Diversidade E Estrutura Genética Em Populações Naturais De Pterodon Emarginatus Vogel (Leguminosae)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

DIVERSIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES NATURAIS DE PTERODON EMARGINATUS VOGEL (LEGUMINOSAE)

MARCOS VINÍCIUS PEREIRA PINTO

Orientador(a): Prof. (ª) THANNYA NASCIMENTO SOARES

Goiânia - GO Brasil Setembro – 2017

Marcos Vinícius Pereira Pinto

Diversidade e estrutura genética em populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título Mestre em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientador (a): Prof. (ª) Dr. (ª) Thannya Nascimento Soares

Goiânia, GO – Brasil 2017

RESUMO

PINTO, M. V. P. Diversidade e estrutura genética em populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae). 2017. 49 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2017.1

A diversidade genética é componente fundamental para a sobrevivência de qualquer espécie ao longo do tempo evolutivo, isto porque configura-se como o repertório de possíveis respostas ás pressões ambientais, que são dinâmicas e constantes. O conhecimento da magnitude e dos padrões de estruturação dessa diversidade permite entender como fatores ambientais e microevolutivos tem interagido ao longo do tempo e moldado as populações, possibilitando melhor uso e conservação. Marcadores microssatélites tem sido a ferramenta molecular mais utilizada nas últimas décadas para estudos de mapeamento de diversidade e estrutura genética, devido ao seu alto grau de polimorfismo, abundância genômica e natureza codominante. Para espécies nativas raramente esses marcadores estão disponíveis, no entanto, as regiões que flanqueiam os microssatélites costumam ser conservadas entre espécies evolutivamente próximas, o que possibilita a transferência desses marcadores. Pterodon emarginatus Vogel, popularmente conhecida como Sucupira Branca, é uma planta arbórea pertencente à família das leguminosas. Esta espécie é amplamente utilizada com propósitos medicinais devido ao vasto potencial terapêutico de seus compostos secundários. Além disso, fornece madeira rígida de interesse para construção civil e também é utilizada como espécie ornamental. Apesar da grande quantidade de estudos direcionados para o potencial medicinal, pouco se sabe sobre a diversidade genética presente nessa espécie. Diante disso, os objetivos do trabalho foram transferir para P. emarginatus marcadores microssatélites desenvolvidos para Dipteryx alata e acessar a diversidade e estrutura genética em populações naturais de P. emarginatus. Para isso, foi testada à amplificação cruzada de 25 iniciadores e 12 populações naturais foram genotipadas para 6 locos microssatelites. Dos 25 iniciadores testados, 2 (8%) apresentaram bom padrão de amplificação e polimorfismo. O conjunto de marcadores utilizados revelou um total de quarenta e cinco alelos, com uma média de 7,667 por loco. Esse valor variou de 4 (DaE12) a 22 (PVESTBR067). As populações apresentaram nível intermediário de diversidade genética (He=0,555) e maior variabilidade dentro de populações do que entre populações. Foram detectados pequenos, porém significativos, níveis de endogamia devido tanto ao sistema de acasalamento quanto a subdivisão populacional (f= 0,07; Fst= 0,073). Esses resultados suportam que a espécie apresenta sistema misto de acasalamento. O padrão de divergência entre as populacionais demonstrou-se moderadamente estruturado no espaço (Mantel= 0,440; p<0,002) indicando um perfil de grandes populações continuas, com níveis significativos de fluxo gênico em distancias até aproximadamente 400 km.

Palavras-Chave: Pterodon emarginatus Vogel, microssatélite, diversidade genética, estrutura genética.

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1 Orientador (a): Prof.a Dr.a Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG

ABSTRACT

PINTO, M. V. P. Diversity and genetic structure in natural populations of Pterodon emarginatus Vogel (Leguminosae). 2017. 49 f. Dissertation (Master of Science in Genetics and Plant Breeding) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2017.1

Genetic diversity is a fundamental component for the survival of any species over evolutionary time, because it is the repertoire of possible responses to environmental pressures, which are dynamic and constant. Knowledge of the magnitude and structuring patterns of this diversity allows to understand how environmental and microevolutionary factors have interacted over time and shaped the populations. Microsatellite markers have been the most used molecular tool in recent decades for mapping studies of diversity and genetic structure due to its high degree of polymorphism, genomic abundance and codominant nature. For native species these markers rarely are available, however, the regions flanking the microsatellites are usually conserved among evolutionarily close species, which allows the transfer of these markers. Pterodon emarginatus Vogel, popularly known as Sucupira branca, is a tree plant belonging to the legume family. This species is widely used for medicinal purposes because of the broad properties of its secondary compounds. In addition, it provides rigid wood of interest for construction and is also used as an ornamental species. Despite the substantial number of studies directed to the medicinal potential, little is known about the genetic diversity present in this species. Therefore, the objectives of the work were to transfer to P. emarginatus microsatellite markers developed for Dipteryx alata and to access the diversity and genetic structure in natural populations of P. emarginatus. For this, the cross-amplification of 25 primers were tested and 12 natural populations were genotyped for 6 loci. Of the 25 primers tested, 2 (8%) showed good amplification and polymorphism pattern. The set of markers used revealed a total of 45 alleles for the 12 populations evaluated, with a mean of 7.667 per locus. This value ranged from 4 (DaE12) to 22 (PVESTBR067). Populations showed intermediate levels of genetic diversity

(He = 0.555) and greater variability within populations than among populations. Small but significant levels of inbreeding were detected due to both the mating system and the population subdivision (f = 0.07; Fst = 0.073). These results support that the species presents a mixed mating system, being preferentially allogama. The pattern of divergence among populations was moderately structured in space (Mantel = 0.440, p <0.002) indicating a profile of large continuous populations with significant levels of gene flow over distances up to approximately 400 km.

keywords: Pterodon emarginatus Vogel, microsatelite, genetic diversity, genetic structure.

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1 Orientador (a): Prof.a Dr.a Thannya Nascimento Soares. ICB-UFG

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 12 2.1 Pterodon emarginatus VOGEL ...... 12 2.1.1 Classificação taxonômica ...... 12 2.1.2 Descrição Botânica ...... 13 2.1.3 Distribuição, Importância sócio-econômica e ambiental ...... 15 2.2 DIVERSIDADE GENÉTICA ...... 16 2.3 ESTRUTURA GENÉTICA ...... 17 2.4 MARCADORES MICROSSATÉLITES ...... 19

3. MATERIAL E MÉTODOS ...... 21 3.1 AMOSTRAGEM ...... 21 3.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA ...... 22 3.3 TESTE AMPLIFICAÇÃO CRUZADA E SELEÇÃO DE LOCOS MICROSSATÉLITES POLIMÓRFICOS ...... 22 3.4 GENOTIPAGEM ...... 25 3.5 ANÁLISES GENÉTICO POPULACIONAIS ...... 25

4. RESULTADOS ...... 27

5. DISCUSSÃO ...... 34

6. CONCLUSÕES ...... 38

7. REFERÊNCIAS ...... 39

8. APÊNDICES ...... 46

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Populações amostradas para análise de diversidade e estrutura genética. Goiás (GO), Minas Gerais (MG) e Mato Grosso (MT) ...... 21

Tabela 2. Marcadores desenvolvidos para Dipteryx alata utilizados nos testes de amplificação cruzada...... 23

Tabela 3. Marcadores utilizados na genotipagem das populações de Pterodon emarginatus Vog...... 27

