ISSN 0373-580 X Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4): 265 - 275. 2003
ESTUDIOS EMBRIOLóGICOS EN LUMA APICULATA (MYRTACEAE)
A. FAIGÓN SOVERNA1, S. FRONTERA1y B. G. GALATI1
Summary: Embryological studies on Luma apiculata (Myrtaceae). The development of the sporangia, sporogenesis, and gametogenesis of Luma apiculata was studied. The anther wall comprises epider¬ mis, endothecium, two middle layers, and tapetum. The tapetum is of the secretory type and has binucleate cells. A tapetai membrane with Ubisch bodies is formed and persists until the opening of the anther. The microspore tetrads are tetrahedral, the pollen grains are tricolporate and are shed at 2-celled stage. The stigma is constituted by 1-celled papillae and the style is solid. The ovule is anacampylotropus, crassinucellate and bitegmic. Both integuments form a zig-zag micropyle. Megaspore tetrads are linear and the chalazal one develops into a Polygonum type of embryo sac. No abnormalities suggestive of any type of sterility or impediments to the sexual reproduction of L. apiculata have been observed during sporogenesis and gametogenesis.
Key words: pollen, Ubisch bodies, megagametophyte.
Resumen: En este trabajo se estudia la esporogénesis y la gametogénesis de Luma apiculata. La pared de la antera comprende epidermis, endotecio, dos capas medias y tapete. El tapete es de tipo secretor y sus células son binucleadas. Una membrana tapetai con cuerpos de Ubisch persiste hasta la apertura de la antera. Las tétrades de micrósporas son tetraédricas. Ei grano de polen es tricolporado, y se dispersa en estado bicelulár. El estigma está formado por papilas unicelulares y el estilo es de tipo sólido. Los óvulos son crasinucelados, anacampilótropos, bitegumentados, con micrópilo en zig-zag. La tétrade de megásporas tiene un arreglo lineal. La megáspora calazal da origen a un S E. tipo Polygonum. No se detectó ninguna anormalidad en los procesos de esporogénesis y gametogénesis que pueda sugerir algún tipo de esterilidad o impedimento para la reproducción sexual de L. apiculata.
Palabras clave: polen, cuerpos de Ubisch, megagametófito.
INTRODUCCIóN Algunos estudios hanrevelado anormalidades como: sacos embrionarios incompletos o no organizados, Luma apiculata (DC.) Burret es una especie óvulos estériles sin saco embrionario, células del arbórea a subarbórea, nativa del sur argentino que megagametófito con polaridad invertida y núcleos suele encontrarse formando bosques puros bastante polares supernumerarios (Roy, 1962; Prakash, 1973) extensos. Vulgarmente conocida como “arrayán” atrae El conocimiento de la biología reproductiva de especialmente la atenciónpor elcolor canela y lalisu¬ las especies vegetales es de gran utilidad e impor¬ ra de su corteza. tancia en la implementación de planes de manejo y Los trabajos embriológicos realizados hasta el conservación. Por esta razón, y debido a lo poco momento en la familia Myrtaceae son escasos y res¬ • que se conoce sobre este aspecto en L. apiculata, tringidos en su mayoría al género Eucalyptus y a se decidió encarar en esta especie un estudio em¬ otras especies paleotropicales (Johri et al. 1992). briológico que abarque los aspectos relativos a la pre- y post-fertilización. En esta primera etapa se 1 Laboratorio de Biología Reproductiva en Plantas ha realizado el análisis detallado de la Vasculares, Depto. Biodiversidad y Biología Experimental, esporogénesis, la gametogénesis y la ontogenia FCEyN, UBA, [email protected] de las estructuras esporofíticas relacionadas. Que-
265 Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4) 2003 da para una segunda etapa el estudio de la forma- ultrafinos para su observación al MET. A tal fin se ción de la Semilla y el fruto. contrastaronconacetato de uranilo y citrato deplomo (Reynolds) (O’Brien&Me Cully, 1981).
