Josefine BICKEL
Phytochemische Analyse der Alge Dasycladus vermicularis
DIPLOMARBEIT
eingereicht an der
LEOPOLD-FRANZENS-UNIVERSITÄT INNSBRUCK
INSTITUT FÜR PHARMAZIE/PHARMAKOGNOSIE
Zur Erlangung des akademischen Grades
MAGISTRA DER PHARMAZIE
Innsbruck, März 2018
Inhaltsverzeichnis
1 Inhaltsverzeichnis
1 Inhaltsverzeichnis ...... 2
2 Einleitung ...... 5
3 Abstract ...... 7
4 Zusammenfassung ...... 8
5 Allgemeiner Teil ...... 9
5.1 Dasycladus vermicularis (Scropoli) Krasser ...... 9
5.1.1 Klassifikation ...... 9
5.1.2 Nähere Beschreibung von Dasycladus vermicularis ...... 10
5.1.3 Cumarine ...... 11
5.1.4 Einteilung der Cumarine ...... 11
5.1.5 Biosynthese der Cumarine ...... 12
5.1.6 Cumarine in der Alge Dasycladus vermicularis ...... 14
5.2 Phenolische Carbonsäuren ...... 15
5.2.1 Biosynthese ...... 15
5.2.2 Sulfatierte Phenolcarbonsäuren ...... 15
5.3 Chromatografie ...... 17
5.3.1 Klassische Säulenchromatografie...... 18
5.3.2 Gelpermeationschromatografie ...... 19
5.3.3 HPLC ...... 20
5.3.4 Flash-Chromatografie ...... 24
5.3.5 Präparative HPLC ...... 25
5.4 NMR Spektroskopie ...... 25
6 Spezieller Teil ...... 26
6.1 Herstellung des Wasser-Methanol-Extrakts ...... 26
6.2 Dünnschichtchromatografische Vorversuche ...... 26
6.2.1 Trennung des Wasser-Methanol Rohextraktes mittels Flash-Chromatografie .... 26
2
Inhaltsverzeichnis
6.2.2 HPLC Analysen der Fraktionen ...... 29
6.2.3 DasyA-W1 ...... 29
6.2.3.1 Fraktionen DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9 ...... 30
6.2.3.2 Fraktionen DasyA-W1-Rev10 und DasyA-W1-Rev11 ...... 31
6.2.3.3 Fraktionen DasyA-W1-Rev12, DasyA-W1-Rev13 und DasyA-W1-Rev14 31
6.2.4 DasyA-W2 ...... 35
6.2.4.1 Fraktionen DasyA-W2-Rev6, DasyA-W2-Rev7 und DasyA-W2-Rev8 ...... 35
6.2.5 DasyA-W-4 ...... 37
6.2.5.1 Fraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DaysA-W4-Rev32 38
6.2.5.2 Fraktion DasyA-W4-Rev45 ...... 39
6.3 Herstellung des Methanolextraktes ...... 40
6.3.1 Fraktion DasyA-M1-Se5 ...... 41
6.3.2 Fraktion DasyA-M1-Se7 ...... 43
6.4 Zuordnung der isolierten Substanzen ...... 44
6.5 Synthese der Cumarine ...... 46
6.5.1 Synthese von 3,7-Dihydroxycumarin und 3,6-Dihydroxycumarin ...... 46
6.5.2 Synthese von 3,6,7 Trihydroxycumarin ...... 47
6.6 Sulfatierung ...... 51
6.6.1 Sulfatierung des 3,6,7-Trihydroxycumarins ...... 51
6.6.2 Sulfatierung der 4-OH-Zimtsäure ...... 53
7 Zusammenfassung ...... 55
8 Experimenteller Teil ...... 57
8.1 Herkunft des Algenmaterials ...... 57
8.2 Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte ...... 57
8.2.1 Herstellung des Methanol-Wasser-Extrakts ...... 57
8.2.2 Herstellung des Methanol Extrakts ...... 57
8.2.3 Dünnschichtchromatografie ...... 58
8.2.4 Flash-Chromatografie ...... 58 3
Inhaltsverzeichnis
8.2.4.1 Auftrennung des Methanol- Wasser Extraktes ...... 58
8.2.4.2 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W2-Rev6, DasyA-W2-Rev7 und DasyA- W2-Rev8 62
8.2.4.3 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DasyA-W4-Rev32 ...... 62
8.2.4.4 Auftrennung der Fraktion DasyA-W4-Rev45 ...... 63
8.2.5 Gelpermeationschromatografie ...... 64
8.2.5.1 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9 ...... 64
8.2.5.2 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev10 und DasyA-W1-Rev11 .... 65
8.2.5.3 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev13, DasyA-W1-Rev14 und DasyA-W1-Rev15 ...... 65
8.2.5.4 Methanol Extrakt ...... 66
8.2.5.5 Aufreinigung des synthetisierten 3,6,7-Trihydroxycumarins ...... 67
8.2.5.6 Aufreinigung des synthetisierten 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfats ...... 68
8.2.6 Analytische HPLC ...... 69
8.2.7 Präparative HPLC ...... 71
8.2.7.1 Fraktion DasyA-W9-Se4 ...... 71
8.2.7.2 Fraktion DasyA-M1-Se5 ...... 71
8.2.7.3 Fraktion DasyA-M1-Se7 ...... 72
8.2.8 Durchführung der Synthesen ...... 73
8.2.8.1 Aufbau der Reaktionsapparaturen ...... 73
8.2.8.2 Herstellung der Reagenzien für die Synthesen...... 73
8.2.9 Chemikalienverzeichnis ...... 74
8.3 Sonstiges ...... 75
9 Abkürzungsverzeichnis ...... 76
10 Lebenslauf ...... 78
11 Danksagung ...... 79
12 References ...... 80
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Einleitung
2 Einleitung
Zum Schutz vor Umweltschäden, vor Fressfeinden, oder vor mikrobiellem Befall haben Pflanzen und Algen verschiedene Strategien entwickelt. Manche davon sollten auch zu einer schnellen und effektiven Wundheilung führen. Meist geschieht dies durch im Gewebe gespeicherte, enzym-aktivierte Stoffe, die bei einer Verletzung schnell rekrutiert werden können. So wurde schon früh entdeckt, dass Pflanzen und Algen bei Verletzung Lipasen und Lipoxygenasen aktivieren, die unterschiedliche Oxolipine produzieren [1]. Diese spielen wichtige Rollen als chemische Abwehrmechanismen, beispielsweise schützt sich so die Rotalge Gracilaria chilensis vor einem Befall mit Epiphyten [2, 3]. Diese Abwehrmechanismen werden aber nicht nur gegen Fressfeinde eingesetzt, sondern sie spielen auch eine wichtige Rolle für den Schutz des Gewebes bei mechanischen Beschädigungen. Besonders bei einzelligen Organismen, wie zum Beispiel siphonalen Grünalgen, sind diese Mechanismen sehr wichtig, damit das verletzte Gewebe schnell und effektiv repariert werden kann, um das Überleben der Alge zu gewährleisten. Ein Beispiel für solche Verbindungen sind sulfatierte phenolische Metaboliten, die als Speicherform im Gewebe vorliegen. Bei einer Verletzung des Gewebes findet eine Desulfatierung statt und der aktivere Metabolit wird freigesetzt. Beispielsweise schützt sich das Seegras Zostera marina damit vor dem Befall mit Mikroorganismen, indem sulfatierte Zoster-Säure (p-Sulfoxy-Zimtsäure) gespeichert wird. Bei einer Verletzung, oder bei mikrobiellem Befall, wird durch Sulfatasen Cumarsäure gebildet [4, 5].
Sulfatierte Cumarine finden sich aber auch in der Grünalge Dasycladus vermicularis. Diese Alge besteht nur aus einer einzigen, riesigen Zelle, deshalb ist eine schnelle und effektive Wundheilung essentiell für ihr Überleben. Als Hauptmetabolit wird in dieser Grünalge 6,7- Dihydroxycumarin-3-Sulfat (THyCS) gebildet. Er spielt nicht nur eine Rolle beim Schutz der Pflanze vor UV-Strahlung, sondern auch beim schnellen und effektiven Wundverschluss. Hierbei wird das Sulfat mittels Sulfatasen abgespalten. Der entstandene Metabolit 3,6,7- Trihydroxycumarin (THyC) initiiert eine Polymerisierung der Proteine, die für den Wundverschluss zuständig sind [6, 7].
Die zusätzlich in Dasycladus vermicularis vorhandenen phenolischen Carbonsäuren liegen ebenfalls meist in sulfatierter Form vor. Auch bei ihnen wird der Schwefelsäure-Rest durch Sulfatasen abgespalten. Den so entstandenen Metaboliten wird eine antimikrobielle Wirkung zugeschrieben [8].
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Einleitung
In dieser Arbeit sollte nun Dasycladus vermicularis auf weitere sulfatierte Cumarine und phenolische Carbonsäuren untersucht werden. Des Weiteren wurden die sulfatierten Inhaltstoffe für eine später durchzuführende qualitative und quantitative Analyse synthetisiert.
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Abstract
3 Abstract
As a protection strategy against environmental threats plants and algae may contain some particular metabolites that are stored in their tissue, to be transformed enzymatically after an injury. For example, oxylipins, produced by wound activated lipases and lipoxygenases, play an important role in chemical defence. Sulphated metabolites are found in many marine organisms, and after wounding, sulfatases release metabolites that initiate a fast wound sealing. Especially in siphonous green algae that consist of one gigantic cell only, this process is very important. The green algae Dasycladus vermicularis is such an algae and it uses a sulphated hydroxylated coumarin derivate as a storage form of a protein cross linker that can be activated upon mechanical injury of the algae. We tried to isulate and identify some of the substances in Dasycladus vermicularis. The compounds were isolated by gel permeation chromatography (LH-20), flash chromatography (reversed phase) and preparative HPLC (also reversed phase). Identification was conducted by LC/MS and NMR spectroskopy. Two aromatic sulfate esters, 4-(sulfoxy) phenylacetic acid and 4-(sulfoxy)benzoic acid and one dimeric coumarin- sulphate could be identified, together with 6,7-Dihydroxy-3-cumarinsulfat.
Based on the low yields and to confirm the structures, we synthesised three different coumarins as well as 4-OH cinnamic acid and Trihydroxycourmarisulphate. The synthesis of the coumarins went well, but after sulfatation we couldn’t isolate the pure trihydroxycoumarin- sulfate but there were many side products. Finally, we also tried to perform a sulfatation of 4- OH-cinnamic acid. We received a good yield of a pure product.
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Zusammenfassung
4 Zusammenfassung
Algen und Pflanzen enthalten bestimmte Metabolite, die erst nach Schädigung des Gewebes durch Enzyme in die aktiven Formen umgewandelt werden. Beispielsweise spielen Oxylipine, die nach einer Verletzung von Lipasen und Lipoxygenasen produziert werden, eine wichtige Rolle in der chemischen Abwehr gegen Keime. Sulfatierte Metabolite findet man in vielen marinen Organismen, und nach Verletzungen setzten Sulfatasen daraus Metabolite frei, die für einen schnellen Wundheilungsprozess verantwortlich sind. Im Besonderen ist dieser Prozess sehr wichtig bei siphonalen Grünalgen, die nur aus einer einzigen, riesigen Zelle bestehen. Dasycladus vermicularis ist eine solche Alge, sie verwendet sulfatierte Cumarinderivate als Speicherform eines Protein Crosslinkers, der nach einer mechanischen Verletzung des Gewebes aktiviert werden kann. Es wurde versucht in dieser Diplomarbeit einige dieser sulfatierten Metabolite aus diese Alge zu isolieren und zu identifizieren. Die Isolierungen wurden mithilfe von Sephadex LH- 20 Säulen oder Flash Chromatografie unter Verwendung verschiedener Lösungsmitteln durchgeführt, manche Substanzen wurden im Anschluss mit einer präparativen HPLC weiter aufgereinigt. Die Identifizierung der Reinsubstanzen erfolgte im Anschluss durch LC-MS und NMR Experimente. Dadurch konnten insgesamt drei verschiedene Substanzen aus isoliert und identifiziert werden: Phenylessigsäure-4-sulfat, 4-Sulfoxy-benzoesäure und 6,7- Dihydroxycumarin-3-sulfat sowie ein Dimeres Cumarin Sulfat. Außerdem wurden vier weitere Substanzen isoliert, deren Struktur noch aufgeklärt werden muss.
Aufgrund der geringen isolierten Mengen und der höheren Reinheit wurden im zweiten Teil der Diplomarbeit 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat und Zimtsäure-4-sulfat synthetisiert. Bei der Synthese des 3,6,7-Trihydroxycumarins wurde eine relativ gute Ausbeute erzielt, die anschließende Sulfatierung hingegen verlief weniger optimal, denn das reine Produkt konnte nicht von einer Reihe von Nebenprodukten abgetrennt werden. Die Sulfatierung der 4-OH- Zimtsäure wurde mit einer anderen Methode durchgeführt und verlief zufriedenstellend.
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Allgemeiner Teil
5 Allgemeiner Teil
5.1 Dasycladus vermicularis (Scropoli) Krasser
5.1.1 Klassifikation
Domäne: Eukaryoten
Reich: Plantae
Unterreich: Viridiplantae
Infrareich: Chorophyta
Abteilung: Chlorophyta
Unterabteilung: Chlorophytina
Klasse: Ulvophyceae
Ordnung: Dasycladales
Familie: Dasycladaceae
Gattung: Dasycladus
Die Ulvophyceae stellen innerhalb der Grünalgen eine von 12 Klassen dar. Zu dieser Klasse werden zum heutigen Standpunkt neun verschiedene Ordnungen gezählt. Eine davon ist die Ordnung der Dasycladales, die in zwei Familien unterteilt wird. Zum einen die Familie der Polyphysaceae, die 19 Arten enthält, und die Familie der Dasycladaceae, die 47 Arten enthält, darunter drei Dasycladus Arten. Eine davon ist Dasycladus vermicularis [9].
Die Klasse der Ulvophyceae beinhaltet hauptsächlich Familien mit Salzwasseralgen, aber auch einige wichtige im Süßwasser vorkommende Vertreter wie etwa Ulothrix aequalis [10, 11].
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Allgemeiner Teil
5.1.2 Nähere Beschreibung von Dasycladus vermicularis
Ein typisches Merkmal der Dasycladales ist die siphonale Organisationsstufe. Die Alge besteht lediglich aus einer riesigen, vielkernigen Zelle die an einer Hauptachse Wirtel aus Kurztrieben hält. In dieser riesigen Zelle liegt um eine große, zentrale Vakuole, ein schmaler Bereich von Cytoplasma mit zahlreichen Kernen herum. Die Zellen fast aller Dasycladales sind stark mit Calciumcarbonat in Form von Aragonitkristallen inkrustiert [12].
Dasycladus vermicularis ist eine marine Alge, die vor allem in tropischen Gewässern, aber auch im Mittelmeer in oberflächennahen Wasserzonen bis zu einigen Metern Tiefe zu finden ist. Sie lebt bevorzugt auf sandigen und kiesigen Böden [13].
Sie ist olivgrün gefärbt, mit wirtelförmig angeordneten, einzelligen Thalli. Sie sind ungestilt, aufrecht und leicht gebogen. Ein Thallus misst 2-4 cm in der Länge und hat einen Durchmesser von 0,4-0,5 cm. Das Gewebe der Thalli ist schwammig und geringfügig kalzifiziert. Im Querschnitt kann man an einem calzifizierten Stamm wirtelförmig angeordneten Verzweigungnen erkennen (Abbildungen 1 und 2) [14].
Als weitere Inhaltstoffe neben Calziumcarbonat beinhaltet Dasycladus vermicularis Chlorophyl a und b um Photosynthese zu betreiben. Außerdem findet man die von uns genauer untersuchten sulfatierten Cumarine, sowie sulfatierte phenolische Carbonsäuren [15].
Dem enthaltenen 3,6,7-Trihydroxycumarin wird eine photoprotektive Wirkung zugeschrieben, sowie eine entscheidende Rolle beim Wundverschluss der Alge [7].
