UNIVERSITÉ DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE SSBCV

Centre d’Etude des Pathologies Respiratoires (CEPR) INSERM UMR 1100

THÈSE présentée par : Mylène WARTENBERG

soutenue le : 13 décembre 2018

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université de Tours Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé / Biochimie

Régulation de l’activité protéolytique des cathepsines à cystéine S et K par des inactivateurs/inhibiteurs chimiques et pseudopeptidiques

THÈSE dirigée par : M LALMANACH Gilles Professeur, Université de Tours, Tours

RAPPORTEURS : Mme LANONE Sophie Directeur de Recherche, INSERM, Créteil M RODRIGUES-LIMA Fernando Professeur, Université Paris Diderot (Paris VII), Paris

JURY : M LALMANACH Gilles Professeur, Université de Tours, Tours Mme LANONE Sophie Directeur de Recherche, INSERM, Créteil M MARCHAND-ADAM Sylvain PU-PH, Université de Tours, Tours M RODRIGUES-LIMA Fernando Professeur, Université Paris Diderot (Paris VII), Paris M SAPI Janos Professeur, Université de Reims Champagne-Ardenne, Reims M VOURC’H Patrick PU-PH, Université de Tours, Tours

Remerciements

Ce travail de thèse a été effectué à l’INSERM U1100 (Centre d’Étude des Pathologies Respiratoires, CEPR, Tours) dirigée par le Dr Mustapha Si-Tahar, au sein de l'équipe 2 "Mécanismes protéolytiques dans l'" (Responsable: Pr Gilles Lalmanach). Ce projet a bénéficié d'un contrat doctoral financé par la Région Centre-Val de Loire.

Je tiens à exprimer mes remerciements à :

Monsieur Gilles Lalmanach, Professeur de l’Université de Tours, pour m’avoir accordée sa confiance et m’avoir donnée la chance de pouvoir travailler à ses côtés durant ces trois dernières années. Merci pour votre enthousiasme à toute épreuve et votre bienveillance. Merci de m’avoir suivie au quotidien tout en me laissant suffisamment de liberté dans mon travail. Grâce à vous, j’ai appris (entre autre) à être « pragmatique » et à arrêter l’« auto-flagellation ».

Madame Sophie Lanone, Directeur de Recherche, INSERM, Créteil, et Monsieur Fernando Rodrigues-Lima, Professeur de l’Université Paris Diderot, pour m’avoir fait l’honneur d’être les rapporteurs de ce travail.

Monsieur Sylvain Marchand-Adam, PU-PH de l’Université de Tours, Monsieur Janos Sapi, Professeur de l’Université de Reims Champagne-Ardenne et Monsieur Patrick Vourc’h, PU- PH de l’Université de Tours d’avoir accepté d’être les examinateurs de cette thèse.

Monsieur Mustapha Si-Tahar, Directeur de Recherche de l’INSERM UMR 1100 - Centre d’Étude des Pathologies Respiratoires, pour m’avoir accueillie au sein de son unité.

Et je tiens également à remercier :

Monsieur Fabien Lecaille, Maître de Conférences à l’Université de Tours, pour sa bonne humeur et ses conseils.

Ahlame Saïdi, ma binôme de galère, pour notre soutien mutuel pendant les heures sombres au LUMINA et au confocal… Merci pour ton aide et pour m’avoir initiée à la culture cellulaire.

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Pierre-Marie Andrault, « maître », pour m’avoir accompagnée dans mes premiers pas au labo et d’avoir répondue à mes innombrables questions. Mariana Kasabova, pour sa bonne humeur, sa gentillesse et son aide dans mes débuts.

Alix Joulin-Giet, Sylvie Mavel et Lydie Nadal-Desbarats, pour leur gentillesse et leur participation à ce travail.

Les membres du Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301 (Orléans) et de l’ICOA, CNRS UMR 7311 (Orléans) pour la synthèse des inhibiteurs et leur participation à ces travaux.

Julien Burlaud-Gaillard, nos rendez-vous trimestriels en microscopie confocale vont me manquer… Même si je sais qu’il ne faudra pas attendre longtemps pour se retrouver au bota! Merci pour ta patience et ton aide précieuse.

David Ducluzeau et Paul Bigot, les étudiants que j’ai eu le plaisir d’encadrer durant leur stage dans l’unité.

Frédéric Esnard, Sylvie Attucci, Thomas Baranek, Sandrine Dallet-Choisy, Thierry Moreau, Florence Velge-Roussel, Marilou Zani, Marilou Fauquet et Fabien Barbarin, membres du département de Biochimie, pour m’avoir accueillie et accompagnée lors de mes trois années d’enseignement.

Aurélie Henriques et Catherine Douteau, pour leur aide au quotidien pour toutes les procédures administratives, leur gentillesse et leur patience.

Yves Courty et Agnès Petit, pour nos discussions sur les sujets les plus divers.

Un merci particulier pour les membres du bureau des « étudiants »: Seda Seren, Justine Renault, Delphine Fouquenet, Lise Vanderlynden, Woodys Lenga (Ouidiz’) et Thibault Chazeirat, qui m’ont supporté pendant ces trois années (N’oubliez pas de continuer la collection de marabout et d’approvisionner la cagnotte!). Ainsi que nos chers stagiaires de M2 partis vers d’autres horizons : Fanny Lisée, Adélaïde Chesnay, Damien Sizaret, Ghania Kara-Ali et Victor Tiroille.

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Un immense merci à « la masse informe » (Christelle, David et Mélia), je pourrais écrire une thèse entière sur les fous rires et les délires que nous avons eu pendant ces trois années : la reproduction des coccinelles, la bataille des ciseaux contre les licornes, le grand chelem au bota, les lettres du corbeau et notre credo : « Brule tout ! »… Merci pour tout, ces années n’auraient pas été pareilles sans vous !

Je tiens également à remercier l’ensemble des personnes que j’ai côtoyé au cours de ces années pour leur accueil et leur gentillesse: Ribal Al-Mawla, Elsa Bodier-Montagutelli, Chloé Boisseau, Déborah Bréa, Maria Cabrera, Florent Creusat, Emilie Dalloneau, Aurélie Domene, Marion Ferreira, Yveline Hamon, Virginie Hervé, Natalie Heuzé- Vourc’h, Sophie Iochmann, Youenn Jouan, Baris Korkmaz, Anne-Sophie Lamort, Déborah Le Pennec, Alexie Mayor, Eric Morello, Christophe Paget, Jeoffrey Pardessus, Pascale Reverdiau, Thomas Secher, Alexandre Valayer, Virginie Vasseur.

Je remercie mes amis de Tours et d’ailleurs : Mes gonzesses (Mathilde, Sara, Didi et Chacha) et leur moitié Antoine, Nico et Pierrot. Les Chesnoys & co : Macké, Céline, Seb, Maïlys, Joe, Mino, Lamith, Elo, Yohann, Mimi, Flo, Clém, Joubis, Alex … pour leur soutien durant ces trois années et leur amitié. Merci de m’avoir permis de m’évader loin de la thèse au moins le temps d’une soirée ou d’un weekend.

Enfin, je remercie ma famille pour leur amour :

Mes parents : tout cela est un peu grâce à vous. Même si je me suis un peu éloignée du pommier, jouer avec des molécules chimiques en plastique quand j’étais petite a porté ses fruits. Merci de m’avoir soutenue et d’avoir cru en moi toutes ces années. Ma sœur (c’est bon tu as enfin le mot « Cathé-pss-in ») et mon beauf pour m’avoir aidée à décompresser quand j’en avais besoin. Mon frère et Nadia (sa femme) pour avoir partagé leur expérience et m’avoir aidée à relativiser (« Plus c’est dur et plus on est heureux quand ça se termine… »). Anna et Zoé, pour avoir fait de moi une tata comblée. Mes grands parents, oncles, tantes, cousins et cousines pour leurs encouragements et leur soutien.

Mickaël, mon cœur, je sais que ces derniers mois ont été durs pour toi aussi, qui as dû supporter mon stress et mes sautes d’humeur. Merci infiniment pour tout ce que tu fais pour moi chaque jour.

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Résumé

La cathepsine (Cat) S est une protéase ciblée pour le développement de médicaments utilisés dans les maladies auto-immunes ou la douleur neuropathique. Elle joue également un rôle clé durant l’emphysème compte tenu de ses propriétés élastinolytiques. La Cat K, qui est une collagénase impliquée dans la résorption osseuse, représente une cible pertinente dans le traitement de l’ostéoporose et des métastases osseuses. De plus ces deux protéases sont des protagonistes majeurs du remodelage matriciel et l’homéostasie pulmonaire. Lors de la BPCO, la dégradation tissulaire bronchique est associée à une réaction inflammatoire qui s’accompagne d’un stress oxydatif et d’un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases. L'exposition à la fumée de cigarette constitue le principal facteur de risque dans la BPCO. Malgré la présence d'une cystéine nucléophile (Cys25) dans son site actif, nous avons constaté que la Cat S conserve partiellement son activité enzymatique après exposition à la fumée de cigarette. Ainsi, nous avons exploré les mécanismes soutenant la stabilité de la Cat S, en présence d’oxydants majeurs de la fumée de cigarette : peroxyde d’hydrogène, formaldéhyde, acroléine et peroxynitrite. Par ailleurs, dans le but de réguler l'activité des cathepsines à cystéine K et S, nous avons développé des inhibiteurs pseudopeptidiques de nouvelle génération dérivés de séquences substrats des cathepsines S et K ainsi que des dérivés triazines.

Mots clés: BPCO, cathepsine K, cathepsine S, dérivés triazines, fumée de cigarette, inhibiteurs pseudopeptidiques, oxydation.

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Résumé en anglais

Cathepsin (Cat) S is an attractive target for drugs in autoimmune diseases or neuropathic pain. Moreover Cat S plays a key role during emphysema according to its potent elastinolytic activity. Cat K is a critical bone-resorbing collagenase and is a relevant target for the treatment of osteoporosis and bone metastasis. Both play a key role in matrix remodeling and pulmonary . During COPD, the degradation of pulmonary parenchyma depends on inflammatory reactions associated with oxidative stress and /antiproteases imbalance. Exposure to cigarette smoke, a major source of oxidants, is the main risk factor for COPD. Despite the presence of a nucleophilic (Cys25) within its , we found that CatS preserved partially its proteolytic activity after exposure to cigarette smoke extract (CSE). Thus, we have explored molecular mechanisms supporting this stability in the presence of selected major CSE oxidants: hydrogen peroxide, formaldehyde, acrolein and peroxynitrite. In the other hand, we have designed innovative pseudopeptidic inhibitors derived from selective substrates of S and K as well triazine derivatives in order to regulate the activity of K and S.

Key words: , , cigarette smoke, COPD, oxidation, pseudopeptidic inhibitors, triazine derivatives

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Table des matières

Remerciements ...... 1 Résumé ...... 5 Résumé en anglais ...... 7 Table des matières ...... 9 Liste des tableaux ...... 13 Liste des figures ...... 15 Publications liées à la thèse ...... 17 Congrès nationaux ou internationaux ...... 18 Liste des abréviations ...... 21 Introduction ...... 23 I- Revue Bibliographique ...... 27 1. Les cathepsines à cystéine ...... 28 1.1 Généralités ...... 30 1.1.1 Classification et phylogénie ...... 30 1.1.2 Structures ...... 31 1.1.3 Fonctionnement et organisation du site catalytique ...... 35 1.1.4 Spécificité enzymatique des cathepsines à cystéine ...... 37 1.1.5 Particularité des exopeptidases ...... 38 1.1.6 Localisation cellulaire ...... 40 1.2 Régulation des cathepsines à cystéine ...... 42 1.2.1 Régulation transcriptionnelle ...... 43 1.2.2 Régulation par le pH et la force ionique ...... 43 1.2.3 Régulation par la prorégion ...... 44 1.2.4 Régulation par les glycosaminoglycanes ...... 45 1.2.5 Inhibiteurs endogènes spécifiques : la famille des Cystatines ...... 46 1.2.6 Inhibiteurs endogènes non spécifiques ...... 51 1.2.7 Inhibiteurs synthétiques ...... 52 1.3 Fonctions physiologiques ...... 59 1.3.1 Maturation des précurseurs protéiques ...... 59 1.3.2 Présentation antigénique ...... 60 1.3.3 Remodelage de la matrice extracellulaire ...... 62 1.3.4 Apoptose ...... 65 9

1.4 Fonctions physiopathologiques ...... 65 1.4.1 Ostéoporose / pycnodysostose ...... 66 1.4.2 Arthrite rhumatoïde ...... 67 1.4.3 Athérosclérose ...... 68 1.4.4 ...... 69 1.4.5 Autres pathologies ...... 70 1.5 Les cathepsines à cystéine dans les pathologies pulmonaires ...... 71 1.5.1 Silicose ...... 71 1.5.2 Mucoviscidose ...... 72 1.5.3 Asthme ...... 73 1.5.5 Lymphangioleiomyomatose ...... 74 2. Inflammation dans la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) ...... 77 2.1 La BPCO - Généralités ...... 77 2.1.1 Définition ...... 77 2.1.2 Mécanismes pathologiques ...... 79 2.2 Le stress oxydatif ...... 82 2.2.1 Oxydants exogènes ...... 82 2.2.2 Oxydants endogènes ...... 87 2.2.3 Systèmes antioxydants ...... 88 2.2.4 Déséquilibre de la balance oxydants/antioxydants dans la BPCO ...... 90 2.3 Balance protéases/antiprotéases ...... 92 2.3.1 Origine et concept ...... 92 2.3.2 Les protéases et leurs inhibiteurs dans la BPCO ...... 92 2.3.3 Action des oxydants sur la balance protéases/antiprotéases ...... 94 2.4 Les cathepsines à cystéine dans la BPCO ...... 95 2.4.1 Localisation pulmonaire des cathepsines à cystéine ...... 95 2.4.2 Cathepsines et déséquilibre protéolytique inflammatoire ...... 96 2.4.3 Cathepsines et dégradation de la MEC (Emphysème) ...... 98 2.4.4 Cathepsines et fibrose ...... 99 2.4.5 Cathepsines et déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases ...... 99 2.5 Régulation des cathepsines par le stress oxydatif ...... 101 2.5.1 Réaction des protéines avec les oxydants ...... 101 2.5.2 Oxydation des cystéines ...... 102

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2.5.3 Réaction des cathepsines avec les oxydants ...... 106 3. Objectifs de la thèse ...... 109 II- Travaux personnels ...... 113 1. Régulation de l’activité de la cathepsine S par les constituants majeurs de la fumée de cigarette ...... 114 2. Inhibition des cathepsines à cystéine par des inhibiteurs pseudopeptidiques et dérivés triazines ...... 167 Conclusion ...... 195 Annexe ...... 251 Résumé ...... 294 Résumé en anglais ...... 294

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Liste des tableaux

Tableau 1: Caractéristiques des cathepsines à cystéine humaines ...... 32 Tableau 2 : Résidus constituant la poche S2 des cathepsines à cystéine ...... 38 Tableau 3 : Propriétés enzymatiques des cathepsines à cystéine ...... 39 Tableau 4 : Valeurs des constantes d’inhibition (Ki) des cathepsines à cystéine par la superfamille des cystatines ...... 47 Tableau 5 : Acides aminés impliqués dans l’inhibition des cystatines humaines ...... 50 Tableau 6 : Principales dérivés d’epoxysuccinate ...... 56 Tableau 7 : Inhibiteurs des cathepsines à cystéine en essais cliniques ou préclinique ...... 58 Tableau 8 : Constituants de la matrice extracellulaire et de la membrane basale dégradés par les cathepsines à cystéin ...... 64 Tableau 9 : Implication des cathepsines à cystéine dans les pathologies pulmonaires ...... 76 Tableau 10 : Classification clinique de la BPCO selon le degré de sévérité (GOLD) ...... 79 Tableau 11 : Constituants majeurs de la phase gazeuse de la fumée de cigarette ...... 83 Tableau 12 : Principales espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de l’azote (RNS) ...... 85 Tableau 13 : Concentrations physiologiques en antioxydants non-enzymatiques ...... 89 Tableau 14 : Expression des cathepsines à cystéine pulmonaires ...... 95 Tableau 15 : Principales formes d’oxydation des chaînes latérales des acides aminés ...... 104

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Liste des figures

Figure 1 : Structures tridimensionnelles des procathepsines L et B ...... 33 Figure 2 : Structures tridimensionnelles des cathepsines L et B ...... 35 Figure 3 : Mécanisme catalytique des protéases à cystéine ...... 36 Figure 4 : Nomenclature de Schechter et Berger ...... 37 Figure 5 : Caractéristiques structurales des cathepsines à activité exopeptidasique ...... 39 Figure 6 : Voie d’adressage et localisation cellulaire des cathepsines à cystéine ...... 40 Figure 7 : Différents mécanismes de régulation des cathepsines à cystéine ...... 42 Figure 8 : Structure schématique des kininogènes humains ...... 49 Figure 9 : Structure tridimensionnelle de la cystatine C de poulet et du complexe stéfine B- papaïne ...... 50 Figure 10 : Mécanisme d’inhibition des protéases à cystéine par les peptidyl nitriles ...... 53 Figure 11 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par des peptidyl halométhyl cétones ...... 54 Figure 12 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par des diazométhyl cétones 55 Figure 13 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par les dérivés epoxysuccinyl ...... 55 Figure 14 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par les vinyl sulfones et les dérivés d’ester α,β-insaturés ...... 57 Figure 15 : Rôle des protéases à cystéine dans la présentation antigénique par le CMH de classe II ...... 61 Figure 16 : Exemple d’implication des cathepsines à cystéine dans des processus pathologiques ...... 66 Figure 17 : Implication des cathepsines à cystéine dans l’érosion tri-directionnelle des articulations arthritiques ...... 68 Figure 18 : Profil d’expression des cathepsines à cystéine dans le microenvironnement tumoral ...... 70 Figure 19 : Mécanismes pathologiques impliqués dans les BPCO ...... 78 Figure 20 : Coupes histologiques de bronches de patients atteints d’asthme ou de BPCO ..... 82 Figure 21 : Régulation des systèmes oxydants et antioxydants pulmonaires ...... 90 Figure 22 : Détection des cathepsines B, L, H, K, S, W et X pulmonaires ...... 96 Figure 23 : Modifications post-transcriptionnelles des cystéines et des méthionines par oxydation ...... 105 15

Figure 24 : Représentation schématique de la régulation des cathepsines par des inactivateurs chimiques et pseudopeptidiques ...... 112

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Publications liées à la thèse

Articles publiés

2018 Substrate-derived triazolo- and azapeptides as inhibitors of cathepsins K and S M. Galibert*, M. Wartenberg*, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach European Journal of Medicinal Chemistry. 2018 Jan 20;144:201-210. (*co-premiers auteurs) (Article 2)

2018 Selective inhibition of human cathepsin S by 2,4,6-trisubstituted 1,3,5-triazine analogs Z. Tber, M. Wartenberg, J-E. Jacques, V. Roy, F. Lecaille, D. Warszycki, A.J. Bojarski, G. Lalmanach & L.A. Agrofoglio , Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2018 Aug 7;26(14):4310-4319. (Article 3)

Article soumis

Cigarette smoking induces overexpression of elastinolytic cathepsin S P-M Andrault, A. C. Schamberger, T. Chazeirat, D. Sizaret, J. Renault, A. Petit, M. Wartenberg, A. Saidi, T. Baranek, S. Guyetant, Y. Courty, O. Eickelberg, G. Lalmanach & F. Lecaille (Annexe 1)

Article en préparation

Oxidation of cathepsin S by major chemicals of cigarette smoke M. Wartenberg M, P-M. Andrault, A. Saidi, L. Nadal-Desbarats, F. Lecaille, G. Lalmanach (Article 1)

Autres Publications

Article soumis

Curcumin inhibits the TGF-β1-dependent differentiation of lung fibroblasts via PPARγ-driven upregulation of cathepsins B and L A. Saidi, M. Kasabova, L. Vanderlynden, M. Wartenberg, G. Kara-Ali, D. Marc, F. Lecaille & G. Lalmanach Scientific Reports (accepté sous réserves de corrections mineures)

Article en préparation

Imaging of extracellular cathepsin S activity by a selective substrate-derived near infrared fluorescence probe M. Wartenberg*, A. Saidi*, M. Galibert, A. Joulin-Giet, J. Burlaud-Gaillard, F. Lecaille, C. Scott, A.F. Delmas, V. Aucagne & G. Lalmanach (*co-premiers auteurs)

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Congrès nationaux ou internationaux

Présentations orales (orateur: *) 2017 Triazolo- and azaGly-peptidomimetics: a new generation of potent reversible substrate- like inhibitors of cysteine proteases, cathepsins K and S M. Wartenberg*, M. Galibert, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach EnzyBio 2017, Le Croisic, France, May 9-12

2017 A bradykinin-derived azapeptide as a potent inhibitor of cathepsin K M. Wartenberg*, M. Galibert, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach 7th International Symposium on Kallikreins and Kallikrein-related Peptidases, Tours, France, September 26-29

2017 Antifibrotic properties of curcumin is associated with an upregulation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma and cysteine cathepsins A. Saidi, M. Kasabova, L. Vanderlynden, M. Wartenberg, F. Lecaille & G. Lalmanach* 10th General Meeting of the International Proteolysis Society, Banff (AB), Canada, October 27-November 1

2018 Cigarette smoking and cathepsin S: dangerous liaisons M. Wartenberg, P-M. Andrault, A.C. Schamberger, A. Saidi, O. Eickelberg, F. Lecaille & G. Lalmanach* FEBS International Symposium on Proteases and Inhibitors, Portoroz, Slovenia, September 8-12

2018 Substrate-derived triazolo- and azapeptides: new generation of compelling inhibitors of cysteine cathepsins M. Wartenberg, M. Galibert, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach* 8th Symposium on Cellular Proteolysis, La Grande Motte, France, October 15-17

2018 Cigarette smoking induces overexpression of elastinolytic cathepsin S P-M. Andrault, A. C. Schamberger, T. Chazeirat, D. Sizaret, J. Renault, A. Petit, M. Wartenberg, A. Saidi, T. Baranek, S. Guyetant, Y. Courty, O. Eickelberg, Y. Courty, G. Lalmanach & F. Lecaille* American Society for Matrix Biology, Biennial Meeting, October 14-17, Las Vegas, Nevada, USA

Posters 2017 A bradykinin-derived azapeptide as a potent inhibitor of cathepsin K M. Wartenberg, M. Galibert, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach 7th International Symposium on Kallikreins and Kallikrein-related Peptidases, Tours, France, September 26-29

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2017 Triazolo- and azaGly-substrate-like peptides as inhibitors of cysteine proteases M. Wartenberg, M. Galibert, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach 30ème Colloque Biotechnocentre, Seillac, France, 12-13 Octobre

2018 Cigarette smoke induces overexpression of cathepsin S in active smokers with and without COPD M. Wartenberg, P-M. Andrault, A. C. Schamberger, T. Chazeirat, D. Sizaret, J. Renault, A. Petit, A. Saidi, S. Guyetant, Y. Courty, O. Eickelberg, Y. Courty, G. Lalmanach & F. Lecaille European Respiratory Society, International Congress 2018, Paris, France, September 15-19

2018 Deciphering molecular mechanisms of cathepsin S resistance to major chemical oxidants of cigarette smoke M. Wartenberg, P-M Andrault, A. Saidi, L. Nadal-Desbarats, F. Lecaille & G. Lalmanach European Respiratory Society, International Congress 2018, Paris, France, September 15-19

2018 Cigarette smoking induces overexpression of elastinolytic cathepsin S P-M. Andrault, A. C. Schamberger, T. Chazeirat, D. Sizaret, J. Renault, A. Petit, M. Wartenberg, A. Saidi, T. Baranek, S. Guyetant, Y. Courty, O. Eickelberg, Y. Courty, G. Lalmanach & F. Lecaille American Society for Matrix Biology, Biennial Meeting, October 14-17, Las Vegas, Nevada, USA

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Liste des abréviations

AAT α1-antitrypsine AP activator APC antigen presenting cell BALF broncho-alveolar lavage fluid BPCO broncho-pneumopathie chronique obstructive CA-074 N-(L-3-trans-propylcarbomoyl-oxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-proline Cat cathepsine C4-S chondroïtine-4 sulfate C6-S chondroïtine-6 sulfate CF cystic fibrosis CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CFV capacité vitale forcée CLIP class II-associated invariant chain peptide CMH complexe majeur d’histocompatibilité CS chrondroïtine sulfate CTGF connective tissue growth factor Cys cystéine DTT dithiothréitol DS dermatane sulfate E-64 1-N-(L-3-trans-carboxyoxirane-2-carbonyl) L-leucyl amino-4-guanidinobutane ETS E-twenty-six FA formaldéhyde GAG glycosaminoglycane GOLD global initiative on obstructive lung disease GSH glutathion HA acide hyaluronique HBSS Hank’s balanced salt solution HMWK high molecular weight kininogen HNE human neutrophil elastase HS héparane sulfate IFN-γ interféron-γ 21

IL interleukine IRF IFN regulatory factor IUBMB international union of biochemistry and molecular biology KS kératane sulfate LBA liquide de lavage broncho-alvéolaire LDL low-density lipoprotein LHVS morpholinourea-leucinyl-homophenylalanine-vinylsulfone-phenyl LMWK low molecular weight kininogen MB membrane basale MEC matrice extracellulaire MMPs matrix metalloproteases, ou métalloprotéases matricielles NAC N-acétylcystéine NFA nitrated fatty acids NFκB nuclear factor kappa B NSP 4 neutrophil serine 4 OMS organisation mondiale de la santé PBL proregion binding loop Pr3 proteinase 3 RANK receptor activator of NFkB RANKL receptor activator of NFkB ligand RCG redox cyclic compounds RNS reactive nitrogen species ROS reactive oxygen species SCCA1 squamous cell carcinoma antigen 1 SLPI secretory leukoprotease inhibitor Sp specificity protein STAT signal transducers and activators of transcription TIMP tissue inhibitors of metalloproteinases TGF-β1 transforming growth factor-β1 TNF-α tumor necrosis factor-α VEMS volume expiratoire maximal à la première seconde

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Introduction

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L’unité INSERM U1100, Centre d’Etude des Pathologies Respiratoires (CEPR), dirigée par le Dr Mustapha Si-Tahar étudie les mécanismes protéolytiques et infectieux impliqués dans les pathologies pulmonaires inflammatoires. Elle vise également à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques comme l’administration de certains composés par aérosolthérapie. Les travaux du groupe de Gilles Lalmanach (Equipe 2), s’articulent autour de deux axes majeurs : le premier axe étudie le rôle des protéases, en particulier les cathepsines à cystéine, dans les pathologies pulmonaires chroniques. Ces études portent sur la régulation des cathepsines à cystéine dans les mécanismes fibrosants ou le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC). Le deuxième axe a pour but de développer différents outils moléculaires comme des sondes ou des inhibiteurs ciblant ces enzymes. Cette approche permet ainsi de mieux appréhender les conséquences de la modulation de leur activité enzymatique et d’évaluer leur pertinence en tant que cible thérapeutique potentielle. Il existe 11 cathepsines à cystéine exprimées chez l’Homme (B, C, F, H, K, L, O, S, V, W et X). Ce sont des protéases ubiquitaires exprimées essentiellement au niveau des lysosomes où leur rôle majeur est la dégradation et le recyclage des protéines. Elles participent également à d’autres rôles physiologiques plus spécifiques comme remodelage de la MEC, la maturation de certaines hormones, l’apoptose ou la présentation antigénique par le CMHII (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II). Elles sont actives à pH acide et rapidement inactivées à pH neutre, à l’exception de la cathepsine S qui conserve son activité à pH 7,4. Cependant, certains facteurs comme la force ionique, les GAGs (glycosaminoglycanes) ou l’acidification du milieu leurs permettent de rester actives au niveau extracellulaire. De nombreux autres facteurs sont capables de réguler l’activité de ces enzymes comme la température, le stress oxydatif et leurs inhibiteurs endogènes (famille des cystatines : stéfines, cystatines et kininogènes). Cependant, une régulation anormale de l’activité de ces protéases peut conduire au développement de certaines pathologies comme l’ostéoporose, l’arthrite rhumatoïde ou certains . Les cathepsines ont également un rôle important dans plusieurs pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme, la mucoviscidose, la silicose, la fibrose ou la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Parmi ces enzymes, seules les cathepsines K et S sont validées aujourd’hui comme des cibles thérapeutiques. La cathepsine K est majoritairement ciblée dans l’ostéoporose et la cathepsine S dans le cadre des maladies auto-immunes. Cependant ces deux enzymes sont également des cibles thérapeutiques privilégiées pour d'autres pathologies particulièrement délétères ou invalidantes (métastases osseuses, douleurs neuropathiques, emphysème). De ce fait, le développement d’inhibiteurs innovants présente un enjeu crucial et plusieurs molécules thérapeutiques sont actuellement en

24 essai clinique pour les cathepsines S et K. Un des critères retenus pour le design d’inhibiteurs des cathepsines est de se fixer réversiblement (avec ou sans formation d'une liaison covalente) à leur site actif. Il existe de nombreuses molécules réversibles candidates d'intérêt comme des analogues de l'état de transition ou des dérivés nitriles en particulier. Une nouvelle génération d’inhibiteurs a également vu le jour : les inhibiteurs pseudopeptidiques dérivés de séquences substrats, qui consiste à remplacer la liaison peptidique du site de clivage par une liaison non- hydrolysable permettant ainsi de conserver une bonne sélectivité.

La BPCO représente un problème majeur de santé publique, selon l’OMS (Organisation mondiale de la santé) elle sera en 2020 la 3ème cause de mortalité dans le monde. Elle se caractérise par une diminution progressive et irréversible des débits expiratoires associée à une réaction inflammatoire pulmonaire anormale suite à l’exposition à des substances nocives gazeuses ou particulaires. Le tabagisme est considéré comme la cause majeure de BPCO (90% des cas). Cependant, il existe d’autres facteurs de risques environnementaux comme la pollution atmosphérique (particules, fumée de bois ...) ou les infections pulmonaires. Bien que la totalité des patients présentent des symptômes cliniques d’obstruction du flux d’air, les mécanismes pathologiques y conduisant peuvent différer en fonction des patients et de la sévérité de la maladie. Parmi ces mécanismes on retrouve : une bronchiolite obstructive, un emphysème et une hypersécrétion de mucus. La bronchiolite induit une fibrose et une obstruction des petites voies respiratoires tandis que l’emphysème est responsable d’un élargissement des espaces aériens, de la destruction du parenchyme pulmonaire, de la perte d’élasticité pulmonaire et la fermeture des petites voies respiratoires. L’inflammation pulmonaire est une composante essentielle de la BPCO. Suite à une exposition à des substances exogènes comme la fumée de cigarette, des cellules immunitaires (neutrophiles, lymphocytes et macrophages) vont être recrutées au niveau pulmonaire. Ces dernières, en plus des cellules endothéliales, vont sécréter une quantité massive de protéases comme des métalloprotéases matricielles (MMPs), des protéases à sérine et des protéases à cystéine, dont les cathepsines à cystéine, contribuant au déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases en faveur de la protéolyse. Les cathepsines vont contribuer à la diminution de la capacité respiratoire en participant au développement d’emphysème, suite à la destruction des composants de la MEC comme l’élastine, les collagènes de type I et II et de la membrane basale comme le collagène IV, la fibronectine ou encore les laminines. En plus des protéases, les cellules vont sécréter des oxydants qui, additionnés aux oxydants exogènes présents dans la fumée de cigarette, vont induire une augmentation du stress oxydatif. Parmi ces oxydants on retrouve les ROS (anion superoxyde, 25 ozone, peroxyde d’hydrogène…), les RNS (oxyde nitrique, peroxynitrite…) ou les aldéhydes (formaldéhyde, acétaldéhyde, acroléine…). Ces molécules sont capables d’oxyder les protéines, les lipides (peroxydation lipidique), les acides nucléiques (ADN et l’ARN), participant ainsi aux lésions tissulaires. Les modifications oxydatives des protéines peuvent avoir lieu sur la chaîne polypeptidique et/ou sur les chaînes latérales sensibles des acides aminés. Ainsi les oxydants peuvent avoir plusieurs effets sur les protéines, incluant l’oxydation des chaînes latérales, la fragmentation potentielle du squelette protéique, leur agrégation, leur modification structurale ou encore leur inactivation enzymatique Les cathepsines à cystéine, en raison d’une fonction thiol libre présente dans leur site actif, sont très sensibles à l’oxydation. En effet, la cystéine avec un pKa d’environ 4-4,5 agit comme un puissant nucléophile. Elle est capable de réagir avec des ROS ou des RNS ce qui induit la perte d’activité protéolytique des cathepsines. On observe alors la formation de formes réversibles (exemple : pont disulfure, acide sulfénique) ou de formes irréversibles comme les acides sulfiniques et sulfoniques ou les ajouts de Michael. Pourtant, des cathepsines à cystéine ont été retrouvées sous forme active dans les liquides biologiques de patients atteints de pathologies inflammatoires, comme la mucoviscidose ou la silicose, malgré un milieu oxydant défavorable (Perdereau et al., 2006; Serveau-Avesque et al., 2006). Des études in vitro ont montré en particulier que la cystéine du site actif peut réagir avec le peroxyde d’hydrogène pour former un acide sulfénique réversible pouvant expliquer la préservation partielle de l’activité de la cathepsine K lors du stress oxydatif (Godat et al., 2008). Par ailleurs, la CatS est surexprimée par le stress oxydatif lié à la fumée de cigarette dans les poumons de patients fumeurs atteints ou non de BPCO. De plus, la CatS conserve son activité protéolytique dans un environnement oxydant pouvant expliquer son rôle dans l’inflammation du tissu pulmonaire associé au tabagisme. Dans ce contexte général, les travaux de cette thèse ont consisté à essayer de mieux comprendre certains mécanismes de régulation de l’activité enzymatique des cathepsines, et en particulier de la cathepsine S, en conditions oxydantes associées à la fumée de cigarette. L'autre axe de nos travaux a consisté à concevoir, développer et évaluer des inhibiteurs pseudopeptidiques dérivés de séquences substrats des cathepsines S et K ainsi que des dérivés triazines dans le but de réguler l'activité des cathepsines à cystéine, pouvant être délétères dans certaines pathologies, et en particulier durant l'emphysème.

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I- Revue Bibliographique 1. Les cathepsines à cystéine

Les protéases sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse de la liaison peptidique des peptides et des protéines. Chez l’Homme, on retrouve 570 gènes codant pour des protéases (Quesada et al., 2009). Elles sont classées en 6 types distincts selon leur mécanisme catalytique, et en particulier en fonction du résidu essentiel à leur activité catalytique : les protéases à sérine, les protéases acides (à aspartate et à glutamate), les protéases à cystéine, les métalloprotéases et les protéases à thréonine (López-Otín & Bond, 2008). Les protéases à cystéine sont largement exprimées au sein des organismes comme les animaux, les végétaux, les champignons, les parasites, les bactéries ou les virus (Otto & Schirmeister, 1997; Rawlings & Barrett, 1994). Parmi les protéases à cystéine, le clan CA est le plus représenté et le plus étudié. Il contient plus de 20 familles de peptidases dont l’une d’entre elles, la famille C1, est connue pour avoir une structure similaire à la papaïne (première protéase à cystéine isolée à partir du latex de Carica papaya) (Barrett & Rawlings, 2001). Chez l’Homme, 11 protéases à cystéine appartiennent à la famille de la papaïne et sont appelées « cathepsines » : les cathepsines B, C, F, H, K, L, O, S, V, W et X. Cependant le terme cathepsine est également utilisé pour désigner des protéases acides (cathepsines D et E) et des protéases à sérine (cathepsine A et G). Ainsi, pour éviter les confusions, le terme cathepsines à cystéine est employé. Le mot cathepsine vient du grec « kathepsien » qui signifie « digérer », il a été introduit pour la première fois en 1929 dans des travaux de Willstäter et Bamann (Willstätter & Bamann, 1929). Cette étude mettait en évidence des protéases intracellulaires, actives à pH acide, présentes dans les muqueuses gastriques et différentes des pepsines. La première cathepsine à avoir été purifiée et caractérisée fut la cathepsine C en 1948 (Gutmann & Fruton, 1948). Il fallut ensuite attendre plusieurs années pour que d’autres cathepsines soit identifiées avec la découverte des cathepsines B, H, L et S (Greenbaum & Fruton, 1957; Kirschke et al., 1976; Turnsek et al., 1975). Puis dans les années 90, la première structure cristallographique d’une cathepsine à cystéine, la cathepsine B, a été déterminée (Musil et al., 1991). Ces dernières années, l’avancée des techniques de biologie moléculaire et de l’étude du génome humain ont permis la découverte des cathepsines F, K, O, V, X et W. Ces méthodes ont également fourni davantage d’indices sur les fonctions physiologiques de ces enzymes. Jusqu’aux années 90, les cathepsines à cystéine étaient connues comme des protéases lysosomales exprimées de manière ubiquitaire, actives à pH acide (5,5 – 6) et rapidement 28 inactivées à pH neutre (à l’exception de la cathepsine S) (Brömme et al., 1993). Cependant, des techniques de knock-out ont permis de démontrer que le rôle des cathepsines à cystéine n’était pas seulement celui de « protéases de ménage » impliquées dans le recyclage protéique au sein des compartiments endosomaux et lysosomaux (Chapman et al., 1997; Turk et al., 2000). De plus, il a été montré que toutes les cathepsines n’avaient pas une distribution ubiquitaire, la répartition de certaines cathepsines a été montrée comme spécifique d’un type tissulaire. La cathepsine K, par exemple, est exprimée principalement au niveau des ostéoclastes où elle joue un rôle important dans la dégradation de la matrice osseuse (Brömme & Okamoto, 1995; Chapman et al., 1997). La cathepsine W est retrouvée dans les lymphocytes T et les cellules NK (Natural Killer). Cette expression est liée à la fonction spécifique de cette protéase dans l’activité cytolytique des cellules T cytotoxiques (Linnevers et al., 1997). La cathepsine V est principalement exprimée par le thymus et les testicules où elle contrôle la formation du complexe αβ-CLIP (Tolosa et al., 2003). La cathepsine S (pour Spleen) est exprimée majoritairement au sein des cellules présentatrices d’antigène comme les cellules dendritiques et les lymphocytes B. Elle y a un rôle majeur dans la présentation de peptides antigéniques par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH) (Hsing & Rudensky, 2005). Les cathepsines peuvent également être sécrétées dans le milieu extracellulaire où elles contribuent à la dégradation et au recyclage des composants de la matrice extracellulaire. Ainsi, les cathepsines sont impliquées dans de nombreuses fonctions physiologiques comme le remodelage de la matrice extracellulaire et osseuse, la présentation antigénique, l’apoptose, ou encore la maturation de certaines hormones (Kasabova et al., 2011; Vasiljeva et al., 2007). Lors d’un déséquilibre de l’expression des cathepsines, elles peuvent également intervenir dans des pathologies comme l’arthrite rhumatoïde, l’ostéoporose, l’asthme, dans des phénomènes d’invasion tumorale ou inflammatoires. Pour toutes ces raisons, l’intérêt pour ces enzymes ne cesse d’augmenter. Elles sont aujourd’hui considérées comme des cibles thérapeutiques potentielles et plusieurs inhibiteurs de ces protéases sont actuellement en étude clinique (Brömme et al., 2016; Korkmaz et al., 2018; Kramer et al., 2017; Turk, 2006).

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1.1 Généralités

1.1.1 Classification et phylogénie

1.1.1.1 L’ « Commission » Cette classification a été réalisée par la commission des enzymes de l’Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (ou IUBMB pour International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Elle est basée sur la spécificité de substrat et sur la nature de la réaction catalysée. Selon cette classification, les protéases appartiennent à la classe des (classe E.C.3) et à la sous-classe des peptidases (hydrolases agissant sur les liaisons peptidiques ; sous-classe E.C.3.4). Cette sous-classe est encore divisée en 14 sous-sous-classes selon la localisation de leur site de clivage. Il est possible des distinguer 3 types de peptidases : les endopeptidases qui clivent à l’intérieur de la chaine polypeptidique ; les exopeptidases qui clivent au niveau des extrémités N-terminales (aminopeptidases) ou C-terminales (carboxypeptidases) de la chaine polypeptidique. La plupart des cathepsines à cystéine sont des endopeptidases, mais on retrouve parmi elles des exopeptidases qui sont donc classées dans d’autres groupes. La cathepsine C est, par exemple, une aminopeptidase tandis que la cathepsine X est une carboxypeptidase. Certaines cathepsines peuvent également être à la fois des endopeptidases et des exopeptidases, comme la cathepsine B.

1.1.1.2 Classification en clans et familles Bien que la classification selon l’ « Enzyme Commission » soit encore largement utilisée, en particulier dans les banques de données, elle ne permet pas la compréhension de l’évolution phylogénétique et fonctionnelle des enzymes. Pour répondre à ce manque, Rawlings et ses collaborateurs ont mis en place une nouvelle nomenclature pour les protéases en clans et en familles (Rawlings et al., 2004). Cette classification est basée sur une analyse statistique de comparaisons des séquences limitées à la région de l’activité catalytique des protéases. Elles sont ensuite répertoriées selon leur évolution à partir d’ancêtres communs. Chaque famille est nommée par une lettre qui désigne la nature du site catalytique suivi d’un numéro. Un clan regroupe un ensemble des familles ayant évolué à partir d’un ancêtre commun mais dont l’origine ne peut être identifiée à partir de la comparaison des séquences. La classification est alors basée sur les structures tridimensionnelles ou sur l’ordre des résidus composants le site catalytique (Rawlings & Barrett, 1994).

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1.1.1.3 Le clan CA, famille C1 ou la famille de la papaïne Les protéases à cystéine sont divisées en 11 clans (CA, CD, CE, CF, CL, CM, CN, CO, CP, CQ et un non assigné) qui contiennent plus d’une soixantaine de familles. Le clan le plus étudié est le clan CA qui regroupe plus de 20 familles de peptidases. Parmi ces familles, on retrouve la famille de la papaïne (C1). Pendant longtemps, le terme de « super-famille de la papaïne » a été utilisé. Elle regroupait les protéases de type cathepsine (B et L), bléomycine et calpaïne (Berti & Storer, 1995). Puis, des études phylogénétiques plus approfondies basées sur la structure tridimensionnelle, ont permis de diviser cette super-famille. On retrouve à présent 3 groupes distincts : les cathepsines à cystéine de la famille de la papaïne (C1a), les protéases de type bléomycine hydrolase (C1b) et de type calpaïne (C2) (Rawlings et al., 2004). Pour les cathepsines à cystéine humaines, on distingue deux groupes distincts caractérisés par la présence de motifs conservés dans la séquence de leur prorégion (Berti & Storer, 1995; Karrer et al., 1993). Le premier groupe correspond aux cathepsines apparentées à la cathepsine L (L- like). Il se caractérise par une prorégion d’une centaine de résidus comprenant deux motifs conservés : ERF(X)NIN et GxNxFxD. On retrouve parmi ce groupe les cathepsines L, K, S, H et V. Le second groupe est celui des cathepsines apparentées à la cathepsine B (B-like). La prorégion de ce groupe ne possède qu’une soixantaine d’acides aminés et un seul motif conservé : GxNxFxD. Ce groupe inclut les cathepsines B, C, O et X. La comparaison des séquences des cathepsines F et W montrent qu’elles sont apparentées et qu’elles n’appartiennent pas aux deux groupes décrits précédemment. Leur prorégion possède un motif ERFNAQ. Il a donc été proposé qu’elles appartiennent à un nouveau sous-groupe appelé « F-like » (Wex et al., 1999).

1.1.2 Structures

Bien que la structure de la papaïne soit connue depuis 1968 (Drenth et al., 1968), il faudra attendre les années 90 pour que la première structure d’une cathepsine de mammifères, celle de la cathepsine B, soit déterminée (Musil et al., 1991). Puis en quelques années les structures de nombreuses autres cathepsines ont été révélées : L (Fujishima et al., 1997), K (McGrath et al., 1997), H (Guncar et al., 1998), X (Guncar et al., 2000), V (Somoza et al., 2000), C (Turk et al., 2001), S (Turkenburg et al., 2002) et F (Somoza et al., 2002). Cependant, les structures cristallographiques des cathepsines O et W restent encore aujourd’hui non élucidées. Les cathepsines à cystéine sont synthétisées sous forme de pré-proenzymes inactives appelées « zymogène ». La pré-région d’une vingtaine de résidus (Tableau 1) correspond à un signal

31 d’adressage vers le réticulum endoplasmique. La prorégion est responsable du bon repliement de la protéase, de sa stabilité et possède également des propriétés inhibitrices vis-à-vis du domaine catalytique (pour revue : Lecaille et al., 2002). La maturation de l’enzyme se fait par clivage et relargage de ce propeptide.

