EVALUACIÓN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DE MEZCLAS DE EXTRACTOS ETANÓLICOS DE Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora y Croton leptostachyus

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo

CLAUDIA CRISTINA PÉREZ JARAMILLO

Director WALTER MURILLO ARANGO Doctor en Ciencias Químicas

Codirector WILMER FERNANDO SÁNCHEZ PERALTA Licenciado en Educación Básica con Énfasis en Ciencias Naturales y Educación Ambiental

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ – TOLIMA 2014

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DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a mi familia, especialmente a mi madre, Amparo Jaramillo Cardona, ella es el pilar de mi vida y quien ha luchado incansablemente para brindarme la mejor educación, por ella he logrado este objetivo que es solo el inicio de grandes propósitos.

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AGRADECIMIENTOS

Son muchas las personas que me han acompañado en esta aventura que inicié hace unos años. Gracias a ellas, en parte, soy lo que soy. Ahora ha llegado el momento de cerrar este capítulo, pero no puedo hacerlo sin antes agradecerles todo lo que me han brindado… A mis directores, Dr. Jonh Jairo Méndez Arteaga y Dr. Walter Murillo Arango por permitir mi incorporación en su grupo de investigación con total libertad y autonomía y por confiar en mí y apoyarme siempre. Especial agradecimiento al Grupo de Investigación en Productos Naturales de la Universidad del Tolima (GIPRONUT), a los compañeros y profesores del área de Química; a los profesores Giann Carlos Peñaloza, Cesar Jaramillo, Antoni Rueda, Elizabeth Murillo; al Licenciado Carlos Martín Guerra; a los Biólogos Ángel Jiménez, Laura Daniela Rodríguez, Diego Oliveros, y a mis compañeros tesistas y pasantes Iván Cupitra, Lina Dávila, Francisco Santamaría y Lorena Osorio. A los integrantes del Laboratorio de Servicios y Extensión de análisis químico (LASEREX); a la Oficina de Investigaciones y Desarrollo Científico de la Universidad del Tolima, al departamento de Química, al programa de Biología de la Facultad de Ciencias Básicas y a todas las personas que en el transcurso del proyecto hicieron parte activa en la ejecución de este. No hay que olvidar a la profesora Julia Ester Gallego, docente de la Facultad de Ciencias de la salud; quien se interesó en mi trabajo y contribuyo con sus conocimientos a enriquecerlo. Agradecer especialmente a Lic. Wilmer Fernando Sánchez Peralta, codirector de este trabajo y compañero de laboratorio incondicional, por apoyarme en todo momento y darme ánimos para continuar. A mi familia: padres, abuelos, tíos, primos… que sin saber muy bien lo que he estado haciendo me han ayudado en los momentos difíciles. Agradecer especialmente a mis padres y hermanos. A los primeros, por haberme proporcionado siempre los mejores apoyos emocionales y materiales, por haberme educado en esos valores en los que me siento tan orgullosa y estar siempre a mi lado. A mis hermanos por su cariño y apoyo. GRACIAS A TODOS

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CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ...... 175

1. JUSTIFICACIÓN ...... 17

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 19

3. OBJETIVOS ...... 21

3.1. OBJETIVO GENERAL ...... 21

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 21

4. MARCO TEORICO ...... 22

4.1. GENERALIDADES DE LA FAMILIA ...... 22

4.1.1. Descripción de las plantas del genero Mollinedia...... 26

4.2. GENERALIDADES DE LA FAMILIA ...... 28

4.2.1. Descripción de las plantas del género Siparuna ...... 31

4.3. GENERALIDADES DE LA FAMILIA EUPHORBIACEAE ...... 34

4.3.1. Descripción de las plantas del genero Croton ...... 37

4.4. RADICALES LIBRES ...... 39

4.4.1. Fuentes endógenas de Radicales Libres ...... 41

4.4.2. Fuentes exógenas de Radicales Libres ...... 42

4.5. ANTIOXIDANTES ...... 42

4.5.1. Sistemas de defensa antioxidantes...... 43

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4.5.1.1. Sistemas de defensa antioxidantes endógenos ...... 43

4.5.1.2. Sistema de defensa antioxidante exógeno ...... 44

4.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN UN MODELO DE CELULAS SANGUINEAS (ERITROCITOS)...... 47

4.7. ANÁLISIS DE INTERACCIÓN MEDIANTE ISOBOLOGRAMAS ...... 48

5. DISEÑO METODOLÓGICO ...... 51

5.1. MATERIALES ...... 51

5.1.1. Obtención del material vegetal ...... 51

5.1.2. Reactivos ...... 53

5.2. MÉTODOS...... 53

5.2.2. Caracterización preliminar de los extractos vegetales ...... 54

5.3. PRUEBA DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO ...... 54

5.3.1. Actividad inhibitoria del catión radical del ácido 2,2- azinobis-(3 etilbenzotiazolina- 6-sulfónico ABTS) ...... 54

5.3.2. Actividad estabilizante del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH) ...... 55

5.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE MEZCLAS DE MOSQUERO (Croton leptostachyus), ROMADIZO (Mollinedia racemosa) Y LIMÓN DE MONTE (Siparuna sessiliflora)...... 56

5.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN UN MODELO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS (ERITROCITOS)...... 56

5.5.1. Obtención de los eritrocitos ...... 56

5.5.2. Inhibición de la Hemolisis (Actividad antioxidante) ...... 56

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 58

6.1. CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES ...... 58

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6.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS ...... 60

6.2.1. Actividad estabilizante del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH)...... 60

6.2.2. Actividad estabilizante del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS.+) ...... 62

6.3. ACTIVIDAD ESTABILIZANTE DPPH DE MEZCLAS DE EXTRACTOS DE M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus ...... 63

6.4. ACTIVIDAD INHIBITORIA DEL RADICAL ABTS.+ DE MEZCLAS DE EXTRACTOS PROVENIENTES DE M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus .... 66

6.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN UN MODELO DE CELULAS SANGUÍNEAS (ERITROCITOS)...... 69

7. CONCLUSIONES ...... 73

RECOMENDACIONES ...... 74

REFERENCIAS ...... 75

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribución geografica de la familia Monimiaceae ...... 23 Figura 2. Características morfológicas de la familia Monimiaceae ...... 24 Figura 3. Especie del genero Mollinedia (Mollinedia schottiana) ...... 27 Figura 4. Distribución geográfica de la familia Siparunaceae ...... 29 Figura 5. Características morfológicas de la un espécimen de la familia Siparunaceae ...... 30 Figura 6. Especie del género Siparuna (Siparuna thecaphora) ...... 32 Figura 7. Distribución geográfica de la familia Euphorbiaceae ...... 34 Figura 8. Características morfológicas de la familia Euphorbiaceae ...... 36 Figura 9. Especie del género Croton (Croton leptostachyus) ...... 38 Figura 10. Neutralización de radicales libre por antioxidantes ...... 47 Figura 11. Representación gráfica de un isobolograma y los comportamientos que pueden generarse en la combinación de sustancias...... 49 Figura 12. Lugar de recolección de Siparuna sessiliflora ...... 52 Figura 13. Lugar de recolección de Croton leptostachyus ...... 52 Figura 14. Lugar de recolección de Mollinedia racemosa ...... 52 Figura 15. Isobolograma de la mezcla Mosquero + Romadizo para DPPH .. 65 Figura 16. Isobolograma de la mezcla Mosquero + Limón de monte para DPPH ...... 65 Figura 17. Isobolograma de la mezcla de Romadizo + Limón de monte para DPPH ...... 65 Figura 18. Curva dosis- respuesta de la mezcla Romadizo + Mosquero + Limón de monte para DPPH ...... 65 Figura 19. Isobolograma de la mezcla Mosquero + Limón de monte para ABTS ...... 68 Figura 20. Isobolograma de la mezcla Mosquero + Romadizo para ABTS .. 68 Figura 21. Isobolograma de la mezcla Romadizo + LImón de monte para ABTS ...... 68

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Figura 22. Curva dosis respuesta de la mezcla Romadizo + Mosquero + Limón de monte para ABTS ...... 68 Figura 23. % de hemolisis de eritrocitos humanos tratados con el extracto etanólico de Romadizo a diferentes concentraciones ...... 710 Figura 24. % de hemolisis de eritrocitos humanos tratados con el extracto etanólico de Mosquero a diferentes concentraciones ...... 71 Figura 25. % de hemolisis de eritrocitos humanos tratados con el extracto etanólico de Limón de monte a diferentes concentraciones ...... 71

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Caracterización taxonómica de la familia Monimiaceae ...... 22 Tabla 2. Caracterización de la familia Mollinedia ...... 26 Tabla 3. Caracterización taxonómica de la familia Siparunaceae ...... 28 Tabla 4. Caracterización taxonómica del genero Siparuna...... 31 Tabla 5. Caracterización taxonómica de la familia Euphorbiaceae ...... 34 Tabla 6. Caracterización taxonómica del genero Croton ...... 37 Tabla 7. Especies reactivas del Oxígeno y el Nitrógeno ...... 40 Tabla 8. Fuentes exógenas de radicales libres ...... 42 Tabla 9. Antioxidantes naturales exógenos ...... 45 Tabla 10. Puntos de muestreo ...... 51 Tabla 11. Tamizaje fitoquímico realizado a M. racemosa, S. sessiliflora y C. leptostachyus ...... 58 Tabla 12. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical DPPH de los 3 extractos crudos ...... 60 Tabla 13. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical ABTS de los 3 extractos crudos ...... 62 Tabla 14. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical DPPH de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus ...... 63 Tabla 15. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical ABTS de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C. leptostachyus ...... 66

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LISTA DE ANEXOS

Anexo A. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH); para cada uno de los extractos crudos…………………………………………………………………………..90 Anexo B. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del Actividad inhibitoria del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS+)……………………………………………… 91 Anexo C. Análisis de regresión generada por el programa Statgrafics en la estabilización del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH); para cada uno de las mezclas de extractos crudos…………………………………………………………………………..93 Anexo D. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6- sulfónico (ABTS.+) para mezclas de extractos crudos……………………………………. 95 Anexo E. Analisis estadístico en la estabilización de los radicales de los extractos crudos……………………………………………………………………………………... 97 Anexo F. Análisis estadístico en la estabilización de los radicales de las mezclas de los extractos…………………………………………………………………………………...98 Anexo G. Análisis de interacción (sinergismo, antagonismo o aditividad) generado por las mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del software COMPUSYN para la estabilización del DPPH…………………………………... 100 Anexo H. Análisis de interacción (sinergismo, antagonismo o aditividad) generado por las mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del software COMPUSYN para la estabilización del ABTS+…………………………………… 102 Anexo I. Acción conjunta generada por mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del programa COMPUSYN para la estabilización del radical 2,2-diphenil-1- picrilhidrazil (DPPH)…………………………………………………………………… 104

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Anexo J. Acción conjunta generada por mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del programa COMPUSYN para la estabilización del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS+)……………………………… 105

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RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial antioxidante de extractos etanólicos crudos y mezclas de extractos de Mollinedia racemosa, Croton leptostachyus y Siparuna sessiliflora, en la estabilización de radicales DPPH, ABTS y evaluar el porcentaje de hemólisis en un modelo de eritrocitos. Las interacciones de mezclas binarias y terciarias fueron expresadas a través del modelo de interacción, isobologramas en el programa compuSyn. La caracterización fitoquímica, para las tres plantas mostró la presencia de terpenoides, fenoles, alcaloides, fenilpropanoides, saponinas y taninos, metabolitos reportados en literatura científica como responsables de actividad antioxidante. Las pruebas de estabilización de DPPH y ABTS realizadas in vitro, demostraron la capacidad antioxidante por parte de las 3 plantas, siendo efectivos de forma decreciente así: M. racemosa y C. leptostachyus y S. sessiliflora. Las mezclas binarias demostraron un sinergismo en la estabilización del DPPH; para el ABTS generaron un antagonismo, y las mezclas terciarias para los dos radicales presentaron un antagonismo. Los 3 extractos crudos mostraron hemólisis en los eritrocitos, siendo mayor en C. leptostachyus (mosquero) y S. sessiliflora (limón de monte), actividad atribuible al contenido de saponinas las dos especies. La complejidad de las matrices vegetales evaluadas, parece tener influencia en el comportamiento observado en los ensayo de interacción, teniendo en cuenta la diversidad de metabolitos presentes en los extractos al ejercer su acción. Los 3 extractos etanólicos revelaron un potencial antioxidante en ensayos indirectos, actividad asociada a la presencia de compuestos de naturaleza polifenólica. Las mezclas binarias mostraron gran relevancia para la estabilización del DPPH, lo que sugiere una interacción potecializada por parte de sus principios activos.

