Análise Citogenética Das Espécies Do Gênero Hypophthalmus (Siluriformes, Pimelodidae) Da Região Do Lago Catalão, Amazonas, Brasil

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

Análise citogenética das espécies do gênero Hypophthalmus (Siluriformes, Pimelodidae) da região do Lago Catalão, Amazonas, Brasil

LEILA BRAGA RIBEIRO

MANAUS – AM 2009

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LEILA BRAGA RIBEIRO

Análise citogenética das espécies do gênero Hypophthalmus (Siluriformes, Pimelodidae) da região do Lago Catalão, Amazonas, Brasil

ORIENTADOR(A): Eliana Feldberg, Dra. CO-ORIENTADOR: Alberto Akama, Dr.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

MANAUS – AM 2009

FICHA CATALOGRÁFICA

R484 Ribeiro, Leila Braga Análise citogenética das espécies do gênero Hypophthalmus (Siluriformes, Pimelodidae) da região do Lago Catalão, Amazonas, Brasil / Leila Braga Ribeiro.--- Manaus : [s.n.], 2009. xiii, 72f. : il. color.

Dissertação (mestrado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2009 Orientador : Eliana Feldberg Co-orientador : Alberto Akama Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. Mapará. 2. Hypophthalmus. 3. Cromossomos. 4. Citogenética. I. Título.

CDD 19. ed. 597.520415

SINOPSE

As espécies do gênero Hypophthalmus que ocorrem na região do lago Catalão foram caracterizadas citogeneticamente e o número diplóide foi igual a 56 cromossomos para todas. Porém, a fórmula cariotípica, o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva e a localização das regiões organizadoras de nucléolo foram espécie-específicas. Os dados cromossômicos obtidos evidenciam que o grupo estudado possui várias características comuns à família Pimelodidae, o que sugere uma macroestrutura cariotípica conservada para as espécies de Hypophthalmus.

Palavras-chave:

Cariótipo, Mapará, Bacia amazônica.

iii

À minha família, pelo amor e incentivo a cada desafio.

“O mundo não deve ser restringido até que seja compreendido... mas a compreensão deve ser expandida até que possa assimilar o mundo.” Francis Bacon

“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende.” Leonardo da Vinci

Apoio

Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Laboratório de Genética Animal INPA/CPBA.

MCT/INPA/PPI - Caracterização genética (cromossomos, proteínas e DNA) de vertebrados amazônicos.

MCT/CNPq/CT-Amazônia/CT-Energ nº 13/2006, Proc. 554057/2006-9 -

Biotecnologia aplicada ao estudo das populações de peixes de importância econômica para a Amazônia sob coordenação da prof. Dra. Izeni Pires Farias.

Convênio do Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) e da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM), pela concessão da bolsa de estudo.

Agradecimentos

À minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg, por me receber de braços abertos em Manaus, pela confiança depositada, pela atenção e dedicação na realização deste trabalho. Obrigada também pela compreensão, pela paciência, pela amizade e exemplo profissional.

Ao meu co-orientador, Dr. Alberto Akama, pelas sugetões, ajuda na escolha do objeto de estudo e identificação dos espécimes.

Ao Dr. Jorge Porto, pelo carinho e apoio no dia-a-dia. A todos os companheiros de laboratório, Brenda, Carlos, Claudia, Eduardo, Érica, Leandra e Rodrigo, pela ajuda e companheirismo durante o mestrado.

A Carlos Sotero e Mário Picanço, que me acompanharam nos trabalhos de campo e foram fundamentais na busca dos maparás.

Ao Dr. Roberto Ferreira Artoni, por me apresentar a citogenética e despertar meu interesse pela pesquisa. A Dr. Mara Cristina de Almeida e ao Dr. Marcelo

Ricardo Vicari, pelas aulas de genética e ensinamentos na bancada. A Miguel Airton de Carvalho, Américo Moraes Neto, e demais companheiros de laboratório da UEPG.

Ao Programa de Pós-Graduação em curso de Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva. Especialmente à secretária Alessandra, sempre disposta a atender nossas solicitações.

Aos colegas de mestrado Arlisson, Alessandra, Elizabete, Fabíola, Rodrigo e

Suzana, pelas boas conversas na hora do almoço e companhia nas disciplinas. A turma do mestrado de 2008, que me “adotou” e me acompanhou em muitos momentos de diversão. À Bárbara, Mariana e Suzana, pela amizade e carinho

vii dedicados.

Aos amigos Carlos Schneider, Maria Claudia Gross e Maria Leandra Terencio, pela ajuda nas coletas, no laboratório, pelos ensinamentos e pelas risadas no dia-a- dia. Vocês foram essenciais na execução deste trabalho e na minha adaptação em

Manaus. Obrigada à Maria Claudia pelas sugestões, pelo apoio, pelo esclarecimento de dúvidas e por atuar como “orientadora” diversas vezes.

Aos amigos Edson e Eduardo, pelas risadas, pelas conversas, pela paciência que tiveram comigo e por cuidarem de mim quando precisei. Minha estadia em

Manaus se tornou mais agradável depois que os conheci. Adoro vocês meninos!

Às velhas amigas de Iguape, Deborah, Edinah e Glauce, que apesar da distância continuam presentes em minha vida e compartilham comigo cada conquista.

Aos colegas da universidade, com os quais dividi quatro anos de muito esforço e diversão, em especial ao Neto, amigo e companheiro de citogenética.

Aos meus pais Dália e Antônio (In memorian), que além de me concederem a vida deram sentido a ela. Obrigada pelos ensinamentos, pelo amor e pela estrutura familiar que me deram. Às minhas “irmães” Cátia e Leidi, pela dedicação, pelo carinho e incentivo, vocês foram fundamentais na minha formação. Ao meu irmão Pedro, ao meu cunhado Paulo, aos meus primos Cristiane, João Carlos e Nilson, por desejarem o meu bem e torcerem pelo meu sucesso a cada desafio. Aos meus sobrinhos Miguel e Raquel, que tornam minha vida mais feliz simplesmente por existirem. Amo todos vocês!

Agradeço a todos, que de alguma maneira, contribuiram para a realização deste trabalho.

viii

Resumo

O gênero Hypophthalmus é constituído por peixes de couro e de hábito pelágico, incluindo quatro espécies válidas, três das quais (H. edentatus, H.fimbriatus e H. marginatus) ocorrem na bacia amazônica. Esse grupo apresenta uma taxonomia baseada apenas em dados morfológicos que é ainda bastante confusa. Dados citogenéticos do gênero são escassos, não existindo nenhuma informação sobre as espécies amazônicas. Com base nisso os objetivos desse trabalho foram otimizar técnicas para obtenção de cromossomos mitóticos em Hypophthalmus spp., caracterizar citogeneticamente as espécies do gênero e seus morfotipos que ocorrem no lago Catalão e buscar marcadores citogenéticos espécie-específicos que auxiliassem na elucidação taxonômica do grupo. Para isso foram capturados 167 indivíduos, pertencentes às três espécies e testadas três metodologias de obtenção de preparações cromossômicas. Desse total foi possível obter preparações cromossômicas de boa qualidade de 43 exemplares, totalizando 1192 metáfases analisadas. O número diplóide obtido para todos os indivíduos foi 56 cromossomos, sem heteromorfismo de cromossomos sexuais e sem diferença entre as espécies e seus morfotipos. Entretanto, diferenças interespecíficas foram vistas com relação à fórmula cariotípica, número fundamental e localização das RONs. As RONs foram simples e sempre localizadas na porção terminal de braços curtos de cromossomos submetacêntricos, que variaram quanto à posição no cariótipo, mostrando-se um bom marcador. Blocos heterocromáticos foram observados nas regiões centroméricas e teloméricas de vários cromossomos do complemento, porém, de uma maneira geral, foram difusos e fracamente corados com apenas alguns blocos mais conspícuos, sendo que as RONs foram positivas para banda C. A caracterização citogenética realizada nesse trabalho permite afirmar que as espécies do gênero Hypophthalmus apresentam uma macroestrutura cariotípica conservada dentro da família Pimelodidae, porém a presença de rearranjos não robertsonianos foram evidentes na diferenciação das espécies. Pode-se sugerir também que houve uma heterocromatinização, uma vez que alguns cromossomos apresentaram os braços curtos totalmente heterocromáticos.

