UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER Sciences

THESE

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III Discipline : Innovation Pharmacologique Présentée et soutenue par : Christelle Coatrieux le 08 octobre 2007

Monoamine oxydases et athérosclérose : signalisation mitogène et études in vivo

Jury

Monsieur Luc Rochette Rapporteur Professeur, Université de Bourgogne, Dijon Monsieur Ramaroson Andriantsitohaina Rapporteur Directeur de Recherche, INSERM, Angers Monsieur Philippe Valet Président Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse III Madame Nathalie Augé Examinateur Chargé de Recherche, INSERM Monsieur Angelo Parini Directeur de Thèse Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse III

INSERM, U858, équipes 6/10, Institut Louis Bugnard, CHU Rangueil, Toulouse Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (EROs) sont impliquées dans l’activation de nombreuses voies de signalisation cellulaires, conduisant à différentes réponses comme la prolifération. Les EROs, à cause du stress oxydant qu’elles génèrent, sont impliquées dans de nombreuses pathologies, notamment l’athérosclérose.

Les monoamine oxydases (MAOs) sont deux flavoenzymes responsables de la dégradation des catécholamines et des amines biogènes comme la sérotonine ; elles sont une source importante d’EROs. Il a été montré qu’elles peuvent être impliquées dans la prolifération cellulaire ou l’apoptose du fait du stress oxydant qu’elles génèrent.

Ce travail de thèse a montré que la MAO-A, en dégradant son substrat (sérotonine ou tyramine), active une voie de signalisation mitogène particulière : la voie métalloprotéase- 2/sphingolipides (MMP2/sphingolipides), et contribue à la prolifération de cellules musculaire lisses vasculaires induite par ces monoamines. De plus, une étude complémentaire a confirmé l’importance des EROs comme stimulus mitogène (utilisation de peroxyde d’hydrogène exogène), et a décrit plus spécifiquement les étapes en amont de l’activation de MMP2, ainsi que l’activation par la MMP2 de la sphingomyélinase neutre (première enzyme de la cascade des sphingolipides).

Enfin, une étude a été menée in vivo sur un modèle de souris développant des plaques d’athérome (ApoE -/-), visant à étudier le rôle athéroprotecteur d’un inhibiteur de MAOs (IMAO), comparé à des piégeurs de carbonyle (ayant pour certains des propriétés IMAOs également). Cette étude montre un effet protecteur des piégeurs de carbonyles, indépendant de leurs propriétés IMAOs, et un faible effet de l’IMAO seul, dans la formation des lésions vasculaires primaires.

En conclusion, ce travail a montré une implication du stress oxydant, et particulièrement des MAOs dans la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires. Il a permis également de mieux décrire l’interaction entre MMP2 et la sphingomyélinase neutre ainsi que la voie de signalisation activée en amont de MMP2.

Enfin, bien que l’étude visant à montrer l’effet athéroprotecteur d’un IMAO sur lésion primaires n’ait pas montré d’efficacité aussi importante que celle notée pour des molécules (IMAOs ou non) piégeurs de carbonyles, ceci n’exclut pas un rôle des MAOs dans la formation des lésions avancées.

Abstract

Reactive oxygen species (ROS) are involved in the activation of many signaling pathways, leading to different responses, such as cell proliferation, inflammation, differentiation or apoptosis. The oxidative stress generated by ROS is involved in the initiation and evolution of many diseases including atherosclerosis.

Monoamine oxidases (MAOs) are two flavoenzymes that catalyze the oxidative deamination of catecholamines and biogenic amines, such as serotonin and tyramine. The degradation of biogenic amines by MAOs generates a large amount of ROS that may play a role in the biological properties of these agents like cell proliferation or apoptosis.

This study showed that ROS generated during the degradation of serotonin or tyramine by MAO-A, trigger the activation of a specific stress-induced mitogenic pathway, namely the metalloprotease2-neutral sphingomyelinase2 pathway (MMP2/nSMase2), which is involved in vascular smooth muscle cell proliferation. This ROS-induced MAO-A dependent signalling was mimicked by exogenous hydrogen peroxyde, which allowed to demonstrate that ROS- induced SMC proliferation requires the downstream activation of sphingosine kinase-1 (SK- 1), a key enzyme in survival and proliferation signalling via the generation of sphingosine 1- phosphate (S1P). Furthermore, we report preliminary data on the mechanisms involved upstream the activation of MMP2 and of nSMase2 (which implicate the proprotein convertase and MT1-MMP, the physiological activator of MMP2).

Lastly, the protective effect of MAO inhibitors has been evaluated in vivo on an animal model for atherosclerosis, the apoE-/- mice. This study indicated that hydrazinic MAO inhibitors were very efficient in inhibiting the development of atherosclerotic lesions in apoE -/- mice, but this was due to the carbonyl scavenger properties of hydrazine and not to their IMAO effect, because non hydrazinic IMAO did not exhibited any protective effect. These data indicate that MAO-dependent oxidative stress is not involved in the formation of early atherosclerotic lesions, which doesn’t exclude an involvement in more advanced states, plaque rupture and remodelling.

In conclusion, this work allowed to demonstrate a role of MAO-dependent oxidative stress in SMC proliferation, via a new stress-induced signalling mechanism, the MMP2/nSMase2/SK-1 pathway, and suggests a role for ROS in the formation and the stability/fragility of fibrous cap in atherosclerosis. Principales abréviations utilisées

AGE : Advanced Glycoxydation MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase Endproduct MDA: Malondialdehyde ALE : Advanced Lipoxydation Endproduct MMP: Matrix MetalloProtease ApoE -/- : Knockout ApolipoprotéineE MT-MMP: Membrane-type CE : Cellules Endothéliales MetalloProtease

CML : Cellules Musculaires Lisses NAD(P)H oxydase : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase ERK : Extracellular-signal Regulated Kinase NF-κB : Nuclear Factor -κB

ERO : Espèce Réactive de l’Oxygène PDGF : Platelet-derived Growth Factor

FAD : Flavin Adenin Dinucleotid SERT : Transporteur à la sérotonine

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène Skase : Sphingosine kinase

HDL : High Density Lipoprotein S1P : Sphingosine 1-phosphate

4-HNE : 4-Hydroxynonenal SM : Sphingomyéline

5-HT : 5-hydroxytryptamine (sérotonine) nSMase : Sphingomyélinase euter

IMAO : Inhibiteur de monoamine oxydase TIMP: Tissue inhibitor of MMP

LDL: Low-Density Lipoprotein TNF alpha (ou TNFα):Tumor Necrosis Factor alpha LDLox: Low-Density Lipoprotein oxydées Trp : Tryptophane MAO: Monoamine oxydase

SOMMAIRE

I. Les Monoamine Oxydases : généralités...... 1 Isoformes...... 1 Structure...... 2 Localisation...... 2 Fonction des MAOs...... 5 a. Réaction enzymatique catalysée ...... 5 b. Rôle au niveau du système nerveux central ...... 5 c. Rôle au niveau des organes périphériques ...... 7 d. Nouveau rôle lié à la production d’EROs ...... 7 Substrats et inhibiteurs...... 8 a. Substrats...... 9 b. Inhibiteurs ...... 10 Pathologies associées...... 11 a. Les maladies neurodégénératives et psychiatriques...... 11 b. Le diabète...... 12

II. Monoamine oxydases et stress oxydant ...... 14 Apoptose...... 14 Hypertrophie (cardiomyocytes)...... 15 Prolifération...... 15

III. Stress oxydant et athérosclérose...... 16 Les maladies cardiovasculaires ...... 16 Facteurs de risque...... 16 Chronologie du processus atheromateux ...... 16 Les espèces réactives de l’oxygène (EROs)...... 19 a. Définition...... 19 b. Les différents dérivés réactifs de l’oxygène...... 19 c. Les principales sources d’espèces réactives de l’oxygène ...... 22 Espèces réactives de l’oxygène et athérosclérose ...... 29 a. LES EROs dans l’athérosclérose ...... 29 b. Sources d’EROs produites par les cellules vasculaires...... 31 c. Conséquences cellulaires du stress oxydant...... 31 d. Principales signalisations intra-cellulaires activées par le stress oxydant...... 32

IV. La Sérotonine ...... 35 Synthèse et dégradation ...... 35 Stockage ...... 37 Rôle ...... 37 Les récepteurs à la sérotonine...... 37 Sérotonine et athérosclérose ...... 39 Signalisation cellulaire de la sérotonine dans les cellules vasculaires...... 39

Objectif du travail...... 41

Matériels et Méthodes...... 43 Animaux : ...... 43 Lignées et culture cellulaire...... 43 Mesures d’espèces réactives de l’oxyène et paramètres d’oxydation : ...... 44 a. Mesure de la production d’EROs intracellulaires ...... 44 b. Dosage des hydroperoxydes (protéines carbonylées) ...... 45 c. Dosage des TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances)...... 45 Prolifération cellulaire...... 46 a. Incorporation de thymidine tritiée...... 46 b. Test au MTT (3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium bromure)...... 46 c. Comptage cellulaire ...... 46 Activités enzymatiques...... 47 a. Activité MAO ...... 47 b. Activité furine ...... 47 c. Activité MMP14 et MMP2 ...... 48 d. Activité nSMase...... 49 e. Activité sphingosine kinase ...... 49 Proteines ...... 50 a. Dosage ...... 50 b. Western Blot ...... 50 c. Immunoprécipitation des protéines...... 51

RESULTATS EXPERIMENTAUX

I. Rôle de la MAO-A et du stress oxydant dans la signalisation mitogène induite sur cellules musculaires lisses ...... 52 I.1. Introduction ...... 52 a. Les métalloprotéases...... 52 b. MMP-2, MT1-MMP et athérosclérose...... 54 c. La voie des sphingolipides...... 55 d. Rôle des sphingolipides dans l’atherosclérose...... 57 I.2. Résultats expérimentaux ...... 58 I.3. Conclusion ...... 113

II. Effet antiathérogène de deux classes d’inhibiteurs de monoamine oxydases sur la formation des lésions précoces...... 114 II.1. Introduction ...... 114 II. 2. Hypothèse de travail...... 114 II.3. Résultats ...... 141 II.4. Conclusion...... 143

Conclusion générale et Perspectives ...... 144

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...... 148

ANNEXE...... 200

Revue Générale Revue Générale I. Les Monoamine Oxydases : généralités

Les amines oxydases sont des enzymes largement distribuées chez les organismes vivants (bactéries, plantes, animaux) (Mondovi and Riccio 1984). Elles catalysent la déamination oxydative des amines (mono-, di- et polyamines), consommant de l’oxygène O2 et de l’eau, et produisant l’aldéhyde correspondant, du NH3 et du peroxyde d’hydrogène

(H2O2). Elles sont généralement classées en deux groupes i/les amines à FAD (monoamine et polyamine oxydases, MAOs et PAOs) et ii/ les amines possédant un atome de cuivre dans leur site actif et un cofacteur organique (également appelées amine oxydases carbonyle dépendantes) comprenant les di-amine oxydases (DAOs), la lysyl-oxydase et les amine- oxydases sensibles au semicarbazide (SSAOs). Plus simplement elles sont appelées respectivement i/FAD-amine oxydases pour celles du premier groupe et ii/ amines oxydases à cuivre ou Cu-amine oxydases pour celles du deuxième.

Leur fonction dans le métabolisme des amines biogènes leur confère un rôle important lors des processus essentiels dans lesquels ces amines biogènes interviennent comme la prolifération (Vindis et al. 2000; Polgar et al. 2007), la différentiation cellulaire et l’apoptose (revue par Toninello et al. (Toninello et al. 2004)).

La monoamine oxydase (MAO) fut isolée pour la première fois en 1928 par Hare et nommée tyramine oxydase pour sa capacité à catalyser une déamination oxydative de la tyramine. Plus tard de nombreux substrats de la MAO, de type monoamines dont les catécholamines (dopamine, noradrénaline, adrénaline) et la sérotonine, furent mis en évidence d’où sa dénomination de monoamine oxydase.

Isoformes

Il existe deux isoformes de MAO : la MAO-A et la MAO-B, différenciées historiquement par la sélectivité de certains inhibiteurs à bloquer l’une ou l’autre des deux formes : la clorgyline bloquant la MAO-A (Johnson et al. 1968) et le déprényl étant spécifique de la MAO-B (Knoll and Magyar 1972; Knoll 1978). Il existe également une préférence de substrat, la MAO-A métabolisant plutôt la sérotonine, alors que la MAO-B a

1 Revue Générale une préférence pour la β-phényléthylamine. La tyramine, l’adrénaline, la noradrénaline, et la dopamine sont métabolisées également par les deux isoenzymes (Glover et al. 1977).

Les deux isoformes de la MAO présentent des poids moléculaires légèrement différents : 60kDa pour la MAO-Aet 58 kDa pour la MAO-B chez l’homme (Cawthon and Breakefield 1979).

Au niveau génomique, les MAOs sont codées par deux gènes différents situés sur le chromosome X (Kochersperger et al. 1986). Leur organisation génomique est très similaire : 15 exons et 14 introns (Grimsby et al. 1991). De plus, le clonage des ADNc a montré chez l’homme une homologie de séquence en acides aminés de 70% entre les deux isoformes (Bach et al. 1988) et la comparaison des séquences de MAO-A ou de MAO-B interespèces a montré également une importante conservation de chacune des isoformes, avec une homologie de 87% entre les MAO-A humaine et bovine, 85% avec le rat (Powell et al. 1989; Kwan and Abell 1992) et de 88% entre les MAO-B humaine et bovine (Ito et al. 1988).

Structure

Les MAOs sont formées de deux sous unites liées par un pont dissulfure, associées à un groupement FAD (flavin adenine dinucléotide) jouant le rôle de cofacteur : les MAOs sont donc des enzymes appartenant à la famille des flavoprotéines. Par mutagenèse dirigée l’etude du site actif des MAOs a montré que certains acides aminés jouent un rôle clé dans l’activité enzymatique (Wu et al. 1993), ou la spécificité de substrat (Tsugeno and Ito 1997).

Des approches structurales (cristallographie) (figure 1) des MAOs ont été récemment réalisées et devraient permettre d’avancer dans la connaissance de leur site catalytique et de leurs sites de liaison aux inhibiteurs ou à leur substrat (Binda et al. 2003; De Colibus et al. 2005); cette nouvelle approche devrait permettre de modéliser de nouvelles molécules.

Localisation

Les MAOs sont des enzymes ubiquitaires très conservées chez les eucaryotes et situées, au niveau sub-cellulaire, sur la membrane mitochondriale externe. La localisation tissulaire des MAOs a essentiellement été étudiée au niveau du système nerveux central à

2 Revue Générale cause de leur rôle dans le turn-over des catécholamines, de la dopamine et de la sérotonine, dont la demi-vie peut être altérée dans de nombreuses pathologies neurodégénérative (maladie de Parkinson, d’Alzheimer). La localisation des MAOs au sein des neurones ne correspond pas forcément à celle de leur substrat naturel : la MAO-A étant souvent présente au niveau des neurones catécholaminergiques et la MAO-B au niveau des neurones sérotoninergiques (Weyler et al. 1990).

La cartographie de l’expression des MAOs dans les tissus périphériques humains, de souris et de rat a fait l’objet de nombreuses études, en fonction de l’age (Saura et al. 1994b; Saura et al. 1994a), du ratio MAO-A vs MAO-B (Sivasubramaniam et al. 2003) et du tissu (Saura et al. 1992; Rodriguez et al. 2000a; Rodriguez et al. 2000b; Billett 2004). Le tableau 1 est une liste non exhaustive de l’expression des MAO-A et –B dans différents tissus périphériques humains.

Figure 1. Structure cristallographique des monoamine oxydases humaines MAO-A : Elle cristallise sous-forme monomérique ; le co-facteur FAD est représenté en violet MAO-B : Elle cristallise sous forme dimérique. Les deux monomères sont représentés en vert et en jaune ; le co-facteur FAD est représenté en violet D’après http://opm.phar.umich.edu/images/proteins/1o5w.gif (MAO-A) et http://opm.phar.umich.edu/phpthumb/phpThumb.php?src=../images/proteins/1ojd.gif&w=250&h=300 (MAO-B)

3 Revue Générale Tableau 1. Expression des MAO-A et -B chez l'Homme dans différents tissus (d'après Billett 2004)

4 Revue Générale Fonction des MAOs

Les MAOs sont impliquées dans la déamination oxydative de monoamines (adrénaline, noradrénaline, dopamine, sérotonine, tryptamine, tyramine). Elles jouent donc un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie des monoamines et catécholamines en contrôlant leurs concentrations, notamment au niveau des vésicules synaptiques (système nerveux). Elles interviennent également dans la détoxification, notamment par le métabolisme des monoamines alimentaires (Ilett et al. 1980).

a. Réaction enzymatique catalysée

Les MAOs catalysent la déamination oxydative des amines primaires aliphatiques et aromatiques, ainsi que sur quelques amines secondaires et tertiaires, selon la réaction générale suivante :

RCH2NH2 + H2O + O2 = RCHO + NH3 + H2O2

Cette réaction se déroule en trois temps : le substrat est tout d’abord oxydé, générant l’imine correspondante et le co-facteur FAD est réduit en hydroquinone (1). L’imine s’hydrolyse ensuite en aldéhyde, libérant de l’ammoniaque (2). Lors de la réoxydation du co- facteur FAD par l’oxygène, du peroxyde d’hydrogène est produit (3).

1) RCH2NH2 + E-FAD ⇒ RCH=NH + E-FADH2

2) RCH=NH + H2O ⇒ R-CHO + NH3

3) E-FADH2 + O2 ⇒ E-FAD + H2O2

L’aldéhyde produit lors de cette réaction est ensuite transformé en acide carboxylique ou en alcool, par un aldéhyde déshydrogénase ou une aldéhyde réductase.

b. Rôle au niveau du système nerveux central

Au niveau central, les MAOs participent au turnover et donc à l’inactivation des catécholamines et de la sérotonine, mais également à la détoxification de certains xénobiotiques.

5 Revue Générale Ainsi, le 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine ou MPTP, un puissant neurotoxique provenant de drogues synthétiques (mépéridine), est métabolisé par la MAO-B en MPP+ ou 1-Methyl-4-phenylpyridinium, un métabolite capté spécifiquement par les neurones dopaminergiques et les détruisant, provoquant des symptômes ressemblant à ceux de la maladie de Parkinson.

Certaines maladies dues à un défaut dans la synthèse de monoamines (maladie de Parkinson, d’Alzheimer) sont soignées par des inhibiteurs de monoamine oxydases (IMAOs).

La maladie d’Alzheimer est semble-t-il associée à une augmentation de l’activité MAO-B (Saura et al. 1994b).

De plus, des études comportementales réalisées sur des animaux délétés pour la MAO- A ou la MAO-B ont permis de mieux comprendre l’importance de chaque isoforme au niveau central.

Les souris knock-out pour la MAO-A présentent une augmentation de la sérotonine et noradrénaline centrales (Cases et al. 1995); elles présentent une agressivité exagérée. Les animaux knock-out pour la MAO-B présentent une augmentation de β-PEA (Grimsby et al. 1997); elles ne présentent pas de comportement agressif particulier, à la différence de l’Homme où une diminution de la MAO-B plaquettaire semble associée à une augmentation de l’agressivité (Garpenstrand et al. 2002). Cependant ces souris sont plus sensibles au stress et ont une moins bonne capacité d’habituation aux activités locomotrices (Lee et al. 2004b).

Un double knock-out par croisement des deux lignées n’est pas possible du fait de la trop grande proximité des deux gènes, mais ce double knock-out a pu être isolé par mutation spontanée (Chen et al. 2004b). Il présente le même type de comportement agressif que le knock-out MAO-A.

Enfin, les MAOs, interviennent dans le développement et la maturation de certaines zones du cerveau (Nicotra et al. 2004) et, de par l’importante production d’espèces réactives de l’oxygène, elles interviennent dans les processus de vieillissement cérébral (Strolin Benedetti and Dostert 1989; Cadenas and Davies 2000), d’autant que de nombreuses études ont montré une augmentation de leur expression dans certaines régions du cerveau avec l’âge (Fowler et al. 1997; Mahy et al. 2000; Nicotra et al. 2004).

6 Revue Générale c. Rôle au niveau des organes périphériques

Au niveau hépatique et intestinal, les MAOs participent à la détoxification des amines biogènes comme la tyramine (O'Carroll et al. 1983) (figure 2.) mais aussi de certains xénobiotiques comme le 1-méthyl-4phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine ou MPTP (Benedetti 2001).

Les MAOs rénales (Fernandes and Soares-da-Silva 1992; Saura et al. 1992) participent a la régulation de la concentration de monoamines produites. Ces monoamines (sérotonine, dopamine) jouent un rôle majeur dans la régulation des fonctions rénales (filtration, excrétion, réabsorption). Les MAOs, en régulant les concentrations de ces amines pourraient participer à la régulation de la fonction rénale (Fernandes and Soares-da-Silva 1994; Soares-da-Silva et al. 1996a).

Figure 2. Métabolisme de la tyramine alimentaire (Youdim and Weinstock 2004)

d. Nouveau rôle lié à la production d’EROs

Pancréas : Les MAOs pancréatiques pourraient participer à la libération d’insuline. En effet, une stimulation pharmacologique des récepteurs β2-adrénergiques (terbutaline) semble stimuler l’activité des MAOs pancréatiques, entraînant une modification de l‘état redox des

îlots β pancréatiques par libération d’H2O2 (Panagiotidis et al. 1993c).

7 Revue Générale

Rein : Le rein est un organe ayant l’une des activités MAO les plus importantes (Fernandes and Soares-da-Silva 1990; Fernandes and Soares-da-Silva 1992; Saura et al. 1992; Pizzinat et al. 1998). Dans les cellules du tubule proximal les MAOs sont la principale voie de dégradation de la sérotonine et de la dopamine, qui participent à la régulation de la réabsorption du sodium (Hubbard and Henderson 1995; Soares-da-Silva et al. 1996b; Aperia 2000). De plus, le peroxyde d’hydrogène produit par les MAOs lors de la dégradation de la dopamine peut, en fonction de sa concentration (et de la concentration en substrat) être prolifératif (Vindis et al. 2000) ou proapoptotique (Bianchi et al. 2003). In vivo, le peroxyde d’hydrogène produit par les MAOs lors de phénomènes d’ischémie / reperfusion chez le rat est responsable de dommages tissulaires (Kunduzova et al. 2002a; Kunduzova et al. 2002b).

Tissus adipeux : Le tissu adipeux blanc et brun de rat, et les adipocytes humains expriment la MAO, notamment la MAO-A (Pizzinat et al. 1999c), susceptible de générer du peroxyde d’hydrogène lors du métabolisme de la tyramine (Raimondi et al. 2000). De plus, le transport de glucose (Marti et al. 1998) et la production d’AMPc (Raimondi et al. 2000) par les adipocytes soient augmentés par la tyramine en relation avec la production de peroxyde d’hydrogène par les MAOs. La lipolyse est également régulée négativement par les MAOs (Visentin et al. 2003). Ces résultats indiquent un rôle important des MAOs dans la balance stockage/lipolyse du tissu adipeux, favorisant plutôt le stockage.

De nombreux autres organes expriment également l’une ou l’autre isoforme de MAO. Ainsi le cœur est un organe exprimant fortement la MAO-A (Cao Danh et al. 1984; Sawyer et al. 2002). L’expression des MAOs augmente avec l’âge dans certains organes comme le coeur (Maurel et al. 2003) et pourrait contribuer au processus de vieillissement tissulaire par le stress oxydant qu’elles engendrent (Cadenas and Davies 2000).

Substrats et inhibiteurs

La spécificité de substrat et d’inhibiteur de chacune des deux isoformes de la MAO est résumée dans le tableau 2.

8 Revue Générale a. Substrats

Il existe une spécificité de substrat chez les deux enzymes, la MAO-A métabolisant plutôt la sérotonine, la MAO-B ayant comme substrat préférentiel la β-phényléthylamine. Certains substrats sont communs, comme la dopamine et la tyramine qui sont métabolisées avec la même efficacité par les deux enzymes.

Tableau 2. Principaux substrats et inhibiteurs des MAOs (Vindis, 2001)

MAO-A MAO-A ET MAO-B MAO-B SUBSTRAT Sérotonine Dopamine b- Adrénaline phenylethylamine Noradrénaline Benzylamine Tyramine Methyl-histamine MPTP INHIBITEURS Moclobémide Milacémide RO-19-6327 REVERSIBLES Toloxatone Befloxatone RO-41-1049 brofaromine INHIBITEURS Clorgyline Pargyline L-déprényl IRREVERSIBLES LY51641 Iproniazide LY54761 Phenelzine tranylcypromine

Cependant, même si chaque isoforme a une affinité variable en fonction du substrat (chacune ayant son ou ses substrats de prédilection), à de fortes concentrations d’enzyme ou de substrat, elles métabolisent de manière moins spécifique un substrat avec lequel elles ont moins d’affinité.

Des xénobiotiques, dont l’exemple le plus connu est le MPTP, sont également susceptibles d’être dégradés par les MAOs (Trevor et al. 1987).

Parmi les substrats des MAOs, se trouvent certains dérivés méthylés de catécholamines ou de la sérotonine, produits respectivement par la catéchol-O- méthyltransferase (COMT) et la 5-hydroxyindole-O- méthyltransferase (5-HIOMT).

Enfin, les MAOs partagent certains de leurs substrats avec d’autres enzymes, comme la benzylamine, principalement métabolisée par la SSAO (semicarbazide sensitive amine oxidase) ou la méthyl-histamine, généralement métabolisée par la DAO (diamine oxidase) ou la SSAO.

9 Revue Générale Notons que parmi ces substrats, la sérotonine, un substrat plus spécifique de la MAO- A, présente des effets biologiques qui feront l’objet d’un chapitre particulier.

b. Inhibiteurs

Les inhibiteurs de MAO ont été développés pour soigner des maladies telles que la dépression. Les premiers IMAOs mis sur le marché étaient non spécifiques d’une forme de MAO et irréversibles (phénelzine, iproniazide, tranylcypromine). Leur utilisation a entraîné d’importants effets secondaires comme une hépatotoxicité, et des risques d’interaction médicamenteuse avec d’autres antidépresseurs de type tricycliques (inhibiteurs du transport de la sérotonine) ou des opiacés. De plus, du fait de leur liaison irréversible à l’enzyme, leur utilisation a entraîné des crises hypertensives baptisées « cheese-effect » car induites entre autre par une consommation de fromages, mais aussi de bière, de chocolat et plus généralement tous les aliments riches en tyramine.

L’industrie pharmaceutique a développé une large gamme d’IMAOs irréversibles ou réversibles, spécifiques de l’une ou l’autre des deux enzymes ou aspécifiques. Ces inhibiteurs appartiennent à plusieurs grandes familles :

™ Les inhibiteurs irréversibles sont reconnus par l’enzyme et convertis en intermédiaires réactifs qui réagissent avec le groupement FAD de la MAO, formant des adduits covalents stables, rendant l’enzyme inactive (Cesura and Pletscher 1992):

# Les dérivés de l’hydrazine (iproniazide, phenelzine)

# Les dérivés de la cyclopropylamine (tranylcypromine, LY51646, LY54761)

# Les dérivés acétyléniques non sélectifs (pargyline), sélectifs de la MAO-A (clorgyline), ou de la MAO-B (L-déprényl, rasagiline).

™ Les inhibiteurs réversibles du fait de leur réversibilité, n’entraînent pas d’interactions médicamenteuses ou de contraintes alimentaires (Cesura and Pletscher 1992):

# Inhibiteurs à structure oxazolidinone (toloxatone, befloxatone)

# Dérivés de la moclobémide

10 Revue Générale # Inhibiteurs à groupement 2-aminoéthyl carboxamide (RO-41-1049 et RO-19- 6327)

Pathologies associées

a. Les maladies neurodégénératives et psychiatriques

De nombreuses pathologies neurologiques sont dues à un déséquilibre dans la synthèse ou la dégradation des catécholamines et de la sérotonine.

Ainsi la sérotonine est augmentée dans certaines migraines et diminuée dans certains syndromes dépressifs et de nombreux désordres psychiatriques (certains symptômes de la maladie de Huntington, anxiété, instabilité d’humeur, impulsivité et agressivité, désordre obsessionnel compulsif, désordres bipolaires, boulimie, schizophrénie et suicide) (Bell et al. 2005). Du fait de son rôle particulier dans le sommeil, la baisse de sérotonine est également une cause d’insomnie chez les personnes dépressives (Wilson et al. 2000). Une famille de Hollandais, présentant chez ses sujets masculins une agressivité exagérée, possède une mutation du gène codant la MAO-A, et donc homozygote chez les hommes puisque situé sur le chromosome X (Brunner et al. 1993).

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative liée à une destruction des neurones dopaminergiques du ganglion basal du cerveau, impliquant une baisse de dopamine la plus connue et étudiée.

Des traitements à base d’inhibiteurs de transporteurs (inhibiteurs de ré-uptake) ou d’inhibiteurs de monoamine oxydases sont depuis longtemps utilisés pour diminuer les effets de ces maladies ; cependant de nombreux inhibiteurs de monoamine oxydases ont été retirés du marché notamment à cause du « cheese effect » ; actuellement les inhibiteurs utilisés ou en cour de développement sont souvent réversibles (moclobémide et brofaromine pour la MAO- A et lazabémide pour la MAO-B par exemple), ou spécifiques du cerveau et non des organes périphériques ce qui évite cet effet secondaire (cf. tableau 3)

11 Revue Générale Tableau 3. Inhibiteurs réversibles et irréversibles des monoamine oxydases utilisés ou ayant été utilisés en médecine (D’après http://www.cnsspectrums.com/aspx/articledetail.aspx?articleid=400)

Sélectivité Réversibilité Antidépresseur Iproniazide A+B Irréversible Phénelzine A+B Irréversible Isocarboxazide A+B Irréversible Tranylcypromide A+B Irréversible Nialamide A+B Irréversible Clirgyline A Irréversible Moclobémide A Réversible Brofaromide A Réversible

En cour de développement Ladostigil A+B (sélectif du cerveau) Irréversible M30 A+B (sélectif du cerveau) Irréversible Befloxatone A Réversible

Anti-Parkinsonien Sélégiline (déprényl) B Irréversible Rasagiline (azilect, agilect) B Irréversible lazabémide B Réversible En cour de développement M30 A+B (sélectif du cerveau) Irréversible ladostigil A+B (sélectif du cerveau) Irréversible

b. Le diabète

Les MAOs et leurs substrats sont présents dans le pancréas exocrine (Lenzen et al. 1983) et endocrine. Dans les îlots bêta la MAO colocalise avec l’insuline dans les granules de sécrétion (Adeghate and Donath 1990; Panagiotidis et al. 1993b).

Les MAOs jouent un rôle dans la régulation de la glycémie, en particulier la sécrétion d’insuline, via la production de peroxyde d’hydrogène (Panagiotidis et al. 1993c). En effet, de nombreuses études montrent que l’inhibition des MAOs stimule la sécrétion d’insuline chez des lapins (Aleyassine and Gardiner 1975; Feldman and Chapman 1975). De même, une administration de L-DOPA (précurseur d’un des substrats des MAOs, la dopamine) diminue la sécrétion d’insuline sur des îlots pancréatiques de souris (Lundquist et al. 1991). Des souris normales mises a jeun une nuit, ont une activité MAO pancréatique augmentée de 35 à 70 %, associée à une diminution de glucose et d’insuline plasmatiques, bien que sur souris obèses, l’activité MAO n’est pas modifiée par le jeune (Panagiotidis et al. 1993a).

12 Revue Générale L’activité MAO dans le pancréas est fortement réduite chez les diabétiques, et associée à une augmentation des taux tissulaires de noradrénaline, adrénaline et sérotonine (Adeghate et al. 2001). L’adrénaline augmente la sécrétion d’insuline pancréatique de sujets sains mais semble la bloquer, dans les pancréas de sujets diabétiques. Des constatations identiques ont été faites avec la noradrénaline (Lindskog and Ahren 1992), et la sérotonine (Coulie et al. 1998).

L’augmentation d’adrénaline, de noradrénaline et de sérotonine pancréatiques pourrait donc contribuer à la diminution de sécrétion d’insuline observée dans le diabète, bien qu’étant responsables d’une augmentation de cette sécrétion dans des pancréas de sujets sains.

13 Revue Générale II. Monoamine oxydases et stress oxydant

L’impact des MAOs sur la signalisation cellulaire a longtemps été associé à leur rôle dans la régulation de la concentration en substrat, par exemple dans la maladie de Parkinson, où elles constituent une cible thérapeutique ; en effet cette maladie est caractérisée par une disparition des neurones dopaminergiques, entraînant un déficit en dopamine dans le système nerveux central. Les inhibiteurs de la MAO-B (qui dégrade la dopamine) par exemple le déprényl, ont été l’une des premières approches thérapeutiques développées pour augmenter la biodisponibilité de dopamine et ainsi ralentir l’évolution de cette maladie et restent encore actuellement l’un des traitements utilisés. D’autres travaux ont attribué un rôle aux métabolites (aldéhydes) produits lors de la dégradation de leur substrat, dans la maladie d’Alzheimer par exemple (Burke et al. 2001).

Il a récemment été envisagé un autre mode d’action des MAOs impliquant la production d’EROs lors de la dégradation de leur substrat. Via cette production d’EROs et le stress oxydant ainsi généré, les deux types de monoamine oxydases sont associés à une signalisation proapoptotique, hypertrophique ou mitogène selon le type cellulaire et la concentration de substrat en présence.

Apoptose

Le rôle des MAOs dans l’induction d’une cascade pro-apoptotique a d’abord été étudié dans le système nerveux central, dans le cadre de maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ; des travaux récents menés in vitro impliquent notamment les deux monoamine oxydases (MAO-A et MAO-B), attribuant ces effets à la production de métabolites aldéhydiques neurotoxiques, mais aussi à la libération d’EROS lors de la dégradation de la dopamine dans ce processus (Nagatsu and Sawada 2006; Naoi et al. 2006; Fitzgerald et al. 2007).

La cascade de signalisation apoptotique de la MAO a été décrite sur cellules tubulaires rénales HEK293 (MAO-B), et sur différents modèles cellulaires tels que PC12 : phéochromocytome (De Zutter and Davis 2001), M14 : mélanome (Malorni et al. 1998) et neuroblastome (Yi et al. 2006) (MAO-A). Deux effecteurs en amont de MAO-A ont été décrits (Bcl2 serait antiapoptotique et son augmentation bloquerait l’effet apoptotique de MAO-A (Yi et al. 2006)) ; P38MAP kinase semble au contraire favoriser l’action de MAO-A

14 Revue Générale en augmentant l’expression de la flavoenzyme conduisant à l’apoptose de la cellule (De Zutter and Davis 2001).

L’apoptose induite par la MAO-A ou la MAO-B implique une modification du ratio Bax/Bcl2, une libération de cytochrome c, et une activation de la caspase3 (Bianchi et al. 2003; Ou et al. 2006). L’apoptose induite par les MAOs a également été décrite sur tissus rénaux et sur cardiomyocytes suite à une ischémie/reperfusion (Kunduzova et al. 2002a; Kunduzova et al. 2002b; Bianchi et al. 2005a), et dans ces deux cas, le phénomène de reperfusion est accompagné d’une augmentation de l’activité de l’enzyme, avec une augmentation de la libération de peroxyde d’hydrogène et mort cellulaire ou lésion de l’organe.

Les derniers travaux de l’équipe ont mis l’accent sur un rôle des espèces réactives de l’oxygène libérées par les MAOs dans les dommages cardiaques suite à une ischémie/reperfusion (Bianchi et al. 2005a) et dans l’apoptose de cardiomyocytes (Bianchi et al. 2005a; Krymskaya et al. 2005; Pchejetski et al. 2007).

Hypertrophie (cardiomyocytes)

Des cardiomyocytes mis en présence de sérotonine s’hypertrophient. Cette hypertrophie est due en partie au récepteur sérotoninergique 5HT2B mais également, à la production d’espèces réactives de l’oxygène engendrée par la MAO-A (Bianchi et al. 2005b). L’hypertrophie cardiaque observée est due à une phosphorylation de Erk1/2.

Prolifération

L’effet prolifératif des MAOs a été montré sur cellules rénales HEK293 (Vindis et al. 2000), et des études menées sur des cellules musculaires lisses pulmonaires ont montré que le transporteur à la sérotonine était nécessaire à la prolifération de ces cellules, suggérant un rôle en aval pour la MAO-A (Eddahibi et al. 1999; Eddahibi et al. 2000; Eddahibi et al. 2001; Lawrie et al. 2005; Morecroft et al. 2005).

Cet effet emprunte les voies classiques de la prolifération (phosphorylation et nucléarisation de Erk1/2 et activation nucléaire des promoteurs mitogènes comme GATA4).

15 Revue Générale III. Stress oxydant et athérosclérose

Les maladies cardiovasculaires

L’athérosclérose est l’une des principales causes d’apparition des maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde et coronaropathies, accident vasculaire cérébral…), qui sont la première cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés avec près de 180000 décès par an en France et 16,7 millions dans le monde (selon le « Rapport sur la santé dans le monde » de 2003 de l’OMS). La prévalence de ces maladies devrait croître dans les prochaines années en raison de l’adoption par des populations jusque-là épargnées de modes de vie occidentaux (ceux-ci étant associés à une augmentation des risques). La connaissance des facteurs de risque d’apparition de ces maladies, notamment de l’athérosclérose, et leur prévention est actuellement un enjeu de santé publique majeur.

Facteurs de risque

Divers facteurs de risque favorisent l’apparition et le développement des plaques d’athérome (Sanz et al. 2007)

♦ L’hypercholestérolémie et l’hypertriglycéridémie

♦ une pression artérielle élevée

♦ le diabète

♦ l’hérédité

♦ le tabagisme (le tabagisme a été montré comme facteur aggravant et accélérant le développement des plaques d’athérome au niveau coronarien, aortique et dans les artères des membres inférieurs).

♦ L’obésité et la sédentarité

♦ Le sexe (les hommes étant des sujets à risque par rapport aux femmes).