Palabras claves: Actividad antioxidante, mezclas, extractos, isobolograma.

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ABSTRACT

The purpose of this study was to evaluate the antioxidant potential of crude and ethanol extracts mixtures of extracts from Mollinedia racemosa, Croton leptostachyus y Siparuna sessiliflora, in DPPH radical stabilization, ABTS and evaluate the percentage of hemolysis in a model of erythrocyte. The interactions of binary and ternary mixtures were expressed through the interaction model, Isobolograms in compuSyn program. The phytochemical characterization, for the three showed the presence of terpenoids, phenols, alkaloids, phenylpropanoids, saponins and tannins, metabolites reported in scientific literature as being responsible for antioxidant activity. The stabilization tests of DPPH and ABTS carried out in vitro, demonstrated the antioxidant capacity of the three plants, being decreasingly effective thus: M. racemosa y C. leptostachyus y S. sessiliflora. The binary mixtures demonstrated a synergism in stabilizing the DPPH; for the ABTS generated an antagonism, and tertiary mixtures, in the two radicals showed an antagonism. The three crude extracts showed hemolysis in erythrocytes, being higher in C. leptostachyus (mosquero) and S sessiliflora (limón de monte), this activity is attributed to the saponin content in both species. The complexity of the evaluated matrices, apparently influenced on the behavior observed in interaction assays, taking into account diversity of metabolites present in extracts to exert their action. The three ethanol extracts showed antioxidant potential indirect assays activity associated with the presence of natural polyphenolic compounds. The binary mixtures showed great relevance to the stabilization of DPPH, suggesting an interaction potecializada by their active ingredients.

Keywords: Antioxidant activity, blends, extracts, isobologram.

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INTRODUCCION

Según la organización mundial de la salud (OMS) existen un importante grupo de enfermedades que afectan la población humana, muchas de ellas estrechamente asociadas con procesos de deterioro oxidativo y daño a nivel celular ocasionadas por radicales libres (RL) (Maldonado, Nahúm y Bernabé, 2010) como: el alzheimer (Butterfield, Castegna, Lauderback y Drake, 2002), el parkinson (Jenner, 2003), la diabetes, (Wiernsperger, 2003), el cáncer (Valko et al, 2001; Valko et al, 2006) y el envejecimiento que sin ser una enfermedad si no un proceso natural de los individuos, se acelera por la acumulación de RL (Paniagua, Gómez y Pérez, 2004; Cadenas y Davies, 2000). Para contrarrestar estas enfermedades se han venido desarrollando alternativas terapéuticas basadas en productos farmacéuticos, eficientes para disminuir los RL (Labieniec y Gabryelak, 2005); pero más eficientes han resultado los fitofármacos o metabolitos secundarios provenientes de las plantas como los compuestos polifenólicos (Mesa, 2010), que inhiben procesos causados por los RL en las células: - - removiendo el O2 , bloqueando la peroxidación lipídica, inhibiendo la formación de OH , y quelan iones metálicos (Rosas, 2003). Teniendo en cuenta el potencial ofrecido por diferentes sustancias sintéticas y naturales para aminorar la incidencia de los RL, se han empleado diferentes teorías como por ejemplo; la química combinatoria (Porras y Javier, 2004), el modelado molecular (Herrera et al, 2008), además de la combinación (Armenta 2000), técnicas que simplifican el desarrollo y la mezcla de fármacos, como estrategias para disminuir el dolor y el avance de algunas enfermedades, utilizando dosis o concentraciones menores de cada uno de los componentes y generando el mismo o mayor efecto que el suministrado por los componentes individuales (Boik y Newman, 2008), Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer y el dolor son diversos los estudios que han mostrado la efectividad de la mezcla de fármacos (Yang et al, 2010), este tipo de mezclas no sólo pueden generarse entre fármacos si no entre otras sustancias como los metabolitos secundarios, estos pueden producir una mayor efectividad biológica, ya que

15 actúan de manera cooperativa potencializándose entre sí (Marinova, Toneva y Yanishlieva, 2008), corrigiendo desordenes en los organismos como los provocados por los RL; además de la efectividad producida por las mezclas en la solución de enfermedades, con ellas se pretenden generar fármacos con menos efectos adversos como; depresión de la médula ósea (Wu, Deng, Wu, ,Ventilador, y Yang, 2004.), mareos (Chaiyasit y Wiwanitkit, 2013), cardiotocixidad (Raschi et al, 2010), entre muchas otras.

Queriendo abarcar un poco más el tema de los antioxidantes naturales obtenidos de matrices vegetales como una opción en la disminución o el control de RL, se realizó este trabajo basado en 3 especies de plantas; Croton leptostachyus, Siparuna sessiliflora y Mollinedia racemosa, especies reconocidas y utilizadas por culturas indígenas por sus cualidades farmacológicas en el tratamiento de úlceras, trastornos estomacales, fiebres, entre otras (Cárdenas y Politis, 2002; López et al., 1990: En: Leitão et al, 1999). En este trabajo se evaluó el potencial polifenólico de cada uno de los extractos de las plantas a través de un tamizaje fitoquímico, además de evaluar la posible actividad antioxidante mediante métodos indirectos (DPPH, ABTS) y directos (eritrocitos); por último se evaluó el comportamiento presentado por mezclas de los extractos crudos a través de un modelo de interacción llamado Isobologramas, que permite observar el comportamiento de combinaciones binarias y terciaras, demostrándonos la aditividad (=1) el sinergismo(<1) o el antagonismo (>1) entre ellos.

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1. JUSTIFICACIÓN

Durante la última década ha crecido el interés en conocer e identificar la interacción de productos quimicos y sus mezclas (Teuschler et al, 2002); para comprender los efectos deseados o indeseados que estos generan, tratando así de disminuir las afecciones a la salud provocadas por la exposicion a xenobióticos y otro tipo de compuestos químicos, lo que conlleva a enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo (Venereo Gutiérrez, 2002). La interacción de metabolitos secundarios, aumenta significativamente el desarrollo de productos fitoterapéuticos, aprovechando su potencial y posteriormente el de sus mezclas, por ende la combinación de dos o más fármacos se convierten en un gran acierto, para lograr efectos terapéuticos deseados, potencializando la actividad proporcionada por los agentes individuales, utilizándose entonces en tratamientos de enfermedades oncológicas e infecciosas (Ren, Qiao, Wang, Zhu, & Zhang, 2003) entre otras. Teniendo en cuenta lo anterior, el análisis de las interacciones se convierten en una alternativa importante en el tratamiento y el control de enfermedades crónicas como; leucemias y linfomas (Glode y Jarkowski, 2009) entre otras. Desde los años 80’s se han desarrollado metodologías para evaluar la interacción entre fármacos, tales como:

 Isobologramas (Fraser 1870-1871-1872; Loewe, 1926; 1928; 1953, 1957),  Método fraccional producto de Webb (1963),  Método de Valeriote y Lin (1975),  Método de Drewinko et al. (1976),  Cálculo de índice de interacción Berenbaum (1977),  Método de acero y Peckham (1979),  La mediana de efecto Método de Chou y Talalay (1984),  Enfoques no paramétrico de Superficie de Respuesta,  Enfoques Paramétricos de superficie de respuesta.

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En este sentido la química de productos naturales ofrece un panorama promisorio a través de la gran variedad y complejidad de metabolitos secundarios como por ejemplo fenoles, flavonoides, fenilpropanoides y taninos, que demuestran un espectro de actividad ampliado, acción sinérgica al combinar dos o más de ellos (Chiremba, 2008; Pinelo et al, 2004), menor incidencia al disminuir la reactividad de un radical y eliminar sus efectos adversos, menores tiempos de desarrollo de productos terminados y la capacidad de modificaciones mediante hemisíntesis, lo cual convierte a los metabolitos secundarios en plantillas ideales para el diseño inteligente de fármacos. Así mismo los extractos crudos ofrecen un potencial importante para el desarrollo de fitofármacos, por ende la evaluación del potencial uso de mezclas de extractos bioactivos puede llegar a ser un adelanto importante para la industria, la medicina y todos los sectores de la sociedad obteniendo de ellos, compuestos importantes como los genem (Louli, Ragoussis, Magoulas et al, 2004; Albu et al, 2004), encargados de neutralizar las acciones generadas por especies reactivas derivadas del oxígeno (EROs), y del nitrógeno (ERN’s). Siendo el oxígeno indispensable para procesos celulares, en ocasiones se reduce en forma incompleta, originando compuestos inestables (EROs), que generan un desbalance en el metabolismo, conocido como estrés oxidativo (Rodríguez Perón, Menéndez López y Trujillo López, 2001). Resaltando esta problemática, la búsqueda de compuestos o mezclas que disminuyan la influencia de los RL es necesaria, por esto se han realizado estudios con diferentes especies (Hamdani et al, 2014; Deng et al 2014), queriendo así, aminorar la influencia de estas especies reactivas (RL). En el caso de los géneros a los que pertenecen las plantas objeto de estudio (Mollinedia, Siparuna y Croton) existe evidencia científica de su potencial biológico y su uso en la medicina tradicional por distintos grupos étnicos alrededor del mundo. Actividad atribuible a la presencia de metabolitos secundarios tales como terpenos, alcaloides y fenoles, especies químicas que se destacan por su amplia gama de bio-actividades dentro de las que se destaca la antioxidante y antiinflamatoria (López, Lin, Duah, Aly, Schiff, 1988; López et al., 1990, Fischer et al., 2004; Franco, Cordero, Morantes, Aristizabal, y Osorio, 2011) entre otras.

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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El daño oxidativo ha sido caracterizado durante los últimos años como la causa de enfermedades como el cáncer (Valko, et al, 2001; Valko, et al, 2006), la diabetes (Wiernsperger, 2003), el Alzheimer (Butterfield, et al, 2002), entre muchas otras, sin dejar de mencionar el envejecimiento relacionado ampliamente con la acumulación del daño oxidativo (Lin y Beal, 2003). Las evidencias científicas apuntan a mostrar que el daño macromolecular aumenta más con la edad de los organismos, causando pérdida de funcionalidad mitocondrial. El daño oxidativo provocado por los radicales libres, se puede generar de diferentes maneras: por vía endógena, resultado del metabolismo ERO’s y las ERN’s, entre otros, cuya principal fuente son las mitocondrias, los lisosomas, los peroxisomas, así como la membrana nuclear y el retículo endoplásmico (Cadenas et al. 2000). También se generan de forma exógena por factores como: la contaminación ambiental, la exposición a radiaciones ionizantes, el tabaco, los medicamentos, los aditivos químicos en alimentos procesados y algunos xenobióticos como pesticidas, herbicidas y fungicidas (Finkel y Holbrook, 2000). Los radicales libres alteran la estructura y, por lo tanto, la función de la mayor parte de las macromoléculas producidas en nuestro cuerpo, oxidando lípidos, proteínas, hidratos de carbono y ácidos nucleicos, alterando los procesos celulares y desencadenando en ocasiones muchas de las enfermedades que se mencionaron con anterioridad (García, 2004). A pesar de la existencia de sistemas endógenos de defensa ante el daño oxidativo, en ocasiones no es suficiente, por esto el consumo de sustancias antioxidantes externas puede ayudar a disminuir la incidencia de muchas enfermedades, por tal razón es importante promover el desarrollo de fármacos y la investigación de los efectos positivos del consumo de frutas, verduras, ácido ascórbico, así como de compuestos de naturaleza fenólica que se sabe intervienen en la estabilización de radicales libres (Halliwell y Gutteridge, 2007; Proestos, Sereli y Komaitis, 2006; Calderón-Vélez, 2007).