Tableau 1: Caractéristiques des cathepsines à cystéine humaines N° AC : numéro d’accession référencé dans la banque de données Swiss-Prot (extrait de Lecaille et al., 2002) Peptide Prodomaine Domaine mature Proforme Localisation signal chromosomique Nom N° AC Taille Masse pI Taille Masse pI Taille Masse (AA) (AA) (Da) (AA) (Da) (AA) (Da)

Cathepsine L P07711 17 96 11724 9.0 220 24170 4.7 333 37546 9q21-22

Cathepsine V (L2) O60911 17 96 11672 9.5 221 23999 8.6 334 37329 9q22

Cathepsine S P25774 16 98 11830 9.3 217 23993 7.6 331 37479 1q21

Cathepsine O P43234 23 84 9894 9.8 214 23460 5.8 321 35957 4q31-32

Cathepsine F Q9UBX1 19 251 27846 9.4 214 23593 5.8 484 53365 11q13.1-3

Cathepsine X (Z) Q9UBR2 23 38 4338 9.6 242 27149 5.5 303 33858 20q13

Cathepsine B P07858 17 62 7245 9.6 260 28663 5.2 339 37807 8p22

Cathepsine C P53634 24 206 23534 8.7 233 26032 5.6 463 51841 11q14.1-3

Cathepsine K (O2) P43235 15 99 11833 6.3 215 23495 8.9 329 36966 1q21

Cathepsine H P09668 22 75 9104 9.8 220 24187 5.7 335 37403 15q24-25

Cathepsine W P56202 21 106 12060 4.8 249 28024 8.9 376 42099 11q13.1-3

1.1.2.1 Prorégion Comme vu précédemment les prorégions des deux groupes de cathepsines (B-like et L-like) varient par leur taille et leur séquence. Pourtant, elles présentent une forte homologie de repliement (Cygler & Mort, 1997). La prorégion des cathepsines de type L se divise en deux parties distinctes. L’extrémité N-term (environ 60 résidus), forme un mini domaine compact constitué de deux hélices α et d’un brin β situé le long de la seconde hélice (Figure 1). Ce domaine interagit avec une boucle appelée PBL (pour Proregion Binding Loop) positionnée à l’entrée du site catalytique et permettant de stabiliser la prorégion. La partie C-term relie le prosegment à la forme mature (au niveau de l’Ala1 pour la cathepsine L). Cette partie se positionne en conformation étendue à la surface de l’enzyme jusqu’au site actif, au niveau duquel elle forme une courte hélice α. Cette hélice empêche ainsi l’accès à des substrats peptidiques (Coulombe et al., 1996). Le prodomaine de la cathepsine B présente un repliement

32 similaire à celui de la cathepsine L, hormis quelques variations comme une délétion d’environ 30 résidus au niveau de l’extrémité N-term ce qui la rend significativement plus courte. De plus, elle n’est formée que d’une hélice α et d’un feuillet β. Cette différence s’explique par la présence d’une boucle d’occlusion en position ouverte qui occupe la place de la première hélice α. La partie C-term est comparable à celle de la cathepsine L. Elle relie le prosegment au niveau de la Leu1 de la cathepsine B et présente toujours une courte hélice α masquant le site actif. La procathepsine X, dont la structure a été déterminée plus tardivement, se distingue des autres cathepsines B-like par sa prorégion. En effet, elle possède le prodomaine le plus court (38 résidus) et ne présente aucunes structures secondaires. De plus, elle présente une interaction atypique avec le site catalytique puisqu’elle forme une liaison covalente avec la cystéine du site actif sous la forme d’un pont disulfure (Sivaraman et al., 2000).

Figure 1 : Structures tridimensionnelles des procathepsines L et B Les formes matures sont représentées en gris. Le propeptide de la cathepsine L est représenté en orange avec en rouge le motif de ERFNIN et en bleu le motif GNFD. Le prodomaine de la cathepsine B est représenté en cyan, avec en bleu le motif GNFD, la boucle d’occlusion en violet et la longue extrémité C-term en vert. (extrait de Verma et al., 2016)

1.1.2.2 Maturation du zymogène Les cathepsines à cystéine comme de nombreuses protéases sont synthétisées sous forme de préproenzymes inactives. Leur activation nécessite le clivage de la partie N-term correspondant à la prorégion. Cette maturation peut se faire au niveau des lysosomes ou des endosomes tardifs par l’action de différentes protéases comme la pepsine, la cathepsine D, l’élastase de neutrophile humain (HNE) ou encore d’autres protéases à cystéine (Hamon et al., 2016; 33

Nishimura et al., 1989; Rowan et al., 1992). Mais il a également été montré que les cathepsines, compte tenu de leur activité endopeptidasique, pouvaient procéder à une automaturation à pH acide. Cette dernière peut se faire selon deux mécanismes distincts : soit selon un mécanisme intermoléculaire qui correspond à l’hydrolyse de la prorégion par une autre cathepsine active, soit par un mécanisme intramoléculaire qui implique que l’enzyme est capable d’hydrolyser sa propre prorégion. Cette dernière voie est plus difficile à appréhender. En effet, le prodomaine se positionne de façon inversée dans le site actif par rapport à la position naturelle d’un substrat, ce qui lui permet de résister à la protéolyse (Cygler & Mort, 1997). Cette automaturation peut toutefois s’expliquer par le fait qu’un pH acide induit un relâchement de la conformation et des interactions plus faibles entre la prorégion et le site catalytique (McQueney et al., 1997; Ménard et al., 1998; Rozman et al., 1999). La diminution de ces interactions permettrait de rendre accessible le site de clivage du propeptide au niveau du site actif. De plus, plusieurs groupes ont montré que les proenzymes présentaient une très faible activité catalytique (Mason et al., 1987; Rozman et al., 1999). Ces éléments pourraient être suffisants pour initier l’automaturation par un mécanisme intramoléculaire et induire une réaction en chaîne avec l’action d’autres protéases actives. Le processus de maturation peut également être accéléré en présence de molécules chargées négativement comme les glycosaminoglycanes (GAGs) (Ishidoh & Kominami, 1994; Rozman et al., 1999; Vasiljeva et al., 2005). Cependant, l’automaturation est uniquement réservée aux endopeptidases, les exopeptidases comme les cathepsines C et X nécessitent impérativement l’action d’autres protéases pour être activées (Dahl et al., 2001; Hamon et al., 2016; Nägler et al., 1999).

1.1.2.3 Forme mature Les formes matures des cathepsines à cystéine sont monomériques avec une masse entre 22 et 28 kDa (Tableau 1), à l’exception de la cathepsine C qui est une molécule tétramérique avec une masse de 200 kDa (Turk & Guncar, 2003). Leur repliement se fait en deux domaines de taille similaire : le domaine gauche ou L (pour Left) et le domaine droit ou R (pour Right) (Figure 2). Le domaine L est constitué de trois hélices α stabilisées entre elles par des ponts disulfures. La plus longue (30 résidus), appelée l’hélice centrale, porte sur son extrémité N- term la cystéine du site actif. Le domaine R, situé du côté C-term, forme une structure appelée tonneau β (β-barrel). Elle est composée de 5 à 6 feuillets β stabilisés par un seul pont disulfure. L’histidine du site catalytique se trouve sur un des feuillets formant le tonneau β. Ces deux domaines sont séparés en haut par une cavité en forme de V qui abrite les acides aminés de la

34 diade catalytique essentiels à l’activité protéasique des enzymes (McGrath, 1999; Turk et al., 2012). Même si la structure de la forme mature est très similaire pour l’ensemble des cathepsines, les cathepsines B et X possèdent une structure supplémentaire appelée la boucle d’occlusion (Musil et al., 1991; Nägler et al., 1999).

Figure 2 : Structures tridimensionnelles des cathepsines L et B Les hélices alpha sont en cyan, les feuillets beta sont en rouge et les parties non structurées sont en gris. La cystéine du domaine catalytique est représentée en jaune et la boucle d’occlusion de la cathepsine B est représentée en vert. La modélisation a été réalisée sous Jmol (www.jmol.org), à l’aide des structures PDB de la cathepsine L (pdb 2xu3) et de la cathepsine B (pdb 1huc).

1.1.3 Fonctionnement et organisation du site catalytique

1.1.3.1 Mécanisme catalytique Comme leur nom l’indique, les cathepsines à cystéine nécessitent la présence d’une diade composée d’une cystéine, la Cys25, ainsi que de l’His159 (selon la numérotation de la papaïne). A un pH inclus entre 3.5 et 8.0, cette diade se trouve sous sa forme ionique, c'est-à-dire thiolate/imidazolium (Cys-S-/His-ImH+), qui résulte du transfert du proton de la cystéine vers l’histidine. On retrouve également la contribution d’un troisième résidu, l’asparagine 175 (Asn175), qui permet de maintenir l’His159 dans le bon positionnement via une liaison hydrogène (Storer & Ménard, 1994). C’est pour cette raison qu’il est parfois question d’une triade même si seule la Cys25 et l’His159 participent activement à la réaction catalytique. La première étape de l’hydrolyse est l’attaque nucléophile du thiolate sur le groupement carbonyle de la liaison peptidique du substrat (Figure 3A). L’oxygène chargé négativement permet la

35 formation d’un intermédiaire tétraédrique appelé oxyanion stabilisé par la formation de liaison hydrogènes avec la Cys25 et la Gln19 (Figure 3B). Suite à une rotation, l’His159 va céder le proton de son groupement imidazolium au profit de la fonction amine du substrat ce qui conduit à la dissociation de l’oxyanion et au clivage de la liaison peptidique. La partie amine du substrat est stabilisée par une liaison hydrogène avec l’His159 tandis que le partie carboxylique forme une liaison thioester avec la Cys25, formant l’acyl-enzyme (Figure 3C). Cette étape est suivie par l’attaque nucléophile du groupement carbonyl de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau (Figure 3D) qui va conduire à la formation d’un nouvel intermédiaire tétraédrique (Figure 3E). L’étape finale est la déacylation de la liaison thioester qui va conduire à la restauration du groupement carboxyle du substrat hydrolysé ainsi que la libération du groupement thiolate de l’enzyme active (Figure 3F) (Ménard et al., 1991; Otto & Schirmeister, 1997; Rzychon et al., 2004).

Figure 3 : Mécanisme catalytique des protéases à cystéine (extrait de Rzychon et al., 2004)

1.1.3.2 Le site de liaison au substrat Au sein du site actif, les sites d’interaction entre les protéases et leurs substrats sont définis selon la nomenclature de Schechter et Berger (Schechter & Berger, 2012) (Figure 4). Une nomenclature revisitée a été proposée plus tard par Turk et ses collaborateurs (Turk et al., 1998). Cette nomenclature définit le site de liaison au substrat de l’enzyme comme une succession de sous-sites, chacun réagissant avec la chaine latérale d’un résidu du substrat. Ces sous-sites, 36 appelés Sn, sont numérotés à partir du site de clivage, soit S1, S2, S3… en amont du site de clivage (côté N-term), soit S1’, S2’, S3’ en aval (côté C-term). Les résidus du substrat polypeptidique sont notés Pn et sont numérotés selon le même principe. Les structures cristallographiques sur des complexes cathepsines/inhibiteurs analogues de substrat montrent que les substrats se lient le long de la cavité formée par le site actif dans une conformation étendue. Les interactions entre les chaines latérales du substrat et l’enzyme s’alternent entre le domaine L et R de la protéase. Les sites S2, S1 et S1’ présentent un positionnement similaires pour l’ensemble des cathepsines (Turk & Guncar, 2003). Au sein de ces sous-sites, le substrat interagit avec les résidus conservés Gly66, Gln29 et Trp177 de l’enzyme afin d’assurer le positionnement correct dans le site actif.

Figure 4 : Nomenclature de Schechter et Berger

1.1.4 Spécificité enzymatique des cathepsines à cystéine

La spécificité enzymatique dépend des interactions entre les résidus composants les sites S et S’ de l’enzyme et les résidus du substrat (P et P’). La superposition des structures a fourni des informations sur trois sites de liaison bien définis : les sites S2, S1 et S1’. Parmi ces sites, seul le site S2 forme une poche et est un des déterminants majeurs de la spécificité (Turk et al., 1998). Ce dernier regroupe des résidus provenant des domaines R et L. Le caractère de cette poche est généralement hydrophobe avec la présence de résidus aliphatiques et de méthionine, ce qui lui confère une affinité préférentielle pour la phénylalanine et la leucine (Tableau 2). Il existe pourtant quelques variabilités de spécificité pour certaines cathepsines. La cathepsine B possède un acide glutamique en position 205 ce qui lui permet l’hydrolyse de substrat avec une arginine en position P2 (Barrett & Kirschke, 1981). La cathepsine K, grâce à une Tyr en position 67 et une leucine en position 205, accepte des petits résidus hydrophobes comme la proline ou la leucine (Lecaille et al., 2002b, 2007a). Le site S1 se situe entièrement dans le domaine L. En général, S1 accepte de préférence des résidus basiques comme l’arginine ou la lysine, 37 probablement grâce au caractère électrostatique favorable de l’environnement (Brocklehurst et al., 1987; Kirschke et al., 1995). Le site S1’ est composé exclusivement de résidus du domaine R. Ce site montre une spécificité moins marquée puisqu’il a été montré que la cathepsine B acceptait des résidus aromatiques et hydrophobes (Trp, Phe, Leu et Tyr). La cathepsine L préfère des petits résidus hydrophiles neutres (Ser, Ala, Asn, Gln) et la lysine, tandis que la cathepsine S préfère les petits résidus (Ala, Ser) (Ménard et al., 1993).

Tableau 2 : Résidus constituant la poche S2 des cathepsines à cystéine

Position des résidus en S2 Enzymes 67 68 133 157 160 205 Papaïne Tyr Pro Val Val Ala Ser Cathepsine B Tyr Pro Ala Gly Ala Glu Cathepsine L Leu Met Ala Met Gly Ala Cathepsine K Tyr Met Ala Leu Ala Leu Cathepsine S Phe Met Gly Val Gly Phe

A l’inverse le site S2’ aurait une spécificité enzymatique bien définie puisqu’il accepterait des résidus hydrophobes comme le tryptophane. La poche S3 est quant à elle assez mal décrite et ne semble pas avoir de spécificité associée aux résidus qui la composent, ces derniers n’étant pas conservés chez les cathepsines (Turk et al., 1998).

1.1.5 Particularité des exopeptidases

La plupart des cathepsines à cystéine possèdent une activité endopeptidasique, pourtant certaines d’entre elles présentent également une faible activité exopeptidasique. En effet, la cathepsine B est à la fois une endopeptidase et une carboxypeptidase et la cathepsine H est à la fois une endopeptidase et une aminopeptidase. En revanche, les cathepsines C et X sont strictement des exopeptidases (Tableau 2). Les structures cristallographiques révèlent que les exopeptidases possèdent des structures supplémentaires qui limitent l’accessibilité de l’enzyme au substrat. Dans le cas des carboxypeptidases, la fixation du substrat est régie par des boucles qui occupent le site actif au niveau des sites S’. Il s’agit de la boucle d’occlusion pour la cathepsine B (20 résidus) et de la mini-boucle de la cathepsine X (3 résidus). Ces boucles vont utiliser des résidus d’histidine (deux pour la cathepsine B et un pour la cathepsine X) afin d’ancrer l’extrémité C-term du substrat (Nägler et al., 1999). A l’inverse, les cathepsines H et C possèdent dans leurs exodomaines des groupements chargés négativement afin d’ancrer la partie N-term du substrat. Pour la cathepsine H il s’agit d’une mini-chaîne (8 résidus) (Guncar

38 et al., 1998) et pour la cathepsine C d’un domaine d’exclusion (Figure 5) (Korkmaz et al., 2018). Cette dernière est une structure unique chez les cathepsine qui lui permet de s’assembler en tétramère (Turk et al., 2001).

Tableau 3 : Propriétés enzymatiques des cathepsines à cystéine

Exopeptidase Nom Endopeptidase Carboxypeptidase Aminopeptidase Cathepsine L + - - Cathepsine V + - - Cathepsine S + - - Cathepsine K + - - Cathepsine W + n.d. n.d. Cathepsine F + - - Cathepsine O + n.d. n.d. Cathepsine B + dipeptidase - Cathepsine X - monopeptidase - Cathepsine H + + monopeptidase Cathepsine C - - dipeptidase n.d.: non déterminé (D’après Nägler et al., 1999; Small et al., 2011; Turk et al., 2000)

Figure 5 : Caractéristiques structurales des cathepsines à activité exopeptidasique Superposition du domaine catalytique de la cathepsine L (en gris) avec les exodomaine de la cathepsine B (en bleu), C (en rouge), H (en vert) et X (en jaune) (Turk et al., 2012).

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1.1.6 Localisation cellulaire

1.1.6.1 Voie d’adressage vers les lysosomes La grande majorité des cathepsines à cystéine sont synthétisées sous forme de préproenzymes (zymogène) inactives au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Le peptide signal qui leur permet l’adressage vers la lumière du RE est clivé par des « signal peptidases ». Suite à cette étape, les procathepsines correctement repliées vont être transportées à travers l’appareil de Golgi (Figure 6 voie A). Au niveau des différents compartiments du Golgi, les proenzymes vont subir des glycosylations au niveau de leurs résidus Asn. Les proenzymes pourront également être phosphorylées avec l’ajout de mannose-6-phosphate (M6P) par le biais de la N- acétylglucosaminylphosphotransférase et la N-acétylglucosaminidase. Ce motif M6P permet leur transport via des vésicules directement vers les endosomes tardifs/lysosomes grâce au récepteur du M6P (voie B et C) où les cathepsines vont être maturées (décrit précédemment, chapitre 1.1.2.2).

Figure 6 : Voie d’adressage et localisation cellulaire des cathepsines à cystéine (Extrait de Brix et al., 2008)

1.1.6.2 Voies alternatives d’adressage Même si les cathepsines sont majoritairement localisées dans le compartiment endosomal/lysosomal, dans certaines cellules épithéliales comme les thyrocytes ou les kératinocytes, les cathepsines sont redirigée vers des voies d’adressage parallèles. Les formes matures sont adressées depuis le compartiment endosomal/lysosomal vers les membranes basales ou apicales pour être sécrétées dans le milieu extracellulaire (voie D et E) (Linke et al., 40

2002a, 2002b). On peut également retrouver cette voie d’adressage dans des cellules tumorales, où les cathepsines vont être sécrétées et vont participer, dans le milieu péricellulaire, à la dégradation de la matrice extracellulaire et ainsi favoriser la migration tumorale (Rozhin et al., 1994; Schlagenhauff et al., 1992). Une autre voie alternative est observée dans les macrophages ou les fibroblastes en raison d’une absence de récepteur M6P et du peptide signal. De ce fait, les cathepsines sont sécrétées sous la forme de zymogènes directement après la sortie du Golgi (voie F). Elles peuvent ensuite être ré-internalisées par des voies indépendantes du M6P (voie G), maturées au niveau des endosomes tardifs/lysosomes et être finalement à nouveau sécrétées sous forme active (voie H et E). Une localisation inhabituelle peut être retrouvée dans le cas d’épissage alternatif des cathepsines conduisant à des variants ne possédants pas de peptide signal. Dans ces cas de figure, les cathepsines tronquées vont être adressées vers le noyau (voie K) (Goulet et al., 2004) ou les mitochondries (voie L) (Müntener et al., 2004). Ces localisations inhabituelles leurs permettraient d’exercer un rôle dans des mécanismes tels que l’initiation de l’apoptose ou encore la régulation du cycle cellulaire. Il a par exemple été montré qu’un variant de la cathepsine L dépourvu de peptide signal, localisé au niveau du noyau, était capable d’activer le facteur de transcription CDP/Cux et ainsi favoriser le passage en phase S du cycle cellulaire (Goulet et al., 2004). De plus, dans certaines conditions pathologiques on peut observer une « fuite lysosomale » conduisant au relargage des cathepsines dans le cytosol où elles pourraient participer à l’initiation de l’apoptose (voie M) (Stoka et al., 2007).

1.1.6.3 Les lysosomes sécrétoires La plupart des cellules stockent leurs produits de sécrétion dans des granules de sécrétion spécialisées qui peuvent fusionner avec la membrane plasmique et libérer leur contenu dans le milieu extracellulaire. A l’inverse, les cellules sont capables d’internaliser des protéines, peptides ou lipides par des mécanismes d’endocytose. Les endocytes vont ensuite fusionner avec les lysosomes où les molécules vont être dégradées. Cependant, certaines cellules possèdent en plus de leurs lysosomes conventionnels, des lysosomes modifiés capables d’agir comme des granules de sécrétions. Ces organelles se nomment les « lysosomes sécrétoires » (Blott & Griffiths, 2002). Seulement certains types cellulaires possèdent ces lysosomes. Parmi elles on retrouve des cellules du système immunitaire comme les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules NK ou les cellules cytotoxiques. Mais on les retrouve également dans les mélanocytes, les cellules de muscle lisse ou les ostéoclastes. Ainsi, les cellules NK et les mastocytes sont capables de sécréter la cathepsine C (Wolters et al., 1998). Les macrophages quant à eux vont relarguer les cathepsines B, K, L et S (Reddy et al., 1995b). Enfin les cellules 41 de muscle lisse sont capables de libérer de la cathepsine S après simulation avec l’interféron-γ (IFN- γ) (Shi et al., 1999).

1.2 Régulation des cathepsines à cystéine

La demi-vie des cathepsines à cystéine peut varier de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des cathepsines concernées et de son environnement cellulaire (Katunuma, 2010; Nissler et al., 1999). En plus de leur régulation au niveau transcriptionnelle, les cathepsines peuvent être régulées par le pH, la température, les GAGs et leurs inhibiteurs endogènes (Korkmaz et al., 2018) (Figure 7).

Figure 7 : Différents mécanismes de régulation des cathepsines à cystéine (D'après Korkmaz et al., 2018)

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1.2.1 Régulation transcriptionnelle

Il existe de nombreux mécanismes conduisant à une surexpression des cathepsines, incluant une activation transcriptionnelle via le facteur de transcription EB impliqué dans la biogénèse des lysosomes (TFEB pour Transcription Factor EB) (Settembre et al., 2011) ou les voies de signalisation STAT (Kreuzaler et al., 2011; Yan et al., 2016). On peut également citer des facteurs de transcription comme AP-1, AP-2, AP-3 (activator protein), IRF-1 (IFN regulator factor), Sp1, Sp3 (Specificity protein) ou ETS-1 (E-twenty-six) (Jean et al., 2002; Lecaille et al., 2008; Troen et al., 1991; Yan et al., 2000). L’action de certaines cytokines peut également être responsable de la surexpression de ces enzymes. Par exemple, il a été montré que les cytokines pro-inflammatoires IL-1α et TNF α augmentaient l’expression et la sécrétion de la cathepsine S mature dans les chondrocytes humains, impliquant une forte dégradation du cartilage (Caglič et al., 2013). L’IFN- γ stimule l’expression des cathepsines B, K et L dans les macrophages et de la cathepsine S dans les kératinocytes (Li & Bever, 1996; Schwarz et al., 2002; Storm van’s Gravesande et al., 2002). Un autre exemple est la régulation de l’expression de la cathepsine K dans les ostéoclastes par le voie RANK/RANKL (receptor activator of NK- κB/ RANK ligand) (Troen, 2006). A l’inverse, l’expression de la cathepsine S par les macrophages est inhibée par l’IL-10 conduisant à la diminution de la présentation antigénique de ces cellules (Chan et al., 2010).

1.2.2 Régulation par le pH et la force ionique

Pendant longtemps, l’inactivation induite par le pH a été considérée comme le facteur majeur de régulation de l’activité protéolytique de ces enzymes. En effet, les cathepsines à cystéine ont une activité optimale à pH faiblement acide, correspondant au pH des compartiments endosomaux et lysosomaux (pH 4-6) et sont rapidement inactivées en condition neutre ou alcaline (Barrett & Kirschke, 1981; Turk et al., 1993, 1994). La perte irréversible d’activité s’explique par d’importants changements de structure, en particulier pour les hélices α (Dufour et al., 1988; Turk et al., 1994). Parmi les cathepsines, la cathepsine L est la plus instable. A l’inverse, la cathepsine S est plutôt insensible à l’inactivation à pH neutre et reste active après une heure d’incubation à pH 7,4 (Kirschke et al., 1989). Cependant, des cathepsines actives ont été montré dans le milieu extracellulaire. Ces données ont permis de mettre en évidence d’autres mécanismes moléculaires permettant de réguler et stabiliser les cathepsines comme la force ionique. En effet, dans un milieu mimant la force ionique extracellulaire appelé solution saline de Hank (Hank’s balanced salt solution ou HBSS), les cathepsines B et L conservent leur

43 activité malgré un pH légèrement basique (pH 7,4) (Dehrmann et al., 1995, 1996). Cependant, ce phénomène est observé uniquement lorsque les enzymes sont sous leur forme active. En effet, les cathepsines inactives incubées dans le milieu extracellulaire perdent rapidement leur conformation native. Il a donc été proposé que la paire ionique thiolate/imidazolium du site actif puisse contribuer à cette stabilité. Un autre mécanisme permet d’expliquer la stabilité des ces protéases dans le milieu extracellulaire : l’acidification du milieu par certains types cellulaires. Les macrophages sont capables in vitro d’acidifier l’environnement péricellulaire grâce à l’action de vacuoles de type H+-ATPase. Ces vacuoles pompent les protons du cytoplasme vers l’extérieur de la cellule ce qui permet aux cathepsines K, L et S sécrétées de maintenir leur activité et de dégrader l’’élastine (Punturieri et al., 2000). Le même processus est observé pour la cathepsine K sécrétée par les ostéoclates (Lecaille et al., 2008). De même, dans certaines cellules tumorales, la présence de canaux sodiques voltage dépendants (Na(V)) augmente le caractère invasif du cancer en acidifiant le milieu péricellulaire et de ce fait, en favorisant l’activité des cathepsines (Gillet et al., 2009).

1.2.3 Régulation par la prorégion

La prorégion est responsable du bon repliement, de l’adressage et de la stabilité des cathepsines. Mais il s’agit également d’un inhibiteur sélectif et compétitif puissant de l’enzyme apparentée. Le premier exemple a été observé avec un propeptide synthétique de la cathepsine B qui inhibe cette dernière à pH 6,0 avec un Ki = 0,4 nM tandis que l’inhibition à pH 4,0 était bien plus faible

(Ki = 64 nM) (Fox et al., 1992). Ces données appuie l’hypothèse suggérant que lors de l’activation à pH acide, le propeptide se dissocie de l’enzyme facilitant son activation (Rozman et al., 1999)(Chapitre 1.1.2.2). Par la suite, des résultats similaires ont été montrés avec la prorégion recombinante de la cathepsine L inhibant cette dernière avec un Ki = 0,088 nM. Ce propeptide inhibe également la cathepsine S mais plus faiblement (Ki = 44,6 nM), tandis qu’aucune inhibition pour la cathepsine B et la papaïne n’est observée. Ces observations ont permis de mettre en évidence une sélectivité de ces propeptides pour leur enzyme parentale (Carmona et al., 1996) et d’ouvrir le champs des possibles dans le design d’inhibiteurs des cathepsines à cystéine (Chowdhury et al., 2002). Des études ont toutefois montré que cette sélectivité reste imparfaite puisque dans le cas de la prorégion de la cathepsine K, on observe que cette dernière inhibe les cathepsines K, L et S avec des Ki de l’ordre du nanomolaire (Ki =

0,27 nM ; Ki = 0,12 nM et Ki = 65 nM respectivement) (Guay et al., 2000). De plus, la stabilité de ces propeptides est limitée puisqu’il a, par exemple, été montré que celui de la cathepsine S

44 est rapidement dégradé par la cathepsine L (Maubach et al., 1997). Ainsi, la prorégion libérée suite à la maturation du zymogène est probablement dégradée, induisant une perte de sa capacité inhibitrice. Les études citées précédemment étant réalisées in vitro à partir de propeptides isolés, elles ne reflètent donc pas nécessairement la situation in vivo.

1.2.4 Régulation par les glycosaminoglycanes

Les glycosaminoglycanes (GAGs) sont des hétéropolysaccharides composés d’unités disaccharidiques répétées, fortement chargés négativement, en raison du grand nombre de groupements carboxyles et sulfates présents dans ces molécules. La plupart des GAGs sont sulfatés comme le chondroïtine sulfate (CS), le kératane sulfate (KS), le dermatane sulfate (DS), l’héparane sulfate (HS) et l’héparine. A l’inverse l’acide hyaluronique (HA) est non sulfaté. De leur côté, les cathepsines possèdent un point isoélectrique (pI) variant entre 4,8 et 9,8 (Tableau 1). Ainsi à leur pH optimal d’activité (pH 4-6), les cathepsines K, S et V sont chargées positivement tandis que les cathepsines B et L sont neutres ou chargées négativement. Les GAGs chargés négativement peuvent interagir avec les cathepsines chargées négativement permettant ainsi de réguler leur stabilité et leur activité (pour revue : (Novinec et al., 2014; Tersariol et al., 2002; Turk et al., 2012)). La régulation des cathepsines par les GAGs a été décrite pour la première fois pour la cathepsine L (Ishidoh & Kominami, 1995; Mason & Massey, 1992). Dans ces travaux, il a été montré que les GAG accéléraient significativement la maturation de la procathepsine L y compris à un pH proche de la neutralité. Ces résultats ont été confirmés pour d’autres cathepsines comme la cathepsine B et S (Caglic et al., 2007; Vasiljeva et al., 2005). La fixation des GAGs semble favoriser la conformation relâchée du zymogène qui permet l’activation des cathepsines à pH acide mais également à pH neutre (Caglic et al., 2007). Cependant, les GAGs peuvent présenter une régulation inverse pour des doses fortes, proches de celles observées en conditions pathologiques comme pour les mucopolysaccharidoses ou l’ostéoporose. En effet, des concentrations fortes en chondroïtine 4- sulfate bloque significativement la maturation de la cathepsine S in vitro ainsi que son activité collagénolytique (Sage et al., 2013).

Les GAGs peuvent également moduler l’activité des cathepsines matures comme pour les cathepsines B, K et S. Par exemple, la présence d’héparane sulfate et d’héparine permet à la cathepsine B d’augmenter sa stabilité et son activité à pH 7,4, en conservant sa structure secondaire dans conditions proche de la neutralité (Almeida et al., 2001). L’effet stabilisateur

45 de l’héparine à pH 7,4 est également retrouvé pour la cathepsine K avec un temps de demi-vie 5 fois plus long (Novinec et al., 2010). De plus, la formation d’un complexe entre la cathepsine K et le C4-S semble nécessaire à son activité collagénolytique (Li et al., 2002). A l’inverse, des interactions avec l’héparane sulfate et l’héparine inhibent cette activité (Li et al., 2004). Enfin, contrairement à l’effet activateur observé pour la cathepsine K, le C4-S inhibe l’activité collagénolytique de la cathepsine S (Sage et al., 2013).

1.2.5 Inhibiteurs endogènes spécifiques : la famille des Cystatines

La famille des cystatines (Famille I25, clan IH) constitue la plus grande famille des inhibiteurs naturels des cathepsines à cystéine (Tableau 4). Il s’agit d’inhibiteurs compétitifs et réversibles possédant de grandes similarités structurales. Sur la base de leur homologie de séquence, cette famille est divisée en trois groupes : les stéfines (sous-famille I), les cystatines (sous-famille II) et les kininogènes (sous-famille III) (Barrett, 1986; Otto & Schirmeister, 1997; Rawlings et al., 2014).

1.2.5.1 Les stéfines Les stéfines sont des protéines nonglycosylées d’environ 11 kDa (100 résidus), constituées d’une seule chaine, ne possédant ni peptide signal, ni pont disulfure. Elles sont principalement intracellulaires (Turk & Bode, 1991) mais peuvent également être détectées en faible quantité dans les fluides biologiques (Abrahamson et al., 1986). On retrouve deux représentantes de cette famille chez l’Homme : les stéfines A et B (aussi appelées cystatines A et B). La stéfine A est exprimée au niveau des cellules épithéliales de la peau où elle semble y jouer un rôle de défense contre l’activité excessive des cathepsines à cystéine. La stéfine B est quant à elle distribuée dans de nombreux tissus, essentiellement au niveau cytoplasmique, où elle aurait un rôle protecteur contre les « fuites lysosomales » des cathepsines (Abrahamson et al., 2003). Il existe une cystéine libre dans la séquence de la stéfine B qui peut former un pont disulfure intermoléculaire avec une autre stéfine B adjacente. Cette liaison conduit à la formation d’un dimère inactif facilement réversible en monomère actif dans des conditions réductrices (Lenarcic et al., 1996; Rawlings & Barrett, 1990).

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1.2.5.2 Les cystatines Les cystatines sont des protéines de 13-14 kDa qui correspondent à une séquence de 120-122 acides aminés avec deux ponts disulfures au niveau de leur extrémité N-term. Elles sont synthétisées sous la forme de proprotéine avec un peptide signal (20 résidus), ce qui suggère leur activité extracellulaire. En effet, ce propeptide permet le transport des protéines matures jusqu’à la membrane vers le milieu extracellulaire. Certains membres de cette famille sont glycosylés (F, E/M et S). Les différents membres retrouvés chez l’Homme sont : les cystatines C, D, E/M, F, S, SA et SN. La cystatine E/M a été découverte par deux groupes simultanément ce qui explique les deux lettres de son nom (Sotiropoulou et al. (1997) qui l’ont nommé cystatine M et Ni et al. (1997) qui l’ont nommé cystatine E). Des homologues ont été trouvés chez les mammifères et les oiseaux (Fossum & Whitaker, 1968).

Tableau 4 : Valeurs des constantes d’inhibition (Ki) des cathepsines à cystéine par la superfamille des cystatines Cystatines Ki (nM) Papaïne Cathepsine B Cathepsine H Cathepsine L Cathepsine S A (Stéfine A) 0,019a 8,2a 0,31a 1,3a 0,05a B (Stéfine B) 0,12a 73a 0,58a 0,23a 0,07a C 0,000011b 0,25a 0,28a < 0,005a 0,008a D 1,2a > 1000a 8,5a 25a 0,24a E /M 0,39c 32c n.d. n.d. n.d. F 1,1d > 1000d 15f 0,31d 140f S 108a n.d. n.d. n.d. n.d. SA 0,32a n.d. n.d. n.d. n.d. SN 0,016a 19a n.d. n.d. n.d. H-kininogènes 0,02e 400g 1,1g 0,109g n.d. L-kininogènes 0,015a 600a 0,72a 0,017a n.d. n.d. : non déterminé ; a : Abrahamson, 1994 ; b : Lindahl et al., 1992 ; c : Ni et al., 1997 ; d : Ni et al., 1998 ; e : Müller-Esterl et al., 1985 ; f : Magister et al., 2012 ; g : Barrett, 1986

Les cystatines S, SA et SN (les cystatines de type S) possèdent une forte homologie de séquence (90%). L’expression de celles-ci est très restreinte puisqu’on ne retrouve la cystatine SN que dans la salive et dans les larmes, alors que les cystatines S et SA sont retrouvées uniquement dans les liquides séminaux (Isemura et al., 1991). La cystatine D est également retrouvée majoritairement au niveau des larmes et de la salive. La cystatine E/M est retrouvée dans de nombreux tissus, spécialement au niveau des épithéliums (Ni et al., 1997) tandis que la cystatine F aussi appelée leucocystatine est exprimée majoritairement au niveau des leucocytes et de la rate. Un screening des différentes cellules sanguines a révélé la présence de la cystatine F dans des cellules de l’immunité telles que les cellules dendritiques, les NK ou les lymphocytes T 47 cytotoxiques (Halfon et al., 1998). La cystatine C est largement distribuée dans la plupart des liquides physiologiques. La plus grande quantité a été retrouvée dans le fluide spinal, où elle représente plus de 90% de la concentration molaire en inhibiteur des protéases à cystéine, et dans le plasma séminal (Abrahamson et al., 1986; Grubb, 2000). Sa large distribution et son fort potentiel inhibiteur (Tableau 4) fait de cette protéine un des inhibiteur majeur des cathepsines à cystéine.

1.2.5.3 Les kininogènes Les kininogènes sont des glycoprotéines multidomaines et multifonctionnelles, qui sont divisées chez l’Homme en deux types : les kininogènes de haut poids moléculaire (HMWK pour High Molecular Weight Kininogen) avec une masse d’environ 120 kDa et de faible poids moléculaire (LMWK pour Low Molecular Weight Kininogen) avec une masse d’environ 68 kDa (Lalmanach et al., 2010). Il existe un troisième type présent chez le rat uniquement : le T- kininogène (ou thiostatine) (Esnard & Gauthier, 1983). Ils sont synthétisés au niveau du foie sous forme de proprotéines contenant un peptide signal de 18 acides aminés. Les HMWK et LMWK sont des précurseurs d’hormones peptidiques, les kinines, libérées à partir des kininogènes sous l’action des kallicréines tissulaires ou plasmatiques (Lalmanach et al., 2010). Ces hormones sont vaso-actives et sont des acteurs majeurs dans la cascade de coagulation. La plus forte concentration de kininogènes est retrouvée au niveau du plasma sanguin et du liquide synovial (Abrahamson et al., 1986), mais on les retrouve également dans le foie et les neutrophiles (Figueroa et al., 1992; Hermann et al., 1996; Stuardo et al., 2004). Les kininogènes sont constitués d’une chaine lourde située du côté N-term et d’une chaine légère située du côté C-term. Ces deux chaines sont liées par un pont disulfure et sont située de part et d’autre du domaine de la bradykinine (BK) (Figure 8). La chaine lourde des HMWK et des LMWK possède une séquence peptidique identique tandis que la chaine légère des HMWK est plus longue que celle des LMWK. La chaine lourde des HMWK et des LMWK est constituée de trois domaines répétés en tandem de type « cystatin-like » (domaine D1, D2 et D3) contenant 8 ponts disulfures. Seuls les domaines D2et D3 sont capables d’inhiber les cathepsines à cystéine, alors que le domaine D1 serait, quant à lui, impliqué dans le transport du calcium (Salvesen et al., 1986). La chaine lourde contient également un quatrième domaine (D4) correspondant au domaine de la BK. La chaine légère est constituée, dans le cas des LMWK d’un seul domaine (D5) et de deux domaines (D5 et D6) pour les HMWK (Kitamura et al., 1985). Contrairement au domaine D5, dont le rôle n’est pas encore clairement établi, on sait que le domaine D6

48 possède des sites de liaison pour la pré-kallicréine et pour le facteur XI et donc intervient dans la coagulation (Müller-Esterl, 1987). Les kininogènes sont des inhibiteurs puissants des cathepsines à cystéine, à l’exception de la cathepsine B, dont la boucle d’occlusion limite l’accès du site actif à l’inhibiteur (Tableau 4) (Naudin et al., 2010).

Figure 8 : Structure schématique des kininogènes humains D2 et D3 : domaines inhibiteurs des cathepsines à cystéine (en bleu) ; BK : domaine de la bradykinine (en jaune).

1.2.5.4 Mécanisme d’inhibition Les cystatines ont un mode d’inhibition compétitif réversible, formant un complexe

équimolaire entre l’inhibiteur et l’enzyme, avec des valeurs de Ki allant du picomolaire au nanomolaire (Abrahamson et al., 2003) (Tableau 4). La seule exception est pour les kininogènes qui, en raison de la présence de deux domaines inhibiteurs (D2 et D3) sur leur chaîne lourde, sont capables d’inhiber deux enzymes simultanément (Higashiyama et al., 1986). De nombreuses études ont permis d’élucider le mécanisme d’inhibition par les cystatines (Abrahamson, 1988; Abrahamson et al., 1987; Bode et al., 1988; Hall et al., 1995; Machleidt et al., 1989; Mason et al., 1998; Stubbs et al., 1990). L’interaction enzyme-cystatine ne résulte pas d’une réaction avec la cystéine du site catalytique. Elle relève de contacts hydrophobes entre la cystatine et les sites de fixation de l’enzyme, bloquant ainsi l’accès au substrat. La structure 3D de la cystatine de poulet a permis d’identifier trois structures contenant des acides aminés hautement conservés (Figure 9). La première région, dite « substrat-like », est située au niveau de l’extrémité N-term et contient pour la cystatine C trois résidus LVG dont la glycine est invariante (Tableau 5). Cette région occupe les sous-sites S3, S2 et S1 de l’enzyme. Elle est essentielle à l’inhibition puisque la cystatine C tronquée de sa partie N-term montre une diminution significative de son potentiel inhibiteur (Machleidt et al., 1989). La seconde région présente une séquence de type QxVxG hautement conservée et positionnée au niveau de la boucle 1. Cette région interagit avec le sous-site S1’ et permet la stabilisation du complexe enzyme-cystatine (Bode et al., 1990; Stubbs et al., 1990). La troisième région contient une paire 49

Pro-Trp qui se situe au niveau de l’extrémité C-term et interagit avec la poche S2’ de l’enzyme. Cependant, ces deux résidus sont absents chez les stéfines et dans le domaine D2 des kininogènes ce qui n’influe pourtant pas sur leur potentiel inhibiteur.

Figure 9 : Structure tridimensionnelle de la cystatine C de poulet et du complexe stéfine B-papaïne La stéfine B est représentée en cyan et la papaïne en violet. Les boucles 1 et 2 sont représentées en rouge et la glycine conservée est indiquée en jaune (extrait de Pogorzelska et al., 2018).

Tableau 5 : Acides aminés impliqués dans l’inhibition des cystatines humaines

Cystatines N-term Boucle 1 Boucle 2 A MIPGG QVVAG B AcMMCGA QVVAG C RLVGG QIVAG VPWQ D TLAGG QIVAG VPWE E/M RMVGE QLVAG VPWQ F VKPGF QIVKG VPWL S IIPGG QTFGG VPWE SA IIEGG QIVGG VPWE SN IIPGG QTVGG VPWE H-kininogènes D2 DCLGC QVVAG DIQL D3 ICVGC QVVAG VPWE L-kininogènes D2 DCLGC QVVAG DIQL D3 ICVGC QVVAG VPWE (D'après Grzonka et al., 2001)

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1.2.6 Inhibiteurs endogènes non spécifiques

1.2.6.1 α-2 macroglobuline L’α-2 macroglobuline est une glycoprotéine synthétisée dans le foie et retrouvée circulante dans le sang ou les liquides interstitiels. Elle est constituée de quatre sous-unités identiques de 185 kDa chacune (Hudson & Koo, 1982). Elle inhibe de façon irréversible et non spécifique les protéases des différentes classes, dont les cathepsines à cystéine en les piégeant dans sa structure tétramérique (Barrett & Starkey, 1973). La formation du complexe inhibiteur-enzyme va induire un changement de conformation de l’α-2 macroglobuline qui lui permet d’interagir avec des récepteurs présents à la surface des macrophages. Cette interaction permet ensuite d’éliminer le complexe par la voie de l’endocytose (Kaplan & Nielsen, 1979)

1.2.6.2 Les thyropines La découverte d’un fragment p41 dérivé de la chaîne invariante Ii du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH II) capable d’inhibiber la cathepsine L a permis de mettre en évidence l’existence d’une nouvelle famille d’inhibiteurs (Bevec et al., 1996, 1997; Ogrinc et al., 1993). Ceci a été confirmé par la découverte d’une nouvelle protéine, l’équistatine, chez l’anémone de mer ou la saxiphiline, chez la grenouille, capables d’inhiber la papaïne et les cathepsines B, L et S (Lenarcic et al., 1997; Stoka et al., 1999; Strukelj et al., 2000) mais également la cathepsine D (Lenarcic & Turk, 1999). Les séquences protéiques du fragment p41 et de l’équistatine ne montrent pas d’homologie avec la cystatine. En revanche, elles présentent une forte homologie avec les domaines de type 1 de la thyroglobuline (Molina et al., 1996). Pour cette raison, le nom de thyropine a été proposé pour thyroglobulin type-1 domaine proteinase inhibitors. Ce domaine, riche en cystéines, est responsable, pour certains des membres de cette famille, de l’inhibition des protéases à cystéine mais également des protéases acides ou des métalloprotéases (Molina et al., 1996).

1.2.6.3 Les serpines Certaines serpines (pour serine proteinase inhibitors), des inhibiteurs des protéases à sérine, sont également capables d’inhiber des cathepsines à cystéine (Turk et al., 2002a). La protéine SCCA1 (pour Squamous Cell Carcinoma Antigen-1) est par exemple un inhibiteur puissant des cathepsine K, L et S (Schick et al., 1998) tandis que l’hurpine et la serpine endopine 2C inhibent sélectivement la cathepsine L (Bylaite et al., 2006; Hwang et al., 2006; Welss et al., 2003).

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1.2.7 Inhibiteurs synthétiques

La plupart des inhibiteurs exogènes sont dérivés de molécules isolées chez des organismes divers ou des petits composés synthétiques. Parmi ces structures, la majorité possède une fonction électrophile qui leur permet la réaction avec la cystéine du site actif sous sa forme thiolate. Elles sont également composées d’une partie peptidique permettant la reconnaissance entre l’enzyme et l’inhibiteur. Les inhibiteurs se divisent en deux groupes en fonction de leur mécanisme d’inhibition : les inhibiteurs réversibles et irréversibles. Pour les inhibiteurs réversibles, on peut citer les dérivés d’aldéhydes ou de nitriles. Dans le cas des inhibiteurs irréversibles, on retrouve les dérivées époxy, de vinyl sulfone ou encore les diazométhyl cétone. A l’origine ces inhibiteurs étaient développés pour une permettre une meilleure compréhension des mécanismes de l’activité protéolytique. Aujourd’hui, le design de ces inhibiteurs vise également au développement de molécules à activité thérapeutique.

