. subulata produziu uma melhora significativa na cicatrização, do ponto de vista macroscópico, quando comparado ao controle negativo e positivo. O crescimento de pêlos na área da pele adjacente à lesão e a epitelização também mostrou-se mais evidente no grupo teste. Associado a isso, os tratamentos foram biocompatíveis, uma vez que não induziram nenhum tipo de reação imunológica, em aspecto macroscópico. As feridas tratadas evoluíram bem durante o tratamento, não apresentando sangramento, infecções ou reações inflamatórias. As formas farmacêuticas de aplicação na pele têm algumas vantagens em relação a outras vias de administração, tais como: menor irritação, e menor toxicidade sistêmica,

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permite melhor controle de absorção e possibilidade de vários locais para aplicação. Vários estudos tem sido desenvolvidos buscando novos medicamentos fitoterápicos de uso tópico para melhoria do processo de reparo tecidual (LOPES, et al. 2006; GARROS, et. al.2006). Vários fitoterápicos já foram testados e usados no processo de cicatrização de feridas. A Aloe Vera (Babosa) foi eficaz no tratamento de feridas abertas em ratos, como foi observado por Faleiro et al. 2009, evidenciando que o fitoterápico na forma de extrato de glicólico proporcionou maior contração das feridas experimentais. Janning et al. 2011, , avaliaram a cicatrização de feridas cutâneas abertas em ratos, tratados com uso tópico do extrato hidroalcoólico de Tabernaemontana catharinensis (Jasmim) , buscando obter informações sobre o efeito que esta planta apresenta no processo de cicatrização. Durante o período experimental nenhum dos animais apresentou necrose ou secreção purulenta na ferida. O grupo tratado com o extrato obteve bons resultados em relação a diminuição da área da ferida sugerindo que a planta tem um efeito cicatrizante importante sobre a epiderme de ratos. Estudos são necessários para verificar os efeitos no gel de T. subulata em nível microscópico para avaliação da presença de fibroblastos, fibras de colágeno, vasos sanguíneos ou mais alterações a nível tecidual.

6.4 Fragilidade Osmótica A avaliação da fragilidade osmótica dos eritrócitos estudados submetidos às duas concentrações de extrato bruto de T. subulata mostrou alteração no perfil da curva de Densidade Óptica (% de hemólise) significativa apenas nas concentrações de 0% e 0,1% de solução hipotônica de NaCl. Contudo, quando comparadas com o controle essa diferença mostrou-se em menor proporção, demonstrando que neste trabalho o extrato bruto de Turnera subulata diminuiu a fragilidade osmótica. A figura 3 mostra a curva de fragilidade osmótica após o tratamento com extrato aquoso de T. subulata em amostras de sangue de ratos Wistar . O resultado indica que o extrato usado altera a curva de fragilidade osmótica quando comparado com o grupo controle. As alterações na integridade da membrana podem estar relacionados com os componentes presentes no extrato capazes de interagir com a membrana e modificar o transporte de íons ou o balanço osmótico.

35 Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

Com isso, é possível afirmar que eritrócitos incubados com produtos naturais podem sofrer um distúrbio na sua estrutura e no seu citoesqueleto causado por alteração do coeficiente de partição na membrana destas células (DIDELON et al.,2000). Isto alteraria a estrutura da membrana plasmática modificando o transporte de íons e por fim causando ou não a lise celular.

[NaCl]

Figura 3: Curva da fragilidade osmótica de amostras de sangue tratados e não tratados com extrato de T. subulata em diferentes concentrações de NaCl. Grupo Controle (salina 0,9%), Grupo 1 (extrato a 100%), Grupo 2 (extrato a 50%).

O volume das células vermelhas do sangue (eritrócitos) parece ser regulado por uma ação direta da bomba de sódio e potássio que controla a concentração de solutos dentro da célula, regulando as forças osmóticas que podem fazer uma célula inchar ou encolher (ALBERTS, 2004). O teste de fragilidade osmótica é uma técnica clássica, rápida e fácil que permite obter informações relevantes sobre a interação de drogas sintéticas e naturais com as membranas celulares (MAIWORN et al., 2008).

6.5 Avaliação das Alterações Bioquímico-Metabólicas em Camundongos: Após a avaliação das concentrações de glicose em mg/dl nos períodos de 0, 2 4, 8, 12 e 24 horas (cinética da glicose) nas doses administradas não foi observada redução significativa quando comparado com o controle. No entanto, após administração do extrato na dose de 50mg/kg, foi observado um aumento na concentração de glicose entre 12 e 24h, quando comparado a concentração de glicose circulante no grupo controle. Bem como, foi

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observado que nas doses de 150 e 250mg não ocorreu alteração significativa durante o período da cinética neste modelo experimental (Figura 4) (Tabela 2).

