Universidade Federal Do Rio De Janeiro Instituto De Química Programa De Pós-Graduação Em Ciência De Alimentos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS

Compostos bioativos recuperados de farelo de soja (Glycine max) por extração aquosa: compostos fenólicos e peptídeos antimicrobianos e antitumorais

Cyntia da Silva de Freitas

Rio de Janeiro 2018

Cyntia da Silva de Freitas

Compostos bioativos recuperados de farelo de soja (Glycine max) por extração aquosa: compostos fenólicos e peptídeos antimicrobianos e antitumorais

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.

Orientadores: Profa .Dra . Vânia Margaret Flosi Paschoalin Prof. Dr. Eduardo Mere Del Aguila Dra. Patricia Ribeiro Pereira

Rio de Janeiro 2018

Freitas, Cyntia da Silva de.

Compostos bioativos recuperados de farelo de soja (Glycine max) por extração aquosa: compostos fenólicos e peptídeos antimicrobianos e antitumorais. / Cyntia da Silva de Freitas. – Rio de Janeiro: UFRJ, 2014. p., il.

Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos) – Universidade Federal do Rio

de Janeiro, Instituto de Química, 2018.

Orientadores: Eduardo Mere Del Aguila, Vânia Margaret Flosi Paschoalin e Patricia Ribeiro Pereira.

1. Glycine max. 2. Farelo da soja. 3. Peptídeos antimicrobianos. I. Del Aguila, Eduardo Mere. II. Paschoalin, Vânia Margaret Flosi. III. Pereira, Patricia Ribeiro. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Programa de Pós Graduação em Ciência de Alimentos. IV. Título.

Cyntia da Silva de Freitas

COMPOSTOS BIOATIVOS RECUPERADOS DE FARELO DE SOJA (GLYCINE MAX) POR EXTRAÇÃO AQUOSA: COMPOSTOS FENÓLICOS E PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANS E ANTITUMORAIS

Profa. Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin Prof. Dr. Eduardo Mere Del Aguila Dra. Patricia Ribeiro Pereira

Aprovada por:

______Profa.Dra. Vânia Margaret Flosi Paschoalin – IQ/UFRJ

______Profa.Dra. Maria Alice Zarur Coelho – EQ/UFRJ

______Prof.Dr.Carlos Conte Adam Junior

______Profa.Dra. Mônica Ferreira Moreira – IQ/UFRJ

______Profa.Dra. Ana Carolina Carvalho – UFRJ/Macaé

Aos meus pais e avós, por toda dedicação, apoio, amor e força durante mais essa jornada. Principalmente à minha mãe e minha vó (Marly), às mulheres da minha vida que me ensinaram o que é força e sabedoria.

“Do. Or do not. There is no try.”

“Always pass on what you have learned.”

Mestre Yoda

Agradecimentos

As agências de fomento CAPES, CNPQ e FAPERJ, pelo apoio financeiro concedido ao estudo.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos - PPGCAL, pela oportunidade e conteúdo essencial transmitido.

A professora Vânia Paschoalin por me receber no laboratório, pelas palavras de sabedoria, pelo apoio, dedicação, aconselhamento, que foram de grande importância para o meu crescimento acadêmica e pessoal.

Ao Professor Eduardo Mere, pelo apoio, dedicação e paciência durante esse período.

A Patricia Ribeiro Pereira, pela orientação, por ter sido meu braço direito e ter sido mais que orientadora, uma amiga. Foi um prazer inenarrável trabalhar com ela.

Ao Giovani Verissimo pela parceria e valorosas discussões.

A minha mãe Sandra e ao meu pai José, pois sempre acreditaram e investiram em mim sem duvidar. A minha avó Marly que sempre foi uma grande inspiração. Ao meu avô Amilton, por ter acreditado em mim. E a Bianca, por ter me apoiado e acreditado.

Aos meus amigos de laboratório Diego Baião, Davi Vieira, Maria Fernanda, Anna Carolina Corrêa e Rafael Luiz, pela parceria, amizade, apoio, palavras de incêntivo e por proporcinarem muitos momentos de descontração e alegria.

A toda minha famíla e amigos que me apoiaram nessa jornada.

Resumo Freitas, Cyntia da Silva. Compostos bioativos recuperados de farelo de soja (Glycine max) por extração aquosa: Compostos fenólicos e peptídeos antimicrobianos e antitumorais. Rio de Janeiro, 2018. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

A soja tem um potencial estratégico na segurança alimentar, além de ser uma fonte de proteínas e compostos bioativos para as necessidades humanas, como polifenóis e oligopeptídeos. Ambos os compostos foram recuperados após a extração aquosa do farelo de soja, um subproduto do refino do óleo de soja. As isoflavonas predominantes são genistina, daidzina, glicitina e malonilgenistina e suas formas glicosídicas exibiram uma bioacessibilidade global próxima a 75%. Outros dezesseis fenólicos com alta bioacessibilidade foram identificados e o ácido cafeico, ácido 5-CQA e hesperidina foram os mais predominantes. O extrato aquoso não apresentou citotoxicidade para células murinas saudáveis, mas apresentou bioatividades como a capacidade antioxidante, que foi aumentada após digestão gástrica in vitro, inibição da peroxidação lipídica, quando comparado a antioxidantes naturais e sintéticos, e atividade antimicrobiana contra patógenos alimentares Gram-positivas e Gram- negativas. Tais atividades biológicas podem ser atribuídas não apenas à presença de polifenóis, mas também a oligopeptídeos, especialmente peptídeos antimicrobianos (PAM). Para avaliar a participação de PAMs na atividade antimicrobiana, os oligopeptídeos foram fracionados por meio de membrana de ultrafiltração com ponto de 10kDa e cromatografia de filtração em gel a partir do extrato aquoso de farelo de soja. Duas frações ricas em peptídeos e com baixo teor de compostos fenólicos - F1 e F2 - exibiram atividade antimicrobiana superior em comparação com o extrato total e foram capazes de inibir a proliferação de céluas de glioblastoma humano, confirmando que contribuem ou são responsáveis por tal atividade. A espectrometria de massa de F1 e F2 seguida de triagem com cinco algoritmos deu origem a doze candidatos a peptídeos antimicrobianos que estavam

encriptados, principalmente, em subunidades alfa e alfa-prime da β-conglicinina com massas moleculares variando de 718,42 a 4872,43 Da. Estudos de alinhamento revelaram dois domínios em subunidades da β-conglicinina que contêm os candidatos a PAMs. A estrutura tridimensional da região contendo os dois domínios foi determinada pela primeira vez, revelando predominância de estrutura em alfa-hélice. A produção em larga escala e o uso de peptídeos multifuncionais e compostos fenólicos é uma aplicação inovadora do conceito de bioeconomia circular, valorizando o subproduto agroindustrial.

Palavras-chave: Farelo de soja, polifenóis, isoflavonas, bioacessibilidade, peptídeos antimicrobianos e antitumorais, modelagem molecular.

Abstract

Freitas, Cyntia da Silva. Bioactive compounds recovered from soybean meal (Glycine max) by aqueous extraction: Phenolic compounds and antimicrobial and antitumor peptides. Rio de Janeiro, 2018. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Soybean has a strategic potential in food security besides being a source of protein and functional bioactives for human needs, such as polyphenols and oligopeptides. Both compounds were recovered after aqueous extraction of soybean meal, a by-product of soy oil refining. The predominant isoflavones are Genistin, daidzin, glycitinand malonylgenistin and their glicosidic forms exhibited an overall bioaccessibility near 75%. Additional sixteen phenolics with high bioacessibility were identified and caffeic acid, 5-CQA acid and hesperidin were the most predominant. The aqueous extract showed no cytotoxicity to healthy murine cells while maintained bioactivities such as antioxidant capacity, that was enhanced after in vitro gastric digestion, inhibition of lipid peroxidation, when compared to natural and synthetic food antioxidants, and antimicrobial activity to gram-positive and gram-negative foodborne pathogens. Biologycal activities can be attributed not only to the presence of polyphenols but also to oligopeptides, especially antimicrobial peptides (AMP). To evaluate the participation of AMPs in the antimicrobial activity, oligopeptides were fractionated by 10kDa-cutoff ultrafiltration membrane followed by gel filtration chromatography of soybean meal aqueous extract. Two peptide-rich and low- polyphenol fractions – F1 and F2 – exhibited superior antimicrobial activity compared with the whole extract and was able to inhibited human glioblastoma proliferation, confirming they contribute or are responsible for the activity. Mass spectrometry of F1 and F2 followed by screening with five algorithms gave rise to twelve antimicrobial peptide candidates which were mainly encrypted in alpha and alpha-prime subunits of β-conglycinin with molecular masses ranging from 718.42 to 4872.43 Da. Alignment studies revealed two domains in β-conglycinin subunits that contain AMP candidates. Three dimensional structure of the region containing both domains was determined for the first time, revealing

predominance of alpha-helix. The production inlarge scale and the use of multifunctional peptides as well as polyphenols is an innovative application of the concept of circular bioeconomy, valuing the agro-industrial by-product.

Keywords: extruded-soy material, polyphenols, isoflavones, bioacessibility, antimicrobial and antitumoral peptides, molecular modelling

Lista de Figuras

Revisão da literatura

Figura 1. Grão desoja e farelo de soja...... 21

Figura 2. Etapas de processamento da soja...... 31

Figura 3.Representação esquemática das principais classes e subclasses de compostos fenólicos e suas estruturas químicas...... 35

Figura 4. Estruturas químicas de ácidos fenólicos...... 36

Figura 5. Estruturas químicas representativas das principais subclasses e estrutura dos flavonoides...... 37 Figura 6. Mecanismos de ação de peptídeos antibacterianos...... 53

Capítulo I

Fig. 1. Kinetics of inhibition of lipid peroxidation by soybean meal aqueous extract………………………………………………………………79

Fig. 2. Antioxidant activity following in vitro simulated gastrointestinal digestion…………………………………………………………………….…80

Fig. 3. Cytotoxicity of soybean meal aqueous extract on mouse bone marrow (BM) and fibroblast L929 cell lines and on human glioblastoma U-87 MG cell line……………………………………………84

Supplementary Data

Fig.1. Representative HPLC chromatogram of a phenolic acid standard mixture……………………………………………………………95

Fig. 2. Representative HPLC chromatogram of an isoflavone mixture……………………………………………………………………….96

Fig. 3. Representative HPLC chromatogram of the products of a Fenton reaction with TPA and a Fenton reaction with a sample and TPA…...... 97

Capítulo II

Fig. 1. Fractionation of the ultra-filtered soybean meal aqueous extract, antimicrobial activity and phenolic content of the resultant fractions….119

Fig. 2. Toxicological screening of F1 and F2 against healthy and Tumoral cells……………………………………………….…………...... 121

Fig. 3. Location of the best AMPs candidates within β-conglycinin primary structure…...... 127

Fig. 4. Three-dimensional structure of β-conglycinin regions containing AMPs candidates sequences...... 130

Suplementary file

Fig. S1. Schematic representation of peptides encrypted in F7J075 (right-hand panel) and Q3V5S6 (Left-hand panel)…………….…….…156

Lista de tabelas

Revisão da literatura

Tabela 1. Componentes funcionais da soja e seus efeitos...... 25

Tabela 2. Tabela de comparação dos componentes do grão e do farelo da soja...... 32

Tabela 3. Lista atualizada do banco de dados existentes dedicados aos peptídeos antimicrobianos...... 49

Capítulo I

Table 1. Bioaccessibility of isoflavones from soybean meal aqueous extract estimated by in vitro simulated gastrointestinal digestion…….75

Table 2. Bioaccessibility of phenolics from soybean meal aqueous extract...... 77

Table 3. Antimicrobial activity of the aqueous extract from soybean meal...... 82

Capítulo II

Table 1. F1 and F2 fraction from soybean meal aqueous extract able to abolish the foodborne pathogen growth…...... 120

Table 2. Quantitative analysis of peptides from F1 and F2 fractions evaluated by nano-LC-MS/MS………………………………………….123

Table 3. Candidate AMP sequences assorted after specific algorithm evaluation...... 124

Suplementary file

Table S1. Peptide sequences identified in F1 and F2 by nano-LC-MS/MS…………………………………………………………148 Table S2. Identity and similarity between F7J075 and the four best hits from blastP versus Uniprot database……………………….155

Lista de abreviaturas

ABTS - 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid/ Ácido 3-etilbenzotiazolino-6- sulfônico

ACP- anticancer peptide/ peptídeo antitumoral

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BHA- butyrate hydroxyanisole/butirato de hidroxianisol

BHT- butylatedhydroxytoluene/hidroxitolueno butilado

BM- bone marrow cell line /céllulas da medula óssea

DAD- diode arrangement detector/ detector de arranjo de diodo

F1- fraction 1/ fração1

F2- fraction 2/ fração2

FRAP- ferric reducing ability of plasma/ redução de ferro no plasma

GAE - Gallic acid equivalents/ equivalentes de ácido gálico

GD- gastric digestion/ digestão gástrica

H2O-DD - deionized and distilled water/água desionizada e destilada/

HPLC - High- performance liquid chromatography/ cromatografia líquida de alta desempenho

HTPA-hydroxyterephthalicacid/ ácidos hidroxiterefálicos

ID- intestinal digestion /digestão intestinal

L929- mouse fibroblast cell line/ células de fibroblastos de camundongo

OD- oral digestion/ digestão oral/

ORAC- oxygen radical/ antioxidant capacity

PAM- peptídeos antimicrobianos

PC- phenolic compounds/compostos fenólicos

PDA- photodiode array/ arranjo de fotodiodos

TAP- total antioxidant potential / total pontencial antioxidante

TEAC- trolox equivalent antioxidant capacity/ capacidade queivalente trolox

TPC –total phenolic compounds/ total compostos fenólicos

U-87MG- human glioblastoma/ostracytoma cell line/ células glioblastoma human

Sumário

Introdução ...... 18 1. Extratos Vegetais...... 22

2. Soja (Glycine max) ...... 24

2.1. Composição da soja ...... 26 3. Farelo de Soja ...... 29

4. Compostos Fenólicos ...... 33

4.1. Caracterização Estrutural e Classificação dos compostos fenólicos ...... 34 4.2. Efeitos dos compostos fenólicos ...... 38 5. Soja - fonte de compostos fenólicos ...... 39

5.1. Bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos fenólicos ...... 41 6. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais...... 42

7. Atividade antioxidante ...... 43

8. Peptídeos bioativos ...... 45

9. Peptídeos antimicrobianos ...... 48

9.1. Peptídeos antimicrobianos de plantas ...... 51 9.2. Mecanismos de ação dos PAMs ...... 52 Justificativa ...... 57

Objetivo geral ...... 59 Objetivos específicos ...... 59 10. Bibliografia ...... 167

CAPÍTULO ...... 60 Introduction ...... 65

2. Materials and methods ...... 67

2.1.Organisms ...... 67 2.2. Preparation of soybean meal aqueous extract...... 67 2.3.Identification and quantification of isoflavones forms by LC-DAD-FL ...... 67 2.4. Identification and quantification of phenolic compounds (PC) ...... 68

2.5. Evaluation of the antimicrobial activity ...... 69 2.6. Determination of total antioxidant activity ...... 70 2.6.1. Determination of ferric reducing ability of plasma (FRAP) ...... 70 2.6.2. Determination of Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) ...... 70 2.6.3. Total antioxidant potential (TAP) ...... 70 2.6.4. Oxygen radical antioxidant capacity (ORAC) ...... 71 2.7. Lipid peroxidation inhibition ...... 71 2.8. In vitro simulated gastrointestinal digestion ...... 72 2.8. In vitro cytotoxicity assays against murine and human cells ...... 72 2.9. Statistical analysis ...... 73 3. Results ...... 74

3.1. Identification and quantification of bioactive compounds in soybean meal aqueous extract and their bioacessibility ...... 74 3.2. Bioactivities of soybean meal aqueous extract ...... 79 3.2.1 Antioxidant activity ...... 79 3.2.2. Antimicrobial activity ...... 81 3.2.3. In vitro cytotoxicity assay in different cell lineages ...... 82 4. Discussion ...... 85

5. Conclusions ...... 93

Supplementary Data ...... 95

References ...... 98

CAPÍTULO II ...... 107

1. Introduction ...... 112

2. Materials and methods ...... 113

2.1. Organisms ...... 113 2.2. Preparation of soybean meal aqueous extract ...... 114 2.3. Determination of peptide content ...... 114 2.4. Purification of peptides ...... 114 2.5. Spectrophotometric assays ...... 114 2.6. Evaluation of antimicrobial activity ...... 115 2.7. In vitro toxicological tests ...... 115

2.8. Concentration and desalinization of peptides in a ZipTip® pipettetips ...... 116 2.9. Nano-liquid chromatography, mass spectrometry and data analyses ...... 116 2.10. Prediction of potential antimicrobial sequences ...... 117 2.11. Sequence comparison of Glycine max proteins ...... 117 2.12. Structural modeling of β-conglycinin protein and localization of AMPs regions 118 2.13. Statistical analyses ...... 118 3. Results ...... 118

3.1. Fractionation of bioactive peptides and evaluation of antimicrobial activity. . 118 3.2. Antitumoral effect of phenolic-reduced fractions on human tumoral cells ..... 120 3.3. Identification of peptides in F1 and F2 fractions by mass spectrometry ...... 122 3.4. Antimicrobial peptide prediction evaluation ...... 124 3.5. Comparative analysis of Glycine max sequence proteins...... 126 3.6. Structural modeling of β-conglycinin protein and location of AMPs regions . 129 4. Discussion ...... 131

Conclusion ...... 135

References ...... 137

Suplementary file ...... 148

Discussão geral ...... 157

Conclusões ...... 164

Perspectivas futuras ...... 165

ANEXO A- ARTIGO SUBMETIDO ...... 183 ANEXO B- PRODUÇÕES CIÊNTÍFICAS ...... 185

Introdução

Extratos de plantas como frutas, vegetais, cereais, vem gerando cada vez mais interesse à indústria de alimentos, devido às suas propriedades bioativas capazes de retardar a degradação, melhorar a qualidade e aumentar o valor nutricional dos alimentos (Wojdyło et al 2007). Esses extratos podem ser usados como aditivos alimentares ou alimentos funcionais.

Os alimentos funcionais são aqueles que, quando consumidos como parte da dieta habitual, além de suas funções nutricionais, também produzem efeitos metabólitos e fisiológicos através do desempenho de algum composto ou nutriente específico, sendo também seguro para consumo sem supervisão médica (Zakir & Freitas, 2015). Os compostos bioativos podem ser utilizados em formas de extratos vegetais, pois sua atividade pode ser potencializada pelo efeito sinérgico de seus compostos, ou na forma de compostos isolados, como no caso de peptídeos bioativos.

Os compostos fenólicos naturais são metabólitos secundários encontrados em vegetais, plantas, cereais, frutas, sementes, óleos, dentre outras fontes naturais (Pérez-Jiménez et al., 2010, Gupta et al., 2013). Em plantas, os compostos fenólicos estão envolvidos na resposta protetora a diferentes estresses, incluindo estresses abióticos, como radiação ultravioleta, ou na defesa contra patógenos (Pérez- Hernández et al., 2016). Nos alimentos esses compostos podem contribuir para o amargor, adstringência, cor, sabor, odor e estabilidade oxidativa (Cheynier et al., 2015).

Estima-se que pelo menos 8000 tipos de compostos fenólicos já tenham sido descritos, considerando compostos naturais, semi-sintéticos ou sintéticos, e este amplo conjunto de estrutura sustenta as propriedades físico-químicas e biológicas exibida por cada classe de compostos. Os compostos fenólicos podem ser classificados como ácidos fenólicos, flavonas e flavonóides, estilbenos e lignanas. No entanto, matrizes alimentares geralmente contêm uma mistura complexa desses compostos, em concentrações variadas (Baião et al., 2017). 18

Tais compostos vêm sendo amplamente estudados devidos aos benéficios que podem trazer para a saude, incluindo atividade antioxidante, atividade antimicrobiana, prevenção de inflamações crônicas, doenças cardiovasculares, câncer e diabetes (Acosta-Estrada et al., 2014).

Como dito anteriormente, os extratos vegetais também são ricos em peptídeos bioativos, definidos como fragmentos específicos de proteínas que possuem um efeito positivo no funcionamento e na melhoria do organismo dos seres vivos. Esses efeitos benéficos são atribuídos a diferentes propriedades dos peptídeos bioativos, incluindo atividades antimicrobianas. Devido à resistência dos microrganismos aos antibióticos, intensificou-se a busca pelos peptídeos antimicrobianos (PAMs) e muitos foram identificados e isolados de diferentes fontes, como animais, plantas, bactérias e fungos. Exibem um amplo espectro de ação contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, bem como outras classes de microrganismos (Del Aguila et al., 2017).

Tipicamente, PAMs possuem de 15–45 resíduos de aminoácidos, em sua grande maioria possuem carga positiva e um alto conteúdo de um ou dois aminoácidos (Gly, Pro, Arg, Hys, Trp e Cys) (Bulet et al. 2004) dando origem a uma grande variedade de sequencias de aminoácidos e características estruturais secundarias incluindo α-hélice, folha β, peptídeos de loop estruturado e não estruturado (Wu & Hancock 1999). Defensinas são uma classe predominante de peptídeos ricos em Cys (CRPs), os quais incluem caracteristicamente 8 regiões Cys e 4 pontes de Cys (Boman 2003, Theis and Stahl 2004).

Uma série de bancos de dados foram criados para reunir sequencias de peptídeos antimicrobianos e disponibilizar ferramentas para predição de sequencias peptidicas com potencial antimicrobiano, totalizando hoje mais de 15 milhões de entradas (Niarchou, Alexandridou et al. 2013). Muitas destas entradas podem ser acessadas em PhytAMP [http://phytamp.pfba-lab-tun.org/main.php] e CAMP [http://www.camp.bicnirrh.res.in/].

Alem das defensinas, outros PAMs são produzidos em diferentes tecidos e tipos celulares de uma variedade de espécies (Zasloff, 2002; Brogden et al. 2003, 19

Lehrer, 2004; Vizioli & Salzet, 2002), incluindo as citocinas e quimiocinas (Cole et al., 2001, Tang et al., 2002., Yeaman et al., 2002, Yang et al., 2003; Chen et al., 2003), neuropeptídios selecionados e peptídeos hormonais (Allaker & Kapas 2003) e fragmentos de proteínas maiores (Kuwata et al., 1998). A caracterização de peptídeos antimicrobianos vem despertando atenção, devido a suas aplicações como conservante de alimentos sem causar efeitos tóxicos ao organismo (Pellegrini et al. 1999). A aplicação de ingredientes antimicrobianos vem sendo amplamente usado para manter a segurança microbiológica e prolongar a meia vida dos produtos alimentares.

Estudos mostram que muitos PAMs agem inicialmente pela ligação e ruptura das membranas celulares bacterianas (Zasloff, 2002; Brogden, 2005; Lai et al., 2006). Devido à natureza não especifica desta interação, espera-se que os antibióticos baseados em PAM possam oferecer uma solução em longo prazo para patógenos resistente a antibióticos.

Peptídeos antimicrobianos mostram habilidades variáveis na discriminação entre alvos microbianos versus células hospedeiras normais. Entretanto, vários temas relacionados às propriedades estruturais e funcionais de peptídeos, como eles interagem com seus alvos potenciais incluem: 1) transmitir a divergência da composição nas afinidades eletroestáticas diferenciais para micróbios versus células hospedeiras; 2) dinâmicas conformacionais que promovem a ativação dos peptídeos ou a sua associação em membranas bacterianas; 3) a energia das células visadas que acelera ou retardam interações de peptídeos com o alvo versus membranas hospedeiras, respectivamente; e 4) limitações no acesso de peptídeos antimicrobianos com uma toxicidade seletiva pobre para tecidos hospedeiros vulneráveis (Marmiroli & Maestri, 2014).

Uma rica fonte de compostos bioativos é a soja (Glycine max), pertence à família Leguminosae, à subfamília Papilionoideae e ao gênero Glycine, L., uma das plantas mais cultivadas do mundo, uma leguminosa, que é o alvo de extensas pesquisas científicas (figura 1), a nível mundial devido ao seu valor econômico no mercado nacional e internacional. Estados Unidos, Brasil e Argentina, figuram como os

maiores produtores de soja, produzem em conjunto cerca de 80% de toda a soja plantada (Medic et al., 2014; Kuligowskiet al, 2017; Wang et al., 2015). A soja é amplamente cultivada devido ao seu valor nutricional, e aos benefícios para a saúde, é uma das fontes mais importantes de proteína e óleo no mundo, bem como uma rica fonte de compostos fenólicos dentre eles as isoflavonas (Villalobos et al., 2016). Segundo Ribeiro et al (2007), a soja apresenta como características positivas a facilidade no transporte e no preparo para consumo, a longa durabilidade e a variedade de subprodutos, o que de certa forma, explica a sua grande aceitação e utilização no mercado internacional.

Figura 1. Grão de Soja e farelo de soja

O grão de soja raramente é consumido cozinhando-se os grãos. Tradicionalmente, é processada para dar origem a alimentos e ingredientes à base de soja para a indústria de alimentos ou passa por um processo de extração do óleo; os grãos podem ser mecanicamente pressionados ou tratados com solventes orgânicos (geralmente o hexano), gerando, no final do processo, um resíduo sólido, chamado de farelo de soja (figura 1), e ainda rico em compostos bioativos como polifenois e peptídeos. Grande parte desse farelo é usado como ração animal, que passa por um tratamento térmico prévio para eliminar fatores anti-nutricionais (Zang et al., 2013; Villalobos et al., 2016).

Apesar de os Cereais serem considerados os alimentos básicos mais importantes da humanidade por proporcionar a maior porção da energia e proteína e muito dos outros nutrientes necessários, o conteúdo de proteína da soja (50 % w/w)

é significativamente superior ao de grãos de cereais, três vezes mais ricos do que ovos e 11 vezes mais ricos que o leite. A qualidade da proteína de soja é comparável à carne e ovos. A atividade biológica de proteínas de soja é atribuída a sequencias especificas de peptídeos, os quais podem ser liberados a partir de hidrólise (Friedman, 1996, Messina et al., 2002, Sitohy et al., 2014).

Considerando que o Brasil está entre os principais produtores de soja no mundo, e esta leguminosa é cultivada em diferentes regiões geográficas, o farelo de soja representa uma fonte barata, prontamente disponível e de fácil obtenção (Snyder & Wilson 2003). A reutilização de coprodutos da indústria vem gerando grande interesse, visto que, tais produtos em sua grande maioria, são ricos em compostos com propriedades bioativas, como é o caso do farelo de soja, que mesmo após o processamento retém grande parte desses compostos bioativos. Devido à atividade de extratos vegetais, é importante a sua caracterização química, em relação à composição de compostos bioativos e suas características biológicas, e a caracterização de compostos isolados bem como a compreensão dos seus mecanismos de ação.

1. Extratos Vegetais

Extratos são preparações concentradas de diversas consistências, obtidas a partir de matérias-primas vegetais secas, que passaram ou não por tratamentos prévios (inativação enzimática, moagem, etc.) e preparados por processos envolvendo um solvente. O objetivo da extração é a utilização dos produtos orgânicos para a produção de compostos naturais com elevado valor agregado nas áreas de alimentos, cosméticos e/ou farmacêutica, devido as suas propriedades funcionais, antimicrobianos ou antioxidantes. O uso de matérias-primas de origem vegetal para a obtenção de extratos é uma atividade de grande interesse para a indústria de alimentos. Nos grandes mercados consumidores mundiais pode-se encontrar com frequência os mais diversos produtos possíveis com um toque vegetal: bebidas carbonatadas formuladas com especiarias e sucos de frutas, águas

minerais vitaminadas, chocolate com óleos essenciais de frutas, produtos lácteos, barras energéticas, snacks, biscoitos, doces, sopas, derivados de carne, entre outros (FIB, 2016; Shah et al., 2014; Proestos et al., 2013).

Atualmente, os extratos naturais são usados como antioxidantes pela indústria alimentícia. Devido à crescente demanda pelo uso de ingredientes naturais, os extratos estão cada vez mais em foco, como uma excelente alternativa para substituir os antioxidantes sintéticos, pois possuem a capacidade de melhorar a estabilidade oxidativa dos produtos alimentícios e, em muitos casos, aumentar a vida útil dos mesmos.

Os fatores determinantes na qualidade dos extratos são a matéria prima, os solventes de extração e o processo utilizado. De um modo geral, as indústrias que incorporam extratos vegetais em seus produtos finais para consumo interessam-se cada vez mais nos detalhes de sua produção. Não somente analisam o produto em si, mas também sua origem e seu processo de extração, para poderem, dessa forma, assegurar uma completa rastreabilidade e uma fabricação totalmente controlada. Assim, os extratos padronizados em princípios ativos e cada vez mais ricos destes compostos, são os mais utilizados (Shah et al., 2014; FIB, 2016).

Os extratos vegetais podem ser utilizados como aditivos alimentares, definidos pelo Codex Alimentarius como “qualquer substância que não seja normalmente consumida como alimento em si e normalmente não utilizado como ingrediente típico do alimento, com ou sem valor nutritivo, cuja adição intencional ao alimento para fins tecnológicos (incluindo organoléptico) na fabricação, processamento, preparação, embalagem e etc., podem afetar ou não as características de tais alimentos. Ao agregar-se poderá resultar em um próprio aditivo ou seus derivados se convertam em um componente do alimento” (Codex Alimentarius, 2018).

Como visto na seção anterior, extratos vegetais são ricos em peptídeos bioativos e fitoquímicos. O termo fitoquímico é mais usado para referir-se a compostos encontrados em vegetais e com efeitos benéficos à saúde. Desta forma, eles diferem do que é tradicionalmente chamado de nutriente, já que não são

necessários para o metabolismo normal e sua ausência ou deficiência não irá resultar em problemas de saúde, (Brasil, 2018a).

2. Soja (Glycine max)

A forma cultivada no Brasil é denominada Glycine max (L). Merril, que cresce anualmente (Liu, 2012). A soja é uma cultura de grande importância econômica para o Brasil, sendo a principal cultura do agronegócio brasileiro. Ela é uma planta originária da região denominada Manchúria, que fica no nordeste da China. A primeira referência sobre soja no Brasil data de 1882, na Bahia, em relato de Gustavo Dutra. As cultivares mais específicas para consumo humano foram trazidas pelos primeiros imigrantes japoneses em 1908. Entretanto, oficialmente, a cultura foi introduzida no Brasil no Rio Grande do Sul em 1914 na chamada região pioneira de Santa Rosa, onde foram iniciados os primeiros plantios comerciais a partir de 1924. No Brasil, a grande expansão teve início a partir da década de 1970, hoje o Brasil é o segundo maior produtor mundial, e, dentre os grandes produtores (EUA, Brasil e Argentina), é o que possui o maior potencial de expansão em área cultivada, podendo, se depender das necessidades de consumo do mercado, mais do que duplicar a produção. Na última safra de 2016/2017, a produção foi de 113,923 milhões de toneladas (Aprosoja, 2018; Brasil, 2018b). Os principais estados brasileiros produtores são: Mato Grosso, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e Mato Grosso do Sul.

No Brasil, o consumo de soja diretamente na alimentação humana ainda é muito restrito, apenas 3,5% da produção em média, simplesmente por não fazer parte do hábito alimentar do brasileiro, ao contrário do que ocorre em diversos países orientais, cujo consumo é verificado há pelo menos três milênios. (Snyder & Wilson, 2013).

Há milênios os chineses já conhecem o potencial da soja para uso na alimentação, mas somente nos últimos anos, os ocidentais passaram a considerar a

soja como alimento funcional que, por definição, além das funções nutricionais básicas, produz efeitos benéficos à saúde (Brasil, 2018a).

Estudos clínicos e epidemiológicos mostram que populações asiáticas, principalmente China e Japão, que consomem uma dieta rica em soja, apresentam menos sintomas da síndrome do climatério, sofrem menos com osteoporose, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer (mama, próstata e cólon) que aqueles que consomem a chamada "dieta americana". Foi observado que essas pessoas consomem 30 a 50 vezes mais produtos de soja do que os ocidentais. Isso motivou várias pesquisas para conhecer os mecanismos de ação dos compostos naturais encontrados nos alimentos, principalmente na soja (Brasil d, 2018; Riedl et al., 2007; Kuligowski et al., 2017).

As sementes de soja contêm, em média, 40 a 41% de proteína em peso seco. Além das proteínas, a soja apresenta vários outros componentes funcionais que podem contribuir igualmente ao benefícioda saúde humana (Tabela 1) (Sugano, 2006; Medic et al., 2014).

Tabela 1. Componentes funcionais presentes na soja e seus efeitos

Componentes Efeitos Benéficos Ácido α-linolênico Ácido graxo essencial, efeito hipotrigliceridémica e melhora a função cardíaca. coração. Isoflavonas Estrogênicas, hipocolesterolêmicas, melhora a função do trato digestivo, ajuda a prevenir o câncer de mama, de próstata e de colón, ajuda na saúde óssea e melhora o metabolismo lipídico. Lecitinas Ativa o metabolismo lipídico, a memória e as habilidades de aprendizagem. Lectinas Efeito anticancerígeno e imunostimulator. Ácido Linoleico Ácido graxo essencial, efeito hipocolesterolêmico Peptídeos Facilmente absorvíveis, reduzem a gordura corporal e tem efeito anticarcinogênico. Fitosterois Efeito hipocolesterolémico e prevenção do o câncer de próstata. Proteínas Efeitos hipocolesterolêmico, anticarcinogênico e reduz a gordura corporal. Saponinas Regulam o metabolismo lipídico e tem ação antioxidante.

(Adaptado de Sugano, 2006; Medic et al., 2014)

Os alimentos à base de soja sao amplamente utilizados na indústria alimentícia, a soja é amplamente aceita como alimento saudável, graças à sua composição nutricional e também devido aos seus efeitos farmacológicos que podem ser atribuídos à presença de diferentes compostos fenólicos considerados valiosos (Yamada, et al., 2003; Jokićet al., 2010).

2.1. Composição da soja

Proteínas

As proteínas das sementes de soja podem ser classificadas em quatro grupos com base no seu papel: enzimas metabólicas, estruturais (incluindo ribossômicas e cromossômicas), proteínas de membranas e proteínas de armazenamento. Em média a soja contém aproximadamente 40% de proteínas, das quais, 90% são compostas por duas globulinas de armazenamento, glicinina (11S) e β-conglicinina (7S). Estas proteínas da soja fornecem todos os aminoácidos essenciais para a nutrição humana sendo compatíveis às proteínas de origem animal, mas, está associada a menos gordura saturada e sem colesterol. Muitas das proteínas da soja são bioativas como, a hemaglutinina, os inibidores de tripsina, a α-amilase e as lipoxigenases; mas o seu conteúdo pode variar com o background genético da soja e suas condições ambientais de crescimento (Liuet al., 2012; Murph, 2008; Medic et al., 2014).

As proteínas de reserva presentes em maior quantidade, glicinina e B- conglicinina, são os precursores da maioria dos peptídeos isolados da soja (Moraes et al., 2006; Singh et al., 2014). A β-conglicinina é composta por tês subunidades (α, α’, β) que compartilham grande grau de homologia de aminoácidos, é uma proteína glicerilada com massa molecular de 150-200kDa. Por outro lado, a Glicinina, tem cinco subunidades principais, G1, G2, G3, G4 e G5, cada uma das quais consiste de um polipeptídeo acídico e básico, tais polipeptídeos são ligados por uma ligação dissulfeto, e possui massa molecular de 360 kDa (Kulkarni et al., 2006; Sitohy et al., 2014).

