DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Clonagem e expressão do cDNA codificante para a toxina do veneno de Lasiodora sp, LTx2, em vetor de expressão pET11a.
Alexandre A. de Assis Dutra
Ouro Preto, Julho de 2006
Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
Clonagem e expressão do cDNA codificante para a toxina do veneno de Lasiodora sp, LTx2, em vetor de expressão pET11a.
Alexandre A. de Assis Dutra
ORIENTADOR: PROF. DR. IESO DE MIRANDA CASTRO
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas na área de concentração Biologia Molecular.
Ouro Preto, julho de 2006
D978c Dutra, Alexandre A. Assis. Clonagem e expressão do DNA codificante para a toxina do veneno de Lasiodora sp, LTx2, em vetor de expressão pET11a: [manuscrito]. / Alexandre A. Assis Dutra. - 2006. xi, 87f.: il., color; graf.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Ieso de Miranda Castro.
Área de concentração: Biologia molecular.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
1. Clonagem - Teses. 2. Biologia molecular -Teses. 3. Toxinas - Teses. 4. Aranha - Veneno - Teses. I.Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. II. Título. CDU: 577.2
Catalogação: [email protected] Agradecimentos
Agradeço ao professor Ieso pela oportunidade de trabalho, pela confiança depositada em mim e pela orientação séria e comprometida;
Lucas, Milene e André, por dividirem as dúvidas, frustrações e as conquistas nesse trabalho;
Aos professores Juliana Fietto e Luciano Fietto por todos os conselhos e sugestões para sempre contornar, com serenidade, os problemas que surgiam;
À Maria José Trópia, por estar sempre pronta e disposta para me tirar do sufoco com boa vontade e bom humor;
Aos amigos do LBCM que fizeram os momentos difíceis parecerem até um pouco cômicos, especialmente Aninha, Lisvane, Mel, Fernanda, Luiza, Renata, Gil, Ju, Ronny, Murilo;
Aos amigos dos outros laboratórios que foram de importância indispensável para a conclusão deste trabalho. Dentre os quais: LIP e Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular;
Um agradecimento especial aos amigos do Laboratório de Venenos e Toxinas Animais – ICB – UFMG; pela ajuda nas análises de dados e purificações, além de sempre me ajudar a manter o bom humor;
Aos professores Adriano Pimenta e Milton Guerra pelas sugestões e discussões sempre muito proveitosas;
À minha família em BH por sempre estar presente, mesmo quando eu não sabia que precisava tanto deles ou não dava o devido valor;
Aos amigos que, mesmo não estando envolvidos diretamente na realização do trabalho, me ajudaram a manter a calma e esquecer dos problemas, quando estes pareciam maiores do que realmente eram;
Agradeço a Deus por ter ajudado a encontrar os caminhos corretos nos momentos de maiores dificuldades.
II Resumo
O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos.
III
Abstract
The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.
IV Índice
Resumo………………………………………………………...…….………….. III Abstract……………………………………………………………..….….…….. IV Abreviaturas importantes………………………………………..….…………IX Lista de Figuras……………………………………………………...…………. X Lista de Tabelas...... XI Apêndice...... XII 1 – Introdução...... 1 1.1 – Aspectos gerais...... 1 1.2 – Estudo de venenos animais ...... 4 1.3 – Estudo de venenos de aranhas...... 6 1.3.1 – Composição dos venenos de aranhas...... 6 1.3.2 – Ação dos venenos em canais iônicos...... 9 1.3.2.1 - Toxinas de aranha e canais de Ca2+...... 10 1.3.2.2 - Toxinas de aranha e canais de Na+...... 13 1.3.2.3 - Toxinas de aranha e canais de K+...... 17 1.3.2.4 - Toxinas de aranha e receptores de glutamato...... 19 1.3.3 – Toxinas inseticidas...... 21 1.3.4 - Atividade bactericida de venenos de aranhas...... 22
1.4 – Varredura de uma biblioteca de cDNA preparado a partir do mRNA
obtido da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp...... 23
2 – Objetivos...... 25
2.1 – Objetivo geral...... 25
2.2 – Objetivos específicos...... 25
3 – Materiais e Métodos...... 26
3.1 – Microrganismos, vetores e condições de cultivo utilizados nos experimentos...... 26 3.1.1 – Microorganismos utilizadas nos experimentos...... 26
V 3.1.2 – Vetores utilizados nos experimentos...... 26 3.1.3 – Meios de cultura...... 27 3.1.3.1 - Meio LB...... 27 3.1.3.2 - LB agar...... 27 3.1.3.3 – Meio SOC...... 27 3.1.4 – Condições de cultivo...... 28 3.2 - Extração de DNA plasmidial em pequena escala (Método CTAB)...... 28 3.3 – Reações da polimerase em cadeia (PCR)...... 29 3.4 - Clonagem da seqüência codificante para LTx2 no vetor pBluescript II SK (+/-)...... 29 3.5 - Clonagem da seqüência codificante para LsTx2 no vetor de expressão pET11a...... 31 3.5.1 – Excisão do plasmídeo pBluescript II SK – LTx2...... 31 3.5.2 - Recuperação do inserto correspondente à seqüência codificante para LTx2...... 32 3.5.3 - Corte e defosforilação do vetor pET11a...... 33 3.5.4 – Recuperação do vetor excisado em gel de agarose...... 35 3.5.5 – Ligação do fragmento codificante para LTx2 no vetor pET11a...... 35 3.6 - Transformação das bactérias...... 36 3.6.1 - Preparo de células competentes – Método de Cloreto de Cálcio...... 36 3.6.2 - Transformação das células competentes...... 36 3.7 - Obtenção de DNA plasmidial e análise dos transformantes...... 37 3.8 – Sequenciamento...... 37 3.8.1 - Reação de sequenciamento...... 37 3.8.2 - Precipitação da reação de sequenciamento...... 38 3.8.3 – Análise das seqüências de nucleotídeos obtidas...... 38 3.9 - Transformação das células BL21 (DE3)...... 39 3.10 – Análise dos plasmídeos extraídos das células BL21 (DE3)...... 39 3.11 - Indução da LTx2 recombinante e análise do perfil eletroforético dos extratos livres de células...... 39 3.11.1- Indução da LTx2 recombinante...... 39
VI 3.11.2 - Lise das células...... 40 3.11.3 – Preparo e coloração dos géis SDS – PAGE...... 40 3.11.3.1 – Preparo dos géis de poliacrilamida...... 40 3.11.3.2 - Coloração dos géis de poliacrilamida pelo método da prata...... 41 3.12 - Western Blotting - Método ECL...... 41 3.13 – Desnaturação dos corpos de inclusão e renaturação das proteínas...... 42 3.13.1 - Solubilização dos corpos de inclusão...... 42 3.13.2 - Renaturação das proteínas...... 43 3.14 - Purificação da proteína recombinante LTx2...... 43 3.15 - Western Blot...... 43 3.16 - Dosagem de proteínas...... 44 3.17 - Análise da seqüência de aminoácidos da LTx2 no programa BLASTp...44 3.18 - Análise da conformação secundária da LTx2...... 44 3.19 - Ensaios Biológicos...... 44 3.20 – Reagente e soluções...... 45 4 – Resultados...... 47 4.1 - Clonagem da seqüência codificante para LTx2 no vetor de expressão pET11a...... 46 4.2 - Análise da seqüência...... 49 4.3 – Transformação de células BL21(DE3) competentes e indução da toxina recombinante LTx2...... 49 4.3.1 – Análise das células competentes BL21(DE3) transformadas com a construção pET11a – LTx2 ...... 49 4.3.2 - Análise do perfil eletroforético dos extratos livres de células...... 51 4.3.3 – Confirmação da presença da LTx2 recombinante por Western Blotting - Método ECL...... 53 4.4 – Purificação da toxina recombinante LTx2 em sistema HPLC...... 54 4.5 – Análise da fração eluída da coluna de fase reversa...... 56 4.5.1 – Eletroforese da fração eluída da coluna de fase reversa...... 56 4.5.2 – Western Blotting da fração eluída na coluna de fase reversa...... 57 4.6 - Análise da seqüência de aminoácidos da LTx2 no programa BLASTp.....57
VII 4.7 - Análise da conformação secundária da LTx2...... 58 4.6 – Ensaios biológicos...... 60 4.6.1 – Teste de atividade antimicrobiana...... 60 5 – Discussão...... 63 6 – Conclusões...... 73 7 – Perspectivas...... 74 8 – Referências bibliográficas...... 75
VIII
Abreviaturas importantes
Aah: Toxinas isoladas do veneno do escorpião Androctonus australis hector AMPA: α-amino-3-hidroxi-5-metil-D-aspartato BLAST: Basis Local Alignment Search Tool cDNA: DNA complementar dNTP: Desoxiribonucleotídeos D.O.: Densidade Óptica EDTA: EthyleneDiamineTetrAcetic acid (ácido etilenodiamino tetra-acético) ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorvente ligado à enzima) GABA: Gamma-aminobutyric acid (Ácido Gama-aminobutírico) HPLC: High Pressure Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Performance) HWTX: Huwetoxina. Toxina isolada da aranha Selenocosmia huwena. ICK: Inhibitor Cistine Knot (Nó-de-cistina inibidor) iGlur: Receptores ionotrópicos de glutamato IPTG: Isopropil- β- D-thiogalactopyranoside Kda: Kilo Dáltons Lqh: Toxinas isoladas do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus hebraeus mRNA: RNA mensageiro nAChr: Receptores nicotínicos de acetilcolina NMDA: N-metil-D-aspartato PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis (Eletroforese em gel de poliacrilamida) PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) PhTx: Toxinas isoladas da aranha Phoneutria nigriventer PMSF: Phenylmethylsulphonylfluoride (Fenil-Metil-Sulfonil-Fluorido) TTX: tetrodotoxina VWF: Von Willebrand Factor (Fator de Von WIllerand) T.E: Tris / EDTA TFA: Trifluor acetic acid (ácido trifluoracético) XIA: X-gal, IPTG, Ampicilina
IX
Lista de figuras
Figura 1 - Esquema representando o motivo estrutural “nó-de-cistina”...... 8
Figura 2 – Modelo de canais de Ca2+ dependentes de voltagem...... 11
Figura 3 – Organização transmembrana das subunidades dos canais de Na+...... 14
Figura 4 – Estrutura dos canais de potássio...... 18
Figura 5: Tradução da seqüência de nucleotídeos que codifica para a toxina LTx2 utilizando o programa SIXFRAME...... 30
Figura 6 – Mapa do vetor de expressão pET11a...... 34
Figura 7: Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos de PCR mostrando a inserção
de um fragmento de aproximadamente 150 pares de bases...... 48
Figura 8 – Eletroforese em gel de agarose com o PCR de colônia dos DNAs plasmidiais extraídos das células competentes BL21(DE3) transformadas com a construção pET11a – LTx2...... 50
Figura 9: Eletroforese em gel SDS-PAGE, mostrando os níveis de expressão da proteína recombinante (LTx2) após indução com IPTG...... 52
Figura 10 - Resultado do Western Blotting método ECL...... 53
Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido com a purificação da toxina LTx2 recombinante...... 55
Figura 12 - Eletroforese com o material recolhido do HPLC...... 56
Figura 13 - Resultado do Western Blotting do pico recolhido do HPLC...... 57
Figura 14 – Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas LTx2, LTx3, LTx1, HWTX-II e HWTX-VII...... 58
Figura 15 – Predição da estrutura secundária adotada pela LTx2, segundo o programa PELE...... 59
Figura 16 – Predição de estrutura secundária para a LTx2 segundo o programa GOR4...... 59
Figura 17 - Ensaio antimicrobiano...... 61
Figura 18 – Controle da regulação da expressão da proteína
X recombinante pelo promotor T7 lac...... 67
Lista de tabelas
Tabela I - diâmetro dos halos de inibição formados nos ensaios antimicrobianos...... 63
XI 1 - Introdução
1.1 - Aspectos gerais
As aranhas pertencem ao filo Artropoda, subfilo Chelicerata, classe Aracnida, ordem Aranea (Ruppert 1994). A ordem Aranea pode ainda ser dividida em 2 subordens: Mesothelae, que compreende uma única família de aranhas primitivas (Liphistiidae) com 85 espécies documentadas. As aranhas da subordem Mesothelae são caracterizadas por apresentarem o abdômen segmentado, enquanto que as aranhas da outra subordem, Opisthothelae, não apresentam segmentação externa do abdômen. A subordem Opisthothelae é dividida em duas Infra-ordens: Labdognatha e Orthognatha. A maioria das Labdognathas respira através de um par de pulmões libriformes e um par de traquéias, que permitem uma troca gasosa mais eficiente, permitindo que sejam menos sedentárias que as Orthognathas. As Labdognathas possuem quelíceras diaxiais, que se movimentam de um lado para o outro e sintetizam a seda para a construção de teias. As Orthognathas possuem quelíceras paraxiais, que se movimentam de cima para baixo, e normalmente sintetizam a seda apenas para construir a ooteca e linhas de reboque. Com algumas poucas exceções, não constroem teias elaboradas (King 2000). Este grupo inclui as maiores aranhas conhecidas. Hoje são conhecidas cerca de 40.000 espécies de aranhas e estima-se que existam aproximadamente 100.000 espécies ainda não caracterizadas. Entretanto, somente a minoria dessas representa algum perigo para o homem (Escoubas et. al. 2000, Lucas 1988). Em geral as aranhas têm de 0,5 mm a 9,0 cm de comprimento corporal, podendo atingir um tamanho de 25 cm da ponta de uma perna à outra, como no caso das caranguejeiras gigantes (King 2004). A diferença mais evidente entre os machos e as fêmeas está no pedipalpo. Os da fêmea são curtos e se assemelham com as pernas; já os do macho possuem o último segmento modificado em órgão copulador, apresentando uma forma dilatada na ponta (Platnick 1971). Uma das características mais distinta das aranhas é a produção de seda. Uma única espécie pode conter até oito fiandeiras, cada uma produzindo seda com uma característica diferente (King 2004). As aranhas construtoras de teias produzem uma variedade de fibras com propriedades mecânicas ímpares na natureza e comparáveis com as melhores fibras produzidas pelo homem, em termos de resistência mecânica (Gosline 1999). Já foram encontradas espécies fósseis do Devoniano com fiandeiras perfeitamente identificáveis (Shear et. al. 1989). A seda das aranhas é formada por pelo menos oito tipos de proteínas (Koovor 1987).
1 As aranhas, como a maioria dos outros aracnídeos, são predadoras e se alimentam principalmente de insetos. De acordo com uma avaliação de Bristowe (1958) as espécies que habitavam a Grã-Bretanha naquela época devoravam por ano uma quantidade de insetos maior que o peso da população humana da ilha, o que ilustra também a importância das aranhas no equilíbrio ecológico. Entretanto, as aranhas são também presas de alguns insetos e vertebrados. Como exemplo alguns grupos de vespas, que utilizam aranhas como alimentos para suas larvas, paralisam a aranha com um ferrão e põem os ovos (Evans & Eberhard 1970, Steiner 1986). No Brasil as aranhas que causam acidentes de maior gravidade são as Araneomorphas do gênero Phoneutria Perty 1833, Loxosceles (Heinecker and Lowe, 1833) e Latrodectus Walckenaer 1805 (Lucas 1987). O gênero Phoneutria Perty 1833, que pertence à família Ctenidae, tem os olhos distribuídos em três fileiras. A primeira mais próxima às quelíceras com dois olhos, a segunda com quatro olhos e a terceira com dois olhos (Lucas 1987). As aranhas desse gênero são popularmente conhecidas pelo nome de “Armadeira” ou “aranha-das- bananeiras”. Elas apresentam hábitos crepusculares, erráticos e não constroem teias, caçando suas presas ativamente dominando-as com o veneno. A Phoneutria pica com freqüência e é bastante agressiva. Não costumam fugir quando provocadas e acompanham o movimento do agressor sempre tentando ficar na frente do mesmo. O veneno possui efeito neurotóxico periférico e central causando dor imediata e intensa. A maioria dos casos de acidente com aranhas deste gênero é de evolução benigna e não costuma ser fatal em adultos (Secretaria de Estado da Saúde, Ins. Butantan 1982). As aranhas do gênero Loxosceles são pequenas, com no máximo três centímetros de comprimento de uma perna à outra. Possuem seis olhos dispostos em três pares. São conhecidas popularmente como “aranha-violino” ou “aranha-marrom”. Normalmente elas não chamam a atenção e podem até ser confundidas com outras espécies menos perigosas (Lucas 1987). Elas aparecem em ambientes domésticos, porões, sótãos, garagens e entulhos (Lucas 1987). Não são aranhas agressivas e normalmente só picam quando comprimidas contra o corpo, situação que, normalmente, causa a morte das mesmas. O veneno tem ação hemolítica e proteolítica. Na maioria das vezes a picada não é percebida pela vítima e após 24 horas aparecem edemas no local da picada, indisposição e algumas vezes febre. A ulceração da pele, apesar da soroterapia, evolui vagarosamente e deixa cicatrizes. As aranhas do gênero Latrodectus são caracterizadas por um abdômen dilatado em forma de globo, exibindo no lado ventral uma cor vermelho-alaranjada. Os olhos são distribuídos em duas fileiras com quatro olhos cada uma. São conhecidas popularmente como “Viúvas-negras”. As fêmeas adultas possuem de 8 a 13 mm de comprimento corporal e os machos possuem até 3
2 mm de comprimento. Estes, normalmente morrem após o acasalamento. A fêmea faz de 3 a 5 ootecas em um intervalo de poucos dias. Os filhotes são espalhados pelo vento e podem se dispersar por quilômetros. As aranhas deste gênero não são agressivas e quando perturbadas deixam-se cair da teia e fingem-se de mortas. Picam somente quando comprimidas contra o corpo (Lucas 1987). O veneno desta aranha é, provavelmente, um dos venenos naturais mais tóxicos. O quadro clínico da picada é caracterizado por espasmos musculares dolorosos. Pode ser de alto risco para crianças, idosos e pessoas com doenças cardiovasculares. O tratamento, quando necessário, é feito com anti-soro específico (Rauber 1983). Os venenos de todas as aranhas deste gênero apresentam modo de ação semelhante e parecem ser compostos das mesmas toxinas (Escoubas et. al. 2000). Quanto às caranguejeiras, pensava-se que estas eram aranhas perigosas por causa do seu tamanho (Bücherl 1971). Mas não há, no Brasil, relatos de acidentes graves causados pelas aranhas da infraordem Orthognatha (Lucas 1987). Em recentes casos de picadas de Theraphosiideos na América do Sul (Lucas et. al. 1994) e Ásia/África (Schmidt 1989) e Austrália (Isbister et. al. 2003) ficou provado que o veneno desta aranha é inócuo para humanos, resultando, na maioria dos casos, apenas em dores locais moderadas, coceiras e rigidez no local da picada. Em casos mais severos podem ocorrer espasmos musculares que podem persistir por várias horas (Escoubas & Rash 2004). A dor causada pela picada desta aranha é resultante principalmente pelo ferimento provocado pelas quelíceras, pelo pH baixo do veneno, efeitos das histaminas, serotoninas e ATP (Schanbacher et. al. 1973 a,b; Chan et. al. 1975; Odell et. al. 1985, 1987). A principal forma de defesa dos Theraphosideos não é o veneno, e sim os pêlos urticantes presentes no abdômen dessa aranha, em uma concentração de 10 mil a 20 mil pêlos por mm (Pickard-Cambridge 1897). Quando o animal se sente ameaçado ele raspa as pernas posteriores no abdômen e lança esses pêlos urticantes no agressor, causando irritação na pele e mucosas. Entretanto, os casos de acidentes com a Mygalomorpha australiana Atrax robustus, da família Hexathelidae, são normalmente graves e antes do desenvolvimento de um anti-veneno eficiente podiam causar até a morte da vítima, como já foi relatado na literatura médica (Hartman & Sutherland 1984, Sutherland 1983, Torda et. al. 1980, Weiner 1961).