Figura 4: Curva da Cinética da Glicose nos Tempos de 0,2,4,8, 12 e 24horas. Grupo I (salina), Grupo II (tratado com 50mg/dL), Grupo III (150mg/dL), e Grupo IV (250mg/dL). Os dados evidenciam que não ocorreu alteração significativa (p>0,05) quando comparado os grupos tratados (II, III e IV) com o extrato aquoso de T. subulata com o tratado com salina (controle negativo).

Tabela 2 . Cinética da Glicose. Valores das médias das concentrações séricas de glicose (mg/dl) nos tempos de 0, 2,4, 8, 12 e 24 horas. Cinética da glicose ( mg/dL)

0h 2h 4h 8h 12h 24h Grupo I 4,24 4,29 4,22 4,27 4,31 4,53 Grupo II 4,67 4,59 4,75 5,27 5,51 5,42 Grupo III 3,75 3,66 3,79 3,84 3,82 4 Grupo IV 3,71 3,73 3,93 3,73 4,00 4,22

Vários estudos têm sido realizados para validarem o uso popular de plantas para uso como hipoglicemiante. Através de um estudo de revisão, Negri (2005), fez um levantamento de plantas que são utilizadas experimentalmente com hipoglicemiantes e observou que a grande diversidade de classes químicas indica uma variedade de

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mecanismos de ação para redução da glicose sérica. No entanto, como foi observado neste estudo, o extrato aquoso de T. subulata , nas doses estudadas, não obteve um efeito hipoglicemiante como descrito pela medicina popular.

Na avaliação da concentração de colesterol, observou-se um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) de sua concentração sérica nas doses estudadas, sugerindo que o extrato pode atuar no metabolismo do colesterol, que se for a nível hepático, aumenta sua síntese, o que por sua vez leva a um aumento do colesterol plasmático (Figura 5) (Tabela 3). A análise dos níveis de triglicerídeos na dose de 50mg/kg apresentou-se diminuída, porém, sem diferença estatisticamente significativa (Figura 6) (Tabela 3).

Figura 5: Médias das concentrações séricas de colesterol. O grupo I tratado com salina, e os grupos II, III e IV tratados com 50, 150 e 250mg/kg do extrato aquoso de Turnera subulata respectivamente. Observa-se um aumento na concentração sérica do colesterol nas doses do extrato estudadas. Valores com p< 0,05.

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Figura 6: Médias das concentrações séricas de triglicerídeos. O grupo I tratado com salina, e os grupos II, III e IV tratados com 50, 150 e 250mg/kg do extrato aquoso de Turnera subulata respectivamente. Observa-se uma pequena diminuição sérica no grupo II. Não foi observada diferença significativa nos grupos estudados. Valores com p> 0,05.

As saponinas naturais e sintéticas inibem a absorção de colesterol no intestino e reduzem a concentração do colesterol do plasma em animais de laboratório e são utilizadas por seu potencial farmacológico no tratamento da hipercolesterolemia (HARWOOD JR et al ., 1993). Segundo Simões et al. (2000) as saponinas tem a propriedade de se complexarem com o colesterol e por isso são utilizadas como hipocolesterolêmicas. Neste caso corrobora com os dados encontrados neste estudo, onde o extrato aquoso de T. subulata foi negativo para pesquisas de saponinas e não obteve efeito significativo sobre a redução de lipídeos séricos. O extrato aquoso de T. subulata pode também ter atuado a nível hepático, inibindo provavelmente a enzima responsável pela produção de colesterol (3-hidroxi-3-metil- glutaril-CoA redutase) no fígado. Estudos tem proposto que os flavonóides apresentam atividade antioxidante, indutora microssomal hepática, inibidora de enzimas e outras. (OLIVEIRA et al. 2002). A dosagem do cálcio sérico, mostrou-se aumentada significativamente na dose de 50mg/kg quando comparado ao controle, porém, não tendo diferença quando comparada aos outros grupos estudados (Figura 7) (Tabela 3) .

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Figura 7: Médias das concentrações séricas de cálcio. O grupo I tratado com salina, e os grupos II, III e IV tratados com 50, 150 e 250mg/kg do extrato aquoso de Turnera subulata respectivamente. Observa-se um aumento da concentração de cálcio sérico no grupo II. Não houve diferença significativa quando comparada as doses administradas ao grupo I (controle). Valores com p> 0,05.