Óleo

Lípidos de semente de soja funcionam como armazenamentode energia para a planta, constituintes de membranas, moléculas de sinalização, defesa contra patógenos, etc, e são depositados principalmente na forma de triacilgliceróis em corpos oleosos. A soja contém aproximadamente de 8% a 24% de óleo sendo que os triglicerídeos são os componentes principais e são caracterizados por quantidades relativamente grandes de ácidos graxos poliinsaturados, contendo aproximadamente 55% de ácido linoléico e aproximadamente 8% de ácidos α- linolénico. O ácido linoleico do óleo de soja é um ácido graxo essencial, pertencente à família ω-6, o qual exerce funções nutricionais e fisiológicas importantes, já o ácido α-linolénico pertence à família do ω-3 de ácidos graxos, e auxilia na regulação de uma série de vias metabólicas. No entanto, devido à presença de lipoxigenases na soja, o ácido linolênico torna o óleo de soja propenso a rancificação. Os componentes secundários do óleo de soja bruto são fosfolipídios, coletivamente chamados de lecitina, fitoesteróis e tocoferóis (Liu, 2012; Medic et al., 2014, Feedipedia, 2018).

Carboidratos

Os carboidratos nas sementes de soja representam cerca de 35% do peso da semente seca. Eles estão presentes em uma alta concentração no revestimento da semente de soja (86% do peso seco da casca), mas também podem ser encontrados nas células do parênquima do embrião. Uma porção de carboidratos de sementes é removida com as cascas, mas o farelo de soja ainda pode conter até 40% de carboidratos totais. Aproximadamente metade dos carboidratos totais na soja são carboidratos estruturais, enquanto a outra metade são carboidratos não estruturais. Os carboidratos estruturais são polissacarídeos de parede celular (celulose, hemicelulose epectinas), enquanto que os carboidratos não estruturais incluem amido e diferentes mono-, di- e oligossacáridos. Além do uso como um suplemento de fibra dietética, polissacarídeos têm sido utilizados para modificar as propriedades físicas de uma variedade de alimentos (Espinosa-Martos & Ruperez, 2006; Medic et al., 2014).

Vitaminas e Minerais

A soja é a melhor fonte de vitaminas do complexo B (Liu, 2012) em relação aos outros grãos, porém, carece de vitaminas B12 e C. O óleo de soja também contém α-, β-,-tocoferol e traços de δ-tocoferol (Liu, 2012; Sugano, 2006), que são excelentes antioxidantes naturais. Os minerais estão presentes em pequenas quantidades (Sugano, 2006), dentre os quais se destacam os elementos K, P, Ca, Mg, Fe e também soy-ferritina (Ajayet al., 2011).

Compostos Fenólicos

As sementes de soja contêm muitos compostos fenólicos, como ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido ferúlico e ácido p-cumárico. Estes possuem efeitos antioxadantes, que são benéficos à saude humana. Entretanto, a maior concentração de compostos fenólicos presente no grão de soja são de isoflavonas. Existem em quatro subgrupos: agliconas, glicosídeos, malonilglicosídeos e acetilglicosídeos. As isoflavonas são conhecidas como fitoestrogéneos por possuirem atividade semelhante ao estrogênio. São importantes na prevenção de câncer, bem como reduzir o risco de doenças cardiovasculares (Kim et al., 2006; Baião et al., 2017).

Ferritina

A soja contém ferritina, uma proteína multimérica de armazenamento de ferro. Este ferro apresenta uma boa biodisponibilidade no organismo humano sendo, portanto, bem absorvido (Lonnerdal, 2009). Por esta razão a incorporação de soja na dieta humana, de pessoas que sofrem de anemia, é recomendada (Ajay et al., 2011).

Ácido Fítico

O ácido fítico (ácido mio-inositol-1,2,3,4,5,6-hexafosfórico) é a principal forma de armazenamento de fósforo em leguminosas e cereais, responsável por 65-80% do total de fósforo de sementes de soja e varia de 1,0 a 2,3% com base em sementes secas. O ácido fítico acumula-se durante todo o período de maturação das sementes

e concentra-se principalmente nos corpos protéicos dos cotilédones da soja (Medic et al., 2014).

3. Farelo de Soja

Resíduos agroindustriais são gerados durante o processamento industrial de produtos agrícolas ou produtos de origem animal. Aqueles derivados de atividades agrícolas são constituídos de partes vegetais como palha, caule, talo, folhas, semente, polpa de frutas, legumes e cereais, como ocorre no arroz, trigo, milho, sorgo e cevada. Esses resíduos são gerados em grandes quantidades ao longo do ano compondo os recursos renováveis mais abundantes na terra. A composição química dos resíduos inclui compostos de interesse industrial, principalmente açúcares, fibras, proteínas e sais minerais.

Do ponto de vista econômico e ambiental, os resíduos agroindustriais representam um produto de grande interesse uma vez que são baratos e renováveis. A reutilização destes compostos para a produção de novos produtos alimentícios, como a ração animal, contribui para redução dos custos de produção (Zortéa, 2012, Mussatto, 2012).

O complexo de soja é uma das maiores cadeias agroindustriais do Brasil, seu principal destino é o processamento do grão em óleo e proteína. Do grão esmagado, aproximadamente 80% é convertido em farelo (resíduo agroindustrial da soja) e o restante em óleo (Souzaet al., 2010). Segundo a Portaria nº 795 de 15/12/93 D. O. U. 29/12/93, o farelo de soja é definido como um produto resultante da extração do óleo dos grãos de soja (Glicine max (L) Merril), por processo mecânico e/ou químico. O farelo é o insumo fundamental para a criação de aves e suínos, e o óleo tem ampla utilização na indústria alimentícia e na produção de biodiesel. A ampla utilização da técnica de esmagamento da soja tem provocado um vínculo crescente entre a indústria, a agricultura e a pecuária (Souzaet al., 2010).

O processamento da soja inicia-se com o recebimentodos grãos de soja que passam pelo processo de tostagem e remoção do solvente no processamento 29

assegura também que os aminoácidos essenciais não sejam inativados pela ligação com compostos fibrosos. A soja sem casca é condicionada e laminada para a obtenção dos flocos com gordura. O processamento pode se dar por extração com solvente orgânico, para uma melhor extração. A temperatura de 105 a 120 oC melhora a percolação e a drenagem do solvente nos flocos. O óleo é extraído com solventes (hexano 65-70oC), para obtenção de um farelo sem gordura, que passa pela dessolventização (33-35oC) de hexano à 105-110oC de 15 à 30 minutos. O material é secado e novamente esfriado à -10oC e moído (BSBIOS, 2018) (Figura 2).

O farelo é a fonte de proteína mais importante usada para alimentação animal. Seu teor proteico pode exceder em mais de 10% ao dos grãos da soja. Ela representa dois terços do total mundial de alimentos proteicos (Oil World, 2018), e o seu valor alimentar é insuperável por qualquer outra fonte de proteína vegetal e é o padrão de comparação para outras fontes de proteína (Cromwell, 1999).

Figura 2. Etapas de processamento da soja. (BSBIOS, 2018)

De acordo com o teor de proteína e óleo do farelo, este pode ser classificado como farelo "high-protein" de soja com 49-50% de proteína + óleo e 3% de fibra bruta, obtidodas sementes descascadas, ou farelo “low protein” de soja, com 44 – 46% de proteína + óleo e 6-7% de fibra bruta, obtido das sementes com casca. No farelo da soja, obtido por extração com solvente orgânico, o teor de óleo é tipicamente inferior a 2%, enquanto que em farelos obtidos por esmagamento, este valor excede 3% (Feedipedia, 2018).

Dentre as sementes de leguminosas, a semente de soja é a que possui a melhor composição em aminoácidos e compostos fenólicos (Banaszkiewicz, 2011). Neste sentido, é interessante notar que, mesmo após todo o processamento, o 31

farelo de soja ainda retém grande parte dos seus componentes incluindo os compostos bioativos (Tabela 2).

Tabela 2. Tabela de comparação dos componentes do grão e do farelo da soja.

Composição Grão de soja % Farelo de soja % Proteína bruta 39,8 53,8 Fibra bruta 6,3 6,7 Total de açúcares 8,7 9,4 Minerais Ferro 0,501 0,52 Zinco 0,178 0,176 Manganês 0,120 0,123 Cobre 0,08 0,055 Potássio 0,074 0,077 Fósforo 0,025 0,023 Cálcio 0,013 0,011 Magnésio 0,010 0,010 Sódio 0,0 0,0 Aminoácidos Ácido glutâmico 17,9 17,7 Ácido aspártico 11,1 11,3 Leucina 7,5 7,5 Arginina 7,2 7,4 Lisina 6,2 6,1 Fenilalanina 5,0 5,0 Prolina 5,0 4,9 Serina 4,9 5,0 Valina 4,7 4,8 Isoleucina 4,5 4,6 Alanina 4,2 4,4 Glicina 4,2 4,2 Treonina 3,9 3,9 Tirosina 3,6 3,5 Histidina 2,7 2,6 Cisteina 1,5 1,5 Metionina 1,4 1,4 Tripitofano 1,3 1,3 Lipídio 19 0,5 Adaptado de Feedipedia (2018), disponível em endereço eletrônico http://www.feedipedia.org/node/674

Com o conhecimento das atividades fisiológicas dos compostos bioativos, o interesse comercial para o uso em alimentos e medicamentos tem se intensificado juntamente com o desenvolvimento de novas tecnologias para a produção em escala industrial. Além disto, o farelo de soja representa uma fonte mais barata e prontamente disponível.

4. Compostos Fenólicos

As plantas podem ser consideradas como sendo um laboratório biossintético, não apenas no que diz respeito à produção de várias substâncias dos processos metabólicos primários de carbono (carboidratos, proteínas, gorduras) envolvidos na respiração, digestão e outros processos vitais, mas também em relação à produção de metabólitos secundários (glicosídeos, alcaloides, terpenóides, flavonóides, entre outros). Esses metabólitos secundários são compostos de baixa massa molar que possuem diversas funções na planta, principalmente de defesa contra predadores e patógenos, e quando estão presentes em alimentos de origem vegetal podem ter efeitos benéficos (Brasil d, 2018; Kuligowski et al, 2017).

Os compostos fenólicos naturais são metabólitos secundários encontrados em vegetais e plantas, cereais, frutas, sementes, e em alimentos a base desses (Pérez- Jiménezet al., 2010; Gupta et al., 2013). Estes compostos estão envolvidos na resposta protetora a diferentes estresses, incluindo estresses abióticos, como a radiação ultravioleta. Neste caso, esses compostos podem proteger contra estresse oxidativo e danos ao DNA, em lesões no corpo vegetal onde polifenóis estimulam o processo de lignificação, contribuindo para a cicatrização. Na defesa contra agressão por patógenos, suas concentrações podem ser aumentadas após a infecção por vírus, fungos, bactérias e até mesmo nematóides (Perez-Hernandez et al., 2016). Nos alimentos, esses compostos podem contribuir para o amargor, adstringência, cor, sabor, odor e estabilidade oxidativa (Chenynier et al., 2015).

Estima-se que pelo menos 8000 compostos fenólicos já tenham sido descritos, considerando os compostos naturais, semissintéticos ou sintéticos. Este amplo

conjunto de estruturas sustenta as propriedades físico-químicas e biológicas exibidas por cada classe de compostos.

Os compostos fenólicos podem ser classificados em classes principais, incluindo ácidos fenólicos, flavonóides, stilbenes e lignans. No entanto, as matrizes alimentares geralmente contêm uma mistura complexa desses compostos, em concentrações variáveis.

4.1. Caracterização Estrutural e Classificação dos compostos fenólicos

Compostos fenólicos são caracterizadospela presença de pelo menos um grupo hidroxila (–OH) quando está ligado a um ou mais anéis aromáticos (C6H5 ou C6), formando a estrutura fenol (C6H5OH). Quando eles exibem um único anel aromático, são denominados mono fenólicos ou fenólicos simples.

Como sugerido por sua nomenclatura, os polifenóis se referem a moléculas com dois ou mais anéis aromáticos e pelo menos um grupo hidroxila ligado a esses anéis, dando origem a um grupo heterogêneo de compostos químicos (Vermerris & Nicholson, 2006; Quideau et al., 2011). Com base no número de grupos hidroxila, a presença de grupos funcionais ligados ao anel benzeno e o tipo de conexão entre os anéis; os compostos fenólicos podem ser divididos em várias classes (Vermerris & Nicholson, 2006) (Figura 3).

Figura 3: Representação esquemática das principais classes e subclasses de compostos fenólicos e seus respectivos esqueletos de estrutura química, onde C6 corresponde ao anel aromático e C1, C2 ou C3 refere-se a cadeias laterais ou intermediárias. (Adaptado Baião et al., 2017)

A classe do ácido fenólico pode exibir estruturas curtas e simples, mas com a presença adicional de um grupo carboxila (–COOH) ligado ao anel aromático, além dos grupos hidroxila ou metoxila, que somam até três grupos funcionais, similarmente aos simples fenóis. Esta classe é dividida em duas subclasses, ácidos hidroxibenzóicos e ácidos hidroxicinâmicos, caracterizados por um esqueleto contendo 7 (C6-C1) e 9 (C6-C3) átomos de carbono, respectivamente (Giada, 2013; Tsao, 2010). Ácidos hidrobenzóicos podem ser representados por ácido gálico(R = R1 = R2 = OH) e ácido vanílico (R = OH, R1 = OCH3, R2 = H) (Figura 4) (Neveu et al., 2010).

O ácido gálico e o ácido vanilina pertencem à subclasse do ácido benzóico, caracterizada por um esqueleto composto de 7 carbonos (C6-C1). O ácido cafeico, o ácido férrico e o ácido p-cumárico representam a subclasse dos ácidos cinâmicos e exibem um esqueleto composto de 9 carbonos (C6-C3) (Pérez-Jiménez et al., 2010).

Figura 4. Estruturas químicas de ácidos fenólicos, adaptadas da base de dados “Conteúdo de polifenóis em alimentos” (http://phenol-explorer.eu).

A maior e mais estudada classe de compostos fenólicos é representada pelos flavonóides, que representam mais de 50% dos compostos fenólicos. Eles são compostos de 15 átomos de carbono que formam dois anéis aromáticos (A e B), conectados por três carbonos, dando origem ao típico esqueleto C6-C3-C6 (Figura 5). Os três átomos de carbono intermediários podem assumir diferentes configurações, variando de cadeias abertas a heterocíclicas, condensadas com o anel aromático A. Neste caso, a cadeia intermediária é chamada de anel C (Vermerris & Nicholson, 2006; Tsao, 2010).

Figura 5. Estruturas químicas representativas das principais subclasses e estrutura básica da maioria dos flavonóides, adaptadas da base de dados “Polyphenol content in foods” (http://phenol-explorer.eu) (Pérez-Jiménez et al., 2010)

Nos últimos anos, um número significativo de estudos sugeriu que o consumo prolongado de vegetais ou alimentos ricos em compostos fenólicos atende às necessidades fisiológicas e confere muitos benefícios à saúde humana, como o combate ao estresse oxidativo, trabalhando como adjuvantes na redução do risco de desenvolvimento de doenças crônicas, proteção contra o desenvolvimento de cânceres, infecções, envelhecimento, asma e doenças neurodegenerativas (Tomas- Barberan & Andres-Lacueva, 2012; Visioli & Davalos, 2011).

Um grande número de estudos, aplicando abordagens in vitro e in vivo sobre os efeitos de vegetais ricos em compostos fenólicos foram conduzidos e a maioria desses estudos de intervenção humana foi realizada com relação à ingestão dietética de um ingrediente, enquanto muitos estudos in vitro foram realizados com relação a compostos fenólicos individuais ou atuando sinergicamente (Perez- Hernandez et al., 2016; Cheynier et al., 2015; Quideau et al., 2011; Weichselbaum & Buttriss, 2010).

4.2. Efeitos dos compostos fenólicos

Estudos sobre a biodisponibilidade de compostos fenólicos em diversas matrizes alimentares devem ser realizados para melhor compreender o desempenho dessas substâncias no organismo. A digestão, absorção e metabolização de cada composto diferem em relação à quantidade de compostos fenólicos nos alimentos e a biodisponibilidade no organismo. Da mesma forma, a estrutura química dos compostos fenólicos em matrizes alimentares pode ser distinta daquelas encontradas em fluidos corporais humanos. Por exemplo, enquanto as agliconas são bem absorvidas no intestino delgado, outros compostos fenólicos são bem absorvidos nas regiões iniciais do trato digestivo. No entanto, a maioria destes compostos está nas formas de éster, glicosídeo e polímero e dificilmente são absorvidos em sua forma nativa. Estes compostos devem ser hidrolisados por enzimas da microflora do cólon antes de serem absorvidos (Kanimozhi et al., 2017).

Os compostos fenólicos possuem um amplo espectro de ação com efeitos confirmados, tais como anti-alérgicos, anti-inflamatórios, antibacterianos, anti- trombóticos, vasodilatadores e, principalmente, antioxidantes (Yildrim et al., 2017).

Flavonóides, como outros compostos fenólicos, são importantes compostos antioxidantes que podem eliminar íons negativos de oxigênio e liberar radical hidroxila in vivo (Eghbaliferiz et al., 2016). Os efeitos benéficos derivados de compostos fenólicos encontrados nos alimentos têm sido atribuídos à sua atividade antioxidante (Singh et al., 2013).

Benefícios dos ácidos fenólicos vêm sendo bastante explorado na indústria de cosméticos. Os ácidos hidroxicinâmicos e seus derivados têm emergido como ingredientes multifuncionais para aplicações tópicas, pois apresentam atividades antioxidante, anti-colagenase, antiinflamatória, antimicrobiana e antitirosinase, bem como efeitos protetores contra raios ultravioleta (UV), sugerindo que podem ser explorados como anti-envelhecimento, agentes anti-inflamatórios, conservantes e ingredientes corretores de hiperpigmentação (Taofiq et al., 2017).

Ácidos ferúlico e cafeico comercialmente disponíveis apresentam bioatividade anti-colagenase e fotoproteção. O uso de 15- 30 μM de ácido ferúlico e de 3,75- 30 μM de ácido cafeico promove a supressão da atividade de MMP-1 induzida por raios UVA, oferecendo atividade protetora ao eritema cutâneo induzido por raios UVB (Pluemsamran, et al., 2012).

5. Soja - fonte de compostos fenólicos

Os vegetais são considerados importantes fontes de compostos bioativos, favorecendo a saúde humana e a boa função orgânica (Holst & Williamson, 2008). Quando a ingestão de alimentos ricos em compostos bioativos é baixa, pode ocorrer um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), causando estresse oxidativo (Chen et al., 2011).

A soja é uma rica fonte de compostos bioativos e amplamente aceita como alimento funcional, devido à sua composição nutricional e efeitos farmacológicos, que têm sido atribuídos à presença de diversos compostos fenólicos. A concentração de compostos fenólicos na soja é influenciada por vários fatores, como tipo de cultivar, período agrícola, local de plantio, nutrição do solo e prazo de validade (Riedl et al., 2007).

Diversos derivados de soja são obtidos por fermentação, como tempeh e doulchi, ou apenas por coagulação, como vários tipos de tofu (Kuligowski et al., 2017). Além disso, a soja pode ser usada na produção de proteínas isoladas ou proteínas vegetais hidrolisadas, que por sua vez são usadas como ingredientes em produtos de carne e panificação, bebidas, sopas e vários outros produtos alimentícios (Snyder & Wilson, 2003; Aguiar et al., 2012). Nestes casos, as proteínas de soja podem conferir textura, retenção de água e gelificação, enquanto aumentam o teor de compostos fenólicos do alimento processado.

Compostos fenólicos presente na soja são flavonoides (isoflavonas), antocianinas, ácidos fíticos, saponinas, ácidos fenólicos, ácidos hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos, isoflavonóides (Lee et al., 2013).

Os ácidos sinápticos, ferúlico e p-cumárico são antioxidantes mais ativos do que os derivados do ácido benzóico, tais como ácido protocatecuico, siríngico e vanílico. Isso se deve à dupla ligação presente na molécula dos derivados do ácido cinâmcio, que participa da estabilidade do radical por ressonância de deslocamento do elétron desemparelhado, enquanto que os derivados do ácido benzóico não apresentam essa característica (Angelo & Jorge, 2007).

Os ácidos fenólicos encontrados na soja conferem sabor e a cor dos alimentos, estes fatores são influenciados pela presença de hidroxicinamicos (Meyer et al., 1998), estes apresentam diferentes tipos de funções fisiológicas, como antioxidante, antiflamatória, antimicrobiana, anticollagenase e atimelanogenica. As funções biológicas desses ácidos fenólicos e seus derivados são amplamente atribuídos à presença de grupos hidroxila em sua estrutura química (Taofiq et al., 2017). Estudos têm demonstrado que o ácido cafeico (derivado dos ácidos hidroxicinâmicos) apresenta atividade antitumoral, (Shahidi & Ambigaipalan, 2015). O acido hidroxibenzóico tem atividade antioxidante, atividade antimicrobiana, fungica, entre outras bioatividades, como estrógenos e propriedades antimutagênicas (Heleno et al., 2015).

As isoflavonas, são compostos sensíveis ao calor, são estruturalmente semelhantes ao estrogênio, podendo agir como um estrogênio mimético. A soja é a fonte mais abundante de isoflavonas (aproximadamente 3 mg/g de peso seco) na natureza. As isoflavonas são estruturalmente semelhantes ao estradiol de mamíferos e pode se ligar às isoformas α e β do receptor de estrogênio, por essa razão sendo denominados fitoestrogênios. No entanto, apesar de terem efeito benéfico à saúde, as isoflavonas não são consideradas nutrientes essenciais da dieta humana (Ajay et al., 2011; Baião et al., 2017). Além disso, possuem alta atividade antioxidante e propriedades quelantes de íons metálicos, possuem a capacidade de controlar ou inibir o crescimento de linhagens celulares de câncer de mama humano em cultura (Kim et al., 2006; Araújo et al., 2013).

Estes fitoestrógenos da soja apresentam baixa massa molecular e ocorrem principalmente em 4 formas químicas, forma malonil-β-glicosídeos malonil daidzina,

malonil glicitina e malonil genistina (70-80%), acetil-β-glicosídeos acetil daidzina, acetil glicitina e acetil genistina (5%), β-glicosídeos daidzina, glicitina e genistina (25%) e forma agliconas daidzeína, gliciteína e genisteína (2%), estruturalmente semelhante ao estrogênio, estradiol-17β, e são capazes de ativar ou bloquear os efeitos do estrogênio, dependendo do tipo de receptor (Riedl et al., 2007; Lee et al., 2013; Tepavčević et al., 2010).

Estudos demonstram a correlação entre o conteúdo de isoflavonas e o ambiente de cultivo, incluindolocal e temperatura. Tais teores são geralmente afetados por fatores ambientais e genéticos, como ano de cultivo, cultivar da soja, local de cultivo e temperatura. Os teores de isoflanonas também variam com o tempo de armazenamento e o período de germinação (Kim et al., 2006; Baião et al., 2017).

5.1. Bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos fenólicos

Os potenciais efeitos benéficos dos compostos fenólicos na saúde humana não dependem somente de sua concentração nos alimentos, mas principalmente de sua bioacessibilidade e biodisponibilidade após a ingestão. Biodisponibilidade é definida como a proporção de determinado composto ou nutriente que é digerida, absorvida e utilizada no metabolismo normal. O primeiro fator determinante a ser considerado quando se avalia a biodisponibilidade de compostos fenólicos é a sua bioacessibilidade, termo utilizado para definir a quantidade do composto que estará disponível para ser absorvida no intestino após o processo de digestão (Palafox- Carlos et al., 2011).

A absorção e transporte de compostos bioativos presentes em vegetais, de maneira geral, são complexos. As agliconas podem ser absorvidas no intestino delgado. No entanto, a maior parte dos compostos fenólicos presentes nos alimentos está na sua forma conjugada (éster, glicosídeos ou polímeros), que não pode ser absorvida diretamente. Essas formas precisam ser hidrolisadas por enzimas intestinais presentes na borda em escova ou pela microflora colônica para serem absorvidas. Estima-se que somente 5 a 10% dos compostos fenólicos ingeridos são absorvidos no intestino delgado, sendo assim, a maior parte segue para o intestino grosso (Manach et al., 2005; Manach et al., 2004). 41

Os compostos fenólicos que são absorvidos no intestino delgado podem ser submetidos à biotransformações de fase I (oxidação, redução e hidrólise) e particularmente de fase II (metilação, sulfatação e glucuronidação) nos enterócitos e em seguida nos hepatócitos, resultando em metabólitos conjugados hidrossolúveis. Estes metabólitos são liberados para a circulação sistêmica, distribuídos para os tecidos e eliminados via urina. Os compostos fenólicos que são secretados via rota biliar até o duodeno, podem ser submetidos à ação de enzimas, especialmente β- glicuronidase, na parte distal do intestino, podendo ser reabsorvidos ou seguir para o cólon (Cardona et al., 2013; Manach et al., 2005; Manach et al., 2014). Entre os 90 a 95% dos compostos fenólicos ingeridos que alcançam o intestino grosso são extensamente metabolizados pela microbiota colônica, podendo ser absorvidos e atingir a circulação sistêmica ou exercer efeitos benéficos no próprio intestino (Del Rio et al., 2010; Manach et al., 2005).

6. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais

A intoxicação alimentar é considerada uma das causas mais comuns de doenças e mortes nos países em desenvolvimento. A maior parte dos relatos de intoxicação alimentar está associada à contaminação bacteriana, especialmente de bactérias Gram negativas, como Salmonella typhi, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Outras bactérias Gram positivas, como Staphylococcus aureus e Bacillus cereus, também foram identificadas como agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos ou agentes causadores de deterioração de alimentos. A prevenção à deterioração de alimentos e seu agente patológico é tradicionalmente combatido com o uso de conservantes químicos. Apesar da eficiência comprovada desses conservantes químicos na prevenção da intoxicação alimentar e na conservação de alimentos, suas repetidas aplicações resultam em um acúmulo de resíduos químicos na cadeia alimentar humana e animal e efeitos colaterais desses produtos na saúde humana. Alem disto, os agentes antimicrobianos atualmente utilizados vêm gerando aumento na resistência dos patógenos e ainda o aparecimento de patógenos emergentes (Junior et al., 2014; Balouet al., 2016). Com base nisto, vem aumentando as buscas por agentes conservantes naturais, 42

potencialmente seguros e saudáveis. Dentro deste contexto, a utilização de extratos vegetais como conservantes de alimentos é de grande importância, pois, além de suas propriedades bioativas, também podem aumentar o valor nutritivo dos alimentos, são nutricionalmente seguros e facilmente degradáveis (Wojdyło et al 2007; Mostafa et al., 2018).

Extratos ricos em compostos fenólicos além de beneficiar a saúde, possuem função multipla incluindo atividade antimicrobiana e antioxidante. Os efeitos dos compostos fenólicos que tem sido relatada em células bacterianas são danos à membrana plasmática, vazamento do conteúdo intracelular e depleção da força motriz de prótons. Em geral, variações nas atividades antimicrobianas podem estar envolvidas nas diferenças de estruturas da superfície celular entre Gram-negativas e Gram-positivas. As Gram-positivas são mais suscetíveis à ação de ácidos fenólicos do que Gram-negativas. Além disso, o número, tipo e posição dos substituintes no anel benzênico dos compostos e do comprimento da cadeia lateral, influenciam o potencia antimicrobiano dos compostos fenólicos contra diferentes tipos de microrganismo (Cetin-Karaca & Newman, 2015).

7. Atividade antioxidante

Muitos estudos vêm demonstrando que alimentos ricos em compostos antioxidantes, como frutas, vegetais e chás, possuem efeitos contra doenças causadas pela produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), como câncer, artrite reumatóide, assim como doeças degenerativas relacionadas à idade, incluindo doença de Parkinson e Alzheimer. Esta atividade foi parcialmente atribuída à presença de diversos compostos como vitaminas e compostos fenólicos, sendo as propriedades antioxidantes a principal característica dessas substâncias (Moo- Huchin et al., 2014).

As espécies reativas de oxigênio (ROS), tais como oxigênio singlet, íon superóxido, íon hidroxila e peróxido de hidrogênio, são moléculas altamente reativas dentro do organismo, que são geradas normalmente nas células durante o metabolismo. O aumento nas concentrações de ROS ou espécie reativa de 43

nitrogênio (RNS) geram um desequilíbrio em relação à capacidade do sistema antioxidante endógeno, gerando assim um estresse oxidativo. Durante o estresse oxidativo podem ser gerados danos oxidativos em diversas moléculas, como por exemplo, em proteínas, lipídios, enzimas, DNA. E nos alimentos, tais moléculas podem levar a deterioração, oxidação e a peroxidação lipídica (Baba & Malik, 2015).

A oxidação de uma substância pode ser definida como conversão desta substância química em um derivado com número menor de elétrons, ou seja, é a perda de um ou mais elétrons para outra substância e o processo inverso pode ser considerado como redução. A auto-oxidação ocorre amplamente em alimentos que contém gorduras, óleos ou lipídios, o que ocasiona deterioração do alimento, podendo acarretar em perda de nutrientes, odor desagradável e formação de substâncias tóxicas. Um composto que possui propriedade antioxidante pode prevenir a oxidação por eliminação das espécies reativas, pela supressão da formação de ROS/RNS por algumas enzimas, pela quelação de metais traços envolvidos na produção de radicais livres e por diminuir o estresse oxidativo (Alves et al., 2010; Baba & Malik, 2015).

Os compostos fenólicos (POH) são vistos como potentes antioxidantes naturais. Dai & Mumper, (2010), descreveram como os compostos fenólicos podem atuar em relação à capacidade antioxidante, das seguintes formas:

Eles atuam como receptores de radicais livres e disjuntores de cadeia. Eles interferem na oxidação de lipídios e outras moléculas por doação rápida de um átomo de hidrogênio a radicais (R):

R + POH → RH + PO·

Os intermediários dos radicais fenoxi (PO ·) são relativamente estáveis devido à ressonância e, portanto, uma nova reação em cadeia não é facilmente iniciada. Além disso, os intermediários dos radicais fenoxi também atuam como terminadores da rota de propagação, reagindo com outros radicais livres:

PO· + R· → POR

Os compostos fenólicos possuem estrutura química ideal para atividades de eliminação de radicais livres, porque eles têm: grupos hidroxila fenólicos que são propensos a doar um átomo de hidrogênio ou um elétron a um radical livre; sistema aromático conjugado estendido para deslocar um elétron desemparelhado.

Devido à diversidade química dos compostos fenólicos e à complexidade da composição em extratos vegetais, é caro e ineficiente separar cada antioxidante fenólico e estudá-lo individualmente. Além disso, como os antioxidantes possuem diversos modos de ação, frequentemente mais de um mecanismo está envolvido, gerando assim um sinergismo. Portanto, é desejável estabelecer métodos de análises de capacidade antioxidante de amostras de extratos vegetais (Dai & Mumper, 2010).

Além de suas propriedades biológicas, os antioxidantes naturais também são de interesse nas indústrias cosmética, farmacêutica e especialmente na alimentícia, pois também podem ser usados como substitutos dos antioxidantes sintéticos que podem ser cancerígenos e instáveis, proporcionando proteção contra a degradação oxidativa dos radicais livres (Moo-Huchin et al., 2014).

Como dito anteriormente (seção 1), devido às atividades dos extratos vegetais e a atividade dos compostos purificados, eles podem ser utilizados como aditivos alimentares e para que isso ocorra a ANVISA diz, “A segurança dos aditivos é primordial. Isto supõe que antes de ser autorizado o uso de um aditivo em alimentos este deve ser submetido a uma adequada avaliação toxicológica, em que se deve levar em conta, entre outros aspectos, qualquer efeito cumulativo, sinérgico e de proteção, decorrente do seu uso” (Brasil, 2018c). Com isso, ensaios de citotoxicidade para o extrato é de fundamental importancia.

8. Peptídeos bioativos

Como visto nas seções anteriores, extratos de plantas, são ricos em compostos bioativos, dentre eles, proteínas e peptídeos com diversas funções biológicas. A soja é a leguminosa com o maior teor de proteínas e mesmo após o processamento de

extração do oleo de soja, o seu co-produto (farelo de soja), ainda retem grande parte dessas proteínas e peptídeos. Esses compostos são de grande interesse à indústria de alimentos e farmacêutica. Devido às suas atividades biológicas, tais compostos também podem ser utilizados como nutracêuticos.

Os nutracêuticos são substâncias de origem natural que podem ser extraídas de várias fontes (por exemplo, frutas, plantas, biomassa lignocelulósica e algas) e que têm importantes benefícios para a saúde quando incorporadas em alimentos ou formulações farmacêuticas. Nos últimos anos, alimentos funcionais e nutracêuticos têm atraído muita atenção, particularmente por seu impacto na saúde humana e na prevenção de certas doenças. Considerando que a maioria dos peptídeos funcionais está presenteem matrizes complexas contendo um grande número de frações de proteína hidrolisada e outros tipos de compostos, sua separação e purificação são necessárias (Sánchez & Váquez, 2017).

Sabe-se que as proteínas são moléculas versáteis com diferentes funções no metabolismo. Elas atuam na defesa, ou sistema imunológico, como enzimas, portadores e mediadores de sinalização, entre outras funções importantes do metabolismo. Bioatividades de peptídeos, encripitados dentro de proteínas, são latentes até que uma vez liberados da proteína parental, possam atuar com diferentes atividades. Tais peptídeos bioativos dentro de são capazes de afetar as atividades celulares, resultando na promoção da saúde. Esses peptídeos podem apresentar múltiplas bioatividades, que incluem atividades antimicrobianas, antioxidantes, anti-hipertensivas antitrombóticas e imunomoduladoras (Del Aguila et al., 2017).

Mais de 7000 peptídeos que ocorrem naturalmente foram identificados, sendo eles com papeis fisiologicos importantes (Fosgerau & Hoffman, 2015). Inúmeras definições foram dadas para peptídeos bioativos e um dos mais apropriados denomina estas moléculas como componentes de alimentos que podem exercer uma atividade de regulação no organismo humano, independentemente das suas funções nutritivas (Meisel 2011).

Em geral, os peptídeos são moléculas sinalizadoras seletivas e eficazes que se ligam a receptores específicos da superficie celular, como receptores acoplados à proteina G (GPCRs) ou canais iônicos, onde desencadeiam efeitos intracelulares. Dado ao seu perfil farmacológico atraente e propriedades intrínsecas, os peptídeos vem ganhando cada vez mais notoriedade terapêutica (Fosgerau & Hoffman, 2015).

A crescente descoberta sobre peptídeos bioativos revelou-se que muitas proteínas e peptídeos provenientes de alimentos apresentam além do seu valor nutricional já estabelecido, atividades biológicas interessantes (Tripathi & Vashishtha 2006; Hartmann & Meisel 2007; Del Aguila et al., 2017). Os peptídeos bioativos derivados de alimentos geralmente contêm de 2 a 9 aminoácidos (Kitts & Weiler, 2003). No entanto, o número de resíduos de aminoácidos pode variar de 20 ou mais (Korhonen & Pihlanto, 2003). Um exemplo é a lunasina, um peptídeo derivado de soja e cevada com atividade anticancerígena, contém 43 aminoácidos com massa molecular de 5,4 kDa (Jeong et. al, 2002).

