“Júlio De Mesquita Filho” Campus De Botucatu Instituto De Biociencias Departamento De Morfología
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Universidad Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus de Botucatu Instituto de Biociencias Departamento de Morfología Análisis Morfométrico, Merístico, Filogenético y Filogeográfico del Caballo de Mar Hippocampus reidi (Ginsburg 1933) (Teleostei: Syngnathidae) de la costa nororiental de Venezuela. ERNESTO JOSE RON ESTEVES Tesis presentada ante el curso de Post Grado del Instituto de Biociencias para la obtención del Título de Doctor en Ciencias Biológicas. Orientador: Dr. Claudio de Oliveira Agosto, 2010 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS Ron Esteves, Ernesto José Análisis Morfométrico, Merístico y Filogeográfico del Caballo de Mar Hippocampus reidi (Ginsburg 1933) (Teleostei: Syngnathidae) de la costa nororiental de Venezuela. / Ernesto José Ron Esteves. – Botucatu : [s.n.], 2010. Tese (Doutorado)–Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu 2010. Orientador: Dr. Claudio de Oliveira Assunto 1. Peixe Marinho – Filogeografia 2. Peixe - Genética 3. Ecologia molecular CDD Palavras-chave: Filogeografia; Morfometria, DNA mitocondrial; Ecologia molecular; Syngnathiformes, Syngnathidae. Página | II Página | III “Sorprenderse, extrañarse, es comenzar a entender” (J. Ortega y Gasset) Página | IV Dedico este trabajo a Camilo Andrés y Luis Martin… Mis hijos Andrés Alejandro y Juan Diego… Mis sobrinos Diana y Elena… Mis sobrinas Niños de hoy y adultos del mañana, herederos del linaje de origen monofilético que constituye mi familia, sin cuyas sonrisas, sueños y esperanzas, en esta sociedad marcadamente estructurada, este trabajo quizás no tendría sentido… Página | V AGRADECIMENTOS Al mar y su naturaleza, por acompañarme todos los días de mi vida. A Lilia Esteves, mi mamá, por apoyarme en todas las aventuras e historias que he emprendido desde que salí de su vientre. A mi súper familia, Jennifer, Luis Martin, Camilo y Reina, por brindarme su apoyo sin restricciones en todas las etapas de mi formación profesional. A mi orientador y amigo el Profesor Claudio de Oliveira, por su confianza al brindarme la oportunidad de hacer este sueño realidad, sin sus profesionales orientaciones y sus enseñanzas este trabajo no habría sido posible. A mi amigo, padre académico y hoy compañero de estudios, Profesor Mauro Nirchio, por su desinteresado apoyo y estimulo constante para seguir creciendo como profesional en el interesante mundo de las ciencias. A mi estudiante, hoy colega y compañera de proyectos Mariana Padrón, por haberme invitado a transitar el camino de los caballitos de mar, gracias por tu confianza. A los compañeros del II Taller sobre Genética de la Conservación, donde se iniciaron las primeras discusiones sobre la posibilidad de esta investigación. Al Profesor y amigo Juan Ignacio Gaviria por su apoyo constante y continuas reflexiones sobre el quehacer universitario. Al Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente por su continuo apoyo financiero; y a todos sus miembros, que desde sus diferentes puestos de trabajo no dejaron de motivarme y alentarme para cumplir esta importante meta. Al Fondo IEA (Iniciativa de Especies Amenazadas) y PROVITA, por el apoyo financiero que permitió realizar parte del trabajo de campo durante los proyectos de monitoreo de las poblaciones de Hippocampus, realizados en las Lagunas de la Restinga y las Marites. A los Profesores Fausto Foresti, Cesar Martins, Adrianne Pinto Wasko, Eli Poulin, Roberto Cipriani, Luis Miguel Márquez por sus certeras orientaciones e incentivos. Página | VI A Guilherme “o vengador justiciero” por su confianza y apoyo en aquellos meses decisivos, en los que alejado mi familia pude trabajar en la obtención de estos resultados. A los amigos y compañeros del “Laboratório de Biologia y Genética de Peixes”: Konrado, Andréia Poletto, Carlos, Daniela, Kelly, Juliana, Irani, Guilherme (Cabelos), Andréia Alves, Tatiane, Marcio, Alex, Kátia, Fernanda Alves, Juliano, Gleisy, Tatiana, Lessandra, Victor, Jefferson, Fábio, Prof. Celso, Wellcy, Patrícia, Lígia, Waldo, Karina, Luciana, Marisa, Luis, Emanuel, Ricardo, Marlon, Ze, Heraldo y Markos (el griego), así como a aquellos que sin querer olvide incluir, por brindarme su cálida amistad y hacer de mis estadías en Brasil, mucho más que un curso de postgrado. A los funcionarios de la “Pós-graduação”: Luciene, Maria Helena e Sergio, por su paciencia, amistad y rapidez en las solicitudes. Al personal del Departamento de Morfología, de la UNESP, Botucatu. A los compañeros y amigos de la cotidianidad en nuestra Escuela de Ciencias Aplicadas del Mar: Montserrat, Nayive, Gabriela, Fabiola, Lorelys, Sara, Yuraima, Rodolfo, Edlin, Jose Patti, Marilina Vásquez, Edoglis, Régulo López padre (tortuguita), José Marcano, Régulo hijo, Alexis Marcano, Juancito, Beto, Wicho, Alexander…… A la comunidad pesquera de las Marites y la Restinga, por su receptividad en los muestreos y en especial a Pancho, Cabeza e Iguana y Chicho. Al Lic. Bladimir Gómez y a la Dra. Carmen Alfonsi, por facilitarme la utilización