Chronologie du processus atheromateux

Il est possible d’établir la chronologie des principaux événements précoces de l’athérosclérose (Schachter 1997)

16 Revue Générale Î Activation et augmentation de la perméabilité endothéliale

Î Infiltration et rétention des lipoprotéines (LDLs)

Î Oxydation de ces LDLs

Î Recrutement des monocytes

Î Migration des cellules musculaires lisses vers l’intima et prolifération

Î Activation et augmentation de la perméabilité endothéliale (Hadi et al. 2005)

Les cellules endothéliales activées participent activement à l’athérogénèse. Dans des conditions normales, l’endothélium (au repos), possède surtout des propriétés antithrombogéniques en s’opposant à l’activation plaquettaire (synthèse de protéoglycanes) et à la coagulation (thrombomoduline, protéine C et S) et en favorisant la fibrinolyse (activateurs du plasminogène). L’activation des cellules endothéliales peut être induite par des forces de cisaillement et ceci entraîne une augmentation de la perméabilité et la synthèse de molécules prothrombogènes (thromboplastine tissulaire et d’inhibiteurs de l’activateur du plasminogène).

Î Infiltration et rétention des lipoprotéines (Mertens and Holvoet 2001)

Lorsque les cellules endothéliales sont activées elles synthétisent de grandes quantités de protéoglycanes. Ceux-ci sont chargés négativement et ceci entraîne de nombreuses interactions avec d’autres molécules dont les LDLs. Ce système de contact retient les lipoprotéines dans la paroi vasculaire.

Î Oxydation des LDLs (Mertens and Holvoet 2001)

L’activation de l’endothélium induit un stress oxydatif qui altère de nombreuses fonctions de l’endothélium dont le tonus vasomoteur, en réduisant la biodisponibilité de monoxyde d’azote. Celle-ci peut résulter de l’augmentation de la dégradation du NO par les radicaux libres. Le radical libre le plus impliqué dans l’inactivation du NO est l’anion

17 Revue Générale •- superoxyde (O2 ) qui semble être produit principalement par la NADH/NADPH oxydase endothéliale. L’activité de cet enzyme est régulée par les forces mécaniques (ou forces de cisaillement), par les cytokines et des hormones ; tous ces stimuli entraînent une augmentation •- soutenue de l’activité de l’oxydase. Les radicaux libres tels que O2 peuvent réagir avec le NO pour former le peroxynitrite, agent qui catalyse l’oxydation des acides gras polyinsaturés, composants essentiels des phospholipides et des esters de cholestérol dans les particules LDL.

Î Recrutement des monocytes (Kraemer 2000; Bobryshev 2006)

L’activation des cellules endothéliales induit une expression d’intégrines ou protéines d’adhésion à la surface de l’endothélium, participant à la réaction inflammatoire. En effet, ces protéines se lient spécifiquement aux récepteurs des monocytes permettant ainsi leur adhésion puis leur pénétration dans l’intima artérielle. Les LDLs oxydées jouent également un rôle de chimioattractant sur les monocytes. Une fois dans l’intima, ils se différencient en macrophages. Ceux-ci internalisent et métabolisent différents composants dont les LDLs modifiées, et deviennent spumeux.

Î Migration et prolifération des cellules musculaires lisses dans l’intima (Kraemer 2000; Willis et al. 2004; Bochaton-Piallat and Gabbiani 2005)

Sous l’impulsion de signaux chimioattractants (dont les LDLs oxydées, différents facteurs de croissance-PDGF, bFGF, TGFβ…-, et d’autres signaux chimioattractants- composants de la matrice…), les cellules musculaires lisses migrent vers l’intima. Les cellules musculaires lisses synthétisent une chape fibreuse riche en collagène, pouvant se calcifier avec le temps. La nature de la chape conditionne la stabilité de la plaque.

Ce phénomène s’auto-entretient ensuite, les macrophages et les cellules musculaires lisses, comme les cellules endothéliales pouvant oxyder des LDLs. Par la suite, certaines cellules entrent en apoptose, sous l’effet de cytokines proinflammatoires (Littlewood and Bennett 2003; Lee and Hirani 2006), de LDLs fortement oxydées (Salvayre et al. 2002). Tous les types cellulaires sont concernés par l’apoptose, contribuant à l’augmentation de volume du core lipidique acellulaire.

18 Revue Générale Les espèces réactives de l’oxygène (EROs)

a. Définition

Les espèces réactives de l’oxygène sont une famille d’entités chimiques regroupant les dérivés non radicalaires (ne possédant pas d’électron célibataire) et les radicaux libres oxygénés (espèces chimiques possédant un électron célibataire - non apparié). On peut distinguer les radicaux primaires, qui ont un rôle physiologique particulier et les radicaux secondaires, issus de la réaction des radicaux primaires avec des entités biochimiques cellulaires (lipides, protéines, glucides…) (Favier 2003; Gardès-Albert M 2003).

b. Les différents dérivés réactifs de l’oxygène

1. Dérivés primaires de l’oxygène

♦ Les dérivés primaires non radicalaires

Ils ne possèdent pas d’électrons non appariés mais sont des précurseurs des radicaux libres et sont aussi réactifs que ceux-ci.

¾ Le peroxyde d’hydrogène H2O2.

Ce n'est pas un radical libre à proprement parler mais une molécule car tous ses électrons périphériques sont appariés. Cependant, il peut générer des radicaux hydroxyle ·OH en présence de cations métalliques tels que Fe2+ (réaction de Fenton), ou Cu+.

2+ · 3+ - H2O2+ Fe → OH + Fe + OH (réaction de Fenton)

.- Il se forme par dismutation de l’anion super oxyde O2 sous l’action d’une enzyme : la superoxyde dismutase (SOD).

- + O2·- +2H+ H2O2+O2 SOD

Le peroxyde d’hydrogène, bien que moins réactif que certains autres EROs, n’en est pas moins un agent de signalisation efficace de par son effet prolongé, au radical hydroxyle à l’effet éphémère et à la demi-vie courte. De plus, en réagissant avec l’anion superoxyde, il fournit l’hydroxyle (réaction de Haber-Weiss)

19 Revue Générale 1 ¾ L’oxygène singulet O2 .

C’est une molécule mise en état d’excitation par activation photochimique de l’oxygène :

1 O2 O2

hυ ou par réaction du peroxyde d'hydrogène avec l'acide hypochlorique HOCl :

+ 1 H2O2+ HOCl H2O + H + Cl-+ O2

¾ L’acide hypochlorique HOCl.

Essentiellement produit par les myeloperoxydases leucocytaires à partir de peroxyde d’hydrogène et d’ion chlorure :

+ - H2O2+ H + Cl H2O + HOCl

¾ Le peroxynitrite ONOO- .

Il est produit par réaction du monoxyde d’azote avec un anion superoxyde

. .- - NO + O2 ONOO

♦ Les radicaux libres oxygénés

Ils possèdent un électron libre non apparié et sont extrêmement réactifs.

¾ Le radical hydroxyle .OH (le plus réactif des radicaux libres oxygénés).

Le radical hydroxyle est particulièrement délétère vis-à-vis des matériaux biologiques. Il peut se former par réaction du peroxyde d’hydrogène avec un ion ferreux (réaction de Fenton)

2+ . 3+ H2O2+ Fe OH + OH- + Fe

20 Revue Générale ou par réaction du peroxyde d’hydrogène avec l’anion superoxyde (réaction de Haber-Weiss)

.- . H2O2+ O2 OH + OH- + O2 ou sous l’effet de radiations ionisantes (rayons X ou gamma).

De par sa demi-vie courte (inférieure à la microseconde), et à la faible distance qu’il peut parcourir (moins de dix nanomètres), il diffuse peu et agit directement sur le site de production.

.- ¾ L’anion superoxyde O2 .

Il peut se former par réaction de l’oxygène avec un électron (généralement cet électron provient d’une fuite au niveau de la chaîne respiratoire mitochondriale, plus précisément l’accepteur terminal : la cytochrome oxydase du complexe IV de la chaîne de transport électronique de la membrane interne mitochondriale). Ainsi l’oxygène n’est réduit que partiellement : 2% de l’oxygène subit une réduction mono électronique au niveau de l’ubiquinone.

- . O2 + e O2 -

La NADPH oxydase est également une source importante d’anion super oxyde.

+ + . NADPH + 2O2 NADP + H + 2 O2 -

NADPH oxydase

Le radical superoxyde est moins réactif que l’hydroxyle, mais sa durée de vie est longue (Gardès-Albert M 2003) et peut diffuser loin de son lieu de production. Ce radical a peu de cibles privilégiées (les superoxyde dismutases, le cytochrome c, l’ascorbate), il réagit avec le peroxyde d’hydrogène pour fournir l’hydroxyle.

. ¾ Le radical perhydroxyle HO2

C’est la forme protonée de l’anion superoxyde (Hool 2006)

21 Revue Générale ¾ Le monoxyde d’azote ou oxyde nitrique NO. .

C’est un agent vasodilatateur (Moncada and Higgs 1993; Cosentino F 2002). Il est synthétisé par les NO synthases (NOS) selon la réaction :

. L- Arginine + O2 L-Citrulline + NO

NOS

2. Dérivés secondaires de l’oxygène

Ces radicaux se forment par réaction des radicaux primaires ci-dessus avec certains composés biochimiques de la cellule.

. ¾ Le radical peroxyle RO2

C’est un radical très réactif avec la plupart des molécules, notamment impliqué dans la propagation de l’oxydation des acides gras poly insaturés des membranes cellulaires. ° O O COOH

. ¾ Le radical alkoxyle RO COO ° O

c. Les principales sources d’espèces réactives de l’oxygène

1. Sources exogènes d’espèces réactives de l'oxygène

Elles sont surtout d’origine physique et chimique (ex radiations X ou gamma, UVA, radiolyse de l’eau, réactions photochimiques ...).

2. Sources endogènes d’EROs

♦ Sources endogènes d’EROs enzymatiques

La chaîne respiratoire mitochondriale

La chaîne respiratoire mitochondriale est constituée d’un ensemble de transporteurs d’électrons mobiles ou membranaires. Au niveau de la chaîne respiratoire a lieu une réduction contrôlée de l’oxygène en eau. Cependant ce système peut laisser fuir quelques électrons qui vont réduire partiellement l’oxygène. 2 % de l'oxygène subit une réduction mono électronique

22 Revue Générale .- (addition d'un seul électron) conduisant à la formation du radical superoxyde O2 (au niveau de l’ubiquinone ou co-enzyme Q) dont elles sont le principal site de production.

.- O2+ 1 e-→ O2

Cette réaction entraîne une accumulation de peroxyde d’hydrogène qui peut réagir avec les ions ferreux de la mitochondrie (réaction de Fenton) et produire des ions hydroxyles OH. . Le rôle du stress oxydant généré par la mitochondrie a été largement documenté dans de nombreuses pathologies, dont l’athérosclérose (Nelson et al. 2004; Ballinger 2005).

Les complexes enzymatiques du réticulum endoplasmique (cytochromes P450)

Les enzymes de la famille cytochrome p450 (CYPs) sont des monooxygénases non spécifiques, exprimées principalement dans le réticulum endoplasmique appartenant à des systèmes multi enzymatiques, incluant la NADPH-cytochrome P450 réductase et le cytochrome b5 contenant les coenzymes FAD/FMN. Cette superfamille catalyse des réactions d’oxydation de leur substrat (oxydation, péroxydation, et/ou réduction par O2 de manière dépendante de NADPH) selon la réaction suivante :

+ + RH + O2 + H + NADPH ROH + H2O + NADP

La réaction consomme une molécule d’oxygène, de 2 protons, et de 2 électrons. Dans cette réaction RH est un substrat lipophile. .

Lors de la réaction, une molécule d’oxygène doit être « activée » : elle est scindée en deux ;

1. - un atome d'oxygène est introduit dans le substrat :

RH→ROH (ω-hydroxylation)

2. - l'autre atome est réduit par 2 électrons pour donner de l'eau :

- + 1/2O2 + 2 e + 2 H → H2O (β-oxydation)

Parmi les substrats de cette réaction, on compte des substances endogènes comme le cholestérol, les stéroïdes, l’acide arachidonique (qu’ils transforment en eicosanoïdes), et des − xénobiotiques. Les CYPs produisent des ions superoxyde O2 et du peroxyde d’hydrogène

H2O2, et cette production peut avoir lieu au cours des deux étapes précédemment citées :

23 Revue Générale o Soit si l’oxygène est réduit au lieu d’être ajouté au substrat lors de l’étape de ω- hydroxylation, ceci en fonction du substrat métabolisé.

o Soit l’un des électrons peut s’échapper des flavines de l’enzyme NADPH:P450 réductase.

Les CYPs sont des sources importantes de ROS contribuant au développement de maladies cardiovasculaires, comme l’hypertension ou les dysfonctions endothéliales (facteurs de risque de l’athérosclérose) (Fleming 2001; Ramos and Moorthy 2005).

Le peroxysome

Le peroxysome est un organite intracellulaire bordé d’une membrane effectuant des réactions de péroxydation lipidique : β-oxydation des acides gras à très longues chaînes (saturés et insaturés). Il réalise également des réactions générant du peroxyde d’hydrogène dans la cellule : des enzymes oxydantes sont présentes dans cet organite : la D-amino-acide- oxydase, l’urate-oxydase, et glycolate oxydase.

Réactions catalysées par ces enzymes

D-aminoacide oxydase

D-aminoacid + H2O+ O2 → 2−oxo aminoacid + NH3 + H2O2

Urate oxydase

Acide urique + O2 → allantoïne + H2O2

Glycolate oxydase

Glycolate + O2 → glyoxylate + H2O2

Bien qu’elles représentent des sources potentielles d’EROs, à ce jour aucune étude n’a montré l’implication de ces enzymes dans la pathologie athéromateuse. En effet le péroxysome est avant tout un organite de détoxification contre les EROs (dans cet organite est localisée la catalase, une enzyme chargée de dismuter le peroxyde d’hydrogène en eau + O2).

24 Revue Générale

La xanthine oxydoréductase

La xanthine oxydoréductase est la principale enzyme de la dégradation des bases puriques. Elle a pour coenzyme un dérivé du GTP, avec un noyau ptérine et un atome de Molybdène. Sa structure comporte encore deux FAD et plusieurs centres Fer-Soufre (molybdoflavoenzyme). Sa localisation subcellulaire est encore discutée : elle est présente dans le cytoplasme (Jarasch et al. 1981), mais aurait également été détectée dans les péroxysomes (Angermuller et al. 1987; Dikov et al. 1988) . Enfin les travaux les plus récents montrent sa présence sur la membrane cellulaire externe (Rouquette et al. 1998; Frederiks WM 1999). L'enzyme comporte une forme réduite (xanthine déshydrogénase - XDH) catalysant la déshydrogénation avec le NAD+ comme coenzyme. Elle peut être convertie par oxydation en un dimère (xanthine oxydase) fonctionnant avec l'oxygène et produisant des peroxydes. In vivo, la forme réduite prédomine dans le foie et la forme oxydée dans les vaisseaux (Berry and Hare 2004).

La xanthine oxydase (XO) est une source importante de radicaux libres. Elle transforme l’hypoxanthine en xantine puis en acide urique, produisant au cours de chacune de ces deux réactions un anion superoxyde. La xanthine déshydrogénase produit quant à elle une molécule de peroxyde d’hydrogène par molécule d’hypoxanthine hydrolysée.

Xanthine oxydase

.- Hypoxanthine + H2O+ O2 → xanthine + O2 → Acide urique

Xanthine déshydrogénase

Hypoxanthine + H2O+ NAD+ → xanthine + (NADH, H+)

Xanthine + H2O + O2 → Acide urique + H2O2

·- Au niveau vasculaire, la xanthine oxydase fournit 25% des ions superoxyde O2 (Guzik et al. 2006) et est fortement impliquée dans les maladies cardiovasculaires (Madamanchi et al. 2005)

25 Revue Générale La NADPH oxydase et les NOX

> La NADPH oxydase phagocytaire et la myéloperoxydase des polynucléaires

La NADPH oxydase est un complexe enzymatique multi protéique, appartenant aux phagocytes (polynucléaires neutrophiles et éosinophiles, monocytes et macrophages) et aux lymphocytes B. Elle catalyse le transfert d'électrons de son substrat le NADPH à l'accepteur final l'oxygène entraînant la production d'anions superoxyde et ses dérivés de réduction : le peroxyde d'hydrogène, le radical hydroxyle et l'oxygène singulet. Ces composés oxydants sont capables de tuer les micro-organismes préalablement endocytés.

+ + .- NADPH + 2O2 NADP + H +O2

Les neutrophiles posssèdent également une myéloperoxydase qui catalyse la réaction du peroxyde d’hydrogène produit à partir de l’anion superoxyde avec des ions chlorure pour produire l’ion hypochloride OCl− et participe à la lutte contre les agents pathogènes

- - H2O2 + C l HOCl + OH

HOCl OCl- + H+

La NADPH phagocytaire semble impliquée dans l’oxydation des LDLs, et de différentes cibles et dans la mort cellulaire des macrophages (apoptose) induite par la captation d’oxystérols (Leonarduzzi et al. 2006). Des effets similaires ont été décrits pour la myéloperoxydase (Madamanchi et al. 2006). Il semble que la NADPH oxydase fournisse plus ·- de 60% des ions superoxyde O2 (Guzik et al. 2006). La NADPH oxydase jouerai un rôle actif dans l’athérosclérose (Ushio-Fukai and Alexander 2004).

> Les NOX

La NADPH oxydase phagocytaire est longtemp restée la seule enzyme décrite spécialisée dans la génération d’ions superoxyde, dans le but de défendre l’organisme contre une invasion de microorganismes. Ces 5 dernières années, de nouveaux membres de la famille de la NADPH oxydase phagocytaire, les NOX (NADPH oxydase), comprenant sept homologues, ont été découverts. Elles sont exprimées dans de nombreux tissus dont le système vasculaire. A ce niveau, l’un de leurs rôles physiologiques serait d’assurer un tonus vasculaire. Les NOX pourraient également jouer un rôle dans la régulation de la prolifération cellulaire. Elles jouent également un rôle dans la physiopathologie de l‘athérosclérose via la production d’EROs (Cai et al. 2003; Ushio-Fukai and Alexander 2004).

26 Revue Générale Les NO synthases

Elles catalysent la réaction suivante :

. L- Arginine + O2 L-Citrulline + NO

NOS

Cette réaction dépend de nombreux co-facteurs : NADPH, FAD, FMN, BH4 (tetrahydrobioptérine) et fer.

Il existe quatre isoformes de NOS : eNOS (endothélial NOS) décrite pour la première fois dans des cellules endothéliales, nNOS (neural NOS) découverte dans les neurones, toutes les deux dépendantes du calcium et constitutivement actives, et iNOS (inductible NOS) indépendante du calcium (Sessa 1994) ; la quatrième NOS est une NOS mitochondriale découverte récemment (Boveris et al. 2002), et localisée dans la membrane mitochondriale interne. Ces quatre isoformes sont largement distribuées dans l’organisme (Nathan and Xie 1994; Boveris et al. 2002), et parfois co-exprimées dans un même type cellulaire.

> eNOS et nNOS

Elles nécessitent une augmentation du calcium/Calmoduline intracellulaire (Abu-Soud and Stuehr 1993). Le taux basal de NO. synthétisé est relativement faible, mais peut être augmenté suite à une stimulation par des agonistes, comme l’acétylcholine (Bredt and Snyder 1994; Harrison 1997; Tsutsui 2004). Dans les cellules vasculaires la eNOS produit du NO. provoquant une vasodilatation. Au niveau du système nerveux central et périphérique où elle est exprimée, la nNOS joue un rôle dans la réponse neuronale.

> iNOS

iNOS fonctionne indépendamment des concentrations intra-cellulaire en calcium/calmoduline. Son expression est stimulée par des cytokines pro-inflamatoires comme le TNF alpha, les interleukines et la présence d’agents pathogènes. Contrairement aux deux autres NOS, iNOS produit des quantités de NO. très importantes (Tsutsui 2004). eNOS et iNOS sont impliquées dans l’athérosclérose, bien que la balance entre le bénéfice apporté par la production de NO par eNOS (la déficience de cette enzyme étant associée à un développement des lésions athéromateuses) et les facteurs de risque de développement

27 Revue Générale comme le diabète engendrés par un excès de iNOS soient encore imparfaitement connus (Cook 2006).

> mtNOS

L’activité de mtNOS est régie par le potentiel de membrane (Korshunov et al. 1997; Kato and Giulivi 2006; Valdez et al. 2006). Une diminution de ce potentiel, provoque un effondrement de la production mitochondriale de NO, alors qu’une hyperpolarisation membranaire potentialise cette production. D’autres signaux, comme par exemple le choc septique, stimulent également cette enzyme (Boveris et al. 2002). A ce jour, cette enzyme n’a pas été impliquée dans l’athérosclérose.

Les cyclooxygénases et lipooxygénases (Vila 2004)

L'activation des phospholipases peut induire une libération d'acide arachidonique qui est métabolisé en prostaglandines et leucotriènes. Cette activité implique un transfert d'électrons qui pourrait initier la formation d'espèces réactives de l’oxygène, par la cyclo-oxygénase et la lipoxygénase.

Les monoamine oxydases

Comme cela a été évoqué lors du chapitre consacré à ces enzymes, lors de l’hydrolyse de leur substrat (amines biogènes), les monoamine oxydases, situées sur la membrane mitochondriale externe, libèrent de façon équimolaire du peroxyde d’hydrogène. L’implication des MAOs et de la dégradation de leurs substrats dans l’athérogénèse n’a jamais été étudiée. Cependant, elles peuvent induire une prolifération (Vindis et al. 2000; Lawrie et al. 2005; Morecroft et al. 2005) ou une apoptose (Bianchi et al. 2003; Bianchi et al. 2005a) cellulaires selon le type cellulaire et la concentration en substrat.

♦ Sources endogènes d’EROs non enzymatiques

L'accumulation d'équivalents réducteurs tels que le NADPH et le NADH (Valdez et al. 2000), le NADPH, les quinones (Boveris et al. 1976; Cadenas et al. 1980) et les

28 Revue Générale flavoprotéines qui peuvent réagir entre eux ou avec l'oxygène, pourrait induire la formation d'EROs.

L’auto-oxydation des catécholamines

°- L’apparition de radicaux superoxydes O2 peut résulter de l'auto-oxydation (oxydation par l'oxygène) de composés tels que des catécholamines, en particulier la dopamine (Graham et al. 1978; Klegeris et al. 1995). En effet, les catécholamines possèdent une structure dihydroquinone QH2, facilement oxydable, notamment en présence d’ions métalliques tels que le fer Fe2+ ou le cuivre Cu2+.

- - Chaîne d’initiation : QH2 + OH QH + H20

- QH + 02 QH· + 02·-

+ · QH- + 02·- + 2H QH + H202

+ Chaîne de propagation : QH·+ 02 Q + 02·- + H

· QH + QH· Q + QH2

+ Chaîne de terminaison : 02·- + 02·- + 2H H202 + 02

Les produits de cette auto-oxydation (semiquinones, quinones et anion superoxyde °- O2 ) sont généralement toxiques pour les cellules (Tanaka et al. 1991; Ben-Shachar et al. 1995; Spencer et al. 1998; Stokes et al. 1999).

L’acide urique produit lors de la dégradation des bases puriques par la xanthine déshydrogénase ou la xanthine oxydase est un puissant antioxydant, mais l’enzyme produit en même temps du peroxyde d’hydrogène ou des ions superoxydes selon qu’elle soit sous forme réduite ou oxydée dimérique (xanthine oxydase). De plus, des études montrent que dans le cas de l’athérosclérose, l’acide urique est un facteur aggravant puisque il cause des dommages au niveau de l’endothélium, diminue la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (dont nous avons vu précédemment le rôle protecteur) (Culleton et al. 1999; Hamed and Nabeshima 2005).

Espèces réactives de l’oxygène et athérosclérose

a. LES EROs dans l’athérosclérose

Les espèces réactives de l’oxygène jouent un rôle primordial dans l’athérosclérose. Ces espèces réactives de l’oxygène participent à la génération de lipoprotéines oxydées (LDL

29 Revue Générale ox) qui, selon leur niveau d’oxydation seront mitogènes ou pro-apoptotiques pour les cellules vasculaires (CML et CE) et induisent la génération de cytokines (Puddu et al. 2005).

Le peroxyde d’hydrogène H2O2 joue un rôle important dans le stress oxydant, non seulement car il est à l’origine d’autres EROs (HOCl, .OH) mais aussi car il agit directement sur les cellules : il peut, selon sa concentration être toxique ou prolifératif (Herbert et al. 1996; Singh et al. 1998; Irani 2000).

Le rôle du radical hydroxyle .OH dans les différentes pathologies cardiovasculaires

(athérosclérose, hypertension) a été également largement documenté (Touyz 2003; Bergamini .- et al. 2004). L’anion superoxyde O2 est aussi un facteur majeur dans le développement de l’athérosclérose (White et al. 1994) et de l’hypertension (Nakazono et al. 1991).

Le monoxyde d’azote NO. (provenant essentiellement de eNOS, au niveau des cellules endothéliales) régule le développement des maladies cardiovasculaires (dont l’athérosclérose) (Naseem 2005). Il agit notamment en régulant l’apoptose des différents types cellulaires impliqués dans la formation de la plaque, plus particulièrement les macrophages, et en inhibant la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires. Son rôle est plutôt protecteur car une déficience en eNOS est associée à une augmentation des lésions. Cette molécule semble avoir un rôle ambivalent puisque le diabète, qui est un facteur de risque de l’athérosclérose et des maladies cardiovasculaires, est associé à une surexpression de iNOS et une surproduction de NO. (Cook 2006). La balance entre le bénéfice et le risque lié à cet ERO reste à élucider.

Les cellules vasculaires génèrent également des quantités importantes d’espèces réactives de l’oxygène : ainsi, les CML produisent du peroxyde d’hydrogène sous l’effet de facteurs de croissance (PDGF (Sundaresan et al. 1995)) ou de ligands de certains récepteurs à sept domaines trans-membranaires comme la thrombine (Patterson et al. 1999). Cette production est nécessaire afin d’observer la prolifération des CMLs ; Un effet mitogène direct des CMLs est induit par le peroxyde d’hydrogène (Rao and Berk 1992; Rao et al. 1993). Les EROs semblent également indispensables à la survie des CMLs, puisque une surexpression de la catalase bloque la prolifération et favorise l’apoptose de ces cellules (Tsai et al. 1996; Brown et al. 1999). Enfin, des concentrations exogènes élevées d’EROs provoquent la mort cellulaire par apoptose des CMLs (Li et al. 1997a; Li et al. 1997b). Certains suppresseurs de tumeurs, comme p53, qui joue un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire, produisent des EROs nécessaires à leur signalisation : une surexpression de p53 est anti-

30 Revue Générale mitogène et pro-apoptotique, et génère des EROs intra-cellulaires. Cette production est indispensable à l’effet de p53, puisque lorsqu’elle est supprimée, l’effet pro-apoptotique de p53 est diminué (Speir et al. 1994).

La survie et la mort des cellules endothéliales est également influencée par les EROs : la mort des cellules endothéliales est un évènement important dans la formation de la plaque d’athérome et cet évènement a été largement étudié ; les EROs extra-cellulaires et les molécules modifiées par oxydation (par exemple LDLox) et les EROs intra-cellulaires générés notamment par la NO synthase et la NADPH oxydase sont très toxiques pour les cellules endothéliales (Li et al. 1999; Ray and Shah 2005).

La survie des cellules endothéliales est un phénomène moins étudié ; pourtant il semble que les EROs (notamment produites par la NADPH oxydase) jouent également un rôle dans ce phénomène lors de stimulations pro-apoptotiques des cellules endothéliales (Deshpande et al. 2000).

b. Sources d’EROs produites par les cellules vasculaires

Les cellules vasculaires possèdent de nombreuses enzymes susceptibles de générer des EROs (cyclooxygénases et lipoxygénases, enzymes de la chaîne mitochondriale, cytochrome p450, xanthine oxydase) évoquées précédemment. Cependant la NADPH oxydase non phagocytaire (NOX), exprimée tant dans les CMLs que dans les cellules endothéliales, semble jouer un rôle majeur, comme nous l’avons détaillé dans le chapitre consacré à cette enzyme. La NO synthase est également un producteur d’EROs.

c. Conséquences cellulaires du stress oxydant

Les conséquences biologiques du stress oxydant sont extrêmement variables selon la dose et le type cellulaire (macrophages, cellules endothéliales, cellules musculaires lisses, fibroblastes). De faibles stress augmentent l’activation de signaux mitogènes et la prolifération cellulaire (Natarajan et al. 1995; Madamanchi et al. 2001; Moon et al. 2001; Shen et al. 2001) ainsi que l'expression de protéines d'adhésion (Rojas et al. 2006), des stress moyens (mais physiologiques) faciliteront les dommages à l’ADN, aux mitochondries et l'apoptose (Escargueil-Blanc et al. 1997; Steinberg 1997; Kockx and Herman 1998; Ballinger et al. 2000) alors que de forts stress provoqueront une nécrose, la balance entre apoptose et

31 Revue Générale nécrose variant d’un type cellulaire à l’autre (Lizard et al. 1999; Burlacu et al. 2001) et des stress extrêmes désorganiseront la membrane cellulaire, entraînant des lyses immédiates.

d. Principales signalisations intra-cellulaires activées par le stress oxydant

¾ Apoptose

La mort cellulaire programmée ou apoptose est un phénomène normal, tout au long de la vie d’un organisme, avec un pic au moment de l’organogenèse. Ce phénomène est très finement régulé, mais des régulations peuvent parfois se produire, entraînant des pathologies diverses. Au niveau cardiovasculaire, l’apoptose serait une étape initiatrice de la formation de la plaque d’athérome, et dans les étapes les plus tardives, comme la fragilisation de plaques puis leur rupture (Harmon and Allan 1997; Dimmeler and Zeiher 2000; Patel et al. 2000; Salvayre et al. 2002). L’apoptose touche tous les types cellulaires impliqués dans la formation de la plaque : les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les macrophages.

¾ Survie

Les bénéfices cellulaires des EROs sont essentiellement retrouvés dans les cellules musculaires lisses où ils sont antiapoptotiques ; en effet, l’angiotensine II et le PDGF deux facteurs de croissance antiapoptotiques et promitotiques nécessitent une production d’EROs pour protéger les CMLs de l’apoptose notamment par l’activation de la NADPH oxydase (Sundaresan et al. 1995; Zafari et al. 1998; Ushio-Fukai and Alexander 2004). Un traitement par des antioxydants a même un effet apoptotique (Tsai et al. 1996; Brown et al. 1999). Les EROs jouent également un rôle important dans la balance apoptose/survie des macrophages (Baran et al. 2004) ; un phénomène original a même pu être démontré : de faibles concentrations de LDL oxydées induiraient l’expression de la MnSOD, protégeant par la suite les macrophages de la cytotoxicité induite par des concentrations supérieures en LDL oxydées (Shatrov and Brune 2003).

32 Revue Générale ¾ Adhésion

La E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1 sont les principales molécules d’adhésion exprimées à la surface des cellules musculaires lisses et endothéliales (Pastore et al. 1999; Pueyo et al. 2000; Brasier et al. 2002). Leur expression est dépendante de facteurs de transcription de la famille de NF-κB (Marui et al. 1993). Ce facteur de transcription ubiquitaire, dont l’activation est redox-sensible est impliqué dans la pathogenèse de l’athérosclérose (Brand et al. 1996).

¾ Migration

La migration vers le site de formation de la plaque concerne essentiellement les cellules musculaires lisses, qui passent de la média à l’adventice, et les macrophages qui vont s’infiltrer dans l’adventice.

Migration des macrophages

Le recrutement des macrophages se fait grâce à l’expression extra-membranaire au niveau de l’endothélium de chimiokines comme MCP-1 (macrophage chemotactic protein-1) (Yoshimura and Yuhki 1991; Gu et al. 1998; Pizzinat et al. 1999c). MCP-1 est une petite protéine (76 acides aminés) de la famille des CC chimiokines. MCP-1 est exprimée essentiellement par les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, macrophages et cellules spumeuses (Cushing et al. 1990; Shin et al. 2002; Sheikine and Hansson 2004). Elle est impliquée dans le recrutement des lymphocytes et macrophages sur le site de l’inflammation.

L’expression de MCP-1, comme celle des molécules d’adhésion, se fait sous le contrôle du facteur de transcription rédox-sensible NF-κB. De nombreux agents oxydants ou issus d’une dégradation oxydative, comme par exemple l’angiotensine II, qui stimule la NADPH oxydase (Brasier et al. 2002), ou les LDL oxydées (Cushing et al. 1990), induisent sa sécrétion. Les macrophages sous l’effet de certains agents inflammatoires (TNF-α, interféron-γ) stimulent aussi eux-mêmes son expression par les cellules endothéliales (Rimbach et al. 2000; Kim et al. 2007).

33 Revue Générale Migration des cellules musculaires lisses

La migration des cellules musculaires lisses vers l’intima du vaisseau se fait sous l’effet de chimiokines. Une étude originale a montré que MCP-1, connue pour son effet chemoattractant sur monocytes, permet également la migration de cellules musculaires lisses, via l’induction de la NADPH oxydase et donc la production d’EROs (Lo et al. 2005). L’effet chemoattractant du PDGF et de la thrombine est également médié par les EROs (Wang et al. 2004; Weber et al. 2004).

¾ Prolifération

Les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses sont les principales cellules à proliférer dans la plaque. Divers agonistes font proliférer ces deux types cellulaires (PDGF, VEGF, angiotensine II, LDL oxydées). La production d’EROs intracellulaires – souvent provenant de l’activation de la NADPH oxydase- est nécessaire à leur effet (Hordijk 2006). Les voies mitotiques classiques activées sont PI3 kinase/Akt (Chien et al. 2003), MAP kinases (Erk 1-2), facteurs de transcription c-fos et c-jun (AP-1) et NF-κB (Chakraborti and Chakraborti 1998) qui sont aussi bien activées par un apport exogène de peroxyde d’hydrogène (Sundaresan et al. 1995; Cai 2005) que par des molécules tels les LDL faiblement oxydées (Robbesyn et al. 2003; Seibold et al. 2004) et permettent la progression dans le cycle cellulaire.

34 Revue Générale

IV. La Sérotonine

La sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) est une amine biogène hydroxy- indolique provenant de l'hydroxylation et de la décarboxylation du tryptophane (Trp). Elle est à la fois un neurotransmetteur dans le système nerveux central et une neurohormone déversée dans la circulation

Synthèse et dégradation

La sérotonine est synthétisée à partir du Trp, acide aminé essentiel de structure indolique. La synthèse a lieu dans le compartiment cérébral (où la demi-vie de la sérotonine est de quelques minutes) dans les neurones sérotoninergiques et également dans le compartiment extra-cérébral (où la demi-vie de la sérotonine est d'une dizaine d'heures) essentiellement dans les cellules entérochromaffines du tractus digestif (cellules de Kultchisky-Masson). Le Trp est tout d'abord oxydé par la Trp-hydroxylase en 5-hydroxy- tryptophane, puis décarboxylé en sérotonine par une amino-acide-décarboxylase (figure 3.).

Figure 3. Synthèse de la sérotonine (D’après http://www.pharmacorama.com/Rubriques/Output/Serotoninea2.php)

La principale voie de dégradation de la sérotonine fait intervenir une déamination oxydative par une mono-amine-oxydase (MAO) en 5-hydroxy-indolylacétaldéhyde, puis en 5- HIAA (acide 5-hydroxy-indolylacétique acide) par une aldéhyde-réductase ou en 5-

35 Revue Générale hydroxytryptophol par un aldéhyde réductase (Figure 4a.). Une faible partie (2 %) est acétylée pour donner ensuite naissance à la mélatonine (N-acétyl-5-méthoxytryptamine) (figure 4b.).

a

b

Figure 4. Dégradation de la sérotonine a. Principale voie de dégradation de la sérotonine par la MAO-A (D’après http://www.pharmacorama.com/Rubriques/Output/Serotoninea2.php) b. Acétylation de la sérotonine en mélatonine (N-acétyl-5-méthoxytryptamine)

(d’après http://www.pharmacorama.com/Rubriques/Output/Serotoninea2.php)

36 Revue Générale Stockage

La sérotonine est synthétisée et stockée au niveau central dans les neurones sérotoninergiques ; au niveau extra-cérébral elle est synthétisée par les cellules entéro- chromaffines intestinales et captée activement et passivement par les plaquettes sanguines (Launay et al. 1994) où elle est stockée dans les granules denses avec ATP et Ca2+. Ainsi, la sérotonine sanguine est essentiellement concentrée dans les plaquettes.

Rôle

La sérotonine intervient dans de nombreux systèmes (Hindle 1994):

- système vasculaire : effet vasoconstricteur direct, par action sur les cellules musculaires lisses du vaisseau, et effet vasodilatateur indirect sur un vaisseau en constriction (via le système nerveux autonome) ; effet sur les plaquettes : agrégation et "shape change"

- rein : antidiurétique

- système musculaire autonome : effet tonique sur les fibres lisses, augmentation du péristaltisme intestinal, accélération du transit.

- système nerveux : intervention de la sérotonine dans les syndromes dépressifs, la schizophrénie, l'anxiété, les troubles du comportement, la maladie d'Alzheimer, la migraine, le sommeil, le vieillissement cellulaire, les encéphalites spongiformes;

- axe hypothalamo-hypophysaire : sécrétion de l'hormone de croissance, de la prolactine, de la LH, de la TSH ;

- régulation de la réponse immunitaire, médiation de l'hypersensibilité immédiate aux côtés de l'histamine.

Les récepteurs à la sérotonine

Traditionnellement les récepteurs à la sérotonine sont classés selon le mécanisme de transduction qu’ils entraînent : les récepteurs 5-HT1 et 5-HT5 sont considérés comme des inhibiteurs d’adénylyl cyclase, et les récepteurs 5-HT2 comme des activateurs de

37 Revue Générale phospholipase C, 5-HT4, 5-HT6 et 5-HT7 comme des activateurs d’adénylyl cyclase. Le récepteur 5-HT3 est un récepteur canal.