Teniendo en cuenta la problemática tan amplia que rodea los radicales libres y sus posibles soluciones los antioxidantes, sobre todo los de origen vegetal, se realizó este

19 trabajo basado en la evaluación del potencial antioxidante de extractos etanólicos crudos de 3 plantas pertenecientes a los géneros Croton, Mollinedia, Siparuna, y el de sus mezclas; en este trabajo se utilizaron extractos crudos, debido a la amplia gama de metabolitos secundarios que exhiben como: carotenoides, alcaloides, polifenoles entre otros, lo que les confiere una mayor capacidad antioxidante (Pinho, Valentão, Ferreres, Oliveira y Andrade, 2011), simulando el desarrollo y la generación de un antioxidante que pueda generar soluciones claras, teniendo en cuenta las potencialidades evidenciadas por las 3 especies.

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3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el potencial antioxidante de mezclas de extractos provenientes de Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora y Croton leptostachyus.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Evaluar la actividad antioxidante mediante los ensayos de actividad estabilizante de los radicales ABTS, DDPH y actividad antioxidante en eritrocitos de los extractos crudos y mezclas obtenidas de Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora y Croton leptostachyus.

 Determinar el tipo de interacción generada (Sinergismo, antagonismo o acción conjunta) de las mezclas de extractos de Mollinedia racemosa, Siparuna sessiliflora y Croton leptostachyus en la inhibición de especies radicalarias.

 Establecer las formulaciones (Mezclas) más efectivas en la estabilización de especies radicalarias a partir de la evaluación de los resultados obtenidos en el modelo de interacción por isobologramas.

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4. MARCO TEORICO

4.1. GENERALIDADES DE LA FAMILIA MONIMIACEAE

En la tabla 1 se encuentra la caracterización taxonómica de la familia Monimiaceae.

Tabla 1. Caracterización taxonómica de la familia Monimiaceae

Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden

Familia Monimiaceae

Determinador Juss, 1809

Fuente: Stevens, 2009

 Distribución geográfica Las especies de esta familia son nativas de regiones australes como Polinesia, Australia, Madagascar, África Tropical y América. En Brasil, Paraguay y en el nor-este de Argentina crece Hennecartia omphalandra J. Poiss, frecuente en el sotobosque de la selva misionera y de los islotes de la selva en galería de Santo Tomé e Ituzaingó en Corrientes (Stevens, 2009). Como se ilustra en la figura 1.

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Figura 1. Distribución geográfica de la familia Monimiaceae

Fuente: Tropicos.org, 2014

 Características morfológicas Árboles o arbustos aromáticos de hojas opuestas, verticiladas o raras veces alternas, sin estípulas, simples, con margen entera o dentada, coriáceas o membranáceas, glabras o densamente pubescentes, con pelos simples o estrellados, a veces lepidotas; inflorescencia cimosa, axilares o terminales, rara vez flores solitarias; flores pequeñas e incospicuas, unisexuales o perfectas, actinomorfas o asimétricas, hipanto urceolado a campanulado, perianto generalmente compuesto por 4 sépalos decusados, estambres de pocos a numerosos en 1-2 series, filamento corto, anteras con dehiscencia longitudinal; fruto drupáceo o en aquenios, generalmente incluidos en el hipanto (Vargas, 2002). En la figura 2. se muestran las características morfológicas de los géneros más representativos (Mollinedia y Siparuna)

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Figura 2. Características morfológicas de la familia Monimiaceae

Fuente: Teillier, 2007

La familia consiste en unos 30 a 35 géneros y cerca de 450 especies distribuidas en las regiones tropicales y subtropicales, especialmente en el hemisferio sur. El género más rico es mollinedia con cerca de 90 especies, género americano. (Vargas, 2002; Renner, 1998).

 Características químicas Leitâo et al. (1999), aislaron algunos metabolitos secundarios (flavonoides y alcaloides) y describieron la composición química y propiedades farmacológicas de la familia Monimiaceae, con especial atención a los géneros Mollinedia.

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Las hojas del boldo poseen un alto porcentaje alcaloides aporfínicos, de los cuales la boldina es el más abundante (O’Brien, Carrasco-Pozo y Speisky, 2006) En estudios realizados a Laurelia aromatica Juss, se encontraron alcaloides de tipo aporfínico y bisbencilisoquinolinico, en su madera se encontró un alto contenido de liriodenina (Urzüa y Vasquez, 1993; Citado por Muñoz, Montes y Wilkomirsky, 2001.), oxonantenina (Hoffmann 1982; Citado por Muñoz et al, 2001), nornantenina (Montes y Wilkomirsky, 1987; Citado por Muñoz et al, 2001), anonaina (Muñoz, Barrera y Mesa, 1981; Citado por Muñoz et al, 2001), nornuciferina (Cassels y Urzua, 1985; Citado por Muñoz et al. 2001), michelalbina (Montes, Valenzuela y Wilkomirsky et al, 1990; Citado por Muñoz., et al, 2001) y estefarina (Schmeda 1994; Citado por Muñoz et al. 2001). Mientras que en sus hojas se evidenció la presencia de safrol (Schmeda, Dutra-Behrens, Habermehi, y Jakupovic, 1996; Citado por Muñoz et al. 2001), laurotetanina (Onai, et al, 1995; Schmeda, 1994. Citados por Muñoz et al, 2001).

 Usos tradicionales Un ejemplo de las cualidades farmacológicas de esta familia es un árbol chileno llamado boldo (Peumus boldus Mol.), este es altamente usado en la medicina tradicional. En los años 1990’s, se realizó un estudio donde se descubrió la boldina uno de los antioxidantes más potentes en la naturaleza (O’Brien, et al., 2006). Peumus boldus, perteneciente a la familia Monimiaceae, se le atribuyen cualidades farmacológicas: antioxidantes (por ejemplo, la promoción, antitumoral, acciones anti-inflamatorias, anti-diabéticos y anti- aterogénicas cito-protección), así como aquellas que no parecen estar asociados con dicha actividad (por ejemplo, vasorrelajante, anti-tripanocida, inmuno-y neuro- modulador, colagogo y / o acciones coleréticos) (O’Brien, et al, 2006). Las especies del género encuentran aplicación principalmente en eventos oxidativos, mediados por radicales libres en la iniciación y/o progresión de los trastornos cardiovasculares, tumorales, inflamatorios y neurodegenerativos (Leitão et al., 1999).

25

4.1.1. Descripción de las plantas del genero Mollinedia. En la tabla 2 se observa la caracterización taxonómica del genero Mollinedia

Tabla 2. Caracterización del género Mollinedia

Reino Plantae Subreino Tracheobionta Filo Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Laurales Juss. ex Bercht. & J. Presl Familia Monimiaceae Genero Mollinedia Aubl. Especie Mollinedia racemosa

Fuente: Tropicos.org, 2014

 Distribución geográfica En un estudio realizado por Vargas (2002), se registra el hallazgo de individuos de este género, especialmente de la especie Mollinedia tomentosa en bordes de bosques maduros e interior de bosques secundarios o muy intervenidos, en los 1700 y los 2800 msnm. Y en reportes de Morales y Grayum (2009); se registran individuos de Mollinedia máxima en bosques húmedos de Costa rica y Ecuador, en elevaciones de 450-900 msnm.

 Características morfológicas La mayoría son árboles o arbustos perennifolios de estratos inferiores de las selvas, con ramificación poco densa, raramente bejucos (aromáticos, usualmente resinosos). Poseen hojas simples y opuestas, siempre verdes, algunas tienen glándulas oleíferas generadoras de aceite esencial casi siempre con olor a limón, otras por el contrario

26

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   Usos tradicionales Las comunidades populares utilizan estas plantas en el tratamiento de diversos desórdenes gastrointestinales, enfermedades de la piel, en la terapia de resfriados, la fiebre, dolor de cabeza y reumatismo y en las mordeduras de serpientes (López et al., 1999). .

4.2. GENERALIDADES DE LA FAMILIA SIPARUNACEAE

En la tabla 3 se encuentra la caracterización taxonómica de la familia Siparunaceae

Tabla 3. Caracterización taxonómica de la familia Siparunaceae

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Laurales Juss. ex Bercht. & J. Presl Familia Siparunaceae Determinador Juss., 1809

Fuente: Tropicos.org, 2014

 Distribución geográfica La familia Siparunaceae incluye 75 especies en dos géneros. Glossocalyx, de África tropical occidental, cuenta con cuatro especies. El resto de las especies de la familia se encuentran en el género Siparuna, que se encuentra en México, América Central y América del Sur tropical. (Encyclopædia britannica, 2009).

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Figura 4. Distribución geográfica de la familia Siparunaceae

.

Fuente: Tropicos.org, 2014

 Características morfológicas Arbustos o árboles, monoicos o dioicos, con tricomas estrellados, lepidótos o ausentes; estípulas ausentes. Hojas simples, opuestas, subopuestas o verticiladas, la lámina entera, los márgenes dentados, aserrados o enteros, con o sin puntuaciones glandulares. Inflorescencias cimosas, espigadas o paniculadas, axilares o naciendo en los nudos defoliados. Flores actinomórficas, unisexuales, sin evidencias de órganos reproductivos opuestos; perigonio compuesto por 4-6 tépalos, separados o connados en la base, ocasionalmente caliptrado, los tépalos cremosos, amarillo-anaranjados, o con menor frecuencia rojizos; androceo compuesto por 1-72 estambres, éstos dispuestos irregularmente en el interior del receptáculo, con solo la parte superior expuesta, por un orificio en el ápice del receptáculo, los filamentos separados, rara vez, tardíamente connados, sin apéndices glandulares, dehiscentes apicalmente; gineceo apocárpico, ovario súpero, carpelos 3-30, encerrados en el receptáculo hasta la antesis y etapas tempranas del fruto, estilos separados, estigmas decurrentes, únicamente la parte superior de los estilos y estigmas, queda expuesta en el orificio central-apical del

29 receptáculo, placentación basal, óvulo 1 en cada lóculo. Frutos drupéolas encerradas en el receptáculo carnoso, el receptáculo liso, tuberculado o espinoso, usualmente reventandose al abrirse, para exponer las drupéolas maduras, éstas con una cobertura carnosa roja o anaranjada; 1 semilla por drupéola, con endospermo (González, 2006).

Figura 5. Características morfológicas de la un espécimen de la familia Siparunaceae

Fuente: Watson y Dallwitz, 1999.

 Características químicas En estudios realizados por Padilla González y Gil Archila, (2012) se reportaron alcaloides isoquinolínicos, compuestos característicos del género Siparuna, y la familia Siparunaceae es rica en estos compuestos del tipo aporfínicos (Leitão et al.1999 y Fischer et al. 2004: Citados por Padilla et al 2012). En especies de esta familia se ha hallado la presencia de flavonas, crysoeriol (5,7,4 '-trihidroxi-3'-metoxiflavona), Tricina (5,7,4'-trihidroxi-3',5'-dimetoxiflavona) y 7-O-β-D-glucopiranósido-5, 4'-dihidroxi-3'- metoxiflavona (Facundo et al 2012), quercetina-3,7-di-O-ramnósido y kaempferol-3, 7di- 30

O-ramnósido (Negri, Santi y Tabach, 2012.), sesquiterpenoides (Jenett-Siems et al, 2003), además de la presencia de flavinantine y- methylflavinantine. (Gerard, MacLean y Antonio, 1986).

 Usos tradicionales Las culturas indígenas han utilizado las especies de esta familia para neutralizar el efecto hemorrágico provocado por las mordeduras de serpientes, conocimiento abstracto comprobado por literatura científica (Otero et al, 2000) También se ha comprobado su capacidad antiplasmodial contra Plasmodium falciparum y Trypanosoma cruzi (Albernaz et al, 2010; Mbah et al, 2004).

4.2.1. Descripción de las plantas del género Siparuna. En la tabla 4 se muestra la caracterización taxonómica del género Siparuna

Tabla 4. Caracterización taxonómica del genero Siparuna

Reino Plantae

Phylum Magnoliophyta

Orden Laurales Juss. ex Bercht. & J. Presl

Familia Monimiaceae Juss

Género Siparuna Ruiz & Pav.

Especie Siparuna sessiliflora (Kunth) A. DC.

