Centro De Ciencias Básicas Departamento De Fisiología

CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA Y FARMACOLOGÍA

TESIS

CARACTERIZACIÓNBIOQUÍMICA DEL VENENO DETRES SERPIENTES DE CASCABEL DE MONTAÑA(Crotalus aquilus, C. lepidus klauberi y C. lepidusxaquilus).

PRESENTA

Eric Abdel Rivas Mercado

PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS; ÁREA DE TOXICOLOGÍA

TUTOR (ES)

Dr. en C. Eduardo de la Cerda González

COMITÉ TUTORAL

Dr. en C. Francisco Anibal Posadas del Río

M. en C. José Luis Moreno Hernández Duque

Aguascalientes, Ags, Noviembre de 2014.

AGRADECIMIENTOS.

A mis padres: Lic. José Reyes Rivas Enríquez y Bertha Alicia Mercado Romo por su esfuerzo e incondicional apoyo brindado.

A mi novia: Kattia Estefanía Aguirre Ramírez, por brindarme un apoyo integral, durante la elaboración de este trabajo.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por brindar beca de manutención durante el tiempo en que se realizó este trabajo.

A mi comité de tutores: Dr. en C. Eduardo de la Cerda González, Dr. en C. Francisco Anibal Posadas del Río y M. en C. José Luis Moreno Hernández Duque.

Por su importante colaboración para los trabajos de campo y colecta a SEMARNAT, por brindar el permiso de colecta de los organismos.

A mi grupo de apoyo de campo: M en C. Rubén Alonso Carbajal Márquez, Biol. Marco Antonio Domínguez de la Riva, Biol. Juan Daniel Rendón Trinidad, Kattia Estefanía Aguirre Ramírez.

Al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México, Laboratorio del Dr. Alejandro Alagón Cano, Investigador Titular “C”.

M. en C. Melisa Bénard Valle y M. en C. Edgar Neri, ayudante de investigador Instituto de Biotecnología, UNAM. Por brindarme la posibilidad de llevar a cabo dos estancias de investigación en los laboratorios del IBt UNAM.

ÍNDICE GENERAL.

ÍNDICE GENERAL...... 1 ÍNDICE DE TABLAS...... 4 ÍNDICE DE FIGURAS...... 5 ACRÓNIMOS...... 6 RESUMEN ...... 8 ABSTRACT...... 9 INTRODUCCIÓN...... 10 1. Clasificación taxonómica de los reptiles...... 12 2. Reptiles venenosos...... 13 3. Aparato inoculador de veneno...... 14 3.1 Serpientes venenosas en México...... 15 3.2 Serpientes venenosas en el estado de Aguascalientes...... 15 4. Organismos de estudio...... 16 4.1 Crotalus aquilus (Klauber, 1952)...... 16 4.2 Crotalus lepidus klauberi (Kennicott, 1861)...... 17 4.3 Crotalus lepidus x aquilus (Bryson R. W., 2010)...... 19 5. Caso clínico...... 19 6. Veneno de serpientes...... 22 6.1 Características del veneno de serpientes y sus efectos...... 22 6.2 Principales componentes del veneno de serpientes...... 23 Metaloproteasas (SVMP’s)...... 24 Serin proteasas tipo trombina (SVSPs)...... 25 Nucleasas, nucleotidasas y fosfomonoesterasas...... 25

Fosfolipasas A2...... 26 Acetilcolinesterasa...... 27 L-Aminoácido oxidasas...... 28

Agentes anti – agregación plaquetaria...... 29 6.3 Toxinas como agentes terapéuticos...... 30 Agentes pro y anti – coagulantes...... 34 Agentes anti – cáncer...... 34 Desintegrinas...... 35 Crotoxina...... 37 7. Hipótesis...... 39 8. Ojetivos...... 39 8.1 Objetivo general...... 39 8.2 Objetivos particulares...... 39 9. Materiales y metodología...... 40 9.1 Trabajo de campo; colecta de los ejemplares de víbora de cascabel...... 40 9.2 Extracción y liofilización del veneno...... 41 9.3 Cuantificación de proteína por el método del ácido bicinconínico (BCA)...... 41 9.4 Cuantificación de proteína por absorbancia a 280 nm...... 42 9.5 Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil sulfato sódico (SDS – PAGE)...... 42 9.6. Cromatografía líquida de alta resolución, fase reversa (RP-HPLC)...... 43

9.7Dosis letal media (DL50)...... 44 9.8 Actividad procoagulante...... 45 9.9Actividad proteolítica sobre azocaseína...... 45 9.10 Detección de crotoxina: Western blot semi – seco...... 46 9.11 Detección y cuantificación de crotoxina mediante ELISA...... 47 10. Resultados...... 49 10.1 Trabajo de campo; colecta de los ejemplares de víboras de cascabel...... 49 10.2 Extracción, liofilización y cuantificación de proteína del veneno de cada serpiente, peso en mg/ordeña, BCA y absorbancia a 280nm...... 49 10.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS - PAGE)...... 50 10.4 Cromatografía líquida de alta resolución, fase reversa (RP-HPLC)...... 52

10.5 Dosis letal media (DL50)...... 54 10.6 Actividad pro coagulante...... 55 10.7 Actividad proteolítica sobre azocaseína...... 56 10.8 Detección de Crotoxina por RP – HPLC...... 57 10.9 Detección de crotoxina: Western blot semi – seco...... 58 10.10 Detección y cuantificación de Crotoxina mediante ELISA...... 59 11. Discusiones...... 60 Letalidad...... 62 Actividad biológica...... 64 CONCLUSIÓN...... 67 GLOSARIO...... 68 BIBLIOGRAFÍA...... 73 ANEXOS...... 86

ÍNDICE DE TABLAS.

Tabla 1. Horarios de los recorridos para colecta en campo de serpientes...... 40 Tabla 2. Gradiente de elución...... 43 Tabla 3. Cuantificación de proteína en mg/ordeña, BCA y ...... 49 Tabla 4. Cuantificación de proteína de los “pool” de veneno de los tres grupos de serpientes en estudio; por peso seco y BCA...... 50

Tabla 5. DL50 de los tres grupos de estudio...... 54 Tabla 6. DMP ...... 55 Tabla 7. ANOVA 1 vía: Comparación de actividad proteolítica entre venenos de C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus sobre azocaseína ...... 56

ÍNDICE DE FIGURAS.

Figura 1. Morfología de la dentición en serpientes (Lee, 2013)...... 14 Figura 2.Víboras de cascabel pigmea Crotalus aquilus; localidad del macho: Sierra el Laurel, Aguascalientes. Hembra: Nochistlan, Zacatecas...... 17 Figura 3.Víboras de cascabel bandeada de las rocas Crotalus lepidus klauberi, macho y hembra, localidad; Montoro, Aguascalientes...... 18 Figura 4. Ejemplar macho adulto de cascabel de montaña C. lepidus x aquilus, localidad: Palo Alto, Aguascalientes...... 19 Figura 5. (A) Brazo izquierdo del paciente después de una hora de haber sido mordido por una cascabel C. l. lepidus. (B) Equimosis en el brazo donde ocurrió la mordedura al cuarto día (fotos tomadas por el paciente)...... 21 Figura 6. Conformación de la cámara semi-seca para la transferencia de proteínas del gel SDS – PAGE a la membrana de nitrocelulosa...... 47 Figura 7. SDS-PAGE de venenos individuales y pool en condiciones reductoras ...... 51 Figura 8. RP – HPLC. Perfiles de elución de los tres pool de veneno...... 53 Figura 9.Gráfica de letalidad con los valores arrojados por los tres pool de veneno ...... 54 Figura 10. Actividad procoagulante en el veneno de C. lepidus x aquilus ...... 55 Figura 11. Actividad proteolítica del veneno de las víboras de cascabel (individual y pool); C. l. klauberi, C. aquilus, C. lepidus x aquilussobre azocaseína...... 56 Figura 12. RP – HPLC. Perfil de elución de Ctx purificada ...... 57 Figura 13. Detección de Ctx por Western blot ...... 58 Figura 14. Cuantificación de Ctx por ELISA...... 59

ACRÓNIMOS.

ABTS Ácido 2,2’ – azinobis (3-etilbenzotiazolín) -6-sulfónico ACE Enzimas convertidoras de angiotensina. AChE Acetilcolinesterasa. ACh Acetil colina. ADAM Familia de proteínas de membrana multidominio (dominio desintegrina y metaloproteasa). BCA Ácido bicinconínico BChE Butirilcolinesterasa. BPP Péptidos potenciadores de bradiquidinas. Ctx Crotoxina.

DL50 Dosis letal media. DMP Dosis mínima procoagulante. ECD Ácido glutámico, Cisteína, Ácido aspártico. ECM Matriz extra celular. EDTA Ácido etilendiaminotetraacético. ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. FAD Flavín Adenín Dinucleótido. FDA Administración de fármacos y alimentos de Estados Unidos de Amércia. INEGI Instituto Nacional de Estadística y Geografía. i.p. Vía de administración (veneno) intra peritoneal. i.v. Vía de administración (veneno) intra venosa. KGD Lisina, Glicina, Ácido aspártico. KTS Lisina, Treonina, Serina. M Molar. MDG Metionina, Ácido aspártico, Glicina. Mg Miligramo. Min Minutos.

mmHg Milímetros de mercurio. mM Milimolar. mL Mililitro. µg Microgramos. µL Microlitro. MLD Metionina, Leucina, Ácido aspártico. MVD Metionina, Valina, Ácido aspártico. Nm Nanómetros. NOM Norma oficial mexicana.

PLA2 Fosfolipasas A2. RGD Arginina, Glicina, Ácido aspártico. RP – HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento, fase reversa. Rpm Revoluciones por minuto. RTS Arginina, Treonina, Serina. SDS – PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato sódico. SEMARNAT Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales. SVMP Metaloproteasas del veneno de serpientes. SVSP Serín proteasas del veneno de serpientes. TFA Ácido trifluoroacético. TFT Toxinas tres dedos. TLE Enzimas tipo trombina. TL- SVSP Serin proteasa tipo trombina. VGD Valina, Glicina, Ácido aspártico. VIH Virus de inmunodeficiencia humana.

RESUMEN.

Existe una cantidad relativamente baja de estudios con enfoque toxicológico y con respecto a las actividades biológicas que poseen los diferentes péptidos presentes en el veneno de las víboras de cascabel de montaña. Debido a esto y al hecho de que la composición del veneno puede variar de una región geográfica a otra, en el presente trabajo se analizaron los venenos de tres grupos de víboras de cascabel (Crotalus lepidus klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus), presentes en el estado de Aguascalientes y Zacatecas(México). Esto con la finalidad de observar si existen diferencias importantes en la composición de los venenos de estos tres grupos de serpientes, así como en las actividades biológicas de los péptidos que los componen. La composición de los venenos fue similar, sin embargo, se demostró la presencia de crotoxina en el veneno de C. l. klauberi así como actividad procoagulante en el veneno de C. lepidus x aquilus. El veneno de C. aquilus posee un porcentaje mayor de péptidos de bajo peso molecular (desintegrinas).

ABSTRACT.

There is relatively small amount of toxicological and biological activities approach studies of mountain rattlesnake venom. Because of this and the fact snake venom composition can vary from each geographic region, in the present work three rattlesnake venoms: Crotalus lepidus klauberi, C. aquilus and intergrade C. lepidus x aquilus from Aguascalientes and Zacatecas (Mexico) were analyzed. The aim of this study was to make a biochemical, toxicological and biological activities analysis of each individual and pooled venoms in order to observe differences at the subspecies and intraspecies levels.

Biochemical composition of the individual and pooled venoms were simiar, however the ELISA showed the presence of crotoxin in C. l. klauberi venom, and procoagulant activity was observed only in C. lepidus x aquilus venom, on the other hand low molecular mass peptides were relatively more abundant in C. aquilus venom.

INTRODUCCIÓN. Los venenos han evolucionado por millones de años, a través del reino animal (Casewell et al., 2013). Así mismo los sistemas de inoculación de veneno han evolucionado independientemente entre los vertebrados (Jackson, 2003).

Uno de los aspectos fascinantes de los animales venenosos es el hecho de que pequeñas cantidades de este material toxico, cuando es inoculado en el cuerpo de la presa o de los depredadores puede causar dolor intenso, hinchazón, edema, hemorragias, necrosis, alteración en la coagulación sanguínea, caída en la presión sanguínea o la muerte (Meebs, 2002).

Las serpientes venenosas tienen en común la capacidad de inocular veneno a través de dientes especializados llamados colmillos (Costa & Giordano, 2014), éstas utilizan sus venenos para matar y algunas veces inmovilizar a sus presas (en la mayoría de los casos vertebrados) así como para defensa en contra de depredadores (Lomonte et al., 2014). Los venenos de serpiente son mezclas complejas de moléculas biológicas que perturban los sistemas fisiológicos vitales de manera efectiva, en especial aquellos relacionados con el movimiento, la respiración y circulación (Das, et al. 2011; Koh & Manjunatha, 2011).

Estos venenos ofrecen percepciones interesantes y con frecuencia únicas dentro de campos biológicos como la farmacología (descubrimiento de drogas) (King, 2011), inmunología (terapias para envenenamientos) (Harrison et al., 2011; Williams et al., 2011), y biología estructural (unión e interacción de proteínas) (Dutertre & Lewis, 2010). La investigación de la composición de estos venenos y la caracterización de sus componentes tóxicos, es de vital importancia en la comprensión de la fisiopatología de los envenenamientos y por lo tanto el desarrollo de tratamientos adecuados (Bénard – Valle et al., 2014), esto es de particular relevancia para las poblaciones de serpientes de diferentes áreas geográficas con componentes hemorrágicos y/o neurotóxicos en sus venenos (Martínez – Romero et al., 2013).

Datos de epidemiología muestran que aunque los envenenamientos por mordedura de serpiente no son sistemáticamente reportadas en la mayoría de los países (Gutiérrez et al., 2010; Chipaux, 1998).Se estima que hay alrededor de 125,000 muertes y 3,000,000 de casos de envenenamiento por mordedura de serpientes anualmente alrededor del mundo, lo cualhace de la mordedura de serpiente un accidente de importancia médica a nivel mundial (Mackessy, 2010). Los datos de mortalidad y morbilidad por continente se presentan en el Anexo A. Otros trabajos estimaron 421,000 casos de envenenamientos y 20,000 muertes en todo el mundo anualmente. Sin embargo estas cifras podrían incrementarse a 1,841,000 envenenamientos y 94.000 muertes, esto debido a que muchas víctimas no buscan atención médica y prefieren remedios tradicionales, algunos pueden morir en sus hogares y sus muertes quedan sin registro (Chipaux, 1998).

En México se estiman 28,000 casos de envenenamientos por mordedura de serpiente anualmente(Kasturiratne et al., 2008). Entre estos casos, los envenenamientos causados por mordeduras de serpientes cascabel de montaña, en especial, especies del grupoCrotalus lepidusson raras, no parece haber reporte de mordeduras en la literatura, excepto por el reportado por Norris, (2005).

En el presente estudio se trabajó con el veneno de tres grupos de serpientes de cascabel de montaña (C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus) a nivel individual y a nivel de grupo, esto con el objetivo de caracterizar los principales componentes en sus venenos y realizar un análisis comparativo de cada veneno así como la comparación entre sus letalidades y actividades biológicas.

1.Clasificación taxonómica de los reptiles. Los reptiles, clase Reptilia, son un grupo de vertebrados que se caracterizan por vivir preferentemente en la tierra; en el caso de sus estrategias reproductivas, están desligados del agua, es decir, sus huevos se incuban en la tierra. La palabra reptil deriva del latín reptere, que significa reptar o arrastrarse. A este grupo pertenecen las tortugas, cocodrilos, lagartos, serpientes, y las únicas dos especies de tuataras que viven en Nueva Zelanda(Vázquez & Quintero, 2005).

Actualmente (agosto 2014) existen10,038 especies de reptiles(www.reptile- database.org). Tradicionalmente se dividen en cuatro órdenes:

1. Orden Chelonia oTestudines. (Tortugas y galápagos), especies terrestres y acuáticas. En México se presentan ≈ 19 géneros y 32 especies, (Vázquez & Quintero, 2005; Flores & García, 2014). 2. Orden Crocodylia. (Cocodrilos, caimanes y gaviales), en México se encuentran 2 géneros y 3 especies, (Flores & García, 2014). 3. Orden Sphenodontia. (Tuátaras), grupo de lepidosaurios parecidos a lagartos, carecen de tímpano. Las dos especies habitan islas aledañas a Nueva Zelanda; Sphenodon punctatus y S. guntheri. No existe ningún representante de este grupo en el resto del mundo. 4. Orden Squamata. (Lagartos o lagartijas y serpientes), es el grupo con mayor número de especies, también conocidos como saurios. Las serpientes carecen de extremidades (Lazcano et al., 2010). Las mandíbulas están unidas al frente por tejido elástico, en la base de éstas un hueso conocido como “cuadrado” actúa como una bisagra doble que les permite abrir desmesuradamente la boca, para poder tragar enteras a sus presas, el cráneo es muy articulado y poco osificado, no presentan párpados móviles, el ojo está recubierto por una escama transparente a manera de lente. Para el país este grupo en la actualidad está representado por 48 géneros y 417 especies (lagartijas), 89 géneros y 393 especies (serpientes), (Flores-Villela & García-Vázquez, 2014).

2.Reptiles venenosos. Los reptiles incluyen el grupo más numeroso de vertebrados venenosos. Especies productoras de veneno se encuentran en distintos grupos de reptiles incluyendo a las familias Atractaspididae, Elapidae, Viperidae y el grupo polifilético Colubridae, así como en la familia de lagartos Helodermatidae (Mackessy, 2010). El grado de toxicidad del veneno es variable, siendo capaz de matar desde pequeñas hasta grandes presas, por lo que pueden llegar a representar un daño para los humanos (Canseco & Gutiérrez, 2010).