Abstract

The genus Hypophthalmus includes pelagic catfishes and is composed by four valid species, with three of them (H. edentatus, H. fimbriatus e H. marginatus) distributed throughout Amazon basin. The species of the group are not well established and present a taxonomy based only in morphological features. The objectives of this work are: to improve cytogenetic analyses on Hypophthalmus spp. testing some methods; and to describe the karyotypic results of the genus. To undertake the study, 167 specimens from Catalão Lake representing the three species were collected and three methods were applied to obtain karyotypes. From these, 43 specimens were analyzed cytogenetically. The diploid number 2n=56 was observed in all the individuals, without evidences of sex chromosome heteromorphism or supernumerary chromosomes. Inter-specific differences were detected in karyotype formula, fundamental number and NOR localization. The constitutive heterochromatin was detected at telomeric and centromeric positions in several chromosomal pairs in all the species. The nucleolus organizer regions (Ag-NORs) were located at terminal position on short arms of the submetacentric chromosomal pairs, suggesting a positive association with heterochromatic regions. The karyotypic analysis of

Hypophthalmus spp. allowed the identification of various characters common to other members of Pimelodidae, indicating conserved characters in the group.

Sumário

Lista de Figuras ...... xii

Lista de Tabelas ...... xiii

1. Introdução ...... 1 1.1 A bacia amazônica ...... 1 1.2 Aspectos ecológicos e taxonômicos dos maparás ...... 2 1.3 Citogenética de Pimelodídeos ...... 4 1.4 Objetivos ...... 13 1.4.1 Objetivo geral ...... 13 1.4.2 Objetivos específicos ...... 13

2. Material e métodos ...... 14 2.1 Material ...... 14 2.2 Métodos ...... 17 2.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 17 2.2.2 Preparação das lâminas para visualização dos cromossomos mitóticos .... 19 2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ...... 20 2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (banda C) ...... 21 2.2.5 Análises cromossômicas ...... 21

3. Resultados ...... 23 3.1 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 23 3.2 Caracterização cariotípica de Hypophthalmus edentatus ...... 26 3.3 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus fimbriatus ...... 28 3.4 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus cf. fimbriatus ...... 30 3.5 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus marginatus ...... 32

4. Discussão ...... 34 4.1 Considerações sobre a obtenção de cromossomos metafásicos das espécies de Hypophthalmus spp...... 34 4.2 Características cromossômicas de Hypophthalmus spp...... 35 4.3 Padrão de bandeamento C e regiões organizadoras de nucléolo ...... 37 4.4 Evolução cariotípica de Hypophthalmus spp...... 40

5. Conclusões ...... 44

6. Perspectivas futuras ...... 44

7. Referências Bibliográficas ...... 45

Lista de Figuras

Figura 1. Local de coleta, região do lago Catalão...... 15

Figura 2. Exemplares de Hypophthalmus edentatus. a) H. edentatus tipo 1; b) H. edentatus tipo 2. As setas indicam a diferença no local de inserção das nadadeiras entre os dois tipos...... 15

Figura 3. Exemplares de Hypophthalmus marginatus. a) H. marginatus tipo 1; b) H. marginatus tipo 2. Setas indicando diferentes locais de inserção das nadadeiras nos dois tipos...... 16

Figura 4. Exemplar de Hypophthalmus fimbriatus...... 16

Figura 5. Exemplar classificado como H. cf. fimbriatus. Seta indicando os longos barbilhões...... 16

Figura 6. Gráfico mostrando a eficiência das técnicas empregadas para obtenção de cromossomos mitóticos em Hypophthalmus spp. Técnica 1: Moreira-Filho & Bertollo, 1990; Técnica 2: Bertollo et al. 1978; Técnica 3: Barreto-Netto et al. 2007...... 24

Figura 7. Metáfases de Hypophthalmus spp., mostrando diferenças na qualidade das preparações celulares: a) Técnica de Moreira-Filho & Bertollo, 1990; b) Técnica de Barreto-Netto et al. 2007...... 24

Figura 8. Cariótipo de H. edentatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada pela impregnação com nitrato de prata; c) coloração para banda C...... 27

Figura 9. Cariótipo de H. fimbriatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada pela impregnação com nitrato de prata; c) metáfase em coloração para banda C. As setas indicam blocos heterocromáticos terminais...... 29

Figura 10. Cariótipo de Hypophthalmus cf. fimbriatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada por impregnação com nitrato de prata; c) Coloração para banda C...... 31

Figura 11. Cariótipo de H. marginatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada pela impregnação com nitrato de prata; c) coloração para banda C...... 33

Figura 12. Hipótese filogenética proposta para a família Pimelodidae, em destaque o gênero Hypophthalmus...... 42

xii

Lista de Tabelas

Tabela 1. Dados cariotípicos da família Pimelodidae compilados da literatura (2n=número diplóide; FC=fórmula cariotípica; NF=número fundamental ou número de braços; m=metacêntrico;sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico). ... 7

Tabela 2. Dados citogenéticos de Hypophthalmus spp...... 25

xiii

1. Introdução

1.1 A bacia amazônica

A bacia amazônica é o maior sistema fluvial já conhecido, com cerca de

7.000.000 km² de área de drenagem e 23.000 km de rios navegáveis (Santos &

Ferreira, 1999). A drenagem amazônica apresenta habitats bastante heterogêneos, pois além de sua grande extensão, a bacia amazônica ainda é formada por diversas sub-bacias altamente influenciadas pelos períodos de seca e cheia, comuns na região

(Goulding et al., 2003). Essa heterogeneidade de ambientes é um dos fatores responsáveis pelo grande número de peixes de água doce da região Neotropical, que pode variar de 6.025 a 8.000 espécies (Vari & Malabarba, 1998; Reis et al., 2003).

A região amazônica apresenta a mais diversificada ictiofauna de água doce do mundo, que mesmo não estando totalmente conhecida abrange cerca de 54 famílias

(43% Characiformes, 39% Siluriformes e 3% Gymnotiformes), as quais não se distribuem uniformemente ao longo da bacia (Santos & Ferreira, 1999).

Avalia-se que 50% da ictiofauna do território brasileiro se encontra no sistema amazônico, uma vez que apenas para o rio Negro são estimadas de 700 a 950 espécies (Chao, 2001; Goulding et al., 2003). Em média, 200 espécies oriundas da bacia amazônica são direcionadas à exportação, constituindo um importante item no mercado externo, quer na forma de pescado semi-industrializado para consumo humano, quer na forma de peixes ornamentais (Santos et al., 1991; Batista, 2003).

Com relação à pesca, a Amazônia assume uma posição de destaque quando comparada às demais regiões brasileiras, tanto pela diversidade de espécies envolvidas quanto pela quantidade de pescado capturado, contribuindo com 25% da

1 produção do pescado nacional. Nos últimos anos houve uma expansão da pesca de espécies de Siluriformes na Amazônia Central, com perspectivas de ampliação

(Barthem & Fabré, 2004). Este aumento se deve ao fato de algumas espécies de peixes lisos como Brachyplatystoma vaillantii (piramutaba), Pseudoplaystoma tigrinum

(surubim) e Hypophthalmus spp. (maparás) dominarem o mercado internacional

(Cabral Jr. & Almeida, 2004).

Atualmente os representantes do gênero Hypophthalmus, conhecidos popularmente como maparás, vêm sendo objeto de estudos para a aplicação de novas técnicas, tais como “minced-fish”, também conhecida como carne mecanicamente separada (CMS), que têm como objetivo aumentar o valor agregado do pescado, visto que o mercado externo valoriza mais estes produtos, como filés, hambúrguer, entre outros (Almeida & Androczevecz, 2004; Cabral Jr. & Almeida,

2004). No estado do Amazonas, a produção pesqueira do mapará apresenta-se maior que de outras espécies amplamente comercializadas, como por exemplo: matrinchã

(Brycon spp.), pescada (Plagioscion spp.), piramutaba (Brachyplatystoma vaillantii), surubim (Pseudoplatystoma tigrinum), tambaqui (Colossoma macropomum) e pirarucu (Arapaima gigas) (Ruffino et al., 2006).

1.2 Aspectos ecológicos e taxonômicos dos maparás

O gênero Hypophthalmus foi recentemente enquadrado na família Pimelodidae

(Lunberg et al., 1991a; de Pinna, 1993) e compreende quatro espécies válidas até o momento: H. edentatus Spix & Agassiz, 1829; H. fimbriatus Kner, 1857; H. marginatus

Valenciennes, 1840; e H. oremaculatus Nani & Fuster, 1947. Distribui-se na América

2 do Sul, sendo que três das quatro espécies descritas ocorrem na bacia amazônica. H. edentatus e H. marginatus ocorrem nas bacias do Orinoco e Amazonas, e em alguns rios da Guiana, Guiana Francesa e Suriname, H. fimbriatus distribui-se apenas na bacia do rio Negro e áreas de influência desse rio, do Brasil até a Venezuela e H. oremaculatus distribui-se apenas na bacia do Paraná (Lundberg & Littmann, 2003;

Ferraris Jr., 2007).

