Expression and Regulation of the Porin Gene Mspa of Mycobacterium Smegmatis
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Expression and regulation of the porin gene mspA of Mycobacterium smegmatis Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Dietmar Hillmann aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2006 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. M. Niederweis Zweitberichterstatter: Prof. Dr. A. Burkovski Index Index 1 Zusammenfassung / Summary 1 2 Introduction 2 2.1 The genus Mycobacterium 2 2.1.1 Taxonomy 2 2.1.2 The architecture of the mycobacterial cell wall 3 2.2 Porins: Structure and function in gram-negative bacteria 5 2.3 Mycobacterial porins 7 2.4 Porin regulation 10 2.5 Expression of mspA of M. smegmatis 12 2.6 Scope of the thesis 13 3 Results 14 3.1 Screening system to monitor mycobacterial promoter activity 14 3.2 Transcriptional mechanisms affecting mspA expression 18 3.2.1 Identification of the mspA promoter 18 3.2.2 A very long upstream DNA element is required for full activity of pmspA 22 3.2.3 Influence of translation initiation signals of pmspA on lacZ expression 24 3.2.4 Influence of a distal DNA element on pmspA activation 25 3.2.5 Alignment of the 5’ regions of mspA, mspB, mspC and mspD 27 3.3 Post-transcriptional mechanisms affecting mspA expression 28 3.3.1 Detection of an antisense RNA to the mspA transcript 28 3.3.2 Secondary structure of the 5’ UTR of mspA 31 3.4 pH dependent mspA expression 31 3.4.1 mspA expression is repressed at pH 4.5 31 3.4.2 The repression of mspA at pH 4.5 is a specific event 32 3.4.3 The regulation of mspA at pH 4.5 requires the original 5’ UTR 33 3.4.4 β-galactosidase based monitoring of pH dependent mspA expression 34 - i - Index 4 Discussion 40 4.1 Transcriptional control of mspA expression 40 4.2 Transcriptional control of mspA, mspB, mspC and mspD 42 4.3 Post-transcriptional control of mspA expression 44 4.3.1 Stability of the mspA transcript 44 4.3.2 The 5’ end of the mspA transcript 44 4.3.3 The 3’ end of the mspA transcript 46 4.3.4 Initiation of translation 46 4.3.5 Detection of an antisense RNA to the mspA transcripts 47 4.4 Adaptation of mspA regulation to low pH 48 4.5 Conclusions and perspectives 50 5 Material and Methods 51 5.1 Material 51 5.1.1 Chemicals, equipment and biological material 51 5.2 Media, buffers and solutions 56 5.2.1 Media 56 5.2.2 Buffers and solutions 57 5.3 General methods 60 5.4 Growth of bacteria 60 5.5 Transformation of bacteria 61 5.5.1 Transformation of chemically competent E. coli 61 5.5.2 Electroporation of M. smegmatis 61 5.6 Methods for nucleic acid purification, modification and analysis 61 5.6.1 Plasmid purification 61 5.6.2 Preparation of chromosomal DNA from mycobacteria 61 5.6.3 Polymerase chain reaction (PCR) 62 5.6.4 Site-directed mutagenesis by combined polymerase chain reaction (CCR) 62 5.6.5 Phosphorylation of oligonucleotides 63 5.6.6 Primer annealing 63 5.6.7 Restriction and ligation 63 5.6.8 Construction of plasmids 63 5.6.9 RNA preparation 64 5.6.10 Primer extension 65 5.6.11 Northern blot analysis 65 5.6.12 Dot blot analysis 66 - ii - Index 5.6.13 RNA probe synthesis for Northern and dot blots 66 5.7 Extraction and analysis of proteins 66 5.7.1 Selective extraction of porins of M. smegmatis 66 5.7.2 Western blot analysis 66 5.7.3 Alkaline phosphatase activity measurement 67 5.7.4 β-galactosidase activity measurement 67 5.8 Computer analyses 68 5.8.1 GeSTer 68 6 References 69 7 Appendix 79 7.1 Use of phoA for pH dependent mspA expression 79 7.2 C2FDG as an alternate substrate for the β-galactosidase 80 7.3 MspA amounts during growth at pH 4.5 83 7.4 List of predicted transcriptional terminators of M. tuberculosis 83 7.5 Abbreviation index 85 - iii - Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Aufgrund ihrer einzigartigen und lipidreichen Zellwand sind Mycobakterien resistent gegenüber einer Vielzahl von Antibiotika. Die Diffusion hydrophiler Substanzen über diese Permeabilitätsschranke erfolgt mit Hilfe wassergefüllter Kanalproteine, der so genannten Porine. Die Anpassung an sich ändernde Umwelteinflüsse stellt einen Kompromiss zwischen der Aufnahme von Nährstoffen und dem Ausschluss toxischer Substanzen dar und wird in gram-negativen Bakterien durch ein komplexes Regulationsnetzwerk erzielt. Bisher war es jedoch unklar, wie die Expression der Poringene in Mycobakterien reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden transkriptionelle und post-transkriptionelle Mechanismen untersucht, die für die Expression von mspA, des Hauptporins in Mycobacterium smegmatis, verantwortlich sind. Die Verwendung eines Tandem-Terminators bestehend aus den aus Escherichia coli und dem Bakteriophagen T4 stammenden Terminatoren ttrrnBT2 und ttT4g32 reduzierte die Hintergrundaktivität der lacZ Reporterplasmide in M. smegmatis 14-fach. Die -10 Region des mspA Promotors wurde durch gezielte Punktmutationen in Verbindung mit lacZ Reportergenfusionen 142 Basenpaare oberhalb von mspA ermittelt und als einziger mspA Promotor identifiziert. 