Tabela 4. Estatísticas descritivas relativas aos seis locos microssatélites avaliados: Número de indivíduos avaliados (N); Número de alelos por loco polimórfico (A); Número médio de alelos por loco para as populações (Ar); Heterozigosidade observada (Ho); Heterozigosidade esperada (He); Índice de fixação intra-populacional (f)...... 28

Tabela 5. Estatísticas descritivas relativas as doze populações avaliadas. São apresentadas as estimativas dos parâmetros: Número médio de alelos por loco para as populações (Ar); heterozigosidade observada (Ho); heterozigosidade esperada (He); índice de fixação intrapopulacional (f)...... 29

Tabela 6. Valores estimados e intervalo de confiança para os parâmetros: índice de fixação intra-populacional (f), coeficiente de endogamia total (F) e diferenciação inter-populacional (θ) geradas pela análise de variância das frequências alélicas com seis locos microssatélites para a espécie Pterodon emarginatus Vog...... 29

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Indivíduo de Pterodon emarginatus Vog...... 14

Figura 2. Variação para a cor das flores em Pterodon emarginatus Vog...... 14

Figura 3. Frutos de Pterodon emarginatus Vog...... 15

Figura 4. Populações amostradas para o estudo de diversidade e estrutura genética em Pterodon emarginatus Vog. ARGMT= Araguaiana, ARUGO= Aruanã, COCMT= Cocalinho, IPOGO= Iporá, PERMG= Perdizes, PIRGO= Pirenópolis, POTGO= Portelândia, PTUMG= Paracatu, SECGO= Serra de Caldas, SFRGO= São Francisco de Goiás, SILGO= Silvânia, TUPMG= Tupaciguara...... 22

Figura 5. Análise de Coordenadas Principais. Primeiro eixo (PCo1) e segundo eixo (PCo2). Entre parêntesis a porcentagem de explicação de cada eixo...... 30

Figura 6. Correlação entre distancia genética e distancia espacial das populações naturais de Pterodon emarginatus Vog...... 31

Figura 7. Representação gráfica da análise de agrupamento bayesiana para 12 populações de Pterodon emarginatus baseada em 6 locos microssatélites e para k=5. Cada indivíduo é representado por uma barra vertical, apresentando a proporção do seu genoma pertencente a cada um dos grupos estabelecidos...... 31

Figura 8. Correlograma entre I de Moran e classes de distância entre populações naturais de Pterodon emarginatus Vog. Os pontos representam o valor médio do I de Moran para cada classe de distância e as linhas tracejadas o desvio padrão. Entre parêntesis a quantidade de valores significativos a 5% (p<0,001)...... 32

Figura 9. Descontinuidade genética (seta) em populações naturais de Pterodon emarginatus Vog estimada pelo algoritmo de máxima diferenciação de Monmonier a partir do primeiro eixo da PCoa e da rede de Gabriel. A intensidade da cor que preenche cada quadrado representa a orientação de cada população no primeiro eixo da PCoA...... 33

Figura 10. Modelo linear entre latitude e variação genética para as doze populações de Pterodon emarginatus Vog...... 33

1. INTRODUÇÃO

A diversidade genética é componente imprescindível para manutenção das espécies ao longo do tempo, pois permite aos indivíduos responderem as constantes mudanças ambientais que lhes são impostas. Populações naturais geralmente apresentam estruturação dessa diversidade no tempo e no espaço, devido à ação de diferentes forças microevolutivas, fatores ambientais e biologia reprodutiva de cada espécie. O conhecimento da magnitude da diversidade e dos padrões de estruturação permite entender como esses fatores tem interagido ao longo do tempo e moldado as populações. Essa compreensão é fundamental para melhor uso e conservação de qualquer espécie.

Marcadores microssatélites tem sido a ferramenta molecular mais utilizada nas últimas décadas para estudos de mapeamento de diversidade genética, devido seu alto grau de polimorfismo, abundancia genômica e natureza codominante. No entanto, para espécies nativas sem imediato interesse econômico, raramente esses marcadores estão disponíveis. O desenvolvimento de novo de microssatélites pode demandar quantidade significativa de tempo e dinheiro, o que geralmente também não está disponível para esse tipo de espécies. Nesse contexto, a possibilidade de se transferir marcadores disponíveis para espécies filogeneticamente próximas mostra-se uma alternativa interessante (Kalia et al., 2011).

Pterodon emarginatus Vog. popularmente conhecida como sucupira branca, é uma planta arbórea pertencente à família das leguminosas. As populações de P. emarginatus estão distribuídas geograficamente nas regiões norte (Rondônia e Tocantins), nordeste (Bahia, Ceará, Maranhão, Piauí), centro-oeste (Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul) e sudeste (Minas Gerais e São Paulo) sendo comumente encontrada no Cerrado. Está presente em quase todos os domínios fitogeográficos brasileiros, exceto nos Pampas, e não é uma espécie endêmica do Brasil (Almeida et al. 1998; Lima & Lima, 2016).

Esta espécie é amplamente utilizada com propósitos medicinais devido as propriedades antireumaticas (Coelho, 2004), analgésicas (Coelho, 2005) e anti-inflamatorias

(Santos, 2010) de seus compostos secundários. Além das propriedades terapêuticas, P. emarginatus fornece madeira rígida de interesse para construção civil (Lima et al., 2012) e também é utilizada como espécie ornamental e apícola devido a beleza de suas flores (Aquino et al., 2007)

Apesar da grande quantidade de estudos direcionados para o potencial medicinal, pouco se sabe sobre a diversidade genética presente nessa espécie. Além disso, a resolução taxonômica do gênero ainda é bastante controversa e, dependendo da literatura consultada, P. pubescens é tratada como sinônimo de P. emarginatus (Vieira et al., 2007; Hansen et al., 2012; The Plant List, 2013; International Legume Database and Information Service, 2015).

Grande parte dessa confusão ocorre devido à existência de duas morfos distintas: Indivíduos com flores roxas e folíolos glabros e indivíduos com flores rosas e folíolos pubescentes. Lewis (1987) considerou esse dimorfismo como variação fenotípica dentro de P. emarginatus. Por outro lado, Rocha (2006) obteve dados moleculares sugerindo que as duas morfos representam duas entidades biológicas distintas. No entanto, essa questão ainda carece de dados adicionais e permanece inconclusiva. Em função disto, neste trabalho utilizamos a abordagem de Lewis (1987), que trata P. emarginatus como uma espécie politípica.

Os objetivos do trabalho foram transferir para P. emarginatus sensu Lewis marcadores microssatélites desenvolvidos para Dipteryx alata e acessar a diversidade e estrutura genética presentes em populações naturais de P. emarginatus.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Pterodon emarginatus VOGEL

2.1.1 Classificação taxonômica

O gênero Ptetodon possui seis espécies descritas até o presente, sendo elas P. apparicioi Pedersoli, P. macrophyllus Klotzsch, P. abruptus (Moric.) Benth, P. pubescens (Benth.) Benth, P. polygalaeflorus (Benth.) Benth.e P. emarginatus Vog. No entanto, esse número não é consenso e varia de acordo com a fonte consultada. O programa The Plant List (2013) reconhece apenas três desses nomes, atribuindo o status de “aceito” para P. abruptus e P. emarginatus e “não resolvido” para P. macrophyllus. A base de dados ILDIS (International Legume Database and Information Service, 2015) lista os seis nomes descritos para o gênero, porém atribui o status de “aceito” somente para P. emarginatus e P. abruptus. P. polygalaeflorus é considerado “variante” de P. emarginatus e os demais nomes recebem o status de “duvidoso”.

