La Ricerca Sulla Sclerosi Multipla

A cura di Gabriele Dati Area Ricerca Scientifica AISM-FISM

Coordinamento editoriale Silvia Zino Area Comunicazione e Ufficio Stampa AISM

Copyryght 2012 Fondazione Italiana Sclerosi Multipla

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Finito di stampare: maggio 2012 finanziata dalla Grafiche G7 – Genova Fondazione Italiana Sclerosi Multipla Pubblicato e distribuito da 2012 Associazione Italiana Sclerosi Multipla - Onlus Via Operai, 40 16149 Genova

ISBN 978-88-7148-063-3 INDICE COMPENDIO 2012 index indice

INTRODUCTION pag. 11 INTRODUZIONE pag. 7 AISM Research: projects focused on the person pag. 12 La ricerca AISM: progetti centrati sulla persona pag. 8

KNOWING THE CAUSES OF THE DISEASE pag. 15 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA pag. 15

QUALITY OF LIFE AND REHABILITATION pag. 67 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE pag. 67

VALIDATION OF NEW TARGETS/PATHWAYS pag. 85 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS pag. 85

NEW DIAGNOSTIC TOOLS pag. 115 NUOVI METODI DIAGNOSTICI pag. 115

FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO AND FELLOWSHIPS pag. 157 FINANZIATI DALLA FISM pag. 157 FISM 2011 Call pag. 158 Bando Ricerca FISM 2011 pag. 158 Special Projects 2011 pag. 163 Progetti Speciali 2011 pag. 163 FISM 2010 Call pag. 166 Bando Ricerca FISM 2010 pag. 166 Special Projects 2010 pag. 173 Progetti Speciali 2010 pag. 173 FISM 2009 Call pag. 176 Bando Ricerca FISM 2009 pag. 176 Special Projects 2009 pag. 181 Progetti Speciali 2009 pag. 181

FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO AND FELLOWSHIPS pag. 183 FINANZIATI DALLA FISM pag. 183 Projects funded before 2009 and presented at FISM 2012 Progetti finanziati prima del 2009 Annual Scientific Congress pag. 184 presentati al Congresso nazionale 2012 pag. 184

SCIENTIFIC COMMITTEE FISM pag. 187 COMITATO SCIENTIFICO FISM pag. 187 Scientific Commitee FISM 2011 pag. 188 Comitato Scientifico FISM 2011 pag. 188 Scientific Commitee FISM 2010 pag. 190 Comitato Scientifico FISM 2010 pag. 190 Scientific Commitee FISM 2009 pag. 192 Comitato Scientifico FISM 2009 pag. 192 INTRODUZIONE COMPENDIO 2012 introduzione

«La missione di ogni uomo consiste nell’essere una forza della natura e non un grumo agitato di guai e di rancori che recrimina perché l’universo non si dedica a renderlo felice. Sono dell’opinione che la mia vita appartiene alla comunità e finché vivrò sarà un privilegio fare per questa quanto posso. È una sorta di torcia che brucia e che ho il compito di tenere per un breve momento. Voglio fare in modo che brilli il più possibile prima di passarla alle future generazioni». In questa lunga citazione di Bernard Shaw sta l’essenza della ricerca scientifica AISM: nasce da persone, i ricercatori, che accolgono la sfida di essere forze della natura, senza concedersi l’alibi delle difficoltà che, anche oggi, sono pesantemente imposte dalla società, dall’economia, dalla politica. I ricercatori AISM sono persone che costruiscono il presente pensando al futuro e alla comunità intera in cui vivono, considerando un privilegio la possibilità di dare il meglio di sé, in ogni campo promettente di studi, per consentire ad altre persone con SM, milioni nel mondo, di poter scegliere di vivere come forze della natura e non come grumi agitati di guai. La ricerca scientifica, in ogni caso, si fa con le intenzioni e i valori, ma soprattutto con i numeri. Ed è nei numeri che la ricerca AISM rivela la sua forza, la sua costante capacità di crescere di valore. Questo Compendio documenta come nel 2011 AISM abbia finanziato 38 Progetti di Ricerca, 7 Borse di studio, diversi Pro- getti Speciali, con un investimento complessivo nella ricerca superiore ai 6 milioni di euro. Cifre notevoli, in crescita anche rispetto al 2010: allora furono sostenuti 37 Progetti di Ricerca, 13 Borse di studio, altri Progetti Speciali con 4,3 milioni di euro. Ciò è stato reso possibile anche dai fondi garantiti dal 5 per mille: mentre la crisi economica taglia i fondi in tanti settori, i cittadini permettono e chiedono ad AISM e ai suoi ricercatori di intensificare la ricerca, riconoscendo l’efficacia dei suoi risultati.

Altri numeri ancora ci rendono orgogliosi di ciò che stiamo realizzando: dal 1987 a oggi AISM e FISM hanno finanziato in tutto 295 ricercatori sulla SM. Una vera e propria scuola, consolidata, che sta lasciando il segno a livello nazionale e internazionale. E il fatto che il 76% dei ricercatori finanziati continui a fare ricerca sulla SM dice di una forte capacità della ricerca AISM di attrarre, sostenere e accompagnare i migliori ricercatori durante tutta la propria carriera. È questo il valore che genera valore: come si parte dalla ricerca di base e si arriva alla fase della clinica, come AISM è in grado, insieme ai propri partner, di giungere a brevettare la proprietà intellettuale delle scoperte effettuate, così un giovane che miri all’eccellenza può iniziare con AISM a svolgere ricerca grazie a una Borsa di addestramento, continuare con Borse di ricerca e arrivare a condurre progetti di ricerca autonomi e rilevanti tramite Borse Senior, e infine il Programma «Costruisci una carriera nella ricerca», il Premio Rita Levi Montalcini.

Tornando ai numeri, con uno sguardo complessivo sulla distribuzione dei 3 milioni di euro investiti dal Bando di ricerca 2011 si nota che il 61,1% è stato utilizzato per ricerca fondamentale, il 16,9% ha riguardato la ricerca preclinica, il 12,3% la traslazionale, il 9,7% la clinica. Tutto nasce dalla ricerca di base, ma tutto deve arrivare a reali benefici per le persone con SM, che sono i veri titolari di un’Associazione come AISM e della sua ricerca scientifica. Sta qui, probabilmente, una sfida importante per la ricerca nel mondo, che nei prossimi anni potrà essere affrontata mettendosi insieme e coordinandosi sempre meglio a livello nazionale ma anche internazionale, come nei campi delle forme progressive, delle staminali o della SM pediatrica: si tratta di fare in modo che molti dei progetti scelti e finanziati “camminino” velocemente sulla scala della ricerca e, partendo dai primi gradini, arrivino fino in fondo, all’individuazione di cure e trattamenti risolutivi. Il mondo libero dalla sclerosi multipla, il mondo in cui le persone con SM sono libere di scegliere la qualità della propria vita, oltre i vincoli imposti dalla malattia, viene generato anche dalle mete che la ricerca AISM, insieme a tutti i suoi ricercatori, sta individuando e raggiungendo, passo dopo passo.

Mario A. Battaglia Presidente FISM

7 Ricerca AISM: progetti centrati sulla persona

La meta della ricerca che AISM finanzia tramite la sua Fondazione FISM è nel suo punto di partenza: le Allo sviluppo della SM, in particolare, sembrano concorrere diversi meccanismi uno tra questi, che apre persone con sclerosi multipla hanno diritto ad avere risposte alle proprie domande, ad avere le migliori nuove aspettative, è quello della funzione mitocondriale oligodendrocitaria (Paolo Pinton, Università di cure e i più efficaci trattamenti nel minor tempo possibile. In una parola: hanno diritto a una ricerca che Ferrara, pagg. 30-33). Senza dimenticare che sta crescendo molto la comprensione dei fattori ambientali cambi in meglio la vita, per tutti, una volta per tutte. implicati nell’insorgenza della SM. Un esempio rappresentativo in questa direzione è lo studio internazionale sui fattori di rischio nella SM coordinato da Maura Pugliatti (Università di Sassari, pagg. 38-41). Si Ma cosa vuol dire oggi realizzare questi diritti? moltiplicano anche gli studi e le conferme sul virus Epstein Barr nella SM (Dianzani-D’Alfonso, Pugliatti e Giulietta Venturi, Istituto Superiore di Sanità, pagg. 20-29). La traduzione più attuale del valore della ricerca AISM, è probabilmente in due parole, o meglio in due strategie che sembrano vincenti. La prima è “partnership”. “Creazione di nuovi modelli operativi” è la Una riabilitazione terapeutica per una vita di qualità seconda strategia fondamentale. AISM da sempre investe direttamente sulla ricerca in riabilitazione, che svolge anche come ricerca intra- murale. Gli ultimi studi pubblicati a livello internazionale sempre di più vanno evidenziando il ruolo tera- Nel 2011, in particolare, AISM si è fortemente impegnata nella messa a punto di nuovi modelli operativi, peutico della riabilitazione, la sua potenziale implicazione nel mantenimento della plasticità neuronale. In integrando non solo l’eccellenza della ricerca italiana, ma anche aprendo a nuovi soggetti, a nuove coo- questa direzione si possono collocare gli studi dedicati all’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva perazioni internazionali, ancora ad altri referenti della ricerca universitaria pubblica, che possano diventare sulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale, verso la personalizzazione di interventi terapeutici in le basi per l’individuazione di nuovi target terapeutici. A questo proposito, possiamo evidenziare due persone con sclerosi multipla. Non solo riabilitazione: la qualità di vita è legata fortemente anche alla co- esempi emblematici. noscenza sulla sclerosi multipla che le persone possono sviluppare con strumenti idonei, già dal momen- to della diagnosi. Forte rilevanza assumono dunque per AISM i progetti coordinati da Alessandra Solari Modello di una ricerca che crea valore e Andrea Giordano (Istituto di Ricerca Besta, Milano, pagg. 68-75) sul benessere fisico e psicologico e Tra gli studi finanziati FISM nel 2010 ve ne è uno che fa capo a Maria Pia Abbracchio, Università di Milano sulla partecipazione delle persone con SM alle decisioni su come affrontare al meglio la malattia. Una va- (vedi pagina 169): è la sorgente di un primo esempio di nuove partnership che danno valore alla ricerca lutazione dell’ausilio informativo “Sapere migliora” è stata curata da Claudia Borreani (Fondazione IRCCS AISM. Grazie al lavoro congiunto di ricercatori dell’Università di Milano, dell’Università di Pisa, del CNR e Istituto Nazionale dei Tumori, Milano, pagg. 76-79). dell’Università di Torino, è stato individuato il nuovo recettore GPR17, un nuovo target per lo sviluppo di terapie innovative. Ora Università di Milano e FISM, insieme, hanno depositato un brevetto per proteggere Nuovi target terapeutici e nuovi metodi diagnostici questa ricerca e operare nel primario interesse delle persone con SM. Gli studi qui riportati hanno evidenziato nuovi possibili bersagli terapeutici e biomarkers. Per limitarsi a un esempio, suscita interesse lo studio che ha portato Giuseppe Battaglia (IRCCS Neuromed, Camerelle, International Progressive Multiple Sclerosis Collaborative Pozzilli, Isernia, pagg. 90-93) a individuare la diretta interazione tra infiammazione e attività neuronale nei Esiste, e il congresso FISM 2012 ne documenta una significativa parte, un consistente portfolio della ri- modelli sperimentali di SM e a ipotizzare il ruolo protettivo del glutammato nelle malattie infiammatorie e cerca finanziata FISM sulle forme progressive di sclerosi multipla. Ma questa eccellenza non basta ancora neurodegenerative. La sfida per l’Associazione è, ora, individuare come sia possibile validare tali bersagli per la identificazione di terapie specifiche, e nemmeno per definire protocolli di studi clinici che misurino e i biomarker individuati dagli studi finanziati, come si possa proseguire dalla ricerca di base alle altre im- l’efficacia degli interventi per le forme progressive. Per accelerare, per colmare le lacune, occorreva creare portanti fasi di ricerca. Di particolare interesse sembra, tra i nuovi metodi diagnostici, la prosecuzione delle un nuovo modello operativo di partnership. Solo coordinando le rispettive ricerche nell’ambito delle forme ricerche di Francesca Gilli, Premio Rita Levi Montalcini 2011 (Istituto di Neuroscienze della Fondazione progressive, i soggetti attivi in tutto il mondo potranno mettere a fuoco cosa ancora manca e, soprattut- Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, Orbassano - TO): ha confermato l’azione di 7 geni to, definire come investire per arrivare alle risposte attese. Ed ecco che AISM si è messa in prima linea, coinvolti nei meccanismi immuno biologici tipici della gravidanza (pagg. 128-131), che potranno in futuro insieme alla nostra Federazione Internazionale MSIF e alle associazioni consorelle le MS Society di USA, essere bersagli di terapie mirate. Ugualmente, anche gli studi di Massimo Filippi (Istituto San Raffaele, Canada, Regno Unito e Olanda nella creazione dell’International Progressive Multiple Sclerosis Collabo- Milano, pagg. 144-149) rivelano substrati anatomici e funzionali responsabili della presenza e della gravità rative, che viene lanciato in Italia in occasione del Congresso FISM 2012. Ecco ancora evidenziato come del deficit cognitivo in pazienti con SM, evidenziando nuovi meccanismi patogenetici. Tutto ciò in un pros- un nuovo modello operativo di partnership tra soggetti differenti vuole indirizzare effettivamente la ricerca, simo futuro potrebbe permettere di individuare nuove strategie farmacologiche e riabilitative. In questo massimizzando per tutti l’efficacia degli investimenti e accelerando i tempi necessari per ottenere i risultati ambito infine, a dimostrazione di come molti studi finanziati abbiano implicanze sulle forme progressive attesi. di SM, lo studio curato da Paolo Muraro (Imperial College, UK, London, pagg. 150-154) ha evidenziato che chi riceve la diagnosi tra 49 e 50 anni ha più probabilità di sviluppare SM secondaria progressiva e di Conoscere le cause della malattia: fattori ambientali, geni e funzione arrivare ad alti livelli di disabilità rispetto a chi ha esordio di malattia a 20 anni. Uno degli ambiti più promettenti per l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici è quello genetico. E questo è uno dei campi di eccellenza della ricerca finanziata FISM. Nell’agosto 2011 su Nature sono stati Il vero capitale umano di AISM: i giovani ricercatori pubblicati gli esiti dello studio curato dall’International Multiple Sclerosis Genetics Consortium” (IMSGC) e Tra i ricercatori finanziati e rappresentati in questo Compendio c’è anche il vincitore del Premio Rita Levi dal “Wellcome Trust Case Control Consortium”, la cui parte italiana è stata co-finanziata da FISM tramite Montalcini 2012, che verrà premiato al Congresso FISM del 30 maggio 2012. È un ricercatore molto gio- uno dei progetti speciali 2009 e coordinata da Sandra d’Alfonso (Università Piemonte orientale, Novara) e vane che, pur avendo da poco iniziato il suo percorso di ricerca nella sclerosi multipla, ha già sviluppato Filippo Martinelli Boneschi (Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, pag. 181). Lo studio ha identificato 29 un rilevante “publication record”. Questo è ciò che fortemente desidera la ricerca AISM: valorizzare quello nuove varianti genetiche coinvolte nella SM, confermando l’implicazione di 23 associazioni già note. Uno straordinario capitale umano che sono i giovani ricercatori, come dice la stessa Professoressa Montalcini, dei geni di cui si è confermata l’associabilità al rischio di SM è il gene CBLB, identificato per la prima volta Presidente onorario di AISM. Vale per quelli che vincono il Premio a lei intitolato, ma anche per coloro nel 2010 dal gruppo di Francesco Cucca (Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, Cittadella Universitaria che possono rispecchiarsi per età, passione e competenza nei vincitori. Insieme ai ricercatori senior, da Monserrato - Cagliari, vedi Compendio 2010: Uno studio di associazione su tutto il genoma in Sardegna tempo preziosi per la ricerca italiana e internazionale sulla SM, sapranno sempre di più fare la differenza in per svelare i fattori genetici predisponenti nei confronti della sclerosi multipla, pag. 27). Lo stesso gruppo un campo di ricerca dove l’Italia è ai vertici mondiali. È l’investimento sull’eccellenza dei giovani ricercatori ora ha effettuato determinanti passi avanti, sia a livello quantitativo che qualitativo, analizzando le varianti la vera speranza per le persone con SM, che all’AISM guardano da sempre con la fiducia di chi sa che si del gene e la loro funzione rispetto all’attivazione delle cellule del sistema immune implicate nella SM. Così sta giorno dopo giorno conquistando la liberà dalla sclerosi multipla. pure lo studio coordinato da Umberto Dianzani e Sandra D’Alfonso (Università Piemonte Orientale - No- vara) ha indagato la funzione di altri geni nella risposta antivirale, producendo anche un nutrito numero di Paola Zaratin pubblicazioni (pagg. 20-21). La linea, a livello nazionale e internazionale sembra dunque tracciata: l’au- Direttore Ricerca Scientifica AISM-FISM mento di conoscenza dei geni coinvolti nella SM e la loro correlazione funzionale con le cellule del sistema immune apre la via all’identificazione di nuovi target terapeutici anche per le forme progressive. 8 9 INTRODUCTION TO THE COMPENDIUM 2012 introduction

«The mission of every man consists in being a force of nature and not an agitated clot of troubles and grudges that recriminates because the universe doesn’t devote itself to making him happy. I am of the opinion that my life belongs to the community and as long as I live it will be a privilege to do as much as I am able to for it. It is a sort of burning torch that I have the task to hold for a brief moment. I want to make it shine as much as possible before passing it on to future generations». In this long quotation from George Bernard Shaw there lies the essence of AISM scientific research: it is born of people, researchers, who welcome the challenge to be forces of nature, without allowing themselves the alibi of the difficulties that, today too, are heavily imposed by society, by the economy and by politics. The AISM researchers are people that build the present thinking about the future and the whole community in which they live, considering it a privilege to be allowed to give the best of themselves, in every promising field of studies, to allow other people with MS, millions around the world, to be able to choose to live as forces of nature and not as agitated clots of troubles. Scientific research, in any case, is done with intentions and values, but above all with figures. And it is in the figures that AISM research reveals its strength, its constant ability to grow in value. This Compendium documents how in 2011 AISM financed 38 research projects, 7 fellowships, and various special projects, with a general investment in the research of over 6 million euros. These are important figures, which have also grown compared to 2010: at that time 37 research projects were supported, 13 fellowships, and other special projects with 4.3 million euros. This was also made possible by the 5 per thousand funds set aside on people’s tax declarations: while the economic crisis cuts funds in so many sectors, citizens allow and indeed ask AISM and its researchers to intensify their research, recognizing the effectiveness of its results.

Other numbers too make us proud of what we are achieving: since 1987 AISM and FISM have financed in all 295 researchers on MS. A true school, a consolidated one, which is leaving a mark at a national and an international level. And the fact that 76% of the researchers financed continue to do research on MS points to the major capacity of AISM research to attract, support and accompany the best researchers during their whole career. This is value that generates value: how one starts from basic research and arrives at the clinical phase, how AISM is able, together with its partners, to succeed in patenting the intellectual property of the discoveries made, so a young person that aims at excellence can begin with AISM to develop research thanks to a training grant, continue with research grants and go on to conduct autonomous and remarkable research projects through Senior Grants, and lastly the Programme called “Build a career in research”, the Rita Levi Montalcini Prize.

Returning to the figures, with an overall look at the distribution of the 3 million euros invested by the 2011 Research Funds, we see that 61.1% was used for fundamental research, 16.9% concerned pre-clinical research, 12.3% translational, and 9.7% clinical research. Everything starts from basic research, but everything has to attain real benefits for people with MS, that is to say the true bosses of an association like AISM and its scientific research. Here, probably, there is an important challenge for research in the world, which in the next few years can be faced by getting together and coordinating research better and better at a national but also at an international level, as in the fields of progressive forms, histamines, stem cells or paediatric MS: we have to make sure that many of the projects selected and financed move quickly up the staircase of research and, starting from the first steps, go all the way, to identification of therapies and decisive treatments. A world free of multiple sclerosis, a world in which people with MS are free to choose the quality of their own lives, over and above the constraints imposed by the illness, is also produced by the goals that AISM research, together with all its researchers, is identifying and attaining, step by step.

Mario A. Battaglia FISM Chairman

10 11 AISM Research: projects focused on the person

The research goal that AISM finances through its FISM Foundation is in its starting point: people with The development of MS, in particular, seems to involve different mechanisms. One of these, which opens multiple sclerosis have the right to get answers to their questions, to have the best therapies and the most up new expectations, is that of oligodendrocytal mitochondrial function (Paolo Pinton, University of Fer- effective treatments in the shortest possible time. In a word, they have the right to research that changes rara, pp. 30-33). It must also be mentioned that there is increasing understanding of the environmental life for the better, for everybody, once and for all. factors implicated in the onset of MS. A representative example in this direction is the international study on risk factors in MS coordinated by Maura Pugliatti (University of Sassari, pp. 38-41). There is also an But what does enacting these rights mean today? increase in studies and confirmations on the Epstein Barr virus in MS (Dianzani-D’Alfonso, Pugliatti and Giulietta Venturi, Higher Institute of Health, pp. 20-29). The most up-to-date translation of the value of AISM research is probably in two words, or more exactly in two strategies that seem to be winning ones. The first is ‘partnership’. ‘Creation of new operational Therapeutic rehabilitation for quality life models’ is the second fundamental strategy. AISM has always directly invested in research on rehabilitation, which it also carries out as intramural research. The latest studies published at an international level are highlighting more and more the therapeutic In 2011, in particular, AISM was strongly committed to setting up new operational models, not only inte- role of rehabilitation, and its potential involvement in the maintenance of neuronal plasticity. This is the grating the excellence of Italian research, but also opening up to new people and bodies, to new forms direction of studies devoted to the impact of motor and cognitive rehabilitation on the dynamic properties of international cooperation, as well as to other people involved in public university research, that can of the cerebral structure, in view of personalization of therapeutic actions in people with Multiple Sclerosis. become the bases for the identification of new therapeutic targets. In this connection, we can underline Not only rehabilitation: the quality of life is also closely linked to knowledge of multiple sclerosis that people two symbolic examples. can develop with appropriate tools, right from the time of diagnosis. Therefore of major importance for AISM are the projects coordinated by Alessandra Solari and Andrea Giordano (Besta Research Institute, Model of research that creates value Milan, pp. 68-75) on physical and psychological wellbeing and on the participation of people with MS in Among the FISM studies financed in 2010 there is one that is headed by Maria Pia Abbracchio, University decisions on how best to face the illness. An evaluation of the information aid ‘Knowing improves’ has of Milan (see page 169): this is the source of a first example of a new partnership that gives value to AISM been drawn up by Claudia Borreani (IRCCS Foundation National Tumour Institute, Milan, pp. 76-79). research. Thanks to the joint work of researchers at Milan University, Pisa University, the National Researc Council and Turin University, the new receptor GPR17 was identified, a new target for the development New therapeutic targets and new diagnostic methods of innovative therapies. Now Milan University and FISM have together deposited a patent to protect this The studies published here have underlined new possible therapeutic targets and biomarkers. Just to research, and to operate in the primary interest of people with MS. give one example, of great interest is the study that has led Giuseppe Battaglia (IRCCS Neuromed, Ca- merelle, Pozzilli, Isernia, pp. 90-93) to identify the direct interaction between inflammation and neuronal International Progressive Multiple Sclerosis Collaborative activity in experimental models of MS and to hypothesize the protective role of glutamate in inflammatory There exists, and the FISM 2012 congress documents a significant part of it, a big portfolio of FISM finan- and neurodegenerative illnesses. The challenge for the association now is to identify how it is possible ced research on progressive forms of multiple sclerosis. But this excellence is not yet enough to identify to validate such targets and the biomarkers identified by the financed studies, and how it is possible to specific therapies, or even to define protocols of clinical studies that measure the effectiveness of actions continue from the basic research to the other important phases of research. It seems to be of particular for progressive forms. To accelerate, to fill the gaps, it was necessary to create a new operational model interest, among the new diagnostic methods, to continue the researches of Francesca Gilli, 2011 Rita of partnership. Only by coordinating the respective researches within progressive forms can the bodies Levi Montalcini Prize (Institute of Neurosciences of the Cavalieri Ottolenghi Foundation, Clinical Neuro- active all over the world bring into focus what is still missing and, above all, define how to invest in order biology Unit, Orbassano, Turin): it has confirmed the action of 7 genes involved in the immuno-biological to attain the desired answers. And so AISM got in the front line, together with our International MSIF Fede- mechanisms typical of pregnancy (pp. 128-131), which in future can be the targets of specific therapies. ration and the sister associations, the MS Societies of USA, Canada, United Kingdom and Holland in the Likewise, the studies by Massimo Filippi (San Raffaele Institute, Milan, pp. 144-149) reveal anatomical and creation of the International Progressive Multiple Sclerosis Collaborative, which was launched in Italy on functional substrata responsible for the presence and gravity of the cognitive deficit in patients with MS, the occasion of the FISM 2012 Congress. Here once again we see how a new operational model of part- highlighting new pathogenic mechanisms. In the near future all this could make it possible to identify new nership between different bodies aims to give research an effective orientation, maximizing for everyone pharmacological and rehabilitative strategies. Lastly, in this sphere, showing how many financed studies the effectiveness of the investments and shortening the time necessary to get the desired results. have implications for progressive forms of MS, the study by Paolo Muraro (Imperial College, London, UK, pp. 150-154) has stressed that those who are diagnosed between 49 and 50 have a higher probability Knowing the causes of the illness: environmental factors, genes and function of developing progressive secondary MS and reaching high levels of disability compared to those whose One of the most promising spheres for the identification of new therapeutic targets is genetics. And this is illness starts at 20. one of the fields of excellence of FISM financed research. In August 2011 “Nature” published the results of the study handled by the International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC) and by the Well- The true human capital of AISM: the young researchers come Trust Case Control Consortium, the Italian part of which was co-financed by FISM through one of Among the financed researchers represented in this Compendium there is also the winner of the 2012 the 2009 special projects and coordinated by Sandra D’Alfonso (University of Eastern Piedmont, Novara) Rita Levi Montalcini Prize, which will be given at the FISM Congress on 30 May 2012. This is a very and Filippo Martinelli Boneschi (San Raffaele Scientific Institute, Milan, page 181). The study identified 29 young researcher that, though having only recently begun to do research on multiple sclerosis, already new genetic variants involved in MS, confirming the implication of 23 already known associations. One of has a major “track record” regarding publications. This is what AISM research greatly desires: valorising the genes which it was confirmed may be associated with the risk of MS is the CBLB gene, first identified that remarkable human capital that is formed by young researchers, as Professor Montalcini, Honorary in 2010 by the group of Francesco Cucca (Institute for Genetic and Biomedical Research, Monserrato President of AISM, herself says. It is valid for those that win the prize named after her, but also for those University Citadel - Cagliari, see Compendium 2010: An association study on the whole genome in Sar- people that for age, passion and competence can mirror themselves in the winners. Together with the dinia to reveal the predisposing genetic factors towards multiple sclerosis, page 27). The same group senior researchers, who have always been precious for Italian and international research on MS, they will has now made decisive steps forward, both at a quantitative and at a qualitative level, analyzing the gene succeed more and more in making the difference in a field of research in which Italy is one of the world variants and their function in relation to the activation of the cells of the immune system implicated in MS. leaders. In investment in the excellence of young researchers lies the true hope for people with MS, who Then the study coordinated by Umberto Dianzani and Sandra D’Alfonso (University of Eastern Piedmont, have always looked to AISM with the trust of those who know that, day by day, freedom from multiple Novara) has investigated the function of other genes in antiviral response, also producing a large number sclerosis is being achieved. of publications (pp. 20-21). Thus at a national and an international level the line seems to be traced out: an increase in knowledge of the genes involved in MS and their functional correlation with the cells of the Paola Zaratin immune system opens up the way to identification of new therapeutic targets, for progressive forms too. AISM-FISM Scientific Research Director

12 13 conoscere le cause della malattia ASSOCIAZIONE FRA GENI E AMBIENTE NELLA SCLEROSI MULTIPLA CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

CONCLUSIONI RESPONSABILE DEL PROGETTO LEONARDO A. SECHI Il Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis può essere considerate un patogeno Professore ordinario ambientale in quanto è la causa della Paratubercolosi nei ruminanti, infetta numerosi animali Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari monogastrici inclusi i primati e l’uomo e si trova con alta frequenza nell’ambiente e negli alimenti, soprattutto il latte. Possiamo ipotizzare che attraverso un processo di mimetismo molecolare Collaboratori: il MAP possa fungere da agente scatenante la malattia in soggetti geneticamente predisposti. DAVIDE COSSU Si dovrebbe investigare se anticorpi anti-MAP2694 che cross reagiscono con il TCR dei linfociti SPERANZA MASALA T possano portare a una deplezione delle stesse cellule precipitando gli eventi che portano DANIELA PACCAGNINI γδ alla MS. Collaborazioni con altri gruppi: ELEONORA COCCO, MARIA GIOVANNA MARROSU, Università di Cagliari LINKING GENES AND ENVIRONMENT

PREMESSE E OBIETTIVI IN MULTIPLE SCLEROSIS

L’eziologia della sclerosi multipla (SM) è a tutt’oggi sconosciuta, ma si ritiene che sia una pato- INTRODUCTION AND AIMS logia multifattoriale, determinata dall’azione combinata di diverse varianti genetiche in presenza di un’esposizione a fattori ambientali scatenanti/permissivi. The etiology of multiple sclerosis (MS) is still unknown but is believed to be a multifactorial Scopo dello studio pilota era quello di verificare se il Mycobacterium avium subsp. paratu- disease, determined by the combined action of different genetic variants in the presence of ex- berculosis (MAP, un batterio patogeno causa della Paratubercolosi nei ruminanti, largamente posure to environmental triggers /permissive. The aim of this pilot study was to assess whether disseminato nell’ambiente), ed il virus di Epstein-Bar potevano essere essere fra i principali Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP, a bacterium responsible of Paratuber- candidati tra i fattori non ereditabili associati alla SM in Sardegna. Lo studio voleva verificare se culosis in ruminants which is widely disseminated in the environment) and Epstein-Bar Virus, più di un fattore ambientale fosse necessario per scatenare la risposta autoimmune in individui could be among the possible candidates among the causative (non genetic) factors involved geneticamente predisposti. in the etiology of MS. The study wanted to see if more than one environmental factor may be associated to the disease in Sardinia. In future the same factors could be investigated if are RISULTATI necessary to trigger (or precipitate) the autoimmune response in genetically predisposed individuals. Si tratta di uno studio pilota le cui risorse sono state utilizzare per acquistare i reagenti necessari alla ricerca e supportare una piccola borsa per un giovane ricercatore In collaborazione RESULTS con la prof. Maria Giovanna Marrosu e la dott.ssa Eleonora Cocco dell’Università di Cagliari abbiamo portato avanti due studi. Nel primo, sono stati coinvolti 50 pazienti con SM e 57 This is a pilot study with limited financial resources. The little resources available were used to controlli etnicamente e demograficamente confrontabili liberi da qualsiasi farmaci immunomo- purchase the necessary reagents for research and support a short fellowship for a young rese- dulatori o immunosoppressivi per almeno 6 mesi. Abbiamo voluto ricercare oltre alla presenza archer. In collaboration with the invaluable collaboration of Professor Maria Giovanna Marrosu di MAP anche geni del batterio che fossero in comune con il repertorio di geni espressi nel and Dr. Eleonora Cocco of the University of Cagliari, we conducted two studies. In the first, 50 SNC umano. Dopo analisi Blast P, abbiamo identificato il gene codificante per la MAP2694. La MS patients and 57 ethnically and demographically comparable controls free from any immu- proteina MAP 2694 è una specie-specifica proteina transmembrana conservato nella famiglia nomodulatory or immunosuppressive drugs for at least 6 months were involved. We wanted to Mycobacteriaceae. Il gene è stato clonato e la proteina espressa di circa 78,5 kDa (la proteine search, in addition to the presence of specific MAP DNA in the blood of the people involved in di fusione MBP di 42,5 kDa e la MAP2694 di 36 kDa. Abbiamo inoltre osservato la presenza di the study, if MAP proteins could mimic human proteins expressed in the CNS. For this, a Blast DNA MAP specifico mediante IS900 PCR. In entrambi i casi una risposta più elevata statistica- P analysis was performed and the MAP gene encoding the MAP2694 was identified. The pro- mente significativa è stata riscontrata nei pazienti MS rispetto ai controlli ( 32% dei pazienti con tein MAP 2694 is a species-specific transmembrane protein retained in the family Mycobacte- SM rispetto al 2% dei controlli). riaceae. The gene has been cloned and the expressed protein of about 78.5 kDa (the fusion La proteina MAP2694 ha un’omologia del 33% con la regione C del recettore della cellula T proteins MBP of 42.5 kDa and the 36-kDa MAP2694) was used to search a humoral response (TCR) catena γ espressa nelle cellule T γδ. Le cellule T γδ pattugliano la barriera epiteliale inte- in the plasma of the people involved in the study. Thirty-two percent of MS patients, but only stinale e sono importanti per il controllo di agenti patogeni infettivi, in particolare micobatteri. È 2% of healthy controls, also harbored Abs recognizing the MAP2694 protein, which displays a stato visto inoltre che la deplezione delle cellule T γδ in modelli murini EAE porta rapidamente 33% homology with the C region of the T-cell receptor (TCR) γ chain expressed by γδ T cells. allo sviluppo e/o esacerbazione della malattia. In un secondo studio il numero dei pazienti MS The γδ Tcell subset patrols gut epithelial barriers and has been called into question in clearing studiati è stato portato a 119 e 117 controlli. Il DNA IS900 specie specifico di MAP è stato infectious pathogens, most notably mycobacteria. As depletion of γδ T cells in murine models ricercato nel sangue dei pazienti con MS e nei controlli. Inoltre, abbiamo identificato, clonato of experimental autoimmune encephalomyelitis leads to disease development or exacerbation, e purificato un’ulteriore proteina di MAP (Mappa FprB) omologa alla proteina umana mielina P we proposed that anti-MAP2694 Abs may cross-react with the γδ TCR, possibly leading to γδ zero (P0) (NP_000521.2). Gli anticorpi contro questa proteina sono stati ricercati nel sangue T-cell depletion triggering increased MS susceptibility. dei pazienti con SM. Sugli stessi campioni è stato ricercato anche il DNA del virus di Epstein In a second study, the number of MS patients studied was increased to 119 and 117 controls. (EBV) che è stato recentemente spesso associato alla MS. Anche in questo caso la presenza The specie-specific MAP IS900 DNA was searched in the blood of MS patients and controls. del virus è stata ritrovata con una differenza statisticamente significativa nei pazienti con MS ri- In addition, we identified, cloned and purified a protein (MAP FprB) homologous to the human spetto ai controlli. Tutti gli obiettivi di partenza del progetto pilota sono stati raggiunti e la ricerca protein myelin P zero (P0) (NP_000521.2). Antibodies against this protein have been also sear- merita senz’altro di essere proseguita aprendo nuovi scenari nei fattori che possono concorrere ched in the blood of patients with MS. 16 al precipitare della malattia. On the same samples was also sought Epstein Barr Virus DNA (EBV) which has been asso- 17 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

ciated with MS. Also in this case the presence of virus was found with a statistically significant PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONVEGNI difference in MS patients in comparison to controls. All initial objectives of the pilot project have been achieved and the research clearly deserve Cossu D, Masala S, Cocco E, Paccagnini D, Frau J, Marrosu MG, Sechi LA. Are Mycobacterium to be continued opening new scenarios in the factors that may contribute to worsening of the avium subsp. paratuberculosis and Epstein-Barr virus triggers of multiple sclerosis in Sardinia? Mult Scler. 2012 Jan 19. [Epub ahead of print] PMID: 22261119 disease. Sechi LA. MAP e Salute Pubblica. Seminario su invito “Paratubercolosi: prospettive per la sanita’ CONCLUSIONS animale e per la salute pubblica”. Roma - Ministero della Salute – 10 novembre 2011

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis can be considered an environmental pa- Sechi LA. Il Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, un commune denominatore per il morbo di Crohn, diabete di tipo 1 e sclerosi multipla?. Lettura su invito al 39 Congresso Nazionale thogen as it is the cause of Paratuberculosis in ruminants, it infects numerous monogastric di Microbiologia. Riccione 3-6 ottobre 2011 animals including primates and humans and it is found with high frequency in the environment and in foods, especially milk. We may hypothesize that through a process of molecular mimicry, Cossu D, Cocco E, Paccagnini D, Masala S, Ahmed N, Frau J, Marrosu MG e Sechi LA. Asso- MAP can act as agent for triggering disease in genetically predisposed individuals. ciation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis with 1 Multiple Sclerosis in Sardinian The possibility that anti-MAP2694 Abs may cross-react with the γδ T-cells, possibly leading to patients. PLoS ONE , 6(4): e18482. doi:10.1371/journal.pone.0018482 published 13 April 2011 γδ T-cell depletion triggering MS susceptibility needs to be explored. PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 1 anno - 25.000 €

18 19 RICERCA DI MARCATORI COINVOLTI NELLO SVILUPPO DELLA SCLEROSI MULTIPLA: CORRELAZIONE CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA DI ALTERAZIONI GENETICHE E FUNZIONALI DELL’IMMUNITÀ CELLULO-MEDIATA CON MARCATORI zione nei confronti di SM indipendentemente da DRB1*15,Cw*05 e MOG-142. La presenza di DELL’INFEZIONE DA EBV Cw*05 incrementava significativamente la protezione osservata nel gruppo HLA-A*02+. Estesa l’analisi agli alleli HLA-B*44 e -B*18 in 1445 pazienti e 973 controlli e in una coorte britannica di 721 pazienti con SM, 408 controlli e 480 trio familiari, sono stati identificati due effetti protettivi indipendenti tra loro e da DR15,identificati rispettivamente da A*02-Cw*05- B*44 e da A*02. RESPONSABILE DEL PROGETTO Abbiamo partecipato a uno studio di replica di 12 nuovi loci di suscettibilità per SM identificati in UMBERTO DIANZANI recenti studi GWAS. I risultati confermano l’associazione per tutti i geni eccetto KIF1B. Abbia- Professore di Immunologia mo replicato l’associazione del gene CBLB in una popolazione di 1435 pazienti italiani e 1466 Dipartimento di Scienze della Salute controlli. Infine abbiamo confermato queste associazioni in un GWAS collaborativo eseguito Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara su 9772 pazienti ottenuti da 15 diverse nazioni europee. L’analisi dei geni di IFIH1, Munc13-4, syntaxina-11, SAP, XIAP, TACI, AIRE e FOXP3 non ha identificato nessuna variazione associata Co-Responsabile del progetto a SM. Tuttavia abbiamo identificato variazioni dei geni di Munc13-4 e SAP associate alla ALPS SANDRA D’ALFONSO e una variazione del gene di XIAP associata alla febbre Periodica Idiopatica. IL-17 è coinvolta Professore di Genetica Medica Dipartimento di Scienze della Salute nella patogenesi di SM e varianti del gene di ICOS sono associate a SM. La stimolazione di Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara ICOS induce una potente secrezione di IL-17A e IL-10 nei linfociti T helper derivati da controlli sani, mentre induce IL-17A ma non IL-10 nelle cellule ottenute da pazienti con SM. Ciò è in Collaboratori: parte ascrivibile alle varianti del gene di ICOS associate alla SM e all’effetto funzionale che ANNALISA CHIOCCHETTI ICOS esercita sulle cellule dendritiche attraverso la stimolazione del suo ligando B7h. Abbiamo RICCARDO MESTURINI ELENA BOGGIO descritto come una difettosa funzione di Fas e una iperespressione della citochina osteopon- LUCA GIGLIOTTI tina sono coinvolte nello sviluppo di SM. Abbiamo dimostrato che il difetto di Fas è anche GIUSEPPE CAPPELLANO coinvolto nello sviluppo della Polineuropatia Infiammatoria Cronica Demielinizzante, mentre la ELISABETTA ORILIERI iperespressione di osteopontina è anche coinvolta nella malattia di Alzheimer. L’analisi dei livelli SARA BOCCA sierici degli anticorpi contro l’antigene nucleare di EBV (EBNA) in 258 pazienti con SM e 125 NADIA BARIZZONE LAURA BERGAMASCHI controlli ha evidenziato una maggiore percentuale di soggetti anti-EBNA+ e livelli più elevati di LUCIA CORRADO questi anticorpi nei pazienti. Abbiamo inoltre trovato una correlazione tra livelli di anti-EBNA e MAURIZIO LEONE varianti dei geni di SAP, IL7Ra e CD6.Infine abbiamo calcolato una misura aggregata del rischio CRISTOFORO COMI per SM sulla base di 26 loci di suscettibilità genetica e dei livelli di anticorpi sierici anti-EBV; questa analisi ha identificato un progressivo incremento (da 2.91 a 9.2 volte) del rischio di SM Collaborazioni con altri gruppi: MARCO SALVETTI con l’aumento nel numero dei fattori di rischio genetico, con un ulteriore incremento legato alla Sapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali inclusione dei livelli di anticorpi sierici anti-EBNA. Dipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, Roma CONCLUSIONI

PREMESSE E OBIETTIVI Questi dati suggeriscono che varianti di alcuni geni coinvolti nella risposta anti-virale possono influenzare lo sviluppo di SM e di altre malattie autoimmuni e confermano una possibile rela- Il progetto ha ricercato alterazioni geniche e funzionali della risposta immunitaria coinvolte nello zione tra infezione da EBV e sviluppo di SM. Le variazioni genetiche e l’infezione da EBV sem- sviluppo della sclerosi multipla (SM), focalizzandosi su geni e funzioni coinvolte nella risposta brano contribuire indipendentemente alla suscettibilità a SM senza una interazione evidente. antivirale e nello spegnimento della risposta immunitaria e ricercando correlazioni con marcatori della infezione da virus di Epstein Barr (EBV). Infatti dati epidemiologici suggeriscono che EBV possa essere un fattore scatenante della SM e che le basi genetiche della malattia siano SEARCH FOR MARKERS INVOLVED IN complesse e coinvolgano l’interazione di molteplici loci genetici capaci di influenzare la risposta immunitaria. Il progetto nasce da nostri studi precedenti che hanno dimostrato che lo sviluppo DEVELOPMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS: di SM può essere favorito da variazioni geniche che riducono l’efficacia della risposta immuni- CORRELATION OF GENETIC AND FUNCTIONAL taria citotossica antivirale e dei meccanismi di spegnimento della risposta immunitaria; entrambi questi difetti possono ritardare l’eliminazione delle infezioni virali e/o prolungare la risposta ALTERATIONS OF CELL-MEDIATED IMMUNITY WITH immune anti-virale favorendo così lo sviluppo di cross-reazioni tra antigeni virali e antigeni self con un meccanismo di “mimetismo molecolare”. È interessante notare che variazioni deleterie MARKERS OF EBV INFECTION di alcuni di questi geni (Fas, osteopontina, perforina, ICOS) sono anche coinvolti nello sviluppo di malattie ereditarie monogeniche, come la sindrome autoimmune linfoproliferativa (ALPS), la INTRODUCTION AND AIMS linfoistiocitosi emofagocitica familiare (FHL) e la immunodeficienza comune variabile (CVID), caratterizzate da linfoproliferazione (e possibile autoimmunità) dovuta a un difetto nella risposta This project searched for genes and functional alterations of the immune response playing a anti-virale o nello spegnimento della risposta immune. role in multiple sclerosis (MS) development focusing on genes and functions involved in the antiviral response and the immune response switching off, and analysing correlations with RISULTATI markers of Epstein Barr virus (EBV). Epidemiological data, indeed, suggest that a MS environmental trigger may be EBV, and genetic basis is complex involving interactions of multiple Abbiamo esplorato il ruolo di degli alleli HLA-A*02,HLA-Cw*05 e MOG-142 nella modulazione loci influencing the immune response. The project stems from our previous data showing that 20 del rischio per SM in 1273 pazienti con SM e 1075 controlli. A*02 conferiva una forte prote- MS development may be favoured by gene variations impairing cell-mediated cytotoxicity and 21 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

the immune response switching off; both defects may delay clearance of the infection and/or PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI prolong the immune response and thus favour cross-reactions between viral and self antigens by “molecular mimicry”. Intriguingly, deleterious variations of some of these genes (i.e. Fas, Boggio E, Melensi M, Bocca S, Chiocchetti A, Comi C, Clemente N, Orilieri E, Soluri MF, D’Alfonso osteopontin, perforin, and ICOS) are also involved in inherited monogenic diseases with lym- S, Mechelli R, Gentile G, Poggi A, Salvetti M, Ramenghi U, Dianzani U. The -346T polymorphism of the SH2D1A gene is associated with development of autoimmunity/lymphoproliferation in males phoproliferation (and possibly autoimmunity) due to defective anti-viral response or impaired with defective Fas function. Hum Immunol. In press 2012 immune response switching off, i.e autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), familial hemophagocytitc lymphohistiocytosis (FHL), and common variable immunodeficiency (CVID). International Multiple Sclerosis Genetics Conssortium (IMSGC): Esposito F, Patsopoulos NA, Ce- pok S, Kockum I, Leppä V, Booth DR, Heard RN, Stewart GJ, Cox M, Scott RJ, Lechner-Scott J, RESULTS Goris A, Dobosi R, Dubois B, Rioux JD, Oturai AB, Søndergaard HB, Sellebjerg F, Sørensen PS, Reunanen M, Koivisto K, Cournu-Rebeix I, Fontaine B, Winkelmann J, Gieger C, Infante-Duarte C, Zipp F, Bergamaschi L, Leone M, Bergamaschi R, Cavalla P, Lorentzen AR, Mero IL, Celius EG, We explored the role of HLA-A*02, HLA-Cw*05 and MOG-142 in modulating the MS risk in Harbo HF, Spurkland A, Comabella M, Brynedal B, Alfredsson L, Bernardinelli L, Robertson NP, 1273 MS patients and 1075 controls. A*02 conferred a strong MS protection independently of Hawkins CP, Barcellos LF, Beecham G, Bush W, Cree BA, Daly MJ, Ivinson AJ, Aubin C, Compston DRB1*15, Cw*05 and MOG-142. Presence of Cw*05 significantly enhanced the protection in A, D’Alfonso S, Haines JL, Hauser SL, Hemmer B, Hillert J, McCauley JL, Oksenberg J, Olsson T, the HLA-A*02-positive group. Moreover, we extended the analysis to HLA-B*44 and -B*18 in Palotie A, Peltonen L, Pericak-Vance MA, Saarela J, Sawcer SJ, Stranger B, Boneschi FM, Comi G, Hafle DA, de Bakker PI, De Jager PL.. IL12A, MPHOSPH9/CDK2AP1 and RGS1 are novel multiple 1445 patients and 973 controls and in a UK cohort (721 MS patients, 408 controls, and 480 sclerosis susceptibility loci. Genes Immun 11:397-405, 2011 family trios). We identified at least two independent protective effects, independent of DR15, which were tagged by A*02-Cw*05- B*44 and A*02, respectively. Corrado L, Bergamaschi L, Barizzone N, Fasano ME, Guerini FR, Salvetti M, Galimberti D, Be- We participated to a replication study of 12 novel MS loci identified in recently published GWAS nedetti MD, Leone M, D’Alfonso S. Association of the CBLB gene with multiple sclerosis: new studies. Results confirmed the association for all genes except for KIF1B. Moreover, we repli- evidence from a replication study in an Italian population. J Med Genet 48:210-1, 2011 cated the association of the CBLB gene in a population of 1435 Italian patients and 1466 con- Bergamaschi L, Ban M, Barizzone N, Leone M, Ferrante D, Fasano ME, Guerini FR,Corrado L, Nal- trols. Finally, we confirmed all these association in a collaborative GWAS involving 9772 cases di P, Dametto E, Agliardi C, Salvetti M, Mechelli R, Galimberti D, Scarpini E, Cavalla P, Bargiggia V, of European descent from 15 countries.Analysis of the IFIH1, Munc13-4, syntaxin-11, SAP, Caputo D, Cordera S, Monaco F, Momigliano-Richiardi P, D’Alfonso S. Association of HLA class XIAP, TACI, AIRE, and FOXP3 genes did not detect MS-associated variations. However, we I markers with multiple sclerosis in the Italian and UK population: evidence of two independent found Munc13-4 and SAP gene variations associated with Autoimmune Lymphoproliferative protective effects. J Med Genet 48:485-92, 2011 Syndrome (ALPS), and a XIAP variation associated with Idiopatic Periodic Fever. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. Leppa V, Surakka I, Tienari PJ, Elovaara I, IL-17 is involved in MS pathogenesis and variants of the ICOS gene are associated with MS. Compston A, Sawcer S, Robertson N, De Jager PL, Aubin C, Hafler DA, Oturai AB, Bach Sønder- We found that ICOS triggering induced potent secretion of IL-17A and IL-10 in T helper cells gaard H, Sellebjerg F, Soelberg Sørensen P, Hemmer B, Cepok S, Winkelmann J, Wichmann HE, from healthy controls, but it induced IL-17A but not IL-10 in those from MS patients. This Comabella M, Bustamante MF, Montalban X, Olsson T, Kockum I, Hillert J, Alfredsson L, Goris difference was partly ascribable to the ICOS genetic variants associated with MS and to the A, Dubois B, Mero IL, Smestad C, Celius EG, Harbo HF, D’Alfonso S, Bergamaschi L, Leone M, Ristori G, Kappos L, Hauser SL, Cournu I, Fontaine B, Boonen S, Polman C, Palotie A, Peltonen L, functional effect that ICOS exerts on dendritic cells by triggering its ligand B7h. These data are Saarela J.The genetic association of variants in CD6, TNFRSF1A and IRF8 to multiple sclerosis: a intriguing since IL-17 and IL-10 exert opposite effect on the autoimmune response in MS. multicenter case-control study. PLoS One, 6:e18813, 2011 We previously reported that defective Fas function and osteopontin hyperexpression are involved in development of MS. Now, we found that the former is also involved in Chronic Inflam- International Multiple Sclerosis Genetics Consortium; Wellcome Trust Case Control Consortium 2, matory Demyelinating Polyneuropathy and the latter in Alzheimer disease. Sawcer S, Hellenthal G, Pirinen M, Spencer CC, Patsopoulos NA, Moutsianas L, Dilthey A, Su Z, Freeman C, Hunt SE, Edkins S, Gray E, Booth DR, Potter SC, Goris A, Band G, Oturai AB, Strange We analysed the serum levels of antibodies to the EBV nuclear antigen (EBNA) in 258 MS A, Saarela J, Bellenguez C, Fontaine B, Gillman M, Hemmer B, Gwilliam R, Zipp F, Jayakumar A, patients and 125 controls. We observed a higher percentage of anti-EBNA+ individuals and a Martin R, Leslie S, Hawkins S, Giannoulatou E, D’alfonso S, Blackburn H, Boneschi FM, Liddle J, higher anti-EBNA concentrations in the patients. We found a correlation of the anti-EBNA levels Harbo HF, Perez ML, Spurkland A, Waller MJ, Mycko MP, Ricketts M, Comabella M, Hammond N, with variants of the SAP, IL7Ra, and CD6 genes. We calculated an aggregate measure of risk Kockum I, McCann OT, Ban M, Whittaker P, Kemppinen A, Weston P, Hawkins C, Widaa S, Zajicek of MS based on 26 genetic susceptibility loci and the anti-EBV serum levels. We observed a J, Dronov S, Robertson N, Bumpstead SJ, Barcellos LF, Ravindrarajah R, Abraham R, Alfredsson L, Ardlie K, Aubin C, Baker A, Baker K, Baranzini SE, Bergamaschi L, Bergamaschi R, Bernstein progressive increase of the OR with the increasing number of genetic risk factors, further en- A, Berthele A, Boggild M, Bradfield JP, Brassat D, Broadley SA, Buck D, Butzkueven H, Capra R, hanced by inclusion of the anti-EBNA levels (OR ranging from 2.91 to 9.2). Carroll WM, Cavalla P, Celius EG, Cepok S, Chiavacci R, Clerget-Darpoux F, Clysters K, Comi G, Cossburn M, Cournu-Rebeix I, Cox MB, Cozen W, Cree BA, Cross AH, Cusi D, Daly MJ, Davis E, CONCLUSIONS de Bakker PI, Debouverie M, D’hooghe MB, Dixon K, Dobosi R, Dubois B, Ellinghaus D, Elovaara I, Esposito F, Fontenille C, Foote S, Franke A, Galimberti D, Ghezzi A, Glessner J, Gomez R, Gout O, Graham C, Grant SF, Guerini FR, Hakonarson H, Hall P, Hamsten A, Hartung HP, Heard RN, These data suggest that variants of some genes involved in the anti-viral response may influen- Heath S, Hobart J, Hoshi M, Infante-Duarte C, Ingram G, Ingram W, Islam T, Jagodic M, Kabesch ce development of MS and other autoimmune diseases, and confirmed a possible relationship M, Kermode AG, Kilpatrick TJ, Kim C, Klopp N, Koivisto K, Larsson M, Lathrop M, Lechner-Scott between EBV infection and MS development. Genetic variations and EBV infection seem to contribute independently to MS susceptibility without an evident interaction.

22 23 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

JS, Leone MA, Leppä V, Liljedahl U, Bomfim IL, Lincoln RR, Link J, Liu J, Lorentzen AR, Lupoli S, Dianzani C, Minelli R, Mesturini R, Chiocchetti A, Barrera G, Boscolo S, Sarasso C, Gigliotti CL, Macciardi F, Mack T, Marriott M, Martinelli V, Mason D, McCauley JL, Mentch F, Mero IL, Mihalova Sblattero D, Yagi J, Rojo JM, Fantozzi R, Dianzani U. B7H triggering inhibits umbilical vascu- T, Montalban X, Mottershead J, Myhr KM, Naldi P, Ollier W, Page A, Palotie A, Pelletier J, Piccio lar endothelial cell adhesiveness to tumor cell lines and polymorphonuclear cells. J. Immunol. L, Pickersgill T, Piehl F, Pobywajlo S, Quach HL, Ramsay PP, Reunanen M, Reynolds R, Rioux JD, 185:3970-9, 2010 Rodegher M, Roesner S, Rubio JP, Rückert IM, Salvetti M, Salvi E, Santaniello A, Schaefer CA, Schreiber S, Schulze C, Scott RJ, Sellebjerg F, Selmaj KW, Sexton D, Shen L, Simms-Acuna B, International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Booth DR, Heard RN, Stewart GJ, Skidmore S, Sleiman PM, Smestad C, Sørensen PS, Søndergaard HB, Stankovich J, Strange RC, Cox M, Scott RJ, Lechner-Scott J, Goris A, Dobosi R, Dubois B, Saarela J, Leppä V, Peltonen L, Sulonen AM, Sundqvist E, Syvänen AC, Taddeo F, Taylor B, Blackwell JM, Tienari P, Bramon E, Pirttila T, Cournu-Rebeix I, Fontaine B, Bergamaschi L, D’Alfonso S, Leone M, Lorentzen AR, Har- Tourbah A, Brown MA, Tronczynska E, Casas JP, Tubridy N, Corvin A, Vickery J, Jankowski J, Vil- bo HF, Celius EG, Spurkland A, Link J, Kockum I, Olsson T, Hillert J, Ban M, Baker A, Kemppinen A, loslada P, Markus HS, Wang K, Mathew CG, Wason J, Palmer CN, Wichmann HE, Plomin R, Willou- Sawcer S, Compston A, Robertson NP, De Jager PL, Hafler DA, Barcellos LF, Ivinson AJ,McCauley ghby E, Rautanen A, Winkelmann J, Wittig M, Trembath RC, Yaouanq J, Viswanathan AC, Zhang JL, Pericak-Vance MA, Oksenberg JR, Hauser SL, Sexton D, Haines J. Lack of support for asso- H, Wood NW, Zuvich R, Deloukas P, Langford C, Duncanson A, Oksenberg JR, Pericak-Vance MA, ciation between the KIF1B rs10492972[C] variant and multiple sclerosis. Nat Genet 42:469-70, Haines JL, Olsson T, Hillert J, Ivinson AJ, De Jager PL, Peltonen L, Stewart GJ, Hafler DA, Hauser 2010; author reply 470-1 SL, McVean G, Donnelly P, Compston A. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature 476:214-9, 2011 Comi C, Osio M, Ferretti M, MesturiniR, Cappellano G, Chiocchetti A, Carecchio M, Nascimbene C, Varrasi C, Cantello R, Mariani C, Monaco F, Dianzani U. Defective Fas-mediated T cell apopto- Barizzone N, Marchini M, Cappiello F, Chiocchetti A, Orilieri E, Ferrante D, Corrado L, Mellone S, sis predicts acute onset CIDP. J Peripher Nerv Syst 14:101-6, 2009 Scorza R, Dianzani U, D’Alfonso S. Association of osteopontin regulatory polymorphisms with systemic sclerosis. Hum Immunol. In press 2011 Ferretti M, Gattorno M, Chiocchetti A, Mesturini R, Orilieri E, Bensi T, Sormani MP, Cappellano G, Cerutti E, Nicola S, Biava A, Bardelli C, Federici S, Ceccherini I, Baldi M, Santoro C, DianzaniI, Comi C, Fleetwood T, Dianzani U. The role of T cell apoptosis in nervous system autoimmunity. Martini A, Dianzani U. The 423Q polymorphism of the XIAP gene influences monocyte function Autoimmunity Reviews. In press 2011 and is associated with periodic fever. Arthritis Rheum 60:3476-3484, 2009

Bergamaschi L, Leone M, Fasano ME, Guerini FR, Ferrante D, Bolognesi E, Barizzone N, Corra- doL, Naldi P, Agliardi C, Dametto E, Salvetti M, Visconti A, Galimberti D, Scarpini E, Vercellino M, PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 Bergamaschi R, Monaco F, Caputo D, Momigliano-Richiardi P, D’Alfonso S. HLA-class I markers per un periodo di 2 anni - 120.000 € and multiple sclerosis susceptibility in the Italian population. Genes and Immunity, 11:173-80, 2010

Ban M, McCauley JL, Zuvich R, Baker A, Bergamaschi L, Cox M, Kemppinen A, D’Alfonso S, Gue- rini FR, Lechner-Scott J, Dudbridge F, Wason J, Robertson NP, De Jager PL, Hafler DA, Barcellos LF, Ivinson AJ, Sexton D, Oksenberg JR, Hauser SL, Pericak-Vance MA, Haines J, Compston A, Sawcer S. A non-synonymous SNP within membrane metalloendopeptidase-like 1 (MMEL1) is associated with multiple sclerosis. Genes Immun 11:660-4, 2010

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Comi C, Carecchio M, Chiocchetti A, Nicola S, Galimberti D, Fenoglio C, Cappellano G, Mona- coF, Scarpini E, Dianzani U. Osteopontin is increased in the cerebrospinal fluid of patients with alzheimer’s disease and its levels correlate with cognitive decline. Journal of Alzheimer’s Disease 9:1143-8, 2010

Boggio E, Indelicato M, Orilieri E, Mesturini R, Mazzarino MC, Campagnoli MC, Ramenghi U, Dianzani U, Chiocchetti A. Role of Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 in development of autoimmunity lymphoproliferation. Haematologica, 95:1897-904, 2010

24 25 EXOSOMI, VIRUS DI EPSTEIN-BARR E SCLEROSI MULTIPLA: RUOLO POTENZIALE NELLA PATOGENESI E COME CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA BIOMARCATORI PER IL MONITORAGGIO CLINICO DELLA MALATTIA mento selettivo negli esosomi di alcuni RNA. Successivamente abbiamo studiato in modelli in vitro il potenziale trasferimento a cellule bersaglio, mediante gli esosomi, di componenti virali. RESPONSABILE DEL PROGETTO Nei nostri esperimenti abbiamo potuto osservare la fusione degli esosomi prodotti da LCL con GIULIETTA VENTURI cellule B EBV-negative (Ramos), ma non abbiamo potuto rilevare l’espressione in queste cellule Ricercatore delle proteine di EBV LMP1 e LMP2a in seguito all’incubazione con gli esosomi da LCL. Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento del Farmaco Infine abbiamo valutato la presenza di componenti di EBV negli esosomi presenti in campioni Collaboratori: biologici di pazienti con SM. Abbiamo analizzato gli esosomi purificati da campioni di plasma di ANDREA CANITANO un piccolo gruppo di pazienti SM e di controlli sani. Sono stati eseguiti esperimenti di Western MARTINA BORGHI blot per l’identificazione della proteina LMP1, ed esperimenti di PCR real time per rilevare gli STEFANO FAIS mRNA e i miRNA virali. Nessuno di questi componenti è stato rilevato nei campioni analizzati.