MATERIALES Y MéTODOS RESULTADOS Materialestudiado:ARGENTINA.Prov.Neuquén: Depto. Los Lagos, Villa La Angostura, Galati 380 Microsporangio (BAFC). La antera de L. apiculata es tetrasporangiada y Estudios al microscopio óptico (MO) condehiscencialongitudinal.Eltejido conectivo está bien desarrollado yposee células tánicas e idioblastos Los materiales fueron fijados en F.A.A. (formol, con drusas (Fig. 1 F). La pared de la antera joven alcohol y ácido acético). Capullos en distintos esta- consta de afuera hacia adentro de: epidermis, dios de desarrollo y flores en antesis se endotecio, 1 a 2 capas medias y tapete de tipo secre- deshidratararon en una serie ascendente de alcoho- tor (Fig. 1 A, B; 2 A-C). El origen de la pared les (alcohol etílico-xilol) y se incluyeronenparafina, corresponde al tipo básico (Davis, 1966), es decir, Se realizaron cortes micrométricos de 5 a 10 pm de una capa media tiene origen común con el tapete y espesor con micrótomo rotativo tipo Minot, los cua- otra con el endotecio. les fueron teñidos según la doble coloración En los primordios florales pequeños, las células Safranina-Fast Green (D’Ambrogio, 1986) y monta- que componen los 4 estratos de la pared tienen m dos luego en resina sintética. tamaño y aspecto semejantes; luego durante el Cortes micrométricos de pimpollos jóvenes se desarrollo van sufriendo transformaciones que le desparafinaron, se colorearonconuna solución acuo- confieren a cada estrato características particulares. samuydiluida de azul de algodón(0,05%) y se obser¬ Las células tapétales sonlasprimeras enaumentar varon euun microscopio de epifluorescencia para la de tamaño; son binucleadas y poseen un citoplasma detección de calosa(O’Brien&McCully, 1981;Rost, microvacuolado(Fig. 2 A). Cuando las células madres 1992). Se comprobó lapresencia de oxalato de calcio de los micrósporos (CMm) se rodean de calosa, el usando una solución acuosa de acetato cúprico a citoplasma de las células tapétales comienza a saturación(D’Ambrogio, 1986). consumirse en forma gradual, susnúcleos a obliterarse y al momento de la reducción meiótica las paredes Estudios al microscopio electrónico de barrido tangencial externa y radiales ya se han degradado (MEB) completamente (Fig. 1 B-C; 2 B, C, E). Comienza entonces a formarse una membrana tapetai con Delmaterial fijado enF.A.A. se separaron anteras; cuerpos de Ubisch (C U),la cual formauna suerte de se deshidrataron en una serie ascendente de bolsa que encierra a los granos depolen(Fig. 2F,G). acetonas, luego se secaron por medio de la técnica Las orbículas o CUson esféricos a sub-esféricos y en depunto crítico.Finalmente se montaronymetalizaron corte se observan sólidos, sinun corazón central y con la con oro-paladio para su observación al MEB. mismaelectrodensidadquelaexina(Fig.3 A;4C).Porotra parte reaccionan con los colorantes de la misma manera Estudios al microscopio electrónico de transmisión 9ue Ia esporopolenina de los granos de polen. (MET) Tanto las células de la epidermis como las del endotecio y de las capas medias crecen radial y Anteras maduras fueron fijadas en glutaraldehído tangéncialmente amedida quela antera vamadurando 3% en buffer fosfato pH 7,6 y refijadas en tetróxido (Fig. 2 B, C,E). Las células epidérmicas desarrollan de osmio 1,5% enelmismobuffer y a igualpH.Luego una gruesa cutícula estriada en los últimos estadios fueron deshidratadas en una serie ascendente de del desarrollo (Fig. 2F,G). alcoholes para su posterior inclusión en resinas ep¬ Durante la microgametogénesis las células del oxy. Se realizaron cortes de 1 pm de espesor con endotecio forman en sus paredes tangenciales ultramicrótomo los cuales fueron coloreados conazul internas y radiales engrasamientos lignificados en de toluidina para su observación al MO y cortes forma de bandas de naturaleza secundaria que se