O potencial terapêutico dos alimentos funcionais é atribuído à presença de grupos funcionais específicos e pelos fragmentos peptídicos derivados destas moléculas que são gerados durante o metabolismo dos alimentos (Agyei et. al, 2012). Peptídeos bioativos podem ser encontrados em hidrolisados proteicos e produtos lácteos fermentados, mas também podem ser liberados durante o processo de digestão das proteínas de diferentes fontes alimentares (Del Aguila et al., 2017).

Nos últimos anos vem crescendo o conhecimento por peptídeos bioativos derivados de sequências interna de proteínas, peptídeos encriptados. Varios peptídeos bioativos não possuem atividade quando codificados em proteínas, entretanto, após serem liberados adquirem seus efeitos biológicos, como antimicrobianos, opióides, imunomoduladores, citomoduladores, antioxidantes, dentre outros (Pessione & Cirricione, 2016). Portanto, compostos bioativos de origem alimentar podem ser obtidos de alimentos convencionais, suplementos alimentares, alimentos funcionais ou alimentos medicinais (Agyei et al, 2012).

Dentre as diferentes funções dos peptídeos, os peptídeos antimicrobianos constituem uma classe especial e promissora de moléculas que poderão substituir 47

os antibióticos atualmente em uso e poderão contribuir para o tratamento de infecções bacterianas e fúngicas (Del Aguila et al., 2017).

9. Peptídeos antimicrobianos

Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são moléculas essenciais no sistema de defesa dos seres humanos, animais e plantas, sendo considerados como parte da primeira linha de defesa (Thevissen et al., 1996, Cole & Ganz, 1997, Zaiou, 2007). Esses peptídeos são eficazes contra várias classes de microrganismos, como bactérias, vírus, protozoários e fungos (Thevissen et al., 1996; Khalid et al., 1999). Eles podem ser facilmente sintetizados de maneira flexível e com baixo consumo de energia e biomassa, devido ao seu pequeno tamanho (Broekaert et al., 1995). Muitos são sintetizados ou ativados pela proteólise de proteínas específicas (Borregaard et al., 2000).

Vários PAMs foram identificados e isolados de todos os tipos de organismos vivos, incluindo animais, plantas, bactérias, protistas e fungos. Eles apresentam um amplo espectro de ação tanto contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Pushpanathan et al., 2013). O número de peptídeos antimicrobianos vem crescendo consideravelmente nos últimos 20 anos (Del Aguila et al., 2017). Atualmente, já foram descritos mais de 1500 tipos de PAMs encontrados em diferentes organismos (Wang & Wang, 2004).

Os PAMs têm se mostrado ferramentas poderosas para aplicação na área médica e na indústria de alimentos, garantindo a segurança e a qualidade dos alimentos (Perez et al., 2012).

Os peptídeos antimicrobianos podem substituir o uso de antibióticos e contribuir para a terapia contra infecções bacterianas e fúngicas e representam um novo modelo para o desenvolvimento de drogas eficazes contra patógenos resistentes aos antibióticos convencionais (Muñoz et al., 2007;De Lucca, 2000; Hancok & Scott, 2000; Selitrennikoff, 2001).

O primeiro PAM relatado em um organismo eucarionte foi o α-purotionina do trigo, descoberto em 1942. Ao longo das últimas décadas, muito mais desses peptídeos têm sido extraídos de diversos tecidos de plantas, incluindo raízes, folhas, sementes e flores (Tavares et al., 2008, Sels et al., 2008).

Além da propriedade antimicrobiana, alguns PAMs têm apresentado atividades anticancerígenas e de cicatrização de feridas (Hancock et al., 2000). Como os PAMs diferem estruturalmente dos antibióticos convencionais produzidos por bactérias e fungos, eles representam um modelo para o desenvolvimento de drogas efetivas contra os patógenos resistentes a estes antibióticos convencionais (Muñoz et al., 2007).

Com o crescente número de novos PAMs, os dados estão sendo acumulados nessa área e há a necessidade de organizar as informações em bancos de dados. Sequências e / ou estruturas de AMP existentes estão disponíveis em pelo menos 18 bases de dados ativas (Tabela 3), que exibem entradas de PAMs de diversas origens ou restritas a uma família ou fonte específica de PAMs (Wang, 2013).

Tabela 3: Lista atualizada dos bancos de dados dedicados aos peptídeos antimicrobianos. Database Website Type RAPD Inactive Recombinant AMPs PhytAMP http://phytamp.pfba-lab-tun.org/main.php Plant AMPs Bacteriocin natural BACTIBASE http://bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php antimicrobial peptides Defensin Knowledgeba http://defensins.bii.a-star.edu.sg/ Defensin family se PenBase inactive Shrimp penaeidin database Peptaibol Fungal AMPs/Restricted to http://peptaibol.cryst.bbk.ac.uk/home.shtml database peptaibol family AMSDb Inactive Eukaryotes AMPs HIV inhibitory peptides from HIPdb http://crdd.osdd.net/servers/hipdb/ various sources APD2 http://aps.unmc.edu/AP/main.php General AMPs DAMPD Inactive General AMPs http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/lam Short AMPs(<100 aa) from LAMP p/ various sources CAMPR3 http://www.camp.bicnirrh.res.in/ General AMPs SAPD Inactive Synthetic antibiotic peptides Cybase http://www.cybase.org.au/ Cyclic protein

Short alpha helix peptides YADAMP http://yadamp.unisa.it/ interacting with cell membranes DADP http://split4.pmfst.hr/dadp/? Anuran defense peptides DBAASP http://dbaasp.org/home.xhtml General AMPs THIOBASE http://db-mml.sjtu.edu.cn/THIOBASE/ Thiopeptides family Bacterial cell wall-degrading http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/Enz enzymes including lysins, EnzyBase yBase/home.php bacteriocins, autolysins and lysozymes MilkAMP http://milkampdb.org/home.php Antimicrobial dairy peptides Hemolytic and non-hemolytic Hemolytic http://crdd.osdd.net/raghava/hemolytik/ peptides AVPdb http://crdd.osdd.net/servers/avpdb/ Antiviral peptides (AVPs) ParaPep Anti-parasitic peptides Dados adaptados de Wang, 2013.

As informações disponíveis mostram que os PAMs são compostos de uma classe variável de moléculas que diferem em tamanho, estrutura molecular e composição de aminoácidos. No entanto, eles compartilham algumas características típicas da molécula de PAM. A maioria dos peptídeos antimicrobianos possui baixo peso molecular composto de 5 a 100 aminoácidos, embora também existam alguns PAMs de maior peso molecular, como a lactoferrina, uma proteína antimicrobiana do leite com cerca de 80kDa, composta de> 600 aminoácidos (Del Aguila et al., 2017).

Como essas moléculas formam um grupo heterogêneo, é difícil classificá-las em uma classificação unificada. Sete diferentes classificações de peptídeos / proteínas têm sido propostas: maquinaria biossintética, fontes e funções biológicas, propriedades peptídicas, padrão de ligação covalente, estrutura tridimensional e alvos moleculares (Singh et al., 2013). Alguns peptídeos bioativos são sintetizados por múltiplas vias enzimáticas, enquanto a maioria é codificada por um único gene. De acordo com as informações do banco de dados, mais de 8.000 sequências de PAMs estão registradas no CAMPR3 (http://www.camp.bicnirrh.res.in/) e a maioria das entradas, considerando bancos de dados dedicados a PAMs gerais, é originária do reino animal (> 70 %), seguido de plantas e bactérias (Nagpure & Gupta, 2013).

Nos últimos 30 anos foram desenvolvidos métodos computacionais para predição de estruturas de proteínas e peptídeos. Tais métodos incluem modelagem

comparativa, predição de enovelamento de proteínas e predição por primeiros princípios. A modelagem comparativa é conhecida como modelagem por homologia, está, usa como molde a estrura de outra proteína de referência, já descrita experimentalmente e com as coordernadas cartesianas que estão depositadas em bancos de dados de estruturas. Esta tecnica se tornou universalmente confiável e amplamente utilizada pelas comunidades de modelagem e biociências (Dutra et al., 2014; Kelley et al., 2015).

9.1. Peptídeos antimicrobianos de plantas

Como visto no capítulo anterior, o farelo de soja é uma rica fonte de proteínas e peptídeos. Cada vez mais vem aumentando o interesse em peptídeos de origem vegetais. As plantas são uma rica fonte de peptídeos com atividades farmacológicas, incluindo antimicrobianos. Estudos vêm demonstrando o interesse na expressão de PAMs em plantas devido à demanda por novos antimicrobianos. Os PAMs naturais e sintéticos são considerados potenciais candidatos para aplicações na agricultura e médica (Flavia et al., 2013).

Muitos peptídeos e proteínas de plantas evoluíram como moléculas sinalizadoras e desempenham um papel fundamental na defesa, diferenciação, crescimento, homeostase e senescência. As plantas podem mostrar a mesma estratégia de defesa que os animais, secretando e / ou sintetizando PAMs em diferentes partes das plantas que poderiam agir contra microorganismos. Os PAMs nos tecidos vegetais são geralmente catiônicos, mas novos estudos mostram uma descoberta crescente de PAMs aniônicos (Hammami et al., 2008).

Alguns genes controlam o sistema de defesa da planta, produzindo proteínas antimicrobianas e PAMs, que também podem ser expressos constitutivamente (Castro & Fontes, 2005). Existem mais de 1700 tipos de PAMs naturais identificados e milhares de derivados e análogos projetados ou gerados sinteticamente, usando PAMs naturais como modelos (Laverty et al., 2011).

As plantas produzem uma ampla variedade de PAMs com características específicas, como baixo peso molecular, estabilidade conferida pela sua carga positiva e alto conteúdo de resíduos de cisteína que formam ligações dissulfeto. Os PAMs de plantas podem ser classificados em diferentes famílias, de acordo com sua estrutura terciária, como tioninas, proteínas de transferência de lipídios (LTPs), defensinas, snakins, knottins e cyclotides semelhantes à heveína (Gao et al., 2001; Hammami et al., 2008; Nawrot et al., 2014).

Peptídeos bioativos derivados de alimentos geralmente contêm de 2 a 20 resíduos de aminoácidos (Kitts & Weiler, 2003; Korhonem & Pihlanto, 2003). Estes peptídeos podem ser encontrados em hidrolisados protéicos e produtos de fermentação microbiana, mas também podem ser liberados durante o processo digestivo de proteínas alimentares de diferentes fontes alimentares. Os peptídeos gerados a partir da digestão no trato gastrointestinal podem apresentar atividades fisiológicas, como propriedades antimicrobianas, imunomoduladoras ou citomoduladoras e antioxidantes (Meisel, 2001; Yang et al., 2009).

Peptídeos bioativos derivados de alimentos e plantas são considerados potenciais agentes antimicrobianos para serem usados na conservação de alimentos. Esses peptídeos podem ser incorporados em novos materiais para criar embalagens com características antimicrobianas (Appendini & Hotchkiss, 2002), a fim de aumentar o prazo de validade, a qualidade e a segurança dos alimentos, reduzindo ou evitando o crescimento bacteriano nas superfícies dos alimentos (Soares et al., 2009).

9.2. Mecanismos de ação dos PAMs

Há um interesse especial em PAMs com propriedades antibacterianas, uma vez que representam uma alternativa promissora para substitutos convencionais de antibióticos. Portanto, as informações disponíveis sobre o mecanismo de ação dos PAMs são, na maioria das vezes, baseadas na capacidade antibacteriana dessas moléculas (Bahar & Ren, 2013). Embora os mecanismos de muitos peptídeos bioativos permaneçam desconhecidos (Selitrennikoff, 2001), é certo que a interação de peptídeos antimicrobianos com membranas de microrganismos é um pré- 52

requisito para permitir sua inibição do crescimento. A maneira pela qual os PAMs interagem com a membrana determina seu modo de ação. A interação do peptídeo com a membrana bacteriana leva à permeabilização da membrana, que pode ocorrer basicamente por dois mecanismos: com a ruptura e a não ruptura da membrana. Uma vez ligado à membrana, os PAMs permeabilizados podem levar à morte bacteriana pelo vazamento do citoplasma através dos poros e canais, formados na membrana, que podem ocorrer por quatro mecanismos clássicos (fig. 6): (i) “aggregate”, (ii) “toroidal pore” , (iii) “barrel-stave” e (iv) “carpet” (Patrzykat et al., 2002; Zhang et al., 2001).

Figura 6. Mecanismos de ação de peptídeos antibacterianos. A membrana bacteriana está representada em amarelo como uma bicamada lipídica e os peptídeos apresentados como cilindros, onde as regiões hidrofílicas estão representadas em vermelho e as regiões hidrofóbicas estão representadas em azul. Os mecanismos de ação estão representados em (A) Modelo “aggregate”. (B) Modelo“toroidal pore”. (C) Modelo “barrel-stave”e (D) Modelo de “carpet” (Adaptado de Jenssen et al., 2006).

No modelo “aggregate”, os peptídeos se agregam de forma não organizada na superfície da membrana pela interação com as cabeças fosfolipídicas formando aglomerados não estruturados e formando poros temporários naquela região. Os PAMs podem atingir alvos intracelulares através de translocação pelos poros (Giuliani et al., 2007).

No modelo “toroidal pore”, os peptídeos são inseridos de forma perpendicular na bicamada lipídica, onde a região hidrofílica do peptídeo se liga à porção hidrofílica das cabeças fosfolipídicas, fazendo com que a bicamada se dobre e forme o poro toroidal. Esse modelo une dois mecanismos, o modelo de bastão e os modelos de carpete (Del Aguila et al., 2017).

O modelo “barrel-stave” foi o primeiro mecanismo proposto para explicar a morte de bactérias por PAMs. Os PAMs são acumulados como monômeros na superfície bacteriana, formando padrões circulares. Posteriormente, como no modelo toroidal, os peptídeos estão associados de forma perpendicular ao plano da bicamada, formando um "barril", com suas regiões hidrofílicas voltadas para o lúmen do poro e as regiões hidrofóbicas interagindo com a bicamada lipídica (Yang et al., 2001; Del Aguila et al., 2017).

No modelo “carpet”os péptidos interagem com os componentes da membrana em uma posição paralela que reveste a área como um tapete. Como no poro toroidal, os peptídeos se ligam às cabeças fosfolipídicas, fazendo com que a bicamada se dobre. A membrana então rompe, formando micelas e deixando poros por onde os componentes internos vazam (Jenssen et al., 2006). Agrupamentos de PAMs podem cobrir a superfície bacteriana de maneira semelhante a carpetes e, quando as concentrações de PAMs aumentam, a membrana sofre modificações estruturais e os PAMs agem de forma semelhante ao detergente, causando rupturas da membrana (Bechinger, 1999).

A permeabilização de membranas por peptídeos é fortemente influenciada por suas características físico-químicas, especialmente a carga líquida. A maioria dos PAMs descritos é predominantemente composta de aminoácidos básicos que conferem uma carga líquida positiva em condições fisiológicas, permitindo sua 54

interação com componentes carregados negativamente da membrana. A hidrofobicidade, o comprimento, a estrutura secundária e a flexibilidade desses peptídeos também contribuem para esse primeiro contato no processo de inibição microbiana (Perez et al., 2012; Malmsten, 2014). Os PAMs catiônicos também mostram uma região rica em aminoácidos hidrofóbicos, produzindo moléculas anfipáticas catiônicas capazes de interagir com os grupos lipídicos e fosfolipídicos da bicamada lipídica (Bahar & Ren, 2013).

Mais especificamente, em bactérias Gram-positivas, as superfícies apresentam peptidoglicanos apresentando grupos de ácido teicóico aniônico, aos quais os PAMs catiônicos serão capazes de se ligar, enquanto que nas bactérias Gram-negativas eles se ligarão à membrana externa através dos grupos fosfato aniônico do LPS (Jenssen et al., 2006).

Foi demonstrado que os peptídeos são capazes de atingir o citoplasma, mesmo sem romper a membrana, onde desencadeia a morte celular através da inibição do DNA, RNA, síntese protéica, ciclo celular e componentes da parede celular. Também é possível que os peptídeos inibam o crescimento bacteriano por ambos os mecanismos, permeabilização da membrana, com ou sem formação de poros e translocação através dela (Giuliani et al., 2007; Matsuzaki, 2009; Brogden, 2005).

A maioria dos PAMs são moléculas catiônicas. Os PAMs catiônicos apresentam em sua maioria, baixa massa molecular, sendo constituídos de menos de 100 resíduos de aminoácidose com predominância de aminoácidos básicos, que lhes conferem uma carga líquida positiva (+2 a +9), em pH fisiológico. Além disso, os PAMs catiônicos também apresentam uma região rica em aminoácidos hidrofóbicos. A separação espacial entre os aminoácidos básicos e os hidrofóbicos torna os PAMs catiônicos moléculas anfipáticas (Bulet & Stocklin, 2005).

Estudos mostram que há predomínio de PAMs catiônicos, mas os PAMs com predominância de resíduos acíclicos em sua sequencia primária também têm sido descritos. Além disso, durante a última década, peptídeos aniônicos têm sido

identificados também em animais vertebrados, invertebrados e plantas, mostrando a importância destas moléculas na imunidade inata (Frederick et al., 2009).

Os mecanismos de ação dos peptídeos aniônicos ainda não são muito bem descritos. Estas moléculas podem interagir com constituintes da membrana como os carboidratos. Alternativamente, os peptídeos catiônicos podem mediar à interação dos peptídeos aniônicos com a porção negativa da membrana. Dessa forma, os peptídeos aniônicos, ancorados aos catiônicos, são transportados para o meio intracelular sem danificar a estrutura da membrana microbiana. Dentro da célula, o peptídeo aniônico pode inibir a ação da atividade da ribonuclease, resultando assim na morte da célula (Del Aguila et al., 2017).

Os PAMs têm despertado o interesse da área clínica e tecnológica, uma vez que eles representam uma ferramenta valiosaa ser utilizada no controle da perda de colheitas e na produção de antibióticos para tratamento deinfecções humanas (Del Aguila et al., 2017). Adicionado a isto, os PAMs podem ser aplicados à indústria alimentar, não só como um conservante de alimentos, mas também como ingredientes de alimentos funcionais para promover a saúde (Fadaei, 2012).

Em relação às plantas, já foi salientado que tem sido identificados e caracterizados muitos peptídeos, como a lunasina. Este peptídeo obtido da soja e cevada tem 43 resíduos deaminoácidos; tioninas que possuem propriedade anticarcinogênica; ciclotides, uma classe de peptídeos com atividade inseticida apresenta atividade anti-HIV e anticitotóxica (Jeong et. al, 2012).

Nos últimos anos, as preferências dos consumidores por conservantes naturais se expandiram e inspiraram a busca de antimicrobianos a partir de organismos seguros. Estes agentes antimicrobianos são eficazes em retardar a deterioração dos alimentos, mantendo as características organolépticas e nutricionais. A adição de AMPs naturais pode prolongar a vida útil e melhorar a segurança e a fabricação de alimentos.

Justificativa

Desde tempos remotos, a utilização de extratos de plantas naturais tem provado ser eficiente para melhorar as condições de saúde dos seres humanos e na conservação de alimentos. Estudos químicos e farmacológicos têm sido realizados com vários extratos de plantas para desvendar sua composição química e confirmar seus efeitos benéficos, identificando seu(s) princípio(s) ativo(s). A utilização de moléculas bioativas de origem vegetal para o tratamento de doenças bem como na formulação de alimentos funcionais e nutracêuticos, tem se mostrado eficiente. O principal objetivo dos alimentos funcionais ou nutracêuticos é reduzir o risco de inúmeras doenças aos seres humanos. No futuro, os alimentos funcionais terão potencial para promover benefícios à saúde, além da nutrição básica, e poderão ser um potencial substituto de suplementos ricos em micronutrientes.

O surgimento de surtos de contaminação associados a produtos alimentícios impulsionou o desenvolvimento de pesquisas nesta área voltado especialmente para o potencial antimicrobiano de peptídeos extraídos de diversas matrizes. Essas moléculas representam uma ferramenta essencial para o controle de surtos causados pela deterioração de alimentos contribuindo para o aumento da vida de prateleira, evitando o desperdício e as doenças desenvolvidas por diferentes toxinas produzidas por bactérias.

A ocorrência de proteínas bioativas ou seus precursores no reino vegetal está bem estabelecido. Porém, muitos aspectos científicos e metodológicos em relação a estas substanciam precisam ser elucidados a fim de aperfeiçoar sua utilização para nutrição e saúde humana. O desenvolvimento de novas tecnologias, incluindo técnicas de separação por cromatografia e membranas, é imprescindível para a produção de frações enriquecidas de peptídeos bioativos extraídos de diferentes matrizes proteicas.

É importante estudar as propriedades tecnológicas das frações enriquecidas de peptídeos bioativos e o desenvolvimento de modelos alimentares os quais contem a atividade antimicrobiana. A possível influencia das condições de extração,

especialmente o aquecimento, na atividade e biodisponibilidade deve ser investigada.

A soja é uma leguminosa amplamente cultivada, de grande interesse econômico, é uma rica fonte de compostos bioativos, apresenta propriedades biológicas relevantes para aplicação na indústria de alimentos como aditivo alimentar, contribuindo para manutenção da saúde e do bem-estar, devido suas propriedades antimicrobianas, antioxidantes, anticarcinogênicas. Normalmente a soja é processada para gerar alimentos a base de soja ou em grande parte é utilizada para extração do óleo, gerando assim um co-produto rico em compostos bioativos, o farelo de soja. A reutilização de co-produtos da indústria, muitas das vezes considerados como rejeito industrial, representa uma alternativa de baixo custo para obtenção de compostos capazes de promover benefícios para a saude. Neste sentido, uma etapa essencial no processo de obtenção de compostos bioativos a partir de fontes naturais, é a caracterização química dos componentes do extrato bruto bem como a identificação dos potenciais candidatos, avaliação de sua atividade biológica, purificação das moléculas interesse e avaliação de citotoxicidade. O extrato aquoso do farelo de soja foi preparado em nosso laboratório utilizando água como solvente e mostrou-se um potente antimicrobiano e antioxidante. O extrato foi caracterizado em relação aos compostos fitoquímicos e proteínas/peptídeos.

Objetivo geral

Caracterizar fisico-quimicamente o extrato aquoso obtido do farelo de soja, avaliar as atividades biológicas do extrato, identificar os compostos ativos, purificar os peptídeos com atividades biológicas, caracterizando-os e identificando.

Objetivos específicos

 Identificar os tipos de compostos ativos presentes no farelo da soja que sejam passíveis de extraçao aquosa; composots fenólicos e peptídeos;

 Avaliar as atividades biológicas do extrato aquoso do farelo de soja, tais como atividade antimicrobiana, antitumoral e antioxidante;

 Avaliar a citotoxicidade do extrato aquoso de farelo de soja contra células saudáveis e células tumorais;

 Avaliar a bioacessibildade dos compostos fenólicos presentes no extrato após a digestão simulada in vitro e ex vivo;

 Avaliar a atividade antioxidante do extrato pré e pós digestibilidade in vitro;

 Isolar os peptídeos bioativos;

 Identificar os peptídeos obtidos por espectrometria de massas;

 Determinar os peptídeos com o melhor potencial antimicrobiano;

 Determinar a estrutura 3D do melhor candidato a peptídeo antimicrobiano por modelagem molecular.

CAPÍTULO I

Original research:

Potential health-promoting compounds recovered from soybean (Glycine max) meal by aqueous extraction

Freitas, C. S., Silva, G. A., Perrone, D., Vericimo, M. A., Baião, D. S., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F., Del Aguila, E. M.

Manuscript submitted: Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2018

Potential health-promoting compounds recovered from soybean (Glycine max) meal by aqueous extraction

Cyntia S. Freitas1; Genilton Alves da Silva1, Daniel Perrone1, Mauricio A. Vericimo2, Diego dos S. Baião1, Patrícia R. Pereira1; Vânia M. F. Paschoalin1 and Eduardo M. Del Aguila1*

1Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 21941-909, RJ, Brazil.

2Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 4020-141, RJ, Brazil. [email protected] (C.S.F.), [email protected] (G.A.S.), [email protected](D.P); [email protected]; (P.R.P.), [email protected] (D.S.B); [email protected] (P.R.P.), [email protected] (V.M.F.P.); [email protected](E.M.D.A.).

*Corresponding author: [email protected]

Tel: 5521-39387362

Fax: 5521-39387266

Abstract

Soybeans have strategic potential in food security as a source of protein and functional bioactives for human consumption. Polyphenols and other bioactive compounds can be recovered after an aqueous extraction from soybean meal, a by product of soy oil refining. Genistin, daidzin, glycitin and malonylgenistin were the predominant isoflavones, and the overall bioaccessibility of their glicosidic forms was nearly 75%. Sixteen phenolics were identified, and caffeic acid, 5-CQA acid and hesperidin were the most predominant phenolics. Approximately 30% of gallic acid, syringic acid, vanillic acid and myricitrin were released after intestinal digestion. The aqueous extract showed no cytotoxicity to healthy murine cells while maintaining several bioactivities, such as antioxidant capacity, which was enhanced after an in vitro gastric digestion, and the ability to inhibit lipid peroxidation compared to natural and synthetic food antioxidants. Antimicrobial activity to several foodborne pathogens and antitumoral activity against a human glioblastoma cell line was also observed.

Keywords: extruded-soy material, polyphenols, isoflavones, bioacessibility, non- cytotoxic, antimicrobial and antimitogenic activities

 Highlights

 Phenolics and isoflavones of high bioaccessibility were regained from soybean meal

 Genistin, daidzin, glycitin and malonylgenistin are the main isoflavones

 Aqueous extract showed antioxidant, antimicrobial and antitumoral activities

 Aqueous extract is non-toxic to healthy mouse bone marrow and fibroblast cells

Introduction

Over the years, plant extracts have been demonstrated to be a rich source of bioactive compounds able to retard degradation, improve the quality and increase the nutritive value of foods and even provide health benefits (Zakir & Freitas, 2015).

Soybean (Glycine max), a leguminous plant, is a resource of several phytochemicals and the second largest source of vegetable oil worldwide (after palm oil) with a global production of 271 million metric tons per annum (Day, 2013) and a high economical value in both national and international markets. The United States of America, Brazil and Argentina are the largest producers of soybeans, reaching together approximately 80% of the cropped grains (Wang et al., 2015).

The large interest in the cultivation of soybean relies on their nutritional value and the health benefits promoted by their components. In addition to its content in protein and lipids, the soybean is a natural resource of phenolic compounds and isoflavones (Villalobos et al., 2016). This crop is rarely consumed by cooking the grain and traditionally it is processed to originate soybean-based food or ingredients for the food industry. To extract the oil, soybean grains are mechanically pressed or treated with organic solvents (usually hexane) to generate, at the end of the process, a solid by-product named soybean meal that still retains most of the bioactive compounds found in the grains. Soybean meal is mostly used to produce animal feed, which requires a prior heat treatment followed by toasting the meal to eliminate anti-nutritional factors, especially trypsin inhibitors and lectins (Zhang et al., 2013; Villalobos et al., 2016).

Polyphenols or phenolic compounds are accumulated in soya as products of the secondary metabolism synthesized by attempts throughout their normal development, for a stress response, such as infections, UV radiation or injury. They contribute to the protection against predators and pathogens and to

the organoleptic characteristics, conferring flavor and sensory properties such as sweetness, bitterness and astringency. Soybeans may contain isoflavones, anthocyanins, fungal acids, saponins, phenolic acids, hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids, isoflavonoids and isoflavones. Soybean isoflavone content ranges from 0.56 to 3.81 mg/g (Hooper et al., 2008) which is distributed in three chemical forms, including aglycones and their β- glucoside conjugates: glucosides, malonylglucosides and acetylglucosides (Barnes et al., 2010).

Isoflavones possess high antioxidant activity and metal-ion chelating properties, but their major importance is as phytoestrogens, binding to both α and β-estrogen receptors, and causing an estrogenic or anti-estrogenic effect according to the type of estrogen receptor. Their intake has been associated with a decreased risk of hormone-related cancers (Kuligowski et al., 2017). Furthermore, soya phytochemicals can display several biological activities such as antioxidant, antimicrobial and antitumoral activities (Baião et al, 2017).

Considering all the health benefits promoted by the bioactive compounds, the commercial interest of food and pharmaceutical industries on these molecules has been intensified along with the development of new technologies for industrial scale production (Korhonen et al., 2003). Soybean meal represents a cheaper and readily available source of bioactive compounds, which could be applied in the isolated form or as a mixture of them using the synergistic effect between bioactive molecules present in soy by- products for different purposes (Bruce et al., 2006).

The main objective of the present study was to compile and quantify the health-promoting compounds from soybean oil refinery by-products, providing detailed information about the valuable bioactive phytochemicals that can be recovered from extruded soybean material after water extraction and their bioacessibility. The potential bioactivities in soluble extract as antimicrobial, antitumoral and antioxidant were screened.

2. Materials and methods

2.1.Organisms

Samples of soybean meal (Glycine max) (9.6 g/100 g moisture) were donated by a soybean oil crush Brazilian industry. The microorganisms used were Acinetobacter genomospecies 3 ATCC 17922 (isolated from sludge refinery), Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, coagulase-negative Staphylococcus aureus KT955005, was isolated from soft cheese, Listeria innocua ATCC 33090, Staphylococcus aureus ATCC 14458, Aeromonas hydrophila FDA 110-36 and ATCC 7966, Escherichia coli DH5alfa, ATCC 43895, Salmonella enterica strains - subsp. enterica ATCC 12325 and subsp. diarizonae ATCC 29934 and Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 were kindly provided by the INCQS cell bank.

Cytotoxicity evaluation was estimated by cell viability assays using three cell lines, mouse bone marrow and fibroblast L929 cells (Sigma-Aldrich Co, MO, USA) and human glioblastoma U-87 MG cell line (Sigma-Aldrich Co).

2.2. Preparation of soybean meal aqueous extract

The aqueous extract was prepared according to Del Aguila et al. (2017), where 50 g of triturated soybean meal (extruded soybean material) was homogenized in 150 mL of distilled water followed by incubation at 50°C for 24 h in constant agitation. The resulting suspension was centrifuged at 8,000 ×g for 10 min at room temperature, and the supernatant was treated at 90°C for 10 min with constant agitation followed by filtration in a 0.22 µm pore membrane (Merck Millipore Co, Darmstadt, GER).

2.3. Identification and quantification of isoflavones forms by LC-DAD-FL

Isoflavones forms were analyzed by LC-DAD-FL as described by Fonseca et al. (2014), by using a quaternary pump (LC-10ADvp) chromatographic system LC-20A Prominence (Shimadzu, Kioto, JPN) with a column oven (CTO-10ASvp), a handgun (8125 Rheodyne, equipped with a loop 67

in 100 µL) a diode arrangement detector (DAD) and a C18-5 µ, Kromasil® (250 × 4.6 mm) column maintained at 40ºC. The mobile phase was milli-Q water (eluent A) and acetonitrile 100% (eluent B), both added with 0.3% formic acid at a flow rate of 1.0 mL/min. Before injection, the column was equilibrated with a mixture of eluent A and B (85%: 15%) and then the eluent mixture was modified during the 30 min assay. Injection intervals of 25 min were used to re-equilibrate the column with the initial gradient. Quantification was performed by external standardization using a diode array detector (DAD) set to 190- 400 nm and fluorescence excitement at 280 nm and emission at 310 nm.

Quantification was performed by external standardization. Isoflavones were quantified by DAD peak area at 250 nm. The contents of malonylglycosides and acetylglycosides isoflavones were determined from the calibration curve of the corresponding β-glycoside isoflavone, correcting for differences in molecular weight. The results were expressed as mg of compound per 100 g of dry weight of extract (dwb). Isoflavones quantification were performed using a calibration curve (0.1-1.0 ppm) with standards at a minimum of five levels of concentration.

2.4. Identification and quantification of phenolic compounds (PC) PC extraction from the soybean meal extract was performed in triplicate, according to Inada et al. (2015), using two extraction methods. Soluble PCs were extracted by ethanol: H2O-DD (80:20, v/v) for 10 min and centrifuged at 2.500 x g at 10°C for 5 min. The extraction was performed twice, the supernatants were combined, the solvents were removed in a rotary evaporator at 130 rpm and the dried residue was reconstituted in H2O-DD.

The PC conjugate extraction was carried out by alkaline and acid hydrolysis, where ealkaline hydrolysis was performed in 10 M NaOH and H2O- DD added to residues after soluble PCs extraction. The residues were kept under stirring for 16 h at room temperature, preventing light exposure. Subsequently, the residue was adjusted to pH 2 with concentrated HCl and then

extracted with ethyl acetate. After centrifugation at 2.500 x g for 5 min at 10°C, the supernatants were treated by alkali, repeated twice. Supernatants were combined, solvents were removed and the dried residues were reconstituted in methanol: H2O-DD (80:20 v/v).

The acid hydrolysis was performed by adding 100% HCl to the residues following alkaline extraction. The residues were kept in a water bath at 85°C for 30 min, and the extraction with ethyl acetate was performed.

All extracts were filtered through 0.45 µm pore cellulose ester-membranes (Merck MilliporeCo) prior to the HPLC analyses.

The HPLC device was equipped with a 5μm reverse phase C18 column (250 x 4.6 mm, I.D., Ascentis®) guarded by a 5μm C18 guard column (10 x 3.0 mm, I.D., Ascentis®) and with a photodiode array (PDA) detector model SPD- M30A (ShimadzuCorp.). The PDA wavelength was monitored from 190 nm to 370 nm. Column temperature was set at 40°C and the injection volume was 20 µL for all samples. The mobile phase (1.0 mL·min-1) was 0.3% formic acid (in

H2O-DD), methanol (100%) and acetonitrile (100%) at a gradient elution. The column was equilibrated with 81% formic acid, 18% methanol and 1% acetonitrile. After sample injection, formic acid and methanol concentrations were raised to 79% and 20%, respectively, in 1 min; 56% and 43% in 18 min; 14% and 85% in 23 min, and kept constant up to 30 min. Between injections, the column was re-equilibrated with 81% formic acid, 18% methanol and 1% acetonitrile for 10 min. PCs quantification were performed using a calibration curve (1–50 ppm) with standards at a minimum of five levels of concentration.

2.5. Evaluation of the antimicrobial activity

Antimicrobial activity was tested against 103 cells of each microorganism A. genomospecie 3 ATCC 17922, E. coli DH5alfa, ATCC 43895 and P. fluorescens ATCC 13525 grown in LB media (Luria-Bertani) (BD™, Le Pont de Claix, FRA), S. aureus ATCC 14458, coagulas-negative S. aureus KT955005,

and A. hydrophila FDA 110-36 grown in BHI (Brain Heart Infusion) (BD™), V. parahaemolyticus ATCC 17802 and Salmonella enterica ATCC 1225 and 29934 were grown in NB (nutrient broth) (Himedia, Mumbai, IND) in the presence of crescent concentrations of soybean meal aqueous extract, from 0.0125 to 0.15 mg/mL at 37ºC for 18 h. Then, cells were serially diluted 1/10 in 0.85 % of NaCL, 0.2% Tween 80, plated on solid LB, NB or BHI, and after incubation at 37°C for 18 h the colony-forming units were counted. The procedure was performed in triplicate.

2.6. Determination of total antioxidant activity

2.6.1. Determination of ferric reducing ability of plasma (FRAP) The FRAP assay was carried out by a modification of the method described by Benzie & Strain (1996). Soybean meal extract samples were diluted (1:10) and then mixed thoroughly with the FRAP reagent. Standard FeSO4 solutions were used and absorbances at 593 nm were measured in a V–530 UV/VIS spectrophotometer (Jasco®). FRAP results for each sample were evaluated in triplicate and expressed as mmol of FeII /100 g.

