UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E CONSERVAÇÃO
DIVERSIDADE GENÉTICA E MORFOMÉTRICA DO GÊNERO Nematocharax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE) EM BACIAS DO LESTE DO BRASIL
SILVIA BRITTO BARRETO
PPGGBC
Jequié-BA 2015 SILVIA BRITTO BARRETO
DIVERSIDADE GENÉTICA E MORFOMÉTRICA DO GÊNERO Nematocharax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE) EM BACIAS DO LESTE DO BRASIL
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, para obtenção do Título de Mestre em Genética, Biodiversidade e Conservação.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Débora Diniz Bezerra Co-orientadores: Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso e Prof. Dr. Ricardo Jucá Chagas PPGGBC
Jequié-BA 2015 3
SILVIA BRITTO BARRETO
DIVERSIDADE GENÉTICA E MORFOMÉTRICA DO GÊNERO Nematocharax (CHARACIFORMES: CHARACIDAE) EM BACIAS DO LESTE DO BRASIL
Aprovada em ____/____/____
Banca Examinadora
Dra. Débora Diniz Bezerra (orientadora) Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB
Dr. Marcelo Cervini Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB
PPGGBC
Dr. Marcelo de Bello Cioffi Universidade Federal de São Carlos - UFSCar
Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Jequié, BA
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PPGGBC
Para a minha mãe Sandra, pelo apoio constante e amor incondicional!
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) e ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação (PPGGBC), pela estrutura e apoio concedidos. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FASPEB), pelo apoio financeiro (PNE0019/2011, RED0009/2013), e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de mestrado. Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), pela licença de coleta concedida, e ao Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA/UESB) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, pela aprovação dos experimentos (processo número 32/2013). À Dra. Débora Diniz, por ter aceitado me orientar, por acreditar no meu potencial e estar sempre disposta a me ajudar. Ao Dr. Paulo Affonso, pela oportunidade, pelo exemplo de profissionalismo e por toda a confiança, amizade e ajuda indispensável. Ao Dr. Ricardo Jucá Chagas, pela disponibilidade, incentivo e conselhos. Ao Msc. André Teixeira, pelos ensinamentos e pelas inúmeras e fundamentais contribuições em todos os momentos. À Dra. Lorena Nunes, por me apresentar a morfometria geométrica e pelo aprendizado, colaboração e companheirismo. Ao Dr. Marcelo de Bello Cioffi, pela valiosa contribuição com a hibridação fluorescente in situ (FISH) e pela atenção e disponibilidade para as correções e sugestões. À Cândida Beatriz, por me acolher carinhosamente em Cruz das Almas. À Dra. Angela Zanata e Msc. Priscila Camelier, pela oportunidade de visitar o Museu de Zoologia da Universidade Federal da Bahia (MZUFBA) e fotografar parte do material de Nematocharax depositadoPPGGBC, pelas importantes informações concedidas e pelo empréstimo de exemplares provenientes de alguns rios. Agradeço também a Gilane Couto e Lívia Oliveira por toda a ajuda. À Dra. Luisa Maria Sarmento-Soares e Ronaldo Fernando Martins-Pinheiro, que também permitiram que eu fotografasse parte do material de Nematocharax depositado no Museu de Biologia Professor Mello Leitão (MBML) e fornecerem importantes informações sobre locais de coleta da espécie. À Dra. Iracilda Sampaio, pela oportunidade de realizar o sequenciamento das amostras na Universidade Federal do Pará (UFPA). À Luciana Watanabe, por todo o auxílio durante os
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procedimentos. À Priscila e Adrianne, que me receberam tão bem durante a minha estadia em Bragança. Ao Dr. Paulo Carneiro e Dr. Marcelo Cervini, pelas sugestões e comentários para a melhoria do trabalho durante o exame de qualificação. À Dra. Caroline Garcia, pelo apoio e pela constante disposição em tirar dúvidas e dar dicas em relação às técnicas citogenéticas. Aos amigos dos laboratórios de Citogenética (Jamille, Lídia, Aline, Aragão, Fabilene, Falcão, Fernando, Gal, Josi, Márcia e Lands) e Biologia Molecular (Henrique, Juliani, Renata, Nathanna, Arlete, Zaline e Cássio), pela convivência agradável, ajuda, carinho, boas risadas e por todo o conhecimento compartilhado. Aos amigos Aragão, Anselmo, Falcão e Fabiane pelo importante auxílio nas viagens de campo. Vocês foram fundamentais! À Josiani Vieira, secretária do PPGGBC, e Jumara Palma, estagiária, por todos os auxílios prestados. Ao meu companheiro de todas as horas, Leo, não sei como agradecer por tudo que fez por mim! Obrigada por vivenciar cada minuto desse mestrado comigo e tornar a minha jornada muito mais fácil. À melhor mãe do mundo, por ser a pessoa que mais me apoia, incentiva, compreende e acredita na minha capacidade. Sempre serei eternamente grata a você por tudo!
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BIOGRAFIA
Silvia Britto Barreto, filha de Sandra Maria Britto Barreto e Silvio Ferreira Barreto, nasceu em 05 de outubro de 1991, na cidade de Jequié, Bahia, Brasil. Em 2009, ingressou no curso de Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em “Ecologia de Águas Continentais”, da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Jequié. Durante a graduação, foi bolsista de iniciação científica PIBIC/CNPq (2011-2012) e desenvolveu trabalhos na área de ecologia trófica de peixes de água doce, sob a orientação do Prof. Dr. Ricardo Jucá Chagas (UESB). Em abril de 2013, concluiu o curso de graduação, com o trabalho de monografia intitulado: “Dieta de Hemigrammus marginatus Ellis, 1911 (Characiformes: Characidae) na Bacia do Alto Rio de Contas, Bahia”. Neste mesmo ano, ingressou no curso de mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus de Jequié, sob a orientação da Profa. Dra. Débora Diniz Bezerra, sendo bolsista CAPES e desenvolvendo trabalhos na área de Citogenética e Biologia Molecular.
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“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende.”
(Leonardo da Vinci)
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RESUMO
Os caracteres morfológicos têm sido tradicionalmente utilizados na taxonomia para identificar espécies. No entanto, a abordagem morfológica apresenta limitações intrínsecas, principalmente pela dificuldade em detectar espécies crípticas. Em vista disso, o uso da taxonomia integrativa tem se expandido nos últimos anos, e permite integrar todas as fontes de dados disponíveis para avaliar a real diversidade de um grupo. Nesse contexto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a diversidade do gênero Nematocharax (Characiformes, Characidae) por meio de marcadores cromossômicos e moleculares, bem como análises de morfometria geométrica, a fim de auxiliar na taxonomia do grupo, que possui apenas uma espécie válida (N. venustus). Os dados citogenéticos revelaram uma macroestrutura cariotípica conservada em todas as populações, com número diplóide igual a 50, fórmula cariotípica composta por 8m+26sm+14st+2a e número fundamental igual a 98, independentemente do sexo ou localidade. Entretanto, foi observada uma considerável variação na distribuição de sequências repetitivas, especialmente em relação ao DNAr 5S, e marcadores cromossômicos específicos para cada população foram identificados. De acordo com a análise das sequências do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) pela técnica de DNA barcode, as divergências interpopulacionais variaram entre 0 e 7,5% e quatro grupos foram bem suportados na árvore de Neighbor-Joining. Adicionalmente, diferenças morfométricas foram encontradas entre as populações, principalmente associadas à altura do corpo, altura e comprimento da cabeça e diâmetro do olho. A população do Alto Contas foi a que mais divergiu tanto nos dados morfométricos quanto genéticos, sugerindo a presença de uma nova espécie de Nematocharax que pode ter se estabelecido na região do alto rio de Contas após o soerguimento da Chapada Diamantina. Fatores como seleção sexual, ciclo de vida rápido, taxa de dispersão bastante restrita e isolamento das bacias podem estar contribuindo para a rápida divergência evolutiva entre asPPGGBC populações de N. venustus. Assim, os dados evidenciam a presença de unidades evolutivas únicas no gênero e a possível presença de um conjunto de formas crípticas. Adicionalmente, demonstra-se que as bacias da região hidrográfica do Atlântico Leste, fortemente alteradas pelas ações antrópicas, constituem áreas prioritárias para a conservação biológica.
Palavras-chave: Nematocharax venustus, Nematocharax costai, FISH, DNA barcode, morfometria geométrica.
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ABSTRACT
Morphological characters have been traditionally used in taxonomy to identify species. Nevertheless, the morphological approach has intrinsic limitations, mainly due to the difficulties in detecting cryptic species. Therefore, the use of integrative taxonomy has expanded in recent years, and allowed integrating all available data sources to assess the actual diversity of a taxon. In this context, the present study aimed to evaluate the diversity in the genus Nematocharax (Characiformes, Characidae) by chromosomal and molecular markers, as well as geometric morphometric analysis in order to evaluate the taxonomic status of this group, which includes a single valid species (N. venustus). Cytogenetic data revealed a karyotype macrostructure conserved in all populations with diploid number equal to 50, karyotype formula composed of 8m+26sm+14st+2a and fundamental number equal to 98, regardless of sex or location. However, a considerable variation in the distribution of repetitive sequences was observed, especially in relation to the 5S rDNA inasmuch as specific chromosomal markers were identified for each population. According to the sequence analysis of the mitochondrial gene Cytochrome C Oxidase Subunit I (COI) by DNA barcoding, the interpopulational differences ranged from 0 to 7.5%, and four groups were well supported in the Neighbor- Joining tree. Morphometric differences were found between populations, mainly related to body height, head height and length and eye diameter. The population of the Upper Contas River was the most divergent one, both in morphometric as in genetic data, suggesting the presence of a new species of Nematocharax that may have settled in after the uplift of the Chapada Diamantina. Factors such as sexual selection, fast life cycle, rather narrow dispersal rate and isolation of the basins might have favored the rapid evolutionary divergence among populations of N. venustus. Thus, these data show the presence of unique evolutionary units in Nematocharax, with putative occurrence of a set of cryptic forms. Additionally, we show that the hydrographic basinsPPGGBC of the eastern Atlantic region, heavily modified by human activities, are priority areas for biological conservation.
Keywords: Nematocharax venustus, Nematocharax costai, FISH, DNA barcode, geometric morphometrics.
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LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Figura 1. Mapa mostrando os locais de coleta de Nematocharax venustus. a Mapa do Brasil, com destaque aos Estados da Bahia e Minas Gerais. b Locais de coleta de N. venustus pertencentes às bacias do rio Almada (Almada), Contas (Alto Contas, Gongogi 1, 2 e 3) e Jequitinhonha (Jequitinhonha 1 e 2) ...... 69
Figura 2. Cariótipo representativo das amostras de Nematocharax venustus de bacias costeiras do Atlântico Leste. Barra = 5 µm ...... 70
Figura 3. Cariótipos após bandamento C das amostras de Nematocharax venustus de bacias costeiras do Atlântico Leste: (A) Almada; (B) Gongogi 1; (C) Gongogi 2; (D) Gongogi 3; (E) Jequitinhonha 1; (F) Jequitinhonha 2 e (G) Alto Contas. Barra = 5 µm ...... 71
Figura 4. Cromossomos das populações de Nematocharax venustus após as técnicas de impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos
(CMA3/DA/DAPI) e hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de DNAr 18S, em vermelho, e 5S, em verde. Notar a sintenia entre as sequências ribossomais em uma das populações do Jequitinhonha ...... 72
Capítulo 2 PPGGBC
Figura 1. Mapa mostrando os locais de coleta de Nematocharax venusts. a) Mapa do Brasil, com destaque para a Região Hidrográfica do Atlântico Leste; b) Mapa da Região Hidrográfica do Atlântico Leste, com os sete locais de coleta, pertencentes à Bacia do Rio Almada (Almada - A), Contas (Gongogi 1 - B, Gongogi 2 - C, Gongogi 3 - D e Alto Contas - G) e Jequitinhonha (Jequitinhonha 1 - E e Jequitinhonha 2 - F); c) Imagens representativas dos locais de coleta . 92
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Figura 2. Árvore de Neighbor-Joining baseada na sequência do COI das populações de Nematocharax venustus e espécies relacionadas com valores de bootstrap mostrados acima de cada ramo ...... 94
Figura 3. Rede de haplótipos construída com sequências do COI, demonstrando as relações entre os haplótipos das populações de Nematocharax venustus de cada localidade amostrada. Cada cor representa uma localidade e a dimensão dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que compartilham cada haplótipo. Os números nos ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos ...... 95
Figura 4. a) Análise de Componentes Principais (ACP) para a forma do corpo dos espécimes de Nematocharax venustus. No gráfico, cada localidade é representada por um símbolo. b,c) Grades de deformação representando os extremos morfológicos no primeiro componente (PC1). O escore negativo está disposto à esquerda, e o positivo à direita. Os vetores indicam a direção e o sentido da variação de cada marco anatômico. d,e) Contorno apresentando as variações na forma dos espécimes. As linhas azuis escuras representam a deformação e as linhas azuis claras representam a forma média dos indivíduos...... 96
Figura 5. Box-plot demonstrando a variação do tamanho do centróide dos espécimes de Nematocharax venustus por localidade. As barras mostram os valores médios ± desvio padrão. Letras distintas representam médias significativamente diferentes pelo Teste de Tukey a 1% ...... 97 PPGGBC Figura 6. a) Análise de Componentes Principais (ACP) para a forma do corpo das fêmeas de Nematocharax venustus. No gráfico, cada localidade é representada por um símbolo. b,c) Grades de deformação representando os extremos morfológicos no primeiro componente (PC1). O escore negativo está disposto à esquerda, e o positivo à direita. Os vetores indicam a direção e o sentido da variação de cada marco anatômico. d,e) Contorno apresentando as variações na forma dos espécimes. As linhas azuis escuras representam a deformação e as linhas azuis claras representam a forma média dos indivíduos...... 98
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Figura 7. Box-plot demonstrando a variação do tamanho do centróide das fêmeas de Nematocharax venustus por localidade. As barras mostram os valores médios ± desvio padrão. Letras distintas representam médias significativamente diferentes pelo Teste de Tukey a 1% ...... 99
Figura 8. Dendrograma gerado por UPGMA ilustrando as distâncias morfométricas médias entre a forma do corpo das fêmeas de Nematocharax venustus oriundas de diferentes localidades em bacias do Atlântico Leste do Brasil ...... 99
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LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1. Dados referentes aos pontos de coleta e amostragem dos exemplares de Nematocharax venustus nas bacias do rio Almada, Contas e Jequitinhonha ...... 69
Capítulo 2
Tabela 1. Dados referentes aos pontos de coleta e amostragem dos exemplares de Nematocharax venustus nas bacias do rio Almada, Contas e Jequitinhonha ...... 92
Tabela 2. Distâncias intrapopulacionais de Nematocharax venustus analisadas com o modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 93
Tabela 3. Distâncias interpopulacionais das amostras de Nematocharax venustus e interespecíficas com espécies relacionadas analisadas com o modelo evolutivo Kimura-2- Parâmetros (K2P) ...... 93
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...... 17
2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 18
2.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE A ICTIOFAUNA E AS BACIAS DO LESTE DO BRASIL ...... 18
2.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE A FAMÍLIA CHARACIDAE E O GÊNERO NEMATOCHARAX ...... 21
2.3. ESTUDOS CITOGENÉTICOS EM CHARACIDAE ...... 24
2.4. UTILIZAÇÃO DO GENE COI PARA IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA EM
PEIXES ...... 28
2.5. MORFOMETRIA GEOMÉTRICA ...... 31
3. OBJETIVOS ...... 35
3.1. OBJETIVO GERAL ...... 35
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 36
4. CAPÍTULO 1: VARIABILIDADE CROMOSSÔMICA ENTRE POPULAÇÕES ALOPÁTRICAS DE Nematocharax venustus (ACTINOPTERYGII, CHARACIFORMES) REVELADA PELA ANÁLISE DA FRAÇÃO REPETITIVA DO GENOMA ...... 50
4.1. INTRODUÇÃO ...... 53
4.2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 54
4.3. RESULTADOS ...... 55 4.4. DISCUSSÃOPPGGBC ...... 57 4.5. REFERÊNCIAS ...... 61
5. CAPÍTULO 2: UNIDADES EVOLUTIVAMENTE SIGNIFICATIVAS EM PEIXES NEOTROPICAIS DO GÊNERO Nematocharax (ACTINOPTERYGII, CHARACIFORMES): IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE EM BACIAS HIDROGRÁFICAS DO NORDESTE BRASILEIRO ...... 73
5.1. INTRODUÇÃO ...... 76
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5.2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 77
5.2.1. AMOSTRAGEM ...... 77
5.2.2. ANÁLISES MOLECULARES ...... 78
5.2.2.1. EXTRAÇÃO, PCR E SEQUENCIAMENTO ...... 78
5.2.2.2. ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS ...... 78
5.2.3. ANÁLISES MORFOMÉTRICAS ...... 79
5.3. RESULTADOS ...... 80
5.3.1. DNA BARCODE ...... 80
5.3.2. MORFOMETRIA GEOMÉTRICA ...... 81
5.4. DISCUSSÃO ...... 82
5.5. REFERÊNCIAS ...... 87
6. CONCLUSÕES GERAIS ...... 100