La familia Viperidaeestá formada por serpientes de cabeza grande de forma triangular. Poseen un aparato venenoso altamente especializado, que se caracteriza por la presencia de dos grandes colmillos móviles, que pliegan cuando la boca está cerrada y despliegan cuando se disponen a morder (condición solenoglifa), los colmillos, completamente tubulares están conectados directamente con las glándulas del veneno, situadas detrás de los ojos. El gran desarrollo de sus glándulas venenosas da a la cabeza de estas serpientes su forma característica (Meebs, 2002).

En el nuevo mundo solo dos especies de lagartos, familia Helodermatidaeson venenosas, el “Monstruo de Gila” (Heloderma suspectum) y el “Lagarto de Cuentas” (Heloderma horridum), ambas especies habitan en México. Mientras que en el viejo mundo la familia Varanidae, con su único género Varanus, todas sus especies producen toxinas, a este grupo pertenece el Dragón de Komodo (Varanus komodiensis), el lagarto más grande del mundo, excediendo los 3m de longitud y los 150kg de peso(Lazcano et al., 2010).

Se sabe que de las más de 3,458 especies de serpientes, aproximadamente 677 especies son venenosas(www.reptile-database.org), aquí se incluyen serpientes que producen veneno pero que rara vez causan envenenamiento a los humanos. Incluso la serpiente europea Natrix tesselata,generalmente considerada como no venenosa tiene glándulas en la mandíbula superior que producen veneno. Si la serpiente es venenosa o no venenosa, con frecuencia será elucidado sólo con una examinación anatómica, (Meebs, 2002).

3.Aparato inoculador de veneno. Algunas serpientes como las constrictoras, matan a su presa con el uso de la fuerza. Las serpientes venenosas inyectan a sus presas una mezcla de toxinas las cuales usualmente matan a la presa en cuestión de minutos. Con sus dientes agudos y curvados hacia atrás, las serpientes son incapaces de aplastar o moler a sus presas así que deben tragarla completa.

En adición a la inyección de veneno estos dientes han evolucionado para sujetar y empujar a la presa hacia el esófago. Los maxilares inferiores están conectados entre sí por ligamentos. Estos se mueven de manera independiente cuando la serpiente está tragando a su presa. Para inmovilizar y matar a sus presas, las serpientes venenosas han evolucionado un aparato venenoso muy elaborado, glándulas especiales están localizadas a ambos lados y a lo largo de los maxilares superiores, estas son las glándulas del veneno, homologas a una glándula salival, las cuales producen una secreción tóxica, el veneno. Este es inyectado a la presa mediante el uso de dientes modificados. La evolución del aparato de venenoocurrió independientemente entre los grupos de serpientes venenosas. Sin embargo la morfología de los dientes y su localización en el maxilar superior permite la distinción de ciertos tipos en el desarrollo del aparato de veneno(Figura 1) (Meebs, 2002).

Figura 1.Morfología de la dentición en serpientes (Lee, 2013).

3.1 Serpientes venenosas en México. El conocimiento de la herpetofaunamexicana tiene raíces antiguas, sin embargo su estudio es reciente, (Vázquez & Quintero, 2005). México se localiza en la porción norte del continente americano entre los paralelos 14° 32’ 27” y 32° 43’ 06” Latitud Norte y los meridianos 86° 42’ 36” y 118° 27’ 24” Longitud Oeste. Cuenta con una extensión territorial de 1 958 201 Km2 de los cuales 1,953 128 Km2 son superficie continental y 75,073 Km2corresponden a superficie insular (INEGI, 1991), son divididos en dos partes iguales por el trópico de cáncer 23° 27’ de latitud norte (Challenger, 1998), que marca una franja de transición entre el clima árido y semiárido del país del clima húmedo y subhúmedo del sur. La ubicación geográfica de México, así como la variedad de climas, aunado a la compleja topografía del territorio mexicano, contribuyeron a formar un mosaico de condiciones ambientales y microambientales que han permitido el desarrollo de una gran variedad de hábitats y formas de vida (Canseco & Gutiérrez, 2010).

En México la familia Elapidae está representada por tres géneros: Pelamis, con una especie,Micruroides, con una especie, y Micrurus, con 18 especies. La familia Viperidae está representada en México por nueve géneros y 59 especies, 39 de ellas son endémicas del país, (Vázquez & Quintero, 2005; Uetz, 2013).

3.2 Serpientes venenosas en el estado de Aguascalientes. Con 71 especies, la herpetofauna del estado de Aguascalientes está compuesta por 16 especies de anfibios. Los reptiles suman 55 especies de las cuales 36 corresponden a serpientes, 17 a lagartijas y dos son tortugas. La herpetofauna de Aguascalientes representa el 6.8% de las 1,164 especies de anfibios y reptiles conocidos en México. Las 71 especies no es una cifra definitiva ya que más de la mitad del territorio estatal permanece sin estudios, en este campo de la investigación biológica. En Aguascalientes las serpientes venenosas están representadas principalmente por dos familias; ElapidaeyViperidae. Al menos una especie de elápido se encuentra en Aguascalientes, La serpiente coral (Micrurus distans). Lo más distintivo de las coralillos son sus vistosos patrones de coloración,

principalmente conformados por anillos de colores, los más comunes; rojo – amarillo – negro – amarillo – rojo.La familiaViperidaeestá representada por seis especies; Crotalus aquilus, C. lepidus klauberi, C. molossus nigrescens, C. polystictus, C. pricei y C. scutulatus scutulatus.De las anteriores sólo C. aquilusy C. polystictusson endémicas de México, (Vázquez & Quintero, 2005).

4. Organismos de estudio.

4.1 Crotalus aquilus (Klauber, 1952). Nombre común: cascabel pigmea de Querétaro. Situación: sujeta a protección especial (NOM-059-SEMARNAT-2010). Esta especie ha oscilado en su clasificación, siendo catalogada originalmente como subespecie de C. triseriatus,ha pasado a ser elevada al nivel de especie, y se considera muy relacionada con C. lepidus (Bryson, 2010). Es una pequeña víbora que alcanza los 62 cm de longitud, las hembras son de color gris oscuro y los machos presentan tonos verdosos (dimorfismo sexual), el dorso es recorrido por una serie de manchas casi negras de forma rectangular, más largas que anchas, siendo sus bordes intensamente oscuros. Su vientre es grisáceo y moteado(Figura 2).

Es de actividad diurna y crepuscular. Se alimenta principalmente de lagartijas que incluyen al género Sceloporusy Gerrhonotus, ranas y salamandras, pequeños ratones y pequeños invertebrados.

Esta víbora de cascabel es endémica de México y su distribución se localiza principalmente en el centro del país. En Aguascalientes sólo se ha observado en las partes altas de la Sierra El Laurel, en los límites entre el estado de Aguascalientes y Jalisco, (Vázquez & Quintero, 2005).

Figura 2.Pareja de ejemplares adultos de víbora de cascabel pigmea Crotalus aquilus; localidad del ejemplar macho (izquierda): Sierra el Laurel, Aguascalientes. Hembra (derecha), Nochistlan, Zacatecas.

4.2 Crotalus lepidus klauberi (Kennicott, 1861). Nombre común: Víbora de cascabel bandeada de las rocas. Situación: sujeta a protección especial (NOM-059-SEMARNAT-2010). La víbora de cascabel bandeada de las rocas Crotaluslepidus, es una víbora de talla mediana, que rara vez supera los 80 cm de longitud. El patrón de coloración de esta especie consiste en bandas transversales oscuras, siendo anchas en el dorso y angostas en los costados; estas manchas se encuentran ampliamente separadas entre ellas. Existe dimorfismo sexual en esta especie, las hembras son de color grisáceo a café grisáceo, en tanto que los machos poseen un color verdoso. En la cabeza tienen una línea delgada, que va del ojo al ángulo de la mandíbula(Figura 3). Es una serpiente de carácter tranquilo, sobre todo los ejemplares jóvenes, en tanto que los adultos suelen ser nerviosos, aunque, ante la presencia de un intruso, prefieren retirarse y ocultarse en su refugio.

Habita zonas de encino – pino y zacatecales de estos bosques, generalmente en zonas accidentadas y casi siempre asociadas a las cercanías de arroyos. Es una especie con amplia distribución en la República Mexicana, a través de la porción oeste del Altiplano Mexicano y la Sierra Madre Occidental hasta el norte de Jalisco (Campbell & Lamar, 1989; Dorcas, 1992). En Aguascalientes está limitada al conjunto de sierras que conforman Sierra Fría en los municipios de San José de Gracia, Jesús María y Calvillo (Vázquez & Quintero, 2005).

Figura 3.Ejemplares adultos de víbora de cascabel bandeada de las rocas Crotalus lepidus klauberi, macho y hembra, localidad; Montoro, Aguascalientes.

Se han registrado cuatro subespecies; Crotalus lepidus lepidus, C. l. klauberi, C. l. morulus, C. l. macuosus. El periodo de actividad de C. lepidus varía considerablemente y es influenciado por la estación del año, clima, elevación y latitud. (Campbell & Lamar, 2004).

Se ha obtenido información acerca del veneno de esta especie, aunque no es mucha, se sabe que los venenos de C. l. lepidus yC. l. klauberison reportados como altamente hemorrágicos con presencia de necrosis en los tejidos. Algunas poblaciones poseen componentes neurotóxicos conocidos como “crotoxina” o también como “toxina Mojave” (Rael et al., 1992). Por ejemplo poblaciones de C. l. lepidus en Texas tienen una toxicidad de 0.72 – 2.20 mg/kg i.v. en ratón. En los venenos de C. l. klauberide Arizona, Nuevo México (E. U. A.) así como de Chihuahua y Durango (México), los cuales contienen toxina

Mojave (Anexo J), tienen LD50 de 0.63 mg/kg. Por otra parte, los venenos de C. l. klauberi, poblaciones de Aguascalientes, Nuevo León y Zacatecas que carecen de toxina Mojave tienen LD50 de 2.6 mg/kg i.p. (Weinstein et al., 1985; Martínez – Romero et al., 2013).

4.3 Crotalus lepidus x aquilus (Bryson R. W., 2010). El grupo de las serpientes de cascabel de montañaconforma el 40% del total de las especies de cascabeles reconocido hasta el momento y se encuentran distribuidas en la mayoría de las regiones montañosas de México. Estas especies comúnmente relacionadas al grupo Crotalus triseriatus (C. triseriatus, C. aquilus, C. lepidus, C. pusillus y C. ravus) son especialmente difíciles de clasificar. El grupo de cascabeles C. lepidus x aquilus pertenecientes a la localidad de Palo Alto, Aguascalientes no es la excepción, presenta características morfológicas que las ubican en ambas especies (C. lepidus y C. aquilus) y su relación filogenética es un tema actual de estudio. Para el presente trabajo este grupo será referido como Crotalus lepidus x aquilus(Figura 4),(Bryson, 2010).

Figura 4.Ejemplar macho adulto de cascabel de montaña C. lepidus x aquilus, a partir del cual se extrajo una de las cuatro muestras de veneno para el estudio de este grupo. Localidad: Palo Alto, Aguascalientes.

5. Caso clínico. Las mordeduras de esta especie son raras, no parece haber reporte de mordeduras por esta subespecie en la literatura,Norris(2005), hace el primer reporte de mordedura de un ejemplar de 46 cm de longitud mantenido en cautiverio de C. l. lepidus,la mordedura fue a un hombre caucásico de 30 años de edad, un coleccionista privado, este fue mordido en la mano mientras manipulaba a la serpiente. La mordedura fue en el dedo pulgar de la mano izquierda, en minutos desarrolló una hinchazón y dolor intenso en la zona de la mordida. Se aplicó una banda de constricción en la muñeca (Figura 5-A)y condujo al hospital, llegando 60 minutos después de la mordedura, para este momento el dolor y la hinchazón se

extendieron a todo su brazo izquierdo, sin embargo no presentó síntomas sistémicos. Con una historia clínica positiva los resultados de sus exámenes arrojaron una presión sanguínea de 141/89 mmHg. Un pulso de 103 latidos por minuto, 18 respiraciones por minuto. Su extremidad izquierda reveló dos marcas punzantes de aproximadamente un centímetro sobre el dorso de su dedo pulgar cercanas a la primera articulación metacarpofalangeal. Presento hinchazón moderada en el área de la muñeca e incapacidad de juntar las puntas del dedo índice y pulgar debido a la hinchazón. Los análisis iniciales completos de sangre fueron normales. Al momento de su caso solo estaba disponible el Antivenin, suero anticrotálico polivalente, pero el paciente rechazó la administración del antídoto. A las 2.25 horas se le administró 1 g de cefazolin vía intravenosa intentando prevenir infección. También se le dieron 2 mg de sulfato de morfina a las tres horas de la mordida, a los 15 minutos se empalideció, se presentó sudor y vómito, sus signos vitales en ese momento: presión sanguínea 105/61 mmHg, ritmo cardiaco 91 latidos por minuto, ventilación a un ritmo de 20 respiraciones por minuto, lo anterior se atribuyó al efecto de la morfina. Se mantuvo bajo observación manteniendo siempre el brazo alzado, mejoró rápidamente con la administración de líquidos intravenosos, recibió un total de dos litros de solución salina normal intravenosa. Por los siguientes dos días desarrolló equimosis en la cara posterior medial del brazo(Figura 5-B). Sus estudios de coagulación permanecieron normales aunque se presentó un descenso en sus plaquetas (117,000/mL. cuarto día en el hospital), hematocrito en el 5to día de hospitalización fue de 36,3%, fue dado de alta al quinto día, sin recibir antídoto, se mantuvo la vigilancia del caso por dos años sin que se presentaran complicaciones (Norris, 2005).

A B

Figura 5.(A) Brazo izquierdo del paciente después de una hora de haber sido mordido por una cascabel C. l. lepidus, notese las marcas de colmillos, el edema y la banda de constricción aplicada por el paciente inmediatamente después de la mordida. (B) Equimosis en el brazo donde ocurrió la mordedura al cuarto día (fotos tomadas por el paciente).

Al igual que muchos venenos de víboras de cascabel, el grupo de cascabeles de las rocas (C. l. lepidus, C. l. klauberi, C. l. morulus y C. l. maculosus)de diferentes localidades geográficas parece tener una variabilidad significativa tanto en la composición de sus venenos como en su toxicidad. Mientras que algunos especímenes de C. lepidus parecen tener un componente en su veneno que esta cercanamente relacionado a la toxina Mojave encontrada en la víbora de cascabel del Mojave C. scutulatus. Este paciente no mostró sintomatología que sugiriera la presencia de neurotoxicidad. Entre otros pocos casos Hardy (1992) reporta una mordedura por C. l. klauberien la cual el paciente también desarrolló hinchazón y ampollas hemorrágicas, y aunque en ninguno de los casos se presentó necrosis del tejido, está documentada en modelos animales, por lo que sigue siendo una posibilidad en humanos.

Los colmillos de esta especie son relativamente cortos (3.2 – 3.6 mm), se obtienen en promedio 30 mg de veneno por extracción, esta cantidad es significativamente menor al de víboras de cascabel de mayor talla, tales como la cascabel diamante del oeste C. atroxque habita las mismas zonas que C. lepidus. La cantidad de veneno extraída de C. atrox es mayor a un gramo (Norris, 2005).

6. Veneno de serpientes. El veneno es la secrecion producida en las glándulas ubicadas a lo largo del maxilar superior (glándula de veneno o de Duvernoy) de serpientes venenosas y “no venenosas”, estos compuestos son uno de los productos naturales más potentes conocidos. El veneno crudo de serpiente es un líquido viscoso incoloro o amarillento (50 a 90% de su contenido es agua) que mediante procesos de liofilizado se transforma en un polvo que puede ser blanco o de color amarillo, este puede permanecer estable (no pierde sus actividades biológicas) por décadas almacenado en seco o congelado. El 90% del veneno seco son proteínas y otros polipéptidos, mientras que los nucleosidos (por ejemplo la adenosina), elementos traza (zinc, calcio, aluminio, etc.), péptidos pequeños, aminoácidos y carbohidratos representan cerca del 10%(Meebs, 2002).El veneno de serpientes es una compleja mezcla de proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos, iones metálicos y componentes orgánicos estos pueden serneurotoxinas, enzimas proteolíticas, fibrinolíticas, mionecróticas, hemorrágicas, hemolíticas, cardiovasculares y citolíticas, además de fosfolipasas,(Lomonte et al., 2014; Serrano et al, 2005; Georgieva et al., 2008; Bottrall et al., 2010; Debnath et al., 2010; Das et al., 2011).

Los venenos de serpiente afectan funciones vitales en su presa y actúan rápidamente, particularmente en roedores, a quienes producen parálisis muscular o producen fallas en la circulación. (Meebs, 2002; Canseco & Gutiérrez, 2010).

6.1 Características del veneno de serpientes y sus efectos. Una de las principales características del veneno de serpientes es su alta complejidad y variabilidad.La variación en la composición del veneno es algo común entre las serpientes y ocurre en todos los niveles taxonómicos (Barlow et al., 2009).La composición del veneno, en algunos casos, puede ser variable entre las especies de serpientes, poblaciones e incluso entre las mismas serpientes. Aparte de la carga genética, otros factores como la distribución geográfica, la edad, preferencia alimenticia, condiciones de mantenimiento, esto cuando las serpientes son mantenidas en cautiverio (granjas de serpientes), etc. Pueden causar variabilidad en la composición del veneno(Meebs, 2002).Las diferencias entre los venenos

de serpientes han atraído interés porque estas diferencias afectan la patología y por lo tanto el tratamiento clínico en victimas envenenadas por mordedura de serpientes.