Abbildung 1: Dasycladus vermicularis [17]
Abbildung 2: Querschnitt durch den Thallus der Alge Dasycladus vermicularis [16]
10
Allgemeiner Teil
5.1.3 Cumarine
Cumarine stellen 1,2-Benzopyrone dar, also Lactone, die hydrolysiert werden können. Dabei entstehen Derivate der α-Hydroxy- Zimtsäure. Die verschiedenen Cumarine unterscheiden sich in der Ringsubstitution, wobei die Position 7 fast immer substituiert vorliegt (Grundstruktur siehe Abbildung 3). Aufgrund des aromatischen Systems weisen viele Cumarine eine fluoreszierende Eigenschaft auf, und können so auch mittels Dünnschichtchromatografie leicht identifiziert werden. Die Ausgangssubstanz, Cumarin, liegt als farblose, kristalline Substanz vor, mit einem Schmelzpunkt von 67°C. Die Substanz riecht aromatisch. In Pflanzen können Cumarine frei im ätherischen Öl oder glycosiliert vorkommen. Cumarin hältige Pflanzen erkennt man oft an einem typischen Geruch, z.B. der Heugeruch von getrocknetem Gras weist auf flüchtige Cumarine hin. Cumarine kommen in ca. 70 verschiedenen Pflanzenfamilien vor. Die wichtigsten Vertreter sind die Tonkabohne (Dipteryx odorata, Fabaceae), der Steinklee (Melilotus officinalis, Fabaceae) und Cassia Zimt (Cinnamomum cassia, Lauraceae). Meist sind sie in den Wurzeln, den Samen und der Blüte zu finden. Erstmals wurden die Cumarine im Jahre 1820 von dem Franzosen Jean-Baptiste-Gaston Guibourt aus dem Samen der Tonkabohne isoliert. Heutzutage finden Cumarine Anwendung in der Kosmetikindustrie als Duftmittel, sowie in der Medizin als Antikoagulantien, sie wirken außerdem analgetisch, antifungal, antioxidativ, immunstimulierend und ödemhemmend. Da Cumarinen hepatotoxische Eigenschaften zugeschrieben wurden, werden sie nicht mehr in reiner Form als Nahrungszusatzstoffe verwendet. Ebenfalls eine Cumarinteilstruktur besitzen die kanzerogenen Aflatoxine [18–20].
Abbildung 3: Grundstruktur eines Cumarins
5.1.4 Einteilung der Cumarine
Die in Pflanzen vorkommenden Cumarine leiten sich alle von einer Grundstruktur ab, es wurden bisher ca. 3000 Derivate in vielen verschiedenen Pflanzen nachgewiesen [21]. Diese können in einfache Cumarine, Furanocumarine, Pyranocumarine und Phenylcumarine unterteilt werden, wobei die meisten Phenylcumarine aus dem Isoflavonmetabolismus stammen und sich
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Allgemeiner Teil deshalb in ihrer Biosynthese von den anderen Cumarinen unterscheiden. Bei Furanocumarinen und Pyranocumarinen können jeweils anguläre oder lineare Formen vorliegen [22].
Abbildung 4: Strukturen einiger natürlich vorkommender Cumarine. Abbildung entnommen aus [22]
5.1.5 Biosynthese der Cumarine
Die natürliche vorkommenden Cumarine werden über den Isoprenweg gebildet (siehe Abbildung 5). Hierbei wird Phenylalanin, das im Schikimisäure- Weg entsteht, durch die Phenylalanin- Ammoniak- Lyase in trans- Zimtsäure umgewandelt. Aus der trans- Zimtsäure entsteht wiederum der Hauptmetabolit 4‘-Cumaroyl-S-CoA. Diese Verbindung kann im Anschluss in viele verschiedene Phenylpropane umgewandelt werden. Hier sind Flavonoide, Isoflavonoide, Catechine und Stilbene als einige Beispiele zu nennen. Auch Cumarin wird aus 4‘-Cumaroyl-S-CoA gebildet, indem es zunächst in Position 6 hydroxyliert wird, dann erfolgt
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Allgemeiner Teil eine cis/trans Isomerisierung der exocyclischen Doppeldbindung, sowie die anschließende, aus der Lactonbildung resultierende, Cyclisierung [23, 24].
Abbildung 5: Biosyntheseweg der Cumarine. Abbildung entnommen aus [23]
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Allgemeiner Teil
5.1.6 Cumarine in der Alge Dasycladus vermicularis
Die Grünalge Dasycladus vermicularis besteht aus einer einzigen riesigen Zelle. Wenn die Alge mechanisch verletzt wird könnte das somit, im Vergleich zu mehrzelligen Pflanzen, fatal enden. Sie benötigt daher einen Mechanismus, der schnell und sicher Verletzungen verschließen kann, denn somit hat die Alge höhere Chancen zu überleben. Sulfatierte Cumarine besitzen eine wichtige Rolle bei diesen Reparaturmechanismen. Die Cumarine liegen in der Alge zunächst in der sulfatierten Form, der Speicherform vor. Im Fall einer Verletzung, werden Sulfatasen aktiviert, die den aktiven Metaboliten freisetzen, der dann weiter oxidiert wird und als Protein- Crosslinker dient. Dieser Crosslinker ermöglicht, dass sich ein Co- Polymer zwischen den Proteinen ausbildet, welches die Wunde verschließt [8].
Die in der Alge vorliegenden Cumarine gehören zu den einfachen Hydroxycumarinen. Als Hauptmetabolit liegt in Dasycladus vermicularis 3,6,7-Trihydroxycumarin (THyC) vor. In intaktem Algenmaterial findet man aber nicht THyC, sondern die sulfatierte Speicherform 6,7- Dihydroxycumarin-3-sulfat (DHyCS). Sobald die Alge verletzt wird mittels Sulfatase der Sulfatrest abgespalten und anschließend über eine, durch die Peroxidase katalysierte Reaktion ein Radikal gebildet, aus dem dann die Quervernetzten Produkte entstehen, die, wie bereits erwähnt, für den Wundverschluss verantwortlich sind [6, 15].
Abbildung 6: Desulfatierung von DHyCS und anschließende Oxidierung [15]
Durch seine antimikrobielle Eigenschaft spielt THyC des Weiteren noch eine wichtige Rolle zur Bekämpfung von zahlreichen Bakterien und Pilzen. Es besitzt außerdem antioxidative Wirkungen, die denen der Ascorbinsäure sehr ähnlich sind [25]. Und nicht zuletzt ist zu nennen, dass UV-A-Licht bei einem Maximum bei ƛ = 345nm sehr stark adsorbiert wird. Aufgrund dessen wird eine photoprotektive Wirkung von THyC diskutiert.
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Allgemeiner Teil
5.2 Phenolische Carbonsäuren
Phenolische Carbonsäuren kommen in Pflanzen und Pilzen als Sekundärmetabolite vor, deren Aufgabe darin besteht vor Bakterienbefall, Insekten und UV- Licht zu schützen.
Strukturell zeichnen sich die Phenolcarbonsäuren dadurch aus, dass sie an einem aromatischen System zusätzlich zu einer oder mehreren OH- Gruppen auch eine Carboxylgruppe aufweisen. Dieses aromatische System mindert die Fluoreszenz von DC- Platten, und dadurch können sie auch relativ leicht detektiert werden [20].
5.2.1 Biosynthese
Phenolische Carbonsäuren stammen ebenso wie Cumarine von Derivaten der Zimtsäure ab, die ihrerseits aus den Aminosäuren Phenylalanin und Thyrosin durch Desaminierung gebildet wird. Die Aminosäuren selbst stammen aus dem Schikimat-Weg. Zunächst wird per β-Oxidation die Seitenkette abgespalten, die entstandene Säure ist somit um 2 C-Atome kürzer, als die Ausgangsverbindung, es entsteht jedoch eine Phenolcarbonsäure, welche das gleiche Substitiutionsmuster wie ihre Ausgangsverbindung besitzt. Beispielsweise wird so aus p- Cumarsäure die p-Hydroxybenzoesäure oder aus Kaffesäure die Protocatechusäure [26].
Die wichtigsten Vertreter der natürlich vorkommenden Phenolcarbonsäuren zählen zu den Hydroxyzimtsäuren und den Hydroxybenzoesäuren [27].
In Pflanzen liegen Phenolcarbonsäuren häufig als Glycoside oder als Esterverbindungen mit Säuren vor. Auch mit Phenolcarbonsäuren acylierte Flavonoide oder Ester mit Alkoholen sind möglich [20].
5.2.2 Sulfatierte Phenolcarbonsäuren
Ebenso wie die Cumarine können in Dasycladus vermicularis auch die phenolischen Carbonsäuren als Sulfate vorliegen. Es wird vermutet, dass sie als Speicherform in der Pflanze vorliegen und ebenfalls durch Sulfatasen gespalten werden. Beispielsweise können die in Dasycladus vermicularis vorkommenden 4-Hydroxybenzoesäure und 4- Hydroxyphenylessigsäure durch bakterielle Sulfatasen in die korrespondierenden Phenole umgewandelt werden. Letzteren wird daher eine stärkere antimikrobielle Wirkung zugeschrieben, als die der jeweiligen Sulfate. Es wird angenommen, dass diese Sekundärmetabolite einen Schutzmechanisums vor mikrobiellen Befall darstellen. 4-
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Allgemeiner Teil
Hydroxybenzoesäure werden zudem eine antioxidative Wirkung gegen eine Reihe von Bakterien und Pilzen, sowie antiöstrogene und antimutagene Eigenschaften zugeschrieben [8, 28].
Abbildung 7: Sulfatase Reaktion von sulfatierten phenolischen Säuren [8]
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Allgemeiner Teil
5.3 Chromatografie
Unter Chromatografie versteht man grundsätzlich ein Verfahren, bei dem Substanzen durch eine Verteilung zwischen zwei verschiedenen Phasen aufgetrennt werden. Es gibt immer eine mobile Phase, die in eine definierte Richtung bewegt wird und eine stationäre Phase, die sich meist in einer Säule befindet aber auch auf eine Platte aufgetragen sein kann (Dünnschichtchromatografie). Die Phasen können entweder fest/flüssig (HPLC, DC), flüssig/flüssig (Ausschütteln, FCPC), oder fest/gasförmig (GC) sein. Die Trennung basiert auf der Verteilung der Substanzen zwischen stationärer und mobiler Phase. Aufgrund der verschiedenen Eigenschaften der Verbindungen, werden diese von der stationären Phase mehr oder weniger stark zurückgehalten und wandern somit in unterschiedlicher Geschwindigkeit durch das Trennmaterial. Das bedeutet, je später eine Substanz aus der Säule eluiert wird, desto stärker sind die Wechselwirkungen mit der stationären Phase. Die Qualität der Trennung hängt von verschiedenen Faktoren wie Temperatur, stationärer und mobiler Phase, Flussrate und Art des Analyten ab. Der Fluss der mobilen Phase kann durch unterschiedliche Prinzipien herbeigeführt werden. So wirken bei der Dünnschichtchromatographie Kapillarkräfte und bei der Säulenchromatographie die Schwerkraft, oder es wird durch eine Pumpe Druck erzeugt. Nach dem Auftragen bzw. der Injektion wird die Probe durch den Fluss der mobilen Phase weitertransportiert und nach Verlassen der Säule von einem nachgeschalteten Detektor aufgezeichnet. Bei der Dünnschichtchromatographie erfolgt die Detektion nach einer bestimmten Laufstrecke über VIS/UV Adsorption, ebenso können die Platten noch mit Sprühreagenzien besprüht werden, um bestimmte Inhaltstoffe sichtbar zu machen [29, 30].
Bei der Säulenchromatographie wird meist ein DAD oder UV Detektor zur Aufzeichnung der Substanzen nachgeschaltet. Ebenso kann ein Fraktionensammler verwendet werden, der nach einer vorher festgelegten Zeit die Fraktionen in Reagenzgläser sammelt.
Die chromatografischen Techniken können nach dem vorherrschenden Trennprinzip unterteilt werden. So gibt es die Adsorptionschromatografie, bei der die Komponenten unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen. Ein Beispiel wäre die Dünnschichtchromatografie unter der Verwendung von Silikagel als stationäre Phase. Des Weiteren gibt es die Verteilungschromatografie, bei der beide Phasen in der Regel flüssig und nicht miteinander mischbar sind. Aufgrund der unterschiedlichen Löslichkeiten verteilen sich die Komponenten in den jeweiligen Phasen. Weitere Varianten wären die Ionen- Austauschchromatografie, bei der ionische Wechselwirkungen zwischen den Analyten- und
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Allgemeiner Teil stationären Phase auftreten, sowie die Größenausschlusschromatografie, wobei hier die verschiedenen Komponenten aufgrund ihrer Größe getrennt werden [29, 30].
5.3.1 Klassische Säulenchromatografie
Bei der Säulenchromatografie wird das Trennmaterial in eine Säule gepackt. Die Probe wird zunächst flüssig oder als Verreibung auf die Säule aufgetragen und dann mit etwas Laufmittel eingespült. Sobald sich die Probe komplett auf der Säule befindet, wird das Laufmittel kontinuierlich hinzugefügt. An das Ende der Säule wird meist ein Fraktionensammler geschalten, der das Eluat innerhalb zuvor bestimmter Intervalle aufsammelt. Die stationäre Phase kann entweder aus Normalphasen- oder Umkehrphasenmaterial bestehen. Bei der Normalphase ist das Säulenmaterial polar, meist wird Kieselgel verwendet, und das Lösungsmittel zu Beginn der Trennung apolar. Somit eluieren zunächst apolare Substanzen, durch eine Steigerung der Polarität der mobilen Phase dann auch polare. Bei der Umkehrphasenchromatographie, auch RP (engl. Reversed Phase) ist das umgekehrt, denn dort wird als stationäre Phase modifiziertes Kieselgel verwendet [31].
Bei RP-Materialien werden an die Hydroxy- Gruppen des Kieselgels kovalent Alkylketten gebunden, damit aus der ursprünglich polaren, stationären Phase, eine apolare wird. An dieser werden dann polare Stoffe, die sich besser in dem polaren Laufmittel lösen, weniger stark gebunden und somit schneller eluiert. Beispielsweise werden hier als Laufmittel Wasser, Methanol oder Acetonitril verwendet [31].
Bei den, im Rahmen dieser Diplomarbeit verwendeten Sephadex- Säulen werden die Komponenten jedoch nach ihrer Größe aufgetrennt. Das zugrunde liegende Trennprinzip ist somit die Größenausschlusschromatografie [29–31].
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Allgemeiner Teil
5.3.2 Gelpermeationschromatografie
Bei dieser Variante der Größenausschlusschromatografie werden die unterschiedlich großen Moleküle zwischen einer mobilen, flüssigen Phase und einer festen Gelphase verteilt. Kleinere Moleküle können sich länger in dem porösen Gel aufhalten als große und werden deshalb zu einem späteren Zeitpunkt eluiert.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde Sephadexmaterial verwendet, dabei handelt es sich um hochpolymere Dextrane, die im alkalischen mit Epichlorhydrin umgesetzt wurden. Dadurch erhält man Polymerketten, die durch Glycinether- Bindungen verknüpft sind. Bei dem verwendeten LH 20 Material wurden zusätzlich Hydroxypropylreste eingeführt, somit erhält das Material sowohl einen hydrophilen, als auch lipophilen Charakter. Deshalb kann es in Wasser und einigen organischen Lösungsmitteln quellen und anschließend verwendet werden. Je nach eingesetztem Quellmittel variiert sowohl die Partikel- als auch die Porengröße [32].
Die Porengröße der Sephadex- Materialien hängt von dem Vernetzungsgrad der Polymere ab. Dadurch können die Gele für Trennungen von Molekülen mit verschiedenen Molekulargewichten eingesetzt werden [33, 34].
Der Vorteil des Sephadex Materials besteht in seiner chemischen Stabilität sowie der Wiederverwertbarkeit.
Abbildung 8: Partialstruktur des Sephadex Materials [35]
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Allgemeiner Teil
5.3.3 HPLC
Als HPLC (Hochdruck Flüssig Chromatografie) wird ein Analyseverfahren bezeichnet, bei dem mit hohem Druck die mobile Phase samt Probe durch eine Säule, welche die stationäre Phase enthält, gepresst wird. Dabei trennen sich die verschiedenen Komponenten der Probe nach der Polarität auf. Anhand des erhaltenen Chromatogrammes kann man sowohl qualitative (über die Retentionszeit) als auch quantitative Aussagen (über die Peakfläche) treffen [30, 36]. Im Folgenden ist der schematische Aufbau einer HPLC Anlage dargestellt.
Abbildung 9: Typischer Aufbau einer HPLC-Anlage. Abbildung entnommen aus [30]
Eluentenvorrat und Entgaser
Hier werden die Laufmittel, die für die Trennung benötigt werden aufbewahrt. Es sollten möglichst reine Lösungsmittel verwendet werden. Um zu vermeiden, dass es zur Luftblasenbildung im System kommt, sollten die Lösungsmittel vor der Verwendung entgast werden. Dies geschieht in den meisten HPLC Anlagen durch einen Entgaser. Prinzipiell handelt es sich dabei um einen Teflonschlauch, aus dem durch Anlegen eines Unterdrucks die Luft in der mobilen Phase entfernt wird [36].