Os maparás são peixes de couro, de corpo alongado e comprimido lateralmente

(Ferreira et al., 1998), com três pares de barbilhões, coloração acinzentada e porte grande, chegando a atingir 50 cm (López-Fernández & Winemiller, 2000; Santos et al., 2006). Diferem-se dos demais pimelodídeos quanto ao hábito alimentar e sua localização na coluna d’água, pois enquanto a maioria dos indivíduos da família possui hábito carnívoro e demersal, os maparás mostram-se planctófagos e pelágicos

(Cutrim & Batista, 2005). Formam cardumes e realizam migrações verticais diárias, relacionadas à alimentação e fuga de predadores, concentrando-se na superfície durante a noite (Barthem & Goulding, 1997; Abujanra & Agostinho, 2002).

A taxonomia do grupo é baseada em caracteres morfológicos e ainda não está completamente estabelecida. Variações morfológicas encontradas entre exemplares de H. fimbriatus que ocorrem no rio Negro e na Venezuela mostram a necessidade de uma revisão detalhada para essa espécie, com descrição de nova entidade taxonômica para os indivíduos classificados como Hypophthalmus cf. fimbriatus, ou inclusão desses em H. fimbriatus (López-Fernández & Winemiller, 2000). Além disso, análises morfológicas de H. edentatus e H. marginatus sugerem que essas duas espécies sejam subdivididas em dois grupos cada uma, e que a espécie H.

3 oremaculatus, de ocorrência restrita à bacia do Paraná, seria na verdade um dos subgrupos de H. edentatus (Michael Littmann com. pess.).

Essa subdivisão de H. edentatus e H. marginatus baseia-se em diferenças morfológicas observadas em exemplares da mesma espécie, principalmente com relação ao local de inserção da nadadeira dorsal, ao comprimento dos barbilhões e ao número de vértebras. Assim sendo, registra-se para a bacia amazônica a ocorrência de seis grupos: H. edentatus tipo 1, H. edentatus tipo 2, H. fimbriatus, H. cf. fimbriatus, H. marginatus tipo 1 e H. marginatus tipo 2 (Michael Littmann com. pess.).

O emprego de técnicas genéticas é de fundamental importância para elucidar problemas taxonômicos, como os encontrados no gênero Hypophthalmus, principalmente por meio da citotaxonomia.

1.3 Citogenética de Pimelodídeos

A citotaxonomia pode ser definida como a nomeação e designação de organismos a táxons, utilizando a citogenética como ferramenta auxiliar, a qual permite individualizar espécies por meio de características cromossômicas. A citotaxonomia está intimamente ligada à citogenética, que é a ciência que estuda os cromossomos, seja de forma isolada ou direcionada ao conjunto cromossômico de uma espécie, abrangendo aspectos morfológicos, funcionais e evolutivos (Guerra,

1988). Os estudos citotaxonômicos realizados com peixes têm como principais ferramentas para a compreensão da estrutura organizacional dos cromossomos a determinação do número diplóide e a fórmula cariotípica. Outros marcadores eficazes

4 na caracterização de espécies são a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) no cromossomo e no cariótipo e o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva no cariótipo. As regiões organizadoras de nucléolo são regiões cromossômicas envolvidas na transcrição de RNA ribossomal, enquanto o padrão de heterocromatina indica como o genoma eucariótico está organizado

(Feldberg et al. 1993; Almeida-Toledo, 1998; Margarido & Galetti Jr., 1999).

A citogenética tem contribuído significativamente no que diz respeito ao conhecimento da biodiversidade genética e da evolução dos peixes amazônicos, principalmente na identificação de espécies crípticas (Nakayama et al., 2001; Teixeira et al., 2006; Nakayama et al., 2008), na detecção de polimorfismos intra-específicos

(Nakayama et al., 2000; Centofante et al., 2002; Mesquita et al., 2008), na detecção de cromossomos supranumerários (Feldberg et al., 2004), na identificação de híbridos

(Alves-Brinn et al., 2004), na determinação de sistemas de cromossomos sexuais (de

Oliveira et al., 2007; 2008; Terencio et al., 2008) e evolução cromossômica

(Benzaquem et al., 2008).

A família Pimelodidae inclui 93 espécies, distribuídas em 29 gêneros (Ferraris

Jr., 2007), e do ponto de vista citogenético apenas 28 espécies válidas foram estudadas. O número diplóide predominante nesta família é 56 cromossomos, entretanto: 2n=50 (Pinirampus pirinampu e Callophysus macropterus); 2n=54

(Pimelodus sp., P. fur e Megalonema platanum) e 2n=58 (Pimelodus blochii e P. cf. maculatus) também foram observados (Tabela 1). Por outro lado, os pimelodídeos mostram variabilidade quanto à estrutura cariotípica, ou seja, no número fundamental, sugerindo a presença de rearranjos do tipo inversão pericêntrica e/ou translocações, os quais modificam o tipo cromossômico, mas não o número diplóide (Swarça et al., 5

2006). Além disso, cromossomos B foram encontrados em seis espécies e um caso de sistema sexual do tipo XX/XY foi descrito para Steindachneridion melanodermatum

(Tabela 1).

Em relação às espécies amazônicas observa-se uma carência de dados citogenéticos, principalmente no que se refere aos maparás (Tabela 1), visto que para o gênero Hypophthalmus só existe a descrição do número diplóide para H. edentatus da bacia do Paraná (Martins-Santos et al., 1990). Entretanto, essa espécie pode ser na verdade a espécie descrita como H. oremaculatus, que tem ocorrência restrita à bacia do Paraná, e que assim como H. edentatus possui taxonomia confusa.

Considerando a crescente pressão de pesca sobre os estoques pesqueiros de espécies do gênero Hypophthalmus (Cutrim & Batista, 2005) e a taxonomia incerta do grupo, como mencionado anteriormente, uma caracterização cromossômica é de fundamental importância para a correta determinação das espécies desse grupo.

Tabela 1. Dados cariotípicos da família Pimelodidae compilados da literatura (2n=número diplóide; FC=fórmula cariotípica; NF=número

fundamental ou número de braços; m=metacêntrico;sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; a=acrocêntrico).

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual Bergiaria Rio São 42m,sm+14st 56 112 0-5 Dias & Foresti (1993) westermanni Francisco (MG)

Calophysus Rios Negro e rio 50 22m+18sm+10a 90 Ramírez-Gil et al.(1998) macropterus Solimões (AM) Rio Araguaia 56 40m,sm+16st,a 96 Faria et al. (2000) (MT) Hemisorubim Rio Araguaia 56 Silva et al. (2004) platyrhynchos (MT)

Rio Paraná 56 22m+18sm+6st+10a 102 Martins-Santos et al. (1996)

Hypophthalmus Bacia do Paraná 56 Martins-Santos et al. (1990) edentatus*

Rio Mogi-Guaçu 56 26m+14sm+12st+4a 108 Dias & Foresti (1990) (SP)

Rio Tibagi (PR) 56 42m,sm+14st,a 98 Garcia et al. (1990)

Iheringichthys Pe. Jurumim 56 22m+18sm+10st+6a 106 Vissotto et al. (1999) labrosus (SP)

Rio Tibagi (PR) 56 32m+8sm+6st+10a 102 Carvalho et al. (2004)

Rio Tibagi (PR) 56 14m+32sm+4st+6a 106 Ribeiro et al. (2008)

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual Megalonema Rio Paraná 54 14m+18sm+12st+10a 98 Sanches (2006) platanum (Argentina) Parapimelodus Rio Guaíba (RS) 56 Costa & Reggi (1986) valenciennis

Phractocephalus Piscicultura 56 Castilho-Almeida et al. (1997) hemioliopterus

Pimelodus 24m+18sm+8st+6a Rio Paraná (PR) 56 106 Borin & Martins-Santos (2002) absconditus

Rio Paraguai 24m+16sm+12st+4a P. argenteus 56 108 Souza et al. (2003) (MS)

Rio Araguaia 56 36m,sm+20st,a 92 Faria & Venere (2000) (MT)

Rio Araguaia P. blochii 56 36m,sm+20st,a 92 Silva et al. (2004) (MT)