266 A. Faigón Soverna et al., estudios embriológicos en Luma apiculata (Myrtaceae)
r - v . 4 ' m /ÿ f - -r * i4 4>c. / B C
r 7 M —i* ’ *2;*1*1 t V - m i I i ¡ •• - i «¡jala*».-t I/?, . s JE - •ÿ * í - ’ .;T p*m ** r-r¿i > .vM Ü ... — /- m / w # Ljf e. . 1 *1 í*; 17/V !--.‘ *%ÿ V.. nr 5. m , FA **jpgí *dp €. L ST • “- |¥ % 1/1 ' »’*» *• « 1 í># V:A *f kI »ÿaL_\ .4':‘ - \¿S~" J¿s» 4» !ÿ«r -Jé-ce Ra* H Fig. 1. A- H: Fotomicrografías al microscopio óptico. A: Lóculo del microspórangio con tejido arquespórico én sección transversal; B: Célula madre de los micrósporos con pared de calosa (c) reffingente; C: Reducción meiótica en célula madre de la micróspora; D: Tétrades tetraédricas de micrósporos rodeadas por calosa; E: Micrósporos recién liberados de la tétrade con restos decalosa; F: Antera madura en sección transversal , tejido conectivo con drusas (d) y células tánicas; G: Célula madre de la megáspora (cmm) situada profundamente en la núcela; H: Tétrade lineal de.megásporas, calosa en paredes transversales que separan a las megásporas (flechas). Escalas:A-E; G-H = 13 mm; F= 500 qm. 267 Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4) 2003 / 'y' 'Jg? 'él © (i O % Y/ ,0/ m. fí 'A x QmÊM e. © 15 ® A Ib ñiQmÊÊÿ?Ê QNj I RJ \ c n ;•S§s3- oWm\ \B» j fe-’ 0\%2 23 © 2 í© 12 268 A. Faigón Soverna et al., Estudios embriológicos en Luma apiculata (Myrtaceae) ¡A» o e nv * cg 1 A Ç . 1 A * «r FB 3 P P P ID nv I m m d r •? 4 71: a - . _ C rr: Fig. 3. A- E: Ultrastructura del grano de polen maduro observado con microscopio electrónico de transmisión. A: Corte transversal de la pared del grano de polen: exina (e), intina (i), detalle del citoplasma de célula vegetativa y orbículas (o) sobre membrana tapetai; B: Núcleo vegetativo (nv) y célula generativa (cg) en corte longitudinal; C: Citoplasma y núcleo de la célula vegetativa. Célula generativa (cg) en corte transversal, detalle de la pared con numerosas conexiones citoplasmáticas (flechas); D: Célula generativa en corte longitudinal, citoplasma con numerosos plástidos (p); E: Detalle de citoplasma de célula vegetativa, amiloplastos (a), dictiosomas (d), mitocondrias (m). Escalas: A-C= 500 nm; D= 1 pm; E= 200 nm. 269 Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4) 2003 interrumpen en la cara tangencial externa y se periférica(Fig. 3B-C). anastomosan en la tangencial intema formando un La célula generativa (CG) es lenticular y posee engrasamiento de aspecto estrellado (Fig. 1F; 2 G). una delgada pared de muy baja electrodensidad, Estos engrasamientos de naturaleza secundaria atravesada por numerosos plasmodesmos. La mayor lignificada le confieren a este estrato la capacidad de parte de su volumen está ocupado por el núcleo de actuar mecánicamente durante laapertura de la antera, posición central, en el cual se observa abundante Las capas medias desaparecen en el estado de cantidad de cromatina periférica. El citoplasma micrósporos libres con la pared de esporopolenina reducido contiene escasas mitocondrias, REr y formada(Fig. 2F). pequeños plástidos (Fig. 3 B-D). En sección transversal la CG se observa ubicada Microsporogénesis y microgametogénesis dentro de una suave concavidad que forma elnúcleo vegetativo (Fig. 3 C). Simultáneamente a la formación de los 4 estratos de la pared de la antera se diferencia el tejido Morfología del grano depolen esporógeno; éste se caracteriza por