2.6.2. Determination of Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) TEAC assays were performed using a modification of the method described by Re et al. (1999). The ABTS radical cation (ABTS•+) was generated by a chemical reaction of ABTS with K2S2O8 in darkness at room temperature for 12-16 h. For the sample analyses, soybean meal extract sample was mixed with the ABTS•+ reagent and absorbances at 720 nm were measured in a V– 530 UV/VIS spectrophotometer (Jasco®). TEAC were determined in triplicate and related to the ABTS•+ inhibition percentage by antioxidants in the samples. TEAC results for soybean meal extract sample were evaluated in triplicate and expressed as mmol of Trolox/100 g.

2.6.3. Total antioxidant potential (TAP) Soybean meal aqueous extract was analyzed as previously described by Da Silva et al. (2016). Samples were diluted (1:10) and centrifuged at 4.500x g 70

for 10 min and the supernatants were filtered through a 0.45 µm pore cellulose membrane (Merck Millipore Co). The resulting samples were transferred to amber vials and incubated at 37°C for 10 min with a solution containing 1 mM 2+ Fe , 10 mM H2O2 and 1 mM terephthalic acid (TPA) in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4). The hydroxyterephthalic acids (HTPA) were detected by HPLC. TAP measurements were obtained by the difference between the chromatogram surface area generated in the Fenton reaction with and without the sample.

2.6.4. Oxygen radical antioxidant capacity (ORAC) The ORAC assay was performed according to Zulueta et al. (2009), with modifications. Sample absorbances were measured on a Wallac 1420 VICTOR multilabel counter (Perkin–Elmer Inc, MA, USA) with fluorescence filters at an excitation wavelength of 485 nm and emission wavelength of 535 nm. ORAC was calculated using the GraphPad Prism 5 software. ORAC determinations were performed in triplicate and values were expressed as mmol Trolox equivalents/100 g.

2.7. Lipid peroxidation inhibition

Lipid peroxidation analyses were carried out as described by Samaranayaka et al., 2010. Butyrate hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), α-tocoferol and soybean meal aqueous extract samples were prepared in an emulsion system containing linoleic acid (1.3% in ethanol)/ethanol (75% /H2O-DD). Flasks containing samples and standards were sealed and incubated at 40°C at 150 rpm for 7 days without light interference. Aliquots of each flask were taken, in triplicate, at different time intervals - 0, 18, 42, 90 and 162 h. A solution containing ethanol (75%), ammonium thiocyanate (30%) and 20 mM ferrous chloride in 3.5% HCl was added to each flask, and after 3 min, absorbance was measured at 550 nm in DU-530 spectrophotometer (Beckman Coulter Inc.).

2.8. In vitro simulated gastrointestinal digestion Analyzes of phenolic compounds, isoflavones, TAP and antioxidant activity assays were repeated following in vitro simulated gastrointestinal digestion performed according to Oomen et al. (2003) and Sagratini et al. (2013). Fluids generated after the oral (OD), gastric (GD) and duodenal (DD) digestions were collected and filtered. Phenolic compounds in the permeated suspensions were analyzed by HPLC-DAD.

The ex vivo colonic fermentation was performed according to the methodologies described by Hu et al. (2004) and Mosele et al. (2015), with modifications. The feces of the volunteers were homogenized in a nutrient-rich medium (0.5 g in 10 ml) described by McDonald et al. (2013) and 5.0 mL of this mixture was added to the in vitro digested material at the end of the entire simulated digestion process, incubated at 37 °C and 50 rpm for 48 h. All steps were performed in triplicate.

Feces were donated by volunteers who filled the inclusion criteria: age between 18 and 35 years, body mass index within eutrophy (18.5 to 24.9 kg/m2), no gastrointestinal disease, regular bowel function and without the use of nutritional supplements, antibiotics, probiotics, prebiotics or symbiotics in the three months prior to collection of feces. The volunteers were instructed not to avoid for at least two days prior to feces collection, the ingestion of foods rich in phenolic compounds as fruits in general, black beans, cabbage, juices, yogurts, soft drinks, alcoholic beverages, soy and soy-derived products.

The study protocol was approved by the Ethics and Research Committee of the University Hospital ClementinoFragaFilho/Universidade Federal do Rio de Janeiro under N° 512847.

2.8. In vitro cytotoxicity assays against murine and human cells

The cytotoxicity of soybean meal aqueous extract was performed by in vitro assays against healthy and tumoral cells. Bone marrow cells were

collected from BALB/c mice aged 8–10 weeks. The study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee for Animal Research/ Universidade Federal Fluminense under N° 821-16.

One hundred microliters containing 6.0 x 103 cells/mL of mouse bone marrow (BM) or fibroblast L929 cell line or human glioblastoma cell line (U-87

MG) were cultured in 96-well microplates for 24 h at 37°C in 5% CO2 humidified atmosphere. To a semi-confluent cell layer, 100 μl of soybean meal aqueous extract in concentrations ranging from 125 to 0.97 mg/mL were added to the wells and after 24 h, cell viability was evaluated by the addition of 20 µL of resazurin (2.5 µg/mL) (Sigma-Aldrich Co), according to McMillian et al. (2002), with modifications. Cells were incubated in the presence of resazurin for an additional 6 h following fluorescence intensity measurement in a Victor™ X microplate reader (Perkin Elmer Inc, MA, USA) at excitation and emission wavelengths of 530 and 590 nm, respectively.

2.9. Statistical analysis

Two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated measurements was performed to identify differences in isoflavones, phenolic compounds and antioxidant capacity among soybean meal aqueous extract before and after the in vitro simulated digestion. Statistical significance was set at the confidence level of 0.05 and additional post hoc test with Bonferroni adjustments were performed. Values were expressed as mean ± standard deviation (SD) and statistical procedures were completed using the GraphPad Prism v.5 software package (GraphPad Software Inc., CA, USA).

Cell viability assays were carried out in triplicate and evaluated by a one- way ANOVA with Tukey post-test (Zar, 1984) to perform all multiple comparisons analyses. Differences were considered to be significant when p<0.05, as determined by using the GraphPad v.7 Software (GraphPad Software Inc., CA, USA).

3. Results

3.1. Identification and quantification of bioactive compounds in soybean meal aqueous extract and their bioacessibility

Isoflavone isoforms 7-O-glucosides, 6-O-acetyl glucosides and 6-O-malonyl glucosides and aglycones, each one composed of 3 compounds totaling 12 isoflavone-derivatives, were found in soybean meal aqueous extract, with a predominance of the glucosidic form of genistin (49 mg/100 g), daidzin (35 mg/100 g) and glycitin (16 mg/100 g), which contributed 100 mg/100 g, compared to malonyl (24 mg/100 g), acetyl (6.6 mg/100 g) and aglycone (8.3 mg/100 g) forms (Table 1).

Table 1. Bioaccessibility of isoflavones from soybean meal aqueous extract estimated by in vitro simulated gastrointestinal digestion (mg/100 g)

Colonic fermentation Gastrointestinal digestion (mg/100 g of dry weight) (mg/100 g of dry weight) Isoflavones structures PD OD GD ID 4 h 24 h 48 h 6-0-Acetyl Acetyldaidzin 3.0±0.0cd 3.0±0.0cd 1.3±0.0d 1.2±0.0d 1.8±0.0c 10.1±0.0a 6.8±0.0b Acetylgenistin 3.0±0.0ab 2.0±0.0b 2.0±0.0b 2.5±0.0b 2.7±0.0ab 3.4±0.0a 3.5±0.0a a a a a a Acetylglycitin 0.6±0.0 0.3±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0 0.8±0.0 nd nd Total 6.6 5.3 3.6 3.9 5.3 13.5 10.3 Aglycones Daidzein 3.0±0.0d 2.0±0.0de 1.1±0.0e 4.0±0.0d 21.1±0.0a 12.7±0.0b 7.1±0.0c Genistein 5.0±0.0b 3.0±0.0c 2.0±0.0d 2.2±0.0d 11.8±0.0ª 5.8±0.0b 4.6±0.0b Glycitein 0.3±0.0d 0.2±0.0d 1.0±0.0e 1.9±0.0e 24.7±0.0a 15.7±0.0b 7.1±0.0c Total 8.3 5.2 4.1 8.1 57.6 34.2 18.8 7-O-Glucoside Daidzin 35.0±0.0a 34.0±0.0a 33.0.0±0.0a 10.0±0.0b nd nd nd Genistin 49.0±0.0a 48.0±0.0a 48.5.0±0.0a 11.0±0.0c nd nd nd Glycitin 16.0±0.0a 15.0±0.0a 14.5±0.0a 4.0±0.0c nd nd nd Total 100.0 97.0 96.0 25.0 - - - 6-O-Malonyl Malonyldaidzin 7.0±0.0a 6.0±0.0a 3.0±0.00b 1.0±0.0c nd nd nd Malonylgenistin 13.0±0.0a 16.0±0.0a 5.0±0.00b 2.0±0.0c nd nd nd a a b b Malonylglycitin 4.0±0.0 3.0±0.0 1.0±0.00 0.3±0.0 nd nd nd Total 24.0 25.0 9.0 3.3 - - -

Total Isoflavones 138.9 132.5 112.7 40.3 62.9 47.7 29.1 PD, Pre-digestion; OD, oral digestion; GD, gastric digestion and ID, intestinal digestion. Values are expressed as the mean ± standard deviation (n = 3). Different letters within the same line indicate differences between samples at significance level p<0.05. nd, not detected. Soybean meal aqueous extract was submitted to in vitro gastrointestinal digestion, simulating the oral, gastric and intestinal phases based on human physiology.

In addition to the isoflavones, sixteen distinct phenolic compounds were identified in the aqueous extract, six in the hydroxybenzoic acid group, four in the hydroxycinnamic acid group and six within flavones and flavonols, all of them found in the soluble fraction. Naringin, hydroxybenzoic acid, gallic acid, vanillic acid, and siringic acid were found in both soluble and insoluble fractions, where they were extracted by acid or alkaline hydrolysis as already mentioned (Table 2).

Table 2. Bioaccessibility of phenolics from soybean meal aqueous extract

Phenolic compounds PD OD GD ID mg/100 g of dry weight Hydroxybenzoics Salicylic acid 3.8±0.0a 2.0±0.2b 2.0.±0.0b 2.1±0.2b Caffeic acid 6.1±0.1a 2.3±0.2c 3.0.±0.2bc 3.8±0.3b Ferulic acid 0.3±0.0a 0.9±0.0a 0.9±0.0a 1.0±0.0a Gallic acid 7.7±0.1a 1.1±0.0d 2.9±1.3c 4.8±0.30b Syringic acid 8.1±0.1a 1.1±0.0c 2.0±0.3c 4.3±0.3b Vanillic acid 9.1±0.2a 1.3±0.0d 3.6±0.6c 6.2±1.6b Total 35.1 8.7 14.4 22.2 Hydroxycinnamics 5-caffeoylquinicchlorogenic acid 3.5±0.2a 1.0±0.0c 2.4±0.3b 1.3±0.0bc p-coumaric acid 2.0±0.0a 1.0±0.01 1.1±0.1a 1.2±0.1a 4-hydroxyphenilacetic acid 3.4±0.0a 1.0±0.0b 1.6±0.0b 1.0±0.0b Sinapic acid 2.7±0.1a 1.0±0.0b 1.1±0.0b 1.0±0.0b Total 11.6 4.0 6.2 4.5 Flavonones and Flavonols Hesperidin 9.1±0.4a 1.2±0.2d 7.1±0.6b 4.2±0.6c Hydroxibenzoic acid 5.1±0.0a 1.2±0.1c 3.1±0.9b 1.7±0.4c Kaempferol 0.4±0.0a 0.9±0.0a 0.9±0.0a 0.9±0.0a Myricitrin 5.0±0.0a 1.3±0.1c 1.7±0.0c 3.2±0.6b Naringin 2.5±0.5a 0.9±0.0b 1.0±0.0b 1.6±0.8ab Rutin 4.9±0.1a 1.8±0.0b 2.1±0.9b 2.6±0.1b Total 27.0 7.3 15.9 14.2 Total phenolics 73.7 20.0 36.5 40.9

Values are the sum of soluble phenolics plus those extracted by acid or alkali, expressed as the mean ± standard deviation (n = 3). Different letters within the same line indicate differences between samples at significance level p<0.001. Soybean meal aqueous extract was submitted to in vitro gastrointestinal digestion, simulating the oral, gastric and intestinal phases based on human physiology. PD, Pre-digestion; OD, oral digestion; GD, gastric digestion; ID, intestinal digestions.

The major compounds were vanillic acid (9.1 mg/100 g), hesperidin (9.1 mg/100 g), syringic acid (8.1 mg/100 g), gallic acid (7.7 mg/100 g), caffeic acid (6.1 mg/100 g), hydroxibenzoic acid (5.1 mg/100 g), myricitrin (5.0 mg/100 g) and rutin (4.9 mg/100 g).

Two hydroxibenzoic acids, gallic acid and gentistic acid, and four hydrocinnanic acids, 5-caffeoylquinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid and sinapic acid were described in soybean sprouts, after hydrolysis according to

the Phenol-Explorer 3.6 database (Phenol-Explorer, 2018), and all of them in lower concentrations than quantified in the present study (Table 2).

The content of isoflavones in the aqueous extract (pre-digestion) was 138.9 mg/100 g (dry weight) and 5%, 19% and 29% decreases were observed after salivary, gastric and intestinal digestions, respectively. At colonic fermentation, the amount of isoflavones was 62.9, 47.7 and 29.1 mg/100 g of dry weight at the time intervals of 4, 24 and 48 h of fermentation, respectively (Table 1). However, an increase in the acetyl derivative of isoflavones was observed at the same time that the concentration of the total amount of isoflavones was reduced. The acetyldiadzin was increased 3-fold after 24 h of colonic fermentation while the acetylgenistin and acetylglycitin showed a discreet enhancement (Table 1). The content of glycosides and malonyl isoflavones decreased over the gastrointestinal digestion and these compounds, if present, are in undetectable levels in the colonic digestion phase.

The total content of phenolic compounds in soybean meal aqueous extract was 73.7mg/100 g and after intestinal digestion this was reduced to 40.9 mg/100 g (Table 2). A lower release of phenolic compounds was observed after the oral digestion, 27.4%, following an increase in the contents of phenolic compounds after the gastric and intestinal digestions, 49.6% and 55.9%, respectively. Ferulic acid, p-coumaric acid and kaempferol showed no changes in their contents at any stage when compared to pre-digested samples. However, hesperidin and hydroxibenzoic acid decreased during the intestinal digestion, while caffeic acid, galic acid, syringic acid, and vanillic acid increased after duodenal digestion.

After the colonic digestion, none of these phenolic compounds were found in detectable concentration.

3.2. Bioactivities of soybean meal aqueous extract

3.2.1 Antioxidant activity The antioxidant activity of soybean meal aqueous extract was evaluated by five different assays (FRAP, TEAC, ORAC and lipid peroxidation inhibition) and associated with antioxidant potential (TAP) determinations.

Soybean aqueous extract showed a similar ability in inhibiting oxidative degradation, evaluated as inhibition of lipid peroxidation, as seen with natural antioxidants, such as α-tocopherol, or synthetic ones, such as BHA and BHT, as showed in Fig. 1.

Fig. 1. Kinetics of inhibition of lipid peroxidation by soybean meal aqueous extract

Control H2O-DD, BHA (buthylatedhydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), α- tocopherol. Samples were taken at the 20 g∙ml-1 in a system of auto-oxidation of linoleic acid, followed during 162 h. Values are expressed as means ± SD (n=3). Data did not exhibit differences (one-way ANOVA, Bonferroni's post-test).

The TAP and antioxidant capacity of aqueous extract from soybean meal, determined by FRAP, TEAC, ORAC assays, were 74.46%, 81.23μmol/ Fe+2, 207.67μmol of Trolox/g and 31.61μM Trolox/g, respectively. Through the TAP

analysis, it was demonstrated that the extract is able to inhibit 74.46 % of the Fe oxidation reaction (Fig. 2).

Fig. 2. Antioxidant activity following in vitro simulated gastrointestinal digestion Antioxidant capacity (TEAC), ferric reducing ability in plasma (FRAP), antioxidant potential (TAP) and oxygen radical antioxidant capacity (ORAC) from aqueous soybean meal extract, after in vitro simulated gastrointestinal (oral, gastric and intestinal) digestion. Values are expressed as the mean ± standard deviation (n=3). Different letters denote difference between means (one-way ANOVA, Bonferroni's post-test), where p<0.05. FRAP assays did not exhibit differences.

There were no differences in the antioxidant activity in all tests performed after the oral digestion, when compared to pre-digestion. In the gastric fluid, we observed an increase of 69% in the antioxidant activity evaluated by TEAC and 100% in ORAC assays, but TAP was enhanced by 22%, when compared to pre-digestion and oral digestion. In the intestinal digestion, antioxidant ability was maintained when compared to those observed in the gastric fluid, after the ORAC and TAP assays (Fig. 2).

3.2.2. Antimicrobial activity

The aqueous extract of soybean meal was able to abolish the growth of strains from distinct species and genus as observed for A. genomospecie 3 ATCC 17922 and A. hydrophila FDA 110-36, several E. colistrains - ATCC 43895 and DH5alfa, P. fluorescens ATCC 13525, S. aureus, coagulase- negative strains, ATCC 14458 and KT955005, respectively, V. parahaemolyticus ATCC 17802 and Salmonella enterica, strains ATCC 1225 and ATCC 29934. L. innocua ATCC 33090 was less sensitive to the antimicrobial agents from soybean meal aqueous extract since 21% of growth inhibition was observed when exposed to 150 mg/mL of aqueous extract (Table 3).

Table 3. Antimicrobial activity of the aqueous extract from soybean meal

Soybean meal aqueous Inhibition Microorganisms extract concentration (%) (mg/mL) Gram-positive L.innocua ATCC 33090 150 21±2.1 coagulase- negative S. aureus KT 955005* 75 100±0.0 S. aureus ATCC 14458 120 100±0.0 Gram-negative

A. genomospecies 3 ATCC 17922 12,5 100±0.0 A hydrophila FDA 110-36 90 100±0.0 A. hydrophila ATCC 7966 50 100±0.0 Escherichia coli DH5 alfa 35 100±0.0 E. coli ATCC 43895 100 100±0.0 S. enterica ATCC 12325 75 100±0.0 S. enterica ATCC 29934 75 100±0.0 V. parahemolyticus ATCC 17802 100 100±0.0 P. fluorescens ATCC 13525 150 100±0.0

Growth inhibition was determined using different concentrations of the aqueous extract tested on 103 cells of each strains, 12.5 to 150 mg/mL at 37ºC for 18 h. Next, cells were serially diluted (1/10), plated, incubated at 37°C for 18 h and colony-forming units were counted. Values expressed as the mean ± standard deviation (n = 3). *Strain isolated from Minas frescal cheese (Nunes et al., 2016).

3.2.3. In vitro cytotoxicity assay in different cell lineages

Different concentrations, from 125 mg/mL to 0.97 mg/mL, of the aqueous extract of soybean meal affected the viability of the three cell lineages in different manners (Fig. 3, top panels). At concentrations of 0.97 to 3.9 mg/mL, healthy mice bone marrow cells viability was not affected in 24 h. On the other hand, at concentrations above 3.9 mg/mL, BM viability was significantly reduced, exhibiting an IC50 of 16.1 mg/mL.

The viability of the mouse fibroblast L929 cell line was not reduced at soybean extract concentrations from 0.97 to 62.5 mg/mL, a stimulation of cell

proliferation was seen though, with an IC50 of ~72.06 mg/mL. On the other hand, at the highest concentration of 125 mg/mL, L929 cell viability was completely abolished. Similarly, the viability of the human glioblastoma U-87 MG cell line was also completely inhibited at soybean concentration of 125 mg/mL and exhibited and IC50 of 65.7 mg/mL. Inferior concentrations of soybean meal aqueous extract did not affect cell viability after 24 h of exposure (Fig. 3).

Fig. 3. Cytotoxicity of soybean meal aqueous extract on mouse bone marrow (BM) cells and fibroblast L929 cell lines and on the human glioblastoma U-87 MG cell line Growth inhibition versus soybean meal aqueous extract concentration plot after 24 h exposure.Results were expressed as the mean ± standard deviation (n=3). Differences between the untreated cells (control) and those incubated with concentrations from 125 mg/mL to 0.97 mg/mL of soybean meal aqueous extract were evaluated by the One-way ANOVA test, with the Tukey post-test ***p<0.001, ****p<0.0001.

4. Discussion

Plant phytochemicals, such as phenolic compounds, can be extracted by using different solvents, including ethanol, methanol, acetone, ethyl acetone, or in combination with water in different proportions. Organic solvents are commonly used for the extraction of free and conjugated phenolics, but some of them cannot be accepted as food grade due to their toxicity (Shi et al., 2005; Li et al., 2014). In contrast, when water is used for extraction, the recovered bioactive compounds can be used as food additives without risks for human health.

Despite the methods used for the reduction or elimination of foodborne pathogens, there is still an increase in foodborne diseases, a major threat to public health. Due to consumer awareness, natural antimicrobials have been replacing antibiotics in food products and the search for natural antimicrobials, mainly derived from plants, has increased (Abutheraa et. al., 2017).

Soybean meal aqueous extract showed a great antimicrobial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria (Table 3). The antimicrobial activity of soybean meal aqueous extract can be due to, at least partially, the peptidic fraction containing oligopeptides displaying molecular masses inferior to 14 kDa, as already shown (Del Aguila et al., 2017). Additionally, phenolic compounds detected in the extract can also generate an adverse effect on microbial growth by inhibiting their metabolic functions (Abutheraa et. al., 2017; Del Aguila et al, 2017). The effects observed in this study could be a result of synergistic action of both groups of molecules.

Studies on the growth inhibition of foodborne pathogens tested against phenolic extracts prepared from soybean flour showed that Gram-positive bacteria were more sensitive than Gram-negative bacteria (Villalobos et al., 2016), but in this study both bacteria were sensitive to the aqueous extract. Gram-negative bacteria would be more resistant to antimicrobials because their outer membrane is composed of lipopolysaccharides, which are not found in Gram-positive bacteria. However, in the present study, 7 tested Gram-negative 85

bacteria strains had their growth abolished, indicating that the difference in sensitivity to phenolics should be due to the outer membrane proteins that might aid in the permeability to phenolics from the soybean meal aqueous extract (Abutheraa et. al., 2017). These results have prompted the food industry to look for alternative food preservatives that can enhance the safety and quality of foods. Compounds derived from natural sources have the potential to be used for food preservation due to their antimicrobial properties against a broad range of foodborne pathogens.

The same isoflavones, usually found in the different colored seed coats of soybeans (yellow, black, brown, and green), evaluated along two crop years, were found in the soybean meal aqueous extract (Cho et al., 2013). The crude extract was obtained free of organic solvents and exhibited a high isoflavone content at the concentration of 138.9 mg/100 g dry weight (Table 1). Although isoflavone contents found in the soybean meal aqueous extract were lower (35%) than the data available for soybean and raw derivatives in the Phenol- Explorer 3.6 database (Phenol-Explorer, 2018), the amount is meaningful because the recovery of these phytoestrogen does not include an obligatory step of removing organic solvent.

As a by-product from soybeans obtained during the refining of soybean oil, which contains a high concentration of isoflavone in the glucoside form (Barnes et al., 2010), the soybean meal aqueous extract displays the major isoflavones in the same structural form, corresponding to 66% (Table 1). Several studies have demonstrated that the thermal treatment carried out in soybean processing promotes the conversion of malonylglycosides to β-glycosides (Aguiar et al., 2012). Soybean flour results in the conversion of isoflavones into their aglycones in different ratios, depending on the methods used to leach the flour, and thus facilitating the absorption of isoflavones (Pandjaitan et al., 2000).

Acetyldaidzin and acetylglycitin found in small concentrations in the aqueous extract were not identified in soy grains, according to the Phenol-Explorer 3.6 database (Phenol-Explorer, 2018) (Table 1). The aqueous extract showed 3-

fold the contents described in soy protein isolate (from 47 to 62 mg/100 g) (Hooper et al., 2008).

The concentrations of daidizin (35 mg/100 g), glycitin (16 mg/100 g) and genistin (49 mg/100 g), in soybean meal aqueous extract described here were superior to those described by Mujić et al., 2011, who evaluated five soy seed cultivars and found contents ranging from 12.4 to 24.4 mg/100 g of daidizin, 5.9 to 11.4 mg/100 g of glycitin and 18.6 to 37.1 mg/100 g of genistin (Table 1). On the other hand, the amount of daidzein and genistein found in the soybean meal extract were lower than those found by Mujić et al. (2011), which described concentrations from 2.5- to 11-fold superior. It is worth mentioning that the flavonoid family, among the phenolics, especially genistein, exhibits the highest antioxidant activity due to their chemical structure, besides their effect as phytoestrogens (Heim et al., 2002).

In addition to the isoflavones, 16 other phenolics were identified in the soybean meal aqueous extract in the soluble and insoluble fractions (after alkaline and acidic hydrolysis). Among them, naringin, hydroxybenzoic acid, gallic acid, vanillic acid, and siringic acid were identified (Table 2). Soluble phenolics are predominant in fruits and vegetables and it is important to note that they show superior bioavailabilty and duodenal absorption in human beings, explaining their great biological importance (Shahidi & Yeo, 2016).

The main phenolic compounds identified in soybean and soybean meals were phenolic acids (chlorogenic acid, cefeic acid, ferulic acid, syringic, o- cummaric, p-coumaric and vanillic) and flavonoids (Villalobos et al., 2016). In another study, 12 isoflavones and 21 other phenolic compounds were found in the phenolic extract of defatted soybean flour, including gallic acid, homogentysic acid, protocatecuic acid, chlorogenic acid, catechin, hydroxybenzoic acid, vanillic acid, caffeic acid, syringic acid, p-coumaric acid, rutin, ferulic acid, verric acid, naringin, myricetin, quercetin, trans-cinnamic acid, kaempferol, hesperetin, hesperidin and synapic acid (Villalobos et al., 2016).

In our aqueous extract from soybean meal, we also detected higher concentrations of syringic, vanillic, salicylic and benzoic acid. However, it must be considered that the composition and levels of phenolics in soy grains and soy meals varies according to the species, cultivar, and season, geographic and environmental conditions, maturity, and finally, depends on the methods of extraction and analysis (Dueñas et al., 2012; Baião et al., 2017).

The aqueous extraction of phenolics proved to be more efficient, since 60% of the total phenolic compounds were extracted, and most of the phenolics already identified in soybean meals were found in the aqueous extract. Such soybean meal aqueous extracts could be used for several purposes, including food fortification and/or food preservation.

To evaluate the antioxidant activity of the extract, distinct assays - TAP, ORAC, FRAP and TEAC - showed that the soybean meal aqueous extract exhibits antioxidant activity. In another study the analysis of antioxidant capacity of soybean meal and soybean grain was carried out, showing an average amount of 7.2 µmol Fe+2/g and 11.5 µmolTrolox/g, respectively, for soybean grain and 10.3 µmol Fe+2/g and 18.6 µmolTrolox/g for soybean meal, considering FRAP and TEAC assays, respectively (Silva & Perrone 2015). However, after aqueous extraction of the same sample, an increase of approximately 8-fold and 11-fold in FRAP and TEAC antioxidant activities was found, 81.23 µmol Fe+2and 207.67 µmolTrolox/g, respectively. Xu & Chang (2008) evaluated the antioxidant capacity in 30 different soybean cultivars and found an average activity ranging from 21.2 to 119.3μmol of ORAC, where the activity described here for the agroindustrial by-product was 31.61 μmol Trolox/g.

These superior levels of antioxidant activities may be due to the process of aqueous extraction that includes a post-heat treatment, which may have released bioactive molecules from soybean meal matrix. The utilization of soybean meal aqueous extract as a source of phenolics seems promising due to the presence of several molecules that can act in synergy with each other,

promoting and enhancing the antioxidant capability of the material, but with a food grade.

The aqueous soybean meal extract can substitute for natural antioxidants, such as α-tocopherol, or synthetic ones, such as BHA and BHT, in inhibiting oxidative degradation against lipid peroxidation, as described in Fig. 1. The aqueous soybean meal extract showed antioxidant activities similar to synthetic antioxidants, BHT and BHA, commonly used as preservatives by the food industry and also exhibited similar antioxidant activity compared to α-tocopherol, known as the most efficient natural chain-breaking free radical reaction.

Natural antioxidants can play a key role in food preservation, retarding oxidation-induced deterioration and they might substitute many synthetic food preservatives since their use is strictly regulated because of carcinogenic effects in animals (Shahidi & Zhong, 2010). Even in physiological conditions, such as the digestive process, the gastrointestinal tract is constantly exposed to newly formed active oxygen species, and the antioxidant compounds may play a role maintaining the redox balance against harmful oxidants and preventing diseases of the gastrointestinal tract linked to the generation of ROS (Manach et al., 2005; Shahidi & Zhong, 2010).

After the digestibility tests it can be observed that structural changes, bioaccessibility and digestibility of aqueous soybean meal extract and its components showed no difference in the antioxidant activity after all tests performed, when compared to the pre-digestion state (Fig. 2). Maybe most of the phenolic compounds present in the soybean meal aqueous extracts are in their conjugated form and need to be hydrolyzed before being absorbed (Manach et al., 2005).

Data obtained after oral digestion indicates that approximately 20% of the compounds in the soybean meal aqueous extract are found in their free form, since no modifications and release of the compounds should be expected. During gastric and intestinal digestions, there was a considerable release of the phenolic compounds, except for ferulic acid, p-coumaric acid and kaempferol,

which did not present alterations when compared to their pre-digestibility content. Bioaccessibility of phenolic compounds from soy beverage showed that the release of these compounds occurs mainly in gastric fluid, corroborating the results described here (Rodríguez-Roque et al., 2013). Gastric pH and digestive enzymes facilitated the release of phenolic compounds from the soybean matrix by the hydrolysis of phenolic bound to macromolecules, such as proteins and carbohydrates, leading to a significant increase in their concentrations after gastric digestion (Saura-Calixto et al., 2007).

In the gastric fluid, an increase in antioxidant activity was observed after all assays performed since acid hydrolysis seems to be capable of releasing phenolic compounds linked to lignins by ether bonds through their hydroxyl groups on the aromatic ring and ester bonds with proteins and structural carbohydrates via their carboxylic group (Fig. 2). The acid treatment mainly breaks down glycosidic bonds and solubilizes the sugars (Shahidi & Yeo, 2016), thus releasing the phenolic compounds, which may increase antioxidant activity. In addition to the total phenolic compounds, the content, profile and activity of isoflavones varied during the gastrointestinal digestion processes, which included physio-chemical processes such as hydration, mild heat treatment, and microbial fermentation, thus contributing to increasing the antioxidant power of such molecules in general (Fernandes et al., 2017).

The in vitro bioaccessibility measurements for phenolics observed here, particularly isoflavones, accomplished by the antioxidant activity determinations, support the health benefits of the bioactive compounds of nutritional significance (Fernández-García et al., 2009; Saura-Calixto & Gon, 2007; Campos-Vega et al., 2015). When the in vitro bioaccessibility estimation of apple phenolics was performed, nearly 65% of the compounds were released following the gastric digestion and less than 10% after the intestinal digestions (Bouayed et al., 2011). These data are similar to those observed herein regarding the major release of phenolic compounds after the gastric digestion in comparison to the intestinal digestion. On the other hand, the percentage of phenolic compounds released from soybean meal aqueous extract presented a

slightly lower percentage, which can be explained by the characteristics of soybean matrix, where both free and conjugated phenolics are found, while in apples only the free phenolics were estimated.

As expected, there were not modifications in the profile of isoflavones after the oral digestion. In the gastric and duodenal phases, a discrete decrease in isoflavone content (17.06% and 9.9%) was observed. However, in intestinal digestion the aglycones content was increased, as discussed before, suggesting that the intestinal environment is adequate for the release of aglycones from soybean meal matrix. The glycosylated isoflavones are partially hydrolyzed in the small intestine, to release the aglycones (daidzein, genistein and glycitein) which are absorbed. Non-hydrolyzed compounds follow to the large intestine where they can be hydrolyzed and, consequently, absorbed (Heinonen et al, 2002).

After the colonic phase, acetyl and aglycone forms were increased by the action of enzymes from colonic microflora, however, acetylglycitine was not detected after 24 and 48 h of colonic fermentation. Bacteria hydrolysis of glycosidic forms of isoflavones can be attributed to β-glycosidases enzymes which have a high affinity for daidzin and genistin, hydrolyzing them to their aglycon forms (Sánchez-Calvo et al., 2013).

After intestinal digestion, a decrease of 32% in hesperidin and of 30% in hydroxybenzoic acid contents were observed (Table 2), but maybe those phenolics upon release could interact with other constituents of the food matrix, as described in soya beverages (Rodríguez-Roque et al., 2013).

Gallic acid, syringic acid, vanillic acid and myricitrin were released during the intestinal digestion (25, 29, 29 and 30%, respectively) at higher amounts than during the gastric digestion. Maybe most of the phenolic compounds in food matrices are in their conjugated form (ester, glycosides or polymers), which cannot be absorbed directly but become available after hydrolysis by intestinal enzymes on the brush border (Manach et al., 2005).

Moreover, similar to other phenolics, the isoflavones from soybeans can either be modified during gastrointestinal tract digestions as mentioned before, involving termic treatment and microbial fermentation, contributing to the increase in the antioxidant capacity of compounds (Fernandes et al., 2017) and as seen for phenolics, they might be conjugated, and cannot be absorbed directly but after becoming available (Manach et al., 2005; Fernandes et al., 2017).

The evaluation of putative cell injury or cytotoxicity from the phytochemicals and/or toxins found in soybean meal aqueous extract were assayed against healthy bone marrow, fibroblasts and tumoral cell lines. The characterization of extracts and evaluation of the cytotoxic effects of compounds of plant origin and the understanding of the potential benefits and/ or toxicity of these plants to health are of fundamental importance to reduce the possible risks of these agents.

The cytotoxicity of the aqueous soybean meal depends on the concentration used and on cell lineage. In the concentration range from 0.97 to 3.9 mg/mL the soybean meal aqueous extract did not affect the viability of healthy mouse bone marrow cells. On the other hand, cellular toxicity is observed when higher concentrations are used, indicating that the utilization of soybean meal aqueous extract in food products should be previously evaluated in healthy human cell lines since higher concentrations could bring cytotoxic effects to these healthy cells, as seen in murine model. For this purpose, bioaccessibility as well as biodisponibility should be considered to determine the maximum concentration of the soybean meal aqueous extract that could be used without causing toxicity to healthy cells. It is widely known that plant extracts are composed of different varieties of compounds, other than polyphenols, which could be contributing to the cytotoxicity of healthy cells. Further studies should be performed to determine the cytotoxicity of each isolated compound identified in soybean meal aqueous extract.

Similarly to the bone marrow cells, another healthy murine cell line, the L929 fibroblast, was not affected at concentrations 62.5 mg/mL, exhibiting an IC50 of 92

~72.06 mg/mL, but its growth was completely abolished at 125 mg/mL, reinforcing the non-cytotoxic effect of soybean meal aqueous extract to healthy cells in a dose-dependent manner. The U-87 MG glioblastoma cell line viability was completely abolished at soybean meal aqueous extract concentrations of 125 mg/mL. As the effective concentration does not match the concentrations considered safe to healthy bone marrow cells the cytotoxicity tests should be carefully evaluated, since most antitumoral compounds in clinical usage exhibit some level of toxicity against healthy cells, but the regimen of administration can overcome the undesirable effects. Further investigation should be conducted to determine whether the antitumoral effect on U-87 MG cells at 125 mg/mL resulted from specific interactions of phenolic compounds and/or peptides from soybean meal aqueous extract with tumor cell receptors.