3 1.2 – Estudo de venenos animais
Os animais que possuem ou que utilizam toxinas, como cobras, escorpiões, Conus, insetos e aranhas contam com a maquinaria genética para a produção destes compostos (Mebs 2001, Escoubas & Rash 2004). A síntese de toxinas envolve a expressão de um gene que acarreta diretamente na toxina e a síntese de compostos secundários com atividade biológica envolve vias metabólicas constituídas de numerosas etapas (Mebs 2001). Já a algum tempo os venenos de origem animal têm sido alvo de grande atenção. O que inicialmente despertou atenção foi o modo de ação desses venenos e a importância médica relativa aos danos que estas substâncias podem causar ao organismo. Recentemente, o interesse por moléculas de origem animal aumentou devido ao fato de elas apresentaram um potencial valor econômico, relacionado ao desenvolvimento de novos fármacos e/ou inseticidas e como sondas específicas úteis para o estudo de canais iônicos e receptores de membranas, fornecendo ferramentas para a investigação de funções celulares bem como drogas úteis no estudo de neuropatologias (Jovem et. al. 1980a, Courad et. al.1982, Budd et. al. 1988, Jackson & Usherwood 1988, Cruz et. al. 1985, Grishin et. al. 1986, DeLima & Martin-Eauclaire 1995, Pimenta et. al. 2001a). O estudo do mecanismo de ação de venenos de origem animal mostrou que moléculas isoladas destes venenos podem revelar muito acerca do processo fisiológico nos quais elas interferem (Escoubas & Rash 2004). Uma das propriedades mais importantes das toxinas de origem animal é a alta especificidade por certos subtipos de canais iônicos ou receptores de membrana. Esta propriedade, quando combinada com a alta potência que geralmente as toxinas possuem, faz delas uma ferramenta de valor inestimável em experimentos para elucidar o papel fisiológico ou patologias relacionadas aos receptores ou canais, já que poucas drogas têm ação específica sobre os mesmos (Harvey 1998). As picadas de serpente causam cerca de 2,5 milhões de acidentes anualmente em todo o mundo, dos quais mais de 100.000 levam à morte (White 2005). A importância clínica dos venenos de serpente é, em parte, responsável pela atenção que já vem sendo dada há muito tempo a este veneno, o que resultou na descoberta de drogas importantes sintetizadas com base na composição do mesmo. Para citar um exemplo de sucesso, o potenciador de bradicinina, captopril, foi desenvolvido a partir do veneno de Jararaca (Harvey et. al. 1998) e hoje é usado como anti-hipertensivo em todo o mundo. Outro exemplo da utilidade das toxinas está no estudo de receptores muscarínicos no
cérebro. Existem cinco tipos de receptores muscarínicos, M1 a M5. Os agentes farmacológicos
4 disponíveis até então só eram capazes de distinguir três subtipos: M1, M2 e M3. Além de não serem seletivos o bastante para cada subtipo, as ferramentas farmacológicas disponíveis não permitiam estudar o envolvimento de cada um desses subtipos em um processo particular (Harvey et. al. 1998). Entretanto, no veneno da serpente Mamba Negra (Dendroapsis polylepis) foram encontradas toxinas que, por experimentos de competição, se mostraram específicas para certos tipos de receptores muscarínicos (Jerusalinsky et. al. 1992). De forma que se pôde
demonstrar, por exemplo, que o bloqueio do receptor M4 causa amnésia em camundongos. No veneno desta mesma serpente também foi encontrada uma das poucas toxinas com ação específica para canais de cálcio do tipo-L, a calciseptina. Outra utilidade prática encontrada para o estudo de venenos animais tem sido a pesquisa com inibidores de agregação plaquetária. O fator Von Willebrand (VWF) não interage com plaquetas em condições normais. Entretanto, certos componentes de venenos de serpente, como botrocetina e bitiscetina induzem a aglutinação plaquetária in vitro, mesmo em condições normais (Matsui & Hamako 2005). Para superar as limitações dos indutores de coagulação disponíveis na prática clínica, Read et.al. (1978) procuraram e encontraram, em 5 dos 73 venenos estudados, atividade de agregação plaquetária mediada pelo VWF. Bem como os venenos de aranhas e escorpiões, os venenos de vespas possuem várias substâncias bioativas (Konno et. al. 2001). Não obstante, eles têm sido negligenciados nos estudos de venenos animais e são pouco conhecidas as substâncias que os compõem. Os venenos de vespa são peculiares por possuírem um efeito paralítico, não-letal, de longa duração (Hisada et. al. 2005), uma vez que elas utilizam a presa paralisada para alimentar suas larvas (Konno et. al. 2001). No veneno da vespa Philantes triangulum foram encontradas philantotoxinas, que são moléculas bloqueadoras do receptor pós-sináptico do glutamato (Piek & Spanjer 1986, Piek et al. 1988, Eldefrawi et. al. 1988). Konno e colaboradores (2001) encontraram no veneno das vespas solitárias Anoplius samariensis e Batozonellus maculifrons uma série de toxinas peptídicas a que denominaram pompilidotoxinas (PMTXs). Esses peptídeos apresentaram ação tanto em sistema nervoso de invertebrados como em sistema nervoso central de mamíferos. Também no veneno da vespa solitária Anoplius samariensis, Konno e colaboradores (2001) encontraram o peptídeo anoplina. Esse peptídeo, composto por apenas 10 resíduos de aminoácidos, apresentou atividade antimicrobiana, e é o primeiro relato de substância com esse tipo de ação encontrada em veneno de vespas. Os venenos de escorpião possuem grupos de neurotoxinas que agem em mamíferos ou insetos. São toxinas polipeptídicas de cadeia longa, com 61 – 76 resíduos de aminoácidos, compostas de uma α-hélice empacotada em 3 folhas β e estabilizadas por quatro pontes disulfeto
5 (Karbat et. al. 2004). Estas toxinas peptídicas podem ser classificadas em duas categorias principais, toxinas α e β, com base no modo de ação e nas propriedades de ligação em sítios dos canais de sódio dependentes de voltagem (Gurevitz et. al. 1998, Wu et. al. 2000, Cestèlle & Catterall 2000, Karbat et. al. 2004). As toxinas α, o grupo que foi mais estudado, causam principalmente um retardo na inativação dos canais de sódio, prolongando o potencial de ação (Catterall 1995, Catterall 2000, Denac et. al. 2000, Gordon & Gurevitz 2003, Sun et. al. 2003). Este grupo pode ainda ser dividido em três subgrupos: Grupo α clássico, ativo em cérebro de mamíferos, como a Aah2 (isolada do veneno do escorpião Androctonus australis hector) e a Lqh2 (isolada do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus hebraeus), que se ligam com alta afinidade em canais de sódio dependentes de voltagem de cérebro de rato, mas que praticamente não são tóxicas em insetos (Karbat et. al. 2004); inseto-toxina α, como a LqhαIT, que tem alta afinidade em canais de sódio dependentes de voltagem de insetos (Karbat et. al. 2004), e o grupo α-like, ativo em sistema nervoso central de mamíferos e insetos (Gordon & Gurevitz 2003, Karbat et. al. 2004) mas incapaz de se ligar em preparação sinaptossomal de rato (Sun et. al. 2003). As toxinas β tornam mais negativa a voltagem necessária para a ativação do canal de sódio, diminuindo a amplitude do pico de potencial de ação (Cestèlle & Catterall 2000).
1.3 – Estudo de venenos de aranhas
1.3.1 - Composição dos venenos de aranhas
Dentre os diferentes grupos de animais venenosos, o das aranhas é provavelmente o menos explorado no aspecto relativo a composição do veneno (Escoubas et. al. 2000). Tal como venenos de outros animais, venenos de aranhas são uma rica fonte de toxinas de complexidade ainda não completamente elucidadas, incluindo peptídeos neuroativos, que são capazes matar ou paralisar a presa através de mecanismos moleculares variados. Os venenos de aranha são uma mistura de peptídeos de baixo peso molecular, neurotoxinas, toxinas dermonecróticas, enzimas (Hash & Hodgson 2002). Também fazem parte da composição de venenos de aranhas uma variedade de fatores humorais com propriedades inflamatórias, poliaminas livres, nucleotídeos, sais inorgânicos, aminoácidos livres, polipeptídeos com mais de 1000 resíduos de aminoácidos e fatores que podem modificar vários componentes da circulação sangüínea, acilpoliaminas e neurotransmissores. (Welsh & Batty 1963, Hash & Hodgson 2002). A função desses neurotransmissores na composição do veneno ainda não é conhecida. Suspeita-se que possam
6 estar relacionados com a ação das neurotoxinas ou que sejam produtos da degradação de outros constituintes do veneno (Escoubas et. al. 2000). As acilpoliaminas, junto com as proteínas e os peptídeos, são os componentes mais estudados e diversificados dos venenos de aranha (Beleboni et. al. 2004). Acilpoliaminas e peptídeos podem ser separados por cromatografia líquida de fase reversa, sendo que as acilpoliaminas são eluídas antes que os peptídeos. Este padrão de eluição já foi demonstrado outras vezes na literatura e parece ser apresentado por todos os venenos de caranguejeiras (Escoubas et. al.1995). As acilpoliaminas, derivados naturais de poliaminas, são moléculas pequenas e potentes que antagonizam várias classes de receptores, como receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChr) e receptores ionotrópicos de glutamato (iGlur). Esses componentes possuem também a capacidade de interagir com canais iônicos dos sistemas nervosos, central e periférico (Olsen et. al. 2004). Elas podem ser divididas em dois grupos: acilpoliaminas que contêm aminoácidos e acilpoliaminas que não contêm aminoácidos. Os dois grupos agem de maneira semelhante bloqueando o receptor de glutamato, receptores nicotínicos e incorporam a mesma família de grupos acil aromáticos terminais (para revisão ver McCormik e Meinwald 1995 e Blagbrough et. al. 1994). Em um estudo com a acilpoliamina AR636, isolada do veneno da aranha Argiope aurantia, Herold & Yaksh (2005) observaram que a AR636 provoca paralisia flácida dose- dependente bem como efeito anestésico, quando injetada em ratos através de um cateter espinhal. As acilpoliaminas agem também em canais de Ca2+ (McCormick et. al. 1993), e parecem ser também os responsáveis pela rápida paralisia observada em insetos durante a predação (Osborne 1996). Os principais componentes dos venenos de aranha são polipeptídeos com massa molecular de 3000 a 8000 Da que dependem de várias pontes de disulfeto para manter sua conformação. Esses polipeptídeos possuem também modificações amino ou carboxi terminais, ou mesmo ambas, que mantêm a estabilidade da molécula in vivo (Norton & Pallaghy, 1998). Essas toxinas têm essencialmente como alvo os vários tipos de canais iônicos de membrana e podem bloquear a liberação de neurotransmissores interrompendo a exocitose dos mesmos pelas membranas pré-sinápticas (Escoubas et. al.2000). Muitas das toxinas que agem em canais iônicos possuem um motivo estrutural chamado de “nó-de-cistina” (Figura 1). O “nó-de- cistina” é um motivo em que um “anel”, sustentado por duas pontes disulfeto, é cruzado por uma terceira ponte disulfeto (Craik et. al. 2001). Em 1994 uma conformação, encontrada em inibidores de proteases de plantas e neurotoxinas de Conus e aranhas, foi caracterizada por dois grupos de pesquisa (Pallaghy et. al. 1994, Narasimhan et. al. 1994). Esse motivo estrutural,
7 chamado de “Nó-de-cistina Inibidor” (ICK) é formado por uma folha-β tripla antiparalela estabilizada por um nó de cistina (Zhu et. al. 2003). Os dados encontrados por Escoubas & Rash (2004) sugerem que as toxinas com o motivo ICK possuem um espectro de ação farmacológica muito ampla, podendo exercer atividade em várias classes de canais iônicos. Até o momento aproximadamente 400 proteínas e peptídeos (1,2 – 27 Kda) já foram isoladas e purificadas, dentre as quais mais de 100 já tiveram a seqüência de aminoácidos determinada completa ou parcialmente (Richardson 2006). Essas toxinas têm essencialmente como alvo os vários tipos de canais iônicos de membrana e podem bloquear a liberação de neurotransmissores interrompendo a exocitose dos mesmos pelas membranas pré-sinápticas (Escoubas et. al.2000).
Figura 1. Esquema representando o motivo estrutural “nó-de-cistina”. O “anel” estabilizado pelas pontes disulfeto representadas em amarelo (VI - III e V – II) é cortado por uma terceira ponte disulfeto, mostrada em vermelho (I – IV). Fonte: http://knottin.cbs.cnrs.fr
Entre as proteínas encontradas nos venenos de aranha estão incluídas neurotoxinas de alto peso molecular e enzimas como proteases, hialuronidases, esfingomielinases, fosfolipases e isomerases. Entretanto, com exceção do veneno da aranha Loxosceles, que possui uma ação dermonecrótica peculiar, a presença de enzimas em venenos de aranha deve ser observada com cautela (Schanbacher et. al. 1973a, Schanbacher et. al. 1973b), principalmente quando a extração do veneno é feita por estímulo elétrico, uma vez que esta causa a contração de todos os músculos
8 anteriores, podendo levar a uma contaminação do veneno com saliva ou fluidos digestivos (Escoubas et. al. 2000). Em um estudo recente, Pimenta et. al. (2005) utilizaram de técnicas de espectrometria de massa para caracterizar estruturalmente peptídeos lineares com atividade antimicrobiana e vasoativas presentes no veneno da aranha Phoneutria nigriventer. Neste estudo foram encontradas 15 isoformas contendo de 7 a 15 resíduos de aminoácidos. São peptídeos normalmente negligenciados nos estudos de veneno em detrimento àqueles com mais toxicidade e presentes em maior quantidade, mas que entretanto podem possuir importantes aplicações em biotecnologia. O fato de não dependerem de pontes disulfeto para manter a conformação nativa favorece a expressão de proteínas ativas tanto por hospedeiros procariotas como eucariotas (Pimenta e De Lima 2005).
1.3.2 – Ação dos venenos em canais iônicos
As toxinas peptídicas de venenos de aranha têm sido de grande utilidade no estudo da eletrofisiologia e farmacologia de canais iônicos. Canais iônicos são proteínas de membrana que permitem o fluxo de íons através da membrana celular, regulando o potencial de membrana e balanço iônico da célula. Como moduladores do potencial de membrana os canais podem regular funções importantes como contração, secreção de hormônios e neurotransmissores e expressão gênica. Com o avanço nos estudos de toxinas, os pesquisadores ganharam uma importante ferramenta que permite uma investigação mais refinada do papel fisiológico dos canais iônicos, permitindo também o mapeamento de sítios específicos nos receptores que podem ser de interesse como alvos para novas drogas (Escoubas et. al. 2000). Vários estudos de caracterização dos venenos de outras aranhas já foram descritos, mas pouco se sabe a respeito das toxinas que compõem o veneno das aranhas do gênero Lasiodora. Recentemente foram descritas ações farmacológicas do veneno dessa aranha, tais como bloqueio do canal de Ca2+ do Tipo-L e alteração da cinética e voltagem de canais de Na+ (Kushmerick et. al. 2001). A interação entre as toxinas peptídicas de caranguejeiras e seus respectivos receptores ainda não é muito bem compreendida em nível molecular. Faltam estudos que definam o papel de determinados resíduos de aminoácidos na afinidade ou seletividade da toxina para determinados subtipos de canal. Seletividade esta que não é sempre absoluta. Uma toxina que possua ação em uma classe de canal permeável a determinado íon pode ter ação em outras
9 classes de canais permeáveis a outros íons. Essa não distinção por certas toxinas reforça o conceito de um sítio de ligação conservado no sensor de voltagem dos canais de cálcio, sódio e potássio (Escoubas & Rash 2004).