poseer pocos espacios intercelulares, células isodiamétricas, Los granos de polen son esféricos, núcleos grandes, paredes delgadas y un citoplasma anguloaperturados, tri-sincolporados. La exina es microvacuolado (Fig. 2 A). En este estado más areolada. El borde del colporo se observa avanzado del desarrollo, cada una de estas células se exteriormente engrosado por efecto deunaelevación preparan para la meiosis dando lugar a las células de laexina(Fig. 4 A,B). madres de los micrósporos (CMm); éstas formanuna Ultraestructuralmente,lapareddel grano maduro pared de calosa que se deposita entre la plasmalema consta de una ectexina fragmentada en areolas no y la pared primaria, de tal manera que se vuelven diferenciadas en tectum y bacula, una capa basal esféricas(Fig.1B;2B;4D).Posteriormente se separan homogénea y de menor electrodensidad que la ante¬ unas de otraspor ladisolución de lalaminillamedia y rior y la intina que es la capa más gruesa y presenta las paredes primarias que mantenían unido al tejido inclusiones citoplasmáticas (Fig. 3 A). (Fig. 2 C). Producida lameiosis, la citocinesis en las células madres es simultánea dando como resultado Gineceo tétrades de micrósporos con disposición tetraédrica (Fig. 1C-D;2D;4E). El ovario es 2- carpelar y 2-locular, el estilo es Laparedde calosa que rodea a las CMm y que se ginobásico y el estigma terminal. El estilo es de tipo conserva hasta el estadio de tétrades, se disuelve y sólido y está inervado por los 6 haces vasculares de se produce la liberación de los micrósporos dentro los carpelos (Fig. 5 C). Las células de la epidermis y del lóculo (Fig. 1 E; 2 E). Una vez libres, los algunas del parénquima subepidérmico presentan micrósporos se hidratan y desarrollan una vacuola contenidos tánico-mucilaginosos (Fig. 5 A-C).Eneste central que empuja al núcleo hacia la periferia, e último se destaca tambiénlapresencia de idioblastos inmediatamente comienza a depositarse sobre ellos con drusas de oxalato de calcio.Las células del tejido la esporopolenina proveniente del tapete (Fig. 2 F). de transmisión son alargadas, con paredes Posteriormente cada micrósporo se divide engrosadas y contenidos citoplasmáticos densos desigualmente dando una célula generativa pequeña (Fig. 5 B). El estigma- está formado por papilas y una vegetativa de mayor tamaño que engloba a la unicelulares y presenta un hendidura central que lo primera. En este estado los granos de polen son conecta directamente con el tejido transmisor del liberados del esporangio (Fig. 2 G). estilo (Fig. 5 A). La célula vegetativa (CV) posee un citoplasma denso con gran cantidad de mitocondrias, Megasporangio dictiosomas, elaioplastos, amiloplastos compuestos yretículo endoplásmicomgoso (REr)(Fig. 3 A-C,E). Los óvulos maduros son anacampilótropos y Este último posee un número elevado de cisternas bitegumentados (Fig. 6 B).El exostoma se encuentra apiladas en forma ordenada(Fig. 3 E).Elnúcleo es de desplazado con respecto al endostoma dando como contorno suavemente lobulado, con un nucléolo resultado una micrópila con disposición en zig-Zag conspicuo y pequeños cúmulos de cromatina (Fig.óB). 270 A. Faigón Soverna et al., Estudios embriológicos en Luma apiculata (Myrtaceae) * - s<--‘ . 1» ' 4'tVC - ' V im *• *> I»saÿ£ :ü fcr; • - & - • j : : *. m « . i, . 