O programa Flora do Brasil 2020 (2016) reconhece P. abruptus, P. apparacioi, P. emarginatus e P. pubescens com entidades taxonômicas distintas e considera P.polygalaeflorus sinônimo de P. emarginatus. A base de dados IPNI (The International Plant Names Index, 2005) reconhece todos os seis nomes existentes como válidos. Grande parte dessa variação no número de espécies aceitas para o gênero é devida à incerteza na delimitação das espécies P. emarginatus, P. pubescens e P. polygalaeflorus. Essa incerteza é gerada pela ocorrência de indivíduos apresentando folhas pubescentes com 6-19 folíolos e flores variando do róseo claro a róseo escuro e indivíduos com folhas glabras com 4-10 folíolos e flores roxas

Lewis (1987) considerou essas duas morfos como variação dentro de uma espécie, P. emarginatus. Mais recentemente, Rocha (2006) realizou análises em nível de DNA utilizando marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) e dados morfológicos para investigar a variação encontrada dentro de P. emarginatus sensu Lewis. Apoiada em seus resultados a autora concluiu que P. emarginatus e P. pubescens são duas espécies diferentes, e P. polygalaeflorus deve continuar sendo mantida como sinônimo de P. emarginatus. A análise molecular demonstrou que 74% da variância encontrada é explicada pela diferença entre as formas rósea e roxa, sendo P. emarginatus caracterizada pela flor roxa e P. pubescens pela flor rósea. No entanto, não existe revisão publicada para o gênero até o presente, o que torna a questão inconclusiva. Diante disso, optamos por abordar p. emarginatus como proposto por Lewis (1987).

2.1.2 Descrição Botânica

P. emarginatus é uma árvore de altura aproximada entre 5 e 15 metros (Figura 1), troncos com diâmetros de até 70 cm; ritidoma de cor acinzentada ou amarelada, ásperos com depressões e deiscência de placas irregulares; casca descamante em arvores velhas, podendo apresentar rachaduras ou fissuras. Suas folhas são compostas; paripinadas; alternadas, espiraladas; com 4 a 19 folíolos; podendo ser alternos ou opostos; oblongos ou ovados; de 2 a 6cm de comprimento e 1 a 4cm de largura; ápices emarginados ou arredondados (Brasil, 2016).

Figura 1. Indivíduo de Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

O florescimento ocorre entre os meses de julho e outubro e frutificação entre junho e setembro. (Lorenzi, 2002; Brasil, 2016). As flores são pequenas, hermafroditas, zigomorfas, com cálice variando do rosa claro ao roxo (Figura 2) e com duas sépalas superiores livres e três inferiores fundidas. As flores são polinizadas principalmente por abelhas do gênero Bombus (Afonso, 1997).

Figura 2. Variação para a cor das flores em Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

O fruto é do tipo criptossâmara monospérmico, indeiscente, comprimido, oval ou raramente oblongo, inflado no núcleo seminífero com a superfície composta por venações concentradas no centro entorno da câmara onde encontra-se a semente tornando-se inconspícuas em direção as alas (Figura 3). Esse tipo de fruto em P. emarginatus demonstra uma adaptação para anemocoria em ambientes abertos e está relacionada à ausência de barreiras físicas e disponibilidade de vento, condições observadas no Cerrado, para que os frutos contendo a semente sejam facilmente transportados (Janzen, 1980; Paiva et al., 2001; Pinto et al., 2014). Suas sementes dispersas por anemocoria são elípticas a oblongas, levemente comprimidas, com arilo reduzido ao redor do hilo, textura coriácea, cor castanho- clara, com um pericarpo que se desprende e o mesocarpo que forma um alo circundando a semente proeminente.

Figura 3. Frutos de Pterodon emarginatus Vogel. Fonte: Brasil 2016.

2.1.3 Distribuição, Importância sócio-econômica e ambiental

As populações de P. emarginatus estão distribuídas geograficamente nas regiões norte (Rondônia e Tocantins), nordeste (Bahia, Ceará, Maranhão, Piauí), centro-oeste (Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul) e sudeste (Minas Gerais e São Paulo) sendo comumente encontrada no Cerrado. Está presente em todos os domínios fitogeográficos, exceto nos Pampas, e apesar de sua ampla distribuição, não é uma espécie endêmica do Brasil (Lima & Lima, 2015; Brasil, 2016).

P. emarginatus conhecida popularmente como “sucupira-branca” ou “faveiro” é reconhecida na medicina popular por suas propriedades terapêuticas, sendo utilizada para

diversas finalidades, muitas já corroboradas por estudos científicos (Hansen et al., 2012). Na medicina popular todas as partes da planta são utilizadas, desde a raiz até as folhas, sob a forma de infusão e decocção (Ferreira et al., 2014).

Os frutos são usados em macerações hidroalcoólicas para tratar infecções laringológicas, para uso infantil em compostos “fortificantes ou estimulantes do apetite”. O óleo da semente é usado no tratamento de dores de garganta (Nunan et al., 1982) e no tratamento de infecções ginecológicas (Almeida & Gottilieb, 1975). As túberas radiculares são empregadas no tratamento do diabetes e a casca tem atividade antimicrobiana (Bustamante et al., 2010⁠), cicatrizante, leishmanicida, antiulcerogênica, antiinflamatória, analgésica (Dutra, 2008⁠), antitumoral (Hansen et al., 2012) e para tratamento de doença remática (Lorenzi, 2002)

A madeira de P. emarginatus é dura e resistente à umidade com grande potencial para a construção civil (Lima et al., 2012). Além da madeira, possui características ornamentais e apícolas apreciáveis (Aquino et al., 2007). Por ser tolerante à luz direta e a baixa fertilidade do solo, é indicada em reflorestamentos mistos destinados a áreas degradadas de preservação (Lorenzi, 2002).

2.2 DIVERSIDADE GENÉTICA

A diversidade genética é constituída pela variedade de alelos e genótipos encontrados em determinado grupo de uma espécie (Frankham, 2010). A diversidade genética é considerada pela International Union for Conservation of Nature (IUCN) como uma das prioridades globais para a conservação. Isto porque para a manutenção e persistência das espécies ao longo do tempo evolutivo, estas precisam possuir diversidade genética suficiente para responder as diversas imposições do ambiente, que são processos contínuos, ininterruptos e que podem ser intensificados pela ação antrópica.

A compreensão dos padrões de distribuição da diversidade genética e do nível de diferenciação são de fundamental importância para a definição de estratégias de conservação e uso sustentado desses recursos genéticos, sendo importante no intuito de preservar a máxima variabilidade genética possível e subsidiar programas de conservação para as espécies (Loveless & Hamrick, 1984; Frankham, 2010; Cruz et al., 2011⁠).

A caracterização da variabilidade genética dentro de populações pode ser efetuada a partir de medidas de diversidade genética intrapopulacional, que podem ser estimadas a partir de dados de marcadores genéticos. A análise dos dados genéticos deve ser baseada em alguma teoria ou modelo. Um modelo é sempre insatisfatório em algum aspecto, sendo incapaz de refletir toda a complexidade do mundo real. Por outro lado, quanto mais um modelo se aproxima da realidade, mais complexo matematicamente ele se torna. Desse modo, um bom modelo é aquele que não é tão distante da realidade e nem tão complexo ao ponto de ser incompreensível matematicamente (Hedrick, 2004)

A variação intrapopulacional pode ser caracterizada pela variação alélica em locos estruturais como a porcentagem de locos polimórficos (P), o número médio de alelos por loco (Ar), heterozigosidade observada (Ho) e a heterozigosidade média esperada (He) segundo as expectativas do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (Hedrick, 2004).