1.2.7.1 Inhibiteurs réversibles

1.2.7.1.1 Aldéhydes Les aldéhydes peptidiques sont des inhibiteurs réversibles, bien qu’ils forment une liaison covalente avec l’enzyme, en formant un hémithioacétal tétraédrique. Les premiers inhibiteurs peptidiques ont été isolés pour la première fois à partir de cultures de souches de Streptomyces. Les leupeptines, les chymostatines, l’antipaïne, l’élastinale ou la β-MAPI ont par exemple été découvert chez ces bactéries. Ces molécules inhibent les cathepsines à cystéine mais également les protéases à sérine (Frommer et al., 1979; McConnell et al., 1993; Schultz et al., 1989). Cependant, la modulation des résidus en P1 et P2 de la partie peptidique a permis d’améliorer la sélectivité et l’affinité de ces inhibiteurs. Par exemple, l’introduction d’une lysine acétylée en P2 augmente considérablement la sélectivité pour la cathepsine S avec une inhibition de l’ordre du nanomolaire comparé à celle observée pour la cathepsine B et L qui est de l’ordre du micromolaire (Katunuma et al., 1999; Saegusa et al., 2002).

1.2.7.1.2 Nitriles L’inhibition des cathepsines à cystéine par les nitriles se produit grâce à la formation d’un intermédiaire thioimidate réversible (Figure 10). Il existe des dérivées peptidiques et non peptidiques des nitriles. Des cyanamides dipeptidiques ciblant la cathepsine B ont montré des valeurs d’IC50 de l’ordre du nanomolaire alors que les cathepsines L et S nécessitent une

52 concentration 100 fois plus importante pour obtenir une inhibition comparable (Greenspan et al., 2001). Des dérivés non peptidiques de nitriles utilisant des cycles pyrrolidine ou azétidine se sont également révélés être d’excellents inhibiteurs des protéases à cystéine (Falgueyret et al., 2001). Ce groupement ne cesse d’inspirer les chercheurs puisque des inhibiteurs nitriles dipeptidiques ont été détournés afin de développer des sondes d’activité (ABP pour Activity Based Probe) en y fixant un groupement fluorophore (Frizler et al., 2012).

Figure 10 : Mécanisme d’inhibition des protéases à cystéine par les peptidyl nitriles (D'après Otto & Schirmeister, 1997)

1.2.7.2 Inhibiteurs irréversibles

1.2.7.2.1 Halométhyl cétones Les peptidyl chlorométhyl cétones sont parmi les premiers inhibiteurs irréversibles à avoir été développés pour les cathepsines à cystéine et les protéases à sérine (Drenth et al., 1976; Schoellmann & Shaw, 1963). Par la suite, de nombreux composés dérivés de la fonction chlorométhyl cétone ont été synthétisés (Shaw, 1990). Ces inhibiteurs alkylent le site actif des cathepsines de manière irréversible par la formation d’une liaison thioether (Figure 11). Il existe pour cela deux mécanismes possibles : (A) L’anion du thiolate peut régir directement avec le carbone du groupement chlorométhyl par substitution nucléophile ; ou (B) Le thiolate attaque le carbone du groupement carbonyl, formant ainsi un intermédiaire tétraédrique pour finalement aboutir au produit final. Malheureusement, en raison de leur forte réactivité, ils inhibent également les protéases à sérine. Ils sont également capables de réagir avec des molécules contenant des groupements thiols comme le glutathion ou des enzymes non protéolytiques (Shaw, 1990). Pour ces raisons, il est inenvisageable de les utiliser in vivo du fait de leur forte toxicité. Pour améliorer leur sélectivité l’atome de chlore a été remplacé par un atome de fluor moins réactif. Cette substitution a permis de réduire considérablement la réactivité des inhibiteurs avec le glutathion et d’obtenir une sélectivité satisfaisante entre les différentes cathepsines (Harth et al., 1993; Shaw, 1990).

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Figure 11 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par des peptidyl halométhyl cétones (D'après Otto & Schirmeister, 1997)

1.2.7.2.2 Diazométhyl cétones Le développement des diazométhyl cétones a débuté grâce à l’observation de l’azasérine (Buchanan, 1973). Il avait été montré que cet antibiotique inhibait la croissance cellulaire par l’alkylation des groupements thiols des amidotransférases, impliquées dans la synthèse des purines. De plus, aucune inhibition vis-à-vis des protéases à sérine n’était observée pour ces molécules (Shaw, 1984). Ainsi, les diazométhyl cétones ont rapidement été considérés comme d’excellents candidats pour des inhibiteurs sélectifs des protéases à cystéine. L’inactivation des protéases à cystéine se fait selon le mécanisme suivant (Figure 12) : la fonction thiolate va attaquer le carbone du carbonyl et former un hémithioacétal. Le carbone du diazométhane va être protoné par la fonction imidazolium de l’histidine ce qui va conduire à un réarrangement et à la formation du thioether après la libération du nitrogène. Le premier inhibiteur de cette famille, Z-Phe-CHN2, a montré une bonne inhibition pour la papaïne et aucune réaction avec des petites molécules contenant des thiols comme le mercaptoéthanol ou le DTT (Leary et al., 1977). Par la suite, des inhibiteurs de type peptidyl diazométhyl cétones mimant la séquence « substrat-like » de la cystatine C ont été développés (Z-LVG-CHN2). Ces derniers inhibent irréversiblement la papaïne et les cathepsines mais n’influent pas sur l’activité des protéases à sérine, acides ou les métalloprotéases (Grubb, 2000). Ces inhibiteurs ont également servis de squelette pour le développement d’ABP permettant de détecter et visualiser

54 les cathepsines actives, en couplant ces inhibiteurs avec de la biotine (Garenne et al., 2015; Lalmanach et al., 1996).

Figure 12 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par des diazométhyl cétones (D'après Otto & Schirmeister, 1997)

1.2.7.2.3 Epoxysuccinates En 1978, Hanada et al. réussissent avec succès à isoler et caractériser un nouvel inhibiteur puissant et irréversible de la papaïne à partir de culture du champignon Aspergillus japonicus. Cette molécule a été nommée 1-[[N-(L-3-trans-carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]amino]-4- guanidinobutane ou plus communément E-64. Il va alkyler la cystéine du site actif par une attaque nucléophile du thiolate au niveau du carbone C-3 de l’époxy (Figure 13).

Figure 13 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par les dérivés epoxysuccinyl (D'après Otto & Schirmeister, 1997)

L’époxy interagit avec le sous-site S1 et la leucine en AA1 (Tableau 6) avec le sous-site S2. Cette inactivation se fait de manière dose-dépendante selon un ratio enzyme : inhibiteur 1 : 1, ce qui lui permet d’être utilisé comme agent titrant (Barrett et al., 1982). De nombreux inhibiteurs ont été synthétisé à partir du E-64 en modulant les différents groupements afin d’améliorer sa sélectivité (Tableau 6). On retrouve, par exemple, le CA074 et le CA030 qui sont des inhibiteurs spécifiques de la cathepsine B (Sumiya et al., 1992). Les inhibiteurs CLIK

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(pour Inhibitors Katunuma) inhibent, quant à eux, la cathepsine L (Katunuma et al., 1999; Tsuge et al., 1999). L’inconvénient majeur de ces inhibiteurs reste cependant leur toxicité in vivo.

Tableau 6 : Principales dérivés d’epoxysuccinate

Dérivés X1 AA1 AA2 X2 E-64 HO Leu - Agm

E-64a HO Leu - NH(CH2)4NH2

E-64c (Ep-475) HO Leu - NH(CH2)2CH(CH3)2

E-64d (EST, loxistatine) EtO Leu - NH(CH2)2CH(CH3)2

Circinamide HO Leu - N((CH2)4NH2)2

Cathestatine C HO Tyr - NH(CH2)5NH2 CA028 HO Ile Pro OH CA030 EtO Ile Pro OH CA074 nPr-NH Ile Pro OH

CLIK 148 2-(2-pyridyl)- Phe - N(CH3)2 ethyl-NH Agm = agmatine (1-amino-4-guanidinobutane) (D’après Powers et al., 2002)

1.2.7.2.4 Vinyls Sulfones et autres accepteurs de Michael Les peptides ou les acides aminés contenant des accepteurs de Michael sont des inhibiteurs spécifiques et irréversibles des protéases à cystéine. On retrouve parmi ces molécules les vinyl sulfones et dérivés carbonyl α,β-insaturés. Le mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par les vinyl sulfones, les dérivés d’ester ou de carbonyls α,β-insaturés se fait par une addition de Michael. La cystéine du site catalytique sous sa forme thiolate va attaquer le carbone en β, suivi par la protonation du carbone en α par l’histidine qui permet de former un dérivé thioéther (Hanzlik & Thompson, 1984) (Figure 14). Hanzlik et ses collaborateurs furent les premiers à développer des séries d’inhibiteurs dérivés d’acides aminés contenant des accepteurs de Michael. En effet, ils ont montré que des vinyl sulfones et des carbonyls α,β-insaturés dérivés de phénylalanine inhibaient la papaïne et la cathepsine C (Hanzlik & Thompson, 1984; Thompson et al., 1986). Par la suite, Palmer et ses collaborateurs ont développés une séries de puissants inhibiteurs dérivés de vinyl sulfones dirigés contre les cathepsines B, K, L et S (Palmer et al., 1995). Ces inhibiteurs sont très prometteurs car ils sont stables et non réactifs

56 vis-à-vis des autres molécules contenant des thiols, puisqu’ils ont besoin de la machinerie catalytique des protéases à cystéine pour être actifs. De plus, les vinyl sulfones interagissent avec l’enzyme de part et d’autre du site actif. Cela permet une grande modulation des résidus en P et P’ dans le but d’améliorer la sélectivité. Pour toutes ces raisons, et parce qu’ils présentent une faible toxicité in vivo, il s’agit de candidats prometteurs pour le traitement de certaines pathologies comme les infections à T. cruzi ou la maladie de Chagas (Engel et al., 1999).

Figure 14 : Mécanisme d’inactivation des protéases à cystéine par les vinyl sulfones et les dérivés d’ester α,β-insaturés Vinyl sulfones : R’ = SO2R’’ Dérivés d’ester α,β-insaturés : R’ = CO2R’’ (D’après Powers et al., 2002)

1.2.7.3 Inhibiteurs en essais cliniques ou pré-cliniques De nombreux inhibiteurs des cathepsines ont fait l’objet d’essais cliniques (Tableau 7), en particulier des inhibiteurs de la cathepsine K pour le traitement de l’ostéoporose. On retrouve également des inhibiteurs pour la cathepsine S qui a largement était étudiée comme une cible thérapeutique pour certaines maladies autoimmunes, comme le psoriasis ou l’arthrite rhumatoïde. Bien que ces deux cathepsines restent les plus étudiées dans le cadre d’inhibiteurs cliniques, certains composés ciblant la cathepsine B ou C sont également en cours d’évaluation (Korkmaz et al., 2018; Lee-Dutra et al., 2011; Li et al., 2017; Wijkmans & Gossen, 2011). Le développement d’inhibiteurs doit idéalement respecter un certain nombre de critères : un poids moléculaire faible, un caractère peptidique minimal et se fixer de manière réversible et hautement sélective afin de ne pas affecter l’activité des autres cathepsines. Un des plus grands défis pour le design d’inhibiteurs est également de répondre aux critères pharmacologiques standards comme la biodisponibilité, la faible toxicité ou une constante d’élimination faible (Brömme & Lecaille, 2009).

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Tableau 7 : Inhibiteurs des cathepsines à cystéine en essais cliniques ou précliniques

Cible Inhibiteur Compagnie Structure Maladie Phase clinique Cat B VBY-376 Virobay Indisponible Hépatite C chronique Phase I Cat C Bronchectasie Phase I GSK GlaxoSmithKline fibrose kystique Abandonné 2793660 Cat K MIV-711 Medivir AB Indisponible Arthrose Phase II Ostéoporose Phase III Abandonné Arthrose Phase II Odanacatib Merck Abandonné Cancer du sein Phase III et de la prostate Abandonné Métastase osseuse

Ostéoporose Phase II Balicatib Novartis Arthrose Abandonné

Ostéoporose Phase II ONO-5334 Ono Ostéopénie Abandonné Pharmaceuticals

Relicatib GlaxoSmithKline Ostéoporose Phase I Arthrose Abandonné

CatS Virobay/LEO Psoriasis VBY-891 Pharma Indisponible Souffrance Phase I neuropathique VBY-036 Virobay Indisponible Souffrance Phase I neuropathique

LY3000328 Eli Lilly Anévrisme de l'aorte Phase I abdominale

RWJ- Johnson & Indisponible Arthrite rhumatoïde Phase II 445380 Johnson Psoriasis RG7625/ Maladie coeliaque, RO5459072 Roche Indisponible Syndrome primaire Phase I, II de Sjogren CRA- Celera/Bayer Indisponible Psoriasis Phase I 028129 Schering Pharma Abandonné Phase I Souffrance Abandonné SAR114137 Sanofi neuropathique Réévalué Maladie de Chagas pour la maladie de Chagas (D’après Kramer et al., 2017)

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Parmi les inhibiteurs des cathepsines, le seul à avoir participé à des essais cliniques de phase III est l’odanacatib, un dérivé nitrile non lysosomotropique hautement sélectif pour la cathepsine K (Bone et al., 2010; Gauthier et al., 2008). Cependant, malgré des résultats encourageants pour le traitement de l’ostéoporose, l’odanacatib n’a pas pu être commercialisé en raison de ces effets secondaires. Les essais cliniques de phase III ont révélé des risques accrus de complications cardiovasculaires incluant des risques d’accident vasculaire cérébral (Chapurlat, 2015; Mullard, 2016). Le seul inhibiteur de la cathepsine K dont les essais cliniques sont encore en cours est le MIV-711, actuellement en Phase II (Brömme et al., 2016). Les premiers résultats ont montré une réduction marquée des fragments de collagène de type I et II dans les urines ou le sérum, suggérant que l’arthrose et l’ostéoporose pourraient être ciblées par cet inhibiteur (Lindstrom et al., 2015). Du fait de son rôle important dans la présentation d’antigène, l’inhibition de la cathepsine S a été proposée comme une stratégie thérapeutique dans des maladies autoimmunes comme l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque (Baugh et al., 2011) ou l’asthme (Deschamps et al., 2011). De plus, la cathepsine S est retrouvée surexprimée dans les peaux psoriasiques (Schönefuss et al., 2010). Ainsi, de nombreux inhibiteurs ont été développés comme le RWJ- 445380 en Phase II pour le traitement du psoriasis et l’arthrite rhumatoïde. D’autres inhibiteurs comme VBY-036, VBY-891 et LY3000328 sont actuellement en essais de Phase I pour le traitement de la douleur neuropathique ou les maladies cardiovasculaires (Payne et al., 2014).

1.3 Fonctions physiologiques

A l’origine, les cathepsines étaient uniquement connues pour leur rôle de dégradation et de recyclage des protéines dans les compartiments endosomaux et lysosomaux. Pourtant, il a été montré qu’elles participent également à des fonctions plus spécifiques comme la présentation d’antigène médiée par le CMH-II, le remodelage osseux ou encore l’activation de prohormones ou d’autres précurseurs protéiques (Turk et al., 2000, 2002c; Vasiljeva et al., 2007).

1.3.1 Maturation des précurseurs protéiques

Les cathepsines à cystéines interviennent dans la maturation/activation de nombreux précurseurs protéiques. Les cathepsines B, L et K participent à la protéolyse au niveau de la thyroïde en libérant la thyroxine et la thyronine à partir de la thyroglobuline (Brix et al., 1996; Dunn et al., 1991; Friedrichs et al., 2003). La cathepsine B est également impliquée dans l’activation de la β-galactosidase (Okamura-Oho et al., 1997), la rénine (Jutras & Reudelhuber, 59

1999) et la trypsine (Halangk et al., 2000). La cathepsine C quant à elle, active de nombreuses protéases à sérine au niveau des neutrophiles comme les granzymes A et B, la cathepsine G, l’élastase de neutrophile (ou HNE pour Human Neutrophile Elastase) et la protéinase 3 (Pr3) (Adkison et al., 2002; Pham & Ley, 1999). Dans les vésicules neuronales, il a été mis en évidence que la cathepsine L participait à la maturation de neuropeptides comme l’encéphaline, la β-endorphine ou la dynorphine (Funkelstein & Hook, 2011). Elle serait également responsable de l’hydrolyse de l’extrémité N-terminale des histones H3 qui a un rôle primordial dans le développement et la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (Duncan et al., 2008) Les cathepsines peuvent également influer sur la balance protéases/antiprotéases en dégradant leurs propres inhibiteurs naturels et ceux d’autres familles de protéases. Par exemple, la cathepsine L est capable de libérer la bradykinine à partir du kininogène (HMWK) (Desmazes et al., 2003) contrairement à la cathepsine K qui est capable de dégrader la bradykinine en deux fragments inactifs (Godat et al., 2004). Il a également été observé que la cathepsine L était capable de cliver les 11 premiers résidus de la cystatine C, impliquant une diminution drastique de l’affinité de l’inhibiteur tronqué vis-à-vis des cathepsines (Popovic et al., 1999). Pour les inhibiteurs des autres familles de protéases, la cathepsine B peut, par exemple, inactiver les TIMPs-1 et 2 (pour Tissue Inhibitor of Metalloproteinases) (Kostoulas et al., 1999) tandis que les cathepsines B, L et S clivent le SLPI (pour Secretory Leucocyte Protease Inhibitor), un inhibiteur des protéases à sérine (Taggart et al., 2001).

1.3.2 Présentation antigénique

Les cathepsines à cystéines sont impliquées dans les réactions du système immunitaire par la formation des peptides antigéniques et la maturation des molécules du CMH II, qui permet la présentation des peptides à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APC pour Antigen Presenting Cell) (Figure 15). In vitro, les cathepsines B, L et S, mais aussi les protéases acides comme les cathepsines D et E, peuvent dégrader les antigènes pour produire des peptides antigéniques (Hsieh et al., 2002; Katunuma et al., 1998; Plüger et al., 2002; Rodriguez & Diment, 1992). Les cathepsines participent également à la présentation antigénique en procédant à la maturation de la chaîne invariante Ii du CMH II. La chaîne Ii est une molécule chaperonne de 31 kDa qui se fixe au niveau des chaînes α et β du CMH II permettant ainsi sa stabilité et son adressage vers les compartiments endosomaux. Elle permet également d’empêcher la fixation précoce des peptides antigéniques. A l’intérieur des endosomes, la 60 chaîne Ii va subir une série de protéolyses successives qui va conduire à l’obtention d’un fragment plus court (15 résidus) nommé CLIP (pour Class-II associated Invariant chain Peptide). Ce peptide est ensuite libéré et remplacé par un peptide antigénique présenté à la surface de la cellule (Figure 15) (Riese & Chapman, 2000). Initialement, il avait été proposé que la cathepsine B, la cathepsine la plus abondante, soit responsable de la dégradation de la chaîne Ii. Cependant, les souris déficiente en cathepsine B ne montrent pas de défaut de présentation antigénique. Cette observation impliquait que la cathepsine B ne jouait pas un rôle critique dans ce processus. En revanche, l’inhibition de la cathepsine S par le LHVS (morpholinurea-leucine-homophenylalanine-vinylsulphone-phenyl) empêche la dégradation de la chaîne Ii chez les lymphocytes B et les cellules dendritiques (Riese et al., 1996). Le rôle crucial de la cathepsine S a été validé par la suite grâce à des modèles murins déficients en cathepsine S (Nakagawa et al., 1999). Cette même étude a montré que cette dégradation n’était pas cathepsine S dépendante dans tous les types cellulaires. Ainsi, la cathepsine L est responsable de ce processus dans les cellules épithéliales corticales du thymus chez la souris (Nakagawa et al., 1998) tandis qu’il s’agit de la cathepsine V chez l’Homme (Tolosa et al., 2003). De plus, dans les macrophages cette dégradation dépend de la cathepsine F (Shi et al., 2000).

Figure 15 : Rôle des protéases à cystéine dans la présentation antigénique par le CMH de classe II (D’après Honey & Rudensky, 2003)

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1.3.3 Remodelage de la matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire ou MEC est réseau complexe de protéines sécrétées par les cellules voisines et représente un échafaudage hautement dynamique qui entoure les cellules dans les tissus et les organes (Rozario & DeSimone, 2010; Theocharis et al., 2016). Son homéostasie est maintenue par un équilibre entre synthèse et dégradation finement régulé (Bonnans et al., 2014; Werb, 1997). Les constituants majeurs de la MEC sont des protéines structurales comme les protéines formants des fibres (collagène, élastine et fibronectine), les laminines, les protéoglycanes ou encore les GAGs (Murphy-Ullrich & Sage, 2014; Ozbek et al., 2010; Theocharis et al., 2016). La membrane basale quant à elle est compacte et contient du collagène de type IV, de la fibronectine et de la laminine. On y retrouve également des protéines de liaisons sécrétées par les cellules endothéliales, épithéliales et stromales (Egeblad et al., 2010; Lu et al., 2012; Mouw et al., 2014; Theocharis et al., 2016). La structure de la MEC est constamment et rapidement modifiée par des mécanismes enzymatiques qui affectent sa fonction et sa stabilité (Lu et al., 2011). Les MMPs (pour Matrix Metalloproteinases), les protéases à sérine et les cathepsines à cystéine sont considérées comme les acteurs majeurs du remodelage de la MEC. En effet, de nombreux constituants de la MEC et de la membrane basale ont été rapportés comme étant des substrats des cathepsines (Tableau 8). Cette dégradation n’est pas exclusivement extracellulaire puisque de nombreuses cellules sont capables d’internaliser les protéines de la MEC pour les dégrader au niveau des lysosomes (Mohamed & Sloane, 2006).

Les cathepsines B, F, K, L, S et V possèdent une activité élastinolytique (Novinec et al., 2007). Des études in vitro ont même montré que dans le cas des cathepsines K et S, cette activité est plus puissante que celle de l’HNE et de la MMP-12 (Chapman et al., 1997; Shi et al., 1992). Pourtant, il semblerait que la cathepsine V soit la plus efficace pour dégrader l’élastine (Yasuda et al., 2004). La cathepsine V est plutôt responsable de la dégradation intracellulaire de l’élastine alors qu’à l’inverse les cathepsine K et S permettent son recyclage extracellulaire. Le fort potentiel élastinolytique de la cathepsine V viendrait de deux exosites hydrophobes qui permettent de stabiliser le complexe enzyme-élastine. Il a été proposé que la fixation à ces exosites permet le bon positionnement du site de clivage de l’élastine au niveau du site actif de l’enzyme. Un mécanisme similaire a été proposé pour les cathepsines S et K (Novinec et al., 2007). Le collagène de type I et II possèdent une structure en triple hélice ce qui les rend fortement résistants à la protéolyse. Pourtant, certaines MMPs, protéases à sérine et la

62 cathepsine K sont capables d’hydrolyser ces fibres (Fields, 2013). La cathepsine K est considérée comme étant d’une importance cruciale dans la dégradation des fibres de collagène (Garnero et al., 1998; Panwar et al., 2013, 2018; Sharma et al., 2015). Elle est capable de cliver le collagène I et II en plusieurs sites au niveau de régions polyproline (Garnero et al., 1998; Kafienah et al., 1998), ce qui est en accord avec sa préférence pour la proline en position P2 (Choe et al., 2006). En plus, elle est capable de cliver au niveau des télopeptides (Atley et al., 2000; Brömme et al., 1996). L’activité collagénolytique de la cathepsine K dépend de la formation d’un complexe avec les GAGs, en particulier le chondroïtine sulfate (CS-4 mais pas le CS-6). Cette interaction se fait au niveau d’exosites chargés positivement situés à l’opposé du site actif (Aguda et al., 2014; Sharma et al., 2015). Il existe un mécanisme de régulation nommé « cannibalisme » qui implique que la cathepsine S peut hydrolyser la cathepsine K et ainsi limiter son activité collagénolytique et élastinolytique (Barry & Platt, 2012). Bien que d’autres cathepsines comme la B, L et S aient montré une activité collagénolytique au niveau des télopeptides in vitro, la cathepsine K reste la seule à avoir une activité avérée in vivo (Panwar et al., 2013, 2018). Les cathepsines à cystéine sont également impliquées dans le remodelage de la membrane basale en dégradant des protéines matricielles (Tableau 8). Par exemple, les cathepsines B, L et S clivent le collagène de type IV et la laminine. La cathepsine S est également capable d’hydrolyser la fibronectine et le perlécan, mais aussi les nidogènes-1 et 2 (Sage et al., 2012).

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Tableau 8 : Constituants de la matrice extracellulaire et de la membrane basale dégradés par les cathepsines à cystéine

Protéines de la MEC Cathepsines Pathologies associées Référence Aggrécane B, K, L, S Arthrose Fosang et al., 1992; Hou et al., 2003; Mort et al., 1998 Collagène de type I et II B, K, L, S Ostéoporose, arthrite rhumatoïde, arthrose, maladies Bossard et al., 1996; Hou et al., 2001; Kafienah et al., 1998; Lecaille et al., 2007; cardiovasculaires et pulmonaires, cancer Maciewicz et al., 1987; Panwar et al., 2013; Podgorski et al., 2005 Elastine B, F, K, L, S, V Maladies cardiovasculaires et rénales, cancer Brömme et al., 1996; Du et al., 2013; Novinec et al., 2007; Yasuda et al., 2004 Fibronectine B, L, S Adipogénèse, cancer Buck et al., 1992; Ishidoh & Kominami, 1995; Kitamoto et al., 2007; Taleb et al., 2006 Ostéocalcine B, H, L, S Ostéoporose Baumgrass et al., 1997; Page et al., 1993 Ostéonectine/SPARC B, K Ostéoporose, cancer Bossard et al., 1996; Page et al., 1993; Podgorski et al., 2009 Collagène de type XVIII L, S Cancer, BPCO Veillard et al., 2011

Protéines de la MB Cathepsines Pathologies associées Référence Perlécan B, L Remodelage vasculaire, Ischémie cérébrale Cailhier et al., 2008; Saini & Bix, 2012 (protection) Nidogène S Cancer Sage et al., 2012 Collagène de type IV B, L, S Cancer, traumatisme intestinal Podgorski et al., 2005; Sameni et al., 2003; Vreemann et al., 2009; Wang et al., 2006 Ténascine C B Cancer Mai et al., 2002 Laminine B, L, S Cancer, traumatisme intestinal Buck et al., 1992; Ishidoh & Kominami, 1995; Vreemann et al., 2009; Wang et al., 2006 64 (D'après Fonović & Turk, 2014; Vizovišek et al., 2018)

1.3.4 Apoptose

A l’inverse des protéases à cystéine de la famille des , le rôle des cathepsines dans l’apoptose est encore mal connu. Deux cathepsines en particulier, les cathepsines C et B, semblent avoir un rôle dans les processus apoptotiques. La première est indispensable à l’activation des granzymes A et B dans les lymphocytes et les cellules NK, impliquées dans la cytotoxicité de ces cellules. De plus, la granzyme B peut activer la 3, une protéase effectrice dans la cascade apoptotique (Pham & Ley, 1999). La deuxième est impliquée dans l’apoptose induite par le TNF-α. Le rôle de la cathepsine B dans les phénomènes de mort programmée a été appuyé par plusieurs travaux. Dans une première étude, Guicciardi et al., ont montré que dans des hépatocytes traités avec le TNF-α, la induisait une augmentation de la cathepsine B cytoplasmique conduisant à l’apoptose (Guicciardi et al., 2000). Dans une seconde étude, ils ont montré que lorsqu’ils traitaient des souris sauvages et déficientes en cathepsine B avec du TNF- α , l’apoptose des hépatocytes était beaucoup moins importante pour les souris knock-out (Guicciardi et al., 2001). De plus, Foghsgaard et ses collaborateurs ont démontré que la cathepsine B était impliquée dans le relargage d’acide arachidonique (AA) induit par TNF- α qui conduit à des voies inflammatoires et apoptotiques ; de plus, l’inhibition de la cathepsine B annule la libération d’AA dans des cellules cancéreuses humaines (Foghsgaard et al., 2002). Ainsi le mécanisme d’action proposé pour la cathepsine B est le suivant : La caspase 8 activée induit le relargage de la cathepsine B dans le cytoplasme après perméabilisation des lysosomes. La cathepsine B va activer un facteur cytosolique (probablement Bid) qui va à son tour induire un relargage de cytochrome c conduisant à l’apoptose (Turk & Turk, 2009; Turk et al., 2002b). Pour les autres cathepsines, elles pourraient également avoir un rôle pro-apoptotique lors de la fuite lysosomale (Česen et al., 2012). Par exemple, les cathepsines B, K, L et S intra-cytoplasmiques sont capables de cliver les facteurs anti-apoptotiques BCL2, BCL-xL et MCL1 (Blomgran et al., 2007; Droga-Mazovec et al., 2008). De plus, la cathepsine L a été proposé comme pro-apoptotique en activant une protéase encore inconnue qui activerait à son tour la procaspase 3 (Turk et al., 2002b).

1.4 Fonctions physiopathologiques

Les cathepsines à cystéines sont impliquées dans de nombreux processus pathologiques généralement dus à une dérégulation de leur activité et/ou une localisation inhabituelle. Ainsi, ces protéases participent à de nombreuses pathologies comme le cancer, l’arthrose,

65 l’athérosclérose, l’ostéoporose ou certaines pathologies neurodégénératrices (Figure 16). Il existe également des maladies génétiques rares impliquant un déficit en cathepsines : La pycnodysostose, causée par la mutation du gène codant pour la cathepsine K ou le syndrome de Papillon Lefèvre dû à un déficit en cathepsine C (Ketterer et al., 2017).

Figure 16 : Exemple d’implication des cathepsines à cystéine dans des processus pathologiques (D’après Kramer et al., 2017)

1.4.1 Ostéoporose / pycnodysostose

L’ostéoporose est une maladie caractérisée par un déséquilibre entre la synthèse osseuse et sa résorption. Dans des conditions physiologiques, les tissus osseux sont renouvelés tous les 5 à 7 ans. Ce processus se nomme le remodelage osseux et se déroule selon les étapes suivantes : Les ostéoclastes vont sécréter des protéases, comme les MMPs et la cathepsine K, ainsi que des protons qui vont permettre l’acidification du milieu. Ces enzymes vont dans un premier temps déminéraliser puis dégrader les fibres de collagène de la matrice osseuse. Puis la matrice osseuse nouvellement dégradée va être remplacée par de la matrice osseuse « fraiche » synthétisée par les ostéolastes (Raisz, 1999). Dans le cas de l’ostéoporose, on observe une dégradation excessive de la matrice osseuse conduisant à un risque accru de fractures. La cathepsine K du fait de sa forte activité collagénolytique, joue un rôle crucial dans le développement et la progression de la pathologie. En effet, cette protéase représente 98% de l’activité des cathepsines totales exprimées par les ostéoclastes (Drake et al., 1996). De plus, le 66 collagène de type I qui constitue 95% de la matrice osseuse, est un excellent substrat de la cathepsine K (Brömme et al., 1996). Le rôle critique de la cathepsine K dans le remodelage osseux a été corroboré par le fait que la déficience en cathepsine K conduit à une maladie autosomale récessive : la pycnodysostose (Gelb et al., 1996b). Les ostéoclastes de ces patients conservent la capacité de déminéraliser mais ne sont plus capables de digérer les fibres de collagène. Un phénotype osseux comparable a été retrouvé dans le cas de souris déficiente en cathepsine K (Saftig et al., 1998). Le rôle critique de la cathepsine K dans la résorption osseuse a conduit les chercheurs à la conviction que des inhibiteurs spécifiques de la cathepsine K pourraient être bénéfiques dans le traitement de l’ostéoporose (Tableau 1).

1.4.2 Arthrite rhumatoïde

L’arthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire des articulations qui concerne environ 1% de la population. De la même manière que pour l’ostéoporose, elle touche majoritairement les femmes (trois fois plus que les hommes). En plus de la composante inflammatoire, cette pathologie est caractérisée par la destruction progressive du cartilage articulaire et de l’os sous- chondral qui peut éventuellement conduire à la perte de fonction de l’articulation. Les cathepsines à cystéine sont impliquées dans les deux composants de cette pathologie : l’inflammation et la destruction osseuse. Le cartilage est attaqué en trois sites : (1) au niveau de la surface lisse du pannus synovial formé de fibroblastes, de macrophages et de leucocytes infiltrés ; (2) des chondrocytes activés du cartilage et (3) des ostéoclates de l’os sous-chondral (Figure 17). Les cathepsines B, K et L ont été retrouvées au niveau des fibroblastes synoviaux et leur expression est induite par des facteurs pro-inflammatoires comme l’IL-1, l’interféron γ ou le TNF-α (Hou et al., 2001, 2002; Hummel et al., 1998; Lemaire et al., 1997; Trabandt et al., 1990, 1991). Les chondrocytes expriment principalement les cathepsines B et L (Kostoulas et al., 1997) et leur concentration est augmentée dans la membrane et le liquide synovial des patients (Dickinson, 2002; Hansen et al., 2000). Au stade le plus avancé de la maladie, la cathepsine K est produite par les ostéoclastes et est retrouvée au niveau des liquides synoviaux (Brömme & Okamoto, 1995; Drake et al., 1996). L’activité de ces enzymes est favorisée par une acidification (pH 5) et la présence de GAGs au niveau des tissus cartilagineux (Konttinen et al., 2002; Wilkins & Hall, 1995). Ainsi, ces conditions favorables permettent à la cathepsine K de dégrader le collagène de type II et pour les autres l’hydrolyse des aggrécanes (Hou et al., 2001; Nguyen et al., 1990, 1991).

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Figure 17 : Implication des cathepsines à cystéine dans l’érosion tri-directionnelle des articulations arthritiques (D’après Lecaille et al., 2002a)

1.4.3 Athérosclérose

L’athérosclérose est la cause de mortalité majeure des pays occidentaux. Elle est caractérisée par un épaississement irrégulier des artères induisant une réduction ou une obstruction de la circulation sanguine, qui peut provoquer des infarctus du myocarde, des accidents vasculaires cérébraux ou des anévrismes aortiques. Un des symptômes précoce est la formation de plaques d’athérome qui consiste en un dépôt de lipides et de macrophages au niveau des artères. Par la suite ces dépôts se transforment en plaque fibreuse avec l’apparition de cellules musculaires lisses et de cellules conjonctives (Sukhova et al., 1998). Les cathepsines S et K ont été localisées au niveau des macrophages et des cellules de muscles lisses dans les plaques d’athérome (Sukhova et al., 1998). Ces deux enzymes possèdent une forte activité élastinolytique, suggérant leur rôle dans la perte d’élasticité de la paroi artérielle (Brömme et al., 1996; Shi et al., 1992). De plus, il a été montré que l’expression de la cystatine C est dramatiquement diminuée lors de l’athérosclérose et des anévrismes aortiques (Shi et al., 1992). Ces observations montrent l’importance de la balance protéases/antiprotéases dans le développement de cette pathologie. La cathepsine F, retrouvée au niveau des zones riches en macrophages des plaques d’athérome, semble également jouer un rôle crucial. Durant la formation des plaques d’athérome, les LDL (pour Low Density Lipoprotein) sont modifiées et fusionnent pour former des gouttelettes lipidiques. Un des mécanismes pouvant expliquer ce phénomène serait la protéolyse des constituants des LDL, les apolipoprotéines apoB-100 (Linke

68 et al., 2006). Il a été montré que la cathepsine F pouvait dégrader les apoB-100 qui conduit à l’agrégation et la fusion des gouttelettes lipidiques dérivés de LDL (Oörni et al., 2004).

1.4.4 Cancer

Les cathepsines à cystéine sont impliquées dans tous les processus cancéreux comme l’angiogénèse, l’invasion et les métastases (pour revue Olson & Joyce, 2015). Une surexpression des cathepsines est corrélée avec la plupart des cancers et souvent associée avec un faible pronostic vital (Berdowska, 2004; Jedeszko & Sloane, 2004). Par exemple, le niveau d’expression de la cathepsine L dans le sérum est élevé dans le cancer malin de l’ovaire (Zhang et al., 2014b). La cathepsine X/Z est surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire et le cancer colorectal et est corrélé avec un mauvais pronostic de survie (Vizin et al., 2012; Wang et al., 2011). Les cathepsines sont sécrétées dans le milieu extracellulaire par les cellules de la tumeur et associées aux tumeurs (Figure 18) et induisent des modifications du microenvironnement tumorale (Turk et al., 2012). Les cathepsines sont capables d’hydrolyser les composants de la matrice extracellulaire et de la membrane basale permettant ainsi la prolifération des cellules tumorales et l’invasion dans les tissus environnants par le biais du système vasculaire. Les cathepsines peuvent également activer ou dégrader des facteurs de croissance, cytokines ou chimiokines. De plus, elles sont impliquées dans la perte des interactions cellule-cellule en clivant les jonctions intercellulaires. L’activité de ces protéases est favorisée par l’acidification du microenvironnement tumoral. Bien que l’augmentation de l’expression et de l’activité des cathepsines aient été rapportée dans la plupart des tumeurs malignes, le profil et le rôle des différentes cathepsines peuvent varier en fonction du type de cancer. De même, la capacité des cathepsines à favoriser la progression tumorale semble dépendante du type cellulaire (Figure 18). Pour l’ensemble de ces raisons, les cathepsines ont été largement étudiées comme une cible thérapeutique potentielle mais également comme un marqueur de pronostic. Par exemple, il a été montré que le traitement par un inhibiteur irréversible époxy à spectre large pour les cathepsines retardait de manière significative la progression tumorale dans un modèle de cancer pancréatique murin (Joyce et al., 2004). Des résultats similaires ont été observés en inhibant les cathepsines dans un modèle de tumeur mammaire de souris (Mikhaylov et al., 2011).

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Figure 18 : Profil d’expression des cathepsines à cystéine dans le microenvironnement tumoral (D'après Mohamed & Sloane, 2006)

1.4.5 Autres pathologies

Les cathepsines K, S et L sont associées à l’obésité où elles sont impliquées dans la régulation de l’adipogénèse. Leur rôle semble lié à la dégradation de la fibronectine, un régulateur de la différenciation adipocytaire et du collagène I (Han et al., 2009; Spiegelman & Ginty, 1983; Yang et al., 2008). La cathepsine K est surexprimée dans les tissus adipeux d’individus obèses et son inhibition diminue la différenciation des pré-adipocytes en adipocytes (Yang et al., 2008). De même la surexpression de la cathepsine S est corrélée avec l’augmentation de l’indice de masse corporelle (IMC) chez des patients obèses (Taleb & Clément, 2007). On retrouve également les cathepsines dans certaines pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Cette pathologie est la forme la plus commune de démence caractérisée par une perte de mémoire et d’autres capacités intellectuelles. Elle se développe suite à la formation de plaques β-amyloïdes neurotoxiques. Cette plaque est constituée d’une accumulation de peptides β-amyloïdes dégradés à partir de leurs précurseurs sous l’action de β-sécrétases. La cathepsine B a été proposée comme une β-sécrétase potentielle (Hook et al., 2005). L’utilisation d’inhibiteurs dirigés contre cette dernière sur des modèles murins d’Alzheimer améliore leur

70 capacité de mémoire et diminue la formation des plaques β-amyloïdes (Hook et al., 2008; Kindy et al., 2012). La cathepsine S a un rôle central dans la génération et le maintien de la douleur, en particulier pour la douleur chronique (Grace et al., 2014; Zhao et al., 2014). La cathepsine S sécrétée par les macrophages influe sur la signalisation de la douleur en clivant le PAR 2 (pour Protease- Activated Receptor 2), un récepteur de la famille des récepteurs couplés aux protéines G qui conduit à une hyperexcitabilité (Cattaruzza et al., 2011; Zhao et al., 2014). Comme vu précédemment, deux inhibiteurs spécifiques de la cathepsine S sont actuellement en essais cliniques de Phase I pour la souffrance neuropathique (Tableau 7) (Kramer et al., 2017). La maladie de Gaucher, aussi appelée shingolipidose, est une maladie de surcharge lysosomale, qui conduit à l’accumulation de sphingolipides au niveau du système nerveux, la rate, le foie ou les poumons. Même si leur rôle est encore mal connu dans cette pathologie, les cathepsines B, K et S sont retrouvées surexprimées dans la rate et le sérum des patients (Moran et al., 2000). La cathepsine K a même été proposée comme biomarqueur pour la maladie de Gaucher de type I (Bobillo Lobato et al., 2015).

1.5 Les cathepsines à cystéine dans les pathologies pulmonaires

Il est aujourd’hui de plus en plus évident que les cathepsines participent à plusieurs processus biologiques et à l’homéostasie pulmonaire. Ainsi, une dérégulation de leur expression conduit à de nombreuses pathologies. Leur production est augmentée dans la plupart des tumeurs et dans les pulmonaires chroniques et aigues comme la silicose, la BPCO (emphysème, bronchite chronique), l’asthme et la dysplasie broncho-pulmonaire. Elles sont considérées comme des facteurs aggravants dans le processus d’inflammation en contribuant au remodelage et/ou la dégradation de la MEC et de la membrane basale. Les cathepsines à cystéine et leurs inhibiteurs naturels sont des marqueurs potentiels de diagnostic et de pronostic dans plusieurs pathologies (Tableau 9).

1.5.1 Silicose

La silicose est une pneunoconiose professionnelle provoquée par l’inhalation chronique de silice cristalline, caractérisée par la formation de petits nodules pulmonaires conduisant à une fibrose progressive (Castranova & Vallyathan, 2000; Mossman & Churg, 1998). Un emphysème peut également survenir dans les stades avancés avec une destruction anormale des fibres de collagène. L’agression répétée des poumons par les poussières de silice, conduit à un

71 recrutement massif de macrophages alvéolaires, déclenchant une cascade de réactions inflammatoires. Dans les modèles animaux de silicose, les poumons contiennent des agrégats de macrophages. Ces derniers vont sécréter une forte quantité de facteurs de chimiotactisme et de protéases lysosomales conduisant à une réponse fibrotique et à des dommages tissulaires (Brain, 1986). Les cathepsines à cystéine, en collaboration avec la MMP-2 (gélatinase A), la MMP-9 (gélatinase B) et la stromélysine, vont dégrader la membrane basale (Chapman et al., 1994; Pérez-Ramos et al., 1999; Scabilloni et al., 2005). Il a été proposé que la cathepsine K joue un rôle protecteur contre le processus de fibrose. Cette hypothèse repose sur une étude montrant que les souris déficiente en cathepsine K présentent une plus forte accumulation de collagène que les souris sauvages (Bühling et al., 2004). Cette enzyme aurait un rôle bénéfique en empêchant l’augmentation des dépôts matriciels. Dans des modèles murins, sa transcription est augmentée après instillation avec des particules de silice et son activité dans les agrégats silicotiques est supérieure à celle des contrôles (van den Brûle et al., 2005). De plus, des souris sensibles à l’induction de la silicose (C57BL/6) présentent une plus faible expression de la cathepsine K plus faible que celle des souris résistantes (BALB/c) (van den Brûle et al., 2005). L’expression de la cathepsine K est inversement corrélée avec celle du TGF-β dans les poumons de souris souffrants de silicose. Ces données suggèrent que le TGF- β pourrait limiter la surexpression de cette enzyme en réponse aux cristaux de silice (van den Brûle et al., 2005). Les cathepsines B, H, K, L et S matures et actives sont présentent dans les LBA de patients atteints de silicose. La cathepsine H, une aminopeptidase, est la plus abondante parmi les cathepsines étudiées, tandis que les cathepsines B et L sont les deux endopeptidases les plus abondantes. La concentration totale en cathepsines chez les patients atteints de silicose est dix fois supérieure à celle des patients contrôles tandis que la balance protéases/antiprotéases montre un déséquilibre en faveur des cathepsines (Perdereau et al., 2006). L’ensemble de ces données suggère que les cathepsines contribuent à la dégradation de la membrane basale qui se produit lors des réponses fibrotiques dans la silicose (Lalmanach et al., 2006).