Los diversos componentes presentes en el veneno, de los cuales se habla en el tema 6.2 sean enzimas, toxinas o la combinación de ambos, producen varios síntomas de envenenamiento característicos para cada especie de serpiente, dependiendo de su actividad, especificidad, concentración, un síntoma en particular puede prevalecer, pero también puede ser reprimido o enmascarado por la acción de otros componentes del veneno. Aunque el veneno de las serpientes así como sus toxinas y su modo de acción, han sido investigadas ampliamente, aún hay mucho por descubrir (Meebs, 2002). El Anexo Bresume los principales efectos o síntomas del envenenamiento por mordedura de serpientes.

6.2 Principales componentes del veneno de serpientes. En general los componentes proteicos pueden ser divididos en dos grupos:

1. Polipéptidos (no enzimáticos)Estas son toxinas con actividad específica hacia estructuras nerviosas y membranas celulares, péptidos con propiedades inhibitorias hacia enzimas (proteasas, acetilcolinesterasas), efectos sobre canales iónicos, péptidos que exhiben efectos sinérgicos con otros componentes no tóxicos, o péptidos con actividad aún desconocida (Meebs, 2002).

2. Enzimas. (metaloproteasas, serin proteasas tipo trombina, nucleasas, nucleotidasas

y fosfomonoesterasas, fosfolipasas A2). Estas son en su mayoría hidrolasas, aminoácido-oxidasas, estas tienen función digestiva. Sin embargo, existe un fenómeno, que es raro en la naturaleza, por lo cual las enzimas pueden convertirse

en toxinas funcionales. Esto incluye fosfolipasas A2, que pueden ejercer efectos altamente específicos sobre estructuras nerviosas y algunas enzimas, las cuales pueden afectar la coagulación sanguínea o causar daño a los tejidos (miotoxinas, hemorraginas) (Meebs, 2002).

Metaloproteasas (SVMP’s). Las metaloproteasas del veneno de serpiente (SVMP’s), comprenden una serie de enzimas dependientes de zinc, de pesos moleculares variados. Estas son responsables del efecto hemorrágico característico en envenenamientos por vipéridos (Gutiérrez & Rucavado, 2000). Estas enzimas han recibido particular atención debido a su asociación con síntomas notables como la hemorragia sistémica. La subfamilia M12 de metaloproteasas está formada por las SVMP’s y ADAM’s (dominio tipo desintegrina y metaloproteinasa), estos son dos grupos de proteínas que comparten ciertas características estructurales incluyendo un dominio metaloproteasa homólogo, así como, en algunos casos estructuras de dominio carboxi para el dominio proteasa. La familia de proteasasADAM’s representan una familia estructuralmente diversa de proteínas con una variedad de características funcionales (Mackessy, 2010).

LasSVMP’s poseen una relativamente alta actividad proteolítica, la cual pudo ser inhibida efectivamente mediante agentes quelantes como el EDTA. Estas son dependientes de zinc para su actividad catalítica. Además se demostró en muchos casos que estas proteínas causaban hemorragia, se les conoce como factores hemorrágicos. Ahora se sabe que las SVMP’s poseen otras actividades aparte de causar hemorragias(Mackessy, 2010).

Las SVMP’s que constan solo con un dominio metaloproteasa son clasificadas como SVMP’s P-I. Las SVMP P-II se caracterizan por presentar en su forma naciente un dominio tipo desintegrina que en la mayoría de los casos presenta el canónico motivo RGD, el cual es procesado proteolíticamente, dando lugar a la liberación de una desintegrina. En las SVMPs P-IIb, el dominio desintegrina no se escinde, permanece formando parte de la estructura de la metaloproteasa. Las SVMPs P-IIc son la forma dimérica de las P-IIb. La clase P-IId es la representación de una forma precursora que da lugar a las desintegrinas homodiméricas observadas en los venenos, mientras que las clase P-IIeson las P-II que liberan desintegrinas con motivos RGD heterodiméricas. Existen cuatro subclasificaciones de las SVMPs clase P-III, todas ellas presentan dominios desintegrina en su forma naciente y dominios ricos en cisteína. Estos dominios desintegrina con motivos RGD difieren de los de la clase P-II en la estructura de sus puentes bisulfuro en la ubicación del sitio de unión a integrina (RGD). En la subclase P-IIIalos dominios tipo desintegrina y los

dominios ricos en cisteína no son procesados de la proteasa, mientras que en la clase P-IIIb el “espaciador”, los dominios tipo desintegrina y los dominios ricos en cisteína son procesados proteolíticamente del dominio metaloproteasa. La subclase P-IIIc es una forma dimérica de la clase P-IIIa, mientras que la P-IIId está compuesta por la estructura de la P- IIIa con la adición de dominios tipo lectina unidos por dos puentes bisulfuro, acoplados postraduccionalmente a la estructura P-IIIa. Estas proteínas poseen principalmente actividad hemorrágica, proteolítica, fibrinolítica, apoptótica, inhibición de agregación plaquetaria, activación de macrófagos, activación del factor X y protrombina (Mackessy, 2010). Para C. lepidus se reportan SVMP’s probablemente P – III basado en peso molecular (Martínez – Romero, et al., 2013).

Serin proteasas tipo trombina (SVSPs). Las SVSP’scomprenden un grupo creciente de enzimas que catalizan un amplio número de reacciones que involucran la cascada de coagulación, sistema de complemento, células endoteliales y plaquetas. SVSP’s individuales catalizan una o algunas de muchas reacciones envueltas en estos procesos. Un subgrupo de SVSP’s, las tipo trombina o “trombin like” SVSP’s (TL- SVSP’s) contienen proteasas funcionalmente relacionadas con la trombina. Sus actividades biológicas se relacionan con la agregación plaquetaria, activación del factor VIII, son principalmente fibrinogenolíticas (Mackessy, 2010). Algunas de estas TL – SVSP’s tienen usos terapéuticos por ejemplo el Reptilase® se utiliza en el diagnóstico para disfibrinogenemia(Stocker, 1998).

Nucleasas, nucleotidasas y fosfomonoesterasas. Los componentes del veneno de serpientes actuando en conjunto dentro de la presa, causan inmovilización e inician la digestión. Ciertas actividades farmacológicas han evolucionado entre algunas enzimas hidrolíticas de los venenos de serpientes, las cuales interfieren con numerosos procesos fisiológicos de la presa. Sin embargo las enzimas hidrolíticas como las nucleasas (DNasa, RNasa y fosfodiesterasa), nucleotidasas (5’ nucleotidasa, ATPasa y ADPasa), y fosfomonoesterasas (fosfomonoesterasas alcalinas y

ácidas) no han sido estudiadas exhaustivamente y sus roles farmacológicos en los venenos no están claramente definidos. También muestran especificidades traslapadasy otras propiedades bioquímicas en común, causando incertidumbre acerca de su identidad en los venenos. Por ejemplo, las DNasas, RNasas y fosfodiesterasas comparten propiedades similares en la hidrolisis de substratos pero difieren en su pH óptimo y el requerimiento del ion metálico para su actividad (Mackessy, 2010).

Fosfolipasas A2.

Las fosfolipasasA2 (PLA2), son enzimas esterolíticas encontradas abundantemente en la naturaleza. Las PLA2de bajo peso molecular (13 – 18 kDa) constituyen una familia de proteínas estructuralmente relaciónadas que hidrolizan fosfolípidos en la posición sn – 2en una manera dependiente de calcio, liberando ácidos grasos y lisofosfolípidos (Dennis, 1994).Son clasificadas en diferentes grupos de acuerdo a su estructura tridimensional, secuencia de aminoácidos, especificidad catalítica, y sitio de expresión, esta familia de enzimas se está expandiendo rápidamente.

Las PLA2 presentes en venenos de serpientes pertenecen a los grupos I y II de PLA2.

(Mackessy, 2010).Las PLA2 de los venenos de serpientes son similares a las enzimas presentes en mamíferos en sus estructuras primaria y secundaria, pero éstas inducen varios efectos farmacológicos en las presas. Estas enzimas se encuentran en los venenos comúnmente como monómeros y en ocasiones formando complejos con otras PLA2o con otras proteínas mediante uniones covalentes o no covalentes(Mackessy, 2010).

Los venenos de serpientes usualmente contienen muchas isoenzimas, por lo tanto se debe de tener cuidado a la hora de su purificación. Estas isoenzimas pueden inducir diferentes efectos farmacológicos a través de su interacción con receptores/aceptores en proteínas. Esta interacción específica con su proteína blanco está mediada por sitios farmacológicos específicos en la superficie molecular(Mackessy, 2010). Una vez unido a su molécula blanco, éstas inducen sus efectos, los cuales pueden ser dependientes o independientes de su actividad enzimática(Mackessy, 2010).

Las PLA2son conocidas por haber evolucionado a partir de una forma ancestral no tóxica(Mackessy, 2010).

En serpientes de cascabel, todas las especies que producen veneno altamente toxico se presenta la expresión del gen para crotoxina/toxina Mojave; esta neurotoxina presináptica es muy potente y le brinda mayor toxicidad al veneno(Da Silva et al., 2014; Hayes & Mackessy, 2010). La crotoxina (Ctx), un componente principal en el veneno de la cascabel C. durissus terrificus, es un heterodímero formado por una subunidad básica: CB, y una

ácida (crotapotina), CA. CB es una PLA2 Asp 49 que depende de la CA para unirse específicamente a la membrana celular (Bon et al., 1979).

Trabajando con ejemplares de cascabel de Mojave, C. scutulatus scutulatus se ha mostrado que la mayoría de los venenos muestreados hasta el momento poseen toxina Mojave. Estos venenos, si carecen de actividad hemorrágica, se denominan venenos tipo A. Por otra parte, algunas serpientes de esta misma especie capturadas en Arizona central, no poseen toxina Mojave, pero son capaces de producir hemorragia en animales de experimentación, estos venenos son referidos como venenos tipo B. Hay un tercer tipo de veneno que contiene tanto actividad hemorrágica como toxina Mojave, a estos venenos se les conoce como venenos tipo A + B(Rael & Lieb, 1993).En el Anexo Cse presenta una escala con especies de serpientes de la familia Viperidae principalmente víboras de cascabel en orden de mayor a menor porcentaje de Ctx en estos venenos.

Acetilcolinesterasa. Las acetilcolinesterasas(AChE) pertenecen a una familia distinta de serín hidrolasas y pueden ser sinápticas y no sinápticas. En la sinapsis juega el papel principal en la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina (ACh), mientras que en tejido no sináptico su función no está clara. Esta enzima es muy importante para la comunicación entre las células excitables, particularmente entre nervios y músculo. El veneno de serpientes, particularmente de la familia Elapidae son una fuente común de AChE no sinápticas, con la notable excepción de las mambas, las cuales poseen fasciculinas.

La AChE está presente en todos los vertebrados, particularmente en los tejidos muscular y nervioso y como ya se mencionó juega un papel importante en la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina:

Acetilcolina AChE acetato + colina.

Estructural y funcionalmente tanto la AChE y BChE, son serín hidrolasas pertenecientes a la familia de las esterasas. La eficacia con la que la AChE controla el tiempo de vida del neurotransmisor en el espacio sináptico depende no solo de su actividad enzimática sino también de su densidad y ubicación relativa con respecto de los receptores de acetilcolina. La AChE también se encuentra en ubicaciones no sinápticas tales como las células sanguíneas como eritrocitos y linfocitos.

Venenos de diferentes tipos de serpientes de los géneros Bungarus, Hemachatus, Naja, y Ophiophagus(familia Elapidae)son fuentes comunes de AChE no sinápticas, aunque su función durante el envenenamiento no está claramente definida. (Mackessy, 2010).

L-Aminoácido oxidasas. Las L-Aminoácido oxidasas (LAAO) se encuentran ampliamente en los venenos de serpientes, esta enzima es altamente específica para L-Aminoácidos y generalmente los aminoácidos hidrófobos son los mejores sustratos. Las LAAO’s son flavoproteínas que consisten de dos subunidades idénticas, cada una con un peso molecular de 57 a 68 kDa. Las enzimas purificadas son glicoproteínas (3 a 4% carbohidratos). La desglicosilación de la enzima no altera su actividad enzimática, pero parece alterar su actividad farmacológica. La secuencia de aminoácidos de las LAAO’s del veneno de serpientes muestra un alto grado de homología (Mackessy, 2010).

Un análisis estructural mediante el uso de rayos X de las LAAO’s revela un sitio activo dinámico y la presencia de tres dominios: un dominio de unión a FAD, un dominio de unión al sustrato, y un dominio helicoidal. Estudios recientes muestran que estas LAAO’s son enzimas multifuncionales, siendo inductoras de edemas, inductoras o inhibidoras de

agregación plaquetaria, inductoras de canal, así como efectos anti-bacteriales, anticoagulantes y anti VIH (Mackessy, 2010).

Las LAAO pueden ser encontradas en venenos de la mayoría de los géneros de serpientes. La fuente más importante de LAAO son los venenos de las serpientes de la subfamilia crotaline. Esta enzima constituye del 1 al 4% del veneno(Mackessy, 2010).

Agentes anti – agregación plaquetaria. Es importante para la hemostasia la detención espontánea de la pérdida de sangre de vasos rotos, esto implica la interacción de varios procesos, tales como la vasoconstricción, activación y agregación de plaquetas, coagulación de la sangre y fibrinólisis. En respuesta a una lesión vascular, las plaquetas se adhieren de manera instantánea al tejido sub-endotelial a través de la presencia del colágeno expuesto, fibronectina y el factor Von Willebrand, vía sus receptores en plaquetas; integrina α2 β1, integrina α5 β1, y glicoproteína Ib-IX. La agregación plaquetaria ocurre a través de la interacción entre el receptor de integrina αIIb β3 y fibrinógeno, llevando a la formación de un trombo plaquetario, el cual cubre los vasos expuestos. En adición las plaquetas activadas también proveen superficies para la activación de múltiples pasos en la coagulación sanguínea (Koh & Manjunatha, 2011).

Muchos factores exógenos aislados del veneno de serpientes y otros animales afectan la función de las plaquetas. Muchos han sido usados como bases para estudiar la función plaquetaria y diseñar agentes antiplaquetarios (Koh & Manjunatha, 2011).

Estas moléculas pertenecen a diferentes clases estructurales de toxinas de veneno de serpientes y actúan a través de diferentes mecanismos. Éstas moléculas incluyen; desintegrinas, proteínas tipo lectinas C, TFT, PLA2, SVSPs, SVMPs, nucleotidasas, y LAAOs. Estos componentes del veneno pueden cumplir un papel similar (Lomonte et al., 2009),éste estárelacionado con la inmovilización de las presas de estos reptiles (Camacho et al, 2014), debido a que evolucionaron para interferir en procesos fisiológicos claves de las presas(Fry et al., 2008); Por ejemplo, la digestión de los tejidos de la presa, se hapensado

generalmente que es realizada por proteasas, especialmente SVMP. Sin embargo existe la posibilidad de que toxinas que inducen necrosis muscular sistémica como la PLA2 o la Ctx, pueden contribuir a la digestión de masa muscular haciendo que sea digerida más fácilmentepor proteasas intracelulares así como por secreciones gástricas y pancreáticas (Lomonte et al., 2009).La naturaleza diversa de su estructura, potencia y especificidad, provee múltiples posibilidades para el desarrollo de agentes antiplaquetarios. El mayor de los esfuerzos en el desarrollo de agentes antiplaquetarios a partir de veneno de serpientes se ha concentrado en las desintegrinas, que se describen en el siguiente capítulo (Koh &Manjunatha, 2011).

6.3 Toxinas como agentes terapéuticos. A principios del siglo XX, emergió la idea de utilizar toxinas purificadas como fuente de agentes terapéuticos. La primera droga exitosa desarrollada a partir de toxinas aisladas ocurrió en 1975, el agente hipotensivo captopril, se creó basado en la estructura de los péptidos potenciadores de bradiquininas (BPPs), aislados del veneno de Bothrops jararaca, como se detalla más adelante (Koh & Manjunatha, 2011).

Los venenos poseen una multitud de componentes farmacológicamente activos, que son usados para la captura de sus presas (Hodgson & Wickramaratna, 2002).Por otra parte, los venenos y toxinas de reptiles tienen un potencial tremendo para el tratamiento de enfermedades humanas y parte de este potencial se ha utilizado en la producción de fármacos basados o modelados a partir de toxinas del veneno. Los venenos de reptiles contienen toxinas que pueden ser dirigidas a cánceres humanos, desordenes hemostáticos o incluso diabetes, debido a que muchas toxinas interactúan con receptores / ligandos con un alto grado de especificidad, son también una fuente de nuevas drogas (Mackessy, 2010).

La toxicidad de las toxinas animales es debida a su alta especificidad a receptores celulares en células de tejidos particulares. Por ejemplo las neurotoxinas, se pueden clasificar de acuerdo al sitio donde éstas actúan o incluso de acuerdo a su sitio de unión en un canal iónico. Las toxinas serían las drogas ideales por su toxicidad altamente selectiva,

dejando otros órganos ilesos. Sin embargo es la alta letalidad de estos productos la cual disuade a las industrias de las drogas acerca de la exploración de sus aplicaciones potenciales. Con todas las precauciones que son consideradas al día de hoy, glucósidos digitalizados, drogas indispensables para el tratamiento de corazones enfermos, podría estar fuertemente aceptado en el mercado de las drogas. Esta pequeña ventana terapéutica, tiene el riesgo de ciertos efectos laterales. Las toxinas de venenos de animales se han convertido en reactivos importantes en la investigación neurofisiológica. Por ejemplo, mediante el uso de la α – bungarotoxina, una neurotoxina en el veneno del búngaro chino Bungarus multicinctus, el primer neuro – receptor; el receptor de acetil colina, se hizo “visible”, y su estructura elucidada. Por casualidad, esta investigación produjo un importante entendimiento en la patogénesis de una forma especial de distrofia muscular, miastenia gravis. Aquí el sistema inmune del mismo paciente genera anticuerpos contra sus propios receptores de acetil colina, los cuales se destruyen y los músculos se degeneran. Las enzimas del veneno de serpientes también son reactivos de diagnóstico importantes para la hemostasia; Reptilasa – R®, Bothrocetin®, Stypven®, Ecarin®, Protac®. El número de los componentes de venenos (en particular toxinas), que son utilizados para investigación se ésta incrementando (Meebs, 2002).

