Peronia Verrculata در سواحل استان بوشهر ) خلیجفارس(
Total Page:16
File Type:pdf, Size:1020Kb
اقیانوسشناسی/ سال دهم/ شماره 38/ تابستان 1398/8/36ـ29 اثر ضد باکتریایی عصاره های استحصالی از شکم پای Peronia verrculata در سواحل استان بوشهر ) خلیجفارس( 5 4 3 *2 1 نجمه جهانی ، سید محمدباقر نبوی ، بیتا ارچنگی ، ابراهیم رجبزاده قطرمی ، رحیم عبدی 1- دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، پست الکترونیکی: [email protected] 2- دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر 3- دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر 4- دانشکده منابع طبیعی ،گروه شیﻻت، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر 5- دانشکده علوم دریایی و اقیانوسی، گروه زیست شناسی دریا، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر تاریخ دریافت: 02/4/97 * نویسنده مسوول تاریخ پذیرش: 97/9/21 چکیده امروزه در اثر تکامل مداوم میکروبهای بیماریزا و مقاومت آنها نسبت به آنتی بیوتیکها، تقاضا برای ایجاد ترکیبـات جدید و مؤثر ضد میکروبی وجود دارد. به همین دلیل عصارههای بوتانولی، متانولی و استونی گونه Peronia verruculata تهیه و با استفاده از روشهای MIC و MBC اثرات ضد باکتریایی دو باکتری گرم مثبت Staphylococcus aureous و گرم منفی Escherichi بر روی عصارههای گرفته شده تعیین شد. بررسی کدورت و شفافیت میکروتیوبهای حاوی مقادیر مختلف عصاره بوتانولی نشان داد که حداقل غلظت ممانعت کنندگی از رشد )MBC( باکتری E.coli برابر با µg/µl 600 و باکتری استافیلوکوکوس اورئوس µg/µl 800 بود. وضعیت رشد باکتری E.coli در پلیتهای حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار در غلظتهای مختلف عصاره بوتانولی حداقل غلظت کشندگی )MBC( این باکتری را 800µg/µl و باکتری استافیلوکوکوس اورئوس را 1000µg/µl نشان داد. عصارههای استونی و متانولی حلزون Peronia verrculata تا غلظت µg/µl 1000 اثری بر روی ممانعت از رشد باکتری نداشتند. کلمات کلیدی: شکم پای Peronia verrculata، فعالیت ضد باکتری، MBC ،MIC. 1. مقدمه آمدهاند )Yasoda, et al., 2006(. بیمهرگان دریایی اغلب به عنوان یکی از منابع مهم پتانسیل داروهای دریایی عنوان می- محیط دریاها و اقیانوسها به عنوان یک منبع غنی از شوند )Proksch, et al., 2002(. مطالعه درمورد ترکیبات ضد متابولیتها و ترکیبات فعال زیستی با پتانسیل ضد قارچی و باکتری بیمهرگان دریایی اطﻻعات مفیدی در زمینه کشف ضد باکتریایی شناخته شده است )James, 2001(. ترکیبات آنتی بیوتیکهای جدید به ما میدهد و بینش جدیدی درمورد فعال زیستی از گروههای مختلف جانوری نظیر مرجانها، ترکیبات فعال زیستی ایجاد میکند )Baze, et al,. 2009(. خرچنگها، خارپوستان، ماهیها، اسفنجها و نرم تنان به دست شاخه نرمتنان دریایی متنوعترین گروه از بیمهرگان دریایی 29 Peronia verrculata جهانی و همکاران / اثر ضد باکتریایی عصارههای استحصالی از شکم پای در سواحل استان بوشهر ) خلیجفارس( پس از بند پایان هستند که صدهزار گونه را شامل میشوند. از Biskupiak and Ireland, 1983, Dolashka, et al.,2015,، Bano این تعداد هشتاد هزار گونه متعلق به شکم پایان میباشند که از ,and Ayub, 2012, Dakhil Degiam ; Tahar Abas, 2010 مناطق ساحلی تا اعماق اقیانوسها پراکنش دارند ,Sivaprakasam Ramya, et. al., 2014, Giftson and Patterson )Haszprunar, (2001. استفاده بی رویه از ترکیبات آنتی .Ulagesan and Kim, 2018 ,2016 بیوتیکی دارای معایبی همچون ایجاد مقاومت دارویی در پتانسیل نرمتنان دریایی به عنوان