Collaborazioni con altri gruppi: MARCO SALVETTI, GIOVANNI RISTORI, ROSELLA MECHELLI Centro di terapie neurologiche CONCLUSIONI sperimentali Ospedale S. Andrea, Sapienza Università di Roma In conclusione, il nostro studio sugli esosomi rilasciati in vitro da cellule B EBV-infette ha confermato la presenza delle proteine di EBV LMP1 e LMP2a, così come già noto in letteratura. PREMESSE E OBIETTIVI Abbiamo inoltre potuto rilevare negli esosomi la presenza di miRNA virali e di sequenze di mRNA specifici di EBV, in particolare sequenze dell’mRNA codificante per LMP2. Ulteriori studi Sempre maggiori evidenze stanno emergendo sull’importanza degli esosomi come immuno- potranno chiarire se si tratti di mRNA funzionali. modulatori e come mezzo di comunicazione fra le cellule. Nel caso di tumori correlati al virus di Gli esperimenti condotti per studiare il potenziale trasferimento di componenti di EBV, mediate Eptein-Barr (EBV), è stato dimostrato il rilascio di esosomi contenenti componenti del virus, ed gli esosomi, a cellule bersaglio EBV-negative, non ci hanno fino a questo momento consentito è stato suggerito un loro ruolo nella patogenesi del tumore. Inoltre, essendo presenti nel plasma di confermare questa ipotesi. Infine nessuno dei componenti di EBV analizzati è stato rilevato di pazienti con tumori associati all’EBV, gli esosomi potrebbero rappresentare utili marcatori per negli esosomi purificati da campioni di plasma dei pazienti con SM e dei controlli sani. I nostri la diagnosi e per il monitoraggio della malattia. L’infezione da EBV potrebbe avere un ruolo im- dati non sono in grado attualmente di fornire nessuna evidenza circa un possibile ruolo di eso- portante anche nella SM. L’accumulo intracerebrale di cellule B EBV-infette e di plasmacellule somi prodotti da cellule EBV infette nella SM. sembra essere una caratteristica ricorrente della SM, e il danno tissutale cerebrale potrebbe derivare da una risposta immunopatologica verso l’EBV. Lo scopo di questo progetto pilota era investigare il possibile ruolo degli esosomi, in particolare di esosomi veicolanti proteine e/o acidi EXOSOMES, EPSTEIN-BARR VIRUS AND MULTIPLE nucleici di EBV, nella SM. La nostra ipotesi era che, nei pazienti SM potesse esserci un abnor- SCLEROSIS: POTENTIAL ROLE IN DISEASE me produzione di esosomi da parte di cellule immunitarie cronicamente attivate, in particolare EBV-infette. Abbiamo anche ipotizzato l’esistenza di una correlazione fra i livelli plasmatici di PATHOGENESIS AND AS BIOMARKERS FOR esosomi e lo stadio della malattia. La presenza di esosomi nei pazienti SM potrebbe anche svolgere un ruolo nella patogenesi della malattia. Per esempio, esosomi veicolanti antigeni di CLINICAL MONITORING OF THE DISEASE EBV potrebbero trasferirli a cellule non infette e anche non suscettibili all’infezione, rendendole un bersaglio per l’attacco da parte del sistema immunitario. Inoltre proteine di latenza di EBV INTRODUCTION AND AIMS veicolate dagli esosomi potrebbero contribuire, rilasciando segnali proliferativi, antiapoptotici e di maturazione alle cellule B, a mantenerne lo stato di attivazione intracerebrale, caratteristico Evidences are accumulating on the important role of exosomes as immune modulators and della SM. as a mean of communication between cells. In the case of malignancies correlated with Ep- stein-Barr virus (EBV) infection, the release of exosomes bearing viral components has been RISULTATI demonstrated and their role in tumor pathogenesis has been suggested. These exosomes are present in plasma samples of patients with EBV-associated tumors and may represent valuable Al fine di chiarire il ruolo potenziale degli esosomi nella SM, abbiamo per prima cosa ricercato la markers for the diagnosis and monitoring of disease. presenza di proteine e acidi nucleici di EBV in esosomi rilasciati in vitro da cellule B EBV-infette EBV infection could have an important role in MS too. Intracerebral accumulation of EBV- (una linea cellulare linfoblastoide -LCL- e i PBMC ottenuti da due donatori sani EBV-positivi). infected B cells and plasma cells seems to be a regular feature of MS, and brain tissue damage Abbiamo analizzato l’espressione delle proteine di latenza LMP1 e LMP2a, un pannello di in MS could be caused by an immunopathological response toward EBV. This pilot project quattro miRNA codificati da EBV, e gli mRNA virali codificanti per le proteine EBNA1, EBNA2, was aimed at investigating if exosomes may have a role in MS, particularly exosomes bearing LMP1 e LMP2. In accordo con dati di letteratura, abbiamo potuto rilevare negli esosomi pro- EBV proteins and/or nucleic acids. Our working hypothesis was that in MS patients it might be dotti da LCL la presenza delle proteine LMP1 e LMP2a. Inoltre, sempre negli esosomi prodotti an abnormal production of exosomes from cronically activated immune cells, particularly from da LCL, abbiamo rilevato la presenza di tutti gli mRNA analizzati, eccetto quello codificante per EBV-infected B cells; a correlation between plasma levels of exosomes and the disease state EBNA1. Gli mRNA codificanti per LMP1 e EBNA2 erano presenti a livelli molto bassi, mentre might also be possible. The presence of exosomes in MS patients could also play a significant l’LMP2 mRNA era il più abbondante. Nessun mRNA fra quelli analizzati è stato invece rilevato role in the pathophysiology of the disease. nei PBMC da donatori sani, né negli esosomi derivati da queste cellule. Infine, nelle LCL e negli For example, exosomes bearing EBV antigens could transfer them to uninfected B cells and esosomi rilasciati da queste cellule, sono stati rilevati tutti i miRNA codificati da EBV analizzati. also to cells that are not susceptible to EBV infection, making these cells a target for the immu- Alcuni di questi miRNA sono stati rilevati anche nei PBMC da donatori sani e negli esosomi ne attack. Since EBV can deliver proliferative, antiapoptotic and maturation signals to B cells da PBMC (ma non nei campioni di plasma raccolti dagli stessi donatori in parallelo ai PBMC). through expression of latency proteins and because these proteins are known to be highly Complessivamente si è notata una scarsa correlazione fra i livelli di EBV mRNA e miRNA negli expressed in the MS brain, EBV proteins loaded on exosomes could contribute to maintain 26 esosomi e nelle cellule da cui gli esosomi erano rilasciati. Questo sembra suggerire un arricchi- intracerebral B-cell activation, which is the hallmark of MS. 27 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

In order to shed light on the potential role of exosomes in MS, we have investigated as a first Canitano A, Borghi M, Fais S, Venturi G. “Characterization of Epstein-Barr virus (EBV) protein and task the EBV protein and nucleic acid content of exosomes released in vitro from EBV-infected nucleic acid content of exosomes released in vitro from EBV-infected cells.” ISEV Annual Scienti- fic Meeting, Gothenburg, Sweden, April 18-21 2012 cells (a lymphoblastoid cell line -LCL- and PBMC obtained from two EBV-positive healthy donors). We have analyzed the expression of LMP1 and LMP2a latency proteins, a panel of four EBV-encoded miRNAs, and EBNA1, EBNA2, LMP1 e LMP2 mRNAs coding sequences. PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 In agreement with literature data, LMP1and LMP2a proteins were detected in LCL-derived per un periodo di 1 anno - 25.000 € exosomes. All of the EBV-mRNAs analyzed except EBNA1 were present in RNA isolated from LCL-derived exosomes. LMP1 and EBNA2 were present at very low levels, while LMP2 mRNA was the most abundant. No EBV mRNA could be detected in RNA isolated from PBMC of EBV positive healthy donors, nor from PBMC derived exosomes. All of the EBV-encoded miRNAs analyzed could be detected in LCLs and also in LCL-derived exosomes. Moreover, some of the EBV-miRNAs analyzed could be detected in PBMC, and in PBMC derived exosomes, but not in plasma samples collected together with PBMC from the same healthy donors. Overall, a poor correlation in levels of EBV mRNAs and miRNAs in the cells, compared with exosomes, was observed, suggesting selective enrichment of some RNAs in exosomes. As a second task we have investigated in in vitro models the potential delivery of EBV proteins and/or nucleic acids by exosomes to target cells. In our experiments we observed the fusion of LCL derived exosomes with an EBV-negative B cell line (Ramos), but we did not detect the expression in these recipient cells of EBV proteins LMP1 nor LMP2a following incubation with LCL exosomes. The third task has been the evaluation of the presence of exosomes loaded with EBV components in biological samples of patients with multiple sclerosis. We have analyzed exosomes purified from plasma samples of a small group of MS patients and healthy controls. Western blot experiments for LMP1 protein and real-time PCR experiments for EBV mRNAs and miRNAs have been performed. None of these EBV components could be detected in the samples assayed.

CONCLUSIONS

In conclusion, our in vitro study about exosomes released from EBV-infected B cells has confirmed the presence of the EBV proteins LMP1 and LMP2a, as already reported in the literature. We could also detect in exosomes the presence of viral miRNAs and the presence of EBV mRNAs sequences, particularly LMP2 mRNA. Further studies will be necessary to understand if the mRNA sequences we have detected are actually functional mRNAs. Our experiments aimed at investigating the potential transfer of EBV components to EBV-negative target cells through exosomes did not confirmed our hypothesis. None of the EBV components analyzed could be detected in exosomes purified from plasma samples of MS patients and healthy controls. Our data so far are unable to provide any evidence about a possible role of exosomes released by EBV infected cells in MS.

28 29 OMEOSTASI INTRACELLULARE DEL Ca2+ E MITOCONDRI IN OLIGODENDROCITI DURANTE STRESS OSSIDATIVO E LORO CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA RUOLO NELLA MORTE PER APOPTOSI

godendrocitario. Trattammenti con TNF-α in OPCs indotti a differenziarsi mediante l’ormone RESPONSABILE DEL PROGETTO tiroideo T3, mostrano (tramite immunofluorescenza) una riduzione della popolazione di oligo- PAOLO PINTON dendrociti maturi, mentre la popolazione progenitrice resta invariata. Professore Associato Sembrerebbe che i mitocondri ricoprano un ruolo strategico nel differenziamento degli OPCs e, Dipartimento di medicina diagnostica e sperimentale, Sezione di Patologia generale quindi, potrebbero essere un bersaglio selettivo per le citochine infiammatorie come il TNF-α. Università di Ferrara Abbiamo provato ad identificare il collegamento tra fisiologia mitocondriale e differenziamento oligodendrocitario riducendo i livelli di MMP utilizzando il disaccoppiante mitocondriale FCCP. Collaboratori: ANGELA BONONI Abbiamo valutato il differenziamento in OPCs trattati con TNF-α o FCCP per 24h e indotti al SIMONE PATEGNANI differenziamento. Come risultato, il trattamento con FCCP induce una forte riduzione nel diffe- ELENA DEMARCHI renziamento in modo analogo al TNF-α. MASSIMO BONORA Abbiamo effettuato uno “screening” di sostanze modulatrici i mitocondri: succinato (substrato della catena respiratoria), ciclosporina A (inibitore del mPTP, capace di alzare i livelli di MMP) e CGP37157 (inibitore dello scambiatore mitocondriale Na+/Ca2+, capace di indurre aumenti del PREMESSE E OBIETTIVI calcio mitocondriale). Solamente in seguito a trattamento con CGP37157, la quota totale di oligodendrociti maturi non risulta più bassa rispetto a quella riscontrata in seguito a trattamento La patogenesi della sclerosi multipla (SM) è stata caratterizzata come una risposta immu- con TNF-α. nologica contro le cellule oligodendrocitarie, che determina perdita di mielina, degenerazione assonale e morte neuronale. CONCLUSIONI Diverse citochine infiammatorie, come TNF-α e IFN-γ, sembrano essere coinvolte durante lo sviluppo e la progressione della SM. Un ruolo principale è stato assegnato alla citochina TNF-α I nostri dati indicano come il TNF-α sia in grado di alterare la fisiologia mitocondriale, abbasan- in quanto è stata individuata come principale agente scatenante la morte degli oligodendrociti do i livelli di MMP e i livelli di Ca2+. Questo effetto è stato riscontrato solo negli OPCs; altre linee appena prima della formazione delle placche, ma è stato anche ampiamente dimostrato possa cellulari, come astrociti, o mediatori dell’infiammazione, come IFN-γ, non sembrano coinvolti. ricoprire un duplice ruolo sia come induttore di apoptosi, sia come promotore di sopravvivenza La dinamica del segnale Ca2+ a livello mitocondriale degli OPCs esposti a TNF-α è modulata cellulare, ruolo dimostrato specialmente in modelli animali dove il TNF-α è responsabile dell’inda una riduzione del MMP, effetto non dovuto all’apoptosi. Gli OPCs trattati ed indotti al dif- duzione della proliferazione oligodendrocitaria e del ripristino della mielina, in seguito ad eventi ferenziamento mostrano una forte riduzione nei livelli di Proteina Basica della Mielina (MBP), demielinizzanti. valutati mediante immunoblot e immunofluorescenza. In questa popolazione di OPCs, i livelli di Recentemente, sono state raccolte diverse evidenze di come i mitocondri siano coinvolti nella progenitori (NG2+) non sono alterati, così come la morte cellulare. Diverse sostanze sono state SM. Difetti nell’espressione, attività nei complessi della catena respiratoria ed alterazioni nella testate per mimare/revertire gli effetti indotti dal TNF-α nei confronti dei mitocondri degli OPCs produzione di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) sono stati evidenziati nei pazienti affetti da e solamente bloccando lo scambiatore mitocondriale Na+/Ca2+ è stato possibile revertire gli SM. In quanto è risaputo che i mitocondri ricoprano un ruolo fondamentale nella produzione effetti negativi sul differenziamento. di energia e nella regolazione dell’apoptosi, specialmente mediante il segnale calcio, il nostro intento è caratterizzare la fisiologia mitocondriale nei progenitori degli oligodendrociti (OPCs) in seguito a condizioni infiammatorie ed analizzare gli effetti indotti sulla sopravvivenza/morte INTRACELLULAR Ca2+ HOMEOSTASIS AND delle cellule. MITOCHONDRIA IN OLIGODENDROCYTES DURING RISULTATI OXIDATIVE STRESS AND THEIR ROLE IN Abbiamo investigato il ruolo di TNF-α e IFN-γ nell’omeostasi del calcio negli OPCs, poichè que- APOPTOTIC CELL DEATH ste citochine sono i protagonisti principali nelle reazioni autoimmuni contro gli OPCs. Abbiamo misurato i flussi di calcio, utilizzando chimere della fotoproteina calcio-sensibile equorina, a INTRODUCTION AND AIMS livello del citosol e della matrice mitocondriale. Fra le citochine infiammatorie solamente il TNF-α riduce l’accumulo di calcio mitocondriale. Multiple Sclerosis (MS) pathogenesis is mostly characterized by the immunological activity ver- Inoltre, l’effetto del TNF-α è esclusivo per i mitocondri (suggerendo un effetto diretto nella sus oligodendrocyte, causing myelin loss, axonal degeneration and neuronal cell death. Multi- fisiologia mitocondriale) e esercita tali effetti solamente nei confronti degli OPCs, e non di altre ple cytokines, such as TNF-α or IFN-γ appear involved in development and progression of MS. cellule gliali come gli astrociti. TNF-α is mainly attributed as the principal initiator of oligodendrocytes death preceding plaque Abbiamo eseguito misure del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), indicatore dello formation, but, its dual role as apoptotic inducer or survival promoter has been widely demon- stato energetico dei mitocondri, con la sonda TMRM mediante l’utilizzo di microscopia confo- strated, especially in animal models where it is responsible for promoting oligodendrocytes cale laser. I risultati indicano che le cellule trattate con TNF-α presentano una forte riduzione proliferation and myelin repair after demyelination events. dei livelli di MMP, mostrando una riduzione dell’attività della catena respiratoria. Differentemen- Recently evidences for mitochondrial involvement in MS were gathered. Defects in respiratory te, non abbiamo riscontrato alterazioni nella produzione di ROS o nella morfologia della rete complexes expression and activity and altered Reactive Oxidative Species (ROS) production mitocondriale, indicando che le cellule non sono sottoposte a danni dovuti a stress ossidativo. were reported characterizing MS patients. Il trattamento con TNF-α determina una riduzione del numero totale di cellule dello 0,89% Because of the ability of mitochondria to be key actors during apoptosis or regulator of energy (E.S.±9,9). Abbiamo quindi valutato anche la morte cellulare: esperimenti di “Cleaved caspa- production, especially in response to calcium signaling, we characterize mitochondrial physio- se-3 detection” e esperimenti di TUNEL, indicano che il trattamento con TNF-α non è tossico logy in oligodendrocytes progenitors cells (OPCs) during inflammation conditions and its con- e non aumenta i livelli di apoptosi negli OPCs. sequences in cell death or survival. 30 Da tali dati, è possibile ipotizzare un ruolo diretto del TNF-α durante il differenziamento oli- 31 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

We evaluated effects of TNF-α and IFN-γ on intracellular Ca2+ homeostasis in OPCs, as these Ferrari D, Pinton P, Campanella M, Callegari MG, Pizzirani C, Rimessi A, Di Virgilio F, Pozzan T, Riz- inflammatory cytokines are the major players in autoimmune reaction against oligodendrocytes. zuto R. (2010) Functional and structural alterations in the endoplasmic reticulum and mitochondria 2+ during apoptosis triggered by C(2)-ceramide and CD95/APO-1/FAS receptor stimulation. Biochem We measured Ca fluxes in mitochondria and cytosol, using a set of specifically targeted chi- Biophys Res Commun. 391:575-81. Sequally contributed meras of Ca2+ sensitive photoprotein aequorin: cytAEQ (localized in the cytosol), mtAEQmut (to the mitochondrial matrix). Pavan C, Vindigni V, Michelotto L, Rimessi A, Abatangelo A, Cortivo R, Pinton P, Zavan B (2010) We concluded that between inflammatory cytokines only TNF-α can reduce [Ca2+] mt uptake, Weight gain related to treatment with atypical antipsychotics is due to activation of PKCß. Phar- whereas IFN-γ does not show any effect. Moreover, TNF-α effects are restricted to mitochon- macogenomics J. 10(5):408-17 drial compartment, suggesting specific effects on mitochondrial physiology and involve exclu- Giorgi C, Agnoletto C, Baldini C, Bononi A, Bonora M, Marchi S, Missiroli S, Patergnani S, Poletti F, sively OPC and not other glial cells types such as astrocytes. Rimessi A, Zavan B, Pinton P. (2010) Redox control of Protein Kinase C: cell and disease? Specific Measurements of mitochondrial membrane potential (MMP), index of mitochondrial energetic significances. Antioxid Redox Signal 13(7):1051-85 status, were performed with the potential sensitive dye TMRM and laser scanning confocal microscopy. The results highlight a strong MMP reduction in cells treated with TNF-α suggesting Biasiotto R, Aguiari P, Rizzuto R, Pinton P, D’’Agostino DM, Criminale V (2010) The p13 protein of human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) modulates mitochondrial membrane potential and an important decrease in respiratory chain activity, while was neither inducing an abnormal calcium uptake. Biochim Biophys Acta (Bioenergetics) 1797(6-7):945-951 ROS production nor an alteration of mitochondrial network morphology, indicating that cells were not involved in oxidative stress damage. Lebiedzinska M, Karkucinska-Wieckowska A, Giorgi C, Karczmarewicz E, Pronicka E, Pinton P, We observed that TNF-α exposure results in 0,89% reduction of total cell number (S.E. ±9,9). Duszynski P, Pronicki M, Wieckowski MR (2010) Oxidative stress-dependent p66Shc phosphory- Also cell death was tested by monitoring cleavage of Caspase3 and TUNEL indicating tre- lation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. Biochim Biophys Acta (Bioener- getics) 1797(6-7):952-960 atment with TNF-α was sub-toxic and significantly increases apoptotic cell death in OPCs. Given our data, it is possible to envisage a direct effect of TNF-α during oligodendroglial dif- Cortivo R, Vindigni V, Iacobellis L, Abatangelo G, Pinton P, Zavan B (2010) Nanoscale particle the- ferentiation. OPCs forced to differentiate with T3 thyroid hormone, pre-treated with sub-toxic rapies for wound and ulcers. Nanomedicine 5(4):641-56 doses of TNF-α, reveal a significant reduction in adult cells appearance, confirmed by immunostaining for the presence of adult oligodendrocytes, while no differences were found in the Giorgi C, Ito K, Lin H, Santangelo C, Wieckowski MR, Lebiedzinska M, Bononi A, Bonora M, Duszynski J, Bernardi R, Rizzuto R, Tacchetti C, Pinton P*, Pandolfi PP (2010) PML regulates number of progenitors. apoptosis at endoplasmic reticulum modulating calcium release. Science 330:1247-51 *co-corre- This suggests that mitochondria could play a strategic role in OPCs differentiation, and also sponding author that could be a selective target to proinflammatory cytokines such as TNF-α in modulation of OPCs differentiation. We tried to identify an axis between mitochondrial physiology and oligo- Celsi F, Pizzo P, Brini M, Leo S, Fotino C, Pinton P, Rizzuto R. (2009) Mitochondria, calcium and cell dendrocyte differentiation by inducing pharmacological reduction of MMP using the mitochon- death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta (Bioenergetics) 1787:335-44 drial uncoupler FCCP. We tested oligodendrocyte differentiation in OPCs treated with TNF-α Murgia M, Giorgi C, Pinton P, Rizzuto R. (2009) Controlling metabolism and cell death: at the heart or FCCP for 24 hrs, then induced to differentiate. Interestingly FCCP treatment induces strong of mitochondrial calcium signalling. J Mol Cell Cardiol. 46:781-8 reduction in cell differentiation, in a way similar to TNF-α. We next screen between three different mitochondrial active compounds: succinate (a sub- Rizzuto R, Marchi S, Bonora M, Aguiari P, Bononi A, De Stefani D, Giorgi C, Leo S, Rimessi A, Si- strate for respiratory chain), cyclosporin A (an inhibitor of mPTP, able to elevate mitochondrial viero R, Zecchini E, Pinton P. (2009) Ca(2+) transfer from the ER to mitochondria: when, how and why. Biochim Biophys Acta (Bioenergetics) 1787:1342-51 membrane potential) and CGP37157 (inhibitor of mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger, able to increase mitochondrial calcium content). Only in presence of CGP37157 the amount of diffe- Giorgi C, De Stefani D, Bononi A, Rizzuto R, Pinton P. (2009) Structural and functional link between rentiated oligodendrocytes was not significantly lower after TNFa exposure compared to con- the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int J Biochem Cell Biol. 41:1817-27 trol. Koziel K, Lebiedzinska M, Szabadkai G, Onopiuk M, Brutkowski W, Wierzbicka K, Wilczynski G, Pinton P, Duszynski J, Zablocki K, Wieckowski MR. (2009) Plasma membrane associated mem- CONCLUSIONS branes (PAM) from Jurkat cells contain STIM1 protein is PAM involved in the capacitative calcium entry? Int J Biochem Cell Biol. 41:2440-9 Our data show that TNF-α alters mitochondrial physiology, lowering mitochondrial membrane potential and Ca2+ homeostasis. This effect is only found in the interaction between TNF-α/ Rimessi A, Marchi S, Fotino C, Romagnoli A, Huebner K, Croce CM, Pinton P, Rizzuto R. (2009) oligodendrocytes; other cell lines, like astrocytes, or other pro-inflammatory mediators such as Intramitochondrial calcium regulation by the FHIT gene product sensitizes to apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 106:12753-8 IFN-γ are not involved. Mitochondrial calcium dynamics in oligodendrocytes exposed to TNF-α is affected by a strong reduction in MMP. This was not due to an engagement of apoptosis as Wieckowski MR, Giorgi C, Lebiedzinska M, Duszynski J, Pinton P. (2009) Isolation of mitochon- expected by absence of several apoptotic markers. driaassociated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4:1582-90 Treated OPCs, induced to differentiate display reduced immunoreactivity for Myelin Basic Pro- tein (MBP) in immunostaining and a lower amount of MBP levels by immunoblotting. In the adult oligodendrocyte population levels of progenitor cells (NG2+) and cell death were not PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 € affected. Several compounds were tested to mimic or revert the effect of TNF-α in oligoden- per un periodo di 2 anni - 60.000 drocyte mitochondria and only the blocker of mitochondrial Na+/Ca2+ exchange were able to revert the effect on differentiation.

32 33 OMEOSTASI INTRACELLULARE DEL Ca2+ E MITOCONDRI IN OLIGODENDROCITI DURANTE STRESS OSSIDATIVO CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA E LORO RUOLO NELLA MORTE PER APOPTOSI

CONCLUSIONI RESPONSABILE DEL PROGETTO ANGELA BONONI I dati da noi raccolti suggeriscono che il TNF-α pregiudica il differenziamento degli OPCs al- Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica terandone la funzionalità mitocondriale. Abbiamo quindi usato varie molecole in grado di mo- Sezione di Patologia Generale, Università di Ferrara dulare diversi parametri mitocondriali, con l’intento di revertire la compromissione del differenziamento oligodendrocitario causata dal TNF-α. La molecola candidata da noi identificata MENTORE: è il CGP37157, una benzodiazepina che mantiene diverse caratteristiche in comune con al- PAOLO PINTON tri membri di questa classe farmaceutica quali diltiazem, clonazepam e diazepam. I prossimi esperimenti saranno quindi volti a valutare se alcuni di questi farmaci già presenti in commercio sono in grado di preservare il differenziamento degli OPCs in presenza di un danno infiamma- PREMESSE E OBIETTIVI torio, con la speranza di individuare così nuovi approcci terapeutici.

La sclerosi multipla (SM) è una malattia neurologica che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da demielinizzazione e neurodegenerazione. Nonostante eziologia e INTRACELLULAR Ca2+ HOMEOSTASIS AND patogenesi della SM non siano ancora state comprese completamente, diversi studi suggeriscono che il danno infiammatorio alla mielina e agli oligodendrociti (le cellule che generano la MITOCHONDRIA IN OLIGODENDROCYTES DURING mielina nel SNC) siano alla base dello sviluppo e della progressione della patologia. Inoltre, in diverse patologie demielinizzanti si sono riscontrate anomalie nella funzionalità dei mitocondri, OXIDATIVE STRESS AND THEIR ROLE IN ed infatti recenti evidenze hanno messo in luce come i mitocondri siano coinvolti nella SM. APOPTOTIC CELL DEATH I mitocondri sono organelli cellulari spesso descritti come le “centrali energetiche” della cellula; tuttavia, è noto come i mitocondri svolgano un ruolo chiave anche nel processo di morte cellu- INTRODUCTION AND AIMS lare. A livello mitocondriale avviene dunque l’integrazione sia di segnali di sopravvivenza che di 2+ morte, e ciò è controllato principalmente sulla base della quantità di ioni Ca che i mitocondri Multiple sclerosis (MS) is a neurological disorder of the central nervous system (CNS) cha- accumulano. Questo progetto di ricerca si è avvalso di differenti approcci sperimentali volti ad racterized by demyelination and neurodegeneration. Although the pathogenesis of MS is not 2+ una migliore comprensione della complessa relazione tra omeostasi del Ca mitocondriale completely understood, various studies suggest that inflammatory damage to myelin and oli- ed i processi di sopravvivenza e differenziamento di precursori degli oligodendrociti (OPCs), godendrocytes (the myelin-forming cells of the CNS) is associated with the development and rivolgendo l’attenzione in particolare alle alterazioni causate dalle condizioni infiammatorie che progression of MS. Also mitochondrial dysfunction is frequently associated with demyelinating si osservano in pazienti con SM. Capire come tali eventi partecipano alla patogenesi della SM disease, and recent evidences have pointed out the involvement of mitochondria in MS. potrà aprire la strada a nuovi approcci terapeutici. Mitochondria are cellular organelles often described as the “powerhouses” of the cell; however mitochondria are now recognised as central players in cell death. Integration of survival and RISULTATI death stimuli occurs in mitochondria and is mainly controlled by accumulation of calcium ions (Ca2+). Inizialmente è stato ottimizzato un protocollo di isolamento e mantenimento in vitro di colture The project utilized a variety of experimental approaches aimed at obtaining a deeper insight cellulari di precursori oligodendrocitari, e il loro differenziamento in oligodendrociti adulti. In into the complex relationship between mitochondrial Ca2+ homeostasis and the process of seguito abbiamo indagato se durante le condizioni infiammatorie che caratterizzano la SM si cell survival and differentiation in oligodendrocyte precursors (OPCs), with special attention to 2+ osservasse un’alterazione dell’omeostasi del Ca . identify alterations caused by the inflammatory processes occurring in MS. Further understan- 2+ Analizzando l’accumulo transiente di Ca nei mitocondri, abbiamo stabilito che il mediatore ding of how these events participate in the pathogenesis of MS can provide rationale for novel dell’infiammazione TNF-α (Fattore di necrosi tumorale-alpha) causa una significativa riduzione therapeutic approaches. della risposta mitocondriale al Ca2+. Tale effetto del TNF-α è stato osservato esclusivamente a carico dei mitocondri, suggerendo dunque un interessamento specifico della fisiologia mito- RESULTS 2+ condriale. Al fine di comprendere meglio come l’omeostasi mitocondriale del Ca è regolata ed alterata in OPCs esposti al TNF-α, abbiamo analizzato altri parametri mitocondriali, indivi- We initially established a protocol for isolation and in vitro culture of oligodendrocytes proge- duando così la presenza di una marcata riduzione del potenziale di membrana mitocondriale. nitors as well as their differentiation into mature oligodendrocyte. Than we investigated if Ca2+ 2+ Tale potenziale è la forza motrice sia della produzione di energia che dell’accumulo di Ca homeostasis in OPCs may be affected during the inflammatory events that characterize MS. nell’organello, e quest’ultima spiega quindi il perché della riduzione dell’accumulo mitocondria- We analysed transient Ca2+ in mitochondria and found that the inflammatory mediator tumor le di Ca2+ da noi osservata in OPCs trattati con TNF- . Un aspetto interessante emerso nel α necrosis factor-alpha (TNF-α) causes a significant reduction of mitochondrial Ca2+ responses. corso dei nostri studi è che né la morfologia dei mitocondri, né la produzione di radicali liberi TNF-α effect was restricted to the mitochondrial compartment, suggesting specific effects on sono alterate nelle nostre condizioni sperimentali, e ciò ci ha permesso di concludere che il mitochondrial physiology. To better understand how mitochondrial Ca2+ homeostasis is regula- trattamento con TNF- non induce morte degli OPCs. Per questo siamo passati a valutare il α ted and altered in OPCs during TNF-α exposure, we analyzed other mitochondrial parameters, possibile effetto del TNF-α nel differenziamento oligodendrocitario ed è emerso che il tratta- and found out a strong reduction of mitochondrial membrane potential (MMP). MMP is the mento con TNF-α riduce in modo significativo il differenziamento di OPCs in oligodendrociti driving force of both energy production and Ca2+ accumulation in mitochondria, so this latter adulti. Infine abbiamo analizzato diversi composti noti per la loro capacità di modulare parame- function explain the reduction of mitochondrial Ca2+ responses observed in treated OPCs. Inte- tri mitocondriali, con l’obbiettivo di revertire le disfunzioni da noi osservate. restingly, neither mitochondrial morphology nor reactive oxygen species production were chan- È risultato che il composto CGP37157, una molecola che agisce aumentando l’accumulo di ged, and so we performed further analysis and finally concluded that treatment with TNF- 2+ α Ca nei mitocondri, è in grado di ripristinare il differenziamento oligodendrocitario anche in does not induce cell death in OPCs. 34 presenza di TNF- 35 α. Therefore we evaluated TNF-α effect on OPCs differentiation, and found that TNF-α treatment CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

significantly reduced the differentiation of OPCs into adult oligodendrocytes. Next we analyzed PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI different compound able to affect mitochondrial physiology, aiming to recover the mitochondrial impairment. We found that CGP37157, a molecule capable of increasing the accumulation of De Stefani D, Bononi A, Romagnoli A, Messina A, De Pinto V, Pinton P, Rizzuto R (2012) VDAC1 Ca2+ in mitochondria is able to revert the TNF-α mediate differentiation impairment. selectively transfers apoptotic Ca2+ signals to mitochondria. Cell Death Differ 19:267-273

CONCLUSIONS Marchi S, Giorgi C, Suski J, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Missiroli S, Patergnani S, Poletti F, Rimessi A, Duszynski J, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondria-ROS crosstalk in the control of cell death and aging. J Signal Transduct 2012:329635 Taken together our data suggest that TNF-α impairs oligodendrocyte differentiation by altering mitochondrial functions. In order to understand a causal relation we used different chemical Giorgi C, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Marchi S, Missiroli S, Patergnani S, Po- compounds targeting selected feature of mitochondria, trying to revert the effect of TNF-α on letti F, Rimessi A, Suski JM, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondrial calcium homeostasis OPCs differentiation. We identified CGP37157 as a candidate able to rescue OPCs differentia- as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion 12:77-85 tion. CGP37157 is a benzodiazepine that display common characteristics with members of the Bononi A, Missiroli S, Poletti F, Suski JM, Agnoletto C, Bonora M, De Marchi E, Giorgi C, Marchi S, benzodiazepine drug family, such as diltiazem, clonazepam and diazepam. In the near future, Patergnani S, Rimessi A, Wieckowski MR, Pinton P (2012) Mitochondria-associated membranes we will test some of these drugs, already approved, to verify if they are able to preserve OPCs (MAMs) as hotspot Ca2+ signalling units. Adv Exp Med Biol In press differentiation during inflammatory damage, and possibly find out new therapeutic approaches. Bonora M, Patergnani S, Rimessi A, De Marchi E, Suski JM, Bononi A, Giorgi C, Marchi S, Missiroli S, Poletti F, Wieckowski MR, Pinton P (2012) ATP synthesis and storage. Purinergic Signalling In press

Bononi A, Agnoletto C, De Marchi E, Marchi S, Patergnani S, Bonora M, Giorgi C, Missiroli S, Poletti F, Rimessi A, Pinton P (2011) Protein kinases and phosphatases in the control of cell fate. Enzyme Res 2011:329098

Patergnani S, Suski JM, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Giorgi C, Marchi S, Missi- roli S, Poletti F, Rimessi A, Duszynski J, Wieckowski MR, Pinton P (2011) Calcium signaling around Mitochondria Associated Membranes (MAMs). Cell Commun Signal 9(1):19

Giorgi C, Agnoletto C, Baldini C, Bononi A, Bonora M, Marchi S, Missiroli S, Patergnani S, Poletti F, Rimessi A, Zavan B, Pinton P (2010) Redox control of Protein Kinase C: cell and disease specific significances. Antioxid Redox Signal 13(7):1051-85

Giorgi C, Ito K, Lin H, Santangelo C, Wieckowski MR, Lebiedzinska M, Bononi A, Bonora M, Du- szynski J, Bernardi R, Rizzuto R, Tacchetti C, Pinton P, Pandolfi PP (2010) PML regulates apoptosis at endoplasmic reticulum modulating calcium release. Science 330:1247-51

Rizzuto R, Marchi S, Bonora M, Aguiari P, Bononi A, De Stefani D, Giorgi C, Leo S, Rimessi A, Siviero R, Zecchini E, Pinton P (2009) Ca(2+) transfer from the ER to mitochondria: when, how and why. Biochim Biophys Acta 1787:1342-51

Giorgi C, De Stefani D, Bononi A, Rizzuto R, Pinton P (2009) Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int J Biochem Cell Biol 41:1817-27

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 per un periodo di 2 anni - 32.000 €

36 37 FATTORI DI RISCHIO NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO INTERNAZIONALE CASO-CONTROLLO CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

studio caso-controllo internazionale su larga scala sull’associazione tra SM e fattori di rischio RESPONSABILE DEL PROGETTO ambientale. La metodologia di base dello studio trae vantaggio dall’utilizzo di registri esistenti MAURA PUGLIATTI di persone con SM basati su popolazione e su questionari autosomministrati. Professore Associato di Neurologia Obiettivo specifico dello studio è l’analisi, oltre che dell’effetto principale anche delle possibili Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale (ex Dipartimento di Neuroscienze e interazioni, tra i fattori ambientali di attuale maggiore interesse (agenti infettivi tra cui EBV e Scienze Materno-Infantili), Università degli Studi di Sassari mononucleosi infettiva, stato metabolico della vitamina D, fattori di stile di vita, incluso il fumo di sigaretta, l’esposizione alla luce solare, fattori occupazionali) ed il rischio per SM. Collaboratori: GIULIO ROSATI STEFANO SOTGIU RISULTATI WANDA M. SATTA ALESSANDRA SANNA Le prime attività di Progetto sono state principalmente focalizzate nel coordinamento dei 7 cen- PAOLA COSSU tri partecipanti allo studio (Italia-Sardegna, Italia-San Marino, Rep. Di S. Marino, Serbia, Norve- LESLIE PARISH STEFANIA LEONI gia, Svezia, Canada) per la definizione e produzione del questionario (EnvIMS-Q), contenuto, BETTINA MARIA GALANTI formato, versione linguistica, e proprietà di affidabilità e accettabilità. È stato inoltre prodotto il materiale incluso nella spedizione del questionario, e amministrate le due spedizioni previste Collaborazioni con altri gruppi: dal disegno di studio. Steering Committee Un totale di 5728 questionari sono stati scannerizzati e i dati trasferiti in un database per analisi Trond Riise, Department of Public Health and Primary Health Care, University of Bergen, Norway Kjell-Morten Myhr, National MS Competence Center, Department of Neurology, Haukeland statistica: 2171 dall’Italia (733 casi e 1438 controlli), 2677 dalla Norvegia (959, 1718), 636 dalla University Hospital, Bergen, Norway Svezia (167, 469) e 244 dalla Serbia (121, 123). Lo studio in Canada è attualmente in corso, Christina Wolfson, Division of Clinical Epidemiology, McGill University Health Centre, Montreal per la fase di test del questionario nelle versioni Inglese e Francese. I dati dello studio EnvIMS sono ora in fase di analisi per l’esposizione età-specifica a fonti di Italy vitamina D (esposizione alla luce solare, dieta e supplementi vitaminici), al fumo di sigaretta laria Casetta, Enrico Granieri, Istituto di Clinica Neurologica, Università di Ferrara Norway (esposizione attiva e passiva), alla mononucleosi infettiva (MI). L’interazione tra MI (espressione Trond Riise, Department of Public Health and Primary Health Care, University of Bergen dell’infezione da EBV) e fumo di sigaretta su 2125 casi e 4455 controlli ha mostrato l’impor- Kjell-Morten Myhr, National MS Competence Center, Department of Neurology, Haukeland tanza, indipendente, dei due fattori per il rischio di SM in tutte le popolazioni prese in esame. University Hospital, Bergen La pooled odds ratio (OR) aggiustata per sesso ed età era 2.0 (95%CI: 1.6-2.4) per MI e 1.8 Sweden (95%CI: 1.6-2.4) per il fumo di sigaretta. L’effetto era più elevato tra i non-fumatori OR aggre- Anne-Marie Landtblom, Department of Neuroscience and Locomotion, University of Linköping Serbia gata di 2.4 (95%CI: 1.8-3.2) che tra i fumatori OR di 1.6 (95%CI: 1.3-2.1), p=0.04 mediante Jelena Drulovic, Institute of Neurology, University of Belgrade regressione logistica moltiplicativa. Tatjana Pekmezovic, Institute of Epidemiology Questa interazione negativa è stata osservata per tutte le popolazioni in studio, e senza diffe- Canada renza per sesso. Se la condizione di non precedente esposizione a fumo di sigaretta e a mono- Christina Wolfson, Division of Clinical Epidemiology, McGill University Health Centre, Montreal nucleosi infettiva costituiva il valore di riferimento (OR=1), un rischio aumentato per SM veniva Consulenti esterni: osservato in coloro esposti solo al fumo (1.7, 95%CI: 1.5 - 1.9) o solo alla MI (2.4, 95%CI: 1.8 - A. Ascherio, Department of Nutrition, Department. of Epidemiology, Harvard Medical School, 3.2), o ad entrambi (2.8, 95%CI: 2.1 - 3.6). Questi dati non supportano l’ipotesi per cui il rischio Boston, USA per SM da infezione EBV sia aumentato dall’esposizione al fumo, ma piuttosto suggeriscono MT. Kampman, Department of Neurology, University Hospital of Northern Norway and University of due vie patogenetiche distinte. Tromsø, Norway Altri risultati preliminari sono consistenti con il ruolo della bassa esposizione alla luce solare T. Holmøy, Department Neurology, Ullevål University Hospital; Institute of Immunology, University of Oslo, Norway in età infantile sul rischio per SM in popolazioni europee sia meridionali che settentrionali. Nei K. Lauer, Darmstadt, Germany Sardi, una bassa esposizione al sole durante tutto l’anno e all’età di 0-5 anni si associa ad un elevato rischio per SM (OR=1.5, 95%CI: 1.1-2.0, p=0.015) con effetto dose-risposta. Questo trend non è stato osservato ad un età più avanzata. PREMESSE E OBIETTIVI EnvIMS ha presentato delle criticità in relazione sia alla natura di studio caso-controllo e multicentrico (utilizzo di questionari, spedizione postale, approvazioni comitato etico), per cui veniva I dati epidemiologici sulla sclerosi multipla (SM) (ad es. l’eterogeneità a livello microgeografico, chiesta una sua estensione al mese di Settembre 2011. le variazioni di incidenza e le evidenze, recenti, di aggregati spazio-temporali nell’adolescenza) suggeriscono l’azione di uno o più fattori esogeni nel determinare la malattia. CONCLUSIONI Nonostante il numero di studi epidemiologici condotti, tuttavia, la causa della SM è ancora sconosciuta. La SM è una malattia polifattoriale e poligenetica caratterizzata da possibili inte- La rilevanza dello studio giace nella possibilità di studiare il ruolo di fattori ambientali e di stile di razioni tra fattori genetici e ambientali. Il disegno di studio ottimale per studiare questo tipo di vita nel determinismo della SM in popolazioni (europee meridionali e settentrionali, e canadese) associazione è lo studio di coorte, che tuttavia presenta nel caso della SM e dei fattori ambien- che differiscono per frequenza di malattia e distribuzione degli stessi fattori attraverso una me- tali limitazioni importanti data la relativa bassa incidenza della malattia e la sua lunga latenza. todologia comune e condivisa. Numerosi studi caso-controllo sono stati pertanto effettuati su questa associazione che tuttavia I risultati finali genereranno ipotesi sul ruolo sia individuale che interattivo età-dipendente dei hanno prodotto risultati deludenti in relazione alla relativa bassa numerosità del campione, singoli fattori nel determinare il rischio per SM. Inoltre poiché alcuni di questi fattori di rischio all’inclusione di casi prevalenti (non incidenti), il cui basso potere statistico può aver maschera- dipendono largamente da stile di vita o occupazione lavorativa (es., abitudine al fumo di siga- to l’effetto di specifici fattori di esposizione. A tutt’oggi, pertanto, nessun disegno ha permesso retta, atteggiamento all’esposizione alla luce solare, dieta) potenzialmente fattori di rischio mo- di escludere un ruolo preponderante dei fattori ambientali nel determinare la SM. dificabili, lo studio contribuirà a identificare gruppi di individui a maggior rischio e a porre in atto 38 39 Nel 2007, grazie al contributo FISM (Grants n. 2007/R/14 e 2008/R/19), è stato avviato uno misure preventive con programmi di educazione sanitaria o interventi a livello di popolazione (es., fortificazione degli alimenti con vitamina D). CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

RISK FACTORS IN MULTIPLE SCLEROSIS: distinct pathogenetic pathways. Preliminary results are also consistent with the role of low sun exposure in early life on the MS risk in both northern and southern Europeans. In Sardinians, AN INTERNATIONAL CASE-CONTROL STUDY low sun exposure all year round at age 0-5 years was significantly associated to a higher MS risk (OR=1.5, 95%CI: 1.1-2.0, p=0.015) and with a dose-response effect. This trend was not INTRODUCTION AND AIMS observed at later age. EnvIMS’ criticalities were linked to both the case-control and multi-site nature of study design The epidemiology of multiple sclerosis (MS) (eg. heterogeneous spatial distribution at micro- (i.e., use of questionnaires, post-mailing, ethical approvals), and therefore an extension of the geographic level, its changing incidence patterns, and evidences of recent space-time cluste- Project timeline from January 2011 to September 2011 was obtained. ring in adolescence) suggests the action of one or more exogenous factor(s) in determining the disease. Despite the large number of epidemiological studies conducted, however, the cause CONCLUSIONS of MS is still unknown. MS has likely a polygenetic and multifactorial etiology with possible strong interactions between genetic and exogenous factors. A cohort study would be the op- The study relevance lies in the possibility to investigate the role of environmental and lifestyle timal study design to investigate the association between any risk factors and the occurrence factors in determining multiple sclerosis (MS) in populations (southern and northern Europeans, of MS. However, important limitations to cohort study designs in MS are the disease relative and Canadians) differing by disease frequency and distribution of risk factors (eg., sunlight low incidence in the population and the long latency. A number of case-control studies have exposure), with common shared methodology. The study results will generate hypotheses on been so far carried out with disappointing results when it comes to associate disease with spe- both the individual and the interactive age-dependent role of the single environmental factors cific environmental agents. These studies, however, have been conducted on relatively small in determining MS (Proximity to find new pathogenic mechanism). Furthermore, as some of samples of prevalence-based cases, whose low statistical power may have hindered the effect the risk factors investigated largely depend on individuals’ lifestyle or occupation (eg., cigarette of specific exposures. To date no studies have been able to rule out a preponderant action of smoking, attitude to sunlight exposure, diet), that are potentially modifiable risk factors, the environmental factors in determining MS. study will contribute to identify groups of individuals at higher risk and possible preventive stra- In 2007 with FISM financial support (Grants n. 2007/R/14 and 2008/R/19) a large-scale in- tegies through health educational programs or interventions at the population level (eg. vitamin ternational case-control study on the association of MS and environmental risk factors was D supplementation) (Proximity to cure). started. The basic methodology of the study took advantage of existing patient registries that cover large areas as a means to identify and recruit cases and to collect data on risk factors using self-administered questionnaires. The focus of such study has been the investigation of PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI the currently most attractive etiological hypotheses for MS: (I) infectious agents (EBV, infectious mononucleosis); (II) diet with regards to vitamin D status, (III) lifestyle factors, including cigarette Riise T, Pugliatti M, Casetta I, Drulovic J, Granieri E, Holmoy T, Kampman MT, Landtblom A-M, Lauer, K, Myhr K-M, Pekmezovic T, Wolfson C. Negative interaction between smoking and infec- smoking, and sunlight exposures, and (IV) occupational exposures. tious mononucleosis in the risk of MS. Mult Scler J 2011;17:S49 – 27th Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS), Amsterdam, The Nether- RESULTS lands, October 2011 (oral presentation)

The 1st year Project activities consisted in coordinating the 7 participating sites (Italy-Sardinia, Pugliatti M, Cossu P, Arru G, Pirastru MI, Spano I, Traccis S, Rosati G. Multiple Sclerosis in Sardi- nia, insular Italy: the highest burden worldwide? Eur J Neurol 2010. 14th Congress of the European Italy-Ferrara, Rep. of San Marino, Serbia, Norway, Sweden, Canada) for finalising the EnvIMS- Federation of Neurological Societies - EFNS 2010, Geneva, Switzerland, September 25-28, 2010 Questionnaire contents and format, its reliability and acceptability in all language versions, its actual production and the mailing package, the management of the first and second mailings Pugliatti M, Sanna PS. TC 3.1. Databasing and registries: methodological issues. In: Teaching in the sites involved. A total of 5728 EnvIMS-Qs were scanned into a database for statistical Course No. 3 - MS registries and natural course of multiple sclerosis. 26th Congress of the Euro- analysis: 2171 from Italy (733 cases, 1438 controls), 2677 from Norway (959, 1718), 636 from pean Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS), and 15th Annual Conference of Rehabilitation in Multiple Sclerosis (RIMS), 13-16 October 2010, Gothenburg, Swe- Sweden (167, 469) and 244 from Serbia (121, 123). The Canadian substudy is currently being den (syllabus of teaching course) pilot tested (EnvIMS-Q English and French versions). The EnvIMS data are now being analysed with regards to age-related past exposure to sources of vitamin D (sunlight, diet, supplemen- Pugliatti M, Cossu P, Sotgiu S, Rosati G, Riise T. Clustering of multiple sclerosis, age of onset and tation), active/passive cigarette smoking, and infectious mononucleosis (IM). Despite Epstein- gender in Sardinia. J Neurol Sci 2009;286:6-13 Barr virus (EBV), low levels of vitamin D, smoking and the HLADRB1 haplotype have consi- Sotgiu S, Pugliatti M, Cossu P, Rosati G. Sclerosi Multipla e Malaria. In: Carcassi U, Mura I (eds). stently shown to be associated with increased MS risk, only modest associations have been Sardegna e malaria un nuovo approccio ad un antico problema. Delfino Editore, Sassari 2009:99- found for their main effect. Interactions between these factors may explain the variation in risk. 107. [Italian] The interaction between smoking and a history of IM (proxy for EBV infection) was studied on a sample of 2125 cases and 4455 controls. Both IM and cigarette smoking, individually, were Pugliatti M, Casetta I, Cossu P, DeGennaro R, Drulovic J, Granieri E, Holmøy T, Kampman TM, important factors in all populations considered. The age- and sex-adjusted pooled odds ratio Landtblom A-M, Lauer K, Myhr K-M, Pekmezovic T, Riise T, Wolfson C. International Case Con- trol Study on Risk Factors for Multiple Sclerosis (MS): Pilot testing the questionnaire. Mult Scler (OR) was 2.0 (95%CI: 1.6-2.4) for IM and 1.8 (95%CI: 1.6-2.4) for smoking. The effect of IM 2009;15:1403 - ACTRIMS, Atlanta, GA, USA, 30 May 2009 was significantly higher among non-smokers, pooled OR of 2.4 (95%CI: 1.8-3.2) than among smokers, pooled OR of 1.6 (95%CI: 1.3-2.1), p=0.04 using multiplicative interaction term in lo- Pugliatti M, Cossu P, Leoni S, Sotgiu S, Manca S, Rosati G. Incidence of pediatric Multiple Scle- gistic regression. This negative interaction was found in all countries included and among men rosis in Sardinia, insular Italy (1968-2007). Neuroepidemiology 2009;33:198. 1st International Con- and women separately. When the condition of no previous exposure to neither IM nor cigarette gress on Clinical Neurology and Epidemiology. Munich, Germany, 27-30 August 2009 smoking represented the reference value, an increasing risk for the disease was observed in those exposed to smoking but not to IM (1.7, 95%CI: 1.5 - 1.9), to IM but not to smoking (2.4, PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 95%CI: 1.8 - 3.2), and to both IM and smoking (2.8, 95%CI: 2.1 - 3.6). This observation does 40 per un periodo di 2 anni - 129.500 € 41 not support that the risk of MS related to EBV is increased by smoking, but rather suggests two SOTTOPOPOLAZIONI DI LINFOCITI T CD8 EFFETTORI E DELLA MEMORIA E DECORSO CLINICO CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA NELLA SCLEROSI MULTIPLA

di riacutizzazione della SMRR. I pazienti con SMSP presentano un aumento dei linfociti T CD8+ RESPONSABILE DEL PROGETTO SLEC esprimenti T-bet suggerendo un difetto del processo di esaurimento in questa fase della ANNA PAOLA BATOCCHI SM a esordio recidivante, che determina la persistenza in circolo di un alta percentuale di lin- Professore Associato di Neurologia fociti T CD8+ effettori completamente differenziati che possono passare attraverso la barriera Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Università Cattolica del ematoencefalica e contribuire al danno del SNC. I pazienti con SMRR mostravano un aumento Sacro Cuore, Roma delle percentuali di linfociti T CD8+ CM esprimenti eomesodermina sia in riacutizzazione che in remissione e un aumento dei linfociti T CD8+ MPEC esprimenti eomesodermina in remissione Collaboratori: rispetto ai pazienti con SMSP e ai CS. Il gruppo più giovane di pazienti con SMRR mostrava GIOVANNI FRISULLO una percentuale alta di linfociti T CD8+ CM e MPEC che diminuiva nel gruppo più vecchio di VIVIANA NOCITI AGATA KATIA PATANELLA pazienti con SMSP. Questi dati suggeriscono che i linfociti T CD8+ CM e MPEC hanno un ruolo RAFFAELE IORIO centrale nel determinare le riacutizzazioni nei pazienti con SMRR e che la loro riduzione sia ALESSANDRO MARTI associata con la fase secondariamente progressiva della malattia.

CONCLUSIONI PREMESSE E OBIETTIVI Evidenziare le eventuali ricadute dei risultati del progetto di ricerca a breve, medio e/o lungo Molti studi hanno evidenziato un ruolo importante dei linfociti T CD8+ nella patogenesi della termine sulle persone con sclerosi multipla. Evidenziare, se possibile, quanto i risultati ottenuti sclerosi multipla (SM). Cellule T CD8+ sono state trovate vicino agli assoni danneggiati e demie- siano vicini alla caratterizzazione di nuovi meccanismi patogenetici della malattia (Proximity to linizzati indicando un possibile ruolo della citotossicità cellulare nel danno tessutale nella SM. find new pathogenic mechanism), oppure allo sviluppo di una terapia (Proximity to cure). Il differente rapporto tra linfociti CD8+ della Memoria Centrale (CM), Effettori precursori della Lo studio ha evidenziato che sia i linfociti T CD8+ esprimenti perforina che quelli della memoria Memoria (MPEC) e Effettori a Vita Breve (SLEC) nel sangue periferico potrebbe essere impor- ed effettori circolanti hanno un ruolo nella patogenesi della SM e influenzano il suo decorso tante per il decorso clinico dei pazienti con SM. Lo scopo del nostro studio è stato quello di clinico. I linfociti esprimenti perforina che sembrano essere coinvolti nello sviluppo della disa- valutare la percentuale di linfociti T CD8+CCR7+IL7R alpha high(CM), CD8+CCR7- IL7R alpha bilità sono aumentati nei pazienti con SMRR in riacutizzazione e con SMSP e SMPP. I linfociti high (MPEC), CD8+CCR7-IL7R alpha low (SLEC) e l’espressione di T-bet, eomesodermina e SLEC esprimenti T-bet sono aumentati sia nella fase recidivante che progressiva della malattia perforina in queste sottopopolazioni nei pazienti con Sindrome Clinicamente Isolata suggestiva mentre i linfociti CM esprimenti eomesodermina sono implicate solo nella fase recidivante della di SM (CIS), con SM Remittente-Recidivante (SMRR) in fase acuta e di remissione, con SM Se- malattia. A breve termine l’identificazione di sottopopolazioni di linfociti T CD8+ coinvolte nella condariamente Progressiva (SMSP) e Controlli Sani (CS). Inoltre abbiamo correlato le percen- patogenesi della SM potrebbe essere utile per identificare i pazienti con SM più gravi che ne- tuali delle diverse sottopopolazioni di linfociti CD8+ e l’espressione di T-bet, eomesodermina e cessitano di un approccio terapeutico più aggressivo. A lungo termine nuovi farmaci che hanno perforina con il decorso clinico dei pazienti. L’identificazione di specifici pattern di sottopopola- come bersaglio i linfociti T CD8+ esprimenti perforina o T-bet e l’eomesodermina potrebbero zioni di linfociti T CD8+ può contribuire a riconoscere pazienti con CIS che svilupperanno la SM essere sviluppati per il trattamento della SM. clinicamente definita e devono iniziare un trattamento precoce e ad identificare precocemente pazienti con SMRR con una malattia più grave ed un alto grado di progressione della disabilità che necessitano di un approccio terapeutico più aggressivo. Inoltre la valutazione del T-bet e CD8 T CELL EFFECTOR AND MEMORY della eomesodermina a livello cellulare può aiutare a definire meglio rispettivamente il ruolo dei linfociti T effettori e della memoria nella patogenesi della SM, mentre la valutazione della perfo- SUBPOPULATIONS AND MULTIPLE SCLEROSIS rina come marker di funzione citotossica dei linfociti CD8+, può aiutare a individuare i pazienti CLINICAL OUTCOME che svilupperanno un decorso più aggressivo e una maggiore disabilità.

RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS

Abbiamo analizzato le percentuali di linfociti T CD8+CCR7+IL7R alpha high (Memoria Cen- Several studies suggested an important role for CD8 T cells in the pathogenesis of multiple trale, CM), CD8+CCR7- IL7R alpha high (Effettori Precursori della Memoria Centrale, MPEC), sclerosis (MS). CD8 T cells have been found proximal to damaged and demyelinating axons CD8+CCR7-IL7R alpha low (Effettori a Vita Breve, SLEC) circolanti esprimenti T-bet, eomeso- indicating a possible role for cellular cytotoxicity in tissue destruction in MS. The different ra- dermina e perforina in 60 controlli sani (CS) e 110 pazienti non trattati con differenti forme di tio of central memory (CM), memory precursor effector (MPEC), short lived effector (SLEC) SM e correlato le percentuali di queste sottopopolazioni di linfociti T CD8+ con l’età, la durata lymphocytes in peripheral blood could be important for the clinical outcome of MS patients. di malattia e il grado di disabilità. The aim of our study was to evaluate the percentage of CD8+CCR7+IL7R alpha high (CM), I pazienti con SMRR, SMSP e SM Primariamente Progressiva (PP) hanno mostrato più alte CD8+CCR7- IL7R alpha high (MPEC), CD8+CCR7-IL7R alpha low (SLEC) T cells and the percentuali di cellule T CD8+CD56−perforina+ circolanti rispetto ai CS. I pazienti con SM e expression of T-bet, Eomesodermin and Perforin in these subpopulations of CD8 T cells from EDSS≥3 mostravano una maggiore percentuale di cellule T CD8+CD56−perforina+ dei pazienti peripheral blood of Clinically Isolated Syndrome (CIS) suggestive of MS patients, relapsing-re- con EDSS <3 e i CS, mentre i pazienti con EDSS <3 mostravano una maggiore percentuale di mitting MS (RRMS) patients in acute and in remission phase of disease, secondary progressive questa sottopopolazione di linfociti che i CS. I nostri dati dimostrano che la SM è caratterizzata MS (SPMS) patients and healthy controls. Furthermore we correlated the percentages of the da una disregolazione dei linfociti T CD8+CD56−perforina+ che possono avere un ruolo nello different CD8 T cell subpopulations and T-bet, Eomesodermin and Perforin expression with pa- sviluppo della disabilità. I pazienti con SMRR in riacutizzazione, se comparati con i pazienti in tients clinical outcome. The identification of specific pattern of CD8 T cell subpopulations may remissione e con i CS, mostravano aumentate percentuali di linfociti T CD8+ SLEC circolanti contribute to recognize CIS patients who will develop Clinically Defined MS (CDMS) and must esprimenti T-bet ed Eomesodermina che pertanto sembrano essere associati alle fasi di riacu- begin an early treatment, and to the early individuation of RRMS patients with a more severe tizzazione della malattia. Questi sottogruppi di linfociti CD8+ con funzione citolitica potrebbero disease and with higher disability progression rate who need a more aggressive therapeutic 42 passare la barriera ematoencefalica e contribuire al danno assonale soprattutto durante le fasi approach. In addition, the evaluation of T-bet and Eomesodermin expression at single cell level 43 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

may help to better define the role of memory and effector CD8 T cell subpopulations in MS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI pathogenesis respectively, while the evaluation of Perforin as marker of cytotoxic function of CD8 T cells, may help to individuate patients who will develop a more aggressive course of the Frisullo G, Plantone D, Marti A, Damato V, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ ef- disease and higher disability. fector and memory T cell subpopulations in relapsing-onset Multiple Sclerosis. (In preparation)

RESULTS Frisullo G, Plantone D, Marti A, Iorio R , Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. Circulating CD8+CD56- Perforin+ T cells are increased in Multiple Sclerosis patients. J Neuroimmunol 2011 Dec 15;240- 241:137-41. Epub 2011 Oct 15 We analyzed the percentages of circulating CD8+CD56-perforin+T cells, CD8+CCR7+CD127high (Central Memory, CM), CD8+CCR7-CD127high (Memory Precursor Effector Cells, MPEC), Frisullo G, Plantone D, Marti A, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ T cell effector CD8+CCR7-CD127low (Short Lived Effector Cells, SLEC) T cells expressing T-bet, Eome- and memory subpopulations in relapsing onset Multiple Sclerosis. 5th Joint Triennial Congress of sodermin and Perforin in 60 healthy subjects (HS) and 110 untreated Multiple Sclerosis (MS) the European and Americas Committees for Treatment and Research in Multiple Sclerosis. Am- patients with different forms of MS and correlated the percentages of these CD8+ T cell subpo- sterdam October 19-22/2011. P326 pulations with age, gender, disease duration and disability score. RRMS, SPMS and primary Plantone D, Frisullo G, Marti A, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ T cell effector progressive (PP)MS patients showed higher percentages of circulating CD8+CD56−perforin+ and memory subpopulations in Multiple Sclerosis. XXI AINI Congress. Pollenzo, 22-25 settembre T cells than HS whereas only relapsing RRMS and PPMS patients showed higher perforin 2011 expression in CD8+CD56− T cells than HS. MS patients with EDSS ≥3 showed higher percentage of CD8+CD56−perforin+ T cells than patients with EDSS <3 and HS whereas patients Frisullo G, Iorio R, Plantone D, Marti A, Nociti V, Patanella AK, Tonali P, Batocchi AP. Involvement of circulating Perforin+ CD8+ T cells and Perforin+CD8+CD56+dim NK cells in MS disability pro- with EDSS <3 showed higher percentage of this T cell subpopulation than HS. Our data show gression. 10th International Congress of Neuroimmunology (ISNI), Sitges (Barcellona, Spain) 26- that MS is characterized by a dysregulation of CD8+CD56−perforin+ T cells that may play a 30 October 2010 role in the development of disability. Patients with RRMS in exacerbation, as compared to HS and remitting RRMS patients, showed increased percentages of circulating CD8+ SLEC ex- Frisullo G, Iorio R, Plantone D, Marti A, Nociti V, Patanella AK, Tonali P, Batocchi AP. Involvement pressing T-bet and Eomesodermin which thus seem to be associated to the active phases of of circulating Perforin+ CD8+ T cells and NK cells in MS disability progression. XX AINI Congress. Stresa 30/9-3/10/2010 the disease. These CD8+ T cell subsets with full cytolytic function may pass across the blood brain barrier and contribute to the axonal damage mainly during the acute phases of RRMS. SPMS patients PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 showed increased percentages of circulating CD8+ SLEC expressing T-bet suggesting the per un periodo di 2 anni - 70.000 € presence of a dysfunction in the process of exhaustion in this phase of relapsing-onset MS, which determines the persistence in the circulation of high percentages of fully differentiated effector CD8+ T cells that can pass across the blood brain barrier and contribute to the CNS damage. RRMS patients showed higher percentages of CD8+ CM expressing Eomesodermin both during relapse and remission and of CD8+ MPEC expressing Eomesodermin in remission than SPMS patients and HS. The younger group of RRMS patients showed high percentages of circulating CD8+ cells CM and MPEC that decreased in the older group of SPMS patients. These data suggest that CD8+ CM and MPEC cells have a central role in determining exa- cerbations in patients with RRMS and that their reduction is associated with the secondary progressive phase.

CONCLUSIONS

Our study evidenced that both perforin expressing and memory and effector circulating CD8+ T cells play a role in the pathogenesis of MS and can influence its clinical outcome. An increase of circulating CD8+CD56−perforin+ T cells that seem to be involved in the development of clinical disability is present in relapsing RR, SP and PPMS patients. SLEC CD8+ T cells expressing T-bet are increased both in the relapsing and in the progressive phase of disease while CM CD8+ T cells expressing Eomesodermin play a major role only in the relapsing phase of disease. On short term the identification of specific CD8+ T cells subpopulations involved in MS clinical outcome could be useful to identify MS patients with more severe forms of the disease who need a more aggressive therapeutic approach. On long term new drugs targeting CD8+ T cells expressing perforin or specific transcription factors such as T-bet or Eomesodermin could be developed and used to treat MS patients.

44 45 STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI DEL DANNO NEURONALE NELLE MALATTIE NEURO INFIAMMATORIE CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

tando i dati ottenuti da queste reti neuronali con quelli ottenuti nella prima parte del progetto RESPONSABILE DEL PROGETTO abbiamo realizzato, sorprendentemente, che il contributo dell’acidificazione è sicuramente più LUCA MUZIO eclatante nel promuovere danno cellulare che quello mediato dalle citochine proinfiammatorie. Dipartimento di Neuroscienze Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano CONCLUSIONI Collaboratori: ROBERTA DE CEGLIA Il danno neuronale osservato sia nei pazienti con SM che in modelli sperimentali di SM è stato ANDREA BERGAMASCHI sempre considerato successivo agli episodi di demielinizzazione. Tuttavia i nostri dati suggeriscono fortemente che citochine proinfiammatorie, secrete durante gli episodi infiammatori, Collaborazioni con altri gruppi: possono direttamente interagire con i neuroni. Queste interazioni producono alterazioni fun- ANDREA MENEGON zionali dei neuroni che nel lungo termine possono portare ad una sofferenza cellulare. Un’altra GIANCARLO FERRIGNO causa di danno cellulare è l’acidificazione della matrice cellulare. Lo studio dell’effetto dell’acidificazione sui neuroni ha evidenziato come piccole riduzioni del pH producano forti alterazioni funzionali nei neuroni. In conclusione, i nostri dati mettono in evidenza che sia le molecole PREMESSE E OBIETTIVI secrete che variazioni dell’ambiente extracellulare sono mediatori del danno neuronale. Questi dati possono contribuire allo sviluppo di piattaforme sperimentali per testare farmaci neuropro- Diverse alterazioni neurologiche sono solitamente associate alla sclerosi multipla (SM). Queste tettori. sono associate a perdita di tessuto neuronale e alterazioni permanenti a carico di assoni. Di- verse evidenze sperimentali suggeriscono che la persistenza nel tessuto nervoso di molecole proinfiammatorie può indurre alterazioni neuronali che, in seconda battuta portano ad una disfunzione funzionale delle cellule neurali. Il primo obbiettivo che ci siamo posti è stato quello STUDY OF THE MECHANISM(S) OF NEURONAL di studiare il ruolo di diverse citochine pro infiammatorie in reti neurali realizzate su dispositivo DEGENERATION DURING INFLAMMATORY di registrazione Micro Electrode Array (MEA). In seconda battuta, abbiamo confrontato i nostri dati elettrofisiologici con il profilo di espressione genica indotto da queste molecole nei neuroni DEMYELINATING DISORDERS e con il profilo di espressione genica studiato in animali affetti da Encefalite Autoimmune Spe- rimentale (EAE). Durante la seconda parte del progetto ci siamo posti l’obbiettivo di estendere INTRODUCTION AND AIMS le nostre osservazioni cercando altri meccanismi potenzialmente coinvolti nel danno neuronale. A questo proposito abbiamo esplorato le alterazione di canali neuronali del Na+/Ca2+ che in Patients with multiple sclerosis (MS) experience acute episodes of neurological dysfunctions diversi modelli di neurogenerazione sono responsabili del danno neuronale. Durante l’infiam- that are only partially recovered. Indeed, these patients accumulate disabilities during disease mazione acuta è stata ripetutamente descritta un’acidificazione della matrice extracellulare. progression that are linked to axonal damage and loss of grey matter within the Central Nervous Solitamente questa deriva da alterazioni del bilancio energetico cellulare che portano ad un System (CNS). In this project we have explored the contribution of secreted pro-inflammatory accumulo di acido lattico e quindi un acidificazione della matrice extracellulare. Questo ab- cytokines to the neural derangement by using primary neural cultures and Micro Electrode Ar- bassamento del pH locale può attivare dei canali sensibili ai protoni che a loro volta inducono ray (MEA) device. We have also explored whole transcriptome in mice affected by Experimental un esagerato ingresso di Na+/Ca2 nei neuroni. Questi protoni possono attivare proteasi che Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) and in neurons exposed to pro-inflammatory cytokines. distruggono il citoscheletro dei neuroni. Nella seconda parte del progetto ci siamo occupati di Among mechanisms leading functional alterations of neurons there are specific alterations of studiare il loro ruolo nei processi neurodegenerativi tipici della SM. neuronal ionic channels The over loading of Na+/Ca2+ in neurons during the inflammatory insult, induces toxicity and leads to neuronal vulnerability. The excessive Na+/Ca2+ influxes RISULTATI activate proteases that disrupt the cytoskeleton, causing axonal swelling and neuronal degeneration. Blood-brain barrier leakage, excitotoxic neuronal death, oedema and inflammation are Nella prima parte del progetto abbiamo valutato il ruolo di citochine pro-infiammatorie (TH1) common features of MS and EAE. They can cause mitochondrial inhibition, energetic failure, su reti neurali coltivate su speciali dispositivi di registrazione elettrofisiologica (MEA). La nostra as well as lactate acidification of the extracellular matrix. Because the extracellular pH in a ricerca ha portato alla realizzazione di nuovi algoritmi per l’analisi di queste reti neurali ed a damaged CNS may decrease by more than two pH units during tissue acidosis, the selective una serie di risultati che indicano un coinvolgimento diretto delle molecole proinfiammatorie activation of H+-gated cation channels might result of pivotal importance to mediate neuronal nel controllo della funzione neuronale. I dati elettrofisiologici ottenuti sono stati confrontati con derangement. In the second part of this project we have explored the contribution of specific dati di espressione genica fatti su neuroni trattati con queste citochine ed in topi affetti da EAE. proton sensitive channels to the neural derangement occurring in EAE. Questi dati sono particolarmente interessanti sia per la comprensione di nuovi meccanismi patogenetici che per lo sviluppo di nuove molecole potenzialmente utilizzabili per promuovere RESULTS neuroprotezione. Abbiamo poi esplorato altri meccanismi coinvolti nei processi di danno neuronale. Diverse evidenze sperimentali suggeriscono che durante l’episodio infiammatorio si ve- During the first year of this project we outlined the effects of proinflammatory cues on neuronal rifica anche una acidificazione della matrice extracellulare. In modelli sperimentali di SM questa networks. We firstly set up methods for primary neuronal cultures plated on MEA devices and acidificazione è stata misurata e raggiunge valori intorno a pH 6.6. Gli effetti della acidificazione then we developed new algorithms for the analysis of these networks. Electrophysiological sugli oligodendrociti e sugli astrociti sono stati studiati da diversi gruppi di ricerca, mentre gli data derived from neurons receiving proinflammatory cytokines (TH1) were compared with effetti dell’abbassamento del pH sui neuroni, ed il loro contributo nel processo patologico, sono gene expression obtained by whole transcriptome analysis performed in primary neuronal cul- ancora poco noti. Durante il secondo anno del progetto abbiamo studiato gli effetti dell’acidi- tures and EAE mice. Recent cogent findings suggest that inflamed regions of the CNS display ficazione su reti neurali coltivate su MEA. Sorprendentemente i neuroni sottoposti a pH acido acidification. Indeed, mitochondrial dysfunction causes a reduction of the ATP production that mostravano una severa alterazione di molti parametri elettrofisiologici, suggerendo che l’acidi- leads to acidification. This occurs in inflamed lesions of EAE mice and strong evidence suggest 46 ficazione della matrice extracellulare può interferire con il funzionamento neuronale. Confron- that also patients with MS might suffer of similar phenotype. Measures performed in vivo in 47 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

EAE mice, during acute inflammation, indicated that physiological pH values dropped to values PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI around pH 6.6. Although, a large body of experimental evidence suggests that acidification occurring in the inflamed CNS can negatively modulate oligodendrocyte homeostasis, very few Muzio L, De Ceglia R, Biffi E, Menegon A, Comi G, Centonze D, Furlan R, Martino G. The inflam- studies investigated the effects of low pH on neuronal functioning. During the second year of matory milieu causes neuronal degeneration in murine neuronal networs. COST meeting (Final Management Committee and Working Groups Meeting), Dublin Ireland, June 3rd 2011 this project we attempted to fill this gap of knowledge. Indeed, we performed several experiments, in vitro, on MEA and in vivo in the chronic EAE animal model to establish the effects of Muzio L. The inflammatory milieu causes neuronal degeneration in murine neuronal networs. Invi- low pH on neuronal networks. Interestingly, low pH treatments affected neuronal bursting acti- ted speaker at XXI AINI congress Pollenzo (Cuneo, Italy) September 22-25, 2011 vity and impaired neuronal spike firing, suggesting that the acid milieu might take fundamental part to axonal and neuronal derangements. De Ceglia R, Biffi E, Comi G, Martino G, Menegon A. and Muzio L. The detrimental role of inflammation in neuronal networks. PhD program translational and molecular medicine DIMET (Univer- sity of Milan Bicocca, Milan, Italy) CONCLUSIONS Rossi S, Muzio L, De Chiara V, Grasselli G, Musella A, Musumeci G, Mandolesi G, De Ceglia R, The central dogma of pathogenesis and neuronal derangement in MS and in its animal models, Maida S, Biffi E, Pedrocchi A, Menegon A, Bernardi G, Furlan R, Martino G. and Centonze D. Im- is that neurodegeneration occurs after demyelination. However, our data support the notion paired striatal GABA transmission in experimental autoimmune encephalomyelitis doi:10.1016/j. bbi.2010.10.004 Brain, Behavior and Immunity 2010 that proinflammatory molecules, per se, might induce significant damages in neurons. We also explored the consequence of tissue acidification on primary neuronal cultures. Because the pH of the extracellular matrix decreases during acute inflammatory insults, we investigated PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 the effects of acidification on primary neuronal cultures. The acidification induces a significant per un periodo di 2 anni - 100.000 € alteration of the electrophysiological activity of neurons, that might impair neuronal survival and functioning. All in all, our data suggests that independently of demyelination, secreted molecules and reduction of pH in the extracellular matrix are trigger signals inducing neuronal derangement. Our model recapitulate in vitro same alterations that possibly occur in vivo, thus it may be of interest for testing new neuroprotective drugs.

48 49 CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DEI LINFOCITI T HELPER (TH)17 NELLA SCLEROSI MULTIPLA ED ANALISI CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA DEI MECCANISMI DELLA LORO INATTIVAZIONE

RESPONSABILE DEL PROGETTO raggiungere il sistema nervoso centrale. FRANCESCO NOVELLI 2) identificare il recettore per le chemochine CCR6, e non il CCR4, come marcatore dei linfociti Professore Associato Th17 nella SM. I linfociti Th17 autoreattivi esprimono alti livelli del CCR6, il quale media il reclu- Dipartimento Medicina e Oncologia Sperimentale tamento di questi al sistema nervoso centrale. Università di Torino 3) chiarire i meccanismi attraverso i quali l’IFNβ inibisce i linfociti Th17. Abbiamo dimostrato che l’IFNβ è in grado di inibire direttamente i linfociti Th17 già differenziati. Collaboratori: vi) identificare la catena 2 del recettore per l’IFNγ e la sua kinasi associata JAK2 come fattori SIMONA ROLLA LAURA CONTI chiave nell’inibizione dei linfociti Th17 da parte dell’IFNγ. Entrambi le molecole sono essenziali DANIELA BOSELLI per la trasmissione del segnale dell’IFNγ. Abbiamo osservato che l’espressione della catena VALENTINA BARDINA 2 del recettore per l’IFNγ e della sua chinasi associata JAK2 aumentano nei linfociti Th17 dei ROBERTA CURTO pazienti con SM in fase attiva, ma non in quelli in fase stabile o nei soggetti sani. A causa dell’aumento dell’espressione della catena 2 del recettore per l’IFNγ e della sua kinasi associata Collaborazioni con altri gruppi: Luca Durelli, Marinella Clerico, Divisione di Neurologia, Università di Torino JAK2, il trattamento in vitro con IFNγ riduce significativamente la proliferazione dei linfociti Th17. Facoltà San Luigi Gonzaga, Ospedale S. Luigi Gonzaga, Orbassano Antonio Uccelli, Unità di Neuroimmunologia, Dipartimento di Neuroscienze CONCLUSIONI Oftalmologia e Genetica, Università di Genova Francesco Ria, Gabriele Di Sante, Istituto di Patologia Generale I dati ottenuti in questo programma di ricerca insieme alle nostre precedenti osservazioni (Durelli Università Cattolica del S. Cuore, Roma Raffaele De Palma, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale et al., Ann Neurol 2009) suggeriscono che i segnali antiproliferativi dipendenti da STAT1 sono Seconda Università di Napoli, Napoli inducibili nei linfociti Th17 sia dagli Interferoni di tipo I (IFNβ) che di tipo II (IFNγ) e dipendono dall’espressione dei loro recettori che varia durante lo sviluppo dei linfociti Th17. Così, l’espansione e la contrazione dei linfociti Th17 potrebbe essere strettamente controllata dai linfociti PREMESSE E OBIETTIVI Th1 o dalle cellule NK attraverso la produzione di IFNγ, e dalle cellule dendritiche attraverso la produzione di IFN di tipo I. Sia JAK2 che la catena 2 del recettore per l’IFNγ potrebbero essere I linfociti T helper (Th) 17 sono una sottopopolazione di cellule CD4+ che producono IL-17 considerati come marcatori della fase attiva della SM e potrebbero funzionare come marcatori e coinvolte nell’infiammazione e in diverse patologie autoimmuni sperimentali. Noi abbiamo prognostici della sensibilità agli Interferoni. Questo studio potrebbe così essere un trampolino precedentemente dimostrato che i linfociti Th17 si espandono nel sangue periferico (SP) nei di lancio per l’identificazione di nuovi marcatori prognostici per gestire la terapia con IFNsy nei pazienti con SM in fase attiva. La maggior parte delle informazioni sullo sviluppo e la funzione pazienti con SM. dei linfociti Th17 derivano tuttavia dallo studio di modelli murini deficitarii per le diverse componenti coinvolte nel segnale delle citochine; l’immunologia clinica ha messo però in evidenza numerose differenze tra il modello sperimentale di SM e la SM nell’uomo. Infatti se da un lato FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF T HELPER il deficit del gene per l’IFNγ o la somministrazione di anticorpi anti-IFNγ esacerbava la malat- (TH) 17 LYMPHOCYTES IN MULTIPLE SCLEROSIS tia mentre la somministrazione di Interferone (IFN)γ curava la malattia del topo, nell’uomo la somministrazione di IFNγ ne esacerbava i sintomi. Al contrario, L’IFNβ che attiva il segnale di AND ANALYSIS OF THE MECHANIMS OF THEIR STAT1 così come l’IFNγ, è stato il primo farmaco approvato per il trattamento cronico della SM. A questo proposito, abbiamo osservato che i linfociti Th17, rispetto ai linfociti Th1, l’altra INACTIVATION popolazione coinvolta nella SM, esprimono più alti livelli della catena 1 del recettore per l’IFNβ e sono molto più sensibili ai suoi effetti inibitori. Questo progetto aveva lo scopo di caratterizzare INTRODUCTION AND AIMS i linfociti Th17 nella SM, capire come gli interferoni ne influenzassero lo sviluppo e valutare se la modulazione del segnale IFN/STAT1 potesse costituire un approccio terapeutico in grado di T helper (Th)17 is a subset of IL-17-producing CD4+ cells that induce tissue inflammation and controllare lo sviluppo dei linfociti Th17 nelle malattie autoimmuni. Ci siamo proposti quindi di: have been associated with many experimental autoimmune diseases and human inflammatory 1) chiarire il ruolo patogenetico dei linfociti Th17 conditions. We have demonstrated that peripheral blood (PB) Th17 cells were expanded in the 2) chiarire i meccanismi della terapia con IFNβ nei pazienti con SM active phase of multiple sclerosis. So far, most of the information on Th17 development and 3) dare informazioni su come la regolazione del segnale IFNγ/STAT1 potesse inibire lo sviluppo function has been obtained from murine models knocked out for genes of various compo- dei linfociti Th17. nents of the cytokine signalling pathway. Coming to clinical immunology, a surprising difference between a human disease and its animal model, the experimental autoimmune encephalomye- RISULTATI litis, was evident. While Interferon (IFN)γ administration greatly worsened clinical signs of disease activity in multiple sclerosis, the administration of IFNγ ameliorates experimental autoimmu- Lo scopo di questo progetto era quello di caratterizzare funzionalmente i linfociti Th17 nella ne diseases and administration of antibodies to IFNγ or knocking out IFNγ gene exacerbated SM e di valutare se l’attivazione del segnale di STAT1 da parte dell’IFNβ o dell’IFNγ potesse this disease. By contrast, IFNβ, which activated dowstream STAT1 signalling pathway as IFNγ, efficacemente inibire l’espansione dei linfociti Th17. Per fare questo, abbiamo studiato le cellule was the first drug approved for chronic multiple sclerosis treatment. We showed that Th17 cells mononucleate del sangue periferico ottenute da 50 pazienti con SM e 30 volontari sani. Lo expressed higher level of the chain 1 of the receptor for IFNβ and are more susceptible than svolgimento di questo studio ci ha permesso di: Th1 cells, the other Th subset involved in multiple sclerosis, to its inhibitory effects. 1) identificare una nuova popolazione coinvolta nella SM costituita da linfociti T CD4+ produ- In this project we carried out studies aimed to characterize Th17 lymphocytes in multiple scle- centi IL-22. Abbiamo osservato che nel sangue periferico dei pazienti con SM l’aumento dei rosis, investigate the role of IFNs in their development and evaluate whether the modulation Th17 è accompagnato da quello di cellule CD4+ producenti IL-22 (linfociti Th22) che sono of the IFNs/STAT1 pathway constitute a therapeutic strategy to control Th17 involvement in 50 distinte dai Th17. Il legame dell’IL-22 prodotta dai linfociti Th22 ai recettori espressi sulla bar- autoimmune diseases. We intended to: 51 riera emato-encefalica risulta nell’interruzione di questa e permette ai linfociti T infiammatori di 1. clarify the pathogenic role of Th17 cells in multiple sclerosis CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

2. clarify the mechanisms of the IFNβ-based therapy in multiple sclerosis. G. Contessa, S.De Mercanti, M. Clerico, A. Di Liberto, A Giai Via, S. Rolla, V. Bardina, A. Uccelli, M. Zaffa- 3. provide information on how the regulation of IFNγ/STAT1 signaling and of IFNγ receptor roni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. T-helper (Th) 22 as an early marker that could anticipate disease activity in multiple sclerosis. 5th joint triennial congress EC TRIMS, would inhibit the development of Th17 lymphocytes. 19 – 22 October 2011, Amsterdam, NL, published on Multiple Sclerosis Journal, 17(Suppl.10), 345

RESULTS S. Rolla, V. Bardina, M. Clerico, P. Bonaventura,P. Quaglino, G. Contessa, L. Durelli and F. Novelli. A new T helper subset producing Interleukin 22 increases in multiple sclerosis patients. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione The aim of this research program was to functional characterize human Th17 cells in multiple sclerosis and to evaluate whether the activation of the IFNs/STAT1 pathway could efficiently S. Rolla, G. Di Sante, M. Clerico, C. Nicolò, A.K. Patanella, A. Amoroso, M.E. Fasano, A.P.Batocchi, F. inactivate Th17 expansion. We collected peripheral blood mononuclear cells from 50 patients Ria and F. Novelli. Characterization Of Autoreactive TCR Repertoire In Patients Affected By Multiple with relapsing-remitting multiple sclerosis and 30 age- and gender-matched healthy volunteer Sclerosis. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione subjects. The accomplishment of this project allowed us to: De Palma R, Conti L, Rolla S, Boselli D, Rodolico G, Silveinnonen O, Clerico M, Contessa G, Durelli L, 1) identify IL-22 producing CD4+ T cells as a new T cells subset involved in multiple sclerosis. Novelli F. JAK2 is overexpressed in human multiple sclerosis Th17 cells and stabilizes cell surface ex- We observed that in the peripheral blood of multiple sclerosis patients the increasing number pression of IFN-gammaR2. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione of Th17 cells is paralleled by that of IL-22-producing CD4+ cells (Th22 cells), distinct from Th17 G. Contessa, S.De Mercanti, M. Clerico, A. Di Liberto, A Giai Vai, S. Rolla, V. Bardina, A. Uccelli, M. cell. The binding of IL-22 secreted by Th22 to its receptor expressed on the blood brain barrier Zaffaroni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. T-helper (Th) 22 as results in its disruption and allows to inflammatory T cells to reach the central nervous system. an early marker that could anticipate disease activity in multiple sclerosis. XLII Congress of the Italian 2) identify the chemochine receptor CCR6, and not CCR4, as a marker of self-reactive Th17 Neurological Society, Torino, October 22-25, 2011, published on Neurological Sciences, 32 (Suppl), 179 cells in multiple sclerosis. Autoreactive Th17 cells expresses high levels of CCR6 that serves to S. Rolla , M. Clerico, V. Bardina, P. Bonaventura,P. Quaglino, G. Contessa, L. Durelli and F. Novelli. Cir- recruit them in the central nervous system. culating T helper 22 cells increase in multiple sclerosis patients: phenotypical and functional characteri- 3) elucidate the mechanism through IFNβ inhibits Th17 cells. We have found that IFNβ acts zation. 5th International Conference on Autoimmunity: Mechanisms and Novel Treatments, Sept. 23-28, directly to inhibit differentiates humanTh17 cells. 2011,Crete, Greece 4) to identify IFNγ receptor2 and its cognate kinase JAK2 as key factors in the inhibition of Th17 F. Novelli, R. De Palma, S. Rolla, L. Conti, M. Clerico, G. Contessa, O. Silveinnonen and L. Durelli. JAK2 cells by IFNγ. Both components are essential to transmit the signal of IFNγ to the nucleus. We is overexpressed in human multiple sclerosis Th17 cells and stabilizes cell surface expression of IFN- have found a increased expression of IFNγ receptor 2 and its cognate kinase JAK2 on Th17 gammaR2. Immunology 2001,98th Annual Meeting of AAI, San Francisco, May 13-17 2011, published cells in the peripheral blood of multiple sclerosis patients in the active phase of the disease, but on J Immunol 2011 186:114 not in patients in inactive phase or healthy subjects. Because of the increased expression of L. Durelli, M. Clerico, S. Rolla, G. Contessa, S. De Mercanti, A.Cucci, V. Bardina, A. Di Liberto, A. Uc- IFNγ receptor 2 and JAK2 in Th17 cells, the in vitro IFNγ treatment induced significant decrease celli, M. Zaffaroni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, L. Sosso, R. Cavallo, P. Quaglino, F. Novelli. T-helper of their proliferation. (Th)22, a newly identified lymphocytes subset, increases 1-3 months before an MS relapse and it is not sensitive to IFNβ. 63rd AAN Annual Meeting, Honolulu, April 9-16, 2011, published on Neurology, 76(9), Suppl.4, 374 CONCLUSIONS S .Rolla, V. Bardina, M. Clerico, L. Durelli and F. Novelli. T helper 22 cells increase in multiple sclerosis Overall, the data obtained from this research program together with our previous results (Durelli patients: phenotypical and functional characterization. 8th Joint Conference of the ICS and ISICR, Chi- et al., Ann Neurol 2009) suggest that STAT1-dependent antiproliferative signals are always in- cago, October 3-7 2010, published on Cytokine,2010: 52(1-2), doi:10.1016/j.cyto.2010.07.053 ducible in Th17 cells by type I (IFNβ) or II (IFNγ) IFNs, depending on their receptor expression, S. Rolla, L. Conti, R. De Palma, D. Boselli, V. Bardina, G. Rodolico, O.Silveinnonen, M. Clerico, L. Durelli, which varies during their life. Thus, expansion and contraction of Th17 cells could be strictly and F. Novelli. In human multiple sclerosis, T helper 17 lymphocytes display increased levels of JAK2 controlled by Th1 and NK cells, through IFNγ production, and by activated dendritic cells, that stabilize cell surface IFN-gR2 chain. 8th Joint Conference of the ICS and ISICR, Chicago, October 3-7 2010, published on Cytokine,2010: 52(1-2), doi: 10.1016/j.cyto.2010.07.362 through type I IFN production. Either JAK2 and IFNγ receptor 2 could be both markers of the active phase of multiple sclerosis and could be used as predictor of the sensitivity to IFNs. This S. Rolla, L. Conti, M. Clerico, L. Durelli and F. Novelli. Longitudinal analysis of IL-17 and/or IL-22 produ- study provides a springboard for the assessment of new prognostic markers for the indication cing CD4+ T lymphocytes in relapsing remitting multiple sclerosis. WIRM 2010, Davos, March 29 –April of IFNβ management in multiple sclerosis patients. 1 2010 L. Durelli, M. Clerico, S. Rolla, G. Contessa, S. De Mercanti, A. Uccelli, M. Zaffarono, P. Cavalla, L. Rinal- di, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli. Can the increase of T-helper 17 lymphocyte percentage in PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI peripheral blood anticipate a relapse in relapsing remitting multiple sclerosis? 2010 AAN Annual meeting, Neurology 2010; 74; 9 (supplement 2) Conti L, De Palma R, Rolla S, Boselli D, Rodolico G, Kaur S, Silvennoinen O, Niccolai E, Amedei A, Ivaldi F, Clerico M, Contessa G, Uccelli A, Durelli L, Novelli F. Th17 Cells in Multiple Sclerosis Express Higher G. Contessa, M. Clerico, S. Rolla, S. De Mercanti, A. Uccelli, M. Zaffarono, P. Cavalla, A. Mattioli, E. Romagnolo, L. Rinaldi, G. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. Can the increase of T-helper Levels of JAK2, Which Increases Their Surface Expression of IFN-γR2. J Immunol. 188(3):1011-8, 2012 17 lymphocyte percentage in peripheral blood anticipate a relapse in relapsing-remitting multiple scle- Rolla S, Clerico M, Bardina V, Quaglino P, Durelli L and. Novelli F. Phenotypical and functional characte- rosis? Mult. Scler. 2010; 16 (suppl.10) rization of T Helper 22 cells in Multiple Sclerosis patients. Keystone Symposia: Th17 Cells in Health and Disease, February 5 - 10, 2012 • Keystone, Colorado PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 Boselli D, Ragimbeau J, Orlando L, Cappello P, Capello M, Ambrogio C, Chiarle R, Marsili G, Battistini per un periodo di 2 anni - 80.000 € A, Giovarelli M, Pellegrini S, Novelli F. Expression of IFNγR2 mutated in a dileucine internalization motif reinstates IFNγ signaling and apoptosis in human T lymphocytes. Immunol Lett. 134(1):17-25; 2010

Di Sante G, Patanella AK, Rolla S, Nicolò C, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Novelli F, Batocchi AP, Ria F. MBP 85-99-specific TCR repertoire in DR2+ patients affected by multiple sclerosis. 5th joint 52 triennial congress EC TRIMS, 19 – 22 October 2011, Amsterdam, NL, published on Multiple Sclerosis 53 Journal, 17(Suppl.10), 128 STUDIO PILOTA PER DETERMINARE IL CONTRIBUTO DEI NEUTROFILI NELLO SVILUPPO DI MALATTIA IN DUE CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA MODELLI ANIMALI PER LA SCLEROSI MULTIPLA CHE MIMANO LA FORMA ACUTA E RECIDIVANTE-REMITTENTE DI MALATTIA Ci siamo quindi focalizzati inizialmente su parametri macroscopici, i.e. la formula ematica ed il peso corporeo. Sorprendentemente il numero di neutrofili circolanti nei ratti trattati con quattro RESPONSABILE DEL PROGETTO dosi di siero aNEU è paragonabile a quello degli animali affetti da EAE. D’altra parte sia negli ROBERTA RIGOLIO animali tratti con aNEU che NRS si osserva un recupero più veloce del peso corporeo rispetto Assegnista di Ricerca agli animali EAE. Dipartimento di Neuroscienze e Tecnologie Biomediche Abbiamo valutato di seguito alcuni parametri cellulari e molecolari che caratterizzano l’anda- Università di Milano-Bicocca mento monofasico nei ratti Lewis e che in letteratura, sono alterati in una forma acuta di EAE indotta nei DA. Perciò la nostra analisi è incentrata sulla milza e sulle tre porzioni di midollo Collaboratori: spinale. Così rileviamo che il siero aNEU non è in grado di contrastare l’ipoplasia della sostanza GUIDO CAVALETTI bianca né la riduzione nella frequenza delle cellule T regolatorie indotta da EAE nella milza a 14 PAOLA PALESTINI e 28dpi né di modificare il grado di infiltrazione leucocitaria del midollo spinale a 14dpi. A 14dpi NORBERTO OGGIONI tuttavia i osserva negli animali trattati con aNEU un aumento nel grado di distribuzione delle CHIORAZZI ALESSIA CRISTINA MEREGALLI cellule macrofagiche ED1+ nel tratto cervicale di midollo spinale, mentre a 28dpi il siero aNEU ELISA BALLARINI non ha alcun effetto né sull’eterogeneo grado di distribuzione di cellule ED1+ né sull’espressio- FEDERICA AVEZZA ne della chemochina MCP-1 (monocytes chemoattractive cytokine 1) tra i differenti tratti indotti dalla malattia. Più interessante invece è l’azione del siero aNEU a 28dpi sull’espressione genica Collaborazioni con altri gruppi: delle citochine indotte da EAE nel midollo. Sebbene infatti il siero aNEU contrasti la variazione LUCA CRIPPA, DVM - ISTOVET dell’espressione delle citochine pro-(INFγ and TNFα) e anti-infiammatorie (TGFβ and IL10) indotta dalla EAE,in ogni tratto di midollo considerato, i cambiamenti più rilevanti si osservano a livello del tratto cervicale dove l’espressione di entrambe le tipologie di citochine è addirittura PREMESSE E OBIETTIVI raddoppiata negli animali trattati con siero aNEU rispetto agli EAE. A 28dpi abbiamo considerato infine l’effetto che il siero aNEU potesse avere sui processi di La sclerosi multipla (SM) è una patologia infiammatoria cronica neurodegenerativa e, come demielinizzazione a carico del midollo spinale. Tuttavia i nostri dati preliminari mostrano che il nel caso del suo modello animale, l’Encefalomielite Autoimmune Sperimentale (EAE), si ritiene trattamento con aNEU non è in gardo di interferire con il grado di espressione dell’RNA della che le cellule T dell’immunità adattativa giochino un ruolo chiave nello sviluppo della malattia proteina basica della mielina (MBP). stessa. Le cellule dell’immunità innata sono poco considerate sia nell’eziopatogenesi che nel decorso della SM e dell’EAE. All’interno di questa popolazione spesso dimenticata, i neutrofili CONCLUSIONI costituiscono la sottopopolazione più abbondante ed in grado di influenzare attivamente la risposta adattativa così come di essere sensibili alle modificazioni citochimiche sia nella SM I neutrofili non sembrano essere strettamente necessari né nella fase cronica né per l’induzione che nell’EAE. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di chiarire il potenziale ruolo dei neu- dell’EAE e il loro significativo incremento nel sangue sembra essere per lo più dovuto a fattori trofili nell’attivazione delle cellule T e nel decorso cronico dell’EAE indotta e valutata nei ratti legati all’andamento naturale della malattia. Dark Agouti (DA). L’EAE sviluppata nel ratto DA è caratterizzata dalla comparsa dei primi segni Tuttavia il siero aNEU modifica il decorso di malattia quando viene somministrato durante la clinici 10-11 giorni dopo l’immunizzazione (dpi) con un peggioramento dei segni neurologici fase di induzione della stessa trasformando una forma cronica di EAE una acuta-monofasica. Il fino a 14dpi e un andamento remittente recidivante fino almeno a 40dpi mimando, almeno in siero aNEU non modifica né l’ipoplasia della sostanza bianca e la frequenza di cellule Treg nella parte, la forma più frequente di malattia tra i pazienti con SM. Per verificare il coinvolgimento milza né il grado di infiltrazione leucocitaria nel midollo spinale a picco di malattia. Inoltre il siero dei neutrofili nella fase cronica o di induzione dell’EAE i neutrofili sono stati depletati dal sangue aNEU sembra modificare principalmente il grado di distribuzione di cellule macrofagiche al impiegando un siero specifico (aNEU) somministrato a giorni alterni A) iniziando al picco di picco di malattia e l’effetto maggiore è a carico del tratto cervicale a 28dpi. Infine il siero aNEU malattia (13dpi) fino a 35dpi oppure B) iniziando il giorno precedente quello dell’induzione fino non sembra avere alcun effetto sull’espressione genica della MBP rispetto agli animali EAE. a otto dpi, periodo di tempo necessario perché si sviluppino le cellule T autoreattive. Abbiamo quindi valutato l’andamento di malattia fino a 35 o 28dpi rispettivamente. Inoltre, per escludere un potenziale effetto confondente sull’andamento di malattia dovuto alle IgG presenti nel siero A PILOT STUDY TO INVESTIGATE THE o allo stress da manipolazione, un gruppo di animali è stato trattato con un siero di controllo (NRS) ottenuto dalla stessa specie animale in cui è stato prodotto l’aNEU. CONTRIBUTION OF NEUTROPHILS TO TWO

RISULTATI MULTIPLE SCLEROSIS RAT MODELS DEVELOPMENT WHICH MIMIC RESPECTIVELY THE ACUTE AND THE La somministrazione di siero aNEU iniziata a 13dpi non migliora l’andamento di malattia. Al contrario quando i ratti ricevono il siero durante la fase di induzione, si osserva un sorprendere- RELAPSING-REMITTING FORM OF THE DISEASE te ed inaspettato miglioramento del decorso dell’EAE già a partire dai giorni seguenti il 14dpi, così che la malattia stessa sembra assumere un andamento acuto-monofasico. D’altro canto INTRODUCTION AND AIMS questo effetto non è genericamente dovuto al siero, dal momento che esso il NRS non sortisce alcun effetto sull’andamento di malattia. Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory neurodegenerative disease and, as it happens Per comprendere i meccanismi attraverso cui il siero aNEU abbia agito, abbiamo quindi deciso for its animal model, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), it’s believed to be di analizzare diversi parametri noti per essere modificati nel corso dell’EAE acuta-monobasica mainly sustained by the action of T cells which belong to the adaptive immunity. Thus the innate 54 indotta nei ratti Lewis. immune system cells are poorly considered both in MS and EAE etiopathogenesis and clini- 55 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

cal disease course. Among this neglected immune system arm, the neutrophils are the most process in the spinal cord. Nevertheless our preliminary results pointed out aNEU could not abundant subpopulation and have been showed to shape the adaptive immune response as affect the myelin basic protein (MBP) mRNA expression. well as to be responsive to environmental changes during the disease course. Only few data are present in literature on the neutrophils involvement in both MS and EAE. CONCLUSIONS Thus our founded work dealt with the potential role of neutrophils in shaping the T cell activation or in sustaining EAE chronic course as it has been induced and evaluated in Dark Agouti The neutrophils neither seem to be strictly important for EAE induction nor for EAE chronic pha- (DA) rat chronic model. se and their relevant increase seem to be mostly a results of the disease natural course since DA EAE model is characterized by the clinical signs appear on 10-11days post EAE induction the repeated depletion performed has no effect on their circulating number. (dpi) with the disease worsening up to 14 dpi while the animals experience a series of subse- Nevertheless aNEU treatment affects the clinical course when it is administered during the quent relapses and remissions up to at least 40 dpi. DA EAE animal model mimics at least in induction phase of EAE transforming a chronic form of EAE into an acut- monophasic one. part the most frequent MS form, the relapsing remitting one. To test the neutrophil involvement aNEU doesn’t affect neither EAE occurring changes in spleen structure and Treg presence, in induction and chronic phase of the disease, we depleted the circulating neutrophils by in- nor the spinal cord leukocyte infiltration degree at the disease peak. Moreover aNEU-treatment traperitoneally injection of specific anti-neutrophil serum (aNEU) every other day starting the seems mainly to affect the macrophagic cells distribution degree at the peak of the disease and treatment A) around the disease peak, on 13dpi, and up to 35dpi or B) the day before EAE although aNEU affects heterogeneously pro- and anti-inflammatory cytokine expression in the induction up to eight dpi that means depletion of neutrophils was effective during the time spinal cord, the main differences are evident in the cervical section on 28dpi. Finally aNEU does reasonably necessary to the induction of autoreactive T cells. Thus we evaluated the clinical not seem to affect MBP expression in comparison with the EAE animals. course up to 35 or 28 dpi respectively. Moreover to exclude the confounding effect on clinical course due to the serum IgG and manipulation stress, a group of EAE DA rats receive normal rabbit serum (NRS), where the aNEU serum was obtain from. PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI RESULTS Rigolio R, Magni A, Ballarini E, Meregalli C, Chiorazzi A, Sala B, Carozzi V, Canta A, Avezza F, While aNEU administration started on 13dpi did not improve the mean clinical score, when DA Oggioni N, Crippa L, Cavaletti G. Preventive treatment with anti-rat neutrophil serum affects the relapsing phase in Dark Agouti EAE rats. XXI AINI congress 2011 (22nd-25th September, Pollenzo, rats received a presyntomatic aNEU-treatment the results was unexpected and surprising. In Italy) Abstract book fact while there were no differences between EAE and aNEU-treated rats up to the peak of the disease (14dpi), a quite complete remission of the clinical signs occurred soon after it so Ballarini E, Carozzi V, Canta A, Chiorazzi A, Meregalli C, Avezza F, Crippa L, Oggioni N, Cavaletti that the clinical course seemed to acquired an acute-monophasic course profile. This effect G, Rigolio R. Neutrophil contribution and immunoglobulin effect in Dark Agouti Experimental Au- could not just be referred to serum itself since the clinical course of NRS- treated animals was toimmune Encephalomyelitis. XX AINI congress 2010 (30th September – 3rd October, Stresa, Italy) Abtract book indistinguishable from that observed in EAE rats. To elucidate the potential mechanisms induced by aNEU in DA rats we investigated the changes occurring in several parameters already known to be involved in the acute monophasic PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 EAE course in Lewis rat. per un periodo di 1 anno - 25.000 € Thus we considered the main macroscopic changes that aNEU treatment can induce, i.e. blood formula and body weight changes. Surprisingly even after receiving four aNEU doses, the circulating absolute neutrophil number increased with the same extent in both aNEU–treated and EAE rats while the body weight gain was faster in aNEU as well as in NRS treated rats compared to EAE rats. We then deepened our investigation focusing on those cellular and molecular parameters which generally characterize the monophasic course in the acute Lewis rat and that in literature are referred to an acute form of EAE induced in DA rats as well. Therefore we considered the changes occurring in the spleen, and in the three different sections of the spinal cord. As shown by our results, aNEU did not neither affected the white pulp hypoplasia induced by EAE nor the reduction in the naturally occurring regulatory T cells frequency in the spleen on both 14 and 28dpi. At the same time aNEU did not influence the spinal cord infiltrating leukocytes degree at the peak of the disease whereas an interesting increase in the distribution degree of ED1+ macrophagic cells occurred in the cervical spinal cord section. On the other hand on 28dpi we observed heterogeneity in ED1+ cells distribution degree as well as in the gene expression of the monocytes chemoattractive cytokine 1 (MCP-1) among the three different spinal cord sections in EAE animals and no effect of aNEU on both of them. More interestingly on 28dpi aNEU seemed to alter the gene expression section-dependent profile induced by EAE. Although it counteracted the effect of EAE on both the pro- (INFγ and TNFα) and anti-inflammatory (TGFβ and IL10) cytokines gene expression, the most interesting changes occurred in the cervical section where the relative expression level of both the kind of cytokines even doubled in aNEU-treated rats compared to the EAE ones. 56 On 28dpi we also considered the potential effect of aNEU on the EAE-induced demyelination 57 RUOLO DELLE CELLULE NATURAL KILLER CD56bright NELLA SCLEROSI MULTIPLA CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

progressiva, che può complicare il trattamento con natalizumab. Natalizumab inoltre tende a RESPONSABILE DEL PROGETTO diminuire la proliferazione delle cellule NK attivate. Esperimenti di cocoltura di cellule CD56dim ALICE LARONI con cellule di melanoma hanno dimostrato una conservata citotossicità per le cellule tumorali Dipartimento di Neuroscienze in presenza di natalizumab anche ad alte concentrazioni. Oftalmologia e Genetica, Università di Genova CONCLUSIONI MENTORE: ANTONIO UCCELLI Nelle persone con SM una compromissione della funzione immunoregolatoria delle cellule CD56bright potrebbe essere alla base della disregolazione della risposta immune e di perdita della tolleranza immunologica che caratterizzano la patologia. La comprensione del mecca- PREMESSE E OBIETTIVI nismo patogenetico alla base di tale deficit permetterà di sviluppare terapie mirate. La terapia con natalizumab potrebbe portare a complicazioni virali e neoplastiche a causa di un’alterata Un insufficiente controllo della risposta autoimmune da parte di cellule regolatorie del sistema immunosorveglianza delle cellule NK CD56dim. immunitario potrebbe essere alla base della sclerosi multipla (SM). Le cellule natural killer (NK) sono una parte del sistema immunitario innato capaci di interagire con componenti del sistema immunitario regolandone l’attivazione. Le cellule NK si dividono DISSECTION OF THE ROLE OF CD56bright nella sottopopolazione CD56dim, predominante nel sangue periferico (90-94%) e nella piccola sottopopolazione CD56bright, con funzione immunoregolatoria. Le cellule CD56bright secerno- NATURAL KILLLER CELLS IN MULTIPLE SCLEROSIS no grandi quantità di citochine e fattori di crescita. Un funzionamento difettivo delle cellule CD56bright è stato chiamato in causa per la patogenesi dell’autoimmunità, anche se il loro ruolo INTRODUCTION AND AIMS nella SM non è chiaro. Non è noto, ad esempio, quali sottopopolazioni NK infiltrino il sistema nervoso centrale (SNC) MS pathogenesis may be associated with a defect in the control of autoreactive immune cells. nella SM. Le cellule CD56bright sono significativamente espanse nei pazienti con SM trattati Natural Killer (NK) cells are a key component of innate immune system (IS), interacting with con interferone beta e con daclizumab (DAC), anticorpo monoclonale attualmente in fase di cells of the innate and adaptive immune system regulating their activation. Circulating NK cells sperimentazione per la SM. In un trial con DAC, l’aumentato numero di CD56bright correlava can be divided in the predominant (90-95%) CD56dim NK cell subset, strongly cytotoxic, and in positivamente con la diminuzione di lesioni attive alla risonanza magnetica e con la diminuzione the small CD56bright NK cell subset, which displays significant “immunoregulatory” properties. di cellule T CD4 e CD8 circolanti. Gli studi in vitro avevano dimostrato che le cellule NK espan- CD56bright NK cells, indeed, are able to secrete different cytokines and growth factors like GM- se durante la terapia con DAC inibivano la sopravvivenza delle cellule T in modo contatto- CSF. The possible role of CD56bright NK cells in the pathogenesis of autoimmunity in general, dipendente. Scopo di questo studio è definire il ruolo delle cellule NK nella patogenesi della and MS in particular, has been hypothesized but is not known. While a few scattered NK cells SM. Un sottostudio ha valutato il fenotipo e la funzionalità delle cellule NK in pazienti trattati could be observed in MS lesions, nothing is known about their phenotype and their presence con natalizumab. Tale terapia, indicata per la SM aggressiva e altamente efficace, può portare in the central nervous system. a complicanze infettive e neoplastiche che potrebbero essere causate da un’alterata funziona- CD56bright NK cells were reported to expand significantly in MS patients treated with interferon lità delle cellule NK, dato il ruolo centrale di tale popolazione cellulare nell’immunosorveglianza beta and with the anti-CD25 monoclonal antibody daclizumab (DAC). In a trial with DAC, the contro infezioni virali e tumori. increased number of CD56bright NK cells correlated with a decreased number of Gad+ lesions on MRI as well as with the decline of circulating CD4+ and CD8+ T cells. The in vitro studies RISULTATI showed that NK cells expanded during DAC therapy limit the survival of activated T cells in a contact-dependent manner. Aim of this work is to characterize the role of NK cells in the pa- La caratterizzazione delle cellule NK nel liquido cefalorachidiano ha dimostrato la presenza di thogenesis of MS. A substudy was aimed to evaluate the phenotype and function of NK cells in un’aumentata percentuale di cellule CD56bright CCR7 positive nei soggetti con SM rispetto ai subjects treated with natalizumab. Such therapy, highly effective for the treatment of aggressive controlli con altre malattie neurologiche. Questo potrebbe rappresentare un meccanismo di MS can lead to infective and neoplastic complications which could be caused by an impaired compenso della risposta autoimmune centrale. È stata studiata la funzionalità delle cellule NK functionality of NK cells, central players in the immunosurveillance against viral infections and in persone con SM precoce non trattate ed in controlli sani. Difficoltà metodologiche relative al neoplasms. basso numero di cellule CD56bright nel sangue periferico sono state affrontate e risolte. Le cellule CD56bright di persone con SM e controlli sani, purificate e stimolate sono state coltivate con RESULTS linfociti T autologhi. Abbiamo dimostrato che le cellule CD56bright di controlli sani, sottoposte ad attivazione con citochine, sopprimono la proliferazione di linfociti autologhi; tale funzione è The characterization of NK cells in the cerebrospinal fluid has demonstrated an increased per- difettiva nei pazienti con SM. Esperimenti di real-time PCR e studi funzionali sono in corso per centage of CD56bright NK cells compared to controls with other neurologic diseases. This might spiegare il meccanismo molecolare alla base di tale osservazione. represent a compensative mechanism of the autoimmune response in the central nervous Lo studio di real-time PCR su cellule NK purificate in pazienti con SM all’esordio ha dimostrato system (CNS). The functionality of NK cells in patients with early MS and healthy controls has una diminuita espressione di Granzyme K da parte delle cellule CD56bright di persone con de- been investigated. Methodological pitfalls concerning the low number of circulating CD56bright corso aggressivo. NK cells have been addressed and resolved. CD56bright from MS patients and health controls Sottostudio su cellule NK e natalizumab. Il recettore di natalizumab, a4 integrina, è risultato have been purified, stimulated and cultured with autologous T lymphocytes. We have observed espresso in misura analoga dalle cellule CD56bright e CD56dim. Le cellule CD56dim, coltivate in a suppressive capacity of CD56bright on autologous T cells in healthy controls, which was impai- presenza di natalizumab, diminuiscono in modo significativo l’espressione di alfa4 integrina; red in MS. Real-time PCR experiments and functional assays are currently ongoing to explain tale diminuzione è molto più marcata per le cellule NK attivate, che svolgono funzione citotos- such difference. sica. Questo potrebbe causare un diminuito passaggio attraverso la barriera ematoencefali- A real-time PCR study on CD56bright NK cells in early MS has shown a decreased expression of 58 ca delle cellule in grado di contrastare infezioni virali, come la leucoencefalopatia multifocale Granzyme K in CD56bright NK cells of subjects with aggressive disease. 59 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

Substudy on NK cells and natalizumab. The receptor of natalizumab, is expressed by both BORSA DI RICERCA FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 CD56bright and CD56dim with a similar pattern. CD56dim NK cells, cultured in presence of nata- per un periodo di 2 anni - 44.000 € lizumab, decrease significantly the expression of alpha-4 integrin; such decrease is significantly more marked in activated NK cells, which perform the cytotoxic function. This might cause an impaired transit through the blood brain barrier to the CNS of cells capable of blocking viral infections, such as the multifocal progressive leukoencelphalopathy, which can be a complica- tion of natalizumab treatment. Moreover, natalizumab decreases the proliferation of activated NK cells. Experiments of coculture of CD56dim NK cells and melanoma cells have shown that treatment with natalizumab does not alter CD56dim-mediated cytotoxicity.

CONCLUSIONS

In patients with MS an impairment of the immunoregulatory function of CD56bright NK cells might cause a dysregulation of the immune response and the loss of immunological tolerance that characterize the disease. Understanding the pathogenetic mechanism causing such impairment will permit to develop therapies targeting NK cells functions. Natalizumab might lead to viral and neoplastic complications due to an impaired immunosurveillance of CD56dim NK cells.

60 61 TOPI CD1 - TRANSGENICI COME NUOVO MODELLO SPERIMENTALE PER LO STUDIO DELLA SM CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

RESPONSABILE DEL PROGETTO dopo stimolazione con i lipidi e cellule presentanti l’antigene che esprimevano molecole CD1b. LUCIA MORI Gli obiettivi di partenza di questo progetto pilota sono stati raggiunti. Experimental Immunology Department of Biomedicine, University Hospital Basel, Switzerland CONCLUSIONI

Collaboratori: I risultati ottenuti suggeriscono un ruolo attivo delle cellule T lipide-specifiche nella patogenesi GENNARO DE LIBERO, Prof. M.D., Ph.D. Scientific advisor, University of Basel, Switzerland della EAE e confermano i dati precedentemente pubblicati dal nostro gruppo in pazienti con HUESEYIN DUYAR, M.D. Research collaborator, University Hospital Basel, Switzerland SM. L’isolamento di cellule T specifiche per molecole lipidiche e la caratterizzazione della strut- FEDERICA FACCIOTT, Ph.D. Research collaborator, University Hospital Basel, Switzerland tura di tali molecole permettera’ di prospettare nuove strategie terapeutiche e sarà fondamen- HANS LASSMANN, Prof. M.D. Scientific advisor, Medical University of Vienna, Austria tale per l’identificazione di eventuali marcatori biologici caratteristici di questa malattia.

PREMESSE E OBIETTIVI TRANSGENIC MICE TO STUDY

La sclerosi multipla (SM) è una malattia molto complessa, caratterizzata dalla progressiva di- GLYCOLIPID-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE IN MS struzione delle guaine dei neuroni del sistema nervoso centrale, che sono essenziali per la conduzione dell’impulso nervoso. Le cellule del sistema immunitario sono responsabili della INTRODUCTION AND AIMS risposta autoimmune. Mentre la risposta immunitaria diretta verso la componente proteica di queste guaine è stata studiata in dettaglio, solo recentemente si è cominciato a studiare la In multiple sclerosis (MS) an immune response against myelin-derived self lipids is generated. risposta immunitaria diretta verso la componente lipidica che rappresenta il 70 % della guaina We have previously observed an increased frequency of CD1b-restricted T cells specific for mielinica. In studi precedenti avevamo riscontrato nel sangue periferico di pazienti con SM un glycolipid components of myelin, in the peripheral blood of MS patients. These T cells release aumento della frequenza di cellule T specifiche per glicolipidi self e prospettato un loro possibile proinflammatory lymphokines. To study in vivo the role of these autoreactive cells in the pa- ruolo nella patogenesi della malattia. La maggior parte degli studi volti a capire le cause della thogenesis of autoimmunity, we have generated transgenic (tg) mice expressing human CD1b SM e quelli per valutare l’attività di nuovi farmaci e composti terapeutici, sono basati sull’uso antigen-presenting molecules. Our aim is to exploit these tg mice as a new animal model di modelli sperimentali in animali da laboratorio. L’encefalomielite autoimmune nel topo (EAE) è for experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) to understand the contribution of lipid- il modello sperimentale piu’ frequentemente utilizzato perché presenta molte caratteristiche in specific T cells to immunopathogenesis and/or immunoregulation of the disease. comune con la SM, sebbene non riproduca perfettamente tutti gli aspetti clinici della malattia The aim of our studies is to investigate the relevance of lipid-specific T cells in the autoimmu- umana. Allo scopo di studiare in vivo il ruolo delle cellule T autoreattive e specifiche per glico- ne response leading to brain tissue damage and MS. We studied EAE in a new humanized lipidi self nella patogenesi della malattia, abbiamo generato topi geneticamente modificati che transgenic mouse model. The clinical and histopathological disease progression, the presence esprimono molecole CD1b umane che presentano questi lipidi. Il nostro scopo è di utilizzare of self-glycolipid-specific T cells and the nature of self-lipids involved in brain autoimmune at- le peculiarità di questi topi transgenici per ottenere un nuovo modello sperimentale di EAE che tack is being investigated. This model may provide new insights into the disease pathogenesis ci permetta di studiare i meccanismi con cui le cellule T lipide-specifiche contribuiscono allo revealing novel associated antigens and new possible therapeutic options of MS. sviluppo della SM ed anche al controllo di questa malattia. RESULTS RISULTATI Transgenic mice expressing human CD1b molecules (CD1B tg) are more susceptible to EAE Le risorse disponibili hanno permesso di ottenere i seguenti risultati. Topi transgenici che espri- than non-tg mice. After immunization with MOG35-55 peptide in complete Freund’s adjuvant, mono la molecola CD1b umana (CD1B tg) sono molto piu’ suscettibili allo sviluppo di EAE CD1B tg mice develop a clinical disease with earlier onset, increased incidence and severity. rispetto ai topi non-tg. La malattia si sviluppa infatti precocemente dopo la classica immuniz- In addition, CD1B tg mice have disease relapses 30-40 days after immunization, which were zazione e con aumentate severità ed incidenza. Solo negli animali CD1B tg sono stati osservati never described in C57BL/6 mice. Histopathological analyses of nervous system tissues from episodi di recrudescenza della malattia. Analisi istopatologiche preliminari effettuate su tessuto CD1B tg and non-tg mice were performed to evaluate: I) the number of perivascular inflamma- nervoso centrale e periferico hanno tuttavia evidenziato che i topi CD1B tg sviluppano un qua- tory infiltrates in spinal cord, II) the number of T cells in spinal cord, III) the score of demyelina- dro infiammatorio e di demielinizzazione meno accentuato rispetto ai topi di controllo. Questa tion of spinal cord, IV) the percentage of demyelinated areas in spinal cord, v) the topography of discrepanza sarà oggetto di ulteriori approfondimenti. Allo scopo di studiare i motivi per cui i inflammatory lesions within different brain areas, and vi) peripheral nervous system lesions (spi- topi CD1B tg sviluppano una forma di malattia diversa dai topi di controllo, abbiamo studiato lo nal roots, trigeminal ganglia and sciatic nerve). The results obtained in a small series of animals sviluppo della EAE in due ulteriori modelli transgenici: topi Lck-CD1B tg che esprimono le mo- at two different disease time points, showed that CD1B tg mice have milder histopathological lecole CD1b esclusivamente nel timo e topi Eα-CD1B tg che esprimono queste molecole nelle signs of EAE with moderate inflammation and demyelination when compared to non-tg mice. cellule periferiche. Nessuno di questi due tipi di animali ha sviluppato una malattia significativa- Thus, a discrepancy between clinical and histopathological results was observed. To evaluate mente diversa da quella di animali di controllo, confermando la nostra ipotesi che il fenomeno whether the observed differences in clinical EAE between CD1B tg and non-tg mice required osservato nei topi CD1B tg richiede l’espressione contemporanea delle molecole CD1b sia the expression of CD1b in particular organs and cell types, EAE was induced in the other two negli organi linfoidi centrali che in quelli periferici. Un’importante implicazione dei nostri risultati transgenic mouse lines which we have previously generated. In Lck-CD1B tg, CD1b is exclu- è che i topi CD1B tg sviluppano una risposta autoreattiva diretta contro molecole lipidiche self sively expressed in immature thymocytes, thus, presentation of CD1b-restricted lipids in the a seguito della reazione infiammatoria e demielinizzante che si sviluppa dopo la classica immu- periphery is not possible. In Eα-CD1B tg, CD1b in only expressed on antigen-presenting cells nizzazione con peptidi MOG in adiuvante. Per dimostrare la presenza di cellule T specifiche per like dendritic cells, macrophages, and B cells, but not in the thymus, where CD1b-restricted lipidi della mielina, abbiamo stimolato linfociti di topi CD1B tg con malattia con estratti lipidici di T cells are supposed to be selected. Disease was compared to that developing in CD1B tg 62 mielina. Queste cellule hanno proliferato ed hanno rilasciato citochine pro-infiammatorie in vitro (derived from intercrossing Lck-tg with Eα-CD1B tg) expressing CD1b both in the thymus and 63 CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

in the periphery. EAE developed with significantly earlier onset, higher incidence and severity in PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI CD1B tg mice. The other two groups develop instead a disease which is not significantly different from the one observed in C57BL/6 mice. The results indicate that proper tissue expression Duyar H, Facciotti F, De Libero G. and Mori L. Humanized CD1B-transgenic mice to study glyco- of CD1b is necessary for disease aggravation and suggest that autoreactive T cells need a lipid-specific immune responses in EAE. Abstract for ECTRIMS, 19-22 October 2011 Amsterdam, The Netherlands selection event in the thymus and proper stimulation in the periphery. One possible explanation of our results is that in CD1B tg mice following MOG-peptide immunization, self-lipids become Duyar H, Facciotti F, Lassmann H, De Libero G. and Mori L. Human CD1B-transgenic mice to study target of specific T cells. To demonstrate that spreading of lipid antigens occurs during EAE, glycolipid-specific immune responses in EAE. Poster at FISM Research Meeting 2010, 26-27 May T cells were isolated from CD1B tg mice with disease and tested for their reactivity by using 2010, Rome, Italy antigen-presenting cells expressing CD1b and myelin-derived glycolipids. Preliminary studies Duyar H, Facciotti F, Lassmann H, De Libero G. and Mori L. Humanized CD1B-transgenic mice to showed that in CD1B tg mice T cells specific for self-glycolipids are present, proliferate and study glycolipid-specific immune responses in EAE. Abstract and oral presentation at the Swiss release pro-inflammatory, but not anti-inflammatory cytokines. MS Society Researcher Meeting, 3 September 2010, Zurich, Switzerland

CONCLUSIONS PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 The results described here provide a basis for further understanding the mechanisms of EAE per un periodo di 1 anno - 30.000 € and MS pathogenesis. The isolation of T cells specific for lipids and the characterization of the structures of immunogenic lipids will be instrumental for the design of new therapeutic strategies and for the identification of lipids as disease-specific biomarkers.