Fuente: Schneider, M. 2007

31

x 'LVWULEXFLyQJHRJUiILFD /DHVSHFLHHVHQFRQWUDGDWtSLFDPHQWHHQXQDDOWLWXGGHDPHWURVVHGLVWULEX\H HQ $PpULFD GHO VXU   SHUWHQHFH DO RUGHQ GH ODV /DXUDOHV IDPLOLD 0RQLPLDFHDH 0DKHFKD   x &DUDFWHUtVWLFDVPRUIROyJLFDV /DV SODQWDV GHO JpQHUR 6LSDUXQD VRQ DUEXVWRV FRQ RORU FtWULFR SHORV VLPSOHV R HVWUHOODGRV +RMDV RSXHVWDV R YHUWLFLODGDV FRULiFHDV FRQ SXQWXDFLRQHV SHO~FLGDV QHUYLDFLyQ SLQQDGD VLQ HVWtSXODV )ORUHV XQLVH[XDOHV HQ FLPDV KLSDQWR JORERVR R FXSXOLIRUPHIORUHVPDVFXOLQDVYHUGHDPDULOOHQWDVDQWHUDVYDOYDGDVIORUHVIHPHQLQDV VLPLODUHVDODVPDVFXOLQDVSHURPiVJUDQGHVJLQHFHR±FDUSHORVOLEUHV 0DKHFKD  (VWHJpQHURVHFDUDFWHUL]DSRUELRVLQWHWL]DUFRPSXHVWRVFRPRVHVTXLWHUSHQRV IODYRQRLGHV\DOFDORLGHVLVRTXLQROtQLFRVVREUHWRGRGHOWLSRDSRUItQLFRV /HLWmRHWDO  FRPSXHVWRVDORVTXHVHOHVDWULEX\HDFWLYLGDGHVELROyJLFDVFRPRDQWLEDFWHULDQDV DQWLPDOiULFDV\DQWLOHLVKPDQLDVLVHQWUHRWUDV 9LOODOWD9DODGHDXHWDO   )LJXUD(VSHFLHGHOJpQHUR6LSDUXQD 6LSDUXQDWKHFDSKRUD 

 )XHQWH'6RODQR   

   Características químicas Se sabe poco acerca de las cualidades químicas de este género pero algunas de sus especies han mostrado potencialidades importantes por compuestos encontrados en ellas como los alcaloides, esteroides (Braz Filho et al, 1976. En Negri et al, 2012), aceites esenciales (Viana et al, 2002; Valentini, Rodriguez-Ortiz y Coelho, 2010) y una mezcla de diglicosilo y flavonoides monoglycosyl derivados de quercetina y kaempferol (et al, 2005). Se conoce que son utilizadas como antiinflamatorios, lo cual puede ser atribuible a su contenido de alcaloides, terpenos, flavonoides y saponinas. (Leitão et al, 1999). Estudios del extracto S. muricata muestran la presencia de alcaloides, terpenos, flavonoides, taninos, esteroides, cumarinas (Ordoñez, Vega y Malagon, 2006).

 Usos tradicionales Las hojas de los individuos de esta especie muestran potencial en la medicina tradicional por sus propiedades analgésica, y cicatrizantes, y en uso externo por su acción desodorante. (Mahecha, 2010). Además de los registros del pueblo Nukak, en los que utilizan las hojas maceradas en emplastos para las picaduras de hormigas (congas) (Cárdenas et al. 2002). Hay pocos reportes de las especies de este género pero S. guianensis muestra un perfil completo acerca de las diferentes utilidades tradicionales que se le confieren a esta especie, como por ejemplo el efecto ansiolítico atribuido por indios sudamericanos, "caboclos" y vecinos ribereños (Rodríguez et al, 2008), además se le atribuyen propiedades febrífugas, analgésicas, antí-inflamatorias, antitusivas, hipotensivas y cicatrizantes, y en uso externo por su acción desodorante. (Negri et al., 2012). En los neotrópicos se usan la infusión de las hojas y frutos, como remedio contra la cefalea, diarrea, fiebre, gastralgia y afecciones psicosomáticas. También los extractos de Siparuna han evidenciado tener actividad antipalúdica (Gonzales, 2006).

33

4.3. GENERALIDADES DE LA FAMILIA EUPHORBIACEAE En la tabla 5 se encuentra la caracterización taxonómica de la familia Euphorbiaceae

Tabla 5. Caracterización taxonómica de la familia Euphorbiaceae

Reino Plantae División Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Malpighiales Juss. ex Bercht. & J. Presl Familia Euphorbiaceae

Fuente: Botánica sistemática, 2007.

 Distribución geográfica Es una familia de distribución cosmopolita, pero mejor representada en regiones tropicales y subtropicales, comprende unas 7500 especies en 300 géneros, en Colombia existen unas 350 especies. En la figura 7. Se observa la distribución mundial del género (Stevens, 2009).

Figura 7. Distribución geográfica de la familia Euphorbiaceae

Fuente: Tropicos.org, 2014

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Las Euphorbiaceae están ampliamente distribuidas en todas las regiones naturales de Colombia. El mayor número de especies se encuentra en la región andina (210 sp.), de las cuales 83 son exclusivas para esta región; le sigue la región amazónica con 129 sp., (71 exclusivas), la región caribe con 114 sp. (36 exclusivas), la región pacífica con 110 sp. (14 exclusivas) y la Orinoquia con 88 sp. (nueve exclusivas). En cuanto a la distribución altitudinal, la familia se encuentra principalmente en zonas bajas, el 63% sólo crece en alturas menores que 1500 m, mientras que el 8.5% crece a más de 1500 m. Euphorbia orbiculata y Dysopsis paucidentata son las únicas especies que pueden alcanzar alturas superiores a los 3500 m. (Murillo,2013). Es importante señalar la existencia de algunas especies de géneros como Croton y Euphorbia en zonas templadas (Jiménez et al, 2011).

 Características morfológicas La familia Euphorbiaceae está representada en Colombia por 78 géneros, 390 especies, 12 subespecies y 9 variedades. Es una familia muy variable morfológicamente, comprende árboles, arbustos, lianas y hierbas; muchas de sus especies son componentes del bosque poco perturbado, pero también las hay de zonas altamente intervenidas y sólo Phyllanthus fluitans es acuática, su distribución es principalmente tropical y la mayoría de taxones crece en zonas bajas, aunque unas pocas especies pueden alcanzar los 4000 m de altitud. Esta familia se caracteriza por presentar látex o exudado coloreado y estípulas de diversas formas; las hojas son simples, espiralmente dispuestas y sólo en algunas especies de Euphorbia son opuestas; generalmente presentan glándulas de diversas formas en la lámina y a veces sobre el pecíolo. Las flores generalmente están arregladas en inflorescencias muy variadas presentándose pseudantos en Dalechampia, Pera y Euphorbia; en éste último se conoce como ciatio. Las flores son unisexuales y generalmente apétalas; el ovario es súpero, sincárpico y en la mayoría de géneros formado por tres carpelos, que contienen uno o dos óvulos. El fruto es una cápsula esquizocárpica con dehiscencia explosiva; que deja una columela central, y sólo se presentan drupas en Drypetes, Hieronyma y Richeria. La semilla tiene un rafe muy notorio y generalmente presenta carúncula o arilo. (Murillo, 2013; Vargas,

35

2002). En la figura 8 se pueden observar las características morfológicas de la familia Euphorbiaceae.

Figura 8. Características morfológicas de la familia Euphorbiaceae

Fuente: Vargas, 2002.

 Características químicas Los principales compuestos presentes en esta familia de plantas son los triterpenoides, flavonoides y alcaloides pero también cumarinicos, glucósidos cianogénicos y taninos. Además en géneros como Aleurites, Croton, Euphorbia, Jatropa, Sapium etc, se han encontrado sustancias tóxicas como ésteres de alcoholes diterpénicos, resiniferonol e ingenol que son irritantes de la piel (Pascual Villalobos y Correal Castellanos, 1992).

 Usos tradicionales La familia Euphorbiaceae es una fuente importante de las hierbas medicinales de uso humano, veterinario y agrícola como por ejemplo; antibacterial, antiviral, antifúngico, nematicida, insecticida, antileismanico (Mwine y Van Damme, 2011).

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4.3.1. Descripción de las plantas del genero Croton

En la tabla 6 se encuentra la caracterización taxonómica del género Croton

Tabla 6. Caracterización taxonómica del genero Croton

Reino Plantae Phylum Magnoliophyta Clase Magnoliopsida Orden Euphorbiales Familia Euphorbiaceae Genero Croton Especie Croton leptostachyus Autor del epíteto especifico Kunth

Fuente: Red Nacional de Jardines Botánicos

 Distribución geográfica Familia de distribución cosmopolita, pero mejor representada en regiones tropicales y subtropicales, comprende unas 7500 especies en 300 géneros, en Colombia son unas 350 especies (Murillo, 1999).

 Características morfológicas Croton es un amplio género de la familia Euphorbiaceae, que comprende cerca de 1300 especies de árboles, arbustos y hierbas de distribución tropical y subtropical en ambos hemisferios (Salatino, Salatino y Negri, 2007).En el género Croton se incluyen todas las plantas desde hierbas hasta árboles, con diversas formas de hojas, exudado coloreado, generalmente con glándulas en la base de la lámina y/o sobre el pecíolo, indumento de pelos estrellados o lepidotas en toda la planta, generalmente con glándulas en la base de la lámina y/o sobre el pecíolo. Estas características sumadas a la disposición de las

37

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  Gurgel, Sidrimb, Martinsc, Filhod, Rao (2005) reportaron actividad antifúngica in vitro de Croton urucurana, actividad atribuida a la presencia de catequinas como galocatequina y epigalocatequina

 Usos tradicionales En cuanto a los usos tradicionales utilizados para aprovechar las propiedades del genero croton; estas son aprovechadas de diferente manera en los continentes. En África, se utilizan las hojas y la corteza del tallo en forma de té o pastillas para el tratamiento de la diabetes, altos niveles de colesterol en la sangre y los trastornos gastrointestinales, así como trastornos hepáticos. En América central y México estas plantas son llamadas "sangre-de-drago", y contienen una savia roja ampliamente manejada en la medicina tradicional, para la tos, la gripe, la diarrea y las úlceras de estómago, y tópicamente como la cicatrización de heridas de cortes, heridas abiertas, herpes, antiséptico después de extracciones dentales y para la administración oral sores (Palatino et al., 2007).

4.4. RADICALES LIBRES

Los Radicales Libres (RL) son especies o fragmentos moleculares que en su estructura atómica presentan un electrón o electrones no apareados en su capa electrónica más externa, pueden existir de forma independiente (Mitjavila López y Sáiz, 2001; Boots, Haenen y Bast, 2008), esta inestabilidad puede llevarlos a generar una alta reactividad frente a otras moléculas cercanas, buscando así su equilibrio. Los radicales libres pueden actuar de dos maneras la primera es desestabilizando las moléculas que se encuentran a su alrededor para buscar su estabilidad y la segunda actúan como mediadores en procesos fisiológicos en nuestro organismo (Mitjavila et al, 2001), teniendo en cuenta lo anterior estas moléculas son necesarias para desencadenar procesos metabólicos importantes.

En la cotidianidad los organismos se exponen a diferentes compuestos, muchos de ellos no son nocivos pero su activación en nuestro metabolismo conlleva a reacciones adversas. Una de estas reacciones perjudiciales es la generación de muchos tipos de

39 radicales libres, siendo los más conocidos las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS), agentes oxidantes y/o fácilmente convertibles en radicales. De forma análoga existen Especies Reactivas del Nitrógeno (RNS), del Cloro (RClS) y del Bromo (BrS) (Halliwell et al, 2007). En la tabla 7 encontramos las principales especies reactivas del Oxígeno y el Nitrógeno.

Tabla 7. Especies reactivas del Oxígeno y el Nitrógeno

Radicales No radicales

- Superóxido (O2 ) Peróxido (H2O2) Hidroxilo (OH) Acido hipocloroso Especies (HOCl)

reactivas de Peroxilo (RO2) Ácido hipobromoso oxigeno (ROS) (HOBr)

Alloxilo (RO) Ozono (O3) 1 Hidroperóxilo (OH2) Oxigeno singlete ( O2)

Óxido nítrico (NO) Acido nitroso (HNO2) + Dióxido de nitrógeno (NO2) Catión nitrosito (NO ) Especies Anión nitroxilo (NO-) reactivas de Peroxinitrito (ONOO-) nitrógeno (RNS) Ácido peroxinitroso (ONOOH) Alquil peroxinitrito (ROONO)

Fuente: Rosas, 2003.