1.3.2.1 - Toxinas de aranha e canais de Ca2+
A importância dos níveis de Ca2+ em vários processos celulares já foi apontada por vários autores. Os canais de Ca2+ dependentes de voltagem permitem a entrada do Ca2+ na célula, em resposta à despolarização da membrana, de forma que esses íons possam exercer suas funções sobre processos fisiológicos tais como a secreção de hormônios e neurotransmissores, regulação da atividade de canais iônicos, controle da secreção de enzimas, expressão gênica, proliferação e morte celular e apoptose (Beleboni et. al. 2004). Uma variedade de canais iônicos dependentes de voltagem estão envolvidos na homeostase de cálcio. Esses canais são membros de uma superfamília de proteínas transmembrana que incluem também canais de K+ e Na+ dependentes de voltagem (Ertel et. al. 2000). Os canais de Ca2+ que dependem de altos níveis de despolarização para serem ativados e não apresentam inativação estão envolvidos essencialmente na liberação de neurotransmissores e são divididos em canais do tipo-L, tipo-N, tipo-P, tipo-Q e tipo-R. Os canais de Ca2+ do tipo-L são encontrados nos músculos liso, esquelético e cardíaco e células endócrinas, onde são responsáveis pelo início da secreção. Esse tipo de canal é o alvo de drogas usadas no tratamento de patologias cardiovasculares e são bloqueados por antagonistas orgânicos de canais de Ca2+ do tipo-L, como dihidropiridinas, fenilalquilaminas e benzotiazepinas (Ertel et. al. 2000). Canais de Ca2+ do Tipo-N, Tipo-P e Tipo-Q são encontrados em dendritos e terminais nervosos; e canais do Tipo-R são encontrados em neurônios. Estes não podem ser bloqueados por antagonistas de canais de Ca2+ do tipo-L, mas o são por toxinas polipeptídicas de Conus e aranhas (Ertel et. al. 2000). Os canais de Ca2+ tipo-T são ativados por pequenas despolarizações, apresentam inativação rápida e são encontrados em uma grande variedade de células, onde são responsáveis pelos disparos repetitivos (Bean 1898, Caterral 2000, Ertel et. al.2000). Todos os canais de Ca2+ ativados por voltagem são heterômeros formados por uma subunidade α1 tetramérica, que é a subunidade formadora do poro, e por várias subunidades reguladoras (α2, β, γ e a δ que é encontrada apenas no músculo esquelético) que são responsáveis pelas propriedades cinéticas e eletrofisiológicas dos canais de Ca2+ (Figura 2). A subunidade α1 é
10 a responsável pelo transporte do íon e pela sensibilidade do canal à voltagem. É nesta subunidade que se ligam drogas e toxinas (Beleboni 2004, Escoubas 2000). A grande diversidade de correntes de cálcio é resultado principalmente da quantidade de genes que codificam para isoformas distintas da subunidade α1 (Catterall 2000).
Figura 2 – Modelo de canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Este modelo é uma modificação do modelo original de canais de Ca2+ dependentes de voltagem de músculo esquelético. As α-hélices estão representadas como cilindros. FONTE: Catterall et. al. 2005.
Algumas toxinas de aranha permitiram a caracterização e classificação de diferentes correntes de Ca2+ em células do sistema nervoso, bem como a descoberta, por Newcomb e colaboradores (1998), dos canais de Ca2+ do Tipo-R, que eram insensíveis a todas as toxinas conhecidas até então. Várias toxinas polipeptídicas provenientes de venenos de aranha apresentam ação inibidora nas funções dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Essas toxinas foram inicialmente denominadas de forma genérica como ω-toxinas (Grishin 1999). As ω-Agatoxinas e acilpoliaminas FTX foram as primeiras moléculas isoladas da aranha Agelenopsis aperta que apresentaram atividade em canais de Ca2+ (Uchite 1997). Algumas ω- Agatoxinas são bastante específicas, como as do tipo I, II e IV, que bloqueiam as correntes de
11 Ca2+ nos canais dos tipos L, N e P, respectivamente. A ω-Agatoxina do tipo III é menos seletiva e bloqueia tanto canais de Ca2+ do tipo-N quanto do tipo-L, com a mesma potência (Escoubas 2000). Outro exemplo da especificidade em canais de Ca2+ se refere a acilpoliamina CNS2103 da aranha Dolomedes akefinokesis, que bloqueia reversivelmente canais de Ca2+ do tipo-L e tipo-R, sem afetar canais do Ca2+ do tipo-T ou qualquer canal de Na+ ou K+ (Kobayashi et. al. 1992, Stromgaard et. al. 2001). A toxina peptídica SNX-325, da aranha asiática Segestria florentina se mostrou seletiva no bloqueio de canais de Ca2+ do tipo-N, na concentração de 10nM (Newcomb et. al. 1995). A ação mais evidente do veneno total das aranhas do gênero Phoneutria é em canais de Na+. Entretanto, o fracionamento do veneno permitiu observar a ação de toxinas isoladas em outros canais iônicos. De fato, o segundo alvo principal do veneno total da aranha Phoneutria nigriventer são os canais de Ca2+ dos vários tipos. O bloqueio desses canais é responsável pela paralisia flácida causada por esse veneno (Cassola et. al. 1998, Leão et. al. 2000, Revisão por Gomez et. al. 2002). Seis diferentes toxinas, Tx3-1 a Tx3-6, foram isoladas da fração PhTx3 do veneno de P. nigriventer. Dentre essas toxinas, três apresentaram atividade de bloqueio do influxo de Ca2+ em terminais nervosos. São elas a Tx3-3, Tx3-4 e Tx3-6, que foram classificadas como ω-toxinas devido ao seu efeito em canais de Ca2+ (Gómez et. al. 2002). Kushmerick e colaboradores (2001) testaram o efeito do veneno total de Lasiodora em células GH3 na presença de tetrodotoxina (TTX), que bloqueia canais de Na+ sensíveis a TTX, para observar o efeito desde veneno em canais de Ca2+. O veneno bloqueou as oscilações dos níveis intracelulares de Ca2+. Quando testado na ausência de TTX, o veneno causou lento aumento do Ca2+ intracelular. Esse efeito sugere que o veneno bloqueie os canais de Ca2+ do Tipo-L. Neste mesmo trabalho foi testado o efeito do veneno na presença de nifedipina ou Cd2+, ambos bloqueadores de canais de Ca2+ do Tipo-L. Como não houve aumento de Ca2+ intracelular, foi sugerido que esse aumento depende da disponibilidade de canais de Na+ e canais de Ca2+ do Tipo-L. Kushmerick e colaboradores (2001) sugeriram, então, que o veneno causa aumento de Ca2+ intracelular através da abertura de canais de Na+. Essa abertura causa uma despolarização da membrana e a entrada de Ca2+ através dos canais de Ca2+ voltagem- dependentes. Uma toxina isolada do veneno da caranguejeira Grammostola spatula, a ω-grammotoxina, bloqueia os canais de Ca2+ dos tipos N, P e Q, mas não tem efeito nos canais do Tipo-L (Sutton et. al. 1998).
12 1.3.2.2 - Toxinas de aranha e canais de Na+
Canais de Na+ dependentes de voltagem estão presentes nas membranas da maioria das células excitáveis, onde são responsáveis pela geração e propagação do potencial de ação (Beleboni et. al. 2004). Os canais de Na+ são proteínas transmembrana compostas de uma subunidade α de aproximadamente 260 KDa e de pelo menos 3 subunidades β auxiliares. As subunidades β são responsáveis pela cinética de abertura e dependência de voltagem do canal. A subunidade α é composta de quatro domínios homólogos, nomeados de I a IV, cada um deles composto de seis regiões transmembrana nomeadas de S1 a S6 (Figura 3). Todos os agentes farmacológicos que agem em canais de sódio possuem sítios receptores na subunidade α (Cestèle & Catterall 2000). A região S6 é a responsável pela ativação do canal, funcionando como um sensor de voltagem. Entre os domínios III e IV existe uma região com a função de inativação do canal (Catterall 2000, Ogata & Ohishi 2002, Yu & Catterall 2003).
13
Figura 3 – Organização transmembrana das subunidades dos canais de Na+. Os cilindros representam as α-hélices preditas e as linhas representam as cadeias polipeptídicas de cada subunidade. Os sítios prováveis de N-glicosilações estão marcados com Ψ. O P está mostrando os sítios onde ocorrem fosforilações por proteína cinase A (círculos) e proteína cinase C (losango). O motivo isoleucina-fenilalanina-metionina-treonina (IFMT), que é crucial para a inativação, está representado por um h em um círculo sombreado. Sítios de ligação para toxinas α e β de escorpião estão indicados. FONTE: Catterall et. al. 2005.
Uma variedade de isoformas de canais de Na+ dependentes de voltagem foi caracterizada com a ajuda de técnicas de eletrofisiologia e bioquímica (Goldin 2001). Para auxiliar na identificação dos canais de sódio dependentes de voltagem já caracterizados, uma nomeclatura foi desenvolvida. Esta nomeclatura utiliza um sistema numérico para definir as subfamílias e subtipos com base em similaridades nas seqüências de aminoácidos dos canais. Neste sistema o nome individual do canal é o símbolo químico do principal íon a que ele é permeável (Na); o principal regulador fisiológico (voltagem) encontra-se subscrito (NaV). O número que se segue
14 no subscrito (NaV1) se refere à subfamília do gene que codifica para o canal. Atualmente existe somente uma subfamília para os canais de sódio. O número após o ponto representa a isoforma
específica do canal, por exemplo, NaV1.1. Com base em sua seqüência de aminoácidos e sensibilidade à tetrodotoxina, os canais de sódio podem ser classificados em dois grupos:
isoformas do grupo Nav1, que são 9 homólogos sensíveis à tetrodotoxina e denominados de
NaV1.1 a NaV1.9, e o grupo NaX, que é insensível à tetrodotoxina e difere estruturalmente do primeiro grupo em regiões críticas do canal, como na região S4, a região responsável pela
inativação, e na região formadora do poro (Goldin et. al. 2000). Os canais do grupo NaV1 encontram-se principalmente nos neurônios, coração, gânglios nervosos e músculo esquelético. + Os canais do tipo NaX são provavelmente responsáveis pelo transporte e absorção de Na , dependem da concentração de Na+ no meio (Watanabe et. al. 2000), e são encontrados principalmente no coração e neurônios sensoriais (Escoubas et. al. 2000). Catterall e Beneski (1980) observaram que os sítios de ligação das neurotoxinas em canais de Na+ apresentavam comportamento alostérico, podendo haver uma alteração conformacional no canal e no balanço entre os estados fechado / inativo, o que também acarretaria mudanças na afinidade da ligação de toxinas com outros sítios onde elas também podem se ligar. Já foram descobertas diversas toxinas que bloqueiam ou alteram as funções dos canais de Na+ dependentes de voltagem. Algumas delas já estão sendo utilizadas como ferramenta para o estudo destes canais (Strichartz et. al. 1987, Catterall 1995). As principais moléculas ativas em canais de Na+ são isoladas dos venenos de Agelenopsis aperta, Phoneutria nigriventer, Atrax robustus e Hadroniche versuta. O veneno de A. aperta foi o primeiro veneno no qual foram encontradas toxinas ativas em canais de Na+. Um grupo de toxinas peptídicas com ação em canais de Na+ foi isolado do veneno desta aranha, as quais foram denominadas μ-agatoxinas (μ- Aga I a μ-Aga VI) (Skinner et. al.1989). As μ-agatoxinas possuem ação semelhante às toxinas de escorpião com ação em insetos, induzindo a uma mudança na cinética de ativação do canal de Na+ de insetos para potenciais mais negativos (Grishin 1999, Beleboni et. al. 2004, revisão). A hainatoxina-IV (HnTx-IV) isolada do veneno da aranha Seleconosmia hainana não exerceu nenhum efeito na cinética das correntes de sódio. Entretanto esta toxina bloqueou as correntes de sódio sensíveis à TTX em neurônios de mamíferos, sugerindo que a mesma age de forma diferente da μ-Agatoxina (Xiao & Liang 2003). Outras duas toxinas (HwTxIV e HnTxV) foram isoladas do veneno da aranha Selescomia huwena e S. hainana. Essas duas últimas toxinas se mostraram seletivas para os canais de Na+ neuronais sensíveis à TTX, porém apresentaram um modo de ação diferenciado, bloqueando o poro sem alterar a cinética das correntes de sódio. Foi sugerido que as toxinas HnTx-IV, HwTxIV e HnTxV se ligam, como a TTX, ao sítio 1 na
15 entrada do poro, e desta forma bloqueiam a passagem do íon. Se confirmado esse modo de ação, poder-se-á concluir que estas toxinas atuam de forma distinta de todas as outras toxinas de
aranha com atividade em canais Nav descritas até o momento (Peng et. al. 2002, Liu et. al. 2003, Xiao & Liang 2003). Essas três toxinas são, também, as primeiras com motivo ICK isoladas do veneno de caranguejeira que não modificam a cinética do canal, mostrando uma diversidade adicional desses venenos (Escoubas & Rash 2004). A fração PhTx2 do veneno da aranha Phoneutria nigriventer diminuiu a inativação dos canais de Na+ e facilitou a sua ativação (Araújo et. al. 1993). A PhTx2 também aumentou a entrada de Na+ em sinaptosomas, aumentou o influxo de Ca2+ e a liberação de glutamato (Romano-Silva et. al. 1993). Quatro peptídeos inseticidas foram isolados por Corzo e colaboradores (2000) do veneno de Paracoelotes luctuosus e foram denominados δ-palutoxinas IT1 – IT4. A δ-palutoxina IT1 é a mais seletiva e potente dentre as δ-palutoxinas e age interferindo na inativação dos canais de Na+. O veneno total de Lasiodora não afetou a ativação dos canais Na+, mas retardou a cinética de despolarização e causou o surgimento de uma corrente que permanecia mesmo após o processo de despolarização. Ao contrário das tetrodotoxinas, isoladas do peixe Baiacu (Tetrodon sp), as toxinas de aracnídeos não interferem com a abertura dos canais, mas retardam a inativação ou alteram a voltagem de ativação, inativação ou ambos. O principal efeito do veneno de Lasiodora foi retardar e tornar incompleta a inativação dos canais de Na+. O veneno tornou mais negativa a voltagem necessária para a ativação. Dessa forma, essas toxinas abrem os canais de Na+ em condições que eles estariam normalmente fechados ou inativos (Escoubas et. al. 2000). Em coração de rato, o veneno da Lasiodora causou um aumento na liberação de acetilcolina na extremidade dos nervos parassimpáticos por ativar canais de Na+ insensíveis a TTX. O veneno, em uma dose de 100μg, causou bradicardia, distúrbios rítmicos e parada cardíaca transitória. Kalapothakis e colaboradores (2003) sugeriram então que o veneno de Lasiodora provavelmente age sobre canais de Na+ insensíveis à TTX já que 200 nM desta substância não foi suficiente para suprimir os efeitos do veneno. Os canais de Na+ dependentes de prótons são a forma mais simples de canal dependente de ligante. Eles estão presentes nos neurônios e possuem um papel importante na transdução de sinal e em patologias como isquemia cerebral ou epilepsia. A toxina peptídica PcTx1, isolada do veneno bruto da caranguejeira Psalmopoeus cambridgei, exerce um bloqueio seletivo em algumas subunidades do canal de Na+ próton-dependente (Escoubas et. al. 2000).
16 1.3.2.3 - Toxinas de aranha e canais de K+
Os canais de K+ são os canais iônicos mais abundantes e ubíquos, e possuem papéis importantes em neurônios e células musculares. O potássio atua em processos de sinalização, participa na geração do potencial de membrana, na excitabilidade dos neurônios e na secreção de neurotransmissores (Beleboni et. al. 2004, Escoubas et. al. 2000). Até o momento três classes principais de canais de K+ foram identificadas: uma delas inclui os canais de K+ retificadores do potencial de repouso através de correntes que saem da célula para o meio externo (outward-rectifier) e, portanto dependentes de voltagem (Kv) e os canais de + 2+ + K ativados por Ca (KCa). Os canais de K dependentes de voltagem regulam o potencial de repouso da membrana, a duração e freqüência do potencial de ação e a secreção de neurotransmissores. Estes canais são constituídos de tetrâmeros, cada um formado de seis segmentos transmembrana (Figura 4). A outra classe de canais de K+ é composta pelos retificadores do potencial de repouso através de correntes que entram na célula (inward-rectifier) ou Kir. A função destes canais é a estabilização do potencial de repouso da membrana próximo ao potencial de equilíbrio do K+ (Nichols & Lopatin 1997, Terlau & Stuhmer 1998). Estes canais são constituídos de tetrâmeros compostos por subunidades que possuem apenas dois segmentos transmembrana.
17
Figura 4 – Estrutura dos canais de potássio. A - Estrutura aberta e fechada dos poros dos canais de potássio. A região responsável pela seletividade está em laranja, a hélice externa (M1) se encontra adjacente à bicamada lipídica. A hélice interna (M2) tem o seu resíduo de glicina conservado marcado em vermelho. Este resíduo é importante para permitir o dobramento da hélice M2 na conformação aberta do poro. B - Estrutura tridimensional de um canal Kv1.2 tetramérico. No centro está a região do poro S5-P-S6 das subunidades 1 e 3. À esquerda, S1 a S4 da subunidade 4 formando o lado proximal do poro e que se projetam para frente do plano da figura. Na direita, S1 a S4 da subunidade 2 formam o lado distal do poro e se projetam para trás do plano da figura. O domínio sensor de voltagem composto pelos segmentos S1 a S4 está posicionado de forma a permitir uma interação com os segmentos S5-P-S6 da subunidade adjacente. FONTE: Yu et. al. 2005.
18 Uma série de toxinas animais já foi utilizada para elucidar os subtipos, funções e estrutura dos canais de K+. Dois subtipos de canais outward-rectifier (Kv2 e Kv4) foram caracterizados graças ao uso de toxinas de aranha (Dolly & Parcej 1996, Kukuljan et. al. 1995). Ao contrário das toxinas de escorpião, que agem bloqueando o poro do canal, as toxinas de aranha se ligam a sítios localizados fora do poro do canal para afetar suas propriedades. Uma acilpoliamina, isolada da aranha Argiope sp., denominada Argiotoxina636 (Arg636), é um inibidor de canais de K+ dependentes de ligantes e inibe também canais dependentes de voltagem (Lee et. al. 1999). Hanatoxinas (HaTx 1 e HaTx2) isoladas do veneno da aranha Grammostola spatulata bloqueiam canais de K+ Kv2.1 alterando a dependência de voltagem do canal (Swartz & MacKinnon 1997). Essa foi a primeira toxina isolada de venenos de aranha que é ativa em canais de K+ Kv2.1 dependentes de voltagem (Escoubas et. al. 2000). Uma toxina peptídica denominada stromatoxina (ScTx1) foi isolada por Escoubas e colaboradores (2002) do veneno da caranguejeira africana Stromatopelma calceata, e foi caracterizada como um potente inibidor dos canais de K+ dos subtipos Kv4.2 e Kv2.2. Dois inibidores dos canais de K+ foram isolados do veneno da caranguejeira Heteroscodra maculata. A heteroscodratoxina 1 inibe o subtipo Kv4 e foi o primeiro peptídeo com ação nos canais Kv4.1. A heteroscodratoxina 2 é específica para os canais do subtipo Kv2 (Escoubas et. al. 2002).