1.5.2 Mucoviscidose

La mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis) est une maladie génétique rare, survenant après une mutation d’un gène codant pour un canal chlore, le canal CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance). Il existe plusieurs mutations possibles pour cette maladie qui conduisent à la synthèse d’une protéine tronquée ou incorrectement adressée à la membrane. L’absence d’un canal CFTR fonctionnel implique une augmentation de la viscosité du mucus

72 et son accumulation dans les voies aériennes. Ces deux facteurs offrent un terrain propice aux pathogènes opportunistes comme Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ou Haemophilus influenzae (Vankeerberghen et al., 2002). Les infections additionnées à une inflammation chronique conduisent à une perte de capacité respiratoire. L’activité des cathepsines B, L, H et S au niveau pulmonaire est plus importante pour les patients CF que pour les témoins (Quinn et al., 2010). De plus, chez ces patients, les fluides de l’épithélium alvéolaire sont acidifiés (pH en dessous de 6) ce qui assure des conditions favorables à l’activité de ces protéases (Tate et al., 2002). En plus de la dégradation des composants de la MEC, les cathepsines sont capables de contribuer au dysfonctionnement de la réponse inflammatoire en inactivant les PAMs (protéines et peptides antimicrobiens), en particulier pour les cathepsines B, L et S. Ainsi, elles vont dégrader les β-défensines-2 et -3, la lactoferrine, SP-A et LL-37 conduisant à la perte de leur activité antimicrobienne (Andrault et al., 2015; Lecaille et al., 2013; Rogan et al., 2004; Taggart et al., 2001, 2003). Cependant, les cathepsines à cystéine ne sont pas des marqueurs d’infection chez des patients avec des poumons colonisés par Pseudomonas aeruginosa. En effet le niveau de cathepsines B, H, K, L et S reste inchangé dans les expectorations des patients infectés ou non par Pseudomonas aeruginosa (Naudin et al., 2011). La cathepsine L est également capable de dégrader l’α1- antitrypsine, un membre de la famille des serpines, favorisant ainsi l’activité protéolytique incontrôlée des protéases à sérine (Johnson et al., 1986). A l’inverse, la cathepsine H est impliquée dans la maturation et de la SP-B, une protéine hydrophobe du surfactant impliquées dans la réduction de la tension de surface et aurait donc un rôle bénéfique dans l’homéostasie pulmonaire (Bühling et al., 2011). Récemment, une étude a montré que le taux de cathepsine B urinaire chez les enfants atteints de mucoviscidose était significativement augmenté par rapport aux témoins. La cathepsine B semblerait être un biomarqueur de l’inflammation chez les enfants atteints de mucoviscidose (Laguna et al., 2018).

1.5.3 Asthme

L’asthme est une maladie pulmonaire inflammatoire chronique dont les principales caractéristiques sont une hyperréactivité des voies respiratoires et une hypersécrétion de mucus conduisant à l’obstruction du flux d’air. Dans les poumons d’asthmatiques on retrouve un fort recrutement de cellules immunitaires comme les mastocytes, les éosinophiles ou les cellules Th2 (pour T helper 2) qui vont sécrétées des cytokines pro-inflammatoires (Hamid & Tulic, 2009; Mukherjee & Nair, 2018). L’inflammation chronique va conduire à une prolifération des

73 cellules musculaires lisses, une fibrose sous-épithéliale et une néovascularisation. Le traitement par E-64 (inhibiteur générique des cathepsines à cystéine) chez un modèle murin asthmatique induit une diminution significative du nombre d’éosinophiles et du poids des poumons (Layton et al., 2001). L’inhalation d’ovalbumine aérosolisée, induisant l’asthme chez les modèles animaux, augmente considérablement les concentrations en cathepsine S suggérant que cette enzyme est un marqueur pour les tissues inflammés (Fajardo et al., 2004). A l’inverse, l’inhibition de la cathepsine S réduit la réaction allergique dirigée contre l’ovalbumine. L’administration pendant une semaine d’un corticostéroïde, le méthylprednisolone, induit une diminution de la concentration de cathepsine S dans le sérum. En revanche, la cyclosporine, un immunosuppresseur, ne présente pas d’effet. Ces résultats confirment l’implication de la cathepsine S dans la pathogénèse de l’asthme et l’utilisation de la cathepsine S comme biomarqueur pour l’évolution de la maladie et la réponse au traitement (Cimerman et al., 2001). Le traitement d’un modèle murin d’hypersensibilité pulmonaire avec un inhibiteur de la cathepsine S bloque l’infiltration des éosinophiles dans les poumons (Riese et al., 1998). Ainsi, la cathepsine S du fait de son rôle essentiel dans les mécanismes immunitaires de présentation d’antigène en dégradant la chaîne invariante du CMH II serait impliqué dans le développement de la réponse allergique. Le mécanisme d’action de la cathepsine S reste pourtant mal connu. La cathepsine S n’est pas la seule à avoir été mise en évidence dans la pathogénèse de l’asthme. En effet, Shi et ses collègues ont trouvé une forte quantité de cathepsine F produite par les macrophages alvéolaires chez la souris (Shi et al., 2000). Or la cathepsine F a également la capacité de dégrader la chaîne invariante et les antigènes en peptides antigéniques dans les macrophages (Shi et al., 2000) (Chapitre 1.3.2). Ainsi, des inhibiteurs spécifiques des cathepsines S ou F, pourrait être bénéfique dans le traitement de l’asthme ou d’autres pathologies avec une réponse immune inappropriée ou excessive (Somoza et al., 2002).

1.5.5 Lymphangioleiomyomatose

La Lymphangioleiomyomatose (LAM) est une maladie pulmonaire polykystique caractérisée par la destruction progressive des poumons. C’est une maladie rare (prévalence estimée de 1- 9/1 000 000) qui affecte presque exclusivement les femmes généralement à l’âge de la pré- ménopause. Les taux de progression et de sévérité de la maladie sont hautement variables mais la durée de survie moyenne est estimée entre 10 et 20 ans (Orphanet: http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php). La LAM est associée à des anomalies affectant le parenchyme pulmonaire provoquées par une infiltration progressive de cellules

74 musculaires lisses. Ces cellules produisent des protéines contractiles comme l’α-SMA (pour α Smooth Muscle Actin) ou la desmine. Des études d’himmunohistochimie ont montré une forte expression de la cathepsine K, restreinte aux cellules de la LAM ce qui pourrait contribuer au remodelage progressive du parenchyme observé dans cette maladie (Chilosi et al., 2009). Des résultats similaires ont été observés dans d’autres pathologies avec des granulomes comme la sarcoïdose, la tuberculose ou la maladie de Wegener (Reghellin et al., 2010). Ainsi, ces travaux suggèrent que la cathepsine K pourrait être un outil immunohistochimique spécifique pour l’évolution des microgranulomes et des réactions granulomateuses dans les maladies pulmonaires interstitielles. Des études sur un modèle murin de sarcoïdose ont montré qu’un déficit en cathepsine K augmentait l’incidence des granulomes pulmonaires, la taille des dépôts et le nombre de cellules géantes mononuclées. A l’inverse, l’absence d’activité des cathepsines S et L empêche la formation et le développement de granulomes (Samokhin et al., 2011).

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Tableau 9 : Implication des cathepsines à cystéine dans les pathologies pulmonaires

Maladies pulmonaires Cathepsines Fonctions Asthme F Dégradation de la chaîne invariante (CMH II), dégradation des antigènes en peptides antigéniques en l'absence de CatS et L Développement de l'éosinophilie dans les poumons de souris S Biomarqueur de l'asthme DBP K Dépôt de collagène extracellulaire Induction de changements fibrotiques chez les nouveau-nés atteints de DBP S Dégradation des composants extracellulaire, activité élastinolytique Cancer B, H, L, S, X Formation, croissance, prolifération et angiogénèse tumorale Marqueurs de pronostic et de diagnostic BPCO (Emphysème) B, F, K, S, L, V Dégradation de l'élastine et/ou du collagène Inactivation du SLPI par la Cat L Régulation de l'hyperréactivité des voies respiratoires induite par l'ozone et de l'inflammation par la CatS Mucoviscidose B, H, L, S Inactivation du SLPI endogène, dégradation des protéines antimicrobiennes, favorisant les infections bactériennes et la colonisation Lymphangioleiomyomatose K Marqueur de diagnostic (IHC) Protéinose alvéolaire B, H, L, S Réservoir d'enzymes matures pulmonaire Sarcoïdose K Déficit en CatK impliqué dans le développement de granulomes pulmonaires L, S Diminution/suppression des granulomes en l'absence de CatL et S Silicose B, H, K, L, S Participation de la CatK dans l'homéostasie pulmonaire, rôle protecteur contre la fibrose (D'après Kasabova et al., 2011)

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2. Inflammation dans la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO)

Les poumons, du fait des échanges gazeux entre l’environnement extérieur et l’organisme, sont en contact direct avec l’atmosphère extérieur et donc exposés à de nombreuses agressions. Le tissu pulmonaire possède plusieurs moyens de défense comme les défenses mécaniques (sécrétion de mucus, clairance mucociliaire), les défenses immunitaires innées (cellules phagocytaires, peptides et protéines antimicrobiens) et les défenses immunitaires adaptatives (IgA sécrétoires). L’exposition des poumons à des pathogènes, à des nanoparticules ou à la fumée de cigarette va induire un recrutement de cellules immunitaires (neutrophile, macrophages, lymphocytes T) qui vont sécrétées des cytokines pro-inflammatoires (IL-8, TNF- α) induisant une inflammation transitoire du tissu pulmonaire. Cependant dans certains processus physiopathologiques, cette réaction peut persister et devenir incontrôlable. Cette inflammation va conduire à un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases, de la balance oxydants/antioxydants et une dégradation de la MEC. La BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive) fait partie des pathologies inflammatoires pulmonaires les plus étudiées.

2.1 La BPCO - Généralités

2.1.1 Définition

La BPCO regroupe un ensemble de maladies chroniques inflammatoires. Elle représente actuellement la quatrième cause de mortalité aux Etats Unis et devrait devenir la troisième cause de mortalité mondiale d’ici 2020. Cette pathologie est caractérisée par une inflammation chronique, un remodelage des petites voies aériennes et la destruction du parenchyme pulmonaire. En 2001, Pauwels et ses collaborateurs proposent la définition du GOLD (Global initiative on Obstructive Lung Disease) qui caractérise la BPCO comme une « limitation du débit d’air progressive et irréversible, qui est associée à une réponse inflammatoire anormale dans les poumons à des substances nocives gazeuses ou particulaires » (Pauwels et al., 2001). Dans les pays développés, le tabagisme est de loin la cause la plus fréquente de BPCO (90% des cas). De plus, il a été montré que 15-20% des fumeurs développent une BPCO (Fletcher & 77

Peto, 1977). Cependant, il existe plusieurs autres facteurs de risques comme la pollution atmosphérique (particules, fumée de bois …), une mauvaise alimentation ou certains agents infectieux. Cette pathologie est également associée à l’âge puisqu’elle touche principalement des personnes entre 45 et 70 ans. La plupart des patients atteints de BPCO présentent trois mécanismes pathologiques : une bronchiolite obstructive, un emphysème et une hypersécrétion de mucus dont la proportion et la sévérité peut varier en fonction des malades (Figure 19). La bronchiolite induit une fibrose et une obstruction des petites voies respiratoires tandis que l’emphysème est responsable d’un élargissement des espaces aériens, de la destruction du parenchyme pulmonaire, de la perte d’élasticité pulmonaire et la fermeture des petites voies respiratoires.

Figure 19 : Mécanismes pathologiques impliqués dans la BPCO (D'après Barnes, 2008)

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Les patients atteints de BPCO présentent des caractéristiques différentes de bronchiolite obstructive, d’emphysème et d’hypersécrétion de mucus mais tous présentent des symptômes cliniques d’obstruction du flux d’air. L’initiative mondiale contre les maladies pulmonaires obstructives chroniques (GOLD) a mis au point une classification de sévérité de la BPCO avec différents stades (I à IV), basée principalement sur des tests de la fonction pulmonaire. Le diagnostic clinique se fait par spirométrie, qui mesure la capacité vitale forcée (CFV) après administration d’un bronchodilatateur et le volume expiratoire forcé en une seconde (VEMS) (Casaburi & ZuWallack, 2009). Un patient est considéré comme atteint de BPCO lorsque le ratio VEMS/CFV est inférieur à 0,70. Une fois diagnostiqué BPCO, le degré de sévérité de la pathologie est évalué en comparant le VEMS mesuré chez le patient à une valeur théorique de VEMS définie par des standards basés sur l’âge, le sexe, la taille et l’origine ethnique du patient.

La valeur du ratio VEMSpatient/VEMSstandard est exprimée en pourcentage et permet de distinguer quatre stades de sévérité de la BPCO (Tableau 10).

Tableau 10 : Classification clinique de la BPCO selon le degré de sévérité (GOLD)

Sévérité Valeur de VEMS associée (% de la valeur standard) GOLD I : légère VEMS ≥ 80% GOLD II : modérée 50% ≤ VEMS < 80% GOLD III : sévère 30% ≤ VEMS < 50% VEMS < 30% GOLD IV : très sévère VEMS < 50% associé à une insuffisance respiratoire grave (D'après Casaburi & ZuWallack, 2009)

2.1.2 Mécanismes pathologiques

2.1.2.1 Bronchiolite obstructive Il est connu depuis longtemps que les patients atteints de BPCO présentent un rétrécissement des voies aériennes périphériques (Cosio et al., 1978; Gelb et al., 1996a; Hogg et al., 1968; Niewoehner et al., 1974). Il se caractérise par une augmentation de l'épaisseur des petites voies aériennes avec une formation accrue de follicules lymphoïdes et un dépôt de collagène dans la paroi des voies respiratoires extérieures. La lumière des petites voies aériennes est réduite par un épaississement de la muqueuse contenant un exsudat inflammatoire, qui augmente avec la sévérité de maladie. Même si les mécanismes conduisant à la fibrose au niveau des voies aériennes périphériques restent méconnus, il semblerait que des facteurs de croissance comme le TGF-β (pour Transforming Growth Factor) y aient un rôle important. En effet, la concentration du TGF-β est augmentée dans les voies respiratoires périphériques (de Boer et

79 al., 1998; Takizawa et al., 2001). Il semblerait que les cellules épithéliales et les macrophages libèrent le TGF-β, qui stimule la prolifération des fibroblastes, entraînant une fibrose dans les petites voies aériennes (Figure 19). De plus, le CTGF (pour Connective Tissue Growth Factor), induit par le TGF-β, pourrait stimuler le dépôt de collagène dans les voies respiratoires (Chen et al., 2003; Ihn, 2002).

2.1.2.2 Emphysème L’emphysème est la conséquence d’une destruction du parenchyme pulmonaire. Il se définit par un élargissement irréversible des voies aériennes distales entraînant, une perte d’élasticité ainsi qu’une perte d’attachement alvéolaire conduisant à la destruction des bronchioles. Il peut être suspecté cliniquement sur la base de l'exploration fonctionnelle et l'imagerie, en particulier le CT-scan thoracique. Le mécanisme conduisant à l’emphysème est le suivant : Suite à l’inhalation de la fumée de cigarette ou d’autres irritants, les cellules épithéliales ou les macrophages vont sécréter des chimiokines qui vont recruter d’autres cellules inflammatoires au niveau du poumon. Ces cellules vont sécrétées des protéases comme les MMPs, des protéases à sérine comme l’HNE ou des cathepsines à cystéine qui induisent la dégradation de l’élastine et donc à l’emphysème. L’apoptose des pneumocytes de type I et des cellules endothéliales a été observé pour les patients atteints de BPCO avec un emphysème pulmonaire sévère (Calabrese et al., 2005; Caramori et al., 2016; Chambers et al., 2018). Les cellules T cytotoxiques de type I vont sécréter du granzyme B et des perforines, qui sont présents à des taux plus élevés dans les expectorations des patients atteints de BPCO que dans celles des sujets fumeurs sains. Ces molécules vont être responsables de l’apoptose des pneumocytes et contribuer au développement de l’emphysème.

2.1.2.3 Hypersécrétion de mucus La sécrétion de mucus fait partit des moyens de défense mécanique des poumons contre les irritants extérieurs. L’épithélium produit des mucines qui s’hydratent pour former un gel viscoélastique qui s’étend sur la surface épithéliale. Chez les individus sains, les corps étrangers inhalés sont piégés dans le mucus et éliminés par le transport mucociliaire et la toux. Dans plusieurs pathologies inflammatoires pulmonaires chroniques comme la BPCO, on observe un excès de mucus suite à la production et l’hypersécrétion par les cellules caliciformes. Ce phénomène est aggravé par la difficulté à éliminer les sécrétions en raison d’une mauvaise fonction ciliaire, de l’occlusion distale des voies respiratoires et de la toux inefficace. 80

L’hypersécrétion de mucus se développe à la suite d’une exposition à la fumée de cigarette (Deshmukh et al., 2005; Ebert & Terracio, 1975), d’une infection virale aiguë ou chronique (Holtzman et al., 2005), d’une infection bactérienne (Burgel & Nadel, 2004) ou d’une activation, par les cellules immunitaires, de la transcription du gène de la mucine via l’activation de l’EGFR (pour Epidermal Growth Factor Receptor) (Burgel & Nadel, 2004). L’expression de mucine dans les voies respiratoires périphériques est augmentée chez les patients atteints de BPCO (Caramori et al., 2004). Cette expression est régulée par l’action de certaines protéases comme les MMPs ou des protéases à sérine comme l’HNE ou la cathepsine G sécrétées par les neutrophiles ou les mastocytes (Kohri et al., 2002; Lemjabbar et al., 2003; Sommerhoff et al., 1989, 1990; Witko-Sarsat et al., 1999). Des études ont démontré que l’hypersécrétion de mucus peut être un facteur de risque potentiel de déclin accéléré des fonctions pulmonaires (Vestbo, 2002; Vestbo et al., 1996). Prescott et ses collègues ont également constaté que l’hypersécrétion chronique de mucus chez les patients hospitalisés atteints de BPCO est associée à un risque accru de décès par infection pulmonaire (Prescott et al., 1995).

2.1.2.4 Différence entre BPCO et asthme Bien que la BPCO et l’asthme impliquent une inflammation chronique des voies respiratoires, les mécanismes d’inflammation sont très différents entre ces deux pathologies. Dans un premier temps, la réponse inflammatoire est déclenchée pour la BPCO par une inhalation chronique d’agents irritants comme la fumée de cigarette et pour l’asthme par des allergènes. L’inflammation dans l’asthme concerne principalement les voies aériennes proximales, alors que la BPCO touche principalement les voies périphériques et le parenchyme pulmonaire. Les coupes histologiques de bronches de patients atteints de ces deux pathologies montrent une infiltration de cellules inflammatoires dans les deux cas (Figure 20). En revanche, la couche de cellules musculaires lisses est épaissie uniquement dans l’asthme. La membrane basale est également plus épaisse dans l’asthme, dû à un dépôt de collagène (Fibrose sous-épithéliale), alors que pour la BPCO, le collagène se dépose principalement autour des voies respiratoires (Fibrose péri-bronchiolaire). La perturbation des attachements alvéolaires est retrouvée uniquement dans la BPCO suite à l’emphysème. Le profil des cellules immunitaires impliquées diffère également. L’asthme est caractérisé par une activation des mastocytes, une infiltration des éosinophiles et une augmentation du nombre de cellules Th2 (pour T helper). En revanche pour la BPCO, les macrophages, les neutrophiles et les cellules T cytotoxiques de type 1 sont prédominants (Barnes, 2008).

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Figure 20 : Coupes histologiques de bronches de patients atteints d’asthme ou de BPCO (D'après Barnes, 2008)

2.2 Le stress oxydatif

Le stress oxydatif résulte d’un déséquilibre de la balance oxydants/antioxydants, soit par un excès d’oxydants, soit par un défaut des défenses antioxydantes. Le stress oxydatif joue un rôle important dans de nombreuses pathologies respiratoires, de par leurs effets nocifs directs, mais également en régulant des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’inflammation. De nombreuses études montrent une augmentation des marqueurs de stress oxydatif dans les espaces aériens, le sang ou les urines chez les fumeurs et chez les patients atteints de BPCO (Boukhenouna et al., 2018; Domej et al., 2014).

2.2.1 Oxydants exogènes

La fumée de cigarette constitue la source principale d’oxydants exogènes. Il s’agit d’un mélange complexe de milliers de molécules chimiques (entre 4000 et 7000) générées suite à la combustion des feuilles de tabac (Tableau 11). La fumée de cigarette peut être définie comme un aérosol dynamique qui comprend des gouttelettes de liquides condensés (la phase particulaire ou le goudron) en suspension dans un mélange de composés volatils/semi-volatils et de gaz de combustion (la phase gazeuse). Une seule bouffée de cigarette contient environ 1014-1015 radicaux hautement réactifs à durée de vie courte dans la phase gazeuse et 1017 molécules radicalaires à durée de vie relativement longue dans la phase particulaire.

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Tableau 11 : Constituants majeurs de la phase gazeuse de la fumée de cigarette Composés Concentration/cigarette (% de l'effluant total) Azote 280-320 mg (56-64%) Oxygène 50-70 mg (11-14%) Dioxyde de carbone 45-65 mg (9-13%) Monoxyde de carbone 14-23 mg (2.8-4.6%) Eau 7-12 mg (1.4-2.4%) Argon 5 mg (1.0%) Hydrogène 0.5-1.0 mg Ammoniaque 10-130 μg Oxydes d'azote (NOx) 100-600 μg Cyanure d'hydrogène 400-500 μg Sulfure d'hydrogène 20-90 μg Méthane 1.0-2.0 mg Autres alcanes aromatiques (20) 1.0-1.6 mg Alcènes volatiles (16) 0.4-0.5 mg Isoprène 0.2-0.4 mg Butadiène 25-40 μg Acétylène 20-35 μg Benzène 12-50 μg Toluène 20-60 μg Styrène 10 μg Autres hydrocarbones volatiles (29) 15-30 μg Acide formique 200-600 μg Acide acétique 300-1 700 μg Acide propionique 100-300 μg Formiate de méthyle 20-30 μg Autres acides volatiles (6) 5-10 μg Formaldéhyde 20-100 μg Acétaldéhyde 400-1 400 μg Acroléine 60-140 μg Autres aldéhydes volatiles (6) 80-140 μg Acétone 100-650 μg Autres cétones volatiles (3) 50-100 μg Méthanol 80-180 μg Autres alcools volatiles 10-30 μg Acétonitrile 100-150 μg Autres nitriles volatiles 50-80 μg (D'après Hoffmann & Hoffmann, 2010)

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Le diamètre des particules contenues dans cet aérosol, de l’ordre du sub-micron, entraine un dépôt alvéolaire important et une absorption extrêmement rapide dans le sang systémique. La composition chimique de la fumée de cigarette montre des éléments constants présents à des teneurs variables en fonction de nombreux facteurs comme la température, la durée de combustion, la marque des cigarettes ainsi que le nombre, le volume ou la durée des bouffées (Rennard, 2004). De plus, ces composés subissent de nombreuses réactions chimiques complexes et leur durée de demi-vie est parfois extrêmement courte (Hatsukami et al., 1987). Parmi les milliers de composés on retrouve des alcaloïdes, des hydrocarbures aromatiques polycycliques, des aldéhydes, des espèces réactives de l’oxygène ou ROS (Reactive Oxygen Species) ou des espèces réactives de l’azote ou RNS (Reactive Nitrogen Species) (Tableau 11).

2.2.1.1 Les espèces réactives de l’oxygène

Lors de la respiration normale, on estime que 2% de l’oxygène inhalée est capable de former des ROS. Cette quantité de ROS est fortement augmentée dans le cas de fumeurs. Ceci s’explique par le fait qu’on dénombre une grande quantité d’oxydants et d’espèces radicalaires dans la phase particulaire ou gazeuse de la fumée de cigarette. En effet parmi les 1017 oxydants contenus dans la phase gazeuse, 1014 sont des ROS (Pryor & Stone, 1993) (Tableau 12). Dans la phase particulaire, on retrouve par exemple les radicaux quinones/hydroquinones (Q/QH2) • - qui peuvent réduire l’oxygène pour produire l’anion superoxyde ( O2 ) conduisant à la • génération de H2O2 et un radical hydroxyle ( OH) (Church & Pryor, 1985; Pryor & Stone, 1993). Parmi les ROS hautement réactifs, on retrouve le •OH pouvant endommager tous les types de macromolécules lors d’une collision, de ce fait il possède une durée de vie limitée avec une diffusion de seulement une nanoseconde (Winterbourn, 2008). Les radicaux hydroxyles peuvent être générés par la chimie de Fenton, qui consiste en la réaction entre H2O2 et le fer ferreux (Fe(II)) ou le cuivre cuivreux (Cu(I)). La phase particulaire est riche en fer ce qui favorise la réaction de Fenton et la formation de •OH dans les poumons (Yi et al., 2014). A l’inverse, H2O2 est un ROS relativement stable qui peut diffuser sur des distances importantes à partir de son site de production (Winterbourn, 2008). Il peut être produit à partir de la réaction entre l’anion superoxyde et le radical hydroxyle correspondant à la réaction d’Haber-Weiss (Nakayama et al., 1989; Zang et al., 1995). Le peroxyde d’hydrogène à faible dose peut servir de molécule de signalisation. En revanche pour des concentrations plus élevées il présente un fort effet délétère pour les cellules (Marinho et al., 2014; Veal et al., 2007). L’ozone (O3) est issu de la réaction entre des gaz précurseurs libérés par la combustion de carburants automobiles

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et l’oxygène atmosphérique sous l’influence des rayonnements UV solaires. Il constitue un polluant atmosphérique majeur responsable de la diminution des fonctions pulmonaires (Nightingale et al., 1999).

Tableau 12 : Principales espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de l’azote (RNS)

Nom Formule Caractéristiques • - Hyperoxyde/superoxyde O2 Hautement instable, Fonction de signalisation, Plasticité synaptique Hydrogène peroxyde H2O2 Toxicité cellulaire, Fonction de signalisation, Génération d'autres ROS Radical hydroxyle •OH Radical libre, Hautement instable, Très réactif Radical alkoxyle RO• Radical libre, Produit de réaction avec les lipides Radical peroxyle ROO• Radical libre, Produit de réaction avec les lipides Anion Hypochlorite OCl- Espèce réactive de l'oxygène, espèce réactive du chlore, généré enzymatiquement par la myeloperoxydase 1 Oxygène singulet O2 Molécule d'oxygène induite/excitée, forme radicalaire et non radicalaire Ozone O3 Toxine environnementale Oxyde nitrique •NO Toxine environnementale, molécule de signalisation endogène - • • Peroxynitrite ONOO Intermédiaire très réactif de la réaction entre O2 et NO • Dioxyde d'azote NO2 Radical hautement réactif, toxine environnementale • Oxyde d'azote NOx Toxine environnementale, incluant NO et NO2, dérivé du processus de combustion (D'après Domej et al., 2014)

2.2.1.2 Les espèces réactives de l’azote

La phase gazeuse contient également des molécules réactives dérivées de l’azote comme • • - l’oxyde nitrique ( NO), le dioxyde d’azote ( NO2) et le peroxynitrite (ONOO ). Ces molécules sont des ROS et des RNS. La fumée de cigarette contient entre 74,5-1008 ppm (pour partie par million) de •NO et représente ainsi l’un des principaux ROS et RNS auxquelles les fumeurs sont • exposés (Chambers et al., 1998). NO a une demi-vie courte (t1/2 de 0,09 à 2 s), cependant il • - réagit rapidement avec O2 pour former du peroxynitrite (constante de vitesse du second ordre ~ 2,4 ± 0,3 × 106 M-2.s-1) (Lewis & Deen, 1994; Szabó et al., 2007; Thomas et al., 2001). Ce dernier est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques (Ferrer- Sueta & Radi, 2009; Radi, 2013). Il possède une très forte capacité d’oxydation et de nitration, pouvant intervenir sur de nombreuses molécules comme l’ADN ou les protéines. Les modifications protéiques les plus importantes médiées par le peroxynitrite sont la nitration et la

85 dimérisation des résidus de tyrosine, l'oxydation du groupement thiol des cystéines, ainsi que l'oxydation du soufre de la méthionine. Dans des systèmes biologiques, le peroxynitrite peut réagir rapidement avec le dioxyde de carbone, conduisant à la formation de radicaux carbonates • - ( CO3 ) et du dioxyde d’azote (NO2). Il peut également se décomposer pour former des radicaux • • • OH et NO2 (Szabó et al., 2007). Le NO a aussi la capacité d’interagir avec les radicaux peroxydes lipidiques organiques (ROO•) présents dans la fumée de cigarette pour former des peroxynitrites d’alkyles (ROONO) qui sont des espèces cytotoxiques. De plus, les nitrates sont utilisés pour favoriser la combustion de la cigarette. Ces nitrates sont incriminés dans la formation des nitrosamines qui sont mutagènes et carcinogènes. Les gaz d’oxyde d’azote sont formés par la combustion d’acides aminés et de protéines contenant de l’azote dans la feuille de tabac (Hoffmann et al., 1997). La fumée de cigarette contient essentiellement du NO avec des traces de dioxyde d’azote (NO2) et d’oxyde nitreux ou protoxyde d’azote (N2O).

2.2.1.3 Composés carbonés Les composés carbonés regroupent les aldéhydes et les cétones. Ils sont très étudiés en raison de leur réactivité et de leur forte concentration (environ 1 mg généré par cigarette). Les aldéhydes les plus présents dans la fumée de tabac sont l’acétaldéhyde, l’acroléine et le formaldéhyde (Counts et al., 2005; Hoffmann & Hoffmann, 2010). Ces molécules induisent un stress carbonyle qui se définit par l’accumulation d’espèces réactives carbonées et la carbonylation des protéines adjacentes. Elles sont formées par l’oxydation des glucides, des lipides, de l’ADN et des protéines (Frohnert & Bernlohr, 2013; Kirkham & Barnes, 2013). Les composés carbonés sont relativement stables, extrêmement hydrophiles et chimiquement réactifs. Contrairement aux ROS, ils peuvent passer la barrière de l’épithélium respiratoire et entrer dans la circulation sanguine où ils augmentent le stress oxydatif systémique et les dommages oxydatifs (Horinouchi et al., 2016). L’acroléine est un aldéhyde α,β-insaturé irritant, hautement réactif retrouvé dans la fumée de cigarette mais également dans l’alimentation ou la pollution (Bein & Leikauf, 2011). En raison de leur fort caractère électrophile, les aldéhydes sont capables de réagir avec les différentes molécules nucléophiles de l’organisme comme les protéines, les lipides, l’ADN ou l’ARN. Par exemple, l’acroléine cible facilement le groupe sulfhydryle de la cystéine, l’imidazole de l’histidine et le groupe amine de la chaîne latérale de la lysine par des additions de Michael (Pizzimenti et al., 2013; Zarkovic et al., 2013).

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2.2.2 Oxydants endogènes

Les oxydants comme les ROS, les RNS et les composés carbonés sont également générés en tant que sous-produits du métabolisme cellulaire. La fumée de cigarette augmente le recrutement pulmonaire de cellules immunitaires comme les neutrophiles ou les macrophages – capables de sécréter des ROS comme O2 ou H2O2 (Hunninghake & Crystal, 1983; Rahman et al., 1996). D’autres sources majeures de ROS endogènes sont la chaîne de transport d’électron de la chaine respiratoire des mitochondries ou les NADPH oxydases (ou NOX) présentent dans une large variété de cellules. Parmi ces cellules on retrouve les cellules phagocytaires et endothéliales qui jouent un rôle central dans les mécanismes de réponse inflammatoire. Par exemple, la NADPH oxydase présente dans les membranes des granules primaires des – phagocytes génère d’importantes quantités de O2 à l’intérieur des phagolysosomes (Babior, – 1999). D’autres enzymes sont capables de former O2 comme la xanthine oxydase contribuant à la formation d’autres ROS ou RNS. La famille des NOSs (pour NO synthase) est une famille d’enzymes capables de catalyser la production d’oxyde nitrique à partir de la L-arginine. La fumée de cigarette semble augmenter l’expression des isoformes solubles de la NOS (principalement la NOS-2) dans une grande variété de types cellulaires comme les macrophages, les plaquettes ou les monocytes (Koppenol et al., 1992; MacMicking et al., 1997; – Müller & Gebel, 1998). Le monoxyde d’azote (NO) va réagir avec O2 pour former des peroxynitrites. D’autres oxydants peuvent être générés par les cellules comme l’acide hypochloreux (HOCl), produit par la myéloperoxydase, ou les radicaux hydroxyles (•OH) obtenus après réaction entre les ions ferreux et H2O2 libérés par les macrophages (Owen, 2005)

(Figure 21). De plus, l’acide hypochloreux HOCl généré en présence de H2O2 peut conduire à la formation de ROS plus toxiques tels que •OH ou l’anion hypochlorite (-OCl) (Hawkins et al., 2003; Salama et al., 2014). Des ROS et des RNS peuvent également être libérés lors du métabolisme des peroxysomes ou lors du processus de maturation des protéines dans le réticulum endoplasmique (Fransen et al., 2012; Zito et al., 2010). La modification des acides gras polyinsaturés (peroxydation lipidique) par des radicaux libres peut générer des peroxydes ou des aldéhydes et ainsi amplifier le stress oxydatif induit par la fumée de cigarette (Gutteridge, 1995). En plus de la peroxydation lipidique, l’acroléine peut être générée par la dégradation de la thréonine par la myéloperoxydase des neutrophiles ou le catabolisme des polyamines comme la spermine ou la spermidine (Stevens & Maier, 2008). L’acétaldéhyde peut être également produit par le métabolisme de l’alcool dans le foie (Voulgaridou et al., 2011). De plus, les

87 cellules épithéliales des voies aériennes exposées au stress carbonylé induisent une surproduction de ROS par les mitochondries conduisant à une réaction en chaîne.

2.2.3 Systèmes antioxydants

Du fait de leur exposition à des sources exogènes et endogènes de stress oxydatif, les poumons ont développé de nombreuses stratégies de défense. Parmi celles-ci on retrouve des systèmes antioxydants non enzymatiques aussi appelés scavengers comme le glutathion (GSH), l’acide ascorbique (vitamine C), l’α-tocophérol (vitamine E) ou l’acide urique. Certaines enzymes peuvent également agir contre les oxydants comme les superoxyde dismutases, les peroxyredoxines, la catalase ou la glutathion peroxydase (Figure 21). Les systèmes antioxydants sont présents dans les compartiments intracellulaires et extracellulaires et protègent les cellules contre les dommages induits par le stress oxydatif (MacNee, 2001; Repine et al., 1997). Les scavengers sont les premières lignes de défense de l’organisme. Parmi eux on retrouve le glutathion réduit (GSH) qui joue un rôle crucial dans les stratégies de défenses antioxydantes. Les concentrations de GSH intracellulaire peuvent varier entre 0,5 à 10 mM en fonction des compartiments cellulaires, les concentrations extracellulaires sont en revanche beaucoup plus faibles (Lushchak, 2012). Plus de 20% du GSH produit est trouvé dans les mitochondries pour neutraliser les ROS de la chaîne respiratoire. En tant que porteur d’un groupe thiol actif, le GSH va interagir avec les ROS/RNS et d’autres composés électrophiles pour former le GSSG (glutathion oxydé) qui pourra être à nouveau réduit sous l’action de la GSH réductase (Lushchak, 2012). Les aldéhydes comme l’acroléine vont réagir rapidement avec le glutathion cellulaire, les cystéines, le N-acétylcystéine (NAC) ou la thioredoxine. Cette addition peut se faire spontanément ou avec l’action de la glutathion-S-transférase. Les conjugués aldéhydes-GSH vont ensuite pouvoir être métabolisés avec l’aide de certaines enzymes comme les aldéhydes déshydrogénases ou les aldo-céto réductases. De plus, le liquide de revêtement de l’épithélium contient une grande quantité de scavengers comme l’acide ascorbique, l’α-tocophérol (vitamine E) ou l’acide urique de l’ordre du micromolaire (Tableau 13). D’autres molécules de plus haut poids moléculaire, comme l’albumine ou la mucine, peuvent agir comme des antioxydants « sacrificiels » en raison de la présence de groupes sulfhydryles libres, sensibles à l’oxydation. On retrouve également dans le plasma des protéines capables de lier le fer comme la céruloplasmine permettant de réduire la production de ROS via la réaction de Fenton (Owen, 2005).

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Tableau 13 : Concentrations physiologiques en antioxydants non-enzymatiques

Antioxydants Plasma (µM) ELF (µM) Acide ascorbique 40 100 Glutathion 1,5 100 Acide urique 300 90 Albumine 500 70 α-tocophérol 25 2,5 β-carotène 0,4 -

ELF : Liquide de revêtement de l’épithélium (Epithelium Lining Fluid) (D'après MacNee, 2001)

L’anion superoxyde est détoxifié sous l’action de la métalloenzyme superoxyde dismutase • - (SOD) qui converti O2 en H2O2 et O2 (McCord & Fridovich, 1969). Différentes SOD existent chez l’Homme et sont classées en fonction des métaux présents dans leur site actif. Ainsi, on retrouve les Cu/Zn-SOD (SOD1 intracellulaire ; SOD3 extracellulaire) et les Mn-SOD (SOD2 mitochondriale) (Omelchenko et al., 2010). Les peroxyredoxines (Prx) sont des enzymes thiol dépendantes qui convertissent H2O2 en eau ou les peroxydes organiques ROOH en alcool. En plus de ce rôle, les Prx diminuent également de manière indirecte les niveaux de HOCl et de • radical OH en réduisant leur précurseur H2O2. Les GSH peroxydases (GPx) sont également capables de convertir H2O2 en eau. Il s’agit d’enzymes tétramériques possédant quatre atomes de sélénium au niveau de leur site actif. Il en existe quatre chez les mammifères présentant une large distribution tissulaire (Margis et al., 2008). Ces enzymes éliminent H2O2 en oxydant le GSH monomérique en glutathion oxydé sous forme de disulfure (GSSG). Le glutathion oxydé est ensuite réduit en GSH sous l’action de la glutathion réductase (Figure 21). Une autre enzyme jouant un rôle crucial dans l’élimination de H2O2 en eau est la catalase, une protéine homotétramérique cytoplasmique. L’expression de la catalase a été rapportée dans de nombreux types cellulaires comme les cellules alvéolaires de type II et les macrophages (Rahman et al., 2006). Finalement, les thioredoxines (Trxs) sont des enzymes sensibles au statut redox, capables de réduire les ponts disulfures des protéines en sulfhydryles en utilisant les équivalents réducteurs NADPH. La Trx oxydée va revenir à son état initial sous l’action de la Trx réductase.

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Figure 21 : Régulation des systèmes oxydants et antioxydants pulmonaires Les systèmes oxydants sont en rouge et les systèmes antioxydants sont en bleu. GSH : glutathion réduit ; GSSG : glutathion oxydé ; MPO : myéloperoxydase ; NOX : NADPH oxydase ; NO : oxyde d’azote ; NOS : NO synthase ; SOD : superoxyde dismutase (D'après Owen, 2005).

2.2.4 Déséquilibre de la balance oxydants/antioxydants dans la BPCO

Chez les fumeurs, le nombre de macrophages alvéolaires augmente d’au moins 2 à 4 fois et celui des neutrophiles de 10 fois par rapport aux non-fumeurs (Hunninghake & Crystal, 1983). De plus, des études in vitro montrent que les leucocytes alvéolaires et les macrophages de - fumeurs libèrent une quantité plus importante d’oxydants comme O2 et H2O2 en comparaison avec ceux des non-fumeurs (Ludwig & Hoidal, 1982; Schaberg et al., 1992). Des résultats similaires ont été observés chez des patients atteints de BPCO (Linden et al., 1993; Renkema et al., 1993; Selby et al., 1991). De plus, il a été reporté un disfonctionnement mitochondrial avec une expression excessive de ROS chez les fumeurs ou les patients avec une BPCO (Hoffmann et al., 2013; Sureshbabu & Bhandari, 2013; Wiegman et al., 2015). La xanthine • - oxydase, qui génère O2 , est également augmentée dans les BALF des patients atteints de BPCO (Pinamonti et al., 1996). La concentration d’autres oxydants est augmentée comme celle de HOCl estimée à plus de 5 mM dans les fluides interstitiels des tissus enflammés (Pattison et al., 2009) ou l’expression de NO conduisant à la formation de ONOO- dans des cellules exposées à la fumée de cigarette (Koppenol et al., 1992; Müller & Gebel, 1998). Le déséquilibre est amplifié par la diminution des défenses antioxydantes. Par exemple une forte déplétion des groupements sulfhydryles des protéines plasmatiques, de la bilirubine et de l’acide ascorbique

90 a été mise en évidence in vitro suite à une exposition à la fumée de cigarette (Cross et al., 1993). En effet, les fumeurs ont des concentrations sériques d’ascorbate inférieures de 15 à 20% à celles des non-fumeurs (Duthie et al., 1991; Lykkesfeldt et al., 1996). La déplétion des antioxydants plasmatiques est corrélée avec un niveau élevé de protéines carbonylées et de peroxydes lipidiques. A l’inverse, le GSH est augmenté dans les ELF chez les fumeurs chroniques. Cette augmentation du GSH dans les BALF (pour Broncho-Alveolar Lavage Fluid) peut s’expliquer par une perméabilisation cellulaire conduisant à la diffusion passive du GSH vers l’espace extracellulaire. Cependant, malgré une concentration deux fois plus importante, le GSH ne semble pas suffisant pour faire face au stress oxydatif (Cantin et al., 1987; Linden et al., 1993; Morrison et al., 1999). A l’inverse, des travaux ont montré une déplétion du GSH intracellulaire associée avec une diminution de l’activité des enzymes impliquées dans son statut redox comme la GSH peroxydase. Rahman et ses collaborateurs ont étudié le métabolisme du GSH après une exposition à la fumée de cigarette in vitro et in vivo. Ils ont montré que la déplétion intracellulaire du GSH était dose et temps dépendante, et corrélée avec la formation de GSH-conjugués (Morrison et al., 1999; Rahman et al., 1995a, 1995b). Par exemple, des aldéhydes comme l’acroléine, dont le niveau est augmenté chez les fumeurs et les patients avec une BPCO, peuvent modifier de manière irréversible le glutathion des cellules épithéliales pulmonaires (Corradi et al., 2003; Salaspuro & Salaspuro, 2004; van der Toorn et al., 2007). L’exposition à des oxydants modifie également des voies de signalisation impliquant la diminution de l’expression d’enzymes antioxydantes. Par exemple, l’expression du TGF-β (pour Transforming Growth Factor) est augmentée dans la BPCO, ce qui inhibe l’expression de la catalase ou de SOD2 (Michaeloudes et al., 2011). De la même manière, plus de 200 enzymes antioxydantes sont sous le contrôle du facteur de transcription Nrf2 (pour Nuclear erythroid-2-related factor 2) qui active l’expression des gènes antioxydants en se fixant sur les éléments de réponse dans leur promoteur. Les patients atteints de BPCO ont une expression réduite des gènes antioxydants sensibles au Nrf2 en raison d’une activité plus faible de ce dernier, impliquant une diminution des défenses antioxydantes enzymatiques (Kobayashi & Yamamoto, 2006; Mercado et al., 2011). L’ensemble de ces mécanismes conduisent au déséquilibre de la balance oxydants/antioxydants en faveur des oxydants générant de nombreuses lésions pulmonaires.

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2.3 Balance protéases/antiprotéases

2.3.1 Origine et concept

Deux observations dans les années 60, l’une clinique et l’autre expérimentale, ont conduit à l’hypothèse d’un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases dans la pathogénèse de l’emphysème. La première observation était que la déficience génétique de l’α1-antitrypsine (AAT), un inhibiteur de l’élastase de neutrophile (HNE), est associée à un emphysème pulmonaire précoce, non lié au tabagisme (Laurell & Eriksson, 1963). La seconde observation était que l’instillation de papaïne dans les poumons de rats induit un élargissement progressif de l’espace aérien (Gross et al., 1965). Depuis, de nombreuses protéases dégradant l’élastine pulmonaire, ont montré des résultats similaires. On retrouve, par exemple, l’élastase pancréatique porcine (Karlinsky et al., 1983), l’HNE et la protéinase 3 (PR3) (Kao et al., 1988; Senior et al., 1977). Sur la base de ces observations l’hypothèse de la balance protéases/antiprotéases a été formulée : L’inhalation de la fumée de cigarette (ou d’autres polluants) entraîne le recrutement de cellules inflammatoires dans les poumons. Ces cellules libèrent diverses protéases en excès par rapport aux inhibiteurs de celles-ci. Ces enzymes incontrôlées dégradent les composants de la matrice extracellulaire (MEC), essentiellement l’élastine, conduisant à la destruction des parois alvéolaires et l’élargissement de l’espace aérien. En raison de l’association entre la déficience congénitale de l’AAT et l’emphysème pulmonaire, les premières études ont porté sur le rôle de l’HNE dans l’élargissement de l’espace aérien. Bien que l’activité excessive d’HNE dans les poumons ait un rôle crucial dans l’emphysème, d’autres protéases comme les MMPs et les cathepsines à cystéine sont également impliqués dans ce processus.

2.3.2 Les protéases et leurs inhibiteurs dans la BPCO

L’importance d’HNE dans la BPCO a été confirmée par de nombreuses études. Par exemple, il a été montré qu’AAT pouvait être inactivé par une exposition à la fumée de cigarette augmentant ainsi l’activité d’HNE. De plus, l’inhibition de l’élastase de neutrophile chez des cobayes exposés à la fumée de cigarette réduit nettement l’emphysème et la réponse inflammatoire des neutrophiles (Wright et al., 2002). L’HNE joue un rôle dans la dégradation de la MEC, mais également dans l’entretien de l’inflammation en participant à la maturation de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, -2, -6, TNF-α) et de zymogènes issus d’autres classes de protéases comme la procathepsine B ou les pro-MMP-2, -7 et -9 (Garcia-Verdugo et al., 2010).