Tableau 4. Identification et fonction des récepteurs sérotoninergiques (Nagatomo et al. 2004).

38 Revue Générale Sérotonine et athérosclérose

Les effets de la sérotonine dans le système cardiovasculaire sont complexes. Elle est impliquée dans des mécanismes centraux et périphériques, via ses nombreux récepteurs. Elle est souvent associée à la balance bradycardie/ tachycardie, hypotension/ hypertension, vasoconstriction/ vasodilatation (Villalon et al. 1997; Frishman and Grewall 2000). Ainsi à faible dose elle induit une vasodilatation (via son récepteur 5-HT1A), mais à fortes doses elle provoque une vasoconstriction via les récepteurs 5-HT1B/D (Akin and Gurdal 2002) et 5-HT2A (Villazon et al. 2002).

La sérotonine est fortement impliquée dans de nombreuses maladies cardiovasculaires (Kaumann and Levy 2006). La sérotonine circulante est essentiellement stockée dans les plaquettes, et libérée lors de l’activation plaquettaire ; elle induit une agrégation plaquettaire (Hilton and Cumings 1971).

De nombreux travaux ont mis en lumière les propriétés mitogènes de la sérotonine sur cellules musculaires lisses via des récepteurs 5-HT2, en particulier le récepteur 5-HT2A (Nemecek et al. 1986; Kavanaugh et al. 1988; Araki et al. 1990; Lee et al. 1991; Pakala et al. 1997; Hayashi et al. 2003), mais également sur cellules endothéliales, via le récepteur 5-HT2 (Pakala et al. 1999).

Des études montrent également la capacité de la sérotonine induire la migration des cellules musculaires lisses (Tamura et al. 1997; Day et al. 2006). La migration des cellules musculaires lisses d’artères pulmonaires passe par le récepteur 5-HT4 et par une réorganisation du cytosquelette d’actine AMP cyclique dépendante, et dépendante de canaux chlore (Cl-) (Day et al. 2006).

La sérotonine pourrait d’ailleurs jouer un rôle important dans l’invasion néointimale par les cellules musculaires lisses (migration et prolifération étant deux évènements clé).

Signalisation cellulaire de la sérotonine dans les cellules vasculaires

Les travaux menés sur la signalisation cellulaire induite par la sérotonine au niveau cardiovasculaire concernent surtout la signalisation récepteur-dépendant (Nagatomo et al. 2004). La sérotonine circulante est essentiellement stockée dans les plaquettes, et libérée lors de l’activation plaquettaire ; elle induit une agrégation plaquettaire (Hilton and Cumings 1971; Villazon et al. 2002).

39 Revue Générale

Il semble que les récepteurs à la sérotonine 5-HT1B/D (Ishida et al. 2001; Liu et al. 2004b) et 5-

HT2A (Tamura et al. 1997; Sharma et al. 1999; Nagatomo et al. 2004) soient les principaux récepteurs responsables des effets de la sérotonine sur cellules musculaires lisses impliqués dans les maladies cardiovasculaires et l’athérosclérose.

La prolifération des cellules musculaires lisses passe par l’activation de voies de signalisation classiques (MAP kinases et tyrosine kinases) (Fanburg and Lee 1997).

L’équipe de Fanburg a également décrit un l’importance du stress oxydant généré par la sérotonine sur cellules musculaires lisses vasculaires, responsable de son effet mitogène (Lee et al. 1994; Lee et al. 1998a; Lee et al. 1998b; Lee et al. 1999; Lee et al. 2001), mais la source des espèces réactives de l’oxygène n’est pas précisée ; selon les auteurs elle serait cependant MAO-indépendante (Lee et al. 1999).

Des travaux récents sur cellules musculaires lisses pulmonaires (dans le cadre d’études sur l’hypertension pulmonaire) ont montré que la sérotonine peut aussi agir via son transporteur (SERT) (Eddahibi et al. 1999; Eddahibi et al. 2000; Eddahibi et al. 2001; Lawrie et al. 2005; Morecroft et al. 2005).

Différentes voies de signalisation mitogènes sont envisagées quant à l’effet prolifératif de la sérotonine en aval des récepteurs 5-HT2A (revues par (Nagatomo et al. 2004) et 5-HT1B/D (Liu et al. 2004b) ou via son transporteur (Lawrie et al. 2005; Morecroft et al. 2005). Cependant les mécanismes activés en aval de cette dernière voie restent encore peu étudiés.

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Objectif du travail

Objectif du travail Objectif du travail

Actuellement le rôle joué par la sérotonine dans l’athérosclérose a été exploré dans le cadre d’une voie de signalisation faisant intervenir l’un de ses récepteurs. De nombreux travaux ont notamment mis en lumière les propriétés mitogènes de la sérotonine sur cellules musculaires lisses via ses récepteurs, en particulier le récepteur 5-HT2A (Nemecek et al. 1986; Kavanaugh et al. 1988; Araki et al. 1990; Lee et al. 1991; Pakala et al. 1997; Hayashi et al.

2003) et le récepteur 5-HT1B/D (Ishida et al. 2001; Liu et al. 2004b), suggérant un rôle majeur de cette voie de signalisation dans les maladies cardiovasculaires et l’athérosclérose. Par ailleurs, l’effet mitogène de la sérotonine nécessite la génération d’un stress oxydant (Lee et al. 1994; Lee et al. 1998a; Lee et al. 1998b; Lee et al. 1999; Lee et al. 2001).

Le stress oxydant joue un rôle primordial dans le processus athéromateux (oxydation des LDLs, rôle de ces LDLs oxydées et des radicaux libres oxygénés dans la prolifération, la migration ou l’apoptose des principaux types cellulaires impliqués dans la formation de la plaque d’athérome : cellules endothéliales, musculaires lisses ou macrophages).

Les MAOs produisent du peroxyde d’hydrogène lors de la dégradation de leur substrat, induisant un stress oxydant lors d’ischémies/reperfusions (rénale ou cardiaque) ; ceci entraîne une apoptose (sur cellules rénales et cardiomyocytes), une prolifération (cellules rénales) ou une hypertrophie cellulaire selon la concentration en substrat mis en présence et le type cellulaire. La sérotonine est l’un des substrats de la MAO-A. Son rôle dans la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires a été décrit dans le cadre d’une stimulation de son récepteur, mais jusqu’à présent, aucun rôle de la MAO n’a été démontré dans l’effet prolifératif de la sérotonine sur ces cellules.

Ce travail a pour objectif d’étudier le rôle que peut jouer cette enzyme, indépendamment du récepteur sérotoninergique, et plus généralement le rôle du stress oxydant à faible concentration (peroxyde d’hydrogène à faible concentration), in vitro dans la prolifération des cellules musculaires lisses, ainsi que les voies de signalisation activées en aval, et in vivo l’implication des MAOs dans la formation des lésions athéromateuses précoces.

Pour cela, la première partie de mon travail de thèse a consisté à étudier l’implication du stress oxydant induit par la MAO-A sur l‘effet prolifératif de la sérotonine et de la tyramine. Après avoir vérifié l’expression de la MAO-A dans les cellules, et avoir déterminé la concentration mitogène en sérotonine, et par l’utilisation de différents inhibiteurs

41 Objectif du travail (inhibiteurs pharmacologiques de MAO, si RNA spécifiques et antioxydants notamment) et d’une amine biogène n’ayant pas de récepteur connu mais substrat des MAOs (la tyramine), nous avons conclu à l’implication des MAOs dans l’effet prolifératif de la sérotonine. Le mécanisme impliqué dans la signalisation mitogène de la tyramine nécessite l’activation d’une voie de signalisation mitogène de stress, décrite précédemment par l’équipe (voie MMP2/sphingomyéline/céramide/sphingosine/sphingosine 1-phosphate).

Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons étudié le mécanisme par lequel le stress oxydant induit lors de la dégradation de la tyramine par la MAO-A, active la voie MMP2/sphingolipide (rôle de la pro-proteine convertase furine, et de MT1-MMP), et les conséquences sur la génération de sphingosine 1-phosphate (activation de la sphingosine kinase 1). Ce travail a été réalisé en utilisant directement du peroxyde d’hydrogène H2O2, afin de modéliser plus facilement le système.

Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié in vivo l’effet antiathérogène de différents inhibiteurs de MAO (pargyline, iproniazide, phénelzine), sur des souris apoE-/-, modèles d’athérosclérose. L’effet de ces molécules a été comparé à celui de dérivés hydraziniques, ne présentant pas de propriétés IMAO connues. Ces animaux ont été traités de l’age de quatre semaines à vingt semaines avec les différentes molécules. Les lésions précoces ont ensuite été quantifiées et comparées en fonctions des traitements.

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Matériels Et Méthodes

Matériels et Méthodes Matériels et Méthodes

Animaux :

Des souris ApoE knock-out (ApoE-/-) (Charles River, les Oncins France) de quatre semaines, recevant une alimentation standard, ont été traitées deux fois /semaine par de la pargyline (60mg/kg i.p) pendant 14 semaines. Après sacrifice les cœurs récupérés sont inclus dans du TissueTek et des coupes de 10µm d’épaisseur sont réalisées au niveau des sinus aortiques (selon la méthode de Paigen (Paigen et al. 1985)) et colorées à l’Oil Red O avec contre coloration à l’hématoxyline ; les plaques d’athérome sont ensuite quantifiées en µm2 grâce au logiciel Cyberview 3.0.

Immunohistochimie

Les sinus aortiques sont coupés, fixés à l’acétone et conservés à -80°C jusqu’à utilisation. L’anticorps anti 4-HNE (Oxis, ref : 24325) est dilué au cinquantième et incubé une heure à température ambiante.

La révélation se fait par utilisation du kit ARK (DAKO, ref. K3954). Les noyaux cellulaires sont contre-colorés à l’hématoxyline. Les lames sont montées avec du liquide de montage eukit.

Lignées et culture cellulaire

Les cellules musculaires lisses d’artère fémorale de lapin (RFA-SMC) (American Type Cell Culture, Rockville, Maryland, USA) sont cultivées en routine dans du RPMI + Glutamax supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté, à 37°C sous

5% de CO2, en atmosphère humide. Les RFA-PDX sont des RFA-SMC transfectées par un plasmide contenant le gène codant l’α1-antitrypsine Portland (protéine inhibiteur de furine) et cultivées dans un milieu contenant un facteur de sélection (G418 à 0.4mg/ml) ; le plasmide a été donné par Gary Thomas, Portland (Anderson et al. 1993). Les RFA-SMC clone 3.2 et clone 5.1 sont des RFA-SMC transfectées respectivement par une construction contenant une forme constitutivement active et une forme dominant-négatif de MT1-MMP (plasmides donnés par Alex Strongin, La Jolla (Golubkov et al. 2005)), et sélectionnées pour leur résistance à la zéocine (0.4mg/ml).

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Matériels et Méthodes Les fibroblastes MMP2+/+ et MMP2-/- sont issus de fibroblastes embryonnaires murins (Itoh et al. 1997; Oh et al. 2004) issus de souris knockout pour la métalloprotéinase MMP2 (MMP2 -/-) ou sauvages (MMP2 +/+). Les fibroblastes Src K +/+ et Src K-/- dérivent de fibroblastes embryonnaires murins C3H-10T1/2 transfectés avec c-Src K (Src K +/+) ou pp60c-SrcK dominant négatif déficient en activité kinase (Src K-/-, clone 430c-Src) (don du Dr.Weber, Charlotteville) (Chen et al. 1987). Les fibroblastes sont cultivés en milieu DMEM supplémenté par 10% de SVF décomplémenté à 37°C sous 5% de CO2, en atmosphère humide ; le milieu de culture des fibroblastes murins transfectés (Src K +/+ et Src K-/-) contient en plus un facteur de sélection (G418 à 0.4mg/ml).

Quelle que soit la lignée, les cellules sont ensemencées à une densité de 25000-50000 cell./ml., et privées en sérum (RPMI +Glutamax sans SVF) 24 à 48 heures avant toute stimulation.

♦ Transfection des SiRNAs

Les cellules sont ensemencées la veille de la transfection en DMEM 10% SVF. Les cellules sont transfectées avec les SiRNA (100nM final) et 9,3mM de CaCl2 dans une solution de Hepes Buffered Saline Phosphate (HBSP) (140mM NaCl, 0.75mM Na2HPO4, 6 mM glucose, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, pH 7.05). Les cellules sont incubées avec ce mix 14 à 16 heures à 37°C, 5%CO2. Le lendemain le milieu contenant les SiRNA est remplacé par du RPMI + 10%SVF. Au bout de 24 heures elles sont privées et stimulées.

Mesures d’espèces réactives de l’oxyène et paramètres d’oxydation :

a. Mesure de la production d’EROs intracellulaires

La mesure de la production d’espèces réactives de l’oxygène se fait au moyen d’une sonde fluorescente (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate ; 2',7'-dichlorofluorescin diacetate ; H2DCFDA) (Ischiropoulos et al. 1999). La sonde H2DCFDA est un indicateur de production intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène pénétrant dans la cellule, non- fluorescent tant que le groupement acétate n’est pas éliminé par les estérases intracellulaires ou l’oxydation intracellulaire.

Les cellules sont stimulées selon une cinétique et 30 minutes avant la fin de l’expérience, la sonde H2DCFDA est rajoutée dans tous les puits en même temps (concentration finale : 5µM). Les cellules sont lavées au PBS (1.5mM KH2PO4, 2mM

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Matériels et Méthodes Na2HPO4, 0.13M NaCl. pH7.4), grattées dans de l’eau distillée, soniquées et la fluorescence est mesurée (blanc : eau distillée, λ excitation = 493nm ; λ émission = 527nm). La quantité de protéines est dosée selon la méthode de Bradford (Biorad Protein Assay, standard protéique : sérumalbumine bovine). Les résultats de fluorescence sont rapportés à la quantité de protéines et exprimés en pourcentage du témoin non stimulé.

b. Dosage des hydroperoxydes (protéines carbonylées)

Les protéines carbonylées sont détectées par utilisation de dinitrophénylhydrazine. Selon la méthode décrite par Ichihashi et al. (Ichihashi K, J Biol Chem 2001). Les aortes ou les cellules sont broyées dans du RIPA (Tris 10mM pH 7.5, Triton X100 1%, DOC 1%, SDS 0.1%, NaCl 150mM, NaF 50mM, aprotinine 2mg/ml, leupeptine 1µg/ml, PMSF 1mM,

Na3VO4 1mM, pepstatine 20µg/ml), lysées dans la glace 30 minutes, centrifugées 10minutes à 15000 rpm et les hydroperoxydes sont dosés sur le surnageant. La détection sur milieu de culture se fait directement. 125µl de surnageant (ou de milieu de culture) dans 125µl d’eau sont incubés avec 250µl de dinitrophenyhydrazine (DNPH) à 0.1% dans HCl 2M (0.1% DNPH w/v, 10% DMSO, dans HCl 2M), pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation. Les protéines sont précipitées par 250 µl de TCA 20% pendant 30 minutes sous agitation. Les échantillons sont ensuite centrifugés une à deux minutes à 2000 rpm. Le surnageant est éliminé, et le culot est lavé trois fois dans une solution d’éthanol/éthyl acétate (v/v). Le culot est ensuite dilué dans une solution de guanidine-hydrochloride 8 M (guanidine- hydrochloride 8M, 13mM EDTA, 133mM Tris, pH 7.4).

La lecture se fait au spectrophotomètre à 365 nm.

c. Dosage des TBARS (Thiobarbituric Acid Reactive Substances)

Sur cellules et sur aortes les échantillons sont traités comme précédemment (broyage dans du RIPA, lyse dans la glace 30 minutes, centrifugation 10minutes à 15000 rpm et dosage sur le surnageant). La détection sur milieu de culture se fait directement. 100 µl d’échantilon dans 900 µl d’eau distillée, sont traités avec 100 µl d’HCl 0.5M et 1ml d’acide thiobarbiturique ou TBA (TBA 120mM, NaOH 2N, Tris 26 mM, pH 7). Les échantillons sont chauffés 10 minutes à 100°C, puis refroidis. L’extraction se fait par 2 ml de butan 1-ol, et centrifugation 10 minutes à 2000 rpm à 4°C.

L’excitation se fait au fluorimètre à 515 nm et l’émission à 548 nm.

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Matériels et Méthodes Prolifération cellulaire

a. Incorporation de thymidine tritiée

Les cellules sont ensemencées à 50000cell./ml, privées le lendemain en sérum pendant 24heures, préincubées éventuellement avec des agents inhibiteurs (préincubation allant de trente minutes à douze heures selon l’inhibiteur) stimulées par les agent prolifératifs à tester (sérotonine, tyramine, peroxyde d’hydrogène, PDGF) pendant 24 à 48 heures. La thymidine tritiée (0.5µCi/ml) est ajoutée 15 à 18 heures avant l’arrêt de l’expérience. L’arrêt se fait par élimination du milieu, deux lavages au PBS, fixation 30 minutes à 4°C avec de l’acide trichloroacétique (TCA) 5%. Un troisième lavage au PBS et une solubilisation des protéines (0.25N NaOH deux heures à température ambiante) la radioactivité est comptée au compteur à scintillation β et les résultats sont exprimés en pourcentage du témoin non traité (maintenu en milieu sans sérum) (Auge et al. 1995).

b. Test au MTT (3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium bromure)

Le MTT est un sel de tétrazolium soluble et jaune, qui, une fois réduit par la succinate déshydrogénase de la chaîne respiratoire mitochondriale, se transforme en cristaux de formazan (bleu et insoluble dans l’eau). Ce test permet d’évaluer la cytotoxicité d’un produit, puisque la quantité de cellules est proportionnelle à la quantité de mitochondries et donc de produit formé.

Les cellules sont stimulées dans différentes conditions d’agent et d’inhibiteur pendant 72h, puis le milieu est remplacé par du RPMI sans SVF, dans lequel le MTT est ajouté (500µg/ml) pendant deux heures à 37°C. Le milieu est enlevé, et les cristaux formés sont solubilisés dans 300µl de diméthyl sulfoxyde (DMSO) et quantifiés par spectrophotométrie (λ = 550nm). Les résultats sont exprimés en pourcentage du témoin non traité, après soustraction du blanc DMSO seul (Denizot and Lang 1986).

c. Comptage cellulaire

Après 72 heures de stimulation les cellules sont trypsinées et le contenu du puits est compté dans un compteur Coulter Beckman. Les résultats sont exprimés en pourcentage du témoin non traité.

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Matériels et Méthodes

Activités enzymatiques

a. Activité MAO

Pour tester l’expression des monoamine oxydases dans chaque lignée cellulaire utilisée, les cellules sont grattées dans du PBS et les culots sont repris dans du tampon phosphate 50mM pH 7.4 + inhibiteurs de protéases (10µg/ml bacitracine, 0.1mM PMSF, 4µg/ml inhibiteur de trypsine), seringuées et les protéines sont dosées selon la méthode de Lowry (Biorad), en utilisant comme standard la gammaglobuline.

L’activité MAO s’effectue sur 40µg de protéines dans un volume final de 50µl. Elle est évaluée en mesurant la quantité de substrat oxydé ([14H]-sérotonine ou [14H]-β-PEA, NEN). L’activité non spécifique est mesurée soit par l’ajout de 10-5M de pargyline soit par l’ajout de 10-7M de clorgyline (inhibiteur de MAO-A) ou de L-déprényl (inhibiteur de MAO- B). Les tubes contenant ou non l’inhibiteur sont préincubés 20 minutes à 37°C. Le substrat est préparé comme suit : [14H]-sérotonine, dilution isotopique au 1/5ème avec sérotonine froide à 250µM final dans le tube d’incubation ou [14H]-β-PEA dilution isotopique au ½ β-PEA froid à 20µM final dans le tube d’incubation. Après une incubation de 15 minutes à 37°C, la réaction est stoppée par ajout de 100µl d’HCl 4N froid. Le substrat non dégradé est séparé de ses métabolites par ajout de 1ml de mélange éthyl-acétate/toluène (1/1), vortexé et les métabolites sont prélevés de la phase organique. La radioactivité est comptée par un compteur β (Tricarb, Packard) sur 750µl de phase supérieure à laquelle sont rajoutés 3ml de liquide scintillant (Emulsifier Safe, Packard).

La radioactivité spécifique correspond à la différence entre la radioactivité totale et la radioactivité non spécifique (obtenue en présence d’inhibiteur). Elle est exprimée en pmol de substrat oxydé/mg de protéine/min d’incubation.

b. Activité furine

Les cellules sont stimulées selon une cinétique ; à la fin de la stimulation 500µl de milieu sont incubés avec 250µl d’une solution de tampon (100mM Mes + 1mM CaCl2 pH7 (NaOH)) + 20nM final de substrat par point (Substrat : acide pyroglutamique-Arg-Thr-Lys-Arg- AMC). Après une incubation de 4 heures à 37°C, la réaction est arrêtée par 250µl d’EDTA

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Matériels et Méthodes 5mM. La fluorescence générée (λ excitation = 370nm ; λ émission = 450nm) est exprimée en pourcentage du témoin.

Différents blancs sont réalisés en contrôle : 1) tampon réaction sans substrat (blanc de lecture fluorescence) + RPMI 2) tampon réaction + substrat + RPMI 3) cellules non traitées + tampon sans substrat (temoin) La gamme est réalisée avec de l’AMC.

c. Activité MMP14 et MMP2

Après stimulation, l’activité MMP2 est mesurée sur 500µl de milieu de culture, incubés avec 500 µl de tampon de réaction (50mM tris pH 7.5, 10mM CaCl2 sans ou avec 5 mM EGTA). Dans chaque condition (sans ou avec EGTA), le blanc sera du milieu de culture (RPMI sans SVF) dans le tampon sans ou avec EGTA avec le substrat fluorescent. L’incubation du milieu avec EGTA (chelateur d’ions, donc bloquant l’activité MMP) permet de déterminer la dégradation non spécifique du substrat et la densité optique mesurée dans le tampon avec EGTA sera soustraite à la DO mesurée sans EGTA.

L’activité MMP14 se fait sur cellules grattées dans 1 ml de tampon de réaction (50mM tris pH

7.5, 10mM CaCl2) et soniquées. Des cellules grattées dans le même tampon mais incubées sans substrat servent de blanc (il existe une autofluorescence des cellules).

Le substrat est ajouté à la concentration de 1µM final, qu’il s’agisse du substrat de MMP14

(substrat MMP14 : Dansyl-Pro-Leu-Ala-Cys-(p-OméthylBenzyl)-Trp-Ala-Arg-NH2, Calbiochem) ou de MMP2 (substrat MMP2/MMP9 : Dinitrophényl-Pro-Leu-Gly-Met-Trp- Ser-Arg-OH, Calbiochem).

La scopoletine et le dansyle sont utilisés comme gamme respectivement pour les activités MMP2 et MMP14.

Les tubes sont placés à 37°C deux heures. La réaction est arrêtée par 250 µl d’EGTA 5mM et la fluorescence est mesurée (pour MMP 14 λ excitation = 280nm ; λ émission = 340nm, pour MMP2 λ excitation = 325 nm ; λ émission = 395 nm). L’activité MMP14 est rapportée à la quantité de protéines (dosage par la méthode de Bradford sur une petite quantité

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Matériels et Méthodes d’extraits cellulaires repris dans le tampon d’incubation). Les activités MMP2 et MMP14 sont exprimées en pourcentage du témoin non traité.

d. Activité nSMase

Après stimulation, les cellules sont grattées dans 150 µl de tampon d’incubation (20 mM Hepes pH 7.4, 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 0.1 mM orthovanadate de sodium

(Na3VO4), 10 mM B-glycerophosphate, 0,1% triton X100 (w/v), 5 mM DTT, 750 μM ATP, 1mM PMSF, 10 μΜ leupeptine, 10 μΜ pepstatine). 100µl d’extraits cellulaires sont incubés avec 100µl de substrat (14C-sphingomyéline, NEN) (100000 dpm, soit 1nmole / essai), dissous dans un tampon (20 mM Hepes pH 7.4, 1 mM MgCl2). Après deux heures d’incubation, à 37°C, la réaction est arrêtée par 300µl d’eau distillée + 2.5ml de chloroforme/méthanol (2 :1). Après une centrifugation de dix minutes à 2500 tours/minutes, 750µl de phase supérieure sont prélevés et comptés au compteur β. La quantité de protéines est dosée sur les 50µl d’extraits cellulaires restants. Le blanc (100µl de substrat + 100µl de tampon d’extraction sans cellules) est soustrait des comptages et les comptages finaux sont rapportés à la quantité de protéines et exprimés en pourcentage du témoin (Auge et al. 1998).

e. Activité sphingosine kinase

A la fin de la stimulation, les cellules sont grattées dans du PBS froid et centrifugées. Les culots sont repris dans 200µl de tampon d’incubation (20mM Tris pH 7.4, 20% glycérol

(w/v), 1mM β-mercaptoéthanol, 1mM EDTA, 1mM Na3VO4, 15mM NaF, 10µg/ml leupeptine et aprotinine,1mM PMSF, 40mM β -glycérophosphate) et soniqués. 180µl d’extrait cellulaire sont incubés avec 200µM de sphingosine, 10mM de MgCl2 et 1mM d’ATP froid dans lequel est rajouté 1µCi d’AT[33P]) (Olivera and Spiegel 1993). Après 30 minutes d’incubation à 37°C la réaction est stoppée par 20µl d’HCl 1N et 800ul de chloroforme/méthanol/HCl (1N) (200 :100 :1), et les métabolites sont extraits par 240 μl chloroforme et 240 μl KCl 2M. Les tubes sont centrifugés à 2000 tour/minute 10 minutes et la phase inférieure est prélevée et évaporée sous azote, solubilisée par un petit volume de chloroforme/methanol/HCl (200 :100 :1) déposés sur plaque de silice et mis à migrer dans un bain de butanol/methanol/acide acétique/eau (80 :20 :10 :20). Les radioéléments formés sont révélés par radioexposition de la plaque 72 heures, et les spots grattés et comptés. Les

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Matériels et Méthodes protéines sont dosées sur les 20µl d’extraits cellulaires restants et la radioactivité est rapportée à la quantité de protéines et exprimée en pourcentages du témoin (Auge et al. 1999).

Proteines

a. Dosage

Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford, après 5 minutes d’incubation avec le Le standard protéique utilisé est une solution de sérumalbumine bovine (1mg/ml dans de l’eau).

b. Western Blot

Les cellules sont grattées dans du PBS froid contenant des inhibiteurs de protéases et de phosphatases (aprotinine 1.5mg/ml, leupeptine 1mg/ml, PMSF 100mM, 100mM Na3VO4, pepstatine 5mg/ml), centrifugées et les culots repris dans du RIPA. Les culots sont lysés 20 minutes dans la glace. Ils sont ensuite centrifugés 10 minutes à 4°C à 15000 rpm. Le surnageant est prélevé et les protéines sont dosées. Des aliquots de 30-45µg de protéines dans lequels est rajouté du bleu de dénaturation (composition finale : Tris 10mM pH 8.8, glycérol 10%, SDS 2%, EDTA 2.5mM, Bleu de Bromophénol 0.012 %, 2.5% β-mercaptoéthanol) sont préparés et chauffés à 95°C.

Les échantillons sont déposés sur gels SDS-polyacrylamide : concentration à 5% d’acrylamide (“stacking”) puis séparation (“running”) : 7.5 à 10% d’acrylamide selon le poids moléculaire de la protéine. Après la migration (tampon de migration Tris 0.12 mM, glycine 0.1 mM, SDS 0.05%) les protéines sont transférées en transfert liquide (Tris 25 mM, glycine 0.2, SDS 1%, pH 8.3) sur membrane de nitrocellulose pendant deux heures et saturés deux heures en sérumalbumine bovine 3% dans TBS-Tween (Tris Buffered Saline – tween 0.1% : Tris 10mM NaCL 100mM, pH 7.5 + ajout extemporané de Tween 20 à 0.1% final).

L’anticorps primaire dilué dans du TBS-Tween est incubé avec la membrane à 4°C sur la nuit, la membrane est lavée 6 X 10 minutes au TBS-Tween, incubée une heure avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (horse raddish peroxidase), lavée à nouveau 6 X 10 minutes et la révélation se fait par enhanced chimioluminescence (Ecl, Amersham Biosciences). La déshybridation se fait avec un tampon sans b-mercaptoéthanol (0,2 M glycine, 0.1% SDS, 1% tween 20, pH 2,2) 10minutes à température ambiante, 2 lavages PBS, un rinçage TBS-Tween.

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Matériels et Méthodes Les western blots sur tissus (aortes de souris), sont réalisés selon le même protocole : les tissus sont broyés dans du RIPA (potter teflón-verre), lysés 30 minutes dans la glace, centrifugés à 15000 rpm. Les protéines sont dosées sur le surnageant, puis le reste du protocole est identique à celui précédement décrit.

c. Immunoprécipitation des protéines

Les cellules sont récupérées dans du PBS froid contenant des inhibiteurs de protéases et de phosphatase (Aprotinine 1.5mg/ml, leupeptine 1mg/ml, PMSF 100mM, 100mM

Na3VO4, pepstatine 5mg/ml), centrifugées et les culots repris dans du RIPA (Tris 10mM pH 7.5, Triton X100 1%, DOC 1%, SDS 0.1%, NaCl 150mM, NaF 50mM, aprotinine 2mg/ml, leupeptine 1µg/ml, PMSF 1mM, Na3VO4 1mM, pepstatine 20µg/ml). Les culots sont lysés 20 minutes dans la glace, puis centrifugés 10 minutes à 4°C à 15000 tours/minute. Le surnageant est isolé et les protéines sont dosées. 1000-2000µg de surnageant cellulaire sont incubés sur la nuit à 4°C avec 1µg d’anticorps primaire. Les protéines sont ensuite immunoprécipitées avec 5mg de protéine-A sépharose pendant quatre heures à 4°C. Les protéines sont ensuite centrifugées et le surnageant éliminé ; les culots sont lavés 5 fois au RIPA, puis repris avec 50µl de bleu de dénaturation 2X (Tris 20mM pH 8.8, glycérol 20%, SDS 4%, EDTA 5mM, Bleu de Bromophénol 0.024 %, β-mercaptoéthanol 5%). Puis comme pour le Western Blot, les échantillons sont chauffés, déposés sur gel SDS-polyacrylamide, migrés et transférés sur membranes de nitrocellulose. L’anticorps primaire est incubé à 4°C sur la nuit, la membrane est lavée 6 X 10 minutes au TBS-Tween, incubée une heure avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase (horse raddish peroxidase), lavée à nouveau 6 fois et révélée comme précédement (western blot).

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Résultats Expérimentaux

Rôle de la MAO-A et du stress oxydant

dans la signalisation mitogène induite

sur cellules musculaires lisses

Résutats expérimentaux I. Rôle de la MAO-A et du stress oxydant dans la signalisation mitogène induite sur cellules musculaires lisses

I.1. Introduction

Durant l’oxydation d’amines biogènes (comme les catécholamines circulantes ou la sérotonine libérée par les plaquettes), les EROs générés par les MAOs des cellules vasculaires pourraient favoriser l’oxydation des LDLs et accélérer l’athérogénèse (Obata and Yamanaka 2001). D’ailleurs, l’inhibiteur de MAO-B, le L-déprényl, bloque l’oxydation des LDLs et leurs effets athérogènes (Thomas et al. 2002). Les résultats préliminaires à ce travail, ont montré que des doses faibles de sérotonine et la tyramine, sont mitogènes pour les CMLs.

L’objectif de ce travail a été d’étudier l’implication des EROs produits par la dégradation MAO-dépendante de la sérotonine et la tyramine, dans la prolifération des CMLs, et les voies de signalisation impliquées. Nous avons plus précisément étudié l’implication d’une voie mitogène de stress, récemment mise en évidence dans l’équipe, la voie MMP2/sphingomyelinase/sphingosine 1-phosphate. Les différents acteurs de cette voie sont brievement décrits dans la partie qui suit.

a. Les métalloprotéases

♦ Généralités sur les metalloprotéases

Les matrix metalloprotéinases (MMPs), sont une famille de métallo-endopeptidases zinc- dépendantes responsables, entre autres, de la dégradation des composants de la matrice. Les MMPs appartiennent plus précisément à la famille M10 et à la sous-famille A (matrixines). Elles peuvent être classées en deux groupes : les metalloprotéinases liées à la membrane (MT- MMPs : membrane-type MMPs) et les MMPs solubles ou zymogènes (MMPs), sécrétées sous forme inactive puis activées dans le milieu extracellulaire.

La principale fonction des MMPs reste la dégradation de la matrice extra cellulaire, qui contribue au remodelage tissulaire (résorption). Cependant, la matrice extra cellulaire fait non seulement partie de l’architecture extra cellulaire, mais peut également être considérée comme un réservoir de molécules biologiquement actives, y compris des facteurs de croissance (Sternlicht and Werb 2001; Visse and Nagase 2003). Sa protéolyse modifie la fonction de certaines macromolécules : ainsi, le clivage de la chaîne alpha2 de la laminine 5 par MMP2 52

Résutats expérimentaux induit une migration de cellules épithéliales du sein en exposant un site cryptique promigratoire de la laminine 5 (Giannelli et al. 1997).

L’activité des MMPs est régulée par des inhibiteurs spécifiques : les TIMPs, qui participent au contrôle spécifique de l’activité locale des MMPs dans les tissus (Gomez et al. 1997; Nagase and Woessner 1999; Visse and Nagase 2003) ou des inhibiteurs pharmacologiques (Batimastat) (Galis and Khatri 2002; Visse and Nagase 2003).

Elles participent à de nombreux processus physiologiques (développement embryonnaire, organogénèse, ovulation, involution utérine postpartum, cicatrisation, angiogénèse, remodelage osseux) et pathologiques (arthrite, cancer, maladies cardiovasculaires,…) (Nagase and Woessner 1999). Les MMPs participent à l’angiogénèse, au remodelage vasculaire et à l’athérosclérose (Galis and Khatri 2002; Lijnen 2002; Visse and Nagase 2003). Les LDLs oxydées et les cytokines inflamatoires (IL-1, TNFα), modifient l'expression et l'activité des MMPs et des TIMPs (Galis and Khatri 2002).

Parmi toutes les metalloprotéases nous nous sommes plus particulièrement intéréssé à MMP-2 et MT1-MMP.

♦ MMP2

MMP-2, également connue comme gélatinase de 72kDa/collagénase type IV et gélatinase A, contient un domaine fibronectine-like au niveau du domaine catalytique, favorisant la liaison du substrat. Elle peut cliver un grand nombre de substrats incluant les gélatines, le collagène de type I, IV, V, VII, X, XI et XIV, la fibronectine, l’élastine, et les protéoglycanes.

MMP-2 est synthétisée sous forme d’une proenzyme de 72KDa (zymogène), sécrétée dans le milieu extracellulaire et activée, à la surface cellulaire, par clivage protéolytique (forme mature : 66KDa). Pro-MMP2 est activée in vivo par des Membrane-Type MMPs actifs (Okada et al. 1990; Butler et al. 1997; Llano et al. 1999; Murphy et al. 1999; Velasco et al. 2000), à l’exception de MT4-MMP (English et al. 2000). L’activité enzymatique de MMP2, est régulée par les TIMPs. En se liant à la proforme de MMP-2 ils en empêchent l’activation.

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Résutats expérimentaux ♦ MT1-MMP

MT1-MMP est une MT-MMP possédant un domaine transmembranaire et un domaine cytosolique C terminal (protéine de type I). Cette protéine a été identifiée en 1994 (Sato et al. 1994), et depuis de nombreuses études ont permis de bien la définir (Itoh and Seiki 2006). Elle est synthétisée sous forme de zymogène inactif et est activée par une proprotéine convertase (la furine) lors de son passage dans l’appareil de Golgi. MT1-MMP est située dans la membrane plasmique. Elle participe à la migration cellulaire, et se trouve pour cela généralement localisée dans la zone de migration des cellules migrantes (lamellipodes) (Sato et al. 1997; Itoh et al. 2001; Mori et al. 2002). Cette localisation spécifique est dirigée par CD44 qui interagit avec le domaine hémopexine de MT1-MMP (Mori et al. 2002).

MT1-MMP peut dégrader une grande variété de protéines de la matrice extra cellulaire, dont les collagènes de type I, II, et III, la fibronectine, la vitronectine, la laminine, la fibrine, et les protéoglycanes, et peut moduler les fonctions cellulaires en maturant un grand nombre d’autres protéines (Berthet et al. 2000; Belkin et al. 2001; Deryugina et al. 2002; Tam et al. 2004). Parmi les fonctions de MT1-MMP (communes avec d’autres MT- MMPs), se trouve également l’activation de pro-MMP-2 (Seiki et al. 2003).

Le clivage de pro-MMP-2 par MT1-MMP, largement étudié a montré la nécessité d’une coopération avec TIMP-2 (Butler et al. 1998; Toth et al. 2000). En effet proMMP-2 et TIMP-2 forment un complexe via leurs domaines C-terminal. L’extrémité N-terminal de TIMP-2 se lie à MT1-MMP (qui devient récepteur de pro-MMP-2, mais est inhibé par TIMP- 2), ce qui rapproche pro-MMP-2 de la surface de la cellule où un autre MT1-MMP adjacent et n’étant pas inhibé par TIMP-2 pourra cliver pro-MMP-2.

b. MMP-2, MT1-MMP et athérosclérose

L’action proangiogénique de MMP-2 a été décrite par Nguyen (Nguyen et al. 2001). MMP-2 intervient dans l’hypertrophie cardiaque (Ahmed et al. 2006), la crise cardiaque (Peterson et al. 2000) et dans toutes les étapes de la formation de la plaque d’athérome, sur des cibles variées. L’importance de MMP2 dans la formation de plaques d’athérome a été mise en évidence in vivo par le croisement de souris ApoE -/- (un modèle d’athérosclérose chez la souris délété pour l’apolipoprotéine E et développant spontanément des lésions athéroscléreuses) avec des souris MMP2-/- (knockout pour MMP2) : ces animaux

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Résutats expérimentaux développent beaucoup moins de lésions que les souris ApoE-/- utilisées comme contrôles (Kuzuya et al. 2006).