Pumpe
Die HPLC Pumpe erzeugt den gewünschten Lösungsmittelfluss, der in der Regel zwischen 0,1 und 10 ml/min liegt. Dabei entstehen Drücke von 400 bar, bei uHPLC Systemen kann der Druck jedoch bis über 1000 bar steigen[18]. Für optimale Messergebnisse muss die Pumpe einen pulsationsfreien Fluss erzeugen, dafür werden spezielle Pumpsysteme verwendet. Zum einen gibt es sogenannte Verdrängerpumpen, die ähnlich wie eine Injektionsspritze funktionieren. 20
Allgemeiner Teil
Der Eluent wird aus einem Reservoir durch einen Kolben langsam durch die Trennsäule gefördert. Mittlerweile hat dieser Pumpentyp aber an Bedeutung verloren. Häufiger verwendet werden Kolbenpumpen. Die Pumpleistung entsteht hier durch eine Auf- und Abwärtsbewegung eines Kolbens, wobei in der Abwärtsbewegung der Eluent in das System befördert wird und in der Aufwärtsbewegung die Eluentenkammer durch den Unterdruck wieder befüllt wird. Die Pulsierung, die hier zwangsweise entsteht, wird durch verschiedene Systeme kompensiert. Zum einen können unsymmetrische Getriebescheiben eingesetzt werden, die die Saugphase im Verhältnis zur Förderphase auf einen sehr kurzen Zeitraum reduzieren, oder es können verschiedene Pulsationsdämpfer eingesetzt werden.
Das optimale System für die Erzeugung eines pulsationsfreien Flusses sind jedoch Doppelkolbenpumpen. Durch phasenversetzt geschaltete Pumpköpfe mit asymmetrischen Getriebescheiben wird hier die Schwankung des Drucks auf ein Minimum reduziert [20 30].
Eluentenmischer
Die meisten HPLC-Anlagen besitzen einen Mischer, in dem die verschiedenen Lösungsmittel zusammengeführt werden und je nach Gradientenbedinung gemischt werden können. Eine isokratische Zusammensetzung der mobilen Phase führt nicht immer zur gewünschten Qualität der Trennung, deshalb wird meistens die Zusammensetzung über die Zeit der Messung verändert. Das nennt man Gradientenelution, wobei der Gradient entweder über ein Niedrigdrucksystem oder über ein Hochdrucksystem erzeugt werden kann. Bei der Verwendung eines Niedrigdrucksystems werden die Eluenten in einer Mischkammer zunächst aus den verschiedenen Vorratsgefäßen gemischt, und dann über die HPLC-Pumpe auf die Säule gefördert. Ein Hochdrucksystem besteht aus mehreren HPLC-Pumpen, und der Gradient wird direkt vor der Säule aufgebaut. Hier ist keine extra Mischkammer nötig [16, 18, 20].
Injektionsventil
Die Injektion der Probe verläuft meist automatisch durch ein Sechs-Wege-Injektionsventil, welches sich im Autosampler befindet. In der Load-Stellung wird der Eluent von der Pumpe direkt zur Säule transportiert. Die Probe wird in eine Dosierschleife, die ein bestimmtes Volumen besitzt, eingespritzt. Nun dreht sich das Ventil auf „inject“ und die mobile Phase spült die Probe auf die Säule [30, 33].
21
Allgemeiner Teil
Säule
Eine HPLC-Säule ist in der Regel ein Stahlrohr, welches im Inneren mit der stationären Phase gefüllt ist. Die Säulen sind meist 5-25 cm lang und können einen Innendurchmesser von 1-10 mm aufweisen. Das Trennmaterial im Inneren der Säule besteht aus Partikeln, die meist 3- 10 µm im Durchmesser aufweisen. Die Packung muss gleichmäßig und durchgehend sein und das gängigste Material, ist modifiziertes Kieselgel. Dieses wird so verändert, dass das Kieselgel seinen ursprünglich hydrophilen Charakter verliert. Beispielsweise werden die endständigen OH-Gruppen mit Octadecyl-Ketten (C-18) derivatisiert und somit wird aus der Normalphase eine Umkehrphase. Um eine längere Haltbarkeit der Säulen zu erreichen, kommen Vorsäulen zum Einsatz. Diese enthalten das gleiche Trennmaterial wie die eigentliche Säule, und durch diesen „Filter“ werden unlösliche Partikel zurückgehalten, sodass die Säule nicht oder weniger verschmutzt wird. Die Vorsäulen sind kostengünstiger als die eigentlichen Trennsäulen und müssen in regelmäßigen Abständen ausgetauscht werden.
Ebenfalls weißt jede Säule eine bestimmte Fließrichtung auf, welche auch eingehalten werden sollte. Außerdem wird die stationäre Phase geschont, wenn man die vom Hersteller definierten pH-, Druck- und Temperaturmaxima einhält [29–31].
Detektoren
Um die Substanzen, die über die Säule getrennt wurden, überhaupt sichtbar zu machen, benötigt man einen Detektor. Es gibt verschiedene Detektoren, die sich im Detektionsprinzip und somit auch in der Art der detektierbaren Substanzen unterscheiden. Je nach Probe und Ziel der Untersuchung wird somit der Detektor ausgewählt. Meistens werden aber relativ universelle Detektoren verwendet, die viele verschiedene Substanzklassen detektieren können, wie beispielsweise der UV/VIS- Detektor oder der Brechungsindexdetektor. Ein speziellerer Detektor wäre der Fluoreszenzdetektor, der nur Substanzen, die Fluoreszenz aufweisen detektieren kann. Sein Anwendungsspektrum kann man erweitern, in dem man nicht fluoreszierende Substanzen mit einer fluoreszierenden Gruppe derivatisiert. Des Weiteren können an HPLC- Anlagen natürlich auch mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden [9].
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Allgemeiner Teil
UV/VIS Detektor
Die Detektion mittels UV-VIS Detektor beruht auf der Anregung von Elektronen im sichtbaren bzw. UV Bereich. Durch die Minderung der Intensität eines Lichtstrahles bei einer bestimmten Wellenlänge kann auf das Vorhandensein und auch auf die Konzentration eines bestimmten Stoffes geschlossen werden. Die Detektion beruht somit auf dem Labert-Beehr’schen Gesetz.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde vor allem mit einem DAD-Detektor (Diode-Array- Detektor) gearbeitet. Das polichromatische Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 – 800 nm wird durch die Detektorzelle geleitet und trifft im Anschluss auf den sogenannten Gitterpolichromator. Dort befinden sich 512 oder 1024 aneinander gereihte Photodioden, die das Licht auffangen und die empfangenen Signale in elektrische Informationen umwandeln. Diese können dann von einem Computer ausgewertet und als bei einer beliebigen Wellenlänge Chromatogramm dargestellt werden. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass auch unterschiedlich absorbierende Substanzen gleichzeitig gemessen bzw. UV-VIS Spektren aufgenommen werden können [9, 29, 30].
Massenspektrometrischer Detektor
Ein weiterer Detektor, der im Zuge dieser Arbeit verwendet wurde, war ein Massenspektrometer. Die Grundlage für diese Technik ist die Ionisierung der Substanzen, die Auftrennung der Ionen aufgrund des Masse/Ladungs-Verhältnisses (m/z) durch Anlegen eines elektromagnetischen Feldes und die anschließende Detektion. Die Ionisierung erfolgte bei dem verwendeten Gerät durch Elektrosprayionisation (ESI). Hier werden mobile Phase und Substanz durch eine Kapillare in einen Hohlraum gesprüht, an den einen hohe Spannung angelegt ist. Die Tröpfchen verdampfen, geladene Moleküle entstehen, und gelangen dann in das Innere des Massenspektrometers [29].
ELSD Detektor
Für die Detektion mancher Substanzen wurde ebenfalls ein ELSD Detektor, oder Lichtstreudetektor, herangezogen. Dieses Detektionsprinzip wird verwendet um nichtflüchtige Substanzen, die keine UV-VIS Absorption zeigen, nachzuweisen. Mit einem Inertgas wird die aus der Trennsäule austretende Lösung zu einem Aerosol zerstäubt. Das Lösungsmittel verdampft und zurück bleibt die zu bestimmende Substanz in Form eines Partikels. Die Partikel driften anschließend durch einen Laserstrahl in der Lichtstreuzelle, und mittels einer Silicium
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Allgemeiner Teil
Photodiode wird das gestreute Licht erfasst. Diese Methode ist fast universell einsetzbar aber relativ unspezifisch und es kann nicht auf die Art der Substanz rückgeschlossen werden [29].
Fluoreszenzdetektor
Diese Detektoren eignen sich für Substanzen, die zur Fluoreszenz angeregt werden können. Das Detektionsprinzip ist sehr selektiv, da nur wenige Substanzen diese Eigenschaft besitzen. Es können aber auch Substanzen ohne diese Eigenschaft, beispielsweise Aminosäuren, gemessen werden, indem sie mit einem Fluoreszenzidikator markiert werden. Das benötigte Licht wird meist durch eine Hochdruck-Gasentladungslampe erzeugt, als Empfänger dient ein Photomultiplier [26, 29].
5.3.4 Flash-Chromatografie
Bei der Flash-Chromatografie handelt es sich um eine chromatografische Technik, bei der die mobile Phase mit einer relativ hohen Flussrate, jedoch mit geringem Druck durch die stationäre Phase gepumpt wird. Die stationäre Phase besteht meist aus Kieselgel oder C-18 Material, die Partikelgröße ist mit 20 µm bis 40 µm jedoch größer als beispielsweise in der HPLC. Das Material befindet sich in Kunststoff- oder Metallkartuschen, die an das Gerät angeschlossen werden können. Die Proben können entweder als Lösung in wenigen Millilitern eines geeigneten Lösungsmittels aufgetragen werden, oder, ist dies nicht möglich, als Verreibung. Letztere wird aus gleichen Teilen Säulen- und Probenmaterial hergestellt. Diese Verreibung wird dann in ein spezielles Bauteil eingebracht und die mobile Phase transportiert die Substanzen aus der Verreibung in die Säule.
Für die Untersuchungen zu dieser Arbeit wurde das Flash System Reveleris X2 verwendet. Die zu trennenden Substanzen werden abhängig vom verwendeten Säulenmaterial aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen wie van der Waals Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen oder Komplexbildung unterschiedlich stark zurückgehalten. Aufgrund des hohen Flusses erfolgt die Trennung relativ rasch, die Qualität der Trennung ist somit meist etwas eingeschränkt. Deshalb eignet sich die Flash Chromatografie besonders zur Auftrennung eines Rohextraktes. Für die Detektion ist am Gerät ein ELSD und ein UV Detektor integriert, sowie ein Fraktionensammler [31, 33].
24
Allgemeiner Teil
5.3.5 Präparative HPLC
Neben der analytischen HPLC wurde auch ein präparatives System verwendet. Hierbei können durch die Verwendung größer, Säulen als in der analytischen HPLC auch größere Mengen eines Substanzgemisches aufgetrennt werden. Die anderen Grundlagen entsprechen denen der herkömmlichen HPLC. Die exakte Struktur der so erhaltenen Reinsubstanzen kann anschließend mittels Massenspektroskopie und NMR Analysen bestimmt werden.
5.4 NMR Spektroskopie
Die NMR Spektroskopie oder auch Kernresonanzspektroskopie ist eine Methode in der Analytik, um auf die exakte chemische Struktur einer Verbindung zu ermitteln. Man betrachtet dabei das Verhalten von Atomkernen im Magnetfeld. Die am häufigsten eingesetzten Varianten sind die 1H-NMR Spektroskopie und die 13C-NMR Spektroskopie. Die Methode beruht auf der Wechselwirkung des magnetischen Moments des Atomkerns mit einem hochfrequent magnetischen Wechselfeld. Somit kann die Umgebung einzelner Atome über die Wechselwirkungen mit Nachbaratomen bestimmt werden. Allerdings können nur solche Isotope bestimmt werden, die ein magnetisches Moment besitzen, wie 1H, 13C oder 15N. Informationen über die Lage und Anordnung der Wasserstoffatome erhält man, weil durch Bindungen mit anderen Atomen unterschiedlich viel Energie benötigt wird, um den jeweiligen Atomkern anzuregen [30].
25
Spezieller Teil
6 Spezieller Teil
6.1 Herstellung des Wasser-Methanol-Extrakts
Zunächst wurden 750 g der getrockneten Alge Dasycladus vermicularis mit einer Kaffeemühle zerkleinert und in drei Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von je 500 ml aufgeteilt. Das Pflanzenmaterial wurde nun mit einer Mischung von gleichen Teilen Methanol (ÖAB, destilliert) und Wasser (HPLC-Qualität) übergossen, sodass das Pflanzenmaterial ungefähr 1 cm mit Flüssigkeit überschichtet war. Danach wurden die Kolben für die Extraktion der Inhaltstoffe zunächst 15 Minuten in das Ultraschallbad, und anschließend über Nacht auf den Schüttler gestellt. Dann wurde die Flüssigkeit durch Watte filtriert, bei 1500 rpm für 3 Minuten zentrifugiert, abdekandiert und im Rotavapor eingeengt. Der Überstand wurde in ein kleines, tariertes Gläschen überführt, getrocknet und gewogen. Das Pflanzenmaterial, sowie der Filter- und Zentrifugenrückstand, wurden erneut mit dem Extraktionsgemisch übergossen. Die Extraktion wurde auf diese Weise insgesamt acht Mal wiederholt, um ein erschöpfendes Ergebnis zu gewährleisten. Schließlich wurden ungefähr 15 g Rohextrakt erhalten.
6.2 Dünnschichtchromatografische Vorversuche
Es wurde jeweils Lösungen des Wasser-Methanol-Extraktes auf DC-Platten (DC-Aluminium
Fertigplatten Kieselgel 60 F254) aufgetragen und in verschiedenen Laufmitteln analysiert. Die Platten wurden nach der Entwicklung unter einer UV- Lampe bei 254 nm und 366 nm betrachtet. Die beste Trennung (auch für den später beschriebenen Methanolextrakt) wurde in einem Laufmittelgemisch aus Ethylacetat, Methanol (ÖAB destilliert) und Essigsäure (Verhältnis 10 : 4 : 1) erhalten. Des Weiteren wurde festgestellt, dass einige Substanzen bei einer Wellenlänge von 366 nm eine blauviolette Fluoreszenz zeigen. Bei der Trennung der synthetisierten sulfatierten Cumarine wurde ein Gemisch aus Chloroform, Essigsäure, Methanol (ÖAB, destilliert) und Wasser (HPLC-Qualität) (Verhältnis 15 : 8 : 3 : 2) verwendet.
6.2.1 Trennung des Wasser-Methanol Rohextraktes mittels Flash- Chromatografie
Der trockene Extrakt wurde aufgrund der großen Menge in vier Teile aufgeteilt und mittels Flash-Chromatografie aufgetrennt. Dazu wurden zunächst ca 1,5 g des Extraktes in 3 ml Wasser 26
Spezieller Teil gelöst und in das Flash-Chromatografie-System injiziert. Für die Trennung wurde eine RP-18- Kieselgel Säule verwendet. Das Laufmittel setzte sich aus zwei Komponenten zusammen, deren Zusammensetzung sich im Laufe der Zeit änderte: Laufmittel A war Wasser (HPLC-Qualität) und Laufmittel B Methanol (ÖAB, destilliert). Detektiert wurde mit einem UV-Detektor bei einer Wellenlänge von 254 nm und 350 nm, sowie mittels ELSD-Detektor. Auf die gleiche Weise wurden nochmals ca. 1,0 g des Rohextraktes aufgetrennt.
Da die Trennung jedoch nicht zufriedenstellend war, wurde bei der dritten Wiederholung (ca. 0,6 g Rohextrakt) als Laufmittel A Wasser (HPLC Qualität) mit 1,5 % Essigsäure und 20 mmol Ammoniumacetat verwendet, um das Ergebnis zu verbessern.
Aufgrund der zähflüssigen Konsistenz und der relativ großen Menge des restlichen Extraktes wurde für die letzte Wiederholung des Auftrennungsschritts eine Verreibung aus gleichen Teilen Säulenmaterial und Extrakt (ca. 11,7 g) hergestellt und diese dann trocken aufgetragen. Hierbei wurde das Laufmittel zunächst durch die Verreibung gespült und das gelöste Extrakt gelang dann auf die Säule. Das Laufmittel A bestand hierbei ebenfalls aus Wasser (HPLC- Qualität) mit 1,5 % Essigsäure und 20 mmol Ammoniumacetat, Laufmittel B war reines Methanol.
Insgesamt wurden aus den vier Wiederholungen 103 Fraktionen erhalten, die mithilfe der Dünnschichtchromatografie (Laufmittel: DCM : MeOH : Essigsäure 10 : 4 : 1) und den Daten des UV/DAD Detektors zu 51 Sammelfraktionen vereinigt wurden (Abbildung 11). Die Sammelfraktionen wurden im Anschluss getrocknet und deren Ausbeute bestimmt.