Um loco polimórfico pode ser arbitrariamente definido como aquele que o alelo mais comum tem frequência igual ou inferior a 0,95 ou 0,99. A medida de locos polimórficos expressa a quantidade de polimorfismo e é dada pela razão entre os locos polimórficos e o total de locos da amostra. A porcentagem de locos polimórficos como medida da variação genética é indicada para análise de populações com um grande número de indivíduos e de locos. O número médio de alelos por loco polimórfico (Ar) é uma medida de riqueza alélica, que é proporcional ao polimorfismo (Brown & Weir, 1983) e também é fortemente dependente do tamanho amostral (Hedrick, 2004).

A heterozigosidade média esperada (He) ou diversidade gênica é a probabilidade de que dois genes escolhidos ao acaso numa população sejam diferentes. Esta tem sido a medida mais utilizada nas ultimas décadas e é considerada a mais completa pois reúne a variação genética de uma população em uma única estatística e não depende da definição de polimorfismo (Nei, 1987; Berg & Hamrick, 1997). Seja pi a frequência populacional do i- ésimo alelo em um loco, a heterozigosidade para este loco em uma população de 2 cruzamentos ao acaso é definida como: ĥ = 1 − Σpi (Hedrick, 2004).

2.3 ESTRUTURA GENÉTICA

Na maioria das espécies, as populações são subdivididas em unidades menores devido a fatores geográficos, ecológicos e comportamentais. Quando uma população está

subdividida, a conectividade genética entre suas partes pode diferir. Essa conectividade depende primariamente da quantidade de fluxo gênico que ocorre entre os subgrupos. A distância geográfica geralmente representa forte limitante desse fluxo, fazendo com que populações mais próximas apresentem maiores taxas e populações mais distantes apresentem menores taxas de fluxo gênico (Hedrick, 2004; Bradburd et al., 2013).

A combinação entre deriva genética local e fluxo gênico restrito resulta em diferenças locais de frequências alélicas, cuja magnitude tende a aumentar proporcionalmente com o aumento da distância geográfica. Desse modo, o nível de diferenciação genética entre populações é determinado pelo balanço entre a força homogeneizadora do fluxo gênico e processos que promovem a diferenciação, tais como deriva genética e adaptações locais (Bradburd et al., 2013).

O fundamento dos estudos de estrutura genética parte do teorema de Hardy- Weinberg. Em conformidade com seus pressupostos (população infinita, cruzamento aleatório e ausência de mutação, migração e seleção) o modelo assume que as frequências gênicas e genotípicas permanecem constantes de geração para geração mantendo a variação genética (Futuyma, 1992). Desse modo, a partir dos desvios encontrados em cada caso, torna-se possível inferir os fatores responsáveis pela estrutura populacional observada (Foll & Gaggiotti, 2006).

Diferentes modelos matemáticos foram propostos para caracterizar a estrutura genética populacional, dos quais cita-se: as estatísticas F (Wright, 1951); a diversidade genética de Nei (1973) e as análises de variância das frequências alélicas (Cockerham, 1969; Weir & Cockerham, 1984). Wright desenvolveu uma abordagem para dividir a variação genética que é comunmente utilizada pois fornece intuitiva descrição da diferenciação. Essa abordagem consiste em três coeficientes (F) de correlação, usados para para alocar a variabilidade genética ao nível total da população (T), subpopulações (S) e indivíduos (I). Na análise de frequências alélicas, os coeficientes de coancestralidade entre indivíduos ou grupos são obtidos a partir da decomposição dos componentes da análise de variância das frequências alélicas (Hedrick, 2004; Holsinger & Weir, 2009).

F (FIT de Wright) é a correlação entre alelos dentro de indivíduos em todas as populações, representando o coeficiente de endogamia dos indivíduos em relação ao

conjunto de populações. O estimador θ (FST de Wright) é a correlação de todos os alelos de diferentes indivíduos na mesma população. É o coeficiente de coancestralidade e mede a divergência entre populações. O estimador f (FIS de Wrigth) é a correlação dos alelos dentro de indivíduos dentro da população a qual estes indivíduos pertencem, ou seja, representa grau de endogamia dentro de populações e pode ser expresso como f = (F - θ) / (1 - θ) (Holsinger & Weir, 2009; Hart & Clark, 2010).

2.4 MARCADORES MICROSSATÉLITES

Microssatélites são regiões do DNA compostas de pequenos motivos de um a seis nucleotídeos repetidos em tandem. Outras denominações são utilizadas como sinônimos de microssatélite, como SSR (Simple Sequence Repeats) e STR (Short Tandem Repeats) (Ferreira & Grattapaglia, 1998). São classificadas pela composição de motivo repetido podendo ser mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos e, também, pelo tipo de sequência repetitiva, como microssatélites perfeitos, imperfeitos e compostos, em função do tipo de repetição que eles apresentam (Tóth et al., 2000⁠).

São ditos perfeitos os microssatélites onde a repetição não apresenta interrupção (por exemplo, CACACACACA). São ditos imperfeitos quando a sequência é interrompida por alguma base que não pertença ao motivo (por exemplo, CACACGACACA). E são considerados compostos os microssatélites que apresentam dois ou mais tipos de repetição conjuntamente (por exemplo, CACACAGCGCGC) (Tautz & Schlötterer, 1994; Goldstein et al., 1994).

A técnica de microssatélites revela polimorfismo em determinado loco devido a diferenças no número de vezes em que estas repetições de sequência simples ocorrem. Para iniciar estudos com marcadores microssatélites, há a necessidade de se ter disponível iniciadores desenvolvidos que flanquearão as regiões microssatélites. Desse modo, conhecendo-se estas regiões adjacentes às sequências microssatélites, é possível o desenho de pares de iniciadores específicos, possibilitando a amplificação, via PCR (polimerase chain reaction), dos fragmentos que contêm o DNA repetitivo em diferentes genótipos (Zane et al., 2002⁠).

O polimorfismo em cada loco microssatélite é resultado da diferença no número de repetições de cada unidade de repetição. Podemos, então, distinguir vários alelos, de um

mesmo loco, pelo tamanho. As sequências microssatélites em um loco variam de um indivíduo a outro, contudo, as sequências de DNA que flanqueiam os microssatélites são bastante conservadas entre espécies evolutivamente próximas (Tautz & Schlötterer, 1994; Oliveira et al., 2006; Kalia et al., 2011⁠).

A identificação dos alelos nos locos microssatélites pode ser feita diretamente com auxílio de brometo de etídeo em géis de agarose, nitrato de prata em géis de poliacrilamida ou através da detecção de picos de fluorescência em analisador automático de DNA. Os iniciadores marcados com fluorescência possibilitam sistemas múltiplos de detecção (multiplex), e consequentemente, permitem a genotipagem simultânea de vários locos de cada amostra analisada (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Nas últimas décadas, os marcadores microssatélites tem sido a ferramenta mais utilizada para estudos genético populacionais devido principalmente a grande ocorrência nos genomas de praticamente todos os organismos e sua natureza codominante e multialélica (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Oliveira, 2006; Kalia et al., 2011). Além disso, uma vez desenvolvidos os iniciadores para microssatélites, estes podem ser rapidamente sintetizados e testados em espécies evolutivamente proximas (Varshney et al., 2005).