1.3.2.4 - Toxinas de aranha e receptores de glutamato
O L-glutamato é considerado o neurotransmissor mais importante em sistemas nervoso central de mamíferos e em sistemas periféricos de insetos (Beleboni et. al. 2004). O glutamato está envolvido em várias funções importantes do cérebro de mamíferos, como cognição, memória e aprendizado (Fonnum 1984, Collingridge & Lester 1989). Os receptores de glutamato estão agrupados em duas classes de acordo com o seu mecanismo de transdução de sinal, sendo elas: receptores metabotrópicos (mGluRs) e receptores ionotrópicos (iGluRs) (Ozawa et. al. 1998, Coutinho & Knopfel 2002). Os receptores de glutamato metabotrópicos utilizam a proteína G para mediar suas funções e são divididos em oito classes funcionalmente distintas: mGluRs1 a mGluRs8 (Pin & Duvoisin 1995, Conn & Pin 1997). Os receptores de glutamato ionotrópicos utilizam íon para exercer suas funções e são subdivididos em N-metil-D-aspartato (NMDA), α-amino-3-hidroxi-5-metil-D-aspartato (AMPA ou receptor quisqualato) e o receptor de kainato. Cada uma dessas proteínas é um canal iônico dependente de glutamato (Hollmann & Heinemann 1994, Beleboni et. al. 2004). O receptor de
19 kainato tem sido um desafio à parte devido à dificuldade de estudar suas subunidades e à falta de drogas que o distingam do receptor AMPA (Bear et. al. 1996). Até o momento não foram relatadas ações de toxinas em receptores metabotrópicos. A liberação do glutamato envolve a síntese, empacotamento em vesículas sinápticas, secreção por exocitose e reabsorção do glutamato. Não há evidência de enzimas que degradem ou inativem o glutamato na fenda sináptica, logo, a única forma de findar a sua ação é através da reabsorção. O contato prolongado do glutamato com os neurônios resulta em ativação excessiva dos receptores de glutamato, que estão envolvidos em várias doenças neuro-degenerativas crônicas, como Alzheimer, Parkinson, isquemia e epilepsia (Reis et. al. 1999). O desenvolvimento de antagonistas de subtipos específicos de receptores de glutamato pode ser de grande importância no desenvolvimento de terapia para essas doenças (Beleboni et. al. 2004). Os venenos das aranhas Argiope trifasciata e Araneus gemma foram caracterizados por Usherwood e colaboradores, que encontraram substâncias que agem como antagonistas do receptor de glutamato em junção neuromuscular de gafanhotos. Os resultados encontrados demonstram que as toxinas só agem quando o receptor do canal de glutamato está ativado por um agonista (Usherwood et. al. 1984). Adams e colaboradores (1987) encontraram no veneno da aranha Argiope aurantia uma mistura de componentes de baixo peso molecular, denominadas argiotoxinas, que bloqueiam a transmissão neuromuscular causando paralisia reversível em insetos (Adams et. al. 1987). Os componentes foram identificados como um resíduo de arginina e uma asparagina ligadas a uma acilpoliamina. Jackson e Parks (1989) demonstraram que acilpoliaminas com aminoácidos em sua estrutura possuem modo de ação similar em junções neuromusculares de invertebrados, causando uma inibição não-competitiva dos receptores sensíveis a AMPA. A acilpoliamina argiotoxina-636 é capaz de bloquear receptores NMDA (Draguhn et. al. 1991). Essa mesma toxina também bloqueia a abertura dos canais AMPA (Herlitze et. al. 1993). A toxina peptídica PnTx4(5-5) isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer inibe reversivelmente as correntes geradas pelo receptor NMDA em neurônios do hipocampo de cérebro de ratos. Esta toxina é também tóxica para insetos (De Figueredo et. al. 2001). Reis et. al. (1999), em um trabalho com a toxina Tx3-4, isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer, demonstraram que esta toxina progressivamente inibe a liberação de glutamato estimulada por KCl. Os autores também concluíram que esta toxina inibe a liberação de glutamato independente de Ca2+ e exerce inibição não competitiva na reabsorção de glutamato.
20 1.3.3 – Toxinas inseticidas
Após a Segunda Guerra Mundial os principais programas de erradicação de pragas agrícolas contavam com a utilização de inseticidas químicos. O DDT em especial foi utilizado tanto em lavouras como em programas bem sucedidos de erradicação da malária (Attaran et. al. 2000). Entretanto, o fato de a maioria destes inseticidas químicos agirem em apenas um, de um total de quatro alvos do sistema nervoso de insetos – canais de sódio dependentes de voltagem, receptor nicotínico de acetilcolina, canal dependente de GABA e acetilcolinesterase – facilitou, por parte das pragas alvo, o desenvolvimento de tolerância sítio específica. Como conseqüência houve o surgimento de resistência cruzada a vários tipos de inseticidas (Brogdon & MacAllister 1998). Este fato levou os agricultores e outros usuários de inseticidas a aumentar a dosagem utilizada, agravando os problemas de resistência e agravando os riscos de contaminação ambiental e de saúde pública. Como resultado, o DDT e outros organoclorados, foram banidos do uso agrícola nos anos setenta. O desenvolvimento de resistência aos inseticidas pelas pragas agrícolas, somado à proibição do uso de algumas famílias de inseticidas químicos, aumentou a necessidade da identificação de novas substâncias eficientes e seguras tanto no combate às pragas agrícolas como a vetores de doenças (Tedford et. al. 2004). Os venenos de aranha são misturas complexas especializadas em matar ou paralisar suas presas. Como a grande maioria das aranhas não apresenta risco ao homem, é grande a possibilidade da descoberta de componentes nesses venenos com ação específica em insetos (Tedford et. al. 2004). Dentre os componentes, com possível ação sobre insetos, estão as poliaminas, que são inibidoras pós-sinápticas capazes de bloquear reversivelmente canais de cálcio, canais sensíveis ao glutamato e canais de músculos locomotores, levando a paralisia (Atkinson et. al. 1992). Já os polipeptídios constituintes desses venenos agem pré- sinapticamente, quase sempre de maneira irreversível, induzindo ou inibindo a liberação de neurotransmissores (Atkinson et. al. 1992). Uma toxina com atividade inseticida foi isolada do veneno da aranha Segestria florentina e foi denominada SIT. Esta toxina causou paralisia irreversível em baratas (Periplaneta americana) (Lipkin et. al. 2002). Figueredo e colaboradores (1995) isolaram uma toxina neurotóxica da fração PhTx4 do veneno da aranha Phoneutria nigriventer, a qual denominaram Tx4(6-1). Esta toxina é um polipeptídeo de cadeia simples com 48 resíduos de aminoácidos e apresentou atividade específica para mosca (Musca domestica) e baratas (P. americana). Toxinas inseticidas ativas em canais de Ca2+ também foram isoladas dos venenos das aranhas Hololena curta (Bowers et. al. 1987), H. versuta (Wang et. al.1999) e Plectreurys tristes
21 (Branton et. al. 1987). Posteriormente, em um trabalho com uma nova toxina chamada PnTx4-3, isolada da fração PhTx4 do veneno de Phoneutria nigriventer, Oliveira et al (2003) observaram que esta toxina exercia efeito excitatório imediato quando injetada em tórax de mosca doméstica (Musca domestica) e barata (Periplaneta americana). A toxina também inibiu de maneira dose- dependente a reabsorção de glutamato em preparação sinaptosomal de rato. A principal vantagem no uso de inseticidas biológicos é a capacidade de algumas toxinas animais serem seletivas entre canais iônicos de insetos ou mamíferos e mesmo entre diferentes classes de canais iônicos (Karbat et. al. 2004), o que resulta em uma especificidade para a praga alvo, não atuando em outros insetos polinizadores, bem como em plantas e outros animais (Bergmann et. al. 2001). Vários peptídeos neurotóxicos com atividade exclusiva em insetos têm sido estudados a fim de tornar mais claro o modo de ação dessas substâncias, o que possibilitaria uma melhor avaliação do uso potencial dessas toxinas para o controle de pragas.
1.3.4 - Atividade bactericida de venenos de aranhas
A busca por peptídeos com atividade bactericida em veneno de aranhas tem sido impulsionada pelo surgimento de bactérias resistentes a antibióticos. O mecanismo de ação desses peptídeos, mais bem conhecido, é através de sua inserção na membrana celular causando destruição ou permeabilização da mesma, levando o microrganismo à morte. Alternativamente, os peptídeos antimicrobianos podem se ligar a um receptor de membrana levando a uma perda específica de sua função. Além disso, ao se translocarem através da membrana, essas moléculas com propriedade antibiótica podem atuar intracelularmente, impedindo a síntese de metabólitos importantes para o microrganismo (Lohner, 2001).
Em 1989, Xu & Qu encontraram um peptídeo antibiótico no veneno da aranha Lycosa singoriensis. Recentemente, Yan & Adams (1998) descreveram a existência de peptídeos com ação inseticida e bactericida no veneno da aranha Lycosa carolinensis, denominados licotoxinas. Kuhn-Nentwig et. al. (1998) publicaram a estrutura de um peptídeo com ação inseticida e bactericida, denominado CSTX-4, do veneno da aranha errante Cupiennius salei. Dois anos depois, Haeberli et. al.. (2000) caracterizaram com maiores detalhes a atividade microbiana dos peptídeos do veneno desta mesma aranha. Budnik et. al. (2004) encontraram no veneno da aranha Lycosa singoriensis 3 peptídeos com atividade antimicrobiana aos quais denominaram lycocitina 1, 2 e 3. As lycocitinas 1 e 2 apresentaram estruturas que ainda não haviam sido observadas dentre os peptídeos com atividade antimicrobiana, enquanto a lycocitina 3 apresenta
22 grande similaridade com a lycotoxina II, isolada da aranha Lycosa carolinensis. Cinco diferentes peptídeos foram isolados do veneno da aranha Cupiennius salei e suas atividades bactericidas foram testadas contra cinco diferentes espécies de bactérias, tanto gram-negativas (Escherichia coli, Pseudomonas putida, Paracoccus denitrificans) como gram-positivas (Staphylococcus epidermidis e Bacillus subtilis). Todas as cinco bactérias foram susceptíveis a todos os cinco peptídeos em concentrações que variaram de 0,18 a 18μM e o veneno bruto causou 100% de inibição no crescimento em diluições até 1:55.000 (Haeberli e cols., 2000).
Belokoneva et. al. (2004) descreverem a estrutura de dois peptídeos catiônicos lineares denominados Pandinina 2 (Pin2 – 24 resíduos de aminoácidos) e Oxyopinina 1 (Oxki1 – 48 resíduos de aminoácidos) isolados do veneno bruto do escorpião Pandinus imperator e da aranha Oxyopes kitabensis, respectivamente. Ambos os peptídeos mostraram exercer efeitos inibitórios sobre o crescimento de bactérias tanto Gram-negativas quanto Gram-positivas e atividade hemolítica sobre eritrócitos contendo quantidades abundantes de fosfatidilcolina na membrana. Os peptídeos Pin2 e Oxki1 ligam-se a fosfocolinas de membrana desencadeando a formação de poros na bicamada lipídica (Belokoneva et. al. 2004). No veneno do escorpião Pandinus imperator também foi encontrada a toxina scorpina (Conde et. al. 2000) que, além de atividade antimicrobiana em E. coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Klebsiella pneumoniae, também apresentou toxicidade em vários estágios do parasita Plasmodium berghei, causador de malária. Os peptídeos antimicrobianos parecem fazer parte de uma família de peptídeos catiônicos, α-helicoidais, anfipáticos e sem resíduos de cisteínas. Os membros desse grupo de peptídeos são amplamente distribuídos em uma miríade de venenos animais e fazem parte de um mecanismo inato de defesa contra diferentes tipos de patógenos (Moerman et. al. 2003).
1.4 – Varredura de uma biblioteca de cDNA preparado a partir do mRNA obtido da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp
Uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp foi construída em uma fase anterior desse trabalho. A construção foi realizada no laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) pelo Dr. Evanguedes Kalapotakhis, Dr. Ieso de Miranda Castro e Dr. Élio Hídeo Babá. As moléculas de cDNA foram inseridas entre os sítios EcoR I e Xho I do vetor Uni-Zap™, que foi empacotado em partículas de fago lambda ZAP usando o Kit Gigapack III Paking Extracts (Stratagene). A varredura dessa biblioteca de cDNA foi realizada utilizando-se a técnica
23 de ELISA (Kalapothakis et. al. 2001). Como primeiro anticorpo utilizou-se anti-soro policlonal anti-veneno total. Os clones que se mostraram positivos após a varredura foram seqüenciados de acordo com o método descrito por Sanger et. al. (1977). O sequenciamento foi feito em ambas as fitas utilizando-se os iniciadores BK reverse e T7 primer, que se anelam no vetor PBK-CMV. A partir dessa varredura da biblioteca de cDNA, foi identificado e isolado o clone 1228, que codifica para a toxina LTx2 (Vieira 2003). Foram feitas tentativas, sem sucesso, de inserir esse clone em vetor de expressão pET11a. Em nosso trabalho foram feitas novas tentativas de clonagem e expressão da toxina recombinante LTx2, bem como sua purificação e ensaios de atividade biológica.
24 2 – Objetivos
2.1 – Objetivo geral
O objetivo geral da nossa proposta de trabalho foi a clonagem molecular da seqüência que codifica para a toxina LTx2 no vetor de expressão pET11a e a expressão e purificação da proteína recombinante.
2.2 – Objetivos específicos
1) Desenhar iniciadores para amplificação da seqüência codificante para a toxina madura;
2) Amplificar o fragmento, purificá-lo e inseri-lo em um vetor de expressão bacteriano;
3) Transformar as bactérias BL21(DE3) com os plasmídeos contendo o inserto a ser clonado;
4) Verificar, por seqüenciamento, se o inserto se encontra no frame correto;
5) Proceder a indução da proteína alvo e verificar, por SDS-PAGE, se a proteína está sendo expressa;
6) Purificar a proteína recombinante;
7) Testar a atividade da proteína recombinante.
25
3 - Materiais e Métodos
3.1 – Microrganismos, vetores e condições de cultivo utilizados nos experimentos
3.1.1 – Microorganismos utilizadas nos experimentos
Escherichia coli TOP 10 F’ F’, mcrA, (mrr-shdRMS-mcrBC), φ80ΔlacΔ-M15, Δlac74, deo R, recA1, araD139, Δ(ara, leu), 7697, galU, galK, λ-, rslp, endA1, nupG.
E. coli BL21 (DE3)
- - - F ompT hsdSb(r B m B) gal dcm.
Staphilococcus epidermidis: Isolado de urocultura, Laboratório de Microbiologia - Escola de Farmácia.
Salmonella Agona: FERNANDES, S.A., et. al. (1997). Characterization of lactose-fermenting Salmonella Agona strains isolated in a pediatric unit. Revista de Microbiologia. 28:273 – 278.
Pseudomonas sp.: ATCC 21025
3.1.2 – Vetores utilizados nos experimentos
pET11a – pET System Vector and Hosts Stratagene – Catalog 211521, 211523, 211621, 211623 Revision 012004;
YEP195 – Acesso GenBank: X75459
26 pBlueScript II SK (+/-) – Stratagene SK(+): #212205; SK(-): #212206; GenBank: #X52328 [SK(+)]; #X52330 [SK(-)].
3.1.3 – Meios de cultura
3.1.3.1 - Meio LB
Para 1 Litro: - Triptona – 10,0 g - Extrato de levedura – 5,0 g - NaCl – 10,0 g Autoclavar.
3.1.3.2 - LB agar
Para 1 Litro: - Triptona - 10,0g - Extrato de levedura – 5,0g - NaCl – 10,0g - Agar - 15,0g Autoclavar
3.1.3.3 – Meio SOC
Para 1 Litro - Triptona – 20,0g - Extrato de levedura – 5,0g - NaCl – 0,5g Homogeneizar e adicionar: - KCl 250 mM – 10,0 mL
- MgCl2 2 M – 5,0 mL Autoclavar e adicionar: - Glicose estéril 1 M – 20,0 mL.
27 3.1.4 – Condições de cultivo
Inicialmente, colônias isoladas de E. coli TOP 10 F’ foram selecionadas de uma placa LB- estreptomicina- tetraciclina- ágar e crescidas em tubos de ensaio contendo 4 mL de meio LB- tetraciclina – estreptomicina durante 18 horas a 37 ºC, sob agitação a 250 RPM, em agitador New Brunswick. Em seguida, os pré-inóculos foram usados para inocular meio LB e procedeu-se o crescimento nas mesmas condições descritas anteriormente.
3.2 - Extração de DNA plasmidial em pequena escala (Método CTAB)
Para a extração de DNA plasmidial, cerca de 4 mL de meio LB era inoculado com as células contendo o DNA de interesse. A cultura era então transferida para tubos de 1,5 mL e centrifugada por 5 minutos a 13.000 RPM. O sobrenadante era descartado e as células suspensas em 200 μL de STET (8% p/v de sacarose, 0,1% v/v de Triton-X100, 50 mM de EDTA, 50 mM de Tris HCl pH 8,0). Adicionou-se 7,0 μL de lisozima (50 mg/mL) e as suspensões foram incubadas a temperatura ambiente por 5 minutos. Para inativar a lisozima, as suspensões foram colocadas por um minuto em um bloco térmico a 95ºC. As suspensões foram centrifugadas a 13.000 rpm por 10 minutos e o resíduo celular foi removido com a ajuda de um palito estéril. Aos sobrenadantes foram adicionados 8,0 μL de CTAB (5% p/v de cetil trimetil brometo de amônio). Foi realizada então uma nova centrifugação a 13.000 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram suspensos em 300 μL de NaCl 1,2M. O DNA foi precipitado pela adição de 750μL de etanol 100% gelado. Para aumentar a eficiência da precipitação a mistura foi deixada por 2 horas a – 20 ºC. Foi realizada uma nova centrifugação a 13.000 RPM por 10 minutos, os sobrenadantes foram descartados e os precipitados foram lavados com 800 μL de etanol 70%. Os DNAs plasmidiais foram secos a 65 ºC em um bloco térmico e então suspensos em 20 μL de água deionizada.