200 Basenpaare von Position -500 bis -700 erhöhten die β-Galaktosidase Aktivität 12-fach und wurden für eine maximale Aktivierung des Promotors benötigt. Die Insertion von 14 Basenpaaren an Position -500 führte zum Verlust dieser Aktivierung und deutet auf eine Phasenverschiebung der DNA Helix und auf die spezifische Bindung eines Aktivators hin. Transkripte, die antiparallel zur untranslatierten Region oberhalb des mspA Gens sind, wurden mittels Northern Blots detektiert und repräsentieren möglicherweise eine regulatorische, komplementäre RNA. Sequenzuntersuchungen des 5’ Endes der mspA mRNA deuten auf die Ausbildung einer Stammschlaufe hin. Diese trägt möglicherweise zu der langen Halbwertszeit der mspA Transkripte von 6 Minuten bei, vermutlich indem der Angriff von Ribonukleasen durch Ausbildung der Sekundärstruktur verhindert wird. Northern und Dot Blot Analysen zeigten, dass die Menge der mspA Transkripte mit sinkendem pH Wert abnahm und bei pH 4.5 nicht mehr detektiert werden konnte. Episomale Fusionen von mspA mit konstitutiven Promotoren führten zu gleich bleibenden Transkriptmengen, unabhängig vom pH Wert. Umgekehrt wurden keine lacZ Transkripte unter der Kontrolle des mspA Promotors bei pH 4.5 nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass der mspA Promotor spezifisch durch den pH Wert reguliert und dieser Effekt durch die 5’ untranslatierte Region von mspA vermittelt wird. Die potentiell komplementäre RNA wurde in gleicher Weise vom pH Wert reguliert wie mspA. Das deutet auf Stabilisierung der mspA Transkripte oder Begünstigung der Ribosomenbindung durch die RNA hin. Somit liefert diese Arbeit erste Erkenntnisse über die transkriptionelle und post- transkriptionelle Regulation der Genexpression von Porinen in M. smegmatis. - 1 - Summary 1 Summary Mycobacteria possess a unique, lipid-rich cell envelope which strongly contributes to their intrinsic resistance against many antibiotics. Hydrophilic compounds cross this permeability barrier by diffusion through transmembrane channel proteins, the so called porins. The balance of nutrient acquisition and blockade of toxic molecules is crucial for adaptation to changing environmental conditions and in gram-negative bacteria it is achieved by a complex network of regulatory circuits. However, it was unknown how expression of porin genes is regulated in mycobacteria. In this study, transcriptional and post-transcriptional factors controlling the expression of the major porin gene mspA of Mycobacterium smegmatis were determined. Background transcription of the lacZ gene of the reporter plasmids in M. smegmatis was reduced 14-fold by a tandem terminator consisting of ttrrnBT2 and ttT4g32 of Escherichia coli and bacteriophage T4, respectively. The -10 region of the promoter of the mspA gene was identified -142 base pairs upstream of mspA by single base pair substitutions in a transcriptional fusion with the lacZ reporter gene. This promoter solely drives transcription of mspA. A 200 base pair fragment at position -500 to -700 was required for full activity of the promoter and induced transcription 12-fold as determined by β-galactosidase activity. Activation was abolished upon insertion of 14 base pairs at position -500 indicating phasing of the DNA helix and factor-dependent promoter activation. Transcripts anti-parallel to the upstream untranslated region of mspA were detected in Northern blots, suggesting the existence of an antisense RNA as a regulator of mspA expression. Sequence analysis revealed a hairpin structure at the 5’ end of the mspA mRNA that likely contributes to the high stability of the mspA transcripts with an average half-life of 6 minutes, probably by blocking access of ribonucleases. The amounts of mspA transcripts were reduced by decreasing pH and were absent at pH 4.5 as detected by Northern and dot blot analyses. Episomal fusions of mspA with constitutive promoters yielded the same amounts of transcripts independent on the pH, whereas no mRNA was detected from lacZ under the control of the mspA promoter at pH 4.5. These results demonstrated that the pH sensitivity is specific for the mspA promoter and is mediated by the untranslated region upstream of mspA. This mechanism can be exploited to subject other genes to pH dependent regulation in fusion with the mspA promoter. The antisense RNA was regulated by pH in the same manner as mspA. This indicated a stabilizing or activating role for the antisense RNA by hybridizing to mspA transcripts and either inducing ribosome binding or preventing RNA degradation. This work revealed first insights into both transcriptional and post-transcriptional mechanisms of regulation of porin gene expression in M. smegmatis. - 1 - Introduction 2 Introduction 2.1 The genus Mycobacterium 2.1.1 Taxonomy Mycobacteria are aerophilic bacteria with a high G+C content of between 62 to 70%.