4 . ' V, •' t A B *fW* •» ypvJ) K3t m¡k.Jl *%P |H M OísSIK W- íéIMBI si 4 1* S ¡I All tr SK7 v I ri V « ,4 ;: < m<- c a Fig. 4. A- C: Ultraestructura del grano de polen y cuerpos de Ubisch observados con microscopio electrónico de barrido. D- F: Observación de calosa con microscopio electrónico de .fluorescencia. A: Vista polar del grano de polen; B: Detalle del colporo; C: Cuerpos de Ubisch. D: Células madres de los micrósporos; E: Tétrades de micrósporos; F: Tétrade de megásporas con paredes transversales de calosa (flechas). Escalas: A= 5 pm; B= 2.5; C= 1 pm; D-F= 10 pm. 271 Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4) 2003 1 *F *«j I I t r ¿XiiTMn * I f r i i i h i i [\ I \ 1 IV i •A m ¡ij| KRfi mM* 4 i :r- iw«rt'A I r W i• / * » " ?; j- * :4-í J I *«»»•' Ofe • « ‘ , ' ?ÍTJÿ ; M i v * !§ÿ ,Suÿ afe'J&'W'/* , Jm f i_A Jfi m &.A: « Ki Fig. 5. A-D: Fotomicrografías al microscopio óptico. At Corte longitudinal de estigma y estilo; B: Detalle de tejido transmisor (tt) en corte longitudinal de estilo; C: Corte transversal de estilo; D: Antípodas- de saco embrionario joven. Escala= 50 pm. 272 A. Faigón Soverna et al., Estudios embriológicos en Luma apiculata (Myrtaceae) La célula madre de las arquésporas se divide los CU, su rol aun no es claro. Varios autores consi- mitóticamente en forma desigual.Lacélula de mayor deran que los CUrepresentanunmecanismo de trans- tamafio ubicada hacia el extremo calazal es la célula porte de la esporopolenina desde el tapete hacia la arquespóricay origina directamente alacélulamadre exina en formación(Echlin, 1971). Otros investigado- de las megásporas (CMM). La célula más pequeña, res como Heslop-Harrison & Dickinson (1969) y ubicada hacia la micrópila, vuelve a dividirse varias Pacini &Franchi(1993) hanpropuesto que formarían vecesoriginando 1omáshileras deaproximadamente 5 una capa hidrofóbica sobre las células tapétales o células cada una entre la CMMy la epidermis nueelar una superficie conigual carga que la exina, facilitan- (Fig. 1 G; 6 A). A su vez esta última se divide do así la expulsión de los granos de polen maduros periclinalmente originando una caliptra que persiste de la antera. Los CU de Luma apiculata de acuerdo a durante todo eldesarrollo delmegametofito (Fig. 6B). su electrodensidad y afinidad por los colorantes, ten¬ drían lamisma composición que la exina del grano de Megasporogénesis y megagametogénesis polen. Sinembargo,unahipótesis acercade surelación enla formaciónde lapareddelgrano depolennopuede La CMM presenta un núcleo conspicuo y un ser planteada, ya que para ello debería realizarse un citoplasma denso enelpolo calazal conmicrovacuolas estudio ontogenético ultraestructural más detallado. haciaelpolomicropilar (Fig. 1G;6C). Los granos de polen de L. apiculata son libera- LadivisiónmeióticadelaCMMdacomoresultado dos de la antera en estado 2-celular. Este hecho con- una tétrade de megásporas de disposición lineal, en cuerda con lo descripto hasta el momento para la fa¬ lacual las 3 célulasmicropilares abortanrápidamente milia(Johri etal.,1992).Lagrancantidadde organelas (Fig. 6 D- E). La presencia de calosa se observa presentes en el citoplasma de la célula vegetativa, únicamente en las paredes transversales que signo de una actividad'biosintética, ha sido reporta- contactan a las megásporas entre sí (Fig. 1H, 4 F). da para la mayoría de especies de Angiospermas es- Luego de 3 ciclos cariocinéticos mitóticos y tudiadas ultraestmcturalmente (Raghavan, 1997). El citocjnesis, la megáspora viable origina un saco citoplasma reducido de la célula generativa contiene embrionario(SE) 8-nuclear,7- celular, tipoPolygonum escasas organelas y algunos plástidos de aspecto (Fig. 6 F). Diñante su desarrollo, este SE crece de tal similar a los presentes en el citoplasma de la célula forma que acompaña la curvatura de la núcela. Las vegetativa, aunque de menor tamaño. Este último sinérgidas poseen