28 3.3 – Reações da polimerase em cadeia (PCR)
As reações de amplificação foram realizadas em um termociclador (Mastercycler, Eppendorf) e preparadas conforme descrito abaixo:
• DNA template – 1,0 μL • Iniciador direto – 1,0 μL (20 pmol/mL) • Iniciador reverso – 1,0 μL (20,0 pmol/mL)
• Tampão para enzima Taq (10X) com MgCl2 – 2,5 μL • dNTPs (solução 2,5 mM) – 2,5 μL • Taq polimerase (Phoneutria) – 0,5 μL • Água deionizada q.s.p 25,0 μL
3.4 - Clonagem da seqüência codificante para LTx2 no vetor pBluescript II SK (+/-)
A toxina LTx2 foi previamente caracterizada por sequenciamento por Vieira et. al. (2004). A figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos predita para esta toxina. Inicialmente a nossa proposta era inserir a seqüência codificante para LTx2 no vetor pET11a. Para tal, a seqüência codificante para a toxina madura LTx2 foi amplificada a partir do clone 1228 proveniente de uma biblioteca cDNA, preparada a partir do mRNA obtido da glândula de veneno da aranha Lasiodora sp (Vieira et. al. 2004). Na amplificação foram usados os seguintes iniciadores:
Iniciadores Seqüências Direto 5’-CCATATGCTTTTCGAATGTAC-3’ Reverso 5’-GGGATCCCTAAATCTTCAAAC-3’
Observem que o iniciador direto apresenta a seqüência CATATG, correspondente ao sítio de reconhecimento para a enzima Nde1, enquanto o iniciador reverso apresenta o sítio GGATCC, de reconhecimento da enzima BamHI. A amplificação foi conduzida em uma mistura reativa preparada de acordo com o protocolo descrito no item 3.3.
29
ATG AGA TCT TTG ACG TTG GCT GCT CTT CTG CTA TGC AGC TTG CTG TTA GTT M R S L T L A A L L L C S L L L V TTT CAC ACT TCA GCA GCT GAA GAG CTT CAA GCT CAG GAA GGC CAT CTG ATG F H T S A A E E L Q A Q E G H L M ATC CCC GGT GAT ACT GAC ACC GCC CTA GAA ACT GTC GAT GAT GAA AGA CTT I P G D T D T A L E T V D D E T L TTC GAA TGT ACT TTT GAA TGC GAC ATT AAA AAA GAA GGC AAA CCA TGC AAA F E C T F E C D I K K E G K P C K CCC AAG GGA TGC AAG TGT GAC GAC AAG GAT AAC AAG GAT CAC AAG AAA TGT P K G C K C D D K D N K D H K K C TCT GGT GGA TGG AGA TGT AAG CTC AAG CTC TGT TTG AAG ATT S G G W R C K L K L C L K I
Figura 5: Tradução da seqüência de nucleotídeos que codifica para a toxina LTx2 utilizando o programa SIXFRAME. A seqüência correspondente ao peptídeo sinal, peptídeo intermediário e à toxina madura são mostrados em vermelho, verde e azul, respectivamente.
A reação da PCR foi conduzida em um termociclador (Mastercycler, Eppendorf), usando o seguinte protocolo: 1 . 95 ºC Æ 3 minutos 2 . 92 ºC Æ 1 minuto 3 . 50 ºC Æ 1 minuto 4 . 72 ºC Æ 3 minutos O ciclo se repetiu por 34 X (passos de 2 a 4): 5 . 72 ºC Æ 4 minutos Abaixamento da temperatura a 4 ºC.
Uma vez amplificado, o produto da PCR foi purificado como no descrito no item 3.5.2, e cortado com as enzimas Nde1 e BamHI. Foram feitas várias tentativas de ligação do fragmento no vetor pET11a cortado com as mesmas enzimas e defosforilado. Devido a baixa eficiência de corte da enzima Nde1, na ausência de uma seqüência onde ancorar, optamos por outra estratégia. O produto da PCR, obtido anteriormente, foi tratado com a enzima Klenow (filling) conforme o protocolo abaixo:
30 10,0 μL do produto de PCR purificado (~ 100 ng) 0,5 μL da enzima Klenow 2,5 μL do tampão da enzima Klenow 10X 1,0 μL de uma mistura de dNTPs (estoque a 2,5 mM) água deionizada q.s.p 25 μL
A mistura foi incubada por 30 minutos a 37 ºC e então por 10 minutos a 65 ºC, para inativar a enzima Klenow. A mistura foi então aplicada em gel de agarose 1% e purificada usando papel Whatmann DE 81, conforme descrito no item 3.5.4. Após a purificação, o fragmento foi ligado ao vetor pBluescript II SK (+ / -), previamente cortado com a enzima EcoR V e defosforilado. Após a ligação, procedemos a transformação de células E. coli TOP 10 F’ competentes, como descrito no item 3.5.6.2. As colônias obtidas foram crescidas em meio LB contendo ampicilina (100,0 µg / mL). Os DNAs plasmidiais foram extraídos como descrito no item 3.2 e submetidos a uma eletroforese. As colônias positivas, que apresentaram um número de pares de bases superior ao controle (plasmídeo vazio), foram selecionadas e testadas por PCR de colônia (item 3.7).
3.5 - Clonagem da seqüência codificante para LTx2 no vetor de expressão pET11a
3.5.1 – Excisão do plasmídeo pBluescript II SK – LTx2
Células transformadas com o plasmídeo pBluescript II SK (+ / -) – LTx2 foram crescidas por 16 horas em meio LB-ampicilina. Após o crescimento, o DNA plasmidial foi extraído, seguindo o protocolo descrito no item 3.2. O fragmento de interesse, referente ao cDNA da toxina madura, foi excisado do plasmídeo pBluescript II SK (+ / -) (Stratagene) com as enzimas de restrição Nde1 e BamH I. A mistura de corte foi preparada como descrito abaixo: - 12,0 µL de DNA plasmidial contendo o inserto; - 2,0 µL de tampão D (Buffer D para Nde1 e BamH I); - 4,2 µL de água deionizada; - 0,8 µL de Nde1; - 1,0 µL de BamH I - 3,2 μL de água deionizada.
A mistura de corte foi incubada em estufa a 37 °C por uma hora e trinta minutos.
31 3.5.2 - Recuperação do inserto correspondente à seqüência codificante para LTx2
A mistura de corte para a excisão do inserto foi aplicada em gel de poliacrilamida 6%, após adição do tampão de amostra para DNA e aplicada no gel preparado conforme descrito abaixo:
- 1,5 mL de solução de poliacrilamida 40% - 1,0 mL de TAE 10X.
- 7,5 mL de H20 destilada. - 75, 0 µL de persulfato de amônio 10%. - 5,0 µL de TEMED.
A eletroforese foi desenvolvida verticalmente a 80V em cuba BIORAD com tampão TAE 1X durante 80 minutos. Após a eletroforese o gel foi corado com brometo de etídio por 20 minutos e visualizado em transluminador U.V. a 312 nm (New Brunswick Scientific). A banda de interesse foi cortada com uma lâmina estéril e então colocada em tubo plástico de 1,5mL contendo 500µL de TE, 1M de NaCl. Os tubos foram brevemente agitados em vortex e deixados à temperatura ambiente por 16 horas. Os tubos foram então centrifugados por 5 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Após adição de 400 µL de uma mistura fenol alcalino / clorofórmio / água (25:24: 1), os tubos foram novamente centrifugados por 10 minutos a 10.000 RPM. A fase aquosa foi cuidadosamente retirada de forma a evitar contaminação com a fase inferior, com a ajuda de uma micropipeta automática, e transferida para um novo tubo. Ao sobrenadante foram adicionados 2 volumes de etanol 100% e os tubos incubados por 40 minutos a -70 °C. Após a incubação os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante descartado. O precipitado foi então lavado com etanol 70% e novamente centrifugado por 10 minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o DNA foi seco a 65°C usando-se um bloco térmico. As amostras secas foram suspensas em 20µL de água deionizada (Sambrook et. al. 1989). Para testar se a recuperação do DNA foi eficiente, 5 µL do DNA foi aplicado em gel de poliacrilamida, como descrito anteriormente, e corado com brometo de etídio.
32 3.5.3 - Corte e defosforilação do vetor pET11a
O vetor de expressão pET11a (Figura 6) foi cortado com as enzimas de restrição Nde1 e BamH I para posterior inserção do fragmento. A mistura de corte foi preparada, em triplicata, conforme descrito abaixo: - 10,0 µL de pET11a - 2,0 µL de Tampão K - 6,5 µL de água deionizada - 0,8 µL de Nde1 - 1,0 µL de BamHI - 6,2 μL de água deionizada
A mistura de corte foi incubada em estufa a 37ºC por uma hora e trinta minutos. Após a incubação o DNA cortado foi defosforilado para evitar sua recircularização. Ao produto de digestão adicionamos 5 µL de tampão CIP; 0,3 µL de CIP (Calf Intestinal Phosphatase) e água deionizada (q.s.p. 50µL). A mistura foi incubada a 37°C e 56°C, sucessivamente, ambas as incubações por 15 minutos. A enzima fosfatase foi inativada por aquecimento a 65°C por 20 minutos. A mistura de corte foi então aplicada em gel de agarose 1,0% para posterior recuperação do DNA de interesse.
33
Figura 6 – Mapa do vetor de expressão pET11a. Fonte: http://www.novagen.com
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3.5.4 – Recuperação do vetor excisado em gel de agarose
A eletroforese foi desenvolvida a 100V por 50 minutos. A corrida foi então interrompida e o gel corado com brometo de etídio para visualizarmos a banda de interesse. Introduzimos um papel Whatmann DE81 logo abaixo da banda de interesse e induzimos corrente novamente por um tempo suficiente para assegurar a transferência do DNA para o papel. O DNA foi eluído do papel Whatmann DE81 pela adição de 500 µL de TE (Tris 1M, EDTA 0,5 M) contendo 1 M de NaCl. A mistura foi homogeneizada, deixada à temperatura ambiente por uma hora e centrifugada a 13.000 RPM por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e a purificação feita de acordo com o método fenol / clorofórmio (Sambrook et. al. 1989).
3.5.5 – Ligação do fragmento codificante para LTx2 no vetor pET11a
Após a recuperação do vetor pET11a cortado com as enzimas Nde1 e BamHI e defosforilado, foi feita a ligação do inserto, previamente recuperado do gel de poliacrilamida, no vetor pET11a. A mistura de ligação foi preparada conforme descrito abaixo:
Mistura 1 - 6,0 µL de inserto; - 6,0 µL de pET11a cortado; - 2,0 µL de tampão de ligase; - 1,0 µL de ligase; - 5,0 µL de água deionizada.
Mistura 2 - 3,0 µL de inserto; - 4,0 µL de pET11a cortado; - 2,0 µL de tampão de ligase; - 1,0 µL de ligase; - 10,0 µL de água deionizada.
As misturas de ligação foram incubadas por 16 horas no bloco térmico a 16°C, no interior da câmara fria.
35 3.6 - Transformação das bactérias
3.6.1 - Preparo de células competentes – Método de Cloreto de Cálcio
Bactérias E. coli da linhagem TOP10F’ provenientes do estoque foram crescidas em placas de LB ágar contendo 15,0 µg/mL de tetraciclina e 20,0 µg/mL de estreptomicina, a 37°C por 16 horas. Uma colônia desta cultura foi utilizada para inocular 4 mL de LB tetraciclina e estreptomicina. O crescimento foi conduzido a 37°C sob agitação. Este pré inóculo foi usado para inocular 100 mL de meio LB. A cultura foi transferida para tubos de 50 mL e centrifugadas durante 8 minutos a 1000 g, a 4°C. As células foram suspensas em 40 mL de cloreto de cálcio 0,1 M resfriado e estéril, e mantidas em banho de gelo por uma hora. Após nova centrifugação nas mesmas condições, as células foram suspensas em 1,0 mL de cloreto de cálcio 0,1 M. As células competentes foram aliquotadas e usadas imediatamente ou estocadas a -70°C, em presença de glicerol a uma concentração final de 30%. A competência das células foi testada realizando uma transformação com o vetor YEP195, que permite seleção branca e azul em placas LB-XIA.
3.6.2 - Transformação das células competentes
Cerca de 10 ng do vetor pET11a vazio, ou as misturas de ligação ou 20μL de TE foram adicionados a 100 µL de células E. coli TOP 10 F’ competentes e mantidos em banho de gelo por 30 minutos. Após a incubação, a mistura foi submetida a um choque térmico por 2 minutos a 42°C e colocada novamente em banho de gelo por um minuto. Foi adicionado 1,0 mL de LB livre de antibióticos às células e os tubos foram incubados por uma hora a 37°C sob agitação a 250 rpm. Após uma hora, a mistura foi centrifugada a 3000 rpm por 4 minutos. O sobrenadante foi desprezado e as células suspensas em 100 µL de LB sem antibiótico. Essa suspensão celular foi distribuída em LB ágar - ampicilina e incubada em estufa a 37°C por 18 horas. Após a incubação as colônias selecionadas foram inoculadas em 4,0 mL de LB ampicilina e novamente incubadas a 37°C por 18 horas sob agitação.
36 3.7 - Obtenção de DNA plasmidial e análise dos transformantes
O DNA plasmidial foi obtido pelo método CTAB, como descrito anteriormente. Para testar a inserção do fragmento de 150 pares de bases no vetor pET11a utilizamos uma PCR de colônia. Para a realização do PCR de colônia, inoculamos cerca de 1 mL de meio LB com as colônias a serem testadas e incubamos no agitador por 2 horas a 37 °C. Um microlitro das culturas foram utilizados como molde nas PCRs. Os iniciadores utilizados foram descritos em 3.4. A mistura de amplificação foi preparada conforme descrito abaixo:
- Iniciador direto (20 pmol/μL) – 1,0 µL - Iniciador reverso (20 pmol/μL) – 1,0 µL - dNTP 2,5 mM – 2,5 µL - Tampão Taq polimerase 10 X – 2,5 µL - DNA template – 1,0 µL da cultura - Taq polimerase 5 u/μL – 0,5 µL - Água deionizada – 16,5 µL
O ciclo usado para a PCR foi:
1 . 95 °CÆ 4 minutos. 2 . 92 °C Æ 1 minuto 3 . 50 °C Æ 1 minuto 4 . 72 °C Æ 1 minuto O ciclo se repetiu por 34 vezes: 5 . 72 °C Æ 5 minutos Abaixamento da temperatura para 4 °C.
3.8 – Sequenciamento
3.8.1 - Reação de sequenciamento
Os clones que apresentaram o plasmídeo pET11a – LTx2 foram seqüenciados de acordo com o método descrito por Sanger et. al. (1977), utilizando-se o kit de sequenciamento DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for Mega BACE DNA Analysis System (Amershan Biosciences). Para seqüênciar os insertos presentes no plasmídeo, adotou-se a reação de
37 sequenciamento descrita abaixo. O sequenciamento foi feito em ambas as fitas utilizando-se os iniciadores direto e reverso descritos no item 3.4.
A reação de amplificação foi preparada como descrito abaixo:
4 μL de Mix (Kit de sequenciamento) 1 μL de iniciador (5 pmol) direto ou reverso 3 μL de DNA 2 μL de água deionizada
As reações foram conduzidas em um termociclador (Mastercycler, Eppendorf), conforme o programa descrito a seguir:
1 . Rápida elevação da temperatura a 95 ºC 2 . 95 ºC Æ 25 segundos 3 . 50 ºC Æ 20 segundos 4 . 60 ºC Æ 1 minuto O ciclo foi repetido por 30 vezes (passos 2 a 4). 5 Æ Abaixamento da temperatura para 4 ºC.
3.8.2 - Precipitação da reação de sequenciamento
Adicionamos ao produto da reação de sequenciamento 1 μL de acetato de amônio e 28 μL de etanol 100%. Após homogeneização, a mistura foi incubada, por 20 minutos à temperatura ambiente sob o abrigo da luz. Após centrifugação por 45 minutos, a 13000 rpm, o sobrenadante foi descartado. Adicionamos 100 μL de etanol 70% e procedemos nova centrifugação por 10 minutos, a 13000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado (DNA) foi suspenso em 10μL de loading buffer (Amershan Biosciences) antes da aplicação da amostra no Mega BACE 500.
3.8.3 – Análise das seqüências de nucleotídeos obtidas
As seqüências de nucleotídeos obtidas foram analisadas através do programa Basic Alignment Search Tool Program for amino acid – BLAST – Gen Bank (Altschul et. al. 1990).
38 3.9 - Transformação das células BL21 (DE3)
Para darmos início ao processo de expressão, células competentes BL21(DE3), preparadas pelo método do cloreto de cálcio, foram transformadas com o plasmídeo pET11a – LTx2, conforme descrito no item 3.5.6.2. As células transformadas foram plaqueadas como descrito anteriormente. As colônias selecionadas das placas foram inoculadas em meio LB contendo ampicilina (100 mL/ mL).
3.10 – Análise dos plasmídeos extraídos das células BL21 (DE3)
Para testar as colônias de BL21(DE3) procedemos a uma PCR de colônia conforme descrito no item 3.5.7. Os DNAs amplificados foram então aplicados em um gel de agarose 1% e analisados. Ao todo foram coletadas e inoculadas 4 colônias de BL21(DE3) transformadas com o produto de ligação pET11a – LTx2.
3.11 - Indução da LTx2 recombinante e análise do perfil eletroforético dos extratos livres de células
3.11.1- Indução da LTx2 recombinante
Cerca de 4mL de meio SOC + ampicilina (100 μL/ mL) foram inoculadas com 30 μL de células BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo pET11a – LTx2. Este inóculo foi crescido no agitador rotatório a 33ºC até atingir a D.O.600 0,2 – 0,6. Desta cultura, uma alíquota de 100 μL foi utilizada para inocular 8 mL de meio SOC contendo ampicilina (100 μL/ mL). Esta nova cultura foi incubada sob agitação a 37ºC até atingir a D.O.600 0,2 – 0,6. Após essa incubação todo o conteúdo de 8 mL foi vertido dentro de um frasco com 100 mL de meio SOC contendo ampicilina
(100 μL/ mL). A cultura foi então incubada até atingir a D.O.600 0,5 – 1,0. Ao atingir a densidade óptica desejada o conteúdo do frasco foi dividido igualmente em dois frascos. A um deles foi adicionado IPTG na concentração de 0,6 mM. O outro frasco serviu como controle não-induzido. Ambos foram incubados sob agitação a 37 °C por quatro horas. Amostras de 5 mL foram coletadas de ambos os frascos nos tempos 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas de indução. As alíquotas coletadas foram lisadas, como descrito no item 3.11.2, e foi feita dosagem de proteínas do extrato livre de células, pelo método de Lowry (1951).
39 3.11.2 - Lise das células
Após indução com IPTG 0,6 mM, por 4 horas, as células foram coletadas por centrifugação (1000 g, 10 minutos, a 4 °C) e lavadas 3 vezes com 20 mL de tampão de lavagem, preparado como descrito abaixo:
- 50 mM Tris HCl pH 8,0 - 50 mM NaCl - 1 mM EDTA - 0,5 mM PMSF
Após as lavagens, as células eram resuspendidas no mesmo tampão (20% peso úmido / volume) e então sonicadas até a ruptura. Foram utilizados 6 ciclos de 20 segundos no ultra-som (Branson Sonifier 250; Duty cycle Constant; output 3), com igual intervalo no banho de gelo. A quantidade de proteínas foi quantificada pelo método de Lowry (1951).