It is widely known that phenolic acids and flavonoids, such as the caffeic acid derived from hydroxycinnamic acids found in soybean meal aqueous extract, have shown antitumoral activity (Shahidi & Ambigaipalan, 2016). Cell viability decreases could be caused by the structural and functional damages in the cell lineage used (Lopes et al., 2011). Additional studies are needed to determine what kinds and extension of the damage the soybean meal aqueous extract caused to tumoral or healthy mouse BM and L929 cells.

5. Conclusions The phenolic content, antioxidant activity, antimicrobial activity and antitumoral activity of the aqueous extract obtained from an agroindustrial waste is of particular interest to the food industry, which investigates extracts from edible plants and their phytochemicals to be used as food preservatives against contamination by a broad range of spoilage microorganisms or as a safe source of natural antioxidants with no cytotoxicity.

The development of a sustainable large-scale separation method to be applied for better recovery efficiency of bioactive compounds, phenolics and peptides from soybean meals will not only add value to this agro-industrial

waste, reducing the overall manufacturing costs and the use of synthetic chemicals, but will also aggregate value to the whole production chain, including its final products.

The results described herein point to the potential usefulness and novel applications for defatted soybean waste. Compounds derived from aqueous soybean meal extract have the potential to be used as health promoting agents to fortify or enrich food matrices or can be included as natural additives controlling foodborne pathogen growth or even as adjuvants to control tumoral cell proliferation.

Abbreviations

BM, bone marrow; DAD, diode arrangement detector; PC, phenolic compounds; PDA, photodiode array; FRAP, ferric reducing ability of plasma; TEAC, trolox equivalent antioxidant capacity; TAP, total antioxidant potential; HTPA, hydroxyterephthalic acids; ORAC, oxygen radical antioxidant capacity; BHA, butyrate hydroxyanisole; BHT, butylated hydroxytoluene; OD, oral digestion; GD, gastric digestion; ID, intestinal digestion.

Acknowledgments

The authors acknowledge financial support from CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) and FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro). Strains from ATCC, FDA, and NTC collections were generously provided by FIOCRUZ- INCQS, Rio de Janeiro, Brazil from theColeção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária-CMRVS.

Supplementary Data

Fig. 1.Representative HPLC chromatogram of a phenolic acid standard mixture.

Fig. 2.Representative HPLC chromatogram of an isoflavones standard mixture.

Fig. 3. Representative HPLC chromatogram of the products of a Fenton reaction with TPA and a Fenton reaction with a sample and TPA.

References

Abutheraa, R., Hettiarachchy, N., Kumar-Phillips, G., Horax, R., Chen, P.,

Morawicki, R., & Kwon, Y. M. (2017). Antimicrobial activities of phenolic

extracts derived from seed coats of selected soybean varieties. Journal of

Food Science, 82, 731-737.

Aguiar, C. L., Haddad, R., Eberlin, M. N., Carrao-Panizzi, M. C., Tsai, S., &

Mand Park, Y. K. (2012).Thermal behavior of malonylglucoside isoflavones

in soybean flour analyzed by RPHPLC/DAD and eletrospray ionization

mass spectrometry.LWT – Food Science Technology, 48,114–119.

Baião, D. D. S., Freitas, C. S., Gomes, L. P., da Silva, D., Correa, A. C. N.,

Pereira, P. R., Del Aguila, E. M., & Paschoalin, V. M. F. (2017). Polyphenols

from root, tubercles and grains cropped in Brazil: chemical and nutritional

characterization and their effects on human health and

diseases. Nutrients, 9, 1-29.

Barnes, S. (2010). The biochemistry, chemistry and physiology of the

isoflavones in soybeans and their food products. Lymphatic Research and

Biology, 8, 89-98.

Benzie, I. F. F., & Strain, J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma

(FRAP) as a measure of ‘‘antioxidant power’’: the FRAP assay. Analytical

Biochemistry, 239, 70-76.

Bouayed, J., Hoffmann, L., & Bohn, T. (2011). Total phenolics, flavonoids,

anthocyanins and antioxidant activity following simulated gastro-intestinal

digestion and dialysis of apple varieties: Bioaccessibility and potential

uptake. Food Chemistry, 128, 14-21.

Bruce, K. J., Karr-Lilienthal, L. K., Zinn, K. E., Pope, L. L., Mahan, D.

C., Fastinger, N. D., Watts, M., Utterback, P. L., Parsons, C.

M., Castaneda, E. O., Ellis, M., &Fahey, G. C. Jr. (2006). Evaluation of

the inclusion of soybean oil and soybean processing by-products to

soybean meal on nutrient composition and digestibility in swine and

poultry.Journal of Animal Science, 84, 1403-1414.

Campos-Vega, R., Vázquez-Sánchez, K., López-Barrera, D., Loarca-Piña, G.,

Mendoza-Díaz, S., & Oomah, B. D. (2015).Simulated gastrointestinal

digestion and in vitro colonic fermentation of spent coffee (Coffea arabica

L.): Bioaccessibility and intestinal permeability. Food Research

International, 77, 156-161.

Cho, K. M., Ha, T. J., Lee, Y. B., Seo, W. D., Kim, J. Y., Ryu, H. W., Jeong, S.

H., Kang, Y. M., & Lee, J. H. (2013). Soluble phenolics and antioxidant

properties of soybean (Glycine max L.) cultivars with varying seed coat

colours. Journal of Functional Foods, 5, 1065 – 1076

Day, L. (2013). Proteins from land plants – Potential resources for human

nutrition and food security.Trends in Food Science & Technology, 32, 25–

42.

Da Silva, D. V., Silva, F. O., Perrone, D., Pierucci, A. P. T. R., Conte-Junior,

C.A., Alvares, T. S., Del Aguila, E. M., & Paschoalin, V. M. F. (2016).

Physicochemical, nutritional, and sensory analyses of a nitrate-enriched

beetroot gel and its effects on plasmatic nitric oxide and blood pressure.

Food & Nutrition Research,60, 1-9.

Del Aguila, E. M., Gomes, L. P., Freitas, C. S., Pereira, P. R., & Paschoalin, V.

M. F. (2017). Natural Antimicrobials in Food Processing: Bacteriocins,

Peptides and Chitooligosaccharides. Frontiers in Anti-Infective Drug

Discovery, 4, 55-108.

Dueñas, M., Hernández, T., Lamparski, G., Estrella, I.,& Muñoz, R. (2012).

Bioactive phenolic compounds of soybean (Glycine max cv. Merit):

modifications by different microbiological fermentations. Polish Journal of

Food and Nutrition Sciences, 62, 241-250.

Fernández-García, E., Carvajal-Lérida, I., & Pérez-Gálvez, A. (2009).In vitro

bioaccessibility assessment as a prediction tool of nutritional

efficiency. Nutrition Research, 29, 751-760.

Fernandes, M. S., Lima, F. S., Rodrigues, D., Handa, C., Guelfi, M., Garcia, S.,

& Ida, E. I. (2017). Evaluation of the isoflavone and total phenolic contents

of kefir-fermented soymilk storage and after the in vitro digestive system

simulation. Food Chemistry, 229, 373-380.

Fonseca, N. D., Villar, M. P. M., Donangelo, C. M., & Perrone, D.

(2014).Isoflavones and soyasaponins in soy infant formulas in Brazil: Profile

and estimated consumption. Food Chemistry, 143, 492-498.

100

Heim, K. E., Tagliaferro, A. R., & Bobilya, D. J. (2002).Flavonoid antioxidants:

Chemistry, metabolism and structure-activity relationships. The Journal of

Nutritional Biochemistry,13, 572–584.

Heinonen, S. M., Wähälä, K., & Adlercreutz, H. (2002).Metabolism of

isoflavones inhuman subjects. Phytochemistry Reviews, 1, 175-182.

Hooper, L., Kroon, P. A., Rimm, E. B., Cohn, J. S., Harvey, I., Le Cornu, K. A.,

Hall, W. L., Ryder, J. J., & Cassidy, A. (2008). Flavonoids, flavonoid-rich

foods, and cardiovascular risk: a meta-analysis of randomized controlled

trials. The American Journal of Clinical Nutrition, 88, 38-50.

Hu, J., Zheng, Y. L., Hyde, W., Hendrich, S., & Murphy, P. A. (2004).Human

fecal metabolism of soyasaponin I. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 52, 2689–2696.

Inada, K. O. P., Oliveira, A. A., Revorêdo, T. B., Martins, A. B. N., Lacerda, E.

C. Q., Freire, A. S., Braz, B. F., Santelli, R. E., Torres, A. G., Perrone, D., &

Monteiro, M. C. (2015). Screening of the chemical composition and

occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciariajaboticaba) and jussara

(Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of Functional Foods, 17,

422-433.

Jeong, H. J., Lam, Y., & de Lumen, B. O. (2002).Barley lunasin suppresses ras-

induced colony formation and inhibits core histone acetylation in

mammalian cells. Journal of agricultural and food chemistry, 50(21), 5903-

5908.

101

Korhonen H.,& Pihlanto A. (2003). Food-derived bioactive peptides-

opportunities for designing future foods.Current Pharmaceutical Design, 9,

1297–308.

Kuligowski, M., Pawłowska, K., Jasińska-Kuligowska, I., & Nowak, J. (2017).

Isoflavone composition, polyphenols content and antioxidative activity of

soybean seeds during tempeh fermentation. CyTA-Journal of Food, 15, 27-

33.

Li, R., Hettiarachchy, N., Rayaprolu, S., Eswaranandam, S., Howe, B., Davis,

M., & Jha, A. (2014). Phenolics and antioxidant activity of saskatoon berry

(Amelanchier alnifolia) pomace extract. Journal of Medical Food, 17,384–

392.

Lopes, J., Damasceno, J. L., Oliveira, P. F., Guedes, A. P., Tavares, D. C.,

Deflon, V. M., Lopes, N. P., Pivatto, M., Batista, A. A., Maia, P. S., & Von

Poelhsitz, G. (2015). Ruthenium (II) Complexes containing anti-

inflammatory drugs as ligands: synthesis, characterization and in vitro

cytotoxicity activities on cancer cell lines. Journal of the Brazilian Chemical

Society, 26, 1838-1847.

Manach, C.; Williamson, G.; Morand, C.; Scalbert, A., & Rémésy, C.

(2005).Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of

93 intervention studies. American Journal of Clinical Nutrition, 81, 243S–

255S.

McDonald, J. A., Schroeter, K., Fuentes, S., Heikamp-deJong, I., Khursigara, C.

M., de Vos, W. M., & Allen-Vercoe, E. (2013).Evaluation of microbial 102

community reproducibility, stability and composition in a human distal gut

chemostat model. Journal of Microbiological Methods, 95, 167-174.

McMillian, M. K., Li, L., Parker, J. B., Patel, L., Zhong, Z., Gunnett, J. W., &

Johnson, M. D. (2002). An improved resazurin-based cytotoxicity assay for

hepatic cells. Cell Biology and Toxicology, 18, 157-173.

Mosele, J. I., Macià, A., Romero, M. P., Motilva, M. J., & Rubió, L. (2015).

Application of in vitro gastrointestinal digestion and colonic fermentation

models to pomegranate products (juice, pulp and peel extract) to study the

stability and catabolism of phenolic compounds.Journal of Functional

Foods,14,529–540.

Mujić, I., Šertović, E., Jokić, S., Sarić, Z., Alibabić, V., Vidović, S., & Živković, J.

(2011). Isoflavone content and antioxidant properties of soybean

seeds.Croatian Journal of Food Science and Technololgy, 3, 16-20.

Nunes, R. S. C., de Souza, C. P., Pereira, K. S., Del Aguila, E. M., &

Paschoalin, V. M. F. (2016). Identification and molecular phylogeny of

coagulase-negative staphylococci isolates from Minas Frescal cheese in

southeastern Brazil: Superantigenic toxin production and antibiotic

resistance. Journal of Dairy Science,99, 2641-2653.

Oomen, A. G., Rompelberg, C. J. M., Bruil, M. A., Dobbe, C. J. G., Pereboom,

D. P. K. H., & Sips, A. J. A. M. (2003). Development of an in vitro digestion

model for estimating the bioaccessibility of soil contaminants. Archives of

Environmental Contamination and Toxicology, 44, 0281-0287.

103

Pandjaitan, N., Hettiarachchy, N., Ju, Z. Y., Crandall, P., Sneller, C., & Dombek,

D. (2000). Evaluation of genistin and genistein contents in soybean varieties

and soy protein concentrate prepared with 3 basic methods. Journal of

Food Science, 65, 399-402.

Phenol-explorer. (2018). < http://phenol-

explorer.eu/search?utf8=%E2%9C%93&query=soybean&button=>.

Acessed: 22 Jun. 2018.

Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-evans, C.

(1999).Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation

decolorization assay.Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231–1237.

Rodríguez-Roque, M. J., Rojas-Graü, M. A., Elez-Martínez, P., & Martín-

Belloso, O. (2013). Soymilk phenolic compounds, isoflavones and

antioxidant activity as affected by in vitro gastrointestinal digestion. Food

Chemistry, 136, 206-212.

Sagratini, G., Caprioli, G., Maggi, F., Font, G., Giardinà, D., Mañes, J., Meca,

G., Ricciutelli, M., Sirocchi, V., Torregiani, E., & Vittori, S. (2013).

Determination of soyasaponins I and βg in raw and cooked legumes by

solid phase extraction (SPE) coupled to liquid chromatography (LC)–mass

spectrometry (MS) and assessment of their bioaccessibility by an in vitro

digestion model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61, 1702-

1709.

104

Samaranayaka, A. G. P., & Li-Chan, E. C. Y. (2008).Pacific hake (Merluccius

productus) fish protein hydrolysates with antioxidative properties. Food

Chemistry, 107, 768-776.

Sánchez-Calvo, J. M., Rodríguez-Iglesias, M. A., Molinillo, J. M., & Macías, F.

A. (2013).Soy isoflavones and their relationship with microflora: beneficial

effects on human health in equol producers. Phytochemistry Reviews, 12,

979-1000.

Saura-Calixto, F., Serrano, J., & Goñi, I. (2007).Intake and bioaccessibility of

total polyphenols in a whole diet.Food Chemistry, 101, 492–501.

Shahidi, F., & Yeo, J. D. (2016).Insoluble-bound phenolics in food.Molecules,

21, 1216-1238.

Shahidi, F., & Zhong, Y. (2010).Novel antioxidants in food quality preservation

and health promotion.European Journal of Lipid Technology, 112, 930–940.

Shi, J., Nawaz, H., Pohorly, J., Mittal, G., Kakuda, Y., & Jiang, Y.

(2005).Extraction of polyphenolics from plant material for functional foods -

engineering and technology.Food Reviews International, 21,139–166.

Silva, F. D. O., & Perrone, D. (2015).Characterization and stability of bioactive

compounds from soybean meal. LWT-Food Science and Technology, 63,

992-1000.

Villalobos, M. D. C., Serradilla, M. J., Martín, A., Ordiales, E., Ruiz-Moyano, S.,

& Córdoba, M. D. G. (2016). Antioxidant and antimicrobial activity of natural

phenolic extract from defatted soybean flour by-product for stone fruit

105

postharvest application. Journal of the Science of Food and Agriculture, 96,

2116-2124.

Wang, D., Thakker, C., Liu, P., Bennett, G. N., & San, K. Y. (2015).Efficient

production of free fatty acids from soybean meal

carbohydrates. Biotechnology and Bioengineering, 112, 2324-2333.

Xu, B., & Chang, S. K. C. (2008).Characterization of phenolic substances and

antioxidant properties of food soybeans grown in the North Dakota-

Minnesota region.Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 9102-

9113.

Zakir, M. M., & Freitas, I. R. (2015).Benefícios à saúde humana do consumo de

isoflavonas presentes em produtos derivados da soja. Journal of Bioenergy

and Food Science, 2, 3-10.

Zhang, Y., Yang, R., Zhao, W., Hua, X., & Zhang, W. (2013).Application of high

density steam flash-explosion in protein extraction of soybean meal. Journal

of Food Engineering, 116, 430-435.

Zulueta, A., Esteve, M. J., & Frígola, A. (2009).ORAC and TEAC assays

comparison to measure the antioxidant capacity of food products. Food

Chemistry, 114, 310-316.

106

CAPÍTULO II

107

Original research:

Encrypted antimicrobial and antitumoral peptides recovered from protein- rich soybean (Glycine max) by-product

Cyntia Silva Freitas1; Mauricio Afonso Vericimo2, Manuela Leal da Silva3, Giovani Carlo Veríssimo da Costa4, Patrícia Ribeiro Pereira1; Vânia Margaret Flosi Paschoalin1andEduardo Mere Del Aguila1*

Manuscript submitted: Journal of Functional Foods

108

Encrypted antimicrobial and antitumoral peptides recovered from protein- rich soybean (Glycine max) by-product

Cyntia Silva Freitas1; Mauricio Afonso Vericimo2, Manuela Leal da Silva3, Giovani Carlo Veríssimo da Costa4, Patrícia Ribeiro Pereira1; Vânia Margaret Flosi Paschoalin1and Eduardo Mere Del Aguila1*

1Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Avenida Athos da Silveira Ramos 149, Rio de Janeiro (RJ) - 21941-909 - Brazil. E-mails: [email protected] (CSF); [email protected] (PRP); [email protected] (VMFP); [email protected] (EMDA).

2Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Outeiro São João Batista Centro,Niterói (RJ) - 4020-141 -Brazil. E-mails: [email protected] (MAV).

3Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Avenida São José do Barreto, 764, Macaé (RJ) - 27910-970 - Brazil. E-mails: [email protected] (MLS).

4Instituto de Saúde Nova Friburgo, Universidade Federal Fluminense, Nova Friburgo, Rio de Janeiro (RJ) - 21941-970 - Brazil.E-mails: [email protected] (GCVC).

*Author to whom correspondence should be addressed; E-mail: [email protected];

Tel.: +55 21 3938 7362 fax: +55 21 3938 7266 109

Abstract

Twelve potential antimicrobial peptides originated from F7J075; Q948X9; Q94LX2; Q3V5S6; Q4LER6;A0A0R0HYM3; I1LMQ8with molecular masses ranging from 718.42 to 4872.43 Da were identified in two fractions obtained from gel filtration chromatography of the deffated by-product generated by soybean oil refinery. Nine of the peptides, present in soybean meal aqueous extract, are encrypted in two regions of β-conglycinin alpha or alpha-prime subunits, the major protein in soybean, and three of them, in uncharacterized protein(s). Collectively, the peptides distributed in both fractions were able to abolish the growth of Gram positive and Gram negative foodborne pathogens, exhibited no toxicity to mouse bone marrow or fibroblast cells but inhibited human glioblastoma proliferation. Three-dimensional structure of the two β- conglycinin domains containing the best AMP candidates was determined by molecular modeling for the first time. The production in large scale and use of multifunctional peptides encrypted in soybean meal proteins is an innovative application of the concept of circular bioeconomy.

Keywords: soybean by-product, food preservation, functional additive, antimicrobial and antitumoral peptides, molecular modeling.

110

Graphical Abstract

Highlights

 Peptide-rich fractions were obtained from soybean meal extract after gel

filtration;

 Peptides affected the growth of foodborne pathogens and human

glioblastoma;

 Twelve antimicrobial peptide candidates were identified bynano LC

MS/MS;

 Antimicrobial peptides are mainly encrypted in -conglycinin;

 3D structure of -conglycinin domain containing the encrypted AMPs was

predicted.

111

1. Introduction

Soybean is becoming one of the most important alternative protein aceous vegetal sources for human and animal consumption due to its amino acid composition, low cost and high abundance. Soybean is the second largest source of vegetable oil worldwide (Day, 2013) and after the refining process for oil extraction, the remaining bulk product, called soybean meal, still rich in protein and fiber, is mainly utilized for animal feeding and a small portion is further processed into various types of soy protein-derivatives for human consumption. Although soybean meal is the most relevant by-product generated by the processing of soybeans, with high protein content, it has not been considered a high value-added food product.

Protein-rich by-products generated by agro-industries have become an alternative source for obtaining encrypted bioactive peptides from protein hydrolyzation able to promote positive effects on human health (Zhu et al., 2015; Luna-Vital et al., 2015; Najafian and Babji, 2015; Chi et al., 2015; Lemes et al., 2016). Those peptides can exhibit several bioactivities interfering in cognitive and neurologic functions, hormonal, nutritional and metabolic activities and can display pharmacological effects, such as antimicrobial or antitumoral properties (Sánchez & Vázquez, 2017). The obtainment of such peptides from by-product proteins, make them cheap and readily available health-promoting agents while adding value to those by-products (Zhu et al., 2015; Luna-Vital et al., 2015; Najafian and Babji, 2015; Chi et al., 2015). At the same time, the utilization of these by-products adds value and also aids decreasing food production environmental impact (Lemes et al., 2016; Laufenberg et al., 2003).

Soybean meal is among the largest protein-rich by-product and bioactive nitrogenous-compounds that is available every year (Rayaprolu et al., 2013). So, the valorization of soybean meal through extraction of two major storage protein glycinin (11S) and -conglycinin (7S) followed by controlled hydrolysis may generate functional ingredients with high added value, since the resulting

112

hydrolysate frequently exhibit bioactive properties such as antioxidant, antitumoral and antimicrobial properties (Peña-Ramos &Xiong, 2002). 7S is one of the most abundant storage proteins in soybeans, constituting 30–46% of the total water-extractable proteins, displaying 180–210 kDa and a compact globular structure at physiological pH consisted of three subunits, α, α’ and β (Santiago et al., 2008). 11S is a 320kDa-holoprotein (Singh et al., 2015) and its quaternary structure consists of five subunits, named G1, G2, G3, G4 and G5 (Natarajan et al., 2006), and the 11S derived-peptides show high hydrophobic character, an important feature of antimicrobial peptides (AMPs) (Kuipers et al., 2007).

The main purpose of this study was to recover, identify and characterize water soluble antimicrobial and antitumoral peptides from soybean meal, prepared according to green chemistry methods and low-cost technologies, food grade, to be used as functional and/or preservative food additives in substitution to synthetic preservatives and antibiotics.

2. Materials and methods

2.1. Organisms Samples of soybean meal (Glycine max) (9.6 g/100 g moisture) was donated by a soybean oil crush Brazilian industry.

For toxicological tests, based on cell viability assays, it was used three cell lines, healthy mouse bone marrow and L929 fibroblast cell lines (ECACC Sigma-Aldrich Co, MO, USA) and human glioblastoma U-87MG cell line (ECACC Sigma-Aldrich Co).

The microorganisms used were Acinetobacter genomospecies 3 ATCC 17922 (isolated from sludge refinery), Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, Listeria innocua ATCC33090, coagulase-negative Staphylococcus aureus KT955005 (isolated from soft cheese), Listeria innocua ATCC 33090, Staphylococcus aureus ATCC 14458, Aeromonas hydrophila FDA110-36 and

113

ATCC 7966, Escherichia coli ATCC 43895 and DH5alfa strains, Salmonella enterica subsp. enterica ATCC 12325, S. enterica subsp. diarizonae ATCC 29934 and Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 were kindly provided by the INCQS cell bank from the Instituto Oswaldo Cruz.

2.2. Preparation of soybean meal aqueous extract

The aqueous extract was prepared according to Del Aguila et al. (2017) and Freitas et al. (2018), where 50 g of extruded soybean material was homogenized in 200 mL of distilled water followed by incubation at 50°C for 24 h in constant agitation. The resulting suspension was centrifuged at 8,000 ×g for 10 min at room temperature, and the supernatant was treated at 90 °C for 10 min with constant agitation followed by filtration though a 0.22 µm pore membrane (Merck Millipore Co, Darmstadt, GER).

2.3. Determination of peptide content

The peptide concentration of the collected fractions was determined by using Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), according to the manufacturer's instructions.

2.4. Purification of peptides

A sample of soybean meal aqueous extract was filtered in Amicon® Ultra- 15 10kDa Centrifugal Filter (Merck Millipore Co), according to the manufacturer’s recommendations. Proteins and peptides >10kDa were accumulated over the membrane and those smaller than the cutoff value were collected in the filtered material. Three milliliters of the filtered suspension were fractionated on gel filtration BIO-GEL P-30 (Biorad, CA, USA) column (1.7 x 23 cm) previously equilibrated with 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.0 in a constant flow rate of approximately 10 mL/h and at room temperature. Fractions were collected every 20 min and monitored in a spectrophotometer (Beckman Coulter, CA, USA) at 280 and 215 nm.

2.5. Spectrophotometric assays

114

Total phenolic compounds (TPC) concentrations were determined using the Folin-Ciocalteu method (Singleton & Lamuela-Raventós, 1999). Results were expressed as mg of gallic acid equivalents per g (mg GAE.g-1) of fresh weight (FW).

2.6. Evaluation of antimicrobial activity

Samples in concentrations ranging from 0.050 to 1.1 mg/mL were tested against 103 cells of each strain: A. genomospecie 3, E. coli DH5alfa and ATCC 43895 grown in LB medium (Luria-Bertani BD™, Fr) and S. aureus ATCC 14458, coagulase-negative S. aureus KT955005 and A. hydrophila ATCC 7966 grown in BHI (Brain Heart Infusion BD™, Le Pont de Claix, FRA), V. parahaemolyticus ATCC 17802 and Salmonella enteric ATCC 1225 and ATCC 29934 were grown in NB (Himedia, Mumbai, IND). Then, cells were serially diluted (1/10) in saline solution (0.85% of NaCl, 0.2% Tween 80), plated on solid LB or BHI, incubated at 37°C for 18 h and colony-forming units were counted.

2.7. In vitro toxicological tests

The cytotoxicity of soybean meal aqueous extract fractions, obtained by gel filtration, was performed by in vitro assays against healthy murine and human tumoral cells. Bone marrow cells were collected from BALB/c mice aged 8–10 weeks (protocol approved by Institutional Ethics Committee for Animal Research at Universidade Federal Fluminense under N° 821-16).

One hundred microliters containing 6.0 x 103 cells/mL of mouse bone marrow (BM), mouse fibroblast L929 or human glioblastoma U-87 MG cell lines were cultured in 96-well microplates for 24h at 37°C in 5% CO2 humidified atmosphere. To a semi-confluent cell layer, 100μl of samples in concentrations ranging from 125 to 0.97 mg/mL were added to the wells and after 24h, cell viability was evaluated by the addition of 0.05 µg resazurin (Sigma-Aldrich Co), according to McMillian et al. (2002), with modifications, where cells were exposed to resazurin for additional 6 h following the detection of fluorescence intensity in a Victor™ X microplate reader (Perkin Elmer Inc, MA, USA) at excitation and emission wavelengths of 530 and 590 nm, respectively.

115

2.8. Concentration and desalinization of peptides in a ZipTip® pipettetips

Pipette tips were activated by 100% acetonitrile and then in 0.1% aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA). Peptides were attached to the ZipTip®C-18 (Merck Millipore Co) washed by 0.1% aqueous TFA and peptides adsorbed to the C-18 matrix were eluted by 4 μL of 0.1% TFA and 70% acetonitrile in water, which were carefully dispensed into a microfuge tube. Reagents were removed by evaporation in a Speed-Vac concentrator (Savant, MA, USA).

2.9. Nano-liquid chromatography, mass spectrometry and data analyses

One hundred micrograms of each sample were suspended in 400 µL of 5% acetonitrile and 0.1% formic acid pH 3.2 and centrifuged at 12,000 x g for 10 min. The supernatant was recovered and an aliquot of 4µL was injected in quadruplicate in a nano-LC Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, IL,USA) coupled to a Quadrupole-OrbitrapQ-Exactive Plus mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER). The peptides were loaded on a pre-column (2 cm length, 200µm inner diameter), packed with ReproSil-Pur C18-AQ 5 µm resin and fractionated in an analytical column Picochip with ReproSil-Pur C18 3µm resin. Peptides were eluted using a gradient of 95% solvent A (95% H2O, 5% ACN, 0.1% formic acid) to 40% solvent B (95% ACN, 5% H2O, 0.1% formic acid) for 40 min; 40% to 85% of solvent B for 10 min; and 95% of solvent B for 15 min, with a flow at 300 nL/min.

The full scan and MS/MS acquisition was obtained using a positive mode applying a Data Dependent Acquisition (DD-MS2). The ion source and S-lens were optimized to spray voltage at 3.4 kV, zero flow of sheath and auxiliary gas at250°C and 80 S-Lens RF level. MS full scan was acquired in a 70,000 resolution at m/z 400-2000 in the Orbitrap analyzer, 106 AGC, and 50 ms maximum ion injection time. The 10 most intense ions with 2-4 charges were selected for higher-energy collision dissociation fragmentation. Fragment acquisition was performed in the Orbitrap using 30 collision energy and dynamic exclusion enabled for 20s. MS/MS scans were obtained using 17,500 resolution, 5x104 AGC, 50 ms maximum isolation time, microscans 1s, range m/z 200-2000 and isolation window m/z 2.0. 116

The DDA raw data were processed and searched by the Proteome Discovery 2.1 software server search engine (Thermo Fisher Scientific, Bremen, GER) with the SEQUEST algorithm and Peaks 8.0 (Bioinformatics Solutions, ON, CAN)by using a tolerance up to ± 0.1Da to precursor ions and 0.01Da to fragment ions. Protein identification was performed by searching the mass spectrometric data against the UniProt-SwissProt protein database (available in April 2018) containing reversed sequences with a false discovery rate (FDR) <1%.

2.10. Prediction of potential antimicrobial sequences

Peptides identified by nano-LC-MS/MS in both fractions - F1 and F2 - were screened from an initial list of >19,606 sequences by hydrolyzates the selection of those peptides with two occurrence in the triplicate and establishing a cutoff value of -15 to 15 ppm.

The initial screening resulted in 308 peptide sequences (Table 1S) that were evaluated using four algorithms including support vector machines (SVM), random forests (RF) artificial neural network (ANN) and discriminant analysis (DA), to determine peptide probability to exhibit antimicrobial activity (Waghu et al., 2015). Peptide sequences were considered the best AMP candidates when a positive result was obtained in at least three algorithms. When the peptide sequence was classified as AMP by two algorithms, they were considered good candidates. The four algorithms can be freely accessed at CAMP R3 website (http://www.camp.bicnirrh.res.in/prediction.php).

Alternatively, β-conglycinin amino acid sequence, the main source of the bioactive peptides from F1 and F2 fractions, was used to screen potential antimicrobial domains using AMPA algorithm available at http://tcoffee.crg.cat/apps/ampa/do (Torrent et al., 2011).

2.11. Sequence comparison of Glycine max proteins

The multiple sequence alignment was performed between β-conglycinin subunits and peptides that exhibited high potential for AMP by the algorithms 117

described above. The CLUSTAL Omega 1.2.4 (Sievers et al., 2011) parameters input were used as no dealing input sequence, 1 max guide tree iterations, no combined iterations, order aligned, MBED-like clustering iterations and MBED- like clustering guide-tree.

2.12. Structural modeling of β-conglycinin protein and localization of AMPs regions

After multiple sequence alignment (MSA) of P11827, P13916, Q4LER6, Q3V5S6 and F7J075 subunits using CLUSTAL, secondary structures (SS) were analyzed using MSA as input by Ali2D (Zimmermann et al., 2018), PSIPRED and QUICK2D (Buchan et al., 2013). pGenTHREADER method (Lobley et al., 2009) was used to predict a profile based fold recognition and I-TASSER (J Yang et al, 2015) to generate a three-dimensional structure (3D) model for Q3V5S6 and F7J075. The Modeller program (Webb &Sali et al., 2016) was used to optimize the secondary structure predict by peptides regions. The 3D analyses were performed with the PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC).

2.13. Statistical analyses

All experiments were performed in triplicate including antimicrobial activity, identification of peptides and cell toxicological tests. Multiple comparison analyses were performed by ANOVA with Tukey post-test (Zar, 1984) and significance was considered when p<0.05, as determined by the GraphPad Software 7 (GraphPad Software Inc., CA, USA).

3. Results

3.1. Fractionation of bioactive peptides and evaluation of antimicrobial activity.

Twelve fractions containing peptides with molecular masses <10 kDa were obtained and tested against foodborne bacteria (Fig. 1A). Fractions 1 and 2 (F1 and F2), showed antimicrobial activity, high peptide content and low content of phenolic compounds, minimizing the contribution of these compounds to the

118

overall bioactivity of F1 and F2, but leaving the antibacterial activity to the peptides (Fig. 1B).

Fig. 1. Fractionation of the ultra-filtered soybean meal aqueous extract, antimicrobial activity and phenolic content of the resultant fractions. (A) Fractionation of the <10kDa fraction of soybean meal aqueous extract on a BioGel P- 30 column equilibrated with 50 mM phosphate buffer pH7.0. Peptide content of the collected fractions was monitored by absorbance at 215 nm. (B) Antimicrobial activity against the model microorganism Acinetobacter genomospecies 3 and total phenolic concentration (TPC) of each fraction determined by the Folin-Ciocalteu method were evaluated. Antimicrobial activity was expressed as positive (+) or negative(-).

F1 and F2 fractions were able to abolish the growth of strains from different species and genus, as Acinetobacter genomospecies 3, Escherichia coli DH5alfa ATCC 43895, Staphylococcus aureus ATCC 14458, coagulase- negative Staphylococcus aureus KT955005, Aeromonas hydrophila ATCC 7966, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 and Salmonella enterica strains ATCC 1225 and ATCC 29934 (Table 1).

119

Table 1. F1 and F2 fraction from soybean meal aqueous extract able to abolish the foodborne pathogen growth.

Fraction Fraction Microorganisms tested F1 F2 mg/mL mg/mL S. aureus ATCC14458 1.0 1.05 Gram coagulase-negative S. aureus KT955005* 0.075 1.05 positive S. aureus ATCC13150 1.01 0.9 Acinetobacter genomospecies 3** 0.072 0.084 Aeromonas hydrophila FDA 110-36 0.09 0.1 A. hydrophilaATCC7966 0.069 0.051 Escherichia coli DH5alfa 0.105 0.098 Gram E. coli ATCC43895 0.105 0.098 negative E. coli NCTC8959 0.105 0.098 Salmonella entericaATCC12325 0.14 0.15 S. entericaATCC29934 0.14 0.15 Vibrio parahemolyticusATCC17802 0.16 0.11 F1 and F2 amount to abolish the growth of 103 cellsat 37ºC for 18 h. Remaining bacterial cells were serially diluted (1/10), plated, incubated at 37°C for 18 h and colony-forming units were counted. The growth inhibition test was performed in triplicate for each concentration of F1 and F2. * Strain isolated from soft cheese (Nunes et al, 2016).**Strain isolated from refinery sludge (Pinhati et al, 2014.)

3.2. Antitumoral effect of phenolic-reduced fractions on human tumoral cells

Toxicological tests of fractions F1 and F2 were performed on murine healthy BM and L929 fibroblast cells.

Decreasing concentrations of F1 ranging from 220.2 to 1.72 g/mL showed no toxicity to mouse healthy BM and L929 cell lines, except for the highest concentration, 220.2 g/mL, which caused a reduction of about 70%-60% on cell viability. F1 fraction exhibited an IC50 of 199.3 g/mL and 134.4 g/mL, for BM and L929 cells, respectively (Fig. 2, top panel).