64 65 qualità della vita e riabilitazione INDAGINE POSTALE DI AUTO-VALUTAZIONE DEL BENESSERE FISICO E PSICOLOGICO NEGLI ADULTI CON QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE SM E NELLE PERSONE A LORO VICINE: FOLLOW-UP A LUNGO TERMINE (STUDIO POSMOS)

RESPONSABILE DEL PROGETTO 2.01; 95%CI 1.02–3.99) controllando per sesso, età e grado di scolarità. Il sesso femminile (OR ALESSANDRA SOLARI 3.24; 95%CI 1.63–6.44) e l’età (OR 1.04; 95%CI 1.01–1.07) erano predittivi anche di un pun- Neurologo teggio patologico al CMDI “sintomi svalutativi”. I SO dei pazienti più compromessi (EDSS au- Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano to-determinata > 6.5) avevano punteggi significativamente peggiori all’SF-36 “funzione fisica” Collaboratori: (p=0.02) e “limitazioni di ruolo fisiche” (p=0.02). Tuttavia, questo effetto non era più presente nel ANDREA GIORDANO, GIUSI FERRARI, Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto modello di regressione logistica ordinale, ove la presenza di un punteggio patologico al CMDI Neurologico C. Besta, Milano “sintomi depressivi” nella persona con SM si associava a valori significativamente più bassi in gran parte delle scale dell’SF-36 dei SO. Altre variabili predittive di peggiore QDV erano l’età Collaborazioni con altri gruppi: anziana (associata ad un punteggio significativamente più basso in tutte le scale dell’SF-36) ed DAVIDE RADICE, Divisione di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Europeo di Oncologia, Milano LUIGI BISANTI, Servizio di Epidemiologia, Azienda Sanitaria Locale, Milano il sesso femminile nei SO (SF-36 “vitalità”, POR 0.32; 95%CI 0.15—0.67 e “salute generale”, GIORGIA RANDI, Servizio di Epidemiologia, Azienda Sanitaria Locale, Milano POR 0.42;95%CI 0.19—0.92). L’unico predittore di punteggio alterato al CMDI “sintomi depressivi” dei SO era un punteggio alterato alla stessa scala dei rispettivi cari con SM (OR 8.24; 95%CI 3.16—21.54). Questo aveva un effetto indipendente sul CMDI “sintomi vegetativi” (OR PREMESSE E OBIETTIVI 9.25; 95%CI 3.33—25.68) e CMDI “sintomi svalutativi” (OR6.27; 95%CI 2.38—16.50).

L’indagine postale sullo stato di salute degli adulti con sclerosi multipla (SM) ed i loro cari (Stu- CONCLUSIONI dio POSMOS) è uno studio di popolazione longitudinale, condotto nella provincia di Milano. Nel 1999 abbiamo estratto un campione casuale di 400 adulti con SM dall’Archivio Sanitario della Le persone vicine ai pazienti con SM hanno un punteggio significativamente più basso in SF-36 Regione Lombardia, e abbiamo spedito loro il Multiple Sclerosis Quality-of-Life-54 (MSQOL-54), “vitalità” ed una tendenza a valori più bassi in SF-36 “salute mentale”, ed un aumento signifi- un questionario demografico e clinico, ed una lettera illustrativa dello studio (partecipazione del cativo dei sintomi depressivi rispetto ai controlli. Questi dati sono stati confermati nei modelli 65%). Nel 2004 abbiamo ricontattato la coorte, inviando loro gli stessi questionari ed il Chicago multivariati, dopo controllo per sesso, età e studi. In questi modelli è emerso un aumento si- Multiscale Depression Inventory (CMDI). Inoltre, abbiamo inviato lo Short Form-36 (SF-36) ed gnificativo di peggior QDV (domini mentale e vitalità) ed un aumento significativo (pari a circa il CMDI alla persona vicina al paziente (SO). Quattordici (6%) persone con SM sono morte nei due volte) di valori patologici per scale depressiva e vegetativa del CMD. Il carico psicologico 5 anni, 32 (13%) non hanno restituito i questionari, mentre 205 hanno partecipato. La parteci- dei SO è risultato particolarmente elevato per le donne e gli anziani, e non è parso influenzato pazione delle persone vicine al paziente è stata pari al 74%. Lo studio attuale (2010) si è rivolto dalla gravità della SM quanto dalla presenza di sintomi depressivi nella persona con SM. I nostri alle 237 persone con SM che erano viventi, le quali hanno ricevuto gli stessi materiali del 2004. risultati sono consistenti con gli studi che indicano la necessità di interventi mirati a ridurre lo Inoltre, 300 persone non affette da SM hanno ricevuto gli stessi materiali inviati ai SO. Questa stress e la depressione nei caregiver delle persone con SM. popolazione di controllo è stata estratta casualmente dal database dei residenti nella provincia di Milano, ed appaiata per sesso ed età (decadi) ai SO. Gli obiettivi principali dello studio erano: (A) Valutare prospetticamente i cambiamenti nello stato A POSTAL SURVEY OF SELF-ASSESSED HEALTH OF di salute e nella qualità di vita (QDV) nel corso di 11 anni in una coorte di persone con SM di popolazione; (B) Valutare la qualità di vita e i sintomi depressivi nelle persone vicine ai pazienti, ADULTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS AND THEIR confrontandoli con una popolazione di controllo di analoga età, sesso e area di residenza. SIGNIFICANT OTHERS: LONG-TERM FOLLOW-UP

RISULTATI (POSMOS STUDY)

Hanno partecipato all’indagine del 2010 205 persone con SM: 14 (6%) della coorte originaria INTRODUCTION AND AIMS sono decedute, mentre 32 (13%) non hanno re-inviato i questionari compilati. Hanno partecipato 142 SO (età media 53.1 anni; 50% donne). I SO erano: partner in 92 (65%), figlio in 18 The postal survey of self-assessed health of adults with multiple sclerosis (MS) and their signifi- (13%), genitore in 17 (12%), ed altro familiare in 6 (4%). Dei 300 controlli di SO contattati, 120 cant others (POSMOS Study) is a longitudinal population-based survey, being carried out in the (40%) hanno restituito i questionari completati. Poiché nessuno dei controlli nella classe di età Province of Milan, Italy. In 1999 a random sample of 400 MS adults was identified from the Lom- più giovane (18-30) ha partecipato, l’età dei controlli è risultata in media 5 anni più elevata di bardy Region Health Register, and sent the Multiple Sclerosis Quality-of-Life-54 (MSQOL-54), a quella dei SO (p=0.005). Le altre caratteristiche demografiche dei controlli partecipanti erano general and clinical questionnaire, and a letter explaining the study and soliciting participation; simili a quelle dei SO e dei controlli che non hanno partecipato all’indagine. L’analisi longitudi- 65% responded. We re-assessed the cohort in 2004, sending the same questionnaires plus nale della coorte delle persone con SM (1999/2004/2010) è in corso. L’analisi di SO e controlli the Chicago Multiscale Depression Inventory (CMDI). Health-related quality of life (Short Form- è stata completata, e viene sintetizzata di seguito. Le variabili associate ad un peggior punteg- 36) and CMDI were also assessed in a significant other. Fourteen (6%) people with MS had gio alla scala vitalità dell’SF-36 nel modello di regressione logistica ordinale erano: essere un died and 32 (13%) did not return the questionnaires; thus 205 participated. A significant other SO (proportional odds ratio, POR 0.45; 95%CI 0.28–0.70), sesso femminile (POR 0.41; 95%CI was available for 74% of responders. The present, most recent (2010) study cohort was made 0.27–0.64) ed età (POR 0.98; 95%CI 0.97–0.99), controllando per il grado di scolarità. Le of the 237 people from POSMOS Study who were alive: they received the same materials as variabili associate ad un peggior punteggio alla scala salute mentale dell’SF-36 erano: essere in 2004. In addition, 300 persons without MS received the same questionnaires as controls un SO (POR 0.62; 95%CI 0.40–0.96), sesso femminile (POR 0.43; 95%CI 0.28–0.67) ed età for the MS patients’ significant others. This control population was selected at random from (POR 0.98; 95%CI 0.97–0.99), controllando per il grado di scolarità. Le variabili associate ad un people living in the province of Milan, and matched by sex and age (decade) to the significant punteggio patologico al CMDI “sintomi depressivi” (modello logistico) erano:essere un SO (OR others. We had two main objectives: (A) To prospectively assess changes in self-perceived 68 2.42; 95%CI 1.14–5.15) ed avere un punteggio patologico al CMDI “sintomi vegetativi” (OR health status and health-related quality of life (HRQOL) over 11 years in our community cohort 69 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

of MS adults; (B) To assess health-related quality of life and depressive symptoms in patients’ PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI significant others, in comparison to a contemporaneous age and sex-matched control group from the same community. Giordano A, Ferrari G, Radice D, Randi G, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Health-related quality of life and depressive symptoms in significant others of people with multiple sclerosis: A community study. Eur J Neurol 2012 Jan 10. doi: 10.1111/j.1468-1331.2011.03638.x. RESULTS [Epub ahead of print]

A total of 205 people participated to the 2010 assessment: 14 (6%) of the original MS cohort Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Depres- had died and 32 (13%) did not return the questionnaires. Overall, 142 SOs (mean age 53.1 sive symptoms in people with multiple sclerosis and their significant others: a population-based years; 50% women) participated. The SO was the partner in 92 (65%) cases, a son/daughter study. 16th Annual Conference of RIMS, 13-14 May 2011, Turku, Finland in 18 (13%), a parent in 17 (12%), and a relative in 6 (4%). Of 300 SO controls contacted, Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L and Solari A on behalf of the POSMOS study. Significant 120 (40%) sent back completed questionnaires, none in 18-30 year class, so that on average others of people with multiple sclerosis have low SF-36 energy and mental health scores. 16th controls were five years older than SOs (p=0.005). The remaining characteristics of responder Annual Conference of RIMS, 13-14 May 2011, Turku, Finland controls were similar to those of SOs (and of non-responder controls). A. The longitudinal analysis of the cohort of MS patients (1999/2004/2010) is ongoing. B. The cross sectional analysis of SOs and controls is reported below. PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 € Variables independently associated with worse SF-36 vitality scale score (ordered logistic re- per un periodo di 1 anno - 40.000 gression models) were: being SO (proportional odds ratio, POR 0.45; 95% CI 0.28–0.70), female sex (POR 0.41; 95% CI 0.27–0.64) and older age (POR 0.98; 95% CI 0.97–0.99) after controlling for education. Predictors of poor SF-36 mental health score were: being SO (POR 0.62; 95% CI 0.40–0.96), female sex (POR 0.43; 95% CI 0.28–0.67) and older age (POR 0.98; 95% CI 0.97–0.99) after controlling for education. Variables independently associated with pathologic CMDI mood (logistic model) were: being SO (OR 2.42; 95% CI 1.14–5.15) and vegetative score (OR 2.01; 95% CI 1.02–3.99) after controlling for sex, age, and education. Being a woman (OR 3.24; 95% CI 1.63–6.44) and older age (OR 1.04; 95% CI 1.01–1.07) were also independently associated with pathologic CMDI vegetative score. Patient characteristics affecting SOs’ wellbeing - Effect of MS severity on SO HRQOL and depressive symptoms SOs differed in SF-36 physical function (p=0.02) and physical role limitation score (p=0.02) in relation to the severity of compromise of their MS companions (assessed by self-determined EDSS score), such that score for these scales were worse in SOs whose companions had more severe MS. However, this difference was not present in the ordered logistic regression models. In these models, EDSS > 6.5 did not retain any effect on the SF-36 scale scores, while pathologic CMDI mood of the MS companion was associated with a worse score in most SF- 36 scales. Other independent variables were older SO age (associated with a worse score in all SF-36 scales) and female sex of the SO (associated with worse SF-36 vitality [POR 0.32; 95% CI 0.15—0.67] and general health [POR 0.42; 95% CI 0.19—0.92]). The only predictor of pathologic CMDI mood in the SO was pathologic CMDI mood in the MS companion (OR 8.24; 95% CI 3.16–21.54). The latter also had an independent effect on pathologic vegetative (OR 9.25; 95% CI 3.33–25.68) and evaluative score (OR 6.27; 95% CI 2.3816.50).

CONCLUSIONS

We found that SOs of people with MS had a worse SF-36 vitality scale score and tended to have a worse SF-36 mental health score than controls; they also had significantly more depressive symptoms than controls. These findings were confirmed by the multivariable models adjusted for sex, age and education, in which SOs had a significantly increased risk of lower HRQOL for vitality and mental health domains, and significantly greater (two-fold) risk of pathologic CMDI mood and vegetative scores. The psychological burden of SOs was particularly high in women and in the elderly. This burden seemed not to be influenced by disease severity but by the presence of depressive symptoms in their MS companions. Our results are consistent with research suggesting a need for interventions to reduce stress and depression for the caregivers of people with MS, and indicate that such interventions should not be limited to the SOs of severely compromised MS people.

70 71 PREFERENZE INDIVIDUALI E PARTECIPAZIONE ALLE DECISIONI MEDICHE NELLA SM QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

RESPONSABILE DEL PROGETTO CONCLUSIONI ANDREA GIORDANO Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano Grazie al finanziamento della mia borsa di ricerca e al prezioso contributo dei ricercatori dello studio AutoMS, sono ora disponibili per le persone con SM, per le comunità scientifica e per il MENTORE sistema sanitario, 5 strumenti. ALESSANDRA SOLARI Il CPS è ora disponibile in una nuova forma elettronica auto-somministrata, che non richiede la presenza di un operatore per la somministrazione e che può essere impiegata sul web. Il vasto numero di registrazioni delle prime visite, fornirà a breve informazioni uniche sulla qualità PREMESSE E OBIETTIVI delle visite presso i centri SM italiani e offrirà uno spaccato della capacità dei neurologi italiani di coinvolgere le persone con SM nelle decisioni mediche. I nostri risultati costituiranno la base La mia borsa di ricerca è parte di un progetto collaborativo internazionale chiamato “Prefe- per lo sviluppo di interventi atti a migliorare le abilità comunicative e di coinvolgimento dei neu- renze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con SM” (AutoMS– rologi durante le visite con i pazienti. ww.automsproject.org). Nell’ambito dello studio AutoMS, sono valutate prospetticamente le preferenze delle persone con SM riguardo la partecipazione alle decisioni mediche in 7 paesi europei (Germania, Italia, Francia, Belgio, Serbia, Estonia e UK), con un partner associato in Australia, usando metodologie condivise e strumenti validati. Il focus è posto maggiormente sui DECISION-MAKING PREFERENCES AND trattamenti disease-modifyng, e vi sono 3 linee di sviluppo: INVOLVEMENT IN CARE OF PEOPLE WITH MS AutoMS-Preferenze: l’obiettivo era quello di validare linguisticamente il Control Preference Sca- le (CPS) nelle lingue dei paesi partecipanti, rivedere le immagini e “migrare” la versione su carta INTRODUCTION AND AIMS del CPS su una versione elettronica auto-somministrata (eCPS). AutoMS-Conoscenza del rischio: lo scopo era quello di produrre e validare linguisticamente My research fellowship was part of an international collaborative project named “Autonomy nelle lingue dei paesi partecipanti un questionario sulla conoscenza del rischio per le persone Preferences, Risk Knowledge and Decision-making Performance in MS Patients” (AutoMS– con SM recidivante-remittente (RRMS-IRKQ). www.automsproject.org). AutoMS prospectively evaluates preferences of MS patients regar- AutoMS-decision making: l’obiettivo era quello di valutare la relazione medico-paziente nel- ding participation in medical decisions and their determinants across 7 European countries le prime visite audio-registrate, utilizzando la scala Observing Patient Involvement (OPTION). (Germany, Italy, France, Belgium, Serbia, Estonia, and UK) with an associated partner in Au- Inoltre, sono state valutate l’influenza delle caratteristiche del medico e del paziente, e la prefe- stralia, using shared methodologies and validated assessment tools. We focussed on most renza di ruolo del paziente, sul punteggio ottenuto con l’OPTION. L’OPTION è una scala a 12 relevant decisions about disease-modifying treatment and we are pursuiting three lines: item, che valuta l’abilità del medico nel coinvolgere il paziente nel processo di decision-making. AutoMS-Preference: To linguistically validate the Control Preference Scale (CPS) in the parti- Le risposte a ciascun item sono disposte su una scala Likert a 5 punti, da 0 (min) a 4 (max); cipating countries, revise cartoons and migrate the interview-based version into an electronic il punteggio totale è 0–48, ed è trasformato su una scala 0–100. Per impiegare l’OPTION è self-administered version (eCPS). richiesta una formazione specifica. L’OPTION è disponibile in tedesco, italiano, francese, ingle- AutoMS-Risk knowledge: To produce and validate cross-culturally, a risk knowledge question- se e olandese. Nell’ambito dell’AutoMS, il mio impegno si è concentrato particolarmente sui naire for RRMS patients (RRMS-IRKQ). sotto-studi AutoMS-Preferenze e Decision-making. AutoMS-Decision making: To assess the patient-physician relationship on audio-recorded first out-patient consultations using the Observing Patient Involvement (OPTION) scale. To assess RISULTATI the influence of patient’s and physician’s characteristics and of patient’s preferred involvement role (as assessed by the CPS) on the OPTION score. OPTION is a 12-item scale that assesses AutoMS-Preferenze: un disegnatore professionista ha prodotto le nuove immagini del CPS, physicians’ ability to involve patients in decision-making. Each item is rated on a 5-point Likert prendendo spunto dagli input degli autori italiani del CPS e dai commenti delle persone con scale ranging from 0 (min) to 4 (max); the total OPTION score range is thus 0–48, and is tran- SM che hanno preso parte alla fase pilota (J Neurol Sci 2008;275:86–91). Le nuove immagini sformed into a 0-100 score. OPTION rating requires a formal training. German, Italian, English, sono state rifinite in una serie di fasi che hanno visto la partecipazione dei centri coinvolti nello French and Dutch versions of the scale are available (www.optioninstrument.com). studio AutoMS. Sono state poi valutate da 26 pazienti con SM italiani e tedeschi: 12 (46 %) My commitment was to all sub-studies, with more specific focus in the AutoMS-Preference and erano donne, l’età mediana era 37 anni, la durata mediana di malattia era 9.3 anni e l’EDSS Decision-making sub-studies. mediano 2.5 (range 0–6.0). Tre pazienti italiani hanno dato risposte incongruenti. I punteggi erano quindi disponibili per 23 RESULTS pazienti (88%): di questi, 10 (44%) preferivano un ruolo collaborativo, 9 (39%) un ruolo attivo e 4 un ruolo passivo (17%). Le preferenze differivano tra i paesi, con i pazienti tedeschi che pre- AutoMS-Preference: a professional cartoonist produced new CPS cartoons based on input ferivano maggiormente un ruolo attivo (p=0.02). Le nuove immagini sono state ben accettate from the authors of the Italian CPS and comments of people with MS who took part in the Ita- da tutti i pazienti. lian pilot testing (J Neurol Sci 2008;275:86–91). The new cartoons were refined in an iterative La migrazione dalla versione cartacea del CPS a quella elettronica è stata effettuata in Italia, in process which involved all the AutoMS centers, and then pilot tested on 26 Italian and German modo che la versione elettronica corrispondesse, in termini di dimensioni del testo e immagini, MS patients: 12 (46 %) were women; median age was 37 years; median disease duration di orientamento e di presentazione, alla versione cartacea. È in corso uno studio di equivalenza 9.3 years; median EDSS score 2.5 (range 0–6.0). Three Italian MS patients gave incongruent che confronta le due versioni utilizzando un disegno crossover. answers. CPS scores were therefore available for 23 patients (88%): of these 10 (44%) preferred a collaborative role, 9 (39%) an active role; and only 4 (17%) a passive role. Role preference differed between countries with German patients preferring a more active role (p=0.02). The 72 new cartoons were well received by all the patients (cognitive debriefing). 73 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

Migration from interview-based to eCPS was performed in Italy so that the latter matched the PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI paper cards in terms of size (cartoons and text), orientation and presentation (simultaneous administration of the five cards). Equivalence of the electronic and interview-administered CPS Giordano A, Ferrari G, Radice D, Randi G, Bisanti L, and Solari A, on behalf of the POSMOS study. is now being assessed using a test-retest crossover design (plus cognitive debriefing in a Health-related quality of life and depressive symptoms in significant others of people with multiple sclerosis: A community study. Eur J Neurol. 2012 Jan 10. doi: 10.1111/j.1468-1331.2011.03638.x. subsample of patients assigned to receive eCPS after the interview CPS). [Epub ahead of print] AutoMS-Decision Making: I participated in translation and cultural adaptation of the PICS from the original US English into Italian, and coordinated/revised the corresponding procedure for the Borreani C, Giordano A, Falautano M, Lugaresi A, Martinelli V, Granella F, Tortorella C, Plasmati Dutch for Belgium, French, Estonian and Serbian versions. I coordinated/revised the translation I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Acquarone N, Miccinesi G, Solari A, on behalf and cultural adaptation of the OPTION from the original UK English into Estonian and Serbian. of the SIMS-Trial group. Experience of an information aid for newly-diagnosed multiple sclerosis patients: a qualitative study on the SIMS-Trial. Health Expect 2011 Nov 1. doi: 10.1111/j.1369- In September 2010 I was certified OPTION rater at the University of Verona. In October 2011 7625.2011.00736.x. [Epub ahead of print] the 3rd AutoMS Investigators’ Meeting was held at AISM Casa Vacanze “I Girasoli” (Lucigna- no, Italy). The meeting was almost entirely dedicated to OPTION training in MS consultations: Giordano A, Granella F, Lugaresi A, Martinelli V, Trojano M, Confalonieri P, Radice D, Solari, on behalf participants were 13 investigators from 5 AutoMS countries. Between April-December 2011 of the SIMS-Trial group. Anxiety and depression in multiple sclerosis patients around diagnosis. J we audio-recorded 92 first consultations at the following MS Centers: Foundation Neurological Neurol Sci 2011; 307:86-91 Institute C. Besta–Milan (n=37), University G D’Annunzio, Chieti-Pescara (n=29), University of Heesen C, Solari A, Giordano A, Kasper J, Köpke S. Decisions on multiple sclerosis immunotherapy: Sassari (n=6), and University of Bari (n=20). Verbatim transcripts of each consultation were New treatment complexities urge patient engagement. J Neurol Sci 2011; 306: 192–197 produced. OPTION rating is ongoing. Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Depressive CONCLUSIONS symptoms in people with multiple sclerosis and their significant others: a population-based study. Presented as poster at RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland

Thanks to my research fellowship, and to the valuable contribute of AutoMS investigators, five Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L and Solari A on behalf of the POSMOS study. Significant instruments are now available to the people with MS of Europe and to the research and health others of people with multiple sclerosis have low SF-36 energy and mental health scores. Presented care community. as poster at RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland The CPS is now available in a patient self-assessed, use-friendly electronic version that does Heesen C, Köpke S, Kasper J, Giordano A, Van Nunen A, Vahter L, Drulovic J, Clanet M, Sharrack not require involvement of any operator/personnel, and can be used also on the web. B, Fulcher G, Solari A, on behalf of the AutoMS-group. Risk knowledge and planned bEhavior que- The large number of first consultations recorded will shortly provide unique information on the stionnaires – new tools to assess decision-making in MS. Presented as poster at RIMS 2011 Confe- quality of the consultations in Italian MS centers and the aptitude of Italian neurologist to involve rence, May 13-14 Turku, Finland MS patients in medical decision making. Our results will be the basis to the devise of interventions to improve physicians’ communication and patients’ involvement skills. Solari A, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Borreani C, on behalf of the SIMSQual and SIMS-Trial groups. Health professionals’ perspective on information aid for newly-diagnosed MS patients: the SIMS-QUAL study. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469-470

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Maggi L, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’Alessandro R. Information preference of newly-diagnosed MS patients: Prospective assessment within the SIMS-Trial. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469

Borreani C, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Solari A, on behalf of the SIMS-Qual and SIMS Trial groups. Participants’ perspective on information aid for newly- diagnosed MS patients: the SIMS-Qual study. Mult Scler 2010; 16: Suppl.10 (Abstract) S21

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Pla- smati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Maggi L, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’A- lessandro R, on behalf of the SIMS-Trial group. Information preference of newly-diagnosed MS patients: Prospective assessment within the SIMS-Trial. Mult Scler 2010; 16: Suppl.10 (Abstract) S328

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Pla- smati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’Alessandro R, on behalf of the SIMS-Trial group. Anxiety and depression symptoms In newly-diagnosed multiple sclerosis patients. Mult Scler 2010;16: Suppl.10 (Abstract) S328

BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 2 anni - 42.000 €

74 75 VALUTAZIONE QUALITATIVA DI UN AUSILIO INFORMATIVO (CD E BOOKLET “SAPERE MIGLIORA”) PER LE PERSONE QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE CON SCLEROSI MULTIPLA (SIMS-QUAL)

RESPONSABILE DEL PROGETTO desideri del singolo paziente. L’ausilio non è adatto per le persone con forma primariamente CLAUDIA BORREANI progressiva. L’integrazione del colloquio informativo con le attività del centro SM può risultare Direttore Unità di Psicologia, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano difficile, per limiti strutturali e di personale: ciò si applica particolarmente ai centri più grandi. Proposte: Migliorare la formazione del personale sanitario all’impiego del CD nell’ambito del Collaboratore: colloquio informativo. Rivedere alcuni contenuti di CD⁄libretto (eliminazione di immagini raf- ELISABETTA BIANCHI figuranti bambini malformati a seguito di esposizione prenatale a talidomide, inserimento di informazioni sulla dieta). Messa a punto di un ausilio informativo dedicato alle persone con Collaborazioni con altri gruppi: sindrome clinicamente isolata, ed a quelle con SM primariamente progressiva. ALESSANDRA SOLARI, ANDREA GIORDANO, Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano MICHELE MESSMER UCCELLI, Area Servizi e Progetti Socio Sanitari AISM, Genova CONCLUSIONI VITTORIO MARTINELLI, MARTA RADAELLI, Dipartimento di Neurologia, IRCCS Istituto San Raffaele, Milano Tutti i partecipanti hanno considerato essenziale la combinazione di colloquio informativo, na- ALESSANDRA LUGARESI, DEBORAH FARINA, Dipartimento di Oncologia e Neuroscienze vigazione del CD e consultazione del libretto, ma hanno sottolineato l’utilità di programmare il Università G. D’Annunzio, Chieti MARIA TROJANO, CARLA TORTORELLA, IMMA PLASMATI, Dipartimento di Scienze colloquio informativo in modo più flessibile. Altri aspetti emersi sono stati la necessità di rive- Neurologiche e Psichiatriche, Università di Bari dere alcuni contenuti e la non adeguatezza dell’ausilio per i pazienti con forma primariamente FRANCO GRANELLA, ELEONORA DALLA BELLA, Dipartimento di Neuroloscienze, Unità di progressiva. Neurologia, Università di Parma I risultati ottenuti supportano ulteriormente il valore dell’ausilio e forniscono indicazioni im- GUIDO MICCINESI, Unità di Epidemiologia, Centro Studi e Prevenzione sul Cancro, Firenze portanti per migliorarne contenuti e modalità di utilizzo. Nella terza fase del progetto (SIMS- MONICA FALAUTANO, Unità di Neuropsicologia, Dipartimento di Neurologia, IRCCS Istituto San Raffaele, Milano Practice, FISM 2010/S/1), attualmente in corso, è verificata l’utilità dell’ausilio nel suo insieme NICOLA ACQUARONE, Dipartimento Organizzazione e Sviluppo, Provincia di Genova (aggiornati e rivisti) vs. il solo libretto nella pratica clinica corrente presso 30 centri italiani.

PREMESSE E OBIETTIVI PARTCIPANTS’’ PERSPECTIVE ON INFORMATION

L’impiego degli ausili decisionali dedicati ai pazienti nella pratica clinica è in aumento. Vi è AID FOR NEWLY DIAGNOSED MS PATIENTS: evidenza che questi strumenti migliorino la conoscenza della malattia, il coping, e facilitino A QUALITATIVE STUDY WITHIN THE SIMS-TRIAL la partecipazione del paziente alle decisioni mediche. A fronte di questa valutazione positiva, manca una documentazione sul loro impiego nell’ambito della SM. Il SIMS-Trial (Efficacia di un (SIMS-QUAL) supplemento informativo nelle persone con SM di nuova diagnosi; ISRCTN81072971, FISM 2007/R/19) è una sperimentazione clinica controllata che ha dimostrato l’efficacia, in termini di INTRODUCTION AND AIMS conoscenza e soddisfazione rispetto alle cure ricevute, del supplemento informativo “Sapere Migliora” (libretto di auto consultazione e colloquio informativo con navigazione di CD) rispetto Patient information aids are increasingly regarded as important components of clinical practi- alla comune pratica clinica in 120 persone con SM di nuova diagnosi. ce. They improve adaptive coping, sense of control, and enable shared decision making with Il SIMS-Qual è uno studio qualitativo finalizzato ad approfondire le esperienze dei partecipanti physicians. Despite broad acceptance of their value, there is little evidence of their successful al SIMS-Trial. L’integrazione dell’approccio quantitativo con la ricerca qualitativa aveva lo scopo implementation in the MS. The SIMS-Trial (Effectiveness of a structured information interview di arrivare a un approfondimento degli effetti derivanti dall’ausilio informativo. in people with newly-diagnosed MS; ISRCTN81072971, FISM 2007/R/19) is a multicenter randomized controlled trial assessing the effectiveness, in terms of patient knowledge and sa- RISULTATI tisfaction with the information received, of an add-on information aid in comparison with usual practice in 120 newly diagnosed MS patients. Abbiamo condotto (I) nove colloqui individuali semi-strutturati con un campione selezionato di We undertook a qualitative study (SIMS-Qual), nested within the SIMS-Trial, aiming to scrutinize persone che hanno ricevuto, nell’ambito del SIMS trial, l’ausilio informativo “Sapere Migliora”, the experience of participants to the SIMS-Trial. Integrating quantitative and qualitative research (II) un focus group (FG) dei medici che hanno condotto i colloqui informativi, ed (III) un FG dei methods, we aimed to gain deeper understanding of the effectiveness of the information aid. neurologi che seguivano i pazienti. Le esperienze dei pazienti sono risultate globalmente positive: l’ausilio informativo ha aumenta- RESULTS to la loro consapevolezza di malattia, ed è stato percepito come un “percorso guidato” nell’ambito della loro malattia. Anche la valutazione da parte dei medici che partecipavano ai colloqui We performed (I) nine individual semi-structured interviews with a purposeful sample of SIMS- informativi è stata nel complesso favorevole, a parte una iniziale difficoltà nell’impiego del CD. Trial patients who received the information aid, (II) focus group meeting (FGM) with the physi- I neurologi curanti hanno prodotto pochi dati esperienziali, ed il loro contributo si è limitato a cians who conducted the personal interview, and (III) FGM with patients’ caring neurologists. considerazioni generali di apprezzamento dell’ausilio. Patients’ experience with the information aid was positive as it enhanced their understanding Sintesi dei dati qualitativi raccolti: of their disease, being viewed as a guided tour of their medical condition. The physicians who Aspetti positivi: L’ausilio migliora il trasferimento di informazioni, l’atteggiamento del paziente conducted the personal interviews were also positive in their overall evaluation but noted an verso la malattia, la sua comprensione e la comunicazione con il personale sanitario dedicato initial difficulty in using the CD. The caring neurologists had limited direct experience of the aid, alla SM e con i familiari. Tutte le componenti dell’ausilio informativo sono state considerate and their views were confined to utility of the information aid in general. necessarie. Main study findings are summarised as follows: 76 Aspetti negativi: Il timing del colloquio informativo può non tenere conto dei bisogni e dei Positive: The aid improved information delivery, patient understanding and communication with 77 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

MS team and significant others, as well as attitude to the disease. All components of the aid PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI were considered necessary. Negative: Timing of the personal interview can be insensitive to patient wishes. The aid is un- Borreani C, Giordano A, Falautano M, Lugaresi A, Martinelli V, Granella F, Tortorella C, Plasmati suitable for patients with primary progressive MS. It can be difficult to integrate the personal I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Acquarone N, Miccinesi G, Solari A, on behalf of the SIMS-Trial group. Experience of an information aid for newly-diagnosed multiple sclerosis interview within working practice of MS centres (particularly high-volume ones) for structural patients: a qualitative study on the SIMS-Trial. Health Expect 2011 Nov 1. doi: 10.1111/j.1369- and personnel limitations. 7625.2011.00736.x. [Epub ahead of print] Proposals: To improve training on CD use in the personal interview. To revise the CD⁄booklet contents by removing images of thalidomide children, and adding information on diet in MS. Solari A, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, To develop a specific aid for patients with clinically isolated syndrome/possible MS, and for Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Borreani C, on behalf of the SIMS-Qual and SIMS-Trial groups. Health professionals’ perspective on information primary progressive MS. aid for newly-diagnosed ms patients: the SIMS-QUAL study. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469-470 CONCLUSIONS

All participants considered the combination of personal interview, CD navigation and take- PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 home booklet essential, but urged a more flexible scheduling of the personal interview. It also per un periodo di 1 anno - 40.000 € emerged that some content required revision and that the aid was unsuitable for patients with primary progressive MS. The results of the study further support the value of the aid and also provide important indications for improving it and refining indications for use. Further work is necessary to clarify the value of the information aid as a whole and its components in routine clinical practice: in the next (third) phase of the SIMS project (SIMS-Practice, FISM 2010/S/1), the effectiveness of the personal interview plus the information materials (updated and revised based on results of the first two phases) is now being compared with the information materials alone in 30 Italian MS centres.

78 79 VALUTAZIONE E TERAPIA MEDIANTE ROBOT NEL TRATTAMENTO DEL DEFICIT DELL’ARTO SUPERIORE QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO MULTI-CENTRO, RANDOMIZZATO E CONTROLLATO

RESPONSABILE DEL PROGETTO rale percepito su un punteggio da uno a sette, VAS; ai soggetti é stato chiesto di attribuire un CLAUDIO SOLARO valore da zero a dieci sulla capacita di svolgere attività della vita quotidiana (relativamente all’ar- Dirigente medico I° livello to superiore). Outcome primario: numero di soggetti con variazione >20% al 9HPT. Outcome UO Neurologia Dipartimento Testa-Collo ASL3 Genovese, Genova secondari clinici: variazioni alle scale ARAT, MFIS, GIC, VAS. Outcome secondari cinematica: lunghezza e durata del movimento. Sono state reclutate 43 persone con SM. 19 soggetti (su Collaboratori: 20) inclusi nel gruppo T e 18 (su 21) del gruppo C hanno partecipato a tutte le otto sessioni MARGIT MUELLER previste. Collaborazioni con altri gruppi: Gruppo T: nove maschi e dieci femmine; età media: 52 anni; EDSS medio: 6; durata media DAVIDE CATTANEO, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, Milano della malattia: 14 anni; decorso: nove primariamente progressive (PP), otto secondariamente ILARIA CARPINELLA, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, progressive (SP), tre recidivante-remittente (RR). Milano Gruppo C: sette maschi e 12 femmine; età media: 46 anni; EDSS medio: 5.3; durata media MAURIZIO FERRARIN, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, della malattia: 14 anni; decorso: cinque PP, sette SP, sette RR. Milano ANGELO BASTERIS, NeuroLab DIST, Universita di Genova (DIST) Il trattamento è risultato efficace per otto persone, mentre solamente tre pazienti nel gruppo VITTORIO SANGUINETI, NeuroLab DIST, Universita di Genova (DIST) di controllo hanno raggiunto lo stesso risultato. Complessivamente, il valore medio del 9HPT è stato ridotto da 73.6 (±9.6) s a 60.4 (±7.9) s nel gruppo T e da 48.2 (±6.0) s a 43.2 (±5.5) s nel gruppo C. Lo stesso miglioramento è consistente con l’incremento osservato nel punteggio PREMESSE E OBIETTIVI ARAT, da 47.1 (±1.3) a 50.3 (±1.2) per il gruppo T e da 50.9 (±1.4) a 52.9 (±1.2) per il gruppo C. Concordemente con i miglioramenti osservati nelle scale cliniche, anche i movimenti osservati Nel 2010 abbiamo pubblicato (Vergaro et al J Neuroeng Rehabil. 2010 Jul 29;7:37) i dati relativi durante la valutazione cinematica mostrano che i pazienti si muovono con una migliore accu- ad un precedente studio pilota nel quale otto persone con sclerosi multipla (SM) e affette da ratezza (significativa riduzione della lunghezza della traiettoria) e minor durata. sintomi cerebellari agli arti superiori erano state trattate con otto sedute di riabilitazione robotica mediante Braccio di Ferro (PhysioAssistant, Celin srl, Follo). Il risultato, seppur su un piccolo CONCLUSIONI campione, era stato molto promettente, in quanto quattro degli otto soggetti trattati presentava un significativo miglioramento una volta valutati al Nine Hole Peg Test (9HPT, test di destrezza Questo progetto conferma i benefici del trattamento robotico del deficit motorio dell’arto su- manuale). Questo studio rappresenta a tutt’oggi uno dei pochissimi esempi di trattamento periore. Sebbene l’outcome primario non abbia raggiunto la significatività si osserva un chiaro dell’arto superiore mediante robot in soggetti con SM. trend (beneficio in otto su 18 vs. tre su 20 soggetti) a vantaggio della terapia con robot attivo. Per tale motivo abbiamo valutato l’efficacia della terapia robotica su soggetti con deficit a cari- Anche la valutazione delle caratteristiche cinematiche del movimento hanno mostrato una su- co dell’arto superiore con uno studio randomizzato, doppio cieco, multicentrico. periorità del trattamento attivo verso i controlli. Il trattamento è stato inoltre ben tollerato con un Scopo dello studio è confrontare il trattamento robot-guidato rispetto al trattamento con robot numero assai basso di drop-out. Inoltre non è stato osservato un effetto certo. In conclusione “spento”. Lo scopo è quello di valutare la reale specificità del trattamento e di escludere l’effetto questo rappresenta il primo studio randomizzato di terapia robotica in persone con SM e apre legato all’uso di una macchina in un ambiente sperimentale. importanti orizzonti sulla terapia riabilitativa dell’arto superiore. Il protocollo riabilitativo prevedeva otto sessioni (due sessioni alla settimana), durante le quali i pazienti eseguivano movimenti di reaching center-out (ampiezza dieci cm) in tre diverse di- rezioni (0°,60°,120°), impugnando un manipolatore robotico planare a due gradi di libertà. Il ROBOT-BASED ASSESSMENT AND THERAPY IN soggetto veniva randomizzato ad eseguire il trattamento attivo, in cui il robot adatta la difficoltà dell’esercizio applicando forze di ampiezza variabile a seconda dei risultati raggiunti dal pazien- THE TREATMENT OF UPPER LIMB IMPAIRMENT IN te (T) o a robot “spento” (C). In questo caso il paziente svolgeva un movimento planare sem- MULTIPLE SCLEROSIS: A MULTI-CENTRE, plice e valutato mediante scale cliniche. Prima e dopo la terapia (T0 e T1), anche i partecipanti del gruppo T hanno svolto lo stesso esercizio (valutazione cinematica). RANDOMISED CONTROLLED TRIAL

RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS

I soggetti sedevano di fronte allo schermo afferrando l’impugnatura del robot con la mano In 2010 we pubblished data related to a previous pilot study (Vergaro et al J Neuroeng Rehabil. dominante. Le spalle e il polso erano mantenuti fissi mediante opportuni sistemi di vincolo. 2010 Jul 29;7:37) in which eight cerebellar persons with MS on upper limb. The patients have L’altezza del sedile era impostata in modo da avere la spalla all’altezza del piano di lavoro del been treated with eight sections of robot therapy using a robotic device “Braccio di Ferro” robot. Il robot è in grado di misurare grandezze caratteristiche del movimento (quali durata e (PhysioAssistant, Celin srl, Follo). Out of eight treated subjects four showed a significantly im- ampiezza, ad esempio) che forniscono un’indicazione oggettiva dell’efficacia della terapia provement on 9HPT. Criteri di inclusione: età maggiore di 18 anni; assenza di esacerbazioni o peggioramenti di un Following the reported results we design a double-blind parallel arm multicentres study on punto negli ultimi tre mesi nella scala EDSS (“Expanded Disability Status Scale”); EDSS < 7.5; robot-therapy for treating upper limb impairment in MS. Aim of the study was to evaluate the Scripps Neurological Rating Scale almeno un punteggio funzionale (piramidale, cerebellare, efficacy of active robot-therapy versus sham treatment. The aim is to show a specific effect of sensitivo) < 5; Scala di Ashworth < 2 all’arto superiore; 9HPT compreso tra 30 e 180. Ogni the therapy based on robot and related to the experimental setting. Moreover was double-blind soggetto è stato valutato dallo stesso esaminatore che ha somministrato tutte le scale ed i test. in both the patient and the evaluator were blind and the reliability of the therapy when admini- I pazienti sono stati valutati tramite: 9HPT, EDSS, ARAT (Action Research Arm Test), Tremor stered using the same device in two centers. The subjects underwent to eight sections in four severity scale (zero-dieci); Ataxia scale punteggio da zero (normale) a quattro (massimo grado weeks during which patients performed a reaching center-out movements in three directions 80 di compromissione), Modified Fatigue Impact Scale (MFIS); SF-36 Quality of Life; Effetto gene- (0-60 and 120). 81 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Inclusion criteria: age > 18 year-old; no clinical exacerbation or worsening of one point in the Basteris A, De Luca A, Boehmker M, Bertoni R, Cattaneo D, Carpinella I, Ferrarin M, Solaro C, last there month at the EDSS (“Expanded Disability Status Scale”); EDSS < 7.5; Scripps Neuro- Sanguineti V. (2011) A tailored exercise program of manipulation of virtual tools to treat upper logical Rating Scale greater than one at pyramidal, cerebellar or sensitivity level < five; Ashworth limb impairment in Multiple Sclerosis in International Conference on Rehabilitation Robotics scale < two at upper limb; 9Hole Peg Test (9HPT) between 30 and 180. Any subject have been (ICORR2011), June 29 – July 1, 2011, Zurich, Switzerland evaluated by the same examiner. The patients have been evaluated by 9HPT, EDSS, ARAT (Action Research Arm Test), Tremor severity scale (zero-ten); Ataxia scale, Modified Fatigue PROGETTO FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 Impact Scale (MFIS); SF-36 Quality of Life; global impression change from one to seven, VAS per un periodo di 2 anni - 60.000 € for daily activity related to upper limb use. The primary outcome: a difference > 20% at 9HPT. Secondary clinical outcomes: variation at ARAT, MFIS, GIC and VAS. Secondary kinematic outcomes: movement length and duration. Forty-three MS subjects (both genders and ages) were recruited for this study. Nineteen subjects (out of the 20 who started) in group T and 18 (out of 21 who started) in group C practiced in all the eight sessions. Group T: nine males and ten females, mean age 52 years, mean EDSS six; mean disease duration: 14 years; disease course: nine primary progressive PP, eight secondary progressive SP, three relapsing-remitting RR. Defining a response to treatment as a reduction of 20% in this score, we had eight re- sponding patients in T group and only three in C group. As regards the average 9HPT score, this decreased from 73.6 (±9.6) s to 60.4 (±7.9) s for group T and 48.2 (±6.0) s a 43.2 (±5.5) s for group C. According to this improvement, ARAT score increased from 47.1 (±1.3) to 50.3 (±1.2) for T group and from 50.9 (±1.4) to 52.9 (±1.2) for C group. The robot-based kinematic evaluation confirmed that trajectory length and movement duration when asked to perform fixed-length, as fast as possible reaching movements, were reduced, thus meaning higher accuracy and speed. However, statistical analysis confirmed efficacy of both type of therapy, without significant group effects.

CONCLUSIONS

This study confirms benefits of robot-therapy in the treatment of upper limb impairment in MS patients. The primary outcome show a trend in favor of active treatment, a benefit was demonstrated in eight of 18 (active) versus three out 20 patients (sham). Also the kinematic parameters showed a significant difference between the two groups. Moreover the treatment was well tolerated and very low number of drop-out were observed. In conclusion the study represent the first randomized double-blind parallel arm multicentres study on robot-therapy for upper limb in MS and future study are needed to assess the best rehabilitation robotic protocol for such patients.

82 83 validazione di nuovi targets- pathways FUNZIONE DI TRKB SUGLI ASTROCITI REATTIVI NELLE PLACCHE DI SCLEROSI MULTIPLA VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

Per studiare l’interazione astrocita-neurone abbiamo sviluppato un modello in vitro in cui i neu- RESPONSABILE DEL PROGETTO roni spinali venivano esposti a mezzo di coltura condizionato dagli astrociti generato sotto sti- CINTHIA FARINA molazione con BDNF, e li abbiamo paragonati ai neuroni esposti a mezzi di coltura astrocitaria Responsabile del Laboratorio di Immunobiologia delle malattie neurologiche generati sotto stimolazione con IL1, una tipica citochina infiammatoria. La disgregazione della Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale rete neuronale e la morte per apoptosi avevano luogo in entrambe le condizioni, e l’ossido nitri- Fondazione Centro S. Raffaele del Monte Tabor, Milano co (NO) era il mediatore neurotossico rilasciato dagli astrociti in risposta a BDNF ed IL1. Inoltre, in maniera simile al BDNF, anche gli altri ligandi di TrkB (NT3 ed NT4) attivavano gli astrociti in Collaboratori: modo da indurre neurodegenerazione, indicando varie possibilità di attivazione di TrkB negli EMANUELA COLOMBO astrociti. Questi effetti erano dipendenti da TrkB astrocitario, poiché gli astrociti isolati dai topi CHIARA CORDIGLIERI transgenici (quindi privi di TrkB) non producevano NO e non inducevano morte neuronale in risposta a BDNF. Collaborazioni con altri gruppi: GIORGIA MELLI, Istituto neurologico Carlo Besta, Milano Inoltre, la rapida cinetica del fenomeno neurodegenerativo, documentata mediante esperimenti ENZO MEDICO, IRCC, Torino di videomicroscopia, era iniziata da NO di origine astrocitaria ed amplificata da NO neuronale. JIA NEWCOMBE, UCL, Institute of Neurology, Londra Per misurare lo stress nitrosativo, dovuto alla deregolata produzione di NO in seguito all’attiva- MARKUS KRUMBHOLZ, REINHARD HOHLFELD, EDGAR MEINL, Max-Planck-Institute of zione dell’enzima iNOS, abbiamo misurato la nitrosilazione delle proteine a livello dei residui di Neurobiology e Institute of Clinical Neuroimmunology, Monaco tirosina. Mediante esperimenti di immunoistochimica abbiamo confermato la forte espressione LUIS PARADA, Center for Developmental Biology, University of Texas, Dallas di iNOS e la deposizione di nitrotirosine in vivo nel midollo spinale di topi controllo con EAE. In accordo con i dati in vitro ottenuti dagli astrociti privi di TrkB, i segnali per iNOS e per le nitrotirosine erano grandemente ridotti nel SNC dei topi transgenici immunizzati, dimostrando che PREMESSE E OBIETTIVI la trasduzione del segnale tramite TrkB negli astrociti è cruciale per la sintesi di NO in vivo. Di rilievo per la patologia umana è stato rilevare nelle lesioni SM aree di diffusa nitrosilazione ed Le neurotrofine (NT) sono fattori di crescita fondamentali per lo sviluppo ed il mantenimento del assoni nitrosilati circondati dalla rete gliotica TrkB positiva. sistema nervoso centrale (SNC). Possono promuovere la sopravvivenza così come la morte di popolazioni neuronali definite. Le NT esercitano la propria azione pleiotropica mediante due CONCLUSIONI classi di recettori: il recettore p75NTR o i recettori Trk. Questi recettori sono stati rilevati anche in tipi cellulari non-neuronali, tuttavia il loro significato biologico è per lo più sconosciuto. Gli astrociti sono importanti regolatori della neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Qui, Studi pubblicati suggeriscono che gli astrociti possono esprimere i recettori delle neurotrofine descriviamo per la prima volta un nuovo processo patologico che sottolinea il contributo dell’a- in seguito ad attivazione. Gli astrociti sono la popolazione gliale più abbondante nel SNC e strocita alla sclerosi multipla. Infatti, come in un tipica reazione infiammatoria, la risposta astroci- sono importanti per la struttura ed il funzionamento del SNC. Offrono supporto trofico ai neu- taria alle neurotrofine tramite il recettore TrkB favorisce l’espressione clinica nel modello animale roni, regolano la trasmissione sinaptica, controllano l’omeostasi di ioni e metaboliti. Inoltre, gli di sclerosi multipla promuovendo un ambiente permissivo all’infiltrazione di cellule immunitarie astrociti hanno un ruolo centrale nella sorveglianza immunologica del SNC, considerato che le ed alla neurodegenerazione. Analisi in vitro ed in vivo dimostrano come l’ossido nitrico sia il loro estremità avvolgono i vasi sanguigni cerebrali. Una caratteristica propria del danno cere- mediatore cruciale responsabile della neurodegenerazione. Quindi, è verosimile immaginare brale è la formazione di tessuto gliotico composto da astrociti e microglia reattivi. Una reazione che nella SM la forte espressione di TrkB sugli astrociti contribuisca al danno neuronale tramite infiammatoria ha luogo in quest’area. Questo fenomeno è comunemente considerato dannoso la produzione di ossido nitrico. Strategie volte a bloccare questo processo neurodegenerativo e responsabile del blocco della crescita assonale nella lesione. Gli astrociti reattivi possono potrebbero condurre allo sviluppo di una nuova terapia neuroprotettiva per la sclerosi multipla. promuovere o inibire questa reazione infiammatoria. Infatti, da una parte possono produrre fattori che alterano la permeabilità della barriera emato-encefalica e attrarre cellule immunitarie all’interno del tessuto neurale. Dall’altra parte, modelli in vivo dimostrano che gli astrociti reattivi ROLE OF TRKB ON REACTIVE ASTROCYTES demarcano l’area danneggiata, promuovono la sopravvivenza neuronale ed il recupero delle funzioni della barriera emato-encefalica. IN MS LESIONS Lo scopo del progetto è stato di capire se le neurotrofine promuovono l’attività neuroinflam- matoria o neuroprotettiva degli astrociti e di declinare queste nuove conoscenze nel contesto INTRODUCTION AND AIMS della sclerosi multipla. Neurotrophins (NTs) are growth factors fundamental for development and maintenance of the RISULTATI vertebrate nervous system. They may promote survival as well as death of defined neuronal populations. NTs exert their pleiotropic actions by two structurally unrelated classes of recep- L’osservazione iniziale di questo progetto è stata la forte espressione di trkB sugli astrociti tors: the p75NTR receptor and the Trk receptors. NT receptors may be detected also in non- nelle lesioni SM e nel suo modello animale (EAE). Esperimenti di PCR quantitativa sul tessuto neuronal cell types, however the biological significance of such expression is mostly unknown. cerebrale umano hanno mostrato un notevole aumento nei livelli dell’isoforma troncata TrkB-T1 Published studies suggest that astrocytes may bear NT receptors after activation. nella sostanza bianca SM rispetto al controllo. Questo dato è stato confermato a livello di pro- Astrocytes are the most abundant glia cells in the central nervous system (CNS) and are funda- teina mediante immunoistochimica con un anticorpo specifico. La stessa isoforma è risultata mental for brain structure and function. They offer trophic support to neurons, regulate synaptic indotta anche sugli astrociti nelle lesioni EAE. transmission, control homeostasis of ions and metabolites. Furthermore, astrocytes are thou- Abbiamo quindi analizzato il ruolo del TrkB astrocitario in vivo nella neuroinfiammazione spe- ght to play a central role in the immune surveillance of the CNS, as their end-feet ensheath rimentale. Sorprendentemente, topi condizionali privi di TrkB sugli astrociti mostravano una most of the cerebrovasculature. A hallmark of CNS injury is formation of scar tissue composed diminuzione nella suscettibilità e nella gravità della EAE. Analisi istologiche hanno evidenziato of activated (“reactive”) astrocytes and microglia. An inflammatory response takes place within che gli infiltrati infiammatori erano significativamente meno presenti nel midollo spinale degli this clearly demarcated area. This phenomenon is commonly regarded as harmful and respon- 86 animali transgenici immunizzati e la neurodegenerazione era assente. sible for the block of axonal regrowth within the lesion. Activated astrocytes may either inhibit 87 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

or promote this inflammatory reaction. In fact, on one hand, they are able to produce factors PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI that alter the blood-brain barrier (BBB) permeability and attract immune cells into the neural tissue. On the other hand, in vivo models demonstrate that reactive astrocytes demarcate the Colombo E, Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Parada L, Medico E, Hohlfeld R, damaged area, promote BBB repair and sustain neuronal survival. Meinl E and Farina C. Stimulation of the neurotrophin receptor TrkB on astrocytes drives nitric oxide production and neurodegeneration. J.Exp. Med., 2012 in press Aim of this proposal was to understand whether neurotrophins promote the neuroinflammatory or the neuroprotective side of astrocytic reactivity and to decline this knowledge in the context Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Medico E, Hohlfeld R, Lassmann R, Meinl E of multiple sclerosis. and Farina C. A neurodegenerative role for astrocytic TrkB in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. X International Congress of Neuroimmunology, Sitges, 26-30 RESULTS Ottobre 2010 Cordiglieri C and Farina C. Astrocytes exert and control immune responses in the brain. Current The initial observation for this project was the robust expression of TrkB on astrocytes in both Immunology Reviews 6 (3) 2010 EAE and MS lesions. Quantitative PCR experiments on human cerebral tissue showed that there was marked up-regulation of the truncated isoform TrkB-T1 in MS tissue compared to Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Medico E, Aloisi F, Hohlfeld R, Meinl E and control white matter, which was confirmed at the protein level by immunohistochemistry with a Farina C. Role of TrkB on reactive astrocytes in MS lesions. 19th Congress of Italian Society of Neuroimmunology, Arzachena, 1-4 Ott 2009 specific antibody directed to the non-catalytically active isoform. TrkB-T1 was upregulated on astrocytes in EAE lesions as well. Then, we analysed the role of astrocyte TrkB in vivo in experimental neuroinflammation. Surprisingly, conditional mice lacking TrkB on GFAP positive cells PROGETTO FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2007 showed strong impairment in EAE susceptibility and severity. Histological analyses indicated per un periodo di 2 anni - 80.000 € that immune infiltrates were present in the spinal cord white matter of the EAE knockout mice, although significantly less than in control EAE littermates. Moreover, neurodegeneration was almost absent in knockout mice. To study astrocyte-neuron interaction we developed an in vitro model in which spinal neurons were exposed to astrocyte conditioned media generated under BDNF stimulation, and compared them to media generated under IL1 stimulation, a typical inflammatory pathway. Disruption of the neuronal network and apoptosis took place under both conditions, and nitric oxide was the common neurotoxic mediator released by astrocytes in response to both BDNF and IL1. Moreover, our in vitro data showed that, similarly to BDNF, also the TrkB ligands NT3 and NT4 activated the astrocytes so that neurodegeneration was induced, indicating multiple options for TrkB activation in astrocytes. These effects were dependent on astrocyte TrkB, as astrocytes from transgenic mice did not produce NO and induce neuronal death. Furthermore, we demonstrated that the fast kinetics of the neurodegenerative phenomenon, highlighted by time-lapse imaging experiments, was driven by the release of astrocyte NO, and amplified by neuronal NO. Nitrosative stress has been well documented in several neurodegenerative disorders. Here, NO is produced in excess following activation of iNOS. A marker of nitrosative stress is the nitrosylation of proteins at the level of tyrosine residues. We confirmed iNOS upregulation and deposition of nitrotyrosine in vivo in the spinal cord of control EAE mice. Consi- stent with the in vitro data obtained from TrkB deficient astrocytes, both iNOS and nitrotyrosine signals were greatly reduced in the CNS of transgenic EAE mice, indicating that TrkB signalling in astrocytes is crucial for NO synthesis in vivo. Interestingly, in MS lesions areas with diffuse nitrosylation were detected and nitrosylated axons were surrounded by the TrkB positive glial network.