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Les neutrophiles sont également capables de sécréter d’autres protéases à sérine comme la cathepsine G ou la PR3. En effet, de fortes concentrations de protéases à sérine sont retrouvées dans les fluides bronchiques lors de pathologies pulmonaires comme la BPCO (10-9 à 10-7 M) (Korkmaz et al., 2010). Comme l’HNE, ces protéases peuvent induire la sécrétion de mucus (Sommerhoff et al., 1990; Witko-Sarsat et al., 1999). Les MMPs jouent également un rôle important dans la BPCO (Shapiro & Senior, 1999). Elles sont classées en fonction de leur structure et leur spécificité de substrat et comprennent : les collagénases (MMP-1, -8, -13 et - 18), les gélatinases (MMP-2 et -9), les stromélysines (MMP-3, -10, -11 et -27) et les matrilysines (MMP-7 et -26). De nombreuses études ont montré que l’expression des protéases à sérine (cathepsine G, PR3 et uPA) et des MMPs (MMP-1, -2, -8, -9, -13 et -14) est augmentée dans les cellules des LBA (Abboud et al., 1998; Finlay et al., 1997; Lim et al., 2000; Reilly & Chapman, 1988; Russell et al., 2002), les BALF (Bronchoalveolar Lavage Fluid) (Betsuyaku et al., 1996, 1999, 2000), les expectorations (Beeh et al., 2003; Cataldo et al., 2000; Culpitt et al., 2005) et les tissus pulmonaires (Damiano et al., 1986; Imai et al., 2001; Kang et al., 2003; Lee et al., 2009) des patients atteints de BPCO ou les fumeurs en comparaison avec les sujets sains. La MMP-12 semble également jouer un rôle crucial dans l’élargissement des voies respiratoires, l’inflammation et l’expression d’autres MMPs dans les poumons (Lanone et al., 2002). De plus, certaines de ces études ont montré une corrélation directe entre le niveau d’expression de ces protéases et la sévérité de la maladie. Les macrophages, en plus de sécréter les MMPs dans les poumons, expriment à leur surface d’autres métallo-protéases : les ADAMs (A Desintegrin and A Metalloproteinase domain). Certaines de ces protéases comme les ADAM-10 et -17 jouent, avec HNE et la MMP-9, un rôle important dans l’hypersécrétion de mucus en activant EGFR (pour Epithelial Growth Factor Receptor) (Deshmukh et al., 2005; Kohri et al., 2002; Shao et al., 2004). HNE, la MMP-9 et -12 participent également à la maturation de cytokines pro-inflammatoires comme IL-8 et le TNF-α (Churg et al., 2003; Van den Steen et al., 2000). Ces protéases sont régulées par des inhibiteurs endogènes : l’AAT, le SLPI (pour Secretory Leukoprotease Inhibitor) et l’élafine pour les protéases à sérine et les TIMPs (pour Tissue Inhibitor of Metalloprotease) pour les MMPs. Le SLPI et l’élafine sont principalement produits par les cellules épithéliales respiratoires, suggérant qu’ils jouent un rôle important dans la BPCO (Tsai & Hwang, 2015). De plus, la concentration de SLPI est beaucoup plus faible chez les patients atteints de BPCO avec des exacerbations fréquentes (Gompertz et al., 2001). Les macrophages alvéolaires sont capables de sécréter le TIMP-1 et le TIMP-2 (Shapiro et al., 1992). Cependant, les macrophages de patients atteints de COPD libèrent moins

93 de TIMP-1 in vitro que ceux des fumeurs sans BPCO et des non-fumeurs (Pons et al., 2005). De plus, la MMP-12 est capable de cliver et inactiver l’AAT augmentant ainsi les dommages pulmonaires médiés par l’HNE. De la même manière, certaines protéases à sérine dont HNE, clivent et inactivent le TIMP-1 ce qui amplifie la destruction des poumons par la MMP-12 (Okada et al., 1988; Shapiro et al., 2003). Il a également été montré que les serpines pouvaient être clivée par les MMPs (Desrochers & Weiss, 1988; Desrochers et al., 1991, 1992; Gronski et al., 1997; Sires et al., 1994). L’augmentation de l’expression des protéases associée à l’inactivation des inhibiteurs endogènes conduit au déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases induisant des lésions pulmonaires. Cependant, d’autres facteurs aggravants comme le stress oxydatif peuvent également amplifier ce déséquilibre.

2.3.3 Action des oxydants sur la balance protéases/antiprotéases

Les oxydants peuvent moduler la BPCO en régulant l’activité des protéases. En effet, les ROS et RNS augmentent l’activité des MMPs en activant les pro-MMPs (Capodici et al., 1989; Okamoto et al., 1997). A l’inverse, HOCl limite l’activité de la MMP-7 in vitro en oxydant deux acides aminés de son domaine catalytique, empêchant ainsi l’interaction avec ses substrats (Fu et al., 2003). Cependant, la régulation de l’activité des MMPs par les oxydants in vivo reste encore incertaine. Les ROS peuvent également activés des protéases à sérine, la kallicréine tissulaire. Cette dernière est présente dans les voies respiratoires sous une forme latente liée à du hyaluronane polymérisé. Les ROS permettent de libérer et d’activer la kallicréine tissulaire en induisant la dépolymérisation du hyaluronane (Casalino-Matsuda et al., 2004). Cette activation induit des mécanismes pulmonaires comme l’hypersécrétion de mucus. Les oxydants peuvent également favoriser l’activité des protéases sérine en inactivant par oxydation certains de leurs inhibiteurs endogènes in vitro : l’AAT, α2-macroglobuline et le SLPI (Hubbard et al., 1987; Kramps et al., 1988). Ces inhibiteurs possèdent une méthionine au sein de leurs sites actifs qui peut être oxydée en méthionine sulfoxyde par les oxydants, ce qui réduit leur capacité à inhiber les protéases à sérine (Carp & Janoff, 1979, 1980; Reddy et al., 1994). Cependant, la question de savoir si l’inactivation oxydative de ces inhibiteurs se produit chez les patients atteints de BPCO reste controversée. En effet, seulement certaines études ont pu mettre en évidence la présence d’ATT oxydé dans des échantillons pulmonaires de patients atteints de BPCO (Abboud et al., 1985; Gadek et al., 1979; Stone et al., 1983). Des résultats similaires ont été observés pour des inhibiteurs d’autres classes de protéases. L’HOCl produit par la myeloperoxydase est capable d’inactiver in vitro le TIMP-1 (Wang et al., 2007). A l’inverse,

94 ce même oxydant inactive la cathepsine G par l’oxydation d’une méthionine au sein de son site catalytique (Shao et al., 2005). Ainsi, l’inactivation des inhibiteurs de protéases pourrait contribuer à la dégradation protéolytique de la matrice extracellulaire dans les poumons. Cependant, bien que la plupart des études soulignent le rôle des oxydants dans l’augmentation de l’activité des protéases, il convient de noter qu’ils sont également responsables dans certains cas de l’inactivation de certaines enzymes matures.

2.4 Les cathepsines à cystéine dans la BPCO

2.4.1 Localisation pulmonaire des cathepsines à cystéine

Des analyses immunohistochimiques indiquent que les cathepsines B, H, L et X sont exprimées de manière ubiquitaire dans les poumons. Les cathepsines B et L sont retrouvées principalement dans les cellules bronchiques, qui sont les premières cellules du poumon a être en contact avec l’environment extérieur, et dans les macrophages (Bühling et al., 1999) (

Tableau 14). La cathepsine H, une aminopeptidase, est également retrouvée dans les cellules épithéliales bronchiques et les macrophages. Elle est également présente en quantités significatives dans les pneumocytes de type II. La cathepsine C est exprimée majoritairement dans ce type cellulaire (Chapman et al., 1994). La cathepsine W, se trouve dans les macrophages ainsi que dans certains lymphocytes (Bühling et al., 2004). Les cathepsines X et S sont principalement exprimées dans les macrophages.

Tableau 14 : Expression des cathepsines à cystéine pulmonaires

Cathepsine Localisation cellulaire B Ubiquitaire, cellules épithéliales bronchiques, macrophages, fibroblastes C Pneumocytes de type II F Macrophages alvéolaires murins H Ubiquitaire, cellules épithéliales bronchiques K Macrophages, cellules épithéliales bronchiques L Ubiquitaire, cellules épithéliales bronchiques, macrophages, fibroblastes S Macrophages, cellules épithéliales bronchiques X Ubiquitaire, macrophages W Macrophages, Lymphocytes (Kasabova et al., 2011, 2014a) La cathepsine K est présente dans les cellules épithéliales bronchiques et alvéolaires ainsi que dans les macrophages Les pneumocytes de type II synthétisent des quantités accrues de

95 cathepsine H au cours de la différenciation (Altiok et al., 2006; Bühling et al., 1999; Lecaille et al., 2008). La cathepsine K est fortement exprimée dans les cellules des couches épithéliales supérieures de l’embryon humain et des extraits tissulaires fœtaux, suggérant un rôle potentiel dans le processus de développement embryonnaire (Haeckel et al., 1999). De plus, la présence de cathepsine S à la surface des cellules aériennes du poumon humain sain pourrait favoriser la motilité de leurs cils et protéger les voies (Chapman et al., 1997).

Figure 22 : Détection des cathepsines B, L, H, K, S, W et X pulmonaires Détection par immuno-histochimie sur du tissu pulmonaire humain A) de la cathepsine L (en rose) dans l’épithélium bronchique (BE), B) de la cathepsine H (en rose) dans les pneumocyes de type II (TIIP) et dans les macrophages alvéolaires (AM), C) de la cathepsine K (en marron) dans le BE, D) des cathepsines S (en marron) et W (en rose) dans les AM. E) de la cathepsine B dans le BE et les AM et F) de la cathepsine X dans le BE et les AM

2.4.2 Cathepsines et déséquilibre protéolytique inflammatoire

En raison de leurs propriétés proinflammatoires résultant de l’extravasation du plasma, de l’activation des mastocytes, des fibroblastes et des macrophages ainsi que la libération de divers médiateurs, les kinines joueraient un rôle important dans l’inflammation pulmonaire. Les kinines, comme la bradykinine (BK) et la kallidine (ou Lys-BK), sont principalement libérés à partir des kininogènes par les kallicréine plasmatiques et tissulaires. Leurs effets pharmacologiques sont médiés par les récepteurs de la bradykinine (Bhoola et al., 1992). Cependant, d’autres voies protéolytiques ont été proposées (pour revue : Veillard et al., 2008). Alors que la cathepsine B clive les kininogènes sans libérer de kinines (Desmazes et al., 2003;

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Naudin et al., 2010), la cathepsine L peut agir comme kininogénase, suggérant qu’elle pourrait représenter une voie alternative pour la production de kinines (Desmazes et al., 2001, 2003; Puzer et al., 2005). A l’inverse, la cathepsine K clive les kinines, libérant des fragments inactifs et altère la concentration des cellules musculaires lisses bronchiques médiée par les récepteurs B2 de la bradykinine chez les rats normaux et hypoxiques chroniques (Godat et al., 2004). Les propriétés kininasiques de la cathepsine K ont été confirmées dans un modèle de rongeur. L’enzyme réduit l’effet hypotenseur de la BK en atténuant la diminution de la tension artérielle induite par la kallicréine (Lecaille et al., 2007b). La bradykinine induit une bronchoconstriction et une hyperréactivité bronchique chez les patients asthmatiques, ainsi des antagonistes pharmacologiques des récepteurs BK réduisent ces effets et améliorent la fonction pulmonaire (Heitsch, 2000). Par conséquent, la capacité de la cathepsine K à dégrader les kinines et ainsi empêcher l’activation des récepteurs, de la BK peut également atténuer la bronchoconstriction au cours des maladies obstructives des voies aériennes (Veillard et al., 2008). La cathepsine L a également été rapportée comme un enzyme de conversion potentielle de l’interleukine-8 (IL- 8). En réponse à des stimuli externes, la cathepsine L est sécrétée par les fibroblastes et semble jouer un rôle important dans la maturation de l’IL-8 au niveau des sites inflammatoires (Ohashi et al., 2003). Par ailleurs, alors que la production d’IL-6, d’IL-18 et de TGF-β reste inchangée, les cellules épithéliales déficientes en cathepsine L sécrètent de cinq à huit fois plus d’IL-8 que les cellules normales. Ces observations soutiennent l’hypothèse que la suppression de l’expression de la cathepsine L conduit à une surproduction d’IL-8 (Wille et al., 2002). De plus, Bühling et ses collaborateurs suggèrent que la cathepsine K pourrait être un marqueur de différenciation des macrophages et d’inflammation (Bühling et al., 2001). L’exposition à l’ozone chez un modèle murin augmente l’expression de la cathepsine S et son inhibition réduit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF), indiquant qu’elle pourrait être une cible dans le traitement de l’hypersensibilité et l’inflammation pulmonaire induite par le stress oxydatif (Williams et al., 2009).

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2.4.3 Cathepsines et dégradation de la MEC (Emphysème)

Le remodelage et la dégradation des constituants majeurs de la MEC pulmonaire et de la membrane basale dépendent essentiellement des protéases à sérine et des MMPs, mais les protéases à cystéine y contribuent également (Barnes et al., 2003; Lecaille et al., 2002a). L’intérêt des cathepsines dans la BPCO a débuté suite à la découverte que l’instillation intratrachéale de cathepsine B dans un modèle animal provoquait un phénotype similaire à l’emphysème humain (Lesser et al., 1992). La rupture des fibres d'élastine conférant l'élasticité des vaisseaux sanguins pulmonaires et des tissus pulmonaires est étroitement associée à l'emphysème (Wolters & Chapman, 2000). Or, les cathepsines B, F, K, L, S et V possèdent une activité élastinolytique (Novinec et al., 2007). Les macrophages dégradent l’élastine à la fois par voie extracellulaire et intracellulaire (Reddy et al., 1995b). Les cathepsines K et S sont principalement impliquées dans la dégradation extracellulaire, alors que la cathepsine V est essentiellement concernée par la digestion lysosomale (Yasuda et al., 2004). Les cathepsines extracellulaires sécrétées par les macrophages sont retrouvées dans les BALFs emphysémateux (Takeyabu et al., 1998) et peuvent contribuer à la dégradation excessive de l’élastine et du collagène observée lors de la BPCO (Lecaille et al., 2002a). En effet, les macrophages alvéolaires de patients atteints de BPCO sécrètent plus de protéases à cystéine actives que les macrophages de fumeurs sains ou de non-fumeurs (Russell et al., 2002b). La protéolyse peut également être favorisée par l’adhérence des macrophages aux fibres, où ils forment un environnement clos et acidifié (Punturieri et al., 2000). Les cobayes exposés à la fumée de cigarette montrent une expression de la cathepsine K trois fois plus importante que celle des cobayes contrôles (Golovatch et al., 2009). Cette augmentation est corrélée avec une dégradation excessive des fibres de collagène et d’élastine des alvéoles pulmonaires. De la même manière, de nombreuses études ont montré une augmentation de la cathepsine L dans les BALFs de fumeurs atteints d’emphysème. De plus, les lysats de macrophages issus de patients fumeurs présentent une activité élastinolytique sept fois supérieure à celle des lysats contrôles (Chapman et al., 1994; Reilly et al., 1991; Takahashi et al., 1993; Takeyabu et al., 1998). D’autres études ont montré que le taux des cathepsines B et S est élevé suite à une exposition à la fumée de cigarette ou chez les patients avec une BPCO via IL-18 (Kang et al., 2007). En se basant sur l’hypothèse que les cytokines régulent l’activation des macrophages conduisant à la libération de cathepsines, des modèles murins surexprimant IFN-γ ou IL-13 ont été développés. Ces souris présentent un phénotype proche de la BPCO humaine avec un emphysème et un élargissement des voies respiratoires. Ces modifications sont corrélées avec une expression

98 accrue des MMPs et des cathepsines B, H, K, L et S. De plus, le traitement de ces souris avec un inhibiteur générique des cathepsines, l’E-64, les protège de l’emphysème (Wang et al., 2000; Zheng et al., 2000, 2005). La neutralisation de l’IFN-γ par un anticorps inhibe également la sécrétion de la cathepsine S par des macrophages incubés dans des LBA de patients atteints de BPCO (Geraghty et al., 2007a). Ainsi, le contrôle de l’expression pulmonaire de la cathepsine S dans la BPCO semble être majoritairement dépendant de l’IFN-γ. Des résultats similaires ont été montrés dans d’autres types cellulaires (Shi et al., 2003; Sukhova et al., 1998).

2.4.4 Cathepsines et fibrose

Les cathepsines influencent également le développement de la fibrose pulmonaire. Les fibroblastes expriment une grande quantité de cathepsine K. En effet, l’expression de la cathepsine K dans les fibroblastes issus de patients avec une fibrose interstitielle ou de bronchiolite oblitérante est augmentée par rapport aux fibroblastes des tissus pulmonaires normaux. L’expression des cathepsines est également supérieure dans des modèles murins avec une fibrose induite par la bléomycine. Chez des souris knock-out pour la cathepsine K, l’exposition à la bléomycine provoque une fibrose plus importante que chez les souris sauvages. A partir de ces résultats, les auteurs ont conclu que la cathepsine K pouvait être impliquée dans la dégradation de la MEC et pourrait donc contrer l’augmentation des dépôts de matrice responsables du développement de la fibrose pulmonaire. Ainsi, comme observé précédemment pour la silicose (voir paragraphe 1.5.1), la cathepsine K jouerait un rôle protecteur et le développement de la fibrose dans la BPCO pourrait être due à une diminution de son activité collagénolytique (Bühling et al., 2004). De plus, le TGF-β qui est un facteur pro-fibrotique diminue l’expression de la cathepsine K dans un modèle murin de fibrose (van den Brûle et al., 2005).

2.4.5 Cathepsines et déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases

L’équilibre de la balance protéases/antiprotéases peut être perturbé par une sécrétion massive d’enzymes ou par l’inactivation de leurs inhibiteurs endogènes. Ainsi l’HNE peut stimuler l’expression de la MMP-2 et de la cathepsine B par les macrophages (Geraghty et al., 2007b). Les cathepsines B, L et S clivent le SLPI et inactivent sa potentiel inhibiteur vis-à-vis des protéases à sérine, ce qui favorise l’activité de HNE dans l’emphysème pulmonaire (Taggart et al., 2001). La cathepsine L dégrade l’AAT in vitro au niveau de son domaine inhibiteur mais cette observation n’a pas été validée in vivo (Johnson et al., 1986). La cathepsine B quant à elle augmenterait l’activité des MMPs en hydrolysant leurs inhibiteurs endogènes TIMP-1 et TIMP- 99

2 in vitro (Kostoulas et al., 1999). L’activité des cathepsines à cystéine peut être favorisée par l’HNE en participant à la maturation de la procathepsine B ou en inactivant la cystatine C (Abrahamson et al., 1991; Buttle et al., 1991). D’un autre côté, de nombreuses études ont montré une augmentation du taux de cystatine C dans le serum et le BALF de patients atteints de BPCO ou de fumeurs avec un emphysème en comparaison avec des patients sains (Hu et al., 2016; Nakajima et al., 2016; Rokadia & Agarwal, 2012; Takeyabu et al., 1998; Zhang et al., 2014a, 2016, 2014c). Ces résultats suggèrent que la cystatine C pourrait être un biomarqueur pour la destruction des tissus pulmonaires et la sévérité de la BPCO. Le niveau de cystatine C a même été proposé comme un facteur prédictif de mortalité après une exacerbation de BPCO (Hu et al., 2016). Nakajima et al., ont mis en évidence des taux plasmatiques de cathepsine S et de cystatin C significativement élevés par rapport aux sujets sains. Ces résultats suggèrent que les concentrations de cathepsine S et le taux de cathepsine S/cystatine C pourraient servir de biomarqueurs potentiels pour la BPCO (Nakajima et al., 2016). L'activité de la cathepsine B augmente nettement dans les homogénats pulmonaires et dans les liquides de lavage broncho- alvéolaire (BALF) du modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine après 14 jours. Au contraire, le taux de la cystatine C, n'est pas affecté dans le BALF des souris de type sauvages et déficientes en cathepsine. Par conséquent, la cystatine C murine n'est pas un marqueur fiable de fibrose au cours de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (Kasabova et al., 2016). Ces données contrastent fortement avec des analyses antérieures effectuées sur le BALF humain de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique, pour lesquels le taux de cathepsine B restait inchangé, tandis que la cystatine C était significativement augmentée (Kasabova et al., 2014b). Ces résultats suggérent que même si le modèle de fibrose induite par la bléomycine chez les rongeurs est largement utilisé pour déchiffrer analyser ou décrypter les mécanismes protéolytiques de la fibrinogénèse, la transposition des résultats à la fibrose humaine doit être faite avec prudence. L’importance des cathepsines dans les mécanismes de fibrose a été confirmée grâce à des sondes d’activité qui montrent une augmentation des cathepsines actives localisées au niveau des lésions fibrotiques. Ces résultats ont été validés chez des modèles murins traités à la bléomycine, dans des biopsies de patients humains et chez des patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique grâce à une méthode d’imagerie non invasive (Withana et al., 2016).

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2.5 Régulation des cathepsines par le stress oxydatif

Comme vu précédemment, les poumons sont soumis à de nombreux oxydants exogènes et endogènes (Chapitres 2.2.1 et 2.2.2). Le terme de stress oxydatif est communément utilisé pour désigner une situation dans laquelle l’homéostasie redox cellulaire, c'est-à-dire l’équilibre entre les oxydants et les antioxydants est altérée, en raison d’une production excessive de ROS et/ou d’une altération des mécanismes antioxydants cellulaires. Par analogie, le terme de stress nitroactif a été inventé par Stamler et ses collègues pour la formation excessive ou dérégulée de RNS (Hausladen & Stamler, 1999).

2.5.1 Réaction des protéines avec les oxydants

Parmi les oxydants responsables des lésions pulmonaires, on retrouve les ROS capables de réagir avec les acides gras polyinsaturés, les glucides, l’ADN et les protéines (Höhn et al., 2013). Les modifications oxydatives des protéines par les ROS peuvent avoir lieu sur la chaîne polypeptidique et/ou sur les chaînes latérales sensibles des acides aminés. Ainsi les oxydants peuvent avoir plusieurs effets sur les protéines, incluant l’oxydation des chaînes latérales, la fragmentation du squelette protéique, la dimérisation/agrégation, le déploiement ou des changements conformationnels ou l’inactivation enzymatique (Ahmad et al., 2017; Davies, 2003; Gracanin et al., 2009; Stadtman, 2006; Stadtman & Levine, 2003). Le clivage oxydatif des liaisons peptidiques peut intervenir selon deux mécanismes : la voie de l’α-amidation ou la voie du diamide (Garrison, 1987; Garrison et al., 1962). Lors du clivage, le radical hydroxyle réagit avec les protéines en libérant une molécule d’eau et un radical carboné. Ce mécanisme est initié par l’arrachement d’un atome d’hydrogène sur le carbone en α de la liaison peptidique. Le clivage de la liaison peptidique peut également intervenir après réaction du radical •OH avec les résidus aspartyl, glutamyl et prolyl (Garrison, 1987; Uchida et al., 1990). Les protéines carbonylées peuvent aussi être formées suite à une réaction de Michael entre des résidus nucléophiles et des aldéhydes α,β-insaturés comme l’acroléine. Comme mentionné plus haut, les oxydants peuvent attaquer les chaînes latérales des acides aminés et former de nombreuses modifications (Tableau 15). Bien que la plupart des acides aminés puissent être modifiés, certains d’entre eux, comme la cystéine, la tyrosine et la méthionine, sont particulièrement sensibles à l’action des ROS, des RNS ou des dérivés carbonés. Par exemple, la méthionine sous l’action des oxydants est convertie en sulfoxyde de méthionine puis en sulfone de méthionine. La forme sulfoxyde est réversible suite à l’action de réductases (Kim & Gladyshev,

101

2004; Moskovitz et al., 1996). Les acides aminés aromatiques sont également sensibles à l’oxydation. La phénylalanine peut réagir avec les radicaux hydroxyles ou les métaux de transition. La tyrosine peut être oxydée par l’acide hypochloreux, l’acide peryxonitreux et le nitrosoperoxycarbonate. Parmi les produits formés, on peut citer le o,o’-dityrosine et la 3- nitrotyrosine. Les protéines peuvent également s’agréger en formant des dérivés protéine- protéine suite à des réactions croisées. Ce phénomène peut se produire selon différents mécanismes : (1) l’oxydation de deux cystéines pour former des ponts disulfures intermoléculaires (Garrison, 1987) ; (2) La réaction de Michael entre une histidine, une lysine ou une cystéine et un aldéhyde α,β-insaturé entraîne la formation d’un ajout aldéhydique, pouvant réagir avec l’amine de la lysine d’une autre protéine par une réaction de Schiff (Friguet et al., 1994; Uchida & Stadtman, 1993) (3) par des liaisons croisées Tyr-Tyr (Huggins et al., 1993; van der Vliet et al., 1995).

2.5.2 Oxydation des cystéines

Le groupe fonctionnel thiol présent sur la chaîne latérale des cystéines peut subir de nombreuses modifications oxydatives et jouer un rôle important dans la physiologie humaine (Figure 23). Cette sensibilité à l’oxydation est due au fait que ce groupement est considéré comme le plus nucléophile des chaînes latérales d’acides aminés dans des conditions physiologique. Cette réactivité peut également être corrélée avec la valeur de pKa faiblement acide du site actif de la papaïne (pKa ~ 4/4,5) (Rullmann et al., 1989). De plus, le faible potentiel redox de la cystéine (autour de -270 mV et -125 mV) lui permet lui permet un transfert d’électron rapide (Collet & Bardwell, 2002; Nishinaka et al., 2001). Le type de modification redox sur le résidu cystéine dépend de la concentration et de la proximité des espèces de ROS/RNS, ainsi que de l’environnement de la cystéine libre. Ces modifications post-traductionnelles peuvent se diviser en deux groupes distincts : les formes réversibles comprenant l’acide sulfénique (R-SOH), la formation de ponts disulfures intra- ou inter-moléculaires, la glutathionylation et la nitrosylation ; et les formes irréversibles incluant les acides sulfiniques (R-SO2H) ou sulfoniques (R-SO3H). La formation d’acide sulfénique est la réaction réversible principale intervenant en réponse au stress oxydatif. Cette réaction peut intervenir après une exposition avec des oxydants tels que H2O2 ou HOCl :

(1) R-SH + H2O2 → R-SOH + H2O (2) R-SH + HOCl → R-SOH + HCl

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La formation de pont disulfure est essentielle à la fonction et la stabilité des protéines. Il peut se former selon deux mécanismes : selon une réaction classique d’oxydo-réduction :

(3) 2R-SH → R-S-S-R + 2e- + 2H+

Ou, suite à la réaction de la cystéine avec des ROS/RNS induisant la formation d’un acide sulfénique. Cette forme oxydée est hautement instable et va réagir avec une autre cystéine à proximité pour former un pont disulfure (Moreno et al., 2014).

(4) R-SOH + R’-SH → R-S-S-R’ + H2O

R-SOH peut également réagir avec le glutathion (GSH) conduisant à une S-glutathionylation :

(5) R-SOH + GSH → R-SSG + H2O

Ces deux mécanismes réversibles sont regroupés sont le nom de S-thiolation et ont été proposés comme des mécanismes temporaires de protection utilisés par les enzymes pendant le stress oxydatif pour prévenir des modifications irréversibles de leur site actif (Thomas et al., 2003). Les ROS/RNS peuvent également réagir directement avec le GSH pour former des intermédiaires réactifs comprenant l’acide glutathion sulfénique (GSOH), le disulfure de glutathion (GSSG) et les radicaux glutathiyle. Ces intermédiaires peuvent à leur tour interagir avec un autre GSH ou des protéines contenant des thiols libres introduisant des ajouts glutathion ou des disulfures mixtes pouvant modifier la fonction des protéines (Ying et al., 2007). Dans le cas où R-SOH ne réagit pas avec une fonction thiol adjacente (déplétion ou oxydation des thiols), il peut être suroxydé en R-SO2H par une attaque nucléophile de ce dernier sur une espèce - peroxyde (H2O2 ou ONOO ). Pendant longtemps, R-SO2H était considéré comme un artefact de la purification des protéines. Cependant, des preuves croissantes montrent que cette hyperoxydation n’est pas un événement rare. En effet, l’analyse quantitative des protéines solubles du foie de rat montre que 5% des cystéines existent sous cette forme (Hamann et al., 2002). Les acides sulfiniques sont considérés comme irréversibles, à l’exception de la réduction sélective de la 2-Cys peroxyredoxine par la sulfiredoxine (Biteau et al., 2003; Woo et al., 2005).

R-SO2H sont des intermédiaires stables, mais s’oxydent facilement en acide sulfonique. Avec un pKa d’environ 2, R-SO2H existe exclusivement sous sa forme déprotonée aux pH physiologiques.

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Tableau 15 : Principales formes d’oxydation des chaînes latérales des acides aminés

Acide aminé Produits Références Arginine Glutamique semialdéhyde Amici et al., 1989 Cystéine CyS-SCy ; CyS-SG ; CySOH ; CySOOH ; CysO2H Brodie & Reed, 1990; Garrison, 1987; Takahashi & Goto, 1990; Zhou & Gafni, 1991 Acide Glutamique Acide oxalique ; ajouts pyruvate Garrison, 1987 Histidine 2-Oxohistidine ; 5-OH-glutamate Garrison, 1987; Kopoldová & Liebster, 1963; Uchida & Kawakishi, 1993 Leucine 3-OH-leucine ; 4-OH-leucine ; 5-OH-leucine Garrison, 1987 Lysine α-aminoadipicsemialdéhyde ; Ne-(carboxyméthyl)lysine Amici et al., 1989; Reddy et al., 1995a; Requena et al., 2001 Méthionine Méthionine sulfoxyde ; méthionine sulfone Garrison et al., 1962; Moskovitz et al., 1996; Pryor et al., 1994; Vogt, 1995 Phénylalanine 2-,3-, et 4-hydroxyphénylalanine ; 2,3-dihydroxyphénylalanine Beckman et al., 1992; Davies et al., 1987; Fletcher & Okada, 1961; Gieseg et al., 1993; Maskos et al., 1992a, 1992b; Solar, 1985 Proline Glutamylsemialdéhyde ; 2-pyrrolidone, 4- et 5-OH-proline ; acide Amici et al., 1989; Creeth et al., 1983; Garrison et al., 1962; pyroglutamique Kato et al., 1992; Uchida et al., 1990 Thréonine Acide 2-amino-3-céto-butytique Taborsky, 1973 Tryptophane 2-, 4-, 5-, 6- 7-hydroxy tryptophane ; formylkynurénine ; 3-OH- Armstrong & Swallow, 1969; Guptasarma et al., 1992; kynurénine ; nitrotryptophane Kikugawa et al., 1994; Pryor & Uppu, 1993; Winchester &

Lynn, 1970 Tyrosine 3,4-dihydroxyphénylalanine ; Liaison Tyr-Tyr ; 3-nitrotyrosine ; 3- Beckman et al., 1992; Dean et al., 1993; Domigan et al., chlorotyrosine ; 3,5-dichlorotyroxine 1995; Fletcher & Okada, 1961; Giulivi & Davies, 1993;

Huggins et al., 1993; Ischiropoulos & al-Mehdi, 1995;

Maskos et al., 1992a; van der Vliet et al., 1995 CyS-SCy : pont disulfure ; CyS-SG : liaison Cystéine-Glutathion ; CySOH : acide sulfénique ; CySOOH : acide sulfinique ; CysO2H : acide sulfonique (D’après Stadtman, 2006)

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- Ainsi, le groupe sulfinate (R-SO2 ), qui se comporte comme un nucléophile faible, montre peu de réactivité dans les cellules. De plus, comme il ne peut pas être réduit par des réducteurs cellulaires typiques, son oxydation en acide sulfonique (R-SO3H) semble être la seule réaction pertinente dans les cellules. Des agents oxydants puissants comme les halogènes, le peroxyde d’hydrogène et l’acide nitrique peuvent générer des acides sulfoniques à partir de thiols (Reddie & Carroll, 2008).

Figure 23 : Modifications post-transcriptionnelles des cystéines et des méthionines par oxydation A) Anion thiolate, B) Cystine, C) Acide sulfénique, D) acide sulfinique, E) Acide sulfonique, F) Cystéine-S-sulfate, G) Cystine-S-monoxyde, H) Cystine-S-dioxyde, I) Méthionine disulfure, J) Complexe tétrahédrique Zn-Cys4 (Giles et al., 2003)

Les RNS comme le ONOO- ou •NO peuvent réagir avec les cystéines des protéines ou avec le GSH qui conduit à une S-nitrosation (RS-NO ou GSNO respectivement) (Gatti et al., 1994; Karoui et al., 1996; Mohr et al., 1994). Parmi les thiols mitochondriaux <1% sont modifiés par la S-nitrosation (Prime et al., 2009). Il a également été rapporté que la réaction entre le peroxynitrite et le GSH entraîne de faibles rendements de GSNO (1%) (Moro et al., 1994; Wu et al., 1994). Les ROS peuvent également former le radical thiyl (R-S•) qui va rapidement réagir avec NO pour former un S-nitrosothiol (Zhang et al., 2005). Cette modification est réversible,

105 sa réduction peut conduire à la formation d’un pont disulfure et son hydrolyse à la formation d’acide sulfénique (Reddie & Carroll, 2008).

(6) R-SNO + H2O → R-SOH + HNO

De plus, les groupes sulfhydryles réagissent rapidement avec l’acroléine ou d’autres aldéhydes α,β-insaturés par une addition de Michael pour former un adduit très réactif capable de réagir à son tour avec les groupes aminés voisins pour former des ajouts de type base de Schiff. En effet, le thiolate va attaquer la double liaison au niveau du carbone en position β. Le thiolate peut également venir réagir avec la fonction aldéhyde de ces composés mais avec une moins bonne efficacité (Cai et al., 2009). Bien que l’acroléine puisse réagir avec d’autres acides aminés comme l’histidine, la cystéine reste son site principal de réaction dans les protéines.

2.5.3 Réaction des cathepsines avec les oxydants

La modification de l’environnement redox a été suggérée comme un mécanisme de contrôle pour réguler les cathepsines à cystéine, qui nécessitent un environnement réducteur pour leur activité (Lockwood, 2000). Cependant, des preuves directes de l’inactivation par oxydation de ces enzymes dans les compartiments réducteurs endolysosomaux restent manquantes (Pillay et al., 2002; Wilcox & Mason, 1992). Le thiol de la cystéine (Cys25) du site catalytique est particulièrement sensible à l’oxydation (Ascenzi et al., 2001). La papaïne, l’archétype des cathepsines à cystéine, est inactivée via la nitrosylation de la Cys25 ou la formation de ponts disulfures mixtes suite à l’exposition avec des donneurs de NO (Salvati et al., 2001; Venturini et al., 1998; Xian et al., 2000). De résultats similaires ont été montré suite à la S-sulfénylation de la papaïne en présence du peroxyde d’hydrogène (Lin et al., 1975; Poole et al., 2007). Ces inactivations par S-nitrosylation ou S-sulfénylation dépendent du temps et de la dose en oxydants et sont réversibles suite à l’ajout d’agents réducteurs. Une autre étude a montré que la réaction avec des RNS comme SIN-1, un donneur de peroxynitrite, pouvait inactiver de manière irréversible la papaïne. Cette inactivation irréversible, malgré l’ajout de DTT serait le résultat d’une oxydation en acide sulfinique ou sulfonique. A l’inverse, le traitement avec GSNO induit une S-nitrosylation réversible qui aurait un rôle protecteur pour la papaïne en empêchant son inactivation irréversible par d’autres RNS (Väänänen et al., 2005). L’inhibition par des donneurs de NO est également observée pour des cathepsines à cystéine humaines comme la cathepsine B (Hausladen & Stamler, 1999; Stamler, 1994; Stamler & Hausladen, 1998; Stamler et al., 1992) et la cathepsine K (Percival et al., 1999). L’inactivation de la cathepsine K par les 106 donneurs de NO se fait selon deux mécanismes distincts : en présence de GSH, la génération de NO entraîne l’accumulation de GSNO qui induit la formation de pont disulfure mixte ; en absence de GSH, les donneurs de NO oxydent de manière irréversible la cystéine en acides sulfinique et sulfonique via une oxydation intermédiaire en acide sulfénique. Les donneurs de NO sont également capables d’inhiber l’automaturation de la procathepsine K en forme mature. Des études ont montré que la NADPH oxydase 2 (NOX2) joue un rôle primordial dans la régulation de l’activité protéolytique des cathepsines à cystéine dans le compartiment endosomal des macrophages (Rybicka et al., 2010). NOX2 inactive les cathepsines directement par la production de ROS (anions superoxydes, peroxyde d’hydrogène) ou par la diminution du potentiel réducteur de l’endosome. Les cathepsines B, L et S sont inactivées de manière 1 irréversible par l’oxygène singulet O2 même en présence d’agent réducteur comme le DTT. En 1 revanche, l’activité des cathepsines acides D et E reste inchangée ce qui suggère que O2 cible la cystéine du site actif des cathepsines (Nagaoka et al., 2005; Suto et al., 2007). Le sulfure d’hydrogène, présent dans la phase gazeuse de la fumée de cigarette, est capable d’inhiber la cathepsine S en provoquant une S-sulfhydration (persulfidation) de la Cys25 (Cao et al., 2018). Le peroxyde d’hydrogène inhibe l’automaturation de la cathepsine K et inactive l’activité de la cathepsine K de manière temps et dose dépendante. La cystéine du site catalytique se retrouve soit sous forme d’acide sulfonique (~70% de -SO3H), qui induit une inactivation irréversible; soit sous forme d’acide sulfénique (~30% de –SOH), une modification réversible qui peut être réduit suite à l’ajout du DTT, rétablissant ainsi l’activité de l’enzyme (Godat et al., 2008). Cette inactivation réversible pourrait agir comme un mécanisme de protection et expliquer partiellement le maintien de l’activité des cathepsines à cystéine au cours des phénomènes inflammatoires comme par exemple lors de la silicose (Perdereau et al., 2006). De plus, il a été suggéré que la catalase pouvait participer à la préservation de l’activité protéolytique de ces enzymes au niveau du milieu extracellulaire dans un contexte de stress oxydatif induit par H2O2 1 (Hervé-Grépinet et al., 2008). Lors du stress oxydatif, O2 et O2 peuvent réagir avec certains acides aminés, peptides ou protéines, conduisant à la formation d’hydroperoxydes au sein de leur structure. Ces composés peuvent rapidement inactiver les cathepsines thiol-dépendantes, isolées ou dans les lysats cellulaires, en fonction du temps et de la concentration. Cette inactivation intervient avec une efficacité similaire à celle de H2O2 dans des conditions équimolaires. La réaction entre les hydroperoxydes et la cystéine a été mise en évidence par la perte de la fonction thiol et la formation d’un intermédiaire sulfénique. De plus il a été montré que la cathepsine L est plus sensible à l’oxydation par les protéines hydroperoxydées que la

107 cathepsine B (Davies, 2016; Headlam et al., 2006). Cette différence de sensibilité a également été observée dans un modèle cellulaire montrant une augmentation du stress oxydatif. Les ROS inhibe l’automaturation de la procathepsine L et interrompt ainsi sa fonction de pro-autophagie. En revanche, la maturation de la cathepsine B n’est pas interrompue par les ROS (Nagakannan & Eftekharpour, 2017). Des études ont également montré que les aldéhydes réactifs et les protéines carbonylés inhibent les cathepsines lysosomales en particulier les cathepsines B, L et S en modifiant le résidu cystéine du site actif (Zeng et al., 2006). Lors de l’inflammation dans la BPCO, les oxydants incluant le NO et les RNS réagissent avec les acides gras insaturés pour former des acides gras nitratés (NFAs pour Nitrated Fatty Acids). Une étude a montré que les NFAs régulent négativement l’expression de la cathepsine S et alkylent spécifiquement la Cys25 de l’enzyme, inhibant ainsi son activité élastolytique et sa capacité à promouvoir l’emphysème (Reddy et al., 2016). En raison de la sensibilité des cathepsines vis-à-vis de l’oxydation, une nouvelle stratégie d’inhibition pour ces enzymes a été développée. Il s’agit de composés cycliques redox (RCG pour Redox Cycling Compounds), des molécules capables de générer de fortes concentrations de ROS comme H2O2 (de l’ordre du millimolaire). Ces RCG montrent une forte inactivation des cathepsines en ciblant la cystéine de leur site catalytique (Mirković et al., 2011).

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3. Objectifs de la thèse

Les pathologies inflammatoires pulmonaires sont caractérisées par un recrutement massif de cellules immunitaires au site de l’inflammation. Dans le cas de la BPCO, le recrutement se fait suite à l’exposition à des agents exogènes comme la fumée de cigarette ou d’autres polluants atmosphériques. Les cellules inflammatoires recrutées (neutrophiles, lymphocytes, macrophages) ainsi que les cellules épithéliales pulmonaires vont sécréter une quantité massive de protéases, comme les protéases à sérine, les MMPs et les cathepsines à cystéine (Figure 24). Même si à l’heure actuelle, la majorité des stratégies thérapeutiques vise plutôt à inhiber l’activité les protéases à sérine du neutrophile (HNE, CatG et Pr3) et les MMPs (MMP-2, -9 et -12), l’intérêt du ciblage des cathepsines à des fins interventionnelles dans les pathologies inflammatoires ne cesse de croître. En effet, ces dernières participent, entre autre, au maintien de la réaction inflammatoire et à la dégradation des composants de la MEC et de la membrane basale qui interviennent dans les pathologies comme la BPCO ou l’emphysème. Les cellules inflammatoires vont également être capables de sécréter des oxydants, qui en s’additionnant avec ceux présents dans la fumée de cigarette amplifient le stress oxydatif. Les oxydants vont induire des lésions tissulaires en réagissant avec des nombreuses molécules comme l’ADN, les lipides ou les glucides. Ils peuvent également inactiver de nombreuses protéines, et en particulier des enzymes. Parmi celles-ci, les cathepsines à cystéine sont particulièrement sensibles à l’oxydation, en raison de la présence d’une fonction thiol au sein de leur site catalytique. Pourtant des cathepsines (B, H, L et S) sont surexprimées et retrouvées actives dans les LBA de patients atteints de BPCO ou de fumeurs, bien que la fumée de cigarette constitue un environnement particulièrement défavorable à leur activité (Chang et al., 1986; Reilly et al., 1991; Takahashi et al., 1993; Takeyabu et al., 1998). L’existence d’états d’oxydation réversible de la cystéine du site actif comme l’acide sulfénique a été proposé comme un mécanisme protecteur transitoire, pouvant expliquer - au moins en partie - la résistance des cathepsines au stress oxydatif (Godat et al., 2008; Owen, 2005; Percival et al., 1999). Bien que ce paradoxe soit connu depuis longtemps, les mécanismes moléculaires sous-jacents de la régulation de l’activité enzymatique des protéases à cystéine (caspases, cathepsines) par les oxydants (en particulier dans le cas de la cathepsine S extracellulaire) ont été très peu explorés et restent donc de façon concomitante encore largement méconnus.

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La première partie de mes travaux de thèse a consisté à étudier l’inactivation de la procathepsine S (zymogène) et de sa forme mature en présence d’extraits de fumée de cigarette ainsi qu‘en présence d'une sélection de quatre composés majeurs présents dans la fumée de cigarette : peroxyde d’hydrogène, acroléine, peroxynitrite et formaldéhyde. Nous nous sommes tout d’abord intéressés à l’oxydation globale de la protéine en étudiant les marqueurs de stress oxydatif comme la carbonylation, mais également d’éventuels changements conformationnels. Puis nous avons étudié plus précisément l’oxydation de la cystéine et la formation des formes irréversibles (acides sulfinique et sulfonique) ou réversibles (acide sulfénique) ainsi que la capacité à restaurer l’activité de la cathepsine S après l’ajout de réducteur (Figure 24 (1)).

L’importance du déséquilibre de la balance protéase/antiprotéase en faveur des protéases a été mise en évidence dans de nombreuses pathologies inflammatoires. La surexpression de ces enzymes, comme les cathepsines à cystéine induit de nombreux effets délétères comme la dégradation de la matrice extracellulaire ou l’amplification de la réponse inflammatoire (Figure 24). En effet, les cathepsines K et S sont validées comme des cibles thérapeutiques et plusieurs inhibiteurs sont actuellement en essais cliniques pour le traitement de l’ostéoporose ou l’arthrose dans le cas de la cathepsine K et contre le psoriasis ou la douleur neuropathique dans la cathepsine S. Le développement d’inhibiteurs doit respecter certains critères comme le caractère pseudopeptidique, la sélectivité ou la fixation réversible au niveau du site actif. Pour cela, il existe de nombreux groupes fonctionnels électrophiles, capables d'interagir avec le résidu nucléophile de cystéine situé dans le site actif de l'enzyme comme les aldéhydes ou les nitriles. Les hétérocycles à base de nitriles ont également été identifiés comme des inhibiteurs puissants et sélectifs des cathepsines K et S (Fleming et al., 2010). De plus, il existe une nouvelle stratégie qui consiste à remplacer la liaison peptidique du site de clivage d’un substrat sélectif par une liaison non-hydrolysable. Ces inhibiteurs sont des inhibiteurs pseudopeptidiques de première génération dérivés de séquences substrats.