Rio Solimões 58 Della-Rosa et al. (1980) (AM)

Argentina 56 Fenocchio et al. (1994) P. clarias Uruguai 56 Gonzales (1994)

Não definida 56 30m+14sm+12a 100 Toledo & Ferrari (1976a)

P. fur Rio São 54 32m+8sm+6st+8a 100 Garcia & Moreira-Filho (2005) Francisco (MG)

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual Rio Tibagi (PR) 56 22m+22sm+6st+6a 106 Souza et al. (2004) P. heraldoi Rio Piquiri (PR) 56 18m+24sm+6st+8a 104 Treco & Dias (2009) Não definida 56 30m+14sm+12a 100 Toledo & Ferrari (1976b) Rio Guaíba (RS) 56 Costa & Reggi (1986) Araquari (MG) 56 56m,sm,st,a Moreira et al. (2004) Rio São 40m,sm+16st,a 56 96 Dias & Foresti (1993) Francisco (MG) Rio Mogi-Guaçu 40m,sm+16st,a 56 96 Dias & Foresti (1993) (SP) Rio Sapucaí 56 40m,sm+16st,a 96 Marques et al. (1998) (MG) Vasconcelos & Martins-Santos Rio Paraná (PR) 56 (2000) Pe.Jurumirim 56 Vissotto et al. (1999)

Rio Paraná (PR) 56 20m+20sm+10st+6a 106 Swarça et al. (2001a) Rio Paraná (PR) 56 20m+20sm+10st+6a 106 Borin & Martins-Santos (2002)

D.Paranaense 56 24m+14sm+12st+6a 106 Heras & Mendoza (2002)

Rio Tejuco (MG) 56 56m,sm,st,a Moreira et al. (2004)

Rio Paraguai P. maculatus 56 22m+16sm+10st+8a 104 Souza et al. (2003) (MS) 56m,sm,st,a São Caetanos Moreira et al. (2004)

Rio São 56 32m+12sm+12st 112 Garcia & Moreira-Filho (2005) Francisco (MG)

Rio 56 20m+20sm+10st+6a 106 Mazzuchelli et al. (2007) Paranapanema

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual P. cf. maculatus Rio Jari (PA) 58 30m,sm+28st,a 116 Souza et al. (2000)

Rio Paraguai P. mysteriosus 56 26m+20sm+2st+8a 104 Souza et al. (2003) (MS) 18m+22sm+6st+10a Rio Paraná (PR) 56 102 Abucarma & Martins-Santos (1996)

P. ornatus 20m+18sm+8st+10a Rio Paraná (PR) 56 102 Borin & Martins-Santos (2002)

24m+18sm+8st+6a Rio Iguaçu (PR) 56 106 0-4 Terencio et al. (2001)

P. ortmanni 24m+18sm+8st+6a Rio Iguaçu (PR) 56 106 Borin & Martins-Santos (2004)

P. paranaensis Rio Piquiri (PR) 56 22m+22sm+4st+8a 104 Treco & Dias (2009) 30m+14sm+12a Não definida 100 Toledo & Ferrari (1976b)

22m+22sm+4st+8a Rio Iguaçu (PR) 56 104 Dias & Foresti (1993)

24m+26sm+4st+2a Rio Iguaçu (PR) 56 110 Souza et al. (2004)

30m+14sm+8st+4a Rio Iguaçu (PR) 56 108 0-4 Borin & Martins-Santos (2004)

Pimelodus sp. Rio São 32m+12sm+6st+6a 56 106 Garcia & Moreira-Filho (2005) Francisco (MG)

Rio Tejuco (MG) 54 54m,sm,st,a Moreira & Morelli (2001)

Rio Araguari 54m,sm,st,a 54 Moreira & Morelli (2001) (MG)

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual

26m+12sm+2st+10a Rio Tibagi (PR) 50 90 Swarça et al. (1999)

Pinirampus Vasconcelos & Martins-Santos pirinampu Rio Paraná (PR) 50 22m+12sm+4st+12a 88 (2000)

Araguari (MG) 50 Molina & Morelli (2004)

Coxim (MS) 56 42m,sm+14st,a 98 Souza et al. (1992)

18m+18sm+10st+10a Rio Mogi-Guaçu 56 102 Bigoni et al. (1992)

Três Marias 56 20m+12sm+12st+12a 100 Fenocchio (1993) (MG)

Porto Rico (PR) 56 18m+16sm+10st+12a 100 Martins-Santos et al. (1996)

Pseudoplatystoma 18m+18sm+10st+10a corruscans Rio Mogi-Guaçu 56 102 Borin & Martins-Santos (2002)

26m+10sm+6st+14a Swarça et al. (2005) Rio Paraná (PR) 56 98

Rio Paraguai 20m+16sm+8st+12a Swarça et al. (2005) 56 100 (MS)

Rio Miranda 56m,sm 56 112 Porto-Foresti et al. (2003) (MT)

Sist. Espécie Localidade 2n FC NF Crom. B Referência Sexual Rio Aquidauana 56m,sm 56 112 Porto-Foresti et al. (2003) (MG) P. corruscans Rio Paraguai 56m,sm 56 112 Porto-Foresti et al. (2003) (MS) Rio Solimões 18m+14sm+10st+14a P. fasciatum 56 98 Fenocchio & Bertollo (1992) (AM) Rio Solimões 18m+16sm+8st+14a P. tigrinum 56 98 Fenocchio & Bertollo (1992) (AM) Rio Solimões 18m+12s+14st+12a 56 100 Fenocchio & Bertollo (1992) (AM) Sorubim lima 20m+14sm+10st+12a Porto Rico (PR) 56 100 Martins-Santos et al. (1996)

Rio 24m+20sm+4st+8a Swarça et al. (2005) Paranapanema 56 104

Steindachneridion (PR) scriptum 24m+20sm+4st+8a Swarça et al. (2005) Rio Tibagi (PR) 56 104

Steindachneridion 20m+24sm+2st+10a XX/ Swarça et al. (2006) Rio Iguaçu (PR) 56 melanodermatum 21m+23sm+2st+10a 102 XY

Foz do Iguaçu 26m+10sm+6st+14a 98 56 Martins-Santos et al. (1996) (PR) Zungaro zungaro 32m+6sm+8st+10a 102 Jupiá (SP) 56 Swarça et al. (2001b)

* Esta espécie pode ser a descrita como H. oremaculatus, de ocorrência restrita à bacia do Paraná.

1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo geral

Fazer um estudo cromossômico das espécies de mapará que ocorrem na região do Catalão (Hypophthalmus edentatus tipo 1, H. edentatus tipo 2, H. fimbriatus, H. cf. fimbriatus, H. marginatus tipo 1 e H. marginatus tipo 2) para se detectar possíveis marcadores que possam auxiliar na taxonomia destes peixes.

1.4.2 Objetivos específicos

a) Determinar o cariótipo das espécies do gênero Hypophthalmus que ocorrem na região do Catalão.

b) Estabelecer o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva e das regiões organizadoras de nucléolo das espécies estudadas.

c) Verificar a ocorrência de variabilidade cariotípica intra-específica.

d) Identificar marcadores cromossômicos espécie-específicos.

2. Material e métodos

2.1 Material

A coleta dos exemplares ocorreu na região do lago Catalão (3º09’57’’S,

59º54’44’W), a qual está situada próximo à confluência dos rios Negro e Solimões

(Figura 1). Tal lago conecta-se ao rio Negro de forma quase permanente e ao rio

Solimões por um curto canal após os primeiros meses de subida das águas. Sendo assim, o nível de água do lago Catalão varia de acordo com o nível dos rios adjacentes, oferecendo abrigo e alimento a diversas espécies e servindo de local de desova para muitos peixes (Leite et al., 2006).

As atividades de campo foram realizadas em períodos de cinco dias nos meses de setembro/2007, fevereiro/2008, junho/2008 e novembro/2008, com o objetivo de encontrar os animais em período de migração, que ocorre nos períodos de enchente e vazante, visto que os mesmos utilizam o lago como local de desova. Os indivíduos foram coletados no período noturno, quando se concentram na superfície d’água, com o auxílio de malhadeiras. As medidas das malhadeiras foram de 2,80m de altura,

55,0m de comprimento e com distância entrenós de 25x30mm e 25x 5mm.