CONCLUSIONS

Astrocytes are important regulators of neuroinflammation and neurodegeneration. Here, we describe for the first time a novel pathological process underlying astrocyte contribution to multiple sclerosis. In fact, as in a typical inflammatory pathway, the TrkB-mediated astrocytic response towards neurotrophins supports EAE expression by fostering a permissive environment for immune cell infiltration and neurodegeneration. In vitro and in vivo analyses demonstrated that nitric oxide is the crucial mediator triggering neurodegeneration. Thus it may be specula- ted that in MS the upregulated expression of TrkB on astrocytes contributes to the neuronal damage via NO production. Strategies to blockade this neurodegenerative pathway could lead to the development of a novel neuroprotective therapy for MS.

88 89 RUOLO DEI RECETTORI METABOTROPICI DEL GLUTAMMATO IN MODELLI SPERIMENTALI VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS DI SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTO munizzati, suggerendo che la delezione genetica dei recettori mGlu4 (un particolare sottotipo GIUSEPPE BATTAGLIA dei recettori mGlu accoppiato a proteine Gi/Go) aumenta la gravità dell’EAS. Il trattamento Dirigente Medico farmacologico sistemico di topi con EAS con un modulatore allosterico positivo dei recettori Istituto Neurologico Mediterraneo - Neuromed, Neuroscienze, Neurofarmacologia mGlu4 era in grado di attenuare significativamente i sintomi neurologici nell’EAS, quando il Pozzilli, Isernia trattamento iniziava un giorno dopo l’immunizzazione con MOG, ma non dopo la comparsa dei sintomi neurologici. Benché il trattamento farmacologico con un modulatore allosterico positivo Collaboratori: dei recettori mGlu4 non aveva effetti sull’EAS dopo che i sintomi si erano sviluppati, i dati in un FRANCESCO FAZIO modello di EAS cronica remissiva indicavano una efficacia significativa del farmaco nel ridurre SERENA NOTARTOMASO il numero e la severità delle ricadute quando somministrato durante il primo attacco clinico. CARLA BUSCETI Sorprendentemente, tali effetti erano mediati da recettori mGlu4 presenti nelle cellule del siste- VALERIA BRUNO FERDINANDO NICOLETTI ma immunitario, in particolare nelle cellule dendritiche, che influenzano criticamente il decorso dell’EAS nei topi. L’attivazione dei recettori mGlu4 nelle cellule che presentano l’antigene orien- Collaborazioni con altri gruppi: ta il differenziamento delle cellule T naive verso le cellule T regolatorie (Treg) responsabili della FRANCESCA FALLARINO, CLAUDIA VOLPI, CARMINE VACCA, tolleranza immunologica, a discapito delle cellule autorattive Th17. L’attivazione dei recettori PAOLO PUCCETTI, MARIA C. FIORETTI, URSULA GROHMANN, Dipartimento di Medicina mGlu4 nella sinapsi immunologica contribuisce al cross-talk e al condizionamento reciproco Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Perugia ROBERTO DI MARCO, Dipartimento di Scienze della Salute, Università del Molise, Campobasso delle cellule T e cellule accessorie. Questi dati forniscono la prima evidenza di un recettore per SIMONA BONAVITA, Università di Napoli un neurotrasmetittore in grado di influenzare il programma differenziativo delle cellule T naive nella sinapsi immunologica. Quindi aprono nuove prospettive nel trattamento sperimentale della sclerosi multipla, basate sull’attivazione di un particolare sottotipo dei recettori metabotropici del glutammato (il recettore mGlu4) presente nelle cellule della sinapsi immunologica, che può PREMESSE E OBIETTIVI far variare il rapporto tra le cellule TH17 dannose e le cellule Treg “protettive”. I neurotrasmettitori come le monoamine e l’acetilcolina contribuiscono a regolare la magnitudo CONCLUSIONI e la qualità delle risposte immunitarie. La scoperta recente delle cellule T helper (TH17) che producono interleukina 17 (IL-17), come un distinto set di cellule effettrici, ha fornito nuove infor- Alti livelli di glutammato sono presenti nel cervello di pazienti con sclerosi multipla dove contri- mazioni nella complessità dell’immunopatologia. Le cellule TH17 hanno importanti ruoli nell’in- buisce alla neurotossicità. Quì abbiamo dimostrato un possibile ruolo alternativo: il glutammato fiammazione e nell’autoimmunità e si sviluppano sotto l’influenza delle cellule T regolatorie guida la risposta delle cellule T regolatorie che migliorano la neuroinfiammazione nell’EAS. (Treg). Sebbene le cellule TH17 agiscono come mediatori dell’autoimmunità nell’encefalomielite L’aumento delle cellule T regolatorie è mediato dai recettori mGlu4 espressi sulle cellule dendri- autoimmunitaria sperimentale (EAS) e la sclerosi multipla, parecchi report sollevano la questio- tiche che sono cruciali per il mantenimento della risposta immunitaria. La nostra ipotesi è che ne se le cellule TH1 o TH17 sono le principali cellule T patogenetiche, suggerendo che ogni il glutammato possa avere un ruolo protettivo nelle malattie infiammatorie neurodegenerative. popolazione contribuisce a specifici aspetti della malattia. Il glutammato, principale neurotra- Il trattamento sistemico dei topi con EAS con un modulatore allosterico positivo dei recettori smettitore eccitatorio del sistema nervoso centrale, può rappresentare un messaggero chimico mGlu4 attenua la malattia ed è associato con un aumento delle cellule T regolatorie nei linfo- comune per le cellule nervose ed immunitarie, e quindi potrebbe essere implicato nell’azione nodi. Quindi, i modulatori allosterici positivi dei recettori mGlu4, che sono attualmente in studio coordinata dei due sistemi in condizioni patologiche. Il glutammato attiva canali ionici (recettori per la malattia di Parkinson, potrebbero fornire un’opportunità per sfruttare quello che sembra ionotropici al glutammato) e recettori metabotropici (mGlu) accoppiati a proteine G. I recettori essere un effetto protettivo del glutammato nei pazienti con sclerosi multipla. mGlu modulano la neurotrasmissione glutammatergica, regolando il rilascio di glutammato dai terminali presinaptici, quindi sono considerati potenziali bersagli per farmaci neuroprotettivi nel trattamento dei disturbi neurodegenerativi. Le connessioni temporali e causali tra le cellule immunitarie e le citochine solubili da un lato, e la trasmissione sinaptica e la neurodegenerazione, ROLE OF METABOTROPIC GLUTAMATE dall’altro rimangono elusive. Il principale obiettivo del progetto è stato l’identificazione di nuove RECEPTORS IN EXPERIMENTAL MODELS strategie terapeutiche per il trattamento sperimentale della sclerosi multipla attraverso l’identificazione di meccanismi coinvolti nei processi neuroinfiammatori e la valutazione degli effetti OF MULTIPLE SCLEROSIS neuroprotettivi in topi con EAS di ligandi sottotipi selettivi dei recettori mGlu. INTRODUCTION AND AIMS RISULTATI Neurotransmitters such as monoamines and acetylcholine contribute to regulating the magni- I recettori accoppiati a proteine G stanno emergendo come “targets” alternativi per il trattamento tude and quality of immune responses. The recent discovery of interleukin (IL)-17-producing T farmacologico della sclerosi multipla. Benchè i recettori mGlu siano tradizionalmente associati helper (TH17) cells as a distinct subset of effector cells has provided novel insight into the intri- alla regolazione della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale, la loro espressione cacies of immunopathology. TH17 cells have important roles in inflammation and autoimmunity in cellule periferiche, incluse le cellule del sistema immunitario, suggerisce l’esistenza di mec- and develop under bidirectional influence by regulatory T (Treg) cells. Although TH17 cells act canismi d’azione aggiuntivi. Diversi sottotipi di recettori mGlu sono espressi nei timociti, e i livelli as mediators of autoimmunity in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and mul- di espressione variano in rapporto al grado di maturazione cellulare. Abbiamo usato il modello tiple sclerosis, several reports raise the question of whether TH1 or TH17 cells are the promi- murino di encefalite autoimmune sperimentale (EAS) come modello di sclerosi multipla ottenuto nent pathogenetic T cells, suggesting that each population contributes specific nuances to the mediante l’immunizzazione di topi con la proteina oligodendrocitaria, MOG. L’immunizzazione disease. Glutamate, the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system, may di topi wild-type e topi knockout per i recettori mGlu4 (Grm4-/-) con MOG ha indotto la malattia represent a chemical messenger common to neural and immune cells, and therefore could be più precocemente ed in forma più grave nei topi Grm4-/-. Segni di demielinizzazione e infiltrati implied in the coordinated action of the two systems in danger conditions. Glutamate activates 90 infiammatori nella sostanza bianca del midollo spinale erano più evidenti nei topi Grm4-/- im- ligand-gated ion channels (ionotropic glutamate receptors) as well as G-protein coupled meta- 91 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

botropic glutamate (mGlu) receptors. mGlu receptors modulate glutamatergic neurotransmis- PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI sion, by regulating glutamate release from presynaptic terminals and therefore are considered as potential targets for neuroprotective drugs in the treatment of neurodegenerative disorders. Fallarino F, Volpi C, Fazio F, Notartomaso S, Vacca C, Busceti CL, Bicciato S, Battaglia G, Bruno The temporal and causal connections between immune cells and soluble cytokines on one V, Puccetti P, Fioretti CM, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco R. Metabotropic glutamate receptor 4 impacts adaptive immunity restraining neuroinflammation. Nat. Med., 2010, 16(8):897-902. hand, and synaptic transmission and neurodegeneration, on the other hand remain elusive. (Questo lavoro è stato evidenziato da Hansen A.M. and Caspi R.R. Glutamate joins the ranks of The principal objective of the project has been the identification of new therapeutic strategies immunomodulators. Nat. Med., 2010, 16(8):856-858; e da Kingwell K. Putting a dampener on infor the experimental treatment of multiple sclerosis through the identification of mechanisms flammation. Nat. Neurosci. Rev., 2010, 9) involved in the control of neuroinflammatory processes and the evaluation of neuroprotective effects in mice subjected to EAE exerted by subtype selective ligands of mGlu receptor. Notartomaso S, Fallarino F, Volpe C, Fazio F, Busceti CL, Battaglia G, Bruno V, Vacca C, Scarselli P, D’amore V, Puccetti P, Fioretti MC, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco RM. Beneficial effect of mGlu4 receptor activation on animal models of experimental autoimmune encephalomyelitis on RESULTS da rats and experimental autoimmune neuritis in lewis rats. Soc. Neurosci. Abs., 2010, 642.27

G-protein coupled receptors are emerging as alternative targets for the treatment of multi- Fazio F, Fallarino F, Notartomaso S, Busceti CL, Volpi C, Vacca C, Battaglia G, Bruno V, Nicoletti ple sclerosis. Although mGlu receptors are traditionally linked to the regulation of synaptic F, Grohmann U, Di Marco R. mGlu4 metabotropic glutamate receptor negatively regulates TH17 cell-driven immune responses: a new target for the experimental treatment of neuroinflammatory transmission in the central nervous system, they are widely expressed in peripheral cells, in- autoimmune disorders. 34° SIF Meeting, Rimini, 2009 cluding immune cells. Individual mGlu receptor subtypes are expressed in thymocytes, and the expression pattern varies in relation to the maturation stage of T lymphocytes. We have Fallarino F, Notartomaso S, Fazio F, Busceti CL, Volpi C, Battaglia G, Bruno V, Nicoletti F, Grohmann used the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model of multiple sclerosis U, Di Marco R. mGlu4 metabotropic glutamate receptor negatively regulates TH17 cell-driven im- obtained by immunization of mice with the oligodendrocyte protein, MOG. Immunizzation of mune responses: a new target for the experimental treatment of neuroinflammatory autoimmune disorders. Soc. Neurosci. Abs., 2009, 334.4 wild-type and mGlu4 receptor knockout (Grm4-/-) mice with MOG induced an earlier onset and more severe disease in mGlu4-/- mice. Signs of demyelination and inflammatory infiltrates in white matters from spinal cords were more evident in immunized Grm4-/- mice, suggesting PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 that the absence of the mGlu4 receptor (a particular mGlu receptor subtype coupled to Gi/Go per un periodo di 2 anni - 130.000 € proteins) enhances the severity of EAE. Systemic pharmacological treatment of EAE mice with a selective positive allosteric modulator of mGlu4 receptors was able to significantly attenuate the neurological score in EAE, when treatment started one day after MOG immunization, but not after the onset of neurological signs. Although pharmacological treatment with a selective allosteric modulator of mGlu4 receptors had no effect on EAE once neurological symptoms had developed, parallel data in a model of relapsing-remitting EAE revealed significant efficacy of the drug in reducing the number and severity of relapses when administered during the first clinical attack. To our surprise, it was the mGlu4 receptor present in immune cells (particularly in dendritic cells) that critically influenced the outcome of MOG-induced EAE in mice. Activation of mGlu4 receptors in antigen-presenting cells within the immunological synapse drives the differentiation of naive T cells towards the immune tolerant Treg cells at the expenses of autoreactive TH17 cells. Our data suggest that the use of a selective allosteric modulator of mGlu4 receptors sustains Treg development, whose regulatory activity mostly affects TH17 cells. To our knowledge, this if the first evidence of any conventional neurotransmitter receptor that can affect the differentiation program of naive T cells towards a specific phenotype. These findings can pave the way to a novel strategy in the treatment of autoimmune disorders of the CNS targeting mGlu receptors present in immune cells, which can shift the ratio between harmful TH17 cells and “protective” Treg cells.

CONCLUSIONS

High amounts of glutamate are found in the brain of individuals with multiple, and whereas this is widely thought to contribute to neurotoxicity, here we have shown an alternative possibility - a role for glutamate in driving a regulatory T cell response that ameliorates neuroinflammation in the EAE. This increase in regulatory T cells is mediated by mGlu4 receptors expressed on dendritic cells, which are crucial for supporting an immune response. We suggest that glutamate may have a protective role in inflammatory neurodegenerative diseases. Systemic treatment of mice with EAE with a positive allosteric modulator of mGlu4 receptors attenuated disease and was associated with an increase in Treg cells in the lymph nodes. Thus, allosteric modulators of mGlu4 receptors, which are currently under investigation for Parkinson’s disease, might provide an opportunity to harness what seems to be a protective effect of glutamate in patients with multiple sclerosis. 92 93 STUDIO SUL RUOLO FUNZIONALE DI RANTES SULLA TRASMISSIONE GLUTAMATERGICA NEL CERVELLO VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS UMANO ED IN TOPI EAE

volgeva anche il sottotipo recettoriale CCR3. Abbiamo quindi valutato come e in che misura questi effetti potessero essere modificati in animali EAE. I dati ottenuti da sinaptosomi isolati RESPONSABILE DEL PROGETTO da terminazioni glutammatergiche del midollo spinale di topi EAE al 13° e al 21° giorno dall’im- ERNESTO FEDELE munizzazione (d.p.i.) hanno dimostrato come non fosse evidente alcuna variazione significativa Professore Associato di Farmacologia né nell’esocitosi di glutammato evocata da stimolo depolarizzante (ossia da elevate concen- Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Farmacologia e Tossicologia trazioni di KCl) né nell’aumento mediato da RANTES del rilascio di tale neurotrasmettitore. Al Università degli Studi di Genova contrario, in sinaptosomi corticali di topi EAE (13 e 21 d.p.i.), si osservava una marcata ridu- Collaboratori: zione dell’esocitosi di glutammato. Questa riduzione era accompagnata da una modificazione ANNA MARIA PITTALUGA dell’effetto inibente di RANTES sul rilascio di glutammato osservato su animali controllo che MARCO MILANESE diveniva potenziante nei terminali corticali ottenuti da topi al 13 d.p.i. per poi scomparire a 21 SILVIA DI PRISCO d.p.i.. È interessante notare come parallelamente i livelli endogeni di RANTES nella corteccia ELISA MEREGA e nel midollo spinale di topo EAE fossero drammaticamente aumentati e correlassero con la gravità della patologia, suggerendo che il rilascio di RANTES potrebbe avere un ruolo chiave nelle variazioni qui riportate. PREMESSE E OBIETTIVI Le modifiche indotte da RANTES sul rilascio di glutammato non erano accompagnate da cambiamenti nella composizione del repertorio recettoriale coinvolto negli effetti descritti, bensì era- La sclerosi multipla (SM) è una patologia autoimmune demielinizzante che colpisce il sistema no correlabili a modifiche dei sistemi di trasduzione intraterminali coinvolti nell’effetto inibente nervoso centrale (SNC), ad eziologia ignota, ma che si sviluppa in individui geneticamente pre- che la chemochina provoca sull’esocitosi di glutammato. disposti, esposti a fattori ambientali in grado di scatenare una cascata di eventi infiammatori diretti verso auto-antigeni. CONCLUSIONI A lungo si è pensato che il sistema immunitario fosse indipendente dal sistema nervoso. Di recente è stata invece dimostrata l’esistenza di una stretta correlazione tra i due sistemi, fonda- Il nostro studio indica che nell’animale EAE si hanno modifiche nella modulazione della tra- mentale nei disturbi centrali neurodegenerativi e infiammatori. In particolare, è stato dimostrato smissione centrale del glutammato da parte di RANTES. Esse presentano una buona corri- come da una parte citochine proinfiammatorie siano in grado di controllare la neurotrasmissio- spondenza con il livello di gravità della patologia e possono dunque rappresentare processi ne e, dall’altra parte, la sintesi e il rilascio di citochine/chemochine selettive venga regolata, a molecolari specifici alla base della patologia autoimmune. Tali risultati inoltre svelano nuove livello cerebrale, da classici neurotrasmettitori. Queste osservazioni aggiungono nuovi risvolti informazioni riguardanti l’interazione tra i sistemi immunitario e neuronale e potrebbero divenire al ruolo delle chemochine nella neuroinfiammazione. Infatti, secondo tale ipotesi, l’espressione potenzialmente utili nel rivelare i processi molecolari mediante i quali nuove terapie possano aberrante delle chemochine che si riscontra nella SM potrebbe causare modificazioni profonde ripristinare funzioni centrali e risultare rilevanti per l’evoluzione della SM. Considerando che i alla neurotrasmissione centrale, rappresentando quindi un meccanismo alla base dei sintomi recettori delle chemochine costituiscono un bersaglio per l’approccio terapeutico della SM e neuropsichiatrici osservati in pazienti con SM. che l’industria farmaceutica e biotecnologica ha affrontato sforzi sostanziali per modulare la Tra le varie citochine, la chemochina proinfiammatoria RANTES viene considerata un marca- loro attività, le nostre osservazioni potrebbero sottolineare nuovi aspetti dell’importanza clinica tore della SM in quanto nei pazienti si osservano modifiche riguardanti la sua produzione e delle chemochine nei disturbi neuroinfiammatori. l’espressione dei suoi recettori. Con questo studio si è voluto verificare se RANTES potesse comportarsi come modulatore della neurotrasmissione centrale e valutare se tale funzione potesse essere modificata in topi STUDIO SUL RUOLO FUNZIONALE DI RANTES affetti da Encefalomielite Autoimmune Sperimentale (EAE), un modello animale che mostra tratti comuni con la SM umana. A partire dall’osservazione che la trasmissione glutammatergica SULLA TRASMISSIONE GLUTAMATERGICA risulta alterata in pazienti con SM, il nostro studio si è focalizzato sull’impatto di RANTES sul NEL CERVELLO UMANO ED IN TOPI EAE rilascio di tale neurotrasmettitore in differenti aree cerebrali in topi controllo ed EAE.

RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS

Abbiamo valutato se RANTES potesse modulare il rilascio di glutammato in diverse aree cere- Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune demyelinating disorder of the central nervous sy- brali del cervello di topo, in condizioni non patologiche. I dati da noi ottenuti hanno dimostrato stem (CNS) of unknown aetiology that could emerge when genetically susceptible individuals che la chemochina RANTES era in grado di controllare la liberazione di glutammato e che encounter environmental triggers that initiate an inflammatory cascade of events against self- questa modulazione avveniva con modalità differente a seconda dell’area cerebrale studiata. antigens. Infatti, a livello corticale, in condizioni basali, RANTES provocava il rilascio di glutammato, ma As to the immune system, for many decades it was thought to be independent from central ne inibiva l’esocitosi causata da stimolo depolarizzante. Al contrario, il rilascio spontaneo di nervous system. Recently, however, the two systems have been proposed to communica- glutammato a livello spinale sembrava non essere influenzato da concentrazioni nanomolari te and to play a role in central neurodegenerative and inflammatory disorders. In particular, della chemochina, mentre le stesse concentrazioni di RANTES erano in grado di indurre un proinflammatory cytokine were reported to control neurotransmission and, on the other side, potenziamento dell’esocitosi evocata da stimolo depolarizzante. La discrepanza tra gli effetti classic neurotransmitters were shown to regulate the synthesis and the release of selective causati dalla chemochina nelle due diverse aree del sistema nervoso centrale (midollo spinale cytokines/chemokines within the brain. These observations have several implications and add e corteccia) poteva suggerire il coinvolgimento di diversi sistemi recettoriali. In accordo con new aspects of interest to the role chemokines in neuroinflammation. Indeed, accordingly to questa ipotesi, abbiamo dimostrato come le modificazioni del rilascio di glutammato siano this thesis, an aberrant expression of the chemokine in MS patients could have profound mo- correlate al legame di RANTES a diversi recettori delle chemochine. In particolare, l’azione difications to central neurotransmission and may account for neuropsychiatric symptoms that potenziante indotta da RANTES sulla liberazione di glutammato dipendeva sempre dall’intera- often are observed in MS patients. 94 zione della chemochina con i sottotipi recettoriali CCR1 e CCR5, mentre l’effetto inibente coin- Among all the cytokines pathologically produced in CNS, the proinflammatory chemokine 95 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

RANTES is considered an hallmark of MS, because of its modified production and of the chan- PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI ges in the expression of chemokine receptors observed in MS patients. The principal aims of our study, was to evaluate whether RANTES could behave as a fine mo- Di Prisco S., Summa M., Merega E., Pittaluga A. RANTES-glutamate interaction in central ner- dulator of central neurotransmission and whether this function could be modified in Experimen- vous system Congresso Nazionale Società Italiana di Neuroscienze, to be held in Catania, 19-22 Aprile 2012 tal Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) mice, an animal model that share some aspects with human MS. Starting from the observation that glutamate transmission is altered in MS subjects, Di Prisco S, Summa M, Merega E, Pittaluga A. RANTES-mediated control of glutamate release in our study was focused on the impact of RANTES on the release of this neurotransmitter in dif- mouse brain occurs in a area-specific manner and involves distinct chemokine receptor repertoi- ferent brain areas in control and EAE mice. res. 8th FENS Forum of Neuroscience, Barcelona, to be held in July 14-18, 2012 Marte A, Cavallero A, Morando S, Uccelli A, Raiteri M, Fedele E. 2010. Alterations of glutamate RESULTS release in the spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuro- chem. 2010 Oct;115: 343-52 As a first approach, we investigated whether RANTES could modulate the release of glutamate Di Prisco S, Summa M, Cherllakudam V, Rossi PIA, Pittaluga A. RANTES-mediated control of in different mouse brain areas in healthy condition. Our first finding was that the chemokine- excytatory amino acid release in mouse spinal cord. Accepted with minor revision, 2012 Februa- mediated control of glutamate release occurs in an area-specific manner. Indeed, at the cortical ry, 24 on J. Neurochemistry level, RANTES elicits the release of glutamate in basal condition but inhibits glutamate exocytosis caused by mild depolarizing stimuli. Fedele E, Raiteri M, Summa M, Di Prisco S, Cavallero A, Gardella E, Pittaluga A Study on the Differently, the spontaneous release of glutamate from spinal cord glutamatergic nerve termi- functional roles of RANTES on glutamate transmission in human and EAE mice brains Convegno scientifico Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, Roma, 26-27 maggio 2011 nals was unaffected by nanomolar concentration of chemokine, while the depolarization-evoked glutamate exocytosis was potentiated. The discrepancy in the effects elicited by the che- Di Prisco S, Summa M, Chellakudam V, Pittaluga A RANTES-glutamate interaction in Central mokine in the two mouse CNS regions (namely the spinal cord and the cortex) was predictive of Nervous System : a glial to neuron cross-talk relevant to central neuroinflammation the involvement of different receptor repertoires. Accordingly to this hypothesis, we found that 35° Congresso Nazionale Società Italiana di Farmacologia, Bologna, 14-17 settembre 2011 RANTES-induced modification to glutamate release always relied on the binding of RANTES Musante V, Summa M, Severi P, Raiteri M and Pittaluga A. RANTES modulates the release of to chemokine receptor 1 (CCR1) or CCR5 subtypes, with the exception of RANTES. We then glutamate in human and mouse neocortex investigated whether and to what extent the above described RANTES-induced effects could Society for Neuroscience, Chicago, 2009 October 16-19 be modified in EAE mice. As to the impact of MOG-immunization on RANTES-mediated controls of glutamate exocytosis, glutamate overflow evoked by a classic depolarizing stimulus (i.e. Musante V, Summa M, Kalfas F, Severi P, Raiteri M, Pittaluga A. RANTES controls the release of high KCl concentration) as well as RANTES-induced facilitation of glutamate exocytosis from glutamate in human and mouse neocortex 36° Colloque de Neuroendocrinologie, Nizza, Septembre 15-18 2009 synaptosomes isolated from the spinal cord of EAE mice at 13 and 21 days post immunization (d.p.i.) was not significantly modified. On the contrary, at the cortical level, a persistent reduc- Summa M, Musante V, Severi P, Raiteri M, Pittaluga A. RANTES modulates central glutamatergic tion of glutamate exocytosis was observed in cortical synaptosomes from EAE mice at 13 and neurotransmission in human and mouse neocortex 21 d.p.i. Inasmuch, RANTES-induced inhibition of glutamate exocytosis turned to facilitation 34° Congresso Nazionale della Società Italiana di Farmacologia, Rimini 14-17 Ottobre 2009 at 13 d.p.i. then disappearing at 21 d.p.i.. Interestingly, endogenous RANTES in the cortex Di Prisco S, Summa M, Severi P, Marchi M and Pittaluga A. The pro-inflammatory chemokine and in the spinal cord of EAE mice was dramatically increased and well correlated with animal RANTES controls glutamate bioavailability in human and mouse neocortex New Therapies for score suggesting that pathologically released RANTES could have a role in the modification Inflammation September 24, 2010, IIT Central Research Lab Genova described above to glutamate release. Changes in RANTES-induced modification to glutamate release were not accompanied by modification of the receptor repertoire, but were paralleled by modification in the intraterminal pathway accounting for the inhibitory effect the chemokine PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 causes on glutamate exocytosis, i.e. the adenylyl cycalse- cAMP- protein kinase A-mediated per un periodo di 2 anni - 100.000 € enzymatic pathway.

CONCLUSIONS

In conclusion, our study indicates that changes in RANTES-induced control of central glutamate transmission well correlate with EAE gravity a could therefore represent a molecular processes specifically targeted in autoimmune processes. Furthermore, these results could provide novel information on the cross talk between immune and neuronal systems that may be relevant to the evolution of MS. They might also be useful in unveiling the molecular processes through which new therapeutic intervention could restore central functions. Considering that chemokine receptors are targets for therapeutic approach to the cure of MS, and that biotechnology and pharmaceuticals indu- stry has mounted substantial efforts to modulate their activity, our observation could help to highlight new aspects of the medical importance of chemokines in neuro-inflammatory diseases.

96 97 STUDIO DELL’EFFICACIA TERAPEUTICA DI NUOVI MODULATORI DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS NELLA SCLEROSI MULTIPLA

una ridotta espressione di proteine fosforilate NF-kB, IKKαβ, ERK, Akt e dell’enzima Cox-2 (il RESPONSABILE DEL PROGETTO CB74 non aveva effetto su Cox-2). Alcuni composti, selezionati per l’efficacia e per l’effetto ANNA MARIA MALFITANO mediato dal recettore CB2 sono stati usati su PBL isolati da pazienti con SM non in trattamento Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche con farmaci immunosoppressori. Il CB74 è stato selezionato per la attività agonista dimostrata Università di Salerno anche da altri studi, il VL23 come derivato chinolinico e l’AF4 come composto piridinico con MENTORE affinità paragonabile per i recettori CB1 e CB2. Gli effetti sulla proliferazione, sulla vitalità e MAURIZIO BIFULCO sull’espressione di Akt e Cox-2 sono stati confermati, in più il CB74 riduceva l’espressione di Cox-2. Il CB74 e il VL23 erano più efficaci nel ridurre l’attivazione nei PBL dei pazienti rispetto ai donatori sani, in particolare il CB74 riduceva CD69 e il VL23 riduceva CD69, CD54 e CD25, l’AF4 non aveva effetto sull’attivazione, quindi una maggiore selettività per il recettore CB2 PREMESSE E OBIETTIVI determinava una maggiore riduzione dell’attivazione nei PBL dei pazienti. I risultati ottenuti soddisfano gli obiettivi proposti. In questi ultimi anni la ricerca ha evidenziato il ruolo chiave del sistema endocannabinoide come promettente bersaglio terapeutico nella sclerosi multipla (SM). Questo sistema comprende i CONCLUSIONI recettori dei cannabinoidi (CB1, CB2), gli endocannabinoidi e gli enzimi responsabili della loro sintesi ed inattivazione. Il recettore CB2 è espresso quasi esclusiavemente dalle cellule del Questi risultati suggeriscono il potenziale utilizzo dei derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chino- sistema immunitario e può avere un ruolo funzionale importante nel sistema nervoso centrale linici nella terapia della SM. Questi composti altamente selettivi per il recettore CB2 riducono con il vantaggio di non causare gli effetti psicoattivi dovuti al recettore CB1. Il sistema endocan- la proliferazione, la produzione di citochine, l’attivazione, la migrazione e l’infiammazione nei nabinoide esercita un ruolo protettivo durante la neuroinfiammazione dovuto almeno in parte linfociti isolati da donatori sani. Effetti simili sono stati riscontrati nei linfociti isolati da pazienti alla ridotta attivazione ed infiltrazione delle cellule immuni. Gli agonisti dei recettori dei canna- con SM, con un effetto inibitorio addirittura maggiore sull’attivazione rispetto ai donatori sani binodi migliorano il decorso della SM sia nell’uomo che nei topi con encefalite sperimentale all’aumentare della selettività per il recettore CB2. Questi risultati suggeriscono l’importanza autoimmune (EAE) e hanno un favorevole profilo farmacologico di sicurezza, sebbene il loro del recettore CB2 nella SM, in particolare i derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici che uso sia limitato dagli effetti psicoattivi. Recentemente è stato dimostrato il ruolo protettivo del agiscono attraverso questo recettore e che hanno il vantaggio di non avere effetti psicoattivi recettore CB2 nell’EAE, i topi deficienti del recettore CB2 presentano un peggioramento della dovuti al recettore CB1, considerati i loro effetti immunomodulatori ed antiinfiammatori potreb- malattia rispetto ai topi normali ed una selettiva attivazione farmacologica di questo recettore bero essere utilizzati per futuri studi clinici e portare alla sviluppo di una nuova terapia per la SM. riduce i sintomi della malattia. Inoltre le cellule T encefalitogeniche deficienti del recettore CB2 proliferano e producono citochine infiammatorie in misura maggiore rispetto alle cellule T normali e sono più resistenti all’apoptosi. Per chiarire l’importanza dell’attivazione del recettore CB2 nella patogenesi della SM, gli effetti di nuovi agonisti altamente selettivi per il CB2, in par- STUDY OF THE THERAPEUTIC EFFICACY OF NOVEL ticolare i derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici sono stati esaminati sulla proliferazione, MODULATORS OF THE ENDOCANNABINOID sull’attivazione, sulla produzione di citochine, sulla sopravvivanza e sul ciclo cellulare nonchè sulle principali vie di attivazione, sulla migrazione e sugli enzimi coinvolti nell’infiammazione dei SYSTEM IN MULTIPLE SCLEROSIS linfociti isolati sia da donatori sani che da pazienti con SM. INTRODUCTION AND AIMS RISULTATI The research of the last years has highlighted the key role of the endocannabinoid system as Gli effetti immunomodulatori e antiinfiammatori di nuovi agonisti del recetto- a promising therapeutic target in multiple sclerosis (MS). This system includes cannabinoid re- re CB2, in particolare di derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici [N-ciclopen- ceptors (CB1, CB2), endocannabinoids and enzymes for their production and inactivation. The til 7-metil-1-(2-morfolin-4-iletil)-1,8-naftiridin-4(1H)-one-3-carbossiammide (CB13), CB2 receptor is almost exclusively expressed by the immune cells and may play a functionally N-(4-metilcicloesil)-1-benzil-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CB74) N- relevant role in the central nervous system with the advantage to be unrelated to psychoactive cicloesil-1-benzil-7-metossi-1,8-naftiridin-4(1H)-one-3- carbossiammide (CB82) N-(4- effects due to the CB1 receptor. metilcicloesil)-1-(p-fluorobenzil)-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CB91), N-ciclo- The endocannabinoid system has a protective role during neuroinflammation exerted, at least eptil-4-idrossi-1-(2-morfolin-4-iletil)-2-osso-1,2-diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide (VL15), in part, by decreasing immune cell activation and infiltration. Cannabinoid receptor agonists N-cicloeptil-1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (VL23), N-cicloep- improve clinical disease in humans with MS and in rodents with experimental autoimmune til-1-(p-fluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide (AF4), N-(4-metilcicloesil)- encephalomyelitis (EAE) and have a favorable drug safety profile, although their use in the clinic 1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (VL8), N-(4-metilcicloesil)- is severely limited by their psychoactivity. Recent works highlighted the protective role of CB2 1-(p-fluorobenzil)-4-idrossi-2-osso-1,2-diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide (LV8), receptors in EAE, CB2 receptor knock-out mice showed an exacerbated clinical score of the N-cicloeptil-1-butyl-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (LV24), N-(4-metilcicloesil)- disease when compared with their wild-type littermates and selective pharmacological CB2 1-pentil-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CF6trans) and N-cicloeptil-5-(p-metossifenil)- activation markedly reduced EAE symptoms. Furthermore, CB2-/- encephalitogenic T cells 1-(p-fluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide (MC21)] sono stati valutati sui exhibited higher rates of proliferation, reduced apoptosis and increased inflammatory cytoki- linfociti isolati dal sangue periferico (PBL) di donatori sani e di pazienti con SM. Nei PBL di ne production as compared to wild-type T cells. In order to better clarify the relevance of the donatori sani questi composti a concentrazioni micromolari bloccavano in alcuni casi in modo CB2 receptor activation in MS pathogenesis, in this project the effects of novel CB2 agonists, dose dipendente la proliferazione indotta con proteina mielina basica, riducevano la vitalità, la 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives, showed to be highly selective for CB2 produzione di TNF-α e di IL-10, l’espressione di marcatori di attivazione, CD69, CD25, CD54 e receptors were investigated on lymphocytes isolated from healthy donors and MS patients. In CD49d, in alcuni casi la migrazione, la transizione di fase G1/S del ciclo cellulare e inducevano particular proliferation, activation, cytokine production, cell survival and cycle and main activa- apoptosi. L’effetto antiproliferativo di molti composti era revertito dall’antagonista del recettore tion pathways were examined as well their effects on cell migration and enzymes associated 98 CB2 questo dato suggeriva un meccanismo mediato dal recettore. È stata osservata anche to inflammation. 99 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

The immunomodulatory and antiinflammatory effects of novel CB2 agonists, in par- Manera C, Saccomanni G, Malfitano AM, Bertini S, Castelli F, Laezza C, Ligresti A, Lucchesi V, ticular 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives, N-cyclopentyl-7-methyl- Tuccinardi T, Rizzolio F, Bifulco M, Di Marzo V, Giordano A, Macchia M, Martinelli M. Rational design, synthesis and antiproliferative properties of new CB2 selective cannabinoid receptor 1-(2-morpholin-4-ylethyl)-1,8-naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide (CB13), ligands: an investigation of the 1,8-naphthyridin-2(1H)-one scaffold. Sottomesso a European N-(4-methylcyclohexyl)-1-benzyl-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (CB74) N- Journal of Medicinal Chemistry cyclohexyl-1-benzyl-7-methoxy-1,8-naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide (CB82) N-(4- methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (CB91), Malfitano AM, Laezza C, D’Alessandro A, Procaccini C, Saccomanni G, Tuccinardi T, Manera C, N-cycloheptyl-4-hydroxy-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-1,8-naphthyridine- Matarese G, Gazzerro P, Bifulco M. CB2 receptor mediated immunomodulation by 1,8-naphthyridine, quinoline and pyridine derivatives in multiple sclerosis. Sottomesso a Journal of Neuro- 3-carboxamide (VL15), N-cyclohepthyl-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-quinolin-2(1H)-on-3-carbo- science xamide (VL23), N-cyclohepthyl-1-(p-fluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxamide (AF4), N-(4-methylcyclohexyl)-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide Malfitano AM, Laezza C, Bifulco M. “Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del (VL8), N-(4-methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-1,8-naphthyri- sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla” CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2011 Roma, dine-3-carboxamide (LV8), N-cycloheptyl-1-butyl-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide 25 - 26 maggio 2011 centro Congressi di Roma Eventi Piazza di Spagna (via Alibert 5a) (LV24), N-(4-methylcyclohexyl)-1-pentyl-quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide (CF6trans) and N- Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and cycloheptyl-5-(p-methoxyphenyl)-1-(p-fluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxami- study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocannabinoid system in multiple de (MC21) were investigated on peripheral blood lymphocytes (PBL) isolated from healthy sclerosis”. CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2011 Roma, 25 - 26 maggio 2011 centro Congressi donors and MS patients. In PBL of healthy donors, these compounds at micromolar concen- di Roma Eventi Piazza di Spagna (via Alibert 5a) trations, inhibited in some cases in a dose dependent manner the proliferation of myelin basic Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Bifulco M. “Studio protein activated PBL reduced vitality, inhibited TNF-α and IL-10 production, the expression dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi of T cell activation markers CD69, CD25, CD54 and CD49d, in some cases cell migration, multipla”CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2010 Roma, 26 - 27 maggio 2010 Istituto Superiore di blocked the G1/S transition phase of the cell cycle and induced apoptosis. The antiproliferative Sanità effect of many compounds was reverted by the CB2 antagonist, finding suggesting a CB2 receptor mediated mechanism. Furthermore, we found down-regulation of phosphorylated Malfitano AM, Manera C, Basu S, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocan- proteins NF-kB, IKKαβ, ERK, Akt and the enzyme Cox-2 (CB74 did not affect Cox-2 levels). nabinoid system in multiple sclerosis”. CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2010 Roma, Some of these compounds, selected for their efficiency and for their CB2 receptor mediated 26 - 27 maggio 2010 Istituto Superiore di Sanità effects were used on PBL isolated from MS patients not in therapy with currently administered immune-suppressive medicines. CB74 was selected for its agonist activity showed also by previous studies, VL23 was selected as quinoline derivative and AF4 as pyridine compounds BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 with similar affinity at both the CB1 and CB2 receptor. The effects on proliferation, vitality and per un periodo di 2 anni - 40.000 € the expression of Akt and Cox-2 were maintained, indeed CB74 inhibited Cox-2 expression. CB74 and VL23 were more efficient to inhibit activation in PBL of MS patients than of normal subject, in particular, CB74 reduced CD69 levels and VL23 reduced CD69, CD54 and CD25 levels, AF4 did not inhibit activation in PBL of patients, thus suggesting that enhanced selectivity at the CB2 receptor determines higher inhibition of activation in PBL from patients. These findings reported satisfy the objectives proposed.

CONCLUSIONS

These findings suggest the potential use of 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives in MS therapy. These highly selective CB2 compounds reduce proliferation, cytokine production, activation, migration and inflammation in lymphocytes isolated from healthy donors. Similar effects were observed in lymphocytes from MS patients, in these cells a higher inhibitory effect on activation was observed with respect to healthy donors when compounds with higher CB2 selectivity were used. These findings suggest the relevance of the CB2 receptor in MS, in particular 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives acting through this receptor, having the advantage to be unrelated to CB1 receptor psycoactivity, and considering their immunomodulatory and anti-inflammatory effects might be used in future clinical studies to lead to the development of a new therapy of MS.

100 101 DEMIELINIZZAZIONE ANTICORPALE NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO TRANSLAZIONALE DALL’UOMO VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS AL TOPO CON ANTICORPI PURIFICATI DA PAZIENTI CON SM IN RELAPSE CLINICA

RESPONSABILE DEL PROGETTO da pazienti con altre malattie disimmuni neurologiche o non-neurologiche, oppure solo con ROSETTA PEDOTTI soluzione fisiologica. Abbiamo osservato un significativo peggioramento clinico dell’ EAE in topi Neurologo Ricercatore trattati con IgG dal paziente SM rispetto ai topi di controllo. In linea con questi risultati clinici, i Unità di Neuroimmunologia, Istituto Neurologico Fondazione Carlo Besta topi trattati con IgG del paziente con SM hanno presentato infiammazione e demielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC) più gravi rispetto ai topi di controllo. Analisi di microscopia Collaboratori: confocale e a doppia immunofluorescenza hanno rivelato una reattività diffusa contro le IgG CARLO ANTOZZI SILVIA MUSIO umane negli oligodendrociti della sostanza bianca del SNC dei topi con EAE trattati con IgG dal MASSIMO COSTANZA paziente con SM. Utilizzando un saggio biologico ad alta sensibilità che permette di rilevare an- ABOU-HAMDAN ticorpi contro la parte extracellulare della myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), uno degli autoantigeni piu’ implicati nella SM, abbiamo osservato reattività contro questo antigene nel Collaborazioni con altri gruppi: siero e nelle IgG purificate da questo paziente. Nessuna reattività contro la MOG è stata rilevata LUIGI POLIANI, Dipartimento di Patologia, Università di Brescia, Spedali Civili di Brescia UO Riabilitazione Specialistica, Brescia nelle IgG purificate dai pazienti di controllo. Non abbiamo tuttavia evidenze che suggeriscono CINTHIA FARINA, PhD. Istituto di Neurologia Sperimentale, Fondazione Centro S. Raffaele che la MOG sia l’antigene bersaglio unico e patogenico di queste IgG. Abbiamo ottenuto IgG del Monte Tabor da un altro paziente con SM in ricaduta che non rispondeva al trattamento con PAI e le abbia- BERNHARD HEMMER, Department of Neurology, Heinrich Heine University, Dusseldorf, Germany mo trasferite nei topi con EAE. Questo trattamento non aggravava l’EAE, come faceva invece il trattamento con IgG dal paziente responsivo all’immunoassorbimento con PAI, osservazione che suggerisce che il miglioramento dei sintomi clinici dopo PAI potrebbe riflettere la presenza PREMESSE E OBIETTIVI di anticorpi patogeni circolanti nel paziente responsivo a tale trattamento. Presi insieme, questi dati forniscono una prova importante a sostegno dell’ipotesi di un ruolo patogenetico degli Il ruolo degli anticorpi (IgG) nella sclerosi multipla (SM) è ancora dibattuto. Alcuni pazienti con autoanticorpi nella SM. SM con recente recidiva rispondono favorevolmente a plasmaferesi, procedura che rimuove anticorpi ed altri componenti del plasma. La terapia con Rituximab, che depleta i linfociti B, è CONCLUSIONI efficace nel migliorare la malattia. Queste evidenze cliniche supportano un ruolo per le cellule B e per le IgG nella SM. Questi dati supportano l’ipotesi di un ruolo importante per gli anticorpi nella patogenesi della Negli ultimi anni abbiamo impiegato l’immunoassorbimento degli anticorpi su proteina A (PAI) SM, almeno in un sottogruppo di pazienti. È ragionevole ipotizzare che l’efficacia della rimozio- in diverse malattie autoimmuni del sistema nervoso periferico e centrale. Tra questi, abbiamo ne degli anticorpi in alcuni pazienti con SM rifletta la presenza di anticorpi circolanti con un ruolo trattato pazienti con SM che non rispondono a terapia standard con corticosteroidi ad alto patogenetico. Tale ruolo potrebbe essere dimostrato, come abbiamo fatto nel nostro studio, dosaggio per via endovenosa. La disponibilità di PAI, trattamento che consente la rimozione mostrando la capacità delle IgG circolanti di indurre peggioramento dell’EAE, incremento del selettiva e massiccia di IgG da plasma umano, ci ha fornito IgG purificate da pazienti con SM. danno nel SNC, e binding delle IgG alla sostanza bianca del SNC. L’implicazione terapeutica Lo scopo del progetto era di fare uso di queste IgG umane ottenute da pazienti con SM nel più importante di questo studio è che questi risultati potrebbero contribuire allo sviluppo della modello animale di malattia, per trovare ulteriori evidenze riguardo all’ipotesi di un ruolo pato- medicina personalizzata per la SM. Infatti, questo lavoro potrebbe aprire la strada a studi volti genico degli anticorpi nella SM. a capire se pazienti con SM che hanno IgG il cui ruolo patogenetico può essere dimostrato in Il design del progetto consisteva nel trasferire passivamente in topi con encefalomielite au- vivo nel modello EAE, possono beneficiare di procedure volte a depletare o interferire con le IgG toimmune sperimentale (EAE), IgG purificate da un paziente con SM recidivante-remittente in relapse clinica, significativamente migliorato dopo rimozione degli anticorpi con PAI. Gravità clinica dell’EAE, infiammazione e demielinizzazione nel sistema nervoso centrale (SNC) sarebbero ANTIBODY MEDIATED DEMYELINATION IN stati valutati in topi con EAE trattati con IgG di questo paziente e confrontati con quelli dei topi trattati con IgG di controllo di diversi pazienti. Sarebbero stati poi valutati sia la specificità della MULTIPLE SCLEROSIS: A TRANSLATIONAL STUDY reattività IgG contro diversi autoantigeni mielinici, sia potenziali differenze di autoreattivita’ tra il FROM MAN TO MOUSE WITH PURIFIED IGG FROM paziente responsivo e uno non-responsivo a PAI. Questo studio aveva lo scopo di identificare possibili target antigenici delle risposte anticorpali potenzialmente patogenetiche nella SM. RELAPSING MS PATIENTS

RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS

La ricerca che abbiamo condotto puo’ essere riassunta come segue. Abbiamo usato anti- The role of antibodies (IgG) in multiple sclerosis (MS) is still debated. A subset of MS patients corpi IgG purificati da un paziente con SM che ha presentato un miglioramento significativo with recent relapse respond favourably to plasmaexchange, a procedure that removes antibo- dei sintomi neurologici nel corso di due relapse consecutive dopo rimozione selettiva di IgG dies, as well as other plasma components. Further, B cell depleting therapy with Rituximab has mediante immunoassorbimento su proteina A (PAI). Questa procedura consente la rimozione been shown to ameliorate disease. These clinical evidence support a role for IgG and B cells selettiva di IgG circolanti. Il miglioramento clinico dopo PAI era strettamente correlato con la in MS. Over the last fifteen years, we employed at our Institution IgG immunoadsorption on rimozione IgG, suggerendo così l’ipotesi di un ruolo delle IgG nella comparsa o persistenza di protein A (PAI) in several autoimmune disorders of the peripheral and central nervous system. sintomi neurologici in questo paziente. Abbiamo trasferito passivamente questi anticorpi IgG Among these, we treated MS patients that did not respond to standard high dose intravenous purificati nel modello animale di sclerosi multipla, la encefalomielite autoimmune sperimentale corticosteroids. The availability of PAI, a treatment that allows the selective and massive remo- (EAE). Abbiamo usato il modello murino di EAE recidivante-remittente indotto con myelin pro- val of IgG from human plasma with negligible interaction with other plasma components, proteolipid protein 139-151 (PLP 139-151). Questi topi immunizzati sono stati trattati con IgG del vided us a considerable amount of purified IgGs from MS patients. The aim of our project was 102 paziente purificate all’inizio della EAE. Come controlli, i topi sono stati trattati con IgG purificate to make use of these precious and unique human IgG derived from MS patients in the animal 103 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

model of this disease to find additional proof of the pathogenic role of IgG in MS. The design PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI of our project was to passively transfer into mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS, IgG purified from a patient with relapsing-remitting Piconese S, Costanza M, Tripodo C, Sangaletti S, Musio S, Pittoni P, Poliani PL, Burocchi A, MS in acute clinical exacerbation who significantly improved after antibody removal with PAI. Passafaro AL, Gorzanelli A, Vitali C, Chiodoni C, Barnaba V, Pedotti R, Colombo MP. The matri- cellular protein SPARC supports follicular dendritic cell networking toward Th17 responses. J Severity of EAE and central nervous system (CNS) inflammation and demyelination would have Autoimmunity. 2011 Dec; 37(4):300-10. Epub 2011 Sep 29 been evaluated in mice with EAE treated with IgG from this patient and compared with those of EAE mice treated with control IgG from different patients. Specificity of IgG reactivity against Piconese S, Costanza M, Musio S, Tripodo C, Poliani PL, Gri G, Burocchi A, Pittoni P, Gorza- several autoantigens would have also been investigated. We also planned to compare reactivity nelli A, Colombo MP and Pedotti R. Exacerbated experimental autoimmune encephalomyelitis against myelin autoantigens of the PAI-responder patient with that of a PAI-non responder MS in mast cell-deficient KitW-sh/W-sh mice. Laboratory Investigation 2011 Feb 14;91,627–641. *Equally contributing authors patient to identify potential target/s of pathogenic IgG response. Pedotti R., Scabeni S., Poliani P. L., Farina C., Costanza M., Musio S., Berzi A., Castellucci F., RESULTS Confalonieri P., Hemmer B., Mantegazza R. and Antozzi C. Demielinizzazione anticorpale nella sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti The research that we performed can be summarized as follows. We used IgG antibodies pu- con SM in relapse clinica. FISM Meeting Roma, 25-26 Maggio 2011 rified from a patient with MS that presented a striking amelioration of neurological symptoms Pedotti R., Scabeni S., Poliani P. L., Farina C., Costanza M., Musio S., Berzi A., Castellucci F., during two consecutive relapses after selective IgG removal with immunoabsorption on Protein Confalonieri P., Hemmer B., Mantegazza R. and Antozzi C.. Demielinizzazione anticorpale nella A (PAI). This procedure allows the selective removal of circulating IgG. The clinical improvement sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti after PAI was strictly time-related with IgG removal, thus suggesting a role for IgG in the appe- con SM in relapse clinica. FISM Meeting Roma, 26-27 maggio 2010 arance and/or persistency of neurological symptoms in this patient. We passively transferred these purified IgG antibodies in the animal model of MS, experimental autoimmune encepha- PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 lomyelitis (EAE). We used the relapsing-remitting mouse model of EAE induced with myelin per un periodo di 2 anni - 50.000 € proteolipid protein 139-151 (PLP 139-151). These immunized mice were treated with patient’s purified IgG at the onset of EAE. As controls, mice were treated with IgG purified from patients with other dysimmune neurological or non-neurological diseases, or with vehicle alone. We observed a significant exacerbation of clinical expression of EAE in mice treated with IgG from the MS patient compared to control treated mice. In line with these clinical findings, mice treated with IgG from the MS patient presented more severe inflammation and increased demyelination in the CNS compared to control treated mice. Double immunofluorescence and confocal microscopy studies revealed a diffuse reactivity against human IgG in oligodendrocytes of CNS white matter of mice treated with IgG from the MS patient. By using a high-sensitivity bioassay, which allows detecting autoantibodies that bind to the extracellular part of native myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), one of the most implicated autoantigen in MS, we observed reactivity against this antigen in serum and purified IgG of this patient. No reactivity against MOG was detected in IgG purified from control patients. However, we don’t have evidence that MOG is the unique and pathogenic target antigen of these IgG, that thus remains to be determined. We obtained IgG from another MS patient in relapse that did not respond to PAI treatment and transferred those IgG in EAE mice. This treatment did not exacerbate EAE, an observation suggesting that amelioration of clinical symptoms after PAI might reflect the presence of pathogenic antibodies. Taken together, these data provide an important evidence in support of the hypothesis of a pathogenic role of autoantibodies in MS.

CONCLUSIONS

Taken together, these data strongly support the hypothesis of an important role for antibodies in the pathobiology of MS, at least in a subset of patients. It is conceivable to speculate that the efficacy of antibody removal in certain MS patients might reflect the presence of circulating antibodies with a pathogenic role. Such a role could be demonstrated, as we did in our study, by showing the capacity of these circulating IgG to induce worsening of EAE, increased CNS damage, and staining of CNS white matter. The most important therapeutic implication of this study is that these results might be of importance for the development of personalized medicine in MS. Indeed, this work might open up future studies aimed at understanding whether MS patients having IgG whose pathogenic role can be demonstrated in vivo in the EAE model, can benefit of procedures aimed at depleting or interfering with IgG.

104 105 RUOLO DI ANTICORPI ANTI OSTEOPONTINA NELLA SCLEROSI MULTIPLA VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

RESPONSABILE DEL PROGETTO ROLE OF ANTI-OSTEOPONTIN ANTIBODIES ELISABETTA ORILIERI IN MULTIPLE SCLEROSIS Dipartimento di Scienze Mediche, Laboratorio di Immunologia, Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara INTRODUCTION AND AIMS MENTORE UMBERTO DIANZANI Our laboratory contributed to demonstrate the involvement of osteopontin (OPN), a cytokine involved in inflammatory and immune response in multiple sclerosis (MS). Elevated levels of OPN were observed in serum, CSF and demyelinating plaques of MS patients and mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS. Morover, variations PREMESSE E OBIETTIVI of the OPN gene contribute to the production of high levels of OPN and represent susceptibility factors for disease development. Il nostro laboratorio ha contribuito a dimostrare il coinvolgimento di osteopontina (OPN), una ci- During EAE anti-OPN antibodies are produced, morover, the administration of a DNA vaccine tochina coinvolta nella risposta immunitaria e infiammatoria, nella sclerosi multipla (SM). Elevati directed against OPN increases the titer. Such vaccination has been shown to be able to im- livelli di OPN sono stati osservati nel siero, nel liquor e nelle placche demielinizzanti di pazienti prove the course of the disease in these animals. In complex these data suggest that the anti- con SM e di topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello animale di OPN response may antagonize the effects of this cytokine on the development of the disease. SM. Inoltre, variazioni del gene di OPN contribuiscono alla produzione di elevati livelli di OPN The specific objectives of the project were: to search for anti-OPN antibodies in MS patients e rappresentano fattori di suscettibilità alla malattia. Nel corso della EAE vengono prodotti performing ELISA using a recombinant form of OPN to be produced in our laboratory; to clone anticorpi anti-OPN. Inoltre, la somministrazione di un vaccino a DNA diretto contro OPN, ne anti-OPN antibodies by selecting libraries and testing their effect on immune activation in vitro; aumenta ulteriormente il titolo. Tale vaccinazione si è dimostrata inoltre capace di migliorare il to construct a vaccine for the murine form of OPN in order to induce the production of anti- decorso della malattia in questi animali. Nel complesso, questi dati suggeriscono che la rispo- OPN in mice, to assess their long-term safety in control mice and confirm their effectiveness in sta anti-OPN potrebbe antagonizzare gli effetti di questa citochina sullo sviluppo della malattia. the treatment of EAE. Gli obiettivi specifici del progetto erano: ricercare anticorpi anti-OPN nei pazienti SM dosandoli con metodica ELISA utilizzando una forma ricombinante di OPN da produrre nel nostro labo- RESULTS ratorio; clonare anticorpi anti-OPN tramite selezione di librerie e valutare il loro effetto sull’attivazione immunitaria in vitro; costruire un vaccino per la forma murina di OPN al fine di indurre In our laboratory we produced the recombinant protein OPN, both the human and the murine la produzione di anticorpi anti-OPN nei topi, valutare la loro sicurezza a lungo termine in topi di ones; those proteins were purified by affinity chromatography and their function was tested controllo e confermare la loro efficacia nel trattamento della EAE. in vitro. By screening a antibody phage libraries we isolated a monoclonal anti-OPN antibody directed against the C-terminal fragment of the protein. By a dual approach, Western Blot and RISULTATI ELISA, we searched for anti-OPN antibodies in MS patients. 53 MS patients were evaluated by Western blot: 25 (47%) were positive for anti-OPN antibodies and 28 (53%) were negative, we Abbiamo prodotto nel nostro laboratorio la proteina OPN ricombinante, sia umana che murina; also tested 38 healthy controls: 12 were positive (32%) and 26 (68%) were negative. By ELISA, le proteine sono state purificate mediante cromatografia di affinità e la loro funzionalità è stata we evaluated 71 MS patients and 38 controls: the average amount of anti-OPN titer was higher testata in vitro. Inoltre, da librerie fagiche anticorpali abbiamo isolato un anticorpo monoclonale in patients than in controls. In order to induce the production of anti-OPN antibodies in mice anti-OPN diretto contro la porzione C-terminale della proteina. we performed a DNA vaccination using C57BL/6 female mice of 8 weeks old to induce EAE. Con un duplice approccio, il Western Blot e l’ELISA abbiamo ricercato anticorpi anti-OPN in No significant differences between mice treated with the OPN vaccine compared with those pazienti con SM. 53 pazienti con SM sono stati valutati in Western Blot: 25 (47%) sono risultati not treated were found concerning of clinical symptoms. For this reason we decided to set positivi per anticorpi anti-OPN e 28 (53%) sono risultati negativi; sono stati testati anche 38 up other vaccination protocols using recombinant proteins produced in our laboratory. These controlli sani: 12 sono risultati positivi (32%) e 26 (68%) sono risultati negativi. Abbiamo quindi experiments are still ongoing. valutato in ELISA la presenza di auto anticorpi anti-OPN in 71 pazienti con SM e 38 controlli: la quantità media di anticorpi anti-OPN prodotti è risultata più alta nei pazienti rispetto ai con- CONCLUSIONS trolli. Al fine di indurre la produzione di anticorpi anti-OPN nei topi abbiamo eseguito una vaccinazione a DNA utilizzando femmine di topo C57BL/6 di 8 settimane di vita alle quali è stata These data demonstrate the presence of anti-OPN antibodies in MS patients with MS. The successivamente indotta l’EAE. finding that anti-OPN autoAb are detectable in healthy controls is in line with the notion that Non sono state riscontrate differenze significative tra i topi trattati con il vaccino OPN rispetto production of autoAb to inflammatory cytokines (such as also IL-1 and TNFα) is a physiologic a quelli non trattati in termini di sintomi clinici, abbiamo quindi deciso di ricorrere ad altri proto- response involved in downmodulatiion of the inflammatory response. Presence of these auto- colli di vaccinazione utilizzando le proteine ricombinanti da noi prodotte. Tali esperimenti sono Ab in healthy controls is comforting at the light of their possible use in vivo to antagonize OPN ancora in corso. function, since it indicates that they should not have toxic effects.