Abbildung 10: Auftrennung des Wasser- Methanol Rohextraktes
27
Spezieller Teil
Abbildung 11: Exemplarische Darstellung der Auftrennung des Wasser-Methanol- Extraktes mittels Reveleris System, erste Wiederholung
28
Spezieller Teil
6.2.2 HPLC Analysen der Fraktionen
Anschließend wurden alle potentiell interessanten Fraktionen mittels HPLC untersucht. Es wurden dazu jeweils 5 mg des Extraktes in 1 ml Wasser (HPLC-Qualität) gelöst. Als mobile Phase wurden Wasser (HPLC-Qualität) und Methanol (ÖAB, destilliert) verwendet, wobei beiden Laufmitteln für eine bessere Trennung 1,5 % Essigsäure und 20 mmol Ammoniumacetat beigefügt wurden. Die genauen Analysebedingungen (Laufmittelzusammensetzung, Säulenmaterial, etc.) sind im Abschnitt 8.2.6 beschrieben. Aufgrund dieser Analyse wurden die Fraktionen ermittelt, mit denen als nächstes weitergearbeitet werden sollte.
6.2.3 DasyA-W1
Die weitere Vorgehensweise zur Isolierung von Substanzen aus den Fraktionen der ersten Auftrennung des Methanol- Wasser Extraktes.
Abbildung 12 Übersicht über die Auftrennung der Fraktionen von DasyA-W1 29
Spezieller Teil
6.2.3.1 Fraktionen DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9
Aufgrund der, aus den vorangegangenen HPLC-Analysen resultierenden ähnlichen Chromatogramme wurden die Fraktionen DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9 auf die gleiche Weise aufgetrennt, und zwar mittels Gelpermeationschromatografie. Es wurde eine Säule mit mit den Maßen 56 x 10 mm verwendet und mit Sephadex LH 20 Material befüllt, sowie eine Pumpe (Merk Hitachi LaChrom Pump L-7100) die einen Fluss von 0,4 ml/min erzeugte. An die Säule angeschlossen wurde außerdem ein UV-Detektor und ein Fraktionensammler. Als Laufmittel wurde ein Gemisch aus Wasser (HPLC-Qualität) und Methanol (ÖAB, destilliert) im Verhältnis 3 : 1 verwendet. Die beiden Fraktionen wurden jeweils in 1 ml Laufmittelgemisch gelöst und anschließend mit einer Pasteurpipette auf verschiedene Säulen aufgetragen. Sobald die Substanz komplett in das Sephadex Material eingedrungen war, wurde die Pumpe, sowie der Fraktionensammler angeschlossen. So wurden 60 Fraktionen erhalten, getrocknet und anschließend je 1 mg davon in 1 ml Wasser aufgelöst und mittels HPLC analysiert. Dadurch konnten aus beiden Trennvorgängen insgesamt 11 Sammelfraktionen gebildet werden. Wovon zwei reine Substanzen enthielten: DasyA-W1- Rev8/9-Seph7 mit einer Ausbeute von 2,5 mg und DasyA-W1-Rev8/9-Seph10 mit einer Ausbeute von 3,5 mg. Für die Klärung der Identität müssen noch LC/MS und NMR Analysen durchgeführt werden. Es kann aber vermutet werden, dass es sich um die gleiche Substanz handelt, da die Retentionszeit im Chromatogramm übereinstimmt. Die genaue Ausbeute der einzelnen Fraktionen ist in Kapitel 8.2.5.1 dargestellt.
UV 350 nm
Abbildung 13: Chromatogramm der Fraktion DasyA-W1-Rev8/9-Seph7, HPLC Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
30
Spezieller Teil
300 DAD-341 nm UVDasyA-W9-S31.dat 341 nm DasyA-W-S10
200
mAU
100
0 0 10 20 30 40 Minutes
Abbildung 14: Chromatogram der Fraktion DasyA-W1-Rev-8/9-Seph-10, HPLC Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
6.2.3.2 Fraktionen DasyA-W1-Rev10 und DasyA-W1-Rev11
Diese beiden Fraktionen wurden aufgrund ähnlicher HPLC-Chromatogramme vereint und wiederum eine Trennung mittels Gelpermeationschromatografie durchgeführt. Die Vorgehensweise war gleich wie zuvor beschrieben, außer dass eine Säule mit den Maßen 100 x 20 cm verwendet wurde. Das Laufmittel war ein Gemisch aus Wasser (HPLC-Qualität) und Methanol (ÖAB, destilliert) im Verhältnis 3:1. Detektiert wurde mittels ein UV Detektor, und die Fraktionen wurden mit einem Fraktionensammler aufgefangen. Die 63 erhaltenen Fraktionen wurden mittels Dünnschichtchromatografie (Laufmittel: DCM : MeOH : Essigsäure 10:4:1) in 12 Sammelfraktionen vereinigt, aus dieser Fraktion konnten jedoch keine Reinsubstanzen isoliert werden, da die vorliegenden Ausbeuten für weitere Aufreinigungsschritte zu klein waren. Die Fraktionierung ist in Kapitel 8.2.5.2 genauer beschrieben.
6.2.3.3 Fraktionen DasyA-W1-Rev12, DasyA-W1-Rev13 und DasyA-W1- Rev14
Aufgrund eines ähnlichen Inhaltstoffmusters wurden diese drei Fraktionen vereinigt und in 2 ml Wasser-Methanol Gemisch im Verhältnis 3:1 gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Sephadex- Säule einer Größe von 110 x 20 mm aufgetragen, welche mit einer Pumpe der Firma Merk– Hitachi (PumpL-7100 LaChrome) verbunden war; die Flussrate war auf 0.4 ml/min eingestellt.
31
Spezieller Teil
Als Laufmittel wurde erneut ein Gemisch aus Wasser (HPLC–Qualität) und Methanol (ÖAB, destilliert) im Verhältnis von 1:3 verwendet. Mittels Fraktionensammler wurden 85 Fraktionen gesammelt, die mithilfe der Dünnschichtchromatografie zu 11 Sammelfraktionen vereinigt wurden. Anhand einer HPLC-Analyse wurden in zweien davon Reinsubstanzen identifiziert: DasyA-W1-Rev12/13/14-Seph9 mit einer Ausbeute von 1,3mg, und DasyA-W1-Rev12/13/14- Seph10 mit einer Ausbeute von 2,0mg. Die genaue Fraktionierung ist in Kapitel 8.2.5.3 beschrieben.
Um die Identität der isolierten Substanzen näher zu bestimmen, wurden anschließend LC-MS- Analysen durchgeführt. Hierfür wurde 1 mg der jeweiligen trockenen Substanzen in 1 ml Wasser (HPLC-Qualität) gelöst. Im negativen ESI- Modus zeigte sich für die Fraktion DasyA- W1-Rev12/13/14-Seph9 ein einzelnes Signal mit dem m/z Wert von 297, welches einem Molekulargewicht von 298 g/Mol entspricht (siehe Abbildung 15). Ebenfalls, mit geringerer Signalstärke, wurde ein m/z Wert von 217 gefunden, welcher einem Fragment nach Abspaltung einer SO3 Gruppe entspricht. Aufgrund dieser Information kann darauf geschlossen werden, dass es sich bei dieser Verbindung um 4-Sulfoxybenzoesäure handeln könnte (siehe Abbildung 16).
Bei der LC-MS-Untersuchung der Fraktion DasyA-W1-Rev12/13/14-Seph10 zeigten sich Signale bei m/z Werten bei 273 sowie 193, welches wieder einem Fragment nach der Abspaltung einer Sulfatgruppe entsprechen könnte (siehe Abbildung 17). Ein Molekulargewicht von 274 g/Mol entspricht der aus der Alge bereits bekannten Verbindung 6,7-Trihydroxycumarin-3-sulfat (siehe Abbildung 18). Für die endgültigen Bestätigungen der Strukturformeln müssen im Anschluss jedoch noch NMR-Messungen durchgeführt werden.
32
Spezieller Teil
UV-Chromatogramm 260 nm
EIC 217
EIC 297
Abbildung 15: LC-MS Analyse der Fraktion DasyA-W1-Rev12/13/14-Seph9; analytische Bedingungen Methode siehe Kapitel 8.2.6
Abbildung 16: 4-Sulfoxybenzoesäure
33
Spezieller Teil
UV-Chromatogramm 350 nm
Abbildung 17: HPLC Analyse der Fraktion DasyA-W1-Rev12/13/14-Seph10, analytische Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
Abbildung 18: 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat
34
Spezieller Teil
6.2.4 DasyA-W2
Die weitere Auftrennung der aus DasyA-W2 erhaltenen Fraktionen wird im Folgenden schematisch dargestellt (siehe Abbildung 19).
Abbildung 19: Aufarbeitung der Fraktionen aus DasyA-W2
6.2.4.1 Fraktionen DasyA-W2-Rev6, DasyA-W2-Rev7 und DasyA-W2-Rev8
Diese drei Fraktionen wurden wiederum vereinigt und anschließend mittels Flash- Chromatografie weiter fraktioniert. Das Laufmittel A setzte sich dabei aus Wasser (HPLC- Qualität), mit 20 mmol Ammoniumformiat und 1,5% Ameisensäure zusammen, das Laufmittel B war Methanol (ÖAB destilliert). Als stationäre Phase wurde RP-18 Material verwendet. Detektiert wurde mithilfe eines UV-Detektors bei 245 nm, 280 nm und 350 nm, sowie ELSD- Detektor. Die Trennung verlief zunächst isokratisch bei 2 % Methanol und steigerte sich nach acht Minuten bis auf 100 % Methanol. Mittels eines, im Gerät integrierten, Fraktionensammlers wurden 15 Fraktionen gesammelt, die nach einer HPLC-Analyse zu 6 Sammelfraktionen vereinigt wurden. Die Fraktion DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev6 wurde zunächst als Reinsubstanz deklariert, nach einer genaueren Untersuchung mittels LC-MS wurden aber zwei Substanzen mit unterschiedlichen Massen gefunden (siehe Abbildung 20), für den ersten Peak wurde ein m/z Wert von 327 und für den zweiten ein m/z Wert von 451 ermittelt. Für eine weitere Analyse mittels NMR-Spektroskopie müssten die Fraktion somit weiter aufgereinigt werden, dafür reichte die vorhandene Menge der Fraktion jedoch nicht aus.
35
Spezieller Teil
UV-Chromatogramm 300 nm
EIC 327
Abbildung 20: LC-MS Analyse der Fraktion DasyA W2-Rev6/7/8-Rev6. HPLC Methode siehe Kapite8.2.6
36
Spezieller Teil
6.2.5 DasyA-W-4
Die weitere Auftrennung der, aus DasyA-W-4 erhaltenen Fraktionen ist im Folgenden schematisch dargestellt (siehe Abbildung 21).
Abbildung 21: Weitere Fraktionierung von Fraktionen aus DasyA-W4
37
Spezieller Teil
6.2.5.1 Fraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DaysA-W4- Rev32
Diese drei Fraktion wurden aufgrund einer ähnlichen Zusammensetzung vereinigt und ebenfalls mithilfe der Flash-Chromatografie aufgetrennt. Die Trennbedingungen waren so wie zuvor beschrieben und es kam erneut eine C-18 Kartusche (4 g) als Trennsäule zum Einsatz. Es wurden vier Fraktionen gesammelt, wobei DasyA-W4-25/31/45-Rev3 eine Reinsubstanz enthielt. In weiterer Folge wurde diese Fraktion noch massenspektroskopisch analysiert, wobei im MS-Spektrum Signale bei 545, 465 und 385 ersichtlich waren. Vermutlich handelt es sich bei dieser Substanz somit um ein dimeres 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat (siehe Abbildung 23). Diese Verbindung wurde bereits als Inhaltstoff von in Dasycladus vermicularis beschrieben. Um dies zu bestätigen sind jedoch NMR Experimente nötig, die beim Abschluss der Arbeit noch nicht vorlagen.
Abbildung 22: LC-MS Analyse der Fraktion DasyA-W4-Rev25/31/45-Rev3; HPLC Methode siehe Kapitel 8.2.6
38
Spezieller Teil
Abbildung 23: Dimeres 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat 6.2.5.2 Fraktion DasyA-W4-Rev45
Auch diese Fraktion wurde mithilfe der Flash-Chromatografie weiter aufgetrennt. Unter analogen Bedingungen wie vorher beschrieben wurden schlussendlich 18 Fraktionen gesammelt, die zu 7 Sammelfraktionen vereinigt wurden. Keine dieser Fraktionen stellte eine Reinsubstanz dar, bzw war die Fraktionsgröße nicht ausreichend für eine weitere Auftrennung.
39
Spezieller Teil
6.3 Herstellung des Methanolextraktes
Das verbliebene, bereits mit 50 % Methanol extrahierte Pflanzenmaterial wurde nun mit reinem Methanol (ÖAB, destilliert) erneut extrahiert. Das Pflanzenmaterial wurde wiederum mit 1 cm Flüssigkeit überschichtet und für 15 min ins Ultraschallbad gestellt. Der Extrakt wurde durch einen Rundfilter filtriert und anschließend mithilfe eines Rotavapors eingedampft.
Anschließend wurde der erhaltene Extrakt (1,3 g) in 3 ml Methanol (ÖAB, destilliert) gelöst und auf eine Sephadex-Säule (LH-20 Material) aufgetragen, an die ein Fraktionensammler angeschlossen war. Als mobile Phase diente Methanol und die Auftrennung wurde bei Atmosphärendruck durchgeführt. Es wurden 160 Fraktionen erhalten, die mittels Dünnschichtchromatografie (Laufmittelzusammensetztung: Ethylacetat : Methanol : Essigsäure 10 :4 :1) nach Analyse unter UV- Licht zu 14 Sammelfraktionen zusammengefasst wurden. Von den trockenen Fraktionen wurde jeweils 5 mg in 1 ml Methanol (HPLC Qualität) gelöst und mittels HPLC analysiert. Die weitere Auftrennung der Fraktionen ist in Abbildung 25 dargestellt, die genaue Fraktionierung wird in Kapitel 8.2.5.4 beschrieben.
80 DAD-267 nm dasy A MeOH
60
40
mAU 20
0
-20 0 10 20 30 40 Minutes Abbildung 24: HPLC Chromatogramm des Methanol Rohextraktes von Dasycladus vermicularis bei 267 nm, analytische Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
40
Spezieller Teil
Abbildung 25: Weitere Auftrennung des Methanolextraktes aus Dasycladus vermicularis
6.3.1 Fraktion DasyA-M1-Se5
Diese Fraktion wurde mittels präparativer HPLC (analytische Bedingungen siehe Kapitel 8.2.7.2) weiter aufgearbeitet, wobei zwei Reinsubstanzen DasyA-M1-Se5-P1 und DasyA-M1- Se5-P2 isoliert werden konnten. Von diesen Substanzen wurden zur weiteren Charakterisierung im Anschluss mittels LC-MS die molekularen Massen bestimmt und dann eine NMR Analyse durchgeführt. Bei der in Fraktion DasyA M1-Se5 P1 enthaltenen Substanz handelt es sich um das 7-Hydroxycumarin-3,6-disulfat. Diese Verbindung wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten als Inhaltstoff der Alge beschrieben. Für die Fraktion DasyA-M1-Se5-P2 waren zum Abschluss der Arbeit noch keine NMR Daten vorhanden.
Fraktion Name Ausbeute 1 DasyA-M1-Se5-P1 3 mg 2 DasyA-M1-Se5-P2 5,8 mg
Tabelle 1: Ausbeute der aus Fraktion DasyA-M1-Se5 mittels präp HPLC isolierter Substanzen
41
Spezieller Teil
Abbildung 26: LC-MS-Chromatogramm der Fraktion DasyA-M1-Se5-P1
Abbildung 27: 7-Hydroxycumarin-3,6-disulfat
42
Spezieller Teil
6.3.2 Fraktion DasyA-M1-Se7
Diese Fraktion wurde ebenfalls mittels präparativer HPLC (genaue analytische Bedingungen siehe Kapitel 8.2.7.3) aufgetrennt und 2 Reinsubstanzen, enthalten in den Fraktionen DasyA- M1-Se7-P1 und DasyA-M1-Se7-P2, konnten isoliert werden. Diese Substanzen wurden ebenfalls mit LC-MS analysiert. In der massenspektrometrischen Analyse konnte für DasyA- M1-Se7-P2 ein Signal mit dem m/z Wert von von 298 g/Mol, sowie 378 g/Mol ermittelt werden. Aufgrund der Informationen aus der Literatur und vorhergehenden Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass erneut ein Sulfat vorliegt. Welche Verbindungen genau vorliegen werden noch durch zuführende NMR Experimente zeigen, eine Übereinstimmung mit bereits aus Dasycladus vermicularis isolierten Verbindungen war jedoch anhand der Masse nicht gegeben.
Fraktion Name Ausbeute 1 DasyA-M1-Se7-P1 1 mg 2 DasyA-M1-Se7-P2 4,3 mg
Tabelle 2: Ausbeute der aus Fraktion DasyA-M1-Se7 isolierten Substanzen
Abbildung 28: LC-MS Analyse der Fraktion DasyA-M1-Se7-P2, Methode siehe Kapitel 8.2.6
43
Spezieller Teil
6.4 Zuordnung der isolierten Substanzen
Insgesamt konnten 9 verschiedene Reinsubstanzen isoliert werden, deren Struktur teilweise jedoch noch aufgeklärt werden muss. Im Methanol/Wasser-Rohextrakt konnten jedoch eindeutig das 7-Hydroxycumarin-3,6-disulfat, das Dimere 6,7-Dihydroxy-3-sulfat sowie 6,7- Dihydroxycumarin-3-sulfat zugeordnet werden. Außerdem wurde eine unbekannte Substanz mit einem Molekulargewicht von 298 g/mol isoliert, die im Chromatogramm (Abbildung 29) nicht zugeordnet werden konnte, da sie in zu geringer Konzentration im Rohextrakt vorliegt.
Abbildung 29: Zuordnung der Hauptverbindungen im Wasser/Methanol Rohextrakt mittels HPLC bei UV 360 nm analytische Bedingungen siehe
44
Spezieller Teil
Aus dem Methanolextrakt wurden drei weitere Substanzen isoliert. Zum einen die 4-OH- Benzoesäure sowie zwei Substanzen, deren Struktur noch nicht aufgeklärt ist. Aufgrund der ermitteltenMasse und der Fragmente kann man aber darauf schließen, dass hier ebenfalls sulfatierte Cumarine vorliegen. Im nachfolgenden Chromatogramm (
Abbildung 30) ist nur die 4-OH Benzoesäure und die Substanz mit einem Molekulargewicht von 298 g/Mol zugeordnet. Die dritte Substanz mit einem Molekulargewicht von 378 g/Mol ist im Rohextrakt nicht direkt zuzuordnen, da sie in zu geringer Konzentration vorliegt.
Unbekannte Substanz mit MR= 378, im 80 DAD-267 nm Chromatogramm nicht zuzuordnen dasy A MeOH
60 Unbekannte Substanz mit Mr= 298 g/Mol
40
mAU 20
0
-20 0 10 20 30 40 Minutes 4-OH-Benzoesäure
Abbildung 30: Auftrennung des methanolischen Extrakts von Dasycladus vermicularis mittels HPLC und Zuordnung von zwei isolierten Verbindungen; analytische Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6.
45
Spezieller Teil
6.5 Synthese der Cumarine
Im zweiten Teil der Diplomarbeit sollten noch die in Dasycladus vermicularis enthaltenen sulfatierten und nicht sulfatierten Cumarine bzw die sulfatierten Phenolcarbonsäuren synthetisch hergestellt werden. Diese Verbindungen werden in weiterführenden Untersuchungen zum einen zur quantitativen Analyse der Inhaltstoffe in der Alge verwendet werden, zum anderen weisen sie eine hohe Reinheit auf und können somit für biologische Aktivitätstests eingesetzt werden. Die Ausbeute der isolierten Cumarine war meist sehr gering, und für eine Testung ausreichende Mengen waren so nicht zu erhalten.
6.5.1 Synthese von 3,7-Dihydroxycumarin und 3,6-Dihydroxycumarin
Zwischenprodukt 1 Zwischenprodukt 2
Abbildung 31: Reaktionsverlauf der Synthese von 3,7 Dihydroxycumarin, 3,6- Dihydroxycumarin und 3,6,7- Trihydroxycumarin [37] Für die Synthese von 3,7-Dihydroxicumarin (bzw. 3,6-Dihydroxycumarin) wurden in einem 250 ml Rundkolben 9,97 g 2,4-Dimethoxybenzaldehyd (2,5-Dimethoxybenzaldehyd), 8,4 g Acetylglycin, 6,36 g Natriumacetat und 3,0 g Essigsäure eingewogen [37]. Das Gemisch wurde auf dem Ölbad unter Rückfluss acht Stunden erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Dann wurden 40 ml Eiswasser hinzugefügt. Das Präzipitat wurde anschließend durch eine Nutsche der Größe 2 gefiltert und mit einer Mischung von gleichen Teilen Wasser und Ethanol gewaschen, bis die Färbung der Waschlösung abnahm. Das rotbraun gefärbte Produkt trocknete über Nacht und wurde dann gewogen. Die Ausbeute des ersten Zwischenproduktes betrug 15,84g (18,89 g).
Im nächsten Reaktionsschritt wurde das erhaltene Zwischenprodukt 1 wiederum in einen 500 ml Rundkolben gegeben und 200 ml 3M HCl hinzugefügt. Das Gemisch wurde auf dem Ölbad für eine Stunde unter Rückfluss erhitzt. Es entstand ein dunkelrot-schwarzer, klebriger Feststoff. Die Flüssigkeit wurde mit einer Nutsche abgezogen und das Produkt mit Wasser so lange gewaschen, bis das Wasser klar war. Dieser Feststoff (Zwischenprodukt 2) wurde anschließend in ein tariertes Gefäß abgefüllt und getrocknet. Die Ausbeute betrug 5,00 g
46
Spezieller Teil
(3,34 g). Die Reinheit des Produktes wurde mittels HPLC überprüft, dafür wurde 1 mg der jeweiligen Substanz in 1 ml Methanol (HPLC Qualität) gelöst.
Abbildung 32: LC-MS Charakterisierung des Zwischenprodukts 2 der Synthese von 3,7- Dihydroxycumarin
Abbildung 33:LC-MS Charakterisierung der Synthese von 3,7-Dihydroxycumarin
6.5.2 Synthese von 3,6,7 Trihydroxycumarin
Diese Synthese dieser Verbindung wurde auf zwei verschiedene Arten durchgeführt.
Variante 1
Hier wurde die Synthese wie oben beschrieben durchgeführt. Eingesetzt wurden 11,7 g Trimethoxybenzaldehyd, 8,40 g Acetylglycin, 6,36 g Natriumacetat und 30,00 g Essigsäureanhydrid.
47
Spezieller Teil
Die Ausbeute des ersten, rot gefärbten Zwischenproduktes betrug 5,00 g, die Ausbeute des zweiten, schwarz gefärbten Zwischenproduktes 1,52 g. Diese Produkte mussten nicht weiter aufgereinigt werden.
Variante 2
Abbildung 34: Synthese des 3,6,7-Trihydroxcumarins nach Variante 2 [6] Diese Synthese wurde insgesamt drei Mal durchgeführt, zunächst mit 500 mg 2,4,5- Trihydroxybenzaldehyd und anschließend zwei Mal mit je 2,31 g 2,4,5- Trihydroxybenzaldehyd.
Zunächst wurden 2,31 g (500 mg bei kleinem Ansatz) 2,4,5-Trihydroxybenzaldehyd, 2,10 g (494 mg) Acetylglycin und 1,59 g (344 mg) Natriumacetat zusammen mit 7,5 g (1632 mg) Essigsäureanhydrid in einem 250 ml Rundkolben eingewogen [6]. Dieses Gemisch wurde auf dem Ölbad auf ca.140°C erhitzt und dann vier Stunden unter Rückfluss gerührt. Anschließend wurde es auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und mit einem Gemisch aus gleichen Teilen Wasser und Ethanol gewaschen, bis sich die Waschlösung nicht mehr gefärbt war. Anschließend wurde das Produkt getrocknet und gewogen (Ausbeuten siehe Tabelle 3).
Für die Hydrolyse wurde das Zwischenprodukt wieder in einen 250 ml Kolben überführt, mit 50 ml 2 N HCl und 2 ml Essigsäure versetzt und unter Rückfluss im Ölbad für eine Stunde bei ca. 120 °C erhitzt. Das entstandene Produkt wurde wiederum über einen Filter von der Flüssigkeit getrennt und mit Wasser (HPLC-Qualität) gewaschen. Das orange Produkt wurde dann in ein Gefäß überführt und getrocknet.
ZWISCHENPRODUKT PRODUKT (NACH AUFREINIGUNG) VERSUCH 1 (500MG) 130 mg 28 mg VERSUCH 2 (2,4G) 2327 mg 667 mg VERSUCH 3 (2,4G) 2630 mg 918mg
Tabelle 3: Ausbeuten der Synthese des Trihydroxycumarins 48
Spezieller Teil
Die Produkte der 3 Ansätze wurden mittels HPLC analysiert beim ersten und zweiten Versuch war das Produkt durch ein Nebenprodukt verunreinigt. Des Weiteren wurde festgestellt, dass in den Waschlösungen noch ein großer Anteil der gewünschten Substanz vorhanden war. Für die endgültige Aufreinigung des Produkts wurde deshalb noch ein weiterer Reinigungsschritt durchgeführt. Es handelte sich hierbei um eine mit Sephadex LH20 Material gefüllte Säule (100 x 20 mm bei der ersten, und 880 x 35 mm bei der zweiten Synthese). Als mobile Phase diente jeweils Methanol. Durch die Aufarbeitung mittels Sephadex konnte das Nebenprodukt entfernt, wie eine weitere Analyse mittels HPLC bestätigte, und somit die Reinheit des gewünschten Produktes erhöht werden. Die Waschlösungen wurden nach Beendigung der Versuche verworfen.
Fraktion Ausbeute Produkt1-F1 3,1mg Produkt1-F2 9,1mg Produkt1-F3 66,1mg Produkt1-F4 23,9mg Produkt1-F5 4,5mg Produkt1-F6 21,1mg
Tabelle 4: Aufreinigung des Syntheseproduktes mittels Gelchromatografie, Fraktionen die die Reinsubstanzen enthielten sind schwarz umrandet. Die Aufreinigung des Produktes der Variante 2 verlief analog. Worum es sich bei dem Nebenprodukt handelte konnte nicht ermittelt werden, da dieses nicht als Reinsubstanz gewonnen werden konnte. Schließlich konnten so 667,2 mg aus der Variante 2 des gewünschten Produkts 3,6,7-Trihydroxycumarin in reiner Form erhalten werden.
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Spezieller Teil
UV 350 nm
Abbildung 35: Syntheseprodukt Variante 2/Versuch 2 vor der Aufreinigung
UV- Chromatogram 350 nm F5
UV- Chromatogram 350 nm F2
UV- Chromatogram 350 nm F1
Abbildung 36: Syntheseprodukt Variante 2/Versuch 2nach der Aufreinigung des Produkts mittels Sephadex LH20 Säule Die dritte Wiederholung der Synthese des 3,6,7-Trihydroxycumarins Variante 2/Versuch 3 erforderte keine Aufreinigung des Produkts per Sephadex, da hier bereits eine reine Substanz in guter Ausbeute erhalten wurde. Wahrscheinlich war es Vorteilhaft, dass in diesem Fall das Produkt sehr langsam abgekühlt wurde, und nicht wie bei den Versuchen zuvor das Abkühlen mit kaltem Wasser beschleunigt wurde.
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Spezieller Teil
6.6 Sulfatierung
6.6.1 Sulfatierung des 3,6,7-Trihydroxycumarins
Dadurch, dass bei der Isolierung aus Dasycladus vermicularis nur sehr geringe Mengen an 6,7- Dihydroxycumarin-3-sulfat erhalten worden waren, wurde nun versucht dieses Monosulfat aus dem zuvor synthetisierten 3,6,7-Trihydroxycumarin herzustellen, da die Ausbeute dieser Synthese relativ groß war. Dieses synthetisch hergestellte Sulfat könnte dann beispielsweise für weitere biologische Tests verwendet werden.
Für die Sulfatierung wurden 500 mg des zuvor synthetisierten Trihydroxycumarins zusammen mit Pyridin Schwefelsäurekomplex (2194,2 mg) und THF (41,4 ml) in einen 250 ml Rundkolben gegeben und bei Raumtemperatur für 24 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt. Anschließend wurden feste und flüssige Bestandteile durch Filtration voneinander getrennt und der feste Bestandteil getrocknet. Die Ausbeute betrug dabei 2,62 g. Im nächsten Schritt wurde 1 mg dieses Produkts in 1 ml Methanol (HPLC-Qualität) gelöst und eine HPLC Analyse durchgeführt, in der, laut Literatur drei Peaks zu sehen sein sollten, welche die drei Monosulfate des Trihydroxycumarins darstellen, also das gewünschte 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat und als Nebenprodukte 3,7-Dihydroxycumarin-6-sulfat sowie 3,6-Dihydroxycumarin-7-sulfat [6]. Allerdings war im entsprechenden Chromatogramm eine Vielzahl von Peaks zu sehen, darunter ein dominierendes Signal (Siehe Abbildung 37). Somit wurde versucht den Hauptpeak abzutrennen. Zunächst wurde der in MeOH unlösliche Teil durch zentrifugieren abgetrennt. Der Überstand wurde dann auf einer Methanol-Sephadexsäule (LH 20 Material, 100x20 cm), an die ein Fraktionensammler angeschlossen wurde, aufgetrennt. Es wurden 74 Fraktionen erhalten, die in 18 Sammelfraktionen zusammengefasst wurden (siehe Tabelle 5).
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Spezieller Teil
Fraktionen Sammelfraktion Ausbeute 16+17 Sulf-F1 0,5 mg 18+19 Sulf-F2 1,4 mg 20+21 Sulf-F3 6,5 mg 22 Sulf-F4 24, mg 23+24 Sulf-F5 450,1 mg 25+26 Sulf-F6 637 mg 27 Sulf-F7 297,6 mg 28+29 Sulf-F8 284,3 mg 30-33 Sulf-F9 10481,3 mg 34-37 Sulf-F10 60,8 mg 38,39 Sulf-F11 23,2 mg 41,42 Sulf-F12 31,5 mg 43-45 Sulf-F13 96,2 mg 46 Sulf-F14 15,7 mg 47-49 Sulf-F15 33,5 mg 50-57 Sulf-F16 68,1 mg 58-61 Sulf-F17 4,0 mg 62-74 Sulf-F17 69,6 mg
Tabelle 5 : Fraktionierung des sulfatierten Trihydroxycumarins mittels Sephadex LH 20 Säule
DAD1 C, Sig=350,8 Ref=off (ANJA\DV-2 ...ANJA\THYC SPIKE HIGH 2018-01-30 13-52-39\SULFATED THYC RESIDUE.D) N o rm . UV 350 nm 1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 m in
Abbildung 37: HPLC Analyse des Produkts der Sulfatierung von 3,6,7-Trihydroxycumarin, HPLC Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
Die einzelnen Sammelfraktionen wurden im Anschluss mittels HPLC analysiert und anhand der Chromatogramme wurden die Fraktionen Sulf-F5 und Sulf-F6 vereinigt und mit einer 52
Spezieller Teil
Sephadexsäule (LH 20 Material, mobile Phase = Methanol) weiter aufgetrennt. So wurden 44 Fraktionen erhalten, die in 5 Sammelfraktionen nach analoger Vorgehensweise zusammengefasst wurden. Es gelang aber nicht, eine Reinsubstanz zu erhalten, denn alle Fraktionen enthielten mehrere Substanzen.
Fraktionen Name Ausbeute 1-4 SulfF5-1 1,0 mg 5-11 SulfF5-2 3,2 mg 12 SulfF5-3 19,8 mg 13-18 SulfF5-4 3,7 mg 19-44 SulfF5-5 3,3 mg
Tabelle 6: Ausbeuten einer weiteren Auftrennung der Fraktionen SulfF5-und SulfF6 mittels Sephadex LH 20
6.6.2 Sulfatierung der 4-OH-Zimtsäure
Bei der 4-OH-Zimtsäure und ihrem Sulfat handelt es sich um Verbindungen, die zwar nicht in Dasycladus vermicularis enthalten sind, wohl aber in einer anderen Art der Familie der Dasycladaceae, und zwar in Neomeris annulata [4].
Für die Synthese wurden 1,5 g 4-OH-Zimtsäure und 1,7 g Pyridin Schwefelsäurekomplex zusammen mit 25 ml Pyridin in einen 250 ml Rundkolben eingewogen. Dieses Gemisch wurde zunächst bei Raumtemperatur für 48 h gerührt [8].
Anschließend wurde das Pyridin am Rotavapor abrotiert und die zurückgebliebene, dickflüssige, leicht gelbliche Substanz mit 20 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 25% KOH Lösung auf 6-7 eingestellt und diese anschließend im Scheidetrichter drei Mal mit je 20 ml Ethylacetat ausgeschüttelt. Dabei bildete sich in der wässrigen Phase ein weißer Niederschlag, der mithilfe eines Filters abgetrennt wurde. Das Filtrat wurde dann am Rotavapor eingedampft und der Rückstand wiederum in so wenig Wasser wie möglich aufgenommen. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit 25% KOH Lösung auf 10 eingestellt.
Diese Lösung wurde zunächst für eine Stunde bei 60°C auf dem Ölbad erhitzt und dann mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert. Die Flüssigkeit wurde abgedampft und der Rückstand in 10 ml 40°C warmen Wasser gelöst. Durch Hinzufügen von 20 ml Methanol bildete sich ein weißer Niederschlag, der mit einem Faltenfilter abgetrennt und mit 10 ml Methanol gewaschen wurde. Die methanolischen Lösungen wurden über Nacht in den Kühlschrank gestellt und es bildete sich wiederum ein weißer Niederschlag, der abgetrennt wurde. Die filtrierte Lösung wurde dann wieder eingedampft und der Rückstand in 2 ml Methanol (ÖAB destilliert) 53
Spezieller Teil aufgenommen und anschließend für einige Minuten ins Ultraschallbad gestellt. Nun bildete sich ein weißer Niederschlag in gelber Lösung. Der Niederschlag wurde abgetrennt und noch einmal mit 1 ml Methanol aufgenommen und für einige Minuten ins Ultraschallbad gestellt. Der erhaltene weiße Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und anschließend in ein tariertes Gefäß überführt. Nach dem Trocknen wurde das Produkt gewogen und die Ausbeute bestimmt. Sie betrug 200,4 mg. Mittels HPLC und LC-MS Analyse wurde im Anschluss die Identität und die Reinheit des Produkts bestätigt. Die erhaltene Verbindung, die natürlich auch im marinen Seegras Zostera marina vorkommt, könnte im Anschluss dafür genutzt werden um ihr Vorkommen in anderen Arten, wie z.B. Neomeris annulata zu bestätigen.
2500 DAD-272 nm UVSulfat-Rep2 272 nm
2000
1500
mAU 1000
500
0 0 10 20 30 40 Minutes
Abbildung 38: HPLC Chromatogramm des synthetisierten Zimtsäuresulfats HPLC Bedingungen siehe Kapitel 8.2.6
54
Zusammenfassung
7 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es Inhaltstoffe der Alge Dasycladus vermicularis zu isolieren. Aus dem Methanol-Wasser-Extrakt der Pflanze konnten insgesamt 9 Verbindungen isoliert werden, davon sind sechs Substanzen strukturell noch nicht aufgeklärt, von einer dieser Substanzen konnte jedoch bereits die Masse bestimmt werden. Von den restlichen drei Substanzen war aufgrund ihrer Masse und mithilfe von Informationen aus vorhergehenden Arbeiten eine Bestimmung der Identität möglich. Aus der Fraktion DasyA-W1 wurden 4- Sulfoxybenzoesäure und 6,7 Dihydroxycumarin-3-sulfat erhalten, aus der Fraktion DasyA-W4 ein Dimeres Cumarinsulfat. Diese Substanzen wurden bereits in vorhergehenden Arbeiten als Inhaltsstoffe der Alge beschrieben.
Aus dem methanolischen Extrakt wurden vier Reinstoffe isoliert, die ebenfalls sulfatierte Cumarine darstellen. Es wurde ebenfalls 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfat isoliert, welches eine wichtige Rolle beim Wundverschluss der Alge einnimmt. Bei zwei weiteren Substanzen muss noch die Struktur anhand von NMR- Experimenten bestimmt werden.
Bei der Synthese des Trihydroxycumarins konnte in einem ersten Versuch die gewünschte Substanz nicht vollständig rein gewonnen werden, denn im HPLC-Chromatogramm war ein zweiter Peak zu sehen. Dieser konnte jedoch mittels Gelchromatografie abgetrennt werden. Bei der letzten Wiederholung der Synthese wurde schon ohne diesen zusätzlichen Schritt ein reines Produkt erhalten. Der Grund dafür könnte die langsamere Abkühlung des Endprodukts im Kolben sein, denn bei den vorherigen Experimenten wurde das Gemisch unter kaltem Wasser abgekühlt, beim dritten Versuch jedoch einfach 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. In Summe wurden insgesamt 1908,8 mg des 3,6,7-Trihydroxycumarins synthetisiert.
Die Synthese der Dihydroxycumarine konnte in dieser Arbeit aus zeitlichen Gründen nur bis zum zweiten Zwischenprodukt durchgeführt werden. Der letzte Schritt wird von Frau Dr. Hartmann zusammen mit Frau Prof. Matuszcak durchgeführt, da es sich bei dem dafür benötigten Reagenz BBr3 um eine sehr reaktive Substanz handelt, und diese Reaktion deshalb aus Sicherheitsgründen im Syntheselabor durchgeführt werden muss. Es wurden aber drei relativ reine Zwischenprodukte erhalten, und der Erfolg der Synthese bis zu diesem Schritt wurde mittels LC-MS überprüft.
Die durchgeführte Sulfatierung von 4-OH-Zimtsäure verlief gut, die Ausbeute des Produktes lag bei 200 mg.
55
Zusammenfassung
Die Sulfatierung der Cumarine, bei der eine entsprechende Methode aus der Literatur zur Sulfatierung verwendet wurde, verlief hingegen nicht optimal. Laut Literaturangabe sollte schlussendlich ein Gemisch aus drei monosulfatierten Cumarinen entstehen, die im Anschluss mittels Präp-HPLC getrennt werden können [6]. In unserem Fall entstand aber ein hochkomplexes Gemisch aus mehreren Substanzen. Ein Hauptpeak war zwar deutlich zu erkennen, aber dieser konnte nicht von den anderen Substanzen abgetrennt werden, auch nicht mithilfe der Gelpermeationschromatografie.
Trotzdem lieferte diese Arbeit neue und wichtige Erkenntnisse zur Isolierung von Stoffwechselprodukten aus Algen. Im vorliegenden Fall stellten diese meist Cumarine dar, wobei eine Reihe weiterer isolierter Substanzen strukturell noch nicht aufgeklärt ist. Zusammen mit den beschriebenen Synthesemöglichkeiten liegen nun größere Mengen an Reinstoffen vor um auch die biologische Aktivität dieser Naturstoffe näher untersuchen zu können.
56
Experimenteller Teil
8 Experimenteller Teil
8.1 Herkunft des Algenmaterials
Die untersuchte Alge Dasycladus vermicularis (Dasycladaceae) wurde von Frau Dr. Anja Hartmann im August 2017 auf Alonissos, Griechenland (39°08'23.8"N 23°50'43.3"E) in einer Wassertiefe von 1,60-1,80 m gesammelt.
8.2 Durchführung der einzelnen Arbeitsschritte
8.2.1 Herstellung des Methanol-Wasser-Extrakts
Das getrocknete Algenmaterial wurde zunächst in einer Kaffeemühle zerkleinert und etwa 10 g zur Seite gestellt. Das restliche Material (738,68 g) wurde in 3 Erlenmeyerkolben mit jeweils 500 ml Volumen aufgeteilt und mit ausreichend Extraktionsmittel bedeckt. Das Extraktionsmittel wurde aus 500 ml Wasser (HPLC-Qualität) und 500 ml Methanol (ÖAB, destilliert) hergestellt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 min im Ultraschallbad extrahiert und anschließend über Nacht auf den Schüttler gestellt. Der erhaltene Extrakt wurde über Watte filtriert, bei 1500 rpm für 3 min zentrifugiert und anschließend im Rotavapor einrotiert. Die Rückstände wurden aus dem Kolben in ein Gläschen transferiert und mithilfe eines Luftstroms vollständig getrocknet. Die Extraktion wurde 8 Mal pro Kolben wiederholt. Die Ausbeute war 17,88 g.
8.2.2 Herstellung des Methanol Extrakts
Das bereits mit Methanol-Wasser- Gemisch extrahierte Pflanzenmaterial wurde anschließend mit reinem Methanol (ÖAB, destilliert) bedeckt und wiederum für 15 min im Ultraschallbad extrahiert, das Extrakt durch einen Rundfilter filtriert und anschließend im Rotavapor zur Trockene eingedampft. Die Extraktion wurde 6 Mal pro Kolben wiederholt. Die Ausbeute lag bei 4,40 g
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Experimenteller Teil
8.2.3 Dünnschichtchromatografie
Für die dünnschichtchromatografischen Untersuchungen wurden 20 x 20 cm große, mit Kieselgel beschichtete, Aluminiumfertigplatten der Firma Merk (Darmstadt, Deutschland) verwendet, die auf eine Größe von ca. 7 x 20 cm zugeschnitten wurden. Das Laufmittel setzte sich aus Ethylacetat, Methanol und Essigsäure im Verhältnis (10 : 4 : 1) zusammen. Es wurde hergestellt, indem 10 ml Ethylacetat, 4 ml Methanol und 1 ml Essigsäure in einem Erlenmeyerkolben gemischt und in eine DC Kammer gefüllt wurden. Das Laufmittel wurde täglich ausgetauscht und die Kammer stets gesättigt verwendet. Die Sättigung wurde erreicht, indem ein Filterpapier in die Kammer gegeben und die Kammer nach der Befüllung 30 min stehen gelassen wurde.
Für die dünnschichtchromatografischen Untersuchungen des synthetisierten Trihydroxycumarins setzte sich das Laufmittel aus Chloroform, Essigsäure, Methanol und Wasser (15 : 8 : 3 : 2) zusammen. Die Herstellung des Gemisches erfolgte wie bereits im vorherigen Absatz beschrieben.
8.2.4 Flash-Chromatografie
Die Trennungen mittels Flash-Chromatografie wurden mit einem Reveleris X2- Flash- Chromatografie System der Firma Grace Davison Discovery Sciences (Columbia, Maryland, USA) durchgeführt. Dieses Gerät wird mittlerweile nicht mehr von Grace, sondern von der Firmal BÜCHI Labortechnik (Flawil, Schweiz) vertrieben [38].
8.2.4.1 Auftrennung des Methanol- Wasser Extraktes
1.Versuch
Für die Trennung dieses Extraktes (1507,1 mg) wurde eine Reveleris C18 80 g Kartusche verwendet. Um die Säule zu spülen und vor dem Lauf zu äquilibrieren, wurde diese zunächst mit 100 % Laufmittel A, Wasser (HPLC-Qualität), und im Anschluss mit 100 % Laufmittel B, Methanol (ÖAB, destilliert) bei einer Flussrate von 15 ml/min gespült. Nach einer 10-minütigen Equilibrierung (100 % Laufmittel A) wurde ein Teil des Extraktes (1507,1 mg) in ca. 3 ml Wasser (HPLC-Qualität) gelöst und mithilfe einer Spritze injiziert. Die im System integrierte, binäre Pumpe baute einen Gradienten auf. Zunächst wurde 18,9 Minuten isokratisch mit 100 % Laufmittel A eluiert. In weitern 11,5 Minuten steigerte sich die Konzentration von Laufmittel B auf 60 %, in weiteren 1,4 Minuten dann auf 100 % Laufmittel B. Diese Zusammensetzung
58
Experimenteller Teil wurde 13,2 Minuten gehalten. Die Trennung dauerte insgesamt 45 Minuten. Die Flussrate betrug 15 ml/min, detektiert wurde mit einem UV-Detektor bei 254 nm und 350 nm sowie einem ELSD-Detektor. Der im Gerät integrierte Fraktionensammler fraktionierte anhand der unterschiedlichen Detektorsignale. Die erhaltenen 46 Fraktionen wurden zu 14 Sammelfraktionen zusammengefasst.
2. Versuch
Hier wurde ebenfalls eine Reveleris C 18 Kartusche (80 g) verwendet. Es wurden die gleichen Laufmittel wie zuvor verwendet. Die Equilibrierungsphase dauerte 10 Minuten, der Fluss wurde dabei auf 20 ml/min eingestellt. Nach der Injektion (998,82 mg Extrakt in 3 ml Lösungsmittel) wurde zunächst für 8 Minuten isokratisch bei 100 % Laufmittel A eluiert, dann steigerte sich die Konzentration von Laufmittel B auf 28 % in drei Minuten, in den nächsten drei Minuten wurde die Konzentration von Laufmittel B auf 100 % gesteigert. Am Ende wurde die Säule noch 20 Minuten mit 100 % Laufmittel B gespült. Mithilfe eines ELSD Detektors und eines UV Detektors, der auf 254 nm und 350 nm eingestellt war, wurden die einzelnen Fraktionen bestimmt. Die ursprünglich 43 Einzelfraktionen wurden anhand der DC- Ergebnisse in 12 Sammelfraktionen zusammengefasst.
3. Versuch
Hier wurde dem Laufmittel A 1,5 % Essigsäure zugesetzt, als stationäre Phase kam erneut eine Reveleris C 18 80 g Kartusche zum Einsatz. Nach der Injektion der Probe (697,9 mg ) erfolgte die Elution für 7 Minuten isokratisch mit 100 % Laufmittel A. Die Konzentration von Laufmittel B steigerte sich über einen Zeitraum von 20 Minuten auf 40 % und anschließend über einen Zeitraum von 2 Minuten auf 100 %. Die letzten 15 Minuten wurde die Säule mit 100 % Laufmittel B gespült. Insgesamt dauerte die Trennung 45 Minuten. Die Flussrate lag bei 20 ml/min, detektiert wurde ebenfalls mit einem ELSD Detektor, sowie einem UV Detektor, der auf 254 nm und 350 nm eingestellt war. Aus 39 Fraktionen wurden nach DC-Analysen 15 Sammelfraktionen gebildet.
4. Versuch
Dem Laufmittel A wurden zusätzlich zu 1,5 % Essigsäure noch 25 mmol Ammoniumacetat als Puffer hinzugefügt. Dafür wurde ein 1000 ml Maßkolben zunächst mit ca. 50 ml Wasser (HPLC-Qualität) befüllt, dann wurden 15 ml Essigsäure und 1,54 g Ammoniumacetat dazugegeben und der Kolben mit Wasser (HPLC-Qualität) bis zur Linie aufgefüllt. Laufmittel B war erneut Methanol (ÖAB, destilliert). 59
Experimenteller Teil
Außerdem wurde der Extrakt (11678,4 mg) nicht mehr in flüssiger, sondern in fester Form aufgetragen, indem gleiche Anteile von trockenem Extrakt und RP 18 Material in einer Reibschale verrieben wurden. Diese Verreibung wurde dann mittels einer speziellen Probenhalterung in das Gerät integriert. Wie in den vorherigen Versuchen wurde eine Reveleris C 18 Säule (80 g) verwendet. Die Elution startete nach einer 5-minütigen Equilibrierung isokratisch für 19 min mit 100 % Laufmittel A. Anschließend wurde die Konzentration von Laufmittel B zunächst in 6 Minuten auf 31 %, dann in 5 Minuten auf 47 %, und zum Schluss in 8 Minuten auf 100 % gesteigert. Letzteres wurde für 10 Minuten beibehalten. Die Flussrate lag in diesem Versuch bei 60 ml/min, die Detektion erfolgte mittels ELSD und UV- Detektoren, wobei der UV Detektor auf 254 nm und 350 nm eingestellt war. Es wurden 60 Fraktionen erhalten, die mithilfe von DC- und HPLC Analysen zu 10 Sammelfraktionen vereint wurden. Die genaue Aufteilung der Sammelfraktionen ist in Tabelle 7 aufgelistet.
60
Experimenteller Teil
Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Lauf 4 Name Ausbeute 1-4 1-4 DasyA-W1-Rev1 1282,7 mg 5+6 5+6 DasyA-W1-Rev2 530,9 mg 7+8 7 DasyA-W1-Rev3 4,1 mg 9 DasyA-W1-Rev4 371,4 mg 10 DasyA-W1-Rev5 288,9 mg 11 DasyA-W1-Rev6 206,5 mg 12 DasyA-W1-Rev7 144,3 mg 13 DasyA-W1-Rev8 103,9 mg 14 DasyA-W1-Rev9 206,6 mg 15 DasyA-W1-Rev10 144,8 mg 16 DasyA-W1-Rev11 33,8 mg 17-29 DasyA-W1-Rev12 74,6 mg 30-39 DasyA-W1-Rev13 82,0 mg 40-42 DasyA-W1-Rev14 189,8 mg 43-46 DasyA-W1-Rev15 281,3 mg 8+9 DasyA-W2-Rev1 325,8 mg 10 DasyA-W2-Rev2 167,8 mg 11 DasyA-W2-Rev3 137,0 mg 12 DasyA-W2-Rev4 67,7 mg 13-15 DasyA-W2-Rev5 66,1 mg 16-19 DasyA-W2-Rev6 32,9 mg 20-23 DasyA-W2-Rev7 12,4 mg 24-31 DasyA-W2-Rev8 40,0 mg 32-35 DasyA-W2-Rev9 33,9 mg 36 DasyA-W2-Rev10 80,9 mg 37-39 DasyA-W2-Rev11 146,4 mg 40-43 DasyA-W2-Rev12 8,1 mg 7 DasyA-W3-Rev3 106,1 mg 8 DasyA-W3-Rev4 80,6 mg 9+10 DasyA-W3-Rev5 5,2 mg 11 DasyA-W3-Rev6 15,3 mg 12 DasyA-W3-Rev7 1,7 mg 18 DasyA-W3-Rev9 1,6 mg 24-27 DasyA-W3-Rev11 4,3 mg 34 DasyA-W3-Rev14 18,2 mg 35-37 DasyA-W3-Rev15 44,0 mg 38,39 DasyA-W3-Rev16 2,6 mg 1-11,15-16,20,28-31 DasyA-W4-Rev1 3562,9 mg 12 DasyA-W4-Rev12 1714,8 mg 13 DasyA-W4-Rev13 1594,7 mg 14 DasyA-W4-Rev14 462,7 mg 17-19 DasyA-W4-Rev17 248,5 mg 21-24 DasyA-W4-Rev21 321,0 mg 25-27 DasyA-W4-Rev25 326,0 mg 31-44 DasyA-W4-Rev31 186,1 mg 32 DasyA-W4-Rev32 566,3 mg 45-60 DasyA-W4-Rev45 533,0 mg
Tabelle 7: Erhaltene Fraktionen nach Auftrennung des Methanol- Wasser Extraktes von Dasycladus vermicularis mittels Flash- Chromatografie; es wurden vier Wiederholungen durchgeführt.