A transferibilidade de um conjunto de iniciadores para amplificar determinados locos microssatélites facilita os estudos entre espécies estreitamente relacionadas, pois descarta a necessidade de desenvolver iniciadores específicos para a espécie. A probabilidade de sucesso de uma amplificação heteróloga para uma sequência de DNA via PCR está inversamente relacionada a distância evolutiva entre duas espécies (Zucchi, 2003). A transferabilidade tem demonstrado sucesso principalmente no nível infra-genérico, com uma estimativa de sucesso de até 60% em dicotiledôneas e de 40% em monocotiledôneas estreitamente relacionadas (Barbará et al., 2007)

Devido as características desses marcadores para estudos em genética de populações, os marcadores microssatélites têm sido escolhidos para diversos estudos em populações de diferentes espécies da flora brasileira, como Dipteryx alata Vogel (Soares et al., 2012), Tibouchina papyrus (Souza et al., 2014) e Pilosocereus gounellei (Monteiro et al., 2015).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAGEM

Foram coletadas amostras foliares de pelo menos vinte e três árvores adultas de P. emarginatus em doze localidades (Tabela 1; Figura 3). Estas amostras foram embaladas em sacos plásticos com sílica gel, identificados com o código da espécie e região de coleta, para o transporte até o Laboratório de Genética & Biodiversidade, da Universidade Federal de Goiás onde os dados moleculares foram obtidos.

Tabela 1. Populações de Pterodon emarginatus Vogel amostradas para análise de diversidade e estrutura genética. Goiás (GO), Minas Gerais (MG) e Mato Grosso (MT) População Código N° de indivíduos Longitude Latitude Perdizes/MG PERMG 32 -47,36658 -19,35077 São Francisco de Goiás/GO SFRGO 32 -49,25153 -15,92095 Cocalinho/MT COCMT 32 -51,36029 -14,95497 Ipora/GO IPOGO 32 -51,15724 -16,41614 Aruanã/GO ARUGO 32 -51,07816 -14,94036 Tupaciagura/MG TUPMG 32 -48,90082 -18,53749 Araguaiana/MT ARGMT 32 -51,83409 -15,45103 Silvania/GO SILGO 32 -48,37823 -16,59767 Paracatu/MG PTUMG 32 -47,04568 -17,06915 Pirenópolis/GO PIRGO 31 -48,95528 -15,74817 Portelândia/GO POTGO 23 -52,60776 -17,35041 Serra de Caldas/GO SECGO 32 -48,66000 -17,77250

Figura 4. Populações amostradas para o estudo de diversidade e estrutura genética em Pterodon emarginatus Vogel. ARGMT= Araguaiana, ARUGO= Aruanã, COCMT= Cocalinho, IPOGO= Iporá, PERMG= Perdizes, PIRGO= Pirenópolis, POTGO= Portelândia, PTUMG= Paracatu, SECGO= Serra de Caldas, SFRGO= São Francisco de Goiás, SILGO= Silvânia, TUPMG= Tupaciguara.

3.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

O DNA genômico foi extraído a partir do tecido foliar, seguindo o protocolo descrito em Doyle & Doyle (1987). Após a extração, o DNA total foi quantificado com auxílio de um marcador de peso molecular conhecido em gel de agarose 1% e tampão de eletroforese TBE (Tris Borato EDTA) na concentração de 1X. Em seguida o DNA foi diluído para uma concentração aproximada de 2,5 ng/μl.

3.3 TESTE AMPLIFICAÇÃO CRUZADA E SELEÇÃO DE LOCOS MICROSSATÉLITES POLIMÓRFICOS

Para os testes de amplificação cruzada foram utilizados vinte e cinco primers desenvolvidos para a espécie D. alata (Guimaraes et al., 2017) (Tabela 2). Os testes foram realizados utilizando o DNA de três indivíduos de P. emarginatus e os primers que apresentaram bom padrão de amplificação foram avaliados quanto à presença de polimorfismo, utilizando o DNA de oito indivíduos.

Tabela 2. Marcadores desenvolvidos para Dipteryx alata Vogel utilizados nos testes de amplificação cruzada.

Marcador Sequências (5'-3') Motivo Tamanho fragmento

F:TTGTTGAAAGCTAGCAAAGTGAA Dal_01 CT 152 R:CAAAGAACCCAACAAAATCTTTC

F: AAGCAGCTTCTGCATGAACTAT Dal_02 GA 167 R: TAAGCAAGGCCAAATTCGAG

F: CAAAGCTTTATACAATAACGCAAA Dal_03 AC 198 R: TCATTTCCACTGCCCAATTT

F: AAAGAGTAGCTGCAGACAGAATTG Dal_04 AG 176 R: AAAGAAGTCCTCAAATGCCTTG

F: TGCCATGATGCTACAAGTATGA Dal_05 AG 188 R: AGCCCCAAAACCGTTAAAAG

F: TGAAAGTGGATGCAAAAAGG Dal_06 TG 156 R: AATCCTTTAATCCCACAAATCA

F: CCCATGTCATTATCAAAAATGCT Dal_07 GA 179 R: CCTGTCATCATCGTGCGTAT

F: TTCAAGAAGCTCCGGTTGAT Dal_08 CT 169 R: CGAATGAGGAAGGAAGCAAA

F: ACCTGAGCCGAACCTCTTCT Dal_09 AG 161 R: GGCGAAAAGCTTCCCATAAT

F: AAATAAGATAAAGCTGTTGCAAAAAT Dal_10 GA 171 R: GATGCGCACCTAGTCTTTTTC

F: CATTTGCCCCTTCTTGTCTTT Dal_11 TC 174 R: AATGCCGATAATTTGTGTTGTTC

F: TGCTGCGTTCATTTTATAGTTTT Dal_12 TC 189 R: CTTTCTTCTTTGGGAGTTTGCT

F: GATTTGTTGGGTAACAGGAAG Dal_13 AG 192 R: GAGTCATTTTAGTCACACTGAGG

F: CATCTCACCAAAGCCATACAGA Dal_14 AG 179 R: TTGTTGCTTCCCGTTTTCTC

F: CAACTCCATCAACCAATACACC Dal_15 CAGGCA 214 R: AAATGAACCCCTCCAACACTT

F: AATTGCGAGGCACAAAAACT Dal_16 TC 185 R: TGAATGATAATGGGGGCAAA

F: AAAGTGAAATTATGTGCTATAAATGG Dal_17 AG 176 R: CAACGAATGATCAAAATCACAA

F: CGATAAGCATTACTATTTCCCTTT Dal_18 AG 198 R: GTGATTGACATCTAACCTCCTCT

F: CATCATACAGAGGCCAGACATT Dal_19 TG 184 R: TTGAGATTTACTGGTGACTTGTCC

F: CACGACTAGGAACCCCTTATTTT Dal_20 TC 183 R: TCTTTGTCATCCTTTCCCTTTG

F: TCTAGCCTCAACACACTGCTTC Dal_21 TC 162 R: CAAGAAAGATGATATGGGAAAAGG

F: TAGAAAGGACCTGAGAAGGAGA Dal_22 AG 199 R: ATCAAGATCATCAATAGCAGCA

F: TAGACAAAGTGCTTGGGGAAA Dal_23 AG 155 R: TTCTTGATTTTTGGATCTCTATCG

F: ATTTTGAGGAAGTCTCTTTGGT Dal_24 AC 129 R: TGGAGTTCATATCCTTATCTTTG

F: CCAGGTGGTGGGATGAGATA Dal_25 ATTGAG 166 R: ATGATGGACACACGAAAGTGAA

As reações em cadeia da polimerase (PCRs) foram realizadas a partir da montagem de um coquetel, com volume final de 10 µL por reação, contendo 7,5 ng de DNA, 0,9 µM de cada primer, 5 U de Taq DNA Polymerase (Phoneutria, Belo Horizonte, BR), 2,5

µM de cada dNTP, 25mg/ml de BSA, tampão 10X (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM a MgCl2, pH 8,3). Os ciclos de amplificação ocorreram em 3 etapas: (1 ) desnaturação inicial da dupla fita de DNA a 94°C/5min; (2a) realização de 30 ciclos, sendo que cada ciclo compreendeu respectivamente, a desnaturação do DNA a 95°C/5seg, o anelamento dos primers à fita molde, variando entre 48°- 60°C/1min (dependendo do iniciador) e a extensão da fita a 72°/30seg; (3a) extensão final a 72°/45min.

Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese vertical em gel desnaturante de poliacrilamida 6% em TBE 1X submetido a uma corrente elétrica de 70 W por aproximadamente duas horas. Para a visualização dos fragmentos amplificados o gel foi submetido a coloração com nitrato de prata conforme o protocolo descrito por Creste et al. (2001).

3.4 GENOTIPAGEM

Os pares de iniciadores que apresentaram polimorfismo tiveram seus iniciadores Forward ressintetizados adicionando os fluoróforos 6-FAM (azul), HEX (verde) ou NED (amarelo) na extremidade 5’ e, juntamente com os marcadores transferidos por Santana (2015), foram utilizados na genotipagem das populações amostradas. O conjunto de marcadores padronizados foi organizado em conjuntos para a genotipagem em sistema multiplex no Analisador genético ABI PRISM® 3500 DNA (Applied Biosystems).

As reações de PCR foram realizadas seguindo o mesmo protocolo descrito na seção de transferibilidade. A presença de amplificaçao foi confirmada em gel de agarose 3%. O tamanho dos fragmentos foi determinado usando marcador interno GeneScan 600 LIZ (Applied Biosystems) e os genótipos de cada indivíduo foram estabelecidos utilizando o programa Gene Mapper (Applied Biosystems).

3.5 ANÁLISES GENÉTICO POPULACIONAIS

O programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2002) foi utilizado para estimar os seguintes parâmetros genéticos: Diversidade genética de Nei (He); Heterozigozidade observada (Ho);

Número de alelos por loco polimórfico (NA); Riqueza alélica (AR); Índice de fixação intrapopulacional (f); Desequilíbrio de ligação entre os locos. O programa Identity 4.0 (Wagner

and Sefc, 1999) foi utilizado para estimar a probabilidade de exclusão de paternidade (Q) e a probabilidade de identidade (I).

Com o intuito de avaliar a magnitude e a distribuição da variabilidade entre e dentro das populações, foram estimados os parâmetros de estrutura genética por meio de uma análise de variância de frequências alélicas (Weir & Cockerham, 1984). Foram utilizadas 10000 reamostragens para estabelecer os intervalos de confiança a 95 % para os valores de f, F e θ. Essas análises foram realizadas no programa GDA-Genetic Data Analysis (Lewis & Zaykin, 2002).

O pacote Hierfstat (Goudet, 2005) do software R foi utilizado para estimar os valores de FST par a par segundo Weir & Cockerham (1984) e gerar uma matriz de distância genética entre as populações aqui estudadas. A partir desta matriz, foi realizada análise de coordenadas principais (PcoA – principal coordinates analysis), para verificar possíveis padrões de divergência genética. O programa Structure 2.3.2 (Pritchard et al., 2000) foi utilizado para designar indivíduos a grupos genéticos (K) e visualizar a estrutura genética das populações de P. emarginatus. A determinação do número K mais provável foi realizada pela estatística ΔK desenvolvida por Evanno et al. (2005).

Com o intuito de verificar padrão espacial na divergência genética entre populações, o pacote Vegan (Oksanen et al, 2017) do software R foi utilizado para correlacionar a matriz de distâncias genéticas com a matriz de distâncias geográficas a partir do teste de Mantel. O software R também foi utilizado para realizar analise de regressão linear entre latitude e primeiro eixo da PCoA. Foi realizada análise de autocorrelação espacial para as frequências alélicas, com base no índice I de Moran. Essa análise foi realizada no software R utilizando script gentilmente cedido por Diniz-Filho (2016). O pacote Adegenet (Jombart, 2008) do software R foi utilizado para identificação de descontinuidade genética entre as populações, a partir do algoritmo de Monmonier.

4. RESULTADOS

Dos vinte e cinco marcadores testados, sete (28%) apresentaram amplificação cruzada e dois (0,8%) apresentaram polimorfismo e completaram a bateria de marcadores utilizados para a genotipagem das populações. Dos nove marcadores transferidos por Santana et al. (2015), quatro apresentaram bom padrão de amplificação para todas as populações avaliadas e foram utilizados na genotipagem das populações. Desse modo, seis marcadores, dos quais três (BM164, PVESTBR067 e PVESTBR268) transferidos da espécie P. vulgaris e três (Da_E12, Dal_15 e Dal_25) transferidos da espécie D. alata, foram utilizados no estudo de diversidade e estrutura genética de P. emarginatus (Tabela 3).

Tabela 3. Marcadores utilizados na genotipagem das populações de Pterodon emarginatus Vogel.

Amplitude Ta Marcador Sequências (5’ – 3’) Motivo alélica Transferibilidade (°C) (bp) (GT)9 (GA)21 BM164 F: CCACCACAAGGAGAAGCAAC 160-168 58°

R: ACCATTCAGGCCGATACTCC (CT)8 PVESTBR067 F: CACTGAGGTTTTCCTCTGCTTT 254-290 54°

R: TGTTGAAGGCAAAACATGAAAC Santana et al. (2015) Da_E12 F: CCTTCTATGCGCTCTCTGCT (ATTTTT)18 200-224 60°

R: TACTTCAACGCCAGCTTCCT PVESTBR268 F: AGATGCAGAACAGATGCTTCAA (CCA)6 282-320 58°

R: TGAAAGGGTCTTCTTGTTCCAT Dal_15 F: CAACTCCATCAACCAATACACC (CAGGCA)9 210-238 58°

R: AAATGAACCCCTCCAACACTT Presente estudo Dal_25 F: CCAGGTGGTGGGATGAGATA (ATTGAG)5 152-170 58°

R: ATGATGGACACACGAAAGTGAA Ta: Temperatura de anelamento.

O conjunto de marcadores utilizados revelou um total de quarenta e cinco alelos para as doze populações avaliadas, com uma média de 7,667 por loco. Individualmente, esse valor variou de quatro (DaE12) a vinte e dois alelos (PVESTBR067).

A diversidade genética de Nei (1978) apresentou média global de 0,555, variando de 0,342 (Dal_25) a 0,850 (PVESTBR067). O marcador PVESTBR067 também apresentou maior riqueza alélica (13,937) enquanto Dal_25 apresentou a menor (2,397) (Tabela 4).