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1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui a maior rede hidrográfica e a maior riqueza de espécies de peixes de água doce do mundo, com um alto grau de endemismo. No entanto, neste mesmo cenário, observa- se também um elevado número de espécies ameaçadas de extinção. Problemas de assoreamento, destruição da vegetação marginal, poluição, implantação de barragens e introdução de espécies exóticas são algumas das causas de perda de biodiversidade em ecossistemas aquáticos continentais brasileiros. Essas ameaças são especialmente frequentes na região hidrográfica do Atlântico Leste, em função da crescente ação antrópica. Assim, a proteção da biodiversidade representa hoje um dos principais desafios a ser enfrentado. Entre esses desafios, ressalta-se o conhecimento incipiente da ictiofauna, com muitas lacunas nos aspectos ecológicos, genéticos, biogeográficos, entre outros. O número de espécies é impreciso e difícil de ser estimado e a ictiofauna de várias bacias hidrográficas encontra-se praticamente desconhecida. A família Characidae é amplamente distribuída e possui o maior número de espécies dentre os Characiformes. Seus representantes são popularmente conhecidos como lambaris e piabas, e podem variar consideravelmente em tamanho, peso, forma, alimentação e comportamento. Dentro desta família, encontra-se o gênero Nematocharax, que, até recentemente, era considerado um gênero monotípico de Characidae, composto apenas por N. venustus. Esta espécie foi originalmente descrita para o rio Jequitinhonha, em Minas Gerais. Segundo estudos sobre composição e distribuição de espécies de peixes, N. venustus habita também as drenagens do rio de Contas, Cachoeira, Almada, Una, Pardo e rio do Braço. Em adição, uma nova espécie (N. costai) foi recentemente descrita para o gênero na sub-bacia do rio Gongogi (região do baixo rio de Contas), na Bahia. Entretanto, após uma revisão taxonômica, foi proposta a sinonimização da espécie, devido à ampla sobreposição de caracteres entre N.PPGGBC costai e N. venustus, e o gênero Nematocharax foi redefinido e novamente considerado monotípico. Diante do exposto, e considerando que ainda são escassas as informações a respeito do gênero Nematocharax, múltiplas ferramentas, como marcadores cromossômicos e moleculares e a morfometria geométrica, são relevantes para conferir se as populações analisadas pertencem à mesma unidade evolutiva ou correspondem a estoques diferenciados que precisam ser conservados e manejados separadamente. Essa abordagem, denominada de taxonomia integrativa, tem se mostrado uma tendência crescente, contribuindo para avaliar a real riqueza da biodiversidade.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Considerações sobre a ictiofauna e as bacias do Leste do Brasil
Os peixes exibem uma enorme diversidade, tanto morfológica, quanto na exploração dos habitats e, ainda, em sua biologia. Essa diversidade é, em parte, o que faz com que o entendimento da história evolutiva do grupo e o estabelecimento de uma classificação sejam tarefas tão difíceis (Nelson, 2006). A ictiofauna brasileira compreende 2.300 espécies de água doce (Reis et al., 2003) e 1.298 espécies marinhas (Menezes et al., 2003). Contudo, o conhecimento sobre a diversidade desta fauna é incompleto, como atestam as dezenas de espécies de peixes descritas anualmente no Brasil e, portanto, é de se prever que a riqueza total efetiva seja ainda muito maior (Rosa e Lima, 2008). A alta diversidade de peixes de água doce no Brasil deve-se principalmente à presença de diversos sistemas hidrográficos de grande porte, com considerável distinção ictiofaunística entre si (Rosa e Lima, 2008). Apesar disso, essa enorme diversidade encontra-se significativamente ameaçada devido à ação humana, a qual vem acarretando a desestruturação das comunidades naturais ou até mesmo a extinção local de algumas espécies (Marinho et al., 2006). No Brasil, as principais ameaças à ictiofauna incluem a sobrepesca, o desmatamento ciliar, a destruição de alagadiços, a poluição, a introdução de espécies exóticas, a regularização de cursos d’água e retificação de leitos, e o represamento dos rios para a construção de reservatórios (Rosa e Menezes, 1996). A região hidrográfica do Atlântico Leste é constituída pelas bacias hidrográficas litorâneas, limitadas ao norte e a oeste pelo sistema do rio São Francisco, incluindo a bacia do rio Vaza Barris, em Sergipe, até a bacia do rio São Mateus, no Espírito Santo (CNRH, 2003). Os principais cursosPPGGBC d’água nessa região nascem na Serra do Espinhaço (Minas Gerais) e Chapada Diamantina (Bahia) e correm para o Oceano Atlântico, incluindo rios importantes como Paraguaçu, Contas, Jequitinhonha, Doce e Paraíba do Sul (MMA, 2006). A bacia do rio de Contas ocupa uma área de 55.483 km2 na região centro-sul do Estado da Bahia, abrangendo 76 municípios (INEMA, 2015). O clima predominante é quente, com a temperatura do mês mais frio superior a 18ºC. Na faixa litoral da bacia, as chuvas são regulares, com índices em torno de 1.750 mm. Porém, à medida que a massa de ar se interioriza, o volume de precipitação diminui, chegando a 750 mm (Severi et al., 2010).
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Com uma extensão de pouco mais de 500 km, o rio de Contas apresenta, desde a sua nascente, na Serra das Almas, até a sua foz, em Itacaré, uma queda de 615 m (CHESF, 2015). Nesse percurso, o rio de Contas passa por três componentes fisiográficos bem distintos: Alto Contas (onde predominam as características climáticas e fisiográficas do semiárido baiano); Médio Contas (onde ocorre a transição do clima semiárido da Caatinga para o clima semiúmido do Baixo Contas) e Baixo Contas (com clima semiúmido e predominância da Mata Atlântica) (SRHSH, 1993). Esse mosaico de paisagens denota elevada heterogeneidade ambiental para a bacia do rio de Contas. Entretanto, esse fator também constitui um desafio para estudos taxonômicos, ecológicos, evolutivos e, especialmente, para propostas de conservação. Para a regularização das descargas do rio de Contas e controle das enchentes, além do abastecimento de água, irrigação agrícola, geração de energia elétrica e incremento da pesca, foram construídas duas barragens no trecho médio do rio de Contas (Pedras e Funil) (Severi et al., 2010). A construção de uma barragem transforma profundamente as características naturais de um rio, reduzindo a velocidade do fluxo, alterando a qualidade da água e o substrato, e tornando as condições semelhantes às existentes em lagoas (Petesse e Petrere Jr., 2012). Sob determinadas circunstâncias, espécies incapazes de se adaptarem a esse tipo de mudança podem ser levadas à extinção (Godinho e Godinho, 1994). Além dessa ameaça, foram introduzidas no reservatório da Barragem da Pedra (e, portanto, também na bacia do rio de Contas) espécies fortemente ictiófagas, como Serrasalmus brandti, Pygocentrus piraya e Plagioscion squamosissimus, com prováveis consequências negativas para toda a ictiofauna dessa localidade (Jucá-Chagas et al., 2004; Castro e Jucá- Chagas, 2008). As espécies introduzidas podem, por exemplo, disseminar patógenos e parasitas, predar ou competir com espécies nativas e causar exclusão por competição (Leão et al., 2011). Soma-se a tudo isso, o comprometimento das águas pela ejeção de esgoto doméstico em alguns locais, comoPPGGBC a calha principal do rio de Contas. O principal foco de tal contaminação localiza-se no município de Jequié, onde foram verificados níveis anormais de cloretos e sólidos totais. Outros pontos também são afetados, como os trechos de mananciais sob a influência dos núcleos urbanos dos municípios de Ipiaú e Ubatã (CRA, 2001). As informações acerca da diversidade da ictiofauna presente na bacia do rio de Contas ainda são incompletas, visto que muitas localidades não foram exploradas, ou o foram de maneira pontual. Assim, pouco se sabe sobre os padrões de distribuição das espécies, bem como sobre aspectos de sua biologia, ressaltando ainda mais a carência de estudos ictiofaunísticos para a região.
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Essa carência de estudos ictiofaunísticos se estende para a bacia do rio Almada, localizada na região Sul da Bahia. Com aproximadamente 1.545 km² e perímetro de 252 km (MMA, 2006), a bacia do rio Almada é limitada ao norte e oeste pela bacia do rio de Contas e ao sul pela bacia do rio Cachoeira. Essa bacia destaca-se como um dos principais sistemas naturais da região em função da extensa cobertura vegetal de cabruca (Mata Atlântica raleada sobre plantação de cacau), bolsões de Mata Atlântica preservados, restingas e manguezais, além da presença de um lago natural de 6,6 km2, denominado Lagoa Encantada. Em 1993, com o objetivo de proteger a diversidade biológica da região, foi criada, pelo Governo do Estado da Bahia, a Área de Proteção Ambiental da Lagoa Encantada, que com sua ampliação em 2003, englobou grande parte da área da bacia do rio Almada (Silva e Gomes, 2010; Viana, 2011). Seu curso principal, o rio Almada, apresenta uma extensão de 138 km, desde a sua nascente na Serra do Chuchu, em Almadina, até a sua foz na Barra de Itaípe, em Ilhéus (Gomes et al., 2010). Os principais afluentes em sua margem direita são o rio do Braço, o ribeirão do Boqueirão e o riacho Sete Voltas. Na margem esquerda, por sua vez, destacam-se o rio São José e os ribeirões de Jussara e Braço Norte (Gomes et al., 2012) O clima da bacia pode ser classificado como quente e úmido, com variações que determinam a caracterização do clima tropical superúmido na costa e tropical úmido no interior (Roeder, 1975; Franco et al., 2011). Apesar de sua relevância, a bacia do rio Almada revela um histórico de ocupação desordenada, desmatamento da vegetação nativa, assoreamento das margens e leito dos rios e poluição de seus afluentes. Os principais conflitos ambientais observados na área da bacia estão associados à falta de saneamento básico, pesca predatória, ação criminosa de caçadores e retirada de madeira nativa. Na zona costeira, somam-se ainda a expansão urbana desordenada, a erosão costeira e a pressão das atividades turísticas, reconhecidas como alternativa econômica à crise da lavoura PPGGBCcacaueira na região (Viana, 2011). Para a bacia do rio Almada, foram descritas espécies de Gymnotiformes (Gymnotus bahianus Campos da-Paz e Costa, 1996), Siluriformes (Pareiorhaphis bahianus Gosline, 1947; Parotocinclus cristatus Garavello, 1977) e Characiformes (Astyanax vermilion e A. burgerai Zanata e Camelier, 2009). Mais ao sul, encontra-se a bacia do rio Jequitinhonha, com cerca de 70.315 km2. A maior parte da sua área está situada em uma das regiões mais secas do Estado de Minas Gerais, com precipitações médias anuais de 600 mm. A área restante situa-se na faixa litorânea mais úmida
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do sudeste da Bahia (Gonçalves, 1997). Na bacia, identifica-se o clima quente semiárido, de influência continental, e o quente subúmido, de influência marítima (CEMIG, 2015). Com uma extensão de 920 km, o rio Jequitinhonha nasce na Serra do Espinhaço, no município do Serro (Minas Gerais), a uma altitude de cerca de 1.200 m, e deságua no Oceano Atlântico no município de Belmonte, no litoral sul da Bahia (CEMIG, 2015). Assim como ocorre para a bacia do rio de Contas, a bacia do rio Jequitinhonha é dividida em Alto, Médio e Baixo Jequitinhonha. A atividade de mineração que se processa no Alto Jequitinhonha desde o início de sua ocupação é a principal responsável pela transformação do rio em um manancial extremamente raso e assoreado (MMA, 2006). O rio Jequitinhonha tem regime permanente, sendo abastecido por afluentes procedentes do sistema morfológico do Espinhaço, caracterizado como uma boa área armazenadora de água. Na região do baixo curso, por sua vez, os tributários são sobretudo periódicos, com regime torrencial na época das chuvas (Gonçalves, 1997). Na bacia, os reflexos da carência de conhecimento são a ausência de um inventário ictiofaunístico da bacia e o pequeno conhecimento sobre a biologia dos peixes, muitos dos quais endêmicos e/ou ameaçados de extinção (Andrade Neto, 2010; Rosa e Lima, 2008). A calha principal do rio Jequitinhonha reúne a maior parte do conhecimento disponível para a bacia. No entanto, uma fração ainda desconhecida dos peixes está localizada em seus tributários, e muitas questões taxonômicas sobre alguns grupos continuam indefinidas (Andrade Neto, 2010).
2.2. Considerações sobre a família Characidae e o gênero Nematocharax
A ictiofauna neotropical é dominada por peixes ostariofisianos (Characiformes, Siluriformes e Gymnotiformes), que correspondem a aproximadamente três quartos dos peixes de água doce do mundoPPGGBC (Hutchins et al., 2003; Albert et al., 2011). A Ordem Characiformes inclui 23 famílias e 2.081 espécies válidas (Eschmeyer e Fong, 2015). Seus membros ocorrem na África e nas Américas, desde o sudoeste dos Estados Unidos, estendendo-se pelo México, América Central e América do Sul (Oyakawa et al., 2006). Os peixes da Ordem Characiformes são caracterizados por possuírem escamas cobrindo todo o corpo, com exceção da cabeça; presença de uma nadadeira adiposa; raios das nadadeiras moles e pré-maxilar fixo ao crânio (não protrátil) (Oyakawa et al., 2006). As linhagens de Characiformes datam de mais de 100 milhões de anos, e evidências morfológicas e genéticas sugerem que grande parte da diversidade de espécies do grupo
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provavelmente se desenvolveu antes da separação dos continentes africano e sul-americano (Hutchins et al., 2003). A família Characidae é a maior e mais complexa dentre os Characiformes, com 1.086 espécies válidas, e inclui a maior parte dos peixes do Brasil (Nelson, 2006; Eschmeyer e Fong, 2015). Os representantes desse grupo apresentam diversas formas corporais, o que lhes permite ocupar diferentes habitats e desenvolver estratégias de vida variadas (Lowe-McConnell, 1999). Os caracídeos distribuem-se no continente americano, desde a fronteira Estados Unidos- México até o sul da Argentina, sendo especialmente diversos nas bacias do rio Amazonas, Orinoco e La Plata (Mirande, 2010). A grande e diversa família Characidae inclui muitos peixes que possuem importância como fonte de proteína animal e de renda para as populações humanas, assim como no mercado da aquariofilia (Nelson, 2006). Não há consenso sobre as relações filogenéticas entre as subfamílias de Characidae (Mirande, 2010), de modo que esta pode ser definida como um vasto grupo de peixes completamente heterogêneo e reconhecidamente não-monofilético, com muitos táxons considerados incertae sedis (Weitzman e Fink, 1983). Isso se deve sobretudo ao grande número de espécies incluídas nessa família, associado à imensa variedade de formas (Lucena, 1993). Pertencente à família Characidae, o gênero Nematocharax difere dos demais por apresentar longos e ramificados raios nas nadadeiras dorsal, anal e pélvicas; duas fileiras de dentes pré-maxilares nos adultos e uma fileira praticamente completa de dentes ao longo da borda maxilar ventral livre (Weitzman et al., 1986). Até recentemente, o gênero Nematocharax era composto por apenas uma espécie, N. venustus, descrita por Weitzman et al. (1986) para o rio Jequitinhonha, em Minas Gerais. Posteriormente, essa espécie também foi encontrada em rios costeiros de porte médio a grande no sudeste da Bahia e nordeste de Minas Gerais, desde o rio de Contas, ao norte, até o rio Jequitinhonha, ao PPGGBCsul, incluindo áreas de Mata Atlântica, Cerrado, Caatinga e zonas de transição (Menezes e Lima, 2008). No momento de sua descrição, as possíveis relações de Nematocharax foram amplamente discutidas (Weitzman et al., 1986), mas permanecem sem resolução (Menezes et al., 2015). Nematocharax venustus foi considerado por Mirande (2010) como grupo irmão dos gêneros Rhoadsia Fowler, 1911 e Carlana Strand, 1928 dentro da subfamília Rhoadsiinae, com base em análises filogenéticas e caracteres morfológicos. Thomaz et al. (2010), por sua vez, sugere que Nematocharax está incluso no clado C previamente definido por Javonillo et al. (2010), próximo a Hemigrammus erythrozonus Durbin, 1909. O clado C contém representantes
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de gêneros incertae sedis (por exemplo, Hyphessobrycon, Hemigrammus, Astyanax e Rachoviscus), bem como membros da subfamília Stethaprioninae. As inferências propostas por Thomaz et al. (2010) foram baseadas em cinco genes, sendo três mitocondriais (COI, ND2 e 16S) e dois nucleares (Sia e Trop), totalizando 2.719 pares de base (pb) e tendo como foco o gênero Hollandichthys Eigenmann 1909. Tagliacollo et al. (2012), buscando investigar a monofilia da subfamília Aphyocharacinae (Characidae), propõe que Nematocharax é grupo irmão de um clado composto por Hasemania sp. e Hemigrammus marginatus Ellis, 1911. Nematocharax venustus é um lambari que atinge pelo menos 15 cm de comprimento padrão e 25 g de peso corporal. Na espécie, destaca-se o dimorfismo sexual, uma vez que os machos apresentam as nadadeiras dorsal, anal e pélvicas com os primeiros raios alongados. Tipos de água em que a espécie foi encontrada variam desde escura (rio Una, alto rio de Contas, rio do Braço, entre outros) até águas barrentas, carregadas de silte, como as do rio Jequitinhonha (Menezes e Lima, 2008). Não existem dados sobre a biologia da espécie, que durante algum tempo foi considerada ameaçada de extinção, na categoria vulnerável (Machado et al., 2008). Na bacia do rio Jequitinhonha, N. venustus enfrenta problemas decorrentes de assoreamento, perda considerável de vegetação marginal, poluição, implantação de grandes barragens e introdução de espécies exóticas, como a Tilapia rendalii (Weitzman et al., 1986; Menezes e Lima, 2008). No entanto, em função das numerosas populações observadas nas bacias dos rios Cachoeira, Almada e Contas, a espécie deixou de ser considerada ameaçada de extinção. Recentemente, Bragança et al. (2013) descreveram uma nova espécie para o gênero: N. costai, restrita à sub-bacia do rio Gongogi, na região do baixo rio de Contas, na Bahia. Essa espécie foi descrita com base em espécimes do riacho Cambiriba, no Balneário Guaíra, município de Iguaí. Assim como para N. venustus, a identificação da espécie foi baseada na morfologia tradicional e não há conhecimento sobre aspectos biológicos. NematocharaxPPGGBC costai difere de seu único congênere pelo número de dentes maxilares dos machos adultos; ausência de ganchos e espínulas nas nadadeiras dorsal e pélvicas; cinco raios da nadadeira anal com espínulas; presença de uma marca horizontal longa rosa escura sobre o pedúnculo caudal; número de supraneurais e pelo filamento amarelo na nadadeira pélvica (Bragança et al., 2013). Esse relato trouxe uma série de dúvidas quanto ao status taxonômico das populações pertencentes ao gênero Nematocharax, principalmente na bacia do rio de Contas e adjacências, bem como suscitou a necessidade de uma revisão taxonômica para o gênero, a qual foi realizada por Menezes et al. (2015).