gancho y un aparato filar bien carácter diferencia aL. apiculata de lamayoría de las desarrollado conproyeccioneshaciaelcitoplasma(Fig. especies estudiadas hasta elmomento, ya que la ocu- 6 G).De las 3 antípodas, 2 sonmáspequeñas y ocupan rrencia de plástidos en la célula generativa es un he- una posición superior. Estas células son efímeras y se chopoco común(Brighigna et al., 1981;Nakamura& ubican enunpequeño caecum (Fig. 5 D). Miki-Hirosige, 1985; Amelaetal.,2002) Laíntima asociación entre la célula generativa y el núcleo vegetativo en el grano de polen maduro estaría DISCUSIóN Y CONCLUSIONES relacionada con la formación de la unidad germinal masculina(UGM).LaUGMestáconstituidapor laaso- E1desarrollo del microsporangio y el proceso de ciación entre las dos células espermáticas y el núcleo megagametogénesis en L. apiculata concuerda con vegetativo (Russell & Cass, 1981). Según Hu (1990), lo observado en otros géneros de la familia. Russell et al. (1990) y Mogensen(1992), la formación delaUGM facilitariael correctoposicionamiento de la La existencia de CUenMyrtaceae fuemencionada células espermáticas en la células del megagametófito por primera vez en 1968 por Davis (Huysmans et al., durante elproceso de fertilización. 1998),quiendescribió lapresencia depequeños gránu- Coincidentemente con las especies de la familia los con afinidadala saffanina sobre laparedtangencial estudiadas embriológicamente, L. apiculata presen- intemadelas células tapétales de anteras deEucalyptus ta óvulos anacampilotropos, crasinucelados , melindora.Ningún estudioultraestructural fuerealiza- bitegumentados y conmicrópila en zig- zag (Johri et do con anterioridad sobre estos cuerpos en la familia, al., 1992). Al igual que enEugenia myrtifolia (Roy, por lo que las descripciones dadas en este trabajo son 1962) en los óvulos maduros de L. apiculata. se de¬ inéditas para Myrtaceae. sarrollauna caliptranueelar. Aunque se han atribuido distintas funciones a En L. apiculata las tétrades de megásporas tie- 273 Bol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4) 2003 C J s' y' A 1? .•••• a (3 \\ v l\ \ : : / i ...i X i7 v / r * G / B b i; i: 0 m 1 Cro m l **' 7 v-W 1ÿ0 i %o Ã77 W F C D E Fig. 6. A- G: Óvulo y desarrollo del saco embfionario. A: Esquema de primordio ovular en estadio de célula madre de la megáspora; B: Óvulo maduro con caliptra nucelar; C: Célula madre de la megáspora. D: Díade de megásporas; E: Tétrade de megásporás, calazal funcional hacia arriba; F: Saco embrionario completo; G: Detalle de sinérgidas maduras con aparato filar. Escala a corresponde a A-B= 200 pm. Escala b corresponde a C-D; G= 25 pm. Escala c corresponde a F= 50 pm. 274 A. Faigón Soverna et al., Estudios embriológicos en Luma apiculata (Myrtaceae) nen arreglo lineal, y la megáspora funcional es la of anther. In: HESLOP-HARRISON, J. (ed). Pollen: develop¬ calazal. Esto concuerda con lo observado en otros ment andphysiology, pp. 41-61. Butterworth, London. representantes de la familia(Johri et al. 1992). HESLOP HARRISON, J. & H. G. DICKINSON. 1969. Time Según Rodkiewicz (1970), Kuran (1972) y relationship of sporopollenin synthesis associated with tapetum and Lilium. Planta Rodkiewics & Bednara (1976), la localización de la microspores in 84: 199-214. primera capa de calosa en la CMM coincide con la HU, S. Y. 1990. Male germ unit and sperm heteromorphism: localización de la megáspora funcional de la tétrade. the current status. Acta Bot. Sin. 27: 1-12. En la CMM de L. apiculata no se detectó calosa. HUYSMANS, S, G EL-GHAZALY & E. SMETS. 1998. 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