In vivo, algunos de estos radicales libres provenientes de diferentes orígenes desempeñan un papel positivo en fisiología celular; sin embargo, también pueden causar un gran daño a las membranas celulares y el ADN, como en la inducción de la oxidación, la peroxidación lipídica de la membrana, mutaciones que contribuyen a la generación de cáncer, enfermedades degenerativas, y otros (Harman, 1994; Ames, 1998; Finkel et al, 2000). 40

4.4.1. Principales fuentes de Radicales Libres: Existen diferentes fuentes para la generación de los radicales libres, de manera endógena, nuestro metabolismo se ve expuesto a una gran diversidad de estas especies reactivas (RL). La exposición a las fuentes exógenas en este momento es relevantemente alta por los cambios en el ambiente y por los nuevos y mejorados productos (Kohen, 1999).

4.4.1. Fuentes endógenas de Radicales Libres. Se refieren principalmente a ciertos procesos que se generan en nuestro metabolismo y que contribuyen a la generación de estas especies inestables; dentro de ellas se distinguen 4 eventos producidos por las células:

a) El primero se refiere a la actividad más realizada por los seres vivos la respiración, esencial para la vida, en el transcurso normal de la respiración aeróbica, las

mitocondrias consumen O2 reduciéndolo en varias etapas a H2O Inevitablemente,

a lo largo de este proceso aparecen subproductos como el O2·-, H2O2 y ·OH (Ames et al, 1993). b) Las células fagocíticas (leucocitos neutrófilos, macrófagos y eosinófilos) al activarse por medio de mediadores proinflamatorios o de productos bacterianos, víricos o de parásitos, destruyen las células infectadas por medio de un ataque - oxidativo en el que se producen grandes cantidades de O2, H2O2, ·OH, NO· y OCl (Forman y Torres, 2001). c) Los peroxisomas, orgánulos encargados de la degradación de ácidos grasos y

otras moléculas, producen H2O2 como subproducto, que es degradado de forma natural por la enzima catalasa (Kasai, Okada, Nishimura, Rao y Reddy, 1989). d) Las enzimas del complejo Citocromo P450 son las principales responsables del metabolismo oxidativo de los xenobióticos. La inducción de estas enzimas previene los efectos de toxicidad aguda de agentes extraños al organismo (Zangar, Davydov y Verma, 2004).

41

4.4.2. Fuentes exógenas de Radicales Libres. Son aquellas que son ajenas a nuestro metabolismo, estas se generan de manera externa por factores que incluyen los alimentos que ingerimos a través de la dieta, el ambiente, y la obtención de nuevos productos a lo que se ve expuesto nuestro organismo (Lachance, Nakat y Jeong, 2001; Fina, 2006; Dreosti, 2000). Las principales fuentes exógenas de radicales libres aparecen relacionadas en la tabla 8.

Tabla 8. Fuentes exógenas de radicales libres

Fibras de asbestos, Polvo de minerales, Ozono, Monóxido de carbono, Óxido nítrico y Dióxido de Contaminantes nitrógeno

Drogas Acetaminofén, Coprofloxacino, Antidepresivos Iones metálicos Hierro, Cobre, Cadmio Radiaciones Ultravioleta, Rayos X, Gamma Dieta Ácidos grasos poliinsaturados, Glucosa Otros Tabaco, Ejercicio intenso

Fuente: Ugartondo Casadevall, 2009

4.5. ANTIOXIDANTES

Gutteridge et al (1998) definieron “antioxidante” como “cualquier sustancia que, cuando está presente a bajas concentraciones respecto a las de un sustrato oxidable, retrasa o previene significativamente la oxidación de este sustrato” (Halliwell y Gutteridge, 1998). Los antioxidantes son sustancias que equilibran las especies reactivas o radicales libres, y al tiempo reducen su toxicidad, cuando estas proporcionan el equilibrio se convierten en un radical no nocivo y asimilable para los individuos (Rodríguez Perón, et al 2001). El sistema de defensa antioxidante juega un papel muy importante, controlando procesos

42 provocados y derivados por los radicales libres, generan un tipo de desintoxicación radical (Thomas, 1994; Halliwell et al, 1998)

4.5.1. Sistemas de defensa antioxidantes. Son mecanismos de defensa endógenos que se han desarrollado ante la oxidación producida por especies reactivas, estos se clasifican según su origen: endógenos (enzimáticos y no enzimáticos), exógenos.

4.5.1.1. Sistemas de defensa antioxidantes endógenos

 Sistemas enzimáticos Son la primera defensa antioxidante que tiene nuestro organismo, estas interactúan directamente con los radicales libres; son muy eficientes ya que con concentraciones muy bajas de ellas se ejerce protección. (Boots et al. 2008). Como por ejemplo:  Superóxido dismutasa (SOD): radical superóxido en peróxido de hidrógeno,  Catalasa (CAT): peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno  Glutatión peroxidasa (GPx): reduce hidroperóxidos (ROOH y H2O2), utilizando el glutatión

 Sistemas no enzimáticos Son la segunda barrera de protección antioxidante a la que se enfrentan los radicales libres están compuestos por sustancias de bajo peso molecular y estos son capaces de controlar y equilibrar las especies reactivas directa o indirectamente. El comportamiento de la acción indirecta se realiza a través de la quelación de metales de transición o reacción tipo Fenton. Como por ejemplo la ceruloplasmina, la transferrina y la lactoferrina, la haptoglobina y la albúmina (Kehrer, 2000; Vertuani, Angusti y Manfredini, 2004).

43

Las moléculas o sustancias que actúan de forma directa lo hacen a través de la transferencia electrónica o a través del secuestro de radicales evitando el daño de células diana. También poseen capacidad quelante de metales, lo que mejora su función como antioxidantes. Entre estas moléculas se encuentran:

• El tripéptido glutatión (GSH): Detoxificar H2O2 e interacciona con radicales como ·OH, · · ROO , RO , HClO y O2, agente quelante, (Ghezzi, 2005). • La bilirrubina y el ácido úrico: Impiden reacciones tipo Fenton. El ácido úrico, protege contra el O3, el NO· y RNS (Becker, 1993).

4.5.1.2. Sistema de defensa antioxidante exógeno. Cuando el sistema de defensa celular, integrado por antioxidantes de carácter enzimático y no enzimático, no logra contrarrestar el efecto oxidante provocado por los radicales libres, estos provocan un aumento de las especies radicalarias generando de esta manera enfermedades complejas como por ejemplo el cáncer (Valko, Morris, Mazur, Rapta, y Bilton, 2001; Valko, Rhodes, Moncol, Izakovic y Mazur, 2006), la diabetes (Wiernsperger, 2003), el Alzheimer (Butterfield, et al. 2002). Por lo anterior, es preciso la búsqueda de sustancias que disminuyan y contrarresten los efectos adversos de los radicales libres en nuestro organismo, esto ha conllevado a la sociedad al uso de fitoquímicos naturales como por ejemplo el té, las frutas y verduras (Kikuzaki, Usuguchi y Nakatani, 1991; Jitoe, Masuda y Tengah, 1992; Kikuzaki y Nakatani, 1993; Lee, Hwang y Ha, 2003). En cuanto al uso de estas plantas, a las cuales se les atribuye un alto potencial antioxidante, actividad atribuible a la presencia de estructuras de antioxidantes activos como los flavonoides, isoflavonas, flavonas, antocianinas, cumarinas, lignanos, catequinas, e isocatequinas. (Prior, Wu y Schaich, 2005; Cai, Luo y Sin, 2004; Kaur y Kapoor, 2002). En la tabla 9 se relacionan los principales antioxidantes naturales exógenos.

44

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  4.7. ANÁLISIS DE INTERACCIÓN MEDIANTE ISOBOLOGRAMAS

Con el aumento de enfermedades complejas la necesidad de fármacos día a día es más alta, es por esto que se han empezado a implementar técnicas farmacológicas para lograr un efecto deseado con los medicamentos, como por ejemplo, las combinaciones de analgésicos que se prescriben con frecuencia con el fin de mejorar el alivio del dolor y la reducción de los efectos adversos. Se ha establecido que la administración de más de un medicamento puede dar efectos mayores que, o menores que, el efecto de cada fármaco administrado individualmente (Cansier, 2003); para determinar el tipo de interacción generado en una mezcla se utilizan diferentes métodos, uno de ellos es el isobolograma, método de representación gráfica construido en un sistema de ejes de coordenadas en el que se ubican las dosis iso-efectivas (para un determinado nivel de efecto) de cada uno de los fármacos utilizados individualmente y de sus combinaciones. La combinación aditiva es una recta diagonal que une las dosis iso-efectivas de los fármacos (Loewe y Muiscaniek, 1927) Figura 12. Es relativamente sencillo para dibujar e interpretar, sin embargo, para esta técnica se utilizan concentraciones equiefectivas de los compuestos o fármacos, sin dejar de lado el comportamiento de estos de manera individual, al final se obtiene concentraciones como variables de las combinaciones y estas mostrarán una línea paralela. (Cansier, 2003). En el análisis de interacciones con isobologramas se aplica el cálculo de las dosis teóricamente aditivas para cada nivel de efecto y su comparación estadística con las dosis que producen el mismo efecto, pero obtenidas experimentalmente. La interpretación de la interacción producida entre dos fármacos o más, se puede explicar por los siguientes postulados:

 Cuando dos o más fármacos manifiestan efectos de manera independiente, no existe interacción y se habla de efectos aditivos (suma de efectos o interacción cero), da/DA + db/DB = 1

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 Si los efectos observados son mayores a los esperados se habla de un efecto sinérgico da/DA + db/DB < 1

 Si los efectos son de menor magnitud a los esperados se habla de un efecto antagónico. (Guadarrama, 2006).

da/DA + db/DB > 1

En la figura 11 se aprecia el comportamiento que se presenta cuando se combinan dosis equiefectivas de dos sustancias y su posible efecto. La línea diagonal (isobolo 1) indica la combinación teórica aditiva. El isobolo 2 muestra una asociación isoefectiva obtenida con dosis inferiores a las aditivas (sinergia). Los isobolos 3 y 4 muestran asociaciones isoefectivas con dosis superiores a las aditivas (antagonísmo).

Figura 11. Representación gráfica de un isobolograma y los comportamientos que pueden generarse en la combinación de sustancias. La línea n°1 muestra un comportamiento aditivo, la línea n°2 muestra un comportamiento sinérgico, mientras que las líneas n° 3 y 4 muestran un comportamiento antagónico.

Fuente: Pérez, A. M. (2004).

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La idea de isobolograma, es representar de la mejor manera, la curva equi-efectiva en diversas concentraciones o dosis de dos fármacos, este método se utiliza hace años; sin embargo, sólo hasta 1984 la derivación formal de su ecuación en la forma general se introdujo por Chou y Talalay. La ecuación isobol es sólo un caso especial de la ecuación de CI (Chou, 2006); Así se automatizo la construcción computarizado del isobolograma clásico (en combinaciones de relaciones constantes) o el isobolograma normalizado (en combinación proporción no constante) se puede realizar en cuestión de segundos utilizando CompuSyn software. (Chou y Martin, 2005)

 Teorema: El Índice de Combinación

El índice de combinación de conceptos (CI) fue presentado por Chou y Talalay TC P. durante 1983-1984. La ecuación del índice de combinación derivada de dos fármacos es:

Donde (Dx) 1 es para (D) 1 "solo" que inhibe un sistema de x y (Dx) 2 es para (D) 2 "solo" que inhibe un sistema de x%, mientras que en el numerador, (D) 1 + (D) 2, "en combinación" también inhiben x%, %, la relación de la fracción afectada (FA). Los denominadores de los dos últimos términos son la expresión de MEE. El CI del valor define cuantitativamente sinergismo (CI <1), efecto aditivo (IC = 1) y el antagonismo (CI> 1).