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Dados morfométricos e merísticos foram obtidos de espécimes de várias bacias hidrográficas ao longo da distribuição de N. venustus, revelando variação intraespecífica de caracteres entre populações geograficamente isoladas (Menezes et al., 2015). Segundo os autores, há uma ampla sobreposição de caracteres entre N. venustus e N. costai e, consequentemente, ausência de características morfológicas sustentando o reconhecimento de duas espécies no gênero. Assim, N. costai foi considerado sinônimo junior de N. venustus, que distribui-se amplamente nas bacias do rio de Contas, Cachoeira, Almada, Una, Pardo e Jequitinhonha. Desta forma, alguns caracteres utilizados para diferenciar as duas espécies correspondem a características sexuais secundárias em machos maduros, tais como presença de ganchos e espínulas em alguns raios das nadadeiras, bem como a forma e o tamanho das nadadeiras. Essas características dependem de muitos fatores e podem, por exemplo, variar sazonalmente (Menezes et al., 2015).
2.3. Estudos citogenéticos em Characidae
Na ictiofauna neotropical, a maioria das informações cromossômicas está concentrada nas ordens Characiformes e Siluriformes (Nirchio et al., 2014), as mais expressivas em número de espécies (Reis et al., 2003). Nesses grupos, as análises citogenéticas têm sido úteis, confirmando a ocorrência de unidades evolutivas únicas (Bertollo et al., 2000; Kantek et al., 2008; Bitencourt et al., 2011). No entanto, frente à diversidade de espécies na região neotropical e a falta de informações sobre a ictiofauna de determinadas localidades, como do Atlântico Leste do Brasil, muito ainda resta por fazer (Nirchio e Oliveira, 2006). Os Characiformes apresentam uma ampla variabilidade cariotípica (Artoni et al., 2000), sendo encontradas espécies com números diplóides que variam de 2n=28, como no gênero Hemigrammus, pertencentePPGGBC à família Characidae (Scheel, 1973), até 2n=102, como em Potamorhina altamazonica, da família Curimatidae (Feldberg et al., 1993; Artoni et al., 2000). De acordo com Arefjev (1990), o cariótipo ancestral dos Characiformes inclui 48-52 cromossomos relativamente pequenos, dos quais 10-12 são portadores de dois braços. Apesar da ausência de confirmação para essa hipótese, sabe-se que praticamente todos os cariótipos conhecidos de Characiformes podem ser formados a partir de tal complemento ancestral e que as inversões pericêntricas parecem ter desempenhado um papel fundamental na evolução cariotípica da ordem.
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Em Characiformes, são observados dois padrões de diversificação cromossômica. No primeiro grupo, como as famílias Erythrinidae e Characidae, pode-se encontrar uma grande variabilidade interpopulacional quanto ao número e estrutura cromossômica, provavelmente em decorrência de um estilo de vida mais sedentário, propiciando tal diversificação entre populações isoladas. No segundo grupo, destacam-se as famílias com uma pequena variação numérica e estrutural, como ocorre em Anostomidae e Prochilodontidae. Nesses grupos, a alta mobilidade e o hábito migrador podem contribuir para a maior homogeneização genética. Entretanto, mesmo em grupos com uma macroestrutura cariotípica mais conservada, a variabilidade pode se fazer presente na microestrutura (Artoni e Matiello, 2003). Com relação à família Characidae, a maior de Characiformes, os estudos citogenéticos tiveram início com o trabalho de Post (1965), o qual relatou os números cromossômicos para diversas espécies. A partir de então, a quantidade de dados citogenéticos para a família aumentou consideravelmente, refletindo a heterogeneidade do grupo. Oliveira et al. (1988) listaram espécies pertencentes a 46 gêneros de Characidae cujas informações a respeito do número haplóide e/ou diplóide e/ou fórmula cariotípica estão disponíveis, sendo possível observar a predominância de cariótipos com 2n=48 a 2n=52 cromossomos. Na família, pode-se destacar a presença de cromossomos supranumerários (Carvalho et al., 2008), como em Astyanax scabripinnis (Moreira-Filho et al., 2004) e Moenkhausia sanctaefilomenae (Foresti et al., 1989), bem como cromossomos sexuais, tal como verificado em espécies do gênero Triportheus (Artoni et al., 2001). Apesar da alta diversidade cromossômica, as espécies da família Characidae geralmente apresentam dois grandes cromossomos metacêntricos como o primeiro par do complemento (Scheel, 1973). A maioria dos estudos citogenéticos em Characidae e nos peixes em geral está restrita à identificação das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) e distribuição da heterocromatina constitutiva (Nirchio e Oliveira, 2006). As RONs sãoPPGGBC regiões cromossômicas envolvidas na transcrição de RNA ribossômico (RNAr) e que podem ser identificadas utilizando a técnica de impregnação por nitrato de prata (Ag-RON), de acordo com sua atividade na célula (Almeida-Toledo, 1998). Uma particularidade da técnica de Ag-RON é que a impregnação do nitrato de prata ocorre nas proteínas acídicas que se associam aos RNAr que são fabricados pelas sequências de DNA ribossômico (DNAr). Portanto, se um determinado organizador nucleolar não esteve em atividade de transcrição no momento imediatamente anterior ao da execução da técnica, não haverá marcação da Ag-RON (Kasahara, 2009).
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Dois padrões de distribuição das RONs são observados nos peixes. Alguns grupos apresentam cístrons ribossômicos localizados em um único par cromossômico (RONs simples), enquanto outros possuem sítios de RONs em vários cromossomos do cariótipo (RONs múltiplas) (Galetti Jr., 1998). Um único par de RONs é tido como caráter basal dos teleósteos (Hsu et al., 1975; Gornung, 2013). Adicionalmente, em espécies com RONs simples, variações no tamanho das RONs entre cromossomos homólogos são frequentemente encontradas (Wasko e Galetti Jr., 2000). Isso provavelmente ocorre em função de crossing-over desigual, duplicações regionais, transposições ou outros rearranjos (Galetti Jr. et al., 1995), resultando em um acúmulo de cópias desse DNAr em um dos cromossomos homólogos (Carvalho e Dias, 2007).
Em Characidae, é encontrada uma notável variabilidade no número e distribuição das RONs, permitindo a diferenciação entre espécies (Rubert e Margarido, 2007; Mendes et al., 2011) e entre populações de uma mesma espécie (Capistano et al., 2008; Peres et al., 2009). Assim como a técnica de Ag-RON, o bandamento C tem sido empregado nas análises citogenéticas, visando uma melhor caracterização dos cariótipos ao fornecer informações sobre localização, quantidade e possíveis variações nos padrões de heterocromatina constitutiva (Kasahara, 2009). A técnica envolve tratamentos ácido, básico e salino dos cromossomos. Dessa forma, as regiões heterocromáticas, por serem mais resistentes ao desgaste, permanecem relativamente intactas e mais fortemente coradas pelo Giemsa (Sumner, 1972; Jack et al., 1985). A presença de heterocromatina na região centromérica ou pericentromérica é uma característica praticamente universal dos vertebrados (Sumner, 2003). Vários grupos também apresentam heterocromatina associada às RONs e em posição terminal, o que parece contribuir para as altas taxas de rearranjos cromossômicos envolvendo os pares portadores dessas regiões (Martins e Wasko, 2004). Embora os métodosPPGGBC tradicionais forneçam uma série de informações importantes sobre a estrutura cromossômica dos organismos, particularmente daqueles ainda pouco estudados, a aplicação de metodologias modernas e avançadas é igualmente indispensável para uma caracterização aprofundada da diversidade intra e interespecífica. Assim, a associação da biologia molecular com a citogenética resultou em uma nova linha de pesquisa: a citogenética molecular, que passou a utilizar técnicas de manipulação do material genético associadas à detecção de sequências específicas de DNA. Além de fluorocromos base-específicos (Schmid, 1980), a citogenética molecular é baseada principalmente na técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH) (Pinkel et al., 1986).
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A coloração com fluorocromos base-específicos auxilia na determinação da natureza composicional das regiões heterocromáticas (isto é, AT- ou GC-ricas) (Almeida-Toledo, 1998), havendo uma forte correlação entre as marcações com cromomicina A3 (CMA3), fluorocromo GC-específico, e as RONs, como visto para diferentes grupos de Characidae (Kavalco et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2006; Santos et al., 2012). A hibridação fluorescente in situ, por sua vez, pressupõe a utilização de uma sonda de DNA marcada a ser hibridada sobre alvos citológicos (cromossomos metafásicos, núcleos interfásicos, fibras de cromatina descondensadas etc.). Essas sondas podem ser de segmentos específicos de cromossomos, tais como regiões teloméricas, centroméricas, ribossomais, DNA satélite, entre outros (Leitch et al., 1994). Esses resultados apresentam diversas aplicações em citotaxonomia, entendimento da estrutura cromossômica, mapeamento físico e diferenciação de genomas (Phillips e Reed, 1996; Martins e Wasko, 2004; Martins et al., 2004). Nos últimos anos, a localização de sequências de DNAr 18S e 5S tem sido rotineiramente empregada na citogenética de peixes. Esses dois genes estão organizados em duas famílias multigênicas distintas compostas por centenas a milhares de cópias. Uma família é representada pelo DNAr 45S, que codifica os RNAs ribossômicos 18S, 5.8S e 26S/28S e constitui as RONs, e a outra é representada pelo DNAr 5S, que codifica o RNAr 5S, um dos componentes da subunidade maior dos ribossomos. O arranjo do DNAr 5S consiste em sequências codificantes de 120 pb, separadas umas das outras por um DNA espaçador não transcrito (NTS) (Galetti Jr. e Martins, 2004). O uso da sonda de DNAr 5S em experimentos de FISH tem sido uma maneira de se identificar mais um marcador citológico para a caracterização cariotípica das espécies e populações (Kasahara, 2009). Provavelmente em função da própria natureza polifilética do grupo, na família Characidae são encontradas diferenças em relação ao número, localização e posição dos sítios de DNAr 18S e 5S (Peres et al., 2008). No entanto, observa-se uma predominância de sítios de DNAr 18S em posição terminalPPGGBC e sítios de DNAr em posição intersticial (Peres et al., 2008; Galetti Jr. e Martins, 2004; Martins e Wasko, 2004). Localização sintênica dos sítios de DNAr 18S e 5S também é encontrada, apesar de a localização cromossômica independente representar o cenário mais frequente, evitando interferências na harmonia desses sítios de múltiplas cópias (Martins e Galetti Jr., 1999; Galetti Jr. e Martins, 2004) Por fim, sabe-se que a definição de unidades evolutivamente significativas é de fundamental importância para uma adequada compreensão da diversidade biológica, tendo implicações diretas para a conservação (Aleixo, 2009). Nessa perspectiva, uma boa caracterização cromossômica de várias espécies, a evidência cariotípica para as suas relações
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evolutivas, o suporte adicional para a identificação de espécies taxonomicamente problemáticas e a obtenção de evidências sobre possíveis casos de espécies crípticas são algumas das contribuições concretas que a citogenética pode fazer para a taxonomia de peixes (Bertollo et al., 1986), contribuindo para uma melhor compreensão desta rica e complexa fauna.
2.4. Utilização do gene COI para identificação taxonômica em peixes
Os métodos históricos de identificação, nomenclatura e classificação das espécies são, em grande parte, baseados na morfologia. No entanto, a taxonomia também tem empregado muitas outras características, incluindo a anatomia interna, fisiologia, comportamento, genes, isoenzimas e geografia. Isso se deve às limitações intrínsecas aos sistemas de identificação baseados na morfologia externa, principalmente quando se trata de peixes (Ward et al., 2009). Como a taxonomia se baseia principalmente em caracteres morfológicos, acontece frequentemente que organismos morfologicamente indistinguíveis pertencem, de fato, a espécies diferentes. O não reconhecimento dessas espécies tem várias consequências, desde a subestimativa da biodiversidade real de cada local até a ameaça de extinção de espécies raras que podem não ser protegidas por serem morfologicamente iguais a outras espécies mais comuns (Frankham et al., 2008). Devido às dificuldades de identificação morfológica, técnicas alternativas, como as que envolvem análise de DNA, tornaram-se necessárias para a separação das espécies. Dessa forma, o termo recentemente introduzido “taxonomia integrativa” refere-se à taxonomia que integra todas as fontes de dados disponíveis para enquadrar os limites da espécie (Yeates et al., 2011). Uma abordagem para a diagnose da diversidade biológica é o sistema de identificação microgenômico baseado no gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI), proposto por Hebert et al. (2003) para todas as espécies animais. Esse método, denominado de DNA barcode ou PPGGBC“código de barras” de DNA, consiste em utilizar um pequeno fragmento de DNA (aproximadamente 650 pares de base) da região 5’ do gene mitocondrial COI para identificar os indivíduos, baseando-se no preceito de que a variação genética intraespecífica deve ser menor do que a interespecífica (barcode gap), determinando o sucesso do COI na separação de espécies (Meyer e Paulay, 2005; Hajibabaei et al., 2007). O COI destaca-se por apresentar regiões variáveis o suficiente para analisar grupos taxonomicamente relacionados (Sahls e Nyblom, 2000). O DNA mitocondrial (DNAmt) representa uma pequena fração do tamanho do genoma do organismo, com apenas 37 genes, e tem sido, de longe, o marcador mais utilizado para
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reconstrução de relações filogenéticas em vários níveis taxonômicos, de populações a filos, e resolução de incertezas taxonômicas (Gissi et al., 2008; Galtier et al., 2009). Isso se deve às característica peculiares do DNAmt, tais como: múltiplas cópias por organela, curto tamanho, padrão de herança uniparental, ausência ou baixa frequência de recombinação, taxa de evolução assimétrica entre diferentes regiões gênicas e ortologia severa (Elson e Lightowlers, 2006; Gissi et al., 2008). Portanto, a escolha do gene COI baseou-se nas características apresentadas pelo próprio genoma mitocondrial. Parte do êxito na escolha do COI como fragmento padrão se deve ao fato de que este gene pode ser facilmente isolado e analisado com primers universais bem estabelecidos, o que permite que ele seja amplificado para a maioria dos animais (Avise, 1991; Simon et al., 1994). Em 2004, foi lançado o CBOL (The Consortium for the Barcode of Life), uma iniciativa internacional dedicada ao desenvolvimento do DNA barcode como uma ferramenta padrão na taxonomia global. O CBOL atualmente compreende 200 organizações de 50 países e tem como principal objetivo promover o desenvolvimento das alianças internacionais de pesquisa necessárias para construir, ao longo dos próximos 20 anos, uma biblioteca de código de barras para toda a vida eucariótica (Waugh, 2007). Este volume potencial de dados motivou o desenvolvimento do BOLD (Barcode of Life Data Systems), uma base de dados de livre acesso e disponível online que permite a aquisição, armazenamento, análise e publicação de sequências barcode de animais, vegetais, fungos e protistas (Ratnasingham e Hebert, 2007). Similarmente, o GenBank contém sequências nucleotídicas publicamente disponíveis para quase 260 000 espécies formalmente descritas (Benson et al., 2013). Esse banco de dados genômicos foi criado e distribuído pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) e, por meio da sua ferramenta de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), é possível confirmar o fragmento do gene amplificado e identificar sequências similares. A bibliotecaPPGGBC barcode de referência para todas as espécies de peixes é denominada FISH- BOL (Fish Barcode of Life Campaign) (Ward et al., 2009). Desde a sua criação, em 2004, o FISH-BOL obteve mais de 100 mil sequências de DNA barcode de mais de 10 mil espécies de peixes. Em peixes, a técnica de DNA barcode tem se mostrado promissora tanto para identificar espécies já conhecidas (Pereira et al., 2011), mesmo as intimamente relacionadas, quanto espécies novas (Benine et al., 2009). Os trabalhos mostram o sucesso da técnica na identificação de espécies crípticas, estágios larvais, juvenis e ovos, indivíduos de ambos os sexos, indivíduos inteiros ou apenas fragmentos destes, além de espécies que apresentam plasticidade fenotípica,
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o que auxilia ecólogos, geneticistas, taxonomistas, além de órgãos envolvidos com controle de pragas, espécies invasoras e segurança alimentar (Hebert et al., 2003; Hebert e Gregory, 2005; Ward et al., 2009). Apesar do seu papel na identificação de amostras a nível de espécie, o DNA barcode não deve ser visto como substituto da análise taxonômica. Por exemplo, quando um espécime desconhecido não retorna estreita correspondência com os registros existentes na biblioteca de código de barras, a sequência barcode não qualifica esse espécime como uma nova espécie, de modo que a análise taxonômica torna-se necessária (Hajibabaei et al., 2007). Adicionalmente, no DNA barcode comumente utiliza-se um grande número de espécies e poucos espécimes (geralmente cinco indivíduos) e, muitas vezes, uma ou poucas localidades (Ward et al., 2009). Entretanto, essa amostragem é, em muitos casos, insuficiente para avaliar a diversidade genética de uma espécie (Zhang et al., 2010), pois pode subestimar as divergências intraespecíficas e superestimar as divergências interespecíficas, influenciando no barcode gap (Ortiz, 2010). Com relação à ictiofauna de água doce, o DNA barcode demonstrou que novas espécies podem ser facilmente diferenciadas de outras espécies congenéricas em virtude da elevada distância genética, como verificado nos gêneros Moenkhausia (Benine et al., 2009) e Tetragonopterus (Melo et al., 2011; Silva et al., 2013), ambos pertencentes à família Characidae. Ainda nessa família, os resultados de DNA barcode permitiram sugerir que Piabina argentea representa seis diferentes unidades biológicas, o que significa a presença de, pelo menos, cinco novas espécies (Pereira et al., 2011). Esse trabalho reforça que o DNA barcode revela a existência de grupos separados com baixa taxa de divergência ou radiação recente, e incentiva o uso dessa ferramenta como parte da descrição formal das espécies. O DNA barcode também mostrou-se uma ferramenta capaz de identificar acuradamente 58 espécies pertencentes a 40 gêneros na bacia do rio Paraíba do Sul, em São Paulo, revelando alta divergência genéticaPPGGBC entre coespecíficos de Characidium alipioi (10,2%) e Geophagus proximus (1,1%) e sinalizando a presença de possíveis novas espécies. Em um estudo mais abrangente, a metodologia de DNA barcode foi muito eficiente, permitindo uma correta identificação de 252 de 254 espécies analisadas (99,2%), o que mostra a utilidade da técnica em auxiliar na identificação de espécies de uma fauna complexa como a de peixes de água doce da região neotropical (Pereira et al., 2013). Mesmo em um gênero especioso, como Hyphessobrycon, o segundo maior dentro da família Characidae, o DNA barcode pode ser usado para discriminar espécies e identificar
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novas espécies, revelando que nem sempre é possível diferenciar espécies corretamente com base somente na morfologia (Paz et al., 2013). Dessa forma, percebe-se que a grande riqueza de espécies de peixes de água doce no Brasil e no mundo, o número insuficiente de taxonomistas e a ocorrência de espécies crípticas, complexos de espécies, entre outros fatores, contribuem para o impedimento taxonômico. Em vista disso, a resolução dessas questões é um passo fundamental para a ampliação do conhecimento sobre a biodiversidade e a adequada proteção desses organismos (Frankham et al., 2008).
2.5. Morfometria geométrica
A forma do corpo dos peixes é um importante caráter para a análise da evolução do grupo (Neves e Monteiro, 2003), podendo ser afetada por fatores genéticos e ambientais, ou pela interação entre ambos, e por variáveis como idade e tamanho (Wimberger, 1992). Diante disso, questões relacionadas às variações de forma e tamanho nos organismos envolvem os processos evolutivos ligados ao surgimento das espécies, os processos fisiológicos e energéticos próprios de cada uma delas e o entendimento de sua ecologia e distribuição (Moraes, 2003). Historicamente, tanto a classificação taxonômica quanto o entendimento da diversidade de organismos basearam-se em descrições morfológicas. Contudo, no início do século XX, a biologia começou uma transição do campo descritivo para o campo quantitativo (Bookstein, 1998). Com isso, os estudos morfológicos passaram a incluir dados quantitativos de uma ou mais características, que eram resumidas como valores médios e comparadas entre os grupos (Bumpus, 1898). Em meados do século XX, a descrição quantitativa da morfologia foi combinada com análises estatísticas para descrever padrões de variação de forma dentro e entre os grupos, e assim o moderno campo da morfometria começou (Adams et al., 2004). Durante muitoPPGGBC tempo, o termo morfometria foi utilizado para definir qualquer estudo que analisava quantitativamente a variação da morfologia encontrada nos organismos (Monteiro e Reis, 1999). Inicialmente, esses estudos eram feitos por meio de comparações de várias medidas, uma a uma. Entretanto, notou-se que várias medidas que descreviam uma estrutura não eram suficientes para descrever a forma como um todo, uma vez que os organismos são multidimensionais (Moraes, 2003). Assim, com o desenvolvimento de computadores e pacotes estatísticos, houve o surgimento de uma área de pesquisa na fronteira entre a biologia, a estatística e a geometria, denominada de morfometria geométrica (Monteiro e Reis, 1999; Rohlf e Marcus, 1993).
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A morfometria geométrica começou a ser mais amplamente utilizada no início dos anos 90, sendo capaz de estudar a forma e o tamanho dos organismos por meio de análises robustas e ferramentas gráficas que quantificam e permitem a visualização da variação morfológica intra e interespecífica (Adams et al., 2013). Portanto, é possível descrever e localizar mais claramente as regiões de mudanças na forma. Na morfometria geométrica, uma grande variedade de dados pode ser utilizada. No entanto, os mais ricos em informação são os landmarks ou marcos anatômicos (Monteiro e Reis, 1999), pontos cujas comparações são consistentes com as regras da homologia e que têm definições anatômicas confiáveis (Bookstein et al., 1985). Homologia, neste caso, significa correspondência biológica da posição de marcos de forma para forma (Sneath e Sokal, 1973), ou seja, o grau de “igualdade” ou correspondência entre partes. Estabelecer a homologia entre os marcos é importante para assegurar uma interpretação biológica dos resultados. Segundo a classificação de Bookstein (1991), os marcos anatômicos podem ser divididos em três tipos: (1) tipo 1 (justaposição de tecidos): pontos no espaço onde três estruturas se encontram; (2) tipo 2 (pontos de máxima curvatura): extremidades de processos e vales de invaginações (menos confiáveis e devem ser evitados); e (3) tipo 3 (pontos extremos): pontos relacionados à maior distância que pode ser medida em uma estrutura (considerados potencialmente deficientes quanto à homologia). Existem casos em que as estruturas biológicas não apresentam um número suficiente de marcos anatômicos identificáveis. Nesses casos, a forma pode ser descrita com base em uma sequência de pontos sem correspondência biológica (isto é, homologia) entre espécimes ao longo do contorno da estrutura ou organismo de interesse (Monteiro e Reis, 1999). Os marcos anatômicos capturam as localizações das características anatômicas, de modo que as diferenças em suas posições relativas indicam diferenças de forma entre os espécimes (Valentin et al., 2008). Diferenças na forma podem indicar diferentes papéis funcionais desempenhados pelasPPGGBC mesmas partes, diferentes respostas às mesmas pressões seletivas (ou diferenças nas próprias pressões seletivas), bem como diferenças nos processos de crescimento e morfogênese. Assim, a análise da forma é uma abordagem que permite a compreensão dessas diversas causas de variação e transformação morfológica (Adams et al., 2004; Zelditch et al., 2004). Os dados primários utilizados na morfometria geométrica são as coordenadas cartesianas (duas ou três dimensões) (Monteiro e Reis, 1999), que devem ser registradas de modo que não sejam afetadas pela variação na localização, orientação e escala do espécime (Rohlf, 2000).
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Diferentemente da morfometria geométrica, na morfometria linear os dados primários não são coordenadas cartesianas, mas sim distâncias, índices ou ângulos. Esses métodos raramente preservam as relações geométricas do objeto de estudo, o que dificulta enormemente a visualização das mudanças de forma. Como consequência, a geração de gráficos ou a visualização dos resultados geralmente são feitas por meio de tabelas pouco intuitivas. Outra importante diferença surge em relação à padronização das variáveis. Embora as distâncias sejam independentes da posição e orientação do objeto do qual são obtidas, não permitem remoção dos efeitos de escala/tamanho, o que é possível na morfometria geométrica em função da sobreposição de Procrustes (Benítez e Puschel, 2014). Assim, remove-se os efeitos da variação de tamanho nos dados, de modo que as diferenças observadas podem ser atribuídas somente à forma. A sobreposição de Procrustes, ou sobreposição generalizada por quadrados mínimos (Rohlf, 1999), transforma uma configuração de marcos por meio de translação, proporcionalização e rotação, a fim de que a soma dos quadrados das distâncias entre os pontos correspondentes seja a menor possível (Monteiro e Reis, 1999). Como variável de tamanho padrão em todas as análises geométricas, utiliza-se o tamanho do centróide, que corresponde ao ponto médio ou centro de massa. Isso se justifica pelo fato de o tamanho do centróide ser a única variável de tamanho que é matematicamente independente da forma, quando o modelo nulo da alometria (ausência de correlação da forma com o tamanho) é verdadeiro (Monteiro e Reis, 1999). Na morfometria geométrica, as coordenadas cartesianas resultantes da sobreposição de Procrustes podem ser sujeitas a análises estatísticas variadas. Dentre as mais utilizadas, estão as análises de componentes principais e de variáveis canônicas. Ambas apresentam os mesmos objetivos fundamentais: reduzir a dimensionalidade e a explicação da variação morfológica em um menor número de variáveis (Monteiro e Reis, 1999). Adicionalmente,PPGGBC um dos métodos mais empregados na morfometria geométrica para avaliar e visualizar mudanças em configurações de pontos de referências é o de funções de deformação de placas finas (thin plate splines) (Bookstein, 1989). Estas funções, baseadas em um modelo físico de deformação de uma placa de metal de espessura desprezível e infinitamente grande, permitem descrever as diferenças entre duas conformações de pontos como uma deformação contínua. Na prática, é como se em uma placa de metal fossem marcados pontos de referência da forma a ser comparada. Esta placa é então deformada de modo que os seus pontos se encaixem sobre os pontos da forma a qual está sendo comparada. A força feita para deformar a placa é uma quantificação das diferenças entre as formas, sendo que formas
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similares necessitarão de pouca deformação, e, portanto, pouca energia envolvida, enquanto formas muito divergentes envolverão uma quantidade maior de energia para realizar a deformação (Monteiro e Reis, 1999; Francoy, 2007). Atualmente, com o avanço dos computadores e a disponibilidade de softwares cada vez mais completos, a morfometria geométrica tem se mostrado extremamente promissora, revelando uma grande capacidade de reconhecer as diferenças entre os grupos, inclusive em peixes (Klingenberg et al., 2003; Chakrabarty et al., 2010; Aguilar-Medrano, 2013; Bichuette et al., 2014; Ornelas-García et al., 2014). Em seu trabalho sobre radiações adaptativas em ciclídeos africanos, Clabaut et al. (2007) descreveram, por meio da morfometria geométrica, a forma do corpo de mais de 1.000 espécimes, com foco no Lago Tanganyika, concluindo que a forma do corpo dos peixes é fortemente influenciada pelas preferências alimentares (nicho trófico) e profundidade em que as espécies ocorrem. Langerhans et al. (2003), estudando duas espécies de peixes neotropicais, verificaram que ambas as espécies apresentam diferenças morfológicas, sobretudo quanto à orientação da boca e posição da profundidade máxima do corpo, entre populações provenientes de ambientes lóticos e populações de ambientes lacustres. De acordo com os autores, os padrões morfológicos observados são consistentes com os princípios morfológicos funcionais, sugerindo divergência adaptativa entre populações da mesma espécie. Em peixes, a morfometria geométrica também tem sido frequentemente utilizada em associação com estudos ecológicos (Santos e Araújo, 2014), taxonômicos (Ibãnez et al., 2007; Sidlauskas et al., 2011), filogenéticos (Nunes et al., 2008; Vergara-Solana et al., 2014), citogenéticos (Lima-Filho et al., 2012; Jacobina et al., 2013; Castro et al., 2014), moleculares (Tancioni et al., 2013; Valentin et al., 2014), entre outros. Assim, a morfometria geométrica tem se mostrado uma técnica de grande alcance e extensão, permitindo que variações morfológicas entrePPGGBC espécies e entre populações de uma mesma espécie possam ser avaliadas com mais precisão mediante o processamento digital de imagens e análises multivariadas.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar a diversidade do gênero Nematocharax por meio de marcadores cromossômicos, moleculares e morfométricos a fim de auxiliar na taxonomia e estimar a diversidade do grupo.
3.2. Objetivos específicos
Definir o número diplóide e a fórmula cariotípica das populações; Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva e localização de sítios ativos de RONs a partir, respectivamente, de técnicas de bandamento C e impregnação por nitrato de prata; Avaliar a composição de regiões heterocromáticas por meio de coloração com
fluorocromos base-específicos (CMA3/DA/DAPI); Determinar a localização precisa de sequências repetitivas dos genes ribossomais 18S e 5S por meio da técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH); Amplificar e sequenciar o gene mitocondrial Citocromo C Oxidase I (COI) de representantes do gênero; Testar a eficácia do DNA barcode na identificação de representantes do gênero; Comparar morfometricamente os exemplares, estabelecendo o grau de diferenciação interpopulacional; Estimar a diversidade intraespecífica do grupo e identificar eventuais unidades evolutivas únicas ou espécies crípticas; Inferir sobre os processos de origem e diversidade do grupo, caso presentes, e suas implicaçõesPPGGBC para a conservação da ictiofauna de bacias costeiras do Atlântico Leste.
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4. CAPÍTULO 1: Variabilidade cromossômica entre populações alopátricas de Nematocharax venustus (Actinopterygii, Characiformes) revelada pela análise da fração repetitiva do genoma
Chromosomal variability between allopatric populations of Nematocharax venustus (Actinopterygii, Characiformes) revealed by analysis of repetitive genome fraction
Artigo a ser submetido à revista Cytogenetic and Genome Research
Silvia Britto Barretoa, Marcelo de Bello Cioffib, Aline Souza Medradoc, André Teixeira da Silvad, Paulo Roberto Antunes de Mello Affonsoa, Débora Diniza aDepartamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, Bahia; bDepartamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, São Paulo; cDepartamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia; dDepartamento de Zoologia, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Rio Claro, São Paulo
Enviar correspondência para Débora Diniz. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Av. José Moreira Sobrinho, s/n, Jequiezinho, Jequié, Bahia, Brasil. CEP: 45.206-190. Tel: +55 73 3528-9661. Fax: +55 3525-6683. E-mail: [email protected]
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Resumo
Dentre os Actinopterygii de água doce, a ordem Characiformes é a mais estudada do ponto de vista citogenético. Entretanto, muitos grupos ainda não dispõem de informações básicas acerca de seu cariótipo, como, por exemplo, o gênero Nematocharax. Neste trabalho, está sendo feita a primeira descrição cariotípica para N. venustus, por intermédio de uma análise cromossômica comparativa entre diferentes populações alopátricas, utilizando distintos métodos de coloração e hibridação fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNAs repetitivos (DNAr 18S e 5S), com o intuito de identificar possíveis diversificações populacionais, contribuindo com os estudos taxonômicos e biogeográficos em Nematocharax. Todos os indivíduos analisados apresentaram um 2n=50 cromossomos, com fórmula cariotípica composta por 8m+26sm+14st+2a (NF=98), independentemente do sexo ou localidade. A heterocromatina mostrou-se distribuída preferencialmente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos e a coloração com fluorocromos base-específicos demonstrou um único par de + cromossomos com marcações Cromomicina A3 (CMA3 ), coincidentes com as RONs. Entretanto, uma considerável variação na distribuição de sequências repetitivas foi observada entre as populações, especialmente em relação ao DNAr 5S, que se mostrou o caráter mais variável. Portanto, apesar das características macroestruturais compartilhadas, marcadores cromossômicos específicos para cada população foram identificados. De fato, os pequenos caracídeos apresentam um ciclo de vida rápido e uma taxa de dispersão bastante restrita, fatores estes que auxiliam na evolução particular de alguns caracteres em cada uma das populações, evidenciando a presença de unidades evolutivas únicas no gênero Nematocharax. Esses dados reforçam que Nematocharax venustus representa um conjunto de formas crípticas.
Palavras-chave: Citogenética de populações, DNAr 18S, DNAr 5S, FISH, peixes. PPGGBC
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Abstract
Among the freshwater Actinopterygii, the Characiformes is the most studied by the cytogenetic viewpoint. However, we still do not have basic information about many groups’ karyotype, for example, the Nematocharax genus. In this work, the first karyotype description is made for N. venustus through a chromosomal comparative analysis between different allopatric populations using various staining methods and fluorescence hybridization in situ (FISH) with repetitive DNA probes (rDNA 5S and 18S) in order to identify possible population diversification, contributing to the taxonomic and biogeographic studies in Nematocharax. All individuals analyzed presented a 2n=50 chromosomes with karyotype formula composed of 8m+26sm+14st+2a (NF=98), regardless of sex or location. Heterochromatin was found to be distributed preferably in the pericentromeric region of most chromosomes and staining with base-specific fluorochrome showed a single pair of chromosomes with markings Chromomycin + A3 (CMA3 ), coinciding with the NORs. However, a considerable variation in the distribution of repetitive sequences was found between populations, especially in relation to the 5S rDNA, which showed a more variable character. Therefore, despite the shared macro-structural characteristics, specific chromosomal markers for each population were identified. In fact, small characins have a quick life cycle and a very limited dispersion rate, factors that facilitate the particular evolution of some features in each of the populations, indicating the presence of unique evolutionary units in the Nematocharax genus. These data reinforce that Nematocharax venustus represents a set of cryptic forms.
Key Words: Population cytogenetics, 18S rDNA, 5S rDNA, FISH, fishes.
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Introdução
A ictiofauna de água doce Neotropical destaca-se pela riqueza, complexidade e alto grau de endemismo (Vari e Malabarba 1998). Dentre os seus principais representantes, estão os peixes da família Characidae, com 1.086 espécies válidas (Eschmeyer e Fong 2015). Entretanto, em função das incertezas taxonômicas e filogenéticas, muitos gêneros dessa família são considerados incertae sedis (Weitzman e Fink 1983). Adicionalmente, a ocorrência de complexos de espécies e/ou espécies crípticas dificulta a adequada caracterização da diversidade da ictiofauna (Medrado et al. 2008; Kavalco et al. 2009; Castro et al. 2014a). Dessa forma, os dados citogenéticos obtidos em peixes têm fornecido informações valiosas sobre as relações entre os grupos, permitindo realizar caracterizações cariotípicas de diversas espécies e populações (Blanco et al. 2010; Almeida et al. 2013; Piscor et al. 2015), especialmente em grupos taxonomicamente controversos (Bellafronte et al. 2011; Mendes et al. 2011). Por meio de novos marcadores cromossômicos, pode-se identificar polimorfismos populacionais e unidades evolutivas únicas (Souza et al. 2007; Bitencourt et al. 2011), mesmo em grupos de difícil distinção por caracteres morfológicos (Pazza e Kavalco 2007; Utsunomia et al. 2014). O gênero Nematocharax era, até recentemente, considerado um gênero monotípico de Characidae, composto apenas por N. venustus (Weitzman et al. 1986), originalmente descrita para a bacia do rio Jequitinhonha. No entanto, Bragança et al. (2013) descreveram uma segunda espécie, N. costai, para a bacia do rio de Contas, gerando controvérsias com relação ao status taxonômico das populações pertencentes ao gênero Nematocharax e impondo a necessidade de revisão dos caracteres diagnósticos para ambas as espécies. Diante disso, Menezes et al. (2015) analisaram dados merísticos, morfométricos, osteológicos e de coloração de espécimes de várias bacias hidrográficas ao longo da distribuição de N. venustus, denominando então N. costai como sinonímiaPPGGBC júnior de N. venustus. Segundo os autores, a comparação detalhada entre as duas espécies revelou ampla sobreposição de caracteres morfológicos, sustentando que Nematocharax seja um gênero monotípico. Nesse contexto, este estudo apresenta uma análise cromossômica comparativa entre diferentes populações alopátricas de N. venustus, incluindo aquelas prematuramente identificadas como N. costai. Distintos métodos de coloração e bandamento (Giemsa convencional, bandamento C, impregnação por nitrato de prata e fluorocromos base- específicos) e hibridação fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNAs repetitivos (DNAr 18S e 5S) foram empregados com o intuito de identificar a estrutura cariotípica do grupo e
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possíveis diversificações populacionais. Esses dados visam contribuir com os estudos taxonômicos em Nematocharax e inferir sobre a biodiversidade e história biogeográfica da ictiofauna da região hidrográfica do Atlântico Leste.
Material e Métodos
Foram coletados 71 machos e 68 fêmeas de N. venustus em sete localidades nas bacias do rio de Contas, Almada e Jequitinhonha, localizadas nos Estados da Bahia e Minas Gerais (Brasil) (fig. 1). Os dados referentes aos pontos de coleta e amostragem dos exemplares estão reunidos na Tabela 1. Os espécimes testemunho foram depositados na coleção do Museu de Zoologia da Universidade Federal da Bahia (MZUFBA) e na coleção ictiológica do Laboratório de Ecologia da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Brasil. A licença para coleta de material ictiológico foi concedida pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), por meio do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO; número da licença: 39728-1). Após acondicionamento e aclimatação dos indivíduos em aquários aerados, foi realizada a estimulação mitótica com a aplicação intraperitoneal de solução de fermento biológico (Lee e Elder 1980). Após 48-72 h, os cromossomos mitóticos foram obtidos por meio das técnicas de Netto et al. (2007) e Blanco et al. (2012). Os procedimentos e a eutanásia foram autorizados pelo Comitê de Ética (CEUA/UESB) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (processo número 32/2013). Os cromossomos foram classificados como metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), de acordo com Levan et al. (1964), e organizados no cariótipo em ordem decrescente de tamanho. As regiões PPGGBC organizadoras de nucléolo ativas (Ag-RONs) foram evidenciadas pela coloração com solução aquosa de nitrato de prata (Howell e Black 1980) e o padrão de distribuição da heterocromatina pelo bandamento C (Sumner 1972). Os sítios cromossômicos ricos em pares de bases (pb) GC e AT foram analisados por meio da tripla coloração com fluorocromos base-específicos cromomicina A3 (CMA3), distamicina (DA) e 4',6-diamidino-2- fenilindole (DAPI), segundo Schweizer (1980). Duas sequências de DNAs repetitivos, isoladas diretamente do genoma de Hoplias malabaricus Bloch, 1794, foram utilizadas. A primeira sonda incluiu cópias repetidas de DNAr 5S, contendo 120 pb do gene codificante (DNAr 5S) e 200 pb do espaçador não-transcrito
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(NTS) (Martins et al. 2006). A segunda sonda correspondeu a um segmento de 1.400 pb do gene do RNAr 18S, obtido por PCR a partir do DNA nuclear (Cioffi et al. 2009). Todas estas sondas foram clonadas em vetores plasmidiais e propagadas em células competentes de Escherichia coli DH5α (Invitrogen, San Diego, CA, USA). As sondas de DNAr 5S e 18S foram marcadas por nick-translation com biotina-14-dATP e digoxigenina-11-dUTP, de acordo com especificações do fabricante, respectivamente (Roche, Mannheim, Germany). A hibridação fluorescente in situ (FISH) foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986), utilizando duas sondas simultaneamente (double-FISH) e sob condição de alta estringência (77%). Os cromossomos metafásicos foram incubados com RNAse (40 µg/ml) por 1 hora a 37°C. Após a desnaturação do DNA cromossômico em formamida 70% e 2 × SSC a 70°C, as preparações foram incubadas em 2 × SSC por 4 minutos a 70°C. A mistura de hibridação (100 ng da sonda desnaturada, 10 mg/ml de sulfato de dextrano, 2 × SSC e formamida 50% em um volume final de 30 µl) foi aplicada sobre as lâminas e a hibridação foi realizada durante uma noite a 37°C, em uma câmara úmida contendo 2 × SSC. Duas lavagens pós-hibridação foram realizadas em um agitador (150 rpm) a 37°C, a primeira em 2 × SSC por 5 min, e a segunda em 1 × SSC por 5 min. Avidina-FITC (Sigma, St. Louis, MO, USA) foi utilizada para a detecção do sinal da sonda de DNAr 5S e anti-digoxigenina rodamina (Roche, Mannheim, Germany) foi usada para detectar as sondas de DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com DAPI (1,2 µg/ml) em solução de Antifading (Vector, Burlingame, CA, USA) e analisados em um microscópio de epifluorescência Olympus BX50 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japan). As imagens foram capturadas utilizando o programa CoolSNAP-Pro (Media Cybernetics).
Resultados
Todos os indivíduos analisados apresentaram 2n=50 cromossomos, com fórmula cariotípica compostaPPGGBC por 8m+26sm+14st+2a (NF=98), independentemente do sexo ou localidade (fig. 2). A heterocromatina C-positiva mostrou-se distribuída preferencialmente na região pericentromérica da maioria dos cromossomos. Blocos heterocromáticos terminais também foram visualizadas em alguns pares (fig. 3). A caracterização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), utilizando a técnica de impregnação por nitrato de prata, evidenciou a presença de RONs simples. Todas as populações apresentaram um par cromossômico marcado na região distal do braço curto, sendo este um submetacêntrico (par 8) na maioria das populações, um submetacêntrico menor (par 10) na
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população do Jequitinhonha 2 e o primeiro par subtelocêntrico (par 18) na população do Alto Contas (fig. 4). No caso das populações do rio Almada, Gongogi 2 e 3, Jequitinhonha 2 e Alto Contas, as RONs mostraram-se intercaladas com blocos heterocromáticos visualizados pelo bandamento C. A coloração com fluorocromos base-específicos demonstrou um único par de cromossomos com marcações CMA3 positivas e DAPI negativas, todas coincidentes com as RONs (fig. 4). Por meio da FISH, foi possível confirmar a presença de RONs simples para a maioria das populações, exceto para Jequitinhonha 2, que apresentou uma região adicional de DNAr 18S em apenas um cromossomo sm. A técnica também permitiu verificar a existência de quatro padrões de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S (fig. 4). O primeiro, compartilhado pelas populações do Almada, Gongogi 1 e Jequitinhonha 1, apresenta sítios de DNAr 18S localizados na região distal do braço curto de um par sm, coincidentes com as Ag-RONs (par 8), e sítios de DNAr 5S em dois pares: um sm (par 16) e um st (par 21), ambos na região intersticial do braço curto. A população do Gongogi 3 se diferencia por apresentar heteromorfismo no par 16, portador dos sítios de DNAr 5S, localizados na porção intersticial do braço curto de um cromossomo e na região pericentromérica do seu homólogo (fig. 4). O segundo padrão foi encontrado na população do Gongogi 2, que se diferencia das anteriores por apresentar sítios de DNAr 5S apenas no par sm (par 16), também na região intersticial do braço curto (fig. 4). Com relação ao terceiro padrão, este mostrou-se exclusivo da população do Jequitinhonha 2, onde foi detectada marcação bitelomérica do DNAr 18S em um cromossomo do par 10, bem como a localização sintênica dos genes 18S e 5S em um dos cromossomos do par 12. O sítio de DNAr 18S está presente na região distal e o de DNAr 5S na região intersticial do braço curto, próximo ao centrômeroPPGGBC (fig. 4). O quarto padrão, verificado na população do Alto Contas, apresenta sítios de DNAr 18S na região distal do braço curto de um par st (par 18) e sítios de DNAr 5S no braço curto de um par sm (par 15), em posição intersticial (fig. 4). Em adição, heteromorfismo de tamanho entre sítios de DNAr 18S de cromossomos homólogos foram identificados, como nas populações do Almada e do Alto Contas (fig. 4).
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Discussão
Apesar de Characiformes ser o grupo de peixes neotropicais mais estudado do ponto de vista citogenético (Nirchio et al. 2014), várias espécies e mesmo gêneros permanecem sem informações básicas acerca de seu cariótipo, como Nematocharax. Assim, os resultados apresentados nesse trabalho representam as primeiras informações citogenéticas sobre o gênero, os quais revelaram padrões cromossômicos peculiares. Assim como observado em outros representantes incertae sedis de Characidae, como Astyanax mexicanus (Kirby et al. 1977), A. scabripinnis (Moreira-Filho e Bertollo 1991), Hasemania nana (Moreira et al. 2007), Hyphessobrycon anisitsi (Mendes et al. 2011) e Hollandichthys multifasciatus (Balen et al. 2013), N. venustus compartilha o número diplóide de 2n=50. Adicionalmente, Nematocharax apresenta um par metacêntrico grande como o primeiro do complemento, caráter considerado plesiomórfico para a família (Scheel 1973; Morelli et al. 1983). Todas as quatro classes cromossômicas estão presentes no complemento cariotípico do gênero, com uma predominância de cromossomos submetacêntricos e número reduzido de acrocêntricos, o que reflete o alto número fundamental encontrado. Apesar dessas similaridades macrocariotípicas entre as populações analisadas, com características compartilhadas por outros Characidae, diferenças microestruturais foram relevantes para discriminá-las, principalmente no que se refere às populações do Jequitinhonha 2 e Alto Contas. Ainda que a presença de sítios ativos de DNAr intercalados com segmentos ricos em GC + (CMA3 ) tenha sido observada para a maioria das populações de N. venustus, os indivíduos do Jequitinhonha 2 apresentaram RONs adicionais inativas identificadas por FISH, caracterizando um sistema múltiplo. A posição dos sítios de DNAr 18S também pode constituir um importante marcador citotaxonômico que diferencia a população do Alto Contas das demais. Enquanto as RONs foram detectadasPPGGBC no primeiro par st nessa população, o par portador de RONs é do tipo sm nas amostras das demais localidades (fig. 4). De fato, a família Characidae apresenta uma ampla variação quanto ao número e localização das RONs (Galetti Jr. 1998), sendo que a presença de um único par portador de RONs tem sido considerada uma característica basal dos teleósteos (Hsu et al. 1975; Gornung 2013). Alguns gêneros de Characidae que compartilham a presença de um sistema de RONs simples são Tetragonopterus (Alberdi e Fenocchio 1997), Moenkhausia (Portela-Castro e Júlio Jr. 2002), Bryconamericus (Paintner-Marques et al. 2003) e Piabina (Pazian et al. 2012). No entanto, a maioria das espécies dessa família tende a apresentar RONs múltiplas, principalmente
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aquelas do gênero Astyanax (Kavalco e Moreira-Filho 2003; Pamponet et al. 2008; Vicari et al. 2008; Medrado et al. 2012; Yano et al. 2014). Assim como os sítios de DNAr 18S, diferenças no padrão de distribuição de heterocromatina podem auxiliar na distinção entre espécies e populações de peixes (Galetti Jr. et al. 1991; Mizoguchi e Martins-Santos 1998; Mantovani et al. 2000; Bitencourt et al. 2011). A presença de cromossomos marcadores identificados por bandamento C é particularmente útil na diferenciação de cariótipos com macroestrutura similar (Martinez et al. 1989; Aguilar e Galetti Jr. 1997; Jacobina et al. 2009; Kasahara 2009), como é o caso de N. venustus. Contudo, as populações analisadas revelaram blocos de heterocromatina basicamente restritos à região centromérica ou pericentromérica e associados às RONs, como comumente relatado em peixes e outros animais (Imai 1991; Feldberg et al. 1999; Aguilar & Galetti Jr. 2008; Rosa et al. 2009). Assim, a análise da heterocromatina mostrou-se pouco informativa para avaliar diferenças interpopulacionais em Nematocharax. Do mesmo modo, marcações CMA3 positivas coincidentes com os sítios de Ag-RONs (fig. 4) são frequentemente relatadas em peixes (Kavalco et al. 2005; Das e Khuda-Bukhsh 2007; Fernandes e Martins-Santos 2006; Verma et al. 2011; Santos et al. 2012). Em Characidae, a ocorrência de uma grande variação no número, localização e posição dos sítios de DNAr 18S e 5S pode ser um reflexo da natureza polifilética desse grupo (Peres et al. 2008). Essa situação é bem ilustrada pelos resultados da FISH neste trabalho, principalmente com relação à distribuição do DNAr 5S. O gene 18S é transcrito pela enzima RNA polimerase I, enquanto o gene 5S é transcrito pela RNA polimerase III. Por conta dessa divergência funcional e evolução independente, especula-se que a distância física entre os sítios de DNAr 18S e 5S seria vantajosa, evitando, por exemplo, translocações indesejadas (Drouin e Moniz de Sá 1995; Martins e Galetti Jr. 1999; Martins e Galetti Jr. 2000). De fato, na maioria das espécies, os sítios de DNAr 18S e 5S geralmente localizamPPGGBC-se em pares cromossômicos diferentes (Galetti Jr. e Martins 2004). No entanto, em alguns grupos, tal como verificado neste trabalho para a população do Jequitinhonha 2 por meio da técnica de double-FISH, os genes de DNAr 18S e 5S ocorrem em condição sintênica. Resultado semelhante foi encontrado em outros gêneros de Characiformes, tais como Astyanax (Almeida-Toledo et al. 2002; Santos et al. 2013; Castro et al. 2014b), Prochilodus (Vicari et al. 2006; Jesus e Moreira-Filho 2003; Hatanaka e Galetti Jr. 2004) e Triportheus (Diniz et al. 2009; Marquioni et al. 2013), bem como na espécie H. malabaricus (Cioffi et al. 2009). Vale ressaltar que na população do Jequitinhonha 2, o par da RON é, preferencialmente, o par 10. Dessa forma, o cromossomo com sintenia dos DNAr 18S e 5S
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pode ter perdido essa função gênica por conta da troca desigual ocorrida. Este evento também pode ter sido responsável pela ausência de visualização do sinal de hibridação em seu homólogo. Adicionalmente, a localização de sítios de DNAr 18S nas regiões terminais dos cromossomos é extremamente comum em peixes, representando uma condição importante. Isso porque permite, por exemplo, que rearranjos ocorram sem alterar outras ligações genéticas no cariótipo (Hanson et al. 1996), bem como promove a realocação do material genético devido à proximidade dos telômeros com o núcleo interfásico (Gornung 2013). Desta forma, um evento de translocação pode explicar a marcação bitelomérica do DNAr 18S em um cromossomo sm na população do Jequitinhonha 2, o que não foi detectado pela impregnação por nitrato de prata. Assim como descrito para a sintenia, sítios de DNAr 18S localizados em ambos os telômeros também já foram verificados em Astyanax fasciatus (Fernandes et al. 2009), A. scabripinnis (Malacrida et al. 2003; Mantovani et al. 2005), A. hastatus (Kavalco et al. 2009) e H. malabaricus (Cioffi et al. 2009; Gemi et al. 2014). Com relação aos sítios de DNAr 5S, na maioria das espécies de peixes estes se apresentam em posição intersticial nos cromossomos (Martins e Galetti Jr. 2001), o que foi verificado nas populações analisadas nesse trabalho. Esta condição é frequentemente reportada em peixes e parece reduzir as chances de transposição quando comparados ao DNAr 18S, o qual geralmente localiza-se em regiões terminais e heterocromáticas com maior capacidade de dispersão genômica (Martins e Wasko 2004). No entanto, no caso da população do Gongogi 3, uma inversão pericêntrica envolvendo a região portadora do sítio de DNAr 5S pode ter ocorrido em um dos homólogos do par sm, resultando em uma alteração na morfologia do cromossomo e na posição do cístron (fig. 3). Esse resultado mostra a importância do mapeamento físico de regiões gênicas na detecção de rearranjos cromossômicos que de outra forma permaneceriam ocultos. Adicionalmente, a presença de um único par cromossômico portador de DNAr 5S, como visualizado em GongogiPPGGBC 2 e Alto Contas, provavelmente representa a condição ancestral no grupo, bem como nos peixes em geral (Martins e Galetti Jr. 1999). Entretanto, a presença de dois pares portadores foi mais frequente nas amostras de Nematocharax, sendo esta a condição mais comumente encontrada em Characiformes (Kavalco et al. 2011; Martins e Wasko 2004). Assim, apesar das características macroestruturais compartilhadas, marcadores cromossômicos específicos para cada população foram constatados, evidenciando a presença de unidades evolutivas únicas no gênero Nematocharax. Em adição às diferenças cromossômicas microestruturais, os indivíduos do Alto rio de Contas, na Chapada Diamantina, apresentam corpo mais baixo e ausência de prolongamento nos raios das nadadeiras pélvicas
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(dados não mostrados), podendo representar uma nova espécie para o gênero. Essa diferenciação das populações do Alto Contas pode ser resultado da separação histórica da região da Chapada Diamantina das porções mais baixas do médio e baixo rio de Contas desde a formação da Serra do Espinhaço. Padrões semelhantes de divergência entre espécies isoladas pela formação dessa barreira biogeográfica tem sido encontrados mesmo entre espécies com maior potencial de dispersão, como beija-flores (Vasconcelos et al. 2012). Ainda, diferenças cromossômicas podem ser fixadas por seleção natural (caso sejam adaptativas) ou por deriva genética em populações isoladas por centenas de quilômetros em bacias distintas. De fato, populações reduzidas ou de distribuição restrita estão particularmente sujeitas aos efeitos de deriva, podendo fixar rapidamente certos variantes cromossômicos (Cioffi et al. 2009; Bitencourt et al. 2012; Castro et al. 2014a,b). No caso de N. venustus, essa hipótese é reforçada pelas características biológicas da espécie e particularidades ambientais, como discutido a seguir. De modo geral, os pequenos caracídeos podem ser caracterizados pelo ciclo de vida rápido, dispersão relativamente restrita e capacidade de explorar uma grande variedade de microhabitats (Castro 1999). Grandes sistemas fluviais tropicais permitem que algumas espécies de regiões de cabeceiras tornem-se geograficamente isoladas por barreiras bióticas, físicas ou químicas (Lowe-McConnell 1969; Centofante et al. 2006; Pazza e Kavalco 2007). Assim, novidades carioevolutivas podem evoluir independentemente em cada uma das populações, em função das restrições ao fluxo gênico e das próprias características biológicas do grupo. Por exemplo, a população do Jequitinhonha 2 apresentou um padrão peculiar de marcação bitelomérica e sintenia dos genes ribossomais 18S e 5S. Na bacia do rio Jequitinhonha, N. venustus provavelmente encontra-se ameaçado de extinção (Menezes e Lima 2008), o que pode ter reduzido o tamanho populacional e fixado essas alterações cromossômicas por efeitos de deriva e endogamia. Por fim, os PPGGBC resultados do presente trabalho ampliam a documentação cariotípica de espécies e populações de caracídeos de bacias costeiras do Atlântico Leste, caracterizadas pelo alto grau de endemismo de peixes e grande significado biogeográfico (Camelier e Zanata 2014), apesar do crescente impacto antrópico. Assim, estudos envolvendo as populações de N. venustus de diferentes localidades em abordagens comparativas são importantes para identificar corretamente cada população e delimitar as unidades evolutivas dentro do grupo.
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Agradecimentos
Esse trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (PNE0019/2011, RED0009/2013). Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA/UESB) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (processo número 32/2013).
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Fig. 1. Mapa mostrando os locais de coleta de N. venustus. a Mapa do Brasil, com destaque aos Estados da Bahia e Minas Gerais. b Locais de coleta de N. venustus pertencentes às bacias do rio Almada (Almada), Contas (Alto Contas, Gongogi 1, 2 e 3) e Jequitinhonha (Jequitinhonha 1 e 2).
Tabela 1. Dados referentes aos pontos de coleta e amostragem dos exemplares de Nematocharax venustus nas bacias do rio Almada, Contas e Jequitinhonha Ponto de coleta Localidade Número amostral Voucher Machos Fêmeas Almada Rio Almada 4 10 UFBA 8020 -14.658883; -39.223131 Gongogi 1 Afluente do Rio Gongogi 7 9 UESB 4486-4512 -14.832417; -40.103459 Gongogi 2 PPGGBCAfluente do Rio Gongogi 19 21 UFBA 8017 -14.342841; -39.463378 Gongogi 3 Riacho Cambiriba 5 7 UFBA 7953/ UFBA 7954 -14.604444; -40.102222 Jequitinhonha 1 Rio Limoeiro 8 6 UFBA 8016 -16.0859; -39.6193 Jequitinhonha 2 Rio Jequitinhonha 13 9 UFBA 8018 -16.094819; -40.001561 Alto Contas Rio Água Suja 15 8 UFBA 8019 -13.409841; -41.633227
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Fig. 2. Cariótipo representativo das amostras de Nematocharax venustus de bacias costeiras do Atlântico Leste. Barra = 5 µm.
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Fig. 3. Cariótipos após bandamento C das amostras de Nematocharax venustus de bacias costeiras do Atlântico Leste: (A) Almada; (B) Gongogi 1; (C) Gongogi 2; (D) Gongogi 3; (E) Jequitinhonha 1; (F) Jequitinhonha 2 e (G) Alto Contas. Barra = 5 µm. PPGGBC
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Fig. 4. Cromossomos das populações de Nematocharax venustus após as técnicas de impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos
(CMA3/DA/DAPI) e hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de DNAr 18S, em vermelho, e 5S, em verde. Notar a sintenia entre as sequências ribossomais em uma das populações do Jequitinhonha.
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5. CAPÍTULO 2: Unidades evolutivamente significativas em peixes neotropicais do gênero Nematocharax (Actinopterygii, Characiformes): implicações para a conservação da biodiversidade em bacias hidrográficas do Nordeste Brasileiro
Evolutionarily significant units in the genus of the neotropical fish Nematocharax (Actinopterygii, Characiformes): implications for the conservation of biodiversity in hydrographic basins of the Brazilian Northeast
Artigo a ser submetido à revista Conservation Genetics
Silvia Britto Barreto1, Lorena Andrade Nunes1, André Teixeira da Silva2, Ricardo Jucá- Chagas1, Débora Diniz1, Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso1
1Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Av. José Moreira Sobrinho, s/n, Jequiezinho, CEP: 45206-190, Jequié, BA, Brasil
2Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Av. 24- A, 1515, Bela Vista, CEP 13506-970, Rio Claro, SP, Brasil
Enviar correspondência para Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso. Endereço: Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Avenida José Moreira Sobrinho, s/n, Jequiezinho, CEP: 45206-190 Jequié, BA, Brasil. Tel.: +55 31 35289725. E-mail: [email protected]
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Resumo
Em virtude das limitações intrínsecas aos sistemas de identificação baseados na morfologia, a taxonomia tem sido utilizada em associação com ferramentas como o DNA barcode e a morfometria geométrica para discriminar espécies e estimar a real biodiversidade de cada local. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo verificar a diversidade do gênero Nematocharax, taxonomicamente controverso, utilizando fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) e análises morfométricas. Diferenças morfométricas foram encontradas entre as populações, principalmente associadas à altura do corpo, altura e comprimento da cabeça e diâmetro do olho. Divergências interpopulacionais com relação às sequências de COI variaram entre 0 e 7,5% e quatro grupos foram bem suportados na árvore de Neighbor-Joining. Assim, os resultados combinados indicam que Nematocharax forma um complexo de espécies. Adicionalmente, sugerem uma nova espécie de Nematocharax para o Alto Rio de Contas, bem como unidades evolutivamente significativas que podem ser vistas como espécies crípticas. Os dados também confirmam que não há diferenciação consistente entre N. costai e N. venustus. Fatores como seleção sexual, curto ciclo de vida e isolamento das bacias podem estar contribuindo para a rápida divergência evolutiva entre as populações e, consequentemente, favorecendo o surgimento de novas espécies. Com esse trabalho, destaca- se a importância da taxonomia integrativa para enquadrar os limites de uma espécie e demonstra-se que as bacias hidrográficas do Nordeste Brasileiro, fortemente alteradas pelas ações antrópicas, constituem áreas prioritárias para a conservação biológica.
Palavras-chave: Complexo de espécies, DNA barcode, ictiofauna, morfometria geométrica, Nematocharax venustus, Nematocharax costai.
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Abstract
Because of the intrinsic limitations of identification systems based on morphology, taxonomy has been used in combination with tools such as DNA barcode and geometric morphometrics to discriminate species and estimate the actual biodiversity of each region. In this context, this study aimed to verify the diversity of the genus Nematocharax, taxonomically controversial, using fragments of the mitochondrial gene Cytochrome C Oxidase Subunit I (COI) and morphometric analysis. Morphometric differences were found between populations, mainly related to body height, head height and length and diameter of the eye. Interpopulation differences regarding COI sequences varied between 0 and 7.5% and four groups were well supported in the Neighbor-Joining tree. Thus, the combined results indicate that Nematocharax forms a complex of species. Additionally, they suggest a new species of Nematocharax for the upper Contas river, as well as evolutionarily significant units that can be seen as cryptic species. The data also confirm that there is no consistent differentiation between N. costai and N. venustus. Factors such as sexual selection, short life cycle and isolation of the basins may be contributing to the rapid evolutionary divergence between the populations and thus favoring the emergence of new species. With this work, we highlight the importance of integrative taxonomy to frame the limits of a species and show that the hydrographic basins of the Brazilian Northeast, heavily modified by human activities, are priority areas for biological conservation.
Keywords: Species complex, DNA barcode, icthyofauna, geometric morphometrics, Nematocharax venustus, Nematocharax costai.
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Introdução
A delimitação de espécies ou unidades evolutivamente significativas é fundamental para a taxonomia e sistemática, bem como para estudos ecológicos, biogeográficos ou para a elaboração de planos de manejo e medidas de conservação (Sites e Marshall 2004). Contudo, diferenciar espécies corretamente com base somente na morfologia é particularmente difícil para alguns grupos, tais como peixes neotropicais. Os fatores que impedem a resolução de incertezas taxonômicas nessa região incluem elevada riqueza de espécies de peixes de água doce (Lévêque et al. 2008), acentuada plasticidade fenotípica (Wimberger 1992) e presença de espécies crípticas (Piggott et al. 2011). Desse modo, os autores defendem a integração entre todas ou o maior número de fontes de dados disponíveis para enquadrar os limites da espécie (Yeates et al. 2011), principalmente dados morfológicos e moleculares. Essa abordagem, denominada de taxonomia integrativa, tem se expandido de modo contundente nos últimos anos e auxiliado nos estudos de biodiversidade e conservação (Dayrat 2005). Na família Characidae, a maior e mais complexa dentre os Characiformes (Nelson 2006), ferramentas como a de marcadores moleculares e a morfometria geométrica tem sido utilizadas para reconhecer espécies e diferenças entre os grupos (Feulner et al. 2007; Ornelas-García et al. 2014; Vergara-Solana et al. 2014). Nematocharax é um gênero da família Characidae que, até recentemente, era considerado monotípico, composto apenas por Nematocharax venustus Weitzman et al., 1986, conhecida popularmente como tetra-véu. Esta espécie foi originalmente descrita para o rio Jequitinhonha, em Minas Gerais (Weitzman et al. 1986), e segundo estudos sobre composição e distribuição de espécies de peixes, habita também rios costeiros do sudeste da Bahia e nordeste de Minas Gerais, desde o rio de Contas, ao norte, até o rio Jequitinhonha, ao sul, incluindo áreas de Mata Atlântica, Cerrado, CaatingaPPGGBC e zonas de transição (Menezes e Lima 2008). A característica morfológica mais marcante de N. venustus é o acentuado dimorfismo sexual, uma vez que os machos possuem as nadadeiras dorsal, pélvica e anal com seus primeiros raios alongados (Weitzman et al. 1986). Adicionalmente, uma nova espécie, N. costai, foi descrita para o gênero na sub-bacia do rio Gongogi (região do baixo rio de Contas), na Bahia, nordeste do Brasil (Bragança et al. 2013). Esse relato trouxe uma série de dúvidas quanto ao status taxonômico das populações pertencentes ao gênero Nematocharax, sobretudo na bacia do rio de Contas e adjacências.
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Assim como para N. venustus, a identificação da espécie foi baseada na morfologia tradicional e não há conhecimento sobre seus aspectos biológicos. Nematocharax costai difere de seu único congênere pelo número de dentes maxilares nos machos adultos; ausência de ganchos e espínulas nas nadadeiras dorsal e pélvicas; cinco raios da nadadeira anal com espínulas; presença de uma marca horizontal longa rosa escura sobre o pedúnculo caudal; número de supraneurais e pelo filamento amarelo na nadadeira pélvica (Bragança et al. 2013). Entretanto, Menezes et al. (2015) verificaram que não há diferenças merísticas, morfométricas, osteológicas e de coloração que sustentem o reconhecimento de duas espécies em Nematocharax, de modo que N. costai deve ser considerado sinônimo junior de N. venustus. Assim, segundo os autores, N. venustus apresenta uma considerável variação intraespecífica de caracteres entre populações isoladas geograficamente, e atenção especial deve ser dada a características sexuais secundárias. Diante do exposto, e considerando a escassez de informações a respeito do gênero Nematocharax, este trabalho teve como objetivo utilizar fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) para verificar a diversidade do gênero e testar a eficácia do DNA barcode, assim como comparar morfometricamente os indivíduos de cada população amostrada, estabelecendo o grau de diferenciação interpopulacional.
Material e Métodos
Amostragem
Foram coletados 212 espécimes de N. venustus em sete localidades nas bacias do rio de Contas (Gongogi 1, 2 e 3, e Alto Contas), Almada (Almada) e Jequitinhonha (Jequitinhonha 1 e 2) (Fig. 1; Tabela 1). As licenças paraPPGGBC coleta de material ictiológico foram concedidas pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), por meio do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO; número da licença: 39728-1). Todos os indivíduos foram anestesiados por imersão em água gelada (Blessing et al. 2010), fotografados e tiveram um pequeno fragmento de tecido removido e preservado em etanol 96% a -20ºC. Após identificação, os espécimes testemunho foram depositados na coleção do Museu de Zoologia da Universidade Federal da Bahia (MZUFBA) e na coleção ictiológica do Laboratório de Ecologia da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Brasil.
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Análises moleculares
Extração, PCR e sequenciamento
O DNA total foi extraído do tecido do fígado ou músculo de cada espécime utilizando o Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega, USA), de acordo com instruções do fabricante. Fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) foram amplificados por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), utilizando o seguinte par de primers: FishF2_t1 (5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT CGA CTA ATC ATA AAG ATA TCG GCA C-3’) e FishR2_t1 (5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA CTT CAG GGT GAC CGA AGA ATC AGA A-3’), desenhados por Ward et al. (2005). Cada reação de PCR foi realizada utilizando 0,2 mM de dNTPs (Invitrogen, Brasil), tampão da PCR 1X (Invitrogen, Brasil), 1,5 mM de MgCl2 (Invitrogen, Brasil), 0,2 µM de cada primer, 1 unidade de Platinum Taq DNA polimerase (5 U/µl) (Invitrogen, Brasil), 50 a 100 ηg de DNA molde e água ultrapura para um volume final de 15 µl. A amplificação foi realizada em um termociclador Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), com a seguinte programação: 94ºC por 4 min; 40 ciclos de 92ºC por 30 s, 55ºC por 30 s e 72ºC por 1 min e 30 s e uma extensão final a 72ºC por 10 min. Os produtos de PCR foram corados com azul de bromofenol e Gel Red na proporção de 3:1 e então identificados em gel de agarose 1% após eletroforese. Comprovada a amplificação, as amostras foram purificadas com polietilenoglicol (PEG) 20%, seguido de uma lavagem com álcool 80%. Posteriormente, a reação de sequenciamento foi realizada de acordo com o método dideoxinucleotídeos terminais (Sanger et al. 1977), com o Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, USA). Finalizada a reação de sequenciamePPGGBCnto, as amostras passaram por precipitação, utilizando-se EDTA 125 mM, etanol absoluto e etanol a 70%, e foram sequenciadas em sequenciador automático ABI 3500 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA).
Análise das sequências
Primeiramente, a qualidade das sequências individuais de cada espécime (forward e reverse) foi visualizada no BioEdit Sequence Alignment Editor versão 7.1.9 (Hall 1999). Em seguida, as sequências foram submetidas ao BLAST (Basic Alignment Search Tool) no NCBI
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(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para confirmar o fragmento amplificado e identificar sequências similares. As mesmas sequências foram comparadas com o banco de dados do BOLD (Barcode of Life Data Systems, http://www.boldsystems.org/), utilizando-se a opção Species Level Barcode Records. Posteriormente, a sequência consenso foi obtida a partir do DNA Baser Sequence Assembler versão 4.16 (Heracle BioSoft SRL 2014). Essas sequências foram alinhadas com a ferramenta ClustalW Multiple Alignment (Thompson et al. 1994) do BioEdit 7.1.9 e editadas manualmente. O número de sítios variáveis, a composição nucleotídica e as distâncias dentro e entre grupos foram obtidas no MEGA versão 6 (Tamura 2013), juntamente com a árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros (K2P) (Kimura 1980) com 1000 réplicas de bootstrap (Felsenstein 1985). As diversidades haplotípicas (h) e nucleotídicas (π) foram calculadas utilizando o DNA Sequence Polymorphism versão 5.10 (Rozas et al. 2010), e a rede de haplótipos foi obtida com o Haplotype Viewer. Todas as sequências foram depositadas na base de dados do BOLD, sob o âmbito do projeto intitulado “DNA barcoding of Nematocharax – PIABA”. As cinco sequências de Nematocharax venustus (HM562862 a HM562866) da bacia do rio Una disponíveis no BOLD foram incorporadas nos alinhamentos e nas análises, bem como sequências de espécies relacionadas, disponíveis no GenBank, como segue: Astyanax lacustris (HM404906.1), Hasemania nana (FJ749062.1), Hemigrammus marginatus (HM906014.1), Rachoviscus crassiceps (HM562857.1) e Hyphessobrycon bifasciatus (HM064997.1).
Análises morfométricas
As imagens PPGGBCpara as análises de morfometria geométrica foram obtidas com uma câmera digital Nikon P510 (16.1 megapixels) da vista lateral esquerda dos espécimes, com escala métrica. Em seguida, as imagens foram convertidas da extensão JPEG para o formato TPS utilizando o tpsUtil versão 1.46 (Rohlf 2010a) para realizar a mensuração. Com base nas imagens, foram inseridos 10 marcos anatômicos do tipo I, caracterizados como pontos localizados em justaposição de tecidos, e seis semimarcos, com o auxílio do tpsDig2 versão 2.16 (Rohlf 2010b). Após a marcação de todos os pontos, estes foram alinhados de acordo com a sobreposição de Procrustes no MorphoJ versão 2.0 (Klingenberg 2011).
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A Análise de Componentes Principais (ACP) foi empregada utilizando machos e fêmeas, bem como apenas fêmeas, visto que a forma dos machos varia ao longo do desenvolvimento ontogenético e em função do período reprodutivo. Assim, a escolha das fêmeas permitiu minimizar a variação intrapopulacional em relação à forma. O tamanho generalizado de cada indivíduo foi estimado utilizando-se o tamanho do centróide. A Análise de Variância (ANOVA) foi realizada para verificar se as diferenças de tamanho entre as populações são significativas, e as médias foram comparadas por meio do Teste de Tukey a 1%. Adicionalmente, uma Análise de Regressão foi realizada para verificar se a forma dos indivíduos varia em função do tamanho. Para averiguar as similaridades entre as populações, uma Análise de Agrupamento pelo método Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Average (UPGMA; 10 000 permutações) foi realizada no PAST 2.17c (Hammer et al. 2001), e a correlação cofenética foi calculada para testar a confiabilidade do agrupamento.
Resultados
DNA barcode
Foram geradas 91 sequências de COI com 652 pb. O número de espécimes por localidade variou de oito a 20, com uma média de 13. Para a construção da árvore de Neighbor-Joining, foram adicionadas cinco sequências de N. venustus coletados na bacia do rio Una e disponíveis no BOLD, bem como cinco sequências de diferentes espécies relacionadas a N. venustus. A seleção dessas sequências para comparação foi baseada no grau de integridade e tamanho comparável com aquelas obtidas nas amostras. Desta forma, o alinhamento total, com 101 sequências, apresentou 202 sítios variáveis e conteúdo médio dasPPGGBC bases nitrogenadas adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C) de 25,6%, 32,5%, 17,2% e 24,7%, respectivamente. A divergência genética intrapopulacional variou de 0 a 2,2% (Tabela 2), sendo a média e o desvio padrão de 0,003±0,007. O maior valor de diversidade intrapopulacional foi encontrado em Gongogi 3 (2,2%, 12 indivíduos). A divergência interespecífica variou de 0 a 21,6% (Tabela 3), e sua média e desvio padrão foram de 0,131±0,07. A maior divergência foi observada entre os espécimes de N. venustus da bacia do rio Una e a espécie Rachoviscus crassiceps. A divergência interpopulacional entre as
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amostras de N. venustus, por sua vez, variou de 0 a 7,5%, e sua média e desvio padrão foram de 0,040±0,02. A árvore de Neighbor-Joining obtida a partir da análise de 1000 réplicas de bootstrap (Fig. 2) gerou quatro grupos suportados por valores iguais ou maiores que 99%: 1) Jequitinhonha 2, Jequitinhonha 1, Gongogi 1, Gongogi 3; 2) Almada e 3) Una e 4) Alto Contas. Os demais indivíduos de Gongogi 3 agruparam-se com espécimes de Gongogi 2 em um ramo à parte com 97% de confiabilidade. Para a construção da rede de haplótipos (Fig. 3), foram utilizadas apenas as sequências do gene COI dos espécimes coletados (n=91), de modo que foram encontrados 16 haplótipos no total. As diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) foram: h=0,538 (três haplótipos) e π=0,00157 em Almada; h=0 (um haplótipo) e π=0 em Alto Contas; h=0,536 (dois haplótipos) e π=0,00082 em Gongogi 1; h=0,868 (seis haplótipos) e π=0,00334 em Gongogi 2; h=0,652 (quatro haplótipos) e π=0,02105 em Gongogi 3; h=0 (um haplótipo) e π=0 em Jequitinhonha 1 e h=0,100 (dois haplótipos) e π=0,00015 em Jequitinhonha 2. A maior diversidade haplotípica encontrada foi em Gongogi 2 (seis haplótipos e sete sítios polimórficos), enquanto a maior diversidade nucleotídica foi verificada em Gongogi 3 (quatro haplótipos e 27 sítios polimórficos).
Morfometria geométrica
A ACP indicou diferenças na forma do corpo dos peixes entre as populações analisadas, considerando machos e fêmeas em conjunto, sendo que os dois primeiros componentes principais explicaram 62,34% da variação total. Observa-se que a população do Alto Contas (Fig. 4a) mostrou-se como um grupo bem estabelecido, separado das demais, independentemente das diferenças sexuais. As grades de deformação mostram que a maior parte da diferenciação morfológicaPPGGBC entre a população do Alto Contas e as demais está associada ao comprimento da cabeça e altura do corpo (Fig. 4b-e). A ANOVA aplicada ao tamanho do centróide foi significativa (p<0.01) e o Teste de Tukey demonstra estas diferenças (p<0.01), em que letras distintas representam as diferenças entre as médias das populações (Fig. 5). Assim, de acordo com a variação do tamanho do centróide, a população do Alto Contas apresentou indivíduos significativamente menores em relação às demais. A ACP aplicada às fêmeas das populações do Gongogi, Almada e Jequitinhonha (Fig. 6a) demonstrou uma maior proximidade entre as duas populações da bacia do rio Jequitinhonha,
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enquanto as populações do Gongogi e Almada apresentaram indivíduos dispersos ao longo de ambos os eixos. Neste caso, foram necessários os quatro primeiros componentes para explicar 67% da variação total. As maiores variações estão relacionadas à altura do corpo, altura e comprimento da cabeça e diâmetro do olho (6b-e). A Análise de Regressão para as fêmeas apresentou resultado significativo (p<0.001), isto é, a forma do corpo varia de acordo com o tamanho dos indivíduos. Na Análise do Tamanho do Centróide, a ANOVA foi significativa (p<0.01), onde os indivíduos amostrados em Jequitinhonha 1 são maiores e os coletados em Gongogi 2 são menores. O Teste de Tukey para as fêmeas está apresentado na Figura 7. A partir do dendrograma (Fig. 8), pode-se verificar a formação de dois grupos distintos com boostrap de 99%: um formado pelas duas populações do Jequitinhonha e outro formado pelas três populações do Gongogi e a população do Almada. A população do Alto Contas permanece isolada das demais. Este dendrograma gerado por UPGMA ilustra as distâncias morfométricas médias entre as populações e apresenta alta correlação cofenética (96%).
Discussão
Foram combinadas evidências de sequências de COI e morfometria geométrica para avaliar o status taxonômico de populações de Nematocharax venustus, em que foi verificada a existência de mais de uma unidade evolutivamente significativa. Vale ressaltar que os resultados das distâncias interpopulacionais das amostras de Nematocharax foram maiores do que o valor de divergência de 2% comumente utilizado para delimitar espécies de peixe (Hubert et al. 2008; Ward et al. 2009; Carvalho et al. 2011; Pereira et al. 2013). Ainda assim, essa abordagem indica de forma consistente que Nematocharax forma um complexo de espécies, o que é corroborado por análises de morfometria geométrica. Nesse cenário,PPGGBC a população do Alto Contas foi a que mais divergiu tanto nos dados morfológicos quanto genéticos, sugerindo a presença de uma nova espécie de Nematocharax com ocorrência na região serrana da Chapada Diamantina. De fato, o grau de divergência das amostras dessa localidade para os demais representantes de Nematocharax foi tão alto (>7%) quanto o esperado para gêneros distintos de uma mesma família (Ward et al. 2009). Trabalhos como o de Zanata e Camelier (2010), Zanata e Serra (2010) e Barbosa e Costa (2011) sugerem uma ictiofauna característica e possivelmente endêmica para esta sub-bacia insuficientemente conhecida, mas de extrema importância biológica.
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Considerando esta população do Alto Contas como uma nova espécie de Nematocharax, sua história evolutiva deve estar intimamente associada aos processos geológicos no alto rio de Contas, que podem ter propiciado vicariância e isolamento de pequenas populações (Buckup 2011). A região hidrográfica do Atlântico Leste, onde a bacia do rio de Contas está inserida, é formada por uma série de bacias hidrográficas atualmente isoladas por paisagens montanhosas da margem oriental do escudo cristalino brasileiro. Esta história de independência das bacias está ligada ao fim das reativações tectônicas no Mesozóico, que influenciaram intensamente o relevo e os padrões de drenagem, e à completa separação dos continentes Africano e Sul- americano há cerca de 93 a 98 milhões de anos (Ribeiro 2006). Desta forma, pode ter ocorrido efeito fundador e estabelecimento desta espécie no alto rio de Contas após o soerguimento da Chapada Diamantina. Reforçando essa hipótese, os espécimes do Alto Contas apresentaram variação intrapopulacional igual a zero, com apenas um haplótipo. Assim, caso essa população tenha sido formada por poucos indivíduos após o isolamento na Chapada Diamantina, os baixos níveis de diversidade genética podem estar relacionados a efeito fundador e deriva. Adicionalmente, os indivíduos na região do Alto Contas apresentam características taxonômicas bem distintas daquelas observadas para N. venustus, como corpo mais baixo e ausência de prolongamento nos raios das nadadeiras pélvicas (dados não mostrados), podendo, assim, tratar-se de uma nova espécie para o gênero. Resultados semelhantes de morfometria geométrica e DNA barcode também foram verificados para as populações do Jequitinhonha, cujos espécimes mostraram-se mais próximos entre si em ambas as análises. Sabe-se que indivíduos de N. venustus comumente são encontrados em locais com águas mais lênticas, próximos às margens e sombreados pela presença de vegetação marginal (Menezes e Lima 2008). Entretanto, na bacia do rio Jequitinhonha, as PPGGBCpopulações encontram-se sob o efeito do processo de assoreamento, perda considerável de vegetação marginal, poluição, implantação de grandes barragens e introdução de espécies exóticas (Menezes e Lima 2008). Nesse caso, a população remanescente deve ter experimentado um recente efeito gargalo, levando à baixa diversidade haplotípica. Cabe salientar que, recentemente, a espécie deixou de ser considerada ameaçada de extinção, sobretudo em função das numerosas populações observadas nas bacias dos rios Cachoeira, Almada e Contas. No entanto, de acordo com os nossos dados, as populações destas bacias não representam a mesma unidade evolutiva que a observada para a bacia do rio Jequitinhonha, a qual provavelmente se encontra ameaçada de extinção devido à intensa degradação.
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De qualquer forma, para confirmar tais suposições, a utilização de outros marcadores, tais como microssatélites, é recomendada a fim de verificar a extensão dessa aparente homogeneidade genética intrapopulacional nas amostras do Alto Contas e Jequitinhonha. Apesar das diferenças na forma do corpo das fêmeas entre as duas populações do rio Jequitinhonha e as populações do rio Gongogi (bacia do rio de Contas), os dados de DNA barcode confirmam que não há diferenciação consistente entre N. costai e N. venustus, tal como visto por Menezes et al. (2015), que reavaliaram os caracteres utilizados para descrever N. costai e diferenciá-la de sua congênere e incorporaram ao leque de variação encontrado dentro da espécie N. venustus. Entretanto, observa-se que alguns espécimes de Gongogi 3 (anteriormente considerado localidade-tipo de N. costai), juntamente com todos os indivíduos de Gongogi 2, formaram um clado separado dos demais e com 97% de bootstrap. Deste modo, no Riacho Cambiriba (Gongogi 3), podem ser encontrados indivíduos com diferenças genéticas acentuadas (quatro haplótipos), indicando a presença de espécies crípticas que necessitam ter seu status de ameaça devidamente conhecido. Este resultado também demonstra a importância de uma amostragem mais ampla para capturar uma parte representativa da variabilidade nas sequências do COI de um grupo, e não se restringir a cinco espécimes como frequentemente utilizado no DNA barcode (Ward et al. 2009). Similarmente, novas espécies de peixes tem sido descritas para esse trecho da bacia do rio de Contas (e.g. Vari et al. 2010). Parece, então, que a sub-bacia do rio Gongogi, a despeito do acentuado grau de degradação ambiental, constitui um hotspot de biodiversidade para peixes neotropicais de grande interesse para a conservação da ictiofauna brasileira. É surpreendente que distintas unidades evolutivas para um grupo até então considerado pouco diverso como Nematocharax possam ocorrer em simpatria e sintopia. Porém, algumas características biológicas desse complexo de espécies podem fornecer insights para a sua rápida divergência evolutiva.PPGGBC De acordo com o modelo de simulação de Turner e Burrows (1995), a especiação pode ser rapidamente estabelecida em condições simpátricas que exibem seleção sexual. Nesse modelo, a reversão da preferência de uma fêmea sob um único macho pode levar rapidamente ao isolamento reprodutivo completo em uma pequena população. Obviamente, qualquer redução no fluxo gênico, ainda que temporária, é susceptível de aumentar a probabilidade de especiação, de modo que o mecanismo proposto também pode ocorrer em alopatria, parapatria ou onde partes da população se especializaram em diferentes habitats. Esse parece ser o caso de Nematocharax, que possui dimorfismo sexual evidente, em que os machos
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apresentam nadadeiras alongadas e coloração mais atraente, traços típicos de espécies com seleção sexual (Andersson 1994). As espécies do gênero Phalloceros (Poeciliidae), representadas por peixes neotropicais amplamente distribuídos por bacias hidrográficas brasileiras, servem como um exemplo análogo para as inferências propostas em Nematocharax, apesar de, nos poecilídeos, o dimorfismo sexual e seus efeitos serem muito mais conspícuos. Phalloceros caudimaculatus Hensel, 1868, até recentemente, era a única espécie formalmente descrita para o gênero, porém Lucinda (2008) a dividiu em 21 espécies novas taxonomicamente reconhecidas. Embora a maioria destas siga um padrão geral de distribuição alopátrica, espécies simpátricas ou mesmo sintópicas podem ser encontradas. Os poecilídeos são marcados por acentuado dimorfismo sexual e as fêmeas parecem ter preferência por macho em função de características tais como tamanho da genitália masculina (Langerhans et al. 2005). O papel da seleção sexual na especiação ainda pode ser facilitado pela baixa capacidade de dispersão dos pequenos caracídeos, permitindo especiação por alopatria ou parapatria. Em adição, os ciclos de vida curtos típicos dos pequenos caracídeos garantem a rápida (re)ocupação de ambientes de riachos (Castro 1999) e diminuem o intervalo de gerações, permitindo que divergências genéticas evoluam em intervalos relativamente curtos de tempo. Similarmente, diferenças populacionais acentuadas foram verificadas em populações de Astyanax isoladas por barragens no rio de Contas e foram associadas, entre outros fatores, ao ciclo de vida rápido desses peixes após o surgimento da barreira física ao fluxo gênico (Pamponet et al. 2008). Todos esses aspectos ainda são reforçados pela localização da área de estudo em um importante refúgio glacial do Pleistoceno (Carnaval e Moritz 2008). Essas áreas são caracterizadas por altos índices de diversidade genética em diferentes grupos animais (Carnaval et al. 2009; Martins 2011), incluindo peixes (Almeida et al. 2013). Com relação à população do rio Almada, esta mostrou-se morfologicamente mais próxima do Gongogi,PPGGBC indicando que, exceto pelo Alto Contas, existe relação entre a morfologia e a distância geográfica das populações analisadas. No entanto, a população do rio Almada formou um agrupamento isolado com 99% de bootstrap na árvore de Neighbor-Joining. O mesmo pode ser visto para a população da bacia do rio Una, cujas sequências foram retiradas do BOLD e formaram um agrupamento com 100% de bootstrap. Estes resultados demonstram a utilidade do DNA barcode como uma ferramenta poderosa na identificação de unidades evolutivamente significativas na sub-bacia do rio Gongogi, bem como nas bacias dos rios Almada e Una. Adicionalmente, assim como discutido para as populações do rio Gongogi, a seleção sexual e o curto ciclo de vida, além do isolamento das bacias, podem ter contribuído
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para as diferenças genéticas interpopulacionais e o surgimento de novas espécies ainda não devidamente reconhecidas em cada uma das bacias. A presença de dimorfismo sexual em uma espécie pode indicar diferenças nos papéis reprodutivos ocupados pelos sexos, os quais influenciam os padrões de seleção e, portanto, levam a diferenças sexuais na morfologia. Os machos devem ter adaptações que aumentam a probabilidade de adquirir parceiras e de sucesso na competição com outros machos. As fêmeas, por sua vez, devem estar sob seleção para processar e armazenar energia para facilitar a produção da prole (Dorado et al. 2012). Diante disso, as diferenças entre a forma do corpo das fêmeas nas diferentes bacias, conforme visto no dendrograma gerado por UPGMA com boostrap de 99% e 10.000 permutações, podem ser resultado de fatores genéticos, ambientais, bem como da interação entre ambos (Wimberger 1992). As divergências morfológicas entre populações coespecíficas podem, por exemplo, ser resultado de diferentes pressões seletivas e usos do recurso, o que varia de acordo com o habitat e/ou estrutura da comunidade em que estão inseridas (Langerhans et al. 2003). Assim, diferenças morfológicas não necessariamente indicam diferenças genéticas, uma vez que a plasticidade fenotípica em peixes é extremamente reconhecida e permite que eles respondam adaptativamente às mudanças ambientais (Klingenberg et al. 2003; Clabaut et al. 2007; Mérona et al. 2009; Arbour et al. 2011; Arechavala-Lopez et al. 2011). Isso pode explicar porque os dados morfométricos foram mais similares entre as populações de habitats com características em comum quando comparados aos dados genéticos. Em suma, os resultados confirmam a eficácia do DNA barcode e da morfometria geométrica em avaliar a diversidade do gênero Nematocharax, fornecendo suporte à presença de novas espécies, bem como de diferentes unidades evolutivamente significativas. Essas informações complementam os dados morfológicos tradicionais, reforçando a importância da taxonomia integrativa (Dayrat 2005) e sugerindo uma revisão para o gênero, sobretudo para avaliar a populaçãoPPGGBC do alto rio de Contas. Por fim, demonstra-se que as bacias costeiras do Leste do Brasil representam áreas prioritárias para a conservação biológica, o que contrasta com o crescimento desordenado de alterações antropogênicas nessas bacias. Por exemplo, os corpos d’água da bacia do rio de Contas encontram-se atualmente fragmentados por barragens, recebem grandes quantidades de efluentes urbanos e agrícolas e têm sido alvo de atividades de mineração em seu entorno (Jesus et al. 2014). Espera-se, assim, que os dados do presente estudo sirvam como forma de sensibilizar os órgãos ambientais para a preservação e restauração dos recursos hídricos da região antes que espécies sejam perdidas antes mesmo de serem formalmente descritas.
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Agradecimentos
Esse trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (PNE0019/2011, RED0009/2013). Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA/UESB) da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (processo número 32/2013).
Referências
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PPGGBC
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Fig. 1 Mapa mostrando os locais de coleta de Nematocharax venustus. a) Mapa do Brasil, com destaque para a Região Hidrográfica do Atlântico Leste; b) Mapa da Região Hidrográfica do Atlântico Leste, com os sete locais de coleta: bacia do rio Almada (Almada - A), Contas (Gongogi 1 - B, Gongogi 2 - C, Gongogi 3 - D e Alto Contas - G) e Jequitinhonha (Jequitinhonha 1 - E e Jequitinhonha 2 - F); c) Imagens representativas dos locais de coleta
Tabela 1 Dados referentes aos pontos de coleta e amostragem dos exemplares de Nematocharax venustus nas bacias do rio Almada, Contas e Jequitinhonha
Ponto de Rio Coordenadas geográficas Número amostral Voucher coleta Latitude Longitude Machos Fêmeas Indefinidos Almada Rio Almada -14.658883 -39.223131 4 10 23 UFBA 8020 Gongogi 1 Afluente do -14.832417 -40.103459 7 9 1 UESB Rio Gongogi 4486-4512 Gongogi 2 Afluente do -14.342841 -39.463378 19 21 1 UFBA Rio Gongogi 8017 Gongogi 3 Riacho -14.604444 -40.102222 5 7 12 UFBA CambiribaPPGGBC 7953/ UFBA 7954 Jequitinhonha Rio Limoeiro -16.0859 -39.6193 8 6 10 UFBA 1 8016 Jequitinhonha Rio -16.094819 -40.001561 13 9 - UFBA 2 Jequitinhonha 8018 Alto Contas Rio Água Suja -13.409841 -41.633227 15 8 24 UFBA 8019 Total 71 70 71
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Tabela 2 Distâncias intrapopulacionais de Nematocharax venustus analisadas com o modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P) População Distância dentro dos grupos Una (n=5) 0,000 Almada (n=14) 0,002 Alto Contas (n=13) 0,000 Gongogi 1 (n=8) 0,001 Gongogi 2 (n=14) 0,003 Gongogi 3 (n=12) 0,022 Jequitinhonha 1 (n=10) 0,000 Jequitinhonha 2 (n=20) 0,000
Tabela 3 Distâncias interpopulacionais das amostras de Nematocharax venustus e interespecíficas com espécies relacionadas analisadas com o modelo evolutivo Kimura-2- Parâmetros (K2P)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1. Astyanax lacustris 0,019 0,020 0,016 0,017 0,020 0,019 0,018 0,019 0,019 0,019 0,019 0,019 2. Hasemania nana 0,182 0,016 0,020 0,019 0,018 0,019 0,017 0,017 0,018 0,017 0,017 0,017 3. Hemigrammus marginatus 0,211 0,147 0,019 0,020 0,017 0,016 0,018 0,017 0,017 0,016 0,017 0,017 4. Hyphessobrycon bifasciatus 0,142 0,190 0,182 0,017 0,018 0,018 0,020 0,019 0,018 0,018 0,019 0,019 5. Rachoviscus crassiceps 0,159 0,191 0,200 0,175 0,020 0,019 0,020 0,018 0,018 0,018 0,018 0,018 6. Una 0,194 0,190 0,173 0,178 0,216 0,006 0,011 0,008 0,007 0,006 0,008 0,008 7. Almada 0,185 0,192 0,160 0,173 0,205 0,029 0,011 0,008 0,007 0,006 0,008 0,008 8. Alto Contas 0,174 0,157 0,167 0,186 0,201 0,070 0,075 0,011 0,011 0,010 0,011 0,011 9. Gongogi 1 0,184 0,167 0,164 0,187 0,199 0,043 0,041 0,074 0,007 0,005 0,002 0,002 10. Gongogi 2 0,188 0,183 0,174 0,179 0,193 0,035 0,029 0,074 0,036 0,004 0,007 0,007 11. Gongogi 3 0,187 0,177 0,169 0,185 0,199 0,040 0,035 0,074 0,025 0,019 0,005 0,005 12. Jequitinhonha 1 0,184 0,166 0,164 0,188 0,198 0,044 0,042 0,072 0,002 0,034 0,024 0,000 13. Jequitinhonha 2 PPGGBC0,184 0,167 0,165 0,188 0,198 0,044 0,042 0,072 0,002 0,034 0,024 0,000
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PPGGBC
Fig. 2 Árvore de Neighbor-Joining baseada na sequência do COI das populações de Nematocharax venustus e espécies relacionadas com valores de bootstrap mostrados acima de cada ramo
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Fig. 3 Rede de haplótipos construída com sequências do COI, demonstrando as relações entre os haplótipos das populações de Nematocharax venustus de cada localidade amostrada. Cada cor representa uma localidade e a dimensão dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que compartilham cada haplótipo. Os números nos ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos
PPGGBC
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Fig. 4 a) Análise de Componentes Principais (ACP) para a forma do corpo dos espécimes de Nematocharax venustus. No gráfico, cada localidade é representada por um símbolo. b,c) Grades de deformação representando os extremos morfológicos no primeiro componente (PC1). O escore negativo está disposto à esquerda, e o positivo à direita. Os vetores indicam a direção e o sentidoPPGGBC da variação de cada marco anatômico. d,e) Contorno apresentando as variações na forma dos espécimes. As linhas azuis escuras representam a deformação e as linhas azuis claras representam a forma média dos indivíduos
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Fig. 5 Box-plot demonstrando a variação do tamanho do centróide dos espécimes de Nematocharax venustus por localidade. As barras mostram os valores médios ± desvio padrão. Letras distintas representam médias significativamente diferentes pelo Teste de Tukey a 1%
PPGGBC
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Fig. 6 a) Análise de Componentes Principais (ACP) para a forma do corpo das fêmeas de Nematocharax venustus. No gráfico, cada localidade é representada por um símbolo. b,c) Grades de deformação representando os extremos morfológicos no primeiro componente (PC1). O escore negativo está disposto à esquerda, e o positivo à direita. Os vetores indicam a direção e o sentidoPPGGBC da variação de cada marco anatômico. d,e) Contorno apresentando as variações na forma dos espécimes. As linhas azuis escuras representam a deformação e as linhas azuis claras representam a forma média dos indivíduos
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Fig. 7 Box-plot demonstrando a variação do tamanho do centróide das fêmeas de Nematocharax venustus por localidade. As barras mostram os valores médios ± desvio padrão. Letras distintas representam médias significativamente diferentes pelo Teste de Tukey a 1%
PPGGBC
Fig. 8 Dendrograma gerado por UPGMA ilustrando as distâncias morfométricas médias entre a forma do corpo das fêmeas de Nematocharax venustus oriundas de diferentes localidades em bacias do Atlântico Leste do Brasil
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6. CONCLUSÕES GERAIS
Apesar de todas as populações de N. venustus compartilharem o mesmo número diplóide (2n=50), fórmula cariotípica (8m+26sm+14st+2a) e número fundamental (NF=98), observou-se uma considerável variação na distribuição de sequências repetitivas; Os dados citogenéticos reforçam que Nematocharax representa um conjunto de formas crípticas, pela evolução particular de alguns caracteres cromossômicos em cada uma das populações; Os dados de DNA barcode confirmam que não há diferenciação consistente entre as espécies N. costai e N. venustus; A população do Alto Contas foi a que mais divergiu tanto nos dados morfométricos quanto genéticos, o que sugere a presença de uma nova espécie de Nematocharax na bacia do rio de Contas. Soma-se a isso o fato de os indivíduos do Alto Contas apresentarem corpo mais baixo e ausência de prolongamento nos raios das nadadeiras pélvicas; A utilização de marcadores cromossômicos, sequências de COI e morfometria geométrica permitiu avaliar a diversidade do gênero Nematocharax, fornecendo suporte à presença de novas espécies, bem como de diferentes unidades evolutivamente significativas ocorrendo em alopatria e simpatria; As diferenças genéticas entre as populações de N. venustus podem estar associadas a fatores como seleção sexual, curto ciclo de vida, capacidade de dispersão relativamente restrita e isolamento das bacias; Diferentes pressões seletivas e uso dos recursos podem ser responsáveis pelas diferenças entre a formaPPGGBC do corpo das fêmeas nas diferentes bacias, que estão principalmente associadas à altura do corpo, altura e comprimento da cabeça e diâmetro do olho; Os dados demonstram a importância das bacias costeiras da região hidrográfica do Atlântico Leste como áreas prioritárias para a conservação biológica.