Las enzimas coagulantes del veneno de serpientes se han usado para tratar enfermedades tromboembólicas. Ancrod®, también conocido como Arvin®, del veneno de la víbora malaya de fosetas Callocelasmarhodostoma, causa un decremento dosis – dependiente en el nivel de fibrinógeno y disminuye la viscosidad de sangre y plasma. La sangre fluye, y la perfusión de los vasos ocluidos se supera. La enzima libera el fibrinopeptido A, mas no el B, del fibrinógeno, llevando a la polimerización de la fibrina disfuncional, la cual es rápidamente disuelta por plasmina. Este fármaco ha sido retirado del mercado, pero puede que sea introducido para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo. La aplicación repetida de Ancrod® induce la formación de anticuerpos, la cual reduce su eficacia. Es posible que otra preparación de enzimas pueda ser utilizada. La Defibrasa®, enzima coagulante (también llamada batroxobin) del veneno de la víbora brasileña cabeza de lanza Bothropsmoojeni, la cual es también un ingrediente de Reptilasa® (Meebs, 2002).

Una nueva y prometedora aplicación del batroxobin se ha encontrado en el desarrollo de un “pegamento de fibrina” el cual es usado en cirugía para detener el sangrado difuso de hígado o pulmón mediante el cubrimiento de la superficie con una capa delgada de fibrina. Se ha desarrollado un elegante procedimiento, utilizando la sangre del propio paciente durante la operación, aplicando batroxobin (ConvaTec; Bristol – Myers – Squibb Co., UK). Desde 120 mL de sangre del paciente, se separa el plasma y el batroxobin es adherido, produciendo una fibrina atípica, la cual es soluble en soluciones ácidas (pH 4). Esto permite la eliminación del batroxobin, el cual es unido a la biotina (vitamina H) y removido de la solución con la ayuda de la avidina. Cuando esto es acoplado con agarosa, se forma un complejo insoluble avidina – biotina – batroxobin que es separado mediante centrifugación. Mediante la adición de una solución buffer alcalina, la fibrina polimeriza y puede ser roseada en el área de la lesión (Meebs, 2002).

Productos naturales, incluidas las toxinas pueden fungir como acarreadores de sustancias y pueden ser más compatibles con la “aplicación clínica” después de una modificación química. Los inhibidores de enzimas convertidores de angiotensina (ACE), tales como el captopril y ramipril (Delix®, Hoechst Marion Rousel), que inhiben específicamente la actividad de ésta enzima, son utilizados de manera exitosa en el tratamiento de hipertensión y falla cardiaca. Estas drogas están basadas en la investigación hecha por dos farmacólogos brasileños; Ferreira y Rocha da Silva, quienes aislaron péptidos a partir del veneno de la víbora cabeza de lanza Bothropsjararaca, estos péptidos potencian el efecto de la bradiquinina, un péptido que disminuye la presión sanguínea. Estos péptidos potenciadores de bradiquininas (BPP) constan de cinco a 13 aminoácidos y se ha encontrado que son inhibidores específicos de las enzimas que convierten angiotensina I, un decapéptido en angiotensina II, un octapéptido con alta actividad en el incremento de la presión sanguínea. Sin embargo estos péptidos no son tan efectivos mediante aplicaciones orales porque son rápidamente inactivados en el tracto digestivo. Por lo tanto se han sintetizado nuevas sustancias basadas en estos inhibidores presentes en estos venenos, los cuales pueden ser tomados como medicamentos orales. El captopril fue el primer inhibidor ACE sintético introducido para uso terapéutico, seguido por el ramipril

(Meebs, 2002), el Anexo Dresume los principales fármacos hechos a partir de componentes en el veneno de serpientes.

Opiáceos como la morfina son drogas importantes para el tratamiento del dolor intenso. Sin embargo tienen un alto potencial de efectos colaterales, incluyendo la dependencia física a esta drogaque es uno de los mayores inconvenientes en su uso. Un alcaloide de la piel de la rana flecha venenosa Epipedobates tricolor, nombrado epibatidina, exhibe un fuerte efecto analgésico en animales experimentales, similar al producido por la morfina. Este parecía ser un modelo interesante para el desarrollo de nuevos analgésicos, pero la alta toxicidad de este alcaloide ha impedido su uso parcial. Incluso en dosis bajas, aunque todavía analgésico, causa una caída en la presión sanguínea, parálisis y convulsiones. Utilizando un compuesto similar sintetizado que fue creado (ABT-594), no se observaron efectos secundarios y seguía exhibiendo la misma eficacia analgésica similar a la morfina. Es de resaltar que aplicaciones repetidas de esta sustancia parece no causar dependencia física a ésta misma, porque ésta actúa sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina, en vez de los receptores opiáceos del cerebro. (Meebs, 2002).

Estos son algunos ejemplos que demuestran el alto valor del potencial terapéutico de las toxinas de origen animal. Todavía existen tantas posibilidades para explorar nuevas toxinas utilizables como la diversidad de péptidos en el veneno de los caracoles cono. Con cada toxina nueva encontrada, la cuestión sería; ¿Cómo ésta podría ser utilizada en medicina para el tratamiento de enfermedades? Quizá mediante una versión modificada químicamente (Meebs, 2002). El aislamiento y estudio de los componentes individuales del veneno de serpiente lleva a una contribución potencial a la mejora de modalidades terapéuticas y ajustes clínicos, también abre posibilidades para el descubrimiento de nuevas toxinas que pueden ser de utilidad para dilucidar procesos celulares y moleculares de importancia biomédica (Yamileth & Lomonte, 2009).

El veneno de las lagartijas de la familia Helodermatidae también contiene péptidos, toxinas conocidas como exendinas, de las cuales, La Exanatida, se ha convertido en el pilar para el desarrollo de nuevos fármacos a partir del veneno de los reptiles. Con el fin de

aprovechar un enfoque nuevo en las investigaciones del veneno de manera racional y efectiva, es importante comprender las bases de cómo los organismos venenosos utilizan su veneno en un contexto natural predador – presa, (Mackessy, 2010).

Agentes pro y anti – coagulantes. Los desórdenes hemorrágicos son típicamente debidos a deficiencias congénitas de factores de coagulación de la sangre u otros traumas físicos o cirugías. La trombosis es provocada por la ruptura de placas arterioscleróticas, alterando las paredes de los vasos. Las bases para el tratamiento de estos desórdenes son sencillas: promover la coagulación sanguínea en pacientes hemofílicos con pro – coagulante, y prever la coagulación sanguínea durante la trombosis con anti – coagulante. Los agentes pro – coagulantes en los venenos de serpientes son usualmente enzimas que activan mediante proteólisis algunos de los factores de coagulación. Por lo tanto las moléculas suelen ser agrupadas de acuerdo con sus funciones. Algunos de las mayores clases de pro – coagulantes de veneno de serpiente incluyen: Enzimas tipo trombina (TLE), activadores de protrombina, activadores FX y activadores FV. En contraste los anti – coagulantes consisten de ambos, enzimáticos

(PLA2, SVMP’s, SVSP’s y LAAO’s) y no enzimáticos (proteínas tipo lectinas tipo C, toxinas de tres dedos) (Koh & Manjunatha, 2011).

Agentes anti – cáncer. Calvette arrojó en 1933, el primer reporte científico acerca de las propiedades anti cáncer del veneno(Debnath et al., 2010).

La mortalidad del cáncer con frecuencia es debida a la metástasis, se requieren las desintegrinas apropiadas para interactuar con ciertas moléculas de matriz extracelular (ECM). Cuando estas interacciones cambian resulta en un crecimiento incontrolado del tumor, invasión a tejidos adyacentes y metástasis(Galán et al., 2008).

Las integrinas juegan un papel múltiple e importante en la patología de cáncer incluyendo la proliferación celular en tumores, angiogénesis, invasión y metástasis. Por

ejemplo las integrinas αv β3, αv β5 y α5 β1, son los factores clave en la formación de vasos sanguíneos nuevos para abastecer a las células tumorales (angiogénesis tumoral). Aunque muchos otros como: α1 β1, α2 β1, α4 β1, α6 β1, α6 β4 y α9 β1, también están involucrados (Koh & Manjunatha, 2011).

La inhibición de la angiogénesis es una de las opciones de tratamiento más altamente exploradas para el cáncer. Las desintegrinas del veneno de serpientes representan una biblioteca de moléculas con diferente estructura, potencia y especificidad y son buenos puntos de inicio para el desarrollo de terapias anti – angiogénesis (Koh & Manjunatha, 2011).

Desintegrinas. Las desintegrinas son una familia de proteínas ricas en cisteína, de bajo peso molecular, inicialmente aisladas a partir del veneno de serpientes de la familia Viperidae, que usualmente contienen los motivos de unión a integrina RGD. Estudios recientes han mostrado la presencia de otras secuencias tripeptídicas tales como KGD, MVD, MLD, VGD, ECD, MDG y KTS. Las secuencias de tri-péptidos RGD y KGD son los principales sitios de unión para el receptor de integrina αIIb β3, la unión de la desintegrina al αIIb β3, previene así la unión del fibrinógeno al receptor y por lo tanto la agregación plaquetaria. Dos drogas Tirofiban (Aggrastat®) y Eptifibatide (Integrilin®), fueron diseñadas, basados en las desintegrinas del veneno de serpientes y están disponibles en el mercado como agentes antiplaquetarios. Tirofiban, el antagonista de αIIb β3 fue diseñado basándose en el farmacóforo RGD. Basado en la distancia que separa las cadenas laterales de Arg y Asp en los motivos RGD de la echistatina, una desintegrina aislada del veneno de Echiscarinatus. El desarrollo de eptifibatide tiene incluso vínculos más cercanos con las desintegrinas del veneno de serpientes. Para descubrir una desintegrina para αIIb β3, se analizaron 62 venenos de serpientes, llevando a la identificación del barbourin en el veneno de Sistrurusmiliariusbarbouri, este se une al receptor αIIb β3 mediante su motivo KGD, y la sustitución de Lys a Arg, conlleva al incremento en la especificidad a αIIb β3, el eptifibatide se diseñó tomando lo anterior como base. Desde que fue descubierto que las

integrinas median las interacciones célula – célula, célula – matriz, importantes en los procesos de adhesión celular, migración celular, organización del tejido, crecimiento celular, hemostasia, y respuestas inflamatorias. Éstas han sido de interés para el desarrollo de nuevas drogas.

El Triflavin, una desintegrina que contiene RGD, aislada del veneno de Trimeresurusflavoviridis, fue la primera en mostrar inhibición de adhesión celular, migración y angiogénesis. Las secuencias RGD, son conocidas por tener como objetivo integrinas como: αIIb β3, αv β3, y α5 β1, y estas últimas tres son claves en el proceso de angiogénesis. Subsecuentemente, muchas otras desintegrinas que contienen RGD, tales como la acutina, salmosina, contortrostatina y rhodostomina, también inhiben angiogénesis tumoral y metástasis. Cuando son inyectadas simultáneamente con células de melanoma en ratón estas reducen significativamente la colonización del tumor en pulmón (Oliva et al., 2007). Otras desintegrinas no – RGD, especialmente las que contienen KTS o RTS como la obtustatina, viperistatina, lebestatina y jerdostatina, cuyo objetivo es la integrina α1 β1, también bloquearon angiogénesis tumoral y metástasis.

Entre todas ellas, la contortrostatina, una desintegrina homodimérica de 13.5 kDa hizo el mayor progreso. Las cadenas monoméricas de la contortrostatina (conteniendo el motivo RGD) se unieron a las integrinas: αIIb β3, αv β3, αv β5, α5 β1, y fueron efectivas en la inhibición del crecimiento del tumor, angiogénesis y metástasis en modelos de cáncer de seno y ovario. La contortrostatina se puede administrar vía intravenosa (i.v), esta proteína encapsulada en liposomas es un sistema de entrega más ventajoso y resulta en la prolongación de la vida media e incrementa el consumo de la desintegrina en el sitio del tumor. En adición la actividad antiplaquetaria es disminuida (mientras la desintegrina es protegida dentro de los liposomas mientras está en circulación), pero el efecto antitumoral es mantenido (a medida que los liposomas se acumulan en los sitios del tumor y liberan la contortrostatina activa). Además se diseñó una variante en la cual la porción C terminal de la echistatina fue insertado sobre la contortrostatina. Se reportó que esta secuencia C terminal mejoró la unión a la integrina α5 β1, la cual es la base de este diseño. Por lo tanto

la contortrostatina parece ser uno de los precursores más importantes en el desarrollo de agentes terapéuticos derivados del veneno de serpientes (Koh & Manjunatha, 2011).

Las desintegrinas y proteínas tipo desintegrinas son moléculas encontradas en el veneno de cuatro familias de serpientes (Atractaspididae, Elapidae, Viperidae, y Colubridae). Estas inhibeninteracciones célula- célula, interacciones célula – matriz y transducciones de señal. Estas proteínas pueden tener un potencial en el tratamiento de ataques cardiacos, canceres, osteoporosis, y diabetes. Las desintegrinas son obtenidas de un proceso de proteólisis de proteínas como SVMP P-II o P-III, estas existen en ambas formas monomérica o dimérica (homo o hetero), y ejercen su acción interactuando con los receptores de integrina. Las desintegrinas pueden interactuar también con varios tipos de células con cáncer. Se han caracterizado alrededor de 90 desintegrinas encontradas en los venenos de serpientes. Muchas de estas desintegrinas son extremadamente conservadas; sin embargo hay diferencias mayores en su afinidad por integrinas. Esta diferencia se debe a distintos motivos de unión (RGD, KGD, MVD, MGD, WGD y VGD) que inhiben la unión de los ligandos naturales, como fibrinógeno, fibronectina y vitronectina (Sánchez et al., 2008),el AnexoE resume las principales desintegrinas obtenidas de veneno de serpientes y sus efectos.

Crotoxina. Varios estudios han demostrado actividades antitumorales in vitro e in vivo para la Ctx. Interfiere con el crecimiento del tumor mediante la modificación de procesos celulares selectivos asociados con el crecimiento celular (Cura et al., 2002). La Ctx sola o en combinación con cardiotoxina (VRCTC – 310) es citotóxica para algunas líneas humanas de células tumorales (leucemia, así como pulmón, cólon, renales, de ovario y carcinoma ductal mamario, melanoma y tumor cerebral) y en ratón (sarcoma, eritroleucemia) (Rudd et al, 1994).

La citotoxicidad de la Ctx es mediada inicialmente por la interacción con sitios de unión de alta afinidad en la superficie de la célula (Montecucco et al., 2008) que involucran la actividad PLA2de la toxina(Corin et al., 1993). Mas recientemente Yan et al.,

(2006)demostró que la Ctx causa un colapso en el potencial de membrana de la mitocondria, la liberación del citocromo c y la activación de la caspasa – 3 en líneas celulares de leucemia mieloide crónica (células K562), sugiriendo la participación de mecanismos apoptóticos en la muerte celular inducida por Ctx.

En adición a la actividad de Ctx en líneas celulares cultivadas, la actividad antitumoral ha sido observada in vivo. Inyecciones i.m. diarias de Ctx inhibieron el crecimiento del carcinoma de pulmón de Lewis y carcinoma mamario humano MX – 1 en 83 y 69% respectivamente (Cura et al., 2002).

En un modelo experimental de dolor por cáncer inducido mediante la inyección intraplantar de células carcinoma Walker 256, la Ctx redujo el crecimiento del tumor y produjo analgesia (Brigatte et al., 2007).

En 1995 la FDA aprobó el estudio en fase I en pacientes con tumores sólidos refractarios en terapia convencional. En este estudio, la administración i. m. de Ctx por 30 días produjo una reducción de la masa del tumor mayor al 50% en algunos pacientes, con una regresión completa regresión de la masa primaria del tumor en un paciente (Cura et al., 2002). Los resultados de los ensayos clínicos correspondientes a la fase II no han sido publicados (Sampaio et al., 2010).

7. Hipótesis. El veneno de las víboras de cascabel de montaña del complejo C. triseriatus (C. l. klauberi,C. aquilusy C. lepidus x aquilus) de Aguascalientes y Zacatecas, poseen componentes tóxicos de naturaleza proteolítica que alteran la coagulación, así como proteínas ricas en cisteína, de bajo peso molecular. Estos venenos, a pesar de que pertenezcan a especies evolutivamente cercanas, presentan variaciónen sus venenos. Por lo tanto, existen diferencias con respecto a sus DL50, actividades biológicas; como actividad proteolítica y actividad procoagulante.

8. Ojetivos.

8.1 Objetivo general. Caracterizar los componentes principales del veneno de las víboras de cascabel C. l.klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus, para observar las diferencias en la composición de sus venenos y sus actividades biológicas.

8.2 Objetivos particulares.  Llevar a cabo el fraccionamiento de las proteínas mediante cromatografía en fase reversa (RP-HPLC).  Separación de proteínas por peso molecular, mediante electroforesis (SDS – PAGE).

 Calcular lasDL50 de los tres grupos de venenos (C. l. klauberui, C. aquilus y C. lepidus x aquilus) observando sintomatología.  Calcular actividad proteolíticia en los tres grupos de venenos.  Evaluar actividad procoagulante mediante la dosis minima procoagulante (DMP).

9.Materiales y metodología.

9.1 Trabajo de campo; colecta de los ejemplares de víbora de cascabel. Se hizo el trámite correspondiente ante SEMARNAT; permiso de colecta de partes o derivados de vida silvestre con fines de investigación científica modalidad B, Oficio: SGPA/DGVS/06483/13.