61
Experimenteller Teil
8.2.4.2 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W2-Rev6, DasyA-W2-Rev7 und DasyA-W2-Rev8
Die trockenen Fraktionen DasyA-W2-Rev6, DasyA-W2-Rev7 und DasyA-W2-Rev8 wurden vereinigt (85,3 mg) und in 3 ml Wasser (HPLC-Qualität) gelöst. Nach dem Durchspülen der Säule (RP 18 Material, 80 g) mit jeweils 100 % Methanol (HPLC-Qualität) und 100 % Wasser (HPLC-Qualität) und einer Equilibrierungszeit von 4,6 Minuten wurde die Probelösung mithilfe einer Spritze injiziert. Die Elution erfolgte zunächst 8 Minuten isokratisch mit einer Konzentration von 100 % Wasser (HPLC Qualität). Dann wurde in einer Minute die Methanol Konzentration auf 2 % erhöht und stieg anschließend in 4 Minuten kontinuierlich auf 100 %. Die Flussrate lag bei 20 ml/min. Mithilfe des UV-Detektors, der auf 220 nm und 240 nm eingestellt war konnten 6 Fraktionen erhalten werden, wobei die Fraktion DasyA-W2- Rev6/7/8-Rev6 eine Reinsubstanz war. Die Ausbeute betrug 1,9 mg.
Fraktion Name Ausbeute 2+3 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev1 49,5mg 4-7 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev2 57,1mg 8-10 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev3 18mg 11+12 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev4 1,7mg 13 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev5 13,8mg 14+15 DasyA-W2-Rev6/7/8-Rev6 1,9mg
Tabelle 8: Sammelfraktionen und Ausbeuten nach der Auftrennung von Fraktion DasyA-W2-Rev 6/7/8 mittels Flash Chromatografie
8.2.4.3 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DasyA-W4-Rev32
Die trockenen Fraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DasyA-W4-Rev32 wurden vereinigt (1,078 g) und in 3 ml Wasser gelöst. Nach einer 4,8 minütigen Equilibrierungsphase erfolgte die Injektion der Lösung mit einer Spritze. Es wurden zwei Laufmittel eingesetzt, zum einen Methanol (ÖAB, destilliert) und zum anderen Wasser (HPLC Qualität) mit 20 mmol Ammoniumformiat und 1,5 % Ameisensäure. Als stationäre Phase wurde eine Reveleris Kartusche C 18 (12 g) verwendet, der Fluss wurde auf 30 ml/min eingestellt. Nach einer 8-minütigen, isokratischen Elution mit der wässrigen Phase wurde in weitern 8 Minuten die Konzentration des Methanols kontinuierlich auf 100 % verändert. Die Fraktionierung erfolgte über die Messung der Absorption bei 254 und 350 nm. Es wurden 4
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Experimenteller Teil
Fraktionen erhalten, wobei die Fraktion DasyA-W4-Rev25/31/32-Rev3 einen Reinstoff mit einer Ausbeute von 231,9 mg darstellte. Die genaue Fraktionierung ist in Tabelle 9 dargestellt.
Name Ausbeute DasyA-W4-Rev25/31/32-Rev1 87,1 mg DasyA-W4-Rev25/31/32-Rev2 158,2 mg DasyA-W4- Rev25/31/32- Rev3 231,9 mg DasyA-W4-Rev25/31/32-Rev4 238,3 mg
Tabelle 9: Auftrennung der vereinigten Sammelfraktionen DasyA-W4-Rev25, DasyA-W4-Rev31 und DasyA-W4-Rev25 mittels Flash- Chromatografie.
8.2.4.4 Auftrennung der Fraktion DasyA-W4-Rev45
Für die Auftrennung dieser Fraktion wurde eine Reveleris C 18 (80 g) Kartusche als stationäre Phase verwendet. Die mobile Phase setzte sich wie in Kapitel 8.2.4.3 beschrieben zusammen. Die Probe wurden in 3 ml Wasser gelöst und injiziert. Der Gradient setzte sich wie folgt zusammen: Nach einer Equilibrierung von 4,8 Minuten wurde zunächst isokratisch, mit 100 % Laufmittel A eluiert. Nach 7 Minuten wurde die Konzentration von B kontinuierlich, über 9 Minuten, bis auf 100 % gesteigert. Am Ende wurde für weitere 15 Minuten mit 100 % Laufmittel B die Säule gespült. Der Fluss lag bei 30 ml/min, detektiert wurde mit einem ELSD Detektor und einem UV Detektor, der auf 220, 254 und 350 nm eingestellt wurde. Insgesamt wurden so 17 Fraktionen gesammelt, die nach einer DC Analyse zu 8 Sammelfraktionen vereint wurden.
Fraktionen Name Ausbeute 1+2 DasyA-W4-Rev45-Rev1 5,0 mg 4-11 DasyA-W4-Rev45-Rev2 11,3 mg 12 DasyA-W4-Rev45-Rev3 3,2 mg 13 DasyA-W4-Rev45-Rev4 4,5 mg 14+15 DasyA-W4-Rev45-Rev5 14,7 mg 16 DasyA-W4-Rev45-Rev6 4,3 mg 17+18 DasyA-W4-Rev45-Rev7 12,6 mg Waste DasyA-W4-Rev45-Rev8 206,0 mg
Tabelle 10: Auftrennung der Fraktion DasyA-W4-Rev45 mittels Flash-Chromatografie.
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Experimenteller Teil
8.2.5 Gelpermeationschromatografie
8.2.5.1 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9
Diese Fraktionen (103,9 mg bzw. 206,6 mg) wurden separat aufgetrennt und dazu jeweils in 1 ml eines Gemisches aus Methanol (ÖAB, destilliert) und Wasser (HPLC Qualität) im Verhältnis 1 : 3 gelöst und mit einer Pasteurpipette auf eine Trennsäule aufgetragen, die mit LH 20 Material gefüllt waren. Die Länge der Säule betrug je 50 cm, der Säulendurchmesser 1 cm. Als mobile Phase diente ein Gemisch aus Wasser (HPLC Qualität) und Methanol (ÖAB, destilliert) im Verhältnis 3:1. Nach dem die Probe in das Material eingedrungen war, wurde eine Pumpe (Merk Hitachi LaChrom Pump L-7100) angeschlossen und ein Fluss von 0,4 ml/min eingestellt. Es war außerdem ein Fraktionensammler nachgeschalten der jeweils 2 Minuten Eluat in ein Glas sammelte. Auf diese Weise wurden 61 Fraktionen erhalten, die nach HPLC Analysen zu 10 Sammelfraktionen vereint wurden (siehe Tabelle 11). Zwei Reinstoffe konnten auf diese Art erhalten werden. Die Ausbeute der Reinsubstanzen DasyA-W1-Rev8/9- Se7 betrug 2,5 mg und der Substanz DasyA-W1-Rev8/9-Se10 3,5 mg.
Fraktion Fraktion Name Ausbeute DasyAW1-Rev8 DasyAW1-Rev9 1-6 1-3 DasyA-W1-Rev8/9-Se1 11,8mg 7+8 DasyA-W1-Rev8/9-Se2 6mg 9+10 4-8 DasyA-W1-Rev8/9-Se3 13,2mg 11-15 4-22 DasyA-W1-Rev8/9-Se4 23,9mg 16-18 DasyA-W1-Rev8/9-Se5 24,1mg 19+20 DasyA-W1-Rev8/9-Se6 1,9mg 21 DasyA-W1-Rev8/9-Se21 0,6mg 22+23 DasyA-W1-Rev8/9-Se7 2,5mg 9-13 DasyA-W1-Rev8/9-Se8 18,6mg 24-30 DasyA-W1-Rev8/9-Se9 5,6mg 31-39 DasyA-W1-Rev8/9-Se10 3,5mg
Tabelle 11 :Fraktionierung von DasyA-W1-Rev8 und DasyA-W1-Rev9, Reinsubstanzen sind schwarz umrandet. Teilweise wurden Fraktionen aus den beiden Auftrennungen vereinigt.
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Experimenteller Teil
8.2.5.2 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev10 und DasyA-W1- Rev11
Nach einer HPLC Analyse wurden diese beiden Fraktionen aufgrund ähnlicher Zusammensetzung zusammengegeben (178,6 mg) und die Probe wurde in 2 ml Lösungsmittelgemisch aus 3 Teilen Wasser (HPLC-Qualität) und 1 Teil Methanol (ÖAB, destilliert) gelöst. Die Probelösung wurde mit einer Pasteurpipette auf eine, mit Sephadex LH 20 gefüllte Säule (Länge 90 cm, Durchmesser 2 cm) vorsichtig aufgetragen. Nachdem die komplette Lösung in das Material eingesickert war, wurde mit Laufmittel, das ebenfalls aus drei Teilen Wasser (HPLC Qualität) und einem Teil Methanol (ÖAB; destilliert) bestand vorsichtig aufgefüllt und eine Pumpe (LaChrom 7100 Pump) mit einer Flussrate von 0,4 ml/min angeschlossen. Die Fraktionierungszeit betrug 4 Minuten. Es wurden 63 Fraktionen erhalten, die zu 12 Sammelfraktionen vereinigt wurden (Siehe Tabelle 12).
Fraktion Name Ausbeute 1-9 DasyA-W1-Rev10/11-Se1 11,6mg 10-12 DasyA-W1-Rev10/11-Se2 2,1mg 13-17 DasyA-W1-Rev10/11-Se3 5,7mg 18-23 DasyA-W1-Rev10/11-Se4 13mg 24-28 DasyA-W1-Rev10/11-Se5 10,1mg 29-30 DasyA-W1-Rev10/11-Se-6 4,4mg 31-36 DasyA-W1-Rev10/11-Se7 27,6mg 37-43 DasyA-W1-Rev10/11-Se8 60,3mg 44-48 DasyA-W1-Rev10/11-Se9 24,2mg 49-50 DasyA-W1-Rev10/11-Se10 3mg 51-54 DasyA-W1-Rev10/11-Se11 3,3mg 55-63 DasyA-W1-Rev10/11-Se12 1,8mg
Tabelle 12: Fraktionierung von DasyA-W1-Rev10 und DasyA-W1-Rev11 8.2.5.3 Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev13, DasyA-W1-Rev14 und DasyA-W1-Rev15
Diese drei Fraktionen wurden aufgrund einer ähnlichen Zusammensetzung vereinigt (551,3 mg), und anschließend in 2 ml eines Gemisches aus Methanol (ÖAB destilliert) und Wasser (HPLC-Qualität) im Verhältnis 1 : 3 gelöst. Die Lösung wurde mit einer Pasteurpipette vorsichtig auf das Sephadex LH 20 Material aufgetragen. Nachdem die Substanz komplett in das Material eingezogen war, wurde vorsichtig mit Laufmittelgemisch (Methanol und Wasser im Verhältnis 1:3) aufgefüllt. Die Säulenlänge betrug 90 cm, ihr Durchmesser 2 cm. An die Säule wurde eine Pumpe (LaChrom Pump L7100) angeschlossen und eine Flussrate von 65
Experimenteller Teil
0,4 ml/min eingestellt. Der Fraktionensammler füllte jeweils 4 Minuten Eluat in ein Reagenzglas. Es wurden 85 Fraktionen erhalten, die in 11 Sammelfraktionen vereinigt wurden (siehe Tabelle 13). Die Fraktion DasyA-W1-Rev13/14/15-S9 mit einer Ausbeute von 1,3 mg, und die Fraktion DasyA-W1-Rev13/14/15-S11 (2,7 mg) stellen jeweils Reinsubstanzen dar.
Fraktion Name Ausbeute 18-26 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se1 44,3mg 27-49 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se2 389,2mg 50-53 DasyA-W1-Rev13/14/15Se3 14,1mg 54-58 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se4 13,1mg 59-67 DasyA-W1-Rev13/15/15-Se5 11,1mg 68-70 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se6 2,7mg 71-73 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se8 2,3mg 74 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se9 1,3mg 75-77 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se10 2,0mg 78-85 DasyA-W1-Rev13/14/15-Se11 2,7mg
Tabelle 13: Gemeinsame Auftrennung der Fraktionen DasyA-W1-Rev13, DasyA-W1-Rev14 und DasyA-W1-Rev15 mittels Gelpermeationschromatografie. Reinsubstanzen sind schwarz umrandet. 8.2.5.4 Methanol Extrakt
Der Extrakt (5,5 g) wurde in 3 ml Methanol gelöst und auf eine bereits mit Sephadex LH 20 Material (Amersham Pharmacia Biotech AB, Schweden) befüllte Säule aufgetragen. Die Höhe des Materials in der Säule betrug 80 cm, der Innendurchmesser der Säule 3,5 cm. Die Trennung wurde bei Atmosphärendruck durchgeführt. Am Ende der Säule wurde außerdem ein Fraktionensammler angeschlossen, der jeweils 10 Minuten lang ein Reagenzglas mit Eluat befüllte. Es wurden 160 Fraktionen gesammelt, die mittels Dünnschichtchromatografie zu 14 Sammelfraktionen vereinigt wurden (siehe Tabelle 14).
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Experimenteller Teil
Fraktion Name Ausbeute 1-4 DasyA-M1-Se1 21,3 mg 5-7 DasyA-M1-Se2 15,4 mg 8-14 DasyA-M1-Se3 975,4mg 15 DasyA-M1-Se4 137mg 16 DasyA-M1-Se5 155,4mg 17 DasyA-M1-Se6 175,1mg 18 DasyA-M1-Se7 203,4mg 19-27 DasyA-M1-Se8 147,8 mg 28-35 DasyA-M1-Se9 573,1mg 36-42 DasyA-M1-Se10 233,7mg 43-60 DasyA-M1-Se11 413,1mg 61-80 DasyA-M1-Se12 1315,7mg 81-110 DasyA-M1-Se13 931,3mg 111-160 DasyA-M1-Se14 100,0 mg
Tabelle 14: Frakitionierung des Methanol- Extraktes aus Dasycladus vermicularis mittels Gelchromatografie 8.2.5.5 Aufreinigung des synthetisierten 3,6,7-Trihydroxycumarins
1.Versuch
Das trockene Syntheseprodukt (100 mg) wurde in Methanol (ÖAB, destilliert) gelöst und auf eine Sephadex Säule aufgetragen. Die Höhe der mit LH-20 Material gefüllte Säule betrug 90 cm, ihr Durchmesser 1 cm; Methanol diente als mobile Phase. Die Auftrennung erfolgte bei Atmosphärendruck, die Fraktionierung erfolgte händisch anhand der Färbung der Substanzen. Insgesamt wurden 8 Fraktionen gebildet, wobei Synth1-F4 und Synth1-F5 das reine 3,6,7- Trihydroxycumarin erhielten. Die gesamte Ausbeute betrug 28,4 mg.
2.Versuch
Das trockene Syntheseprodukt (1,8 g) wurde auf 2 Teile aufgeteilt, die in je 2 ml Methanol (ÖAB, destilliert) gelöst und dann jeweils auf eine mit Sephadex LH 20 Material gefüllte Säule aufgetragen wurden. Letztere hatte eine Höhe von 83 cm und einen Durchmesser von 2,5 cm. Die Fraktionierung erfolgte händisch und es wurden 14 Fraktionen erhalten, wobei Synth2-F1, Synth2-F2, Synth2-F4, Synth2-F5 sowie Synt2-2F3, Synth2-2F5 Synth2-2F6 und Synth2-2F7 das reine 3,6,7-Trihydroxycumarin enthielten. Die Ausbeute betrug insgesamt 667,2 mg.
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Experimenteller Teil
8.2.5.6 Aufreinigung des synthetisierten 6,7-Dihydroxycumarin-3-sulfats
Für die Aufreinigung wurden 2,62 g des erhaltenen Produktgemisches in 3 ml Methanol gelöst und auf eine mit Sephadex LH 20 Material gefüllte Säule aufgetragen. Die Höhe des Materials betrug 87 cm, der Durchmesser der Säule 3,5 cm. Mittels eines Fraktionensammlers, der alle 4,5 Minuten ein neues Glas befüllte, wurden 74 Fraktionen erhalten, die in 18 Sammelfraktionen zusammengefasst wurden. Als mobile Phase diente Methanol.