Não foi encontrado evidência de desequilíbrio de ligação entre os pares de locos. O conjunto de marcadores apresentou poder de exclusão de paternidade (Q=0.994) e de probabilidade de identidade (PI=3.551 x 10-8)

Loco A Ar Ho He f BM164 5 4,776 0,306 0,403 0,240 DaE12 4 3,653 0,539 0,551 0,022 Dal_25 4 2,397 0,329 0,342 0,037 Dal_15 6 5,040 0,684 0,670 -0,021 PVESTBR268 4 3,641 0,473 0,517 0,086 PVESTBR067 22 13,937 0,778 0,850 0,085 Média 7,667 5,674 0,518 0,555 0,075

Em nível populacional, ARGMT apresentou maior riqueza alélica (5,245) e SILGO apresentou a menor riqueza (3,712). ARGMT também apresentou maior diversidade genética (He=0,694) enquanto que COCMT apresentou menor diversidade (He=0,479). ARGMT foi a única população que apresentou valor significativo para a estatística f (0,249), indicando déficit de heterozigotos em relação ao esperado sob equilíbrio de HW (Tabela 5).

População Ar Ho He f PERMG 4,641 0,422 0,480 0,121 SFRGO 4,567 0,516 0,545 0,054 COCMT 4,127 0,453 0,479 0,054 IPOGO 4,415 0,563 0,534 -0,054 ARUGO 4,519 0,495 0,528 0,062 TUPMG 5,142 0,542 0,580 0,066 ARGMT 5,245 0,521 0,694 0,249* SILGO 3,712 0,547 0,546 -0,002 PTUMG 4,294 0,464 0,541 0,144 PIRGO 5,027 0,581 0,611 0,050 POTGO 4,333 0,630 0,608 -0,037 SECGO 4,245 0,484 0,518 0,065 Média 4,522 0,518 0,555 0,048 *Valor significativo ao nível de 5% (p<0,00069). A análise de variância das frequências alélicas apresentou valores significativos para as três estatísticas estimadas (Tabela 6). O valor de θ indica estruturação moderada entre as populações avaliadas.

Tabela 6. Valores estimados e intervalo de confiança para os parâmetros: índice de fixação intrapopulacional (f), coeficiente de endogamia total (F) e diferenciação inter-populacional (θ) geradas pela análise de variância das frequências alélicas com seis locos microssatélites para a espécie Pterodon emarginatus Vog.

Estimativas f F θ Limite superior (95%) 0,017 0,075 0,050 Limite Inferior (95%) 0,136 0,218 0,094 Média dos locos 0,070 0,138 0,073

O primeiro e o segundo eixos da PCoA foram capazes de explicar aproximadamente 57% e 35% da variação presente na matriz, respectivamente. PERMG, PTUMG e SILGO demonstraram-se as populações mais divergentes enquanto que o restante das populações foram agrupadas em praticamente um grande grupo (Figura 4).

Figura 5. Análise de Coordenadas Principais. Primeiro eixo (PCo1) e segundo eixo (PCo2). Entre parêntesis a porcentagem de explicação de cada eixo. O teste de Mantel apresentou valor de correlação matricial igual a 0,440 (p=0,002) (Figura 5), indicando que parte do padrão de divergência genética presente entre populações avaliadas pode ser explicado pela distância espacial, ou seja, indivíduos distantes espacialmente tendem a ser distantes geneticamente.

Figura 6. Correlação entre distancia genética e distancia espacial das populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel.

O número de grupos K=5 é o que melhor explica a estrutura genética presente nas populações, conforme a estatística delta K. A atribuição de genótipos realizada pelo Structure revelou grande quantidade de mistura dentro dos indivíduos para a maioria das populações (Figura 6). No entanto, PERMG, SILGO e POTGO apresentaram-se mais homogêneas, contendo indivíduos com genótipos quase que totalmente atribuídos a apenas um grupo.

Figura 7. Representação gráfica da análise de agrupamento bayesiana para 12 populações de Pterodon emarginatus Vogel baseada em 6 locos microssatélites e para k=5. Cada indivíduo é representado por uma barra vertical, apresentando a proporção do seu genoma pertencente a cada um dos grupos estabelecidos.

A população de ARGMT apresentou composição de praticamente dois grupos distintos: 16 indivíduos alocados quase que totalmente ao grupo amarelo e 16 indivíduos apresentando mistura entre os grupos roxo, rosa e verde. Ao considerar esses dois conjuntos de 16 indivíduos como duas populações distintas, foi obtido um θ de 0,279 entre elas. Esse valor representa alta divergência entre os indivíduos e é aproximadamente quatro vezes maior do que o valor de θ encontrado para todas as populações.

O correlograma resultante da análise de autocorrelação espacial das frequências alélicas revelou inexistência de padrão espacial em curtas distâncias e indicou que populações com distâncias acima de 400 km tendem a se tornar geneticamente diferentes (Figura 7).

Figura 8. Correlograma entre I de Moran e classes de distância entre populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel. Os pontos representam o valor médio do I de Moran para cada classe de distância e as linhas tracejadas o desvio padrão. Entre parêntesis a quantidade de valores significativos a 5% (p<0,001). O algoritmo de Monmonier revelou a existência de descontinuidade genética entre SILGO e as populações PIRGO e SECGO, separando as populações em dois subgrupos (Figura 8).

Figura 9. Descontinuidade genética (seta) em populações naturais de Pterodon emarginatus Vogel estimada pelo algoritmo de máxima diferenciação de Monmonier a partir do primeiro eixo da PCoa e da rede de Gabriel. A intensidade da cor que preenche cada quadrado representa a orientação de cada população no primeiro eixo da PCoA. A análise de regressão linear entre latitude e o primeiro eixo da PCoA revelou r2 ajustado no valor de 0,640, indicando que aproximadamente 64% da variação genética presente em P. emarginatus pode ser explicada pela latitude (Figura 9).

Figura 10. Modelo linear entre latitude e variação genética para as doze populações de Pterodon emarginatus Vogel.

5. DISCUSSÃO

A chance de sucesso de amplificação cruzada de um iniciador microssatélite é inversamente proporcional à distância evolutiva entre as espécies envolvidas. Considerando que o parentesco entre P. emarginatus e D. alata ocorre em nível de tribo, a taxa de sucesso obtida no presente estudo (0,8%) pode ser considerada baixa (Dayanandan et al.,1997; Barbará et al. 2007). Em concordância com a maior distância evolutiva, Santana (2015) obteve menor taxa de sucesso na amplificação cruzada de 539 iniciadores desenvolvidos para P. vulgaris.

O loco Dal_25 apresentou maior número de alelos em P. emarginatus (4) quando comparado com o encontrado D. alata (3) e maior heterozigosidade observada (Ho=0,329 e Ho=0,261), no entanto, apresentou menor heterozigosidade esperada, respectivamente (He=0,342 e He=0,595). O loco Dal_15 apresentou o mesmo número de alelos (6), no entanto, apresentou tanto maior heterozigozidade observada (Ho=0,684 e Ho=0,361) quanto heterozigosidade esperada, respectivamente (He=0,670 e He=0,463). Entretanto, essa comparação pode estar enviesada devido ao menor número de indivíduos avaliados em D. alata (Guimaraes et al., 2017).

Santana (2015) utilizou 88 indivíduos provenientes de 3 populações para a caracterização dos 9 marcadores transferidos para P. emarginatus, sendo que 4 desses marcadores foram utilizados no presente estudo. Apesar do menor número de indivíduos avaliados, a autora encontrou para esses 4 marcadores estatísticas semelhantes com as do presente estudo. A única exceção ocorreu para PVESTBR067, para o qual o aumento de indivíduos avaliados resultou em um aumento de 9 alelos.