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5. DISEÑO METODOLÓGICO:

5.1. MATERIALES

5.1.1. Obtención del material vegetal. Para el presente estudio se utilizaron las partes aéreas (hojas) de las 3 plantas objeto de estudio: mosquero (Croton leptostachyus) figura 14, romadizo (Mollinedia racemosa) figura 15, limón de monte (Siparuna sessiliflora) figura 13. En la tabla 10 aparece el lugar de recolección y coordenadas de cada una de las plantas utilizadas en el trabajo,

Tabla 10. Puntos de muestreo

Planta Lugar de recolección Coordenadas

Vía Payande, Municipio de 4° 19’ 34,4’’ N Croton leptostachyus Ibagué (Figura 14) 75° 05’ 35,7’’ W

Yopal, Casanare 5° 19’ 15,2’’ N Mollinedia racemosa (Figura 15) 72° 23’ 28,5’’ W

Jardín Botánico, Universidad 4° 42’ 69,7’’ N Siparuna sessiliflora del Tolima 75° 21’ 32,8’’ W (Figura 13)

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Figura 112. Lugar de recolección de Siparuna sessiliflora

Figura 13. Lugar de recolección de Cr Croton leptostachyus

Fuente: SIGOT (IGAC)

Figura 14. Lugar de recolección de Mollinedia racemosa

Fuente: SIGOT (IGAC)

Fuente: SIGOT (IGAC)

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Dicho material fue colectado y traído al laboratorio GIPRONUT de la Universidad del Tolima para realizar su posterior secado (48 horas a 40°C), sucesivo a esto se realizó la trituración del material vegetal. Un Boucher de cada una de los especímenes se enviaron al herbario de la Universidad Nacional para su identificación. Se identificaron Mollinedia racemosa y Croton leptostachyus y Siparuna sessiliflora con número de colección 530879, 572765 y 575456 respectivamente.

5.1.2. Reactivos .Todos los reactivos utilizados en el desarrollo de este trabajo fueron de grado analítico. El radical ABTS.+ (ácido 2,2’azinobis-(3 etilbenzotiazolina)-6- sulfónico) y el radical DPPH (2,2-diphenil-1-picrilhidrazil) fueron obtenidos de SIGMA Chemical Co. El solvente utilizado (etanol) fue comprado a la Fábrica de licores con los rubros asignados por la oficina de investigaciones de la Universidad del Tolima para dicho proyecto.

5.2. MÉTODOS

5.2.1. Obtención de extractos vegetales (Método soxhlet). Para la extracción se hizo uso de un equipo de extracción soxhlet, para dicha extracción se utilizaron: 75,23 g de (Mollinedia racemosa) romadizo, 88,81 g de mosquero (Croton leptostachyus) y 76,81 g de limón de monte (Siparuna sessiliflora); se utilizó etanol como solvente, la extracción se repitió hasta el agotamiento de la muestra. El material obtenido después de la extracción se concentró en un rotaevaporador BÛCHI R114 y se almacenaron (4ºC), en frascos ámbar debidamente rotulados hasta su utilización. Para determinar la concentración final de cada uno de los extractos obtenidos se realizó la determinación de solidos totales.

Para determinar la concentración final de cada uno de los extractos obtenidos se realizó la determinación de solidos totales.

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5.2.2. Caracterización preliminar de los extractos vegetales. Para la caracterización de los extractos crudos se realizó un tamizaje evaluando así la presencia de metabolitos secundarios presentes en las plantas objeto de estudio; como saponinas, polifenoles, terpenos, esteroides, y alcaloides. La detección se realizó mediante ensayos cualitativos individuales para cada grupo químico, según la guía metodológica para la detección rápida de algunos núcleos secundarios y caracterización de una droga cruda, propuesto por Murillo-Perea y Méndez-Arteaga (2011). Lo anterior mediante reacciones de precipitación y de coloración.

5.3. PRUEBA DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

5.3.1. Actividad inhibitoria del catión radical del ácido 2,2- azinobis-(3 etilbenzotiazolina- 6-sulfónico ABTS). Para evaluar la actividad estabilizante de cada una de las plantas se utilizó la metodología descrita por Marquina, Araujo, Ruíz, Rodríguez-Malaver, y Vit, 2008; se preparó una mezcla entre el radical ABTS (7 mM) u el persulfato de amonio (4,9 mM) en relación 1:1. Esta mezcla se dejó en reposo 16 horas en oscuridad, después de lo cual s diluyo con etanol al 20% hasta alcanzar una absorbancia de 0,7 ± 0,02 a 734 nm; seguidamente se agregaron alícuotas de las concentraciones de 0,2 a 100 ppm; la mezcla se hizo en relación 1:50 respectivamente; posterior a esto se midió el cambio de densidad óptica a 734 nm después de los primeros 6 minutos de reacción. La actividad estabilizante del ABTS se determinó mediante la ecuación:

AABTS − A6min AEABTS = ( ) × 100 AABTS

Donde:

AEABTS: Actividad estabilizante del radical ABTS, expresada en porcentaje

AABTS: absorbancia del ABTS antes de agregar la muestra

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A6min: Absorbancia de la mezcla reaccionante a los 6 minutos

Como patrón se utilizó (0,0312 a 1 µg/mL), el cual fue sometido a las mismas condiciones de ensayo

5.3.2. Actividad estabilizante del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH). La capacidad para estabilizar el radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) se realizó siguiendo la metodología propuesta por Braca, Sortino y Politi (2002), con algunas modificaciones. Un volumen de cada una de las soluciones diluidas (5 a 1250 ppm) de los extractos (0,5 mL) se mezcló con la solución etanólica de DPPH (0,5 mL, 0.02%), en relación 1:1. La mezcla se conservó en oscuridad (30 min) y se midió la absorbancia a 517 nm contra un blanco (solvente y DPPH). Una curva patrón se preparó con trolox (0,0039 a 0,0625 µg/mL), para comparar la actividad de los constituyentes de las muestras para estabilizar el radical. Los valores de actividad antioxidante, a las distintas concentraciones de trabajo, se calcularon mediante la ecuación:

AB − AM %CEDPPH = ( ) × 100 AB

Dónde:

CEDPPH: Capacidad estabilizadora del radical DPPH, expresada en porcentaje. AB: Absorbancia del blanco AM: Absorbancia de la mezcla reaccionante

A partir de estos valores se estimó el porcentaje de inhibición del 50% del radical (CI50) (Concentración necesaria para inhibir o estabilizar el 50% de la concentración del radical bajo las condiciones de ensayo).

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5.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE MEZCLAS DE MOSQUERO (Croton leptostachyus), ROMADIZO (Mollinedia racemosa) Y LIMÓN DE MONTE (Siparuna sessiliflora).

Para este ensayo se realizaron mezclas binarias y terciarias de los 3 extractos vegetales.

Se tuvieron en cuenta las concentraciones medias inhibitorias (CI50) obtenidas en la estabilización de los radicales por los extractos crudos; y estas se sumaron 2 o 3 de las dependiendo fuera el caso (mezcla binaria o terciaria). Después se evaluó la actividad antioxidante mediante la estabilización de los radicales DPPH (Braca et al. 2002), y ABTS (Marquina et al. 2008). Y finalmente se les realizó el análisis de interacción mediante el programa Compusyn de versión libre (Chou et al, 2005).

5.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN UN MODELO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS (ERITROCITOS)

5.5.1. Obtención de los eritrocitos. Para la obtención de la sangre se utilizó la metodología propuesta por Sánchez en el 2009. Las muestras de sangre fueron obtenidas por venopunción en tubo sin anticoagulante, de donadores voluntarios sanos para enfermedades hemolíticas. La sangre fue centrifugada a 2500rpm por 10 minutos; el plasma y los leucocitos fueron removidos. Las células rojas se lavaron tres veces con buffer fosfato salino isotónico (PBS: Na2HPO4 22,2mM, KH2PO4 5,6mM, NaCl 123,3mM y glucosa 10mM en agua destilada, a pH 7,4).Cabe resaltar que se utilizó sangre fresca para evitar la hemolisis por otros factores.

5.5.2. Inhibición de la Hemolisis (Actividad antioxidante). El ensayo para estimar el efecto inhibitorio de los extractos sobre la hemólisis se realizó a través del método descrito por Ebrahimzadeh, Nabavi, Nabavi y Eslami (2010) con algunas modificaciones. Se tomaron alícuotas de 400µL de eritrocitos al 5% (v/v) en PBS a pH 7,4; luego se le adicionaron 200µL de los extractos a diferentes concentraciones de trabajo, excepto para el control negativo en el cual se adicionó PBS. Seguido a esto, se adicionaron 400 µL de

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H2O2 a una concentración 100mM, mezclando por inversión. Luego los tubos fueron incubados a 37°C con movimiento constante (en agitador) durante 1 hora. Pasado este tiempo, se adicionaron 6mL de PBS y se centrifugó a 4000rpm durante 10 minutos. Con el fin de evidenciar la hemoglobina liberada, se tomó el sobrenadante obtenido por centrifugación y se midió por espectrofotometría a 540nm. El porcentaje de inhibición de hemolisis fue calculado utilizando la siguiente ecuación:

% de Inhibición de Hemólisis = [(AC – A)/ AC] x 100

Donde Ac es la absorbancia del control negativo y A es la absorbancia de la muestra (con el extracto a cada una de las concentraciones estudiadas). Como control positivo fue utilizado Ácido Ascórbico a la misma concentración de los extractos (en los ensayos donde se utilizó el Ácido Ascórbico como control positivo; este fue preparado al momento del ensayo). Como control positivo se utilizó la vitamina C a concentraciones que varían entre 3,125 y 50 ppm.

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES

En la tabla 11 se presentan los resultados obtenidos tras el tamizaje fitoquímico

Tabla 11. Tamizaje fitoquímico realizado a los extractos crudos de M. racemosa, S. sessiliflora y C. leptostachyus

Extracto Núcleo secundario Prueba M. S. C. racemosa sessiliflora leptostachyus

Espuma - + + Saponinas Rosenthaler - ++ +++ Folin-Ciocalteau +++ + ++ Polifenoles CCD +++ ++ ++

FeCl3 +++ + ++ Gelatina-sal ++ + + Taninos Taninos +++ + - condensados Shinoda ++ + + Flavonoide PEW’S + + +

Fenilpropanoides Arnow +++ - + Terpenos Lieberman- + + + Y esteroides Burchard Salkowski + + +++

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Iridoides Vainillina - - ++ etanólica Dragendorff +++ + - Mayer - + - Alcaloides Erlich - - - Tanred + + - Valser + - - Quinonas Bornträger - - - Cumarinas CCD - + + Lactonas CCD - + + Cardiotónicos CCD - + + Barfoed - + +

CCD: Cromatografía de capa delgada +: Presente en baja cantidad ++: Presente en mediana cantidad +++: Presente en alta cantidad -: No están presentes en las condiciones de la prueba

En la tabla.11 se observan los resultados obtenidos tras la caracterización cualitativa de los extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus; las 3 especies mostraron la presencia de metabolitos como; taninos, flavonoides y fenilpropanoides, entre otros. La presencia de compuestos de naturaleza polifenólica en las 3 plantas fue abundante, destacando el contenido mayoritario de estos metabolitos en M. racemosa, compuestos que proporcionan una defensa ante diversos factores como, protección frente a factores externos como la radicación UV, ataque de los animales, de hongos y bacterias (Cooper-Driver y Bhattacharya, 1998; Stevenson y Hurst, 2007); estos metabolitos han sido reportados en literatura científica como unos de los principios activos más importante para la estabilización de radicales (Lambert, Sang y Yang, 2007; Cadenas, 2000).

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Los ensayos realizados para reconocer núcleos de naturaleza alcaloidal fueron positivos para M. racemosa, S. sessiliflora, destacando los de tipo morfina (analgésico utilizado en el tratamiento de dolores agudos), codeína, papaverina, noscapina, entre otros, y del grupo de las anfetaminas y derivados, como reportó Murillo, Lombo y Mendez (2011). Las saponinas encontradas en C.leptostachyus y S. sessiliflora, en esta caracterización podrían ser predictivos de la actividad hemolítica y tóxica que pueden presentar los extractos de estas plantas. Y están relacionados con la actividad hemolítica que se analizará más adelante.

