Universidad de Oviedo Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Identificación de nuevos componentes del degradoma y estudio de la regulación biológica por miRNAs en un modelo animal deficiente en la metaloproteasa Face-1 Tesis Doctoral Alejandro Piñeiro Ugalde Oviedo 2011 Director de la Tesis Carlos López-Otín ABREVIATURAS, SIGLAS Y SÍMBOLOS ADAM metaloproteasa y desintegrina ADAMTS ADAM con dominios trombospondina cDNA DNA copia Ci curio dCTP desoxicitidina trifosfato DNA ácido desoxirribonucleico dNTPs desoxinucleósidos trifosfato GH hormona de crecimiento HGPS síndrome de Hutchinson-Gilford IGF-1 factor de crecimiento similar a insulina 1 kb kilobase MBS sitio de unión de microRNAs MMP metaloproteasa de matriz miRNA microRNA mRNA RNA mensajero pb pares de bases PCR reacción en cadena de la polimerasa RNA ácido ribonucleico ROS especie reactiva del oxígeno RISC complejo de silenciamiento inducido por RNA SSC tampón citrato sódico TAE tampón Tris/acetato con EDTA TBE tampón Tris/borato con EDTA TE tampón Tris con EDTA TIMP inhibidor tisular de metaloproteasa Tris tris(hidroximetil)-aminometano ÍNDICE Introducción ................................................................................................. 1 Los sistemas proteolíticos .................................................................................................. 4 Metaloproteasas ................................................................................................. 6 Aminopeptidasas ................................................................................................ 9 Metzinquinas ..................................................................................................... 12 Envejecimiento ................................................................................................................. 15 Síndromes progeroides .................................................................................... 19 Laminopatías .................................................................................................... 21 Eje somatotrofo ................................................................................................. 25 microRNAs ....................................................................................................................... 28 Biogénesis y mecanismos de acción de los miRNAs ....................................... 29 Relevancia funcional de los miRNAs ................................................................. 33 Objetivos .................................................................................................... 37 Material y métodos .................................................................................... 41 Material ............................................................................................................................. 43 Técnicas de Biología Molecular ....................................................................................... 45 Técnicas de Biología Celular ........................................................................................... 52 Ensayos en animales de experimentación ...................................................................... 56 Técnicas bioinformáticas .................................................................................................. 57 Resultados .................................................................................................. 59 I. Metaloproteasas y el degradoma .......................................................................... 61 II. Identificación y caracterización de la aminopeptidasa O humana ......................... 91 III. Aminopeptidasa O ............................................................................................... 101 IV. Identificación y caracterización de las arqueometzinquinas 1 y 2 humanas ....... 113 V. Señalización del eje somatotrofo y contribución de los miRNAs a su regulación en el envejecimiento acelerado .......................................................... 125 VI. Efecto rejuvenecedor de la señalización somatotrofa en el envejecimiento acelerado ............................................................................................................. 135 VII. Análisis de la función de los miRNAs en el envejecimiento ................................ 143 VIII. Otros trabajos relacionados con la Tesis ............................................................. 163 Discusión ................................................................................................. 165 Conclusiones ........................................................................................... 189 Bibliografía ............................................................................................... 193 INTRODUCCIÓN Introducción Los elementos reguladores de la actividad celular son responsables del desarrollo, la homeostasis, la plasticidad e incluso el envejecimiento de los organismos y han sido señalados como principal vehículo de la evolución de las especies. Estos elementos constituyen una proporción considerable del genoma de los organismos y se encargan de coordinar la información contenida en el DNA para adaptar el comportamiento celular a las distintas circunstancias exigidas en el espacio y en el tiempo. Este año se cumple el cincuenta aniversario del modelo del operón publicado por François Jacob y Jacques Monod en el que se introducía por primera el concepto de los genes reguladores y se definía un modelo plausible de control de la expresión génica (Jacob y Monod, 1961). La elaboración de este modelo se considera uno de los grandes hitos de la biología molecular de la segunda mitad del siglo XX al señalar el camino que dio lugar al actual conocimiento sobre los sistemas reguladores de la expresión génica. Desde entonces, el modelo originalmente propuesto para bacterias se ha refinado sucesivamente y se han añadido numerosos niveles adicionales de regulación en organismos eucariotas. Así, además del control de la expresión génica mediante factores de transcripción que se unen a secuencias reguladoras situadas en los promotores de los genes, existen sistemas remodeladores de la cromatina que añaden información heredable a la secuencia primaria del DNA en un proceso denominado modificación epigenética (Feinberg, 2007). De igual forma, en las últimas décadas se han identificado diversos grupos de genes que codifican importantes elementos reguladores que actúan a nivel post-transcripcional, ya sea sobre los mRNAs o sobre las proteínas. Entre estos sistemas de regulación post-transcripcional, las proteasas, al igual que las quinasas o fosfatasas, se han revelado como un importante grupo de enzimas que, además de participar en procesos biosintéticos o catabólicos, constituyen un nivel de regulación adicional al de la expresión génica al controlar numerosas propiedades de las proteínas (López-Otín y Hunter, 2010). Por último, el comienzo del siglo XXI ha supuesto una nueva revolución en el campo del control de la actividad génica, con el descubrimiento de miles de moléculas de RNA reguladoras, entre las que destacan los microRNAs y los lincRNAs (large intervening non-coding RNAs) (Lee y col., 1993; Guttman y col., 2009). 3 Introducción La interacción entre todos estos sistemas de regulación da lugar a una intrincada red de conexiones que permite que un mismo genoma sea capaz de generar y coordinar la notable variedad de tipos celulares especializados que conforman un organismo vivo, así como adaptar sus funciones a las distintas condiciones que se puedan presentar. Dada su importancia vital, en la presente Tesis Doctoral abordaremos el estudio de los sistemas de regulación biológica mediante una serie de objetivos dirigidos a la identificación de nuevas proteasas y al análisis de la función reguladora de los microRNAs en procesos de envejecimiento normal y patológico. Los Sistemas Proteolíticos Las proteasas constituyen un grupo de enzimas presente en todos los seres vivos, desde virus hasta mamíferos. La característica común de este conjunto de enzimas es la hidrólisis del enlace peptídico, un proceso históricamente asociado a la degradación inespecífica de proteínas, pero que en los últimos años se ha revelado como un evento clave en la regulación de múltiples procesos biológicos. Así, hoy sabemos que la proteólisis constituye un sistema altamente selectivo de modificación post-traduccional que condiciona numerosas propiedades de las proteínas, ofreciendo un amplio abanico de posibilidades de regulación. Este tipo de hidrólisis específica de determinados enlaces peptídicos de proteínas concretas se denomina procesamiento proteolítico y su impacto sobre las proteínas es muy diverso, permitiendo modular características tales como su localización subcelular, su estado de actividad, su interacción con otras proteínas o su vida media, entre otras (López-Otín y Overall, 2002). Consecuentemente, las proteasas influyen decisivamente en procesos tan importantes como la replicación del DNA, el control del ciclo celular, la proliferación y migración celulares, la diferenciación celular o la muerte celular programada. Asimismo, la proteólisis afecta a numerosas funciones del organismo, como la morfogénesis y remodelación tisulares, la cicatrización de tejidos, la ovulación y fertilización, la angiogénesis, la hemostasis o la inmunidad (López-Otín y Bond, 2008). 4 Introducción Dada su relevancia funcional, los sistemas proteolíticos requieren una estricta regulación que garantice su correcta actividad