3.11.3 – Preparo e coloração dos géis SDS – PAGE
3.11.3.1 – Preparo dos géis de poliacrilamida
Utilizamos eletroforese em gel desnaturante (Laemmli 1970) para confirmamos a eficiência do processo de indução. As concentrações dos géis foram 4% para o gel de concentração e 18% para o gel de separação. As amostras foram tratadas com o tampão de amostra SDS-PAGE 4X contendo o agente redutor β-mercaptoetanol, fervidas durante 5 minutos e aplicadas no gel. O preparo do gel foi feito de da seguinte forma:
Gel de separação: - Água destilada – 4,6 mL - Solução acrilamida / bisacrilamida 40% - 10,0 mL - Tris 1,5 M; pH 8,8 – 5,0 mL - SDS 10% - 0,2 mL - Persulfato de amônio 10% - 0,2 mL - TEMED – 8,0 µL.
40 Gel de concentração: - Água destilada – 3,4 mL - Solução acrilamida / bisacrilamida 40% - 0,83 mL - Tris 1,0 M; pH 6,8 – 0,63 mL - SDS 10% - 0,05 mL - Persulfato de amônio 10% - 0,05 mL - TEMED – 5,0 µL
A eletroforese foi desenvolvida verticalmente em placas 16 x 15 cm a 100V, em tampão TRIS 0,025M; pH 8,3 contendo 0,196M de glicina e 0,1 % de SDS. Após a eletroforese o gel foi revelado em solução de nitrato de prata.
3.11.3.2 - Coloração dos géis de poliacrilamida pelo método da prata
Após as eletroforeses os géis foram transferidos para uma cuba contendo solução fixadora (38 mL de água, 50 mL de metanol 50%, 12 mL de ácido acético), onde permaneceram por uma hora. Em seguida os géis foram lavados com etanol 50% por 3 vezes, por aproximadamente 8 minutos cada. Após as lavagens, os géis foram tratados com solução de tiosulfato de sódio (0,4 g/mL) por um minuto. Depois disso os géis foram lavados com água destilada por 3 vezes, totalizando 20 minutos, e deixados na solução de impregnação (0,1 g de AgNO3, 75 μL de formaldeído e água q.s.p 100 mL) por 20 minutos. Os géis foram então colocados em solução de desenvolvimento (6 g de Na2CO3, 50 μL de formaldeído, 2 mL de solução tiosulfato e água q.s.p. 100 mL) até o aparecimento das bandas. A reação foi interrompida pela adição da solução de parada (50 mL de metanol, 12 mL de ácido acético e água q.s.p. 100 mL).
3.12 - Western Blotting - Método ECL
O material lisado teve a fração solúvel separada dos corpos inclusão por centrifugação a 15000 g por 20 minutos a 4 ºC. A quantidade de proteína foi dosada pelo método de Bradford (1976). Em um gel de poliacrilamida aplicamos 30 μg de proteína da fração solúvel e dos corpos de inclusão. A eletroforese foi desenvolvida a 80 V por 50 minutos. Em seguida, as amostras foram transferidas para filtro de nitrocelulose (Amershan, poros de 0,45 µm) como descrito por Towbin et. al. (1979). Para a transferência das proteínas empregou-se o método contínuo de acordo com o manual do
41 aparelho Pharmacia LKB-PhastSystem (Pharmacia), por 40 minutos, 5 v, 50mA. O sistema foi montado fazendo-se um sanduíche com 3 folhas de papel de filtro 3MM, 1 membrana de nitrocelulose, o gel contendo as amostras a serem transferidas e mais 3 folhas de papel filtro 3 MM, todos embebidos no tampão de transferência (Tris-HCl 25 mM, metanol 10%, glicina 0,192M, 0,1% SDS, pH 8,3). Após a transferência corou-se a membrana com Ponceau S (0,1% em ácido acético 10%) por 10 minutos, e lavamos com água destilada para verificação da eficiência do processo de transferência. A membrana foi bloqueada em solução tampão PBS-T (Na2HPO4 0,05M; NaCl 0,15M; 0,05% Tween, pH 7,4) contendo 5% de leite em pó desnatado, por uma hora a temperatura ambiente sob leve agitação. Após o bloqueio a membrana foi incubada com antisoro policlonal anti-veneno total, por 12 – 16 horas, sob leve agitação a 4°C. O soro pré-imune foi usado como controle negativo. Após a incubação, as membranas foram lavadas 4 vezes por 15 minutos com PBS-T, procedendo-se então a incubação durante uma hora com o anticorpo secundário anti-IgG de coelho acoplado a peroxidase (Sigma ou BioRad) na diluição 1:2000 em PBS-T. Após a incubação com o anticorpo secundário, as membranas foram novamente lavadas como descrito acima e então procedemos a revelação. Os filmes (Hypefilm ECL, Amersham Biosciences) foram expostos por 1, 5 e 10 minutos e então revelados usando-se as soluções reveladoras/ fixadoras comercializadas pela Kodak.
3.13 – Desnaturação dos corpos de inclusão e renaturação das proteínas
3.13.1 - Solubilização dos corpos de inclusão
Após realizarmos testes imunoquímicos (item 3.12) com a fração solúvel e com os corpos de inclusão, concluímos que a nossa proteína alvo estava sendo expressa na forma de corpos de inclusão. Os procedimentos de solubilização dos corpos de inclusão e renaturação da proteína recombinante foram feitos de acordo com o protocolo descrito por Roberto et. al. (2004). Após a lise das células o material foi centrifugado a 15.000 g por 15 minutos a 4 °C para separar o material solúvel do material insolúvel. O sobrenadante foi descartado e procedemos a solubilização dos corpos de inclusão. Os precipitados foram resuspensos em 20 mL de solução de uréia 6,0 M e 5% de β- mercaptoetanol, e deixado sob leve agitação a 4 °C, por 16 horas. Após este tempo o material insolúvel era separado por centrifugação dos corpos de inclusão solubilizados (15.000g, 15 minutos a 4 °C).
42 3.13.2 - Renaturação das proteínas
Após a desnaturação dos corpos de inclusão, procedemos a renaturação das proteínas. A renaturação foi realizada através do método de diálise, que foi desenvolvida por 48 horas a 4 °C. Foi utilizado 1 L de tampão para a diálise, e o mesmo foi trocado quatro vezes ao longo dessas 48 horas. O tampão de renaturação foi preparado conforme descrito abaixo:
- 25 mM Tris-HCl pH 8,0 - 5 mM L-Cisteína - 1 mM L-Cistina - 1 M Uréia.
A solução foi continuamente mantida sob leve agitação, com barra magnética, para evitar a formação de gradiente dentro do recipiente.
3.14 - Purificação da proteína recombinante LTx2
A purificação da proteína alvo foi realizada através de Cromatografia Líquida de Fase Reversa em Sistema HPLC Äcta™ Explorer 100 System (Amershan Biosciences, Uppsala, Sweden) e controlada pelo software UNICORN 4.11. Foi utilizada uma coluna PepMap C8 (2,4 mL) e como fase móvel, água deionizada/ 0,1% TFA (solução A) e acetonitrila/ 0,1% TFA (solução B). Foi utilizado um gradiente linear de acetonitrila que variou de 0% a 60%. A eluição das proteínas foi monitorada a 280nm e 214 nm. As frações eluídas foram coletadas em um coletor automático (Frac920 Amershan Biosciences, Uppsala, Sweden). O pico recolhido do HPLC foi aplicado em um gel SDS-PAGE e corado pelo método da prata, para confirmar a eficiência da purificação.
3.15 - Western Blot
O material eluído da coluna de fase reversa foi aplicado em um gel de poliacrilamida como descrito anteriormente. A transferência das amostras do gel de poliacrilamida para a membrana de nitrocelulose seguiu o protocolo descrito no item 3.12. Para a revelação foram utilizados 6,0 mg de diaminobenzidina (Sigma) diluído em 6,0 mL de PBS e 3,0 mg de 4-cloronaftol (Sigma) diluído em 1,0 mL de metanol e em seguida acrescentado 5,0 mL de PBS. As duas soluções foram
43 misturadas no momento do uso e acrescida de 10,0 µL de H2O2 30% (v/v). A revelação foi interrompida após a visualização das bandas através de uma rápida lavagem das membranas com água destilada.
3.16 - Dosagem de proteínas
A dosagem de proteínas foi feita de acordo com o método de Bradford (Bradford 1976) ou Lowry modificado (Lowry et. al. 1951), utilizando albumina bovina como padrão.
3.17 - Análise da seqüência de aminoácidos da LTx2 no programa BLASTp
A seqüência de aminoácidos correspondente à toxina LTx2 foi analisada no programa BLASTp (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST) para verificarmos a existência de similaridade com outras proteínas. As proteínas que apresentaram maior similaridade com a LTx2 foram submetidas ao programa de alinhamento CLUSTALW (http://seqtool.sdsc.edu) para verificarmos se os resíduos de cisteína encontram-se em posições conservadas. Os parâmetros utilizados foram aqueles sugeridos pelo programa como padrão.
3.18 - Análise da conformação secundária da LTx2
Para verificarmos a predição da conformação secundária adotada pela LTx2 utilizamos os programas de predição de estrutura secundária PELE (http://seqtool.sdsc.edu) e GOR4 (http://doc.bioperl.org/releases/bioperl-1.4/Bio/Tools/Analysis/Protein/GOR4.html).
3.19 - Ensaios Biológicos
Para o ensaio antimicrobiano foram feitos pré-inóculos do microrganismos Gram negativos E. coli TOP 10 F’, e duas linhagens de Salmonella Agona e Pseudomonas sp. e do microrganismo Gram positivo Staphilococcus epidermidis em cerca de 4 mL de meio LB sem qualquer antibiótico. Esses pré-inóculos foram incubados por 16 horas a 37 °C. Após a incubação retiramos
44 uma alíquota de 50 μL de cada um dos inóculos e completamos o volume, com meio LB, para 1 mL. Essa diluição de 20 vezes das amostras possibilita uma leitura de D.O600 mais precisa. Com o valor obtido pela leitura de densidade óptica, calculamos o volume de cultura a ser acrescentado em 10 mL de meio LB-ágar para obtermos uma densidade óptica de 0,8. O meio LB-ágar inoculado foi distribuído em placas de Petri. Após a solidificação fizemos teste de inibição do crescimento utilizando 10 μL da toxina na concentração de 30,0 μg/μL para Pseudomonas sp. e 400,0 μg/μL para os demais microrganismos. Como controle negativo utilizamos 10 μL de PBS. Como controle positivo utilizamos os antibióticos ampicilina 100 mg/mL para E. coli; kanamicina 50 mg/mL e ampicilina 10 mg/mL para Salmonella agona; tetraciclina 15 mg/mL para Staphilococcus epidermidis e kanamicina 50 mg/mL e tetraciclina 15 mg/mL para Pseudomonas sp. A inibição foi avaliada pela formação de halos.
3.20 – Reagente e soluções
IPTG O IPTG foi dissolvido em água deionizada estéril na concentração 100mM no momento do uso. PMSF O PMSF foi dissolvido em isopropanol na concentração final de 100 mM e estocado a -20ºC. Ampicilina A ampicilina foi dissolvida em água deionizada estéril na concentração final de 100 mg/mL (solução estoque 1000X concentrada) e estocada a – 20ºC. Estreptomicina A estreptomicina foi dissolvida em água deionizada estéril na concentração de 20 mg/ mL (solução estoque 1000X concentrada) e estocada a -20ºC. Tetraciclina A tetraciclina foi dissolvida em etanol na concentração de 15 mg/mL (solução estoque 1000X concentrada).
Soluções para gel de agarose TAE (Tampão Tris-acetato) Solução estoque 10X: 48,8 g de Tris, 20 mL de EDTA 0,5 M. Acertar o pH para 8,0 com ácido acético glacial. Completar o volume para 1 litro.
Tampão de amostra: 0,25% de azul de bromofenol, 0,25% de xilenocianol e 30% de glicerol.
45 Corante: Brometo de etídio diluído em água para uma concentração de 10mg/mL (solução estoque). Solução de uso: Solução estoque diluída 20X.
Soluções para extração de DNA plasmidial STET 8% p/v de sacarose, 0,1% v/v de Triton X-100, 50mM de EDTA, 50mM de Tris-HCl. Ajustar o pH para 8,0. Lisozima A lisozima foi diluída em água deionizada para uma concentração de 50 mg/mL. CTAB Cetil trimetil brometo de amônio diluído em água deionizada para uma concentração de 50mg/mL.
Soluções para SDS – PAGE Solução A: 39g de acrilamida, 1g de bisacrilamida, água q.s.p. 100mL. Filtrar a solução e armazenar em frasco escuro a 4ºC. Solução B: 18,15g de Tris, ajustar o pH para 8,8 com HCl concentrado, água deionizada q.s.p. 100mL. Armazenar a 4ºC. Solução C: 6g de Tris, ajustar o pH para 6,8 com HCl concentrado, água deionizada q.s.p. para 100mL. Armazenar a 4ºC. SDS 10%: 10g de SDS diluídos em água deionizada q.s.p. 100mL. Armazenar à temperatura ambiente. PSA 10%: Persulfato de amônio dissolvido em água deionizada na concentração de 0,1g/ml. Tampão da amostra (com agente redutor – 2X concentrado): 1ml de solução C, 0.8 mL de glicerol, 1.6mL de SDS 10%, 0.2mL de azul de bromofenol 0.2%, 0,4mL de β-mercaptoetanol. Tampão de corrida (5X concentrado): 4,5g de Tris (0,125M), 21,6g de glicina (0,96M), 1,5g de SDS (0,5%), água deionizada q.s.p. 300mL. Acertar o pH para 8,3. Armazenar a 4ºC.
46 4 - Resultados
4.1 - Clonagem da seqüência codificante para LTx2 no vetor de expressão pET11a
Com o objetivo de clonar a seqüência codificante para a toxina madura LTx2 no vetor de expressão pET11a, a seqüência correspondente foi amplificada utilizando iniciadores que possuíam adaptadores para os sítios de restrição das enzimas Nde1 (direto) e BamH I (reverso). Como a eficiência de corte da enzima Nde1 é baixa na ausência de uma seqüência onde ela possa se ancorar, o produto da PCR foi tratado com a enzima Klenow nas condições descritas em Materiais e Métodos, e o vetor pBluescript II SK (+ / -) foi cortado com a enzima EcoR V e defosforilado. Após a ligação do produto da PCR tratado com Klenow no vetor pBluescript II SK (+ / -) e transformação de células E. coli TOP 10 F’ competentes, as colônias selecionadas foram crescidas em meio LB contendo ampicilina e testadas por PCR de colônias utilizando-se os mesmos iniciadores usados na amplificação da seqüência codificante para a toxina madura. Colônias apresentando um fragmento de cerca de 150 pb foram estocadas. Posteriormente, o vetor pET11a foi digerido com as enzimas de restrição Nde1 e BamH I para a inserção da seqüência excisada do vetor pBluescript II SK (+ / -) – LTx2 com as mesmas enzimas. Após a ligação do inserto no vetor pET11a e transformação de células competentes, as colônias selecionadas foram analisadas através de PCR de colônia. Para tal, inoculamos cerca de 1 mL de meio LB com as colônias selecionadas e incubamos por 2 horas a 37 ºC. Então, retiramos 1,0 µL das culturas para utilizarmos como moldes no PCR. A região amplificada no vetor vazio deveria possuir aproximadamente 147 pares de bases, enquanto a região amplificada nos vetores onde houve inserção do fragmento de interesse deveria possuir aproximadamente 257 pares de bases. O resultado do gel de poliacrilamida (Figura 7) com o produto da PCR nos permite concluir que um fragmento de aproximadamente 150 pares de bases foi inserido no sítio múltiplo de clonagem do vetor pET11a.
47
1 2 3 4 5 6
300 200
100
Figura 7: Eletroforese em gel de poliacrilamida dos produtos de PCR mostrando a inserção de um fragmento de aproximadamente 150 pares de bases, correspondente a seqüência codificante para LTx2, no sítio múltiplo de clonagem do vetor pET11a. Canaleta 1: Padrão de pares de bases 1 Kb; Canaleta 2: Controle negativo da PCR; Canaleta 3: Controle negativo do experimento (pET11a vazio); Canaletas 4, 5, 6: Produtos de PCR de DNAs plasmidiais extraídos de diferentes clones a serem testados.
48 4.2 - Análise da seqüência
Com o objetivo de confirmar a inserção correta do fragmento codificante para a LTx2 no vetor de expressão, realizamos o sequenciamento dos plasmídeos que apresentaram a inserção de um fragmento de 150 pares de bases. O sequenciamento foi realizado em ambas as fitas. Os sequenciamentos com os iniciadores direto e reverso são mostrados no anexo I. O resultado dos sequenciamentos confirma que a seqüência codificante para a toxina madura LTx2 foi inserida no frame correto no vetor de expressão.
4.3 – Transformação de células BL21(DE3) competentes e indução da toxina recombinante LTx2
4.3.1 – Análise das células competentes BL21(DE3) transformadas com a construção pET11a – LTx2
Após confirmar, através de sequenciamento, que o inserto clonado no vetor pET11a era o cDNA codificante para a toxina madura LTx2, procedemos a transformação de células BL21(DE3) competentes. Os transformantes foram testados através de PCR de colônia, e a análise dos fragmentos foi semelhante àquela utilizada no item 4.1. A figura 8 nos permite observar que tivemos sucesso na transformação das células competente BL21 (DE3) com a construção pET11a – LTx2.
49
1 2 3 4 5 6 7 8
300 200 100
Figura 8 – Resultado da eletroforese em gel de agarose 1% com o PCR de colônia dos DNAs plasmidiais extraídos das células competentes BL21(DE3) transformadas com a construção pET11a – LTx2. Nas canaletas 1, 2, 3, 4 e 5 foram aplicados clones a serem testados; Canaleta 6: controle negativo do experimento (pET11a vazio); Canaleta 7: controle negativo da PCR; canaleta 8: Padrão de peso molecular 1 Kb.