CONCLUSIONI

Nel complesso questi dati dimostrano l’esistenza di anticorpi anti-OPN nel siero di pazienti con SM. L’aver riscontrato tali anticorpi anche in soggetti sani conferma i dati riportati in letteratura, che indicano che auto-anticorpi anti citochine infiammatorie (come la IL-1 e il TNF) rappresentano una risposta fisiologica coinvolta nello spegnimento della risposta infiammatoria. La presenza di questi autoAb nei controlli sani è confortante alla luce del loro possibile utilizzo in vivo 106 per antagonizzare le funzioni di OPN, in quanto indica che sono ben tollerati dall’organismo. 107 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Soluri MF, Orilieri E, Cappellano G, Dianzani U, Chiocchetti A. “Functional mapping of osteopontin activity in EAE and MS” “Role of anti-osteopontin antibodies in Multiple Sclerosis”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Dianzani U, D’Alfonso S, Chiocchetti A, Mesturini R, Orilieri E, Bergamaschi L, Barizzone N, Cor- rado L. “Searching for markers involved in multiple sclerosis development: correlation of genetic and functional alteration of cell-mediated immunity with markers of EBV infection”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Orilieri E, Chiocchetti A, Soluri MF, Boggio E, Dianzani U. “Role of anti-osteopontin antibodies in Multiple Sclerosis”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Gigliotti L, Soluri MF, Boggio E, Orilieri E, Buttini S, Comi C, Chiocchetti A, Dianzani U. “Analysis of the role of osteopontin and B7H on dendritic cell development and function in multiple sclerosis”; Parigi 12-13 maggio 2011- The 20th ARSEP Foundation on Multiple Sclerosis

Cappellano G, Aricò M, Cetica V, Melensi M, Orilieri E, Soluri MF, Clemente N, Boggio E, Chioc- chetti A, Ramenghi U, Dianzani U. “Variations of MUNC13-4 gene in patients with autoimmunity/ lymphoproliferation and defective FAS function”; Riccione 28 Settembre-1 Ottobre 2011- 2011 Joint Annual Meeting Italian Society of Immunology (SIICA) and German Society of Immunology (DGfl)

Gigliotti L, Mesturini R, Chiocchetti A, Orilieri E, Dianzani U. “Icos triggering induces il-17 secretion in human naive T helper cells”; Gubbio 20-22 Ottobre 2011- Joint National PhD Meeting

BORSA DI RICERCA FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 2 anni - 40.000 €

108 109 GENERAZIONE DI CELLULE STAMINALI RIPROGRAMMATE DA CELLULE MURINE E DA CELLULE DI VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS PAZIENTI CON SCLEROSI MULTIPLA E DIFFERENZIAMENTO IN PRECURSORI NEURONALI E OLIGOGLIALI una migrazione preferenziale delle mNS iPSCs confrontando topi trapiantati e topi controllo. RESPONSABILE DEL PROGETTO Da queste analisi è emersa una disregolazione di geni appartenenti alla cascata di Wnt nei CECILIA LATERZA topi trapiantati con mNS iPSCs. Dal momento che la famiglia dei geni Wnt è coinvolta sia Dipartimento di Neuroimmunologia, Università Vita-Salute San Raffaele nella regolazione del differenziamento e della maturazione di OPCs che nella regolazione della formazione della cicatrice gliale a seguito di un danno ed è riportato in letteratura che la disre- MENTORE golazione di questi geni causa un rallentamento sia nella mielinizzazione durante lo sviluppo VANIA BROCCOLI che nel processo di rimielinizzazione dopo un danno, crediamo sia fondamentale focalizzare la nostra attenzione su esperimenti mirati per capire se l’effetto terapeutico che noi associamo al trapianto delle mNS iPSCs sia dovuto alla loro capacità di modulare la cascata dei geni Wnt in PREMESSE E OBIETTIVI modo da promuovere la rimielinizzazione delle aree demielinizzate.

Lo sviluppo di terapie cellulari volte a riparare le cellule mielinizzanti danneggiate nella sclerosi CONCLUSIONI multipla (SM) ha avuto un enorme sviluppo negli ultimi 30 anni. La maggior parte di questi approcci terapeutici risulta molto efficace in malattie demielinizzanti focali, ma non altrettanto Per poter rendere il trapianto di aNPCs e/o OPCs un’alternativa reale per la terapia della SM, è in malattie multi focali come la SM, in cui si ha un danno cellulare diffuso. Il trapianto di cellule necessario avere a disposizione una fonte autologa ed amplificabile di queste cellule. Per rag- staminali neurali rappresenta pertanto una possibile alternativa terapeutica per questa pato- giungere questo obiettivo abbiamo proposto in questo progetto l’utilizzo di iPSCs, una nuova logia. I risultati fino ad ora ottenuti nel nostro laboratorio, in modello animale, indicano che il fonte di cellule staminali ottenute mediante riprogrammazione di cellule somatiche. A nostro trapianto di cellule staminali neurali adulte (aNPCs) risulta una pratica sicura ed efficace nel parere, le iPSCs rappresentano lo strumento più appropriato per rispondere a queste necessi- trattamento di malattie demielinizzanti multifocali. In particolare, il trapianto di queste cellule tà. Questa tecnologia offre la possibilità di generare, a partire dalle cellule del paziente stesso, riesce a supportare una rigenerazione diffusa della mielina promuovendo la neuroprotezione una fonte illimitata di NPCs e OPCs autologhe che possono venire utilizzate per le terapie cel- tramite il rilascio di fattori neurotrofici (effetto by stander). Tuttavia l’unica fonte disponibile per gli lulare senza causare problemi di rigetto. Lo sviluppo e il miglioramento di questa tecnologia e i studi sull’uomo risulta di tipo fetale e questo richiede una concomitante immunosoppressione test preclinici in modelli animali risultano fondamentali per un più immediato trasferimento nella per evitare rigetto a seguito del trapianto. Recentemente è stata generata una nuova fonte di pratica clinica di uno strumento come le iPSCs. cellule staminali mediante la riprogrammazione di cellule somatiche, chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che potrebbe risolvere i problemi legati alle fonti eterologhe di cellule in quanto generate a partire dalle cellule stesse dei pazienti e differenziate in vitro ed espanse GENERATION OF MOUSE IPSCS AND HUMAN IPSCS come cellule staminali neurali. Questo progetto si prefigge lo scopo di derivare cellule staminali neurali a partire da iPSCs ottenute da fibroblasti di topo e da fibroblasti umani di pazienti con FROM MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS AND THEIR SM e da controlli sani, e di testarne, in vitro e in vivo, la capacità di indurre neuroprotezione IN VITRO DIFFERENTIATION INTO OLIGOGLIAL AND mediante immunomodulazione ed effetto by stander. I risultati ottenuti da questo progetto possono rappresentare un passo cruciale che avvicina le terapie cellulari alla pratica clinica nel NEURONAL PROGENITORS trattamento della SM. INTRODUCTION AND AIMS RISULTATI The development of cell-based therapies aimed at repairing damaged myelin producing cells in Abbiamo raccolto 40 biopsie cutanee di pazienti con diversi tipi di SM. I fibroblasti ottenuti da multiple sclerosis (MS) patients has been pursued in the last 30 years. Although successful in queste biopsie sono stati riprogrammati mediante l’utilizzo di vettori retrovirali e di un vettore promoting site-specific repair in focal myelin disorders, most of these therapeutic approaches lentivirale. Tuttavia l’utilizzo di questi vettori è risultato molto inefficiente, generando solo poche have failed to foster repair in multifocal myelin disorders, such as MS, where the anatomical linee di iPSCs. Alla luce di questo, abbiamo recentemente iniziato una collaborazione per gene- and functional inflammation-induced cell damage is widespread. Neural stem cell-based the- rare iPSCs mediante vettori non integranti creati a partire dal Sendai virus. In parallelo abbiamo rapies might represent in the near future a plausible alternative cell-based therapeutic strategy riprogrammato con gli stessi vettori anche fibroblasti murini ottenuti da topi transgenici. La in this disorder. We have been working to address the safety and the efficacy of the transplan- pluripotenza delle linee umane e murine ottenute è stata valutata mediante diverse metodiche. tation of different sources of neural stem cells in animal models of MS. Results obtained so far Una volta generate linee di miPSCs e di hiPSCs, sono state differenziate in cellule staminali indicate that adult neural stem cells can be safely and efficaciously transplanted into animal neurali che hanno mostrato caratteristiche molto simili alle aNPCs. Per quanto riguarda le cel- model of multifocal myelin disorders. lule murine, siamo riusciti a generare una linea stabile di cellule staminali neurali (mNS iPSCs) in As a matter of fact, these cells support widespread myelin repair by inhibiting inflammation- grado di differenziare in neuroni, astrociti ed oligodendrociti. Per ciò che concerne invece le cel- induced cell damage and by promoting neuropotection. Although these results open new per- lule umane, non siamo ancora riusciti ad ottenere una linea stabile. Ci siamo quindi focalizzati spectives for neural stem cell-based therapies in MS, so far the only available source of neural sull’analisi in vivo delle proprietà rimielinizzanti e immunomodulanti delle mNS iPSCs mediante stem cells for human studies is of fetal origin. Thus, concomitant immunosuppression is requi- trapianti in un modello di demielinizzazione congenita e nel modello murino di sclerosi multipla. red to avoid cell rejection after transplantation. A new source of stem cells recently obtained Da questi esperimenti è emerso che le mNS iPSCs trapiantate in topi shiverer sono in grado di by genetic reprogramming of somatic cells – induced pluripotent stem cells (iPSCs) – may differenziare in oligodendrociti maturi. In oltre, le mNS iPSCs trapiantate nella cisterna magna represent the appropriate tool to overcome this problems since they can be derived directly (ics) di topi EAE sono in grado di migliorare la clinica di questi animali. Dal momento che solo from patient own cells. This project is aimed at deriving neural stem cells from iPSCs obtained l’1% delle cellule trapiantate persiste all’interno del sistema nervoso centrale, pensiamo che il from mice and humans, including MS patients and sex and age matched healthy subjects and meccanismo d’azione associato al miglioramento clinico osservato sia dovuto alla secrezione testing their therapeutic efficacy in promoting, both in vitro and in vivo, neuroprotection via im- di molecole neuro protettive che agiscono favorendo la rimielinizzazione endogena e riducendo munomodulation and remyelination. If successful our project could represent a further crucial 110 il danno tissutale. Abbiamo effettuato quindi un microarray sul tessuto in cui abbiamo osservato step to foster clinical translation of stem cell-based therapies in MS patients. 111 VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

We have collected skin fibroblasts from 40 MS patients with different disease courses. Low Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells passage human fibroblasts have been infected both with three retroviral and with a lentiviral for multiple sclerosis therapy”. NMSS international congress (New York, USA) JANUARY 10-14 2011 Poster presentation vector. However, we had few problems concerning the efficiency of human fibroblast reprogramming. Given this we start to generate hiPSCs using a new non integrating reprogramming Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells viral vector. We obtain only few lines from a couple of MS patients and from an healthy controls. for multiple sclerosis therapy”. Scientific congress FISM (Rome, Italy) In parallel, in mouse embryo fibroblasts have been reprogrammed into miPSCs by the same MAY 25-26 2011 Poster presentation techniques. The pluripotent state of both miPSC and hiPSC lines so far have obtained have Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells been confirmed by different techniques. Once generated, miPSCs and hiPSCs have been also for multiple sclerosis therapy”. Stem cells research italy (Pescara, Italy) induced to differentiate toward neural and oligoglial lineages. Higly enriched population of NS JUNE 10-12 2011 Oral and poster presentation (Best poster award) iPSCs can be obtained from both miPSCs and hiPSCs and share the vast majority of features with adult NPCs (aNPCs). Moreover we obtained a stable mNS iPSC line able to differentiate Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells in all the three neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes). Concerning hiPSCs for multiple sclerosis therapy”. 11th ESNI course (Glasgow, Scottland) JULY 4-7 2011 Oral presentation oligoglial induction, hNS iPSCs were subjected to conditions previously established and we obtained a considerable number of mature oligodendrocytes and OPCs. We focalized on the Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial analysis of the in vivo remyelination capacity and anti-inflammatory properties of mNS iPSCs, and neuronal progenitors”. Multiple Sclerosis Scientific retreat (Pieve a salti) performing transplantation experiments respectively in a genetic model of demyelination and in JANUARY 21-23 2010 Oral presentation a mouse model of multiple sclerosis. We found that mNS iPSCs transplanted in shiverer mice Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial pups are able to regenerate MBP+ fibers, confirming their myelinating ability. Moreover, we and neuronal progenitors”. Scientific congress FISM (Rome, Italy) found that mNS iPSCs transplanted intracisternally EAE mice are able to ameliorate the clinical MAY 26-27 2010 Poster presentation severity of transplanted animals. Given that only 1% of transplanted mNS iPSCs persisted along the entire neuraxis, the therapeutic efficacy of our cells could be related to the secretion Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells of neuroprotective molecules. We focused on the molecules promoting the bystander effect for multiple sclerosis therapy”. 10th International congress of autoimmunology, ISNI (Sitges, Spain) OCTOBER 26-30 2010 Poster presentation by performing a microarray analysis on injured tissue in which transplanted cells preferentially migrated and we found significant differences among transplanted vs sham treated groups. Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial The Wnt pathway-related genes were the most dysregulated ones in mNS iPSC-treated mice. and neuronal progenitors”. The myelin project annual meeting (Toronto) Since it is well know that the Wnt family is involved in the regulation of OPCs differentiation/ OCTOBER 22-25 2009. Oral presentation maturation and glial scar formation after injury and there is solid evidence showing that dysre- Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligo- gulation of Wnt pathway results in profound delay of both developmental myelination and adult glial and neuronal progenitors”. Reprogramming cell fate basic biology and medical perspectives remyelination, it is worthwhile to perform further experiments in order to understand whether (SEMM, Milan) or not the therapeutic potential of ics transplanted mNS iPSCs is due to the capability of such DECEMBER 11-13 2009 Poster presentation cells to modulate the expression of the members of the Wnt pathway so to promote remyelination of demyelinated areas. BORSA DI ADDESTRAMENTO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 € CONCLUSIONS per un periodo di 2 anni - 38.000

In MS, bench to bedside translation of transplantation protocols using aNPCs and/or OPCs requires an expandable autologous source of human aNPCs and OPCs. This would avoid concomitant immunosuppression thus rendering such therapeutic strategy more straightforward. To reach this goal we propose to use iPSCs, a new source of pluripotent stem cells. In our view, iPSCs represent the most appropriate tool since they are derivable from adult somatic cells of different origin. This technology offers the opportunity to obtain from the patient own cells an unlimited expandable source of autologous aNPCs and OPCs which, in turn, may be used for therapies without any concern for the patient immune response. The development and the improvement of such a strategy and preclinical testing in animal models on MS have a considerable relevance not also for the health service, representing the basis for a rapid transferability of such therapeutic approaches to assistance.

112 113 nuovi metodi diagnostici APPROCCIO PROTEOMICO PER L’IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI LIQUORALI RICONOSCIUTI DALLE IGG NUOVI METODI DIAGNOSTICI NELLA SCLEROSI MULTIPLA (2008/R/4)

RESPONSABILE DEL PROGETTO della reattività immunitaria (Farinazzo et al. J Neuroimmunol 2011). Un ulteriore argomento del BRUNO BONETTI nostro studio ha riguardato l’analisi della risposta autoimmune nel CSF di pazienti con SM, in Professore Associato particolare sulle due principali frazioni di IgG ottenute dopo separazione elettroforetica: OB e Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Sezione di Neurologia non-OB IgG. Lo scopo del lavoro era di identificare mediante 2D-PAGE e immunoblotting i Università di Verona, Verona targets molecolari delle IgG espresse nella frazione OB, comparando la reattività degli anticorpi contenuti in questa frazione e quelli nella parte intera del liquor nei confronti di antigeni della Partecipanti dell’unità di Verona: sostanza bianca cerebrale normale. SILVIA MARCONI, ELENA ANGHILERI, ERMANNA TURANO Per analizzare la risposta immunitaria nel liquor di pazienti con SM, abbiamo innanzitutto ese- Assegnista: ALESSIA FARINAZZO guito una separazione elettroforetica delle due principali frazioni liquorali, OB e non-OB, esami- nando campioni liquorali di 15 pazienti con SM clinicamente definita e 5 soggetti sani. L’appli- Collaboratori: cazione combinata di 2D-PAGE e immunoblotting ha permesso di confrontare la risposta delle BEATRICE GINI ERMANNA TURANO frazioni liquorali di IgG precedentemente separate verso antigeni presenti nella sostanza bianca SILVIA MARCONI cerebrale normale. L’analisi ha mostrato che numerose proteine neurali erano riconosciute da ELENA BAZZOLI IgG autoreattive in entrambe le frazioni di CSF pur con differenze quali-quantitative in termini ELENA ANGHILERI di segnale. In particolare, nei pazienti con SM la reattività delle IgG nella frazione OB per le STEFANO ANGIARI proteine cerebrali era maggiore rispetto a quella riscontrata nelle non-OB. Lo studio compara- BARBARA ROSSI tivo degli autoantigeni riconosciuti esclusivamente dalle IgG della frazione OB ha selezionato Collaborazioni con altri gruppi: un ristretto numero di proteine neurali con intensità variabile e differentemente espresse nei LUCA BINI, RICCARDO CIANTI e ALESSANDRO ARMINI pazienti SM. I dati di spettrometria di massa condotti su questi autoantigeni hanno identificato Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Siena molte delle proteine come enzimi coinvolti in meccanismi di trasduzione del segnale, in proces- Partecipanti dell’unità di Siena: si immunitari o con funzioni metaboliche/regolatorie. Per capire il significato degli autoantigeni LUCA BINI, ALESSANDRO ARMINI identificati e quali processi potessero essere responsabili dell’autoreattività, abbiamo messo a confronto la loro sequenza amminoacidica con quella di autoantigeni noti (MOG, CNPase, PREMESSE E OBIETTIVI MBP), analogamente a quanto eseguito nel precedente studio nella EAE. La presenza di una parziale omologia di sequenza supporta l’ipotesi che un fenomeno di “molecular mimicry” pos- La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica, infiammatoria e demielinizzante sa avere un ruolo importante nella patogenesi della SM. che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Presenta un quadro clinico e un decorso di malattia eterogenei. Molti studi hanno dimostrato come nella SM la risposta immunitaria coin- CONCLUSIONI volga l’attivazione sia di linfociti T che B con conseguente produzione di autoanticorpi. Tuttavia, sebbene a livello sperimentale siano stati fatti molti tentativi per caratterizzare l’intero pattern di Il presente studio 2D-immunomico della reattività delle IgG espresse nelle frazioni liquorali OB e anticorpi, gli antigeni bersaglio di tale risposta rimangono ancor oggi non ben identificati. Inol- non-OB su campioni di sostanza bianca cerebrale in pazienti con SM ha rivelato che entrambe tre, la presenza di bande oligoclonali (OBs) nel liquido cerebrospinale (CSF) ma non nel siero di le frazioni riconoscono un ampio pannello di proteine neurali. Analizzando più specificatamente pazienti con SM, rappresenta un chiaro esempio di una continua stimolazione locale di cloni di l’autoreattività anticorpale della sezione OB, questo studio ha evidenziato un eterogeneo pat- cellule B in grado di riconoscere antigeni neurali tuttora sconosciuti. Al fine di identificare questi tern di separazione tra i pazienti con SM, la maggior parte dei quali presentava un ristretto nu- targets molecolari coinvolti nella risposta autoimmune nella SM, abbiamo condotto una serie mero di spots dopo separazione bidimensionale. L’applicazione del metodo 2D-immunomico di studi proteomici su pazienti con SM e sul modello sperimentale di malattia (EAE). Utilizzando assieme ad altre tecniche complementari potrebbe favorire l’identificazione di set di proteine un approccio immunomico-bidimensionale, abbiamo inizialmente identificato una complessa tali da distinguere la frazione OB da quella non-OB in pazienti con SM. Inoltre questi approcci autoreattività nei pazienti SM nei quali diversi autoanticorpi riconoscevano un’ampia gamma di metodologici potrebbero aiutare a trovare nella porzione liquorale OB potenziali autoantigeni il proteine neurali. Tra queste, l’enzima transketolase (TK) era particolarmente espresso nel 50% cui ruolo potrebbe chiarire molti aspetti della risposta autoimmune nella SM. dei pazienti e non nei controlli risultando così il principale target liquorale delle immunoglobuline (IgG) (Lovato et al. Mol Cell Proteomics 2008). L’identificazione di tali proteine neurali suggeriva il coinvolgimento di diversi meccanismi quali l’attivazione di numerosi cloni di cellule B o PROTEOMIC APPROACH FOR THE IDENTIFICATION l’espressione del fenomeno di “inter-molecular mimicry” da parte di auto-antigeni. Per approfondire meglio questo aspetto, abbiamo analizzato la risposta autoimmune in modelli murini di OF CEREBRO-SPINAL FLUID IGG-REACTIVE SM dopo immunizzazione con un singola proteina mielinica (MBP totale, peptide 89-104 della AUTOANTIGENS IN MULTIPLE proteina MBP o omogenato cerebrale). SCLEROSIS (2008/R/4) RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS L’analisi mediante tecniche ELISA e 2D immunoblotting ha evidenziato una reattività verso la proteina MBP solo nei topi immunizzati con la proteina MBP intera; a parte tale dato, nei Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory, demyelinating autoimmune disease of the sieri di tutti i topi EAE gli autoanticorpi erano in grado di riconoscere altre proteine neurali di- central nervous system (CNS) with heterogeneous clinical presentation and course. A number verse dalla proteina MBP. In seguito allo studio comparativo delle sequenze amminoacidiche of evidences have demonstrated that the autoimmune response in MS involves the activation di queste proteine con la proteina MBP, la presenza di epitopi con una parziale omologia di of both T and B lymphocytes with the production of autoantibodies. Despite enormous efforts 116 sequenza suggeriva che un processo di “inter-molecular mimicry” poteva essere responsabile and the use of different experimental approaches, the target antigens of such autoreactive an- 117 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

tibodies have not been clearly identified to date. Moreover, the presence of oligoclonal bands PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI (OB) in the cerebrospinal fluid (CSF) but not in serum of MS patients represents a clear example of intratecal immune activation of local B-cell clones raised against yet unknown neural anti- Farinazzo A. Proteomic approach for the Identification of autoantigens recognized by CSF oligo- gens. In order to highlight the molecular target(s) of the autoimmune response in MS, we have clonal IgG bands in Multiple Sclerosis. Oral communication at XXI AINI Congress, 2011 previously performed a series of proteomic studies on MS patients and the experimental model Farinazzo A, Gini B, Ruffini F, Milli A, Cecconi D, Furlan R, Bonetti B. 2D immunomic approach for of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Firstly, we have demonstrated the study of IgG autoantibodies in the experimental model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. by 2D immunomics the presence of a complex autoreactivity in MS patients where multiple 2011 Mar; 232(1-2): 63-7. Epub 2010 Nov autoantibodies were able to recognize a large spectrum of neural proteins. Among them, the oligodendroglial enzyme transketolase (TK) was the major target of CSF IgG being present in Farinazzo A. Oral communication at XX AINI Congress, 2010 and at Italian Proteomics Association (ItPA) V National Congress, 2010 50% of MS patients but not in control (Lovato et al. Mol Cell Proteomics 2008). The identification of such neural proteins suggested that different mechanisms could be involved such as Gini B, Farinazzo A, Ruffini F, Cecconi D, Furlan R, Bonetti B. Immunomic analysis of the autoan- the activation of multiple B cell clones or a process of inter-molecular mimicry by autoantigens. tibody response in EAE following immunization with different encephalitogenic autoantigens. Oral To have further information on this regard, we have analyzed the autoantibody response in EAE communication at XIX AINI Congress, 2009 mice upon the immunization with a single myelin antigen [peptide89-104 of the myelin basic Bonetti B. Immunomic approach in CNS autoimmune diseases. Invited lecture at XIX AINI Con- protein (MBP)], total MBP or spinal cord homogenate (SCH). gress, 2009

RESULTS PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 The analysis by ELISA assay and 2D immunomics showed the presence of anti-MBP IgG only per un periodo di 2 anni - 70.000 € in mice immunized with total MBP; in addition, in all EAE mice seric autoantibodies targeted other neural proteins different from MBP. Moreover, the sequence analysis of these proteins and of MBP has identified epitopes with partial homology, suggesting a process of inter-molecular mimicry (Farinazzo et al. J Neuroimmunol 2011). In addition, we have explored the autoimmune response in the CSF of MS patients, focusing on the IgG fractions separated by electrophoretic technique (OB and non-OB IgG). The aim of study was to identify the targets of OB IgG comparing such CSF IgG repertoires against antigens derived from CNS normal white matter by 2D-PAGE and immunoblotting assay. To analyze the reactivity of IgG in the CSF from patients with clinically defined MS and controls we have first separated by horizontal electrophoresis CSF IgG samples from 15 MS patients and 5 controls in two main IgG fractions: OB and non-OB IgG. Combining 2D-PAGE and immunoblotting assay we have matched the reactivity of separated CSF IgG fractions against antigens derived from normal human white matter. The analysis showed that several neural proteins were recognized by autoreactive IgG from both set of fractions (OB and non-OB), although with relevant quantitative and qualitative differences of signals. In particular, the reactivity to the white matter proteins by OB IgG was higher than non-OB IgG fraction in MS patients. Further, the comparative analysis of autoantigens recognized only by CSF OB IgG revealed the presence of a restricted number of neural proteins with variable intensity and differently expressed among MS patients. The preliminary data by mass spectrometry of such autoreactive OB IgG have identified several proteins as enzymes involved in signal transduction or immune processes or with metabolic/regulatory functions. To understand the significance of identified autoantigens and which processes could be responsible for such autoreactivity, we compared their aminoacidic sequence with those of known MS autoantigens (e.g. MOG, CNPase, MBP). The presence of a partial sequence homology suggested that a process of inter-molecular mimicry could be involved in MS disease.

CONCLUSIONS

The present 2D-immunoblotting study of the reactivity of OB and n-OB IgG from CSF of MS patients tested on human white matter revealed that both fractions recognized a wide range of neural proteins. Focusing on the fine autoreactivity of OB IgG, we evidenced a heterogeneous expression profile among MS patients, with a restricted number of spots present in most MS patients. The application of 2D immunomics in association to complementary approaches could help to identify set of proteins able to discriminate OB and n-OB fractions in MS patients and to find putative autoantigens in CSF OB fraction, whose role could shed light on the autoimmune repertoire present in MS patients. 118 119 VIE ADRENERGICHE/DOPAMINERGICHE NEI LINFOCITI CIRCOLANTI COME MARCATORI PRECOCI NELLE NUOVI METODI DIAGNOSTICI SINDROMI CLINICAMENTE ISOLATE CHE PROGREDISCONO IN SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTO sione di mRNA per FoxP3 e verso un’espressione incrementata di mRNA per TH, DRD5 e MARCO COSENTINO beta2-AR, che raggiungeva la significatività statistica nel caso di DRD5. Professore I soggetti con CIS inclusi nello studio verranno monitorati almeno fino a 12 mesi dalla prima Dipartimento di Clinica Medica Sezione di Farmacologia Sperimentale e Clinica Università manifestazione per verificare se l’espressione di mRNA per beta2-AR, DRD5, e TH nella PBMC dell’Insubria, Varese e nelle Treg e per FoxP3 nelle Treg possano costituire indicatori utili a identificare precocemente soggetti a più alto rischio per la progressione a SM conclamata. Collaboratori: FRANCA MARINO LAURA SCHEMBRI CONCLUSIONI EMANUELA RASINI MASSIMILIANO LEGNARO I soggetti con CIS presentano una elevata espressione di mRNA per TH nelle PBMC, con ridot- PAOLA SPAGNUOLO ta capacità di incrementare l’espressione di beta2-AR mRNA dopo attivazione; una aumentata RAFFAELLA BOMBELLI espressione di mRNA per DRD5 nelle Treg, che mostrano pure una tendenza verso ridotta GIORGIO BONO espressione di mRNA per FoxP3, TH e beta2-AR.Queste differenze sono in accordo con la di- Collaborazioni con altri gruppi: sregolazione delle vie adrenergiche/dopaminergiche ben caratterizzata nei linfociti dei pazienti MAURO ZAFFARONI, Centro di ricerca sulla Sclerosi Multipla, Gallarate, Varese con SM conclamata. L’incrementata espressione di mRNA per DRD5 è in linea con il ruolo di ANGELO GHEZZI, Centro di ricerca sulla Sclerosi Multipla, Gallarate, Varese questi recettori nella riduzione della funzione regolatoria delle Treg. L’insufficienza funzionale MARIO GUIDOTTI, Ospedale Valduce, Como delle Treg è implicata nella patogenesi della SM. Il monitoraggio di questa coorte di soggetti RAFFAELLA CLERICI, Ospedale Valduce, Como con CIS consentirà di stabilire se l’espressione di mRNA per DRD5 nelle Treg possa risultare utile per identificare i soggetti a maggior rischio di progressione a SM. PREMESSE E OBIETTIVI

L’obiettivo principale del progetto consisteva nello studio delle eventuali alterazioni delle vie ADRENERGIC/DOPAMINERGIC PATHWAYS IN adrenergiche/dopaminergiche nei linfociti di individui con sindromi cliniche isolate (clinically isolated syndromes - CIS) e della loro associazione con la successiva progressione a sclerosi mul- CIRCULATING LYMPHOCYTES AS EARLY MARKERS tipla (SM). Esistono solide evidenze sul ruolo di meccanismi adrenergici e dopaminergici nella OF CLINICALLY ISOLATED SYNDROMES SM, tuttavia i tentativi di utilizzare agenti farmacologici attivi su di essi si sono rivelati fino ad ora deludenti. Diversi gruppi tra cui il nostro hanno documentato alterazioni di questi meccani- PROGRESSING TO MULTIPLE SCLEROSIS smi nei linfociti dei pazienti con SM, e soprattutto la capacità di trattamenti immunomodulanti come l’IFN-beta di restaurarne il funzionamento. Di fatto, i cambiamenti recettoriali e metabolici INTRODUCTION AND AIMS adrenergici/dopaminergici sono dinamici e specifici per le diverse sottopopolazioni linfocitarie, e riteniamo che la loro comprensione sia la chiave per massimizzare i benefici clinici del tratta- The main aim of the project was to investigate the possible occurrence of dysregulations of mento con agenti adrenergici/dopaminergici. La comprensione del network catecolaminergico adrenergic/dopaminergic pathways in circulating lymphocytes from subjects with clinically iso- che regola la risposta immunitaria potrebbe fornire, in questo senso, prospettive originali e lated syndromes (CIS) and to assess their possible relationship with subsequent progression innovative per la farmacoterapia della SM. to clinically established multiple sclerosis (MS). Extensive evidence suggests that adrenergic/ dopaminergic mechanisms may play a role in MS, however attempts to exploit the therapeutic RISULTATI potential of adrenergic/dopaminergic drugs have been so far disappointing. We and others have extensively documented the occurrence of dysregulated adrenergic/dopaminergic recep- Abbiamo realizzato uno studio longitudinale in soggetti con sindromi cliniche isolate (clinically tor-mediated mechanisms in lymphocytes from MS patients, which are partially restored by isolated syndromes - CIS), includendo un gruppo di soggetti sani come confronto healthy immunomodulating treatments e.g. with IFN-beta. Dynamic changes indeed occur to receptor controls (HC). I soggetti con CIS sono stati studiati al momento della manifestazione clinica e expression and function (and to endogenous catecholamine production) in circulating lym- dopo 12 mesi, oppure al momento della progressione a SM. Ad ogni visita, è stato ottenuto un phocytes during treatment with immunomodulatory drugs such as IFN-beta, and we believe campione di sangue venoso e sono stati valutati i seguenti parametri: that this the key to maximize the clinical benefits from adrenergic/dopaminergic agents. Com- nelle cellule mononucleate circolanti (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) stimolate prehensive understanding of the catecholaminergic network regulating the immune response con PHA, l’espressione di mRNA per i beta2-adrenocettori (AR), i recettori dopaminergici (do- is therefore mandatory and is likely to provide novel and exciting perspectives in pharmacothe- paminergic receptors, DR) D2 e D5 e per la tirosina idrossilasi (TH) nei linfociti T regolatori rapy of MS. CD4+CD25+ (Treg), l’espressione di mRNA per i beta2-AR, i DRD2 e D5, la TH e il FoxP3 Fino ad ora sono stati arruolati 15 soggetti con CIS e 10 HC. Le cellule dai soggetti con CIS RESULTS mostrano numerose differenze rispetto ai HC: la più evidente è l’aumentata espressione di mRNA per TH nelle PBMC, sia non stimolate che dopo stimolo con PHA. Come atteso, l’e- We performed a longitudinal study in subjects with CIS. A cohort of healthy controls (HC) was spressione di mRNA per DRD2 era in prevalenza non rilevabile, mentre gli mRNA per DRD5 e included for comparison. CIS subjects were studied at the time of clinical manifestations and beta2-AR mRNA erano espressi e mostravano un notevole incremento dei livelli dopo PHA, sia after 12 months (or at the time of progression to MS). At each visit, a sample of venous blood nelle cellule dei soggetti con CIS che in quelle da HC. Le PBMC dei soggetti con CIS tuttavia was taken and the following parameters were evaluated: mostravano una capacità significativamente ridotta di incrementare i livelli di mRNA per beta2- in cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with PHA, mRNA expres- AR dopo PHA. sion of beta2-adrenoceptors (AR), of dopaminergic receptors (DR) D2 and D5 and of tyrosine 120 Inoltre, le Treg dei soggetti con CIS mostravano una chiara tendenza verso una ridotta espres- hydroxylase (TH). 121 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

in purified CD4+CD25+ T regulatory lymphocytes (Treg), mRNA expression of beta2-AR, DRD2 PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI and D5, TH and FoxP3. The study included so far 15 subjects with CIS and 10 HC. Cells from CIS subjects showed Schembri L, Spagnuolo P, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic and a number of significant differences in comparison to cells from HC, the most prominent being dopaminergic pathways in circulating lymphocytes of subjects with Clinically Isolated Syndro- me (CIS). Abstracts del XXI Congresso dell’Associazione Italiana di Neuroimmunologia, Pollenzo increased expression of TH mRNA in PBMCs, both at rest as well as after PHA. As expected, (CN), 22-25 settembre 2011 DRD2 mRNA expression was usually undetectable, while DRD5 and beta2-AR mRNA were expressed and underwent strong upregulation after PHA in cells from both CIS subjects and Schembri L, Spagnuolo P, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic and HC. PBMCs from CIS subjects however showed significantly impaired ability to upregulate dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as early markers of clinically isolated syndro- beta2-AR mRNA expression. mes progressing to multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, Roma, 25-26 maggio 2011 In addition, Treg from CIS subjects showed a clear trend to decreased expression of FoxP3 mRNA and increased expression of TH, DRD5 and beta2-AR mRNA, which reaches statistical Spagnuolo P, Loraschi A, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic significance in the case of DRD5 mRNA. and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as early markers of clinically isolated syn- CIS subjects included in the study will be monitored for at least 12 months to assess whether dromes progressing to multiple sclerosis. XX Riunione annuale SIN-SNO lombarda, Como, 25-26 expression of mRNA for beta2-AR, DRD5, and TH in PBMCs and in Treg and for FoxP3 in Treg marzo 2011. Update in Clinical Neurology (G. Comi, M. Arnaboldi, M. Guidotti, eds.), New Maga- zine, Trento (I), 201: p. 54 may reveal a suitable marker to identify subjects at higher risk for progression to established MS. Spagnuolo P, Loraschi A, Bombelli R, Rasini E, Legnaro M, Luini A, Lecchini S, Bono G, Marino F, Zaffaroni M, Cosentino M. Adrenergic and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as CONCLUSIONS early markers of clinically isolated syndromes progressing to multiple sclerosis. Società Italiana di Neuroscienze, Riunione nazionale dottorandi e borsisti italiani in neuroscienze e materie affini, Busto Arsizio (VA), 27-28 maggio 2010 This study was to provide a “proof of concept” that lymphocyte adrenergic/dopaminergic dysregulation could be an “early marker” of CIS subjects at major risk for progression to MS. Subjects with CIS have higher expression of TH mRNA in PBMCs, which however show im- PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 paired ability to upregulate beta2-AR mRNA expression upon activation and have higher ex- per un periodo di 1 anno - 50.000 € pression of DRD5 mRNA in Treg, as well as a trend to impaired expression of FoxP3, TH and beta2-AR mRNA in these cells. Such differences are in line with the well-established dysregulation af adrenergic/dopaminergic pathways in lymphocytes of patients with established MS. Upregulation of DRD5 mRNA in Treg is in line with the notion that DRD5-operated pathways reduce Treg regulatory function. Impairment of Treg function has been implicated in the pathogenesis of MS. Follow up of this cohort of CIS subjects will allow to assess whether DRD5 mRNA expression in Treg may be useful in identifying subjects at high risk to progress to MS.

122 123 IDENTIFICAZIONE DI BIOMARCATORI E NUOVI BERSAGLI TERAPEUTICI NELLA SCLEROSI MULTIPLA NUOVI METODI DIAGNOSTICI MEDIANTE L’UTILIZZO DI APPROCCI DI BIOLOGIA DEI SISTEMI COMPLESSI regolazione genica, il numero di geni up-regolati risulta maggiore rispetto ai monociti di con- RESPONSABILE DEL PROGETTO trollo. Questi dati hanno indicato che lo stato di attivazione dei monociti di pazienti RRMS è MARIA FOTI diverso sia dai pazienti PPMS che dai controlli. Alcuni campioni non sono risultati appartenere Ricercatore alla classe fenotipica corretta e sono stati quindi rimossi dall’analisi statistica. Tuttavia, l’analisi Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze Laboratorio di medicina molecolare e dei dati clinici ha rivelato che questi pazienti avevano avuto una ricaduta recente (una o due immunologia Università degli Studi di Milano-Bicocca, Milano settimane prima della raccolta del sangue) che ha quindi giustificato la scorretta assegnazione della classe fenotipica di appartenenza. Collaboratori: L’analisi delle componenti principali ha rivelato che i profili di espressione genica di campioni SAMANTHA BALDASSARRI SM sono chiaramente distinguibili da quelli dei donatori sani indicando che la selezione di una ANNA TORRI lista di geni con potere classificatorio e predittivo è raggiungibile. SILVIA FUMAGALLI La seconda strategia che abbiamo seguito per scoprire nuovi biomarcatori e target terapeutici CHIARA RIPAMONTI STEFANIA CITTERIO è stato quello di studiare i profili dei microRNA. I microRNA sono ormai ampiamente riconosciuti, come nuovi regolatori genici importanti in molte malattie autoimmuni. Infatti, non sono Collaborazioni con altri gruppi: stati ancora descritti studi di caratterizzazione di queste molecole nello specifico in monociti DOMENICO CAPUTO, MARCO ROVARIS, Fondazione Don Gnocchi, Milano da pazienti SM. In un primo studio pilota, abbiamo analizzato il profilo di circa 834 microRNA FABIO STELLA, Dipartimento di Informatica, Università di Milano-Bicocca nei monociti di cinque controlli sani, sei pazienti PPMS e tre pazienti RRMS. Siamo stati in FRANCESCA ZOLEZZI, Consorzio Genopolis, Università di Milano-Bicocca grado di selezionare circa 23 microRNA modulati che potrebbero essere potenzialmente coinvolti nell’attività della malattia. La convalida di questi risultati su singoli microRNA è in corso di studio su un set di campioni indipendenti. Inoltre, stiamo aumentando il numero di campioni PREMESSE E OBIETTIVI da includere in entrambe le analisi in maniera tale da poter estendere i nostri risultati ai diversi fenotipi di malattia. La sclerosi multipla (SM) è caratterizzata dalla presenza di elementi cellulari nelle lesioni del sistema nervoso centrale appartenenti sia all’immunità innata che a quella acquisita. Recente- CONCLUSIONI mente, è stato ipotizzato un maggior coinvolgimento dell’immunità adattativa prevalentemente nella forma remittente-recidivante (RRMS) mentre disfunzioni del sistema innato sembrano es- Abbiamo osservato che i monociti provenienti da sangue periferico di pazienti RRMS presen- sere coinvolte nella forma progressiva (PPMS) della malattia. Quindi, l’identificazione di mole- tano profili diversi di attività rispetto a pazienti PPMS e ai soggetti di controllo. I dati indicano cole bersaglio in cellule del sistema immunitario è un obiettivo importante per lo sviluppo di test che i monociti sono coinvolti nell’attività della malattia. Inoltre, sono stati selezionati un insieme immunologici innovativi per la diagnosi e la prognosi della malattia stessa. L’espressione genica di geni in grado di distinguere i campioni SM dai controlli. È interessante notare, che abbiamo di monociti provenienti da sangue periferico da pazienti SM non è stata ancora studiata come trovato anche una deregolazione delle molecole di microRNA nei monociti di pazienti SM indi- possibile predittore di attività di malattia, anche se è stata dimostrata una correlazione positiva cando che anche queste molecole possono essere adatte alla selezione di nuovi biomarcatori. tra la presenza di monociti fortemente attivati e l’insorgenza di recidive nel modello murino di Inoltre, i dati ottenuti da questo studio suggeriscono che i cambiamenti nell’attività dei monociti SM (i topi EAE). in pazienti con SM possono essere considerati un meccanismo patogenetico aggiuntivo che Pertanto, abbiamo studiato i geni modulati nei monociti provenienti da pazienti con SM allo può contribuire a sostenere lo stato infiammatorio osservato nella malattia. Per questo motivo, scopo di monitorare l’attività della malattia, la progressione e il grado di infiammazione. Per proponiamo i monociti come nuovo bersaglio cellulare per monitorare l’attività della malattia e questo, abbiamo utilizzato un modello attraverso il quale l’analisi di specifici trascritti possa per individuare nuovi target terapeutici. aumentare il valore predittivo delle misure di risonanza magnetica che sono normalmente utilizzate per monitorare la malattia e la risposta al trattamento farmacologico. Lo scopo del progetto di ricerca è stato quello di sviluppare test diagnostici innovativi basati su impronte genetiche. In particolare, abbiamo cercato di identificare marcatori molecolari in A SYSTEMS BIOLOGY APPROACH TO IDENTIFY grado di differenziare le forme RRMS dalla forme PPMS. Accanto allo sviluppo di biomarcatori, BIOMARKERS AND THERAPEUTIC TARGETS IN sono stati identificati nuovi geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi della SM. Per questi analisi abbiamo impiegato approcci genomici di ultima generazione per lo studio del trascritto- MULTIPLE SCLEROSIS ma, per la generazione del profilo di microRNA e di strumenti bioinformatici avanzati. INTRODUCTION AND AIMS RISULTATI Key actors of the multiple sclerosis (MS) pathogenesis are elements of the innate and acqui- In questo progetto abbiamo studiato la risposta trascrizionale dei monociti di pazienti con SM red immune system present in the Central Nervous System (CNS) lesions. In this respect, as mediante analisi microarray e di microRNA. I nostri criteri di selezione sono stati molto selettivi increasing evidence implicates peripheral immunity changes in disease stages, a new notion in quanto l’espressione genica delle cellule circolanti è fortemente influenzata dalla terapia far- that adaptive immunity may be involved in relapsing-remitting disease, while specific innate macologica in corso o dalla presenza di altre condizioni infiammatorie (ad es. malattie infettive). immunity dysfunction may relate to disease progression, is arising. The elucidation of the target Per questo motivo, nessuno dei pazienti reclutati per questo studio, era in terapia immuno- molecules of the immune system in MS is a relevant goal for the development of innovative dia- modulante o immuno-soppressiva al momento del reclutamento. gnostic and prognostic immunological tests. The gene expression of MS peripheral monocytes In una prima serie di analisi, abbiamo esaminato i campioni provenienti da 14 donatori sani, has never been studied as a predictor of disease activity although inflammatory monocytes 11 pazienti RRMS e 10 pazienti PPMS. Abbiamo utilizzato l’array più recente che contiene le have been shown to correlate with relapses in the mouse model of MS (EAE mice). informazioni di più di 30000 geni ben annotati. Sorprendentemente, abbiamo osservato una Systems analysis of the transcriptional activity of circulating immune effectors cells could be forte down-modulazione dei geni nei monociti RRMS rispetto alle cellule sane di controllo. used beside biomarker discovery, to identify conserved elements in the host response to syste- 124 L’analisi dei monociti da pazienti PPMS ha mostrato un modello completamente differente di mic chronic inflammation and to gain insight into the fisiopathological process. Therefore, we 125 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

sought to prospectively identify and validate peripheral blood monocyte genes that could mark from this study suggested that changes in monocytes activity in MS may be considered as an disease activity, progression and inflammation using a model by which RNA transcripts could additional pathogenic mechanism that may contribute to sustain the inflammatory state of MS. increase the predictive value of magnetic resonance (MR) measures that are used to monitor For this reason, we propose the monocytes as a new cellular target for monitoring disease treatment outcomes in MS trials. activity and to identify novel therapeutic targets. The aim of the research project was the development of innovative diagnostic tests based on genetic signatures for disease activity and progression in MS. Specifically, we sought to identify molecular markers that are able to differentiate the RRMS and PPMS samples subtypes. PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI Beside biomarkers development, novel therapeutic targets and genes involved in MS pathogenesis have been identified. We employed state-of-the-art genomic approaches to study whole Baldassarri S, Torri A, Fumagalli S, Ripamonti C, Caputo D, Rovaris M and Foti M. A systems bio- genome transcriptomics, to generate microRNA profiling and advanced bioinformatics tools. logy approach to identify biomarkers and therapeutic targets in Multiple sclerosis. 2011 XXI AINI Congress, September 22th – 25th, Pollenzo - Bra, Cuneo, Italy

RESULTS Baldassarri S, Torri A, Fumagalli S, Ripamonti C, Caputo D, Rovaris M and Foti M. A systems biology approach to identify biomarkers and therapeutic targets in Multiple sclerosis. 2011 Joint In this project we studied the gene transcriptional response of MS patients monocytes by mi- Annual Meeting SIICA-DGFL, September 28th – October 1st, Riccione, Italy croarray and microRNA analysis. All patients were recruited at the Multiple Sclerosis Unit of the Fondazione Don Gnocchi, Milan in collaboration with Dott. Caputo and Rovaris. Our selection PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 criteria were very selective because gene expression of circulating cells is influenced by drug per un periodo di 1 anno - 50.000 € therapy or other inflammatory conditions (infectious diseases) as we observed from previous studies from our laboratory. For this reason, none of MS patients were under immuno-modulating or immuno-suppressive therapy at the time of recruitment. In a first set of analysis, we profiled samples from 14 healthy donors, 11 relapsing remitting (RRMS) and 10 primary progressive (PPMS) patients. We used the most recent array con- taining the information of more than 30000 well annotated genes. Strikingly, we observed a strong down-modulation of genes in RRMS monocytes compared to healthy controls cells. The analysis of PPMS monocytes displayed a completely different pattern of gene regulation, here an higher number of up-regulated genes was observed compared to controls which indicated an increase in monocytes activity. Few samples did not fall in the correct phenotypic class and were therefore removed from the statistical analysis. A deep look on clinical data indeed revealed that those patients experienced a recent relapse (one or two weeks before blood collection) making the wrong assignment on the phenotypic class rational. To determine whether it was possible to classify the MS disease, we performed a supervised analysis. Principal component analysis revealed that gene expression profiles of MS samples are clearly distinct from those from healthy donors indicating that the selection of a predicting MS signature is feasible, and we are currently selecting and validating the minimal list of genes with classification power. The second strategy that we followed to find out novel biomarkers and therapeutic targets was to study the microRNA profiling in MS monocytes samples. MicroRNA are now widely recognized, as important gene regulators in many autoimmune diseases. Indeed, currently no studies yet have described these molecules specifically on MS monocytes. In a pilot study, we profiled five healthy controls, six PPMS and three RRMS for microRNA gene expression. We were able to select about 23 microRNA genes modulated in MS that could be potentially involved in disease activity. The validation of these results on individual microRNAs is on going on an independent set of samples. Moreover, we are extending the analysis to more patients in the group of RRMS and we are increasing the number of samples in the whole analysis to be able to extend these results to the different disease phenotypes.

CONCLUSIONS

In conclusion, we observed that peripheral blood monocytes in RRMS present different activity profile compared with PPMS and control cells. The data strongly indicate that monocytes maybe implicated in disease progression and activity. A set of genes that are able to distinguish MS samples from controls have been selected. Interestingly, we found also dysregulation of microRNA genes in RRMS monocytes compared to controls and PPRM samples pointing out that also these molecules represent suitable targets for biomarker selection. The data obtained 126 127 I MECCANISMI IMMUNO-BIOLOGICI DELLA GRAVIDANZA: COME POSSONO INDURRE UNA SPONTANEA REMISSIONE NUOVI METODI DIAGNOSTICI NELLA SCLEROSI MULTIPLA

processi infiammatori sia nella patogenesi della SM sia nella gravidanza. Una volta appurata la RESPONSABILE DEL PROGETTO correlazione tra i trascritti e l’infiammazione, si è proceduto con l’analisi dell’effetto indotto da FRANCESCA GILLI ormoni gravidanza-specifici sull’espressione genica. Tra i trattamenti testati, l’idrocortisone ha Ricercatore a contratto evidenziato una più forte capacità di modulazione genica. Tuttavia, è interessante notare come Istituto per le Neuroscienze Cavalieri Ottolenghi, c/o Ospedale Universitario le modulazioni maggiori sono state riscontrate nella popolazione di controllo, confermando San Luigi Gonzaga, Orbassano, Torino l’ipotesi dell’esistenza di meccanismi anti-infiammatori difettosi nei pazienti con SM. Come terzo punto, è stata valutata l’espressione deregolata in diverse sottopopolazioni cellu- Collaboratori: lari, quali monociti, linfociti T e linfociti B. I risultati hanno dimostrato che ciascuna sottopopo- ANTONIO BERTOLOTTO lazione è coinvolta nella deregolazione genica osservata. SIMONA PERGA Infine, per determinare l’effettiva esistenza di uno shift Th2, lo studio ha confrontato la produ- NICOLE NAVONE SIMONA MALUCCHI zione di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie in pazienti con SM e controlli, prima, MARCO CAPOBIANCO durante e dopo la gravidanza. L’analisi dei profili non ha evidenziato alcuna modulazione di citochine nel corso della gravidanza, in entrambi i gruppi di donne. L’unico dato interessante è l’esistenza di un sottogruppo di pazienti con SM in cui si osserva una massiccia produzione di PREMESSE E OBIETTIVI citochine con valori di circa 100 volte superiori alla media. Tuttavia, ad oggi non è stata dimostrata alcuna correlazione tra la maggiore espressione di citochine e gli esiti clinici nei pazienti. La gravidanza è uno stato fisiologico transitorio di tolleranza immunitaria atta ad evitare il rigetto del feto ed è frequentemente associata ad una riduzione dell’attività di malattia nella sclerosi CONCLUSIONI multipla (SM). Tra i principali meccanismi associati al controllo della SM durante la gravidanza vi è una modulazione della risposta pro-infiammatoria (Th1) verso un fenotipo anti-infiamma- Nel complesso, i risultati del presente studio confermano una deregolazione dei sette geni torio (Th2). I fattori immunoregolatori coinvolti in questa modulazione sono proteine sieriche e infiammazione-associati identificati nel nostro precedente del progetto finanziato da FISM. In molecole di varia natura che promuovono la tolleranza. Inoltre, gli ormoni che derivano dalla particolare, la suddetta deregolazione genica è stata osservata in monociti, linfociti T e linfo- placenta possono direttamente agire sulla funzione delle cellule immunitarie che esprimono i citi B, evidenziando che ciascuna delle tre sottopopolazioni cellulari può essere una parte del recettori estrogenici. pathway associato alla malattia. Infine, tra i trattamenti di esposizione testati, l’idrocortisone, Con lo scopo di comprendere i meccanismi di adattamento immunologico durante la gravidan- prodotto dalle donne nella fase tardiva della gravidanza, ha dimostrato un forte effetto sull’e- za, abbiamo recentemente comparato i profili di espressione genica nelle cellule mononucleate spressione dei geni analizzati. di pazienti con SM e volontari sani, prima e durante la gravidanza. I risultati di tale studio hanno I risultati qui presentati portano ad una migliore comprensione dei meccanismi immunologici evidenziato nelle pazienti analizzate prima della gravidanza, un’alterata espressione di trascritti coinvolti nell’effetto benefico della gravidanza e al loro impatto sulla immunopatogenesi della coinvolti nella regolazione negativa dell’infiammazione; la gravidanza per contro, induceva una SM. Ciò può fornire una base per lo sviluppo di nuove, più efficaci strategie terapeutiche, por- “normalizzazione” dei livelli di espressione, in particolar modo in sette trascritti genici. tando quindi ad una migliore gestione della malattia. Il progetto qui presentato ha la finalità di analizzare nel dettaglio i sette trascritti precedentemente identificati. In particolare ci si è focalizzati sullo studio dei sette trascritti in diverse coorti di pazienti con SM, sull’identificazione dei fattori (ormoni gravidanza specifica quali prolattina, THE IMMUNE-BIOLOGICAL MECHANISMS estrogeni e progesterone o altri fattori immuno-modulatori) che determinano la modificazione nell’espressione dei trascritti durante la gravidanza, sulla caratterizzazione delle differenti sotto- BEHIND PREGNANCY: popolazioni cellulari eventualmente coinvolte nell’espressione dei sette trascritti e sull’indagine HOW THEY CAN INDUCE SPONTANEOUS dei livelli di citochine circolanti specifiche per i pattern Th1/Th2/Th17, prima, durante e dopo la gravidanza. REMISSION IN MULTIPLE SCLEROSIS

RISULTATI INTRODUCTION AND AIMS

Il progetto è stato focalizzato all’indagine dei sette trascritti in diverse coorti di pazienti con SM. Pregnancy represents a physiological transitory state of immune tolerance to avoid the rejec- Le analisi hanno confermato la deregolazione genica identificata nel nostro precedente studio tion of the fetus, and is frequently associated with reduced activity of multiple sclerosis (MS). genome-wide. Degno di nota è il fatto che i trascritti trovati sotto-espressi nei pazienti con SM The immunomodulatory mechanisms contributing to the control of harmful autoimmune activity codificano per molecole coinvolte nella regolazione negativa dell’infiammazione. I risultati con- are probably directed towards the adaptive immune system; putative beneficial mechanisms fermano una deregolazione non sesso-specifica. La terapia con natalizumab normalizza l’e- in the control of MS during pregnancy include a shift from a prevailing pro-inflammatory (Th1) spressione di un unico trascritto, suggerendo una bassa sovrapposizione tra il meccanismo di response to an anti-inflammatory (Th2) response. Immunoregulatory factors specific for pre- protezione fornito dalla terapia e quello fornito dalla gravidanza. Diversamente, sia l’interferone- gnancy comprehend serum proteins and tolerance-promoting signaling molecules. In addition, beta sia il glatiramer acetato hanno determinato una reversione nell’espressione di un elevato placenta-derived hormones, prolactin, estrogens and progesterone can directly affect the fun- numero di trascritti, suggerendo una buona sovrapposizione dei meccanismi di protezione. ction of the immune cells, which express estrogen receptors. Considerando poi una coorte di attività di malattia, tra i sette trascritti, due hanno evidenziato Aiming at getting better inside into these mechanisms, we recently compared gene expression una modulazione a seguito di recidiva clinica. L’esposizione ai corticosteroidi ha determinato un profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with MS and healthy vo- ripristino dei livelli di espressione iniziale, amplificando la risposta sistemica anti-infiammatoria. lunteers before and during pregnancy. Our preliminary results clearly illustrate that the expres- In secondo luogo, il progetto ha valutato l’effetto di specifici stimoli infiammatori nonché di sion of transcripts involved in the negative regulation of inflammation are altered nonpregnant stimolazioni ormonali sull’espressione dei sette trascritti. patients compared to controls. Complementary changes occurring in the immune system du- I dati hanno dimostrato che tutti trascritti sono coinvolti nell’infiammazione. Tale risultato evi- ring pregnancy revert this imbalance, particularly for seven transcripts. 128 denzia l’esistenza di una deregolazione genica SM-specifica, come anche il coinvolgimento di Present project encompassed the investigation of the seven identified transcripts, potentially 129 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

contributing to the reduced disease activity during pregnancy. Specifically, it focused on the PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI investigation of the seven transcripts in different cohorts of MS patients, the determination of whether pregnancy-induced changes in transcript’s expression are due to placenta-derived Gilli F, Navone ND, Perga S, Marnetto F, Caldano M, Capobianco M, Pulizzi A, Malucchi S, Ber- hormones or other immunomodulatory factors, the characterization of the blood cell subpo- tolotto A. Loss of braking signals during inflammation: a factor affecting the development and pulations differently involved in gene expression and the investigation of changes in the levels disease course of multiple sclerosis. Arch Neurol. 2011;68(7):879-88 of circulating cytokines with a focus on the Th1/Th2/Th17 balance during and after pregnancy. Bertolotto A, Navone ND, Perga S, Pulizzi A, Marnetto F, Gilli F. (2011) Deregulated Gene Expres- sion Pattern of Anti-Inflammatory Transcripts in Monocytes and T-Lymphocytes from Patients with RESULTS Multiple Sclerosis. Neurology, 22 Suppl. 3: P02.168

The first task of the project was the investigation of the seven transcripts in different cohorts of Bertolotto A., Navone N., Perga S., Pulizzi A., Malucchi S., Gilli F. (2011) Loss of braking signals patients with MS. Analyses have confirmed the pattern of deregulated expression as observed during inflammation affects the development and disease course of multiple sclerosis. Multiple in our previous genome-wide transcriptional analysis: a deregulated expression was observed Sclerosis, 17 Suppl. 10: P283 in patients as compared with healthy controls. Notably, transcripts that were found down- regulated in patients with MS encode all for critical negative regulators in inflammatory pro- Gilli F, Navone ND, Cosentino C, Perga S, Calogero R, Bertolotto A. (2011) Coordinated deregula- cesses. Overall, findings confirm a not gender-specific deregulation. Therapy with natalizumab tion of microRNA and mRNA targets causes defects of the negative feedback loop that suppress leads to the reversion in expression of a single transcript, suggesting almost no overlap in the inflammation in multiple sclerosis. Multiple Sclerosis, 17 Suppl. 10: P759 mechanism of protection between therapy and pregnancy. Differently, both interferon-beta and glatiramer acetate lead to the reversion in expression of a higher number of genes transcripts, Bertolotto A, Navone N, Malucchi S, Valentino P, di Sapio A, Perga S, Capobianco M, Pulizzi A, Marnetto F, Caldano M, Gilli F. (2010) Overlapping molecular mechanisms of protection during pre- suggesting partially overlapping mechanisms of protection. gnancy and diseasemodifying therapies in patients with Multiple Sclerosis. Neurology, 17 Suppl. Considering a disease activity cohort, among the seven transcripts, two changed expression 3: P02.157 following clinical relapse. Notably, corticosteroids exposure resulted in a reinforcement and amplification of the systemic anti-inflammatory response. Gilli F, Navone ND, Perga S, Pulizzi A, Bertolotto A. (2010) Dysregulated expression pattern of anti- The second task aimed at evaluating the effect of inflammatory stimuli as well as of hormones inflammatory transcripts in monocytes and T-lymphocytes from patients with Multiple Sclerosis. stimulation on the expression of the seven transcripts. Data firstly showed that all of transcripts Atti congressuali Stresa, AINI 2010 are inflammation-related. This result highlights the MS-specific deregulation as well as the involvement of inflammatory mechanisms in both pregnancy and MS outcome. Gilli F, Navone N, Valentino P, Perga S, Marnetto F, Sperli F, Malucchi S, Bertolotto A. (2009) Over- Once aware that we were studying inflammation-related genes, we analyzed the effect of lapping molecular mechanisms of protection during pregnancy and interferon-beta therapy in specific hormones stimulation on gene expression. Among the tested exposure treatments, patients with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis, 15 Suppl. 2: P795 hydrocortisone demonstrated the strongest effect on gene expression, as all genes significantly Bertolotto A, Navone N, Malucchi S, Valentino P, Perga S, Pulizzi A, Marnetto F, Caldano M, Gilli F. changed in expression. Notably, the most significant changes were observed in healthy con- Overlapping molecular mechanisms of protection during pregnancy and disease-modifying thera- trols rather than in patients with MS, confirming the hypothesis of a defective anti-inflammatory pies in patients with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis, 16 Suppl. 10: P438 pathway in patients with MS. For the purpose of the third task, we ascertained gene expression deregulation in monocytes, T-lymphocytes and B-lymphocytes. Finally, findings have showed Perga S, Navone ND, Caldano M, Gilli F, Bertolotto A. Transcriptional analysis of seven MS-asso- that each of the three cell subpopulation may be a part of the deregulated gene expression ciated genes after ex vivo stimulation with LPS/PMA. Multiple Sclerosis, 16 Suppl. 10: P255 pathway linked to MS. To determine whether a Th2 shift occurs, the fourth task of the project aimed at comparing the production of pro-inflammatory cytokines and Th2 cytokines among BORSA DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 the samples obtained from patients with MS and healthy controls, before, during and after pre- per un periodo di 2 anni - 90.000 € gnancy. Profiling analysis did not show any cytokine modulation throughout pregnancy in both groups of women. The only interesting finding in this task that warrants further investigation has been that there is a fraction of patients with MS with an about 100-fold higher expression amount of pro-inflammatory cytokines. To date we did not show any kind of correlation between higher cytokines expression and clinical outcomes in patients.