Las salidas de campo se hicieron a partir del día 16 de julio hasta el día 19 de octubre de 2014. Se hicieron un total de 36 muestreosen las áreas naturales del estado de Aguascalientes, y sus límites con los estados de Zacatecas y Jalisco; abarcando los municipios de San José de Gracia, Calvillo y Aguascalientes.

Se hizo colecta directa de los organismos, utilizando la metodología descrita por Manzanilla & Péfaur(2000). Utilizando material especializado para el área de herpetología, el cual incluye ganchos, pinzas y tubos herpetológicos.

Se hicieron recorridos para mayor eficiencia en la cobertura de área de muestreo, éstos se aplicaron con los horarios marcados en la tabla 1.

Tabla 1. Horarios de los recorridos para colecta en campo de serpientes.

Recorrido diurno 9:00 a 14 horas

Recorrido nocturno 18:00 a 23:00 horas

Cinco ejemplaresC. lepidus x aquilus fueron donados por la Asociación para la Conservación de la Biodiversidad del Centro de México A. C.

9.2 Extracción y liofilización del veneno. El veneno se obtuvo mediante extracción manual, sujetando a las serpientes por la parte posterior de la cabeza y permitiéndoles morder sobre un tubo falcon de 50mL cubierto con parafilm.

Una vez extraído el veneno de cinco ejemplares de C. l. klauberi, cinco ejemplares de C. aquilus, y cuatro ejemplares de C. l. klauberi x aquilus,éste se mezcló con acetato de amonio(CH3COONH4) 20 mM pH4.7 y se centrifugó por 3 min a 12000 rpm. Para desechar detritus celulares (pastilla), se congeló a -70°C hasta ser colocado en el liofilizador durante toda la noche. El acetato de amonio se volatilizó durante la liofilización quedando sólo el veneno seco. El veneno se congeló una hora a -70°C, posteriormente se colocó en un liofilizador a -50°C y 25pa. Durante toda la noche.

9.3Cuantificación de proteína por el método del ácido bicinconínico (BCA). Procedimiento para microplacas marca Falcon. El procedimiento para la preparación de los reactivos se presenta en el Anexo F.

Para las diluciones se tomaron 3 mg de veneno (peso seco)y se resuspendió en 1 mL de solución salina (NaCl 150 mM)dilución 1 en 20 µL de muestra en placa.

1. Se transfirieron 20µL de cada ST y MP, 3mg en diferentes pozos, incluidosdos blancos los cuales llevan sólo el buffer(NaCl 150 mM) en el que se encuentran diluidas las muestras y los estándares.

2. Se añadieron 200µL de MR a cada pozo y se mezclaron en el lector de ELISA por 30 segundos.

3. Se cubrió la placa con una tapa y se incubó a 37°C por dos horas.

4. Se Leyó absorbancia en el lector de ELISA con un filtro de 570 nm utilizando el método de BCA que se encuentra en el software Magellan.

9.4 Cuantificación de proteína por absorbancia a 280nm. Se hizo la cuantificación por absorbancia a 280 nm de las muestras de cada uno de las ejemplares.

1. Se hicieron diluciones de la muestra en PBS.

2. Se tomó absorbancia a 280 nm del blanco (PBS).

3. Se tomó absorbancia a 280 nm de las muestras.

4. El valor de la absorbancia se multiplicó por la diluciónque se utilizó para dichas muestras. Esto tomando como fundamento la ley de Lambert y Beer expresada y despejada en el Anexo F.

Se utilizaron las diluciones 1:20 hechas previamente para BCA, y los pool 1mg/mL de C. l. klauberi, C. aquilus, yC.lepidusx aquilus. Posteriormente se midió absorbancia a 280 nm, en espectrofotómetro UV. Eppendorf Biophotometer.

9.5Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de Dodecil sulfato sódico (SDS – PAGE). Los reactivos y el procedimiento para formar las diluciones necesarias para los geles concentrador y separador, son descritos en el Anexo G.

Se cargaron 25 µg de veneno de C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus, muestras individuales (5) y en pool de cada grupo de estudio, así mismo, se cargaron 25 µg del marcador de peso molecular en SDS-PAGE en condiciones reductoras (β – mercaptoetanol) . Se corrió a 200 V por 45min.

Se hizo la tinción durante toda la noche con azul de Coomassie, desteñido con 10% metanol + 10% ácido acético en agua desionizada (Anexo G).

Los geles fueron escaneados para su análisis(Figura 7).

9.6. Cromatografía líquida de alta resolución, fase reversa(RP-HPLC). Para las corridas cromatográficas se cargó 1 mg de venenode cada pool (C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus) a partir de una solución de 3 mg/mL de veneno en NaCl 150 mM,se centrifugó la muestra a 12,000 rpmpor 5 min para retirar impurezas antes de su inyección en la columna C18.

Fase móvil:

a). Solución A: Agua + 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA).

b). Solución B: Acetonitrilo + 0.1% de TFA.

Fase estacionaria:

Columna C18analítica.

Previo a la inyección de la muestra, la columna se lavó con 100% de la solución B durante 15 min y se estabilizó con 100% de la solución A durante 15 min.

Tabla 2. Gradiente de elución.

Tiempo (min) Flujo (mL/min) %A %B 0 1 100 0 5 1 100 0 15 1 85 15 75 1 55 45 85 1 30 70 94 1 30 70

9.7 Dosis letal media (DL50). Se utilizaron ratones ICR de 18 a 20 g de peso, sin importar el sexo.

1. Se seleccionaron dosis de veneno, asegurándose de obtener un 100% de supervivencia y 100% de mortalidad. Se formaron grupos de 3 ratones por dosis de veneno. Como control se inyectaron tres ratones con NaCl 150 mM.

2. Teniendo el rango de 100% de supervivencia y 100% mortalidad, se seleccionaron al menos 5 dosis intermedias y fueron inyectadas en grupos de 3 ratones para cada una de las cantidades.

3. Se registró el porcentaje de mortalidad a las 24 horas posteriores a la inoculación.

4. Los datos se procesaron con el software GraphPad Prism 4.

Se realizó la inyección intravenosa, utilizando la vena caudal de cada ratón. Las dosis se administraron de la siguiente manera:

C. l. klauberi: 7, 10, 16, 19, 22, 25, 50 µg/ratón.

C. aquilus:25, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 100 µg/ratón.

C. lepidusxaquilus:50, 75, 100, 115, 125, 130, 135 µg/ratón.

Para obtener la DL50 se graficó el porcentaje de mortalidad en función del logaritmo de la dosis de veneno inyectado por grupo. Estos datos fueron analizados utilizando una regresión no lineal (Curva dosis-respuesta de pendiente variable) en el software Graphpad

Prism 4.0. La DL50 fue definida como la dosis de veneno que causa la muerte a la mitad de la población de ratones (Theackston & Reid, 1983).

9.8 Actividad procoagulante. 1. Se tomaron 15 mL de sangre de un donador voluntario sano y se mezclaron con 5

mL de citrato de potasio (C6H5K3O7) 0.5M.

2. Se centrifugó a 3000 rpm. Por 15 min.

3. En 15 tubos de ensayo de vidrio, se colocaron 200 µL de plasma a cada tubo y se incubaronpor 3 min a 37°C.

4. Se añadieron 20 µL(concentración: 3.2 µg/µL) de venenode C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus a cada muestra y se midió el tiempo transcurrido desde la inyección del veneno hasta la formación del coagulo. Se utilizó veneno de Bothrops asper como control positivo.

La dosis mínima procoagulante (DMP). Se define como la cantidad de veneno necesaria para evidenciar la formación de un coagulo en 60 segundos (Theakston & Reid, 1983; Gené et al., 1989).

9.9 Actividad proteolítica sobre azocaseína. 1. Se preparó solución de azocaseína (Sigma A2765) de 10 mg/mL en buffer Tris –

HCl 50 mM, NaCl 0.15 M y CaCl2 5 mM, pH 8.0.

2. Se mezclaron 100 µL de azocaseína con 20 µL de la toxina o el veneno a probar, diluido en el mismo buffer (NaCl 150mM). Se hicieron triplicados de cada muestra y se utilizó buffer de dilución de la toxina como control negativo.

3. Se Incubócada muestra por 90 min a 37°C.

4. Se agregaron a cada tubo 200 µL de ácido tricloroacético (CCl3COOH) al 5%, se mezclaron y centrifugaron por 5 min a 15000 rpm. (para microplaca se agregaron 180 µL de ácido tricloroacético).

5. Se mezclaron 150 µL del sobrenadante con 150 µL de NaOH 0.5M. (en placa de ELISA).

6. Se midió absorbancia a 405nm.

9.10 Detección de crotoxina: Western blot semi – seco. La preparación de los buffers de transferencia y ABTS se muestra en el Anexo H.Se cargaron5mg de muestra por carril (1. Marcador de peso molecular, 2. Crotoxina pura, 3. Veneno de C. s. scutultus A, 4. C. s. scutulatus B, 5. Poolde venenode C. l. klauberi, 6. C. aquilus, 7. C. lepidus x aquilus)en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Una vez que el gel terminó de correr, se sacó éste de la cámara de electroforesis y fue transferido a una membrana de nitrocelulosa.

Se utilizaron anticuerpos monoclonales anti – crotoxina (anticuerpo primario) en una dilución 1:1000 (Hernández, 2013).

Se utilizaron anticuerpos anti-conejo marcados con peroxidasa de rábano en dilución 1:1000 (Hernández, 2013).

Cámara semi-seca:  Se hizo un “sándwich”: o Se colocaron 3 papeles filtro (3M) del tamaño del gel sobre la cámara. o Se colocó el gel. o Luego fue colocado el papel de nitrocelulosa. o Finalmente se agregaron otros 3 papeles filtro (3M).

NOTA: Todos los papeles del sándwich estuvieron previamente sumergidos en buffer de transferencia, el sándwich debe quedar bien mojado y sin burbujas.

Se tapó la cámara y se aplicó corriente constante a 400 mAmps. Se dejó la transferencia durante 1hora(Figura 6).

Figura 6. Conformación de la cámara semi-seca para la transferencia de proteínas del gel SDS – PAGE a la membrana de nitrocelulosa.

9.11Detección y cuantificación de crotoxina mediante ELISA. 1. Se sensibilizaron placas NUPEC con el anticuerpo 4F6 anti-crotoxina(Hernández, 2013)y solución de sensibilizado (Buffer de bicarbonatos pH 9.5) a una concentración de 1 mg/mL, incubando durante una hora a 37°C.

2. Al término de la incubación se desechó el sobrenadante y se agregaron 200 µL de solución de lavado (Tris 1M pH 8 + NaCl 5M + Tween 20). Se repitió tres veces.

3. Los pozos se bloquearon con gelatina (Tris 1M pH 8 + gelatina + Tween 20) agregando 200 µL a cada pozo e incubando 2 horas a 37°C.

4. Se hicieron 3 lavados.

5. Se agregaron 100 µL de solución de reacción (SR: Tris 1M pH 8 + NaCl 5M + Gelatina + Tween 20) a las columnas 2 – 12 y filas A – H. Posteriormente se agregaron 150 µL de una concentración de 2µg/mL de crotoxina (Ctx: para la curva estándar), y diferentes concentraciones de los venenos problema (C. l. k:veneno de C. l. klauberi, C. a: C. aquilus, C. lxa:C. lepidus x aquilus, C -: veneno de C. s. scutulatus tipo B utilizado como control negativo) con solución de reacción al pozo 1A a 1H a partir de estos se tomaron 50 µLde sobrenadante y se transfirieron al siguiente pozo, de manera sucesiva hasta llegar al pozo 10, en elAnexo Ise muestra una descripción gráfica de éste procedimiento.

6. Se incubó una hora a 37°C.

7. Se aplicaron 3 lavados.

8. Se incubó 1 hora a 37°C con una concentración de 1 µg/mL, dilución 1:1000 del anticuerpo monoclonal de conejo anti – crotoxina(Hernandez, 2013).

9. Se preparó una dilución 1:1000 de anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano y solución de reacción, se agregaron 100 µL a cada pozo y se incubó una hora a 37°C (Hernández, 2013).

10. Se hicieron 3 lavados.

11. Se realizó el revelado con una mezcla de 1 mL de buffer para Ácido 2,2’ – azinobis (3-etilbenzotiazolín) -6-sulfónico (ABTS). 75 µL de ABTS, aforando a 10 mL de agua destilada.

10. Resultados.

10.1 Trabajo de campo; colecta de los ejemplares de víboras de cascabel. Se colectaron un total de 18 ejemplares (4 hembras y 11 machos adultos, 3 crías 2013) de cascabel bandeada de las rocas C. l. klauberi (Montoro – Aguascalientes) así como un ejemplar de cascabel pigmea Crotalus aquilus (Sierra el Laurel – Aguascalientes) y 4 C. aquilus (Nochistlan – Zacatecas).

10.2 Extracción,liofilización y cuantificación de proteína del venenode cada serpiente,peso en mg/ordeña, BCA y absorbancia a 280nm. Los resultados obtenidos de las extracciones, y la cuantificación de proteína se muestran en la tabla 5. Donde los ejemplares marcados con asterisco (*) son animales cuya longitud del cuerpo es mayor a 40 cm.

Tabla 3. Cuantificación de proteína en mg/ordeña, BCA y abs a 280 nm. Muestra mg/ordeña BCA C mg/mL C. l. klauberi 1* 58 2.98 3.6 C. l. klauberi 2 22.3 2.52 2.58 C. l. klauberi 3 16.3 2.34 3.28 C. l. klauberi 4 10 2.54 3.78 C. l. klauberi 5 14.3 2.52 2.82 C. aquilus 1* 52.2 2.9 3.4 C. aquilus 2 8.1 2.66 3.12 C. aquilus 3 14.6 1.93 2.96 C. aquilus 4 2.9 2.43 2.62 C. aquilus 5 1.6 1.62 1.54 C.lepidus x aquilus 1* 67.1 3.83 3.22 C.lepidus x aquilus 2 11.9 2.99 3.44 C.lepidus x aquilus 3* 126.6 2.82 3.42 C.lepidus x aquilus 4 28.9 2.95 3.7

De un ejemplar adulto se pueden extraer hasta 126.6 mg de veneno (peso seco). Aunque en promedio la cantidad que se les puede extraer es de 76 mg de veneno (peso seco). Mientras

que de los ejemplares jóvenes (˃ 30 cm de longitud del cuerpo) en promedio se les extrajeron 2.25 mg de veneno (peso seco).

Posteriormente se hicieron los pool pesando 3 mg de veneno de cada ejemplar y se colocaron en tubos ependorff (un tubo para cada grupo de estudio), una vez colocado el veneno en los tubos se resuspendió con 1 mL de NaCl 150mM.Estos tres pool fueron cuantificados por BCAy a partir de ésta cuantificación se hicieron las pruebas de actividad biológica y caracterización bioquímica.

Tabla 4. Cuantificación de proteína de los “pool” de veneno de los tres grupos de serpientes en estudio; por peso seco y BCA. Veneno “Pool” Peso seco BCA Pool C. l. klauberi 18.3 11.6 Pool C. aquilus 8.8 6.29 Pool C.lepidus x aquilus 12.1 6.13

Basados en las concentraciones obtenidas mediante el BCA, se aplicaron los ensayos posteriores.

10.3Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS - PAGE). Se obtuvieron tres geles, con perfiles similares de bandeo;tanto de los pool como de las muestras individuales de veneno de los tres grupos de estudio (C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidusxaquilus). En la Figura 7. Se aprecia la separación electroforética;las familias de proteínas fueron asignadas tomando en cuenta sólo sus pesos moleculares.

Tanto el grupo de C. lepidusxaquiluscomo C. l. klauberiposeenPLA2 (~14 kDa) mientras que C. aquilusposee concentraciónes menores. Los tres grupos de las dos especies y C. lepidus x aquilus poseen concentraciones importantes de posibles metaloproteasas (~23 kDa). Éste peso molecular coincide con elque poseen las SVMPP-I(Mackessy, 2010).No se presentó una diferencia marcada en la región en la cual aparecen las SVMPP- III, los tres grupos de estudio poseen cantidades similares de estas proteínas.

Figura 7. SDS-PAGE en condiciones reductoras; (MPM) marcador de peso molecular. (Pool) pool de veneno de cada grupo. (A) C. l. klauberi, los carriles K1 a K5 representan el veneno de cinco ejemplares de esta especie. (B) C. aquilus, los carriles A1 a A5 representan muestras de cinco ejemplares, de las cuales A4 y A5 son crías de 2 meses de edad. (C) C. lepidus x aquilus, carriles H1 a H4 corresponden a muestras de veneno de cuatro ejemplares. A la derecha las Familias de proteínas (Mackessy, 2010).

10.4 Cromatografía líquida de alta resolución, fase reversa (RP-HPLC). Se cargó 1mg del pool de veneno de cada uno de los grupos de estudio (C. l. klauberi,

C. aquilus y C. lepidusxaquilus) en una columna C18 (características descritas en material y metodología).

Se obtuvo el perfil de elución de la separación del veneno de los tres grupos de estudio, mostrando mayor similitud entre los perfiles de C. l. klauberiy C. lepidusxaquilus. Ambos muestran picos bien definidos en los tiempos de retención del minuto 55 al minuto 94, por los tiempos en los que eluyeron las fracciones podemos inferir que se trata principalmente de SVMP’s,PLA2, SVSP’s principalmente.

Los cromatogramas correspondientes al pool de cada uno de los tres grupos de venenos estudiados se presentan en la figura 8.

Figura 8.RP – HPLC.Perfiles de elución de proteínas por muestra; Pool de veneno de C. l. klauberi ,C. aquilus,C. lepidus x aquilus. Se cargó 1 mg de veneno en una columna C18 Grace Vydac (250 X 4.6mm, partícula 5µm)como se describe en material y métodos. Eje X: unidades de miliabsorbancia (mUA). Eje Y: tiempo de retención (TR).