50 4.3.2 - Análise do perfil eletroforético dos extratos livres de células
Com o objetivo de induzir a expressão da toxina recombinante LTx2, inoculamos meio de cultura SOC com a bactéria E. coli BL21 (DE3) contendo o plasmídio pET11a – LTx2 e induzimos a expressão adicionando 0,6 mM IPTG ao meio. Após coletarmos as amostras correspondentes ao controle não induzido e da cultura induzida por 1, 2, 3 e 4 horas, realizamos dosagem de proteína pelo método de Bradford (1976) e aplicamos 20 microgramas de proteína em cada canaleta. Além do padrão de peso molecular Low Molecular Weight, utilizamos aprotinina como referência de peso molecular, já que ela possui aproximadamente 6KDa. A análise do gel obtido com as alíquotas coletadas durante a indução (Figura 9) nos permite sugerir que há um aumento na expressão, sobretudo das bandas protéicas correspondentes a 6 Kda e 13 KDa. Este resultado sugere que a proteína pode estar sendo expressa tanto na forma de monômeros como em agregados. O protocolo de eletroforese utilizado foi em condições desnaturantes, utilizando β-mercaptoetanol, o que pode explicar a maior intensidade de bandas na altura esperada para a toxina recombinante na forma solúvel.
51
1 2 3 45 6 Aprot P.M
30 KDa
21,1 KDa
14,4 KDa
6 Kda (Aprotinina )
Figura 9: Eletroforese em gel SDS-PAGE 18% corado pelo método da prata, mostrando os níveis de expressão da proteína recombinante (LTx2) após indução com IPTG. Em cada canaleta foram aplicadas 20 microgramas de proteínas. Canaleta 1: Transformação com vetor vazio sem indução; Canaleta 2: Transformação com vetor contendo o fragmento sem indução; Canaletas 3, 4, 5, 6: Indução com 1, 2, 3 e 4 horas de indução, respectivamente; Canaleta 7: LMW ( Low Molecular Weight ). É possível observar que houve aumento na expressão de pelo menos 3 bandas. O que sugere que a proteína pode estar sendo expressa também na forma de agregados.
52 4.3.3 – Confirmação da expressão da LTx2 recombinante por Western Blotting - Método ECL
Após a indução da expressão da LTx2 recombinante utilizamos a técnica de Western Blotting para confirmar a presença da proteína. Realizamos o ensaio com uma alíquota da cultura incubada por 4 horas após adição de IPTG. O resultado da Figura 10 mostra que o anti-soro policlonal anti-veneno total reconhece pelo menos três bandas, o que confirma a expressão da LTX2 na forma de monômeros e de agregados.
LTx2 V.B.
Figura 10 - Resultado do Western Blotting método ECL. LTx2: Toxina LTx2 recombinante; V.B.: veneno bruto. Podemos observar, na canaleta onde foi aplicada a toxina recombinante, o reconhecimento de pelo menos 3 bandas, indicadas pelas setas azuis, confirmando a expressão da toxina tanto na forma monomérica como na forma de agregados. A seta vermelha indica a banda referente à fração do veneno bruto reconhecida pelo antisoro policlonal anti-veneno total.
53 4.4 – Purificação da toxina recombinante LTx2 em sistema HPLC
Após a confirmação por Western blotting da presença da toxina LTx2 recombinante no extrato livre de células, procedemos a separação por centrifugação e desnaturação dos corpos de inclusão, como descrito em Materiais e Métodos. Os corpos de inclusão foram separados das proteínas solúveis por ultra-centrifugação e então solubilizados em uma solução contendo 6M uréia. Realizamos, através de diálise, a renaturação das proteínas. O material dialisado foi purificado em sistema HPLC. A purificação foi realizada com uma coluna de fase reversa C8, utilizando um gradiente linear de acetonitrila. A figura 11 mostra o perfil cromatográfico obtido. Podemos observar a presença de um pico eluído na concentração de 25% de acetonitrila. Teoricamente, os picos eluídos na ausência ou baixas concentrações de acetonitrila referem-se ao sal e outras contaminações presentes na amostra. Por termos tratado nossa amostra previamente com 6 M de uréia, realizamos uma etapa de lavagem extensa, de 40 minutos, antes de introduzir o gradiente de acetonitrila.
54
corpos de inclusao 220805:1_UV1_280nm corpos de inclusao 220805:1_UV2_214nm corpos de inclusao 220805:1_Conc corpos de inclusao 220805:1_Fractions
%B 100
80
60
25,0% ACN
40
20
0 1A1 1A3 1A5 1A7 1A9 1A11 1B121B10 1B8 1B6 1B4 1B2 1C1 1C3 1C5 1C 7 Waste 0 20 40 60 80 100 120 ml Figura 11 – Perfil cromatográfico obtido com a purificação da toxina LTx2 recombinante. Foi utilizada uma coluna de fase reversa C8. O gradiente de acetonitrila variou de 0% a 100%.A linha azul representa a leitura em 280 nm, a linha vermelha representa a leitura a 214 nm e a linha verde, o gradiente de acetonitrila. Os picos que aparecem na concentração de 0% de ACN são referentes ao sal presente na amostra, que havia sido tratada com 6 M de uréia. Os outros picos menos expressivos são referentes a contaminações presentes na amostra. O pico indicado pela seta representa a proteína recombinante, que foi eluída com uma concentração de 25% de acetonitrila.
55 4.5 – Análise da fração eluída da coluna de fase reversa
4.5.1 – Eletroforese da fração eluída da coluna de fase reversa
O pico eluído no HPLC, em 25%acetonitrila, foi coletado e 20 μg da proteína foi aplicada em um gel SDS-PAGE, o qual foi posteriormente corado pelo método da prata. Na figura 12 podemos observar a presença de uma banda única na canaleta onde aplicamos o material eluído com 25% de acetonitrila, sugerindo eficiência do processo. Para confirmar que essa banda se tratava da LTx2 recombinante, procedemos um novo Western Blotting.
21,1 KDa
14,4 KDa
Aprotinina
Figura 12 - Eletroforese com o material recolhido do HPLC. Podemos observar a presença de uma banda única referente à LTx2 recombinante. O que indica que o processo de purificação por RP-HPLC foi adequado.
56 4.5.2 – Western Blotting da fração eluída na coluna de fase reversa
Para confirmar se o pico eluído na cromatografia líquida correspondia à toxina LTx2 recombinante, realizamos um ensaio de Western Blotting com a fração. Na figura 13 podemos observar que o antisoro policlonal anti-veneno total reconheceu o material que foi eluído, sugerindo se tratar da toxina LTx2 recombinante.
1 2
Figura 13 - Resultado do Western Blotting do pico recolhido do HPLC. Canaleta 1: fração eluída, apontada pela seta azul; canaleta 2: veneno total, apontado pela seta vermelha.
4.6 - Análise da seqüência de aminoácidos da LTx2 no programa BLASTp
Para verificarmos a similaridade da toxina LTx2 com outras proteínas realizamos uma busca no banco de dados utilizando o programa BLASTp, que realiza a busca de uma seqüência de aminoácidos que tenham similaridade com outras seqüências de aminoácidos. Além das toxinas LTx1 (score 107 e E-value 2 x 10-22) e LTx3 (score 108 e E-value 8 x 10-23), também da aranha Lasiodora sp., a LTx2 apresentou similaridade com huwetoxina-II (HWTX-II), com score de 57,8 e um E-value de 3 x 10-8; e huwetoxina-VII (HWTX-VII), com um score de 57,8 e um E-value de 1 x 10-7; ambas da aranha Selenocosmia huwena.
57 A posição dos resíduos de cisteína foi analisada utilizando o programa CLUSTAL W. A figura 14 mostra que, no alinhamento realizado utilizando os parâmetros sugeridos pelo programa, todos os resíduos de cisteína da LTx2 estão em posições conservadas nas toxinas HTWX-II e HTX-VII.
Figura 14 – Alinhamento das seqüências de aminoácidos das toxinas LTx2, LTx1 e LTx3 (Lasiodora sp.), HWTX-II e HWTX-VII (ambas de Selenocosmia huwena). Podemos observar que nas 3 seqüências alinhadas, os resíduos de cisteína se encontram em posições conservadas. * (asterisco) marca os resíduos idênticos; : (dois pontos) marca grupos fortes conservados; . (ponto) marca grupos fracos conservados, onde não há nenhum desses sinal não há nenhum consenso.
4.7 - Análise da conformação secundária da LTx2
Para verificarmos a predição da conformação secundária adotada pela LTx2 utilizamos os programas de predição de estrutura secundária PELE e GOR4 . O programa PELE, utilizando de vários algoritmos, mostra que a LTx2 tem possibilidade de formação de duas α-hélices na região N-terminal (figura 15). Esse resultado confirma a predição realizada pelo programa GOR4 (figura 17), que também previu duas α-hélices N-terminais para a LTx2.
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Figura 15 – Predição da estrutura secundária adotada pela LTx2, utilizando vários algoritmos, pelo programa PELE. Podemos observar a grande possibilidade de formação de α-hélices na região N-terminal da proteína. H – α-hélice; E – folha β; C – espiral (coil).
Figura 16 – Predição de estrutura secundária para a proteína LTx2 realizada pelo programa GOR4. Assim como o programa PELE, aqui foram previstas duas α-hélices N-terminais. A região em vermelho representa α-hélice; em azul, folha β, e a região em preto representa espiral (coil).
59 4.6 – Ensaios biológicos
Após a purificação da LTx2 recombinante, nós realizamos ensaios biológicos para testar se a proteína encontra-se ativa. O conteúdo de proteína do material eluído da coluna foi quantificado e a amostra foi resuspensa em PBS pH 7,2.
4.6.1 – Teste de atividade antimicrobiana
Para verificar a atividade antimicrobiana da toxina LTx2 recombinante utilizamos 4 microrganismos: Salmonella Agona, E. coli TOP 10 F’, Staphiloccocos epidermidis e Pseudomonas sp. A atividade antimicrobiana foi observada pela formação de um halo de inibição nas placas (figura 17). O sorotipo Salmonella Agona utilizado no experimento foi isolado de pacientes em um trabalho realizado em Ouro Preto, Minas Gerais (Fernandes et. al. 1997). No experimento com Salmonella Agona 142 observamos a formação de um halo de 17 mm no local onde aplicamos a toxina (400 mg/mL), 20 mm onde aplicamos ampicilina 100 mg/mL e 22 mm onde aplicamos canamicina 50 mg/mL. Observamos, na Salmonella Agona 186, um halo de inibição de 10 mm no local onde aplicamos a toxina, um halo de 23 mm onde aplicamos de ampicilina 100 mg/mL e de 22 mm onde aplicamos canamicina 50 mg/mL. Os números 142 e 186 são referentes ao número do paciente do qual a bactéria foi isolada. Em E. coli TOP 10 F’ observamos a formação de um halo de inibição de 6 mm no local onde aplicamos a toxina (400 mg/mL), e de 19 mm onde colocamos 10 μL de ampicilina 100 mg/mL. No experimento com S. epidermidis, observamos a formação de um halo de inibição de 12 mm no local onde aplicamos a toxina e de 27 mm no local da tetraciclina 15 mg/mL. No experimento com Pseudomonas sp. não observamos a formação de nenhum halo no local onde aplicamos a toxina na concentração de 30,0 mg/μL. A tabela I mostra os resultados condensados dos ensaios antimicrobiano.
60
Figura 17 - Ensaio antimicrobiano com o Salmonella Agona 142 (A); Salmonella Agona 142 (B); E. coli TOP 1’0 F’ (C) e Staphilococcus epidermidis (D). A formação dos halos de inibição onde aplicamos 10 μL da toxina na concentração de 400,0 mg/mL é indicada pela seta vermelha. Os locais onde aplicamos antibióticos estão indicados pelas setas azuis. Os antibióticos aplicados, o diâmetro dos halos de inibição e as respectivas concentrações estão apresentados na tabela I.
61 Tabela I: Diâmetro dos halos de inibição formados nos ensaios antimicrobianos utilizando-se 10 microlitros de LTX2 recombinante e diferentes antibióticos. LTx2 Antibiótico (controle positivo) Microrganismo Recombinante Ampicilina Canamicina Tetraciclina 4000 μg 1000 μg 500 μg 150 μg E. coli TOP 10 F’ 6 mm 19 mm Não foi usada Não foi usada S. agona 186 10 mm 23 mm 22 mm Não foi usada S. agona 142 17 mm 20 mm 22 mm Não foi usada S. epidermidis 12 mm Não foi usada Não foi usada 27 mm
Pseudomonas sp Não houve halo 20 mm Não foi usada 18 mm Toxina 300 μg de inibição.
62 5 – Discussão
Venenos de aranhas contêm diversos componentes de interesse para a sociedade e, por isso, muitos pesquisadores têm se dedicado a pesquisar sua composição. Toxinas presentes no veneno de diversas aranhas já foram isoladas e caracterizadas, mas a utilização de técnicas de biologia molecular permitiu contornar uma série de limitações das técnicas existentes. A utilização de bibliotecas de cDNA combinadas com técnicas de biologia molecular facilita o isolamento e a obtenção de quantidades significativas das toxinas necessárias para estudos mais detalhados com relação à estrutura e mecanismo de ação destas toxinas (Diniz et. al. 1993, Kalapothakis et. al. 1998, Escoubas et. al. 2000, Kalapothakis et. al. 2002, Cardoso et. al. 2003, de Deus et. al. 2003). O veneno da aranha Lasiodora sp ainda é pouco explorado. Embora tenha sido relatada atividade tóxica de frações desse veneno sobre insetos e mamíferos, poucos estudos foram realizados com este veneno. Kushmerick et. al. (2001), com o objetivo de estudar a ação do veneno total de Lasiodora sp. em canais iônicos de células GH3, testaram o efeito desse veneno nas oscilações dos níveis de cálcio intracelular. Utilizando-se a técnica de Patch Clamp, estes autores observararam inibição de canais de cálcio do tipo L e modulação da cinética de canais de sódio. Quando as células foram tratadas com o veneno (400 μg/mL de proteína) na presença de tetrodotoxina (TTX), as oscilações no sinal de cálcio foram rapidamente eliminadas. A TTX é um inibidor específico dos canais de sódio e o bloqueio desses canais eliminou as oscilações dos níveis intracelulares de cálcio dependentes de canais de sódio. Para testar a participação dos canais de sódio nos níveis intracelulares de cálcio, o mesmo experimento foi realizado sem a TTX. Nessas condições, o veneno eliminou inicialmente o sinal de cálcio intracelular. Porém, em um segundo momento que os pesquisadores chamaram “fase 2”, foi possível observar novamente o sinal de cálcio. Esse resultado permitiu concluir que o veneno total da Lasiodora sp., além de agir em canais de cálcio tipo L, também altera a cinética de canais de sódio. Kalapothakis et. al. (2003) utilizando o veneno total de Lasiodora sp em preparação de tecido cardíaco de rato observou que o veneno, na maior dose utilizada (100 μg), causou bradicardia bem como alterações no ritmo cardíaco. Os autores sugeriram, então, que o veneno exercia esses efeitos por causar uma liberação de acetilcolina a partir dos terminais parassimpáticos. Essa hipótese foi confirmada, nesse mesmo trabalho, em um experimento no qual se utilizou anti-colinesterase. A anti-colinesterase neostigmina aumentou significativamente o efeito do veneno.