de los ejemplares de sus investigaciones de campo para la adquisición de las muestras del Golfo de Cariaco. A Henio y Gim por facilitar el acceso a las muestras de Maracaibo. Al Instituto de Biociencias de la Universidade Estadual Paulista de Botucatu y a la Escuela de Ciencias Aplicadas del Mar de la Universidad de Oriente, por facilitar sus instalaciones para la realización de esta investigación. A mis estudiantes, sin cuyo apoyo y estímulo constante este esfuerzo no tendría sentido… A todos Uds… Mil gracias por su apoyo! Página | VII TABLA DE CONTENIDO Pág. I. RESUMEN XI II. ABSTRACT XIII III. LISTA DE TABLAS XV IV. LISTA DE FIGURAS XVII 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. El Género Hippocampus: Aspectos Taxonómicos y su Estatus de Conservación 1 1.2. Marcadores Moleculares y ADN Mitocondrial 9 1.3. Estructura Poblacional y Variabilidad Genética 16 2. OBJETIVOS 27 3. MATERIALES Y MÉTODOS 28 3.1. Ubicación de las Localidades de Procedencia de las Muestras 28 3.2. Colecta de las Muestras de Tejido 29 3.3. Identificación Taxonómica de las Especies del Género Hippocampus 29 3.4. Extracción de ADN 34 3.5. Electroforesis en Gel de Agarosa 36 3.6. Amplificación de los Fragmentos de los Genes Citocromo B y Citocromo Oxidasa I. 37 3.7. Verificación de las Reacciones de PCR 39 3.8. Purificación de los Productos de PCR para Secuenciación 39 3.9. Secuenciamiento de los Productos de PCR 39 Página | VIII 3.10 Análisis de los Datos 41 3.10.1 Análisis Merístico 41 3.10.2 Análisis Morfométrico 41 3.10.3 Análisis Morfológico 42 3.10.4 Análisis Filogenético 42 3.10.5 Análisis Poblacionales 44 4. RESULTADOS 51 4.1. Caracterización Taxonómica de las Especies 51 4.1.1. Análisis Merístico 51 4.1.2. Análisis Morfométrico 52 4.1.3. Análisis Morfológico 58 4.2. Diferenciación Molecular de las Especies 59 4.2.1. Caracterización de los Marcadores Moleculares 59 4.2.1.1. Citocromo Oxidasa I (COI) 59 4.2.1.2. Citocromo B (CYT B) 61 4.2.1.3. Partición COI+CYTB 63 4.2.2. Análisis Filogenético 65 4.2.2.1. Método de Neigbourg – Joining 65 4.2.2.2. Método de Máxima Parsimonia 66 4.2.2.3. Método de Máxima Probabilidad 67 4.2.3. Descripción de las Especies Estudiadas 70 4.3. Diversidad y Estructura Genética Poblacional 74 4.3.1. Diversidad Nucleotídica y Haplotípica 74 4.3.2. Análisis de Varianza Molecular 78 Página | IX 4.3.3. Comparaciones Inter - Poblacionales 79 4.3.4. Inferencia demográfica 82 4.3.5. Análisis de clados anidados 86 5. DISCUSIÓN 89 5.1 Caracterización Taxonómica de las Especies 89 5.2 Diferenciación Molecular de las Especies 93 5.3 Diversidad y Estructura Genética Poblacional 98 5.3.1 Diversidad Nucleotídica y Diversidad Haplotípica 98 5.3.2 Estructura Genética Poblacional 99 5.3.3 Inferencia Demográfica y Análisis de Clados Anidados 103 5.3.4 Consideraciones Taxonómicas y para la Conservación. 106 6. CONCLUSIONES 110 7. RECOMENDACIONES 112 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 113 9. ANEXOS 129 Página | X RESUMEN Fue realizado el análisis morfométrico, merístico, morfológico y filogenético del caballo de mar Hippocampus reidi (Ginsburg 1933) (Teleostei: Syngnathidae) de la costa nororiental de Venezuela, mediante la aplicación de técnicas de taxonomía convencional y molecular utilizando fragmentos secuenciados de los genes Citocromo Oxidasa I y Citocromo B como marcadores genéticos. Los resultados indican que no es posible identificar las diferentes entidades taxonómicas de la región caribeña venezolana con base solamente en un solo tipo de caracteres, por lo que es necesario utilizar información merística, morfológica y morfométrica de forma conjunta para la identificación de las mismas, lográndose identificar las variables longitud del rostro (SnL), ancho del cuerpo en la región torácica (TW9), longitud de la cabeza (HL), altura de la coroneta (CH), número de espinas supra oculares (ES) y posición de los anillos prominentes en vista dorsal, como caracteres diagnósticos a nivel específico. La aplicación de las técnicas moleculares fue de suma utilidad en la correcta identificación y separación de los individuos de las dos especies, resaltando la importancia e utilidad de los genes Citocromo Oxidasa I y Citocromo B como marcadores moleculares para estas especies. Adicionalmente, fue realizado un análisis genético poblacional bajo el enfoque filogeográfico, con la especie Hippocampus reidi que resultó ser la más abundante en las regiones de muestreo, con la finalidad de comparar la diversidad genética, con base en la información obtenida de secuencias del gen Citocromo B del ADN mitocondrial, para determinar la estructura geográfica y proponer una hipótesis filogeográfica que establezca las relaciones entre y dentro de las poblaciones del Mar Caribe (Laguna de la Restinga, Laguna de las Marites, Golfo de Cariaco y Golfo de Venezuela) y la localidad de Natal, Brasil, ubicada en el Océano Atlántico Sur Occidental. Los resultados de la diversidad nucleotídica y diversidad haplotípica, conjuntamente con la presencia de varios haplotipos únicos en cada una de las localidades, señalaron diferencias importantes entre las localidades de estudio.