L’activation de MMP-2 sur des cellules endothéliales, des cellules musculaires lisses et des macrophages suite à stimulation par différents agents, a fait l’objet de nombreuses études in vitro et in vivo (Werle et al. 2002; Kuzuya et al. 2003; Johnson and Galis 2004).

MT1-MMP est un facteur important du remodelage matriciel, et a son importance dans de nombreuses maladies où la protéolyse ou l’invasion et la prolifération cellulaire sont dérégulées, non seulement parce qu’il participe de manière très active à ce remodelage matriciel pathologique, mais aussi indirectement en activant d’autres membres de la famille des matrix métalloprotéinases. Au niveau vasculaire, MT1-MMP participe à l’angiogénèse en favorisant l’invasion par les cellules endothéliales entre autres, et en stimulant la synthèse de VEGF (Chun et al. 2004; Sounni et al. 2004). Son expression est supérieure au niveau des lésions d’athérosclérose (Rajavashisth et al. 1999). Son activité peut être augmentée par la plupart des agents intervenant dans l’athérosclérose : LDL oxydées, interleukine1-alpha, TNF-alpha sur cellules musculaires lisses et monocytes (Rajavashisth et al. 1999; Hong et al. 2000; May et al. 2005; Tellier et al. 2007). Le stress oxydant up régule également MT1-MMP dans les cellules musculaires lisses et favorise l’invasion de celles-ci dans le vaisseau, participant au remodelage vasculaire de la matrice extra cellulaire ayant lieu lors de l’évolution de plaques d’athérome (Filippov et al. 2005; Valentin et al. 2005).

c. La voie des sphingolipides

Les sphingolipides sont des constituants des membranes lipidiques des cellules. Outre leur rôle structural au sein des membranes, ils ont également un rôle de second messager intracellulaire, intervenant dans la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’inflammation (Auge et al. 1999; Auge et al. 2000; Auge et al. 2002; Pettus et al. 2002; Watterson et al. 2005). Les sphingolipides sont généralement localisés dans des domaines bien précis de la membrane : les “rafts lipidiques”, où ils colocalisent avec des enzymes spécialisées dans le métabolisme des sphingolipides : la sphingomyélinase (Kilkus et al. 2003), la céramidase (Mitsutake et al. 2001), la sphingosine kinase (Urtz et al. 2004).

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Résutats expérimentaux ♦ La sphingomyélinase

La sphingomyélinase assure la conversion métabolique de la sphingomyéline en céramide. Plusieurs sphingomyélinases ont été à ce jour caractérisées différant essentiellement par leur pH optimal d’action, et leur localisation subcellulaire : la sphingomyélinase acide lysosomale (aSMase) (Gatt et al. 1966), Trois sphingomyélinases neutres (Marchesini and Hannun 2004) la sphingomyélinase alcaline (bile et tractus digestif). Nous nous sommes particulièrement intéressés à la sphingomyélinase neutre magnésium-dépendante (sphingomyélinase neutre de type 2 ou smpd3), décrite par l’équipe comme étape initiatrice de la voie mitogène des sphingolipides (Auge et al. 1998).

♦ La céramidase

La céramidase transforme le céramide en sphingosine. Il existe cinq formes de céramidases, la céramidase acide clonée en 1996 (Koch et al. 1996), deux céramidases neutres, dont l’une pouvant être mitochondriale (El Bawab et al. 2000), et deux alcalines (Mao et al. 2001).

♦ La sphingosine kinase

Elle phosphoryle la sphingosine sur sa fonction alcool. Il en existe deux à ce jour : SPK1 et SPK2 clonées récemment (Kohama et al. 1998; Liu et al. 2000). Ces deux isoenzymes semblent jouer au sein de la cellule deux rôles différents, voire opposés (Maceyka et al. 2005).

L’isoforme 1 (SphK1) est activée par des stimuli tels que facteurs de croissance et de survie et la sphingosine 1-phosphate qu’elle produit a un effet anti-apoptotique et mitotique (Olivera et al. 1999b; Edsall et al. 2001; Shu et al. 2002) mais ces effets ne semblent pas forcément médiés par un des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate (Olivera et al. 2003). L’isoforme 2 (SphK2) est moins connue. Elle favoriserait plutot une signalisation antimitotique et proapoptotique, indépendamment d’un récepteur (Igarashi et al. 2003; Liu et al. 2003). Nous nous sommes intéressés à SphK1 (Auge et al. 2004; Tellier et al. 2007).

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Résutats expérimentaux d. Rôle des sphingolipides dans l’atherosclérose

Les sphingolipides agissent comme seconds messagers intracellulaires dans les principaux phénomènes de la vie de la cellule impliqués dans l’athérosclérose : apoptose, migration, adhésion, prolifération, et ce dans tous les types cellulaires présents dans la plaque.

♦ L’apoptose

Le céramide est connu pour être proapoptotique lorsque sa concentration atteint un certain seuil et cet effet proapoptotique a été largement documenté y compris dans l’athérosclérose (cellules musculaires lisses, endothéliales, macrophages) (Chatterjee 1999; Auge et al. 2000; Steinbrecher et al. 2004). Selon le type cellulaire, la sphingomyélinase acide (cellules musculaires lisses, macrophages) (Loidl et al. 2003; Steinbrecher et al. 2004) et la sphingomyélinase neutre (cellules musculaires lisses) (Chatterjee 1999; Loidl et al. 2004) ont été décrites comme impliquées dans l’apoptose induite par le céramide dans le cadre de l’athérosclérose. Il semble que ce soit la balance entre le céramide et la sphingosine 1- phosphate qui détermine la survie ou l’apoptose des cellules (Cuvillier et al. 1996).

♦ La migration

La sphingosine 1-phosphate, a étét décrite comme inductrice de la migration des cellules endothéliales via ses récepteurs à sept segments transmembranaires Edg-1 et Edg-3 (endothélial differentiation gene) (Kimura et al. 2003) ou inhibitrice de la migration des cellules endothéliales, lymphocytes, cellules musculaires lisses … (Tamama and Okajima 2002).

♦ L’adhésion

L’UDP:galactose:glucocéramideβ1,4galactosyl-transférase produit du lactosylcéramide à partir du céramide. Des résultats obtenus avec ce glycosphingolipide suggèrent qu’il intervient dans l’expression de molécules d’adhésion telles que ICAM-1 sur cellules endothéliales (Bhunia et al. 1998), et Mac-1 (Arai et al. 1998) sur les neutrophiles et macrophages, contribuant ainsi à leur adhésion à la surface des cellules endothéliales et initiant le processus d’athérosclérose (Chatterjee 1998).

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Résutats expérimentaux ♦ La prolifération

De nombreux sphingolipides sont mitogènes sur cellules vasculaires (céramide, sphingosine, sphingosine 1-phosphate, sphingosylphosphocholine, lactosylcéramide) (Chatterjee 1998; Auge et al. 2000)

I.2. Résultats expérimentaux

Des travaux menés par l’équipe ont montré que la voie sphingomyéline/céramide/sphingosine/sphingosine-1-phosphate est activée par le couple MT1-MMP/MMP-2 (Auge et al. 2004; Tellier et al. 2007), et impliquée dans la signalisation mitogène sur cellules musculaires lisses.

Nous avons émis l’hypothèse que la réponse mitogène induite par les amines biogènes pourrait être médiée par les EROs produits lors de leur dégradation par les MAOs, et une cascade de signalisation de stress impliquant la métalloprotéinase MMP-2 et la voie sphingomyéline/céramide. Nous présentons dans un premier article l’implication de cette voie dans la prolifération des CML induite par la sérotonine et la tyramine et le rôle de la MAO-A.

Dans le deuxième article nous étudions le rôle de la sphingosine kinase et de la sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la prolifération induite par la tyramine et mimée par H2O2.

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MAO-A-induced mitogenic signaling is mediated by reactive oxygen species, MMP-2 and the sphingolipid pathway.

Christelle Coatrieux*,†,, Marie Sanson*, Anne Negre-Salvayre*, Angelo Parini†, Yusuf Hannun***, Shigeyoshi Itohara‡, Robert Salvayre*, Nathalie Auge*

* - INSERM UMR-466, Dept of Biochemistry1, IFR-31, CHU Rangueil, Toulouse, France † - INSERM U388, IFR-31, CHU Rangueil, Toulouse, France ‡ - RIKEN Brain Research Institute, Wako-Shi, Saitama 351-0198, Japan *** Medical University South Carolina, Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Charleston, SC, 29425, USA.

Acknowledgments: This work was supported by grants from INSERM, University Paul Sabatier, Agence Nationale de la Recherche (ANR-05-PCOD-019-01-LiSA) and "Groupe Lipides et Nutrition". The authors thank Ms MH Grazide for excellent technical assistance. C. Coatrieux is recipient of the Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, and M. Sanson from "Groupe de Reflexion sur la Recherche Cardiovasculaire".

Address correspondence to: Dr A. Negre-Salvayre INSERM U466 - Biochemistry - IFR-31 - CHU Rangueil 1, avenue Jean Poulhes - TSA-50032 - 31059 Toulouse Cedex 9 - France. Tel. (33) 561-32-27-05 - Fax (33) 561-32-20-84 E-mail: [email protected]

Running title: MMP/sphingolipids in MAO-A signaling

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Abstract

The degradation of biogenic amines by monoamine oxidase A (MAO-A), generates Reactive Oxygen Species (ROS) which participate in serotonin and tyramine signaling. This study aimed to investigate the role of ROS in the mitogenic signaling activated during tyramine and serotonin oxidation by MAO-A in smooth muscle cells (SMC).

Incubation of SMC with serotonin or tyramine induced intracellular ROS generation, and a signaling cascade involving metalloproteases and the neutral sphingomyelinase-2 (nSMase2, the initial step of the sphingolipid pathway), ERK1/2 phosphorylation, and DNA synthesis. Silencing MAO-A by siRNA, pharmacological MAO-A inhibitors, (pargyline and Ro41-1049), and the antioxidant/ROS scavenger butylated hydroxytoluene (BHT), inhibited the signaling cascade, suggesting that ROS generated during tyramine oxidation by MAO-A were required. The MMP inhibitors Batimastat, MMP2-specific siRNA and MMP2 deletion (MMP2-/- fibroblasts) blocked nSMase activation and SMC proliferation, suggesting a role for MMP2 in this signaling pathway. Silencing nSMase2 by siRNA did not inhibit ROS generation and MMP2 activation, but blocked SMC proliferation induced by tyramine, suggesting that nSMase2 is downstream MMP2.

These findings demonstrate that H2O2-generated during tyramine oxidation by MAO-A triggers a stress-induced mitogenic signaling via the MMP2/sphingolipid pathway, which could participate in excessive remodeling and alteration of the vascular wall.

Key-words: MAO-A, ROS, serotonin, tyramine, neutral sphingomyelinase, MMP2, proliferation.

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Introduction

Monoamine oxidases A and B (MAO A and MAO B) are flavoenzymes tightly associated with the outer membrane of mitochondria, (Mitoma and Ito 1992; Shih et al. 1999) and catalyze the oxidative deamination of biogenic and dietary amines (Billett 2004). MAOs are primarily involved in the degradation of neurotransmitters within the central nervous system and are also implicated in the metabolism of biogenic amines in peripheral tissues and vascular cells (Kopin 1994; Agostinelli et al. 2004; Billett 2004). MAO-A and MAO-B oxidize dopamine and tyramine, whereas serotonin (5-hydroxytryptamine or 5-HT) and norepinephrine are preferred substrates for MAO-A and phenylethylamine for MAO-B. Reactive oxygen species (ROS), hydrogen peroxide (H2O2), and oxidation products generated during the oxidation of biogenic amines (Pizzinat et al. 1999b) may trigger cell signaling and lead to oxidative stress.

Oxidative stress generated within the vascular wall may play a major role in atherogenesis i/ by promoting LDL oxidation, which induces foam cells and fatty streak formation (Steinberg 1997; Stocker and Keaney 2005), ii/ by inducing endothelial dysfunction, inflammatory responses, smooth muscle cell (SMC) proliferation, intimal hyperplasia and apoptosis (Steinberg 1997; Irani 2000; Napoli et al. 2001; Stocker and Keaney 2005). ROS trigger a huge variety of signaling responses, including activation of tyrosine kinase receptors, ERK1/2, p38 MAPK, the sphingolipid pathway, and transcription factors (NFkappaB), or activation of pro-apoptotic pathways through caspase activation and calcium deregulation (Irani 2000; Leonarduzzi et al. 2000; Napoli et al. 2001; Tedgui and Mallat 2001; Salvayre et al. 2002; Orrenius et al. 2003). Oxidative stress may trigger apparently opposite effects, such as survival and apoptosis, dependent on duration, intensity of the stress, nature of the oxidants and cell type (Irani 2000; Salvayre et al. 2002). This balance is particularly important for SMC, which migrate and proliferate in the intima and secrete extracellular matrix and key constituents of the fibrous cap, thereby regulating the stability of atherosclerotic plaques and the occurrence of athero-thrombotic events (Irani 2000; Napoli et al. 2001; Salvayre et al. 2002).

During oxidation of biogenic amines (such as circulating catecholamines or serotonin released by platelets), MAOs, expressed in vascular cells, generate ROS (H2O2) that may promote

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LDL oxidation and accelerated atherogenesis (Obata and Yamanaka 2001). Consistently, the MAO-B inhibitor L-deprenyl, blocks LDL oxidation and prevents their atherogenic effects (Thomas et al. 2002). A variety of biological effects of ROS generated during biogenic amines oxidation have been reported. For instance, oxidation of serotonin by MAO-A induces ROS-dependent cell death of cardiomyocytes (Bianchi et al. 2005a), while the recently described transcription factor R1 (RAM2/CDCA7L/JPO2), inhibits the MAO-A promoter and MAO-A-mediated cell death ((Ou et al. 2006)). ROS generated during dopamine oxidation trigger a mitogenic signaling on renal epithelial cells (Vindis et al. 2001).

Matrix metalloproteinases (MMPs), a large family of zinc proteases, are implicated in extracellular matrix (ECM) degradation, angiogenesis, vascular wall remodeling and atherosclerosis (Galis and Khatri 2002; Lijnen 2002; Visse and Nagase 2003). MMPs are synthesized as latent proenzymes that are activated by cleavage of the N-terminal pro- segment by serine-proteases such as plasmin or thrombin (Orrenius et al. 2003) or by cell surface-associated MT1-MMP (Visse and Nagase 2003). MMP activity is inhibited by tissue MMP inhibitors (TIMPs) (Visse and Nagase 2003) and by chemical inhibitors like Batimastat (Skiles et al. 2001; Visse and Nagase 2003). As MMPs activity is increased in atherosclerotic lesions, it has been hypothesized that MMPs may be involved in atherosclerotic processes (Galis and Khatri 2002; Lijnen 2002; Visse and Nagase 2003). OxLDLs and inflammatory cytokines, including IL-1 and TNFα, alter the expression and activity of MMPs and TIMPs (Galis and Khatri 2002). Recently, the mitogenic signaling triggered by oxidized LDL has been shown to involve the sequential activation of MMP-2 and the sphingomyelin/ceramide pathway (Auge et al. 2004). The sphingomyelin/ceramide pathway is a stress-induced signaling pathway potentially implicated in a variety of cellular responses, including proliferation or apoptosis, and several pathophysiological conditions, such as cardiovascular diseases and cancers (Auge et al. 2000; Ogretmen and Hannun 2004). The sphingomyelin/ceramide pathway has been shown to play a role in the mitogenic signaling triggered by oxidized LDL (Auge et al. 1998). The neutral sphingomyelinase (nSMase), which catalyzes the initial step of the sphingomyelin/ceramide pathway, is regulated by oxidative stress (Liu and Hannun 1997) and by MMP (Auge et al. 2004).

This led us to investigate whether the mitogenic response to oxidation of biogenic amines

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C.Coatrieux et al. Free Rad. Biol. Med, 43(2007)80-89 MMP/sphingolipids in MAO-A signaling ______by MAO is mediated by ROS and the stress signaling cascade involving the metalloprotease MMP2 and the sphingomyelin/ceramide pathway.

Experimental procedures

Chemicals [3H]Thymidine (5 Ci/mmol) was purchased from Amersham (Les Ullis, France) [choline- methyl-14C]sphingomyelin and [P33]γ -ATP from DuPont NEN. Rabbit anti-phospho-ERK1/2 was from Promega (Madison, WI). Anti-ERK1/2, anti-MMP2 and anti-MAO-A antibodies were from Santa Cruz (Tebu, France). Batimastat was a generous gift of H.W. Krell (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany) and Ro-41–1049 (N-(2-aminoethyl)-5-(m-fluorophenyl)-4- thiazole carboxamide hydrochloride] was from F. Hoffmann La Roche (Basel, Switzerland) Other reagents were from Sigma or Amersham Biosciences.

Cell Culture Rabbit femoral SMC (ATCC), were grown in RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), under the previously used conditions (Auge et al. 2004). MMP2-deficient fibroblasts issued from MMP2 -/- mice (Itoh et al. 1997) were grown in DMEM supplemented with 10% FCS. Cells were serum-starved in RPMI 24 h before each experiment.

DNA synthesis, western blots and cytotoxicity DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine incorporation. Western blots and cytotoxicity evaluated by the MTT test, were performed under the previously used conditions (Auge et al. 2004).

Enzyme activities determination and RNA interference transfection. Neutral sphingomyelinase (nSMase) activity was determined in SMC extracts using [choline- methyl-14C]sphingomyelin (120 000 dpm/assay), as reported (Auge et al. 1999). Silencing of MAO-A (GGCUCAACAUGCUGACAAAdTdT) and of MMP2 (SMARTPool MMP2 catalog number L-005959) and of nSMase2 (sequence AAt-GCTACTGGCTGGTGGACC) (Eurogentec, Belgium), was done in the following conditions: SMC were transfected with 20µM siRNA in Optimem medium (Gibco) mixed with oligofectamine, as described (Marchesini et al. 2004)). 16h after transfection, SMC were incubated in RPMI containing

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10% FCS for 24 h. Then SMC were incubated for 12h in RPMI containing 0.5% FCS, and used for experiments. MMP activity was determined on SMC media, using the DNP-pro-Leu- Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2 fluorogenic substrate (Calbiochem-WWR) as described (Auge et al. 2004). After overnight incubation (37°C), the reaction was stopped by adding 1ml Tris- HCl buffer pH 7 and the fluorescence was read (excitation and emission wavelengths 280 and 360nm, respectively). Monoamine oxidase activity was determined in SMC extracts using specific substrates, [14C]5-hydroxytryptamine (59.7 mCi/mmol - NEN Life Science Products) for MAO-A, and [14C]β-phenylethylamine (41.8 mCi/mmol - NEN Life Science Products) for MAO-B, under the previously reported assay conditions (Pizzinat et al. 1999a). Protein concentration was determined using the Bradford reagent (Biorad).

Intracellular reactive oxygen species determination Intracellular ROS were measured using the fluorescent probe (H2DCFDA-AM) (Molecular Probes, Interchim, France), as previously used (Robbesyn et al. 2003).

Statistical analysis Data are presented as mean ± SEM. Estimates of statistical significance were performed by ANOVA (Turkey test; SigmaStat software). Values of P<0.05 were considered significant.

Results

Serotonin and tyramine trigger SMC proliferation through MAO-A-generated H2O2 Incubation of cultured arterial SMC with low concentrations of serotonin and tyramine (5 µM) triggers DNA synthesis (as assessed by [3H]thymidine incorporation) (Fig.1A), without toxicity (as shown by MTT assay) (Fig.1B). As expected, the mitogenic signaling was associated with a biphasic activation of ERK1/2 (Vindis et al. 2001), with an early peak at 5 min followed by a reinforced activation at 2-3 hours (Fig.1C). It may be noted that the second sustained wave of ERK activation is required for the mitogenic effect (Kahan et al. 1992). In order to investigate the mitogenic mechanism resulting from oxidation of biogenic amines by MAO, we utilized cells expressing mainly MAO-A, which is specific to serotonin degradation (Fig.1D,E) and employed tyramine which is oxidized by MAO-A and does not bind any known surface receptor (in contrast to serotonin), in order to exclude any

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C.Coatrieux et al. Free Rad. Biol. Med, 43(2007)80-89 MMP/sphingolipids in MAO-A signaling ______interferences of HT receptor signaling. First, we investigated whether reactive oxygen species (ROS) generated by MAO-A are really involved and required for the mitogenic signaling. The MAO inhibitors Pargyline (a pan-MAO inhibitor) and Ro-41-1049 (more specific for MAO- A) (Cesura et al. 1990), strongly inhibited both the serotonin- and tyramine-induced DNA synthesis (Fig.2A,B). The role of MAO-A was confirmed by the use of MAO-A specific siRNA, which inhibited strongly MAO-A activity (Fig.2C), and cell proliferation induced by tyramine. In contrast, as expected, pargyline and MAO-A siRNA had no effect on PDGF-induced SMC proliferation (Fig.2A,B). As ROS are generated during the oxidation of biogenic amines by MAOs (Fig.2D), we investigated whether ROS were involved in the mitogenic effect of tyramine. In agreement with this hypothesis, MAO-A siRNA, MAO inhibitors pargylin and Ro-41-1049, and the antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT) blocked the tyramine-induced rise of intracellular ROS (rise of fluorescence of the permeant oxidant-sensitive fluorogenic probe H2DCFDA-AM) (Fig.2E). In addition, ERK1/2 activation by tyramine was inhibited by Ro- 41-1049 and MAO-A specific siRNA, as well as by the antioxidant BHT (Fig.2F). Altogether, these data suggest that, in our experimental system, the mitogenic effect of serotonin and tyramine is mediated by MAO-A and requires the generation of ROS.

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Tyramine-induced ROS trigger activation of the MMP2/sphingolipid pathway Since the mitogenic mechanism evoked by tyramine and ROS is not well elucidated (Griendling et al. 2000), and since oxidative stress is able to trigger nSMase activation (Liu and Hannun 1997), we hypothesized that tyramine-induced mitogenic signaling may involve the recently described stress-induced metalloprotease/sphingolipid pathway (Auge et al. 1998). As reported in Fig.3A, the inhibition of the tyramine-induced DNA synthesis by pharmacological inhibitors and by MMP2 specific siRNA, strongly supports a role for MMP2 in the mitogenic signaling. Consistently, serotonin and tyramine induced DNA synthesis in wild type mouse fibroblasts (like in SMC), but this mitogenic effect was abrogated in fibroblasts derived from MMP2 knockout mice (MMP2-/- fibroblasts) (Fig.3B). These data show that, in SMC and fibroblasts, MMP2 activation is required for the tyramine-induced DNA synthesis. It may be noted that, as expected, the PDGF-induced mitogenic effect did not require MMP2 (Fig.3A,B). In agreement with these data, tyramine treatment of SMC induced rapidly the release of active MMP in the culture medium (Fig.3C). This MMP rise was inhibited by MAO-A specific siRNA, the MAO-A inhibitors Pargylin and Ro-41-1049, and the antioxidant BHT (Fig.3D), thus suggesting a role for ROS generated by MAO-A in the activation of MMP. As expected, the MMP inhibitor Batimastat and MMP2-specific siRNA inhibited the tyramine-induced MMP activation (Fig.3D). In order to confirm that ROS are upstream MMP2 activation (as suggested by the data of Fig.3D), we investigated the effect of MMP inhibitors on ROS generation. As shown in Fig.3E, both MMP2 specific siRNA and Batimastat (used under conditions of MMP2 inhibition of Fig.3D) did not inhibit the tyramine-induced ROS generation (Fig.3E). Similarly, in wild type and MMP2-/- fibroblasts (which exhibit similar level of MAO-A activity, i.e. 0.75±0.1 and 0.70±0.1 nmol of oxidized serotonin/min.mg, respectively) the tyramine-induced ROS generation was not altered. This confirms that ROS are upstream of MMP2 and are involved in its activation. Taken together, these data indicate that MMP2 is involved in the mitogenic signaling of tyramine through a ROS-mediated mechanism.

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As MMP2 has been shown to mediate the oxidized LDL-induced activation of nSMase (Auge et al. 2004), its involvement in tyramine-mediated mitogenic signaling was investigated using MMP2 specific siRNA and MMP2-/- fibroblasts. Tyramine triggered the activation of nSMase (the initial step of the sphingolipid pathway) that peaked at 60 min (Fig.4A). The nSMase activation was blocked by MAO-A inhibitors Ro-41-1049 and MAO- A specific siRNA, the antioxidant BHT, the MMP inhibitor Batimastat and by MMP2 specific siRNA (Fig.4B). In the same way, tyramine induced nSMase activation in wild type fibroblasts (which was inhibited by Ro-41-1049), but not in MMP2-/- fibroblasts, thereby confirming the role of MMP2 in nSMase activation (Fig.4C). As shown in Fig.4D,E, nSMase2-specific siRNA and DMS, a sphingosine kinase inhibitor (used under conditions of sphingolipid pathway inhibition), did not inhibit ROS generation and MMP activation, thus confirming that nSMase acts downstream from ROS and MMP2. These data support the idea that tyramine-induced nSMase activation is mediated by ROS and MMP2. Finally, nSMase2- specific siRNA and DMS resulted in the inhibition of ERK1/2 phosphorylation and DNA synthesis induced by tyramine (Fig.4F,G), thus demonstrating the involvement of nSMase2 and the sphingolipid pathway in SMC proliferation. Altogether, these data strongly suggest that tyramine oxidation by MAO-A triggers the following sequential signaling cascade: i/ tyramine oxidation by MAO-A generates ROS, ii/ ROS are involved in MMP2 activation, iii/ MMP2 is required for activating nSMase2, iv/ activation of nSMase2 and the sphingolipid pathway mediates ERK1/2 phosphorylation and DNA synthesis, as summarized in the general schema of Fig.5.

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Discussion Oxidative stress and oxidized lipids, resulting from membrane peroxidation or from LDL oxidation, play a major role in vascular diseases and particularly in atherosclerosis, by promoting inflammatory response, cell proliferation and apoptosis (Steinberg 1997; Irani 2000; Leonarduzzi et al. 2000; Napoli et al. 2001; Salvayre et al. 2002; Stocker and Keaney 2005). Beside the classical cellular pathways involved in ROS generation in the vascular wall and atherosclerotic plaques (Irani 2000; Thannickal and Fanburg 2000; Napoli et al. 2001; Wolin et al. 2005), the degradation of biogenic amines by MAOs is an additional source of ROS (Thannickal and Fanburg 2000). In this study, we report for the first time that ROS generated during tyramine or serotonin oxidation by MAO-A, trigger SMC proliferation, through a stress-induced mitogenic mechanism involving MMP2, and nSMase (Fig.5).

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The first important finding is that ROS generated by MAO-A in SMC and fibroblasts mediate the mitogenic effect of serotonin and tyramine. This hypothesis is supported by MAO-A silencing using specific siRNA, which inhibited completely the tyramine signaling leading to DNA synthesis, this being confirmed by the inhibitory effect of MAOs classical pharmacological inhibitors, pargyline and Ro-41-1049. Moreover, the role of ROS was supported by the inhibitory effect of the antioxidant BHT. It may be noted that the mitogenic effect of MAOs substrates occurred at low concentrations (around 1-5 µM), whereas higher concentrations were inhibitory or/and toxic [36]. This is in agreement with the general properties of oxidative stress in vascular cells (Irani 2000; Napoli et al. 2001), and more precisely for ROS released during oxidation of MAOs substrates, which are mitogenic for mesenchymal cells (Vindis et al. 2001). Moreover, high oxidative stress induced during biogenic amines oxidation is proapoptotic in epithelial cells and in cardiomyocytes, after hypoxia/reoxygenation and ischemic myocardial injury (Bianchi et al. 2003; Bianchi et al. 2005a). The biological effect (proliferation/apoptosis) resulting from biogenic amines oxidation depends on oxidative stress intensity (itself depending on MAO expression and substrate availability), on cellular antioxidant defenses, and on the expression of pro- (e.g.

Bad, Bax) vs anti-apoptotic (e.g. Bcl-2, Bcl-XL) proteins (Irani 2000; Napoli et al. 2001; Salvayre et al. 2002; Orrenius et al. 2003). ROS generation and the mitogenic effect triggered by serotonin, would be also mediated by NADPH oxidase, through a mechanism involving either the 5-HT transporter or the receptor, depending on the cell type (Lee et al. 1998a; Lee et al. 2001). In our experimental system, we used tyramine, in order to avoid signaling mediated by the 5-HT receptor, and the inhibition of ROS production by MAO-A pharmacological inhibitors and specific siRNA strongly supports the role of MAO-A in this system. However, it is not excluded that ROS generated by MAO may induce NADPH oxidase, in agreement with previous reports showing that mitochondrial H2O2 is indirectly involved in the generation of superoxide anion and subsequent LDL oxidation via NADPH oxidase (Mabile et al. 1997). The second important finding of this work is the involvement of the metalloprotease MMP2 and the sphingolipid enzyme nSMase2 in the mitogenic signaling triggered by ROS generated by MAO-mediated oxidation of biogenic amines. The sphingolipid pathway plays a major role in the balance proliferation/inflammation vs apoptosis within the vascular wall, since it is induced by a large number of stress-inducing

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C.Coatrieux et al. Free Rad. Biol. Med, 43(2007)80-89 MMP/sphingolipids in MAO-A signaling ______agents present in the atherosclerotic lesion, including TNFalpha, oxidized LDL and oxidative stress (Auge et al. 2000). Intracellular redox modifications and oxidative stress trigger nSMase activation and generation of ceramide (Liu and Hannun 1997) that may block the mitochondrial respiratory chain, generate in turn H2O2, and finally amplify the sphingolipid signal (Gudz et al. 1997). The sphingolipid pathway can modulate catecholamine secretion in rat chromaffin (Gudz et al. 1997) and PC12 cells (Sofic et al. 2001), but the involvement of nSMase in catecholamine signaling is not known so far. Here we show that, subsequently to tyramine oxidation by MAO-A, nSMase is rapidly activated through a ROS and MMP2- dependent mechanism. The involvement of nSMase2 (smpd3) in SMC proliferation induced by tyramine was strongly supported by the inhibition of DNA synthesis occurring after silencing nSMase2 by specific siRNA, in agreement with Marchesini et al. (Marchesini et al. 2004). The role of nSMases in cell signaling is controversial since ceramide generated from sphingomyelin hydrolysis or from de novo biosynthesis, may be linked either to apoptosis or cell proliferation, the cell fate being influenced by the balance between ceramide and sphingosine-1-phosphate (Spiegel and Milstien 2003). In agreement, in our experimental system, we observed a concomitant activation of sphingosine kinase (data not shown) that was required for SMC proliferation, as assessed by the inhibitory and pro-apoptotic effect of DMS. Interestingly, the generation of ROS by MAOs in ischemia/reperfusion conditions leads to apoptosis of cardiomyocytes and cardiac injury, through ceramide accumulation and sphingosine kinase inhibition (Pchejetski et al. 2007). These results confirm the dual role of ROS in the balance proliferation/apoptosis depending on cell type and MAO-A expression and activation, and the relevance of sphingosine kinase as "sphingolipid rheostat", in the regulation of cell proliferation, survival, and cell death (Maceyka et al. 2002). Furthermore, our data are consistent with those observed in experiments utilizing mitogenic concentrations of oxidized LDL, in which nSMase is activated and generates ceramide, the first mediator of the ‘sphingolipid pathway’, which can lead to sphingosine 1-phosphate generation of the proliferative/anti apoptotic mediator. Accordingly, it may be noted that smpd3-deficient or KO mice do not exhibit any apparent defect of apoptosis, but rather growth retardation (Aubin et al. 2005; Stoffel et al. 2005), which is in agreement with a role for nSMase2 in cell proliferation.

Until now, the mechanism of nSMase activation by oxidative stress is only poorly understood. We recently reported that MMP2 (and MT1-MMP which mediates both

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C.Coatrieux et al. Free Rad. Biol. Med, 43(2007)80-89 MMP/sphingolipids in MAO-A signaling ______proteolysis and activation of proMMP2) (Murphy et al. 1999; Itoh and Seiki 2006) are involved in the activation of nSMase triggered by oxidized LDL (Auge et al. 2004). Furthermore, exogenous MT1-MMP and MMP2 activate nSMase and DNA synthesis in SMC (Auge et al. 2004), thereby indicating that MMP2 is sufficient to trigger nSMase activation in these cells. Here we show that MMP2 is involved in the activation of nSMase by ROS, this being supported by MMP2 defect (siRNA against MMP2, MMP2-deficient fibroblasts, and pharmacological MMP inhibitor Batimastat). Thus MMP2 plays a crucial role in this ROS- induced mitogenic signaling and is part of the missing link between oxidative stress and nSMase activation. Previous reports have shown that oxidative stress (H2O2 or xanthine/xanthine oxidase system), triggers the overexpression of MMP2 (Yoon et al. 2002; Galli et al. 2005), but an early activation of MMP2 by ROS as well as its involvement in ROS-mediated mitogenic signaling was not known. Here we show that MMP2 is activated very early following oxidative stress generated by MAO-A activity (no MMP2 activation was observed in MAO-A-silenced SMC), and is involved in DNA synthesis by triggering nSMase activation. The mechanism evoked by MMP2 remains to be elucidated. One hypothesis is that MMP2 and nSMase2 interact within a complex formed at the cell surface between the different partners of this signaling pathway, including extracellular matrix components, plasma membrane lipids, integrins and cytoskeleton proteins. In conclusion, the reported data shed light on a novel mitogenic signaling cascade triggered by ROS that are generated during the oxidation of biogenic amines by MAOs. The ROS-induced signaling requires the sequential activation of MMP-2 and nSMase2. Interestingly, MMP-2 and nSMase are not implicated in cell proliferation induced by PDGF and fetal calf serum (this manuscript and [22]), in agreement with the observation of Kuzuya et al. (Kuzuya et al. 2003). This suggests that the mechanism reported here has probably no or only minor role under physiological conditions, but rather participates in stress response and might be of importance under conditions leading to high level of activated MMP-2 in the vascular wall (Wang and Keiser 1998; Johnson and Knox 1999; Galis and Khatri 2002; Lijnen 2002; Visse and Nagase 2003). In addition to the well-known role of MMPs in extracellular matrix remodeling, the recently described involvement of MMP-2 in the activation of nSMase2 and the sphingolipid pathway, may be of importance in various cellular responses, including proliferation, migration and apoptosis (Auge et al. 2000; Ogretmen and

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Hannun 2004). These cellular events may participate not only in intimal hyperplasia, but also in the formation and remodeling of atherosclerotic plaques (Auge et al. 2000). From a pathophysiological and pharmacological point of view, our data provide a molecular basis to the clinical use of inhibitors of MMP and/or sphingolipid pathway to prevent excessive SMC proliferation such as observed in coronary artery disease, carotid stenosis, and peripheral artery disease. However, the use of drugs reducing SMC proliferation must be cautious because a strong fibro-proliferative cap may increase plaque stability and reduce the risk of atherothombotic events.

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Résutats expérimentaux

Ce travail met en évidence le rôle de la MAO-A dans l’effet mitogène de la sérotonine et de la tyramine sur les CMLs et l’implication de MMP2 et de la voie des sphingolipides.

En effet, la sérotonine, comme la tyramine, activent les MAP kinases et la prolifération des CMLs. L’effet de la sérotonine est dû à un mécanisme récepteur-médié, largement décrit dans la littérature et connu également pour générer des EROs via l’activation de la NAD(P)H oxydase exprimée dans la membrane plasmique. La dégradation de la sérotonine (et de la tyramine) par la MAO-A (exprimée dans les cellules vasculaires, et précisément dans les CMLs) génère H2O2, qui se comporte comme un second messager capable d’induire la prolifération, la différenciation ou l’apoptose comme décrit dans les cardiomyocytes (Bianchi et al. 2005a). La génération d’EROs, via la MAO-A en présence de sérotonine ou de tyramine, est impliquée dans la prolifération des CMLs, comme démontré dans ce travail, par l’utilisation de siRNA et d’inhibiteurs spécifiques de MAO-A. Par ailleurs, la signalisation mitogène des EROs implique la voie MMP/sphingolipides, déjà décrite dans la prolifération de stress induite par le TNFalpha, ou les LDL oxydées. Par ailleurs, comme montré dans l’article suivant, H2O2 mime la signalisation mitogène induite par la tyramine.

Dans cet article nous avons étudié l’activation de la sphingosine kinase par H2O2, ses liens avec la voie MMP/nSMase, et l’implication potentielle du PDGF récepteur qui est décrit comme étant activé par H2O2 (Saito et al. 2002). Dans ce travail, nous utilisons H2O2 pour mimer l’effet de la tyramine. Il est à noter que des résultats identiques à ceux obtenus avec H2O2, ont été observés avec la tyramine, indiquant donc que la voie de signalisation décrite est la même.

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Christelle Coatrieux et al 1st version - june 2007

Sphingosine kinase-1 activation and DNA synthesis mediated by hydrogen peroxide require the PDGF receptor and the metalloprotease/sphingolipid pathway

Christelle Coatrieux*,†, Anne Nègre-Salvayre*, Angelo Parini†, Yusuf Hannun***, Shigeyoshi Itohara‡, Robert Salvayre*, Nathalie Augé*

* - INSERM U858 I2MR and Dept of Biochemistry1, IFR-31, CHU Rangueil, Toulouse, France † - INSERM U388, IFR-31, CHU Rangueil, Toulouse, France ‡ - RIKEN Brain Research Institute, Wako-Shi, Saitama 351-0198, Japan ***Medical University South Carolina, Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Charleston, SC, 29425, USA.