10.5 Dosis letal media (DL50).

Los valores obtenidos de DL50 se reportan en la tabla 5.

Tabla 5. DL50 de los tres grupos de estudio. 2 Grupo DL50 Intervalo de R µg/ratón confianza 95% C. l. klauberi 12.24 10.42 a 14.39 0.9614 C. aquilus 44.86 42.58 a 47.26 0.9471 C. lepidusxaquilus 117.6 109.1 a 126.7 0.8025

Los resultados de los tres grupos de venenos analizados semuestran en la figura 9.

Figura 9.Se muestra la gráfica de letalidad con los valores arrojados por los tres pool de veneno. Se hicieron grupos de tres ratones por cada dosis, y se registraron muertes a las 24 horas como se explica en material y metodología.

10.6 Actividad pro coagulante. La actividad procoagulante (Figura 10), se evaluó mediante la dosis mínima procoagulante (DMP), ésta se define como la cantidad de veneno necesaria para evidenciar la formación de un coagulo en 60 segundos (Theakston & Reid, 1983; Gené et al., 1989). Sólo se detectó actividad procoagulnte en el veneno de C. lepidus x aquilus a dosis mayores a 100 µg.

Tabla 6. DMP Veneno DMP Bothrops asper (control +) 2.3 µg C. l. klauberi No presentó C. aquilus No presentó C. lepidus x aquilus 175.5 µg

Actividad procoagulante Actividad procoagulante C. B. asper. lepidus x aquilus.

Figura 10.Actividad procoagulante en el veneno de C. lepidus x aquilus; interpolando al segundo 60 se observan las DMP de cada veneno. Se utilizó veneno

con alta actividad procoagulante; B. asper; como control.

10.7 Actividad proteolítica sobre azocaseína. Una unidad de actividad proteolítica se define como el cambio en 0.2 unidades de absorbancia por minuto(Gutierrez et al., 2008).Los resultados obtenidos de actividad proteolítica sobre azocaseína se muestran gráficamente en la figura 11.

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0 3.67 3.80 3.79 3.76 3.72 3.5 3.34 3.47 3.36 3.34 3.29 1.5 3.2 3.05 3.07 3.23 3.21 3.02

1.0

0.5 0.7 0.3 0.29 0.17 0.19 0.16 0.20 0.22 0.23 0.16 0.30 0.21 0.19 0.15 0.25 0.22 0.31 0.0 k1 k2 k3 k4 k5 A1 A2 A3 A4 A5 H1 H2 H3 H4 Pk PA PH

PROMEDIO dst

Figura 11.Actividad proteolítica del veneno de las víboras de cascabel; C. l. klauberi (k1, k2, k3, k4, k5), C. aquilus (A1, A2, A3, A4, A5), C. lepidus x aquilus (H1, H2, H3, H4), pool de C. l. klauberi (Pk), pool de C. aquilus (PA), pool de C. lepidus x aquilus (PH), sobre azocaseína.

Se observan pequeñas diferencias en las actividades proteolíticas de cada veneno, la proteólisis es mayor en los venenos de C. aquilus y C. lepidus x aquilus que en C. l. klauberi, la cual posee 3.29 ± 0.25 unidades de actividad enzimática, sin embargo esta diferencias no son estadísticamente significativas (P >0.05). Tabla 7.

Tabla 7. ANOVA 1 vía: Comparación de actividad proteolítica entre venenos de C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus sobre azocaseína(Diferencias significativas si: P < 0.05). Excel 2013. Grados Origen de las Suma de de Promedio de F Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados P para F (tabla) Entre grupos 0.001617857 2 0.000808929 0.01027181 0.989790245 3.982297957 Dentro de los grupos 0.866275 11 0.078752273

Total 0.867892857 13

10.8 Detección de Crotoxina por RP – HPLC. Se hicieron corridas en HPLC utilizando el pool de venenode C. l. klauberiy Ctx purificadadel veneno de C. durissus terrificus (control positivo).

A 2

B 1 2

Figura 12.RP – HPLC. Perfil de elución de Ctx pura (A). Veneno de C. l. klauberi a 3mg/mL en NaCl 150 mM. (B). Se inyectó 1mg de veneno en la columna C18. El pico 1 representa la subunidad ácida, el pico 2 representa la subunidad básica de la Ctx.

10.9 Detección de crotoxina: Western blot semi – seco. El Western blotaplicado sobre los venenos de los tres grupos de estudio, arrojó un reconocimiento por parte de los anticuerpos monoclonales 4F6 anti-crotoxina hacia este componente neurotóxico presente en el veneno de la víbora de cascabel bandeada de las rocas C. l. klauberi. Mientras que los otros dos venenos (C. aquilus y C. lepidus x aquilus) poseen PLA2 que no son Ctx, como se aprecia en el SDS – PAGE, y RP – HPLC.

C. C. C. C. l. MP CTX s. s. s. s. C. l. a. x a. M A B k. kDa.

175 80 46

23 17 10

Figura 13. Western blot (5 mg). Se muestra la membrana de nitrocelulosa donde se aprecia la transferencia y el reconocimiento de bandas (péptidos) por los anticuerpos monoclonales anti – crotoxina. (MPM) Marcador de peso molecular; (CTX) Crotoxina; (C. s. s. A) Veneno de C. s. scutulatus tipo A; (C. s. s. B) C. s. scutulatus tipo B; (C. l. k.) Veneno de C. l. klauberri; (C. a.) C. aquilus; (C. l. x a.) C. lepidusx aquilus. Las flechas rojas indican un reconocimiento de los anticuerpos anti – crotoxina hacia la crotoxina en el veneno de C. l. klauberi.

10.10 Detección y cuantificación de Crotoxina mediante ELISA. Mediante la técnica de detección y cuantificación de Ctxen los pool de venenos de los tres grupos de estudio (C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidusxaquilus) por ELISA tipo “sándwich”sólo se obtuvo una reacción positiva para el veneno de C. l. klauberi.

Figura 14. La gráfica muestra la (C. E.) curva estándar, así como los valores de absorbancia (abs) a 405nm interpolados del veneno de C. l. klauberi.

Se calculó que el 10.8 % de la composición proteica del veneno deC. l. klauberiesCtx(intervalo de confianza: 95%).

11.Discusiones. Los resultados obtenidos con respecto a la colecta de los organismos tomando como base las horas de mayor actividad de esta especie reportadas por Beaupre, citado por (Campbell & Lamar, 2004), en las zonas reportadas por (Vázquez & Quintero, 2005) donde ocurren las especies de víboras de cascabel estudiadas C. l. klauberiy C. aquilus coinciden. El grupo de víboras de cascabel C. lepidusxaquilus corresponde a una población en actual estudio con respecto a su taxonomía(Bryson, 2010).

El volumen de veneno de las víboras ordeñadas en promedio fué de 76 mg. Se llegaron a obtener hasta 126 mg de veneno de un ejemplar de C. lepidusxaquilus(longitud 54 cm). Para C. aquilus(longitud 36 cm) la mayor cantidad de veneno obtenida de una sola extracción fue de 52 mg., así mismo se obtuvieron hasta 58 mg de veneno de un solo ejemplar del grupo C. l. klauberi(longitud 64cm), estos datos difieren de los reportados por (Norris, 2005) que reportaun valor de 30 mg el cual es menor a los obtenidos en este estudio. Sin embargo paravíboras de mayor tamaño (con respecto a C. lepidus x aquilus) comoC. r. ruber(longitud 96 cm), se reportómenor cantidad de veneno (117 mg) comparado conC. lepidus x aquilus.Estos datos contrastan con los de especies como C. viridis caliginis 19 mg, C. catalinensis 21 mg(Glenn & Straight, 1985). A la cascabel diamante del oeste C. atrox se le extrajo hasta 1 gramo de veneno, esta especie puede llegar a 1.8 m de longitud y se encuentra en zonas donde habita C. lepidus(Klauber, 1956), lo que favorece el supuesto de que conforme crece la serpiente, aumenta la cantidad de veneno que puede almacenar en sus glándulas(Klauber, 1972; Mackessy, 2003), lo que a su vez influye en la cantidad de veneno que estas inyectan cuando muerden (Hayes et al., 2002; Hayes, 2008). Se ha demostrado un alto nivel de variación en cuanto a la cantidad de veneno inoculado por serpientes en ataques predatorios y defensivos (Smith et al., 2014)

Lo que se muestra aquí es el alto grado de variación que puede haber en cuanto a cantidad de veneno que produce cada serpiente independientemente que pertenezcan a la misma especie y/o a la misma población o región geográfica(Daltry et al., 1996).La producción de veneno conlleva costos energéticos potencialmente altos y estos influyen en su tasa de producción(Mirtschin et al., 2002), sin embargo, los resultados de un estudio

hecho con Acantophis antarticussugieren que los costos energéticos totales de la producción de veneno son relativamente pequeños cuando se comparan a los costos energéticos del proceso de digestión y ecdisis(Pintor et al., 2010).

Además de la variación en la producción de veneno (cantidad), éste también puede variar en su composición. Las proteínas en el venenode serpiente pueden mostrar altos niveles de variación a nivel individuo, pero los mecanismos ambientales y moleculares que generan esta diversidad aún no se han esclarecido (Gibs et al., 2011).

La separación de proteínas del veneno mediante SDS – PAGE, mostró pocas diferencias marcadas en la composición de estos tres grupos de venenos, estas diferencias para el caso de C. aquilus,podrían ser explicadas mediante el fenómeno de variación ontogenética, sin embargo se muestran pequeñas diferencias en los venenos de los dos últimos ejemplares analizados de C. l. klauberi(Figura 7, carriles k4 y k5) que no se pueden explicar por este proceso debido a que los ejemplares de los que se obtuvo el veneno son ejemplares adultos. Existe evidencia indirecta de que la variación puede estar sujeta a control genético (Chippaux et al., 1982). En los tres grupos de venenos analizados se encontró que hay relativa abudancia de probablemente SVMP P-I (~23kDa) y P-III(~54 kDa) en base al peso molecular. Así como una presencia importante de PLA2 (~14 kDa) en los venenos de C. l. klauberiy C. lepidusxaquilus. El veneno de C. aquilus presenta bandas menos conspicuas en este rango de pesos moleculares, se puede inferir que las PLA2 no son abundantes en el veneno de C. aquilus con respecto a los otros dos grupos de estudio. Estos resultados fueron similares a los obtenidos por (Martínez – Romero et al., 2013), sin embargo hace falta una caracterización de PLA2para poder aseverar la carencia de esta enzima en el veneno de C. aquilus, ya que los pesos moleculares pueden variar.

El RP – HPLC de los pool de veneno de los tres grupos de estudioarrojó perfiles de eluciónsimilares con excepción del perfil de C. aquilus, en éste, los picos en los tiempos de retención que van del minuto 15 al minuto 35 son evidentes, pero enC. l. klauberi y C. lepidus x aquilusno son tan evidentes o están ausentes,en estos tiempos de retención generalmente eluyen desintegrinas(Sánchez et al., 2005; Galán et al., 2008; Sánchez et al., 2008; Lomonte et al., 2012). Por otra parte los tres venenos mostraron picos a los tiempos

de retención en los cuales con frecuencia son eluídas las PLA2(Mackessy, 2010; Vargas et al., 2012),estos resultados son congruentes con el SDS – PAGE ya que éste no mostró presencia importante de PLA2en el veneno de C. aquilus,sin embargo en el cromatograma de ésta, aparecen picos que probablemente corresponden aPLA2. Los picos en la región donde generalmente eluyen SVSPs, LAAOs ySVMPs(Lomonte et al., 2012; Bernardes et al., 2013)están presentes en los tres pool de veneno analizados (Figura 8).

Letalidad.

La DL50 ha ganado amplia aceptación como una medida de toxicidad aguda de todo tipo de sustancias (DePass, 1989).En este estudio los valores de éste parámetro difieren de los reportados por Martínez-Romero et al., (2013), donde se trabajó con muestras de veneno deC. l. klauberi de Aguascalientes, Chiuahua y Zacatecas;C. l. lepidus de Coahuila y Nuevo León, éstas tienen DL50 i.v. de 25.5 y 28.22 µg/ratón respectivamente. En el presente estudioC. l. klauberitiene una letalidad mayor (Tabla 5) con respecto a la reportada por Martínez-Romero et al., (2013) y a los venenos de: C. aquilusy C. lepidus x aquilus. Hay una diferencia de 32.62 µg entre las DL50de los venenos de C. l. klauberiyC. aquilus, la mayor diferencia se da en el valor obtenido del veneno de C. lepidus x aquilus(117.6 µg/ratón). Este resultado se contrapone a la hipótesis de que estas especies pertenecientes al grupo C. triseriatus conocidas como cascabeles de montaña (Bryson,

2010), poseen venenos con DL50 iguales.Neri et al., (2013) ha reportado diferencias a niveles de subespecie entre letalidades del complejo C. simus(C. simus simus, C. simus culminatus, y C. s. tzabcan), el veneno de C. s. simus es el de mayor letalidad(DL50i.v.3.99 µg/ratón), mientras que C. s. culminatus el de menor letalidad(170.24 µg/ratón), este patrón de variación de DL50es similar al observado en C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus, y puede ser explicado por la presencia deCtx en el veneno de mayor letalidad (C. l. klauberi) así como en el veneno de mayor letalidad de las subespecies de C. simus(Anexo C).

Al observar sintomatología durantela DL50se observó parálisis flácida (parálisis en músculos de extremidades posteriores) en los ratones inyectados con el venenode C. l.

klauberi, esto sugiere la presencia en este veneno deCtx(Brazil et al., 1966; Sampaio et al.,

2010). La presencia de Ctx puede explicar la letalidad (valor menor de DL50)observada en el veneno de C. l. klauberi como afirma Glenn et al., (1983),Algunos venenos son significativamente más letales que otros, debido principalmente a la presencia de neurotoxinas.Los resultados de este estudioproveen evidencia a favor de una relación entre la presencia de Ctx en un veneno y su DL50, esta relación también es evidente en los venenos de C. s. simusreportados por Neri et al., (2013) yC. s. scutulatusGlenn et al., (1983).Esta toxina fue detectada de manera cualitativa con RP-HPLC y Western blott (Figura12, 13), donde se aprecia el reconocimiento por parte de los anticuerpos 4F6 anti- crotoxina a una banda de ~14 kDa en el veneno de C. l. klauberi. Sin embargo, la prueba de ELISA arrojó no solo la detección,también la cuantificación de Ctx en el veneno de C. l. klauberi, éste posee un 10.8% deésta neurotoxina, un valor relativamente bajo si se compara con el de Crotalus durissus cascavellade 72.5% (Anexo C), sin embargo no todas las poblaciones de C. l. klauberi poseen esta toxina.Glenn & Straight (1982), afirman que el veneno de C. l. klauberi de Aguascalientes, Nuevo León y Zacatecas carecen de Ctx.

Martínez – Romero et al., (2013), reportaron presencia de PLA2en los venenos de C. l. lepidus y C. l. klauberi, pero no identificaron si formaban parte deCrtx, por lo tanto, los resultados del Western blott y ELISA, contradicen los resultados de (Glenn & Straight, 1982)con respecto al veneno deC. l. klauberi de Aguascalientes y complementan los reportados por Martínez – Romero et al., (2013).Sin embargo, son necesarios estudios acerca de la distribución geográfica de Crtx en el veneno de C. l. lepidus y C. l. klauberi (en el AnexoJse muestra el mapa de distribución de Ctx en las poblaciones de C. l. klauberi que la presentan en sus venenos),ya que tienen relevancia al momentode la selección de los venenos para la obtención de antivenenos específicos. Weinstein et al., (1985) menciona que esta neurotoxina en las serpientes de cascabel se distribuye a manera de mosaico, esto concuerda con los resultados obtenidos en este estudio y los reportados porGlenn & Straight, (1982).Con respecto a la variación en la composición de los venenos Calvete, (2010), Calvete et al., (2009), Gutiérrez et al., (2009), afirman que la heterogeneidad intraespecífica en la composición de los venenos puede explicar la diferencia en los síntomas clínicos observados en los casos de envenenamiento en humanos y pueden afectar la capacidad de neutralización de los antivenenos. Además, para

los fabricantes, quienes buscan optimizar la producción de antiveneno, las diferencias intraespecíficas en la composición de los venenos podría ser muyrelevante al momento de decidir si los pool de veneno de diferentes regiones deberían de ser considerados o si el veneno de una región es representativo de la especie. Neri et al., (2013), menciona que el complejo patrón de variación intraespecífica del veneno en las subespecies del complejo C. simus provee valiosa información para el diagnóstico y el tratamiento clínico de los envenenamientos por esta especie en México, así como para la preparación de los pool de venenopara el control de producción y calidad de antivenenos.Esta información puede ser de utilidad en la comprensión de la fisiopatología de los envenenamientos. También se ha demostrado el efecto antitumoral de la Ctx (Rudd et al, 1994) y efecto analgésico (Brigatte et al., 2007), por lo tanto, esta toxina una vez aislada, podría ser de utilidad para el tratamiento de enfermedades humanas.