120

Despite of its non-toxic effect on murine cells, F1 caused at least 30% of viability reduction (Fig. 2, top panel) in concentrations 110.1 to 1.72 μg/mL and abolished viability of U-87 MG tumor cells when added at concentration of 220.2

g/mL ( IC50= 6.74 g/mL).

Similarly, F2 fraction did not affect healthy BM and L929 cells after a time period of incubation of 24h, except for the highest concentration 222.8 g/mL that causes 78% and 55% reduction, respectively, displaying IC50 of 158.6 g/mL and 196.5 g/mL (Fig. 2, bottom panel). On the other hand, the viability of U-87 MG tumor cell line was reduced at least 50% at all concentrations tested but , reaching 100% inhibition at 222.8 g/mL (IC50= 2.57g/mL) (Fig. 2, bottom panel).

Fig. 2. Toxicological screening of F1 and F2 against healthy and tumoral cells. F1 (top panel) and F2 (bottom panel) were tested against mouse healthy bone marrow (BM) and fibroblast L929cells and human glioblastoma U-87MGcell line survival after 24 h exposition. Results were expressed as mean ± standard deviation (n=3). Proliferation inhibition versus fraction concentration plot. ***p<0.001 and ****p<0.0001 indicates difference between the untreated cells (control) and those incubated with F1 or F2 concentrations from 222.8 µg/mL to 1.72 µg/mL evaluated by the One-way ANOVA test with Tukey post-test. 121

3.3. Identification of peptides in F1 and F2 fractions by mass spectrometry

The nano-LC-MS/MS analysis of fractions F1 and F2 revealed a variety of peptides with molecular masses ranging from 718.42 to 4872.43 Da, after the ultrafiltration process of the whole soybean meal aqueous extract through a 10kDa molecular weight cutoff membrane (Table 2). A total of 308 non-identical peptides were identified in fractions F1 and F2 (Table 1S). Some of these peptides showed truncated and/or overlapping sequences revealed by comparison with data available from UniProt database protein and Peak analysis (Fig. 1S). They were encrypted in soybean proteins, mainly in - conglycinin alpha and alpha-prime subunits, followed by glycinin, uncharacterized proteins, proteins involved in maturation process, oleosin, Kunitz trypsin inhibitor and seed biotinylated protein 68 kDa isoform (Table 2).

122

Table 2. Quantitative analysis of peptides from F1 and F2 fractions evaluated by nano-LC-MS/MS.

Access No. #peptides % Proteinsource Theo. MH+ [Da] F1 F2 F1 F2 F1 F2 Beta-conglycinin F7J075; Q948X9; Q94LX2; Q4LER6 Q3V5S6; F7J075; Q4LER6 150 118 63.03 67.82 857.47 to 4872.43 K7K5Q8;I1JKB3; K7LDT9; A0A0R0LAD9;I1MUI0;K7N2A2; I1KID4; I1M222;A0A0R0HYM3; A0A0R0HYM3; I1M222; I1M0W1; A0A0R0JWF4; I1M0W1; I1LHP6; A0A0R0JWF4; I1K7E6; K7LEQ5; Uncharacterized 55 22 23.11 12.64 718.42 to 3808.66 I1K7E6; A0A0R0FBK4; C6T1V2; I1LHP6;I1LMQ8; I1L957; I1JMQ3; C6SWV3;K7LEQ5; I1L957; I1K1B0; I1M5Y9 I1JYG6; I1KV72; A0A0R0KKD6; K7MID0. Glycinin P93707;Q9SB11 P93707;Q9SB11 22 26 9.24 14.94 1411.72 to 3560.53 Maturationprotein Q42447 Q42447 3 1 1.26 0.57 1436.82 to 1669.74 Seedmaturationproteins Q541U1;Q9S7N8; Q9ZTY1;Q541U1; Q9XES8 3 4 1.26 2.30 1128.56 to 2173.97 Oleosin I1N747 ND 3 ND 1.26 0.00 1308.68 to 1645.84 Kunitztrypsininhibitor Q39898 Q39898 1 3 0.42 1.72 1211.61 Seed biotinylated protein 68 C6K8D1 ND 1 ND 0.42 0.00 1090.62 kDa isoform Peptides from fractions F1 and F2 were identified by nano-LC-MS/MS were screened by ppm cutoff value of 15 to -15 and occurrence in at least two replicates. The quantity of peptides generatedby each protein source was expressed in percentage (%). Access No. refers to the protein source code deposited at the protein database UniProt available at https://www.uniprot.org(accessed in April 2018). Access numbers in bold correspond to the protein source that originated the peptides classified as the bestAMPcandidates by CAMPR3analysis.ND – not detected.

123

3.4. Antimicrobial peptide prediction evaluation

The potential antimicrobial peptides (AMP) were identified by using four algorithms, support vector machines (SVM), random forests (RF) artificial neural network (ANN) and discriminant analysis (DA) available at CAMPR3 (Collection anti-microbial peptide) website (Waghu et al., 2015). A total of 83 peptide sequences were classified as AMP candidates (Table 3). Peptides were considered the best AMP candidates when matched at least 3 algorithms. Ten peptides were selected and 70%of them were originated from -conglycinin alpha and alpha-prime subunits and the remaining 30%, from uncharacterized proteins. Alternatively, the AMPA algorithm was used to find potential AMP regions within the primary sequence of the antimicrobial protein -conglycinin. The analysis revealed two potential antimicrobial peptides, which were found in both fractions, F1 and F2 (Table 3). Mass spectrometry analysis generated reliable and highly precise results which are represented by the spectrum of an AMP candidate (PRPIPFPRPQP), shown in Fig. 3A.

Table 3. Candidate AMP sequences assorted after specific algorithm evaluation.

Physicochemical characteristics Occurrence CAMPR3 Peptides * analysis Hydrophobic Proline Charge F1 F2 ratio ratio GEQQHEEEEREREHPQPHPPHEERG + + + - -6 0 16% x

GEQQHEEEEREREHPQPHPPHE + + + - -6 0 18% x

ERQQHGEKEEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQEE + + + - -4 6% 19% x

EGEQPRPFPFPRP + + + - 0 15% 38% x x GEQPRPFPFPRP + + + - 1 16% 41% x x PRPIPFPRPQP + + + - 2 18% 54% x x IPRPRPRPQHPEREPQ + + + - 2 6% 37% x

EKSKRILRGLKTLFFLITMVISLLL + + + - 4 56% 0 x

EQDEREHPRPHQPHQKEEEKH + + + - -3 0% 14% x

FPFPRPPHQK + + + - 2 20% 40% x

DEREHPRPHQPHQKEEEKH + + - - -2 0% 15% x

EEQDEREHPRPHQPHQKEEEKH + + - - -4 0% 13% x

GEQPRPFPFP + + - - 0 20% 40% x

EGEQPRPFPFP + + - - -1 18% 36% x x EGEQPRPFPFPRPRQP + + - - 1 12% 37% x

124

DEGEQPRPFPFPRPRQP + + - - 0 11% 35% x x GEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE + + - - -4 8% 25% x

EKEEDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -4 10% 30% x x EEKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQKE + + - - -10 5% 11% x

EKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQKE + + - - -9 5% 11% x

RPRPQHPEREPQQPGEKEE + + - - -1 0% 26% x x ERKQEEDEDEEQQRESEESED + + - - -10 0% 0% x

QPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQ + + - - -3 8% 28% x

GEIPRPRPRPQHPEREPQ + + - - 1 5% 33% x

GEIPRPRPRPQHPEREPQQPG + + - - 1 4% 33% x

EDEQPRPIPFPRPQP + + - - -1 13% 40% x x DEEEDQPRPDHPPQRPS + + - - -4 0% 29% x x EEEDQPRPDHPPQRP + + - - -3 0% 33% x

EDEEEDQPRPDHPPQRPS + + - - -5 0% 27% x x EEEDQPRPDHPPQRPSRPE + + - - -3 0% 31% x

EEEDQPRPDHPPQRPS + + - - -3 0% 31% x x EEEEREREHPQPHPPHEERG + + - - -5 0% 20% x x EEEREREHPQPHPPHEERG + + - - -4 0% 21% x x EEREREHPQPHPPHEERG + + - - -3 0% 22% x

DEDEDEDKPRPSRPSQGK + + - - -3 0% 16% x x GRGHERRKEEEETARR + + - - 1 6% 0% x x FPFPRPP + + - - 1 28% 57% x

DEEQDERQFPFPRPP + + - - -3 13% 26% x x EDEQPRPIPFP + + - - -2 18% 36% x x EDEDEEQDERQFPFPRPP + + - - -6 11% 22% x x EEQDERQFPFPRPP + + - - -2 14% 28% x x DEDEEQDERQFPFPRPP + + - - -5 11% 23% x x EDEDEQPRPIPFP + + - - -4 15% 30% x x EEDEDEQPRPIPFP + + - - -5 14% 28% x x DEQPRPIPFP + + - - -1 20% 40% x x EDEEQDERQFPFPRPP + + - - -4 12% 25% x x EDEDEDEEQDERQFPFPRPP + + - - -8 10% 20% x

DEDEDEEQDERQFPFPRPP + + - - -7 10% 21% x x DEEQDERQFPFP + + - - -4 16% 16% x x EDEDEDEEQDERQFPFP + + - - -9 11% 11% x

DEDEDEEQDERQFPFP + + - - -8 12% 12% x x DEDEEQDERQFPFP + + - - -6 14% 14% x x QPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -4 8% 30% x

GEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -4 9% 28% x x DEQPRPIPFPRPQP + + - - 0 14% 42% x x EEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -9 8% 17% x

DEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -2 12% 37% x x DEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -3 11% 23% x

125

EDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -8 9% 18% x x EDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -3 11% 35% x x EEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -10 8% 16% x

DEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -7 9% 19% x x DEDEDEEQDERQFPFPRPPH + + - - -7 10% 20% x

DEDEQPRPIPFPRP + + - - -2 14% 35% x x EHPRPHQPHDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -5 7% 25% x

FSRAFPFPPR + + - - 2 40% 30% x

DEDEQPRPIPFP + + - - -3 16% 33% x

DEQPRPIPFPRP + + - - 0 16% 41% x

EDEDEEQDERQFPFP + + - - -7 13% 13% x

EDEDEEQDERQFPFPRPPHQ + + - - -6 10% 20% x

EEDEDEQPRPIPFPRP + + - - -4 12% 31% x

EEDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -4 11% 33% x

KEEDEDEQPRPIPFPRPQP + + - - -3 10% 31% x

DEDEQPRPFPFPRPQP + + - - -2 12% 37% x

EEDEDEQPRPFPFPRPQP + + - - -4 11% 33% x

GSEEEQDEREHPRPHQPH + + - - -4 0% 16% x

REHPRPHQPHQKEEEKH + + - - 0 0% 17% x x DEGEQPRPFPFPRPRQPH + + - - 0 11% 33% x

DEEEDQPRPDHPPQRP + + - - -4 0% 31% x

RPEQQEPRG + + - - 0 0% 22% x

GEQQHEEEEREREHPQPHPPHEE + + - - -7 0% 17% x

HPEREPQQPGE** NA -2 0 27% x x EQDERQFPFP ** NA -2 20% 20% x x Peptide sequences were evaluated by *CAMP R3 method using 4 kinds of algorithms, support vector machines (SVM), random forests (RF) artificial neural network (ANN) and discriminant analysis (DA) (Waghu et al., 2015). NA - Not applied. The first ten peptide sequences were considered the best candidates since they were positively classified as AMP by at least 3 algorithms (+ + + -). The sequences positive in only two of four algorithms (+ + - -) were considered good candidates and are shaded in gray. **Sequences within β-conglycin inidentified by AMPA algorithm analysis as potential active regions(Torrent al., 2011). The two peptides were included in the best candidates group.

3.5. Comparative analysis of Glycine max sequence proteins.

A preliminary multiple sequence alignment (CLUSTAL Omega1.2.4) was performed between β-conglycinin subunits Q3V5S6, F7J075, Q4LER6, P11827 and P13916 followed by the localization of AMP candidate within the protein sequences. AMP sequences showed high identity with the protein sequences found in database (Table 2S and Fig. 3B). The BlastP versus UNIPROT

126

QE-001821_NEMO_030418_101_F1 03-Apr-18 1:36:13 PM

RT: 19.82 - 40.33 SM: 15G database is shown in table S2. The localizationRT: 32.59 of the 10 best AMPsNL: 3.59E4 within β- AA: 152703 m/z= 100 conglycinin subunits revealed two distinct short domains (region 1 and651.38115-651.38245 region F: 2) FTMS + c NSI Full ms 80 [350.0000-2000.0000] MS (Fig. 3B). However, the localization of AMP best candidates in theICIS tertiary QE- structure60 of β-conglycinin subunits were not directly performed since001821_NEMO_030418_10 the 3D 1_F1 structure40 of this specific region is not available in public databases.

Relative Abundance RT: 31.45 20 RT: 39.61 AA: 8784 AA: 7785 0 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Time (min)

QE-001821_NEMO_030418_101_F1 #9638 RT: 32.59 AV: 1 NL: 8.65E5 F: FTMS + c NSI d Full ms2 [email protected] [90.0000-1350.0000] A 651.37848 z=2 100

254.16144 80 z=1 1048.59485 z=1 60

40 281.17966 237.13484 838.45795 z=2 602.85199 z=1 z=1

Relative Abundance z=2 708.41974 20 113.07136 341.18207 481.29730 944.54736 z=1 821.43164 1169.64929 z=1 z=1 z=2 z=1 z=? z=1 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 m/z

127

Fig. 3. Location of the best AMPs candidates within β-conglycinin primary structure. (A) Representative spectra of original and processed peptide (PRPIPFPRPQP) identified bynano-LC-MS/MS, and proposed asone of the best candidates for AMPs in Table 3 (ppm <6.7 and 651.38 m/z represent the precursor ion). (B) The predictive functional sequences of five β-conglycinin subunits Q3V5S6, F7J075, Q4LER6, P11827 and P13916 deposited at UniProt database were aligned by Clustal Omega and the 10 AMP best candidates were localized within the sequences. Regions shaded in orange correspond to antimicrobial domains containing the complete or partial amino acid sequences of the best AMP candidates shown in Table 3.

128

3.6. Structural modeling of β-conglycinin protein and location of AMPs regions

To determine the three-dimensional structure of the two regions containing the 10 best AMP candidates within β-conglycinin, a consensus was constructed using the results SS from I-TASSER, Ali2D, PSIPRED and PSSPRED. Fig. 4A shows part of MSA for the target regions in P11827, P13916, Q4LER6, Q3V5S6 and F7J075. I-TASSER simulations generated a large ensemble of structural conformations for the Q3V5S6 and F7J075 proteins. The top 5 3D models were predicted and ranked and the final model analyze the confidence of each model and the peptide regions compare with others secondary predictions. The most relevant 3D model for Q3V5S6 was obtained with C-score value of -2.86 and estimated TM-score of 0.39±0.13 and the most relevant 3D model for F7J075was obtained with C-score value of -2.48 and estimated TM-score of 0.43±0.14. I-TASSER uses the TM-align structural alignment program to match the first I-TASSER model to all structures in the PDB library. Proteins displaying the closest structural similarities with Q3V5S6 and F7J075 3D models from the PDB was 7S globulin-1 from Phaseolus angularis (PDBid 2EA7_A) and - conglycinin from Glycine max (PDBid 1IPK_C), respectively. In Fig. 4B, the 3D model built for F7J075 protein (in blue) is presented after applying the secondary structure restraints. SS prediction was used to guide this module in Modeller package.

129

Fig. 4. Three-dimensional structure of β-conglycinin regions containing AMPs candidates sequences. (A) Partial alignment between P11827, P13916, Q4LER6, Q3V5S6 and F7J075 with region 1sequence shaded in magenta and region 2 in green. The prediction of the secondary structure is represented by red H for alpha-helix and black C for beta-sheet. (B) Structural analysis by superposition of F7J075 3D model in blue and 7S globulin-1 from Phaseolus angularis in orange (PDB ID 2EA7_A). Region1in magenta and region 2in green, containing the 10 best AMPs.

130

4. Discussion

The emergency of multi-resistant bacteria as a result of the excessive use of antibiotics has become a problem not only for the public health system but also for the food industries. Foodborne pathogen resistance has increased in the last decades due to their dissemination thorough products of animal origin due to the indiscriminate use of antibiotics in veterinary clinical practice. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., coagulase-negative Staphylococcus spp., Shigella, Enterococcus ssp. and Escherichia coli are among the main bacteria with multidrug resistance, which are included in the category of community and hospital acquired pathogens, in response to the strong demand by consumers for novel and broad-spectrum antibiotics against several pathogens (De Billerbeck, 2007; Fisher & Phillips; 2008).

The searching for alternative agents such as AMPs, which exhibit broad antimicrobial spectrum but low ability to trigger the mechanisms for bacteria resistance have impulse the development of these novel antimicrobial compounds (Shagaghi et al., 2018). Antimicrobial peptides can be naturally present or encrypted into a larger protein sequence where in its encrypted form does not show functionality. To exert their biological effects, encrypted peptides have to be released by different ways including enzymatic gastrointestinal digestion, microbial proteolytic enzymes, fermentation process or the action of endogenous proteolytic enzymes on the matrix where peptides are encrypted (Agyei, 2015; Guaadaoui et al., 2014).

Soybean proteins and/or peptides are generally extracted by water or aqueous buffer containing phosphate salts (Amnuaycheewa& Gonzalez, 2010). Herein, the peptide-rich and stable soybean meal extract was prepared by aqueous extraction followed by thermal treatment to induce controlled proteolysis under a mild temperature condition (50 °C), which favors the enzymatic activity of proteases naturally present in soybean meal. Proteolysis step was ended by a severe heat shock at 90 °C, generating a peptide-rich extract, which is able to inhibit the growth of foodborne bacteria (Freitas et al.,

131

2018). The antimicrobial effect of the soybean meal aqueous extract was input to phenolic compounds, as isoflavones and/or antimicrobial peptides with molecular masses inferior to 10kDa. Previous reports have shown that soybean isoflavones can display antibacterial activity per se and the ability to act as potentiators of other antimicrobial agents such as α-linoleic acid, synthetic and natural antibiotics, as norfloxacin and beberine (Laodheerasiri & Pathirage, 2017; Hong et al., 2006). According to Morel et al. (2003), the utilization of isoflavones from L. argenteus in combination with the antibiotic beberine, enhanced the uptake of beberine by naturally resistant Staphylococcus. aureus, improving its antimicrobial effectiveness.

Considering that the soybean meal aqueous extract is rich in peptides and isoflavones, the separation of the antibacterial compounds was performed by the fractionation on a gel filtration chromatography, to eliminate or minimize isoflavones interference and facilitate the identification of antimicrobial peptides. Additionally, vegetable extracts contain several interfering substances, including flavonoids in their glycoside forms, where the sugar content decreases the effectiveness of antibacterial activity, resulting in poor reproducibility, one of the main obstacles encountered. Besides this, qualitative and quantitative variation in the content of bioactive phytochemicals in plant extracts result in inconstant effectiveness (Negi, 2012).

The gel permeation of soybean meal aqueous extract resulted in 12 fractions with distincttypes and content of peptides and phenolic compounds. To guarantee that phenolic compounds, especially isoflavones, would not interfere in antimicrobial assays, the fractions with just traces of phenolics, F1 and F2 (≤ 0.2 mg/mL) were selected for further analysis. Both fractions were able to abolish foodborne bacteria growth in concentrations ranging from 0.051 to 1.05 mg/mL. It is interesting to note that Gram-negative bacteria exhibited higher sensitivity to antimicrobial peptides from soybean meal aqueous extract, requiring lower concentrations of such peptides to abolish their growth. The physicochemical characteristics of these peptides are essential to their antimicrobial action, where the selectivity to Gram-negative bacteria could be

132

the result of positively charged peptides interactions with negatively charged membrane constituents such as phospholipids and lipopolysaccharides that promote the rupture of the membrane or inhibit internal constituents of the cell. Hydrophobicity also plays an essential role on peptide ability to interact with bacterial membrane (Del Aguila et al., 2017). No difference in F1 and F2 antimicrobial efficiencies were observed since they abolished bacterial growth in pretty similar concentrations indicating that they should share many antimicrobial peptides evidenced by the absence of sharped peaks released by Biogel P-30 permeation, resulting in a poor separation of peptides in F1 and F2 (Fig. 1A).

Both fractions did not exhibit toxic effects to mouse health bone marrow and fibroblast cells at peptide concentrations ranging from 111.4 to 1.74 g/mL for BM and L929 cell lines (Fig. 2). These results suggest that AMPs in F1 and F2 may be promissory antimicrobial agents to be safely applied to food products without causing toxicity to consumers. Further studies are still necessary to study the effects of such AMPs on human healthy cells.

F1 and F2 also exhibited similar antitumoral effect against glioblastoma U-87 MG cell line, reinforcing the possibility that they should share many of their peptides (Fig. 2). Such cells had their viability reduced by at least 90% at 111.4 g/mL and maintained reduced viability up to 50% when exposed the lowest concentration, 1.74 g/mL. These results indicate a higher specificity of F1 and F2 peptides for glioblastoma U-87 MG cell line, a malignant brain tumor of invasive nature and rapid progression, resulting in low survival rates after surgical resection and specific treatment (Stuppet al., 2005). Based on this, the peptides recovered from soybean meal aqueous extract should have their individual effectiveness investigated on such a serious tumor cell line aiming their use as functional additives in food products to aid in the fight against glioblastoma and possibly contribute to improve the quality of life or extend patient survival. It has been reported that many antimicrobial peptides, including anionic or cationic and cell penetrating ones, can also act as anticancer peptides (ACPs),

133

sharing similar mechanism of action with antimicrobial functionality. The utilization of AMPs as ACPs has the same advantages of AMPs, low propensity to resistance and low toxicity to host healthy cell lines. The peptides described herein could also be considered valuable anticancer candidates, according to their toxicity to U-87 MG tumor cells (Felicio et al., 2017; Deslouches and Di et al., 2017; Gaspar et al., 2013; Prabhu et al., 2014 and 2013).

The identification of peptides in fractions F1 and F2 by mass spectrometry analysis confirmed the presence of 308 non-identical molecules and, as already suspected, many of them are shared by both fractions, supporting the similar effects observed in antimicrobial, antitumoral and toxicological tests (Table S1).

Not surprisingly, the majority of peptides were originated from -conglycinin followed by glycinin, which together, account for >80% of total soybean protein content (Wang et al., 2014). These major globulins are known to exhibit antimicrobial properties (Vasconceloset al., 2014; Sitohy et al., 2012) and, therefore, are potential targets to originate antimicrobial and/or anticancer peptides. In fact, after analysis of each identified peptide, using five algorithms to predict their potential antimicrobial activities, 12 peptide sequences were selected as the best AMP candidates, 9 of them were originated from β- conglycinin and other 3 from uncharacterized proteins (Table 3). AMP prediction tools are based on typical antimicrobial characteristics including composition, physicochemical characteristics and structural amino acids features (Thomas et al., 2009; Shaini et al., 2010). Although the candidate peptides identified herein exhibit the required antimicrobial properties, experimental validation is an essential step to verify each particular effectiveness. These peptides shared characteristics such as the high frequency of proline (P) in most of the sequences, positive or negative net charge and, in some cases, high ratio of hydrophobic residues, all essential features required by AMPs to efficiently exert their function (Li et al., 2014; Tam et al., 2015).

Uniprot database information revealed that the β-conglycinin subunit protein (F7J05) has 605 amino acid residues. The 1-22 aa residues is the signal peptide sequence and the 23-605 is inferred as the functional region of protein

134

(available at https://www.uniprot.org/uniprot/F7J075). The available information in PDB structure database and others databank comprised only part of the structure of the molecule (195-598 aa) (available at https://swissmodel.expasy.org/repository/uniprot/F7J075?csm=B6198E8E4610 AD25). Surprisingly, the portion of the sequence in which the new AMPs peptides were identified by mass spectrometry analysis did not comprise the available structure stretchs in databank repository. For this reason, the total three-dimensional structure of 22-605 aa of β-conglycinin was determined in this study and predicted peptides described as antimicrobial candidates were located in alpha-helice structures in the outer region of the molecule. To date, no information on the antimicrobial activity of this predicted region had been described, but it is known that this is a domain region comprising the Cupin-like superfamily (available at https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?dps=1&uid=1UIJ).

In a previous study, Sitohi et al. (2012) showed that purified intact glycinin and β-conglycinin subunits exhibit antimicrobial properties. These autors also showed that killing efficiency was in the following descending order; basic glycinin subunit>glycinin>β-conglycinin against L. monocytogenes, B. Subtilis and S. Enteritidis.

Conclusion

Antimicrobial peptides are a novel class of bio-pharmaceuticals that possess significant therapeutic potential. The results of this study indicate that soybean meal peptides such as GEQQHEEEEREREHPQPHPPHEERG; GEQQHEEEEREREHPQPHPPHE; ERQQHGEKEEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQEE; EGEQPRPFPFPRP; GEQPRPFPFPRP; PRPIPFPRPQP; IPRPRPRPQHPEREPQ; EKSKRILRGLKTLFFLITMVISLLL; EQDEREHPRPHQPHQKEEEKH; FPFPRPPHQK; HPEREPQQPGE; EQDERQFPFP could possibly be used in the development of a biocompatible and biodegradable alternative antimicrobial

135

or antitumoral agents for use in the food industry or adjuvant chemotherapy in cancer. There is a dire need to develop and exploit high throughput techniques for drug analysis and antimicrobial/antibiotic screening in the pharmaceutical industry. Encrypted antimicrobial peptides obtained by a sustainable processing from an agroindustry protein-rich by-product without generating hazardous sub products should encourage the efficient industrial-scale production of those antimicrobial peptides. The production in large scale and use of multifunctional peptides encrypted in soybean meal proteins is an innovative application of the concept of circular bioeconomy.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest and the founding sponsors had no role in the study design, data collection, analysis, or interpretation, in the manuscript preparation writing or in the decision to publish the results.

Acknowledgment

The authors acknowledge financial support from CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) and FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro). Strains from ATCC, FDA and CDC collections were kindly provided by FIOCRUZ- INCQS, Rio de Janeiro, Brazil, from the Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária-CMRVS.

136

References

Agyei, D. (2010). Bioactive proteins and peptides from soybeans. Recent

Patentson Food, Nutrition & Agriculture, 7, 100-107.

Amigo-Benavent, M., Clemente, A., Caira, S., Stiuso, P., Ferranti, P.,&del

Castillo, M. D. (2014).Use of phytochemomics to evaluate the bioavailability and bioactivity of antioxidant peptides of soybean ß-conglycinin.Electrophoresis, 35,

1582–1589.

Amnuaycheewa, P.,&de Mejia, E., G. (2010).Purification, characterization, and quantification of the soy allergen profilin (Gly m3) in soy products. Food

Chemistry, 119, 1671-1680.

Buchan, D. W., Minneci, F., Nugent, T. C., Bryson, K., & Jones, D. T. (2013).

Scalable web services for the PSIPRED Protein Analysis Workbench. Nucleic acids research, 41, W349-W357.

Cheng, A. C., Lin, H. L., Shiu, Y. L., Tyan, Y. C., &Liu, C. H. (2017). Isolation and characterization of antimicrobial peptides derived from Bacillus subtilis E20- fermented soybean meal and its use for preventing Vibrio infection in shrimp aquaculture. Fish & Shellfish Immunology, 67, 270-279

Chi, C.-F., Wang, B., Wang, Y.-M., Zhang, B.,&Deng, S.-G.(2015). Isolation and characterization of three antioxidant peptides from protein hydrolysate of bluefin

137

leatherjacket (Navodonseptentrionalis) heads.Journal of Functional Foods, 12,

1–10.

Day, L. (2013).Proteins from land plants – Potential resources for human nutrition and food security.Trends in Food Science & Technology, 32, 25–42.

De Billerbeck, V. G. (2007).Huilesessentiellesetbactériesrésistantes aux antibiotiques. Phytothérapie, 5, 249-253.

Del Aguila, E.M., Gomes, L.P., Freitas, C.S., Pereira, P.R., &Paschoalin, V.M.F.

(2017). Natural Antimicrobials in Food Processing: Bacteriocins, Peptides and

Chitooligosaccharides. Frontiers in Anti-Infective Drug Discovery, 4, 55-108.

Deslouches, B., Di, Y. P. (2017). Antimicrobial peptides with selective antitumor mechanisms: prospect for anticancer applications. Oncotarget, 8, 46635.

Dhayakaran, R., Neethirajan, S., &Weng, X. (2016).Investigation of the antimicrobial activity of soy peptides by developing a high throughput drug screening assay. Biochemistry and Biophysics Reports, 6, 149–157.

Erdmann, K., Cheung, B. W.,&Schröder, H. (2008).The possible roles of food- derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease. The

Journal of nutritional biochemistry, 19, 643-654.

138

Farrokhi, N., Whitelegge, J. P.,&Brusslan, J. A. (2008).Plant peptides and peptidomics. Plant biotechnology journal, 6, 105-134.

Felício, M. R., Silva, O. N., Gonçalves, S., Santos, N. C., &Franco, O. L. (2017).

Peptides with dual antimicrobial and anticanceractivities. Frontiers in chemistry

,5, 1-9.

Fisher, K., &Phillips, C. (2008). Potential antimicrobial uses of essential oils in food: is citrus the answer? Trends in Food Science & Technology, 19, 156-164.

Gaspar, D., Veiga, A. S., &Castanho, M. A. R. B. (2013).

Fromantimicrobialtoanticancerpeptides. Rev Front Microbiol, 4, 294.

Guaadaoui, A., Benaicha, S., Elmajdoub, N., Bellaoui, M.,&Hamal, A. (2014).

What is a bioactive compound? A combined definition for a preliminary consensus. International Journal of Nutrition and Food Sciences,3, 174-179.

Hong, H., Landauer, M. R., Foriska, M. A.,&Ledney, G. D. (2006).Antibacterial activity of the soy isoflavone genistein. Journal of Basic Microbiology, 46, 329-

335.

Hou, Y., Wu, Z., Dai, Z., Wang, G., &Wu, G. (2017).Protein hydrolysates in animal nutrition: industrial production, bioactive peptides, and functional significance. Journal of animal science and biotechnology, 8, 1-13.

139

Kim, H. W., Kim, K. M., Ko, E. J., Lee, S. K., Ha, S., Song, K. B., &Bae, D. H.

(2004). Development of antimicrobial edible film from defatted soybean meal fermented byBacillussubtilis. Journal of microbiology and biotechnology, 14,

1303-1309.

Kuipers, B.J., A.C. Alting, &H. Gruppen, (2007).Comparison of the aggregation behavior of soy and bovine whey protein hydrolysates.Biotechnology Advances,

25, 606–610.

Laodheerasiri, S., &HoranaPathirage, N. (2017).Antimicrobial activity of raw soybean, soybean flour and roasted soybean extracted by ethanol-hexane method. British Food Journal, 119, 2277-2286.

Laufenberg, G., Kunz, B.,&Nystroem, M. (2003).Transformation of vegetable waste into value added products: (A) the upgrading concept; (B) practical implementation. Bioresource Technology,87, 167–198.

Lemes, A. C., Sala, L., Ores, J. C., Braga, A. R. C., Egea, M. B., &Fernandes,

K. F. A. (2016).Review of the Latest Advances in Encrypted Bioactive Peptides from Protein-Rich Waste.International Journal of Molecular Sciences,17, 950-

962.

Li, W., Tailhades, J., O’Brien-Simpson, N. M., Separovic, F., Otvos, L., Hossain,

M. A., &Wade, J. D. (2014).Proline-rich antimicrobial peptides: potential therapeutics against antibiotic-resistant bacteria. Amino acids, 46, 2287-2294.

140

Lobley, A., Sadowski, M., I., & Jones, D., T. (2009) pGenTHREADER and pDomTHREADER: New Methods For Improved Protein Fold Recognition and

Superfamily Discrimination. Bioinformatics.25, 1761-1767.

Lopes, J., Damasceno, J. L., Oliveira, P. F., Guedes, A. P., Tavares, D. C.,

Deflon, V. M., Lopes, N. P., &Von Poelhsitz, G. (2015).Ruthenium (II)

Complexes containing anti-inflammatory drugs as ligands: synthesis, characterization and in vitro cytotoxicity activities on cancer cell lines. Journal of the Brazilian Chemical Society, 26, 1838-1847.

Luna-Vital, D. A., Mojica, L., González de Mejía, E., Mendoza, S.,&Loarca-Piña,

G. (2015).Biological potential of protein hydrolysates and peptides from common bean (Phaseolusangularis L.): A review.Food Research International,

76, 39–50.

Morel, C., Stermitz, F. R., Tegos, G., &Lewis, K. (2003).Isoflavones as potentiators of antibacterial activity. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 51, 5677-5679.

Najafian, L.,&Babji, A.S. (2015).Isolation, purification and identification of three novel antioxidative peptides from patin (Pangasiussutchi) myofibrillar protein hydrolysates.LWT-Food Science and Technology,60, 452–461.

Natarajan, S. S., Xu, C., Bae, H., Caperna, T. J.,&Garrett, W. M. (2006).

Characterization of storage proteins in wild (Glycine soja) and cultivated

141

(Glycine max) soybean seeds using proteomic analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 3114-3120.

Negi, P. S. (2012). Plant extracts for the control of bacterial growth: Efficacy, stability and safety issues for food application. International Journal of Food

Microbiology, 156, 7-17.

Nunes, R. S. C., de Souza, C. P., Pereira, K. S., Del Aguila, E. M., Paschoalin,

V. M. F. (2016). Identification and molecular phylogeny of coagulase-negative staphylococci isolates from Minas Frescal cheese in southeastern Brazil:

Superantigenic toxin production and antibiotic resistance. Journal of Dairy

Science, 99, 2641-2653.

Osman, A. O., Mahgoub, S. A., &Sitohy, M. Z. (2013).Preservative action of

11S (glycinin) and 7S (β-conglycinin) soy globulin on bovine raw milk stored either at 4 or 25 °C.Journal of Dairy Research, 80, 174–183.

Peña-Ramos, E. A., &Xiong, Y. L. (2002). Antioxidant activity of soy protein hydrolysates in a liposomal system.Journal of Food Science, 67, 2952–2956.

Pinhati, F. R., Del Aguila, E. M., Tôrres, A. P. R., Sousa, M. P. D., Santiago, V.

M. J., Silva, J. T., &Paschoalin, V. M. F. (2014). Evaluation of the efficiency of deterioration of aromatic hydrocarbons by bacteria from wastewater treatment plant of oil refinery. Química Nova, 37, 1269-1274.

142

Prabhu, S., Dennison, S. R., Lea, B., Snape, T. J., Nicholl, I. D., Radecka, I.,

&Harris, F. (2013).Anionic antimicrobial and anticancer peptides from plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 32, 303-320.

Prabhu, S., Dennison, S. R., Mura, M., Lea, R. W., Snape, T. J.,&Harris, F.

(2014). Cn‐AMP2 from green coconut water is an anionic anticancer peptide. Journal of Peptide Science, 20, 909-915.

Pushpanathan, M., Gunasekaran, P., &Rajendhran, J. (2013).Antimicrobial peptides: versatile biological properties. International Journal of

Peptides, 2013, 1-16.

Rayaprolu, S.J., Hettiarachchy, N. S., Chen, P., Kannan, A.,&Mauromostakos,

A. (2013). Peptides derived from high oleic acid soybean meals inhibit colon, liver and lung cancer cell growth. Food Research International,50, 282–288.