Running title: Activation of sphingosine kinase-1 by H2O2

Address correspondence to: Dr A. Negre-Salvayre INSERM U466 - Biochemistry - IFR-31 - CHU Rangueil 1, avenue Jean Poulhes - TSA-50032 - 31059 Toulouse Cedex 9 - France. Tel. (33) 561-32-27-05 - Fax (33) 561-32-20-84 E-mail: [email protected]

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Christelle Coatrieux et al 1st version - june 2007

Abstract

Among the proatherogenic factors involved in SMC proliferation, oxidative stress exerts mitogenic and proapoptotic properties, which contribute to the formation of the fibrous cap, and the stability of the plaque in atherosclerotic lesions. The metalloprotease2 (MMP2)/neutral sphingomyelinase2 (nSMase2), is a stress-induced mitogenic signaling pathway which contributes to cell proliferation via the activation of sphingosine kinase-1 (SK-1) and the generation of sphingosine 1-phosphate. This study was carried out to investigate the role of SK-1 in H2O2-induced SMC proliferation. We report that low concentrations of H2O2 (5µM) activate SK-1 and DNA synthesis via two separate and independent pathways i/ the MMP2/nSMase2 pathway as assessed by the inhibitory effect on SK-1 of Batimastat (a specific MMP inhibitor), and of siRNA specific for MMP2 and nSMase2, and by the lack of SK-1 activation and DNA synthesis in fibroblasts from MMP2-/- KO mice, and from fro (smpd3) mice, deficient in nSMase2 activity, ii/ PDGFRβ and src kinase, as assessed by the inhibitory effect on SK-1 activation of AG1295, the PDGFRβ-intrinsic tyrosine kinase inhibitor, of the src inhibitor PP2, and by the lack of SK-1 activation in fibroblasts expressing a dominant negative form of src. No crosstalks were observed between src, PDGFRβ and the MMP2/nSMase2 pathway, as confirmed by the use of PDGF-BB which triggered a strong SK-1 activation, independently of MMP2 and nSMase2.

These data shed light on a novel stress-induced mitogenic cascade triggered by H2O2, which necessites SK-1 activation for SMC proliferation, with possible consequences under conditions leading to increased oxidative stress in the vascular wall.

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Christelle Coatrieux et al 1st version - june 2007

Introduction

Oxidative stress generated within the vascular wall play a major role in atherogenesis by promoting LDL oxidation, which induces the formation of foam cells and fatty streak the early atherosclerotic lesions (Steinberg 1997; Stocker and Keaney 2005). Furthermore, oxidative stress contributes to endothelium dysfunction, inflammatory responses, smooth muscle cell proliferation, intimal hyperplasia and apoptosis (Steinberg 1997; Irani 2000; Napoli et al. 2001; Stocker and Keaney 2005). Oxidative stress triggers the activation of various signaling pathways such as tyrosine kinase receptors, ERK1/2, p38MAPK, the sphingolipid pathway, or the proinflammatory redox-sensitive transcription factors (NFkappaB) (Napoli et al. 2001). Oxidative stress induces cell death by necrosis or apoptosis and activates pro-apoptotic signalings such as caspase activation and calcium deregulation, (Irani 2000; Leonarduzzi et al. 2000; Napoli et al. 2001; Tedgui and Mallat 2001; Salvayre et al. 2002; Orrenius et al. 2003). The dual and opposite effects of oxidative stress/survival /proliferation vs apoptosis-, depend on the duration and the intensity of the stress, the nature of the oxidants and the cell type (Irani 2000; Salvayre et al. 2002). The balance proliferation/apoptosis is particularly important for smooth muscle cells (SMC), which migrate and proliferate in the intima and secrete extracellular matrix and other key constituents of the fibrous cap, thereby regulating the stability of atherosclerotic plaques and the occurrence of athero-thrombotic events (Irani 2000; Napoli et al. 2001; Salvayre et al. 2002).

The MMP2/sphingolipid pathway (sphingomyelin/ceramide/sphingosine 1-phosphate (Spm/Cer/S1P) pathway is a newly described stress-induced mitogenic signaling, which involves the activation of a signaling cascade by stress-inducing agents (cytokines, oxidized LDL), leading to the activation of the metalloprotease MMP2 itself involved in the activation of the neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2), through a yet unknown mechanism (Auge et al. 2004; Tellier et al. 2007). In the last decade, the sphingolipid pathway has emerged as a major signaling system, involved in cell proliferation, differentiation or apoptosis, depending on the cell type, the nature of the agonist and of stimulus intensity (Levade et al. 2001). Ceramide formed during sphingomyelin turnover is a pro-apoptotic mediator (Pettus et al. 2002) but can be metabolized into sphingosine-1-phosphate (S1P) by ceramidase and sphingosine kinase (SK-1), a potent anti-apoptotic and survival agent that plays a major role 85

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in cell proliferation and migration (Pyne and Pyne 2000; Xia et al. 2000; Hobson et al. 2001; Spiegel et al. 2002), through diverse signaling pathways including the specific S1P receptors/EDG (Endothelial Differentiation Gene) family of G-protein-coupled receptors (Hla et al. 1999; Kluk and Hla 2002). The neutral sphingomyelinase 2, which catalyzes the initial step of the SM/Cer pathway, is regulated by oxidative stress (Liu and Hannun 1997) and by MMP (Auge et al. 2004). Recently, it has been shown that H2O2 generated by the hydrolysis of serotonin and tyramine by MAO-A, may trigger the activation of MMP2 and nSMase2, which participate to the mitogenic signaling of these biogenic amines (Coatrieux et al. 2007; Coatrieux C 2007). This study was carried out to investigate the involvement of SK-1 in cell proliferation induced by low concentrations of H2O2, and the relations with the MMP2/nSMase2 pathway, vs the activation (by H2O2) of the PDGFRβ, which is a known target of oxidative stress, and may activate SK-1 independently of nSMase activation (Olivera et al. 1999a; Spiegel and Milstien 2002).

Experimental procedures

Chemicals [3H]Thymidine were purchased from Amersham (Les Ullis, France) [choline-methyl- 14C]sphingomyelin and [P33]γ -ATP from DuPont NEN. Rabbit anti-phospho-MAPK was from Promega (Madison, WI). Anti ERK1/2 and anti phosphotyrosine were from Santa Cruz (Tebu, France). Batimastat was a generous gift of H.W. Krell (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany). Other reagents were from Sigma or Amersham Biosciences.

Cell Culture

Rabbit femoral SMC (ATCC), were grown in RPMI-1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), under the previously used conditions (Auge et al. 2004). Fibroblasts issued from control and fro/fro mice (deficient in nSMase2 activity) and MMP2 deficient fibroblasts issued from MMP2 -/- mice (Itoh et al. 1997) were grown in DMEM supplemented with 10% FCS. SrcK+ and SrcK– cells, derived from C3H-10T1/2 murine embryo fibroblasts

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transfected with and overexpressing dominant negative form of pp60c-Src-deficient in kinase activity (SrcK– cells, clone 430c-Src) or wild-type c-Src (SrcK+), were from Dr. S. J. Parsons (Charlottesville, VA) and were grown in DMEM medium.supplemented with G418 (0.4 mg/ml), according to Maupas-Schwalm et al. (2004). Cells were serum-starved in RPMI 24 h before each experiment.

DNA synthesis, western blots and cytotoxicity. DNA synthesis was evaluated by [3H]thymidine incorporation. Western blots and cytotoxicity by the MTT test, were performed under the previously used conditions (Auge et al. 2004).

Enzyme activities determination and RNA interference transfection Neutral sphingomyelinase (nSMase) activity was determined in SMC and fibroblast extracts using [choline-methyl-14C]sphingomyelin (120 000 dpm/assay), as reported (Auge et al. 1999). Silencing of nSMase2 (sequence AAt-GCTACTGGCTGGTGGACC) (Eurogentec, Belgium), was done in the following conditions: SMC were transfected with 20µM siRNA in Optimem medium (Gibco) mixed with oligofectamine, as described (Marchesini et al. 2004). 16h after transfection, SMC were incubated in RPMI containing 10% FCS for 24 h. Then SMC were incubated for 12h in RPMI containing 0.5% FCS, and used for experiments. MMP-2 expression was inhibited by small-interference RNA (siRNA) 5'- AGUUGGCAGUGCAAUACCUGA-3' (sense strand) (Dharmacon). SMCs were transfected with 20 µmol/L double-strand siRNA in Optimem medium (Gibco) mixed with oligofectamine, as described previously (Auge et al. 2004). Three hours after transfection, SMCs were incubated in RPMI containing 10% FCS for 24 hours. Then SMCs were incubated for 12 hours in RPMI containing 0.5% FCS before treatment with oxLDLs (100µg/mL). Alternatively, cells were treated with an irrelevant siRNA (p120 catenin siRNA) as negative control. Sphingosine kinase-1 (SK-1) activity was determined according to Maupas-Schwalm et al (Maupas-Schwalm et al. 2004). Briefly, after incubation with or without H2O2, cells were washed with ice-cold PBS, harvested, sedimented by centrifugation and cell pellets were solubilized in the kinase buffer. The SK-1 assay was performed in cell extracts (50 µg protein) with sphingosine (50 µM) and Triton X-100 0.25%, [33P]ATP and unlabeled ATP (1 µCi, 1 mM) containing 10 mM MgCl2, in a final volume of 200 μl. After incubation for 30 min at 37 °C, the reaction was stopped by the addition of 20 µl of 1 N HCl 87

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and the [33P]ATP-labeled S1P was extracted, isolated by TLC and quantified as described (Olivera and Spiegel 1998). MMP activity was determined on SMC media, using the DNP-pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D- Arg-NH2 fluorogenic substrate (Calbiochem-WWR) as described (Auge et al. 2004). After overnight incubation (37°C), the reaction was stopped by adding 1ml Tris-HCl buffer pH 7 and the fluorescence was read (excitation and emission wavelengths 280 and 360nm, respectively). Protein concentration was determined using the Bradford reagent (Biorad).

Statistical analysis Data are presented as mean ± SEM. Estimates of statistical significance were performed by ANOVA (Turkey test; SigmaStat software). Values of P<0.05 were considered significant.

Results

H2O2 is known to enter the cell and trigger cell signaling (Rao and Berk 1992). We recently reported that H2O2 released from the hydrolysis of serotonin and tyramine by MAO-A in SMC, is involved in the mitogenic effect of biogenic amines, through an activation of the metalloprotease/sphingolipid pathway. Since the mitogenic signaling of the sphingolipid system (sphingomyelinase/ceramide), requires a downstream activation of sphingosine kinase, the present work was designed to investigate the involvement of sphingosine kinase (SK-1), in cell proliferation induced by H2O2. As shown in Fig.1A, low concentrations of H2O2 (1- 10 µM) trigger DNA synthesis whereas higher concentrations are cytotoxic. Further experiments were done using 5µM of H2O2, which is mitogenic for SMC and fibroblasts, and triggers a rapid ERK1/2 phosphorylation after 5-15 min of contact with SMC (Fig.1C). The mitogenic effect of H2O2 was inhibited by the antioxidants BHT and NAC, by the metalloprotease inhibitor Batimastat and by the sphingosine kinase inhibitor DMS (Fig.1B). Conversely, BHT, Batimastat and DMS inhibited the activation of ERK1/2, (Fig.1C). These data are in agreement with previous results indicating an involvement of the metalloprotease MMP2 and of the sphingolipid system in the mitogenic effect of H2O2 released from the degradation of serotonin and tyramine by MAO-A (Coatrieux et al. 2007). We then checked the activation of MMP, nSMase and SK-1 by H2O2. As shown in Fig.1D, the incubation of SMC with H2O2 resulted in a rapid activation of MMP (peaking at 1-5 min), and

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concomitantly of nSMase (Fig.1E) and SK-1 (Fig.1F). BHT and Batimastat blocked the activation of MMP, nSMase and SK-1 (Fig.5D-F) thus suggesting that SK-1 activation could depend on MMP and nSMase. DMS did not inhibit the activation of MMP and of nSMase, but inhibited the activation of SK-1, indicating that SK-1 is involved in the mitogenic effect of H2O2, downstream MMP and nSMase (Fig.1D-F).

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A B

150 C 150

H202 - + + + + Inhibitor - - Bati DMS BHT Act-ERK1/2

ERK1/2 100 100

[3-H]-thymidine (%) Incorporation 0 [³H] Thymidine[³H] (%) incorporation 0 H2O2 (µM) 0 1 5 10 50 H2O2 -+++++ BHT DMS NAC BATI

E D ns F ns

150 150 150

MMP2 activity (%) 100 100 100 nSMase activity (%) SKase activity (%)

0 0 0 H2O2 -+++++ H2O2 - + + + + + H2O2 -++++ + BHT NAC DMS BATI BHT BHT NAC DMS NAC BATI DMS BATI

Figure 1. The mitogenic signaling of H2O2 involves the MMP2/sphingolipid pathway. A,B - Proliferative SMC were grown in 24 multiwell plates in RPMI containing 10% FCS. 24h before the beginning of the experiment, SMC were starved in serum-free RPMI, then incubated with H2O2. SMC proliferation was determined 24h later, by measuring the incorporation of [3H]thymidine (added 8h before the end of the experiment) as reported in the Experimental section. A, dose-response of H2O2 on DNA synthesis in SMC. B, effect of BHT (10 µM), NAC (10mM), Batimastat (BATI, 10 nM) and DMS (2 µM) on DNA synthesis induced by H2O2 (5µM). The inhibitors were preincubated for 1h with SMC before the addition of H2O2. Mean+/-SEM of 4 separate experiments, *p<0.05. C, ERK1/2 phosphorylation induced by H2O2 (5µM, 10 min) and inhibitory effect of Batimastat, DMS and BHT . D,E,F – Effect of H2O2 on MMP, nSMase2 and SK-1 activation, and effect of inhibitors. C, MMP activity was determined in the culture medium of SMC after 10 min of incubation with H2O2 (5µM), in the absence or in the presence of the different inhibitors, as in B, and using the DNP-pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2 fluorogenic substrate as described in the Experimental Section. D, activation of nSMase by H2O2 and effect of inhibitors. The activity of nSMase was determined using the [choline-methyl-14C]sphingomyelin substrate. The basal activity of nSMase in unstimulated SMC was 275 +/-5 pmol/h/mg cellular proteins. E, activation of SK-1 by H2O2, determined in presence of sphingosine and [33P]ATP, as described in the Experimental section, and effect of inhibitors. Mean ± SEM of 4 separate experiments. *p<0.05.

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MMP2 and nSMase2 are involved in the mechanism of SK-1 activation by H2O2

Previous reports have shown that MMP2 is required for the activation of nSMase2, the first step of the sphingolipid pathway, by stress-inducing agents such as TNFα or oxidized LDL (Auge et al. 2004; Tellier et al. 2007). Here we aimed to characterize the links between the activation of SK-1 induced by H2O2 and the MMP2/nSMase pathway. As shown in Fig.2, MMP2 and nSMase2 silencing by specific siRNA inhibited the DNA synthesis induced by H2O2 (Fig.2A) as well as nSMase (not shown) and SK-1 activation (Fig.2B), thus suggesting that both MMP2 and nSMase2 are required for activating SK-1 in presence of H2O2. Conversely, the activation of nSMase and of SK-1 by H2O2 was abolished in fibroblasts deriving from MMP2-/- KO mice (Fig.2C-E), while no SK-1 activation by H2O2 nor cell proliferation were observed in fibroblasts isolated from fro mice, in which the mutation of the smpd3 gene results in nSMase2 deficiency (Aubin et al. 2005) (Fig.2C-E). It is to note that cell proliferation induced by fetal calf serum (10%) was not inhibited in MMP2-/- and fro fibroblasts nor in presence of siRNA (not shown), thus indicating that MMP2 and nSMase are not required for cell proliferation mediated by fetal calf serum. Altogether these data indicate that SK-1 activation by H2O2 results from an upstream activation of the MMP2/nSMase2 pathway.

PDGFRβ and src are involved in SK-1 activation by H2O2 independently of the MMP/nSMase system

Several reports indicate that SK-1 is activable by PDGF-BB, and takes part in the mitogenic signaling of PDGFRβ, and that oxidative stress may directly activate the PDGFRβ -signaling pathway (Gonzalez-Rubio et al. 1996; Okuyama et al. 2001). Therefore we investigated the involvement of PDGFRβ in SK-1 activation by H2O2, and its links with the MMP2/nSMase2 pathway. We first investigated the effect of H2O2 on the activation of PDGFRβ. As shown on Fig.3A, H2O2 triggered a transient phosphorylation of PDGFRβ which was inhibited by AG1295, by BHT and by the specific src inhibitor PP2, as previously reported for EGFR (Liu et al. 2004a), but not by Batimastat and DMS. The PDGFRβ inhibitor AG1295 blocked DNA synthesis and SK-1 activation triggered by H2O2 (Fig.3B,E), but had no effect on the activation of MMP2 and nSMase (Fig.3C,D), suggesting that the two pathways, PDGFRβ and the MMP/nSMase system are dissociated and are necessary for the activation of SK-1 by 91

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H2O2.

A B SMC SMC SiRNA MMP2 SiRNA MMP2 SiRNA nSMase2

150 150

ns ns

100 SKase100 activity (%)

[3-H]-Thymidine (%) Incorporation 0 0 H2O2 -+ -+ -+ H2O2 - + - +

C D E MMP2 wt MMP2 wt MMP2 wt MMP2-/- MMP2-/- MMP2-/- Smpd3wt Smpd3wt Smpd3wt Smpd3-/- Smpd3-/- Smpd3-/-

150 150 150 ns

ns ns ns ns ns 100 100 100 [³H]Thymidine (%) incorporation Skase activity (%) nSMase activity (%) 0 0 0 H2O2 -+-+-+-+ H2O2 -+-+-+-+ H2O2 - + - + - + -+

Figure 2. The activation of SK-1 by H2O2 requires the MMP2/nSMase2 pathway A,B. Inhibitory effect of siRNA specific for MMP2 (grey bars), and for nSMase2 (blue bars), on DNA synthesis (A) and SK-1 activation (B) induced by H2O2 (5µM). SiRNA were incubated with SMC for 48h, in the conditions defined by the manufacturer. The silencing of MMP2 was checked by western-blot showing the inhibition of MMP2 expression in SMC (Auge et al, 2004). The silencing of nSMase2 was checked by determining the nSMase activation by TNF? (Tellier et al, 2007). C, D, E. Determination of DNA synthesis (C), nSMase (D) and SK-1 activation by H2O2 (5µM) in fibroblasts isolated from MMP2-/- KO mice vs MMP2+/+ cells (grey bars), and in fibroblasts isolated from fro mice (in which nSMase2 activity is deficient), vs controls. Mean +/-SEM of 5 separate experiments (*p<0.05).

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B

150 A MW (kDa) PTyr 179 PDGFRβ 179 H2O2 - + + + + + 100 Bati PP2 DMS AG1295

[3-H]-Thymidine (%) Incorporation 0 H2O2 -++ + AG PP2

C D E ns ns 150 150 150

100 MMP2 activityMMP2 (%) 100 100 SKase activity (%) nSMase activity (%)

0 0 0 H2O2 -+++ H2O2 - + + + H2O2 -+++ AG AG PP2 AG PP2 PP2

Figure 3. PDGFRβ and src are involved in SK-1 activation by H2O2 A, Effect of H2O2 on the phosphorylation of PDGFRβ and effect of inhibitors. Cell extracts prepared from SMC incubated for 5 min with H2O2 (5µM) in the absence or in the presence of inhibitors, AG1295 (10 µM), PP2 (1µM), Batimastat (BATI, 10 nM) and DMS (2 µM), were separated by SDS-PAGE and immunoblotted with the antiphosphophotyrosine and anti PDGFRβ antibodies. B, Effect of PDGFRβ and src inhibitors on DNA synthesis induced by H2O2. C,D,E, effect of PDGFRβ and src inhibitors on MMP, NSMase and SK-1 activation by H2O2 (5µM). Mean +/-SEM of 5 separate experiments (*p<0.05).

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Since we reported recently that the activation of SK-1 necessites src kinase, and since src can be activated (at least in part) via the PDGFRβ, we investigated the effect of a specific src inhibitor, PP2, which exhibited a net inhibitory effect on SK-1 activation and DNA synthesis (Fig.3B,E), but did not inhibited MMP2 and nSMase activation by H2O2 (Fig.3C,D).

These data were confirmed by the use of 'kinase dead' srcK- mutant fibroblasts (clone 430c- Src) which did not proliferated in presence of H2O2 , contrary to the wild-type c-src (srcK+) (Fig.4A). H2O2 induced a normal activation of MMP2 and nSMase in both srcK-/- and srcK+ cells (Fig.4B,C), (indicating that src is not involved in the upstream activation of the MMP/sphingolipid pathway), but failed to induce any SK-1 activation in srcK- cells (Fig.4D). These data indicate that src is required for the activation of SK-1 by H2O2, as previously reported for plasminogen activators (Maupas-Schwalm et al. 2005).

We checked the existence of links between PDGFRβ and the MMP2/nSMase system, in the activation of SK-1. As shown in Fig.5, the phosphorylation of PDGFRβ by its own ligand PDGF-BB was inhibited by AG1295 and by PP2, but not by Batimastat nor DMS. Mitogenic concentrations of PDGF-BB did not activate any MMP nor nSMase activity (Fig.5C,D), while they triggered a strong activation of SK-1 (Fig.5E), in agreement with previous reports from Spiegel et al (Spiegel et al. 2002). The activation of SK-1 was not inhibited by Batimastat, (contrary to SK-1 activation mediated by H2O2), but was blocked by AG1295, PP2, and by DMS (Fig.5E). Conversely, the proliferation of SMC mediated by PDGF-BB was inhibited by AG1295, PP2 and DMS, but not by Batimastat (Fig.5A). PDGF-BB was not mitogenic for srcK- fibroblasts (by comparison with srcK+ cells) (not shown), and did not induce any SK-1 activation in these cells, again indicating that src plays a pivotal role in the activation of SK-1 in the mitogenic effect elicited by PDGF-BB and H2O2.

Altogether, these data indicate that i/ the mitogenic effect of the PDGF-BB involves the activation of SK-1, but doesn’t require nor the MMP2/nSMase system, ii/ DNA synthesis mediated by H2O2 requires the activation of SK-1 via two separate mechanisms, the PDGFRβ signaling system, and the stress-induced MMP/nSMase2 pathway, and the inhibition or the silencing of each pathway results in an inhibition of SK-1 activation and DNA synthesis induced by H2O2, iii/ src kinase is required for the activation of SK-1 induced by H2O2 and by PDGF-BB.

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A B SrcK +/+ SrcK +/+ SrcK -/- SrcK -/-

150 150

100 activityMMP2 (%) 100

[3-H]-Thymidine Incorporation (%) 0 0 H2O2 - + H2O2 - +

C SrcK +/+ D SrcK +/+ SrcK -/- SrcK -/-

150 150

100 SKase100 activity (%) nSMase activity (%)

0 0 H2O2 - + H2O2 - +

Figure 4. Src kinase is involved in SK-1 activation by H2O2 Fibroblasts overexpressing a mutant dominant negative form of src (src-/-) or a fully active form of src (src+/+), were stimulated by H2O2 (5µM). A, DNA synthesis; B, activation of MMP in the culture medium of fibroblasts stimulated or not by H2O2; C, activation of nSMase; D, activation of SK- 1. Mean +/-SEM of 5 separate experiments (*p<0.05).

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B ns

A MW (kDa) 150 PY20 179

PDGFRβ 179 PDGF - + + + + + 100 Bati PP2 DMS AG1295 [3-H]-Thymidine (%) Incorporation 0 PDGF - + + + + + +

AG PP2 BHT DMS BATI

C D E ns ns ns 100 100 150

100 SKase activity (%) nSMase activity (%) MMP2 activityMMP2 (%) 0 0 0 PDGF - + + + + + + PDGF - + PDGF - + AG PP2 BHT DMS BATI

Figure 5. PDGF-BB activates SK1 independently of the MMP2/nSMase system A, Western-blot of the PDGFRβ phosphorylation induced by PDGF-BB (10 nM, 5 min incubation), and effect of inhibitors AG1295 (10 µM), PP2 (1µM), Batimastat (BATI, 10 nM) and DMS (2 µM). B, Effect of inhibitors on SMC proliferation induced by PDGF-BB. C, Effect of PDGF-BB on MMP activity in SMC culture medium. D, Effect of PDGF-BB on nSMase activity in SMC. E, Activation of SK-1 by PDGF-BB and effect of inhibitors. Mean +/-SEM of 5 separate experiments (*p<0.05).

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Discussion

Oxidative stress and ROS induce various signaling responses such as cell proliferation, inflammation or apoptosis, and is implicated in the initiation or aggravation of neurodegenerative and vascular diseases, including atherosclerosis (Steinberg 1997; Irani 2000; Leonarduzzi et al. 2000; Napoli et al. 2001; Salvayre et al. 2002; Stocker and Keaney 2005). We recently reported that ROS generated during tyramine or serotonin oxidation by MAO-A, triggers SMC proliferation, through a stress-induced mitogenic mechanism involving MMP2, and nSMase2 (Coatrieux et al. 2007). We report here that the proliferation of mesenchymatous cells elicited by low concentrations of H2O2 requires the activation of SK-1, a key enzyme for the generation of sphingosine 1-phosphate, involved in cell survival and proliferation (by contrast with ceramide which induces cell differenciation and apoptosis) (Watterson et al. 2003). The activation of SK-1 as well as DNA synthesis induced by H2O2 requires the concomitant activation of two separate and independent pathways, namely the PDGF receptor β signaling, and the MMP2/nSMase2 pathway, whereas DNA synthesis induced by PDGF-BB involves the activation of SK-1 but not MMP2 nor nSMase2. This suggests that the MMP2/nSMase2 system is specifically activated by stress-inducing agents, such as H2O2 and as previously shown for oxidative stress (Coatrieux et al. 2007), TNFα (Tellier et al. 2007), or oxidized LDL (Auge et al. 2004).

The first important finding is that H2O2-mediated SMC and fibroblast proliferation involves the metalloprotease MMP-2 and the sphingolipid enzyme nSMase2, as shown during the degradation of biogenic amines by MAO-A, which generates H2O2 (Coatrieux et al. 2007). The involvement of both MMP2 and nSMase2 was strongly supported by the use of mutant fibroblasts from MMP2 KO mice which do not elicit any nSMase activation, SK-1 activation nor DNA synthesis following incubation with H2O2, while fetal calf serum was mitogenic for these cells. Same results were obtained in fibroblasts isolated from fro mice, which exhibit a deficient nSMase2 activity due to the mutation of the smpd3 gene (Aubin et al. 2005), and do not proliferate in presence of H2O2 (whereas these cells proliferate like controls in presence of SVF). Also, no proliferation was observed after silencing MMP2 and nSMase2 with specific siRNA, in agreement to previous reports (Marchesini et al. 2004). Interestingly, SK-1 was not activated in MMP2 and nSMase2-silenced cells, and in mutant fibroblasts for MMP2 and nSMase2, thus indicating that SK-1 results from the upstream activation of the sphingolipid pathway, e.g. nSMase2 activation (induced by MMP2), sphingomyelinase 97

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hydrolysis, ceramide and sphingosine generation, which leads to SK-1 activation. As reported by Pitson (Pitson et al. 2003) and Maupas-Schwalm et al (Maupas-Schwalm et al. 2005), the activation of SK-1 is regulated by phosphorylation mediated by ERK1/2 and by src , while SK-1 (via S1P) itself, is involved in a second wave of ERK1/2 phosphorylation and nuclear translocation, necessary for SMC proliferation (Pitson et al. 2003; Maupas-Schwalm et al. 2005). We show here that ERK1/2 was rapidly activated by H2O2, and inhibited by the MMPs inhibitor Batimastat, thus suggesting that ERK1/2 activation depends on MMPs. Anyway the activation of ERK1/2 was strongly inhibited by DMS, the inhibitor of SK-1, thus it is difficult to speculate if the ERK1/2 inhibition observed in presence of Batimastat is due to a direct effect of the inhibitor on ERK1/2, or results from an indirect SK-1 inhibition, due to the inhibition of MMP2 and nSMase2.

The second finding of this paper is that SK-1 activation by H2O2 could result from the phosphorylation of PDGFRβ and src, which are activated by H2O2 independently of the MMP2/nSMAse2 pathway. These data were supported by the use of specific inhibitors of PDGFRβ and src, and by the use of src-/- mutant fibroblasts which did not inhibited MMP2/nSMase2, but blocked SK-1 activation and DNA synthesis induced by H2O2, while Batimastat had no inhibitory effect on H2O2-mediated PDGFRβ phosphorylation. The phosphorylation of PDGFRβ by oxidative stress reported here is in agreement with previous reports (Gonzalez-Rubio et al. 1996; Okuyama et al. 2001; Catarzi et al. 2005) and could result from several mechanisms i/ a direct effect on growth factor receptor dimerization allowing the conformational change of the receptor resulting in an activation of the intrinsic tyrosine kinase activity (Vacaresse et al. 1999), ii/ an inhibitory effect on tyrosine phosphatases involved in the dephosphorylation of PDGFRβ (Escargueil-Blanc et al. 2001; Markova et al. 2003), iii/ a transactivation of growth factor receptor involving tyrosine kinase like PKC, Jun and src allowing to promote an increased phosphorylation and activation of PDGFR and subsequent signaling (Catarzi et al. 2005). In our system, src was involved in the phosphorylation of PDGFRβ by H2O2 and PDGF-BB, since PP2, a specific src inhibitor, inhibited totally PDGFRβ phosphorylation induced by both agents. However, src was not involved in the activation of the MMP2/nSMase2 pathway, since no inhibition of MMP2 nor nSMase was observed in presence of PP2 or in srcK- fibroblasts. Anyway, an activation of src by the MMP2/nSMase2 pathway is not excluded. Indeed, the activation of MMP2 involves the formation of a complex at the cell surface including the physiological MMP2 activator 98

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MT1-MMP, TIMP2, cytoskeletal proteins and integrins, (Remacle et al. 2006). This complex may results in src activation via a transactivation mechanism occurring between integrins, focal adhesion kinase and src kinase family (Mitra and Schlaepfer 2006). Preliminary results indicate that such complex is formed in presence of H2O2, and could lead to src activation, while PDGFRβ would be directly activated by H2O2 (by phosphatase inhibition, or oxidation of thiol residues allowing the dimerisation of the receptor as reported (Vindis et al. 2006). Further experiments will allow to clarify the implication of MT1-MMP and integrins in the activation of src by H2O2, and the links with PDGFRβ.

DNA synthesis induced by H2O2 and PDGF-BB required the activation of SK-1, via different mechanisms since contrary to H2O2, PDGF-BB did not activate MMP2 nor nSMase2, though it triggered a strong activation of SK-1. Note that Batimastat did not blocked the phosphorylation of PDGFRβ by PDGF-BB, and that MMP2-/- fibroblasts proliferated like MMP2+/+ cells in presence of PDGF-BB (data not shown), thus indicating that the MMP2/nSMase2 system is a stress-induced mitogenic signalling, not induced by growth factors and SVF. The lack of SK-1 activation and DNA synthesis observed in srcK- cells after stimulation by H2O2 or PDGF-BB indicates that src is strongly involved in SK-1 activation, in agreement with previous data reported by Maupas-Schwalm et al (Maupas- Schwalm et al. 2005).

Taken together, these data indicate that i/ SK1 plays a key role in cell proliferation elicited by PDGF-BB, and by H2O2, ii/ the MMP2/nSMase2 signalling pathway is required for SK-1 activation by H2O2, but not by PDGF-BB, thus indicating that growth factors and stress-inducing agents exert a different mitogenic signalling, iii/ src kinase is required for SK- 1 activation by H2O2 and PDGF-BB, and represents the common mechanism shared by both pathways for triggering SK-1 activation and DNA synthesis. In conclusion, the reported data shed light on a novel mitogenic signaling cascade triggered by ROS, which requires an activation of SK-1 mediated by two different signaling mechanisms, namely the MMP2/nSMase2 pathway and PDGFRβ with a major involvement for src kinase, as reported previously (Maupas-Schwalm et al. 2005). It is likely that the mechanism evoked by H2O2 has no or only minor role under physiological conditions, but rather participates in stress response and might be of importance under conditions leading to

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increased oxidative stress in the vascular wall, with consequences in intimal hyperplasia, and in the evolution of fibrous cap and atherosclerotic lesions (Auge et al. 2000).

Acknowledgements

This work was supported by grants from INSERM, University Paul Sabatier, Agence Nationale de la Recherche (COD 2005, n° APV05043BSA). The authors thank Ms M.H. Grazide for excellent technical assistance. Ms. C. Coatrieux is recipient of the Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche and Fondation pour la Recherche Medicale.

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Résultats expérimentaux

Ce deuxième travail montre que H2O2 peut mimer l’effet mitogène et les voies de signalisation induites par la sérotonine et la tyramine. De plus, nous montrons que l’effet mitogène induit par H2O2 et décrit dans ce travail, implique l’activation de la sphingosine kinase-1 (SK1), et la génération de sphingosine 1-phosphate (S1P), qui est un facteur mitogène et de survie, antagoniste du céramide proapoptotique.

Nos résultats montrent que l’activation de SK1 par H2O2 résulte de deux voies de signalisation différentes mais complémentaires et nécessaires à l’effet prolifératif induit par H2O2.

En effet, l’activation de SK1 résulte d’une part de la voie MMP/nSMase décrite dans l’article 1, comme démontré par l’effet inhibiteur du Batimastat et des siRNA de nSMase et de MMP2. Par ailleurs aucune activation de SK1 n’est observée dans les cellules MMP2-/- et les cellules de souris fro (fragilitas ossium : mutation invalidant la nSMase II). Il est à noter que ces cellules ne prolifèrent pas sous l’effet de H2O2 (et de la tyramine).

D’autre part, nous avons recherché l’activation du PDGF récepteur qui est activé par H2O2, et active SK1, comme déjà rapporté dans la littérature (Olivera et al. 1999a; Saito et al. 2002). Cette activation est indépendante de la voie MMP/sphingolipides, puisque non inhibée par le Batimastat. De plus, la prolifération des CMLs induite par le PDGF, n’est pas inhibée par le Batimastat, ni par le D-MAPP qui inhibe la conversion du céramide en sphingosine (donc se situe en amont de SK1). Par ailleurs, le PDGF n’active pas MMP2 ni nSMase2, mais active SK1, comme rapporté par le groupe de S.Spiegel (Olivera et al. 1999a). Cette activation de SK1 induite par le PDGF, est inhibée par AG1295, l’inhibiteur du PDGFR, mais pas par le Batimastat.

En accord avec les résultats rapportés par Maupas-Schwalm et al (Maupas-Schwalm et al. 2005), nous montrons que l’activation de SK1 via PDGFR, implique la voie src, puisque les cellules src-/- ne prolifèrent pas avec H2O2 et avec PDGF, ne montrent pas d’activation de SK1 avec les deux agonistes, alors que l’activation de MMP2 et de nSMase est comparable à celle observée dans les cellules src+ /+. De plus l’inhibiteur de src PP2 bloque la prolifération des CMLs induite par H2O2 ou le PDGF, mais n’inhibe pas l’activation de nSMase et de MMP2 par H2O2. Par contre PP2 bloque la phosphorylation du PDGFR par PDGF et par

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Résultats expérimentaux

H2O2, comme déjà rapporté dans la littérature (src étant nécessaire à la dimérisation et l’amplification du signal du PDGF (Choudhury et al. 2006)).

Ces résultats montrent donc que les deux voies, PDGFR et MMP2/nSMase sont impliquées dans l’activation de SK1, et que la voie src est impliquée au moins pour ce qui concerne le PDGFR. Nous n’avons pas encore montré si la voie src est impliquée (ou non) dans le mécanisme d’activation de SK1 par MMP2/nSMase. Ce mécanisme pourrait passer par les MAPKs, comme déjà rapporté par Pitson et al. (Pitson et al. 2003), et par Maupas- Schwalm et al (Maupas-Schwalm et al. 2005). De plus, ces résultats montrent que la mise en place du rhéostat ceramide/S1P induit la prolifération cellulaire dans les conditions utilisées ici, alors qu’il va vers l’apoptose des cardiomyocytes au cours de l’ischémie/reperfusion (Pchejetski et al. 2007).

Cette voie de signalisation originale, démontrée par l’utilisation de siRNAs spécifiques de MMP2 ou de nSMase2, implique en amont l’activation de la furine et de MT1- MMP, l’activateur physiologique de MMP2.

Les résultats présentés ci-dessous, montrent que MT1-MMP et la furine jouent en effet un rôle essentiel dans l’activation de MMP2 et de la nSMase.

♦ Rôle de MT1-MMP

Le rôle de MT1-MMP a été étudié sur des clones de CMLs transfectées avec un vecteur dominant négatif d’une forme mutante de MT1-MMP (clones 5) (Tellier et al. 2007). Nous avons testé l’effet mitogène de H2O2 sur ces cellules. Comme montré dans la figure 5, les clones 5 ne prolifèrent pas sous l’effet de H2O2. On ne retrouve pas d’activation de MMP2 dans ces cellules, ni de la nSMase et de la SKase. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus avec le TNFalpha (Tellier et al. 2007), ou les LDL oxydées (Auge et al. 2004), et indiquent que MT1-MMP est nécessaire à l’activation de MMP2 et de la voie mitogène des sphingolipides.

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Résultats expérimentaux

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Résultats expérimentaux

♦ La furine

Un des activateurs de MT1-MMP le plus connu est la furine.

En effet, de nombreuses protéines ayant une activité biologique sont synthétisées sous forme de pro-protéines inactives (précurseurs), rendus actifs par l’élimination d’un peptide signal (au niveau d’un site spécifique), soit dans la cellule ou à la surface cellulaire, soit une fois libérés dans le milieu extra-cellulaire selon la localisation finale de la protéine. Les précurseurs convertases catalysent la conversion des proformes en protéines actives. Leurs substrats sont divers : hormones, neuropeptides, facteurs de croissance, récepteurs, facteurs de transcription,… (Seidah and Chretien 1999; Thomas 2002).

La furine est une précurseur convertase de la famille des pro-protéine convertases (PC). Il s’agit d’une sérine endoprotéase membranaire de type I, de 794 acides aminés, exprimée ubiquitairement dans l’organisme (Seidah et al. 1998). La furine est essentiellement localisée dans la cellule au niveau des saccules trans de l’appareil de Golgi. Ce compartiment adresse les protéines sécrétées ou membranaires (membrane plasmique, endosomes, lysosomes) vers leur compartiment de destination. A partir de sa localisation transgolgienne d’origine, la furine peut se retrouver dans différents compartiments (endosomes) ou à la surface de la cellule (Molloy et al. 1999). Du fait de sa capacité à quitter son compartiment la furine peut agir sur de nombreuses proprotéines. Cette enzyme, exprimée potentiellement dans toutes les cellules, est essentielle à la survie de l’organisme puisque sa délétion est létale à l’état embryonnaire (Roebroek et al. 1998).