Capturou-se um total de 167 indivíduos, distribuídos entre as três espécies do gênero: Hypophthalmus edentatus, H. fimbriatus e H. marginatus. No caso das espécies H. edentatus e H. marginatus que apresentam dois subtipos, foram obtidos exemplares de cada subtipo (Figuras 2 e 3). Foram capturados também alguns indivíduos que apresentavam longos barbilhões maxilares, diferentes dos observados em H. marginatus, mas menos espessos do que os presentes em H. fimbriatus

(Figura 4). Tais espécimes foram tratados como H.cf. fimbriatus, como sugerido em

López-Fernández & Winemiller (2000) (Figura 5). Os peixes coletados foram levados vivos ao Laboratório do Flutuante do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia –

INPA, no Catalão, onde foram obtidas as suspensões celulares.

Figura 1. Local de coleta, região do lago Catalão (Modificado de Teixeira et al., 2002).

Figura 2. Exemplares de Hypophthalmus edentatus. a) H. edentatus tipo 1; b) H. edentatus tipo 2. As setas indicam a diferença no local de inserção das nadadeiras entre os dois tipos. 15

Figura 3. Exemplares de Hypophthalmus marginatus. a) H. marginatus tipo 1; b) H. marginatus tipo 2. Setas indicando diferentes locais de inserção das nadadeiras nos dois tipos.

Figura 4. Exemplar de Hypophthalmus fimbriatus.

Figura 5. Exemplar classificado como H. cf. fimbriatus. Seta indicando os longos barbilhões.

2.2 Métodos

2.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos

Para obtenção dos cromossomos mitóticos os animais foram anestesiados em

água gelada e sacrificados em seguida. Foi retirada a porção anterior e/ou posterior do rim, órgão hematopoiético dos peixes. Em virtude dos maparás morrerem com muita facilidade em situação de estresse, três técnicas foram testadas e adaptadas, visando otimizar a obtenção de cromossomos em metáfase. Após a preparação cromossômica todos os exemplares foram fixados em formol 10%, lavados e guardados em álcool 70%, para posteriormente serem depositados na coleção ictiológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

A primeira técnica testada foi descrita por Moreira-Filho & Bertollo (1990), que consiste na adição de colchicina “in vitro”. Nessa metodologia a porção anterior do rim foi colocada em 15mL de solução hipotônica de KCL 0,075M e dissociada com pinças de dissecação e seringas de vidro desprovidas de agulha. Em seguida colocou-se 0,5 mL de colchicina na concentração de 0,0062% e a suspensão celular foi mantida em banho-maria a 37° C por 30 minutos. Após esse tempo, o material foi ressuspendido e transferido para um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Adicionou- se 0,3 mL de fixador Carnoy (metanol: ácido acético 3:1) à suspensão celular, que foi centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm e teve seu sobrenadante posteriormente descartado. Ressuspendeu-se o material novamente com o auxílio de uma pipeta

Pasteur, e adicionou-se 8 mL de fixador Carnoy à suspensão antes de nova centrifugação a 900 rpm por 10 minutos. Esse procedimento foi repetido por mais duas vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5 mL de

17 fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. Essa suspensão celular foi então estocada em tubo tipo “eppendorf” e mantida em freezer (-10º C).

A segunda metodologia (Bertollo et al., 1978), que consiste na aplicação da colchicina “in vivo”, sofreu modificações e foi testada apenas nos indivíduos que apresentaram maior resistência, sobrevivendo por cerca de uma hora em aquário bem aerado. Injetou-se intraperitonealmente uma solução de colchicina 0,0062% na proporção de 1mL para cada 100 g de peso do animal. Os peixes foram mantidos em aquários por cerca de 50 minutos. Em seguida os indivíduos foram sacrificados e tiveram a porção anterior do rim retirada, a qual foi colocada em uma solução hipotônica de KCL 0,075M e divulsionada com o auxílio de uma seringa de vidro. Em seguida, retirou-se o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta Pasteur, que foi colocado em tubo de centrífuga. A suspensão celular foi incubada a 37 °C por 30 minutos. Esse material foi pré-fixado com seis gotas de metanol:ácido acético (3:1) e ressuspendido. Essa suspensão ficou em repouso por 5 minutos e centrifugado por

10 minutos a 900 rpm. O sobrenadante foi desprezado e completou-se para 6mL com fixador, ressuspendendo o material novamente. A suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 900 rpm, descartando o sobrenadante e completando para 6mL de fixador.

Esse processo foi repetido por mais duas vezes. Após a última centrifugação e a eliminação do sobrenadante, 1,5 mL de fixador foram adicionados e o material ressuspendido. Essa suspensão celular foi estocada em tubo “eppendorf” e mantida em freezer para posterior análise.

A terceira metodologia testada foi descrita por Barreto Netto et al. (2007), que consiste na utilização de meio de cultura RPMI 1640. Uma porção pequena do rim foi retirada, lavada em meio RPMI 1640 gelado e dissociada em 5mL de meio RPMI 18

1640 gelado, com auxílio de pinças de dissecação e seringas sem agulha. A suspensão foi transferida para um tubo de centrífuga, completando para 10 mL com meio RPMI 1640. Essa suspensão foi mantida refrigerada por um período de 12 horas. Passado esse tempo adicionou-se 10 gotas de colchicina a 0,0062% e o material foi mantido em temperatura ambiente por 30 minutos. O material foi centrifugado a 900 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante foi descartado.

Acrescentou-se 10 mL de solução hipotônica KCL 0,075M e após a homogeneização a suspensão foi mantida em temperatura ambiente por 20 minutos. Cinco gotas de fixador Carnoy recém preparado na proporção 3:1 (metanol: ácido acético) foram adicionadas à suspensão e o material foi novamente centrifugado a 900 rpm por 10 minutos. Após o descarte do sobrenadante foram adicionados 6mL de fixador. O material foi ressuspendido e submetido à nova centrifugação a 900 rpm durante 10 minutos, sendo o sobrenadante posteriormente descartado. Tal procedimento foi repetido mais duas vezes. Após a última centrifugação o sobrenadante foi descartado e adicionou-se 1,5 mL de fixador Carnoy, previamente preparado na proporção 1:1

(metanol: ácido acético). Tal suspensão foi armazenada em tubo “eppendorf” e mantida em freezer (-10º C) para análise posterior.

2.2.2 Preparação das lâminas para visualização dos cromossomos mitóticos

Para a visualização dos cromossomos mitóticos, as lâminas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente imersas em água destilada a 50º C, em banho-maria.

Após cinco minutos, as lâminas foram retiradas do banho-maria de forma a manter uma película de água sobre a sua superfície, sobre a qual foi gotejada a suspensão 19 celular em diferentes regiões. As lâminas foram secas diretamente ao ar, sendo posteriormente coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 15 minutos, lavadas em água destilada, secas ao ar e analisadas ao microscópio

óptico.

2.2.3 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs)

Para a caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (RON) foi utilizada a técnica de precipitação de cristais de Prata (Ag-RON), descrita por Howell

& Black (1980), com pequenas modificações. A técnica consiste em pingar sobre a lâmina com a preparação cromossômica uma gota de uma solução coloidal, obtida com 1g de gelatina comercial sem sabor dissolvida em 50 mL de água destilada e acrescida de 0,5 mL de ácido fórmico. Em seguida, adicionou-se sobre a solução coloidal duas gotas de solução aquosa de AgNO3 (Nitrato de Prata) a 50%. A lâmina foi levemente agitada e coberta com lamínula. A lâmina foi mantida sobre chapa aquecedora a 60 ºC por cerca de 5 minutos. Em seguida foi lavada em água destilada de forma a permitir que a lamínula fosse retirada com o próprio jato de água. As lâminas secaram diretamente ao ar. Para facilitar a visualização das metáfases algumas lâminas foram posteriormente coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato

0,06M e pH 6,8 por 2 minutos, lavadas em água corrente e secas ao ar.

2.2.4 Detecção da heterocromatina constitutiva (banda C)

Para a caracterização da heterocromatina constitutiva utilizou-se a técnica de banda C descrita por Sumner (1972), com adaptações.

As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 46 ºC, lavadas em água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Em seguida, as lâminas foram incubadas em solução de hidróxido de bário a 5%, recém preparada e filtrada, a 46 ºC, por 2 minuto e 30 segundos.

Interrompeu-se a ação do hidróxido de bário imergindo-se a lâmina em solução de

HCl 0,2N (46 ºC) por cerca de 30 segundos, sendo posteriormente lavada em água destilada. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC (Cloreto de

Sódio 0,3M e Citrato Trisódico 0,03M, pH 6,8) em banho-maria a 60 ºC, por um período de 15 minutos, lavadas e secas ao ar. Posteriormente foram coradas com

Giemsa 10% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 20 minutos, lavadas em água corrente e secas novamente ao ar.