CONCLUSIONS

Overall, findings confirm a deregulation of the seven inflammation-related genes identify in our previous FISM-founded project. Notably, the above-mentioned gene deregulation was observed in monocytes, T-lymphocytes and B-lymphocytes, highlighting that each of the three cell subpopulation may be a part of the deregulated pathway linked to MS. Finally, among the tested exposure treatments, hydrocortisone, which is produced in late pregnancy, demonstrated the strongest effect on gene expression. Results of the present study lead to a better understanding of the immunological mechanisms of pregnancy-related beneficial effects and their impact on the immunopathogenesis of MS. This may provide basis for the development of novel and possibly more effective therapeutic strategies, and thus will ultimately lead to better management of the disease. 130 131 STUDIO NEUROFISIOLOGICO E NEURORADIOLOGICO DEI CIRCUITI TRONCOENCEFALICI IN PAZIENTI CON NUOVI METODI DIAGNOSTICI SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTO evidenziato assenza di lesioni del TE nel 28,3% dei casi. Le alterazioni dei RT correlavano FRANCA DERIU significativamente con la durata di malattia e con i segni/sintomi piramidali (p=0,020). La stes- Professore Associato di Fisiologia sa associazione positiva è stata trovata tra le suddette variabili cliniche e le alterazioni dei PE Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari (rispettivamente, p=0,0001 e p=0,025) e il carico lesionale del tronco evidenziato dalla RM (rispettivamente, p=0,024 and p=0,019). Anche le alterazioni dei RT correlavano positivamente Collaboratori: con quelle dei PE (p=0,009). Infine, la frequenza delle alterazioni dei quattro RT correlava si- GIULIO ROSATI gnificativamente (p=0,007) col carico lesionale del tronco, evidenziato dalla RM bilateralmente. EUSEBIO TOLU Riguardo alle singole regioni del tronco, solo il carico lesionale del ponte e del bulbo correlava MAURIZIO CONTI significativamente con le alterazioni dei RT (rispettivamente, p=0,001 e p=0,016). ELENA GIACONI GIOVANNA PILURZI, Tra i 60 pazienti che hanno partecipato allo studio, sei si sono ritirati e 17 sono stati rivalutati MARIA PAOLA CABBOI dopo un anno. Di questi, solo alcuni hanno mostrato un leggero peggioramento del quadro IMMACOLATA MAGNANO clinico, neurofisiologico e neuroradiologico, ma senza alcuna significatività statistica. ANTONIO ACHENE Le risorse messe a disposizione dalla FISM per questo progetto sono state destinate in parte ANDREA SALIS all’avvio di un laboratorio di neurofisiologia clinica per la registrazione dei riflessi del tronco GIOVANNI MARIA PES encefalico, presso il Dipartimento di Scienze Biomediche dell’Università di Sassari. La parte restante è stata destinata al pagamento di una borsa di studio per i giovani ricercatori impiegati specificamente nella realizzazione del progetto. PREMESSE E OBIETTIVI CONCLUSIONI Il tronco encefalico (TE) è una piccola parte dell’encefalo dove le lesioni da sclerosi multipla (SM) sono spesso clinicamente silenti. Sebbene essenziale per formulare la diagnosi iniziale e La registrazione dei RT ha suggerito la presenza di anomalie del TE nell’85% dei pazienti. Que- per rilevare nuove lesioni, la risonanza magnetica convenzionale (RM) non è efficace nel moni- sto risultato è di interesse alla luce della sua comparazione con quello dell’esame clinico (che torare la perdita o il ripristino della funzione entro la lesione. La RM non convenzionale supera ha evidenziato un coinvolgimento del TE nel 37,3% dei casi), con i PE (alterati nell’80,0% dei questi limiti, ma è costosa e disponibile solo in pochi centri. I pazienti con SM spesso presen- casi) e con la RM (che ha documentato lesioni del tronco nel 72,7% dei pazienti). Questi dati tano segni/sintomi di coinvolgimento del TE e si ritiene che anomalie dei riflessi del tronco (RT) fanno ritenere che la valutazione complessiva dei RT dia informazioni aggiuntive su eventuali riflettano un grave danno del TE. Per migliorare il monitoraggio dell’evoluzione, sia silente che alterazioni della funzionalità dei circuiti del TE, specialmente quando queste non sono eviden- manifesta, della malattia, è imperativo fornire al clinico un ampio spettro di mezzi non invasivi ziate da altre procedure cliniche e/o paracliniche. Il follow-up ad un anno non ha mostrato ed economici, la cui disponibilità e facilità di utilizzo possano surrogare metodi più sofisticati. modificazioni significative rispetto alla valutazione basale, probabilmente a causa del limitato Oltre a presentare questi vantaggi, la registrazione dei RT permette di testare neuroni e vie ner- campione rivalutato. L’estensione del follow-up ad un maggior numero di pazienti, è necessaria vose del TE, potenzialmente in relazione con segni/sintomi o interessati da lesioni clinicamente per comprendere se i RT possano essere utili nel monitorare la funzione del tronco nel tempo. silenti. L’attenzione è stata focalizzata su quattro riflessi: il vestibolo-collico (VC), il trigemino- cervicale (TC), il vestibolo-masseterino (VM) e l’acustico-masseterino (AM). Tra questi, solo il riflesso VC è stato studiato sistematicamente nella SM; al contrario, il TC è stato indagato solo in un ristretto numero di pazienti, e sia il VM che il AM non sono mai stati studiati nella NEUROPHYSIOLOGIC-NEUROIMAGING PAIRED SM. Questo progetto si proponeva l’obiettivo di effettuare una valutazione sistematica e una STUDY OF BRAINSTEM CIRCUITS IN PATIENTS WITH rivalutazione ad un anno dei RT suddetti allo scopo di: a) fare un confronto nei pazienti e in un comparabile gruppo di soggetti sani; b) correlare le anormalità dei RT con la condizione clinica MULTIPLE SCLEROSIS dei pazienti; c) valutare il valore diagnostico dei RT rispetto ai potenziali evocati multimodali (PE) e al quadro RM; d) documentare la varietà dei possibili pattern attesi in ciascun paziente, un INTRODUCTION AND AIMS anno dopo la valutazione iniziale. The brainstem (BS) is a small part of the brain where multiple sclerosis (MS) lesions are often RISULTATI clinically silent. Although essential for formulating the initial diagnosis and for detecting new lesions, conventional magnetic resonance imaging (MRI) is not effective in monitoring loss or Sessanta soggetti sani (31,9±7,8 anni) e 60 pazienti (33,3±8,3 anni, 44 femmine e 16 maschi) restoration of function within the lesion. Non-conventional MRI can overcome these limits but it hanno partecipato allo studio. I pazienti avevano una diagnosi di SM recidivante-remittente, is expensive and available only in a few centres. Patients with MS often exhibit signs/symptoms una scala di disabilità (EDSS) <5.0 (EDSS=0 nel 15,3% dei pazienti; EDSS≤2.5 nel 67,8% dei of BS involvement and BS reflex (BSR) abnormalities were proved to reflect major BS damage. pazienti e EDSS≤5 nel 16,9%) e una durata di malattia di 10,0±14 anni. L’esame neurologico To improve assessment of the silent and manifest evolution of the disease, it is imperative to ha mostrato segni/sintomi di interessamento del TE nel 37,3% dei casi (EDSS del TE≤2,5). La provide clinicians with a wide spectrum of low-cost, painless tools whose availability and easi- frequenza dei riflessi alterati era significativamente diversa (p=0,00001) tra controlli e pazienti. ness of implementation can surrogate for more sophisticate methods. Besides offering these Nel complesso, quando le anomalie dei quattro RT venivano cumulate, nessuno dei controlli advantages BSR recordings allow testing BS neurons and pathways, which are potentially aveva più di un RT alterato, con una Frazione di Falsi Positivi del 6,7%. Sulla base di questo related to signs/symptoms often observed in MS or which are involved by clinically silent le- dato è stato assunto che avere più di un riflesso alterato è indice di patologia. Per quanto ri- sions. Our attention was focused on four BSR: the vestibulo-collic (VCR), the trigemino-cervical guarda i pazienti, la Frazione dei Falsi Negativi era del 15% mentre la frequenza con la quale i (TCR), the vestibulo-masseteric (VMR) and the acoustic-masseteric (AMR) reflexes. Among pazienti presentavano almeno uno, due, tre o quattro riflessi alterati era pari, rispettivamente al these, only the VCR has been widely investigated in MS; by contrast the TCR has been studied 85,0%, 65,0%, 21,6% e 6,6%. Considerati complessivamente, i PE multimodali erano alterati in a small number of cases and both the VMR and AMR have never been investigated in MS. nel 80,0% dei pazienti e l’indagine RM ha rilevato lesioni mono e/o bilaterali sopratentoriali Objectives of this project were to carry out an initial systematic assessment and a complete 132 nel 98,3% dei pazienti, di cui il 72,7% aveva anche lesioni nel tronco encefalico. La RM ha reassessment 12 months later of VMR, AMR, TCR and VCR in MS in order to: a) compare 133 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

the frequency of BSR in MS patients and healthy subjects; b) correlate BSR abnormalities to PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI clinical conditions; c) evaluate BSR diagnostic value respect to multimodal evoked sensory potentials (EP) and MRI; d) document the variety of possible patterns expected in each patient Giaconi E, Pilurzi G, Coiana J, Magnano I, Cabboi MP, Achene A, Salis A, Conti M, Pes G, Tolu E, after one year from initial evaluation. Deriu F. Exploration of brainstem function through vestibular and trigeminal reflexes in healthy people and in patients with multiple sclerosis. 62° National Congress of Italian Physiological Society; Sorrento 25-27 th September 2011. Acta Physiologica 203 (suppl. 688): p. 103, 2011 RESULTS Deriu F, Giaconi E, Rothwell JC, Tolu E. Reflex responses of masseter muscles to sound. Clin Neu- Sixty healthy subjects (31.9±7.8 years old) and 60 patients (33.3 ± 8.3 years old, 44 females rophysiol. 2010 Oct;121(10): 1690-9 and 16 males) participated in the study. Patients had a diagnosis of definite relapsing-remittent Magnano, MP Cabboi, P Cossu, M Conti, A Achene, A Salis, GF Sau, F Deriu, I Aiello. L’onda MS, an expanded disability scale status (EDSS) <5.0 (EDSS=0 in 15.3% of patients; EDSS≤2.5 P14 nello studio del tronco dell’encefalo (TE) in pazienti affetti da Sclerosi Multipla Recidivante- in 67.8% of patients and EDSS≤5 in 16.9%) and an illness duration of 119.7±175.4 months. Remittente (SMRR). Abstract Book Congresso Nazionale della Società Italiana di Neurofisiologia Neurological examination showed symptoms and/or signs of BS involvement in 37.3% of cases Clinica (SINC) Siena, 13-15 mag 2010 pag.294 (with BS-EDSS≤2.5). The frequency of altered reflexes was significantly different (p=0.00001) between controls and patients. In the whole, when the four BSR were cumulated, none of the Magnano I, Cabboi MP, Pilurzi G, Conti M, Achene A, Salis A, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Sau GF, Pes GM, Aiello I Tolu E, Deriu F. (2009). Alterazioni tronco-encefaliche nella Sclerosi Multipla (SM): controls had more than one altered reflex, with a False Positive Fraction of 6.7%. Based on this risultati di uno studio Neurofisiologico e Neuroradiologico. Abstract Book, Congresso Nazionale finding we assumed that having more than one altered reflex is an indication of abnormality. As SINC, Salerno 28-30 maggio 2009, pag 248 for patients, the False Negative Fraction was 15% and the True Positive Fraction of having at least one, two, three or four altered reflexes was 85.0%, 65.0%, 21.6% and 6.6% respectively. Pilurzi G, Magnano I, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Ruiu E, Pes GM, Tolu E, Deriu F. (2009). Vestibulo In the whole, multimodal EP revealed brainstem abnormalities in 80.0% of patients and MRI masseteric reflex and jaw acoustic reflex: a new tool to assist exploration of brainstem function in multiple sclerosis? Abstract book of International Workshop and Conference on Human Reflexes investigation detected monolateral and/or bilateral lesions in the supratentorial compartment – Wiring and Firing of Motoneurones 11-15 May, Izmir (Turkey), pag 71-72 of 98.3% of patients, 72.7% of whom had additional lesions in the brainstem. MRI procedure did not evidence any lesion in the brainstem in 28.3% of patients. BSR alterations consistently Pilurzi G, Giaconi E, Ortu E, Deriu S, Ruiu E, Magnano I, Cossu P, Achene A, Salis A, Conti M, Pes correlated with illness duration and pyramidal signs and/or symptoms (p=0.020). The same G, Tolu E, Deriu F. (2009). The acoustic masseteric reflex (AMR) and the vestibulo masseteric reflex positive associations were found between the above mentioned clinical variables with EP alte- (VMR): a new tool to explore brainstem (BS) function in man. Acta Physiologica 197(Supplement 672): 96 rations (p=0.0001 and p=0.025, respectively) and with brainstem lesion load detected by MRI (p=0.024 and p=0.019, respectively). A significant positive correlation of cumulated reflexes with EP overall score was found (p=0.009). Finally, cumulative frequency of altered brainstem PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 reflexes significantly (p=0.007) correlated with total brainstem lesion load detected from MRI per un periodo di 2 anni - 60.000 € bilaterally. As for distinct brainstem regions, only pons and medulla load significantly correlated with global reflex alterations (p=0.001 and p=0.016 respectively). Among the 60 patients who participated in the initial study, six dropped out and 17 had a second assessment after one year from initial evaluation. Only in some of the 17 reassessed MS the follow-up revealed a slight worsening of the outcome of all the tests performed but with no statistical significance. Part of FISM resources for this project were devoted to start the set-up of a laboratory of clinical neurophysiology specifically addressed to recording of brainstem reflexes in the Department of Biomedical Sciences of the University of Sassari. The rest was used to provide a fellowship to young researchers specifically employed in the realization of this project.

CONCLUSIONS

BSR recording indicated the presence of possible BS circuit abnormalities in 85% of patients. This finding is interesting in the light of the comparison of BSR data with those obtained by clinical examination (proving BS involvement in 37.3% of cases), EP (altered in 80% of cases) and by MRI (showing BS lesions in 72.7% of patients). Data allow to be confident of the usefulness of BSR testing in providing additional information about abnormal function of BS circuits, especially when it is not detected by clinical and/or paraclinical procedures. The follow-up carried out after one year from initial evaluation, did not show any significant modification in comparison with basal data. The small sample may account for the lack of statistical significance. The reassessment of a larger number of patients will allow to understand whether BSR recording is of value in documenting evolution of BS function over time.

134 135 VALIDAZIONE DI MARKERS ELETTROFISIOLOGICI DI DANNO NERVOSO IN MODELLI ANIMALI NUOVI METODI DIAGNOSTICI DI SCLEROSI MULTIPLA

I PE somatosensoriali (PESS) sono stati registrati in topi C57 femmine wt. Sotto anestesia da RESPONSABILE DEL PROGETTO Sevofluorano, tre viti epidurali sono state impiantate: due sulle cortecce parietali e una referen- LUIS TENEUD za occipitale. Per il recording, sotto anestesia di Sevofluorano, le zampe posteriori degli animali Istituto di Neurologia Sperimentale sono state stimolate con impulsi quadri di corrente. I PESS sono stati registrati solo in alcuni Ospedale San Raffaele, Milano casi. Ci sono stati problemi nel recording dei PESS; sono necessari più trials per standardizzare questa tecnica. MENTORE: LETIZIA LEOCANI CONCLUSIONI

I dati mostrano un aumento nella latenza dei PEV dal momento di picco della malattia, mentre PREMESSE E OBIETTIVI l’ampiezza comincia a diminuire a 40 dpi. Questi dati mostrano che i PEV si possono registrare sia nei topi wt che nel modello murino di EAE, costituendo un modello molto utile per il monito- I potenziali evocati (PE) sono un buon marcatore di gravità per danni del sistema nervoso nella raggio della funzionalità neuronale nel modello cronico di EAE. La disponibilità di recording mi- sclerosi multipla (SM). Il loro uso nella diagnosi dell’SM è stato fortemente ridotto dopo l’av- nimamente invasivi nel topo garantirebbe un biomarker eccellente per correlazioni longitudinali, vento della risonanza magnetica funzionale (fMRI). Tuttavia, a differenza dall’fMRI, i PE bene funzionali e patologiche, per poter comparare l’adeguatezza di modelli animali con la patologia correlano con la disabilità clinica, generando una misura funzionale della conduzione nervosa umana e poter valutare gli effetti delle terapie nel sistema nervoso. grazie alla sua capacità di rilevare coinvolgimenti sub-clinici di una certa patologia. Inoltre, i PE sono predittivi nell’evoluzione della malattia. Infine, il rapporto costo/benefici è molto basso. Le misure di danno funzionale in modelli animali di SM sono largamente basate su valutazioni cliniche; la maggior limitazione di questo approccio sta nella sua soggettività e nel fatto che è VALIDATION OF NEUROPHYSIOLOGICAL MARKERS confinata alla valutazione dell’equilibrio. D’altra parte, studi istopatologici permettono misure OF NERVOUS DAMAGE IN ANIMAL MODELS oggettive e specifiche del danno nervoso, ma non danno alcuna informazione sulla funzionali- tà; inoltre, richiedono il sacrificio dell’animale, e quindi di un gran numero di soggetti per studi OF MULTIPLE SCLEROSIS longitudinali, con conseguenze etiche e economiche negative. Studi precedenti su PE nei modelli animali di SM hanno usato diversi roditori rispetto ai topi. INTRODUCTION AND AIMS Tuttavia, l’uso dei topi ha diversi vantaggi rispetto ad altri roditori, permettendo l’uso di transgenici e un più facile approccio genetico. È essenziale avere una tecnica standard, rapida e Evoked potentials (EPs) are a good marker of the severity of nervous damage in multiple sclero- riproducibile per registrare e analizzare i PE in maniera minimalmente invasiva, garantendo sis (MS). Their use in the diagnosis of MS has been greatly reduced after the advent of the ma- all’animale uno stress minimo ed evitando di interferire con il normale corso della malattia e con gnetic resonance imaging (MRI) techniques. However, differently from MRI, EPs well correlate la valutazione clinica e istopatologica. with clinical disability, providing a functional measurement of nervous conduction by its ability to Lo scopo del presente studio è di sviluppare e validare un biomarker elettrofisiologico dei danni detect subclinical involvement on a given pathway. Moreover, they may have a predictive value del sistema nervoso nel modello animale di SM, per essere usato nella valutazione di terapie regarding the evolution of disability. Also, their cost/benefit ratio is to be considered quite low. sperimentali. Measurement of functional damage in animal models of multiple sclerosis has been based largely on clinical assessment. The main limitations of this approach rely on its subjectivity RISULTATI and on the fact that it is mainly confined to the assessment of gait and balance. On the other hand, histopathological studies allow objective and specific measure of nervous damage, but L’encefalomielite autoimmune sperimentale cronica (EAE) è stata indotta in topi femmine C57 do not provide information on nervous function; moreover, they require to sacrifice the animal, di otto/nove settimane tramite immunizzazione sottocutanea con oligodendrocyte glycoprotein requiring larger number of animals for longitudinal studies, with negative ethic and economical (MOG) 35-55 in complete Freund’s adjuvant (CFA). I controlli sono stati infettati con incomplete consequences. Freund’s adjuvant. La tossina Pertussis è stata somministrata ad entrambi i gruppi. Previous studies on EPs in animal models of MS have used rodents other than mice. However, Due elettrodi epidurali sono stati impiantati sotto anestesia da Sevofluorano: l’attivo sulla cor- mice models have important advantages over the use of other rodents, allowing more easily the teccia visiva V1 e il riferimento sulle aree frontali destre. Dopo adattamento al buio, i topi sono use of transgenic animals and gene targeting approaches. It becomes important the availability stati anestetizzati e i PE visivi (PEV) sono stati registrati 10, 20 e 40 giorni dopo immunizzazione of standardized, fast and reproducible technique for recording and analysis of EPs minimally (dpi). Un gruppo differente è stato usato come baseline. L’ampiezza rispetto alla baseline e la invasive, allowing minimal animal discomfort and avoiding to interfere with the natural clinical latenza dei PEV sono stati misurati per le tre maggiori componenti, N1, P1 e N2 ad ogni time- course of the disease and with the clinical/histopathological assessments. point. Gli animali sono stati sacrificati agli stessi tempi e un sottogruppo è stato utilizzato per The aim of this project is to develop and validate an electrophysiological biomarker of nervous analisi istologiche. Le latenze sono state analizzate statisticamente tramite analisi ANOVA. damage for experimental mice animal models of MS, to be used in the evaluation of the effects Le componenti più conservate nei PEV da flash sono l’onda negativa N1 (21.83 ±0.2), la pri- of experimental therapies. ma positiva N2 (29.08±0.51) e la seconda negativa N2 (51.44±0.97). Di queste, la più stabile e riproducibile è la P1. Le analisi neurofisiologiche nei topi EAE mostrano che le latenze delle RESULTS maggiori componenti dei PEV aumentano durante il corso della malattia. Questo effetto è più marcato per le latenze di P1 (10 dpi, p =0.002; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p <0.001), ma è an- Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in C57BL/6 naive fe- che significativo per N1 (10 dpi, p =0.02; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p =0.001) e N2 (10 dpi, p male mice of eight-nine weeks of age by subcutaneous immunization with myelin oligoden- =0.170; 20 dpi, p =0.012; 40 dpi, p =0.02). Inoltre, l’ampiezza di P1 diminuisce nei topi EAE drocyte glycoprotein (MOG) 35-55 in complete Freund’s adjuvant (CFA). Controls were injected ma, come già riportato, la loro variabilità ne rende difficile l’interpretazione. with incomplete Freund’s adjuvant. Pertussis toxin was administrated to both groups. Le analisi neuropatologiche mostrano infiltrati cellulari, demielinizzazione e degenerazione as- Under sevoflurane anaesthesia two epidural stainless steel screw electrodes were implanted: 136 sonale in diverse proporzioni, maggiormente nelle aree periferiche del nervo ottico. active over the right V1 cortex and right frontal reference. Following overnight dark adapta- 137 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

tion, mice were anesthetized with sevoflurane. Flash-VEPs were recorded at 10, 20 and 40 PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI days post immunization (dpi). Another group was included as baseline. The amplitude with respect to baseline and latency from stimulus onset of the three main components of flash- Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa J, Cursi M, Comi G, Leocani L. Flash visual VEPs (N1-P1-N2) were measured at each time point. Animals were sacrificed at 10, 20 and evoked potentials in mice can be modulated by tDCS. Neuroscience, 185:161-165, 2011 40 dpi. A small number of mice were randomly selected at each time for neuropathological Teneud L, Cambiaghi M, Dina G, Quattrini A, Furlan R, Martino G, Comi G, Leocani L. Flash visual investigations. Statistical analysis was performed. VEPs latency of three groups were entered evoked potentials as neurophysiological marker of nervous damage in animal models of Multiple into a one way ANOVA. Sclerosis. 21st Meeting of the European Neurological Society. 28 – 31 May 2011. Lisbon, Portugal The most consistent components observed in flash VEPs were the first negative N1 (21.83 ±0.2), first positive P1 (29.08±0.51) and second negative N2 (51.44±0.97), as has been de- Teneud L, Cambiaghi M, Dina G, Quattrini A, Furlan R, Martino G, Comi G, Leocani L. Flash visual evoked potentials as neurophysiological marker of nervous damage in animal models of Multiple scribed previously. Of them, P1 looks like the most stable and reproducible. Concisely, neu- Sclerosis. 14th European Congress on Clinical Neurophysiology. 21-25 June 2011. Rome, Italy rophysiological determinations in EAE mice show that latencies of main components of VEPs increased through the course of the disease. This effects is especially marked for P1 latencies Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Transcranial (10 dpi, p =0.002; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p <0.001), but is also significant for N1 (10 dpi, p direct current stimulation (tdcs) in the mouse brain: electrophysiological effects. 1st International =0.02; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p =0.001) and N2 (10 dpi, p =0.170; 20 dpi, p =0.012; 40 dpi, Workshop on Synaptic Plasticity: From Bench to Bed Side. 28th April - 1st May 2010. Giardini- Naxos, Italy p =0.02). Besides, P1 amplitude decreased in EAE mice but, as have been reported previously, their relative high variance makes difficult to analyze these values. Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Stimolazione Neuropathological findings in EAE animals showed infiltrating cells, demyelinating lesions and transcranica con corrente diretta (tDCS) nel topo: effetto sui potenziali evocati visivi (PEV). Con- degenerating axons in variably proportions, mainly in the peripheral areas of the optic nerves. gresso Nazionale della Società Italiana di Neurofisiologia Clinica. May, 2010. Siena, Italy On the other hand, somatosensory evoked potentials (SSEP) were registered in healthy Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Electro- C57BL/6 naive female mice. Under sevoflurane anaesthesia, three epidural stainless steel physiological effects of transcranial direct current stimulation (tDCS) in the mouse brain on visual screw electrodes were implanted: two active over the parietal cortex and one reference electro- evoked potentials (VEPs). New prospects of transcranial electrical stimulation (tES): from bench de over the prefrontal region. On registration day, animals were anesthetized. Two stimulating to bed side. November, 2010. Brescia, Italy electrodes were placed over the calf and square wave current pulses were applied. SSEP only could be registered in a few cases. I have great problems obtaining the signals. More trials are necessary to standardize this EP technique. BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO 2008 per un periodo di 2 anni - 41.000 € CONCLUSIONS

Data show increased VEPs latency as from the peak of the disease while the amplitude decreased at 40 days. These results display that VEPs can be recorded in healthy mice and in the chronic EAE model, constituting a useful method for monitoring peripheral nervous function in chronic-progressive EAE. The availability of minimally invasive VEPs in mice would grant a biomarker allowing longitudinal, functional and pathological correlations, to compare the ade- quateness of animal models to human diseases and to assess the effects of therapies on nervous system.

138 139 RUOLO DI PROGRANULINA NELLA SCLEROSI MULTIPLA NUOVI METODI DIAGNOSTICI

macrofagi fagocitanti detriti mielinici e a livello della microglia attivata. Nelle lesioni demieliniz- RESPONSABILE DEL PROGETTO zanti croniche attive, si osserva una immunoreattività per PGR a livello della microglia attivata MARCO VERCELLINO al bordo della lesione. Dipartimento di Neuroscienze Una immunoreattività per PGR si osserva a livello della microglia attivata nella NAWM e nelle Azienda Ospedaliero-Universitaria San Giovanni Battista di Torino lesioni croniche inattive; la quasi totalità delle cellule CD68 positive esprime anche PGR. L’e- spressione di PGR a livello microgliale è maggiore nella SM progressiva che nella SMRR. Collaboratori: PAOLA CAVALLA Nelle lesioni corticali e nella NAGM si osserva una immunoreattività per PGR a livello della mi- MARIA TERESA GIORDANA croglia e del citoplasma neuronale. Anche negli infiltrati infiammatori leptomeningei si osserva DARIO GIOBBE una immunoreattività per PGR a livello di monociti e macrofagi. SILVIA MASERA Nei casi di controllo si osserva una immunoreattività per PGR solamente a livello del citoplasma ALESSANDRA MATTIODA neuronale, mentre non è presente a livello della microglia. ALBERTO ROMAGNOLO SILVIA GRIFONI CLAUDIA TREBINI B) Determinazione della concentrazione di PGR nel liquor (ELISA) CARLOTTA CHIAVAZZA Non sono state osservate differenze significative nella concentrazione liquorale di PGR tra i pazienti con SM (media 21.32 ng/ml ± SEM 2.14) e i controlli (media 17.15 ng/ml ± SEM 1.60). Collaborazioni con altri gruppi: La concentrazione liquorale media di PGR è risultata significativamente più alta nei pazienti CAPELLO E, MANCARDI GL, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica Università di Genova con SMRR in fase di recidiva di malattia (media 31.26 ng/ml ± SEM 3.14) e nei pazienti con FENOGLIO C, GALIMBERTI D, DE RIZ M, SCARPINI E, IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico SMSP (media 24.92 ng/ml ± SEM 1.69). rispetto ai pazienti con SMRR con malattia in fase di Milano di stazionarietà (media 14.56 ng/ml ± SEM 1.54) (p < 0.01). Una correlazione modesta (r = 0.579, p<0.05) è stata riscontrata tra la concentrazione liquorale di PGR e il numero di cellule nel liquor, nei pazienti con SM. PREMESSE E OBIETTIVI C) Studio genetico La progranulina (PGR), proteina con importanti ruoli nel controllo dell’infiammazione e della Nei pazienti con SM con esordio di malattia <= 25 anni, è stata osservata una aumentata riparazione del danno tissutale, è un fattore neurotrofico di fondamentale importanza, in grado frequenza del genotipo rs4792938 CC (23.8% vs 7.2%, OR 3.99, p = 0.001) e del genotipo di promuovere la sopravvivenza neuronale e la crescita assonale. È infatti l’unico fattore neu- rs3785817 GG (16.3% vs 4.3%, OR 4.27, p = 0.005), rispetto ai pazienti con esordio dopo i rotrofico la cui carenza geneticamente determinata è causa di malattia nell’uomo (demenza 25 anni. frontotemporale). Nei pazienti con decorso di malattia più aggressivo (MSSS >= 5) è stata osservata una ridotta La PGR può andare incontro a proteolisi da parte di serina proteasi, con formazione di fram- frequenza del genotipo rs5848 CC, rispetto ai pazienti con decorso meno aggressivo (MSSS < menti di minori dimensioni, chiamati granuline (GRN). Tali frammenti hanno funzioni biologiche 5) (25.9% vs 48.5%, OR 0.37, p = 0.004). diverse da quelle della proteina originaria. Mentre la PGR ha attività essenzialmente anti-in- Lo studio è tuttora in corso su una popolazione più ampia di pazienti. fiammatoria, le GRN hanno attività pro-infiammatoria. Il grado di proteolisi di PGR può quindi risultare in una modulazione dell’infiammazione. CONCLUSIONI La PGR potrebbe giocare un ruolo importante nella sclerosi multipla (SM), per le sue funzioni regolative di infiammazione e di fattore neurotrofico. Si è dimostrata la presenza di una aumentata espressione di PGR nel tessuto cerebrale nei casi Gli obiettivi dello studio sono: di SM analizzati, dove, oltre che dai neuroni, PGR è intensamente espressa anche da macro- − valutare l’espressione di PGR nel tessuto cerebrale di casi di SM, rispetto ad aspetti fonda- fagi e microglia. Quindi si è osservato un incremento liquorale di PGR, come atteso dall’intensa mentali della malattia quali demielinizzazione e infiammazione. espressione di PGR nelle lesioni demielinizzanti attive. Tale concentrazione è risultata pure − determinare eventuali correlazioni tra concentrazione di PGR nel liquor e aspetti clinici della incrementata nei pazienti con SM progressiva, probabilmente dovuta all’aumentata attivazione SM. Questa parte dello studio è stata effettuata su campioni di liquor provenienti dagli archivi microgliale diffusa tipica della SM progressiva. Infine si è rilevato come alcuni comuni poli- dell’Univ. di Torino (20 pazienti con SM recidivante-remittente (SMRR) con malattia in fase di morfismi genetici di PGR possano influenzare l’età di esordio e la gravità del decorso clinico stazionarietà, 10 pazienti con SMRR in fase di recidiva clinica di malattia, 10 pazienti con SM della SMRR. Tali risultati suggeriscono un ruolo importante di PGR la cui produzione potrebbe secondariamente progressiva (SMSP)). rappresentare un meccanismo protettivo nella SM, considerata la sua funzione neurotrofica. − valutare se comuni polimorfismi genetici di PGR possono influenzare decorso o età di esordio Inoltre l’equilibrio tra l’azione anti-e pro-infiammatoria di PGR potrebbe rappresentare uno dei della SM. L’analisi genetica di PGR è stata effettuata su una popolazione preliminare di 226 meccanismi di regolazione dell’infiammazione nella SM. pazienti con SMRR, dai Centri SM dell’AOU San Giovanni Battista di Torino e dell’IRCCS Ospe- dale Maggiore Policlinico di Milano. Per descrivere il decorso clinico della SM è stato utilizzato il Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS). ROLE OF PROGRANULIN

RISULTATI IN MULTIPLE SCLEROSIS

A) Espressione di PGR nel tessuto cerebrale in casi di SM e in controlli INTRODUCTION AND AIMS Nel tessuto cerebrale di casi di SM, si osserva una espressione di PGR a livello di cellule infiammatorie come macrofagi e microglia attivata, colocalizzando con HLA-DR e CD68, mentre non Progranulin (PGR) is a multifunctional protein with important roles in inflammation and tissue è osservabile a livello dei linfociti T o B. Una debole immunoreattività citoplasmatica per PGR si repair, and also a neurotrophic factor that enhances neuronal survival and axonal outgrowth osserva anche a livello dei neuroni. (Ahmed, 2007; Eriksen, 2008; Van Damme, 2008). Its importance as a trophic factor is under- 140 Nelle lesioni demielinizzanti attive, si osserva una intensa immunoreattività per PGR a livello dei scored by the fact that PGR is the only neurotrophic factor identified to cause human disease 141 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

(frontotemporal dementia) through null mutations and haploinsufficiency (Baker, 2006). vs. 4.3%, OR 4.27, p = 0.005) was observed, if compared to patients with disease onset after Proteolytic cleavage of the PGR protein by extracellular proteases, such as elastase, produces age 25. smaller fragments termed granulins (GRN) (He, 2003). These fragments have biological fun- Furthermore, in patients with more aggressive disease course (MSSS >= 5) a decreased fre- ctions different from the parent PGR protein. PGR may have pro- or anti-inflammatory proper- quency of the rs5848 CC genotype was observed, if compared to patients with less aggressive ties, depending upon the extent of regulated proteolysis of the anti-inflammatory parent PGR disease course (MSSS < 5) (25.9% vs. 48.5%, OR 0.37, p = 0.004). protein and the generation of pro-inflammatory GRN peptides. Studies have shown that PGR Further analysis of the data is still ongoing. and GRN have different effect on epithelial cells and inflammatory cells. GRN stimulate epithelial cells to secrete interleukin-8, a major chemoattractant for neutrophils and monocytes, whereas CONCLUSIONS PGR has no such effect. PGR inhibits degranulation and respiratory burst of neutrophils activated by TNFα. In contrast, GRN peptides have no inhibitory effect. These observations suggest Here, we have demonstrated an increased expression of PGR in brain tissue in all MS cases in pro-inflammatory and anti-inflammatory roles for GRN and PGR, respectively (Ahmed, 2007). our series. While in normal brain tissue neurons are the main source of PGR, in MS activated PGR, with its functions both as a regulator of inflammation and as a fundamental neurotrophic microglia and macrophages appear to be the predominant cellular sources of PGR. factor, might play a key role in multiple sclerosis (MS). Through this study, we hope to evalua- Moreover we observed increased CSF PGR concentration in active MS patients. PGR CSF te the presence and distribution of PGR in MS brain tissue, correlating it with features such concentration is also increased in SPMS patients, probably due to increased widespread mi- as demyelination and inflammation, to characterize the relationship between Cerebro Spinal croglial activation. Fluid (CSF) PRG and clinical features of the disease, and to determine if common genetic Finally, we have shown that common genetic polimorphisms of PGR may influence age onset polymorphisms of PRG may influence disease course in MS. and clinical severity of RRMS. Production of PGR by microglia and macrophages might represent one of the mechanisms of RESULTS neuroprotective inflammation in MS brains, influencing the survival of different neuronal cell populations in response to noxious stimuli. Furthermore, production of PGR, and more specifically A) Distribution of PGR immunoreactivity in MS and control brain tissue the balance between pro-/anti-inflammatory subforms of PGR, might be important in regulating In MS brain tissue, PGR immunoreactivity was constantly observed on inflammatory cells (ma- inflammation in MS brain tissue. crophages, activated microglia). Weak PGR immunoreactivity was also observed in neuronal cytoplasm. In active demyelinating lesions, intense PGR immunoreactivity was observed on myelin-laden PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI macrophages and activated microglia. In chronic active demyelinating lesions, PGR immunoreactivity was observed in activated microglia at the lesion border. Vercellino M, Grifoni S, Romagnolo A, Masera S, Mattioda A, Trebini C, Chiavazza C, Caligiana L, PGR immunoreactivity was observed also on activated microglia in the NAWM, in progressive Capello E, Mancardi GL, Giobbe D, Mutani R, Giordana MT, Cavalla P. Progranulin expression in brain tissue and cerebrospinal fluid levels in multiple sclerosis. Mult Scler 2011 Oct;17(10): 1194- MS more than in relapsing-remitting MS (RRMS). 201 In cortical GM lesions and in the NAGM, PGR immunoreactivity was observed on activated microglia and neuronal cytoplasm. PGR immunoreactivity was also observed on monocytes/ Vercellino M, Fenoglio C, Mattioda A, Romagnolo R, Matta M, De Riz M, De Matteis F, Giobbe D, macrophages in leptomeningeal inflammatory infiltrates in MS brain tissue. Scarpini E, Galimberti D, Giordana MT, Cavalla P. Progranulin gene variability influences age of In controls, PGR immunoreactivity was only observed in neuronal cytoplasm; no PGR immu- onset and clinical course of relapsing-remitting Multiple Sclerosis. Presentation at the ECTRIMS 2011 and SIN 2011 congresses noreactivity was found in the WM. B) CSF PGRN ELISA This part of the study was performed on CSF samples from the archives of the University of PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 Turin (20 RRMS patients during clinical remission, 10 RRMS patients during clinical relapse, 10 per un periodo di 1 anno - 25.000 € secondary progressive MS (SPMS) patients). No significant difference was found in mean PGR concentration in the CSF between MS (mean 21.32 ng/ml ± SEM 2.14) and control patients (mean 17.15 ng/ml ± SEM 1.60). Mean PGR concentration in the CSF was significantly higher in RRMS during clinical relapse (mean 31.26 ng/ml ± SEM 3.14), and in progressive MS (mean 24.92 ng/ml ± SEM 1.69), than in RRMS during clinical remission (mean 14.56 ng/ml ± SEM 1.54) (p < 0.01). A weak but significant correlation (r = 0.579, p<0.05) was found between PGR CSF concentration and CSF cell count in MS patients. C) Genetic study PGR gene variability has been analyzed in a preliminary sample of 226 patients with RRMS, from the Azienda Ospedaliero-Universitaria San Giovanni Battista of Turin and from the IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico of Milan. MS clinical course has been estimated using the Mul- tiple Sclerosis Severity Score (MSSS). Four tagging single-nucleotide polymorphisms (SNPs) covering the entire PGR sequence were chosen. In addition, rs5848, located in the untranslated region but influencing mRNA transcription, was included as well. In MS patients with disease onset <= age 25, an increased frequency of the rs4792938 CC genotype (23.8% vs. 7.2%, OR 3.99, p = 0.001) and of the rs3785817 GG genotype (16.3% 142 143 CORRELATI FUNZIONALI E STRUTTURALI DELL’ATTIVITÀ DEL NETWORK COGNITIVO IN PAZIENTI CON SM NUOVI METODI DIAGNOSTICI E DIVERSI FENOTIPI DI MALATTIA

atrofia regionale della SG e di distribuzione delle lesioni sono associati alla presenza di deficit cognitivi. I confronti tra gruppi non hanno evidenziato differenze tra i pazienti con RR e deficit RESPONSABILE DEL PROGETTO cognitivi e i pazienti con SM secondariamente progressiva (SP), mentre molte aree sono più MASSIMO FILIPPI atrofizzate nei pazienti con SMSP rispetto a quelli con decorso primariamente progressivo (PP). Professore Nei pazienti con SMRR e SMSP, c’è una corrispondenza tra la localizzazione delle lesioni in Direttore Neuroimaging Research Unit, INSPE, Divisione di Neuroscienze, Fondazione specifiche strutture della sostanza bianca (SB) e della SG (vicine spazialmente o funzionalmen- Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano te correlate), mentre nei pazienti con SMPP tale associazione non è stata trovata. Successiva- mente si è valutata la distribuzione regionale dell’atrofia della SG e SB in un ampio gruppo di Partecipanti: pazienti con SMRR e la relazione tra tali alterazioni e sesso, reperti clinici e carico lesionale. Si MARIA ASSUNTA ROCCA, Assistente di ricerca in neurologia, Ospedale San Raffaele PAOLA VALSASINA, Bioingegnere, Ospedale San Raffaele è riscontrato che esistono diversi pattern di distribuzione regionale dell’atrofia con un rispar- VITTORIO MARTINELLI, Direttore Unità Trials clinici, Ospedale San Raffaele mio della SG nelle regioni sottotentoriali. Sesso, durata di malattia e disabilità clinica alterano BRUNO COLOMBO, Neurologo ricercatore, Ospedale San Raffaele diversamente la distribuzione dell’atrofia regionale, mentre le lesioni giocano un ruolo modesto. MONICA FALAUTANO, Direttore Unità di Neuropsicologia, Ospedale San Raffaele Infine, si è applicata la sequenza DIR e quella in diffusione per quantificare il danno microstrut- ANDREA FALINI, Direttore Dipartimento di Neuroradiologia, Ospedale San Raffaele turale di lesioni corticali e SG apparentemente normale in pazienti a diversi stadi di malattia. GIANCARLO COMI, Direttore del Dipartimento di Neurologia, Ospedale San Raffaele Abbiamo trovato che natura ed entità del danno a livello delle lesioni corticali contribuiscono nel differenziare i diversi fenotipi di malattia. PREMESSE E OBIETTIVI CONCLUSIONI I disturbi cognitivi sono riportati in una percentuale variabile tra il 30 ed il 60% dei pazienti con I disturbi cognitivi sono riportati in una percentuale variabile tra il 30 ed il 60% dei pazienti sclerosi multipla (SM). Studi di risonanza magnetica (RM) convenzionale hanno dimostrato con SM. Nonostante l’elevata prevalenza e il drammatico effetto che questo sintomo ha nella scarse correlazioni tra il livello di compromissione cognitiva e l’estensione delle alterazioni en- vita quotidiana dei pazienti, i suoi substrati anatomici e funzionali non sono stati ancora chia- cefaliche in questi pazienti. Uno dei fattori che è stato considerato per spiegare la discrepanza riti completamente. La nostra ricerca ha contribuito ad ottenere nuovi importanti dati circa i tra misure di RM e misure cliniche nella malattia è la variazione interindividuale dei meccanismi substrati anatomici e funzionali responsabili della presenza e della gravità del deficit cognitivo di plasticità corticale. Molto di quello che conosciamo circa le funzioni cognitive in pazienti con in pazienti con questa malattia. Abbiamo, inoltre, evidenziato nuovi meccanismi patogenetici SM deriva da studi dove è stato somministrato un compito attivo. Tuttavia, diversi studi hanno responsabili dell’eterogeneità clinica dei fenotipi di malattia. Tutto questo potrebbe guidare in identificato la presenza di un’attività spontanea a riposo dei network cerebrali (incluso il “default un prossimo futuro nuove strategie farmacologiche e riabilitative. mode network” [DMN]) anche in assenza di specifiche istruzioni cognitive (resting state [RS]). Usando tale approccio, alcuni studi hanno descritto una disorganizzazione funzionale del cervello con l’invecchiamento o in pazienti con patologie neurodegenerative e psichiatriche. Lo scopo principale di questo progetto è stato di approfondire la conoscenza dei meccanismi FUNCTIONAL AND STRUCTURAL CORRELATES OF responsabili della sindrome da disconnessione cortico-sottocorticale nei pazienti con SM e COGNITIVE NETWORK FUNCTION IN MS PATIENTS lieve/moderata compromissione cognitiva. Il progetto si è principalmente focalizzato sull’indagine dei substrati funzionali e strutturali responsabili della disfunzione del lobo frontale in questi WITH DIFFERENT DISEASE PHENOTYPES pazienti, allo scopo di valutare i correlati funzionali dell’esecuzione del compito di Stroop nei pazienti con SM, esplorare, utilizzando la RS RM funzionale (RMf), se la malattia altera l’attività INTRODUCTION AND AIMS funzionale intrinseca del cervello e infine stimare le correlazioni tra le alterazioni riscontrate con la RMf e la gravità del danno encefalico strutturale nei pazienti con SM a diversi stadi della Cognitive impairment affects 30-60% of MS patients. Although conventional MRI studies have malattia. shown that the degree of cognitive impairment in MS patients is correlated with the extent and severity of brain structural abnormalities, this correlation remains weak. The application RISULTATI of modern, MR-based techniques to the study of MS patients is increasing dramatically the understanding of MS pathophysiology and the mechanisms responsible for the accumulation Abbiamo acquisito un protocollo di RM (a 3.0 Tesla) strutturale (doppio eco, “double inversion of irreversible disability. In this context, one of the factors which has been advocated to ex- recovery” (DIR), 3D T1 e diffusione) e funzionale (RS e compito Stroop) in 60 pazienti con SM plain the well-known clinical/conventional MRI discrepancy in MS is the interindividual variation (diversi fenotipi; valutazione sia clinica con “Expanded Disability Status Scale” (EDSS sia neu- in brain plasticity. Much of what is currently known about cognitive function in MS derives ropsicologica) e 30 controlli sani. from studies where a task or stimulus has been administered. However, several studies have Nei pazienti con SM progressiva abbiamo trovato che un’alterazione della connettività funzio- identified spontaneous activity in functionally distinct networks (including the default model nale delle regioni anteriori del DMN è tra i fattori responsabili della presenza di deficit cognitivi. Il network [DMN]) in the absence of specific cognitive instructions (resting state [RS]). Using this danno strutturale di corpo calloso e cingolo è correlato alla severità del deficit cognitivo e delle “cognitively unbiased” approach, recent reports noted disruptions of intrinsic brain functional alterazioni del DMN. In un secondo studio, abbiamo esplorato le modificazioni delle connes- organization with normal aging and in patients suffering from neurodegenerative or psychiatric sioni funzionali tra cervelletto e aree prefrontali in pazienti con diversi fenotipi di SM durante il disorders. Against this background, the main aim of the project was to investigate cortico- compito Stroop, evidenziando che, nella SM, una modifica delle attivazioni e della connettività subcortical disconnection mechanisms in MS patients with mild cognitive impairment, with a effettiva tra cervelletto destro e aree dei lobi fronto-parietali determina un’inefficace riorganizza- focus on the investigation of structural MRI and functional MRI (fMRI) substrates of frontal lobe zione corticale con incremento del carico cognitivo. Infine, in un ampio gruppo di pazienti con dysfunction in these patients. To this aim, we investigated the functional correlates of Stroop SM a ricadute e remissioni (RR), abbiamo trovato alterazioni all’interno e tra i diversi network performance in MS patients, we explored, using RS fMRI, whether MS affects the intrinsic brain cerebrali, correlate con il carico lesionale e con il grado di disabilità clinica. functional activity and finally we assessed the magnitude of the correlation between cognitive- Usando una sequenza volumetrica 3D T1 e un’analisi morfometrica, abbiamo valutato la distri- related cortical changes and the severity of macroscopic and microscopic brain tissue damage 144 buzione regionale dell’atrofia della sostanza grigia (SG). Si è riscontrato che pattern distinti di in MS patients at different stages of the disease. 145 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

We acquired structural (dual-echo, double inversion recovery, 3D T1-weighted and diffusion Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V., Radaelli M., Falini A, Comi G, Filippi M. Mapping tensor [DT] MRI sequences) and functional MRI (resting state [RS] sequence and Stroop-word regional gray and white matter atrophy in relapsing remitting multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal, In press task) in 60 MS patients with different disease phenotypes and 30 healthy controls, using a 3.0 Tesla scanner. Pagani E, Rocca MA, Preziosa P, Copetti M, Mesaros S, Colombo B, Horsfield MA, Falini A, Comi All patients underwent clinical evaluation, with rating of the Expanded Disability Status Scale G, Lassmann H, Filippi M. Microstructural MR imaging of cortical lesions in multiple sclerosis phe- (EDSS) score and neuropsychological assessment. notypes. Platform presentation, 64th American Accademy of Neurology, 2012 In patients with progressive MS, we found that the disruption of the anterior components Rocca MA, Valsasina P, Preziosa P, Riccitelli G, Martinelli V, Falini A, Comi G, Filippi M. Functional of the DMN is among the factors responsible for the presence of cognitive impairment (CI). connectivity abnormalities and cognitive impairment in relapse-onset MS patients: a whole-brain Structural damage to the corpus callosum and cingulum was strictly related to the severity of functional network connectivity analysis. Poster, 64th American Accademy of Neurology, 2012 cognitive impairment and DMN abnormalities. In a second step, we explored the modification of the connections between cerebellar and prefrontal areas in patients with different MS clinical Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Patterns of phenotypes during Stroop performance and we found that MS patients experience different regional gray and white matter atrophy are associated to PASAT and SDMT performances in relapsing remitting multiple sclerosis patients. Poster, 64th American Accademy of Neurology, 2012 abnormalities of activations and effective connectivity between the right cerebellum and fronto- parietal areas, which contribute to inefficient cortical reorganization with increasing cognitive Valsasina P, Rocca MA, Martinelli V, Messina R, Misci P, Falini A, Comi G, Filippi M. Large-scale load. Finally, in a large group of patients with relapsing remitting (RR) MS, we found that fun- neuronal tetwork dysfunction in relapsing remitting multiple sclerosis. Poster, 64th American Ac- ctional abnormalities within and between large-scale neuronal networks occur and are related cademy of Neurology, 2012 to the extent of T2 lesions and the severity of disability. Pagani E, Rocca MA, Preziosa P, Mesaros S, Colombo B, Horsfield MA, Falini A, Comi G, Filippi M. Using 3D-T1 weighted sequence and voxel-based morphometry (VBM) analysis, we investiga- Principal diffusion direction in relation to the geometry of the cortical surface in multiple sclerosis. ted the regional distribution of gray matter (GM) atrophy in our patients and their relationship e-poster, ISMRM 2012 with CI, focal lesions and clinical disability. We found that distinct patterns of regional GM atrophy and lesions are associated with CI in MS patients. The between-group comparisons Rocca MA, Valsasina P, Preziosa P, Riccitelli G, Martinelli V, Falini A, Comi G, Filippi M. Functional showed no difference between CI RRMS and secondary progressive (SP) MS patients, whi- connectivity abnormalities and cognitive impairment in relapse-onset MS patients: a whole-brain functional network connectivity analysis. e-poster, ISMRM 2012 le several areas were significantly more atrophied in SPMS vs. primary progressive (PP) MS patients. In RRMS and SPMS patients a correspondence was found between location of T2 Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Patterns of lesions in specific WM structures and GM atrophy spatially closed or functionally linked to these regional gray and white matter atrophy are associated to PASAT and SDMT performances in re- structures; in PPMS such an association was not found. lapsing remitting multiple sclerosis patients. Poster, ISMRM 2012 In a second step, we investigated the regional distribution of GM and WM atrophy in a large Riccitelli G, Rocca MA, Forn C, Falini A, Pagani E, ME Rodegher, Falautano M, Rossi P, Comi G, group of RRMS patients and their relationship with gender, clinical findings, and T2 lesions. We Filippi M. Patterns of regional gray matter atrophy and cognitive impairment in multiple sclerosis found that GM and WM atrophy have distinct patterns of regional distribution, with a sparing of patients with different disease phenotypes. HSR Scientific Retreat, Stresa 2011 GM infratentorial regions. Gender, disease duration and disability affected differently the topography of GM/WM atrophy, while T2 lesions played a modest role. Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional Finally, we used double inversion recovery (DIR) and DT MRI to quantify tissue damage in cor- gray and white matter atrophy are largely unrelated in relapsing remitting multiple sclerosis. 63nd American Accademy of Neurology, 2011 tical lesions (CLs) and the apparently normal cortex in patients with MS at different stages of the disease. We found that the nature and extent of CL damage contribute to distinguish the Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M Voxel-wise asses- different MS clinical phenotypes. sment of white matter architecture integrity in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. 63nd American Accademy of Neurology, 2011 CONCLUSIONS Pagani E, Rocca MA, Riccitelli G, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional gray and white matter atrophy are largely unrelated in relapsing remitting multiple sclerosis. ISMRM, Cognitive impairment is described in 30-60% of patients with MS. Despite this high prevalence 2011 and the dramatic effect that this symptom have on patients’ daily life activity, its anatomical and functional substrates have not been fully elucidated yet. Our research has contributed to Pagani E, Rocca MA, Riccitelli G, Martinelli V, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. provide some important pieces of information regarding the functional and structural substra- Voxel-wise assessment of WM architecture integrity in MS patients with different clinical phenotypes. ISMRM, 2011 tes responsible for the presence and severity of cognitive impairment in patients with MS. We have also obtained novel insights on the mechanisms responsible for the clinical heterogeneity Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. Voxel-wise as- of MS clinical phenotypes. All of this is likely to guide future pharmacological and rehabilitative sessment of white matter architecture integrity in patients with relapsing remitting multiple scle- strategies. rosis. ISMRM, 2011 Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional grey matter atrophy is largely unrelated to white matter tissue loss in relapsing-remitting multiple sclerosis. 21st Meeting of the European Neurological Society, 2011

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. Voxel-wise assessment of WM architecture integrity in MS patients with different clinical phenotypes. 21st Meeting of the European Neurological Society, 2011 146 147 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. White matter Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, architecture integrity studied with DT MRI in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Filippi M. Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secon- 20th Meeting of the European Neurological Society, 2011 dary progressive multiple sclerosis. ECTRIMS Meeting, 2009

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Rodegher M, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. Cognitive im- Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Rossi P, Rodegher ME, Falini A, Comi G, Filippi M. pairment in multiple sclerosis is associated to different patterns of gray matter atrophy according Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secondary pro- to clinical phenotype. Hum Brain Mapp 2011; 32: 1535-1543 gressive multiple sclerosis. SIN Meeting, 2009

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional Riccitelli G, Rocca MA, Forn C, Falini A, Pagani E, ME Rodegher, Falautano M, Rossi P, Comi G, grey matter strophy is largely unrelated to white matter tissue loss in relapsing-remitting multiple Filippi M. Patterns of Gray Matter Atrophy and Cognitive Impairment in Multiple Sclerosis Patients sclerosis. 5th joint ECTRIMS/ACTRIMS triennial congress, 2011 with Different Disease Phenotypes. Thirteenth Advanced Course: Magnetic Resonance Techiques in Multiple Sclerosis, Milan 2009 Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. Voxel-wise assessment of WM architecture integrity in MS patients with different clinical phenotypes. 5th joint ECTRIMS/ACTRIMS triennial congress, 2011 PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008 per un periodo di 2 anni - 130.000 € Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional gray matter atrophy is largely unrelated to white matter tissue loss in relapsing remitting multiple sclerosis. XLII Congresso della Società Italiana di Neurologia, 2011

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. Voxel-wise assessment of WM architecture integrity in MS patients with different clinical phenotypes. XLII Congresso della Società Italiana di Neurologia, 2011

Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Agosta F, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secondary progressive multiple sclerosis. HSR Scientific Retreat, Stresa 2010

Riccitelli G, Rocca MA, Forn C, Falini A, Pagani E, ME Rodegher, Falautano M, Rossi P, Comi G, Filippi M. Patterns of Regional Gray Matter Atrophy and Cognitive Impairment in Multiple Sclerosis Patients With Different Disease Phenotypes. 62nd American Academy of Neurology, 2010

Riccitelli G, Rocca MA, Forn C, Falini A, Pagani E, ME Rodegher, Falautano M, Rossi P, Comi G, Filippi M. Patterns of Regional Gray Matter Atrophy and Cognitive Impairment in Multiple Sclerosis Patients with Different Disease Phenotypes. ENS Meeting, 2010

Riccitelli G, Rocca MA, Forn C, Falini A, Pagani E, ME Rodegher, Falautano M, Rossi P, Comi G, Filippi M. Patterns of regional gray matter atrophy and cognitive impairment in multiple sclerosis patients with different disease phenotypes. ISMRM Meeting, 2010

Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Rodegher ME, Misci P, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. Default-mode network dysfunction and cognitive impairment in progressive MS. Neuro- logy. 2010; 74: 1252-1259

Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Rossi P, Rodegher M, Falini A, Comi G, Filippi M. Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secondary progressive multiple sclerosis. Neurol Sci 2009; 30:S311-S312

Absinta M, Rocca MA, Valsasina P, Riccitelli G, Agosta F, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secondary progressive multiple sclerosis. Neurology 2009; 72 Suppl 3: A138-139

Absinta M, Rocca MA, Valsasina P, Riccitelli G, Agosta F, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. Disruption of the Default Mode Network in Patients with Primary Progressive and Secondary Progressive Multiple Sclerosis. 61nd American Accademy of Neurology, 2009

Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M. Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and se- 148 condary progressive multiple sclerosis. 19th Meeting of the European Neurological Society, 2009 149 IDENTIFICAZIONE DI FATTORI PROGNOSTICI CONDIZIONANTI L’ESITO A LUNGO TERMINE DELLA NUOVI METODI DIAGNOSTICI SCLEROSI MULTIPLA: ESTESA ANALISI DEL DATABASE DI LONDON ONTARIO