En collaboration avec l’équipe du Dr Vincent Aucagne, nous avons donc synthétisé des inhibiteurs pseudopeptidiques dérivés de séquences de substrats sélectifs des cathepsines K et S. Ces inhibiteurs nous ont permis de tester l’hypothèse selon laquelle l’introduction de liaisons non-hydrolysables mimant la liaison peptidique native comme un hétérocycle azoté triazole ou une liaison semicarbazide permettrait de conserver la sélectivité et l’affinité du substrat parent.

Lors de travaux préliminaires initiés ultérieurement avec le Pr Luigi Agrofoglio, nous avions conçu des dérivés 1,3,5-triazines substituées avec une fonction nitrile et un cyclohexylamine 110 ou une pipérazine. Ces molécules ont montré un potentiel inhibiteur puissant vis-à-vis de l’ensemble des cathepsines à cystéine testées faisant d’elles d’excellentes molécules candidates pour l’inhibition de ces protéases. Dans le but d’améliorer leur sélectivité une nouvelle série d’inhibiteurs a donc été développée et testée.

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Figure 24 : Régulation de l’activité des cathepsines par des inactivateurs chimiques et pseudopeptidiques (Représentation schématique)

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II- Travaux personnels

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1. Régulation de l’activité de la cathepsine S par les constituants majeurs de la fumée de cigarette

Article 1 : Oxidation of cathepsin S by major chemicals of cigarette smoke M. Wartenberg, P-M. Andrault, A. Saidi, L. Nadal-Desbarats, F. Lecaille & G. Lalmanach (manuscrit en préparation)

Introduction : La BPCO est actuellement la quatrième cause de mortalité aux Etats Unis et deviendra en 2020 la troisième cause de mortalité dans le monde. La BPCO regroupe plusieurs pathologies qui se caractérisent par une limitation du débit d’air progressive et irréversible, qui est associée à une réponse inflammatoire anormale dans les poumons à des substances nocives gazeuses ou particulaires. L’exposition à la fumée de cigarette, source majeure d’oxydants exogènes, est un des principaux facteurs de risque. Parmi ces oxydants, on retrouve principalement les ROS (pour reactive oxygen species), les RNS (pour reactive nitrogen species), semi-quinones et les aldéhydes (acroléine, formaldéhyde…) qui participent au déséquilibre de la balance oxydants/antioxydants. Les cathepsines à cystéine, en raison de la présence d’un groupe sulfhydryle nucléophile hautement réactif au sein de leur site actif, sont très sensibles à l’oxydation. En effet, des études ont montré que les cathepsines à cystéine humaines sont inactivées par les ROS (Godat et al., 2008; Nagaoka et al., 2005; Suto et al., 2007) ou les RNS (Ascenzi et al., 2001; Percival et al., 1999). Pourtant, des cathepsines à cystéine actives ont été retrouvées dans les liquides de lavage bronchoalvéolaire et les expectorations de patients atteints d’inflammations aigues, de mucoviscidose et de silicose, malgré un environnement oxydant défavorable (Naudin et al., 2011; Perdereau et al., 2006; Serveau-Avesque et al., 2006). De plus, nous avons récemment démontré que l’expression de la Cat S est significativement augmentée dans les poumons de fumeurs ou de patients atteints de BPCO (Voir article: P-M Andrault et al - Annexe 1). De manière intéressante, l’activité de la Cat S est partiellement préservée en présence de CSE (pour cigarette smoke extracts). Néanmoins, les mécanismes moléculaires de résistance de la Cat S au stress oxydatif induit par la fumée de cigarette ont été très peu explorés et restent encore aujourd’hui largement méconnus. Dans le but d’expliquer la stabilité inattendue de la Cat S, nous avons sélectionné quatre oxydants prédominants et représentatifs de la fumée de cigarette : le peroxyde 114 d’hydrogène (H2O2), le formaldéhyde (FA), l’acroléine (aldéhyde α,β-insaturé ; accepteur de Michael) et le peroxynitrite (ONOO- ; en utilisant le donneur de peroxynitrite SIN-1). Nous avons ensuite testé leurs effets in vitro sur la pro-Cat S et la Cat S mature.

Résultats : La Cat S est une puissante élastase, qui participe à la dégradation de l’élastine extracellulaire lors de l’emphysème. Nous avons donc vérifié dans un premier temps la capacité de la Cat S à dégrader la DQ-élastine (un substrat fluorescence dérivé de l’élastine) en présence de CSE et des oxydants, dans des conditions mimant la Cat S sécrétée. Comme observée in vivo, la Cat S reste partiellement active en présence de CSE. De plus, à l’exception de l’acroléine, les oxydants présentent une faible inactivation de la capacité élastinolytique de la Cat S. Les constantes cinétiques d’inactivation de la Cat S en présence des quatre oxydants à pH acide (pH des compartiments endosomaux / lysosomaux) et à pH 7,4 (pH du milieu extracellulaire) ont confirmé que le formaldéhyde est un inhibiteur faible vis-à-vis de la Cat S. - ONOO inactive la Cat S de manière similaire à ces deux pH. A l’inverse, H2O2 inactive plus efficacement la Cat S à pH 5,5, tandis que l’acroléine inhibe plus puissamment à pH 7,4. L’oxydation de la Cys25 du site actif de la Cat S a été suivi grâce à une sonde d’activité (ABP pour activity based probe) développée précédemment par notre équipe (Garenne et al., 2015). Une diminution dose- et temps-dépendante du marquage du groupe thiolate par la sonde a été observée. Cette diminution corrobore les constantes cinétiques d’inactivation observées précédemment indiquant que l’inhibition de l’activité de la Cat S est thiol-dépendante. Malgré l’oxydation de la Cys25 et une forte carbonylation de la protéine globale, aucun changement significatif dans l’organisation structurelle de la Cat S n’a été observé. Des études précédentes réalisées dans notre équipe, ont montré que suite à l’inactivation de la Cat K par H2O2, l’ajout d’un réducteur permettait de restaurer ~ 1/3 de l’activité initiale et ceci de manière indépendante

à la concentration en H2O2. Des résultats similaires ont été observés pour la Cat S en présence de H2O2 et de CSE, suggérant qu’il pourrait exister un mécanisme général pour les cathepsines à cystéine humaines. En revanche, l’acroléine inhibe l’activité protéolytique de la Cat S de manière irréversible pouvant s’expliquer par la réaction de cet aldéhyde α,β-insaturé avec Cys25, conduisant à un ajout de Michael stable. ONOO- inactive la Cat S selon un mécanisme différent puisqu'en concentrations élévées, on observe une inhibition irréversible comme décrit précédemment pour d’autres enzymes (Dairou et al., 2004; Josephs et al., 2002; Mohr et al., 1997; Percival et al., 1999). Ces études suggèrent que cette inhibition pourrait résulter de l’oxydation du groupe thiolate du site actif en acides sulfinique et/ou sulfonique (Dairou et al., 2004; Percival et al., 1999; Väänänen et al., 2005). En revanche, pour des doses plus faibles, 115 on observe environ 40% de réversibilité, ce qui correspondrait à la formation d’acide sulfénique réductible (Percival et al., 1999). Il a également été rapporté que les donneurs de NO comme ONOO- peuvent conduire à la formation de S-nitrosothiol (RS-NO), et inactiver l’activité d’enzyme thiol-dépendante de manière réversible. Ce dernier critère a été utilisé pour postuler dans plusieurs études (mais souvent en l’absence de preuves directes ) la présence d’un groupe S-nitrosothiol suite à l’action de NO (Li et al., 1997; Michetti et al., 1995; Mohr et al., 1997; Väänänen et al., 2005). Ainsi, la rareté dans la littérature de preuves concrètes de la formation d’acides sulféniques ou de S-nitrosothiol en réponse aux donneurs de NO, peut s’expliquer en partie par leur labilité et leur détection particulièrement délicate.. Bien que les modifications de la Cys25 suite à l’exposition avec le ONOO- restent incertaines, ces résultats ont cependant permis de mettre en évidence différents mécanismes conduisant à des formes irréversibles et réversibles. Ces dernières formes ont été proposées comme des formes stables correspondant à un mécanisme de protection transitoire vis-à-vis d’oxydants plus nocifs pouvant conduire à une inactivation irréversible (Väänänen et al., 2005). Afin d’essayer de comprendre les mécanismes sous-jacents de cette inhibition partielle de la Cat S, nous avons suivi l’oxydation de la Cys25 en présence de H2O2. L’identification des formes oxydées de la Cys25 suite à une digestion de la Cat S par la trypsine par spectrométrie de masse a été envisagée. Cependant, des études précédentes ont montré que cette technique pourtant puissante et adaptée présentait des limites importantes dans l'analyse des cathepsines à cystéine, puisqu’elle n’a pas permis d’identifier, après digestion par la trypsine, les fragments peptidiques contenant la Cys25 oxydée de la papaïne (utilisée comme témoin pour la famille C1) ou de la Cat K (Godat et al., 2008). Afin de contourner ces limitations techniques, nous avons choisi d’utiliser des redox sensing probes spécifiques ciblant l'acide sulfénique (Qian et al., 2011) ou l’acide sulfinique (Lo Conte et al., 2015). Les résultats montrent une oxydation séquentielle de la Cys25 avec formation dans un premier temps d’acide sulfénique (0-60 minutes) suivi de sa conversion lente en acide sulfinique. La formation retardée de l’acide sulfinique pourrait expliquer la réversibilité observée précédemment en présence de H2O2 et renforcer l’hypothèse selon laquelle l’acide sulfénique pourrait jouer un rôle protecteur. Une étude précédente a montré qu’une forte proportion de proformes était retrouvée dans les expectorations de patients BPCO (Voir article: P-M Andrault et al - Annexe 1), suggérant que les oxydants de la fumée de cigarette pourraient influer sur la maturation de la Cat S. H2O2 inhibe précocement et de manière dose-dépendante la maturation de la pro-Cat S. L’acroléine retarde la maturation plus lentement, selon un mécanisme différent puisqu’une accumulation

116 de forme intermédiaire est observée. A l’inverse, ONOO-, le formaldéhyde et les extraits de cigarettes n’empêche pas la conversion de la Pro-Cat S en Cat S mature. Ceci confirme que

H2O2 est un puissant oxydant à pH acide vis-à-vis de la Pro-Cat S et de la forme mature. Cependant, la fumée de cigarette, ainsi que le formaldéhyde, ONOO-, n’empêche pas la maturation et l’activation de la pro-Cat S, suggérant que les proformes de la Cat S pourraient servir de réservoir de Cat S active relarguée lors d’inflammation pulmonaire.

Conclusion : L’ensemble de ces études ont montré qu’il existe plusieurs niveaux de résistance pour la Cat S en réponse au stress oxydatif induit par la fumée de cigarette. Le premier est la faible inactivation de l’activité élastinolytique et peptidique. En effet, on observe une inactivation faible de la Cat S en présence de CSE et en particulier à pH 7,4. A l’exception de

H2O2 à pH 5,5 et de l’acroléine à pH 7,4, de fortes concentrations d’oxydants (de l'ordre de plusieurs centaines de µM) sont nécessaires à l’inactivation de la Cat S. Le deuxième niveau de résistance est la formation de formes réversibles pouvant avoir un rôle protecteur contre d’autres oxydants. Finalement, la préservation de la capacité d’automaturation de la Pro-Cat S même en conditions oxydatives pourrait renforcer le potentiel élastinolytique des formes matures. Ainsi l’ensemble de cette étude a fourni des indices mécanistiques sur la stabilité inattendue de la Cat S vis-à-vis du CSE, confirmant ainsi sa contribution néfaste dans la BPCO et en particulier durant l’emphysème. Un autre mécanisme pouvant expliquer la résistance est l’influence des antioxydants. Le glutathion (GSH), principal réducteur physiologique intracellulaire, pourrait jouer un rôle protecteur pour la Cat S comme observé pour d’autres enzymes thiol-dépendantes (Dairou et al., 2004; Väänänen et al., 2005). En effet, le GSH est généralement présent à une concentration de 1 – 2 mM et peut atteindre jusqu'à 10 mM dans certaines conditions (Filomeni et al., 2002), jouant ainsi un rôle essentiel sur le statut redox de la cellule. Ainsi, en plus de la capacité du GSH à restaurer l’activité de la Cat S, il serait intéressant d’étudier son rôle de scavenger. La N-actétylcystéine (NAC), utilisée comme traitement dans certaines pathologies comme la mucoviscidose pour son action mucolytique, est capable de restaurer l’activité de la Cat S après exposition à la fumée de cigarette. Ainsi, il pourrait également agir comme scavenger et protéger la Cat S vis-à-vis des oxydants.

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Oxidation of cathepsin S by major chemicals of cigarette smoke

Mylène Wartenberg 1,2, Pierre-Marie Andrault 1,2 *, Ahlame Saidi 1,2,

Lydie Nadal-Desbarats 1,3, Fabien Lecaille 1,2, Gilles Lalmanach 1,2 **

1 Université de Tours, Tours, France 2 INSERM, UMR1100, Centre d'Etude des Pathologies Respiratoires (CEPR), Team « Mécanismes Protéolytiques dans l'Inflammation », Tours, France 3 INSERM, UMR1253, Imagerie et Cerveau (iBrain), Team « Imageries, Biomarqueurs et Thérapies », Tours, France.

* Current address: Department of Oral Biological and Medical Sciences, University of British Columbia, Vancouver (BC), Canada

** Corresponding author: Gilles Lalmanach INSERM UMR1100, Centre d'Etude des Pathologies Respiratoires (CEPR) Team « Mécanismes Protéolytiques dans l'Inflammation » Université de Tours, Faculté de Médecine 10 Boulevard Tonnellé, 37032 Tours cedex, France Tel : (+33) 2 47 36 61 51 – Mail : [email protected]

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Abstract

During smoke-induced emphysema, lung cysteine cathepsin S (CatS) plays a deleterious role in alveolar remodeling via its potent elastin-degrading properties. Despite the presence of a nucleophilic cysteine (Cys25) within its active site, we found that CatS preserved partially its activity after exposure to cigarette smoke extract (CSE), a major source of sulfhydryl oxidants.

This result led us to decipher CatS resistance to major and representative CSE oxidants: H2O2, − formaldehyde, acrolein and ONOO . CatS was inactivated by H2O2 and acrolein in a time- and − dose-dependent manner, while ONOO and formaldehyde were weaker oxidants. H2O2, but not CSE, formaldehyde and ONOO−, impaired the autocatalytic maturation of pro-CatS, whereas acrolein prevented the formation of mature CatS without hindering the initial step of the autocatalytic process. Far-UV CD spectra analysis supported that oxidation by CSE and H2O2 did not led to a structural alteration of CatS, despite a wide protein carbonylation. Evaluation of the oxidation status of Cys25 by specific biotinylated redox sensing probes revealed the sequential formation of sulfenic acid followed by a slower conversion to sulfinic acid after incubation with H2O2. Addition of reducing reagents (dithiothreitol, glutathione and N-acetyl cysteine) led to a partial and dose-independent recovery of CatS activity following incubation − with H2O2 and CSE. Conversely rescue of CatS activity depended on ONOO concentrations. Current results provide some mechanistic evidence of unexpected CatS stability to cigarette smoke, supporting its harmful contribution to the pathophysiology of emphysema.

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Introduction:

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is one of the major causes of death and morbidity worldwide. Although the prevalence of the disease is increasing, no therapies are currently available. COPD is a heterogeneous disease that encompasses emphysema, chronic bronchitis, small airway obstruction and/or fibrosis, and is associated to mucus hyper secretion. The progressive and irreversible airflow obstruction is combined with an abnormal inflammatory response of the lungs punctuated by exacerbation episodes. The mechanistic basis underlying COPD is complex and involves oxidative stress (oxidant/antioxidant imbalance), protease/antiprotease imbalance, but also environmental offense, host genetic and epigenetic factors [1]. Cigarette smoke (CS) exposure serves as the major risk factor for developing COPD, by increasing the epithelium permeability and the recruitment of inflammatory cells that contribute to chronic airway inflammation and pathological lung tissue remodeling. Moreover, CS increases directly the burden of oxidants in the respiratory tract. CS is a complex mixture, which includes condensed liquid droplets and combustion gases. Among these constituents, numerous oxidant chemicals were identified, such as semiquinones and aldehydes (e.g. acrolein, formaldehyde). CS is also the main source of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) to the lungs and the body in exposed individuals. Both species initiate protein oxidation, participate in the alteration of the extracellular matrix, inactivate alpha-1-antitrypsin, the major inhibitor of neutrophil elastase in lung, and may induce • − apoptosis. ROS and RNS include superoxide (O2 ), hydrogen peroxide (H2O2), nitric oxide • − − (NO), or peroxynitrates. NO react with O2 to form peroxynitrite (ONOO ), a highly potent oxidizing molecule, which in turn can react with thiols. Also, ONOO− may cause the nitration of tyrosine to form 3-nitrotyrosine (3-NO2-Tyr), an oxidation product that is detected in greater concentrations in body fluids (urine, plasma, epithelial lining fluid) and the lungs of patients with COPD.

Proteases are key components of regulatory mechanisms, through irreversible cleavage of substrates resulting in their activation, inactivation, or modulation of function [2,3]. Based on their different catalytic machineries, five major classes of proteases are known in mammals including serine, cysteine, metallo, acidic, and threonine proteases, the three first families being the most widespread in mammals. Besides matrix metalloproteinases (MMPs), and their closely related A disintegrin and metalloproteinases (ADAMs) and ADAMs with thrombospondin motifs (ADAMTS), and serine proteases (neutrophil serine proteasess (e.g. elastase, proteinase 3), membrane-anchored serine proteases (e.g. matriptase) or kallikrein- 121 related peptidases), it is now established that lung cysteine cathepsins take part in diverse biological processes and participate in pulmonary homeostasis, although their exact functions need to be clarified [4]. Lung cysteine cathepsins are primarily lysosomal/endosomal proteases that are related to the family C1 (eleven cysteine cathepsins for the : cathepsins B, H, L, S, C, K, O, F, V, X (a.k.a. Z) and W) [5–7]. Cathepsins are produced by a wide variety of cell types including fibroblasts, macrophages and epithelial cells, and could be also found in the pericellular environment as secreted soluble enzymes or associated with cell surfaces [8]. Lung cysteine cathepsins are involved in the degradation/recycling of extracellular matrix and basement membrane constituents as well antimicrobial peptides [9–11]. Their dysregulation contributes to lung illnesses such as emphysema, chronic bronchitis, idiopathic pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, and asthma [9]. Cathepsin S (EC number: 3.4.22.27) remains stable extracellularly, contrary to other related cathepsins that are rapidly inactivated at neutral pH. IL-13, IFN-γ, IL-1 and TNF-α stimulate the expression of cathepsin S (CatS) in murine models of induced COPD disease. Additionally, cigarette smoke extract (CSE) enhances production of IL-18 (an IFN-γ inducing factor), which subsequently induces the expression of CatS in murine lung macrophages as well as in human lung tissues from COPD smokers, as demonstrated by immunohistochemistry studies. Treatment by pharmacological inhibitors of CatS, a highly potent elastin-degrading enzyme, significantly reduces the severity of emphysema and inflammation in mice. However, the proteolytic activity of CatS was not evaluated in these studies. Otherwise, we identified active cysteine cathepsins in bronchoalveolar lavage fluids and sputa of patients with acute inflammations, cystic fibrosis and silicosis [12–14]. By using an in vitro model of monocytic THP-1 cells, we observed the presence of a constitutive peroxidase (catalase) activity that may protect extracellular cathepsins against H2O2, providing a reliable but limited explanation to the unexpected stability of secreted cathepsins to oxidation [9,15,16]. Recently, we demonstrated that CatS expression is significantly increased in the lung of current smokers, while CatS activity is retained for a while in the presence of CSE (Andrault et al., manuscript in preparation). Given its compelling elastinolytic activity, the cigarette smoke-dependent overexpression of CatS supports that the protease may be harmful to lung homeostasis and play a deleterious role in the pathophysiology of COPD. Cysteine is a key of enzyme function/regulation that may exist at different oxidative states (see for review: [17]). The sulfhydryl group of the conserved thiolate- imidazolium pair (Cys25, His159) of the active site of cathepsins acts as a highly reactive nucleophile in a combination of covalent and acid-base catalysis [18]. Cys25 was also reported

122 to be highly sensitive to oxidations and chemical modifications, consistently to its low acidic pKa (pKa ~ 4/4.5) [19]. For instance, cysteine cathepsins B, K and L were inhibited time- and dose-dependently by peroxides [16,20,21]. Analogous observations were reported for caspases [22]. Nevertheless the resistance of thiol-dependent cathepsins, and especially CatS, to oxidative stress induced by CSE remains a puzzling question, which has never been addressed at our knowledge. To tentatively understand these apparently conflicting statements, we decided to decipher in vitro molecular mechanisms of CatS resistance to CSE. Among numerous chemicals found in a cigarette puff, we selected four predominant and representative chemical oxidants to tentatively provide a mechanistic rational to unexpected CatS stability: hydrogen peroxide (H2O2), formaldehyde (FA), acrolein (a.k.a propenal, a Michael acceptor) and peroxynitrite (ONOO−; using SIN-1 as the peroxynitrite donor), respectively.

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Material and methods:

Chemicals and oxidants: Schiff’s reagent, L-3-carboxy-trans-2, 3-epoxy-propionyl-leucylamide-(4-guanido)- butane (E-64), ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), polyethylene glycol lauryl ether (Brij35), dithiothreitol (DTT), glutathione (reduced form, GSH) and N-acetyl cysteine were obtained from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Benzyloxy-carbonyl-Phe-Arg- 7-amino-4-methyl coumarin (Z-FR-AMC) was purchased from Bachem (Bubendorf, Switzerland). SIN-1 (3-Morpholinosydnonimine, HCl) was supplied by Calbiochem (Merck

Millipore SAS, Guyancourt, France). Hydrogen peroxide (H2O2), formaldehyde (FA), and acrolein (Prop-2-enal) were supplied by Sigma-Aldrich. The OxyBlot protein oxidation detection kit was provided by Calbiochem.

Enzymes: Recombinant human procathepsin S was expressed in Escherichia coli and purified as previously described [23]. Processing of pro-CatS to mature active CatS was conducted in 0.1 M sodium acetate buffer pH 4.0, containing 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35, for 5 h at 26°C [24]. The activity buffer of CatS was 0.1 M sodium acetate buffer pH 5.5, containing 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35. Cat S activity was recorded using as substrate Z-FR- AMC (λex = 350 nm, λem = 460 nm). The fluorescence release was monitored using a Spectramax Gemini spectrofluorimeter (Molecular Devices, Saint Grégoire, France). The active concentration of CatS was determined by titration with E-64. Catalase from bovine liver was supplied by Sigma-Aldrich.

Probes:

Biotinyl-(PEG)2-Ahx-Leu-Val-Gly-DMK, a cystatin-derived activity-based probe, was synthetized as described elsewhere [25]. The sulfenic acid probe, biotin-1,3-cyclopentanedione (BP1) was purchased from Kerafast, Inc. (Boston, MA, USA). The NO-Bio sulfinic acid probe that consists of a 2-nitroso terephthalic acid warhead coupled to a biotin tag by a PEG spacer was supplied by Kerafast. The extravidin-peroxydase conjugate came from Sigma-Aldrich.

Preparation of cigarette smoke extracts (CSE):

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CSE was prepared as previously described (Andrault et al., manuscript in preparation). Mainstream smoke of three filter Research-grade cigarettes (reference: 3R4F; Kentucky Tobacco Research and Development Center at the University of Kentucky, Lexington, KY) was bubbled in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5 (50 mL) or in 100 mM HEPES buffer, pH 7.4 (50 mL) in a closed environment (average burning time/cigarette: ~8 min). The obtained solution was considered as 100% CSE, and was aliquoted and stored at -80 °C. CSE preparation was standardized by measuring the absorbance of polycyclic compounds (quinic acid and nicotine) (λ=320 nm; Cary 100 spectrophotometer, Agilent Technologies, Courtaboeuf, France).

Inactivation of elastinolytic activity of cathepsin S: The elastinolytic activity of CatS (1 nM) was recorded using DQ-elastin (2.5 µg/mL, Thermo Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) as a fluorogenic substrate (λex = 490 nm, λem = 515 nm) in the presence of increasing amounts of CSE (0-10%) during 30 min at 37°C in 0.1 M HEPES buffer pH 7.4, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT (Cary Eclipse spectrofluorimeter, Agilent Technologies). The same assays were repeated in the presence of increasing concentrations (0- 500 µM) of four representative CS oxidants: H2O2, formaldehyde (FA), acrolein and peroxynitrite (ONOO−), respectively. SIN-1 (range: 0-4000 µM) was used as the parent peroxynitrite donor in order to generate an estimated 0-1000 µM concentration of ONOO− (i.e. four times lower than SIN-1) [26].

Inactivation of cathepsin S by CSE or by major CS oxidants: Kinetic assays: The activity of human catS (1 nM) was measured at 37°C in 0.1 M sodium acetate buffer pH 5.5, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT with increasing amounts of CSE (0-40%) in 96-well microplates (Nunc, Thermo Fisher Scientific), using Z-FR-AMC (20 µM) as substrate (λex = 350 nm, λem = 460 nm). The fluorescence release was monitored using a Spectramax Gemini spectrofluorimeter. The same assay was performed in 0.1 M HEPES buffer pH 7.4, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT. Alternatively, kinetic analysis of CatS inactivation was performed in the presence of CS − oxidants, H2O2 (0-250 µM), acrolein (0-300 µM), FA (0-1000 µM), and ONOO (0-1000 µM), respectively. Assays were performed under pseudo-first-order conditions. Progress curves were fitted by non-linear regression analysis. Experimental data best matched with the first- order equation: P = L. [1-exp (-kobs.t)], where P represents the product formation at time t, L

125 represents the limiting rate and kobs is the apparent first-order rate constant (Enzfitter software;

Biosoft, Cambridge, UK). Values of kinact (the first-order rate constant of enzyme inactivation) were further calculated using the equation kobs = kinact / (1 + S0/Km) as described elsewhere [27], where Km is the Michaelis constant of CatS for Z-FR-AMC (Km = 22 µM, [28] ; S0 = 20 µM).

Plots of kinact values vs oxidant concentrations ([I]) gave a linear fit suggesting that inactivation obeys a single-step mechanism. The slope of plots corresponded to the second-order rate constant kinact/[I] (n=3, three independent experiments).

Endpoint assays: CatS (1 nM) was incubated 20 minutes at 37°C with increasing amounts of CSE (0-40%), H2O2 (0-300 µM), SIN-1 (0-2500 µM), acrolein (0-300 µM) or FA (0-1000 µM) respectively, in 0.1 M sodium acetate buffer pH 5.5, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT. Residual activity was measured using the substrate Z-Phe-Arg- AMC (20 µM) and monitored using a Spectramax Gemini spectrofluorimeter (λex = 350 nm, λem = 460 nm). Alternatively, experiments were also performed in 0.1 M HEPES buffer pH

7.4, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT, using CSE (0-40%), H2O2 (0- 1000 µM), SIN-1 (0-2000 µM), acrolein (0-100 µM) or FA (0-1000 µM). Three independent assays were done in triplicate. Data are represented as the mean of activity % compared to the condition without oxidants ± SEM (n=3).

Maturation of procathepsin S in presence of oxidants or CSE: Autoprocessing of pro-CatS (1 µg) was performed in 0.1 M sodium acetate buffer pH 4.0, 15 µM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 for 0-12 h at 26°C in the presence of increasing concentration of oxidants (0-1000 µM) or in presence of CSE (0-40%). Samples were then diluted in Laemmli buffer, boiled and subjected to a 15% SDS-PAGE under reducing conditions. Gels were stained with Coomassie Brilliant blue G-250. The same experiment was repeated except that samples were further incubated at 37°C with a molar excess (1:200) of Biot-(PEG)2-Ahx-LeuValGly-DMK [25]. After electrophoresis and transfer onto nitrocellulose membrane, samples were incubated with an extravidin-peroxydase conjugate (Sigma-Aldrich, 1:2500 in PBS 1X, BSA 3%, Tween20 0.1%), and visualized by chemiluminescence (ECL Plus Western blotting detection system; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) according to the manufacturer's instructions. The same experiment was completed using a constant amount of oxidants (150 µM) during varying incubation times (0-60 minutes). In parallel, the proteolytic activation of CatS was monitored in 96-well microplates (Nunc microtiter plates). Pro-Cat S (1 µg) was

126 incubated in 0.1M sodium acetate buffer pH 4.0, 15µM DTT, 1mM EDTA, 0.01% Brij 35 for 0-1 h at 26°C with oxidants (150 µM) or in the presence of CSE (10%). Samples were repeatedly removed and immediatly diluted (1:100) in HEPES buffer pH 7.4, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and the release of AMC recorded using Z-FR-AMC (20 µM) as substrate. Values were normalized and expressed as % activity compared to the pro-CatS oxidant-free processing (n=3, three independent experiments).

Evaluation of the oxidation status of CatS by immunodetection of carbonyl groups:

Protein carbonylation of CatS following incubation with H2O2 (0-300 µM) was assessed using the OxyBlot protein oxidation detection kit (Merck Millipore). Briefly, CatS (500 nM) was incubated with increasing amounts of H2O2 at 37°C in 0.1M sodium acetate buffer pH 5.5, 15 µM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 during 30 min before adding catalase (10 nM). Protein samples were further treated with a dinitrophenylhydrazine (DNPH) derivatization solution at room temperature for 15 minutes according to the protocol provided by the supplier. DNPH-tagged CatS was submitted to a 15% SDS-PAGE and tranferred onto a nitrocellulose membrane. Finally, DNPH-derivatized samples were incubated with a murine anti-DNP antibody (1:150), then a peroxydase-conjugated secondary antibody (1:300). The carbonylation level of CatS was revealed by ECL.

Reversibility of CatS activity:

CatS (1 nM) was incubated for 20 minutes with increasing concentrations of H2O2 (0-

500 µM), before adding catalase (10 nM) for 5 min to eliminate the excess of H2O2. Then, DTT (2 mM) was added and the restored Cat S activity was measured by monitoring fluorescence release using Z-FR-AMC (20 µM) as substrate (λex = 350 nm, λem = 460 nm; Cary eclipse spectrofluorimeter, Agilent Technologies, France). The experiment was repeated in 0.1 M HEPES buffer pH 7.4, containing 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35 and 15 µM DTT with increasing concentration of H2O2 (0-500 µM). Data were expressed as the mean±SD (n=3, three independent experiments). Alternatively similar assays were performed with acrolein (0-300 µM) and ONOO- (0-1250 µM), or.in the presence of increasing amounts of CSE (0-40%).

Active site labeling of cathepsin S with a biotinylated activity-based probe: CatS (50 nM) was incubated during 30 minutes at 37°C in 0.1M sodium acetate buffer pH 5.5, 15 µM DTT, 1 mM EDTA, and 0.01% Brij 35 with increasing amounts of H2O2 (0-

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1000 µM). The same experiment was performed in 0.1 M HEPES buffer pH 7.4, containing 15 µM DTT, 1 mM EDTA, and 0.01% Brij 35. Following incubation, catalase (10 nM) was added during 5 minutes and the thiolate-directed probe, Biot-(PEG)2-Ahx-LeuValGly-DMK (10 µM) was added during 1h at 37°C. Samples were separated on a 15% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane. Then samples were incubated with an extravidin-peroxydase conjugate and visualized by chemiluminescence (ECL Plus Western blotting detection system) as described above. The same experiment was completed using a constant amount of H2O2 (150 µM) during varying incubation times (0-420 minutes).

Labeling of oxidized CatS by biotin-1,3-cyclopentanedione and by NO-Bio probes:

CatS (50 nM) was incubated with H2O2 (150 µM) for 0 to 300 minutes, at 37°C in 0.1 M sodium acetate buffer pH 5.5, 15 µM DTT, 1 mM EDTA, 0.01% Brij 35. After removal of H2O2 by catalase (10 nM) during 5 minutes, samples were incubated in the presence of biotin- 1,3-cyclopentanedione sulfenic acid (BP1) probe (10 µM) during 1h at 37°C [29].

Alternatively, after removal of H2O2 by catalase, DTT (2 mM) was added to reduce reversible oxidized forms of Cat S. After 30 minutes, recovered free thiols of the active site were trapped irreversibly by incubation with E-64 (100 µM) during 1h at room temperature. Then the samples were incubated 1h at 37°C with the NO-Bio sulfinic acid probe (10 µM), according to Lo Conte et al. (2015) [30]. Lastly reactions for both BP1- and NO-Bio- treated samples were stopped by addition of non-reducing Laemmli buffer and boiling. Samples were further separated on a 15% SDS-PAGE, transferred onto nitrocellulose membrane, incubated with an extravidin- peroxydase conjugate and revealed by chemiluminescence as reported earlier. Bands were quantified by densitometric analysis using the ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Circular dichroism: CD spectra of CatS (0.05 mg/mL) were obtained using a Jasco J-810 spectropolarimeter (Jasco France, Bouguenais, France) equipped with a Peltier thermostat system. The path length of the cell was 0.1 cm (Hellma, VWR International SAS, Fontenay-sous-Bois, France). Far UV measurements (200-250 nm) were performed at 37°C. CD spectra of CatS were recorded in

0.1M sodium phosphate buffer pH 5.5 after 6 h of incubation with 40% CSE, H2O2 (1000 µM) and acrolein (1000 µM), respectively. A CD control assay was done in the absence of oxidants. Baseline recordings were performed before each experiment and subtracted to CatS spectra.

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Data acquisitions were made at 1 nm intervals with a dwell time of 1 s between 200 and 250 nm and averaged from three repeated scans. The observed ellipticity (θd) was converted in mean residue ellipticity using the formula θmr = θd × (M / C × l × nr), where θmr is the mean residue 2 ellipticity (deg.cm /dmol), θd is the observed ellipticity (mdeg), M is molecular weight (g/mol), 3 C is the concentration of cathepsin S (g/cm ), l is the pathlength (cm) and nr is the number of residues. The aminoacid sequence of human CatS was obtained from UniProtKB/Swiss-Prot (ID: P25774) and its secondary structure composition was calculated using "the secondary structure server" [31]. The experimental secondary structure content of CatS was assessed by deconvolution of the CD spectra using the "spectra manager" software (Jasco) (mean ± SEM, n=3).

Chemical stability of CS oxidants: NMR studies: In order to verify the stability over time of acrolein, the molecule was pre-incubated in the different buffers used for the experiments (see previous paragraphs, pH range: 4.0-7.4) for 1 hour, before performing NMR analysis. Acrolein (50 µM) was added to deuterium oxide 99% solution (D2O, 50 µl) to set up the spectrometer (final volume: 210 µl). The resulting solution was transferred to a 3mm NMR tubes (CortecNet, Paris, France). Measurements were performed on a Bruker AVANCE III 600MHZ spectrometer (Bruker Sadis, Wissembourg, France), operating at 14T, with a TCI cryoprobe head, equipped with a Z-gradient coil. NMR measurements were performed at 298 K. Standard 1H NMR spectra were acquired using a “noesypr1d” pulse sequence (relaxation delay of 5 s, mixing time of 10 ms, 8 scans on 64K data points and a spectral width of 12 ppm). Water suppression was achieved by presaturation during the relaxation delay and mixing time (Bruker Sadis). Spectra were corrected for phase distortion and baseline correction. The same NMR experiment was repeated for SIN-1 (50 µM).

Spectroscopic analyses: FA (500 µM) was incubated (0-1 h, 37°C) in the three buffers used for the experiments. Schiff’s reagent (a.k.a. fuchsin-sulphurous acid) was added at t=0 and t=1h, respectively, according to the protocol provided by the supplier (Sigma-Aldrich). Stability of FA was deduced from its aldehyde content measured at λ=553 nm (Spectramax Gemini spectrophotometer). The stability of H2O2 (1000 µM) in the different buffers (0-1 h, 37°C) was determined by monitoring its specific absorbance at 250 nm (Cary 100 UV visible spectrophotometer) [32].

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Results & Discussion:

Inactivation of elastinolytic activity of CatS: Contrary to other cysteine cathepsins that are rapidly inactivated at neutral pH, CatS remains stable and active extracellularly. Earlier studies have demonstrated the key role of CatS in the extensive degradation of elastin fibers, supporting that it contributes to ECM remodeling associated to lung inflammations during COPD and emphysema. Moreover, lung CatS expression correlated positively with pack-years of cigarette smoking. Since both CatS expression and activity are significantly increased in the lung and BALF of current smokers (Andrault et al., manuscript in preparation), we first tested if CatS may degrade DQ-elastin under exposure to cigarette smoke extracts at a neutral pH (pH 7.4) mimicking the pH of the extracellular medium. The mainstream smoke of 3R4F research-grade filter cigarettes (international reference for research purposes; provided by the Kentucky Tobacco Research & Development Center) was used to prepare standardized cigarette smoke extract (CSE) as described in the experimental section. The elastinolytic activity of CatS was only partly impaired in the presence of increasing amounts of CSE (Figure 1a). We repeated experiments in the presence of four selected major chemicals of cigarette smoke: acrolein, formaldehyde − (FA), hydrogen peroxide (H2O2) and peroxynitrite (ONOO ). Acrolein, a Michael acceptor, and − in a lesser extent ONOO , but not FA and H2O2, inhibited in a substantial manner elastinolysis at pH 7.4. Interestingly, although both acrolein and FA encompass an aldehyde function, only acrolein, which is a highly reactive electrophile, inactivated the proteolytic activity of CatS via a Michael addition. In overall, these first results support that cathepsin S exhibits an unexpected resistance to inactivation by cigarette smoke, thus allowing it to maintain elastinolytic activity despite the presence of powerful oxidizing agents. Also these findings endorse previous reports, which showed that cysteine cathepsins were still enzymatically active in bronchoalveolar lavage fluids from patients with acute lung injury and infiltrative inflammatory disorders, despite the exposure to oxidative stress [12].

Kinetics of inactivation by CS oxidants:

First, we assessed the pH-dependent stability of the four reagents (H2O2, acrolein, FA and SIN-1/ONOO-) in order to circumvent any bias associated with a possible damage of the oxidants, depending on the nature of the buffers used. Analyses of the samples by spectrocopy or by 1D NMR supported that molecules were chemically stable (experimental pH range: 4.0-

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7.4) and that their molecular integrity was not affected by the different buffers used here (see: Supplementary figure 1). Accordingly, CatS was incubated for 20 minutes at both pH 5.5 and − pH 7.4, with CSE or in the presence of H2O2, acrolein, FA and ONOO , respectively, before measurements of the residual peptidase activity. Endpoint assays indicated that CSE as well

H2O2 inactivated more efficiently CatS at pH 5.5 than at pH 7.4, while acrolein was more potent at neutral pH (Figure 2). On the other hand, ONOO− inhibited CatS in a similar way at both acidic and neutral pH. As observed above using DQ-elastin as substrate, FA appeared to be a relatively inefficient compound toward CatS. It should be noted that the doses of CSE used here correspond to an extensively wide range (0-40%), since amounts of CSE greater than 10% are severely toxic for primary human bronchial epithelial cells (pHBECs) and induce cell death (Andrault et al, submitted). However, the use of supraphysiological doses of CSE braces that it poorly inhibited CatS activity. Time-dependent analyses of CatS inactivation were further conducted in the presence of increasing concentrations of oxidants (see: Supplementary figure 2). Progress curves were fitted by non-linear regression analysis, and corresponding apparent first-order rate constant (kobs) and first-order rate constant (kinact) were determined. Finally, the second-order rate constants kinact/[I] were obtained by plotting kinact values vs oxidant concentrations ([I]). Plots of kinact values vs ([I]) gave a linear fit suggesting that CatS inactivation may obey a single-step mechanism. Quantitative analysis of the second-order rate constant values confirmed that FA is a weak inhibitor of CatS (Table 1). ONOO− exhibited similar kinact/[I] values at both pH 5.5 and pH 7.4. On the other hand, H2O2 inactivated more effectively CatS at pH 5.5, while acrolein was more potent at neutral pH. Again kinetics results correlate with those monitored during the inactivation of elastinolytic activity at pH 7.4 (Figure 1), sustaining that CatS may have deleterious properties during emphysema, given its high stability against chemical agents contained in cigarette smoke.

Time- and dose-dependent oxidation of Cys25:

First, CatS was incubated with H2O2 (150 µM) or CSE (10%), respectively at both pH 5.5 and pH 7.4 for 0-420 minutes. The activity-based probe Biot-(PEG)2-Ahx-LeuValGly- DMK was further added to tag specifically the nucleophilic Cys25 of the active site [25]. We observed a time-dependent decrease of labeling of the thiolate group (Figure 3). This signal loss was slower at pH 7.4 in agreement with kinetics data, endorsing that CatS is more sensitive to

H2O2 inactivation at acidic pH (pH 5.5). In the presence of CSE, we observed an analogous time-dependent labeling profile with a higher stability of CatS at neutral pH, again matching

131 kinetic analysis of inactivation. Then, CatS was incubated for 30 minutes at both pH 5.5 and − pH 7.4 in the presence of increasing amounts (0-1000 µM) of H2O2, acrolein, ONOO and FA, as well CSE (0-40%). The slight variation of CatS labeling by Biot-(PEG)2-Ahx-LeuValGly- DMK, following incubation with FA, confirmed that this chemical is a poor inhibitor of CatS − at both pH. Also incubations with H2O2, acrolein, ONOO and CSE led to a dose-dependent decrease of active Cys25 labeling that depended on the pH used (Figure 3), and corroborated kinetics data (Figure 2). On the other hand, it is commonly admitted that carbonyl group formation on protein side chains is a broad marker of oxidative stress that is frequently observed in a variety of acute and chronic diseases. Analyses were performed using the OxyBlot protein oxidation method. A dose-dependent increase of carbonylation was noticed in the presence of

H2O2, in parallel with the sulfhydryl peroxidation of Cys25 of the active site (Figure 4 a-b). Further investigations by CD spectroscopy were performed (Figure 4 c-d). Far UV CD spectra of CatS were recorded in the absence (experimental values, helix %: 32.8 ±1, beta sheet %:

24±2, others %: 45±3) or in the presence of a high concentration of H2O2 (1000 µM, 6 hours of incubation) (experimental values, helix %: 32.2 ±3, beta sheet %: 26.5±4, others %: 42.3±6).

The lack of significant modifications of CD spectra resulting from H2O2 treatment supported that the overall oxidation (i.e. both peroxidation of Cys25 and formation of carbonyl derivatives) of CatS had no substantial consequences on the secondary structure of CatS (secondary structure composition of CatS, http://2struc.cryst.bbk.ac.uk/; helix %: 31, beta sheet %: 24, others %: 45). Likewise we obtained similar results after a 6 hour treatment of CatS by 10% CSE (experimental values, helix %: 30.2 ±5, beta sheet %: 24.2±8, others %: 45.7±10) (Figure 4). Despite a wide CSE-dependent carbonylation, no significant changes in the structural organization of CatS were observed, strengthening that the protease could retain an unexpected and scarce resistance to oxidative stress. Thus, regardless of the oxidative stress that leads to significant carbonylation of its peptide backbone, the three-dimensional structure of CatS is apparently unaffected. Such analytical data strengthen the notion that CatS remains active during COPD and participate in remodeling and the degradation of elastin fibers.