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Experimenteller Teil
8.2.6 Analytische HPLC
HPLC Bedingungen:
Für die Analysen wurde jeweils eine Phenomenex Gemini Säule verwendet. Ihre Dimension war 150 x 4,6 mm, die Partikelgröße 3 µm, und die Porengröße 110 Å. Das Injektionsvolumen lag bei 5 µl.
Die mobile Phase setzte sich aus zwei verschiedenen Laufmitteln zusammen.
Laufmittel A bestand aus Wasser (HPLC-Qualität) mit 20 mmol Ammoniumacetat und 1,5 % Essigsäure. 1 L Laufmittel wurde hergestellt indem in einen 1000 ml Maßkolben 1541,6 mg Ammoniumacetat eingewogen wurden, die dann in Wasser (HPLC-Qualität) gelöst wurden. Dem Gemisch wurden zudem noch 15 ml Essigsäure zugegeben.
Laufmittel B setzte sich aus 90 % Methanol, 10 % Wasser, 1,5 % Essigsäure und 20 mmol Ammoniumacetat zusammen. Hergestellt wurde es indem zunächst 1541,6 mg Ammoniumacetat in einem 100 ml Maßkolben eingewogen, in Wasser gelöst und 15 ml Essigsäure hinzugefügt wurden. Anschließend wurde der Maßkolben auf 100,0 ml mit Wasser (HPLC Qualität) aufgefüllt. Die 100,0 ml der wässrigen Lösung wurden in einen 1000 ml Maßkolben überführt und dieser mit Methanol (HPLC- Qualität) auf bis zur Marke aufgefüllt.
Die HPLC Analysen wurden auf einem Gerät der Firma Merk (Hitachi-La-Chrome-Elite) durchgeführt. Das System setzte sich zusammen aus dem Autosampler L-2200, der Pumpe L- 2100, dem Säulenofen L-2300 und dem Detektro L-2300.
Die verwendete Methode dauerte inklusive Equilibrierungsphase 45 Minuten. Der Lösungsmittelgradient veränderte sich im Laufe der Zeit mehrmals wie folgt: Zu Beginn der Messung erfolgte eine isokratische Phase für 5 Minuten mit 98 % Laufmittel A und 2 % Laufmittel B. Danach erhöhte sich die Konzentration von Laufmittel B kontinuierlich sodass sein Anteil nach einer Laufzeit von 25 min 60 % betrug. Zwischen 25,1 min bis 35,0 min stieg die Konzentration von Laufmittel B auf 90 % an. Die restliche Zeit wurde dafür verwendet, die Ausgangsbedingungen wiederherzustellen, indem ab einer Laufzeit von 35,1 Minuten die Konzentration von Laufmittel B wieder auf 2 % herabgesetzt wurde. Die Säule wurde unter diesen Bedingungen 10 Minuten lang equilibriert.
Die Säulentemperatur betrug 40°C, die Fließgeschwindigkeit war auf 0,3 ml/min eingestellt, 5µl der Probe wurden jeweils injiziert.
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Experimenteller Teil
Detektiert wurde mit einem Massendetektor im ESI negativ, sowie einem DAD Detektor, der auf eine Wellenlänge von 200-800 nm eingestellt war.
Zeit Laufmittel A Laufmittel B 0,0 Minuten 98 % 2 % 5,0 Minuten 95 % 5 % 25 Minuten 40 % 60 % 35 Minuten 10 % 90 % 35,1 Minuten 98 % 2 % 45 Minuten 98 % 2 %
Tabelle 15: Schematische Darstellung des verwendeten HPLC Gradienten.
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Experimenteller Teil
8.2.7 Präparative HPLC
Für die semi- präparativen HPLC Auftrennungen wurde stets eine HPLC- Anlage der Firma Dionex (ThermoFischer, Walthan, USA) mit einer HPG-3200 Pumpe, einem VWD-3100 Detektor, Säulenofen und einem Fraktionensammler verwendet. Als stationäre Phase wurde eine Lichrosorb RP-18 Säule (250 x 10 mm, 7 µm) verwendet, die Ofentemperatur war auf 20°C eingestellt, das UV Detektorsignal auf 350 nm.
8.2.7.1 Fraktion DasyA-W9-Se4
Es wurden 20 mg der Probe in 1 ml Wasser (HPLC Qualiät) gelöst, das Injektionsvolumen lag zunächst bei 50 µl und wurde nach einigen konstanten Läufen auf 100 µl erhöht. Die Flussrate wurde auf 1,6 ml/ Minute eingestellt. Die Laufmittelzusammensetzung änderte sich von zunächst 2 % Laufmittel B innerhalb von 35 min auf 60 % Laufmittel B. Danach wurde für 10 Minuten mit der ursprünglichen Zusammensetzung reequilibriert. Laufmittel A setzte sich aus Wasser (HPLC Qualität) mit 20 mmol Ammoniumacetat und 1,5 % Essigsäure zusammen, Laufmittel B war Methanol (HPLC Qualität). Die Fraktion wurde in 4 Hauptpeaks aufgetrennt, die mit einem Fraktionensammler separat aufgefangen wurden. Die Ausbeute von Peak 1 lag bei 0,8 mg von Peak 2 bei 15,3 mg, von Peak 3 bei 1,2 mg und von Peak 4 bei 8,9 mg.
Zeit Laufmittel A Laufmittel B 0 Minuten 98 % 2 % 35 Minuten 40 % 60 % 35,1 Minuten 2 % 98 % 45 Minuten 2 % 98 %
Tabelle 16 Auftrennung der Fraktion DasyA-W9-Se4 mittels präp HPLC
8.2.7.2 Fraktion DasyA-M1-Se5
Für die Auftrennung wurden die gleichen Laufmittel wie zuvor beschrieben gewählt. Die Probe (30 mg) wurde in 1 ml Methanol (HPLC-Qualität) gelöst, pro Lauf wurden je 100 µl injiziert. Die Analyse dauerte 45 Minuten inklusive einer Equilibrierungsphase von 10 Minuten. Zunächst wurde für 5 Minuten isokratisch mit 98 % Laufmittel A und 2 % Laufmittel B eluiert, die nächsten 20 Minuten erhöhte sich der Anteil von Laufmittel B auf 70 % und in den letzten 10 Minuten auf 90 %. Im Anschluss wurde die ursprüngliche Zusammensetzung wiederhergestellt. Die Flussrate war dabei auf 1,0 ml/min eingestellt. Es konnten zwei
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Experimenteller Teil
Hauptpeaks aufgetrennt werden. Nach acht Wiederholungen betrug die Ausbeute 3,0 mg von Peak 1 und 5,8 mg von Peak 2.
Zeit Laufmittel A Laufmittel B 0 Minuten 98 % 2 % 5 Minuten 98 % 2 % 25 Minuten 30 % 70 % 35 Minuten 10 % 90 % 35,1 Minuten 98 % 2 % 45 Minuten 98 % 2 %
Tabelle 17: Auftrennung der Fraktion DasyA-M1-Se5 mittels semi-präparativer- HPLC.
8.2.7.3 Fraktion DasyA-M1-Se7
Zur Herstellung der Probelösung wurden 10 mg Probe in 1 ml Methanol (HPLC-Qualität) gelöst. Davon wurden je Lauf 100 µl injiziert, wobei die Flussrate stets 2 ml/min betrug.
Als mobile Phase wurden Wasser (HPLC-Qualität) und Methanol (HPLC-Qualität) gewählt, der Gradient begann mit zunächst 2 % Methanol und der Anteil dieser Phase wurde in 32 Minuten auf 60 % gesteigert. Im Anschluss wurde 10 Minuten mit 98 % Methanol reequilibriert. Zwei Substanzen konnten isoliert werden, mit der Ausbeute von 0,5 mg (Peak 1) und 0,8 mg (Peak 2).
Zeit Wasser (HPLC Qualität) Methanol (HPLC Qualität) 0 Minuten 98 % 2 % 32 Minuten 55 % 45 % 32,1 Minuten 2 % 98 % 45 Minuten 2 % 98 %
Tabelle 18: Auftrennung der Fraktion DasyA-M1-Se7 mittels semi-präparativer HPLC.
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Experimenteller Teil
8.2.8 Durchführung der Synthesen
8.2.8.1 Aufbau der Reaktionsapparaturen
Für alle durchgeführten Cumarin-Synthesen wurde eine Apparatur verwendet, die sich aus einem 500 ml oder 250 ml Rundkolben, einem Intensivkühler und einem Trockenröhrchen zusammensetzte. Beheizt wurde der Kolben mithilfe eines Ölbades, dessen Temperatur mit einem Thermometer bestimmt wurde. Um einen Siedeverzug zu verhindern, kam ein Magnetrührer und ein Rührfisch zum Einsatz. Für den ersten Reaktionsschritt wurde eine Temperatur von 140 °C eingestellt, für den zweiten Schritt lag die Temperatur etwas niedriger, bei 120 °C.
8.2.8.2 Herstellung der Reagenzien für die Synthesen
Für die Herstellung von 3 M Salzsäure wurden 24,8 ml 37 % Salzsäure in einen 100 ml Messkolben gefüllt und mit Wasser (HPLC-Qualität) bis zur Marke aufgefüllt.
Für die Sulfatierung der 4-Hydroxyzimtsäure wurde 25 %ige KOH Lösung und verdünnte Schwefelsäure benötigt. Diese wurden wie folgt hergestellt:
25 % ige KOH Lösung: 12,5 g KOH Plättchen wurden mit etwas Wasser (HPLC-Qualität) in einem 50,0 ml Messkolben gelöst. Dann wurde mit Wasser (HPLC-Qualität) auf 100 ml aufgefüllt.
Verdünnte Schwefelsäure: in einem 100,0 ml Messkolben wurden zu 90 ml Wasser (HPLC Qualität) 6 ml konzentrierte Schwefelsäure (95 %) gegeben und dann bis zur Marke mit Wasser (HPLC-Qualität) aufgefüllt.
Die eigentlichen Synthesen wurden analog Literaturangaben durchgeführt. Eine genaue Beschreibung dazu findet sich in den Kapiteln 6.5 und 6.6.
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Experimenteller Teil
8.2.9 Chemikalienverzeichnis
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden folgende Chemikalien verwendet:
Name Bezugsquelle Bestellnummer Aceton Institut für Pharmakognosie, --- Universität Innsbruck Ameisensäure 98 - 100 % Merck KGaA (Darmstadt, 1.00264.1000 Deutschland) Ammoniumacetat Merck KGaA (Darmstadt, 1.01116.1000 Deutschland) Aqua bidem NANO pure Institut für Pharmakognosie, --- (HPLC) Universität Innsbruck Essigsäure 100% VWR-Chemicals (Randor, 20104.298 Pennsilvania, USA) Ethylacetat Institut für Pharmakognosie, --- Universität Innsbruck Methanol ÖAB Institut für Pharmakognosie, --- Universität Innsbruck Methanol (HPLC) Merck KGaA (Darmstadt, 1.06007.2500 Deutschland) N-Acetylglycin Sigma-Aldrich (St.Louis, A16300-100G Missouri, USA) Natriumacetat, wasserfrei Merck KGaA (Darmstadt, 229873 Deutschland) Schwefelsäure 95 % Merck KGaA (Darmstadt, 1007311000 Deutschland) Schwefeltrioxid-Pyridin- Sigma-Aldrich (St. Louis, S7556-25G Komplex Missouri, USA) Pyridin Merck KGaA (Darmstadt, 1.07463.0500 Deutschland) 2,4,5- Sigma-Aldrich, (St. Louis, 493864-1G Trihydroxybenzaldehyd Missouri, USA) 2,4,5- Sigma-Aldrich (St. Louis, 132152-25G Trimethoxybenzaldehyd Missouri, USA) 2,4-Dimethoxybenzaldehyd Sigma-Aldrich (St. Louis, D130400-25G Missouri, USA) 2,5-Dimethoxybenzaldehyd Sigma-Aldrich (St. Louis, D130605-25G Missouri, USA) 4-Hydroxyzimtsäure Sigma-Aldrich (St. Louis, C9008-1G Missouri, USA) Tabelle 19: Verwendete Chemikalien
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Experimenteller Teil
8.3 Sonstiges
Abgesehen vom HPLC- System kamen folgende Geräte zum Einsatz:
Art des Gerätes Bezeichnung und Hersteller Laborwaage Sartorius Cubis Semimikrowaage, Sartorius AG (Göttingen, Deutschland) pH Meter Mettler Toledo SevenMulti, Mettler-Toledo International Inc. (Columbus, Ohio, USA) Rotationsverdampfer BÜCHI Rotavapor R-114, BÜCHI Labortechnik AG (Flawil, Schweiz) Zentrifuge Heraeus Function Line Labofuge 400, Heraeus Holding GmbH (Hanau, Deutschland) Heizplatte mit Magnetrührer
Tabelle 20: Verwendete Laborgeräte
Des Weiteren wurden für die Diplomarbeit folgende Hilfsmittel verwendet:
Hilfsmittel Bezeichnung und Hersteller DC-Platten DC-Aluminium-Fertigplatten Kieselgel 60 F254, Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) Einmalkanülen HSW FINE-JECT 0,80 × 40 mm, Henke- Sass, Wolf GmbH (Tuttlingen, Deutschland) Pipetten Eppendorf Research 1000, Eppendorf AG (Hamburg, Deutschland) Spritzenvorsatzfilter Sartorius Minisart NML (Porengröße: 0,45 μm; Filtermaterial: Celluloseacetat), Sartorius AG (Göttingen, Deutschland)
Tabelle 21: Verwendete Hilfsmittel
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Abkürzungsverzeichnis
9 Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Bedeutung BPC Basispeakchromatogramm (engl.: Base peak Chromatogram) ca Circa cm Zentimeter DAD Diodenarraydetektor DC Dünnschichtchromatografie Dr. Doktor EIC Extrahiertes Ionenchromatogramm (engl.: Extracted Ion Chromatogram) ELSD Verdampfungs-Lichtstreudetektor (engl.: Evaporative Light Scattering Detector) Engl. Englisch ESI Elektrosprayionisation (engl.: Electrospray Ionisation) Et al. Und andere (lat. Et alii bzw. et aliate) F254 Fluoreszenzindikator, der bei 254 nm anregbar ist g Gramm h Stunde H2O Wasser HCl Salzsäure HPLC Hochleistungsflüssigkeitschroatografie (engl.: High Performance Liquid Chromatography) L Liter M Molar m Masse MeOH Methanol mg Milligramm min Minute mM Milimolar Mr Relative Molekülmasse MS Massenspektrometrie NMR Kernresonanz (engl.: Nuclear Magnetic Resonance) NP Normalphase o Ortho ÖAB Österreichisches Arzneibuch p Para pH Lat. Pondus Hydrogenii Pyr Pyridin RP Umkehrphase (engl.: Reversed Phase) Umdrehungen pro Minute (engl.: rounds per rpm minute) Tab. Tabelle 76
Abkürzungsverzeichnis
THyC 3,6,7 Trihydroxycumarin TIC Totalionenchromatogramm (engl.: Total Ion Chromatogram) u.a. Und andere UV Ultraviolett VIS Sichtbar (engl.: visible) z Ladungszahl z.B. Zum Beispiel °C Grad Celsius µL Mikroliter µm Mikrometer
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Lebenslauf
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Persönliche Daten
Name: Josefine Bickel Geburtsdatum: 21.01.1992 Geburtsort: Sonthofen Nationalität: Deutsch Adresse: Bachgasse 5 6020 Innsbruck
Schulische und universitäre Ausbildung 1998-2002 Grund-und Volksschule Ofterschwang 2002-2011 Gymnasium Sonthofen Seit 2011 Pharmaziestudium an der „Leopold-Franzens- Universität“ in Innsbruck
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Danksagung
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Allen voran möchte ich mich bei Frau Dr. Anja Hartmann und Herrn Professor Dr. Markus Ganzera für die ausgezeichnete Betreuung bei meiner Diplomarbeit bedanken. Dadurch konnte ich an einem sehr interessanten Themengebiet mitarbeiten, viele neue Erfahrungen sammeln und ich erhielt außerdem einen Einblick in die Forschungsarbeit. Besonders möchte ich mich bei Anja Hartmann für die Unterstützung während der praktischen Arbeit bedanken, sie beantwortete alle meine Fragen kompetent und freundlich.
Außerdem möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Fachbereiches der Pharmakognosie bedanken, für das angenehme Arbeitsklima.
Und nicht zuletzt gilt mein Dank meinen Eltern und Geschwistern, ohne euch wäre das Studium nicht möglich gewesen, sowie meinen Freunden, die mich in allen Berg- und Talfahrten der letzten Jahre begleitet und unterstützt haben.
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