Sánchez, A., & Vázquez, A. (2017).Bioactive peptides: A review.Food Quality and Safety, 1, 29-46.

Santiago, L. G., Maldonado-Valderrama, J., Martín-Molina, A., Haro-Pérez, C.,

García-Martínez, J., Martín-Rodríguez, A., &Gálvez-Ruiz, M. J.

(2008).Adsorption of soy protein isolate at air–water and oil–water interfaces.

Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 323, 155–

162.

143

Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., Lopez, R.,

McWilliam, H., Remmert, M., Söding J., Thompson, J. D., & Higgins, D. G.

(2011). Fast, scalable generation of high‐quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular systems biology, 7, 539.

Singh, A., Meena, M., Kumar a, D., Dubey, A. K., & Hassan, I. (2015).Structural and Functional Analysis of Various Globulin Proteins from Soy Seed.Critical reviews in food science and nutrition,55, 1491-502.

Scientific, T. Pierce BCA protein assay kit. Pierce BCA 449 Protein Assay

Kit.(2018). https://assets.thermofisher.com/TFS-

Assets/LSG/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf/

Accessed 16 September 2018.

Shagaghi, N., Palombo, E. A., Clayton, A. H., &Bhave, M. (2018).Antimicrobial peptides: biochemical determinants of activity and biophysical techniques of elucidating their functionality. World Journal of Microbiology &

Biotechnology, 34, 1-13.

Singleton, V. L., Orthofer, R., &Lamuela-Raventós, R. M. (1999).Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-

Ciocalteau reagent. Methods of Enzymology (p.p 152-178). New York, NY.

Sirohi, J., & Mahadik, R. (2012). Harvesting wind energy using a galloping piezoelectric beam. Journal of vibration and acoustics, 134, 1-8.

144

Sitohy, M. Z., Mahgoub, S. A., &Osman, A. O. (2012).In vitro and in situ antimicrobial action and mechanism of glycinin and its basic subunit. International Journal of Food Microbiology, 154, 19-29.

Stupp, R., Mason, W. P., Van Den Bent, M. J., Weller, M., Fisher, B., Taphoorn,

M. J.,&Curschmann, J. (2005).Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma, New England Journal of Medicine, 352, 987–

996.

Thomas, S., Karnik, S., Barai, R. S., Jayaraman, V. K., &Idicula-Thomas, S.

(2009).CAMP: a useful resource for research on antimicrobial peptides. Nucleic

Acids Research,38, D774-D780.

Tam, J. P., Wang, S., Wong, K. H., &Tan, W. L. (2015).Antimicrobial peptides from plants. Pharmaceuticals,8, 711-757.

Torrent, M., Di Tommaso, P., Pulido, D., Nogués, M. V., Notredame, C., Boix,

E., &Andreu, D. (2011).AMPA: an automated web server for prediction of protein antimicrobial regions. Bioinformatics, 28, 130-131.

Vasconcellos, F. C. S., Woiciechowski, A. L.,Soccol, V. T., Mantovani, D.,

&Soccol, C. R. (2014). Antimicrobial and antioxidant properties of-conglycinin and glycinin from soy protein isolate. International Journal of Current

Microbiology and Applied Sciences, 3, 144-157.

145

Waghu, F. H., Barai, R. S., Gurung, P., &Idicula-Thomas, S. (2015).CAMPR3: a database on sequences, structures and signatures of antimicrobial peptides. Nucleic Acids Research, 44, 1094-1097.

Wang, T., Qin, G. X., Sun, Z. W., &Zhao, Y. (2014).Advances of research on glycinin and β-conglycinin: a review of two major soybean allergenic proteins. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 54, 850-862.

Webb, B., &Sali, A. (2014).Comparative protein structure modeling using

MODELLER. Currentprotocols in bioinformatics, 47, 5-6.

Yang, J., Yan, R., Roy, A., Xu, D., Poisson, J., & Zhang, Y. (2015).The I-

TASSER Suite: protein structure and function prediction. Nature methods, 12,

7-8.

Yang, R.Y.; Zhang, Z.F.; Pei, X.R.; Han, X.L.; Wang, J.B.; Wang, L.L.; Long, Z.;

&Shen, X.Y.; Li, Y. (2009). Immunomodulatory effects of marine oligopeptide preparation from Chum Salmon (Oncorhynchus keta) in mice. Food Chemistry,

113, 464–470.

Xiang, N., Lyu, Y., Zhu, X., Bhunia, A. K., &Narsimhan, G. (2017).Effect of physicochemical properties of peptides from soy protein on their antimicrobial activity. Peptides,94, 10-18.

146

Zimmermann, L., Stephens, A., Nam, S. Z., Rau, D., Kübler, J., Lozajic, M.,

Gabler, F., Söding, J., Lupas, A. N., Alva, V. (2018).A completely

Reimplemented MPI bioinformatics toolkit with a new HHpred server at its

Core. Journal of molecular biology, 430, 2237-2243.

Zhu, K.-X., Wang, X.-P.,&Guo, X.-N.(2015). Isolation and characterization of zinc-chelating peptides from wheat germ protein hydrolysates.Journal of

Functional Foods, 12, 23–32.

147

Suplementary file

Table S1. Peptide sequences identified in F1 and F2 by nano-LC-MS/MS

Theo. Peptidesequences F1 F2 Origin MH+ [Da] GEIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 4872.43 x F7J075 F7J075, Q948X9, FPFPRPP 857.47 x Q3V5S6 DEEQDERQFPFPRPP 1886.87 x x F7J075, Q948X9 EDEQPRPIPFP 1324.65 x x F7J075, Q948X9 EDEDEEQDERQFPFPRPP 2259.98 x x F7J075 F7J075, Q948X9, EEQDERQFPFPRPP 1771.84 x x Q3V5S6 F7J075, Q948X9, DEDEEQDERQFPFPRPP 2130.94 x x Q3V5S6 EDEDEQPRPIPFP 1568.72 x x F7J075, Q948X9 EEDEDEQPRPIPFP 1697.77 x x F7J075, Q948X9 DEQPRPIPFP 1195.61 x x F7J075, Q948X9 F7J075, Q948X9, EDEEQDERQFPFPRPP 2015.91 x x Q3V5S6 EDEDEDEEQDERQFPFPRPP 2504.05 x F7J075 DEDEDEEQDERQFPFPRPP 2375.01 x x F7J075, Q3V5S6 F7J075, Q948X9, DEEQDERQFPFP 1536.66 x x Q3V5S6 EDEDEDEEQDERQFPFP 2153.84 x F7J075 DEDEDEEQDERQFPFP 2024.80 x x F7J075, Q3V5S6 DEDEEQDERQFPFP 1780.73 x x F7J075, Q948X9 EQDERQFPFPRPP 1642.80 x x F7J075, Q948X9 DERQFPFPRPP 1385.70 x x F7J075, Q948X9 PGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2587.24 x x F7J075 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 3588.71 x F7J075 REPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 3225.56 x x F7J075 EREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 3354.60 x x F7J075, Q94LX2 PEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 3451.65 x x F7J075, Q94LX2 QPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2715.30 x F7J075 GEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2490.19 x x F7J075 Q948X9, Q94LX2, EKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2433.17 x x F7J075 EPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 3069.45 x x F7J075, Q94LX2 PQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2940.41 x x F7J075 Q948X9, Q94LX2, EDEQPRPIPFPRPQP 1802.92 x x F7J075 DEQPRPIPFPRPQP 1673.88 x x F7J075 EEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 2898.21 x F7J075 DEDEQPRPIPFPRPQP 1917.95 x x F7J075 DEEQDERQFPFPRPPHQ 2151.98 x F7J075, Q948X9 148

EDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 2769.17 x x F7J075, Q3V5S6 EDEDEQPRPIPFPRPQP 2046.99 x x F7J075, Q3V5S6 EEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 3027.25 x F7J075 SEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 3114.28 x F7J075 DEDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 2640.12 x x F7J075, Q3V5S6 DEDEDEEQDERQFPFPRPPH 2512.06 x F7J075 DEDEQPRPIPFPRP 1692.83 x x F7J075, Q948X9 EHPRPHQPHDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 3511.59 x Q948X9 EEGQIPRPRPQHPERE 1954.98 x Q4LER6 EEGQIPRPRPQHPERERQ 2239.14 x Q4LER6 EEGQIPRPRPQHPE 1669.84 x Q4LER6 EEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQE 2702.27 x Q4LER6 HGEKEEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQE 3153.49 x Q4LER6 KEEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQEEEH 3225.51 x Q4LER6 HPRPHQPHQKEE 1519.75 x x Q4LER6 EKHEWQHKQEKH 1643.80 x x Q4LER6 IPRPRPQHPERERQQ 1924.04 x Q4LER6 DEREHPRPHQPHQKE 1919.92 x x Q4LER6 EQDEREHPRPHQPHQKEEEKH 2700.26 x Q4LER6 DEREHPRPHQPHQKEEEKH 2443.16 x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKE 3215.50 x x Q4LER6 EREHPRPHQPHQKEE 1933.94 x x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQK 3086.45 x Q4LER6 DEREHPRPHQPHQK 1790.88 x x Q4LER6 EQDEREHPRPHQPHQKE 2177.02 x Q4LER6 GGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKE 2821.30 x x Q4LER6 GGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKEE 2950.34 x x Q4LER6 GSEEEQDEREHPRPHQPHQKE 2579.16 x x Q4LER6 GSEEEQDEREHPRPHQPHQKEE 2708.20 x x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPH 2468.13 x Q4LER6 REHPRPHQPHQKE 1675.85 x x Q4LER6 EEHEQKEEHE 1323.54 x Q4LER6 REHPRPHQPHQK 1546.81 x Q4LER6 EEHEWHRKEEKH 1673.78 x Q4LER6 IPRPRPQHPERE 1511.82 x Q4LER6 REHPRPHQPHQKEEEKH 2199.09 x x Q4LER6 REHPRPHQPHQKEE 1804.89 x x Q4LER6 EEHEWHRKEEKHGGK 1915.92 x Q4LER6 HPRPHQPHQKE 1390.71 x Q4LER6 EEGQIPRPRPQHPERERQQHGE 2690.33 x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKEEEKH 3738.74 x x Q4LER6 IPRPRPQHPERERQ 1795.98 x Q4LER6 ERQQHGEKEEDEGEQPRPFPFPRPRQPHQEE 3823.79 x Q4LER6

149

EEQDEREHPRPHQPHQKEEEKH 2829.30 x Q4LER6 EDEGEQPRPFPFPRP 1797.86 x x Q4LER6 EEDEGEQPRPFPFPRP 1926.90 x x Q4LER6 DEGEQPRPFPFPRP 1668.81 x x Q4LER6 GEQPRPFPFP 1171.59 x Q4LER6 EGEQPRPFPFP 1300.63 x x Q4LER6 EEDEGEQPRPFPFP 1673.74 x x Q4LER6 EDEGEQPRPFPFP 1544.70 x x Q4LER6 DEGEQPRPFPFP 1415.66 x x Q4LER6 GEQPRPFPFPRP 1424.74 x x Q4LER6 EGEQPRPFPFPRPRQP 1935.00 x Q4LER6 DEGEQPRPFPFPRPRQP 2050.03 x x Q4LER6 EGEQPRPFPFPRP 1553.79 x x Q4LER6 RKEEKRGEKGSEEED 1805.86 x Q94LX2 EEGEIPRPRPRPQHPEREPQ 2434.23 x Q94LX2, Q948X9 EIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEEDE 3160.55 x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPRP 2656.19 x x Q94LX2, Q948X9 EEGEIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEED 3346.62 x Q94LX2, Q948X9 EEGEIPRPRPRPQHPE 1923.98 x Q94LX2, Q948X9 GEIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEED 3088.53 x Q94LX2, Q948X9 EEQEWPRKEEKRG 1700.84 x x Q94LX2, Q948X9 PRPIPFPRPQP 1301.75 x x Q94LX2, Q948X9 EEQEWPRKEEKR 1643.81 x x Q94LX2, Q948X9 EIPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEE 2916.48 x Q94LX2, Q948X9 EREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 3767.80 x Q94LX2 EREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPR 3510.70 x Q94LX2 KEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 2717.33 x Q94LX2 GEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 2903.39 x Q94LX2 EPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 3482.66 x Q94LX2 DEDEQPRPIPFPRPQPRQEEEH 2726.29 x Q94LX2 FPFPRPPHQK 1250.68 x Q94LX2, Q948X9 EKRGEKGSEEEDEDEDEEQ 3899.69 x x Q94LX2 DERQFPFPRPPHQKE 1907.95 x Q94LX2, Q948X9 EEKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQKE 4284.88 x Q94LX2 PQHPEREPQQPGEKEEDEDEQPR 2784.25 x x Q94LX2, Q948X9 EEDEDEQPRPIPFPRPQPRQEEEHEQR 3397.58 x Q94LX2 EKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQKE 4155.84 x Q94LX2 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 4001.91 x Q94LX2 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPR 3744.81 x Q94LX2 EKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQFPFPRPPHQK 4026.80 x Q94LX2 DEDEQPRPIPFPRPQPRQEEEHEQR 3139.49 x Q94LX2 EKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQ 2795.14 x x Q94LX2 RPRPQHPEREPQQPGEKEEDE 2568.22 x x Q94LX2, Q948X9

150

HPEREPQQPGEKEED 1804.81 x x Q94LX2, Q948X9 RPQHPEREPQQPGEKEE 2071.00 x x Q94LX2, Q948X9 IPRPRPRPQHPEREPQQPGEKEE 2787.44 x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGEKEE 1689.78 x x Q94LX2, Q948X9 RPRPQHPEREPQQPGEKEED 2439.18 x x Q94LX2, Q948X9 Q94LX2, Q948X9, RPRPQHPEREPQQPGEKEE 2324.15 x x F7J075 EEKRGEKGSEEEDEDEDEEQDERQ 2924.18 x x Q94LX2 PQHPEREPQQPGEKEEDE 2158.96 x x Q94LX2, Q948X9 PEREPQQPGEKEED 1667.75 x x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGEKEEDEDE 2177.92 x x Q94LX2, Q948X9 PQHPEREPQQPGEKEEDED 2273.99 x x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGEKEEDE 1933.85 x x Q94LX2, Q948X9 ERKQEEDEDEEQQRESEESED 2653.06 x Q94LX2 PRKEEKRGEKGSEEEDE 2031.96 x Q94LX2 PRPQHPEREPQQPGEKEEDED 2527.14 x Q94LX2, Q948X9 PQHPEREPQQPGEKEED 2029.92 x x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGE 1303.60 x x Q94LX2, Q948X9 REPQQPGEKEEDE 1570.70 x x Q94LX2, Q948X9 PRPQHPEREPQQPGEKEED 2283.07 x Q94LX2, Q948X9 QPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPQPRQ 2999.46 x Q94LX2 EEGEIPRPRPRPQHPEREPQQPGE 2845.41 x Q94LX2, Q948X9 GEIPRPRPRPQHPEREPQ 2176.15 x Q94LX2, Q948X9 EEQEWPRKEEKRGEKGSE 2231.07 x x Q94LX2, Q948X9 PQHPEREPQQPGEKE 1785.85 x Q94LX2, Q948X9 RPRPQHPEREPQQPGEKEEDED 2683.25 x Q94LX2, Q948X9 QHPEREPQQPGEKEE 1817.84 x Q94LX2, Q948X9 GEIPRPRPRPQHPEREPQQPG 2458.28 x Q94LX2, Q948X9 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPRQP 3744.81 x Q948X9 EREPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPRQP 3510.70 x Q948X9 EPQQPGEKEEDEDEQPRPIPFPRPRQP 3225.56 x Q948X9 DEEEDQPRPDHPPQRPS 2028.90 x x P93707 EEEDQPRPDHPPQRP 1826.84 x P93707 EDEEEDQPRPDHPPQRPS 2157.94 x x P93707 EEEDQPRPDHPPQRPSRPE 2296.07 x P93707 EDQPRPDHPPQRPS 1655.79 x x P93707 EEEDQPRPDHPPQRPS 1913.87 x x P93707 EEDQPRPDHPPQRPS 1784.83 x x P93707 EEDQPRPDHPPQRPSRPE 2167.03 x P93707 EDEDEEEDQPRPDHPPQRPS 2402.01 x x P93707 DEDEDEEEDQPRPDHPPQRPS 2517.04 x x P93707 DEDEDEEEDQPRPDHPPQRPSRPE 2899.24 x P93707 DDEDEDEEEDQPRPDHPPQRPS 2632.07 x P93707 RPSHGKHEDDEDEDEEEDQPRPDHPPQRPS 3560.53 x x P93707

151

DQPRPDHPPQRPS 1526.75 x x P93707 QPRPDHPPQRPS 1411.72 x x P93707 DQPRPDHPPQRPSRPE 1908.94 x P93707 EDQPRPDHPPQRPSRPE 2037.98 x P93707 KIKETVVGKDDDDDDDHGDGHGGLKDD 2895.29 x I1M222 KIKETVVGKDDDDDDDHGDGHGGLK 2665.23 x x I1M222 ERTKEKTEEVAASAGE 1734.85 x x I1M222 DTKESAKDAAGTVAD 1478.70 x x I1M222 KIKETVVGKDDDDDDDHGD 2115.93 x I1M222 DTKESAKDAAGTVA 1363.67 x I1M222 SAKDAAGTVADKSREGA 1633.81 x I1M222 NEGYDRAKDQARE 1551.71 x I1M222 EEEEREREHPQPHPPHEERG 2504.13 x x A0A0R0HYM3 EEEREREHPQPHPPHEERG 2375.09 x x A0A0R0HYM3 EEREREHPQPHPPHEERG 2246.04 x A0A0R0HYM3 EEREREHPQPHPPHE 1903.88 x A0A0R0HYM3 GEQQHEEEEREREHPQPHPPHE 2741.20 x A0A0R0HYM3 RRERGRQEGEKEEKEQDER 2444.20 x A0A0R0HYM3 GREKDVTKEGGVEE 1532.76 x A0A0R0JWF4 ETKVEAKGREKDVTKEGGVEEQG 2503.26 x A0A0R0JWF4 GREKDVTKEGGVEEQG 1717.84 x x A0A0R0JWF4 GREKDVTKEGGVEEQGRGRKE 2344.20 x x A0A0R0JWF4 GREKDVTKEGGVEEQ 1660.81 x A0A0R0JWF4 GREKDVTKEGGVE 1403.71 x A0A0R0JWF4 DEQIPSHPPRRPSHG 1709.85 x Q9SB11 DEDEDEDEDKPRPSRPS 2015.84 x x Q9SB11 DEDEDEDKPRPSRPSQGK 2084.95 x x Q9SB11 DEDEDEDEDKPRPSRPSQGK 2329.02 x x Q9SB11 DEDEDKPRPSRPS 1527.70 x Q9SB11 AEYVGQKTKEVG 1308.68 x I1N747 AAEYVGQKTKEVGQ 1507.78 x I1N747 EVGQKTKEVGQDIQS 1645.84 x I1N747 KIEEKLPGGEEGEGKEHAH 2074.02 x I1M0W1 EEKLPGGEEGEGKEHAH 1832.84 x x I1M0W1 EKLPGGEEGEGKEHAH 1703.80 x x I1M0W1 EEHAGRGHERRKEEEETAR 2306.10 x I1LHP6 GRGHERRKEEEETAR 1839.92 x I1LHP6 GRGHERRKEEEETARR 1996.02 x x I1LHP6 DGPVDKDAIKPK 1282.70 x I1K7E6 KGQPEKPTKPPASESQ 1708.89 x x I1K7E6 EELDEKARQGE 1303.61 x A0A0R0FBK4 QGETVVPGGTGGK 1186.61 x A0A0R0FBK4 GAHQTSAMPGHGTGQPTGHVTE 2173.97 x Q541U1

152

SAMPGHGTGQPTGH 1334.59 x Q541U1 TVTVPKEEDKKPQ 1498.81 x C6T1V2 TVTVPKEEDKKPQVK 1725.97 x C6T1V2 KSPDPTPAKGPDPTPGKPMS 2005.01 x C6SWV3 KSPDPTPAKGPDPTPGKPM 1917.97 x C6SWV3 AYGVDTGRQHSS 1277.59 x K7LEQ5 KIKEKLPGGHSDK 1436.82 x K7LEQ5; Q42447 DKIKEKLPGGHSDK 1551.85 x x K7LEQ5; Q42447 AGYRKEHRQHDQSH 1748.83 x K7LEQ5 TADTGTGPRSGNTGGTGY 1669.74 x Q42447 SGKTEETKEKVSETA 1623.81 x I1L957 SGKTEETKEKVSETAE 1752.85 x I1L957 EAEPVLQKPPEQPVVTKE 2018.08 x I1K1B0 EDSPYVKYK 1128.56 x Q9S7N8 QDQDAAAAAAQPEEEEEVDETGVEPHDIDLVMTQAG 3808.66 x I1JYG6 DVKKGGEEDDEEENKKPTL 2160.03 x I1KV72 IAKNLQGENEGEDKG 1601.78 x A0A0R0KKD6 SAGEKVKKPF 1090.63 x C6K8D1 TEKLAPVSGKDA 1215.66 x K7MID0 PLPKPPDTLPPRPPDTLPPHPPGP 2530.38 x K7K5Q8 VPKTEPPPPVPKEQPVLPTP 2147.21 x K7K5Q8 PLPKPPDTLPPRPPDTLPPHPPGPD 2645.41 x K7K5Q8 LAPVEPEPPLAEAPPLE 1768.94 x I1JKB3 LAPVEPEPPLAEAPPL 1639.89 x I1JKB3 DQHIPDDHDLGEEDEVDEYPEVH 2732.12 x K7LDT9 EEAIDIDESKF 1295.60 x A0A0R0LAD9 MDTTNSSTPRPQP 1431.65 x I1MUI0 SVVEDLPEGPAV 1211.62 x x Q39898 FSRAFPFPPR 1221.65 x K7N2A2 TVPAPAPVDPEPPLA 1470.78 x I1KID4 EEGEIPRPRPRPQHPEREP 2306.17 x F7J075 EEKRGEKGSEEEDEDEDEEQ 2395.95 x x F7J075 EIPRPRPRPQHPEREPQ 2119.13 x F7J075 HPEREPQQPGEK 1431.70 x F7J075 HPEREPQQPGEKEEDED 2048.88 x F7J075 HPEREPQQPGEKEEDEDEQPR 2559.13 x F7J075 IPRPRPRPQHPEREPQ 1990.08 x F7J075 PQHPEREPQQPGEKEE 1914.89 x F7J075 PRKEEKRGEKGSEEED 1902.92 x F7J075 PRPQHPEREPQQPGEKEEDE 2412.12 x F7J075 REPQQPGEKE 1197.59 x F7J075 REPQQPGEKEEDED 1685.72 x F7J075 REPQQPGEKEEDEDEQPR 2195.98 x F7J075

153

RPQHPEREPQQPGEKEEDE 2315.06 x F7J075 DEDEQPRPIPFP 1439.68 x F7J075 DEQPRPIPFPRP 1448.76 x F7J075 EDEDEEQDERQFPFP 1909.77 x F7J075, Q3V5S6 EDEDEEQDERQFPFPRPPHQ 2525.10 x F7J075, Q3V5S6 EDEEQDERQFPFP 1665.70 x F7J075 EEDEDEQPRPIPFPRP 1950.92 x F7J075 EEDEDEQPRPIPFPRPQP 2176.03 x F7J075 EEDEDEQPRPIPFPRPQPRQE 2589.23 x F7J075 KEEDEDEQPRPIPFPRPQP 2304.13 x F7J075 DEDEQPRPFPFPRPQP 1951.93 x Q3V5S6 EEDEDEQPRPFPFPRPQP 2210.01 x Q3V5S6 DEREHPRPHQP 1397.67 x Q4LER6 EEKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKEE 3473.58 x Q4LER6 EEQDEREHPRPHQPHQKEE 2435.11 x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPH 2830.30 x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQ 2958.36 x Q4LER6 EKHGGKGSEEEQDEREHPRPHQPHQKEE 3344.54 x Q4LER6 EQDEREHPRPHQP 1654.77 x Q4LER6 EQDEREHPRPHQPHQKEE 2306.07 x Q4LER6 GGKGSEEEQDEREHPRP 1936.87 x Q4LER6 GSEEEQDEREHPRPHQPH 2193.97 x Q4LER6 HGEKEEDEGEQPRP 1636.72 x Q4LER6 REHPRPHQPHQ 1418.71 x Q4LER6 DEGEQPRPFPFPRPRQPH 2187.08 x Q4LER6 EEDEGEQPRPFPFPRPRQP 2308.11 x Q4LER6 KEEDEGEQPRPFPFP 1801.84 x Q4LER6 KEEDEGEQPRPFPFPRP 2054.99 x Q4LER6 DEEEDQPRPDHPPQRP 1941.87 x P93707 DQPRPDHPPQRP 1439.71 x P93707 PRPDHPPQRP 1196.63 x P93707 RPEQQEPRG 1096.55 x P93707 DEDEDEDKPRPSRP 1684.74 x Q9SB11 DEDEDEDKPRPSRPS 1771.77 x Q9SB11 DEDEDKPRPSRP 1440.67 x Q9SB11 EDEDEDEDKPRPSRPS 1900.82 x Q9SB11 EDEDEDEDKPRPSRPSQGK 2213.99 x Q9SB11 EDEDEDKPRPSRP 1569.71 x Q9SB11 EDKPRPSRPSQGKREQDQDQDEDEDEDEDQP 3697.57 x Q9SB11 EQIPSHPPRRPSHGK 1722.91 x Q9SB11 EEEEEGGSVLSGF 1368.58 x Q9SB11 EEEREREHPQPHPP 1766.82 x A0A0R0HYM3 EEREREHPQPHPP 1637.78 x A0A0R0HYM3

154

GEQQHEEEEREREHPQPHPPHEE 2870.25 x A0A0R0HYM3 GEQQHEEEEREREHPQPHPPHEERG 3083.37 x A0A0R0HYM3 KGQPEKPTKPP 1206.68 x I1K7E6 SAHNMPKSGQTTMDSNTSD 2024.83 x Q9XES8 EGGKIADSQPVDLFS 1562.77 x Q9XES8 TADTGTGPRSG 1019.48 x K7LEQ5 AMPGHGTGQPTGH 1263.55 x Q541U1 SHPIGTNRGPGGTATAH 1630.80 x Q541U1 KAGEYKDYTAEK 1402.68 x Q9ZTY1 EKSKRILRGLKTLFFLITMVISLLL 2932.81 x I1LMQ8 SVVEDLPEGPAVKIGE 1638.86 x Q39898 SVVEDLPEGPAVKIGEN 1752.90 x Q39898 DVGRFDEEEGVVNV 1563.73 x I1L957 AIGVYPGIDIGRDHETT 1813.91 x Q42447 SNAPAPSIEDPGHFPSLGGK 1977.97 x I1JMQ3 MITLVAA 718.42 x I1M5Y9 Peptides were screened from an initial list of >19,000 sequences by establishing a cutoff value of -15 to 15 ppm and considering peptides present in two replicates at least. Sequences shaded in orange represents the best AMP candidates according to the four algorithms evaluation shown in table 3.

Table S2. Identity and similarity between F7J075 and the four best hits from blastP versus Uniprot database.

Identity (%)/Similarity (%) F7J075 P11827 P13916 Q4LER6 Q3V5S6

F7J075 100/100 78/83 99/99 81/86 99/99

P11827 100/100 77/83 96/96 77/83

P13916 100/100 80/86 99/99

Q4LER6 100/100 81/86

Q3V5S6 100/100

155

Fig. S1. Schematic representation of peptides encrypted in F7J075 (right-hand panel) and Q3V5S6 (Left-hand panel).

156

Discussão geral

157

Produtos naturais, como extratos de plantas, seja na forma de compostos purificados ou como extratos brutos, oferecem possibilidades ilimitadas para o controle do crescimento microbiano devido à sua diversidade química (Negi, 2012). No presente trabalho, o extrato preparado com o farelo de soja mostrou uma potente atividade antimicrobiana. Soares, em 2013, relatou que o hidrolisado do extrato protéico do farelo de soja, obtido com papaína, não apresentou atividade antimicrobiana significativa contra a bactéria E. coli e bactérias Gram-negativas. Entretanto, em nosso estudo, o extrato aquoso do farelo de soja apresentou atividade antimicrobiana contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, sendo elas, S. coagulase negative, A. genomospecie 3, E. coli, A. hydrophila, P. fluorencens. Essa atividade está relacionada com a presença de compostos bioativos presentes no extrato, incluindo compostos fenólicos e peptídeos bioativos. Como mostrado, a metodologia utilizada neste estudo resultou em um extrato bruto livre de solvente orgânico e rico em compostos bioativos. Mostrando também que, o farelo de soja, um co-produto industrial de baixo custo, pode ser utilizado como fonte de compostos com atividade antimicrobiana. Os extratos de plantas, frutas, vegetais, cereais, entre outros extratos vegetais, vem gerando cada vez mais interesse à indústria de alimentos, devido às suas propriedades bioativas, se usados como aditivos alimentares podem retardar a degradação, melhorar a qualidade e/ou aumentar o valor nutricional dos alimentos (Wojdyło et al 2007). Assim, estes extratos além de serem usados como aditivos alimentares podem, muitas vezes, serem consideradosalimentos funcionais.

Dentre os compostos fenólicos presentes no extrato aquoso do farelo de soja doze são as isoflavonas. Esses compostos são de grande interesse, visto que, tais moléculas são reconhecidas como fitoestrogênios e sua recuperação partir de um co-produto agroindustrial, como o farelo de soja, é valioso. O extrato aquoso apresentou teores elevados de isoflavonas glicosiladas, corroborando com os resultados de Xiao et al. (2011), Flachowsky et al. (2011) realizaram uma extração com 80% de metanol (v/v) e extraíram oito das doze isoflavonas presentes no farelo de soja, porém, em nosso estudo, foi feito uma extração aquosa, sem adição de solventes orgânicos, que foi capaz de 158

extrairas doze isoflavonas que estão presentes no farelo de soja. O método de extração e as condições de extração podem influenciar a quantidade de compostos extraídos, e neste caso a extração foi eficiente.

Após o ensaio de digestibilidade, observou-se que os teores de isoflavonas foram diminuindo a cada etapa da digestão, entretanto, após a etapa de fermentação colônica realizada no período de 48h de fermentação, observou- se um aumento nos teores de agliconas, fenômeno originado pelo processo de fermentação, mas que também pode ser resultante de tratamento térmico, ou hidrólise química, ou enzimática, que causam mudanças na composição do perfil de isoflavonas. Esta modificação nas moléculas das isoflavonas facilita sua absorção, pois as agliconas são facilmente absorvidas, enquanto as formas glicosídicas precisam ser transformadas em agliconaspara então serem absorvidas (da Silva et al., 2012).

Nos últimos anos, muitos estudos vêm demonstrando a importância dos compostos fenólicos e suas propriedades biológicas, na dieta e na saúde humana. Além disso, o uso de chás, extratos vegetais ou óleos essenciais como conservantes naturais de alimentos, têm sido cuidadosamente investigados, resultando no aprimoramento da qualidade e/ou segurança de vários produtos perecíveis. Um grande número de plantas e seus extratos vêm sendo testados quanto ás suas atividades antioxidantes e antimicrobianas, sempre in vitro, e tais atividades vem sendo relacionadasà presença de compostos fenólicos (Koutelidakis et al., 2016).

Além das isoflavonas, outros dezesseis compostos fenólicos foram identificados no extrato do farelo de soja, sendo seis deles derivados do ácido hidroxibenzoico, quatro derivados do ácido hydroxycinnamico e seis flavonas e flavonóis. Os dezesseis compostos foram identificados na fração solúvel, enquanto que na fração insolúvel (após a hidrólise alcalina e ácida) foram identificados os compostos naringina, ácido hidroxibenzóico, ácido gálico, ácido vanílico e ácido siringico. Ao que tudo indica, as extrações ácida e alcalina facilitaram a liberação dos compostos que estavam ligados à matriz ou a outras moléculas, permitindo assim a sua identificação. Outros autores já relataram 159

que os compostos fenólicos solúveis são predominantes em frutas e vegetais e é importante destacar que os compostos fenólicos solúveis são mais biodisponíveis no organismo humano (Acosta-Estrada et al., 2014; Serna- Saldívar, 2014) e, portanto, de maior relevânciapara benefícios à saúde humana..

Além da atividade antimicrobiana, tais compostos também podem apresentar uma capacidade antioxidante. Os compostos antioxidantes tem efeito na saúde humana por proteger o organismo contra diversos tipos de doenças degenerativas (Baião et al., 2017). Adicionalmente, os antioxidantes exercem um papel essencial na conservação de alimentos, retardando a deterioração induzida pela oxidação dos componentes da matriz alimentar (Jiang et al., 2014). Antioxidantes sintéticos tem sido muito utilizados na preservação de produtos alimentícios, no entanto, seu uso é estritamente regulado devido aos efeitos cancerígenos já descritos em animais (Shahidi & Zhong, 2010). Assim, a busca por antioxidantes naturais tem se intensificado cada vez mais.A avaliação da capacidade antioxidante do extrato aquoso do farelo de soja, utilizando diferentes métodos (TAP, FRAP, TEAC e ORAC), mostrou que os compostos antioxidanetes presentes neste subproduto agroindustrialmantiveram sua funcionalidade mesmo após o processamento industrial para obtenção do óleo de soja e, continuam aptos a inibir processos de oxidação.

Após o ensaio de inibição da peroxidação lipídica que mostrou que o extrato é capaz de inibir a peroxidação lipídica de maneira semelhante a dois antioxidantes sintéticos -BHA e BHT- e a um antioxidante natural, o α- tocoferolcomumente utilizado pela indústria de alimentos. A peroxidação lipídica é uma das principais causas da deterioração de alimentos, que pode resultar na formação de compostos tóxicos. Na indústria de alimentos são utilizados antioxidantes sintéticos, como aditivos alimentares para preservar a deterioração do alimento. No entanto, o uso de antioxidantes sintéticos tem sido cada vez mais restrito, devido aos seus potenciais riscos para a saúde (Tawaha et al., 2007). Neste sentido, existe uma crescente conscientização dos

160

consumidores em relação à segurança de aditivos alimentares. Atualmente, há um aumento de interesse em fitoquímicos como antioxidantes naturais em alimentos e preparações farmacêuticas em substituição aos sintéticos.

Muitos estudos têm utilizado métodos de digestão simulada in vitro para avaliar mudanças estruturais, bioacessibilidade e digestibilidade de alimentos e seus componentes. Os modelos de digestão simulada in vitro são uma alternativa aos modelos animal e humano. Embora os modelos in vivo proporcionem resultados mais fidedignos, eles requerem mais tempo e apresentam custo elevado (Hur et al., 2011). Após as etapas da digestão simulada foi possível observar que na fase oral não houve uma diferença significativa na atividade antioxidante (em todos os testes realizados), se comparado com a pré digestão. Isso acontece porque maior parte dos compostos fenólicos presentes nos alimentos estão na sua forma conjugada devendo ser hidrolisados para serem absorvidos (Manach et al., 2005). De fato, na fase gástrica, foi possível observar um aumento de atividade antioxidante, em todos os testes realizados. A hidrólise ácida é capaz de liberar compostos fenólicos, uma vez que esses compostos podem formar ligações éter com ligninas por meio dos seus grupos hidroxilas presentes no anel aromático e ligações éster com proteínas e carboidratos estruturais por meio de seu grupo carboxílico. O tratamento ácido rompe principalmente ligações glicosídicas e solubiliza os açúcares (Acosta-Estrada et al., 2014), liberando assim os compostos e aumentando a atividade antioxidante.