Tabela 3 . Valores da média e desvio padrão para as concentrações séricas de Colesterol, Triglicerídeo, Cálcio e Proteínas Totais. Colesterol Triglicerídeos Cálcio Proteínas Totais (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) Grupo I 61,03±6,8 141,78±39,51 6,4±1,09 6,4±0,30 Grupo II 77,58±2,71 124,85±20,23 8,9±1,14 6,34±0,81 Grupo III 83,76±7,09 147,16±32,56 8,2±0,77 6,99±0,59 Grupo IV 80,84±8,35 170,33±38,28 7,7±0,72 6,93±1,06 Os valores foram considerados significativos com p<0,05.

Os valores de proteínas totais, que não mostraram variação estatisticamente significante após a administração do extrato aquoso (Figura 8), indicam que não houve interação metabólica das proteínas totais com o extrato a nível de absorção intestinal e de produção hepática, o que corrobora com os achados de Brandt et al. (2009).

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Figura 8 : Médias das concentrações séricas de proteínas totais. O grupo I tratado com salina, e os grupos II, III e IV tratados com 50, 150 e 250mg/kg do extrato aquoso de Turnera subulata respectivamente. Não houve diferença significativa quando comparada as doses administradas ao grupo I (controle). Valores com p> 0,05.

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7. CONCLUSÕES

• A análise fitoquímica demonstrou a presença de O-glicosídeos (quercetina e kampferol) e C-glicosídeos(orientina/iso-orientina e vitexina/isovitexina) no extrato aquoso de Turnera subulata.

• No estudo sobre a toxicidade aguda ( Dl 50 ) não foi observado letalidade em nenhuma das doses administradas; • A utilização de gel da Turnera subulata , permitiu a ocorrência do processo de reparação cutânea de feridas abertas em camundongos; • O EAL diminuiu a fragilidade osmótica, reduzindo a ruptura das membranas; • O EAL não alterou significativamente os níveis de proteínas totais, triglicerídeos,VLDL-c, cálcio e glicose; • O EAL alterou nos níveis de colesterol circulante, provavelmente o extrato altera a enzima responsável pela produção de colesterol (3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redutase) no fígado; • O EAL demonstra apresentar vários efeitos biológicos alterando os alguns mecanismos metabólicos pela presença de flavonóides e outros derivados.

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49 Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

9. ANEXOS

9.1 TABELA 4: SISTEMAS DAS ANÁLISES FITOQUíMICAS

Pesquisa Sistema Padrão Revelador Polifenóis Experimental* Alcachofra DFB*** -UV Proantocianidinas Experimental Jatobá Vanilina clorídrico Alcalóides Experimental Pilocarpina Dragendorff Terpenos GURU** ácido bursólito Liebermann burchard WAGNER, BLADT, 1996

*Experimental: acetato de etila: acetato fórmico:acido acético: água(100:11:11:26). **GURU: tolueno: acetato de etila(90:12) ***DFB: difenilborinato-2-etil

9.2 ACOMPANHAMENTO MACROSCÓPICO DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO

Fotos tiradas durante o processo de preparo, indução e tratamento de ferida aberta em camundongos. O acompanhamento macroscópico das feridas foi feito até o 14º dia.

Figura 9: epilação do dorso (A) e excisão de fragmento cutâneo com pinça e tesoura cirúrgica até exposição da fáscia muscular dorsal (B e C).

50 Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

Figura 10 : início de tratamento das feridas abertas dos grupos estudados. Salina (D), Fibrase (E) e Gel de T. subulata (F).

Grupo Gel de T. subulata Grupo Fibrase Grupo Salina

Figura 11 : acompanhamento da cicatrização. Fotos tiradas no 4º e 14º dia após indução da ferida. G e G 1 (feridas tratadas com gel), H e H 1 (feridas tratadas com Fibrase), I e I 1 (feridas tratadas com Salina).

51 Avaliação de Atividades Biológicas da Turnera subulata SILVA, T.R.P.M.

9.3 . ATIVIDADES PARALELAS

ENVIO DE TRABALHO PARA CONGRESSOS

Apresentação de trabalho - FESBE 2011.

Avaliação da Toxicidade Aguda (DL 50 ) e Fragilidade Osmótica de Extrato Bruto Aquoso de Turnera subulata . 1 1 1 1 1 1 2. Costa, R.C., Silva, T. R. P.M, Barreto, T.L.P., Silva, N.M.B., Brito, M.M.V., Gouveia, A.L.A., Magnata,S.S.L.P, 1 Catanho, M.T.J.A,1.Departamento de Biofísica e Radiobiologia CCB, UFPE, 2.Centro Acadêmico de Vitória (Núcleo de Ciências Biológicas) UFPE.