RESPONSABILE DEL PROGETTO iniziale conversione a SM SP dettano i tempi del decorso clinico la cui evoluzione è peraltro PAOLO MURARO uniforme. L’esordio della fase SP rappresenta pertanto uno spartiacque tra due fasi di malat- Clinical Reader in Neuroimmunolgy tia indipendenti tra loro. Infine abbiamo dimostrato che pazienti con esordio ad età avanzata Centre of Neuroscience, Division of Experimental Medicine, Department of Medicine sono a più alto rischio di entrare nella fase SP e pertanto hanno un maggior rischio di prognosi Imperial College, Hammersmith Hospital, London (UK) sfavorevole. Tuttavia il decorso clinico durante la fase progressiva non è influenzato dall’età di esordio né della fase RR né della fase SP. La fase progressiva, preceduta (SP) o no (decorso Collaboratori: primariamente progressivo, PP) dalla fase RR, inizia alla stessa età media fra i pazienti, e con- ANTONIO SCALFARI duce al raggiungimento di alti livelli di disabilità alla stessa età media (RR/SP Vs PP: DSS 6: 49 GEORGE EBERS Vs 48; DSS 8: 58 Vs 58; DSS 10: 78 Vs 78 anni). Collaborazioni con altri gruppi: MARTIN DAUMER, SYLVIA LAWRY, Centre, Munich (GER) CONCLUSIONI ANNEKE NEUHAUS, SYLVIA LAWRY, Centre, Munich (GER) I risultati non supportano una stretta correlazione tra attacchi infiammatori e meccanismi responsabili dell’accumulo di disabilità permanente e suggeriscono altri fattori patogenetici. La PREMESSE E OBIETTIVI frequenza delle ricadute cliniche precoci (2 anni dall’esordio) ha un valore predittivo riguardo l’evoluzione clinica. Il raggiungimento di elevati livelli di disabilità è verosimilmente legato ai La sclerosi multipla è una malattia dal decorso altamente imprevedibile. Può presentarsi in meccanismi che conducono all’esordio della fase SP, probabilmente già attivi nelle fasi iniziali maniera aggressiva, determinando grave disabilità entro un breve periodo, o mostrare un com- di malattia, che pertanto rappresentano una finestra di opportunità terapeutica. Quindi, una portamento benigno senza determinare importante disabilità anche dopo diversi anni. La va- stratificazione in base all’età dovrebbe essere attentamente considerata nella pianificazione dei riabilità del decorso clinico crea diverse problematiche nella gestione del paziente, per il quale, trial clinici. In conclusione, abbiamo identificato che un’alta frequenza di attacchi nei primi due allo stato attuale, non è ancora possibile dare una valutazione prognostica sulla base delle anni ed una età più avanzata all’esordio sono due criteri base che possono essere impiegati osservazioni cliniche relative ai primi anni di malattia, al fine di selezionare interventi terapeutici per identificare gruppi di pazienti ad alto rischio di disabilità nei quali è indicato un approccio commisurati al rischio di sviluppo di grave disabilità. Capire la storia naturale di questi specifici terapeutico più aggressivo. sottogruppi rappresenta un passo fondamentale per la futura programmazione di studi clinici. Lo scopo della nostra ricerca è stato di evidenziare fattori prognostici precoci che ci permettono di prevedere la prognosi a lungo termine, attraverso l’analisi del London Ontario database. IDENTIFICATION OF EARLY PROGNOSTIC Il London Ontario database include più di 1000 pazienti osservati per 28 anni, tra il 1972 e il 2000. Grazie allo studio della storia naturale della malattia e del valore prognostico di diversi FACTORS AFFECTING THE LONG-TERM OUTCOME fattori clinici e demografici, in particolare età e attacchi infiammatori, abbiamo cercato di co- IN MS: EXTENSIVE ANALYSIS OF THE LONDON struire e testare modelli predittivi del decorso a lungo termine, allo scopo di quantificare per ogni singolo paziente il rischio di raggiungimento di livelli di disabilità da moderati a severi come ONTARIO DATABASE ad esempio l’uso di appoggio durante la deambulazione, l’essere costretti a letto o il decesso in tempi specifici. Ci siamo inoltre focalizzati sugli aspetti clinici potenzialmente associati ad un INTRODUCTION AND AIMS decorso particolarmente aggressivo della malattia con lo scopo di porre le basi per l’utilizzo più razionale in futuro di terapie immunosoppressive. Clinical severity of MS ranges from benign (no disability after 15 years of disease) to malignant forms, characterized by an aggressive course with accumulation of severe disability or death RISULTATI within a short time. It is particularly important that this variability is taken into account both in clinical practice and in randomised controlled studies design. A major challenge is to predict Ci siamo focalizzati sul valore prognostico di attacchi infiammatori ed età, valutando i tempi the long term clinical evolution of individual patients on the basis of observations taken during di raggiungimento della fase progressiva e di alti livelli di disabilità (DSS 6 = uso di appoggio an early stage of the disease. Prognostic prediction would allow offering more intense disease- unilaterale, DSS 8 = essere ristretti a letto, DSS 10 = il decesso). Abbiamo identificato caratte- modifying therapies to those at higher risk of major disability and avoiding unnecessary drugs ristiche clinico-demografiche presenti nelle fasi iniziali della malattia che si associano ad un più to those destined to have a benign course. The clinical effects of therapies may vary largely de- alto rischio di diventare secondariamente progressivi (SP) e conseguentemente di accumulare pending on different forms and stages of disease evolution. Clinical trials increasingly attempt disabilità. Tali informazioni permettono di selezionare sottogruppi di pazienti con alta probabilità to reduce the heterogeneity of responses to treatment by selecting specific subpopulations of di decorso aggressivo e che pertanto possono beneficiare di un approccio terapeutico più patients. Therefore, it is important to understand the natural history of MS in these subgroups. incisivo. Gruppi di pazienti con un alto (≥5), intermedio (3-4) e basso (1-2) numero di attacchi Aim of this study was to investigate early prognostic factors predicting the long-term clinical (esacerbazioni cliniche) durante la fase recidivante remittente (RR) hanno raggiunto alti livelli outcome in MS by analysing the London Ontario (LO) database. This is one of the largest di disabilità in tempi simili, dimostrando che la frequenza delle ricadute non è correlata con la collection of MS data from more than 1000 patients longitudinally followed up for 28 years. severità del decorso clinico. Tuttavia, il numero di riesacerbazioni durante i primi due anni di Studying the natural history and the prognostic value of many demographic and clinical va- malattia ha un valore predittivo e può essere usato per selezionare pazienti a più alto rischio di riables, particularly age and inflammatory attacks, we planned to construct and test models disabilità. Ciò nonostante è improbabile che ci sia un rapporto causa-effetto, poiché anche tra predicting disability. We aimed to construct an algorithm to quantify risk of individual subjects of coloro che hanno un’ intermedia/alta frequenza di attacchi (≥ 3) nei primi due anni di malattia, developing a progressive course and of reaching a hard level of disability such as requiring use il 35% non sono mai successivamente entrati nella fase progressiva. La latenza dell’inizio della of a cane, becoming wheelchair-bound, bedridden and dying from MS at defined time points. fase progressiva condiziona la probabilità di accumulo di disabilità dall’esordio ma non influen- We also aimed to identify clinical features predicting an aggressive behaviour of the disease, 150 za l’andamento della fase progressiva stessa, dimostrando che i meccanismi che portano alla which will allow in future a more rationale use of experimental therapies. 151 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

RESULTS PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

We then extensively investigated the effects of (i) relapses and (ii) age on (a) latency to progres- Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Ebers GC and Muraro PA. Age and disability accumulation in sion and (b) time to hard outcomes. We identified early clinical features affecting the probability multiple sclerosis. Neurology 2011. 27;77 (13): 1246-52 of and the latency to the secondary progressive (SP) phase and ultimately the attainment of Nicholas R, Giannetti P, Alsanousi A, Friede T and Muraro PA. Development of oral immunomodu- hard disability outcomes. This information can help identify subgroups of patients more likely latory agents in the management of multiple sclerosis. Drug Design, Development and Therapy. to experience a more aggressive behaviour and therefore to benefit from more aggressive 2011. 5 (1): 255-274. DOI: 10.2147/DDDTS10498 therapies. We demonstrated that the total number of attacks before the onset of SP is not a reliable indicator of disease severity. Times to disability endpoints (disability status scale, DSS 6 Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Ebers G and Muraro PA. Age and disability accumulation in multiple sclerosis, American Academy Neurology 2011, Honolulu (US) = requiring walking aid; DSS 8 = being bedbound; DSS10 = dying from MS) were equal among groups with high (≥5), intermediate (3-4) and low (1-2) numbers of relapses during the relap- Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. High early relapse frequency and sing remitting (RR) phase. However, early relapses frequencies (during first two years of the disability accumulation in multiple sclerosis. American Academy Neurology 2011, Honolulu (US) disease) predict late outcomes and can be used for selecting patients more likely to have poor prognosis. Nevertheless, a causative association remains unlikely. Indeed, among those with ≥ Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. Inflammation and disability accumulation: do relapses really matter. ECTRIMS 2011, Amsterdam 3 attacks during the first two years (“frequent early relapsers”) 35% did not even enter SP and the remaining 65% became SP and had a rapid disease course, indicating that mechanisms Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. The onset of the SP phase is the key leading to SP MS are not well explained by inflammatory attacks alone. In contrast, the latency determinant of long term disease evolution. ECTRIMS 2011, Amsterdam to SP is a strong predictor of long-term evolution, dictates the tempo of disability accumulation and accounts for the variability of disease course among patients. We demonstrated that lon- Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. Secondary progressive multiple sclerosis as an outcome: predictive factors ger time to SP was associated with lower probability of developing severe disability and with * awarded as second best poster presentation. European Charcot Foundation Symposium 2011, Marbella (SPA) longer times to endpoints from disease onset. However, the slope of the SP phase (time from SP to DSS levels) was not affected by duration of the RR phase, confirming that the onset of Scalfari A. High early relapses frequency and late outcome in Multiple Sclerosis. MS Frontiers progression represents a watershed between two independent stages of the disease. Finally 2011, London (UK) we showed that age, independent of the number of early relapses, strongly affects the proba- Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro P, Ebers G. Factors affecting time to second attack in bility of experiencing a progressive course and is therefore an important determinant of long- relapsing remitting patients. ECTRIMS 2010, Gothenburg (Sweden) term prognosis. Subjects who are older at RR onset have significantly higher risk of becoming progressive and shorter times to SP and to disability outcomes. However, disease evolution Daumer M, Neuhaus A, Thiele A, Leray E, Scalfari A, Edan G, Ebers G. Similarities and differences during the SP phase is not affected by age at RR onset. In addition ages at the onset of SP between two major multiple sclerosis natural history studies. ECTRIMS 2010, Gothenburg (Swe- phase and of primary progressive (PP) disease do not influence times from onset of progres- den) sion to disability endpoints. The progressive course, preceded or not by the RR phase, starts Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. The effect of relapses and time to at remarkably similar ages and its evolution, homogenous among progressive subtypes, leads onset of progression on disability accumulation in multiple sclerosis. CoNy (controversies in neu- to the attainment of moderate to severe disability milestones at the same median ages in RR/ rology) 2010, Barcelona (Spain)* SP and PP patients (DSS 6: 49 Vs 48 years; DSS 8: 58 Vs 58 years; DSS 10: 78 Vs 78 years, *Awarded as best poster presentation in category “multiple sclerosis” respectively. Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. The effect of relapses and latency to progression on disease evolution in multiple sclerosis. European Charcot Foundation Symposium CONCLUSIONS 2010, Fiuggi (IT)

Our results do not support a strong correlation between inflammatory attacks and mecha- Scalfari A, Neuhaus A, Degenhardt A, Rice GP, Muraro PA, Daumer M and Ebers GC. The natural nisms driving disability accumulation, suggesting a role of other pathogenetic mechanisms. history of multiple sclerosis, a geographically based study 10: relapses and long-term disability. Brain 2010 133: 1914-1929 Early relapse frequency (2 years from onset) has some predictive value towards later evolution of disability. Attainment of severe disability is induced by mechanisms tied to the onset of SP Scalfari A, Nicholas R, Malik O and Muraro PA. Escalating Immunotherapies for highly active mul- and probably already active during the early RR phase, representing the only window for thera- tiple scelrosis: reviewing the evidence. CML-Multiple Sclerosis 2010; 2(3):61-73 peutic opportunity. The onset of progression, the key determinant of prognosis, should be the target of future therapies. Given the strong effect of age on the conversion to the SP phase, Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Ebers G, Muraro PA. The effect of age on disability development in multiple sclerosis. ENS 2010, Berlin (Germany) attention should be paid to stratification by age in randomized clinical trials. Therefore, high early (≤ 2 years) relapse frequency and older age at RR onset can be used for selecting groups Scalfari A. The role of relapses affecting the long-term disability outcome in MS. 1st International of patients at higher risk of entering the SP phase for whom a more aggressive therapeutic Conference on Clinical Neuroepidemiology, Munich (August 2009) (GER) approach is warranted. Scalfari A, Degenhardt A, Neuhaus A, Harner N,Seemueller S, Nicholas R, Muraro P, Daumer M, Ebers G. The Role of Relapses Affecting the Long- Term Disability Outcome in the London Ontario Multiple Sclerosis Database. Neuroepidemiology Aug 2009; 33:131–223 SS3/2

Scalfari A. The role of relapses affecting the long-term disability outcome in MS. FISM (Italian MS federation) annual meeting (MAY 2009): Rome (IT)

152 153 NUOVI METODI DIAGNOSTICI

Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Ebers G and Muraro PA. Age and disability in the London On- tario Multiple Sclerosis database. European Charcot Foundation Symposium 2009, Lisbon (PO)

Neuhaus A, Strobl R, Daumer M, Scalfari A, Muraro P, Ebers G. Analysis of long-term clinical outcome in MS – a longitudinal approach. ECTRIMS 2009 (GERMANY)

Scalfari A, Neuhaus A, Harner N, Seemueller S, Ebers G, Daumer M and Muraro PA. New criteria for defining “Death due to Multiple sclerosis” and assessment of survival in the London Ontario database. MS Frontiers 2009 (MS UK Society) London (UK)

Scalfari A and Muraro PA. The Natural History of Multiple Sclerosis: Comparative Analysis of the London Ontario and Lyon Databases. Young Scientist Day (Imperial College), London (UK), May 2008

Scalfari A, Neuhaus A, Harner N, Seemueller S, Nicholas R, Ebers G, Daumer M and Muraro PA. The London Ontario Database: descriptive analysis after 25 years of follow-up. ECTRIMS 2008, Montreal (CA)

Scalfari A, Degenhardt A, Neuhaus A, Harner N, Seemueller S, Nicholas R, Muraro PA, Daumer M and Ebers G. The role of relapses affecting the long-term disability outcome in MS in the London Ontario database. ECTRIMS 2008, Montreal (CA)

Scalfari A. The long term evolution of Multiple Sclerosis. State of the art and future prospective in MS; Biella (IT)

PROGETTO FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 2 anni - 60.000 €

154 155 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2011 BANDO RICERCA FISM 2011 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2011

CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA La deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAs bersaglio causa un difetto nel circuito di retroazione negativa che sopprime l’infiammazione in pazienti con sclerosi multipla CRISTINA AGRESTI Progetto di ricerca E 80.000,00 | 1 anno Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Roma Studio del ruolo dei recettori del TNF durante i processi di demielinizzazione e FRANCESCA GILLI rimielinizzazione Istituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Progetto di ricerca E 117.600,00 | 2 anni Clinica, Orbassano, Torino La deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAs bersaglio causa un difetto nel circuito FRANCESCA ALOISI di retroazione negativa che sopprime l’infiammazione in pazienti con sclerosi multipla Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Roma Progetto di ricerca E 80.000,00 | 1 anno Analisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr e della risposta immunitaria nel fluido cerebrospinale e nel sangue di pazienti con sclerosi multipla mediante tecniche BRUNO GRAN altamente sensibili di PCR University of Nottingham, Division of Clinical Neurology, Nottingham (UK) Progetto di ricerca E 97.000,00 | 1 anno Modulazione dell’ equilibrio tra cellule T regolatrici e T helper 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioni per la sclerosi multipla VINCENZO BARNABA Progetto di ricerca E 28.000,00 | 2 anno Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Roma ROBERTA MAGLIOZZI Immuno-attivazione cronica nella sclerosi multipla Istituto Superiore di Sanità, Biologia Cellulare e Neuroscienze, Roma Progetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno Studio neuropatologico e molecolare mirato a comprendere la relazione tra processo infiammatorio nelle meningi e danno cerebrale corticale nella sclerosi multipla LUCA BATTISTINI Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Fondazione Santa Lucia, Neuroscienze Sperimentali, Roma Ruolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come la flora intestinale influenza le MARA MARONGIU risposte autoimmuni CNR- Consiglio Nazionale delle Ricerche, IRGB- Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica Progetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno Cittadella Universitaria Monserrato, Monserrato, Cagliari Studio del meccanismo funzionale alla base dell’associazione di CBLB con la PAOLA CAIAFA sclerosi multipla Sapienza Università di Roma, Facoltà di Farmacia e Medicina, Dipartimento di Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Roma Riprogrammazione epigenetica nella sclerosi multipla STEFANO MORARA Progetto di ricerca E 40.000,00 | 1 anno Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze, Milano Ruolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) nella patogenesi dell’EAE PAOLO CALABRESI Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni Università di Perugia, Clinica Neurologica, Laboratori di Neurologia Sperimentale Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche e Sanità Pubblica, Ospedale S Maria FRANCESCO NOVELLI della Misericordia, Perugia Università di Torino Dipartimento Medicina e Oncologia Sperimentale, Centro Ricerche Uno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterata plasticità sinaptica in modelli Medicina Sperimentale, AOU San Giovanni Battista, Torino sperimentali di sclerosi multipla Regolazione interferone-dipendente dei linfociti Th17 e Th22 nella sclerosi multipla Progetto di ricerca E 35.000,00 | 1 anno Progetto di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

ANNALISA CHIOCCHETTI STEFANO PREVITALI IRCAD & Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento Scienze Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE, Divisione di Neuroscienze, Mediche, Novara Milano Ruolo di Osteopontin a degli anticorpi anti-Osteopontina nella sclerosi multipla Ruolo di COP5/Jab1 nella mielinizzazione e nella rimielinizzazione del Sistema Nervoso Progetto di ricerca E 70.000,00 | 3 anni Centrale (CNS) Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni SANDRA D’ALFONSO Università degli Studi del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di MARCO SALVETTI Scienze Mediche, Novara Sapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali Studio delle alterazioni nelle risposte antivirali dell’immunità innata in pazienti con SM Dipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, Roma Progetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno Caratterizzazione dei genoptipi del virus di Epstein-Barr nella sclerosi multipla attraverso approcci di sequenziamento massivo FRANCESCA GILLI Progetto di ricerca E 150.000,00 | 1 anno Istituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia 158 Clinica, Orbassano, Torino 159 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2011

ANTONIO UCCELLI QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE Università di Genova, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Genova Studio di un modello murino transgenico per la caratterizzazione del proteoglicano MARTA BASSI NG2/CSPG4 nella patogenesi della sclerosi multipla Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Cliniche, Milano Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni Il sistema della cura: promozione del benessere tra persone con sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitari FLAVIA VALTORTA Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Neuropsicofarmacologia Sperimentale, Milano MARCO BOVE Ruolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nella modulazione dell’attività e della Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di composizione presinaptica: nuove prospettive nella ricerca sulla sclerosi multipla Fisiologia Umana, Genova Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno L’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale: verso la personalizzazione di interventi terapeutici in pazienti affetti LAURA BERGAMASCHI da sclerosi multipla Duke University - Medical Center, Center for Human Genetics, Durham, NC Progetto di ricerca E 146.000,00 | 1 anno Analisi molecolare dell”espressione allele specifica di IL-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da IL-7 in cellule: mDC, CD4+ e CD8+ isolate da pazienti con sclerosi FLAVIA MATTIOLI multipla e controlli sani Spedali Civili di Brescia, UO Riabilitazione Specialistica, Brescia Progetto di ricerca E 37.000,00 | 1 anno L’efficacia della stimolazione tramite tDCS (transcranial Direct Current Stimulation) nella riabilitazione cognitiva della sclerosi multipla: studio clinico controllato GIUSEPPE CHIAPPETTA Progetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno Istituto Superiore di Sanità Reparto di Malattie infiammatorie e demielinizzanti del sistema nervoso, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Roma FRANCA TECCHIO Ricerca di interazioni patogeneticamente rilevanti tra EBV e il retrovirus endogeno della Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ISTC, LET’S, Dip. di Neuroscienze Ospedale famiglia W MSRV nel cervello con sclerosi multipla Fatebenefratelli, Roma Borsa di addestramento E 22.000,00 | 1 anno Alleviare la Fatica nella sclerosi multipla mediante stimolazione transcranica in corrente continua (tDCS): è possibile differenziare target di stimolazione entro le cortecce DILETTA DI MITRI primarie sensorimotorie? IRCCS Fondazione Santa Lucia Unità di Progetto di ricerca E 24.000,00 | 2 anni Neuroimmunologia, Roma Ruolo svolto dall’immunosenescenza nell’insorgenza e nella progressione della VALENTINA TOMASSINI sclerosi multipla University of Oxford Nuffield Department of Clinical Neurosciences (FMRIB Centre and Borsa di Ricerca Senior E 64.000,00 | 1 anno Clinical Neurology), FMRIB Centre, John Radcliffe Hospital, Headington, Oxford Cardiff (UK) ANNA FALCO Valutazione delle capacità di immaginazione motoria e degli effetti della pratica mentale Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Divisione di di un compito motorio in pazienti affetti da sclerosi multipla Neuroscienze, Milano Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni Regolazione degli interneuroni cerebrali e spinali da parte delle GTPasi Rac Borsa di addestramento E 37.000,00 | 2 anni CARLO TROMPETTO Istituto di Neurologia, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, SILVIA MUSIO Università di Genova, Genova IRCCS Istituto Neurologico C.Besta, Immunologia e Patologia Muscolare, Milano Effetto delle onde d’urto sulla rigidità della caviglia in pazienti con sclerosi multipla Il ruolo dei basofili nella encefalite autoimmune sperimentale, un modello animale Progetto di ricerca E 41.300,00 | 1 anno di sclerosi multipla Borsa di Ricerca E 52.000,00 | 1 anno VALIDAZIONE DI NUOVI TARGET/PATHWAYS

LORETTA TUOSTO JONATHAN VINET Sapienza Università di Roma Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, Department of Neuroscience, section Medical Physiology University Medical Center Roma Groningen, Groningen, The Netherlands Caratterizzazione delle vie di segnalazione del CD28 come bersagli terapeutici nella Caratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevole alla rimielinizzazione regolazione della tolleranza immunologica nella sclerosi multipla Borsa di ricerca E 55.000,00 | 1 anno Progetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno

PASQUALE ANNUNZIATA Università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche e 160 del Comportameno, Siena 161 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2011

Studio degli effetti immunomodulatori di un nuovo cannabinoide agonista selettivo per il ANDREA COSSARIZZA recettore CB2 su cellule immunocompetenti nella sclerosi multipla Università di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento di Scienze Biomediche Sezione di Progetto di ricerca E 40.000,00 | 2 anni Patologia Generale, Modena Polifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come marcatore immunologico delle FRANCESCO CUCCA differenti forme di sclerosi multipla Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica (IRGB) of CNR, Dipartimento di Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Biomedicina del CNRIRGB, Cittadella Universitaria di Monserrato, Monserrato, Cagliari Approccio razionale per la ricerca di composti per la cura della sclerosi multipla basato MASSIMO FILIPPI sull’analisi dei target biologici individuati dagli studi di associazione sull’intero genoma Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Neuroimaging Research Unit, INSPE in Sardegna Divisione di Neuroscienze, Milano Progetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno Definizione della rete di connettività strutturale e funzionale nella sclerosi multipla tramite l’applicazione dell’approccio “graph theory” ROBERTA DE SIMONE Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, Roma I mitocondri come bersagli e mediatori degli effetti benefici degli agonisti PPARg PASQUINA MARZOLA nella sclerosi multipla Università di Verona, Dipartimento di Informatica, Verona Progetto di ricerca E 61.000,00 | 2 anni Imaging funzionale nello studio della plasticità neuronale in un modello sperimentale di sclerosi multipla su ratto MASSIMO DEGANO Progetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor Divisione di Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, Milano FRANCA DERIU Comprendere il meccanismo ed aumentare l’efficacia del composto FTY720 Università di Sassari, Dipartimento di Scienze Biomediche, Lab di Fisiologia e (Fingolimod) nella terapia della sclerosi multipla tramite un approccio di biologia Bioingegneria dell’Uomo, Sassari strutturale Studio neurofisiologico, neuroradiologico e clinico del tronco encefalico in pazienti Progetto di ricerca E 70.000,00 | 1 anno con sclerosi multipla Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno LETIZIA LEOCANI IRCCS university Hospital San Raffaele, Neurological Dep.t; INSPE-Experimental MORENA MARTUCCI Neurophysiology, Milano Charitè Medical University, Institute of Biochemistry, Berlin (Germany) Stimolazione cerebrale transcranica a corrente diretta come terapia immunomodulante Identificazione di marcatori infiammatori e dei relativi meccanismi specific nella SM: studio pilota in modelli murini per la sclerosi multipla Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni Borsa di addestramento E 58.000,00 | 2 anni

ROSETTA PEDOTTI Neurological Institute Foundation IRCCS Carlo Besta, Neuroimmunology and Muscolar Pathology Unit, Milano PROGETTI SPECIALI 2011 Il sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzanti autoimmuni del sistema nervoso centrale: meccanismi patogenetici e possibili nuovi bersagli di terapia per la MIELINIZZAZIONE sclerosi multipla Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni CARLA TAVEGGIA Istituto di Neurologia Sperimentale, Ospedale San Raffaele - Milano PAOLA TIRASSA Laboratorio Interazioni Axo-Gliali Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto Biologia Cellulare & Neurobiologia, Roma Progetto Speciale E 240.000,00 | 3 anni Il nerve growth Factor dato in forma di collirio in un modello animale di sclerosi multipla: uno studio prospettico sul trattamento durante le fasi precoci della malattia Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni NUOVI TRATTAMENTI SINTOMATICI

NUOVI METODI DIAGNOSTICI DIEGO CENTONZE Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, LAURA BONZANO Dipartimento di Neuroscienze, Roma Università degli Studi di Genova, DINOG - Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Symptomatic treatment through central and peripheral neurostimulation procedures for Genetica, Genova people with Multiple Sclerosis Performance motoria della mano come nuovo endpoint clinico quantitativo nella SM: Progetto Speciale E 382.000,00 | 3 anni valutazione longitudinale su pazienti CIS e correlazione con accumulo di disabilità e integrità tissutale alla RM 162 Progetto di ricerca E 50.400,00 | 1 anno 163 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2010 BANDO RICERCA FISM 2010 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2010

CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA SIMONA PERGA AOU S. Luigi Gonzaga, Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla, Orbassano, GIANLUCA MENICHETTI Torino Fondazione Cavalieri Ottolenghi Istituto di Neuroscienze Dipartimento di Neuroscienze, Analisi delle variazioni di singoli nucleotidi polimorfi in TNFAIP3 associati alla sclerosi Sezione di Fisiologia, Università di Torino, Torino multipla Effetto dell’interazione oligodendrocita-assone sulla regolazione delle propietà E 40.000,00 | 2 anni intrinsiche di crescita assonale e maturazione oligodendrocitaria Borsa di ricerca E 36.000,00 | 2 anni PAOLA COSSU Università degli Studi di Sassari Dipartimento di Neuroscienze e Scienze Materno-Infantili, PAOLO GIANNETTI Sezione Clinica Neurologica, Sassari Imperial College London Multiple Sclerosis Trial Collaboration, London UK Studio della via metabolica della vitamina D e suo possibile ruolo nella suscettibilità Il ruolo della microglia attivata nella sclerosi multipla e nelle sindromi clinicamente della popolazione Sarda alla sclerosi multipla isolate: studio di imaging immunologico Borsa di ricerca E 49.000,00 | 2 anni Borsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni CHIARA FRESIA PAOLO CALABRESI Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale (DIMES), Università degli Studi di Perugia, Clinica Neurologica, Dipartimento Specialità Sezione Biochimica, Genova Medico-Chirurgiche, Perugia Ruolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla: studio dei livelli in vivo nei pazienti e Uno studio elettrofisiologico sulla plasticità sinaptica in modelli sperimentali di degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroni sclerosi multipla Borsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni E 30.000,00 | 1 anno MATTEO COEN ANGELA BONONI University of Geneva, Faculty of Medicine Department of Pathology and Immunology, Università di Ferrara Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Geneva (Switzerland) Sezione di Patologia Generale, Ferrara Caratterizzazione della parete venosa nella sclerosi multipla Ruolo di proteine mitocondriali nella patogenesi della sclerosi multipla Borsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni Borsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni COSIMA BALDARI SIMONE PATERGNANI Università di Siena, Dipartimento di Biologia Evolutiva, Siena Università di Ferrara, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, La proteina adattatrice Rai in differenziamento, attività e chemiotassi dei linfociti Th17 e Sezione di Patologia Generale, Ferrara nella patogenesi della sclerosi multipla Analisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti durante condizioni E 100.000,00 | 2 anni pro-infiammatorie Borsa di addestramento E 37.000,00 | 2 anni ANTONIO BERTOLOTTO Azienda Ospedaliero Universitaria (AOU) S. Luigi Gonzaga SCDO Neurologia 2 - Centro di MARZIA PERLUIGI riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM),Orbassano, Torino Sapienza Università di Roma, Facoltà di Medicina, dipartimento di Scienze Correlazione tra neurodegenerazione e infiammazione nella sclerosi multipla: NR4A2 Biochimiche, Roma come modulatore di infiammazione Ruolo dello stress ossidativo nella sclerosi multipla. Un’analisi proteomica E 30.000,00 | 1 anno e red-ox proteomica E 25.000,00 | 1 anno GABRIELA CONSTANTIN Università degli Studi di Verona, Dipartimento di Patologia, Verona FRANCESCO RIA Ruolo della mucina e immunoglobulina TIM-1 nella migrazione dei linfociti nel sistema Università Cattolica, Istituto di Patologia Generale, Roma nervoso centrale infiammato Meccanismi molecolari del trasferimento delle informazioni ambientali alle cellule T E 50.000,00 | 1 anno nella patogenesi della EAE: ruolo del TLR2 E 120.000,00 | 2 anni ELISABETTA VOLPE Fondazione Santa Lucia, Unità di Neuroimmunologia, Roma GIULIO DISANTO Meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’apoptosi di cellule Th17 nella University of Oxford, Department of Neurology, Wellcome Trust Centre for Human sclerosi multipla Genetics, Prof. Ebers group, Oxford UK E 30.000,00 | 1 anno Caratterizzazione funzionale delle varianti dei geni KIF coinvolti nella patogenesi della sclerosi multipla ANTONINA DOLEI Borsa di ricerca E 20.700,00 | 3 anni Universita di Sassari, Centro di Eccellenza per lo sviluppo della ricerca biotecnologica e per lo studio della biodiversità della Sardegna e dell’area mediterranea, Sassari 166 167 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2010

Studio del retrovirus associato alla sclerosi multipla (MSRV)/HERV-W come marcatore PAOLO RICCIO prognostico di progressione e del suo contributo alla patogenesi Università della Basilicata, Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, E 110.000,00 | 2 anni Potenza Le basi molecolari per un intervento nutrizionale nella sclerosi multipla QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE E 60.000,00 | 2 anni

DOMENICO RESTIVO PATRIZIA PANTANO Unità Operativa di Neurologia, Ospedale Nuovo Garibaldi, Catania Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Roma Valutazione del trattamento della disfagia associata a sclerosi multipla, con Plasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni longitudinali della stimolazione elettrica periferica del faringe. Studio pilota microarchitettura della sostanza bianca associate con il training propriocettivo E 20.000,00 | 1 anno E 30.000,00 | 1 anno

NINO BASAGLIA VALIDAZIONE DI NUOVI TARGET/PATHWAYS Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara UO Medicina Riabilitativa, Dipartimento di Neuroscienze/Riabilitazione, Ferrara MARIA PIA ABBRACCHIO Gli effetti della terapia robotica del cammino sulla capacità deambulatoria e Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Laboratorio di sull’attivazione delle unità motorie in soggetti con sclerosi multipla. Uno studio Famacologia Cellulare e Molecolare della Trasmissione Purinergica, Milano randomizzato controllato Strategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla: focus su GPR17, nuovo E 20.000,00 | 1 anno recettore coinvolto nel differenziamento oligodendrocitario Progetto di ricerca E 100.000,00 | 2 anni ANTONIO CERASA Istituto di Scienze Neurologiche-CNR, Unità di Ricerca Neuroimmagini, Germaneto, OVIDIO BUSSOLATI Catanzaro Università degli Studi di Parma Dipartimento di Medicina Sperimentale, Parma I correlati di neuroimmagine della riabilitazione cognitiva nei pazienti con sclerosi L’induzione dei trasportatori per il glutamato EAAT da parte dei retinoidi: un approccio multipla con sintomi cerebellari per la prevenzione del danno eccitotossico degli oligodendrociti e dei loro precursori E 20.000,00 | 1 anno E 30.000,00 | 1 anno

FRANCA TECCHIO MARILENA PALMISANO Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Scienze e Tecnologie della Cognizione, Fondazione San Raffaele del Monte Tabor Dipartimento di Genetica e Biologia Cellulare Roma Laboratorio di Neuro Glia, Milano Alleviare la Fatica nella sclerosi multipla: un intervento con stimolazione transcranica in Ruolo delle MAP chinasi p38 nella mielinizzazione corrente continua (tDCS) Borsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni E 30.000,00 | 1 anno ALESSANDRA BOLINO GRAZIELLA FILIPPINI Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE-Division of Neuroscience, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta, Unità Neuroepidemiologia, Milano Milano Integrare le esperienze e le preferenze dei pazienti con sclerosi multipla con i risultati Un possibile ruolo per la chinesina kif13B nella mielinizzazione e rimielinizzazione del della ricerca scientifica per sviluppare informazioni sulla salute utili per decisioni sistema nervoso centrale informate e condivise E 30.000,00 | 1 anno E 110.680,00 | 1 anno MAURO MACCARRONE ALESSANDRA SOLARI Università degli Studi di Teramo, Dipartimento di Scienze Biomediche Comparate, Teramo Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, Milano Ruolo del sistema endocannabinoide nel processo neurodegenerativo della sclerosi Preferenze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con multipla sperimentale sclerosi multipla (AutoMS) E 130.000,00 | 2 anni E 130.680,00 | 2 anni IVAN DE CURTIS NICOLA DE STEFANO Università Vita-Salute San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Adesione Università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche cellulare, Milano e del Comportamento, Siena Regolazione degli interneuroni GABAergici da parte delle GTPasi Rac: implicazioni per Modifiche nell’arco di 10 anni della sostanza bianca e grigia cerebrale in pazienti con la sclerosi multipla sclerosi multipla in rapporto a disabilità fisica e disfunzione cognitiva E 30.000,00 | 1 anno E 100.000,00 | 2 anni CARLO AVOLIO Università degli Studi di Foggia, Sezione di Clinica delle Malattie del Sistema Nervoso 168 Dipartimento di Scienze Mediche e del Lavoro, Foggia 169 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2010

Recettore purinergico P2X7 su monociti di pazienti con sclerosi multipla ed effetti degli RNA non codificanti e plasticità terapeutica delle cellule staminali neurali attuali trattamenti immunomodulanti per la malattia E 105.000,00 | 3 anni E 30.000,00 | 1 anno RICCARDO SACCARDI FRANCESCA FALLARINO Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze, SODc Ematologia, Dipartimento di Università degli Studi di Perugia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Area Critica Medico Chirurgica, Università di Firenze, Firenze Biochimiche - Sezione di Farmacologia, Perugia Valutazione immunologica del midollo osseo in pazienti affetti da sclerosi multipla Induzione di immunità protettiva in un modello murino sperimentale di sclerosi multipla severa sottoposti ad autotrapianto di cellule staminali ematopoietiche mediante agonisti dei recettori TLR7 e TLR9 E 184.000,00 | 2 anni E 30.000,00 | 1 anno ALESSIO NENCIONI ROBERTO FURLAN Università degli Studi di Genova Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Neuroscienze, Istituto di Genova Neurologia Sperimentale, Unità di Neuroimmunologia Clinica, Milano FK866 e fluridone: nuovi farmaci NAD-correlati contro la sclerosi multipla? IL-27 e IL 35 nella encefalomielite autoimmune sperimentale: un affare di famiglia E 30.000,00 | 1 anno E 120.000,00 | 2 anni ANNALISA CHIOCCHETTI GIAN CARLO AVANZI Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di Scienze Mediche, Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di Medicina Clinica e Novara Sperimentale Laboratorio di Medicina Interna e Immunologia Clinica, Novara Mappatura funzionale dell’attività di Osteopontina nell’encefalomielite autoimmune Il ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla: studio clinico e biologico sperimentale e nella sclerosi multipla E 30.000,00 | 1 anno E 30.000,00 | 1 anno

SIMONA CASAZZA KATIA MANGANO Università degli Studi di Genova Dipartimento di Neurologia, Oftalmologia e Genetica, Università degli Studi di Catania, Dipartimento di Scienze Biomediche, Catania Genova Trattamento epigenetico con il composto ipometilante 5-aza-2-deossicitidina in modelli Le cellule mesenchimali staminali influenzano l’ambiente microgliale? Implicazioni animali di sclerosi multipla per il trattamento della sclerosi multipla Borsa di ricerca E 48.000,00 | 2 anni Borsa di ricerca senior E 64.000,00 | 2 anni ROBERTO COSIMO MELCANGI LAURA LOVATO Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Università degli Studi di Genova Dipartimento di Neuroscienze Oftalmologia e Genetica, Applicata (DEFIB), Milano Genova Valutazione degli effetti protettivi degli steroidi neuroattivi nel modello della Identificazione mediante marcatura isotopica di proteine coivolte nell’azione encefalomielite autoimmune sperimentale immunomodulante e neuroprotettiva della cellule staminali mesenchimali Borsa di ricerca E 30.000,00 | 1 anno Borsa di addestramento E 64.000,00 | 2 anni MARIA BEATRICE PASSANI MIRIAM MATTOSCIO Università di Firenze, Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, Firenze Imperial College London Centre for Neuroscience, Division of Experimental Medicine, Potenziali terapeutici di antagonisti del recettore istaminergico H4 nel trattamento di London UK neuropatologie autoimmuni Mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche in pazienti affetti da sclerosi multipla E 20.000,00 | 1 anno in terapia con anticorpo monoclonale anti alfa-4 integrina: rilevanza funzionale e possibili applicazioni NUOVI METODI DIAGNOSTICI Borsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni MASSIMO FILIPPI PAOLO MURARO Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Unità di Neuroimaging Quantitativo, Imperial College London Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neuroscienze, Milano London UK Definizione delle misure RM predittive dell’accumulo di disabilità e compromissione Rilevanza funzionale della mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche a seguito cognitiva a lungo termine in pazienti con SM e un esordio a ricadute della malattia: di trattamento con anticorpo contro integrina alpha4 in pazienti con sclerosi multipla studio longitudinale a 13 anni E 67.000,00 | 2 anni Progetto di ricerca E 60.000,00 | 1 anno

STEFANO PLUCHINO VITTORIO MARTINELLI Cambridge Centre for Brain Repair, Department of Clinical Neurosciences, Cambridge UK Instituto Scientifico San Raffaele, Dipartimento di Neurologia, Milano

170 171 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2010

Caratterizzazione di profili di espressione di geni e di microRNA, da cellule di sangue PROGETTI SPECIALI 2010 perifierico di pazienti affetti da sclerosi multipla E 60.000,00 | 2 anni CCSVI

DAMIANA PIERAGOSTINO GIOVANNI MALFERRARI Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara, Dipartimento di Scienze Biomediche, labo- Dipartimento Neuromotorio; S.C. Neurologia; S.S. Patologia Cerebrovascolare ratori del Ce.S.I. Centro Studi sull’Invecchiamento, Fondazione universitaria, Chieti Arcispedale Santa Maria Nuova, Reggio Emilia Strategie di Proteomica nella sclerosi multipla: studi strutturali e funzionali delle Confronto fra studio neurosonologico con valutazione in real time (Virtual Navigator) e isoforme ossidate della transtiretina, un possibile biomarcatore di malattia RMN nell’analisi dell’emodinamica venosa cerebrale in pazienti con SM e controlli E Borsa di ricerca 48.000,00 | 2 anni Progetto Speciale E 99.850,00 | 1 anno CLAUDIA VERDERIO Istituto CNR di Neuroscienze - Milano, Dipartimento di Farmacologia Medica, Milano SALUTE E QUALITÀ DELLA VITA Microvescicole microgliali nel liquido cerebrospinale: un potenziale marcatore nella sclerosi multipla ALESSANDRA SOLARI E Borsa di ricerca 30.000,00 | 1 anno Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, Milano La versione italiana del “Motherhood Choice”: un ausilio decisionale sulla maternità per le donne con SM Progetto Speciale E 48.000,00 | 1 anno

SALUTE E QUALITÀ DELLA VITA

ANDREA GIORDANO Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, Milano Impiego del supplemento informativo “Sapere Migliora” per i pazienti con SM di nuova diagnosi nella pratica clinica corrente (SIMS-Practice) Progetto Speciale E 43.500,00 | 1 anno

172 173 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2009 BANDO RICERCA FISM 2009 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2009

CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA FRANCESCO CECCONI Dipartimento di Neuroscienze Sperimentali IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma LUCIANA GIARDINO Ruolo dell’autofagia nella regolazione delle cellule T associata alla sclerosi multipla Diaprtimento Morfofisiologia Veterinaria e Produzioni Animali (DIMORFIPA) Università di E 70.000,00 | 2 anni Bologna, Ozzano Emilia, Bologna Insuccesso della rimielinizzazione in sclerosi multipla: un caso di ipotiroidismo tissutale ELIANA MARINA COCCIA indotto dall’infiammazione? Dipartimento di Malattie infettive, parassitarie ed immuno-mediate Istituto Superiore di E 70.000,00 | 2 anni Sanità, Roma Cellule dendritiche plasmacitoidi: ruolo nel controllo della risposta immunitaria in LUISA BERNARDINELLI pazienti trattati con IFN-ß Dipartimento di Scienze Sanitarie Applicate e Psicocomportamentali Università degli Borsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni Studi di Pavia Ricerca di variazioni di sequenza nella regione HLA di classe I associate alla SM CHIARA FRESIA attraverso un approccio basato sul risequenziamento di pool di DNA Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale (DIMES), E 140.000,00 | 2 anni Sezione Biochimica, Genova Ruolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla: studio dei livelli in vivo nei pazienti e LUCIA CORRADO degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroni Dipartimento di Scienze Mediche, Laboratorio di Genetica Umana Università del Borsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara Ricerca di variazioni di sequenza nella regione HLA di classe I associate alla SM ALICE LARONI attraverso un approccio basato sul risequenziamento di pool di DNA Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology Brigham and Women’s Hospital Borsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni and Harvard Medical School, Boston, MA USA Ruolo della popolazione cellulare natural killer CD56bright nella ROBERTA RIGOLIO Epidemiologia e Ezioatogenesi della sclerosi multipla Dipartimento di Neuroscienze e Tecnologie Biomediche Università di Milano-Bicocca, Borsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni Monza Studio pilota per determinare il contributo dei neutrofili nello sviluppo di malattia in due GRAZIA MARIA LIUZZI modelli animali per la sclerosi multipla che mimano la forma acuta e Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare e Biologia Molecolare Università degli recidivante-remittente di malattia Studi di Bari “Ernesto Quagliariello” E 25.000,00 | 1 anno Analisi del network proteolitico nella sclerosi multipla: una breccia significativa verso la comprensione dei meccanismi patogenetici e la valutazione LEONARDO ANTONIO SECHI laboratoristica dell’efficacia della terapia Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Sassari E 50.000,00 | 2 anni Associazione fra geni e ambiente nella sclerosi multipla E 25.000,00 | 1 anno LUCA MUZIO Dipartimento Neuroscienze, INSpe HSR Fondazione San Raffaele del Monte Tabor, Milano GIULIETTA VENTURI Studio dei meccanismi molecolari del danno neuronale nelle malattie Dipartimento del Farmaco Reparto Farmaci Antitumorali Istituto Superiore di Sanità, neuro-infiammatorie Roma E 100.000,00 | 2 anni Exosomi, virus di Epstein-Barr e sclerosi multipla: ruolo potenziale nella Epidemiologia e Ezioatogenesi e come biomarcatori per il monitoraggio clinico della malattia FRANCESCO NOVELLI E 25.000,00 | 1 anno Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale Università di Torino, Centro Ricerche Medicina Sperimentale (CERMS) Ospedale San Giovanni Battista, Torino LUCIA MORI Caratterizzazione funzionale dei linfociti T helper (Th)17 nella sclerosi multipla ed analisi Department of Biomedicine, University Hospital Basel, Basel, Switzerland dei meccanismi della loro inattivazione Topi CD1-transgenici come nuovo modello sperimentale per lo studio della SM E 80.000,00 | 2 anni E 30.000,00 | 1 anno SIMONA ROLLA ANNA PAOLA BATOCCHI Dipartimento di Oncologia e Medicina Sperimentale Università degli Studi di Torino Dipartimento di Neuroscienze Istituto di Neurologia Università Cattolica del Sacro Cuore, Caratterizzazione del repertorio TCR dei linfociti Th17 autoreattivi nella sclerosi multipla Roma Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni Sottopopolazioni di linfociti T CD8 effettrici e della memoria e decorso clinico nella sclerosi multipla Neuroimmunologia ADA MARIA TATA E 70.000,00 | 2 anni Università di Roma La Sapienza Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Roma Acetilcolina di derivazione non neuronale nella sclerosi multipla: possibile duplice ruolo 176 177 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2009

come modulatore della risposta immunitaria e nel reclutamento di progenitori Studio longitudinale sul funzionamento neuropsicologico in pazienti con sclerosi oligodendrocitari multipla in confronto con la popolazione generale E 52.000,00 | 3 anni E 100.000,00 | 3 anni

QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE VALIDAZIONE DI NUOVI TARGET/PATHWAYS

PIER MARIA FURLAN MARIA CRISTINA GAUZZI Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche S.C.D.U. Psichiatria Università degli Studi Biologia Cellulare e Neuroscienze Istituto Superiore di Sanità, Roma di Torino, Orbassano, Torino 1,25(OH)2D3 come modulatore della SM: metabolismo, attività immunoregolatoria e L’efficacia dell’Eye Movement Desensitization and Reprocessing (EMDR) in pazienti relazione con l’IFN di tipo I in cellule dendritiche. Neuroimmunologia con Disturbo Post Traumatico da Stress con diagnosi di sclerosi multipla. Uno studio E 55.000,00 | 2 anni randomizzato controllato E 52.000,00 | 3 anni LAURA PICCIO Washington University in St Louis School of Medicine, Neurology, St Louis, Missouri, USA MARIA GRAZIA GRASSO Ruolo di TREM-2 nella sclerosi multipla e nel suo modello animale IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma E 120.000,00 | 2 anni La disfagia nella sclerosi multipla: correlazioni cliniche di risonanza e di fibroscopia seguita da riabilitazione CECILIA LATERZA E 80.000,00 | 2 anni Divisione di Neuroscienze Istituto Scientifico San Raffaele, Milano Generazione di cellule staminali riprogrammate da Pazienti con sclerosi multipla e ALBERTO PRIORI differenziamento in precursori neuronali ed oligogliali Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico, Borsa di addestramento E 38.000,00 | 2 anni Mangiagalli e Regina Elena, Milano La stimolazione transcranica con correnti dirette (tDCS) delle aree corticali motorie per CLAUDIO SETTE il trattamento della fatica nella sclerosi multipla Fondazione Santa Lucia Laboratorio di Neuroembriologia, Roma E 40.000,00 | 1 anno MyD88: un nuovo bersaglio molecolare per la terapia della sclerosi multipla E 70.000,00 | 2 anni NICOLA SMANIA Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione Università degli Studi di Verona ROSETTA PEDOTTI Effetti di un training dell’abilità di integrazione sensori-motoria sui disturbi dell’equilibrio Unità di Patologia Muscolare e Immunologia Istituto Nazionale Neurologico Carlo Besta, in pazienti affetti da sclerosi multipla Milano E 70.000,00 | 2 anni Demielinizzazione anticorpale nella sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti con SM in relapse clinica CLAUDIA BORREANI E 50.000,00 | 2 anni Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Unità di Psicologia, Milano Valutazione qualitativa di un ausilio informativo (CD e booklet “Sapere Migliora”) per le ELISABETTA ORILIERI persone con sclerosi multipla (SIMS-Qual) Dipartimento di Scienze Mediche, laboratorio di Immunologia Università del Piemonte E 40.000,00 | 1 anno Orientale Amedeo Avogadro, Novara Ruolo di anticorpi anti-Osteopontina nella sclerosi multipla ALESSANDRA SOLARI Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni Unità di Neuroepidemiologia e Eziopatogenesi, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano MAURIZIO BIFULCO Indagine postale di auto-valutazione del benessere fisico e psicologico negli adulti con Scienze Farmaceutiche Università degli Studi di Salerno, Fisciano SM e nelle persone a loro vicine: follow-up a lungo termine (Studio POSMOS) Progettazione, sintesi e studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema E 40.000,00 | 1 anno endocannabinoide nella sclerosi multipla E 140.000,00 | 2 anni ANDREA GIORDANO Unità di Neuroepidemiologia e Eziopatogenesi, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico ALBERTO CHIARUGI C. Besta, Milano Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, Università di Firenze, Firenze Preferenze individuali e partecipazione alle decisioni mediche nella SM Inibizione del fenomeno dell’epitope spreading con farmaci inibitori della PARP-1 e Borsa di ricerca E 42.000,00 | 2 anni relative implicazioni teraputiche in modelli di R-EAE E 70.000,00 | 2 anni SIMONA MALUCCHI Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla & Neurobiologia Clinica Azienda ANNA MARIA MALFITANO Ospedaliera Universitaria San Luigi Gonzaga, Orbassano, Torino Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche Università degli Studi di Salerno 178 Studio dell’’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide 179 PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2009

nella sclerosi multipla PROGETTI SPECIALI 2009 Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni GENETICA FRANCESCA GILLI AOU S. Luigi Gonzaga Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla Orbassano, SANDRA D’ALFONSO Torino Dipartimento di Scienze Mediche, Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, I meccanismi immuno-biologici della gravidanza: come possono indurre una Novara spontanea remissione nella sclerosi multipla FILIPPO MARTINELLI BONESCHI E Borsa di ricerca 90.000,00 | 2 anni Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neurologia, Istituto Scientifico San Raffaele, Milano NUOVI METODI DIAGNOSTICI Analisi genetica della SM: progetto Immunochip Progetto Speciale E 200.000,00 | 2 anni PAOLO MARIA ROSSINI Università Campus Bio-Medico Ospedale S. Giovanni Dipartimento di Neuroscienze Cliniche Roma Fatica nella sclerosi multipla: Identificazione di un profilo neuroanatomico e funzionale [FaMuS] E 60.000,00 | 1 anno

MARCO ROVARIS Fondazione Don Carlo Gnocchi, IRCCS Santa Maria Nascente Unità Operativa Sclerosi Multipla, Milano Fisiopatologia del danno tissutale nella sclerosi multipla progressiva: studio comparativo immunologico e di RM rispetto a pazienti con malattia del motoneurone E 55.000,00 | 2 anni

MARCO VERCELLINO Dipartimento di Neuroscienze Università di Torino Ruolo delle progranulina nella sclerosi multipla E 25.000,00 | 1 anno

MARCO COSENTINO Dipartimento di Clinica Medica Sezione di Farmacologia Sperimentale e Clinica Università dell’Insubria, Varese Vie adrenergiche/dopaminergiche nei linfociti circolanti come marcatori precoci nelle sindromi clinicamente isolate che progrediscono in sclerosi multipla E 50.000,00 | 1 anno

MARCO DI DARIO Istituto di Neurologia Sperimentale IRCCS San Raffaele, Milano Profilo di espressione genica delle cellule mononucleari del sangue periferico: identificazione di potenziali marcatori molecolari per la sclerosi multipla Borsa di addestramento E 36.000,00 | 2 anni

PAOLO EDOMI Dipartimento di Scienze della Vita Università di Trieste, Trieste Validazione di nuovi marcatori biologici della sclerosi multipla e loro utilizzo per la produzione di un chip proteico diagnosti E 45.000,00 | 1 anno

MARIA FOTI Biotecnologie e Bioscienze Laboratorio di medicina molecolare e immunologia Università degli Studi di Milano-Bicocca, Milano Identificazione di biomarcatori e nuovi bersagli terapeutici nella sclerosi multipla mediante l’utilizzo di approcci di biologia dei sistemi complessi 180 E 50.000,00 | 1 anno 181 PROGETTI FINANZIATI PRIMA DEL 2009 PRESENTATI AL CONGRESSO NAZIONALE 2012 PROGETTI FINANZIATI PRIMA DEL 2009 PRESENTATI AL CONGRESSO NAZIONALE 2012

CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA NUOVI METODI DIAGNOSTICI

PAOLO PINTON MASSIMO FILIPPI Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica Università degli Studi di Ferrara Divisione di Neurologia Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano Omeostasi intracellulare del Ca2+ e mitocondri in oligodendrociti durante stress Correlati funzionali e strutturali dell’attività del network cognitivo in pazienti con SM e ossidativo e loro ruolo nella morte per apoptosi diversi fenotipi di malattia E 60.000,00 | 2 anni | 2008 E 130.000,00 | 2 anni | 2008

ANGELA BONONI FRANCA DERIU Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica; Sezione di Patologia Generale Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche ed Anestesiologiche Università degli Università di Ferrara Studi di Sassari Omeostasi intracellulare del Ca2+ e mitocondri in oligodendrociti durante stress Studio neurofisiologico e neuroradiologico dei circuiti del tronco dell’encefalo in ossidativo e loro ruolo nella morte per apoptosi pazienti con sclerosi multipla Borsa di addestramento E 32.000,00 | 2 anni | 2008 E 60.000,00 | 2 anni | 2008

UMBERTO DIANZANI LUIS TENEUD Dipartimento di Scienze Mediche Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Servizio di Neurofisiologia Clinica, Lab. di Psicofisiologia e Neurofisiologia Sperimentale Novara IRCCS Ospedale San Raffaele Ricerca di marcatori coinvolti nello sviluppo della sclerosi multipla: correlazione di Validazione di markers elettrofisiologici di danno nervoso in modelli animali di alterazioni genetiche e funzionali dell’immunità cellulo-mediata con marcatori sclerosi multipla dell’infezione da EBV Borsa di ricerca E 41.000,00 | 2 anni | 2008 E 120.000,00 | 2 anni | 2008 PAOLO MURARO MAURA PUGLIATTI Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Division of Neuroscience and Mental Clinica Neurologica Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Sassari Health Imperial College, London Fattori di rischio nella sclerosi multipla: uno studio internazionale caso-controllo Identificazione di fattori prognostici condizionanti l’esito a lungo termine della sclerosi E 129.500,00 | 2 anno | 2008 multipla: estesa analisi del database di London Ontario E 60.000,00 | 2 anni | 2008 QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE BRUNO BONETTI CLAUDIO SOLARO Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Sezione di Neurologia, Ospedale Dipartimento di Neurologia ASL 3 Genovese Policlinico Università di Verona Valutazione e terapia mediante robot nel trattamento del deficit dell’arto superiore nella Approccio Proteomico per la Identificazione di Autoantigeni riconosciuti da IgG del sclerosi multipla: uno studio multi-centro, randomizzato e controllato Liquor Cerebro-Spinale nella sclerosi multipla E 60.000,00 | 2 anni | 2008 E 70.000,00 | 2 anni | 2008

VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS

ERNESTO FEDELE (subentra a MAURIZIO RAITERI) CINTHIA FARINA Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Farmacologia e Tossicologia, Centro Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale, Fondazione Centro di Eccellenza per la Ricerca Biomedicale, Università di Genova S. Raffaele del Monte Tabor, Milano Studio sul ruolo funzionale di RANTES sulla trasmissione glutamatergica nel cervello Funzione di TrkB sugli astrociti reattivi nelle placche di sclerosi multipla umano ed in topi EAE E 80.000,00 | 2 anni | 2007 E 100.000,00 | 2 anni | 2008

GIUSEPPE BATTAGLIA Neuroscienze, Neurofarmacologia, Istituto Neurologico Mediterraneo - Neuromed, Pozzilli, Isernia Ruolo dei recettori metabotropici del glutammato in modelli sperimentali di sclerosi multipla E 130.000,00 | 2 anni | 2008

184 185 2011 COMITATO 2010 SCIENTIFICO FISM 2009 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2011 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2011

FRANCESCA BAGNATO PAOLO RICCIO Department of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata, Vanderbilt University, Nashville USA Potenza

LUCA BATTISTINI MARCO SALVETTI IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Università “La Sapienza” - Neurologia e Centro Neurologico Terapie Research, Roma Sperimentali (CENTERS), Roma

ANTONIO BERTOLOTTO ALESSANDRA SOLARI ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM), Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Orbassano (TO) C. Besta, Milano

DIEGO CENTONZE JEAN-LOUIS THONNARD Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Université catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS), Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze, Roma Bruxelles, Belgique

GABRIELA CONSTANTIN BERNARD ZALC Dipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona, Verona Bâtiment de la Pharmacie, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière, Paris, France FRANCESCO CUCCA Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari, Sassari CHAIRMAN COMITATO SCIENTIFICO FISM UMBERTO DIANZANI Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale GIULIO LEVI Amedeo Avogadro, Novara Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema, Roma ROBERTO FURLAN Unità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

MARIA GRAZIA GRASSO IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma

MATILDE INGLESE Mount Sinai School of Medicine, New York, USA

GIANVITO MARTINO Unità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

PAOLO MURARO Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London, London, UK

VITO PISTOIA Laboratorio di Oncologia, I.R.C.C.S. G. Gaslini, Genova

188 189 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2010 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2010

FRANCESCA BAGNATO MARCO SALVETTI Department of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Università La Sapienza, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Vanderbilt University, Nashville USA Sperimentali (CENTERS), Roma

LUCA BATTISTINI ALESSANDRA SOLARI IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Research, Roma C. Besta, Milano

ANTONIO BERTOLOTTO JEAN-LOUIS THONNARD ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento regionale Sclerosi Multipla (CReSM), Université catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS), Orbassano, Torino Bruxelles Belgique

DIEGO CENTONZE LAWRENCE WRABETZ Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Laboratorio di Biologia della Mielina, IRCCS Ospedale San Raffaele, Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze, Roma DIBIT, Milano

FRANCESCO CUCCA BERNARD ZALC Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari, Sassari Bâtiment de la Pharmacie, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière, Paris France UMBERTO DIANZANI Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara COORDINATORE DELLA RICERCA FISM

ROBERTO FURLAN GIULIO LEVI Unità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e DIBIT, Milano Sistema, Roma

ENRICO GRANIERI Istituto di Clinica Neurologica, Università di Ferrara, Arcispedale Sant’Anna, Ferrara

MARIA GRAZIA GRASSO IRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma

MATILDE INGLESE Mount Sinai School of Medicine, New York USA

GIANVITO MARTINO Unità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

PAOLO MURARO Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London, London UK

VITO PISTOIA Laboratorio di Oncologia, IRCCS G. Gaslini, Genova

190 191 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2009 COMITATO SCIENTIFICO FISM 2009

FRANCESCA BAGNATO GIOACCHINO TEDESCHI Neuroimmunology Branch, NINDS, Waaren G. Magnuson Clinical Center, NIH, Bethesda, Seconda Università di Napoli, Istituto di Scienze Neurologiche, II Clinica USA di Neurologia, Napoli

UMBERTO DIANZANI LAWRENCE WRABETZ Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro Dipartimento di Scienze Mediche, IRCCS Ospedale San Raffaele, Dipartimento di Biotecnologie Avanzate (DIBIT), IRCAD, Novara Laboratorio di Biologia della Mielina, Milano

ROBERTO FURLAN BERNARD ZALC IRCCS Ospedale San Raffaele, Unità di Neuroimmunologia DIBIT, Milano Biologie des Interactions Neurones/Glie, Unite Mixte de Recherche Inserum U-711, UPMC, Hôpital de la Salpêtrière, Paris France PAOLO GIRLANDA A.O.U. Policlinico G. Martino, Dipartimento di Neuroscienze Psichiatria e Anestesiologia, Servizio di Neurofisiopatologia, Messina COORDINATORE DELLA RICERCA FISM

ENRICO GRANIERI GIULIO LEVI Università di Ferrara, Istituto di Clinica Neurologica, Arcispedale Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sant’Anna, Ferrara Sistema, Roma e Sistema, Roma

MARIA GRAZIA GRASSO IRCCS Fondazione Santa Lucia, Unità Operativa “E” Sezione Sclerosi Multipla, Roma

JURG KESSELRING Rehabilitationszentrum Chefarzt Neurologie Valens, Suisse

GIANVITO MARTINO Unità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

XAVIER MONTALBAN Hospital General, Clinical Neuroimmunology Unit, Barcelona, Spain

PAOLO MURARO Faculty of Medicine, Imperial College, Charing Cross Campus, Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Division of Neuroscience and Mental Health, London UK

VITO PISTOIA Laboratorio di Oncologia, IRCCS G. Gaslini, Genova

MARCO SALVETTI Università La Sapienza, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Roma

ALESSANDRA SOLARI Istituto Nazionale Neurologico Carlo Besta, Laboratorio di Epidemiologia, Milano

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