La furine a de nombreux substrats (neuropeptides, hormones, facteurs de croissance, enzymes) (Seidah and Chretien 1999; Khatib et al. 2002). La furine active aussi les enzymes chargées du remodelage de la matrice : les MMPs (matrix metalloprotéinases), particulièrement pro-MT1MMP/pro-MMP2 et pro-MMP9 (Murphy et al. 1999; Stawowy et al. 2005b).

L’intérêt du contrôle de l’activation de substrats endogènes ou d’agents pathogène, a conduit au développement de peptides mimant la séquence consensus reconnue par ces prohormone convertases. Ces inhibiteurs de protéines, regroupés sous le nom de serpines (serine protéases inhibitors) peuvent être naturels (P18, une protéine ayant deux sites consensus de la furine) ou issues de bioengineering. 108

Résultats expérimentaux

L’alpha1 antitrypsine est une glycoprotéine de 53KDa, inhibiteur naturel et physiologique de l’élastase des neutrophiles. Elle est connue car sa déficience génétique conduit au développement de désordres circulatoires sévères et d’emphysème pulmonaire, ainsi que des problèmes hépatiques (hépatomégalie et risque de cirrhose). Suite à une mutation naturelle de la Met358 en Arg, au niveau du site actif, le mutant produit, nommé variant alpha1 antitrypsine Pittsburg (α1AP), a perdu la capacité à inhiber l’élastase et est devenu un puissant inhibiteur de thrombine. Cette observation a ouvert la voie à la création de mutations du site actif. Etant donnée l’importance des résidus Arginine en position P1 et P4 dans les substrats reconnus par la Furine et d’autres subtilisin-like protoxine prohormone convertases (SPC), Anderson et al. ont introduit une seconde mutation dirigée contre l’acide aminé en position 356 d’A1AP par mutagénèse dirigée. Le mutant Ala 356 : Arg d’A1 AP baptisé alpha1 antitypsine Portland (α1PDX) crée un site de reconnaissance subtillisin-like protoxine prohormone convertase de haute affinité pour la furine et PC5, ainsi qu’une bonne affinité pour PC7, in vitro et ex vivo (Anderson et al. 1993). Outre la serpine native P18 et l’α1PDX, un mutant d’alpha2 macroglobuline (Gly-Phe-Tyr-Glu : Arg-Ser-Lys-Arg) et le mutant du troisième domaine de l’ovomucoide de dinde (Ala-Cys-Thr-Lu : Arg-Cys-Lys-Arg) ont également été créés, qui reconnaissent les enzymes furine-like.

La découverte de la présence de la furine et d’une autre proprotéine convertase dans les lésions athéroscléreuses est récente (2005) (Stawowy et al. 2005a; Stawowy et al. 2005b). La furine est présente dans les plaques dans les cellules musculaires lisses et endothéliales, quel que soit le stade de développement de celles-ci, mais aussi dans les macrophages. Dans les lésions plus avancées, son expression concerne aussi les macrophages et cellules spumeuses (Osterud and Bjorklid 2003; Stawowy et al. 2005b). La furine agit sur différentes cibles déterminantes dans la pathologie athérosclérotique : les intégrines et les matrix metalloprotéinases (Kanda et al. 2000).

♦ Implication de la furine dans la signalisation mitogène de H2O2

Le rôle de la furine est étudié sur des cellules transfectées avec un inhibiteur naturel α1-antitrypsine Portland ou PDX (Jean et al. 1998; Tellier et al. 2007). Cet inhibiteur bloque l’activité de la furine de façon permanente. Les cellules PDX stimulées par H2O2 ne prolifèrent pas, et ne montrent pas d’activation de MT1-MMP, MMP2 , nSMase et SKase, ce qui indique que la furine est bien impliquée en amont de MT1-MMP, dans cette voie de

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Résultats expérimentaux

signalisation (figure 6). Des expériences sont actuellement en cours, avec des siRNA furine et MT1-MMP pour confirmer ces résultats.

Le mécanisme d’activation de la furine reste à démontrer, mais pourrait impliquer soit un effet direct de H2O2 sur la furine sécrétée dans le milieu extracellulaire, soit sur la proforme présente dans le réticulum endoplasmique, permettant ainsi sa maturation et sa translocation à la membrane plasmique, ou elle protéolyserait MT1-MMP. Un autre mécanisme pourrait impliquer l’activation par H2O2, de modulateurs de maturation de la furine, tels que la phosphatase PP2A, ou la créatine kinase II, qui agissent sur des systèmes impliqués dans le transport de la furine hors du réticulum endoplasmique ou du Golgi, et permettent la translocation de la furine à la membrane. Ce système, activé par H2O2 serait induit par d’autres agents de stress tels que les cytokines inflammatoires, les LDL oxydées ou les activateurs de plasminogène, et représentent donc une nouvelle voie de signalisation impliquée dans la prolifération et la migration cellulaire, et peut-être également dans l’apoptose.

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Résultats expérimentaux

RFA RFA RFA PDX A PDX B C PDX P-Erk Erk total TIME 0 1 5 15 0 1 5 15 200 150 RFA PDX P-Erk Erk total 100 TIME 0 30 60 120 0 30 60 120 100 Furin activity (%) [3-H] thymidine (%) 0 0 H2O2 - + H2O2 - +

D RFA E RFA F RFA G RFA PDX PDX PDX PDX

150 150 150 150

100 100 100 100 SKase assay (%) nSmase (%) activation MMP2 activity (%)

MT1-MMP activity (%) 0 0 0 0 H2O2 - + H2O2 - + H2O2 - + H2O2 - +

Figure 6 : La furine est impliquée dans la prolifération induite par H2O2 Les CML sauvages (RFA) sont comparées avec des CML transfectées avec un inhibiteur naturel de furine, l’α1antitrypsine portland (PDX) (A) Prolifération induite par H2O2 sur RFA (CML-WT) vs PDX (Furine inhibée). Les cellules sont ensemencées dans des plaques 24 puits. Après 24heures de privation en sérum (RPMI sans sérum) elles sont incubées avec H2O2 (5µM). L’effet mitogène est déterminé après 48 heures d’incubation par mesure de [3H]thymidine incorporée (B) Cinétique de phosphorylation de Erk1/2 induite par H2O2 sur RFA (wt) vs PDX (C-G) Détermination de l’activation de la furine, MT1-MMP, MMP2, nSMase, et SK-1par H202 (5µM)sur RFA (wt) vs PDX Ces résultats sont la moyenne de 4à 5 expériences. *p<0.05

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Résultats expérimentaux

Nous n’avons pas élucidé les mécanismes impliqués dans l’activation de la nSMase2 par MMP2. Nos premiers résultats montrent que ces enzymes interagissent après stimulation par H2O2, comme le montrent des expériences de co-immunoprécipitation (Figure 7). Cette interaction pourrait se faire au sein d’un complexe à la surface cellulaire impliquant des protéines du cytosquelette, des intégrines et les métalloprotéases MMP2 et MT1-MMP, bien que nos résultats montrent que la forme soluble de MMP2 est également impliquée dans l’activation de la nSMase2. Des travaux complémentaires seront nécessaires afin de déterminer comment MMP2 active nSMase2 (protéolyse d’un co-activateur ou d’un inhibiteur, ou protéolyse directe d’une proforme de nSMase2, bien que des expériences indiquent que MMP2 ne soit pas capable d’activer directement nSMase2 in vitro, ce qui n’exclut pas cependant une protéolyse in vivo).

IP: MMP2 A B FlagSMase MMP2

200 100

150

Arbitrtray units 0 Agonist 0 Tyram H2O2 Time (min) 30 10 nSMase activity (%) 100 anti-flagSMase 0 Tyramine 0 10 30 - - - anti-MMP2 H2O2 - - - 0 5 10 IP: flagSmase Incubation time (min) Figure 7 : Interactions MMP2/nSMase (A) Détermination de l’activité nSMase sur lysat cellulaire immunoprécipité avec un anticorps ant- MMP2, après stimulation par H2O2. (B) Les cellules sont transfectées transitoirement avec un plasmide nSMase2 marquée flag en N- terminal. Après stimulation par H2O2 les cellules sont lysées et le lysat est immunoprécipité (anticorps anti-flag), afin d’immunoprécipiter nSMase2. La présence de MMP2 dans l’immunoprécipité est ensuite mise en évidence par western blot.

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Résultats expérimentaux

I.3. Conclusion

En conclusion nous décrivons une nouvelle voie de signalisation stress-dépendante, impliquée dans la prolifération des CMLs et activée par H2O2 ou par les EROs générés par la dégradation de la sérotonine ou de la tyramine. Les perspectives actuelles concernent l’étude des mécanismes impliqués dans l’activation de la voie furine/MT1-MMP, les liens entre MMP2 et nSMase2, et la balance prolifération/apoptose dépendant de l’équilibre céramide/S1P, et ses conséquences en pathologie vasculaire, en particulier la stabilité/fragilité de la plaque d’athérome.

Ainsi, nous montrons que la voie sphingomyéline/céramide/sphingosine/sphingosine-1- phosphate, que nous avons étudié lors de ce travail, est induite par le stress et impliquée entre autres dans les pathologies cardiovasculaires ou les cancers (Auge et al. 2000; Ogretmen and Hannun 2004).

La sphingomyélinase neutre de type 2 (nSMase2), qui catalyse l’étape initiale de la voie sphingomyéline/céramide/sphingosine/sphingosine-1-phosphate est régulée par le stress oxydant (Liu and Hannun 1997) et les MMPs (Auge et al. 2004). La sphingosine-1-phosphate produite lors de l’activation de cette voie est mitogène sur CMLs après stimulation par différents agents proathérogènes (LDL oxydées ou TNFα) (Auge et al. 1998; Auge et al. 1999; Maupas-Schwalm et al. 2004; Tellier et al. 2007).

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Effet antiathérogène de deux classes d’inhibiteurs de monoamine oxydases sur la formation des lésions précoces

Résultats expérimentaux

II. Effet antiathérogène de deux classes d’inhibiteurs de monoamine oxydases sur la formation des lésions précoces

II.1. Introduction

Nos travaux précédents montrent que la MAO-A pourrait intervenir dans l’athérogénèse en induisant un stress oxydant lors de la dégradation de la sérotonine ou de la tyramine. Le stress oxydant est impliqué à plusieurs niveaux dans l’athérosclérose, en particulier dans l’oxydation des LDLs qui se produit dans la paroi vasculaire, et est à l’origine de la formation des cellules spumeuses et des stries graisseuses (lésions primaires). Le stress oxydant intervient par ailleurs dans le développement de phénomènes inflammatoires impliqués dans l’évolution des lésions vers des stades plus avancés, la migration et la prolifération des CMLs dans l’intima, la formation de la chape fibreuse, et les phénomènes d’apoptose, de rupture de plaque et de remodelage vasculaire. Des expériences d’ischémie/reperfusion réalisées in vivo, indiquent que la MAO-A est impliquée dans l’apoptose des cardiomyocytes via une rupture de la balance céramide/sphingosine 1 phosphate, qui entraîne une accumulation de céramide (Pchejetski et al. 2007) et l’apoptose. Ces résultats indiquent que la MAO-A pourrait intervenir au plan vasculaire, dans les phénomènes d’apoptose, de rupture de plaque et de remodelage vasculaire. Cependant le rôle des MAOs et du stress oxydant MAO-dépendant ne sont pas connus, et pourraient intervenir dans l’oxydation des LDLs et la formation des cellules spumeuses, donc des lésions primaires.

II. 2. Hypothèse de travail

Ce travail a pour objectif de déterminer le rôle potentiel des monoamine oxydases dans la formation des lésions athéromateuses précoces. Nous avons dans ce but testé la capacité de la pargyline (IMAO dérivé acétylénique dépourvu de propriétés carbonyl scavenger) et de deux IMAOs dérivés de l’hydrazine, la phénelzine et l’iproniazide, à ralentir ou à prévenir la formation des plaques d’athérome chez la souris apoE-/-. Ce modèle animal d’athérosclérose permet essentiellement d’étudier la formation des lésions primaires.

L’effet de ces agents a par ailleurs été étudié in vitro, sur l’oxydation des LDLs par les cellules endothéliales en culture, sur leur efficacité cytoprotectrice contre la toxicité des

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Résultats expérimentaux

LDL oxydées, et sur leur capacité à bloquer la formation de cellules spumeuses ou la génération d’ion superoxyde extracellulaire.

L’effet des IMAOs a été comparé à celui d’autres dérivés hydraziniques dépourvus d’effet IMAO. En effet les dérivés de l’hydrazine ont des propriétés piégeurs de carbonyle (carbonyl scavenger), et neutralisent les aldéhydes formés lors de l’oxydation des LDLs et des lipides (4-hydroxynonenal, malondialdehyde), qui forment des adduits sur les protéines cellulaires, et sont responsables de dommages cellulaire et tissulaire impliqués dans les maladies inflammatoires ou liées au vieillissement.

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Antiatherogenic effect of hydrazine derivatives: A new youth for old drugs?

Christelle Coatrieux 1, Anne Nègre-Salvayre1,2, Angelo Parini 1, Marie-Hélène Grazide 2, Jean-Claude-Thiers 1,2, Koji Uchida 3, Robert Salvayre 1,2, Meyer Elbaz 1,4

1 - Inserm UMR-858 I2MR, IFR-31, CHU Rangueil, Toulouse, France 2 - University Toulouse 3, Faculty of Medicine Rangueil, Dept of Biochemistry, Toulouse 3 - Laboratory of Food and Biodynamics (K.U.), Nagoya University, Japan. 4 - CHU Rangueil, Departement of Cardiology.

Running title: Antiatherogenic hydrazine derivatives

Corresponding author: Dr A. Negre-Salvayre Inserm UMR-858, I2MR - IFR-31 - CHU Rangueil 1, avenue Jean Poulhes - POB 84225 - 31432 Toulouse cedex 4 Tel. (33) 561-32-27-05 - Fax (33) 561-32-20-84 e-mail: [email protected]

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Abstract Reactive carbonyl compounds (RCC) generated by the oxidation of polyunsaturated fatty acids alter progressively the function of cellular and tissular proteins by forming adducts on free amino groups and thiol residues (carbonyl stress). In this study we investigated the carbonyl scavenger and antiatherogenic properties of hydrazine derivatives, namely hydralazine, (an antihypertensive drug), isoniazid, (an anti tuberculosis agent), and two anti depressants, phenelzin and iproniazid. All these drugs prevented the carbonyl stress in cultured smooth muscle cells (SMC) stimulated by oxidized LDL (oxLDL) and 4- hydroxynonenal (4-HNE), by inhibiting the free amino group content decrease, the increase in carbonylated proteins and the formation of 4-HNE and acrolein-adducts on PDGFR (a RCC target). All these agents inhibited oxLDL and 4-HNE-mediated cytotoxicity, but except hydralazine, were unable to inhibit the oxidation of LDL mediated by cultured vascular cells. Experimental studies were carried out on apoE-/- mice using hydrazine derivatives (10/mg/kg) and showed a significant carbonyl stress inhibition in vessels (decrease in free amino group content, inhibition of RCC-adduct on PDGFR), correlated with a significant reduction of atherosclerotic lesions. These data indicate that hydrazine derivatives exhibit potent carbonyl scavenger and antiatherogenic properties, which could open a new field of therapeutic approaches for atherosclerosis and its cardiovascular complications.

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Introduction Reactive carbonyl compounds (RCCs), are formed during the oxidation of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and carbohydrates, and are the precursors of Advanced Lipoxidation (ALE) and Glycoxidation (AGE) End products, which are the hallmark of age- linked diseases (Miyata et al. 1999; Singh et al. 2001; Stadtman 2001; Beal 2002). RCCs modify cellular and tickler proteins through the Maillard reaction, characterized by the formation of RCC-adducts on thiol residues and free amino groups (lysine, histidine, or cysteine), thus generating AGEs and ALEs (Thornalley 1998; Poli and Schaur 2000; Thorpe and Baynes 2003). More than simple markers of lipid peroxidation, RCCs play an active role in cell signalling by altering progressively the protein structure and function, which leads to cellular and tissular dysfunctions, with consequences on cell proliferation, survival and viability (Thornalley 1998). RCCs are also associated with oxidative stress-linked diseases, in particular atherosclerosis (Stadtman 2001; Thorpe and Baynes 2003), in which oxidized LDLs present in vivo within atheroma plaques are thought to play a major role in the generation of early lesions, i.e. foam cells accumulation and fatty streaks formation (Steinberg 1997; Steinbrecher 1999; Lusis 2000). Moreover, the biological properties of oxidized LDLs suggest that they could be involved in the progression of atherosclerotic lesions towards more advanced states, by inducing smooth muscle cell proliferation, extracellular matrix accumulation, local inflammatory response and apoptosis (Lusis 2000). The biological activity of oxidized LDL depends on their content in bioactive lipid peroxidation products such as oxysterols, hydroperoxides and aldehydes (Hajjar and Haberland 1997; Leonarduzzi et al. 2000; Uchida 2000). Reactive aldehydes, such as malondialdehyde (MDA), hydroxynonenal (HNE) and acrolein, form adducts on cellular proteins, and could account in part the biological effects of oxidized LDL (Sovic et al. 2001; Negre-Salvayre et al. 2003; Schaur 2003; Uchida 2003). Antioxidants inhibit the generation of reactive oxygen species and lipid peroxidation products, and are thereby efficient in preventing the formation of RCCs, but their efficacy in vivo against atherosclerosis and its complications is debated and controversial (Albertini et al. 2002; Brigelius-Flohe et al. 2002; Fang et al. 2002). These discrepancies could be in part due to the bioavailability of the drugs within the plaque, their chemical nature (and hydrophobicity), and their inability to scavenge RCCs once adducts are formed on proteins (Romero et al. 1998). Carbonyl scavengers are able to react with RCCs either during their generation, or during 118

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chemical reactions involved in adduct formation. Aminoguanidine and pyridoxamine are able to trap AGEs by inhibiting the Maillard reaction and may therefore represent a new therapeutical approach in diseases involving AGEs, such as diabetes, diabetes-associated nephropathies and neurodegenerative diseases (Freedman et al. 1999; Jakus et al. 1999; Cantini et al. 2001; Dukic-Stefanovic et al. 2001; Abdel-Rahman and Bolton 2002; Stitt et al. 2002). Carnosine (beta-alanyl-L-histidine) also reacts with AGEs, and could delay aging (Hipkiss and Brownson 2000a; Dukic-Stefanovic et al. 2001). Aminoguanidine and pyridoxamine are theoretically also able to inhibit ALEs in atherosclerosis (Requena et al. 1992; Onorato et al. 2000; Bonnefont-Rousselot 2002; Voziyan et al. 2002; Metz et al. 2003). On the other hand, dinitrophenylhydrazine (DNPH) is largely utilized to evaluate RCCs levels and to detect RCCs on western-blots using an anti-DNPH antibody (Waeg et al. 1996). DNPH reacts with RCCs at acidic pH, which facilitates the rupture of the covalent bond RCC- protein, and the binding of RCCs on hydrazine, thus forming hydrazone (Puhl et al. 1994). DNPH prevents in vitro the formation of acrolein- and HNE-adducts on cellular proteins, as well as the cytotoxicity of oxidized LDL in vascular cells (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). Unfortunately, DNPH cannot be used in vivo because of its haemolytic, mutagenic and carcinogenic properties (Brooke I 1997). This led us to investigate whether other hydrazine derivatives, less or non-toxic, could also scavenge RCCs, and exhibit an antiatherogenic effect in animal models for atherosclerosis. A large number of drugs containing a hydrazine group are used for medicinal purposes, for instance isoniazid or isonicotinyl hydrazine (anti-tuberculous), phenelzin and iproniazid (anti-depressant), or hydralazine (anti-hypertensive). Moreover, the carbonyl scavenger properties of hydralazine against acrolein have been recently reported in vitro (Burcham et al. 2000; Burcham and Pyke 2006). Anti-atherogenic property of hydralazine has been reported (Spence et al. 1984), but not in animal models for atherosclerosis.

The aim of this work was to evaluate whether the carbonyl scavenger efficiency of several hydrazine-containing drugs is associated with anti-atherogenic properties in apoE-/- mice.

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Materials and Methods

Cell culture. Rabbit femoral artery smooth muscle cells (SMC) were obtained from ATCC (Manassas, US) and were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat inactivated fetal calf serum, 100U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin, as reported (Escargueil-Blanc et al. 2001).

LDL isolation and oxidation LDL were isolated by ultracentrifugation from the pooled plasma of healthy normolipidemic human subjects and dialyzed against PBS containing 100µmol/L EDTA, as previously indicated (Duval et al. 2003). To evaluate cell-mediated LDL oxidation, SMC were seeded in 24 multiwell plates. The standard culture medium (on sparse proliferative cells), was removed and replaced by serum-free RPMI-1640 containing native LDL (100 μg apoB/ml) and incubated at 37°C for 6h with cells or in cell-free medium, as previously used (Duval et al. 2003). Hydrazine derivatives (solubilized in DMSO) were added to the culture medium at the indicated concentrations, before adding LDL. At the end of the incubation, LDL-containing medium was immediately used for determining thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) formation as reported (Mabile et al. 1997). Alternatively, LDL were oxidized by mild UV-irradiation, as reported (Escargueil-Blanc et al. 2001).

Evaluation of cytotoxicity Cytotoxicity of oxidized LDL and protection by hydrazine derivatives were evaluated using the MMT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra-zolium bromide) test (Escargueil- Blanc et al. 2001).

Animal studies ApoE KO mice were from Transgenic Alliance (IFFA Credo, Charles River, Les Oncins, France). 6 groups of 20 male mice (aged 4 weeks old), housed under specific pathogen-free conditions, were fed a standard diet supplemented with the different agents (10 mg/kg) or placebo. Basal systolic and diastolic blood pressures (BP) and resting heart rate were measured in conscious animals by the tail-cuff method, and were similar in treated vs

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untreated animals (115 ± 5 mmHg), except phenelzin which clearly induced hypotension (75 ± 5 mmHg). Mice were killed at age 20 weeks. Serum glucose and lipids were measured and did not exhibit any difference between control and hydrazine derivatives-treated animals (glycemia levels were 7.5 mmol/l +/- 2.5, triglycerides 1.5 mmol/l +/- 0.5, cholesterol 12 mmol/l +/- 3, HDL-cholesterol 4 +/- 1).

Quantification and Characterization of Atherosclerotic Lesions

The lesions were estimated as described by Bucciarelli et al (Bucciarelli et al. 2002). Hearts were washed in phosphate buffered saline, frozen on a cryostatmount with OCT compound (Tissue-Tek), and stored at −80 °C. Serial sections 10 µm thick of aortic sinus were stained with Oil Red O, counterstained with hematoxylin-eosin, and evaluated for morphometric evaluation of the lesion size, using a computerized Biocom morphometry system. The mean lesion size in aortic sinus was expressed in μm2±SEM. For biochemical studies, ascending aortas were directly frozen at -80°C until use.

Determination of free amino groups content and carbonyls. Free amino groups were determined on cultured SMC and on vascular tissue extracts by utilizing the amine-reactive probe [3H]N-succinimidylpropionate ([3H]NSP), (Amersham- Biosciences, 99.0 Ci/mmol), as previously used (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). Alternatively, the protein carbonyl content of SMC or vascular tissues was determined using DNPH, according to Ichihashi et al. (Ichihashi et al. 2001).

Western- blot analysis. Cultured SMC and aorta samples obtained from apoE-/- mice (control and treated with hydrazine derivatives) were lyzed and proteins (up to 50 µg) were resolved by SDS-PAGE electrophoresis, transferred onto nitrocellulose membrane (Hybond-C, Amersham), probed with the indicated antibodies (1:1000), anti-4-HNE-protein (Calbiochem-VWR), and anti- acrolein (prepared as previously reported in Uchida et al. (Uchida et al. 1998b)), or anti β- actin (1:1000), followed by the appropriate second antibody (1:5000), and visualized with the ECL detection system (Amersham-Biosciences), as previously used (Escargueil-Blanc et al. 2001).

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Immunohistochemistry Frozen section of aortic sinus from apoE-/- and wild type mice were labeled by anti acrolein antibody, and revealed by a peroxidase-conjugated secondary antibody, as described (Vindis et al. 2006). Nuclei were counterstained with hematoxylin.

Statistical analysis Data are given +/-SEM. Estimates of statistical significance were performed by Anova (Tukey test, SigmaStat software). Values of p<0.05 were considered significant.

Results - Phenylhydrazine derivatives prevent LDL oxidation by SMC and oxLDL- or 4-HNE- mediated cytotoxicity We first aimed to determine the ability of hydrazine derivatives to inhibit LDL oxidation mediated by smooth muscle cells as well as their carbonyl scavenger efficiency to prevent the modification of cellular proteins induced by oxLDL or 4-HNE. Subconfluent SMC were incubated for 6h in RPMI 1640 culture medium containing native LDL (100 µg/ml) and the different agents solubilized in DMSO (less than 0.1% final concentration). LDL oxidation was monitored by the TBARS content, as described (Mabile et al. 1997). The tested molecules exhibited a low antioxidant effect by comparison to probucol tested as control (Table I). Among the different agents, Hydralazine was the most efficient as it inhibited 55% of LDL oxidation at 100µM and more than 80% at 500µM, whereas the other agents, phenelzin, iproniazide and isoniazide exhibited weak efficiency and at higher concentration (500 µM). Pargyline had no effect. The partially protected LDL were less toxic whatever the tested molecules, as shown by the MTT viability test measurement (Table I). Note that the tested molecules exhibited no self cytotoxicity at the used concentrations (data not shown).

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Alternatively, the antioxidant effect of the different agents was evaluated on LDL oxidation induced by copper for 4h at 37°C, as reported (Negre-Salvayre et al. 1991). No protection against LDL oxidation was observed in these conditions, thus indicating that the protective effect of hydrazine derivatives doesn’t depend on their direct antioxidant properties against LDL oxidation. In another set of experiments, we tested the cytoprotective effect of hydrazine derivatives against the cytotoxicity of oxLDL (200µg/ml) and 4-HNE (50µM). This was studied by incorporating various concentrations of the tested drugs in the culture medium of SMC simultaneously with 4-HNE or LDL previously oxidized by UV irradiation, as reported (Escargueil-Blanc et al. 2001). All the tested compounds increased significantly the resistance of cells against the cytotoxic effect of oxLDL and 4-HNE in a dose-dependent manner, 123

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hydralazine being again the most efficient. In contrast pargyline exhibited no protection (Table II). Altogether, these data indicate that hydrazine derivatives exhibit 1/ a mild antioxidant activity which inhibits only in part LDL oxidation and their subsequent cytotoxicity, and 2/ a cytoprotective effect against oxLDL and 4-HNE-mediated cytotoxicity, possibly related to their potential carbonyl scavenger properties.

- Hydrazine derivatives prevent the modification of cellular proteins induced by oxLDL and 4-HNE The carbonyl scavenger properties of the different agents were evaluated on the protein modification induced either by oxLDL or by 4-HNE in SMC, using 3 different approaches : determination of protein carbonyl content, quantification of free NH2 group content, western- blot of cellular protein extracts from SMC incubated with the different agents in presence of oxLDL. As shown in Fig.2 and as previously reported (Suc et al. 1998; Escargueil-Blanc et al. 2001), oxLDL and 4-HNE induce a net decrease in the free amino group content measured with the radiolabelled probe [3H]succinimidyl propionate. This decrease was efficiently prevented by all the tested agents (hydralazine and phenelzin, 100 µM; isoniazide and iproniazide 500 µM), except pargyline (100 µM) which did not exhibited any effect. Same results were observed on the protein carbonyl content which clearly increased in presence of oxLDL or 4-HNE, and was prevented by all the tested agents. We recently reported that PDGFR can be modified by acrolein or by 4-HNE in presence of oxLDL (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006), thus we checked the effect of hydrazine derivatives on the PDGFR modification using an anti acrolein-adduct antibody (Fig. 2). The formation of acrolein-adducts on PDGFR induced by oxLDL was prevented by all the tested hydrazine derivatives, which again confirms the carbonyl scavenger activity of these agents. In contrast, pargyline did not exhibit any protective effect on PDGFR modification by acrolein. (Fig.2). Taken together, these data indicate that hydrazine derivatives may in vitro prevent the formation of aldehyde-adducts on cellular proteins. We then aimed to investigate in vivo the capacity of the different hydrazine molecules to block the carbonyl stress and atherosclerotic lesion development in apoE-/- mice.

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- Hydrazine derivatives prevent the development of atherosclerotic lesions and the formation of aldehyde-adducts in apoE-/- mice The different agents (10 mg/kg/day) were added to drinking water, and animals were killed after 20 weeks of treatment. Note that side-effects of IMAO such as aggressivity, were not observed in animals treated with hydrazine drugs exhibiting IMAO activity (phenelzin, iproniazid, and pargyline). Hypotension was observed in mice treated with phenelzin but not in presence of iproniazid and pargyline. All the tested animals exhibited normal plasmatic levels of ASAT (250UI/l +/-100) and ALAT (30 +/-10) indicating the lack of any hepatic toxicity with the tested agents. Aortic root analysis of atherosclerotic lesions indicated an important heterogeneity of the results and individual variations within apoE-/-control mice, in agreement with previous reports (Nakashima et al. 1994). All the hydrazine derivatives were efficient in preventing the formation of the atherosclerotic lesion (40-50 % inhibition for each tested agent) (Fig.3). Pargyline was poorly effective in preventing the lesions development, which indicates that i/MAO-A is probably not involved in the formation of early atherosclerotic lesions and ii/the antiatherogenic effect of hydrazine derivatives with known MAO inhibitory effect (Phenelzin, iproniazid) doesn’t depend on their IMAO activity. We then checked the effect of hydrazine derivatives on the generation of carbonyl stress in vessels, by measuring the free amino group and protein carbonyl content in aortas extracts of apoE-/- mice. As shown in Fig. 3, all the tested hydrazinic agents prevented the decrease in free amino group content, as well as the increase in protein carbonyl content observed in untreated apoE-/- mice. These data were confirmed by immunohistochemical studies showing the inhibitory effect of hydrazine derivatives against acrolein-adducts formation within the atherosclerotic lesion. Western blots experiments of aorta protein extracts indicated that PDGFR was modified in vivo by 4-HNE and acrolein, and this was efficiently protected by hydrazinic agents. Pargyline moderately inhibited the formation of atherosclerotic lesion and carbonyl stress, thus confirming that an IMAO-mediated inhibitory effect is probably not involved in the protection exhibited by hydrazine derivatives with IMAO activity.

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DISCUSSION The formation of slight atherosclerotic vascular lesions begins early during the intra uterine period in at least one third of newborns (Stary 1992) (foam cells and fatty streaks accumulation). The most frequently given explanations of this phenomenon are related to mother diet or genetical factors driving to early intravascular wall lipid accumulation and LDL oxidation (Steinberg 1997; Steinbrecher 1999). Since years, an increasing body of literature has been focused on the efficiency of antioxidants in preventing both LDL oxidation by cultured vascular cells, and atherosclerosis development in animal models (Cominacini et al. 1997; Albertini et al. 2002; Brigelius-Flohe et al. 2002; Fang et al. 2002). Besides antioxidants, a new field of investigation is emerging for alternative drugs able to neutralize carbonyl precursors and aldehydes formed during the lipid and sugar oxidation process (Shapiro 1998). We report here that hydrazine derivatives are strongly efficient in preventing the carbonyl stress i.e. the modification of cellular and tissular proteins induced by aldehydes formed during lipid oxidation (4-HNE and acrolein). This ability is correlated with a significant reduction in the atherosclerotic lesions area in apoE-/- mice model. Phenylhydrazine and dinitrophenylhydrazine are used since years as aldehyde reagents for determining microamounts of aldehydes in biological or dietary samples (Lawrence 1965; Levine et al. 2000; Ichihashi et al. 2001). We previously reported that DNPH can neutralize in living cells, the formation of 4-HNE adducts induced by oxLDL on cellular proteins and tyrosine kinase receptor (EGFR, PDGFR), and prevent oxLDL-induced cytotoxicity (Vieira et al. 2000). The carbonyl scavenger effect of DNPH is due to the formation of hydrazones, resulting from the chemical combination between hydrazine and ketones or aldehydes (Chevion et al. 2000), but this molecule cannot be used for in vivo purposes because of its hemolytic and mutagenic properties. Recently, the Burcham’s group explored the carbonyl scavenger properties of hydralazine, an antihypertensive drug and hydrazine derivative, which can in vitro trap and neutralize acrolein, by forming hydrazones with acrolein-adducts formed on proteins, ("adduct-trapping") (Burcham et al. 2004; Burcham and Pyke 2006). In agreement with the Burcham’s group, we reported recently that hydralazine (like DNPH), prevents the modification of PDGFR by 4-HNE and acrolein either in vitro in SMC incubated with oxLDL, or in vivo, in rabbits fed with an hypercholesterolemic diet (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). Indeed PDGFR and more generally tyrosine kinase receptors are targets for the modification by 4-HNE and acrolein (Suc et al. 1998; Escargueil-Blanc et al. 2001; Portero-Otin et al. 2002; Vindis et al. 2006). This modification occurs on free amino 128

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groups and on cysteine (Esterbauer et al. 1991) and induces progressively a desensitization of the receptor to its own ligand, as well as a loss of signaling function, as reported on PDGFR (Vindis et al. 2006). The modification of PDGFR by 4-HNE and acrolein was reversed by hydralazine, and was correlated to a dramatic reduction of the atherosclerosis lesion size (Vindis et al. 2006). In vivo, the antiatherogenic properties of hydralazine were first attributed to its antihypertensive properties (Spence et al. 1984), as it is known that antihypertensive drugs like calcium channel blockers, angiotensin-receptor blockers or ACE-inhibitors exhibit antiatherosclerotic effect in vivo, in animals and in clinical studies (Zanchetti 1996; Hernandez et al. 2003; Ansell 2005; Sierra and de la Sierra 2005; Kurtz 2006). Anyway our experiments were conducted on non-hypertensive animals, the BP was similar between treated and control apoE-/- mice at the end of the study, suggesting that other mechanisms such as adduct-trapping observed in vitro (Burcham et al. 2004; Burcham and Pyke 2006), could also participate to its antiatherogenic properties. On the other hand, an antioxidant effect cannot be excluded for explaining the protective effect of hydralazine, since this molecule inhibits membrane-bound NADPH oxidase and the subsequent generation of superoxide anion (Munzel et al. 1996). This antioxidant effect was not observed with the other hydrazine derivatives, whereas these agents were found efficient as adduct-trapping agents. These drugs are usually used for very different medical purposes, e.g. isoniazid (isonicotinic acid hydrazide or INH) is an antituberculosis agent, iproniazid and phenelzin are antidepressant and exhibit a strong monoamine-oxidase inhibitory effect. We also investigated the effect of pargyline, a non-hydrazinic derivative and MAO inhibitor, since the degradation of biogenic amines by MAO-A generates free radicals (Weyler et al. 1990) possibly involved in LDL oxidation, carbonyl stress, and lesion development and remodeling. The effect of all these agents in vascular diseases was not known so far. Moreover, the medical use of these drugs is limited except for isoniazid and hydralazine (which combined to isosorbide dinitrate (BiDil), is used in the treatment of heart failure affecting African- American patients) (Franciosa 2006). In contrast to hydralazine, the other hydrazine derivatives did not (or poorly) inhibit LDL oxidation mediated by cultured vascular SMC. Anyway, these agents prevented the cytotoxicity mediated by oxLDL and 4-HNE which suggests that they neutralize (at least in part), lipid oxidation products (aldehydes) transported by oxLDL, and involved in oxLDL-mediated cytotoxic effect (Leonarduzzi et al. 2000). The hydrazine derivatives completely prevented the carbonyl stress elicited in vitro by oxLDL (decrease in amino group content, modification of PDGFR by 4-HNE or acrolein). It is to 129

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note that unlike carbonyl scavengers, antioxidants inhibit only in part the oxidized LDL- mediated modification of tyrosine kinase receptors like PDGFR or EGFR, and have no effect on that mediated by 4-hydroxynonenal (Vacaresse et al. 1999; Vieira et al. 2000; Escargueil- Blanc et al. 2001). Pargyline was unable to block LDL oxidation, cytotoxicity and the carbonyl stress, which suggests that the protective effect of phenelzin and iproniazide is independent of their IMAO activity (at least in vitro). Carbonyl stress also occurred in vivo, as evidenced by the decrease in free amino groups content and the modification of tissular proteins and PDGFR by acrolein-adducts in aortas from apoE-/- mice. In contrast, aortas from animals supplemented with hydrazine derivatives exhibited a very significant decrease in carbonyl stress parameters (free amino group content and PDGFR modification) in agreement with previous results reported in hypercholesterolemic rabbits (Vindis et al. 2006). This effect was correlated with a net decrease in atherosclerotic lesion development in apoE-/- mice (- 45-50% of lesions by comparison to control untreated mice), and was higher or comparable to the effect of phenolic antioxidants (Hishikawa et al. 2005) and resveratrol (Fukao et al. 2004). Pargyline exhibited a moderate inhibitory effect (- 20%), thus suggesting that MAOs do not play a major role in ROS generation, LDL oxidation and the generation of early lesions in atherosclerosis. Anyway, this doesn’t exclude a role for MAOs in more advanced lesions and vascular remodelling, as suggested by their role in ischemia/reperfusion (Bianchi et al. 2005a), and myocardial cell apoptosis (Pchejetski et al. 2007). Taken together, these results suggest that hydrazine derivatives exhibit potent carbonyl scavenger and antiatherogenic properties. These data could be related to the neutralization of reactive carbonyl adducts formed by acrolein on cellular and tissular proteins e.g. PDGFR, and are in agreement with the antiatherogenic and anti aging properties of other carbonyl scavengers such as aminoguanidine, arginine or carnosine (Hipkiss and Brownson 2000b; Thomas et al. 2005a). Future development of drugs sharing both antioxidant and carbonyl scavenger activities should allow to slow down or prevent the formation of atherosclerotic lesions in patients presenting high susceptibility for cardiovascular events at least in primary cardiovascular prevention (early atherosclerotic lesions formation). Moreover, even if the proven antiatherosclerotic effects of hydralazine seems independent of blood pressure in our study, these antihypertensive known properties give to hydralazine a high interest in the subset population of patients presenting coronary or cerebrovascular disease with high blood pressure levels (more then 30% of treated patients in secondary prevention studies). One other 130

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interest of the molecule is its low social coast. Further clinical studies are nevertheless needed to confirm our in vitro and animal results.