یک منبع از ترکیبات فعال باکتریها، ایجاد مشکﻻت زیست محیطی، گران بودن و به زیستی در ایران ناشناخته مانده است. ضرورت تحقیق حاضر صرفه نبودن، وجود بقایای دارویی در گوشت آبزی و انتقال به تعیین اثر ضد باکتریایی عصارههای استخراجی از حلزون دریایی مصرف کننده را دارد )Thanikachalam et al., 2010(. در Peronia verrculata میباشد. دهههای اخیر تقاضا برای کشف ترکیبات ضد میکروبی موثر و غیر سمی با افزایش مقاومت پاتوژنها در برابر آنتی بیوتیکها 2. مواد و روشها افزایش یافته است )Chellaram, et al., 2004(. حلزونهای دریایی به عنوان یک منبع غنی از متابولیتهای ثانویه و نمونههای حلزون Peronia verrculata )شکل 1( از مناطق پتانسیل باﻻ در زمینه زیست پزشکی، بیشترین مطالعات را در بین جزرومدی سواحل صخرهای استان بوشهر از سواحل اولی گروه نرمتنان در زمینه محصوﻻت طبیعی دریا نشان میدهند شمالی و جنوبی به تعداد 10 نمونه از هر منطقه مطالعاتی جمع )Faulkner, 1996(. آوری گردید )شکل 2(. سپس نمونهها به صورت زنده به Peronia verruculata حلزون دریایی فاقد صدف با تنفس آزمایشگاه منتقل شدند. هوازی )Hoffman, 1929( از رده شکم پایان، راسته Pulmonata، خانواده Onchidiidae و جنس Peronia میباشد ) ; Chan Caley, 2003(. بیضی شکل و کمی در سمت پشتی- شکمی پهن و اندازه آنها در حدود 6 سانتی متر است. دارای بدنی نرم هستند و آهسته حرکت میکنند. حلزونهای دریایی به طور مداوم در معرض غلظت نسبتا باﻻیی از باکتریها و ویروسها و قارچها هستند که بسیاری از آنها مضر هستند. از این رو اگر انواع شیوه- های دفاعی را نداشته باشند، در برابر شکارچیان بسیار آسیبپذیر هستند )Wagele and Klussmann-Kolb, 2000(. بقا این موجودات وابسته به مکانیسمهای ضدمیکروبی موثر برای حمایت شکل 1: شکم پای Peronia verrculata جمع آوری شده در سواحل استان از آنها در برابر عفونتهای میکروبی است، که شامل رفتارهای بوشهر تغییر رنگ، تغییرسایز، توانایی تولید موکوس و مهمترین آنها تولید متابولیتهای شیمیایی است )-Wagele and Klussmann برای تهیه عصاره، گونههای جمع آوری شده جهت بررسی Kolb, 2005( . پتانسیل ضد باکتری در آزمایشگاه با آب مقطر شستشو داده شدند اولین تﻻشها برای یافتن فعالیتهای آنتی میکروبی و در یک مخلوط کن هموژن شده و برای عصارهگیری آماده موجودات دریایی در دهه 1950 آغاز شد. بعد از آن زمان شدند. به این منظور نمونهها به سه قسمت تقسیم شدند و در 3 ارگانیسمهای دریایی زیادی با شاخههای متعدد برای بررسی حﻻل قرار گرفتند. حﻻلها به نسبت 1:3 به اجزای جاندار اضافه فعالیتهای ضد میکروبی بررسی شدند )Shaw et. al., 1976(. گردید. نمونهها طی 72 ساعت در ارلنهای بسته شده با پارافین و مطالعات اندکی روی فعالیتهای ضد باکتری عصارههای شکم- ورقههای آلومینیومی در دمای آزمایشگاه و محیط فاقد نور پایان انجام شده است مانند: قرارگرفتند. 30 اقیانوسشناسی/ سال دهم/ شماره 38/ تابستان 1398/8/36ـ29 شکل 2: موقعیت جغرافیایی روستاهای اولی شمالی و جنوبی در خلیج فارس به منظور کاهش خطا و افزایش دقت در روند کار، عصاره استفاده گردید. برای تعیین MIC هر یک از عصارههای مورد گیری از هر کدام از اجزای بدن حلزونهای بدون صدف دو بار بررسی یک سری 9 تایی از لولههای آزمایش مورد استفاده قرار دیگر تکرار شد. به این منظور پس از هر 72 ساعت محتوای گرفت 7 لوله برای آزمایش رقتهای مختلف عصاره و یک لوله ارلنها با استفاده از قیف و کاغذ صافی، صاف شده و اجزای به عنوان کنترل مثبت )محیط کشت + باکتری( و یک لوله نیز به جاندار برای عصارهگیری بعدی وارد حﻻل تازه گردید. سپس عنوان