Além dos compostos fenólicos, o extrato aquoso de farelo de soja é rico em peptídeos antimicrobianos que, neste caso, foram gerados por hidrólise térmica.Os estudos sobre a utilização de agentes antimicrobianos naturais em alimentos vêm crescendo constantemente. A maioria dos estudos utiliza extratos brutos de vegetais, que geralmente contêm outras substâncias interferentes, como flavonóides na forma glicosídica. As moléculas de açúcar presente nestes compostos diminui a eficácia da atividade contra algumas bactérias, interferindona reprodutibilidade, sendo este um dos principais obstáculos encontrados. Somado a isso, variações qualitativas e quantitativas

161

de fitoquímicos em extratos vegetais podem resultar em preparações sem atividade biológica. A purificação dos compostos bioativos é vantajosa uma vez que elimina os interferentes aumentando a reprodutibilidade e eficácia dos fitoquímicos.

Após a caracterização e avaliação da atividade do extrato aquoso do farelo de soja, foi realizada a purificação dos peptídeos presentes no extrato. O extrato foi preparado em condição branda de temperatura (50° C), o que favorece a atividade enzimática de proteases naturalmente presentes no farelo. Em seguida, a reação enzimática foi finalizada por um tratamento térmico severo (90° C), resultando em um extrato rico em peptídeos. Em geral, os peptídeos envolvidos em sinalização de rotas metabólicas e de ativação dos mecanismos de defesa são originados de precursores maiores (polipeptídeos), que sofrem proteólise, em alguns casos, ou sofrem outras modificações para se tornarem funcionais (Farrokih et al., 2008). As duas frações obtidas por filtração em gel foram capazes de abolir o crescimento de todas as espécies bacterianas testadas, tanto bactérias Gram-negativas quanto Gram-positivas. Os PAMs são considerados produtos naturais de grande diversidade. Estas moléculas representam ferramentas poderosas com diferentes aplicações, como na agroindústria, atuando contra fitopatógenos, e na indústria alimentar, como agentes conservantes. Produtos naturais, tais como extratos de plantas, seja na forma de compostos purificados ou como extratos brutos, oferecem possibilidades ilimitadas para o controle do crescimento microbiano devido à sua diversidade química (Negi, 2012).

Embora o extrato e os peptídeos tenham sido obtidos de matrizes alimentares deve-se sempre considerar possível citotoxicidade, e avaliar a melhordose a ser utilizada. De acordo com a ANVISA (Brasil, 2009), ensaios de citotoxicidade visam determinar a resposta biológica de células de mamíferos in vitro com o uso de parâmetros biológicos apropriados (NBR ISO 10993-5), através da avaliação do dano celular por meios morfológicos e medições destes danos, crescimento celular e aspectos específicos do metabolismo celular.

162

A caracterização de extratosde origem vegetal seguido de purificação de peptídeos, avaliação de seus efeitos citotóxicos e a compreensão dos potenciais benefícios e / ou toxicidade destes para a saúde humana são de fundamental importância para reduzir os possíveis riscos de utilização desses agentes. Os resultados aqui mostrados indicam uma diferença no perfil de citotoxicidade do extrato em diferentes concentrações para as três linhagensutilizadas no estudo. A concentração de 125 mg/mL foi citotóxica para as 3 linhagens celulares testadas, BM, U-87MG e L929, inibindo o crescimento de tais células em 100%. Entretanto, nas demais concentrações, o extrato não apresentou citotoxicidade e até estimulou o crescimento da linhagem L929. Em relação às células damedula óssea de camundongos, tratada com diferentes concentrações do extrato, observou-se a perda da viabilidade quando as células são expostas a altas concentrações dos agentes presentes no extrato, como os compostos fenólicos, que podem ter provocado lesões estruturais e funcionais nas células, tornando-se tóxicos a esta linhagem celular nas concentrações mencionadas (Lopes et al., 2011).

O fracionamento em permeação em gel mostrou que várias frações apresentaram atividade antimicrobiana, sendo que algumas delas continham alta concentração de fenólicos. As frações F1 e F2 apresentaram baixa concentração de fenólicos, 0,1 e 0,2 mg/mL e ainda capazes de abolir o crescimento bacteriano. A ana’lise por nano LC-MS revelou a presença de 308 peptideosnão-redundantes, presentes em pelo menos 2 replicatas e em concentração de cerca de 15 ppm. Estes peptídeos estão distribuídos nas duas frações ea maioria delesestão encriptadosna β-conglicinina seguida pela glicinina, que juntas, respondem a 80% do conteúdo total de proteína de soja (Wang et al., 2014). Uma vez que estas proteinas possuem propriedade antimicrobiana (Vasconcelos et al., 2014; Sitohy et al., 2012), elas seriam potencialmente capazes de originar peptídeos antimicrobianos. De fato, após a análise de cada peptídeo identificado, usando cinco algoritmos para prever seu potencial antimicrobiano, 12 seqüências peptídicas foram selecionadas como as melhores candidatas a PAM, nove delas originadas das subunidades  e - prime da β-conglicinina e outras três de proteínas não caracterizadas. Embora 163

os peptídeos candidatos aqui identificados exibam as propriedades físico- quimicas requeridas por um PAM, à validação experimental é um passo essencial para verificar a sua eficacia. Esses peptídeos compartilham características como a alta freqüência de prolina (P) na maioria das seqüências, carga líquida positiva ou negativa e, em alguns casos, alta proporção de resíduos hidrofóbicos, todas características essenciais exigidas para que os PAMs possar exercer eficientemente sua função.

As propriedades nutricionais e físicos-químicas são fatores determinantes para a aceitação de novos ingredientes protéicos pela indústria de alimentos. Além da melhoria das características nutricionais, vários estudos têm demonstrado a contribuição das proteínas da soja também na melhoria de certas propriedades físico-químicas em sistemas alimentares (Alezandro, 2009). Alem disto, a presença de proteínas e peptídeos bioativos na soja pode beneficiar a saúde humana em vários aspectos, como na prevenção de doenças circulatórias, do diabetes, na proteção contra o câncer, na redução do nível colesterol, na prevenção da obesidade, atuando como imunomoduladores e como antimicrobianos (Wang & Mcjia, 2005). Neste sentido,o interesse comercial para usá-los em alimentos e medicamentos tem se intensificado juntamente com o desenvolvimento de novas tecnologias de valorização de coprodutos agroindustriais visandoa produção destes compostos bioativos em escala industrial.

Conclusões

 Fenólicos e isoflavonas de alta bioacessibilidade foram recuperados do farelo de soja;

 Genistina, daidzina, glicitina e malonilgenistina são as principais isoflavonas;

164

 O extrato aquoso do farelo de soja apresentou atividades antioxidante e antimicrobiana;

 Duas frações ricas em peptídeos foram obtidas do extrato de farelo de soja por filtração em gel;

 Peptídeos presentes nas frações foram capazes de afetar o crescimento de patógenos de origem alimentar e células de glioblastoma humano;

 Doze peptídeos candidatos a antimicrobianos foram identificados por espectrometria de massa;

 Os peptídeos antimicrobianos de ambas as frações estão encriptados principalmente em β-conglicinina;

 A estrutura 3D dos domínios contendo candidatos a AMP foi determinada pela primeira vez.

Perspectivas futuras

 Sintetizar os melhores candidatos a peptídeos antimicrobianos

identificados nas frações;

 Avaliar a atividade antimicrobiana, antitumoral e citotoxicidade dos

peptídeos sintetizados;

 Encapsular os peptídeos em quistosana, para aplicação como aditivo

alimentar;

 Caracterizar os complexos peptídeo-quitosana por microscopia

eletrônica de varredura (MEV), e dynamics light scattering (DLS);

165

 Avaliar a cinética de liberação do peptídeo in vitro em função do tempo,

pH e temperatura;

 Avaliar a citotoxicidade e atividade antimicrobiana dos complexos

peptídeo-quitosana sobre células animais;

 Avaliar a propriedade antitumoral in vitro do peptídeo encapsulado

contra diferentes linhagens de células tumorais.

166

Bibliografia

AGUIAR, Claudio L. et al. Thermal behavior of malonylglucoside isoflavones in soybean flour analyzed by RPHPLC/DAD and eletrospray ionization mass spectrometry. LWT-Food Science and Technology, v. 48, n. 1, p. 114-119, 2012.

ACOSTA-ESTRADA, Beatriz A.; GUTIÉRREZ-URIBE, Janet A.; SERNA- SALDÍVAR, Sergio O. Bound phenolics in foods, a review. Food chemistry, v. 152, p. 46-55, 2014.

AGYEI, Dominic; DANQUAH, Michael K. Rethinking food-derived bioactive peptides for antimicrobial and immunomodulatory activities. Trends in Food Science & Technology, v. 23, n. 2, p. 62-69, 2012.

AGYEI, Dominic. Bioactive proteins and peptides from soybeans. Recent patents on food, nutrition & agriculture, v. 7, n. 2, p. 100-107, 2015.

ALLAKER, Robert P.; KAPAS, Supriya. Adrenomedullin and mucosal defence: interaction between host and microorganism. Regulatory peptides, v. 112, n. 1-3, p. 147-152, 2003.

ALMEIDA, Maria Mozarina Beserra et al. Bioactive compounds and antioxidant activity of fresh exotic fruits from northeastern Brazil. Food Research International, v. 44, n. 7, p. 2155-2159, 2011.

ALVES, C. Q. et al. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, p. 110-120, 2010.

ANGELO, Priscila Milene; JORGE, Neuza. Compostos fenólicos em alimentos– Uma breve revisão. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 66, n. 1, p. 1-9, 2007.

APPENDINI, Paola; HOTCHKISS, Joseph H. Review of antimicrobial food packaging. Innovative Food Science & Emerging Technologies, v. 3, n. 2, p. 113-126, 2002.

167

Aprosoja, A história da soja, disponível em: Acesso em: 19 Març. 2018.

ARAÚJO, Michel Mozeika; FANARO, Gustavo Bernardes; VILLAVICENCIO, Anna Lucia Casañas Haasis. Soybean and Isoflavones–From Farm to Fork.In: Soybean-Bio-Active Compounds. Intech, 2013.

BABA, Shoib A.; MALIK, Shahid A. Determination of total phenolic and flavonoid content, antimicrobial and antioxidant activity of a root extract of Arisaema jacquemontii Blume. Journal of Taibah University for Science, v. 9, n. 4, p. 449-454, 2015.

BAHAR, A. A., REN, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. V. 6, n. 12, p. 1543-75, 2013.

BALOUIRI, Mounyr; SADIKI, Moulay; IBNSOUDA, Saad Koraichi. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of pharmaceutical analysis, v. 6, n. 2, p. 71-79, 2016.

BOMAN, H. G. Antibacterial peptides: basic facts and emerging concepts. Journal of internal medicine, v. 254, n. 3, p. 197-215, 2003.

BORREGAARD, Niels et al. Innate immunity: from plants to humans. Immunology today, v. 21, n. 2, p. 68-70, 2000.

Brasil a. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Compostos fitoquímicos da soja e seus benefícios para a saúde humana, disponível em Acesso em: 18 de Març. 2018.

Brasil b. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, soja em números, safra 2016/2017, Disponível em: Acesso em: 19 Març. 2018.

168

Brasil c. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Portaria nº 540, de 27 de outubro de 1997. Disponível em: Acesso em: 2 Agos. 2018.

Brasil d. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Importância dos fitoestrogénios presentes na soja para a saúde humana. Disponível em: Acesso em: 15 Agos. 2018.

BECHINGER, Burkhard. The structure, dynamics and orientation of antimicrobial peptides in membranes by multidimensional solid-state NMR spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, v. 1462, n. 1, p. 157-183, 1999.

BROEKAERT, Willem F. et al. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant physiology, v. 108, n. 4, p. 1353, 1995.

BROGDEN, Kim A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?. Nature reviews microbiology, v. 3, n. 3, p. 238, 2005.

BROGDEN, Kim A. et al. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences. International journal of antimicrobial agents, v. 22, n. 5, p. 465- 478, 2003.

BSBIOS Energia Renovável. Qualidade. Tecnologia Industrial. Processamento de Grão. Disponível em Acesso em: 15 Fev. 2018.

BULET, Philippe; STÖCKLIN, Reto; MENIN, Laure. Anti‐ microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunological reviews, v. 198, n. 1, p. 169- 184, 2004.

BULET, Philippe; STOCKLIN, Reto. Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein and peptide letters, v. 12, n. 1, p. 3- 11, 2005.

169

CASTRO, Mariana S.; FONTES, Wagner.Plant defense and antimicrobial peptides. Protein and Peptide letters, v. 12, n. 1, p. 11-16, 2005.

CETIN-KARACA, Hayriye; NEWMAN, Melissa C. Antimicrobial efficacy of plant phenolic compounds against Salmonella and Escherichia Coli. Food Bioscience, v. 11, p. 8-16, 2015.

CHEN, Hai et al. Oxidative stress in ischemic brain damage: mechanisms of cell death and potential molecular targets for neuroprotection. Antioxidants & redox signaling, v. 14, n. 8, p. 1505-1517, 2011.

CHEYNIER, Véronique; TOMAS-BARBERAN, Francisco A.; YOSHIDA, Kumi. Polyphenols: from plants to a variety of food and nonfood uses. Journal Agriculture Food Chemistry, v. 63,p.7589–7594, 2015.

Codex Alimentarius. Disponível em . Acesso em: 01 Agost. 2018.

COLE, Alexander M. et al. Cutting edge: IFN-inducible ELR− CXC chemokines display defensin-like antimicrobial activity. The Journal of Immunology, v. 167, n. 2, p. 623-627, 2001.

COLE, Alexander M.; WEIS, Peddrick; DIAMOND, Gill. Isolation and characterization of pleurocidin, an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. Journal of Biological Chemistry, v. 272, n. 18, p. 12008- 12013, 1997.

DAI, Jin; MUMPER, Russell J. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules, v. 15, n. 10, p. 7313-7352, 2010.

DE MORAES, Rita Maria Alves et al. Caracterização bioquímica de linhagens de soja com alto teor de proteína. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 41, n. 5, p. 725-729, 2006.

170

DEL AGUILA, Eduardo M. et al. Natural Antimicrobials in Food Processing: Bacteriocins, Peptides and Chitooligosaccharides. Frontiers in Anti-Infective Drug Discovery, v. 4, p. 55, 2017.

DE LUCCA, Anthony J. Antifungal peptides: potential candidates for the treatment of fungal infections. Expert opinion on Investigational drugs, v. 9, n. 2, p. 273-299, 2000.

DIXIT, Ajay K. et al. Soybean constituents and their functional benefits.Research Signpost, v. 661, n. 12,p. 367-383, 2011.

DUTRA, Luanna Maria Filgueiras et al. Modelagem molecular de proteínas: o caso de uma glucoronosiltransferase (GumK) de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5. Journal of Biology & Pharmacy and Agricultural Management, v. 10, n. 3, 2015.

EGHBALIFERIZ, Samira; IRANSHAHI, Mehrdad. Prooxidant activity of polyphenols, flavonoids, anthocyanins and carotenoids: updated review of mechanisms and catalyzing metals. Phytotherapy Research, v. 30, n. 9, p. 1379-1391, 2016.

EL-AASSAR, M. R. et al. Microencapsulation of lectin anti-cancer agent and controlled release by alginate beads, biosafety approach. International journal of biological macromolecules, v. 69, p. 88-94, 2014.

ESPINOSA-MARTOS, Irene; RUPÉREZ, P. Soybean oligosaccharides.Potential as new ingredients in functional food. Nutricion hospitalaria, v. 21, n. 1, p. 92-96, 2006.

FADAEI, Vajiheh. Milk Proteins-derived antibacterial peptides as novel functional food ingredients. Annals of Biological Research, v. 3, n. 5, p. 2520- 2526, 2012.

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations). 2017. Avaliable online http://www.fao.org/home/en/ (accessed on 19 July2017).

171

FEEDIPEDIA. Animal feed resouces information system. Soybean meal, high protein (dehulled).Disponível em: Acesso em: 30 jan. 2018.

FIB FOOD INGREDIENTS BRASIL Nº 39. 2016. Disponível em Acesso em: 28 mai. 2018.

FOSGERAU, Keld; HOFFMANN, Torsten. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug discovery today, v. 20, n. 1, p. 122-128, 2015.

FLAVIA CANCADO VIANA, Juliane et al. Heterologous production of peptides in plants: Fusion proteins and beyond. Current Protein and Peptide Science, v. 14, n. 7, p. 568-579, 2013.

FLACHOWSKY, Gerhard et al. Isoflavone concentration of soybean meal from various origins and transfer of isoflavones into milk of dairy cows. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, v. 6, n. 4, p. 449-456, 2011.

FRIEDMAN, Mendel. Nutritional value of proteins from different food sources.A review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 44, n. 1, p. 6-29, 1996.

GIADA, Maria de Lourdes Reis.Food phenolic compounds: main classes, sources and their antioxidant power. In: Oxidative stress and chronic degenerative diseases-a role for antioxidants. InTech, v. 55, p.87–112, 2013.

GIULIANI, Andrea; PIRRI, Giovanna; NICOLETTO, Silvia. Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics. Open Life Sciences, v. 2, n. 1, p. 1-33, 2007.

GUPTA, Apoorva; KAGLIWAL, Lalit D.; SINGHAL, Rekha S. Biotransformation of polyphenols for improved bioavailability and processing stability. In: Advances in food and nutrition research. Academic Press, 2013. V. 69, p. 183-217.

172

HAMMAMI, Riadh et al. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. Nucleic acids research, v. 37, n. suppl_1, p. D963-D968, 2008.

HAMILL, Pamela et al. Novel anti-infectives: is host defence the answer?. Current opinion in biotechnology, v. 19, n. 6, p. 628-636, 2008.

HANCOCK, Robert EW; SCOTT, Monisha G.The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proceedings of the national Academy of Sciences, v. 97, n. 16, p. 8856-8861, 2000.

HARTMANN, Rainer; MEISEL, Hans. Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current opinion in biotechnology, v. 18, n. 2, p. 163-169, 2007.

HELENO, Sandrina A. et al. Bioactivity of phenolic acids: Metabolites versus parent compounds: A review. Food chemistry, v. 173, p. 501-513, 2015.

HOLST, Birgit; WILLIAMSON, Gary. Nutrients and phytochemicals: from bioavailability to bioefficacy beyond antioxidants. Current opinion in biotechnology, v. 19, n. 2, p. 73-82, 2008.

HUR, Sun Jin et al. In vitro human digestion models for food applications. Food Chemistry, v. 125, n. 1, p. 1-12, 2011.

JENSSEN, Håvard; HAMILL, Pamela; HANCOCK, Robert EW.Peptide antimicrobial agents. Clinical microbiology reviews, v. 19, n. 3, p. 491-511, 2006.

JIANG, Haiping et al. Purification and characterization of antioxidative peptides from round scad (Decapterus maruadsi) muscle protein hydrolysate. Food Chemistry, v. 154, p. 158-163, 2014.

JOKIĆ, Stela et al. Modelling of the process of solid-liquid extraction of total polyphenols from soybeans. Czech Journal of Food Sciences, v. 28, n. 3, p. 206-212, 2010.

173

JUNIOR, César Luis Siqueira; FREIRE, Maria das Graças Machado; MOREIRA, Antônio Sergio Nascimento. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre o desenvolvimento de Acidovorax avenae subsp citrulli. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, v. 9, n. 3, p. 157- 161, 2014.

KANIMOZHI, Sivamani; BHAVANI, Pakkiri; SUBRAMANIAN, Perumal.Influence of the flavonoid, quercetin on antioxidant status, lipid peroxidation and histopathological changes in hyperammonemic rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry, v. 32, n. 3, p. 275-284, 2017.

KELLEY, Lawrence A. et al.The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature protocols, v. 10, n. 6, p. 845, 2015.

KHALID, M. N. et al. Swelling properties and mechanical characterization of a semi-interpenetrating chitosan. STP pharma sciences, v. 9, n. 4, p. 359-364, 1999.

KIM, E. H. et al. Analysis of phenolic compounds and isoflavones in soybean seeds (Glycine max (L.) Merill) and sprouts grown under different conditions. European Food Research and Technology, v. 222, n. 1-2, p. 201, 2006.

KITTS, David D.; WEILER, Katie.Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery. Current pharmaceutical design, v. 9, n. 16, p. 1309-1323, 2003.

KULIGOWSKI, Maciej et al. Isoflavone composition, polyphenols content and antioxidative activity of soybean seeds during tempeh fermentation. CyTA- Journal of Food, v. 15, n. 1, p. 27-33, 2017.

KORHONEN, Hannu; PIHLANTO, Anne.Food-derived bioactive peptides- opportunities for designing future foods. Current pharmaceutical design, v. 9, n. 16, p. 1297-1308, 2003.

KOUTELIDAKIS, A. E. et al. Antioxidant and antimicrobial properties of tea and aromatic plant extracts against bacterial foodborne pathogens: a comparative

174

evaluation. Current Topics in Nutraceuticals Research, v. 14, n. 2, p. 133, 2016.

KULKARNI, Dhananjay S. et al. Reduction of flatus‐ inducing factors in soymilk by immobilized α‐ galactosidase. Biotechnology and applied biochemistry, v. 45, n. 2, p. 51-57, 2006.

LAVERTY, Garry; GORMAN, Sean P.; GILMORE, Brendan F.The potential of antimicrobial peptides as biocides. International journal of molecular sciences, v. 12, n. 10, p. 6566-6596, 2011.

LEE, Jin Hwan et al. Changes in phenolic compounds (isoflavones and phenolic acids) and antioxidant properties in high-protein soybean (Glycine max L., cv. Saedanbaek) for different roasting conditions. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, v. 56, n. 5, p. 605-612, 2013.

LIU, KeShun. Soybeans: chemistry, technology, and utilization. Springer, v. 25, p. 113-120, 2012.

LÜDERS, Torben et al. Strong synergy between a eukaryotic antimicrobial peptide and bacteriocins from lactic acid bacteria. Applied and environmental microbiology, v. 69, n. 3, p. 1797-1799, 2003.

MALENČIĆ, Djordje et al. Polyphenol contents and antioxidant activity of soybean seed extracts. Bioresource technology, v. 99, n. 14, p. 6688-6691, 2008.

MALMSTEN, M. Antimicrobial peptides. Upsala journal of medical sciences, v. 119, p. 199-204, 2014.

MARMIROLI, Nelson; MAESTRI, Elena. Plant peptides in defense and signaling. Peptides, v. 56, p. 30-44, 2014.

MATSUZAKI, Katsumi. Control of cell selectivity of antimicrobial peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, v. 1788, n. 8, p. 1687-1692, 2009.

175

MELLO FILHO, Odilon Lemos de et al. Grain yield and seed quality of soybean selected for high protein content. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 39, n. 5, p. 445-450, 2004.

MEDIC, Jelena; ATKINSON, Christine; HURBURGH JR, Charles R. Current knowledge in soybean composition. Journal of the American oil chemists' society, v. 91, n. 3, p. 363-384, 2014.

MESSINA, Mark; GARDNER, Christoper; BARNES, Stephen. Gaining insight into the health effects of soy but a long way still to go: commentary on the fourth International Symposium on the Role of Soy in Preventing and Treating Chronic Disease. The Journal of nutrition, v. 132, n. 3, p. 547S-551S, 2002.

MEYER, Anne S. et al. Fruit hydroxycinnamic acids inhibit human low-density lipoprotein oxidation in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 46, n. 5, p. 1783-1787, 1998.

MOO-HUCHIN, Víctor M. et al. Antioxidant compounds, antioxidant activity and phenolic content in peel from three tropical fruits from Yucatan, Mexico. Food chemistry, v. 166, p. 17-22, 2015.

MONTEIRO, L. P. (2015). Determinação da atividade citotóxica do extrato vegetal de Croton urucurana Baill em linhagens de células tumorais. 79f. Dissertação de Mestrado-Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

MOSTAFA, Ashraf A. et al. Antimicrobial activity of some plant extracts against bacterial strains causing food poisoning diseases. Saudi Journal of Biological Sciences, v. 25, n. 2, p. 361-366, 2018.

MUÑOZ, Alberto et al. Antimicrobial properties of derivatives of the cationic tryptophan-rich hexapeptide PAF26. Biochemical and biophysical research communications, v. 354, n. 1, p. 172-177, 2007.

NAGPURE, Anand; GUPTA, Rajinder K. Purification and characterization of an extracellular chitinase from antagonistic Streptomyces violaceusniger. Journal of basic microbiology, v. 53, n. 5, p. 429-439, 2013.

176

NEGI, Pradeep Singh. Plant extracts for the control of bacterial growth: Efficacy, stability and safety issues for food application. International journal of food microbiology, v. 156, n. 1, p. 7-17, 2012.

NEVEU, Vanessa et al. Phenol-Explorer: an online comprehensive database on polyphenol contents in foods. Database, 2010, bap024.

PATRZYKAT, Aleksander et al. Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 46, n. 3, p. 605-614, 2002.

PELLEGRINI, Antonio et al. Isolation and identification of three bactericidal domains in the bovine α-lactalbumin molecule. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, v. 1426, n. 3, p. 439-448, 1999.

PÉREZ-JIMÉNEZ, J. et al. Identification of the 100 richest dietary sources of polyphenols: an application of the Phenol-Explorer database. European journal of clinical nutrition, v. 64, n. S3, p. S112, 2010.

PEREZ ESPITIA, Paula Judith et al. Bioactive peptides: synthesis, properties, and applications in the packaging and preservation of food. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v. 11, n. 2, p. 187-204, 2012.

PÉREZ-HERNÁNDEZ, Jesús et al. A potential alternative against neurodegenerative diseases: Phytodrugs. Oxidative medicine and cellular longevity, v. 2016, p. 837-861, 2016.

PESSIONE, Enrica; CIRRINCIONE, Simona. Bioactive molecules released in food by lactic acid bacteria: encrypted peptides and biogenic amines. Frontiers in microbiology, v. 7, p. 876-895, 2016.

PLUEMSAMRAN, Thanyawan; ONKOKSOONG, Tasanee; PANICH, Uraiwan. Caffeic acid and ferulic acid inhibit UVA‐ induced matrix metalloproteinase‐ 1 through regulation of antioxidant defense system in keratinocyte HaCaT cells. Photochemistry and Photobiology, v. 88, n. 4, p. 961-968, 2012.

PROESTOS, Charalampos et al. Antioxidant capacity of selected plant extracts and their essential oils. Antioxidants, v. 2, n. 1, p. 11-22, 2013. 177

PUSHPANATHAN, Muthuirulan; GUNASEKARAN, Paramasamy; RAJENDHRAN, Jeyaprakash. Antimicrobial peptides: versatile biological properties. International journal of peptides, v. 2013, p. 675-691, 2013.

SÁNCHEZ, Adrián; VÁZQUEZ, Alfredo. Bioactive peptides: A review. Food Quality and Safety, v. 1, n. 1, p. 29-46, 2017.

SHAHIDI, Fereidoon; ZHONG, Ying.Novel antioxidants in food quality preservation and health promotion. European Journal of Lipid Science and Technology, v. 112, n. 9, p. 930-940, 2010.

SINGH, Sheo B. et al. Isolation, structure, and biological activity of phaeofungin, a cyclic lipodepsipeptide from a Phaeosphaeria sp. using the genome-wide Candida albicans fitness test. Journal of natural products, v. 76, n. 3, p. 334- 345, 2012.

SINGH, Brij Pal; VIJ, Shilpa; HATI, Subrota. Functional significance of bioactive peptides derived from soybean. Peptides, v. 54, p. 171-179, 2014.

QUIDEAU, Stephane et al. Plant polyphenols: chemical properties, biological activities, and synthesis. Angewandte Chemie International Edition, v. 50, n. 3, p. 586-621, 2011.

RIEDL, Ken M. et al. Isoflavone profiles, phenol content, and antioxidant activity of soybean seeds as influenced by cultivar and growing location in Ohio. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 87, n. 7, p. 1197- 1206, 2007.

RODRÍGUEZ-ROQUE, María Janeth et al. Impact of food matrix and processing on the in vitro bioaccessibility of vitamin C, phenolic compounds, and hydrophilic antioxidant activity from fruit juice-based beverages. Journal of Functional Foods, v. 14, p. 33-43, 2015.

SELITRENNIKOFF, Claude P. Antifungal proteins. Applied and environmental microbiology, v. 67, n. 7, p. 2883-2894, 2001.

178

CABALLERO, Benjamin et al. Encyclopedia of food sciences and nutrition: Volumes 1-10. Elsevier Science BV, 2003.

SHAH, Manzoor Ahmad; BOSCO, Sowriappan John Don; MIR, Shabir Ahmad. Plant extracts as natural antioxidants in meat and meat products. Meat science, v. 98, n. 1, p. 21-33, 2014.

SHAHIDI, Fereidoon; AMBIGAIPALAN, Priyatharini. Phenolics and polyphenolics in foods, beverages and spices: Antioxidant activity and health effects–A review. Journal of functional foods, v. 18, p. 820-897, 2015.

SINGH, Manjinder; KAUR, Maninder; SILAKARI, Om. Flavones: An important scaffold for medicinal chemistry. European journal of medicinal chemistry, v. 84, p. 206-239, 2014.

SITOHY, Mahmoud Z.; OSMAN, Ali O.; MAHGOUB, Samir A. Bioactive proteins against pathogenic and spoilage bacteria. Functional Foods in Health and Disease, v. 4, n. 10, p. 451-462, 2014.

SNYDER, H. and WILSON, L. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Finglas and Paul. Oxford, Academic Press. V. 9, p. 5383-5389, 2003.

SOARES, N. B. (2013). Obtenção de hidrolisado proteico de torta de soja e avaliação de sua atividade antimicrobiana. 89f. Dissertação de Mestrado- Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.

CABALLERO, Benjamin et al. Encyclopedia of food sciences and nutrition: Volumes 1-10. Elsevier Science BV, 2003.

SOARES, F. et al. Recent patents on active packaging for food application. Recent patents on food, nutrition & agriculture, v. 1, n. 2, p. 171-178, 2009.

TANG, Yi-Quan; YEAMAN, Michael R.; SELSTED, Michael E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infection and immunity, v. 70, n. 12, p. 6524- 6533, 2002.

179

TAOFIQ, Oludemi et al. Hydroxycinnamic acids and their derivatives: cosmeceutical significance, challenges and future perspectives, a review. Molecules, v. 22, n. 2, p. 281, 2017.

TAWAHA, Khaled et al. Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species. Food chemistry, v. 104, n. 4, p. 1372-1378, 2007.

TEPAVČEVIĆ, Vesna et al. Isoflavone composition, total polyphenolic content, and antioxidant activity in soybeans of different origin. Journal of medicinal food, v. 13, n. 3, p. 657-664, 2010.

THEIS, T.; STAHL, U. Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, v. 61, n. 4, p. 437- 455, 2004.

THEVISSEN, Karin et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins. Journal of Biological Chemistry, v. 271, n. 25, p. 15018-15025, 1996.

TOMÁS-BARBERÁN, Francisco A.; ANDRÉS-LACUEVA, Cristina.Polyphenols and health: current state and progress. Journal Agriculture Food Chemistry., v.60,p. 8773–8775, 2012.

TSAO, Rong. Chemistry and biochemistry of dietary polyphenols. Nutrients, v. 2, n. 12, p. 1231-1246, 2010.

TRIPATHI, Vishal; VASHISHTHA, Bhavana. Bioactive compounds of colostrum and its application. Food reviews international, v. 22, n. 3, p. 225-244, 2006.

VERMERRIS, Wilfred; NICHOLSON, Ralph.Families of phenolic compounds and means of classification. In: Phenolic compound biochemistry. Springer, Dordrecht, 2008. p. 1-34.

VILLALOBOS, María del Carmen et al. Antioxidant and antimicrobial activity of natural phenolic extract from defatted soybean flour by‐ product for stone fruit

180

postharvest application. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 96, n. 6, p. 2116-2124, 2016.

VISIOLI, F.; DAVALOS, A. Polyphenols and cardiovascular disease: a critical summary of the evidence. Mini reviews in medicinal chemistry, v. 11, n. 14, p. 1186-1190, 2011.

VIZIOLI, Jacopo; SALZET, Michel. Antimicrobial peptides from animals: focus on invertebrates. Trends in pharmacological sciences, v. 23, n. 11, p. 494- 496, 2002.

WANG, Dan et al. Efficient production of free fatty acids from soybean meal carbohydrates. Biotechnology and bioengineering, v. 112, n. 11, p. 2324- 2333, 2015.

WANG, Zhe; WANG, Guangshun. APD: the antimicrobial peptide database. Nucleic acids research, v. 32, n. suppl_1, p. D590-D592, 2004.

WEICHSELBAUM, E.; BUTTRISS, J. L. Polyphenols in the diet. Nutrition Bulletin, v. 35, n. 2, p. 157-164, 2010.

WOJDYŁO, Aneta; OSZMIAŃSKI, Jan; CZEMERYS, Renata.Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food chemistry, v. 105, n. 3, p. 940-949, 2007.

WU, Manhong; HANCOCK, Robert EW.Interaction of the cyclic antimicrobial cationic peptide bactenecin with the outer and cytoplasmic membrane. Journal of Biological Chemistry, v. 274, n. 1, p. 29-35, 1999.

XIAO, Meitian et al. Determination of soybean isoflavones in soybean meal and fermented soybean meal by micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC). Food chemistry, v. 126, n. 3, p. 1488-1492, 2011.

YAMADA, Letícia Tamie Paiva et al. Composição química e conteúdo de ferro solúvel em soja [Glycine max (L.) Merrill]. Ciência e Agrotecnologia, v. 27, n. 2, p. 406-413, 2003.

181

YANG, Lin et al. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophysical journal, v. 81, n. 3, p. 1475-1485, 2001.

YANG, Ruiyue et al. Immunomodulatory effects of marine oligopeptide preparation from Chum Salmon (Oncorhynchus keta) in mice. Food Chemistry, v. 113, n. 2, p. 464-470, 2009.

YANG, De et al. Many chemokines including CCL20/MIP‐ 3α display antimicrobial activity. Journal of leukocyte biology, v. 74, n. 3, p. 448-455, 2003.

YILDIRIM, Arzu Birinci et al. Evaluation of antibacterial, antitumor, antioxidant activities and phenolic constituents of field-grown and in vitro-grown Lysimachia vulgaris L. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, v. 14, n. 2, p. 177-187, 2017.

ZAIOU, Mohamed. Multifunctional antimicrobial peptides: therapeutic targets in several human diseases. Journal of Molecular Medicine, v. 85, n. 4, p. 317- 329, 2007.

ZAKIR, Mayara Miranda; FREITAS, Irene Rodrigues. Benefícios à saúde humana do consumo de isoflavonas presentes em produtos derivados da soja. Journal of bioenergy and food science, v. 2, n. 3, p. 107-116, 2015.

ZHANG, Yanpeng et al. Application of high density steam flash-explosion in protein extraction of soybean meal. Journal of food engineering, v. 116, n. 2, p. 430-435, 2013.

ZHANG, Lijuan; ROZEK, Annett; HANCOCK, Robert EW.Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes. Journal of Biological Chemistry, v. 276, p. 35714-22, 2001.

182

ANEXO A- ARTIGO SUBMETIDO

183

184

ANEXO B- PRODUÇÕES CIÊNTÍFICAS

185

186

187

188

189

190