Actividad biológica. Los venenos presentes en la familia Viperidae contienen abundantes proteasas que afectan la cascada de coagulación a través de mecanismos pro y anti coagulantes (Zingali, 2007).En el presente estudio, sólo el veneno de C. lepidus x aquilus mostró actividad procoagulante, éste tuvo una DMP mayor a 100 µg, en comparación con la DMP de especies como Bothrops asper(tabla 6),se puede decir que el veneno de C. lepidus x aquilus tiene poca actividad procoagulante.Rael et al., (1992) reporta los venenos de C. l. lepidus y C. l. klauberi como altamente hemorrágicos, lo que concuerda conMartínez – Romero et al., (2013) que reporta actividad anticoagulante en el veneno deC. l. klauberi,(DMH 0.25 µg), así mismolos venenos de tres subespecies de C. lepidus (C. l. lepidus, C. l. klauberi y C. l. morulus) indujeron mionecrosis y hemorragia después de la inyección de veneno en tejido muscular de ratón, seguido de una reacción inflamatoria local caracterizada por infiltrado celular abundante (Martínez – Romero et al., 2013).La fisiopatología que conlleva al edema tisular es multifactorial, las citotoxinas y enzimas proteolíticas (digestivas) que causan lesión tisular y filtración capilar están entre los principales contribuyentes. Las anormalidades en la coagulación usualmente se manifiestan clínicamente con trombocitopenia y desfibrinación, la cual puede llevar a sangrado local o en raras ocasiones sangrado difuso o coagulación. Las anormalidades hematológicas son

debidas principalmente a enzimas tipo trombina y fibrinogenasas (Norris & Bush, 2001). Muchos de los componentes que inducen estos patrones de lesión, son SVMPs(French et al., 2004). Según Fox & Serrano, (2009); McCue, (2005); French et al., (2004), el daño local en los tejidos es una de las características más obvias del envenenamiento por serpientes de la familia Viperidae, involucrando efectos patológicos complejos como hemorragia local, degradación de matriz extracelular, ampollas y necrosis provocadas por lasSVMP’s, lo que concuerda con la sintomatología reportada por Norris (2005), estas SVMP’s probablemente fueron observadas(con base en el peso molecular) en los geles SDS – PAGE de los tres pool de veneno analisados, por lo tanto es factible que el envenenamiento causado por estas especies, produzca la sintomatología ya mencionada.

Con respecto a la actividad proteolítica. Los venenos de C. aquilus y C. lepidus x aquilus, pueden considerarse menos proteolíticos con respecto a C. l. klauberi, sin embargo estas diferencias no son estadísticamente significativas (Tabla 7).Martínez – Romero et al., (2013), reporta mayor actividad proteolítica sobre caseína en el veneno de C. l. morulus, comparados con C. l. lepidus y C. l. klauberi.Un aspecto interesante es queBryson et al., (2010), propone que C. l. lepidus y C. l. klauberi están estrechamente emparentados mientras que C. l. morulus está ubicado dentro del taxón de C. aquilus.En el presente estudio C. aquilus y C. lepidus x aquilus presentan mayor actividad proteolítica que C. l. klauberi, estos datos con respecto a proteólisis coinciden con los reportados por Martínez – Romero et al., (2013) y proveen evidencia a favor de la relación más cercana entre C. l. morulus con C. aquiluspropuesta por Bryson et al., (2010), al menos desde el punto de vista toxicológico.

Dentro de la variación en el veneno de serpientes, se han identificado patrones recurrentes. En el caso de los venenos de C. s. scutulatus se dan tres: tipo A, los cuales poseen cantidades altas de toxina Mojave y muestran efectos neurotóxicos mientras que el tipo B tiene cantidades altas de SVMP y muestra efectos hemorrágicos y el tipo A + B, que es una combinación de ambos y despliega ambos efectos, tanto neurotóxicos como hemorrágicos (Glenn & Straight, 1989), lo que concuerda con Hardy, (1983), que reporta efectos mezclados (neurotoxicidad, daño a los tejidos y alteraciones de la coagulación) en envenenamientos por mordida de C. s. scutulatus (Veneno A + B) y C. helleri. Por otra

parte Rokyta et al., (2013), reporta venenotipo A, venenotipo B, venenotipo A+B y venenotipo C; el cual no presenta toxina “canebrake” (neurotoxina) ni actividad hemorrágica. French et al., (2004), reportó un individuo de C. hellerique carece de actividad hemorrágica y de toxina Mojave, éste también coincide con un venenotipo C. Aunque French et al., (2004) menciona que hay poca cantidad o ausencia de SVMP en venenos que contienen toxina Mojave, los venenos A + B parecen ser una excepción.Mackessy, (2008) reporta una clasificacióngeneral para el veneno de cascabeles; venenos tipo I y II, ésta enfatiza en una relación inversa entre la toxicidad y la actividad de SVMPvista en muchas especies de víboras de cascabel. Los resultados muestran que el veneno de C. l. klauberi, posee tanto Ctx como SVMP, estos ubicarían al veneno de ésta subespecie como un venenotipo A + B de la clasificación propuesta para C. s. scutulatus por (Glenn & Straight, 1989) aunque no se ha reportado neurotoxicidad por envenenamientos en humanos debido a lo raro de las mordeduras por esta subespecie en Aguascalientes.Conforme a Mackessy, (2008), se aproxima más al venenotipo II, sin embargo en este estudio C. l. klauberi tuvo una actividad proteolítica media de 3.29 ± 0.25unidades de actividad proteolítica, la cual comparada con C. aquilus y C. lepidus x aquilus tiende a ser menor, aunque la diferencia no es estadísticamente significativa.

CONCLUSIÓN. Los venenos de C. l. klauberi, C. aquilus y C. lepidus x aquilus tienen patrones electroforéticos y cromatográficos similares,las diferencias radican en la abundancia relativa de cada componente en sus venenos. Los tres grupos de víboras de cascabel estudiadas poseen los componentes típicos a las serpientes de la familia Viperidae

(Nucleasas, LAAO, CRISP, SVMP, SVSP, PLA2, Desintegrinas) esto con base en el peso molecular de las principales familias de proteínas reportadas porMackessy, (2010). Con respecto al RP – HPLC, hay una alta probabilidad de que uno de los picos en el cromatograma de C. aquilus ubicados entre los tiempos de retención 15 a 35 min., corresponda a desintegrinas, sin embargo,hace falta hacer una caracterización bioquímica con mayor profundidad, la cual permita obtener las secuencias de los principales péptidos y proteínas en el veneno de estos tres grupos. No obstante la similitud entre los venenos; los venenos de C. aquilus y C. lepidus x aquilus son ligeramente más proteolíticos que el de C. l. klauberi, la proteólisis se debe principalmente a la acción de las SVSP ySVMP. El veneno de C. l. klauberi tiene un valor menor de DL50 que el de C. aquilus y C lepidus x aquilus, este grado de letalidad mayor se debe a la presencia de Ctx en el veneno de ésta subespecie. El veneno deC. l. klauberi de la localidad Mesa Montoro, en el estado de Aguascalientes presenta Ctx y SVMP´s, por lo que se puede concluir que este es un veneno tipo A + B, mientras que los venenos de C. aquilus y C. lepidus x aquilus son venenos tipo B según la clasificación de (Glenn & Straight, 1989). LaCtx en el veneno de C. lepidus está reportada para Arizona, Nuevo México (E.U.A.), Chihuahua, Durango(Glenn & Straight, 1982) y Aguascalientes (México).

Las diferencias biológicas encontradas en los venenos estudiados son el resultado de factores múltiples inherentes a cada subespecie, como la variación regional en dieta o características geográficas. Un entendimiento más profundo acerca de las implicaciones adaptativas de las diferencias en los venenos de estas especies requiere de información más detallada acerca de su historia natural.

GLOSARIO.

tejidos que lo rodean y puede dispersarse A (metástasis) a organos distantes., 5, 7, 8, 18, 37, 38, 39, 40, 89 Acetilcolinesterasa. Cefazolin. Enzima que hidroliza la acetilcolina en colina y Antibiótico del grupo de las cefalosporinas de acetato, 26, 30 primera generación., 23 Angiogénesis. Concentración. Formación de vasos sanguíneos nuevos., 38, 39, 89 Cantidad de una sustancia, expresada en peso o en Antagonista. moles (S), por unidad de peso o volumen del (1). Sustancia que disminuye o invierte el efecto medio en que se encuentra. Puede expresarse inducido por un agonista. (2). Sustancia que se como porcentaje. No es sinónimo de dosis., 7, une y bloquea los receptores celulares que 26, 46, 48, 49, 89, 90 normalmente se enlazan a sustancias naturales Conjugados. en su acción fisiológica. Una molécula que se une Compuesto producido por la unión de dos o más a una proteína receptora pero que no dispara la sustancias, como los conjugados de los vía de señalización., 38 anticuerpos con los fluorocromos, enzimas, Anticuerpo. radioisótopos, entre otros., 49 Molécula proteica (inmunoglobulina) producida por Conspicuo. el sistema inmunitario, se une específicamente a Sobresaliente, notorio., 63 la molécula (antígeno o hapteno) que induce su Control. síntesis., 49 (1). Caso, grupo o individuo seleccionado para Anticuerpo monoclonal. usarlo como referencia en un estudio por sus Anticuerpo derivado de un clon. Un grán numero de características específicas, como edad, sexo, céluas descendientes de la misma célula y tienen raza, estatus económico, etc. (2). Sustancia o propiedades idénticas., 48, 49 preparación conocida que se utiliza como Apoptosis. referencia o testigo en las determinaciones Proceso fisiológico previsto de muerte y cualitativas y cuantitativas, para detectar desintegración de tejidos dentro del desarrollo interferencias o errores analíticos., 7, 45, 46, 49, normal de los seres vivos., 32 57, 59, 63, 66, 79, 93 Crotoxina. C Heterodímero compuesto de una subunidad ácida (no toxica, no enzimática ) llamada crotapotina Canal. (CA) y una subunidad básica fosfolipasa A2 de Proteína de pasaje que es continua y que permite el poca toxicidad (CB)., 6, 7, 11, 21, 30, 47, 48, 49, flujo de iones rápidamente a través de una 60, 61, 65, 87 membrana eucariótica desde un compartimiento de concentración más alto a un compartimiento más bajo. Generalmente compuestos de cuatro a D seis subunidades o dominios y son estimulados Desfibrinación. por el potencial de membrana, efectores Destrucción o separación de fibrina de la sangre., 66 alostéricos o modificación covalente., 34 Detritus celulares. Cáncer. Restos de la desintegración de tejidos vegetales o Denominación de las tumoraciones malignas. Los animales., 42 carcinomas se originan en las células epiteliales Dimorfismo sexual. carcinoma, epitelioma, sarcoma. Término Diferencia en formas, coloración y tamaños entre relacionado machos y hembras de una misma especie., 19, 21 neoplasia, tumor. Un crecimiento Disfibrinogenemia. descontrolado de células anormales, creando un tumor que puede invadir los

Deficiencia hereditaria de la coagulación Macromoléculas biológicas que actuan como caracterizada por la alteración de la catalizadores para reacciones bioquímicas, 30, fibrinogénesis., 28 31, 32, 34, 35, 63 Dominio. Epidemiología. Región de una proteína con interés biológico Estudio de la distribución de estados de salud y sus funcional o estructural. Es una región de la determinantes en las poblaciones y la aplicacion estructura tridimensional de una proteína con de este estudio al control de problemas una función concreta., 10, 27, 28, 32 sanitarios., 14 Dosis. Equimosis. Cantidad de sustancia administrada o absorbida por Lesión subcutanea caracterizada por depósitos de un indivivuo en proporción a su peso o volumen sangre debajo de la piel o un hematoma, corporal. Se suele expresar en mg/Kg, 34, 36, 45, comúnmente llamado moretón., 23 46, 57, 88 Dosis letal media. F (DL50) Dosis, calculada estadísticamente de un agente químico o físico (radiación) que se espera Fármaco. que mate a 50% de los organismos de una Cualquier producto que puede ser absorbido por un población bajo un conjunto de condiciones organismo, difundirse en él y producirle cambios, definidas., 6, 45, 56 favorables o no. Los fármacos empleados para el Dosis mínima procoagulante. tratamiento de enfermedades son los (DMP). Cantidad de veneno necesaria para medicamentos., 34 evidenciar la formación de un coagulo en 60 Fasciculinas. segundos., 46, 57 Polipéptidos producidos por mambas (Dendroaspis spp) inhibidores de la AChE, denominados así por E producir fasciculaciones prolongadas, durante 5 a 7 horas administradas a ratones en dosis de Edema. 0,05 - 3 mg/Kg peso vía i.p., 31 Inchazón causada por la acumulación de líquido en Fibrinólisis. los tejidos del cuerpo., 13, 66, 86, 87 Proceso corporal que impide que los coágulos Efectos sinérgicos. sanguíneos que ocurren de forma natural Fenómeno en el cual el efecto de la influencia o crezcan y causen problemas., 32 trabajo de dos o más agentes actuando en Filogenética. conjunto es mayor al esperado considerando a la Parte de la biología que estudia la evolución de las suma de las acciones de los agentes por especies de forma global, en contraposición a la separado., 26 ontogenia que estudia la evolución del ELISA. individuo., 22 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la Flavoproteínas. cuantificación de la presencia de un antígeno Proteínas que contienen un nucleótido derivado de usando una enzima enlazada a un anticuerpo la vitamina B2 para el antígeno., 6, 7, 9, 42, 43, 47, 48, 61, 65, flavín adenín dinucleótido (FAD) o flavín 89, 93 mononucleótido (FMN)., 31 Endémicas. Fosfolipasas. Termino utilizado en biología que describe la Clase de enzimas de especificidad variante que tendencia de especies de plantas y animales a cataliza la degradación de los fosfolípidos, 25, 26, limitarse de manera natural a una zona 29, 86 determinada, dentro de la cual se dice que son endémicos., 19 H Enzima. Catalizador de las reacciones bioquímicas, que Hematocrito. facilita la transformación de los sustratos.

proporción del volumen de sangre que forman los M glóbulos rojos., 23 Hemorragias. Membranas. Pérdida de sangre. Puede ser interna o externa., 13, Estructuras parecidas a láminas compuestas de 27 lípidos y proteínas, usualmente sólo unas pocas Hemostasia. moléculas gruesas, que forman fronteras Fenómeno fisiológico que detiene el sangrado., 32, cerradas entre diferentes compartimentos, 26 34, 39, 88 Metacarpofalangeal. Herpetofauna. Articulaciones formadas entre las cabezas convexas Corresponde a reptiles y anfibios, 18, 19 de los metacarpianos y las fosillas articulares de Historia clínica. las bases de las falanges proximales., 23 (HC), documento médico legal que se caracteriza Metástasis. por ser objetivo y comprensible por terceros, y Movimiento o diseminación de las células no sólo por quien lo escribe, 23 cancerosas de un órgano o tejido a otro., 38, 39, Homólogo. 89 En biología, se refiere al vínculo de correspondencia Mionecrosis. que mantienen entre sí aquellas partes que, en Necrosis de tejido muscular., 66 diferentes organismos, cuentan con idéntico Morbilidad. origen pero que desarrollan una función que Proporción de personas que enferman en un lugar resulta distinta. En bioquímica, las moléculas (o durante un periodo de tiempo determinado en partes de ellas) que tienen un origen y una relación con la población total de ese lugar., 8, 9, función análogas pero que son distintas 14, 85 mantienen un nexo de correspondencia que Mortalidad. también se define como homólogo., 27 Número de muertes por lugar, intervalo de tiempo y causa., 14, 38, 45 I Motivos de unión. Elementos conservados en la secuencia de Insular. aminoácidos, habitualmente asociados con una Relativo a isla, 18 función concreta., 38, 40 Isoenzimas. Son distintas formas moleculares de una misma N enzima que muestran especificidad por el mismo sustrato., 29 Necrosis. Muerte del tejido corporal, ocurre cuando no llega L suficiente sangre al tejido., 13, 21, 24, 33, 67, 86 Neurotoxicidad. Lepidosaurios. Conjunto de efectos sobre el sistema nervioso, que super orden que incluye al orden squamata al que pueden afectar al cerebro o a la médula espinal pertenecen lagartos y serpientes., 15 (neurotoxicidad central) o a las raíces nerviosas, Liofilizado. plexos o nervios (neurotoxicidad periférica)., 24, Método de desecación en el que se elimina el agua 67 por congelacion del producto húmedo y posterior sublimación del hielo en condiciones P de vacío., 25 Liposomas. Patología. Vesículas esféricas, de 20 a 30 nm de diámetro. Rama de la medicina que estudia los transtornos Están rodeadas por una membrana compuesta anatómicos y fisiológicos de los tejidos y los de un fosfolípido y un colesterol bicapa, que órganos enfermos, así como los síntomas y envuelve una sustancia acuosa, sirven para signos a través de los cuales se manifiestan las transporte de estas sustancias., 39, 40

enfermedades y las causas que las producen., 26, Alcaloide fenantreno del opio siendo preparado el 38 sulfato por neutralización con ácido sulfúrico. Poblaciones. Ésta es una sustancia controlada agonista En ecología, es un conjunto de individuos de la utilizada en anestesia, analgesia, tratamiento del misma especie que viven el la misma área dolor asociado a la isquemia miocárdica y para la geográfica., 13, 21, 22, 25, 65 disnea asociada al fracaso ventricular izquierdo Pool. agudo y edema pulmonar., 23 Muestra representativa de un grupo de estudio, Sustrato. esta contiene las muestras individuales de cada Un reactante en una reacción química. Una enzima ejemplar que forma un grupo de estudio., 9, 43, cataliza una sola reacción química o un conjunto 44, 47, 52, 54, 59, 61, 63, 64, 66 de reacciones cercanamente relacionadas y los Proteasas. componentes de aquellas reacciones son Enzimas que degradan proteínas por la separación llamados sustratos., 32 de uniones peptídicas, 5, 10, 26, 27, 28, 33, 66 Proteínas. Macromoléculas biológicas compuesta de un T arreglo lineal de aminoácidos unidos por uniones Topografía. peptídicas, 9, 10, 13, 25, 27, 28, 29, 32, 37, 38, Conjunto de características que presenta la 40, 52, 63, 68, 86, 87 superficie o el relieve de un terreno, 18 Toxicidad. R Capacidad para producir daño a un organismo vivo, en relación con la cantidad o dosis de sustancia Receptor. administrada o absorvida, la vía de Sitio de unión (ligando) de gran afinidad por un administración y su distribución en el tiempo determinado tóxico, de cuya unión se derivará (dosis única o repetidas), tipo y severidad del un efecto., 32, 34, 38, 39 daño, tiempo necesario para producir éste, la naturaleza del organismo afectado y otras S condiciones intervinientes., 16, 22, 30, 34, 36, 64, 68 Síntoma. Toxicidad aguda. Evidencia subjetiva de una afección o enfermedad, Capacidad de una sustancia para producir efectos percibida por el propio sujeto que la sufre (por adversos dentro de un corto plazo de tiempo ejemplo náuseas, dolor, jaqueca). Término (usualmente hasta 14 días) después de la relacionado administración de una dosis única (o una signo., 7, 8, 23, 26, 27, 65, 86, 87 exposición dada) otras dosis o exposiciones Sintomatología. múltiples en 24 horas., 64 Descripción general de los signos y síntomas que Toxinas. experimenta un enfermo. Término relacionado Sustancias venenosas producidas por organismos síndrome., 24, 64 (microbio, animal o planta)., 16, 17, 26, 32, 33, Sistema de complemento. 34, 35, 36, 37, 86 Conjunto de moléculas plasmáticas implicadas en Trombina. distintas cascadas bioquímicas, cuyas funciones Peptidasa. No es un componente de la sangre, sino son potenciar la respuesta inflamatoria, facilitar que se forma como parte del proceso de la fagocitosis y dirigir la lisis de células incluyendo coagulación sanguínea. Ayuda en la degradación la apoptosis., 28 del fibrinógeno a monómeros de fibrina., 5, 26, Sistémico. 28, 35, 37, 66 Med. De la circulación general de la sangre o Trombo. relativo a ella. Del organismo en su conjunto o Coágulo sanguíneo que se forma en un vaso y relativo a él., 23 permanece allí., 32, 88 Sulfato de morfina. Trombocitopenia.