2.2.5 Análises cromossômicas

As preparações cromossômicas foram analisadas em microscópio óptico comum com objetiva de imersão e as células selecionadas foram fotografadas, com máquina digital Sony Cybershot 7.2MP ou em fotomicroscópio Olympus Bx-51. A montagem dos cariótipos se deu com auxílio do programa Adobe Photoshop, versão

CS3, a partir de cromossomos metafásicos mitóticos, os quais foram recortados e tentativamente emparelhados. Os cromossomos foram medidos pelo programa livre

ImageJ e colocados em ordem decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica

21 foi determinada levando em consideração a posição do centrômero, segundo a proposta de Levan et al. (1964). Os cromossomos mitóticos foram agrupados com base no índice de relação de braços (RB=comprimento do braço maior/comprimento do braço menor), de acordo com a seguinte classificação: metacêntricos (m) (RB=

1,0-1,70), submetacêntricos (sm) (RB=1,71-3,00), subtelocêntricos (st) (RB=3,01-

7,00) e acrocêntricos (a) (RB>7,00). O número fundamental (NF) foi determinado de acordo com o número de braços cromossômicos, considerando-se os metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e os cromossomos acrocêntricos como tendo apenas um braço.

3. Resultados

3.1 Obtenção de cromossomos mitóticos

Realizou-se análise citogenética de 167 exemplares pertencentes ao gênero

Hypophthalmus (7 H. edentatus tipo 1, 13 H. edentatus tipo 2, 3 H. fimbriatus, 8 H. cf. fimbriatus, 107 H. marginatus tipo 1 e 29 H. marginatus tipo 2). Entretanto, cromossomos mitóticos, em condições de análise, só foram obtidos em 43 indivíduos: dois H. edentatus tipo 1 (1 fêmea, 1 macho), sete H. edentatus tipo 2 (3 fêmeas, 4 machos), três H. fimbriatus (2 fêmeas, 1 macho), cinco H. cf. fimbriatus (2 fêmeas, 3 machos), 24 H. marginatus tipo 1 (10 fêmeas, 9 machos, 5 com sexo indeterminado) e dois H. marginatus tipo 2 (1 fêmea, 1 com sexo indeterminado), o que representa apenas 25,74% de sucesso na obtenção de cromossomos mitóticos destes peixes.

As três técnicas foram utilizadas de início como descritas pelos autores, mas ainda passaram por algumas modificações, como por exemplo, a alteração da concentração de colchicina para 0,0062% e tempo de hipotonização. Comparando as três técnicas utilizadas neste trabalho, a que permitiu obter cromossomos com melhor qualidade para análise citogenética em Hypophthalmus spp. foi a descrita por Barreto

Netto et al. (2007). Tanto a metodologia descrita por Moreira-Filho & Bertollo (1990), quanto a descrita por Bertollo et al. (1978), apresentaram um índice baixo de metáfases e a qualidade das mesmas não foi satisfatória para análise dos cromossomos (Figura 6). Na metodologia com meio de cultura a longo prazo foi possível observar maior número de metáfases e cromossomos de melhor qualidade, principalmente no que diz respeito ao nível de compactação dos mesmos (Figura 7).

Figura 7. Metáfases de Hypophthalmus spp., mostrando diferenças na qualidade das preparações celulares: a) Técnica de Moreira-Filho & Bertollo, 1990; b) Técnica de Barreto- Netto et al. 2007.

Para a determinação do número diplóide das espécies foi analisado um total de

1192 metáfases, sendo que todos os exemplares apresentaram 2n=56 cromossomos e ausência de heteromorfismo cromossômico sexual. Porém, variações na fórmula cariotípica e localização da região organizadora de nucléolo foram verificadas entre as espécies (Tabela 2).

Tabela 2. Dados citogenéticos de Hypophthalmus spp (presente trabalho).

Número Número Localização Espécie Fórmula Cariotípica Diplóide Fundamental da RON H. edentatus 2n=56 18m+20sm+6st+12a NF=100 Par nº 13 (sm)

H. fimbriatus 2n=56 18m+16sm+6st+16a NF=96 Par nº 11 (sm)

H. cf. fimbriatus 2n=56 10m+22sm+10st+14a NF=98 Par nº 10 (sm)

H. marginatus 2n=56 12m+22sm+8st+14a NF=98 Par nº 16 (sm)

3.2 Caracterização cariotípica de Hypophthalmus edentatus

Os indivíduos pertencentes a H. edentatus apresentaram um número diplóide modal de 56 cromossomos sem heteromorfismo de cromossomos sexuais. A fórmula cariotípica foi igual a 18m+20sm+6st+12a e NF=100 (Figura 8a). A impregnação por nitrato de Prata (Ag-RON) evidenciou a região organizadora de nucléolo em posição terminal, nos braços curtos de um par submetacêntrico, provavelmente o par 13, coincidente com a constrição secundária visível em coloração convencional (Figura

8b). A distribuição da heterocromatina constitutiva se deu em porções terminais e centroméricas de vários cromossomos do complemento. Os pares cromossômicos 1 e 3 apresentaram blocos heterocromáticos centroméricos e biteloméricos, e cerca de cinco pares submetacêntricos mostraram os braços curtos totalmente heterocromáticos. A RON também foi positiva para banda C (Figura 8c).

Apesar de H. edentatus ser morfologicamente diferenciada em tipo 1 e tipo 2, nenhuma diferença citogenética foi verificada entre os subtipos, seja em fórmula cromossômica, posição da região organizadora de nucléolo ou padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva.

Figura 8. Cariótipo de H. edentatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada pela impregnação com nitrato de prata; c) coloração para banda C.

3.3 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus fimbriatus

Os indivíduos pertencentes a H. fimbriatus apresentaram um número diplóide modal de 56 cromossomos sem heteromorfismo de cromossomos sexuais. A fórmula cariotípica foi igual a 18m+16sm+6st+16a e NF=96 (Figura 9a). A região organizadora de nucléolo foi observada em posição terminal, nos braços curtos de um par submetacêntrico, provavelmente o de número 11 (Figura 9b). Nessa espécie o resultado de banda C não foi satisfatório para se determinar o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva, devido principalmente à qualidade das metáfases.

Porém, pode-se observar uma quantidade menor de blocos heterocromáticos, comparada à H. edentatus e estes foram observados, principalmente em porções teloméricas (Figura 9c).

3.4 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus cf. fimbriatus

Os indivíduos pertencentes a H.cf. fimbriatus apresentaram um número diplóide modal de 56 cromossomos, sem heteromorfismo de cromossomos sexuais. A fórmula cariotípica foi igual a 10m+22sm+10st+14a e NF=98 (Figura 10a). A localização da região organizadora de nucléolo foi detectada no par submetacêntrico número 10, ora marcando apenas um dos homólogos e ora apresentando comportamento de associação de RONs (Figura 10b), visível inclusive com coloração convencional. Nas metáfases em que a associação não foi observada apenas um dos cromossomos do par subtelocêntrico apresentou marcação positiva para o nitrato de prata, com heteromorfismo de tamanho das RONs. Esse padrão foi visto apenas nessa espécie e mostrou-se positivo para a banda C. Essa espécie apresentou também poucos blocos heterocromáticos no complemento cromossômico, os quais estão distribuídos em regiões terminais e centroméricas, porém marcações biteloméricas foram evidenciadas apenas no par subtelocêntrico número 17 (Figura 10c).

Figura 10. Cariótipo de Hypophthalmus cf. fimbriatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo em associação evidenciada por impregnação com nitrato de prata; c) Coloração para banda C (par nucleolar em associação).

3.5 Caracterização cromossômica de Hypophthalmus marginatus

Os indivíduos pertencentes a H. marginatus apresentaram um número diplóide modal de 56 cromossomos, sem heteromorfismo de cromossomos sexuais. A fórmula cariotípica foi igual a 12m+22sm+8st+14a e NF=98 (Figura 11a). A localização da região organizadora de nucléolo foi detectada no par submetacêntrico número 16

(Figura 11b), coincidente com a constrição secundária. Essa espécie apresentou blocos heterocromáticos distribuídos nas porções teloméricas e centroméricas em vários cromossomos do complemento, inclusive alguns biteloméricos. Pelo menos em seis pares (4, 8,10, 12, 20,21) os braços curtos foram totalmente heterocromáticos. A região organizadora de nucléolo foi positiva para a banda C (Figura 11c).