Acknowledgements This work was supported by Inserm, Paul Sabatier University, Agence Nationale pour la Recherche (ANR-05-PCOD-019-01-LiSA) and Groupement Lipides et Nutrition. CC is recipient of the Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche and Fondation pour la Recherche Médicale.

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Table I: Protective effect of phenylhydrazine derivatives on LDL oxidation ______Cell-mediated oxidation 4-HNE modified LDL ______TBARS MTT Carbonyls ______Control 0 100 0 oxLDL 100µg/ml 100 25 00 + Agents (µM) Hydralazine 10 90±5 38±15 05±5 100 25±7 * 70±12 * 6±5 500 5±2 * 85±12 * 0±5 Phenelzin 10 101±4 23±4 7±6 100 57±4 * 50±5 * 8±3 500 15±4 * 70±5 * 8±5 Isoniazid 10 105±5 25±5 81±5 100 95±6 32±4 8±3 500 45±4 * 55±5 * 4±3 Iproniazid 10 110±8 25±4 4±5 100 104±5 25±5 0±5 500 30±4 * 65±5 * 8±5 Pargyline 10 102±5 25±5 5±5 100 108±8 23±4 7±5 500 112±4 21±6 7±4 Probucol 25 10±4 95±5 5±5 ______Molecules were tested at variable concentration on the oxidation of LDL mediated by SMC (6h), 4h at 37°C). The TBARS content is measured on an aliquot of the culture medium, the results are expressed as % of the control (LDL oxidized by cells in the absence of molecules (TBARS content 15±5 nmol/mg and 8.7±2.4 nmol/mg apoB respectively). The cytotoxicity of cell-oxidized LDL was evaluated by the MTT test, on HMEC-1 reporter cells after transfert of the oxLDL-culture medium ± the tested molecules, for 24h. Mean ± SEM of 5 separate experiments.

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Table II: Protective effect of phenylhydrazine derivatives on oxLDL and 4-HNE-induced cytotoxicity (MMT assay, expressed as% of untreated control). ______+OxLDL + 4-HNE None (200 µg/ml) (50 µM)

No agents 15±5 37±3 -

+ Agents (µM) Hydralazine 10 34±3 40±3 100 100 65±5 63±3 98 500 85±5 71±4 95 Phenelzin 10 32±4 38±3 100 100 45±4 62±4 92 500 56±5 47±3 80 Isoniazid 10 20±4 35±5 100 100 39±3 54±4 100 500 65±5 68±3 90 Iproniazid 10 18±4 34±4 100 100 46±2 58±3 100 500 63±4 62±4 100 Pargyline 10 14±5 35±4 100 100 13±3 33±4 98 500 17±4 36±4 94 ______

Molecules were tested at variable concentration on the cytotoxicity of LDL oxidized by UV irradiation (200 µg/ml) and of 4-HNE (50 µM), in SMC placed in SVF-free RPMI medium 24 h before the experiment. After 24h incubation, the SMC viability was evaluated by the MTT test. Mean ± SEM of 5 separate experiments.

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Résultats expérimentaux

II.3. Résultats

Les résultats rapportés dans cette étude indiquent que la pargyline, qui est un IMAO non hydrazinique, n’est pas efficace pour prévenir in vitro l’oxydation des LDLs et la formation des cellules spumeuses, de même que la génération extracellulaire d’ion superoxyde (impliqué dans l’oxydation des LDLs), et n’a pas d’effet cytoprotecteur contre la toxicité des LDL oxydées. Par ailleurs la pargyline ne protège pas ou peu, de la formation des lésions primaires d’athérosclérose chez la souris apoE-/-.

Par comparaison, les IMAOs hydraziniques, iproniazide et phénelzine, sont très efficaces, à la fois pour inhiber l’oxydation des LDLs et la toxicité des LDL oxydées, de même que la formation des cellules spumeuses et la génération d’ion superoxyde, et pour prévenir de la formation des lésions primaires chez la souris apoE-/-. Ces propriétés sont à rapprocher des effets carbonyl scavenger des dérivés de l’hydrazine, puisque les autres dérivés hydraziniques testés (isoniazide, hydralazine) présentent des propriétés protectrices similaires. Il est à noter cependant que l’isoniazide n’est pas antioxydant, puisqu’il ne bloque pas l’oxydation des LDL, ni la génération d’ion superoxyde extracellulaire. L’isoniazide est cependant efficace en tant que carbonyl scavenger puisqu’il piège la toxicité des LDL oxydées ou du 4-HNE, et par ailleurs bloque la formation des lésions primaires chez la souris.

Ces résultats indiquent donc que la MAO-A ne participerait pas à la génération des cellules spumeuses et des lésions primaires, ce qui n’exclut pas son implication dans la formation de lésions plus avancées en particulier la prolifération des CMLs dans l’intima (suggérée par les résultats obtenus in vitro sur CMLs en culture), et également l’évolution des plaques vers des phénomènes d’apoptose, de rupture ou de remodelage vasculaire. L’absence d’implication du stress oxydant induit par les MAOs dans l’oxydation des LDLs est à rapprocher du fait que les MAOs génèrent H2O2 qui peut diffuser dans le milieu extracellulaire, mais ne participe pas à l’oxydation des LDLs, comme suggéré par l’absence d’effet protecteur de la catalase, déjà rapporté dans la littérature (Mabile et al. 1997), et contrairement à l’ion superoxyde qui joue un rôle essentiel dans cette oxydation. A l’inverse, les dérivés hydraziniques, en particulier l’hydralazine, peuvent bloquer la génération d’ion superoxyde (comme rapporté dans notre travail) en inhibant l’activation de la NADH oxydase (Munzel et al. 1996), ce qui inhibe en conséquence l’oxydation des LDLs.

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Résultats expérimentaux

Par ailleurs, les dérivés de l’hydrazine piègent les groupements carbonyl tels que les aldéhydes formés lors de l’oxydation des lipides, et inhibent donc la dérivatisation des protéines cellulaires et leur dysfonction. C’est le cas en particulier pour le récepteur au PDGF (PDGFR), qui est une cible du 4-HNE présent dans les LDL (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). La modification du PDGFR par le 4-HNE induit progressivement une dysfonction du récepteur, caractérisée dans un premier temps par la phosphorylation du PDGFR et l’activation en aval des voies de signalisation PDGFR-dépendantes, et dans un second temps, par une désensibilisation progressive du PDGFR à son propre ligand, le PDGF. Cet effet se traduit par une inhibition de la phosphorylation du PDGFR sous l’effet du PDGF, et une diminution marquée de la prolifération cellulaire. Les travaux précédents de l’équipe avaient montré que la dinitrophényl hydrazine (DNPH) et l’hydralazine, réversent in vitro l’effet du 4-HNE sur le PDGFR, en piégeant le 4-HNE. Par ailleurs l’hydralazine prévient la formation des lésions d’athérosclérose et la modification du PDGFR chez deux modèles animaux, le lapin hypercholestérolémique et la souris apoE-/- (Vindis et al. 2006). Nous montrons ici que cette propriété est partagée par les autres dérivés de l’hydrazine, qui sont par ailleurs des agents thérapeutiques anciens, connus pour leur efficacité dans des domaines très différents, soit comme antituberculeux (isoniazide ou INH), ou IMAO (phénelzine, iproniazide), l’hydralazine étant elle-même un antihypertenseur. Ces différents agents sont efficaces pour prévenir in vivo la formation des lésions primaires et la modification du PDGFR, dans ce cas les molécules sont administrées à la souris à 4 semaines (à cet âge, les lésions ne sont pas encore présentes). Par ailleurs lorsque ces agents sont administrés à 8 semaines (alors que les souris ont déjà commencé à développer les lésions), ces molécules sont également capables de ralentir le processus d’accumulation des lésions, et pourraient donc présenter un effet curatif sur leur évolution. Cet effet protecteur fait intervenir la double propriété carbonyl scavenger et antioxydante de ces molécules (à l’exception de l’isoniazide), et ouvre des perspectives nouvelles pour le développement de nouveaux agents antiathérogènes, en essayant de limiter les effets secondaires de ces agents (inhibition de la vitamine B6, agressivité chez les souris traitées à la phénelzine…).

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Résultats expérimentaux

II.4. Conclusion

Grâce à leurs propriétés piégeurs de carbonyle, les dérivés hydraziniques testés (hydralazine, phénelzine, isoniazide, iproniazide) ont permis de réduire l’oxydation cellulaire des LDLs, la cytotoxicité de LDLs oxydées et la formation d’adduits in vitro, et sont efficaces pour inhiber la formation des lésions primaires chez les souris ApoE-/-, et la formation d’adduits dans les tissus. Ces effets protecteurs impliquent des propriétés carbonyl scavenger de ces molécules, associées ou non à un effet antioxydant, et sont indépendants d’un effet inhibiteur de MAOs puisque la pargyline, un IMAO non hydrazinique, n’est pas efficace in vitro et très peu in vivo. Cette étude n’exclut pas cependant un rôle plus tardif des MAOs dans le remodelage des plaques.

Ces résultats ouvrent des perspectives dans le développement de nouveaux agents antiathérogènes, et plus largement dans les pathologies liées au stress oxydant, avec des molécules capables de piéger la formation d’adduits sur les protéines cellulaires et tissulaires, et donc de restaurer leur fonction. La revue annexe fait le point sur les différentes classes d’agents piégeurs de carbonyle utilisés in vitro ou in vivo et parfois en thérapeutique humaine, pour prévenir ou inhiber la formation des adduits et les effets délétères des groupements carbonyles.

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Conclusions générales et Perspectives

Conclusions générales et Perspectives

Conclusion générale et Perspectives

Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un rôle potentiel de la MAO-A dans les effets mitogènes des amines biogènes (sérotonine et tyramine) sur cellules musculaires lisses vasculaires. Cet effet est médié par la production de H2O2 libéré par la dégradation des substrats de la MAO-A et l’activation d’une voie de signalisation proliférative « de stress » déjà décrite par l’équipe, la voie Metalloprotéase/Sphingolipides (sphingomyéline/céramide /sphingosine 1-phosphate). Nous avons pu identifier la sphingomyelinase neutre nSMase2 (smpd3, première enzyme de la cascade des sphingolipides activée), comme étant impliquée dans la réponse mitogène, et nous avons mis récemment en évidence l’existence d’interactions directes entre MMP2 et nSMAse2, bien que le mécanisme d’activation de nSMase2 par MMP2 reste à démontrer. Nos résultats apportent donc des connaissances nouvelles dans le domaine de la signalisation médiée par la MAO-A, jusque là surtout associée aux phénomènes d’apoptose, avec une implication dans la prolifération cellulaire, et a fortiori dans la formation de la chape fibreuse et le remodelage vasculaire.

L’effet EROs-dépendant de la MAO-A a été mimé par H2O2 ajouté directement dans le milieu, qui active également la voie mitogène MMP2/Sphingolipides. Nous avons par ailleurs étudié les mécanismes activés en amont de MMP2, en l’occurrence l’implication de la proprotéine-convertase furine et de MT1-MMP, la métalloprotéase activant MMP2. Cependant, les voies impliquées dans l’activation de la voie furine et sa translocation à la membrane plasmique, restent à démontrer, et sont actuellement en cours d’investigation (effet direct de H2O2 sur la furine, implication potentielle de la furine sécrétée dans le milieu, implication des systèmes de maturation tels que sortie du reticulum endoplasmique ou du Golgi vers la membrane plasmique….). Nous avons par ailleurs étudié les voies impliquées dans l’activation de la sphingosine kinase (SK1). Cette activation de SK1 nécessite deux voies séparées, la voie MMP2/sphingolipides et la voie du PDGF récepteur via l’activation de src kinase. Ces deux voies de signalisation sont indépendantes et nécessaires à l’activation de la SK1, la production de sphingosine 1-phosphate et la prolifération cellulaire. Le rôle de src dans l’activation de SK1 par différents agonistes avait été rapporté dans l’équipe (Maupas- Schwalm et al. 2005), mais ses liens avec la voie MMP2/nSMase ne sont pas connus, et sont en cours d’investigation dans l’équipe. Une hypothèse concerne l’implication des MAP

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Conclusions générales et Perspectives

kinases comme rapporté par le groupe de S. Pitson (Pitson et al. 2003), et par Maupas- Schwalm et al. (Maupas-Schwalm et al. 2005).

Par ailleurs, l’étude des mécanismes par lesquels MMP2 active nSMase montre une interaction entre ces deux enzymes après stimulation par H2O2 (les travaux préliminaires montrent que les deux enzymes co-immunoprécipitent). Différentes hypothèses sont envisagées quant au mécanisme conduisant à cette activation, comme l’existence d’un complexe cellulaire, au niveau duquel se ferait la cascade de signalisation conduisant à l’activation de nSMase, composé de différents acteurs, dont MMP2 et la nSMase, mais également d’autres partenaires (ex : protéines du cytosquelette, intégrines, et MT1-MMP), bien que la forme soluble de MMP2 soit a priori impliquée dans l’activation de la nSMase2. Les questions qui se posent concernent les mécanismes par lesquels MMP2 active nSMase2 (protéolyse d’un co-activateur ou d’un inhibiteur, ou protéolyse directe d’une proforme de nSMase2, bien que des expériences indiquent que MMP2 ne soit pas capable d’activer directement nSMase2 in vitro, ce qui n’exclut pas cependant une protéolyse in vivo).

Pro-MMP2 MMP2

MT1-MMP SM Cer Sp S1P H2O2 nSMase2 Voie des SK1 sphingolipides Edg Furine ? Ek1/

P H2O2 & ROS

MAO-A SrcK

Tyramine Synthèse ADN Mitochondrie Serotonine Prolifération Cellulaire

PDGF-R

Figure 8. Conclusions et Perspectives in vitro

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Conclusions générales et Perspectives

La deuxième partie de ce travail montre une étude in vivo concernant le rôle des MAOs dans le développement des lésions primaires, sur un modèle de souris développant spontanément des plaques d’athérome (souris Apo E-/-). Pour cela les animaux âgés de 4 semaines ont été traités par des inhibiteurs de MAOs de deux classes différentes, et les lésions ont été quantifiées après 16 semaines de traitement. Ce travail a permis de montrer que la pargyline (un dérivé acétylénique à activité IMAO) n’induit pas de diminution significative des plaques d’athérome. A l’inverse, les IMAO hydraziniques, l’iproniazide et la phénelzine, ainsi que d’autres dérivés hydraziniques non IMAOs (isoniazide et hydralazine), sont efficaces pour limiter la formation et le développement des lésions. L’effet protecteur de ces molécules serait dû à leur capacité à piéger les carbonyles, comme l’ont montré des expériences menées in vitro (détermination des groupements aminés libres et détection des protéines carbonylées, mais également diminution de la formation d’adduits entre les protéines et les aldéhydes de peroxydation lipidique, tels que acroléine ou 4-HNE, en particulier sur le récepteur au PDGF. Certains de ces agents présentent également des propriétés antioxydantes (iproniazide, phénelzine, hydralazine), mais celles-ci n’expliquent pas entièrement leur efficacité car l’isoniazide n’a aucune propriété antioxydante mais est un piégeur de carbonyle puissant, très efficace dans la réduction de formation de lésions primaires chez la souris apoE -/-.

Ces résultats indiquent d’une part que les MAOs vasculaires ne semblent pas participer à la formation de lésions primaires, ce qui n’exclut pas leur contribution aux phénomènes de remodelage vasculaire, dans les lésions plus avancées. D’autre part, les propriétés « piégeur de carbonyle » des dérivés hydraziniques et leur capacité à protéger in vitro contre la formation d’adduits et la cytotoxicité des LDL modifiées et in vivo contre la formation des lésions primaires en font des candidats de choix pour le développement de molécules antioxydantes capables de piéger la formation d’adduits, et donc potentiellement d’un intérêt thérapeutique dans le traitement de maladies liées au stress oxydant.

En conclusion, ce travail a permis de montrer un nouveau mode d’action de la sérotonine dans les vaisseaux, récepteur indépendant, faisant intervenir sa métabolisation par la MAO-A.

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Conclusions générales et Perspectives

La MAO-A vasculaire est le premier filtre lors d’une augmentation brutale de sérotonine dans la circulation sanguine (activation plaquettaire), et est la première à la dégrader, de manière à ce que la concentration de sérotonine arrivant aux organes (ex : le cœur) soit moins importante. Ce pourrait être un moyen physiologique de protection des organes (la sérotonine étant toxique à fortes concentrations pour certains organes).

Ce nouveau mécanisme d’action de la sérotonine dans la fonction vasculaire impliquant la MAO-A peut avoir une implication pathologique, par exemple lors d’évènements thrombotiques survenant dans les lésions athéroscléreuses évoluées. Ici nous avons décrit une voie de signalisation mitogène en aval, mimée par du peroxyde d’hydrogène exogène, impliquant l’activation d’une proprotéine convertase (la furine), de metalloprotéases (MT1-MMP et MMP2) et la voie des sphingolipides, déjà décrite par l’équipe d’Anne Nègre- Salvayre.

Bien que les résultats in vivo suggèrent que la MAO-A n’intervient pas dans la formation des lésions précoces son rôle dans le remodelage des plaques n’est pas exclu puisque les mécanismes impliquent à la fois des phénomènes d’apoptose et de prolifération.

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Annexe

Annexe

ANNEXE

Les groupements carbonyles (reactive carbonyl compounds ou RCCs) se forment au cours de l’oxydation des acides gras polyinsaturés ou des carbohydrates. Les RCCs induisent le stress carbonylé caractérisé par la formation d’adduits et de cross-links sur les protéines, conduisant à un dysfonctionnement protéique et par la suite tissulaire, avec une inflammation et une apoptose. En effet, les RCCs sont les précurseurs des produits avancés de lipoxydation ou de glyoxydation (ALEs et AGEs) qui sont des marqueurs de pathologies liées au vieillissement comme l’athérosclérose, le diabète non-insulinodépendant et les maladies neurodégénératives (Singh et al. 2001; Beal 2002).

Les RCCs modifient les protéines cellulaires et tissulaires via la réaction de Maillard, formant des adduits sur certains acides aminés possédant des groupements aminés libres (lysine, histidine), ou sur les groupements thiol (cystéine), générant les AGEs et ALEs (Thornalley 1998; Poli and Schaur 2000; Thorpe and Baynes 2003). Ces adduits induisent le « carbonyl stress », qui perturbe la signalisation cellulaire, en modifiant la structure et la fonction des protéines, ce qui conduit à des dysfonctionnements cellulaires et tissulaires, et des changements sur la prolifération, la survie et la viabilité cellulaire (Thornalley 1998).

Les RCCs sont impliqués dans les pathologies associées au stress oxydant, notamment l’athérosclérose (Stadtman 2001), maladie dans laquelle les lipides oxydés et particulièrement les LDLs (Low Density Lipoproteins) sont fortement impliqués, tout du moins dans l’apparition des lésions primaires, caractérisées par l’accumulation de cellules spumeuses et de stries graisseuses (Steinberg 1997; Steinbrecher 1999). En effet, la modification des LDL par les aldehydes formés au cours de l’oxydation des acides gras polyinsaturés (malondialdéhyde –MDA, hydroxynonénal –HNE, acroléine…(Hajjar and Haberland 1997; Leonarduzzi et al. 2000; Uchida 2000), se produit sur des acides aminés (histidine, lysine), impliqués dans la reconnaissance des LDL par le récepteur apoB/E. Cette modification altère donc la reconnaissance des LDL par leur récepteur, et au contraire favorise leur captation par le récepteur scavenger des macrophages, qui captent et dégradent ces LDL modifiées, et accumulent des esters de cholestérol dans le cytosol, d’où formation de cellules spumeuses (Steinberg 1997; Steinbrecher 1999). Cet effet des aldehydes sur les LDL est donc bien à

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l’origine du processus d’accumulation des cellules spumeuses (Steinberg 1997; Steinbrecher 1999; Uchida 2000).

Les antioxydants et les piégeurs de carbonyles (carbonyl scavengers), inhibent la génération d’espèces réactives de l’oxygène et de produits d’oxydation lipidique, et sont efficaces pour prévenir la formation de RCCs in vitro, mais leur efficacité in vivo contre les complications liées à l’athérosclérose est discutée (Albertini et al. 2002; Brigelius-Flohe et al. 2002; Fang et al. 2002) notamment à cause du problème de biodisponibilité des molécules dans la plaque, de leur nature chimique (et hydrophobicité) et de leur incapacité à piéger les RCCs, après que les adduits soient formés sur les protéines (Romero et al. 1998).

Les RCCs sont inhibés par les carbonyl scavengers dont l’efficacité dépend de leur capacité à interagir avec les RCCs pendant leur formation, ou au cour de réactions chimiques impliquées dans la formation d’adduits. En fait, l’aminoguanidine et la pyridoxamine sont en théorie capables de piéger les RCCs et inhibent les ALEs au cours de l’athérosclérose (Bonnefont- Rousselot 2002; Voziyan et al. 2002; Metz et al. 2003). Ces composés préviennent la formation d’AGEs et représentent donc une nouvelle approche thérapeutique dans des pathologies impliquant les AGEs, comme le diabète, les néphropathies liées au diabète et les maladies neurodégénératives (Dukic-Stefanovic et al. 2001; Stitt et al. 2002). La carnosine (beta-alanyl-L-histidine) réagit également avec les AGEs et pourrait ralentir le vieillissement (Hipkiss and Brownson 2000a).

La dinitrophénylhydazine (DNPH), un dérivé hydrazinique, prévient la formation in vitro d’acroléine- et HNE-adduits sur les protéines cellulaires, ainsi que la cytotoxicité des LDLs oxydées sur cellules vasculaires (Vindis et al. 2006). Mais elle ne peut être testée in vivo à cause de ses effets secondaires importants (hémolytique, mutagène et carcinogène (Malca- Mor and Stark 1982)).

D’autres molécules dérivées de l’hydrazine et utilisées en thérapeutique humaine, comme l’isoniazide (antituberculeux), la phénelzine et l’iproniazide (antidepresseurs), l’hydralazine (antihypertenseur), pourraient prévenir la formation d’adduits in vivo chez la souris apoE-/- (cf. papier précédent).

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Annexe

La revue qui suit fait le point sur ces différents agents piégeurs de carbonyle et les possibilités thérapeutiques qui s’ouvrent dans ce domaine, dans les pathologies liées au stress oxydant en général, et en particulier l’athérosclérose.

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Advanced lipid peroxidation end products in oxidative damage to proteins. Potential role in diseases and therapeutic prospects for the inhibitors

Anne Negre-Salvayre, Christelle Coatrieux, Cecile Ingueneau, Robert Salvayre

INSERM U858, IFR-31 and Biochemistry Department, CHU Rangueil, University Toulouse- 3, Toulouse, France

Running title: Therapeutic interest of ALE carbonyl scavengers

Corresponding author: Anne Negre-Salvayre, PhD, DrSciPharm Inserm U858, IFR31, Team 10, CHU Rangueil, BP 84225, Toulouse Cedex 4, 31432, France Tel: 33 561 322 059 Fax: 33 561 322 084 E-mail: [email protected]

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Summary

Reactive carbonyl compounds (RCCs) formed during lipid peroxidation and sugar glycoxidation, namely Advanced lipid peroxidation end products (ALEs) and Advanced Glycation end products (AGEs), accumulate with ageing and oxidative stress-related diseases, such as atherosclerosis, diabetes or neurodegenerative diseases. RCCs induce the ‘carbonyl stress’ characterized by the formation of adducts and cross-links on proteins, which progressively leads to impaired protein function and damages in all tissues, and pathological consequences including cell dysfunction, inflammatory response and apoptosis. The prevention of carbonyl stress involves the use of free radical scavengers and antioxidants that prevent the generation of lipid peroxidation products, but are inefficient on pre-formed RCCs. Conversely, carbonyl scavengers prevent carbonyl stress by inhibiting the formation of protein cross-links. While a large variety of AGE inhibitors has been developed, only few carbonyl scavengers have been tested on ALE-mediated effects. This review summarizes the signalling properties of ALEs and ALE-precursors, their role in the pathogenesis of oxidative stress-associated diseases, and the different agents efficient in neutralizing ALEs effects in vitro and in vivo. The generation of drugs sharing both antioxidant and carbonyl scavenger properties represents a new therapeutic challenge in the treatment of carbonyl stress- associated diseases.

Keywords: acrolein, ALE, atherosclerosis, cancer, carbonyl scavenger, carbonyl stress, diabetes, 4-hydroxynonenal, inflammation, lipid peroxidation, malondialdehyde, metabolic disorders, methylglyoxal, neurodegenerative diseases.

Abbreviations: 4-HNE, 4-hydroxynonenal; MDA, malondialdehyde; ALE, advanced lipoxidation (lipid peroxidation) end products; AGE, advanced glycoxidation end products.

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Introduction

Reactive carbonyl compounds (RCCs) formed endogenously during lipid peroxidation and the glycoxidation of carbohydrates, are precursors of advanced glycation end products (AGEs) and advanced lipid peroxidation end products (ALEs) which form cross-links on tissular proteins (carbonyl stress), and accumulate during ageing and in chronic diseases (Brownlee et al. 1984; Voziyan et al. 2002; Smit and Lutgers 2004). Carbonyl stress induces progressively protein dysfunctions and damages in all tissues, with pathological consequences such as inflammation and apoptosis contributing to the progression of diseases (Dalle-Donne et al. 2003; Petersen and Doorn 2004). Therefore, inhibiting the chemical modification of tissue proteins may prevent the pathological consequences of carbonyl stress and may represent a new therapeutic strategy for patients. Most of the carbonyl stress inhibitors used so far, have been developed to prevent the accumulation of AGEs in diabetes and its complications including accelerated atherosclerosis, nephropathy, cataract and neuropathies (Thomas et al. 2005b; Peyroux and Sternberg 2006). In contrast, except antioxidants which inhibit indirectly the generation of lipid peroxidation products, few carbonyl scavenger agents known to reduce in vitro the accumulation of ALEs precursors, have been tested in vivo on the progression of ALE-related diseases. This review summarizes the mechanisms involved in the generation of ALE precursors, their targets and role in carbonyl stress and their consequences in ageing and in the pathogenesis of diseases. The review then focuses on carbonyl scavenger agents able to neutralize in vitro and in vivo protein modifications induced by ALE precursors, and their potential interest in pre-clinical and clinical studies, as new pharmacological approaches in carbonyl stress-related diseases.

Formation and signalling properties of ALEs and ALE precursors Lipid peroxidation induced by oxidants and oxidative stress, generates a huge variety of lipid peroxidation products, including reactive carbonyl compounds (RCCs) and more stable products such as ketones and alkanes (Figs.1 and 2). Moreover, the α-oxoaldehyde

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methyglyoxal may be generated during glycoxidation (Thornalley et al, 1999) and as a by- product of catabolism of lipids, glucose and amino acids (Fig.3) (Peyroux et al, 2006). RCCs such as aldehydes and dicarbonyls, including hydroxyalkenals, acrolein, malondialdehyde (MDA), glyoxal (GO) and methylglyoxal (MGO), exhibit a large panel of biological properties. These aldehydes react on cellular and tissular proteins to form adducts (ALEs) that induce protein dysfunctions and alter cellular responses (Petersen and Doorn 2004).. The rate of oxidation and aldehyde-adduct formation is low under physiological conditions, but increases with ageing together with the decrease in antioxidant defences (McEwen et al. 2005; Voss and Siems 2006). It is a slow process countered by the rapid turnover of short half-life cellular proteins, whereas modified long-life proteins accumulate in tissues with age (Lyons et al. 1991; Sell et al. 1996).

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- Formation of ALE precursors or Reactive carbonyl compounds (RCCs). The oxidation of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) generates RCCs, including highly reactive α,β-unsaturated hydroxyalkenals, such as 4-hydroxynonenal (4-HNE) and 4- hydroxyhexenal (4-HHE). Oxidation of n-6 PUFAs (mainly linoleic and arachidonic acids) leads to the formation of 4-hydroxynonenal (4-HNE) (Esterbauer 1993) whereas oxidation of n-3 PUFAs (docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid and linolenic acid) generates 4- hydroxyhexenal (4-HHE) (Van Kuijk et al. 1990). 4-HNE can react with histidine, cysteine, or lysine residues of proteins, leading to the formation of stable Michael adducts with a hemiacetal structure (Schaur 2003). The chemical reactions involved in 4-HNE interactions with proteins are summarized in Fig.4, and include reactions between the C=C double bond with a nucleophile (cysteine, glutathione, amine) via 1,2- and 1,4-Michael addition (Nadkarni and Sayre 1995). The 1,2-Michael addition involves the reaction of a primary amine (lysine) with the α,β-unsaturated carbonyl, resulting in the formation of a Schiff base at acidic pH. This step is reversible (Petersen and Doorn 2004). The 1,4-Michael addition of 4-HNE involves the reaction of the nucleophile with the β- carbon, resulting in the addition of the nucleophile and proton across the C=C double bond (Nadkarni and Sayre 1995). Among the protein residues that react with 4-HNE, cysteine (Cys) exhibits the highest reactivity, followed by histidine (His) and lysine (Lys) (Petersen and Doorn 2004), but Cys-HNE adducts could be less stable than His-HNE adducts (Uchida 2003). Concerning the modification of apolipoprotein B, 4-HNE was reported to attack mainly the lysine and to a lesser extent histidine and cysteine residues (Jürgens et al.., 1986). MDA and acrolein, are formed during lipid peroxidation and bind to nucleophiles (Esterbauer et al. 1991; Poli and Schaur 2000). MDA is one of the most abundant aldehydes, resulting from peroxidation of arachidonic, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid (Esterbauer et al. 1991). MDA reacts with Lys residues by forming Schiff bases (Esterbauer 1993), and plays a major role in LDL modification and their metabolic deviation toward macrophages (Palinski et al. 1989; Steinberg 1997). Protein modifications by bifunctional aldehydes can also lead to intramolecular or intermolecular protein cross-linking. The accumulation of MDA-adducts on proteins is involved in the formation of the fluorescent pigment lipofuscin, which accumulates progressively during ageing (Chowdhury et al. 2004). Acrolein

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(CH2=CH-CHO) is also formed during lipid peroxidation and is a strong electrophile exhibiting high reactivity with Cys, His and Lys nucleophile residues (Esterbauer et al. 1991; Uchida et al. 1998a).

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Another class of reactive ALE precursors is represented by α-oxoaldehydes (methylglyoxal, glyoxal) (Fig.1). These agents are basically generated during diabetes and hyperglycemia, from the Maillard reaction, which involves the condensation of sugars (glucose) with proteins, leading to the formation of a Schiff base, followed by a rearrangement (non-enzymatic glycation) generating the Amadori product. During Amadori rearrangement, α-oxoaldehydes (methylglyoxal, glyoxal) are formed, and react with lysine and arginine residues to form AGEs. These α-oxoaldehydes are also generated from lipid peroxidation (glyoxal), the catabolism of ketone bodies and the fragmentation of triosephosphates (methylglyoxal) (Fig.3). α-oxoaldehydes are increased in the early stages of glycation in hyperglycaemic conditions, and are detected in atherosclerotic lesions (Thornalley et al. 1999).

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Methods for the detection of ALE precursors and ALEs modified protein (or RCC/protein adducts)

- Determination of ALEs precursors. Several analytical methods have been used to determine RCCs ranging from whole evaluation of RCCs by poorly specific methods, such as TBA reactive substances (TBARs) assay, to highly specific methods allowing a precise structural determination and quantitation. As ALE precursors are formed in lipid fractions, a first difficulty is because RCCs are chemically reactive compounds that may react during sample preparation. It is therefore necessary to prepare RCCs derivatives, generally as DNPH derivatives (Esterbauer et al. 1991). More recently, RCCs derivatives of pentafluorophenylhydrazine, N-methylhydrazine, cysteamine and of o-phenylene diamine have been used successfully and exhibit several analytical advantages, as reviewed recently by Shibamoto (2006). Another difficulty is the isolation and extraction of these compounds from lipid-rich samples. The classical extraction by solvent partition is difficult because of the amphiphilic character of numerous lipid peroxidation products. This led to develop new and more sophisticated methods, utilizing solid phase extraction cartridge, or "simultaneous purging and solvent extraction apparatus" (see review by Shibamoto, 2006). DNPH derivatives converted into their corresponding hydrazones can be separated and analysed by various methods including gas chromatography (GC), gas chromatography/mass spectrometry (GC), HPLC/UV and HPLC/MS (Shibamoto, 2006).

- Detection of ALEs modified proteins. Classical methods to detect and evaluate carbonyl content of modified protein (ALEs modified proteins) are based on the reaction of DNPH with carbonyl groups to form DNP- hydrazone derivatives that are measured by spectrophotometry. An alternative ELISA method is the detection of the DNP moiety of the proteins by specific antibodies. Recently, proteomics (mass spectrometry) methods have been used to identify ALEs modified proteins (RCC/protein adducts) after proteolytic digestion and analysis of peptide

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mass fingerprints by MALDI-TOF-MS or LC-ESI-MS/MS (Carini et al., 2004, Sayre et al., 2006, Aldini et al., 2006). Polyclonal and specific monoclonal antibodies against RCC-protein adducts (including anti-4-HNE and anti-acrolein antibodies) allowed to visualise the presence of such modified proteins in various tissues, under physiological and pathophysiological conditions (Jurgens et al., 1990; Uchida et al., 1995, Waeg et al., 1996; Xu et al., 2000). Recently, this also allowed developing enzyme-linked immuno-sorbent assays (ELISA) techniques for quantitative determination of oxidatively modified LDL and circulating proteins (Satoh et al., 1999; Borovic et al., 2006). Moreover, modification of specific cellular or tissular protein can be evaluated by western blot of the immunoprecipitated protein revealed with specific antibodies (e.g. anti-HNE, anti-CML) and the modification can be compared to functional changes (Suc et al., 1998, Vindis et al., 2006).

Molecular and cellular targets and signalling properties of ALEs and ALE precursors. ALEs precursors play an active role in signal transduction by altering progressively the structure and function of circulating and tissular proteins, with consequences on the inflammatory status, cell proliferation and viability (Petersen and Doorn 2004). The biological effects of ALE precursors, are modulated by their local concentration, their availability depending on the presence of cellular detoxifying or metabolising systems, for instance the conjugation of 4-HNE with cellular glutathione (GSH) catalyzed by glutathione- S-transferase (GST) and the functionality of proteolytic systems involved in the degradation of modified proteins (Petersen and Doorn 2004).

- LDL modification. One of the best-known effects of ALEs precursors is their role in the modification of LDLs which is involved in the formation of early atherosclerotic lesions, according to the oxidative theory for atherosclerosis (Chisolm and Steinberg 2000; Lusis 2000). LDL oxidation is a slow process, which occurs in the sub-intimal space, by contact of LDLs with reactive oxygen species generated by vascular cells. Oxidized LDLs (oxLDLs) can be obtained in vitro by incubating LDLs with oxidants or cultured vascular cells (Jurgens et al. 1987; Steinberg 1997; Steinbrecher 1999). The oxidation process generates a huge variety of lipid peroxidation

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products among them MDA, 4-HNE, acrolein, or glyoxal (Esterbauer et al. 1991; Esterbauer 1993). As summarized in Fig.5, these aldehydes react with the lysine residues of apoB, which are required for LDL recognition by its specific apoB/E receptor expressed on most cell types except macrophages. LDL modification alters their affinity for the apoB/E receptor, and deviates their metabolism towards scavenger receptor-bearing cells, (macrophages and smooth muscle cells), that are progressively transformed into foam cells (Steinbrecher 1999). The accumulation of foam cells leads to the formation of fatty streaks which are characteristic of the early atherosclerotic lesions (Stary 1990; Ross 1993). Like 4-HNE and MDA, methylglyoxal and glyoxal may directly modify LDLs and deviate their metabolism towards macrophages (Brown et al. 2005). Moreover, the degradation of oxLDLs in lysosomes is slowed down, possibly because 4- HNE is able to modify and inactivate the lysosomal cathepsin B (Hoppe et al. 1994; Hoff et al. 2003). Beside their metabolic deviation, oxLDLs exhibit a large variety of biological and atherogenic properties, involved in the activation of inflammatory, mitogenic, or proapoptotic pathways (Hajjar and Haberland 1997; Leonarduzzi et al. 2000; Uchida 2000). The biological activity of oxLDLs depends on the presence of lipid peroxidation products such as oxysterols, lipoperoxides, lysophospholipids and reactive aldehydes (4-HNE, MDA, acrolein or methylglyoxal). These agents can mimic the toxic, inflammatory or mitogenic signalling mediated by oxLDLs (Leonarduzzi et al. 2005).