6.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS

6.2.1. Actividad estabilizante del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Los resultados de la actividad estabilizante del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH), expresado como CI50; se representan en la Tabla 12.

Tabla 12. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical DPPH de los 3 extractos crudos

Planta CI 50 (ppm) Límites de confianza Límites de inferior confianza superior Mollinedia racemosa 128,8 ± 0,92 155,7 104,4 (Romadizo) Croton leptostachyus 53,5 ± 1,09 78,5 36,5 (Mosquero) Siparuna sessiliflora 304,1 ± 12,6 248,4 361,1 (Limón de monte) Trolox (patrón) 3.15x10-2 0,04 0,02 ± = desviación estándar

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Es notable la diferencia entre las CI50 de cada uno de los extractos en la estabilización del radical DPPH, los extractos estabilizaron el radical en forma decreciente asi; C. leptostachyus (53,5 ± 1,09), M. racemosa (128,8 ± 0,92) y por último S. sessiliflora

(304,1 ± 12,6) esta diferencia entre las CI50 de los 3 extractos podría explicarse en términos de sus núcleos fitoquímicos ya que la estabilización de dicho radical concuerda con los resultados obtenidos tras el tamizaje presentado en la tabla. 11; C. leptostachyus obtuvo la CI50 más efectiva en la estabilización de este radical aunque no tuvo la mayoría de núcleos fitoquímicos, lo cual indica la participación adicional de otros metabolitos, como por ejemplo los compuestos de naturaleza terpénica, ya que en esta planta se encontró gran cantidad y en estudios realizados por Salatino et al. (2007) se encuentran reportes del género de esta especie de diterpenoides de tipo cembranoides, clerodano, neoclerodano, halimano, isopimarano, kaurano, seco-kaurano, labdano y de triterpenoides pentacíclicos y esteroidales; los cuales han sido destacados por presentar capacidad antioxidante (Carreras, Miguel y Artiñano, 2012) debido a factores estructurales como: 1) Los dobles enlaces conjugados 2) la presencia de un grupo ceto conjugando con un doble enlace y 3) la posición trans de los enlaces conjugados respecto a la cis (Olleta, Apaza y Viturro, 2011). La diversidad de compuestos fenólicos (polifenoles, fenilpropanoides, cumarinas, flavonoides y taninos), son evidencia del potencial que pueden ofrecer estas plantas y un incentivo para estudios posteriores, de efectos fisiológicos y farmacológicos, atribuidos principalmente a su capacidad antioxidante. Entre los diferentes metabolitos encontrados puede destacarse la presencia de polifenoles ya que fueron los compuestos más abundantes encontrados en las 3 plantas, los cuales están relacionados con la capacidad antioxidante de matrices de este tipo, tal como lo confirman algunos autores (Ugartondo, 2009), destacandos por su capacidad quelante de metales y la estabilización de radicales libres (Lodovici et al., 2001). Mediante el análisis estadístico se determinó que la relación dosis-respuesta en la estabilización de este radical, se ajustó a diferentes modelos de regresión, siendo estadísticamente significativos (Los detalles pueden ser consultados en el anexo A).

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6.2.2. Actividad estabilizante del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS.+). Los resultados de la actividad estabilizante del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS.+), expresado como CI50; se representan en la Tabla 13.

Tabla 13. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical ABTS de los 3 extractos crudos

Planta CI 50 (ppm) Límites de Límites de confianza inferior confianza superior Mollinedia racemosa 11,2 ± 0,3 9,6 12,8 (Romadizo) Croton leptostachyus 11,6 ± 0,3 13,8 9,6 (Mosquero) Siparuna sessiliflora 47,2 ± 2,5 58,1 37,5 (Limón de monte) Trolox (patrón) 5,82 x 10-1 0,51 0,66

Los valores de CI50 observados en la estabilización del radical ABTS con mayor efectividad fueron romadizo (11,23) y mosquero (11,60), estos 2 extractos demostraron una actividad antirradicalaria mayor, esto puede atribuirse al contenido polifenólico (tabla. 11); estos compuestos exhiben una alta reactividad frente a los radicales libres (Londoño, 2012). Cuando se evalúa la capacidad de estabilización de radicales en matrices vegetales debe tenerse en cuenta la diferencia entre capacidad antioxidante y reactividad de un antioxidante; la primera proporciona información sobre el efecto antioxidante, mientras la segunda, demuestra la dinámica del efecto antioxidante a una concentración fija (Roginsky y Lissi, 2005; Roginsky, Barsukova, Loshadkin,y Pliss, 2003), si tienen en cuenta estos dos parámetros, en este estudio se evalúo dicha reactividad; es por esto que los métodos DPPH y el ABTS, siendo indirectos, demostraron resultados diferentes, ya que estabilizan los radicales por mecanismos disímiles, teniendo mayor influencia el mecanismo de estabilización radicalaria utilizado para estabilizar el radical ABTS 62

(trasferencia electrónica), frente al mecanismo de estabilización utilizado para el DPPH

(trasferencia de átomos de hidrogeno), ya que las CI50 presentadas en la estabilización del radical ABTS fueron mucho más efectivas que las presentadas para el DPPH; lo cual puede indicar que en los 3 extractos existen metabolitos capaces de hacer una mejor transferencia electrónica. Mediante el análisis estadístico se determinó que la relación dosis-respuesta en la estabilización de este radical, se ajustó a diferentes modelos de regresión (Ver detalles en anexo B).

6.3. ACTIVIDAD ESTABILIZANTE (DPPH) DE MEZCLAS DE EXTRACTOS DE M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus

Los resultados de actividad estabilizante del (DPPH), de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus se presentan en la Tabla 14.

Tabla 14. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical DPPH de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus

Planta IC 50 (ppm) Límites de Límites de confianza confianza inferior superior M.racemosa + C. leptostachyus 13,1 ± 0,3 6,6 443,0

C. leptostachyus + S. sessiliflora 178,1 ± 2,7 227,6 135,7 M.racemosa + S. sessiliflora 99,2 ± 0,9 175,5 56,5 M.racemosa + C. leptostachyus 80,4 ± 1,9 176,3 36,8 + S. sessiliflora

Las CI50 de las mezclas (romadizo + mosquero; mosquero+ limón de monte; romadizo + limón de monte; romadizo + mosquero + Limón de monte), halladas para la estabilización del radical DPPH a través del análisis estadístico, indican una mayor efectividad

63 antirradicalaria en la mezcla binaria preparada a partir de los extractos, romadizo + mosquero, si se compara con las CI50 obtenidas para este radical por parte de los extractos individuales; lo que indica una potencialización de la capacidad antirradicalaria evaluada mediante la interacción de los principios activos presentes en esta mezcla. Mediante el análisis estadístico se determinó que la relación dosis-respuesta en la estabilización de este radical, se ajustó a diferentes modelos de regresión (Los detalles pueden ser consultados en el anexo C). Además se realizó un análisis de interacción a través del software COMPUSYN para la estabilización del radical DPPH; en las figuras 16-18 se encuentran los isobologramas obtenidos para las mezclas binarias, con 3 interpolaciones a las cuales pueden seguirse obteniendo combinaciones de los extractos, la figura 19 es la dosis respuesta de la mezcla ternaria, mostrándonos el tipo de interacción generada, además se obtuvieron índices de interacción (anexo I); todos estos valores fueron inferiores a 1, lo que indica una interacción sinérgica entre las mezclas binarias de los extractos evaluados. La mezcla obtenida a partir de los extractos de mosquero + romadizo (figura 15) muestra los índices de interacción más efectivos en la estabilización de dicho radical los cuales oscilan entre 0.02883 y 0.04715 (ver anexo G), indicando una acción sinérgica entre ellos. En cuanto a la mezcla ternaria (figura 18), se evidencian índices de interacción que oscilan entre 0.11801 y 0.07813, índices inferiores a 1 demostrando una acción sinérgica disminuida con tendencia a la aditividad. De lo anterior se puede concluir que la estabilización del radical DPPH se realiza de una forma potenciada por las mezclas binarias de los extractos, y que no se hace necesario evaluar mezclas ternarias ya que no se encontraran efectos potencializados en ella.

64

Figura 15. Isobolograma de la mezcla Figura 16. Isobolograma de la Mosquero + Romadizo para DPPH mezcla Mosquero + Limón de monte para DPPH

Figura 17. Isobolograma de la Figura 128. Curva dosis- respuesta de mezcla de Romadizo + Limón de la mezcla Romadizo + Mosquero + monte para DPPH Limón de monte para DPPH

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6.4. ACTIVIDAD INHIBITORIA DEL RADICAL ABTS.+ DE MEZCLAS DE EXTRACTOS PROVENIENTES DE M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus

Los resultados de actividad inhibitoria del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS.+) de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C.leptostachyus se presentan en la Tabla 15.

Tabla 15. Concentraciones inhibitorias medias para la estabilización del radical ABTS de mezclas de extractos provenientes de M. racemosa, S. sessiliflora y C. leptostachyus

IC 50 (ppm) Límites de Límites de Planta confianza confianza inferior superior M. racemosa + C. leptostachyus 12,0 ± 0,2 13,3 10,7 C. leptostachyus + S. sessiliflora 36,7 ± 1,1 45,2 29,2 M.racemosa + S. sessiliflora 26,8 ± 0,6 30,8 23,0 M.racemosa + C. leptostachyus 27,9 ± 0,1 32,6 23,6 + S. sessiliflora

Las CI50 estimadas para las mezclas de los extractos (Romadizo + Mosquero; Mosquero+ Limón de monte; Romadizo + Limón de monte; Romadizo + Mosquero + Limón de monte), indican una mayor efectividad en la mezcla binaria Romadizo + Mosquero

(11,96), al comparar este resultado con las CI50 de los extractos individuales, se deduce que los extractos individuales demuestran una mayor capacidad antirradicalaria. Adicional a la actividad antioxidante generada por las mezclas de los extractos se realizó un análisis de interacción a través del software libre COMPUSYN. En las figuras 19 a 21 se encuentran los isobologramas correspondientes a las interacciones generadas entre las mezclas binarias y 3 extrapolaciones en las cuales puede realizarse dicha mezcla, la figura 22 es la figura de la dosis-respuesta generada por la mezcla ternaria de los

66 extractos. Los índices de interacción (Anexo H) generados a partir del software COMPUSYN en la estabilización del radical ABTS.+, genero valores superiores a 1, lo que indica una interacción de tipo antagónico en todas las mezclas evaluadas. La mezcla binaria Romadizo- Limón de monte, muestra los índices de interacción más altos, estos oscilan entre 0.74468 y 211.001. En cuanto a la mezcla ternaria se evidenciaron valores entre 18.4807 y 2.23341, evidenciando una acción antagónica. El análisis de varianza determinó que la relación dosis-respuesta en la estabilización de este radical ABTS, se ajustó a diferentes modelos de regresión (Los detalles pueden ser consultados en el anexo D).

Como ya se había mencionado anteriormente es importante considerar los diferentes mecanismos de estabilización radicalaria y la interacción que puede existir entre los distintos metabolitos que influencian la actividad antioxidante, ya que la mezcla de extractos o componentes bioactivos no necesariamente potencian una determinada actividad biológica. En este caso las mezclas generaron interacciones que no están relacionadas exactamente con la actividad individual de sus componentes, por esto se hace necesario realizar este tipo de evaluaciones como: la transferencia protónica para DPPH y la transferencia electrónica para ABTS, hecho que podría influir en el tipo de interacciones observadas, además,

No existe un método estandarizado para determinar la capacidad antioxidante, puesto que debería cumplir con condiciones como: 1) utilizar siempre un radical biológicamente relevante, 2) ser un método simple, 3) utilizar un punto final definido y un mecanismo conocido, 4) emplear instrumentación disponible fácilmente, 5) tener reproducibilidad, 6) ser adaptable para medir antioxidante lipofilicos/hidrofilicos y a diferente radicales, 7) ser adaptable a formatos de tamizaje de alta capacidad para control de calidad de rutina en gran cantidad de muestras (Prior et al, 2005).