کنترل منفی )محیط کشت( به کار رفت. ابتدا باکتریهای محتوای ارلنها با استفاده از کاغذ صافی و قیف صاف و اجزای Staphylococcus aureous و Escherichi coli در محیط کشت جاندار از حﻻل جداسازی شد )بیگی نصیری، 1396(. حﻻلهای (Tryptic Soy Broth(TSB کشت داده شده، به محیط کشت سه مرحله عصـارهگیری با هم مخلوط شده و برای تغلیظ آنها از مولر هینتون براث Mueller Hinton Broth در لوله های آزمایش روتاری Heidorph مدل 0r0612119 استفاده شد. برای حفظ اضافه و میزان کدورت حاصل از باکتری با استاندارد 5/0 مک ساختـار ترکیبات عصارهها دمای روتاری 37 درجه سانتیگراد فارلند( cfu/ml 108*5/1) تنظیم گردید سپس به لولههای حاوی تنظیم گردید. پس از تغلیظ عصارهها به منظور جداسازی کامل محیط کشت مـولر هینتون براث همراه بـا ـباکتری عصاره حﻻل از عصارهها، از دستگـاه فریز درایر)Freeze drier( استفاده حلزونهای دریایی با غلظت های 100، 200، 300، 400، 600، گردید. عصـارهها در پلیتهای شیشهای از قبل وزن شده ریخته 800، 1000 میکروگرم بر میکرولیتر اضافه شد. سپس لولههای o و در فـریزر با دمـای C 20- درجه سانتیگراد برای انجـام مذکور به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در آزمایشهای میکروبی بعدی نگهداری شدند )بیگی نصیری، انکوباسیون نگهداری و بعد از سپری شدن زمان کدورت آنها 1396(. بررسی و غلظت اولین لولهای که در مقایسه با شاهد شفاف بود دو باکتری گرم مثبت Staphylococcus aureous )کد ATCC) به عنوان MIC در نظر گرفته شد. برای تعیین حداقل غلظت 9011 و گرم منفی Escherichi coli )کد ATCC 2207( از کشندگی Minimum Bactericidal Concentration باکتریهای بیمارستان دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز بصورت خالص Staphylococcus aureous و Escherichi coli توسط عصارههای تهیه شدند. باکتریها ابتدا در محیط کشت Tryptic Soy Broth استخراج شده از حلزون دریـایی، از محتویات آن دسته از (TSB) کشت و بعد از 24 ساعت توسط سرم فیزیولوژی شستشو غلظتهایی از عصارههای مذکور که در محیط کشت مولر هینتون داده شده و در یخچال در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 3 براث در آزمایش تعیین MIC فاقد کدورت بودند، به میزان 100 روز برای انجام مطالعات مورد نظر نگهداری شدند. میکرو لیتر برداشت و در پلیت های محتوی مولر هینتون آگار برای تعیین حداقل غلظت بازدارندگی رشد Muller Hinton Agar( Minimum( به روش خطی کشت داده شد. سپس MIC( Inhibotory Concentration( باکتریهای مورد استفاده پلیتها در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت توسط عصارههای استونی، بوتانولی و متانولی از روش رقت نگهداری شدند، پس از اتمام مدت زمان انکوباسیون کمترین لولهای )Vanden et al., 1991; Sindambiwe et al., 1999( غلظتی از عصارههای مورد بررسی را که باکتری در آنها رشد 31 Peronia verrculata جهانی و همکاران / اثر ضد باکتریایی عصارههای استحصالی از شکم پای در سواحل استان بوشهر ) خلیجفارس( نکرده بود به عنوان حداقل غلظت کشندگی )MBC( در نظر Hemifusus pugilinus نیز بیشترین اثر ضد باکتری را در برابر گرفته شد (Vanden et al., 1991; Sindambiwe et al., 1999(. باکتری E.coli نشان داد )Srinivasan G., 2008(. جدول 3: مقایسه حداقل غلظت ممانعت کنندگی از رشد )MIC( باکتری 3. نتایج و بحث استافیلوکوکوس اورئوس توسط عصاره های مختلف در این مطالعه تاثیرات ضد باکتریایی عصارههای بوتانولی، غلظت عصاره C - C+ 1000 800 600 400 300 200 100 متانولی و استونی در آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت.