UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS Evolutionary history of Philaenus spumarius (Hemiptera, Aphrophoridae) and the adaptive significance and genetic basis of its dorsal colour polymorphism Doutoramento em Biologia Especialidade em Biologia Evolutiva Ana Sofia Bartolomeu Rodrigues Tese orientada por: Professor Doutor Octávio Paulo Doutor Chris Jiggins Documento especialmente elaborado para a obtenção do grau de doutor 2016 UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS Evolutionary history of Philaenus spumarius (Hemiptera, Aphrophoridae) and the adaptive significance and genetic basis of its dorsal colour polymorphism Doutoramento em Biologia Especialidade em Biologia Evolutiva Ana Sofia Bartolomeu Rodrigues Júri: Presidente: ● Doutora Maria da Luz da Costa Pereira Mathias, Professora Catedrática da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Presidente do júri por subdelegação de competências Vogais: ● Doutor Thomas Schmitt, University Professor (W3) da Faculty of Natural Sciences I da Martin Luther Universität Halle Wittenberg (Alemanha) ● Doutor Diogo Francisco Caeiro Figueiredo, Professor Catedrático da Escola de Ciências e Tecnologia da Universidade de Évora ● Doutora Maria Alice da Silva Pinto, Professora Adjunta da Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Bragança ● Doutor José Alberto de Oliveira Quartau, Professor Catedrático Aposentado da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa ● Doutor Octávio Fernando de Sousa Salgueiro Godinho Paulo, Professor Auxiliar da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa ● Doutora Sofia Gonçalves Seabra, Professora Auxiliar Convidada da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa Documento especialmente elaborado para a obtenção do grau de doutor 2016 TABLE OF CONTENTS AGRADECIMENTOS \ ACKNOWLEDGEMENTS iii ABSTRACT v RESUMO vii CHAPTER 1 – General Introduction 1 1.1 – A view of the adaptation process 3 1.2 – Colour polymorphisms and the study of adaptation 5 1.3 – Genetic basis of colour variation 6 1.4 – Colour genes for pigmentation variation 8 1.5 – From genetics to genomics 10 1.6 – Meadow spittlebugs as models to study colour polymorphisms 12 1.6.1 – The meadow spittlebug Philaenus spumarius 12 1.6.2 – Dorsal colour variation 13 1.6.3 – Evolutionary history of the species 17 1.6.4 – Philaenus species 18 1.7 – Objectives and thesis structure 19 1.8 – References 21 CHAPTER 2 – New mitochondrial and nuclear evidences support recent demographic expansion and an atypical phylogeographic pattern in the spittlebug Philaenus spumarius (Hemiptera, Aphrophoridae) 37 CHAPTER 2 – Supporting information 51 CHAPTER 3 – Differential survival and reproduction in colour forms of Philaenus spumarius (Hemiptera, Aphrophoridae) give new insights to the study of its balanced polymorphism 69 CHAPTER 4 – Assessing genotype-phenotype associations in three dorsal colour morphs in the meadow spittlebug Philaenus spumarius (L.) (Hemiptera: Aphrophoridae) using genomic and transcriptomic resources 79 CHAPTER 4 – Supporting information 113 CHAPTER 5 – Genetic variation of the yellow gene in spittlebugs of genus Philaenus (Hemiptera, Aphrophoridae) 141 CHAPTER 5 – Supporting information 163 i CHAPTER 6 – General Discussion 167 6.1 – General Discussion 169 6.2 – Final Remarks 176 6.3 – Future Directions 177 6.4 – References 178 NOTE: The varying format of some chapters in this thesis reflects the specific requirements of the scientific publications to which the presented manuscripts were submitted. ii AGRADECIMENTOS / ACKNOWLEDGEMENTS Gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuiram para a realização deste trabalho e sem o apoio dos quais esta tese não teria sido possível. Ao Professor Doutor Octávio S. Paulo e à Doutora Sofia Seabra por me terem sugerido este projeto de doutoramento e pelo apoio no planeamento e realização do mesmo. Por terem partilhado os seus conhecimentos e me atrairem para o mundo da Biologia Evolutiva. Pelo seu entusiasmo e encorajamento face aos muitos desafios colocados ao longo deste trabalho. Agradeço ainda pela confiança depositada nas minhas capacidades e pela oportunidade de aprender um pouco mais sobre este inseto fascinante. To Dr Chris Jiggins for kindly accepting to be my co-adviser and for giving me access to his laboratory at Zoology Department of Cambridge University. For contributing with his expertise to this project. Thank you so much for your patience to attend all my requests and to comment the drafts of my thesis and manuscripts. To the Financial support provided from National Funds through FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Portugal under projects PTDC/BIA-BEC/098783/2008 and UID/BIA/00329/2013, and grant SFRH/BD/73879/2010. A todos aqueles que colaboraram e me ajudaram na recolha de amostras no campo: Sara E. Silva, Eduardo Marabuto, José A. Quartau, Paulo A.V. Borges, Rui Nunes, Luís Ferreira, Carla Pereira, Paulo Fonseca, Vera Nunes, Filipe Ribeiro, Paula Simões, Andreia Penado, Selçuk Yurtserver, Olli Halkka, Liisa Halkka, K. Halkka, Mike Wilson, Vinton Thompson, Andy Beckenbach, Martin Corley, Vera d' Urso, Federico Lessio, Jerome Constant e MajaDerlink. To everyone that helped me in the laboratory work at Faculdade de Ciências and at Zoology Department of Cambridge University, specially to Sofia Seabra, Sara E. Silva, Carla Ribeiro and Dr. Simon Baxter. À Sara, uma amiga que acompanhou de perto todos os altos e baixos desta minha caminhada e com quem tenho partilhado esta aventura ciêntifica desde o 1º ano da faculdade. Obrigada pelos bons momentos passados no campo e por aturares os meus “stresses”. Obrigada por me ajudares no laboratório e pela disponibilidade que demonstraste quando te pedi para reveres os manuscritos da tese e artigos. Sobretudo, obrigada pela tua amizade. iii À Carla Ribeiro, uma amiga com quem partilhei esta aventura. Obrigada pela tua ajuda no laboratório e não só. Agradeço pela tua boa disposição e alegria que me contagiaram nos momentos menos bons. Não me esqueço das boleias que me deste sempre que os senhores revisores e maquinistas dos transportes públicos resolviam tirar uns dias para “descansar”. Obrigada por teres sido uma companheira nesta viagem, pelas palavras de conforto e incentivo. Ao Francisco Pina Martins, agradeço pela disponibilidade e paciência demonstrada aquando dos meus “stresses” bioinformáticos. Obrigada por me ajudares a entrar neste mundo agora não tão assustador. Hoje posso dizer que sei escrever um script, ler código e resolver problemas básicos de programação. Contudo, não sou uma “expert” e sei que ainda te vou chatear muito, afinal és o único capaz de pôr o PC a funcionar apenas por estares presente. À Catarina Dourado, por todo o carinho e amizade. Pelos bons momentos que passámos juntas e pelas palavras de conforto. Obrigada pelos momentos de descontração e procrastinação. Agradeço-te a ti e à Claúdia pelo tempo passado na vossa companhia e que me permitiu esquecer um pouco os “stresses” do trabalho. Pelas nossas aventuras e passeios pela Europa que espero continuar a partilhar com vocês. Ao Eduardo, pela imprescindível ajuda no trabalho de campo. Pela sua boa disposição e palavras de incentivo. Mas principalmente por ser um bom amigo. À Telma, pelas suas palhaçadas que me fizeram rir nos bons e maus momentos. Pelo incentivo e apoio. Pelas nossas conversas sobre tudo e sobre nada. Aos meus restantes amigos e colegas do CoBig, agradeço pela amizade e pelos momentos de boa disposição, pela entreajuda e partilha de conhecimentos e sobretudo pelo encorajamento nos momentos mais difíceis da tese. A toda a minha família, em especial à minha mãe e à minha irmã, pelo apoio e incentivo que sempre me deram ao longo destes anos e por estarem comigo nos momentos mais difícies da realização desta tese. Mãe obrigada pela tua força e coragem e por todos os sacrifícios que fizeste por mim e que me permitiram chegar até aqui. A todos aqueles que me esqueci de mencionar mas sem os quais esta tese não seria possível. iv ABSTRACT Understanding the genetic basis of adaptive traits and how natural populations adapt to their environment, are fundamental problems in evolutionary biology. Colour polymorphisms are good systems in which these issues can be addressed. This work exploits the adaptive significance of the dorsal colour polymorphism in Philaenus spumarius and describes the efforts to identify genomic region(s) linked to the dorsal colour variation in this species. It also involves the investigation of the evolutionary pattern of P. spumarius. The phylogeographic results showed that main demographic and evolutionary events for the European populations seem to have occurred during Pleistocene, probably as a consequence of the main climatic oscillations that characterised this period. Evidence of recent gene-flow among Mediterranean peninsulas, as well as a close relationship between Iberia and North Africa, a probable British origin for the populations of the Azores and New Zealand, and indication that both western and north-eastern Europe colonised North America, were also found. Captivity experiments, testing the adaptive function of P. spumarius' dorsal colour polymorphism, indicated a higher longevity, a higher number of oviposition events, and a higher number of eggs laid for trilineatus than for marginellus and typicus. A total of 1,837 genomic markers (SNPs) and 928 loci were obtained through RAD sequencing for 33 individuals of three colour phenotypes (trilineatus, marginellus and typicus), and a genome wide association study performed to identify regions