Teniendo en cuenta los ideales anteriores las pruebas de actividad antioxidante realizadas en este estudio no son suficientes para determinar el potencial de las 3

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plantas, por lo que se hace necesario implementar el uso de más pruebas directas e indirectas para llegar resultados verdaderos frente a esta actividad.

Figura 19. Isobolograma de la mezcla Figura 20. Isobolograma de la mezcla Mosquero + Limón de monte para ABTS Mosquero + Romadizo para ABTS

Figura 21. Isobolograma de la mezcla Figura 22. Curva dosis respues de la Romadizo + Limón de monte para ABTS mezcla Romadizo + Mosquero + Limón de monte para ABTS

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6.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN UN MODELO DE CELULAS SANGUÍNEAS (ERITROCITOS)

Los resultados anteriores, cuestionan muchos de los trabajos que se realizan en torno a las evaluaciones de actividad antioxidante in vitro, ya que los métodos indirectos popularizados con algunos radicales meta-estables demuestran la habilidad de un compuesto para estabilizar algún radical; pero estos solo miden la capacidad para donar hidrógenos o electrones, este mecanismo será determinado por la estructura química del antioxidante o por factores como; solubilidad, coeficiente de partición, energía de disociación del enlace (EDE), potencial de ionización (PI) entre otros (Wright, Johnson y Dilabio, 2001), y no se relacionan con la actividad antioxidante (Londoño, 2012), generando la necesidad de probar esta actividad en modelos que permitan extrapolar de manera eficaz los resultados bajo condiciones in vivo, o métodos directos que se basan en el efecto antioxidante sobre la degradación oxidativa, usando proteínas, ácidos nucleicos, grasas o membranas celulares (Londoño, 2012). En este estudio, se utilizaron eritrocitos (modelo de células sanguíneas), usando el peróxido de hidrogeno (H2O2) como sistema generador de especies radicalarias, considerando su reactividad, y el efecto nocivo para las biomembranas, lo cual lo convierte en precursor del daño oxidativo a nivel celular (Sroka y Cisowski, 2003).

Los resultados observados en la evaluación de la actividad antioxidante demuestran que los extractos crudos y las mezclas de los extractos inhiben especies radicalarias como DPPH y ABTS, mientras que los resultados de los ensayos donde se determinó una actividad hemolítica muestran efectos diferentes. En los extractos de C. leptostachyus y S. sessiliflora se podría explicar por la presencia de saponinas, las cuales podrían enmascarar el potencial hemolítico o protector del resto de metabolitos presentes en los extractos

Debido a que en el ensayo se probaron las CI50 de los extractos frente a los radicales estudiados, es de entenderse que las concentraciones más altas se hayan probado.

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(QRUGHQGHFUHFLHQWHGHWR[LFLGDGVHHQFXHQWUDQ6VHVVLOLIORUD&OHSWRVWDFK\XV\0 UDFHPRVD (QHOFDVRGH0UDFHPRVDQRVHREVHUYyQLQJ~QHIHFWRSURWHFWRUSRUSDUWHGHOH[WUDFWR VREUH OD PHPEUDQD GH ORV HULWURFLWRV D SHVDU GH TXH QR VH GHWHFWy OD SUHVHQFLD GH VDSRQLQDV HQ HO WDPL]DMH ILWRTXtPLFR UHDOL]DGR DO LQLFLR GH HVWH WUDEDMR WDEOD   OD SRVLEOHFRPSHWHQFLDHQWUHORVPHFDQLVPRV\ODJHQHUDFLyQGHHVSHFLHVSURR[LGDQWHV 3pUH]7UXHED  SRGUtDVHUXQIDFWRUGHWHUPLQDQWHDOPRPHQWRGHHVWDEOHFHUOD HVWDELOLGDG GH ODV HVSHFLHV JHQHUDGDV \ VX FRQWULEXFLyQ FRQ UHVSHFWR D OD DFWLYLGDG DQWLR[LGDQWHWRWDOHQXQVLVWHPDFRPRHOTXHVHHYDOXyHQHVWHWUDEDMR /RVUHVXOWDGRVGHORVDQiOLVLVGHYDULDQ]DUHDOL]DGRVFRQORVH[WUDFWRVGHODVSODQWDVVH SXHGHQDSUHFLDUHQODVILJXUDV\  )LJXUDGHKHPROLVLVGHHULWURFLWRVKXPDQRVWUDWDGRVFRQHOH[WUDFWRHWDQyOLFRGH 0UDFHPRVD URPDGL]R DGLIHUHQWHVFRQFHQWUDFLRQHV

      







    

  Figura 24. % de hemolisis de eritrocitos humanos tratados con el extracto etanólico de C. leptostachyus (mosquero) a diferentes concentraciones

Medias y 95,0% de Fisher LSD

166

146

126

106

86 % Hemolisis Mosquero

66 50 100 200 400 800 ppm

Figura 25. % de hemolisis de eritrocitos humanos tratados con el extracto etanólico de S. sessiliflora (limón de monte) a diferentes concentraciones

Medias y 95,0% de Fisher LSD

1100

900

700

500

300

100 % Hemolisis Limón de monte -100 250 500 1000 2500 5000 Concentracíon ppm

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Cabe resaltar que con este ensayo se cualifico de manera indirecta su toxicidad, demostrándonos que estos extractos a pesar de tener una capacidad para estabilizar los radicales en ensayos indirectos, en ensayos directos generaron una lisis. No obstante, estos resultados no son determinantes de toxicidad de estas especies ya que es un ensayo preliminar que no considera todas las condiciones de un sistema in vivo, por lo cual ensayos posteriores de este tipo podrían ampliar el conocimiento respecto a la inocuidad o toxicidad de las matrices objeto de estudio.

Teniendo en cuenta la citotoxicidad generada por los extractos crudos utilizados en este estudio, estos podrían utilizarse en el tratamiento de enfermedades oncológicas, estos podrían disminuir la proliferación de este tipo de células, y así apreciaríamos sin duda el potencial mostrado por estas plantas. .

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7. CONCLUSIONES

 La complejidad de las matrices vegetales evaluadas en este trabajo, parece tener una fuerte influencia en la mayoría de ensayos realizados; teniendo en cuenta que cada uno de los extractos debe demostrar una interacción entre sus metabolitos de acuerdo a lo encontrado en el barrido fitoquimico, quizás por esto los ensayos realizados a los extractos individuales demostraron mejores resultados que las mezclas, ya que entre estas se puede estar generando un enmascaramiento o una acción prooxidante entre sus metabolitos, generando de esta manera una disminución en su actividad.

 La acción generada sobre los eritrocitos demuestra una alta toxicidad, resultados poco alentadores para el objetivo de este trabajo; pero esto puede ser un indicio para estudios posteriores, especialmente para los que están relacionados con terapia anticancer por ejemplo.

 Existen limitaciones inherentes a cada una de las metodologías utilizadas para la evaluación de la actividad antioxidante, por lo que se hace necesario complementar la información obtenida con la implementación de más modelos in vitro y algunos modelos in vivo que permitan obtener un mayor conocimiento de las especies.

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RECOMENDACIONES

 Emplear métodos antioxidantes directos e indirectos para evaluar las potencialidades de una plata especifica.  Realizar una cuantificación de los metabolitos presentes en las plantas a estudiar para tener un panorama amplio y asi atribuir actividades.

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88

ANEXOS

89

Anexo A. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH); para cada uno de los extractos crudos

Limón de monte

Mosquero

90

Romadizo

Anexo B. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del Actividad inhibitoria del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS.+)

91

92

Anexo C. Análisis de regresión generada por el programa Statgrafics en la estabilización del radical 2,2-diphenil-1-picrilhidrazil (DPPH); para cada uno de las mezclas de extractos crudos

93

94

Anexo D. Análisis de regresión generadas por el programa Statgrafics en la estabilización del catión radical del ácido 2,2-azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico

(ABTS.+) para mezclas de extractos crudos.

95

96

Anexo E. Análisis estadístico en la estabilización de los radicales de los extractos crudos

 DPPH

Extracto Modelo R2 % Coeficiente de correlación Romadizo Raíz cuadrada X , ACTIVIDAD abs = 98,9238 0,994604 -24,8856 + 6,59939*raiz2(Concentración ppm) Mosquero Raíz cuadrada-Y Log-X. ACTIVIDAD abs 98,4507 0,992223 = (-0,667296 + 1,9443*ln(concentración ppm))^2 Limón de Raíz cuadrada X. ACTIVIDAD abs = 98,381 0,991872 monte 3,48655 + 0,152947*concentración ppm

 ABTS Extracto Modelo R2 % Coeficiente de correlación Romadizo Lineal. ACTIVIDAD abs = 5,83738 + 98,4471 0,992205 3,93048*concentración ppm Mosquero Doble raíz cuadrada. ACTIVIDAD abs = 99,1384 0,995683 (1,80658 + 1,54574* raiz2(concentración ppm))2 Limón de Raíz cuadrada-X. ACTIVIDAD abs = - 98,8616 0,994292 monte 13,8858 + 9,30096*sqrt(CONCENTRACION ppm)

97

Anexo F. Análisis estadístico en la estabilización de los radicales de las mezclas de los extractos

 Mezclas de extractos (DPPH)

Mezcla de Modelo R2 % Coeficiente de extractos correlación (DPPH) Romadizo + Curva S. actividad abs = 92,8031 0,963344 Mosquero exp(4,48558 - 7,4994/concentración ppm)

Romadizo + Raíz cuadrada-Y Log-X. ACTIVIDAD 96,8675 0,984213 Limón de abs = (-2,86456 + monte 2,16127*ln(CONCENTRACION ppm))^2

Mosquero + Raíz cuadrada-X. ACTIVIDAD abs = 98,2081 0,991 Limón de -15,8939 + 6,98212* raiz2 monte (CONCENTRACION ppm)

Romadizo + Log-X. ACTIVIDAD abs = - 94,1689 0,970407 Mosquero+ 57,8138 + 24,574*ln(CONCENTRACION Limón de ppm) monte

98

 Mezclas de extractos (ABTS)

Mezcla de Modelo R2 % Coeficiente extractos de (ABTS) correlación Romadizo + Doble raíz cuadrada. ACTIVIDAD 99,6501 0,998249 Mosquero abs = (1,11687 + 1,72196*sqrt(CONCENTRACION ppm))^2 Romadizo + Doble raíz cuadrada. ACTIVIDAD 99,459 0,997291 Limón de abs = (1,03048 + monte 1,16746*sqrt(CONCENTRACION ppm))^2 Mosquero + Raíz cuadrada-X. ACTIVIDAD abs 98,4219 0,992078 Limón de = -9,68574 + monte 9,85882*sqrt(CONCENTRACION ppm) Romadizo + Doble raíz cuadrada. ACTIVIDAD 99,4181 0,997086 Mosquero+ abs = (1,03048 + Limón de 1,16746*sqrt(CONCENTRACION monte ppm))^2

99

Anexo G. Análisis de interacción (sinergismo, antagonismo o aditividad) generado por las mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del software COMPUSYN para la estabilización del DPPH

 Mezcla binaria: Mosquero + Romadizo. Las dos primeras tablas muestran las concentraciones y los efectos mostrados por los extractos individuales y la tercera muestra las concentraciones y los efectos de la mezcla.

 Mezcla binaria: Mosquero + Limón de monte

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 Mezcla binaria: Romadizo + Limón de monte

 Mezclas terciaria: Romadizo + Mosquero + Limón de monte

101

Anexo H. Análisis de interacción (sinergismo, antagonismo o aditividad) generado por las mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del software COMPUSYN para la estabilización del ABTS+.

 Mezcla binaria: Mosquero + Limón de monte

 Mezcla binaria: Mosquero + Romadizo

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 Mezcla binaria: Romadizo + Limón de monte

 Mezclas terciaria: Romadizo + Mosquero + Limón de monte

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Anexo I. Acción conjunta generada por mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del programa COMPUSYN para la estabilización del radical 2,2-diphenil-1- picrilhidrazil (DPPH)

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Anexo J. Acción conjunta generada por mezclas de los extractos crudos, determinadas a través del programa COMPUSYN para la estabilización del catión radical del ácido 2,2- azinobis-(3 etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS+)

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