Reversibility of CatS inactivation:

Following incubation at both pH 5.5 and 7.4 in the presence of CSE, H2O2, acrolein and ONOO−, the ability of a reducing agent to withdraw CatS inactivation was evaluated. Assays were not made in the presence of FA, given its low efficiency against CatS. After incubation with H2O2 then addition of DTT (2 mM), a partial recovery of the peptidase activity (expressed

132 as mean ± SEM) occured at pH 5.5 (24 % ± 6 %) and pH 7.4 (18 % ± 6 %) (Figure 5a) (non significant differences between pH, non-parametric Kruskal-Wallis test). We observed a similar reversibility of CatS activity in the presence of CSE (pH 5.5, 25 % ± 7; pH 7.4, 13 % ± 5 %). Interestingly a comparable but slightly higher restoration of CatK activity (~1/3 of the initial hydrolysis rate), which was unrelated to H2O2 concentration, was reported [16], suggesting that it may correspond to a fairly general mechanism for cysteine cathepsins. Likewise, following its inactivation by CSE, CatS activity was restored in a similar manner in the presence of glutathione (reduced form, GSH) and N-acetyl cysteine (pH 5.5, 19% ± 4 ; 22% ± 4, respectively). Conversely DTT did not significantly fix up CatS activity after reaction with acrolein. This result was expected since acrolein was reported to react with thiolate, leading to a highly stable Michael addition adduct (Figure 5b). No concentration-dependent effect was measured, as already observed in the presence of 10% CSE (pH 5.5) or H2O2. On the other hand, a different situation is observed in the presence of ONOO− that inhibited similarly CatS -1 -1 -1 -1 at both pH 5.5 (kinact/[I] = 4.0 ± 1.6 M .s ) and pH 7.4 (kinact/[I] = 4.9 ± 0.8 M .s ) (Table I). Indeed we established that the recovery of CatS activity depends on ONOO− concentrations. In the presence of an elevated concentration of peroxynitrite (mM range), only ~8-10 % of the initial hydrolysis rate was regained (Figure 5b) [33,34]. This results supported that high concentrations of ONOO− inactivated irreversibly CatS as demonstrated for other peroxynitrite- sensitive enzymes [35–39]. As suggested previously, this inactivation could result from the oxidation of the active site sulfhydryl group to irreversible sulfinic and/or sulfonic acids [35– 37]. But circa 36-42 % of CatS activity was restored by DTT, following treatment by a lower ONOO− concentration; as reported elsewhere, these data suggest that the chemical reaction of ONOO− with Cys25 led partly to the formation of a reducible DTT-sensitive sulfenic acid (Figure 5b) [37,38]. The restoration of proteolytic activity of CatS compared to that observed for CatK; it remained partial (~1/3 of the initial hydrolysis rate) and did not depend on the initial peroxide concentration [16]. Likewise, Väänänen and colleagues proposed that the inactivation of cysteine proteases by nitric oxide-related species could correspond to a protective mechanism besides the known irreversible oxidation by more harmful oxidants (e.g. hypochlorous acid) [36].

Labeling of CatS by redox sensing probes: According to oxidants must be disregarded beforehand for accuracy of the examination, we could only carry out this analysis for peroxide treatment (150 µM H2O2; 0-300 minutes).

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H2O2 was first removed by an enzymatic treatment (10 nM catalase). The identification of oxidized forms of Cys25-containing peptides of cathepsins by mass spectrometry being a challenging duty [16], the oxidation status of the active site thiol of CatS was investigated by using both sulfenic and sulfinic redox sensing probes [29,30], as described in the experimental section. Interestingly untreated recombinant CatS (t=0) was already labeled by both biotin-1,3- cyclopentanedione (BP1, sulfenic acid probe) and NO-Bio (sulfinic acid probe) (Figure 6a; see Figures 6b and 6c for trap mechanisms). This observation is consistent with the result of the E- 64 titration, i.e. 40% of active (reduced form) CatS, which support that a large amount of CatS has undergone oxidation during the preparative (purification and activation) steps [24]. Present results obtained using the two redox sensing probes support that catalytically active CatS was oxidized sequentially, i.e. via the formation of a reversible sulfenic acid (0-60 minutes) before a slower conversion to sulfinic acid, as suggested by the densitometric analysis of the BP1/NO- Bio ratio over time (Figure 6a). Interestingly, this delayed increase of sulfinic acid could provide a mechanistic rational to the transient stability of active CatS in the presence of H2O2. One could hypothesize that such sequential reaction may correspond to a transient protection [21], allowing CatS to remain temporarily active. Nevertheless we have to notice that we were unable to evaluate the formation rate of sulfonic acid due to the lack of an available and specific redox sensing probe.

Time- and Dose-dependent inactivation of pro-CatS maturation by CS oxidants: Proforms of cathepsins represent an in vivo reservoir of activatable mature enzymes (for review: [9]). Such activation may have important physiological consequences because zymogens were often found secreted in various pathological conditions, including lung inflammations [12,14]. Accordingly we analyzed the autoprocessing of recombinant procathepsin S under in vitro conditions (12h incubation, 26°C) with increasing concentrations of CSE (0-40%) and oxidants (0-1000 µM). In the absence of treatment (Figure 8a, lane2), pro- CatS was fully processed with the exception of a faint band that corresponds to an intermediate precursor of CatS that is circa 2/3 kDa heavier than the mature enzyme. This intermediate protein band was found to be an equal mixture of species corresponding to cleavage at Ser-

76p1Ser-77p and Met-72p1Ser-73p (propeptide numbering) according to [40]. H2O2 inhibited in a dose-dependent manner the maturation of pro-CatS. The activity-based probe Biot-(PEG)2- Ahx-LeuValGly-DMK was found to label mature CatS, its zymogen and the intermediate form, depending on H2O2 amount (Figure 7a). Remarkably, even after 12h incubation with H2O2

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(1000 µM), the CatS proform still reacted with Biot-(PEG)2-Ahx-LeuValGly-DMK, indicating that pro-CatS is catalytically active. Present data are in agreement with a previous report that demonstrated that pro-CatB is active [41]. Also acrolein inhibited pro-CatS maturation.

However the inhibitory profile was distinctive to that observed with H2O2, since the initial step of conversion of pro-CatS to the intermediate form still occurred as shown by Coomassie staining (Figure 7b). A dose-dependent accumulation of ABP-reactive intermediate form was observed. On the other hand, ONOO− did not impair activation of pro-CatS to mature CatS. Yet there was a significant decrease in CatS labeling, suggesting that CatS was inhibited by ONOO− following pro-CatS autoprocessing. Finally both FA and CSE exhibited a similar ineffectiveness to prevent activation of pro-CatS. In a second step, we examined the processing of pro-CatS in the presence of a constant amount of CSE (10%) and oxidants (150 µM), using shorter incubation times (0-60 minutes) to analyze the initial activation steps. In the absence of oxidizing reagents, pro-CatS was converted to the intermediate precursor. Under these experimental conditions, CSE as well FA and ONOO− did not impair maturation (Figure 8, a1- a5). Conversely H2O2 inhibited pro-CatS processing, while an enhancement of the intermediate form of CatS was observed in the presence of acrolein. Measurements of the residual peptidase activity (t=60 minutes) confirmed that the intermediate form was proteolytically functional

(Figure 8, b1-b5). Moreover it confirmed that H2O2 is strongly potent compared to other chemicals and CSE to prevent maturation of pro-CatS. Taken together, these data revealed that cigarette smoke, unlike H2O2, did not prevent the maturation and activation of pro-CatS. According to cathepsin proforms represent a proteolytic reservoir (see for reviews: [9,42]), present results suggest that pro-CatS is still activable despite the effective oxidative environment observed during COPD (Oxidative stress index (OSI) of 0.940.2 for smokers with COPD vs 0.590.1 for non smokers) (ref: papier P-M A). Subsequently, the autocatalytic maturation of pro-CatS could enhance the elastinolytic potential of active CatS. In overall, this study has provided some mechanistic clues of the unexpected CatS stability to CSE, supporting its harmful contribution to the pathophysiology of emphysema.

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Acknowledgements: This work was supported by the Région Centre-Val de Loire, France (BPCO-Lyse project: # 201500103986). We acknowledge the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) for institutional fundings. MW is a doctoral recipient from the Région Centre-Val de Loire, France.

Author contributions: MW and GL designed research and planned studies. MW, AS and LN- D performed experiments. P-MA performed and FL supervised initial experiments. MW and GL analyzed data. LN-D analyzed NMR data. GL and MW wrote the paper. All authors revised the paper and approved the final version of the manuscript.

Competing Interests: The authors declare no competing interest.

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2. Inhibition des cathepsines à cystéine par des inhibiteurs pseudopeptidiques et dérivés triazines

Article 2 : Substrate-derived triazolo- and azapeptides as inhibitors of cathepsins K and S. M. Galibert*, M. Wartenberg *, F. Lecaille, A. Saidi, S. Mavel, A. Joulin-Giet, B. Korkmaz, D. Brömme, V. Aucagne, A.F. Delmas & G. Lalmanach G *co-premiers auteurs European Journal of Medicinal Chemistry (2018) Jan 20;144:201-210.

Introduction : Les cathepsines humaines K et S sont des protéases à cystéines capables de cliver les constituants de la matrice extracellulaire, comme les collagènes, la fibronectine, les laminines ou l’élastine. La cathepsine S a été identifiée comme une cible pertinente pour le traitement des maladies auto-immunes (Lalmanach et al., 2015) ou les douleurs neuropathiques (Wilkinson et al., 2015). La cathepsine K, qui est principalement exprimée dans les ostéoclastes et joue un rôle crucial dans la résorption osseuse, est une cible thérapeutique validée pour le traitement de l’ostéoporose et des métastases osseuses (Brömme et al., 2016; Lecaille et al., 2008). Ces pathologies sont associées à une surexpression ou une dérégulation de l’activité de ces enzymes, ce qui en fait des cibles thérapeutiques potentielles pour le développement de nouvelles thérapies (Vasiljeva et al., 2007). Parmi les stratégies possibles pour développer des inhibiteurs compétitifs réversibles de protéases, on peut citer la conversion d’un substrat peptidique en molécule inhibitrice stable. Pour cela, on introduit une liaison non-hydrolysable à la position P1-P1’, ce qui permet de conserver les principales caractéristiques du substrat parent. Par exemple, les liaisons amino-méthylène (appelées « liaisons amides réduites ») ou les substituts hydroxyéthylène sont fréquemment utilisés comme liaisons pseudopeptidique non clivables (Gentilucci et al., 2010). Cependant, cette introduction conduit souvent à une diminution notable de l’affinité. Dans le but d’améliorer l’affinité, nous nous sommes intéressés à l’hétérocycle 1,2,3-triazole disubstitué en 1,4 qui mime les caractéristique géométriques, stériques et électroniques de la liaison peptidique native (trans-amide) et peut également participer aux interactions des liaisons hydrogène et dipôle-dipôle. En parallèle, nous avons incorporé une liaison azaGly (semicarbazide) qui consiste à remplacer le carbone α du résidu glycine en P1 par un atome d’azote (Horne et al., 2004; Valverde et al., 2012, 2013). Pour les séquences substrats sélectives nous nous sommes appuyés sur des travaux précédents. Pour le

167 substrat de la cathepsine S nous avons utilisé la séquence : Gly-Arg-Trp-His-Pro-Met-Gly-Ala- Pro-Trp-Glu-D-Ala-D-Arg; dérivé d'un substrat précédemment conçu pour la quantification de l'activité de la Cat S dans les "Antigen-Presenting Cells" (APCs; macrophages ou cellules dendritiques) (Lützner & Kalbacher, 2008). Pour la séquence de la Cat K, nous avons choisi comme squelette peptidique, la bradykinine (BK), une hormone pro-inflammatoire qui participe à de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques (ex: vasodilatation et contraction des muscles lisses, augmentation de la perméabilité microvasculaire, régulation de la fonction rénale et de la pression artérielle) (Lalmanach et al., 2010). Dans un travail précédent, nous avons montré que la Cat K, mais pas les Cat B, L et S, peut agir comme une kininase, une propriété unique parmi les protéases à cystéine des mammifères (Lecaille et al., 2007b; Veillard et al., 2008). La Cat K coupe plus efficacement BK au niveau de la liaison Gly4-Phe5 et le substrat à extinction interne de fluorescence (FRET substrat) mimant la -1 -1 bradykinine, Abz-BK-(3-NO2-Tyr) (pH 6,0 : kcat/Km = 12 500 mM . s ; pH 7,4 : kcat/Km = 6 930 mM-1. s-1) que l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) (Godat et al., 2004). Ici, nous avons conservé la séquence peptidique et la paire donneur / accepteur de fluorescence (Abz / 3-NO2-Tyr) du FRET substrat parent. En effet, la présence de la paire donneur / accepteur permet d’évaluer directement la résistance à la protéolyse en suivant la libération de fluorescence en cas de clivage. Ces inhibiteurs ont été synthétisés en collaboration avec l’équipe du Dr Vincent Aucagne (Bioorthogonal & Synthetic Protein Chemistry group, Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, Orléans) et testés vis-à-vis des cathepsines.

Résultats : Les cathepsines à cystéine partagent des structures tridimensionnelles proches, un même mécanisme catalytique et une spécificité de substrat similaire. L’inhibition sélective est donc un véritable challenge dans le développement de molécules candidates. Cette sélectivité a été testée vis-à-vis des principales cathepsines (Cat B, H, L, K et S) et d’autres familles de protéases comme les MMPs (MMP-2), les protéases acides (Cat D) et les protéases à sérine (trypsine, chymotrypsine et HNE). Malgré de fortes doses, aucune inhibition n’a été reportée pour les autres classes de protéases dans le cas des inhibiteurs de la cathepsine S. A un pH acide représentant le compartiment lysosomal, une inhibition croisée est observée. En effet, 1a (triazole) et 1b (azaGly), inhibent la Cat S mais également les Cat K et L. Dans le cas de 1b une inhibition pour la Cat H est également observée mais dans une moindre mesure. Il est important de noté que le substrat peptidique parent n’a pas été testé contre la Cat K et la CatH dans l’étude initiale, pouvant expliquer cette réaction croisée. 1a inhibe de manière réversible et compétitive les Cat S, K et L avec des constantes d’inhibition Ki de l’ordre du micromolaire, 168 tandis que 1b inhibe puissamment ces enzymes avec des valeurs de l’ordre du nanomolaire. Contrairement à la plupart des cathepsines lysosomales qui sont actives de manière optimale dans un environnement acide et rapidement inactivées à pH neutre, la Cat S reste stable à pH 7,4. Ceci suggère donc que les inhibiteurs pourraient acquérir une plus grande sélectivité pour la Cat S à un pH proche du milieu extracellulaire. En effet, les deux composés inhibent la Cat S mais pas les Cat K et L à pH 7,4 avec des valeurs comparables à celles obtenues à pH acide, prouvant que la sélectivité de 1a et 1b est partiellement dépendante du pH. De par leur caractère peptidique, ces inhibiteurs sont sensibles à l’hydrolyse par les protéases, la stabilité de ces molécules est donc un critère important. Des analyses par RP-HPLC, n’ont montré aucune dégradation pour les composés 1a et 1b. La sélectivité du composé 1b a été validée grâce à un modèle ex vivo : des lysats de rate de souris sauvages ou knock-out pour la Cat S. Cette expérience a permis de montrer que seule la Cat S est inhibée par 1b à pH 7,4 indiquant également que cet inhibiteur est stable dans des milieux complexes. Ainsi, l’ensemble de ces résultats confirment que le peptide 1b est un puissant inhibiteur sélectif de la Cat S à pH neutre.

Les inhibiteurs de la Cat K, le triazolopeptide 2a et l’azapeptide 2b dérivé de la bradykinine, ne présentent aucune inhibition pour les autres familles de protéases testées. Cependant, la trypsine et la Cat B sont capables d’hydrolyser 2a et 2b. Le site de clivage a été localisé au niveau de la liaison amide entre le résidu Arg9 en C-terminal et l’extincteur de fluorescence (3-

NO2-Tyr) comme rapporté précédemment pour le substrat parent. Dans le cas de 2b, une libération de fluorescence due à une dégradation partielle est également observée en présence de chymotrypsine et de Cat D. Les deux inhibiteurs annulent l’activité protéasique de la Cat K avec une bonne sélectivité par rapport à la Cat L. De manière inattendue, 2b présente également un faible potentiel inhibiteur pour la Cat H. Ce résultat peut être corrélé avec une observation précédente selon laquelle cette enzyme peut agir comme une endopeptidase métabolisant la BK après une incubation prolongée (Brguljan et al., 2003). Comme observée précédemment avec les inhibiteurs de la Cat S, l’introduction d’un résidu azaGly résulte en un inhibiteur plus puissant et sélectif que l’incorporation d’un hétérocycle triazole. Dans le but d’évaluer l’efficacité de ces inhibiteurs à annuler l’activité kininasique de la Cat K, nous avons mis en compétition ces inhibiteurs avec le substrat parent, la bradykinine. En présence de 2a et 2b, la capacité de la Cat K à cliver la BK au niveau de la liaison Gly4-Phe5 et à libérer les fragments BK (1-4) et BK (5-9) est totalement altérée. Dans le but de mieux comprendre la différence d’inhibition entre le composé 2a et 2b, des études de docking ont été effectuées. Les résultats montrent que le pseudopeptide contenant une liaison semicarbazide recouvre totalement le site 169 actif de la Cat K (sous-sites S3-S3’) tandis que l’inhibiteur avec une liaison triazole interagit uniquement avec les sous unités S3-S1 de l’enzyme. Ce phénomène peut s’expliquer par le fait que la liaison triazole coplanaire induit un coude tandis que la liaison semicarbazide permet de conserver la flexibilité et la liberté entropique de la liaison amide native.

Conclusion : Cette étude a montré que le résidu azaGly est plus favorable qu'un groupement 1,2,3-triazole disubstitué en 1,4 pour préserver une forte affinité vis-à-vis de sa cible protéasique. Ces données fournissent également la preuve du concept que l’incorporation d’une liaison semicarbazide en position P1-P1’ est une stratégie pertinente pour développer des inhibiteurs puissants, compétitifs et réversibles des cathepsines à cystéine et pouvant être étendus à d'autres classes ou familles de protéases. Toujours en lien étroit avec le Dr Vincent Aucagne (Bioorthogonal & Synthetic Protein Chemistry group, Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, Orléans), des pseudopeptides azapeptidiques de seconde génération et dérivés de substrats naturels seront prochainement conçus, synthétisés et évalués. L'idée sous-jacente au design de tels biomimétiques innovants est d'améliorer leur stabilité vis à vis des autres protéases non ciblées, tout en conservant la sélectivité et l'affinité apportée par la séquence substrat dérivée de la molécule parentale naturelle.

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Article 3: Selective inhibition of human cathepsin S by 2,4,6-trisubstituted 1,3,5-triazine analogs. Z. Tber, M. Wartenberg, J-E. Jacques, V. Roy, F. Lecaille, D. Warszycki, A.J. Bojarski, G. Lalmanach & L.A. Agrofoglio Bioorganic & Medicinal Chemistry. (2018) Aug 7;26(14):4310-4319

Introduction : Une autre stratégie pour développer des inhibiteurs réversibles des cathepsines est la modulation de structures chimiques candidates afin d’améliorer leur sélectivité. Les inhibiteurs de cathepsines à cystéine contiennent fréquemment un groupe fonctionnel électrophile, capable d’interagir avec le résidu cystéine nucléophile situé dans leur site actif. De tels groupes comprennent les aldéhydes et les vinyl sulfones. Une étude précédente a rapporté la synthèse et l'évaluation biologique des 1,3,5-triazines substituées par une fonction nitrile et un cyclohexylamine ou une pipérazine (Plebanek et al., 2016). Parmi les composés synthétisés, certains dérivés de cyclohexylamine ont montré un effet inhibiteur très puissant (gamme nM) contre les Cat B, K, L, et S (Frizler et al., 2011; Plebanek et al., 2016). Les inhibiteurs les plus prometteurs des dérivés pipérazine ont montré une activité élevée pour les cathepsines K et S

(IC50 < 30 nM). Des études de docking moléculaire ont montré que le groupe pipérazine de ces inhibiteurs interagit avec le sous-site S1' et forme une liaison hydrogène avec la chaîne latérale de Gln19. Cependant, malgré leur forte activité inhibitrice un manque de sélectivité a également été rapporté. Sur la base de ces résultats, nous avons décidé de substituer la cyclohexylamine et la pipérazine par une morpholine et une N-pipéridine comme nouveaux pharmacophores, afin de préserver les interactions (via des liaisons hydrogène) avec la poche S1 des cathepsines et d’améliorer leur sélectivité. Ainsi une nouvelle série de composés candidats dérivés de ces structures ont été synthétisés (Pr Luigi Agrofoglio et Dr Vincent Roy, ICOA, CNRS UMR 7311, Orléans) et leurs propriétés inhibitrices évaluées contre les cathepsines à cystéine.

Résultats : Parmi les composés synthétisés, les analogues de la morpholine (7a-j) inhibent tous la Cat S, à l’exception des composés 7i et 7j portant la (R) ou la (S)-2-hydroxyl-2- phényléthylamine. A l’inverse, ils n’inhibent pas la Cat B et la Cat L (IC50>1000 nM). De plus, ces molécules présentent un faible potentiel inhibiteur vis-à-vis de la Cat K sauf pour les inhibiteurs possédant un fluor en para ou méta (7g et 7h). Même si certains composés (7c, 7e et 7h) présentent une puissante inhibition pour la Cat S (IC50 < 20 nM), seul le composé 7c montre une sélectivité élevée avec un IC50 de 4 nM pour la Cat S et pas ou peu d’inhibition vis

à vis des Cat B, K et L (IC50 > 2 µM). La substitution de la morpholine du composé 7c par le fragment pipéridine (composé 9c) entraîne une diminution de son potentiel inhibiteur pour la 181

Cat S (IC50> 150 nM). Ce groupement est mieux toléré par la Cat K et la Cat L, et il diminue son potentiel inhibiteur vis-à-vis de la Cat S pour les composés 9f et 9g. Pour élucider le mode d’inhibition du 7c, des études de docking moléculaire entre la structure tridimensionnelle (obtenue par cristallographie) de la Cat S et cet inhibiteur ont été effectuées. En accord avec les travaux effectués précédemment (Plebanek et al., 2016), la substitution de la pipérazine des molécules de la première série par une morpholine ne modifie pas les mécanismes d’interactions. En effet, ces études montrent que la Cys25 nucléophile du site actif se lie de manière covalente avec le composé 7c (chapitre 1.2.7.1.2 : Mécanisme d’inhibition des nitriles). De plus, l’azote de l’imine du 7c forme une liaison hydrogène avec la chaîne latérale de Gln19 (poche S1’) et la partie triazine interagit avec le résidu Gly23 de la poche S1. Cependant, par rapport aux dérivés de pipérazine, des interactions supplémentaires ont été observées entre le 7c et le site S2. En effet, l’oxygène de la morpholine forme une liaison hydrogène avec le groupement –NH de Asn67, pouvant expliquer le gain de sélectivité pour la Cat S par rapport aux molécules de la première série.

Dans les liquides de lavage broncho-alvéolaire inflammatoires (BALF), la Cat S est principalement retrouvée sous forme de précurseur protéique (zymogène). Ces proformes peuvent être activées de manière autocatalytique, indiquant que les procathepsines du liquide alvéolaire constituent un réservoir protéolytique important de formes matures. Ainsi, la régulation de la maturation additionnée à l’inhibition de la forme mature de la Cat S pourrait représenter une approche innovante et pertinente dans le traitement de certaines pathologies inflammatoires. Nous avons donc testé la capacité du 7c à altérer l’automaturation de la pro- Cat S. Il a été montré que en plus de l'inhibition de la Cat S mature, le composé 7c bloque aussi de manière dose-dépendante la maturation de la pro-Cat S sous une forme intermédiaire. Cette inhibition est similaire à celle observée en présence du LHVS, un autre inhibiteur sélectif de la Cat S.

Conclusion : Les résultats indiquent que la substitution de la pipérazine par une morpholine permet d’améliorer la sélectivité. Parmi les composés de cette deuxième série, le 7c est un inhibiteur réversible, puissant et très sélectif de la Cat S mature. Le 7c a également la propriété de bloquer l’automaturation de son zymogène (pro-Cat S). Ce travail supporte l'idée que la molécule 7c (4-(morpholin-4-yl)-6-[4-(trifluorométhoxy)anilino]-1,3,5-triazine-2-carbonitrile) représente une structure candidate prometteuse pour le design d'une nouvelle série d'analogues synthétiques de 1,3,5-triazine en ciblant à la fois les cathepsines à cystéine et leurs précurseurs

182 protéiques, et en particulier la cathepsine S et sa profome pro-Cat S. Cependant, au vue d’expériences supplémentaires cette molécule présente un manque de stabilité dans des milieux biologiques plus complexes. En effet, la capacité de cet inhibiteur à inhiber la Cat S a été testée dans des surnageants de cellules THP1 (monocytes différenciés en macrophages) et aucune inhibition de la Cat S n’a été reporté, suggérant que le 7c doit probablement être dégradé ou réagir avec d’autres molécules du surnageant.

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La broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une cause majeure de morbidité et de mortalité à travers le monde. Elle représente un intérêt de santé publique primordial puisqu’elle sera selon l’OMS, la 3ème cause de décès dans le monde d’ici 2020 après les accidents vasculaires cérébraux et les pathologies cardiaques. Elle se caractérise par une obstruction progressive et irréversible des voies respiratoires en réponse à l’inhalation de gaz ou de particules toxiques. La BPCO est une maladie hétérogène sur le plan clinique et pathologique et comprend une inflammation chronique, une hypersécrétion de mucus et une fibrose sous épithéliale dans les petites voies respiratoires. Il a été montré que les protéinases et le stress oxydatif jouaient un rôle critique dans tous ces aspects de la maladie. L’hypothèse de l’implication de la balance protéases / antiprotéases dans la pathogénèse de la BPCO a été formulé pour la première fois dans les années 60 suite à deux observations clés. La première

était qu’un déficit génétique en α1-antitrypsine (AAT), l’inhibiteur principal de l’élastase de neutrophile induisait un emphysème sévère précoce (Laurell & Eriksson, 1963). La seconde était que l’instillation de papaïne dans les poumons de rat entraînait un élargissement progressif de l’espace aérien (Gross et al., 1965). Les principales sources de protéases dans les poumons sont les cellules inflammatoires, comme les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes. Parmi les enzymes sécrétées on retrouve les protéases à sérine (élastase, cathepsine G et protéase 3) et les métallo-protéases matricielles (ou Matrix Metallo-Proteases, MMPs). A la différence de ces deux familles de protéases, les cathepsines à cystéine sont encore peu étudiées bien que, leur implication dans le développement de la BPCO est aujourd’hui de plus en plus évidente. Par exemple, l’expression des cathepsines B, H, L et S pulmonaires est augmentée significativement chez les patients fumeurs ou atteints de BPCO par rapport au patients sains (Voir article: P-M Andrault et al - Annexe 1). A l’inverse, l’inhibition pharmacologique des cathepsines B, H, K, L et S chez des souris avec une BPCO induite par IFN-γ ou IL-13, diminue l’emphysème pulmonaire soulignant le rôle néfaste de ces enzyme dans la BPCO (Wang et al., 2000; Zheng et al., 2000). Un autre facteur important du développement de la BPCO est le stress oxydatif. En effet, le principal facteur de risque de cette pathologie est l’exposition à la fumée de cigarette (90% des cas). La phase gazeuse de la fumée contient près de 1015 molécules hautement réactives par bouffée. Parmi elles on retrouve les semi-quinones, les ROS ou les RNS. L’environment oxydant généré par la fumée de cigarette constitue un milieu défavorable pour l’activité des cathepsines à cystéine. Pourtant, certaines d’entre elles, sont retrouvées actives dans ces conditions. Il a précédemment été montré que la Cat S en plus d’être

197 surexprimée, préservait son activité dans les tissus pulmonaires chez les fumeurs atteints ou non de BPCO et dans les expectorations de patients BPCO en phase d’exacerbation. Au cours de cette thèse nous nous sommes donc intéressés à ce paradoxe, en étudiant les mécanismes moléculaires pouvant expliquer cette stabilité enzymatique inattendue de la Cat S lors de stress oxydatif. Pour cela, nous avons utilisé des extraits de fumée de cigarette et sélectionné des oxydants représentatifs de la phase expirée : le peroxyde d’hydrogène, l’acroléine, le formaldéhyde et le peroxynitrite. Ces travaux ont permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes pouvant expliquer la résistance de la Cat S au stress oxydatif induit par la fumée de cigarette. Tout d’abord, nous avons montré une faible inactivation de l’activité élastinolytique et peptidique par les différents oxydants. En effet, de fortes concentrations d’oxydants (de l'ordre de plusieurs centaines de µM) sont nécessaires à l’inactivation de la Cat S, à l’exception de H2O2 au pH des compartiments endosomaux / lysosomaux et de l’acroléine au pH du milieu extracellulaire. Un autre mécanisme de défense de la Cat S, est la formation transitoire de formes réversibles décrites comme ayant un rôle protecteur vis-à-vis d’oxydants plus puissants. Finalement, la maturation des proformes de la Cat S, représentant un réservoir de formes matures actives, reste peu affectée en conditions oxydatives en comparaison avec la cathepsine K (Godat et al., 2008; Percival et al., 1999). L’ensemble de ces résultats confirment que la grande stabilité enzymatique de la Cat S et donc la préservation partielle de son activité élastinolytique pourrait être un facteur aggravant dans le développement de la BPCO et en particulier durant l’emphysème. D’autres pistes pourraient expliquer la stabilité de la Cat S dans la BPCO, comme l’effet d’agents anti-oxydants. Par exemple, le glutathion (GSH), principal réducteur physiologique intracellulaire, fait partie des premières lignes de défense cellulaire contre le stress oxydatif. Il a été montré que le niveau de GSH est augmenté dans les lavages broncho- alvéolaires des fumeurs chroniques (Cantin et al., 1987; Linden et al., 1993; Morrison et al., 1999). Ainsi, il pourrait, en plus de réduire les formes réversibles de la Cys25, jouer un rôle de scavenger comme décrit précédemment pour d’autres enzymes thiol-dépendantes (Dairou et al., 2004; Väänänen et al., 2005). La N-actétylcystéine (NAC), utilisée pour fluidifier le mucus dans certaines pathologies comme la mucoviscidose, pourrait également partager ces propriétés protectrices. Un autre facteur qui pourrait contribuer à l’effet néfaste de la Cat S dans la BPCO est une dérégulation de l’expression et de l’activité des inhibiteurs endogènes des cathepsines à cystéine. Il a été montré dans notre équipe que l’expression intracellulaire de la stéfine B est diminuée de manière dose dépendante par la fumée de cigarette. De même le niveau

198 d’expression de la cystatine C est fortement réduit dans des expectorations de patients BPCO exacerbés. De plus, il a été montré que l’oxydation de certains inhibiteurs de protéases induisait la perte de leurs propriétés inhibitrices (Cavarra et al., 2001; Dooley & Pryor, 1982; Heinzel- Wieland et al., 1991; Johnson, 1987; Wang et al., 2007). Ainsi, il serait intéressant de tester l’effet des extraits de fumée de cigarette et des quatre oxydants sur les principaux inhibiteurs endogènes des cathepsines à cystéine : la cystatine C, les stéfines A et B et les kininogènes (LMWK et HMKW). L’ensemble de ces données converge vers un déséquilibre de la balance protéases / antiprotéases en faveur des protéases, ce qui suggère le rôle important de la Cat S dans la protéolyse excessive et incontrôlée des composants de la matrice extracellulaire lors de l’emphysème. En raison de l’implication néfaste de ces cathepsines à cystéine dans certaines pathologies, elles sont de plus en plus proposées comme des cibles thérapeutiques pertinentes pour le développement de nouvelles thérapies. Parmi les cathepsines à cystéine, la Cat S et la Cat K, sont les plus étudiées dans le cadre du développement d’inhibiteurs à visée thérapeutique. En effet, la Cat S a été identifiée comme une cible potentielle pour le traitement des maladies auto-immunes ou les douleurs neuropathiques (Lalmanach et al., 2015; Wilkinson et al., 2015). La cathepsine K, quant à elle, est une cible thérapeutique validée pour le traitement de l’ostéoporose et des métastases osseuses (Brömme et al., 2016; Lecaille et al., 2008). Un des critères indispensables au développement d’inhibiteurs est la sélectivité, qui représente un challenge dans le cas des cathepsines en raison de leurs structures tridimensionnelles proches, de leur mécanisme catalytique commun et de leur spécificité de substrat similaire. Les molécules doivent également répondre à des critères pharmacologiques standards comme la biodisponibilité, la faible toxicité ou une constante d’élimination faible afin de limiter les effets secondaires (Brömme & Lecaille, 2009). Au cours de ma thèse, nous avons testé deux stratégies différentes pour le design d’inhibiteurs. La première a consisté à introduire une liaison non-hydrolysable à la position P1-P1’, ce qui permet de conserver les principales caractéristiques du substrat parent tout en faisant une molécule inhibitrice compétitive, stable et réversible. Nos résultats ont montré que parmi les deux liaison testées, la liaison semicarbazide (introduite via le résidu azaGly) est plus favorable que le groupement 1,2,3-triazole disubstitué en 1,4 pour préserver une forte affinité vis-à-vis de sa cible protéasique. Ces données fournissent également la preuve du concept que l’incorporation d’une liaison semicarbazide en position P1-P1’ est une stratégie pertinente pour développer des inhibiteurs puissants, compétitifs et réversibles des cathepsines à cystéine et

199 pouvant être étendus à d'autres classes ou familles de protéases. Dans le but d’améliorer la stabilité de ces inhibiteurs, une étude portant sur le design de pseudopeptides azapeptidiques de seconde génération dérivés de séquence substrats débutera prochainement, en collaboration avec le Dr Vincent Aucagne (Bioorthogonal & Synthetic Protein Chemistry group, Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS, UPR 4301, Orléans). La deuxième stratégie testée au cours de ma thèse était de moduler des structures chimiques candidates afin d’améliorer leur sélectivité. Pour cela, nous nous étions appuyer sur une étude précédente qui avait rapporté la synthèse et l'évaluation biologique des 1,3,5-triazines substituées par une fonction nitrile et un cyclohexylamine ou une pipérazine. Ces travaux avaient montré un effet inhibiteur très puissant (gamme nM) contre les Cat B, K, L, et S (Frizler et al., 2011; Plebanek et al., 2016). Les résultats ont montré que la substitution de la pipérazine par une morpholine permettait d’améliorer la sélectivité. Une molécule en particulier a montré d’excellents résultats pour le design d'une nouvelle série d'analogues synthétiques de 1,3,5- triazine: le 7c (4-(morpholin-4-yl)-6-[4-(trifluorométhoxy)anilino]-1,3,5-triazine-2- carbonitrile) qui permet d’inhiber efficacement la Cat S mature ainsi que l’autoactivation de sa profome, la pro-Cat S. Cependant, la stabilité de ces molécules reste à améliorer et devrait faire l’objet d’une autre série de molécules candidates.

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250

Annexe

251

252

Annexe 1

Cigarette smoking induces overexpression of elastinolytic cathepsin S P-M Andrault, A. C. Schamberger, T. Chazeirat, D. Sizaret, J. Renault, A. Petit, M. Wartenberg, A. Saidi, T. Baranek, S. Guyetant, Y. Courty, O. Eickelberg, G. Lalmanach & F. Lecaille

253

254

Cigarette smoke induces overexpression of active cathepsin S in lungs from current smokers with or without COPD

1,2,Š`,* 3* 1,2 1,4 Pierre-Marie Andrault , Andrea C. Schamberger , Thibault Chazeirat , Damien Sizaret , 1, † 1,2 1,2 1,2 1,2 Justine Renault , Agnès Petit , Mylène Wartenberg , Ahlame Saidi , Thomas Baranek , 1,4 1,2 3, ‡ 1,2 1,2¶ Serge Guyetant , Yves Courty , Oliver Eickelberg , Gilles Lalmanach , Fabien Lecaille

1 Université de Tours, Tours, France 2 INSERM, UMR 1100, Centre d'Etude des Pathologies Respiratoires, Team Mécanismes Protéolytiques dans l'Inflammation, Tours, France. 3 Comprehensive Pneumology Center, Institute of Lung Biology and Disease, University Hospital, Ludwig-Maximilians-University and Helmholtz Zentrum München, Member of the German Center for Lung Research (DZL), Munich, Germany. 4 Service d'Anatomie et Cytologie Pathologique, Centre Hospitalier Régional Universitaire de Tours, France.

Š Current address: Department of Oral Biological and Medical Sciences, Faculty of Dentistry, University of British Columbia, Vancouver, Canada. † Current address: Unité de Biologie Fonctionnelle et Adaptative, CNRS, UMR 8251, Université Paris Diderot, Paris, France ‡ Current address: Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of Colorado Anschutz School of Medicine, Aurora, USA.

¶Corresponding author information: Fabien Lecaille, PhD, Université de Tours, INSERM, UMR 1100, CEPR, 10 Boulevard Tonnellé, F-37032 Tours cedex, France. Tel: (+33) 247366047; e-mail: [email protected]

*These authors contributed equally to this manuscript.

Running title: Cigarette smoke increases cathepsin S activity

255

Abbreviations: AEBSF, 4-(2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride; AMP, antimicrobial peptide and protein; ASL, airway surface liquid ; BALF, bronchoalveolar lavage fluid ; BM, basement membrane; CA-074, N-(L-3-trans-propylcarbamoyloxirane-2-carbonyl)-L- isoleucyl-L-proline; Cat, cathepsin; CF, cystic fibrosis; COPD, chronic obstructive pulmonary disease; CS, Current smoker; CSE, Cigarette smoke extract; ECM, extracellular matrix ; FEV, Forced expiratory volume; FS, Former smoker; GOLD, global initiative for chronic obstructive lung disease; hCAP, human cathelicidin antimicrobial peptide ; LHVS, Morpholinourea- leucinyl-homophenylalanine-vinyl-sulfone; MMP, Matrix metallo-proteinase; MMTS, S- Methyl thiomethanesulfonate; NS, Never smoker; NSP, Neutrophil serine proteases; pHBECs, primary human bronchial epithelial cells; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; ProCat, procathepsin.

256

Abstract: Cigarette smoking has marked effects on lung tissue, including induction of oxidative stress, inflammatory cell recruitment and a protease/anti-protease imbalance, which contribute to tissue remodeling destruction resulting in loss of lung function in COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) patients. Cathepsin S (CatS) is a cysteine protease, which contributes to the remodeling/degradation of connective tissue and basement membrane. Aberrant expression or activity of CatS has been implicated in a variety of diseases, including arthritis, cancer, cardiovascular and lung diseases. However, little is known about the effect of cigarette smoking on CatS, and the role of CatS in smoking-related lung diseases. Here, we evaluated the expression and activity of CatS in lung tissue lysates from never-smokers and smokers with or without COPD. Despite the presence of an oxidizing environment, CatS expression and activity was significantly higher in both non-COPD and COPD current smokers compared to non- smokers, and correlated positively with smoking history. Moreover, we found that the exposure of primary human bronchial epithelial cells to cigarette smoke extract increased CatS, which involved activation of P2X7 receptors. The present data suggest that excessive CatS expression and activity contribute to the deleterious effects of cigarette smoke on pulmonary homeostasis.

Keywords: cigarette smoke, COPD, cysteine protease, oxidant, smokers

257

Introduction: Over 7 million deaths per year worldwide were recorded in 2017 that could be attributed to past or current smoking, and trends indicate that this will increase to 8 million annually by 2030 [1]. Besides longtime smokers having a shorter life-expectancy (10 years) compared with never- smokers (www.cdc.gov/tobacco/data_statistics), long-term effects of cigarette smoking include the risk of cardiovascular disease, lung cancer and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), which is characterized by progressive and irreversible airflow obstruction. Conversely, cigarette smoking cessation improves substantially longevity in men and women, irrespective of the age [2, 3]. Cigarette smoke exposure contributes to chronic airway inflammation and pathological lung tissue remodeling and destruction by increasing the recruitment of inflammatory cells such as neutrophils and macrophages. The burden of oxidative stress associated to cigarette smoke enhances recurrent bacterial infections and leads to a protease/anti-protease imbalance [4]. The principal classes of proteases expressed in human lungs are neutrophil serine proteases (NSP), matrix metalloproteases (MMP), and cysteine proteases [5]. Lysosomal cysteine cathepsins are produced by a wide variety of cell types such as fibroblasts, macrophages, and epithelial cells, and these can be active outside lysosomes (secretory vesicles, cytosol, mitochondria, nucleus, and extracellular medium). Among them, cathepsins B, K, L, and S play important roles in diverse physiological events and are capable of degrading extracellular matrix (ECM) and basement membrane (BM) constituents as well antimicrobial peptides (AMPs) [6]. Moreover, similar to NSPs and MMPs, dysregulation of cysteine cathepsins expression may disrupt these normal biological processes and contribute to a number of diseases such as cancer, osteoporosis, arthritis, neurodegenerative and airway diseases (for review: [7–10]). In particular, cathepsin S (CatS), which is predominantly expressed in dendritic cells, macrophages and epithelial cells, is thought to play a pivotal role in chronic inflammatory lung diseases including cystic fibrosis (CF) and COPD [11–16]. Various studies have implicated CatS in extensive degradation of elastin fibers and collagens as well as in the cleavage and the inactivation of key antimicrobials in CF airways (for review: [5, 6]). Contrary to other related cathepsin family members that are rapidly inactivated at neutral pH, CatS remains stable, a property that enables it to be active extracellularly particularly during ECM remodeling. Overexpression of CatS is observed in mouse models of experimental emphysema induced by IL-13 or IFN, and CatS inhibition by synthetic inhibitors reduces significantly the severity of emphysema and inflammation [17, 18]. These data are supported by the observation

258 that exposure of macrophages to bronchoalveolar lavage fluid (BALF) from patients with COPD markedly increased CatS secretion that was inhibited by IFN- neutralising antibodies [19], a finding that is in line with the observation that IFN- stimulates CatS expression and activity in various cell types, including keratinocytes and monocytes [20, 21]. Interestingly, cigarette smoke (CS) enhanced the production of IL-18 (an IFN- inducing factor), and induced the expression of immuno-reactive CatS in lung macrophages of cigarette smoke-exposed mice as well as in lung tissues of patients with COPD [11]. Despite increasing evidence for a role of CatS in inflammatory lung diseases, very little is known about the relationship between smoking status (current and former smokers) and history (pack-years) and CatS expression and activity in the lungs of (ex)-smokers with or without COPD. Furthermore, the active site cysteine residue (Cys25, papain numbering) of thiol-dependent cathepsins is highly sensitive to oxidative reagents. The fact that CatS remains active in animal models and in COPD patients, raises the question of its resistance to unfavorable conditions due to CS-induced oxidative stress. Therefore, in the current study, we compared both the protein levels and the enzymatic activity of CatS in human lung tissue from never-smokers, and current or ex-smokers with normal lung function or with various stages of COPD severity (GOLD I-III). Significantly higher levels of active CatS were detected in lung tissue from current smokers compared to never-smokers or former smokers. On the other hand, lung tissue from current smokers with or without COPD unveiled similar levels of active CatS regardless of the stage of the disease. To gain a better molecular understanding of the relation between smoke exposure and CatS expression and activity, we used primary human bronchial epithelial cells (pHBECs) that were exposed to non- toxic doses of cigarette smoke extract (CSE). CSE increased the expression of CatS in pHBECs in a dose dependent-manner. Conversely, pharmacological inhibition of P2X7, an ATP-gated cation channel, reduced CatS expression, which is in line with the concept that P2X7 plays a regulatory role in CatS expression as previously reported for human lung macrophages and mouse bone marrow-derived macrophages [22]. Finally, even at high levels of CSE exposure, CatS activity was preserved suggesting that elastinolytic CatS may contribute in conjunction with other proteases to parenchymal destruction that is the hallmark of emphysema.

259

Material and methods: Enzyme, substrates and inhibitors: Details are provided in the online supplementary material.

Ethic statement: This study was conducted in accordance with the ethical standards set out in the Helsinki Declaration and the local French bioethical committee of the CHRU Tours, Hôpital Bretonneau (approval No. DC-2008-308), and informed consent was obtained for each patient.

Human lung tissue: Peripheral tumor-free lung tissue was collected from seventy-two patients who underwent surgery for non-small cell lung cancer at the Trousseau Hospital (Tours, France) between 2006 and 2011, as previously described elsewhere [23]. Clinical characteristics of these patients are described in Table 1. Details of macroscopically normal tissue and paraffin sections and immunostaining of cells are provided in the online supplementary material.

Western blotting and immunoassays: Methods and antibodies are described in the online supplementary material.

Measurement of total anti-oxidant (TAS) and oxidant (TOS) status in lung tissues: TAS and TOS levels in tissue sample (5 µg) were measured by Erel's methods [24, 25] according to the instructions of the manufacturer (Rel Assay Diagnostics; Mega Tip, Gaziantep, Turkey). Further details are provided in the online supplementary material.

Active site titration of CatS and elastinolytic activity in lung tissues: Active site titration of CatS as well as measurement of the total endopeptidase cysteine cathepsin activity in lung tissue samples was adapted from a previous report [26]. Details are provided in the online supplementary material.

Preparation of aqueous cigarette smoke extract (CSE): CSE was prepared using a protocol modified from [27]. Methods are described in the online supplementary material.

Oxidative potential of CSE: The oxidative potential of CSE was determined by the redox conversion of reduced (non-fluorescent) dihydro-rhodamine-123 to oxidized (fluorescent) rhodamine-123 (Sigma-Aldrich) [28]. Briefly, CSE (0 to 40%) was incubated in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5 with dihydro-rhodamine-123 (50 µM) protected from light for 1

260 h at room temperature. Since CatS is stable and active at neutral pH, similar assays were performed in 100 mM HEPES buffer, pH 7.4. Released fluorescence was then measured using a Cary Eclipse spectrofluorimeter (Agilent Technologies, France, excitation wavelength: 490 nm, emission wavelength: 530 nm), and quantified using a calibration curve of rhodamine-123 (0 to 200 nM).