Rocha (2006) utilizou 32 marcadores RAPD para avaliar 119 indivíduos provenientes de 7 populações P. emarginatus sensu Lewis. Apesar do marcador empregado pela autora possuir diferente natureza genética, a magnitude da diversidade genética detectada está em concordância com a verificada no presente estudo.

No mesmo sentido, Santana (2015) obteve valores intermediários de diversidade genética para os 88 indivíduos avaliados com 9 marcadores microssatélites. Diante disso, é possível inferir que P. emarginatus apresenta nível intermediário de diversidade genética.

Quando comparadas com outras plantas do cerrado avaliadas com microssatélites, P. emarginatus apresentou maior diversidade que D. alata He=0,415 (Guimaraes et al, 2017); e menor diversidade que Byrsonima cydoniifolia He=0,727 (Bernardes et al., 2014) e Cariocar brasiliensis He=0,856 (Collevatti et al, 2001).

Em plantas, as principais fontes de endogamia são autofecundação e fluxo gênico restrito. Esses fatores aumentam a correlação entre os gametas que são combinados durante a fecundação, resultando em homogeneização genotípica dentro de populações e aumentando a diferenciação genética entre populações. No sentido contrário, fecundação cruzada e fluxo gênico amplo reduzem a correlação entre gametas e a subdivisão intrapopulacional. A estimativa do parâmetro f capta o efeito do sistema de cruzamento na endogamia que existe dentro das populações, representando a proporção da variação genética total que está entre indivíduos dentro das populações (Loveless & Hamrick, 1984; Holsinger & Weir, 2009).

No presente estudo, o valor estimado de f demonstrou-se estatisticamente diferente de zero, no entanto foi relativamente baixo (0,07), sugerindo baixas taxas de autofecundação. P. emarginatus apresenta flores hermafroditas, o que possibilitaria a ocorrência de autofecundação. Estudando a viabilidade de pólen em P. emarginatus, Rocha (2006) encontrou correlação negativa entre percentagem de pólen fértil e sementes viáveis dentro de indivíduos, sugerindo que os indivíduos da espécie podem apresentar investimento diferencial na produção de pólen fértil e sementes. Esses resultados corroboram com a hipótese de que as flores da espécie não são funcionalmente hermafroditas e que a espécie apresenta sistema de acasalamento preferencialmente alógamo.

A subdivisão populacional promove a ação da deriva genética, que por sua vez resulta na diferenciação genética entre as subpopulações. No sentido contrário, o fluxo gênico entre populações reduz a subdivisão populacional e consequentemente reduz a estruturação genética. Por serem organismos sesseis, o fluxo gênico em plantas está restrito a dispersão de seus gametas via pólen, e de indivíduos via semente. O parâmetro θ representa a proporção da variação genética total que está entre as populações e é influenciado pela

subdivisão populacional. No presente estudo foi encontrado valor significativo para essa estatística (0,075), indicando que aproximadamente 7% da variabilidade genética está entre as populações, e que 93% da variabilidade está contida dentro das populações. Utilizando marcadores RAPD, Rocha (2006) encontrou valores semelhantes de estruturação entre populações. Essa magnitude de estruturação sugere que P. emarginatus apresenta níveis suficientes de fluxo gênico para contrapor os efeitos da deriva genética.

Esses resultados estão de acordo com o esperado para espécies de plantas que apresentam estratégias de dispersão de gametas semelhantes as observadas em P. emarginatus. O movimento de seus polens é mediado por abelhas do gênero Bombus (Afonso, 1997) que apresentam alto potencial de dispersão. Suas sementes apresentam adaptações para anemocoria, o que pode resultar também em dispersão de longas distâncias. Esses dois fatores combinados contribuem para maior fluxo gênico e consequentemente menor divergência entre populações.

Em concordância com os resultados obtidos no presente estudo, Braga & Collevatti (2011) avaliaram a dispersão de pólen e estrutura espacial em Tabebuia aurea, espécie arbórea tropical que também é polinizada por abelhas do gênero Bombus e apresenta dispersão de sementes por anemocoria. As autoras detectaram longas distâncias de dispersão de pólen (máxima= 2,608 m e média=351,5 m) e fraca estrutura espacial.

Algumas populações se apresentam individualmente em grupos distintos, como é o caso de SILGO, PTUMG e PERMG. Para as duas últimas, essa divergência pode ser explicada pela distância geográfica em relação as demais populações, o que é corroborado pelo teste de Mantel e pelo padrão latitudinal de divergência genética detectado pela análise de regressão linear. As demais populações apresentaram relativo baixo nível de divergência, sugerindo que as populações de P. emarginatus se comportam como grandes complexos contínuos, com níveis significativos de fluxo gênico entre elas. No entanto, o correlograma demonstra que essa continuidade é interrompida a partir de distâncias acima de 400 km, sendo que a partir dessa distância as populações começam a ficar geneticamente mais distantes do que o esperado pelo acaso.

O presente estudo não foi delineado para avaliar a diferença genética entre as morfos e provavelmente a maioria dos indivíduos amostrados é da morfo rosa, pois a literatura descreve a ocorrência da morfo rosa principalmente para o sul de Goiás e os estados

de Minas Gerais e São Paulo, o que coincide com região amostrada no presente estudo (Rocha, 2006). Rocha (2006) encontrou grande divergência genética entre as duas morfos de P. emarginatus, o que levou a autora concluir que as morfos representam entidades biológicas (espécies) distintas. O fato de termos encontrado baixos valores de estrutura e distância genética entre as populações, corrobora com o fato de que provavelmente não coletamos populações de morfos distintas.

Por outro lado, existe a possibilidade de termos amostrados indivíduos de morfos distintas dentro das populações, o que explicaria a formação de dois grupos divergentes dentro de ARGMT e a divergência genética apresentada por SILGO em relação as populações geograficamente próximas. Ainda assim, a magnitude da divergência obtida para os dois casos anteriores foi relativamente baixa e também pode ser explicada pela coleta de um subconjunto de indivíduos aparentados no caso de ARGMT e restrição de fluxo gênico devido a fatores ambientais para o caso de SILGO. De fato, ARGMT foi a única população que apresentou nível de endogamia significativo (f=0,249; p<0,00069), o que corrobora a hipótese de coleta de indivíduos aparentados.

6. CONCLUSÕES

Os marcadores transferidos no presente estudo demonstraram boa qualidade para realizar analises genético-populacionais e agregaram poder de resolução ao conjunto de marcadores previamente transferidos para P. emarginatus. As populações naturais avaliadas apresentaram nível intermediário de diversidade genética e maior variabilidade dentro de populações do que entre populações. Foram detectados pequenos, porem significativos, níveis de endogamia devido tanto ao sistema de acasalamento quanto a subdivisão populacional. Esses resultados suportam que a espécie apresenta sistema misto de acasalamento, com maiores proporções de alogamia. O padrão de divergência entre as populacionais demonstrou-se moderadamente estruturado no espaço, apresentando gradiente latitudinal de divergência genética. Esses resultados indicam um perfil de grandes populações continuas, com altos níveis de fluxo gênico em distancias até aproximadamente 400 km.

7. REFERÊNCIAS

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8. APÊNDICES

Apêndice A. Frequências alélicas obtidas para o loco BM164

Apêndice B. Frequências alélicas obtidas para o loco DaE12

Apêndice C. Frequências alélicas obtidas para o loco Dal_25

Apêndice D. Frequências alélicas obtidas para o loco Dal_25

Apêndice E. Frequências alélicas obtidas para o loco PVESTBR268

Apêndice F. Frequências alélicas obtidas para o loco PVESTBR067