Apesar de H. marginatus ser morfologicamente diferenciado em tipo 1 e tipo 2, nenhuma diferença citogenética foi verificada entre os subtipos, seja em fórmula cromossômica ou padrões de bandeamento.

Figura 11. Cariótipo de H. marginatus: a) em coloração convencional; b) região organizadora de nucléolo evidenciada pela impregnação com nitrato de prata; c) coloração para banda C.

4. Discussão

4.1 Considerações sobre a obtenção de cromossomos metafásicos das espécies de Hypophthalmus spp.

A extrema fragilidade dos maparás dificultou a obtenção de preparações cromossômicas de boa qualidade, pois muitos exemplares já se encontravam mortos antes de serem retirados das malhadeiras. Os indivíduos retirados com vida não sobreviviam tempo suficiente para receberem tratamento adequado, como por exemplo, a indução de mitoses por uso de fermento biológico, que necessitaria da sobrevivência por no mínimo 24 horas. Devido a isso, tanto a técnica de colchicina “in vitro” (Moreira-Filho & Bertollo, 1990) quanto a técnica de colchicina “in vivo” (Bertollo et al., 1978) mostraram-se pouco eficazes na obtenção de cromossomos mitóticos, provavelmente pelo fato da divisão celular não ser estimulada anteriormente. Tal fato resultou em suspensões com baixo índice metafásico e cromossomos muito condensados, dificultando a análise citogenética.

De forma geral, a obtenção de cromossomos metafásicos em pimelodídeos não é tida como fácil, o que pode ser percebido nos resultados compilados na Tabela

1, onde não foi possível determinar a fórmula cariotípica de várias espécies e em algumas delas os cromossomos foram classificados em apenas dois grupos (m-sm; st-a), o que evidencia a dificuldade em se determinar a morfologia cromossômica.

A metodologia que mostrou maior eficiência na obtenção de cromossomos mitóticos em Hypophthalmus spp. foi a descrita por Barreto Netto et al. (2007), que consiste em manter o órgão hematopoiético dos peixes em meio de cultura RPMI

1640 por um período mínimo de 12 horas. Isso permitiu a indução da atividade

34 mitótica nas células incubadas e favoreceu a sincronização da divisão celular, resultando em maior número de metáfases.

Também foi observado que os indivíduos apresentavam cromossomos pequenos e de difícil visualização, sendo assim, realizou-se testes para encontrar uma concentração de colchicina adequada. Utilizou-se colchicina a 0,0062% pois nessa concentração o grau de condensação cromossômica diminuiu, tornando possível a determinação da fórmula cariotípica e de bandeamentos cromossômicos, que até o momento não haviam sido efetuados em espécies desse gênero. Essa técnica foi utilizada após vários testes, nos quais diversos indivíduos foram sacrificados sem sucesso na obtenção de cromossomos mitóticos, e devido a isso os resultados aqui apresentados são de apenas 25,74% do total de exemplares analisados. Entretanto, o número diplóide e a fórmula cromossômica puderam ser determinados com segurança.

4.2 Características cromossômicas de Hypophthalmus spp.

A maioria das espécies da família Pimelodidae apresenta um número diplóide igual a 56 cromossomos, como pode ser observado na Tabela 1. Das 29 espécies descritas citogeneticamente, 27 apresentaram 2n=56 cromossomos, sendo que três dessas ainda mostraram uma variação no número diplóide em algumas populações

(Pimelodus blochii – Della-Rosa et al. (1980); Pimelodus sp. – Moreira & Morelli

(2001); P. fur – Garcia & Moreira-Filho (2005).

Considerando os números fundamentais (NF) descritos na Tabela 1, pode-se observar que há uma variação de 92 a 112. Portanto, apesar de compartilharem o mesmo número diplóide, o NF, as fórmulas cariotípicas e a localização das RONs no 35 cariótipo variam de forma considerável. Também se pode observar na Tabela 1 que uma mesma espécie quando coletada em mais de uma localidade pode possuir até oito fórmulas cariotípicas, como por exemplo, Pimelodus maculatus e

Pseudoplatystoma corruscans.

As três espécies de Hypophthalmus aqui analisadas (H.edentatus, H. fimbriatus e

H. marginatus), mais H. cf. fimbriatus, também apresentaram 2n=56 cromossomos, número também encontrado para H. edentatus da bacia do Paraná por Martins-

Santos et al. (1990), e considerado ancestral para a ordem Siluriformes (Oliveira &

Gosztonyi, 2000). Apesar de compartilharem o número diplóide as fórmulas cariotípicas entre os quatro grupos variaram, o que evidencia a presença de rearranjos não robertsonianos.

Rearranjos cromossômicos não robertsonianos têm sido considerados por alguns autores como os mais importantes na diferenciação cariotípica da família Pimelodidae

(Garcia & Moreira-Filho, 2005; Mazzuchelli et al., 2007), uma vez que a morfologia cromossômica é alterada e o número diplóide mantido. Segundo Andreata et al.

(2006), variações no número fundamental em peixes podem estar relacionadas com a presença de segmentos positivos para banda C, já que o acúmulo desses segmentos pode mudar a morfologia cromossômica.

Em Hypophthalmus spp. as diferenças nas fórmulas cariotípicas indicam a ocorrência de rearranjos cromossômicos, como por exemplo inversões pericêntricas.

Entretanto, no caso específico dessas espécies, essa variação também poderia estar relacionada a rearranjos do tipo duplicação in tandem devido à presença de braços cromossômicos inteiros heterocromáticos, vistos em alguns cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos. 36

As espécies H. edentatus e H. marginatus, que podem ser separadas em dois subtipos cada uma com base em caracteres morfológicos, conforme mencionado anteriormente, não apresentaram diferenças cariotípicas entre os subtipos. Acredita- se que essa diferença morfológica intraespecífica seja um polimorfismo relacionado a fatores ambientais, ou esteja em nível gênico, num estágio inicial de especiação.

Assim sendo, tem-se a necessidade de uma revisão taxonômica com estudos pormenorizados a respeito do comportamento, fisiologia, e reprodução dessas espécies, aliados a análises moleculares.

4.3 Padrão de bandeamento C e regiões organizadoras de nucléolo

A heterocromatina, detectada pela técnica de bandeamento C, constitui parte importante do genoma de eucariotos por possuir funções como segregação cromossômica, organização nuclear e regulação da expressão gênica (Grewal & Jia,

2007). O padrão de distribuição da heterocromatina visto nas espécies de

Hypophthalmus é o mesmo previamente descrito para espécies da família

Pimelodidae e para a maioria dos Siluriformes, ou seja, blocos heterocromáticos localizados em regiões teloméricas e centroméricas, e muitos cromossomos do complemento com ausência de heterocromatina ou presença de blocos pálidos e difusos. Um aspecto interessante nas espécies desse gênero são os cromossomos com braços curtos totalmente heterocromáticos. Este padrão foi identificado em outras espécies da ordem Siluriformes por diferentes autores (LeGrande, 1981;

Fenocchio & Bertollo, 1992; Swarça et al., 2001b; Treco et al., 2008), que chamaram atenção para a dificuldade em se detectar a heterocromatina constitutiva devido a

37 características peculiares da cromatina nesses peixes quanto ao grau de condensação.

Variações na quantidade e na distribuição da heterocromatina constitutiva têm sido consideradas características importantes na evolução de alguns grupos de peixes e permitido a diferenciação de espécies e de populações, além de ser uma ferramenta útil em relações filogenéticas (Andreata et al., 2006; Treco et al., 2008).

Essas diferenças são resultantes de mecanismos epigenéticos como remodelamento da cromatina e metilação do DNA, que auxiliam na compactação e organização do genoma em domínios cromáticos. Isso é importante devido ao fato de diversas atividades gênicas serem dependentes do estado de condensação da cromatina, que pode mudar em resposta a sinais celulares e atividade gênica, respondendo inclusive a mudanças ambientais (Grewal & Jia, 2007).

Tais fenômenos epigenéticos podem explicar o padrão diferenciado de distribuição da heterocromatina, onde alguns blocos heterocromáticos podem ser marcadores de gênero de peixes, como observado para as espécies de piranha do gênero Serrasalmus, as quais possuem um grande bloco proximal no braço longo de um cromossomo relacionado com o DNAr 5S (Nakayama et al, 2008) ou de populações como a diferença no padrão de distribuição de banda C vista em

Geophagus brasiliensis (Vicari et al. 2006). Para as espécies de Hypophthalmus o padrão de banda C foi muito similar, embora pôde-se perceber uma diferença interespecífica com relação à quantidade da heterocromatina. Apesar da dificuldade na obtenção dos bandeamentos verificou-se que a distribuição da heterocromatina coincide com o padrão previamente descrito na família Pimelodidae (Swarça et al.,

2001a; Carvalho et al., 2004; Treco et al., 2008), onde os indivíduos apresentam 38 pouca quantidade de heterocromatina, distribuída principalmente em blocos centroméricos e terminais.

Segundo Grewal & Jia (2007), as regiões heterocromáticas apresentam alta densidade de DNA repetitivo, o qual contém “clusters” de DNA satélite, RNA ribossomal e elementos transponíveis e essa associação da heterocromatina com seqüências repetitivas é crucial para organização funcional de estruturas cromossômicas como centrômeros e telômeros, bem como para a regulação da atividade de sítios ribossomais (Boisvert et al., 2007). Quanto a este aspecto, ficou evidente a relação de heterocromatina com as RONs, uma vez que as quatro espécies apresentaram a RON positiva para a banda C, confirmando a presença de heterocromatina associada à cístrons ribossomais (Swarça et al., 2005).

A associação das RONs com as regiões de heterocromatina constitutiva promove um controle epigenético do genoma, uma vez que pode ocorrer tanto a manutenção de cópias de DNA ribossomal expressas para as células, quanto o silenciamento desses genes. Considerando que a região de DNA ribossomal é instável e responde a danos causados por diversos fatores, incluindo fatores ambientais, existe a necessidade de se ter um mecanismo de regulação da expressão gênica eficiente nessas regiões (Grewal & Jia, 2007). Além disso, associações de RONs com blocos heterocromáticos têm promovido a mudança de posição dos organizadores nucleolares no cariótipo (Tabela 2) por meio de rearranjos, sendo esses mecanismos já relatados em diferentes grupos de peixes, e são mais evidentes em famílias que apresentam um número diplóide conservado, como por exemplo Curimatidae,

Anostomidae e Pimelodidae (Galetti et al., 1991; Feldberg et al., 1992; 1993; presente trabalho). 39

Com relação ao heteromorfismo de tamanho da RON descrito em H. cf. fimbriatus pode-se dizer que é bastante comum em peixes, e já foi relatado em outras espécies da mesma família, como por exemplo, em Iheringichthys labrosus (Vissotto et al.,

1999; Carvalho et al., 2004; Ribeiro et al., 2008) e Pimelodus maculatus (Vissotto et al., 1999; Souza et al., 2003; 2004; Treco et al., 2008). Esta variação pode ser oriunda de mecanismos como “crossing-over” desigual, transposições ou outros rearranjos incluindo deleções e/ou duplicações, freqüentemente atribuídos a mecanismos de modificações estruturais das RONs (Carvalho et al., 2004; Ribeiro et al., 2008). O comportamento de associação das RONs também pode ser o responsável pela presença de tal heteromorfismo, uma vez que envolve segmentos de cromossomos homólogos. Essa característica da RON em H. cf. fimbriatus pode representar um marcador citogenético para esta espécie, uma vez que tal característica não foi observada nas demais espécies analisadas.

Assim, o que se observa no presente estudo e nos dados da literatura é que as espécies da família Pimelodidae, bem como a ordem Siluriformes, apresentam uma compactação da cromatina muito diferente das ordens Characiformes e Perciformes, o que pode ser observado pelo pequeno tamanho dos cromossomos e pelo padrão de banda C.

4.4 Evolução cariotípica de Hypophthalmus spp.

Entre os Siluriformes observa-se uma variabilidade considerável de cariótipos, envolvendo principalmente o número diplóide e a fórmula cariotípica. Os números diplóides encontrados nessa ordem variam de 2n=22 a 2n=132 cromossomos, com

40 um número modal de 58 (±2) cromossomos (Oliveira et al., 1988). Tal diversidade é considerada uma característica distinta nos Siluriformes, principalmente entre as espécies das famílias Heptapteridae, Pseudopimelodidae e Pimelodidae.

Para a família Pimelodidae a variação ocorre principalmente no que diz respeito aos números fundamentais descritos, que foi de 92 a 112, mas o número diplóide é mantido (Swarça et al., 2007). A fixação de mecanismos de manutenção do número diplóide reforça a idéia proposta por Oliveira & Gosztonyi (2000), de que 2n=56 cromossomos seria o número diplóide ancestral nos Siluriformes.

As espécies da família Pimelodidae que apresentam número diplóide igual a 56 cromossomos foram subdivididas em dois grupos: “Pimelodus” e “Sorubiminae”, por apresentarem características citogenéticas peculiares, como por exemplo a localização das RONs. No grupo “Pimelodus” as RONs localizam-se em porções terminais em braços longos, em contrapartida, os “Sorubiminae” apresentam RONs em porções terminais de braços curtos de cromossomos submetacêntricos ou subtelocêntricos (Swarça et al., 2007). Considerando a árvore filogenética proposta por Lundberg et al.(1991b) e tendo em vista que dados cromossômicos da família

Pimelodidae foram sobrepostos a esta árvore (Swarça et al., 2007), é possível confirmar a inclusão de Hypophthalmus no grupo “Sorubiminae” com base nos resultados citogenéticos aqui apresentados (Figura 12), principalmente no que diz respeito às características das regiões organizadoras de nucléolo.

Figura 12. Hipótese filogenética proposta para a família Pimelodidae, em destaque o gênero Hypophthalmus (Modificado de Swarça et al., 2007).

Apesar da dificuldade de se fazer comparações entre os cariótipos dos

Siluriformes devido ao alto nível de condensação cromossômica (LeGrande, 1981), que dificulta a determinação do tipo cromossômico e a organização do cariótipo, é possível observar que dentro do gênero Hypophthalmus a variação das fórmulas cariotípicas entre as espécies se deve a rearranjos cromossômicos associados ao processo de especiação e não decorrentes de eventos de poliploidia, como sugerido para a origem de outros gêneros pertencentes à mesma ordem (Fenerich et al.,

2004). Tais rearranjos podem ser considerados não robertsonianos, sendo os

42 principais: inversões pericêntricas, visto pelo número de pares cromossômicos por categoria (m, sm, st, a), translocações ou transposições, visto pela diferença na posição das RONs nos cariótipos e duplicações “in tandem” que resultaram na heterocromatinização de braços inteiros.

A diversidade cariotípica encontrada nos Siluriformes é determinada por diferenças no número diplóide, na fórmula cariotípica e cromossomos sexuais em alguns gêneros, como por exemplo, em Ancistrus (Loricariidae), para o qual foram descritos quatro sistemas de cromossomos sexuais (de Oliveira et al., 2007; 2008), indicando que essa ordem constitui um modelo interessante para estudos de mecanismos envolvidos no processo de especiação dos peixes neotropicais.

Entretanto, a revisão sistemática dos diferentes táxons dessa ordem faz-se necessária, e os dados citogenéticos podem ser de grande valia, uma vez que novas espécies podem apresentar características citogenéticas particulares. Como visto em

H. cf. fimbriatus, analisada nesse trabalho, que possui características cromossômicas mais semelhantes a H. marginatus do que a H. fimbriatus.

5. Conclusões

a) A caracterização cariotípica descrita mostra que o gênero Hypophthalmus apresenta uma macroestrutura cariotípica conservada entre os pimelodídeos.

b) Os bandeamentos cromossômicos, juntamente com a fórmula cariotípica e localização das RONs permitem distinção entre as espécies do gênero.

c) A divisão das espécies H. edentatus e H. marginatus em dois tipos cada uma, não é confirmada citogeneticamente, podendo estar associada a fatores ambientais e/ou comportamento reprodutivo, que podem resultar em diferenças morfológicas intraespecíficas.

6. Perspectivas futuras

No decorrer desse trabalho surgiram novos questionamentos, os quais poderão ser explorados em trabalhos posteriores, o que contribuirá para a compreensão da evolução do gênero Hypophthalmus. Todos os exemplares coletados no presente estudo tiveram tecido muscular armazenado, que deverá ser utilizado na produção de sondas para mapeamento físico cromossômico de genes ribossomais e elementos transponíveis, bem como para análises moleculares. Tais análises associadas aos dados citogenéticos aqui obtidos permitirão maior esclarecimento acerca da evolução cariotípica e da diferenciação de espécies no gênero em questão.

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