Es cualquier trastorno en el cual hay una cantidad 17, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, anormalmente baja de plaquetas., 66 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 51, Tumor. 52, 54, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, (1). Inflamación (bulto) o crecimiento anormal de un 68, 87, 88, 89, 90, 93 tejido, ya sea benigno o maligno. (2). Vida media. Crecimiento anormal, en velocidad y estructura a Tiempo requerido para que la cantidad de una partir del tejido normal, sin utilidad fisiológica., sustancia presente en un sistema biológico se 38, 39, 40, 78 reduzca a la mitad, predominantemente por procesos biológicos, cuando el ritmo de U eliminaciónes aproximadamente exponencial. El tiempo requerido para eliminar una mitad de la Unidad de actividad proteolítica. cantidad de una sustancia desde el cuerpo., 39 Es el cambio en 0.2 unidades de absorbancia por minuto., 58 W

V Western blot. Técnica de inmunoensayo utilizada para detectar Variación intraespecífica. una proteína específica en una célula o en un Nivel de variación que se da entre individuos de una fluido corporal. Una muestra es sometida a misma especie., 66 electroforesis en un gel de poliacrilamida - SDS, Vasoconstricción. las proteínas resueltas son transferidas a una Disminución del calibre de los vasos sanguíneos y, lámina de polímero y entonces un anticuerpo por tanto, del aporte sanguíneo al tejido., 32 específico para la proteína de interés es Veneno. incubado con la muestra transferida; otros (1). Toxina animal utilizada para autodefensa o anticuerpos o marcadores radiactivos pueden ser depredación y liberada normalmente por utilizados para ayudar a visualizar el complejo mordedura o picadura. (2). Tóxico usado antígeno - anticuerpo deseado. , 6, 7, 9, 47, 60, intencionalmente., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16, 92

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ANEXOS. Anexo A: Evaluación global de mordeduras de serpiente, tomada de J. P. Chippaux, (1998); Distribución global de morbilidad por mordedura de serpiente. Anexo B: Principales efectos o síntomas de envenenamiento por mordedura de serpiente (Meebs, 2002) modificado. Anexo C. Contenido de crotoxina en venenos de serpientes de la familia Viperidae. Anexo D: Fármacos hechos a partir de componentes en el veneno de serpientes. Anexo E: Desintegrinas y sus principales efectos sobre cáncer. Anexo F: Cuantificación de proteína por BCA; Formula de la ley de Lambert y Beer utilizada para calcular la concentración de proteína en cada muestra de veneno. Anexo G: Preparación de diluciones y preparación de los geles separador y concentrador para SDS – PAGE. Anexo H: Western blot: Preparación de los buffers de transferencia y TBST. Anexo I: Esquema del procedimiento de diluciones seriadas para ELISA; (SR) solución de reacción, (C.l.k) veneno de C. l. klauberi, (C. a) C. aquilus, (C. lxa) C. lepidus x aquilus, (C-) control negativo. Anexo J: Distribución geográfica, distribución de C. l. klauberi con Ctx en sus venenos.

Anexo A:Evaluación global de mordeduras de serpiente, tomada de J. P. Chippaux, (1998); Distribución global de morbilidadpor mordedura de serpiente.

Población Número total Numero de Número de (x106) de mordidas envenenamientos muertes Europa 730 25,000 8,000 30 Medio Oriente 160 20,000 15,000 100 E. U. A. y Canadá 270 45,000 6,500 15 Centro y Sudamérica 400 300,000 150,000 5,000 África 760 1,000,000 500,000 20,000 Asia 3,500 4,000,000 2,000,000 100,000 Oceanía 20a 10,000 3,000 200 Total 5,840 5,400,000 2,682,500 125,345 a Población en riesgo

Anexo B: Principales efectos o síntomas de envenenamiento por mordedura de serpiente (Meebs, 2002) modificado.

Sintoma Familia Efectos. Hay bloqueo de transmisión neuromuscular en el botón terminal de la neurona motora Crotoxina (sinapsis). Síntomas de Neurotoxicidad. (Da Silva et al., 2014) parálisis: oftalmoplejía, ptosis Toxinas de tres dedos (TFT’s) (parálisis del párpado (Utkin, 2013) superior), parálisis de los músculos faciales. Parálisis progresiva de los músculos respiratorios, lo que puede llevar a la muerte por falla respiratoria. Afectan y lisan los músculos Fosfolipasas A2 estriados, dolor y debilidad Daño al musculo (Costa et al., 2008) muscular, mioglobinuria, esquelético. SVMP’s incremento masivo de creatin (Gutierrez & Rucavado, 2000) kinasa (CK), potasio, falla renal, complicaciones cardiacas. Tiempo de coagulación prolongado el cual se puede SVSP’s extender hacia una completa (Mackessy, 2010) incapacidad de coagulación de LAAO la sangre, esto debido a la (Mackessy, 2010) activación de factores de Trastornos Desintegrinas, proteínas tipo coagulación como el factor X hemostáticos. lectinas C, toxinas tres dedos y el factor Xa. O por la (TFT’s), fosfolipasas A2, hidrolisis de fibrinógeno y su SVMP’s, nucleotidasas consecuente transformación en (Koh y Manjunatha, 2011) fibrina, sangrado sistémico, que puede conllevar a la muerte.

En el área de la mordida, la LAAO mayoría síntomas locales. (Mackessy, 2010) Daño a las paredes de los Hinchazón, edema, SVMP’s vasos sanguíneos, inflamación, hemorragia y necrosis. (Gutierrez & Rucavado, 2000) desarrollo de edema Fosfolipasas A2 (extensivo, hasta tres litros de (Teixeira et al., 2003) líquido), ampollas, sangrado subcutáneo, que puede llevar a necrosis del tejido y a la perdida de una extremidad.

Caída rápida de presión sanguínea, debida a la Cardiotoxina de Naja kaouthia habilidad del veneno de los NK-CT1 (Debnath et al., 2010) vipéridos de liberar péptidos Síntomas péptidos potenciadores de hipotensivos de las proteínas cardiovasculares. bradiquininas (BPPs) del plasma. Los síntomas de (Koh y Manjunatha, 2011) shock son debidos a la perdida de fluidos de la circulación debido a la formación del edema y el sangrado.

Anexo C. Contenido de crotoxina en venenos de serpientes de la familia Viperidae.

Especie País Crotoxina Referencia (localidad) (%) Crotalus durissus cascavella Brasil 72.5 Boldrini – Franςa et al., 2010 C. d. collineatus Brasil 67.4 Boldrini – Franςa et al., 2010 C. tigris ------66 Calvete et al., 2012 C. d. terrificus Brasil 60 Gutiérrez et al., 2009 C. scutulatus scutulatus E. U. A. (Arizona, C*) 44.38 Massey et al., 2012 C. s. scutulatus E. U. A. (Arizona, P*) 18.3 Massey et al., 2012 C. simus simus México 14.3 Neri et al., 2013 C. lepidus klauberi México 10.8 Presente estudio C. simus simus Costa Rica 4 Gutiérrez et al., 2009 C. helleri E. U. A. (+) French et al., 2004 (California R*) C. s. scutulatus E. U. A. (Arizona Y*) (+) Weinstein et al., 1985 C. s. scutulatus E. U. A. (Arizona M*) (+) Weinstein et al., 1985 C. s. scutulatus E. U. A. (New Mexico) (+) Weinstein et al., 1985 C. s. scutulatus E. U. A. (Texas BB*) (+) Weinstein et al., 1985 C. viridis concolor ------(+) Weinstein et al., 1985 C. horridus E. U. A. (+) Weinstein et al., 1985 (Valdosta Georgia) C. atrox E. U. A. (+) Weinstein et al., 1985 (Arizona M*) Trimeresurus flavoviridis ------(+) Weinstein et al., 1985 Sistrurus catenatus E. U. A. (Ohio W*) (+) Gibbs & Mackessy, 2009 catenatus C. vegrandis ------(+) Kaiser & Aird, 1987

Las letras con (*), corresponden a los condados: C* Cochise; P* Pima: R* Mt San Jacinto, Riverside; Y* Yuma; M* Maricopa; BB* Big bend; W* Wyandot. Los signos (+) indican la presencia de toxina Mojave/Crotoxina en los venenos.

Anexo D: Fármacos hechos a partir de componentes en el veneno de serpientes.

ESPECIE FÁRMACO DESCRIPCIÓN

Agentes hipotensivos (1975). Basado en estructura de péptidos potenciadores de Bothrops jararaca Captopril, Ramipril bradiquidina (BPPs).Inhibidores de enzimas convertidores de angiotensina (ACE), son utilizados de manera exitosa en el tratamiento de hipertensión y falla cardiaca.

Bothrops moojeni Reptilasa® Reactivos de diagnóstico importantes para Bothrocetin®, la hemostasia. Stypven®, Ecarin®, Protac® Enzima coagulante (también llamada batroxobin), “pegamento de fibrina” usado Bothrops moojeni Defibrasa® en cirugía para detener sangrado difuso de hígado o pulmón mediante el cubrimiento de la superficie con una capa delgada de fibrina.

Enzimas coagulantes del veneno de serpientes utilizadas para tratar Calloselasma rhodostoma Ancrod® ó Arvin® enfermedades trombo- embolicas. Decremento dosis – dependiente en nivel de fibrinógeno, disminuye viscosidad de sangre y plasma. Formación de anticuerpos.

Anexo E: Desintegrinas y sus principales efectos sobre cáncer.

DESINTEGRINA EFECTO ESPECIE DE DONDE SE AISLO Triflavin Inhibición de adhesión celular, Trimeresurus flavoviridis migración y angiogénesis. Deinagkistrodon acutus. Acutina, salmosina, Gloydius ussuriensis. contortrostatina y Inhiben angiogénesis tumoral y Agkistrodon contortrix. rhodostomina, metástasis. Calloselasma rhodostoma. obtustatina, viperistatina, Vipera lebetina obtusa. lebestatina y jerdostatina. Vipera paleastinae. Protobothrops jerdonii.

Anexo F:Cuantificación de proteína por BCA; Formula de la ley de Lambert y Beer utilizada para calcular la concentración de proteína en cada muestra de veneno.

Reactivo A: carbonato de sodio (Na2CO3), bicarbonato de sodio (NaHCO3), BCA

(C20H12N2O4), y tartrato de sodio (C4H4Na2O6) en hidróxido de sodio (NaOH) 0.01M.

Reactivo B: 4% de sulfato cúprico (CuSO4). Albúmina sérica bovina (BSA): solución stock a 2 mg/mL en 0.9% NaCl y 0.05% de azida de sodio (NaN3). Lector de ELISA con filtro de 570nm. Microplacas para ELISA de 96 pozos marca Falcon.

Preparación de estándares (ST). 1. Se prepararon cinco estándares de albúmina sérica bovina en buffer PBS 1x con las siguientes concentraciones:  (1) 320 µg/mL  (2) 160 µg/mL  (3) 80 µg/mL  (4) 40 µg/mL  (5) 20 µg/mL

Preparación de la muestra problema (MP). 1. Una vez decidida la dilución, se preparó la solución problema (veneno) para que se encuentre dentro del rango de la curva estándar (20 a 320 µg/mL), en un volumen suficiente para que se hicieran duplicados. Considerando 25µL por pozo.

Preparación de la mezcla de reacción (MR). 1. Se preparó MR mezclando 50 partes del reactivo A con una parte del reactivo B.

A = (α) ( l ) ( c ) despejando c: c = A / (α ) ( l ) Como α = 1 y l = 1 entonces: c = A / ( α ) ( l ) Quedando: c = A

Dónde: A = absorbancia; α = coeficiente de extinción molar; l = ancho de la celdilla; c = concentración.

Anexo G: Preparación de diluciones y preparación de los geles separador y concentrador para SDS – PAGE.

Solución de acrilamida 30% de acrilamida + 0.8% de bis-acrilamida.

Amortiguador inferior “Lower buffer” (buffer tris 1.5 M, SDS 0.4%). Se disolvieron 18.7 g de tris en 50 mL de agua desionizada y se adicionaron 2 mL de SDS al 20%. Se ajustó el pH a 8.8 con HCl concentrado y se aforó a 100 mL.

Amortiguador superior “Upper buffer” (buffer tris 0.5 M, SDS 0.4%). Se disolvieron 6.06 g de tris en 50 mL de agua desionizada y se adicionaron 2 mL de SDS al 20%. Se ajustó pH a 6.8 con HCl concentrado, posteriormente se aforó a 100 mL.

Amortiguador de corrida (buffer tris 0.25 M, glicina 0.19 M, SDS 0.1%). Para una solución 10X, se disolvieron 15.2 g de tris y 72.1 g de glicina en 300 mL de agua desionizada, se adicionaron 25 mL de SDS al 20% y se ajustó pH a 8.6 con NaOH a 10 M, y se aforó a 500 mL.

Amortiguador de corrida desnaturalizante 5X (10% glicerol + 2.5% SDS + 50 mM tris – HCl pH 6.8 + 5% 2 – mercaptoetanol + 0.002% azul de bromofenol). En un tubo marca Falcon de 15 mL, se mezclaron los siguientes volúmenes: 2.5 mL de glicerol, 3.125 mL de SDS al 20%, 1.25 mL tris – HCl 1 M pH 6.8, 1.25 mL de β – mercaptoetanol, 0.5 mL de 1% azul de bromofenol, se aforó a 10 mL con agua desionizada.

Persulfato de amonio al 10% (catalizador). Se disolvieron 0.1 g de persulfato de amonio en 1 mL de agua desionizada.

Solución de tinción (25% isopropaanol + 10% ácido acético + 0.2% de azul de Coomasie R – 250). Se disolvió 1 g de azul de Coomasie R – 250 en 125 mL de isopropaanol, 50 mL de ácido acético y se aforó a 500 mL con agua desionizada.

Solución para desteñir (10% metanol + 10% ácido acético). Se mezclaron 400 mL de agua desionizada, 50 mL de metanol y 50 mL de ácido acético.

Tabla 13. Gel separador 15% Reactivos Volumen Lower Buffer 1.5 mL Sln Acrilamida 3.0 mL H2O desionizada 1.5 mL TEMED 10 µL 10% PSA 45 µL

Tabla 14. Gel concentrador 4% Reactivos Volumen Upper Buffer 0.63 mL H2O Desionizada 1.54 mL Sln. Acrilamida 0.33 mL TEMED 10 µL 10% PSA 40 µL

Anexo H: Western blot: Preparación de los buffers de transferencia y TBST.

Buffers:

Buffer de transferencia (Nitrocelulosa) para 500 mL:

 Glicina 39 mM ------1.45 gr.  Tris Base 48 mM------2.9 gr.  SDS 0.037 % ------0.185 gr.  Metanol 20% ------100 mL.

Buffer de transferencia CAPS (inmobilon-P) para 1.2Lts. 2.65 gr. de CAPS 10 mM ajustado a pH 11 con NaOH (10 N) y llevado a 1.08 Lts. Se agregaron 120 mL de metanol.

TBST para 500 mL: TBST 10X 500 mL: Tris – HCl 1M pH 7.5 ------5 mL 50 mL NaCl 5M ------15 mL 150 mL Tween 20 0.2% ------250 µL2.5 mL

Anexo I: Esquema del procedimiento de diluciones seriadas para ELISA; (SR) solución de reacción, (C.l.k) veneno de C. l. klauberi, (C. a) C. aquilus, (C. lxa) C. lepidus x aquilus, (C-) control negativo. a). Placa 1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx B SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx C SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k D SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k C. l. k E SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a F SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a C. a G SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C - C - C - C - C - C - C - C - C - C - H SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C - C - C - C - C - C - C - C - C - C - b). Placa 2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx B SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx Ctx C SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa D SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa C. lxa E ------F ------G SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C - C - C - C - C - C - C - C - C - C - H SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR SR C - C - C - C - C - C - C - C - C - C -

50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL

Anexo J:Distribución geográfica de C. l. klauberi con crotoxina en sus venenos.