Treatment of pHBECs by CSE and cytoxicity assays: Normal primary human bronchial epithelial cells (pHBECs, Lonza) from three different donors were seeded at passage 3 in 21cm² dishes at a density of 10000 cells/cm² in BEGM medium (Lonza) with supplements and antibiotics, and allowed to reach confluence (~7 days). Then cells were treated with 0%, 2.5%, 5%, 10%, or 20% CSE for 2 h in a total amount of 5 mL media. Cytoxicity assays are described in the online supplementary material. Culture media were then harvested and treated immediately with 100 mM sodium acetate, pH 5.0, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM EDTA, 40 μM pepstatin A, 1 mM MMTS (preservative buffer). Cell debris were removed by centrifugation (1000 g, 8 min, 4°C). Supernatant was concentrated by centrifugal ultrafiltration (Vivaspin 4, Sartorius, Dourdan, France) then stored at -80°C until analysis. Alternatively, plated cells were washed twice with ice-cold PBS and scraped in the preservative buffer (250 µL). Total cell extracts were obtained by a series of three freeze/thaw cycles. Cell lysates were centrifuged (5000 g at 4°C for 10 min), and cell lysate supernatants were collected and frozen at -80 °C. Protein quantification was assessed by Bradford assay (Biorad). Titration of the endopeptidase cysteine cathepsin activity was performed with E-64 as previously described. Cell-lysate supernatants (5 µg of total protein) were subjected to 15% SDS-PAGE under reducing conditions and immunoblotted as described above using anti-CatS, anti-phospho-p38 MAPK and anti-phospho-cPLA2 antibodies (1:1000).

Hydrolysis of LL-37 by pHBECs: Synthetic LL-37 (20 ng, GeneCust Europe, Dudelange, Luxembourg) was incubated with cell-lysate supernatants from pHBECs, (0.2 µg of total protein) treated or not with 10% CSE, in 100 mM sodium acetate buffer pH 5.5 for 0-24 h at 37°C, in the presence or absence of E-64 (10 μM) or LHVS (100 nM). Cell-lysate supernatants were subjected to 15% SDS-PAGE under reducing conditions and immunoblotted as described above using polyclonal anti-LL-37 antibodies (1:10000, Innovagen, Lund Sweden).

Treament of pHBECs with P2X7 antagonist: Confluent pHBECs were pre-incubated with AZ

261

11645373, a highly specific P2X7 antagonist (1 µM, Tocris Bioscience) or mock (DMSO) for 1 h, before exposure for 2 h to 2.5 % CSE. Culture media were then harvested and treated as reported in the previous paragraph. Titration of cathepsins was performed with E-64. Cell-lysate supernatants were subjected to 15% SDS-PAGE under reducing conditions and immunoblotted using anti-CatS antibody (R&D system, 1:1000).

Modulation of the enzymatic activity of CatS by CSE: The activity of CatS (1 nM) was measured in vitro at 37 °C in the presence of increasing amounts of CSE (0-40%) in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5, 0.01% Brij35, 15 µM DTT, using Z-Leu-Arg-AMC (20 µM) as substrate. Experiments were performed in 96-well microtitration plates (Nunc, microtiter plates, ThermoFisher Scientific, France) and fluorescence release was monitored using a Spectramax Gemini spectrofluorimeter (Molecular Devices, wavelengths of 350 nm for excitation and of 460 nm for emission). Under these experimental conditions, the substrate consumption was less than 5%. The same assays were repeated in 100 mM HEPES buffer, pH 7.4, 0.01% Brij35, 15 µM DTT in the presence of CSE (0-40%). All kinetic measurements were performed in triplicates and repeated twice.

Statistical analysis: Data were expressed as meanSD unless indicated. Statistical significance between the different values was analyzed by non-parametric Mann-Whitney U test and groups comparison were performed with non-parametric Kruskal-Wallis test. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 7 (GraphPad software, San Diego, CA, USA). Differences at a p-value < 0.05 were considered significant.

262

Results Clinical data of patients undergoing lung resection Seventy-two patients were enrolled for this study and divided into nine groups based on their smoking status. Their clinical characteristics are summarized in Table 1. All groups were similar with regards to age (60 to 70 years old). The number of pack-years was similar in all groups of smokers (including current smokers (CS) and former smokers (FS) with or without COPD) with a median of 40 pack-years smoking. Moderate and severe COPD patients (CS and

FS, GOLD stages II and III) showed lung functional alterations, including lower FEV1 (forced expiratory volume in one second, % predicted), which were significantly lower compared to non-COPD patients and GOLD stage I patients (p<0.05).

Detection of CatS in lung tissue of smokers Immunohistochemistry (IHC) was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded lung tissue sections from never smokers (NS), non-COPD current smokers (CS) and CS with COPD to evaluate CatS expression (Fig. 1A). In agreement with a previous work [11], modest level of immunoreactive CatS was observed in the lungs of never-smokers, while higher expression of CatS was readily detected in non-COPD and COPD CS. Highest expression of CatS was observed in the bronchial epithelial layer, type II pneumocytes and alveolar macrophages. CatS immunoreactivity was also detected in submucosal glands, while non-ciliated club cells of the bronchiolar epithelium were weakly stained. The degradation of the lung interstitium by elastinolytic proteases including CatS is a critical factor of the pathogenesis of cigarette smoke- induced emphysema. Accordingly, areas with interruption and fragmentation of elastin fibers in lung tissues from CS and CS with COPD compared with NS were observed. In this study, we expanded previous observations by first comparing CatS levels in a cohort of 72 patients, including NS, smokers with and without COPD. Western-blot analysis confirmed a higher CatS protein expression in selected samples of non-COPD and COPD smokers versus NS (Fig. 1B). While the mature form of CatS (25 kDa) was heavily stained, its proform was faintly revealed. This finding is in line with findings from a previous study showing that the level of mature CatS is higher in bronchoalveolar lavage fluids from COPD patients compared with healthy volunteers [19], and extends this by showing that smoking status is a determinant of CatS expression. Moreover, the CatS protein expression determined by Enzyme-Linked- ImmunoSorbent Assay (ELISA) was significantly ~2.5-fold higher in lung tissues from the

263 cohort of cigarette smokers (62 patients including current and former smokers with and without COPD) compared to NS (p = 0.0033) (Fig. 1C).

Active smoking increased pulmonary CatS expression To evaluate whether CatS expression might be correlated with the smoking status and history, we compared specifically the levels of CatS by ELISA in lung tissue samples from NS, current and former smokers with or without COPD groups (Fig. 2). Levels of CatS were significantly higher (4-fold) in lung tissues from non-COPD and COPD CS than those from NS, while FS expressed lower levels (1.5-fold) of CatS (Fig. 2A). Interestingly, a 2-fold decrease of CatS expression was measured in non-COPD and COPD FS compared with CS (p<0.05 for each comparison). Pack-years of cigarette smoking correlated positively with lung CatS expression

(rs = 0.468, P = 0.012, Fig. 2B) in the cohort that encompasses never-smokers (NS) and current smokers (CS) with and without COPD, while CatS expression correlated negatively with FEV1

(% predicted) (rs = -0.5337, p = 0.0041, Fig. 2C). However, no significant relationship between

CatS expression and the number of pack-years or FEV1 was found with non-COPD and COPD former smokers (FS). Nevertheless, the number of pack-years correlated negatively with FEV1

(%) in the cohort of 72 patients (rs = -0.429, p = 0.0002) (Supplementary Fig 1). This suggests that overexpression of CatS in CS is mostly associated with the number of pack years smoked and is inversely related to a decline in lung function. Of note, no computed tomographic (TC) and/or diffusion lung capacity for carbon monoxide (DLCO) were performed to evaluate emphysema in the cohort of patients. To extend our analysis on the relation between COPD severity and CatS expression, we further subdivided former and current smokers with COPD into three groups based on the GOLD stages (I, II and III) and investigated expression of CatS by Western-blot and densitometry analysis (Fig. 2D, 2E). Mature CatS from pooled samples from CS with COPD was significantly higher (3-fold for GOLD I, II and 5-fold for GOLD III), compared with NS (p<0.05), while its expression was lower in FS with COPD. This result was further confirmed by ELISA, which was performed in each lung tissue sample (Fig. 2F, 2G). There was a tendency toward an increase of CatS levels depending of the GOLD stages in

CS, but not in FS. Interestingly the negative correlation between CatS expression and FEV1 was significantly higher in NS, CS with GOLD, I II and III subgroups (rs = -0.5428, p = 0.0061), and even more when the cohort of CS GOLD I patients (“potentially overdiagnosed” patients with respiratory symptoms but normal lung function) was removed (rs = -0.6043, p = 0.0079),

264 compared with the cohort of NS and CS without COPD (rs = -0.4772), which was not statistically significant. These results suggested that increased levels of CatS may be related to the severity of the COPD in current smokers. Nevertheless, these results must be taken carefully and confirmed using a larger cohort.

Oxidative state and CatS activity in lung tissues of smokers Based on the induction of oxidative stress by cigarette smoke [29] and our observation that CatS expression was higher in current smokers, we next investigated total oxidant status (TOS) and total antioxidant status (TAS) in lung tissue samples (Table 2). The values of TOS and Oxidative stress index (OSI = TOS/TAS) in both non-COPD and COPD current smoker groups were significantly higher than that in never-smokers groups (p<0.05; p<0.0001, respectively). In contrast, values of TAS were significantly lower in both current smoker groups in comparison to never-smokers (p<0.05). Consistent with immunoassays (ELISA and Western-blot data), active-site titration of CatS was significantly higher in CS (non-COPD groups: p = 0.007; COPD groups: p = 0.0003) compared to NS, while FS expressed significant lower levels of active CatS (Fig. 3A). There was a trend for CatS activity to increase with the severity of COPD only in CS patients (Supplementary Fig. 2A, 2B). A significant 4-fold increase of CatS activity was observed in current smokers with GOLD III compared with NS (p<0.05). Moreover, we observed a significant increase of the elastinolytic activity of CatS in smokers of the cohort (non-COPD and COPD CS and FS) vs NS (p = 0.0002), using a fluorescein-labeled elastin (DQ-elastin) (Fig. 3B). Hydrolysis of DQ-elastin was impaired by morpholinourea-leucinyl-homophenylalanine-vinyl-sulfone (LHVS), a selective inhibitor of CatS, supporting that overexpressed CatS may contribute to matrix remodeling in smokers. Finally, active-site titration of CatS in NS and CS with or without COPD correlated positively with the number of pack-years (rs = 0.419, p = 0.0063) and negatively with FEV1 (% predicted) (rs = -0.381, p = 0.046) (Fig. 3C, 3D). Interestingly no significant correlation was observed between CatS activity and FEV1 in the subgroups of NS and CS without COPD, contrary to NS and CS with COPD (Gold I, II, III) cohorts (rs = -0.3981, p = 0.048). Among the later, the correlation was even stronger when subgroups of GOLD I was removed (rs = -0.4618, p = 0.046).

265

CSE-induced increase in Cat S is mediated by the P2X7 receptor in pHBECs CatS has a restricted tissue distribution with a major expression in antigen presenting cells (e.g. dendritic cells, macrophages) but also in airway epithelial cells [16, 30]. Accordingly, we investigated whether CSE could induce production of active CatS in primary human bronchial epithelial cells (pHBECs) (Fig. 4). No signs of toxicity were observed in CSE-exposed pHBECs (2.5-20%) compared to untreated cells (data not shown) as previously reported [27]. After 2 h of CSE exposure, we observed by both Western-blot and ELISA a marked increase of intracellular CatS in a dose-dependent manner (Fig. 4A, B). Although we could not determine the specific concentration of active CatS in cell lysates, we did find a dose-dependent increase of cathepsin activity toward Z-Phe-Arg-AMC in pHBECs lysates (r2 = 0.81, p<0.05) (Fig. 4C). For example, the concentration of active cathepsin (following E-64 titration) was significantly higher in 20% CSE-exposed cells (32.8 ± 4.2 nmol/mg of total protein) compared with untreated cells (22.0 ± 3.6 nmol/mg of total protein) (p<0.01). To provide evidence for CatS activity in pHBEC lysates, we investigated degradation of the antimicrobial peptide LL-37, because we previously demonstrated that CatS efficiently cleaved and inactivated LL-37 [31]. We therefore next incubated synthetic LL-37 with 10% CSE-exposed pHBECs lysates for 6 and 24 h and observed a loss of immunoreactive LL-37 in a time-dependent manner (Fig. 4D). LL-37 hydrolysis was prevented by addition of LHVS (100 nM), supporting that its degradation was the result of overexpression of CatS following exposure to 10% CSE, compared with untreated pHBECs cells. It was shown that CSE (0-10%) exposure triggers the release of ATP from HBECs cells via the sequential activation of transient receptor potential cation channels of the vanilloid subtype (TRPV) 1 and 4 and pannexin-1 channel pore, respectively [32]. Likewise, ATP acts on the ionotropic purinoceptor P2X7, that plays an important role in cigarette smoke-induced lung inflammation and emphysema [32, 33]. Interestingly, lipopolysaccharide combined with high concentration of ATP (millimolar concentrations) promotes rapidly (<4 h) the release of active CatS from microglial lysosomes, via P2X7 receptor activation as well as the downstream activation of p38 MAPK and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) [34]. According to these data, we hypothesized that CSE could drive the calcium-dependent cPLA2-induced lysosomal secretion of CatS, via the activation of the P2X7 receptor. To test this assumption, pHBECs cells were treated with 2.5% CSE for 2 h in the presence or absence of a P2X7 receptor antagonist (AZ 11645373). A subsequent Western-blot analysis indicated that P2X7 antagonist reduced the expression of CatS (Fig. 4E). Likewise, a quantitative analysis by ELISA

266 confirmed that the level of immunoreactive CatS was below the limit of detection (<15.6 pg/mL) in P2X7 antagonist-treated pHBEC cells compared with that measured in 2.5% CSE- exposed pHBEC (37.8515 pg/mL). Previous reports demonstrated unambiguously that phosphorylation of p38 MAPK and cPLA2 was significantly up-regulated by exposure to cigarette smoke [35, 36]). Consistent with these findings, our result showed that CSE induced in pHEBCs both phosphorylated cPLA2 and p38 MPAK expression in a relative dose- dependent manner (Fig. 4F). Taken together present data suggest that the CSE-induced upregulation of CatS is partly mediated by the MAPK signaling pathway, through P2X7 receptor activation in pHBECs (Fig. 5).

Partial inactivation of CatS by CSE Due to its low pKa, the active-site thiol of cysteine cathepsins is highly sensitive to redox modifications, resulting in a decreased proteolytic activity [28]. Nevertheless, active CatS is found in lung tissue of smokers and CSE-exposed pHBEC cells despite an unfavorable oxidizing environment. To tentatively understand these apparently contrasting observations, we studied the activity of CatS at pH 5.5 and 7.4 with increasing amounts of CSE in vitro. Concentration of CSE solutions (2.5-40%) were quantified and calibrated by measurement of the conversion of dihydrorhodamine-123 to rhodamine-123 (320 nm) [37], as described in the experimental section (Fig. 6A and 6B). CSE inactivated partly CatS in a time- and concentration-dependent manner (Fig. 6C). Nevertheless, CatS activity is more stable at pH 7.4 than pH 5.5 with CSE (Fig. 6D), likely due to a 2-fold decrease of the ability of CSE to induce oxidative stress via the production of rhodamine-123 at pH 7.4 compared to pH 5.5. Although neutral pH and oxidative environment are believed to be a major plight for the extracellular activity of cathepsins, our result shows that CatS can retain significant catalytic activity under oxidative stress at both acidic and neutral pH.

Discussion In the present study, we examined the expression and activity of CatS in lung tissues of 72 patients including never-smokers, smokers with or without COPD, and related this to their smoking status and history, and lung function. Increased levels and activity of CatS were demonstrated by ELISA, Western-blot analyses and and activity analysis in non-tumorous lung parenchyma clinical samples of smokers. This increase in CatS was most prominent comparing CS vs NS, but also the observation that FS displayed markedly lower levels of CatS than CS is

267 in line with the hypothesis that active smoking is an important driver of CatS expression in lung tissue. To our knowledge, this is the first report that establishes a relationship between human CatS expression and activity, and cigarette smoking, and is consistent with a previous report showing that CatS protein level in lung tissues differed between current and former smokers using semi-quantitative IHC technique [11]. Our observation showing increased CatS in current smokers, suggest that CatS may contribute to smoking induced lung injury. Although the present cohort of patients was not suited to determine the minimal time of exposure to cigarette smoke needed to enhance CatS expression in the lungs of smokers, we did find that CatS overexpression correlates positively with cumulative cigarette exposure (pack-years) in current smokers, but not former smokers. Conversely no significant difference in CatS levels were observed between non-COPD and COPD smokers. Nevertheless, we observed variations in CatS protein levels and activity with GOLD stages in COPD current smokers only, and both were particularly higher in severe COPD (stage III) compared to NS, suggesting that CatS may be a suitable biomarker for severe COPD development. One concern is that all the resected samples for the study came from patients who all underwent surgery for primary lung cancer. Nevertheless, the present analysis was restricted to non-tumorous lung tissues. Our results demonstrated unambiguously that significant differences in CatS expression between CS vs NS and between CS vs FS were not explained by pulmonary malignancies. On the other hand, we observed a statistically significant correlation between the severity of airflow obstruction

(decline in FEV1) and CatS expression/activity in lung tissues from current smokers with COPD. In line with these findings, an elegant study has demonstrated that the increase of both CatS activity and protein levels in BALF from patients with cystic fibrosis (CF) are associated with a decline in lung function [16]. According to these results, it is tempting to speculate that upregulation of CatS may not only be linked to the development and progression of COPD in smokers, but also in other chronic airway inflammatory disorders. About 40% of “heavy” smokers (>1 pack of cigarettes per day) develop emphysema [38], and increased CatS may contribute to extensive breakdown of parenchymal lung tissue. A number of studies have investigated elastin degradation in vitro by lysosomal cysteine cathepsins, and showed that the elastinolytic activities of CatS and CatK, and to a less extent of CatL, are higher than those of neutrophil elastase and MMPs, strengthening their pivotal role in matrix degradation and remodeling [39–42]. Also, among cysteine proteases expressed in lungs, CatS has the unique property to efficiently degrade elastin fibers at both pH 5.5 and 7.4 [43], and in vivo studies demonstrated the capacity of CatS to cause airspace enlargement in mice [17, 44]. We

268 demonstrated that the specific CatS-dependent elastinolytic activity was critically enlarged in the lung extracts of smokers compared to never-smokers. Similar findings showing an increased activity of CatS associated to smoke-exposure were found using as models smoke-exposed guinea pigs and mice [11, 42]. Accordingly, cigarette smoke-exposed animals developed emphysema with a significant decrease of ECM content (collagen and elastin) [42]. Other lung components may also be very important substrates of CatS. Interestingly, a fragment of decorin, one of the most abundant proteoglycans of the ECM, has been detected in the serum of patients with COPD and also fibrotic lung disorders; this decorin-derived peptide that is specifically released by CatS was proposed as a valuable serum biomarker for these lung disorders [45]. Despite the fact that CatS has a restricted cellular distribution with a prevalence expression in antigen presenting cells (e.g. alveolar macrophages), there is evidence that other lung cells also produce CatS [16, 30, 46]. Present IHC studies revealed that the increased immunoreactivity of CatS in peripheral lung tissue of current smokers is also assigned to type II pneumocytes and bronchial epithelial cells. We demonstrated that exposure of bronchial epithelial cells to CSE rapidly induced a dose dependent increase of CatS expression. A previous study showed that acute CSE exposure of primary airway bronchial epithelial cells triggered a dose-related increase of extracellular ATP, via the sequential activation of TRPV1/V4 receptors and pannexin-1 channel pore, resulting in the subsequent P2X7 activation [32]. Furthermore, it has been reported that the levels of extracellular ATP, proinflammatory cytokines including IL-18, and P2X7 receptor are increased in the airways of both non-COPD and COPD smokers and may contribute to the pathogenesis of smoking-related lung diseases [47–49]. Interestingly, extracellular ATP rapidly enhanced the expression of active CatS from microglia, a process that involved P2X7 receptor activation and downstream activation of p38 MAPK and cPLA2, which plays a crucial role in membrane fusion during lysosome exocytosis [34, 50]. Consequently, data presented herein suggest a crucial role for P2X7 receptor, also implying p38 MAPK and cPLA2 signaling pathways, in the release of CatS in pHBECs in response to CSE exposure. This study suggests that activation of P2X7 receptor in response to cigarette smoke may contribute to lung tissue damage through the release of degradative CatS. A number of studies have investigated the potential benefits of P2X7 blockade in rodent models of inflammatory disorders, including neurologic inflammation, rheumatoid arthritis, bone cancer and COPD (for review: [51]). It may be speculated that inhibition of this mechanism by specific P2X7 antagonists may reduce the release of CatS and could account for the reduction of lung

269 symptoms in heavy smokers with or without COPD. Alternatively, the potentially harmful actions of CatS in autoimmune and inflammatory chronic diseases is well established, suggesting its inhibition by selective and specific compounds may be crucial for patient outcome. Several studies have validated the safety and clinical efficacy of such inhibitory compounds in preclinical models and clinical studies for the treatment of rheumatoid arthritis, skin diseases and neuropathic pain (for review: [15]). The emerging role of CatS deregulation in smoking related lung diseases may pave the way for the development of further CatS inhibitors, which hopefully may represent a modulatory strategy for treating in part the emphysema component in heavy smokers with or without COPD by limiting elastic fiber destruction.

Acknowledgments We are grateful to Dr A. Barascu and Dr F. Gueugnon whom both handled lung tissue samples. Mu-Leu-Hph-VSPh (CatS inhibitor) was kindly provided by Pr J. H. McKerrow (University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA). Dr P-M. Andrault was a recipient of a doctoral grant from Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Région Centre- Val de Loire, France. T. Chazeirat is a recipient of a doctoral grant from University of Tours. M. Wartenberg is a doctoral recipient from Région Centre-Val de Loire. We also acknowledge Pr Pieter Hiemstra (Leiden University, Medical Center, Leiden, The Netherlands) for critical reading of the manuscript and English proof reading. P. Hiemstra is currently a visiting scientist at INSERM UMR 1100 (Studium Chair, Région Centre-Val de Loire). This work was supported by institutional funding from the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) and the Région Centre-Val de Loire (project BPCO-LYSE #2015103986). These agencies played no role in study design, data collection and analysis, the decision to publish or preparation of the manuscript.

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Legends to Figures

Figure 1: CatS protein expression in peripheral lung tissues of never-smokers and smokers. A) Lung tissue was obtained from never-smokers (NS), non-COPD current smokers (CS) and CS with COPD. Representative histological sections (original magnification: 400 x) of bronchiolar and alvelolar epithelium are shown to illustrate the difference between NS, non- COPD CS (middle) and COPD CS (Gold III) (right) (Bars, 100 µm). The lung parenchyma and elastin fibers were respectively stained with hematoxylin-phloxine-saffron (HPS) and orcein. Elastin fibers are highlighted with arrows. Expression of CatS was visualized by immunohistochemistry (IHC) using primary antibody against CatS (1:100) and an anti-CD68 antibody (1:200) was used to highlight the alveolar macrophages. B) Representative Western- blot of mature CatS in peripheral lung tissue lysates (30 µg/well) of five NS, five non-COPD CS and five CS with COPD. Patient ID numbers are shown on top. C) Total CatS expression was evaluated by ELISA in lung tissue lysates from NS patients (n=10) and smokers (n=62, including non-COPD and COPD CS, FS). Statistical significance was assessed using Mann- Whitney U test. Data are expressed as meanSD.

Figure 2: CatS protein levels increases in non-COPD and COPD current smokers. A) Total CatS levels in tissue lysates from NS (n=10) and CS with different status including CS (n=10), FS (n=10) w/o COPD, and CS (n=18) and FS (n=24) with COPD (Gold I-III) were quantified by ELISA. Statistical significance between each category of smokers versus NS was assessed using Mann-Whitney U test. B) Correlation between CatS levels and smoking history

(packs/year), and C) the lung function evaluated as forced expiratory volume in 1 s (FEV1) in samples from NS and CS (non-COPD and COPD). Correlations were determined by linear regression and indicated by the Spearman coefficient (rs) and levels of significance (p). D) CatS expression was evaluated in different groups; NS, non-COPD CS and FS, CS and FS with different stages of COPD severity (GOLD I, mild; GOLD II, moderate; GOLD III, severe). The expression of CatS is expressed with reference to the total protein concentration in lung samples (30 µg of protein pooled from equal amount of samples from each group). Samples were separated by 15% SDS-PAGE under reducing conditions. Detection of CatS (white arrow: proform, black arrow: mature form) was carried out by Western-blot. For protein load control anti-β-actin polyclonal antibody was used. Similar results were obtained in three independent

277 experiments. E) Densitometric analysis of CatS was performed using the ImageJ software. All expression values were normalized to the respective loading control and data are represented as mean±SD. F) Total CatS levels in tissue lysate from NS (n=10) and CS with COPD (Gold I, n=7; Gold II, n=9 and Gold III, n=2) and G) from NS and FS with COPD (Gold I, n=10; Gold II, n= 9; Gold III, n=5) were quantified by ELISA. Statistical analyses of CatS levels were performed for each category of smokers using Mann-Whitney U test and values were compared with NS (*: p<0.05).

Figure 3: CatS activity increases in lung tissue lysates of current smokers. A) Titration of active CatS in tissue lysates. Detection of active-site titration of CatS in tissue lysate (10 µg of total protein) of each patient was measured after 1 h incubation at 37°C in 0.1 M phosphate sodium buffer, pH 7.4, 5 mM DTT, Brij35 0.01%. Titration was performed with E-64 (0-20 nM) before adding Z-Leu-Arg-AMC (50 µM). B) Elastinolytic activity of CatS (pH 7.4) in tissue lysates from NS and all smokers, using DQ-elastin as a substrate. Controls were performed using the CatS inhibitor (LHVS, 100 nM). Statistical analyses of CatS activity were performed using Mann−Whitney U test. C) Correlation between active site titration of CatS and smoking history (packs/year), and D) FEV1 (% predicted) in samples from NS and CS (non- COPD and COPD). Correlations were determined by linear regression and indicated by the

Spearman coefficient (rs) and levels of significance (p).

Figure 4: Effect of CSE-treated pHBECs on CatS expression. Cultures of pHBECs were treated with 0%, 2.5%, 5%, 10%, or 20% cigarette smoke extract (CSE) for 2 h. A) pHBECs whole-cell lysates were subjected to 15% SDS-PAGE (total protein amount: 5 μg/ lane) under reducing conditions and immunoblotted using an anti-CatS polyclonal antibody. Anti-β-actin polyclonal antibody was used as loading control. B) Protein levels of CatS were determined by ELISA. Data are represented as mean ± SD of evaluations from three independent pHBEC donors. C) Total cathepsin activity in whole-cell lysates of pHBECs (standardized protein amount: 100 ng) was measured using Z-Phe-Arg-AMC (50 μM) in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5, 5 mM DTT, and 0.01% Brij35. D) Western-blot of LL-37 hydrolysis. LL-37 (20 ng) was incubated for 0-24 h at 37°C with cell free lysate (total protein amount: 5 µg) treated or not with 10 % CSE. Controls were performed with E-64 and LHVS. E) Representative Western-blot of CatS in whole-cell lysates of pHBECs exposed or not to CSE for 2 h (2.5%). Cells were pre-treated 1 h with P2X7 receptor antagonist (1 µM), or mock (DMSO). F) Representative Western-blot image showing expression of phosphorylated- 278 p38 MAPK (Thr180/Tyr182) and phosphorylated-cPLA2 (Ser505) in pHBECs cells following treatment with 0, 2.5, 5, 10 and 20% CSE for 2 h.

Figure 5: Schematic of proposed mechanism of intracellular CatS overexpression in CSE- exposed pHBECs. CSE exposure causes an increase in ATP from primary human bronchial epithelial cells, via the activation of TRPV1, TRPV4 and pannexin-1 channels [32]. ATP activates P2X7 receptors leading to efflux of K+ and influx of Ca2+ [34]. Increase of cytosolic Ca2+ levels stimulates p38

MAPK phosphorylation leading to an increase of phospholipase A2 (cPLA2) expression, leading to the release of lysosomal CatS.

Figure 6: Effect of CSE on CatS activity. A) CSE preparation was standardized by measuring the absorbance at 320 nm at pH 5.5 (filled black diamond) and 7.4 (empty circle). B) The oxidant potential of each CSE preparation was measured by its ability to convert non-fluorescent dihydrorhodamine-123 to oxidized fluorescent rhodamine-123 (λexc: 490 nm, λem: 530 nm) at pH 5.5 (filled black diamond) and 7.4 (empty circle). C) Inhibition of CatS activity by CSE. CatS (1 nM) activity (relative fluorescence unit, RFU) was measured continuously (0-60 min) at 37°C in the presence or absence of CSE (2.5-40 %) at pH 5.5 and 7.4, using Z-Leu-Arg-AMC (20 µM) as a substrate. D) CatS (1 nM) was preincubated at 37°C for 10 min in the presence or absence of CSE (2.5- 40 %) at pH 5.5 (filled black diamond) and 7.4 (empty circle), and residual activity was monitored at 37°C using Z-Leu-Arg-AMC (20 µM).

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Data Supplement

Cigarette smoke induces overexpression of active cathepsin S in lungs from current smokers with or without COPD

Pierre-Marie Andrault, Andrea C. Schamberger, Thibault Chazeirat, Damien Sizaret, Justine Renault, Agnès Petit, Mylène Wartenberg, Ahlame Saidi, Thomas Baranek, Serge Guyetant, Yves Courty, Oliver Eickelberg, Gilles Lalmanach, Fabien Lecaille

Material and methods:

Enzyme, substrates and inhibitors: Human cysteine cathepsins S was supplied by Calbiochem (VWR International S.A.S., France) and its active site titration was determined using L-3-carboxy-trans-2, 3-epoxy- propionylleucylamide-(4-guanido)-butane (E-64) (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). Unless stated, cathepsin activity assays were performed in acetate sodium buffer 100 mM, pH 5.5, dithiothreitol (DTT) 5 mM, and Brij35 0.01%. Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7- amino-4-methyl coumarin (Z-Phe-Arg-AMC) and Benzyloxycarbonyl-Leu-Arg-7-amino-4- methyl coumarin (Z-Leu-Arg-AMC) were purchased from R&D System (R&D System Europe, Abingdon, UK). Benzyloxycarbonyl-Val-Leu-Arg-7-amino-4-methyl coumarin (Z-Val-Leu- Arg-AMC) was from Anaspec (Eurogentec, Angers, France). DQ-elastin was purchased from Molecular Probes (Life Technologies, Saint Aubin, France). Pepstatin A, EDTA, AEBSF (Pefabloc), and S-methyl thiomethanesulfonate (MMTS) were from Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France). Morpholinourea-leucinyl-homophenylalanine-vinyl-sulfone phenyl inhibitor (LHVS) was a kind gift from Dr. J. H. McKerrow (University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA). The P2X7 antagonist 3-[1-[[(3'-Nitro[1, 1'-biphenyl]-4- yl)oxy]methyl]-3-(4-pyridinyl)propyl]-2, 4-thiazolidinedione (a.k.a. AZ 11645373) came from Tocris Bioscience (Bristol, UK).

Human lung tissues: Resected lung samples were obtained from seventy-two patients who underwent surgery for primary lung cancer at the Trousseau Hospital (Tours, France) between 2006 and 2011. The pathological findings of pulmonary nodule were non-small cell lung cancer. Non-tumor tissue was harvested at least 3 cm away from the tumor. The absence of carcinoma was checked 286 histologically. Tissue samples were selected, reviewed for validation by the Department of Pathologic Anatomy and Cytology (Centre Hospitalier Régional Universitaire de Tours,

France). A diagnosis of COPD was made by the physician, based on smoking history (>20 pack- years) and forced expiratory volume in 1 s versus forced vital capacity (FEV1/FVC) ratio of

<0.7 using spirometric tests. According to the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) staging, we reported 17 patients as having GOLD stage I, 18 as GOLD stage II, and 7 as GOLD stage III. Smoking history was calculated in pack-years, defined as the number of packs of cigarettes smoked per day multiplied by the number of years the person has smoked. Subjects were considered former smokers after cessation of smoking for at least one year before surgery. Upon collection, samples were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 °C. Tissue samples were embedded in Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek Europe, Alphen aan de Rijn, The Netherlands) and 4 µm section were prepared using a cryotome (Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Tissue sections were incubated in PBS or in a lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10% glycerol, 1% NP40, 2 mM EDTA, 137 mM NaCl) containing 200 mM sodium orthovanadate, a phosphatase inhibitor, and a cocktail of proteases inhibitors (10.4 mM AEBSF, 0.8 μM aprotinin, 40 µM bestatin, 140 µM E-64, 20 µM leupeptine, 15 µM pepstatine A). Incubation was made for 45 min at 4°C under agitation and then samples were centrifuged (21000 g) at 4°C for 20 min. Supernatant were harvested and frozen at -80°C until required. Protein quantification in supernatants was assessed with bicinchoninic acid assays (BCA protein assay kit, Interchim, Montluçon, France). Morphological analyses were performed using formalin-fixed paraffin-embedded lung tissues. The lung parenchyma and elastin fibers were respectively stained with Hematoxilin-Eosin-Safran and with Orcein

(Tissue-Tek Prisma, Sakura). Prior to immunohistochemical staining, the paraffin wax was removed by xylene. Tissue sections were rehydrated by sequential washings with ethanol and with water, and next immersed in the Dako Target Retrieval solution (EDTA 10 mM, pH 8). Slides were heated (1 h at 56°C) then cooled according to the manufacturer’s instructions, and first washed with water and next with PBS containing 0.2% (v/v) Tween 20. Endogenous peroxidase activities were neutralized by addition of hydrogen peroxide 3% for 10 min.

Immunohistochemical analysis of CatS in lung tissues: After washing (PBS containing 0.2% Tween 20), tissue sections were incubated with the polyclonal goat anti-human CatS antibody (1:100, Abcam, France) diluted in the Real Dako Antibody Diluent for 1 h at room temperature. The secondary biotinylated anti-goat antibody

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(Dako) was used to reveal binding of anti-CatS. Specificity of the staining was controlled by omission of the primary antibody. Staining was performed by the high-sensitivity substrate- chromogen system, Dako Liquid DAB (3, 3-diaminobenzidine tetrahydrachloride). In parallel, anti-cytokeratin 7 (a cytoplasmic marker that is confined to glandular and transitional epithelial cells, 1:200, Dako), anti-thyroid transcription factor 1 (a nuclear marker, which located primarily in the nucleus of type II pneumocytes and club cells, 1:50, Dako) and anti-CD68 (a monocyte and macrophage marker, 1:200, Dako) were used as control. Hematoxylin was applied, and next the sample was dehydrated with alcohol. Finally, digital microscopic images were acquired (Nikon E600 optical microscope, magnification: x 400; Olympus DP70 camera) and processed with the Olympus DP Controller software. IHC staining controls were performed under the same conditions.

Western blotting and immunoassays: Goat polyclonal anti-human cathepsin S was from R&D System. The lack of cross reactivity with cathepsins B, K, L and H was checked as described elsewhere [1]. Mouse monoclonal anti-β-actin was from Sigma-Aldrich. Anti-phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) rabbit monoclonal antibody was from Cell Signaling (Ozyme, Saint

Quentin Yvelines, France) and anti-phospho-cPLA2 (anti-phospho Ser505) polyclonal rabbit antibody from Abcam (Paris, France). In order to prevent any bias associated with individual clinical specimen, tissue samples of each of the groups were equally pooled to deposit same amount of protein (30 µg) on 15% SDS-PAGE gels prior to be transferred onto nitrocellulose membranes (Hybond-ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). The following groups were used: never-smokers, non-COPD current smokers, non-COPD former smokers, COPD current smokers at stages I, II and III, and COPD former smokers at stages I, II and III. Membranes were treated with antibodies (1:1000 in PBS, 0.1% Tween 20, 5% powdered milk) using standard Western-blot techniques, then incubated with corresponding (anti-goat, anti- mouse or anti-rabbit) secondary IgG-horseradish peroxidase conjugate (1:5000) for 1 h at room temperature prior to the detection using the ECL Plus Western Blotting (Amersham Biosciences). β-actin was used as an internal control of each protein sample, using β-actin antibody (1:2000) to ensure equal protein loading. Densitometric analysis of membranes was carried out using the ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA). Data from tissue samples were normalized to β-actin signal. Assays were repeated at least three independent times. In addition, CatS concentrations were determined using sandwich ELISA DuoSet kit (R&D Systems) (measurement in triplicate).

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Measurement of total anti-oxidant (TAS) and oxidant (TOS) status in lung tissues: Briefly, TAS method depends on the ability of antioxidants present in the sample to inhibit ABTS+ radical cation formation from the oxidation of ABTS (2, 2′-azino-di-3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) by metmyoglobin and hydrogen peroxide. The assay is calibrated with a standard stable antioxidant solution of known concentration, referred to as Trolox equivalent (6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; a soluble vitamin E analog). Values of TAS are expressed as μmol Trolox equivalent/liter (μmol Trolox eq./L). The TOS method is used to assess the total amount of oxidant molecules present in the sample and is based on the capacity of oxidants in the sample to oxidize the ferrous ion-chelator complex to ferric ions, generating a colored complex with xylenol orange in an acidic medium

(Abs = 530 nm). The TOS assay is calibrated with hydrogen peroxide (H2O2) and the results were expressed in μmol H2O2 eq./L.

Titration of CatS and elastinolytic activity in lung tissues: As CatS is more stable than the other cathepsins at neutral pH, its specific activity was assayed under neutral condition. Tissue samples (5 µg of total protein) were incubated in 100 mM sodium-phosphate buffer pH 7.4 for 1 h at 37°C to inactivate the other endopeptidase cathepsins. An aliquot was then removed, diluted with 100 mM sodium-acetate buffer pH 5.5, 10 mM DTT and Brij35 0.01% and used to measure the CatS activity at 37°C with Z-Val-Leu- Arg-AMC (20 µM) in the presence of increasing concentration of E-64 (0-500 nM). The CatS activity was monitored using excitation and emission wavelengths of 350 nm and 460 nm (Gemini spectrofluorimeter, Molecular Devices) in 96-well Nunc microtiter plates (ThermoFisher Scientific, Illkirch, France) under gentle agitation. Measurement of CatS elastinolytic activity was made using DQ-elastin (25 µg) as substrate (excitation and emission wavelengths of 480 nm and 530 nm, respectively). Controls were performed with the inhibitor LHVS (100 nM).

Preparation of aqueous cigarette smoke extract (CSE): Mainstream smoke of three Research-grade cigarettes (3R4F) with filter (Kentucky Tobacco Research and Development Center at the University of Kentucky, Lexington, KY) was bubbled in 100 mM sodium acetate buffer, pH 5.5 (50 mL) or in 100 mM HEPES buffer, pH 7.4 (50 mL) in a closed environment. The average burning time per cigarettes was about 8 min. The

289 obtained solution was considered as 100% CSE and was aliquoted and stored at -80°C until required. CSE preparation was standardized by measuring the absorbance at 320 nm (corresponding to the absorbance of polycyclic compounds, e.g. quinic acid or nicotine) with a Cary 100 UV visible spectrophotometer (Agilent Technologies, Courtaboeuf, France). CSE (100%) designed for cell culture was generated in BEBM media (Lonza, Workingham, UK) and sterile-filtered through a 0.2 µm filter, as previously described ([2]).

Cytotoxicity assays: The viability of CSE treated cells was assessed by MTT assay on 104 cells/cm² seeded on 24 wells plates as previously described ([2]). Briefly, After 2 h of CSE treatment (0-20%), thiazolyl-blue-tetrazolium-bromide (Sigma-Aldrich) was added to each well (final concentration 0.5 mg/mL) and incubated 1 h at 37 °C. Supernatants were aspirated and isopropanol, 0.1% Triton X-100 were added to dissolve formazan crystals. Absorbance was measured at 570 nm with a microplate reader (Tecan; Männedorf, Switzerland). Alternatively, activity of released lactacte deshydrogenase (LDH) was assessed with the cytotoxicity detection kit (LDH) (Roche, Mannheim, Germany) following the manufacturer’s instructions.

References:

1. Sage J, Leblanc-Noblesse E, Nizard C, Sasaki T, Schnebert S, Perrier E, Kurfurst R, Brömme D, Lalmanach G, Lecaille F. Cleavage of nidogen-1 by cathepsin S impairs its binding to basement membrane partners. PLoS ONE 2012; 7: e43494.

2. Schamberger AC, Mise N, Jia J, Genoyer E, Yildirim AÖ, Meiners S, Eickelberg O. Cigarette smoke-induced disruption of bronchial epithelial tight junctions is prevented by transforming growth factor-β. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2014; 50: 1040–1052.

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Figure Legends

Supplementary Figure 1:

Correlation between the lung function evaluated as forced expiratory volume in 1 s (FEV1, % predicted) and smoking history (packs/year) in the cohort of 72 patients. Correlation was determined by linear regression and indicated by the Spearman coefficient (rs) and levels of significance (p).

Supplementary Figure 2: Titration of active CatS in tissue lysates. Detection of active-site titration of CatS in tissue lysate (10 µg of total protein) of each patient was measured after 1 h incubation at 37°C in 0.1 M phosphate sodium buffer, pH 7.4, 5 mM DTT, Brij35 0.01%. Titration was performed with E- 64 (0-20 nM) before adding Z-Leu-Arg-AMC (50 µM). A) Tissue lysates were from NS (n=10 ) and CS with COPD (Gold I, n=7; Gold II, n=9 and Gold III, n=2) and B) and from NS and FS with COPD (Gold I, n=10; Gold II, n= 9; Gold III, n=5). All expression values were normalized to the respective loading control and data are represented as mean±SD. Statistical analyses of CatS levels were performed for each category of smokers using Mann-Whitney U test and values were compared with NS (*: p<0.05).

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Supplementary Figure 1

rs= -0.429, P = 0.0002 120

) 100

d

e

t

c i 80

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e

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1 1 Cigarettes (packs/year)

Supplementary Figure 2

A) B)

*

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Mylène WARTENBERG Régulation de l’activité protéolytique des cathepsines à cystéine S et K par des inactivateurs/inhibiteurs chimiques et pseudopeptidiques Résumé

La cathepsine (Cat) S est une protéase ciblée pour le développement de médicaments utilisés dans les maladies auto-immunes ou la douleur neuropathique. Elle joue également un rôle clé durant l’emphysème compte tenu de ses propriétés élastinolytiques. La Cat K, qui est une collagénase impliquée dans la résorption osseuse, représente une cible pertinente dans le traitement de l’ostéoporose et des métastases osseuses. De plus ces deux protéases sont des protagonistes majeurs du remodelage matriciel et l’homéostasie pulmonaire. Lors de la BPCO, la dégradation tissulaire bronchique est associée à une réaction inflammatoire qui s’accompagne d’un stress oxydatif et d’un déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases. L'exposition à la fumée de cigarette constitue le principal facteur de risque dans la BPCO. Malgré la présence d'une cystéine nucléophile (Cys25) dans son site actif, nous avons constaté que la Cat S conserve partiellement son activité enzymatique après exposition à la fumée de cigarette. Ainsi, nous avons exploré les mécanismes soutenant la stabilité de la Cat S, en présence d’oxydants majeurs de la fumée de cigarette : peroxyde d’hydrogène, formaldéhyde, acroléine et peroxynitrite. Par ailleurs, dans le but de réguler l'activité des cathepsines à cystéine K et S, nous avons développé des inhibiteurs pseudopeptidiques de nouvelle génération dérivés de séquences substrats des cathepsines S et K ainsi que des dérivés triazines.

Mots clés: BPCO, cathepsine K, cathepsine S, dérivés triazines, fumée de cigarette, inhibiteurs pseudopeptidiques, oxydation.

Résumé en anglais

Cathepsin (Cat) S is an attractive target for drugs in autoimmune diseases or neuropathic pain. Moreover Cat S plays a key role during emphysema according to its potent elastinolytic activity. Cat K is a critical bone-resorbing collagenase and is a relevant target for the treatment of osteoporosis and bone metastasis. Both enzymes play a key role in matrix remodeling and pulmonary homeostasis. During COPD, the degradation of pulmonary parenchyma depends on inflammatory reactions associated with oxidative stress and proteases/antiproteases imbalance. Exposure to cigarette smoke, a major source of oxidants, is the main risk factor for COPD. Despite the presence of a nucleophilic cysteine (Cys25) within its active site, we found that CatS preserved partially its proteolytic activity after exposure to cigarette smoke extract (CSE). Thus, we have explored molecular mechanisms supporting this stability in the presence of selected major CSE oxidants: hydrogen peroxide, formaldehyde, acrolein and peroxynitrite. In the other hand, we have designed innovative pseudopeptidic inhibitors derived from selective substrates of cathepsin S and K as well triazine derivatives in order to regulate the activity of cathepsins K and S.

Key words: Cathepsin K, cathepsin S, cigarette smoke, COPD, oxidation, pseudopeptidic inhibitors, triazine derivatives