63 De Deus (2003) obteve 3 frações distintas ao fracionar o veneno total da aranha Lasiodora sp em coluna de filtração molecular Sephadex G-50F. Estas frações foram denominadas P1, P2 e P3. Ao testar a atividade biológica das frações, a autora observou que as três frações possuíam ação em mamíferos, enquanto somente as frações P2 e P3 possuíam atividade em insetos. Com o objetivo de identificar e caracterizar os clones que codificam para toxinas presentes no veneno total, foi feita uma varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno de Lasiodora sp. utilizando o antisoro policlonal IgG anti-veneno total como anticorpo primário. Nesta varredura foi identificado o clone 1228, que contem a seqüência codificante para a toxina madura LTx2. A toxina LTx2 é expressa na forma de um prepropeptídeo composto por peptídeo sinal, um peptídeo intermediário e a toxina madura (Figura 5). A região do peptídeo sinal da LTx2 é composta por 23 resíduos de aminoácidos e apresenta as características de um peptídeo sinal clássico, como o núcleo hidrofóbico rico em leucina, logo após o qual aparece o sítio de reconhecimento da enzima peptidase sinal. O sítio de reconhecimento da enzima apresenta uma distribuição bem localizada e não randômica de resíduos de alanina (Perlman & Halvorson 1983). A região do peptídeo intermediário da LTx2 é composta por 27 resíduos de aminoácidos. O peptídeo sinal está relacionado à exportação da molécula e orientação dentro da célula (Boyd e Beckwith 1990). A função dos peptídeos intermediários ainda não foi bem esclarecida, mas Oliveira et. al. (1990 e 1991) e Price-Carter e cols. (1996) sugerem que esteja relacionado com o enovelamento da toxina, e que os mesmos são alvos de enzimas envolvidas em modificações pós-traducionais (Price-Carter e cols, 1996). A região da toxina madura, que é composta por 49 resíduos de aminoácidos, apresenta grande similaridade com as toxinas huwetoxina-II, huwetoxina-VII e huwetoxina-IIa, provenientes da aranha Selenoscosmia huwena, além das toxinas Ltx1 e LTx3, isoladas da aranha Lasiodora sp. Essa similaridade pode ser explicada pelo fato de ambas as aranhas, Lasiodora sp. e Selenocosmia huwena, pertencerem à mesma família. A huwetoxina-II (HWTX-II), um peptídeo com 37 resíduos de aminoácidos e 3 pontes disulfeto, ao ser testada, paralisou reversivelmente insetos, bloqueou a transmissão neuro-muscular em nervo de ratos, causou a morte em camundongos quando injetada i.c.v. e apresentou atividade cooperativa com a da HWTX-I (Shu & Liang 1999, Shu et. al. 2002). A estrutura tridimensional da HWTX-II é muito semelhante à de duas outras toxinas isoladas de caranguejeiras: ESTX, isolada da aranha norte americana Eurypelma californicum (Anette 1989); e a proteína 1 isolada do veneno da aranha mexicana Brachypelma smithii (Kaiser et. al. 1994). A outra toxina com atividade inseticida que divide grande similaridade com a LTx2 e HWTX-II é a huwetoxina-VII (HWTX-VII) (Dai et. al. 2003). A seqüência da HWTX-VII, composta de 35 resíduos de aminoácidos, é semelhante àquela da HWTX-II, exceto por seis resíduos. A atividade biológica
64 da HWTX-VII também é semelhante à da HWTX-II, causando paralisia em gafanhotos, causando morte em camundongos após injeção i.c.v. e agindo cooperativamente com a HWTX-I (Liang 2004). A conformação terciária adotada por uma proteína é ditada muito mais pelo padrão de formação das pontes disulfeto do que simplesmente por sua seqüência de aminoácidos. E como é essa conformação que define primariamente a função de uma proteína, estudos de conformação são mais importantes do que simplesmente estudar a similaridade entre seqüências primárias para tentar definir a função de uma proteína (Shu et. al. 2001). Realizando um alinhamento com as toxinas LTx2, LTx1, LTx3, HWTX-II e HWTX-VII, observamos que os resíduos de cisteína estão em posições conservadas nessas toxinas. A predição de estrutura secundária realizada com as 3 toxinas pelo programa PELE (http://seqtool.sdsc.edu), mostrou a presença de duas alfa- hélices em todas as toxinas, sendo que elas estão na porção C-terminal nas HWTX-II e HWTX- VII e na porção N-terminal na LTx2. Já o programa GOR4 (http://doc.bioperl.org/releases/bioperl-1.4/Bio/Tools/Analysis/Protein/GOR4.html), que também mostrou duas alfa-hélices, as localizou na porção N-terminal em todas as toxinas submetidas à análise. Uma semelhança na estrutura terciária dessas toxinas poderia significar que a ação delas também sejam similar. Entretanto, não encontramos na literatura relatos sobre ensaios de atividades, mais específicos, realizados com as toxinas HWTX-II e HWTX-VII. Em nosso trabalho, nós realizamos a excisão da seqüência codificante para a toxina madura LTx2 do vetor pBlueScript II SK (+/-) e a inserimos em vetor de expressão pET11a. Posteriormente, nós induzimos a expressão da proteína alvo e realizamos um ensaio biológico para testar a eficiência do processo de solubilização dos corpos de inclusão e renaturação das proteínas. Como hospedeiro para expressão, nós utilizamos a bactéria E. coli. A escolha dessa bactéria para a expressão de proteínas recombinantes tem sido recorrente nos trabalhos de biologia molecular devido ao seu genoma ser bem conhecido, possuir uma alta eficiência de transformação e a facilidade para cultivar e manter as células (Saída et. al. 2006). As tentativas anteriores de clonagem não deram resultado devido ao fato de a enzima Nde1 não estar cortando de forma eficiente o produto da PCR, uma vez que esta precisa de uma região flanqueando o sítio de restrição onde ela possa se ancorar. A seqüência codificante foi então inserida no sítio para EcoRV do vetor pBlueScript II SK (+/-), de onde ela foi eficientemente excisada utilizando-se as enzimas Nde1 e BamHI. Após a excisão, procedemos à inserção da seqüência codificante para a LTx2 recombinante no vetor de expressão pET11a. O problema de recircularização do vetor foi contornado com a defosforilação do mesmo. Após a confirmação da clonagem por PCR de colônia, realizamos o seqüenciamento em ambas as fitas do fragmento de acordo com o método
65 de Sanger (1977) para confirmar se o frame estava correto. No resultado do sequenciamento (Anexo I) foi possível observar tanto o códon de iniciação quanto o stop códon, bem como a seqüência codificante para toxina madura; a análise também permitiu confirmar que a inserção da seqüência codificante no sítio múltiplo de clonagem do vetor de expressão pET11a se deu de forma correta. Procedemos, então, a indução da expressão da toxina recombinante utilizando IPTG. O sistema pET foi o escolhido por este ser considerado um dos sistemas de indução mais poderosos já desenvolvidos para a clonagem e expressão de proteínas recombinantes em bactérias E. coli. O sistema de indução é baseado no promotor T7 RNA polimerase, desenvolvido por Studier et. al. (1990). Nos vetores pET11a o “lac operator” se encontra inserido entre o promotor T7 e seqüências de iniciação de tradução, o que permite a desrepressão mediada por IPTG do promotor T7 em adição a indução por IPTG da T7 polimerase do promotor lac UV5 em cepas de bactérias DE3 (Figura 18). (Manual de plasmídeos da Novagen; Studier et. al. 1990; Ataíde 2000).
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Figura 18 – Controle da regulação da expressão da proteína recombinante pelo promotor T7 lac. Fonte: http://www.novagen.com
O processo de indução inicialmente foi realizado de acordo com o que está descrito em Sambrook et. al. (1989). Entretanto, observamos que tanto o crescimento da cultura quanto a taxa de expressão estavam baixos. Seguindo as recomendações do manual do sistema pET para expressão de proteínas tóxicas (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000), utilizamos, ao invés do meio de cultura LB, o meio de cultura SOC para crescimento da bactéria. Quando as culturas atingem a fase estacionária de crescimento, toda a glicose disponível já foi consumida e então uma fonte alternativa de carbono, como o glicerol, passa a ser utilizada. O metabolismo de fontes alternativas de carbono resultam no aumento dos níveis de cAMP o que leva à expressão da T7 RNA polimerase mesmo na ausência de IPTG, o que é chamado de expressão basal da proteína alvo (Grossman at. al. 1998). Minimizar a expressão basal é particularmente importante para a
67 expressão com vetores pET quando a proteína alvo possui algum tipo de atividade tóxica (Saida et. al. 2006). Portanto, a utilização do meio de cultura SOC teve como objetivo diminuir a expressão basal da proteína alvo, já que este meio contém glicose, e eliminou o problema do pouco crescimento da cultura. A baixa taxa de expressão da proteína alvo foi revertida através de sucessivas trocas do meio de cultura. Células sem o plasmídeo podem crescer rapidamente na cultura sempre que faltar o antibiótico seletivo. O uso de ampicilina como antibiótico seletivo requer cuidados porque a β-lactamase é produzida em quantidades significativas pelas células resistentes e é secretada no meio, onde pode destruir toda a ampicilina. Além disso, a ampicilina é sensível à hidrólise causada pelo meio ácido resultante do metabolismo celular (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000). Somado a isso, outro problema que pode ocorrer é que quase todas as células retêm o plasmídeo até a saturação. Entretanto, sob incubação contínua o número de células contendo o plasmídeo diminui sucessivamente e, com a ampicilina sendo degradada, um número maior de células sem o plasmídeo cresce na cultura. (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000). Não ficar atento a estes problemas pode levar a uma interpretação errônea de que os genes estão sendo pouco expressos quando, na verdade, há apenas uma pequena fração das células da cultura contendo o plasmídeo recombinante. Para contornar esse problema recorremos, como foi descrito no item 3.11.1 de materiais e métodos, à utilização de subculturas diluídas para a indução. O que ajudou a eliminar do meio a β-lactamase secretada e manteve o meio sempre seletivo. Após a indução observamos, através de ensaios imunoquímicos e SDS-PAGE, que a proteína alvo estava sendo expressa na forma de corpos de inclusão. A expressão de proteínas em células procarióticas é uma tarefa complexa já que as proteínas muitas vezes são expressas na forma de corpos de inclusão (Singh & Jia, 2005). Nestas células, proteínas mal enoveladas ou agregados de proteínas são renaturados em sua conformação nativa com o auxílio de chaperones. Se o renovelamento correto não é possível, essas proteínas são degradadas por proteases. Os corpos de inclusão são densos agregados de proteínas que não sofrem ação de proteases (Markossian & Kurganov 2004) e também são formados pelas bactérias como uma resposta à toxicidade da proteína recombinante (Sorensen et. al. 2003). A formação de corpos de inclusão pelas bactérias pode ser vantajosa na medida em que é grande a quantidade de proteína recombinante encontrada nesses agregados. Entretanto, gera uma série de dificuldades para a obtenção da proteína solúvel e ativa. Um procedimento para a obtenção de proteínas ativas que vem apresentando resultados favoráveis é a desnaturação dos corpos de inclusão e a posterior renaturação das proteínas solubilizadas (Nishiyama et. al. 2003, Singh & Jia 2005, Okumura et. al. 2006). Porém, a renaturação das proteínas solubilizadas a partir de corpos de inclusão é um processo de tentativa
68 e erro (Tsumoto et. al. 2003). Definir uma estratégia eficiente para desnaturação dos corpos de inclusão e posterior enovelamento da proteína recombinante é uma das tarefas mais desafiadoras e importantes em todo o processo de expressão heteróloga (Middelberg 2002). A escolha do agente desnaturante, como por exemplo uréia, hidrocloreto de guanidina ou detergentes, é crucial para a eficiência da solubilização, para a conformação a ser adotada pela proteína quando desnaturada bem como para o processo de renaturação (Tsumoto et. al. 2003). A eficiência da renaturação também é afetada pela maneira como o agente desnaturante é removido da solução (Tsumoto et. al. 2003). Para a obtenção da proteína solúvel seguimos, com modificações, o protocolo descrito por Roberto et. al. (2004). A desnaturação dos corpos de inclusão foi realizada em solução contendo uréia 6 M e a renaturação foi realizada através de diálise. Normalmente a concentração de uréia de 6 a 8 M é suficiente para garantir a desnaturação dos corpos de inclusão (Tsumoto et. al. 2003). Utilizamos a concentração de 6 M, pois é essa a concentração máxima de sal suportada pela coluna de cromatografia utilizada na purificação. O material renaturado foi então aplicado em uma coluna de fase reversa no sistema HPLC. Esse procedimento nos permitiu, além de purificar a proteína, retirarmos qualquer uréia restante presente na amostra. O material coletado foi aplicado em gel SDS-PAGE para averiguarmos a eficiência da purificação. No resultado da eletroforese foi possível observar a presença de uma banda única, o que confirma a purificação. Para confirmar que a banda observada na eletroforese se tratava da toxina recombinante, realizamos um ensaio de Western Blotting utilizando o veneno total como controle positivo. O resultado do Western Blotting mostrou que a proteína recombinante foi reconhecida pelo antisoro policlonal anti- veneno total. O procedimento que utilizamos para obternção de proteína ativa já havia sido utilizado com sucesso em outros trabalhos (Roberto et. al. 2004, Tsumoto et. al. 2003, Sorensen et. al. 2003). Após a confirmação de que a proteína purificada correspondia à toxina LTx2 recombinante, realizamos um ensaio antimicrobiano para testarmos se a proteína recombinante encontrava-se ativa e se ela possuía esse tipo de atividade. Em nosso ensaio antimicrobiano foram utilizados quatro microrganismos: Salmonella Agona isolada de dois pacientes durante um surto ocorrido na cidade de Ouro Preto, Minas Gerais; Escherichia coli TOP10 F’, Estaphilococcos epidermidis e Pseudomonas sp. A salmonelose é uma das zoonoses de maior importância médica, afetando pessoas tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (Fernandes et. al. 1997). Alguns sorotipos de Salmonella persistem por um longo período, já outros apenas ocorrem por curtos espaços de tempo. Como foi o caso da Salmonella Agona, que ocorreu em vários países, incluindo o Brasil (Calzada et. al. 1984, Clark et. al. 1973, Pessoa et. al. 1978).
69 Em Ouro Preto, este sorotipo ocorreu por um período de 6 meses, sendo detectado de 28 de Novembro de 1984 a 24 de Maio de 1985 (Fernandes et. al. 1997, Calzada et. al. 1984 & Clark et. al.. 1973). Fernandes et. al. (1992) mostrou que as cepas de Salmonella Agona pertencentes ao biotipo 1a apresentavam resistência a diversos antibióticos. A Salmonella Agona, assim como os outros sorotipos de Salmonella, é incapaz de fermentar lactose. A identificação de cepas capazes de fermentar lactose, isoladas de crianças hospitalizadas, chamou a atenção dos pesquisadores, que tentaram isolar e caracterizar essas cepas (Fernandes et. al. 1997). A toxina, na concentração de 300,0 μg/mL, inibiu o crescimento de ambas a colônias de Salmonella Agona utilizadas, bem como o crescimento de Estaphilococcos epidermidis e de E. coli TOP10 F’, o que pode justificar o crescimento lento da colônia antes de eliminarmos a expressão basal da proteína recombinante. A toxina não inibiu o crescimento de Pseudomonas sp. na concentração de 40,0 μg/mL. A comparação do resultado obtido em nosso ensaio com aqueles realizados em outros estudos de atividade microbiana é difícil de ser feito devido a diferenças na metodologia (ensaio de crescimento em cultura x crescimento em placas) e diferenças nas cepas de microrganismos utilizados. A busca por peptídeos com atividade bactericida em venenos animais, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos comerciais, pode ser de interesse para o combate a doenças infecciosas devido ao surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos clássicos (Lohner & Staudegger 2001). Para que se consiga obter substâncias naturais que sejam realmente eficazes no combate a essas doenças infecciosas, é vital o investimento em pesquisas que têm como objetivo identificar substâncias com atividade antimicrobiana específica e que, preferencialmente, exerçam essa atividade através de mecanismos distintos daqueles dos antibióticos clássicos (Daffre et. al. 2001). A presença de mais de 700 peptídeos antimicrobianos já foi constatada nos mais variados organismos, incluindo bactérias, fungos, insetos, moluscos, crustáceos, aracnídeos, entre outros (Daffre et. al.2001). A maioria dos peptídeos com atividade antimicrobiana descrita até o momento foram obtidos da hemolinfa, e alguns poucos foram encontrados como secreção da glândula de veneno de artrópodes (Pimenta e De Lima 2005). Dentre os venenos de aracnídeos, podemos citar: Lycosa singoriensis (Xu & Qu 1989, Budnik et. al. 2004), as licotoxinas encontradas no veneno da aranha L. carolinensis (Yan & Adams 1998) e L. erythrognatha (Santos et. al. 2004), bem como as encontradas no veneno de escorpião (Conde et. al. 2000). A presença de vários peptídeos antimicrobianos em um mesmo animal pode ser importante para garantir um amplo espectro de ação contra vários patógenos, bem como atuar sinergisticamente no combate às infecções. Esses peptídeos podem ser agrupados em duas classes de acordo com propriedades químicas e estruturais: lineares e cíclicos. Os lineares não
70 formam pontes disulfeto e podem ser subdivididos nos que formam uma α-hélice anfipática e nos que são ricos em um determinado tipo de aminoácido, como prolina, histidina e triptofano (Daffre et. al. 2001). Os cíclicos possuem pontes disulfeto e podem ter extremidades abertas ou fechadas. Na seqüência de aminoácidos da LTx2 existem 8 resíduos de cisteína, o que classificaria a proteína como cíclica.
A função desses peptídeos na composição do veneno não é bem definida, mas acredita-se que os mesmos sejam responsáveis por evitar infecções no duto que liga a glândula de veneno ao exterior, já que este entra em contato direto com a presa no momento da picada e fica susceptível à ação de microorganismos (Conde et. al. 2000) ou que façam parte de um mecanismo inato de defesa contra diferentes tipos de patógenos (Moerman et. al. 2003). A possibilidade de atuarem desinfetando a presa é descartada devido ao fato de a aranha regurgitar sobre a mesma uma mistura de enzimas proteolíticas que resulta na digestão extra-corpórea da maior parte da presa capturada (Collatz, 1987). A maioria dos peptídeos com atividade antimicrobiana adota uma conformação anfipática com propriedades hidrofóbicas e catiônicas que auxiliam na interação com a parede celular e membrana plasmática dos microrganismos (Pimenta & De Lima 2005). Alternativamente, podem se ligar a um receptor de membrana, levando a uma perda específica de sua função ou se translocarem através da membrana para o meio intracelular onde eles podem impedir a síntese de metabólitos importantes para o microrganismo (Lohner, 2001). Uma análise da estrutura terciária adotada pela toxina LTx2 recombinante é necessária para definir por qual dessas maneiras a toxina age impedindo o crescimento dos microorganismos testados. Para tanto, teríamos que conseguir a proteína recombinante em maior quantidade, o que permitiria também ensaios de concentração inibitória mínima (MIC). Testar novas metodologias para desnaturação dos corpos de inclusão e renovelamento da proteína solubilizada parece ser o caminho para conseguirmos uma recuperação de maior quantidade de toxina. Um melhor rendimento no processo de purificação permitiria também, em trabalhos posteriores com a proteína recombinante, estudos de eletrofisiologia, que visem determinar qual a participação da LTx2 nos efeitos do veneno total em canais de cálcio e sódio bem como a ação da toxina em diferentes células. Peptídeos antimicrobianos isolados de toxinas animais apresentam uma série de características desejáveis. Dentre as quais podemos citar o largo espectro de atividade, sinergia com outros antibióticos e por neutralizarem endotoxinas, bloqueiam a resposta septicêmica (Daffre et. al. 2001). No entanto, vários aspectos devem ser considerados e problemas resolvidos antes da produção em escala industrial e utilização terapêutica. Um dos problemas é a massa
71 molecular grande dessas substâncias quando comparados com antibióticos comerciais, o que inviabiliza a produção das mesmas através de síntese química, tornando necessária a produção de moléculas recombinantes através de técnicas de biologia molecular, visando assim abaixar o custo da produção (Daffre et. al.2001). Dentre os aspectos a serem considerados podemos citar a resistência desses peptídeos à ação proteolítica do organismo, o que pode ser contornado protegendo-os em lipossomos (Hancock & Scott 2000) ou modificando quimicamente a estrutura do peptídeo (Pimenta & De Lima 2005). Também devem ser levados em consideração a estabilidade in vivo, toxicidade e aspectos farmacocinéticos dessas substâncias (Pimenta & De Lima 2005).
72 6 – Conclusões
• A estratégia adotada neste trabalho permitiu-nos clonar a seqüência para LTx2 no vetor de expressão pET11a;
• Uma melhor expressão da toxina recombinante foi obtida nos tempos 3 - 4 horas após adição do indutor, `a temperatura de 30 °C;
• A proteína recombinante foi expressa, sobretudo, na forma de corpos de inclusão e na forma de monômeros e agregados;
• Após renaturação, a proteína recombinante foi purificada em uma única etapa utilizando-se de uma coluna de cromatografia líquida de fase reversa (RP-HPLC);
• A proteína recuperada apresentou atividade antimicrobiana, sugerindo que a mesma encontra-se ativa.
73
7 – Perspectivas
• Testar novas estratégias para recuperação da proteína alvo bem como novos sistemas de expressão, incluindo sistemas que possam facilitar a purificação da proteína recombinante, visando obtê-la em maior quantidade.
• Proceder outros estudos funcionais: ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos.
• Estudar a ação da toxina recombinante em insetos e mamíferos, com o intuito de verificar a possibilidade de no futuro investirmos em um bioinseticida;
• Clonar a toxina em baculovírus.
• Realizar mutações sítio-dirigidas, que podem aumentar a atividade da toxina.
74
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