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- Modification of tyrosine kinase receptors and cell cycle. 4-HNE added to cultured cells exhibits a clear dose-dependent effect, since physiological concentration of 4-HNE has growth regulating effect, whereas higher concentration is primarily cytotoxic (Zarkovic et al., 1993). 4-HNE present in oxLDLs or exogenously added to the culture medium induces both modification and dysfunction of tyrosine kinase receptors (TKRs) such as EGF receptor (EGFR) and PDGF receptor (PDGFR), in a biphasic manner. 4-HNE, at physiological and moderate concentrations (< 1 µM and 1-10 µM, respectively), triggers a sustained activation of TKRs EGFR and PDGFR (Suc et al. 1997; Escargueil-Blanc et al. 2001; Leonarduzzi et al. 2004). 4-HNE involved in TKRs modification originates from oxLDLs (as evidenced by the use of oxLDLs radiolabelled with [3H] hydroxynonenal), and from the lipid peroxidation of cell membrane (Escargueil-Blanc et al. 2001). The mechanism of TKRs activation involves the formation of 4-HNE-adducts on the receptor, which triggers TKR autophosphorylation and the activation of the downstream signalling pathway, ERK1/2 phosphorylation and cell cycle progression (Suc et al. 1997; Escargueil-Blanc et al. 2001). Modification of purified TKRs by 4-HNE in vitro triggers the activation of the receptor, thereby demonstrating that TKR modification and activation are causally related (Suc et al. 1997; Escargueil-Blanc et al. 2001). From these observations, it can be speculated that, at low (physiological ?) concentrations, 4-HNE can act as a growth factor and promotes cell proliferation. However, high concentrations of 4-HNE inhibit cell proliferation mediated by growth factor receptors EGFR and PDGFR (Liu et al, 1999; Vindis et al., 2006), though a twofold increase of the c- fos mRNA level was observed as a protective but abortive stress-induced response (Kreuzer et al., 1998). This inhibitory effect of 4-HNE on growth factor-mediated cell proliferation is in agreement with the progressive desensitization of PDGFRβ to its own ligand PDGF-BB, observed in SMC in prolonged contact with oxLDL or 4-HNE (at concentrations > 10 µM). The desensitization of PDGFRβ is characterized by an inhibition of the PDGF-induced PDGFRβ autophosphorylation, of the signalling cascade and of cell proliferation (Vindis et al., 2006). Inhibition of cell cycle progression, reported in leukemic cells, is mediated by a decrease in expression of cyclin D1, D2 and A and an increase in the expression of the cycline kinase inhibitor p21, thereby inducing an accumulation of cells in the G0/G1 phase of the cell

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cycle (Barrera et al, 2005). 4-HNE induces an accumulation of the hypophosphorylated form of the retinoblastoma (Rb) tumor-suppressor gene product pRb (ppRb) which binds and inactivates the E2F transcription factors, represses the transcription, and induces cell-cycle arrest (Barrera et al, 2005). Moreover, 4-HNE inhibits the expression of the protooncogene c- myc in HL-60, without affecting the expression of c-fos (Barrera et al., 1996). Higher toxic concentrations of 4-HNE (50 µM) enhanced c-fos transcription while cell proliferation is inhibited (Kreuzer et al., 1997). 4-HNE- and acrolein-adducts on PDGFR, occur also in vivo in atherosclerotic lesions from hypercholesterolemic rabbits, apoE-/- mice and human patients (Vindis et al. 2006), which suggests that 4-HNE may impair RTK signalling (PDGFR) within the vascular wall, and may potentially disturb PDGFR-mediated responses (proliferation, cell migration, wound healing). These biological effects are not restricted to 4-HNE, since methylglyoxal is also able to inhibit various RTKs, including EGFR, PDGFR and insulin receptor, suggesting a role for this modification in accelerated atherosclerosis in diabetes (Portero-Otin et al., 2002; Cantero et al., 2007; Van Obberghem et al., 2006).

- Other signalling protein kinases. Sub-cytotoxic concentrations of 4-HNE are known to directly or indirectly alter a variety of cell signalling kinases (Leonarduzzi et al., 2004). Only few reports provide information on the molecular mechanisms and on the identity of proteins that are targeted by 4-HNE. Sub- toxic concentrations of 4-HNE induce the expression of antioxidant genes such as heme- oxygenase and thioredoxine-1, via the activation of the MAPK pathway and the transcription factor Nrf2 (Chen et al. 2005; Siow et al. 2007), suggesting that 4-HNE may promote adaptive response to oxidative stress. Low 4-HNE concentrations induce the release of MCP- 1 by macrophages, through an activation of PKCβ (Nitti et al. 2002) whereas the activation of PKCδ and of Jun N-terminal kinase is rather associated to apoptosis via an up-regulation of the activator protein-1 DNA binding transcription factor (Castello et al. 2005). More generally, the activation of JNK and p38 kinase pathways by 4-HNE is associated to the activation of transcription factors initiating cellular responses including cell proliferation, inflammatory responses, proteasomal-mediated protein degradation, and apoptosis (Petersen and Doorn 2004; Carbone et al. 2005; Leonarduzzi et al. 2005).

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- Proteasome Proteasome is activated by oxidative stress (Grune and Davies, 2003) and by low concentrations of oxLDLs (Robbesyn et al., 2003). In contrast HNE-modified proteins are poorly degraded by proteasome, and tend to inhibit the proteolytic activity (Grune and Davies, 2003). The extensive modification of cellular proteins by 4-HNE and by the related aldehydes leads to the formation of protein aggregates that accumulate in cells and are not degraded by the proteasome (Grune and Davies 2003). The decreased degradation of modified protein and their accumulation could result from a direct inhibition of proteasome by oxidized and cross-linked proteins (Sitte et al., 2000; Grune and Davies, 2003), and by 4-HNE- modified proteins (Friguet, 2006). Though the modification of proteasome is not observed at low or moderate 4-HNE concentrations (Grune and Davies, 2003), higher concentrations may directly form adducts on the three proteolytic activities of proteasome (trypsin, chymotrypsine and peptidylglutamyl peptide hydrolase) (Okada et al., 1999; Ferrington and Kapphahn, 2004), which readily inhibits the enzymatic activity of proteasome and contributes to the accumulation of modified proteins (Grune and Davies, 2003), and to apoptosis mediated by oxidized LDL (Vieira et al., 2000). For instance, the reduction in the chymotrypsin-like activity could be explained by the modification of cysteine residues, as mimicked by treatment of purified proteasome sub-units with the sulfhydryl-reactive chemical N- ethylmaleimide (Kapphann et al., 2007). The inhibition of proteasome contributes to the pathogenicity of diseases characterized by an accumulation of cross-linked proteins, such as Alzheimer’s disease, in which HNE-modified amyloid beta peptide accumulates and efficiently inhibits the proteasome (Shringarpure et al., 2000). The accumulation of ubiquitinated modified proteins resulting from proteasome inhibition in neuronal cells triggers a proinflammatory response characterized by an upregulation of COX-2 and the production of prostaglandin PGE2, which contributes to neurodegeneration (Rockwell et al., 2000). The ubiquitination conjugation process may be not necessary for the degradation of oxidized protein by proteasome, (Shringapure et al., 2003), but is involved in the degradation of cellular proteins in contact with oxLDL or 4-HNE, since its inhibition potentiates apoptosis (Vieira et al., 2000). This ubiquitination process is not altered by 4-HNE (Vieira et al, 2000), and could occur at a faster rate than that of native proteins, as reported for 4-HNE-modified

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alphaB-crystallin (Marques et al, 2004). In this paper, the authors describe another ubiquitin/lysosomal pathway that could degrade HNE-modified proteins independently of proteasome (Marques et al, 2004). However, other reports indicate that the lysosomal degradation of modified proteins, by lysosomal cathepsin is impaired in aging and in pathological situations leading to the accumulation of modified proteins (Sitte et al., 2000).

- NFkB. The pro-inflammatory transcription factor NF-κB (nuclear factor κB) is a direct regulator of proinflammatory and anti-inflammatory genes, cell survival and proliferation (de Winther MP, 2005). The activation of NF-κB requires the phosphorylation of its inhibitor IκB which is necessary for its degradation by the ubiquitin-proteasome pathway (Roff et al., 1996). 4-HNE and acrolein inhibit the activation of NFκB, either via a direct inhibitory effect on proteasome or through the inhibition of an upstream step required for the phosphorylation of IκB as reported in human monocytic cells, in which 4-HNE inhibits the activation of NFκB induced by LPS, IL1-beta and phorbol ester (Page et al. 1999). Conversely, 4-HNE prevents the activation of NFκB elicited by Chlamydia Pneumoniae by inhibiting the phosphorylation of IκB and its subsequent proteolysis (Donath et al., 2002). A potential mechanism has been recently proposed by Valacchi and coll. who report that the inhibition of TNFα-induced activation by acrolein could be due to the modification of IKK beta-subunit by acrolein (Valacchi et al. 2005). In contrast, aldehydes may induce inflammation via an activation of NFκB, as shown for 4-HHE which activates NFkB via the IκB kinase (IKK)/NF-κB inducing kinase (NIK) pathway. This mechanism involves an upstream activation of p38 MAPK and ERK1/2 kinase (Je et al. 2004).

- Apoptosis signalling Elevated concentrations of 4-HNE or acrolein (> 20 µM) are highly toxic for most cell types. The mechanism of apoptosis elicited by ALE precursors involves various effects, including signalling or protein modification. The activation of JNK has been particularly investigated in the antiproliferative and apoptotic effect of 4-HNE (Yang et al. 2003). This JNK pathway plays a major role in the cooperative apoptotic effect of TGFβ-1 and 4-HNE on

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colon cancer cell lines (Biasi et al. 2006). Both acrolein and 4-HNE increase the levels of the phosphorylated form of transcription factors c-jun (which promotes apoptosis) and CREB (involved in survival), but decrease the activity of the CREB-responsive promoters (while increasing c-jun responsive promoter), which contributes to neuron degeneration and apoptosis (Pugazhenthi et al. 2006). Methylglyoxal and glyoxal are pro-apoptotic through mechanisms involving calcium deregulation (Jan et al. 2005), GSH depletion, oxidative stress and the activation of stress kinases p38 and JNK (Shangary et al. 2003; Catalan et al. 2005; Fukunaga et al. 2005; Chan et al. 2007). 4-HNE increases the mRNA and protein expression of the pro-apoptotic adaptors/regulators FasR, FasL, Bax, and caspases -1, -2, -3 and -8 (Choudhary et al. 2002; de Villiers et al. 2007). In human lens cultured cells (HLE B-3), 4-HNE adducts are correlated with the induction of Fas, the activation of JNK and caspase 3, while the transfection of the alpha-class glutathione S-transferase mGSTA4a (which neutralizes 4-HNE), inhibits Fas expression (Cheng et al. 2001). The mechanism of cell death evoked by these aldehydes could also involve the generation of peroxynitrite (ONOO-), as reported for 4-HHE (Lee et al. 2004a) and for methylglyoxal (de Arriba et al. 2006). 4-HNE impairs the mitochondrial function, via the alteration of GSH metabolism and the induction of massive mitochondrial oxidative stress (Lee et al. 2006; Raza and John 2006). More specifically, moderately elevated concentrations of 4-HNE or very low doses of 4-HHE, trigger a calcium-mediated induction of the mitochondrial transition pore (Kristal et al. 1996). In addition, in vitro experiments on isolated mitochondria or reconstituted models for the adenine nucleotide translocator (ANT) pre-treated with 4-HNE or 4-HHE, indicate that the modification of ANT by these aldehydes impairs its function and activity (Chen et al. 1995). Lastly, 4-HNE alters mitochondrial calcium uptake and cytosolic calcium homeostasis, which results in necrosis or apoptosis. This mechanism is involved in neuronal cell death (Kruman and Mattson 1999).

ALEs and ALE precursors in ageing and diseases. Considerable evidence suggests the involvement for ALEs in ageing and age-related diseases. Ageing process is associated with an imbalance between increased oxidative stress

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and progressive decrease in antioxidant defences, as well as the accumulation of modified proteins, due to increased protein damage and/or decreased degradation by proteasome (Friguet 2006). More than simple markers of lipid peroxidation, ALEs may participate in initiation and progression of diseases, including cardiovascular diseases, diabetes, cancer, inflammatory and neurodegenerative disorders.

- ALEs in cardiovascular and related diseases. The oxidative theory of atherosclerosis proposed by Steinberg 25 years ago postulates that 4-HNE and MDA-modified LDLs are directly involved in the mechanisms of fatty streak formation, an early step of atherogenesis (Steinberg 1997). The detection of 4-HNE- and MDA-adducts and oxLDLs within the plaque is an hallmark in atherosclerosis (Palinski et al. 1989; Torzewski et al. 1998). The presence of auto-antibodies recognizing MDA-modified LDLs has been reported in the plasma, but their role on the development of atherosclerosis is debated (Fredrikson et al. 2006). Nonetheless, the detection in human plasma and atherosclerotic lesions, of auto-antibodies directed against 4-HNE or MDA-modified LDLs, is considered as a marker of evolution for vascular atherosclerotic process (Tsimikas 2006). Circulating modified LDLs constitute new and suitable prognostic indicators of cardiovascular diseases, e.g. acute coronary syndromes, vulnerable plaques, preclinical or accelerated atherosclerosis and chronic renal failure in diabetes (Makita et al. 1996; Fraley and Tsimikas 2006). Chronic renal failure complications including renal toxicity, ischemia/reperfusion and myocardial injury, result in a massive oxidative stress and the generation of MDA and 4-HNE, that deplete antioxidants defences, modify enzyme function and mitochondrial respiration by forming adducts on proteins (Siems et al. 2002). The presence of MDA and 4-HNE-adducts in dialyzed patients is considered as an additional risk factor for cardiovascular complications (Carluccio et al. 2002; Usberti et al. 2002). Coronary heart diseases and stroke due to accelerated atherosclerosis are the principal cause of mortality in diabetes. LDL modification by AGE- and ALE-precursors is detected in the plasma of diabetic patients (Makita et al. 1996) and is thought to play a role in the development and progression of accelerated atherosclerosis in diabetes. Moreover, diabetic cataract is associated to increased deposition of AGEs/ALEs-modified proteins in lens. The

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deposition of 4-HNE and MDA-adducts in the lens of aged rats or submitted to high oxidative stress is directly correlated to the apoptosis of lens cells and cataract formation (Marsili et al. 2004). At last, 4-HNE could contribute to the mechanisms of obesity and insulin resistance, via the modification of adipose regulatory proteins (e.g. adipocyte fatty acid-binding protein) (Grimsrud et al. 2007).

- Neurodegenerative diseases Increasing evidences suggest that oxidative stress is involved in the pathogenesis of neurodegenerative diseases, including Alzheimer (Lovell and Markesbery 2006), Parkinson (Jenner 2003), Creutzfeld-Jacob and prion diseases (Brown 2005). It is likely that the mechanisms involved in neurodegeneration are multiple, and it is not clear so far if oxidative stress is cause or consequence of the neuronal death, as it may occur during apoptosis and in the early steps or in advanced stages of the disease. Moreover, the detection of aldehyde- adducts in the brain of neurodegenerative diseases strongly suggests the occurrence of an oxidative stress during brain degeneration (Zarkovic 2003). In Alzheimer disease, amyloid beta-peptide induces an oxidative stress which results in the formation of 4-HNE and acrolein-adducts and the accumulation of modified proteins (Sayre et al. 1997; Smith et al. 1998; Butterfield 2002). 4-HNE forms adducts on lysine residues of proteins of axonal neurofilaments (Wataya et al. 2002) and induces a dysfunction of membrane calcium-ATPases, and of glucose and glutamate transporters, which increases calcium influx, disrupts the synaptic calcium homeostasis and finally leads to apoptosis (Mattson and Chan 2003). In Parkinson disease, the oxidative stress contributes to mitochondrial dysfunction and degeneration of dopaminergic cells (Jenner 2003). 4-HNE is formed during the lipid peroxidation process and reacts with proteins of the nigral neurons (Yoritaka et al. 1996). In addition, 4-HNE- and peroxynitrite-induced modification of proteins, associated with the defect of the ubiquitin-proteasome system, leads to the accumulation of modified proteins and contributes to neuronal cell death (Jenner 2003). The neurodegenerative process in prion diseases may result, at least in part, from a defect in antioxidant function of the mutant form of prion protein (Brown 2005). 4-HNE is generated

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in brains of human patients affected with Creutzfeldt-Jakob disease, and in scrapie-infected mice. 4-HNE adducts are detected in astrocytes, not in neurons, and their role in the progression of the prion disease is not elucidated so far (Andreoletti et al. 2002).

- Cancer The role of lipid peroxidation in cancer is debated because, in the majority of tumours, the lipid composition of membrane is modified, with decreased PUFA level, and increased cholesterol content. Moreover, an increase in antioxidants and antioxidant defences is often observed, thus indicating that lipid peroxidation could be reduced in these diseases (Dianzani 1989). In addition, in vivo studies on human colon adenocarcinoma show a reduced expression of TGFβ-1 correlated with a decrease in 4-HNE-protein adducts. This could mean that neoplastic progression is better under these conditions, since TGFβ-1 and 4-HNE cooperate for inducing the apoptosis of colon cell via activation of the JNK pathway (Biasi et al. 2006). On the other hand, 4-HNE itself is mutagenic (it can form adducts on guanine), and carcinogenic for hepatocytes (Weber et al. 2003). Low 4-HNE concentrations trigger proliferative and inflammatory responses which could play a role in tumour growth, this being supported by the detection of 4-HNE adducts in various tumor cells (Dianzani 1989). Moreover, high heam-iron intake (reproduced by high meat intake), is associated to lipid peroxidation and 4-HNE generation, potentially involved in the promotion of colon cancer carcinogenesis (Pierre et al. 2007). The same authors propose the detection of an urinary metabolite of 4-HNE, the dihydroxynonane mercapturic acid (DHN-MA), as a new biomarker suitable for the determination of pre-neoplasic lesions (Pierre et al. 2006).

- Chronic inflammatory diseases MDA- and 4-HNE adducts are detected in osteoarthritic synovial cartilage (Shah et al. 2005), and contribute to cartilage degradation, by modifying type II collagen, which increases its degradation by metalloprotease MMP13 (Morquette et al. 2006). Moreover, 4-HNE alters osteoarthritic osteoblast activity by triggering diverse cellular responses such as increased osteocalcin and type I collagen synthesis, inhibition of alkaline phosphatase activity,

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induction of COX-2 expression and prostaglandin E2 release (Shi et al. 2006). Protein oxidation is involved in the pathogenesis of Systemic Lupus Erythematosus (Morgan et al. 2005), and the detection of 4-HNE-modified proteins in the plasma of the affected patients has been proposed as a marker for the evolution of this disease (Grune et al. 1997). Oxidative stress and lipid peroxidation contribute to the pathogenesis of asthma, acute lung inflammation, and allergic airway inflammation (Boldogh et al. 2005; Castro et al. 2006). In these diseases, the exact role of 4-HNE is not yet established and its targets are not identified, but the overexpression of heme-oxygenase reduces oxidative stress, 4-HNE- adducts formation and the progression of inflammation (Almolki et al. 2004). Increased MDA- and 4-HNE protein adducts, correlated with decreased levels of GSH and antioxidants vitamin E and C, is a constant observation in chronic viral and alcoholic hepatitis (Loguercio and Federico 2003). Conversely, the reduced expression of GST in bile duct leads to the accumulation of 4-HNE, and contributes to the pathogenic process of primary biliary cirrhosis (Tsuneyama et al. 2002).

Pharmacological inhibitors of ALE formation The pharmacological inhibition of ALE formation involves several approaches including the use of transition metal chelators and antioxidants, which block oxidative stress, lipid peroxidation, and the generation of aldehydes, and the use of carbonyl scavengers, which interact more specifically with aldehydes and neutralize the formation of adducts. Most studies have been focused on AGE inhibitors, as recently reviewed by (Peyroux and Sternberg 2006), whereas ALE inhibitors have been less investigated so far. Although most inhibitors efficient on AGE formation may potentially inhibit ALE formation (Baynes and Thorpe 2000), this review is focused on the main pharmacological agents, which have been reported to neutralize ALE precursors generated from lipid peroxidation.

- Hydrazine derivatives

Hydrazine (N2H4), is widely used in chemical synthesis as it condensates rapidly with the carbonyl group of ketone or aldehyde to form a methylene or methyl group via a hydrazone intermediate.

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Dinitrophenylhydrazine (DNPH) is a hydrazine derivative largely utilized for the quantitative detection of carbonyl groups (particularly 4-HNE) in tissues and biological fluids, using HPLC and spectrophotometric methods or for immunohistochemistry and western- blotting using DNPH labelled antibodies (Waeg et al. 1996). DNPH reacts with aldehydes at acidic pH, which facilitates the rupture of the covalent bond aldehyde-protein, and the binding of aldehyde on hydrazine, forming dinitrophenylhydrazones (Puhl et al. 1994). DNPH prevents in vitro the formation and the accumulation of acrolein- and 4-HNE-adducts on cellular proteins from cultured vascular cells, as well as the cytotoxicity of oxLDLs (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). Anyway, the use of DNPH for in vivo trials in animals is limited because of its high mutagenic and toxic properties (Brooke I 1997).

Hydralazine (1-hydrazinophthalazine monohydrochloride) is a hydrazine derivative used as antihypertensive, and regarded for years as a drug of choice for the treatment of severe hypertension in pregnancy (Montan 2004). Hydralazine and dihydralazine are efficient in trapping aldehyde-adducted proteins. It is particularly efficient in trapping acrolein, resulting in a strong protection against acrolein-induced hepatotoxicity (Burcham et al. 2000; Burcham et al. 2002; Kaminskas et al. 2004). Hydralazine traps 4-HNE adducts formed in smooth muscle cells in presence of oxLDL, particularly on PDGF receptor, which reverses the inhibition of PDGF signalling (Vindis et al. 2006). Hydralazine reverses in vivo the formation of 4-HNE- and acrolein-adducts on tissue proteins, particularly the modification of PDGFR in atherosclerotic aortas of hypercholesterolemic rabbits and of apoE-/- mice. This protective effect could contribute to slow down the atherosclerotic process (Escargueil-Blanc et al. 2001; Vindis et al. 2006). Hydralazine inhibits the modification of LDL induced by glyoxal and methylglyoxal, and prevents the formation and accumulation of foam cells (Brown et al. 2006), as well as renal damage in type 2 diabetes animal models (Nangaku et al. 2003). Hydralazine is a powerful antioxidant which inhibits the activation of NADH oxidase at the plasma membrane and the subsequent generation of reactive oxygen species (Munzel et al. 1996).

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Aminoguanidine (hydrazinecarboximidamide) is an early-stage inhibitor of AGE generation, and one of the most efficient drugs able to prevent proteins cross-linking induced by AGE precursors. Aminoguanidine reacts in vitro and in vivo with the α-oxoaldehydes methylglyoxal and glyoxal and ALE precursors (MDA) to form 3-amino-1,2,4-triazine derivatives (Thornalley et al. 2000). It is a highly nucleophilic agent which reacts rapidly with glucose and pyruvate, but also with pyridoxal phosphate, thereby decreasing the availability of vitamin B6 (Chen et al. 2003). Pyridoxal-aminoguanidine, a Schiff base formed between pyridoxal and aminoguanidine, prevents the decrease in pyridoxal phosphate, without altering and rather enhancing the carbonyl scavenger activities of aminoguanidine (Chen et al. 2003; Chen et al. 2004a). Most beneficial effects of aminoguanidine are related to its carbonyl scavenger properties which protect in vitro and in vivo, against the deleterious effects of AGE and ALE precursors (Peyroux and Sternberg 2006). Aminoguanidine has been proved efficient in experimental animal models for diabetes, in inhibiting pathological complications, such as nephropathies (prevention of albuminuria, glomerulonephritis), accelerated atherosclerosis (inhibition of lipid peroxidation), cataract (inhibition of AGE-deposition in lens), neurovascular complications (Peyroux and Sternberg 2006). In addition, the protective effect of aminoguanidine is largely due to its antioxidant and chelating properties (Price et al. 2001). For instance, aminoguanidine reduces the expression of growth factors TGF-β1 and PDGF-β and of proinflammatory cytokines (TNF-α) (Peyroux and Sternberg 2006), probably by preventing oxidative stress and NFκB activation. Aminoguanidine inhibits the activity of the inducible iNOS, which is up-regulated in diabetes and generates high NO levels leading to peroxinitrite generation and endothelial dysfunction (Bardell and MacLeod 2001). Conversely, aminoguanidine inhibits the semicarbazide- sensitive oxidase (SSAO) which contributes to the generation of methylglyoxal and formaldehyde in diabetes (Yu and Zuo 1997). Like hydralazine, aminoguanidine blocks the modification of LDL induced by methylglyoxal and MDA, thereby preventing their metabolic deviation towards macrophages (Brown et al. 2006). This protective effect (inhibition of apoB carbonylation) could result from its antioxidant properties, in addition to the carbonyl- scavenger activity (Jedidi et al. 2003).

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Because aminoguanidine exhibits extensive beneficial effect in pre-clinical studies in experimental animal models for diabetes, several clinical trials in humans have been designed for evaluating its efficiency to slow down the progression of diabetes complications. These studies were not found conclusive, in part because of side-effects, and of weak carbonyl scavenger effects in human vascular tissues (Bolton et al. 2004).

OPB-9195 [(+/-)-2-isopropylidenehydrazono-4-oxo-thiazolidin-5-yla cetanilide] (Miyata et al. 2000) is a hydrazine derivative which inhibits the formation of AGEs (pentosidine and CML) in the plasma of uremic and diabetic patients (Miyata et al., 2000). OPB-9195 is more efficient than aminoguanidine for trapping 4-HNE and MDA from arachidonate oxidation (Miyata et al. 2000). As for aminoguanidine, clinical trials were not conclusive and were stopped because of the side-effects of this compound, particularly pyridoxal depletion which resulted in vitamin B6 deficiency (Peyroux and Sternberg 2006).

- Vitamine B6 derivatives Vitamin B6 exhibits antioxidant properties as it participates in the maintenance of reduced glutathione, which is a major antioxidant and a natural ALE precursor scavenger. Vitamin B6 acts as a cofactor in the synthesis of cysteine (the rate limiting precursor for glutathione biosynthesis) (Grimble 1997). Deficiency or low levels in vitamin B6 result in an increased homocysteine level and oxidative stress potentially involved in accelerated atherosclerosis in vitamin B6-deficient rats (Endo et al. 2006).

Pyridoxamine is one of the three natural forms of vitamin B6 (with pyridoxal and pyridoxine). Pyridoxamine prevents the formation of AGEs such as CML and CEL, and is a potent inhibitor of lysine modification by 4-HNE and MDA generated during LDL oxidation by copper (Onorato et al. 2000). It is a potent MDA-scavenger, which also blocks the accumulation of the fluorescent MDA-related pigment, lipofuscin (Kang et al. 2006). Pyridoxamine inhibits NO-mediated apoptosis of insulin secreting RINm5F cells, which occurs via the formation of ALE precursors (e.g. MDA) (Cahuana et al. 2003). Moreover pyridoxamine has a lipid-lowering effect and protects against the development of nephropathy, neuropathy and vaculopathy in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats. Like

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aminoguanidine, pyridoxamine represents a potentially useful agent for the treatment of diseases involving hyperlipemia and oxidative stress (Voziyan and Hudson 2005).

Pyridoxal isonicotinoyl hydrazones. These classes of agents exhibit potent chelating properties against iron and block iron-induced oxidative stress and lipid peroxidation, in particular MDA formation. Their use is reserved to iron overload diseases and neurodegenerative disorders (Whitnall and Richardson 2006).

- Amino acid derivatives Carnosine (beta-alanyl-L-histidine) is a dipeptide of beta-alanine and histidine, exhibiting antioxidant and carbonyl scavenger properties. Carnosine blocks the formation of MDA- and MGO-adducts in in vitro experimental models for lipid peroxidation and MDA-induced cytotoxicity in cultured brain endothelial cells (Hipkiss et al. 1997). At the cellular level, carnosine protected cultured human fibroblasts and rat brain endothelial cells against the toxic effects of MDA, and AGEs. Interestingly, carnosine protects against amyloid peptide toxicity and DNA-protein cross-linking in neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease, cardiovascular ischemic damages, and inflammatory diseases (Guiotto et al. 2005).

Histidyl hydrazide is a histidine analogue which selectively scavenges 4-HNE, and reduces the 4-HNE-induced apoptosis of cultured neurons, chemical hypoxia and glucose deprivation. This drug could be of interest in the treatment of related neurodegenerative diseases and 4- HNE associated pathologies (Tang et al. 2007).

N-acetyl cysteine (NAC) exhibits highly protective scavenging properties against 4-HNE and MDA. NAC pre-treatment protects against MDA increase and GSH decrease in an animal model for Alzheimer (Fu et al. 2006), and prevents accelerated atherosclerosis in uremic apoE-/- mice (Ivanovski et al. 2005), as well as neuronal injury (Arakawa et al, 2007).

S-Adenosylmethionine is more potent than N-acetyl cysteine for inhibiting 4-HNE adduct formation, and prevents efficiently hepatic toxicity induced by acetaminophen, which involves oxidative stress and lipid peroxidation (Valentovic et al. 2004).

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- Other therapeutic agents exhibiting protection against ALE formation Angiotensin converting enzyme inhibitors. Angiotensin converting enzyme inhibitors exhibit antioxidant properties and block LDL oxidation, lipid peroxidation and the generation of MDA and 4-HNE (Hayek et al. 1999). ACE inhibitors (Captopril, Enalapril, Fosinopril) exhibit a potent antiatherogenic effect in apoE-/- mice, due not only to blood pressure reduction but also to their protective effect against LDL oxidation (Hayek et al. 1998; Hayek et al. 1999). Moreover, a direct MDA-scavenging effect has been reported for Captopril (Altuntas et al. 1995).

AT1 angiotensin receptor inhibitors (Losartan, Candesartan), inhibit the formation of circulating MDA-modified LDLs in human diabetic patients and the modification by MDA of lungs in rats affected with bleomycin-induced pulmonary fibrosis (Yao et al. 2006).

Antioxidants are efficient in preventing lipid peroxidation, thus the formation of ALEs on proteins. Among natural antioxidants involved in the detoxification of ALE precursors, glutathione (GSH, Glu-Cys-Gly), exhibits a high reactivity for 4-HNE and is essential for maintaining antioxidants in an active state (α-tocopherol), and for protecting the cell against oxidative stress mediated by ROS (Petersen and Doorn,2004). Though GSH can react spontaneously with 4-HNE via Michael addition, the reaction is much more rapid via the conjugation process catalyzed by glutathione-S-transferase (EC 2.5.1.18; GST), the highest activity being exhibited by GST A4-4 and GST 5.8 (Petersen and Doorn, 2004; Hubatsch et al, 1998). The conjugation catalyzed by GSTs transforms 4-HNE into a glutathione conjugate, thus decreases GSH intracellular concentration, while GSTs may also limit 4-HNE generation by reducing hydroperoxide formed during lipid peroxidation (Awasthi et al., 2004). GST4 activity is reduced in obese mice, which is correlated with the modification by 4-HNE of a fatty acid binding protein on cysteine, thus supporting the existence of links between oxidative stress and insulin resistance (Grimsrud et al, 2007). Interestingly, low doses of 4- HNE can induce the expression of the glutamate-cysteine ligase (GCL, a rate-limiting enzyme in GSH biosynthesis), through a mechanism implying the EpRE-Nrf2 signalling pathway (Zhang et al, 2007).

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Pre-treatment of neurons with high NAC concentrations prevents 4-HNE-induced neuronal death, and suppresses the decrease in intracellular levels of GSH and sulfhydryl groups induced by 4-HNE. Lower NAC concentrations, potentiated the protective effect of the seleno-organic glutathione peroxidase mimetic Ebselen (Arakawa et al, 2007), though Ebselen itself prevents the generation of 4-HNE adducts formed during cerebral ischemia (Imai et al, 2003), or alcohol induced liver injury (Konno et al, 2001). These data are interesting as they propose a dual protective mechanism for these drugs via i/ their carbonyl scavenger effect against ALE precursors (4-HNE), and ii/ the maintenance of an efficient level in natural intracellular antioxidants (GSH), and the natural protection of the cells against oxidative stress. However, antioxidants cannot neutralize the effects of ALE precursors once adducts are formed. For instance, trolox and phenolic acids cannot protect against the modification of TKRs induced by 4-HNE (Suc et al. 1997; Escargueil-Blanc et al. 2001). In vivo studies indicate that the protective effect of antioxidants on the formation of 4-HNE, MDA or acrolein in atherosclerotic plaques or in neurodegenerative diseases is variable, while agents efficient in vitro or in pre-clinical studies, fail to protect significantly once tested in human patients (Peyroux and Sternberg 2006). U-101033E (2,4-diaminopyrrolopyrimidine) is highly efficient in inhibiting 4-HNE or MDA generation (Rohn et al. 1998), but its inhibitory effect on ALE formation has not been studied in vivo. Vitamin E failed to protect humans from cardiovascular disease outcome and its antiatherogenic effect in apoE-/- is controversial (Suarna et al. 2006). Pyrrolidine dithiocarbamate blocks efficiently lipid peroxidation (MDA) in chronic inflammation (collagen-induced arthritis) (Cuzzocrea et al. 2002) and cerulein- induced pancreatitis (Virlos et al. 2003). Polyphenols reduce hyperlipemia and inhibit lipid peroxidation and atherosclerosis development in diabetic LDL receptor KO mice (Fuhrman et al. 2005; Zang et al. 2006). Resveratrol, a red wine polyphenol, exhibits protective properties against lipid peroxidation and ALE formation in experimental models for numerous diseases including atherosclerosis, diabetes and Alzheimer diseases (Anekonda 2006). However most agents were not tested in human patients and any correlation between their protective effect on ALE generation and the progression of the disease remains speculative.

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Conclusion ALEs are formed in a large variety of diseases and represent a suitable marker of lipid peroxidation. Their deleterious effect on proteins and their own signalling properties suggest that ALEs also contribute to initiate several diseases or aggravate their severity. Obviously, the early inhibition of lipid peroxidation and ALE formation by antioxidants blocks efficiently atherogenesis in animal models, whereas antioxidants fail to protect on more advanced states and in therapeutic human trials. Studies using AGE/ALE-precursor scavengers on the progression of diabetes complications were not conclusive in humans, and led to variable conclusions in animals. The effect of drugs like hydralazine on cardiovascular, inflammatory or neurodegenerative diseases has not been investigated in humans, thus it is not known if ALE-precursor scavengers could be beneficial or not on the late steps of ALEs-associated diseases. The synthesis and development of new drugs sharing both potent antioxidant and carbonyl scavenger properties should allow i/ to better understand the implication of ALEs in the advanced steps of diseases, ii/ to better evaluate the potential therapeutic interest of this class of carbonyl scavengers. The new therapeutical perspectives of these new drugs will also depend on their influence on natural cellular antioxidants and their ability to protect or regenerate their protective effect against oxidative stress.

Acknowledgements This work was supported by grants from INSERM, Université Paul Sabatier-Toulouse III, Agence Nationale de la Recherche (ANR-05-PCOD-019-01-LiSA) and Groupement Lipides et Nutrition. C. Coatrieux is the recipient of a fellowship from MENRT and Fondation pour la Recherche Médicale

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Title: Monoamine oxidases and atherosclerosis: mitogenic signalling and in vivo study

Summary Reactive oxygen species (ROS) are involved in the activation of pathways, such as cell proliferation and involved in the development of many diseases including atherosclerosis. Monoamine oxidases (MAOs) catalyze the oxidative deamination of biogenic amines, such as serotonin and tyramine. The degradation of biogenic amines by MAOs generates large amounts of ROS that may play a role in the signaling of these agents like cell proliferation. ROS generated by MAO-A activate a mitogenic pathway, the MMP2/sphingolipids pathway, involved in smooth muscle cell proliferation. This signalling is mimicked by exogenous hydrogen peroxide. Furthermore, we report preliminary data on the mechanisms involved upstream the activation of MMP2 (which implicates furin and MT1-MMP). Lastly, the protective effect of MAO inhibitors was evaluated on an animal model for atherosclerosis, apoE-/- mice. This study indicated that hydrazinic MAO inhibitors were efficient in inhibiting the development of atherosclerotic lesions in apoE -/- mice, because of carbonyl scavenger properties and not due to their IMAO effect ; a non hydrazinic IMAO wasn’t as protective. These data indicate that MAO-dependent oxidative stress is not involved in the formation of early atherosclerotic lesions, which doesn’t exclude a role in advanced lesions. In conclusion, this work demonstrates a role of MAO-dependent oxidative stress in SMC proliferation, via a new stress-induced signalling mechanism, the MMP2/sphingolipid pathway.

Key words Monoamine oxidase, oxidative stress, proliferation, mitogenic signalling, in vivo, atherosclerosis.

Monoamine Oxydases et athérosclérose : signalisation mitogène et études in vivo Thèse de Sciences (Ecole doctorale Biologie/Santé/Biotechnologies, spécialité Innovation Pharmacologique, soutenue par Christelle Coatrieux, le 8 octobre 2007, à la Salle des thèses de Médecine de Rangueil (Toulouse III). Directeur de thèse : Angelo Parini et Anne Negre-Salvayre

Résumé Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) activent de nombreuses voies de signalisation cellulaires, comme la prolifération et sont impliquées dans l’athérosclérose. Les monoamine oxydases (MAOs), dégradent les amines biogènes, libérant des ROS. Elles jouent un rôle dans la prolifération cellulaire ou l’apoptose par le stress oxydant qu’elles génèrent. Ce travail a montré que la MAO-A, en générant des ROS, active une voie de signalisation mitogène particulière : la voie MMP2/sphingolipides, et contribue à la prolifération de cellules musculaire lisses vasculaires. Cet effet a été mimé par l’utilisation de peroxyde d’hydrogène exogène, et a décrit plus spécifiquement les étapes en amont de l’activation de MMP2, ainsi que l’activation par la MMP2 de la sphingomyélinase neutre. Enfin, une étude a été menée in vivo sur un modèle murin d’athérosclérose (ApoE -/-), visant à étudier le rôle protecteur de différents inhibiteurs de MAOs (IMAO), dont certains piègent les carbonyles. Cette étude montre un effet protecteur des piégeurs de carbonyles, et un faible effet de l’IMAO seul, dans la formation des lésions vasculaires primaires. En conclusion, ce travail a montré une implication du stress oxydant, et particulièrement des MAOs dans la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires. Il a permis de mieux décrire l’interaction MMP2-sphingomyélinase neutre ainsi que la voie de signalisation activée en amont de MMP2. Enfin, bien que l’étude visant à montrer l’effet athéroprotecteur d’un IMAO sur lésion primaires n’ait pas montré d’efficacité, ceci n’exclut pas un rôle des MAOs dans la formation des lésions avancées.

Mots-clé Monoamine oxydase, stress oxydant, prolifération, signalisation mitogène, in vivo, athérosclérose.

INSERM U858 equipes 6/10, IFR31, CHU Rangueil, Bât. L3, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex4